Técnicas analíticas no control da fraude por substitución en produtos da pesca e a súa aplicación en España

Javier Castelos Esparís Técnicas analíticas no control da fraude por substitución en produtos da pesca e a súa aplicación en España Facultade de Veterinaria Grao en Veterinaria Ano 2021 Modalidade do Traballo: Revisión Bibliográfica Traballo de Fin de Grao Licenza Agás onde se faga constar explicitamente, esta obra pertence a Javier Castelos Esparís e está baixo unha licenza de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. 1 Resumo Técnicas analíticas no control da fraude por substitución en produtos da pesca e a súa aplicación en España A alta complexidade na cadea alimentaria que presentan os produtos da pesca é ideal para a presenza de actividades fraudulentas que poden supoñer un risco elevado para a saúde pública. Co fin de combater as fraudes alimentarias neste sector, existen numerosos mecanismos públicos que verifican que as actividades dos operadores son completamente lícitas. Entre eses mecanismos preséntanse unha gran variedade de técnicas analíticas, tanto de índole biolóxica como química, que permiten identificar con elevada precisión as especies que se presentan nos mercados. Entre as máis empregadas destacan o código de barras do ADN, a PCR (sobre todo as variantes que emiten resultados a tempo real) e a espectrometría, todas elas contan con numerosos estudos que avalan a súa efectividade para esta labor. Unha boa implementación destas ferramentas nas inspeccións pode supoñer un avance máis cara a mellorar a loita contra a fraude alimentaria. Palabras chave: rastrexabilidade, métodos analíticos, peixe, fraude, inspección, control oficial, España. 2 Resumen Técnicas analíticas en el control del fraude por substitución en productos de la pesca y su aplicación en España La alta complejidad en la cadena alimentaria que presentan los productos de la pesca es ideal para la presencia de actividades fraudulentas que pueden suponer un riesgo elevado para la salud pública. Con el fin de combatir los fraudes alimentarios en este sector, existen numerosos mecanismos públicos que verifican que las actividades de los operadores son completamente lícitas. Entre estos mecanismos se presentan una gran variedad de técnicas analíticas, tanto de índole biológica como química, que permiten identificar con elevada precisión las especies que se presentan en los mercados. Entre las más empleadas destacan el código de barras del ADN, la PCR (sobre todo las variantes que emiten resultados en tiempo real) y la espectrometría, todas ellas cuentan con numerosos estudios que avalan su efectividad para esta labor. Una buena implementación de estas herramientas en las inspecciones puede suponer un avance más en la mejora de la lucha contra el fraude alimentario. Palabras clave: trazabilidad, métodos analíticos, pescado, fraude, inspección, control oficial, España. 3 Abstract Analytical techniques in the control of substitution fraud in fishery products and their application in Spain The high complexity of the food chain for fishery products is ideal for fraudulent activities that can pose a high risk to public health. In order to combat food fraud in this sector, numerous public mechanisms are in place to verify that operators' activities are completely legal. These mechanisms include a wide variety of analytical techniques, both biological and chemical, which allow highly accurate identification of the species sold on markets. Among the most used are DNA barcoding, PCR (especially those varieties with real-time results) and spectrometry, all of them appear in several studies that support their effectiveness for this work. A good implementation of these tools in inspections can be a further step improving the fight against food fraud. Key words: traceability, analytical methods, fish, fraud, inspection, official control, Spain. 4 Índice Resumo .......................................................................................................................................... 1 Resumen ........................................................................................................................................ 2 Abstract ......................................................................................................................................... 3 Índice de gráficas .......................................................................................................................... 6 Índice de ilustracións ..................................................................................................................... 6 Índice de táboas ............................................................................................................................. 6 Abreviaturas .................................................................................................................................. 7 1. Introdución e obxectivos ........................................................................................................... 9 1.1. Situación actual do sector pesqueiro na Unión Europea .................................................... 9 1.2. Fraude alimentaria nos produtos da pesca ........................................................................ 11 1.2.1. Categorías de fraude alimentaria ............................................................................... 11 1.2.2. Lexislación aplicable ................................................................................................. 14 2. Materiais e métodos ................................................................................................................ 16 3. Exposición do tema ................................................................................................................. 16 3.1. Métodos biolóxicos .......................................................................................................... 16 3.1.1. Análise sensorial ....................................................................................................... 17 3.1.2. Análise de proteínas .................................................................................................. 18 3.1.2.1. Isoelectroenfoque nativo (IEF) ........................................................................... 18 3.1.2.2. Electroforese en xeles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) ...................... 18 3.1.2.3. Electroforese bidimensional (2-DE) ................................................................... 18 3.1.2.4. Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) ............... 19 3.1.2.5. Ensaio por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) ................................... 19 3.1.3. Análise do ADN ........................................................................................................ 19 3.1.3.1. Código de barras do ADN (DNA Barcoding) .................................................... 19 3.1.3.2. Reacción en Cadea da Polimerase (PCR) ........................................................... 21 3.1.3.2.1. Reacción en cadea da polimerase xunto co polimorfismo de lonxitude de fragmentos de restrición (PCR-RFLP) ........................................................................ 21 3.1.3.2.2. Reacción en cadea da polimerase do polimorfismo de conformación de cadea simple (PCR-SSCP) .................................................................................................... 22 3.1.3.2.3. Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) ............................... 22 3.1.3.2.4. Polimorfismos na lonxitude de fragmentos amplificados (AFLP) .............. 23 3.1.3.2.5. Reacción en cadea da polimerase en tempo real (RT-PCR) ........................ 23 3.1.3.2.6. Análise de Fusión de Alta Resolución (SA-HRMA) .................................. 24 5 3.1.3.2.7. Secuenciación de nucleótidos con información forense (FINS) ................. 24 3.1.3.2.8. Análise de pirosecuenciación ...................................................................... 24 3.2. Métodos físico-químicos .................................................................................................. 25 3.2.1. Espectrometría de masas (MS) .................................................................................. 25 3.2.1.1. Espectrometría de masas en tándem (MS/MS) .................................................. 25 3.2.1.2. Desorción/ionización láser asistida por unha matriz con detección de masas por tempo de voo (MALDI-TOF-MS) .................................................................................. 27 3.2.1.3. Espectrometría de masas de relacións isotópicas (IRMS) .................................. 27 3.2.1.4. Espectrometría de masas de ionización por evaporación rápida (REIMS) ........ 28 3.2.2. Espectroscopia de reflectancia no infravermello próximo (NIRS) ........................... 28 3.2.3. Espectroscopia de impedancia................................................................................... 29 3.2.4. Impresión dixital de oligoelementos (TEF) ............................................................... 29 3.3. Perspectivas no control da fraude e da rastrexabilidade do peixe .................................... 30 3.4. Estado actual do control analítico da fraude pesqueira en España ................................... 30 3.4.1. Mecanismos documentais contra a fraude ................................................................. 32 3.4.2. Exemplo de protocolo de actuación ante sospeita de fraude alimentaria .................. 33 4. Conclusións ............................................................................................................................. 37 5. Bibliografía ............................................................................................................................. 38 6 Índice de gráficas Gráfica 1. Participantes do sector pesqueiro ata o consumidor final (elaboración propia, baseado no traballo de Leal et al., 2015). .................................................................................................. 11 Índice de ilustracións Ilustración 1. Filetes de bacallau (Fonte: Leffmann, 2017). ....................................................... 14 Ilustración 2. Electroforese de produtos inespecíficos amplificados mediante PCR (Fonte: Retama, 2008). ............................................................................................................................ 21 Ilustración 3. Espectro de masas dunha mestura de péptidos (Fonte: Mkolt, 2005). .................. 27 Ilustración 4. Etiqueta dun lote de palometa á venda na Lonxa de Vigo (autoría propia). ......... 32 Ilustración 5. Corpo de atún fresco no mercado pesqueiro de Marsella (Fonte: Ratki, 2014). ... 33 Índice de táboas Táboa 1. Consumo de produtos da pesca en España no período 2014-2019 (Fonte: INE, 2020). ..................................................................................................................................................... 10 Táboa 2. Técnicas analíticas baseadas en métodos biolóxicos, mediante análise sensorial e de proteínas, efectivas nos control da fraude (elaboración propia). ................................................. 17 Táboa 3. Técnicas analíticas baseadas en métodos biolóxicos, mediante análises do ADN, efectivas nos control da fraude (elaboración propia). ................................................................. 20 Táboa 4. Técnicas analíticas baseadas en métodos físico-químicos efectivas nos control da fraude (elaboración propia). ................................................................................................................... 26 7 Abreviaturas 16s ARN: ARN ribosómico da subunidade ribosómica 16S 2-DE: 2-dimensional electrophoresis (Electroforese bidimensional) ADN: Ácido desoxirribonucleico ADNmt CR: Rexión de control do ADN mitocondrial ADNmt: ADN mitocondrial ADNr: ADN ribosómico AESAN: Axencia Española de Seguridade Alimentaria e Nutrición AFLP: Amplified fragment length polymorphism (Polimorfismos na lonxitude de fragmentos amplificados) AG: Ácidos graxos AMS: Ambient Mass Spectrometry (Espectrometría de masas en condicións ambientais) BCD: Documentación de capturas do atún vermello Bp: Base pair (Par de bases) CE: Comunidade Europea Cyt b: Citocromo b COI: Citocromo c oxidase I CNA: Centro Nacional de Alimentación CSIC: Consello Superior de Investigacións Científicas DOP: Denominación de Orixe Protexida EFTA: European Free Trade Association (Acordo Europeo de Libre Comercio) ELISA: Ensaio por inmunoabsorción ligado a enzimas ENAC: Entidade Nacional de Acreditación FAO: Organización das Nacións Unidas para a Alimentación e a Agricultura FINS: Forensically informative nucleotide sequencing (Secuenciación de nucleótidos con información forense) ICCAT: International Commission for the Conservation of Atlantic Tunas (Comisión Internacional para a Conservación do Atún Atlántico) IEF: Isoelectric focusing (Isoelectroenfoque nativo) INDNR: Pesca ilegal, non declarada e non regulamentada INE: Instituto Nacional de Estatística IRMS: Isotope-ratio mass spectrometry (Espectrometría de masas de relacións isotópicas) ITS1: Internal transcribed spacer (Espazador transcrito interno) IXP: Indicación Xeográfica Protexida 14 En España, o bacallau (Ilustración 1), a merluza e o atún vermello son os produtos que adoitan substituírse por especies de menor valor comercial (Pardo & Jiménez, 2020). Nesta clase de alimentos, canto maior é o grao de transformación na industria alimentaria e máis elaborados se encontran, máis posibilidades existen de que a actividade fraudulenta pase desapercibida. 1.2.2. Lexislación aplicable A finais de 2013, publícase a nova Política Pesqueira Común (PPC), lexislada polo Regulamento (UE) Nº 1379/2013 e o Regulamento (UE) Nº 1380/2013 do Parlamento Europeo e do Consello nos que se establece unha organización común de mercados para a industria da pesca e da acuicultura (OCM) co obxectivo de contribuír a un mercado eficiente e transparente en favor dos intereses tanto dos consumidores como dos produtores. Na actualidade, a normativa europea en materia de inspección de produtos da pesca atópase regulada polo Regulamento (UE) Nº 2017/625, que derrogaba o anterior regulamento sobre controis oficiais e o Regulamento (CE) Nº 854/2004, entre outros. Complétase a lexislación co Regulamento de Execución (UE) Nº 2019/627, o Regulamento (UE) Nº 2019/624 e o Regulamento (UE) Nº 2019/628. O Regulamento de Execución (UE) Nº 2019/627, de aplicación directa en tódolos estados membros, determina os labores e procedementos do inspector veterinario respecto ós alimentos de orixe animal, incluíndo os produtos da pesca. Segundo esta normativa, os controis oficiais realizaranse en tódolos buques atracados nos portos autorizados dos Estados membros, aínda que tamén existe a posibilidade da inspección no mar. Serán tamén zonas de controis periódicos as lonxas, os mercados grosistas, os lugares de almacenaxe e os transportes. Durante este labor, o veterinario oficial deberá velar pola saúde publica prestando atención a diversos criterios como a calidade organoléptica, os indicadores de frescura do produto, a posibilidade de contaminación biótica e abiótica ou os peixes velenosos. Aqueles produtos que fagan sospeitar de risco para a saúde deberán ser obxecto de mostraxe para realizar as comprobacións pertinentes. Toda mercadoría que implique risco para a saúde, tanto humana como animal ou por calquera razón xustificada, poderá declararse non apta para consumo. Por outro lado, o control debe realizarse tamén cos documentos que acompañan a estes produtos. Para evitar a fraude, os produtos pesqueiros sempre deben de acompañarse dos certificados oficiais correspondentes. No Regulamento (UE) Nº 2017/625 determínase a capacidade das autoridades competentes para previr e sancionar o uso indebido dos certificados e a súa falsificación. Esta normativa recolle as medidas a adoptar en caso de confirmarse o Ilustración 1. Filetes de bacallau (Fonte: Leffmann, 2017). 15 incumprimento, xunto cun réxime de sancións eficaces, proporcionadas e disuasorias aplicables a estas situacións, poñendo especial fincapé nas infraccións cometidas baixo accións fraudulentas que atenten contra o dereito nacional. As sancións presentan particularidades dentro de cada comunidade, as autonomías teñen as súas propias leis de pesca nas que se reflicte este réxime sancionador máis especifico cá normativa europea. No referente á rastrexabilidade desta clase de produtos de orixe animal, o artigo 58 do Regulamento (UE) Nº 1224/2009 determina a obrigatoriedade directa de que os produtos tanto da pesca como da acuicultura sexan rastrexables en tódalas súas fases da cadea de produción. Para isto especifica a necesidade dun etiquetado completo e correcto no que se deberá incluír de forma imprescindible datos como o nome común e científico da peza, a data de captura ou de produción e a zona xeográfica entre outros. O Regulamento (UE) Nº 1379/2013, xa citado anteriormente, completa indicando a información obrigatoria que deberá aparecer no etiquetado cara ó consumidor 2 engadindo, ós datos xa mencionados, se o produto foi conxelado, a data de duración mínima e o método de produción. É importante ter en conta que a loita contra a fraude alimentaria require, non só a actuación dos inspectores oficiais, senón unha implicación intersectorial que permita abarcar as posibles infraccións que poidan cometerse dentro da cadea alimentaria. A día de hoxe, é obriga dos operadores das empresas alimentarias (tanto produtores primarios, como industrias, como distribuidores) cumprir coa normativa vixente e, polo tanto, non incorrer en fraude. Non obstante, para comprobar ese cumprimento, debe existir unha estreita colaboración entre as autoridades sanitarias, as autoridades fiscais, aduaneiras e policiais, incluíndo tamén as institucións encargadas da persecución de delitos e outras forzas e corpos de seguridade estatais (Secretaría General del Consejo, 2019). O obxectivo é abordar as situacións fraudulentas de maneira coordinada para actuar da forma máis rápida e efectiva posible. A isto é indispensable sumarlle as campañas de sensibilización dos destinatarios finais dos alimentos, os consumidores, favorecendo a ampliación do seu coñecemento sobre o que implica a fraude alimentaria (DG Health and Food Safety, 2020). Unha das ferramentas clave da UE para garantir a seguridade alimentaria nos estados membros é a RASFF (Rapid Alert System Feed and Food). Creada en 1979, permite o intercambio rápido de información relativa a medidas tomadas en resposta a riscos graves, directos ou indirectos, relacionados cos alimentos e pensos entre as autoridades competentes que participan no labor de garantir produtos seguros para os consumidores no mercado (Comisión Europea, 2020b). A nivel 2 Sen prexuízo do Regulamento (UE) Nº 1169/2011 sobre a información alimentaria facilitada ó consumidor. 16 nacional existe tamén unha rede de intercambio de información rápida chamada SCIRI (Sistema Coordinado de Intercambio Rápido de Información) que permite e facilita a vixilancia das posibles incidencias alimentarias que poidan repercutir na saúde dos consumidores, entre as que se atopan as actividades fraudulentas en calquera punto da cadea alimentaria. O SCIRI atópase integrado tamén nos sistemas de alerta europeos como a RASFF (Axencia Española de Seguridade Alimentaria e Nutrición [AESAN], 2019). 2. Materiais e métodos A procura bibliográfica realizouse a través das bases de datos Google Scholar, Web of Science, Pubmed e Dialnet, empregando as seguintes palabras chave en inglés: fishery, fraud e analytical methods. O período temporal de busca estivo comprendido entre os anos 1998 e 2021. O principal criterio de inclusión da bibliografía foi a aplicabilidade dos estudos ás especies comerciais presentes nos mercados nacionais. Revisáronse un total de 57 publicación relacionadas ca fraude alimentaria no sector pesqueiro ca intención de recompilar as principais formas de control analítico empregado na loita contra a fraude por substitución. Para a xestión desta bibliografía utilizouse ProQuest®RefWorks. 3. Exposición do tema Intercambiar sen declarar e de forma intencionada especies pesqueiras nun produto alimentario co propósito de acadar beneficios económicos, é a forma de incorrer na fraude alimentaria por substitución. Esta actividade ilegal provoca o descoñecemento do consumidor sobre o que vai inxerir, o que supón un perigo directo sobre a súa saúde. Debido a elevada presenza dos produtos da pesca na dieta habitual das familias españolas, é fundamental o uso de ferramentas analíticas nos controis oficiais de cara a incrementar a precisión e a efectividade na detección da fraude por substitución nas mercadorías pesqueiras, co fin de proporcionar alimentos seguros para os consumidores. Dentro dos métodos analíticos de identificación de especies empregados nos produtos da pesca podemos diferenciar os métodos biolóxicos e os métodos físico-químicos, cada un coas súas características intrínsecas e fundamento analítico. Estes métodos presentan distintas vantaxes e desvantaxes na súa aplicación para o control da fraude por substitución nos produtos da pesca, que serán discutidas a continuación. 3.1. Métodos biolóxicos Aínda que a principal utilidade dos métodos biolóxicos na inspección do peixe sexa a avaliación da presencia de organismos prexudiciais para a saúde dos consumidores, medíante as técnicas microbiolóxicas, tamén posúen mecanismos efectivos para a identificación de especies e, polo 17 tanto, para empregar na loita contra a fraude nos produtos de orixe pesqueira. Os métodos biolóxicos poden dividirse naqueles que funcionan en base ó estudo das proteínas (Táboa 2) ou en base a análise do ADN presente na mostra (Táboa 3). Globalmente, a utilidade de cada unha destas técnicas vese fortemente marcada polo grao de elaboración e/ou procesamento do produto alimenticio que se pretende analizar. Táboa 2. Técnicas analíticas baseadas en métodos biolóxicos, mediante análise sensorial e de proteínas, efectivas nos control da fraude (elaboración propia). 3.1.1. Análise sensorial Dentro dos métodos biolóxicos pódense engadir as técnicas de recoñecemento sensorial (Fiorino et al., 2018). Esta é a forma máis tradicional de inspección que, mediante os sentidos do propio inspector (sobre todo o sentido da vista) e a súa experiencia e habilidade, permiten a diferenciación entre especies morfoloxicamente semellantes (Xiong et al., 2019). O uso dos sentidos limita a súa efectividade a todos aqueles produtos que conserven os caracteres individuais e recoñecibles da especie. De feito, resultan inservibles na gran maioría dos casos nos que estes produtos pasan a ser procesados na industria. Ademais, a fiabilidade sempre vai a estar suxeita á capacidade de percepción do propio inspector que pode ser variable ou ineficiente e depende de numerosos factores intrínsecos e extrínsecos. A raíz desta situación limitadora na identificación do peixe aparece a necesidade de atopar novas técnicas que permitan realizar este traballo de maneira efectiva. Polo tanto, nas últimas décadas Técnicas Finalidade Vantaxes Desvantaxes Análise sensorial Análise sensorial Recoñecemento dos caracteres morfolóxicos específicos de cada especie Valoración no momento. Efectiva en puntos de venda de produtos frescos. Non efectiva cando faltan os caracteres distintivos. Necesita de experiencia do inspector. Análise de proteínas IEF Identificación de especies de peixes e crustáceos non procesados termicamente Sinxeleza e baixos custos. Non poden empregarse en produtos procesados a altas temperaturas. Dificultade na identificación de especies moi emparentadas. SDS-PAGE Identificación de especies de peixes 2-DE Identificación de especies. Diferenciación de especies salvaxes e de acuicultura Maior resolución cas técnicas nunha dimensión. Efectiva en mesturas RP-HPLC Identificación de especies en mesturas de produtos frescos ou conxelados Rapidez. Capacidade de obter perfís específicos de cada especie. ELISA Identificación de especies in situ en produtos non procesados Rápida, sinxela, barata. 18 comezan a presentarse diversos métodos moleculares, baseados principalmente na detección de proteínas e ADN, que pasan a empregarse no recoñecemento das distintas especies comerciais. 3.1.2. Análise de proteínas 3.1.2.1. Isoelectroenfoque nativo (IEF) Esta ferramenta permite o estudo das proteínas en base ó seu punto isoeléctrico. Nun gradiente de pH no que se aplica un campo eléctrico as proteínas tenden a migrar segundo a súa carga eléctrica cara a un dos polos e, cando estas alcanzan o seu punto isoeléctrico, precipitan (Saubi, 2019). Trátase dunha técnica empregada para a identificación de peixe e crustáceos (Altinelataman et al., 2009), sobre todo de produtos indebidamente etiquetados. Como as proteínas sometidas a temperaturas elevadas desnaturalízanse facilmente, esta técnica non pode ser usada naquelas elaboracións mediadas por procesos térmicos. O IEF foi empregado recentemente en Alemaña para a detección da fraude por substitución de linguado (Solea solea) por especies de menor valor comercial nos restaurantes (Kappel & Schröder, 2016). 3.1.2.2. Electroforese en xeles de poliacrilamida con SDS (SDS-PAGE) Na técnica de electroforese en xel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico (SDS-PAGE), a separación das proteínas prodúcese en función da súa masa molecular. Migran sobre a superficie dun xel de poliacrilamida no que se debe incluír, previamente, un patrón de pesos moleculares coñecidos. A diferenza da IEF, este tipo de electroforese permite analizar mostras de produtos procesados termicamente. Non obstante, ó tratarse dunha técnica electroforética dunha soa dimensión, non se pode distinguir especies dunha mestura xa que non teñen capacidade para resolver máis dun centenar de compoñentes proteicos diferentes nun mesmo xel (Sánchez, 2012). Esta técnica é barata e sinxela e foi empregada con éxito, por exemplo, para a identificación de sete das especies da familia Tetraodontidae, comunmente denominadas peixes globo: Lagocephalus wheeleri, L. gloveri, L. lunaris, L. inermis, Takifugu oblongus, T. xanthopterus e Sphoeroides pachygaster (Chen & Hwang, 2002). 3.1.2.3. Electroforese bidimensional (2-DE) O método da electroforese bidimensional (2-DE) combina ámbalas dúas técnicas anteriores, conseguindo unha primeira dimensión de estudo en base ó IEF e unha segunda dimensión mediante á SDS-PAGE (Sánchez, 2012). A técnica resulta efectiva na correcta identificación do peixe sen as limitacións propias das técnicas dunha dimensión, como evidencia un estudo de diferenciación entre as catro principais especies que se engloban dentro do termo “perca”: perca europea (Perca fluviatilis), perca do Nilo (Lates niloticus), lucioperca europea (Stizostedion lucioperca) e lubina soleada (Morone chrysops x saxatilis) (Berrini et al., 2006). 19 Tamén pode combinarse, a maiores, con outra electroforese monodimensional. Esta asociación presentou bos resultados na distinción analítica entre filetes de bacallau salvaxe (Gadus morhua) dos criados en piscifactoría (Martinez et al., 2007). 3.1.2.4. Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) Unha alternativa á lentitude dos métodos electroforéticos no estudo das proteínas poden ser as técnicas cromatográficas como a cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RPHPLC), xa que posibilita a separación de proteínas e péptidos para a súa análise. Segundo a polaridade que mostran estas moléculas poden ser representadas nun cromatograma, xerando un perfil específico para cada especie analizada. Pode ser aplicada con éxito en mesturas de produtos frescos e/ou conxelados. Con todo, carece de utilidade nos produtos procesados termicamente e mostra dificultade para diferenciar especies relacionadas filoxeneticamente (Knuutinen & Harjula, 1998). A parte da súa utilidade na identificación de especies, a cromatografía líquida de alta resolución tamén pode ser aplicada na detección de aditivos usados na elaboración dos alimentos, servindo así como método analítico de elección para detectar aditivos non declarados ou aqueles de uso prohibidos como poden ser, por exemplo, os sulfitos no peixe fresco (Lim et al., 2014). 3.1.2.5. Ensaio por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) A meirande parte das técnicas xenéticas de principios de século destacan pola necesidade de posuír equipos custosos, elevada experiencia dos técnicos e por longos períodos de tempo para obter unha conclusión en base ás análises (Asensio et al., 2008). En consecuencia, desenvólvense novas aplicacións para técnicas inmunolóxicas como o ensaio por inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA). As grandes vantaxes que presenta son a rapidez e a sinxeleza. O ELISA postúlase como unha ferramenta barata e eficaz para empregar de maneira habitual na inspección de numerosos produtos pesqueiros non procesados. A base do seu funcionamento radica no uso de anticorpos con marcadores que se unen a receptores específicos presentes na mostra da especie a identificar, de esta maneira a reacción prodúcese unicamente naquelas mostras que conteñan o peixe que se quere detectar (Asensio et al., 2008). A simplicidade deste método abriu a porta á chegada de kits comerciais rápidos para aplicar na identificación diaria in situ e favorecer a rastrexabilidade dos produtos e, polo tanto, implementar a actuación na loita contra a fraude (Asensio et al., 2008). 3.1.3. Análise do ADN 3.1.3.1. Código de barras do ADN (DNA Barcoding) As técnicas máis empregadas para a identificación de produtos pesqueiros fundaméntanse na detección do ADN (Táboa 3) das especies comercializadas (Xiong et al., 2019), principalmente 20 mediante a codificación do ADN mitocondrial por medio do DNA barcoding, tamén chamado, código de barras de ADN (Pardo & Jiménez, 2020). Táboa 3. Técnicas analíticas baseadas en métodos biolóxicos, mediante análises do ADN, efectivas nos control da fraude (elaboración propia). Aínda que o ADN poida chegar a desnaturalizarse a causa dalgúns procedementos industriais dos alimentos, trátase de moléculas máis estables cas proteínas (sobre todo o ADNmt) de aí que a súa empregabilidade abranga tanto materias primas como alimentos procesados (Fiorino et al., 2018). A codificación de ADN detectando o fragmento 650 bp do xene mitocondrial citocromo C oxidasa I (COI) utilízase para a diferenciación da gran maioría das especies do reino animal. Polo tanto, pódese usar de maneira efectiva na identificación de especies de tódolos produtos comerciais de orixe pesqueira (De Battisti et al., 2014). Dito fragmento curto da cadea de ADN pode ser secuenciado e estandarizado de maneira sinxela para cada unha das especies, de tal forma que esta caracterización ten a posibilidade ser gardada nun banco de datos xenéticos como GenBank ou EMBL-BANK. Esta técnica susténtase no sinxelo illamento e detección dese fragmento xenético na especie a analizar para despois seren comparado ca base de datos taxonómica xa coñecida (Saubi, 2019). Con todo, aínda existen deficiencias na harmonización dos métodos empregados para xerar as distintas bases de datos, isto pode dificultar a interpretación dos resultados cando os procedementos de estudo e os das bases non se corresponden (Clark, 2015). Caracterízase pola simpleza do proceso, o que lle outorga rapidez e baixo custo a unha técnica Técnicas Finalidade Vantaxes Desvantaxes Análise de ADN Código de barras do ADN Identificación de especies. Detección de produtos mal etiquetados. Diferencia tódalas especies comerciais. Creación dunha base de datos xenéticos. Falta de harmonización de criterios para as bases de datos e os métodos de avaliación. PCR-RFLP, PCRSSCP, RAPD, AFLP Identificación e diferenciación de especies emparentadas filoxeneticamente de cefalópodos e peixes Alta sensibilidade e especificidade Efectivas en alimentos procesados e mesturas Dificultade para distinguir especies emparentadas Necesidade de coñecer patróns de referencia da especie (agás RAPD) RT-PCR Identificación rápida de produtos pesqueiros frescos, conxelados ou procesados Redución de tempo e custos cas demais PCR. Resultados en tempo real. Non obter toda a información dos nucleótidos complica a diferenciación das especies emparentadas SA-HRMA Identificación e distinción de especies emparentadas FINS, Pirosecuenciación Identificación de peixe e produtos da pesca frescos e procesados Efectivas en mostras co ADN parcialmente degradado. Dificultade na identificación de produtos mesturados 21 altamente efectiva para a identificación de especies e detección de produtos erroneamente etiquetados. Os avances nesta técnica durante a última década foron encamiñados ó desenvolvemento do deseño de iniciadores universais. Isto permiten aumentar a capacidade de obter, dun pequeno fragmento xenético, unha rexión amplificada con valor filoxenético suficiente para diferenciar especies mediante unha simple secuenciación de cebadores universais baseada no fragmento 16s ARNr (Horreo et al., 2013). 3.1.3.2. Reacción en Cadea da Polimerase (PCR) A técnica de bioloxía molecular denominada Reacción en Cadea da Polimerase (PCR), desenvolta a finais do século pasado, obtivo grande importancia como método de identificación de produtos alimentarios. A PCR funciona replicando fragmentos de ADN orixinal presente nas mostras a analizar. Os produtos obtidos son amplificacións de información xenética que poderán ser avaliados posteriormente. Para isto, o procedemento consta da repetición de varios ciclos a diferentes temperaturas, altas e baixas, que permiten a desnaturalización da molécula de ADN. A continuación, mediante cebadores, delimítase a rexión que vai ser amplificada para que a enzima polimerase poida actuar duplicando as febras do ADN. Desta forma aumenta a lonxitude da cadea de nucleótidos e facilítase así o seu estudo (Burbano et al., 2017). Os fragmentos resultantes adoitan ser separados por electroforese dando lugar a patróns específicos (Ilustración 2) que posibilitan a identificación das distintas especies. A maior limitación que presenta a PCR relaciónase ca dificultade de distinguir entre especies moi emparentadas posto que os patróns dos fragmentos poden ser moi semellantes nestes casos (Saubi, 2019). A súa efectividade para as actividades de identificación fana unha ferramenta idónea para actuar na detección da fraude e a supervisión da rastrexabilidade dos produtos da pesca. Ademais, a súa utilidade pode abarcar dende as materias primas ata os alimentos procesados e mesturas de distintas especies. Porén, a medida que a tecnoloxía avanza, aparecen variacións da técnica orixinal que perfeccionan máis o seu uso na inspección de alimentos. 3.1.3.2.1. Reacción en cadea da polimerase xunto co polimorfismo de lonxitude de fragmentos de restrición (PCR-RFLP) A PCR-RFLP é un método baseado na amplificación de fragmentos restrinxidos de ADN que permite xerar gran cantidade de marcadores xenéticos favorecendo a detección de distintas especies debido as súas diferencias de masa molecular. O procedemento consta da amplificación dunha rexión previamente seleccionada que posteriormente é sometida a unha electroforese co Ilustración 2. Electroforese de produtos inespecíficos amplificados mediante PCR (Fonte: Retama, 2008). 22 obxectivo de separar os fragmentos a analizar e obter o patrón específico de cada especie (Saubi, 2019). Xa que esta técnica por si mesma presenta limitacións á hora de identificar especies altamente emparentadas, no ano 2019, Pappalardo e colaboradores presentaron un estudo no que empregaban a combinación da PCR-RFLP e o código de barras do fragmento 650 bp do xene COI (mencionado anteriormente) co fin de distinguir entre as 5 principais especies de esturións e as especies máis empregadas na fraude por substitución do caviar: Acipenser transmontanus, A. gueldenstaedtii, A. stellatus, A. baerii, Mallotus villosus, Huso huso, Cyclopterus lumpus e Eumicrotremus orbis. O resultado determina que esta nova estratexia molecular, a COIbar-RFLP, é unha ferramenta rápida (proceso que dura ó redor de 7 horas) que posúe capacidade para discernir entre especies taxonomicamente achegadas e que podería ser usada como método de screening na rutina de identificación de especies. 3.1.3.2.2. Reacción en cadea da polimerase do polimorfismo de conformación de cadea simple (PCR-SSCP) A PCR-SSCP é unha técnica sinxela e rápida que permite identificar e caracterizar polimorfismos xenéticos. O seu fundamento radica en que a secuencia primaria e a lonxitude dun fragmento de ADN determinan a súa estrutura secundaria cando migra nun xel de poliacrilamida (Han & Robinson, 2003). Esta migración pode provocar variacións na secuencia de nucleótidos, dando lugar a cambios tamén no patrón electroforético (Sánchez, 2012), cambios que poden ser detectados mediante a lectura dos nucleótidos radioactivos engadidos ó ADN durante a PCR previa. Como condición indispensable para a interpretación correcta dos resultados, é necesario o coñecemento previo da migración de patróns das especies de referencia ó mesmo tempo que a mostra problema está a seren analizada, xa que a alteración das condicións electroforéticas poden xerar certas variacións nos patróns de bandas (Sánchez, 2012). 3.1.3.2.3. Amplificación aleatoria de ADN polimórfico (RAPD) Esta variación da PCR usa cebadores simples, universais e inespecíficos co obxectivo de amplificar fragmentos aleatorios dunha mostra de ADN. Desta forma obtense un vasto espectro de amplificación mediante os numerosos produtos resultantes da PCR que, migrados nun xel de agarosa, dan lugar a un patrón específico da cada especie (Senthil & Gurusubramanian, 2011). Débese obter, tamén, o patrón da especie de referencia, empregando os mesmos cebadores, para a posterior comparación e confirmación dos resultados. Trátase dunha técnica sinxela e de baixo custo que non precisa do coñecemento previo do xenoma das especies a estudar (Asensio et al., 2002). 23 Por outra lado, con esta técnica resulta imposible distinguir entre fragmentos de tamaños semellantes que pertencen a distintas rexións do ADN e, ademais, cando o ADN está degradado adoitan producirse alteracións nos patróns de bandas (Sánchez, 2012). Aínda que a RAPD non sufriu moito uso na identificación de especies pesqueiras, nalgúns casos empregouse con resultados positivos para a detección de substitución de especies como o mero (Epinephelus marginatus) co o peixe náufrago do Atlántico (Polyprion americanus) e ca perca do Nilo (L. niloticus) (Asensio et al., 2002). 3.1.3.2.4. Polimorfismos na lonxitude de fragmentos amplificados (AFLP) Este método combina as dúas técnicas anteriormente comentadas: RFLP e RAPD. O procedemento comeza cunha primeira dixestión do ADN a analizar mediante enzimas de restrición. Engadindo ós extremos dos fragmentos uns adaptadores nucleotídicos, estes poden ser amplificados mediante PCR usando cebadores complementarios. Os produtos resultantes estúdanse nun xel de agarosa ou de poliacrilamida (Sánchez, 2012). Para a interpretación dos resultados é necesario ter unha base de datos de referencia coa que comparalos e determinar a especie correcta. Debido a súa elevada sensibilidade, aínda que menor ca outras técnicas baseadas na PCR, trátase dunha técnica eficaz para analizar os produtos que non poden selo de maneira tradicional co fin de identificar as especies pesqueiras (Maldini et al., 2006). Non obstante, o seu emprego diminúe cada vez máis pola aparición de novas técnicas máis eficientes como a PCR a tempo real ou a FINS. 3.1.3.2.5. Reacción en cadea da polimerase en tempo real (RT-PCR) A maior parte dos métodos xenéticos empregados adoitan ser complexos e consomen moito tempo antes de obter os resultados. Por este motivo, nos últimos anos están a desenvolverse técnicas máis simples e de rápido funcionamento para poder seren aplicadas no mesmo sitio da inspección polas autoridades. Unha desas novas técnicas é a PCR en tempo real (RT-PCR), un método cunha efectividade superior a 90 % (Velasco et al., 2020), que permitiría reducir custos e promover a loita contra a fraude en primeira liña de inspección. Este procedemento, cunha duración aproximada de 3-4 horas, pode detectar e cuantificar pequenas cantidades de ADN mediante un único paso (Velasco et al., 2020), presentando elevada especificidade e sensibilidade en produtos da pesca frescos, conxelados e mesmo cociñados, incluídos produtos elaborados a partir de mesturas de varias especies distintas. Na RT-PCR a amplificación do fragmento xenético prodúcese durante a propia reacción, non ó final como no caso dunha PCR convencional, de maneira que a fluorescencia xerada neste proceso é detectada a medida que se vai producindo (Saubi, 2019). 30 3.3. Perspectivas no control da fraude e da rastrexabilidade do peixe Aínda que moitos dos avances van destinados a mellorar e perfeccionar as técnicas analíticas xa existentes, a tecnoloxía tamén ofrece novas ferramentas innovadoras que poden adaptarse ó comercio para loitar contra a fraude alimentaria dende unha nova perspectiva. Un destes mecanismos que se están a implementar co obxectivo de mellorar a rastrexabilidade dos produtos da pesca e, polo tanto, blindar o comercio fronte a fraude alimentaria é o Blockchain (cuxa tradución corresponderíase con “cadea de bloques”). A cadea de bloques pode definirse como un sistema de almacenaxe aberto de datos sobre transaccións, xestionado de maneira descentralizada. As bases do seu funcionamento céntranse na transformación de calquera activo, material ou inmaterial, nun código dixitalizado que queda rexistrado nas bases dunha “cadea de datos” dada (Francisco, 2018). O obxectivo da introdución deste sistema dentro do comercio alimentario é aproveitar a súa capacidade para xerar e rexistrar transaccións transparentes que faciliten a rastrexabilidade dun produto dende a orixe ata a chegada ó consumidor. Esta tecnoloxía xa foi probada con resultados prometedores no ano 2016 por The Provenance, unha empresa británica cun proxecto piloto que permitiu almacenar todos os datos do atún listado (Katsuwonus pelamis) nos caladoiros do sueste asiático, dende as capturas ata a chegada dos produtos finais ós consumidores, os cales podían obter mediante un smartphone toda a información (produtores, tipo de pesca, procesos na industria alimentaria, etc.) sobre o que ían mercar (The Provenance, 2016). Na actualidade, o desenvolvemento do Blockchain céntrase principalmente nas especies de atún, merluza e camarón. As súas numerosas aplicacións poden ser de utilidade para garantir a inocuidade dos alimentos, o ecoetiquetado dentro da legalidade e, tamén, para combater a fraude alimentaria (FAO, 2020). 3.4. Estado actual do control analítico da fraude pesqueira en España A día de hoxe, moitas das técnicas que se empregan para analizar e identificar os produtos da pesca resultan complexas de aplicar fora do laboratorio, sexa por falta de tempo, por elevados custos de preparación e/ou do instrumental necesario ou por capacidade insuficiente do método para obter un resultado concluínte. De aí a necesidade de desenvolvemento de ferramentas efectivas para o emprego rutineiro por parte das autoridades competentes. Unha técnica analítica ideal sería aquela que, sendo barata, permitiría un resultado analítico válido mediante unha técnica sinxela, rápida e sen problemas loxísticos a causa do equipamento (Leal et al., 2015). Non obstante, ningunha técnica actual é capaz de cumprir con todas estas características. Por esta razón, o uso das ferramentas analíticas encóntrase limitado en función de produto que se pretende analizar. Por exemplo, as mercadorías frescas ou non procesadas mediante tratamentos tecnolóxicos que permiten aumentar a súa vida útil, non deberían ser 31 sometidas a procedementos duradeiros que impliquen perda de tempo de utilidade destes produtos sen estar no mercado, feito que desencadea perdas económicas para a empresa alimentaria. En base a isto, o uso das técnicas actuais para detectar a fraude na cadea alimentaria dos produtos da pesca restrínxese a sospeitas e posibles situacións de risco para o consumidor. No entanto, existen uns controis oficiais mínimos obrigatorios que se deben realizar nas empresas alimentarias co obxectivo de combater a fraude, recollidos dentro dos Plans Nacionais de Control Oficial da Cadea Alimentaria (PNCOCA). O último PNCOCA (2021-2025) presenta nos seus obxectivos, como novidade con respecto o Plan Nacional anterior, un énfase específico sobre a loita contra a fraude alimentaria. Nos vindeiros 5 anos, as autoridades competentes autonómicas deberán inspeccionar anualmente un 15-20 % das empresas de alimentos localizadas no territorio na procura deste delito (Subdirección General de Control de la Calidad Alimentaria y Laboratorios Agroalimentarios, 2020). Non obstante, os controis oficiais poden realizarse tamén, entre outros motivos, en función de sospeitas sobre un produto ou unha empresa por unha demanda dos consumidores, por altos valores comerciais en certas mercadorías que incitan os axentes da cadea alimentaria a cometer fraude e, incluso, nas empresas alimentarias que xa incorreron en fraude con anterioridade. Hai que lembrar que estes controis poden seren realizados en calquera momento aínda que non haxa sospeita de incumprimento se o inspector considérao adecuado (MAPA, 2021). A autoridade competente encargada da coordinación destas estratexias enfocadas a asegurar a calidade alimentaria e a loitar contra a fraude é a Secretaria Xeral de Agricultura e Alimentación do Ministerio de Agricultura, Pesca e Alimentación. Con todo, son as propias comunidades autónomas as encargadas de pautar e executar os plans de control oficiais marcados polo Ministerio. A toma de mostras dun alimento poderá realizarse sempre que o inspector o precise. Esta recollida de mostras deberá seguir a normativa vixente estipulada polo Real Decreto 1945/83. Neste decreto márcase tamén a obrigatoriedade da execución das análises en laboratorios oficiais ou nos laboratorios privados acreditados (recollidos no PNCOCA), mediante métodos aprobados oficialmente ou, en caso de non existiren, mediante procedementos recomendados recoñecidos nacional e internacionalmente (RD 1945/1983, de 22 de xuño). En España, as ferramentas analíticas para o emprego na industria alimentaria son acreditadas pola Entidade Nacional de Acreditación (ENAC) en base a normativa UNE-EN ISO/IEC 17025:2017 que recolle os requisitos xerais das competencias dos laboratorios oficias de ensaio e calibración (ENAC, 2020). Ante a presencia de resultados que mostren algunha deficiencia que evidencie prácticas fraudulentas nos alimentos, iniciaranse os trámites necesarios para expedientar ós axentes implicados e impoñer sancións eficaces que favorezan a disuasión e a corrección deste delito. 32 3.4.1. Mecanismos documentais contra a fraude Aínda que este traballo trata dos métodos analíticos, a principal medida de control da seguridade alimentaria no referente á fraude son os documentos que recollen os datos sobre os produtos que van a ser comercializados. Recollen todos aqueles datos relevantes que permitan trazar con precisión todo o camiño que seguen ditos alimentos durante a totalidade da cadea alimentaria. A información que posibilita unha rastrexabilidade eficiente recóllese na normativa correspondente mencionada con anterioridade no traballo. O Regulamento de execución (UE) Nº 93/2011 e o Regulamento (UE) Nº 1224/2009 determinan os requisitos e a información que deberá acompañar os alimentos de orixe animal en todo momento para permitir a súa rastrexabilidade, tendo en conta as facturas, os albarás, os números de rexistro das empresas participantes ou as etiquetas dos produtos (Ilustración 4). Información que, como xa foi tratado en apartados anteriores, vese completada co indicado no Regulamento (UE) Nº 1379/2013 sobre a información que debe de aparecer no etiquetado no caso dos produtos da pesca. No entanto, existen tamén bases de datos e rexistros documentais que complementan a información relativa ós produtos alimentarios. Neste caso pódense poñer como exemplo os sistemas documentais de capturas, que son un instrumento útil para impedir a entrada de peixe fraudulento no comercio interior, asegurando a legalidade dos produtos mariños no punto de entrada. Outros exemplos son tamén os sistema de identificación automática (SIA) ou de localización de buques vía satélite (SLB) (FAO, 2020). A presenza de sistemas públicos, como as bases de datos, poden facilitar o coñecemento sobre as distintas especies pesqueiras comercializadas. Son ferramentas funcionais para todos os operadores, inspectores e demais intermediarios e participantes na cadea alimentaria. Un bo exemplo é o sistema de información sobre as ciencias acuáticas e a pesca (ASFIS), trátase dunha lista de referencia normalizada recollida pola FAO na que se atopa a base de datos xeral sobre a clasificación, nomes científicos e códigos correspondentes para cada un dos elementos de especie. O obxectivo desta plataforma é a difusión da información relacionada ca industria pesqueira e as ciencias acuáticas para velar por un comercio veraz. Cabe destacar o interese por implementar esta clase de recursos co fin de seguir facilitando o control sobre os produtos. Entre as novas tecnoloxías que están a xurdir destacan as imaxes por satélite en alta resolución, as cámaras e sensores in situ, as bases de ADN e perfís xenéticos máis Ilustración 4. Etiqueta dun lote de palometa á venda na Lonxa de Vigo (autoría propia). 33 completas, as cadeas de bloques (blockchain), a Internet das cousas (IoT), a intelixencia artificial (IA) e o aprendizaxe automático (FAO, 2020). 3.4.2. Exemplo de protocolo de actuación ante sospeita de fraude alimentaria O Thunnus thynnus, comercialmente denominado atún vermello (“atún rojo” en castelán), é unha das principais especies comercializadas dos túnidos no mercado mundial. Trátase do atún máis valioso kilo por kilo (The Pew Charitable Trusts, 2017). O seu elevado valor comercial e a tendencia de vendelo elaborado e transformado a un consumidor final sen coñecemento suficiente para distinguilo doutras especies, fan do atún vermello un produto ideal para a aparición de perigosas prácticas fraudulentas no seu comercio. No ano 2017 xurdiu un escándalo a nivel europeo por producírense máis de 150 intoxicacións alimentarias por histamina, orixinadas a partir de atún vermello adulterado procedente de España. As malas prácticas consistiron no emprego fraudulento de colorantes vexetais que tinguían de vermello o produto para aparentar maior frescura da que en realidade tiña (Agencia EFE, 2017). Outro tipo de fraude moi frecuente nos produtos do T. thynnus (Ilustración 5) son as substitucións de especies. Investigadores españois do Departamento de Ecoloxía Mariña do Centro de Estudos Avanzados de Blanes, pertencentes ó CSIC (Consello Superior de Investigacións Científicas), realizaron un estudo recadando mostras de produtos clasificados como atún vermello en Merca-Madrid, Merca-Málaga e Merca-Barna, ademais de en peixarías e restaurantes diversos da zona de Cataluña. Concluíron que no 75 % dos casos, nos puntos de venda, non se identificaba correctamente a especie e no 83 % de mostras dos restaurantes non se especificaba a especie que se estaba a comercializar. No 40 % dos casos tratábase de fraude por substitución (porcentaxe que aumentaba ata un 62 % nos puntos de venda ó consumidor final), principalmente por especies de menor valor comercial, sobre todo polo Thunnus obesus¸ denominado comercialmente como patudo (Gordoa et al., 2017). Por outra banda, pode existir tamén a fraude no sentido contrario, é dicir, vender atún vermello como outro de menor valor para impedir que se coñeza a orixe ilexítima do devandito produto (Olmedo et al., 2019). Isto faise porque o control actual da orixe das pezas de atún vermello é moi exhaustivo por parte das administracións públicas. Un exemplo disto é a Comisión Internacional para a Conservación do Atún Atlántico (ICCAT), que obriga a presentar un rexistro dos buques dedicados á pesca do atún vermello e un documento de captura individual para cada peza abreviado como BCD (ICCAT, 2018). Ilustración 5. Corpo de atún fresco no mercado pesqueiro de Marsella (Fonte: Ratki, 2014). 34 Partindo destas premisas, preséntase a continuación un caso hipotético de fraude por substitución nun lote de produtos identificados incorrectamente como atún vermello, e proponse un posible protocolo de actuación dunha inspectora veterinaria baseado nas técnicas analíticas abordadas neste traballo. O caso consiste nunha empresa de transformación de alimentos que dedica parte do seu labor á produción de filetes conxelados etiquetados como atún vermello, que posteriormente venden ós restaurantes, os cales presentarán o produto ó consumidor final no seu maior estado de elaboración. Debido a sospeitas procedentes de denuncias de consumidores que teñen experiencia suficiente como para dubidar da autenticidade do produto comercializado como T. thynnus, as autoridades competentes deciden tomar medidas e realizar unha inspección sobre ese produto na empresa alimentaria. Sen necesidade de programar ou avisar do día da inspección, a inspectora veterinaria preséntase na empresa. O operador ou a operadora desta empresa deberá facilitar calquera información ou procedemento que requira a autoridade sanitaria (Regulamento (UE) nº 2017/625 do Parlamento europeo e do Consello, de 15 de marzo de 2017). Como o obxectivo é verificar se o produto que comercializan baixo o nome de atún vermello é realmente esa especie, o primeiro que se debe revisar é a documentación de orixe do produto: as facturas, os albarás, as etiquetas, etc., comprobando toda a información obrigatoria que debería acompañar ó produto a súa chegada á empresa. Nestes documentos, os datos aportados deben permitir á inspectora determinar a orixe da mercancía dende a súa captura no buque. A documentación aportada pola empresa, sexa por falta de información ou porque esta sexa incorrecta, non permite esclarecer a procedencia do produto e, polo tanto, non se pode coñecer con exactitude a especie coa que están a traballar. Ante esta situación xustifícase a recollida de mostras para proceder, mediante técnicas analíticas, coa identificación da especie que están empregando para elaborar eses produtos. Non se trata dunha recollida de mostras programada polo PNCOCA, polo tanto, deberase realizar unha mostraxe de tipo regulamentaria en base ó Real Decreto 1945/83. A inspectora recollerá tres exemplares homoxéneos da mostra do produto: un para a análise oficial a cargo da Administración, outro para a análise contraditoria gardada polo operador da empresa e outro para a dirimente, tamén en mans da Administración. Estas mostras deberán acondicionarse, precintarse e etiquetarse correctamente garantindo a identidade do seu contido durante o tempo de conservación. As análises, como xa se mencionou anteriormente, en base á lexislación, deberán realizarse en laboratorios acreditados e mediante procedementos oficiais ou recoñecidos. Existen varios estudios que demostran a aplicación das ferramentas analíticas na identificación das oito especies do xénero Thunnus¸ sobre todo na autenticación do atún vermello e 35 diferenciación das especies máis emparentadas. O primeiro destes métodos baséase nas técnicas moleculares de secuenciación do ADN. O código de barras do ADN, que emprega a rexión mitocondrial COI, demostra ter rapidez e efectividade para este labor, non obstante, presenta unha gran desvantaxe sendo incapaz de distinguir entre as especies de atún vermello (T. thynnus), atún de aleta azul do Pacífico (T. orientalis) e o bonito do norte (T. alalunga) debido ás similitudes que mostran no devandito marcador (Viñas & Tudela, 2009). Porén, existen outros marcadores que teñen maior eficiencia para o recoñecemento individual destas especies, sendo a rexión de control do ADN mitocondrial (ADNmt CR) a que maior relevancia presenta. Cabe destacar que existe a posibilidade, entre o atún vermello e o bonito do norte, de que aínda empregando o ADNmt CR as especies non se distingan correctamente a causa da introgresión xenética que presentan. Por iso, no ano 2009, Viñas e Tudela presentan un procedemento de validación máis efectivo usando o método FINS para secuenciar o espazador transcrito interno de ADNr (ITS1) como segundo marcador, permitindo así a distinción completa entre as oito especies de túnidos (Viñas & Tudela, 2009). Un ano despois dese estudo, Terio e colaboradores demostraron a posibilidade de utilizar a técnica da PCR a tempo real (RT-PCR) para diferenciar entre as principais especies catalogadas como atún na venda de produtos enlatados (T. thynnus, T. alalunga e T. albacares), técnica aplicable tamén nos produtos conxelados. Baseándose na PCR e dirixindo os ensaios cara á discriminación do xene mitocondrial citocromo b (Cyt b), desenvolveron ligantes de oco menor altamente específicos (evitando así posibles reaccións cruzadas) que permiten recoñecer con rapidez calquera das tres especies de atún citadas. Este protocolo de alta sensibilidade e especificidade pode ser empregado con éxito en alimentos mesturados, pero pode verse dificultado naqueles produtos que conteñen certos aditivos que poden inhibir a PCR (Terio et al., 2010). Ás dúas técnicas analíticas anteriores, debemos engadir tamén o estudo do Cyt b mediante o método da PCR-RFLP, o cal mostra efectividade tamén para discernir entre as principais especies de túnidos e outros peixes comunmente empregados para cometer fraude por substitución. Utilizando 5 enzimas de restrición diferentes para dixerir o Cyt b, esta ferramenta preséntase como un procedemento rápido e simple para identificar os produtos do atún cru erroneamente etiquetado (Yao et al., 2020). Por último, estudos moi recentes presentan a REIMS (Song et al., 2020), cunha precisión superior ó 93 %, como unha ferramenta útil para diferenciar, en poucos segundos, entre as catro principais especies de túnidos: T. thynnus, T. alalunga, T. albacares e T. obesus. Este método químico fundamenta a súa efectividade na diferenza estatisticamente significativa dos perfís de ácidos graxos e fosfolípidos que presenta cada unha destas especies. 36 Tratándose de produtos conxelados, é dicir, de produtos que poden conservarse un tempo considerable sen que exista a necesidade de vendelos rapidamente, o ideal é realizar as análises mediante a técnica que maior efectividade presente, sen ter en tanta consideración a velocidade do procedemento. Neste caso, o código de barras de ADN sería a técnica de elección, empregando dous marcadores para evitar a introgresión xenética entre as especies máis emparentadas, pódense obter resultados concluíntes que determinen con precisión a especie que está usando a empresa nos seus produtos. Os resultados destes estudos permitirán determinar se a empresa alimentaria está acometendo unha irregularidade comercializando como atún vermello outra especie diferente. En función dos resultados obtidos, da consideración da inspectora e das administracións públicas, determinaranse as medidas a tomar e, seguindo o réxime sancionador adecuado en función da comunidade autónoma, determinarase o tipo de infracción e de sancións que deberá afrontar esta empresa alimentaria. 37 4. Conclusións Os avances no control da fraude da industria alimentaria dos produtos da pesca a nivel europeo e estatal son evidentes na última década. Os esforzos por unha maior vixilancia destes alimentos dende a súa orixe ata a súa chegada ó consumidor final van en aumento. Non obstante, tamén avanzan os mecanismos tecnolóxicos e a habilidade daqueles intermediarios que queren obter maiores beneficios empregando a fraude alimentaria como forma ilícita de lucro. Acompañando na loita contra a fraude ós mecanismos documentais, á concienciación e educación de consumidores e produtores e á organización das autoridades competentes xunto cos seus aliados públicos, atópanse as técnicas analíticas como métodos de alta precisión que facilitan este labor. Na actualidade, as ferramenta máis empregadas para detectar a fraude por substitución de especies de peixe son aquelas baseadas no estudo do ADN, debido á súa versatilidade, principalmente a técnica denominada código de barras do ADN, que permite identificar practicamente a totalidade das especies comercializadas en España. Con todo, a realización desta técnica supón a presenza obrigada dun técnico con experiencia, a posibilidade de introgresión xenética en especies moi emparentadas e un gasto de tempo considerable que colle moita importancia nos casos de produtos frescos. Por iso, a tendencia dos avances nos métodos analítico encamíñase cara a procedementos máis rápidos, baratos e sinxelos que manteñan un índice de precisión elevado. Neste contexto preséntanse técnicas como a RT-PCR, a REIMS ou a SA-HRMA, as cales mostran excelentes resultados na identificación do peixe mediante procedementos de escasa duración. Sendo a fraude alimentaria nesta clase de produtos un problema en aumento, sería aconsellable seguir implementando estas tecnoloxías na rutina dos controis oficiais, obtendo como beneficio evidente unha maior precisión e efectividade á hora de atallar a substitución fraudulenta de especies en calquera das fases da cadea alimentaria. Estas ferramentas analíticas teñen a capacidade de supoñer un salto cualitativo na seguridade alimentaria dos produtos de orixe pesqueira, mellorando así a calidade destes produtos e a confianza dos propios consumidores no sector da pesca. 38 5. Bibliografía Abbadi, M., Marciano, S., Tosi, F., Battisti, C. D., Panzarin, V., Arcangeli, G., & Cattoli, G. (2017). Species identification of bivalve molluscs by pyrosequencing. Journal of the Science of Food and Agriculture, 97(2), 512-519. doi:10.1002/jsfa.7754 AESAN (2019). Memoria del sistema coordinado de intercambio rápido de información (SCIRI). Recuperado o 12 de xuño de 2021, de https://www.aesan.gob.es/AECOSAN/web/seguridad_alimentaria/subseccion/SCIRI.htm Agencia EFE (27 de septiembre de 2017). Sanidad confirma 154 intoxicados por atún adulterado en España. La Voz de Galicia. Recuperado o 15 de maio de 2021, de https://www.lavozdegalicia.es/noticia/sociedad/2017/09/27/sanidad-confirma-154- intoxicados-atun-adulterado-espana/00031506517451988729954.htm Altinelataman, C., Kündiger, R., Cakli, S., & Rehbein, H. (2009). Comparison of IEF patterns of sarcoplasmic proteins of fish from north atlantic and aegean sea. Food Control, 20(11), 980- 985. doi:10.1016/j.foodcont.2008.11.007 Angel Pardo, M., & Jimenez, E. (2020). DNA barcoding revealing seafood mislabeling in food services from Spain. Journal of Food Composition and Analysis, 91(103521) doi:10.1016/j.jfca.2020.103521 Argenta, D. F., Martelli, S. M., & Caon, T. (2019). Chapter 10 - dendrimer as a platform for drug delivery in the skin. In A. Holban, & A. M. Grumezescu (Eds.), Materials for Biomedical Engineering (pp. 331-367). Bucharest: Elsevier. Recuperado de https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/B9780128184332000108 Asensio, L., González, I., Fernández, A., Rodríguez, M. A., Lobo, E., Hernández, P. E., García, T., & Martín, R. (2002). Application of random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis for identification of grouper (Epinephelus guaza), wreck fish (Polyprion americanus), and nile perch (Lates niloticus) fillets. Journal of Food Protection, 65(2), 432- 435. doi:10.4315/0362-028X-65.2.432 Asensio, L., Samaniego, L., Pavón, M. A., González, I., García, T., & Martín, R. (2008). Detection of grouper mislabelling in the fish market by an immunostick colorimetric ELISA assay. Food and Agricultural Immunology, 19(2), 141-147. doi:10.1080/09540100802100202 Aursand, M., Mabon, F., & Martin, G. (2000). Characterization of farmed and wild salmon (Salmo salar) by a combined use of compositional and isotopic analyses. Journal of the American Oil Chemists' Society, 77(6), 659-666. doi:10.1007/s11746-000-0106-5 39 Berrini, A., Tepedino, V., Borromeo, V., & Secchi, C. (2006). Identification of freshwater fish commercially labelled “perch” by isoelectric focusing and two-dimensional electrophoresis. Food Chemistry, 96(1), 163-168. doi:10.1016/j.foodchem.2005.04.007 Black, C., Chevallier, O., Haughey, S., Balog, J., Stead, S., Pringle, S. D., Riina, M. V., Martucci, F., Acutis, P. L., Morris, M., Nikolopoulos, D. S., Takats, Z., & Elliott, C. (2017). A real time metabolomic profiling approach to detecting fish fraud using rapid evaporative ionisation mass spectrometry. Metabolomics, 13(12), 1-13. doi:10.1007/s11306-017-1291- y Brien, N., Hulse, C. A., Pfeifer, F., & Siesler, H. W. (2013). Near infrared spectroscopic authentication of seafood. Journal of Near Infrared Spectroscopy (United Kingdom), 21(4), 299-305. doi:10.1255/jnirs.1063 Burbano Rosero, E. M., Caetano de Almeida, B., Otero Ramírez, I. D., & Lorena Álvarez, S. (2017). Manual de biología molecular: Procedimientos básicos. Universidad de Nariño: Editorial Universitaria. Recuperado o 12 de xuño de 2021, de https://www.researchgate.net/profile/Edith-Burbano- Rosero/publication/326905291_Manual_de_Biologia_Molecular- Procedimientos_Basicos/links/5b7de35292851c1e12291a22/Manual-de-Biologia- Molecular-Procedimientos-Basicos.pdf Carlos, K. S., Treblin, M., & de Jager, L. S. (2019). Comparison and optimization of three commercial methods with an LC–MS/MS method for the determination of sulfites in food and beverages. Food Chemistry, 286, 537-540. doi:10.1016/j.foodchem.2019.02.042 Carrera M., Cañas B., & Gallardo J.M. (2013) Fish Authentication. In: Toldrá F., Nollet L. (eds) Proteomics in Foods. Food Microbiology and Food Safety, vol 2 (pp. 205-222). Springer, Boston: MA. doi.org/10.1007/978-1-4614-5626-1_12 Chace, D. H., & Kalas, T. A. (2005). A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing. Clinical Biochemistry, 38(4), 296- 309. doi:10.1016/j.clinbiochem.2005.01.017 Chen, T.-Y., & Hwang, D.-F. (2002). Electrophoretic identification of muscle proteins in 7 puffer species. Journal of Food Science, 67(3), 936-942. doi:10.1111/j.1365-2621.2002.tb09431.x Clark, L. F. (2015). The current status of DNA barcoding technology for species identification in fish value chains. Food Policy, 54, 85-94. doi:10.1016/j.foodpol.2015.05.005 Comisión de Medio Ambiente, Salud Pública y Seguridad Alimentaria (2013). INFORME sobre la crisis alimentaria, los fraudes en la cadena alimentaria y el control al respecto (2013/2091(INI)) (Documento de sesión). Bruselas. Recuperado o 23 de maio de 2021, de https://www.europarl.europa.eu/doceo/document/A-7-2013-0434_ES.html 46 Saubi Oriol, M. (2019). Situación del fraude en pescado a nivel mundial (Trabajo final de máster). Universitat Autònoma de Barcelona. Máster Oficial en Calidad de Alimentos de Origen Animal. Barcelona, España. Recuperado de https://recercat.cat/handle/2072/365418 Secretaría General del Consejo (2019). Ulteriores medidas para combatir y desalentar más eficazmente las prácticas fraudulentas en la cadena agroalimentarias en la cadena agroalimentaria (Conclusiones del Consejo, anexo). Bruselas: Consejo de la Unión Europea. Recuperado de https://data.consilium.europa.eu/doc/document/ST-15154-2019- INIT/es/pdf Senthil Kumar, N., & Gurusubramanian, G. (2011). Random amplified polymorphic DNA (RAPD) markers and its applications. Science Vision, 11(3), 116-124. Recuperado de https://www.researchgate.net/publication/267860691_Random_amplified_polymorphic_D NA_RAPD_markers_and_its_applications Song, G., Chen, K., Wang, H., Zhang, M., Yu, X., Wang, J., & Shen, Q. (2020). In situ and realtime authentication of thunnus species by iKnife rapid evaporative ionization mass spectrometry based lipidomics without sample pretreatment. Food Chemistry, 318, 1-9. doi:10.1016/j.foodchem.2020.126504 Sotelo, C. G., Velasco, A., Perez-Martin, R. I., Kappel, K., Schröder, U., Verrez-Bagnis, V., Jérôme, M., Mendes, R., Silva, H., Mariani, S., & Griffiths, A. (2018). Tuna labels matter in europe: Mislabelling rates in different tuna products. PloS One, 13(5), 1-12. doi:10.1371/journal.pone.0196641 Spielmann, G., Spielmann, G., Huber, I., Huber, I., Maggipinto, M., Maggipinto, M., & Pavlovic, M. (2018). Comparison of five preparatory protocols for fish species identification using MALDI-TOF MS. European Food Research and Technology, 244(4), 685-694. doi:10.1007/s00217-017-2983-2 Subdirecció General de la Inspecció i Control Agroalimentari (2015). Vigilància i control oficial de la qualitat agroalimentària i lluita contra el frau agroalimentari (exercici 2014). Direcció General d’Alimentació, Qualitat i Indústries Agroalimentàries. Recuperado o 25 de maio de 2021, de http://agricultura.gencat.cat/es/ambits/alimentacio/lluita-frau-alimentari/controloficial/ Subdirección General de Control de la Calidad Alimentaria y Laboratorios Agroalimentarios (2020). Programa Nacional de Control Oficial de la Calidad Alimentaria. Plan Nacional de Control Oficial de la Cadena Alimentaria 2016-2020. Actualización 2020. Recuperado o 25 de maio de 2021, de https://www.mapa.gob.es/es/ministerio/planes-estrategias/plannacional-de-control-de-la-cadena-alimentaria/plan-nacional-control-oficial-cadena- alimentaria-2016-2020.aspx 47 Terio V, Di Pinto P, Decaro N, Parisi A, Desario C, Martella V, Buonavoglia C, & Tantillo M.G. (2010). Identification of tuna species in commercial cans by minor groove binder probe realtime polymerase chain reaction analysis of mitochondrial DNA sequences. Molecular and Cellular Probes, 24(6), 352-356. doi:10.1016/j.mcp.2010.07.006 The Pew Charitable Trusts (2017). La historia del atún rojo del atlántico. Recuperado de https://www.pewtrusts.org/es/research-and-analysis/issue-briefs/2017/10/the-story-of- atlantic-bluefin The Provenance (2016). Tracking tuna from catch to customer. Recuperado de https://www.provenance.org/news/technology/tracking-tuna-catch-customer Tomás, C., Ferreira, I. M. P. L. V. O., & Faria, M. A. (2017). Codfish authentication by a fast short amplicon high resolution melting analysis (SA-HRMA) method. Food Control, 71, 255-263. doi:10.1016/j.foodcont.2016.07.004 UNE 195004:2013. Guía de trazabilidad de los productos de la pesca y de la acuicultura (Norma UNE 195004). Madrid: AENOR. Recuperado o 25 de xuño de 2021, de https://www.mapa.gob.es/es/pesca/temas/calidad-seguridad- alimentaria/guiatrazabilidad.aspx Unión Europea. Reglamento (CE) nº 1224/2009 del Consejo de 20 de noviembre de 2009 por el que se establece un régimen comunitario de control para garantizar el cumplimiento de las normas de la política pesquera común. Diario Oficial de la Unión Europea L 343, 22 de diciembre de 2009, pp. 1-50. Unión Europea. Reglamento (CE) nº 853/2004 del Parlamento Europeo y del Consejo, de 29 de abril de 2004, por el que se establecen normas específicas de higiene de los alimentos de origen animal. Diario Oficial de la Unión Europea L 139, 30 de abril de 2004, pp. 55-206. Unión Europea. Reglamento (UE) nº 1379/2013 del Parlamento Europeo y del Consejo de 11 de diciembre de 2013 por el que se establece la organización común de mercados en el sector de los productos de la pesca y de la acuicultura. Diario Oficial de la Unión Europea L 354, 28 de diciembre de 2013, pp. 1-21. Unión Europea. Reglamento (UE) nº 1380/2013 del Parlamento Europeo y del Consejo de 11 de diciembre de 2013 sobre la política pesquera común. Diario Oficial de la Unión Europea L 354, 28 de diciembre de 2013, pp. 22-62. Unión Europea. Reglamento (UE) nº 2017/625 del Parlamento europeo y del Consejo, de 15 de marzo de 2017, relativo a los controles y otras actividades oficiales realizados para garantizar la aplicación de la legislación sobre alimentos y piensos, y de las normas sobre salud y bienestar de los animales, sanidad vegetal y productos fitosanitarios. Diario Oficial de la Unión Europea L 95, 7 de abril de 2017, pp. 1-142. 48 Unión Europea. Reglamento de ejecución (UE) 2019/627 de la Comisión por el que se establecen disposiciones prácticas uniformes para la realización de controles oficiales de los productos de origen animal destinados al consumo humano, de conformidad con el Reglamento (UE) 2017/625 del Parlamento Europeo y del Consejo. Diario Oficial de la Unión Europea L 131, 17 de mayo de 2019, pp. 51-100. Unión Europea. Reglamento de ejecución (UE) n ° 931/2011 de la Comisión, de 19 de septiembre de 2011, relativo a los requisitos en materia de trazabilidad establecidos por el Reglamento (CE) n ° 178/2002 del Parlamento Europeo y del Consejo para los alimentos de origen animal. Diario Oficial de la Unión Europea L 242, 20 de septiembre de 2011, pp. 2-3. Velasco, A., Ramilo-Fernández, G., & Sotelo, C. G. (2020). A real-time PCR method for the authentication of common cuttlefish (Sepia officinalis) in food products. Foods, 9(3), 286. doi:10.3390/foods9030286 Viñas, J., & Tudela, S. (2009). A validated methodology for genetic identification of tuna species (Genus thunnus). Plos One, 4(10), 1-10. doi:10.1371/journal.pone.0007606 Wulff, T., Nielsen, M. E., Deelder, A. M., Jessen, F., & Palmblad, M. (2013). Authentication of fish products by large-scale comparison of tandem mass spectra. Journal of Proteome Research, 12(11), 5253-5259. doi:10.1021/pr4006525 Xiccato, G., Trocino, A., Tulli, F., & Tibaldi, E. (2004). Prediction of chemical composition and origin identification of european sea bass (Dicentrarchus labrax L.) by near infrared reflectance spectroscopy (NIRS). Food Chemistry, 86(2), 275-281. doi:10.1016/j.foodchem.2003.09.026 Xiong, X., Huang, M., Yuan, F., Lu, L., & Xiong, X. (2019). Development and validation of a fast DNA extraction protocol for fish products. Food Analytical Methods, 12(9), 1998-2008. doi:10.1007/s12161-019-01554-z Yao, L., Lu, J., Qu, M., Jiang, Y., Li, F., Guo, Y., Wang, L., & Zhai, Y. (2020). Methodology and application of PCR‐RFLP for species identification in tuna sashimi. Food Science & Nutrition, 8(7), 3138-3146. doi:10.1002/fsn3.1552