Presenza de Mycoplasma haemofelis e outros micoplasmas hemotrópicos en gatos do noroeste de España

Facultade de Veterinaria Traballo de Fin de Grao Grao en Veterinaria Ano 2023 Modalidade do Traballo Experimental Presenza de Mycoplasma haemofelis e outros micoplasmas hemotrópicos en gatos do noroeste de España MIRIAM PARGA BRAÑA Licenza Agás onde se faga constar explicitamente, esta obra pertence a Miriam Parga Braña e está baixo unha licenza de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. Resumo Os micoplasmas hemotrópicos (hemoplasmas) son bacterias intracelulares que infectan os glóbulos vermellos dunha gran variedade de mamíferos provocando anemias hemolíticas graves; no caso dos gatos, estes patóxenos provocan a anemia infecciosa felina. Os micoplasmas hemotrópicos atópanse amplamente estendidos mundialmente, e nos últimos anos están adquirindo gran relevancia en España. Os obxectivos deste traballo de fin de grado foron determinar a posible presenza de micoplasmas hemotrópicos nos gatos do noroeste de España e identificar as especies atopadas de xeito molecular e, tamén, se existe influenza de factores como a idade, o sexo, a presenza de pulgas e o estilo de vida dos gatos sobre a presenza destes microorganismos. Para isto realizouse unha mostraxe dun total de 74 mostras de sangue enteiro de gatos do noroeste de España, recollendo ademais diferentes datos sobre a súa procedencia, sexo, idade, presenza de pulgas e o seu estilo de vida. A partir das mostras de sangue enteiro realizouse unha PCR convencional para a detección de micoplasmas hemotrópicos, e a continuación as mostras positivas foron secuenciadas mediante o método Sanger. Por último, construíuse unha árbore filoxenética coas secuencias obtidas e outras de referencia previamente descritas e realizouse unha análise estatística para estudar si entre as variables recollidas e a positividade había diferencias significativas. Un total de 12 mostras (16,22 %) resultaron positivas a Mycoplasma spp. hemotrópicos mediante PCR. As especies atopadas e as súas prevalencias foron as seguintes: Mycoplasma haemofelis, 6,76 %; “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, 6,76 %; Mycoplasma wenyonii, 1,35 %; e “Candidatus Mycoplasma haemobos”, 1,35 %; así, este traballo arroxa nova información sobre a presenza das diferentes especies de micoplasmas hemotrópicos no noroeste de España. Polo que respecta ao estudo estatístico, as variables idade e sexo non presentaron relacións significativas coa positividade (p > 0,05), mentres que a presenza de pulgas e o estilo de vida colonia-acceso ao exterior si mostraron diferenzas significativas (p < 0,05). Estes resultados reforzan a idea de que a transmisión mediante vectores como as pulgas e a transmisión por contacto directo son as formas de transmisión máis importantes nestas infeccións. Ademais, este estudo supón a primeira descrición de “Candidatus M. haemobos” en gatos, un micoplasma hemotrópico cuxo hospedeiro principal son os bóvidos. Palabras chave: micoplasmas hemotrópicos, gatos, PCR, factores de risco, secuenciación, filoxenia Resumen Los micoplasmas hemotrópicos (hemoplasmas) son bacterias intracelulares que infectan los glóbulos rojos en una amplia variedad de mamíferos y causan anemias hemolíticas graves; en el caso de los gatos, estos patógenos causan la anemia infecciosa felina. Los micoplasmas hemotrópicos están muy extendidos a nivel mundial y, en los últimos años, han adquirido gran relevancia en España. Los objetivos de este trabajo de fin de grado fueron determinar la posible presencia de micoplasmas hemotrópicos en gatos del noroeste de España e identificar las especies encontradas molecularmente y, también, si factores como la edad, el sexo, la presencia de pulgas o el estilo de vida influyen en la presencia de estos microorganismos. Para lograr esto, se realizó un muestreo de un total de 74 muestras de sangre entera de gatos del noroeste de España, recogiendo además diferentes datos sobre su procedencia, sexo, edad, presencia de pulgas y su estilo de vida. A partir de las muestras de sangre entera, se realizó una PCR convencional para la detección de micoplasmas hemotrópicos, y a continuación las muestras positivas fueron secuenciadas mediante el método de Sanger. Finalmente, se construyó un árbol filogenético, con las secuencias obtenidas y otras de referencia previamente descritas, y un análisis estadístico para estudiar si había diferencias significativas entre las variables recogidas y la positividad. Un total de 12 muestras (16,22%) resultaron positivas para Mycoplasma spp. hemotrópicos por PCR. Las especies encontradas y sus prevalencias fueron: Mycoplasma haemofelis, 6,76%; “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, 6,76%; Mycoplasma wenyonii, 1,35%; y “Candidatus Mycoplasma haemobos”, 1,35%; así, este trabajo aporta nueva información sobre la presencia de diferentes especies de micoplasmas hemotrópicos en el noroeste de España. Por lo que respeta al estudio estadístico, las variables edad y sexo no presentaron relaciones significativas con la positividad (p > 0,05), mientras que la presencia de pulgas y el estilo de vida colonia-acceso al exterior sí mostraron diferencias significativas (p < 0,05). Estos resultados refuerzan la idea de que la transmisión a través de vectores como las pulgas y la transmisión por contacto directo son las formas de transmisión más importantes de estas infecciones. Además, este estudio representa una primera descripción de "Candidatus M. haemobos" en gatos, un micoplasma hemotrópico cuyo huésped principal son los bóvidos. Palabras clave: micoplasmas hemotrópicos, gatos, PCR, factores de riesgo, secuenciación, filogenia Abstract Hemotropic mycoplasmas (hemoplasmas) are intracellular bacteria that infect red blood cells in a wide variety of mammals and cause severe hemolytic anemias; in the case of cats, these pathogens cause feline infectious anemia. Hemotropic mycoplasmas are widespread worldwide and, in recent years, have gained great importance in Spain. The objectives of this The Final Project were to determine the possible presence of hemotropic mycoplasmas in cats from the Northwest of Spain and to identify molecularly the species found, moreover, the influence of factors such as influence of factors such as age, sex, the presence of fleas or the lifestyle of cats on the presence of these microorganisms was evaluated A total of 74 whole blood samples were collected from cats from the Northwest of Spain as well as data on their origin, sex, age, presence of fleas and their lifestyle. From the whole blood samples, a conventional PCR was performed for detecting hemotropic mycoplasmas, and then the positive samples were sequenced using the Sanger method. Subsequently, a phylogenetic tree was built with the sequences obtained and other reference sequences previously described. Finally, a statistical analysis was performed to evaluate if there were significant differences between the variables collected and the positivity. A total of 12 samples (16.22%) were positive for Mycoplasma spp. hemotrophic by PCR. The species found and their prevalence were: Mycoplasma haemofelis, 6.76%; "Candidatus Mycoplasma haemominutum", 6.76%; Mycoplasma wenyonii, 1.35%; and "Candidatus Mycoplasma haemobos", 1.35%; so, this work provides new information on the presence of different species of hemotropic mycoplasmas in northwestern Spain. As regards the statistical study, the variables age and sex did not present significant relationships with the positivity (p > 0.05), while the presence of fleas and the colony-access lifestyle show significant differences (p < 0.05). These results reinforce the idea that transmission through vectors such as fleas and direct transmission by direct contact are the most important forms of transmission of these infections. In addition, this study represents a first description of "Candidatus M. haemobos" in cats, a hemotropic mycoplasma whose main host is bovids. Keywords: hemotropic mycoplasmas, cats, PCR, risk factors, sequencing, phylogeny ÍNDICE Resumo ........................................................................................................................................3 Resumen.......................................................................................................................................4 Abstract ........................................................................................................................................5 Índice de abreviaturas ..................................................................................................................8 Índice de táboas e figuras ...........................................................................................................10 1. Introdución .........................................................................................................................11 1.1 Etioloxía .....................................................................................................................11 1.2 Epidemioloxía ............................................................................................................12 1.2.1 Distribución xeográfica ......................................................................................12 1.2.2 Hospedeiros ........................................................................................................12 1.2.3 Transmisión ........................................................................................................13 1.2.4 Factores de risco .................................................................................................15 1.3 Patoxénese ..................................................................................................................16 1.4 Signos clínicos e lesións .............................................................................................17 1.5 Diagnóstico ................................................................................................................17 1.5.1 Hemograma e Bioquímica ..................................................................................17 1.5.2 Frotis sanguíneo..................................................................................................18 1.5.3 Proba de Coombs ................................................................................................18 1.5.4 PCR ....................................................................................................................19 1.6 Tratamento .................................................................................................................19 1.7 Prevención e control ...................................................................................................20 2. Obxectivos .........................................................................................................................21 3. Material e métodos .............................................................................................................22 3.1 Criterios de selección .................................................................................................22 3.2 Análise de laboratorio.................................................................................................22 3.2.1 Extracción de ADN ............................................................................................22 3.2.2 PCR convencional ..............................................................................................23 3.2.3 Secuenciación do ADN.......................................................................................26 3.3 Análise filoxenético ....................................................................................................26 3.3.1 Ensamblaxe e corrección de secuencias ..............................................................26 3.3.2 Identificación de secuencias especies de Mycoplasma spp. hemotrópicos ..........27 3.3.3 Aliñamento .........................................................................................................27 3.3.4 Construción da árbore filoxenética .....................................................................28 3.4 Análise estatística .......................................................................................................29 4. Resultados e discusión........................................................................................................30 4.1 Presenza de micoplasmas hemotrópicos ...........................................................................30 4.2 Especies de micoplasmas hemotrópicos atopadas ............................................................30 4.3 Árbore filoxenética ...........................................................................................................33 4.4 Factores de risco avaliados que poden influír na transmisión ...........................................34 5. Conclusións ........................................................................................................................39 6. Bibliografía ........................................................................................................................40 Índice de abreviaturas ADN: Ácido desoxirribonucleico AIC: Akaike Information Criterion ARNr: Ácido ribonucleico ribosómico BLAST: Basic Local Alignment Search Tool ºC: grados Celsius CPDA-1: Citrato-fosfato-dextrosa-adenina dnaK: proteína de choque térmico 70 de la chaperona de ADN EDTA: Ácido etilendiaminotetraacético EF-Ts: factor de elongación - sensible a temperatura ELISA: Inmunoadsorción ligada a enzimas F: Forward g: gramo gapA: gliceraldehído-3-fosfato deshidroxenasa GTR + I + G: General Time Reversible + Invariant sites + Gamma-distributed h: hora M.: Mycoplasma mA: miliamperio MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis X mg/kg: miligramo/kilogramo Mhf: Mycoplasma haemofelis min: minuto Mhm: “Candidatus Mycoplasma haemominutum” ml: mililitro mM: milimolar Mtc: “Candidatus Mycoplasma turicensis” NCBI: National Center for Biotechnology Information PCR: Reacción en cadea da polimerasa pgk: fosfoglicerato quinasa pb: par de bases R: Reverse rpm: revolución por minuto Rt- PCR: PCR en tempo real TAE: Tris, acetato e EDTA UI: Unidades internacionais μm: micrómetro μl: microlitro μM: micromolar V: voltios W: vatio χ²: Chi-cadrado - Os gatos que viven no exterior e teñen contacto con outros gatos e cos artrópodos teñen máis probabilidade de infectarse (Willi et al., 2007a). - A coinfección con outras especies de hemoplasmas, que potencian a acción entre eles. - A coinfección con outros patóxenos ou patoloxías, que pode potenciar a anemia e reactivar a infección en gatos portadores. Entre as patoloxías asociadas encontramos por exemplo o virus da leucemia felina, o virus da inmunodeficiencia felina, o virus da peritonitis infecciosa felina, a bacteria Bartonella henselae e algunhas neoplasias. 1.3 Patoxénese A adhesión dos micoplasmas á superficie da membrana dos glóbulos vermellos produce dano na mesma que vai reducindo o tempo de vida das células infectadas. A isto hai que engadir a resposta inmunitaria que se produce fronte a bacteremia: a adhesión dos micoplasmas expón antíxenos e o hospedeiro responde con anticorpos, xerándose así unha reacción antíxeno-anticorpo complementaria que da lugar a hemólise. Esta hemólise acaba producindo a anemia hemolítica característica da infección por Mycoplasma haemofelis (Harvey, 2008). En xeral, a hemólise intravascular créese que é mínima; na maioría dos casos a anemia prodúcese por hemólise extravascular debida a eritrofagocitose por parte dos macrófagos do bazo, fígado, pulmóns e medula ósea (Harvey, 2008). Na patoxénese da infección por Mhf pódense diferenciar catro etapas: - O período de incubación oscila entre unha e tres semanas pasada a infección do patóxeno (Lobetti, 2007). - A fase aguda dura ao redor dun mes e correspóndese co momento no que o animal presenta o maior nivel de bacteremia. Nesta fase aparecen os signos clínicos (aínda que non en todos os gatos), polo que este é o momento no que se adoita acudir ao veterinario (Sykes, 2010). - Na fase de recuperación redúcense os micoplasmas en sangue e o hematócrito comeza a repoñerse (Palmero e Carballés, 2010). - A fase crónica é a que experimentan algúns gatos durante toda a súa vida, estes recupéranse da infección pero quedan como portadores crónicos. Aínda que non está totalmente estudada, no ano 2009 atopáronse mediante rt-PCR algunhas evidencias que parecían indicar que o pulmón, fígado e bazo son os órganos onde quedan secuestrados os micoplasmas hemotrópicos, xa que nestes órganos atopáronse o maior número de copias dos micoplasmas. Non obstante, non foron capaces de confirmar esta hipótese (Tasker et al., 2009a). Con todo, se o protocolo de tratamento é adecuado o animal debería quedar completamente libre da bacteremia en sangue e sen signos clínicos (Novacco et al., 2018). No caso de que o gato quede infectado de forma crónica, a reactivación da enfermidade pode ocorrer en calquera momento no que o gato se atope nun período de inmunosupresión; normalmente, os gatos infectados de forma crónica teñen hematócritos normais e resulta difícil atopar os hemoplasmas no frotis sanguíneo, polo que a única maneira de detectalos é mediante o uso de técnicas moleculares (Willi et al., 2006a; Palmero e Carballés, 2010). 1.4 Signos clínicos e lesións Mycoplasma haemofelis provoca cadros anémicos que varían dende subclínicos a severos, podendo chegar a comprometer a vida do animal. Aínda que na maioría dos casos é típica a presenza dunha anemia rexenerativa, describíronse casos con anemia non rexenerativa, posiblemente debido a que non transcorreu o tempo suficiente (3 a 5 días postinfección) para que se producise a resposta rexenerativa por parte da medula ósea (Palmero e Carballés, 2010). A sintomatoloxía é moi variada e a maior parte prodúcese como resultado do proceso anémico que o animal está sufrindo. Entre os sinais máis frecuentes atopamos: letarxia, debilidade, inapetencia, colapso, palidez de mucosas, taquicardia, disnea/taquipnea, sopros cardíacos, hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatía, deshidratación, febre, perda de peso e ictericia (Barker, 2019). 1.5 Diagnóstico 1.5.1 Hemograma e Bioquímica Cando o animal presenta os signos clínicos e acude ao veterinario o hematócrito adoita estar por debaixo do 20 %, incluso por debaixo do 10 %. O normal neste momento é atopar unha anemia rexenerativa macrocítica e hipocrómica (Harvey, 2008). En canto ao glóbulos brancos, estes poden estar en valores normais ou presentar leucopenia ou mesmo leucocitose; no caso das plaquetas, o achado máis característico é a trombocitopenia (Sykes, 2010). No perfil bioquímico podemos atopar hiperproteinemia fundamentalmente debida a deshidratación e, debido ao dano no fígado, os encimas hepáticos adoitan atoparse en valores por enriba do normal (Tasker, 2010). No caso de que a hemólise sexa masiva (intravascular e extravascular) e se supere a capacidade de conxugación da hemoglobina a nivel hepático, producirase bilirrubinemia e bilirrubinuria moderada e transitoria (Palmero e Carballés, 2010). 1.5.2 Frotis sanguíneo Ao observar unha extensión de sangue no microscopio observase aglutinación, policromasia, anisocitose e máis corpos de Howell-Jolly do normal. Os eritrocitos adoitan ser de maior tamaño (macrocíticos), nucleados e dunha cor máis pálida ao transportar unha menor cantidade de hemoglobina (hipocrómicos (Harvey, 2008). Os micoplasmas vense na superficie do eritrocito de xeito individual, en parellas ou en cadeas como un punteado azulado (Figura 1). As tinguiduras utilizadas para visualizalos poden ser Diffquick, Romanowsky o Giemsa (Sykes, 2010). O principal problema dos frotis sanguíneos é que tanto a sensibilidade como a especificidade son moi baixas; por exemplo, Mhf só é visible no 50% dos casos (Tasker, 2010). Podemos atopar tanto falsos negativos por desprendemento dos micoplasmas se o frotis non se realiza antes dunha hora postextracción do sangue, como falsos positivos se os confundimos con corpos de Howell- Jolly (Sykes, 2010; Tasker, 2010). A aglutinación é outro achado característico da infección por M. haemofelis e débese a anemia hemolítica inmunomediada producida pola hiperproteinemia que cambia a carga da membrana dos glóbulos vermellos e favorece a súa agrupación (Palmero e Carballés, 2010; Sykes, 2010). Figura 1. Micoplasmas hemotrópicos na superficie dos eritrocitos. Frotis sanguíneo en Diff-quick, 1000x. Fonte propia. 1.5.3 Proba de Coombs Esta proba emprégase para demostrar que existe presenza de anticorpos na superficie dos eritrocitos. De xeito similar aos frotis, trátase dunha proba cunha baixa sensibilidade, polo que un resultado negativo non descarta a infección. Ademais, nun estudo realizado no 2009 empregando esta proba en gatos infectados coas tres principais especies de micoplasmas hemotrópicos felinos, só se detectaron animais positivos nos gatos infectados experimentalmente con Mhf, polo que só se podería empregar para o diagnóstico desta especie (Tasker et al., 2009b). 1.5.4 PCR A reacción en cadea da polimerasa é a proba de elección para diagnosticar a infección por micoplasmas hemotrópicos, xa que é o método que presenta maior sensibilidade. Esta proba tipicamente detecta e amplifica o xene que codifica o fragmento 16S do ARNr dos micoplasmas hemotrópicos (Willi et al., 2007b). É importante sinalar que as mostras de sangue se deben recoller sempre en tubos con EDTA, xa que a heparina de litio inhibe a PCR (Tasker, 2010). Existen dous tipos de PCR que se poden empregar para a detección dos micoplasmas hemotrópicos, a PCR convencional e a PCR en tempo real (rt-PCR), sendo esta última a que se emprega con maior frecuencia. Entre as súas vantaxes atopamos que é máis específica e que permite cuantificar a cantidade de ADN dos micoplasmas hemotrópicos que presenta o paciente no sangue, de forma que se pode avaliar o curso da enfermidade e a resposta ao tratamento (Willi et al., 2007b; Tasker, 2010). 1.6 Tratamento O emprego de antibióticos como as tetraciclinas (doxiciclina, oxitetraciclina) ou as fluoroquinolonas (enrofloxacina, marbofloxacina) durante tres semanas logra a remisión da enfermidade clínica, e tamén a eliminación dos hemoplasmas do sangue (Foster, 2000; Tasker et al., 2009a). Para lograr a eliminación completa da infección un estudo realizado no ano 2018 propón empregar a doxicilina 5 mg/kg dúas veces ao día por vía oral durante 28 días. Naqueles gatos que permanecían positivos a rt-PCR substituíron a doxiciclina polo marbofloxacino 2 mg/kg unha vez ao día por vía oral durante 14 días e, posteriormente, repetiron rt-PCR obtendo todos os resultados negativos. Este estudio tamén demostrou que tras un período de inmunosupresión con doses altas de metilprednisolona os gatos seguían sendo negativos a PCR, o que confirmaba que os protocolos de tratamento que eles propoñían eran suficientes para lograr eliminar completamente a bacteremia sanguínea provocada por Mycoplasma haemofelis (Novacco et al., 2018). Outro antibiótico que se adoita empregar logrando a eliminación completa dos micoplasmas é o enrofloxacino, a dose de 5 mg/kg unha vez ao día vía oral durante 14 días (Dowers, 2002). En relación co tratamento da anemia, poden empregarse os glucocorticoides como a prednisolona a 1 a 2 mg/kg oral cada 12 horas (Harvey, 2008), pero só naqueles casos nos que o animal empeore a pesar da administración do antibiótico, cando se crea que a anemia hemolítica inmunomediada primaria teña un gran peso sobre a enfermidade ou cando o hemoplasma non sexa o principal responsable da anemia. No resto de casos é preferible non empregalos debido ao seu poder inmunosupresor que pode empeorar o cadro da enfermidade (Tasker, 2010). A transfusión sanguínea debe realizarse nos casos no que o hematócrito estea por debaixo do 15 %, testando sempre aos animais doantes fronte a micoplasmas hemotrópicos (Foster, 2000; Palmero e Carballés, 2010). Tamén se recomenda administrar fluídos que inclúan glucosa intravenosa nos casos de animais graves e moribundos (Harvey, 2008). Unha vez finalice o tratamento debería confirmarse mediante rt-PCR que o gato é negativo, dando por finalizada a bacteremia no sangue. Aínda que o resultado sexa negativo, para poder considerar cun risco mínimo que o gato non permanece como portador crónico debe repetirse esta análise dúas veces máis con intervalos dun mes (Tasker et al., 2009a; Palmero e Carballés, 2010). O prognóstico vai depender fundamentalmente de si o paciente presenta outras enfermidades concomitantes, do momento no que se comece a tratar e da facilidade ca que responda ao tratamento (Foster, 2000). 1.7 Prevención e control Como medidas preventivas deben eliminarse os artrópodos que inxiran o sangue dos felinos mediante o emprego de produtos repelentes (fipronilo, selamectina, lotilaner…), e evitar a transmisión iatroxénica realizando análise mediante PCR ao doante antes de realizar a transfusión sanguínea, así como evitar compartir outros materiais como agullas, instrumentos quirúrxicos… (Foster, 2000; Harvey, 2008). Polo momento non hai ningunha vacina fronte os micoplasmas hemotrópicos; non obstante, si existen na actualidade varios antíxenos candidatos a ser empregados en vacinas, como o dnaK (proteína de choque térmico 70 de la chaperona de ADN), pgk (fosfoglicerato quinasa), EF-Ts (factor de elongación - sensible a temperatura) y gapA (gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa); ademais, estes polipéptidos poden empregarse tamén como marcadores da infección nos gatos (Barker et al., 2012). 2. Obxectivos Cos antecedentes descritos ata o de agora, os obxectivos propostos no presente Traballo de Fin de Grao foron os seguintes: 1º. Determinar se existe presenza de micoplasmas hemotrópicos nos gatos do noroeste de España e identificar de xeito molecular as especies atopadas. 2º. Determinar a influenza de factores como a idade, o sexo, a presenza de pulgas e o estilo de vida dos gatos sobre a presenza destes micoplasmas hemotrópicos. 3. Material e métodos 3.1 Criterios de selección Este estudo levouse a cabo entre o 22 de setembro do 2022 e 15 de marzo do 2023. Durante este período recolléronse e analizáronse mostras dun total de 74 gatos, dos cales 68 eran de distintos concellos de Galicia (67 de Lugo e 1 de A Coruña), 4 procedían de Cantabria e 2 de Asturias. As mostras foron extraídas das venas xugular ou ilíaca e enviadas ao laboratorio de Enfermidades Infecciosas da Facultade de Veterinaria de Lugo en tubos con EDTA nun sobre xunto ao historial dos animais. Ademais disto, coa información recollida de cada animal elaborouse un rexistro no cal se reflectían os datos de sexo, idade, estilo de vida e tamén se o animal presentaba pulgas no momento da recollida da mostra. Para as variables “idade” e “estilo de vida” establecéronse as seguintes categorías: - Idade:  Gatos de menos de 12 meses.  Gatos entre 12 e 36 meses.  Gatos de máis de 36 meses. - Estilo de vida:  Con acceso ao exterior (outdoor).  Sen acceso ao exterior (indoor).  Colonia. 3.2 Análise de laboratorio 3.2.1 Extracción de ADN A partir das mostras de sangue enteiro realizouse unha extracción do ADN empregando un kit comercial (High pure PCR template preparation kit, Darmstadt, Alemania) adecuado para a obtención e purificación de ADN a partir de numerosos tipos diferentes de mostras. O protocolo empregado foi o descrito a continuación: 1. De cada tubo de EDTA transferimos a un tubo eppendorf 200 μl de sangue enteiro. 2. Engadimos 200 μl de Binding Buffer e 40 μl de Proteínasa K reconstituída a cada mostra. 3. Axitamos 1 minuto e incubamos 10 minutos a 70ºC. 4. Engadimos 100 μl de isopropanol e axitamos 15 segundos. 5. Colocamos unha columna de filtrado nun tubo colector (Figura 2) e transferimos todo o contido dos eppendorf en cada correspondente columna. 6. Centrifugamos 1 minuto a 9300 rpm. 7. Colocamos a columna sobre un novo tubo colector e rexeitamos o restante. 8. Engadimos 500 μl de Inhibitor Removal Buffer. 9. Centrifugamos 1 minuto a 9300 rpm. 10. Colocamos a columna sobre un novo tubo colector e rexeitamos o restante. 11. Engadimos 500 μl de Wash Buffer (1º lavado). 12. Centrifugamos 1 minuto a 9300 rpm. 13. Colocamos a columna sobre un novo tubo colector e rexeitamos o restante. 14. Engadimos 500 μl de Wash Buffer (2º lavado). 15. Centrifugamos 1 minuto a 9300 rpm. 16. Baleiramos o tubo colector e volvemos a colocar a columna. 17. Centrifugamos durante 3 minutos a 10400 rpm; este aumento de tempo de centrifuga faise para que se seque a membrana. 18. Colocamos a columna nun tubo eppendorf novo estéril onde se almacenará a mostra ata o seu análise, despois engadimos a cada columna 100 μl de Elution Buffer (prequentado a 70ºC), deixamos a incubar 1 minuto e, posteriormente, centrifugamos 1 minuto a 9300 rpm. 19. Gardamos en conxelación a -80 ºC os tubos eppendorf nos que temos o ADN extraído das mostras. 3.2.2 PCR convencional O ADN extraído a partir das mostras de sangue analizouse mediante PCR convencional para detectar a presenza de micoplasmas hemotrópicos mediante uns cebadores deseñados por Criado- Fornelio e colaboradores (2003); estes cebadores permiten detectar calquera dos micoplasmas hemotrópicos descritos ata a actualidade (Criado-Fornelio et al., 2003). Figura 2. Columnas de filtrado e tubo colector empregados durante a extracción de ADN. Fonte propia. Membrana de sílice O procedemento para realizar a PCR convencional descríbese a continuación: 1. Preparamos a Master Mix mesturando nun tubo eppendorf todos os reactivos necesarios para o correcto funcionamento da PCR (Táboa 3). Para calcular a cantidade de cada un destes reactivos precisamos multiplicar o volume final de cada un deles polo número de mostras que teñamos máis o control positivo e o negativo. Táboa 3. Listado dos reactivos necesarios para a preparación da Master Mix empregada para a detección de micoplasmas hemotrópicos. Concentración inicial Concentración final Volume final/reacción Cl2Mg 50 mM 1,5 mM 1,5 μl Tampón Tris-HCl 10 x 1 x 5 μl Desoxirribonucleótidos trifosfato 2 mM 200 mM 5 μl 1F (Primer)1 10 μM 1 μM 5 μl 1R (Primer)2 10 μM 1 μM 5 μl Taq (encima polimerase) 5 UI/ μl 2,5 UI 0,5 μl H2O 25 μl TOTAL 47 μl 1Forward (HBT-F) = ATACGGCCCATATTCCTACG 2Reverse (HBT-R) = TGCTCCACCACTTGTTCA 2. Axitamos e centrifugamos durante 30 segundos a 9000 rpm. 3. Preparamos os tubos de PCR de 200 μl e en cada un engadimos 47 μl da Master Mix preparada no paso 1. 4. Engadimos 3 μl do ADN extraído no anterior protocolo a todas as mostras, menos aos controles positivos e negativos. Como control positivo empregouse unha mostra positiva a Mycoplasma haemofelis obtida e secuenciada previamente, e como control negativo auga bidestilada estéril. Este paso debemos facelo cos tubos inxeridos nun pousatubos de frío para que a reacción de PCR non comece antes de tempo. 5. Centrifugamos os tubos de PCR a 1600 rpm durante un minuto. 6. Introducimos os tubos de PCR no termociclador (Bio-Rad T100, Bio-Rad Laboratories Inc., Estados Unidos) co seguinte protocolo térmico (Táboa 4): Táboa 4. Protocolo térmico empregado para a amplificación das mostras de este estudo mediante PCR convencional. Temperatura Tempo Ciclo 94 ºC 10 minutos 1 95 ºC 30 segundos 40 60 ºC 30 segundos 72 ºC 30 segundo 72 ºC 10 minutos 1 A continuación, para comprobar o resultado da PCR convencional é preciso visualizar os fragmentos obtidos en xel. O protocolo de electroforese que se segue é o seguinte: 1. Facemos o xel de agarosa ao 1 %: prepararamos nun matraz 60 ml de tampón TAE (trisaminometano, acetato e EDTA) a concentración 1x e engadimos 0,6 g de agarosa. Quentamos a mestura no microondas (1 min, 900 W) e cando comece a burbullar, paramos o microondas, axitamos o matraz e quentamos durante outros 30 segundos. 2. Deixamos arrefriar o matraz lixeiramente antes de engadir 3 μl RedSafe, e removemos suavemente xirando o matraz para que non se formen burbullas. A solución de tinguidura de Ácidos Nucleicos RedSafe emite fluorescencia verde ao unirse ao ADN ou ARN tras as súa exposición a luz ultravioleta. 3. Preparamos o soporte para o xel, axustándoo e equilibrándoo coa axuda do nivel. A continuación colocamos o peite, que serve para formar os pozos nos que colocaremos as mostras. 4. Baleiramos o xel nunha esquina do soporte para que non se formen burbullas e se reparta por si mesmo por toda a superficie. Deixamos solidificar durante 40 minutos. 5. Preparamos unha placa de microtitulación con 2 μl de tampón de mostra para cada unha das mostras. 6. Unha vez que o xel se endureza, retiramos primeiro o peite. A continuación, desmontamos o soporte de xel e colocámolo na cubeta de electroforese. Por último, cubrimos o xel con tampón TAE 1x. 7. Cargamos 5 μl do Ladder no primeiro pozo do xel. Este ladder é o marcador que se emprega para estimar o tamaño dos fragmentos obtidos na PCR. 8. Cargamos as mostras e mesturamos 10 μl de cada mostra co tampón de mostra que tiñamos preparado na placa de microtitulación. Cargamos todo o volume e dispensámolo no correspondente pozo situado no xel. 9. Pechamos a cubeta e configuramos o programa de electroforese (100 V, 400 mA, 45 min). 10. Unha vez rematado o tempo, apagamos a fonte de alimentación e abrimos a cubeta. Retiramos o soporte do xel e escorrémolo e secamos por debaixo cun anaco de papel. 11. Observamos os resultados no analizador de imaxes (Figura 3). Táboa 6. Resume dos datos das mostras positivas a Mycoplasma spp. hemotrópicos neste estudo, coa identificación a nivel de especie e porcentaxe de homoloxía coas secuencias previamente descritas en GenBank. Código mostra Sexo Pulgas Estilo de vida Idade (meses) Lugar Especie Homoloxía (%) G.6 Macho Si Acceso ao exterior 48 Begonte (Lugo) Mycoplasma haemofelis 94,35 G.7 Femia Si Acceso ao exterior 5 Castro de Rei (Lugo) Mycoplasma haemobos 99,81 G.8 Femia Si Acceso ao exterior 12 Vimianzo (A Coruña) Mycoplasma wenyonii 99,83 G.13 Macho Si Colonia 36 Lugo (Lugo) “Candidatus Mycoplasma haemominutum” 100 G.22 Macho Si Colonia 96 Lugo (Lugo) “Candidatus Mycoplasma haemominutum” 99,84 G.33 Macho Si Acceso ao exterior 24 Lugo (Lugo) “Candidatus Mycoplasma haemominutum” 99,84 G.34 Femia No Acceso ao exterior 24 Camargo (Cantabria) “Candidatus Mycoplasma haemominutum” 99,67 G.62 Macho Si Colonia 6 Lugo (Lugo) Mycoplasma haemofelis 99,83 G.63 Macho Si Colonia 72 Lugo (Lugo) Mycoplasma haemofelis 99,83 G.67 Femia Si Colonia 24 Lugo (Lugo) Mycoplasma haemofelis 99,83 G.72 Macho Si Acceso ao exterior 47 Lugo (Lugo) “Candidatus Mycoplasma haemominutum” 99,51 G.88 Macho No Acceso ao exterior 5 Gijón (Asturias) Mycoplama haemofelis 99,83 4.3 Árbore filoxenética En relación co estudo filoxenético baseado nas relacións evolutivas construído a partir do modelo GTR + I + G obtívose a árbore que se mostra a continuación na Figura 5. Esta árbore filoxenética permite ver as relacións existentes entre as diferentes especies do estudo e as especies de referencia recollidas da base de datos GenBank. Figura 5. Árbore filoxenética obtida a partir das mostras de este estudo e secuencias de referencia da base de datos GenBank. En diferentes cores móstranse os subclados para as diferentes especies atopadas neste traballo (amarelo: M. wenyonii; verde: “Candidatus M. haemominutum”; vermello: M. haemofelis; azul: “Candidatus M. haemobos”). As porcentaxes próximas aos nodos das ramas da árbore sinalan a probabilidade posterior obtida para dito nodo no análise filoxenético. Se observamos a árbore filoxenética en detalle vemos que todas as mostras e as especies de referencia escollidas parten dun antecesor común. Na parte inferior da árbore encontramos as especies de Mycoplasma spp. non hemotrópicas escollidas neste estudo como outgroup para poder realizar o enraizamento da árbore, mentres na parte superior vemos como as especies de micoplasmas hemotrópicos se dividen en dous clados claramente diferenciados: - O clado superior divídese a súa vez en dous subclados, atopando no superior a mostra G8 estreitamente relacionada cas dúas especies de referencia de M. wenyonii, o cal confirma o resultado de homoloxía obtido coa ferramenta BLAST. Cabe sinalar que nesta mesma rama atópanse tamén as especies “Candidatus M. haemovis” e M. ovis, típicas da especie ovina, e neste mesmo subclado pero noutra rama máis separada encóntranse tamén as especies M. suis e M. parvum, típicas do gando porcino. No subclado inferior atopamos as mostras G.72, G.22, G.34, G.13 e G33 xuntas na mesma rama coas secuencias de referencia de Mhm, o cal confirma de novo os resultados do BLAST, estando tamén moi relacionadas coas especies de “Candidatus M. Hematoparvum” pero que se encontran noutra rama lixeiramente separada pero no mesmo subclado. - O clado inferior presenta tres ramas, onde en relación coa raíz da árbore podemos diferenciar unha primeira coas secuencias de referencia de Mtc e unha segunda coas secuencias de “Candidatus M. haemobos” onde se sitúa a mostra G7 deste estudio. A terceira rama recolle as mostras G.88, G.67, G.63, G.62 e G6F, que están directamente relacionadas coas mostras de referencia de Mhf e moi próximas as secuencias de M. haemocanis, o que indica que ambas especies están moi relacionadas dende un punto de vista filoxenético. 4.4 Factores de risco avaliados que poden influír na transmisión A partir dos resultados obtidos neste estudo, as variables “sexo” e “idade” non parecen influír sobre a presenza de micoplasmas hemotrópicos nesta poboación (p-valor > 0,05). Sen embargo, as variables “presenza de pulgas” e “estilo de vida”, e dentro de esta en concreto a categoría “con acceso ao exterior” respecto da categoría “colonia”, si mostraron significativamente unha maior positividade a micoplasmas hemotrópicos (p-valor < 0,05). A continuación, móstranse as táboas de continxencia empregadas (Táboas 7, 8, 9 e 10), así como o estatístico χ² e os p-valores obtidos na análise estatística (Táboa 11). Táboa 7. Táboa de continxencia para as variables sexo e positividade á PCR. SEXO Resultados de micoplasmas hemotrópicos Negativo Positivo Total xeral Femia 29 4 33 Macho 33 8 41 Total xeral 62 12 74 Táboa 8. Táboa de continxencia para as variables idade e positividade á PCR. IDADE Resultados de micoplasmas hemotrópicos Negativo Positivo Total xeral >36 meses 10 4 14 <12 meses 36 4 40 12-36 meses 15 4 19 Total xeral 62 12 74 Táboa 9. Táboa de continxencia para as variables presenza de pulgas e positividade á PCR. PULGAS Resultados de micoplasmas hemotrópicos Negativo Positivo Total xeral Negativo 29 2 31 Positivo 32 10 42 Total xeral 61 12 73 Táboa 10. Táboa de continxencia para as variables estilo de vida e positividade á PCR. ESTILO DE VIDA Resultados de micoplasmas hemotrópicos Negativo Positivo Total xeral Colonia 38 5 43 Sen acceso ao exterior 9 0 9 Acceso ao exterior 15 7 22 Total xeral 62 12 74 Táboa 11. Resultados da proba de Chi-cadrado para cada unha das variables estudadas en relación coa positividade a micoplasmas hemotrópicos. Variables analizadas Chi-cadrado p-valor Sexo/positividade 0,7351 0,3912 Pulgas/positividade 3,912 0,048 Estilo de vida/positividade 6,3498 0,0418 Colonia/sen acceso ao exterior 1,158 0,282 Colonia/con acceso ao exterior 3,941 0,048 Sen acceso ao exterior/con acceso ao exterior 3,699 0,054 Idade/positividade 3,002 0,2229 Entre os datos recollidos dos animais deste estudo encontrábase o sexo dos animais, no que dos 74 gatos estudados 33 eran femias e 41 eran machos. Das femias só catro foron positivas, mentres que nos machos houbo oito gatos positivos; isto significa que o 12,12 % das femias e o 19,51 % dos machos do estudo eran positivos a algún dos micoplasmas hemotrópicos. Non obstante, estatisticamente non se atoparon diferencias significativas neste traballo, se ben é certo que o número de animais deste estudo non é moi elevado e isto puido influír neste sentido. Este resultado concorda con algúns estudos nos que tampouco se sinala asociación estatística entre o sexo e a positividade a micoplasmas hemotrópicos (Martínez-Díaz et al., 2013; Duarte et al., 2015). Con todo, a pesar de non ser estatisticamente significativo, a maior porcentaxe de gatos machos infectados concorda cos autores que si asocian o sexo a unha maior positividade; estes autores defenden que os machos enteiros, ao estar máis involucrados en liortas nas que se producen mordeduras, e tamén ao desprazarse máis lonxe tendo máis probabilidade de contacto con outros gatos, poden estar máis expostos á infección resultando nun maior número de positivos (Martínez- Díaz et al., 2013; Duarte et al., 2015; Álvarez-Fernández et al., 2022). Que o sexo masculino estea máis involucrado na positividade reforza a idea de que as liortas que implican mordeduras entre os gatos poden propiciar a transmisión directa entre un gato positivo e un gato san. Ademais, confirmouse cun estudo de inoculación de Mtc vía subcutánea que son suficientes dúas gotas de sangue (10 μL) para mostrar resultados positivos mediante PCR en gatos previamente sans (Museux et al., 2009). A idade foi outro dos factores que se tivo en conta á hora de recoller os datos dos gatos. Neste caso fixéronse tres grupos: o primeiro e máis numeroso, con 40 gatos de idade menor ou igual a 12 meses e no que houbo catro animais positivos (10 %); o segundo, con 19 gatos entre 12 e 36 meses, no que tamén houbo catro positivos (21 %); e o terceiro, eran 14 gatos de máis de 36 meses, onde outra vez atopamos catro positivos (29 %). Ao estudar a esta variable non se atoparon diferenzas significativas, o cal é oposto ao descrito por outros autores que mostran certa asociación entre a idade e a infección ao encontrar máis positivos nos gatos adultos; estes autores xustifican este achado polo feito de que os gatos de máis idade puideron estar expostos aos artrópodos chupadores durante máis tempo, ademais dunha maior probabilidade de interaccións agresivas neste grupo de idade que nos gatos máis novos (Sykes et al., 2007; Martínez-Díaz et al., 2013; Díaz-Regañón et al., 2018). Así, aínda que no presente estudo hai unha maior porcentaxe de gatos positivos na categoría de gatos adultos, o feito de que non se atopase ningunha relación estatisticamente significativa pode estar probablemente relacionado co pequeno tamaño da mostraxe. A transmisión de micoplasmas hemotrópicos en gatos mediante artrópodos, e especialmente mediante pulgas (Ctenocephalides felis), é un dos mecanismos máis estudados; con todo, non se chega a un acordo de consenso entre os autores. Neste estudo, o 23,8 % dos animais que foron positivos a micoplasmas hemotrópicos presentaban pulgas, fronte só a un 6,45 % dos animais positivos nos que non se evidenciou a presenza deste parasito. Así a todo, debemos mencionar que todos os animais positivos que non presentaban pulgas si que tiñan acceso ao exterior, polo que non se pode descartar que, a pesar de que no momento da toma de mostras non se atoparon pulgas, non as tiveran previamente. O porcentaxe de animais positivos e con pulgas deste estudo é parecido ao descrito en Reino Unido, onde se demostrou que o 36,4 % das mostras recollidas de gatos con pulgas foron positivas (Shaw et al., 2004). En relación co estudo estatístico, no presente traballo si se atoparon diferencias significativas ao estudar a presenza de pulgas, o que reforza a idea da súa implicación na transmisión destes micoplasmas hemotrópicos. Outro dato importante a ter en conta é que gran parte das mostras recollidas neste traballo de fin de grado recolléronse nos meses de inverno, entre o 22 de setembro do 2022 e 15 de marzo do 2023, nos cales as pulgas teñen menor actividade polo momento do ciclo no que se atopan. Estudos como o realizado en Madrid apoian a idea de que un tempo cálido inflúe na presenza de pulgas e por tanto na transmisión de micoplasmas hemotrópicos, xa que se observou unha maior presenza de animais positivos (63,5 %) nas mostras recollidas durante a primavera e o verán que nas recollidas en outono e inverno (36,5 %) (Díaz-Regañón et al., 2018). Con todo, hai lugares onde non abundan as pulgas e se detectan igualmente gatos positivos aos micoplasmas hemotrópicos, o que suxire que existan outros mecanismos de transmisión (Jensen, 2001). En relación a transmisión de micoplasmas hemotrópicos mediantes pulgas, e respecto a detección de Mycoplasma wenyonii e “Candidatus Mycoplasma haemobos” en mostras de gatos de este estudo, unha posible explicación para este achado podemos atopala na presenza destes axentes en vectores diferentes das pulgas, como por exemplo os mosquitos. No caso de Mycoplasma wenyonii, coñécese que algunha especie de culícidos como Aedes aegypti pode ser vector potencial deste patóxeno, xa que se descubriron exemplares na natureza que contiñan ADN deste micoplasma hemotrópico (Reagan et al., 2017) ; con todo, este vector específico non está presente en Galicia, pero non podemos descartar por completo que outros vectores similares poidan estar implicados na transmisión. Aínda que non se demostrou se os mosquitos poden transmitir este micoplasma hemotrópico típico do vacún, nese mesmo traballo si se logrou a infección experimental de mosquitos no laboratorio tras alimentarse de gatos positivos a Mhm e Mhf, resultando positivos a ambos micoplasmas; con todo, ningún gato san se infectou tras a exposición aos mosquitos positivos a Mhm e Mhf, o que non aclara a súa implicación na transmisión (Reagan et al., 2017). Esta podería ser unha liña de traballo a continuar a partir dos resultados que se obtiveron neste estudio de gatos positivos a micoplasmas hemotrópicos de bovinos. O estilo de vida dos gatos é outro dos factores que parece influír na positividade dos animais. A maioría das mostras proviñan de gatos de colonia, cunha porcentaxe do 11,63 % de mostras positivas nestes animais (5/43); con todo, a maior porcentaxe de animais positivos (31,82 %) atopouse na categoría de gatos que eran de propietario e tiñan acceso ao exterior (7/22). Por último, os nove gatos que non tiñan acceso ao exterior todos resultaron negativos. Deste xeito, pódese observar que todos os gatos positivos a micoplasmas hemotrópicos do estudo viven en colonias ou teñen acceso ao exterior, motivo polo que teñen mais contacto con outros animais ou están mais expostos a posibles vectores. Así, isto reforza novamente a idea da transmisión ben por contacto directo ou ben mediante vectores. A pesar de que no presente estudo non se atopou ningún gato positivo sen acceso ao exterior, estudos como o de Barcelona demostran que si é posible. A explicación máis razoable para isto é que estes gatos puideron estar en contacto con pulgas cando eran máis pequenos, non se sabe o tempo que levaban cos seus donos, ou que a transmisión puido ser a través da nai; este último mecanismo non está estudado pero tampouco se descarta que sexa posible (Álvarez-Fernández et al., 2022). Dende un punto de vista estatístico, a variable "estilo de vida" parece influír sobre a porcentaxe de gatos infectados; con todo, ao facer as comparacións das categorías desta variable dous a dous unicamente se observaron diferenzas significativas entre a vida en colonia e os gatos de propietario con acceso ao exterior, cunha maior porcentaxe de infectados nesta última categoría, aínda que hai que salientar tamén que a diferenza entre as categorías "sen acceso ao exterior" e "con acceso ao exterior" tende tamén a significación (p-valor = 0,054). Isto posiblemente sexa debido a unha falta de potencia estatística da mostraxe, xa que o dividir os datos en tres categorías o número resultante de cada un é pequeno, o que dificulta a aparición de diferenzas significativas. Non obstante, o feito de que os gatos de propietario vaian xeralmente de xeito máis frecuente ás clínicas veterinarias que os gatos de colonia tamén pode favorecer que se diagnostique esta infección nunha maior porcentaxe destes animais. 5. Conclusións 1ª. A porcentaxe de gatos infectados con micoplasmas hemotrópicos é do 16,22 % neste estudo realizado no noroeste de España. 2ª. Das especies de micoplasmas hemotrópicos propias dos gatos, neste estudo só se atoparon Mycoplasma haemofelis e “Candidatus Mycoplasma haemominutum”, mentres que “Candidatus Mycoplasma turicensis” non se atopou en ningún dos gatos analizados. 3ª. Neste traballo atopáronse dous gatos positivos a Mycoplasma wenyonii e “Candidatus Mycoplasma haemobos”, sendo ambas as dúas especies de micoplasmas cuxo hospedeiro principal son os bóvidos. No caso de “Candidatus Mycoplasma Haemobos”, este estudo supón a primeira descrición desta especie en gatos. 4ª. As variables sexo e idade non mostraron asociación estatisticamente significativa ca presenza de micoplasmas hemotrópicos nos gatos analizados. 5ª. A variable “presenza de pulgas” si demostrou estatisticamente ser un factor de risco para a infección con micoplasmas hemotrópicos, o cal reforza a idea da transmisión destes patóxenos mediante vectores. 6ª. O estilo de vida dos gatos parece influír na probabilidade de infección con micoplasmas hemotrópicos, xa que unicamente se atoparon animais infectados entre os que viven en colonias e os que viven en domicilios con acceso ao exterior; isto apoia a teoría da transmisión directa e da transmisión mediante vectores, xa que os animais destas categorías teñen máis probabilidade de contacto entre si e tamén cos posibles vectores. 6. Bibliografía Álvarez-Fernández, A., Maggi, R., Martín-Valls, G.E., Baxarias, M., Breitschwerdt, E.B., Solano- Gallego, L., 2022. Prospective serological and molecular cross-sectional study focusing on Bartonella and other blood-borne organisms in cats from Catalonia (Spain). Parasit Vectors 15, 1–14. Barker, E., Peters, I., Helps, C., Tasker, S., 2012. Methods of diagnosis and vaccines (WO 2012/010849 A2). Acceso online: https://patentimages.storage.googleapis.com/70/cf/8c/174597f58f3026/WO2012010849A2.pdf Barker, E.N., 2019. Update on Feline Hemoplasmosis. Veterinary Clinics of North America - Small Animal Practice 49, 733–743. Baumann, J., Novacco, M., Riond, B., Boretti, F.S., Hofmann-Lehmann, R., 2013. Establishment and characterization of a low-dose Mycoplasma haemofelis infection model. Vet Microbiol 167, 410– 416. Brown, D.R., May, M., Janet M. Bradbury, J.M., Karl-Erik Johansson K.E., Neimark, H., 2010. Order I. Mycoplasmatales, in: Krieg, N., Ludwig, W., Whitman, W., Hedlund B., Paster, B., Staley, J., Ward, N., Brown, D. (Eds.), Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Springer, pp. 574– 612. Clark, R., 1942. Eperythrozoon felis (SP.NOV) in a cat. Journal of African Veterinary Medicine Association 13, 15–16. Criado-Fornelio, A., Martinez-Marcos, A., Buling-Saraña, A., Barba-Carretero, J.C., 2003. Presence of Mycoplasma haemofelis, Mycoplasma haemominutum and piroplasmids in cats from southern Europe: A molecular study. Vet Microbiol 93, 307–317. Darriba, D., Taboada, G. L., Doallo, R., Posada, D., 2012. jModelTest 2: more models, new heuristics and parallel computing. Nature methods 9, 772-772. Díaz-Regañón, D., Villaescusa, A., Ayllón, T., Rodríguez-Franco, F., García-Sancho, M., Agulla, B., Sainz, Á., 2018. Epidemiological study of hemotropic mycoplasmas (hemoplasmas) in cats from central Spain. Parasit Vectors 11, 1–9. Dowers KL, Olver C, Radecki SV, Lappin MR, 2002. Use of enrofloxacin for treatment of large-form Haemobartonella felis in experimentally infected cats. . J Am Vet Med Assoc 251, 250–253. Duarte, A., Marques, V., Correia, J.H.D., Neto, I., Bráz, B.S., Rodrigues, C., Martins, T., Rosado, R., Ferreira, J.P., Santos-Reis, M., Tavares, L., 2015. Molecular detection of haemotropic Mycoplasma species in urban and rural cats from Portugal. J Feline Med Surg 17, 516–522. Estela Quiroz-Castañeda, R., Amaro-Estrada, I., Rodríguez-Camarillo, S., Hugo Aguilar-Díaz, J., 2020. Micoplasmas hemotrópicos, presencia y métodos de detección en animales con importancia veterinaria. Revista de Salud Animal 42, 1–9. Ford William W, Eliot Calista P., 1928. The transfer of rat anemia to normal animals. J Exp Med 48, 475–492. Foster, D., 2000. Haemobartonella felis, in: Day, M., Mackin, A., Littlewood, J. (Eds.), Manual of Canine and Feline Hematology and Transfusion Medicine. British Small Animal Veterinary Association, pp. 79–83. Gary, A.T., Richmond, H.L., Tasker, S., Hackett, T.B., Lappin, M.R., 2006. Survival of Mycoplasma haemofelis and “Candidatus Mycoplasma haemominutum” in blood of cats used for transfusions. J Feline Med Surg 8, 321–326. Gladden, N., Haining, H., Henderson, L., Marchesi, F., Graham, L., McDonald, M., Murdoch, F.R., Bruguera Sala, A., Orr, J., Ellis, K., 2016. A case report of Mycoplasma wenyonii associated immune-mediated haemolytic anaemia in a dairy cow. Ir Vet J 69, 1–8. Harvey J.W., 2008. Micoplasmosis hemotrófica (hemobartonelosis), in: Greene C.E. (Ed.), Enfermedades Infecciosas Del Perro y Del Gato. Elsevier, Buenos Aires, pp. 282–291. Kumar, S., Stecher, G., Li, M., Knyaz, C., Tamura, K., 2018. MEGA X: Molecular Evolutionary Genetics Analysis across Computing Platforms. Mol. Biol. Evol. 35, 1547. Jensen WA, 2001. Use of a polymerase chain reaction assay to detect and differentiate two strains of Haemobartonella felis in naturally infected cats. Am J Vet Res 62, 604–608. Lobetti, R., 2007. Hemoplasmosis felina, in: World Small Animal Veterinary Association World Congress Proceedings. pp. 1–3. Martínez-Díaz, V.L., Silvestre-Ferreira, A.C., Vilhena, H., Pastor, J., Francino, O., Altet, L., 2013. Prevalence and co-infection of haemotropic mycoplasmas in Portuguese cats by real-time polymerase chain reaction. J Feline Med Surg 15, 879–885. Méndez, L.C., Montoya, L.N.F., Mazo, M.M., Sepúlveda, J.C., Valencia, E., Portilla, T., Restrepo, L., 2022. Diagnostic comparison between cytological and molecular analysis for the detection of Mycoplasma haemofelis in resident cats of the city of Pereira, Risaralda, Colombia. Revista de Investigaciones Veterinarias del Perú 33.