Identificación mediante proteómica de nuevas adipoquinas y mioquinas implicadas en la obesidad

Identificación mediante proteómica de nuevas adipoquinas y mioquinas implicadas en la obesidad Arturo Roca Rivada 2013 Dr. Felipe Casanueva Freijo, Catedrático del Departamento de Medicina de la Universidad de Santiago de Compostela y Jefe del Servicio de Endocrinología y Nutrición del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela. Dra. María Pardo Pérez, Investigadora del Sistema Nacional de Salud Miguel Servet, Instituto de Investigaciones Sanitarias de Santiago de Compostela (IDIS)/SERGAS. CERTIFICAN: Que la presente Tesis Doctoral titulada: “Identificación mediante proteómica de nuevas adipoquinas y mioquinas implicadas en la obesidad” que presenta Arturo Roca Rivada ha sido realizada bajo su dirección en el grupo Obesidómica (IDIS) del Hospital Clínico Universitario de Santiago de Compostela, estimando que se encuentra concluida y en condiciones de ser presentada para optar al grado de Doctor en la Universidad de Santiago de Compostela. Para que así conste a los efectos oportunos, firman la presente autorización: Fdo. Felipe Casanueva Freijo Fdo. María Pardo Pérez Fdo. Arturo Roca Rivada Santiago de Compostela, 2013 Ustedes me dicen, entonces, que tengo que perecer como también las flores que cultivé perecerán. ¿De mi nombre nada quedará, nadie mi fama recordará? Pero los jardines que planté, son jóvenes y crecerán... Las canciones que canté, ¡cantándose seguirán! HUEXOTZÍNCATZIN Príncipe de Texcoco, 1484 Dedicado a Álex, Porque la inmortalidad reside en la memoria. Abreviaturas 9 9 Abreviaturas 1-DE Electroforesis en una dimensión/monodimensional 2-DE Electroforesis en dos dimensiones/bidimensional ABA Anorexia basada en la actividad ACBP Proteína de unión a acil-CoA AgRP Proteína r-agouti ARC Núcleo arcuato ARNm ARN mensajero bFGF Factor de crecimiento básico de fibroblastos BMP-1 Proteína morfogénica ósea 1 BNDF Factor neurotrófico derivado del cerebro CART Transcrito regulado por cocaína y anfetamina CABA Control anorexia basada en la actividad CCK Colecistoquinina CDIO Control obesidad inducida por la dieta CILAIR Comparación de ratios de incorporación de aminoácidos marcados con isótopos estables CRH Hormona liberadora de corticotropina DDP4 Dipeptidil peptidasa 4 DIO Obesidad inducidad por la dieta DMEM Medio de cultivo Eagle modificado por Dulbecco DMN Núcleo dorsomedial DTT Ditiotreitol ELISA Ensayo por inmunoabsorción ligado a enzimas ERKs Quinasas reguladoras de la señal extracelular FABP Proteína de unión a ácidos grasos FBS Suero fetal bovino FDG 18F-fluorodeoxiglucosa FFAs Ácidos grasos Libres FGF-21 Factor de crecimiento de fibroblastos 21 FNDC5 Fibronectina tipo III con 5 dominios FSH Hormona folículo estimulante GH Hormona de crecimiento GHS-R Receptor de secretagogos de la hormona de crecimiento Glut4/SLC2A4 Transportador de glucosa 4 dependiente de insulina GREM1 Gremlina 1 hASC Células madre mesenquimales derivadas de TA humano HOMA-IR Modelo homeostático de evaluación de la resistencia a insulina HPLC-MS/MS; LC-MS/MS Cromatografía bidimensional acoplada a un espectrómetro de masas Abreviaturas 10 10 IEF Isoelectroenfoque IFNG Interferón gamma IL Interleuquina IMC Índice de masa corporal INHBB Inhibina beta B iTRAQ Marcaje isobárico para la cuantificación absoluta y relativa KRH Tampón Krebs-Ringer-Hepes LEPR Receptor de leptina LH Hormona luteinizante MALDI Ionización láser asistida por matriz MCH Hormona concentradora de melanina MCP-1 Proteína quimioatrayente de monocitos-1 MGP Proteína gla de la matriz MMP-2 Metaloproteinasa 2 de matriz MS Espectrometría de masas MS/MS Espectrometría de masas en tándem MVECS Células endoteliales microvasculares myf-5 Factor de transcripción miogénico 5 Mw Masa molecular NFkB Factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas NPY Neuropéptido Y PAI-1 Inhibidor del activador del plasminógeno-1 PBS Tampón fosfato salino PCA Análisis de los componentes principales PEDF Factor derivado del pigmento epitelial PET-CT Tomografía por emisión de positrones - tomografía computerizada PGC-1α Coactivador-1α del receptor activado de proliferación de los peroxisomas γ pI Punto isoeléctrico POMC proopiomelanocortina PP Polipéptido pancreático PTN Pleiotrofina PVN Núcleo paraventricular PYY Péptido tirosina-tirosina qRT-PCR PCR a tiempo real cuantitativa RE Retículo endoplasmático RIPA Tampón de radioinmunoprecipitación ROS Especies reactivas del oxígeno RP-HPLC Cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa SDS Dodecilsulfato sódico SELDI Desorción/ionización por láser de superficie variante mejorada SILAC Aminoácidos marcados con isótopos estables en cultivos celulares SLPI Inhibidor de la peptidasa secretoria de los leucocitos 1 SNC Sistema nervioso central SNF2-α Activador probable de la transcripción global 2 alpha Abreviaturas 11 11 SPARC Proteína ácida secretada rica en cisteína TA Tejido adiposo TAB Tejido adiposo blanco TAP Tejido adiposo pardo TAS Tejido adiposo subcutáneo TASa Tejido adiposo subcutáneo abdominal TASf Tejido adiposo subcutáneo femoral TASg Tejido adiposo subcutáneo gluteal TAV Tejido adiposo visceral TAVg Tejido adiposo visceral gonadal TAVm Tejido adiposo visceral mesentérico TAVo Tejido adiposo visceral omental TAVr Tejido adiposo visceral retroperitoneal TGF-β Factor de crecimiento transformante β TNF-α Factor de necrosis tumoral alfa TOF Tiempo de vuelo TZD Tiazolidinediona UCP-1 Proteína desacopladora tipo 1 VLDL Lipoproteínas de muy baja densidad VMN Núcleo ventromedial ZDF Modelo de ratas Zucker diabéticas Índice de figuras 18 18 3. Validación y caracterización de la fetuina A como nueva adipoquina. ________ 174 3.1 La fetuina A de tejido adiposo es secretada de forma exclusiva por los adipocitos maduros. _________________________________________________________ 174 3.2 El tejido adiposo secreta varias formas fosforiladas de fetuina A. __________ 174 3.3 Validación de la expresión de fetuina A en animales bajo diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. ____________________________________________ 175 3.4 Caracterización de la presencia de fetuina A en suero y secretomas de animales bajo diferentes condiciones fisiológicas o patológicas. _____________________ 178 4. Caracterización del secretoma de tejido muscular para la identificación de nuevas miokinas ___________________________________________________________ 180 4.1 Establecimiento y optimización de la incubación de explantes de tejido muscular de rata para el análisis de su secretoma y su alteración tras el ejercicio. _______ 180 4.2 Mapas 2-DE de referencia de los secretomas de tejido muscular gucolítico-rápido y oxidativo-lento. __________________________________________________ 184 4.3 Estudio diferencial entre los secretomas del tejido muscular esquelético gucolítico-rápido y oxidativo-lento bajo condiciones ad libitum. _____________ 188 4.4 Estudio del efecto del ejercicio en los secretomas del tejido muscular gucolíticorápido y oxidativo-lento. _____________________________________________ 190 5. Caracterización de la hormona FNDC5/irisina. ___________________________ 195 5.1 FNDC5/irisina como mioquina. _____________________________________ 195 5.1.1 Validación de las muestras para su análisis e identificación de la banda de inmunodetección perteneciente a FNDC5/irisina________________________ 195 5. 1.2 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido muscular esquelético se ve afectada por la restricción calórica y por el ejercicio. ________________ 197 5.1.2.1 Secreción de FNDC5/irisina _________________________________ 197 5.1.2.2 Expresión de FNDC5 intracelular y ARNm ______________________ 198 5.1.3 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido muscular esquelético también se encuentra alterada en situaciones patológicas. _______________ 199 5.1.3.1 Secreción de FNDC5/irisina _________________________________ 199 5.1.3.2 Expresión de FNDC5 intracelular y ARNm ______________________ 201 5.2 FNDC5/irisina como adipoquina ____________________________________ 203 5.2.1 El tejido adiposo blanco también secreta FNDC5/irisina. _____________ 203 5.2.2 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido adiposo está modulada por el ejercicio y el estado nutricional. _______________________ 205 5.2.2.1 Secreción de FNDC5/irisina _________________________________ 205 Índice de figuras 19 19 5.2.2.2 Expresión de FNDC5 intracelular y ARNm ______________________ 207 5.2.3 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido adiposo también se encuentra alterada en situaciones patológicas. _________________________ 209 5.2.3.1 Secreción de FNDC5/irisina _________________________________ 209 5.2.3.2 Expresión de FNDC5 intracelular y ARNm ______________________ 210 5.2.4 Los niveles de FNDC5/irisina circulantes reflejan la modulación observada en los secretomas de tejido muscular esquelético y adiposo. ________________ 212 5.2.5 La expresión de PGC1-α en el tejido adiposo no se corresponde en la mayoría de los casos con los niveles de FNDC5 observados. ______________________ 213 5.2.6 Capacidad de browning del tejido adiposo ________________________ 215 5.2.7 La secreción de FNDC5/irisina la llevan a cabo los adipocitos maduros de rata y en el tejido adiposo humano también aparece expresión y secreción.______ 217 V. Discusión __________________________________________________ 219 1. Establecimiento y caracterización de modelos animales en diferentes situaciones fisiológicas y patológicas. _____________________________________________ 222 1.1 Restricción calórica, ejercicio y anorexia basada en la actividad (ABA) ______ 222 1.2 Obesidad inducida por la dieta (DIO) ________________________________ 226 2. Caracterización del secretoma del tejido adiposo blanco en función de su localización anatómica. _______________________________________________ 228 2.1 Establecimiento y validación de los secretomas a partir de explantes de TA _ 229 2.2 Los mapas 2-DE de referencia de los secretomas de TAVo, TAS y TAVg reafirman la hipótesis de que el tejido adiposo presenta diferentes funciones dependiendo de su localización anatómica. ___________________________________________ 230 2.3 El análisis diferencial del secretoma de los tres depósitos de TA muestra la existencia de grandes diferencias con respecto a su capacidad secretora. ______ 231 3. Validación y caracterización de la fetuina A como nueva adipoquina. ________ 232 3.1 La secreción de fetuina A en el TA se produce exclusivamente por los adipocitos y los niveles séricos están afectados por la obesidad y la restricción calórica. ____ 233 3.2 El TAVo participa en mayor medida que el TAS en la modulación de la expresión y secreción de fetuina A. ______________________________________________ 234 4. Caracterización del secretoma de tejido muscular para la identificación de nuevas miokinas____________________________________________________________235 Índice de figuras 20 20 4.1 Desarrolló de una metodología de cultivo de explantes para la identificación de proteínas secretadas por el tejido muscular esquelético. ___________________ 236 4.2 Los músculos sóleo y grastrocnemio presentan diferencias en su perfil de secreción según la composición de fibras mayoritaria y el ejercicio físico. ______ 238 5. Caracterización de la hormona FNDC5/irisina. ___________________________ 240 5.1 La FNDC5/irisina como mioquina ___________________________________ 241 5.1.1 Validación de las muestras para su análisis e identificación de la banda de inmunodetección perteneciente a FNDC5/irisina________________________ 241 5.1.2 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido muscular esquelético se ve afectada por la restricción calórica y por el ejercicio. ________________ 242 5.1.3 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido muscular esquelético también se encuentra alterada en situaciones patológicas. _______________ 243 5.2 FNDC5/irisina como adipoquina ____________________________________ 245 5.2.1 El tejido adiposo blanco también secreta FNDC5/irisina. _____________ 245 5.2.2 La secreción y expresión de FNDC5/irisina en el tejido adiposo está modulada por el ejercicio y el estado nutricional, así como en situaciones patológicas. _____________________________________________________ 245 VI. Conclusiones _____________________________________________ 249 VII. Apéndice _________________________________________________ 255 VIII. Bibliografía _____________________________________________ 273 Índice de figuras 21 21 Índice de figuras Página Figura 1 . ................................................................................................................................. 29 Figura 2. .................................................................................................................................. 32 Figura 3. .................................................................................................................................. 33 Figura 4. .................................................................................................................................. 35 Figura 5 ................................................................................................................................... 37 Figura 6. .................................................................................................................................. 39 Figura 7 ................................................................................................................................... 40 Figura 8 ................................................................................................................................... 42 Figura 9 ................................................................................................................................... 48 Figura 10 ................................................................................................................................. 50 Figura 11 ................................................................................................................................. 53 Figura 12 ................................................................................................................................. 54 Figura 13 ................................................................................................................................. 59 Figura 14 ................................................................................................................................. 62 Figura 15 ................................................................................................................................. 66 Figura 16. ................................................................................................................................ 68 Figura 17 ................................................................................................................................. 70 Figura 18 ................................................................................................................................. 71 Figura 19 ................................................................................................................................. 73 Figura 20 ................................................................................................................................. 76 Figura 21 ................................................................................................................................. 77 Figura 22 ................................................................................................................................. 81 Figura 23 ................................................................................................................................. 84 Figura 24 ................................................................................................................................. 87 Figura 25 ................................................................................................................................. 90 Figura 26 ................................................................................................................................. 99 Figura 27 ............................................................................................................................... 100 Figura 28 ............................................................................................................................... 104 Figura 29 ............................................................................................................................... 105 Figura 30 ............................................................................................................................... 106 Figura 31 ............................................................................................................................... 107 Figura 32 ............................................................................................................................... 122 Figura 33 ............................................................................................................................... 124 Figura 34 ............................................................................................................................... 126 Figura 35 ............................................................................................................................... 127 Índice de figuras 22 22 Figura 36 ............................................................................................................................... 128 Figura 37 ............................................................................................................................... 129 Figura 38 ............................................................................................................................... 130 Figura 39 ............................................................................................................................... 131 Figura 40 ............................................................................................................................... 132 Figura 41 ............................................................................................................................... 134 Figura 42. .............................................................................................................................. 140 Figura 43 ............................................................................................................................... 142 Figura 44 ............................................................................................................................... 143 Figura 45 ............................................................................................................................... 144 Figura 46 ............................................................................................................................... 147 Figura 47 ............................................................................................................................... 149 Figura 48 ............................................................................................................................... 150 Figura 49 ............................................................................................................................... 151 Figura 50 ............................................................................................................................... 151 Figura 51 ............................................................................................................................... 153 Figura 52 ............................................................................................................................... 154 Figura 53 ............................................................................................................................... 155 Figura 54 ............................................................................................................................... 156 Figura 55 ............................................................................................................................... 158 Figura 56 ............................................................................................................................... 166 Figura 57 ............................................................................................................................... 167 Figura 58 ............................................................................................................................... 168 Figura 59 ............................................................................................................................... 169 Figura 60 ............................................................................................................................... 170 Figura 61. .............................................................................................................................. 172 Figura 62 ............................................................................................................................... 174 Figura 63 ............................................................................................................................... 175 Figura 64 ............................................................................................................................... 176 Figura 65. .............................................................................................................................. 177 Figura 66 ............................................................................................................................... 178 Figura 67 ............................................................................................................................... 179 Figura 68 ............................................................................................................................... 181 Figura 69 ............................................................................................................................... 182 Figura 70 ............................................................................................................................... 183 Figura 71 ............................................................................................................................... 185 Figura 72 ............................................................................................................................... 186 Figura 73 ............................................................................................................................... 187 Figura 74 ............................................................................................................................... 189 Figura 75. .............................................................................................................................. 191 Figura 76 ............................................................................................................................... 194 Figura 77. .............................................................................................................................. 196 Figura 78. .............................................................................................................................. 198 Figura 79 ............................................................................................................................... 200 Figura 80 ............................................................................................................................... 201 Índice de figuras 23 23 Figura 81 ............................................................................................................................... 202 Figura 82 ............................................................................................................................... 204 Figura 83 ............................................................................................................................... 206 Figura 84 ............................................................................................................................... 208 Figura 85 ............................................................................................................................... 210 Figura 86 ............................................................................................................................... 211 Figura 87 ............................................................................................................................... 212 Figura 88 ............................................................................................................................... 213 Figura 89. .............................................................................................................................. 214 Figura 90. .............................................................................................................................. 216 Figura 91 ............................................................................................................................... 217 Figura 92 ............................................................................................................................... 248 Índice de tablas 25 25 Índice de tablas Página Tabla 1 .................................................................................................................................... 31 Tabla 2. ................................................................................................................................... 31 Tabla 3 .................................................................................................................................... 45 Tabla 4 .................................................................................................................................... 47 Tabla 5 .................................................................................................................................... 63 Tabla 6 .................................................................................................................................... 74 Tabla 7 .................................................................................................................................... 78 Tabla 8 .................................................................................................................................. 113 Tabla 9 .................................................................................................................................. 115 Tabla 10 ................................................................................................................................ 116 Tabla 11 ................................................................................................................................ 117 Tabla 12 ................................................................................................................................ 121 Tabla 13 ................................................................................................................................ 125 Tabla 14 ................................................................................................................................ 125 Tabla 15 ................................................................................................................................ 159 Tabla 16 ................................................................................................................................ 162 Tabla 17 ................................................................................................................................ 163 Tabla 18 ................................................................................................................................ 164 Tabla 19. ............................................................................................................................... 173 Tabla 20. ............................................................................................................................... 187 Tabla 21 ................................................................................................................................ 190 Tabla 22 ................................................................................................................................ 192 Tabla 23. ............................................................................................................................... 193 Tabla suplementaria 1 ........................................................................................................... 260 Tabla suplementaria 2. .......................................................................................................... 262 Tabla suplementaria 3 ........................................................................................................... 264 Tabla suplementaria 4 ........................................................................................................... 265 Tabla suplementaria 5 ........................................................................................................... 267 Tabla suplementaria 6 ........................................................................................................... 269 Tabla suplementaria 7 ........................................................................................................... 270 Tabla suplementaria 8. .......................................................................................................... 271 Tabla suplementaria 9 ........................................................................................................... 272 I. Introducción Introducción 34 34 enorme gasto económico calculado entre el 2 y el 8 por ciento del gasto sanitario [10][10][10][10][10][10][10][10][10][10]. 2.1 Actualidad: incidencia y cómo tratar la obesidad. Los principales métodos de actuación para combatir el sobrepeso son la dieta y el ejercicio, y cuando estos fallan se combinan con la terapia farmacológica. En casos más extremos, o en casos en donde la obesidad viene asociada a una diabetes tipo II, la solución más eficaz es la cirugía [11]. 2.1.1 Dieta A lo largo de los últimos años han ido surgiendo distintos tipos de dietas, unas más efectivas que otras, sin embargo la mayoría de ellas se basan en dos principios: la restricción calórica y la reducción del apetito. Se han abordado estrategias que van desde el incremento en el porcentaje de proteínas consumidas, las comidas bajas en carbohidratos o la sustitución en la dieta de los ácidos grasos de cadena larga por ácidos grasos de cadena media/corta [12]. Uno de los principales problemas a los que se enfrenta este tipo de estrategia de reducción de peso corporal es la baja adhesión de los pacientes a continuar las dietas a lo largo del tiempo, los beneficios evidentes que se observan durante los primeros meses de dieta, se reducen e incluso empeoran en un gran porcentaje de pacientes debido a su incapacidad de cumplir estrictamente con la dieta prescrita, ya que la modificación de la dieta tiene que implicar también un cambio en su estilo de vida. Se estima que la efectividad de este tratamiento a largo plazo supone una reducción del 10% del peso inicial, lo que implica una mayor prevención de enfermedades relacionadas con la obesidad como pueden ser la diabetes tipo 2 y la hipertensión [13]. 2.1.2 Ejercicio El ejercicio ha demostrado ser un potente aliado para combatir la obesidad, en numerosos estudios se ha observado que incluso un pequeño aumento de la actividad física del individuo puede derivar en la mejora de las condiciones generales, y como es de esperar, un mayor incremento del mismo conlleva unos mayores beneficios [14], por lo que los especialistas recomiendan mantener rutinas de ejercicio físico independientemente de padecer obesidad, incluso en ancianos [15]. El ejercicio físico no contribuye únicamente a aumentar el gasto energético y la pérdida de tejido adiposo, también protege frente a la pérdida de masa muscular, mejora las condiciones cardiorespiratorias, reduce los riesgos de sufrir enfermedades Introducción 35 35 cardiológicas y metabólicas relacionadas con la obesidad, e incluso aporta al individuo una mayor sensación de bienestar. Al igual que ocurre con las dietas, el ejercicio para una persona habituada al sedentarismo implica un cambio en su estilo de vida, por lo que es muy importante monitorizar el estado psicológico del individuo y estimular y potenciar mediante diferentes mecanismos las rutinas de ejercitación física [16]. 2.1.3 Tratamiento farmacológico En los últimos años se han producido numerosos avances en el ámbito del estudio de la regulación del peso corporal, sin embargo el progreso en la terapia farmacológica para combatir la obesidad está siendo muy lento [11]. Los escasos tratamientos existentes en la actualidad, así como las investigaciones que se encuentran en curso; se centran en cinco estrategias principales para lograr la pérdida de peso (figura 4) [17]:  Reducción de la ingesta de comida mediante la estimulación del efecto de las señales anorexigénicas o el bloqueo de las señales orexigénicas.  Bloquear la absorción de nutrientes en el estómago, especialmente la grasa.  Aumentar la termogénesis para disipar el exceso de energía almacenada en forma de calor.  La modulación del metabolismo o el almacenamiento de grasas y proteínas.  Modulación del sistema central de regulación del peso corporal. Figura 4: Diagrama de las distintas moléculas diana farmacológicas según la estrategia seguida para combatir la obesidad. Modificado de [17]. Introducción 36 36 2.1.4 Cirugía bariátrica La cirugía bariátrica es la opción más eficaz actualmente para el control del peso corporal en pacientes en los que las demás estrategias han fracasado y/o que debido a su peso corporal sufren enfermedades relacionadas con la obesidad como la diabetes tipo 2 o enfermedades cardiovasculares [18]. La cirugía bariátrica se puede clasificar en dos tipos, restrictiva y/o malabsortiva. Los procedimientos restrictivos limitan el diámetro luminal del estómago, pero no reconducen el paso de la comida a través del tracto gastrointestinal mediante la eliminación de segmentos intestinales; se basan en la introducción de ciertos materiales exógenos o bandas como por ejemplo la banda gástrica ajustable por laparoscopia. Por otro lado, los procedimientos malabsortivos están diseñados para reducir el área de mucosa intestinal que se encarga de la absorción de los nutrientes mediante la gastrectomía parcial de esa zona [19]. La cirugía bariátrica no sólo produce una importante pérdida de peso del paciente, sino que mejora ostensiblemente el control del peso corporal a largo plazo. Diversos estudios realizados sobre pacientes sometidos a este tipo de cirugía han demostrado además otros tipos de beneficios al margen del peso corporal, como los efectos positivos sobre la diabetes, riesgo cardiovascular y calidad de vida, disminuyendo incluso el riesgo a padecer cáncer. El dato más positivo de este tipo de intervención es la baja tasa de mortalidad que presenta este procedimiento [20]. 2.2 Enfermedades asociadas 2.2.1 Incremento de tejido adiposo corporal Existen un elevado número de complicaciones médicas severas relacionadas con el incremento excesivo de tejido adiposo blanco que conlleva la obesidad. Estas complicaciones afectan en mayor o menor medida tanto a la calidad de vida como a la tasa de mortalidad prematura de los individuos que las padecen. El síndrome coronario agudo, la diabetes tipo 2, hipertensión, síndrome respiratorio, dislipemia, síndrome metabólico, esteatosis hepática o incluso ciertos tipos de cáncer son sólo un ejemplo de la larga lista de enfermedades directa o indirectamente relacionadas con la obesidad (figura 5) [21-23]. Introducción 37 37 Figura 5: Conjunto de complicaciones que pueden surgir como producto del incremento de tejido adiposo corporal. Modificada de [24] La obesidad se caracteriza por presentar elevados niveles de insulina plasmática en ayuno y una respuesta exagerada a la sobrecarga oral de glucosa. La adiposidad general y la distribución de los depósitos de tejido adiposo corporal influyen en el metabolismo de la glucosa a través de una serie de mecanismos independientes pero aditivos. A medida que aumenta el peso corporal también se observa un incremento progresivo de los niveles medidos de glucosa e insulina tras la prueba de sobrecarga oral de glucosa, con una correlación positiva entre la adiposidad abdominal o central y la resistencia a insulina. La resistencia a la insulina conlleva la inhibición del efecto antilipolítico de la insulina en el tejido adiposo, lo que resulta en un incremento de los ácidos grasos libres (FFAs) liberados en especial por los adipocitos del tejido adiposo visceral al sistema porta hepático. El incremento de FFAs en el hígado reduce la respuesta de este órgano a la insulina plasmática activando su programa de gluconeogénesis e incrementando la liberación de glucosa hepática, lo que contribuye a los niveles de Introducción 38 38 glucosa tan elevados observados en obesidad. La falta de acción de la insulina sobre el hígado induce como respuesta un incremento en la liberación de la misma; así los niveles muy elevados de insulina plasmática terminan por ocasionar una regulación negativa de sus receptores en los tejidos diana. La resistencia a la insulina no se produce sólo en los adipocitos, el mismo proceso se produce también en el tejido muscular esquelético, por lo que el proceso se vuelve sistémico [5]. En la actualidad, la obesidad y la diabetes se considera que están estrechamente relacionadas a través de un estado de inflamación crónica sistémica y de bajo grado. Se ha visto, que los niveles circulantes de varios marcadores de inflamación (Ej. IL-6, haptoglobina o la proteína C-reactiva) se encuentran muy elevados en obesidad y reducidos en pacientes normopeso. La hipótesis más plausible es que los factores inflamatorios derivados del tejido adiposo podrían ser los responsables de la resistencia a la insulina y otras enfermedades asociadas a este estado como el síndrome metabólico [25]. 2.2.2 Ausencia de ejercicio físico El ejercicio físico se puede definir como cualquier actividad física que implique un gasto energético del individuo. A nivel fisiológico el término ejercicio incluye el conjunto de respuestas adaptativas que se producen en el organismo durante el esfuerzo físico [26]. Las adaptaciones al ejercicio ocurren en casi todos los órganos y sistemas, como el respiratorio, neuronal, endocrino, músculo-esquelético o gastrointestinal. Estas adaptaciones confieren importantes beneficios como resistencia a padecer enfermedades cardiovasculares, diabetes, fibromialgia, osteoporosis, depresión e incluso obesidad, por lo que también protegería frente a las enfermedades asociadas a esta (figura 6) [27-29]. Las bases del efecto protector del ejercicio están relacionadas directamente con la fisiología propia del tejido muscular esquelético. La actividad muscular es un potente estimulador del metabolismo y la síntesis proteica; confiriendo al músculo la capacidad de adaptarse continuamente a las actividades que realice el individuo produciéndose desde hipertrofia muscular a cambios en el tipo de fibras, resultando en un mayor rendimiento energético al ser un tejido capaz de modificar su preferencia por una fuente energética u otra. La inactividad física induce el desarrollo de fibras más rápidas que consumen preferentemente glucosa en detrimento de fibras lentas que presentan un metabolismo más oxidativo; esta dinámica produce cambios en el metabolismo hepático con un incremento en la gluconeogénesis. Por otro lado, el músculo se convierte en un tejido capaz de realizar movimientos de gran intensidad y de corta Introducción 39 39 duración a expensas de fatigarse más rápido. Estos cambios en el tipo de fibras y en la fisiología del músculo influyen de manera determinante en el metabolismo energético general, y en especial en el desarrollo de enfermedades relacionadas con la señalización de la insulina y el metabolismo de la glucosa y ácidos grasos [30]. Figura 6: Algunas consecuencias observadas por el efecto de la inactividad física. Modificada de [26]. Recientemente se ha propuesto la hipótesis de que la inactividad física podría conducir a un incremento en la adiposidad central, en especial de tejido adiposo visceral, produciéndose una infiltración de macrófagos que activarían una serie de rutas que derivarían en un estado de inflamación crónica sistémica y que en última instancia sería la causante de la mayoría de enfermedades relacionadas con la ausencia de ejercicio físico (figura 7) [31]. Con respecto a este tema, el tejido muscular esquelético se ha destacado como un potente sistema de defensa frente a la inflamación a través de la secreción de una serie de proteínas (como las proteínas de shock térmico) con efectos antiinflamatorios, además de jugar un papel fundamental Introducción 40 40 en la señalización que se produce durante la inflamación sistémica así como en la modulación de la respuesta inflamatoria. Figura 7: Esquema de los procesos inflamatorios derivados de la inactividad física. Modificada de [31]. Actualmente se desconocen los mecanismos concretos responsables de los efectos beneficiosos producidos por el ejercicio físico; se cree que el mecanismo fundamental se encuentra en la comunicación bidireccional que existe entre el tejido muscular esquelético y órganos periféricos como el tejido adiposo. Así, en los últimos años se ha abierto un nuevo paradigma al demostrar que el músculo puede comportarse como un órgano endocrino secretando una serie de proteínas denominadas mioquinas. Estas proteínas de señalización formarían parte del sistema de comunicación entre el tejido muscular y otros tejidos periféricos y/o centrales, y estarían relacionadas directamente con los efectos del ejercicio. Ante esta nueva situación, el estudio de estas proteínas en los próximos años será fundamental para entender muchas de las enfermedades derivadas de la ausencia del ejercicio físico y su papel en la obesidad y trastornos relacionados [32]. Introducción 41 41 3. Regulación de la ingesta La movilización y almacenamiento de energía en forma de ácidos grasos o glucógeno es un proceso esencial y dinámico que permite al organismo poder responder rápidamente a la demanda energética y que se regula de una manera compleja con el fin de asegurar un estado de homeostasis energética correcto. Esta regulación se lleva a cabo por un lado mediante sistemas orexigénicos que promueven el apetito y el consumo de alimentos favoreciendo un balance energético positivo, mientras que por otro lado están los sistemas anorexigénicos, que promueven la saciedad limitando el consumo de alimentos y activando sistemas de consumo energético, con lo cual favorecen un balance energético negativo [33]. El cerebro recibe continuamente información mediante una serie de receptores que monitorizan las reservas energéticas presentes en los órganos críticos y su movilización a través del torrente sanguíneo, lo que asegura un control central de las necesidades energéticas de cada tejido. Esta información es aportada por ciertos órganos periféricos implicados en la homeostasis energética, como el estómago o el tejido adiposo, a través de un complejo sistema de señales liberadas a la sangre características de cada uno de los órganos implicados [34]. En términos generales la ingesta se regula por un lado a través del sistema nervioso central (SNC), siendo el hipotálamo la región fundamental; y por otro lado a través del complejo sistema de señales periféricas que informan al sistema nervioso central (figura 8). 3.1 Sistema nervioso central: El hipotálamo El área principal y más importante del cerebro implicada en la regulación del apetito y en la homeostasis energética es el hipotálamo, aunque también se encuentran implicadas regiones del tronco cerebral y del cerebelo [35]. El hipotálamo consiste en una pequeña área de la región mediobasal del cerebro localizada justo debajo del tálamo, que se divide en varios núcleos interconectados: el núcleo arcuato, el núcleo paraventricular, el área hipotalámica lateral, el núcleo ventromedial y el núcleo dorsomedial. Esta región del cerebro comenzó a captar la atención de los investigadores tras los datos clínicos observados en pacientes con síndrome de Fröhlich, los cuales presentaban una serie de tumores pituitarios asociados a hipogonadismo y a un exceso de tejido adiposo subcutáneo [36]. Más tarde, mediante una serie de experimentos en los que se destruían ciertos núcleos del hipotálamo, se profundizó en el papel regulador de la ingesta de este órgano. Se comprobó como las lesiones en el núcleo ventromedial producían un incremento de la ingesta y obesidad, mientras que las lesiones en el área hipotalámica lateral producían una disminución de la ingesta y Introducción 42 42 anorexia. Por lo que se empezó a hablar de un “modelo de doble centro” compuesto por un “centro de la saciedad” y un “centro del hambre” [37]. Figura 8: Representación esquemática de los múltiples sistemas que regulan el apetito. Modificada de [38]. Anatómicamente el núcleo arcuato (ARC) se sitúa en una zona donde la barrera hematoencefálica es más débil, permitiendo el paso de hormonas y nutrientes, este hecho convierte a este núcleo en el área receptora principal de las señales metabólicas periféricas. El núcleo arcuato se caracteriza por poseer dos circuitos neuronales opuestos, un circuito orexigénico, que secretan los neuropeptidos Y (NPY) y la proteína r-agouti (AgRP); y un circuito anorexigénico, que expresan neuropéptidos como la proopiomelanocortina (POMC) y el transcrito regulado por cocaína y anfetamina (CART) [38]. El núcleo dorsomedial (DMN) recibe numerosas terminaciones nerviosas procedentes de las neuronas del núcleo arcuato y está implicado en diversos mecanismos de regulación del sueño y de los ritmos circadianos, así como de la modulación en la secreción de gonadotropinas. A pesar de que se ha comprobado que Introducción 43 43 lesiones en esta región producían un aumento en la ingesta, todavía no se conocen bien los mecanismos que implican a este núcleo en la homeostasis energética [39]. Las neuronas del núcleo paraventricular (PVN) secretan una serie de neuropéptidos que estimulan una respuesta catabólica, como es el caso de la hormona liberadora de corticotropina (CRH), la somatostatina, vasopresina o la oxitocina. Este núcleo libera estas señales a través del sistema nervioso simpático en órganos periféricos como el hígado o el tejido adiposo, estimulando la oxidación de ácidos grasos y la lipólisis. [40]. El núcleo ventromedial (VMN) presenta neuronas sensibles a la glucosa y a la leptina, secretando el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF), que tiene carácter anorexigénico. En términos generales, este núcleo se considera un área imprescindible en la generación de la sensación de saciedad y en el mantenimiento de la homeostasis de la glucosa. El área hipofisaria lateral presenta dos poblaciones neuronales que secretan neuropéptidos orexigénicos, una población que expresa la hormona concentradora de melanina (MCH) y otra población que expresan las hipocretinas. Esta área se considera “el centro del hambre” y está implicada en la ingesta de alimentos, así como en la sensibilidad a la glucosa y en la regulación de los ciclos del sueño [38]. 3.2 Órganos periféricos 3.2.1 Tracto gastrointestinal El tracto gastrointestinal es considerado el órgano endocrino más grande del cuerpo, se expresan más de 30 genes hormonales y se producen más de 100 péptidos bioactivos. La anticipación y la presencia de comida en el estómago e intestino delgado estimulan la secreción de muchas de estas hormonas a través de estímulos mecánicos y químicos, por ejemplo, la distensión del estómago produce una serie de señales que inducen la sensación de saciedad. En general se considera que el tracto gastrointestinal se encarga de la regulación del apetito a nivel periférico [41]. El tracto gastrointestinal secretor está dividido en varias zonas y glándulas accesorias con funciones tanto exocrinas como endocrinas y que regulan la ingesta de forma periférica. Sus zonas endocrinas principales son el estómago y ciertas regiones del intestino delgado; y las glándulas implicadas son el páncreas y el hígado [38, 42]. Introducción 50 50 células musculares, mientras que estos genes a su vez no se expresaban en los adipocitos blancos [71]. Más adelante, en estudios con ratones se confirmó que las células que expresaban el factor de transcripción miogénico 5 (myf-5) durante su desarrollo, podían derivar tanto en células musculares como en adipocitos marrones, pero nunca en adipocitos blancos. Por lo que se estableció la existencia de dos linajes celulares distintos y bien diferenciados: un linaje celular que daría lugar a los adipocitos blancos; y otro linaje, caracterizado por la expresión de myf-5, que daría lugar tanto a los precursores musculares como a los adipocitos marrones (figura 10) [72]. Figura 10: Esquema del proceso de diferenciación de los adipocitos blancos y marrones. Modificada de [72]. 4.1.1 Adipocito blanco El adipocito blanco, también llamado célula unilocular por la característica gota lipídica que ocupa la mayor parte de su citoplasma, es el único tipo celular especialmente adaptado para almacenar lípidos sin comprometer su integridad funcional; posee toda la maquinaria necesaria para sintetizar ácidos grasos, almacenar triglicéridos en periodos de abundancia energética y a movilizarlos mediante lipólisis en casos de déficit calórico [68]. Esta célula también presenta una importante función secretora, sintetizando hormonas y moléculas bioactivas, como la leptina y la adiponectina, que actúan tanto de forma autocrina/paracrina como endocrina para regular el tejido adiposo y el metabolismo sistémico. A parte de los adipocitos, las Introducción 51 51 células del estroma vascular también participan en la función endocrina del tejido adiposo, liberando al torrente sanguíneo péptidos como la omentina, visfatina, el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α) o la interleuquina-6 (IL-6) [73]. 4.1.2 Adipocito marrón El adipocito marrón, o célula multilocular, es el principal componente del TAP y se caracteriza por almacenar lípidos en pequeñas gotas a lo largo de su citoplasma, en el cual se encuentra una gran cantidad de mitocondrias, lo que confiere a esta célula el color marrón característico. Estas mitocondrias presentan una maquinaria modificada que usa los ácidos grasos almacenados para la generación de calor mediante la activación de la proteína desacopladora tipo 1 (UCP-1), exclusiva de este tipo celular; esto permite la termogénesis mediada por el sistema nervioso simpático. Así, la expresión de esta proteína está fuertemente inducida por la exposición al frío [74]. Los adipocitos marrones han suscitado un gran interés en los últimos años, debido a recientes descubrimientos sobre su posible papel en la regulación metabólica y su función endocrina en adultos [75]. 4.1.3 Adipocito beis Desde hace ya bastantes años se conoce la existencia de ciertas células, dentro del TAB, que expresan altos niveles de UCP-1 y que presentan, de manera similar a los adipocitos marrones, una morfología multilocular con gran cantidad de mitocondrias en su citoplasma [76]. Hace poco se descubrió que estas células provenían del mismo precursor que los adipocitos blancos, que no expresan myf-5; por lo que el desarrollo de este tipo celular estaría regulado de diferente manera que el de los adipocitos marrones. A estos adipocitos se les denominó adipocitos beis, y se considera que comparten funcionalidades metabólicas similares a la de los adipocitos marrones, sin embargo, tanto en su genética como en su origen celular difieren completamente [71]. Para explicar el origen de los adipocitos beis, el grupo de Spiegelman acuñó el término browning para referirse a un fenómeno de interconversión en el que los adipocitos blancos del TAB, en presencia de una serie de factores como el péptido FNDC5/irisina, verían activada la maquinaria genética que permitiría a estas células llevar a cabo la termogénesis y la adquisición de características similares a las de los adipocitos marrones [77]. Este grupo comprobó que la inducción de este fenómeno de browning podría servir de protección frente a la obesidad inducida por la dieta y la diabetes, e incluso sugirieron que la mayoría de depósitos de tejido adiposo pardo encontrados en humanos adultos podrían estar compuestos por adipocitos beis [78]. Introducción 52 52 4.2 Tejido adiposo blanco Además de sus funciones como aislante térmico y soporte estructural y mecánico, el TAB se ha definido tradicionalmente como el mayor almacén de energía del cuerpo. Durante periodos de incremento de la ingesta o de poca demanda energética, la energía sobrante es depositada en el TAB en forma de triglicéridos, mediado por enzimas lipogénicas claves. Sin embargo, en el caso contrario, con escasez de alimentos o de grandes necesidades energéticas, este tejido es capaz de liberar eficazmente sus reservas lipídicas para incrementar la disponibilidad energética en el organismo, ya que los adipocitos también contienen lipasas que rompen los triglicéridos en glicerol y ácidos grasos que son transportados por el torrente sanguíneo al hígado, músculo o TAP [79]. El TAB presenta una importante función endocrina de regulación de la homeostasis energética. Este tejido se divide en diversos depósitos localizados en diferentes zonas del organismo, presentando diferencias estructurales, de organización, tamaño celular y función biológica entre los distintos depósitos. La distribución del tejido adiposo parece ser un factor clave en el riesgo a desarrollar enfermedades relacionadas con la obesidad, más importante incluso que el total de tejido adiposo corporal de un individuo [80]. 4.2.1 Localización El TAB es uno de los tipos tisulares más abundantes del organismo, llegando a suponer más de la mitad del peso corporal en situaciones de obesidad [67]. Este tejido se encuentra localizado en diferentes regiones anatómicas en mayor o menor cantidad, y según su localización recibe distintos nombres: Los principales depósitos de tejido adiposo son el visceral (TAV) y el subcutáneo (TAS). El TAV se encuentra asociado al aparato digestivo, y dentro de este se pueden distinguir varios subtipos: el omental (TAVo), que se encuentra en contacto con el estómago; el mesentérico (TAVm), asociado al intestino delgado y colon; y una serie de depósitos periféricos como son el retroperitoneal (TAVr), rodeando a los riñones; y el gonadal (TAVg), unido al útero y ovarios en mujeres y al epidídimo y testículos en hombres [80]. El TAS se divide en tres depósitos principales que se denominan según su localización corporal: abdominal (TASa), gluteal (TASg) y femoral (TASf) (figura 11) [73]. Introducción 53 53 Figura 11: Representación esquemática de los distintos depósitos de tejido adiposo blanco humanos. Modificada de [73]. La distribución del TAB está determinada por el sexo, la edad y las diferencias poblacionales. Los hombres suelen acumular mayor cantidad de tejido adiposo en la zona abdominal, tanto TAV como TASa; mientras que en mujeres la mayor acumulación se suele dar en la región gluteofemoral (TASg y TASf). Se cree que este dimorfismo sexual viene determinado por las hormonas sexuales esteroideas [81], aunque los mecanismos que regulan la distribución del tejido adiposo son poco conocidos. Con respecto a las diferencias poblacionales, los caucásicos presentan un menor índice de obesidad que el resto de poblaciones. En EUA los afroamericanos e hispanos presentan una menor cantidad de TAV, mientras que las poblaciones de asia del sur presentan una mayor adiposidad central con respecto a la caucásica. Atendiendo a la edad, en general, la adiposidad central (TAV y TASa) se incrementa con los años [73]. Metabólicamente los distintos depósitos de tejido adiposo se comportan de manera diferente según su localización. Actualmente se sabe que el incremento en el TAV está asociado a un aumento en el riesgo de padecer enfermedades asociadas con la obesidad y existe una correlación directa entre los niveles de adiposidad y los niveles de resistencia a la insulina. Por otro lado el TAS, en especial el TASg y TASf, protege frente a los efectos lipotóxicos del almacenamiento a corto y largo plazo de triglicéridos. A nivel celular, los adipocitos del TAV son lipolíticamente más activos y Introducción 54 54 presentan una mayor cantidad de mitocondrias que los adipocitos del TAS [80]. Con respecto a las células del estroma vascular, se ha comprobado cómo, tanto en su composición como en su funcionalidad, estos depósitos difieren enormemente entre ellos; y los preadipocitos del TAS poseen una mayor capacidad de diferenciación que los del TAV, lo que sugiere una mayor plasticidad de este tipo tisular concreto [82]. Por otro lado, el TAVg se encuentra fuertemente regulado por las hormonas sexuales y existe una relación directa con la funcionalidad del aparato reproductor [80, 83]. 4.2.2 TAB como órgano endocrino El TAB es un órgano endocrino complejo y altamente activo que contiene la maquinaria metabólica necesaria para la comunicación con órganos distantes, incluido el SNC. Actualmente se conocen una amplia variedad de péptidos bioactivos secretados por este tejido, conocidos como adipoquinas, que actúan tanto a nivel local (función autocrina/paracrina) como a nivel sistémico (función endocrina) (figura 12). Además el TAB expresa numerosos receptores que le permiten responder a las señales aferentes procedentes de los sistemas hormonales tradicionales y del SNC [84]. Figura 12: Diversos efectos de algunas de las adipoquinas conocidas. Modificada de [85]. Introducción 55 55 Durante las últimas dos décadas, los avances en las investigaciones sobre obesidad han dado lugar al descubrimiento de más de 600 adipoquinas. Estas proteínas juegan importantes papeles en la regulación del apetito y el control de la saciedad, distribución del tejido adiposo, sensibilidad y secreción de insulina, gasto energético, inflamación, presión arterial, hemostasis y funciones endoteliales. De forma autocrina y paracrina, las adipoquinas contribuyen a la regulación de la adipogénesis, la infiltración de células inmunitarias en el tejido adiposo, el metabolismo de los adipocitos y su función. Pero más importantes son sus efectos sistémicos sobre otros órganos del cuerpo, como el cerebro, hígado, músculo, sistema vascular, corazón y células β pancreáticas. Los patrones de secreción de las adipoquinas reflejan la función del tejido adiposo y suponen unos biomarcadores muy importantes que determinan el riesgo de un individuo a padecer enfermedades metabólicas y/o cardiovasculares relacionadas con la obesidad [85]. 4.2.2.1 Leptina El descubrimiento de la leptina en 1994 [66] y de su receptor un año más tarde [86], supuso un punto de inflexión en los estudios que hasta entonces se habían venido realizando en la regulación de la ingesta. Esta proteína es sintetizada y liberada por los adipocitos blancos (y en menor medida los marrones), pero aunque es característica, no es exclusiva del tejido adiposo; varios tejidos como el muscular esquelético, placenta y estómago la expresan y secretan [46]. El efecto metabólico de la leptina está ampliamente documentado, los niveles plasmáticos de esta proteína aumentan en proporción a la cantidad de tejido adiposo corporal y puede ser usado como biomarcador de adiposidad. La leptina penetra la barrera hematoencefálica y es reconocida por los receptores expresados en las neuronas del hipotálamo, en especial las del núcleo arcuato. La activación de estos receptores induce una reducción en la ingesta y mejora el gasto energético [38]. Si bien los tratamientos de casos de obesidad debida a deficiencia de esta proteína mediante la administración de leptina han resultado exitosos, en los casos comunes de obesidad se ha visto como los niveles circulantes de leptina se encuentran muy elevados, produciéndose un fenómeno de resistencia a esta hormona. Los mecanismos que llevan a esta resistencia son aún poco conocidos, y algunos autores sugieren que podrían estar relacionada con un fallo en la señalización o en el paso de la leptina a través de la barrera hematoencefálica [84]. Otros efectos endocrinos importantes de la leptina incluyen la regulación de la función inmune, hematopoyesis, angiogénesis y osteogénesis. Introducción 56 56 El receptor de leptina (LEPR) es miembro de la familia de receptores de citoquina de clase I con un único dominio transmembrana. Hasta el momento se han identificado varias isoformas del mismo con variaciones en la longitud del dominio intracelular e incluso se conoce la existencia de una forma secretada sin los dominios transmembrana e intracelular [87]. La isoforma que presenta el dominio más largo es considerada la única forma activa y se expresa en el sistema nervioso central, preferentemente en los centros aferentes de la saciedad en el hipotálamo. LEPR también se expresa en tejidos periféricos como el tejido adiposo, muscular, células beta pancreáticas e hígado; lo que indica la importancia de la leptina como hormona tanto endocrina como autocrina/paracrina en la regulación del metabolismo energético [88]. 4.2.2.2 Adiponectina La adiponectina es una proteína de 30 kDa descubierta en 1995 simultáneamente por varios grupos. La adiponectina se expresa casi exclusivamente en los adipocitos y se secreta al torrente sanguíneo, en donde circula en elevadas concentraciones (casi el 0.01% de las proteínas plasmáticas totales) [89]. La localización de los depósitos de tejido adiposo influye de manera diferencial a las concentraciones de adiponectina circulante. La secreción de esta proteína decrece al incrementarse la adiposidad central, sin embargo, altos niveles de adiposidad en el TAS están asociados a altas concentraciones de adiponectina. Además se ha observado una relación inversa entre los niveles de esta adipoquina y la presencia de intolerancia a glucosa y diabetes tipo 2, incluso con la propensión a desarrollar estas enfermedades [90]. Desde el descubrimiento de esta proteína, se le han ido atribuyendo cada vez más funciones. La adiponectina mejora la sensibilidad periférica a la insulina y posee una acción antiinflamatoria y antiapoptótica en diferentes tipos celulares. Esta proteína promueve la funcionalidad y la supervivencia celular de las células beta del páncreas, encargadas de secretar insulina, y presenta también una acción a nivel central, estimulando el aumento de gasto energético y la pérdida de peso [85]. 4.2.2.3 Otras adipoquinas Las adipoquinas vaspina (secretada por las células del estroma vascular) y visfatina (producida por los adipocitos) presentan funciones de sensibilización a la insulina y efectos miméticos a esta respectivamente. Se ha comprobado que los niveles de estas dos proteínas estaban elevados en pacientes con diabetes tipo 2, tanto en obesos como en no obesos. Los niveles circulantes de vaspina y visfatina se correlacionan con los de IL-6 y la presencia de estas 3 adipoquinas se asocia positivamente con el índice Introducción 57 57 de masa corporal, el índice HOMA-IR (modelo homeostático de evaluación de la resistencia a insulina), el porcentaje de la hemoglobina glucosilada HbA1c y los niveles de triglicéridos. Estos datos sugieren que estas proteínas pueden jugar un papel importante en los fenómenos de resistencia a la insulina y la diabetes tipo 2 [91]. La resistina es una adipoquina descubierta en 2001 que se expresa en los adipocitos blancos de ratones y en los macrófagos y monocitos del EV en humanos. Esta proteína comparte tan sólo un 64% de homología entre ambas especies y no está claro que las funciones que se le ha atribuido a esta adipoquina en ratón sean equivalentes en humanos. En los estudios realizados en ratones, se vio que esta proteína se encontraba elevada tanto en la obesidad inducida por la dieta como en los modelos de obesidad genética y diabetes (ob/ob y db/db respectivamente). Al administrar exógenamente resistina se vio que disminuía la sensibilidad a la insulina, mientras que las concentraciones de colesterol y triglicéridos se vieron incrementadas. También se comprobó que la expresión de esta proteína en el TAV es 15 veces mayor que en el TAS [84]. Algunos autores han considerado a esta proteína como un mediador de la resistencia a la insulina y de las disfunciones metabólicas [92, 93], sin embargo otros autores no apoyan que esta adipoquina se encargue de regular la acción de la insulina [94, 95]. A pesar de la controversia generada sobre la acción de esta proteína, recientemente se ha asociado su presencia en humanos con los niveles de obesidad y resistencia a insulina; así como en el desarrollo y progresión de la ateriosclerosis y enfermedades cardiovasculares [96]. 4.3 Tejido adiposo pardo Desde hace ya bastantes años se estableció que el TAP estaba presente de manera activa en humanos recién nacidos y que este tejido se encargaba del mantenimiento de la temperatura corporal del neonato a través de la generación de calor. Este proceso de termogénesis era posible gracias al desacoplamiento de la cadena de transporte de electrones de la membrana de las mitocondrias de los adipocitos marrones gracias a una serie de proteínas desacoplantes como la UCP-1 (considerada como un marcador exclusivo de adipocitos marrones). A este fenómeno se denominó termorregulación no tiritante y se consideró como un mecanismo puente hasta desarrollarse completamente el sistema de termorregulación tiritante, controlado por el SNC y caracterizado por generar calor mediante contracciones rítmicas del tejido muscular. De esta forma, a medida que el recién nacido se iba desarrollando, los depósitos de TAP a su vez disminuían, por lo que se suponía que en la etapa adulta este tejido o no estaba presente o que podría encontrarse en cantidades muy pequeñas [72]. Introducción 58 58 Basándose en este principio de función puente del TAP durante el desarrollo y debido a la inexistencia en esos momentos de técnicas sensibles que permitieran comprobar la existencia de TAP activo en humanos adultos, durante años el estudio de este tejido en humanos pasó relativamente inadvertido [97]. Sin embargo en la última década, los avances en las técnicas de detección y los recientes descubrimientos indicando la presencia de este tejido también en adultos, supusieron un vuelco en la percepción general sobre este tejido, dotándole de una gran importancia a nivel endocrino y de regulación de la homeostasis energética. Gracias a la tomografía por emisión de positrones - tomografía computerizada (PETCT) la visión del TAP ha dado un vuelco. Esta tecnología, muy utilizada en el diagnóstico de tumores malignos se basa en el uso del análogo de la glucosa, la 18F- fluorodeoxiglucosa (FDG), que se incorpora a células con elevadas tasas metabólicas como las células tumorales. En estudios recientes se encontraron tasas de retención de FDG simétricas y elevadas en regiones en donde no se encontraba presente ningún tumor que se identificaron como tejido adiposo. Además se observó que dicha retención de FDG se incrementaba a bajas temperaturas ambientales, mientras que se reducía al realizar un tratamiento previo con bloqueadores beta-adrenérgicos implicados en la absorción de glucosa en un mecanismo que depende directamente de la activación de UCP-1. Con estas pruebas se llegó a la conclusión de que el marcaje por FDG en el tejido adiposo en regiones específicas estaba reflejando la actividad metabólica del TAP. Tras estos descubrimientos han surgido numerosas cuestiones relacionadas con sus posibles funciones y su importancia fisiológica. Varios estudios han relacionado este tejido con la regulación del gasto energético corporal, estando implicado, al menos en parte, tanto en la termogénesis inducida por calor como en la inducida por la dieta [98]. Estos descubrimientos han revitalizado el interés en el estudio de este tejido con el fin de encontrar métodos más útiles para combatir la obesidad. Así, se ha estimado que la activación de aproximadamente 50 g de TAP es suficiente para incrementar alrededor de un 20% el gasto energético diario en una persona que consume unos 2500 kcal/día, equivalente a los beneficios obtenidos por un individuo tras haberse sometido a dieta o a ejercicio físico para disminuir su peso corporal [99]. 4.3.1 Localización En humanos adultos el TAP se localiza comúnmente en la región supraclavicularcervical, en la región ventral del cuello y las regiones superficial y lateral a los músculos esternocleidomastoideos. En individuos con altas tasas de retención de FDG, se localizó también la presencia de TAP entre los músculos pectorales y subcapulares, la Introducción 59 59 región posterior al plexo braquial y en diversas regiones a lo largo de la línea paraespinal (figura 13) [100]. Figura 13: Localización del TAP en adultos y recién nacidos según los datos aportados postmortem y mediante estudios PET/CT. (A) tiroide/traqueal, (B) mediastinal, (C) paracervical/supraclavicular, (D) paratoracical, (E) supra y perirenal. Tomada de [101]. La presencia de TAP en adultos está relacionada directamente con la edad, más del 50% de las personas de entre 20-30 años presentan TAP activo, pero a medida que aumenta la edad, este porcentaje se va reduciendo, detectándose este tejido únicamente en un 10 % de los individuos analizados de 50-60 años. Se ha comprobado que en mujeres se encuentran mayores cantidades de TAP activo que en hombres en rangos que van entre 2 y 3 veces más cantidad. También se ha encontrado una relación inversa entre el IMC y la presencia de TAP activo, lo que refuerza la idea de que este tejido presenta una importante función metabólica en adultos [98, 100]. Introducción 66 66 músculo como pilar central en el desarrollo evolutivo del metabolismo del resto de órganos del cuerpo humano y a las mioquinas como factores importantes o incluso clave en la regulación del metabolismo general. Este paradigma ofrecería las bases que podrían explicar las múltiples consecuencias que conlleva llevar un estilo de vida sedentario (figura 15) [31]. Figura 15: El tejido muscular esquelético libera al torrente circulatorio mioquinas con acción tanto a nivel central como periférico. Modificada de [31]. 5.4.1 Interleuquina-6: la primera mioquina descrita. La IL-6 tiene el honor de ser la primera mioquina descrita y la más estudiada. Fue caracterizada como mioquina al descubrirse que sus niveles circulantes se encontraban incrementados hasta más de 100 veces durante el ejercicio. Esta proteína ya era conocida desde hacía años como citoquina procedente de diferentes células inmunitarias; sin embargo al demostrarse que era producida y secretada por el tejido muscular esquelético durante el ejercicio, se produjo un renovado interés por su estudio. La existencia de esta mioquina suponía una paradoja, ya que por un lado los niveles circulantes de IL-6 se encontraban significativamente más elevados en los periodos inmediatamente posteriores al ejercicio, periodos en los que se observa una mayor sensibilidad a la insulina y cuando su acción es más eficaz. Sin embargo, por otro lado la presencia de esta proteína había sido también asociada a la obesidad y a la resistencia a insulina [111]. Introducción 67 67 Numerosos estudios han demostrado que la IL-6 se secreta en respuesta a contracciones musculares y ejerce una serie de efectos en varios órganos periféricos, que van desde el incremento de la absorción de glucosa a la inducción de la oxidación de ácidos grasos[112, 113]. También se ha demostrado que la IL-6 produce un incremento en la producción de glucosa hepática durante el ejercicio, así como favorecer la lipólisis en el tejido adiposo [111]. Pero la IL-6 no es la única mioquina descubierta, se han descrito diversas proteínas secretadas por el tejido muscular esquelético con un posible efecto endocrino como la IL-8, IL-15, el factor de crecimiento de fibroblastos 21 (FGF-21), la proteína relacionada con la folistatina 1 o la mioquina de reciente descubrimiento mionectina [114, 115]. 5.4.2 El papel de la proteína PGC-1α en la expresión de los “genes del ejercicio” El coactivador-1α del receptor activado de proliferación de los peroxisomas γ (PGC- 1α), que fue originariamente identificado como un factor que interaccionaba con la proteína PPAR-γ en tejido adiposo pardo, es un coactivador de la transcripción que no se une al ADN pero que presenta una fuerte acción estimuladora de la expresión de determinados genes al unirse a diversos factores. PGC-1α induce la biogénesis mitocondrial y la expresión de enzimas oxidativas en diferentes tipos celulares [32]. La proteína PGC-1α se expresa en el tejido muscular esquelético de una forma diferencial, siendo mayores los niveles observados en músculos lentos que en los rápidos. El ejercicio puede inducir una rápida activación de PGC-1α, que al translocarse al núcleo induce el incremento en la transcripción de enzimas mitocondriales, acción que se lleva a cabo antes incluso de observarse un incremento en los niveles de expresión del ARN mensajero (ARNm) de PGC-1α [116]. El papel del ejercicio sobre esta proteína parece estar al menos en parte mediado por el sistema nervioso simpático y por la activación de los receptores β2 adrenérgicos, ya que la sobreexpresión de PGC-1α inducida por el ejercicio puede ser evitada mediante el uso de inhibidores específicos para este receptor [117]. Los estudios realizados en ratones transgénicos que sobreexpresan PGC-1α mostraron un aumento en el contenido de mitocondrias en las fibras musculares rápidas, así como un incremento de los niveles de las enzimas oxidativas. Se observó también que aumentaba la proporción de fibras tipo I y IIA haciendo a los músculos más resistentes a la fatiga [103]. Estudios realizados en músculo esquelético de individuos obesos demostraron que estos poseían una menor cantidad de mitocondrias que en individuos normopeso, dado que PGC-1α es un potente inductor de la biogénesis mitocondrial, se descubrió que la elevación de ácidos grasos libres plasmáticos reducían la expresión de PGC-1α en músculo, y que la reducción en la Introducción 68 68 expresión de esta proteína se asociaba a obesidad y diabetes tipo 2; esto se relacionaba directamente con las deficiencias de ejercicio físico, ya que estos pacientes normalmente llevan una vida sedentaria [118]. En 2008 el grupo de Spiegelman propuso la hipótesis de que la proteína PGC-1α era el factor clave que relacionaba el ejercicio con los beneficiosos efectos sistémicos que produce sugiriéndose como el mayor responsable de la protección frente a las diferentes enfermedades relacionadas con el sedentarismo. Este grupo postuló que la reducción en la expresión de PGC-1α en músculo esquelético debida a estilos de vida sedentarios, podría estar causando una respuesta proinflamatoria crónica que afectaría negativamente a otros tejidos. Por tanto, al eliminar este estado de inflamación crónica mediante la inducción de PGC-1α con el ejercicio, disminuiría la frecuencia o la severidad de las enfermedades inflamatorias relacionadas, muchas de ellas asociadas con la obesidad. La cascada de efectos beneficiosos producidos por la PGC-1α y que derivan en una supresión de la inflamación crónica, van desde inducir una mayor vascularización del músculo, incrementar su capacidad de detoxificación de las especies reactivas del oxígeno (ROS), mejorar las capacidades metabólicas de este tejido mediante la biogénesis mitocondrial y sobre todo la inducción de la expresión de toda una serie de genes implicados en los efectos beneficiosos del ejercicio (los cuales denominaron “genes del ejercicio”), desde enzimas oxidativas a posibles factores secretados por el músculo (figura 16) [32]. Figura 16: Efectos derivados de la acción de la PGC-1α. Modificada de [32]. Introducción 69 69 5.4.3 La FNDC5/irisina como mioquina inducida por PGC-1α La sospecha de que la proteína PGC-1α podría estar implicada en la secreción por parte del músculo de proteínas con una función endocrina condujo al grupo de Spiegelman a realizar una serie de estudios para intentar demostrar este hecho. Estudiaron ratones transgénicos que sobreexpresaban PGC-1α en músculo, observando que estos animales eran resistentes a la obesidad relacionada con la edad y a diabetes, lo que sugería que presentaban algún tipo de alteración del balance energético sistémico [119]. Este grupo se centró en el estudio de los genes encargados de activar el programa termogénico y el desarrollo del tejido adiposo pardo, descubriendo que en el TAS de estos ratones transgénicos aparecían una serie de adipocitos con características similares a los adipocitos marrones, con una gran expresión de ARNm de UCP-1, propio del TAP. También observaron una mayor cantidad de células multiloculares en este tejido que presentaban grandes concentraciones de la proteína UCP-1. Por el contrario, tanto en el TAVg como en el TAP no se observaban diferencias. Este modelo y sus efectos (llamado fenómeno de browning) también fue observado al someter a ratones de la cepa salvaje a distintos tipos de ejercicio durante 3 semanas [77]. Para evaluar si el fenómeno de browning era producido efectivamente por un factor secretado procedente del músculo esquelético, el grupo de Spiegelman realizó un experimento en el que añadía a un cultivo primario de adipocitos del TAS medio de cultivo libre de suero procedente de miocitos que expresaban PGC-1α, observando en estos adipocitos el incremento de ARNm de varias proteínas específicas del TAP. Mediante el uso de chips de expresión génica pudieron aislar una serie de proteínas reguladas por la acción de la PGC-1α y con la capacidad en teoría de ser secretadas por el músculo esquelético (IL-15, FNDC5, VEGF-β, LRG1 y TIMP4). Se probó la acción de estas proteínas sobre cultivos primarios de adipocitos de TAS, descubriendo que el factor implicado en el fenómeno de browning era la FNDC5. La fibronectina tipo III con 5 dominios (FNDC5) se caracterizó como una proteína de membrana tipo I de 20 kDa que presenta péptido señal y que sufre una modificación proteolítica del extremo N-terminal que origina un péptido de unos 12 kDa que se secretaría a la circulación siendo susceptible de ser modificado por glucosilación y que correspondería a la forma activa de esta proteína. A este fragmento secretado se le puso el nombre de irisina en relación con la diosa Iris de la mitología griega (la mensajera de los dioses en la Ilíada) y se consideró como una mioquina capaz de iniciar la maquinaria termogénica en el tejido adiposo blanco (figura 17). Sin embargo, los datos aportados mediante técnicas de inmunodetección mostraron una serie de discrepancias con respecto al peso de la irisina y de su modificación proteolítica, puesto que los tamaños de las bandas identificadas como pertenecientes a la irisina en Introducción 70 70 ningún momento fueron inferiores a 20 kDa, y utilizando anticuerpos específicos frente a la región endógena de la FNDC5 se detectaron grandes cantidades de la proteína completa en el medio de cultivo libre de células [77]. Estos datos sugieren que la proteína FNDC5 puede ser secretada también en su forma completa y que todavía hace falta más conocimiento sobre los mecanismos exactos mediante los cuales esta proteína es secretada por parte de las células musculares. Figura 17: Diferentes modelos de termogénesis mediada por adipocitos. (a) Termogénesis clásica de los adipocitos marrones, (b) termogénesis mediada por los adipocitos beis inducidos por la acción de la irisina. Modificado de [120]. Para ensayar los efectos de esta proteína in vivo, el grupo de Spiegelman forzó la sobreexpresión de la proteína completa FNDC5 en el hígado de ratones sometidos a una dieta alta en grasa de la cepa C57BL/6, por ser una cepa susceptible a la obesidad y la diabetes inducida por la dieta. Con los datos aportados con este experimento, se concluyó que el incremento de FNDC5 en la circulación podría aumentar el gasto energético, reducir el peso corporal y mejorar la resistencia a insulina inducida por la dieta. Como aseveración final, el grupo de Spiegelman destacó el futuro potencial de esta proteína para poder ser usada en la clínica en situaciones de obesidad o resistencia a insulina mediante la inyección directa del péptido y así inducir la termogénesis en el TAS humano y mejorar las condiciones metabólicas del individuo (Figura 18). Introducción 71 71 Desde la publicación de este trabajo, han surgido numerosos comentarios en las revistas científicas más relevantes, en las que se destaca esta investigación, pero también se demanda un mayor conocimiento e investigación futura sobre la irisina, su papel en el fenómeno de browning y sus efectos fisiológicos [121-124]. Por el momento hay pocos trabajos originales sobre esta proteína, y los existentes no ayudan a aclarar el papel de la irisina con respecto a la regulación metabólica del organismo. Incluso en aspectos tan concretos como los niveles de irisina humana en obesidad (niveles que el grupo de Spiegelman no consideraron) se ofrecen datos contrarios, mientras unos grupos encuentran mayores niveles en pacientes obesos [125, 126], otros autores sugieren lo contrario [127]. Figura 18: Dibujo esquemático del modelo propuesto para la acción de la irisina. Modificada de [124]. 6. Comunicación músculo-adiposo Durante los últimos 20 años, el conocimiento sobre la comunicación endocrina del organismo ha dado un vuelco completo con la inclusión de dos nuevos órganos dentro del complejo mapa endocrino existente, este hecho supone el establecimiento de un nuevo paradigma en la regulación de la homeostasis energética al otorgar un enorme protagonismo a tejidos que antes se creían inertes endocrinológicamente hablando. El primero de ellos en ser reconocido como tal fue el tejido adiposo con la caracterización de la leptina [66], este hito supuso la puerta de entrada al descubrimiento de decenas Introducción 72 72 (si no cientos) de adipoquinas implicadas en los grandes aspectos de la regulación metabólica del organismo, desde el mantenimiento del peso corporal hasta el gasto y el rendimiento energético. Este descubrimiento ha derivado en el entendimiento en cierta medida del cómo y del porqué de muchas enfermedades metabólicas, incluyendo la obesidad y la diabetes tipo 2, y supondrá en el futuro un órgano clave para la nueva generación de estrategias terapéuticas para combatirlas [128]. Años más tarde, el mismo proceso vivido por el tejido adiposo ha ocurrido de una manera similar con el tejido muscular esquelético. A partir de 2004 se descubrió que este tejido era capaz de producir y secretar de manera activa toda una serie de proteínas (mioquinas) con efectos sistémicos en diferentes tejidos, siendo la primera representante de este nuevo grupo de hormonas la IL-6 [129]; estos hallazgos han llamado la atención de una buena parte de la comunidad científica poniendo de relieve que el tejido muscular esquelético podría estar jugando un papel importante en la comunicación entre los diferentes tejidos implicados en el metabolismo, pudiendo estar implicado en muchas enfermedades relacionadas con procesos de inflamación sistémicos e incluso postularse como una futura diana el tratamiento de estas enfermedades [31]. A raíz de todo este conocimiento generado en los últimos años con respecto a estos dos tejidos y su más que demostrada paralela implicación en el desarrollo de diversas enfermedades endocrinas, ha surgido la hipótesis de la existencia de una comunicación bidireccional entre el tejido muscular y el tejido adiposo por medio de las mioquinas y las adipoquinas respectivamente para el control de diversos procesos metabólicos, en especial en el control de la lipólisis y en la modulación de la sensibilidad a la insulina [130]. Las evidencias de esta comunicación quedan patentes de forma indirecta al observar la relación existente entre la práctica de ejercicio físico con la prevención de la resistencia a insulina en humanos. Pero también existen numerosos ejemplos directos que sugieren esta interrelación. La miostatina es una mioquina que regula negativamente el crecimiento muscular, los animales mutantes para el gen de esta proteína presentan hipertrofia e hiperplasia del tejido muscular esquelético, pero además también se observa una total supresión de la acumulación de grasa corporal lo que sugiere una conexión muy importante entre ambos tejidos. De manera similar, la sobreexpresión en ratones del gen c-ski, que regula negativamente la expresión del factor de crecimiento transformante β (TGF-β) producido y secretado en grandes cantidades por el tejido adiposo en condiciones de obesidad, genera un fenotipo de hipertrofia muscular y una marcada reducción en la capacidad de almacenamiento de ácidos grasos por parte de los adipocitos [131]. Otro ejemplo concreto lo protagoniza la interleukina-15 (IL-15), que es una mioquina con efectos anabólicos en el tejido muscular esquelético pero que también parece jugar un papel importante en el Introducción 73 73 metabolismo lipídico. La IL-15 se sobreexpresa con el ejercicio físico y se ha encontrado una asociación negativa entre los niveles plasmáticos de esta proteína y la presencia de TAV, pero no de TAS en humanos. Confirmando estos datos, en ratones mutantes con sobreexpresión de IL-15 y por tanto niveles elevados de esta proteína en plasma, se observó una significativa reducción en el peso corporal y un incremento el contenido mineral óseo, sin afectar a la cantidad total de masa muscular corporal o a los niveles de otras citoquinas conocidas; lo que sugiere que la proteína IL-15 podría estar implicada también en la regulación del TAV (figura 19) [111]. Figura 19: Esquema de la hipotética comunicación cruzada entre el tejido muscular esquelético y el tejido adiposo a través de la IL-15 y las hormonas TNF-α y leptina respectivamente. Modificado de [131]. Pero el mayor ejemplo que evidencia la comunicación bidireccional entre el músculo y el tejido adiposo es la IL-6, proteína que actúa como una mioquina secretada a la circulación por el músculo con efectos directos sobre el tejido adiposo, pero que también actúa como una adipoquina secretada por el mismo tejido adiposo afectando al músculo [132]. La IL-6 es la mioquina más estudiada y conocida, se sabe que se secreta a la circulación en grandes cantidades durante el ejercicio y que la estimulación a corto plazo de miocitos con esta proteína mejora la sensibilidad de los mismos a la insulina; sin embargo el incremento crónico de esta proteína se relacionan con la resistencia a la insulina en humanos. La IL-6 también se encarga de activar la Introducción 74 74 lipólisis en el tejido adiposo, y parece jugar un papel muy importante en la disponibilidad de energía durante el ejercicio. Que esta proteína parezca tener funciones contradictorias y que sus niveles aparezcan muy elevados tanto en ejercicio como en obesidad sugiere que los efectos de la IL-6 son dependientes del tejido que la produce y de la condición metabólica en la que se encuentra el individuo. Estudios recientes de los efectos agudos de la administración de IL-6 en el tejido adiposo y muscular de individuos sanos demostraron que mientras el tejido adiposo se mantenía inalterado, en el músculo se activaba la ruta de señalización de STAT3 (implicada en la proliferación celular) y se incrementaba la lipólisis; lo que apoya la hipótesis de que la mioquina IL-6 presenta una gran importancia en el rendimiento muscular durante la contracción aguda, mientras que la IL-6 como adipoquina, especialmente cuando se encuentra elevada crónicamente, puede inducir la resistencia a la insulina del músculo [130]. Hasta la fecha se han caracterizado numerosas hormonas procedentes del tejido adiposo y muscular (tabla 6), y a medida que avancen las investigaciones con respecto a la capacidad secretora de ambos tejidos y su papel en la señalización celular, la relación entre ambos tejidos se irá aclarando aún más [131]. Tabla 6: Algunas de las proteínas secretadas que podrían jugar un papel muy importante en la comunicación bidireccional entre el tejido adiposo y el tejido muscular esquelético. Modificada de [131]. Introducción 75 75 7. Secreción proteica 7.1 Tipos de Secreción Las proteínas secretadas son una clase importante de proteínas cuya codificación supone aproximadamente el 10 % del genoma humano [133]. La mayor parte son proteínas del suero (por ejemplo albúmina, transferrina o inmunoglobulinas), proteínas de la matriz extracelular (por ejemplo colágenos, proteoglicanos, fibronectina o lamininas), enzimas digestivas (por ejemplo la tripsina), o proteínas de la leche. Otras proteínas, a pesar de encontrarse en comparación en muy bajas concentraciones, son altamente bioactivas, dentro de este grupo se incluirían los factores de crecimiento, citoquinas, hormonas o proteasas procesadoras de la matriz extracelular [134]. El término secretoma engloba todas las proteínas liberadas por una célula, tejido u organismo al medio extracelular, a través de mecanismos de secreción tanto clásicos como no clásicos. En el mecanismo clásico, una vez sintetizadas, las proteínas se translocan al lumen del retículo endoplasmático (RE), son transportadas a través del aparato de Golgi y liberadas por exocitosis [135]. Estas proteínas se expresan a partir de un ARNm que presenta una secuencia señal que guía el paso del ribosoma a la membrana del RE e inicia el transporte del péptido hacia el lumen del RE. Esta secuencia señal del RE, que normalmente se encuentra en la región amino-terminal del péptido, se compone de uno o más aminoácidos cargados positivamente seguidos de una cadena continua de 6 a 12 residuos hidrofóbicos. Esta secuencia señal normalmente se corta en los ribosomas y no se encuentra en el péptido final (figura 20). Por otro lado, en las vías no clásicas de secreción, no se produce el paso de los péptidos a través del RE y el aparato de Golgi, pero hasta el momento el mecanismo exacto por el que se regula este proceso todavía es desconocido [136]. Se han descrito numerosas proteínas que no se secretan por la vía clásica, como ciertos reguladores de la respuesta inmune. Otros ejemplos son factores de crecimiento, diferenciación o angiogénesis que no presentan péptido señal, como por ejemplo el factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF), lectinas como la galectina 1 y 3, y ciertos miembros de la familia de las interleuquinas como la IL-1b. Se han descrito al menos 5 rutas de secreción no clásica (figura 21): Introducción 82 82 8.3 Estudios proteómicos del secretoma de tejido adiposo 8.3.1 Secretoma del TA completo El TA es un tejido complejo y heterogéneo compuesto no sólo por adipocitos maduros, sino que también está compuesto por preadipocitos, pericitos, células endoteliales, macrófagos y linfocitos T. Bajo este contexto, es razonable aceptar que los factores secretados por la fracción del estroma vascular contribuyen al secretoma del TA y modulan la secreción de adipoquinas por parte de los adipocitos. Por tanto, la caracterización del secretoma del TA, por encima de la caracterización individual de las células que componen este tejido, podría aportar una visión más fisiológica de la función secretora de este órgano. Por otro lado, el TA presenta mayores dificultades de manejo para estos estudios, ya que existen mayores posibilidades de la aparición de contaminaciones debidas a las proteínas del suero o a proteínas intracelulares provenientes de la rotura o daño celular. Los contaminantes pueden afectar drásticamente al rango dinámico de las muestras y por tanto a la identificación de proteínas secretadas [149]. La primera caracterización del secretoma del TA humano completo mediante técnicas de proteómica fue publicado recientemente [150]. En este estudio, la recolección del secretoma del TAV fue estandarizado experimentalmente al probar diversas variaciones del protocolo hasta obtener unas concentraciones y composiciones proteicas óptimas. El protocolo final consistió en la realización de un lavado de los explantes de TAV tras 1 hora de incubación, seguido de dos o tres lavados en un periodo máximo de 8 horas, tras los cuales se incubó la muestra toda la noche. Finalmente el TA se mantuvo en cultivo durante 48-114 horas hasta obtener la muestra final. Además, para averiguar si las proteínas estaban siendo realmente secretadas, incubaron los explantes junto a un medio marcado con L-[13C6, 15N2]-Lys. De las 259 proteínas identificadas, 108 contenían péptido señal, y 70 de ellas habían incorporado el marcaje, considerándose como secretadas por el TA. Estas proteínas fueron clasificadas en cinco categorías de acuerdo con la función, la mayoría eran proteínas que formaban parte de la matriz extracelular (por ejemplo la perlecan y la versican), seguidas por un segundo grupo de proteínas relacionadas con la señalización celular (por ejemplo la neurofilina-1). Como era de esperar, este estudio también mostró como un considerable número de proteínas eran liberadas no sólo por los adipocitos, sino también participaban en la secreción otros tipos celulares como macrófagos y células endoteliales (por ejemplo endoplasmina, gelsolina, proteína disulfuro isomerasa, calreticulina, catepsina D y peroxiredoxina 4). Los cambios cuantitativos en la secreción proteica del TAV también han sido recientemente medidos mediante el uso de la técnica de comparación de ratios de incorporación de aminoácidos marcados con isótopos estables (CILAIR), una variante Introducción 83 83 de la tecnología SILAC [149]. En este estudio, los autores determinaron el efecto de la insulina en el secretoma de explantes de TAV procedentes de un paciente mediante la comparación de los ratios de incorporación de L-[13C6]-Lys en presencia y ausencia de insulina. En este experimento descubrieron que durante el tratamiento con insulina se disminuía la secreción de proteínas relacionadas con la respuesta al estrés del RE y las encargadas de la remodelación de la matriz extracelular (ECM). Por otro lado se realizaron análisis comparativos de los depósitos de TA epididimal entre ratas obesas y normopeso, además de los efectos del tratamiento con tiazolidinediona (TZD); marcando para ello los péptidos con 18O, y realizando cromatografía bidimensional acoplada a MS (2D-LC-MS/MS) [151]. Este estudio mostró que el TA de animales obesos libera más proteínas inflamatorias y de ECM, además de colágeno y proteasas. Además observaron que el tratamiento con TZD inhibía la secreción de estas proteínas en el TA de animales obesos, obteniendo un perfil similar al de animales normopeso. 8.3.2 Secretoma de adipocitos maduros El primer estudio de la secreción de adipocitos maduros fue realizado después del aislamiento de adipocitos procedentes de TA epididimal, inguinal y omental de ratas [152]. En este caso también se siguió una estrategia basada en el marcaje proteolítico con 18O y 2D-LC-MS/MS, para identificar y comparar los niveles de proteínas secretadas en el medio condicionado de las células en cultivo mediante la presencia o ausencia de insulina (figura 23). De las 84 proteínas identificadas como adipoquinas, 53 nunca habían sido catalogadas como producto de la secreción del TA y de estas sólo 13 de ellas no aparecieron en estudios proteómicos posteriores. Bajo la administración crónica de insulina, se detectó la modulación de varias proteínas, por ejemplo se incrementaron los niveles de adiponectina, mientras que disminuyeron los niveles del inhibidor del activador del plasminógeno-1 (PAI-1) y de la osteonectina. El estudio de la secreción de adipocitos maduros humanos no se realizó hasta hace apenas 2 años, y para ello se utilizaron las técnicas de 2-DE y MALDI-TOF. En este estudio, la caracterización in vitro del secretoma de TAV humano reveló la secreción del factor derivado del pigmento epitelial (PEDF) [153] y la identificación de la dipeptidil peptidasa 4 (DDP4) como una nueva adipoquina [154]. Esta aproximación proteómica mostró que PEDF es una de las proteínas que más abundantemente libera el adipocito. La validación por otras técnicas de los resultados obtenidos mediante 2- DE y MS, demostraron que la secreción de esta proteína se encontraba regulada por la insulina y la hipoxia. Además, tras realizar ensayos in vitro, este grupo concluyó que la PEDF inducía la resistencia a insulina en los adipocitos y en las células musculares esqueléticas humanas; además también se le atribuyeron efectos proinflamatorios en Introducción 84 84 células musculares lisas humanas. Estos resultados confirman las conclusiones de trabajos anteriores en los que se había sugerido que la PEDF podría tener un papel importante en el desarrollo de diabetes y enfermedades relacionadas con la obesidad. Con respecto a la identificación de DDP4, los experimentos realizados llevaron a la conclusión de que los adipocitos maduros secretan más DDP4 que los preadipocitos o los macrófagos, además el TAV de individuos obesos presenta mayores niveles de esta proteína con respecto al TAS. Por otra parte, al tratar con DDP4 de cultivos de adipocitos, células musculares esqueléticas y lisas; se inhibía la ruta de señalización de la insulina. Además los niveles observados en el TA se correlacionaron positivamente con el riesgo a padecer síndrome metabólico. Figura 23: Diseño esquemático del experimento realizado por Chen y col. para la identificación del secretoma de adipocitos maduros [152]. Introducción 85 85 8.3.3 Secretoma de la fracción EV En el año 2007 se publicó un estudio en el que se realizaba un análisis comparativo utilizando las técnicas de 2-DE y MS/MS de la fracción del estroma vascular del TAS de mujeres bajo condiciones normales o mediante la inducción de la adipogénesis [155]. Esta investigación permitió la identificación de proteínas sin péptido señal clasificadas como citoplasmáticas como actina o lactato deshidrogenasa, y adipoquinas bien caracterizadas como la adiponectina y el PAI-1. En este trabajo también se identificaron proteínas como las serpinas, PEDF, el inhibidor de la trombina placentaria y el inhibidor de la proteasa C1. En otro estudio se realizó un análisis diferencial del secretoma de la fracción del EV de TA epididimal procedente de ratas Zucker obesas frente al secretoma de adipocitos maduros mediante técnicas de 2D LC-MS/MS [151]. El resultado obtenido mostró que el EV y los adipocitos presentan diferentes perfiles de secreción proteica tanto cuantitativa como cualitativamente. La mayoría de las proteínas identificadas en el secretoma de la fracción del EV estaban relacionadas con la respuesta inmune, ECM y proteólisis; sugiriendo una posible función local de forma autocrina/paracrina sobre el TA. Por el contrario, los adipocitos secretan factores que participan en la regulación de actividades sistémicas. Bajo el contexto de la medicina regenerativa, se estudió recientemente el secretoma de células madre mesenquimales derivadas de TA humano (hASC) mediante LC-MS/MS [156]. Se investigó el papel de las hASC durante procesos inflamatorios, por lo que se analizaron estas células en presencia de TNF-α. El secretoma obtenido tras el tratamiento presentaba un incremento en varios tipos de citoquinas y quimiocinas como la IL-6, IL-8, el ligando 6 de la quimiocina CXC y la proteína quimioatrayente de monocitos-1 (MCP-1). La TNF-α también produjo el incremento de los niveles de varias proteasas como la catepsina L, metaloproteasas de la matriz, e inhibidores de proteasas; así como la inducción de la secreción de la pentraxina 3, implicada en la inmunidad innata. 8.3.4 Secretoma durante la diferenciación adipocitaria Hay actualmente varios ejemplos en la literatura en los cuales se analiza el secretoma durante la diferenciación de células madre adipocitarias (o preadipocitos) con el objetivo principal de entender el proceso de adipogénesis. Apoyando todas estas aproximaciones in vitro, existe un estudio de predicción de expresión génica que trató de predecir el posible secretoma de preadipocitos humanos al diferenciarse. Esta predicción destacó una serie de nuevos genes candidatos relacionados con componentes de la coagulación sanguínea y del sistema fibrinolítico; además de Introducción 86 86 sugerir a la proteína gla de la matriz (MGP) y a la inhibina beta B (INHBB) como nuevas adipoquinas [157]. Existe un estudio en el que se realizó una caracterización del secretoma de hASC a diferentes etapas de la diferenciación adipocitaria y osteobástica mediante 1-DE y MS/MS [158], identificando un total de 73 proteínas entre los días 0 y 3 de diferenciación. La clasificación funcional de estas proteínas indicó que la mayoría de ellas pertenecían a la matriz extracelular y a componentes del citoesqueleto, así como a proteínas de choque térmico. PAI-3 se detectó en los días 0 y 3 de la diferenciación osteoblástica, pero en ningún momento en la diferenciación adipocitaria. La técnica SILAC se aplicó en la caracterización simultánea del proteoma y secretoma durante la diferenciación de la línea celular 3T3-L1 (figura 24) [159], identificándose proteínas presentes en trabajos previos sobre diferenciación, como la adiponectina y la lipoproteína lipasa, además de nuevas proteínas como el complejo THO 4 y el activador probable de la transcripción global 2 alpha (SNF2- α). El complejo THO, relacionado con la activación de la transcripción, se ha encontrado elevado en etapas intermedias de la adipogénesis; mientras que los niveles de SNF2-α, una proteína remodeladora de la cromatina, se encontraban disminuídos al inicio de la adipogénesis, mientras que se mantuvieron constantes en el resto de etapas. Una estrategia similar a la anterior fue la seguida por un grupo que realizó la caracterización a distintas etapas de la diferenciación, esta vez, de cultivos primarios de preadipocitos humanos, mediante el uso de la técnica proteómica de marcaje isobárico para la cuantificación absoluta y relativa (iTRAQ) [160]. El resultado de este estudio reveló la presencia tanto de adipoquinas conocidas como la de otras proteínas que no se habían encontrado previamente en otros estudios, como el glipicano 1, el factor de crecimiento derivado del hepatoma, la proteína de unión modular al calcio 1 relacionada con SPARC o el factor similar al receptor de citoquinas 1. Finalmente, hay que destacar la aproximación cuantitativa libre de marcaje para el estudio del secretoma de la fracción del estroma vascular durante la adipogénesis mediante LC-MS/MS [161], observando que varios componentes extracelulares de las vias de señalización de Wnt y TGF-beta estaban alterados durante la adipogénesis. Introducción 87 87 Figura 24: Estrategia de 5-plex SILAC y tinción de rojo oleoso de la diferenciación adipocitaria. Modificado de [159]. 8.3.5 Secretomas de diferentes depósitos de tejido adiposo. Existen cada vez más evidencias que muestran numerosas diferencias tanto biológicas como genéticas en el TA dependiendo de su localización anatómica [82, 162, 163]. Bajo este contexto, resultaría interesante identificar las diferencias entre los distintos tipos de depósitos de TA; y en este sentido se han realizado hasta el momento unos cuantos estudios proteómicos que se centran en las diferencias entre los proteomas específicos de los depósitos de TA [164, 165]. Sin embargo todavía hay muy pocas evidencias que muestren las diferencias en la secreción proteica de los distintos depósitos de TA. El año pasado se publicó un estudio que indagaba entre las posibles diferencias que se podían dar entre las proteínas secretadas por el TAV frente al TAS, encontrando tres posibles proteínas secretadas que se encontrarían más elevadas en TAV, la gremlina 1 (GREM1), la pleiotrofina (PTN) y el inhibidor de la peptidasa secretora de los leucocitos 1 (SLPI) [166]. Introducción 88 88 Mediante la utilización de la técnica de cromatografía de afinidad en lectinas inmovilizadas, con el fin de aislar las proteínas que presentan glucosilaciones (modificación proteica predominante en las proteínas secretadas); el grupo de Hocking y col. realizaron un análisis cuantitativo de los secretomas de explantes de TAV frente a TAS de ratón [167]. De manera adicional, también compararon el secretoma de preadipocitos y de células endoteliales microvasculares (MVECS) de ambos depósitos de TA. En este estudio no se encontraron apenas diferencias en los secretomas de los explantes completos de VAT y SAT, preadipocitos o MVECS; sin embargo describen un mayor nivel de secreción de proteínas por parte de las muestras de TAV. Este hecho es particularmente relevante, ya que el TAV constituye tan solo una pequeña parte de todo el TA corporal (alrededor del 18%) comparado con los depósitos de TAS (aproximadamente un 82%). Por otra parte, este grupo concluye que casi el 50% del secretoma de los explantes de TA está compuesto por factores con una importante implicación en la angiogénesis, sugiriendo que el TAV tiene una mayor capacidad de expansión que el TAS. 8.4 Estudios proteómicos del secretoma de tejido muscular esquelético 8.4.1 Panorama actual El descubrimiento de las capacidades del tejido muscular esquelético para funcionar como un órgano endocrino al igual que el TA es relativamente muy reciente y por tanto apenas hay trabajos en la bibliografía que aborden la tarea de caracterizar la secreción de este tejido mediante el uso de técnicas proteómicas. En los últimos años han empezado a surgir estudios al respecto, pero centrados en el uso de cultivos de líneas celulares de músculo esquelético [168-172] y miotubos humanos [173, 174]. Hasta el momento no existen trabajos en la proteómica clínica dedicados a la caracterización de la secreción del tejido muscular esquelético mediante estrategias de explantes completos de tejido, y menos aún que centren su caracterización en diferenciar el tejido muscular por su composición de fibras. 8.4.2 Secretomas de líneas celulares condicionadas Los primeros trabajos realizados con el afán de identificar nuevas mioquinas se basaron en el uso de líneas celulares animales condicionadas para intentar inducir la secreción proteica y comprobar los efectos de ciertas señales en el perfil secretor de las células musculares. Introducción 89 89 En un trabajo publicado en el año 2008, se realizó el estudio proteómico de la línea celular muscular de rata L6 GLUT4myc diferenciada, comparando su secreción en presencia o ausencia de insulina mediante estrategias de cromatografía líquida de alta resolución en fase reversa (RP-HPLC) y MS/MS para la identificación de las proteínas secretadas [168]. En este trabajo se identificaron un total de 254 proteínas, de las cuales 153 se clasificaron como secretadas. 14 proteínas se secretaron en mayores niveles durante la estimulación con insulina, incluyendo algunas proteínas relacionadas con enfermedades metabólicas, como la metaloproteinasa 2 de matriz (MMP-2) o la PAI-1. Se encontraron también 19 proteínas cuya secreción disminuía en presencia de insulina, como la proteína de unión a acil-CoA (ACBP) y la proteína morfogénica ósea 1 (BMP-1). El mismo grupo años más tarde, siguiendo una estrategia similar, realizó una caracterización proteómica de la misma línea celular de rata en presencia o ausencia de TNF-α para tratar de averiguar si esta mioquina podría presentar un efecto de resistencia a insulina [169]. Se encontraron 28 proteínas cuya secreción estaba regulada por TNF-α, 10 de ellas con niveles elevados (por ejemplo la alfa enolasa y la proteína de unión a fosfatidiletanolamina 1) y 18 con sus niveles disminuídos en presencia de TNF-α (por ejemplo la proteína DJ-1, la peroxiredoxina 4 y la disulfuro isomerasa). Para completar este estudio realizaron un análisis por microchips de la expresión genética en muestras musculares obtenidas de ratas Zucker. 8.4.3 Secretomas durante la diferenciación de miotubos Los estudios de la secreción durante la diferenciación adipocitaria han aportado un valioso conocimiento sobre la regulación de este proceso y el descubrimiento de nuevas adipoquinas que han ayudado a entender aún más el funcionamiento del TA. De esta forma era de esperar que una de las estrategias seguida por algunos de los investigadores intrigados por el funcionamiento del tejido muscular como órgano endocrino, fuera el estudio de la secreción proteica durante el desarrollo y diferenciación del tejido muscular esquelético. El primer trabajo realizado al respecto, se centró en el estudio de la secreción durante la diferenciación de la línea celular miotubular de ratón C2C12 mediante electroforesis mono-dimensional y MALDI-TOF [170]. En este estudio se identificaron 80 proteínas, de las cuales 27 de ellas se clasificaron como secretadas, entre las que se encontraba la MMP-2, cistatina C y la proteína ácida secretada rica en cisteína (SPARC); ambas implicadas en la ruta de señalización de TGF-β y en el programa de diferenciación miogénica. Otras proteínas secretadas que se identificaron estaban relacionadas con la ECM, la proliferación celular, migración y señalización. Introducción 90 90 El mismo grupo completó su investigación sobre la diferenciación de C2C12 con otro trabajo publicado en 2011 en el que utilizaron una estrategia basada en la tecnología de marcaje SILAC y MS/MS (figura 25) [171]. Se identificaron 30 proteínas secretadas de manera diferencial durante el desarrollo de los miotubos, algunas de ellas de nuevo descubrimiento y que podrían tener una gran importancia biológica en el mantenimiento de la pluripotencia y la diferenciación celular. Algunas de las proteínas identificadas fueron la proteína relacionada con la folistatina 1, osteoglicina, espondina-2 y el inhibidor de apoptosis inducido por citoquinas 1. En un trabajo similar de caracterización de la secreción de C2C12 por SILAC y MS/MS realizado un año antes [172], este grupo llegó a identificar hasta 635 proteínas secretadas por estas células, considerándose el estudio con el mayor número de proteínas secretadas por el músculo identificadas hasta el momento. Entre la ingente cantidad de proteínas secretadas, destacar 3 isoformas de la TGF-β, cuyos niveles se vieron aumentados durante la diferenciación, al igual que los factores de crecimiento similares a insulina 1 y 2. Otras proteínas identificadas serían la proteína de unión a ácidos grasos (FABP), SPARC, fibronectina o de nuevo la proteína MMP-2. Figura 25: Estrategia de SILAC seguida por Chan y col. Para el estudio de la secreción proteica durante la diferenciación de miotubos. Modificado de [171]. Introducción 91 91 8.4.4 Secretomas de células musculares humanas Más allá de los estudios realizados en líneas celulares procedentes de animales, existen unos pocos estudios centrados en la caracterización de la secreción en células musculares humanas. En un trabajo publicado en 2011, se utilizaron mioblastos procedentes de biopsias del músculo oblicuo interno abdominal humano para ser diferenciadas a miotubos e identificar en su secretoma nuevas proteínas secretadas con las que realizar un estudio posterior de expresión en respuesta al esfuerzo físico. Para la identificación se usaron técnicas proteómicas de electroforesis mono-dimensional y LC-MS/MS [173]. Se identificaron 18 proteínas secretadas como la fibronectina 1, gelsolina, proteína relacionada con folistatina 1 y SPARC; de las cuales 15 presentaban niveles de expresión elevados en muestras procedentes de individuos sometidos a un programa de ejercicio tras un análisis posterior de su expresión genética. Con el objetivo de estudiar los procesos de regeneración muscular, el grupo de Le Bihan y col. se propusieron estudiar los mecanismos de comunicación intercelular durante este proceso mediante la identificación de mioquinas en mioblastos diferenciados obtenidos a partir de células satelite humanas procedentes de necropsias. Las proteínas fueron identificadas mediante 2-DE y LC-MS/MS [174]. Se encontraron 253 proteínas clasificadas en anteriores trabajos como secretadas, de las cuales 43 de ellas estaban implicadas en la miogénesis, mientras que otras se encargan de la regulación de otros tipos celulares, sugiriendo un papel importante de los mioblastos en la remodelación muscular. También caracterizaron dos tipos de microvesículas de secreción derivadas de la membrana plasmática, que pueden ayudar a entender en parte los complejos procesos de regulación de la secreción por parte del tejido muscular esquelético. Materiales y Métodos 99 99 1. Técnicas experimentales 1.1 Animales de experimentación Los estudios fueron realizados utilizando ratas macho Rattus norvegicus de la cepa Sprague-Dawley procedentes del Animalario Central de la Universidad de Santiago de Compostela (figura 26A). El modelo de ratas Zucker diabéticas procede de una cepa mutante de Rattus norvegicus (fa/fa) (Charles River laboratories, France) (figura 26B). Los animales se mantuvieron en el animalario del Departamento de Fisiología de la Facultad de Medicina (USC) a una temperatura estable de 22 ± 2ºC y con ciclos de 12 horas luz/oscuridad. Hasta el inicio de los experimentos los animales tuvieron libre acceso a pienso comercial estándar (SAFE-Panlab, España) y agua. Todos los protocolos de manipulación y experimentos llevados a cabo han sido aprobados previamente por el Comité Ético de Experimentación Animal de la Universidad de Santiago de Compostela. Figura 26: Las dos cepas de ratas utilizadas en este trabajo. Sprague-Dawley (A); rata Zucker, cepa mutante de Rattus norvegicus (fa/fa) (B). 1.1.2. Modelos animales 1.1.2.1 Ejercicio Se utilizaron ratas de 6 semanas de edad (aproximadamente 160 g) y se mantuvieron estabuladas en jaulas de actividad especiales con una rueda de 40 centímetros de diámetro acoplada a un contador de vueltas (Harvard Apparatus, MA, EUA) (figura 27). Los animales estuvieron 5 días en periodo de aclimatación, tras el cual se comprobó su actividad en la rueda durante las siguientes 8 horas. Las ratas cuyo número de vueltas fue menor o mayor que la media se descartaron. Materiales y Métodos 100 100 El ejercicio fue voluntario y duró 6 días durante los cuales los animales tuvieron libre acceso a comida estándar y agua. Se midió diariamente el número de vueltas, comida ingerida y peso corporal, así como la composición corporal a 0, 3 y 6 días mediante resonancia magnética nuclear (Whole Body Composition Analyzer, EchoMRI). Como grupo control (Control Ejercicio) se utilizaron animales de las mismas características y en las mismas condiciones. Se mantuvieron durante 6 días en jaulas similares sin rueda. Adicionalmente se realizó un modelo de ejercicio similar pero con una duración de 3 semanas de acceso libre a la rueda. Figura 27: Imagen de la jaula de actividad con el contador de vueltas conectado. 1.1.2.2 Anorexia basada en la actividad. La anorexia basada en la actividad (ABA) es un modelo establecido en ratas hace 50 años [175] que combina la reducción del aporte calórico con la actividad física voluntaria. Lo característico de este modelo es la rápida reducción del peso corporal a la vez que aumenta la actividad física diaria de los animales. Así, se utiliza como modelo de anorexia nerviosa humana sobre todo en estudios de comportamiento por la similitud de muchos de sus síntomas. El diseño experimental fue equivalente al modelo de ejercicio, pero añadiendo una restricción en el acceso a pienso y a la rueda. Tras el periodo de aclimatación y adaptación a la rueda, los animales se mantuvieron durante 6 días con libre acceso a agua y a la rueda de ejercicio salvo durante el periodo de alimentación, que duró sólo una hora al día. Este periodo de alimentación fue realizado todos los días a la misma hora. Materiales y Métodos 101 101 Por motivos éticos, no se permitió a los animales superar una pérdida de peso mayor del 20-30% de su peso corporal inicial. Los animales que alcanzaron esta cifra antes de los 6 días de experimento fueron descartados [176]. Como grupo de control para ABA (Control ABA) se utilizaron animales de las mismas características y en las mismas condiciones, pero sin acceso a rueda. 1.1.2.3 Obesidad inducida por la dieta. El modelo de obesidad inducida por la dieta (DIO) se utiliza para estudiar los efectos de la obesidad producida al someter a los animales a una dieta hipercalórica alta en grasas. La singularidad de este modelo radica en que muchos de estos efectos son similares a los registrados en la obesidad humana, como son el aumento en los niveles de leptina, insulina y triglicéridos circulantes o la disminución de la sensibilidad a insulina.[177] Se utilizaron ratas de 8 semanas de edad (aproximadamente 250 g) que tras una semana de aclimatación se dividieron en dos grupos experimentales. El primer grupo fue alimentado con una dieta alta en grasa (Hight fat diet D12492; Research Diets Inc., NJ, EUA) y el segundo grupo con una dieta estándar. La dieta alta en grasa consistía en un 60% de grasa, 20% de proteína y 20% de carbohidratos; 5.24 Kcal/g. La dieta estándar consistía en un 5,5% de grasa, 23% de proteína y 50% de carbohidratos; 3.5 Kcal/g. Tras 10 semanas bajo este tipo de dieta las ratas fueron sacrificadas. Durante todo el experimento se registraron una vez por semana los valores de ingesta, peso y composición corporal. 1.1.2.4 Modelo de ratas Zucker diabéticas El modelo de ratas Zucker diabéticas (ZDF) es un modelo animal de diabetes tipo 2 bien caracterizado que porta una mutación espontánea en el receptor de leptina (fa) [178], causando obesidad y resistencia a insulina. Las ratas Zucker diabéticas derivan del apareamiento endogámico entre ratas Zucker obesas, las cuales presentan obesidad y resistencia a insulina, ocasionando un fenotipo diabético a partir de la 10 semana de edad [179]. Se utilizaron ratas Zucker de 10 semanas de vida homocigotas (grupo experimental) y heterocigotas (grupo control) que en todo momento tuvieron libre acceso a dieta estándar y agua durante 12 semanas (figura 26B). Materiales y Métodos 102 102 1.2 Líneas celulares 1.2.1 3T3-L1 Es una línea celular derivada de la establecida en 1962 por Todaro y Green [180] y obtenida a partir de tejido embrionario de ratones de la cepa Swiss. Presenta una morfología tipo fibroblasto y bajo condiciones apropiadas las células pueden diferenciarse a adipocitos maduros. Las células se mantuvieron en placas de cultivo petri de 100x20 mm (BD Bioscience, NJ, EUA) en 8 ml de medio de cultivo DMEM (Lonza, Suiza) con 10% de suero fetal bovino (FBS), 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Para la diferenciación [181] las células se incubaron hasta llegar a confluencia, posteriormente el medio de cultivo fue suplementado con 10 µg/ml de insulina, 0.5 mM de 3 isobutil- 1-metilxantina y 1 µM de dexametasona durante 2 días. Durante los siguientes 12 días, el medio fue suplementado únicamente con 10 µg/ml de insulina, cambiando el medio cada 2 días. 1.2.2 L6E9 La línea celular L6E9 es un subclón de la línea celular neonatal de rata L6 [182] utilizada en numerosos estudios relacionados con el músculo debido a su especial facilidad para diferenciarse a miotubos [183]. Las células se incubaron en placas de cultivo petri de 100x20 mm (BD Bioscience, NJ, EUA) a baja densidad en el mismo medio de cultivo descrito para 3T3-L1. Para inducir la diferenciación a miotubos, las células se mantuvieron hasta llegar a confluencia, posteriormente se incubaron durante 8-10 días en 8 ml de medio de cultivo DMEM con sólo un 2% de FBS. 1.2.3 Secretomas de líneas celulares 3T3-L1 y L6E9 Se retiró el medio de la placa de cultivo y se lavaron las células varias veces con cuidado con el tampón HAM, intentando eliminar todo rastro de FBS que se había utilizado para suplementar el medio de cultivo. Inmediatamente se incubaron las células durante 24 horas (para la línea 3T3-L1) o 12 horas (para la línea L6E9) en medio DMEM sin FBS ni rojo fenol (Lonza, Suiza) y suplementado con 100 U/ml de penicilina y 100 U/ml de estreptomicina. Materiales y Métodos 103 103 Al día siguiente se recogió el medio de cultivo en filtros de ultracentrifugación (Amicon Ultra 3kDa cut off, Millipore, Billerica, EUA) y se concentró hasta un volumen de entre 100-250 µl centrifugando a 3500 rpm a 4ºC. 1.3 Extracción de tejido adiposo humano Todas las muestras procedentes de humanos fueron obtenidas de los pacientes tras haber firmado un consentimiento informado aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia (CEIC de Galicia) de acuerdo con la Declaración de Helsinki. El tejido adiposo se extrajo de pacientes obesos (índice de masa corporal superior a 35) sometidos a una operación quirúrgica de gastrectomía por laparoscopia gracias a la colaboración del Servicio de Cirugía del Complexo Hospitalario Universitario de Santiago de Compostela. El TAV extraído se localiza en la región hipogástrica (alrededor de los órganos internos) y el TAS en la región mesogástrica. Los tejidos se transportaron desde el quirófano al laboratorio en el tampón Krebs- Ringer-Hepes (KRH) estéril suplementado con penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml. 1.4 Extracción de tejidos procedentes de animales Todos los tejidos de los animales fueron extraídos cuidadosamente en el quirófano del animalario, minimizando todo lo posible las contaminaciones, en especial el pelo de las ratas. Se utilizó material quirúrgico previamente esterilizado. - Los tejidos destinados a experimentos de secreción se transportaron al laboratorio en el tampón KRH estéril con penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml) a temperatura ambiente. Posteriormente se procesaron para eliminar cualquier contaminante mediante lavados sucesivos en KRH en condiciones esteriles (campana de flujo laminar). - Los tejidos destinados a estudios de proteína intracelular y mensajero fueron congelados en hielo seco en el mismo quirófano y almacenados posteriormente a - 80ºC en el laboratorio. - Los tejidos destinados a inmunohistoquímica se introdujeron en un tubo tipo Falcon de 50 ml envueltos en una gasa quirúrgica empapada en suero fisiológico y se trasladaron inmediatamente al laboratorio a temperatura ambiente. 1.4.1 Localización de los tejidos extraídos Materiales y Métodos 104 104 - El tejido adiposo blanco se seleccionó de tres localizaciones distintas:  TAVo: Localizado en la cavidad peritoneal, alrededor de las vísceras (figura 28A).  TAVg: Tejido adiposo unido a los testículos (figura 28B).  TAS: Situado bajo la piel de las ingles (figura 28C). - El Tejido adiposo pardo se extrajo de la región subcutánea del área supraclavicular (figura 28D). - En el caso del tejido muscular esquelético, se seleccionaron dos tipos músculares distintos situados en la pata del animal:  Sóleo: Caracterizado por poseer mayoría de fibras tipo I (oxidativas lentas) (figura 28E).  Gastrocnemio: Con mayoría de fibras tipo II (glucolíticas rápidas) (figura 28F). Figura 28: Localización de los tejidos extraídos en rata. TAVo (A); TAVg (B); TAS (C); TAP (D); Gastrocnemio (E); Sóleo (F). 1.4.2 Cultivos de explantes El protocolo de cultivo de explantes se basó en el desarrollado por Álvarez-Llamas en 2007 para el estudio del secretoma del TAV humano [150]. Una vez extraídos los tejidos (los cuales presentaron pesos similares según el tipo), se realizó una serie de preincubaciones con el fin de acondicionar el tejido para el experimento de secreción y eliminar en la medida de lo posible todos los Materiales y Métodos 105 105 contaminantes presentes en el tejido, tanto sangre como componentes intracelulares procedentes de la rotura celular. Inicialmente los tejidos fueron incubados en placas de cultivo de 6 pocillos (Iwaki, Tokio, Japón) con 5 ml de medio DMEM sin rojo fenol ni suero y suplementado con una mezcla de penicilina (100 U/ml) y estreptomicina (100 µg/ml). El medio de cultivo se cambió cada 2 horas dos veces y una más a las 16 horas. Finalmente se añadieron 3 ml de medio fresco a los tejidos y se incubaron durante 24 horas (tejido adiposo) y 12 horas (tejido muscular esquelético) (figura 29). Tras este tiempo, se recogió el medio de cultivo (secretoma), se centrifugó para eliminar células que se pudieran haber desprendido y se congeló a -80ºC hasta su uso, o se procedió directamente a su procesado. Figura 29: Foto del cultivo de diferentes explantes tisulares. De izquierda a derecha y de arriba abajo: TAS, TAVo, TAVg, TAP, gastrocnemio y sóleo. 1.5 Establecimiento de cultivos primarios en tejido adiposo blanco. 1.5.1 Dispersión tisular Tras la extracción de tejido adiposo blanco, se lavó varias veces en tampón fosfato salino (PBS) estéril para eliminar los posibles restos de sangre, se colocaron aproximadamente 5 gramos de tejido en una placa petri con 10 ml de medio DMEM- F12 (Lonza, Suiza) y con la ayuda de dos bisturíes se cortó el tejido en trozos de aproximadamente 1 mg para poder ser recogidos utilizando una pipeta pasteur (dispersión mecánica). Materiales y Métodos 106 106 Se recogieron los trozos y el medio de la placa en un tubo tipo Falcon de 50 ml al que se le añadió colagenasa tipo I 0.2% (Gibco, CA, EUA). El volumen final se llevó a 20 ml con medio DMEM-F12 y se incubó la muestra a 37 ºC en agitación de 30 a 60 minutos (dispersión enzimática). 1.5.2 Separación de las fracciones celulares Una vez realizada la dispersión, se filtró el homogenado con un filtro de 100 µm de diámetro de poro (BD Biosciences, NJ, EUA), con ayuda de una pipeta pasteur se pasó a un tubo nuevo tipo Falcon de 50 ml y se llevó a un volumen de 20 ml con medio DMEM-F12 fresco suplementado con un 5% de suero fetal bovino. La muestra se centrifugó a 1800 rpm durante 10 minutos. Tras la centrifugación se observaron varias fases bien diferenciadas (figura 30):  Capa transparente/amarilla: Grasa liberada por las células rotas.  Fase blanca (inmediatamente debajo): Adipocitos maduros intactos.  Fase acuosa: Medio de cultivo libre de células.  Pellet: Fracción celular del estroma de tejido adiposo más las células que se han roto y restos de tejido sin disgregar que han pasado por el filtro. Figura 30: Representación de las distintas capas resultantes de la digestión enzimática. Materiales y Métodos 107 107 1.5.2.1 Obtención de los adipocitos maduros Se recogió la fase blanca intermedia tras retirar con cuidado la fase amarilla y se transfirió a un tubo tipo falcon de 50 ml con 10 ml de medio DMEM-F12. Se centrifugó a 950 rpm durante 10 minutos y se recogió nuevamente la fase blanca, la cual se congeló directamente a -80ºC o se preparó para los experimentos de secreción. 1.5.2.2 Obtención de las células del estroma del tejido adiposo. Tras la separación de las distintas fracciones celulares del tejido adiposo, se aislaron las células del pellet con la ayuda de un filtro de 40 µm de diámetro de poro (BD Biosciences, NJ, EUA) y se pasaron a un tubo nuevo tipo Falcon de 50 ml con 10 ml de medio DMEM-F12. Las células se centrifugaron a 950 rpm durante 10 minutos y se eliminó el sobrenadante por decantación. Se volvió a añadir 10 ml de medio DMEM- F12 y se centrifugó de nuevo a 950 rpm durante 10 minutos. Tras eliminar el sobrenadante, el pellet se resuspendió en 5 ml de medio DMEM- F12 suplementado con un 10% de suero fetal bovino y se sembraron aproximadamente 1.000.000 de células en una paca petri de 100x20 mm (BD Bioscience, NJ, EUA); se dejaron asentar entre 24-48 horas tras lo cual, según el volumen final de células asentadas observado con ayuda de un microscopio óptico, se levantaron y se repartieron en varias placas petri. Las células se mantuvieron en cultivo 10 pases, hasta el quinto pase aproximadamente hubo mezcla de preadipocitos, macrófagos y otros tipos celulares que componen el estroma; pero a partir del sexto pase, la mayoría de las células presentes eran preadipocitos (figura 31). Figura 31: Imagen de preadipocitos aislados de TAB tras el sexto pase tomada con un microscopio óptico invertido de campo claro. A: TAS, B: TAVo. Materiales y Métodos 114 114 El protocolo seguido fue el especificado en las instrucciones del kit. La cuantificación se realizó a 450 nm mediante un lector VersaMax ELISA Microplate Reader (Molecular Devices, CA, EUA) 2.1.6 Radioinmunoensayo (RIA) Para la determinación de insulina, leptina y grelina se usó la técnica de Radioinmunoensayo. Este procedimiento se basa en la competencia de unión a un anticuerpo específico que se establece entre la hormona a cuantificar (libre) y cantidades conocidas de la misma marcada con un isótopo radiactivo. De esta forma, cuanta más hormona libre, menor será la unión de la marcada al anticuerpo y vicerversa. 2.1.6.1 RIA Ghrelina Los niveles circulantes de ghrelina se determinaron en el plasma de las ratas mediante la utilización de un kit comercial de radioinmunoensayo (Linco research Inc., MO, EUA). Los reactivos utilizados fueron los siguientes:  Hormona marcada: I125-Ghrelina. 302 μCi/μg  Curva estándar de 8 puntos: 10 pg/ml a 1000 pg/ml  Anticuerpo: Anti-ghrelina obtenido en cobaya  Tampón de ensayo: Fosfato 0.01M, EDTA 0.01M, azida sódica 0.08%, y gelatina pH 6.85  IgG de suero de cobaya obtenido en cabra  Reactivo precipitante: IgG de suero de cobaya obtenido en cabra, polietilenglicol 3% y Triton X-100 0.05% diluido en fosfosalino 0.05M, EDTA 0.025M y azida sódica 0.08%. Primer día: Se pipetearon 300 µl de tampón de ensayo a los tubos NSB, 200 µl a los TB y 100 µl al resto de los tubos del ensayo excepto a los TC. A continuación se añadieron 100 µl de los estándares, controles de calidad y muestras a los tubos correspondientes (todos por duplicado). Seguidamente se añadieron 100 µl de anticuerpo a todos los tubos excepto los TC y NSB. La mezcla se agitó y se dejó cubierta durante toda la noche a 4ºC (tabla 9). Segundo día: Se añadieron 100 µl de hormona marcada a todos los tubos. Agitar la mezcla, cubrir e incubar toda la noche a 4ºC. Materiales y Métodos 115 115 Tabla 9: Distribución de los tubos del ensayo para la detección de ghrelina y reactivos añadidos a cada uno. Tercer día: Se añadieron 10 µl de IgG de suero de cobaya a todos los tubos excepto a los TC. Posteriormente se añadieron 1.0 ml de reactivo de precipitación frío (4ºC) a todos los tubos excepto a los TC. Se agitó la mezcla y se incubó durante 20 minutos a 4ºC. Finalmente todos los tubos excepto los TC se centrifugaron a 3000 g durante 20 minutos. Se eliminó el sobrenadante por decantación dejando el precipitado seco. La radiactividad del precipitado se midió mediante un contador γ (Wizard 1470, Wallac). Las concentraciones de ghrelina se calcularon automáticamente utilizando el programa RIAcalc-LBK (Wallac) 2.1.6.2 RIA Insulina Los niveles circulantes de insulina se determinaron en el plasma de las ratas mediante la utilización de un kit comercial de radioinmunoensayo (Linco research Inc., MO, EUA). Los reactivos utilizados fueron los siguientes:  Hormona marcada: I125-Insulina. 367 μCi/μg Materiales y Métodos 116 116  Curva estándar de 7 puntos: 0.1 ng/ml a 10 ng/ml  Anticuerpo: Anti-insulina obtenido en cobaya  Tampón de ensayo: fosfosalino pH 7.4 0.05M, EDTA 0.025M, azida sódica 0.08%, y BSA 1%.  Reactivo precipitante: IgG de suero de cobaya obtenido en cabra, polietilenglicol 3% y Triton X-100 0.05% diluido en fosfosalino 0.05M, EDTA 0.025M y azida sódica 0.08%. Tabla 10: Distribución de los tubos del ensayo para la detección de insulina y reactivos añadidos a cada uno. Primer día: Se pipetearon 200 µl de tampón de ensayo a los tubos NSB y 100 µl a los TB. A continuación se añadieron 100 µl de los estándares, controles de calidad y muestras a los tubos correspondientes (todos por duplicado). Seguidamente se añadieron 100 µl de hormona marcada a todos los tubos, y 100 µl de anticuerpo excepto los tubos TC y NSB. La mezcla se agitó y se dejó cubierta durante toda la noche a 4ºC (tabla 10). Segundo día: Se añadieron 0.1 ml de reactivo de precipitación frío (4ºC) a todos los tubos excepto a los TC. Se agitó la mezcla y se incubó durante 20 minutos a 4ºC. Finalmente todos los tubos excepto los TC se centrifugaron a 3000 g durante 20 minutos. Se eliminó el sobrenadante por decantación dejando el precipitado seco. Se midió la radiactividad del precipitado y se calcularon las concentraciones de insulina del mismo modo que para el RIA de ghrelina. Materiales y Métodos 117 117 2.1.6.3 RIA Leptina Los niveles circulantes de leptina se determinaron en el plasma de las ratas mediante la utilización de un kit comercial de radioinmunoensayo (Linco research Inc., MO, EUA). Los reactivos utilizados fueron los siguientes:  Hormona marcada: I125-leptina. 135 μCi/μg.  Curva estándar de 7 puntos: 0.05 ng/ml a 10 ng/ml.  Anticuerpo: Anti-leptina obtenido en cobaya.  Tampón de ensayo: fosfosalino pH 7.4 0.05M, EDTA 0.025M, azida sódica 0.08%, y BSA 1% y triton-X 0.05%.  Reactivo precipitante: IgG de suero de cobaya obtenido de cabra, polietilenglicol 3% y Triton X-100 0.05% diluido en fosfosalino 0.05M, EDTA 0.025M y azida sódica 0.08%. Tabla 11: Distribución de los tubos del ensayo para la detección de leptina y reactivos añadidos a cada uno. Primer día: Se pipetearon 300 µl de tampón de ensayo a los tubos NSB, 200 µl a los TB y 100 µl al resto de los tubos del ensayo excepto a los TC. A continuación se añadieron 100 µl de los estándares, controles de calidad y muestras a los tubos correspondientes (todos por duplicado). Seguidamente se añadieron 100 µl de hormona marcada a todos los tubos, y 100 µl de anticuerpo excepto los tubos TC y NSB. La mezcla se agitó y se dejó cubierta durante toda la noche a 4ºC (tabla 11). Materiales y Métodos 118 118 Segundo día: El protocolo para este día fue similar al seguido para el RIA de insulina. Se midió la radiactividad del precipitado y se calcularon las concentraciones de leptina del mismo modo que para el RIA de ghrelina. 2.1.7 Inmunohistoquímica Se uso la técnica de inmunohistoquímica para determinar la presencia de fibras rápidas (miosina rápida) o lentas (miosina lenta) en el tejido muscular esquelético. Para ello, las muestras de tejido a estudio se enviaron a la Plataforma de Inmunohistoquímica disponible en el Servicio de Anatomía Patológica-Dpto. Ciencias Morfológicas (CHUS). Allí las muestras se congelaron en isopentano, previamente enfriado en nitrógeno líquido, y se cortaron utilizando un criostato. Se montaron secciones de 10 µm de ancho en portaobjetos FLEX IHC (Dako, Glostrup, Dinamarca) para realizar la inmunodetección de forma automática mediante un AutostainerLink 48 (Dako). El protocolo seguido fue el siguiente:  5 min de bloqueo con EnVision FLEX peroxidase-blocking reagent (Dako).  30 min de incubación con el anticuerpo monoclonal de ratón para miosina lenta (Novocastra, Newcastle, UK) con una dilución 1/10, y el anticuerpo monoclonal de ratón para miosina rápida (Novocastra) a una dilución 1/20 en un corte contiguo.  20 min de incubación con EnVision FLEX/HRP (polímero de dextrano conjugado con peroxidasa de rábano y anticuerpos frente a ratón y conejo).  10 min de revelado con tetrahidrocloruro de 3,3'-diaminobenzidina (DAB) (Dako). Tras este paso se tiñeron los núcleos durante 9 minutos con EnVision FLEX hematoxilina (Dako). Las preparaciones fueron observadas y fotografiadas utilizando para ello un microscopio óptico de campo claro. 2.2 Estudios de expresión (ARNm): PCR cuantitativa a tiempo real (qRT-PCR) Para la determinación de la expresión genética se utilizó la qRT-PCR. La reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT-PCR, reverse transcription polymerase chain reaction) es una variante de la PCR en la cual una hebra de ARN se Materiales y Métodos 119 119 retrotranscribe a ADN complementario utilizando la enzima transcriptasa inversa, amplificándose este ADN mediante una PCR en tiempo real. La PCR en tiempo real permite cuantificar de manera absoluta el producto de la reacción de PCR mediante el uso de sondas Taqman (sondas específicas marcadas con fluorocromos: donador y aceptor), cuyo sistema de detección se basa en la transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET) entre las dos moléculas. 2.2.1 Extracción RNA-Trizol  0.1 g de tejido (adiposo o muscular) almacenado a -80ºC se introdujo en un eppendorf con 800 µl de agente Trizol® (invitrogen, CA, EUA) y una o dos bolas de metal para ser homogenizado mecánicamente mediante un homogenizador automático “TissueLyser II” (Quiagen, Japón) a 30 Hz durante 3 minutos.  Tras la homogenización, la muestra se centrifugó a 12000 g durante 10 minutos a 8 ºC y se recogió el sobrenadante en un eppendorf limpio.  Se añadieron 160 µl de cloroformo por cada 800 µl de Trizol, se agitó el eppendorf por inversión y se incubó alrededor de 3 minutos hasta verse bien diferenciadas las dos capas.  Posteriormente se centrifugó a 12000 g durante 15 minutos a 4 ºC, se recogió el sobrenadante en otro eppendorf nuevo con cuidado de no tocar la interfase blanquecina (proteínas).  Se añadieron 400 µl de isopropanol por cada 800 µl de Trizol, se agitó el eppendorf por inversión y se incubó 10 minutos a temperatura ambiente.  A continuación, se centrifugaron a 12000 g durante 10 minutos a 4 ºC (a partir de esta centrifugación la muestra debe permanecer siempre en hielo). Se eliminó el sobrenadante por decantación con mucho cuidado de no arrastrar el pellet. Posteriormente se añadieron 800 µl de etanol al 75% diluido en H2O DEPC (H2O bidestilada con dietilpirocarbonato al 0.1%) por cada 800 µl de Trizol.  Se centrifugó a 7500 g durante 5 minutos a 4 ºC, se eliminó el sobrenadante decantando el eppendorf con cuidado de no arrastrar el pellet. Una vez seco, se resuspendió el pellet en 25 µl de H2O DEPC.  Finalmente se cuantificó en un NanoDrop 2000c Spectophotometer (Thermo Scientific, MA, EUA) Materiales y Métodos 120 120 2.2.2 Tratamiento con DNasas  Se siguió el protocolo del kit comercial Ambion® DNA-free™ (Life Technologies, CA, EUA)  Para el tratamiento se calculó el volumen necesario para retrotranscribir 2 µg de RNA en un volumen máximo de 12,5 µl de H2O DEPC.  Se preparó una mezcla con 1.5 µl del tampón proporcionado por el kit comercial y 1 µl de DNasa I, y se añadió a la muestra. Se incubó el eppendorf en el termociclador Illumina Eco Real Time PCR System (Cultek S.L.U., España) durante 30 minutos a 37 ºC. Tras la incubación se pasó directamente el eppendorf a hielo.  Se añadieron 2 µl del reactivo de inactivación de la DNasa y se incubó 3 minutos a temperatura ambiente.  Tras este tiempo se centrifugó la muestra a 1000 g durante 1.5 minutos y se pasaron 10 µl de sobrenadante a otro eppendorf.  Finalmente se continuó con la retrotranscripción (la muestra puede ser congelada a -80 ºC en el caso de no usarse tras el tratamiento con DNasas) 2.2.3 Retrotranscripción Se utilizó el kit comercial High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit (Applied Biosystems, CA, EUA). Lo primero que se hizo fue preparar una mezcla conteniendo 2 µl de tampón de retrotranscripción 10x, 0.8 µl de mezcla de dNTP al 20x (100 mM), 2 µl de cebadores de retrotranscripción aleatorios, 1 µl de MultiScribe Reverse Transcriptase y 4.2 µl de H2O DEPC. Se pipetearon 10 µl de la mezcla sobre los 10 µl de la muestra y se colocó en el termociclador con el programa: 10 minutos a 25 ºC / 120 minutos a 37 ºC / 5 minutos a 85 ºC / 4 ºC hasta la recogida de la muestra. Materiales y Métodos 121 121 2.2.4 qRT-PCR Se utilizó el kit comercial TaqMan® Universal PCR Master Mix, No AmpErase® UNG (Applied Biosystems, CA, EUA). Siempre que se realizó para un gen o un tejido por primera vez fue requisito necesario hacer una prueba de las diluciones apropiadas. Se probaron las siguientes diluciones: Sin diluir (2 µl de cDNA + 7 µl de H2O DEPC) / 1:50 / 1:500 / 1:5000 Para dar por buenas las diluciones debería haber 3 ciclos aproximadamente entre una y otra; en este estudio se escogió aquella dilución que caía entre los 20-30 CT (cycle threshold, ciclo umbral). Una vez escogida la dilución se preparó la mezcla por gen usado en placas de 96 pocillos (tanto para el gen problema como para el gen constitutivo), en la que en cada pocillo irían 1 µl de primer y 10 µl de la Master Mix proporcionada por el kit. El gen constitutivo usado fue HPRT y todas las muestras se analizaron por duplicado (Tabla 12). A la mezcla de cada pocillo se les añadieron 9 µl del ADN complementario correspondiente obtenido tras la retrotranscripción. Se selló la placa con un adhesivo óptico y se centrifugó a 3000 rpm durante 1 minuto. Finalmente la placa se introdujo en el equipo de PCR a tiempo real (Step One Plus Real-Time PCR System; Applied Biosystems, CA, EUA), utilizando el protocolo estándar de 2 horas de duración. Los resultados se analizaron utilizando el software proporcionado por el aparato. Tabla 12: Lista de cebadores utilizados en este trabajo. Materiales y Métodos 122 122 2.3 Estudios de composición corporal: Imagen por resonancia magnética (IRM) Para realizar las medidas de la composición corporal se utilizó un sistema de imagen por resonancia magnética que proporciona medidas precisas de los parámetros de composición corporal: grasa corporal total, masa de tejido magro, fluidos corporales, y agua corporal total en ratas y ratones de hasta 700 gramos sin la necesidad de anestesia o sedación. (Whole Body Composition Analyzer, EchoMRI Echo Medical Systems, TX, USA). Las mediciones se realizaron en los animales a distintos tiempo según modelo experimental, permitiendo conocer los valores en gramos del total de tejido adiposo, así como de tejido magro (masa muscular libre de tejido adiposo) corporal de las ratas (figura 32). Figura 32: Imagen del aparato de imagen por resonancia magnética EchoMRI (foto tomada de www.echomri.com). Materiales y Métodos 123 123 2.4 Estudios metabólicos 2.4.1 Determinación de glucosa en sangre Se utilizó un medidor de glucosa Accu-CHEK sensor (Roche, Suiza) para determinar los valores de glucosa en sangre obtenida a través de un fino corte realizado con un bisturí en la cola de las ratas tras 20 horas en ayunas. 2.4.2 Modelo de evaluación de la homeostasis (índice HOMA) Se utilizó este método para cuantificar la resistencia a insulina y el porcentaje remanente de células β (beta). Fue descrito por primera vez por el Dr.Matthews y colaboradores en el año 1985 [185]. Este procedimiento está basado en la relación que existe entre la concentración de insulina en suero y la concentración de glucosa en sangre según la siguiente ecuación: Así, los valores elevados de índice HOMA indican baja resistencia a insulina y viceversa. Los valores de insulina se obtuvieron en suero de ratas mediante la técnica de RIA, mientras que los valores de glucosa en sangre se obtuvieron gracias a un medidor de glucosa tal y como se describe en apartados anteriores. 2.5 Análisis estadístico Salvo cuando se indica lo contrario (Ej. Análisis de imagen en estudios proteómicos), el análisis estadístico se realizó mediante el software GraphPad Prism 5 (GraphPad Software Inc, CA, EUA). En concreto los datos fueron analizados utilizando el test no paramétrico Mann-Whitney, considerando una p<0.05 como significativo y una p<0.01 como muy significativo. Los resultados se expresaron como media±SEM. 3. Técnicas proteómicas Todas las técnicas que se describen a continuación fueron hechas en la Unidad de Proteómica del Hospital Clínico Universitario de Santiago (Fundación Ramón Domínguez/Instituto de Investigación Sanitaria de Santiago). En concreto los pasos previos a la identificación por espectrometría de masas se realizaron en la sala blanca de dicha unidad bajo presión positiva minimizando así la contaminación de las Materiales y Métodos 130 130 Figura 38: Dibujo esquemático mostrando la distribución de las fosforilaciones y glucosilaciones de una proteína en un gel 2D. 3.3 Análisis de imagen diferencial El análisis diferencial de geles 2-DE es una poderosa herramienta utilizada para identificar diferencias cualitativas y cuantitativas de una proteína entre varios grupos experimentales distintos. Tras la tinción de un gel de electroforesis 2-DE se observa un patrón de manchas más o menos complejo, en el cual en teoría, cada mancha correspondería a una proteína de la muestra analizada. Para el análisis de este trabajo se compararon las imágenes de varios grupos de 4 geles 2-DE cada uno (cada gel correspondiente a una muestra concreta y cada muestra correspondiente a un solo animal) (figura 39). Para llevar a cabo la comparación, las condiciones para la obtención de las imágenes tuvieron que ser las mismas (geles, IEF y electroforesis realizadas a la vez), intentando obtener patrones de manchas lo más homogéneos posibles dentro de cada grupo experimental. La homogeneidad de los mismos se observó mediante la realización de un análisis de los componentes principales (PCA). Según el estudio realizado, se utilizaron dos tipos de análisis de imagen:  El estudio del secretoma de tejido adiposo se llevó a cabo utilizando el software de análisis de imagen Ludesi REDFIN BASIC (Ludesi, Suecia, http://www.ludesi.com). Este análisis permitió un control óptimo sobre las potenciales variaciones derivadas de la técnica. Para la detección de las manchas, segmentación y colocalización en los geles se siguió un protocolo estricto que Materiales y Métodos 131 131 aseguró un alto nivel de exactitud. Se midieron las intensidades de cada una de las manchas, normalizadas con la intensidad de fondo de los geles. Esta normalización permite eliminar diferencias sistemáticas en los geles como son variaciones de la intensidad en la tinción, tiempo de escaneado y carga proteica; permitiendo una cuantificación y comparación adecuada de los diferentes geles. Para las manchas que presentaban un incremento de cambio >2 y una varianza p<0.05 (test estadístico ANOVA) se consideró que presentaban diferencias significativas, mientras que aquellas con una p<0.001 se consideraron muy significativas y fueron seleccionadas para su escisión e identificación.  Para el estudio del secretoma de tejido muscular esquelético, las imágenes se enviaron al Centro de Análisis de Ludesi (Lund, Suecia, http://www.ludesi.com) en donde se realizó un análisis profesional mediante el software Ludesi REDFIN Solo. Gracias a este software y al asesoramiento profesional del equipo de Ludesi, permitió un control más intensivo de las diferentes variaciones en los geles logrando un análisis robusto de las diferencias existentes entre los geles. Las manchas con un incremento de cambio >2 y una varianza p<0.05 (test estadístico ANOVA) del análisis diferencial de sóleo frente a gastrocnemio, y un incremento de cambio >2 y una varianza p<0.01 del análisis comparativo bajo condiciones ad libitum frente a ejercicio, fueron seleccionadas para su escisión e identificación. Figura 39: Esquema del proceso de análisis de imagen para el estudio comparativo del secretoma de los tres depósitos principales de TA en rata. A la derecha, distribución en el gel de las manchas que presentaban diferencias significativas. Materiales y Métodos 132 132 3.4 Digestión proteica en gel Una vez finalizado el análisis diferencial, las manchas seleccionadas se cortaron del gel. Esto se hizo de forma manual utilizando la mitad de una punta de pipeta de 200 µl para poder obtener con mayor precisión la sección del gel en donde se encuentra la mancha. En el caso de geles teñidos con azul de coomassie, las manchas se pudieron cortar a simple vista; sin embargo para los geles teñidos en Sypro Ruby, fue necesaria la utilización de un transiluminador Dark Reader DR46B Transilluminator (Clare Chemical Research, CO, EUA) en oscuridad (figura 40A). Los trozos de gel se pasaron a tubos eppendorf individuales con unos 10 µl de H2O ultrapura. Figura 40: Principales equipos utilizados para la escisión, digestión e identificación de las manchas seleccionadas en un gel 2-DE. Dark Reader DR46B Transilluminator (A); Savant SpeedVac Concentrator (B); Opti-TOF MALDI plate (C); 4800 MALDI-TOF/TOF Analyze (D). Materiales y Métodos 133 133 Antes de poder realizarse la identificación mediante el espectrómetro de masas fue necesario hacer una serie de modificaciones y realizar una digestión peptídica de las proteínas dentro del mismo gel. Dichas modificaciones son la reducción de puentes disulfuro y la alquilación de las cisteínas, de esta forma las proteínas quedan desnaturalizadas mostrando los sitios de corte para la digestión enzimática y también evitando la formación de dímeros. El protocolo utilizado fue el siguiente (figura 41):  Se realizaron 3 lavados de 30 minutos cada uno con 190 µl de una solución de bicarbonato amónico 50 mM (Sigma-Aldrich, MO, EUA) y metanol 50% de grado HPLC (Scharlau, España) (solución de lavado) si la tinción fue realizada con azul de Coomassie. En el caso de las muestras teñidas con Sypro Ruby, cada uno de los tiempos de lavado fueron de 20 minutos. Posteriormente se dejaron 5 minutos en 50 µl de acetonitrilo 100% de grado HPLC (Scharlau, España) para deshidratar los geles y se secaron mediante una centrífuga de evaporación al vacío (Savant SpeedVac Concentrator, Thermo Scientific, MA, EUA) (figura 40B).  Se redujeron los posibles puentes disulfuro de la muestra mediante una incubación de 30 minutos a 56ºC con 50 µl de ditiotreitol 10 mM (Sigma-Aldrich, MO, EUA) en bicarbonato amónico 50 mM. Tras esto se realizaron 2 lavados de 10 minutos cada uno con 190 µl de la solución de lavado, para luego volver a incubar la muestra 5 minutos con 50 µl de acetonitrilo 100% y se deshidrató la muestra.  Una vez deshidratada, la muestra se incubó 20 minutos en oscuridad con 40 µl de yodoacetamida 55 mM (Sigma-Aldrich, MO, EUA) en bicarbonato amónico 50 mM para producir la alquilación de las cisteínas. Posteriormente se repitieron los pasos de lavado y deshidratación comentados arriba.  Se añadió tripsina porcina 20 ng/µl (Promega, WI, EUA) en bicarbonato amónico 20 mM y se incubó a 37ºC durante toda la noche.  Tras la digestión, se extrajeron los péptidos resultantes con una solución de acetonitrilo 60% y ácido fórmico 0.5% (Scharlau, España). Este paso se realizó 3 veces para obtener la mayor cantidad posible de péptidos (35-40-35 µl). Entre cada extracción se incubaron las muestras 20 minutos con la solución.  Finalmente se unieron las tres extracciones peptídicas, se concentraron al vacío y se guardaron a -20ºC hasta su uso. Materiales y Métodos 134 134 Figura 41: Protocolo esquemático de los pasos necesarios para realizar la digestión enzimática de las proteínas dentro de un gel de electroforesis. 3.5 Espectrometría de masas Para la identificación por espectrometría de masas, las muestras se resuspendieron en ácido fórmico 0.5%, tras esto se cargaron 0.5 µl de muestra junto con 0.5 µl de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinámico (3 mg diluidos en 1 ml de acetonitrilo 50% y ácido trifluoroacético 0.1%) en un plato de 384 espacios Opti-TOF MALDI plate (Applied Biosystems, CA, EUA) (figura 40C), y se dejó secar la mezcla a temperatura ambiente. Los datos de espectrometría de masas fueron obtenidos automáticamente utilizando un 4800 MALDI-TOF/TOF Analyzer (Applied Biosystems, CA, EUA) con fuente de ionización MALDI (desorción/ionización láser asistido por matriz) (figura 40D). Los espectros de masas (MS) se adquirieron en modo reflector positivo con un láser Nd:YAG (neodymium-doped yttrium aluminium garnet) de 355 nm. La media de disparos del láser por muestra fue de 1000 y se utilizaron al menos tres picos resultantes de la autolisis de la tripsina como calibración interna. Todos los espectros de fragmentación MS/MS fueron realizados tras seleccionar los precursores con una resolución 300 FWHM (“Full Widht High at Half Maximum”) y la supresión de metaestables. El análisis automático de los datos obtenidos se realizó mediante el software 4000 Series Explorer Software v3.5 (Applied Biosystems, CA, EUA). Los datos de los espectros de MS y MS/MS se combinaron a través del GPS Explorer Software v3.6 mediante el Materiales y Métodos 135 135 Mascot Software v2.1 (Matrix Science) para realizar la búsqueda en una base de datos no-redundante (SwissProt release 56.0), con una tolerancia de 30 ppm para la masa del péptido y 0.35 Da de tolerancia para los fragmentos peptídicos resultantes. Todos los espectros y datos obtenidos fueron revisados manualmente en detalle usando los softwares previamente citados. Los valores de detección obtenidos por identificación superiores a 56 fueron aceptados como significativos (p<0.05), considerando positiva la identificación cuando el coeficiente de intervalo se encontraba por encima del 98%. En el caso de los espectros MS/MS, el porcentaje de confianza aceptado se dispuso por encima del 95%. 3.6 Predicción de proteínas secretadas Las proteínas identificadas se analizaron a través del servidor SecretomeP 2.0 (Centre for Biological Sequence Analysis: http://www.cbs.dtu.dk/services/SecretomeP/), un método de predicción basado en la secuencia capaz de identificar proteínas secretadas de mamíferos tanto para las rutas clásicas como no clásicas de secreción [139, 186]. Por cada secuencia aminoacídica introducida de la proteína (en formato FASTA), el servidor predice la posibilidad de que la proteína siga la ruta de secreción no clásica, otorgando los valores más altos (hasta un máximo de 1.00) a las proteínas que entran dentro de las rutas de secreción clásica (aquellas proteínas con péptido señal). Se consideraría que la proteína sigue una ruta de secreción no clásica cuando los valores obtenidos superen el límite normal de 0.50. 3.7 Análisis de la interacción entre proteínas Se usó el Ingenuity Pathways Analysis Software IPA 8.0 (Ingenuity Systems, CA, EUA) para examinar posibles interacciones entre todas las proteínas identificadas en los distintos secretomas estudiados por proteómica. Las rutas interactivas fueron generadas para representar las relaciones potenciales tanto directas como indirectas entre las proteínas secretadas. Los valores de probabilidad proporcionados por el software surgen a partir de un valor p<0.05. Sólo se escogieron las redes con al menos un 10% de participación entre todas las proteínas identificadas. IV. Resultados Resultados 139 139 1. Establecimiento y caracterización de modelos animales en diferentes situaciones fisiológicas y patológicas. 1.1 Restricción calórica, ejercicio y anorexia basada en la actividad (ABA) El aporte nutricional y la actividad física son los factores más relevantes en el mantenimiento de la homeostasis energética interna. los tejidos implicados en este proceso responden rápidamente a los estímulos inducidos por estos factores, por lo que consecuentemente se produce una variación en la señalización endocrina que puede ser medida y aprovechada en investigación para la identificación y/o la caracterización de nuevas señales implicadas en esta regulación. El modelo de anorexia basada en la actividad (ABA) [175] es un modelo animal prometedor, poco usado en estudios endocrinológicos, que combina la acción del ejercicio junto con la restricción calórica, por lo que podría ser muy útil para estudios de señalización endocrina. Se realizó una caracterización de este modelo para evaluar su eficacia como modelo endocrinológico y su uso en estudios posteriores. 1.1.1 Parámetros fisiológicos Como muestra la figura 42, los grupos con alimentación ad libitum y ejercicio mostraron un aumento progresivo en su peso corporal, a lo largo de los 6 días de duración del experimento, sin haber diferencias significativas entre ellos. Por el contrario, el acceso limitado a comida durante una hora al día sumado al libre acceso a la rueda de ejercicio produjo en el grupo ABA una marcada disminución del peso corporal, que fue evidente desde el día 1 al 6. Se fijó el límite de 6 días para el experimento de ABA por motivos éticos, puesto que a partir del sexto día las ratas alcanzaban pérdidas de su masa corporal superiores al 25-30 % y empezaban a aparecer síntomas de desnutrición severa, como úlceras en el estómago y pérdida en el control de la temperatura corporal. Debido a estas condiciones extremas, también a partir del sexto día, se observó una significativa reducción de su actividad física como se muestra en la figura 42C. Resultados 146 146 ABA, al compararlos con el grupo ad libitum (figura 46B). No obstante, la banda predominante de LEPR encontrada en los grupos de ejercicio y ABA pertenecían a la forma inactiva. Por el contrario, la expresión total de LEPR en sóleo disminuyó en condiciones de ejercicio y restricción calórica, incluyendo el grupo ABA, comparados con los animales del grupo ad libitum; esta disminución se encontró muy marcada en el caso del grupo de ejercicio (figura 46B). Al contrario de lo que ocurría en el músculo gastrocnemio, la forma predominante de LEPR en el sóleo del grupo ABA fue la activa. El estudio del receptor de leptina en los diferentes depósitos de tejido adiposo mostró una marcada variación dependiendo de la localización anatómica. El TAVo y el TAVg de los grupos de ejercicio y restricción de comida, incluido el grupo ABA, expresaron exclusivamente la forma corta de LEPR, mientras que el TAS mostró las dos formas, produciéndose una sobreexpresión de ambas en el grupo ABA, mientras que su expresión se veía disminuida en condiciones de ejercicio. En general los tejidos sóleo, TAS y TAVo parecen los más sensibles a ghrelina, destacando su mayor participación en la regulación metabólica del organismo en comparación de los tejidos gastrocnemio y TAVg. En el caso de la leptina, al comprobar la expresión de la forma activa de su receptor, de entre todos los tejidos analizados, los tejidos sóleo y TAS se definieron como los más sensibles a esta hormona y por tanto los que ofrecerían una respuesta más rápida a los cambios inducidos por la leptina. Resultados 147 147 Figura 46: Expresión de los receptores de ghrelina (GHS-R1a) y leptina (LEPR) en tejidos periféricos. A. Expresión de GHS-R1a; B. Expresión de LEPR. Las líneas celulares 3T3-L1 y L6E9 diferenciadas fueron utilizadas como controles positivos. La densitometría de las bandas se muestra como porcentaje frente a los animales ad libitum. La expresión de la forma larga y corta de LEPR se representa en los histogramas con los colores negro y blanco respectivamente. Las diferencias significativas se indican como *p<0.05 frente a ad libitum. El TAVg del grupo ABA extraído fue insuficiente para la realización del análisis por inmunodetección. Resultados 148 148 1.2 Obesidad inducida por la dieta (DIO) El modelo de obesidad inducida por la dieta es uno de los modelos animales más conocidos y mejor caracterizados para la realización de estudios endocrinológicos, en concreto para los estudios de los efectos de la obesidad y de la acumulación excesiva de tejido adiposo. Debido a este conocimiento, para el establecimiento de este modelo y su posterior uso en subsiguientes estudios, se realizó una caracterización equivalente, aunque menos intensiva, a la realizada para los modelos de restricción calórica, ejercicio y ABA. 1.2.1 Parámetros fisiológicos Durante las 10 semanas que duró el experimento, se fue monitorizando el incremento de peso producido por la diferente dieta aportada a los animales. Como se muestra en la figura 47A, ya desde la primera semana las ratas del grupo DIO presentaban un peso significativamente mayor que el grupo control, diferencias que se fue incrementando a medida que avanzaba el modelo. Resulta destacable comprobar cómo al medir la ingesta media de los animales, no se encontraron diferencias significativas a lo largo del experimento dentro del mismo grupo, sin embargo al comparar ambos grupos, se observó que el grupo DIO consumía una menor cantidad de alimento, demostrando que la dieta hipercalórica produce una mayor sensación de saciedad en los animales (figura 47B). Los datos de composición corporal aportados por la técnica de imagen por resonancia magnética, mostraron como se iban incrementando los porcentajes tanto de masa grasa (figura 47C) como de masa libre de grasa o masa magra (figura 47D) con diferencias significativas entre grupos a partir de la primera semana. El incremento más notable se produjo con respecto al porcentaje de masa grasa. Resultados 149 149 Figura 47: Variación de parámetros fisiológicos durante el desarrollo del experimento DIO. A. Variación de peso corporal (%); B. Ingesta diaria de comida (g/animal/día); C. Variación de masa grasa (%); D. Variación de masa magra (%). Las diferencias significativas se indican como ***p<0.001 frente a CDIO. Resultados 150 150 Se realizó el test oral de intolerancia a la glucosa la semana previa a finalizar el experimento (semana 9). Tras la administración de glucosa oral exógena a los animales se midieron los niveles de glucosa en el tiempo, observándose que los animales del grupo control presentaban una distribución normalizada; sin embargo en las ratas con dieta hipercalórica, los niveles se mantuvieron elevados a los largo de la prueba, sugiriendo la existencia de una intolerancia a la glucosa o incluso resistencia a la insulina (figura 48). Figura 48: Test de tolerancia a la glucosa en el experimento DIO. 1.2.2 Parámetros hormonales y metabólicos Al igual que en los modelos descritos antes, se utilizaron los valores de las hormonas leptina y ghrelina, tras las 10 semanas de duración del experimento, como marcadores del estado nutricional. Como era de esperar, el grupo DIO presentó unos mayores niveles de leptina circulante, correlacionándose positivamente con la mayor cantidad de tejido graso respecto al grupo control (figura 49A). Para intentar determinar qué depósito de tejido adiposo participaba más activamente de la secreción de leptina, se midieron los niveles de leptina presentes en los secretomas de explantes de TAS, TAVo y TAVg; comprobando que el TAVo era con diferencia el mayor responsable en la secreción de leptina (figura 49B), y el único que presentaba diferencias entre los grupos siguiendo una distribución similar a los niveles observados en suero. El aporte en ng/ml de leptina por parte del TAS y TAVg tanto en obesidad como su control fue similar al Resultados 151 151 observado en el modelo ABA caracterizado previamente, sin embargo en el TAVo de los animales del modelo DIO se observaron los valores más elevados. Figura 49: Niveles de leptina circulante y en secretomas de tejido adiposo. A. Niveles de leptina en suero; B. Niveles de secreción de leptina a partir de los depósitos de TAS, TAVo y TAVg. Las diferencias significativas se indican como *p<0.05 frente a CDIO. En el caso de la ghrelina, de forma sorprendente se comprobó que los niveles en DIO se encontraban significativamente más elevados que en sus controles (figura 50). Figura 50: Niveles de ghrelina circulantes en el modelo DIO. Las diferencias significativas se indican como *p<0.05 frente a CDIO. Resultados 152 152 2. Caracterización del secretoma del tejido adiposo blanco en función de su localización anatómica. A lo largo de la bibliografía se pueden encontrar diferentes estudios proteómicos realizados sobre la secreción del tejido adiposo, sin embargo dichos estudios se basaron mayoritariamente en describir los patrones de secreción de la fracción celular; muy pocos se han basado en la secreción directa de explantes de tejido adiposo y menos aún en cuantificar las diferencias entre los distintos depósitos existentes. Bajo este contexto se consideró de gran importancia la caracterización del perfil de secreción de los depósitos de tejido adiposo más relevantes en rata, Así mismo, se propuso realizar un estudio diferencial entre estos depósitos mediante técnicas proteómicas; todo ello en muestras bajo condiciones ad libitum. 2.1 Establecimiento y validación de los secretomas a partir de explantes La técnica de explantes de tejido adiposo para la obtención de su secretoma es una técnica que puede aportar una valiosa información sobre las proteínas que secreta este tejido, sin embargo no está exento de complicaciones que pueden alterar el resultado final apareciendo falsos positivos o la enmascaración de proteínas potencialmente interesantes en favor de otras más conocidas y menos relevantes. Por tanto fue necesario realizar un proceso de estandarización y validación de los secretomas antes de su uso en los diferentes estudios. El primer aspecto que se valoró fue la elección de los diferentes depósitos de tejido adiposo que se iban a utilizar para la obtención de los secretomas. Se seleccionó el TAVo, situado entre las vísceras, por ser el tejido adiposo cuya acumulación causa la mayor parte de problemas derivados de la obesidad y su posición y funciones se asemejan en gran medida al TAVo humano. Como representante del TAS se optó por el situado en la zona glúteo-femoral, depósito pocas veces relacionado con las complicaciones de la obesidad [67]. Por último, se consideró oportuno utilizar el depósito de tejido adiposo unido físicamente a los testículos TAVg, relacionado directamente con la función sexual [83] pero que en multitud de estudios se ha utilizado indistintamente como depósito representativo del TAV por la facilidad de su extracción [77, 151]. Una vez seleccionados, los distintos depósitos se extrajeron minimizando al máximo tanto las contaminaciones externas como la rotura o daño celular. El proceso de obtención de los secretomas fue optimizado según se describe en el apartado de materiales y métodos, y se procedió a su validación mediante el estudio de la secreción de adipoquinas conocidas, seleccionando para ello la adiponectina y la leptina (figura 51). Se comprobó que ambas proteínas se encontraban presentes en los Resultados 153 153 tres depósitos observándose diferencias significativas en sus niveles de secreción al compararlos entre sí. Figura 51: Imagen de la inmunodetección de leptina y adiponectina en los secretomas de explantes de TA usados en este estudio. 2.2 Mapas 2-DE de referencia de los secretomas de tejido adiposo visceral, subcutáneo y gonadal Los secretomas de los depósitos de tejido adiposo procedentes de diferentes localizaciones anatómicas se recogieron tras 24 horas de incubación in vitro de los explantes y fueron procesados para su análisis por 2-DE como se describe en la sección de materiales y métodos. Para la segunda dimensión, se hicieron geles del 10 y 15 % de acrilamida/bisacrilamida para separar las proteínas de alto y bajo peso molecular respectivamente, cortando las manchas más representativas para conformar los mapas de secreción (335 manchas en TAVo, 161 en TAS, y 113 en TAVg) (figuras 52, 53 y 54). El análisis de espectrometría de masas de estas manchas, permitieron la identificación de 188, 85 y 91 proteínas diferentes en TAVo, TAS y TAVg respectivamente (apéndice, tablas suplementarias 1, 2, 3). Resultados 154 154 Figura 52: Mapa 2-DE de secreción del TAVo. Las manchas numeradas fueron seleccionadas para su identificación por espectrometría de masas. Imagen de arriba: gel de electroforesis realizado al 10% de acrilamida/bisacrilamida; imagen de abajo: gel realizado al 15% de acrilamida/bisacrilamida. Resultados 155 155 Figura 53: Mapa 2-DE de secreción del TAS. Las manchas numeradas fueron seleccionadas para su identificación por espectrometría de masas. Imagen de arriba: gel de electroforesis realizado al 10% de acrilamida/bisacrilamida; imagen de abajo: gel realizado al 15% de acrilamida/bisacrilamida. Apéndice 258 258 Secretoma de TAVo (2 de 4) (Continúa en la página siguiente) Apéndice 259 259 Secretoma de TAVo (3 de 4) (Continúa en la página siguiente) Apéndice 260 260 Secretoma de TAVo (4 de 4) Tabla suplementaria 1: Secretoma de TAVo. Proteínas totales identificadas ordenadas según el índice otorgado por el software SecretomeP (Los números de mancha corresponden a la figura 52). SignalP: la proteína contiene péptido señal. Apéndice 261 261 Secretoma de TAS (1 de 2) (Continúa en la página siguiente) Apéndice 262 262 Secretoma de TAS (2 de 2) Tabla suplementaria 2: Secretoma de TAS. Proteínas totales identificadas ordenadas según el índice otorgado por el software SecretomeP (Los números de mancha corresponden a la figura 53). SignalP: la proteína contiene péptido señal. Apéndice 263 263 Secretoma de TAVg (1 de 2) (Continúa en la página siguiente) Apéndice 264 264 Secretoma de TAVg (2 de 2) Tabla suplementaria 3: Secretoma de TAVg. Proteínas totales identificadas ordenadas según el índice otorgado por el software SecretomeP (Los números de mancha corresponden a la figura 54). SignalP: la proteína contiene péptido señal. Apéndice 265 265 Análisis diferencial TAVo vs. TAS vs. TAVg Tabla suplementaria 4: Análisis diferencial TAVo vs. TAS vs. TAVg. Proteínas totales identificadas ordenadas según el índice otorgado por el software SecretomeP (Los números de mancha corresponden a la figura 61). SignalP: la proteína contiene péptido señal. Apéndice 266 266 Secretoma gastrocnemio (1 de 2) (Continúa en la página siguiente) Apéndice 267 267 Secretoma gastrocnemio (2 de 2) Tabla suplementaria 5: Secretoma de gastrocnemio. Proteínas totales identificadas ordenadas según el índice otorgado por el software SecretomeP (Los números de mancha corresponden a la figura 71). SignalP: la proteína contiene péptido señal. Bibliografía 275 275 1. Spiegelman, B.M. and J.S. Flier, Obesity and the regulation of energy balance. Cell, 2001. 104(4): p. 531-43. 2. Wells, J.C., The evolution of human adiposity and obesity: where did it all go wrong? Dis Model Mech, 2012. 5(5): p. 595-607. 3. Bellisari, A., Evolutionary origins of obesity. Obes Rev, 2008. 9(2): p. 165-80. 4. Martins, C., M.D. Robertson, and L.M. Morgan, Effects of exercise and restrained eating behaviour on appetite control. Proc Nutr Soc, 2008. 67(1): p. 28-41. 5. Kopelman, P.G., Obesity as a medical problem. Nature, 2000. 404(6778): p. 635-43. 6. Hocking, S., et al., Adiposity and Insulin Resistance in Humans: The Role of the Different Tissue and Cellular Lipid Depots. Endocr Rev, 2013. 7. Rossner, S., Obesity: the disease of the twenty-first century. 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De una manera opuesta al síndrome de bloqueo del escritor, mi cabeza hierve con la cantidad de nombres que deberían aparecer en esta sección y con las miles de maneras que se me ocurren para poder plasmar, mínimamente, todo ese profundo agradecimiento que se merecen todos ellos por haberme ayudado de una manera u otra a estar plantado delante de la pantalla del ordenador a punto de dar por concluida una de las mejores experiencias que habré vivido en toda mi vida. Estoy bloqueado, sin embargo estoy convencido que todos estos sentimientos que ocupan mi cabeza fluirán a medida que avance este texto, y a pesar de que muchos nombres no podrán aparecer en esta sección, no significará ni mucho menos que me vaya a olvidar nunca de ellos y de la ayuda que me han ofrecido durante estos últimos años. Miro ahora hacia atrás y me sorprende pensar que han pasado ya 6 años desde aquel día que paseando por la facultad de farmacia por casualidad me encontré con la oferta del grupo de Endocrinología para realizar la tesis doctoral. Han pasado 6 años ya desde aquel momento que entré por primera vez en aquel “extraño” y antiguo laboratorio de la facultad de Medicina, dirigido por el prestigioso profesor Felipe Casanueva (al que nunca podré agradecer lo suficiente el haber confiado en mí como para ofrecerme la oportunidad de trabajar en su equipo y aprender de los mejores). Ahí me encontré por primera vez con algunas de las personas que marcarían para siempre mi vida como estudiante predoctoral. Han pasado 6 años, pero yo aún recuerdo todo como si hubiera ocurrido ayer… Fue en ese estrecho laboratorio en donde conocí a geniales investigadores principales que me ayudarían muchísimo en el futuro (de las más inimaginables maneras), desde la ayuda que me brindó Yola para aprobar un examen de RMN del postgrado de Biotecnología (de no ser por ella estaría perdido), pasando por esas rutas de señalización celular que “casi” consigo comprender al completo gracias a la enorme experiencia y conocimiento de Jesús (aunque sigo creyendo que cuando tengo una ruta dominada, misteriosamente esta se ramifica más y más). Muy importante sigue siendo la ayuda ofrecida por la magnífica experta en fisiología Sisi, sin la cual las ratas seguirían siendo para mí esos bichos con cola con los que mantener siempre una distancia prudencial. Ayuda complementada de manera impresionante gracias a la presencia de Omar, el cual, siendo sincero, aparte de fisiología me lo enseñó todo en cuestión de vivir un doctorado y prepararme para dar el salto al postdoc; por lo que al verlo ahora abriéndose paso en la investigación española tras su estancia postdoctoral en EUA, genera en mi una mezcla de alegría, admiración y orgullo por haber compartido con él parte de su etapa investigadora. No olvidaré nunca a muchas de las personas que pasaron por ese “histórico” laboratorio, como a Carlos y a María, los cuales veo desde la distancia haciéndose un nombre en el panorama científico internacional; o a Marcos, el cual se embarcó en el postdoctorado internacional al poco de llegar, pero al que más adelante tendría la oportunidad de conocer mejor. De la que guardaré un gran recuerdo por supuesto será de Uxía, todo un personaje (en el buen sentido de la palabra) que me acompaña desde el principio de esta empresa para completar la tesis doctoral, la persona con más anécdotas de viaje que he conocido nunca, de hecho una de las frases más escuchadas en el laboratorio es “Lo que no le pase a Uxía…” Pronto nos tocó hacer las “maletas científicas” para mudarnos al Hospital Clínico, unas nuevas instalaciones en las que compartiríamos nuestra experiencia con grupos de investigación de lo más variado, desde Cardiología a Oncología pasando por Reumatología, y en el que por sorpresa me encontré rodeado de antiguos compañeros y amigos de la carrera como Bruno, Toño o María; haciendo si cabe más especial esta etapa. En estas nuevas instalaciones, que luego se integrarían dentro del Instituto de Investigaciones Sanitarias de Santiago (“el IDIS” a partir de entonces), conocí y todavía sigo conociendo a muchísimas personas nuevas de las cuales no sería justo destacar unas sobre otras, pues considero el IDIS un todo, un ecosistema en el que todos han aportado su granito de arena para que la experiencia investigadora y personal vivida allí se convierta en una huella imborrable en mi memoria durante el resto de mis peripecias vitales. Y no sólo el IDIS me ha aportado esta huella, servicios del hospital, como el de Cirugía General y Digestiva liderado por los doctores Baltar y bahamonde o el servicio de Anatomía Patológica liderado por el doctor García-Caballero, con su impagable ayuda, me han enseñado como se puede establecer una colaboración básica-clínica perfecta. Fue en este hospital en donde vi crecer al laboratorio de Endocrinología con muchísimas incorporaciones nuevas y la creación de nuevos grupos henchidos de ganas por crear la mejor ciencia posible. Investigadores como Ana, doctorandos como Begoña o Icía y los magníficos técnicos María y Carlos han hecho si cabe más completo y agradable mi paso por este grupo. Es en estos lares en donde hice mis primeros pinitos como “profesor” que trata de conseguir que los recién llegados puedan volar por sí mismos en el mundo de la pipeta y de la poyata, en especial con Lucía, que tras ayudarnos mutuamente (ella a que me formase como “profesor” y yo a que sacara adelante su proyecto fin de máster), la veo ahora despegando para lograr dar forma a su propia tesis doctoral. Ahora mismo hay muchas caras nuevas, demasiadas como para ponerles nombre a todas, sin significar eso que no formen parte de esta aventura personal; pero si tengo que destacar a una sobre las demás, esta sería Cecilia, una técnico de apoyo que más que apoyo me ha aportado la mejor de las ayudas y la más perfecta de la compañía que alguien puede desear en un laboratorio, el trinomio formado por Omar, Cecilia y yo mismo será algo que difícilmente se podrá repetir en el futuro, algo que atesoro en mi memoria como uno de los mejores periodos de estos últimos años. Pero no todo aconteció en Santiago, durante mi doctorado tuve la fortuna de recalar en uno de los mejores laboratorios de España y sin duda en uno de los que mejor me lo he pasado, tanto profesional como personalmente. Siendo sincero, el ambiente vivido en Córdoba fue algo inmejorable, un lugar en el que abundaba el compañerismo, el “buenrollismo” y las bromas; a la par que la mejor ciencia y la mayor exigencia como investigadores. Allí he conocido a personajes irrepetibles como la gran profesora Malagón, que me acogió en su grupo como si fuera uno más y con la que cada vez que conversaba, sin importar el tema, yo sentía que había aprendido una cosa nueva. O Rocío, que tratando de poner a punto la técnica de DIGE confió en mí ayuda a la vez que yo aprendía de su experiencia. Me gustaría destacar también a Marina, que sin duda fue la persona que más me facilitó la estancia en Córdoba con su apoyo y su riquísima comida. En ese laboratorio he conocido tanta gente buena que me apena no poder dedicarles un párrafo a cada uno de ellos, sin embargo estoy convencido que la experiencia cordobesa me seguirá allá a donde vaya en el futuro. Deliberadamente dejo para el final a las dos personas que más han contribuido a que esta tesis se haya completado y que más han influido en mi etapa profesional. La primera de ellas es Jana, la gran compañera proteómica de la que tanto he aprendido en relación con esta técnica (así como en organización). Una persona que me ha enseñado desde a llevar la mayor pulcritud y exactitud posible en el trabajo con proteínas para obtener las identificaciones más exactas a incluso poder manejar y entender un espectrómetro de masas y el complejo software que le acompaña. Pero no sólo profesionalmente me ha ayudado, Jana ha sido siempre un apoyo personal en esta etapa, e incluso ahora desde la lejana Escocia, sigue colaborando conmigo para dar forma a esta tesis con sus consejos y correcciones. Sin duda, la última y más importante de las personas que me han ayudado en todos estos años ha sido María Pardo, mi jefa y directora de tesis, pero también amiga y compañera de laboratorio. Una persona que durante los primeros años compartió poyata a mi lado pipeta en mano, para enseñarme desde las técnicas más básicas a las más complejas, a la vez que yo iba descubriendo la ciencia desde su perspectiva personal llenándome la cabeza de ilusiones de futuro y de ganas por ahondar en la investigación con el fin de lograr los más asombrosos resultados. Una persona que fue capaz de generar en mí el deseo de querer convertirme en el mejor investigador que fuese capaz, sin importar el esfuerzo requerido. Una persona que me permitió entender todos los pasos por los que debe pasar un investigador principal para afianzar su carrera y su vida, desde la obtención de sus primeros proyectos de investigación al establecimiento de su propio grupo emergente, pasando por temas más personales como la compaginación del trabajo y la familia; aprendiendo a cada paso lo que me espera en el futuro si quiero dedicar mi vida a la ciencia y con la certeza de que todo objetivo es posible si uno tiene la decisión firme de llevarlo a cabo. Podría llenar páginas y más páginas sobre lo que supone para mi haber tenido una directora de tesis como María Pardo y lo agradecido que le estaré siempre, pero creo que la mejor forma de poder agradecer todo lo que ha hecho por mí será hacer la mejor ciencia posible en mis siguientes etapas, pues todo lo que logre a partir de ahora habrá sido gracias a su influencia. Hasta aquí la parte más “profesional” de este capítulo, sin embargo una tesis no se genera tan sólo con las experiencias y ayudas provenientes de un laboratorio, existen multitud de personas ajenas al mundo de la investigación sin las cuales yo no podría haber conseguido llegar hasta aquí. Desde las aventuras vividas junto a los “pitxeleiros”, donde cada viaje a Pontevedra se convierte en una aventura y cada fiesta de peñas en un “reunión familiar”; a los necesarios momentos de desconexión que supone acercarse a mi amado Ribadeo, el único lugar del mundo que siempre consideraré como mi único y verdadero hogar; en donde tan buenos amigos me esperan siempre para compartir Xiras, fines de año, noches interminables o los “road trips” a Lóngara. Mi familia ha sido siempre mi gran apoyo vital a partir del cual conseguir todo lo que me proponía, sin su ayuda no sólo no me habría convertido en investigador, sino que incluso no habría terminado la carrera. Durante mi vida he pasado por momentos muy buenos, pero también muy malos, y en todos ellos han estado ahí apoyándome absolutamente en todo. Tanto a mis padres, que tanta paciencia y esfuerzo han demostrado conmigo, como a mi hermana, toda una artista que incluso ha sacado tiempo para diseñar la portada de esta tesis; no les voy a dedicar esta tesis, puesto que es demasiado pequeña comparada con todo lo que me han ofrecido y me ofrecerán en el futuro; lo mínimo que puedo hacer para agradecerles todo lo que han hecho por mí es dedicándoles toda mi vida, aún a sabiendas de que toda una vida todavía no es suficiente agradecimiento por todo lo que significan para mí. Si por algo se ha caracterizado esta etapa predoctoral ha sido por la sucesión de momentos buenos y malos, fruto de las complicaciones inherentes a un trabajo de investigación y al estrés de escribir una tesis, malos momentos que me afectaron también anímicamente a nivel personal influyendo en cierta medida en las personas que me rodearon. En esta etapa tuve la grandísima suerte de encontrarme con Morena, una persona capaz de ayudarme a afrontar esos momentos, en especial durante los últimos meses (durante los que sufrí el llamado “estado pretésico”), impidiendo que me dejase llevar por ellos; una persona que quiero muchísimo y agradezco profundamente que esté a mi lado independientemente de todo lo que pase, ofreciéndome su cariño y comprensión en todo momento. A todos los que habéis formado parte de mi vida de una forma o de otra en estos 6 últimos años, independientemente de que aparezcáis aquí nombrados o no: Muchísimas gracias!