Estudio de la presencia de Escherichia coli productoras de BLEE en aves silvestres

Alba Pescador Vázquez Estudio de la presencia de Escherichia coli productoras de BLEE en aves silvestres. Facultad de Veterinaria Grado en Veterinaria Año 2024 Modalidad del Trabajo: Experimental Trabajo de Fin de Grado Licencia Excepto donde se haga constar explícitamente, esta obra pertenece a Alba Pescador Vázquez y está bajo una licencia de “Creative Commons Reconocimiento 4.0 Internacional”. 1. RESUMEN/ RESUMO/ ABSTRACT RESUMEN La lucha contra las resistencias bacterianas constituye uno de los grandes retos de la medicina del siglo XXI. Escherichia coli es una bacteria implicada en múltiples enfermedades que afectan tanto al ser humano como a los animales, y además, debido a su ubicuidad y alta plasticidad genética, es una de las bacterias en la que es más frecuente la aparición de cepas resistentes a antibióticos. En particular, la aparición de cepas productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) en E. coli es un riesgo emergente de pérdida de eficacia en el tratamiento terapéutico de las infecciones causadas por E. coli. La fauna silvestre puede actuar como reservorio de estas cepas resistentes y puede poner en riesgo la salud animal y pública. En este estudio analizamos 102 aves silvestres ingresadas en dos Centros de Recuperación de Fauna de dos zonas distintas de España, de las que tomamos muestras mediante hisopos cloacales con el objetivo de evaluar la presencia de E. coli, y en particular de cepas BLEE, en estas especies. Se detectó la presencia de E. coli en 75/102 de las muestras (73,5 %). En 7 de las 102 aves (6,9 %) se detectó la presencia de ocho cepas con fenotipo compatible con BLEE mediante siembra en medio TBX suplementado con antibiótico. Estas ocho cepas fueron sometidas a una PCR multiplex para identificar los genes de resistencia implicados en la producción de BLEE, detectando la presencia de blaCTX-M, blaSHV y blaTEM en 6 de las cepas (5,9 % del total de aves), siendo el gen más frecuente blaCTX-M (5/6 cepas). La presencia de varios genes de resistencia en la misma cepa también fue frecuente (4/6 cepas). Nuestros resultados confirman la circulación de cepas resistentes a antibióticos en aves silvestres. Serían necesarios estudios posteriores para poder definir más detalladamente el rol preciso de cada especie. La presencia de estas cepas podría constituir un riesgo epidemiológico tanto por los hábitos de ciertas especies (aves carroñeras o habituadas a vivir en ambiente humanizados) que pueden favorecer el contagio, como por sus migraciones, pudiendo dispersas distintos tipos de resistencias durante sus viajes. La detección de cepas resistentes en aves carroñeras sugiere la posibilidad de utilizarlas como indicadoras de contaminación ambiental. Palabras clave: E. coli, BLEE, aves silvestres, resistencias antibióticas, betalactámicos 1 RESUMO A loita contra a resistencia bacteriana constitúe un dos grandes retos da medicina do século XXI. Escherichia coli é unha bacteria implicada en múltiples enfermidades que afectan tanto a humanos como aos animais, e ademais, pola súa ubicuidade e alta plasticidade xenética, é unha das bacterias nas que é máis frecuente a aparición de cepas resistentes aos antibióticos. En particular, a aparición de cepas produtoras de betalactamasas de espectro estendido (BLEE) en E. coli é un risco emerxente de perda de eficacia no tratamento terapéutico das infeccións causadas por E. coli. A vida salvaxe pode actuar como reservorio para estas cepas resistentes e pode poñer en risco a saúde animal e pública. Neste estudo analizamos 102 aves silvestres ingresadas en dous Centros de Recuperación de Fauna Silvestre en dúas zonas diferentes de España, das que se tomaron mostras mediante hisopos cloacais co obxectivo de avaliar a presenza de E. coli, e en particular cepas de BLEE, nestas especies. A presenza de E. coli detectouse en 75/102 das mostras (73,5 %). En 7 das 102 aves (6,9 %) detectouse a presenza de oito cepas con fenotipo compatible con BLEE mediante a sementeira en medio TBX complementado con antibiótico. Estas oito cepas foron sometidas a unha PCR múltiple para identificar os xenes de resistencia implicados na produción de BLEE, detectando a presenza de blaCTX-M, blaSHV e blaTEM en 6 das cepas (5,9% do total de aves), sendo as máis frecuentes. xene blaCTX-M (5/6 cepas). Tamén foi frecuente a presenza de varios xenes de resistencia nunha mesma cepa (4/6 cepas). Os nosos resultados confirman a circulación de cepas resistentes aos antibióticos en aves silvestres. Serían necesarios máis estudos para definir con máis detalle o papel preciso de cada especie. A presenza destas cepas podería constituír un risco epidemiolóxico tanto polos hábitos de determinadas especies (aves carroñeras ou aves afeitas a vivir en ambientes humanizados) que poden favorecer o contaxio, como polas súas migracións, onde se poden dispersar diferentes tipos de resistencias durante as súas viaxes. A detección de cepas resistentes en aves carroñeras suxire a posibilidade de utilizalas como indicadores de contaminación ambiental. Palabras chave: E. coli, BLEE, aves silvestres, resistencias antibióticas, betalactámicos 2 ABSTRACT The fight against bacterial resistance constitutes one of the great challenges of 21st century medicine. Escherichia coli is a bacteria involved in multiple diseases that affect both humans and animals, and in addition, due to its ubiquity and high genetic plasticity, it is one of the bacteria in which the appearance of strains resistant to antibiotics is most common. In particular, the emergence of extended-spectrum beta-lactamase (ESBL)-producing strains in E. coli is an emerging risk of loss of efficacy in the therapeutic treatment of infections caused by E. coli. Wildlife can act as a reservoir for these resistant strains and can put animal and public health at risk. In this study we analyzed 102 wild birds admitted to two Wildlife Recovery Centers in two different areas of Spain, from which we took samples using cloacal swabs with the aim of evaluating the presence of E. coli, and in particular ESBL strains, in these species. The presence of E. coli was detected in 75/102 of the samples (73.5 %). In 7 of the 102 birds (6.9 %), the presence of eight strains with ESBL-compatible phenotype was detected by sowing in TBX medium supplemented with antibiotic. These eight strains were subjected to a multiplex PCR to identify the resistance genes involved in the production of ESBL, detecting the presence of blaCTX-M, blaSHV and blaTEM in 6 of the strains (5.9% of the total birds), being the most frequent gene blaCTX-M (5/6 strains). The presence of several resistance genes in the same strain was also frequent (4/6 strains). Our results confirm the circulation of antibiotic-resistant strains in wild birds. Further studies would be necessary to define in more detail the precise role of each species. The presence of these strains could constitute an epidemiological risk both due to the habits of certain species (scavenging birds or birds accustomed to living in humanized environments) that can favor contagion, and due to their migrations, where different types of resistance may be dispersed during their travels. The detection of resistant strains in scavenging birds suggests the possibility of using them as indicators of environmental contamination. Key words: E. coli, ESBL, wild birds, antibiotic resistance, beta-lactams 3 2. ÍNDICE 1. RESUMEN/RESUMO/ABSTRACT 1 2. ÍNDICE 4 3. ABREVIATURAS 5 4. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 6 4.1 Características generales de las infecciones por Escherichia coli 6 4.1.1 Etiología 6 4.1.2 Importancia clínica de las infecciones por E. coli 7 4.1.2.1 Importancia clínica de las infecciones por E. coli en humanos 8 4.1.2.2 Importancia clínica de las infecciones por E. coli en animales 9 4.2 Escherichia coli y las resistencias bacterianas a antibióticos 10 4.2.1 Antibióticos y resistencias bacterianas 10 4.2.2 Tipos y mecanismo de resistencias bacterianas 11 4.2.3 Antibióticos beta-lactámicos 12 4.2.3.1 Definición, mecanismo de acción y tipos de betalactámicos. 12 4.2.3.2 Mecanismos de resistencias frente a betalactámicos 13 4.2.3.3 Betalactamas de espectro extendido (BLEE) 13 4.3 Aves silvestres y BLEE 14 4.3.1 El papel de las aves silvestres en la transmisión de patógenos. 14 4.3.2 Características de las poblaciones de aves silvestres en España 15 4.3.3 Prevalencia de Escherichia coli en aves silvestres 17 4.4 Objetivos 18 5. MATERIAL Y MÉTODOS 19 5.1 Origen de las muestras y características de las zonas de muestreo 19 5.2 Toma de muestras y recogida de información epidemiológica 20 5.3 Análisis de laboratorio 23 5.3.1. Cultivo microbiológico 23 5.3.2 Análisis molecular de genes de resistencia 24 5.3.2.1 Extracción de ADN 24 5.3.2.2 Amplificación con PCR multiplex 24 5.3.2.3 Comprobación de la amplificación en gel de agarosa y lectura 25 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 26 6.1 Muestras obtenida e información epidemiológica 26 6.2 Presencia de E. coli en las aves muestreadas 29 6.3 Presencia de BLEE en las aves muestreadas 32 7. CONCLUSIONES 38 8. BIBLIOGRAFÍA 39 4 3. ABREVIATURAS ADN: Ácido desoxirribonucleico AIEC:E. coli adherente invasiva AMUS: Acción por el Mundo Salvaje APEC:E. coli patogénica aviar ATP: Adenosín Trifosfato BLEE: Betalactamasa de espectro extendido CRAS: Centro de Recuperación de Animales Silvestres CRF: Centros de Recuperación de Fauna CTX: Cefotaxima CTX-M:Cefotaximase from Munich DAEC:E. coli adherente difusa dNTPs: Desoxirribonucleótidos trifosfato EAEC:E. coli enteroagregativa EHEC:E. coli enterohemorrágica EPEC:E. coli enteropatógena ETEC:E. coli enterotoxigénica ExPEC:Extraintestinal pathogenic E. coli IBA: Áreas Importantes para la Conservación de las Aves y la Biodiversidad en España IPEC:Intestinal pathogenic E. coli MAPAMA: Ministerio de Agricultura, Pesca, Alimentación y Medio Ambiente MITECO: Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico NMEC:E. coli asociada a meningitis neonatal OXA: Oxacilinasa PBPs:Penicillin-binding proteins PCR: Reacción en cadena de la polimerasa rpm: Revoluciones por minuto SEO: Sociedad Española de Ornitología SEPEC:E. coli asociada a septicemia SHV:Sulfhydryl variant TAE: Tris-Acetato-EDTA TBX: Triptona-Bilis-X-glucurónido UPEC:E. coli uropatogénica VNO: Virus del Nilo Occidental ZEPA: Zonas de Especial Conservación para las Aves 5 4. INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS 4.1 Características generales de las infecciones por Escherichia coli 4.1.1 Etiología Escherichia coli es una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa, con forma de bacilo que forma parte de la familia Enterobacteriaceae. Esta bacteria se encuentra en multitud de especies animales donde forma parte de la microbiota del intestino de la mayor parte de los vertebrados de sangre caliente (Riley, 2020). Aunque la relación entre E. coli y su hospedador tradicionalmente se había definido como comensalismo, hoy en día se plantea considerarla de mutualismo (Martinson & Walk, 2020), ya que tanto el hospedador como la bacteria resultan beneficiados en la relación: la bacteria obtiene el alimento y el refugio que necesita pero, a cambio, participa en la síntesis de las vitaminas K (Suvarna et al., 1998) y B12; consume el oxígeno que entra en el intestino, creando así un ambiente más favorable para el resto de bacterias anaerobias estrictas que componen la microbiota; y además, con su presencia excluye la posible colonización de otras bacterias patógenas del intestino (Blount, 2015), si bien es cierto que también existen cepas patógenas de la propia bacteria. Por su gran ubicuidad, la facilidad para trabajar con ella, y la rapidez con la que crece en diferentes medios, E. coli es una de las bacterias con las que más se ha trabajado en los laboratorios de microbiología en el siglo XX (Blount, 2015), y, por tanto, una de las especies más conocidas y mejor caracterizadas. El genoma de E. coli se caracteriza por presentar una alta variabilidad, de forma que algunas cepas pueden llegar a compartir solo el 20 % de los genes (Riley, 2020). Por tanto, E. coli es un ejemplo de especie con pangenoma abierto, es decir, el número de genes totales de la especie no está fijado y puede aumentar a medida que se descubren nuevas cepas o individuos. De esta forma, podemos encontrarnos tres tipos de genes: por un lado, una parte del genoma que se denomina central o “core”, el conjunto de genes que aparecen en la totalidad de las cepas de E. coli secuenciadas; otros genes que, solamente se encuentran en una cepa, y que se denominan como genoma único; y por último, están los genes compartidos entre varias cepas pero que no se encuentran en todas, y que conforman el genoma prescindible. Esto otorga una alta plasticidad genética a la bacteria y gran capacidad para adquirir nuevos genes de su entorno, dando como resultado múltiples fenotipos con los que puede adaptarse a diferentes condiciones ambientales (Leimbach et al., 2013). Como resultado vamos a encontrar una gran variabilidad dentro de la especie. A nivel molecular podemos distinguir ocho grupos filogenéticos: A, B1, B2, C, D, E, F, G, y cinco clados de Escherichia (I a V). Los filogrupos se diferencian en las características fenotípicas y genotípicas, así como en los nichos ecológicos que ocupan, la patogenicidad o la probabilidad 6 de que acumulen genes de resistencia a antibióticos. Dentro del filogrupo B1 hay cepas que se encuentran en el ambiente y que están adaptadas a vivir en el suelo, el agua o las plantas (Lagerstrom & Hadly, 2023). Asimismo, algunas cepas pueden sobrevivir y crecer en el medio sin necesidad de un hospedador (Jang et al., 2017). El serotipo de las cepas se puede determinar a partir de los antígenos somáticos (O), capsulares (K) y flagelares (H). Tanto las cepas patógenas como las inocuas suelen presentar diversidad de serotipos, si bien algunos son más frecuentes. Por ejemplo, E. coli O157H7, causante de muchos brotes por intoxicaciones alimentarias en muchos países (Jang et al., 2017). 4.1.2 Importancia clínica de las infecciones por E. coli Escherichia coli puede causar enfermedad en una gran variedad de especies. Las cepas comensales pueden resultar patógenas en caso de inmunodepresión del hospedador o si atraviesan algunas barreras naturales (Blount, 2015). Sin embargo, existen otras cepas que tienen características específicas de virulencia y patogenicidad que les permite causar de forma primaria diferentes tipos de enfermedades en los seres humanos y en los animales. Estas cepas se incluyen dentro de patotipos en función de los factores de virulencia que presenten, del cuadro clínico que produzcan y de su filogenética. Principalmente se diferencia entre patotipos intestinales (IPEC) y extraintestinales (ExPEC), con gran variedad de cuadros clínicos (Tabla 1). Los intestinales están representados en los filogrupos A, B1 y C (Lagerstrom & Hadly, 2023), y causan cuadros diarreicos. Los más importantes son: E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli enterohemorrágica (EHEC), E. coli enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteroagregativa (EAEC), E. coli adherente invasiva (AIEC) yE. coli adherente difusa (DAEC) (Denamur et al., 2020). Las cepas que conforman los patotipos extraintestinales forman parte de la microbiota intestinal, están representadas en los filogrupos B2, D y F (Lagerstrom & Hadly, 2023), y se caracterizan por tener ciertos factores de virulencia que las convierten en patógenas cuando se encuentran en otras partes del organismo. Las más habituales son E. coli uropatogénica (UPEC), el patógeno más comúnmente asociado a las infecciones del tracto urinario no complicadas (Lüthje & Brauner, 2014), E. coli patogénica aviar (APEC), responsable de la colibacilosis aviar, causa de grandes pérdidas económicas a nivel industrial por aumentar la mortalidad debido a la aparición de múltiples cuadros como septicemia, pericarditis o infecciones respiratorias (Rocha et al., 2021), E. coli asociada a meningitis neonatal (NMEC), que llega a tener un 10 % de mortalidad y hasta un 30 % de morbilidad (Sarowska et al., 2019), y E. coli asociada a septicemia (SEPEC), con una mortalidad estimada del 30 % (Biran & Ron, 2018). 7 Las BLEE se pueden dividir en varias familias. Las primeras en describirse fueron las TEM, a principios de la década de 1960, denominadas así porque se aislaron por primera vez de un cultivo sanguíneo de una paciente griega llamada Temoneira (Castanheira et al., 2021). Las oxacilinasas (OXA) betalactamasas también fueron de las primeras enzimas con estas características en describirse, con un sustrato mucho más heterogéneo que las ya descritas TEM pero con mucha más actividad contra la oxacilina y la meticilina (Evans & Amyes, 2014). Más tarde, en 1985, se aislaron las BLEE del grupo SHV (sulfhydryl variant). Esta variante, junto con las TEM, fueron las más comúnmente encontradas hasta la década de los 2000, cuando empezó a crecer la prevalencia de las CTX-M (cefotaximase from Munich), una variedad descrita por primera vez en Alemania a finales de los 80, y que desde entonces se ha convertido en la familia de BLEE más encontrada en todo el mundo (Castanheira et al., 2021). Una de las características bioquímicas más importantes de las BLEE se refiere a su susceptibilidad frente a los inhibidores de las betalactamasas como el ácido clavulánico, el sulbactam o el tazobactam. Esto se ha aprovechado en la clínica diaria en la lucha contra este tipo de resistencias al combinar un antibiótico beta-lactámico con un inhibidor de las betalactamasas, ampliando así el espectro de acción conseguido. En cambio, las OXA no cumplen con esta característica, por lo que su inclusión en el grupo de las BLEE ha sido discutida (Castanheira et al., 2021). 4.3 Aves silvestres y BLEE 4.3.1 El papel de las aves silvestres en la transmisión de patógenos. Las aves silvestres son sumamente relevantes desde el punto de vista de la Salud Pública. Intervienen directamente en el ciclo epidemiológico de enfermedades zoonósicas importantes como el Virus del Nilo Occidental (VNO); son portadoras asintomáticas de prácticamente todas las combinaciones antigénicas del virus de la influenza aviar, con el consiguiente riesgo de que ocurra reorganización genética con cepas humanas que aumente la virulencia de este virus en nuestra especie; y, además, también pueden contaminarse con enteropatógenos como E. coli al alimentarse en aguas residuales y propagar estos patógenos a los seres humanos y/o animales de producción o viceversa, pueden infectarse en las granjas y extender los patógenos a través de sus rutas migratorias (Viso, 2017). La distinta biología y ecología de las diferentes especies de aves va a influenciar en la manera en que pueden afectar a la transmisión de patógenos a los seres humanos u otras especies domésticas. En el caso de las aves migratorias, sus amplios desplazamientos les permiten dispersar patógenos y vectores artrópodos, lo que puede ocasionar la aparición de nuevos focos endémicos de enfermedad a largas distancias (Viso, 2017). La migración de las aves permite el 14 mayor aprovechamiento posible de los recursos durante todo el año. Es un comportamiento que muchas aves presentan, se estima que la mitad de las 9.000 especies del mundo (Tellería, 2004), y en su transcurso pueden recorrer hasta 80.000 km anuales, como es el caso del charrán ártico (Sterna paradisaea) que en su migración viaja desde un polo a otro (Egevang et al., 2010). Las especies ligadas al mundo rural y al ganado, como las galliformes silvestres, palomas, córvidos o estorninos, tienen especial relevancia desde el punto de vista de la bioseguridad ganadera (MAPAMA, 2024), ya que pueden transmitir patógenos a las especies domésticas, sin embargo también pueden adquirirlos y propagarlos al resto de la comunidad silvestre (Kuiken & Cromie, 2022). Las rapaces por su parte, debido a su dieta, basada en la depredación de otras especies animales, pueden actuar como bioacumuladores de patógenos al alimentarse de individuos portadores o infectados, incluso algunas enfermedades como el VNO pueden transmitirse de esta manera (Vidaña et al., 2020). Al igual que pasa con el resto de carnívoros, su situación en lo alto de la cadena trófica las convierten en buenas indicadoras del estatus sanitario del ecosistema al que pertenecen (MAPAMA, 2024). En particular, las aves carroñeras, como los buitres, se consideran un buen indicador de contaminación con antibióticos del medio y de transmisión de fuentes antropogénicas de resistencias debido a que muchas veces se alimentan de cadáveres de ganadería extensiva que es tratada con antibióticos (Suarez‐Pérez et al., 2021). 4.3.2 Características de las poblaciones de aves silvestres en España España es un país de gran importancia ornitológica con más de 600 especies de aves diferentes de un total de cerca de 10.000 especies diferentes en todo el mundo según la Sociedad Española de Ornitología (SEO)/BirdLife, (2022). Algunas de las cuales son exclusivas de la península ibérica. Además, constituye un enclave muy importante dentro del Paleártico Occidental para la avifauna migratoria europea por su situación meridional y su gran extensión con gran diversidad de ambientes. Por otra parte, debido a su situación, sirve de puente entre el continente europeo y el africano por lo que es una importante zona de paso migratorio. La estructura de las poblaciones de aves silvestres es compleja y diversa dada la amplia variedad de factores que la modulan y de especies con diferentes estrategias biológicas, así como aves residentes o migratorias con distintos patrones temporales. De este modo, España recibe aves migratorias en invierno (invernantes) y en primavera y verano (estivales o reproductoras). En términos generales, se considera que el 63 % de las especies son reproductoras y autóctonas, el 15 % son aves migrantes, el 14 % representan a especies exóticas y, además, existe un 8 % de especies que se consideran raras y que no se reproducirían o lo harían de forma ocasional (SEO/BirdLife, 2022). 15 La distribución de todas estas especies aviares es heterogénea a través de la geografía española. Las condiciones climáticas propias de cada zona, así como las características geográficas, la disponibilidad tanto de hábitats adecuados como de alimento y el impacto de las actividades humanas van a condicionar el tipo de aves que encontramos. En la Figura 1 podemos ver distintas zonas con distinto número de especies reproductoras, las áreas con mayor número parecen concentrarse a lo largo de las cuencas de ríos importantes como el Ebro, el Tajo o el Guadalquivir, mientras que en otras zonas, como las islas, disminuyen las especies que se reproducen allí. Figura 1: Mapa de biodiversidad de aves reproductoras en la península ibérica. Tomado de European Bird Census Council (EBCC), (2022). Para proteger y asegurar a largo plazo las especies y los distintos tipos de hábitat de Europa surge en 1992 la Red Natura 2000, como una red ecológica europea de áreas de conservación de diversidad. En este marco, se crean las Zonas de Especial Conservación para las Aves (ZEPA). Estas son fracciones del territorio necesarias para preservar, mantener o restablecer una diversidad y una superficie suficiente de hábitat para todas las especies de aves incluidas en el Anexo I de la Directiva 2009/147/CE del parlamento europeo y del consejo relativa a la conservación de las aves silvestres (MAPAMA, 2021). La organización SEO/BirdLife define las Áreas Importantes para la Conservación de las Aves y la Biodiversidad en España (IBA) como aquellas zonas en las que se encuentran presentes regularmente una parte significativa de la población de una o varias especies de aves consideradas prioritarias. En España se han identificado 469 IBA (SEO/BirdLife, 2011) y el Ministerio para la Transición Ecológica y el Reto Demográfico (MITECO) identifica 662 ZEPA (MITECO, s. f.) (Figura 2). Muchas de ellas coinciden con zonas de alta biodiversidad de aves reproductoras (Figura 1), como es el caso de la comunidad autónoma de Extremadura. 16 Figura 2: Mapa representativo de zonas ZEPA e IBA en España. Elaboración propia a partir de: SEO/Birdlife, 2011; MAPAMA, 2021. 4.3.3 Prevalencia de Escherichia coli en aves silvestres Escherichia coli puede encontrarse fácilmente en muestras cloacales en aves silvestres al formar parte de la microbiota normal de estos animales, aunque las prevalencias entre especies pueden diferir: en Canadá Parker et al. (2016) describieron una prevalencia total de 68 % que variaba desde 44,8 % para zorzal pechirrojo (Turdus migratorius) hasta un 92 % para el cuervo americano (Corvus brachyrhynchos); en Europa también se han descrito estas diferencias entre especies, Guenther et al. (2012) en un estudio enfocado en las aves rapaces obtuvieron desde un 69,2 % de prevalencia en los milanos negros (Milvus migrans) muestreados, hasta un 22 % en los busardos ratoneros (Buteo buteo), con una prevalencia total encontrada de 38 %. También aparecen diferencias en las prevalencias de E. coli obtenidas en función del origen de las muestras, Gargiulo et al. (2018) encontraron una baja prevalencia en muestras de mucosa intestinal de cadáveres de aves rapaces (6,8 %) frente a 54,5 % en hisopos cloacales de aves vivas (Giacopello et al., 2016) Por otra parte, la primera cita de resistencias bacterianas a antibióticos en fauna salvaje se registró con cepas de E. coli en palomas en 1975 (Sato et al., 1978), y desde la primera descripción de E.coli productora de BLEE en animales de vida salvaje, en 2006 en aves de un centro de recuperación de fauna en Portugal (Costa et al., 2006), se han encontrado resistencias de tipo BLEE en aves salvajes en todos los continentes excepto en la Antártida (Bonnedahl & Järhult, 2014; Nešporová et al., 2020). Incluso han aparecido en zonas remotas con poca 17 influencia del ser humano prevalencias comparables a aquellas encontradas en zonas más humanizadas (10,8 % de las aves muestreadas en una zona remota de Mongolia frente a 13,8 % en zona humanizada de Alemania) (Guenther et al., 2012). Las cepas de E. coli productoras de BLEE que afectan a aves silvestres pueden ser las mismas que afectan a los seres humanos. Por ejemplo, en Francia se encontraron en gaviotas patiamarillas (Larus michahellis) las mismas cepas bacterianas productoras de la BLEE CTX-M-1 que es la más presente en la clínica humana en el país (Bonnedahl et al., 2009). Teniendo esto en cuenta adquiere especial relevancia el papel de las migraciones de las aves, ya que cepas resistentes pueden diseminarse a zonas más aisladas donde no parece haber influencia del ser humano, o a otras zonas humanizadas y transmitiendo así nuevas cepas para los habitantes de lugares lejanos. Esto se vio reflejado en un estudio en Chile (Hernández et al., 2013); en él se observó que los seres humanos y las gaviotas de Franklin (Leucophaeus pipixcan) comparten la misma secuencia de los genes que codifican para la producción de BLEE en E. coli, con una prevalencia de más del doble en las gaviotas. Además, esta secuencia era la misma que aparecía en humanos en la zona de Canadá donde las mismas gaviotas anidan tras migrar, lo que sugiere, aparte de una transmisión interespecie, una dispersión del mismo mecanismo de resistencia a través de la migración de las gaviotas. En España, las BLEE más extendidas en la clínica de humanos son las CTX-M-1 (Pérez et al., 2019) y la SHV-12 (Díaz et al., 2010), también son las más encontradas en aves silvestres (Alcalá et al., 2015; Oteo et al., 2018). Al ser España un país con una gran diversidad de aves silvestres que acoge a un gran número de especies migradoras, es especialmente importante hacer una vigilancia de la presencia de genes codificantes de BLEE en las aves, tanto para prevenir que lleguen nuevas cepas que puedan suponer un riesgo de salud pública, como para controlar el nivel de dispersión de resistencia a estos antibióticos en el medio ambiente. 4.4 Objetivos Debido a la ya mencionada importancia de las resistencias a antibióticos, en especial de las BLEE en E. coli por las razones ya expuestas, y al importante papel que desempeñan las aves silvestres; en este estudio hemos definido los siguientes objetivos: 1. Evaluar la presencia de E. coli en distintas especies de aves silvestres. 2. Evaluar la presencia de E. coli productoras de BLEE en distintas especies de aves silvestres. 3. Estudiar qué genes implicados en la producción de BLEE están presentes en las cepas de E. coli detectadas en aves silvestres. 18 5. MATERIAL Y MÉTODOS 5.1 Origen de las muestras y características de las zonas de muestreo Las muestras de aves analizadas en este estudio se tomaron de aves remitidas a dos centros de recuperación de fauna silvestre. Estos centros atienden y rehabilitan a ejemplares heridos, enfermos o debilitados de la fauna silvestre, con el fin de que puedan ser devueltos en las mejores condiciones a su hábitat natural. Las aves son encontradas por particulares o directamente por los agentes medioambientales de cada comunidad autónoma que son los encargados de recogerlas y trasladarlas. La casi totalidad de las causas de ingresos son provocadas directa o indirectamente por el ser humano, siendo las más frecuentes electrocuciones, disparos, atropellos o intoxicaciones (Molina, 2013; SEO/BirdLife, 2023). Debido a la amplia variabilidad de especies y situaciones epidemiológicas, se seleccionaron dos zonas de muestreo distintas que abarcan el área de trabajo de dos centros de recuperación de fauna silvestre: Acción por el Mundo Salvaje (AMUS, Villafranca de los Barros, Badajoz), que recibe toda la fauna silvestre recogida en la provincia de Badajoz, con una extensión de 21.766 km² (Zona 1); y el Centro de Recuperación de Animales Silvestres (C.R.A.S) de Burgos (Albillos, Burgos), que recoge ejemplares procedentes de las provincias de Burgos, Palencia y Soria, cubriendo una extensión de 32.650 km² (Zona 2). Las zonas de muestreo presentan diferencias climáticas y geográficas que influyen en la densidad, distribución y tipo de especies que predominan en cada una de ellas. La Zona 1 presenta un clima mediterráneo en el que los veranos son calurosos con una temperatura media de 26ºC y los inviernos suaves con una media de 6ºC, con precipitaciones moderadas concentradas sobre todo en otoño y primavera (Fernández et al., 2011). Se encuentra en la comunidad autónoma de Extremadura que presenta una gran diversidad de paisajes y una gran riqueza de avifauna, como demuestra que sea la comunidad autónoma de España con más Zonas de Especial Protección para las Aves (ZEPA) (71). De estas, 33 se encuentran en Badajoz, ocupando unas 596.264 Ha (datos de la Junta de Extremadura). Muchas de ellas incluyen zonas húmedas, debido a la gran cantidad de embalses y pantanos de la provincia, donde es fácil encontrar anátidas, garzas, limícolas, espátulas, gaviotas, cormoranes y otras muchas especies aviares.También son importantes los campos de cultivo de cereal y las zonas de dehesa donde podemos encontrar aves típicas de zonas abiertas como la avutarda euroasiática (Otis tarda), el sisón común (Tetrax tetrax), alcaraván común (Burhinus oedicnemus), el aguilucho cenizo (Circus pygargus) o el cernícalo primilla (Falco naumanni), pero también otras de zonas arbustivas y forestales como el rabilargo ibérico (Cyanopica cooki), el abejaruco europeo 19 (Merops apiaster), la carraca europea (Coracias garrulus), el cuco común (Cuculus canorus), el mochuelo europeo (Athenea noctua), la abubilla común (Upupa epops) o la cigüeña blanca (Ciconia ciconia) y negra (Ciconia nigra). En toda la provincia son abundantes las aves rapaces de las que aparecen gran variedad como el águila real ibérica (Aquila chrysaetos), el águila imperial (Aquila adalberti), el alimoche común (Neophron percnopterus), el buitre leonado (Gyps fulvus) o el buitre negro (Aegypius monachus), el águila perdicera (Aquila fasciata), el cernícalo vulgar (Falco tinnunculus), el búho real (Bubo bubo), el águila calzada (Hieraaetus pennatus), la culebrera europea (Circaetus gallicus), el milano negro (Milvus migrans), el milano real (Milvus milvus) o el busardo ratonero (Buteo buteo). Extremadura es, además, la comunidad autónoma donde inverna el grueso de la población de grulla común (Grus grus) europea. En cambio, la Zona 2 presenta un clima oceánico-continental, en el que los inviernos son largos y pueden alcanzarse hasta 12 ºC bajo cero, y los veranos son cortos y calurosos. Abarca tres provincias, Burgos, Palencia y Soria, con una densidad de población de 24,91; 19,76; y 8,6 hab/km² respectivamente, y en las que encontramos un total de 23 zonas ZEPA. Los paisajes que encontramos van desde la alta montaña hasta las llanuras cerealistas de la meseta, por lo que podemos encontrar tanto aves asociadas a medios agrícolas como escribanos, gorriones, alondras, perdiz roja (Alectoris rufa), cernícalo vulgar (F. tinnunculus), o mochuelo europeo (A. noctua), a medios forestales como pico picapinos (Dendrocopos major), arrendajo euroasiático (Garrulus glandarius), oropéndola europea (Oriolus oriolus), rabilargo ibérico (C. cooki) o cuco común (Cuculus canorus), como adaptados a vivir entre riscos montañosos como el águila real ibérica (A. chrysaetos), el buitre leonado (G. fulvus), la chova piquigualda (Pyrrhocorax graculus) o el roquero rojo (Monticola saxatilis). 5.2 Toma de muestras y recogida de información epidemiológica La recogida de muestras se realizó a principios de 2023 y se dividió en dos fases. En la primera fase se recogieron muestras de la Zona 1 durante cinco semanas desde febrero a marzo de 2023, y la segunda se llevó a cabo posteriormente en la Zona 2 durante cuatro semanas del mes de abril de 2023. En total se muestrearon 102 aves: 71 de la Zona 1 y 31 de la Zona 2. Las entradas de aves en los centros de recuperación pueden ser tanto de animales vivos como de cadáveres para ser practicada la necropsia. Al llegar al centro a cada animal se le asigna un número de entrada y es evaluado por los veterinarios encargados. Se tomaron muestras de las aves que ingresaron en el centro durante el período de recogida de muestras (vivas o muertas), así como de aves que ya estaban presentes en el centro al inicio del estudio. En el primer caso, se recogieron las muestras a la recepción de cada ave, durante el 20 reconocimiento veterinario, y en el segundo, en momentos en los que necesitaron ser manejadas por el personal del centro, con el objetivo de evitar estrés innecesario, como por ejemplo durante la realización de curas, muestreos rutinarios de influenza aviar, traslados a otros centros, o en liberaciones. La toma de muestras se realizó mediante hisopo cloacal de animales vivos, o bien durante las necropsias realizadas durante el período de recogida de muestras. Los hisopos se guardaron en medio Amies (Deltalab, Barcelona, España) y se mantuvieron en refrigeración hasta su envío al laboratorio. Con el objetivo de reducir la cantidad de envíos, las muestras se remitieron al laboratorio semanalmente, todos los lunes, enviando a la vez todas las muestras recolectadas durante la semana. Las muestras se transportaron en neveras equipadas con acumuladores de frío. Una vez en el laboratorio se procesaron en menos de 48 horas. Con cada muestra se registró el centro; el número de historia asignado; la fecha de ingreso del animal y de recogida de la muestra; el municipio donde el ave fue recogida; la especie; el sexo; la edad; la causa del ingreso; si se trataba de un animal vivo o de un cadáver; si había recibido algún tratamiento antibiótico en el mes anterior a la recogida de la muestra; y si presentaba signos de enfermedad. Para determinar el sexo se atendió a características externas relacionadas por ejemplo con el tamaño corporal o el diseño del plumaje (Ollé & Trabalon, 2019; Blasco-Zumeta & Heinz, 2023). Sin embargo, en algunos ejemplares vivos no fue posible determinar el sexo de esta forma ya que ciertas especies de aves (como el buitre leonado o la cigüeña blanca), no presentan dimorfismo sexual aparente, y se registró como “indeterminado”. No obstante, en algunos ejemplares de las especies sin dimorfismo sexual se pudo registrar el sexo ya que fueron sometidos a análisis genético para determinar el sexo por interés del centro. En cuanto a la edad, se usaron métodos de datación basados en las mudas del plumaje y las características de cada especie para determinar el año calendario en el que se encontraban las aves (Ollé & Trabalon, 2019; Blasco-Zumeta & Heinz, 2023). Cuando se habla de "año calendario" en la medición de la edad de las aves silvestres, se refiere al conteo de años completos según el calendario humano convencional, es decir, se considera que el primer año de vida de un ave comienza desde su nacimiento y continúa hasta el final del primer año calendario completo. Este enfoque de medición de la edad se utiliza comúnmente en estudios científicos y observaciones de aves, ya que facilita la comparación y el seguimiento de las edades de las aves en diferentes momentos y lugares. En consecuencia, los individuos se clasificaron en “0-1 años”: pollos nacidos esa misma primavera o para las aves en su segundo año calendario, “1-2 años”: aves en su tercer año calendario, y “2 años o más” para el resto, ya que en muchas especies a partir del tercer año calendario se alcanza el plumaje de adulto, lo que dificulta la 21 datación exacta de la edad. Para las aves en las que no fue posible establecer una edad se anotó como “indeterminado”. Sin embargo, es importante tener en cuenta que la madurez del animal puede variar según su ciclo de vida y desarrollo de la especie, por ello también se clasificó entre “pollos”, “juveniles”, y “adultos”, teniendo en cuenta que diferentes especies alcanzan la madurez y el plumaje de adulto en diferentes momentos (Tabla 4). Tabla 4: Año calendario en el que cada especie muestreada presenta el plumaje y las características físicas del adulto. FAMILIA ESPECIE EDAD ADULTA Accipitridae Gavilán común (Accipiter nisus), Aguilucho pálido (Circus cyaneus), Aguilucho lagunero (Circus aeruginosus) 3º año calendario Milano real (Milvus milvus), Milano negro (Milvus migrans), Busardo ratonero (Buteo buteo), Aguilucho cenizo (Circus pygargus) 4º año calendario Buitre leonado (Gyps fulvus), Buitre negro (Aegypius monachusi), Alimoche común (Neophron percnopterus) 5º año calendario Águila real (Aquila chrysaetos), Águila imperial ibérica (Aquila adalberti) 6º año calendario Falconidae Cernícalo vulgar (Falco tinnunculus), Cernícalo primilla (Falco naumanni), Esmerejón (Falco columbarius) 3º año calendario Strigidae Búho chico (Asio otus) 3º año calendario Búho real (Bubo bubo), Cárabo común (Strix aluco) 5º año calendario Ardeidae Garza real (Ardea cinerea), Garcilla bueyera (Bubulcus ibis) 3º año calendario Gruidae Grulla común (Grus grus) 3º año calendario Ciconiidae Cigüeña blanca (Ciconia ciconia) 3º año calendario Laridae Gaviota sombría (Larus fuscus) 4º año calendario Cuculidae Críalo europeo (Clamator glandarius) 3º año calendario Fringillidae Jilguero europeo (Carduelis carduelis) 3º año calendario Elaboración propia a partir de Ollé & Trabalon, (2019); Blasco-Zumeta & Heinz, (2023). 22 5.3 Análisis de laboratorio 5.3.1. Cultivo microbiológico Para identificar la presencia de E. coli e identificar las muestras portadoras de cepas productoras de BLEE cada hisopo se sembró en dos placas con medio de cultivo Triptona-Bilis-X-glucurónido (TBX) (Labbox, Barcelona). En una de las placas el medio se suplementó con cefotaxima diluida a una concentración de 2 mg/ml (TBX/CTX). El TBX es un medio enriquecido que contiene extracto de soja, tripticasa y otros nutrientes que favorecen el crecimiento bacteriano. Es un medio selectivo, ya que permite el crecimiento de enterobacterias e inhibe el crecimiento de bacterias Gram positivas, y diferencial para E. coli ya que contiene un compuesto cromogénico (5-bromo-4-cloro-3-indolol-β-D-glucurónico) que reacciona con la enzima 𝛃-D glucuronidasa que produce E. coli haciendo que las colonias de esta bacteria puedan ser diferencias por su color azul-verdoso, mientras que otras coliformes no presentan color (Figura 3). Por otro lado, la adición de cefotaxima, antibiótico de la familia de los betalactámicos (cefalosporina de tercera generación), solo permite el crecimiento de las colonias de E. coli resistentes a este tipo de antibióticos y se utiliza como screening marcador de la presencia de resistencias tipo BLEE (World Health Organization, 2021). De esta manera, el medio TBX nos permite hacer un screening visual de la presencia de E. coli en las muestras, y el medio TBX/CTX nos permite identificar si los E. coli presentes en la muestra son resistentes a CTX. Una vez inoculadas, las placas se incubaron durante 24 h a 37 ºC y se leyeron y se registraron los crecimientos. Figura 3: Cultivo de muestras en TBX/CTX con crecimiento de E. coli resistentes a cefotaxima (azules) y otras colonias (blancas). Fotografías propias. 23 Figura 7: Frecuencia de aislamiento de E. coli por especie. De esta manera, las especies con una representación de 10 o más individuos: buitre leonado, cigüeña blanca y busardo ratonero; muestran prevalencias muy altas (70 % - 86,4 %) (Figura 8). En el caso de los buitres leonados, la prevalencia hallada en nuestro estudio es de 83,3 %, en línea con lo descrito por Sevilla et al. (2020) en España para la misma especie (86,5 %). En cambio, en Francia se han descrito prevalencias menores de un 51 % (Haenni et al., 2023), estas diferencias pueden deberse tanto a la variación geográfica, como a distintos tipos de dieta, ya que el estudio de Francia se centraba únicamente en buitres que se alimentaban de cadáveres producto de la ganadería extensiva. También hay que tener en cuenta que gran parte de los buitres muestreados en la Zona 1 convivían en las mismas instalaciones por lo que es lógico que se transmitieran la bacteria entre ellos. De forma similar, respecto a las cigüeñas blancas, nuestros resultados (86,4 %) también concuerdan con lo anteriormente descrito en España (Martín-Maldonado et al. (2022) 95 %), así como los obtenidos en busardos ratoneros (70 %) con lo hallado por Radhouani et al. (2012) (85,7 %). 30 Sería interesante para estudios futuros que se incluyeran más número de muestras por especie a fin de caracterizar más correctamente la prevalencia de E. coli en otras especies diferentes. Figura 8: Prevalencia de E. coli en las especies más representadas. Las diferencias en la prevalencia de E. coli en cuanto al sexo, los grupos de edad y la procedencia de las muestras se pueden consultar en la Tabla 7. Encontramos una prevalencia general mayor en hembras que en machos, que también se cumple para la mayoría de las especies individuales en los que tenemos muestreados e identificados individuos de ambos sexos (buitres leonados, busardos ratoneros y milanos reales). En el resto la prevalencia está igualada entre sexos, aunque es cierto que el bajo número de individuos muestreados por especie puede ser una limitación a la hora de interpretar estos resultados. Esta es una variable que no hemos encontrado analizada en otros estudios, por lo que podría ser la primera vez que se describiera. Dada la mayor tendencia a portar E. coli vista en hembras sería interesante realizar otros estudios que profundizasen en los motivos de dicha disparidad, que podrían ser desde cuestiones genéticas a diferencias en las interacciones sociales y de comportamiento. En cuanto a la edad, no se observó una tendencia clara, pero resultó parecida y relativamente alta en todos los casos (Tabla 7). Otros estudios parecen indicar que los ejemplares más jóvenes tienen prevalencias menores, como es el caso del realizado por Guenther et al. (2012) que muestrearon pollos aún en el nido y encontraron un 38 % y 40,7 % en dos áreas distintas. También Zurfluh et al. (2019) describen prevalencias menores (53,7 %) en un estudio en el que el 83,4 % de las aves muestreadas eran pollos/juveniles. Esto se puede explicar por la mayor probabilidad de adquirir la bacteria con un mayor tiempo de vida. En nuestro estudio sólo se incluyó un pollo, el resto de la categoría de las aves más jóvenes (“0 a 1 año”) corresponden con aves de segundo año calendario; además, la gran mayoría de los positivos de esta categoría 31 (20/30) corresponden a buitres leonados que compartían las instalaciones, lo que ha podido influir en elevar esta prevalencia. Por último, contrasta con otros estudios nuestro gran número de aislamientos de colonias de E. coli procedentes de muestras recogidas en cadáveres; Yapicier et al. (2022) encontraron una prevalencia de 62,2 % en muestras de heces y de mucosa intestinal de cadáveres y Gargiulo et al. (2018) únicamente un 6,8 % en muestras de mucosa intestinal también en aves muertas. Los procesos de descomposición podrían modificar el ambiente intestinal favoreciendo la proliferación de la bacteria y, por tanto, su probabilidad de detección. Tabla 7: Frecuencia y prevalencia de E. coli en función de “Sexo”, “Edad” y “Procedencia” Variable Sexo Edad Procedencia Categoría Macho Hembra 0 a 1 años 1 a 2 años 2 años o más Vivos Cadáveres Positivos/N 24/36 31/35 30/37 8/9 34/50 51/75 24/27 Porcentaje 66,7 % 88,6 % 81,1 % 88,9 % 68 % 68 % 88,9 % Dado que las aves fueron recogidas en centros de recuperación, los animales podían haber sido sometidos a tratamientos antibióticos y esto podría alterar la capacidad de detección de E. coli. No obstante, solamente tres aves habían recibido tratamiento antibiótico en el mes previo a la recogida de las muestras. En todas ellas se administró amoxicilina, en un caso combinada con tobramicina, lo que no impidió que en las tres muestras hubiese crecimiento de E. coli en medio TBX. Por lo que podemos concluir que la administración de antibióticos no influyó de manera negativa a la hora de la recogida de las muestras. 6.3 Presencia de BLEE en las aves muestreadas En cuanto a la presencia de cepas de E. coli productoras de BLEE, se aislaron ocho colonias compatibles con crecimiento en medio TBX/CTX de siete aves diferentes, ya que en un ave se aislaron dos colonias que morfológicamente eran distintas (textura, tamaño, etc.), siendo ambas compatibles con E. coli. En seis de esas colonias, procedentes de seis aves diferentes, se detectaron genes codificantes de resistencias tipo BLEE, lo que supone un 5,9 % del total de las 102 aves y un 8 % de las aves portadoras de E. coli (6/75). Las cifras a nivel global en aves salvajes varían desde tan solo un 1,7 % de prevalencia en pollos en Suiza (Zurfluh et al., 2019), o 3,3 % en Grecia (Athanasakopoulou et al., 2022), hasta un 13,2 % en Italia (Prandi et al., 2023), 13 % en Brasil (De Jesus et al., 2019) o 26,9 % encontrada en Portugal en aves rapaces (Pinto et al., 2010). En España, la prevalencia encontrada en otros estudios es superior a la 32 nuestra. Alcalá et al. (2015) encontraron una prevalencia del 14 % y Oteo et al. (2018) del 8,7 %, los dos en la comunidad autónoma de Madrid. Ambos recogieron sus muestras en centros de recuperación de fauna al igual que nosotros y, como en nuestro estudio, no seleccionaron ninguna especie o familia de aves en concreto. Las aves en las cuales encontramos las cepas productoras de BLEE fueron una cigüeña blanca, una gaviota sombría, un búho real, dos buitres negros y un buitre leonado (Figura 9). Destaca que en todos los casos se trata de aves con hábitos fuertemente ligados a entornos humanizados, que llegan incluso a alimentarse de forma regular en vertederos, o bien de aves rapaces. Los hábitos de las primeras podrían haber facilitado la transmisión de estas cepas resistentes desde los humanos a las aves. Si bien es cierto que en nuestro estudio, a pesar de que las cigüeñas blancas (familia Ciconiidae) fueron una de las especies con mayor número de muestras, la prevalencia de BLEE fue muy baja (Tabla 8) en comparación con otros resultados que han llegado a describir un 44,4 % de prevalencia en esta especie (Alcalá et al., 2015), lo que pone de manifiesto la gran diferencia que se puede encontrar entre distintas zonas geográficas. También por estas razones la familia de las gaviotas (Laridae) ha sido sugerida como posible centinela para evaluar la contaminación del medio con cepas de E. coli resistentes a antibióticos (Stedt et al., 2014), y en España un 63,2 % de las E. coli aisladas en gaviotas procedentes del centro de España presentaban algún fenotipo resistente (Martín-Maldonado et al., 2022). Nuestro estudio solo incluye una gaviota, pero que la única muestreada sea portadora de una cepa productora de BLEE puede concordar con elevadas prevalencias en esta especie en nuestro país. Esto es compatible con los resultados obtenidos por Vergara et al., (2017) en Barcelona donde describieron una prevalencia de BLEE en gaviotas de 54,5 %, muy por encima de lo encontrado en otros puntos de Europa: 19 % (Veldman et al., 2013); 9,4 % (Bonnedahl et al., 2009). Ya se había descrito un gradiente creciente de norte a sur de Europa en la frecuencia de aparición de cepas resistentes en gaviotas, así como pasa en seres humanos y animales de producción (Stedt et al., 2014), quizás debido a un mayor uso de los antibióticos (Cars et al., 2001). Las aves rapaces son otro grupo de aves que también se han sugerido como posibles especies indicadoras de contaminación del medio con cepas resistentes a antibióticos debido a su posición en lo alto de la cadena trófica. No obstante, en nuestro estudio, si analizamos únicamente las rapaces muestreadas (familias Accipitridae,Strigidae yFalconidae), encontramos que solamente en 4/74 aves se detectó la presencia de cepas BLEE (5,4 %); una cifra muy inferior al 26,4 % encontrada en Portugal por Pinto et al. (2010). En otros estudios también se indicaron la presencia de prevalencias bajas, aunque ligeramente superiores: 13,8 % 33 en Alemania y 10,8 % en Mongolia descritos por Guenther et al. (2012). En nuestro país, Alcalá et al. (2015) encontraron un 10,8 % de BLEE en 74 rapaces muestreadas en la comunidad autónoma de Madrid. La mayor prevalencia observada por estos autores puede deberse a una densidad de población muy superior a nuestras zonas de estudio, que favorezcan una mayor frecuencia de contacto con aves silvestres y la contaminación de las aves con cepas resistentes. Estas densidades pueden ser más bajas en áreas con ganaderías más extensivas, lo que puede favorecer prevalencias menores de cepas resistentes. Esto es relevante ya que los cadáveres provenientes de la ganadería son una fuente importante de alimento para rapaces carroñeras como los buitres, que no solo aprovechan los cadáveres de la ganadería extensiva sino que muchas veces son alimentados en puntos de alimentación suplementarios conocidos como muladares con cadáveres provenientes de la ganadería intensiva. Hay que destacar que todas las colonias aisladas en medio TBX/CTX, es decir, con fenotipo resistente a cefotaxima, de la Zona 2 corresponden con buitres negros y leonados que ingresaron a la vez debido a una sospecha de intoxicación, así que podrían ser individuos que se moviesen normalmente juntos en busca de alimento y que se alimentaran de las mismas carcasas, lo que llevaría a una posible misma fuente de contaminación, o a una transmisión entre los individuos. Figura 9: Frecuencia encontrada de BLEE por especie. 34 Tabla 8: Prevalencias de E. coli y BLEE por familias de aves Familia n Prevalencia E. coli Prevalencia BLEE Accipitridae 63 71,4 % 4,8 % Ardeidae 2 50 % - Ciconiidae 22 86,4 % 4,5 % Cuculidae 1 0 % - Falconidae 4 50% - Fringillidae 1 0 % - Gruidae 1 100 % - Laridae 1 100 % 100 % Strigidae 7 85,7 % 14,3 % Las ocho cepas en las que se detectaron fenotipos compatibles con la presencia de BLEE fueron analizadas mediante PCR para identificar los genes responsables de la resistencia. La PCR puso de manifiesto la presencia de tres genes diferentes en el conjunto de las muestras analizadas: blaSHV (1), blaCTX-M (5) y blaTEM (4) (Tabla 9). Nuestros resultados indican una mayor prevalencia de CTX-M en aves silvestres, en concordancia con la mayoría de estudios a nivel mundial, en los que las CTX-M son también las más encontradas en aves silvestres (Pinto et al., 2010; Veldman et al., 2013; Oteo et al., 2018; De Jesus et al., 2019; Athanasakopoulou et al., 2022), pero también en humanos (Karanika et al., 2016). En España, las CTX-M en humanos también son las BLEE predominantes (Pérez et al., 2019), pero la prevalencia de la familia SHV aumenta con respecto a otros países. En concreto el gen blaSHV-12 es el más encontrado dentro de esta familia (Díaz et al., 2010). En nuestro estudio no hemos secuenciado las colonias resistentes encontradas, así que no podemos afirmar que sea este el gen que se encuentra circulando, pero su presencia será relevante ya que se ha descrito como causa importante de infecciones extra-hospitalarias en la comunidad (Díaz et al., 2010). Una mayor frecuencia de aparición de esta familia de BLEE en el ámbito de la medicina humana en nuestro país puede ser la causa de que en algunos estudios con aves silvestres este gen haya sido el más frecuente (Alcalá et al., 2015; Vergara et al., 2017). 35 No obstante, la presentación combinada de varios genes fue la situación más frecuente. La asociación descrita entre blaTEM con blaSHV o blaCTX-M ya ha sido descrita en otros estudios, apareciendo de esta manera más frecuentemente que en solitario (Alcalá et al., 2015; Vergara et al., 2017), de la misma manera que ocurre en este estudio. Tabla 9: Datos epidemiológicos asociados a las colonias de E. coli aisladas en medio TBX/CTX y resultado de PCR multiplex para genes codificantes de BLEE Zona Muestra Especie Genes implicados Sexo Edad Origen 1 8 Cigüeña blanca blaSHV y blaTEM Indeterminado 2o+ (Adulto) Ave viva 9 Búho real blaCTX-M Indeterminado 1 a 2 (Juvenil) Ave viva 55 Gaviota sombría blaCTX-M y blaTEM Macho 2o+ (Adulto) Ave viva 2 100 Buitre leonado blaCTX-M Hembra 2o+ (Adulto) Cadáver 101A Buitre negro negativo Indeterminado 1 a 2 (Juvenil) Ave viva 101B blaCTX-M y blaTEM 102 Buitre negro negativo Macho 1 a 2 (Juvenil) Cadáver 103 Buitre negro blaCTX-M y blaTEM Hembra 1 a 2 (Juvenil) Cadáver En dos de las ocho colonias compatibles obtenidas no fue posible identificar ninguno de los genes analizados en la PCR. Esto puede ser debido a la existencia de otros tipos de betalactamasas como son las AmpC para las cuáles la PCR utilizada no tiene capacidad de discriminación. Los resultados de nuestro estudio contribuyen a mejorar el conocimiento epidemiológico previo de la presencia de cepas de E. coli BLEE en las aves silvestres. La variedad geográfica en el muestreo y de especies analizadas nos proporciona una imagen preliminar general de la situación de este problema en las aves silvestres. Una de las principales limitaciones, típica de 36 este tipo de estudios, es el bajo número de muestras para ciertas especies de aves silvestres debido a las dificultades para la recolección de los ejemplares. Nuestros resultados pueden ayudar a la hora de identificar aquellas especies con mayores prevalencias para realizar caracterizaciones posteriores a mayor escala. Aunque las prevalencias han sido generalmente bajas, nuestros resultados ponen en evidencia la circulación de estas cepas y la existencia de diferentes genes de resistencia presentes en las aves silvestres. Las especies con presencia de cepas resistentes identificadas en este estudio (cigüeña blanca, gaviota sombría, búho real, buitre leonado y buitre negro) fueron especies cuyas características tróficas pueden favorecer el contacto con estas cepas, y está en consonancia con su posible rol como reservorios o indicadoras de presencia ambiental de cepas multirresistentes (Stedt et al., 2014; Viso, 2017; Suarez‐Pérez et al., 2021). Asimismo, las aves también pueden jugar un papel como diseminadoras geográficas de E. coli multirresistentes, de forma similar a como ocurre con otras enfermedades, aunque serían necesarios más estudios para caracterizar epidemiológicamente este hecho con más detalle. El análisis molecular de las cepas BLEE detectadas confirmó la presencia de varios genes de resistencia, también encontrados en otros estudios en aves silvestre. No obstante, a pesar de haber utilizado un diseño de PCR típico para este tipo de estudios, algunas cepas no pudieron caracterizarse correctamente, lo que sugiere la existencia de otros genes responsables de resistencias circulantes y unas relaciones epidemiológicas más complejas. Son necesarios más estudios que permitan caracterizar en más detalle la diversidad molecular de los elementos de resistencia de los E. coli circulantes en aves silvestres. 37 7. CONCLUSIONES 1. Nuestros resultados confirman una alta prevalencia de E. coli en los hisopos cloacales de aves silvestres. 2. En las zonas analizadas se detectancepas de E. coli productoras de BLEE en diferentes aves silvestres. 3. Las aves rapaces, en especial las carroñeras, o las aves ligadas a entornos humanizados presentan cepas de E. coli productoras de BLEE con mayor frecuencia. Esto añade más evidencia a su posible papel como indicadoras de contaminación ambiental y agentes de propagación de cepas resistentes, que deberían ser evaluados en futuros estudios. 4. Se encontró una alta diversidad de genes implicados en resistencias de tipo BLEE. La familia de BLEE CTX-M es la más frecuentemente encontrada, al igual que ocurre en medicina humana o en animales domésticos, lo que sugiere que las aves silvestres pueden actuar como reservorio de las mismas cepas que nos afectan a nosotros. 38 8. BIBLIOGRAFÍA Alcalá, L., Alonso, C. A., Simón, C., González-Esteban, C., Orós, J., Rezusta, A., Ortega, C., & Torres, C. (2015). Wild birds, frequent carriers of Extended-Spectrum Β-Lactamase (ESBL) producing Escherichia coli of CTX-M and SHV-12 types. Microbial Ecology,72(4), 861-869. https://doi.org/10.1007/s00248-015-0718-0 Allocati, N., Masulli, M., Alexeyev, M., & Di Ilio, C. (2013). Escherichia coli in Europe: an overview. International Journal of Environmental Research and Public Health,10(12), 6235-6254. https://doi.org/10.3390/ijerph10126235 Aslam, B., Khurshid, M., Arshad, M., Muzammil, S., Rasool, M., Yasmeen, N., Shah, T., Chaudhry, T. H., Rasool, M. H., Shahid, A., Xia, X., & Baloch, Z. (2021). Antibiotic Resistance: One Health One World Outlook. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology,11. https://doi.org/10.3389/fcimb.2021.771510 Athanasakopoulou, Z., Diezel, C., Braun, S. D., Sofia, M., Γιαννακόπουλος, Α., Monecke, S., Gary, D., Krähmer, D., Chatzopoulos, D., Touloudi, A., Birtsas, P., Palli, M., Georgakopoulos, G., Spyrou, V., Petinaki, E., Ehricht, R., & Billinis, C. (2022). Occurrence and characteristics of ESBLand carbapenemaseproducing Escherichia coli from wild and feral birds in Greece. Microorganisms,10(6), 1217. https://doi.org/10.3390/microorganisms10061217 Biran, D., & Ron, E. Z. (2018). Extraintestinal pathogenic Escherichia coli. En Current Topics in Microbiology and Immunology (pp. 149-161). https://doi.org/10.1007/82_2018_108 Blair, J. M. A., Webber, M. A., Baylay, A. J., Ogbolu, D. O., & Piddock, L. J. V. (2014). Molecular mechanisms of antibiotic resistance. Nature Reviews Microbiology,13(1), 42-51. https://doi.org/10.1038/nrmicro3380 Blasco-Zumeta, J., & Heinz, G.-M. (2023). Atlas de identificación de las aves continentales de la península ibérica (2.aed.). Tundra. Blount, Z. D. (2015). The unexhausted potential of E. coli.eLife,4. https://doi.org/10.7554/elife.05826 Bonnedahl, J., Drobni, M., Gauthier‐Clerc, M., Hernández, J., Granholm, S., Kayser, Y., Melhus, Å., Kahlmeter, G., Waldenström, J., Johansson, A., & Olsén, B. (2009). Dissemination of Escherichia coli with CTX-M type ESBL between humans and Yellow-Legged gulls in the south of France. PLOS ONE,4(6), e5958. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0005958 Bonnedahl, J., & Järhult, J. D. (2014). Antibiotic resistance in wild birds. Upsala Journal of Medical Sciences,119(2), 113-116. https://doi.org/10.3109/03009734.2014.905663 39 Poirel, L., Madec, J., Lupo, A., Schink, A., Kieffer, N., Nordmann, P., & Schwarz, Š. (2018). Antimicrobial resistance in Escherichia coli.Microbiology spectrum,6(4). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.arba-0026-2017 Poole, K. (2004). Resistance to Beta-Lactam antibiotics. Cellular and Molecular Life Sciences, 61(17). https://doi.org/10.1007/s00018-004-4060-9 Prandi, I., Bellato, A., Nebbia, P., Stella, M. C., Ala, U., Degerfeld, M. M., Quaranta, G., & Robino, P. (2023). Antibiotic resistant Escherichia coli in wild birds hospitalised in a wildlife rescue centre. Comparative Immunology Microbiology and Infectious Diseases,93, 101945. https://doi.org/10.1016/j.cimid.2023.101945 Radhouani, H., Poeta, P., Gonçalves, A., Pacheco, R., Sargo, R., & Igrejas, G. (2012). Wild birds as biological indicators of environmental pollution: antimicrobial resistance patterns of Escherichia coli and enterococci isolated from common buzzards (Buteo buteo). Journal of Medical Microbiology,61(6), 837-843. https://doi.org/10.1099/jmm.0.038364-0 Riley, L. W. (2020). Distinguishing pathovars from non pathovars: Escherichia coli. Microbiology spectrum,8(4). https://doi.org/10.1128/microbiolspec.ame-0014-2020 Rocha, D., De Oliveira Salle, F., Borges, K. A., Furian, T. Q., Nascimento, V. P. D., De Souza Moraes, H. L., & Salle, C. T. P. (2021). Avian pathogenic Escherichia coli (APEC) and uropathogenic Escherichia coli (UPEC): characterization and comparison. Journal of Infection in Developing Countries,15(07), 962-971. https://doi.org/10.3855/jidc.14217 Rodríguez-Beltrán, J., DelaFuente, J., León‐Sampedro, R., MacLean, R. C., & Millán, Á. S. (2021). Beyond Horizontal Gene transfer: The role of plasmids in bacterial evolution. Nature Reviews Microbiology,19(6), 347-359. https://doi.org/10.1038/s41579-020-00497-1 Sarowska, J., Futoma-Kołoch, B., Jama-Kmiecik, A., Frej−Mądrzak, M., Książczyk, M., Bugla-Płoskońska, G., & Choroszy−Król, I. (2019). Virulence factors, prevalence and potential transmission of extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolated from different sources: recent reports. Gut Pathogens,11(1). https://doi.org/10.1186/s13099-019-0290-0 Sato, G., Oka, C., Asagi, M., & Ishiguro, N. (1978). Detection of conjugative R plasmids conferring chloramphenicol resistance in Escherichia coli isolated from domestic and feral pigeons and crows. PubMed,241(4), 407-417. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/366994 SEO/BirdLife. (2011). Las áreas importantes para la conservación de las aves en España. https://seo.org/wp-content/uploads/2013/07/Manual-IBA-completo-Internet-1_B.pdf SEO/BirdLife. (2022). III Atlas de aves en época de reproducción en España. SEO/Birdlife. https://atlasaves.seo.org/ SEO/BirdLife. (2023). Informe sobre las causas de mortalidad no natural de avifauna en España. https://doi.org/10.31170/0092 46 Sevilla, E., Marín, C., Delgado-Blas, J. F., González‐Zorn, B., Vega, S., Kuijper, E. J., Bolea, R., & Jaime, R. C. M. (2020). Wild griffon vultures (Gyps fulvus) fed at supplementary feeding stations: potential carriers of pig pathogens and pig‐derived antimicrobial resistance? Transboundary and Emerging Diseases,67(3), 1295-1305. https://doi.org/10.1111/tbed.13470 Stafford, K. J., & Gregory, N. G. (2008). Implications of intensification of pastoral animal production on animal welfare. New Zealand Veterinary Journal,56(6), 274-280. https://doi.org/10.1080/00480169.2008.36847 Stedt, J., Bonnedahl, J., Hernández, J., McMahon, B. J., Hasan, B., Olsén, B., Drobni, M., & Waldenström, J. (2014). Antibiotic resistance patterns in Escherichia coli from gulls in nine European countries. Infection ecology & epidemiology,4(1), 21565. https://doi.org/10.3402/iee.v4.21565 Suarez‐Pérez, A., Corbera, J. A., González-Martín, M., & Tejedor-Junco, M. T. (2021). Multidrug-Resistant phenotypes of Escherichia coli isolates in wild canarian Egyptian vultures (Neophron percnopterus majorensis). Animals,11(6), 1692. https://doi.org/10.3390/ani11061692 Suvarna, K., Stevenson, D., Meganathan, R., & Hudspeth, M. E. S. (1998). Menaquinone (Vitamin K 2) Biosynthesis: Localization and characterization of the MENA gene from Escherichia coli.Journal of Bacteriology,180(10), 2782-2787. https://doi.org/10.1128/jb.180.10.2782-2787.1998 Tellería, J. L. (2004). Migración de aves en el Paleártico occidental: aspectos ecológicos y evolutivos. En La Ornitología hoy. Homenaje al profesor Francisco Bernis Madrazo (pp. 109-125). Editorial Complutense de Madrid. Tooke, C., Hinchliffe, P., Bragginton, E. C., Colenso, C. K., Hirvonen, V. H. A., Takebayashi, Y., & Spencer, J. (2019). Β-Lactamases and Β-Lactamase inhibitors in the 21st century. Journal of Molecular Biology,431(18), 3472-3500. https://doi.org/10.1016/j.jmb.2019.04.002 Veldman, K., Van Tulden, P., Kant, A., Testerink, J., & Mevius, D. (2013). Characteristics of Cefotaxime-Resistant Escherichia coli from wild birds in the Netherlands. Applied and Environmental Microbiology,79(24), 7556-7561. https://doi.org/10.1128/aem.01880-13 Vergara, A., Pitart, C., Montalvo, T., Roca, I., Sabaté, S., Hurtado, J. C., Planell, R., Marco, F., Ramírez, B. U., Peracho, V., Simon, M., & Vila, J. (2017). Prevalence of Extended-Spectrum-Β-Lactamaseand/or Carbapenemase-Producing Escherichia coli isolated from Yellow-Legged Gulls from Barcelona, Spain. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,61(2). https://doi.org/10.1128/aac.02071-16 47 Vidaña, B., Busquets, N., Napp, S., Pérez‐Ramírez, E., Jiménez‐Clavero, M. Á., & Johnson, N. (2020). The role of Birds of Prey in West Nile virus epidemiology. Vaccines,8(3), 550. https://doi.org/10.3390/vaccines8030550 Viso, S. (2017). Estudio de la fauna silvestre como reservorio de cepas de Escherichia coli productoras de betalactamasas de espectro extendido (BLEE) y del grupo clonal pandémico ST131 en el noroeste de España [Tesis doctoral]. Universidade de Santiago de Compostela. World Health Organization. (2021). WHO integrated global surveillance on ESBL-producing E. coli using a “One health” approach: implementation and opportunities. Yang, S., Lin, C., Aljuffali, I. A., & Fang, J. (2017). Current pathogenic Escherichia coli foodborne outbreak cases and therapy development. Archives of Microbiology,199(6), 811-825. https://doi.org/10.1007/s00203-017-1393-y Yapicier, O. Ş., Kandır, E. H., & Öztürk, D. (2022). Antimicrobial resistance of E. coli and Salmonella isolated from wild birds in a rehabilitation center in Turkey. PubMed,77(1), 257-267. https://doi.org/10.22092/ari.2021.356322.1823 Zurfluh, K., Albini, S., Mattmann, P., Kindle, P., Nüesch‐Inderbinen, M., Stephan, R., & Vogler, B. R. (2019). Antimicrobial resistant and extended‐spectrum Β‐lactamase producing Escherichia coli in common wild bird species in Switzerland. MicrobiologyOpen,8(11). https://doi.org/10.1002/mbo3.845 48