Anafilaxia por Vespa velutina nigrithorax: estudio molecular y su aplicación clínica

ESCUELA DE DOCTORADO INTERNACIONAL DE LA USC Virginia Rodríguez Vázquez Tesis doctoral Anafilaxia por Vespa velutina nigrithorax: estudio molecular y su aplicación clínica Santiago de Compostela, 2023 Programa de doctorado en Investigación Clínica en Medicina ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL (EDIUS) Tesis Doctoral Anafilaxia por Vespa velutina nigrithorax: estudio molecular y su aplicación clínica Virginia Rodríguez Vázquez ESCOLA DE DOUTORAMENTO INTERNACIONAL PROGRAMA DE DOUTORAMENTO EN INVESTIGACIÓN CLÍNICA EN MEDICINA SANTIAGO DE COMPOSTELA 2022 II III DECLARACIÓN DE LA AUTORA DE LA TESIS Doña Virginia Rodríguez Vázquez Presento mi tesis, siguiendo el procedimiento adecuado al Reglamento, y declaro que: a) La tesis abarca los resultados de la elaboración de mi trabajo. b) En su caso, en la tesis se hace referencia, a las colaboraciones que tuvo en este trabajo. c) La tesis es la versión definitiva presentada para su defensa y coincide con la versión enviada en formato electrónico. d) Confirmo que la tesis no incurre en ningún tipo de plagio de otros autores ni de trabajos presentados por mi para la obtención de otros títulos. En Santiago de Compostela, a 16 de diciembre de 2022 IV V AUTORIZACIÓN DE LA DIRECTORA Y TUTORA DE LA TESIS Anafilaxia por Vespa velutina nigrithorax: estudio molecular y su aplicación clínica Dª Carmen Vidal Pan INFORMA: Que la presente tesis, se corresponde con el trabajo realizado por Dª Virginia Rodríguez Vázquez, bajo mi dirección y tutorización, y a utorizo su presentación, considerando que reúne os r equisitos exigidos en el R eglamento de Estudios de Doctorado de la USC, y que como director de esta no incurre en las causas de abstención establecidas en la Ley 40/2015. De acuerdo con lo indicado en el Reglamento de Estudios de Doctorado, declara también que la presente tesis doctoral es idónea para ser defendida en base a la modalidad de Monográfica con reproducción de publicaciones, en los que la participación del doctorando/a fue decisiva para su elaboración y las publicaciones se ajustan al Plan de Investigación. En Santiago de Compostela, 16 de diciembre de 2022 VI VII DECLARACIÓN DE CONFLICTO DE INTERÉS Doña Virginia Rodríguez Vázquez, Declara no tener ningún conflicto de interés en relación con esta tesis doctoral. En Santiago de Compostela, 16 de diciembre de 2022 XIV XV Resumen Introducción. La Vespa velutina es una especie de himenóptero invasora procedente de Asia que, desde 2015, está provocando problemas de salud en nuestra población en forma de reacciones alérgicas graves. La falta de métodos diagnósticos y terapéuticos específicos condujo a la realización de los presentes estudios. Objetivo general. Estudiar el perfil de sensibilización alérgico de los pacientes que habían padecido una reacción alérgica grave, anafilaxia, tras la picadura de Vespa velutina, tratando de identificar los componentes moleculares implicados y comprobar una posible respuesta terapéutica con el veneno de una especie próxima filogenéticamente. Pacientes y Métodos. La Tesis se compone de 4 subestudios: 1. Estudio transversal de prevalencia de reconocimiento de IgE específica frente a venenos de himenópteros disponibles comercialmente en pacientes con anafilaxia por Vespa velutina. Se recogieron las variables epidemiológicas y clínicas y se realizó mediante ImmunoCAP® la determinación de IgE total y específica frente a venenos de Vespula vulgaris, Polistes dominula, Apis mellifera, Vespa crabro y Dolichovespula; así como frente a sus componentes moleculares (rApi m 1, rApi m 5, rApi m 10, rVes v 1, rVes v 5, rPol d 5 y CCD) y los niveles de triptasa basal. 2. Estudio transversal de reconocimiento de IgE específica a Vespa velutina y sus componentes moleculares nVesp v 1 y nVesp v 5 unidas a ImmunoCAP® activados con estreptavidina. Estudios de inhibición recíproca entre Vespa velutina y Vespula spp como método de identificación de sensibilizante primario. 3. Estudio transversal de la capacidad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes nVesp v 1 y nVesp v 5 medida mediante prueba de activación de basófilos con expresión de CD63 en la superficie de los mismos. Simultáneamente se realizó una revisión bibliográfica sobre la evidencia publicada con este método diagnóstico en la alergia al veneno de los himenópteros. 4. Estudio longitudinal de seguimiento de los cambios inmunológicos (IgE e IgG4 específicas) inducidos por el veneno de Vespula spp administrado a pacientes con anafilaxia por Vespa velutina. Resultados. Con un punto de corte de 0.35 kUA/L, el 100% de los pacientes presentan IgE positiva frente a Vespula spp, reconociendo principalmente rVes v 5. El componente molecular en Apis mellifera que es reconocido con más frecuencia es Api m 5, equivalente a Ves v 3 en los véspidos. Existe una muy buena correlación entre Vespa velutina, nVesp v 1 y nVesp v 5, con Vespula spp, Ves v 1 y Ves v 5, respectivamente. El veneno de Vespula spp inhibe la unión a la IgE del veneno de Vespa velutina por lo que Vespula spp se presenta como el sensibilizante primario. De los componentes moleculares de Vespa velutina, nVesp v 5 es el alérgeno mayor pues se detecta en más del 50% de la muestra. Por su parte, nVesp v 1, al contrario de lo que sucede con otras fosfolipasas A1 de venenos de himenópteros, es una molécula glicosilada. Respecto a la actividad biológica medida por medio de la expresión de CD63, tanto Vespa velutina como nVesp v 1 y nVesp v 5 son capaces de activar los basófilos, siendo mayor el XVI porcentaje de activación conseguido por el veneno completo. Por último, la inmunoterapia con veneno de Vespula spp administrada a los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina inducen cambios en los niveles de IgE (disminución) e IgG4 específica (aumento) que son más evidentes a los 12 meses de tratamiento. Conclusión general. Los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina presentan un elevado grado de reactividad cruzada con el veneno de Vespula spp que es, hasta la fecha, el sensibilizante primario, produciendo la inmunoterapia con Vespula spp cambios inmunológicos significativos en los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina. Palabras clave Anafilaxia. IgE. Vespa velutina. Vespula spp. Componentes moleculares. Estudios de inhibición. Activación de basófilos. CD63. IgG4. Inmunoterapia específica. XVII ÍNDICE Declaración de la autora de la tesis III Autorización de la directora y tutora de la tesis V Conflicto de interés de la autora VII Agradecimientos IX Estructura general de la tesis y rol de la doctoranda XI Aclaración sobre la terminología y abreviaturas empleadas XIII Resumen XV Índice XVII Índice de Figuras XX Índice de Tablas XXI Introducción 1 1. Los véspidos: una aproximación entomológica 3 2. Vespa velutina nigrithorax: una especie invasora 4 2.1. Ciclo biológico 5 2.2. Expansión de la Vespa velutina y sus consecuencias 7 3. Las picaduras de los himenópteros como causa de enfermedad 12 3.1. Tipos de manifestaciones clínicas tras la picadura de los himenópteros 12 3.2. Prevalencia de las reacciones adversas al veneno de los himenópteros 14 3.3. Historia natural y factores de riesgo en las reacciones por picaduras de himenópteros 15 3.4. Datos diferenciales en las picaduras que orientan al himenóptero implicado en la reacción 16 3.5. Componentes moleculares alergénicos del veneno de los himenópteros y detección de IgE específica frente a los mismos 18 3.6. No disponemos de IgE específica frente a Vespa velutina ni sus componentes moleculares 20 3.7. Se ha identificado el transcriptoma de Vespa velutina pero no se han identificado las moléculas alergénicas ni se dispone de vacuna para tratar a los pacientes 20 3.8. La prueba de activación de basófilos como método diagnóstico 20 4. Tratamiento específico de la alergia al veneno de los himenópteros: inmunoterapia 21 4.1. Elección del veneno 22 XVIII 4.2. Seguimiento de los pacientes 22 Justificación 25 Objetivos 29 Pacientes, Material y Métodos 33 1. Estudio del perfil de sensibilización de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina y su comparación con el perfil de pacientes con anafilaxia debida al veneno de otros himenópteros 35 1.1. Determinaciones 35 1.1.1. Cuaderno de recogida de datos (CRD) 35 1.1.2. Estudios de laboratorio 36 2. Identificación de Vesp v 1 y Vesp v 5 como alérgenos en la sensibilización al veneno de Vespa velutina 37 2.1. Determinaciones 37 2.1.1. Cuaderno de recogida de datos (CRD) 37 2.1.2. Estudios de laboratorio 38 3. Identificación de la actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares Vesp v 1 y Vesp v 5 mediante la prueba de activación de basófilos 39 3.1. Revisión de la utilidad de la prueba de activación de basófilos en el diagnóstico de la alergia al veneno de los himenópteros aplicado al seguimiento de la inmunoterapia específica con estos alérgenos 39 3.2. Metodología empleada en la prueba de activación de basófilos como medida de actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares 40 4. Seguimiento de la sensibilización mediada por IgE de los pacientes con anafilaxia por veneno de Vespa velutina y tratados con veneno de Vespula spp como medida de control de la respuesta inmunológica 42 4.1. Administración de inmunoterapia 42 4.2. Estudios de seguimiento de laboratorio 43 5. Análisis de los datos: estudio estadístico aplicado en los sucesivos estudios 43 6 Aspectos éticos y financiación 44 Resultados 45 1. Estudio del perfil de sensibilización de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina y su comparación con el perfil de pacientes con anafilaxia debida al veneno de otros himenópteros 47 1.1. Datos clínicos 48 1.2. Estudios de laboratorio 48 2. Identificación de Vesp v 1 y Vesp v 5 como alérgenos en la sensibilización al veneno de Vespa velutina 52 XIX 3. Identificación de la actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares Vesp v 1 y Vesp v 5 mediante la prueba de activación de basófilos 56 3.1. Revisión de la utilidad de la prueba de activación de basófilos en el diagnóstico de la alergia al veneno de los himenópteros aplicado al seguimiento de la inmunoterapia específica con estos alérgenos 57 3.2. La prueba de activación de basófilos como medida de actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares 59 4. Seguimiento de la sensibilización mediada por IgE de los pacientes con anafilaxia por veneno de Vespa velutina y tratados con veneno de Vespula spp 64 Discusión 67 1. Perfiles de sensibilización de los pacientes 69 2. Actividad biológica de Vespa velutina y sus componentes, Vesp v 1 y Vesp v 5, medida por activación de basófilos y utilidad general en el seguimiento de la alergia al veneno de los himenópteros 71 3. Evaluación de la gravedad clínica y seguimiento de la inmunoterapia específica 72 4. Fortalezas y limitaciones del estudio 74 Conclusiones 77 Bibliografía 81 Anexos Anexo I: Vía rápida de anafilaxia por veneno de himenópteros 93 Anexo II: Consentimiento Informado 97 Anexo III: Cuaderno de Recogida de Datos (CRD) 103 Anexo IV: Autorización del Comité Ético de Investigación de Galicia 109 Anexo V: Listado de verificación STROBE 113 Publicaciones 117 XX Índice de Figuras Figura 1. Variantes de coloración de Vespa velutina 4 Figura 2. Imagen de sendos ejemplares (macho y hembra) de Vespa velutina 5 Figura 3. Fotografía original de un nido secundario 6 Figura 4. Número de nidos de Vespa velutina identificados y retirados (2015-2018) 8 Figura 5. Recomendaciones para atrapar ejemplares de Vespa velutina 10 Figura 6. Cartel informativo de la Xunta de Galicia 11 Figura 7. Imagen de la forma del aguijón de abejas y avispas 17 Figura 8. Diferentes tipos de nidos construidos por véspidos 18 Figura 9. Diagrama de flujo de la selección de revisión bibliográfica 40 Figura 10. Porcentaje de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina con sIgE positiva a venenos de himenópteros 49 Figura 11. Porcentaje de inhibición de la unión de seuro al ImmunoCAP de Vespa velutina, Vesp v 5 y Vesp v 1 por el veneno de Vespula spp 54 Figura 12. SDS-PAGE teñido para detectar glicoproteínas 55 Figura 13. Representación y datos del porcentaje de activación de la expresión de CD63 en la superficie de los basófilos tras la exposición a Vespa velutina, Vesp v 1 y Vesp v 5. 60 Figura 14. Imagen del citómetro con resultados de 3 pacientes con distinto perfil de activación 63 Figura 15. Evolución de la sIgE y sIgG4 frente al veneno de Vespula spp y Vespa velutina tras inmunoterapia 64 XXI Índice de Tablas Tabla 1. Gravedad de la anafilaxia según Mueller 13 Tabla 2.Componentes alergénicos identificados en Apis mellifera, Vespula vulgaris y Polistes dominula 19 Tabla 3. Gravedad de la anafilaxia (adaptada de Brown) 36 Tabla 4. Cálculo del riesgo de padecer un síndrome de activación mastocitaria (REMA) 37 Tabla 5. Cuadro resumen de los reactivos utilizados en el TAB con Basotest-kit© 41 Tabla 6. Concentraciones del veneno Vespa velutina y sus componentes moleculares 42 Tabla 7. Datos clínicos de los pacientes estratificados por el insecto responsable 49 Tabla 8. Resultados de laboratorio de los pacientes en función del insecto responsable 50 Tabla 9. Cociente sIgE e IgE total en los pacientes del estudio 51 Tabla 10. Estudios de la inhibición de la unión de la IgE en 5 pacientes con anafilaxia por Vespa velutina 53 Tabla 11.Estudios de la inhibición de la unión de IgE a Vesp v 1 por CCD 52 Tabla 12.Resultados del laboratorio y datos clínicos de los pacientes incluidos en el estudio de TAB 59 Tabla 13.Resultados individuales de la prueba de TAB con el veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares 61 - 1 - INTRODUCCIÓN - 2 - - 9 - Las especies exóticas invasoras constituyen la segunda causa de la pérdida de biodiversidad en el mundo, tras la modificación del entorno. La Ley 42/2007, de 13 de diciembre, del Patrimonio Natural y de la Biodiversidad, define una especie exótica invasora como “aquella que se introduce o establece en un ecosistema o hábitat natural o seminatural y que es un agente de cambio y amenaza para la diversidad biológica nativa, ya sea por su comportamiento invasor, o por el riesgo de contaminación genética”. Se ha incluido a la Vespa velutina en el Catálogo Español de Especies Exóticas Invasoras (Real Decreto 630/2013, de 2 de agosto), y desde 2016 también en Europa, en el Listado de especies foráneas invasoras, lo que implica que “las especies no pueden ser importadas, criadas, transportadas, comercializadas, o intencionalmente liberadas en el entorno de la Unión Europea”. Las principales consecuencias de la invasión de Vespa velutina son: a) Ecológica, por su capacidad depredadora de los insectos polinizadores y de modificar la biodiversidad. La fuente proteica principal para las larvas de Vespa velutina son los himenópteros y los dípteros, mientras que recurren a azúcares como frutas maduras y néctar para cubrir sus necesidades energéticas [Muller et al., 2009]. Al igual que otros insectos invasores sociales, son muy eficientes por su gran plasticidad en el comportamiento gracias a sus habilidades cognitivas y de comunicación [D´Adamo & Lozada, 2011] lo que, como ya se ha comentado, les confiere mecanismos de defensa que les ayudan a sobrevivir [Couto et al., 2014]. Los odorantes más atractivos para Vespa velutina son la miel, el polen y el geraniol según se desprende del comportamiento de su en condiciones experimentales [Couto et al., 2014]. b) Económica, por su influencia en la actividad apícola y, posiblemente, en la agricultura. Debido a la depredación de abejas, la Vespa velutina ha producido un importante efecto en la industria apicultora. Una sola avispa puede capturar entre 25 a 50 abejas por día, atrapando inicialmente a las obreras, para después entrar a la colmena y proceder a la captura de las crías y a alimentarse de la propia miel. La Vespa velutina podría ser responsable de la pérdida de hasta un 65% de las colonias de abejas melíferas en zonas invadidas [Fedele et al. 2019]. Los niveles de depredación son más altos en la mañana y por la tarde, correspondiente al ritmo diario de los vuelos de las abejas. Además de su ataque directo, la Vespa velutina ha producido un cambio en el comportamiento de las colonias, que pasan menos tiempo alimentándose de néctar, conduciendo a un menor transporte de polen, por temor a ser víctimas de la Vespa velutina [Tan et al., 2013]. Menos se conoce del papel de la Vespa velutina sobre la polinización y su efecto en los productos agrícolas, pero se han señalado daños importantes en algunos cultivos de vid, manzana y arándanos, aunque estos efectos no se han cuantificado en términos económicos de una forma precisa [Jones et al., 2020]. c) Sanitaria, por los efectos de la inyección de veneno en las personas. La cepa importada en Europa no parece ser particularmente agresiva para el hombre [Villemant et al., 2006] y, así, se pueden observar los nidos a 4-5 metros de distancia sin riesgo de ataque. Sin embargo, y al igual que otros himenópteros sociales, pueden atacar en manada si perciben peligro para la supervivencia del nido. - 10 - El veneno de los himenópteros es una mezcla de compuestos de bajo peso molecular, péptidos y proteínas, que pueden actuar como feromonas, toxinas y alérgenos. Las feromonas de Vespa velutina que se liberan por las hembras para atraer a los machos homólogos favoreciendo la reproducción especie-específica [Cappa et al., 2019], no son peligrosas para los humanos [Cheng et al., 2017]. Los efectos de las toxinas son la principal causa de la mortalidad asociada a las picaduras de las avispas en China, especialmente cuando son múltiples [Xie et al., 2013]. Las toxinas de Vespa velutina se agrupan en 8 clases, siendo las neurotoxinas y las que alteran la hemostasia las más peligrosas. El efecto hemolítico es probablemente el principal factor letal del fallo multiorgánico producido por las picaduras de este himenóptero [Liu Z et al., 2015]. El fallo renal por necrosis tubular por rabdomiólisis o nefrotoxicidad aguda es más común tras picaduras múltiples de avispas [das RN & Mukherjee K, 2008; de Haro et al., 2010; Xie et al., 2013]. Consecuencia de todos estos efectos perjudiciales, se han desarrollado campañas específicas dirigidas a controlar, en la medida de lo posible, la expansión de este himenóptero [Jones et al., 2020; Leza et al., 2021]. Alguna de estas campañas en la Comunidad Autónoma de Galicia en donde este problema es, años tras año, más acuciante. En la Figura 5 y 6 se muestran dos ejemplos de este tipo de iniciativas. Figura 5. Recomendaciones para atrapar ejemplares de Vespa velutina distribuidos por la Xunta de Galicia (https://www.politecnicodesantiago.es/system/files/arquivos_dir/ficha_elaboracion_trampas_vespa_ve lutina.pdf) (acceso libre Xunta de Galicia) - 11 - Figura 6. Cartel informativo de la Xunta de Galicia (Convenio Xunta de Galicia con FEGAMP -Federación Gallega de Municipios y Provincias-) (acceso libre Xunta de Galicia). - 12 - 3. Las picaduras de los himenópteros como causa de enfermedad La inyección por parte del himenóptero del veneno que lleva en su saco puede producir reacciones diversas en los sujetos. 3.1. Tipos de manifestaciones clínicas tras la picadura de los himenópteros Las principales formas o fenotipos de reacciones adversas tras la inyección del veneno de un himenóptero son: a) Reacciones locales normales. Se trata de reacciones de inflamación y edema bien delimitado que se presenta en individuos no sensibilizados. Suele tratarse de reacciones de un tamaño inferior a 10 cm de diámetro mayor que tiende a ceder en 24-48 horas, aunque, si afecta a tejidos profundos y especialmente en las extremidades, puede ser más duradera. Es una reacción que se produce como consecuencia del contacto con los componentes vasoactivos del veneno. b) Reacciones locales extensas. Son reacciones inflamatorias que superan los 10 centímetros de diámetro mayor, aparecen tras 12 a 24 h y persisten varios días. En cara y extremidades pueden ser muy intensas, pudiendo sobrepasar las articulaciones proximales en miembros e incluaAso afectarlas por completo. En estos casos, a los síntomas locales pueden acompañarlos otros como malestar, mareo, fiebre o escalofríos. El mecanismo es inmunológico, y se ha sugerido que es una reacción inflamatoria tardía dependiente de IgE, pues en casi el 90% de los pacientes se detecta IgE específica sérica a algún componente del veneno [Bilò et al., 2005; Tripolt et al., 2020]. Estas reacciones locales extensas no son graves, salvo que se localicen próximas al territorio orofaríngeo o en cuello, ya que en ese caso podrían producir un estrechamiento de la vía aérea. Los pacientes deben saber que tienen alta probabilidad de desarrollar nuevas reacciones locales extensas en sucesivas picaduras, pero no existe información concreta que permita deducir el riesgo de una reacción sistémica en futuras exposiciones. Algunos autores estiman que hasta un 15% de los pacientes con reacciones locales extensas podrían presentar una reacción sistémica [Bilò & Bonifazi, 2009]. Estudios en vida real analizando repicaduras espontáneas, eleva la cifra a un 24%, con un riesgo mayor en los pacientes con IgE positiva a Apis mellifera y Vespula spp detectada por prueba cutánea (OR 2.1 y 3.8, respectivamente) y, particularmente, si el resultado es positivo a la concentración de 0.001 µg/mL (OR 13.4 y 16.5, respectivamente) [Bilò et al., 2019a]. Otros autores, sin embargo, discrepan de estos resultados e indican un menor riesgo de producir reacción sistémica si el sujeto ha padecido previamente una reacción local aumentada [Pucci et al., 2015]. c) Reacciones sistémicas alérgicas o mediadas por IgE. Se trata de reacciones en la que los pacientes presentan síntomas más allá de la zona de la picadura, pudiendo llegar a provocar una anafilaxia, shock e incluso muerte. En la mayoría de los casos son reacciones mediadas por IgE, debido a alergia a los componentes del veneno [Bilò & Bonifazi, 2009]. En función del número de órganos afectados y la presencia o no de compromiso vital, las reacciones sistémicas se clasifican por grados de gravedad. Las dos clasificaciones más utilizadas son la clasificación - 13 - de Mueller (Tabla 1) y la clasificación de Brown (clasificación utilizada en la presente Tesis Doctoral, ver Sección de Pacientes, Material y Métodos, Tabla 3). Hasta el 25% de las reacciones sistémicas se clasifican como graves [Ruëff et al., 2009]. La gravedad se asocia al compromiso respiratorio o cardiovascular, siendo las principales causas de muerte el edema de vía respiratoria superior, el broncoespasmo, y el colapso cardiovascular. Los síntomas más frecuentemente referidos son los cutáneos (prurito, eritema, urticaria, angioedema), y están presentes en el 80% de los adultos, y más en niños [Bilò et al., 2019a]. Le siguen en frecuencia los síntomas respiratorios que aparecen en la mitad de las reacciones sistémicas [Bilò et al., 2005]. La hipotensión es la manifestación cardiovascular más frecuente. Se produce por la vasodilatación y el aumento de la permeabilidad vascular secundaria a la liberación de los mediadores si bien podría ser debida a la disminución del gasto cardiaco por la hipoxia secundaria a la obstrucción bronquial. El mareo, las palpitaciones y la opresión torácica preceden habitualmente a la pérdida de conocimiento y al shock. La ausencia de manifestaciones cutáneas o respiratorios complica el diagnóstico diferencial. Esta forma de presentación con síntomas cardiovasculares aislados es más frecuente en adultos que en niños, y en pacientes con síndrome de activación mastocitaria [Bilò et al., 2019a]. Otras complicaciones cardiovasculares son la hipertensión, debido a las catecolaminas endógenas, la isquemia cardiaca y diferentes alteraciones del ritmo. En un tercio de las reacciones sistémicas refieren síntomas gastrointestinales como náuseas, dolor abdominal, o diarrea, generalmente en el contexto de una anafilaxia y con otros síntomas acompañantes. Más raramente aparecen manifestaciones del sistema neurológico, en forma de parestesias, cefalea, o convulsiones, y se han descrito contracciones uterinas en mujeres, incluso con sangrado [Bilò et al., 2005]. Es importante la vigilancia de reaparición de los síntomas, entre 4-12 horas después de la resolución del evento, pues en hasta un 14 % de las anafilaxias por alergia por veneno de los himenópteros son bifásicas [Bilò MB, et al., 2019a; Dribin et al., 2020]. Tabla 1. Gravedad de la anafilaxia según Mueller [Mueller et al., 1996]. Clasificación de las reacciones anafilácticas según su gravedad Grado I Urticaria generalizada, prurito, ansiedad y malestar general Grado II Angioedema (por sí solo), o cualquiera de las anteriores más dos de las siguientes: opresión torácica, nauseas, vómitos, diarrea, mareo, dolor abdominal Grado III Disnea, broncoespasmo, estridor, o cualquiera de las anteriores más dos de las siguientes: disfagia, disartria, disfonía, debilidad, confusión, sensación de muerte inminente Grado IV Cualquiera de las anteriores más dos de las siguientes: hipotensión, shock, pérdida de conocimiento, incontinencia de esfínteres, cianosis. Exitus - 14 - Un capítulo aparte lo constituyen las reacciones sistémicas por picaduras múltiples (más de 50 individuos) que son debidas a un efecto tóxico y no a una reacción alérgica. 3.2. Prevalencia de las reacciones adversas al veneno de los himenópteros Entre un 56.6% y un 94.5% de la población recuerda haber sufrido al menos una picadura de un himenóptero en su vida [Bilò & Bonifazi, 2009]. Por definición, y de acuerdo con el mecanismo fisiopatológico implicado en las reacciones de alergia, los pacientes alérgicos deben tener IgE específica frente al alérgeno que se supone responsable de la reacción. Además, y para poder desarrollar IgE específica, los sujetos deben exponerse a la fuente alergénica para que, de esa forma, se pueda producir el cambio de isotipo de las inmunoglobulinas. En la alergia al veneno de los himenópteros, igual que sucede con cualquier otro tipo de alergia, es imprescindible una exposición previa que se traduce en la necesidad de haber sufrido alguna picadura previa. Esta picadura sería la responsable de la producción de IgE específica. Se consideraría causa necesaria pero, a la vez, no suficiente y explica la alta prevalencia de sensibilización o presencia de IgE que no es paralea a la significación clínica. De esta forma, la IgE podría considerase como un marcador de exposición pues solo los sujetos expuestos y que han sufrido esa picadura previa pueden llegar a reaccionar posteriormente a picaduras subsiguientes. La prevalencia de determinación positiva de IgE frente a alguno de los componentes del veneno de los himenópteros se sitúa entre un 6 y un 20% de la población general por pruebas in vivo o in vitro, sin que haya presentado síntomas relevantes tras la picadura. Esta población se considera como “sensibilizados asintomáticos” [Schäfer & Przybilla, 1996; Nittner-Marszalska et al., 2004; Fernandez et al., 2005]. El riesgo de reacción entre la población con IgE positiva y la que no presenta esta sensibilización, es 9,5 veces mayor para la aparición de reacciones locales pero no se asocia a una mayor prevalencia de reacción sistémica [Sturm et al., 2014]. Tampoco se ha podido identificar factor alguno que permita predecir la aparición de una reacción futura en un paciente sensibilizado [Bilò & Bonifazi, 2009]. El aumento del nivel de IgE después de la picadura no fue un indicador de conversión en los sensibilizados asintomáticos, y las pruebas disponibles actualmente (pruebas cutáneas, IgE específica sérica, test de activación de basófilos) no pudieron distinguir entre sensibilización asintomática, y la aparición de reacción local extensa o reacción sistémica [Sturm et al., 2014]. La situación es aún más complicada cuando se analiza que hasta la mitad de los sujetos con reacciones sistémicas fatales no tenían antecedente documentado de alergia al mismo insecto [Bilò & Bonifazi, 2009; Xu et al., 2014; Mullins et al., 2016]. La alergia al veneno de los himenópteros es una causa frecuente de anafilaxia, ocupando el tercer lugar tras la alergia a los alimentos y a los medicamentos, en la mayoría de las series [Muraro et al., 2014; Grabenhenrich et al., 2016]. Se estima que entre un 0.3 y un 7.5% de la población adulta y un 3.4% de la población en edad pediátrica han padecido una reacción sistémica por alergia al veneno de los himenópteros [Bilò & Bonifazi, 2009]. En las últimas décadas se ha producido un incremento de las visitas a urgencias por anafilaxia debido a las picaduras de los himenópteros [Estelle et al., 2015], siendo culpables del 10-20% de los casos totales de anafilaxia, aunque en los registros europeos se sitúa próximo al 50% de los casos en adultos [Worm et al., 2014; Grabenhenrich et al., 2016]. - 15 - La prevalencia global aumenta con el número de picaduras que recibe una persona, y así, en apicultores puede superar al 30 % de la población estudiada [García-Robaina et al., 1997; Ediger et al., 2018]. Las reacciones sistémicas son más frecuentes en población adulta que en joven y se ha observado una preponderancia del sexo masculino de aproximadamente 2:1 [Fernández et al., 2005; Golden et al., 2011], hallazgos probablemente debidos también a una mayor exposición y mayor número de picaduras a lo largo de la vida. Existe una mayor prevalencia en habitantes de zonas rurales, unas 2.69 veces más que en zonas urbanas [Grigoreas et al., 1997]. Respecto a la atopia, se ha encontrado que el riesgo de desarrollar una reacción sistémica es mayor en atópicos [Schäfer & Przybilla, 1996; Münstedt et al., 2008] y la probabilidad aumenta cuantas más enfermedades atópicas estén presentes en el individuo [Celikel et al., 2006], aunque hay estudios que no han encontrado esta asociación. Otro factor que influye en el resultado de los estudios de prevalencia es el criterio empleado para diagnosticar una reacción alérgica, dependiendo si se emplea un cuestionario o se utilizan pruebas diagnósticas de confirmación, como son las pruebas cutáneas y serológicas. Con estos condicionantes, en España, la prevalencia de reacción sistémica se sitúa entre el 2.3% [Navarro et al., 2004] y el 2.8% [Fernández et al., 2005] en población general y rural, respectivamente. La prevalencia de reacciones locales extensas se sitúa entre el 5.3% en población general [Navarro et al., 2004] y el 15.8% en población rural [Fernández et al., 2005]. La incidencia de mortalidad tras una picadura de un himenóptero parece ser baja, en un rango de 0.03 al 0.48 muertes por millón de habitantes al año [Bilò & Bonifazi, 2009], pero probablemente esté subestimada o mal documentada. De hecho, hasta el 23% de sueros analizados post mortem de decesos súbitos e inexplicables ocurridos en exterior, en los meses de mayo a noviembre presentaban IgE específica positiva lo que podría orientar a una posible causa [Schwartz et al., 1986]. Tras el análisis de los registros oficiales de 32 países europeos, se estima una mortalidad asociada a picaduras de himenóptero (abejas, avispas, y avispones) para el periodo entre 1994-2016, de 0.26 (02.24) por millón de habitantes [Feás et al., 2022]. En España la mortalidad por picaduras de himenópteros en los últimos 20 años (n=78) se asoció estrechamente al género masculino (85.9%), edad mayor a 65 años (52.6%), y a los meses de julio y agosto (50%). En esta revisión, Galicia es la comunidad con mayor número de casos (35.8%), y con la mayor incidencia (2.22 por millón de habitantes en el año 2018), produciéndose 8 muertes para el periodo 2014-2018 [Feás, 2021]. 3.3. Historia natural y factores de riesgo en las reacciones por picaduras de himenópteros Conocer la historia natural de la alergia al veneno de los himenópteros es fundamental para evaluar el riesgo de un alérgico ante una nueva picadura y tomar la decisión de iniciar o no una inmunoterapia específica. Teniendo en cuenta que el 60% de los pacientes que han presentado una reacción sistémica, repetirán reacción de igual o superior gravedad en caso de una nueva picadura, la protección que la inmunoterapia específica confiere resulta fundamental [Bonifazi et al., 2005]. En un estudio observacional multicéntrico sobre 962 pacientes con alergia confirmada al veneno de abeja o avispa que habían padecido una reacción sistémica tras la picadura espontánea, la frecuencia de presentación de una nueva reacción sistémica fue significativamente - 16 - mayor en los sujetos con valores de triptasa sérica más elevados [Bonadona et al., 2009; Ruëff et al., 2009]. Otros factores identificados en dicha serie fueron la alergia al veneno de véspidos, la edad avanzada, el sexo masculino, el uso de IECAs (inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina) y el antecedente de reacciones sistémicas [Ruëff et al., 2009]. Llama la atención el hecho de que el tiempo transcurrido entre dos picaduras influye de manera inversa en el riesgo de desarrollar una nueva reacción sistémica. El 60% de los pacientes con una reacción sistémica había padecido una picadura en los dos meses previos con buena tolerancia [Pucci S et al., 1994]. En relación con esto, y en caso de múltiples picaduras consecutivas en un intervalo corto de tiempo se podría ejercer un efecto de protección al inducir tolerancia por un mecanismo equiparable al que se trata de inducir con la inmunoterapia específica [Carballada et al, 2011; Carballo et al., 2017]. A modo de resumen se podrían establecer como factores de riesgo que influyen en la gravedad de una reacción a la picadura de un himenóptero en los pacientes sensibilizados los siguientes: 1. Grado de exposición, definido por la profesión y el medio en que vive en paciente. Los pacientes que viven o trabajan en el medio rural tienen más probabilidades de ser picados en reiteradas ocasiones [de la Torre-Morin F et al., 1995; Carballada et al, 2011; Carballo et al., 2017]. 2. Gravedad de la reacción previa. A mayor gravedad previa, mayor probabilidad de reacciones de igual o mayor gravedad que la anterior. 3. Edad. En niños, las reacciones sistémicas son raras, de intensidad leve en un 0.9-3.4%. y en menos del 1% son graves [Jennings et al., 2010]. El pronóstico en los niños es mejor que en los adultos, ya que la mayoría de ellos con reacciones sistémicas superan su alergia a los himenópteros espontáneamente. Solo en el caso de una reacción sistémica grave, la probabilidad de repetir una reacción de similar gravedad con la repicadura aumenta [Lange et al., 2016]. Según datos del registro europeo [Worm et al., 2014], la alergia a los himenópteros es la segunda causa de anafilaxia en niños (20%), tras la alergia a los alimentos. 4. Triptasa basal elevada y posibilidad de padecer una mastocitosis indolente o un síndrome de activación mastocitaria [Bonadona et al., 2009]. 5. Comorbilidades del paciente. El empleo de fármacos beta-bloqueantes o IECAS, enfermedades cardíacas o pulmonares previas aumentan la gravedad de la reacción. 3.4. Datos diferenciales en las picaduras que orientan al himenóptero implicado en la reacción En la evaluación de los pacientes que han sufrido reacciones sistémicas tras la picadura de los himenópteros, resulta fundamental la correcta identificación del insecto por parte del paciente. Curiosamente, para el caso de las picaduras por Vespa velutina, los pacientes muestran un elevado grado de identificación, probablemente, por la publicidad que se ha hecho de las mismas, el trabajo o vivienda en el medio rural y el tamaño y características morfológicas propias de este himenóptero. - 17 - Algunos pacientes muestran dificultades en la identificación de véspidos comunes, como los del género Polistes o Vespula pues sus rasgos diferenciales son más sutiles. Por ejemplo, los himenópteros del género Polistes tienen en el abdomen un estrechamiento suave y progresivo mientras que en las Vespula es muy marcado y brusco. El vuelo de Polistes es lento y, característicamente, siempre llevan las patas traseras colgando (https://www.seaic.org/alergia-abejas-y-avispas/vespidos-sociales-en-europa/clavesde-especies/genero-vespa-y-vespula). La época del año en que se ha producido la picadura puede ayudar en la identificación, pues Polistes aparecen en primavera y verano mientras que la Vespula suelen aparecer en agosto y resiste mejor a las inclemencias climatológicas, sobreviviendo hasta ya iniciado el invierno. En caso de dudas en la diferenciación de las superfamilias Vespidae y Apidae, el aguijón puede orientar al agente causal. Mientras que en las avispas es liso y permite que un mismo individuo pueda picar varias veces, en las abejas es aserrado y queda clavado en el punto de picadura produciendo la evisceración del insecto al levantar éste el vuelo. El aguijón es el aparato ovopositor modificado de las hembras, que usan tanto para atacar como para defenderse de sus potenciales enemigos (Figura 7). Figura 7. Imagen de la forma del aguijón de abejas y avispas tomada de: https://es.wikihow.com/tratar-una-picadurade-abeja-o-de-avispa, con acceso abril 2019) (Creative commons BY-NC-SA 3.0) La forma del aguijón y el hecho de que quede o no clavado en la piel del sujeto al que han picado tiene, además, consecuencias en la cantidad de veneno inyectado. Así, la cantidad de veneno que suelen inocular las abejas es más o menos constante y de alrededor de unos 40-50 µg. Por su parte, las avispas al poder picar a más de una persona inyectan una cantidad variable de veneno. Por último, la posibilidad de sobreinfección es más alta con las picaduras de avispas que con las de las abejas. En ocasiones, los pacientes son capaces de identificar el tipo de nido o colmena en donde se encontraba el insecto (Figura 8) pero, en otras, la picadura ocurre en un lugar geográfico alejado del propio nido. - 18 - Figura 8. Diferentes tipos de nidos construidos por véspidos. Reproducido con permiso de su autor (Antonio Martínez Pernas. www.cousasdonorte.com). 3.5. Componentes moleculares alergénicos del veneno de los himenópteros y detección de IgE específica (sIgE) frente a los mismos El veneno de los himenópteros es una mezcla de compuestos de bajo peso molecular, péptidos y proteínas/glicoproteínas. Los componentes de baja masa molecular (aminas, azúcares, aminoácidos…) son el 20-25 % del peso seco, y no suelen ser alergénicos. Sin embargo, estas aminas causan vasodilatación y aumento de la permeabilidad vascular, con una reacción inflamatoria local normal, que puede facilitar la sensibilización al favorecer la absorción de proteínas y la distribución del veneno por todo el cuerpo de la víctima. Los compuestos de masa molecular elevada, péptidos y proteínas, producen diferentes efectos: tóxico, quimiotáctico, antibacteriano, enzimático… y algunos de ellos son alergénicos. La composición del veneno puede variar entre los individuos en función de la casta, edad, y época del año. Se conoce mejor el veneno de las abejas que el de las avispas. Las principales proteínas alergénicas identificadas en los venenos de abejas y avispas se recogen en la Tabla 2. Respecto al veneno de abeja, y en concreto para la especie dominante europea Apis mellifera, los péptidos predominantes son la apamina, una neurotoxina, y la melitina (denominado Api m4), que produce contracción muscular y es una de las causas del dolor provocado por la picadura. Muchos de los componentes de masa molecular elevada son enzimas (como la fosfolipasa y hialuronidasa) que permiten la penetración del veneno en tejidos, siendo la fosfolipasa A2, la más abundante y el alérgeno mejor conocido (Api m 1). Otras enzimas alergénicas son la hialuronidasa (Api m 2), la fosfatasa ácida (Api m 3), y la dipeptidilpeptidasa IV (Api m 5). Actualmente se han identificado 5 alérgenos mayores, Api m 1, Api m 2, Api m 3, Api m 5, y Api m 10 (icarapina), con reconocimiento de sIgE en más del 50% de los sueros de alérgicos a veneno de abeja. - 25 - JUSTIFICACIÓN - 26 - - 27 - La alergia al veneno de Vespa velutina es un problema emergente y potencialmente grave para el que no se dispone de las herramientas diagnósticas y terapéuticas específicas que sí existen para la alergia a otros himenópteros. Resulta de especial interés, desde el punto de vista alergológico, realizar un estudio de sensibilización alérgica de los pacientes que sufren una anafilaxia tras la picadura de uno de estos himenópteros con el fin de reconocer el componente molecular responsable, su grado de similitud con los componentes moleculares de otros himenópteros mejor estudiados con finalidad tanto diagnóstica como terapéutica. - 28 - - 29 - OBJETIVOS - 30 - - 31 - 1.Objetivo principal El objetivo principal es conocer el perfil molecular de sensibilización sIgE que presentan los pacientes que han padecido una reacción sistémica alérgica tras la picadura de Vespa velutina. 2.Objetivos secundarios 1. En pacientes con anafilaxia por alergia al veneno de los himenópteros, conocer la proporción de sIgE que va dirigida frente a los componentes moleculares disponibles (Api m 1, Api m 5, Api m 10, Ves v 1, Ves v 5, Pol d 5) respecto a la IgE que se dirige al veneno total de Vespula, Vespa crabro o Dolichovespula 2. Investigar la relación de la sensibilización mediada por IgE frente a los componentes moleculares disponibles con el antecedente de picaduras previas, grado de exposición, el sexo, la edad, el hábitat y la presencia de sIgE frente a CCDs. 3. Identificar cual de estos componentes moleculares es capaz de producir mayor sIgE en los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina. 4. Disponer de veneno de Vespa velutina para poder determinar la existencia o no de sIgE frente al mismo en los pacientes con anafilaxia tras la picadura de este himenóptero y, en su caso, identificar sus componentes moleculares más relevantes. 5. Conocer la actividad biológica del veneno de Vespa velutina de forma indirecta a través de la activación de los basófilos de sujetos con anafilaxia por este himenóptero. 6. Evaluar la respuesta al veneno de Vespula spp en términos de evolución clínica e inmunológica (sIgE y sIgG4) en pacientes con anafilaxia por Vespa velutina durante el primer año de inmunoterapia. - 32 - - 33 - PACIENTES, MATERIAL Y MÉTODOS - 34 - - 41 - 3.2. Metodología empleada en la TAB como medida de actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares Estudio realizado de forma prospectiva sobre 10 nuevos pacientes diagnosticados de anafilaxia tras la picadura de Vespa velutina en el Servicio de Alergología de la EOXI de Santiago de Compostela, entre diciembre de 2020 y febrero de 2021. Se trató de 10 varones con una edad mediana de 57 años (rango, 26-81 años) que vivían en el medio rural con alto nivel de exposición. Los pacientes referían una reacción de anafilaxia que había ocurrido antes de 30 minutos tras la picadura de una mediana de dos Vespa velutina (rango, 1-13) y frente a los que se había demostrado la existencia de sIgE positiva al veneno de Vespa velutina y/o alguno de sus componentes moleculares nVesp v 1 o nVesp v 5. Las TABs se realizaron entre 3 y 4 meses tras la reacción anafiláctica y se utilizó para ello el kit comercial BASOTEST® (Celonic™ Deutschland) que detecta la traslocación de CD63 desde los lisosomas citoplasmáticos a la superficie de los basófilos en muestras de sangre heparinizada, siguiendo la siguiente metodología: En el BASOTEST Kit® se determina el porcentaje de granulocitos basófilos CD63 +, que se han degranulado tras la incubación con el alérgeno o fMLP (N-formilmetionil-leucilfenilalanina) La prueba requiere de la presencia de controles de activación positivos y negativos. El control negativo mide la activación basal, que sería óptima entre 1.8-9.5 5%, según información del kit. Como control negativo se empleará el PBS (Phosphate-BufferedSaline). El control positivo trata de medir la capacidad de los basófilos de responder a estímulos. En el BASOTEST Kit® se utiliza el fMLP, que activa a los basófilos por la vía de las fosfolipasas C y las MAPK y no por IgE. El porcentaje de basófilos activados con el control positivo debe ser entre 25.2 y 59.5%, según la información del fabricante. Se estima que entre un 10 y un 15% de los individuos son no respondedores [Hoffmann et al., 2015]. En la Tabla 5 se muestran los reactivos empleados en el estudio, incluyendo los propios del BASOTEST Kit® y los venenos de Vespa velutina y sus componentes moleculares identificados. Tabla 5. Cuadro resumen de los reactivos utilizados en el TAB con BASOTEST kit®. REACTIVOS CONTROL POSITIVO fMLP (N-formilmetionil-leucil-fenilalanina) CONTROL NEGATIVO PBS: Suero salino buffer fosfato MARCADORES DE ACTIVACIÓN CD63 MARCADORES IDENTIFICACIÓN BASÓFILOS Anti-IgE-PE conjugada con ficoeritrina Anti-CD63-FITC conjugado con fluoresceína REACTIVOS DE Vespa velutina nVesp v1, nVesp v5, Veneno completo de Vespa velutina - 42 - - Etapas del procedimiento Tras la extracción de sangre completa en tubos con heparina litio a los pacientes del estudio, se trasladaron los tubos de forma inmediata desde el Hospital de Conxo al Laboratorio de Inmunología en el Hospital Clínico de la EOXI de Santiago. La extracción en tubos con heparina es fundamental pues otros anticoagulantes como el EDTA o ácido cítrico provocarían interferencias con la consiguiente disminución de la activación celular. Una vez en el laboratorio, se siguieron los pasos indicados en el procedimiento por el fabricante, incluyendo la preparación de los extractos problema cuyas concentraciones se recogen en la Tabla 6, la identificación de los basófilos, la incubación y procesado final con el análisis de las células en el citómetro de flujo, utilizando luz de excitación azulverde (láser de ion argón de 488 nm), utilizando un FACScan™ (Sistema de Inmunocitometría Becton-Dickinson) y el software CellQuest™. Tabla 6. Concentraciones del veneno de Vespa velutina y de sus componentes moleculares empleados en el estudio. Concentración Vespa velutina nVesp v 1 nVesp v 5 10 µg/mL 10 ng/mL 10 ng/mL 1 µg/mL 1 ng/mL 1 ng/mL 0.1 µg/mL 0.1 ng/mL 0.1 ng/mL 0.01 µg/mL 0.01 ng/mL 0.01 ng/mL Los resultados del TAB se expresaron, en este estudio, como reactividad o número de basófilos respondedores (CD63+) tras el estímulo con el alérgeno, correspondiendo a la máxima respuesta alcanzada tras llegar a un plateau en una curva dosis-respuesta con diferentes concentraciones. Se considera positiva toda activación que incremente en un 15% los basófilos activados. Cinco individuos sanos (4 atópicos y uno no atópico) con antecedentes negativos de alergia al veneno de los himenópteros y ausencia de sIgE fueron reclutados como controles. 4. Seguimiento de la sensibilización mediada por IgE de los pacientes con anafilaxia por veneno de Vespa velutina y tratados con veneno de Vespula spp como medida de control de la respuesta inmunológica Estudio realizado de forma prospectivo en 46 pacientes diagnosticados de padecer una anafilaxia por alergia al veneno de Vespa velutina que iniciaron inmunoterapia con veneno de Vespula spp entre noviembre de 2019 y mayo de 2020. La selección del veneno se realizó por el reconocimiento de sIgE frente al veneno de Vespula spp y al no - 43 - disponer comercialmente de un veneno de Vespa velutina aprobado por la AEMPS (Agencia Española del Medicamento y Productos Sanitarios) para su uso en esta población. Si bien la muestra de pacientes que se encuentran, actualmente, en seguimiento con esta inmunoterapia es superior, el estudio se realizó con determinaciones seriadas en estos pacientes. La mediana de edad de la muestra fue de 61 años (rango, 20-78 años) y 39 (84.8%) eran hombres. La mayoría de los pacientes (93.5%) informaron picaduras previas de Vespula spp y/o Apis mellifera (31, 67.4%) y solo 10 (21.7%) informaron picaduras previas por Vespa velutina. 4.1. Administración de inmunoterapia El veneno de Vespula spp (Pharmalgen® ALK), se administró en un programa clúster de inducción de cinco dosis y 2 días. El día 0, los pacientes recibieron inyecciones subcutáneas (10 μg, 20 μg y 30 μg) del extracto de veneno (vial 4 a una concentración de 100 μg/mL) en brazos alternos a intervalos de 30 minutos para las dos primeras dosis, y con observación de 60 minutos tras la tercera dosis. El día 7, cada paciente recibió dos inyecciones subcutáneas con 50 μg en brazos alternos a intervalos de 60 minutos. Esto fue seguido por la administración mensual de 100 μg de extracto del veneno de Vespula spp. 4.2. Estudios de seguimiento de laboratorio - Determinaciones de sIgE y sIgG4: se midieron sIgE y sIgG4 frente a Vespa velutina (disponible comercialmente como «alérgeno de investigación U1223», Thermo Fisher Scientific™ desde mayo de 2020) y Vespula spp, utilizando el sistema ImmunoCAP-250™ (Thermo Fisher Scientific™™) antes de iniciar la inmunoterapia con alérgenos, y 6 y 12 meses después. 5. Análisis de los datos: estudio estadístico aplicado en los sucesivos estudios Los datos fueron analizados usando el software Statistical Package for Social Sciences (SPSS, Chicago, USA). Los pacientes con valores perdidos no fueron eliminados del estudio por lo que, en las tablas, se especifica sobre cuántos pacientes se ha realizado cada determinación en función de la disponibilidad del dato. Estadística descriptiva: Las variables categóricas se representaron por su número absoluto y su porcentaje. Para las variables cuantitativas, dada la distribución no-normal en la gran mayoría de ellas, se utilizó la mediana como representación de la tendencia central y los intervalos (rangos, intercuartil o absoluto) como representación de la dispersión. Estadística analítica: Para la comparación de proporciones se utilizó la prueba de Chicuadrado con corrección de Yates, cuando fue necesario. La prueba de Chi-cuadrado de - 44 - tendencia se empleó para investigar las tendencias de proporciones relativas a variables independientes en categorías ordinales. Para la comparación de variables numéricas emplearon pruebas estadísticas no paramétricas. Para la comparación de dos grupos independientes se empleó el test de Mann-Whitney. Se utilizó la prueba de Wilcoxon para comparar muestras pareadas. Se empleó el test de Jonckheere-Terpstra para el análisis de tendencia de una variable numérica entre más de dos categorías ordinales. Se utilizó la prueba de rangos de Spearman para evaluar la correlación entre variables. Para los análisis multivariantes, se establecieron modelos de regresión múltiple. Cuando la variable dependiente era cuantitativa se emplearon modelos de regresión lineal. Dada la distribución no-normal de la IgE sérica, se procedió a su transformación logarítmica previa para garantizar el ajuste a la normalidad entre los requerimientos del modelo. Cuando la variable dependiente fue categórica binaria, se emplearon modelos de regresión logística. Cuando alguna de las covariables era categórica con más de dos categorías, se diseñaron variables dummy para las mismas, estableciendo previamente la categoría de referencia. En todos los modelos se forzó la entrada de las covariables en la ecuación. Se consideraron significativos los valores de P menores de 0.05. Se aportaron siempre los valores exactos de P. 6. Aspectos éticos y financiación El presente estudio fue aprobado por el Comité Ético de Investigación Clínica (CEIC) de Galicia (Sección Santiago-Lugo) con el código 2018-622 (Anexo IV). El Proyecto se realizó respetando la Declaración de Helsinki de la Asociación Médica Mundial de 1964 y la ratificación de las siguientes asambleas, la Orden SCO/256/2007, por la que se establecen los Principios y las directrices detalladas de Buena Práctica Clínica, el Convenio relativo a los derechos humanos y a la Biomedicina (Oviedo, 1997), la Ley 14/2007 de Investigación Biomédica, la Ley 3/2018 de Protección de Datos de Carácter Personal y Derechos Digitales, la Ley 41/2002 (Básica Reguladora de la Autonomía del Paciente y de Derechos y Obligaciones en Materia de Información y Documentación Clínica), la Ley 3/2001 (Reguladora del Consentimiento Informado y de la Historia Clínica de los Pacientes), la Ley 3/2005 de modificación de la Ley 3/2001 y el Decreto 29/2009, por el que se regula el Acceso a la Historia Clínica Electrónica. El estudio fue financiado por el Instituto de Salud Carlos III (Fondo de Investigaciones Sanitarias, Ministerio de Sanidad, PI16/1401 y PI19/01023) y una Beca de investigación de la Fundación de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica (SEAIC). - 45 - RESULTADOS - 46 - - 47 - 1. Estudio del perfil de sensibilización de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina y su comparación con el perfil de pacientes con anafilaxia debida al veneno de otros himenópteros Los resultados de este capítulo han sido publicados por: Carmen Vidal1,2, Margarita Armisén1, Rafael Monsalve3, Tomás González-Vidal1, Santiago Lojo4, Sara López-Freire1, Paula Méndez1, Virginia Rodríguez1, Laura Romero1, Agustín Galán3, Arturo González-Quintela2,5. Anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax: pattern of sensitization for an emerging problem in Western countries. J Investig Allegol Clin Immunol 2021,31:228-35. 1. Servicio de Alergia, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Facultad de Medicina, Universidad de Santiago de Compostela, España 2. Red de Trastornos Adictivos, RD16/0017/0018), España 3. Chemistry, Manufacturing and Control Research and Development, ALK-Abelló, Madrid, España 4. Departamento de Bioquímica, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela, España. 5. Departamento de Medicina, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Facultad de Medicina, Universidad de Santiago de Compostela, España - 48 - 1.1. Datos clínicos Un total de 100 pacientes consecutivos fueron incluidos en esta primera parte del estudio. De ellos, 77 (77%) identificaron Vespa velutina como el insecto culpable de la reacción, 11 pacientes identificaron Vespula spp, 10 pacientes Apis mellifera y 2 pacientes no fueron capaces de identificar el insecto responsable. Todos los pacientes con anafilaxia por Vespula spp y Apis mellifera recordaban picaduras previas con los insectos respectivos mientras que tan solo el 20.8% (16/77) de los pacientes con anafilaxia por la picadura de Vespa velutina reconocían haber sido picados previamente por otro ejemplar de la misma especie. Por el contrario, todos estos pacientes con anafilaxia por Vespa velutina referían picaduras previas por Vespula spp (75/77, 97.4%) o Apis mellifera (41/77, 53.2%). Veintitrés pacientes relataron episodios pasados de anafilaxia antes de la presente picadura, pero no habían sido enviados para evaluación (14 episodios relacionados con Vespula spp, 5 con Vespa velutina y 4 a Apis mellifera). No se registraron picaduras adicionales en el periodo entre la reacción sistémica y la inclusión en el estudio. En la Tabla 7 se muestran estos resultados junto a otros datos epidemiológicos. La mayoría de las reacciones ocurrieron en los primeros 15 minutos tras producirse la picadura, sin diferencias con respecto al insecto culpable. La reacción anafiláctica fue leve en 17 casos (17%), moderada en 45 (45%) y grave en 38 (38%) casos. La gravedad de la anafilaxia producida por Vespa velutina fue similar a la de la anafilaxia por Vespula spp o por Apis mellifera (Tabla 7). La adrenalina se utilizó en 48 pacientes (48%). A mayor gravedad de la reacción, más frecuente fue el uso de adrenalina (17.6% en reacciones leves; 44.4% en moderadas y 65.8% en graves; P<0.001, test de tendencia). 1.2. Estudios de laboratorio - Determinaciones de IgE total y específica disponible comercialmente. La sIgE frente a Vespula spp estuvo disponible en 76/77 pacientes con anafilaxia a Vespa velutina y todos ellos mostraron un resultado positivo (>0,35 kUA/L). La mayoría (>70%) de los pacientes con anafilaxia a Vespa velutina también mostraron sIgE positiva a todo el extracto de veneno de Dolichovespula maculata, Polistes dominula, Vespa crabro y Apis mellifera, en ese orden (Figura 10). En cuanto a los componentes moleculares, los pacientes con anafilaxia a Vespa velutina mostraron positividad sIgE a rVes v 5 con mayor frecuencia que a rVes v 1. La sIgE a rPol d 5 estuvo presente en la mayoría de los pacientes con anafilaxia a Vespa velutina. El único componente molecular de Apis mellifera que mostró una tasa de positividad de sIgE >50% en pacientes con anafilaxia a Vespa velutina fue rApi m 5. - 49 - Tabla 7. Datos clínicos de los pacientes estratificados por el insecto responsable. La edad aparece como mediana y (rango intercuartil). El resto son números absolutos y (porcentajes). VVN vs VV: comparación de Vespa velutina con Vespula vulgaris. VVN vs AM: comparación de Vespa velutina con Apis mellifera. Figura 10. Porcentaje de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina con sIgE positiva (>0,35 kUA/L) a venenos de himenópteros enteros (Vespula spp [n=76], Polistes dominula [n=77], Apis mellifera [n=76], Vespa crabro [n=75] y Dolichovespula maculata. [n=76] (a la izquierda), y sus componentes moleculares (rApi m 1 [n=76], rApi m 5 [n=72], rApi m 10 [n=75], rVes v 1 [n=77], rVes v 5 [n=76], rPol d 5 [n=75], y o214 [MUXF, como marcador CCD, n=77] (a la derecha). Cada veneno y sus componentes moleculares se representan con el mismo color para facilitar la identificación (imagen de Vidal et al 2021 con autorización de ESMON, editorial de JIACI. Ver publicaciones en Anexo). Insecto responsable Valor de P Vespula spp (n=11) Vespa velutina (n=77) Apis mellifera (n=10) VVN vs VV VVN vs AM Edad (años) 58 (56-65) 63 (54-69) 54 (41-68) 0.618 0.348 Género (hombre) 11 (100) 66 (85.7) 9 (90.0) 0.394 0.712 Picaduras previas Vespula vulgaris 11 (100) 75 (97.4) 8 (80.0) 0.999 0.095 Vespa velutina 2 (18.2) 16 (20.8) 0 (0.0) 0.999 0.245 Apis mellifera 6 (54.5) 41 (53.2) 10 (100) 0.936 0.013 Reacción sistémica previa Vespula vulgaris 1 (9.1) 13 (16.9) 0 (0.0) 0.826 0.349 Vespa velutina 0 (0.0) 5 (6.5) 0 (0.0) 0.862 0.914 Apis mellifera 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (30.0) 0.999 <0.001 Habitat (rural) 11 (100) 75 (97.4) 9 (90.0) 0.999 0.775 Exposición laboral (exterior) 8 (72.7) 43 (55.8) 5 (50.0) 0.463 0.991 Grado de anafilaxia Grado I 3 (27.3) 12 (15.6) 2 (20.0) 0.628 0.419 Grado II 4 (36.4) 33 (42.9) 6 (60.0) Grado III 4 (36.4) 32 (41.6) 2 (20.0) Período de latencia Menos de 15 minutos 7 (63.6) 61 (79.2) 7 (70.0) 0.514 0.431 15-30 minutos 3 (27.3) 12 (15.6) 3 (30.0) Mas de 30 minutos 1 (9.1) 4 (5.2) 0 (0.0) Uso de adrenalina 5 (45.5) 37 (48.1) 5 (50.0) 0.872 0.908 - 50 - Tabla 8. Resultados de laboratorio de los pacientes incluídos en el estudio en función del insecto responsable de la reacción. n, número de pacientes con la determinación. IQR, rango intercuartílico. MUXF (o214), marcador de reactividad cruzada en los carbohidratos. VVN vs VV: comparación entre Vespa velutina y Vespula vulgaris. VVN vs AM: comparación entre Vespa velutina y Apis mellifera. Cuando se analizaron las concentraciones de sIgE a venenos en relación con la IgE total, se observó un perfil similar, es decir, los pacientes con anafilaxia a Vespa velutina mostraron un patrón de sensibilización a sIgE similar al de los pacientes con anafilaxia a Vespula spp y diferente al de los pacientes con anafilaxia a Apis mellifera (Tabla 9). Insecto responsable Valor de P Vespula spp Vespa velutina Apis mellifera n Mediana (rango IQR) n Mediana (rango IQR) n Mediana (rango IQR) VNN vs VV VVN vs AM sIgE en suero (kUA/L) MUXF 11 0.20 (0.00-0.92) 77 0.05 (0.00-0.34) 10 0.09 (0.00-1.55) 0.362 0.562 Apis mellifera 11 1.12 (0.31-3.79) 76 0.91 (0.22-3.67) 10 7.48 (2.88-27.4) 0.655 <0.001 rApi m 1 10 0.07 (0.00-0.35) 76 0.01 (0.00-0.12) 10 2.45 (1.50-7.79) 0.332 <0.001 rApi m 5 10 1.17 (0.11-10.2) 72 0.50 (0.00-3.93) 9 1.15 (0.02-15.4) 0.432 0.710 rApi m 10 10 0.04 (0.01-0.07) 75 0.03 (0.00-0.86) 10 0.31 (0.04-2.25) 0.802 0.053 Vespula vulgaris 11 14.0 (8.51-57.3) 76 5.38 (2.03-14.2) 9 0.08 (0.00-7.23) 0.019 0.007 rVes v 1 11 0.07 (0.03-5.98) 77 0.15 (0.03-1.44) 9 0.00 (0.00-1.29) 0.870 0.820 rVes v 5 11 12.4 (0.52-65.0) 76 4.45 (1.48-12.3) 9 0.00 (0.00-0.75) 0.322 <0.001 Polistes dominula 11 4.22 (2.95-36.1) 77 1.54 (0.41-6.72) 9 0.06 (0.00-2.43) 0.060 0.024 rPol d 5 11 6.89 (0.85-15.7) 75 1.65 (0.50-8.31) 9 0.01 (0.00-0.57) 0.151 0.001 Dolichovespula sp 7 4.78 (1.10-13.5) 76 1.34 (0.42-4.05) 8 0.15 (0.00-8.85) 0.046 0.185 Vespa crabro 7 2.98 (0.98-3.79) 75 0.93 (0.34-3.34) 9 0.02 (0.00-8.48) 0.137 0.073 IgE total (UI/mL) 11 189 (126-264) 76 78.5 (33.0-198) 10 45.0 (16.2-182) 0.017 0.247 Triptasa basal (ng/mL) 11 4.3 (3.5-5.2) 77 5.1 (3.9-6.4) 10 4.5 (4.1-6.3) 0.304 0.868 57 3.1. Revisión de la utilidad de la prueba de activación de basófilos en el diagnóstico de la alergia al veneno de los himenópteros aplicado al seguimiento de la inmunoterapia específica con estos alérgenos En la revisión se incluyeron 10 estudios, [Erdmann et al., 2004; Ebo et al., 2007; Mikkelsen et al., 2010; Cichocka-Jarosz et al., 2011; Eržen et al., 2012; Žitnik et al., 2012; Bidad et al., 2013; Rodríguez Trabado et al., 2016; Sainte-Laudy et al., 2016; Urra et al., 2016] con datos de 182 pacientes que habían presentado una reacción sistémica tras la picadura de los himenópteros y que, además, estaban en tratamiento con veneno de himenóptero. Para el análisis se consideraron sólo los pacientes que realizaron todo el periodo de seguimiento planteado en el estudio, y que tuvieran los resultados de un TAB basal, previo al inicio de la inmunoterapia, positivo al veneno y al menos otro TAB más en diferentes momentos de la fase de inicio o mantenimiento. De esta selección resultó un total de 167 pacientes, de los que 137 eran adultos y 30 menores de 18 años en el momento de la inclusión en los diferentes estudios. Respecto al himenóptero responsable de la reacción, 46 pacientes eran alérgicos a Apis mellifera y 121 a véspidos: 102 a Vespula spp, 15 a Polistes spp (Polistes dominulus), 3 a Vespa crabro y un paciente tenía doble sensibilización a Vespula spp y Polistes spp. En la muestra se incluyeron 11 pacientes con mastocitosis sistémica que procedían de un único estudio [Bidad et al., 2013]. En todos los estudios se cuantificó CD63 por citometría de flujo, mientras que en 2 trabajos [Mikkelsen et al., 2010; Bidad et al., 2013] se utilizó CD203c como marcador de activación complementario. No se analizó el método empleado para la técnica de activación o para la selección de la población de basófilos, pero los estudios revisados debían disponer de datos de una activación espontánea (control negativo) y de una activación como control positivo (con anti-IgE, anti-FcɛRI, o fMLP). Para la activación con el alérgeno se emplearon al menos dos concentraciones del veneno implicado, seleccionadas tras la realización de una curva dosis-respuesta. En varios estudios [Cichocka-Jarosz et al., 2011; Žitnik et al., 2012; Bidad et al., 2013] se especificó que el TAB se realizaba previo a la administración de la dosis de inmunoterapia para evitar el efecto de degranulación de los basófilos tras la inyección subcutánea del alérgeno. El umbral de reactividad o positividad establecido por la mayor parte de los autores fue >15% de células CD63+, salvo en el trabajo de Cichocka-Jarosz et al. que fue del 10% [Cichocka-Jarosz et al., 2011] y en tres de ellos que no se especificó el umbral de positividad [Ebo et al., 2007; Mikkelsen et al., 2010; Bidad et al., 2013]. El umbral de sensibilidad se expresó en 2 estudios como LC50 [Mikkelsen et al., 2010; Bidad et al., 2013]. Los estudios de Zitnik y cols. sugieren que la sensibilidad del basófilo, expresada como ratio 0.1/1, es de utilidad para predecir la aparición de efectos secundarios durante la fase de incremento de la dosis de la inmunoterapia [Žitnik et al., 2012]. Sin embargo, en otros estudios no se confirma la utilidad de la ratio para este fin [Mikkelsen et al., 2010]. En dos de los estudios revisados [Erdmann et al., 2004; Eržen et al., 2012], los pacientes se sometieron a prueba de la repicadura controlada, haciendo un total de 48 pacientes sometidos a esta exposición, siendo negativo el resultado en todos ellos excepto uno. En tres estudios [Ebo et al., 2007; Zitnik et al., 2012; Rodríguez-Trabado et al., 2016], se 58 registró la concurrencia de picaduras espontáneas en el curso del tratamiento, siendo todas ellas bien toleradas. Las variables analizadas en cada uno de los estudios fueron: a) Concentración del veneno de himenóptero empleada en el TAB En la mayoría de los estudios revisados se presentó la curva dosis-respuesta frente a diferentes concentraciones del alérgeno hasta alcanzar el plateau de respuesta máxima, lo que permitió la validación de la técnica para los estudios posteriores. En la fase de estudio longitudinal se utilizaron al menos dos concentraciones, incluyendo la respuesta máxima. La concentración óptima del alérgeno parece depender del uso que se le quiera dar a la técnica: diagnóstico o de seguimiento de vacunación. En el primer caso, la concentración utilizada debe ser capaz de discriminar entre pacientes y controles. Ebo y cols. encontraron que la concentración de 10 µg/mL de veneno presentaba una sensibilidad del 83.8% y una especificidad del 100% si bien en otros estudios, se utilizaron concentraciones inferiores con menor éxito [Erdmann et al., 2004; Ebo et al., 2007], 0.1 µg/mL [Mikkelsen et al., 2010; Bidad et al., 2013; Urra et al., 2016]. Concentraciones altas sirven en la fase de diagnóstico pero no marcan diferencias en la evolución. El empleo de concentraciones submáximas como 0.1 µg/mL [Eržen et al., 2012; Žitnik et al., 2012; Rodríguez Trabado et al., 2016], 0.05 µg/mL [Bidad et al., 2013] y 0.01 µg/mL [Ebo et al., 2007] permite, por el contrario, detectar diferente grado de activación a lo largo del tiempo. b) Momento de la inmunoterapia en que se analiza la prueba de TAB Durante las fases iniciales de tratamiento no se detectan cambios significativos ni permanentes en la respuesta de activación alérgeno-específica del basófilo. El empleo de pautas rápidas de inicio no parece acelerar los cambios en la activación de los basófilos [Ebo et al., 2007; Cichocka-Jarosz et al., 2011]. Los principales cambios en la activación de los basófilos se concentraron en la fase de mantenimiento y, especialmente, en los últimos años de tratamiento. Para RodríguezTrabado y cols. una primera determinación a los 3 meses de iniciar la vacunación es capaz de detectar un descenso significativo en la activación de los basófilos (tras una pauta de incremento semanal en 6 semanas y primeras dosis de mantenimiento) pero la activación decae definitivamente tras dos años de tratamiento. En todos los estudios en los que se valoró la respuesta del basófilo al final del tratamiento [Eržen et al., 2012; Žitnik et al., 2012; Rodríguez Trabado et al., 2016; Sainte-Laudy et al., 2016] se encontraron cambios significativos respecto al basal en el TAB. c) Edad de los pacientes Se han incluido en esta revisión dos artículos [Cichocka-Jarosz et al., 2011; Žitnik et al., 2012] que emplearon el TAB en el seguimiento de la inmunoterapia en la población infantil, incluyendo un total de 30 pacientes que representan el 18% del total de la muestra revisada. En ambos casos, los pacientes eran alérgicos al veneno de Apis mellifera. Cabe remarcar que no se encontraron cambios sustanciales en los resultados respecto a los encontrados en la población adulta de modo que el 80% de los pacientes mostraron una disminución de la activación de basófilos al finalizar el tratamiento. Estos 59 estudios no incluyeron la realización de prueba de repicadura pero sí control de los eventos tras repicaduras espontáneas que se dio en el 45% de los pacientes, siendo toleradas en todos ellos. 3.2. La prueba de activación de basófilos como medida de actividad biológica del veneno de Vespa velutina y sus componentes moleculares Los 10 pacientes analizados mediante la prueba de TAB presentaron un resultado positivo de sIgE (≥0,35 kUA/L) a Vespa velutina y al veneno de Vespula spp. En 9 de estos pacientes se detectó sIgE a Vespa crabro y Polistes dominula. Los niveles de sIgE frente a Vespula spp fueron más altos que los niveles de sIgE a Vespa velutina. Estos resultados se muestran en la Tabla 12 junto al resto de evaluaciones de sIgE y otros parámetros de manera individualizada para cada uno de los pacientes. Tabla 12. Resultados de laboratorio y datos clínicos de los pacientes incluídos en el estudio de TAB. -Prueba de activación de basófilos. Como se puede ver en la Figura 13 y la Tabla 13, todos menos 1 paciente (# 3) presentaron un resultado positivo en los experimentos TAB con, al menos, 1 de los Parámetro Paciente Parameter #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9 #10 Edad (años) 26 48 59 64 79 74 81 36 45 55 Grado anafilaxia 1 1 3 3 3 3 2 2 2 2 REMA 1 0 1 0 1 -2 1 -2 -2 -2 IgE total (UI/mL) 172 356 496 1134 91 488 88 167 119 70 Triptasa basal (ng/mL) 14.5 4.8 11.1 4.7 4.2 6.7 4.9 5.7 5.2 2.1 sIgE MUXF3 (kUA/L) 0.15 0.32 0.02 0.13 0.07 8.03 0.01 0.01 0.10 0.07 sIgE Apis mellifera (kUA/L) 0.44 0.63 4.64 1.63 0.60 60.90 0.36 0.03 0.11 1.48 sIgE rApi m 1 (kUA/L) 0.04 0.02 0.65 0.03 0.04 22.20 0.29 0.00 0.00 0.00 sIgE rApi m 5 (kUA/L) 0.03 2.20 0.18 10.40 0.99 30.60 0.01 0.02 0.37 2.70 sIgE rApi m 10 (kUA/L) 0.00 0.10 12.30 0.02 0.15 6.89 0.00 0.04 0.00 0.00 sIgE Vespula spp (kUA/L) 3.35 16.70 >100 >100 8.77 35.30 6.44 9.82 6.84 6.37 sIgE rVes v 1 (kUA/L) 2.77 19.50 0.40 1.42 0.02 0.78 0.03 12.50 0.02 6.89 sIgE rVes v 5 (kUA/L) 0.13 1.21 >100 >100 12.30 20.40 4.13 0.60 7.25 0.11 sIgE Polistes dominula (kUA/L) 0.14 36.00 48.80 >100 1.56 28.60 3.30 10.30 3.47 19.9 sIgE rPol d 5 (kUA/L) 0.19 14.80 83.20 >100 2.00 23.30 1.42 1.44 5.17 0.77 sIgE Vespa crabro (kUA/L) 0.87 5.82 2.94 7.79 0.30 24.10 3.39 8.02 0.87 1.87 sIgE Vespa velutina (kUA/L) 1.11 4.93 8.29 2.42 0.41 32.60 2.80 7.66 2.25 1.63 sIgE nVesp v 1 (kUA/L) 0.70 1.12 0.56 0.53 0.07 9.44 0.12 1.17 0.05 0.91 sIgE nVesp v 5 (kUA/L) 0.03 1.71 26.90 62.40 1.51 14.20 1.36 0.16 5.41 0.07 60 alérgenos probados. Los componentes alergénicos nVesp v 1 y nVesp v 5 activaron los basófilos en 5 y 7 pacientes, respectivamente (las imágenes de 3 pacientes representativos se pueden ver en la Figura 14. Cuando fueron positivos, los porcentajes de basófilos activados con veneno entero de Vespa velutina, nVesp v 1 y nVesp v 5 fueron similares. La prueba de rango de Spearman no reveló correlaciones entre el porcentaje máximo de basófilos activados y las concentraciones de sIgE contra ningún alérgeno probado (r = 0.103, P = 0.777 para el veneno entero de Vespa velutina; r = 0.055, P = 0.881 para nVesp v 1; y r = 0.067, P = 0.885 para nVesp v 5) o la gravedad de la reacción anafiláctica. Los 5 controles sanos presentaron resultados negativos en la prueba de activación (Tabla 14). Figura 13. Representación y datos del porcentaje de activación de la expresión de CD63 en la superficie de los basófilos tras la exposición a diferentes concentraciones del veneno completo de Vespa velutina, nVesp v 1 (fosfolipasa A1), y nVesp v 5 (antígeno 5) en cada paciente (imagen de Rodriguez-Vázquez et al. 2022 con autorización de ESMON, editorial de JIACI. Ver publicaciones en Anexo). 61 Tabla 13. Resultados individuales de la prueba de TAB con el veneno completo Vespa velutina y con sus componentes moleculares (nVesp v 1 and nVesp v 5) en los 10 pacientes estudiados Los datos se presentan como porcentajes de activación en la prueba de TAB a cada concentración del alérgeno y utilizando el kit Basotest®. Control negativo, solución de lavado. Control positive, n-formyl-Met-Leu-Phe peptide (fMLP). Alérgeno Paciente Basal (-) fMLP (+) Vespa velutina 10µg/mL Vespa velutina 1µg/mL Vespa velutina 0.1µg/mL Vespa velutina 0.01µg/mL Vesp v 1 10ng/mL Vesp v 1 1ng/mL Vesp v 1 0.1ng/mL Vesp v 1 0.01ng/mL Vesp v 5 10ng/mL Vesp v 5 1ng/mL Vesp v 5 0.1ng/mL Vesp v 5 0.01ng/mL #1 1.78 30.75 13.70 16.10 5.61 3.34 3.25 5.18 2.16 1.02 1.06 2.08 0.53 1.14 #2 5.88 36.21 31.36 38.21 35.29 27.64 19.26 20.99 13.97 9.75 36.9 37.57 36.92 36.19 #3 1.61 47.10 6.59 7.93 3.72 3.30 2.63 2.52 1.69 2.51 5.98 5.71 4.93 6.10 #4 3.69 30.43 15.54 14.98 10.96 5.11 4.88 4.34 8.43 4.17 21.31 28.33 27.41 23.6 #5 4.27 43.37 10.87 12.55 7.50 2.60 3.40 2.45 1.64 1.66 36.12 33.27 36.00 16.16 #6 1.26 25.00 31.78 33.79 29.18 22.25 1.85 5.15 0.82 1.54 32.87 31.13 32.23 31.37 #7 2.13 16.44 61.63 62.50 55.75 44.60 45.44 35.32 24.90 2.00 64.34 60.37 50.99 56.19 #8 4.81 27.37 66.88 32.24 20.04 14.44 27.75 27.61 21.63 14.80 5.05 5.34 4.63 2.94 #9 1.73 31.40 57.04 59.35 64.34 61.27 21.89 12.90 4.63 2.09 61.18 63.88 69.8 62.01 #10 4.00 45.41 35.38 59.00 60.82 41.43 53.60 60.00 58.19 50.39 33.73 35.56 39.38 30.67 62 Los resultados del TAB fueron consistentes con la presencia de sIgE específica de modo que todos los pacientes excepto uno (#3) con una sIgE específica positiva al veneno completo de Vespa velutina presentaron una activación positiva al exponerse al veneno completo de Vespa velutina o a sus componentes moleculares (nVesp v 1 or nVesp v 5). Sin embargo, no se encontró una correlación entre el grado de activación de los basófilos y el nivel de sIgE. Considerando una variable dicotómica tanto para la presencia o no de sIgE como para la activación o no de los basófilos (positivo frente a negativo), el veneno completo de Vespa velutina y nVesp v 5 se comportaron mejor que nVesp v 1 (Tabla 14). Tabla 14. Concordancia entre los resultados de CAP (sIgE) y TAB con veneno entero de Vespa velutina, nVesp v 1 y nVesp v 5 Vespa velutina nVesp en 1 nVesp v 5 Paciente sIgE>0,35 BAT>15% Concordancia sIgE>0,35 BAT>15% Concordancia sIgE>0,35 BAT>15% Concordancia #1 Positivo Positivo Sí Positivo Negativo No Negativo Negativo Sí #2 Positivo Positivo Sí Positivo Positivo Sí Positivo Positivo Sí #3 Positivo Negativo No Positivo Negativo No Positivo Negativo No #4 Positivo Positivo Sí Positivo Negativo No Positivo Positivo Sí #5 Positivo Negativo No Negativo Negativo Sí Positivo Positivo Sí #6 Positivo Positivo Sí Positivo Negativo No Positivo Positivo Sí #7 Positivo Positivo Sí Negativo Positivo No Positivo Positivo Sí #8 Positivo Positivo Sí Positivo Positivo Sí Negativo Negativo Sí #9 Positivo Positivo Sí Negativo Positivo No Positivo Positivo Sí #10 Positivo Positivo Sí Positivo Positivo Sí Negativo Positivo No 63 A modo ilustrativo, se presenta en la siguiente figura un ejemplo de la visualización de la activación de CD63 en tres pacientes y un control. Figura 14. Imagen del citómetro en donde se presentan los resultados de 3 pacientes con distintos modelos de activación. #10 se activa con Vespa velutina, nVesp v 1 y nVesp v 5; #7 se activa con Vespa velutina y con nVesp v 1; # se activa solo con nVesp v 5 y paciente control no activado (imagen de Vidal et al 2021 con autorización de ESMON, editorial de JIACI. Ver publicaciones en Anexo). 64 4. Seguimiento de la sensibilización mediada por IgE de los pacientes con anafilaxia por veneno de Vespa velutina y tratados con veneno de Vespula spp Los resultados de este capítulo han sido publicados por: Virginia Rodríguez-Vázquez1, Margarita Armisén1, Jose Gómez-Rial2, Beatriz Lámas-Vázquez2, Carmen Vidal1. Immunotherapy with Vespula venom for Vespa velutina nigrithorax anaphylaxis: preliminary clinical and immunological results. Clin Exp Allergy 2022;52:345-7. 1. Servicio de Alergia, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Facultad de Medicina, Universidad de Santiago de Compostela, España 2. Laboratorio de Inmunología. Servicio de Análisis Clínicos, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela, España. 65 Se realizó un análisis de la evolución de la sIgE y sIgG4 en 46 pacientes con anafilaxia por Vespa velutina y tratados con veneno de Vespula spp. La edad mediana de estos pacientes fue de 61 años (rango, 20–78 años) and 39 (84.8%) eran hombres. Al igual que en el resto de los estudios realizados, la mayoría de los pacientes (93.5%) había comunicado picaduras previas de Vespula spp y/o Apis mellifera (31, 67.4%) y en solo 10 casos (21.7%) habían comunicado picaduras previas por Vespa velutina. Todos los pacientes que iniciaron inmunoterapia específica entre noviembre de 2019 y mayo de 2020 participaron en el estudio. En la Figura 15 se representan los cambios en sIgE y sIgG4 en estos pacientes desde la situación basal a los 6 y 12 meses tras el inicio de la inmunoterapia específica. Se observó una reducción significativa de la sIgE frente a Vespa velutina y Vespula spp (mediana de reducción, 10.4% y 25% respectivamente) después de 12 meses. No se detectaron cambios significativos a los 6 meses. En cuanto a la sIgG4 se detectó un aumento significativo tanto frente a Vespa velutina como a Vespula spp (mediana de aumento. 25.3% y 30.8% respectivamente) a los 12 meses. Contrariamente a lo que había sucedido con la sIgE, los cambios en la sIgG4 fueron significativos a los 6 meses. La disminución de la sIgE a los 12 meses se observó en 35 pacientes (76.1%), mientras que el aumento de la sIgG4 se observó en 37 pacientes (80.4%). Figura 15. Evolución de la sIgE y sIgG4 frente a veneno de Vespula spp y Vespa velutina en los pacientes del estudio (imagen tomada de la publicación de los resultados en Rodriguez-Vázquez et al, 2022 con autorización de Wiley, editorial de Clinical and Experimental Allergy). No se pudo encontrar ninguna diferencia basal entre los pacientes que presentaron cambios con respecto a los que no lo hicieron en cuanto a la edad, la gravedad de la 66 reacción o los niveles basales de sIgE a Vespa velutina o Vespula spp. No se realizó prueba de repicadura con Vespa velutina, pero 13 pacientes (28.2%) sufrieron picaduras de campo sin reacciones sistémicas después de una mediana de 9 meses (rango, 4-12 meses) después de comenzar la inmunoterapia. Doce de estos pacientes presentaron un aumento de la sIgG4 o una disminución de la sIgE o ambas. 73 El grupo de estudio de alergia al veneno de himenópteros de la Sociedad Española de Alergología e Inmunología Clínica destaca la elevada prevalencia de síndromes de activación mastocitaria entre los pacientes con anafilaxia por veneno de himenóptero. Se ha llegado a sugerir que cerca del 20 % de los pacientes con esta clínica y diagnóstico de anafilaxia por veneno de himenóptero padecen un síndrome de activación mastocitaria [González de Olano et al., 2007; Vázquez-Revuelta, 2018]. Esta cifra contrasta con el bajo número de pacientes con criterios clínicos de activación mastocitaria en nuestra serie. Utilizando como primera aproximación diagnóstica el cálculo del REMA, un 2% de los pacientes de nuestra área sanitaria con anafilaxia tienen un valor de REMA igual o superior a 2. En estos pacientes es necesario completar el estudio mediante una determinación genética que se conoce como c-kit y que, en nuestros pacientes, fue negativa. El hecho de padecer o no este síndrome de activación mastocitaria, tiene implicaciones terapéuticas dado que los pacientes deben mantener la inmunoterapia específica toda su vida. Cuando esto no sucede, la duración estimada del tratamiento es de 3 a 5 años [González de Olano et al., 2007; Bonadona et al., 2009]. Como se ha comentado en el correspondiente apartado de la INTRODUCCIÓN las reacciones a los venenos de los himenópteros varían en su intensidad desde reacciones locales a sistémicas. Solo las reacciones sistémicas con demostrada presencia de sIgE frente al insecto implicado son subsidiarias de vacunación [Dhami et al., 2016; Sturm et al.,2018]. Los pacientes incluidos en estos estudios lo fueron por haber padecido reacciones sistémicas y, por tanto, con indicación de inmunoterapia específica. La selección del veneno para la inmunoterapia depende del reconocimiento del insecto y del perfil de sensibilización de los pacientes. Sobre el reconocimiento de Vespa velutina, la mayoría de los pacientes han reconocido el insecto responsable. Esto se ve reforzado por las campañas de información que favorecen el reconocimiento de Vespa velutina. A esto se suma, el medio rural en el que los pacientes del área viven o trabajan que facilita tanto la exposición, por tanto, la picadura, como su reconocimiento. El veneno empleado fue el de Vespula spp. La razón de su selección fue la falta de un extracto adecuado, en aquel momento, de Vespa velutina y la elevada reactividad cruzada entre ambas especies. Todo esto apoyado por los estudios de inhibición que mostraron una sensibilización primaria o genuina frente a Vespula spp. El seguimiento se realizó con las determinaciones de sIgE y sIgG4. En este estudio no se realizaron pruebas de exposición o repicaduras que se sugieren como patrón oro de seguimiento oro [Ruiz-León B et al., 2022]. Una de las razones por las que esta prueba no se llevó a cabo fue por las descripciones previas de la transcriptómica del veneno de Vespa velutina que orientaban a ciertos componentes tóxicos que podrían contraindicar la prueba. Se decidió, por tanto, un seguimiento de seroconversión y control de repicaduras espontáneas. De acuerdo con lo que cabría esperar, la sIgE descendió tras unos meses de tratamiento y se produjo una elevación de la IgG4 específica. Estudios previos realizados sobre el mecanismo de acción de la inmunoterapia ya apuntaron que estos cambios inmunológicos no necesariamente se acompañan de mejoría clínica; es decir, no existe una correlación directa entre los niveles de sIgE y sIgG4 y la tolerancia o 74 no de la exposición al alérgeno [Rueff et al., 2014; Shamji et al., 2017]. En cualquier caso, los cambios detectados son acordes con los esperados según estudios previos [Müller U et al., 1989; Michils et al., 2000]. Tan solo un cuarto de los pacientes había padecido repicaduras espontáneas, pero, ninguno de ellos, presentó reacción sistémica tras las mismas. Fortalezas y limitaciones del estudio Limitaciones del estudio Las limitaciones de todo estudio pueden referirse a su validez interna (sesgos de confusión, de selección, de medición-clasificación o de especificación) o a su validez externa (posibilidad de generalización de los resultados). Problemas de confusión El fenómeno de la confusión (distorsión de la asociación causal entre una variable de exposición y un efecto por una tercera variable que se asocia con la exposición y, causalmente, con el efecto) es una constante en los estudios observacionales y puede considerarse un sesgo cuando se investiga causalidad, como es el caso de los trabajos presentados. El fenómeno de la confusión puede controlarse en el análisis si se han recogido las variables necesarias. En el presente estudio la identificación del insecto puede llevar a problemas de interpretación habida cuenta de la gran reactividad cruzada que parece existir entre las distintas especies. La causa de la anafilaxia se clasificó de acuerdo con la identificación del insecto culpable proporcionada por los pacientes porque las muestras de los insectos no estaban disponibles. Este problema de clasificación siempre está presente cuando se trata de anafilaxia debida a especies de himenópteros. Sin embargo, el hecho de que casi todos los pacientes vivan o trabajen en un entorno rural donde están acostumbrados a reconocer himenópteros disminuye el riesgo de identificación errónea. Además, Vespa velutina se ha vuelto muy popular en nuestra región después de su proliferación, por lo tanto, las fotografías de ellos y sus nidos se muestran con frecuencia en los periódicos locales y en la televisión. Solo dos pacientes no consiguieron ver el insecto culpable. Sesgos de selección El estudio se ha realizado en una población seleccionada, como es la que acude a un Servicio de Alergología para estudio de una reacción que, en otro centro (Atención Primaria, Servicio de Urgencias, entre otros), se ha considerado como anafiláctica y la derivación se ha producido a través de la Vía rápida de la anafilaxia (Anexo I). Existe la posibilidad de que la reacción padecida en origen haya sido malinterpretada y que la existencia de sIgE solo sea un indicador de exposición. El hecho de contar con un sistema informatizado de historia electrónica como es IANUS, en nuestra Comunidad Autónoma, permite comprobar los datos clínicos del día de la reacción, siendo más difícil que este sesgo se produzca por una errónea identificación de la reacción al poder ser analizado por los facultativos del Servicio de Alergología e, incluso, comentados en sesión. Sesgos de medición (clasificación) Las variables de efecto (IgE total, IgE sérica frente a las fuentes alergénicas y frente a los componentes moleculares disponibles en plataformas) fueron determinadas con técnicas 75 comerciales estándar, adecuadamente validadas y con controles de calidad, por lo que es poco probable que en este aspecto hayan existido problemas de medición o clasificación. No ocurre lo mismo en el caso de la determinación de sIgE frente al veneno completo de Vespa velutina en los estudios en los que se realizó una técnica customizada o con las determinaciones de nVesp v 1 y nVesp v 5. En estos casos se trata de un método manual en el que la posibilidad de cometer un error es mayor, sin embargo, la buena correlación entre los distintos resultados obtenidos apunta a que sea poco probable que se haya incurrido en errores en el procedimiento. Sesgos de especificación Suelen denominarse de esta manera a los errores sistemáticos por el uso de herramientas estadísticas inadecuadas. La estadística del presente estudio ha sido simple y poco expuesta a este tipo de problemas. Se ha preferido el uso de pruebas no paramétricas por la distribución no-normal de la mayoría de variables numéricas y porque, también, es más conservadora o garantista, en el sentido de que tiene menor poder para mostrar diferencias significativas que la estadística paramétrica. En los modelos multivariantes, especialmente expuestos a este tipo de sesgos, se comprobó detenidamente el cumplimiento de los requerimientos de los modelos. Limitaciones a la validez externa Como se ha comentado más arriba, la población de estudio (personas que acuden al Servicio de Alergología procedentes de la Vía rápida) es altamente seleccionada pero se trata de una población similar a la que es alérgica a otros venenos de himenópteros en lo que a tipo de manifestaciones clínicas o resultados esperables de sensibilización se refiere. Los resultados se podrían, por tanto, generalizar a pacienets de otras localizaciones con unas características de exposición y clínica similares a los incluidos en el estudio. Una limitación externa es la no disponibilidad comercial de los componentes moleculares estudiados pero ya existe, y de hecho se ha utilizado en alguno de los estudios, sIgE comercial frente a Vespa velutina. Fortalezas del estudio La principal fortaleza del estudio es la homogeneidad en la recolección de la información y, en el caso del seguimiento de la inmunoterapia específica, su carácter longitudinal, que permite observar el efecto del tratamiento sobre los parámetros inmunológicos estudiados en tiempos predefinidos. No se ha realizado prueba de repicadura en los pacientes, considerada patrón oro, al no disponer de estudios sobre la toxicidad del veneno de Vespa velutina. Sin embargo, la población que ha padecido repicaduras espontáneas esta bien controlada e identificada. 76 77 CONCLUSIONES 78 79 En relación con los OBJETIVOS planteados en la presente Tesis Doctoral se pueden extraer las siguientes conclusiones: 1. El veneno de Vespa velutina se ha convertido en la primera causa de anafilaxia por veneno de himenóptero en nuestra área sanitaria; sin embargo, no existen diferencias epidemiológicas con respecto a posibles factores de riesgo respecto a las picaduras ocasionadas por el veneno de otros himenópteros. El grado de gravedad de la reacción provocada por la picadura de Vespa velutina es similar a la provocada por la picadura de otros himenópteros. 2. El alérgeno del veneno de otras especies de himenópteros que con más frecuencia reconoce la IgE de los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina es Vespula spp y, más concretamente, el antígeno 5 o Ves v 5. 3. En la población estudiada, el veneno de Vespula spp actúa como sensibilizante primario o genuino como se demuestra por los estudios de inhibición. 4. Api m 5 es el alérgeno de Apis mellifera que reconocen con mayor frecuencia los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina, posiblemente por su homología con Ves v 3. 5. Los niveles de sIgE frente a Vespa velutina son bajos pero se correlacionan bien con los niveles de sIgE frente a Vespula spp. De forma similar, existe una alta correlación entre los niveles de sIgE frente a los componentes moleculares de Vespa velutina, nVesp v 1 y nVesp v 5 con los componentes moleculares de Vespula spp, Ves v 1 y Ves v 5. 6. Existe una correlación significativa entre los niveles de nVesp v 1 y el MUXF3 como marcador de CCD. 7. El componente molecular del veneno de Vespa velutina que, con más frecuencia detectan los pacientes alérgicos al veneno de este himenóptero es nVesp v 5 que podría considerarse como un alérgeno mayor en esta población, 8. nVesp v 1 es un nuevo alérgeno identificado en el veneno de Vespa velutina cuya naturaleza glicosilada queda demostrada por estudios de inhibición con glicanos y por la tinción específica que reconoce la presencia de proteínas glicosiladas. 9. El veneno completo de Vespa velutina es un buen marcador de la actividad biológica medida por pruebas de activación de basófilos y expresión de CD63, siendo suficiente una concentración de 1 µg/mL para inducir reactividad en los basófilos. 10. De acuerdo a la revisión bibliográfica realizada, los estudios de activación de los basófilos se pueden emplear en el seguimiento de la inmunoterapia específica con venenos de himenópteros si bien no existe acuerdo sobre las concentraciones de alérgeno o el momento más adecuado para realizar la determinación. 11. La inmunoterapia con veneno de Vespula spp administrada durante un año a los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina inducen cambios en los niveles de sIgE y sIgG4 específica que son más evidentes a los 12 meses de tratamiento. 80 81 BIBLIOGRAFÍA 82 89 Münstedt K, Hellner M, Winter D, von Georgi, R. Bee venom allergy in beekeepers: allergy to bee 2008;18:100-5. Muraro A, Roberts G, Worm M, Bilò MB, Brockow K, Fernández Rivas M, Santos AF, Zolkipli ZQ, Bellou A, Beyer K, Bindslev-Jensen C, Cardona V, Clark AT, Demoly P, Dubois AE, DunnGalvin A, Eigenmann P, Halken S, Harada L, Lack G, Jutel M, Niggemann B, Ruëff F, Timmermans F, Vlieg-Boerstra BJ, Werfel T, Dhami S, Panesar S, Akdis CA, Sheikh A; EAACI food allergy and anaphylaxis guidelines group. Anaphylaxis: guidelines from the European Academy of Allergy and Clinical Immunology. Allergy 2014;69:1026-45. Navarro LA, Peláez A, de la Torre F, Tenias Burillo JM, Megías J, Martínez I. Epidemiological factors on Hymenoptera venom allergy in a Spanish adult population. J Investig Allergol Clin Immunol 2004;14:13441. Nittner-Marszalska M, Liebhart J, Liebhart E, Dor A, Dobek R, Obojski A, Medrala W. Prevalence of Hymenoptera venom allergy and its immunological markers current in adults in Poland. Med Sci Monit 2004;10:CR324-9. Ortíz J. Mapa de distribución de véspidos. J Investig Allergol Clin Immunol 2013;23:47–9. Perrard A, Arca M, Rome Q, Muller F, Tan J, Bista S, Nugroho H, Baudoin R, Baylac M, Silvain JF, Carpenter JM, Villemant C. Geographic variation of melanisation patterns in a hornet species: genetic differences, climatic pressures or aposematic constraints? PLoS One 2014;9:e94162. Peternelj A, Silar M, Bajrovic N, Adamic K, Music E, Kosnik M, Korosec P. Diagnostic value of the basophil activation test in evaluating Hymenoptera venom sensitization. Wien Klin Wochenschr. 2009;121:344-8 Pravettoni V, Piantanida M, Primavesi L, Forti S, Pastorello EA. Determinants of venom-specific IgE antibody concentration during long-term wasp venom immunotherapy. Clin Mol Allergy 2015;13:29. Pucci S, Antonicelli L, Bilò MB, Garritani MS, Bonifazi F. Shortness of interval between two stings as risk factor for developing Hymenoptera venom allergy. Allergy 1994;49:894-6. Pucci S, D'Alò S, De Pasquale T, Illuminati I, Makri E, Incorvaia C. Risk of anaphylaxis in patients with large local reactions to Hymenoptera stings: a retrospective and prospective study. Clin Mol Allergy 2015;13:21 Rodríguez Trabado A, Cámara Hijón C, Ramos Cantariño A, Romero-Chala S, García-Trujillo JA, Fernández Pereira LM. Short-, intermediate-, and long-term changes in basophil reactivity induced by venom immunotherapy. Allergy Asthma Immunol Res 2016;8:412-20. Rome Q, Perrard A, Muller F, Villemant C. Monitoring and control modalities of a honeybee predator, the yellow legged hornet Vespa velutina nigrithorax ( Hymenoptera: Vespidae). Aliens 2011;31:7–15. Rome Q, Muller F, Villemant C. Expansion en 2011 de Vespa velutina en Europe (Hym., Vespidae). Bulletin de la Société Entomologique de France 2012;117:114. Rome Q, Dambrine L, Onate C, Muller F, Villemant C, García-Pérez AL, Maia M, Carvalho-Esteves P, Bruneau E. Spread of the invasive hornet Vespa velutina Lepeletier, 1836, in Europe in 2012 (Hym., Vespidae). Bulletin de La Société Entomologique de France 2013;118:21–2. Ruëff F, Przybilla B, Müller U, Mosbech H. The sting challenge test in Hymenoptera venom allergy. Position paper of the subcommittee on insect venom allergy of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology. Allergy 1996;51:216-25. Ruëff F, Przybilla B, Biló MB, Müller U, Scheipl F, Aberer W, Birnbaum J, Bodzenta-Lukaszyk A, Bonifazi F, Bucher C, Campi P, Darsow U, Egger C, Haeberli G, Hawranek T, Körner M, Kucharewicz I, Küchenhoff H, Lang R, Quercia O, Reider N, Severino M, Sticherling M, Sturm GJ, Wüthrich B. Predictors of severe systemic anaphylactic reactions in patients with Hymenoptera venom allergy: importance of baseline 90 serum tryptase. A study of the European Academy of Allergology and Clinical Immunology interest group on insect venom hypersensitivity. J Allergy Clin Immunol 2009;124:1047-54. Sabogal-Cuadro P, Zakzuk J. Prueba de activación de basófilos: aspectos técnicos, metodológicos, y su utilidad clínica. Rev Fac Med 2018;66:447-57 Sahiner UM, Durham SR. Hymenoptera venom allergy: how does venom immunotherapy prevent anaphylaxis from bee and wasp stings? Front Immunol 2019;10:1959. Sainte-Laudy J, Sabbah A, Drouet M, Lauret MG, Loiry M. Diagnosis of venom allergy by flow cytometry. Correlation with clinical history, skin tests, specific IgE, histamine and leukotriene C4 release. Clin Exp Allergy 2000;30:1166-71. Sainte-Laudy J, Touraine F, Cluzan D, Belle Moudourou F. Follow-up of venom immunotherapy on flow cytometry and definition of a protective index. Int Arch Allergy Immunol 2016;170:243-50. Sauvard D, Imbault V, Darrouzet É. Flight capacities of yellow-legged hornet (Vespa velutina nigrithorax, Hymenoptera: Vespidae) workers from an invasive population in Europe. PLoS One 2018;13:e0198597. Schäfer T, Przybilla B. IgE antibodies to Hymenoptera venoms in the serum are common in the general population and are related to indications of atopy. Allergy 1996;51:372-7. Schwartz HJ, Squillace DL, Sher TH, Teigland JD, Yunginger JW. Studies in stinging insect hypersensitivity: postmortem demonstration of antivenom IgE antibody in possible sting-related sudden death. Am J Clin Pathol 1986;85:607-10. Shamji MH, Durham SR. Mechanisms of allergen immunotherapy for inhaled allergens and predictive biomarkers. J Allergy Clin Immunol 2017;140:1485-98. Smit J, Noordijk J, Zeegers T. Will the Asian hornet (Vespa velutina) settle in the Netherlands? Entomol Ber 2018;78:2–6. Sturm GJ, Kranzelbinder B, Schuster C, Sturm EM, Bokanovic D, Vollmann J, Crailsheim K, Hemmer W, Aberer W. Sensitization to Hymenoptera venoms is common, but systemic sting reactions are rare. J Allergy Clin Immunol 2014;133:1635-43.e1. Sturm GJ, Varga EM, Roberts G, Mosbech H, Bilò MB, Akdis CA, Antolín-Amérigo D, Cichocka-Jarosz E, Gawlik R, Jakob T, Kosnik M, Lange J, Mingomataj E, Mitsias DI, Ollert M, Oude Elberink JNG, Pfaar O, Pitsios C, Pravettoni V, Ruëff F, Sin BA, Agache I, Angier E, Arasi S, Calderón MA, Fernandez-Rivas M, Halken S, Jutel M, Lau S, Pajno GB, van Ree R, Ryan D, Spranger O, van Wijk RG, Dhami S, Zaman H, Sheikh A, Muraro A. EAACI guidelines on allergen immunotherapy: Hymenoptera venom allergy. Allergy 2018;73:744-64. Tan K, Hu Z, Chen W, Wang Z, Wang Y, Nieh JC. Fearful foragers: honeybees tune colony and individual foraging to multi-predator presence and food quality. PLoS One 2013;8:e75841 Tripolt P, Arzt-Gradwohl L, Čerpes U, Laipold K, Binder B, Sturm GJ. Large local reactions and systemic reactions to insect stings: similarities and differences. PLoS One 2020;15:e0231747. Urra JM, Cabrera CM, Alfaya T, Feo-Brito F. Agreement of skin test with IL-4 production and CD40L expression by T cells upon immunotherapy of subjects with systemic reactions to Hymenoptera stings. Mol Immunol 2016;70:134-9. Valcárcel MA, Vidal C, Armisén M, Rodríguez V, Gonzalez-Quintela A. Sensitization to cross-reactive carbohydrate determinants in 2 patients with Hymenoptera venom allergy and alcoholic cardiomyopathy. J Allergy Clin Immunol 2012;130:1001-3. 91 van der Brempt, X. Les anaphylaxies aux piqûres de frelons asiatiques (Vespa velutina) : cas déclarés au Réseau d’Allergo-Vigilance® (RAV) de 2011 à 2021 et conduite à tenir. Revue Française d’Allergologie 2022;62:166-70. Van der Vecht J. Notes on Oriental Vespinae, including some species from China and Japan (Hymenoptera, Vespidae). Zool Mededel 1959;13:205-32. Vázquez-Revuelta P, González-de-Olano D. Prevalence of Clonal Mast Cell Disorders in Patients Presenting With Hymenoptera Venom Anaphylaxis Might Be Higher Than Expected. J Investig Allergol Clin Immunol 2018;28:193-4. Vidal C. The Asian wasp Vespa velutina nigrithorax: Entomological and allergological characteristics. Clin Exp Allergy 2022;52:489-98. Villemant C, Haxaire J, Streito JC. Premier bilan de l’invasion de Vespa velutina Lepeletier en France (Hymenoptera, Vespidae). Bull Soc Entomol Fr 2006;111:535–8. Villemant C, Barbet-Massin M, Perrard A, Muller F, Olivier G, Figuet F, Rome Q. Predicting the invasion risk by the alien bee-hawking yellow-legged hornet Vespa velutina nigrithorax across Europe and other continents with niche models. Biol Cons 2011;144:2142–50. Witt, R. Esrtfund eines Nestes der Asiatischen Hornisse Vespa velutina Lepeletier, 1838 in Deutschland und Details zumm Nestbau (Hymenosptera, Vespinae). Ampulex 2015;7:42–53. Worm M, Moneret-Vautrin A, Scherer K, Lang R, Fernandez-Rivas M, Cardona V, Kowalski ML, Jutel M, Poziomkowska-Gesicka I, Papadopoulos NG, Beyer K, Mustakov T, Christoff G, Bilò MB, Muraro A, Hourihane JO, Grabenhenrich LB. First European data from the network of severe allergic reactions (NORA). Allergy 2014;69:1397-404. Xie C, Xu S, Ding F, Xie M, Lv J, Yao J, Pan D, Sun Q, Liu C, Chen T, Li S, Wang W. Clinical features of severe wasp sting patients with dominantly toxic reaction: analysis of 1091 cases. PLoS One 2013: 8:e83164. Xu YS, Kastner M, Harada L, Xu A, Salter J, Waserman S. Anaphylaxis-related deaths in Ontario: a retrospective review of cases from 1986 to 2011. Allergy Asthma Clin Immunol 2014;10:38. Žitnik SE, Vesel T, Avčin T, Šilar M, Košnik M, Korošec P. Monitoring honeybee venom immunotherapy in children with the basophil activation test. Pediatr Allergy Immunol 2012;23:166-72. 92 93 Anexo I Vía rápida para anafilaxia por veneno de himenóptero 94 95 96 97 Anexo II Hojas de Consentimiento Informado 98 105 Anafilaxia por Vespa velutina Estudio del perfil molecular frente a alérgenos de Vespula spp, Polistes dominula y Apis mellifera que reconocen los pacientes con anafilaxia por Vespa velutina en el área sanitaria de Santiago de Compostela CVP-Vespv-2018-01 CUADERNO DE RECOGIDA DE DATOS Código Sujeto: Fecha: 106 Código del sujeto *Nota de codificación: Codificación CHUS - (Vespv) - (número de sujeto) Descripción CHUS: Complexo Hospitalario Universitario de Santiago Vespvel 01, 02, 03… Variables epidemiológicas (señalar lo que corresponda) 1. Sociodemográficas 1.1. Mes y Año de Nacimiento: ____________ / ______ 1.2. Edad: _______ años en el momento de la primera consulta 1.3. Sexo: 0. Mujer 1. Varón 1.4. Ingesta de alcohol en g/semana (cada unidad de bebida equivalente a 10 g de alcohol): _________________________ g/semana 2. Grado de exposición 2.1. Vivienda habitual: 0. Rural 1. Urbano *Se consideran urbanos los que viven en la ciudad de Santiago de Compostela y rurales el resto. 2.2. Exposición laboral (en función del trabajo*) 0. No 1. Si * Se considera exposición por medio laboral cualquier trabajo que se realice al aire libre en medio rural (apicultor, labores de campo, agricultor, ganadero, construcción en el exterior en medio rural,..) 3. Antecedente de picaduras previas (Se pueden marcar varias casillas) 3.1. Avispas (1=SI; 0= NO) 3.2. Vespa velutina (1=SI; 0=NO) 3.3. Abejas (1=SI; 0=NO) 107 4. Antecedente de reacción sistémica previa 4.1. Avispas (1=SI; 0= NO) 4.2. Vespa velutina (1=SI; 0=NO) 4.3. Abejas (1=SI; 0=NO) Episodio de anafilaxia motivo de la consulta 5. Himenóptero implicado en la reacción Avispas (1) Vespa velutina (2) Abejas (3) 6. Número de insectos implicados en la reacción: ____________ 7. Período de latencia En los primeros 15 minutos (1) Entre 15 y 30 minutos (2) Más de 30 minutos (3) 8. Grado de anafilaxia (1) Grado I. Leve (Afectación cutánea en forma de eritema, urticaria y/o angioedema con malestar general sin datos objetivos de afectación de otros órganos) (2) Grado II. Moderada (Afectación respiratoria (disnea, estridor, sibilancias), cardiovascular (mareo, sudoración, opresión torácica) y/o gastrointestinal (vómitos, diarrea, dolor abdominal) (3) Grado III. Grave (Presencia de cianosis, saturación de O2 por debajo del 92%, hipotensión, confusión, hipotonía y/o pérdida de conocimiento) 9. ¿Se administró adrenalina? 0. No 1. Sí 108 Variables serológicas (a) Valor de la IgE total: _____________ (UI/mL) (b) Valor de la IgE específica (kUA/L) frente a: 1. i1: Abeja "Apis mellifera" _______________________ 2. i2: Avispón "Dolichovespula maculata" ____________ 3. i3: Avispa "Vespula spp." _______________________ 4. i5: Avispón "Dolichovespula arenaria" _____________ 5. i75: Abejorro "Vespa crabro" ____________________ 6. i77: Avispa "Polistes dominula" _________________ 7. i208: rApi m1 (fosfolipasa A2) ___________________ 8. i209: rVes v 5 ________________________________ 9. i210: rPol d 5 ________________________________ 10. i211: rVes v 1 (fosfolipasa A1) __________________ 11. i214: rApi m 2 (hialuronidasa) __________________ 12. i215: rApi m 3 (fosfatasa ácida) _________________ 13. i216: rApi m 5 (dipeptidil peptidasa)______________ 14. i217: rApi m 10 (icarapina)_____________________ 15. o214: CCD (MUFX3 de bromelina)________________ 109 Anexo IV Autorización del Comité Ético de Investigación de Galicia 110 111 112 113 Anexo V Listado de verificación STROBE 114 J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235© 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 ORIGINAL ARTICLE Abstract Objective: To define the sensitization pattern of patients with anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax (VVN). Methods: We studied 100 consecutive Spanish patients with anaphylaxis to Hymenoptera venom and systematically determined specific IgE (sIgE) to whole venoms ( Vespula species, Polistes dominula , Apis mellifera , Vespa crabro , and Dolichovespula maculata ) and their molecular components (rApi m 1, rApi m 5, rApi m 10, rVes v 1, rVes v 5, rPol d 5, and cross-reactive carbohydrates). Specific IgE to VVN venom and its antigen 5 (nVesp v 5) were measured in a subsample. Results: Seventy-seven patients had anaphylaxis to VVN. Of these, only 16 (20.8%) reported previous VVN stings, but were stung by other Hymenoptera. Positive sIgE (>0.35 kUA/L) to each of the whole venoms was detected in >70% of patients ( Vespula species in 100%). The components showing >50% positivity were rApi m 5 (51.4%), rPol d 5 (80.0%), and rVes v 5 (98.7%). This pattern was similar to that of Vespula species anaphylaxis (n=11) but different from that of A mellifera anaphylaxis (n=10). Specific IgE to nVesp v 5 was positive in all patients (n=15) with VVN anaphylaxis and was correlated with sIgE to both rVes v 5 (R=0.931) and rPol d 5 (R=0.887). Conclusions: VVN has become the commonest cause of Hymenoptera anaphylaxis in our area. Most cases report no previous VVN stings. Their sensitization pattern is similar to that of patients with anaphylaxis to other Vespidae . Specific IgE to antigen-5 from VVN, Vespula species, and P dominula are strongly correlated in patients with VVN anaphylaxis. Key words: Vespa velutina nigrithorax . Anaphylaxis. Ves v 5. Pol d 5. Vesp v 5. Allergy. Hymenoptera. Resumen Objetivo: Definir el patrón de sensibilización alérgica de pacientes con anafilaxia por Vespa velutina nigrithorax (VVN), un problema emergente en países occidentales. Métodos: Se estudió una población de 100 pacientes adultos con anafilaxia por veneno de himenóptero en España. Se determinó IgE específica frente a los venenos completos de Vespula spp, Polistes dominula , Apis mellífera , Vespa crabro , Dolichovespula maculata , y algunos de sus componentes moleculares (rApi m 1, rApi m 5, rApi m 10, rVes v 1, rVes v 5, rPol d 5, carbohidratos [MUXF]). En una muestra de 15 pacientes con anafilaxia por VVN se determinó la IgE específica frente a este veneno completo y al antígeno 5 de VVN (denominado nVesp v 5). Resultados: Setenta y siete pacientes (77,0%) padecieron anafilaxia por VVN. De ellos, tan solo 16 (20,8%) habían padecido picaduras previas por VVN si bien reconocían picaduras previas por otros himenópteros. Más del 70% de los pacientes con anafilaxia por VVN presentaron IgE específica positiva (>0,35 kUA/L) frente a cada uno de los venenos completos estudiados (el 100% en el caso de Vespula spp). Los componentes moleculares reconocidos por la IgE de más del 50% de los pacientes fueron rApi m 5 (51,4%), rPol d 5 (80,0%), y rVes v 5 (98,7%). Este patrón de sensibilización fue similar al de los pacientes con anafilaxia por Vespula spp (n=11) y diferente al de los pacientes con anafilaxia por Apis mellifera (n=10). La IgE específica frente a nVesp v 5 fue positiva en el 100% de los pacientes con anafilaxia por VVN analizados (15/15). La correlación entre la IgE específica frente a nVesp v 5 y la IgE específica frente a rVes v 5 (R=0,931) y rPol d 5 (R=0,887) fue muy significativa. Conclusiones: VVN es la principal especie de himenóptero responsable de anafilaxia en la actualidad en nuestra área. El perfil de sensibilización es similar al de los pacientes con anafilaxia por otros Véspidos. La IgE específica frente al antígeno 5 de VVN, Vespula spp, y Polistes dominula se correlaciona estrechamente en los pacientes con anafilaxia por VVN. Palabras clave: Vespa velutina nigrithorax . Anafilaxia. Ves v 5. Pol d 5. Vesp v 5. Alergia. Hymenoptera. Anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax: Pattern of Sensitization for an Emerging Problem in Western Countries Vidal C1,2, Armisén M1, Monsalve R3, González-Vidal T1, Lojo S4, López-Freire S1, Méndez P1, Rodríguez V1, Romero L1, Galán A3, González-Quintela A2,5 1Allergy Department, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, School of Medicine, University of Santiago de Compostela, Spain 2Spanish Network for Addictive Disorders (Red de Trastornos Adictivos, RD16/0017/0018), Spain 3CMC R&D (Chemistry, Manufacturing and Control Research and Development), ALK-Abelló, Madrid, Spain 4Department of Biochemistry, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela, Spain 5Department of Medicine, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Faculty of Medicine, University of Santiago de Compostela, Spain J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235 doi: 10.18176/jiaci.0474 Vidal C, et al. J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235 © 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 Introduction Alien species causing biological invasions are recognized as a significant problem nowadays, primarily because of the impact on biodiversity, but also because they cause new health problems. Vespa velutina nigrithorax (VVN), commonly known in Spain as Asian wasp, is one of the 12 color variants of Vespa velutina Lepeletier 1836, which is naturally distributed in Asia from Afghanistan to eastern China, Indochina, and Indonesia [1]. The first record of the presence of VVN in Europe was in 2005 in Lot-et-Garonne, France, where it was thought to have arrived in 2004 [2]. This unexpected invasion seems to have been due to an accidental transport of at least 1 hibernating founder queen in pottery or other horticultural commercial products from China (bonsai tree) [3,4]. From that moment onwards, VVN has spread rapidly across France [5-7] and the Basque Country in the North of Spain [8]. In 2011, Villemant et al [7] published an interesting model predicting the future invasion of VVN. The model predicted that many countries in western Europe had a high probability of being invaded, with the highest risk being along the Atlantic and northern Mediterranean coasts. Coastal areas of the Balkan Peninsula, Turkey, and Near East also appeared suitable and could potentially be colonized later [7]. Other parts of the world with high climatic suitability for this species could also be threatened by VVN, since the species could enter again through international trade [7]. This prediction is now a reality, since VVN has spread into Spain (particularly in the north and northwestern areas (information available at http://webs-gis. cesga.es/velutina/), Portugal, Italy, and the UK [4,9,10]. In Galicia, a region in the northwest of Spain, more than 47 394 nests were identified and 24 196 retrieved and destroyed in 2018 (compared to 769 in 2014) (Consellería de Medio Rural, Xunta de Galicia). Vespa velutina is one of the most aggressive and feared Hymenoptera species in China, where it is known as killer wasp, because it causes a number of deaths every year [11]. Most affected persons die after multiple stings because of multiple organ dysfunction induced by toxins in the venom [11,12]. Apart from these toxic effects, V velutina can provoke allergic reactions similar to those caused by other Hymenoptera species. In fact, up to 6 deaths after VVN stings, presumably due to fatal allergic reactions, were reported by the media in Spain in 2017 and 2018 (5 in the northwest). For that reason, the population of the north and northwest of Spain has been alerted to the presence of VVN, and specific political campaigns have been activated to fight against the invasion. The first well-identified case of anaphylaxis due to VVN in Spain was reported in 2014 [13]. The first patient with anaphylaxis to VVN in our area was detected in June 2015. Two additional cases were seen in 2016 and 9 in 2017. This increase in the frequency of anaphylaxis to VVN and the lack of commercially available assays for identifying specific IgE (sIgE) against VVN or its components led us to initiate the present study. Our objective was to identify the sensitization profile of patients with anaphylaxis to VVN and to compare it with that of patients who experience anaphylaxis caused by other Hymenoptera. We used commercially available sIgE determinations against both the whole venom and molecular components of Vespula species, Polistes dominula, Apis mellifera, Vespa crabro, and Dolichovespula maculata. We also aimed to investigate the usefulness of a customized test to detect VVN-sIgE based on binding biotin to the whole venom extract and to its purified components, phospholipase and antigen 5 (namely Vesp v 1 and Vesp v 5). Patients and Methods Study Population and Design We performed a cross-sectional study in which we prospectively enrolled all adult individuals with anaphylaxis due to Hymenoptera venom who attended our Allergy Department for the first time between December 2017 and June 2019. Our institution is a reference teaching hospital in northwest Spain. Patients were submitted from either primary care or the emergency department after experiencing an anaphylactic reaction to Hymenoptera sting. Patients with large local reactions were not included in the study. The hospital covers an area of approximately 500 000 people, of whom nearly 90 000 live in the city of Santiago de Compostela and the remainder in primarily rural areas. All eligible patients (n=100) agreed to participate. The median age was 63 years (range, 2090 years), and 87 (87.0%) were males. Most patients (97 [97%]) lived in a rural environment, and 57 (57%) worked outdoors, thus leading them to be considered at high risk of exposure. A physician-administered structured questionnaire was completed for every patient to obtain a series of data: (a) identification of the Hymenoptera species involved in the reaction (bees, common wasps, and VVN); (b) recall of previous Hymenoptera stings (bees, common wasps, and VVN); (c) a history of previous systemic reactions after Hymenoptera stings; (d) time elapsed between exposure to Hymenoptera venom and when symptoms and appearance of the first signs; (e) signs and symptoms reported by the patient; (f) signs and symptoms reported by doctors who treated the patients after the reaction; and (g) history of Hymenoptera stings after the reported reaction and before entering the study. The severity of the systemic reaction was classified based on the information recorded and divided into 3 categories: mild (skin and subcutaneous lesions plus nonspecific general symptoms), moderate (features suggesting respiratory, cardiovascular, or gastrointestinal involvement), and severe (hypoxia, hypotension, or neurologic compromise) (adapted from [14]), as accepted for systemic reactions to Hymenoptera venom [15]. Information was recorded between 15 and 30 days after the reaction and all laboratory determinations were performed in serum samples obtained under baseline conditions 1-2 months after the reaction. Finally, and following the recommendations of the European Competence Network on Mastocytosis, we recorded the Spanish Mastocytosis Network (REMA) score [16] to calculate the risk of a clonal mast cell disorder that could increase the severity of the reaction. Laboratory Determinations Commercially available specific IgE Allergen sIgE was measured using the ImmunoCAP-250 system (Thermo Fisher Scientific) and included sIgE against Vespula species, P dominula, A mellifera, V crabro, D maculata, rApi m 1, rApi m 5, rApi m 10, rVes v 1, rVes v 5, rPol d 5, and MUXF (o214) as a marker of cross-reactive carbohydrate 229 Anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235© 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 Serum tryptase Serum tryptase was determined using the ImmunoCAP 250 tryptase assay (Thermo Fisher Scientific). Statistical Analyses The chi-square test (with continuity correction and analysis of trend, when needed) was used to compare proportions. The Mann-Whitney test was used to compare numerical variables between groups. The Jonckheere-Terpstra test was used to analyze the trend of numerical variables in relation to ordinal categories. The Pearson test was used to assess correlation. Linear regression was used to predict the value of a dependent variable (VVN-sIgE) based upon the values of independent variables (commercially available sIgE to related allergens). Ethics The study was approved by the Institutional Ethics Committee and complied with the recommendations of the Declaration of Helsinki. Written informed consent was obtained from all participants. determinant (CCD). Following the manufacturer’s instructions, sIgE levels ≥0.1 kUA/L were deemed positive, although analyses were performed with the classic 0.35-kUA/L threshold level for positivity. Customized specific IgE We measured sIgE to VVN whole venom extract and to VVN phospholipase and antigen 5 (nVesp v 1 and nVesp v 5, respectively) in a subsample of 15 patients with anaphylaxis to VVN. The nVesp v 1 and 5 components were purified from an extract of VVN venom (ALK-Source Materials) by successive chromatographic steps [17] in a procedure similar to that used for purifying the allergenic components of Vespula species and P dominula [18]. VVN whole venom extract and nVesp v 1 and nVesp v 5 proteins were biotinylated [19], bound to highstreptavidin-coated high-capacity plates (o212, Thermo Fisher Scientific, Inc.), and subsequently used as specific reagents in the ImmunoCAP-250 platform. Serum total IgE Total IgE was measured in serum samples using a chemiluminescence immunoassay in a Centaur XP System analyzer (Siemens). Table 1. Clinical Data of Study Patients Stratified by Culprit Insect Culprit Insect P Valuea Vespula species Vespa velutina Apis mellifera VVN vs VVN vs (n=11) nigrithorax (n=77) (n=10) VV AM Age, yb 58 (56-65) 63 (54-69) 54 (41-68) .618 .348 Male sex 11 (100) 66 (85.7) 9 (90.0) .394 .712 History of previous stings Vespula species 11 (100) 75 (97.4) 8 (80.0) .999 .095 Vespa velutina nigrithorax 2 (18.2) 16 (20.8) 0 (0.0) .999 .245 Apis mellifera 6 (54.5) 41 (53.2) 10 (100) .936 .013 Previous systemic reactions Vespula species 1 (9.1) 13 (16.9) 0 (0.0) .826 .349 Vespa velutina nigrithorax 0 (0.0) 5 (6.5) 0 (0.0) .862 .914 Apis mellifera 0 (0.0) 0 (0.0) 3 (30.0) .999 <.001 Habitat (rural) 11 (100) 75 (97.4) 9 (90.0) .999 .775 Occupational exposure (outdoors) 8 (72.7) 43 (55.8) 5 (50.0) .463 .991 Grade of anaphylaxis Grade I 3 (27.3) 12 (15.6) 2 (20.0) .628 .419 Grade II 4 (36.4) 33 (42.9) 6 (60.0) Grade III 4 (36.4) 32 (41.6) 2 (20.0) Time to reaction Less than 15 min 7 (63.6) 61 (79.2) 7 (70.0) .514 .431 15-30 min 3 (27.3) 12 (15.6) 3 (30.0) More than 30 min 1 (9.1) 4 (5.2) 0 (0.0) Use of adrenaline 5 (45.5) 37 (48.1) 5 (50.0) .872 .908 aVVN vs VV, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Vespula species. VVN vs AM, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Apis mellifera . bAge data are median and interquartile range (in parenthesis). The remainder are absolute numbers and percentages (in parenthesis). 230 Vidal C, et al. J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235 © 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 P<.001, trend test). Baseline serum tryptase levels (available for all patients) tended to increase with the severity of the anaphylactic reaction. Median tryptase was 3.9 ng/mL (3.65.4 ng/mL), 4.5 ng/mL (3.5-5.9 ng/mL), and 5.4 ng/mL (4.3-6.7 ng/mL), in patients with mild, moderate, and severe reactions, respectively (P=0.015, trend test). However, serum tryptase levels were similar in patients with anaphylaxis to VVN, Vespula species, and A mellifera (Table 2). The REMA score was <2 in 98 patients. Only 2 patients, both of whom belonged to the VVN group, had a REMA score higher than 2, although the hematological study performed enabled us to rule out the presence of a clonal mast cell disorder. Sensitization Profile Commercially available specific IgE determinations Specific IgE against Vespula species was available in 76/77 patients with anaphylaxis to VVN, and results were positive (>0.35 kUA/L) for all of them. Most patients with anaphylaxis to VVN (70%) also had positive sIgE to the whole venom extract of D maculata, P dominula, V crabro, and A mellifera, in that order (Figure 1). Regarding molecular components, patients with anaphylaxis to VVN had positive sIgE to Vespula species rVes v 5 more frequently than to rVes v 1. Specific IgE to P dominula rPol d 5 was present in most patients with anaphylaxis to VVN. The only molecular component from A mellifera with a positive sIgE rate >50% in patients with anaphylaxis to VVN was rApi m 5 (Figure 1). Patients with anaphylaxis due to VVN had similar levels of sIgE against Vespula species, P dominula, rVes v1, rVes v 5, rPol d 5, D maculata, and V crabro than patients with anaphylaxis due to Vespula species. In contrast, patients Results Clinical Data Seventy-seven patients (77.0%) identified VVN as the insect responsible for the reaction. Only 11 (11.0%) and 10 (10.0%) patients identified the common wasp (Vespula species) and honeybee (A mellifera) as the culprit insect, respectively. Two patients (2%) did not recognize the insect involved in the reaction. All patients with anaphylaxis to Vespula species and A mellifera reported previous stings by the culprit insect. In contrast, only 20.8% (16/77) of patients with anaphylaxis to VVN reported a previous sting by this species. However, all patients with anaphylaxis to VVN reported previous stings by either Vespula species (75/77, 97.4%) or A mellifera (41/77, 53.2%). Twenty-three patients reported past episodes of anaphylaxis before the present attack, even though they had not been sent for evaluation (14 episodes related to Vespula species, 5 to VVN, and 4 to A mellifera). No additional stings were recorded after the last systemic reaction and before inclusion in the study. No differences were found regarding the culprit insect with respect to age, sex, environment (rural or urban), or occupation (outdoors or indoors) (Table 1). Most reactions happened in the first 15 minutes after the sting, with no differences regarding the culprit insect (Table 1). The anaphylactic reaction was mild in 17 cases (17%), moderate in 45 (45%), and severe in 38 (38%) cases. Severity of anaphylaxis to VVN was similar to that of anaphylaxis to Vespula species or A mellifera (Table 1). Adrenaline was used in 48 patients (48%): the more severe the reaction, the more frequent the use of adrenaline (17.6% in mild reactions, 44.4% in moderate reactions, and 65.8% in severe reactions; Table 2. Laboratory Data for Study Patients Stratified by Culprit Insect Culprit Insect P Valuea Vespula Vespa velutina Apis species nigrithorax mellifera n Median (IQR) n Median (IQR) n Median (IQR) VVN vs VV VVN vs AM Serum specific IgE, kUA/L MUXF 11 0.20 (0.00-0.92) 77 0.05 (0.00-0.34) 10 0.09 (0.00-1.55) .362 .562 Apis mellifera 11 1.12 (0.31-3.79) 76 0.91 (0.22-3.67) 10 7.48 (2.88-27.4) .655 <.001 rApi m 1 10 0.07 (0.00-0.35) 76 0.01 (0.00-0.12) 10 2.45 (1.50-7.79) .332 <.001 rApi m 5 10 1.17 (0.11-10.2) 72 0.50 (0.00-3.93) 9 1.15 (0.02-15.4) .432 .710 rApi m 10 10 0.04 (0.01-0.07) 75 0.03 (0.00-0.86) 10 0.31 (0.04-2.25) .802 .053 Vespula species 11 14.0 (8.51-57.3) 76 5.38 (2.03-14.2) 9 0.08 (0.00-7.23) .019 .007 rVes v 1 11 0.07 (0.03-5.98) 77 0.15 (0.03-1.44) 9 0.00 (0.00-1.29) .870 .820 rVes v 5 11 12.4 (0.52-65.0) 76 4.45 (1.48-12.3) 9 0.00 (0.00-0.75) .322 <.001 Polistes dominula 11 4.22 (2.95-36.1) 77 1.54 (0.41-6.72) 9 0.06 (0.00-2.43) .060 .024 rPol d 5 11 6.89 (0.85-15.7) 75 1.65 (0.50-8.31) 9 0.01 (0.00-0.57) .151 .001 Dolichovespula m 7 4.78 (1.10-13.5) 76 1.34 (0.42-4.05) 8 0.15 (0.00-8.85) .046 .185 Vespa crabro 7 2.98 (0.98-3.79) 75 0.93 (0.34-3.34) 9 0.02 (0.00-8.48) .137 .073 Serum total IgE, kU/L 11 189 (126-264) 76 78.5 (33.0-198) 10 45.0 (16.2-182) .017 .247 Serum tryptase, ng/mL 11 4.3 (3.5-5.2) 77 5.1 (3.9-6.4) 10 4.5 (4.1-6.3) .304 .868 Abbreviations: MUXF (o214), marker of cross-reactive carbohydrate determinant; Dolichovespula m , Dolichovespula maculata . aVVN vs VV, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Vespula species. VVN vs AM, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Apis mellifera . 231 Anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235© 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 with anaphylaxis to VVN had lower levels of sIgE against A mellifera and its main allergen, rApi m 1, than patients with anaphylaxis to A mellifera. Of note, sIgE levels to rApi m 5, rApi m 10, rVes v 1, and the CCD marker (MUXF, o214) were similar in all patients, irrespective of the culprit insect (Table 2). Patients with anaphylaxis to Vespula species presented higher levels of total IgE than patients with anaphylaxis to VVN or A mellifera (Table 2). A similar profile was observed when concentrations of venom-specific IgE were considered in relation to total IgE, ie, patients with anaphylaxis to VVN displayed a pattern of sIgE sensitization similar to that of patients with anaphylaxis to Vespula species and different from that of patients with anaphylaxis to A mellifera (Table 3). Customized specific IgE determinations In a subsample of 15 patients with anaphylaxis to VVN, 13 (86.6%) had positive sIgE (>0.35 kUA/L) to a whole Table 3. Ratio of Serum Specific IgE to Serum Total IgE for Study Patients Stratified by Culprit Insect Culprit Insect P Valuea Vespula Vespa velutina Apis species nigrithorax mellifera Ratio of serum specific IgE, n Median (IQR) n Median (IQR) n Median (IQR) VVN vs VVN vs kUA/L to total IgE, kU/L (100) VV AM Apis mellifera 11 0.51 (0.34-1.43) 76 1.07 (0.31-2.92) 10 16.7 (12.3-38.3) .358 <.001 Vespula species 11 8.45 (5.93-21.0) 75 5.54 (3.12-15.7) 9 0.22 (0.0-1.64) .419 <.001 Polistes dominula 11 3.27 (1.01-13.8) 76 2.02 (0.84-5.63) 9 0.18 (0.0-4.16) .319 .040 Vespa crabro 7 1.12 (0.58-3.46) 74 1.91 (0.59-3.35) 9 0.11 (0.0-1.81) .814 .043 Dolichovespula maculata 7 1.83 (1.25-7.11) 75 1.97 (0.85-3.35) 8 0.83 (0.0-2.52) .578 .112 aVVN vs VV, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Vespula species. VVN vs AM, comparison of Vespa velutina nigrithorax with Apis mellifera . Polistes dominula Apis mellifera rApi m 1 rApi m 10 CCD (o214) rApi m 5 rVes v 1 rVes v 5 rPol d 5 Vespa crabro Vespula species Dolichovespula m. 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Patients, % 71.1 74.7 79.2 80.3 23.4 32 35.1 51.4 80 98.7 15.8 100 Figure 1. Percentage of patients with anaphylaxis due to Vespa velutina nigrithorax and positive sIgE (>0.35 kUA/L) to whole Hymenoptera venoms ( Vespula species [n=76], Polistes dominula [n=77], Apis mellifera [n=76], Vespa crabro [n=75], and Dolichovespula maculata [n=76], left side) and their molecular components (rApi m 1 [n=76], rApi m 5 [n=72], rApi m 10 [n=75], rVes v 1 [n=77], rVes v 5 [n=76], rPol d 5 [n=75], and o214 [MUXF, as a CCD marker, n=77], right side). Each venom and its molecular components are represented with the same color to facilitate identification. Figure 2. Scatterplots representing the relationship between serum specific IgE to rVes v 5 and rPol d 5 and specific IgE to Vespa velutina nigrithorax antigen 5 (nVesp v 5). Linear regression models were constructed to predict nVesp v 5 concentrations as a function of rVesv5 and rPol d 5 concentrations, thus explaining 86% and 78% of the variability of nVesp v 5, respectively. R= 0.931 (R2 0.86, P <.001) Constant 0.95 (SE 0.48) B (slope) 0.24 (SE 0.02) 20 15 10 5 0 40 30 20 10 0 R= 0.887 (R2 0.78, P <.001) Constant 0.05 (SE 1.55) B (slope) 0.74 (SE 0.11) Specific IgE to nVesp v 5, kUA/L Specific IgE to nVesp v 5, kUA/L Specific IgE to Pol d 5, kUA/L Specific IgE to nVesp v 5, kUA/L 0 0 20 20 40 40 10 10 30 30 50 60 232 Vidal C, et al. J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235 © 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 venom extract of VVN. Levels of sIgE to VVN were low (median [IQR], 1.1 kUA/L [0.12-20.5 kUA/L]). Using the same methodology, 100% of these patients presented positive sIgE to nVesp v 5, while only 28.8% presented positive sIgE levels to nVesp v 1. Median (IQR) levels of sIgE to nVesp v 5 (2.71 [0.52-37.2 kUA/L], n=15) tended to be higher than those of sIgE to nVesp v 1 (0.17 kUA/L, [0.99-27.1 kUA/L], n=14) and tended to be higher than those of sIgE to whole venom extract of VVN (2.71 [0.52-37.2 kUA/L], n=15). A significant correlation was found between sIgE to VVN and sIgE to Vespula species (R=0.669, P=.009), P dominula (R=0.620, P=.014), D maculata (R=0.973, P<.001), and V crabro (R=0.968, P<.001). There was also a strong correlation between sIgE to nVesp v 5 and sIgE to rVes v 5 (R=0.931, P<.001) and between sIgE to nVesp v 5 and rPol d 5 (R=0.887, P<.001). Figure 2 shows a scatterplot of nVesp v5 in relation to rVes v5 and rPol d 5 and linear regression parameters to predict the level of sIgE to nVesp v5, given the values of rVes v 5 and rPol d 5. Finally, no significant correlation was found between sIgE to nVesp v 1 and sIgE to rVes v 5 and rVes v 1 (R=0.429, P=.143, R=–0.002, P=.993). Discussion The present study enables us to conclude the following: (a) Anaphylaxis to VVN has increased rapidly in frequency recent years in our area, where it represents the most common form of Hymenoptera anaphylaxis today; (b) Most patients with anaphylaxis to VVN do not report previous stings by VVN, although they do report previous stings to other Hymenoptera, especially common wasps (Vespula species); (c) The IgE sensitization profile of patients with anaphylaxis to VVN is similar to that of patients with anaphylaxis to other Vespidae; and (d) Most patients with VVN anaphylaxis show sIgE to antigen 5 from Vespula species (rVes v 5) and antigen 5 from P dominula (rPol d 5), which is strongly correlated with sIgE to antigen 5 from VVN (n Vesp v 5) in the same patients. Taken together, these findings suggest a degree of cross-reactivity between VVN and other Vespidae, which may be important for sensitization and relevant for diagnostic and therapeutic purposes. Our data confirm anaphylaxis to VVN to be a significant emerging problem. The number of patients reporting anaphylaxis to VVN has increased exponentially from the first case in 2015 in our area. The number of incident cases of anaphylaxis caused by other Hymenoptera remained stable in those years, although more than three-quarters of incoming patients reporting Hymenoptera anaphylaxis today identify VVN as the culprit insect. As an example, and considering the number of patients receiving venom immunotherapy, while 60.3% of 126 patients were being treated with A mellifera venom in 2015, 68.2% of 245 were being treated with Vespula species venom in June 2019 (most after experiencing anaphylaxis to VVN). To the best of our knowledge, this is the largest series of VVN anaphylaxis that has been reported in the English-language literature. The paucity of previous reports is noteworthy. We found no scientific reports of anaphylaxis to VVN or anaphylaxis to V velutina variants from the countries of origin in Asia. In the case of European countries where VVN has expanded, we found only 1 case of VVN anaphylaxis in the literature, corresponding to the first case described in 2014 in Spain [13]. While cases of VVN anaphylaxis are commonly reported by the mass media in Spain, underreporting of epidemiological, clinical, and immunological characteristics of VVN anaphylaxis prompted us to report this series in an attempt to fill the knowledge gap for this emerging, relevant clinical problem. Importantly, most of the patients who experienced anaphylaxis to VVN did not recall previous stings from the insect. This fact, together with the results of sIgE determinations, supports the idea that, in our study, allergic reactions to VVN may develop after stings by other Hymenoptera, mainly Vespula species. It could also explain why patients reported here more frequently reacted against Vespula species than against V crabro, which is nearer to VVN than Vespula species. Likewise, cases of anaphylaxis to Vespa orientalis (a different member of the Vespidae family) without previous stings by this insect were reported in American soldiers deployed in Afghanistan [20]. The existence of crossreactivity among allergens from different Vespidae could explain these reactions [18,21-23]. The specific reasons for potentially increased susceptibility to VVN anaphylaxis after sensitization via different Hymenoptera species are not known. Most of the anaphylactic reactions to VVN were moderate to severe. The proportion of cases with moderate-to-severe reactions was similar to that of reactions to Vespula species and A mellifera in the present series. Our data cannot answer the question of potentially more frequent anaphylaxis after VVN sting than after sting by other Hymenoptera species. Taking into account the size of VVN, a more severe reaction could be expected, as occurs with V crabro sting, which is known to induce 3 times more life-threatening reactions than Vespula species or A mellifera stings [22]. Of note, 5 deaths after a VVN sting were reported during 2017 and 2018 in the Galicia region of Spain, which is home to some 2.7 million people. Thus, the number of deaths attributable to VVN was higher than expected for the general population according to a UK national database that sets the risk of death from Hymenoptera stings at 0.09 cases per million inhabitants per year (95%CI, 0.07‐0.10) [24]. These observations further support the clinical importance of emerging VVN anaphylaxis. The lack of specific tools to diagnose and treat patients who are allergic to VVN is challenging for physicians, who must choose the best therapeutic option. In the population studied, all patients with anaphylaxis to VVN presented sIgE to Vespula species, and almost all of them presented sIgE to rVes v 5 and to rPol d 5. We also confirmed the presence of sIgE to antigen 5 from VVN by using the novel allergen nVesp v 5 in all cases from a subsample of patients with anaphylaxis to VVN. Of note, sIgE to antigen 5 from Vespula species, P dominula, and VVN was closely correlated in patients with VVN anaphylaxis. Hence, antigen 5 from VVN appears to be a good candidate as a major allergen. In contrast, a poorer diagnostic value was recorded for nVesp v 1. In addition, sIgE to rApi m 5 (dipeptidyl peptidase IV, which is homologous to Ves v 3 from Vespula species) [25] was detected in more than 50% of patients with anaphylaxis to VVN; consequently, it could also be considered a major allergen. The fact that more than 70% of patients with 233 Anaphylaxis to Vespa velutina nigrithorax J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235© 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 anaphylaxis to VVN reacted against all the venoms used in the study suggests a high level of cross-reactivity that cannot be explained though sensitization to CCD. Therefore, further studies are needed to identify other relevant allergens in VVN venom that would likely react to other venoms as well. Analogies in the sensitization profile of patients who experience anaphylaxis to VVN and Vespula species led us to systematically use a commercially available immunotherapy regimen based on Vespula species (data not shown). To date, only 5 patients with anaphylaxis to VVN and treated with Vespula species venom were stung by VVN after initiating immunotherapy, and none presented systemic reactions (data not shown). Likewise, immunotherapy with Vespula species in patients with anaphylaxis to V orientalis has proven to be efficacious [23], and immunotherapy with Vespula species was efficacious in patients with anaphylaxis to V crabro [26]. Further studies are needed to develop specific immunotherapy for VVN, and a longer follow-up is needed to support the efficacy of immunotherapy initiated in the patients we treat. Meanwhile, commercially available Vespula-based immunotherapy seems to be a wise option in patients with VVN anaphylaxis. Our study is subject to a series of limitations. First, the cause of anaphylaxis was classified according to the identification of the culprit insect provided by the patients, because samples of the insects were not available. Classification is always problematic when dealing with anaphylaxis due to Hymenoptera species. However, the fact that almost all patients live or work in a rural environment, where Hymenoptera are easily recognized, decreases the risk of misidentification. Besides, given that VVN has become very well-known in our region as a result of its proliferation, photographs of insects and their nests are frequently displayed in local newspapers and on television. The reason 2 patients were unable to identify the culprit insect was that they had not seen it. Second, determinations of sIgE to VVN venom and nVesp v 5 were available for a small subsample of patients; therefore, findings should be confirmed in larger studies. Finally, as already mentioned, further molecular and follow-up studies are needed to add information to the profile and outcome of patients that cannot be provided from this preliminary, cross-sectional study. In conclusion, anaphylaxis to VVN is a relevant, emerging problem and has quickly become the most common type of Hymenoptera anaphylaxis in our area. Similarities in sensitization profile between VVN and other Vespidae (particularly Vespula species) could help in the diagnosis and treatment of VVN anaphylaxis when specific determinations and immunotherapy are not readily available. Acknowledgments The authors thank Emilia Martínez Lourido for helping with the collection and storage of serum samples Funding The study was supported by the Instituto de Salud Carlos III (Fondo de Investigaciones Sanitarias, Spanish Ministry of Health, PI16/1401 and PI19/01023) and Fundación de la Sociedad Española de Alergología e Immunología Clínica (SEAIC). Conflicts of Interest Carmen Vidal reports grants from Fundación SEAIC and grants from Instituto Carlos III during the conduct of the study. Rafael Monsalve is an employee of ALK-Abelló. Agustín Galán is an employee of ALK-Abelló. The remaining authors declare that they have no conflicts of interest. References 1. Perrard A, Arca M, Rome Q, Muller F, Tan J, Bista S, et al. Geographic variation of melanisation patterns in a hornet species: genetic differences, climatic pressures or aposematic constraints? PLoS ONE. 2014;9:e94162. 2. Haxaire J, Bouguet JP, Tamisier JP. Vespa velutina Lepeletier, 1836, une redoutable nouveauté pour la faune de France (Hymenoptera: Vespidae). Bull Soc Entomol Fr. 2006;111:194. 3. Monceau K, Bonnard O, Thiéry D. Vespa velutina: a new invasive predator of honeybees in Europe. Journal of Pest Science. 2014:87;1-16. 4. Arca M, Mougel F, Guillemaud T, Dupas S, Rome Q, Perrard A, et al. Reconstructing the invasion and the demographic history of the yellow-legged hornet, Vespa velutina, in Europe. Biological Invasions. 2015:17;2357-71. 5. Villemant C, Haxaire J, Streito JC. Premier bilan de l’invasion de Vespa velutina Lepeletier en France (Hymenoptera, Vespidae). Bull Soc Entomol Fr. 2006;111:535-8. 6. Rome Q, Muller F, Gargominy O, Villemant C. Bilan 2008 de l’invasion de Vespa velutina Lepeletier en France (Hymenoptera: Vespidae). Bull Soc Entomol Fr. 2009;114:297302. 7. Villemant C, Barbet-Massin M, Perrard A, Muller F, Gargominy O, Jiguet F, et al. Predicting the invasion risk by the alien beehawking yellow-legged hornet Vespa velutina nigrithorax across Europe and other continents with niche models. Biological Conservation. 2011;144:2142-50. 8. Castro L, Pagola-Carte S. Vespa velutina Lepeletier, 1836 (Hymenoptera: Vespidae), recolectada en la Península Ibérica. Heteropterus Rev Entomol. 2010;10:193-6. 9. Monceau K, Thiery D. Vespa velutina nest distribution at a local scale: an 8-year survey of the invasive honeybee predator. Insect Science. 2016;00:1-12. 10. Budge GE, Hodgetts J, Jones EP, Ostoja-Starzewski JC, Hall J, Tomkies V, et al. The invasion, provenance and diversity of Vespa velutina Lepeletier (Hymenoptera: Vespidae) in Great Britain. PLoS ONE. 2017;12:e0185172. 11. Liu Z, Chen S, Zhou Y, Xie C, Zhu B, Zhu H, et al. Deciphering the venomic transcriptome of killer-wasp Vespa velutina. Sci Rep. 2015;5:9454. 12. Xie C, Xu S, Ding F, Xie M, Lv J, Yao J, et al. Clinical features of severe wasp sting patients with dominantly toxic reaction: analysis of 1091 cases. PLoS One. 2013;8:e83164. 13. Chugo S, Lizaso MT, Alvarez MJ, Arroabaren E, Lizarza S, Tabar AI. Vespa velutina nigritorax: a new causative agent in anaphylaxis. J Investig Allergol Clin Immunol. 2015;25:231-2. 234 Vidal C, et al. J Investig Allergol Clin Immunol 2021; Vol. 31(3): 228-235 © 2021 Esmon Publicidad doi: 10.18176/jiaci.0474 14. Brown SGA. Clinical features and severity grading of anaphylaxis. J Allergy Clin Immunol. 2004;114:371-6. 15. Bilò MB, Pravettoni V, Bignardi D, Bonadonna P, Mauro M, Novembre E, et al. Hymenoptera Venom Allergy: Management of Children and Adults in Clinical Practice. J Invest Allergol Clin Immunol. 2019;29:180-250. 16. Vázquez-Revuelta P, González-de-Olano D. Prevalence of Clonal Mast Cell Disorders in Patients Presenting With Hymenoptera Venom Anaphylaxis Might Be Higher Than Expected. J Invest Allergol Clin Immunol. 2018;28:193-4. 17. Monsalve RI, Gutiérrez R, Hoof I, Lombardero M. Purification and molecular characterization of phospholipase, antigen 5 and hyaluronidases from the venom of the Asian hornet (Vespa velutina). PLoS One. 2020;15(1):e0225672 18. Monsalve RI, Vega A, Marques L, Miranda A, Fernandez J, Soriano V, et al. Component-resolved diagnosis of vespid venom-allergic individuals: phospholipases and antigen 5s are necessary to identify Vespula or Polistes sensitization. Allergy. 2012;67:528-36. 19. Erwin EA, Custis NJ, Satinover SM, Perzanowski MS, Woodfolk JA, Crane J, et al. Quantitative measurement of IgE antibodies to purified allergens using streptavidin linked to a highcapacity solid phase. J Allergy Clin Immunol. 2005;115:102935. 20. Turbyville JC, Dunford JC, Nelson MR. Hymenoptera of Afghanistan and the central command area of operations: assessing the threat to deployed U.S. service members with insect venom hypersensitivity. Allergy Asthma Proc. 2013:34:179-84. 21. Ollert M, Blank S. Anaphylaxis to insect venom allergens: role of molecular diagnosis. Curr Allergy Asthma Rep. 2015;15:26. 22. Antonicelli L, Bilo M, Napoli G, Farabollini B, Bonifazi F. European hornet (Vespa crabro) sting: a new risk factor for life-threatening reaction in hymenoptera allergic patients? Allerg Immunol (Paris). 2003;35:199-203. 23. Goldberg A, Shefler I, Panasoff J, Paitan Y, Confino-Cohen R. Immunotherapy with commercial venoms is efficacious for anaphylactic reactions to Vespa orientalis stings. Int Arch Allergy Immunol. 2013;161:174-80. 24. Turner PJ, Gowland MH, Sharma V, Lerodiakonou D, Harper N, Garcez T, et al. Increase in anaphylaxis-related hospitalizations but no increase in fatalities: an analysis of United Kingdom national anaphylaxis data. 1992-2012. J Allergy Clin Immunol. 2015;135:956-63. 25. Blank S, Seismann H, Bockisch B, Braren I, Cifuentes L, McIntyre M, et al. Identification, recombinant expression, and characterization of the 100 kDa high molecular weight Hymenoptera venom allergens Api m 5 and Ves v 3. J Immunol. 2010;184:5403-13. 26. Košnik M, Korošec P, Šilar M, Mušiè E, Eren R. Wasp venom is appropriate for immunotherapy of patients with allergic reaction to the European hornet sting. Croat Med J. 2002;43:25-7. Manuscript received September 6, 2019; accepted for publication December 16, 2019. Carmen Vidal Allergy Department Complejo Hospitalario Universitario de Santiago Faculty of Medicine, University of Santiago Rúa Ramón Baltar, s/n 15706 Santiago de Compostela, Spain E-mail: [email protected] 235 https://www.revistaalergia.mx 102 Artículo de Revisión Basophil activation test to follow-up of patients treated with hymenoptera venom immunotherapy: a review of current evidence Prueba de activación de basófilos en el seguimiento de pacientes que reciben inmunoterapia con veneno de himenópteros: revisión de la evidencia actual Virginia Rodríguez-Vázquez,1 Sara López-Freire,1 Paula Méndez-Brea,1 María Teresa González-Fernández,1 Cristian Hernández-Pérez,2 Carmen Vidal,1,2 Abstract Hymenoptera venom immunotherapy (HVI) is a long-term effective treatment to avoid new systemic reactions in patients with Hymenoptera allergy. The sting challenge test is considered the gold standard to confirm the tolerance. However, the use of this technique is not generalized in clinical practice, being the basophil activation test (BAT), which functionally explores allergen response, an alternative that does not entail any of the provocation risks associated with the sting challenge test. This study reviews the publications that used the BAT to follow up and evaluate the success of the HVI. Studies assessing the changes between a baseline BAT before the start and BATs performed between the starting and maintenance phases of the HVI were selected. Ten articles were found, comprising information from 167 patients, of which 29% used the sting challenge test. The studies concluded the importance of evaluating the responses with submaximal allergen concentrations, which reflect basophil sensitivity, to monitor the HVI using the BAT. It was also observed that changes in the maximum response (reactivity) could not reflect the clinical status of tolerance, particularly in the initial phases of HVI. Key words: Hymenoptera venom; Immunotherapy; Basophil activation test; Immune tolerance Resumen La inmunoterapia con veneno de himenópteros (IVH) es, a largo plazo, un tratamiento eficaz para evitar nuevas reacciones sistémicas en pacientes con alergia a este tipo de insectos. La prueba de repicadura controlada es el estudio de referencia para confirmar la tolerancia del individuo. Sin embargo, no se ha generalizado su indicación clínica, por lo que la prueba de activación de basófilos (TAB) resulta una buena alternativa, pues valora de manera funcional la respuesta al alérgeno y está exenta de los riesgos asociados con la provocación. En esta revisión se explora la utilidad de la TAB en el seguimiento y valoración del éxito de la IVH. Se seleccionaron estudios que evalúan los cambios entre una TAB basal y en otro momento de la fase de inicio o mantenimiento de la IVH. Se incluyeron 10 estudios con datos de 167 pacientes, de los que el 29% había tenido prueba de repicadura controlada. Para vigilar la eficacia de la IVH debe explorarse la respuesta del basófilo, con la determinación de las concentraciones submáximas del alérgeno, que reflejan la sensibilidad del basófilo. Los cambios en la respuesta máxima (reactividad) no pueden aportar información del estado de tolerancia, especialmente en las fases iniciales de la IVH. Palabras clave: Veneno de himenópteros; Inmunoterapia; Prueba de activación de basófilos; Tolerancia inmunológica 1 Servicio de Alergología, Complejo Hospitalario Universitario de Santiago, Santiago de Compostela, España. 2 Facultad de Medicina, Universidad de Santiago de Compostela, España. Correspondencia: Virginia Rodríguez Vázquez virginia.rodriguez.[email protected] Recibido: 13-06-2022 Aceptado: 24-09-2022 DOI: 10.29262/ram.v69i2.1135 Rev Alerg Mex. 2022;69(2):102-112. Rodríguez-Vázquez V et al. Prueba de activación de basófilos e inmunoterapia con veneno de himenópteros https://www.revistaalergia.mx Rev Alerg Mex. 2022;69(2):102-112. 103 Introducción Se estima que entre 0.3 y 7.5% de la población adulta, incluso el 3.4% de la infantil, ha padecido alguna reacción sistémica después de la picadura de un himenóptero, debido a la alergia a su veneno.1 La mortalidad asociada varía del 0.03 al 0.48 por cada millón de habitantes al año.1 La inmunoterapia con veneno de himenópteros (IVH) es el tratamiento de elección para evitar nuevas reacciones sistémicas, moderadas-graves, luego del contacto con el insecto.2,3 Entre el 75 y 85% de los pacientes con alergia al veneno de las abejas (Apis mellifera) y entre el 90 y 95% de los alérgicos al veneno de los véspidos (Vespula spp o Polistes spp) consiguen protección después de realizar un ciclo de tratamiento, cuya duración recomendada varía de 3 a 5 años.4,5 Se consideran factores de buen pronóstico para la suspensión de la inmunoterapia con veneno de himenópteros: pérdida de sensibilización, evidenciada de resultado negativo en la determinación de IgE específica, ausencia de reacciones sistémicas durante la administración de las dosis de la vacuna, y buena tolerancia a las picaduras espontáneas o controladas en el medio hospitalario (denominada prueba de repicadura).6 La prueba de repicadura controlada, si bien no es recomendable realizarla con fines diagnósticos en pacientes sin tratamiento debido al riesgo alto de anafilaxia,7 se considera el estudio de referencia para el seguimiento de la inmunoterapia con veneno de himenópteros.3,7 Aun así, no posee una especificidad del 100%, y su indicación en la práctica clínica no se ha generalizado, principalmente por motivos éticos y debido a su complejidad técnica y de accesibilidad al insecto. La determinación de IgE específica al veneno de himenópteros es una prueba comúnmente empleada en la práctica clínica para detectar la sensibilización a himenópteros. Sin embargo, la evolución de los valores de IgE específica después la inmunoterapia no se correlaciona con el estado de tolerancia, pues el 50% de los casos no llega a negativizarse, aun cuando el paciente es capaz de tolerar la exposición.8 En este contexto, se han buscado métodos alternativos que estén exentos de riesgo y permitan predecir el éxito del tratamiento, y de esta forma diferenciar a los pacientes tolerantes de los que requieren tratamiento más prolongado o con mayores concentraciones. Entre las técnicas in vitro propuestas se encuentra la prueba de activación de basófilos (TAB), que valora de manera funcional la respuesta de activación del basófilo luego de la exposición con el alérgeno, lo que se considera una provocación ex vivo.9 La prueba de activación de basófilos cuantifica los cambios en la expresión de los marcadores de activación del basófilo después de la estimulación específica con el alérgeno. En la mayor parte de los protocolos se mide el marcador CD63, situado en la membrana de los gránulos intracitoplasmáticos en reposo y solo es accesible a su detección en la superficie celular después de la activación por la unión con la membrana celular. El CD63 no es un marcador exclusivo de basófilos, por lo que en esta prueba se utilizan otros marcadores específicos de reconocimiento de basófilos para diferenciarlos de otras células sanguíneas.10 La respuesta de activación del basófilo es heterogénea, varía entre los individuos dependiendo del alérgeno empleado. Entre las ventajas de la prueba de activación de basófilos destaca su alta especificidad de respuesta al alérgeno, y el hecho de haberse utilizado frente a inhalantes, alimentos, venenos de himenópteros, látex o medicamentos.9 Como prueba diagnóstica es especialmente útil en pacientes con discordancia entre las manifestaciones clínicas y resultados ambiguos de otras técnicas, cuando no existe una fuente alergénica adecuada para efectuar pruebas cutáneas o de provocación, o en situaciones en las que una nueva exposición pueda suponer un riesgo.9 Sin embargo, es una prueba de compleja facturación, que requiere medios técnicos específicos, como la disponibilidad de un citómetro de flujo, que no siempre se encuentra al alcance de todos los centros asistenciales. Por último, y aun disponiendo de un citómetro, la prueba de activación de basófilos es un estudio de difícil interpretación. Sus resultados se expresan, principalmente, en dos medidas de actividad del basófilo: 1) reactividad y 2) sensibilidad.9 La reactividad se refiere a la cantidad de basófilos que responden (CD63+) al estímulo del alérgeno, correspondiendo a la máxima respuesta alcanzada después de llegar a un plateau, en una curva dosis-respuesta con diferentes concentraciones. La principal utilidad de la medida de reactividad del basófilo es el diagnóstico de la patología alérgica, que alcanza una sensibilidad del 85-100% y especificidad del 83-100% para el veneno de himenópteros, cuando se utiliza CD63 como marcador de activación.11,12,13 En pacientes con anamnesis de reacciones sistémicas después de la picadura de algún himenóptero, en quienes el resultado de IgE específica es negativo, la prueba de activación de basófilos ofrece como ventaja diagnóstica una mayor sensibilidad, que no se afecta por el tiempo transcurrido entre la reacción y la prueba,14 especialmente en pacientes con valores bajos de IgE total.15 También supone un método preciso y seguro para el diagnóstico de alergia a himenópteros en pacientes con mastocitosis.15 Además, es especialmente útil para identificar el himenóptero responsable en caso de doble sensibilización y falta de reconocimiento por parte del paciente, evitando así una doble inmunoterapia.16,17 La sensibilidad, por su parte, hace referencia al umbral de concentración del alérgeno que produce una respuesta positiva. Puede expresarse de diferentes maneras: 1) EC50, que corresponde a la concentración que produce una respuesta en el 50% de los basófilos reactivos en una curva dosis-respuesta, 2) CD-sens, índice que resulta de la inversión del EC50 y al multiplicar por 100, o 3) LC50, que equivale al log10 de la concentración que produce un 50% de la activación de los basófilos. Otra aproximación a la sensibilidad es la ratio 0.1/1, medida que se ha relacionado con la aparición de