Contribución a la identificación y caracterización de pescados frescos y conservados, mediante Electroforesis sobre gel de Poliacrilamida

UNIVERSIDAD DE SANTIAGO FACULTAD DE FARMACIA Departamento de Bromatologia-Toxicologia y Análisis Quimico Aplicado CONTRIBUCIÓN A LA IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PESCADOS FRESCOS Y CONSERVADOS, MEDIANTE ELECTROFORESIS SOBRE GEL DE POLIACRILAMIDA. Memoria presentada en la Facul tad de Farmacia de la Universi dad de Santiago de Compostela, para optar al Grado de Doctor en Farmacia, por ELVIRA ALVAREZ VEGA. ·-----------------------~---- -------~ D.L.: C. 378-1973 Servicio de MecanizaciÓn de la Universidad de Santiago / \ D. JESUS SIMAL LOZANO, Profesor Agregado de Bromato logía y Toxicología de la Facultad de Farmacia de la Uní versidad de Santiago de Compostela, CERTIFICA: vo so Codirector, Que la Tésis Doctoral CONTRIBUCION A LA IDENTIFICACION Y CARACTERIZACION DE PESCADOS FRESCOS Y CONSER1'ADOS MEDIANTE ELECTROFORESIS SO - ERE GEL DE POLIACRILAMIDA~ ha sido realizada bajo mi dirección y la del Prof. D. A. Charro Arias, en el Departamento de Bromatología - Toxicología y Análisis Químico Aplicado de la Facultad de Farmacia de Santiago de Compostela. Santiago de Compostela, Setiembre de 1973. El Director, Deseo expresar mi agradecimiento a los Pl•ofs. D. Jesús Simal Lozano y D. Aniceto Charro Arias,por la dirección de esta Tésis asi como su continua orientación en mi formación cientifica. Al Pro f. D. José M. Cr•eus Vidal y demás compañeros de Depártamento por la ayuda proporcionada. Igualmente agradezco la ayuda y colaboración prestada por el Director del Departa mento de Farmacia Galénica Prof. D. Rafael Ca-- dórniga Carro y el Dr. D. Isaac Arias Santos en la liofilización de los pescados y al Prof. D. Pablo Sanz Pedrero Director del Departamento de Fisico-Quimica por las facilidades prestadas p~ ra la utilización del Chromoscan. Asi mismo hago constar mi gratitud al Ministerio de Educación y Ciencia por la Beca de Formación de Personal Investigador que ha sustentado económicamente este trabajo. N O T A.- Algunos de los resultados encontrados en las especies de la Familia GADIDOS, han sido objeto de una publicación en Anales de Bromato logía XXIV-3 235250 (1.972). I N D I C E 1.- INTRODUCCION. 1.1.- Consideraciones previas.- 1.2.- Composición del pescado.- 1.3.- Distintas formas de presentación del pescado en el mercado.- 1.4.- Justificación de la aplicación de la electro foresis.- 2.- ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS. 2.1.- Ventajas de la electroforesis en gel de poliacrilamida.- 2.2.- Distintas aplicaciones de esta técnica.- 2.3.- Trabajos realizados sobre pescados mediante electroforesis.- 2.3.1.- Electroforesis en general: 2.3.2.- Electroforesis sobre gel de poliacrilamida: _____ ___:____ ________________ ~ 3.- PARTE EXPERIMENTAL. 3.1.- Introducción.- 3.2.- Material.- 3.3;- Reactivos.- 3.3.1.- Técnica de electroforesis: 3.3.2.- Determinación del nitrógeno: 3.4.- Geles estudiados.- 3.5.- Pescados estudiados.- 3.5.1.- Motivo de estudio: 3.5.2.- Clasificación de los pescados: 3.5.3.- Características de los pescados: 3.6.- Muestras.- 3.7.- Preparación del extracto.- 3.8.- Determinación del nitrógeno de la muestra.- 3.9.- Cantidad de muestra a utilizar.- 3.10.- Elaboración del gel estudiado.- 3.11.- Colocación de la muestra.- 3.12.- Desarrollo electroforético.- 3.13.- Tinción y fijado de las proteínas.- 3.14.- Decoloración. --~ ---~~--~---~---------~-- 4.- ELABORACION DE RESULTADOS. 4.1.- Antecedentes.- 4.2.- Interpretación.- 5.- RESULTADOS DE LOS PESCADOS ESTUDIADOS. 5.1.- Pescados frescos.- 5.1.1.- Anguila: 5.1.2.- Congrio: 5. l. 3. - Ga 11 o: 5.1.4.- Lenguado: 5.1.5.- Bacaladilla: 5.1.6.- Faneca: 5 .l. 7.- Abadejo: 5 . l. 8 . - Me r 1 u z a : 5.1.9.- Pescadilla: 5.1.10.- Caracterización e identificación de las especies estudiadas: 5.2.- Pescados congelados.- 5.2.1.- Merluza congelada "Pescanova": 5.2.2.- Merluza fresca conservada en el congelador á -10°C. de 3 á 7 días: 5.2.3.- Filetes de Merluza congelada "Pescanova" (A): 5.2.4.- Filetes de Merluza congelada "Pescanova" (B): 5.3.- Pescados empanados.- 5.3.1.- 6 porciones Merluza empanada "Pescanova": 5.3.2.- 8 porciones Merluza empanada "Pescanova": 5.4.- Pescados liofilizados.- 5.4.1.- Bacaladilla liofilizada: 5.4.2.- Faneca liofilizada: 5.4.3.- Merluza 5.5.- Pescado secado al sol.- 5.5.1.- Congrio secado al sol: 5.6.- Pescado en verde.- 5.6.1.- Bacalao en verde: 5.7.- Pescado cocido.- 5.7.1.- Merluza cocida y su líquido de cocción: 6.- CONCLUSIONES. 7.- BIBLIOGRAFIA. ----------------------~------------------------------- 1.4.- Justificación de la aplicación de la electrofore sis.- Esta gran variedad de formas comerciales, que 1n cluso a veces se presentan (no enteros) hacen que el aspecto de la especie de que procede sea modificado y en muchas de estas formas no es posible observar el color de sus agallas, tersura, escamas, etc., pudiendo suceder que especies de mejor calidad y precio más alto sean sustituídas por otras de propiedades organolépticas parecidas, p~ ro de precio y calidad inferior, por lo que es ne cesario disponer de métodos analíticos que permitan la identificación de una determinada especie, y su estado de alteración, aún en el caso de encontrarse en pequeños trozos (croquetas, filetes, porciones empanadas, etc.). Uno de los métodos más recientes e interesantes es sin duda el de "electroforesis en gel de poliacrilamida" ó "electroforesis de disco", así llamada porque las proteínas resultan dispuestas en una serie de pequeños discos a lo largo del cilin dro que constituye el gel soporte de la electrofo resis, veanse fotografíás en 4.2. -25- 2.- ANTECEDENTES BIBLIOGRAFICOS 2. 1.- Ventajas de la electroforesis en gel de poliacrl lamida.- La electroforesis en gel de poliacrilamida puesta en práctica por ORNSTEIN, L. (4) y DAVIS, B.J. (S) presenta las siguientes ventajas: la.- Exige poco tiempo para el proceso. 2a.- Permite desarrollar simultáneamente varias muestras de pocos ~1. 3 a.- L "" . ogra separar prote1nas y sustanc1as con gran resolución en las bandas. 4a.- Interpretación de dichas bandas por densito me tría. Sa.- Resistencia del gel al manejo. 6a.- Fácil conservación del gel en ácido acético al 7,5%. 2.2.- Distintas aplicaciones de esta técnica.- Aunque este método se inició a partir de 1.964, -26- cuenta ya con aplicaciones muy diversas, como ejemplo, señalaremos que ha sido utilizada por SILANO, V. y col. (6) para reconocer y determi nar cuantitativamente mezclas de harina de arroz en harinas de trigo y en la comprobación del tipo de harina empleada en la pasta alimenticia. A la harina de trigo, grano y pasta alimenticia le añade harina de arroz en proporción decrecie~ te del 20 al 2% y los extractos proteicos obteni dos con agua-etanol (10-90) son analizados por electroforesis en gel de poliacrilamida, lo que permite reconocer y determinar la cantidad de arroz añadida mediante la determinación densitométrica de la banda proteica característica del arroz. SILAEV, A.B. y col. (7), en 1.965 utilizan la téc nica de electroforesis horizontal sobre poliacrilamida logrando subfraccionar las albúminas del arroz en 11 componentes. BARBER, S. y col. (8) en 1.972 determinan, media~ te electroforesis de disco, los cambios de la albú mina durante el almacenamiento del arroz elaborado y los comparan con los producidos por el curado ar tificial y el tratamiento con vapores de formol. Silano, V. y col. (9), también aplican esta técnica -27- '·- en la caracterización de las proteínas del huevo en "pastas alimenticias al huevo". La sensibilidad de esta técnica permite a PORTMANN, A. y PIERRE, A. (lO) poner en evidencia un mínimo de caseína as 1 de vaca correspondiente á 1,5-2 partes por cien de leche de vaca, aplicándola a la búsqueda y medida de la leche de vaca en los quesos de cabra. En 1.970 cHANG, P. y col. (11) comprueban que esta técnica es efectivá para la separación de protei nas de albúmina tratada térmicamente, albúmina sin tratar y yema de huevo completo centrifugado. Encontrando bandas para las ovoalbúminas, conalbúminas y ovoglobulinas no pudiendo ser detectado el ovomucoide. Las livetinas y lipovitelinas de la yema se separan en dos bandas distintas. Con el huevo completo centrifugado se observan bandas electroforéticas de livetina y albúmina, pero las bandas varían completamente cuando se calienta a temperatura de pasteurización, 61,7°C ó a temperaturas superiores. MORR, C.J. (12) hace una comparación de los geles de almidón y poliacrilamida en el examen de los productos de degradación de la caseína en el queso, preparados en 5 variedades de queso, de 1 -18- día á 13 meses después de su elaboración. También utiliza la electroforesis de poliacrilamida GRACHEVA, I.M. (13) en la caracterización de la composición proteica del mosto de cerveza obteniendo 6 fracciones de diferente peso molecu lar, comprendido entre 26.000 y 166.000. Esta técnica también es empleada en la identificación de la especie zoológica. HOYEN, T. y THORSON, B. (14) separan las mioglobinas del: caballo, ballena, vaca, oveja, alce, reno, cabra, cerdo y oso. Presenta fotografías de los geles y hallanuna relación para la banda principal y secundaria (Rb). Este método le permite averiguar si las carnes de mayor coste están mezcladas con las de precio más bajo. FRATI, G. y col. (15) estudian9 especies animales e identificanla especie zoológica utilizando el Rb de la banda principal y secundaria para cada uno de ellos. En este trabajo atestiguanel gran valor de la electroforesis de disco sobre gel de poliacrilami da en estudios entre extractos proteicos acuosos, como método rápido y sensible en la determinación de la especie zoológica. -29- CODURI, R.J. y RAND, A.G. (16) obtienen mediante ~ectroforesis sobre placas de gel de ~oliacrila mida fotografías de los proteinogramas correspo~ dientes a la carne de vaca, ternera, cerdo, cordero, y caballo lo que lffipermite diferenciar di chas especies. En el mismo trabajo hacen un estudio de mezclas de carne de vaca y cerdo: vaca 100% 50% --------------- 75% --------------- 85% --------------- 90% --------------- 95% --------------- 97,5% --------------- cerdo 50% 25% 15% 10% 5% 2,5% 100% detectando la adulteración de la carne de vaca con un mínimo del 5% de cerdo Y de vaca y caballo en las proporciones: vaca 100% 50% 75% -30caballo 50% 25% 85% -------------- 90% -------------- 95% -------------- 97,5% -------------- 15% 10% 5% 2,5% 100% logrando detectar una adulteración de la carne de vaca con un mínimo del 20% de carne de caballo. Es también muy amplia la utilización de esta técnica en la separación y determinación de isoenzimas, así, ENMANUELLI, G. y col. (17) la emplean para la determinación de la.láctico-deshidrogenasa y de la málico-deshidrogenasa, presentando las fotografías de dichos isoenzimas en diferentes órganos de rata: cerebro, riñón, bazo, múscu lo, miocardio e hígado. COROMINAS, A. y col. (18) hacen una comparación de distintos métodos electroforéticos en la sep~ ración de isoenzimas de lacto-deshidrogenasa. PARSONS, A.L. y col. (19) establecen una diferen cía electroforética de proteínas en el cerdo pr~ sentando los electroforetogramas de distintas miosinas del cerdo así como los de las trompomi~ sinas del cerdo, oveja, buey y conejo. -31- 2.3.- Trabajos realizados sobre pescados mediante electroforesis.- 2.3.1.- EZeatroforesis en general: Las distintas técnicas de electroforesis (Tiss~ lius, papel, acetato de celulosa, etc.) han sido ampliamente utilizadas para el estudio e iden tificación de los pescados. Datan de 1.953 los primeros trabajos dentro de la línea de identificación de pescados y son d~ bidos a CONNELL, J.J. (20) que utiliza un apar~ to de Tisselius, con un buffer de fosfato disódico y monopotásico, de pH 7,5 fuerza iónica de 0,05 á 0,02, logrando proteinogramas diferentes según la especie estudiada. En 1.953 el mismo CONNELL, J.J. (21) publica un· trabajo sobre los extractos musculares de 20 es pecies (cuadro I) y señala la existencia de con siderables diferencias en los diagramas electr~ foréticos, así como.la posibilidad de utili~ar los mismos a modo de hueZZas dactilares para la identificación de los pescados estudiados. La mayoría de los autores que aplican la electroforesis a los pescados, solo señalan su nombre común, lo que imposibilita la comparación de resultados dado que una determinada especie -32- •, CUADRO CONNELL, J.J. (1.953) Español Inglés Francés Alemán Portugués Bacalao .......... !Cod .................. ~abillaud .... .. Eglefin .......... !Haddock .......... lf:grefin .......... ISchellfisch .. la\rinca .......... .. iting .......... rlan ............ ittling ........ !Badejo .....•••.... rlan oalfiah .••.••.. ruca ..•...••••.• ILing •......•.••..•.. ingue ....•...•••. ng •••.........••.• ~nzela ..••••.••• qfiacb eh, rluza •••••••.•• IJiake ••••••••••.••••• llferlua ............ IBecbeebte ••• ._ rluc:he Arenque ......... . Rape ................ ¡Auglerfiab .... jlawltoie•---IS•cteufel .. -- 'ller -33ELECTROFORESIS DE TISSELIUS EE.UU. Latfn Gadus morrhua (L.) Gadus callarías (L.) Helanogrammus aeglefinus. Gadus aeglefinus (L.) iting ..•....... 1 Herlangius merlangus (L.) Gadus merlangus (L.) Gadus virens Holva aolva (L.) Lota aolva (L.) Merluccius merlucciu (L.) Herlucc:iua vulgaris (Flem.) Clupea harengus (L.) lerfiah •••• 1 Lophiua piac:atoriua (L.) CUADRO continuación CONNELL, J.J. (1.953) ELECTROFORESIS DE TISSELIUS 1 Español Inglés Francés Alemán Portugués EE.UU. Latin Solla .............. ! Plaice ............ l Plie ................ , Scholle .......... , S8lha .............. , Plaice ............ , Pleurenectes Carrelet Goldbutt Platessa (L.) Lengua lisa 1 Lemon sole····l Limande solej Limande··········¡ Azevia ··········¡ Lemon sole····¡ Pleurenectes microceph~l Echte lus (DONOV). 1 Rotzunge Microstomus Kitt (DAY)., Hendo falso 1 Witch··············1 Plie Grise····¡ Rotzunge········¡ Lingua············¡ Witch··············¡ Glyptocephalus cynogloLenguado sus. Sallo··············! Megrin············l Cardine··········l Migram············l Areiro············l Megrin············l Lepidorhombus whiffiagonis. Lepidorhombus bosci (Risso). Pleuronectes Limanda (U Rodaballo······( Turbot ........... ~ Turbot·· .......... ¡ Steimbutt······l Pregado··········l Turbot············l Rhombus maximus (L.) Scophthalmus maximus (U Raya noruea.j Flapper skai Pocbeteau··-·1 Glattrocbe···1 Raía oírega 1 Flapper aka-1 Raja batís (L.) te. gris te, Rayacoaún···i Thornbaclt-···~ Raie louc:lf.j Mqelroche-·.J bia pinta .. ..j ThornbacJt ...... ¡ Raja clavata (L.) ray. ray Raya santí.!_l Cucltoo ray-1 bie fleuri.( Kucltucka ro-lbia de doí; Cucltoo ray···.J Raja airaletus (L.) gueaa 1 chea lolhoa JRaja naevus (M. y H.) -34- 1 • •1 estudio de 22 especies, (cuadro V). En 1.967 THOMPSON, R.R. (29) dió a conocer un método para la identificación de pescados mediante electroforesis de disco. Poco después, el mismo THOMPSON, R.R. (30) e~ pone las diferencias encontradas entre.el bacalao, el abadejo y la_perca, hallando 7 frac cienes que denomina con otras tantas letras del abecedario y cuya intensidad mide subjeti vamente señalándola con mayor o menor número de cruces. El método lo propone para que sea adoptado por la A.O.A.C. como oficial. La téc nica aparece recogida en los Métodos de Análi sis de la A.O.A.C. edición de 1.970 (31), si bién se indica la necesidad de hacer estudios comparativos con especies tipo. ROD CHU en 1.968 (32) estudia 15 especies de pescados (cuadro VI) e indica las diferentes posiciones de las bandas, más destacadas, intermedias y menores a las que, subjetivamente, designa por las letras: a, b y c. Dentro del grupo SoZe la identificación es posible, pero en el caso del grupo Rock 6 de las 8 especies que estudia no tienen diferencias en sus electrofore~ogramas. -41- .... <11 "" "" ., e: "' <11 ..... ...... ..... S <11 :.... l.. c.. ¡:: §; CUADRO V MANCUSO, V.M. (1.964) Español Inglés Francés Alemán Red Snapper Vivaneaux .. Schnapper .. Lane snapper Vivaneaux .. Schnapper .. 1 l 1 1 ¡ ________ l_ ___________ l ________ j ______ 1 ackl'nhars- ¡ctw 4~ ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Portugués Castanholas Castanholas f-·-- ------- EE.UU. Red or American Lane ............ White .......... Bastard ........ Yellow Eye .. Mexican ...... Mangrove ····¡ Mexican ...... green tail 1 Hamhone ...... 1 Kittv chp)) Scamps mi tl : Latín Lutjanus blackjordi Lutjanus synagris 1 1 1 ! i 1 1 1 ! ¡ -- - --- -- -- ---- _., ~\~ctso, v.~. (1.964) Español : Corvinas Corvinas .... Corvinas .... San reatro W'hite sea .. 1 Bass Spotted weakfish Gallineta .. 1 lte-d fish .... nórdica CUADRO V continuación ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Corvina ...... ! Sand trout .. j Cynoscion arenaWhite or .... Silver trout Speckled .... trout or Spotte weak fish Sebastes .... 1 Rotharsche .j Cantarilho .j Red fish or Ocean perch Red drum rius Cynoscion nobilis Cynoscion nebulosus Sebastes marinus S. mentella S. viviparus Corvinas ...• 1 Bl.tckdrum •. 1 Grand tambour Adlerfische 1 Corvina ...... 1 Black drum Pogonias cromus Perca ......... . Perch ......... . Perch Barsche ...... -43Perca ......... . Perch ........ .. Perca fluviatilis (L.) CUADRO V continuación 'IA~CCSO, V.M. (1.964) ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA 1 1 1 Español Inglés Francés Alemán Portugués EE.UU. Latín 1 1 1 1 1 ! 1 Abadejo ........ 1 Pollock ........ Lieu jaune .. Pollack ........ Badejo .......... Pollock ........ , Pollachius pollai chius (L.) 1 ' Gadus pollachius 1 1 (L.) f Platijas ...... Flounder ...... Flounder ...... Se da a la familia PLEURONECTIDOS Merluza ........ Hake .............. Merlu ............ Secheehte , ... Pescada ........ Hake or ........ Merluccius merluWhinting ccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem.) Salmonetes .. Striped ........ Rouget .......... Meerbarben .. Salmonete .... Striped or .. Mullus barbazus mullet barbet Black mullet -44- CUADRO VI ROO CHU (1.968) ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA ] Espaftol Ingl~s Francés Alemán Portugués EE.UU. Latín Sonddab sole Citharichthys sordidus. Rex sole .... Rex sole .... Clyptocephalus zachi rus Rémol .......... Brill .......... Barbue ........ Kleist ........ Rodavalho .. Petrale sole Eopsetta jordani 1 1 Lenguados .. Dover sole .. Soles .......... Dover sole .... Microstonus pacificus Split-nose .. Sebastodes diploproa ¡ roe k Chilipepper Sebastodes goodei roe k Bocacc io ...... Sebastodes pancispiroe k nis j _________ Striped-tail Sebastodes saxicola roe k ·- ·-------- -45- CUADRO VI continuación ROO CHU (l. 968) ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA Español Inglés Francés Alemán Portugués EE.UU. Latin Widow rock .... Sebastodes entomelas Blue rock .... Sebastodes mystinus Olive rock .. Sebastodes derranoides Pacific ........ Paz if ischer Pacifir ........ Sehastod(•s alutus ocean perch Rotbarsch ocean perch Wi tebait ....... Allosmt>rus t>lnngatus Carita .......... King f ish .... Thazard ........ KiinigsmakreCavala-irt>al Kingfisch .... Gl•ny(,n(•mtJs J j Ot'ilt liS le 1 1 1 1 ! ' ' 1 ! 1 1 ------ 46-- COWIE, W.P. (33) en 1.968 mediante electrofor~ sis de los miógenos musculares sobre capas del gadas de gel de poliacrilamida, obtiene la dis tribución de las bandas electroforéticas de 20 especies comerciales la cual es característica para cada especie y no se altera por almacenamiento en hielo o conservación del pescado co~ gelado. Esto le hace posible la identificación de cualquier filete .de pescado fresco o congelado perteneciente a una de estas 20 especies por comparación de la distribución de las bandas con los patrones obtenidos. Señala también que dicho método se puede emplear para identificar 2 ó mas especies de pe~ cado fresco mezcladas, pero no sirve para iden tificar pescado cocido. ALYKOVA, T.V. y MIRONOVA, O.V. (34) en 1.970 hacen un estudio de las proteínas sarcoplasm! ticas del tejido muscular del Esturión obteniendo 9 fracciones. Ponen de relieve la venta ja del método de electroforesis de disco sobre la electroforesis de papel en la separación electroforética de proteínas. También estudian la dinámica de la variación del contenido de proteínas en función del tiempo de almacenamien to del pescado. -47- Recientemente entre nosotros, ARIAS, E. y col. (35) aplican esta técnica para identificar 3 especies del género Diplodus: Diplodus vulgaris Diplodus sargus Diplodus annularis presentan unos esquemas de los electroforegramas obtenidos con cada una de ellas, logrando diferenciarlas. En trabajos que hemos realizado anteriormente (36) sobre la familia Gadidos: Merlangus poll~ chius (Abadejo), Merlangus poutassou (Bacaladi lla, que por error aparece consignado como Bacalao), Gadus luscus (Faneca) y Merluccius M. Atlanticus (Merluza), se han encontrado, media~ te estadística, diferencias notables tanto en las movilidades relativas como en el porcentaje proteico de las especies estudiadas, lo que posibilita su identificación. CODURI, R.J. y RAND, A.G. (37) en 1.972, aplican la electroforesis en gel de poliacrilamida a la diferenciación de especies de pescados y mariscos (cuadro VII) presentando las fotografías de los proteinogramas correspondientes. -~- • CUADRO VII CODURI, R.S. y RAND, A.C. (1.972) ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA -----···-------- ------------ ¡ Francés Alemán Español Portugués 1 EE.UU. ¡ La+.ín J +-----+-----+--------+-----~----+-- +--------------1 Inglés ' iEglefín 1 1 1 . ........ 1 Haddock ...... ¡ 1 Cod .............. ¡ 1 ¡Bacalao 1 1 ¡Merluza ........ 1 Hake Gallineta nórdica Redfish ...... Eglefín Cobillaud .. 1 1 Morue Merlu .......... Sebastes .... Schellfisch l Kabeljan .... 1 Dorsch 1 Secheehte .. , Rotharsche 1 Arinca 1 '''1 Bacalhau · Pescada Cantarilho .. Haddock Codfish Atlantic Ha k e ...... Ocean perch 1 ! Melanogrammus aeglefinus Gadus aeglefinus (L.) Gadus morrhua (L.) Gadus callarías (L.) Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem.) Sebastes mentella Halibut ............ ! Halibut ...... ¡ Fletan de .. 1 Heilbutt .... i Alabote ...... 1 Halibut ...... 1 Hipoglosus hipoglosus atlantic l'Atlantiqu Mendo Falso guado len- / ' Nendo limón lengua lisa Rodaballo .... Witch .......... 1 Lemon sole Summer ........ flounder Turbot ........ Plie grise 1 Rotzunge .... ! Lingua ........ ! Yellowtail 1 Limanda ferruginea Limanda sol e Cardean D'été Turbot ........ Limante ...... , Rotzunge Azevia ........ , Steinbutt .. 1 Pregado ...... ¡ -49flounder Blackback .. Pseudopleuronectes flounder americanus Summer floParalichthys dentatus under o Fluke Greenland .. 1 Rhombus maximus Turbot 3.- PARTE EXPERIMENTAL 3.1.- Introducción.- Teniendo en cuenta la gran cantidad de especies que se capturan en los puertos gallegos (cuadro 1) (38) y que muchas de ellas son diferentes a las de otras costas atlánticas y más aún, a las de otros mares, nos ha parecido de interés apli car la electroforesis de disco a los pescados de esta región, con lo que a parte de establecer, si es posible, la diferenciación entre ellos, ta~ bien estudiaremos las modificaciones que experimentan las fracciones proteicas al ser sometidas a la congelación, liofilización, secado al sol, etc. 3.2.- Material.- 1°).- De los numerosos equipos para electroforesis de gel que se encuentran en el mercado hemos utilizado el de la casa Pleuger (Bé! gica) "Acrilophor", modelo 140, (figura I) que consta de las siguientes partes: -50- 14°).- Frascos de color topacio para guardar dichas disoluciones. 15°).- Destilador de agua de la casa Afora, Mode lo Vitrolab. 16°).- Otro material de vidrio corriente en labo ratorios como: matraces aforados, capsulas, vasos de precipitados, probetas, embudos, tubos de en~ayo, etc., etc. 3.3.- Reactivos.- 3.3.1.- Téaniaa de eZeatroforesis: Después de los ensayos oportunos con distintos geles, que más tarde señalaremos, hemos seleccionado como más adecuado para nuestro trabajo el gel de BLOEMENDAL, H. (39) que utiliza las siguientes disoluciones: A) Para la formación de los geles: la.- 30 gr. de acrilamida y 0,8 gr. de NN'm~ tilenbisacrilamida en lOO ml. de agua destilada. 2a.- 1,6 gr. de S dimetilaminopropionitrilo en 100 ml. de disolución de TRIS-glicina (3 gr. de tris-hidroximetil-aminome- -57- tano y 14,4 grs. de glicina en 250 ml. de agua destilada), 3a.- 30 mgrs. de ferricianuro potásico en 100 m l. de agua destilada. 4a.- 450 mgrs. de persulfato amónico en lOO m l. de agua destilada. Dichas disoluciones deben guardarse en botellas oscuras y conservarlas en nevera, tenien do un tiempo de duración de 3 á 4 semanas. B) Colorante trazador: azul de bromofenol. C) Colorante para teñir las fracciones proteicas: amidoschwars 10 B (colorante azul) D) Para la fijación de las fracciones proteicas, decoloración y conservación de los geles: ácido acético. E) Disolución buffer: 3 gr. de TRIS y 14,4 gr. de glicina en 1000 ml.de agua destilada. 3.3.2.- Determinación del nitPógeno: • En la determinación del nitrógeno por el método -58- • de LOWRY, D.M. (40) son necesarios los siguie~ tes reactivos: Carbonato sódico. Hidróxido sódico. Sulfato sódico cristalizado con 5 mole culas de agua. Tartrato sódico potásico. Wolframato sódico, cristalizado con 2 moléculas de agua. Molibdato sódico, cristalizado con 2 moléculas de agua. Acido fosfórico. Acido clorhídrico concentrado. Sulfato de litio .. Agua de bromo. 3.4.- Geles estudiados.- La técnica de electroforesis en gel de poliacrilamida utiliza como principal monómero la acrila mida, en mezcla con el comonómero metilenobiscri lamida (BIS), en proporciones adecuadas para con seguir geles manejables. Cuando por exigencia técnica baja la concentración del monómero debe aumentarse la del comonómero. -59- La concentración del monómero puede variar del 3 al 30% con lo que se reduce el diámetro del poro del gel, y consiguientemente la posibilidad de eliminar moléculas proteicas de tamaño más o menos grande. Las utilizadas más corrientemente son de 5 y 7,5% de monómero. Dicha concentración se refiere exclusivamente al monómero acrilamida. Cambios minúsculos en estas disoluciones pueden originar variaciones en la separación de proteínas, por ello, debe tenerse gran cuidado en las pesadas, pH, etc. Es de señalar que los monómeros son neurotóxicos por lo que deben manejarse con cuidado. Para la polimerización del monómero se utiliza un sistema iniciador-catalizador. Como iniciador se puede emplear TEMED o DMAPN, que también sirve para controlar la polimerización, debiendo usarse concentraciones adecuadas para que el proceso dure de lO á 30 minutos. La catálisis se puede lograr por método químico, con persulfato amónico, o por método fotoquímico con riboflavina. El proceso de catálisis con pe~ sulfato es inmediato mientras que con riboflavina -60- ,. hace falta la acción de la luz fluorescente blan ca y tarda de 30 á 45 minutos, por lo que el pri mero es más utilizado. Hemos elaborado distintos tipos de geles a fín de conocer cual resultaba mas adecuado. El primero ensayado fue el de BLOEMENDAL, H.(39) formado por un solo gel de concentración 7,5%, y que utiliza las disoluciones anteriormente señaladas (3 • 3 • L-) . El segundo gel estudiado es también el de BLOEMENDAL, H. (39) pero con una concentración de acr~ lamida del 5%, consiguiendo poro mas abierto. Otro gel ensayado fue el propuesto por THOMPSON, R.R. (30) como método oficial de la A.O.A.C., fo~ mado por tres geles: Gel separante del 7,5%, Gel espaciador del 5% y Gel muestra del 2,5%. El último gel estudiado fue el de VITTORIO SILANO (9) formado por dos geles; uno inferior del 7,5% y otro superior del 2,5%. Todos los casos anter1ormente señalados utilizan como buffer: 3 grs. de TRIS y 14,4 grs. de glicina en 1.000 ml. de agua destilada, pH 8,8 (9,0). -61- 3.5.- Pescados estudiados.- 3.5.1.- Motivos de estudio: Se ha hecho un estudio del pescado bajo diversidad de formas, para lo cual hemos escogido varias especies frescas que clasificamos por familias. Una vez estudiadas éstas, repetimos los ensayos del algunas de ellas bajo los siguientes aspectos: 1°).- En el caso de la Merluza estudiamos la va riación que hay con el tamaño, comparánd~ la con la Merluza joven o Pescadilla. 2°).- Se estudian las modificaciones ocasionadas por algunos métodos de conservación, como congelación, liofilización, secado al sol, etc., dado que así se presentan en el mercado, utilizando los pescados abajo señalados. 3.5.2.- Clasificación de los pescados: A.- PESCADO FRESCO que ha sido clasificado mediante la clave de PERRIER, R. (41), la de LOZANO, L. (42) MUltilingual Dictionary of -62- ¡:.c;h and p:r•oducts (22) (Cuadro VIII) FAMILIA GADIDOS Abadejo Merlangus pollachius (L.) (*) Bacaladilla .................... Merlangus poutassou (L.) (Risso) Faneca .............................. Gadus luscus (L.) Merluza ............................ Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem.) Pescadilla ...................... Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem.) Gallo FAMILIA PLEURONECTIDOS Lepidorhombus bosci (Risso) Pleuronectes limanda (L.) Lenguado .......................... Solea solea (L.) Anguila Congrio Solea vulgaris (Quensel). FAMILIA ANGUILIDOS Anguilla anguilla (L.) Anguilla vulgaris (Turton) Conger conger (L.) Conger vulgaris (Cuv.). (*) Según nuestro Codigo Alimentario (3) y la clave de LOZANO, L. (42) el Abadejo sería también un Gadido, pero por la ausencia de barbilla debajo de la mandí bula inferior nos parece más indicado clasificarlocomo Merlangus según PERRIER, R. (41). -63- CUAUKU V 111 ESPECIES ESTCDIADAS E~ ESTE TRABAJO ELECTROFORESIS EN GEL DE POLIACRILAMIDA 1 Español Inglés Francés Alemán Portugúes EE.UU. Latín Anguila ...... ¡ Eels ............ ¡ Anguilles .. ¡ Aale .......... .. Flussaale Congrio ...... ¡ Congers ...... ¡ Congres ...... ¡ Congeraale .. Heeraale Conger Eiró ............ 1 Eels ............ ! Anguilla vulgaris Congro ........ 1 Congers ...... Safio (Turton) Anguilla anguilla (L) Conger vulgaris (Cuv) Conger conger (L.) Gallo .......... 1 Hegrin ........ ¡ Cardine ...... \ Higram ........ 1 Areiro ........ 1 Hegrin ........ 1 Lepidorhombus whiffiagonis L. bosci (Risso) Pleurenectes limanda (L.) Lenguado .... ¡ Witch ......... ; 1 Plie · grise 1 Rotzunge .... j Lingua ........ j Witch .......... ¡ Glyptocephalus cynoglosus Bacaladilla Faneca ........ Pout .......... .. Abadejo ...... Pollock ...... Merluza ...... Ha k e Tacaud ........ Lieu jaune Merlu ......... . Franzosendorsch Pollack ...... Secheehte .. -64Faneca Badejo Pescada •••••• Pout Pollock ...... Halte 6 Whitin¡ Solea solea (L.) Solea vulgaris (Quensel) 1 Herlangus poutassou J (Risso) Gadus luscus (L.) Pollachius pollachiu~ (L.) Gadus pollachius (L. Herlangus pollachius (L.) Merluccius merlucciua (L.). Merluccius vulgaris (Fl-.) B.- PESCADO CONGELADO: comprado como tal en el mercado: Merluza ........................ Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) C.- PESCADO FRESCO CONSERVADO EN EL CONGELADOR A -l0°C: Merluza ........................ Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) D.- PESCADO CONGELADO EN FILETES: Filetes de Merluza .... Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) E.- PESCADO EMPANADO: 6 porciones empanadas. Merluza ........................ Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) 8 porciones empanadas. Merluza ........................ Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) F.- PESCADO FRESCO LIOFILIZADO expresamente para este trabajo: Bacaladilla ................ Merlangus poutassou (Risso) Faneca .......................... Gadus luscus (L.) -65- G.- PESCADO CONGELADO DEL MERCADO, LIOFILIZADO posteriormente por nosotros. Merluza ...................... Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Felm) H.- PESCADO EN VERDE: Bacalao verde .......... Gadus callarías (L.) Gadus Morrhua (L.) I.- PESCADO SECADO ~L SOL: Congrio ...................... Conger conger (L.) Conger vulgaris (L.) J.- PESCADO COCINADO: Merluza ...................... Merluccius merluccius (L.) Merluccius vulgaris (Flem) K.- LIQUIDO DE COCCIONDEL PESCADO ANTERIOR. 3.5.3.- Caracteristicas de los pescados: Las características de tamaño, peso, cantidad de nitrógeno del extracto, % de proteínas del extrae to y cantidad de muestra utilizada, de los pescados estudiados aparecen en el cuadro 2. -66- CUADRO 3 % proteínas % proteínas (M. Lowry) ( Refractómetro) 1,20 ........................ 1,3 1 '68 ........................ 1 '5 1,57 ........................ 1,6 3,29 ........................ 3,0 4 '84 ························ 4' 2 4 '23 •••••••••••••••••••••••• Le •O 4 '40 ························ 4' 1 5,46 ························ 5,4 5,46 ........ ............... 5,4 5,46 ........................ 5,4 5 '66 ........................ 5' 7 5' 62 ........................ 5' 6 5,38 ........................ 5,1 5,62 ························ 5,6 5,16 ························ 4,9 5,18 ........................ 5,0 4,96 ........................ 5,0 4,96 ························ 5,0 5,57 ························ 5,4 5,57 ........................ 5,4 5,01 ........................ 4,8 5,23 ........................ 5,1 5 '85 ........................ 5' 7 -73- % proteínas (M. Lowry) % proteínas (Refractómetro) 0,68 ························ 1 '4 0,79 ························ 1,5 0,90 ························ 1,7 0,79 ························ 1,5 0,57 ........................ 1,2 0,79 ························ 1,5 0,79 ........................ 1 ,5 0,23 ........................ 2,7 0,29 ........................ 3,0 0,29 ........................ 3,0 1,57 ........................ 1 '6 0,34 ........................ 2,6 0,29 ........................ 2,4 0,34 ........................ 2,6 2,57 ........................ 2,5 3,4 ........................ 3,1 2,8 ........................ 2,8 1,79 ........................ 2,0 2,73 ........................ 2,7 2,90 ........................ 3,0 2,46 ························ 2,6 2,18 ........................ 2 ;o 3.9.- Cantidad de muestra a utilizar.- El extracto obtenido se diluye 1/100 para que su contenido proteico quede dentro de la escala. En 1 ml. de esta disolución se hace la reacción de LOWRY, D.M. (40) y se lee el color desarrollado en el espectrofotómetro. La extinción encontrada se lleva a la curva de calibrado y así conocemos el % de proteínas que hay en 1 ml. de la dilución y fácilmente en el extracto. Se ha comprobado que la cantidad Óptima a aplicar por tubo es 200 microgramos, pudiendo fácilmente conocer la cantidad de extracto a utilizar para tener este contenido proteico, una vez conocido el del extr¿¡cto. Sin embargo, para simplificar estas operaciones, hemos construído un ábaco, gráfica II, con el cual, una vez conocida la absorbancia, se obtie ne directamente la cantidad adecu~da de extracto a colocar en cada tubo, siempre que permanezcan invariables los reactivos y demás condiciones de la reacción. 3.10.- Elaboración del gel utilizado.- Las disoluciones que conserv:J.mos en la nevera -74- ABSORBANCIA = l:: c. 1 ~ -.J 3 VI 1 i 111 ... ; 1» e ~ Ñ" ~ w (3. 3 .l.) se tienen durante media hora a temp.eratura ambiente, al cabo de este tiempo y mediante pipetas y una pera de goma se cogen 5 ml. de cad3 una de ellas y se mezclan bien, ubteniendo así la disolución necesaria para la formación de 8 geles. Se colocan los tubos de vidrio en el soporte, que debe estar sobre una superficie plana, y se llenan con la disolución anterior hasta unos 5 mm. del borde. Esta operación, se puede hacer mediante una jeringa, pipeta o vertiendo directamente el líquido ayudándonos con una varilla fina de vi drio, pero siempre deslizandolo por la pared del tubo a fín de asegurarnos que no quedan burbujas de aire. En el caso de que se formara alguna burbuja golpear suavemente durante el llenado, pues dichas burbujas inhiben la polimerización del gel, o pu~ den ser atrapadas por el mismo. Manteniéndolos siempre a temperatura ambiente se espera hasta la polimerización, que es visible por la formación de un menisco, operación que du ra aproximadamente media hora. Una vez formado el gel se tira el líquido que s~ brenada y se lava tres veces con disolución tampón el espacio que queda vacio en los tubos forma -76- dores de geles. Finalmente se llenan con disolución tampón dichos tubos hasta el borde, procediendo a continuación a la colocación de la muestra. 3.11.- Colocación de la muestra.- Una vez conocida la cantidad de extracto de muestra a aplicar, se coloca encima del menisco mediante una microjeringa procurando que quede repartida por igual formando un fino disco. Esta operación es muy importante pues una mala colocación nos condiciona un desarrollo defectuoso y consiguientemente la formación de picos en las bandas proteicas. Los tubos se separan del soporte y se colocan en el recipiente superior del aparato de electroforesis. 3.12.- Desarrollo el~ctroforético.- En el recipiente inferior se coloca disolución tampón hasta un nivel determinado, se superpone la parte superior sobre ésta, de forma que los bordes de los tubos queden sumergidos en la di- -77- solución tampón. En esta parte superior también se pone disolución tampón a la que se añade el colorante trazador hasta producir un tinte azul definido. Como colorante trazador utilizamos el azul de bromo-fenol. Se se operase con menos de 8 tubos, los agujeros no usados deben taparse antes de colocar la diso lución buffer. En este recipiente la colocación del tampón es muy delicada, debe hacerse lentamente y siempre en el centro para evitar posible difusión de la muestra. Hay que evitar se formen burbujas de aire entre el tampón del tubo y el del recipiente a fín de permitir que la corriente eléctrica no tenga una resistencia mayor o incluso llegue a anularse. Se cierra con la tapa del aparato que lleva inco~ porado el polo (-), procurando siempre que este quede cubierto por la disolución tampón. Todo el proceso a partir de la colocación de la muestra debe hacerse con la mayor rapidez para que las fracciones proteicas no difundan a través del gel. -78- --------------------------------------------------- El desarrollo se realiza a 80 voltios durante 45 minutos y después a 160 voltios hasta que la ba~ da frontal del colorante trazador llegue al final del gel. 3.13.- Tinción y fijado de la fracciones proteicas.- Inmediatamente después del desarrollo electroforético es necesario teñir y fijar las fracciones proteicas a fín de que estas no difundan a través del gel. Se separan los tubos del soporte uno a uno para no confundirnos la numeración y se separa el gel del tubo mediante una jeringa con agua operando de la forma siguiente: Introducir la aguja entre el gel y el tubo, manteniéndola siempre contra la superficie del tubo para evitar romper o dañar el gel y girarla completamente alrededor de él forzando al mismo tiem po una corriente de agua a través de la aguja. Si estas etapas son efectuadas cuidadosamente el gel entero e intacto sera liberado y se deslizara a través del tubo. Estos geles se colocan en la cubeta de tinción que esta numerada, en la que se ha puesto disolu ción de negro de 2nilina B-10 al 0,1% en ácido -79- a~~tico al 7% (v/v), durant~ media hora. El ácido acético fija las fracciones proteicas. 3.14.- Decoloración.- Una vez teñidos los geles se vierte la disolución de negro de anilina en su recipiente, la misma se puede utilizar varias veces, y se lavan los geles tres ó cuatro veces con disolución de ácido acéti co al 7,5% (v/v) en la cubeta de tinción. Mediante la jeringa de 50 ml. con agua se introd~ cen otra vez en los tubos y estos se colocan en el aparato de electroforesis igual que en el desarrollo. La cubeta inferior y superior se llenan hasta un nivel adecuado con ácido acético al 7,5% (v/v) y se aplica una corriente que no sobrepase los 7 miliamperios por tubo hasta lograr un gel transparente en el que tan solo persistan las fracci~ nes proteicas teñidas (veanse fotografías en 4. 2.). -80- 4.- ELABORACION DE RESULTADOS 4.1.- Antecedentes.- La interpretación de los resultados en los traba jos de electroforesis de disco hasta ahora reali zados, no sigue un criterio uniforme, y cada autor se vale de los medios más apropiados para él. Unos lo hacen mediante fotografías de los geles como PAYNE, W.R. (27), GOROMINAS, A. y col. (18), CODURl, R.J. y RAND, A.C. (16) y (37), etc. THOMPSON, R.R. (29) clasifica las bandas según su intensidad mediante 1, 2 ó 3 cruces. CHU, R. (32) también clasifica las bandas por su intensidad denominándolas mayor, intermedia y me nor a las que representa con las letras a, b y c. Otros como ARIAS, E. y col. (35) presentan esqu~ mas de los electroforetogramas. Los hay que hacen lecturas densitométricas de los geles como PARSONS, A.L. y col. (19) y EMANUELLI, G. y col. (17) pero no fijan la posición de las bandas ni determinan su área. Otros autores, sin embargo, ya determinan la po- -81- ------------------------------------------------------------ ---------- sición de las bandas, pero aún no existe una denominación oficial para ésta, así SILANO, V. y col. (6) la denowinan Rf. Este Rf lo obtienen di vidiendo la longitud a que sale la banda entre la longitud total del gel que es en su caso 5,3 cm. Más tarde los mismos autores en otro trabajo (9) determinan la movilidad relativa de las bandas a las que designan Mb. Dicha movilidad la determinan .tomando como referencia la banda de azul de bromo-fenal a la que dan el valor 1. La denominación Rb es utilizada por FRATI, G. y col. (15), H0YEN, T. y THORSON, B. (14) para fi jar la posición de las bandas, y lo calculan dividiendo la longitud de la banda entre la longitud a que sale la del azul de bromo-fenol. Nosotros hemos tratado de introducir una proteína conocida de gran movilidad que tomaríamos como referencia para poder hacer medidas relativas a ella, de las movilidades de las proteínas problema. La más idónea en este caso sería la albúmina por ser una de las que más se alejan del principio del gel, por lo que ensayamos con disolución acuosa de: -82- se tablas en 5. En segundo lugar, se puede conocer el area de e~ da fracción, directamente del integrador que 11~ va acoplado el Chrornoscan, lo que permite calcular el porcentaje relativo para cada banda electroforética, representados en las tablas del apa~ tado 5.- en el que, en términos generales, no 1nfluye la cantidad de muestra utilizada, si bien, corno ya hemos indicado en 3.8. es conveniente que la cantidad de nitrógeno por tubo sea de unos 200 rnicrograrnos. Finalmente con los valores promedios obtenidos para movilidades y áreas de cada fracción, construirnos los gráficos de varas representativos de cada especie, lo que nos permite identifícar los pescados. -89- 5.- RESULTADOS DE LOS PESCADOS ESTUDIADOS. 5.1.- Pescados frescos.- 5. l. l.- Angu i 1 a ( Angui Ua angui Ua L. ) : Su proteinograma presenta 8 bandas y el origen, figura 1, cuyas movilidades en las determinacio nes efectuadas, han dado los resultados que recogemos en la tabla l. Estos datos han sido sometidos a estudio estadístico aplicándole un programa elaborado en e~ te Departamento (46) que permite conocer la media aritmética X, la varianza a2 y la desviación standard o desviación normal a así como un criterio de rechazo de resultados no compre~ didos entre X + a t. Tabla 2 Análogamente, con el porcentaje relativo de cada fracción, tabla 3, se obtienen los valores que recoge la tabla 4. En la 3a fracción de la tabla 3, el valor 7,40* no entra en los límites, por lo que es rechazado, obteniendo los nuevos valores: -90- - X ............................ 5,0100 a2 ............................ 0,4952 a ............................ 0,7037 t ···························· 2' 160 X + a t .................. 6,5 X -a t .................. 3,5 En la 4a fracción de la misma tabla, hay que re chazar 8,50* obt~niendo los valores: X a2 ........................... . t X + a t .................. X -a t .................. 4,6557 0,6043 0,7773 2' 160 6,3 3,0 Todas las movilidades presentan una desviación típica rozando o inferior a la unidad. Por Último, con las movilidades y áreas relati vas de cada fracción electroforética, se construye el gráfico de varas 1, que permitirá caracterizar a esta especie. -91- Fig. l.- ANGUILA FRESCA -92- DetermiFRACCIONES ELECTROFORETICAS l*iOI* ,. ti ~ ,. s• e- .,. .. g8 ¡a 7,50 77,00 50,20 47,00 36,00 25,90 20,70 10,70 o 2a 7,55 76,80 49,60 46,00 36,80 26,30 21,50 10,60 o 3a 7,86 77,50 49,60 45,30 36,20 28,00 21,60 10,80 o 4a 7,75 77,10 49,80 45,00 36,30 26,50 21,30 10,30 o 5a 7,62 76,80 48,30 44,90 36,00 27,00 21,00 10.00 o 1 6a 7,60 76,50 48,60 44,10 35,00 26.30 20,70 9,50 o 7a 7,70 76,00 49,50 44,30 36,00 26.30 21.70 10,70 o ga 8,03 77,00 49,80 45,40 36,70 28.20 22.30 11.30 o ~ 8,10 77,70 49,80 45,70 37.30 28.30 22.50 11,60 o lOa 8,05 77,50 49,90 45,50 36.80 28.60 22.40 11 .30 o lla !LOS 77,10 50,80 46.20 37.60 28,60 22.40 11,20 o 12a 8,07 77.50 50.20 46,50 35.40 28.50 21.40 9.90 o 13a 8.30 77.10 50.30 46.70 36.00 27.80 21.70 11.80 o 14a 7.80 77,00 49,00 45.40 36,00 26.50 21.20 10.00 o 15a 7.70 76.00 49.20 45.60 36,60 26.20 21.60 10.20 o TABLA l. Movilidad rellltiva de las fracciones clectroforéticas de la ANGUILA FRF.SCA. -93- FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,. 2' al 4. s• ea .,. ... gl 100 77,0 49,6 45,6 36.3 27.3 21.6 10,7 o Amplitud 8,3-7,5 77,7-76,0 50,8-48,3 47,0-44.1 37,6-35,0 28,6-25,9 22.5-20.7 11.8-9.5 X 7,8453 76,9733 49,6400 45.5733 36.3133 27.2666 21,6000 10.6600 Origen al 0.0579 0,2564 0.4325 0.6764 0.4569 1.0638 0.3485 0.4611 a 0.2406 0.5063 0.6577 0.8224 0.6760 1.0314 0.5903 0.6790 t 2,145 2,145 2.145 2.145 2.145 2.145 2.145 2.145 - X+ut 8.4 78,1 S 1.0 47.3 37.8 29.5 22.9 12.1 - X - at 7.3 75.9 48.2 43.8 34.9 25.0 20.3 9.2 - -- - T ABL\ 2. ¡:<.:TUOIO ESTAOISTIC'O DE LA movilidad relativa dt• las fr;n:.:iont•s clectroforéticas de la ANGUILA FRESCA. 94 FRACCIONES ELECTROFORETICAS Determinec:imel ,. :za a4. s• se .,. ea ga la 2,25 8,45 5,62 4,50 33,20 12,92 7.30 16,30 <1.55 2a 1,80 7,20 3,60 3,60 33,30 14,40 8.10 17,10 10,80 3a 2,30 9,55 5,28 5.28 32.30 13,20 10.20 17,80 4,27 4a 2,72 9,55 5,80 4,76 33,60 12,25 10,00 16,00 5,10 58 2,57 9,00 5,13 4,50 32,20 12,85 7,07 15,40 11.55 68 3,20 8,00 4,80 4,00 31,30 12,80 7,20 18,40 10,40 7• 3,80 8,90 5,09 4,82 33,70 14,22 7,10 15,00 7,38 8• 2,25 5,8S 4,95 5,40 34,30 12,20 9,00 16,70 9,45 9B t,85 4,93 6,48 6,25 29,50 15,40 9,85 18,50 7,40 JOS 3,80 8,90 5P9 4,82 33,70 14,22 7,10 15,00 7,38 u• 4,03 4,70 7,40't 3,35 30,90 12,10 7,40 19,50 10,38 1 12 8 2,25 5,85 4,95 5,40 34.30 12,20 9,00 16,70 9,45 13 8 2,57 9,00 5,13 4,50 32,20 12,85 11)1 15,40 JI ,55 1 148 3,20 8,00 4,80 4,00 31,30 12,80 7,20 18,40 10,40 1s• 2.24 5,35 4.03 ..,.,. 32,20 10.70 S .SO 17,90 10,72 •_v._ ...... TABLA 3.- 0/o dllde cada fracción .-uof'cdtica de la ANGUILA FRESCA. -95- FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,. :!' ~ 4. s• se 7. aa ga 2,7 7S 5,2 4,9 32,5 13,0 1!.1 ló,9 9.0 Amplitud 4,0-1,8 9,5-4,7 7,4-3,6 8,5-3,3 34,3-29,5 15,4-10.7 10,2-7 .o 19,515 .o 11 .5 4.~ - X 2,7220 7,5486 5,2100 4,9120 32,5333 13,0073 8.1393 16,9400 9.05~0 r:r 0,5162 3,0567 0,8162 1,5464 1.8881 1,3435 1.4079 2,0440 5,0776 a 0,7185 1,7483 0,9034 1,2435 1,3740 1,1591 1,1865 1 .4296 2,2533 t 2,145 2,145 2,145. 2,145 2,145 2,145 2,145 2,145 2,145 - X+ ot 4,3 11,3 7,1 7,6 35,5 15,5 10,7 20,0 13,9 Xat 1,2 3,8 3,3 l,J 29,6 10,5 5,6 13,9 4,2 - - - -~ - TABLA 4.- ESTUDIO ESTADISTICO del 0 /o delde cada fracción electrofon!tica de la ANGUILA FRESCA. -96- Gráfico de V aras l ANGJILA FRESCA -97-- 5.1.2.- Congrio (Conger conger L.): Su proteinograma presenta 11 bandas y el origen, figura 2, bien agrupadas, si se exceptúa la lOa, ·cuyos valores presentan gran ampli·tud, come se confirma al observar las desviaciones standards respectivas. Las movilidades de cada fracción y su porcentaje relativo, tablas 5 y 7, así como su estudio estadístico, tablas 6 y 8, permiten conocer las medias y límites correspondientes. En la fracción 11 de la tabla 5, 4,15* no está incluído en los límites calculados, se rechaza y se determinan los nuevos parámetros: X o2 ........................... . o t X+ o t X - o t 5,5500 0,2201 0,4692 2,179 6,6 4,5 En la 2a fracción de la tabla 7, se excluyen los datos que no están dentro de los límites y se obtienen los valores: - X 1,0790 o2 •.•.••.••••••••••••••••••••• 0,0171 o 0,1310 -98- 1 l Gráfico de V aras 2 CONGRIO FRESCO -105l 5.1.3.- Gallo (Pleuronectes Zimanda L): En algunas partes de Galicia también se denomina Rapante. En el proteinograma, sus bandas son 10 y el or1 gen, figura 3, y todas con una desviación típica rozando o inferior a la unidad. Las movilidades, porcentajes de cada fracción y su estudio estadístico respectivo, se agrupan en las tablas 9, 11, lO y 12. En la fracción 11 de la tabla 11 el valor 6,00* hay que rechazarlo por no estar dentro de los límites. Se repite el cálculo, prescindiendo de dicho valor y se obtienen: X .......................... 3,0284 o2 .......................... 0,7114 o .......................... 0,8434 t .......................... 2,179 X + o t ................ 4,9 X -o t ................ 1,2 Su gráfico de varas, 3, al igual que su proteinograma, figura 3, permite diferenciarlo de los pescados estudiados. -106- Fig. 3.- GALLO FRESCO. -107- FRACCIONES ELECTROFORETICAS De1ermi- ~ se e• .,. niiCionel ,. 2' ~ &11 gil 1o& ,,. la 8,20 74,80 63,00 47,50 42,20 33,00 21,00 17,10 14.18 7,95 o ,a 10,20 75.00 62.40 47,50 42,00 30,30 20,50 16.19 12.75 7,85 o 3a 9,30 73,00 62.00 47,30 41,30 30,50 20,80 16,10 13,10 8.70 o 4a 9,60 73.00 61.00 48.10 41,70 32,00 21,10 15.90 12.20 7.30 o sa 8.92 74.80 62,80 47,00 41,40 32,00 20,80 17.20 13.40 6,85 o 6a 9.05 74,20 62,00 46,20 41,00 31,50 19,50 16.50 13.50 8.30 () 7a 9,10 74,90 63,10 46,20 41,00 31.40 19.50 16.50 13.20 7,15 o 8a 9.32 72.50 61.50 46.40 42.40 32.20 20,60 16.60 12.00 8,05 o qa 9,62 72.50 61.20 46.70 42,60 32.00 20.30 15.60 13.20 6.44 o lOa 8.60 73.00 62.50 47,50 41,00 31.80 20.80 16.00 12.80 7.55 o 1 1 a 8,l)0 n.2o 6!,60 46.70 42.30 32.10 2!.00 17.10 13.:'.0 8,00 () 12 3 9,45 7 2.90 63.00 46.20 41.80 31.50 20.70 !6.50 13.10 7.80 o IJa 9.15 74.70 62.40 47.00 42.20 32.00 20.!0 15.90 13.00 6.90 o !4a <l,(l7 74.90 1>2.80 47.60 42.25 32.20 19.50 16.30 12.20 7.15 o T.\BL.\ '1. Movilidad relativa do: la' fracc·iono:' t•lo:drofon'ti<:a' do:l GALLO FRESCO. 108 FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,. t' ~ 4J ~ " ..,. .. ~ 1o' ,,. 1 100 73,8 62,2 47,0 41,2 31,7 20,4 16,4 13,0 7,6 o i Amplitud 10,2-8,2 75,0-72,5 63,1-61,0 ~.1-46,2 42,4-41,0 33,0-30,3 21 ,2-19,.5 17,2-15,6 14,1-12,0 8,7-6,4 X 9,2200 73,8142 62,2357 46,9928 41,7964 31,7500 ~0,4428 16,3921 12,9878 7,5707 Origen . (jl 0,2463 1,0364 0,4890 0,3803 0,3219 0,4811 0,3359 0,2425 0,3341 0,3980 a 0,4962 1,0180 0,6992 0,6166 0,5673 0,6936 0,5795 0,4924 0,5780 0,6308 t 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 X+ at 10,3 76,0 73,7 48,3 43,0 33,2 21,7 17,4 14,2 8,9 X-at 8,1 71,6 60,7 45,7 40,6 30,2 19,2 15,3 11,7 6.2 - ----- TABLA 10.- ESTUDIO ESTADISTICO de la rnowillded NIMivll de las fracciones electroforéticas del GALLO FRESCO. -(()<)- FRACCIONES ELECTROFORETICAS '-T---, ~mi1 1 1 naciones 18 ~ 38 48 58 68 78 aa ga 1~ 1 ¡a 22,00 1.47 1,65 14,65 7,33 22.55 2! .10 3.6ó 2.20 1.10 1 2.~0 ,a 22.40 1,49 1.49 14,75 6,62 22.40 21.20 3.21 2.35 1,07 1 2.46 %,,. literatun 3a 4a 5a 6a 7a ga 9a 10~ 11 a ! ,a 1u a 14a 22.50 0.92 1.50 14,50 6.45 22.70 21.ó0 3.4'\ 2,53 22,50 1.30 1.54 14.65 7,10 22.70 :!!JO 3.20 2,13 22.40 1.66 UH 14.10 6,76 22.40 21,00 3.!16 2.07 22.20 1.26 1,90 l.ó 1 1.45 22.30 1.67 1,93 14.70 7,71 22.40 21.20 1 3.22 1.92 l.óX 1 13.40 ó.60 2230 21.HO 3.35 2.10 22.50 22.ó0 22.30 22.20 ~ 2.1 () 1 22.HO 22,00 1 1.20 1.4'1 1.41 1 1 ,90 1 1.90 14.00 ó,l9 21.10 20.70 1 2.l)l 2.18 14.00 7,00 21.50 ~1.20 1 .1.05 ¡2.15 1.'17 1.'13 1.1>0 1.4'1 1.77 1.65 l 14.'\0 7.71 21.70 21.30 1 2.'10 1,93 u 'i4 7.00 22.00 :.:1.50 14.0'\ 14.20 14.(1) 11.112 7.00 1 1>.83 1 22.40 1 21.20 1 , , 55 1 --. j 1 i 21.20 21 ()() .: l. 1 () 3.15 ~ .2 1 .\.O'i 3.611 ! ¡ i 2.10 235 2.15 2.20 !AHL\ 1 l. 0 /o del érea lk ..:a da fracción L'kctrnforL'Iica tkl (u\ LLO FIH seo 110 ¡ 1,15 1.65 1.52 1,93 1.02 I.H2 1.1>1 lAS 1.22 1 .07 l.fll 1.10 3,00 2.49 2.76 2.011 4.112 !>.()()* .>.05 2.'10 . 4.fl2 1 3.46 1 -" 3.). 2.20 i FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,a 2a JB 4a sa ea 7a sa ga 1o& 11a 22,3 1,5 1,7 14,3 6,9 22,1 21,2 3,3 2,2 1,3 3,2 Amplitud 22,8-22,0 1,9-{),9 . 1,9-1,3 14,7-13,4 . 7,7-6,1 22,7-21,1 21,8-20,7 3$-2,9 2,5-l ,9 1$-1,0 6,0-2,0 X 22,3428 1,4807 1,6771 14,2635 6,9228 22,1357 21,2285 3,2771 2,1692 1,3157 3,2407 a2 0,0561 0,0705 0,0375 0,1901 0,1952 0,2959 0,0745 0,0832 0,0256 0,0783 1,2874 a 0,2368 0,2655 0,1937 0,4360 0,4418 0,5440 0,2729 0,2885 0,1602 0,2799 1,1346 t 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2,160 2.160 - X +at 22,8 2,0 2,1 15,2 7,9 23,3 21,8 3,9 2,5 1,9 5,7 -i X -at 21,8 0,9 1,3 13,3 6,0 21,0 20,6 2,6 i 1,8 0,7 0.8 TABLA 12.--ESTUDIO ESTADISTICO del 0 /o del área de cada fracción electroforética del GALLO FRESCO. -111- 1 1 Gráfico de Varas 3 GALLO FRESCO 112 1 5.1.4.- lenguado (Solea solea L.): Su proteinograma, figura 4, presenta 9 bandas y el origen, todas bastante agrupadas excepto la 9a, pues su desviación normal es de 1,2431. Los valores de movilidades, porcentajes de cada fracción y su estudio estadístico se recogen en las tablas 13, 15, 14 y 16, respectivamente. En la la fracción de la tabla 13, el dato 10,12* no está dentro de los límites calculados, y una vez rechazado se obtienen los nuevos valores: X a2 •••••••••.•••••••••••••••••• 9' 7707 0,0081 a •••..•..••..••..•.••••.••.•. 0,0902 t ............................ 2,160 X + a t ................ 10,0 x -a t ................ 9,6 En la 5a fracción de la tabla 15 hay que rech~ zar el valor 13,81*, sin el cual resultan: X 12,2878 a2 .......................... 0,0534 a t X+ a t - X - a t -1130,2312 2,160 12,8 11,8 El proteinograma, figura 4, y el gráfico. de varas 4, permiten compararlos con los del Gallo fresco 5.1.3. ambos pertenecientes a la familia PLEURONECTIDOS, y comprobar el éxito de la elec troforesis sobre gel de poliacrilamida en la caracterización y diferenciación de especies. -114- 5.1.5.- Bacaladilla (Merlangus poutassou L.): En la plaza de Abastos de Santiago de Compost~ la, de donde proceden las muestras, se le asig_ na a este pescado el nombre de BACALAO, pero una vez clasificado 3.5.2. es el Merlangus po~ tassou al que corresponde el nombre de BACALADILLA, según la Nomenclatura Oficial de los Animales Marinos de Interés Pesquero (47). Su proteinograma presenta 10 bandas y el orif · 5 d 1 1 4a 6a · gen, 1gura , e as que a y t1enen una desviación normal superior á 1, vease tabla 18. Las movilidades y porcentajes de cada fracción así como su estudio estadístico, se expresan en las tablas 17, 19, 18 y 20. En la fracción 10, de la tabla 17, es rechazado el valor 5,05* por no estar dentro de los límites y volviendo a calcular la X o, etc., se ob tienen los valores: o t X + o t X - o t -1216,6875 0,2398 0,4896 2,201 7,8 5,6 En la tabla 19, se rechaza en la la fracción el valor 5,40*, resultando: - X .............................. 3,6100 a2 ............................ o, 1808 a ............................ 0,4252 t ............................ 2,201 - X + a t .................. 4,5 X - a t 2,7 En la 4a fracción no entra en los límites el valor 12,50* y una vez rechazado se obtiene: - X .............................. 10,4250 a2 •••••••••••••••••••••••••••• 0,3947 a .............................. 0,6283 t .............................. 2,201 X + a t X - a t 11,8 9,0 y en la 8a fracción se rechaza, por análogas razones, el valor 8,95*, obteniéndose: X .............................. 5,1925 a2 ............................ 1,3681 a t X + a t X - a t -1221,1696 2,201 7,8 2,6 Su proteinogrma, figura S, y el gráfico de varas S, al compararlos con los del Bacalao en verde, S.6.1., procedente de Terranova y Groen landia, confirman que es una especie distinta. -123- Fig. 5.- BACALADILLA FRESCA. -124- o..nniFRACCIONES ELECTROFORETICAS MCÍOMI ,. tJ al 4• s• e• .,. se gl ,ae 1 ,. la 9,00 81,00 46,70 41,00 35,00 29,00 25,50 19,30 16,20 5,95 o .,a 8,80 81,20 46,50 41,80 35,00 29,50 25,00 19,50 16,50 6,56 J o 3a 8,90 82,00 46,30 41,50 35,80 30,30 25,80 19,10 16,80 6,25 o 4a 9,15 82,50 46,00 42,50 37,00 31,60 27,10 20,70 17,50 6,50 o 1 5a 9,05 81,50 45,50 42,00 36,10 30,00 26,00 19,20 17,00 6,19 o 6a 10,15 82,00 45,50 39,60 34,60 29,60 26,50 20,50 15,00 5.05* o 73 9,55 82,00 44,50 40,00 35.60 32,00 27,20 20,50 17,80 6,80 o 8a 9,60 82.00 44,80 41.00 36.50 32,50 27,30 19,30 16.30 6,25 o 9a 9,55 82.30 44.40 39,90 36.00 32,00 27,20 20.50 17,80 6,80 o lOa 9,65 82.00 44.30 39.50 35.50 32,50 28.00 20,20 17.60 7.10 o 11 3 9.70 81.50 44.20 39,00 35,50 32,00 28.00 20,20 17,50 7.60 o 12 3 9.91 82.20 45.50 40.50 34.20 29.80 25,70 19.20 16.18 7.10 o u a 9.80 81.00 44,00 39.50 36.00 31.80 27.60 20.20 17.90 7.15 o • Véue litentun. TABLA 17. Movilidad relativa de la~ fra~~:ioncs clcctroforéticas de la BACALADILLA FRESCA. 1.~5- FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,. 2'1 aa 48 s• ea .,. aa ga 1oll ,,. 100 81,8 45,2 40,6 35,6 31 ,O 26,7 19,9 16,9 6.6 o Amplitud 10.15-8,80 8:!,5-81 ,O 46,7 -44.0 4!,5 -39 .o 37,0-34,2 32.5- :!9,0 28.0 25.0 20,7-19.1 179 15.0 7.6 5 .o - X 9,4469 81,7845 45.2461 40,6000 35,6000 30,9692 26.6846 19,8769 16,9292 6,5615 Ori)!en a2 0,1793 0,2458 0.8863 1,2483 0,5900 1.6377 0,9906 0.3745 0.7492 0.4266 - a 0.4234 0.4957 0.9414 1.1172 0.7681 1.'2797 0,9952 0.6119 0.8655 0,6531 t 2.179 2,179 2,179 2.179 2.179 2.179 2.179 2.179 2.179 2.179 -X -+-at 10.4 82.9 47.3 43.0 37,3 33.8 28.8 21.2 18.8 1:!.0 - X -al 8,5 80,7 43.2 38.2 33,9 28.2 24.5 18.5 15.0 5.1 TABLA 18.- ESTUDIO FST ADISTJCO de la movilidad relativa de las fracciones l'lectrofnréticas de la BAC ALADILLA FRESCA. 1~6 ¡ FRACCIONES ELECTROFORETICAS 1 Determi1 naciones ,a ~ as 4a sa sa 7a aa ga 1Qél 11a ¡a 3,75 19,60 12,40 !1,20 9,25 16,09 3,47 5,63 4.90 2.89 11.00 2a 3,91 20,10 12,50 11,00 10,41 16,20 3,65 4,45 4,17 3.13 10.70 3a "<.42 17,10 10,60 11,80 10,35 16,45 3,50 5,19 4,56 3.80 13,40 4a 3,43 18,10 12,50 !0,60 10,90 15,55 3,80 4,87 5,91 3,43 11.70 5a 4,05 19,00 11,30 10,20 8,40 18,60 3,65 4,75 5,85 3,65 11.40 6a 3,45 19,00 10,10 10,40 9,65 16,40 4,15 3,10 5,10 3,10 15,40 i 7a 5,40* 20,00 11,60 10,00 8,85 15,90 4,25 5,08 5,00 5.25 9 80 i . 1 8a 4,36 16,60 11,70 9,80 9,30 17,65 6,00 7,00 4,10 2,73 JI ,40 9a 4,00 16,80 11,30 10,30 11,80 17,45 7,20 3,65 3,10 3,45 10,60 lOa 2,95 15,40 8,30 10,20 8,45 18,01 6,70 6,50 2,77 6,70 14,00 JI a 3,65 16,00 9,30 9,90 9,35 16,47 5,72 5,41 4,53 6,95 12,70 12a 3,35 17,50 7,70 12,50* 10,10 15,65 5,82 6,68 2,70 3,35 13,65 J3a 3,00 15,60 8,20 9,70 8,85 17,60 4,73 8,95* 3,64 5,80 13,85 - ------ - -- L__,_~_ L__~ ------~- * Y éase literatura TABLA !9.- 0 /o del área de cada fracción electroforética de la BACALADILLA FRESCA. -127- ' FRACCIONES ELECTROFORETICAS 2a jJ ' 5a ! ,a i 4a sa 7a sa ga 103 1 11 3 3,7 17,7 10,6 10,6 9,7 16,8 4,8 5,5 4,3 4.2 1 1::! .3 1 1 Amplitud 5.4~2,9 20,1-15,4 12,5~7,7 12,5~9,7 11 ,8~8,4 18,6~15,5 7,2-3,4 89-3,1 5,9~2.7 6.9-2,7 1 15,4 9,8 - X 3,7192 17,7538 10,5769 10,5692 9,6661 16,7707 4,8184 5,4815 4,3330 4.1715 1:.::!769 a2 0,3917 2,7643 2,9202 0,6756 1,0089 0,9523 1,7105 2,3402 1,1186 2.1697 ::!,7881 á 0,6259 1,6626 1,7088 0,8219 1,0044 0,9759 1,3078 1 ,5297 1,0576 1,4730 1.6697 t 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 2,179 X+at 5,1 21,4 14,3 12,4 11,8 18,9 7,7 8,8 6,6 7,4 15,9 -· X-at 2,3 14,1 6,8 8,8 7,5 14,6 2,0 2,1 2,0 1 ,O 1 8,6 1 ---------- ¡ TABLA 20.- ESTUDIO ESTADISTICO del 0/o del área de cada fracción electroforética de la BACALADILLA FRESCA. -128- Gráfico de V aras 5 BACALADILLA FRESCA -1291 5.1.6.- Faneca (Gadus luscus L.): Su proteinograma presenta 10 bandas y el origen, a figura 6, altamente agrupadas excepto la 5 cuya desviación normal es 1,6959. Las tablas 21, 23, 22 y 24 recogen sus movilidades, porcentajes y el estudio estadístico de estos. En la la fracción de la tabla 23, después de efectuar los rechazos, resultan los valores definitivos: - X ............................ 0,4760 o2 ............................ 0,0217 o ............................ 0,1475 t ............................ 2,262 X + o t .................. 0,8 X -o t .................. O, 1 El proteinograma, figura 6, y su gráfico de varas 6, permiten compararla: 1°).- Con la FANECA LIOFILIZADA, 5.4.2., al objeto de comprobar su identidad y/o modifi caciones producidas por este método de conservación y 21.- Con los pescados estudiados, pertenecientes a la familia GADIDOS para confirmar -130- 1 1 Gráfico de V aras 6 FANECA FRESCA -137- 5.1.7.- Abadejo (Merlangus poZlachius L.): En el proteinograma se observan 9 bandas y el origen, figura 7, de las cuales están bién agr~ a a a padas la 1 , 3 y 4 , las restantes tienen gran .amplitud, como puede comprobarse al observar sus desviaciones standards respectivas. La movilidad y el porcentaje de cada fracción se expresan en las tablas 25 y 27, y al aplicar el estudio estadístico, resultan los parámetros que se recogen en las tablas 26 y 28. En la 6a fracción de la tabla 27 no entra en los límites el valor 17,90 *y una vez rechazado se obtienen: - X 13,6272 a2 •••••••••••••••••••••••••••• 1,0622 a t X + a t - X - a t 1,0306 2,228 15,9 11,3 Todo esto y su gráfico de varas 7, confirman de nuevo las diferencias existentes con las distin tas especies de esta misma familia, utilizando la electroforesis sobre gel de poliacrilamida. -138- Fig. 7.- ABADEJO FRESCO. -139- r- ! FRACCIONES ELECTROFORETICAS ~~knn;~ nac1ones 1a ~ J8 48 sa ea -,a aa ga 1dl la 7.90 7h.OO 59.50 43.50 38.20 :!9,00 22.70 13.h0 7.70 o ' ·,<1 7,90 74.50 5il.50 43.00 38,00 28.50 22.20 13.30 8.20 o ·- 3a 7.90 73.00 59.00 43.20 38.00 27.90 2::!.70 12.90 8.80 o 4a 7.15 72,00 57,60 43.50 37,50 29,50 19.60 11.30 5.00 o sa 7.50 73,00 59,00 44.20 40,00 :!9,00 :!2.70 12.00 h.70 o r,a 7.70 74,00 59,80 45,00 49,20 :!9.70 23,30 13,00 7.80 o 7a 7.90 74,50 58,00 43,00 38,00 26,70 :!0.30 10.70 5.10 o 8a 7,55 73,00 59,00 44,00 40,00 29,00 21,40 1:!,00 6.80 o 9a 7,50 74,50 59,00 43,80 40,00 29,00 22,20 11,80 6,70 o lOa 7,85 73,00 58,00 44,50 39,00 29,20 22,20 11.00 6.50 o 11 a 7,15 74,00 58,00 44,00 37,00 26,00 19,80 13,50 7.00 o - - TABL.\ 25.-Movilidad relativ.de las fracciones electroforéticas del ABADEJO FRESCO. -)40- ¡ ! FRACCIONE~ ELECTROFORETICAS i ,. ~ 311 4• se se ~ &11 gil 1()11 1 ' 100 73.8 58,7 43.8 38,7 28.5 21.7 12.2 6.9 o Amplitud 7,9-7,1 76,0-72,0 59,8-57,6 45,0-43,0 40.~-37,0 29,7-26,0 ~3.3--19,6 13,610.7 8,8-5.0 X 7,6363 73,7727 58,6727 43,7909 38,7181 28,5000 21,7363 12.2818 6,9363 Origen a'- 0,0856 1,2226 0,4957 0,3997 1,3526 1,3780 1,6395 1,0661 1,3855 a 0,2925 1,1057 0,7040 0,6322 1,1630 1,1738 1,2804 1,0325 1,1770 t 2,228 2,228 2,228 2,228 2,228 2,228 2,228 2,228 2.228 1 X+at 8,3 76,2 64,2 45,2 41,3 31,1 24,6 14,6 9,6 1 X--at 7,0 71,3 57,t 42,4 31,1 25,9 18,9 10,0 4,3 1 ; ABLA 26.- ESTIJDIO EST ADISTICO de la movlicMd Nllrtiva de las fracciones electrofonUicas del ABADEJO FRESCO. -141- FRACCIONES ELECTROFORETICAS Determinaciones ,. -¿1 311 4• se .,. .,. se ge 1()11 ¡a 10,00 0,59 1,18 4,35 15,00 15,::!0 18,70 11,60 10,00 13.00 2a 9,50 0,59 1,39 4,75 13,50 14,90 20,30 11,10 11,70 1 ::!,70 3a 9,50 1,26 2,90 5,80 17,40 11,60 16,20 7,80 11,60 8,40 4a 9,80 1,19 2,35 5,90 18,70 12,20 17,00 8,90 12,20 9,80 5a 11,00 0,84 3,10 8,75 17,80 14,20 17,60 8,70 10,70 7,80 6a 7,90 0,87 2,40 8,35 14,20 17,90• 17,20 8,70 12,30 7,80 7a 9,20 1,12 1,95 8,40 15,60 13,10 l5,l0 11,40 15,00 7,60 8a 8,10 1,62 2,45 7,90 16,20 13,80 16,40 8,60 15,40 9,00 ~ 8,20 1,09 2,45 7,68 18,00 12,20 16,10 8,40 15,00 8,60 toa 9,30 1,36 3,00 7,75 15,30 14,50 18,00 9,60 11,36 9,80 Ita 9,40 1,66 2,77 8,30 15,00 13,60 17,60 7,70 12,50 11,47 12 1 8,90 1,16 2,60 6,64 15,20 12,60 20,50 9,50 11,40 11,50 •w..--.. T ABLA 27.- 0 /o dll .,_ de cada fncci6ll electroforitice del ABADEJO FRESCO. -142- FRACCIONES ELECTROFORETICAS ,. 2'1 a4' s• a- .,. B' ga 1 1()1 ! 9,2 1.1 2,4 7.0 16,0 14.0 17.6 9.3 1 ~.4 '))\ Amplitud 11,0-7,9 1,6 0,5 3,1··1,1 8,7-4,3 18.7 13,5 17,9 1 ~.~ ~0.5 15.3 ll.ó 7.7 15.4 10.0 13.0 7,1> - X 9.~333 1.1125 2,3783 7.0475 15.9916 13,9833 17.5750 9.3333 1 ~.4300 9.7H'I 1 a2 0.7678 0.1~07 0.36~7 ~.~915 ~.6644 ~.4869 2.59~9 1.X224 3.1300 3.7461 a 0,876~ 0.3474 0.602~ 1.5137 1.6323 1.5770 1.6102 1 .3499 1.76'12 1.'1354 t 2.201 2.201 2.201 2.201 ~.201 2.201 2.201 2.201 2.201 2.201 - ~ X + ~~t 1 1.2 1,9 .u 10.4 19.6 17.4 21.1 12.3 )(,_) 14.0 1 X at 7.3 0.3 1.0 3.7 12.4 10.5 14.0 6.4 H.5 5.5 ----- ---- r \HL\ 2H. ISITDIO I'SL\DISTICO del 0 /o delirea de cada fra<.·ción t•lcctroforética del A HA DUO FRFSCO. 143 Gráfico de Varas 7 ABAD E) O FRESCO -1441 5.1.8.- MerZuza (MerZuccius merluccius L.): En estas condiciones de trabajo su proteinogr~ ma presenta 10 bandas y el origen, figura 8. Las muestras obtenidas en la plaza de Abastos de Santiago de Compostela, se han clasificado como Merluccius merluccius variedad Atlanticus, por considerar, según la gráfica III (48), que las aguas de Galicia donde se capturo, contienen esta especie. Las movilidades y porcentajes de cada fracción así como su estudio estadístico, se recogen en las tablas 29,31, 30 y 32. En la 4a fracción de la tabla 29 al rechazar 43,50 *por no estar comprendido entre 41,2 y 43,4, se obtienen los nuevos valores: a2 •••••••••••••••••••••••••••• a t X + a t X - a t 42,2181 0,2216 0,4707 2,080 43,2 41,2 En la lOa fracción, se rechazan los valores no comprendidos en los límites y se obtienen: -145- 3.60 ... -- - ···-· e /h-/~S 11fUÍJCc/tJS J.f{i!l/t'CII.S. o - mtdile~ralleus. + se~tgtJ/tnsis. A Cdritlldti. O po/k'. +~+ 6 -+-A+ Caboltoxo c«ptnsis. pirddo.ttJS ~.! ' ,, ¡ 1 '· . , A4-A+A+ 15. o· GRAFICA I1I -146- .......... ........ ~···· ......... .......... IIBA-4AA 15' '. . (5° l. . FRACCIONES ELECTROFORETICAS 1a :za Ji~ 4a sa aa 7a a a ga 1cF 11a 1,6 u 11,3 5,2 9,2 7,4 8,9 6.4 10.3 20,5 18,1 Amplitud 3,6-0,2 3,5-0,3 14,0-8,3 6,6-4,1 11,6-7,2 8,7-5$ 10,3 -6$ 8,7-4,3 13,6 8,2 22,6-18,1 22,8-13,2 - X 1,6359 1,6881 11,3300 5,2586 9,1977 7,4118 8,8704 6,4168 í0,2727 20,4700 Is,oqn-· · -- a2 1,2186 1,1124 2,3847 0,7845 1,0761 0,9323 0,8119 1,3698 2,6353 1,3119 10.244:: a 1,1039 1,0547 1,5442 0,8857 1,0373 0,9655 0,9010 1,1703 1,6233 1.1454 3,2006 t 2,080 2,080 2,080 2,080 2,080 2,080 2,080 2,080 2,080 2.tJ80 2,08C - X +at 3,9 3,9 14,5 7,1 11,3 9,4 10,7 8,9 13,6 22,8 24,7 - X-at -0,7 -0,5 8,1 3,4 7,0 5,4 7,0 4,0 6,9 18,1 11,4 - -- - TABLA 32.- ESTUDIO ESTADISTICO del 0 /o deUrea de cada fracción electroforética de la MERLUZA FRESCA. -153-- Gráfico de V aras 8 MERLUZA FRESCA -1541 J 5.1.9.- Pescadilla (Merluccius merluccius L;): Según la obra de LOZANO, L. (42) pagina 99, correspondiente a la MERLUZA JOVEN por lo que se ha hecho su estudio para caracterizarla y sobre todo para ver si hay modificaciones electroforéticas con el tamaño de un pescado, al poder compararla con la MERLUZA 5.1.8. Su proteinograma presenta 10 bandas y el origen figura 9, todas bien agrupadas a excepción de la lOa, que tiene una desviación stan dard superior á l. La movilidad y porcentaje de cada fracción se recogen en las tablas 33 y 35 y al hacer su estudio estadístico se obtienen los valores reflejados en las 34 y 36. En la la fracción de la tabla 33 hay que rech~ zar el valor 8,20* encontrando la media y lími tes siguientes: X ···························· 8,7992 cr2 ............................ 0,0150 cr ............................ 0,1228 t ............................ 2,160 X + cr t .................. 9,1 X - cr t .................. 8,5 -155- y en la 2a fracción se rechaza el valor 88,00* obteniendo de nuevo: X .......................... 87,1428 a2 ·························· 0,0826 a .......................... 0,2875 t .......................... 2,160 X + a t ................ 87,8 X -a t ················ 86,5 En la tabla 35 hay que rechazar datos en las sí guíentes fracciones: en la 4a; el valor 4,18* obteniendo: X 5,7978 a2 •••••••••••••••••••••••••••• O, 2605 a t X + a t X - a t 0,5104 2,160 6,9 4,7 en la 6a; el valor 11,00* obteniendo: X 8,0350 a2 •••••••••••••••••••••••••••• 0,8412 a t X + a t X - a t -1560,9171 2,160 10,01 6,0 En la 7a; el valor 9,60* obteniendo: - X ........................... 12,2964 a2 .......................... O, 3971 a .......................... 0,6301 t .......................... 2,160 X + a t ................ 13,6 - 10,9 X -a t ................ a y en la 11 ; después de efectuados los rechazos correspondientes resultan: X .......................... 10,3875 a2 .......................... 0,2809 a .......................... 0,5300 t .......................... 2,201 X + a t ................ 11 ,5 X -a t ................ 9,2 Para concluir sobre la analogía o diferencia entre la PESCADILLA y la MERLUZA: 1 o).- Se observa si la media de movilidades de la PESCADILLA está incluída en los límites (x ±o t) correspondientes a la MERLUZA. Límites de la MERLUZA: 10,3 88,9 66,5 43,2 37,9 30,9 28,7 25,2 18,0 7,0 o 7,0 86,1 64,3 41,2 34,5 29,7 25,7 22,6 15,8 4,8 o -157- Límites de la PESCADILLA: 8,8 87,1 65,6 48,8 37,0 28,5 25,9 22,5 16,7 7,2 o No cumplen esta regla la 4a y 6a fracción y la 8a y lOa están rozando los límites. 2°).- Se hace una comparación estadística de me días de movilidades, para el caso de pequeñas muestras, en función de la varianza estimada de la población "a 2" (1); la varianza standard de la diferencia "S2 " d (2); el error standard "Sd" y la relación de la diferencia entre las medias y su error standard o Índice t de Student "t" (3). (2) S 2 d (3) t nl + a2 _1_+ nl n2 a2 ' n2 2 a 2 2 Calculado el valor de "t" para cada una de las fracciones de la PESCADILLA y de la MERLUZA, resulta: 0,42281,0282- -158- 1,2281 - 34,0264 - 3,3704 - 8,8125 - 5,7270 - 8,0438 - 1,02583,3790 y 0,0000, que comparados con el correspondiente en las tablas de Fischer para un coeficiente de seguridad del 95% y 36 grados de libertad, 2,034, se deduce que la diferencia es significativa en las frac . .4a 5a 6a 7a .8a a e 1ones : , , , , y 1 O • En resumen, la PESCADILLA y la MERLUZA son di~ tintas como se desprende del estudio realizado; sin embargo, como en la separación electrofor~ tica de estas dos poblaciones ha habido multitud de variantes: poro del gel dependiente de la temperatura ambiental, intensidad de la corriente durante el fraccionamiento, tiempo de desarrollo, etc., quizás en nuestro caso, el primer criterio sea suficiente para juzgar la diferencia o igualdad de estas dos muestras, y así, poder concluir, que solo las fracciones 4a y 6a permiten diferenciar un pescado del otro. El porcentaje de áreas de cada fracción varía mucho y posiblemente dependa del sexo, de la alimentación, de la estación del año, etc. por lo que en esta contribución no se hace el estudio comparativo de los mismos. Unicamente es de señalar que la desviación stan dard de los valores encontrados para la frac- -159- ción de origen, en todos los pescados, s~ele ser elevada, lo que puede atribuirse a protei nas desnaturalizadas y no a una verdadera frac ción. Su gráfico de varas, 9, confirma lo antes dicho, para la mobilidad y caracterización de la PESCADILLA. -160-- Fig. 9.- PESCADILLA FRESCA. -161- f FRACIONES ELECTROFORETICAS 1 Determi- ' 1 . ~ __ naciones la za JI! 48 58 sa 78 88 ga ' loB lla 1 1 a ll.80 87.00 66,00 49.50 37.30 .::!9.50 .::!5,50 .::!2 .50 17.60 'l.50 o ~a 1-!.8.::! 1-!7.00 65,70 48.50 37.00 .::!7,30 .::!5 ,50 22.20 17.00 7.61 o - ~ ,¡ 8,80 1'!6.50 65.50 48.00 36,30 26.80 25.50 22.40 15.85 7.35 o ..¡a H,96 87.00 66,00 49,60 37.30 .::!7 ,40 :?.6,40 :?..::!.80 17,05 h.S 1 o 5;¡ 8,70 87,00 65,50 50,00 37.50 .::!7,90 .::!5,10 .::!.::!,90 17,30 5.XO o 6a 8,75 87,10 65,20 49.50 37,40 28.60 25,80 .::!.::!,80 16.70 5.75 o 7a 8,70 87,10 65,50 48.50 37,70 28,60 25.80 22.60 17 . .::!0 6.85 () 8a 9,05 87,00 66,00 49,00 37.00 28.00 25.40 2.::!.50 16.10 6,<l0 (} 9a 8,53 87,30 65,50 48,30 37,30 29.50 26,50 22.00 16.60 X .JO o Joa 8,90 87,50 66,00 48,50 37,00 28,30 25,30 2.::! . .::!0 15.40 7.h0 o ¡¡a 8,20* 87,50 66,00 48,30 36.50 28.70 26,00 22.60 16,30 7.00 o 12a 8,80 87,00 65,20 48,90 36,20 28,20 25,60 22.30 16.25 6.80 o i3a 8,76 87,50 65,30 48,90 36,50 211.50 26,70 22.70 17,30 5.70 o 14 3 8,82 88,00• 65,00 49,00 36,80 29,50 26,70 22,30 16,QO 6,Q5 o 1 15 3 8,80 87,50 66,00 48,10 36,60 29,30 26,90 22,70 17,00 9.05 o -- -·-~ • Véase litenlun TABLA 33.- Movilidad relativa de las fracciones electroforéticas de la PESCADILLA FRESCA. -162- '- FRACCIONES ELECTROFORETICAS i ,. 'zl J8 4• se &1 7• sa ga 1()8 ' 1 100 78.4 59,0 47,7 36,5 27,5 18,1 10.0 3.0 () l Amplitud 9,78,0 80,076,5 60,0-57 ,O . 49,9--46,3 38,0-34,9 29,326,0 19,7 16,3 12 .o X .S 3,!l 2.2 - X 8.7583 78,3750 58,9833 47,7083 36.6583 27,5416 18,1416 10.0041 ::!.9616 Origen r--- ' 0,::!734 0,9::!75 0,9615 0.7590 0,7335 1.0026 0.8194 0.866::! 0.::!51X o· a 0,5::!29 0.9630 0,9805 0.871::! 0.8564 1,0013 0.905::! 0,9307 0.501X t ::!.::!01 ::!.::!01 ::!.::!01 ::!.::!01 ::!.::!01 2.201 2.201 2,201 2.201 l X+ot 9,9 80.5 61.1 49.6 31'-S 29.7 20.1 1::!.0 4.1 1 ! -- , X -ot 7.6 76.2 56.8 45.X 34.H 25.3 16,1 7.9 l. X ; L ___ T-\ BL\ 80. ESTl 1 DIO l:STADISTICO de la movilidad relativa de las fracciones clc..:trolorética., del BA(' ALAO en VI'.RDL. 265 FRACC.ONES ELECTROFORETJCAS Determinaciones ,. 1' 3' 4• fl' .. .,. sB gl 1oB ¡a 2,13 10,10 18,40 21,80 8,81 16,80 12,95 4,56 1,28 3,14 ,a 2,57 11,60 18,20 22,40 6,82 16,60 13,57 3,87 2,58 1,94 3a 2,70 10,60 17,85 22,30 7,25 16,20 13,40 3,90 2,23 4,40 4a 2,02 10,90 18,50 22,80 7,72 16,98 12,60 3,36 2,01 3,10 5a 1,87 10,90 19,30 22,10 7,80 16,10 12,80 4,36 2,50 2,27 6a 1,78 11,88 17,80 21,90 8,30 16¡00 12,45 3,55 1,78 4,40 7a 1,93 11,60 18,40 21,70 7,25 16,40 12,10 3,86 2,90 3,46 sa 2.10 11,30 18,40 22,60 8,37 17,20 12,08 3,25 2,10 2,60 9a 1,93 10,10 17,70 22,60 8,70 17,41 13,20 3,23 1,29 3,80 ¡oa 2.03 10,80 19,10 22,30 6,90 17,41 12,20 4,87 1,22 3.25 JI a 1,81 11,57 18,10 22,60 7,01 16,30 12,45 3,40 2.36 4,50 12a 1.71 11.20 18,25 21,90 8,52 17,80 12,20 4,90 1 .22 2.50 -- TABLA 81. 0/o del6rea de cada fracción electroforética del BACALAO en VERDE. -266-- FRACCIONES ELECTROFORETICAS 1a i' 'JI fll 511 fiJ -¡a ffJ 1 t¡jJ ! 1()11 1 2,0 11,0 18,3 22,2 7,8 16,8 12,7 3,9 1 L9 3,3 Amplitud 2,7-1.7 11,9-10,1 19,3-17,7 22,8-21,7 8,8-6,9 17,8-16,0 13,512,1 4.9 3.2 2.9--1,2 4,51,9 - X 2,0483 1 1,0525 18,3333 22,2500 7,7875 16,7666 12,6666 3,9258 1,9558 3,2800 a2 0,0918 0,3289 0,2328 0,1336 0,5388 0,3512 0,2668 0,3743 0,3503 0.7490 1 a 0,3030 0,5735 0,4825 0,3655 0,7340 0,5926 0,5166 0,6118 0,5918 0,865~ t 2,201 2,201 2,201 2,201 2,201 2,201 2,201 2,201 2.201 2,201 - X+at 2,7 12,3 19,4 23,0 9,4 18,1 13,8 5,3 3,3 5,2 - X-at 1,4 9,8 17,3 21,4 6,2 15,5 11,5 2,6 0,65 1,4 TABLA 82.- ESTUDIO EST ADISTICO del 0 /o del área de cada fracción electroforética del BACALAO en VERDE. -267- 1 1 Gráfico de Varas 20 BACALAO en VERDE -268 5.7.- Pescados cocidos.- 5.7.1.- Merluza cocida: A pesar de que el nitrógeno encontrado en su extracto acuoso es de 0,14% equivalente á 0,87% de proteínas, su proteinograma, figura 21, no presenta fracciones, como era de esp~ rar, ya que la acción del calor desnaturali_za las proteínas, lo que imposibilita su frac cionamiento electroforético. Liquido de cocción.- En este líquido el contenido de nitrógeno resul tó ser de 0,18% (1,12% gr. proteínas), por lo que se ha intentado el desarrollo electroforéctico, obteniéndose un proteinograma, figura 22, en el que tampoco aparecen bandas. -269- Fig. 21.- MERLUZA COCIDA. -270- Fig.22.- Liquido de coción de la MERLUZA COCIDA. -271- 6.- CONCLUSIONES 1).- Tras aplicar diversos geles de Za técnica de eZectroforesis de disco, al estudio de pescados, se considera como más adecuado el de BZoemendaZ de concentración en acrilamida del ?,5%. 2).- Se establece que Za cantidad óptima a aplicar en cada gel es de 200 ~grs. de proteinas totales y se propone un ábaco que permite conocer en función de Za absorción espectrofotométrica (del color desarrollado por el método de Lowry) el volumen de extracto a colocar en cada gel. 3).- Se propone una técnica original de interpretación de Zas curvas densitométricas, que permite el cálculo de Za movilidad relativa de Zas bandas eZectroforéticas, asi como, su porcentaje relativo, hasta ahora esta interpretación era subjetiva. 4).- Se concluye que el test "t" permite determinar· di existen o no diferencias significativas entre las medias de movilidades, y asi conocer: si se trata -272- de especies iguales o distintas; diferenciar varie dades dentro de una misma especie y comprobar si los métodos de conservación modifican el pe3cado. 5).- Se utiliza, por primera vez, la electroforesis sobre gel de poliacrilamida, para el estudio de pescado fresco de las costas gallegas: ANGUILA, CONGRIO, GALLO, LENGUADO, BACALADILLA, FANECA, ABADEJO, MERLUZA y PESCADILLA, y se encuentran diferencias cuali y cuantitativas que posibilitan caract~ rizar y diferenciar las distintas especies. 6).- Se comprueba mediante esta técnica, que el extraeto acuoso de la PESCADILLA (Merluza Jóven) tan solo se diferencia de la MERLUZA en la mcvi Udad de la cuarta y sexta fracción electroforética. 7).- Se emplea este método analitico en el estudio de las modificaciones que pueden originar algunas té~ nicas de conservación: MERLUZA conservada por congelación industrial y doméstica; MERLUZA, FANECA y BACALADILLA liofilizadas y CONGRIO secado al sol, comprobándose: a).- que la congelación no influye en las caracteristicas electroforéticas de la especie, posi -273- •• • r·ilitando su 1:dentificac:ión con fines biológi_ cos y bPomatológicos. hJ.- que la liofilización no altePa sensiblemen~e las fPacciones pPoteicas de la MERLUZA y la FANECA~ logPando su identificación después de sometidos a esta técnica. En la BACALADILLA poP el contPaPio~ se obsePvan modificaciones más pPofundas atPibuibles a su gPan al tePabi lidad. e).- que el CONGRIO secado al sol (CongPio de Mugia) pPesenta notables difePencias cuali y cuantitativas Pespecto al fPesco~ aunque pu~ de seP identificado mediante este método ana litico. 8).- Se aplicó esta técnica electPofoPética al estudio de divePsas foPmas comePciales de pescados: pm·- ciones empanadas~ y filetes congelados~ concluyendo que es posible compPohaP la identidad del pescado utilizado en su elaboPación. q).- La electPofoPesis sobPe gel de poliacPilamida pepmite compPobaP que la especie~ comePcialmente~ BACALAO~ en Za plaza Je Abastos de Santiago de C'om- --274- 45).- SIMAL, J., CHARRO, A. y FIERRO, C.- Anales de Bro matología ~. 451-463 (1967). 46).- CHARRO, A. y CREUS, J.M.- Anales de Bromatología 22. 273-297 (1970). -- 4 7).- LOZANO, F., RODRIGUEZ, O. y ARTE, P.- "Nomenclat~ ra Oficial Española de los Animales Marinos de interés Pesquero". Dirección General de Pesca Marítima. Subsecretaría de la Marina Mercante. Madrid (1965). 48).- LOZANO CABO, F.- Publicaciones Técnicas de la Jun ta de Estudios de Pesca n° 4. Ministerio de Comercio (1965). -281-