1
EGYETEMI DOKTORI (PhD) ÉRTEKEZÉS TÉZISEI
PCR alapú aszpe gillózis diagnosz ikai módsze ek
ejlesz ése és alidálása
Paholcsek Melinda
Téma eze ő: P o . D . Bi ó Sándo
DEBRECENI EGYETEM
MOLEKULÁRIS SEJT-ÉS IMMUNBIOLÓGIA DOKTORI ISKOLA
Deb ecen, 2015
2
PCR alapú aszpe gillózis diagnosz ikai módsze ek
ejlesz ése és alidálása
É ekezés a dok o i (PhD) okoza megsze zése é dekében
az elméle i o os udományok udományágban
Í a: Paholcsek Melinda
okle eles bio echnológus
Készül a Deb eceni Egye em Molekulá is Sej - és Immunbiológia dok o i
iskolája
ke e ében
Téma eze ő: P o . D . Bi ó Sándo , az MTA dok o a
A dok o i szigo la i bizo ság:
elnök: P o . D . Oláh É a, az MTA dok o a
agok:
P o . D . Balázs Ma gi , az MTA dok o a
P o . D . Raskó Is án, az MTA dok o a
A dok o i szigo la időpon ja: Deb eceni Egye em ÁOK Humángene ika
Tanszék, 2014. ok óbe 6. 10 ó a.
Az é ekezés bí álói:
D . Bácsi A ila, PhD
D . Sinkó János, PhD
A bí álóbizo ság:
elnök: P o . D . Szabó Gábo , az MTA dok o a
agok: P o . D . Széll Má a, az MTA dok o a
D . Bácsi A ila, PhD
D . Sinkó János, PhD
D . Szabó Judi , PhD
Az é ekezés édésének időpon ja: Deb eceni Egye em ÁOK, Gye mekgyógyásza i In éze
Tan e me, 2015. decembe 7. 13 ó a.
3
BEVEZETÉS
Az Aspe gillus spp. az egyik legnagyobb számú gombacsopo . Akad köz ük számos,
az élő sze eze ek e ká os ha ású nö ény, álla - és humánpa ogén aj is (Aspe gillus
umiga us, Aspe gillus e eus, Aspe gillus len ulus, Aspe gillus la us, Aspe gillus nige ).
Az in azí mikózisok napjainkban o ább a is a ejle o szágok legmagasabb
mo bidi ású és mo ali ású megbe egedései közé a oznak. P e alenciájuk okoza osan
nö ekedő endenciá mu a . Szaki odalmi ada ok az in azí mikózisban szen edők számá
közel ké millió a becsülik, és má a má közel annyi embe haláláé elelnek, min a malá ia
agy a ube kulózis.
A mo ali ási a ány aká 100% is lehe . Bizonyí o ény o ábbá, hogy bizonyos
be egcsopo okban minden, an imik obiális kezelés nélkül el el ó a jelen ős mé ékben képes
nö elni a mo ali ás . Kó házi s a isz ikák sze in az eu ópai populációban az összes
halálozások 7%-áé az Aspe gillus umiga us- a ják elelősnek. Az elmúl é ekben azonban
jelen ős mé ékben emelkede az Aspe gillus e eus ál al okozo megbe egedések
gyako isága is.
A Candida ajok melle az Aspe gillus-ok elelősek a leggyako ibb nozokomiális,
gombás megbe egedések előidézéséé . A izikócsopo ba immunde iciens be egek,
elsőso ban kó os, hema ológiás (neu ophil sej ek száma <500 x 106/li e ) megbe egedésekben
szen edőek a oznak. Különösen az aku mieloid leukémiában (AML) szen edő be egek
annak ki é e leginkább az in ekció eszélyének.
Mi el a gombain ekciók okoz a mo bidi ás jelen ősen be olyásolja az
onkohema ológiai osz ályokon kezel be egek éle kilá ásai és éle minőségé , egy e nagyobb
jelen őség e esz sze a kó házi in ekciókon oll.
A meg elelő diagnózis elállí ása nehézkes. A meg ámado szö e ekben a gombák
jelenlé e csak időigényes enyész éses, agy hisz opa ológiai eljá ásokkal, azaz a meg elelő
hely ől szá mazó biológiai min ák, biopsziás min a é elezések (b onchoal eolá is la age
min a é el; BAL) gomba enyésze einek elemzésé el igazolha ó kellő biz onsággal.
4
A sze ológiai módsze ek az időigényes enyész éses eljá ásokkal ellen é ben aká má
há om ó án belül képesek e edményeke szolgál a ni. Az élő ilágban ál alánosan elő o duló
gombasej al alko ók a szű nek, így nem alkalmasak az okozó ágensek aji szin ű
azonosí ás a, ezé a di e enciál diagnózishoz kombinálni kell őke egyéb más, bioma ke
de ek áláson alapuló módsze ekkel (leggyak abban PCR).
A nukleinsa alapú módsze ek könnyű ki i elezhe őségüknek, idő aka ékosságuknak
és jó ep odukálha óságuknak köszönhe ően endkí ül el e jed ek. A meg elelően
meg e eze PCR eakciók nemcsak az Aspe gillusok genus, hanem aká a species szin ű
azonosí ásá a is alkalmasak.
Azonban a nem meg elelően ki i eleze , ám endkí ül szenzi í eal- ime PCR
eakciók, az ubiqui e okozó ágensek jelenlé éből adódóan hamis-pozi í e edményekhez és a
speci ici ás omlásához eze he nek. Sze ológiai módsze ek ese én a hamis-pozi í
e edmények kiug óan magas száma olyan be egcsopo ok ese ében apasz alha ó, amelyeke
köz e lenül a diagnózis megelőzően Pipe acillin-Tazobac am, Ampicillin-Sulbac am
alamin Amoxicillin-Kla ulánsa bé a-lak ám ípusú an ibio ikumok és bé a-lak amáz gá lók
együ es kombinációjá al alamin egyéb an ibio ikumokkal, min PenicillinG, Ce iaxon,
Imipenem, Cip o loxacin, Vancomicin, Gen amicin s b. kezel ek.
Az ISHAM (In e na ional Socie y o Human and Animal Mycology) - EAPCRI
(Eu opean Aspe gilllus PCR Ini ia i e) egy nonp o i sze eze , lé ejö e elének egyik ő
célja, hogy a agok össze endeze és koo dinál munkájának köszönhe ően megoldás aláljon
a nukleinsa alapú, in azí aszpe gillózisoka de ek áló eljá ások legége őbb hiányosságá a, a
s anda dizáció a. A labo a ó iumi munkacsopo i ö zs agok é en e 2-3 alkalommal
üléseznek. Ke ekeasz al megbeszéléseik so án összegzik az elmúl időszak e edményei .
Beszélnek o ábbá közös, nemze közi koope ációkon alapuló pályáza i lehe őségek ől. A
klinikai munkacsopo célja, hogy elemezze és összegezze a labo a ó iumi és s a isz ikai
munkacsopo új e edményei a ké másik udományos sze eze el; EBMT- el (Eu opean
Socie y o Blood and Ma ow T ansplan a ion), és EORTC- el (Eu opean O ganisa ion o
Resea ch and T ea men o Cance ) együ működ e. Ja asla é eleikkel ins uálják a DNS
alapú aszpe gillusz diagnosz ika nemze közi, alidációs, kö -kon ollos izsgála ai .
5
A S ep omycesek az Ac inomyce es osz ály Ac inomyce ales endjének G am-pozi í ,
apa ogén, szap o i a bak é iumai, amelyek a alaj e mésze es populációjának aká a 20%-á is
alko ha ják. A má emlí e humánpa ogén Aspe gillus ajokkal közös ökológiai élőhelyeken
osz oznak. Nö ekedésük so án olyan komplex mo ológiai és biokémiai di e enciálódási
olyama okon mennek ke esz ül, melyek sajá ságai szilá d és olyékony áp alajon jelen ős
el é éseke mu a nak. Össze e éle ciklusuk szabályozásának lényeges komponensei a
pleio óp ha ású au o egulá o ok.
Az egye len, eddig isme ehé je ípusú au o egulá o , a C ak o ehé jé a DOTE
Biológiai In éze ében (ma DE-ÁOK Humángene ikai Tanszék) sike ül elsőkén a e melő
S ep omyces g iseus 45H - az új axonómiai beso olás sze in S. albido la us 45H -
ö zsének 72 ó ás enyészle éből izolálni, azonosí ani, majd génjé klónozni, szek enálni, és
szabályzó ha ásá izsgálni. A szek éció a ke ül ehé je 324 aminosa ból áll.
Az é e C ak o ehé je aminosa szek enciájá PSI-BLAST homológiake eső
p og amokkal izsgál a hozzá nagyon hasonló o ológ, azaz más ajokban meglé ő,
élhe ően hasonló unkciójú és közös e olúciós e ede el endelkező géneke alál unk négy
humánpa ogén onalas gomba ajban (lásd alább), o ábbi ké apa ogén gombában, egyéb más
S ep omyces ajokban, ill. néhány G am-pozi í , nem Ac inomyces, alacsony G+C a almú
bak é iumban, alamin ezek ágjaiban.
A pa ogén onalas gombák közül az Aspe gillus umiga us és az Aspe gillus e eus
ajokban alálha ó meg a gén. Sajá ada aink alapján a még nem szek enál Aspe gillus
len ulus genom is endelkezik acC o ológ génekkel. Ráadásul az Aspe gillus umiga us
ese ében a C- ak o génje egysze e ke ő, a há mas és az ö ös k omoszómákon is
meg alálha ó.
Mi el az ada bázis ada ok alapján, a acC gén o ológjainak meglé e őkén olyan
euka ió a, humánpa ogén gomba ajok ese ében bizonyí o , melyek az aszpe gillózisos
megbe egedések elsődleges ki ál óikén isme ek, ill. azon ajok genomjában nincsenek jelen,
amelyek az immungyenge egyének sze eze ében meg eleped én szisz émás e őzéseke
(gombás, és bak e iális) okoznak, ezé kézen ek ő lehe őség kínálkozo olyan, in azí
aszpe gillózis de ek áló nukleinsa esszék ejlesz ésé e, amelyek a C ak o ehé je o ológ
génjei használják ( acC) a ge kén .

6
CÉLKITŰZÉSEK
•!Aszpe gillózis diagnosz izáló eal- ime esszék ejlesz ése az in azí aszpe gillózis
leg őbb, ill. gyako i okozóikén isme Aspe gillus umiga us, Aspe gillus e eus, ill.
Aspe gillus len ulus ajok genomjában meglé ő S ep omyces acC génekkel o ológ
génszakaszok a.
•!Az Aspe gillus umiga us és Aspe gillus e eus speci ikus, acC o ológokhoz
e eze Taqman® esszék eakció ha ékonyságának, anali ikai szenzi i i ásának, ill.
speci ici ásának megha á ozásá a.
•!Az Aspe gillus umiga us, ill. Aspe gillus len ulus ajoknak a jellemző ol adáspon jaik
(ol adáspon analízis), leol adási gö béik (HRM analízis) alapján ö énő azonosí ása.
•!Taqman® esszék dinamikus a ományának izsgála a Aspe gillus umiga us ill.
Aspe gillus e eus konídium a almú, nagyszámú szé um min án, au oma a
nukleinsa izoláló endsze ben.
•!A Taqman®-LNA p óbás Aspe gillus umiga us speci ikus eal- ime esszék alidálása
p ospek í ese -kon oll anulmány so án a Deb eceni Egye em Belgyógyásza i
In éze é el, alamin az O osi Mik obiológiai, és Pa ológiai In éze ekkel
együ működ e. Kombinál biológiai ma ke analízis so án lázas, neu opéniás
be egeke moni o ozunk Aspe gillus speci ikus an i es ek, ill. Aspe gillus umiga us
acC o ológok jelenlé é e, há om napos nyomonkö e éssel. A kombinál bioma ke
analízisek e edményei össze e jük egymással és a kon encionális módsze ek
e edményei el, majd megha á ozzuk az egyes módsze ek diagnosz ikai ha ékonyságá .
•!Rész eszünk az é enkén legalább egy alkalommal megsze eze kö kon ollos
izsgála okban, lehe ősége e em én sajá ejlesz ésű, Aspe gillus gomba nukleinsa
de ek áláson alapuló, eal- ime diagnosz ikai endsze eink o ább ejlesz ésé e,
esz elésé e, alami a nemze közi mezőnyben el oglal helyünk elmé ésé e.
7
ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK
Bioin o ma ikai módsze ek C- ak o homológok ke esésé e
Az C ak o ehé je aminosa szek enciájá PSI-BLAST homológia ke eső
p og ammal izsgál uk. Fehé je ada bázisokban égez ünk ke esés a be i szek enciá al.
Taqman® MGB és Taqman® LNA esszék ejlesz ése
Összesen nyolc különböző Taqman® hid olízis esszé (4 Taqman®-MGB ill. 4
Taqman®-LNA p óbás) ejlesz e ünk Aspe gillus umiga us és Aspe gillus e eus ajok
azonosí ásá a. A mono-copy endsze ek ese ében csak egye len a ge gén alálha ó. Mi el az
Aspe gillus umiga us genomjában egysze e ké példányban (AFUA_3G14910,
AFUA_5G00540) is meg alálha óak acC o ológ gének, ezé az Aspe gilus umiga us
diagnosz izáló endsze ek ese ében ejlesz e ünk ún. dual-copy esszéke is. Ez u óbbiak
ese ében egye len eal- ime PCR eakció so án négy szek encia speci ikus p ime és ké ,
ugyanaz a luo o ó a almazó p óba használa á al egysze e ké gén ől, szimul án ö énik
az ampli ikáció.
Aspe gillus ajok enyész ése és a gDNS kinye ése
Há om (Aspe gillus umiga us AF293), ill. hé napos (Aspe gillus e eus NCCB
IH2624 ill. Aspe gillus len ulus SZMC3118) ö zsek spó a szuszpenziói használ uk
inokulumkén és enyész e ük olyékony, glükóz a almú, minimál áp alajon. Pa ogén
gombák elüle i enyésze ei mechanikus lízissel olyékony ni ogénben á uk el és genomi
DNS- izolál unk.
PCR ampli ikációs kon ollok
A genomi ek i alens (GE) egy ado aj egye len genomjá ep ezen áló DNS
mennyiségé jelen i. A különböző, Aspe gillus umiga us, Aspe gillus e eus, ill. Aspe gillus
len ulus gDNS koncen ációjú min ák eal- ime endsze ű analízise so án minden egyes u ás
a almazo meg elelő belső kon olloka . Az Aspe gillus umiga us A 293 és Aspe gillus
e eus IH2624 haploid genomjá (1 GE) 15 g-nak becsül ük.
8
Taqman® MGB és Taqman® LNA esszék eakció ha ékonyságának és speci ici ásának
mé ése gDNS paneleken
Az egyes esszék eakció ha ékonyságának, ill. de ek ációs küszöbének
megállapí ásához s anda d so oka (panelek) készí e ünk a onalas gombák genomi DNS
izolá umaiból, így megha á oz uk esszéink dinamikus a ományá . Aspe gillus umiga us
AF293, Aspe gillus e eus NCCB IH2624 ajok genomi DNS izolá umaiból 25 agból álló,
15 ng - 15 g (7-log10) a ományú hígí ási so oza oka készí e ünk nukleázmen es izben
(Ambion PCR g ade wa e ). Min ánkén há om pá huzamos eakció al dolgoz unk, majd
sike es ampli ikáció kö e ően a kapo Cp é ékeke á lagol uk és kalib ációs egyenes
illesz e ünk az egyes min ákhoz endel Cp é ékek és isme DNS a almuk 10-es alapú
loga i musának ügg ényében kapo pon ok a. A kapo lineá is gö bék me edekségéből (y =
mx + b) eakció ha ékonyságo (E = e iciency) számol unk.
Taqman®-MGB esszéink speci ici ásá izsgál uk humán placen a ill. számos
p oka ió a ill. euka ió a pa ogén gomba klinikai izolá umainak, alamin apa ogén gombák
genomi DNS-é el. Taqman®-LNA4 esszénk speci ici ásá az ISHAM-EAPCRI ál al 2013-
ban (2013/08/20) kibocsá o kö kon ollos panelen izsgál uk.
Ol adáspon analízis Aspe gillus umiga us és Aspe gillus len ulus ajok azonosí ásá a
Az ISHAM-EAPCRI 2013/08/20 kö kon olos panel eldolgozásá al kapo
e edmények kié ékelésé kö e ően az apasz al uk, hogy az Aspe gillus umiga us speci ikus
Taqman®-LNA3 esszé képes ol az Aspe gillus len ulus gDNS-é el is eagálni. Ebből a a a
kö e kez e és e ju o unk, hogy a még nem szek enál Aspe gillus len ulus genom is a almaz
acC o ológ gén(eke) . Aspe gillus umiga us AFUA_3G14910, ill. AFUA_5G00540 gének
eljes ampli ikációjához p ime eke e ez ünk és Aspe gillus umiga us A 293 ö zsének
gDNS-én op imalizál uk a gének ampli ikációjához szükséges eakció kö ülményeke . Az
Aspe gillus umiga us AFUA_3G14910-génhez a ozó, p ime pá al sike esen ampli ikál
Aspe gillus len ulus nukleinsa agmen eke megszek enál a uk, majd meg e ez ük az
Aspe gillus umiga us A 293 acC o ológ (AFUA_3G14910), és az Aspe illus len ulus
SZMC3118 ö zs acC o ológ génekhez egya án hib idizáló PCR p ime eke , amelyeke a
o ábbiakban az Aspe gillus umiga us, ill. Aspe gillus len ulus ajok amplikonjainak jellemző
szek encia el é éseiből adódó ol adáspon jaik, és leol adási gö béik (HRM analízis) alapján
ö énő azonosí ásá a e ezzük használni.
9
HRM esszé eakció ha ékonyságának mé ése gDNS paneleken
Aspe gillus umiga us AF293 ill. Aspe gillus len ulus SZMC3118 genomi DNS
a almú paneleke (HRM panel-1, HRM panel-2, HRM panel-3) készí e ünk 7 log10
a ományban (106-1 GE/PCR eakció).
Taqman® esszék dinamikus a ományának mé ése Aspe gillus konídium a almú
paneleken
A biológiai min ák (kon oll és panel min ák egya án ) nukleinsa ex akciója Roche
MagNA Pu e LC 2.0 au oma a nukleinsa izoláló endsze ben oly . Ha agú eljes é
paneleke készí e ünk Taqman®-MGB (Taqman®-MGB3, Taqman®-MGB4), ill. Taqman®-
LNA (Taqman®-LNA3, Taqman®-LNA4) esszéink dinamikus a ományainak
megha á ozásához. Ö agú, nagyszámú szé um paneleken Taqman®-LNA esszéinke o ább
esz el ük.
A panelekkel megegyező számú nega í kon oll szé umok analízise oly . Az
ex akciós kon oll min ák (ECN-ek) 5%-nál magasabb als pozi i i ása ese én kapo
e edményeink nem ke ül ek kié ékelés e.
A gomba konídiumoka MagNA Lyse (Roche Applied Science) készülékkel és
ke ámia gyöngyök alkalmazásá al, ál alunk op imalizál p o okollnak meg elelően á uk el a
o ábbi elhasználásnak meg elelően 250 µl, ill 1250 µl-ben. Az au oma a nukleinsa izolálás
Roche MagNA Pu e LC 2.0 endsze ben zajlo .
A Taqman®-MGB eal- ime PCR ampli ikációk az Applied Biosys ems 7500 Real-
Time PCR készüléken, míg a Taqman®- LNA eal- ime analízisek a Roche Ligh Cycle ® 480
Ins umen II készüléken u o ak 20 µl eakció é oga ban és meg elelő PCR-IC, ill. PCR-
NTC kon olok beik a ása melle .
16
Diagnosz ikai ha ékonysági mu a óka ; szenzi i i ás (Se), speci ici ás (Sp),
alószínűségi hányadosoka (LR+, LR-), p edik í é ékeke (PV+, PV-) és esélyhányados
(DOR) számol unk a Pla elia Aspe gillus GM-EIA sze ológia és acC-PCR esz ek e.
Cohen éle kappa-s a isz iká égez ünk a ké éle diszk iminá o (Pla elia Aspe gillus
GM-EIA ill. acC-PCR) e edmények konko danciájának a izsgála á a. A kappa index é éke
(Ƙ = 0.258), amely a ké izsgál diszk iminá o e edményeinek mé sékel egyezésé mu a a.
Túlélési á ák
Ese -kon oll anulmányunk eljes úlélési á ája 48.15% ol . A 27 izsgál be egből
13 halálozo el a nyomonkö e ési pe iódus időszaka so án. A 23 GM-EIA nega í be eg
43,47%-a, míg a 4 GM-EIA pozi í be eg 75%-a halálozo el.
Há om ese anulmány
Az elhuny be egek 53.85%-ában (7/13) égez ek posz -mo em hisz ológiai (PMH)
izsgála o . Há om be eg ese ében mu a kozo jelen ős ellen mondás a PMH ada ok, ill. a
klinikai izsgála ok e edményei közö .
Az ID-4 epizódo a klinikus az EORTC/MSG k i é ium endsze ben leí aknak
meg elelően e ede ileg kon oll (lehe séges ITA) csopo ba so ol a, ám halálá kö e ően a
PMH egyé elműen igazol a a üdejében az Aspe gillusok a jellemző dicho omikus hi a
elágazásoka így az ID-4 epizód, u ólagos ko ekció kö e ően á ke ül az ese csopo ba. A
kombinál bioma eke moni o ozás és a közel él é es nyomonkö e és so án a 11 acC-PCR
esz e edményei egye len ki é ellel pozi í nak bizonyul ak, míg ezzel szemben az ez ala az
időszak ala összegyűl GM-sze ológia e edményei konzek ensen nega í ak ma ad ak.
Az ID-24 be ege az an ibio ikum a nem eagáló láz, pozi í CT, nega í Aspe gillus-
GM sze ológia (és ugyancsak nega í acC-PCR e edményekkel) és nega í BAL
e edményekkel e ede ileg az ese ( alószínű ITA) csopo ba so ol a a klinikus. A
posz mo em hisz ológiai izsgála azonban nem ud a mege ősí eni a üdőben enyésző
Aspe gillus hi ák jelenlé é . Ez az epizódo égül ugyancsak á ka ego izál ák a kon ol
csopo ba
An ibio ikum a nem eagáló láz, Aspe gillus pozi í BAL enyésze és a há omból egy
pozi í GM-EIA e edmény alapján, az e ede ileg ese csopo ba ( alószínű ITA) so ol ID-10
epizód ól szin én nem sike ül az au opszia olyamán igazolni a üdőaszpe gillózis , azonban,

17
ennek ellené e a klinikus szakembe ek úgy í él ék meg, hogy nem szükséges az
á ka ego izálás.
18
MEGBESZÉLÉS
A dolgoza émájának alapjául azon el edezés szolgál , mely sze in p oka ió a
e ede ű, acC o ológ gének ke ülhe ek á ho izon ális gén ansz e el, apa ogén, onalas
S ep omyces bak é iumok genomjából bizonyos euka ió a, humánpa ogén, onalas,
Aspe gillus gombákba.
Kísé le esen igazol uk, hogy azon humánpa ogén gomba ajok közül, melyek a
legyengül immun endsze ű egyének sze eze ében meg elepedni, idő el gene alizálódni,
majd szisz émás, in azí e őzéseke kialakí ani képesek, és így biológiai ma ke eik a é ben
megjelenhe nek, csak az Aspe gillus umiga us, Aspe gillus e eus, ill. ahogy a a munkánk
so án ény de ül , az Aspe gillus len ulus ajok is endelkeznek acC o ológ génekkel. Ezen
gének meg elelően ki álasz o szakaszai köz i szek encia di e gencia mé éke elegendőnek
bizonyul ahhoz, hogy olyan speci ikus esszéke ejlesszünk, amelyek sem más ajokkal, sem
pedig egymással nem adnak ke esz eakció , lehe ősége e em e a há om emlí e aj nagyon
é zékeny és speci ikus, aji szin ű azonosí ásá a különböző biológiai ( eljes é , szé um,
BAL) min ákból.
Nyolc különböző Taqman® eal- ime, alamin egy HRM esszé ejlesz e ünk
Aspe gillus umiga us, Aspe gillus e eus, ill. Aspe gillus len ulus ajok speci ikus és
é zékeny de ek álásá a. Mé éseink alapján az Aspe gillus umiga us speci ikus Taqman®-
LNA3, ill. az Aspe gillus e eus speci ikus Taqman®-LNA4 eal- ime esszéink de ek álási
küszöb é ékei bizonyul ak a legalacsonyabbnak (LoD = 1 CFU/biológiai min a) különböző
konídium a almú biológiai paneleken. Az Aspe gillus umiga us és Aspe gillus len ulus
ajoka jellemző ol adási gö béjük alapján azonosí ani képes HRM esszé klinikai min ákon
ö énő alidálása jelenleg is olyama ban an. Az esszé anali ikai szenzi i i ása különböző,
Aspe gillus umiga us, ill. Aspe gillus len ulus gDNS a almú paneleken izsgál a; LoD = 1
GE.
Az elmúl é ek so án alkalmunk ol dolgozni szé um, eljes é , ill. BAL min ákkal
egya án . A biológiai min ák jellegé ől üggően számos p o okoll op imalizál unk. Teljes é ,
ill. BAL min ák nukleinsa ex akciójához a ke ámia gyöngyös, mechanikai lízissel (Roche,
MagNA Lyse ) kombinál au oma a nukleinsa izolálás (Roche, MagNA Pu e LC 2.0)
bizonyul ak a legha ékonyabbnak (módsze -1). Annak ellené e, hogy a eljes é , ill. BAL
min ák a almazzák az egységnyi é oga a eső leg öbb gomba nukleinsa molekulá , az
elmúl néhány é so án a szé um min ák mind hangsúlyosabb sze ephez ju o ak.
19
Real- ime esszéink anali ikai speci ici ásá esz el ük a 2013-as ISHAM-EAPCRI
panelen is. Ez a panel különböző pa ogén, in azí aszpe gillózis agy candidózis okozó, ill.
egyéb gomba gDNS izolá umai a almaz a ál ozó koncen ációban.
E edményeink alapján az Aspe gillus e eus speci ikus Taqman®-LNA4 esszé LoD-
é éke nagyon alacsonynak bizonyul . A PCR eakciókban, 18 g-nyi (1,2 GE) mennyiségben
jelen le ő Aspe gillus e eus alamely klinikai izolá umának DNS-é ol képes de ek álni,
amely e a kö kon ollos izsgála ban ész e ő cen umok o ábbi 45%-a (a öbbi ész e ő
cen um ál al isszaszolgál 33 ada so ból 15) ol még képes. A Taqman®-LNA4 esszé
speci ici ása maximális, 100% ol . Azonban az Aspe gillus umiga us Taqman®-LNA3 esszé
má nem ol képes a PCR eakció 20 µl-ében elméle ileg, 1,2 GE-nek meg elelő Aspe gillus
umiga us alamely klinikai izolá umának DNS-é de ek álni.
Az ISHAM-EAPCRI labo a ó iumi munkacsopo jának agjakén ész e ünk a
2014-es kö kon ollos BAL panelek izsgála ában, amelyek egy észe Aspe gillus umiga us
e ede ű nukleinsa molekuláka , míg más észük Aspe gillus umiga us konídiumoka
a almazo különböző koncen ációban.
Aspe gillus umiga us konídium, ille e a gDNS panelek analízisé el kapo
e edményeinke összegez én megállapí ha ó ol , hogy izsgál módsze eink közül a
legmagasabb pon o az ál alunk op imalizál , ke ámiagyöngyös-mechanikai lízisen és LC 2.0
kapillá is de ek áláson alapuló módsze -1 (25 pon az összesen kapha ó 32-ből) kap a.
Megállapí ha ó o ábbá az is, hogy az ál alunk op imalizál , ke ámiagyöngyös-
mechanikai lízis lényegesen ha ékonyabban á ja el a biológiai (BAL) min ákban jelen le ő
Aspe gillus umiga us konídiumoka úgy, hogy közben nem oncsolja gomba e ede ű
nukleinsa aka .
A pon os és ko ai diagnózis k i ikus jelen őségű, hiszen amíg az aszpe gillózisos
be egek úlélési esélyei jelen ős mé ékben csökkennek, úgy kezelésük köl ségei d asz ikus
mé ékben nö ekszenek a be egség elő ehalad á al. A kó házi in ekciókon oll és a
izikócsopo ok moni o ozása abban az ese ben lehe ne még e edményesebb, ha olyan u in
diagnosz ikai módsze ek állnának endelkezés e, amelyek köl ségha ékonyak, így meg elelő
indikáció ese én endsze es biológiai ma ke -moni o ozás ennének lehe ő é.
20
Annak okán, hogy a különböző súlyos, őleg hema ológiai megbe egedésekben
(elsőso ban aku leukémia) szen edő be egek, hosszan a ó, elhúzódó neu opéniá al,
jelen ős eszélynek annak ki é e az in azí üdőaszpe gillózis szempon jából, ezé
ese ükben kiemel sze ephez ju na a szigo ú kó házi in ekciókon oll.
Miu án megalakul a Deb eceni Egye emen a molekulá is biológusoka , gene ikusoka ,
mik obiológusoka , hema ológus és pa ológus szakembe eke magában oglaló, in azí
aszpe gillózis munkacsopo unk, egy é en á a ó, p ospek í , ese -kon oll izsgála ba
kezd ünk. A be egeke , a különböző izsgála i e edmények alapján, a klinikus kollégák
u ólag, e ospek í módon so ol ák az EORTC/MSG gomba mikózisok a ona kozó
i ányel einek meg elelően a há om okoza ú kockáza i endsze ka egó iáinak (bizonyí o ,
alószínű, lehe séges) egyikébe.
Diagnosz ikai és e ápiás s a égiánk észekén a láz megjelenésének első napján
in enzí biológiai ma ke -moni o ozásba kezd ünk, és há om egymás kö e ő napon (á lag:
3.11 ±2.36) izsgál uk a be egek szé um min ái Aspe gillus genus speci ikus GM an igének
(Pla elia Aspe gillus GM-EIA), ill. Aspe gillus umiga us speci ikus nukleinsa a ge
molekulák ( acC-PCR) jelenlé é e. Megállapí o uk, hogy mind a CT, mind pedig a BAL
magas nega í p edik í é ék mu a ókkal endelkeznek (PV-=0.85, ill. PV-=0.93), ehá
sokkal inkább alkalmasak az in azí üdőaszpe gillózis kizá ásá a, min mege ősí ésé e. A
kombinál bioma ke analízisek lezá ul á al megha á oz uk a módsze ek diagnosz ikai
esélyhányadosai , melyek közül a Pla elia Aspe gillus GM-EIA ese ében, DOR = 15,33, míg a
acC-PCR ese ében, DOR = 28,67 ol ak.
Végeze ül pedig éleményünk sze in diagnosz ikai esz ünke jó eséllyel lehe ne
ki esí e ke eskedelmi o galomba hozni. A legideálisabb al e na í a az lenne, ha az zá ,
au oma a endsze e szabha nánk (pl. Roche Cobas modulá is endsze ).
21
ÖSSZEFOGLALÁS
PhD munkám alap e ő célja olyan PCR módsze ek ejlesz ése ol , amelyek képesek az in azí
aszpe gillózis azonosí ásá a. Ennek meg elelően nyolc Taqman® eal- ime esszé (4 Taqman®-
MGB és 4 Taqman®-LNA) ejlesz e ünk az Aspe gillus umiga us és az Aspe gillus e eus ajok
de ek álásá a, ill. egy HRM esszé az Aspe gillus umiga us és Aspe gillus len ulus ajok
azonosí ásá a amplikonjaik ol adáspon jai alapján. Különböző ál alunk, ill. az ISHAM-EAPCRI
közpon i labo a ó iumi munkacsopo ja ál al készí e genomi DNS paneleken megha á oz uk
esszéink eakció ha ékonyságá , szenzi i i ásá , speci ici ásá , és Aspe gillus umiga us, ill.
Aspe gillus e eus konídium a almú eljes é paneleken a diagnosz ikai ha ékonyságuka .
Taqman®-LNA3 és Taqman®-LNA4 esszéink endelkez ek a legalacsonyabb LoD é ékekkel,
ennek meg elelően dinamikus a ományuka nagyszámú szé um min án o ább esz el ük. Az
ISHAM-EAPCRI labo a ó iumi munkacsopo agjakén sajá ejlesz ésű diagnosz ikai
esz jeinkkel és ál alunk op imalizál eljá ásokkal ész eszünk nemze közi, kö -kon ollos
izsgála okban, ahol a o ábbi ész e őkkel együ működ e alidálunk és s anda dizálunk PCR
alapú, aszpe gillózis de ek áló módsze eke , ill. izsgáljuk, melyek azok a ényezők, amelyek
be olyással bí nak diagnosz ikai ha ékonyságuk a. Mé ési e edményeink alapján megállapí ha ó,
hogy biológiai min ák széles skáláján ( eljes é , szé um, BAL) és é oga a ományában (2,5
ml-200 µl) agyunk képesek gomba nukleinsa ak biológiai min ákból aló ha ékony kinye ésé e
(közel 100%) mind manuális, mind pedig au oma a endsze ben. To ábbá sike esen
op imalizál unk egy olyan mechanikai lízis p o okoll , amely mé éseink alapján nukleinsa
esz eség nélkül képes az Aspe gillus konídiumok biológiai min ákból ö énő ha ékony
el á ásá a. To ábbi célunk ol a acC-PCR és az Aspe gillus GM-EIA módsze ek diagnosz ikai
e ejének a mé ése in azí üdő aszpe gillózis de ek álásá a különböző hema ológiás
megbe egedésben szen edő, lázas neu opéniás be egek nagyszámú szé um min áin. A
posz mo em hisz ológiai e edmények isme e ében el égez ük a szükséges ko ekció a be egek
ka ego izálásá ille ően és ennek meg elelően megmé ük a acC-PCR és az Aspe gillus GM-EIA
módsze ek diagnosz ikai pon osságá (AUC acC-PCR ese ében 0,80, míg a GM-EIA ese ében
0,73) és megállapí o uk, hogy a acC-PCR-hez a ozó esélyhányados (DOR acC-PCR 28,67)
magasabbnak bizonyul a GM-EIA-hoz a ozónál (DOR GM-EIA 15,33). P ospek í ese -
kon oll anulmányunk so án megha á oz uk a kon encionális klinikai módsze ek (CT, ill. BAL)
diagnosz ikai é éké és összehasonlí o uk a kombinál biológiai ma ke -moni o ozásé al ( acC-
PCR és GM-EIA kombinál analízis). A mé egyezés 70,13% ol , amely alapján a kappa
s a isz ika 0,258-nak adódo . E edményeink alapján igazolás nye , hogy a kon encionális
diagnosz ikai módsze ek és a PCR-el kombinál biológiai ma ke moni o ozások e edményeinek
együ es igyelembe é ele képes lehe ko ai és ha ékony diagnózis meghoza alá a.

22
23
24
AZ TÉZIS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ ELŐADÁSOK JEGYZÉKE
Paholcsek M., Bi ó S.: Aspe gillus diagnos ics in Deb ecen. 5 h Molecula Cell and Immune Biology
Win e Symposium, 2012. januá 4-7, Galya e ő.
Paholcsek M., Bi ó S.: Hol a jelenleg az aszpe gillusz diagnosz ika Deb ecenben és
ilág iszonyla ban. A Magya Mik obiológiai Tá saság 2012. é i Nagygyűlése. 2012. ok óbe 24-26,
Kesz hely, Hunga y.
Paholcsek M., Bi ó S.: S a is ical aspec s o Aspe gillus diagnosis; Mul icen e Aspe gillus DNA
de ec ion in Whole Blood and Se um. 6 h Molecula Cell and Immune Biology Win e Symposium,
2013. januá 8-11, Galya e ő.
Paholcsek M.: Gene ic linkage be ween bac e ia and Aspe gillosis? A no el in en ion using highly
sensi i e and speci ic TaqMan assays o he iden i ica ion o Aspe gillus umiga us and Aspe gillus
e eus species. In asi e Mycoses in Hema ological Malignancies VII. 2013. má cius 22,
Uni e si ä sklinikum Wü zbu g, Zen um ü Inne e Medizin, Ge many.
Paholcsek M., Bi ó S.: An al e na i e way in he diagnosis o aspe gillosis; a possible example o
ansla ional medicine. 7 h Molecula Cell and Immune Biology Win e Symposium, 2014. januá 7-
10, Galya e ő.
AZ TÉZIS TÉMÁJÁHOZ KAPCSOLÓDÓ POSZTEREK LISTÁJA
Paholcsek M., Bi ó S.: No el me hods in Aspe gillus diagnosis. 4 h Molecula Cell and Immune
Biology Win e Symposium, 2011. januá 11-14, Galya e ő.
Sp inge J., Paholcsek M., Alzheime M., Heinz WH., Schloßnagel H., Einsele H, Loe le J.:
Op imized Molecula Diagnosis i In asi e Aspe gillosis in Pa ien s a e Allogeneic S em Cell
T ansplan a ion – a Second Con i ma o y Assay is C ucial. 37 h Mee ing o he Eu opean G oup o
Blood and Ma ow T ansplan a ion. Le Palais De Cong es, 3-6 Ap il 2011, Pa is, F ance
Ma ko ics A., Paholcsek M.: Labo a o y backg ound o pa hogen de ec ion. 7 h Molecula Cell and
Immune Biology Win e Symposium, 2013. januá 8-11, Galya e ő.
Fidle G., Paholcsek M.: Diagnos ic accu acy o PCR compa ed o galac omannan in se um samples
o in asi e sys ema ic aspe gillosis. 7 h Molecula Cell and Immune Biology Win e Symposium,
2014. januá 7-10, Galya e ő.
Paholcsek M., Fidle G., Bi ó S.: DNA based aspe gillosis diagnos ics in Deb ecen, Hunga y; s a e o
he a and u he challenges. 6 h Ad ances Agains Aspe gillosis Con e ence, 2014 eb uá 27-
má cius 1, Mad id, Spain.