Tumorbiologische Bedeutung von SMARCA4 und SMARCE1 im Magenkarzinom, Korrelation mit ARID1A, Mikrosatellitenstatus sowie SMARCE1/ERBB2 Ko-Amplifikation

Aus dem Ins i u ü Pa hologie (Di ek o : P o . D . med. C. Röcken) im Uni e si ä sklinikum Schleswig-Hols ein, Campus Kiel an de Ch is ian-Alb ech s-Uni e si ä zu Kiel Tumo biologische Bedeu ung on SMARCA4 und SMARCE1 im Magenka zinom, Ko ela ion mi ARID1A, Mik osa elli ens a us sowie SMARCE1/ERBB2 Ko-Ampli ika ion Inaugu aldisse a ion zu E langung de Dok o wü de de Medizin de Medizinischen Fakul ä de Ch is ian-Alb ech s-Uni e si ä zu Kiel o geleg on KATHARINA PRIES aus Hambu g Kiel 2023 1. Be ich e s a e : P o . D . Ch is oph Röcken, Ins i u ü Pa hologie 2. Be ich e s a e /in: P o . D . D . Janka Held-Feind , Klinik ü Neu ochi u gie Tag de mündlichen P ü ung: 20.11.2024 Zum D uck genehmig , Kiel, den 30.08.2024 gez.: P o . D . Ch is oph Röcken, Ins i u ü Pa hologie I Inhal s e zeichnis Abkü zungs e zeichnis .......................................................................................... III Tabellen e zeichnis ................................................................................................ VI Abbildungs e zeichnis ........................................................................................... VII 1 Einlei ung ............................................................................................................ 1 1.1 Das Magenka zinom ...................................................................................... 1 1.1.1 Epidemiologie ......................................................................................... 1 1.1.2 Ä iopa hogenese ..................................................................................... 1 1.1.3 Pa hologie ............................................................................................... 4 1.1.4 TNM-Klassi ika ion und UICC-S adien .................................................... 5 1.1.5 P ognose ................................................................................................ 7 1.1.6 The apie .................................................................................................. 7 1.2 De SWI-/SNF-Komplex ................................................................................ 9 1.2.1 Funk ion und Au bau ............................................................................... 9 1.2.2 Tumo biologische Bedeu ung on SMARCA4 und SMARCE1 ............. 10 1.3 F ages ellung ............................................................................................... 11 2 Ma e ial ............................................................................................................. 13 2.1 S udienkollek i ........................................................................................... 13 2.2 Ge ä e ......................................................................................................... 13 2.3 So wa e ...................................................................................................... 14 2.4 Chemikalien ................................................................................................. 14 2.5 Ki sys eme ................................................................................................... 15 2.6 An ikö pe .................................................................................................... 15 2.7 Oligonukleo ide ............................................................................................ 15 2.8 Ve b auchsma e ial ..................................................................................... 15 3 Me hoden .......................................................................................................... 16 3.1 Immunhis ochemie ...................................................................................... 16 3.1.1 Auswe ung ........................................................................................... 17 3.2 Ve gleich on SMARCE1 und HER2 ........................................................... 18 3.3 D ople Digi al PCR ..................................................................................... 19 3.3.1 Du ch üh ung ........................................................................................ 19 3.3.2 Auswe ung ........................................................................................... 21 3.4 He kun wei e e klinisch-pa hologische Da en ......................................... 21 3.5 S a is ische Auswe ung .............................................................................. 21 II 4 E gebnisse ........................................................................................................ 24 4.1 Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 ................................................ 24 4.2 Ko ela ion mi Pa ien encha ak e is ika ...................................................... 26 4.3 SMARCE1 und HER2 in Immunhis ochemie und CISH .............................. 38 4.4 Ampli ika ion on SMARCE1 in de ddPCR ................................................. 40 4.5 Ampli ika ion on SMARCE1 und ERBB2 ................................................... 40 5 Diskussion ........................................................................................................ 43 5.1 Me hodische Diskussion .............................................................................. 43 5.2 Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 ................................................ 45 5.3 SMARCA4, SMARCE1 und ande e umo biologische Eigenscha en ......... 46 5.4 Ampli ika ion on SMARCE1 ....................................................................... 49 5.5 SMARCE1 und HER2 .................................................................................. 49 6 Zusammen assung .......................................................................................... 51 7 Li e a u e zeichnis ......................................................................................... 53 A Anhang .............................................................................................................. 58 A.1 E hik o um ................................................................................................... 58 B Publika ionen ................................................................................................... 60 C Danksagung ..................................................................................................... 61 D E klä ung .......................................................................................................... 62 III Abkü zungs e zeichnis bzw. beziehungsweise ca. ci ca CIN ch omosomal ins abil CISH Ch omogene in si u Hyb idisie ung CNV Copy Numbe Va ia ion DAB Diaminbenzidin ddPCR D ople Digi al PCR DNA desoxy ibonucleid acid (engl.), Desoxy ibonukleinsäu e EBV Eps ein-Ba Vi us EDTA E hylendiamin e aessigsäu e EGFR epide mal g ow h ac o ecep o (engl.), epide male Wachs ums ak o ezep o engl. Englisch ESD endoskopische Submukosadissek ion e al. e alii (la .), und ande e FFPE Fo malin- ixed pa a in embedded issue g G amm GTP Guanosin iphospha GTPase GTP-bindendes P o ein, G-P o ein H. pylo i Helicobac e Pylo i HE Hema oxylin und Eosin HER2 Human epide mal g ow h ac o ecep o 2 (engl.), Hu- mane epide male Wachs ums ak o ezep o 2 IHC Immunhis ochemie la . la einisch l Li e li. links mg Millig amm Min Minu e IV ml Millili e mm Millime e MSI Mik osa eli en ins abil µg Mik og amm µl Mik oli e µm Mik ome e n Anzahl nm Nanome e OS O e all Su i al (engl.), Gesam übe leben PIK3CA Phospha idylinosi ol-4,5-Bisphosphona 3-Kinase ka aly i- sche Un e einhei Alpha PCR polyme ase chain eac ion (engl.), Polyme aseke en eak- ion e. ech s RNA ibonucleic acid (engl.), Ribonukleinsäu e Sek Sekunde SMARCA4 SWI-/SNF ela ed, ma ix associa ed, ac in dependen eg- ula o o ch oma in, sub amily a, membe 4 (engl.), SWI- /SNF bezogene , Ma ix assoziie e , Ac in abhängige Ch oma in egula o , Un e amilie A, Mi glied 4 SMARCE1 SWI-/SNF ela ed, ma ix associa ed, ac in dependen eg- ula o o ch oma in, sub amily e, membe 1 (engl.), SWI- /SNF bezogene , Ma ix assoziie e , Ac in abhängige Ch oma in egula o , Un e amilie E, Mi glied 1 SWI-/SNF-Komplex Swi ch-/Suc ose-non- e men ing-Komplex TMA Tissue Mic o A ay TSS Tumo speci ic su i al (enlg.), Tumo spezi isches Übe leben TNM Tumo -Nodus-Me as asen u.a. un e ande em UKSH Uni e si ä sklinikum Schleswig-Hols ein UICC Union o In e na ional Cance Con ol (engl.) .a. o allem s. e sus (la .), gegen V WHO Wel gesundhei so ganisa ion z.B. zum Beispiel °C G ad Celsius z.T. zum Teil VI Tabellen e zeichnis Tabelle 1: TNM-Klassi ika ion on 2017. Quelle: Wi ekind, 2017 [33] ............................................... 5 Tabelle 2 UICC-S adien des Magenka zinoms. Quelle: Wi ekind, 2017 [33] ..................................... 6 Tabelle 3: Cyling Phasen bei de ddPCR Hie au ge üh sind die Cycling Phasen des gewähl en P o okolls, welche de The mocycle ü die ddPCR du chlie . Dabei wu de die P oben-DNA 40 Mal dena u ie und du ch DNA-Syn hese in jedem Zyklus e doppel , sodass die Ausgangsmenge de P oben-DNA um 240 e meh we den konn e....................................................................................... 20 Tabelle 4: Kombina ionen de bei SMARCA4 nachgewiesenen Fä bein ensi ä en [56] ............... 25 Tabelle 5: Kombina ion de bei SMARCE1 nachgewiesenen Fä bein ensi ä en [56] ................... 25 Tabelle 6: S a is ische Auswe ung Exp ession on SMARCE1 und klinisch-pa hologische Pa ien encha ak e is ika (1) Fishe 's exac Tes , (2) Kendall's au Tes , (3) log- ank Tes , die nach angewand e Mul iple-Tes ing-Ko ek u signi ikan e bliebenen We e wu den mi * ma kie . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56]. ........................... 28 Tabelle 7: S a is ische Auswe ung de Exp ession on SMARCA4 und de Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes (1) Fishe 's exac Tes , (2) Kendall's au Tes , (3) log- ank Tes , die nach angewand e Mul iple-Tes ing-Ko ek u signi ikan e bliebenen We e wu den mi * ma kie . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56]. ............................ 32 Tabelle 8: Ve gleich SMARCE1 und HER2 IHC und CISH Au ge üh is de jeweilige His osco e des un e such en Falls, welche die Ausp ägung de Exp ession on SMARCE1 wiede geben soll. Sowie die Ausp ägung de Exp ession on HER2 in de Immunhis ochemie, und die Ampli ika ion on HER2 in de CISH, welche in eine o angegangenen S udie des Ins i u s ü Pa hologie am UKSH Kiel un e such wu den [57].Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] ................................................................................................................................................. 39 Tabelle 9: Ampli ika ionsanalyse on SMARCE1 du ch ddPCR Angegeben sind die G öße de Tumo a eale in de jeweiligen in de Immunhis ochemie nachgewiesene Exp essionsin ensi ä on SMARCE1, die We e de CNV aus de e s en und zwei en ddPCR mi de zugehö igen abschließenden Bewe ung sowie die Da en des S udienkollek i s zum Ampli ika ionss a us on HER2 aus CISH-Un e suchungen o angegangene S udien des Ins i u s ü Pa hologie am UKSH Kiel [57]. In 3 Fällen lag kein Ma e ial ü eine zwei e ddPCR o : n.a. = nich anwendba . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] ...... 41 VII Abbildungs e zeichnis Abbildung 1: Re e enz älle ü die In ensi ä en des His osco es bei de IHC-Analyse Da ges ell sind die In ensi ä en 0 bis 3+ ( on links nach ech s). Obe e Reihe: An i-SMARCA4 IHC (400- ache Ve g öße ung). Un e e Reihe: An i-SMARCE1 IHC (400- ache Ve g öße ung) © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] ............................................................................ 18 Abbildung 2: He e ogenes Exp essionsmus e in SMARCA4 und SMARCE1 links: An i- SMARCA4 IHC (400- ach e g öße ) ech s: An i-SMARCE1 IHC (400 ach- e g öße ) © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] ................................................................ 26 Abbildung 3: Kaplan-Meie Ku e zum OS on SMARCA4 und SMARCE1 Da ges ell sind die Gesam übe lebensku en (OS) on SMARCA4 und SMARCE1 dicho omisie am Median und ka ego isie in „hohe“ und „nied ige“ Exp ession. ................................................................................ 36 Abbildung 4: Kaplan-Meie Ku en zum TSS on SMARCA4 und SMARCE1 Da ges ell sind die Ku en zum umo spezi ischen Übe leben (TSS) on SMARCA4 und SMARCE1 dicho omisie am Median und ka ego isie in „hohe“ und „nied ige“ Exp ession. © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56]. ........................................................................................... 36 Abbildung 5: Kaplan-Meie Ku en zum OS und TSS on SMARCE1 In ensi ä 3+ o handen Da ges ell sind die Ku en zum Gesam übe leben (OS) und umo spezi ischen Übe leben (TSS) zum Vo handensein de In ensi ä 3+ in de IHC on SMARCE1 ................................................................. 37 Abbildung 6: Kaplan-Meie Ku en OS und TSS de Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes Da ges ell sind die Ku en zum Gesam übe leben (OS) und umo spezi ischen Übe leben (TSS) zu Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes, welche als o handene Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 „beide hoch“ und „beide nied ig“ de inie wu de. ............................................................... 37 Abbildung 7: Ve gleich de Exp ession und Ampli ika ion on SMARCE1 und HER2 Obe e Reihe: übe eins immend keine Exp ession on SMARCE1 (links) und HER2 (Mi e), sowie keine Ampli ika ion on HER2 ( ech s) im gleichen Tumo a eal. Un e e Reihe: übe eins immend s a ke Exp ession on SMARCE1 (links) und HER2 (Mi e) sowie Ampli ika ion on HER2 ( ech s) in einem ande en Tumo a eal desselben Falls. Links An i-SMARCE1 An ikö pe (400- ach e g öße ), Mi e Ani -HER2 An ikö pe (400- ach e g öße ), ech s HER2 CISH (400- ach e g öße ). © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] ................................................................ 38 Einlei ung 7 1.1.5 P ognose Neben dem TNM-S a us beein lussen wei e e Tumo eigenscha en die P ognose. Diese lassen sich in essenzielle und zusä zliche Fak o en un e scheiden, die wiede- um in umo -, wi - und umwel bezogene Fak o en un e eil we den können. De TNM-S a us s ell als eine de wich igs en P ognose ak o en einen essenziellen, umo bezogenen Fak o da . Auch de HER2-S a us zähl in diese Ka ego ie. Ein wei- e e essenzielle , jedoch umwel bezogene Fak o is de Residual umo s a us. So mach es einen Un e schied, ob de Tumo R0, also im gesunden Gewebe, en e n wu de ode , ob de Tumo in die R2-Ka ego ie zähl , bei de be ei s mak oskopisch sich ba Teile des Tumo s nach de Resek ion im Kö pe e blieben sind. Zusä zliche umo bezogene Fak o en sind die Tumo lokalisa ion (Ka dia s. dis ale Magen), de His ologische Typ (di us s. in es inal) und die Ge äßin asion. Auch das Al e und die dami e bundenen häu ige en Komo bidi ä en nehmen als wi bezogene Fak o ei- nen Ein luss au die P ognose des Pa ien en [33, 35]. Dennoch is man au de Suche nach wei e en, neuen Fak o en. Als iel e sp echend haben sich dabei das molekula e P o il des Tumo s (Mik osa elli enins abili ä ) und die E hnie (Asia isch s. Nich -Asia- isch) he ausges ell . Alle dings sind nich alle übliche weise ü maligne Tumo en an- gewand en P ognosema ke auch sinn oll beim Magenka zinom anzuwenden. Dies gil z. B. ü den Ki67-P oli e a ionsindex, de zu den am häu igs en angewand en P ognosema ke n ü maligne Tumo en zähl . Es zeig e sich kein Zusammenhang zwi- schen dem immunhis ologisch bes imm en Ki67-Index und dem Pa ien enübe leben [36]. Neben po enziellen p ognos ischen Ma ke n ha die A de The apie einen en - scheidenden Ein luss au das Pa ien enübe leben. 1.1.6 The apie Das Ziel de Behandlung is g undsä zlich da on abhängig, wie wei die E k ankung be ei s o gesch i en is . Eben alls da on abhängig sind auße dem die he apeu i- schen Möglichkei en. Wäh end im F ühs adium noch eine endoskopische Resek ion in Fo m eine endoskopische Submukosadissek ion (ESD) du chge üh we den kann, is ü o gesch i ene e S adien ode auch schlech di e enzie e Tumo e ein adika- le es Vo gehen, beispielsweise du ch eine Teil esek ion bis hin zu o alen Resek ion des Magens, no wendig [37]. Einlei ung 8 Bishe gil de chi u gische Ansa z als einzige ku a i e Behandlung ü Magenka zi- nome und s ell dami die S anda d he apie esek able Tumo e da . Neben de chi u - gischen The apie wi d in einigen Fällen auch die pe iope a i e Chemo he apie emp- ohlen. Sie kann nachgewiesene maßen das Gesam übe leben e besse n. Von eine p äope a i en Radiochemo he apie ode An ikö pe he apie wi d jedoch abge a en [37]. Da ca. jedes d i e diagnos izie e Magenka zinom be ei s me as asie is , sind die The apiemöglichkei en o beg enz [2]. Die pallia i e The apie ha dann das Ziel, das Übe leben zu e besse n und die Lebensquali ä zu e hal en. An diese S elle kann eine sys emische Chemo he apie eingese z we den. Vo Beginn eine pallia i en The- apie soll e auße dem de HER2-S a us bes imm we den. Diese gil als ein posi i e p ädik i e Fak o ü eine An ikö pe he apie mi T as uzumab, die im Falle eines He 2/neu-übe exp imie enden Tumo s zusä zlich zu eine Chemo he apie angewand wi d [37]. Zusä zlich dazu kann eine Mis el he apie die Lebensquali ä des Pa ien en e besse n, auch wenn sie nich zu Ve besse ung des Übe lebens bei agen kann [38]. Die Ve besse ung de Behandlung du ch geziel e Tumo he apien („Ta ge ed-The a- pies“) is Gegens and ak uelle Fo schungsa bei en. Dabei kommen Medikamen e zum Einsa z die gegen o he im Tumo un e such e Ziels uk u en ge ich e sind, wie z.B. T as uzumab bei HER2-posi i en Magenka zinomen. Besonde s die genauen Me- chanismen, die zu Tumo wachs um, Me as asie ung abe auch zu Medikamen en e- sis enz üh en sind hie on In e esse. Die be eilig en Rezep o en, signal e mi elnden P o eine und ande e ü den Tumo spezi ische Eigenscha en we den gegen den Tu- mo genu z . Hie ü gib es be ei s un e schiedliche Me hoden. Beispielsweise können An ikö pe wahlweise di ek ih e Wi kung an Rezep o en en al en ode abe da ü ge- nu z we den, gekoppel e Chemo he apeu ika spezi isch an ih en Wi kungso zu b in- gen. Auch das kö pe eigene Immunsys em kann geziel s imulie und zu Bekämp ung on Tumo zellen eingese z we den. Du ch das zunehmende Ve s ändnis de Tumo - biologie können The apeu ika also imme p äzise gegen Tumo e eingese z we den. He kömmliche Chemo he apeu ika wi ken an allen sich schnell e meh enden Zellen gleiche maßen und üh en dadu ch zu Nebenwi kungen wie Haa e lus , Beein äch- igung des Knochenma ks ode des Gas oin es inal ak s [39]. De Un e gang des Knochenma ks kann jedoch nich nu zu eine Anämie üh en, sonde n auch die Einlei ung 9 Funk ion des Immunsys ems on Pa ien en deu lich einsch änken. Pa ien en sind dann nich nu an ällige ü In ek e, sie sind auch ge äh de e ü das Au e en eine eb ilen Neu openie [40], welche als schwe e Nebenwi kung als lebensbed ohlich gil [41]„Ta ge ed The apies“ sollen den Tumo im Ve gleich zu he kömmlichen Chemo he apeu ika dami nich nu wi kungs olle sonde n auch nebenwi kungsä me ü gesunde Zellen bekämp en [39]. 1.2 De SWI-/SNF-Komplex 1.2.1 Funk ion und Au bau Beim Swi ch-/Suc ose-non- e men ing-Komplex (SWI-/SNF-Komplex) handel es sich um einen ATP-abhängigen Ch oma in-Remodelle . E is in de Lage, die T ansk ip ion zu egulie en, indem e die Ch oma ins uk u e ände . Dabei üh die ATPase Ak i- i ä des Komplexes zu eine Un e b echung des His on-DNA-Kon ak es. Es komm zu eine DNA-T ansloka ion, indem eine Loop-Fo ma ion gebilde wi d, welche sich um das Nukleosom ausb ei e und die DNA anschließend mi Abs and zu o he igen Nuk- leosom-Posi ion neu posi ionie . Diese Ablau wi d auch als „Sliding“ bezeichne und kann auße dem zu eine Ejek ion eines benachba en Nukleosomen üh en. Du ch diesen Vo gang wi d die Zugänglichkei ü T ansk ip ions ak o en e höh und dami die T ansk ip ion egulie [42]. De SWI-/SNF-Komplex bes eh aus 9 bis 12 Un e einhei en. Man un e scheide haup sächlich zwei A en on SWI-/SNF-Komplexen: BRG1-assoziie e Fak o (BAF, auch bekann und im Folgenden bezeichne als SWI-/SNF-A) und polyb omo BRG1- assoziie e Fak o (PBAF, auch bekann und im Folgenden bezeichne als SWI-/SNF- B). Die Ke nun e einhei en inden sich dabei sowohl im SWI-/SNF-A-Komplex, als auch im SWI-/SNF-B-Komplex. Zu diesen Un e einhei en gehö en BRG1 (im Folgen- den als SMARCA4 bezeichne ), BAF155 (SMARCC1), BAF170 (SMARCC2) und SNF5 (SMARCB1). Auße den Ke nun e einhei en gib es wei e e a iie ende Un- e einhei en, die sich eben alls in beiden Komplexen inden lassen. Hie zu zählen ß- Ac in, BAF53 (SMARCA2), BAF60 (SMARCD3), BAF45 sowie BAF57 (SMARCE1) [42]. Einlei ung 10 De SWI-/SNF-A-Komplex un e scheide sich om SWI-/SNF-B-Komplex du ch ü ihn spezi ische Un e einhei en. Eine spezi ische Un e einhei des SWI-/SNF-A-Komplexes is das AT- eiche-in e ak i e-Domain-P o ein 1A und 1B (ARID1A/ ARID1B), ü das be ei s ein Zusammenhang mi dem TNM-S a us und de In asions ie e des Magen- ka zinoms nachgewiesen we den konn e [42, 43]. Zu den spezi ischen Un e einhei en des SWI-SNF-B-Komplexes gehö en BAF200 (ARID2), BAF180 (PBRM1) und BRD7. De SWI-/SNF-A-Komplex kann dabei sowohl SMARCA4 als auch BRM als ka aly i- sche ATPase Un e einhei beinhal en, wäh end allein SMARCA4 als ka aly ische AT- Pase Un e einhei des SWI-/SNF-B-Komplexes dien [42]. 1.2.2 Tumo biologische Bedeu ung on SMARCA4 und SMARCE1 SWI-/SNF ela ed, ma ix associa ed, ac in dependen egula o o ch oma in, sub a- mily a, membe 4 (SMARCA4) is eine de ka aly ischen ATPase Un e einhei en des SWI-/SNF-Komplexes, dessen Gen au Ch omosom 19 lokalisie is (19p 13.2) [42, 44]. Obwohl häu ige on Mu a ionen in SMARCA4 be ich e wi d, die übe einen Funk- ions e lus de Un e einhei zu einem agg essi e en Tumo wachs ums üh en und da- mi au eine Rolle als Tumo supp esso schließen lassen, wu de auch schon Gegen- eiliges beobach e [45–47]. Somi is die umo biologische Bedeu ung on SMARCA4 bis heu e nich nu ü das Magenka zinom unkla . SWI-/SNF ela ed, ma ix associa ed, ac in dependen egula o o ch oma in, sub a- mily e, membe 1 (SMARCE1) is eine de a iablen Un e einhei en des SWI-/SNF- Komplexes, dessen Gen sich au Ch omosom 17 be inde (17q21.2) und dami eng mi ERBB2 benachba is , welches ü H2/neu kodie (17q12-21) [48]. De humane epi- de male Wachs ums ak o ezep o 2 (He 2/neu) is . a. ü seine Rele anz beim B us k ebs bekann und wi d do be ei s als ein wich ige Bioma ke zu The apiepla- nung eingese z [49, 50]. Eine Übe exp ession on He 2/neu e mi el eine Zunahme de Zellp oli e a ion und e leich e dadu ch ein unkon ollie es (Tumo -) Zellwachs- um. Die Übe exp ession on He 2/neu gil des Wei e en bei B us k ebspa ien en als ein Indika o ü eine schlech e P ognose [51, 52]. Beim Magenka zinom wi d He 2/neu als Ang i spunk eine de zielge ich e en The apien („ a ge ed he apies“,An ikö - pe he apie) genu z , um die Übe lebenszei de pallia i en Pa ien en zu e länge n [37]. Fü SMARCE1 wu de in eine S udie aus Asien beobach e , dass eine hohe Einlei ung 11 Exp ession einen signi ikan en Zusammenhang mi eine schlech en P ognose sowie o gesch i ene Tumo g öße, In asions ie e und höhe em UICC-S adium beim Ma- genka zinom au wies [53]. Ande e S udien bes ä ig en auße dem, dass eine e höh e Exp ession on SMARCE1 mi Me as asie ung des Tumo s in Zusammenhang ge- b ach we den kann [54, 55]. Diese Eigenscha schein SMARCE1 übe den ERK/MAPK-Signalweg zu e mi eln, welche eben alls du ch die Ak i ie ung on He 2/neu in Gang gese z we den kann [51, 53]. 1.3 F ages ellung Die Funk ionsweise des SWI/SNF-Komplexes sowie die bishe dazu o liegenden S u- dien geben Hinweise au eine Rele anz in de Tumo biologie des Magenka zinoms eben dieses Komplexes ode seine Un e einhei en [45–47, 53–55]. Ebenso wi die äumliche Nähe on SMARCE1 zu ERBB2 au Ch omosom 17 [48] die F age au , ob hie eine Ko-Ampli ika ion o lieg . Eine de a ige Ko-Ampli ika ion könn e mögliche - weise in de En s ehung on Resis enzen gegen The apeu ika wie T as uzumab, wel- ches als An ikö pe in de pallia i en The apie HER2-posi i e Magenka zinome ein- gese z wi d, be eilig sein. Dahe sollen in diese Disse a ion die hie genann en Hy- po hesen übe p ü we den: (1) SMARCA4 und SMARCE1 zeigen un e schiedlichen A en de Exp ession sowie in a umo ale He e ogeni ä beim Magenka zinom. (2) Die Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 ko elie mi klinisch-pa hologi- schen Pa ien encha ak e is ika. (3) Es lieg eine Ko-Ampli ika ion on SMARCE1 und ERBB2 o . Um diese Thesen zu p ü en, wu de zunächs jeweils ein An ikö pe ü die immunhis- ochemische Fä bung on SMARCA4 und SMARCE1 e ablie . Diese wu den einzeln zu immunhis ochemischen Fä bung on Ganzgewebeschni en eine gu cha ak e i- sie en Koho e on übe 400 Magenka zinompa ien en genu z . Die ge ä b en Gewe- beschni e wu den im Anschluss mik oskopie und anhand eine op ischen Skala (His o-Sco e) bewe e , um die Ausp ägung sowie die A de Exp ession zu e mi eln. Die so e hobenen Da en wu den in eine Da enbank einge agen, in de be ei s iele wei e e klinisch-pa hologische Pa ien encha ak e is ika zu den Fällen des Einlei ung 12 S udienkollek i s un e such wu den. Die in o angegangen Un e suchungen be ei s als HER2 posi i bewe e en Fälle wu den speziell in de Exp ession on He 2/neu und SMARCE1 e glichen, um zunächs es zus ellen, ob SMARCE1 und He 2/neu an den gleichen S ellen inne halb de Ka zinome exp imie wu den. Zusä zlich wu de ch o- mogene in si u Hyb idisie ung (CISH) on HER2, welche einen Hinweis au die zu- g unde liegende Ampli ika ion on ERBB2 lie e n, in den Ve gleich mi einbezogen. Zule z wu den ausgewähl e Fälle, un e denen sich auch ERBB2-ampli izie e be an- den, mi els ddPCR au die Ampli ika ion on SMARCE1 un e such . Im Anschluss wu de eine s a is ische Auswe ung de e hobenen Da en du chge üh und die Ex- p ession on SMARCA4 und SMARCE1 mi o liegenden klinisch-pa hologischen Pa- ien encha ak e is ika ko elie . Me hoden 13 2 Ma e ial 2.1 S udienkollek i Das S udienkollek i umschließ 468 he apienai e Adenoka zinome des Magens ode gas oösophagealen Übe gangs aus dem A chi des Ins i u s ü Pa hologie des Uni- e si ä sklinikums Schleswig-Hols ein (UKSH), welche zwischen 1997 und 2009 diag- nos izie und ope ie wo den sind. Eingeschlossen wu den Pa ien en im Al e on 28 bis 92 Jah en. Das Du chschni sal e des Kollek i s lieg bei 67 Jah en. Fälle, ü die nich meh aus eichend Gewebe zu Un e suchung o handen wa , wu den ausge- schlossen. Die nachs ehend au ge üh en Pa ien encha ak e is ika wu den du ch das Ins i u ü Pa hologie des UKSH be ei s o Beginn diese S udie e ass : Geschlech , Al e , Tumo lokalisa ion, Tumo yp nach Lau én, G ading, TNM-S a us und UICC-S a- dium. Follow-up-Da en übe den Pa ien en od wu den om K ebs egis e Schleswig- Hols ein bezogen. Die olls ändigen Pa ien encha ak e is ika sind zudem in den Ta- bellen 6 und 7 da ges ell 2.2 Ge ä e Das e wende e Gewebe wu de in de Kühl-Ge ie kombina ion Liebhe p emium no- os (Liebhe , Bulle, Schweiz) gelage . Zum Pipe ie en wu den Eppendo Resea ch plus Pipe en (Eppendo AG, Hambu g) in den G ößen 10µl, 20µl, 100µl und 200µl sowie de Vo ex Schü le V 2 (IKA-We ke GmbH & Co. KG, S au en) genu z . De Leica BOND-MAX (Leica Biosys ems, We zla ) wu de zu Fä bung eingese z . Mi dem Cogni i e Cxi Labe P in e (Leica Biosys ems, We zla ) wu den E ike en ged uck . Deckgläse n wu den mi de P omoun e RCM 2000 Co e slipping Machine (MEDITE Medical GmbH, Bu gdo ) au geb ach . Einzelne ge ä b e Gewebeschni e wu den mi dem Leica Scanne SCN 400 (Leica Mic osys ems, We zla ) eingescann und digi ali- sie . Des Wei e en wu de de Vo ex Schü le V 2 (IKA-We ke GmbH & Co. KG, S au en) und die The mo Scien i ic™ Pico™ 17 Mik ozen i uge (The mo Fishe Scien i ic, Mas- sachuse s, USA) e wende . Es wu de Eis aus dem Eisbe ei e Sco sman AF130 (Sco sman Ice Sys ems, Ve non Hills, USA) eingese z . Gea bei e wu de an mi Ul - a iole S e ilizing PCR Wo ks a ion (Peqlab Bio echnologie GmbH, E langen) ausge- s a e en A bei splä zen. Fü die Du ch üh ung de ddPCR kamen ein DG8™ Ca idge Holde #1863051 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA), ein QX200 D ople Me hoden 14 Gene a o #1864002 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA), de PX1 Hea Seale #1864000 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA), ein C1000 Touch The mocycle mi Deep Well Reac ion Module #1851197 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) sowie de QX200 D ople Reade #1864003 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) und ein Leno o ThinkPad L540 (Leno o, Qua y Bay, Hongkong) zum Einsa z. 2.3 So wa e Zu E assung und s a is ischen Auswe ung de gewonnenen Da en wu de an Com- pu e n mi dem Be iebssys em Mic oso ® Windows 10 (Mic oso Deu schland GmbH, Schwabing) gea bei e . Die E assung de Da en e olg e mi Mic oso O ice 365® P oPlus (Mic oso Deu schland GmbH, Schwabing sowie speziell ü die ddPCR mi Quan aSo ™ Ve sion 1.7 #1864011 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA). Die s a is ische Auswe ung e olg e mi Hil e on SPSS 27.0 (IBM Co po a ion, New Yo k, USA) 2.4 Chemikalien Fü die immunhis ochemische Fä bung am Leica BOND-MAX (s. 2.2 Ge ä e) wu den die Bond Dewax Solu ion (Leica Biosys ems, We zla ), die Bond Epi ope Re ie al So- lu ion 2 (Leica Biosys ems, We zla ), Bond P ima y An ibody Diluen (Leica Biosys- ems, We zla ) und BOND Wash Solu ion 10X Concen a e (Leica Biosys ems, We z- la ) genu z . Nach de Fä bung wu den die Objek äge in 70% E hanol (Th. Geye GmbH & Co. KG, Renningen) ge auch und mi dH2O (Th. Geye GmbH & Co. KG, Renningen) abgewaschen. Fü das Waschen de Schni e in de au s eigenden Alko- hol eihe wu de Xylol (Th. Geye GmbH & Co. KG, Renningen) e wende . Fü den P obenansa z de ddPCR wu de mi Nuclease eiem Wasse (Qiagen, Hilden) und ddPCR Supe mix o P obes (No dUTP) (Bio-Rad, Kali o nien, USA) gea bei e . Auße dem wu de D ople Gene a o Oil o P obes #1863005 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) und D ople Reade Oil #1863004 eingese z (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA). Me hoden 15 2.5 Ki sys eme Zu immunhis ochemischen Fä bung wu de das BOND Polyme Re ine De ec ion Ki (Leica Biosys ems, We zla ) eingese z . 2.6 An ikö pe In de immunhis ochemischen Fä bung on SMARCA4 kam de monoklonale Maus An ikö pe An i-SMARCA4/-BRG1, Klon E8V5B on Cell Signaling Technology (Be- e ly, MA, USA) in de Ve dünnung 1 : 400 zum Einsa z. Zu immunhis ochemischen Fä bung on SMARCE1 wu de de monoklonale Hasen An ikö pe , An i-SMARCE1/- BAF57, Klon E6H5J on Cell Signaling Technology (Be e ly, MA, USA) in de Ve dün- nung 1 : 300 eingese z . 2.7 Oligonukleo ide Fü die Du ch üh ung de ddPCR wu den ü SMARCE1 die im Folgenden genann en P ime eingese z . Selbs design e P ime (Biome s.ne GmbH, Ulm) SMARCE1 o - wa d: 5’-ACACTCCTTTTTATGGTTACTGGT-3’ und selbs design e P ime (Bio- me s.ne GmbH, Ulm) SMARCE1 e e se: 5’-TTCTCTGGAAACGGGCGGT-3’. Die Sonde ü SMARCE1 wa eben alls selbs designed (Biome s.ne GmbH, Ulm) und ha e die Sequenz 5’-6-FAM-TGTTCACTCCAGATTATGATGATGGC-BMN-Q530-3’. Fü EFTUD2 wu den P ime nach dem Design on Liu e al. [53] e wende . P ime EFTUD2 o wa d (Biome s.ne GmbH, Ulm): 5’-GGTCTTGCCAGACACCAAAG-3’ und P ime EFTUD2 e e se (Biome s.ne GmbH, Ulm): 5’-TGAGAG- GACACACGCAAAAC-3’. Die Sonde ü EFTUD2 wu de selbs designed (Biome s.ne GmbH, Ulm) und ha die Sequenz 5’-6-HEX-GGACATCCTTTGGCTTTTGA-BMN- Q530-3’. 2.8 Ve b auchsma e ial Als Ve b auchsma e ial ü die Immunhis ochemie kamen Objek äge de So e Su - gipa h® Apex BOND Supe io Adhesi e Slides on Leica Biosys ems (We zla ) zum Einsa z. Dazu wu den Deckgläse N .1 on Th. Geye GmbH & Co. KG (Renningen) e wende . Zum Pipe ie en des An ikö pe -Ansa zes wu den Biosphe e® ges op e Fil e -Tips on SARSTEDT AG & Co. KG (Nümb ech ) genu z . Me hoden 16 Die P oben de ddPCR wu den in das DG8™ Ca idge #1864008 (Bio-Rad Labo a- o ies, Kali o nien, USA) pipe ie und mi einem DG8™ Gaske #1863009 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) e schlossen. Die e igen D ople s we den in ddPCR™ 96 well pla es #12001925 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) übe üh und mi eine Pie cable Foil Hea Seal #1814040 (Bio-Rad Labo a o ies, Kali o nien, USA) e siegel . Zum Pipe ie en wu den Biosphe e® ges op e Fil e -Tips on SARSTEDT AG & Co. KG (Nümb ech ) e wende . 3 Me hoden 3.1 Immunhis ochemie Zu Un e suchung de Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 in Magenka zinom- gewebe wu den immunhis ochemische Fä bungen mi da ü spezi ischen An ikö pe n du chge üh . Die ü die hie du chge üh e immunhis ochemische Un e suchung e wende en Ge- webep oben wa en alle in Fo malin ixie und in Pa a in eingebe e wo den (FFPE: Fo malin- ixed pa a in-embedded issue). Aus diesen Pa a in-Blöcken wu den 2 µm dicke Schni e he ges ell , welche au Objek äge n au geb ach und zu Fä bung ge- nu z wu den. Die immunhis ochemische Fä bung de FFPE-Gewebeschni e wu de am Bond-Max au oma isie du chge üh . Sowohl ü SMARCA4 als auch SMARCE1 beinhal e e das Fä bep o okoll eine Vo behandlung mi de Bond Epi ope Re ie al Solu ion 2 (ER2) übe 20 Minu en. Fü die Fä bung zu Da s ellung de Exp ession on SMARCA4 wu de ein monoklonale Maus-An ikö pe gegen SMARCA4 in de Konzen a ion 1:400, mi Bond P ima y An ibody Diluen e dünn , angewende . Fü die Fä bung zu Da s ellung de Exp ession on SMARCE1 wu de ein monoklonale Hasen-An ikö pe gegen SMARCE1 in de Konzen a ion 1:300, mi Bond P ima y An ibody Diluen e - dünn , angewende . Zu De ek ion de An ikö pe bindung wu de das Polyme Re ine De ec ion Ki on Leica Biosys ems e wende , in welchem als Subs a DAB en hal en wa . Als Gegen ä bung wu de Häma oxylin eingese z . Nach de immunhis ochemischen Fä bung wu den die Gewebeschni e ü 20 Minu en in 70%igen Alkohol geleg , mi Lei ungswasse und des illie em Wasse (dH2O) ge- spül und anschließend in eine au s eigenden Alkohol eihe dehyd ie . Zule z wu den Me hoden 23 Kaplan-Meie -Me hode bes imm . Um hie die Signi ikanz de Un e schiede zu bes im- men, wu de de log- ank Tes angewand [56]. E gebnisse 24 4 E gebnisse 4.1 Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 SMARCA4 und SMARCE1 we den nukleä exp imie . Die Exp ession on SMARCA4 konn e immunhis ochemisch sowohl in Tumo zellen als auch in nich neoplas ischem und me aplas ischem Epi hel nachgewiesen we den. Ebendies gal auch ü die Ex- p ession on SMARCE1. Hie konn e jedoch auch eine konsequen e und s a ke Ex- p ession in Lymphozy en nachgewiesen we den, welche als in e ne Kon olle genu z wu de. Die Fä bein ensi ä en de Immunhis ochemie eich en on 0 bis 3+ (s. Abbil- dung 1). Dabei zeig en 50,1 % de ü SMARCA4 un e such en Fälle an eilig keine Exp ession (0) im Tumo a eal. In 87,8 % kam an eilig eine schwache (1+), in 89,3 % eine mäßige (2+) und in 53,1 % de Fälle eine s a ke (3+) Exp ession o . 66,9 % de ü SMARCE1 un e such en Fälle zeig en an eilig keine (0) Exp ession im Tumo a eal. In 97,2 % kam an eilig eine schwache (1+), in 76,9 % eine mäßige (2+) und in 17,9 % de Fälle eine s a ke (3+) Exp ession o . Die Spanne de G öße de Fläche, die eine Exp ession on SMARCA4 im Tumo a eal au wies, eich e ü die Ka ego ie „keine Exp ession“ (0) on 0 % bis 100 % des gesam en Tumo a eals. Fü die Ka ego ien „schwache Exp ession“ (1+), „mäßige Exp ession“ (2+) und „s a ke Exp ession“ (3+) eich e die Spanne on 0 % bis 95 % des gesam en Tumo a eals. Fü SMARCE1 eich e die Spanne de G öße de Fläche, die keine Exp ession (0) im Tumo a eal au wies on 0 % bis 100 % des gesam en Tumo a eals. Fü die Ka ego ie „schwache Exp ession“ (1+) eich e die Spanne on 0 % bis 99 %, ü „mäßige Exp ession“ (2+) on 0 % bis 95 % und ü „s a ke Exp ession“ (3+) on 0 % bis 90 % des gesam en Tumo a eals. Sowohl ü SMARCA4 als auch ü SMARCE1 zeig e jeweils ein Fall kei- nen Nachweis de Exp ession in Tumo zellen (0 x 100 % = His osco e 0) [56]. Insgesam zeig en 466 Fälle, die mi dem An ikö pe zum Nachweis de Exp ession on SMARCA4 ge ä b wu den, un e schiedliche Kombina ionen on zwei ode meh Fä bein ensi ä en. Ein Fall wies im gesam en Tumo be eich keine Exp ession on SMARCA4 au und dami auch keine Kombina ion on un e schiedlichen Fä bein en- si ä en. Die ü SMARCA4 nachgewiesenen Kombina ionen de Fä bein ensi ä en sind die in Tabelle 4 au ge üh en. E gebnisse 25 Tabelle 4: Kombina ionen de bei SMARCA4 nachgewiesenen Fä bein ensi ä en [56] Kombina ion de Fä bein ensi ä en Anzahl de Fälle An eil am gesam en Kollek i 0/ 1+ 43 9,2 % 0/ 2+ 4 0,9 % 1+/ 2+ 66 14,1 % 2+/ 3+ 38 8,1 % 0/ 1+/ 2+ 101 21,6 % 0/ 1+/ 3+ 2 0,4 % 0/ 2+/ 3+ 10 2,1 % 1/ 2+/ 3+ 129 27,6 % 0/ 1+/ 2+ / 3+ 69 14,7 % 467 Fälle, die mi dem An ikö pe zum Nachweis de Exp ession on SMARCE1 ge- ä b wu den, wiesen eben alls un e schiedliche Kombina ionen on zwei ode meh Fä bein ensi ä en au . Ein Fall wies im gesam en Tumo be eich keine Exp ession on SMARCE1 au und dami auch keine Kombina ion on un e schiedlichen Fä bein en- si ä en. Die ü SMARCE1 nachgewiesenen Kombina ionen de Fä bein ensi ä en sind die in Tabelle 5 au ge üh en. Tabelle 5: Kombina ion de bei SMARCE1 nachgewiesenen Fä bein ensi ä en [56] Kombina ion de Fä bein ensi ä en Anzahl de Fälle An eil am gesam en Kollek i 0/ 1+ 106 22.6 % 0/ 2+ 1 0.2 % 1+/ 2+ 95 20.3 % 1+/ 3+ 1 0.2 % 2+/ 3+ 9 1.9 % 0/ 1+/ 2+ 181 38.7 % 0/ 2+/ 3+ 2 0.4 % 1+/ 2+/ 3+ 50 10.7 % 0/ 1+/ 2+/ 3+ 22 4.7 % E gebnisse 26 Wie hie da ges ell we den konn e, gib es eine Vielzahl an Kombina ionen de Fä - bein ensi ä en in un e schiedlich g oßen Flächenan eilen de ü SMARCA4 und SMARCE1 ge ä b en Tumo a eale. Diese Da en belegen eine he e ogene Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 im Magenka zinom, sowohl als „g ey-scale“ (G aus u- en, ineinande übe gehende Ände ung de Fä bein ensi ä en) als auch als „black-and- whi e“- Mus e (Schwa z-Weiß, s a ke Fä bein ensi ä i au di ek ang enzende Tu- mo a eale ohne Exp ession). Dabei lag sowohl ü SMARCA4 als auch ü SMARCE1 in de Meh hei de Fälle ein „g ey-scale“-Mus e o . Die nach olgende Abbildung 2 zeig jeweils einen exempla ischen Fall ü die zu o e wähn en Exp essionsmus e [56]. Abbildung 2: He e ogenes Exp essionsmus e in SMARCA4 und SMARCE1 links: An i-SMARCA4 IHC (400- ach e g öße ) ech s: An i-SMARCE1 IHC (400 ach- e g öße ) © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] 4.2 Ko ela ion mi Pa ien encha ak e is ika Säm liche im Folgenden e wähn en E gebnisse sind in Tabelle 6 und Tabelle 7 am Ende on Kapi el 4.2 zusammenge ass . Nachdem die Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 am Median dicho omisie und mi den klinisch-pa hologischen Pa ien encha ak e is ika des S udienkollek i s ko elie wu de, anden sich be ei s e s e au ällige We e in de S a is ik. Es zeig e sich eine Ko ela ion ü SMARCA4 mi Mik osa eli enins abili ä und de Exp ession E gebnisse 27 on ARID1A. Fü SMARCE1 konn e eben alls eine Ko ela ion mi Mik osa eli enin- s abili ä , de Exp ession on ARID1A sowie de Exp ession on TP53 nachgewiesen we den. Ansons en konn en wede ü die Exp ession on SMARCA4 noch on SMARCE1 wei e e Ko ela ionen es ges ell we den (Tabelle 6 und 7). Im zwei en Sch i wu den die Fälle des S udienkollek i s sowohl ü die Exp ession on SMARCA4 als auch ü die Exp ession on SMARCE1 in Qua ile un e eil . Dazu wu de ü SMARCA4 das 1. Qua il (His osco e <111) gegen die es lichen d ei Qua - ile (His osco e ≥111) e glichen. Fü SMARCE1 wu de das 4. Qua il (His osco e >170) gegen die e s en d ei Qua ile (His osco e ≤170) e glichen. Bei Anwendung diese Ka ego isie ung konn en die olgenden Ko ela ionen es ges ell we den. SMARCA4 ko elie e wei e hin mi Mik osa eli enins abili ä , de Exp ession on SMARCA4 und zusä zlich de Exp ession on TP53, wäh end sich ü SMARCE1 nu noch eine Ko ela ion mi Mik osa eli enins abili ä und de Exp ession on ARID1A zeig e [56]. Beim Ve gleich de Exp ession on SMARCA4 mi de Exp ession on SMARCE1, um die A des Ve hal ens beide Un e einhei en des SWI-/SNF-Komplexes zueinande zu e mi eln, konn e nachgewiesen we den, dass eine nied ige Exp ession on SMARCA4 mi eine nied igen Exp ession SMARCE1 ko elie e. Eben alls and sich eine Ko ela ion zwischen eine hohen Exp ession on SMARCA4 und eine hohen Exp ession on SMARCE1 [56]. Die Übe p ü ung de Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes e gab einen signi ikan- en Zusammenhang mi de Exp ession on ARID1A. Diese wu den ka ego isie in „jede Exp ession“ e sus „komple e Ve lus de Exp ession“ sowie in „komple e Ve - lus de Exp ession ode schwa z-weiß Mus e “ e sus „jede ande e Exp ession on ARID1A“. Wei e hin ko elie e die Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes mi de Exp ession on TP53 sowie Mik osa eli enins abili ä [56]. Das Gesam übe leben und das umo spezi ische Übe leben hängen insbesonde e on un e schiedlichen klinisch-pa hologischen Pa ien eneigenscha en ab. Diese sind bei- spielsweise de Phäno yp nach Lau én, de TNM-S a us, das UICC-S adium, abe auch das G ading, de Mik osa eli ens a us und das Vo handensein ode Fehlen on ande en Bioma ke n. Dennoch konn e in de gesam en s a is ischen Auswe ung kein E gebnisse 28 Zusammenhang zwischen de Exp ession on SMARCA4 ode SMARCE1 und dem Pa ien enübe leben nachgewiesen we den (siehe Abb. 3 - 6) [56]. Tabelle 6: S a is ische Auswe ung Exp ession on SMARCE1 und klinisch-pa hologische Pa i- en encha ak e is ika (1) Fishe 's exac Tes , (2) Kendall's au Tes , (3) log- ank Tes , die nach angewand e Mul iple-Tes ing-Ko ek u signi- ikan e bliebenen We e wu den mi * ma kie . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56]. SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 In ensi ä 3+ p äsen To al His osco e nied- ig (< 120) His osco e hoch (≥ 120) Q123 Q4 ehl p äsen n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) To al 232 236 358 110 384 (82,1) 84 (17,9) Geschlech n p(1 468 0,704 468 0,824 468 0,265 Weiblich 179 (38,2) 91 (50,8) 88 (49,2) 138 (77,1) 41 (22,9) 142 (79,3) 37 (20,7) Männlich 289 (61,8) 141 (48,8) 148 (51,2) 220 (76,1) 69 (23,9) 242 (83,7) 47 (16,3) Al e n p(1 468 0,355 468 0,514 468 1,000 < 68 Jah e 237 (50,6) 112 (47,3) 125 (52,7) 178 (75,1) 59 (24,9) 194 (81,9) 43 (18,1) >= 68 Jah e 231 (49,4) 120 (51,9) 111 (48,1) 180 (77,9) 51 (22,1) 190 (82,3) 41 (17,7) Lokalisa ion n p(1 466 0,046 466 0,077 466 0,026 P oximal 146 (31,3) 62 (42,5) 84 (57,5) 104 (71,2) 42 (28,8) 111 (76,0) 35 (24,0) Dis al 320 (68,7) 169 (52,8) 151 (47,2) 253 (79,1) 67 (20,9) 272 (85,0) 48 (15,0) Lau én Phä- no yp n p(1 468 0,884 468 0,408 468 0,023 In es inal 240 (51,3) 118 (49,2) 122 (50,8) 178 (74,2) 62 (25,8) 190 (79,2) 50 (20,8) Di us 148 (31,6) 72 (48,6) 76 (51,4) 116 (78,4) 32 (21,6) 127 (85,8) 21 (14,2) Gemisch 31 (6,6) 15 (48,4) 16 (51,6) 27 (87,1) 4 (12,9) 30 (96,8) 1 (3,2) Unklassi- izie ba 49 (10,5) 27 (55,1) 22 (44,9) 37 (75,5) 12 (23,5) 37 (75,5) 12 (24,5) G ading n p(1 468 0,588 468 0,305 468 0,570 G1 / G2 110 (23,5) 52 (47,3) 58 (52,7) 80 (72,7) 30 (27,3) 88 (80,0) 22 (20,0) G3 / G4 358 (76,5) 180 (50,3) 178 (49,7) 278 (77,7) 80 (22,3) 296 (82,7) 62 (17,3) T n p(1 468 0,522 468 0,626 468 0,208 T1a / T1b 58 (12,4) 27 (46,6) 31 (53,4) 45 (77,6) 13 (22,4) 48 (82,8) 10 (17,2) T2 53 (11,3) 30 (56,6) 23 (43,4) 46 (86,8) 7 (13,2) 42 (79,2) 11 (20,8) T3 185 (39,5) 84 (45,4) 101 (54,6) 128 (69,2) 57 (30,8) 146 (78,9) 39 (21,1) T4a / T4b 172 (36,8) 91 (52,9) 81 (47,1) 139 (80,8) 33 (19,2) 148 (86,0) 24 (14,0) N n p(1 467 0,949 467 0,742 467 0,528 N0 134 (28,6) 68 (50,7) 66 (49,3) 106 (79,1) 28 (20,9) 109 (81,3) 25 (18,7) N1 64 (13,7) 28 (43,8) 36 (56,3) 40 (62,5) 24 (37,5) 46 (71,9) 18 (28,1) N2 84 (18,0) 45 (53,6) 39 (46,4) 67 (79,8) 17 (20,2) 76 (90,5) 8 (9,5) N3a/b 185 (39,6) 91 (49,2) 94 (80,8) 144 (77,8) 41 (22,2) 152 (82,2) 33 (17,8) E gebnisse 29 SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 In ensi ä 3+ p äsen To al His osco e nied- ig (< 120) His osco e hoch (≥ 120) Q123 Q4 ehl p äsen n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) M n p(1 468 0,241 468 0,098 468 0,647 M0 378 (80,8) 182 (48,1) 196 (51,9) 283 (74,9) 95 (25,1) 308 (81,5) 70 (18,5) M1 90 (19,2) 50 (55,6) 40 (44,4) 75 (83,3) 15 (16,7) 76 (84,4) 14 (15,6) UICC-S a- dium n p(1 467 0,450 467 0,441 467 0,638 IA / IB 81 (17,3) 41 (50,6) 40 (49,4) 66 (81,5) 15 (18,5) 67 (82,7) 14 (17,3) IIA / IIB 99 (21,2) 46 (46,5) 53 (53,5) 69 (69,7) 30 (30,3) 79 (79,8) 20 (20,2) IIIA / IIIB / IIIC 197 (42,2) 95 (48,2) 102 (51,8) 147 (74,6) 50 (25,4) 161 (81,7) 36 (18,3) IV 90 (19,3) 50 (55,6) 40 (44,4) 75 (83,3) 15 (16,7) 76 (84,4) 14 (15.6) LN Ra io n p(1 467 0,926 467 0,329 467 0,336 nied ig (<0.189) 227 (48,6) 112 (49,3) 115 (50,7) 169 (74,4) 58 (25,6) 182 (80,2) 45 (19,8) hoch (≥0.189) 240 (51,4) 120 (50,0) 10 (50,0) 188 (78,3) 52 (21,7) 201 (83,8) 39 (16,3) L n p(1 449 0,131 449 0,377 449 0,271 L0 219 (48,8) 115 (52,5) 104 (47,5) 171 (78,1) 48 (21,9) 184 (84,0) 35 (16,0) L1 230 (51,2) 104 (45,2) 126 (54,8) 171 (74,3) 59 (25,7) 183 (79,6) 47 (20,4) V n p(1 448 0,290 448 0,154 448 0,170 V0 399 (89,1) 198 (49,6) 201 (50,4) 308 (77,2) 91 (22,8) 329 (82,5) 70 (17,5) V1 49 (10,9) 20 (40,8) 29 (59,2) 33 (67,3) 16 (32,7) 36 (73,5) 13 (26,5) R n p(1 464 0,575 464 1,000 464 1,000 R0 406 (87,5) 198 (48,8) 208 (51,2) 310 (76,4) 96 (23,6) 333 (82,0) 73 (18,0) R1 / R2 58 (12,5) 31 (53,4) 27 (46,6) 45 (77,6) 13 (22,4) 48 (82,8) 10 (17,2) HER2 n p(1 437 0,223 437 0,305 437 0,038 Nega i 401 (91,8) 204 (50,9) 197 (49,1) 310 (77,3) 91 (22,7) 336 (83,8) 65 (16,2) Posi i 36 (8,2) 14 (38,9) 22 (61,1) 25 (69,4) 11 (30,6) 25 (69,4) 11 (30,6) MET n p(1 456 0,147 456 1,000 456 0,635 Nega i 423 (92,8) 216 (51,1) 207 (48,9) 325 (76,8) 98 (23,2) 349 (82,5) 74 (17,5) Posi i 33 (6,9) 12 (36,4) 21 (63,6) 26 (78,8) 7 (21,2) 26 (78,8) 7 (21,2) ARID1A jede Exp es- sion s. komple e Ve lus n p(1 415 0,000* 415 0,000 415 0,165 His osco e = 0 (Ve lus ) 45 (10,8) 38 (84,4) 7 (15,6) 43 (95,6) 2 (4,4) 40 (88,9) 5 (11,1) His osco e > 0 370 (89,2) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) ARID1A B/W s. non-B/W n p(1 392 0,075 392 0,215 392 0,093 non-B/W 370 (94,4) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) B/W 22 (5,6) 14 (63,6) 8 (36,4) 19 (86,4) 3 (13,6) 21 (95,5) 1 (4,5) ARID1A Ve lus o. B/W s. Res n p(1 437 0,000* 437 0,000 437 0,027 E gebnisse 30 SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 In ensi ä 3+ p äsen To al His osco e nied- ig (< 120) His osco e hoch (≥ 120) Q123 Q4 ehl p äsen n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) Res 370 (84,7) 157 (42,4) 213 (57,6) 268 (72,4) 102 (27,6) 295 (79,7) 75 (20,3) Ve lus o. B/W 67 (15,3) 52 (77,6) 15 (22,4) 62 (92,5) 5 (7,5) 61 (91,0) 6 (9,0) TP53 His o- sco e Me- dian n p(1 459 0,007 459 0,743 459 0,116 nied ig (His- osco e ≤ 91.5) 230 (50,1) 128 (55,7) 102 (44,3) 177 (77,0) 53 (23,0) 195 (84,8) 35 (15,2) hoch (His o- sco e > 91.5) 229 (49,9) 98 (42,8) 131 (57,2) 173 (75,5) 56 (24,5) 181 (79,0) 48 (21,0) TP53 His o- sco e Qua - ile n p(1 459 0,020 459 0,038 459 0,398 Q1/Q4 229 (49,9) 100 (43,7) 129 (56,3) 165 (72,1) 64 (27,9) 184 (80,3) 45 (19,7) Q2/Q3 230 (50,1) 126 (54,8) 104 (45,2) 185 (80,4) 45 (19,6) 192 (83,5) 38 (16,5) TP53 IHC G oup n p(1 459 0,448 459 0,075 459 1,000 No mal (IHC0 < 90% and IHC3 < 50%) 274 (59,7) 139 (50,7) 135 (49,3) 217 (79,2) 57 (20,8) 224 (81,8) 50 (18,2) Ex em (IHC0 ≥ 90% o. IHC3 ≥ 50%) 185 (40,3) 87 (47,0) 98 (53,0) 133 (71,9) 52 (28,1) 152 (82,2) 33 (17,8) TP53 Mu a- ion n p(1 107 0,153 107 0,240 107 0,445 w o. silen Mu a ion 72 (67,3) 40 (55,6) 32 (44,4) 57 (79,2) 15 (20,8) 59 (81,9) 13 (18,1) Mu a ion 35 (32,7) 14 (40,0) 21 (60,0) 24 (68,6) 11 (31,4) 26 (74,3) 9 (25,7) SMAD4 Cy His osco e Q123/Q4 n p(1 458 0,050 458 0,220 458 0,128 Q123 364 (79,5) 189 (51,9) 175 (48,1) 283 (77,7) 81 (22,3) 305 (83,8) 59 (16,2) Q4 94 (20,5) 38 (40,4) 56 (59,6) 67 (71,3) 27 (28,7) 72 (76,6) 22 (23,4) SMAD4 Nuc HSco e0 n p(1 458 0,707 458 0,824 458 0,220 p äsen 260 (56,8) 131 (50,4) 129 (49,6) 200 (76,9) 60 (23,1) 219 (84,2) 41 (15,8) ehl 198 (43,2) 96 (48,5) 102 (51,5) 150 (75,8) 48 (24,2) 158 (79,8) 40 (20,2) H. pylo i n p(1 396 0,674 396 1,000 396 0,267 Nega i 336 (84,8) 170 (50,6) 166 (49,4) 259 (77,1) 77 (22,9) 275 (81,8) 61 (18,2) Posi i 60 (15,2) 28 (46,7) 32 (53,3) 46 (76,7) 14 (23,3) 53 (88,3) 7 (11,7) EBV-S a us n p(1 453 0,036 453 0,583 453 1,000 Nega i 434 (95,8) 210 (48,4) 224 (51,6) 330 (76,0) 104 (24,0) 356 (82,0) 78 (18,0) Posi i 19 (4,2) 14 (73,7) 5 (26,3) 16 (84,2) 3 (15,8) 16 (84,2) 3 (15,8) MSI S a us n p(1 452 0,000* 452 0,001 452 0,170 MSS 417 (92,3) 194 (46,5) 223 (53,5) 311 (74,6) 106 (25,4) 339 (81,3) 78 (18,7) MSI 35 (7,7) 30 (85,7) 5 (14,3) 34 (97,1) 1 (2,9) 32 (91,4) 3 (8,6) PIK3CA n p(1 461 1,000 461 0,806 461 1,000 Wild yp 437 (94,8) 219 (50,1) 218 (49,9) 336 (76,9) 101 (23,1) 359 (82,2) 78 (17,8) E gebnisse 31 SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 Exp ession im Zellke n SMARCE1 In ensi ä 3+ p äsen To al His osco e nied- ig (< 120) His osco e hoch (≥ 120) Q123 Q4 ehl p äsen n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) mu ie 24 (5,2) 12 (50,0) 12 (50,0) 18 (75,0) 6 (25,0) 20 (83,3) 4 (16,7) KRAS n p(1 461 0,323 461 0,382 461 1,000 Wild yp 444 (96,3) 220 (49,5) 224 (50,5) 339 (76,4) 105 (23,6) 365 (82,2) 79 (17,8) mu ie 17 (3,7) 11 (64,7) 6 (35,3) 15 (88,2) 2 (11,8) 14 (82,4) 3 (17,6) RHOA n p(1 400 0,803 400 0,245 400 0,200 Wild yp 384 (96,0) 178 (46,4) 206 (53,6) 290 (75,5) 94 (24,5) 313 (81,5) 71 (18,5) mu ie 16 (4,0) 8 (50,0) 8 (50,0) 10 (62,5) 6 (37,5) 11 (68,8) 5 (31,3) Jede Mu a- ion n p(1 37 0,515 37 1,000 37 0,713 Wild yp 23 (62,2) 11 (47,8) 12 (52,2) 15 (65,2) 8 (34,8) 17 (73,9) 6 (26,1) Mind. 1 Mu- a ion 14 (37,8) 5 (35,7) 9 (64,3) 10 (71,4) 4 (28,6) 9 (64,3) 5 (35,7) E-Cadhe in n p(1 431 0,127 431 0,197 431 0,062 nega i 317 (73,5) 166 (52,4) 151 (47,6) 248 (78,2) 69 (21,8) 268 (84,5) 49 (15,5) posi i 114 (26,5) 50 (43,9) 64 (56,1) 82 (71,9) 32 (28,1) 87 (76,3) 27 (23,7) ß-Ca enin n p(1 433 0,122 433 0,451 nega i 245 (56,6) 128 (52,2) 117 (47,8) 204 (83,3) 41 (16,7) posi i 188 (43,4) 84 (44,7) 104 (55,3) 151 (80,3) 37 (19,7) O e all Su - i al [Mo- na e] p(3) 456 0,931 456 0,498 456 0,913 To al / E en s / zensie 224/173/51 232/181/51 347/269/78 109/85/24 374/288/86 82/66/16 Median Su - i al 14,0 ± 1,8 15,6 ± 1,4 14,1 ± 1,2 16,7 ± 2,6 14,6 ± 1,1 16,0 ± 4,0 95% C.I. 10,5 – 17,5 12,9 – 18,3 11,7 – 16,4 11,7 – 21,7 12,6 – 16,7 8,2 -23,8 Tumo Spe- ci ic Su i- al [Mona e] p(3) 427 0,610 427 0,320 427 0,471 To al / E en s / zensie 207/142/65 220/147/73 323/221/102 104/68/36 349/238/111 78/51/27 Median Su - i al 14,7 ± 1,9 17.1 ± 1,9 15,5 ± 1,5 19,5 ± 3,3 15,5 ± 1,4 22,2 ± 2,7 95% C.I. 11,0 – 18,3 13,3 – 20,8 12,6 – 18,3 13,1 – 25,9 12,8 – 18,2 16,9 - 27,5 E gebnisse 32 Tabelle 7: S a is ische Auswe ung de Exp ession on SMARCA4 und de Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes (1) Fishe 's exac Tes , (2) Kendall's au Tes , (3) log- ank Tes , die nach angewand e Mul iple-Tes ing-Ko ek u signi- ikan e bliebenen We e wu den mi * ma kie . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56]. SMARCA4 Exp ession im Zellke n SMARCA4 Exp ession im Zellke n Dys egula ion on SMARCE1 und SMARCA4 To al His osco e nied- ig (≤ 175) His osco e hoch (> 175) Q1 Q234 Beide His osco e nied ig Beide His o- sco e hoch n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) n (%) To al 236 231 117 350 148 (31,6) 147 (31,4) Ge- schlech n p(1 467 0,128 467 0,443 295 0,476 Weiblich 179 (38,2) 82 (45,8) 97 (54,2) 41 (22,9) 138 (77,1) 55 (47,4) 61 (52,6) Männlich 289 (61,8) 154 (53,5) 134 (46,5) 76 (26,4) 212 (73,6) 93 (52,0) 86 (48,0) Al e n p(1 467 0,267 467 0,749 295 0,201 < 68 Jah e 237 (50,6) 113 (47,9) 123 (52,1) 61 (25,8) 175 (74,2) 68 (46,3) 79 (53,7) >= 68 Jah e 231 (49,4) 123 (53,2) 108 (46,8) 56 (24,2) 175 (75,8) 80 (54,1) 68 (45,9) Lokalisa- ion n p(1 465 0,369 465 0,731 294 0,526 P oximal 146 (31,3) 79 (54,1) 67 (45,9) 35 (24,0) 111 (76,0) 42 (47,2) 47 (52,8) Dis al 320 (68,7) 157 (49,2) 162 (50,8) 82 (25,7) 237 (74,3) 106 (51,7) 99 (48,3) Lau én Phäno yp n p(1 467 0,031 467 0,179 295 0,210 In es inal 240 (51,3) 134 (56,1) 105 (43,9) 69 (28,9) 170 (71,1) 82 (54,3) 69 (45,7) Di us 148 (31,6) 63 (42,6) 85 (57,4) 30 (20,3) 118 (79,7) 39 (42,9) 52 (57,1) Gemisch 31 (6,6) 12 (38,7) 19 (61,3) 5 (16,1) 26 (83,9) 8 (40,0) 12 (60,0) Unklassi- izie ba 49 (10,5) 27 (55,1) 22 (44,9) 13 (26,5) 36 (73,5) 19 (57,6) 14 (42,4) G ading n p(1 467 0,021 467 0,377 295 0,266 G1 / G2 110 (23,5) 66 (60,6) 43 (39,4) 31 (28,4) 78 (71,6) 38 (56,7) 29 (43,3) G3 / G4 358 (76,5) 170 (47,5) 188 (52,5) 86 (24,0) 272 (76,0) 110 (48,2) 118 (51,8) T n p(1 467 0,434 467 0,592 295 0,878 T1a / T1b 58 (12,4) 25 (43,9) 32 (56,1) 15 (26,3) 42 (73,7) 14 (42,4) 19 (57,6) T2 53 (11,3) 34 (64,2) 19 (35,8) 13 (24,5) 40 (75,5) 21 (67,7) 10 (32,3) T3 185 (39,5) 95 (51,4) 90 (48,6) 49 (26,5) 136 (73,5) 59 (47,6) 65 (52,4) T4a / T4b 172 (36,8) 82 (47,7) 90 (52,3) 40 (23,3) 132 (76,7) 54 (50,5) 53 (49,5) N n p(1 466 0,153 466 0,144 294 0,349 N0 134 (28,6) 76 (56,7) 58 (43,3) 38 (28,4) 96 (71,6) 46 (56,1) 36 (43,9) N1 64 (13,7) 28 (43,8) 36 (56,3) 18 (28,1) 46 (71,9) 17 (40,5) 25 (59,5) N2 84 (18,0) 45 (54,2) 38 (45,8) 21 (25,3) 62 (74,7) 31 (56,4) 24 (43,6) N3a/b 185 (39,6) 87 (47,0) 98 (53,0) 40 (21,6) 145 (78,4) 54 (47,0) 61 (53,0) M n p(1 467 0,348 467 0,417 295 1,000 M0 378 (80,8) 195 (51,7) 182 (48,3) 98 (26,0) 279 (74,0) 118 (50,0) 118 (50,0) M1 90 (19,2) 41 (45,6) 49 (54,4) 19 (21,1) 71 (78,9) 30 (50,8) 29 (49,2) UICC-S a- dium n p(1 466 0,208 466 0,173 294 0,731 E gebnisse 39 Tabelle 8: Ve gleich SMARCE1 und HER2 IHC und CISH Au ge üh is de jeweilige His osco e des un e such en Falls, welche die Ausp ägung de Exp ession on SMARCE1 wiede geben soll. Sowie die Ausp ägung de Exp ession on HER2 in de Immunhis ochemie, und die Ampli ika ion on HER2 in de CISH, welche in eine o angegangenen S udie des Ins i u s ü Pa hologie am UKSH Kiel un e such wu den [57].Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] N . SMARCE1 His osco e HER2 Immunhis o- chemie HER2 Ampli i- ka ion Beme kung Komple e Übe eins immung 31 280 2+ + 25 255 3+ X HER2 Ampli ika ion nich bewe ba . 26 250 3+ + 17 230 3+ + 18 220 3+ + 34 215 3+ + 30 185 3+ + 32 185 2+ + 8 175 3+ + 4 165 3+ + 5 160 3+ + 13 160 2+ + 9 140 3+ + 24 140 3+ X HER2 Ampli ika ion nich bewe ba . 1 130 3+ + 6 110 2+ + 27 105 3+ + 14 95 3+ + 15 85 3+ + 2 50 3+ + Pa ielle Übe eins immung 11 230 3+ + Pa ielle Übe eins immung. SMARCE1 und HER2 posi- i e Tumo a eale s immen übe ein. Es zeig sich jedoch ein s a k posi i es A eal ü SMARCE1, welches HER2 nega i is . 12 190 3+ + Die Exp ession on HER2 is he e ogen. HER2 posi i e A eale sind s a k SMARCE1 posi i . 33 180 3+ + Die Exp ession on HER2 is he e ogen. Die Exp es- sion on SMARCE1 is wei e b ei e , zeig jedoch keine Va ia ion. 7 170 3+ + De G oß eil des Tumo s is muzinös. Übe eins im- mung nu im nich muzinösen Tumo an eil. De muzi- nöse Tumo an eil is komple HER2 nega i abe SMARCE1 posi i . 19 115 3+ + Die Exp ession on HER2 is he e ogen. HER2 posi i e A eale sind s a k SMARCE1 posi i . 28 110 2+ + Pa ielle Übe eins immung. SMARCE1 und HER2 posi- i e Tumo a eale s immen übe ein. Es zeig sich jedoch ein s a k posi i es A eal ü SMARCE1, welches HER2 nega i is . 29 85 3+ X HER2 nega i e Tumo a eale sind eilweise SMARCE1 posi i . HER2 Ampli ika ion nich bewe ba . E gebnisse 40 N . SMARCE1 His osco e HER2 Immunhis o- chemie HER2 Ampli i- ka ion Beme kung 21 75 3+ + Die Exp ession on HER2 is he e ogen. HER2 posi i e A eale sind s a k SMARCE1 posi i . Keine Übe eins immung 35 170 3+ X HER2 posi i e und SMARCE1 posi i e A eale sind un- e schiedlich e eil . HER2 Ampli ika ion nich bewe - ba . 16 165 3+ X G oß lächig HER2 posi i e A eale sind SMARCE1 ne- ga i . HER2 Ampli ika ion nich bewe ba . 23 120 2+ + Das kleine HER2 posi i e A eal is komple SMARCE1 nega i . G oße SMARCE1 posi i e A eale sind HER2 nega i . 22 105 3+ + De g oße HER2 posi i e Be eich is in de SMARCE1 Fä bung nich o handen. De kleine HER2 posi i e Be- eich, welche in de SMARCE1 Fä bung en hal en is , is SMARCE1 nega i . G oße SMARCE1 posi i e A e- ale sind HER2 nega i . 20 70 3+ X Die HER2 posi i en A eale sind zum Teil SMARCE1 posi i und nega i . HER2 Ampli ika ion nich bewe ba . 36 50 3+ + SMARCE1 is g öß en eils nega i (His osco e 50!). Die posi i en A eale ü HER2 und SMARCE1 sind un e - schiedlich e eil . 3 1 3+ + Das kleine HER2 posi i e A eal is komple SMARCE1 nega i (His osco e 1!). 10 / Kein Gewebe ü SMARCE1 Immunhis ochemie o - handen. 37 100 Das HER2 posi i e A eal is in de Fä bung ü SMARCE1 au G und eine ande en Tumo ebene nich o handen. 4.4 Ampli ika ion on SMARCE1 in de ddPCR Die Analyse de Ampli ika ion mi Hil e de ddPCR e gab eine Ampli ika ion on SMARCE1 in 4 on 34 Fällen. Dabei wu den Fälle mi eine CNV (Copy-Numbe -Va i- a ion) > 3 als ampli izie gewe e . Die G öße de CNV eich e dabei on 3,99 (e s e ddPCR) /3,81(zwei e ddPCR) bis 20/19,3 (siehe Tabelle 9). In 3 Fällen lag nich aus- eichend Ma e ial ü eine zwei e ddPCR o [56]. 4.5 Ampli ika ion on SMARCE1 und ERBB2 Die du chge üh e ddPCR zeig e in 4 on 34 un e such en Fällen eine Ampli ika ion on SMARCE1. Bei d ei on diesen Fällen wa zu o schon au eine Ampli ika ion on ERBB2 un e such und als ampli izie klassi izie wo den [57]. Dami konn e in 3 on 4 (75%) Fällen eine Ko-Ampli ika ion on SMARCE1 und ERBB2 nachgewiesen we - den. In einem Fall lag zwa eine Ampli ika ion on ERBB2 o , es konn e jedoch keine E gebnisse 41 Ampli ika ion on SMARCE1 ge unden we den. Die olgende Tabelle 3.6 s ell die E - gebnisse de Ampli ika ionsanalyse on SMARCE1 in Gänze da [56]. Tabelle 9: Ampli ika ionsanalyse on SMARCE1 du ch ddPCR Angegeben sind die G öße de Tumo a eale in de jeweiligen in de Immunhis ochemie nachgewie- sene Exp essionsin ensi ä on SMARCE1, die We e de CNV aus de e s en und zwei en ddPCR mi de zugehö igen abschließenden Bewe ung sowie die Da en des S udienkollek i s zum Ampli ika i- onss a us on HER2 aus CISH-Un e suchungen o angegangene S udien des Ins i u s ü Pa hologie am UKSH Kiel [57]. In 3 Fällen lag kein Ma e ial ü eine zwei e ddPCR o : n.a. = nich anwendba . Teile diese Tabelle wu den be ei s publizie © P ies e al. Cance Medicine published by John Wiley & Sons L d. [56] N . SMARCE1 In ensi ä 0 %-A eal SMARCE1 In ensi ä 1+ %-A eal SMARCE1 In ensi ä 2+ %-A eal SMARCE1 In ensi ä 3+ %-A ea SMARCE1 His osco e CNV SMARCE1 e s e ddPCR CNV SMARCE1 zwei e ddPCR SMARCE1 Ampli ika ion ERBB2 Ampli ika ion Po en iell ampli izie e Fälle mi hohe SMARCE1 Exp ession 1 0 30 10 60 230 2,33 2,48 - - 2 0 10 10 80 270 3,99 3,81 + - 3 0 10 0 90 280 2,08 2,39 - - 4 0 0 70 30 230 2,08 2,08 - - 5 0 10 50 40 230 20,00 19,30 + + 6 0 15 65 20 205 2,56 2,59 - - 7 0 20 10 70 250 10,4 11,40 + + 8 0 0 80 20 220 2,29 2,36 - - 9 0 5 35 60 255 2,29 2,51 - - 10 5 40 35 20 170 2,77 2,85 - - 11 10 0 70 20 200 2,19 2,20 - - 12 0 5 10 85 280 8,82 9,6 + + 13 0 5 70 25 220 2,31 2,21 - - 14 0 0 30 70 270 1,89 1,94 - - 15 0 0 60 40 240 2,06 n.a. - - 16 0 20 50 30 210 2,03 2,27 - - Po en iell nich ampli izie e Fälle mi nied ige SMARCE1 Exp ession 17 95 5 0 0 5 2,42 2,59 - - 18 95 5 0 0 5 2,24 2,90 - - 19 95 5 0 0 5 2,01 2,37 - - 20 95 5 0 0 5 2,23 2,53 - - E gebnisse 42 21 0 10 90 0 190 2,83 2,83 - - 22 5 0 95 0 190 2,21 n.a. - + 23 0 5 90 5 200 2,28 2,44 - - 24 1 5 90 4 197 2,3 2,38 - - 25 0 10 90 0 190 2,84 3,14 - - 26 0 0 90 10 210 2,35 2,48 - - 27 0 10 89 1 191 2,55 2,31 - - 28 0 0 95 5 205 2,31 2,24 - - 29 0 5 93 2 197 2,26 n.a. - - 30 0 5 95 0 195 2,6 2,57 - - 31 0 0 95 5 205 1,91 1,95 - - 32 0 10 85 5 195 3 3,30 - - 33 5 5 80 10 195 2,55 2,42 - - 34 0 10 85 5 195 2,59 2,42 - - Diskussion 43 5 Diskussion De SWI-/SNF-Komplex is als Ch oma in-Remodelle in de Lage, epigene ische Ve - ände ungen zu e mi eln. Dies bie e Raum ü neue Möglichkei en in de zukün igen Medizin, speziell in de Diagnos ik und The apie on K ebspa ien en. Dennoch is de po en ielle Ein luss eine Dys egula ion dieses Komplexes wei es gehend unbekann , so auch in Bezug au das Magenka zinom. Zu einigen Un e einhei en des SWI-/SNF- Komplexes gab es in de Ve gangenhei be ei s einzelne S udien, welche jedoch haup sächlich aus dem asia ischen Raum s amm en. Dies is zunächs nach ollzieh- ba , is hie doch die Inzidenz ü Magenka zinome im wel wei en Ve gleich am höchs- en [1]. Dennoch is nich kla , ob sich die E gebnisse auch au die Wel be ölke ung übe agen lassen. So gib es doch zahl eiche Umwel ein lüsse, die zu En s ehung eines Magenka zinoms bei agen können. Un e ande em gel en die E näh ungsge- wohnhei en, welche sich abhängig on de jeweiligen Kul u s a k un e scheiden kön- nen, als Ein luss ak o in de Ä iopa hogenese (siehe Kapi el 1.1.2 „Ä iopa hoge- nese“)[14, 15, 18–20, 22, 23]. Eine kü zlich e schienene S udie konn e zeigen, dass eine hohe Exp ession on SMARCE1 zu eine schlech e en P ognose üh e und die Me as asie ung o an ieb [53]. Die ak uelle S udienlage zum Ein luss de Un e einhei SMARCA4 au die Tumo biologie is ambi alen . Einige kommen zu dem E gebnis, eine hohe Exp ession sei mi einem o angesch i enen Tumo s adium und eine schlech e en P ognose assoziie [45, 67], ande e weisen au eine Funk ion als Tu- mo supp esso hin [42, 47]. In diese S udie wu de eine unabhängige Koho e on wes lichen Magenka zinomen au den po enziellen umo biologischen Ein luss bezüg- lich de Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 sowie die Exp essionsmus e selbs und Zusammenhänge mi wich igen gene ischen Cha ak e is ika wie Mik osa - eli ens abili ä , un e such [56]. 5.1 Me hodische Diskussion Zum Nachweis on SMARCA4 und SMARCE1 au P o einebene wu de die Immunhis- ochemie gewähl . Die Immunhis ochemie gil als gängiges und e lässliches Ve ah- en zu Da s ellung de Exp ession spezi ische Genp oduk e. Nach wiede hol en Fä - bungen zu E ablie ung de An ikö pe e gab de An ikö pe zu SMARCA4-Fä bung die bes en E gebnisse in de Ve dünnung 1:400 mi EDTA als Pu e . Fü SMARCE1 Diskussion 44 wu de die Fä bung mi eine Ve dünnung des An ikö pe s in 1:300 mi EDTA als Pu e e ablie . Die Fä bungen mi Ci a e gaben zwa eben alls gu e E gebnisse, jedoch muss e dazu eine ge inge e Ve dünnung de An ikö pe genu z we den, welches ei- nen höhe en Ve b auch an An ikö pe insgesam bedeu e hä e. Aus diesen G ünden en schied ich mich, bei gleichwe igem E gebnis ü eine Fä bung mi EDTA als Pu e . Als in e ne Kon olle des Fä bee olgs on SMARCA4 und SMARCE1 wu den das nich neoplas ische Epi hel sowie Lymphozy en ü SMARCE1 genu z . Die Fä bung selbs e olg e au oma isie , sodass Schwankungen in de Du ch üh ung du ch die du ch üh ende Pe son auszuschließen sind. Die Ve dünnung des jeweilig genu z en An ikö pe s e olg e jedoch händisch, hie sind ge inge Inkonsis enzen denkba . Zu Auswe ung de immunhis ochemischen Fä bung on SMARCA4 und SMARCE1 wu de de His osco e genu z , welche au eine indi iduellen Einschä zung des Un- e suche s zu In ensi ä und an eilige G öße de Tumo a eale be uh . Um eine Be- s ändigkei in de Einschä zung de In ensi ä en zu gewäh leis en, wu den o ab Ve - gleichs älle ausgewähl und wäh end de Auswe ung hinzugezogen. Dennoch be uh die Angabe des An eils eine In ensi ä inne halb des abgebilde en Tumo gewebes au Schä zungen und kann on de exak en, nich bes immba en P ozen zahl abweichen. Es wi d da on ausgegangen, dass sich Ungenauigkei en beim Schä zen du ch ebenso o o kommendes Übe - wie Un e schä zen desselben Un e suche s ausgleichen. Die Auswe ung de immunhis ochemischen Fä bungen mi Hil e des His osco es wu den dahe nu du ch einen Un e suche du chge üh . Die so un e such en Fälle wu den e s nach Abschluss de Auswe ung anhand des Medians dicho omie und in Qua ile einge eil , um eine Beein lussung de E gebnisse du ch die Auswe ung de IHC selbs zu e hinde n. Zu Auswe ung eine po en iellen Ko-Exp ession on SMARCE1 und He 2/neu wu de beim immunhis ochemischen Ve gleich sowie beim Ve gleich mi de CISH da au ge- ach e , dass die jeweilige genu z e Tumo ebene inne halb eines Falls dieselbe wa ode zumindes an eilig mi e ass , um alsch nega i e E gebnisse du ch in a umo ale He e ogeni ä und S ichp oben ehle auszuschließen ode wenigs ens zu eduzie en. Fü die Analyse de Ampli ika ion on SMARCE1 kam die ddPCR zu Anwendung, da es keine komme ziellen Sonden ü eine in si u-Hyb idisie ung gab. Die ddPCR bie e im Ve gleich zu he kömmlichen PCR-Ve ah en wie de qPCR (Real-Time PCR) iele Diskussion 45 Vo eile. Dazu zähl die g öße e Tole anz gegenübe mi de DNA ko-isolie en Inhibi- o en, welche besonde s g oßen Ein luss bei de Ampli ika ionsanalyse ha . Die ko- isolie en Inhibi o en üh en bei eine qPCR zu eine Ve inge ung de E izienz de PCR und einem e höh en Cq-We (Schwellenwe , ab wie iel Zyklen in de PCR eine P obe ein posi i es Signal e gib ). In olgedessen wi d eine ge inge e Kopienzahl ge- messen als die eigen liche du ch die Ausgangsmenge e eich e. Bei de ddPCR g ei- en gleich zwei Mechanismen, welche diesem E ek en gegenwi ken. Zum einen we - den bei de ddPCR posi i e und nega i e Signale im Ve häl nis zueinande ausgewe - e , sodass de Ein luss de Inhibi o en e s dann sich ba wi d, wenn du ch die Inhibi- o en ein posi i es Signal als nega i es Signal gewe e wi d. Zum ande en we den die P oben zu Du ch üh ung de ddPCR s a k e dünn , sodass auch die Inhibi o en s a k e dünn we den [68]. Dadu ch geling mi Hil e de ddPCR eine wesen lich sensi i e e und genaue e Analyse de Kopienzahl des gesuch en DNA-Abschni s und dami eine besse e Ampli ika ionsanalyse. 5.2 Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 In a umo ale He e ogeni ä konn e be ei s ü iele Bioma ke n nachgewiesen we den [36, 57, 61, 69]. Die meis en de in diese S udie eingeschlossenen Fälle zeig en ein di us e eil es Exp essionsmus e un e schiedliche Fä bein ensi ä en inne halb ei- nes Tumo s ü sowohl SMARCA4 als auch SMARCE1. Dieses Mus e , welches als „g ey-scale“ bezeichne wi d und sich au ineinande übe gehende Fä bein ensi ä en bezieh (siehe Abb. 2), wu de in 95,2 % (446 Fälle) alle ü SMARCA4 ge ä b en Fälle ge unden. 98,9 % (463 Fälle) de ü SMARCE1 ge ä b en Magenka zinome zeig en eben alls ein Exp essionsmus e in G aus u en. In 5 (1 %) Fällen konn e ein komple e Ve lus de Exp ession on SMARCA4 nachgewiesen we den. Ein komple e Ve lus de Exp ession on SMARCE1 wu de nu in einem Fall beobach e (0,2 %). Ein pa i- elle Ve lus de Exp ession, welche sich als „black-and-whi e“ Mus e in de Fä bung zeig e (siehe Abb. 2), konn e ü SMARCA4 in 16 (3 %) Fällen nachgewiesen we den, ü SMARCE1 in 3 (0,6 %) Fällen. Diese E gebnisse üh en zu dem Schluss, dass die Einschä zung des Ve lus s de Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 in kleinen Gewebep oben wie z. B. Biopsien (Tumo s anzen) ode Tissue Mic o A ay Un e su- chungen (TMA) an ällig ü S ichp oben ehle is [56]. Diskussion 46 Dami konn e die Hypo hese, dass SMARCA4 und SMARCE1 im Magenka zinom un- e schiedliche A en de Exp ession sowie in a umo ale He e ogeni ä zeigen, bes ä- ig we den. SMARCA4 und SMARCE1 zählen zu den Un e einhei en des SWI-/SNF-Komplexes [42]. Die e hobenen Da en weisen au eine Ko ela ion de Exp ession on SMARCA4 mi SMARCE1 und umgekeh hin. Eine nied ige Exp ession on SMARCA4 ko elie e signi ikan mi eine nied igen Exp ession on SMARCE1 (p <0,001, siehe Tabelle 7). Dies allein e laub jedoch noch keinen Schluss zu Dys egula ion de Un e einhei en. Schließlich wi d ü SMARCE1 eine hohe Exp ession als dys egulie angenommen, wäh end ü SMARCA4 ein Ve lus de Exp ession on Rele anz zu sein schein [53, 70, 71]. Es e anschaulich jedoch, dass die Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes komplex is und e mu lich meh als eine einzelne Un e einhei da an be eilig is . Diese Annahme wi d du ch zusä zliche Da en de Un e suchung ges ü z , so konn e ein signi ikan e Zusammenhang zwischen de Exp ession on sowohl SMARCA4 als auch SMARCE1 mi ARID1A es ges ell we den, welches eine wei e e Un e einhei des SWI/SNF-Komplexes da s ell [42]. In ühe en S udien des Ins i u s ü Pa hologie des UKSH Kiel wu de be ei s de Nachweis in a umo ale He e ogeni ä on ARID1A e b ach . Des Wei e en wu de in de S udie zu ARID1A ein Zusammenhang zwischen dem Ve lus on ARID1A mi eine e höh en Exp ession on PD-L1 sowie mi dem EBV- und Mik osa eli ens a us es ges ell , welche unabhängig on de p ozen ual om Ve lus be o enen Tumo läche bes and [65, 72]. Schließlich könn en einzelne Be eiche eines Tumo s on eine biologisch ele an en Dys egula ion des SWI-SNF- Komplexes be o en sein, welche z.B. du ch inak i ie ende Mu a ionen on ARID1A [43] e mi el wi d und wei e e Un e einhei en des SWI-SNF-Komplexes be e en kann. Dies komplizie das Ve s ändnis des Zusammenhangs mi dem Pa ien enübe - leben. So konn e, einzeln ü SMARCA4 und SMARCE1 be ach e , kein Zusammen- hang mi dem Pa ien enübe leben nachgewiesen we den (siehe Abb. 3 - 6) [56]. 5.3 SMARCA4, SMARCE1 und ande e umo biologische Eigen- scha en In diese S udie wu de de Zusammenhang on SMARCA4 und SMARCE1 mi kli- nisch-pa hologischen Pa ien encha ak e is ika un e such . Ein bekann e Bioma ke Diskussion 47 bei Tumo en is TP53, welche als Tumo supp esso häu ig in e schiedenen Ka zino- men mu ie o lieg . Zu diesen Ka zinomen zähl auch das Magenka zinom [32, 73]. Dabei is TP53 nich in allen Magenka zinomen gleich häu ig mu ie . Es konn e in de Ve gangenhei gezeig we den, dass Mu a ionen on TP53 zwa nu sel en bei EBV- posi i en Magenka zinomen o kommen, jedoch o bei ch omosomal ins abilen (CIN) Magenka zinomen nachgewiesen we den können [32, 73]. Ve gleichba mi dem SWI- SNF-Komplex e häl sich p53 als T ansk ip ions-Ak i a o in einem komplexen Ne z- we k aus Genen, dessen P oduk e eine Rolle in e schiedenen Signal-T ansduk ions- wegen einnehmen [74]. Ich konn e zeigen, dass eine nied ige Exp ession on SMARCA4 mi eine nied igen Exp ession on p53 im Magenka zinom assoziie is . Diesen Zusammenhang konn e ich eben alls ü SMARCE1 und p53 nachweisen. Diese E gebnisse üh en zu de Annahme, dass die Dys egula ion des SWI-/SNF- Komplexes . a. in CIN-Magenka zinomen au i [56]. Eine in eg a i e, genomische Analyse des Cance Genome A las Resea ch Ne zwe ks schläg zu Ein eilung on Pa ien en und Ve suchen zu „ a ge ed he apies“ die Un e - scheidung on Magenka zinomen in ie Sub ypen o : EBV-, MSI- (Mik osa eli en- ins abil), CIN- und genomisch s abilen Magenka zinomen o [32]. „Ta ge ed he a- pies“ sind mode ne und zielge ich e e The apien in de Behandlung on K ebs. Dabei we den geziel Eigenscha en des jeweiligen Ka zinoms als Ang i spunk e in de The- apie genu z [75]. E gänzend zudem genann en Zusammenhang on SMARCA4 und SMARCE1 mi TP53 konn e auße dem eine in e se Ko ela ion de Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 mi MSI nachgewiesen we den. Eben alls zeichne e sich eine Tendenz eines in e sen Zusammenhangs de Exp ession on SMARCE1 und einem posi i em EBV-S a us bei Magenka zinomen ab. Dies un e s ü z die zu o ge- mach e Annahme, dass eine Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes . a. CIN-Ma- genka zinome be i und wenige MSI- ode EBV-posi i e Magenka zinome [56]. Die E gebnisse bishe du chge üh e S udien zu SMARCA4 und SMARCE1 ließen einen Ein luss beide au den TNM-S a us sowie das Pa ien enübe leben auch beim Magenka zinom e mu en [53, 67]. Dennoch konn en wi keinen Zusammenhang zwi- schen de Exp ession on SMARCA4 und SMARCE1 mi dem TNM-S a us ode dem Pa ien enübe leben, wede im Gesam übe leben noch im umo spezi ischen Übe le- ben, inden. SMARCA4 schein in bishe igen S udien als mögliche Tumo supp esso in E scheinung zu e en [70, 71], o z dessen konn e in diese Un e suchung keine Diskussion 48 Ko ela ion zwischen eine nied igen Exp ession ode dem komple en Ve lus de Ex- p ession und dem TNM-S a us, dem Gesam - ode umo spezi ischen Übe leben nachgewiesen we den. In den o ausgegangenen S udien, welche zu dem Schluss kamen, dass die Dys egula ion de Un e einhei en einen Ein luss au die P ognose on Pa ien en habe, wu den haup sächlich Pa ien enkoho en asia ische He kun als G undlage genommen [53, 67]. Im Gegensa z dazu, wu de als G undlage diese S u- die ein Pa ien enkollek i kaukasische He kun genu z . Da aus läss sich ablei en, dass ein Un e schied zwischen Pa ien en kaukasische und asia ische He kun be- s ehen könn e. Dies un e s ü z den Ansa z eine Un e scheidung zwischen asia i- schen und nich asia ischen Magenka zinomen in de The apieplanung, da sich zu- nehmend de Ve dach e hä e , dass die e hnische He kun des Pa ien en einen Ein- luss au die P ognose ha [33, 56]. Zusä zlich zu dem Ein luss de einzelnen Un e einhei en SMARCA4 und SMARCE1 au die Tumo biologie des Magenka zinoms wu de in diese S udie de Zusammen- hang eine Dys egula ion des SWI-/SNF-Komplexes mi den klinisch-pa hologischen Pa ien encha ak e is ika un e such . Die Dys egula ion wu de dabei als hohe Exp es- sion on sowohl SMARCA4 und SMARCE1 ode nied ige Exp ession diese beiden Un e einhei en de inie . Ähnlich zu den bishe igen E gebnissen konn e auch hie ein Zusammenhang mi dem p53- und Mik osa eli ens a us sowie dem ARID1A-S a us beobach e we den. Wie zu o e wähn , handel es sich bei ARID1A um eine wei e e Un e einhei des SWI-/SNF-Komplexes [42], welche den gleichen Zusammenhang mi dem Mik osa eli ens a us zeig [65, 70], wie in diese S udie ü SMARCA4 und SMARCE1 beleg . Dies zeig e neu wie komplex sich die Dys egula ion des SWI- /SNF-Komplexes ges al e [56]. Kü zlich e schienene S udien zu SMARCA4 e gaben eine Be eiligung on SMARCA4 in de E-Cadhe in abhängigen Induk ion de Epi helial-Mesenchymalen T ansi ion (EMT), welche zu eine o sch ei enden Me as asie ung üh [76, 77]. Die E gebnisse diese Un e suchung konn en keinen Zusammenhang zwischen de Exp ession on SMARCA4 und dem E-Cadhe in S a us bes ä igen sowie zu o be ei s genann auch keinen Zusammenhang zum TNM-S a us, welche die Ausb ei ung de Me as asie ung abbilde [56]. Li e a u e zeichnis 55 32. The Cance Genome A las Resea ch Ne wo k (2014) Comp ehensi e molecula cha ac e iza ion o gas ic adenoca cinoma. Na u e 513(7517):202–209. doi: 10.1038/na u e13480 33. Wi ekind C (2017) Tnm: Klassi ika ion Maligne Tumo en. John Wiley & Sons, In- co po a ed, Weinheim, GERMANY 34. B ie ley JD, Gospoda owicz MK, Wi ekind C (2017) TNM Classi ica ion o Malig- nan Tumou s. John Wiley & Sons, Inco po a ed, Chices e , UNITED KINGDOM 35. Picci illo JF, Vlahio is A, Ba e LB e al. (2008) The changing p e alence o como bidi y ac oss he age spec um. C i Re Oncol Hema ol 67(2):124–132. doi: 10.1016/j.c i e onc.2008.01.013 36. 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P o esso Röcken bo mi die Möglichkei , mich an de Themen indung zu be eiligen und e möglich e mi Zugang zu allen Räumlichkei en und Ma e ialen, die ü die Umse zung diese A bei on Nö en wa en. Sein eno mes En- gagemen sowie die ausgezeichne e Be euung hal en mi wäh end des gesam en P ozesses. Besonde e Dank gil auße dem den Mi a bei e n und Mi a bei e innen des Immunla- bo s und des molekula pa hologischen Labo s. Das Team un e s ü ze mich in de p ak ischen Umse zung alle Gewebe ä bungen und de Be ei s ellung, de da ü be- nö ig en Ma e ialien. Insbesonde e wäh end des eingesch änk en Zugangs zu den La- bo en au G und de Co onapandemie wa das Team mi eine g oße Hil e, da ü bin ich auße o den lich dankba . Ge ne möch e ich mich auch he zlich bei He n D . med. S e en Heckl bedanken, welche mich spon an in de Du ch üh ung de ddPCR un e - s ü z e. Eben alls bedanke ich mich bei He n Dipl.-Phys. Hans-Michael Beh ens und F au Sand a K üge . Ich danke F au Fee Anschei , die mich sei Kindhei s agen als enge F eundin und Schwes e , die ich nie ha e, beglei e . Mein Dank gebüh auße dem F au Lea Klie, ü die achlichen und mo i ie ende Gesp äche wäh end de A bei an unse en Dok- o a bei en. Schließlich möch e ich mich bei meine Familie bedanken. Ich danke meine Schwä- ge in Lisa P ies, die diese Disse a ion so o Ko ek u las, bis sie sie auswendig konn e. Abe o allem danke ich meinem Ehemann Eike P ies, de mi jeden Tag zu Sei e s and, alle meine Launen aushiel und mi imme wiede die K a zum Wei e - machen gab. E klä ung 62 D E klä ung Hie mi e klä e ich, Ka ha ina P ies, dass ich die o liegende A bei selbs s ändig an- ge e ig habe. Es wu den nu die in de A bei ausd ücklich benann en Quellen und Hil smi el benu z . Wö lich ode sinngemäß übe nommenes Gedankengu habe ich als solches kenn lich gemach .