Distribución de las resistencia de origen plasmídico a antibióticos β-lactámicos en enterobacterias

DEP ART AMENTO DE MEDICINA PREVENTIVA y SOCIAL, HIGIENE Y SANIDAD AMBIENTAL. DISTRIBUCION DE LAS RESISTENCIAS DE ORIGEN PLASMIDICO A ANTIBIOTICOS f3 -LACT AMICOS EN ENTEROBACTERIAS. A. Maris� Larrubia, M. Espigares García, J. A. Pérez López, A. Cueto Espinar y D. Jurado Chacón. RESUMEN Se estudia la presencia de f3 -lactamasas en las entero bacterias que se ais lan en el Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Granada. Se detectaron tres tipos de enzimas, TEM (71,72 OJo), SHV (12,04 OJo) y OXA (16,23 OJo), cuyas proporciones relativas coinciden con las obtenidas por otros autores. El interés epidemiológico de la detección de f3 -lactamasas se discute en el último apartado de este trabajo. SUMMARY Enterobacteriaceas strains isolated in the Mycrobiology Department of the Universitary Hospital in Granade (Spain) containing f3 -lactamases deter minated by plasmids R were studied. Three types of these enzymes, TEM (71,72 OJo), SHV (12,04 OJo) and OXA (16,23 OJo), has been identified and theirs relatives percentages were similar to the other workers. Epidemiological inte rest of the f3 -lactamases clasifications are discussed in the last part o this arti ele. INTRODUCCION La determinación de los mecanismos bioquímicos de la resistencia bacte riana a los antibióticos proporciona datos mucho más objetivos sobre el esta do de las resistencias que los aportados por el antibiograma (1). Además, la movilidad del material genético, pIásmidos, transposones e incluso del ADN cromosómico, hacen necesario buscar nuevos métodos en el estudio de las re sistencias que proporcionen un mayor interés clínico y utilidad con fines epi demiológicos (2 y 3). Ars Phurmuceuticu. Tomo XXVIII. Núm. 1, 1987 78 ARS PHARMACEUTICA En este trabajo se analiza la presencia de {3 -lactamasas de origen plasmí dico en una muestra representativa de las entero bacterias aisladas en el Hospi tal Universitario de Granada. La identificación de las {3 -lactamasas presentes en estas cepas proporciona no solamente un dato de interés clínico al predecir un mayor número de resistencias que el antibiograma, sino que permite ade más conocer más estrechamente los mecanismos responsables del manteni miento de las resistencias en nuestro hospital. MATERIAL Y METODOS Microorganismos. Sobre un conjunto de 695 cepas de enterobacterias ais ladas durante el período de nuestro estudio, se seleccionaron 177 por presen tar resistencia a antibióticos en el cual se incluyeran al menos la resistencia a algún {3-lactámico. El período de estudio fue de un año y las cepas estudiadas se recogieron un único día de cada semana en el intervalo citado. Se pretendía de esta forma que la muestra elegida de manera aleatoria fuera representativa de la población de entero bacterias existentes en nuestro estudio. Sensibilidad a antibióticos. El patrón de resistencias de cada cepa se de terminó por el método del antibiograma disco-placa utilizando agar Mueller Hinton (Oxoid) y un inóculo de 107-108 ufc/ml (4). Los discos de antibióticos utilizados procedentes de la firma BBL fueron los siguientes: ampicilina, car benicilina, cefaloridina, cefalotina, cefamandol, cefoxitina, cloxacilina y me ticilina. Técnicas genéticas. La determinación del origen genético de las resisten cias a {3-lactámicos se efectuó en primera instancia mediante transferencia del material genético por conjugación de cada una de las cepas aisladas con la ce pa receptora Eschericha coli K12 162 na/o En caso de no obtenerse conjugan tes, esta transferencia de material genético se efectuó mediante transforma ción, aislando el ADN plasmídico según se ha descrito previamente (5) y utili zando como cepa receptora Escherichia coli HB101. Las técnicas de conjuga ción y transformación se realizaron siguiendo métodos ya descritos (6). Los antibióticos utilizados en el aislamiento de transconjugantes y transformantes en las placas selectoras fueron: ampicilina (30 Il g/mI), Carbenicilina (125 Il g/mI), cefalosporina C (30 Il g/mI) y cefamandol (10 Il g/mI), obtenidos de Sigma. En la conjugación se añadió además a cada placa selectora ácido nali díxico (250 Il g/mI) de Sterwing Española. Técnicas enzimáticas. La identificación de las {3 -lactamasas presentes en las cepas resistentes se realizó a partir de extractos celulares utilizando una téc nica biológica basada en la utilización de diversos inhibidores de {3 -lactamasas, concretamente p-cloromercuribenzoato 0,5 mM, CINa 100 mM y Cloxacilina 0,1 mM. (7). Para la obtención de los extractos celulares se utilizó un Sonicator Cell Disrruptor W-375 a 100 W en impulsos de 50 OJo de segundo durante 4,5 minutos. ARS PHARMACEUTICA 79 RESULTADOS En la tabla I se indica la totalidad de microorganismos aislados en nues tro período de estudio. De las 695 aislados, 177 cepas (25,46 OJo) presentaron resistencia a algún antibiótico de tipo f3 -lactámico. Como se indica en la tabla 11, la distribución de estas resistencias fue de 171 (96,61 OJo) cepas resistentes a algún tipo de penicilinas y 39 (22,03 OJo) resistentes a alguna de las celalospori nas ensayadas, si bien 33 de estas fueron resistentes simultáneamente a penici linas. La presencia de f3 -lactamasas determinadas por plásmidos se detectó en 163 cepás de las 177 aisladas resistentes a f3 -lactámicos. El tipo de enzima y el número de cepas en que se identificaron, bien de forma individual o con más de una enzima por cepa se expresa en la tabla 111. La. (3 -lacta masa más fre cuente fue del tipo TEM detectadas en 137 cepas, enzimas de tipo OXA se pre sentaron en 31 cepas y de tipo SHV en 23. La distribución de f3-1actamasas se gún el microorganismo de origen se indica en la tabla IV así como por porcen tajes relativos de cada uno de ellos. TABLA 1. Microorganismos aislados Especie cepas OJo E. coli 264 37,9 K. pneumoniae 113 16,3 P. mirabilis 92 13,2 E. c/oacae 33 4,7 S. marcescens 32 4,6 Salmonella sp. 28 4,0 E. aerogenes 25 3,6 Shigella sp. 19 2,7 Citrobacter sp. 18 2,6 M. morganii 18 2,6 P. rettgeri 13 1,9 E. alkalescens 12 1,7 P. vulgaris 12 1,7 E. coli intermedio 11 1,6 K. oxytoca 5 0,7 TOTAL 695 80 ARS PHARMACEUTICA TABLA 11 Microorganismos resistentes a f3 -lactámicos Microorganismo Cepas resistentes al Penicilinas Cefalosporinas ambos Escherichia 92 O 8 Klebsiella 20 2 4 Shigel/a 10 O O Salmonella 7 O O Proteus 4 1 2 Citrobacter 2 O 1 Serratia 2 O 10 Enterobacter 3 8 1 Se indica el número de cepas resistentes a algún antibiótico de los grupos citados o a ambos gru pos. TABLA III f3 -lactamasas determinadas por plásmidos f3 -lactamasas N.o de OJo cepas TEM 114 69,94 SHV 18 11,04 OXA 3 1,84 TEM Y OXA 23 14,11 SHV y OXA 5 3,07 TOTAL 163 DISCUSION La muestra de microorganismos analizada fue representativa tanto en nú mero como en distribución por especies del período de tiempo en que se reali zó este estudio en nuestro hospital. El aislamiento, identificación y antibiogra rna de cada microorganismo se realizó según el protocolo seguido en el Servi cio de Microbiología de dicho centro dependiendo de cada tipo de muestra. En la detección del origen genético de las resistencias, la transferencia median te transformación únicamente hubo que realizarla con 22 cepas de las que no ARS PHARMACEUTICA 81 se habían obtenido transconjugantes resistentes a f3 -lactámicos. De estas 22 cepas se obtuvieron transformantes con estas resistencias en 8 casos no pu diéndose asociar en las restantes dichas resistencias·con la presencia de plásmi dos. Los resultados de la transferencia fueron no obstante superiores a los ob tenidos por Mitsuhashi (8) también con microorganismos de origen clínico. TABLA IV Origen y distribución de las f3 -lactamasas codificadas por plásmidos Tipo de f3 -lactamasa Microorganismo cepas TEM SHV OXA N.O OJo N.o OJo N.o OJo Escherichia 98 92 93,1 6 6,1 3 3,1 K/ebsiel/a 24 10 41,6 14 58,3 5 20,8 Enterobacfer 10 9 90 O 7 70 Proteus 5 3 60 2 40 4 80 Sa/monel/a 7 7 100 O O Shige//a 3 3 100 O O SerraNa 13 12 92,3 O 11 84,6 Citrobacter 3 33,3 1 33,3 33,3 Nota: Los porcentajes están hechos con relación al total de cepas de cada género que presentaron f3 -Iactamasas de origen plasmídico. El método biológico seguido para la identificación de las f3 -lactamasas basado en reacciones de inhibición mediante 3 sustratos solamente resulta aplicable con enzimas de origen plasmídico y una vez que los plásmidos res ponsables se transfieren, como en nuestro estudio, a cepas bien conocidas ge notípicamente y caracterizadas por no producir ningún tipo de f3 -lactamasas de tipo cromosórnico o plasmídico. Se utilizó esta técnica en lugar de otras más específicas (9) debido a su simplicidad y facilidad de evaluación de gran número de muestras. No requiere material costoso ni sofisticado, puede reali zarse por personal no especializado y permite diferenciar las f3 -lactamasas de origen plasmídico en aquellos grupos de enzimas caracterizados por su afini dad de sustratos y con un interés clínico común para la política de antibióticos de un centro hospitalario (10). Entre los microorganismos aislados (695) indicados en la tabla 1 se detec tó resistencia a f3-lactámicos en 177 cepas según se demuestra en la tabla n. Como puede observarse la mayor proporción de resistencias fue sobre todo a 82 ARS PHARMACEUTlCA antibióticos del tipo de las penicilinas (165 cepas) de las cuales 33 fueron ade más resistentes a cefalosporinas. Solamente 6 cepas fueron resistentes única mente a cefalosporinas. La utilización indiscriminada de antibióticos como la ampicilina tanto en el medio intra como extrahospitalario puede explicarnos el mantenimiento de las resistencias a penicilinas en un nivel tan alto, en compa ración con las restricciones que se aplican sobre el segundo tipo de antibióticos citados en nuestro medio. De los 177 microorganismos citados en 163 se detectó la presencia de plásmidos de resistencia a f3 -lactámicos mediante su transferencia a la cepa receptora respectiva según se tratase de la conjugación o transformación. Co mo se desprende de la tabla 111, se detectaron 31 cepas con enzimas de tipo OXA responsables de las resistencias a cefalosporinas principalmente y 160 en zimas de los tipos TEM y SHV que hidrolizan con una mayor tasa antibióti cos del tipo de las penicilinas. En 5 cepas resistentes a penicilinas y en 9 a cefa losporinas, estas resistencias no se pudieron asociar con la presencia de plás midas con las técnicas empleadas, conjugación y transformación, y aunque esta posibilidad no puede descartarse, los indicios apuntan hacia otros meca nismos de resistencia posiblemente de origen cromosómico (11). Al analizar la distribución de las f3 -lactamasas según el microorganismo de origen, podemos apreciar la desigual distribución contraria a la gran movi lidad de los genéticos responsables. Esta tendencia de determinadas f3 -lactamasas por localizarse en especies bacterianas concretas tienen igual mente un gran valor epidemiológico y nos induce a pensar en la implicación en dicha distribución de componentes genéticos, posiblemente relacionados con la incompatibilidad de plásmidos o de transferencia de material genético (12). En cuanto a la proporción de los diferentes enzimas por géneros bacterianos, la observada en nuestro estudio resulta similar a la detectada por otros autores en diferentes partes del mundo, indicando una gran homogeneidad en su dis tribución a nivel mundial (13 y 14). En resumen, la incidencia de plásmidos de resistencia a f3 -lactámicos presenta unos valores bastante altos en nuestro hospital, lo cual puede expli carnos las dificultades observadas cuando a través de la política de antibióti cos en nuestro hospital, se ha pretendido disminuir el nivel de estas resisten cias mediante la racionalización del uso de estos antibióticos. La erradicación de estas resistencias únicamente se podrá acometer cuando se comprendan los factores que permiten su mantenimiento. Creemos que la epidemiología basa da en los mecanismos genéticos de las resistencias y los factores responsables de su proliferación es el mejor método que puede proporcionarnos datos sufi cientes para el control de este grave problema clínico. ARS PHARMACEUTlCA 83 BIBLIOGRAFIA (1) CASEWELL, M. W. Recent adyances infection 2. Churchill Liyingstone. Londres (1982). (2) NOONE, P. y SHAFI, M. S. J. Clin. Pathol. 26, 140 (1973). (3) EICKHOFF, T. C. Hospital infection. Little Brown and Co. Boston (1979). (4) BAUER, A. W.; KIRBY, W. M. M.; SHERRIS, J. C. and TURCK, M. Am. J. Clin. Pat hol. 45, 493 (1966). (5) ECKHARDT, T. Plasmid. 1, 584 (1978). (6) DA}'IES, R. W.; BOTSTEIN, D. y ROTH, J. R. Adyanced Bacterial genetics. Cold Spring Harbor. New York (1980). (7) MARISCAL, L., A.; ESPIOARES, O., M., PEREZ, L., 1. A.; PIEDROLA, A., O. y OALVEZ, V., R. Laboratorio. 75,721 (1983). (8) MITSUHASHI, S. Plasmids, Medical and Theoretical Aspects. A VICENUM. Czechoslo yak Medical Press. Prague (1977). (9) NEU, H. C. Antibiotics in Laboratory Medicine, 2. a ed. Williams and Wilkins, Baltimore. U.S.A. (1986). (lO) NAVASHIN, M. y FOMINA, 1. Plasmids, Medical and Theoretical Aspects. AVICENUM. Czechosloyak Medical Press, Prague (1977). (11) BRYAN, L. E. Plasmids and Transposons. Academic Press. New York. (1980). (12) JACOBY, O. A. and SUTTON, L. Antirnicrob. Agents and Chemother. 16, 243 (1979). (13) MATTHEW, M. Antimicrob. and Chemother. 5, 349 (1979). (14) PETROCHEILOU, V. D. Chemioterapia. 4, N.O 2, 23 (1985).