Desarrollo de microsensores de oxígeno disuelto para la caracterización de biopelículas

Escola Tècnica Superior d’Enginyeria PROYECTO FINAL DE CARRERA Enginyeria Tècnica Industrial, Especialitat Química Industrial DESARROLLO DE MICROSENSORES DE OXÍGENO DISUELTO PARA LA CARACTERIZACIÓN DE BIOPELÍCULAS Javier Ibáñez Abad Cerdanyola del Vallès, Septiembre 2010 CERTIFIQUEN: Que l’alumne Javier Ibáñez Abad ha dut a terme, sota la nostra direcció, el treball amb títol “Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas” que presenta en aquesta memòria, la qual constitueix el seu treball en l’assignatura “Projecte Final de Carrera” (Codi 24675). I perquè consti als efectes que correspongui, es presenta el treball esmentat davant l’Escola Tècnica Superior d’Enginyeria de la Universitat Autònoma de Barcelona, signant el present certificat. Cerdanyola del Vallès, 14 de setembre de 2010 David Gabriel Buguña, professor del Departament d’Enginyeria Química de la Universitat Autònoma de Barcelona, María del Mar Baeza Labat, professora del departament de Química de la Universitat Autònoma de Barcelona i Gemma Gabriel Buguña tutora de l’empresa col·laboradora Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM). David Gabriel Buguña Gemma Gabriel Buguña Mª del Mar Baeza Labat Agradecimientos En primer lugar me gustaría agradecer a David Gabriel, Mª del Mar Baeza y Gemma Gabriel por su colaboración, apoyo y disponibilidad. Esto ha resultado clave para poder sacar adelante este proyecto. Del mismo modo agradecer la colaboración de la empresa Institut de Microelectrònica de Barcelona (IMB-CNM) por las facilidades que han dado en cuanto a acceso y horarios, permitiendo horarios de trabajo en los laboratorios muy flexibles y acceso a equipos e instalaciones de última generación. Gracias a las instalaciones y a las explicaciones de Gemma Gabriel, la tutora en la empresa, ha resultado una estancia muy interesante y complementaria a la formación universitaria. Finalmente agradecer también a familiares y amigos, que aunque ajenos a la universidad y el proyecto han resultado un buen apoyo y fuente de buenos consejos durante estos meses. ÍNDICE 1. Introducción………………………………………………………………….……………………………..…………1 1.1. Monitorización……………………………………………………………………….……………………………..1 1.2. Sondas de oxígeno disuelto………………………………………………………….……………………….3 1.2.1. Electrodo de Clark…………………………………………………………………………………….4 1.2.2. Microsensores de oxígeno disuelto…………………………………………….…….…….5 1.2.2.1. Microsensores de Clark………………………………………………………………………6 1.2.2.2. Tecnología CMOS……………………………………………………………………………….8 1.3. Técnicas electroquímicas……………………………………………………………..………………….……9 1.3.1. Voltamperometría cíclica………………………………………………..…………….………..10 1.3.1.1. Análisis de los voltamperogramas………………………………………..…….…….11 1.3.1.2. Análisis de curvas hidrodinámicas………………………………..…………….…….12 1.3.2. Linear Sweep………………………………………………………………….………………..…….13 1.3.3. Cronoamperometría……………………………………………….……………………..………14 1.4. Aplicaciones…………………………………………………………………………………….……………..…..15 1.4.1. Medida de oxigeno disuelto en biofilms……………………………………...…………16 1.4.1.1. Biofiltración……………………………………………………………………….…..…………17 1.4.1.2. Lodo granular………………………………………………………………….…..……………20 2. Objetivos…………………………………………………………………………………………………….…………..……….23 3. Materiales y métodos………………………………………………………………………….………………………..….25 3.1. Microelectrode Arrays (MEAs)……………………………………………………………..……………..26 3.1.1. Estructura de los MEAs………………………………………………………..…….……………26 3.1.2. Configuraciones de los MEAs……………………………………………….………….……..27 3.1.2.1. MEAs de 4x300 µm…………………………………………………………………………..27 3.1.2.2. MEAs de 4x120 µm…………………………………………………………………………..28 3.1.2.3. MEAs de 11x40 µm…………………………………………………………………….…….29 3.2. Montaje experimental…………………………………………………………………………………………31 3.3. Metodología…………………………………………..……………………………………………………………33 3.3.1. Activación de los microelectrodos…………………………………………………………..34 3.3.2. Caracterización de los microelectrodos…………………………………………………..35 Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 6 - Fig. 1.3. Geometrías y campos de difusión en microelectrodos. A) disco plano B) cilíndrico C) MEA (array de microelectrodos) [14] Esta diferencia en el perfil de difusión provoca que la difusión sea el proceso limitante en los macroelectrodos, mientras que la velocidad del proceso redox (cinética) lo será en el caso de los microelectrodos. Las ventajas relacionadas directamente con este control cinético en los microelectrodos son la alta accesibilidad del analito a la superficie del electrodo, el aumento de la relación señal/ruidio en este tipo de sensores y un aumento de la velocidad de respuesta.(Rosa Olivé-Monllau et al., 2010) Igualmente, el tamaño de los electrodos está relacionado directamente con la constante de tiempo característica de la celda electroquímica, lo que permite el empleo de los microelectrodos en la monitorización de procesos que requieran medidas a pequeñas escalas temporales (microsegundos) [14]. Además de las ventajas electroquímicas asociadas, el hecho de contar con sensores de tan reducido tamaño permite experimentos en que sea necesaria información precisa en un punto espacial concreto en tiempo real. Por lo tanto, permite obtener información espacial y temporal de la composición de una muestra o sistema en estudio. En el ámbito de los microelectrodos de oxígeno, se encuentran dos alternativas básicas: microelectrodos de Clark y CMOS, que se discutirán en los apartados siguientes (1.2.2.1 y 1.2.2.2). 1.2.2.1. Microsensores de Clark Se trata de microelectrodos análogos a los macroelectrodos de Clark, pero de reducidas dimensiones. El principio de funcionamiento es exactamente el mismo, pero aportan las ventajas inherentes a la disminución de escala debida a la miniaturización de los sensores. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 7 - A menudo este tipo de electrodos son fabricados manualmente en los laboratorios, siguiendo un proceso bastante tedioso, largo y complicado [6]: 1Se construye la carcasa exterior, partiendo de una pipeta Pasteur que es estirada manualmente, mediante calentadores, hasta conseguir el diámetro requerido (<10um) Se abre la punta de la pipeta con un instrumento de precisión y se aplica silicona. 2Se introduce un hilo de platino afinado hasta un diámetro inferior a los 10um, en un capilar de vidrio, consiguiendo que quede expuesta un área de platino de unos 10-20um. Es recomendable la orificación del platino dado que elimina interferencias y mejora la respuesta del sensor. 3Se integra el electrodo de referencia (Ag/AgCl) y se realizan las conexiones eléctricas. 4Se rellena la cápsula con la solución de electrolito soporte La principal dificultad asociada con la construcción de estos electrodos es la baja reproducibilidad del proceso de elaboración., que da lugar a electrodos de áreas cambiantes, con diferentes distancias entre los electrodos de referencia y de trabajo, lo que repercute en la respuesta final de cada electrodo particular, que diferirá entre el resto de electrodos. Además, los electrodos fabricados mediante este procedimiento resultan poco robustos, siendo extremadamente fácil su rotura al mínimo contacto con una superficie sólida, limitando mucho su tiempo de vida y sus posibles aplicaciones reales. A B Fig 1.4. A: microelectrodo de Clark fabricado manualmente. B: esquema detallado de los componentes de un microelectrodo de Clark [6] Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Existen microelectrodos de Clark esquema que los fabricados en laboratorio (figura 1.4 A), pero mediante métodos más reproducibles, dando lugar a sensores de mejores prestaciones pero de elevado coste. 1.2.2.2. Tecnología CM La tecnolog ía de semiconductor de óxido de metal complementario (Complementary Metal Oxide Semiconductor, CMOS) se basa en el mediante diferentes técnicas que se ha diseñado para los microsensores. Fig. 1.5. Oblea de silicio grabada con diferentes microelectrodos de tecnología CMOS La tecnología CMOS presenta grandes ventajas respecto a la manufacturación de electrodos de Clark, sobretodo en cuanto a re consecuente disminución del precio por unidad, y robustez de los sensores. El proceso de fabricación es realizado en instalaciones especiales, llamadas sala blanca. Se trata de instalaciones en las temperatura, humedad, presión y calidad del aire dentro de unos parámetros equipos y permitan la fabricación a esta escala. Esto representa el principal inconveniente de esta técn ica, pues no resulta económica una instalación de este tipo. Las técnicas utilizadas en la fabricación de microsensores son principalmente: deposición y crecimiento, fotolitografía y grabado Las técnicas de deposición y crecimiento, como su propio no la formación o deposición de capas del material de interés sobre el sustrato (oblea de silicio). Según el material a depositar existen numerosas técnicas: Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 8 - Existen microelectrodos de Clark comercializados por diferentes empresas, siguiendo el mismo esquema que los fabricados en laboratorio (figura 1.4 A), pero mediante métodos más reproducibles, dando lugar a sensores de mejores prestaciones pero de elevado coste. Tecnología CM OS ía de semiconductor de óxido de metal complementario (Complementary Metal Oxide Semiconductor, CMOS) se basa en el de obleas de silicio (Fig. 1.5.) que son procesadas mediante diferentes técnicas microelectrónicas con el fin de conseguir el esquema eléctri que se ha diseñado para los microsensores. Oblea de silicio grabada con diferentes microelectrodos de tecnología CMOS La tecnología CMOS presenta grandes ventajas respecto a la manufacturación de electrodos de Clark, sobretodo en cuanto a re producibilidad, posibilidad de producción en masa, con la consecuente disminución del precio por unidad, y robustez de los sensores. El proceso de fabricación es realizado en instalaciones especiales, llamadas sala blanca. Se trata de instalaciones en las que se lleva un control riguroso del ambiente, manteniendo temperatura, humedad, presión y calidad del aire dentro de unos parámetros equipos y permitan la fabricación a esta escala. Esto representa el principal inconveniente de ica, pues no resulta económica una instalación de este tipo. Las técnicas utilizadas en la fabricación de microsensores son principalmente: deposición y crecimiento, fotolitografía y grabado [16]. Las técnicas de deposición y crecimiento, como su propio no mbre indica, son las que permiten la formación o deposición de capas del material de interés sobre el sustrato (oblea de silicio). Según el material a depositar existen numerosas técnicas: Biopelículas comercializados por diferentes empresas, siguiendo el mismo esquema que los fabricados en laboratorio (figura 1.4 A), pero mediante métodos más reproducibles, dando lugar a sensores de mejores prestaciones pero de elevado coste. ía de semiconductor de óxido de metal complementario (Complementary Metal que son procesadas con el fin de conseguir el esquema eléctri co Oblea de silicio grabada con diferentes microelectrodos de tecnología CMOS La tecnología CMOS presenta grandes ventajas respecto a la manufacturación de electrodos de producibilidad, posibilidad de producción en masa, con la El proceso de fabricación es realizado en instalaciones especiales, llamadas sala blanca. Se que se lleva un control riguroso del ambiente, manteniendo temperatura, humedad, presión y calidad del aire dentro de unos parámetros que protejan los equipos y permitan la fabricación a esta escala. Esto representa el principal inconveniente de Las técnicas utilizadas en la fabricación de microsensores son principalmente: deposición y mbre indica, son las que permiten la formación o deposición de capas del material de interés sobre el sustrato (oblea de silicio). Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 9 - • Crecimiento térmico: se hace reaccionar el silicio con un oxidante a altas temperaturas, formando una capa de SiO 2 . • Deposición en fase gaseosa: se deposita un material ajeno a la matriz principal. Existen procesos de deposición con y sin reacción. Las técnicas de fotolitografía permiten definir las zonas del sensor, dejando libre el área de los electrodos y formando cada circuito individual. Esta técnica se basa en el uso de máscaras o transparencias, que contienen los motivos grabados que han de transmitirse a la oblea, gracias al empleo de fotorresinas, un material que cambia su solubilidad al ser irradiado con luz ultravioleta. Podemos diferenciar entre fotorresinas positivas, que se hacen solubles al ser irradiadas, y fotorresinas negativas, que polimerizan al ser irradiadas. Las técnicas de grabado permiten definir las estructuras de los microsensores o microdispositivos, eliminando las zonas que no han quedado protegidas por la fotorresina en el proceso de litografía. En la figura 1.6 se muestra una ampliación de un microsensor de platino para oxígeno. Fig 1.6. Imagen microscopio óptico de dos electrodos de platino fabricados con tecnología CMOS. 1.3. Técnicas electroquímicas A lo largo de este proyecto se han utilizado diferentes técnicas electroquímicas para diversos fines, como la activación de los electrodos, su caracterización o la calibración previa de estos antes de efectuar las medidas de oxígeno. Las principales técnicas utilizadas han sido la voltamperometría cíclica, linear sweep o barrido lineal y la cronoamperometría; de las cuales se hablará a continuación. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 10 - 1.3.1. Voltamperometría cíclica Esta técnica se basa en la realización de un barrido triangular de potencial, iniciando en un potencial E i hasta llegar a un potencial E f y retornar de nuevo al potencial inicial, o bien a un segundo potencial diferente. Al aplicar el barrido triangular de potencial (Fig. 1.7. Función de entrada) y registrar la variación de la intensidad respecto al voltaje aplicado, se obtiene un voltamperograma (Fig 1.7.Voltamperograma) que será de gran utilidad para el análisis de procesos redox. Fig 1.7. Esquema voltamperometría cíclica. (C-contraelectrodo, W-electrodo de trabajo, Rreferencia) En el voltamperograma, en el supuesto de realizar el barrido inicialmente en sentido anódico, se observa que al alcanzar cierto potencial aumenta notablemente la intensidad, debido a la reacción de oxidación. Del mismo modo, al realizarse el barrido en sentido contrario se observa un pico de intensidad al producirse la reacción de reducción (Fig 1.8.) Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 11 - Fig 1.8. Voltamperograma cíclico. Solución Fe 3+/ Fe 2+ 0.01M en KNO 3 0.1M y velocidad de barrido 0.05 V·s -1 La utilidad de esta técnica depende de la naturaleza del analito a estudiar. Es necesario que sea un analito con posibilidad de ser oxidado o reducido en el rango de potenciales del barrido aplicado y es deseable que la reacción redox sea reversible. La forma que presentará el voltamperograma dependerá del analito, de su concentración, de la ventana de potenciales escogida y la velocidad de barrido. La forma del voltamperograma será lo que nos dará información acerca del analito y/o del electrodo y según la finalidad del estudio electroquímico nos centraremos en unos parámetros u otros, como se detallará en los apartados siguientes. 1.3.1.1. Análisis de los voltamperogramas Como se observa en la figura 1.8, los datos de interés del voltamperograma son los siguientes: • Ipc: pico de intensidad catódica. Señalará el pico de intensidad alcanzado en el proceso de reducción. • Ipa: pico de intensidad anódica. Señalará el pico de intensidad alcanzado en el proceso de oxidación. • Ipc/Ipa: cociente de intensidades • |Epa-Epc|: diferencia de potencial absoluto entre los picos catódico y anódico. -3,00E-06 -2,00E-06 -1,00E-06 4,00E-20 1,00E-06 2,00E-06 3,00E-06 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Intensidad (A) Potencial(V) Ipa Ipc |Epa-Epc| Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 12 - La diferencia de potencial absoluto entre los picos catódico y anódico es fruto de una combinación entre los diferentes coeficientes de difusión del par y el sobrepotencial necesario para transferir electrones entre la superficie del electrodo y el analito. Esta diferencia de potencial está relacionada directamente con el número de electrones que interviene en la reacción, según la ecuación 1: | −|= 2.218 ∗ ோ் ௡ி Ecuación 1 De este modo, a temperatura de 25ºC, la separación teórica debería ser aproximadamente de 59mV para parejas redox en que la transferencia sea de un único electrón, independientemente de la concentración o la velocidad de barrido. A mayor separación de picos se tendrá un proceso cada vez más irreversible. Las intensidades de pico están relacionadas con la concentración de la especie y la velocidad de barrido, según la ecuación 2:  = 2.69 ∗ 10 ହ  ଷ/ଶ  ଵ/ଶ  ଵ/ଶ Ecuacución 2 Donde Ip es la corriente de pico en Amperios, A el área del electrodo en cm 2 , D el coeficiente de difusión en cm 2 ·s -1 , C la concentración en mol·cm 3 y v la velocidad de barrido en V·s -1 . De esta manera, para una pareja reversible, el cociente de intensidades Ipc/Ipa debería tener un valor cercano a 1. 1.3.1.2. Análisis de curvas hidrodinámicas En los extremos de los voltamperogramas cíclicos pueden producirse reacciones parásitas que pueden enmascarar la reacción de interés. Se puede utilizar la voltamperometría cíclica como técnica para determinar la ventana de potenciales entre los que se puede llevar a cabo la medida sin que se vea afectada por estas reacciones parásitas. Algunas de éstas podrían ser la formación de hidrógeno sobre la superficie del electrodo, en el caso de soluciones acuosas. El gráfico obtenido se denomina curva hidrodinámica, y es una información característica para cada electrodo. En la curva hidrodinámica se observan básicamente dos zonas diferenciadas, en el caso de una solución en la que simplemente tengamos agua y un electrolito soporte que no presente actividad redox, una zona plana y dos zonas en los extremos en las que aumentará Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 13 - sensiblemente la corriente (Fig 1.9). La zona de trabajo será la zona plana, dado que las reacciones parásitas no se darán en este rango. Estas curvas son útiles para la determinación si un tipo de electrodo concreto es viable para la determinación de un analito, conociendo el potencial al que idealmente se beben realizar las medidas para esa finalidad concreta. También se puede emplear para comparar la utilidad de diferentes sensores, por ejemplo en el caso de que diferentes materiales puedan ejercer de catalizadores de las reacciones parásitas, dando lugar a ventanas de trabajo más estrechas, como se observa en la Fig 1.9. Fig 1.9. Ejemplo de curvas hidrodinámicas de un electrodo de platino y uno de platino con oro electrodepositado. 1.3.2. Linear Sweep En la voltamperometría de barrido lineal, o linear sweep, se realiza un barrido de potencial desde un potencial E 1 hasta un potencial E 2 , a velocidad de barrido constante, y se registra la corriente que circula a través del electrodo de trabajo, como se muestra en la figura 1.10. Fig 1.10. Bases de la técica de voltamperometría de barrido lineal. A: ejemplo barrido de potencial Linear Sweep. B: voltamperograma linear sweep, reducción de O 2 disuelto. -1,00E-04 -5,00E-05 -1,00E-18 5,00E-05 1,00E-04 1,50E-04 -2 -1 0 1 2 3 Intensidad (A) Potencial (V) Au Pt -1,20E-07 -1,00E-07 -8,00E-08 -6,00E-08 -4,00E-08 -2,00E-08 0,00E+00 -1 -0,5 0 Intensidad (A) Potencial (V) A B Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 14 - La forma característica de este tipo de voltamperogramas (Fig 1.10. B) se explica de manera análoga a la de los voltamperogramas cíclicos. En el caso del voltamperograma anterior, al comenzar el barrido el potencial inicial no es suficiente para reducir las especies en el medio, al ir aumentando el potencial se observa un primer aumento de la intensidad, señal de que se está produciendo una reacción de reducción del analito, esta intensidad aumenta hasta alcanzar un pico máximo, tras el que retorna a la línea base. Esto se explica debido a que en este punto la reacción se encuentra limitada por la difusión del analito, la cual no es suficiente para mantener la concentración de analito estable en la superfície del electrodo, dando lugar a una menor transferencia de electrones y en consecuencia una disminución de la intensidad registrada. Esta técnica aporta mucha información cuantitativa de los analitos en solución, dado que la intensidad pico registrada en la reacción redox de la especie estudiada está relacionada con la concentración de ésta. Del mismo modo se puede obtener información cualitativa de las especies en solución, dado que cada especie tiene un potencial característico de oxidación/reducción. Debido a su utilidad y sencillez se trata, junto a la voltamperometría cíclica, de una de las primeras técnicas a utilizar en cualquier investigación electroquímica. 1.3.3. Cronoamperometría Esta técnica, esquematizada en la figura 1.11 se basa en aplicar un programa de escalones de potencial, en el que se somete al electrodo a un potencial E 1 durante un determinado periodo de tiempo y después se pasar directamente a un potencial E 2 , dando tiempo suficiente para que la medida se estabilice. Fig 1.11. Técnica de cronoamperometría. A: escalón de potencial aplicado. B: cronoamperograma obtenido. -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 0 10 20 Potencial (V) Tiempo (s) -1,50E-07 -1,00E-07 -5,00E-08 0,00E+00 5,00E-08 0 10 Intensidad (A) Tiempo (s) A B Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 15 - Esta técnica se complementa del linear sweep, de modo que se escoje el potencial E 2 que coincida con la zona de potenciales en que el analito de interés se oxida o reduce, de tal modo que se elimina la información que aportan las otras especies en solución que no son de interés en el estudio. Idealmente se escoge el potencial E 2 para asegurar la máxima señal, siendo éste el pico de intensidad máximo obtenido mediante la técnica de linear sweep. En el cronoamperograma obtenido (Fig 1.11.) se observa un gran aumento inicial de la intensidad de corriente (seg 5), debido al inicio de la reacción redox, momento en el que el analito presenta una concentración elevada entorno a la superficie del electrodo, dando lugar a una excelente transferencia de carga. Al avanzar la reacción, el consumo de analito en la misma y el aumento del grosor de la capa de difusión, hacen que el transporte de materia hasta el electrodo ejerza de parámetro limitante, disminuyendo la intensidad de corriente registrada. Esta técnica resulta de gran utilidad para análisis cuantitativo del analito, así como la calibración previa necesaria de los sensores, gracias a la gran sencillez a la hora de interpretar los datos del voltamperograma. Si se ha seleccionado el potencial de medida adecuado éste nos proporcionará información únicamente del analito de interés, estando relacionada la intensidad de corriente obtenida con la concentración del analito en la muestra. Así mismo, se puede utilizar esta técnica para la determinación experimental del coeficiente de difusión del analito, debido a que éste guarda relación con la intensidad medida en la zona de equilibrio. 1.4. Aplicaciones La miniaturización de sensores de oxígeno, además del aporte de ventajas asociadas con la propia miniaturización, abre un amplio abanico de posibilidades de uso y aplicación. En consecuencia, este proyecto se centrará en el uso de estos microsensores construidos con tecnología microelectrónica, como instrumentos de medida de la concentración de oxígeno en sistemas biológicos heterogéneos; como por ejemplo el interior de películas de biofilms o gránulos de biomasa. De manera que se obtendrá información sobre el proceso que está sucediendo, perfiles de oxígeno disuelto en el medio y en la biomasa, o se monitorizaran las condiciones aerobias o anaerobias que se dan a diferentes profundidades del biofilm. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 22 - Fig 1.16. Imágenes biofilm sobre soporte tradicional de anillos (A) y lodo granular (B) Del mismo modo que esta tecnología ha permitido la viabilidad de multitud de procesos anaerobios, también se puede emplear con la finalidad de conseguir resultados optimizados con los procesos aerobios, aunque en determinados casos el transporte de oxígeno hasta la biomasa, puede resultar el paso limitante del proceso. A B Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 23 - 2. OBJETIVOS El principal objetivo de este proyecto es la caracterización y desarrollo de unos microsensores de oxígeno que permitan realizar medidas de la concentración de oxígeno en el interior de biomasa activa. Este objetivo global engloba los siguientes objetivos concretos: • Análisis viabilidad del microsensor a partir de pruebas con electrodos ya construidos. • Caracterización electroquímica de los microelectrodos. • Diseño de procedimientos de activación y mantenimiento de los microsensores. • Calibración de los microelectrodos para su uso como sensores de oxígeno y análisis de la influencia del medio en la calibración. • Analizar la estabilidad de la calibración de los microsensores. • Obtención de medidas de oxígeno en el interior de gránulos de biomasa. • Diseño de unos electrodos específicos para la obtención de un perfil de oxígeno en el interior de un gránulo de biomasa. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 24 - Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 25 - 3. MATERIALES Y MÉTODOS Durante la realización de este proyecto se han utilizado los instrumentos detallados en la tabla 3.1. Tabla 3.1. Lista de equipos y fabricantes Equipo Fabricante Potenciostato µAutolab type III Metrohm AG (Herisau, Suiza) Impedance/gain - phase analyzer SI1260 + Electrochemichal interface SI1287 Solartron analytical (Farnborough, UK) Inolab terminal Level 3 WTW (Weilheim, Alemania) Sonda oxígeno Cellox 325 WTW (Weilheim, Alemania) Electrodo Pt Metrohm 6.0351.100 Metrohm AG (Herisau, Suiza) Electrodo Ag/AgCl Metrohm 6.0726.100 Metrohm AG (Herisau, Suiza) Del mismo modo, los reactivos empleados han sido los especificados en la tabla 3.2. Tabla 3.2. Lista de reactivos empleados Reactivos Nitrato potásico Hexacianoferrato(II) de potasio Hexacianoferrato(III) de potasio Oro no cianurado Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 26 - A partir de los reactivos de la tabla 3.2. se han preparado las siguientes disoluciones para el experimental requerido: • Nitrato potásico 0.1 M: preparada por pesada a partir de la sal de nitrato potásico y disolviendo con agua destilada hasta el volumen requerido. Preparación sin material volumétrico preciso, debido a que no requiere de más precisión por su finalidad. • Disolución Ferro/Ferri 0.01 M: preparada por pesada directa de las sales de ferro y ferricianuro más la cantidad adecuada de nitrato potásico para dar conductividad al medio (0.1 M). Se disuelve en agua destilada en un matraz aforado hasta el volumen requerido. La disolución se conserva a temperatura ambiente, protegida de la luz solar. Ambas disoluciones se renuevan semanalmente para garantizar su estabilidad. 3.1. Microelectrode Arrays (MEAs) Los sensores utilizados en el proyecto se tratan de arrays de microelectrodos, es decir, una matriz en la que encontramos múltiples microelectrodos con los cuales podemos realizar medidas conjuntas o independientes. Los microelectrodos han sido fabricados mediante tecnología CMOS (ver 1.2.2.2.), en la sala blanca del Instituto de Microelectrónica de Barcelona, IMB-CNM, perteneciente al Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC) A lo largo del proyecto se han utilizado diversas configuraciones y materiales, que detallaremos a continuación. 3.1.1. Estructura de los MEA Los microelectrodos de oro y platino utilizados en este trabajo se basan en estructuras del tipo pyrex/SiO 2 /metal y pasivadas con SiO 2 /Si 2 N 4 elaboradas con las técnicas fotolitográficas estándar. Como se puede observar en la figura 3.1. el chip se encapsula a unas estructuras que actúan de interfase llamadas Printed Circuit Board (PCB) mediante la técnica de wire bonding. Esto permite la conexión física del chip con el equipo de medida, ya sea mediante cables o con otro tipo de interfase. Finalmente los contactos eléctricos se protegen primero con un polímero fotocurable (Epoxi, H70E2) y las pistas de la PCB con (Epoxi OG147-7 de EpoTek) lo que permite la completa inmersión del electrodo en las disoluciones sin peligro de cortocircuito. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 27 - 3.1.2. Configuraciones de los MEA A lo largo del proyecto se han empleado 3 tipos de MEA diferentes, con variaciones en cuanto a estructura y materiales, los cuales detallaremos a continuación: 3.1.2.1. MEAs de 4x300 µ µµ µm Al comienzo del experimental se aprovechó la existencia de unos MEA ya fabricados para otra finalidad, permitiendo empezar las pruebas inmediatamente y verificar de este modo la viabilidad del proyecto. Las características de estos electrodos se resumen en la tabla 3.3. Tabla 3.3. Características electrodos 4x300µm Arista 300um Geometría cuadrada Área 90000 um 2 Número electrodos 4 Material Platino Este MEA seguía el esquema de configuración de la figura 3.1. Fig. 3.1. A: Esquema MEA 4x300µm donde se puede distinguir el chip, la PCB y la zona de los cables. B: Fotografía del MEA 4x300µm una vez encapsulado y conectado a los cables, listo para realizar medidas experimentales. Como se observa en la figura 3.1. el MEA en forma de aguja consta de 4 electrodos en un extremo, más un sensor de temperatura, no utilizado en este experimental. En el extremo opuesto se encuentran los 4 puntos de conexión, pads de contacto, correspondientes a los electrodos. A B Cables Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 28 - 3.1.2.2. MEAs de 4x120 µ µµ µm Aprovechando el mismo diseño de MEA empleado en los MEA 4x300um se observó la posibilidad de realizar las conexiones de forma inversa, dando la vuelta al MEA. En este nuevo diseño se utilzaron lo que anteriormente habían sido los contactos para soldar los cables en el pcb como microelectrodos y lo que anteriormente se había utilizado como microeletrodos pasaron a ser los contactos en el PCB. Con esta modificación se obtuvieron MEAs con las siguientes características (Tabla 3.4.) Tabla 3.4. Características microelectrodos 4x120um Arista 120um Geometría cuadrada Área 14400 um 2 Número electrodos 4 Material Platino Estos MEAs siguen el esquema de configuración de la figura 3.2. Fig 3.2. Esquema MEA 4x120µm en el que se distinguen los 4 electrodos y sus pads de contacto, la PCB de diseño alargado y la zona de los cables. La utilización de lo que eran los contactos en los MEA 4x300um como microelectrodos nos permitió reducir el área del microeletrodo en más de 6 veces el tamaño de la primera, pudiendo así realizar medidas más localizadas y potenciar las ventajas del uso de microeletrodos ( ver 1.2.2.). Además en este nuevo diseño se ha cambiado la forma de la pcb, haciéndola más alargada lo cual facilita el experimental. En el anterior diseño el efecto memoria de los cables hacía más complicada la colocación de los electrodos siempre en la misma posición, lo que variaba en pequeña medida la celda en cada experimental. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 29 - Del mismo modo que en el diseño anterior la PCB se aisló eléctricamente con resina fotocurable (Fig 3.3.), hasta unos ¾ de la altura total, permitiendo sumergir toda esa zona sin peligro de cortocircuito. Fig 3.3. Imagen MEA 4x120um. 3.1.2.3. MEAs de 11x40 µ µµ µm A partir de la experiencia obtenida con las configuraciones anteriores, se diseñaron unos MEAs específicos para la finalidad concreta del proyecto: medir un perfil de oxígeno en el interior de un gránulo de biomasa. Para este fin específico se necesitan principalmente más puntos de medida, de manera que obtuviéramos datos de la evolución de la concentración de oxígeno en multitud de puntos en el interior del gránulo de biomasa. Además, se observó durante el experimental que los microelectrodos de oro presentaban diversas ventajas respecto a los de platino, por lo cual se decidió fabricar los electrodos directamente en este material Bajo esta premisa se diseñó una aguja de las siguientes características (Tabla 3.5.) Tabla 3.5. Características MEAs 11x40µm Diámetro (aprox.) 40um Geometría (aprox.) circular Área (aprox.) 1588 um 2 Número electrodos 11 Material Oro Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 30 - El diseño de la oblea donde se integran estos MEAs se compartió con el diseño de otros chips de otro proyecto, como se muestra en la figura 3.4. Fig 3.4. Arriba: diseño de la oblea. Los rectángulos rojos marcan la posición de los MEAs para medidas de oxígeno. Abajo: Diseño del MEA 11x40µm. Como se observa en la Figura 3.4. en estos MEA se ha implementado un electrodo de referencia en el propio MEA. Debido al tamaño de estos microelectrodos no son necesarias las medidas a 3 puntas utilizando contraelectrodo, electrodo de trabajo y de referencia, dado que la magnitud de las corrientes medidas es tan peqqueña que la caída de potencial es despreciable, permitiendo que le mismo electrodo de referencia actúe a la vez de contraelectrodo. Así, con en este diseño de MEA viene integrado todo lo necesario para realizar las medidas. La PCB se ha construido del mismo modo que en la configuración de 4x120um. Estos MEA han sido impresos sobre la oblea mediante el uso de transparencias. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 31 - Fig 3.5. Imágenes microscopio MEA 11x40um Las áreas se han calculado gracias a un software incluido en el microscopio, obteniendo la media expresada en la tabla 3.5. La desviación es aproximadamente de +/- 150um 2 . 3.2. Montaje experimental Durante el experimental se han utilizando básicamente dos montajes: A) Montaje microautolab En este montaje se ha empleado un vaso de 200ml, con una tapa plástica (que ayuda a mantener la constante de celda igual en las diferentes medidas) con agujeros por donde se introducían los diferentes electrodos y la vía de nitrógeno, como se observa en la Figura 3.6. Fig. 3.6. Imágenes montaje microautolab. Todo el montaje se encuentra en el interior de una caja de Faraday, conectada a tierra, gracias a la cual se consigue una gran reducción del ruido eléctrico. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 38 - Comparando las imágenes SEM de un electrodo de platino sin modificar, Fig 3.10. A, y uno electrodepositado con oro, Fig 3.10. B, se puede apreciar visualmente la diferencia de rugosidad. La sección obtenida con el FIB permite diferenciar las diferentes capas que tenemos en el chip. La más oscura corresponde al pyrex, la capa superior es la del metal (que tiene un grosor de unos 180 nm; 30nm de Ti + 150 nm Pt), y la última rugosa es el oro electrodepositado. Esta técnica permite determinar que se depositan alrededor de unos 150 nm de oro. La rugosidad observada en las imágenes de SEM (Fig 3.10) se cuantificó mediante un equipo de AFM (Atomic Force Microscope) a partir de los valores de RMS. Este equipo consta de una sonda o punta (cantiléver) acoplada a un listón muy flexible (Fig 3.10). La sonda recorre la superficie de la muestra y registra las interacciones con ésta mediante un laser, generando una imagen de la topografía de la muestra. Fig 3.11. Izquierda: Esquema equipo AFM. Derecha: Imagen SEM de un cantiléver de AFM. [26] Mediante el equipo de AFM se compararon las rugosidades de un microelectrodo cuya superficie había sido modificada con oro electrodepositado y la de un microelectrodo fabricado directamente en este material (Fig. 3.13). Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 39 - Fig 3.13. Imágenes en 3D y perfil topográfico de A y C: electrodo modificado con oro electrodepositado, B y D: electrodo sin modificar. Como se observa en la figura 3.13 la superficie modificada es notablemente más rugosa (con una RMS de 13µm respecto a los 5µm del electrodo no modificado) que la de un electrodo sin modificar, aportando los beneficios mencionados. A D A C B Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 40 - 3.3.4. Recubrimiento con pHEMA El metal electrodepositado sobre la superficie del electrodo no se encuentra adherido a ésta, de modo que los roces o simplemente con el paso del tiempo esta capa electrodepositada se puede desprender de su superficie. Con el fin de mejorar las propiedades mecánicas de la capa de metal electrodepositado se ha recubierto con pHEMA (poly(2-hydroxyethil) methacrylate). El pHEMA se ha depositado sobre los microelectrodos formando una capa ultrafina por el método de deposición química gaseosa fotoiniciada (piCVD). Se trata de una técnica sencilla con la que se consigue depositar una capa de unos 100 nm de grosor sobre el electrodo, consiguiendo mejorar sus propiedades físicas sin interferir en la respuesta eléctrica. Fig. 3.14. Imagen SEM capa de pHEMA sobre electrodo modificado. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 41 - 4. RESULTADOS 4.1. MEAs de 4x300µ µµ µm 4.1.1. Protocolo de activación de los MEAs de 4x300 µ µµ µm Como se ha referido anteriormente (ver sección 3.3.1.) tanto el método de fabricación como el uso y conservación de los microelectrodos genera una capa de pasivación sobre éstos, haciendo necesaria su activación con el fin de obtener una respuesta homogénea y acorde a las características del microelectrodo. Previa a la activación del electrodo se ha realizado un voltamperograma cíclico entre los potenciales -0.05 y 0.4V con el par redox Fe 2+ /Fe 3+ , observándose una respuesta muy distorsionada e intensidades muy inferiores a las que cabría esperar de un electrodo de esas características. Posteriormente se ha procedido a la activación mediante programas de 15 ciclos consecutivos de voltamperometría cíclica en un medio conductor de KNO 3 (ver 3.3.1 A). La evolución de la respuesta se ha seguido mediante voltamperometría cíclica del par redox Fe 3+/ Fe 2+ (Fig. 4.1.) Fig. 4.1. Evolución respuesta de los microelectrodos para diferentes ciclos de activación. -3,00E-06 -2,00E-06 -1,00E-06 0,00E+00 1,00E-06 2,00E-06 3,00E-06 -0,1 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Intensidad (A) Potencial (V) Sin activar 15 ciclos 30 Ciclos 45 Ciclos Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 42 - Se observa en la figura 4.1. que la definición del voltamperograma cíclico para el par redox inicial, previa a la activación del electrodo es prácticamente nula, sin diferenciarse los picos de oxidación y reducción de la especie electroactiva. Se hace evidente la eliminación de la capa de pasivación tras los primeros 15 ciclos de limpieza, observándose una gran mejora en la definición del voltamperograma, observándose claramente los picos de oxidación y reducción. Tras 30 ciclos de activado y en adelante las diferencias entre los voltamperogramas resultan irrelevantes por lo que se concluye que se ha eliminado totalmente la capa de pasivación del electrodo y está preparado para dar una respuesta adecuada a sus características. Por lo que se concluye el siguiente protocolo de activación (Tabla 4.1.): Tabla 4.1. Protocolo activación mediante voltamperometría cíclica. MEAs 4x300um Técnica Voltamperometría cíclica Ei 0.08 V Ef -2.2 V Ciclos 30 Velocidad de barrido 100 mV·s -1 Este protocolo de activación resultaba ser lento, por lo que se estudió la posibilidad de utilizar otra técnica electroquímica que nos permitiese obtener los mismos resultados en un tiempo más reducido. Analizando los voltamperogramas de activación, se observan dos zonas de interés para la activación. Una zona de potencial fuertemente negativo, inferior a -1V, en donde se genera el hidrógeno necesario para la limpieza del microelectrodo, y una segunda zona donde el potencial no es suficiente para la formación de hidrógeno, permitiendo la eliminación de las burbujas de gas adheridas sobre la superficie de los microelectrodos que pudieran dificultar la transferencia de carga para la correcta activación (Fig. 4.2.) Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 43 - Fig 4.2. Ejemplo voltamperograma cíclico para activación electrodos 4x300um Con tal de conseguir el mismo efecto pero en menor tiempo se decidió diseñar un protocolo usando la técnica de la cronoamperometría estableciendo escalones de potencial pertenecientes a ambas zonas de interés. Se diseñó un programa de cronoamperometría para E 1 =-2V durante 10s y E 2 =0v durante 5s. Del mismo modo que anteriormente se evaluó la respuesta de los microelectrodos mediante voltamperometría cíclica en una disolución del par redox Fe 2+ /Fe 3+ . Se observó que se obtenía una respuesta equivalente a la activación mediante voltamperometría cíclica tras 10 escalones de potencial. De este modo el protocolo de activación mediante cronoamperometría queda especificado como se detalla en la tabla 4.2.: Tabla 4.2. Protocolo activación mediante cronoamperometría. MEAs 4x300um Técnica Cronoamperometría E 1 -2 V Tiempo E 1 10 s E 2 0 V Tiempo E 2 5 s Escalones 10 Mediante este nuevo protocolo se consiguió una activación efectiva de los electrodos en 1’30’’, una gran mejora respecto a los más de 20’ necesarios con el protocolo anterior. -4,50E-04 -4,00E-04 -3,50E-04 -3,00E-04 -2,50E-04 -2,00E-04 -1,50E-04 -1,00E-04 -5,00E-05 3,00E-19 5,00E-05 -2,2 -1,7 -1,2 -0,7 -0,2 Intensidad (A) Potencial (V) Formación H 2 Eliminación burbujas H 2 Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 44 - Más adelante, al comprobar visualmente la orificación de los microelectrodos, se observó que parte del oro recubría las pistas metálicas que deberían estar recubiertas con la capa de pasivación. Analizando las posibles causas se llegó a la conclusión de que las densidades de corriente que soportaban los electrodos durante los protocolos de activación eran demasiado elevadas, de tal manera que dañaban la capa de pasivación levantándola y haciendo que la respuesta del electrodo fuera poco reproducible. Con tal de solucionar este problema se limitó la corriente que pasaría por los electrodos durante las activaciones. En el caso de los electrodos de 300um se limitó a un valor máximo de 0.1 mA, lo que representa un densidad de corriente de 1111 A/m 2 . Se observó que el límite de corriente no afectaba significativamente a la activación de los microelectrodos, haciendo innecesaria su modificación. Del mismo modo, los electrodos activados con el límite de corriente no presentaron daños en la pasivación de las pistas. 4.1.2. Análisis de la pasivación de los MEAs 4x300µ µµ µm La conservación y uso de los microelectrodos puede generar una capa de pasivación sobre el microelectrodo del mismo modo que se genera la capa de óxido por las condiciones térmicas de la fabricación. La pasivación por uso y/o conservación se verá influenciada por el medio en el que se encuentren los microelectrodos. Con el fin de determinar la influencia del medio se analizó la pérdida de señal que experimentaban diferentes microelectrodos conservados en diferentes medios, a lo largo de 5 días. Los medios utilizados fueron: • Atmósfera inerte de nitrógeno • Medio salino (KNO 3 0.1M) • Aire libre Inicialmente se activaron los microelectrodos y se obtuvo el voltamperograma cíclico inicial para cada uno de los microelectrodos. A lo largo de los 5 días del estudio se realizaron voltamperogramas cíclicos a los 2 y 5 días (Fig 4.3.) Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 45 - Fig. 4.3. Voltamperogramas cíclicos disolución Fe2+/Fe3+ 0.01M. Análisis evolución respuesta de un electrodo conservado al aire libre. La evolución de la intensidad de la señal se evaluó mediante voltamperometría cíclica (ver 1.3.1.), comparando la media de los picos de intensidad catódico y anódico a lo largo de los días de estudio (Tablas 4.3, 4.4 y 4.5) Tabla 4.3. Evolución señal microelectrodo conservado en atmósfera inerte N 2 . Nitrógeno I promedio (A) % pérdida sensibilidad 0 días 3,45E-06 0,00% 2 días 3,38E-06 2,13% 5 días 3,26E-06 5,67% Tabla 4.4. Evolución señal microelectrodo conservado en medio salino KNO 3 . Medio Salino I promedio (A) % pérdida sensibilidad 0 días 3,39E-06 0,00% 2 días 3,37E-06 0,67% 5 días 3,07E-06 9,40% -3,00E-06 -2,00E-06 -1,00E-06 0,00E+00 1,00E-06 2,00E-06 3,00E-06 -0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 Intensidad (A) Potencial (V) Electrodo activado 2 días aire libre 5 días aire libre Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 46 - Tabla 4.5. Evolución señal microelectrodo expuesto al aire ambiente. Aire ambiente I promedio (A) % pérdida sensibilidad 0 días 3,16E-06 0,00% 2 días 2,98E-06 5,56% 5 días 2,76E-06 12,65% Como se observa en las tablas 4.3 a 4.5, los cálculos concluyen que en cualquiera de los tres medios la señal se ve afectada por pasivación del electrodo. Si más no, el medio salino y el aire libre provocan una mayor pasivación del microelectrodo, afectando más a la reducción de la sensibilidad a lo largo del tiempo. Se concluye así que es necesaria una activación del microelectrodo, mediante el protocolo adecuado, antes de cada uso con tal de obtener una señal representativa del electrodo, sea cual sea el medio de conservación. En caso de no usar el microelectrodo durante un largo período de tiempo, se recomienda su conservación en atmósfera inerte de nitrógeno, puesto que es el medio menos pasivante de los sometidos a estudio. 4.1.3. Caracterización de los MEAs 4x300µ µµ µm de platino La respuesta electroquímica de los microelectrodos ha sido evaluada mediante voltamperometría cíclica del par redox Fe 2+ /Fe 3+ . Este par redox es ampliamente utilizado dado que sus propiedades electroquímicas son perfectamente conocidas, lo que permite evaluar la respuesta de nuestros microelectrodos comparándola con la respuesta ideal. Tras la activación de los microelectrodos mediante el procedimiento establecido (ver 4.1.1.) se procede a su caracterización. Los voltamperogramas obtenidos son analizados según determinado en el punto 1.3.1.1. En la tabla 4.6 se muestran los resultados de intensidad de pico catódico (Ipc), intensidad de pico anódico (Ipa), su cociente y la separación entre los picos de oxidación y reducción obtenidos experimentalmente. Tabla 4.6. Resutaldos obtenidos en la caracterización de los MEAs 4x300µm ΔEp (V) experimental Ipc (uA) Ipa (uA) Ipc/Ipa 0,081 3,04 2,76 1,10 0,081 3,47 2,96 1,17 0,088 3,20 2,68 1,19 0,089 3,39 2,92 1,16 0,088 3,20 2,80 1,14 0,086 3,21 2,72 1,18 0,087 3,32 2,82 1,18 0,089 3,20 2,84 1,13 Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 47 - Como se puede observar en la tabla 4.6. la separación de picos es en promedio de 86 mV, no muy lejanos a los 59 mV teóricos para este par redox, indicando una correcta transferencia electrónica. Las intensidades de pico son muy similares entre diferentes electrodos, presentado desviaciones de entre un 3% y un 4%, demostrando una gran homogeneidad entre los electrodos. Esto indica una correcta fabricación y activación de los microelectrodos. Por último, el cociente de intensidades es siempre cercano a la unidad, algo mayor en todos los casos, atribuible al diferente coeficiente de difusión de los dos iones del par. 4.1.4. Calibración de los MEAs 4x300µ µµ µm como sondas de oxígeno disuelto La finalidad última de este proyecto consiste en la utilización de estos microelectrodos de tecnología CMOS como sondas capaces de medir la concentración oxígeno disuelto. Con tal de verificar la viabilidad del proyecto, primeramente se analizó la respuesta del electrodo, mediante linear sweep, ante una disolución conductora (KNO3 0.1M) saturada en oxígeno y una purgada de oxígeno. Fig. 4.4. Comparación voltamperogramas linear sweep en disolución saturada y purgada de oxígeno. La reacción de reducción de oxígeno, en un medio de pH neutro o básico, corresponde a la siguiente: O 2 + 2 H 2 O + 4 e - → 4 OH - -1,00E-06 -9,00E-07 -8,00E-07 -7,00E-07 -6,00E-07 -5,00E-07 -4,00E-07 -3,00E-07 -2,00E-07 -1,00E-07 0,00E+00 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 Intesidad (A) Potencial (V) O2 Saturado O2 Purgado Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 54 - 4.1.8. Comparación de la funcionalidad como sensores de oxígeno de los MEAs 4x300 µ µµ µm de platino, orificados y recubiertos con pHEMA De forma análoga a la metodología de la calibración realizada para los electrodos de platino (ver sección 4.1.4.), se han realizado calibrados para los microelectrodos modificados por electrodeposición de oro. Los resultados de las calibraciones de los microelectrodos con oro electrodepositado se muestran en la tabla 4.10: Tabla 4.10. Resultados de la calibración para oxígeno disuelto de los microelectrodos orificados. Sensibilidad (nA/ppm) Ordenada en el origen (nA) R^2 -24,30 16,60 0,991 -24,74 18,59 0,990 -22,67 14,55 0,996 -26,05 18,60 0,996 La capa de oro electrodepositado ha sido protegida mediante el hidrogel pHEMA, tal y como se detalla en la sección 3.3.4. con la finalidad de hacerla mecánicamente más resistente, dificultando su desprendimiento de la superficie del microelectrodo. La capa de hidrogel es de un grosor de pocos nanómetros, lo que no debería interferir en la respuesta electroquímica del electrodo. Los resultados de las calibraciones de los microelectrodos orificados protegidos con pHEMA se muestran en la tabla 4.11: Tabla 4.11. Resultados de la calibración para oxígeno disuelto de los microelectrodos orificados recubiertos con el hidrogel pHEMA. Sensibilidad (nA/ppm) Ordenada en el origen (nA) R^2 -26,58 17,61 0,999 -29,31 -78,68 0,992 -24,80 9,47 0,999 -25,59 1,32 0,986 Como se puede observar en las tablas anteriores la sensibilidad del electrodo no se ve afectada por efecto de la capa de pHEMA puesto que la capa de hidrogel es de un grosor de pocos nanómetros, por lo que no interfiere en la respuesta electroquímica del electrodo. En general, del mismo modo que se había observado mediante voltamperometría cíclica del par redox Fe 2+ /Fe 3+ en las caracterizaciones de los microelectrodos, al modificar la naturaleza de la superficie mediante la electrodeposición de oro se observa un aumento de la sensibilidad de éste, como se detalla en la tabla 4.12 Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 55 - Tabla 4.12. Resumen promedio sensibilidad para los microelectrodos de Pt, orificados y con pHEMA. Sensibilidad Pt promedio (nA/ppm) Sensibilidad Au promedio (nA/ppm) Sensibilidad A u+pHEMA promedio (nA/ppm) -17,87 -24,44 -26,57 En la caracterización de los microelectrodos se había observado un aumento de un 10% en la sensibilidad de los electrodos para el par redox Fe 2+ /Fe 3+ . En el caso de la sensibilidad al oxígeno disuelto se observa un aumento de entre un 37 y un 49% a favor de los electrodos modificados. Este importante aumento se puede achacar a dos causas principalmente: • El aumento de la rugosidad de la superficie facilita el intercambio de cargas con el analito. El aumento debido a este fenómeno se ha estimado en un 10% de aumento de la sensibilidad de acuerdo a los resultados obtenidos en la caracterización (ver sección 4.1.6). • La modificación de la naturaleza de la superficie evita la formación de hidrógeno al potencial de medida. La formación de burbujas de hidrógeno sobre la superficie del electrodo puede actuar de pasivante temporal sobre éste, dificultando la difusión de nuestro analito de interés hasta la superficie del mismo e introduciendo variabilidad en las medidas. Este último punto se ve reflejado al realizar un voltamperograma mediante linear sweep con un electrodo orificado (Fig 4.9.) Fig 4.9. Voltamperograma linear sweep en medio salino KNO 3 0.1M, mediante un electrodo orificado. -1,20E-07 -1,00E-07 -8,00E-08 -6,00E-08 -4,00E-08 -2,00E-08 0,00E+00 -1 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0 Intensidad (A) Potencial (V) Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 56 - Como se observa en la figura 4.9., en el caso de los electrodos orificados se observan perfectamente los dos picos de reducción correspondientes a las semirreacciones de reducción del oxígeno. El detalle del segundo pico no era visible en el caso de los microelectrodos de platino, pues quedaba enmascarado por la formación de hidrógeno (Fig 4.4.) 4.1.9. Análisis de estabilidad de los calibrados de los MEAs 4x300 µ µµ µm Es interesante el uso de este tipo de microelectrodos como sondas de oxígeno implementadas en equipos industriales permitiendo medidas en continuo del proceso. Para esta finalidad es de suma importancia conocer la evolución de la respuesta del sensor a lo largo del tiempo de trabajo. Como visto anteriormente (en la sección 4.1.2.) las condiciones del medio en que se encuentra afectan a la respuesta del microelectrodo a lo largo del tiempo debido a la pasivación de su superficie. Con la finalidad de evaluar el efecto de la pasivación por uso en continuo del electrodo sobre la sensibilidad en la medida de oxígeno disuelto se elaboró un experimental en el que se realizaron 3 calibrados de los microelectrodos a lo largo de un día de trabajo, manteniendo los electrodos sumergidos en el medio salino en todo momento. Estas pruebas se llevaron a cabo tanto con electrodos de platino como con electrodos orificados y recubiertos con pHEMA, con tal de valorar la influencia de las modificaciones sobre la estabilidad del calibrado. Los resultados de estabilidad asociados a los diferentes microelectrodos se detallan a continuación en las tablas 4.13 a 4.15. Tabla 4.13. Resultados del análisis de la estabilidad de la sensibilidad para medidas en continuo con electrodos de platino Electrodo Tiempo (h) Sensibilida d (nA/ppm) Error asociado a la sensibilidad (nA/ppm) R^2 Pérdida de sensibilidad 1 Pt 0 -18,03 8,07 0,98 0,00% 1 Pt 3 -17,57 7,22 0,98 2,52% 1 Pt 7 -13,37 5,07 0,98 25,82% 2 Pt 0 -17,22 9,04 0,97 0,00% 2 Pt 3 -16,33 6,29 0,98 5,16% 2 Pt 7 -13,98 5,01 0,99 18,79% 3 Pt 0 -18,06 4,53 0,99 0,00% 3 Pt 3 -17,90 5,29 0,99 0,88% 3 Pt 7 -14,85 6,70 0,98 17,80% Como se observa en la tabla 4.13, a lo largo de las 7 horas de experimental se produjo una disminución de aproximadamente un 20% de la señal. Cabe destacar que la disminución de la Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 57 - sensibilidad no se produjo de forma progresiva, si no que se mantuvo estable durante las primeras horas y disminuyó sensiblemente en las últimas. Tabla 4.14. Resultados del análisis de la estabilidad de la sensibilidad para medidas en continuo con electrodos orificados Electrodo Tiempo (h) Sensibilidad (nA/ppm) Error asociado a la sensibilidad (nA/ppm) R^2 Pérdida de sensibilidad 1 Au 0 -24,74 7,46 0,990 0,00% 1 Au 3 -18,47 3,86 0,995 25,35% 1 Au 7 -15,15 3,19 0,995 38,74% 2 Au 0 -22,67 4,42 0,996 0,00% 2 Au 3 -16,99 1,92 0,999 25,06% 2 Au 7 -14,95 1,55 0,999 34,03% 3 Au 0 -26,05 4,83 0,996 0,00% 3 Au 3 -18,47 6,40 0,987 29,11% 3 Au 7 -16,44 1,86 0,999 36,90% En el caso de los microelectrodos cuya superficie se encuentra modificada por electrodeposición de oro se observó una disminución de la sensibilidad de en torno a un 36%. En este caso la pasivación del microelectrodo se produjo principalmente durante las primeras horas del experimental, afectando en torno a un 26% en la sensibilidad durante las 3 primeras horas. Tabla 4.15. Resultados del análisis de la estabilidad de la sensibilidad para medidas en continuo con electrodos orificados y recubiertos con el hidrogel pHEMA Electrodo Tiempo (h) Sensibilidad (nA/ppm) Error asociado a la sensibilidad (nA/ppm) R^2 Pérdida de sensibilidad 1 pHEMA 0 -25,59 9,32 0,986 0,00% 1 pHEMA 3 -24,99 15,54 0,998 2,35% 1 pHEMA 7 -25,28 1,46 1,000 1,22% 2 pHEMA 0 -24,80 2,09 0,999 0,00% 2 pHEMA 3 -23,11 8,79 0,999 6,83% 2 pHEMA 7 -22,05 4,24 0,996 11,10% 3 pHEMA 0 -26,58 6,92 1,000 0,00% 3 pHEMA 3 -23,57 14,22 0,998 11,32% 3 pHEMA 7 -21,85 1,99 0,999 17,79% Para los microelectrodos a los que se aplicó el hidrogel pHEMA se obtuvo una reducción promedio de un 10% de la señal, de un 18% en el peor de los casos. En general la pasivación se produjo de forma progresiva a lo largo del experimental. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 58 - Las diferencias de estabilidad entre los microelectrodos de platino y los orificados, se pueden deber principalmente a que el aumento de la rugosidad de la superficie conlleva que ésta sea más susceptible de que compuestos pasivantes se depositen sobre ella. En el caso de los microelectrodos protegidos con pHEMA se observa una estabilidad mucho mayor en la sensibilidad del microelectrodo. Esto es debido a que las características del hidrogel dificultan la adherencia sobre la superficie del microelectrodo, haciéndola mucho más resistente a la pasivación. Se concluye de este experimental que la mejor respuesta y estabilidad del sensor se obtiene para los electrodos de oro protegidos con pHEMA. 4.2. MEAs de 4x120 µ µµ µm Fruto de la experiencia obtenida en el trabajo con los microelectrodos de 300 um, se ha decidido trabajar directamente con electrodos orificados, puesto que presentan una mayor sensibilidad en la medición de oxígeno disuelto y una mejor correlación lineal en los calibrados. 4.2.1. Acondicionamiento de los MEAs de 4x120µ µµ µm Análogamente al esquema seguido con los microelectrodos de 300um se ha procedido a diseñar un protocolo de activación, un protocolo de orificación y se ha hecho la caracterización electroquímica de los microelectrodos mediante voltamperometría cíclica. • Protocolo de activación de los MEAs de 120 um Partiendo de la experiencia obtenida en el diseño experimental del protocolo de activación en los microelectrodos de 300um, se partió del protocolo de activación mediante voltamperometría cíclica (tabla 4.2), evaluando la respuesta del electrodo mediante voltamperometría cíclica del par redox Fe 2+ / Fe 3+ . El límite de corriente se estableció en 10uA, dando lugar a una densidad de corriente en la superficie del electrodo de 694 A·m -2 , algo inferior a los 1111 A·m -2 que se daban en los microelectrodos de 300um. La evolución de la respuesta del electrodo tras diversos ciclos de activación se observa en la figura 4.10. Se estableció que los electrodos quedan perfectamente activados tras 15 ciclos de activación. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 59 - A tenor de los resultados se estableció el protocolo de activación especificado en la tabla 4.16: Tabla 4.16. Protocolo activación microelectrodos de 120um. Técnica Cronoamperometría E 1 -2 V Tiempo E 1 10 s E 2 0 V Tiempo E 2 5 s Escalones 15 Fig. 4.10. Voltamperogramas cíclicos de un microelectrodo de 120 um para diversos ciclos de activación mediante cronoamperometría. • Protocolo de orificación de los MEAs de 120 µ µµ µm Partiendo del protocolo de orificación diseñado para los microelectrodos de 300 um, se adaptó la intensidad de corriente acorde a la reducción del área, obteniéndose orificaciones óptimas con los siguientes parámetros: • Intensidad de corriente: -4 uA • Tiempo: 100 s Posterior a la orificación se procedió al recubrimiento de la superficie de los microelectrodos con el hidrogel pHEMA, con el fin de aprovechar las ventajas experimentadas en los microelectrodos de 300 um. -6,00E-07 -4,00E-07 -2,00E-07 0,00E+00 2,00E-07 4,00E-07 6,00E-07 -0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Intensidad (A) Potencial (V) No activado 5 ciclos 10 ciclos 15 ciclos 25 ciclos Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 60 - 4.2.2. Caracterización de los MEAs de 120 µ µµ µm orificados Con los electrodos perfectamente activados se procedió a su caracterización electroquímica, mediante el análisis de los voltamperogramas cíclicos del par redox Fe 2+ / Fe 3+ , análogamente a los electrodos de 300 um. Los resultados obtenidos en la caracterización se pueden observar en la tabla 4.17: Tabla 4.17. Resultados caracterización microelectrodos 120um orificados ΔEp (V) experimental Ipc (uA) Ipa (uA) Ipc/Ipa 0,11 0,79 0,74 1,08 0,11 0,78 0,75 1,04 0,10 0,70 0,64 1,10 0,10 0,67 0,58 1,14 0,11 0,68 0,55 1,24 0,12 0,73 0,64 1,14 En el caso de los microelectrodos de 300 um orificados obtuvimos una intensidad de pico promedio de 3,70 um. Teniendo en cuenta la relación de áreas entre los microelectrodos, la intensidad de pico promedio esperable para éstos electrodos debería ser 6.25 veces menor, es decir, de 0.60 um. La intensidad de pico observada (tabla 4.17) resulta ser 0.69, un 13% superior a lo esperable por su relación geométrica. En esto pueden influir tanto la nueva configuración de la celda, gracias al nuevo diseño de estos MEA con la pcb rígida, como la mejora de la difusión asociada a la disminución de la escala del microelectrodo (ver fig 1.2.) 4.2.3. Calibración como sensores de oxígeno de los microelectrodos orificados y recubiertos con pHEMA Análogamente a como se procedió con los microelectrodos de 300um, se realizó una calibración de los microelectrodos con tal de evaluar su respuesta como sensores de oxigeno y se estudió la evolución de la sensibilidad a lo largo de un día de trabajo. Los resultados de las calibraciones y su evolución en el tiempo se detallan en las tablas 4.18 y 4.19. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 61 - Tabla 4.18. Valores calibrado y evolución en el tiempo microelectrodo de 120um orificado Electrodo Tiempo (h) Sensibilidad (nA/ppm) Ordenada en el origen (nA) R^2 Pérdida de sensibilidad 1 Au 0 -7,19 4,39 0,995 0,00% 1 Au 3 -6,21 2,77 0,995 13,60% 1 Au 7 -5,40 0,61 0,994 24,86% 2 Au 0 -7,16 5,01 0,987 0,00% 2 Au 3 -5,65 2,69 0,995 21,18% 2 Au 7 -4,41 -0,24 0,978 38,39% 3 Au 0 -7,11 3,93 0,985 0,00% 3 Au 3 -5,66 2,33 0,997 20,42% 3 Au 7 -4,59 -0,63 0,989 35,44% Tabla 4.19. Valores calibrado y evolución en el tiempo microelectrodo de 120um orificado y recubierto con hidrogel pHEMA. Electrodo Tiempo (h) Sensibilidad (nA/ppm) Ordenada en el origen (nA) R^2 Pérdida de sensibilidad 1 pHEMA 0 -6,70 -2,97 0,997 0,00% 1 pHEMA 3 -6,08 -2,08 0,999 9,25% 1 pHEMA 7 -5,80 -1,98 0,997 13,45% 2 pHEMA 0 -6,96 -3,22 0,997 0,00% 2 pHEMA 3 -6,30 -0,86 0,998 9,51% 2 pHEMA 7 -6,07 -2,87 0,998 12,71% 3 pHEMA 0 -6,19 -4,68 0,996 0,00% 3 pHEMA 3 -5,79 -3,06 0,995 6,48% 3 pHEMA 7 -5,44 -3,14 0,991 12,02% Como se observa en las tablas anteriores, la sensibilidad de calibración se encuentra en torno a 7 nA/ppm; en comparación con los microelectrodos de 300um, que se obtuvieron sensibilidades en torno a 25 um, y teniendo en cuenta la disminución del área esta sensibilidad es un 75% mayor en relación por unidad de área. Ya habíamos observado este aumento relativo en la señal a la hora de caracterizar los microelectrodos, pero resulta mucho más acusado en el caso de las medidas de oxígeno. Esto probablemente esté relacionado con las concentraciones mucho menores de analito que se dan en el oxigeno, lo cual influye directamente en el efecto limitante de la difusión sobre la intensidad de corriente medida. Observamos de nuevo una evolución muy similar de la señal a lo largo de un día de trabajo, una pérdida en torno al 30% de la señal en el caso de los microelectrodos orificados y poco más de un 10% en el caso de los que han sido modificados con la capa de hidrogel pHEMA, gracias a su efecto antipasivante. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 62 - 4.2.4. Medidas de oxígeno en biomasa con MEAs de 4x120µ µµ µm Como referido en los objetivos, la finalidad global de este estudio era la aplicación de estos microelectrodos como sondas capaces de medir la concentración de oxígeno en el interior de gránulos de biomasa. Tras la completa caracterización, diseño de protocolos y determinación de las mejores condiciones de medida para estos microelectrodos, se procedió a verificar la viabilidad final de la aplicación. 4.2.4.1. Medidas de oxígeno en el medio salino del reactor Con tal de verificar la posible influencia del medio sobre la sensibilidad de los microelectrodos, se realizaron calibrados de oxígeno utilizando este medio. Hasta este momento el medio utilizado había sido una solución salina de KNO 3 0.1M. Esta sal actúa como electrolito soporte, aportando conductividad al medio y facilitando la circulación de cargas, algo básico si queremos evaluar electroquímicamente la muestra. Se extrajo medio salino del reactor y se analizó para conocer su composición, resultando ser un medio muy pobre en sales (menos de 200mg/l – aproximadamente 0.005 M) en comparación al empleado hasta el momento. La baja concentración en sales podría dificultar las medidas de cronoamperometría, al tratarse de un medio de muy baja conductividad. Tabla 4.19. Resultados calibrado como sondas de oxígeno. Electrodos de 120um, medio salino del reactor. Sensibilidad (nA/ppm) Ordenada en el origen (nA) R^2 -3,98 -2,83 0,992 -3,62 -3,39 0,994 -4,46 -6,05 0,986 Como se observa en la tabla 4.19. en el medio de baja conductividad se vio ligeramente disminuida la sensibilidad del microelectrodo, sin embargo la correlación lineal de las calibraciones es satisfactoria. Se concluye de esta prueba la viabilidad de la implementación del microelectrodo como sonda de oxígeno en el reactor, previa calibración del sensor en este medio. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 63 - 4.2.4.2. Perfil de oxígeno en gránulo de biomasa Tras la verificación de la viabilidad de los microelectrodos como sondas de oxígeno en el medio del reactor se procedió a realizar medidas en el interior de uno de los gránulos de biomasa con la finalidad de determinar la distribución de oxígeno que se da dentro de su estructura. El gránulo se atravesó con uno de los MEA (fig 4.11.), y se utilizaron los 4 microelectrodos de éste como puntos de medida a diferentes profundidades del gránulo. Fig. 4.11. MEA de 4x120um atravesando un gránulo de biomasa para elaborar perfil de la distribución de oxígeno en el interior del gránulo. El gránulo se introdujo en la solución salina del reactor, añadiendo 60 mg/L de cloruro de amonio, con el objetivo de garantizar la actividad de los microorganismos nitrificantes. La concentración de oxígeno del medio se midió mediante la sonda comercial, siendo de 7.5 ppm. El gránulo se dejó sumergido en el medio durante una hora, tras lo que se realizaron las primeras medidas de oxígeno mediante cronoamperometría, que se repitieron tras 24 horas. Los resultados del perfil de oxígeno se pueden observar en el gráfico de la figura 4.12. Desarrollo de Microsensores de Oxígeno Disuelto para la Caracterización de Biopelículas - 70 - 18. http://www.crison.es/pdfs/09/crison_9_1.pdf 19. http://aprendeenlinea.udea.edu.co/lms/moodle/mod/resource/view.php?id=54362 20. http://www.answers.com/topic/cyclic-voltammetry 21. http://www.emison.com/145.htm 22. http://www2.ine.gob.mx/publicaciones/libros/396/biofiltra.html 23. http://www.cua.uam.mx/docs/CNI/profesores/archivos/296.pdf 24. http://es.wikipedia.org/wiki/Granulación_aerobia 25. http://en.wikipedia.org/wiki/Field_emission_microscopy 26. http://es.wikipedia.org/wiki/Microscopio_de_fuerza_atómica