DIAGNÓSTICO DE LEISHMANIOSIS CANINA
MEDIANTE LA TÉCNICA DE REACCIÓN
EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):
UN PROCEDIMIENTO SIMPLE PARA USO
EN LA CLÍNICA.
P. Za agoza",
I.
Ma in-Bu iel-, R. Os a-,
M. Gascón-
RESUMEN.
Pa a de ec a la p esencia de Leishmania ssp, en
dis in as mues as clínicas de pe os sospechosos de
padece es a en e medad, se ha u ilizado la écnica
PCR, ampli icando pa a ello un agmen o del gen
SSU RNA, epe ido más de 100 eces en el genoma
del pa ási o. El mé odo se ha op imizado pa a
u iliza lo como mé odo de u ina en la clínica.
El p ocesado de las mues as es ápido y simple. El
diagnós ico se ha ealizado po p esencia/ausencia
del pa ási o, u ilizando pa a ello mues as de sang e,
médula ósea y ganglio lin á ico p incipalmen e. En el
caso de exis i el pa ási o en el huésped se isualiza
una banda ní ida de un amaño de 603 bp y en el
caso de que el pa ási o es é ausen e, no se de ec a la
p esencia de es a banda. Los mejo es esul ados se
ob u ie on cuando la mues a de pa ida ue médula o
ganglio lin á ico. El mé odo p esen a la en aja
adicional de de ec a po ado es asin omá icos,
incluidos los i ulas de
IFI
dudosos. La écnica PCR se
p esen a como es de diagnós ico u ina io, siendo
más ápida, e icaz y económica que los mé odos de
diagnós ico clásicos.
Palab as cla e:.
INTRODUCCIÓN.
Las en e medades endémicas son un iesgo pa a
la calidad de ida y signi ican un iesgo de mo bi-
lidad, debilidad y mo alidad pa a la población.
La salud de la población es un ac o muy impo -
an e a ene en cuen a en un país y po supues-
o egión, pues p oduce un ue e impac o an o
lLabo a o io de Gené ica Bioquímica y G upos
Sanguíneos.
Facul ad de Ve e ina ia.
50013 Za agoza.
2Depa amen o de Pa ología Animal.
Facul ad de Ve e ina ia.
50013 Za agoza.
ABSTRACT.
The echnique PCR has been used in a de o de ec
he p esence o Leishmania ssp in di e en clinic
examples o dogs ha migh su e om his illness.
The echnique was pe o med by ampli ying a
agmen o he gene SSU RNA, ha is epea ed
mo e han a hund ed imes in he
pa así c's
genome.
This me hod has been op imized o use i as a ou ine
me hod in he clinic since he p ocessing o he
specimen is quick and simple.
The diagnos ic was ca ied ou by checking he
p esence/absence o he pa asi e using, mainly, blood
samples, bone ma ow and lympha ic gland. In he
case ha he pa asi e exis ed in he hos , a clea band
wi h a dimension o 603 bp can be isualized. On he
con a y,
i
he pa asi e is absen no clea band can
be isualized.
The bes esul s we e ob ained when he used
samples we e lympha ic gland o bone ma ow. This
me hod shows he addi ional bene i o de ec ing he
asymp oma ic ca ie s, including he doub ul IFI.
The PCR echnique shows o be a as e , mo e
e icien and mo e economic diagnosis han he
classic me hods.
Key wo ds:
económico como social. Las en e medades endé-
micas disminuyen la calidad de ida de una zona,
siendo po an o, muy impo an e pode diagnos-
ica de o ma p ecoz es as en e medades y loca-
liza a sus po ado es.
Los p o ozoos del gene o Leishmania son un
g upo de pa ási os de mo ología simila que cau-
san en e medades en el homb e y en el pe o,
43
Diagnós ico de leishmaniosis canina median e la écnica de eacción en cadena de la pclime asa (peR): Un p ocedimien o simple pa a uso en la clínica. P. Za agoza e
a/.
Clínica Ve e ina ia de Pequeños Animales (A epa) Vol. 20, n" L, 2000.
siendo es a úl ima una zoonosis que p oduce la
mue e en los indi iduos en los que no se ealiza
un diagnós ico cla o y emp ano, Conc e amen e, .
la leishmaniosis es una en e medad endémica en
A agón y de amplio in e és en la ac ualidad ya
que es á conside ada po la OMS como indicado-
a de SIDA
Es a en e medad es de di ícil diagnós ico ya que
pueden exis i pocos pa ási os, incluso en indi i-
duos con apa en e clínica y además su localiza-
ción suele se bas an e e á ica y en o ma de g a-
nulomas no isibles a simple is a,
Las écnicas clásicas de diagnós ico de leishma-
niosis canina se han basado p incipalmen e en la
obse ación mic oscópica del pa ási o en ex en-
siones de aspi ado de nódulo lin á ico y médula
ósea y en mé odos se ológicos como IFI ( Inmu-
no luo escencia Indi ec a) (p ueba de e e encia
de la OMS), El desa ollo de la écnica de PCR
pa a la de ección de dis in os pa ási os (Ma his y
Deplazes, 1995) ha p opo cionado una he a-
mien a ápida y e icaz pa a el diagnós ico de es a
en e medad, Osman
y
cols. (1997) e alua on la
e icacia de es a écnica en e a mé odos clásicos
pa a la de ección de leishmanias en pe sonas que
su ían la en e medad y en pacien es sospechosos
de padece la, encon ando una mayo sensibilidad
de la PCR en e a la mic oscopía,
La PCR es una écnica sensible y especí ica pa a
el diagnós ico de a ias in ecciones, conside án-
dose además al amen e e icaz si los cebado es u i-
lizados pa a el diagnós ico aco an una zona del
genoma del pa ási o, que co esponde a secuen-
cias de más de una copia po célula, En el caso de
la leishmania, es as zonas pueden es a en el kine-
oplas o (pequeños cí culos de DNA),en los que se
incluyen genes muchas eces epe idos,
De las secuencias pe enecien es a es e g upo de
genes mul icopia, podemos indica según la
bibliog a ía consul ada, una se ie de secuencias
candida as: SSU RNA y 18S RNA Es as zonas
son bien conocidas ya que han sido secuenciadas
pa a más de 100 especies incluyendo Leishma-
nia dono ani, T ypanosoma b ucei, T ypanoso-
ma c uzi, C i hidia [ascicula a.
Conoce una zona candida a que nos pe mi a
di e encia con cla idad al pa ási o, del hospeda-
do y del ec o , pe mi i á p opone un nue o
mé odo de diagnós ico. La compa ación de las
secuencias an es indicadas en e humano y pe o
(hospedado ), a ópodos ( ec o ) y Kine oplas o
(pa ási o), las hacen idóneas pa a su posible u ili-
zación (Eys
y
cols., 1995).
El uso de la PCR como mé odo de diagnós ico,
pe mi e desca a , en zonas endémicas, indi iduos
que, aún con i ulación de an icue pos apa en e,
no sean ya po ado es del agen e. Es o lógica-
men e, solo es posible con el diagnós ico di ec o
del agen e causal y en la ac ualidad el mé odo más
ápido, económico, sensible y e icaz es la PCR.
Po odas es as azones el p esen e a ículo p e-
ende demos a la e icacia de la gené ica mole-
cula como he amien a de diagnós ico y así
pode eemplaza o as écnicas hoy u ilizadas y,
desde nues o pun o, de is a menos iables.
MATERIAL Y MÉTODOS.
Ob ención
de
mues as yg upos
de
animales.
A pa i de animales a ec ados de leishmaniosis,
p oceden es p incipalmen e de pe os sospecho-
sos de se po ado es de leishmania que acuden a
la Consul a de Medicina In e na de Pequeños Ani-
males (SMIPA) de la Facul ad de Ve e ina ia de
Za agoza, se han ob enido las siguien es mues-
as:
- Aspi ado de ganglio lin á ico (25 a 100 mI
disuel os en 100 ]JITE pH8).
- Aspi ado de médula ósea (25 a 100 ]JIdisuel-
os en 250 mI TE pH8).
- Sang e, bas a con 500 ]JI.
En e las mues as ecibidas en nues o se icio,
se eligie on animales a ec ados de leishmaniosis
co espondien es a los siguien es g upos:
1. Animales asin omá icos, con í u o de IFI
dudoso (1/60 ó meno ) (20 pe os).
2. Una camada de cinco cacho os, hijos de una
pe a po ado a de leishmania, odos posi i os
se ológicamen e (IFIposi i a a diluciones mayo es
de 1/160).
3. Animales a ados de leishmania, en es e caso
se ealiza on con oles a los 3 meses y al año pos-
a amien o (10 casos).
4. Animales con cuad os clínicos inespeci icos,
inclusi e no compa ibles con el cuad o clásico de
leishmaniosis, donde se desca a leishmania den-
o de un p o ocolo más amplio. Conc e amen e
en es e g upo se incluyen dos casos con sólo sín-
omas de coli is c ónica, sin esponde , e iden e-
men e, a ningún a amien o y sin encon a o a
causa después de ealiza odo el p o ocolo diag-
nós ico, y con í ulos IFI dudosos pa a Leishmania
(posi i o a dilución 1/60).
O o g upo lo cons i ui ía el de los animales cla-
amen e posi i os po IFIy po isualización di ec-
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Diagnós ico de leishmaniosis canina median e la écnica de eacción en cadena de
la
polime asa (peR): Un p ocedimien o simple pa a uso en
la
clínica. P. Za agoza e al.
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2000.
a de leishmania en aspi ados de médula ósea; en
es os casos el clínico u iliza menos la PCR, ya que
las o as écnicas son más asequibles pa a su clí-
nica. E iden emen e en es os casos, los que
hemos ecibido en nues o se icio pa a con as-
a las dos écnicas, siemp e hubo co elación de
la IFI, isualización di ec a y esul ados de la PCR.
En los g upos desc i os más a iba, las mues as
ue on emi idas po que no se obse a on o mas
de leishmanias en los aspi ados de médula ósea.
Ob ención de DNA apa i de sang e, exuda-
do de ganglio lin á ico ymédula ósea.
El ONA se ex ae median e una écnica ápida (4
ho as), basada en la diges ión con p o einasa
K
y
el de e gen e T i ón X-lOO. El p oceso es el
siguien e:
1º. Disolución de 200 ul de mues a en un mI.
de NE (CINa: 0,585 g ; EDTA: 3,725 g ; has a 11
de H2
0;
pH: 7.5).
2º. Agi a y cen i uga a 13.000 pm du an e
un minu o y e i a el sob enadan e ( epe i es
eces). El p ecipi ado ob enido se agi a ené gica-
men e.
3º. Añadi al p ecipi ado 400 mi de una solu-
ción que con iene P o einasa
K
(2x10-
3
g /ml.)
4º. Man ene a 62 "C du an e 1h. 30 m.
5º. Añadi un olumen de Fenal-Clo o o mo
isoamílico. Agi a y cen i uga a 13.000 .p.m.
du an e 10 m.
6º. Recoge la ase acuosa y añadi un 10% de
AcNA 3M y 2 olúmenes de e anol absolu o.
Man ene a -70 "C du an e 5 m.
7º. Cen i uga a 13.000 .p.m. du an e 5 m. y
as e i a el sob enadan e, la a con e anol al
70%, cen i ugando un minu o.
8º. Seca la mues a (no malmen e con Speed
Vac),
y es au a en dis in as can idades de TE
(1,208 g . de T is ClH, 0,372 g . EDTA en 11de
H20,
Ph 8).
9º. Conse a congelado a -30
oc.
Búsqueda de secuencias de los dis in os genes
candida os en las bases de da os.
Pa a la búsqueda de las posibles secuencias de
ONA, que pe mi an su u ilización pa a el diag-
nós ico de Leishmaniosis canina, se ha comenza-
do el es udio de aquellas que p esen an un mayo
g ado de homología en e las dis in as especies de
Leishmania.
El es udio se ealizó en las bases de da os EMB
y Gen Bank, cuya di ección en in e ne es:
h p://www.ncbi.nlm.nih.go /index.h ml.
Diseño de los p ime s.
A pa i de las secuencias ob enidas en las bases
de da os, y la in o mación ob enida en la biblio-
g a ía (Ma his y Deplazes, 1995), se eligió la
ampli icación de una zona del gen que codi ica la
subunidad pequeña del RNA (SSU RN). Los p i-
me s elegidos ue on:
P 22l: GGT TCC TTT CCT GAT TIA CG
P 332: GGC CGG TAA AGG CCG AAT AG
Ampli icación del DNA con los p ime s dise-
ñados.
La eacción de ampli icación ue lle ada a cabo
median e un e mociclado 9600 Pe kin Elme . El
olumen de la mues a empleado ue de 15 mI.
Como pa áme os más impo an es se busca án
las condiciones de iempo y empe a u a que nos
pe mi a la ob ención de bandas ní idas e in ensas.
Se u iliza on 35 ciclos pa a ealiza la ampli ica-
ción:
94 °C__5'
94 °C__
l'
60 °C__
l'
72 °C__
l'
35 ciclos
72 °C__lO'
4 °C_ has a ecoge la mues a
Análisis de los agmen os ampli icados.
A pa i de un olumen de 15 mi de p oduc o
ampli icado se ealizó elec o o esis ho izon al en
gel de aga osa al 2% y inción con b omu o de e i-
dio, pa a la isualización pos e io con UVA de los
agmen os ob enidos.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Pa a de ec a la p esencia de Leishmania spp,
en dis in as mues as clínicas de pe os sospecho-
sos de padece es a en e medad, se ha u ilizado la
écnica PCR, ampli icando pa a ello un agmen-
o del gen SSU RNA, epe ido más de 100 eces
en el genoma del pa ási o (Uliana ycols. 1991;
Van Eys ycols., 1992). Conc e amen e el ag-
men o ob enido en el caso de de ec a la p esen-
cia del pa ási o en el huésped, ué de un amaño
de 603 bp ( éase Fig. 1).
Es necesa io indica que pa alelamen e y pa a
sabe si el agmen o ampli icado de 603bp, se
ili
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Diagnós ico de leishmaniosis canina median e la écnica de eacción en cadena de la polime asa (peR): Un p ocedimien o simple pa a uso en la clínica. P. Za agoza
e
al.
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l,
2000.
4-
603 bp
123 4
5
67
Fig.
1.
Dianós ico po peR de Leishmaniosis canina. De ección de p o-
duc os ampli icados después de una elec o o esis ho izon al en gel de aga osa
y inción con B omu o de e idio. El agmen o de 603 bp. co esponde al ONA
ampli icado de Leishmania. Línea 1: ma cado de alla: BRL 1Kb. Línea 2:
Con ol in e no posi i o (animal en e mo). Línea 3: Mues a 1 (posi i a a Leish-
mania). Línea 4: Mues a 2 (nega i a a Leishmania). Línea 5: Mues a 3 (posi-
i a a Leishmania). Línea 6: Con ol in e no nega i o (animal sano). Línea 7:
Mues a sin ONA.
co esponde ealmen e con agmen os de Leish-
mania, se ealizó diges ión del mismo con dis in-
as enzimas de es icción, analizando los dis in os
modelos ob enidos y compa ándolos con la
bibliog a ía exis en e. Conc e amen e cuando se
digie e con la enzima de es icción Hae3, el ag-
men o de 603bp se digie e en 6 agmen os de
allas: 281bp, 24bp, 211bp, 4bp, 71bp y 13bp.
Logicamen e en un gel de aga osa solamen e los
agmen os más g andes se pueden isualiza
( éase Fig. 2). T as comp oba que la banda ob e-
nida co esponde especí icamen e a Leishmania y
pa a e i a alsos posi i os, en cada diagnós ico se
incluyó el análisis de un animal sano y un con ol
nega i o (mues a sin ONA), así como un con ol
posi i o de ampli icación (animal en e mo). En
odas la mues as nega i as (ausencia del pa ási o)
se ealizó la comp obación de exis encia de ONA,
como mé odo de con o!.
La meno sensibilidad de la écnica 'se obse ó
cuando la mues a es sang e pe i é ica, al ez po
el limi ado iempo de pe manencia del pa ási o en
sang e. Ello nos indica que es a mues a no es
adecuada pa a el diagnós ico, es a obse ación es
álida pa a odos los g upos.
En odos los casos en los que' se u ilizó como
ma e ial biológico médula ósea y siemp e que el
análisis mic oscópico ue posi i o, el diagnós ico
po PCR ambién lo ue. Igualmen e, en más de
un 95% de los casos de animales sospechosos de
padece la en e medad, así cómo en animales a-
ados p e iamen e en e a leishmaniosis, el diag-
nós ico po PCR de e minó la p esencia del pa á-
si o, a pesa de que el bajo g ado de pa asi osis
había impedido la isualización de Leishmanias,
~71bp
1
2
3
4
5
Fig. 2. P ueba de que el agmen o de 603 bp. co espon e con el gen
SSU RNA de Leishmania. Pa ones de es icción ob enidos con la enzima
Hae 3, as la ampli icación de agmen o de 603 bp del gen SSU RNA de
Leishmania. Línea 1: ma cado de alla: BRL 1Kb. Línea 2: agmen o ampli-
icado sin dige i ( alla: 603 bp). Línea 3,4 y5: Ampli icación dige ida con Hae
( agmen os de 281 bp, 211 bp y71 bp).
en el caso de o is medula . Es a ci cuns ancia es
ecuen e encon a la en el g upo C, animales a-
ados, en los que as el a amien o, si el clínico
se deja lle a po los esul ados de la IFI y la isua-
lización di ec a de leishmania en mues as de
médula ósea, puede da al animal como cu ado,
al encon a í ulos bajos y no obse a Leishma-
nias en la médula, a ios de los casos analizados
de es e g upo p esen a on es a ci cuns ancia y en
cambio die on posi i os en el PCR de mues as
medula es. No obs an e, hemos encon ado ani-
males a ados que llegan a se PCR nega i os
unos meses después del a amien o: ¿Cu ados ó
po ado es asin omá icos? ¿Depende del p o oco-
lo u ilizado?¿Es á en elación con la espues a
inmuni a ia de cada animal y en unción del es a-
día e olu i o de la en e medad en el momen o de
inicia el a amien o? ¿Puede ocu i que en zonas
endémicas el animal se ein es e? Es as son p e-
gun as cuya espues a no es ácil, la opinión de
los clínicos es á di idida y que equie e el segui-
mien o a la go plazo de un mayo núme o de
casos. De los 10 casos es udiados 7 die on nega-
i os po PCR a los 3 meses, y en 4 de es os 7
casos la PCR ol ió a se posi i a al año de habe
sup imido el a amien o.
En mues as con í ulos se ológicos de 1/60
(g upo A) se ob u ie on diagnós icos posi i os po
PCR (8 animales) y ambién nega i os (12 anima-
les). Los casos que incluimos en es e g upo ue on
aquellos casos en los que la ausencia de sín omas
podía inclina al clínico hacia la nega i idad, ó
bien al p opie a io se le había o ecido el inicia
un p o ocolo de a amien o en base a una posi-
ble posi i idad. En ambos supues os se decidió en
ili
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Diagnós ico de leishmaniosis canina median e la écnica de eacción en cadena de la polime asa (peR): Un p ocedimien o simple pa a uso en la clínica. P. Za agoza e al.
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l.
2000.
odos los casos con as a con la PCR pa a ase-
gu a el diagnós ico. O a al e na i a se ía espe a
un pe iodo de iempo y ol e a epe i la se olo-
gía; no suge imos es a opción pues en nues as
ap eciaciones pe sonales hemos is o como en
algunos casos, en el pe iodo de espe a, cuad os
isce ales sin sín omas dé micos han a anzado lo
su icien e como pa a suge i la eu anasia del ani-
mal (po desa ollo p incipalmen e de insu icien-
cias enales g a es). Tan o en un supues o como
en o o, la PCR esuel e las dudas en cues ión de
ho as e i ando e o es lamen ables.
En el g upo S, los cacho os enían í ulo sc o-
lógico al o, pe o ue on desca ados de padece la
en e medad as el diagnós ico po PCR, que ue
nega i o en odos ellos. Es e esul ado es debido
a la p esencia de an icue pos p o enien es de la
mad e en el cacho o, sin exis i el agen e e ioló-
gico en los mismos. La combinación de IFI - PCR
en es e caso di e encia si el animal es po ado del
agen e e iológico y iene an icue pos ó, como en
los cacho os es udiados, hay an icue pos pe o no
agen e e iológico.
Se es a ealizando en es e momen o el es udio
de la especi icidad y sensibilidad de la écnica PCR
compa ada con el es o de mé odos de diagnós i-
co, u ilizados de o ma habi ual. Pa a ello se p o-
BIBLIOGRAFIA.
1. Ashlo d DA, Bozza M. F ei e M, Mi anda JC, She lock I, Eulalia C. Lopes
U, F emamdes O, Deg a e W, Ba ke RH. Bada o R. Da id JR. Compa-
ison ol he polyme ase chain eac ion and se ology la he de ec ion ol
canine isce alleishmaniasis. Am. J]. T op. Med. Hyg. 1995; 53: 251-
255.
2. Blackwell JM. Leishmaniasis epidemiology: all down o he DNA. Pa asi-
ology 1992; 104 supp: S19-34.
3. B ujin MHI, Lab ada LA, Smy h AJ, San ich C, Ba ke DC. A compa-
a i e s udy ol diagnosis by he polyme ase chain eac ion and by cu en
c1inical me hods using biopsias
í om
Colombian pa ien s wi h suspec ed
leishmaniasis. T opi. Med. Pa asi ol. 1993; 44: 201-207.
4. Deg ade W, Fe nandes O, Campbell D, Bozza M, Lopes U. Use o mole-
cula p obes and PCR Io de ec ion and yping ol Leishmania - a mini
e iew. Men lns Oswaldo C uz 1994; 89: 463-469.
5. Laskay T, Miko TL. Negesse Y. Solbach W, Rollinghol MY. F ommel D.
De ec ion o cu aneous Leishmania inlec ion in pa al in-embedded skin
biopsies using he polyme ase chain eac ion. T ons R. Soc T op Med
Hyg 1995; 89: 273-275.
6. Ma his A, Deplazes P. PCR and in i o cul i a ion o de ec ion ol Leish·
mania spp. in diagnos ic samples I om humans and dogs. Joumal o/ cli-
nicol mic obiology. 1995; 3: 1145-1149.
cesa án los sue os po Inmuno luo escencia Indi-
ec a (IFI)y Aglu inación Di ec a (AD) y una ez
analizadas las biopsias de nódulo lin á ico y médu-
la ósea, además de la sang e, se analiza á es adís-
icamen e la conco dancia de los esul ados de
cada una de es as p uebas con los esul ados de la
PCR.
CONCLUSIÓN FINAL.
Po la simplicidad, economía, iempo, apidez,
sensibilidad de la écnica, se p opone como mé o-
do de diagnós ico de leishmaniosis canina, el
mé odo PCR a pa i de exudado de ganglio lin-
á ico o biopsia de médula ósea, sin desca a el
posible uso de o as mues as como piel has a
aho a no analizadas. Las mues as de sang e pe i-
é ica no son adecuadas pa a es e ipo de es .
Hemos p esen ado di e en es supues os en los
que la inclusión de la PCR en el diagnós ico de
leishmaniasis pe mi e al clínico gana iempo pa a
ins au a un a amien o más p ecoz, hace el
seguimien o del animal an es, du an e y después
del mismo, y e i a en o os casos e o es diag-
nós icos, y así, si uaciones emba azosas.
7. Osman FO. Oskan LM. Zijls a ED. K oon MM, Schoones GJM, Tahl E.
Khalil AG. Hassan AM, Kage PA. E alua ion o PCR o diagnosis o is-
ce al Leishmaniasís. Joumal o/ clinical mic obiology. 1997; 35: 2454-
2457.
8. Ouelle e M, Papadopoulou B, Oli ie M. Nou eaux aspec s moléculai es e
ceUulai esdu pa asi e Leishmania. Médecin<iScience. 1997; 13: 934-941.
9. Pia oux R, Gamba elli F. Dumon H. Fon es M, Dunan S, Ma y CH. Toga
B, Quilici M. Compa ison ol PCR wi h di ec examina ion lo bone .
ma ow aspí a íon, myelocul u e, and se ology la diagnosis ol isce al
leishmaniasi in immunocomp omised pa ien s. Joumal o/ clinical mic o-
biology. 1994; 32: 746-749.
10. Pague GP, Lee NS. Koul S. Dwye DM. Nakhasi HL. Iden ilica ion ol dil-
e en ially exp esed Leishmania dono ani genes using a bi a ily p imed
polyme ase chain eac ions.
J
Gene. 1995; 165: 31-38.
11. Uliana SR, Al onso MHT, Cama o EP, F1oe e-Win e LM. Leishmania:
genus iden i ica ion base on a speci ic sequence ol he 18S ibosomal
RNA sequence. Exp Pa asi o/. 1991; 72: 157-163.
12. Van Eys GJJ, Schoone GJ. K oom NCM, Ebeling SB. Sequence analysis
o small subuni ibosomal RNA genes and i s use o de ec ion and iden- .
i ica ion lo Leishmania pa asi es. Molecula and Biochemical Pa asi·
ology. 1992; 51: 133-142.
ili
47