Estudi de la interpretació entre els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack

Universitat Autònoma de Barcelona Facultat de Ciències Departament de Bioquímica i Biologia Molecular TESI DOCTORAL Estudi de la interacció entre els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack Sara Pagans i Lista Novembre del 2002 Programa de Bioquímica i Biologia Molecular Estudi de la interacció entre els factors de transcripció de Drosophila GAGA i Tramtrack Memòria presentada per la Sara Pagans i Lista per aspirar al grau de Doctor en Bioquímica i Biologia Molecular. Aquest treball ha estat realitzat sota la direcció del Dr. Ferran Azorín i Marín en el Departament de Biologia Molecular i Cel.lular de l’Institut de Biologia Molecular de Barcelona (IBMB-CSIC). Vist-i-plau del director: Vist-i-plau del tutor: Dr. Ferran Azorín i Marín Dra. M. Carmen Martínez I. Índex 1 I.-ÍNDEX I. Índex 2 I. Índex 3 ÍNDEX DE MATÈRIES I. ÍNDEX 1 ÍNDEX DE MATÈRIES 3 ÍNDEX DE TAULES I FIGURES 11 ABREVIATURES 15 II. INTRODUCCIÓ 17 1. Mecanismes de regulació de la transcripció 19 1.1. El procés de transcripció a eucariotes 19 1.1.1. Estructura dels promotors Pol II 19 1.1.2. Transcripció basal 20 1.1.3. Iniciació 21 1.1.3.1. RNA Polimerasa II (RNAP II) 21 1.1.3.2. Factors generals de transcripció o GTFs 22 1.1.3.3. El “Mediator” 23 1.1.4. Elongació i reiniciació 24 1.2. La transcripció en presència de cromatina 25 1.2.1. Efectes de l’estructura de la cromatina en la transcripció 25 1.2.1.1. Els nucleosomes i la cromatina 25 1.2.1.2. Paper repressor dels nucleosomes i la cromatina 25 1.2.1.3. Eucromatina i heterocromatina 26 1.2.2. Complexes remodeladors de la cromatina 27 1.2.3. Modificacions post-traduccionals de les histones 30 1.2.3.1. Acetilació/desacetilació d’histones 31 1.2.3.2. Metilació d’histones 35 1.2.3.3. Fosforilació d’histones 36 1.2.3.4. Ubiquitinització d’histones 37 1.2.3.5. Metilació del DNA i la seva connexió amb HDACs i HMTs 37 1.2.4. Reclutament dels complexes remodeladors i modificadors de la cromatina 38 I. Índex 4 1.2.5. Elongació i cromatina 39 1.3. Mecanismes d’activació i de repressió 40 1.3.1. Activació 41 1.3.1.1. Classificació dels activadors 41 1.3.1.2. Mecanismes d’activació 42 1.3.1.3. Actuacions sinèrgiques dels activadors 43 1.3.2. Repressió 44 1.3.2.1. Mecanismes de repressió 44 1.3.2.2. Long-range/short-range repression 46 1.3.2.3. La repressió long-range mediada per Groucho 47 1.3.2.4. La repressió short-range mediada per dCtBP 48 1.3.3. Factors de transcripció involucrats en procesos d’activació i de repressió 50 2. GAGA i Tramtrack, dos factors de transcripció amb dominis POZ 51 2.1. Els dominis POZ/BTB 51 2.1.1. Proteïnes amb dominis POZ 51 2.1.2. Dominis associats 52 2.1.3. Interaccions entre proteïnes mediades pel domini POZ 53 2.1.4. Estructura del domini POZ 54 2.1.5. Funcions associades al domini POZ 56 2.1.5.1. Modulació de l’activitat transcripcional 57 2.1.5.2. Modulació de la unió al DNA 58 2.1.5.3. Localització nuclear 59 2.2. La proteïna GAGA 59 2.2.1. Isoformes de GAGA 59 2.2.2. Dominis de GAGA 61 2.2.2.1. El domini POZ/BTB de GAGA 61 2.2.2.2. La regió X 62 2.2.2.3. El domini d’unió a DNA de GAGA 62 2.2.2.4. El domini ric en glutamines o domini Q 64 2.2.3. Funcions de GAGA 64 2.2.3.1. GAGA com a factor de transcripció 64 2.2.3.2. GAGA i la remodelació de la cromatina 65 I. Índex 5 2.2.3.3. GAGA en la regulació dels gens homeòtics 66 2.2.3.4. GAGA en els insulators 67 2.2.3.5. GAGA i heterocromatina 68 2.3. La proteïna Tramtrack 68 2.3.1. Isoformes de TTK 69 2.3.2. Dominis de TTK 70 2.3.2.1. El domini POZ/BTB de TTK 70 2.2.2.2. El domini d’unió a DNA de TTK 71 2.3.3. Funcions de TTK 72 2.3.3.1. TTK69 i els gens “pair-rule” 72 2.3.3.2. TTK en la regulació del destí neuronal 74 2.3.3.3. Possibles mecanismes d’actuació de TTK 75 III. OBJECTIUS 77 IV. MATERIALS I MÈTODES 81 1. Materials 83 1.1. Enzims i reactius 83 1.2. DNA: plàsmids i oligonucleòtids 83 1.2.1. Plàsmids 83 1.2.1.1. Plàsmids bàsics 83 1.2.1.2. Plàsmids d’expressió de proteïnes en bacteris 84 1.2.1.3. Plàsmids de dos híbrids 85 1.2.1.4. Plàsmids de transfecció a SL2 86 1.2.2. Oligonucleòtids 89 1.3. Proteïnes recombinants 91 1.4. Soques i línies cel.lulars 91 1.4.1. Soques bacterianes d’E. coli 91 1.4.2. Soques de S. cerevisiae 92 1.4.3. Línies cel.lulars eucariotes 92 I. Índex 6 1.5. Anticossos 92 2. Mètodes 95 2.1. Mètodes de manipulació del DNA 95 2.1.1. Mètodes d’obtenció de DNA 95 2.1.1.1. Minipreparacions de DNA 95 2.1.1.2. Maxipreparacions de DNA 95 2.1.2. Transformació del DNA en bacteris 95 2.2. Tècniques bàsiques de proteïnes 96 2.2.1. Anàlisi de proteïnes per electroforesi en gels de poliacrilamidaSDS (SDS-PAGE) 96 2.2.2. Anàlisi de proteïnes per Western blot 97 2.3. Expressió i purificació de proteïnes recombinants 97 2.3.1. Expressió i purificació de proteïnes fusionades a una cua d’histidines 97 2.3.1.1. Tramtrack69 98 2.3.1.2. GAGA-519 101 2.3.2. Expressió i purificació de proteïnes fusionades a GST 102 2.4. Obtenció i purificació d’anticossos 103 2.4.1. Obtenció d’anticossos policlonals α-TTK 103 2.4.1.1. Preparació de l’antigen 103 2.4.1.2. Immunització 104 2.4.1.3. Processament de la sang 104 2.4.2. Purificació d’anticossos 104 2.4.2.1. Fraccionament o precipitació amb sulfat amònic del sèrum α-TTK 105 2.4.2.2. Purificació per afinitat del sèrum α-TTK 105 2.5. Experiments de co-immunoprecipitació 106 2.6. Assaig d’interacció proteïna-proteïna in vitro: GST-pulldowns 108 2.6.1. In vitro transcripció-traducció en lisat de reticulòcits 108 2.6.2. Preparació de les proteïnes de fusió unides a Glutatió Sepharosa 109 I. Índex 7 2.6.3. Assaig GST-pulldown 109 2.7. Assaig de dos híbrids a S. cerevisiae 110 2.7.1. Manteniment de les cèl.ules de S. cerevisiae 110 2.7.1.1. Creixement 110 2.7.1.2. Congelació 111 2.7.1.3. Descongelació 111 2.7.2. Transformació dels llevats per acetat de liti 111 2.7.3. Anàlisi de les interaccions per creixement en placa 112 2.8. Mètodes de treball amb SL2 112 2.8.1. Manteniment de les cèl.ules 112 2.8.1.1. Creixement 112 2.8.1.2. Congelació 113 2.8.1.3. Descongelació 113 2.8.2. Transfecció pel mètode de fosfat càlcic 113 2.8.3. Assajos de transcripció a cèl.lules SL2 114 2.8.3.1. Transfecció i preparació dels extractes cel.lulars 114 2.8.3.2. Determinació de les activitats luciferasa i β-galactosidasa 115 2.8.4. Immunolocalitzacions a cèl.ules SL2 116 2.8.5. Extracció àcida d’histones 118 2.9. Mètodes d’anàlisi d’interaccions DNA-proteïna in vitro 119 2.9.1. Marcatge radioactiu dels fragments de DNA 119 2.9.2. Electroforesi en gels de retardament (EMSA) 120 2.9.3. Footprinting amb DNasa I 120 2.9.3.1. Marcador G+A 121 2.9.3.2. Digestió amb DNasa I 121 V. RESULTATS I DISCUSSIÓ 123 1. Estudi de la interacció entre les proteïnes GAGA i TTK 125 1.1. Experiments de co-immunoprecipitació en extractes cel.lulars de SL2 126 1.2. Anàlisi de la interacció GAGA-TTK in vitro: GST-pulldowns 128 I. Índex 14 I. Índex 15 ABREVIATURES aa Aminoàcid BSA Albúmina de sèrum boví dNTP Desoxiribonucleòtids trifosfats DNasa I Desoxiribonucleasa DNMT DNA metilasa DO Densitat òptica DTT Ditiotreitol ECL Enhanced Chemiluminescence EDTA Àcid etilen-diamo-tetracètic EMSA Electrophoretic mobility shift assay HAT Acetiltransferasa d’histones HDAC Desacetilasa d’histones HMT Metiltransferasa d’histones HEPES Àcid N-2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfònic IPTG Isopropil-b-D-tiogalactopiranòsid kpb 103 parells de bases kDa 103 Daltons LB Luria Bertrani, liquid broth NP-40 Nonidet P-40 NuRCs Complexes remodeladors de la cromatina o/n Overnight PAGE Poliacrilamide gel electrophoresis pb Parells de bases PBS Phosphate buffer saline PCR Reacció en cadena de la polimerasa PEV Position effect variegation PIC Complex de preiniciació PLB Protein loading buffer PMSF Fluor Fenilmetilsulfonil PSA Persulfat amònic RNasa Ribonucleasa rpm Revolucions per minut SDS Dodecil sulfat sòdic Tª Temperatura TEMED N,N,N’-(tetrametil)-etilendiamino TSA Trichostatina A TTK Tramtrack I. Índex 16 II. Introducció 17 II.-INTRODUCCIÓ II. Introducció 18 II. Introducció 19 1. MECANISMES DE REGULACIÓ DE LA TRANSCRIPCIÓ 1.1. El procés de transcripció a eucariotes La transcripció és el procés pel qual una RNA polimerasa sintetitza una cadena de RNA a partir d’un DNA motlle. En els organismes eucariotes existeixen tres tipus de RNA polimerases (I, II i III), de les quals la RNA polimerasa II (RNAP II) és la responsable de la síntesi dels mRNAs que codifiquen per proteïnes (així com també d’alguns snRNAs). La transcripció per una RNA polimerasa determinada està associada a una arquitectura concreta del gen. Així, es poden definir com a gens de classe II aquells que estan regulats per la RNAP II. 1.1.1. Estructura dels promotors Pol II Els elements de seqüència en cis que dirigeixen un programa concret de transcripció per la RNAP II inclouen la regió basal del promotor (core) i els elments enhancer. La regió basal del promotor (core promoter) comprèn les seqüències mínimes que dirigeixen el reclutament de la RNAP II i el lloc d’inici de la transcripció. Els elements del core estan situats entre –35 i +35 bases del lloc d’inici de transcripció, i constitueixen llocs de reconeixement pels factors involucrats en l’inici de la transcripció. Aquests elements són variables en seqüència i es poden presentar en forma de diferents combinacions a l’hora de constituir el core (revisat a Veenstra i Wolffe, 2001): -la caixa TATA, de seqüència consens TATAAA, està situada al voltant de la posició –25/–30 i és reconeguda de manera específica per la proteïna TBP (TATA binding protein). -l’element BRE (IIB recognition element), situat a 5’ de la caixa TATA i de seqüència consens (G/C)(G/C)(G/A)GGCC, és un element de reconeixement pel factor TFIIB. -l’element iniciador (Inr), responsable d’assenyalar el lloc d’inici de transcripció (i localitzat al voltant d’aquest), és reconegut per alguns TAFs (TBP associated factors) del complex TFIID. A Drosophila té com a seqüència consens TCA(T/G)TPyPy. -l’element DPE (downstream promoter element), de seqüència consens (A/G)G(A/T)CGTG, va ser identificat originalment en promotors de Drosophila, tot i que II. Introducció 20 també s’ha trobat en alguns promotors de mamífers. Està situat a la posició +30 i consitueix un element de reconeixement per TAFs (Smale, 2001; Butler i Kadonaga, 2001). Els enhancers són elements de reconeixement per a factors de transcripció específics de seqüència. Es caracteritzen per poder activar la transcripció independentment de la seva orientació o distància relativa al lloc d’inici de transcripció. Segons la seva localització, s’han definit dos tipus d’enhancers: els enhancers proximals, situats entre 50 i centenars de bases a 5’ de l’inici de transcripció, i els enhancers distals, que es troben fins a milers de kilobases upstream o downstream de l’inici de transcripció (Orphanides et al, 1996; Lemon i Tjian, 2000; Butler i Kadonaga, 2001). El mecanisme pel qual funcionen aquests enhancers distals és encara un interrogant, tot i que s’han descrit alguns models que proposen la formació de loops de DNA, deslliçament de proteïnes al llarg del DNA o la generació de grans dominis cromatínics que facilitarien o impedirien l’activació gènica (Mahmoudi et al, 2002). De manèra anàloga als enhancers, es poden definir també com a silencers els elements de reconeixement per moduladors negatius de la transcripció (repressors); poden estar també situats en regions properes o llunyanes a l’inici de transcripció segons el mode d’actuació del repressor (veure apartat 1.3.2.2: long/short–range repression). El fet de poder trobar seqüències reguladores molt llunyanes a l’inici de transcripció així com dins la seqüència codificant fa realment difícil poder definir els límits d’un promotor. No obstant, sí que s’empra sovint el terme de promotor proximal com la regió compresa fins a centenars de bases del lloc d’inici de transcripció i que conté elements de seqüència reconeguts per factors moduladors de la transcripció. 1.1.2.Transcripció basal La transcripció basal es defineix com el procés de transcripció que té lloc in vitro en presència de l’aparell de transcripció basal, constituït pels factors generals de transcripció (GTFs) i la RNAP II. En aquest context, la presència de molècules reguladores (activadors o repressors) que s’uneixen a seqüències concretes del promotor, donarà lloc a una transcripció activada o reprimida (Orphanides et al, 1996). A la cèl.lula, aquesta divisió entre transcripció basal i activada no té cap sentit: l’empaquetament del DNA en forma de cromatina provoca una repressió generalitzada, i només la presència d’activadors induirà l’expressió d’un gen concret. Per tant, in vivo només es pot parlar de transcripció activada. No obstant, els estudis de transcripció basal in vitro han permès obtenir una visió seqüencial de la mecanística del procés. D’aquests estudis sorgí la divisió del procés de transcripció en tres etapes: iniciació, elongació i “terminació”. La iniciació comprèn en primer lloc una primera fase anomenada preiniciació, en la qual els GTFs s’uneixen al promotor basal i recluten la RNAP II, formant el complex de preiniciació (PIC). Una vegada el PIC està ensamblat al promotor, es separen les cadenes de DNA (promoter melting) de II. Introducció 21 forma depenent d’ATP, i la RNAP II sintetitza el primer enllaç fosfodièster del mRNA naixent. La transició iniciació-elongació inclou un alliberament de la RNAP II del promotor (promoter clearence), acompanyat d’una hiperfosforilació de la CTD de la RNAP II. A partir d’aleshores, la RNAP II s’associa a factors d’elongació que, juntament amb altres factors reguladors, facilitaran la transcripció del mRNA. La “terminació” pròpiament dita culmina amb el final de la síntesi del mRNA per part de la RNAP II. El processament d’aquest pre-mRNA (5’ capping, splicing i alliberament de la cua poli-A) s’ha observat que té lloc co-transcripcionalment, i les reaccions que el constitueixen estan coordinades i interconnectades amb el procés de transcripció (Proudfoot et al, 2002). 1.1.3. Iniciació Les característiques principals dels components de la maquinària transcripcional durant el procés d’iniciació es descriuen a continuació: 1.1.3.1. RNA polimerasa II (RNAP II) La RNAP II, constituïda per 12 subunitats, pot catalitzar inespecíficament la síntesi d’un RNA a partir d’un DNA motlle, però requereix dels GTFs per reconèixer de forma específica un promotor. Un dels elelments clau de la RNAP II, tant en la regulació de la transcripció com en la coordinació co-transcripcional de les reaccions de processament del mRNA, és el domini Cterminal (CTD) de la subunitat major Rpb1. El domini CTD és hiperfosforilat (forma IIA) quan la RNAP II està elongant de forma activa, mentre que per iniciar la transcripció ha d’estar defosforilat (forma IIO). Aquesta fosforilació permet que la RNAP II s’alliberi del promotor i els GTFs, però no afecta a la seva capacitat d’elongació. Hi ha descrites vàries CTD quinases: la cdk8/ciclinaC del “Mediator”, que fosforila la CTD abans de l’ensamblatge del PIC (Hampsey i Reinberg, 1999); la cdk7 del TFIIH, clau en la transició iniciació-elongació; i el pTEF-b, factor d’elongació responsable de retornar a l’estat actiu la RNAP II després de l’addició del capping. Com a CTD fosfatasa només es coneix la Fcp1, reponsable de reciclar la forma fosforilada de la RNAP II (Woychik i Hampsey, 2002). A més de ser sensible a fosforilació, el domini CTD és també un lloc d’interacció amb altres factors moduladors de la transcripció (“Mediator” o “Elongator”) o el processament del mRNA (Proudfoot et al, 2002). Així doncs, el CTD serveix com a plataforma per a l’ensamblatge ordenat dels factors responsables de la transcripció i processament del mRNA durant les diferents etapes de síntesi del trànscrit (Orphanides i Reinberg, 2002). II. Introducció 22 1.1.3.2. Factors generals de transcripció o GTFs • TFIID: El complex TFIID està constituït per la TBP (TATA binding protein) i uns deu TAFIIs (TBP-associated factors). La TBP s’uneix específicament a les caixes TATA dels promotors, un pas que s’ha descrit com el més limitant de tota la regulació de la transcripció (Colgan i Manley, 1992). Els TAFIIs, no requerits en la transcripció basal, van ser descrits inicialment com a coactivadors que mediaven la interacció entre activadors transcripcionals i la maquinària basal (Verrijzer i Tjian, 1996); no obstant, recentment s’ha pogut descriure activació independent de TAFIIs (Oelgeschlager et al, 1998), posant en dubte el paper essencial dels TAFIIs com a co-activadors. D’altra banda, degut a la capacitat d’alguns TAFIIs d’unir-se a als elements Inr i DPE del promotor i al seu requeriment en promotors sense caixa TATA, es considera que una de les funcions més importants dels TAFIIs seria la de reclutar la TBP en promotors sense TATA (Orphanides et al, 1996; Woychik i Hampsey, 2002). S’ha proposat també que la unió al DNA d’alguns TAFIIs (histone-like TAFIIs) podria ser en forma d’un octàmer similar a les histones, i de fet recentment s’ha aconseguit reconstituir un octàmer de TAFs in vitro (Selleck et al, 2001), però es desconeix si in vivo també adoptarien aquesta estructura. Aquests histone-like TAFIIs no són específics per TFIID, sinó que també formen part de complexes acetiltransferasa d’histones com SAGA, PCAF o TFTC, havent-se suggerit un paper d’aquests TAFIIs com a elements core de múltiples complexes. L’únic TAFII al que se li ha descrit activitat enzimàtica és el TAFII250, concretament activitats quinasa (es pot autofosforilar i fosforilar la subunitat RAP74 de TFIIF) i acetiltransferasa d’histones. • TFIIB: El segon pas de la iniciació és el reconeixement del complex TFIID-DNA per TFIIB i la formació d’un complex ternari TFIIB-TFIID-DNA molt estable. Degut a que TFIIB té llocs d’unió per RNAP II i TFIIF, s’ha proposat que TFIIB participa en el reclutament de la RNAP II i en la determinació precisa del lloc d’inici de la transcripció (revisat a Orphanides et al, 1996). No obstant, estudis molt recents suggereixen que la unió de TFIIB a l’element BRE de fet reprimiria la transcripció basal, essent la disrupció de la interacció BRE-TFIIB per part d’un activador (TFIIB és una diana per alguns activadors acídics o rics en glutamines) un mecanisme d’activació gènica (Evans et al, 2001). • TFIIA: TFIIA també s’uneix al complex TFIID-DNA i incrementa l’estabilitat de TBP per l’element TATA independentment de TFIIB (Imbalzano et al, 1994). Associada a aquesta funció estabilitzadora, a TFIIA se li ha atribuït també una funció antirepressora, que implicaria un desplaçament de factors que estan units al DNA tant de forma específica (repressors específics) com inespecífica. II. Introducció 23 • TFIIF: TFIIF és un heterotetràmer format per dues subunitats grans (TFIIFα/RAP74) i dues de petites (TFIIFβ/RAP30) que participen en diferents estadis de la iniciació i l’elongació. En la iniciació, TFIIF s’associa amb la RNAP II per incrementar l’eficiència de reclutament d’aquesta. A més a més, també té una funció desestabilitzadora d’interaccions RNAP IIDNA inespecífiques, evitant una iniciació expúria (Woychik i Hampsey, 2002). La funció de TFIIF durant l’elongació, en la qual hi participa activament augmentant-ne la velocitat, és totalment depenent de la subunitat RAP74. Concretament, una de les accions que se li han atribuït a RAP74 durant l’elongació és la d’estimular la Fcp1 CTD fosfatasa (Svejstrup et al, 1996). L’activitat de TFIIF és regulada per fosforilació de la subunitat RAP74 (pot ser fosforilada per diferents quinases, una d’elles TAFII250), una modificació que augmenta la velocitat d’iniciació i elongació in vitro (Orphanides et al, 1996). • TFIIE: Les funcions de TFIIE en la transició iniciació-elongació estan molt lligades a TFIIH: per una banda, la seva incorporació al PIC després de TFIIF (via interacció amb la forma IIA de la RNAP II) és imprescindible pel posterior reclutament del complex TFIIH; i per altra banda, té una funció reguladora de les activitats quinasa i helicasa/ATPasa de TFIIH (Roeder, 1996; Woychik i Hampsey, 2002). • TFIIH: TFIIH consta de nou subunitats organitzades en dos subcomplexes (core-TFIIH i un complex ciclina-quinasa (CAK)). És un complex multifuncional, ja que a més de la seva funció associada a la transcripció participa en processos de reparació de DNA i control del cicle cel.lular. En la transcripció, TFIIH hi té un paper essencial en la transició iniciació-elongació. En primer lloc, actua en la separació de les cadenes de DNA després de l’ensamblatge del PIC (promoter melting) utilitzant l’activitat helicasa depenent d’ATP d’una de les seves subunitats (XPB). I posteriorment, la subunitat cdk7 del mateix complex fosforila el domini CTD de la RNAP II, donant lloc a una forma IIO que es pot desenganxar del promotor (promoter clearence) i iniciar l’elongació (Orphanides et al, 1996). 1.1.3.3. El “Mediator” Inicialment, el “Mediator” es va descriure com un complex co-activador íntimament associat a la RNAP II que mediava la interacció entre activadors i maquinària transcripcional durant el procés d’iniciació. No obstant, també s’ha observat que en determinats casos pot exercir com a co-repressor, i per això es considera que el complex “Mediator” de fet actuaria com un element integrador de moltes i diverses senyals reguladores que són transmeses a la maquinària de la RNAP II (Woychik i Hampsey, 2002). La seva interacció amb la RNAP II II. Introducció 30 (b) bloqueig de la unió del complex remodelador de la cromatina, una paper que compartirien la histona linker H1 (els NuRCs no es poden unir a estructures nucleosomals que contenen la histona H1) i les proteïnes PcG (una vegada reclutats productes PcG als loci PRE -elements de resposta a Polycombes mantenen els patrons de repressió transcripcional al llarg del desenvolupament degut a que impedeixen la unió dels complexes remodeladors). (c) inactivació dels complexes (la fosforilació d’algunes subunitats del complex SWI/SNF inactiva l’enzim). 1.2.3. Modificacions post-traduccionals de les histones Les cues N i C-terminal de les histones són uns dominis desestructurats i flexibles que sobresurten del nucleosoma, proporcionant una superfície exposada per interaccions potencials amb altres proteïnes (Strahl i Allis, 2000). Tot i que són dispensables per a la formació del nucleosoma, són essencials en les interaccions entre nucleosomes per formar la fibra de cromatina i, com ja s’ha comentat anteriorment, per establir la cromatina transcripcionalment repressiva (heterocromatina) (Zhang i Reinberg, 2001). Les cues de les histones contenen varis residus conservats que són succeptibles a una varietat de modificacions post-traduccionals que inclouen acetilació, fosforilació, metilació, ADP-ribosilació i ubiquitinització (Goll i Bestor, 2002) (figura I.2). Donat el nombre de llocs potencialment modificables i la varietat d’aquestes modificacions, s’ha proposat l’existència d’un codi d’histones que postula que les modificacions a la mateixa o a diferents cues de les histones són interdependents i generen una determinada combinació que és “llegida” per proteïnes o complexes proteics que intervenen en la formació d’estructures de la cromatina d’ordre superior o en processos d’activació/inactivació gènica (Strahl i Allis, 2000; Jenuwein i Allis, 2001). Figura I.2. Residus de les cues de les histones humanes H2A, H2B, H3 i H4 sensibles a ser modificats post-traduccionalment per acetilació (rosa), metilació (vermell), fosforilació (blau) o ubiquitinització (taronja). Extret de Zhang i Reinberg, 2001. II. Introducció 31 D’acord amb aquesta hipòtesi, s’han identificat una sèrie de dominis proteics, presents en proteïnes que participen en la regulació de la transcripció i/o estructuració de la cromatina que reconeixen de manera específica aquestes modificacions de les histones (Jenuwein i Allis, 2001; Marmorstein, 2001). Els exemples més coneguts són el bromodomain i el chromodomain. El bromodomain interacciona específicament amb lisines acetilades i és present en acetiltransferases d’histones (PCAF, p300/CBP o TAFII250) i en complexes remodeladors (a la subunitat ATPasa Swi2/Snf2). Per la seva banda, el chromodomain, és present en vàries proteïnes com Polycomb, Mi-2, Su(var)3-9 i HP1, tot i que només en el cas d’HP1 s’ha observat que reconeix específicament la metilació de la lisina 9 de la histona H3. Aquest reconeixement específic de les modificacions de les histones és també doncs un element clau a l’hora d’explicar la influència que pot tenir una modificació pre-existent en el reclutament d’altres activitats modificadores. 1.2.3.1. Acetilació/desacetilació d’histones L’acetilació dels grups ε-amino de les lisines disminueix l’afinitat de les cues de les histones pel DNA carregat negativament, contrarrestant la tendència dels nucleosomes a formar estructures d’ordre superior i fent que la cromatina sigui més accessible a proteïnes d’unió a DNA (Rice i Allis, 2001; Eberharter i Becker, 2002); altres estudis recents suggereixen que l’acetilació també comportaria una alteració de l’estructura de les histones increment-ne el contingut en α-hèlix (Wang et al, 2000). L’acetilació de les histones la duen a terme acetiltransferases (HATs), algunes de les quals havien estat inicialment identificades com a co-activadors que modulaven l’accés d’activadors als promotors i estimulaven l’inici de la transcripció (Lee et al, 1993; Nightingale et al, 1998); anàlogament, proteïnes identificades originalment com a corepressors s’ha demostrat que tenen activitat desacetilasa d’histones (HDACs) i el seu reclutament és necessari en molts processos de repressió (Kadosh i Struhl, 1998). Tot i que durant molt de temps s’han relacionat processos d’acetilació amb activació i processos de desacetilació amb repressió, no sempre existeix una correlació tan directa, i fins i tot s’han trobat algunes excepcions en què l’acetilació té com a conseqüència una repressió transcripcional (Jenuwein i Allis, 2001). De fet, s’ha suggerit que l’acetilació per se no comporta una activació, sinó que serveix com a senyal pel reclutament d’altres activitats modificadores o complexes remodeladors de la cromatina (Eberharter i Becker, 2002). • Acetiltransferases d’histones (HATs) Les HATs estan agrupades en dues grans categories: les HATs de tipus A (nuclears), que acetilen les histones cromosomals i participen en processos de regulació de la transcripció, i les HATs de tipus B (citoplasmàtiques), que s’encarreguen d’acetilar les histones H3 i H4 sintetitzades de novo per ser dipositades al DNA després de la replicació (Workman i Kingston, 1998). II. Introducció 32 Complexes HAT i la seva funció relacionada amb la transcripció Complex HAT Subunitat catalítica Organisme Activitat HAT i paper en la transcripció p300/CBP H. sapiens Regulador transcripcional global Activitat HAT estimula la transcripció in vivo Acetila H2A, H2B, H3 nucleosomals i factors de transcripció SCR1/ACTR H. sapiens Transcripció depenent de receptors nuclears Complex PCAF PCAF H. sapiens Interacció amb p300/CBP, SCR1/ACTR i activadors Activitat HAT estimula la transcripció in vivo Acetila H3 i factors de transcripció STAGA/TFTC GCN5L H. sapiens Pot substituir TFIID en la transcripció Acetila H3 nucleosomal TFIIIC p220, p110, p90 H. sapiens Essencial per la transcripció RNAP III Acetila H2A, H3 i H4 nucleosomals TFIID hTAFII250 H. sapiens Subunitat del complex TFIID dTAFII230 D. melanogaster Acetila H3, H4 i factors de transcripció yTAFII130 S. cerevisiae SAGA GCN5 S. cerevisiae Interacciona amb dominis d'activació acídics i TBP Activitat HAT estimula la transcripció Acetila H3 i H2B nucleosomals ADA GCN5 S. cerevisiae Acetila H3 i H2B nucleosomals NuA3 ? S. cerevisiae Acetila H3 nucleosomal NuA4 ESA1 S. cerevisiae Interacciona amb dominis d'activació acídics Activitat HAT estimula la transcripció in vitro Acetila H4 nucleosomal i H2A Elongator ELP3 S. cerevisiae Elongació de la transcripció Acetila histones H2A, H2B, H3 i H4 Taula I.2. Principals complexes HAT i les seves funcions relacionades amb la transcripció (extret de Brown et al, 2000 i altres). S’han identificat sis famílies de proteïnes HAT de tipus A, les quals només tenen en comú el domini HAT responsable de la unió al cofactor Acetil-CoA i de l’activitat acetiltransferasa: Gcn5/PCAF: y-hGcn5, hPCAF. CBP/P300: hCBP/p300. MYST: ySas2, ySas3, yEsa1, dMOF, hTip60, hMOZ, hHB01. TAFII250: y-hTAFII250 SRC: hSRC-1, hACTR/AIB1/pCIP/TRAM-1/RAC-3,hSRC-3, hTIF-2, hGRIP-1,hATF-2. GNAT: yElp-3, yHpa-2, y-hHAT1, yTFIIIC. II. Introducció 33 Tot i que algunes d’elles tenen activitat acetiltransferasa in vitro, in vivo formen part de grans complexes que difereixen tant en composició, especificitat d’acetilació com en funcions biològiques en què estan involucrats (Marmorstein i Roth, 2001). Les subunitats no HATs d’aquests complexes participen en el seu reclutament cap a gens concrets via interacció amb factors reguladors i també modulen l’activitat acetilasa del complex. A la taula I.2 es descriuen els complexes HAT descrits i la seva funció relacionada amb la transcripció. Les HATs de tipus B identificades fins al moment corresponen a la HAT1 (que per homologia pertany a la superfamília GNAT) i la HAT2. Ambdues formen part o bé estan associades amb complexes d’ensamblatge de la cromatina com el complex CAF-1 (chromatin assembly factor-1), encarregats de la incorporació de noves histones H3 i H4 acetilades al DNA replicat de novo (Workman i Kingston, 1998; Makowski et al, 2001). • Desacetilases d’histones (HDACs) Les HDACs identificades fins a la data en humans es poden agrupar en tres classes i estan relacionades amb algun membre trobat a S. cerevisiae i/o Drosophila: HDACs de classe I (homòlogues a y-dRPD3): HDAC 1, 2, 3 i 8. Consten d’un sol domini catalític homòleg a Rpd3. Són proteïnes exclusivament nuclears que presenten una expressió ubicua a tots els teixits. HDACs de classe II (homòlogues a yHda1): HDAC 4, 5, 6, 7, 9, 10 i 11. Tenen un domini N-terminal no-catalític o regulador i un domini C-terminal catalític (excepte les 6 i 10 que presenten dos dominis catalítics). Les HDACII es caracteritzen per estar regulades nucleocitoplasmàticament a través d’un mecanisme llançadora (shuttling), i per tenir una expressió específica de teixit (revisat a Khochbin et al, 2001). HDACs de classe III (homòlogues a y-dSir2): SIRT 1, 2, 3, 4, 5, 6 i 7. L’activitat desacetilasa de Sir2 és depenent de NAD+ i està acoblada a una activitat ADPribosiltransferasa, essent ambdues necessàries pel silenciament mediat per Sir2 (Tanny et al, 1999). Les classes I i II es caracteritzen per ser sensibles a Trichostatina A (TSA) i estar relacionades amb processos de regulació de la transcripció, mentre els membres de classe III són desacetilases depenents de NAD+, insensibles a TSA i estan relacionades amb silenciament heterocromàtic. De manera similar a les HAT, les HDACs formen part de grans complexes: COMPLEXES CLASSE I Complex Sin3/HDAC. Està format per set polipèptids diferents que inclouen dues desacetilases (HDAC1 i 2), Sin3, RbAp46, RbAp48, SAP30 i SAP18 (Zhang et al, 1997). Sin3, identificat inicialment com un repressor transcripcional, és una proteïna multidomini molt gran que segurament actua com a plataforma en l’ensamblatge del complex; a més, té II. Introducció 34 varis dominis d’interacció que medien la unió de Sin3 amb factors de transcripció i proteïnes accessòries: co-repressors N-CoR, SMRT o l’homòleg de Drosophila SMRTER, p53, PLZF i la CpG binding protein (MeCP2) entre d’altres (Knoepfler i Eisenman, 1999). RbAp46 i 48 s’uneixen a les histones core i es creu que faciliten el remodelatge de nucleosomes necessari per una desacetilació eficient (Ng i Bird, 2000). SAP30 interacciona amb mSin3 i N-CoR, essent requerit per la repressió mediada per N-CoR (Laherty et al, 1998). I finalment, SAP18 s’ha proposat que també podria intervenir en el reclutament del complex Sin3/HDAC ja que s’ha observat que està associat amb Sin3 i interacciona amb factors transcripcionals de Drosophila com GAGA (Espinás et al, 2000), Bicoid (Zhu et al, 2001) o Enhancer of zeste (Wang et al, 2002), tot i que es desconeix si aquestes interaccions tenen una repercussió en el funcionament del complex Sin3/HDAC o bé són un indicatiu de que SAP18 contribueix en les activitats de múltiples complexes. Complex NuRD. A més a més de les subunitats que comparteix amb el complex Sin3 (HDAC1, HDAC2, RbAp46 i RbAp48), el complex NuRD també conté les subunitats Mi2α, Mi-2β, MTA-1, MTA-2 i MBD3 (Zhang et al, 1999). Mi-2 és un factor remodelador de la cromatina depenent d’ATP que en el context de NuRD es creu que facilita l’actuació de les HDAC1 i 2 incrementant l’accessibilitat al DNA, per la qual cosa s’ha suggerit que NuRD actuaria en regions més tancades i inaccessibles (Knoepfler i Eisenman, 1999). Mi-2 s’ha vist també que interacciona amb alguns repressors com Hunchback, Polycomb (Kehle et al, 1998) o TTK69 (Murawsky et al, 2001). MTA-2, homòloga a MTA-1, modula l’activitat desacetilasa del complex associant-se amb el complex via MBD3 (Zhang et al, 1999). MBD3, tot i que té un domini methyl CpG binding domain (MBD) homòleg al de les MeCPs no s’uneix a DNA metilat; en canvi, l’homòloga MBD2, una proteïna que sí uneix DNA metilat, interacciona amb el complex NuRD dirigint-lo a regions metilades (Zhang et al, 1999). Les identitats de les subunitats dels complexes Sin3/HDAC i NuRD suggereixen dos possibles modes de reclutament: per interacció específica amb repressors/co-repressors o per reconeixement de zones de DNA metilat. De fet, arrel de l’observació que els complexes Sin3/HDAC i NuRD exhibeixen una associació constitutiva amb determinades regions de la cromatina, recentment s’ha proposat que els complexes HDAC contribuirien a la repressió tant per mecanismes específics que involucrarien un reclutament per co-repressors, com per mecanismes inespecífics, degut a una associació constitutiva dels complexes a la cromatina que precisament podria ser a través del DNA metilat (Li et al, 2002). Complex HDAC3 que conté SMRT/N-CoR. La desacetilasa HDAC3 forma part de complexes que contenen TBL-1 (homòloga al co-repressor Groucho) i SMRT/N-CoR, els quals estan involucrats en la repressió per receptors d’hormones nuclears (Guenther et al, 2000; Li et al, 2000). II. Introducció 35 COMPLEXES CLASSE II Estudis recents suggereixen que l’activitat d’algunes HDACII, concretament HDAC4, 5 i 7, és depenent de l’associació amb complexes HDAC3-N-CoR/SMRT via interacció directa amb N-CoR i SMRT (Fischle et al, 2001; Fischle et al, 2002). COMPLEXES CLASSE III L’estudi de la desacetilasa Sir2 a llevat ha permès identificar-la com a component de dos complexes diferents, el complex SIR i el complex RENT, implicats en silenciament de l’heterocromatina i de l’rDNA respectivament (Moazed, 2001). L’homòleg de Drosophila, per la seva banda, semblaria estar implicat tant en silenciament heterocromàtic com en silenciament de loci eucromàtics per interacció amb repressors (Rosenberg i Parkhurst, 2002). 1.2.3.2. Metilació d’histones La metilació de les cues d’histones es dóna principalment a les cadenes bàsiques dels residus lisina i arginina. In vivo, les lisines metilades es poden trobar mono-, dio trimetilades, mentre les arginines es poden monoo dimetilar (i en aquest cas de manera simètrica o asimètrica). Les posicions preferides per metilar lisines són K4, K9, K27 i K36 de la histona H3 i la K20 de la histona H4; i la metilació d’arginines té lloc principalment a les posicions R2, R17 i R26 de la H3 i la R3 de la H4. Els enzims responsables de la metilació, les metiltransferases d’histones (HMTs), metilen de manera preferencial un o altre residu, per tant es pot parlar de metiltransferases de lisina o metiltransferases d’arginina. Unes i altres, però, utilitzen com a grup donador S-adenosil-metionina (Zhang i Reinberg, 2001; Bannister et al, 2002). El fet de que no s’hagi identificat cap desmetilasa d’histones ha dut a pensar durant molt de temps que la metilació d’histones era un procés irreversible, una “marca epigenètica” estable. No obstant, evidències recents suggereixen l’existència d’un turnover actiu de grups metil que té lloc lentament però és detectable, proposant-se tres possibles mecanismes (desmetilació, reemplaçament de les histones o tall de la cua metilada) per explicar la dinàmica d’intercanvi observada (Bannister et al, 2002). • Metiltransferases de lisina La primera metiltransferasa d’histones que es va identificar corresponia a la proteïna Su(var)3-9, originalment coneguda com a supressora de la PEV, l’activitat de la qual anava dirigida de manera específica cap a la K9 de la histona H3 (Rea et al, 2000), tot i que més tard s’ha vist que també és capaç de metilar la K-26 de la histona H1 (Jenuwein i Allis, 2001). El domini conservat SET de Su(var)3-9 és el responsable de l’activitat catalítica, tot i II. Introducció 36 que només s’observa activitat enzimàtica quan es troba flanquejat per dues seqüències riques en cisteïnes (pre-SET i post-SET). A part del domini SET, Su(var)3-9 presenta un domini de tipus chromodomain (revisat a Kouzarides, 2002). La metilació de la H3-K9 per Su(var)3-9 és essencial per a la formació d’heterocromatina i el silenciament de gens eucromàtics: H3-mK9 és reconeguda de manera específica pel chromodomain de la proteïna HP1, la qual propaga l’heterocromatinització en oligomeritzar a través del chromoshadowdomain (Richards i Elgin, 2002); en els gens eucromàtics, la proteïna del retinoblastoma Rb, sembla tenir un paper essencial en el reclutament de Su(var)3-9 i HP1 en promotors específics (Nielsen et al, 2001). El previ requisit de la desacetilació de les lisines 9 i 14 per tal que es dongui la metilació de la K9, així com la recent observació per dos grups diferents que Su(var)3-9 està associada física i funcionalment a les desacetilases HDAC 1, 2 i 3 (Czermin et al, 2001; Vaute et al, 2001), ha fet sorgir la hipòtesi segons la qual l’actuació concertada de la desacetilació i metilació per un complex que contingués Su(var)3-9 i desacetilases mediaria el silenciament de determinades regions del genoma. Altres metiltransferases d’H3-K9 són la G9a, involucrada en la repressió transcripcional de gens eucromàtics (Tachibana et al, 2002), i la SETDB1, la qual té un domini MBD i contribueix al silenciament de gens eucromàtics mediat per HP1 (Schultz et al, 2002). D’altra banda, també hi ha algunes metiltransferases de lisines que participen en l’activació transcripcional. Aquest seria el cas de Set9, la metilació de la qual a H3-K4 impedeix per una banda que el complex desacetilasa NuRD pugui interaccionar amb H3 i per l’altra que Su(var)3-9 pugui metilar H3-K9 (Nishioka et al, 2002). De fet, així com H3-mK9 és una marca d’un estat reprimit de la cromatina, H3-mK4 es troba localitzada en barreres heterocromàtiques i loci actius (Zhang i Reinberg, 2001). • Metiltransferases d’arginina (PRMTs) Fins al moment es coneixen cinc metiltransferases d’arginina, les quals tenen en comú un domini catalític molt conservat. PRMT1 és la principal HMT específica de la histona H4 (metila específicament H4-R3) i està involucrada en la regulació de múltiples processos. CARM1/PRMT4 metila R2, R17 i R26 de la H3, i actua com a co-activador transcripcional en actuacions sinèrgiques amb acetilases d’histones com p300/CBP (revisat a Zhang i Reinberg, 2001; Kouzarides, 2002). 1.2.3.3. Fosforilació d’histones La fosforilació de la S-10 de la histona H3 és requerida per la correcta condensació dels cromosomes a mitosi i meiosi i, a més, està correlacionada amb la transcripció de gens després d’una inducció mitogènica. El fet que una mateixa modificació estigui associada a dos processos que involucren alteracions físiques de la cromatina oposades, dóna suport a la II. Introducció 37 idea que les modificacions actuen més com a superfícies de reconeixement per altres factors que no per alteració directa de l’estat de la cromatina (Berger, 2002). Així, es creu que per una eficient condensació dels cromosomes serien necessàries múltiples fosforilacions a la mateixa o diferents cues; en canvi, l’activació transcripcional de determinats gens correlacionaria la fosforilació de la S-10 amb una acetilació en determinats residus (Strahl i Allis, 2000). Precisament, i donant suport a aquesta hipòtesi, s’ha observat que la quinasa d’histones Rsk actua de manera conjunta amb les acetilases CBP/p300. 1.2.3.4. Ubiquitinització d’histones Recentment han sorgit evidències que indicarien que la ubiquitinització d’histones també tindria un paper important en la regulació transcripcional. Primer, s’ha observat que alguns residus de lisina conservats de les cues C-terminal de les histones H2A i H2B poden ser subjectes a monoubiquitinització com una via alternativa al processament proteolític de la histona sencera. I en segon lloc, s’ha identificat una activitat ubiquitinitzadora de la histona H1 a TAFII250 que correlaciona amb l’activació transcripcional (Jenuwein i Allis, 2001). 1.2.3.5. Metilació del DNA i la seva connexió amb HDACs i HMTs La metilació de citosines al carboni 5 dels dinucleòtids CpG per les DNA metilases (DNMTs) és una característica de molts genomes eucariotes. En vertebrats, entre el 60 i 90% de les CpGs estan metilades, i les no metilades es troben troben localitzades a les anomenades “illes CpG”, normalment formant part de promotors funcionals. Hi ha moltes evidències experimentals que suggereixen que la metilació del DNA és incompatible amb l’activació transcripcional o, dit d’una altra manera, que la conseqüència més directa de la metilació és el silenciament (Ng i Bird, 1999). Recentment, a més a més, s’ha demostrat l’existència d’una connexió entre la metilació del DNA i dues de les modificacions més conegudes de les histones: l’acetilació i la metilació. La connexió entre metilació del DNA i desacetilació d’histones ha estat objecte d’estudi en els darrers anys a partir de l’observació que el DNA poc metilat es trobava associat a la cromatina acetilada mentre que el DNA molt metilat correlacionava amb un estat hipoacetilat de la cromatina. Actualment, està bastant acceptat que la metilació del DNA en 5-metilC per DNMTs indueix un estat de la cromatina encara més silenciat per un reclutament de desacetilases (Bird i Wolffe, 1999); aquestes últimes accedirien a les regions metilades via interacció amb MeCP o MBP, o bé a través de la interacció directa amb DNA metilases (figura I.3A). Un cop desacetilades, la cromatina seria més succeptible a la metilació per HMTs, les quals s’unirien directament al DNA metilat via MBDs (figura I.3B). En el cas de la metilació d’histones, en canvi, s’ha suggerit que aquesta modificació és un pre-requisit per la metilació de novo del DNA: concretament, s’ha proposat que les histones metilades servirien com a diana de reconeixement per al reclutament de DNMTs (figura I.3C) (Zhang i Reinberg, 2001; Ben-Porath i Cedar, 2002; Richards i Elgin, 2002). II. Introducció 38 Figura I.3. Possibles models sobre la connexió entre metilació del DNA, desacetilació d’histones i metilació d’histones. A. Methyl-CpG binding proteins unides a DNA metilat reclutarien complexes HDACs per desacetilar les histones properes. B. En dominis cromatínics on les histones són hipoacetilades, HMTs amb dominis MBD s’unirien directament al DNA nucleosomal metilat i metilarien les cues de les histones. C. Les cues de les histones metilades reclutarien DNMTs per metilar DNA i així aconseguir un silenciament a llarg plaç (extret de Zhang i Reinberg, 2001). 1.2.4. Reclutament dels complexes remodeladors i modificadors de la cromatina En els darrers anys s’han dedicat molts esforços en estudiar les interaccions funcionals que tenen lloc entre els nombrosos complexes que regulen la transcripció per tal d’intentar establir quina és la seqüència d’aconteixements que determinaran que un gen concret es transcrigui. No obstant, aquests estudis han evidenciat que no hi ha un requeriment a priori de que el reclutament de complexes remodeladors, modificadors d’histones, factors reguladors o components de la maquinària transcripcional tingui lloc en un ordre determinat (figura I.4), sinó que l’activació de cada gen comporta un ordre de reclutament de factors concret i específic (Narlikar et al, 2002). Actualment no hi ha gaires exemples de promotors en què s’hagi arribat a establir l’ordre d’esdeveniments que en porten l’activació; un d’aquests casos correspon al promotor del gen HO de llevat (Cosma et al, 1999). Quan les activitats modificadores de la cromatina són requerides a nivell global, el mecanisme de reclutament involucra dianes poc específiques (com seria el cas del reclutament d’HDACs en zones de DNA metilat per propagar silenciament). En canvi, quan els complexes remodeladors/modificadors són necessaris en seqüències diana concretes, factors de transcripció específics de seqüència (activadors o repressors) s’hi uneixen directament o indirectament (via co-activadors/co-represssors) per reclutar-los de forma específica (veure exemples a l’apartat 1.3). II. Introducció 39 Figura I.4. Reclutament de reguladors, complexes HAT i complexes remodeladors en el procés d’activació de la transcripció. Diferents ordres d’actuació d’aquests factors (A, B o C), poden donar lloc a un motlle competent per la transcripció a partir d’una estructura condensada de la cromatina. Encara que no es mostri, també és possible que la unió de GTFs precedeixi l’acció i reclutament de complexes HAT (extret de Narlikar et al, 2002). D’altra banda, també tenen lloc interaccions físiques entre remodeladors i modificadors que en molts casos són essencials per l’activitat d’algun d’ells. Així, s’ha observat que els complexes acetiltransferasa SAGA i NuA4 de llevat estabilitzen la unió del complex SWI/SNF als nucleosomes del promotor diana (Hassan et al, 2001). 1.2.5. Elongació i cromatina En un principi, es va suggerir que el pas de la RNAP II a través dels nucleosomes durant el procés de transcripció era facilitat per una transferència de l’octàmer d’histones que tenia davant cap al seu darrere, i que aquest procés estaria catalitzat per enzims remodeladors de la família SWI2/SNF2. No obstant, aquest mecanisme tan sols s’ha observat per polimerases petites, però no sembla factible per una polimerasa tan gran com la RNAP II (Orphanides i Reinberg, 2000). El model més acceptat actualment és el de la dissociació parcial d’un dímer H2A/H2B d’un nucleosoma durant l’elongació i la posterior reassociació després del pas de la RNAP II. Consistent amb aquest model, recentment s’ha demostrat que durant la transcripció in II. Introducció 46 altra banda, un canvi conformacional en TBP que inhibeix la unió de TFIIA al complex TBP-DNA (revisat a Maldonado et al, 1999). 4. Reclutament de complexes modificadors de la cromatina Anàlogament als activadors, que poden reclutar complexes remodeladors o modificadors d’histones per tal d’incrementar l’accessibilitat dels factors de transcripció a les seves seqüències diana, els repressors poden reclutar complexes modificadors de la cromatina l’activitat dels quals resulti en una major compactació nucleosomal, dificultant així la unió dels factors de transcripció. De fet, al llarg dels últims anys i arran del “boom” que hi ha hagut en l’estudi dels processos d’acetilació/desacetilació, s’han anat coneixent molts casos de repressors que actuen reclutant directa o indirectament desacetilases d’histones, i actualment potser és el mecanisme de repressió més estudiat i que genera més interès. Un dels exemples més coneguts correspon a la repressió dels gens Hox a Drosophila, iniciada pel repressor Hunchback (Hb) i mantinguda per algunes proteïnes PcG. S’ha observat que tant Hb com les proteïnes PcG interaccionen física i funcionalment amb dMi-2 (homòleg a hMi-2 del complex NuRD). Per tant, un possible mecanisme per a la repressió dels gens Hox seria que Hb reclutés NuRD, el qual modificaria la cromatina permetent la unió de les proteïnes PcG o bé reclutant-les directament (revisat a Ahringer, 2000). 1.3.2.2. Long-range/short-range repression La repressió transcripcional té un paper clau en l’establiment precís dels patrons d’expressió gènica durant el desenvolupament embrionari de Drosophila. Així, la majoria de reguladors transcripcionals que controlen la formació del patró a l’embrió primerenc són repressors (Jiménez et al, 1997). Degut a que aquests repressors poden actuar sobre distàncies curtes (<100 pb) o llargues (1 quilobase o més) es parla de short-range o longrange repression. Els repressors long-range es caracteritzen perquè actuen de forma dominant, bloquejant tots els enhancers (encara que estiguin a milers de pb) i impedint que puguin tenir cap influència sobre el promotor, podent silenciar un locus cromosòmic sencer. En canvi, els repressors short-range actuen, bé bloquejant la funció d’activadors units a elements enhancers propers sense interferir amb els que estan units a seqüències més allunyades (permeten autonomia entre enhancers), bé inhibint l’activitat del complex de preiniciació al promotor core. Una altra diferència és que els long-range poden induir un estat reprimit estable, mentre els short-range tenen un efecte més puntual, essent un tipus de repressió més flexible (Cai et al, 1996). La repressió short-range és, a més, especialment important en la regulació dels promotors dels gens “pair-rule”, on cada enhancer funciona de manera independent. Estudis recents indiquen que aquests dos modes de repressió, long-range i short-range, estan associats a dos co-repressors diferents, Groucho i dCtBP respectivament (Zhang i Levine, 1999). II. Introducció 47 1.3.2.3. La repressió long-range mediada per Groucho Tot i que el co-repressor Groucho (Gro) va ser identificat originalment a Drosophila, s’han trobat homòlegs en molts organismes eucariotes, des de llevats (Tup1) fins a humans (proteïnes TLE i TBL-1). Els membres de la família Gro es caracteritzen per tenir un domini d’homotetramerització molt conservat a la regió N-terminal (anomenat domini Q per la seva abundància en residus Gln) essencial per l’acció repressora de Gro; un regió central poc conservada; i un domini C-terminal altament conservat format per set motius de tipus WD implicat en interaccions proteïna-proteïna. Groucho és reclutat als promotors diana via interaccions directes amb repressors de tipus long-range que s’uneixen al DNA de forma específica. Entre aquests repressors hi trobem els factors de la família Hairy o Runt, els quals s’uneixen a Gro a través del motiu WRPW o WRPY respectivament; o proteïnes com Engrailed, Goosecoid, Dorsal o Hairless, que interaccionen amb Gro per un motiu de tipus eh1 (engrailed-homology motif) (revisat a Courey i Jia, 2001). S’ha suggerit que la repressió mediada per Groucho involucraria l’ensamblatge d’un complex multiproteic anomenat repressossoma. El repressossoma es formaria per una unió cooperativa de múltiples molècules repressores a les seves seqüències diana, les quals s’encarregarien de reclutar Gro al promotor. Per facilitar l’ensamblatge i manteniment del repressossoma també hi serien requerides, de manera similar a l’enhanceosoma, proteïnes “arquitectòniques”. L’exemple més estudiat de repressossoma és el que es forma a l’element silenciador VRR del gen zen, on té lloc l’ensamblatge cooperatiu d’un complex multiproteic que inclou els repressors Dorsal i Dead-ringer, el co-repressor Gro i la proteïna arquitectònica Capicua (Courey i Jia, 2002). S’han descrit dos possibles mecanismes a través dels quals Groucho exerciria la seva activitat repressora: • Reclutament de complexes desacetilases. Estudis recents demostren que Groucho i la desacetilasa Rpd3 (HDAC1) de Drosophila poden formar un complex in vivo per interacció directa a través d’un domini ric en glicina i prolina (GP) situat a la regió central de la proteïna Groucho. Aquesta interacció amb Rpd3 contribueix en bona part a la repressió mediada per Groucho (Chen et al, 1999). D’altres estudis en cèl.lules humanes indiquen que HDAC1, Sin3 i RbAp48 co-immunoprecipiten amb Groucho. Finalment, també s’ha identificat TBL-1 humana com a part d’un macrocomplex amb HDAC3, SMRT i N-CoR (Guenther et al, 2000; Li et al, 2000). Aquestes evidències suggereixen que la repressió mediada per Groucho involucraria un reclutament d’activitats desacetilases en el promotor diana, bé directament per interacció amb HDAC1 com indirectament per interacció amb altres components de complexes HDAC. II. Introducció 48 D’altra banda, i de manera similar a Sir3 i Sir4, els co-repressors Gro/Tup1 uneixen histones hipoacetilades (Flores-Saaib i Courey, 2000). Això ha fet sorgir la hipòtesi d’un mecanisme d’actuació de Gro semblant a l’emprat per les proteïnes Sir en el silenciament heterocromàtic. Concretament, s’ha proposat que una vegada portat al promotor per repressors específics, Gro reclutaria HDACs, les quals desacetilarien les histones properes (Sir3 i Sir4 recluten Sir2); aleshores Gro s’uniria a aquestes histones hipoacetilades, reclutaria noves HDACs i així successivament, donant lloc a una extensió de l’estat silenciat al llarg de la cromatina (figura I.5A). Aquesta hipòtesi, tot i que no està demostrada, seria una explicació plausible de l’actuació repressiva de Groucho sobre grans loci cromosòmics (Courey i Jia, 2002). •Interaccions amb la maquinària basal. Existeixen vàries evidències experimentals que demostren que la repressió mediada per Groucho també involucra interaccions amb la maquinària basal. Així, s’ha observat que alguns homòlegs humans de Gro interaccionen específicament amb el factor TFIIE, una interacció que serviria per bloquejar la formació del PIC (Yu et al, 2001). Altres estudis demostren que Tup1 de llevats es pot unir a la subunitat Srb7 del “Mediator”, impedint que aquesta s’associï a la subunitat Med6 i pugui mediar una estimulació de la transcripció induïda per proteïnes activadores (Gromoller i Lehming, 2000). 1.3.2.4. La repressió short-range mediada per dCtBP Inicialment, CtBP (C-terminal binding protein) es va identificar en base a la seva interacció amb la regió C-terminal de la proteïna d’adenovirus humà E1A i la seva activitat com a supressor de tumors (Boyd et al, 1993; Schaeper et al, 1995). Estudis posteriors han identificat proteïnes de la famíla CtBP des de Drosophila a vertebrats amb un alt grau d’homologia entre elles i una funció comuna de co-repressors transcripcionals (revisat a Chinnadurai, 2002). Una de les característiques peculiars de CtBP és la seva homologia amb les 2-hidroxiàcid deshidrogenases depenents de NAD i la seva capacitat d’unió a NAD/NADH. A Drosophila s’ha pogut constatar que la funció de molts dels repressors short-range que actuen durant el desenvolupament de l’embrió primerenc entre els quals s’inclouen Giant, Krüppel, Knirps i Snail és, almenys en part, depenent de dCtBP (Nibu et al, 1998b). Knirps i Snail interaccionen amb dCtBP a través d’un motiu P-DLS-K (Nibu et al, 1998a) i Krüppel a través d’un motiu P-DLS-H; Giant, en canvi, tot i tenir un motiu conservat VLDLS similar als anteriors, no interacciona amb dCtBP directament, sinó que ho fa a través d’algun altre factor (Nibu i Levine, 2001). Aquests repressors, tot i que actuen principalment per mecanismes depenents de dCtBP, en alguns casos també poden funcionar-ne de forma independent (Keller et al, 1998). Hairy, descrit inicialment com un repressor de tipus long-range, s’ha observat que també interacciona amb dCtBP a través del motiu P-SLV-K (Poortinga et al, 1998). Tot i que Gro II. Introducció 49 és el principal co-repressor de Hairy, les evidències experimentals suggereixen que Hairy també podria actuar de forma depenent de dCtBP (és a dir, com a repressor short-range) en la repressió de determinats gens diana (Nibu et al, 2001), i que la interacció entre Hairy i dCtBP modularia negativament la funció repressora de Hairy associada a Groucho (Phippen et al, 2000; Zhang i Levine, 1999). Recentment també s’ha descrit que Hairless interacciona amb dCtBP a través del motiu PLNLS-K, i que aquesta interacció és essencial per la seva funció repressora (Morel et al, 2001). Per la seva banda, TTK69 té un motiu P-DLS que semblaria contribuir en la seva funció en el desenvolupament dels fotoreceptors (Wen et al, 2000). Figura I.5. Models suggerits per a l’actuació dels co-repressors Groucho i dCtBP en les repressions de tipus long-range i short-range. A. Després de ser portat al DNA per repressors específics, el co-repressor Groucho reclutaria HDACs cap a les cues d’histones properes, resultant en una alteració de l’estructura de la cromatina. La capacitat dels co-repressors d’unir histones hipoacetilades permetria que es poguessin extendre al llarg de la cromatina i així poder reclutar noves HDACs. Aquest procés acabaria donant lloc a un llarg locus cromosòmic en estat reprimit. B. El co-repressor dCtBP també pot reclutar HDACs a les regions promotores. Aquest reclutament resultaria en una desacetilació local dels nucleosomes, donant lloc a una estructura alterada de la cromatina que desplaçaria activadors propers del seu lloc d’unió. Degut a la incapacitat d’aquests co-repressors de polimeritzar, l’efecte seria local (extret de Courey i Jia, 2001). La repressió mediada per CtBP en determinats promotors és sensible a TSA, mentre en d’altres és insensible a la presència d’aquest inhibidor de desacetilases. Això suggereix, anàlogament al co-repressor Groucho, dos tipus de mecanismes d’actuació de CtBP, un depenent i l’altre independent d’HDACs: •Mecanisme depenent de desacetilases. Hi ha vàries evidències de que CtBP pot reclutar complexes HDACs: per una banda, s’ha observat que CtBP1 humà pot interaccionar amb HDAC1, HDAC2 i Sin3 (Zhang et al, 2001; Chinnadurai, 2002); a més a més, HDAC4 II. Introducció 50 i 7 tenen un motiu PXDLR a través del qual interaccionen amb CtBP (Deltour et al, 2002). Aquest reclutament de complexes HDACs per dCtBP donaria lloc a una desacetilació local dels nucleosomes que desplaçaria activadors units a llocs propers. No obstant, la incapacitat de CtBP d’unir histones hipoacetilades impediria que aquest efecte s’extengués més enllà de la regió promotora on CtBP ha estat portat per un repressor (figura I.5B). •Mecanisme independent de desacetilases. L’observació de que CtBP de mamífers es pot associar amb proteïnes PcG ha fet sorgir la hipòtesi d’un possible mecanisme d’actuació de CtBP via el reclutament de complexes PcG, induïnt un estat compactat de la cromatina (Turner i Crossley, 2001). D’altra banda, també seria factible pensar en una possible acció de CtBP bloquejant la formació del complex de preiniciació, ja que recentment s’ha pogut observar que CtBP pot interaccionar amb dos components de la maquinària basal (Koipally i Georgopoulos, 2000). Evidències experimentals suggereixen que l’activitat de dCtBP podria estar regulada per varis mecanismes: (a) per fosforilació de CtBP; (b) per una acetilació de lisines properes al motiu P-DLS de les proteïnes amb qui interacciona CtBP, una modificació que disminueix l’afinitat per CtBP; o (c) per unió a NAD/NADH: CtBP funciona com a sensor dels nivells NAD/NADH cel.lulars, i la seva activitat repressora es veu estimulada en 2-3 ordres de magnitud quan uneix NADH respecte quan està unit a NAD (revisat a Chinnadurai, 2002). 1.3.3. Factors de transcripció involucrats en processos d’activació i de repressió En la classificació dels factors de transcripció en activadors/repressors o dels cofactors en co-activadors/co-repressors hi ha proteïnes que serien difícils d’ubicar, ja que poden actuar com a (co-)activadores o (co-)repressores depenent del context en què es troben. En aquests casos, les interaccions amb altres proteïnes són les que acaben determinant que un factor transcripcional acabi actuant com a activador o repressor: La proteïna NC2 (Dr1/Drap1), per exemple, identificada com un repressor en promotors que tenen caixa TATA, recentment s’ha pogut observar que en promotors amb l’element DPE actua com un activador transcripcional (Willy et al, 2000). Un altre exemple molt conegut correspon a Dorsal, una proteïna que pot interaccionar amb CBP i TAFIIs per activar la transcripció, però que en presència de Groucho i d’altres factors actua com a repressor induïnt la formació d’un repressossoma en el promotor diana (Flores-Saaib et al, 2001). I per últim citar el cas de CBF1/RBP-Jκ, l’homòleg a mamífers de la proteïna Suppressor of Hairless de Drosophila, el qual passa d’actuar de repressor a activador en resposta a la senyal de Notch. Quan actua com a repressor, CBF1/RBP-Jκ recluta el complex SMRT/HDAC1. Però quan s’activa la via de Notch es transloca al nucli una forma truncada de Notch que interacciona amb CBF1/RBP-Jκ, desplaçant el complex desacetilasa i donant lloc a una activació transcripcional (Kao et al, 1998). II. Introducció 51 2. GAGA I TRAMTRACK, DOS FACTORS DE TRANSCRIPCIÓ AMB DOMINIS POZ 2.1. Els dominis POZ/BTB 2.1.1. Proteïnes amb dominis POZ El domini POZ (poxvirus and zinc fingers) o BTB (broad complex, tramtrack and bric à brac) és un motiu estructural d’interacció proteïna-proteïna d’uns 120 aa evolutivament molt conservat. Tot i que originalment es va identificar en proteïnes de poxvirus i alguns factors de transcripció amb dominis d’unió a DNA de tipus dits de zinc, actualment hi ha descrites moltes proteïnes amb dominis POZ/BTB des de llevats fins a humans, on participen en funcions biològiques molt diverses que van des de l’organització del citoesquelet i la matriu nuclear a la regulació de la transcripció (Aravind i Koonin, 1999). A Drosophila s’han identificat 64 gens que codifiquen per proteïnes amb dominis POZ (Rubin et al, 2000), la funció dels quals sovint està associada a etapes concretes del desenvolupament de la mosca. Així, els productes del gen Broad-Complex (BR-C) participen en la regulació de la metamorfosi, i les proteïnes Bric à Brac (BAB1 i 2) són requerides tant per al desenvolupament de potes i antenes com per la morfogènesi dels ovaris (Pointud et al, 2001). Per la seva banda, els productes dels gens tramtrack (TTK69 i TTK88) són repressors transcripcionals que regulen processos com la segmentació abdominal de l’embrió i el desenvolupament dels fotoreceptors. Finalment, el gen Trithorax-like (que codifica per GAGA) i el gen mod(mdg4), corresponen a enhancers de variegació E(var) i, en el cas de GAGA, és requerida per a la correcta expressió d’alguns gens que participen en el desenvolupament de l’embrió. A humans s’han trobat 113 proteïnes amb dominis POZ, moltes de les quals tenen papers essencials durant el desenvolupament, homeòstasi i neoplàsia. Una de les més estudiades és PLZF (promyelocytic leukemia zinc finger), un repressor transcripcional que participa en la regulació del desenvolupament embrionari i l’hematopoiesi. En aquest darrer cas PLZF actua com a supressor de creixement, bloquejant la proliferació i diferenciació mieloide, a través II. Introducció 52 del silenciament de gens involucrats en el cicle cel.lular (Collins et al, 2001). El gen de PLZF es troba disromput en pacients amb leucèmia promielocítica aguda (APL) associada a la translocació t(11;17)(q23;q21), en la qual la regió N-terminal de PLZF (contenint el domini POZ) està fusionada al receptor d’àcid retinoic α (RARα), formant el producte PLZF-RARα. Aquest nou producte oncogènic actua com a repressor en els elements de resposta a l’àcid retinoic i interfereix en la via normal de PLZF, donant lloc a una desregulació de la diferenciació mieloide que es manifesta en forma de leucèmia aguda (He et al, 1998; Melnick et al, 2002). Una altra proteïna humana molt estudiada per la seva relació amb processos tumorigènics és LAZ3/Bcl-6 (lymphoma-associated zinc finger 3/B cell lymphomas 6). Bcl-6 actua com a repressor d’un gran nombre de gens involucrats en l’activació de cèl.lules B, resposta immune depenent de cèl.lules T, inflamació i regulació del cicle cel.lular, essent essencial en molts d’aquests processos (Lemercier et al, 2002). El gen BCL-6 va ser identificat per la seva implicació en les translocacions cromosomals associades al limfoma non-Hodking’s (NHL), on la juxtaposició entre promotors heteròlegs (derivats d’altres cromosomes) i la seqüència codificant intacta per Bcl-6 resulta en una expressió desregulada d’aquest gen. A més a més, s’han trobat mutacions puntuals a la seqüència 5’ no codificant del gen BCL-6 en una gran proporció (40-70%) d’aquests limfomes. Aquestes evidències suggereixen doncs com a causa principal de la diferenciació de limfòcits, l’expressió desregulada del gen BCL-6 (Chang et al, 1996; Huynh i Bardwell, 1998). D’entre les proteïnes amb funcions no relacionades amb la regulació transcripcional, les més estudiades corresponen a les proteïnes kelch d’unió a actina, que actuen en la formació de canals circulars durant el desenvolupament dels oòcits de Drosophila (Robinson i Cooley, 1997), o les proteïnes dels poxvirus, la funció dels quals es desconeix. 2.1.2. Dominis associats El domini POZ és un motiu estructuralment independent que desenvolupa funcions específiques a la proteïna on es troba. Normalment es troba en una sola còpia per proteïna i localitzat a la regió N-terminal d’aquesta, en combinació amb altres dominis com els motius de tipus “kelch”, motius “ankyrin”, dominis transmembrana, dominis d’unió a DNA de tipus Psq o dominis d’unió a DNA de tipus dits de zinc (revisat a Aravind i Koonin, 1999). Aproximadament dues terceres parts de les proteïnes amb dominis POZ tenen dits de zinc a través dels quals s’uneixen a seqüències específiques de determinats promotors diana, on actuen regulant la transcripció (Ahmad et al, 1999). El nombre de dits de Zn en aquestes proteïnes és variable, podent trobar proteïnes amb un sol dit (seria el cas de GAGA), dos (TTK), cinc (PLZF o ZF5) o sis (Bcl-6). Els altres dominis d’unió a DNA que es poden trobar associats al POZ són els dominis Psq (Pipsqueak), formats per quatre repeticions en tàndem d’un motiu Psq que s’ha suggerit que té una estructura similar a les helix-turn-helix. Les proteïnes Pipsqueak (PsqA i PsqB) i II. Introducció 53 Bric à brac (BAB1 i BAB2) de Drosophila són dos exemples de proteïnes amb la combinació dels dominis POZ i Psq (Siegmund i Lehmann, 2002). 2.1.3. Interaccions entre proteïnes mediades pel domini POZ La funció principal del domini POZ és la de mediar interaccions proteïna-proteïna, les quals poden ser de tres tipus: (a) interaccions entre proteïnes d’una mateixa espècie a través del domini POZ, donant lloc a la formació d’homooligòmers; (b) interaccions entre proteïnes diferents que tenen dominis POZ, donant lloc a la formació d’heterooligòmers; i (c) interaccions entre proteïnes amb dominis POZ i altres proteïnes. La diversitat de proteïnes amb dominis POZ, així com la diversitat de possibles interaccions que poden mediar, suggereix un paper crític d’aquest domini en la regulació de molts processos biològics a través de la formació de complexes proteics. La formació d’homooligòmers a través del domini POZ sembla ser un denominador comú per les proteïnes que el contenen, havent-se descrit tant per a proteïnes kelch, proteïnes amb domini Psq i proteïnes amb dits de zinc. No obstant, el tipus d’oligòmer que es forma no és igual per a tots els POZes, trobant casos com Bric à brac o PLZF on la forma predominant és un dímer (Chen et al, 1995; Li et al, 1997a), o el cas de la proteïna GAGA, que pot formar dímers, tetràmers i complexes d’alt pes molecular (Espinás et al, 1999; Katsani et al, 1999). La formació d’heterooligòmers, en canvi, no sembla estar tan generalitzat, havent-se descrit tant interaccions positives com negatives entre proteïnes amb dominis POZ diferents. Concretament, s’han observat interaccions entre els POZes de PLZF i Bcl-6 (Daniel i Reynolds, 1999), HIC-1 i γFBP-B (Deltour et al, 1999), Bach2 i MAZR (Kobayashi et al, 2000), TTK i Bric à Brac (Pointud et al, 2001) o Pipsqueak i GAGA (Schwendemann i Lehmann, 2002). D’altra banda, l’absència d’interacció entre els POZes de ZID vs els de GAGA, TTK o Poxvirus (Bardwell i Treisman, 1994), així com entre els POZes de Bcl-6 i Kaiso (Daniel i Reynolds, 1999), suggereix que no tots els dominis POZ poden interaccionar entre si, sinó que hi ha certa especificitat d’interacció. La interacció dels dominis POZ amb altres proteïnes va ser descrita inicialment arrel de l’observació que les proteïnes Bcl-6 i PLZF es podien unir als co-repressors N-CoR i SMRT a través d’aquests dominis (Dhordain et al, 1997; Hong et al, 1997; Huynh i Bardwell, 1998). Estudis posteriors han identificat noves interaccions entre els dominis POZ de Bcl-6 i PLZF i altres co-repressors com Sin3A (Wong i Privalsky, 1998) o BCoR (Huynh et al, 2000), així com interaccions directes amb HDACIs (David et al, 1998). Aquestes interaccions no són equivalents per les dues molècules repressores, sinó que s’han descrit diferències tant d’afinitat (PLZF s’uneix més dèbilment a SMRT que Bcl-6) com d’especificitat (el co-repressor BCoR interacciona de forma selectiva amb el domini POZ de Bcl-6), suggerint que els mecanismes de repressió, tot i que semblen anar per vies similars, no són idèntics per Bcl-6 o PLZF (Wong i Privalsky, 1998). II. Introducció 54 Altres interaccions observades són les dels domins POZ de Bric à Brac (BAB1 i BAB2) amb BIP2/dTAFII155 de Drosophila (Pointud et al, 2001), o la del POZ de PLZF amb p300 (Melnick et al, 2000), tot i que en ambdós casos se’n desconeix la repercussió biològica. 2.1.4. Estructura del domini POZ El domini POZ de PLZF ha estat cristal.litzat recentment per dos grups diferents i se n’ha pogut resoldre la seva estructura (Ahmad et al, 1999; Li et al, 1999a). L’estructura cristal.lina, molt similar en ambdós casos, mostra un dímer POZ-POZ fortament entrellaçat amb una extensa interfase hidrofòbica. Aquestes característiques, típiques d’un homodímer obligat, serien consistents amb l’observació que el dímer POZ-POZ és una estructura molt estable i el seu desplegament implica una transició en dos estats totalment irreversible (Li et al, 1997a). Figura I.6. Estructura tridimensional del domini POZ de PLZF. A. Estructura cristal.lina resolta del domini POZ de PLZF en forma de dímer, on cada monòmer està representat per un color diferent. Vénen indicades les regions corresponents al solc potencial d’unió al lligand i a la cara hidrofòbica del dímer. B. Representació esquemàtica de la topologia del dímer (extret d’Ahmad et al, 1999). L’esquelet central de la proteïna està format per una agrupació d’hèlixs-α flanquejada per làmines β a la part superior i inferior de la molècula, donant lloc a una estructura globular en forma de papallona (figura I.6). Interaccions entre les regions N i C-terminal dels dos monòmers a la base inferior del dímer contribueixen al sosteniment de l’estructura: així, la superfície hidrofòbica solc potencial d’unió al lligand II. Introducció 55 cadena β1 de l’N-terminal d’un monòmer interacciona amb la cadena interna β5’ de l’altre monòmer formant una làmina β antiparal.lela; a més a més, una cara d’aquesta làmina β1/β5’ s’empaqueta amb l’hèlix α6’ de la regió C-terminal del segon monòmer, formant una extensa superfície còncava a la cara inferior del dímer (Ahmad et al, 1999) (figures I.6A i I.6B). L’estructura dimèrica del domini POZ i la seva capacitat d’interaccionar amb altres proteïnes permet definir tres classes estructurals de residus a la molècula: els situats a l’interior del core del monòmer, els situats a la interfase del dímer i els exposats a la superfície: Core del monòmer: les cadenes β2, β3 i β4 formen el sostre del cor hidrofòbic de cada monòmer, el qual està estabilitzat per alguns residus dels segments helicoidals α2, α3, α4 i α5. Tots aquests residus implicats en l’estructura del core del domini POZ corresponen als que estan més conservats entre les proteïnes de la família BTB/POZ (veure figura I.7). Així, His-48 (loop β3-α2), Leu-52 (α2), Ser-56 (loop α2-α3) i Tyr-88 (α4) es troben conservats en pràcticament tots els dominis POZ. Interfase del dímer: una quarta part de la superfície del monòmer accessible està involucrada en els contactes intermoleculars per a la formació del dímer. Aquests contactes són bàsicament a dos nivells: les interfases “tancades”, que involucren β1/β5’/α6’ i β1’/β5/α6 a banda i banda de la part inferior del dímer; i una interfase “oberta” central formada per un entrecreuament de les hèlixs α1 i α1’ que s’estabilitza en empaquetar-se α1’ d’un monòmer amb el loop α2/α3 de l’altre. Figura I.7. Alineament de seqüència d’alguns dominis POZ/BTB i l’estructura secundària observada pel domini POZ de PLZF. La numeració s’ha fet en base al PLZF, i l’estructura cristal.lina s’ha resolt pels residus compresos entre les posicions 6-126. En negreta venen indicats els aminoàcids idèntics, i en gris els que estan conservats en almenys un 50% de les proteïnes. • indica els aminoàcids classificats com a “enterrats”. Els números en color representen el percentatge amb què contribueix un residu determinat a la interfase “tancada” (vermell) o “oberta” (blau) del dímer (extret d’Ahmad et al, 1999). II. Introducció 62 DNA, la qual, en forma d’oligòmer, pot unir simultàniament diversos llocs independents (Espinás et al, 1999). Així doncs, l’oligomerització i unió cooperativa al DNA explica que l’afinitat de GAGA per seqüències múltiples i properes sigui més gran que per llocs únics i curts. Estudis realitzats amb microscopi electrònic indiquen que la unió sinergística de l’oligòmer de GAGA provoca una curvatura en el DNA, suggerint un possible paper de l’oligomerització en assistir la comunicació entre elements molt allunyats en seqüència (Katsani et al, 1999). Donant suport a aquesta hipòtesi, recentment s’ha pogut observar que GAGA facilita la trans-activació actuant com a proteïna pont que media la comunicació entre un enhancer distal i el promotor, i que aquesta funció és depenent de l’oligomerització a través del domini POZ (Mahmoudi et al, 2002). D’altra banda, assajos de transcripció in vitro han demostrat que els oligòmers de GAGA són transcripcionalment actius, i que encara que el domini POZ no és necessari per l’activació, en la seva absència no s’observa un sinergisme en incrementar el nombre de llocs d’unió (Espinás et al, 1999). 2.2.2.2. La regió X A diferència dels altres dominis, la regió X, que abarca els residus 121-310, ha estat poc estudiada i actualment encara se’n desconeix la seva funció. No obstant, l’alt grau de conservació que presenta entre les espècies de D. melanogaster i D. virilis suggereix que exerceix algun paper important per a la proteïna GAGA (Lintermann et al, 1998). Aquesta regió conté la putativa senyal de localització nuclear (NLS) de GAGA (Lintermann et al, 1998). D’altra banda, recentment s’ha pogut demostrar que és necessària per la interacció de GAGA amb NURF301 (Xiao et al, 2001), i que contribueix en la interacció de GAGA amb SAP18 (Espinás et al, 2000). 2.2.2.3. El domini d’unió a DNA de GAGA El domini d’unió a DNA o DBD (DNA binding domain), que inclou els residus 310-372, està format per un únic dit de zinc de tipus Cys2-His2 flanquejat per tres regions bàsiques anomenades BR1, BR2 (localitzades a N-terminal del dit de zinc) i BR3 (situada en posició C-terminal). En la majoria de proteïnes amb dits de zinc, aquests es troben repetits en tàndem en un nombre que oscil.la entre 2 i 32. Quan estan en nombre múltiple, els dominis Cys2-His2 acostumen a reconèixer les dianes de forma modular, de manera que cada unitat reconeix 3 pb de DNA. En el cas de GAGA, el domini mínim de reconeixement al DNA requereix, a més del dit de zinc, les regions BR1 i BR2, les quals li confereixen afinitat i especificitat d’unió. La regió BR3, tot i no ser necessària per la unió, n’incrementa l’afinitat (Pedone et al, 1996). El domini d’unió a DNA ha estat un dels més estudiats de la proteïna GAGA, i s’ha arribat a resoldre la seva estructura per RMN conjuntament amb l’oligonucleòtid de doble II. Introducció 63 cadena GAGAG (que constitueix la seqüència consens mínima d’alta afinitat de GAGA). Segons aquesta estructura, el dit de zinc s’uniria als tres primers nucleòtids, i les dues regions bàsiques BR1 i BR2 s’unirien a les dues últimes bases. De fet, BR1 i BR2 semblen tenir una contribució menor en la interacció amb el DNA, ja que mutacions en un sol nucleòtid de la seqüència consens (excepte la G central) tenen només efectes moderats en la unió al DNA (Omichinski et al, 1997). Aquests resultats estarien d’acord amb el fet que, tot i que la seqüència consens d’alta afinitat és el pentanucleòtid GAGAG, el DBD també és capaç d’unir el trinucleòtid GAG tant en promotors naturals com en llocs sintètics, tot i que amb menor afinitat que seqüències d’unió més llargues (Wilkins i Lis, 1998). Figura I.10. Distribució dels llocs d’unió de GAGA en diversos promotors. Les localitzacions dels llocs d’unió, obtinguts mitjançant footprinting amb DNasa I, s’indiquen amb el.lipses blaves (extret de Soeller et al, 1993). Tot i que la seqüència GAGAG s’ha definit com la seqüència consens a què GAGA s’uneix amb elevada afinitat, els llocs d’unió naturals presenten gran variabilitat tant en longitud com en seqüència (revisat a Granok et al, 1995). GAGA participa en la regulació de l’expressió de bastants gens de Drosophila, els quals inclouen gens induïbles o regulats (hsp26, hsp70, H3/H4, Adh, E74), gens involucrats en el desenvolupament (engrailed, even-skipped, fushi-tarazu, Krüppel, Ultrabithorax) i gens constitutius o housekeeping (actina 5-C, α 1 − tubulina) (Soeller et al, 1993). Tots aquests gens presenten llocs d’unió de GAGA en nombre múltiple i extesos al llarg de les seves regions promotores, normalment en un rang entre –30/-300, tot i que en alguns casos es troben més allunyats o bé downstream del lloc d’inici de transcripció (figura I.10). Sovint aquests elements GAGA es troben solapats o agrupats en forma de clusters, una disposició que facilitaria la unió d’una GAGA oligomèrica al DNA (Wilkins i Lis, 1997). engrailed -400 -300 -200 -100 +1 E74 -400 -300 -200 -100 +1 fushi tarazu -400 -300 -200 -100 +1 even-skipped -400 -300 -200 -100 +1 Krüppel -400 -300 -200 -100 +1 +100 Ultrabithorax -400 -300 -200 -100 +1 hsp26 -400 -300 -200 -100 +1 hsp70 -400 -300 -200 -100 +1 engrailed -400 -300 -200 -100 +1 engrailed -400 -300 -200 -100 +1 E74 -400 -300 -200 -100 +1 E74 -400 -300 -200 -100 +1 fushi tarazu -400 -300 -200 -100 +1 fushi tarazu -400 -300 -200 -100 +1 even-skipped -400 -300 -200 -100 +1 even-skipped -400 -300 -200 -100 +1 Krüppel -400 -300 -200 -100 +1 +100 Krüppel -400 -300 -200 -100 +1 +100 -400 -300 -200 -100 +1 +100 Ultrabithorax -400 -300 -200 -100 +1 Ultrabithorax -400 -300 -200 -100 +1-400 -300 -200 -100 +1 hsp26 -400 -300 -200 -100 +1 hsp26 -400 -300 -200 -100 +1 hsp70 -400 -300 -200 -100 +1 hsp70 -400 -300 -200 -100 +1 II. Introducció 64 El paper de GAGA no només està limitat a les regions promotores o enhancers, per això també trobem llocs d’unió de GAGA als elements de resposta a Polycomb (concretament als PRE iab-7 i bxd) i en un domini barrera o boundary (Fab-7) del complex Bithorax (Hagstrom et al, 1997; Horard et al, 2000). Finalment, GAGA també s’ha observat que s’uneix a algunes zones heterocromàtiques, concretament als satèl.lits (AAGAG)n (Raff et al, 1994; Platero et al, 1998). 2.2.2.4. El domini ric en glutamines o domini Q L’extrem C-terminal de la proteïna GAGA té vàries regions riques en glutamines, per això es coneix com a domini Q. És la única regió diferent per a la GAGA-519 i la GAGA581, tant en seqüència aminoacídica com en longitud (Q-581 té el doble de residus que Q519). Anàlogament a d’altres activadors transcripcionals amb dominis rics en glutamines, s’ha pogut assignar el domini Q com el responsable de la funció transactivadora de GAGA, ja que la deleció d’aquest domini aboleix l’activitat transcripcional de la proteïna. Un anàlisi exhaustiu d’aquest domini ha permès observar que presenta una estructura interna modular en què cadascuna de les diferents regions contribueixen a l’activació. A més a més, el domini Q pot actuar independentment de la resta de la proteïna (Vaquero et al, 2000). Addicionalment a la seva funció transactivadora, al domini Q se li han assignat també altres propietats, com la de distorsió del DNA o la de mediar la multimerització de GAGA formant agregats de tipus fibres amiloides (Agianian et al, 1999; Wilkins i Lis, 1999). D’altra banda, estudis recents sobre les propietats dels dominis Q-519 i Q-581 suggereixen que aquestes regions influenciarien o modularien la selecció del lloc d’actuació d’aquestes dues isoformes (Greenberg i Schedl, 2001). 2.2.3. Funcions de GAGA 2.2.3.1. GAGA com a factor de transcripció Els primers estudis en què es va identificar GAGA suggerien que aquesta era un activador transcripcional que actuava sobre molts gens de Drosophila que contenien seqüències alternants d(GA·TC)n a les seves regions promotores, ja que en assajos de transcripció in vitro i de transfecció a cèl.lules s’observava que l’addició de GAGA estimulava la transcripció d’aquests gens (Biggin i Tjian, 1988; Soeller et al, 1988; Thummel, 1989; Chung i Keller, 1990; Read et al, 1990). Més tard, en estudis d’activació del gen Krüppel es suggerí que l’activació de la transcripció observada en presència de GAGA no era deguda a una acció de GAGA com a activador transcripcional, sinó que aquesta de fet actuaria com un antirepressor (Kerrigan et al, 1991). Concretament, es va observar que GAGA només estimulava la transcripció quan en el DNA motlle hi era present la histona H1, la qual s’unia de forma inespecífica a les II. Introducció 65 regions d(GA·TC)n i era desplaçada per GAGA degut a la seva major afinitat per aquestes seqüències. En canvi, sobre DNAs nus sense histona H1, GAGA no era capaç d’activar, mentre altres repressors com Sp1 o GAL4VP16 sí (Croston et al, 1991). Finalment, els mateixos autors van descriure l’antirepressió com un fenomen generalitzat i una propietat de la majoria d’activadors, essent essencial el domini d’unió a DNA per aquesta activitat (Croston et al, 1992). Estudis posteriors han demostrat que GAGA realment funciona com a activador transcripcional, tant in vivo (Soeller et al, 1993; Benyajati et al, 1997) com in vitro (Vaquero et al, 2000). Tot i que es desconeix el mecanisme d’activació de GAGA, existeixen evidències experimentals que suggereixen que GAGA estimula tant el reclutament de GTFs al promotor com la reiniciació (Vaquero et al, 2002). 2.2.3.2. GAGA i la remodelació de la cromatina Les primeres evidències que revelaren una funció de GAGA associada a la reorganització de l’estructura de la cromatina sorgiren d’estudis sobre el mecanisme d’activació dels gens heat shock (hsp26 i hsp70) de Drosophila. Hsp26 i hsp70 són gens l’expressió dels quals pot ser induïda ràpidament en resposta al xoc tèrmic. Això es deu a que les seves regions promotores presenten una estructura de la cromatina oberta, que permet que la maquinària transcripcional estigui constitutivament unida al promotor i la RNAP II pugui iniciar la transcripció, però no pugui progressar més enllà d’una elongació primerenca, mantenint-se aturada entre les posicions +17 i +37. La inducció per xoc tèrmic desencadena una fosforilació del heat shock factor (HSF) que indueix la seva trimerització, i li permet aleshores unir-se als heat shock elements (HSE) del promotor. Aquesta unió desbloqueja l’estat de pausa en què es troba la RNAP II, la qual aleshores pot continuar elongant normalment (Shopland et al, 1995; Wilkins i Lis, 1997). GAGA té un paper fonamental en l’activació d’aquests gens, ja que en unir-se a les seves regions promotores genera llocs d’hipersensibilitat a DNasa I (llocs DH), mantenint una conformació oberta del promotor que és essencial tant per la unió constitutiva de la maquinària transcripcional (facilita el reclutament de RNAP II i TFIID) com per la unió del HSF als seus elements (Shopland et al, 1995; Leibovitch et al, 2002). D’altra banda, estudis de crosslinking in vivo han evidenciat que GAGA també es pot unir a les regions codificants d’alguns gens durant l’elongació, seguint una cinètica similar a la de la polimerasa (O’Brien et al, 1995). Això ha fet sorgir la hipòtesi de que GAGA podria actuar de dues formes: unint-se constitutivament als llocs d’alta afinitat del promotor, i avançant al llarg del gen una vegada ha estat induït, obrint la cromatina i facilitant el pas de la polimerasa. Tsukiyama et al, 1994, van estudiar l’efecte de GAGA sobre el promotor del gen hsp70 reconstituït in vitro en cromatina a partir d’un extracte embrionari de Drosophila. En absència de GAGA, el sistema d’ensamblatge era capaç de col.locar un nucleosoma sobre dos de les quatre seqüències d(GA·TC)n de promotor. No obstant, l’addició de GAGA abans, II. Introducció 66 durant o després de l’ensamblatge de la cromatina produïa una disrupció dels nucleosomes i la formació de llocs DH tant a l’element GAGA com al HSE, així com una reordenació dels nucleosomes adjacents. Aquest procés era depenent d’ATP, i com GAGA no té la capacitat d’hidrolitzar ATP, es buscà el factor que actuava en cooperació amb GAGA, que resultà ser el complex remodelador NURF (Tsukiyama i Wu, 1995). Aquesta acció conjunta de NURF i GAGA estaria facilitada per una associació directa entre la subunitat NURF301 del complex remodelador i GAGA (Xiao et al, 2001), i consistiria en un deslliçament (sliding) de nucleosomes per part de NURF que permetria a GAGA unir-se a les seves seqüències de reconeixement; posteriorment, i una vegada unida, GAGA redefiniria les posicions dels nucleosomes. Aquesta propietat de reorganitzar nucleosomes no és exclusiva de GAGA, sinó que altres factors d’unió a DNA com HSF (Wall et al, 1995) o derivats de GAL4 (Mizuguchi et al, 1997) poden actuar també en cooperació amb NURF i afectar l’estructura de la cromatina de manera similar a GAGA. D’altra banda, l’acció de GAGA no sembla dependre de la presència del complex NURF, sinó que tan sols requeriria la subunitat ATPasa ISWI, present també en altres complexes remodeladors. En aquest sentit, s’ha descrit que GAGA i ISWI poden actuar conjuntament per mediar una disrupció nucleosomal al promotor de fushi tarazu que dóna lloc a una activació de la transcripció del gen (Okada i Hirose, 1998). A més a més, GAGA i ISWI colocalitzen en molts loci eucromàtics en cromosomes politènics (Deuring et al, 2000), haventse suggerit que una acció dels dos factors sobre les regions promotores podria ser important en l’activació de determinats gens. Un punt de controvèrsia constant en el mode d’actuació de GAGA ha estat el solapament de les seves propietats activadores i remodeladores de la cromatina. Això ha fet dubtar sovint de la funció de GAGA com a activador de la transcripció, havent-se atribuït l’efecte que s’observava en presència de GAGA a la seva acció sobre els nucleosomes. No obstant, estudis recents en mosques transgèniques indiquen que l’activació transcripcional mediada per GAGA no necessàriament ve acompanyada d’una reorganització nucleosomal, sinó que les dues activitats són independents (Pile i Cartwright, 2000). 2.2.3.3. GAGA en la regulació dels gens homeòtics El Complex Bithorax (BX-C), de més de 300 kpb, està dividit en grans dominis cadascun dels quals dirigeix l’expressió dels gens homeòtics Ultrabithorax, Abdominal-A i Abdominal-B en un parasegment de la mosca. Les senyals reguladores inicials provenen dels gens “gap” i “pair-rule”, però quan aquestes senyals decauen els patrons d’expressió són mantinguts pels membres dels grups PcG (Polycomb-group) i TrxG (Trihorax-group), per als quals s’han identificat elements de resposta al llarg del BX-C, els Polycomb response elements (PRE) i els Trithorax response elements (TRE). Les funcions d’aquests dos grups de gens són en principi antagòniques, de tal manera que els membres PcG (Polycomb, Pleiohomeotic, Posterior Sex Combs, Extra Sex Combs i Enhancer of Zeste) indueixen estats reprimits de determinades regions per compactació de la II. Introducció 67 cromatina, mentre els TrxG (Trithorax, GAGA, Brahma, Moira, Kismet, Osa i dISWI) produeixen un efecte positiu sobre l’activació dels loci genètics, bé fent més accessible la cromatina a altres factors, bé reclutant elements amb funcions remodeladores de la cromatina (revisat a Farkas et al, 2000). GAGA, com els altres membres de la família TrxG, actua positivament sobre l’expressió dels gens homeòtics, mantenint una estructura oberta de la cromatina en determinades regions reguladores i activant l’expressió d’alguns d’ells. No obstant, recentment han sorgit una sèrie d’evidències que apuntarien a que GAGA també podria estar associada a una funció repressora en cooperació amb membres PcG. Per una banda, GAGA co-localitza amb Polycomb en alguns PREs (Strutt et al, 1997), a més d’haver-se trobat formant part d’alguns complexes PcG i ser requerida per la unió d’aquests als PRE en experiments in vitro (Horard et al, 2000), suggerint que GAGA participa activament en el reclutament dels PcG als seus elements de resposta. A més a més, s’ha observat que per al correcte silenciament del PRE iab-7 i el silencer MCP d’Abdominal-B són necessaris tant GAGA com Pleiohomeotic (Mishra et al, 2001; Busturia et al, 2001). Algunes evidències experimentals com la interacció física i funcional entre GAGA i SAP18 (Espinás et al, 2000), així com la presència de GAGA, Rpd3 i membres del PcG en un complex silenciador (Poux et al, 2001), han fet sorgir la hipòtesi que la col.laboració entre GAGA i membres PcG per a la repressió de determinats loci vindria mediada per un reclutament de desacetilases. D’altra banda, estudis molt recents demostren que GAGA està acomplexada in vivo amb la proteïna Pipsqueak, i que de fet ambdues s’uneixen als mateixos elements GAGA per actuar cooperativament en l’activació transcripcional i el silenciament dels gens homeòtics (Schwendemann i Lehmann, 2002). Aquesta funció repressora de GAGA semblaria no estar limitada al context de la regulació dels gens homeòtics. Concretament, recentment s’ha pogut observar en experiments de transfecció a cèl.lules de Drosophila que GAGA media la repressió del seu propi promotor en una acció que requereix del seu domini d’unió a DNA i de la presència dels elements GAGA al promotor Trl (Kosoy et al, 2002). 2.2.3.4. GAGA en els insulators Els insulators són elements de seqüència que aïllen la regió on es troben de la influència d’enhancers o silenciadors de la regió adjacent. Així, la presència d’un insulator permet que un enhancer afecti a un promotor però no a un altre situat en direcció oposada S’ha proposat que GAGA podria facilitar l’acció d’alguns insulators, bloquejant enhancers distals i estabilitzant interaccions enhancer-promotor. Concretament, s’ha identificat un element que funciona com a insulator entre la caixa TATA i el lloc d’inici de transcripció del promotor d’even-skipped (eve) que conté una seqüència GAGAG. Mutacions en aquest element donen lloc a una activació dels gens situats a 5’ d’eve per enhancers situats a 3’, suggerint que en el promotor natural la unió de GAGA al seu element impediria II. Introducció 68 que enhancers a 3’ tinguessin cap influència sobre el promotor (Ohtsuki i Levine, 1998). Aquesta acció de GAGA, “atrapant” enhancers distals per una estabilització de les interaccions enhancer-promotor, de fet es podria explicar per la seva capacitat d’actuar com a proteïna pont entre elements allunyats físicament (Mahmoudi et al, 2002). 2.2.3.5. GAGA i heterocromatina GAGA no sembla estar implicada només en l’estructuració de la cromatina en regions promotores o grans loci genètics com el BX-C, sinó que també té una influència en regular l’estructura de l’heterocromatina. La primera evidència d’aquesta funció sobre l’heterocromatina fou l’observació que els mutants del gen Trl actuaven com a enhancers de PEV (Farkas et al, 1994), suggerint un paper de GAGA en mantenir una estructura oberta de la cromatina en determinades regions heterocromàtiques. Concretament, s’ha postulat que la funció de GAGA en relació amb l’heterocromatina podria ser la d’obrir la cromatina per a permetre l’expressió de gens situats en aquestes regions per una banda, i impedir l’expansió de l’heterocromatina als punts on estaria unida per l’altra. Alternativament, també s’ha proposat un paper més general de GAGA modificant l’estructura de la cromatina localment, bé promovent un arranjament nucleosomal alterat o bé permetent que factors específics d’heterocromatina accedissin al DNA (Jiménez-García, 1998). D’acord amb aquesta hipòtesi, s’ha observat que GAGA es pot unir a regions específiques de l’heterocromatina, concretament als satèl.lits (AAGAG)n i (AAGAGAG)n. En embrions pre-blastodèrmics, on encara no s’ha establert l’heterocromatina, GAGA es troba unida a aquestes regions al llarg de tots els estadis del cicle cel.lular (Raff et al, 1994); en canvi, en embrions més tardans en els quals ja ha tingut lloc l’heterocromatinització, la localització de GAGA als satèl.lits (AAGAG)n i (AAGAGAG)n tan sols s’observa durant la mitosi (Platero et al, 1998). El fet que GAGA només es trobi unida a l’heterocromatina a mitosi, juntament amb l’observació que mutants hipomòrfics Trl13C presenten defectes en la condensació i segregació dels cromosomes, ha dut a suggerir un paper actiu de GAGA en l’organització correcta de l’heterocromatina en el moment de la mitosi, evitant una compactació desordenada (Bhat et al, 1996). 2.3. La proteïna Tramtrack Tramtrack (TTK) va ser identificat com un repressor transcripcional que s’unia a determinades regions promotores dels gens “pair-rule” even-skipped i fushi tarazu (Harrison i Travers, 1990; Read i Manley, 1992; Brown i Wu, 1993). Estudis posteriors han demostrat que TTK també té un paper essencial en el desenvolupament de les cèl.lules neuronals, reprimint la identitat neuronal i estabilitzant els destins no-neuronals (Xiong i Montell, 1993; Lai i Li, 1999; Badenhorst, 2001). II. Introducció 69 2.3.1. Isoformes de TTK El gen tramtrack (ttk), situat a la posició 100D3 a cromosomes politènics, genera per splicing alternatiu dos mRNAs de 3.6 i 4.2 kpb que donaran lloc a dues proteïnes, Tramtrack69 (TTK69) i Tramtrack88 (TTK88), de 641 i 811 aminoàcids i amb pesos moleculars predits de 69 i 88 kDa respectivament. TTK69 i TTK88 tenen iguals els primers 291 aminoàcids, essent diferents en la resta. A diferència de les isoformes de GAGA, TTK69 i 88 s’han pogut associar a funcions diferents. Així, mentre TTK69 participa tant en la regulació de la segmentació abdominal de l’embrió com en el desenvolupament neuronal, TTK88 bàsicament se l’ha relacionat amb funcions repressores del destí neuronal. Els patrons temporals i espaials d’expressió d’ambdues isoformes al llarg de l’embriogènesi són força complexes, i han estat objecte de nombrosos estudis (Harrison i Travers, 1990; Read i Manley, 1992; Read et al, 1992; Brown i Wu, 1993). Durant les 2 primeres hores després de la fertilització, i fins a l’estadi de blastoderm cel.lular, TTK69 i 88 s’expressen de forma generalitzada per tot l’embrió degut a la deposició dels respectius mRNAs per part de la mare (són, igual que GAGA, d’efecte matern). Entre les 2-4 hores, de blastoderm a gàstrula, els trànscrits de ttk ja han desaparegut, i encara no s’ha iniciat l’expressió zigòtica. Aquesta darrera comença a ser evident entre les 4-8 hores, període en què es van incrementant gradualment els nivells de les dues proteïnes fins arribar a un pic a les 8-12 hores. Durant aquesta etapa, que coincideix amb la gastrulació i extensió de la banda germinal, l’expressió de TTK69 i 88 al llarg de l’embrió presenta força diferències. Una de les característiques més peculiars de l’expressió de TTK69 (i que precisament és l’origen del nom de la proteïna), és la formació de 14 bandes a l’ectoderm i mesoderm de la banda germinal en extensió i la posterior fusió d’aquestes bandes formant un patró enreixat o de “tramtrack” al voltant de la banda germinal. Entre les 18-24 hores els nivells de les proteïnes TTK decauen considerablement, essent pràcticament inapreciable a l’estadi de larva. Posteriorment, a pupa i adults, es tornen a detectar quantitats considerables de les dues isoformes. S’ha suggerit que el patró d’expressió de TTK69 al llarg del desenvolupament és determinant per a les funcions associades a aquesta proteïna. Per una banda, l’aport matern de TTK contribuiria a determinar el moment de l’expressió dels gens de segmentació, prevenint-ne l’activació prematura. I per altra banda, la funció de TTK en el desenvolupament neuronal tindria lloc al final de l’embriogènesi, quan la majoria de tipus cel.lulars s’han especificat i el destí triat s’ha d’estabilitzar, coincidint amb els elevats nivells d’expressió d’aquesta proteïna. II. Introducció 70 Estudis sobre la funció de TTK al sistema nerviós han evidenciat que tant TTK69 com TTK88 poden ser ubiquitinitzats en un mecanisme que promou la ràpida degradació d’ambdues proteïnes a les cèl.lules neuronals (Li et al, 1997b; Tang et al, 1997). D’altra banda, estudis recents amb cèl.lules SL2 indiquen que TTK69 és substrat per la conjugació amb dSmt3, l’homòleg de SUMO-1 de mamífers (una proteïna relacionada amb l’Ubiquitina) (Lehembre et al, 2000). Aquesta observació suggereix la sumoilització com un mecanisme de regulació dels nivells de TTK al llarg del cicle cel.lular. També s’ha proposat que TTK podria ser fosforilat, tot i que encara es desconeix si aquesta modificació té lloc in vivo i quina repercussió té en l’activitat de la proteïna (Lehembre et al, 2000). 2.3.2. Dominis de TTK TTK només té dos dominis estructuralment ben definits: un domini POZ/BTB a Nterminal de la proteïna, comú per a les dues isoformes, i un domini d’unió a DNA situat a la regió C-terminal, diferent per a TTK69 i TTK88 (veure figura I.11). A part d’aquests dominis, s’han identificat alguns motius conservats a la seqüència aminoacídica de TTK69: trams d’aminoàcids similars a les seqüències PEST, típiques de proteïnes amb vides mitges curtes i ràpid turnover entre els residus 280-317; tres putatives senyals de localització nuclear (NLS), distribuïdes entre els dominis POZ i d’unió a DNA; una regió de 100 aminoàcids, just a N-terminal del primer dit de zinc, d’unió a dMi-2; una seqüència consens P-DLS d’unió a dCtBP entre els aminoàcids 591-595; i una regió rica en serines i alanines a C-terminal de la proteïna, present també en altres repressors transcripcionals com Hunchback o Invected. 2.3.2.1. El domini POZ/BTB de TTK El domini POZ de TTK inclou els primers 114 residus de la proteïna. Diverses evidències experimentals apunten a que de forma similar a GAGA o altres proteïnes amb dominis POZ, TTK podria formar homooligòmers a través d’aquest domini. Concretament, a partir d’experiments de co-traducció in vitro i immunoprecipitació s’ha observat que TTK pot interaccionar amb si mateix a través dels primers 153 residus de la proteïna (Bardwell i Treisman, 1994). A més a més, estudis molt recents han pogut demostrar, emprant microscopia electrònica, que el domini POZ de TTK oligomeritza en forma de tetràmer (Badenhorst et al, 2002). D’altra banda, també s’ha suggerit que el POZ de TTK pot mediar la formació d’heterooligòmers amb altres proteïnes que tenen domini POZ, concretament GAGA (Bardwell i Treisman, 1994), i Bric à Brac (Pointud et al, 2001). II. Introducció 71 TRAMTRACK69 A Figura I.11. Dominis de Tramtrack69 (A) i seqüència aminoacídica (B) amb els motius més representatius assenyalats. 2.3.2.2. El domini d’unió a DNA de TTK Les dues isoformes de TTK tenen dos dits de Zn de tipus Cys2-His2, situats entre els residus 508-559 a TTK69 i 610-667 a TTK88. El primer dit és substancialment diferent per a les dues proteïnes, mentre el segon mostra més d’un 50% d’identitat, però tot i això TTK69 i TTK88 tenen especificitats d’unió a DNA força diferents. El domini d’unió a DNA de TTK69 ha estat àmpliament estudiat, essent el domini més ben caracteritzat de la proteïna. Així, s’ha determinat la regió mínima de reconeixement a DNA que inclou, a més dels dos dits de Zn, una petita seqüència de 7 aminoàcids a Nterminal del primer dit que l’hi confereixen afinitat i especificitat d’unió (els dos dits són insuficients per unir-se al DNA específicament) (Fairall et al, 1992). 1 114 649508 559 POZ/BTB BD P-DLS Seqüències Pest 591-595 d-Mi2 4081 114 649508 559 POZ/BTB BD P-DLS Seqüències Pest 591-595 d-Mi2 408 B POZ/BTB MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVS HPEKHPIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGL TEVNDD KPSPAAAAAGAGATGSESTATTPQLQRIQPYLVPQRNRSQAGGLLASAANAGNTPT L PVQPSLLSSALMPKRKRGRPRKLSGSSNGTGNDYDDFDRENMMNDSSDLGNGKMCNESYSGN DDGSDDNQPNAGHTDDLNESRDSLPSKRSKNSKDHRVVSHHEDNSTSDGNDSDGEGLDTSYM EPQLMLDEYDEPVEFKYNPLTDNSSPTQDHTDGSHLNEQARQQAFLIAAQRKHQVETAAAAA ASGIKLNIIGMAAGGAQVKSMVSIPKLTPIGKVNAASTPLVSPAGSFSTATVKPRVQKRPKL GKQNGDVKPAVFSSQEYLDIYNSNDGFKLKAAGLSGSTPNLSAGLGTPSVKTKLNLSSNVGE GEAEGSVRDYC BD TKEGEHTYRCKVCSRVYTHISNFCRHYVTSHKRNVKVYPCPFCFKEFTRKDNMTAHVKIIHK I ENPSTALATVAAANLAGQPLGVSGASTPPPPDLSGQNSNQSLPATSNALSTSSSSSTSSSSG SLGPLTTSAPPAPAAAAQ Possibles NLS Seqüències PEST Regió d’unió a dMi-2 Dits de zinc seqüència consens d’unió a dCtBP tracks Ser/Ala III. Objectius 78 III. Objectius 79 L’objectiu fonamental d’aquest treball ha estat analitzar la interacció entre les proteïnes GAGA i TTK i estudiar les possibles conseqüències que pot tenir aquesta interacció en la seva funció com a factors reguladors de la transcripció. Concretament, el què ens proposàvem era: −Determinar si GAGA i TTK poden interaccionar tant in vivo com in vitro i analitzar les regions d’ambdues proteïnes responsables de la possible interacció. −Utilitzant un sistema de transfecció transitòria a cèl.lules SL2, evaluar la contribució de la possible interacció GAGA-TTK en la regulació del promotor eve stripe 2, que conté llocs d’unió per a GAGA i TTK. −Determinar el mecanisme d’actuació de GAGA i TTK en la seva potencial funció reguladora del promotor eve stripe 2, analitzant: (a) quins són els dominis de GAGA i TTK necessaris per dur a terme les seves respectives activitats transcripcionals. (b) quines són les regions del promotor eve stripe 2 requerides per la funció de GAGA i TTK sobre aquest promotor. (c) com afecta la possible interacció GAGA-TTK a la seva unió al DNA. III. Objectius 80 V. Resultats i discussió 123 V.-RESULTATS I DISCUSSIÓ V. Resultats i discussió 124 V. Resultats i discussió 125 1. ESTUDI DE LA INTERACCIÓ ENTRE LES PROTEÏNES GAGA i TTK Una característica comuna entre els factors de transcripció de Drosophila GAGA i TTK és la presència d’un domini POZ d’interacció proteïna-proteïna que en ambdós casos es troba situat en posició N-terminal. Com ja s’ha comentat a la Introducció, els domins POZ són motius conservats evolutivament, sobretot en els residus que configuren el core del monòmer o que estan implicats en la interfase del dímer POZ-POZ. Aquesta conservació suggereix que tots els dominis POZ adopten una estructura similar a la descrita pel PLZF, i que els residus diferencials són els que determinen les diferències d’especificitats i afinitats en les interaccions amb altres proteïnes. En el cas dels dominis POZ de GAGA i TTK, el grau de conservació és especialment elevat, com es pot apreciar en un alineament de seqüència on es comparen els POZes de GAGA, TTK i PLZF (figura R.1). Concretament, la regió d’homologia entre els dominis POZ de GAGA i TTK correspon als primers 117 residus de la seqüència de GAGA (114 de la seqüència de TTK) i mostra una identitat total del 40%. 10 20 30 40 50 60 70 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| PLZF MDLTKMGMIQLQNPSHPTGLLCKANQMRLAGTLCDVVIMVDSQEFHAHRTVLACTSKMFEILFHRNSQHY GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... PLZF TLDFLS---PKTFQQILEYAYTATLQAKAEDLDDLLYAAEILEIEYLEEQCLKMLETIQ GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA Figura R.1. Alineament de seqüència dels dominis POZ de GAGA, TTK i PLZF. S’indiquen amb negreta els residus idèntics, i amb gris els que són similars. La matriu de similitud emprada és la Blosum 62. V. Resultats i discussió 126 El fet que la capacitat de formar homooligòmers sigui tan extesa entre les proteïnes amb domini POZ és força indicatiu de que entre dominis idèntics existeix una elevada afinitat d’interacció. Això suggereix que com més s’assemblin dos dominis POZ, més probabilitats hi haurà de que puguin interaccionar entre ells. Donada l’elevada conservació entre els dominis POZ de GAGA i TTK, sembla doncs bastant factible pensar en una interacció GAGA-TTK mediada pels respectius dominis POZ. La possibilitat d’una interacció heteromèrica entre GAGA i TTK s’ha suggerit en nombroses ocasions, i fins i tot en alguns casos s’ha donat per demostrada, però en realitat no ha arribat a ser analitzada amb detall. De fet, només els estudis de Bardwell i Treisman, 1994, aporten els primers indicis que suggereixen que GAGA i TTK poden formar heterooligòmers a través dels respectius dominis POZ. Concretament, a partir d’experiments de co-traducció in vitro i immunoprecipitació, es va observar que una forma truncada de GAGA contenint els primers 245 residus de la proteïna (GAGA245) era capaç d’interaccionar amb una forma truncada de TTK formada pels primers 153 residus d’aquest (TTK153), tot i que aquesta interacció tan sols es detectava quan ambdues proteïnes eren co-expressades alhora, i no si es mesclaven després d’expressar-les. A més a més, les proteïnes truncades utilitzades en aquests experiments contenien, a més del domini POZ, regions de longitud significativa (127 residus per GAGA i 38 residus per TTK) que també podrien contribuir en la interacció (Bardwell i Treisman, 1994). Amb l’objectiu de confirmar les evidències esmentades que suggereixen una interacció entre les proteïnes GAGA i TTK, en aquesta primera part del treball es va realitzar un estudi exhaustiu de la capacitat d’aquestes dues proteïnes de formar heterooligòmers tant in vivo com in vitro, i es van analitzar amb detall les regions implicades en la interacció. 1.1. Experiments de co-immunoprecipitació en extractes cel.lulars de SL2 Per tal de determinar si GAGA i TTK poden interaccionar in vivo es varen realitzar experiments de co-immunoprecipitació a partir d’extractes totals de cèl.lules SL2 transfectades amb plàsmids d’expressió de les proteïnes GAGA-519 i TTK69. Seguint el protocol detallat a l’apartat 2.5 de Materials i Mètodes, es van co-transfectar cèl.lules SL2 amb 15 µg de vector de sobreexpressió de GAGA (pActPPA-GAGA) i 15 µg de vector de sobreexpressió de TTK (pActPPA-TTK). Els extractes cel.lulars corresponents, obtinguts al cap 48 hores, van ser immunoprecipitats amb els anticossos α-GAGA, α-TTK i fracció IgG de sèrum preimmune, i posteriorment incubats amb Proteïna A Sepharosa. Les proteïnes presents en els extractes immunoprecipitats es varen analitzar per Western blot (figura R.2). V. Resultats i discussió 127 Figura R.2. Co-immunoprecipitació de GAGA i TTK a SL2. A. Immunoprecipitacions dels extractes de cèl.lules SL2 sobreexpressant GAGA-519 i TTK69 amb fracció IgG de sèrum preimmune (carril 1), α-TTK purificat per afinitat (carril 2 ) i α-GAGA purificat per afinitat (carril 3) analitzades amb sèrum α-TTK fraccionat. B. Immunoprecipitacions dels mateixos extractes amb fracció IgG de sèrum preimmune (carril 1), α-GAGA purificat per afinitat (carril 2 ) i α-TTK purificat per afinitat (carril 3) analitzades amb sèrum α-GAGA fraccionat. Les fletxes assenyalen les posicions de TTK69, GAGA-519 i GAGA-581. La immunoprecipitació amb anticossos α-GAGA dóna lloc a una precipitació de quantitats significatives de proteïna TTK (figura R.2A, carril 3) indicant que, efectivament, GAGA i TTK poden formar complexes in vivo, a cèl.lules de Drosophila SL2. En aquestes condicions, les formes de GAGA són eficientment immunoprecipitades (figura R.2B, carril 2): concretament, i d’acord amb amb el què ja està descrit (Benyajati et al, 1997), GAGA apareix en forma de dos doblets, dels quals, el de menor migració electroforètica correspon a la forma endògena de GAGA-581, mentre les espècies de mobilitat més ràpida corresponen a la forma de GAGA-519 sobreexpressada de forma selectiva en aquests experiments. La no detecció de proteïna TTK quan la immunoprecipitació es dugué a terme en presència d’un excés de la fracció IgG de sèrum preimmune (figura R.2A, carril 1) confirma l’especificitat de la co-immunoprecipitació de TTK en presència d’α-GAGA. En l’experiment recíproc, els anticossos α-TTK no semblen capaços d’immunoprecipitar GAGA (figura R.2B, carril 3), tot i que en aquestes condicions TTK immunoprecipita de forma abundant (figura R.2A, carril 2). La no detecció de co-immunoprecipitació amb els anticossos α-TTK pot ser una conseqüència bé de la incapacitat d’aquests anticossos de detectar els complexes GAGA-TTK, bé de que pels epítops que reconegui de la proteïna TTK, la seva presència distorsioni o fins i tot arribi a trencar aquests complexes. TTK69 GAGA-519 GAGA-581 A B 1 2 3 1 2 3 V. Resultats i discussió 128 1.2. Anàlisi de la interacció GAGA-TTK in vitro: GST-pulldowns Per tal de confirmar la interacció GAGA-TTK observada i analitzar la contribució dels respectius dominis POZ en aquesta, es varen realitzar assajos d’interacció proteïna-proteïna in vitro per GST-pulldowns amb formes truncades de les proteïnes GAGA i TTK. Les construccions utilitzades vénen esquematitzades a la figura R.3A. És destacable el fet que, mentre a les formes ∆POZ tant de GAGA com de TTK se’ls ha delecionat el què correspondria al domini POZ estricte (122 i 115 residus respectivament), la proteïna POZGAGA correspon a una forma una mica més llarga del què seria el POZ estricte, ja que està formada pels primers 245 residus de la proteïna. Això és degut a que la proteïna recombinant POZ122 de GAGA no s’expressa soluble en E. coli (Dra. M.L. Espinás, comunicació personal). Les proteïnes TTK o ∆POZTTK marcades amb 35S-Met es van obtenir a partir d’un sistema de transcripció-traducció in vitro en lisat de reticulòcits a partir dels plàsmids d’expressió corresponents (apartat 2.6.1 de Materials i mètodes). L’anàlisi de l’eficiència d’aquestes reaccions es va fer per mètodes autoradiogràfics i serví per donar-nos una idea de les quantitats relatives d’ambdues proteïnes (figura R.3B). Per la seva banda, les diferents versions de GAGA fusionades al pèptid GST, així com el pèptid GST sol, van ser expressades a E. coli i purificades segons el protocol descrit a l’apartat 2.3.2 de Materials i mètodes. A continuació es van immobilitzar a reïna de Glutatió Sepharosa (apartat 2.6.2 de Materials i mètodes) i es varen analitzar les quantitats relatives en un gel SDS-PAGE (figura R.3C). Per realitzar l’assaig de pulldown, les reïnes de Glutatió Sepharosa amb les proteïnes GST unides van ser incubades amb les proteïnes TTK marcades amb 35S-Met. Es van fer els rentats pertinents, i s’analitzà la quantitat de proteïna marcada que havia quedat retinguda a la columna per autoradiografia (figura R.4). És important destacar l’absència de senyal obtinguda quan les proteïnes marcades s’havien incubat amb la proteïna GST, una clara indicació de la manca de soroll de fons i de l’especificitat de les interaccions positives observades (figures R.4A i B). Els resultats obtinguts en els assajos realitzats amb la proteïna TTK sencera (figura R.4A) mostren l’existència d’una interacció de TTK amb les fusions GST-GAGA o GST-POZGAGA, però no amb la forma truncada de GAGA que ha perdut el domini POZ (GST-∆POZGAGA). Això indica que el domini POZ de GAGA és necessari perquè GAGA i TTK puguin interaccionar. De forma similar, el domini POZ de TTK també sembla important per la interacció, ja que si a TTK se li deleciona el seu domini POZ (∆POZTTK) esdevé incapaç d’unir-se eficientment a GST-GAGA (figura R.4B). V. Resultats i discussió 129 Figura R.3. Proteïnes utilitzades a l’assaig GST-pulldown. A. Representació esquemàtica de les construccions de GAGA i TTK emprades. ∆POZGAGA i ∆POZTTK corresponen als polipèptids sense els primers 122 i 115 residus respectivament, mentre POZGAGA correspon a la forma de GAGA que conté els primers 245 residus. B. Anàlisi de les reaccions d’in vitro transcripció-traducció de les proteïnesTTK i ∆POZTTK en un gel al 10% SDS-PAGE. El gel va ser transferit a una membrana de nitrocel.lulosa i exposat en un film d’autoradiografia per determinar l’eficiència de les reaccions. Cada carril correspon a 1 µL de la reacció indicada. C. Anàlisi de les proteïnes GST expressades en E. coli, purificades i immobilitzades a reïna Glutatió Sepharosa, en un gel 12% SDS-PAGE. A cada carril van ser carregats 10 µL de la reïna indicada en cada cas. Els carrils M corresponen als marcadors de pesos moleculars de proteïnes (en KDa). Figura R.4. Assajos GST-pulldown de la interacció de les proteïnes recombinants TTK (A) o ∆POZTTK (B) amb les proteïnes de fusió a GST indicades en cada cas. Les línies marcades com a input corresponen a un 20% de la proteïna total incubada en les reaccions. La detecció de les proteïnes marcades amb 35S-Met es va fer per autoradiografia. TTK ∆POZ TTK (∆POZ 115 ) BDPOZ/BTB BD GAGA POZ GAGA (POZ 245 ) ∆POZ GAGA (∆POZ 122 ) POZ/BTB BD Q X POZ/BTB X BD Q X A ∆ POZ TTK GST- ∆ POZ GAGA GSTPOZ GAGA GST-GAGA B 98 64 50 36 30 M TTK 250 C 98 64 50 36 30 M GST 250 TTK ∆POZ TTK (∆POZ 115 ) BDPOZ/BTB BD TTK ∆POZ TTK (∆POZ 115 ) BDPOZ/BTB BD GAGA POZ GAGA (POZ 245 ) ∆POZ GAGA (∆POZ 122 ) POZ/BTB BD Q X POZ/BTB X BD Q X A GAGA POZ GAGA (POZ 245 ) ∆POZ GAGA (∆POZ 122 ) POZ/BTB BD Q X POZ/BTB X BD Q X A ∆ POZ TTK GST- ∆ POZ GAGA GSTPOZ GAGA GST-GAGA B 98 64 50 36 30 M TTK 250 B 98 64 50 36 30 M TTK 250 C 98 64 50 36 30 M GST 250 C 98 64 50 36 30 M GST 250 GSTPOZ GAGA GST- ∆ POZ GAGA GST GST-GAGA input A TTK GST GST-GAGA input B ∆POZ TTK GSTPOZ GAGA GST- ∆ POZ GAGA GST GST-GAGA input A TTK GST GST-GAGA input B ∆POZ TTK GST GST-GAGA input A TTK GST GST-GAGA input B ∆POZ TTK V. Resultats i discussió 136 V. Resultats i discussió 137 2. CONSEQÜÈNCIES FUNCIONALS DE LA INTERACCIÓ GAGA-TTK: ASSAJOS TRANSCRIPCIONALS A CÈL.LULES SL2 Com s’ha comentat a la Introducció, tant GAGA com TTK són dos factors de transcripció de Drosophila que contribueixen de manera essencial en la regulació de l’expressió gènica durant el desenvolupament embrionari, tot i que no es coneixen amb detall els mecanismes moleculars de la seva acció (veure apartats 2.2 i 2.3). El fet d’haver observat que aquestes dues proteïnes puguin interaccionar, suggereix que una associació GAGA-TTK en determinats estadis de l’embriogènesi podria tenir repercussions funcionals importants en el seu paper com a factors reguladors de la transcripció. En aquesta segona part del treball es va analitzar la possible contribució de la interacció GAGA-TTK en la regulació transcripcional. El context escollit fou el promotor d’evenskipped, un gen “pair-rule” en la regulació del qual semblaria que GAGA i TTK hi podrien participar, GAGA positivament, i TTK negativament. Per tal de realitzar aquest estudi, es posà a punt un assaig transcripcional a cèl.lules SL2 en què es pogués determinar l’activitat promotora d’eve en resposta a la sobreexpressió de GAGA i/o TTK. 2.1. El promotor d’even-skipped 2.1.1. Regulació de l’expressió d’even-skipped Even-skipped (eve) és un gen “pair-rule” primari que té un paper regulador clau en la segmentació de l’embrió durant els primers estadis del desenvolupament de Drosophila. Eve apareix a l’estadi 12 de l’embriogènesi (embrions de 2 hores) en forma d’una sola banda ampla que cobreix la major part de l’embrió, i no és fins a l’estadi 14 (blastoderm cel.lular) que s’expressa en el característic patró de 7 bandes o stripes transversals al llarg de l’eix antero-posterior de l’embrió. Durant la fase de gastrulació, cadascuna d’aquestes bandes es divideix en dos, resultant en un patró de 14 bandes que acaben desapareixent durant l’extensió de la banda germinal. A estadis més tardans de l’embriogènesi, even-skipped V. Resultats i discussió 138 s’expressa d’una forma més localitzada en cèl.lules precursores neuronals (MacDonald et al, 1986; Frasch et al, 1987). L’expressió d’even-skipped en els primers estadis de l’embriogènesi té dos programes diferents de regulació, primerenc i tardà, regulats per dues classes diferents d’elements reguladors al promotor d’eve. Els elements “primerencs” o early (E) són específics de banda i dirigeixen l’expressió inicial de cadascuna d’aquestes en el blastoderm cel.lular. En canvi, l’element “tardà” o late (L), responsable de l’expressió d’eve durant la gastrulació per tal d’aconseguir un refinament de les bandes, és un sol element “multistripe” que regula l’expressió de les 7 bandes. Els elements early responen als gens “gap” hunchback, Krüppel, giant, tailless, knirps i al morfogen bcd, mentre l’element late respon als gens “pair-rule” hairy, runt, paired i al mateix even-skipped, el qual exerceix un paper autoregulador positiu de la seva expressió en aquests estadis tardans (Goto et al, 1989). A més a més, existeixen evidències que suggereixen que els factors de transcripció GAGA i TTK també participarien en el control de l’expressió d’eve: GAGA, pel fet d’haverli identificat múltiples llocs d’unió a la regió situada immediatament a 5’ del lloc d’inici de transcripció, s’ha proposat que podria tenir un paper positiu en la regulació de l’expressió d’eve (Read et al, 1990); en canvi, TTK ha estat descrit com un repressor d’eve, ja que a més de tenir varis llocs d’unió al llarg del promotor, aboleix el patró d’expressió de 7 bandes característic d’eve quan és sobreexpressat ectòpicament (Read et al, 1992, Brown i Wu, 1993). Tot i que inicialment s’havia definit el promotor d’even-skipped com la regió d’unes 7 kpb situada upstream del lloc d’inici de transcripció, estudis recents han evidenciat que tots els elements reguladors de l’expressió d’eve estan localitzats en una regió de 15.6 kpb que s’extén entre –6.4 i +9.2 kpb respecte l’inici de transcripció (Sackerson et al, 1999). Així, l’expressió de les bandes 1 i 5 està regulada per elements situats en una regió compresa entre +4.8 i +8.4 kpb, i l’expressió de les bandes 4 i 6 està dirigida per elements localitzats entre les posicions +4.8 i +6.6 kpb. A més a més, s’ha pogut observar que la regió 3’UTR d’eve controla els nivells d’aquesta proteïna en cèl.lules neuronals (Fujioka et al, 1999). D’altra banda, els elements situats entre les posicions –6.4 kpb i +1 pb inclouen: la regió reguladora de la banda 2 (eve stripe 2) entre les posicions –1700 i +1 pb; l’element que dirigeix l’expressió de les bandes 3 i 7 entre les posicions –3.8 i –2.9 kpb; i l’element regulador late entre les posicions –5.9 i –5.2 kpb (figura R.9). Convé esmentar que en aquest darrer element s’hi ha definit una regió de 200 pb anomenada Minimal autoregulatory sequence (MAS) responsable de mediar l’autoregulació d’eve; aquesta regió conté, a més de llocs d’unió per la proteïna Even-skipped, llocs d’unió tant per GAGA com per TTK, els quals s’ha suggerit que podrien actuar intensificant la resposta autoreguladora d’eve al llarg de la gastrulació (Jiang et al, 1991). V. Resultats i discussió 139 Figura R.9. Representació esquemàtica de la regió reguladora del gen even-skipped (eve) compresa entre –6.4 kpb i el lloc d’inici de transcripció. Els elements reguladors de les bandes 2, 3 i 7, així com els de les 1, 4, 5 i 6 situades més enllà de l’inici de transcripció, dirigeixen l’expressió de cadascuna d’aquestes bandes a l’etapa de blastoderm cel.lular, mentre l’element late controla l’expressió de les 7 bandes d’eve durant l’etapa de gastrulació. 2.1.2. El promotor eve stripe 2 El promotor eve stripe 2 es va definir a partir d’estudis realitzats amb mosques transgèniques com la regió de 1.7 kpb situada immediatament anterior al lloc d’inici de transcripció que era suficient per dirigir l’expressió d’un gen marcador LacZ en els límits de la banda 2 (Harding et al, 1989). Estudis posteriors van acotar l’element regulador mínim capaç de conduir l’expressió de la banda 2, essent una regió de 480 pb situada entre les posicions –1.5 i –1.1 kpb que rebé el nom de Minimal stripe element (MSE). Aquest element conté un total de 12 llocs d’unió pels productes dels gens bicoid (bcd), hunchback (hb), giant (gt) i Krüppel (Kr) que en alguns casos es troben solapats (figura R.10) i, de fet, diferents aproximacions genètiques suggereixen un paper clau d’aquests quatre gens en l’inici de l’expressió de la banda 2 (Small et al, 1992). Concretament, s’ha proposat que les proteïnes Bicoid i Hunchback actuarien sinergísticament per activar l’expressió de la banda 2 en estadis primerencs de l’embriogènesi. Els límits d’aquesta banda estarien definits per la repressió selectiva del producte del gen giant en regions anteriors i de Krüppel en regions posteriors de l’embrió, els quals s’ha proposat que actuen per un mecanisme de quenching segons el qual la seva unió a llocs solapats o molt propers als de Bcd i Hb interfereix en l’activitat d’aquests activadors; consistent amb aquesta hipòtesi, s’ha pogut observar que és necessària la unió al DNA d’aquests dos factors per la seva activitat repressora (Small et al, 1991). No obstant, existeixen evidències experimentals que postulen que l’activació sinergística mediada per Bicoid i Hunchback és de fet “promíscua”, podent ser la seva funció substituïda per altres activadors. Això duu a pensar que, de fet, l’expressió de la banda 2 d’eve tan sols requereix la unió de suficients dominis d’activació que puguin actuar cooperativament per estimular la transcripció (Arnosti et al, 1996). LATE EXPRESSION ELEMENT STRIPES 3 i 7 STRIPE 2 - 6.4 kpb - 5.9 - 5.2 - 3.8 - 2.9 - 1.7 +1 GASTRULACIÓ BLASTODERM LATE EXPRESSION ELEMENT STRIPES 3 i 7 STRIPE 2 - 6.4 kpb - 5.9 - 5.2 - 3.8 - 2.9 - 1.7 +1 GASTRULACIÓ BLASTODERM V. Resultats i discussió 140 Tal i com ja s’ha comentat a la Introducció (veure apartats 2.2.2.3 i 2.3.3.1) al llarg de la regió promotora eve stripe 2 s’han descrit llocs d’unió putatius per a GAGA i TTK, tot i que els únics que estan ben establerts com a tals estan situats a la regió compresa entre les posicions –400 i +1 pb (figura R.10). En extractes nuclears preparats a diferents estadis del desenvolupament embrionari, s’ha pogut determinar que l’activitat d’unió de GAGA a aquesta regió és constant al llarg de l’embriogènesi, i per això s’ha suggerit que el seu paper com a activador transcripcional estaria regulat per altres factors en els diferents estadis del desenvolupament de l’embrió. En canvi, la unió de TTK varia d’acord amb el seu patró d’expressió, observant-se una màxima activitat d’unió en els extractes preparats entre les 5 i 15 hores després de la fertilització (Read et al, 1990). Aquesta presència de llocs d’unió per a GAGA i TTK al promotor eve stripe 2, així com els ja descrits efectes d’expressió ectòpica de TTK en el patró d’expressió d’eve o la possible funció de GAGA com a regulador d’eve, suggereixen que GAGA i TTK tenen papers importants en controlar la correcta expressió d’even-skipped. El promotor eve stripe 2 apareix, així doncs, com un context adequat per estudiar la possible contribució de la interacció GAGATTK en la regulació transcripcional. Figura R.10. Representació esquemàtica del promotor eve stripe 2. S’indiquen els llocs d’unió per als productes dels gens bicoid, hunchback, giant i Krüppel a l’element MSE (minimal stripe element), així com els llocs d’unió de GAGA i TTK que principalment es concentren a la regió més proximal del promotor. 2.2. Estudi de l’efecte de la sobreexpressió de GAGA i TTK en l’activitat del promotor eve stripe 2 Per poder analitzar els efectes de GAGA i TTK sobre l’activitat del promotor eve stripe 2 es va posar a punt l’assaig transcripcional a cèl.lules de Drosophila SL2 (veure apartat 2.8.3 de Materials i mètodes). Es realitzaren transfeccions transitòries d’un plàsmid amb la regió promotora eve stripe 2 fusionada al gen marcador luciferasa (pGL3-eve) amb quantitats creixents de plàsmids de sobreexpressió de les proteïnes GAGA i/o TTK (pActPPA-GAGA, promotor eve stripe 2 -1759 pb -1550 -1070 +1 MSE -400 TTK GAGA Hunchback Bicoid Giant Krüppel promotor eve stripe 2 -1759 pb -1550 -1070 +1 MSE -400 TTK GAGA Hunchback Bicoid Giant Krüppel TTK GAGA Hunchback Bicoid Giant Krüppel Giant Krüppel V. Resultats i discussió 141 pActPPA-TTK) i un plàsmid control de transfecció amb expressió constitutiva del gen βgalactosidasa (pCMV-βGal). Així, l’activitat luciferasa present a l’extracte normalitzada respecte l’activitat β-galactosidasa es pogué correlacionar amb l’activitat transcripcional del promotor eve stripe 2 en resposta a la sobreexpressió de GAGA i/o TTK. A cada experiment, però, aquests valors d’activitat luciferasa foren a la vegada normalitzats respecte l’activitat basal del promotor eve stripe 2 determinada en absència de cap proteïna sobreexpressada; això ens permeté representar l’activitat del promotor amb GAGA i/o TTK en relació amb la seva activitat transcripcional basal, i poder fer comparables experiments diferents. A la figura R.11 es mostren els efectes de la sobreexpressió de GAGA i/o TTK en l’activitat del promotor. Els nivells d’expressió de les proteïnes es van determinar per Western blot a partir dels extractes corresponents (figura R.12). Figura R.11. Estudi de l’efecte de la sobreexpressió de GAGA i/o TTK en l’activitat del promotor eve stripe 2. Es van transfectar cèl.lules SL2 amb 7 µg de plàsmid pGL3-eve (format per la fusió entre el promotor eve stripe 2 i el gen marcador luciferasa) i les quantitats indicades de plàsmids pActPPA sobreexpressant GAGA (A) o TTK (C), o bé 4 µg de vector pActPPA-GAGA amb quantitats creixents de plàsmid pActPPA-TTK (B). Les activitats luciferasa es van mesurar com s’ha especificat a Materials i mètodes (2.8.3), i van ser normalitzades respecte l’activitat basal del promotor eve stripe 2 determinada en presència del plàsmid buit pActPPA (és a dir, sense sobreexpressar proteïna). Les dades representades corresponen a la mitjana de quatre experiments independents. µg GAGA 0 2 4 6 8 Activitat relativa B A Activitat relativa µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 C Activitat relativa µg TTK 0 1 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 µg GAGA 0 2 4 6 8 Activitat relativa B A Activitat relativa µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 C Activitat relativa µg TTK 0 1 2 4 6 8 Activitat relativa µg TTK 0 1 2 4 6 8 0 2 4 6 8 10 0 2 4 6 8 10 0 5 10 15 20 25 V. Resultats i discussió 142 Figura R.12. Anàlisi per Western blot dels nivells de sobreexpressió de GAGA i TTK en els experiments de transfecció indicats a la figura R.11. Es va analitzar la sobreexpressió de GAGA i TTK en transfectar quantitats creixents del plàsmid pActPPA-GAGA (A), o pActPPA-TTK (C) respectivament, així com la sobreexpressió de GAGA (B) i TTK (D) en co-transfectar quantitats creixents del vector pActPPA-TTK en presència de 4 µg de pActPPA-GAGA. A cada carril es van carregar 50 µL d’extracte cel.lular provinent d’una transfecció amb les quantitats de plàsmids d’expressió indicats. La detecció de les proteïnes GAGA i TTK sobreexpressades es va fer amb els sèrums α-GAGA (A, B) o α-TTK (C, D) fraccionats. Els carrils M corresponen als marcadors de pesos moleculars de proteïnes (en KDa). Com es pot observar a la figura R.11A, la sobreexpressió de GAGA resulta en una activació significativa del promotor eve stripe 2 d’una forma depenent de dosi: l’activitat luciferasa augmenta a mida que s’incrementa l’expressió de GAGA fins a una màxima activació d’unes 15 vegades quan es transfecten 4-6 µg del vector de sobreexpressió de GAGA. L’anàlisi per Western blot dels extractes de les cèl.lules transfectades en aquest experiment permeté corroborar que la transfecció de quantitats creixents del plàsmid de sobreexpressió de GAGA es tradueix en un increment dels nivells de sobreexpressió d’aquesta proteïna (figura R.12A). Aquests resultats indiquen que GAGA és capaç d’estimular la transcripció del promotor eve stripe 2. L’activació del promotor eve stripe 2 en transfectar 4 µg del plàsmid d’expressió de GAGA és reprimida eficientment per una sobreexpressió de TTK (figura R.11B): en presència de 0.5 µg de plàsmid pActPPA-TTK l’activitat luciferasa es redueix de forma dràstica, i amb tan sols 2 µg de vector aquesta activitat assoleix els nivells basals. En aquest experiment, i tal com ens mostren els anàlisis per Western blot corresponents als extractes de les cèl.lules transfectades en aquest assaig (figura R.12B i D), els nivells de sobreexpressió B M 98 64 50 36 30 250 GAGA 0 4 4 4 4 4 µgGAGA 0 0 0.5 1 2 4 µgTTK A M 98 64 50 36 30 250 0 2 4 6 8 µgGAGA C 0 0 0.5 1 2 4 µg TTK M 98 64 50 36 30 250 TTK 0 1 2 4 6 8 µgTTK D GAGA M 98 64 50 36 30 250 0 4 4 4 4 4 µgGAGA TTK B M 98 64 50 36 30 250 GAGA 0 4 4 4 4 4 µgGAGA M 98 64 50 36 30 250 98 64 50 36 30 250 GAGAGAGA 0 4 4 4 4 4 µgGAGA 0 0 0.5 1 2 4 µgTTK A M 98 64 50 36 30 250 0 2 4 6 8 µgGAGA M 98 64 50 36 30 250 M 98 64 50 36 30 250 0 2 4 6 8 µgGAGA C 0 0 0.5 1 2 4 µg TTK M 98 64 50 36 30 250 TTK M 98 64 50 36 30 250 M 98 64 50 36 30 250 TTKTTK 0 1 2 4 6 8 µgTTK D GAGAGAGA M 98 64 50 36 30 250 0 4 4 4 4 4 µgGAGA TTK M 98 64 50 36 30 250 M 98 64 50 36 30 250 0 4 4 4 4 4 µgGAGA TTKTTK V. Resultats i discussió 143 de GAGA no es redueixen en sobreexpressar TTK. Per tant, el decrement observat en l’activitat luciferasa quan es sobreexpressa TTK reflecteix la repressió del promotor eve stripe 2 i no una disminució de l’expressió de GAGA. D’altra banda, quan TTK és sobreexpressat en absència de GAGA (veure figura R.12C) no es detecten canvis significatius en l’activitat luciferasa, indicant que TTK per ell mateix no afecta l’activitat basal del promotor eve stripe 2 (figura R.11C). En resum, doncs, aquests resultats indiquen, per una banda, que GAGA és capaç d’activar el promotor eve stripe 2, i per l’altra que TTK reprimeix l’activació depenent de GAGA del promotor però no la seva activitat basal, la qual cosa suggereix que aquesta repressió és deguda a la interacció directa GAGA-TTK. L’anàlisi dels dominis de GAGA i TTK necessaris per observar l’efecte descrit confirmà aquesta hipòtesi (veure apartats 2.3 i 2.4). A continuació es va analitzar si l’efecte repressor de TTK sobre l’activació depenent de GAGA era exclusiu del promotor d’eve. Diferents estudis de transfecció a cèl.lules SL2 realitzats al nostre laboratori demostren que el promotor 5×GAL4hsp70UAS, que conté 5 llocs d’unió per GAL4 inserits a 5’ del promotor mínim hsp70 de Drosophila, és eficientment activat per GAGA, amb uns nivells d’activació força similars als observats pel promotor eve stripe 2 (de fet l’activació de GAGA no requereix els llocs GAL4, i només depèn del promotor mínim del gen hsp70). Aquest resultat, que a més està d’acord amb estudis anteriors que apuntaven a un paper clau de GAGA en l’activació del gen hsp70 (veure apartat 2.2.3.2 de la Introducció), ens proporcionà un nou context on poder evaluar la capacitat de TTK de reprimir una activació mediada per GAGA. Es varen realitzar assajos de transfecció a SL2 amb el plàsmid reporter pGL35×GAL4hsp70UAS i quantitats creixents de plàsmid de sobreexpressió de TTK en presència de 4 µg de plàsmid de sobreexpressió de GAGA. Els resultats es mostren a la figura R.13, on s’observa que TTK és capaç de reprimir eficientment aquest promotor heteròleg 5×GAL4hsp70UAS activat per GAGA: en presència de 0.5 µg de vector de sobreexpressió de TTK s’observa una reducció significativa de l’activitat luciferasa present a l’extracte, i amb 2-4 µg de vector aquesta activitat és fins i tot inferior a la dels nivells basals. Aquest resultat indica que la repressió per TTK sobre l’activació de GAGA no està limitada al context del promotor eve, sinó que també pot tenir lloc en altres promotors que puguin ser activats per GAGA, suggerint que l’acció d’ambdós factors podria contribuir activament en la regulació de l’expressió de nombrosos gens de Drosophila. V. Resultats i discussió 144 Figura R.13. Anàlisi de la funció repressora de TTK en el context del promotor 5×GAL4hsp70UAS. Es varen transfectar cèl.lules SL2 amb 5 µg de plàsmid pGL3-5×GAL4hsp70UAS (format per la fusió entre el promotor 5×GAL4hsp70UAS i el gen marcador luciferasa) i quantitats creixents de vector de sobreexpressió de TTK en presència de 4 µg de plàsmid de sobreexpressió de GAGA. Les dades representades corresponen a la mitjana de tres experiments independents. 2.3. Anàlisi de la contribució dels dominis POZ de GAGA i TTK a la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA Per tal de determinar si la repressió observada era deguda a la interacció GAGA-TTK o bé era deguda a efectes indirectes, es va estudiar quina era la contribució dels dominis POZ de GAGA i TTK en aquesta repressió. Per aquesta raó, es varen construir vectors de sobreexpressió de les proteïnes GAGA i TTK a les quals se’ls hi havia delecionat els respectius dominis POZ, i es va analitzar la capacitat d’aquestes delecions de reproduir l’efecte observat per les proteïnes GAGA i TTK senceres. 2.3.1. Estudi de la contribució del domini POZ de TTK: la proteïna ∆POZTTK Amb l’objectiu d’evaluar la capacitat repressora de la proteïna truncada ∆POZTTK, a la qual se li han delecionat els primers 115 residus corresponents al domini POZ (figura R.14A), es van efectuar assajos transcripcionals a SL2 co-transfectant quantitats creixents del plàsmid de sobreexpressió de ∆POZTTK juntament amb 4 µg del plàsmid de sobreexpressió de GAGA i 7 µg del reporter pGL3-eve. Els resultats, representats a la figura R.14B, mostren que la sobreexpressió de ∆POZTTK no interfereix en l’activació del promotor eve stripe 2 depenent de GAGA: els nivells d’activitat luciferasa que s’assoleixen en només transfectar el plàsmid pActPPA-GAGA no varien significativament quan alhora es co-transfecten de 0.5 a 4 µg de plàsmid de sobreexpressió de ∆POZTTK. Això indica que en absència del domini POZ, TTK és incapaç de reprimir el promotor eve stripe 2 activat per GAGA, i que per tant el POZ de TTK és 0 2 4 6 8 10 12 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 Activitat relativa 0 2 4 6 8 10 12 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 Activitat relativa V. Resultats i discussió 145 essencial per la seva activitat repressora. Això donaria suport a la hipòtesi formulada anteriorment segons la qual la interacció GAGA-TTK té un paper fonamental en la repressió per TTK. Figura R.14. Anàlisi de la contribució del domini POZ de TTK en la repressió. A. Representació esquemàtica de la deleció ∆POZTTK emprada en aquest experiment comparada amb la proteïna TTK sencera. B. Activitat luciferasa detectada en extractes de cèl.lules SL2 transfectades amb 7 µg de plàsmid pGL3-eve, 4 µg de plàsmid pActPPA-GAGA i les quantitats indicades del plàsmid de sobreexpressió de ∆POZTTK. Les dades representades corresponen a la mitjana de tres experiments independents. C. Anàlisi per Western blot de la sobreexpressió de ∆POZTTK a cèl.lules SL2. A cada carril es van carregar 50 µL d’extracte provinent d’una transfecció amb les quantitats de plàsmids de sobreexpressió indicats. La detecció de la sobreexpressió de ∆POZTTK es va fer amb sèrum α-TTK fraccionat. El carril M correspon al marcador de pes molecular de proteïnes (en KDa). No obstant, es volgué descartar la possibilitat de que la no detecció de repressió en cotransfectar ∆POZTTK fos deguda a una minsa expressió d’aquesta proteïna o bé a que no es pogués localitzar correctament a nucli, per la qual cosa s’analitzà amb detall la seva sobreexpressió. En primer lloc, s’analitzaren per Western blot els extractes corresponents a les cèl.lules transfectades amb el vector pActPPA-∆POZTTK, on es va poder constatar que els nivells de sobreexpressió de ∆POZTTK en els experiments descrits són equivalents als nivells amb què es sobreexpressa la proteïna TTK sencera en assajos de transfecció similars (figura R.14C, comparar amb la figura R.12C i D). ∆POZ TTK (∆POZ 115 )BD dMi-2 P-DLS TTK BDPOZ/BTB dMi-2 P-DLS A BC µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg∆POZTTK 0 0 0.5 1 2 4 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 0 0 0.5 1 2 4 µg∆POZTTK 0 4 4 4 4 4 µgGAGA ∆POZTTK M 98 64 50 36 30 250 ∆POZ TTK (∆POZ 115 )BD dMi-2 P-DLS TTK BDPOZ/BTB dMi-2 P-DLS ∆POZ TTK (∆POZ 115 )BD dMi-2 P-DLS ∆POZ TTK (∆POZ 115 )BD ∆POZ TTK (∆POZ 115 )BD dMi-2 P-DLS TTK BDPOZ/BTB dMi-2 P-DLS TTK BDPOZ/BTB dMi-2 P-DLS A BC µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg∆POZTTK 0 0 0.5 1 2 4 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg∆POZTTK 0 0 0.5 1 2 4 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 0 0 0.5 1 2 4 µg∆POZTTK 0 4 4 4 4 4 µgGAGA ∆POZTTK M 98 64 50 36 30 250 0 0 0.5 1 2 4 µg∆POZTTK 0 4 4 4 4 4 µgGAGA ∆POZTTK M 98 64 50 36 30 250 V. Resultats i discussió 152 Figura R.18. Anàlisi de la capacitat repressora de les proteïnes ∆TTK580 i POZTTK. A. Representació esquemàtica de les delecions ∆TTK580 i POZTTK emprades en aquest experiment comparades amb la proteïna TTK sencera. Les cèl.lules SL2 van ser transfectades amb 7 µg de plàsmid pGL3-eve, 4 µg de plàsmid pActPPA-GAGA i les quantitats indicades dels plàsmids de sobreexpressió de ∆TTK580 (B) o POZTTK (C). Les dades representades corresponen a la mitjana de tres experiments independents. Tenint en compte que a la proteïna POZTTK li manquen les tres putatives senyals de localització nuclear de TTK (estan situades entre els dominis POZ i d’unió a DNA, veure figura I.11), podria ser que aquest requeriment de quantitats més elevades de vector de sobreexpressió de POZTTK per poder observar un efecte repressor significatiu fos degut a que la proteïna truncada POZTTK no es localitzés correctament al nucli. Es procedí doncs a analitzar els nivells de sobreexpressió de POZTTK, però degut a que l’anticòs α-TTK no reconeix de manera eficient el domini POZ sol, en aquest cas no es va poder realitzar per Western blot o immunolocalitzacions. Així doncs, per poder evaluar la correcta expressió d’aquesta proteïna s’optà per construir un plàsmid de sobreexpressió que dugués la fusió entre el POZ de TTK i la proteïna GFP (Green Fluorescent Protein), i transfectar-lo lo a cèl.lules SL2 amb el plàsmid de sobreexpressió de GAGA (com a control de sobreexpressió nuclear). Les cèl.lules transfectades foren tenyides simultàniament amb α-GAGA purificat per afinitat i amb DAPI tal com s’indica a l’apartat 2.8.4 de Materials i mètodes, i per tècniques fluorescents es pogué detectar una triple senyal corresponent a POZTTK-GFP (verd), GAGA (vermell) i DNA (blau). TTK BDPOZ/BTB POZ/BTB POZTTK(POZ114) ∆TTK580 BDPOZ/BTB dMi-2 dMi-2 P-DLS A C µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 0 5 10 15 20 Activitat relativa µgPOZ TTK 0 0 0.5 1 2 4 8 POZTTK B µg∆TTK580 0 0 0.5 1 2 4 0 5 10 15 20 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 Activitat relativa ∆TTK580 TTK BDPOZ/BTB POZ/BTB POZTTK(POZ114)POZ/BTB POZTTK(POZ114) ∆TTK580 BDPOZ/BTB dMi-2 ∆TTK580 BDPOZ/BTB dMi-2 dMi-2 P-DLS A C µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 0 5 10 15 20 Activitat relativa µgPOZ TTK 0 0 0.5 1 2 4 8 POZTTK B µg∆TTK580 0 0 0.5 1 2 4 0 5 10 15 20 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 Activitat relativa ∆TTK580 C µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 0 5 10 15 20 Activitat relativa µgPOZ TTK 0 0 0.5 1 2 4 8 POZTTK B µg∆TTK580 0 0 0.5 1 2 4 0 5 10 15 20 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 Activitat relativa ∆TTK580 V. Resultats i discussió 153 Figura R.19. Localització de les proteïnes GFP i POZTTK-GFP. Cèl.lules SL2 van ser transfectades amb 7 µg de plàsmid peGFP (A), 7 µg de plàsmid peGFP-POZTTK (B), o bé co-transfectades amb 7 µg de peGFPPOZTTK i 7 µg de pActPPA-GAGA (C). La impactació i tractament de les cèl.lules es va fer tal i com s’especifica a l’apartat 2.8.4 de Materials i mètodes. La senyal verda correspon a les proteïnes GFP o POZTTKGFP, la blava a la tinció del DNA amb DAPI i la vermella a la tinció de la proteïna GAGA amb α-GAGA purificat per afinitat. La co-localització de la senyal de POZTTK-GFP amb la del DNA i de GAGA mostra que la localització de POZTTK-GFP té lloc a nucli (B, C), mentre que la proteïna GFP es localitza per tota la cèl.lula (A, imatges cedides amablement per C. Bonet). GFP DAPI GFP +DAPI A B DAPIPOZ TTK -GFP α-GAGA POZ TTK -GFP +DAPI α-GAGA +DAPI C POZ TTK -GFP DAPI POZ TTK -GFP + DAPI GFP DAPI GFP +DAPI A B DAPIPOZ TTK -GFP α-GAGA POZ TTK -GFP +DAPI α-GAGA +DAPI C POZ TTK -GFP DAPI POZ TTK -GFP + DAPI V. Resultats i discussió 154 La co-localització de la senyal de POZTTK-GFP amb la del DNA i GAGA (figura R.19C) demostra inequívocament que la proteïna POZTTK-GFP sobreexpressada es localitza al nucli. A més a més, aquesta localització nuclear no sembla dependre de la presència de GAGA, ja que quan es sobreexpressa el POZTTK-GFP sol es continua detectant una senyal molt intensa al nucli de les cèl.lules transfectades (figura R.19B). D’altra banda, en sobreexpressar la proteïna GFP sense el domini POZ de TTK, la senyal de GFP es localitza de forma difusa per tota la cèl.lula (figura R.19A, imatges cedides amablement per C. Bonet). Això indica que l’expressió de POZTTK-GFP a nucli és atribuïble a la presència del domini POZ de TTK, i permet inferir que en els nostres assajos transcripcionals a SL2 la proteïna POZTTK s’ha localitzat correctament a nucli. 2.4.3. La proteïna de fusió POZTTK∆POZGAGA Amb els experiments descrits fins al moment el POZ de TTK apareix com el principal responsable de la repressió observada sobre l’activació mediada per GAGA. Si, com sembla, aquest domini pot exercir per ell mateix una funció repressora, quines propietats funcionals tindria una proteïna GAGA on el seu domini POZ s’hagués substituït pel domini POZ de TTK? Facilitaria una activació sinergística de GAGA, en ser un domini d’oligomerització, o bé aboliria la capacitat de GAGA d’activar, pel fet de ser un domini repressor? Per poder respondre aquesta qüestió es va construir la proteïna POZTTK∆POZGAGA, formada per la fusió entre el domini POZ de TTK i la forma truncada ∆POZGAGA, que li manquen els primers 122 residus corresponents al domini POZ (figura R.20A). El primer que es va analitzar va ser si aquesta proteïna mantenia la capacitat transactivadora de GAGA sobre el promotor eve stripe 2, a partir d’assajos transcripcionals a SL2 en presència del vector reporter pGL3-eve i quantitats creixents del plàsmid de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA (figura R.20B). S’observa que, tot i expressar-se eficientment (figura R.20C), POZTTK∆POZGAGA no té cap efecte sobre l’activitat basal del promotor eve stripe 2, mentre la sobreexpressió de GAGA en el mateix experiment activa la transcripció a nivells considerables. Sembla doncs que la conseqüència més directa de la substitució del POZ de GAGA pel POZ de TTK és la pèrdua de la capacitat transactivadora de GAGA. Això indica que les funcions d’aquests dos dominis POZ no estan conservades, tot i presentar un elevat grau d’homologia entre ells. V. Resultats i discussió 155 Figura R.20. Estudi de l’activitat transcripcional de la proteïna POZTTK∆POZGAGA. A. Representació esquemàtica de la proteïna de fusió POZTTK∆POZGAGA. B. Activitat luciferasa detectada en extractes de cèl.lules SL2 transfectades amb 7 µg de plàsmid pGL3-eve i les quantitats indicades de plàsmids pActPPA sobreexpressant GAGA o POZTTK∆POZGAGA. Les dades representades corresponen al promig de tres experiments independents. C. Anàlisi per Western blot dels nivells de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA. A cada carril es van carregar 50 µL d’extracte de cèl.lules SL2 provinent d’una transfecció amb les quantitats de plàsmid de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA indicats. La detecció dels nivells de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA es va fer amb sèrum α-GAGA fraccionat. El carril M correspon al marcador de pes moleculars de proteïnes (en KDa). A continuació es va estudiar si la presència del POZ de TTK conferia a aquesta nova proteïna de fusió la propietat de reprimir l’activació mediada per GAGA. Els resultats es representen a la figura R.21A, on s’observa que POZTTK∆POZGAGA reprimeix de manera significativa el promotor eve stripe 2 activat per GAGA. De fet, s’observa un perfil de repressió bastant similar al descrit per la proteïna POZTTK, ja que són necessàries quantitats relativament altes del vector de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA (8 µg) per poder detectar una repressió total. 0 2 4 6 8 µg POZ TTK ∆POZ GAGA M 98 64 50 36 30 250 POZ TTK ∆POZ GAGA C B GAGA POZTTK ∆POZGAGA µg vector 0 2 4 6 8 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 POZTTK ∆POZGAGA BD Q X POZ/BTB ∆POZ GAGA (∆POZ 122 )POZ TTK (POZ 114 ) 1114123 519 A 0 2 4 6 8 µg POZ TTK ∆POZ GAGA M 98 64 50 36 30 250 POZ TTK ∆POZ GAGA C 0 2 4 6 8 µg POZ TTK ∆POZ GAGA M 98 64 50 36 30 250 M 98 64 50 36 30 250 POZ TTK ∆POZ GAGA C B GAGA POZTTK ∆POZGAGA µg vector 0 2 4 6 8 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 B GAGA POZTTK ∆POZGAGA GAGA POZTTK ∆POZGAGA µg vector 0 2 4 6 8 Activitat relativa 0 5 10 15 20 25 POZTTK ∆POZGAGA BD Q X POZ/BTB ∆POZ GAGA (∆POZ 122 )POZ TTK (POZ 114 ) 1114123 519 A POZTTK ∆POZGAGA BD Q X POZ/BTB BD Q X POZ/BTBPOZ/BTB ∆POZ GAGA (∆POZ 122 )POZ TTK (POZ 114 ) 1114123 519 A V. Resultats i discussió 156 Per descartar que aquesta repressió fos deguda a una competició pels llocs d’unió a DNA entre GAGA i POZTTK∆POZGAGA (ambdues proteïnes tenen el mateix domini d’unió a DNA), es varen realitzar experiments recíprocs sobreexpressant ∆POZGAGA, que com ja s’ha comentat anteriorment no és capaç d’activar però sí d’unir-se al DNA. En aquests experiments es va detectar una lleugera inhibició de l’activació de GAGA en presència d’elevades quantitats de vector de sobreexpressió de ∆POZGAGA (figura R.21B), la qual seria perfectament atribuïble a un desplaçament de la proteïna GAGA per competició pels llocs d’unió. No obstant, aquesta inhibició no és comparable a la repressió que s’observa en sobreexpressar POZTTK∆POZGAGA, i per tant es pot afirmar que la capacitat repressora de POZTTK∆POZGAGA no és deguda a una competició amb GAGA pels llocs d’unió al promotor, sinó a la presència del domini POZ de TTK. Així doncs, la proteïna GAGA es pot convertir en un repressor de la seva pròpia activació en substituir el seu domini POZ pel domini POZ de TTK, donant més suport a la consideració del POZ de TTK com un domini repressor. Figura R.21. Estudi dels efectes de la sobreexpressió de les proteïnes POZTTK∆POZGAGA i ∆POZGAGA sobre l’activació de GAGA. Cèl.lules SL2 van ser co-transfectades amb 7 µg del vector reporter pGL3-eve, 4 µg de plàsmid pActPPA-GAGA i les quantitats indicades dels plàsmids de sobreexpressió de POZTTK∆POZGAGA (A) o ∆POZGAGA (B). Les dades representades corresponen al promig de tres experiments independents. A 0 2 4 6 8 10 12 14 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µgPOZ TTK 0 0 2 4 6 8 10 ∆POZ GAGA Activitat relativa B 0 2 4 6 8 10 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µg ∆POZ GAGA 0 0 2 4 6 8 10 Activitat relativa POZ TTK ∆POZ GAGA ∆POZ GAGA A 0 2 4 6 8 10 12 14 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µgPOZ TTK 0 0 2 4 6 8 10 ∆POZ GAGA Activitat relativa A 0 2 4 6 8 10 12 14 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µgPOZ TTK 0 0 2 4 6 8 10 ∆POZ GAGA Activitat relativa 0 2 4 6 8 10 12 14 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µgPOZ TTK 0 0 2 4 6 8 10 ∆POZ GAGA Activitat relativa B 0 2 4 6 8 10 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µg ∆POZ GAGA 0 0 2 4 6 8 10 Activitat relativa B 0 2 4 6 8 10 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µg ∆POZ GAGA 0 0 2 4 6 8 10 Activitat relativa 0 2 4 6 8 10 µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µg ∆POZ GAGA 0 0 2 4 6 8 10 Activitat relativa µg GAGA 0 4 4 4 4 4 4 µg ∆POZ GAGA 0 0 2 4 6 8 10 Activitat relativa POZ TTK ∆POZ GAGA ∆POZ GAGA V. Resultats i discussió 157 El conjunt d’observacions descrites fins al moment demostren que el domini POZ de TTK és el principal responsable de la repressió que exerceix aquest factor sobre l’activació del promotor eve stripe 2 depenent de GAGA, essent tan necessari com suficient perquè aquesta tingui lloc. Per una banda, el fet que el POZ de TTK pugui reprimir en absència d’un domini d’unió al DNA suggereix que aquesta repressió no requereix una unió directa de TTK amb el DNA motlle. I per altra banda, el fet que un domini POZ pugui actuar per ell mateix com a domini repressor convé recordar que també s’ha observat en les proteïnes PLZF i Bcl-6, els dominis POZ de les quals reprimeixen la transcripció mitjançant el reclutament de complexes HDACs al promotor, bé directament (David et al, 1998), o bé indirectament a través d’interaccions amb altres co-repressors (Dhordain et al, 1997; Hong et al, 1997; Huynh i Bardwell, 1998). Tot i que no és un mecanisme generalitzat pels repressors amb dominis POZ, un reclutament d’HDACs mediat pel domini POZ de TTK seria una possibilitat bastant factible per explicar la repressió per TTK. 2.5. Estudi de l’efecte del TSA sobre la repressió per TTK del promotor eve activat per GAGA Amb l’objectiu d’analitzar si el mecanisme de repressió per TTK implica un reclutament d’HDACs al promotor, es va evaluar si la presència del TSA (Trichostatina A), un inhibidor de les HDACs de classe I i II, té algun efecte en l’eficiència de repressió per TTK sobre l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA. 2.5.1. Efectes del TSA sobre l’acetilació d’histones a SL2 En primer lloc es va estudiar quin és l’efecte que produeix el TSA en els nivells d’acetilació d’histones a cèl.lules SL2, per tal de determinar la seva eficàcia com a inhibidor de les HDACs a SL2. Seguint el protocol detallat a l’apartat 2.8.5 de Materials i mètodes, 5 plaques de cèl.lules SL2 van ser tractades amb TSA a una concentració final de 0, 100, 200, 300 i 400 nM respectivament. 20 hores després de l’addició del TSA es van recol.lectar les cèl.lules i es van sotmetre a una lisi àcida per extreure les histones. Els nivells d’acetilació de les histones presents en cada mostra es van analitzar per Western blot emprant un anticòs específic contra lisines acetilades (figura R.22). Es pot observar que l’acetilació de les histones H4 s’incrementa significativament a mida que s’ha augmentat la concentració de TSA amb què s’han tractat les cèl.lules. Això significa que les desacetilases que en condicions normals mantenen uns nivells moderats d’acetilació de la histona H4, en presència de TSA es troben inhibides i no poden revertir les activitats acetiltransferasa presents a la cèl.lula, resultant en últim terme en un augment d’histones H4 acetilades. V. Resultats i discussió 158 D’altra banda, semblaria que el TSA té efectes contraris en els nivells d’acetilació de les histones H2A/H2B i H3: en incrementar la concentració de l’inhibidor, s’observa un lleuger decrement en el grau d’acetilació d’aquestes histones (comparar carrils 0 i 400, figura R.22). Figura R.22. Anàlisi dels efectes del TSA sobre l’acetilació d’histones a cèl.lules SL2. Es va fer una extracció àcida d’histones de les cèl.lules SL2 tractades amb 0, 100, 200, 300 o 400 nM TSA, i es van analitzar en un gel 18% SDS-PAGE amb un anticòs α-lisines acetilades. El carril H correspon a les histones comercials acetilades. La posició corresponent a marcadors de pes molecular conegut (en KDa) s’indica a l’esquerra. Així doncs, aquests resultats demostren que l’inhibidor de desacetilases TSA és actiu a cèl.lules SL2, ja que en la seva presència es veuen alterats els nivells d’acetilació de les histones. A més a més, el fet que el grau d’acetilació de la histona H4 estigui significativament incrementat en presència de TSA indica que a les concentracions en què s’ha utilitzat el TSA aquest inhibeix l’activitat almenys d’alguna de les desacetilases d’histones presents a la cèl.lula. De fet, existeixen altres evidències experimentals que també demostrarien que el TSA és actiu a SL2. Concretament, estudis realitzats en aquesta línia cel.lular demostren que el TSA a una concentració de 300 nM inhibeix l’activitat d’Rpd3 (HDAC1), resultant en una parcial abolició de la repressió associada al co-repressor Groucho (Chen et al, 1999). 2.5.2. Efecte del TSA en la repressió per TTK de l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA Després d’haver comprovat l’eficiència del TSA a SL2, es va estudiar si la presència d’aquest inhibidor de desacetilases afectava la repressió per TTK sobre l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA. Es van co-transfectar cèl.lules SL2 amb concentracions creixents del plàsmid de sobreexpressió de TTK en presència de 4 µg de vector de sobreexpressió de GAGA i 7 µg de vector reporter pGL3-eve (condicions que es podrien anomenar “estàndard” de l’efecte de TTK sobre l’activació GAGA). Per fer comparables els resultats obtinguts en presència o absència de TSA, de les dues plaques de cèl.lules que configuraven cada duplicat de M 36 17 16 4 30 H4 H2A/H2B H3 H 0 100 200 300 400 M 36 17 16 4 30 M 36 17 16 4 30 H4 H2A/H2B H3 H 0 100 200 300 400 V. Resultats i discussió 159 transfecció, només una d’elles va ser tractada amb TSA a una concentració de 300 nM final 20 hores abans de recol.lectar les cèl.lules. Així, en un mateix experiment i en cèl.lules transfectades a partir del mateix precipitat, es pogué determinar l’activitat luciferasa present a l’extracte havent estat en absència o en presència de 300 nM TSA. Els resultats de l’assaig vénen representats a la figura R.23A. El primer aspecte destacable és la menor eficiència en l’activació de GAGA quan les cèl.lules han estat tractades amb TSA. Tenint en compte els estudis realitzats al nostre laboratori que indiquen que GAGA es pot acetilar almenys in vitro (C. Bonet, comunicació personal), es podria pensar que aquesta modificació post-traduccional afecta les propietats activadores de GAGA: concretament, la GAGA en estat acetilat (en presència de TSA) tindria disminuïda la seva capacitat de transactivació. De tota manera, s’ha de tenir en compte que el TSA pot afectar molts processos, i per tant aquesta menor capacitat activadora de GAGA podria ser conseqüència d’un efecte indirecte del TSA. Figura R.23. Efecte del TSA en la repressió per TTK de l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA. A. Activitat luciferasa present en extractes de cèl.lules SL2 transfectades amb 7 µg de vector reporter pGL3-eve, 4 µg de plàsmid de sobreexpressió de GAGA i les quantitats indicades de plàsmid de sobreexpressió de TTK, no tractades (blau) o tractades amb 300 nM TSA (vermell). Les dades representades corresponen al promig de quatre experiments independents. B. Les mateixes dades del panell A representades com a percentatge de repressió respecte la màxima activació obtinguda per cada condició (+ o –TSA). 0 20 40 60 80 100 -TSA 300 nM TSA 0 2 4 6 8 10 - TSA 30 0 n M TSA µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 A B Activitat relativa % repressió 0 20 40 60 80 100 -TSA 300 nM TSA 0 2 4 6 8 10 - TSA 30 0 n M TSA µg GAGA 0 4 4 4 4 4 µg TTK 0 0 0.5 1 2 4 A B Activitat relativa % repressió V. Resultats i discussió 160 D’altra banda, la capacitat de TTK de reprimir l’activació d’eve mediada per GAGA no semblaria veure’s afectada per la presència de TSA, ja que en les dues condicions de treball la sobreexpressió de TTK comporta una reducció significativa de l’activació mediada per GAGA fins a nivells basals (figura R.23A). No obstant, el fet que la màxima activació en presència de GAGA estigui força reduïda amb TSA fa una mica més difícil apreciar si la repressió per TTK és tan eficient com en cèl.lules no tractades amb TSA. Per aquesta raó s’ha representat el percentatge de repressió, calculat en funció de l’activació de GAGA en absència de TTK observada en cada cas (a 0 o 300 nM TSA), seguint la següent fórmula: % repressió = 100 − (ATTK/AGAGA)×100 on: ATTK representa l’activitat luciferasa per una determinada concentració de TTK AGAGA representa l’activitat luciferasa determinada en absència de TTK Comparant l’eficiència de repressió en les dues condicions en què s’ha fet l’assaig s’observa que tant sense TSA com a 300 nM TSA, amb 4 µg de vector de sobreexpressió de TTK s’arriba pràcticament al 100% de repressió (figura R.23B), confirmant així que la capacitat repressora de TTK és igualment d’eficaç en absència o en presència del TSA. Això significa que la repressió que exerceix TTK sobre l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA no requereix d’activitats desacetilases d’histones sensibles al TSA. No obstant, no es pot descartar la possibilitat de que la funció repressora de TTK involucri un reclutament d’HDACs insensibles al TSA: tot i que en principi el TSA està descrit com un inhibidor de les HDACs de classe I i II (les desacetilases relacionades amb processos transcripcionals), les HDACs II de Drosophila no estan molt ben caracteritzades i es desconeix si també obeeixen a aquesta “norma”. De fet, estudis molt recents han identificat la dHDAC6 (que seria una HDAC de classe II), i han pogut observar que és insensible a varis inhibidors de desacetilases, entre ells el TSA (Barlow et al, 2001). Així doncs, per tal de determinar si hi ha algun tipus d’activitat desacetilasa d’histones que col.labora amb TTK per reprimir la transcripció, s’haurien de realitzar experiments similars en presència d’inhibidors que tinguessin un espectre d’acció diferent del TSA, com el butirat sòdic, el TPX (trapoxin), etc. 2.6. Determinació de les regions del promotor d’eve que medien la repressió per TTK de l’activació mediada per GAGA Com ja s’ha comentat anteriorment, el fet d’haver trobat una forma de TTK capaç de reprimir en absència del domini d’unió a DNA (el POZTTK) suggereix que la repressió per TTK no requereix una unió directa al DNA. No obstant, la repressió mediada per POZTTK semblaria menys eficient que l’observada per les formes que tenen domini d’unió a DNA V. Resultats i discussió 161 (TTK sencer o ∆TTK580), ja que només s’observa en co-transfectar quantitats relativament altes del vector de sobreexpressió de POZTTK (veure figura R.18C). Podria ser doncs, que encara que no sigui estrictament requerit per la repressió, la unió al DNA de TTK incrementés l’eficiència de repressió. Per tal d’evaluar aquesta hipòtesi, es va estudiar si la repressió per TTK sobre l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA requereix de la presència de llocs d’unió de TTK, analitzant la capacitat de TTK de reprimir l’activació de GAGA en diferents delecions del promotor eve stripe 2. Resultats obtinguts en estudis anteriors indicaven que en el promotor eve stripe 2, la major part dels llocs d’unió per a GAGA i TTK es concentren a la regió més proximal del promotor, entre les posicions –400 i +1 (Read et al, 1990). Concretament, a partir d’assajos de footprinting es van identificar en aquesta regió 8 llocs d’unió per GAGA i 4 llocs d’unió per TTK (figura R.24A), uns resultats que han estat confirmats en aquest treball amb experiments d’EMSA i de footprinting amb DNasa I (veure apartat 3). Per tal d’analitzar si aquesta regió és suficient per les activitats de GAGA i TTK detectades sobre el promotor sencer, es va delecionar la regió de l’element eve stripe 2 més enllà de la posició –413 (figura R.24A), i el plàsmid resultant, pGL3-413eve, es va cotransfectar amb els vectors de sobreexpressió de les proteïnes GAGA i TTK. Els resultats, representats a la figura R.24B, mostren que GAGA pot estimular la transcripció del promotor –413eve seguint un perfil d’activació que no és significativament diferent a l’observat pel promotor eve stripe 2 sencer, assolint una màxima activació de 10 vegades en presència de 8 µg del vector de sobreexpressió de GAGA. D’altra banda, TTK reprimeix l’activació mediada per GAGA en aquest promotor –413eve tan eficientment com ho fa en el promotor eve stripe 2 sencer: en presència de 0.5 µg de vector de sobreexpressió de TTK l’activació de GAGA es veu reduïda a la meitat, i amb 2 µg de vector l’activitat luciferasa present als extractes cel.lulars assoleix els nivells basals. En el promotor –413eve, els quatre llocs d’unió per TTK es troben entre les posicions –400 i –200 (veure figura R.24A). Per tant, la repressió observada sobre el promotor –413eve no exclou la possibilitat que TTK requereixi unir-se a aquests elements per poder dur a terme la seva activitat repressora. Per aquesta raó, es realitzà una segona deleció sobre el –413eve fins a la posició –185, resultant-ne un promotor –185eve sense cap lloc d’unió per TTK (corroborat in vitro per assajos EMSA i de footprinting amb DNasa I, veure apartat 3.2), tot i que encara conserva alguns llocs d’alta afinitat per GAGA (figura R.24A). Consistent amb la presència de llocs d’unió de GAGA en aquesta regió, GAGA activa la transcripció del promotor –185eve d’un mode depenent de la quantitat de proteïna sobreexpressada, tal i com ja s’ha descrit per al promotor eve stripe 2 sencer o la deleció –413eve (figura R.24C, gràfica esquerra). En aquest cas, la màxima activació és d’unes 15 vegades respecte els nivells basals i es detecta en presència de 4 µg del vector de sobreexpressió de GAGA. V. Resultats i discussió 168 Figura R.26. Anàlisi per EMSA de la unió de GAGA als fragments proximal (413), intermedi (666) i distal (680) del promotor eve stripe 2. A. Esquema del promotor amb les regions proximal, intermèdia i distal assenyalades. Els assajos EMSA es van realitzar amb quantitats creixents de GAGA recombinant: 0, 0.14, 0.28, 0.42, 0.56, 0.84, 1.12, 1.4, 1.7 i 2.1 µg (carrils 1-10 respectivament), en presència d’un total de 10 ng dels fragments 666 i 413 (B) o 680 i 413 (C) marcats radioactivament i en quantitats equimolars. Els complexes formats es van analitzar en gels d’agarosa al 0.8%. A les gràfiques de la dreta es representen els percentatges d’unió a cadascun dels fragments en funció de la quantitat de GAGA. 0 20 40 60 80 100 fragment 413 fragment 666 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 A fragment 680 fragment 413 0 20 40 60 80 10 0 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 CGAGA 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 413 BGAGA 666 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 0 20 40 60 80 100 fragment 413 fragment 666 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 0 20 40 60 80 100 fragment 413 fragment 666 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 A fragment 680 fragment 413 0 20 40 60 80 10 0 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 fragment 680 fragment 413 0 20 40 60 80 10 0 fragment 680 fragment 413 0 20 40 60 80 10 0 % unió µgGAGA 0 0.4 1.12 2.1 CGAGA 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GAGAGAGA 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 680 413 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 413 BGAGA 666 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 GAGAGAGA 666 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666666 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 V. Resultats i discussió 169 Figura R.27. Anàlisi per EMSA de la unió de TTK als fragments proximal (413), intermedi (666) i distal (680) del promotor eve stripe 2. A. Esquema del promotor amb les regions proximal, intermèdia i distal assenyalades. Els assajos EMSA es van realitzar amb quantitats creixents de TTK recombinant: 0, 0.25, 0.5, 0.75, 1, 1.5, 2, 3, 4, i 5 µg (carrils 1-10 respectivament), en presència d’un total de 10 ng dels fragments 666 i 413 (B) o 680 i 413 (C) marcats radioactivament i en quantitats equimolars. Els complexes formats es van analitzar en gels d’agarosa al 0.8%. A les gràfiques de la dreta es representen els percentatges d’unió a cadascun dels fragments en funció de la quantitat de TTK. TTK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 % unió 0 0.75 2 5 0 20 40 60 80 100 µgTTK fragment 413 fragment 666 B 0 20 40 60 80 100 % unió µgTTK 0 0.75 2 5 fragment 413 fragment 680 TTK 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C A DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 TTK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 % unió 0 0.75 2 5 0 20 40 60 80 100 µgTTK fragment 413 fragment 666 B TTK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 % unió 0 0.75 2 5 0 20 40 60 80 100 µgTTK fragment 413 fragment 666 TTK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 TTK 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 666 413 666 413 % unió 0 0.75 2 5 0 20 40 60 80 100 µgTTK fragment 413 fragment 666 % unió 0 0.75 2 5 0 20 40 60 80 100 µgTTK fragment 413 fragment 666 B 0 20 40 60 80 100 % unió µgTTK 0 0.75 2 5 fragment 413 fragment 680 TTK 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C 0 20 40 60 80 100 % unió µgTTK 0 0.75 2 5 fragment 413 fragment 680 0 20 40 60 80 100 % unió µgTTK 0 0.75 2 5 fragment 413 fragment 680 TTK 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C TTKTTK 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 680 413 680 413 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 C A DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 A DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 DISTAL 680 pb INTERMEDI 666 pb PROXIMAL 413 pb -1079 -413 +1 -1759 V. Resultats i discussió 170 Els experiments anàlegs realitzats amb la proteïna TTK es mostren a la figura R.27. Igual que pels EMSAs realitzats amb GAGA, no es formen bandes discretes de retardament, indicant que TTK també s’uneix al DNA en forma oligomèrica. En aquest cas, s’observa una situació totalment contrària a la de GAGA, ja que TTK s’uneix preferencialment a les regions intermèdia (R.27B) o distal (R.27C) respecte la regió proximal. Analitzant els percentatges d’unió (calculats com s’ha explicat per GAGA) s’observa que aproximadament 1 µg de proteïna pot unir quasi completament els fragments 666 o 680, mentre que en aquestes condicions el fragment 413 presenta un percentatge d’unió molt baix. Aquest resultat no deixa de ser sorprenent, si és té en compte que s’havia descrit la presència de 4 llocs d’unió per TTK a la regió 413 (concretament entre les posicions –400 i –200) (Read et al, 1990). De fet, el què estaria indicant és que les regions intermèdia i distal contenen més llocs d’unió per TTK o de major afinitat que la regió proximal. Les repercussions que podria tenir la unió de TTK a la regió compresa entre les posicions –1759 i –413 no deixen de ser una incògnita. En el nostre sistema experimental, on TTK reprimeix l’activació mediada per GAGA independentment del seu domini d’unió a DNA i de la presència de llocs d’unió al promotor, no sembla que aquesta unió sigui important per la seva funció repressora. No obstant, podria ser que en la regulació d’eve TTK actués a varis nivells: per una banda, reprimint una activació estimulada per GAGA, en una acció que segons els nostres resultats implica unió directa entre GAGA i TTK; i per altra banda, unintse directament a les regions distals del promotor, on aleshores segurament actuaria per altres mecanismes. 3.2. Efecte de TTK sobre la unió de GAGA al promotor proximal –185eve Per poder analitzar si la presència de TTK té algun efecte en la unió de GAGA al DNA, es realitzaren assajos d’EMSA i de footprinting amb DNasa I utilitzant com a sonda la regió –185eve del promotor eve stripe 2. Aquesta regió, com s’ha comentat anteriorment, conté varis llocs d’unió per GAGA però cap lloc d’unió per TTK (Read et al, 1990), i per tant en principi TTK no s’hi pot unir directament. D’aquesta manera, qualsevol alteració en l’activitat d’unió de GAGA pogué ser atribuïble a la seva interacció amb TTK. 3.2.1. Anàlisi per EMSA de la unió de GAGA i TTK a la regió –185eve En primer lloc, es varen realitzar assajos d’EMSA incubant quantitats creixents de les proteïnes recombinants GAGA o TTK amb el fragment –185eve. Les reaccions d’unió es van dur a terme en les condicions descrites a l’apartat 2.9.2 de Materials i mètodes, i els complexes formats es van resoldre en gels d’agarosa al 0.8%. V. Resultats i discussió 171 Figura R.28. Anàlisi per EMSA de la unió de GAGA i TTK a la regió -185eve. Les reaccions d’unió es van fer amb 0, 100, 200, 400 i 600 ng (carrils 1-5) de les proteïnes recombinants GAGA (A) o TTK (B) en presència d’1ng de fragment –185eve marcat radioactivament. En C, la unió de 0, 240, 480 i 720 ng de TTK (carrils 1-4) es va fer en presència de 280 ng de GAGA. Confirmant la presència de llocs d’unió per GAGA en aquesta regió (Read et al, 1990), GAGA s’uneix eficientment al fragment –185eve, donant lloc a un retardament total en presència d’uns 600 ng de proteïna recombinant (figura R.28A). En canvi, les mateixes quantitats de TTK recombinant no mostren una unió significativa al fragment –185eve (figura R.28B). Aquests resultats, al mateix temps que corroboren la presència de llocs GAGA i l’absència de llocs TTK a la regió més proximal del promotor eve, ens indiquen que el context escollit és l’adequat per poder analitzar un possible efecte de TTK sobre la unió de GAGA al DNA. A continuació es van realitzar experiments similars amb quantitats creixents de TTK en presència d’una concentració de GAGA que mostra un 50% d’unió aproximadament (veure figura R.28C, carril 1). En aquestes condicions, s’observa una unió total al fragment –185eve a concentracions de TTK que, en absència de GAGA, no donen lloc a un retardament significatiu (carrils 2-4 de la figura R.28C). Així, quan les reaccions es fan en presència de 280 ng de GAGA, l’addició de 240 ng de TTK és suficient per obtenir un retard total del fragment –185eve (carril 2 de la figura R.28C), mentre que en absència de GAGA, TTK és incapaç d’unir-se significativament a aquest fragment encara que s’emprin concentracions de fins a 600 ng de proteïna (carril 5 de la figura R.28B). − − GAGA TTK GAGA − TTK 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 ABC ++ + + − − GAGAGAGA TTKTTK GAGA − TTKTTK 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 ABC ++ + + V. Resultats i discussió 172 Per una banda, aquest resultat indica que TTK no inhibeix la unió de GAGA al DNA, descartant així la possibilitat que la repressió mediada per TTK en els experiments de transfecció fos deguda a que la formació de complexes GAGA-TTK dificultés la unió de GAGA al DNA. Contràriament, l’efecte que s’observa en presència d’ambdues proteïnes suggeriria que els complexes GAGA-TTK són més eficients en la unió al DNA. De fet, aquestes observacions apunten a que TTK és reclutat per GAGA al promotor –185eve degut a la interacció GAGA-TTK. D’acord amb aquesta hipòtesi, els retards que s’observen en presència de GAGA i TTK semblen tenir un pes molecular més alt que el que s’observa només amb GAGA (comparar carrils 4-5 de R.28A amb carrils 3-4 de R.28C), suggerint que TTK és present en aquests complexes. Amb l’objectiu de confirmar aquesta presència de TTK en els complexes de retardament formats, es varen intentar realitzar assajos de “super-shift” emprant anticossos α-GAGA i α-TTK. Però degut al tipus de retardament que presenten GAGA i TTK en forma de “llepissades” enlloc de bandes discretes, sumat a l’elevat pes molecular dels complexes proteïna-DNA formats, fou impossible poder arribar a identificar un canvi de mobilitat electroforètica en presència d’un dels dos anticossos. Per aquesta raó es va optar per analitzar la unió de GAGA i TTK al fragment –185eve mitjançant assajos de footprinting amb DNasa I. 3.2.2. Anàlisi per footprinting amb DNasa I de la unió de GAGA i TTK a la regió –185eve La tècnica de footprinting permet determinar amb precisió a quines regions concretes d’un determinat fragment de DNA s’uneix una proteïna. En el nostre cas, però, l’ús d’aquesta tècnica el què ens permetrà és analitzar si els complexes GAGA-TTK s’uneixen als mateixos llocs GAGA o es generen noves interaccions a la regió –185eve. Els assajos de footprinting amb DNasa I es varen realitzar com es descriu a l’apartat 2.9.3 de Materials i mètodes. Les condicions de les reaccions d’unió van ser les mateixes que les dels assajos de retardament en gel, per tal que ambdós resultats poguessin ser comparables. Primer de tot es varen analitzar les unions de GAGA i TTK per separat sobre el promotor –185eve. Com es pot apreciar a la figura R.29B, GAGA presenta quatre llocs d’unió a la part central d’aquesta regió que coincideixen exactament amb els llocs d’unió descrits (Read et al, 1990), tot i que en el nostre cas les “finestres” de protecció són més extenses (figura R.29A). És per aquesta raó que el lloc d’unió 3, que està format per 3 elements GAGA molt propers (veure figura R.29A), en els nostres assajos apareix com una única “finestra” de protecció que abarca un total de fins a 26 bases al llarg de la seqüència del promotor (figura R.29B). V. Resultats i discussió 173 Figura R.29. Anàlisi per footprinting amb DNasa I de la unió de GAGA i TTK a la regió -185eve. A. Seqüència de la regió -185eve amb les posicions dels llocs d’unió de GAGA prèviament descrits a Read et al, 1990 (blau) i els observats en aquest assaig (negre). 1 ng de fragment –185eve marcat radioactivament i purificat per gel d’acrilamida es va incubar amb 0, 0.2, 0.4, 0.8 i 1.2 µg (carrils 2-6) de proteïnes recombinants GAGA (B) o TTK (C) en un volum final de 50 µL contenint 1 µg de BSA i 100 ng de DNA d’E. coli sonicat i desnaturalitzat. La incubació es va fer durant 20 minuts a 20ºC i va donar pas a la digestió amb 0.4 U de DNasa I durant 1 minut a 20ºC. Les mostres van ser tractades com s’ha descrit a l’apartat 2.9.3.2 de Materials i mètodes i analitzades en un gel 6% acrilamida: bisacrilamida 8M urea. En les reaccions corresponents al panell D, la unió de 0, 0.2, 0.4, 0.8 i 1.2 µg de TTK (carrils 3-7) es va fer en presència de 0.1 µg de GAGA. Les línies 1 corresponen als marcadors G+A preparats com s’ha indicat a l’apartat 2.9.3.1 de Materials i mètodes. Amb línies verticals s’assenyalen les posicions de la seqüència corresponents als llocs d’unió de GAGA (numerats de l’1 al 4 en vermell), i els asteriscs assenyalen els llocs on millor s’observa l’efecte de TTK sobre la unió als llocs GAGA. TTK G/A − GAGA G/A − G/A TTK − − +++++ − = = = = = GAGA 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 BCD 5’ 3’ 1 2 3 4 1 2 3 4 Atcagcaccgagagcacagcagcgcatccactctcagcaccgcacgatta gcaccgctccgctcaggctgtcccgctcgcacctgcctgggtcgctgcg attggccgctcccagcgacggcggccatttgcctgcagagcgcagcggt ataaaagggcgcggggtggctgagagcagcacactcga −185 −136 −87 −38 4 3 21 = TTKTTK G/A − GAGAGAGA G/A − G/A TTKTTK − − +++++ − = = = = = GAGA 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 6 7 BCD 5’5’ 3’3’ 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 Atcagcaccgagagcacagcagcgcatccactctcagcaccgcacgatta gcaccgctccgctcaggctgtcccgctcgcacctgcctgggtcgctgcg attggccgctcccagcgacggcggccatttgcctgcagagcgcagcggt ataaaagggcgcggggtggctgagagcagcacactcga −185 −136 −87 −38 4 3 21 Atcagcaccgagagcacagcagcgcatccactctcagcaccgcacgatta gcaccgctccgctcaggctgtcccgctcgcacctgcctgggtcgctgcg attggccgctcccagcgacggcggccatttgcctgcagagcgcagcggt ataaaagggcgcggggtggctgagagcagcacactcga −185 −136 −87 −38 4 3 21 = V. Resultats i discussió 174 De fet, els llocs d’unió de GAGA a l’element –185eve descrits són sis (Read et al, 1990), però en els nostres assajos els situats a les posicions més distals no es varen poder arribar a identificar pel fet d’estar massa propers als extrems del fragment. D’altra banda, en els assajos realitzats en presència de TTK no s’observa cap canvi en el patró de digestió amb DNasa I del fragment –185eve (figura R.29C). Això demostra, un cop més, que TTK no presenta llocs d’unió específics en aquesta regió promotora, confirmant els resultats obtinguts en l’anàlisi per retardament. Anàlogament als experiments EMSA descrits anteriorment, després d’estudiar la unió de GAGA i TTK separadament es va analitzar la unió de TTK en presència de GAGA. En aquest cas, però, si s’utilitzava una concentració de GAGA que ja s’unia força bé al fragment, les “finestres” formades disminuïen ja des d’un principi la intensitat de les bandes de digestió, essent complicada l’observació de noves reduccions d’intensitat o noves finestres en afegir TTK. Per aquesta raó es va optar per emprar una concentració de GAGA que s’unia molt dèbilment (0.1 µg), essent així més fàcil detectar qualsevol canvi produït per la presència de TTK. La figura R.29D mostra el resultat d’aquest assaig, on s’observa que a mida que s’afegeixen quantitats creixents de proteïna TTK, la unió als llocs GAGA es veu significativament incrementada (les posicions on millor es pot apreciar aquest efecte s’han marcat amb asteriscs) i, en canvi, no s’arriba a detectar la formació de cap nou lloc d’unió al llarg de la seqüència del fragment. Aquests resultats evidencien que la presència de TTK té un efecte significatiu en la unió al DNA de GAGA, que es concreta en una major eficiència d’unió als llocs GAGA. I com que TTK no es pot unir a aquest fragment per si sol, sembla doncs que ha de ser la interacció entre ambdues proteïnes la que permetria portar a TTK fins al DNA. D’altra banda, el fet que no es detectin nous llocs d’unió al fragment –185eve i en canvi sí s’observi una major unió als llocs GAGA està indicant que, una vegada reclutat al DNA, TTK no s’hi uneix de manera inespecífica. VI. Discussió general 175 VI.-DISCUSSIÓ GENERAL VI. Discussió general 176 VI. Discussió general 177 1. LA INTERACCIÓ ENTRE GAGA i TTK El domini POZ/BTB és un domini d’interacció proteïna-proteïna d’uns 120 aminoàcids evolutivament molt conservat des de Drosophila a humans. A través d’aquest domini, les proteïnes POZ/BTB poden formar homooligòmers (Chen et al, 1995; Li et al, 1997; Espinás et al, 1999; Katsani et al, 1999) i, en alguns casos, heterooligòmers amb altres proteïnes que també tinguin domini POZ (Deltour et al, 1999; Kobayashi et al, 2000). A més a més, en alguns factors de transcripció s’ha observat que els dominis POZ estan involucrats en interaccions amb co-repressors, com és el cas de Bcl-6 i PLZF (Dhordain et al, 1997; Hong et al, 1997; Huynh i Bardwell, 1998). Aproximadament dues terceres parts de les proteïnes amb dominis POZ corresponen a factors de transcripció que tenen dominis d’unió a DNA de tipus dits de zinc (Ahmad et al, 1999). Entre aquests hi trobem els factors de transcripció de Drosophila GAGA i TTK (Zollman et al, 1994), els dominis POZ dels quals presenten un elevat grau d’homologia i fins a un 40% d’identitat (figura R.1). A més d’aquesta similitud entre POZes, estudis de cotraducció in vitro i immunoprecipitació amb formes truncades de GAGA i TTK apuntaven a una possible una interacció entre aquestes dues proteïnes (Bardwell i Treisman, 1994). Per aquesta raó es va decidir estudiar la interacció entre GAGA i TTK, així com la contribució dels respectius dominis POZ/BTB en aquesta interacció. Les tres tècniques utilitzades, GST-pulldown, co-immunoprecipitació a cèl.lules de Drosophila SL2 i assaig de dos híbrids a S. cerevisiae, confirmen que GAGA i TTK poden interaccionar tan in vivo com in vitro. A més a més, l’anàlisi de la interacció GAGA-TTK a S. cerevisiae utilitzant mutants de deleció de les dues proteïnes demostra que aquesta depèn estrictament de la presència d’ambdós dominis POZ. Concretament, aquests dominis apareixen com les regions no només necessàries sinó també suficients perquè pugui tenir lloc la interacció, ja que quan es troben en forma aïllada poden interaccionar i a més molt fortament (figura R.7B). VI. Discussió general 184 Quines conseqüències pot tenir la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA a Drosophila? Respecte l’activació de GAGA sobre el promotor eve, és interessant comentar el fet que pugui donar-se només en presència de la regió més proximal del promotor (–185eve). Aquesta regió, de fet, no només és necessària per l’expressió de la banda 2 sinó també per la correcta expressió de la resta de bandes de l’embrió (Goto et al, 1989; Harding et al, 1989), ja que duu els elements mínims que conformen el promotor basal o core. Per tant, es podria suggerir que el paper de GAGA com a regulador de l’expressió d’even-skipped no estaria restringit a la banda 2, sinó que seria un paper activador més global que afectaria l’expressió de totes les bandes d’even-skipped. En aquest sentit, un potencial paper de TTK com a repressor de l’activació d’eve per GAGA durant l’embriogènesi també hauria de repercutir en l’expressió de totes les bandes d’expressió d’even-skipped, ja que TTK també és capaç de reprimir el promotor –185eve activat per GAGA. I, de fet, això és el què s’observa en els experiments d’expressió ectòpica de TTK, on totes les bandes resulten afectades (Read et al, 1992; Brown i Wu, 1993). Tenint en compte que l’activitat d’unió de GAGA a la regió promotora d’eve és constant al llarg de tot el desenvolupament embrionari (Read et al, 1990), es podria pensar doncs que la seva funció d’activador transcripcional d’even-skipped està modulada per la presència o absència de TTK: així, durant l’estadi de 0-2 hores, la presència de TTK matern reprimiria una possible activació de GAGA sobre eve, impedint l’expressió d’aquest gen; a partir de les 2 hores, en què TTK matern ja ha desaparegut, GAGA podria activar eficientment l’expressió d’eve, donant lloc al patró típic de 7 bandes de l’embrió blastodèrmic; i finalment, en iniciar-se l’expressió zigòtica de TTK, l’activació d’eve per GAGA es tornaria a veure inhibida. Diverses evidències experimentals donarien suport a aquesta hipòtesi, que de fet també podria fer-se extensiva a la regulació de l’expressió de fushi tarazu. Per una banda, el fet que l’expressió d’even-skipped i fushi tarazu siguin complementàries a la de tramtrack tant en l’espai com en el temps (MacDonald, et al, 1986; Harrison i Travers, 1990) suggereix que aquests dos gens “pair-rule” no es poden expressar en presència de la proteïna TTK. En aquest sentit, qualsevol alteració en l’expressió de tramtrack afectarà directament al patró d’expressió d’eve o ftz, que és de fet el què s’ha observat en diferents estudis: concretament, a més dels efectes de l’expressió ectòpica de ttk ja comentats (Read et al, 1992; Brown i Wu, 1993), s’ha vist que un increment de la dosi materna de ttk dóna lloc a un retard en l’expressió de ftz, mentre que una disminució d’aquesta en mutants nuls ttk1e11 incrementa sensiblement l’expressió de ftz en un període on normalment no s’expressa (Pritchard i Schubiger, 1996). Això indica que la repressió que exerceix TTK sobre els gens “pair-rule” even-skipped i fushi tarazu és depenent de dosi, que és el mateix que observem nosaltres en els experiments de transfecció. VI. Discussió general 185 Tot i que en el cas de ftz primer caldrien fer experiments similars als realitzats amb eve, les seves similituds en quant al patró d’expressió així com el paper que exerceixen GAGA i TTK com a reguladors positius i negatius respectivament (Read et al, 1992; Brown i Wu, 1993; Okada i Hirose, 1998), suggereix que aquests dos gens “pair-rule” podrien ser regulats per GAGA i TTK de forma similar. No obstant, el paper repressor de TTK sobre l’activació mediada per GAGA no semblaria estar limitat a la regulació de gens “pair-rule” com even-skipped o fushi tarazu. Els nostres assajos transcripcionals a SL2 demostren que la repressió per TTK no requereix de la presència de llocs TTK al promotor (reprimeix l’element promotor –185eve), i que a més també pot tenir lloc en un context heteròleg com és el promotor 5×GAL4hsp70UAS, tot i que en ambdós casos només s’observa repressió si el promotor està essent activat per GAGA. Això ens està suggerint que aquells promotors que estan essent activats per GAGA són sensibles a una repressió per TTK. Quines repercussions pot tenir aquest fet en les funcions de GAGA i TTK com a factors reguladors de la transcripció in vivo? GAGA participa en la regulació de nombrosos gens de Drosophila, ja siguin induïbles (hsp26, hsp70...), constitutius (actina 5C, tubulina), o involucrats en processos de desenvolupament (en, Kr, eve, ftz, Ubx) (Soeller et al, 1993), mentre que les funcions repressores de TTK estan associades amb els gens “pair-rule” (Read i Manley, 1992; Brown i Wu, 1993) i amb el desenvolupament neuronal (Lai i Li, 1999; Badenhorst, 2001). Segons aquestes dades, semblaria que els únics gens on ambdues proteïnes participen en la seva regulació són els estudiats, els “pair-rule”. No obstant, s’ha de tenir en compte que de fet no s’ha realitzat cap estudi sobre si TTK té algun paper en la regulació de l’expressió d’aquests altres gens citats que també estan sota el control de GAGA, o anàlogament, sobre si GAGA té alguna funció associada en la regulació del destí de les cèl.lules neuronals. En aquest sentit, seria interessant analitzar si la funció repressora de TTK a nivell del desenvolupament neuronal també depèn d’una activació mediada per GAGA, o bé si en aquest context TTK actua per altres mecanismes. Quin és el mecanisme de la repressió de TTK sobre l’activació depenent de GAGA? Una de les qüestions bàsiques d’aquest treball ha estat intentar elucidar per quin mecanisme TTK reprimeix l’activació depenent de GAGA. En un principi vàrem suggerir quatre possibles models que podrien explicar aquesta repressió (figura D.5): El primer model proposa que la formació d’heterooligòmers GAGA-TTK impediria a GAGA unir-se eficientment al DNA, i en conseqüència poder activar la transcripció (figura D.5A). No obstant, els assajos de retardament i de footprinting amb DNasa I amb el VI. Discussió general 186 fragment –185eve, que conté varis llocs d’unió per GAGA però cap lloc d’unió per TTK, demostren que TTK no inhibeix la unió de GAGA al DNA, sinó que contràriament la seva presència incrementa significativament l’eficiència d’unió als llocs GAGA. Tenint en compte que TTK per si sol no es pot unir al fragment –185eve emprat, aquestes observacions suggereixen que en aquest cas és la formació d’heterooligòmers GAGA-TTK el què permet portar TTK fins al DNA. I d’altra banda, el fet que s’incrementi la unió als llocs GAGA en presència de les dues proteïnes, suggereix que els complexes GAGA-TTKDNA que es formen són molt estables. Per explicar l’estabilitat d’aquests complexes podem pensar en dues possibilitats (figura D.4). La primera seria que una vegada reclutat al promotor per GAGA, TTK fos capaç d’unirse dèbilment i de forma inespecífica al DNA (figura D.4A). Això voldria dir que la major afinitat que mostren els heterooligòmers GAGA-TTK és deguda a la contribució de TTK en unir-se al DNA. Buscant un paral.lelisme en els experiments de transfecció, on s’observa que les formes de TTK capaces d’unir el DNA (TTK sencer o ∆TTK580) són molt més eficients que el POZTTK en reprimir l’activació de GAGA, seria raonable pensar que la unió de TTK al DNA, tot i que sigui a llocs de baixa afinitat com és el cas del promotor –185eve, podria estabilitzar un complex ternari GAGA-TTK-DNA i així incrementar l’eficiència de la repressió. Una altra possibilitat seria que TTK, degut a la seva interacció amb GAGA a través dels respectius dominis POZ, provoqués una alteració de les propietats d’unió al DNA de GAGA que en últim terme donés lloc a un increment de l’estabilitat del complex GAGA-TTK-DNA (figura D.4B). Per intentar diferenciar entre aquestes dues possibilitats, seria interessant analitzar si una forma de TTK sense domini d’unió a DNA encara és capaç de promoure un increment de la unió dels complexes GAGA-TTK al promotor. Figura D.4. Models per la unió al DNA dels heterooligòmers GAGA-TTK. A. La formació d’heterooligòmers GAGA-TTK permet a TTK unir-se inespecíficament als llocs GAGA. B. La interacció amb TTK altera les propietats s’unió al DNA de GAGA. GAGA TTK + GAGA TTK A GAGA TTK B GAGAGAGA TTKTTK + GAGA TTK GAGA TTKTTK A GAGA TTK GAGA TTKTTK B VI. Discussió general 187 Figura D.5. Possibles models per la repressió de TTK sobre l’activació depenent de GAGA. En un promotor amb llocs d’unió per GAGA, aquesta activa la transcripció. TTK podria reprimir l’activació depenent de GAGA interferint en la unió de GAGA al promotor (A), o interaccionant amb components de la maquinària transcripcional, impedint el seu reclutament al promotor (B). Alternativament, els heterooligòmers GAGA-TTK podrien ser ineficients de reclutar co-activadors necessaris per l’activació de la transcripció (C) o participar activament en el reclutament de complexes co-repressors (D). En el segon model de repressió, TTK interacciona amb co-activadors o altres components de la maquinària transcripcional, obstaculitzant-ne el seu reclutament al promotor per GAGA (figura D.5B). Com ja s’ha comentat, recentment s’ha pogut observar una interacció entre el domini POZ de TTK i dTAFII155 (Badenhorst et al, 2002), per tant sembla factible que TTK pugui associar-se amb components de la maquinària basal i interferir el seu ensamblatge. Però el fet que només s’observi repressió si el promotor està activat per GAGA, i no si es troba en estat basal o en presència d’altres activadors com GAL4Q, està evidenciant que TTK no exerceix la seva funció repressora per ell mateix, sinó que requereix de la presència de GAGA. TTK TATA TATA GAGA CO-ACT A CD GAGA TATA CO-ACT TTK GAGA TATA CO-REP TTK GAGA TATA CO-ACT B GAGA TTK TTKTTK TATA TATA GAGA CO-ACT TATATATA GAGAGAGA CO-ACT A CD GAGAGAGA TATA CO-ACT TTK GAGA TATA CO-ACT TTKTTK GAGAGAGA TATA CO-REP TTK GAGA TATA CO-REP TTKTTK GAGAGAGA TATA CO-ACT B GAGA TTK TATA CO-ACT B GAGAGAGA TTKTTK VI. Discussió general 188 A més a més, els experiments de transfecció demostren que la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA requereix de la contribució d’ambdós dominis POZ. Tenint en compte que aquests dominis són els responsables de la interacció GAGA-TTK, els models que apareixen com a més probables són els que impliquen una interacció directa entre aquestes dues proteïnes, a través de la qual, i d’acord amb els resultats d’unió a DNA in vitro, GAGA contribuiria al reclutament de TTK al promotor (figura D.5C i D). Aquesta hipòtesi estaria d’acord amb l’observació de repressió tot i en absència de llocs d’unió de TTK, així com que el domini POZ de TTK per ell mateix té un efecte repressor significatiu. D’altra banda, el fet que la proteïna GAGA pugui esdevenir un repressor de la seva pròpia activació quan el seu domini POZ és intercanviat pel POZ de TTK, a més de donar més arguments a la idea que el POZ de TTK és el domini repressor, està indicant que les funcions associades als dominis POZ de GAGA i TTK no estan conservades, tot i presentar un elevat grau d’homologia entre ells (figura R.1). En aquest sentit, es podria pensar que són els residus no conservats entre els POZes de GAGA i TTK els que determinen les diferències que s’observen en les respectives funcions. I, de fet, si s’analitza amb detall l’alineament de seqüència dels dominis POZ de GAGA i TTK, s’observen diferències importants en les regions situades al loop α1-β2 (residus 23-34) i al loop α3-β4 (residus 60-66), els quals formen part, respectivament, del terra i les parets del solc potencial d’unió al lligand (figura D.6). Això suggereix que les especificitats d’interacció dels dominis POZ de GAGA i TTK amb proteïnes que s’uneixen a través d’aquest solc poden ser força diferents. Un cop reclutat al promotor per GAGA, quins mecanismes podrien estar implicats en la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA? Una possibilitat seria que el reclutament de TTK al promotor interferís en la formació o ensamblatge d’un complex d’activació productiu (figura D.5C). En aquest sentit, es podria pensar que la formació d’heterooligòmers GAGA-TTK impedeix que GAGA pugui reclutar molècules co-activadores necessàries perquè tingui lloc l’activació de la transcripció. Alternativament, aquí també es podria suggerir que una vegada portat al promotor, TTK interaccionés amb dTAFII155 o algun altre component del PIC i disrompés la maquinària basal ensamblada al promotor, resultant en darrera instància en una abolició del procés transcripcional. Un bloqueig de la interacció entre GAGA i la maquinària transcripcional correspondria al què s’ha descrit a la Introducció com un mecanisme de quenching. No obstant, normalment es considera quenching aquella situació en què activadors i repressors s’uneixen a seqüències adjacents, podent-se establir contactes proteïna-proteïna entre ambdues molècules. En el nostre cas, en canvi, l’ordre dels esdeveniments seria diferent, ja que TTK no s’uneix directament al DNA, i més aviat és la interacció amb GAGA el què el permet ser reclutat al promotor. VI. Discussió general 189 Figura D.6. Posició dels residus no conservats entre els POZes de GAGA i TTK en l’estructura d’un homodímer POZ-POZ. A. Regions no conservades entre els dominis POZ de GAGA i TTK (loops α1-β2 i α3β4, assenyalats en taronja per un monòmer i verd clar per l’altre) en l’estructura d’un homodímer POZ-POZ. B. Alineament de seqüència dels dominis POZ de GAGA i TTK amb la corresponent estructura secundària segons l’estructura resolta del POZ de PLZF (Ahmad et al, 1990). L’altra possibilitat seria que una vegada portat al promotor, TTK reclutés complexes corepressors (figura D.5D). Un co-repressor candidat a participar en aquesta repressió és dCtBP, pel qual ja s’ha descrit una associació funcional amb TTK en el desenvolupament dels fotoreceptors (Wen et al, 2000). Els nostres experiments indiquen que la regió Cterminal de TTK, que conté la seqüència consens d’unió a dCtBP, no és necessària per una repressió eficient. No obstant, alguns estudis apunten a que el domini de TTK responsable de la interacció amb dCtBP és el domini POZ, i que la seqüència P-DLS situada a l’extrem C-terminal tan sols hi tindria una contribució secundària. Si és certa aquesta hipòtesi, i el domini POZ de TTK per ell sol és capaç de mediar un reclutament de dCtBP, podríem pensar en un mecanisme de repressió dirigit pel POZTTK segons el qual: 1) TTK seria reclutat al promotor per una interacció amb GAGA; 2) una vegada al promotor, podria portar el co-repressor dCtBP; i 3) l’acció repressora de dCtBP resultaria en una inhibició de l’activació mediada per GAGA. En aquests moments s’està intentant analitzar aquesta hipotètica participació de dCtBP en la repressió per TTK sobre l’activació depenent de GAGA emprant el mateix tipus d’assajos transcripcionals a SL2. solc potencial d’unió al lligand 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 B solc potencial d’unió al lligandsolc potencial d’unió al lligand 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 B 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 10 20 30 40 50 60 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....| GAGA MSLPMNSLYSLTWGDYGTSLVSAIQLLRCHGDLVDCTLAAGGRSFPAHKIVLCAASPFLLDLLKNTPCKH TTK ---MASQRFCLRWNNHQSNLLSVFDQLLHAETFTDVTLAVEGQHLKAHKMVLSACSPYFNTLFVSHPEKH 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA 80 90 100 110 120 ....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|....|.... GAGA PVVMLAGVNANDLEALLEFVYRGEVSVDHAQLPSLLQAAQCLNIQGLAPQTVTKDDYTT TTK PIVILKDVPYSDMKSLLDFMYRGEVSVDQERLTAFLRVAESLRIKGLTEVNDDKPSPAA β1α1β2β3α2α3 β4α4β5α5α6 B VI. Discussió general 190 Un altre possible candidat a ser reclutat per TTK és dMi-2, la subunitat ATPasa del complex remodelador i desacetilasa NuRD. Com ja s’ha comentat, la interacció entre TTK i dMi-2 està mediada per una regió de 100 aa situada just a N-terminal del domini d’unió a DNA de TTK (Murawsky et al, 2001). Estudis recents sobre la funció repressora de TTK als òrgans sensorials observen que tot i que el POZ de TTK és el principal responsable d’aquesta activitat, la deleció de la regió a través de la qual s’uneix a dMi-2 disminueix parcialment l’eficiència de TTK com a repressor (Badenhorst et al, 2002). De manera similar, els resultats obtinguts en els nostres assajos de transfecció indiquen que en el mutant de deleció de TTK que no conté la regió d’unió a Mi-2 (POZTTK), la repressió observada és menor que en les formes on hi és present (TTK o ∆TTK580). Tenint en compte aquestes observacions, es podria suggerir un model de repressió per TTK segons el qual l’efecte repressor mediat principalment pel domini POZ de TTK podria ser incrementat en presència de la regió d’unió a dMi-2 per un reclutament del complex NuRD. Finalment, també és possible que l’acció de TTK impliqui un reclutament directe d’HDACs al promotor, no com el cas anterior del complex NuRD en què el reclutament de les desacetilases HDAC1 i 2 tindria lloc indirectament, a través de la subunitat Mi-2. Basantnos en el precedent que els dominis POZ de Bcl-6 i PLZF poden interaccionar directament amb desacetilases (David et al, 1998), és factible pensar que el POZ de TTK pugui actuar per mecanismes similars. En aquest sentit, els assajos de transfecció realitzats en presència de TSA apuntarien a que la repressió per TTK no involucra un reclutament de desacetilases sensibles a aquest inhibidor. No obstant, com ja s’ha dit, no estan del tot establerts els efectes del TSA sobre les HDACs de Drosophila, i de fet recentment s’ha identificat una HDACII insensible al TSA, la dHDAC6 (Barlow et al, 2001), amb la qual cosa no es pot descartar la possibilitat que en la repressió per TTK hi estiguin participant desacetilases insensibles al TSA. Seria doncs interessant realitzar assajos en presència d’inhibidors que tinguessin un espectre d’acció diferent del TSA, per tal d’analitzar si hi ha algun tipus d’activitat desacetilasa d’histones que col.labora amb TTK per reprimir la transcripció. En resum, els nostres resultats indiquen que la funció repressora de TTK sobre l’activació depenent de GAGA implica una interacció directa GAGA-TTK i no requereix la unió directa de TTK al DNA. Aquestes observacions suggereixen un model de repressió en el que TTK és reclutat per GAGA al promotor i aleshores exerceix la seva acció repressora. No obstant, els nostres resultats no permeten distingir si la repressió de TTK és deguda a una interferència sobre l’activació depenent de GAGA o a un reclutament actiu de co-repressors. VII. Conclusions 191 VII.-CONCLUSIONS VII. Conclusions 192 VII. Conclusions 193 1.- En experiments de co-immunoprecipitació, GST-pulldowns i assajos de dos híbrids a Saccharomyces cerevisiae s’ha detectat la interacció dels factors de transcripció de Drosophila GAGA i TTK. 2.- Els dominis POZ/BTB de GAGA i TTK, responsables de la formació dels homooligòmers GAGA-GAGA i TTK-TTK, són també necessaris i suficients per la interacció GAGA-TTK tant in vivo com in vitro. 3.- En assajos de transfecció a SL2, l’activació del promotor eve stripe 2 mediada per GAGA és reprimida eficientment per TTK. En absència de GAGA, la sobreexpressió de TTK no té cap efecte sobre l’activitat basal del promotor. 4.- La repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA requereix la presència dels dominis POZ de GAGA i de TTK, suggerint que és conseqüència de la interacció GAGATTK. 5.- El domini POZ de TTK és capaç per si sol de reprimir l’activació mediada per GAGA. Pel contrari, la regió C-terminal de TTK, que conté la seqüència consens P-DLS d’unió al co-repressor dCtBP, no contribueix de manera significativa a la repressió. Aquests resultats identifiquen el domini POZ de TTK com el principal responsable de la repressió. 6.- Consistent amb 5, l’intercanvi del domini POZ de GAGA pel domini POZ de TTK aboleix la capacitat transactivadora de GAGA i converteix la proteïna de fusió POZTTK∆POZGAGA en un repressor de l’activació depenent de GAGA. 7.- La repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA no és inhibible per TSA, suggerint que les HDACs no contribueixen en aquesta repressió. No obstant, no es pot descartar que la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA pugui estar mediada per un reclutament de complexes HDACs insensibles al TSA. 8.- La repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA pot tenir lloc en absència de llocs d’unió de TTK al promotor, indicant que la repressió no requereix unió directa de TTK al DNA. 9.- Els assajos d’unió a DNA in vitro mostren que TTK no interfereix en la unió de GAGA al DNA. Contràriament, els complexes GAGA-TTK semblen tenir una major afinitat d’unió al DNA. 10.- Aquestes observacions suggereixen un model en el que la repressió per TTK de l’activació depenent de GAGA implica una interacció directa GAGA-TTK a través de la qual GAGA contribueix al reclutament de TTK al promotor. No obstant, els nostres resultats no permeten distingir si l’activitat repressora de TTK és deguda a la interferència en l’activació depenent de GAGA o a un reclutament actiu de co-repressors.