Entwicklung eines dreidimensional gedruckten
humanisierten Lebermodells als Modellsystem für virale
Infektions- und Transduktionsversuche
vorgelegt von
M.Sc.
Thomas Hiller
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer.nat -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Neubauer
Gutachter 1: Prof. Dr. Jens Kurreck
Gutachter 2: Prof. Dr. Juri Rappsilber
Gutachter 3: Prof. Dr. Claus-Thomas Bock
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30.08.2019
Berlin 2019
Inhaltsverzeichnis I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................ I
Zusammenfassung .............................................................................................................. V
Abstract .............................................................................................................................. VI
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................... VII
Abbildungsverzeichnis .................................................................................................... VIII
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................... IX
1. Einleitung ...................................................................................................................... 1
1.1 3D Biodruck ............................................................................................................ 2
1.1.1 Konstruktion von 3D Strukturen ........................................................................ 2
1.1.2 Techniken des 3D Biodrucks ............................................................................ 2
1.1.2.1 Extrusionsdruck......................................................................................... 3
1.1.3 Biotinten ........................................................................................................... 4
1.1.3.1 Alginat ....................................................................................................... 7
1.1.3.2 Gelatine .................................................................................................... 9
1.1.3.3 Extrazelluläre Matrix .................................................................................10
1.2 Leber ......................................................................................................................11
1.2.1 Aufbau der Leber ............................................................................................11
1.2.1.1 Leberläppchen .........................................................................................12
1.2.2 Infektionen der Leber ......................................................................................13
1.2.2.1 Adenovirus ...............................................................................................13
1.2.3 Gentherapie in der Leber ................................................................................13
1.2.3.1 RNA-Interferenz .......................................................................................14
1.2.3.2 Adeno-assoziierte Viren ...........................................................................15
1.3 Notwendigkeit von 3D Lebermodellen ....................................................................16
1.4 3D Lebermodelle ....................................................................................................17
1.4.1 AAV-Transduktion in humanisierten Rattenlebern ...........................................19
1.5 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................................20
2 Material und Methoden ...............................................................................................21
2.1 Material ..................................................................................................................21
2.1.1 Laborequipment ..............................................................................................21
2.1.2 Verbrauchsmaterialien ....................................................................................22
2.1.3 Biopolymere ....................................................................................................22
2.1.4 Chemikalien ....................................................................................................23
2.1.5 Kits ..................................................................................................................24
II Inhaltsverzeichnis
2.1.6 Puffer ..............................................................................................................24
2.1.7 Medien ............................................................................................................24
2.1.8 Medienzusätze ................................................................................................25
2.1.9 Zellen ..............................................................................................................25
2.1.10 Enzyme ...........................................................................................................25
2.1.11 Viren ...............................................................................................................25
2.1.12 AAV-Plasmide .................................................................................................25
2.1.13 DNAse Verdau ................................................................................................26
2.1.14 PCR Mastermix ...............................................................................................26
2.1.15 PCR Primer .....................................................................................................26
2.1.16 Software ..........................................................................................................26
2.2 Methoden ...............................................................................................................27
2.2.1 Zellkultur .........................................................................................................27
2.2.1.1 Auftauen von Zellen .................................................................................27
2.2.1.2 Passage und Expansion von Zellen .........................................................28
2.2.1.2.1 Differenzierung von HepaRG-Zellen .....................................................28
2.2.1.3 Zählung von Zellen ...................................................................................29
2.2.1.4 Einfrieren von Zellen ................................................................................30
2.2.2 HepaRG-beladene 3D Strukturen....................................................................31
2.2.2.1 Bestimmung der optimalen CaSO4·2H2O-Konzentration ..........................31
2.2.2.2 Bestimmung des optimalen Gelatineanteils ..............................................31
2.2.2.3 Isolation humaner extrazellulärer Matrix ...................................................32
2.2.2.4 Kombination der Alginat/Gelatinebiotinten mit hECM ...............................34
2.2.2.5 Herstellung HepaRG-beladener Biotinten ................................................34
2.2.2.6 Design HepaRG-beladener 3D Strukturen ...............................................35
2.2.2.7 Extrusionsdruckprozess ...........................................................................35
2.2.2.8 3D Zellkultur .............................................................................................36
2.2.2.9 Rheologie .................................................................................................36
2.2.2.10 Zellverteilung ............................................................................................37
2.2.2.11 Lebend/Tot-Färbung ................................................................................37
2.2.2.12 XTT ..........................................................................................................37
2.2.2.13 Laktatdehydrogenase ...............................................................................38
2.2.2.14 Cytochrom P450 3A4 Aktivität ..................................................................39
2.2.2.15 Albumimsekretion .....................................................................................40
2.2.2.16 Produktion des humanen Adenovirus Serotyp 5 .......................................41
2.2.2.17 Adenovirus Serotyp 5 Infektion .................................................................41
Inhaltsverzeichnis III
2.2.2.18 Nachweis des adenoviralen Wachstums ..................................................42
2.2.2.18.1 Cell-Killing Assay ................................................................................42
2.2.2.18.2 qPCR ..................................................................................................43
2.2.2.19 Produktion von AAV-Vektoren ..................................................................44
2.2.2.20 AAV-Vektor-Quantifizierung .....................................................................46
2.2.2.21 HepaRG-Transduktion durch AAV ...........................................................47
2.2.2.22 AAV-Verteilung ........................................................................................47
2.2.2.23 hCycB-Expression ....................................................................................48
2.2.3 Statistik ...........................................................................................................51
3 Ergebnisse ...................................................................................................................52
3.1 Herstellung HepaRG-beladener 3D Strukturen .......................................................52
3.1.1 Alginat/Gelatinebiotinte ...................................................................................52
3.1.1.1 Bestimmung der CaSO4·2H2O-Konzentration ..........................................52
3.1.1.2 Bestimmung des Gelatineanteils ..............................................................54
3.1.2 Alginat/Gelatine/hECM-Biotinten .....................................................................55
3.1.3 HepaRG-beladene Biotinten ............................................................................55
3.1.4 Charakterisierung HepaRG-beladener 3D Strukturen ......................................58
3.1.4.1 Zellverteilung ............................................................................................59
3.1.4.2 Metabolische Aktivität ..............................................................................60
3.1.5 Infektion HepaRG-beladener 3D Strukturen ....................................................65
3.1.5.1 AdV5-Replikation .....................................................................................66
3.1.6 Transduktion mit AAV-Vektoren ......................................................................68
3.1.6.1 Virale (AAV) Verteilung ............................................................................69
3.1.6.2 Genstilllegung ..........................................................................................69
3.1.7 A549-beladene 3D Strukturen .........................................................................71
4 Diskussion ...................................................................................................................75
4.1 Wahl der Drucktechnik ...........................................................................................75
4.2 hECM-haltige HepaRG-beladene 3D Strukturen ....................................................77
4.3 Räumliche Anordnung der HeaRG Zellen ..............................................................78
4.4 Metabolische Aktivität der HepaRG-Zellen .............................................................81
4.5 Nachweis viraler Transduktion und Infektion ..........................................................86
4.6 Schlussfolgerung ....................................................................................................87
4.7 Ausblick ..................................................................................................................88
5 Literaturverzeichnis ....................................................................................................93
6 Anhang ....................................................................................................................... 117
6.1 AAV-Vektorproduktion .......................................................................................... 117
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