Zur Rolle von p53 und zum Einfluss von Cadmiumchlorid
auf DNA-Reparaturprozesse und Zellzykluskontrolle
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemiker
Gunnar Jahnke
aus Karlsruhe
von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard
Berichter: Prof. Dr. A Hartwig
Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10. Oktober 2007
Berlin 2007
D 83
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung............................................................................................. 1
2 Einleitung............................................................................................................ 4
2.1 Thematische Einführung .................................................................................. 4
2.2 Cadmium.......................................................................................................... 5
2.2.1 Vorkommen und Verwendung............................................................... 5
2.2.2 Exposition des Menschen ..................................................................... 5
2.2.3 Genotoxizität und Kanzerogenität ......................................................... 7
2.3 RNA-Interferenz............................................................................................... 9
2.4 DNA-Schäden und ihre Reparatur ................................................................. 12
2.4.1 UV-induzierte DNA-Schäden............................................................... 12
2.4.2 BPDE-induzierte DNA-Schäden.......................................................... 13
2.4.3 DNA-Reparaturprozesse..................................................................... 15
2.4.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur......................................................... 16
2.5 Das Tumorsuppressorprotein p53.................................................................. 18
2.5.1 Struktur und Funktion.......................................................................... 18
2.5.2 Bedeutung von p53 in der NER........................................................... 20
2.5.3 Bedeutung von p53 in der Zellzykluskontrolle..................................... 21
3 Fragestellung.................................................................................................... 24
4 Material und Methoden..................................................................................... 25
4.1 Material .......................................................................................................... 25
4.2 Methoden....................................................................................................... 25
4.2.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen.................................................. 25
4.2.1.1 Zellkultur ...................................................................................... 25
4.2.1.2 Inkubationslösungen .................................................................... 26
4.2.1.3 Bestrahlung mit UVC.................................................................... 26
4.2.2 Koloniebildungsfähigkeit ..................................................................... 26
4.2.3 Zellzyklusuntersuchung....................................................................... 27
4.2.4 Transfektionsexperimente................................................................... 28
4.2.4.1 Bestimmung der Geneticin-Toleranzdosis ................................... 28
4.2.4.2 Transfektion von HeLa S3, MCF7 und A549 Zellen..................... 28
4.2.4.3 Bestimmung der Transfektionseffizienz ....................................... 29
4.2.4.4 Selektion und Isolierung von stabil transfizierten Zellklonen........ 29
4.2.5 Bestimmung der relativen Genexpression .......................................... 30
Inhaltsverzeichnis
II
4.2.5.1 RNA-Isolierung............................................................................. 30
4.2.5.2 RNA-Quantifizierung .................................................................... 31
4.2.5.3 RNA-Elektrophorese .................................................................... 31
4.2.5.4 cDNA-Synthese ........................................................................... 31
4.2.5.5 Real-Time RT-PCR...................................................................... 32
4.2.5.6 Auswertung.................................................................................. 34
4.2.6 Immunologischer Nachweis zellulärer Proteine................................... 36
4.2.6.1 Zelllyse......................................................................................... 36
4.2.6.2 Proteinbestimmung nach Bradford............................................... 36
4.2.6.3 Elektrophorese und Westernblot.................................................. 36
4.2.6.4 Chemilumineszenz-Detektion ...................................................... 37
4.2.7 Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden .......................................... 37
4.2.7.1 Nachweisprinzip........................................................................... 37
4.2.7.2 Versuchsdurchführung................................................................. 38
4.2.8 Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte ......................................... 39
4.2.8.1 Nachweisprinzip........................................................................... 39
4.2.8.2 Versuchsansatz ........................................................................... 40
4.2.8.3 DNA-Isolierung und -Quantifizierung ........................................... 40
4.2.8.4 DNA-Hydrolyse ............................................................................ 41
4.2.8.5 HPLC-Analyse ............................................................................. 42
5 Ergebnisse und Diskussion .............................................................................. 43
5.1 Transfektionsexperimente.............................................................................. 43
5.1.1 Methodenetablierung .......................................................................... 43
5.1.2 Charakterisierung der Zellen............................................................... 44
5.2 Zytotoxizität.................................................................................................... 48
5.2.1 Cadmiumchlorid .................................................................................. 48
5.2.2 UVC-Strahlung.................................................................................... 51
5.2.3 Benzo[a]pyrendiolepoxid ..................................................................... 53
5.3 Zellzyklusuntersuchungen.............................................................................. 55
5.3.1 Einfluss von Cadmiumchlorid auf die Zellzykluskontrolle nach
UVC-Bestrahlung................................................................................. 55
5.3.2 Einfluss von Actinomycin D auf die Zellzyklusverteilung ..................... 59
5.3.3 Einfluss von Benzo[a]pyrendiolepoxid auf den Zellzyklus ................... 62
5.4 Untersuchung der Protein- und Genexpression nach BPDE-Inkubation........ 66
Inhaltsverzeichnis
III
5.4.1 Einfluss von BPDE auf p53 und XPC auf Proteinebene...................... 66
5.4.2 Einfluss von BPDE auf die Genexpression von
p53, p48, p21 und XPC ....................................................................... 76
5.5 Einfluss von p53 auf Bildung und Reparatur BPDE-induzierter
DNA-Addukte................................................................................................. 82
5.5.1 Untersuchungen in A549 Zellen.......................................................... 82
5.5.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen..................................................... 84
5.5.3 Bewertung der Ergebnisse.................................................................. 86
5.6 Einfluss von p53 und Cadmiumchlorid auf die Reparatur UVC-induzierter
DNA-Schäden................................................................................................ 89
5.6.1 Untersuchungen in A549 Zellen.......................................................... 89
5.6.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen..................................................... 90
5.6.3 Bewertung der Ergebnisse.................................................................. 91
6 Zusammenfassende Diskussion....................................................................... 94
7 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 99
8 Anhang........................................................................................................... 111
8.1 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ 111
8.2 Chemikalien ................................................................................................. 116
8.3 Lösungen und Puffer.................................................................................... 120
8.4 Geräte.......................................................................................................... 125
8.5 Verbrauchsmaterial...................................................................................... 127
8.6 Transfektionsexperimente............................................................................ 128
8.6.1 Geneticin-Toleranzdosis.................................................................... 128
8.6.2 Verwendete Plasmide ....................................................................... 129
8.6.3 Transfektionseffizienz ....................................................................... 130
8.7 Bestimmung der relativen Genexpression ................................................... 130
8.7.1 RNA-Integrität ................................................................................... 130
8.7.2 PCR-Analysenprogramm .................................................................. 131
8.7.3 PCR-Primersequenzen ..................................................................... 132
8.7.4 cDNA-Verdünnungsreihen ................................................................ 132
8.8 HPLC-Analyse ............................................................................................. 134
8.8.1 Analysenprogramm........................................................................... 134
8.8.2 Chromatogramme ............................................................................. 135
8.8.3 Kalibrierung....................................................................................... 136
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