Zur Rolle von p53 und zum Einfluss von Cadmiumchlorid
auf DNA-Reparaturprozesse und Zellzykluskontrolle
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemiker
Gunnar Jahnke
aus Karlsruhe
von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. W. Rotard
Berichter: Prof. Dr. A Hartwig
Berichter: Prof. Dr. L. W. Kroh
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 10. Oktober 2007
Berlin 2007
D 83
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
1 Zusammenfassung............................................................................................. 1
2 Einleitung............................................................................................................ 4
2.1 Thematische Einführung .................................................................................. 4
2.2 Cadmium.......................................................................................................... 5
2.2.1 Vorkommen und Verwendung............................................................... 5
2.2.2 Exposition des Menschen ..................................................................... 5
2.2.3 Genotoxizität und Kanzerogenität ......................................................... 7
2.3 RNA-Interferenz............................................................................................... 9
2.4 DNA-Schäden und ihre Reparatur ................................................................. 12
2.4.1 UV-induzierte DNA-Schäden............................................................... 12
2.4.2 BPDE-induzierte DNA-Schäden.......................................................... 13
2.4.3 DNA-Reparaturprozesse..................................................................... 15
2.4.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur......................................................... 16
2.5 Das Tumorsuppressorprotein p53.................................................................. 18
2.5.1 Struktur und Funktion.......................................................................... 18
2.5.2 Bedeutung von p53 in der NER........................................................... 20
2.5.3 Bedeutung von p53 in der Zellzykluskontrolle..................................... 21
3 Fragestellung.................................................................................................... 24
4 Material und Methoden..................................................................................... 25
4.1 Material .......................................................................................................... 25
4.2 Methoden....................................................................................................... 25
4.2.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen.................................................. 25
4.2.1.1 Zellkultur ...................................................................................... 25
4.2.1.2 Inkubationslösungen .................................................................... 26
4.2.1.3 Bestrahlung mit UVC.................................................................... 26
4.2.2 Koloniebildungsfähigkeit ..................................................................... 26
4.2.3 Zellzyklusuntersuchung....................................................................... 27
4.2.4 Transfektionsexperimente................................................................... 28
4.2.4.1 Bestimmung der Geneticin-Toleranzdosis ................................... 28
4.2.4.2 Transfektion von HeLa S3, MCF7 und A549 Zellen..................... 28
4.2.4.3 Bestimmung der Transfektionseffizienz ....................................... 29
4.2.4.4 Selektion und Isolierung von stabil transfizierten Zellklonen........ 29
4.2.5 Bestimmung der relativen Genexpression .......................................... 30
Inhaltsverzeichnis
II
4.2.5.1 RNA-Isolierung............................................................................. 30
4.2.5.2 RNA-Quantifizierung .................................................................... 31
4.2.5.3 RNA-Elektrophorese .................................................................... 31
4.2.5.4 cDNA-Synthese ........................................................................... 31
4.2.5.5 Real-Time RT-PCR...................................................................... 32
4.2.5.6 Auswertung.................................................................................. 34
4.2.6 Immunologischer Nachweis zellulärer Proteine................................... 36
4.2.6.1 Zelllyse......................................................................................... 36
4.2.6.2 Proteinbestimmung nach Bradford............................................... 36
4.2.6.3 Elektrophorese und Westernblot.................................................. 36
4.2.6.4 Chemilumineszenz-Detektion ...................................................... 37
4.2.7 Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden .......................................... 37
4.2.7.1 Nachweisprinzip........................................................................... 37
4.2.7.2 Versuchsdurchführung................................................................. 38
4.2.8 Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte ......................................... 39
4.2.8.1 Nachweisprinzip........................................................................... 39
4.2.8.2 Versuchsansatz ........................................................................... 40
4.2.8.3 DNA-Isolierung und -Quantifizierung ........................................... 40
4.2.8.4 DNA-Hydrolyse ............................................................................ 41
4.2.8.5 HPLC-Analyse ............................................................................. 42
5 Ergebnisse und Diskussion .............................................................................. 43
5.1 Transfektionsexperimente.............................................................................. 43
5.1.1 Methodenetablierung .......................................................................... 43
5.1.2 Charakterisierung der Zellen............................................................... 44
5.2 Zytotoxizität.................................................................................................... 48
5.2.1 Cadmiumchlorid .................................................................................. 48
5.2.2 UVC-Strahlung.................................................................................... 51
5.2.3 Benzo[a]pyrendiolepoxid ..................................................................... 53
5.3 Zellzyklusuntersuchungen.............................................................................. 55
5.3.1 Einfluss von Cadmiumchlorid auf die Zellzykluskontrolle nach
UVC-Bestrahlung................................................................................. 55
5.3.2 Einfluss von Actinomycin D auf die Zellzyklusverteilung ..................... 59
5.3.3 Einfluss von Benzo[a]pyrendiolepoxid auf den Zellzyklus ................... 62
5.4 Untersuchung der Protein- und Genexpression nach BPDE-Inkubation........ 66
Inhaltsverzeichnis
III
5.4.1 Einfluss von BPDE auf p53 und XPC auf Proteinebene...................... 66
5.4.2 Einfluss von BPDE auf die Genexpression von
p53, p48, p21 und XPC ....................................................................... 76
5.5 Einfluss von p53 auf Bildung und Reparatur BPDE-induzierter
DNA-Addukte................................................................................................. 82
5.5.1 Untersuchungen in A549 Zellen.......................................................... 82
5.5.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen..................................................... 84
5.5.3 Bewertung der Ergebnisse.................................................................. 86
5.6 Einfluss von p53 und Cadmiumchlorid auf die Reparatur UVC-induzierter
DNA-Schäden................................................................................................ 89
5.6.1 Untersuchungen in A549 Zellen.......................................................... 89
5.6.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen..................................................... 90
5.6.3 Bewertung der Ergebnisse.................................................................. 91
6 Zusammenfassende Diskussion....................................................................... 94
7 Literaturverzeichnis .......................................................................................... 99
8 Anhang........................................................................................................... 111
8.1 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ 111
8.2 Chemikalien ................................................................................................. 116
8.3 Lösungen und Puffer.................................................................................... 120
8.4 Geräte.......................................................................................................... 125
8.5 Verbrauchsmaterial...................................................................................... 127
8.6 Transfektionsexperimente............................................................................ 128
8.6.1 Geneticin-Toleranzdosis.................................................................... 128
8.6.2 Verwendete Plasmide ....................................................................... 129
8.6.3 Transfektionseffizienz ....................................................................... 130
8.7 Bestimmung der relativen Genexpression ................................................... 130
8.7.1 RNA-Integrität ................................................................................... 130
8.7.2 PCR-Analysenprogramm .................................................................. 131
8.7.3 PCR-Primersequenzen ..................................................................... 132
8.7.4 cDNA-Verdünnungsreihen ................................................................ 132
8.8 HPLC-Analyse ............................................................................................. 134
8.8.1 Analysenprogramm........................................................................... 134
8.8.2 Chromatogramme ............................................................................. 135
8.8.3 Kalibrierung....................................................................................... 136
Inhaltsverzeichnis
IV
9 Publikationsliste.............................................................................................. 137
10 Danksagung ................................................................................................... 140
Zusammenfassung
1
1 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der DNA-Reparatur und in der
Zellzykluskontrolle untersucht, zum Teil unter dem zusätzlichen Einfluss von
Cadmiumchlorid. Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt eine zentrale Rolle in der
Aufrechterhaltung der genetischen Stabilität. Als Transkriptionsfaktor ist es an der
Regulation wichtiger zellulärer Mechanismen wie Apoptose, Zellzykluskontrolle und
DNA-Reparatur beteiligt. Mutationen von p53 sind eng verknüpft mit der Entstehung
von Krebserkrankungen. In mehr als 50 % der menschlichen Primärtumoren ist p53
mutiert und dadurch in seiner Funktion gestört. Strukturelle und funktionelle
Veränderungen des Proteins können auch durch Metallverbindungen induziert
werden. Für Cadmiumverbindungen konnte dies bereits gezeigt werden. Eine
mögliche Erklärung dafür ist die Wechselwirkung mit der Zink-bindenden Struktur des
Tumorsuppressorproteins.
Zunächst wurden umfangreiche Vorarbeiten durchgeführt, um mittels RNA-
Interferenz (RNAi) Zellen mit reduzierter Expression des Tumorsuppressorgens p53
zu generieren. Diese Methode wurde in HeLa S3, MCF7 und A549 Zellen erfolgreich
eingesetzt. In A549 Zellen wurde eine Reduktion der relativen p53-Genexpression
um ca. 80 % erreicht, die sich auch in einem deutlich verringerten p53-Proteingehalt
der Zellen widerspiegelte.
Untersuchungen zum Einfluss von Cadmium auf die Zellzyklusverteilung in A549
Zellen wurden durchgeführt. Sie ergaben einen leichten G1-Arrest unabhängig vom
p53-Status der Zellen. Nach Bestrahlung mit 5 J/m2 UVC war ein S-Phasen Arrest zu
beobachten, der nach Vorinkubation mit Cadmium unabhängig von p53 deutlich
abgeschwächt wurde. Zum Vergleich wurden weitere Versuche mit HCT116 Zellen
durchgeführt, von denen auch eine isogene, p53-defiziente Zelllinie zur Verfügung
stand. Auch bei diesen Zelllinien führte die Bestrahlung mit UVC zu einem p53-
unabhängigen Arrest in der S-Phase des Zellzyklus. Weitere Untersuchungen zur
Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle wurden nach Behandlung der Zellen mit
Actinomycin D durchgeführt. In den A549 und in den HCT116 Zellen konnte dabei
eine Abhängigkeit der Zellzyklusregulation von p53 am G1/S- und am G2/M-
Übergang festgestellt werden. Dadurch konnte auch ein Beweis für die funktionellen
Konsequenzen des p53 knock-down in den A549 Zellen erbracht werden.
Zusammenfassung
2
Als weiteres DNA-schädigendes Agens wurde Benzo[a]pyrendiolepoxid (BPDE)
eingesetzt. Die Behandlung der Zellen mit BPDE führte zu einem
konzentrationsabhängigen S-Phasen Arrest, der unabhängig vom p53-Status war. In
weiteren Versuchen wurde die Expression von p53 und XPC nach Inkubation mit
BPDE zunächst auf Proteinebene in den A549 und HCT116 Zelllinien betrachtet. In
allen A549 Zelllinien und in den p53-profizienten HCT116 Zellen war nach Ende der
BPDE-Inkubation eine konzentrationsabhängige Zunahme des p53-Proteins mit
einem Maximum nach 8 h erkennbar. Das XPC-Protein blieb in allen Zelllinien
unabhängig von der Behandlung konstant. Die relative Genexpression zeigte in allen
A549 Zelllinien und in den p53-profizienten HCT116 Zellen nach Ende der BPDE-
Inkubation insbesondere für p21 eine starke Induktion und folgte im zeitlichen Verlauf
der beginnenden Akkumulation des p53-Proteins.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal der Einfluss von p53 auf die Bildung und
Reparatur von DNA-Addukten nach Inkubation mit BPDE in A549 und HCT116
Zellen untersucht. Die Induktion der Addukte war konzentrationsabhängig aber
unabhängig vom p53-Status der Zellen. Bezüglich der Reparatur BPDE-induzierter
DNA-Schäden konnte weder in den A549 noch in den HCT116 Zellen ein Einfluss
von p53 festgestellt werden.
Die Reparatur UVC-induzierter CPD wurde untersucht, um die Rolle von p53 in der
Reparatur verschiedener DNA-schädigender Agenzien vergleichen zu können. Bei
den p53-defizienten HCT116 Zellen war die Reparatur nach 24 h um etwa 25 %
vermindert. In den A549 Zellen hingegen konnte kein Einfluss des p53-Status auf die
Reparatur festgestellt werden. Möglicherweise ist dies auf im Gegensatz zu den
HCT116 p53 knock-out Zellen in den knock-down Zellen noch vorhandenes p53-
Protein zurückzuführen. Dadurch könnte in den knock-down Zellen eine p53-
abhängige Induktion von p48 und XPC nach UVC-Bestrahlung noch möglich sein.
Die zusätzliche Inkubation mit Cd(II) ergab weder in den HCT116 Zellen noch in den
A549 Zellen eine Reparaturhemmung. Ob dafür möglicherweise methodische oder
mechanistische Gründe eine Rolle spielen, sollte in weiteren Untersuchungen
abgeklärt werden.
Für den unterschiedlichen Einfluss von p53 auf die Reparatur UVC- und BPDE-
induzierter DNA-Schäden könnte einerseits die Schadenserkennung verantwortlich
sein. Es ist bekannt, dass die p53-abhängige Expression von p48 für eine effiziente
Reparatur von CPD notwendig ist. Für die Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte
Zusammenfassung
3
ist dies bislang nicht beschrieben worden. Zum anderen könnte die Anzahl der
induzierten DNA-Schäden Einfluss auf die Abhängigkeit des Reparaturprozesses von
p53 nehmen. Möglicherweise ist der p53-unabhängige Grundspiegel an XPC-Protein
für die Reparatur einer mäßigen Anzahl von DNA-Schäden ausreichend, während es
bei Auftreten einer großen Zahl an Läsionen der p53-abhängigen Induktion von XPC
bedarf. Weitere Untersuchungen könnten dazu beitragen, ein tieferes Verständnis für
die Rolle von p53 in der NER zu erlangen.
Einleitung
4
2 Einleitung
2.1 Thematische Einführung
In der Zelle entstehen DNA-Schäden zum einen permanent durch endogene
Stoffwechselprozesse, sie können zum anderen aber auch durch die Einwirkung
DNA-schädigender Agenzien aus der Umwelt hervorgerufen werden. Zu den
Umweltschadstoffen zählen auch Metallverbindungen, die zum Teil sowohl direkt als
auch über indirekte Mechanismen die Stabilität des Genoms beeinflussen. So konnte
bereits gezeigt werden, dass verschiedene Metallverbindungen in der Lage sind,
DNA-Reparaturprozesse zu hemmen (zusammengefasst in Hartwig und Schwerdtle,
2002). Die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen sind bislang nur
unzureichend verstanden, jedoch deutet vieles darauf hin, dass Zink-bindende
Strukturen mögliche Angriffspunkte darstellen (zusammengefasst in Hartwig et al.,
2002a). Einige DNA-Reparaturproteine enthalten so genannte Zinkfingerstrukturen.
Dabei handelt es sich um ein Strukturmotiv, das u. a. für Protein/DNA- und für
Protein/Protein-Wechselwirkungen verantwortlich ist (zusammengefasst in Berg,
1990). Darüber hinaus gibt es noch weitere Proteine, die zwar keine
Zinkfingerstrukturen besitzen, für die aber dennoch die Bindung von Zink essentiell
für die Aufrechterhaltung von Struktur und Funktion ist. Ein Beispiel dafür ist das
Tumorsuppressorprotein p53, dem eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung der
genomischen Stabilität zukommt. Es ist an zentralen zellulären Mechanismen
beteiligt, deren Aufgabe es unter anderem ist, DNA-Schäden zu reparieren, die
Replikation geschädigter DNA zu verhindern oder den programmierten Zelltod
(Apoptose) auszulösen (zusammengefasst in Hainaut und Hollstein, 2000).
Untersuchungen zur Wechselwirkung mit Metallverbindungen sind daher von großem
Interesse. Veränderungen in der Struktur und Funktion von p53 durch
Cadmiumverbindungen konnten bereits nachgewiesen werden (Meplan et al., 1999;
Thuy, 2006).
Einleitung
5
2.2 Cadmium
2.2.1 Vorkommen und Verwendung
Cadmium (Cd) ist ein Element der II. Nebengruppe des Periodensystems. Es ist ein
silberweißes, relativ weiches Schwermetall, das in seinen Verbindungen praktisch
nur die Oxidationsstufe +2 besitzt. Cadmium kommt in der Natur nur gebunden,
meist vergesellschaftet mit Zink, aber auch mit Blei und Phosphaten, als
Cadmiumblende (Greenockit, CdS) und als Cadmiumcarbonat (Otavit, CdCO3) vor.
Zu den wasserlöslichen Cadmiumverbindungen zählen Cadmiumchlorid (CdCl2) und
Cadmiumsulfat (CdSO4), während Cadmiumoxid (CdO), Cadmiumsulfid (CdS) und
Cadmiumcarbonat (CdCO3) in Wasser nur schwer löslich sind (Holleman, 1995).
Industriell wird Cadmium vor allem bei der Herstellung von Nickel-Cadmium-
Batterien, für Legierungen, in Pigmenten sowie in Stabilisatoren für Kunststoffe
verwendet (zusammengefasst in Pinot et al., 2000).
Durch natürliche Freisetzung und die Verfeuerung fossiler Brennstoffe sowie durch
Eisen-, Blei- und Zinkverhüttung und durch Müllverbrennung wird Cadmium in die
Atmosphäre freigesetzt und gelangt mit den Niederschlägen in Böden und Gewässer
(zusammengefasst in Benemann et al., 2004). Weiterhin gelten die
landwirtschaftliche Nutzung von cadmiumhaltigen Phosphatmineralien und
Klärschlämmen als Dünger sowie die industrielle Nutzung als Hauptursachen der
weitläufigen Verteilung von Cadmium in der Umwelt und in Lebensmitteln (Satarug et
al., 2003).
2.2.2 Exposition des Menschen
Für den Menschen ist Cadmium ein biologisch nicht essentielles, aber toxisches
Schwermetall, das sich vor allem in Nieren und Leber anreichert. Toxische
Wirkungen betreffen in Abhängigkeit vom Aufnahmeweg vor allem die Nieren, die
Lunge und die Knochen (Jin et al., 1998). Eine mögliche Exposition am Arbeitsplatz,
zum Beispiel in Batteriefabriken, Zinkschmelzen, Pigmentfabriken und bei
Lötarbeiten geschieht vor allem über die Atemwege (Jarup, 2002). Beruflich nicht
exponierte Nichtraucher nehmen Cadmium vor allem über die Nahrung auf, wobei
insbesondere pflanzliche Lebensmittel den größten Anteil besitzen. Übliche Gehalte
liegen für pflanzliche Lebensmittel meist unter 0,1 mg/kg Frischgewicht, für tierische
Lebensmittel wie Milch und Fleisch meist um 0,01 mg/kg, wobei Leber und Nieren
Einleitung
6
von Schlachttieren deutlich höhere Gehalte von etwa 1 mg/kg erreichen können. Die
Aufnahme über das Trinkwasser spielt im Allgemeinen nur eine untergeordnete
Rolle. Die mittlere tägliche Cadmiumaufnahme durch die Nahrung in Europa und den
USA wird mit 6-30 µg/Tag angegeben, in Deutschland liegt sie nach
Warenkorbanalysen bei 10-14 µg/Tag für Erwachsene (zusammengefasst in:
Satarug et al., 2003; Benemann et al., 2004). Der von der
Weltgesundheitsorganisation (WHO) vorgeschlagene PTWI (provisional tolerable
weekly intake) liegt bei 7 µg/kg Körpergewicht pro Woche (WHO, 2006). Eine
Untersuchung der tatsächlich mit der Nahrung von Kindern und Erwachsenen in
Deutschland aufgenommenen Cadmiummenge zeigt allerdings insbesondere bei
Kindern zum Teil eine Überschreitung dieses Wertes (Wilhelm et al., 2002). Das
Zigarettenrauchen stellt einen wesentlichen Beitrag zur Cadmiumbelastung für
Raucher dar, der die Aufnahme über die Nahrung übersteigen kann. So führt das
Rauchen einer Zigarette zur Inhalation von 0,1-0,2 µg Cadmium. Die
Absorptionsquote bei inhalativer Aufnahme liegt mit 40-60 % im Vergleich zur
gastrointestinalen Aufnahme von ca. 5-15 % deutlich höher (zusammengefasst in
Benemann et al., 2004). So haben Raucher im Vergleich zu Nichtrauchern eine etwa
4- bis 5-fach höhere Cadmiumkonzentration im Blut (Hoffmann et al., 2000). Die
Cadmiumgehalte der Außenluft haben meist nur geringen Einfluss auf die
Gesamtbelastung des Menschen. In einer Untersuchung in Nordrhein-Westfalen
wurde in ländlicher Gegend ein Cadmiumgehalt von 0,5 ng/m³, und in industriellem
Umfeld Gehalte von 1,5-31 ng/m³ gemessen (Wilhelm et al., 2005). Die geschätzte
tägliche Inhalation über die Atemluft in Europa beträgt in ländlichen Gebieten
0,01 µg, in industriellem Umfeld bis zu 0,4 µg (WHO, 2000). Cadmium wird nach der
Aufnahme in den Körper zunächst im Blutplasma an Albumin gebunden, dann zur
Leber und anderen Organen transportiert. In der Leber bindet es an Methallothionein
(MT), dessen Genexpression u. a. durch Cadmium induziert wird. An MT gebunden
gelangt es dann wieder in das Blut, um in der Nierenrinde globulär filtriert und von
den Tubuluszellen reabsorbiert und gespeichert zu werden. Durch Abbau von MT in
den Lysosomen wird Cd freigesetzt, welches die MT-Synthese in den Tubuluszellen
induziert und dadurch wieder gebunden wird. Seine Nephrotoxizität wird mit dem
Verhältnis von freiem zu MT-gebundenem Cd in Verbindung gebracht (Jin et al.,
1998). Nur geringe Mengen werden mit dem Urin ausgeschieden (1-2 µg pro Tag).
Die Niere ist daher neben der Leber das wichtigste Speicherorgan für Cadmium. Die
Einleitung
7
biologische Halbwertszeit der Ausscheidung aus der Niere wird mit 10-30 Jahren
angegeben (zusammengefasst in: Pinot et al., 2000; Benemann et al., 2004).
2.2.3 Genotoxizität und Kanzerogenität
Cadmium und Cadmiumverbindungen wurden von der IARC (International Agency
for Research on Cancer) als kanzerogen für den Menschen eingestuft (IARC, 1993).
Mehrere epidemiologische Studien zeigen eine deutliche Korrelation zwischen einer
Cadmiumexposition und dem vermehrten Auftreten von Lungenkrebs. Weiterhin
werden Krebserkrankungen der Prostata, der Nieren, der Leber, der Harnblase, des
Magens und des blutbildenden Systems mit einer Cadmiumexposition in Verbindung
gebracht. Auch im Tierversuch haben sich die untersuchten Cadmiumverbindungen
als kanzerogen erwiesen (zusammengefasst in Waalkes, 2003).
Die zugrunde liegenden Mechanismen der Cadmium-induzierten Kanzerogenese
sind allerdings noch weitgehend unbekannt. Als mögliche Ursachen werden neben
einer direkten genotoxischen Wirkung insbesondere indirekte Mechanismen
diskutiert. So ist Cadmium zwar kein redoxaktives Metall, verursacht jedoch
oxidativen Stress durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies. Dies konnte
bereits in verschiedenen Zelllinien gezeigt werden. Als Ursache dafür werden die
Störung antioxidativer Schutzsysteme der Zelle, wie die Absenkung des
Glutathiongehaltes oder die Hemmung von Enzymen wie Katalase oder
Superoxiddismutase (SOD) sowie die Freisetzung redoxaktiver Metalle wie Kupfer
und Eisen aus Proteinen diskutiert (zusammengefasst in Waalkes, 2003; Valko et al.,
2005; Filipic et al., 2006). In zellulären Testsystemen konnten DNA-
Einzelstrangbrüche und chromosomale Abberationen nachgewiesen werden, meist
allerdings erst in hohen Konzentrationen des Metalls (Ochi und Ohsawa, 1985; Dally
und Hartwig, 1997). Daher werden diese Mechanismen nicht als die wichtigsten
angesehen, zumal Cd(II) in bakteriellen Testsystemen als nicht mutagen und in
Säugerzellen im Allgemeinen erst in hohen Konzentrationen als schwach mutagen
gilt. Demnach scheinen indirekte Mechanismen wie veränderte Genexpression,
verstärkte Zellproliferation, unterdrückte Apoptose und die Hemmung von DNA-
Reparaturprozessen eher eine Schlüsselrolle in der Cadmium-induzierten
Kanzerogenese zu spielen (zusammengefasst in Waalkes, 2003).
So erhöht Cadmium die UVC-induzierte Mutationsrate in V79 Zellen (Hartwig und
Beyersmann, 1989) und hemmt verschiedene DNA-Reparaturmechanismen. Dabei
Einleitung
8
ist die Reparaturhemmung meist bereits bei niedrigen, nicht zytotoxischen
Konzentrationen feststellbar. Es konnte gezeigt werden, dass Cadmium in der Lage
ist, die Mismatch-Reparatur (MMR) sowohl in Hefezellen als auch in Extrakten
menschlicher Zellen in Konzentrationen ab 5 µM zu hemmen (Jin et al., 2003).
Weitere Untersuchungen in verschiedenen menschlichen Zellen geben ebenfalls
Hinweise auf eine Beeinflussung der MMR durch Cadmium (Lutzen et al., 2004;
Slebos et al., 2006).
Für die Basenexzisionsreparatur (BER) existieren mehrere Untersuchungen, die eine
Reparaturhemmung beschreiben. So konnten Dally und Hartwig (1997) eine
konzentrationsabhängige Hemmung der Reparatur oxidativer DNA-Schäden ab
0,5 µM Cadmium in HeLa Zellen feststellen. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass
Cadmium die Reparatur MMS- und MNU-induzierter DNA-Schäden in verschiedenen
menschlichen sowie in Hamsterzellen bereits ab niedrigen mikromolaren
Konzentrationen hemmt (Hartmann und Speit, 1996; Fatur et al., 2003). Für mehrere
an der BER beteiligte Enzyme liegen Ergebnisse vor, die einen direkten hemmenden
Einfluss des Metalls auf die Aktivität beschreiben. Für die bakterielle
Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase (Fpg) wird eine Hemmung ab 50 µM Cd(II)
beobachtet (Asmuss et al., 2000b). Das in Säugerzellen vorkommende homologe
Protein 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase-1 (OGG1) wird von Konzentrationen größer
als 100 µM Cd(II) gehemmt (Zharkov und Rosenquist, 2002). Darüber hinaus wird
die Expression der OGG1 in menschlichen Fibroblasten und in HeLa S3 Zellen
bereits von 10 µM Cd(II) durch Hemmung des Transkriptionsfaktors Sp1 reduziert
(Youn et al., 2005). Ein weiteres Ziel einer Cd-vermittelten Hemmung ist die AP-
Endonuklease-1 (Ape1), die in Extrakten menschlicher Zellen ab 10 µM gehemmt
wird (McNeill et al., 2004). Ein weiteres, an der BER beteiligtes Protein ist die
Poly(ADP-Ribose)-Polymerase-1 (PARP-1). In HeLa S3 Zellen konnte die Hemmung
der Poly(ADP-Ribosyl)ierung durch Cadmium nachgewiesen werden
(zusammengefasst in Hartwig et al., 2002b).
Andere Arbeiten befassen sich mit dem Einfluss von Cadmium auf die
Nukleotidexzisionsreparatur (NER). Dabei konnte eine Reparaturhemmung sowohl
UV-induzierter DNA-Schäden in menschlichen Fibroblasten und in Hamsterzellen
(Nocentini, 1987; Fatur et al., 2003) als auch BPDE-induzierter DNA-Schäden in
A549 Zellen sowie in Zellextrakten von HeLa Zellen gezeigt werden (Schwerdtle,
2002; Mukherjee et al., 2004). Bereits 0,5 µM Cd(II) beeinträchtigt in Zellextrakten
Einleitung
9
von HeLa Zellen die DNA-Protein-Wechselwirkung von an der Schadenserkennung
beteiligten Proteinen (Hartmann und Hartwig, 1998). Asmuss et al. (2000a) konnten
eine Hemmung der Bindung des XPA-Proteins an UV-geschädigte Oligonukleotide
ab 100 µM Cd(II) feststellen, die durch Zugabe von Zn(II) größtenteils wieder
aufgehoben wurde. In Untersuchungen an einem synthetisierten Peptid, das die
Zinkfingerdomäne des XPA-Proteins repräsentiert, konnte der Austausch von Zn(II)
durch Cd(II) gezeigt werden (Kopera et al., 2004). Somit stellen Zink-bindende
Proteinstrukturen wie zum Beispiel Zinkfingermotive ein mögliches Ziel für die
Interaktion mit Cadmium auf molekularer Ebene dar.
2.3 RNA-Interferenz
Bei der RNA-Interferenz (RNAi) handelt es sich um eine Methode zur gezielten
Hemmung der Genexpression, die erstmals von Fire et al. (1998) beschrieben wurde.
RNA-Interferenz beruht auf einem evolutionär konservierten Mechanismus, der mit
gewissen Unterschieden bei allen eukaryotischen Organismen vorhanden ist
(Hannon, 2002). Den Mechanismus der RNAi kann man sich wie folgt vorstellen
(Abbildung 1): doppelsträngige RNA (dsRNA) wird im Zytoplasma durch ein Dicer
genanntes Enzym, eine Nuklease aus der RNase III Familie, in kleine, etwa 21-23
Nukleotide (nt) große Fragmente mit jeweils 2 nt Überhängen an den 3’-Enden
gespalten (Bernstein et al., 2001). Diese doppelsträngigen RNA-Fragmente werden
als „short interfering RNA“ (siRNA) bezeichnet. Sie werden durch einen
Proteinkomplex, den so genannten „RNA-induced silencing complex“ (RISC)
gebunden. Anschließend wird der so genannte sense- oder Begleit-Strang der siRNA
durch eine Untereinheit des RISC, die Endonuklease Argonaute 2 (AGO2), gespalten
(Matranga et al., 2005; Rand et al., 2005). So entsteht ein aktiver RISC-Komplex, der
den so genannten antisense- oder Leit-Strang der siRNA enthält und dadurch in der
Lage ist, an komplementäre mRNA zu binden und diese mit Hilfe von AGO2 zu
spalten. Diese Spaltung der Ziel-mRNA erfolgt zwischen Base 10 und 11 relativ zum
5’-Ende des siRNA Leit-Strangs und führt im weiteren Verlauf zum Abbau der
gespaltenen mRNA durch zelluläre Exonukleasen (Elbashir et al., 2001; Orban und
Izaurralde, 2005). Somit steht die Ziel-mRNA für die Proteinsynthese nicht mehr zur
Verfügung. Der aktive RISC-Komplex kann noch mehrfach weitere mRNA spalten,
dadurch ist eine deutliche Reduktion des Transkripts zu erreichen. Dieser Effekt der
Einleitung
10
verringerten Genexpression auf post-transkriptioneller Ebene wird auch als knock-
down bezeichnet. Die Anwendung dieser Methode zum gezielten Ausschalten von
Genen bei Säugerzellen scheiterte zunächst daran, dass durch das Einbringen von
langer, doppelsträngiger RNA in die Zellen unspezifische Reaktionen ausgelöst
werden, die zur Ausschüttung von Interferonen, der Blockade der Proteinsynthese
und dem unspezifischen Abbau von RNA führen können (Kumar und Carmichael,
1998; Gil und Esteban, 2000). Erst die Entdeckung, dass der direkte Einsatz von
siRNA zu einer Inaktivierung von Genen unter Umgehung einer Interferon-
Ausschüttung führt, ermöglichte die Anwendung der RNAi in Säugerzellen (Elbashir
et al. 2001).
siRNA
RISC
mRNA-Spaltung
mRNA
Spaltung des sense-
oder Begleit-Strangs
antisense- oder
Leit-Strang
Bindung an komplementäre mRNA
siRNA
RISC
mRNA-Spaltung
mRNA
Spaltung des sense-
oder Begleit-Strangs
antisense- oder
Leit-Strang
Bindung an komplementäre mRNA
Abbildung 1: Vereinfachtes Schema der RNA-Interferenz.
Neben der Anwendung von siRNA zur gezielten vorübergehenden (transienten)
Herunterregulierung von Genen hat die Verwendung von DNA-Konstrukten, die für
siRNA kodieren zur Schaffung von Zelllinien mit stabil inaktivierten Genen
mittlerweile breite Anwendung gefunden. Für diesen Zweck werden neben viralen
Vektoren oft auch Plasmide eingesetzt (zusammengefasst in McManus und Sharp,
2002). Dabei werden die DNA-Konstrukte häufig so gewählt, dass als primäres
Transkript zunächst eine haarnadelförmige, so genannte short hairpin RNA (shRNA)
Einleitung
11
entsteht. Diese wird durch Dicer zu typischen siRNA mit jeweils 2 nt Überhängen an
den 3’-Enden prozessiert (Abbildung 2).
5´
3´
siRNA
19-21 nt
5´
3´
short hairpin RNA
Dicer
5´
3´
siRNA
19-21 nt
5´
3´
short hairpin RNA
Dicer
Abbildung 2: Prozessierung von short hairpin RNA zu siRNA durch Dicer.
Neben dem geschilderten Mechanismus der RNAi existieren noch weitere, eng
verwandte zelluläre Regulationsmechanismen. Während sich die siRNA durch
perfekte Komplementarität zur Ziel-mRNA und durch deren Spaltung auszeichnen,
führen die so genannten microRNA (miRNA) durch partielle Komplementarität mit der
Ziel-RNA zur Hemmung der Translation und dem nachfolgenden Abbau der RNA
(zusammengefasst in Kim und Rossi, 2007). In Säugerzellen wurden bereits über
200 endogene miRNA identifiziert, die regulatorische Funktionen in der
Differenzierung und Entwicklung sowie in physiologischen Prozessen besitzen sollen
(Ambros, 2004; Bartel, 2004). Darüber hinaus wird die Beteiligung von RNAi-
Prozessen an epigenetischen Regulationsmechanismen wie DNA- und Histon-
Methylierung diskutiert (Matzke und Birchler, 2005).
Neben der RNA-Interferenz existieren noch weitere Methoden der gezielten
Hemmung der Genexpression. Dies ist zum einen die Gen-Inaktivierung durch
homologe Rekombination, bei der durch gezieltes Unterbrechen eines Exons meist
durch einen Selektionsmarker die weitere Expression des Gens verhindert wird. Es
wird kein funktionelles Protein mehr gebildet und man spricht von so genannten
Einleitung
12
knock-out Zellen bzw. Organismen (Mülhardt, 2003). Zum anderen gibt es weitere
Inhibitoren auf Nukleinsäure-Basis, die als Antisense-Oligonukleotide durch sterische
Hinderung die Translation hemmen oder über RNAse H die Ziel-mRNA spalten, und
als Ribozyme oder DNAzyme enzymatische Aktivität besitzen und spezifisch ihre
Ziel-RNA spalten (zusammengefasst in Scherer und Rossi, 2003).
Mehrere Arbeiten haben sich mit dem Methodenvergleich zwischen RNAi und
Antisense-Techniken beschäftigt. Dabei stellten sich die verwendeten siRNA in
Zellkulturversuchen als die effizientesten der untersuchten Agenzien dar (Bertrand et
al., 2002; Grunweller et al., 2003).
Verschiedene Arbeitsgruppen haben sich mit der Anwendung der RNAi zur
Herunterregulierung des Tumorsuppressorproteins p53 beschäftigt. Dabei sind
sowohl siRNA zum transienten knock-down als auch Vektorsysteme zur stabilen
Hemmung der p53-Genexpression in Säugerzellen zum Einsatz gekommen (Barton
und Medzhitov, 2002; Brummelkamp et al., 2002; Liu et al., 2004; He et al., 2005;
Menendez und Lupu, 2005; Troester et al., 2006).
2.4 DNA-Schäden und ihre Reparatur
Die in dieser Arbeit angewendete Schädigung der DNA erfolgte zum einen mit UVC-
Strahlung und zum anderen mit dem reaktiven Benzo[a]pyren-Metaboliten
(+)-anti-Benzo[a]pyrendiolepoxid (BPDE). Im Folgenden wird daher zunächst auf
UVC- und BPDE-induzierte DNA-Schäden näher eingegangen, um dann auf den für
ihre Reparatur wichtigsten Mechanismus, die Nukleotidexzisionsreparatur
überzuleiten.
2.4.1 UV-induzierte DNA-Schäden
Die Sonne ist die Hauptquelle für die menschliche Exposition gegen UV-Strahlung.
UV-Strahlung kann in drei Wellenlängenbereiche eingeteilt werden. UVA umfasst die
Wellenlängen von 400 bis 315 nm, UVB die von 315 bis 280 nm und UVC schließt
den Bereich zwischen 280 und 100 nm ein. Umweltrelevant sind nur UVA und UVB
mit einem Anteil von 95 bzw. 5 % der auf der Erde ankommenden solaren UV-
Strahlung, da UVC praktisch vollständig von der Ozonschicht absorbiert wird. Das
Spektrum der durch UV-Strahlung induzierten DNA-Schäden variiert mit der
Wellenlänge. Dabei handelt es sich bei den durch UVA-Strahlung induzierten
Einleitung
13
Schäden hauptsächlich um oxidative Basenschäden, während UVB überwiegend
und UVC fast ausschließlich DNA-Photoprodukte induziert. Da das
Absorptionsmaximum der DNA bei 260 nm liegt und somit durch Bestrahlung mit
UVC eine effiziente photochemische Reaktion stattfindet, wird in vielen Studien UVC-
Strahlung angewendet. UVC-Strahlung (254 nm) führt hauptsächlich durch
[2+2]-Cycloaddition benachbarter Pyrimidine zur Bildung von zwei Produkten, zum
einen von Cyclobutanpyrimidindimeren (CPD), die mit ca. 75 % den Hauptteil der
Photoprodukte ausmachen und zum anderen von (6-4)-Photoprodukten (6-4-PP) mit
einem Anteil von 24 % (Abbildung 3). Beide Läsionen sind zytotoxisch und können
zu Mutationen führen (zusammengefasst in: IARC, 1992; Ravanat et al., 2001;
Brendler-Schwaab et al., 2004).
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
UVC
A
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
OH
N
N
HO
UVC
B
DNA DNA DNA DNA
DNADNA DNA
DNA
DNA DNA
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
UVC
A
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
N
NH
O
O
OH
N
N
HO
UVC
B
DNA DNA DNA DNA
DNADNA DNA
DNA
DNA DNA
Abbildung 3: Bildung von (A) Cyclobutanpyrimidindimeren und (B) 6-4-Photo-
produkten (Ravanat et al., 2001).
2.4.2 BPDE-induzierte DNA-Schäden
Polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) gehören zu den bedeutendsten
Umweltschadstoffen, denen der Mensch tagtäglich ausgesetzt ist. Sie sind ubiquitär
in der Umwelt verbreitet und entstehen überwiegend durch unvollständige
Verbrennung organischer Substanzen. Im Körper werden sie zu elektrophilen
Derivaten metabolisiert, die mit Purinbasen der DNA kovalente Addukte bilden
können. Die Kanzerogenität vieler zu den PAK gehörender Verbindungen ist
Einleitung
14
bekannt, wobei Benzo[a]pyren (B[a]P) in der Gruppe der PAK zu den stärksten
Kanzerogenen zählt. Die wichtigsten Expositionsquellen sind, abgesehen von einer
beruflichen Exposition, Tabakrauch und Lebensmittel. 70 % der täglichen B[a]P-
Aufnahme erfolgen für einen beruflich nicht exponierten Nichtraucher über die
Nahrung, insbesondere durch Gemüse, Fisch und Fleisch (zusammengefasst in
Phillips, 1999).
B[a]P ist gut resorbierbar und wird im menschlichen Metabolismus zu einer Vielzahl
reaktiver Verbindungen umgewandelt (Abbildung 4). Für die kanzerogene Wirkung
von B[a]P ist vermutlich der relevanteste Reaktionsweg die Bildung des Metaboliten
(+)-anti-BPDE ((+)-r-7,t-8-dihydroxy-t-9,10-epoxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren),
der mit der DNA vor allem kovalente N2-Guaninaddukte bildet. Diese inhibieren durch
die partielle Verzerrung der DNA die Replikation und Transkription und können zu
Mutationen führen (zusammengefasst in Conney et al., 1994; Melendez-Colon et al.,
1999). B[a]P wirkt durch weitere Abbauwege in der Zelle, bei denen reaktive
Sauerstoffspezies (ROS) entstehen, zusätzlich zytotoxisch. Gebildete Dihydrodiole
werden durch eine Dehydrogenase in Katechole umgewandelt, welche schnell zu
Semichinonradikalen und o-Chinonen autoxidieren können. An der Autoxidation ist
das Superoxidradikalanion beteiligt. Durch nichtenzymatische Reduktion über
NADPH oder enzymatische Ein-Elektronen-Reduktion werden immer wieder
Katechole gebildet, die dann wieder oxidiert werden (zusammengefasst in Bolton et
al., 2000). Ein weiterer Weg führt über die Bildung eines Radikal-Kations an der C6-
Position des B[a]P. Diese Radikale können an der N7- oder C8-Position von
Purinbasen instabile DNA-Addukte bilden, die in AP-Stellen resultieren, welche
ebenfalls mutagenes Potential besitzen können (zusammengefasst in Cavalieri und
Rogan, 1995). Die Radikale können auch zu 6-Hydroxy-B[a]P hydrolysiert werden,
welches zu erweiterten Chinonen autoxidieren kann, die wiederum zu Semichinonen
reduziert werden. Nach erneuter Autoxidation können wieder ROS gebildet werden
(Joseph und Jaiswal, 1994).
Einleitung
15
HO
OH
Cytochrom P450
o
O
O
Epoxidhydrolasen Cytochrom P450
Benzo[a]pyren (+)-anti-BPDE
N²-Guaninaddukt
O
2
erweiterte
Chinone
Semichinone
ROS
Autoxidation
Reduktion
Hydrolyse
Autoxidation
Cytochrom P450
(Ein-Elektronen-Oxidation)
instabile
DNA-Addukte
Dihydrodiol-Dehydrogenase
Katechol
Semichinonradikalanion
o-Chinon
instabile
DNA-Addukte
NAD(P)
+
HO
HO
O
HO
HO
•
+
8
10
12 1
3
7 6
9
HO
NH
N
NH
N
N
O
DNA
HO
HO
O
2
-•
O
2
-•
H
2
O
2
NAD(P)H
O
O
-
HO
OH
HO
OH
Cytochrom P450
oo
O
O
Epoxidhydrolasen Cytochrom P450
Benzo[a]pyren (+)-anti-BPDE
N²-Guaninaddukt
O
2
erweiterte
Chinone
Semichinone
ROS
Autoxidation
Reduktion
Hydrolyse
Autoxidation
Cytochrom P450
(Ein-Elektronen-Oxidation)
instabile
DNA-Addukte
Dihydrodiol-Dehydrogenase
Katechol
Semichinonradikalanion
o-Chinon
instabile
DNA-Addukte
NAD(P)
+
HO
HO
HOHO
HO
O
HO
HO
•
+
••
+
8
10
12 1
3
7 6
9
8
10
12 1
3
7 6
9
10
12 1
3
7 6
9
12 1
3
7 6
9
HO
NH
N
NH
N
N
O
DNA
HO
HO
O
2
-•
O
2
-•
O
2
-•
O
2
-•
H
2
O
2
NAD(P)H
O
O
-O
O
-O
O
O
O
-
Abbildung 4: Schema des B[a]P-Metabolismus (erstellt nach: Conney et al., 1994;
Cavalieri und Rogan, 1995; Bolton et al., 2000).
2.4.3 DNA-Reparaturprozesse
Die DNA ist fortlaufend den Einwirkungen von endogenen und exogenen
schädigenden Agenzien ausgesetzt, die die Integrität des Genoms gefährden
können. DNA-Reparaturprozesse gehören zu den wichtigsten zellulären
Mechanismen zur Aufrechterhaltung der genomischen Stabilität. In Säugerzellen
existieren mehrere wichtige Wege zur Reparatur verschiedener Arten von DNA-
Schäden. Dies sind zum einen die Mechanismen zur Reparatur von
Doppelstrangbrüchen, das nichthomologe End-Joining (NHEJ) und die homologe
Rekombination (HR), sowie zum anderen die Basenexzisionsreparatur (BER), die
Nukleotidexzisionsreparatur (NER) sowie die Mismatch- oder
Basenfehlpaarungsreparatur (MMR).
Doppelstrangbrüche gehören zu den für die Zelle besonders schwerwiegenden DNA-
Läsionen. Sie entstehen u. a. durch ionisierende Strahlung. Die BER ist der
Einleitung
16
wichtigste Mechanismus zur Reparatur von Basenschäden, wie sie durch
Alkylierungsmittel, aber auch durch endogen gebildete reaktive Sauerstoffspezies
(ROS) entstehen können. Darüber hinaus werden auch AP-Stellen durch die BER
repariert. Zur Reparatur UV-induzierter Pyrimidin-Photoaddukte sowie durch
mutagene Umweltschadstoffe verursachte großräumige DNA-Addukte ist die NER
der entscheidende Weg. Die MMR ist verantwortlich für die Reparatur von
Basenfehlpaarungen sowie von Polymerasen eingefügte Nukleotid-Insertionen und -
Deletionen wie sie bei der Replikation entstehen können (zusammengefasst in
Schärer, 2003). Im Folgenden soll näher auf die NER eingegangen werden, da sie im
Mittelpunkt der Untersuchungen in dieser Arbeit steht.
2.4.3.1 Nukleotidexzisionsreparatur
Die Nukleotidexzisionsreparatur (NER) gilt als der wichtigste Reparaturweg für
großräumige DNA-Schäden, wie sie durch Umweltmutagene wie zum Beispiel durch
polyzyklische aromatische Kohlenwasserstoffe (PAK) oder durch UV-Strahlung
entstehen können. Dabei unterscheidet man zwischen der globalen genomischen
Reparatur (GGR), die im gesamten Genom aktiv ist, und der
transkriptionsgekoppelten NER (TCR), die sich nur auf den transkribierten DNA-
Strang aktiver Gene bezieht. Beide Pfade unterscheiden sich vor allem in der
Schadenserkennung. Insgesamt sind an der NER etwa 30 Proteine beteiligt, wobei
noch nicht alle Einzelheiten dieses komplexen Mechanismus aufgeklärt sind. Eine
grobe Gliederung kann in die Schritte der Schadenserkennung, DNA-Entwindung,
Inzision und Entfernung der Läsion, Reparatursynthese und Ligation vorgenommen
werden.
Defekte in den NER-Genen können beim Menschen zu schwerwiegenden
Krankheitsbildern führen. So führt die autosomal-rezessive Erkrankung Xeroderma
Pigmentosum (XP), die sich je nach betroffenem Gen in die
Komplementationsgruppen XPA bis XPG sowie XPV unterteilen lässt, zu extremer
Sonnenlichtempfindlichkeit und einer Prädisposition für Hautkrebs.
Immunfluoreszenzmikroskopische Untersuchungen nach lokaler UV-Bestrahlung
menschlicher Fibroblasten führten zu folgendem Modell (Abbildung 5) für die Bildung
des NER-Inzisionskomplexes (Volker et al., 2001).
Einleitung
17
Abbildung 5: Bildung des Inzisionskomplexes in der NER (GGR) (Volker et al., 2001).
Die Schadenserkennung bei der GGR erfolgt zunächst durch einen Proteinkomplex
aus XPC und hHR23B. Dieser erkennt die durch eine DNA-Läsion hervorgerufene
helikale Verzerrung und rekrutiert weitere Proteine zum Schaden. Dies ist zunächst
der Transkriptionsfaktor TFIIH, der aus mehreren Untereinheiten, darunter die
Helikasen XPB und XPD, besteht. Nach der lokalen Entwindung der DNA lokalisieren
die 3’-Endonuklease XPG, der Proteinkomplex XPA-RPA und schließlich die 5’-
Endonuklease ERCC1-XPF an die Schadensstelle. Dabei ist zwar die Anlagerung
von XPG im Gegensatz zu ERCC1-XPF unabhängig von XPA, allerdings gilt XPA zur
Aktivierung der Endonukleaseaktivität von XPG als essentiell. XPA-RPA wird eine
besondere Rolle in der Schadensverifizierung und in der Positionierung der
Endonukleasen zugesprochen. Anschließend erfolgt die Doppelinzision und ein
Oligonukleotid von 25-32 nt wird freigesetzt, die entstandene Lücke durch
Reparatursynthese der Polymerasen δ und ε sowie PCNA und RFC aufgefüllt und
mittels DNA-Ligase I verschlossen (zusammengefasst in: Friedberg, 2001; Schärer,
2003).
Einleitung
18
Im Zusammenhang mit UV-induzierten DNA-Schäden konnte gezeigt werden, dass
weitere Faktoren an der Schadenserkennung beteiligt sind. Das damaged DNA
binding protein (DDB) mit seinen Untereinheiten DDB1 (p127) und DDB2 (p48) ist für
die Bindung von XPC an CPD notwendig (Fitch et al., 2003b). 6-4-PP führen im
Vergleich zu CPD zu einer stärkeren DNA-Helixverzerrung und können von XPC
vermutlich direkt erkannt werden (Sugasawa et al., 2002). In einer weiteren Arbeit
konnte allerdings gezeigt werden, dass in menschlichen Fibroblasten durch DDB
auch die Reparatur von 6-4-PP deutlich beschleunigt wird (Moser et al., 2005). Im
Anschluss an die Assoziation an den DNA-Schaden wird p48 ubiquitiniert und über
das Proteasom abgebaut, möglicherweise um den Zugang für XPC und die anderen
Faktoren an die DNA zu ermöglichen (Rapic-Otrin et al., 2002).
Für die TCR verläuft die Schadenserkennung unabhängig von XPC durch eine
Transkriptionshemmung der RNA-Polymerase II (RNA-Pol II) am DNA-Schaden, die
dann zur Assoziation weiterer Reparaturproteine führt. Somit ist es wahrscheinlich,
dass RNA-Pol II die Rolle von XPC/hHR23B in der Schadenserkennung der TCR
übernimmt. Weitere Proteine wie CSA, CSB und XAB2 sind im Gegensatz zur GGR
direkt an der TCR beteiligt. Generell gilt die TCR als der schnellere und effizientere
Reparaturpfad im Vergleich zur GGR (zusammengefasst in Mellon, 2005).
2.5 Das Tumorsuppressorprotein p53
2.5.1 Struktur und Funktion
Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt eine zentrale Rolle in der Aufrechterhaltung
der genomischen Stabilität. Es ist an wichtigen zellulären Prozessen wie der
Apoptose, der Zellzyklusregulation und der DNA-Reparatur beteiligt und wird auch
als „Hüter des Genoms“ bezeichnet (Lane, 1992). Diese besondere Funktion wird
auch dadurch verdeutlicht, dass etwa 50 % aller menschlichen Primärtumoren
Mutationen im p53-Gen aufweisen, die zu einem funktionell inaktiven Protein führen
(Hollstein et al., 1991).
Das Protein p53 besitzt ein Molekulargewicht von 53 kDa, besteht aus 393
Aminosäuren und gehört zu einer Proteinfamilie, der mit p63 und p73 zwei strukturell
und funktionell verwandte Proteine angehören (D'Erchia et al., 2003). Das p53-
Protein lässt sich in mehrere strukturelle und funktionelle Domänen unterteilen
(Abbildung 6).
Einleitung
19
100 200 300
NES
Transaktivierung
DNA-Bindung
Tetramerisierung
NES
NLS
MDM2-
Bindung
NLS
NLS
N C
Regulatorische
Domäne
100 200 300
NES
Transaktivierung
DNA-Bindung
Tetramerisierung
NES
NLS
MDM2-
Bindung
NLS
NLS
N C
Regulatorische
Domäne
100 200 300
NES
Transaktivierung
DNA-Bindung
Tetramerisierung
NES
NLS
MDM2-
Bindung
NLS
NLS
N C
Regulatorische
Domäne
Abbildung 6: Struktur des p53-Proteins. NES: Kernexportsignal, NLS: Kernlokalisierungs-
signal (modifiziert nach Michael und Oren, 2003).
An die N-terminale Transaktivierungs-Domäne binden Proteine, die die Fähigkeit von
p53 als Transkriptionsfaktor zu wirken, regulieren. Das wichtigste Regulationsprotein
ist MDM2, das als E3-Ubiquitin-Ligase am Abbau von p53 beteiligt ist. Ubiquitin (Ub)
ist ein 8 kDa Protein, das über einen mehrstufigen enzymatischen Prozess an
Lysinreste von Proteinen kovalent gebunden wird. In Form von poly-Ub-Ketten stellt
es ein Signal für den proteasomalen Abbau des modifizierten Proteins dar. Das 26S-
Proteasom ist ein Proteinkomplex, der für den Abbau von polyubiquitinierten
Proteinen verantwortlich ist (zusammengefasst in Haglund und Dikic, 2005). Dieser
Regulationsmechanismus führt in normalen, ungestressten Zellen zu einer p53-
Halbwertszeit von etwa 20 min. In Folge von verschiedenen Stressfaktoren kommt es
jedoch zu Phosphorylierungen am N-Terminus die eine Bindung von MDM2
behindern und so zur Stabilisierung von p53 führen. Die DNA-Bindungsdomäne von
p53 ist verantwortlich für die sequenzspezifische Bindung an DNA, wodurch das
Protein seine Funktion als Transkriptionsfaktor ausüben kann. Die Mehrzahl der
bekannten Mutationen im p53-Gen ereignet sich in der zentralen DNA-bindenden
Domäne und führt zu einem Verlust der DNA-Bindungsfähigkeit. Die C-terminale
Region enthält weitere Funktionsbereiche: ein Kernexportsignal und drei
Kernlokalisierungssignale regulieren die subzelluläre Lokalisierung des
Tumorsuppressorproteins und die Tetramerisierungsdomäne, die für die Bildung der
transkriptionell aktiven tetrameren Form von p53 verantwortlich ist. Durch
Tetramerisierung wird das Kernexportsignal maskiert und p53 akkumuliert im
Einleitung
20
Zellkern. Acetylierung im C-terminalen Bereich verstärkt die sequenzspezifische
DNA-Bindungsfähigkeit. Das durch Phosphorylierung und Acetylierung aktivierte
Protein ist als Transkriptionsfaktor in die Regulation einer Reihe wichtiger zellulärer
Prozesse wie Apoptose, Zellzykluskontrolle und DNA-Reparatur involviert, wodurch
sich seine Funktion als Tumorsuppressorprotein erklären lässt. Dabei bindet p53 als
Tetramer an so genannte p53-responsive Elemente in der Promotorregion seiner
Zielgene und führt zu deren Transkription. Zu den Genprodukten die p53-abhängig
transkribiert werden gehört auch MDM2, so dass sich eine Selbstregulation ergibt. Es
gibt allerdings auch Beispiele p53-vermittelter Transkriptionshemmung, deren
Mechanismus allerdings noch wenig verstanden wird (zusammengefasst in: Hainaut
und Hollstein, 2000; Stewart und Pietenpol, 2001; Collot-Teixeira et al., 2004).
Von zentraler struktureller Bedeutung für das p53-Protein ist seine Zink-bindende
Region als Teil der DNA-bindenden Domäne. Dabei wird ein Zinkion von drei
Cystein- und einem Histidinrest komplexiert. Dieses Strukturmotiv stellt dabei keinen
klassischen Zinkfinger, wie er in anderen Transkriptionsfaktoren vorliegt, dar.
Vielmehr stabilisiert die Zinkbindung die Tertiärstruktur von p53 und ermöglicht
dadurch die Bindung an die kleine Furche der DNA. Die Koordination von Zink ist
essentiell für die korrekte Faltung und die sequenzspezifische DNA-
Bindungsfähigkeit. Wird Zink aus der Proteinstruktur entfernt, resultiert eine so
genannte „mutante“ Konformation des p53, mit teilweise entfalteter DNA-bindender
Domäne die ihre DNA-Bindungsfähigkeit verloren hat (zusammengefasst in Hainaut
und Mann, 2001).
2.5.2 Bedeutung von p53 in der NER
In Folge von DNA-Schäden kommt es zu einer Aktivierung von p53 als
Transkriptionsfaktor. Zu den durch p53 transkriptionell regulierten Genprodukten
zählen auch die an der NER-Schadenserkennung beteiligten Proteine XPC und p48
(DDB2) (Hwang et al., 1999; Adimoolam und Ford, 2002). Mehrere Untersuchungen
an verschiedenen Zelllinien belegen einen Zusammenhang zwischen der Reparatur
UV-induzierter DNA-Photoprodukte und dem p53-Status der Zellen. Dabei stellte sich
heraus, dass der Verlust von funktionell aktivem p53 selektiv die globale
Genomreparatur (GGR) hemmt, während die transkriptionsgekoppelte Reparatur
(TCR) unbeeinflusst bleibt (zusammengefasst in Adimoolam und Ford, 2003).
Weitergehende Untersuchungen führten zu der Erkenntnis, dass vor allem die
Einleitung
21
Reparatur von CPD und weniger die Reparatur von 6-4-PP von der Hemmung
betroffen ist (Adimoolam et al., 2001). Aus diesen Beobachtungen entwickelte sich
ein Modell, wonach die Funktion von p53 in der NER in erster Linie auf seine
Funktion als Transkriptionsfaktor für die an der Schadenserkennung in der GGR
verantwortlichen Proteine XPC und p48 zurückzuführen ist (zusammengefasst in
Ford, 2005). Da die Schadenserkennung in der TCR über RNA-Pol II vermittelt wird,
ist hier auch kein Einfluss von p53 feststellbar. Darüber hinaus wird eine direkte
Beteiligung von p53 am so genannten Chromatin-Remodelling diskutiert. Zur
effizienten Schadenserkennung muss die Zugänglichkeit der DNA für die NER-
Proteine gegeben sein. Dazu müssen reversible Strukturveränderungen des
Chromatins erfolgen, an denen p53 möglicherweise direkt beteiligt ist (Rubbi und
Milner, 2003; Allison und Milner, 2004).
Ein ähnlicher Einfluss auf die Reparatur konnte auch nach Induktion von DNA-
Addukten durch Benzo[a]pyrendiolepoxid (BPDE) und Benzo[g]chrysendiolepoxid
(B[g]CDE) festgestellt werden. Mehrere Untersuchungen im Zellkulturmodell zeigten
die Abhängigkeit der GGR dieser Addukte von funktionell aktivem p53, wohingegen
die TCR BPDE-induzierter DNA-Addukte nahezu unbeeinflusst blieb (Lloyd und
Hanawalt, 2000; Wani et al., 2000; Lloyd und Hanawalt, 2002; Wani et al., 2002).
2.5.3 Bedeutung von p53 in der Zellzykluskontrolle
Der Zellzyklus ist der strikt regulierte Ablauf zellulärer Vorgänge von einer Zellteilung
bis zur nächsten. Er gliedert sich in Interphase und Mitose (M)-Phase. Zur Interphase
zählen die Ruhephase G0, die G1- und die G2-Phase in der die Synthese von mRNA
und Proteinen für die jeweils nächste Phase stattfindet sowie die dazwischen
liegende S-Phase, in der die DNA repliziert wird.
Der Ablauf des Zellzyklus wird durch Cycline, Cyclin-abhängige Kinasen (Cdk) und
Cdk-Inhibitoren (CDKI) reguliert. Bisher sind 8 verschiedene Cycline (Cyclin A-H)
bekannt, die in den Ablauf des Zellzyklus involviert sind. Die meisten Cycline zeigen
im Verlauf des Zellzyklus starke Veränderungen in ihrer mRNA- und
Proteinexpression. Cdk werden durch Bindung an verschiedene Cycline aktiviert und
haben auch eine Funktion in der Regulation der Transkription. Bislang sind
mindestens 11 verschiedene Cdk identifiziert (Cdk 1-11). Cyclin-Cdk-Komplexe sind
heterodimere Serin/Threonin-Proteinkinasen, die ihrerseits durch Phosphorylierung
und Dephosphorylierung in ihrer Aktivität reguliert werden. Aktive Cyclin-Cdk-
Einleitung
22
Komplexe phosphorylieren eine ganze Reihe von Substraten, wodurch der Ablauf
des Zellzyklus gesteuert wird. Zu den CDKI gehören zum einen die Proteine der
INK4-Familie (inhibitor of Cdk4) und zum anderen die Proteine der CIP/KIP-Familie
(Cdk interacting protein/kinase inhibitor protein) (zusammengefasst in: Harper und
Brooks, 2005; Malumbres und Barbacid, 2005).
In Folge von DNA-Schäden kann der Zellzyklus an so genannten DNA-Schaden-
bzw. Zellzyklus-Kontrollpunkten verzögert oder angehalten werden. Solche
Kontrollpunkte (Checkpoints) existieren am G1-S-Übergang, in der S-Phase und am
G2-M-Übergang. Die Kontrollpunkte erhalten die Integrität des Genoms indem sie die
Replikation geschädigter DNA und Mitosestörungen verhindern (Iliakis et al., 2003).
Die Rolle von p53 im Zellzyklusarrest am G1-S-Übergang ist recht gut verstanden. In
Folge von DNA-Schäden kommt es über Signalkaskakaden zur Aktivierung von p53
als Effektor-Protein. Diese komplexen Signalkaskaden, die über Sensoren,
Mediatoren und Transduktoren zu den Effektoren verlaufen, sind bislang nur zum Teil
aufgeklärt. Als Sensor wird zum Beispiel ein Proteinkomplex aus Rad9, Rad1 und
Hus1 (9-1-1-Komplex) diskutiert, der ähnlich wie PCNA als ringförmiger Komplex an
der DNA entlang gleiten soll. Dabei wird er von einem Rad17-RFC-Komplex
unterstützt. Als Mediatoren fungieren u. a. Proteine mit einer BRCT-Domäne, wie sie
in BRCA1 vorkommt. Als Transduktoren spielen die Proteine ATM (ataxia
teleangiectasia mutated) und ATR (ATM and Rad3-related) eine entscheidende
Rolle, die als Protein-Kinasen direkt oder indirekt über die Aktivierung der
Checkpoint-Kinasen Chk1 und Chk2 eine Vielzahl von Substraten phosphorylieren.
Zu diesen Effektoren gehört auch das Tumorsuppressorprotein p53
(zusammengefasst in: Abraham, 2001; Niida und Nakanishi, 2006). Aktiviertes p53
führt als Transkriptionsfaktor zur verstärkten Expression von p21, das als CDKI der
CIP/KIP-Familie an Cyclin D-Cdk4-Komplexe bindet und diese inhibiert. Dadurch wird
die Phosphorylierung des Tumorsuppressorproteins pRb verhindert, es bleibt an
Transkriptionsfaktoren der E2F-Familie gebunden und hemmt die Expression von
Genen, die für den Übergang in die S-Phase notwendig sind (Harper und Brooks,
2005). Darüber hinaus kann p21 durch Bindung an PCNA auch die Replikation
hemmen (Waga et al., 1994).
Im Gegensatz dazu wird der Kontrollpunkt in der S-Phase als unabhängig von p53
oder p21 beschrieben (Iliakis et al., 2003). Abhängig von der Schadensinduktion
werden verschiedene Signalwege diskutiert, die zum einen über ATM und Chk2 und
Einleitung
23
zum anderen über ATR und Chk1 zum Ubiquitin-vermittelten Abbau der Phosphatase
Cdc25A und dadurch zur Hemmung der Cyclin E/A-Cdk2-Aktivierung, die für ein
Fortschreiten der Replikation notwendig ist, führen (Heffernan et al., 2002). Zudem
wird über die Beteiligung weiterer Faktoren wie BRCA1, SMC1 und des NRM-
Komplexes (Nbs1, Rad50, Mre11) berichtet (zusammengefasst in Qin und Li, 2003).
Der G2-M-Übergang wird vor allem durch den Cyclin B-Cdk1-Komplex reguliert, der
durch die Phosphatase Cdc25C dephosphoryliert und dadurch aktiviert wird. Die
Signalkaskade am G2-M-Kontrollpunkt verläuft über ATM und Chk2 bzw. ATR und
Chk1, die durch Phosphorylierung von Cdc25C dessen Phosphataseaktivität
hemmen. Zusätzlich kann das 14-3-3-Protein an phosphoryliertes Cdc25C binden
und es im Zytoplasma festhalten. Außerdem führt 14-3-3 zur Inaktivierung von Cdk1.
Weiterhin ist p21 an diesem Kontrollpunkt beteiligt, indem es durch Hemmung der
CAK (Cdk-aktivierende Kinase) die Aktivierung von Cyclin B-Cdk1 verhindert. Zudem
soll GADD45 durch Bindung an Cdk1 die Aktivität des Cyclin B-Cdk1-Komplexes
hemmen. Der Einfluss von p53 auf den G2-M-Kontrollpunkt besteht in seiner Form
als transkriptioneller Aktivator für p21, 14-3-3σ und GADD45. Darüber hinaus soll
p53 die Transkription von Cdk1 und Cyclin B hemmen (zusammengefasst in: Iliakis
et al., 2003; Collot-Teixeira et al., 2004; Harper und Brooks, 2005).
Fragestellung
24
3 Fragestellung
Das Tumorsuppressorprotein p53 spielt eine wichtige Rolle in der Aufrechterhaltung
der genomischen Stabilität. Als Transkriptionsfaktor ist p53 an der Regulation
zentraler zellulärer Mechanismen beteiligt, darunter sind Apoptose,
Zellzykluskontrolle und DNA-Reparatur. Mutationen von p53 sind eng verknüpft mit
der Entstehung von Krebserkrankungen. In mehr als 50 % der menschlichen
Primärtumoren ist p53 mutiert und dadurch in seiner Funktion gestört. Strukturelle
und funktionelle Veränderungen des Proteins können auch durch
Metallverbindungen induziert werden, wie es zum Beispiel für Cadmiumverbindungen
bereits gezeigt wurde. Cadmiumverbindungen gelten als kanzerogen für den
Menschen, die genauen Ursachen dafür sind allerdings noch nicht vollständig
aufgeklärt. Eine mögliche Erklärung ist die Wechselwirkung mit Zink-bindenden
Strukturen, wie sie im p53-Protein oder auch in einigen DNA-Reparaturproteinen in
Form von Zinkfinger-Motiven vorkommen.
Zunächst soll die Beteiligung des Tumorsuppressorproteins p53 an wichtigen
zellulären Schutzmechanismen in den verwendeten Zelllinien aufgeklärt werden, um
in weiteren Versuchen den Einfluss von Cadmiumchlorid auf einzelne Prozesse zu
betrachten. Dabei steht zunächst die Bildung von p53 knock-down Zellen mittels
RNAi-Technik im Vordergrund. Für die dafür eingesetzten A549 Zellen existieren
bereits umfangreiche Ergebnisse zum Einfluss von Cadmiumverbindungen auf
zelluläre Prozesse. Zusätzlich werden HCT116 Zellen, von denen eine isogene, p53-
defiziente Zelllinie zur Verfügung steht, für die weiteren Versuche verwendet. Neben
Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle nach Behandlung mit
UVC, Actinomycin D oder BPDE soll der Einfluss von Cd(II) auf den UVC-induzierten
S-Phasen Arrest im Zellzyklus in Abhängigkeit vom p53-Status der Zellen betrachtet
werden. Weiterhin wird die Induktion von p53 und die Beteiligung von p53 an der
Expression einzelner DNA-Reparatur- und Zellzyklusgene nach Inkubation mit BPDE
beobachtet. Die Beteiligung von p53 an der NER soll anhand der Reparatur BPDE-
induzierter DNA-Addukte und UVC-induzierter Photoläsionen untersucht werden,
letztere auch unter dem Einfluss von Cadmiumchlorid.
Material und Methoden
25
4 Material und Methoden
4.1 Material
Eine Zusammenstellung aller verwendeten Chemikalien, Lösungen und Puffer sowie
der benutzten Geräte und Verbrauchsmaterialien befindet sich im Anhang.
4.2 Methoden
4.2.1 Zellkultur und Behandlung der Zellen
4.2.1.1 Zellkultur
Bei den in dieser Arbeit eingesetzten Zelllinien handelt es sich um die humane
Zervixkarzinom-Zelllinie HeLa S3, die humane Brustkrebszelllinie MCF7, humane
Lungenadenokarzinomzellen der Linie A549 und um humane Kolonkarzinomzellen
der Linie HCT116 sowie deren p53-defizientes Pendant (HCT116 p53-/-). Die Zellen
wachsen als Monolayer in Zellkulturschalen bei 37 °C, 5 % CO2 und 100 %
Luftfeuchtigkeit. Als Kulturmedium wird F12 (HeLa S3) bzw. DMEM mit einem Zusatz
von 10 % FKS, Penizillin (100 U/ml) und Streptomycin (100 µg/ml) verwendet. Die
Zellen werden regelmäßig mittels PCR auf Mykoplasmenkontamination untersucht.
Die Lagerung der Zellen erfolgt in flüssigem Stickstoff bei –196 °C in einem
Einfriermedium aus 90 % FKS und 10 % DMSO.
Sämtliche Zellkulturarbeiten werden unter einer Sicherheitswerkbank durchgeführt.
Flaschen werden nach dem Erwärmen im Wasserbad auf 37 °C mit 70%igem
Ethanol abgewischt und nach dem Öffnen unter der Sterilbank noch zusätzlich
abgeflammt. Die verwendeten Glaspipetten werden bei 180 °C für 4 Stunden
heißsterilisiert. Verbrauchsmaterial wie zum Beispiel Kunststoffpipettenspitzen wird
bei 120 °C für 20 Minuten bei 3 atm autoklaviert.
Alle 3 bis 4 Tage werden die Zellen in eine neue Zellkulturschale mit frischem
Medium überführt (Passagieren). Dazu wird das Kulturmedium abgesaugt und die
Schale zunächst mit Trypsin gewaschen. Nach erneutem Absaugen wird Trypsin
hinzupipettiert, 30 Sekunden geschwenkt, das Trypsin abgesaugt und die Schale für
2-3 Minuten in den Brutschrank gestellt. Nach Zugabe von frischem Medium werden
die Zellen mit einer Pipette vereinzelt. Die Bestimmung der Zellzahl erfolgt mit dem
Material und Methoden
26
automatischen Zellzählgerät (Casy). Eine entsprechende Menge der Zellsuspension
wird in eine neue Zellkulturschale mit frischem Medium gegeben, die Schale zur
Verteilung der Zellen hin und her bewegt und im Brutschrank aufbewahrt.
4.2.1.2 Inkubationslösungen
Zur Inkubation der Zellen mit Cadmiumchlorid wird aus einer sterilfiltrierten
Stammlösung (100 mM) durch Verdünnen mit sterilem Wasser eine 10 mM
Arbeitslösung hergestellt und diese in entsprechender Menge in das Kulturmedium
pipettiert.
Zur Behandlung der Zellen mit dem reaktiven Metaboliten (+)-anti-BPDE wird die bei
-80 °C gelagerte Stammlösung (1 mg/ml in THF/5 % Triethylamin) unmittelbar vor
der Verwendung in THF/0,5 % Triethylamin verdünnt und im Verhältnis 1:1000 in das
Medium pipettiert, so dass die Lösungsmittelkonzentration immer 0,1 % beträgt.
Nach 1 h wird die Inkubation durch Waschen mit Medium beendet.
Die Inkubation der Zellen mit 5 nM Actinomycin D erfolgt durch 1:1000 Verdünnung
einer sterilen 5 µM Stammlösung direkt in das Zellkulturmedium. Die Stammlösung
wird durch Verdünnen einer wässrigen, sterilfiltrierten Stocklösung (0,5 mM)
hergestellt, die bei -20 °C mehrere Monate stabil ist.
4.2.1.3 Bestrahlung mit UVC
Für die Bestrahlung mit UVC wird zunächst das Kulturmedium abgenommen, die
Schalen einmal mit PBS gewaschen und die Zellen mit der gewünschten Dosis
bestrahlt. Anschließend wird das zuvor abgenommene Medium wieder hinzugefügt
und die Schalen entsprechend der Nachinkubationszeit in den Brutschrank
zurückgestellt. Die Bestrahlung erfolgt bei 254 nm im Abstand von 30 cm zur UV-
Lampe, so dass eine Strahlungsintensität von 1 J/m² pro Sekunde erreicht wird. Die
korrekte Einstellung der Bestrahlungsapparatur wird regelmäßig mittels UV-
Radiometer überprüft.
4.2.2 Koloniebildungsfähigkeit
Zur Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit der Zellen nach Inkubation mit
Cadmiumchlorid wird pro Konzentrationsstufe in eine 100 mm Zellkulturschale je eine
Material und Methoden
27
Million Zellen ausgesät. Nach 24 h erfolgt die Inkubation mit Cadmiumchlorid. Nach
weiteren 24 h werden die Zellen abtrypsiniert und nach dem Vereinzeln
entsprechend einer 1:20 Verdünnung in ein Eppendorfgefäß mit Medium pipettiert.
Nach der Bestimmung der Zellzahl am automatischen Zellzählgerät (Casy) werden
aus der 1:20 verdünnten Zellsuspension jeweils 300 Zellen in 3 Zellkulturschalen
(60 mm) mit je 5 ml Medium pipettiert. Die Schalen werden schließlich für weitere
7 Tage im Brutschrank aufbewahrt. In dieser Zeit wachsen aus den einzelnen Zellen
Kolonien heran, die mit dem bloßen Auge zu erkennen sind. Zum Auswerten müssen
die entstandenen Kolonien gefärbt werden. Dazu wird aus den Zellkulturschalen das
Medium abgesaugt und die Schalen werden mit kaltem PBS gewaschen. Die Zellen
werden mit eiskaltem Ethanol (96 %) fixiert und mit Giemsa (5 % in Wasser) gefärbt.
Schließlich werden die Zellkulturschalen mit Wasser gewaschen, um anhaftende
Farbstoffreste zu entfernen. Nach dem Trocknen wird die Anzahl der Kolonien in
jeder Schale ausgezählt. Durch Vergleich der Koloniezahlen der verschiedenen
Konzentrationsstufen mit denen der unbehandelten Kontrolle werden die durch die
entsprechende Substanz verursachten und auch längerfristig auftretenden
zytotoxischen Effekte sichtbar.
Die Bestimmung der Koloniebildungsfähigkeit nach einstündiger Inkubation mit BPDE
oder nach Bestrahlung mit UVC erfolgt nach einer modifizierten Vorgehensweise.
Dazu werden je Konzentrationsstufe in 3 Zellkulturschalen (60 mm) je 300 Zellen
ausgesät und über Nacht anwachsen gelassen, wobei unbehandelte Kontrollen
sowohl zu Beginn als auch am Ende angesetzt werden. Nach der Inkubation bzw.
Bestrahlung werden die Schalen für ca. 7 Tage im Brutschrank aufbewahrt und die
dann vorhandenen Kolonien wie zuvor beschrieben angefärbt und ausgezählt.
4.2.3 Zellzyklusuntersuchung
Zur Untersuchung der Zellzyklusverteilung werden je 3x105 Zellen in 60 mm Schalen
ausgesät. Je nach Versuch erfolgt nach 24 h eine Inkubation mit CdCl2 und/oder
nach weiteren 24 h mit BPDE oder eine Bestrahlung mit UVC mit 8- bzw. 9-stündiger
Nachinkubationszeit. Die Inkubation mit Actinomycin D dauert 21 h. Anschließend
werden die Zellen abtrypsiniert und in PBS/FKS aufgenommen, in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen überführt und 3 min bei 340 g zentrifugiert. Nach dem Absaugen
des Überstandes wird das Zellpellet mit 1 ml PBS resuspendiert und auf dem
Material und Methoden
28
Vibrationsmischer mit 3 ml eiskaltem Ethanol zur Fixierung versetzt und mindestens
24 h bei -20 °C aufbewahrt. Zur Färbung mit dem DNA-bindenden
Fluoreszenzfarbstoff DAPI wird nach einem weiteren Zentrifugationsschritt der
Überstand abgenommen und das Zellpellet mit 1 ml DAPI-Färbelösung pro 1 Mio.
Zellen resuspendiert. Bis zur Messung am Durchflusszytometer werden die Proben
über Nacht bei 4 °C oder ca. 4 h bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert.
Schließlich werden die Proben in Messröhrchen überführt und nach Anregung mittels
UV-Lampe die Fluoreszenz (435-475 nm) auf Einzelzellebene gemessen. Mit Hilfe
der Auswertesoftware FlowMax können aus den Messdaten Histogramme generiert
und Zellzyklusverteilungen ermittelt werden.
4.2.4 Transfektionsexperimente
4.2.4.1 Bestimmung der Geneticin-Toleranzdosis
Zur Selektion stabil transfizierter Zellen wird das neo-Resistenzgen und das
Selektionsantibiotikum Geneticin (G418) verwendet. In Vorversuchen muss zunächst
für jede Zelllinie ermittelt werden, welche Konzentration an G418 zum Absterben aller
Zellen ohne Resistenzgen innerhalb von etwa 14 Tagen führt. Zur Ermittlung der
Toleranzdosis wird zuerst ein Vorversuch mit je 400 Zellen in 24-Loch
Mikrotiterplatten durchgeführt, wobei 12 verschiedene Konzentrationen im Bereich
von 0 bis 1,1 mg/ml eingesetzt werden. Nach 12-16 Tagen wird die Platte nach dem
Waschen mit PBS und fünfminütigem Fixieren der Zellen mit eiskaltem Ethanol mit
Giemsa (5 % in Wasser) gefärbt und visuell ausgewertet. Zur Dokumentation werden
die Platten am Dokumentationsgerät (Fuji LAS3000) abfotografiert. In einem weiteren
Versuch werden 2000 Zellen in 60 mm Schalen ausgesät und nach 24 h mit G418 im
Konzentrationsbereich bis 0,8 mg/ml inkubiert. Nach 12-14 Tagen wird die
Lebendzellzahl am Zellzählgerät (Casy) bestimmt und gegen die G418-Konzentration
aufgetragen.
4.2.4.2 Transfektion von HeLa S3, MCF7 und A549 Zellen
Zur Transfektion in einer 24-Loch Mikrotiterplatte werden je Kavität 2x105, 0,5x105
bzw. 1,5x105 HeLa S3, MCF7 bzw. A549 Zellen ausgesät und 24 h in Medium mit
10 % FKS ohne Antibiotika inkubiert. Die Transfektion wird mit dem Reagenz
Material und Methoden
29
Lipofectamine in Kombination mit dem Plus-Reagenz (Invitrogen) durchgeführt. Dazu
wird für jede Kavität serumfreies Medium in ein steriles Eppendorfreaktionsgefäß
vorgelegt, 0,4 µg Plasmid-DNA zugegeben, gemischt, 4 µl Plus-Reagenz zugegeben
und nach erneutem Mischen 15 min bei Raumtemperatur inkubiert (je 25 µl
Gesamtvolumen). Für jede Kavität werden 24 µl serumfreies Medium mit 1 µl
Lipofectamine versetzt und gemischt. Je 25 µl Lipofectamine/Medium-Mischung
werden zur Plasmid-DNA/Plus-Reagenz-Mischung gegeben, gemischt und 15 min
bei Raumtemperatur inkubiert. In den Kavitäten der 24-Loch Mikrotiterplatte wird das
Medium abgesaugt, jeweils einmal mit 200 µl serumfreiem Medium gewaschen,
erneut je 200 µl serumfreies Medium und 50 µl Plasmid-DNA/Lipofectamine/Plus-
Reagenz-Mischung zugegeben und nach dem Mischen bei 37 °C inkubiert. Nach 4 h
wird je Kavität 1 ml Medium mit 13 % FKS zugegeben. Informationen zu den
verwendeten Plasmiden befinden sich im Anhang.
4.2.4.3 Bestimmung der Transfektionseffizienz
Die Bestimmung der Transfektionseffizienz mittels β-Galaktosidase-Aktivität wird zur
Optimierung der Transfektionsmethode und zum Vergleich der Transfizierbarkeit
verschiedener Zelllinien angewendet. Hierzu wird ein Plasmid (pSV-β-Gal)
verwendet, das für β-Galaktosidase kodiert. Durch die Enzymaktivität der
β-Galaktosidase wird das Substrat X-Gal in einen Farbstoff überführt, der die Zellen
unter dem Mikroskop blau erscheinen lässt (Schrimpf, 2002).
Etwa 24 h nach der Transfektion in einer 24-Loch Mikrotiterplatte werden die Zellen
zweimal mit je 500 µl PBS gewaschen, mit 250 µl Glutaraldehyd (0,25 %) für 5 min
bei Raumtemperatur fixiert und anschließend dreimal mit je 1 ml PBS gewaschen,
wobei der Puffer beim 2. Waschschritt für 10 min auf den Zellen verbleibt. Schließlich
werden 250 µl X-Gal-Lösung zugegeben und bei 37 °C bis zu 24 h inkubiert. Die
Auswertung erfolgt durch Auszählen am Mikroskop, wobei zur Dokumentation Fotos
angefertigt werden.
4.2.4.4 Selektion und Isolierung von stabil transfizierten Zellklonen
24 h nach der Transfektion werden die Zellen passagiert und 1:20 verdünnt in
100 mm Schalen in Medium ohne Antibiotika ausgesät. Nach weiteren 24 h wird das
Medium mit G418 versetzt. Während der folgenden 10- bis 14-tägigen
Material und Methoden
30
Selektionsphase wird alle 3-4 Tage ein Mediumwechsel mit Selektionsmedium
durchgeführt, bis in einer mitgeführten Kontrollschale ohne Resistenzgen keine
lebenden Zellen mehr vorhanden und in den übrigen Schalen Kolonien mit dem
bloßen Auge sichtbar sind. Am Mikroskop werden Kolonien ausgewählt und an der
Unterseite der Schale mit schwarzem Stift markiert, das Medium abgesaugt und ca.
1-2 ml frisches Medium zugegeben, so dass die Zellen nicht austrocknen können. Mit
einer sterilen Pinzette wird ein Klonierungsring aus der Vorratsschale entnommen
und vorsichtig um eine markierte Kolonie positioniert und angedrückt. Mit einer
sterilen Pasteurpipette werden Mediumreste aus dem Ring abgesaugt, 60 µl Trypsin
in den Ring pipettiert, das Trypsin abgesaugt, erneut 60 µl Trypsin in den Ring
pipettiert und die Schale für 3 min in den Brutschrank gestellt. Dann werden die
Zellen unter dem Mikroskop kontrolliert, mit einer Eppendorf-Pipette im Ring
vereinzelt und in vorbereitete 60 mm Schalen mit 5 ml Medium überführt. Um die
Zellen weiterhin unter Selektionsdruck zu halten, werden sie kontinuierlich in G418-
haltigem Medium kultiviert.
4.2.5 Bestimmung der relativen Genexpression
4.2.5.1 RNA-Isolierung
Zur Isolierung der Gesamt-RNA werden ca. 2x106 Zellen in ein 15 ml
Zentrifugenröhrchen überführt, bei 340 g (4 °C) abzentrifugiert und der Überstand
abgenommen. Das Zellpellet wird in 1 ml PBS resuspendiert, in ein 1,5 ml
Eppendorfreaktionsgefäß überführt und bei 850 g abzentrifugiert. Nach Abnehmen
des Überstandes wird das Pellet mit 350 µl Lysepuffer (R1-Puffer) und 3,5 µl
Mercaptoethanol versetzt und durch fünfmaliges Aufziehen durch eine Kanüle
(Ø 0,4 mm) geschert. Im Anschluss wird das gleiche Volumen Ethanol (70 %)
zugegeben, gemischt, die gesamte Lösung in ein Reaktionsgefäß mit Filtereinsatz
überführt und bei 7700 g für 30 s abzentrifugiert. Der Durchlauf wird verworfen und
die Säule mit 350 µl MDB-Puffer (membrane desalting buffer) versetzt. Nach
Abzentrifugieren bei 11500 g für 1 min wird der Durchlauf erneut verworfen und ein
DNase-Verdau auf der Säule durchgeführt. Hierzu werden 95 µl DNase
Reaktionsgemisch (10 µl DNase + 90 µl DNase Reaktionspuffer) für 15 min bei
Raumtemperatur auf die Säule gegeben. Daraufhin werden zum Abstoppen 200 µl
RA2-Puffer auf den Filter gegeben und 30 s bei 7700 g zentrifugiert. Die Säule wird
Material und Methoden
31
im Anschluss auf ein neues 2 ml Reaktionsgefäß überführt und mit 600 µl RA3-Puffer
gewaschen. Nach dem Zentrifugieren für 30 s bei 7700 g wird der Durchlauf
verworfen und die Säule ein zweites Mal mit RA3-Puffer (250 µl) gewaschen. Nach
Zentrifugation für 2 min bei 16000 g wird die RNA durch Zentrifugieren mit 100 µl
RNase-freiem Wasser bei 16000 g von der Säule eluiert. Die Lagerung der Proben
erfolgt bei -80 °C.
4.2.5.2 RNA-Quantifizierung
Zur Konzentrationsbestimmung der isolierten RNA wird zunächst eine 1:50
Verdünnung hergestellt. Hierfür werden 98 µl Wasser mit 2 µl der RNA-Lösung
versetzt und im Anschluss die Extinktion der verdünnten Lösung bei 260 nm am
Biophotometer bestimmt. Alternativ kann die Extinktion der unverdünnten Probe am
Nanodrop Spektralphotometer gemessen werden. Für die Auswertung wird folgende
Beziehung zu Grunde gelegt: 1 OD260nm = 40 µg RNA (Sambrook und Russell, 2001).
4.2.5.3 RNA-Elektrophorese
Zur Überprüfung der Integrität der isolierten RNA wird eine denaturierende RNA-
Gelelektrophorese durchgeführt. Hierzu wird ein 1,2%iges formaldehydhaltiges
Agarosegel hergestellt. Es werden 1,2 g Agarose mit 83 ml Wasser und 5 ml 20x
MOPS-Puffer aufgekocht und nach Abkühlen auf ca. 65 °C mit 12 ml
Formaldehydlösung (37 %) versetzt. 1 µg der isolierten Gesamt-RNA wird mit
Formamid-Denaturierungspuffer auf 15 µl Gesamtvolumen gebracht und 10 min bei
65 °C auf dem Heizblock denaturiert, so dass die RNA einzelsträngig vorliegt. Nach
Zugabe von ca. 1,5 µl Lämmli-Ladepuffer erfolgt die Elektrophorese mit MOPS (1x)
bei 60 V für ca. 2 h. Zur Detektion wird das Gel bei 520 nm am
Geldokumentationssystem (Herolab) abfotografiert (siehe Anhang).
4.2.5.4 cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese erfolgt im Allgemeinen nach folgender Vorgehensweise, wobei
ein Ansatz mit 20 µl Gesamtvolumen für 1 µg Gesamt-RNA wie folgt pipettiert wird:
x µl (entsprechend 1 µg) RNA
10 – x µl RNase freies Wasser
Material und Methoden
32
1 µl Oligo (dT)15 (0,5 µg/µL)
1 µl 10 mM dNTP (je 10 mM)
werden auf 65 °C für 5 min erhitzt und anschließend auf Eis gestellt.
Ein Mastermix aus:
4 µl 5x First-Strand Puffer
2 µl 0,1 M DTT
1 µl RNase out
wird bei 42 °C für 2 min inkubiert und dann mit 1 µl SuperScript II reverse
Transkriptase versetzt. Es folgen 50 min Inkubation bei 42 °C und die Inaktivierung
des Enzyms durch Erhitzen auf 70 °C für 15 min.
Die Synthese der cDNA für die Bestimmung der Genexpression nach Inkubation mit
BPDE erfolgt mittels cDNA-Synthesekit von Bio-Rad, welches auf einer modifizierten
MMLV reversen Transkriptase mit RNAse H+-Aktivität sowie einem Gemisch aus
Oligo(dT)- und random hexamer Primern basiert. Der Reaktionsansatz wird bei 4 °C
im Eisblock nach folgendem Schema pipettiert:
15 – x µl RNase freies Wasser
x µl (entsprechend 1 µg) RNA-Probe
4 µl 5x iScript Reaktionsgemisch
1 µl iScript reverse Transkriptase.
Dieser Ansatz wird bei 25 °C für 5 min inkubiert, damit sich die Primer an die
einzelsträngige RNA anlagern. Im Anschluss erfolgt bei 42 °C die reverse
Transkription für 30 min. Durch Erhitzen auf 85 °C für 5 min wird die Reaktion
beendet und die synthetisierte cDNA kann für die PCR eingesetzt werden.
4.2.5.5 Real-Time RT-PCR
Die Real-Time RT-PCR-Analysen werden am iCycler (Bio-Rad) durchgeführt. Dabei
wird die DNA-Amplifikation durch den Einsatz des Fluoreszenzfarbstoffs SYBR
Green in Echtzeit verfolgt. Hierbei handelt es sich um einen Farbstoff, der
unspezifisch in doppelsträngige DNA interkaliert, dadurch fluoreszenzaktiv wird und
somit mit fortschreitender Zyklenzahl zu einem Fluoreszenzanstieg führt. Die
Fluoreszenzmessung erfolgt bei einer Anregungswellenlänge von 490 nm und einer
Emissionswellenlänge von 530 nm.
Material und Methoden
33
Für den Probenansatz werden pro Reaktionsgefäß 25 µl eingesetzt, bestehend aus:
12,5 µl SYBR Green Supermix
10,5 µl Wasser
0,5 µl forward Primer
0,5 µl reverse Primer
1 µl cDNA.
Zur Vermeidung von Pipettierfehlern wird für jede zu untersuchende cDNA-Probe ein
Mastermix angesetzt, der Supermix, cDNA und Wasser enthält. Dieser wird auf die
verschiedenen Ansätze verteilt und im Anschluss werden die Primerpaare
zugegeben. Eine Liste mit den verwendeten Primersequenzen befindet sich ebenso
wie das verwendete Temperaturprogramm im Anhang. In Abbildung 7 ist das
Ergebnis einer Real-Time PCR beispielhaft dargestellt.
Abbildung 7: Beispielhaftes Ergebnis einer Real-Time PCR.
Da es sich bei SYBR Green um eine unspezifische Interkalation handelt, wird bei
dem Fluoreszenzanstieg auch die Amplifikation unspezifischer Produkte wie z.B. die
Bildung von Primer-Dimeren oder die Bildung unspezifischer PCR-Produkte aufgrund
unspezifischer Primer-Bindung an die DNA erfasst. Daher wird nach
abgeschlossener PCR stets eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt, um die
Abwesenheit unspezifischer Produkte zu bestätigen. Hierbei werden die PCR-
Produkte nach abgeschlossener PCR kontinuierlich über einen bestimmten
Material und Methoden
34
Temperaturbereich erhitzt. Währenddessen kommt es zu einer Denaturierung der
Doppelstränge, wobei die Denaturierungstemperatur u. a. von der Länge des PCR-
Produktes abhängt. Am Schmelzpunkt des Amplifikats kommt es zu einer
schlagartigen Abnahme des Fluoreszenzsignals. Dies lässt sich in der
Ableitungsfunktion der Fluoreszenz nach der Temperatur als Maximum detektieren
(Abbildung 8).
Abbildung 8: Schmelzkurvenanalyse nach Abschluss der PCR.
4.2.5.6 Auswertung
Als Maß für die Quantifizierung werden die so genannten threshold cycle (Ct)-Werte
herangezogen. Die Ct-Werte entsprechen der Anzahl der Zyklen die nötig sind, um
ein konstant festgelegtes Fluoreszenzniveau zu erreichen. Bei diesem Wert befindet
sich in allen Reaktionsgefäßen die gleiche Menge an neu synthetisierter DNA. Daher
ist die Zahl der Zyklen, die für die amplifikationsbedingte Fluoreszenzzunahme zum
Erreichen des Ct-Wertes erforderlich sind, invers proportional zu der Menge an
ursprünglich eingesetzter DNA. Im Falle einer 100%igen Effizienz der Reaktion
verdoppelt sich die Anzahl der DNA-Stränge während der exponentiellen Phase der
PCR mit jedem Zyklus. Eine Probe, die zu Reaktionsbeginn doppelt so viele DNA-
Moleküle wie die Vergleichsprobe enthält, benötigt somit einen Zyklus weniger, um
den gleichen Ct-Wert zu erreichen. Anhand der unterschiedlichen Ct-Werte der
beiden Proben lässt sich demnach der relative Unterschied des Nukleinsäure-
Gehaltes zwischen den Proben berechnen (Pfaffl, 2004). Aufgrund von
Material und Methoden
35
Schwankungen während der cDNA-Synthese und um Pipettierfehler beim Einsatz
der RNA-Menge für die cDNA-Synthese zu berücksichtigen, wird zusätzlich zu dem
zu untersuchenden Gen ein weiteres, so genanntes Housekeeping-Gen untersucht.
Hierbei handelt es sich um ein Gen, bei dem davon ausgegangen wird, dass es
unabhängig von äußeren Einflüssen, d.h. unabhängig von der Behandlung der
Zellen, exprimiert wird. In dieser Arbeit wurde als Housekeeping-Gen GAPDH
(Glycerinaldehyd-3-Phosphat-dehydrogenase), einem Enzym, das an der Glykolyse
beteiligt ist, verwendet. Die für das zu untersuchende Gen erhaltenen Ct-Werte
werden somit im Endeffekt auf die für das Housekeeping-Gen erhaltenen Ct-Werte
normiert. Mit der folgenden Gleichung lässt sich die relative Genexpression (R) der
behandelten Probe in Bezug auf die unbehandelte Kontrolle darstellen (Livak und
Schmittgen, 2001; Pfaffl, 2001):
)
)
)(
)
GAPDHBehandelt,GAPDHKontrolle,
GAPDH
XGenBehandelt,XGenKontrolle,
XGen
Ct(Ct
(E
CtCt
(E
=R -
-
Die Effizienz (E) der Reaktion hängt u. a. von der Länge der Amplifikate, von evtl. im
Amplikon enthaltenen Sekundärstrukturen und vom G/C-Gehalt des Amplikons ab.
Geringere Effizienzen weisen auf eine nicht optimale PCR-Reaktion hin. Auch
Effizienzen größer 2, also größer 100 % sind bei der Verwendung von SYBR Green
möglich. Dies weist darauf hin, dass zusätzlich zu dem spezifischen zu
untersuchenden Gen ein weiteres unspezifisches Produkt gebildet wird. Daher ist es
notwendig, zunächst die Effizienzen zu bestimmen und anschließend evtl. die PCR-
Bedingungen (Annealingtemperatur, Annealingzeit, eingesetzte Primer) zu
optimieren.
Hier wird die Effizienz anhand von Verdünnungsreihen bestimmt. Zunächst wird aus
den zu untersuchenden cDNA-Proben eine Mischprobe hergestellt, indem die
verschiedenen Proben zu gleichen Teilen miteinander versetzt werden. Nach
Herstellung einer Verdünnungsreihe wird nach abgeschlossener PCR die
eingesetzte cDNA-Menge in einer logarithmischen Funktion gegen den Ct-Wert
aufgetragen. Die Effizienz (E) errechnet sich aus der Steigung (m) der erhaltenen
Geraden nach folgender Gleichung:
E = 10 - 1/m (Pfaffl, 2001).
Material und Methoden
36
Die Verdünnungsreihen und die daraus ermittelten Effizienzen sind in Abbildung 58
und Abbildung 59 sowie in Tabelle 2 im Anhang aufgeführt.
4.2.6 Immunologischer Nachweis zellulärer Proteine
4.2.6.1 Zelllyse
Zur Zelllyse werden ca. 3-5 Millionen Zellen in ein 15 ml Zentrifugenröhrchen
überführt und bei 340 g 3 min abzentrifugiert. Das Pellet wird mit 100 µl RIPA-Puffer
versetzt, in ein Eppendorfreaktionsgefäß überführt und durch Ultraschallbehandlung
aufgeschlossen. Nach dem Abzentrifugieren der Zelltrümmer (16000 g, 20 min) kann
der Proteingehalt im Überstand bestimmt werden.
4.2.6.2 Proteinbestimmung nach Bradford
Zur Proteinbestimmung nach Bradford (1976) werden jeweils 5 µl Proteinextrakt mit
495 µl Wasser vermischt und 20 µl der Probenverdünnung (Dreifachbestimmung) in
eine Mikrotiterplatte (96-Loch) pipettiert. Dazu werden 180 µl Bradfordlösung (Bio-
Rad Reagenz) gegeben und fünf Minuten nach Reagenzzugabe wird die Absorption
bei 595 nm in einem Mikrotiterplattenlesegerät (TECAN SpektraFluor) bestimmt.
Durch die Bindung des in der Bradfordlösung enthaltenen Farbstoffs Coomasie
Brillantblau G 250 an Proteine verschiebt sich in saurer Lösung die Absorption von
465 nm nach 595 nm. Zur Berechnung der Proteinkonzentration wird auf jeder
Lochplatte eine Kalibriergerade mit Rinderserumalbumin (BSA) im Bereich von
0-200 µg/ml mitgeführt.
4.2.6.3 Elektrophorese und Westernblot
40 µg Gesamtprotein werden mit 5 µl Lämmli-Ladepuffer (4x) versetzt, mit H2O auf
20 µl ergänzt und bei 95 °C für 5 min denaturiert. Im Anschluss werden die Proben
auf ein denaturierendes Polyacrylamidgel (5%iges Sammelgel, 12%iges Trenngel)
aufgetragen. Die Elektrophorese erfolgt bei 80 V im Sammelgel und zur Trennung
der Proteine im Trenngel bei 100 V. Auf jedem Gel wird ein Molekulargewichtsmarker
mitgeführt. Zur Übertragung der Proteine auf eine PVDF-Membran werden die
Proteine nach erfolgter Trennung in einer Semidry-Blot-Apparatur bei 0,8 A/cm2
Membran für 1 h auf eine PVDF-Membran geblottet.
Material und Methoden
37
4.2.6.4 Chemilumineszenz-Detektion
Zur Blockierung aktiver Bindungsstellen wird die Membran nach dem Westernblot
zunächst für 3 min in PBS gewaschen und für 30 min in Blockierlösung (5 %
Magermilchpulver in PBS-T) geschwenkt. Anschließend wird die Membran für eine
Stunde bei Raumtemperatur oder bei 4 °C über Nacht mit einem primären Antikörper
(gegen p53, XPC oder Aktin gerichtet) inkubiert. Hierzu wird die Membran mit einer
Verdünnung des Antikörpers in Blockierlösung in Kunststofffolie luftblasenfrei
eingeschweißt. Im Anschluss erfolgt nach jeweils zehnminütigem, dreimaligem
Waschen der Membran in PBS-T (0,05 % Tween 20) die Inkubation mit dem an
Meerrettich-Peroxidase gekoppelten sekundären Antikörper. Dazu wird ebenfalls
eine Verdünnung des jeweiligen Antikörpers in Blockierlösung zusammen mit der
Membran luftblasenfrei eingeschweißt. Nach Ablauf von mindestens einer Stunde
erfolgt nach drei Waschschritten mit PBS-T für jeweils 10 min und einem
abschließenden Waschschritt in PBS für 3 min die Detektion am
Geldokumentationsgerät (Fuji LAS3000). Hierzu wird die Membran für 1 min mit etwa
1 ml des ECL-Detektionsreagenz (GE Healthcare) inkubiert und im Anschluss das
Chemilumineszenzsignal der Reaktion der Peroxidase mit dem Substrat detektiert.
Zur Detektion weiterer Proteine auf derselben Membran werden nach einem
einstündigen Waschschritt in PBS die Inkubation und alle nachfolgenden Schritte mit
einem weiteren primären und dem dazugehörigen sekundären Antikörper wiederholt.
4.2.7 Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden
4.2.7.1 Nachweisprinzip
Der Nachweis UVC-induzierter DNA-Schäden erfolgt mittels Immunfluoreszenz-
mikroskopie. Hierzu werden auf Deckgläschen wachsende Zellen nach der
Bestrahlung und einer eventuellen Nachinkubationszeit zunächst fixiert und nach
dem Blockieren unspezifischer Bindungsstellen mit spezifischen Antikörpern gegen
Cyclobutanpyrimidindimere (CPD) inkubiert. Dann erfolgen die Inkubation mit einem
sekundären fluoreszenzgekoppelten Antikörper und die Färbung der DNA im Zellkern
mit 4´,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI). Am Fluoreszenzmikroskop werden die
Präparate schließlich abfotografiert und die Fluoreszenzsignalintensität wird als Maß
für die CPD auf Einzelzellebene quantifiziert.
Material und Methoden
38
4.2.7.2 Versuchsdurchführung
In die Kavitäten einer 6-Loch-Platte werden 2,5x105 A549 bzw. 5x105 HCT116 Zellen
auf Deckgläschen in 3 ml Medium ausgesät. Hierzu werden die Deckgläschen
zunächst 5 min in Diethylether entfettet, nach dem Trocknen 10 min in Alcian Blue
(1 mg/ml in Ethanol) gefärbt, mit 70%igem Ethanol und anschließend mit Wasser
gespült und nach dem Polieren mit Zellstoff-Tüchern autoklaviert.
Nach 24 h erfolgt dann eine Inkubation mit Cadmiumchlorid, an die sich nach
weiteren 24 h eine UVC-Bestrahlung (der Proben mit 24 h Nachinkubationszeit)
anschließt. Zur Bestrahlung werden die Deckgläschen aus der Platte entnommen,
mit PBS gespült und auf einen mit Parafilm bespannten Deckel einer Zellkulturschale
gelegt. Nach der Bestrahlung werden die Deckgläschen wieder in die Kavitäten der
Platte überführt. Nach Ablauf von 24 h Nachinkubationszeit erfolgt die Bestrahlung
der Proben ohne Nachinkubationszeit und die sofortige Aufarbeitung aller Proben.
Hierfür wird die Platte auf Eis gestellt, das Medium abgesaugt und einmal mit
eiskaltem PBS gespült. Im Anschluss werden 2 ml Fixierlösung zugegeben und die
Platte für 30 min im Dunkeln aufbewahrt. Nach zweimaligem Spülen mit eiskaltem
PBS werden die Deckgläschen herausgenommen und auf einem mit Parafilm
bespannten Schalendeckel platziert. Im folgenden Denaturierungsschritt werden je
100 µl HCl (0,1 M) zugegeben und 10 min bei 37 °C inkubiert. Anschließend erfolgt
ein doppelter Waschschritt mit eiskaltem PBS, auf den die Blockierung
unspezifischer Bindungsstellen mit je 100 µl Blockierlösung für 30 min bei
Raumtemperatur im Dunkeln folgt. 100 µl des primären Antikörpers (Maus-anti-CPD,
1:1500 in Waschpuffer) werden für 1 h bei 37 °C inkubiert. Die Spezifität dieses
Antikörpers gegen CPD ist in der Literatur beschrieben (Mori et al., 1991). Nach
dreimaligem Waschen mit Waschpuffer folgt die Inkubation mit 100 µl sekundärem
Antikörper (AlexaFluor488-anti-Maus, 1:1000 in Waschpuffer) für 1 h bei
Raumtemperatur im Dunkeln. Nach erneutem fünfmaligem Waschen mit
Waschpuffer erfolgt eine Nachfixierung mit Postfix-Lösung für ca. 10 min und das
Einbetten der Präparate in Vectashield mit DAPI auf Objektträger, wodurch die DNA
im Zellkern angefärbt wird. Abschließend findet die Bildaufnahme am
Fluoreszenzmikroskop (Axio Imager, Carl Zeiss) und die computergestützte
Bildauswertung mittels Axio Vision Software (Carl Zeiss) statt. Abbildung 9 zeigt
beispielhaft fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen.
Material und Methoden
39
DAPI FITC DAPI+FITC
Kontrolle
+UVC
0 h
+UVC
24 h
DAPI FITC DAPI+FITC
Kontrolle
+UVC
0 h
+UVC
24 h
Abbildung 9: Fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen von HCT116 Zellen 0 h bzw. 24 h
nach Bestrahlung mit 10 J/m2 UVC. Kontrolle: unbestrahlte Zellen. Dargestellt sind die
Fluoreszenzkanäle für DAPI (DNA-Färbung) und FITC (Cyclobutanpyrimidindimere) in
63-facher Vergrößerung.
4.2.8 Nachweis BPDE-induzierter DNA-Addukte
4.2.8.1 Nachweisprinzip
Der Einfluss von p53 auf die NER wird anhand der Bildung und Reparatur von
BPDE-induzierten DNA-Addukten untersucht. Als Nachweissystem dient ein
empfindliches und reproduzierbares HPLC/Fluoreszenz-Testsystem (Schwerdtle et
al., 2002). Dafür werden die Zellen mit (+)-anti-BPDE inkubiert, die DNA isoliert und
gereinigt. Durch die anschließende saure Hydrolyse werden die DNA-Addukte
freigesetzt. Bei der Rückneutralisation entsteht das Isomer Tetrol I-1, welches über
die HPLC/Fuoreszenz-Detektion quantifiziert wird (Abbildung 10). Durch die
Quantifizierung der Addukte zu verschiedenen Zeiten nach der BPDE-Inkubation
können Rückschlüsse auf die Funktionalität der Reparaturmechanismen in den
Zellen gezogen werden.
Material und Methoden
40
kultivierte Zellen
isolierte DNA
DNA-Lösung mit Tetrol I-1
OH
O
O
HO
HO
HO
HO
N
NN
NH
O
DNA
NH
HO
HO
HO
(+)-anti-BPDE
-Inkubation mit (+)-anti-BPDE für 1 h
-Nachinkubation für 0-24 h
-Isolierung, Reinigung und Konzentrationsbest immung der DNA
N²-Guaninaddukt
-Hydrolyse (0,1 N HCl, 90 °C, 4 h)
-Neutralisation (0,1 N NaOH)
Tetrol I-1
HPLC
- Trennung auf RP-18 Säule
- Fluoreszenzdetektion von Tetrol I-1
kultivierte Zellenkultivierte Zellen
isolierte DNAisolierte DNA
DNA-Lösung mit Tetrol I-1DNA-Lösung mit Tetrol I-1
OH
O
O
HO
HO
HO
HO
N
NN
NH
O
DNA
NH
HO
HO
HO
(+)-anti-BPDE
-Inkubation mit (+)-anti-BPDE für 1 h
-Nachinkubation für 0-24 h
-Isolierung, Reinigung und Konzentrationsbest immung der DNA
N²-Guaninaddukt
-Hydrolyse (0,1 N HCl, 90 °C, 4 h)
-Neutralisation (0,1 N NaOH)
Tetrol I-1
HPLC
- Trennung auf RP-18 Säule
- Fluoreszenzdetektion von Tetrol I-1
Abbildung 10: Prinzip des Nachweises von BPDE-induzierten DNA-Addukten.
4.2.8.2 Versuchsansatz
3x105 Zellen werden in 60 mm Schalen oder 1x106 Zellen in 100 mm Schalen
ausgesät und nach 48 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert. Nach einer Stunde wird die
Inkubation durch zweimaliges Waschen mit Medium beendet und die Schalen
werden zur Nachinkubation für 4, 8 oder 24 h in den Brutschrank zurückgestellt.
4.2.8.3 DNA-Isolierung und -Quantifizierung
Zur Isolierung der DNA werden die Zellen von der Kulturschale abtrypsiniert, in kalter
TBS-Lösung (pH 7,4) aufgenommen, gezählt und für 5 min bei 650 g (4 °C)
zentrifugiert. Das Zellpellet wird in 100 µl TE-Puffer (pH 8,0) resuspendiert und die
Zellsuspension nach Zugabe von 900 µl Extraktionspuffer (pH 8,0) für 1 h bei 37 °C
inkubiert. Anschließend folgt eine dreistündige Inkubation bei 50 °C mit Proteinase K
(Endkonzentration 100 µg/ml). Zur Abtrennung der DNA von den Proteinen wird die
Lösung mit 1 ml einer Mischung aus Tris-gepuffertem Phenol, Chloroform und
Isoamylalkohol (25:24:1) versetzt, geschüttelt und zur Phasentrennung für 10 min bei
13700 g zentrifugiert. Hierbei denaturiert Phenol die Proteine, die sich zum großen
Teil in der Interphase zwischen der wässrigen DNA-Lösung und der Phenolphase
Material und Methoden
41
anreichern. Mit der oberen wässrigen Phase wird die Phenol-Chloroform-
Isoamylalkohol-Extraktion wiederholt bis sich keine Interphase mehr bildet. Zur
Entfernung des Phenols aus der wässrigen Phase schließt sich eine Extraktion mit
Chloroform-Isoamylalkohol (24:1) an. Danach wird die DNA durch Zugabe von 10 µl
einer 10 M Ammoniumacetatlösung und ca. 1,5 ml Ethanol (absolut) ausgefällt. Um
eine möglichst vollständige Fällung zu erzielen, werden die Proben über Nacht bei
-18 °C aufbewahrt.
Am folgenden Tag wird die DNA bei 8600 g für 10 min zentrifugiert. Darauf folgen
mehrere Waschschritte mit 70%igem Ethanol, um mitgefällte Salze zu entfernen.
Zuletzt wird das gereinigte DNA-Pellet in einem definierten Volumen Reinstwasser
aufgenommen und die DNA-Konzentration photometrisch anhand der Absorption bei
260 nm (A260) bestimmt. Die Quotienten A260/A280 und A260/A230 geben Aufschluss
über die Verunreinigung der DNA mit Proteinen und Salzen. Bei gut aufgereinigter
DNA sollten die Quotienten A260/A280 > 1,75 und A260/A230 ≈ 2,3 sein (Schrimpf,
2002).
4.2.8.4 DNA-Hydrolyse
Für die Hydrolyse wird ein Aliquot der isolierten und gereinigten DNA mit 4 N HCl
(Endkonzentration 0,1 mol/l) versetzt und im Trockenschrank für 4 h bei 90 °C erhitzt.
Durch die saure Hydrolyse der isolierten DNA wird die Bindung zwischen dem C10-
Atom des B[a]P-Metaboliten und der N2-Position des Guanin gespalten und es
entstehen zwei isomere Tetrole, die sich lediglich in der Stellung der Hydroxygruppe
am C10-Atom unterscheiden. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur wird das
Hydrolysat mit 4 N NaOH auf pH 7 rückneutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird
zur HPLC-Analyse eingesetzt.
Es ist bekannt, dass bei der Rückneutralisation Tetrol I-2 (r-7,t-8,t-9,t-10-
tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren) nahezu vollständig in Tetrol I-1 (r-7,t-
8,t-9,c-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-tetrahydrobenzo[a]pyren) übergeht, so dass die
Quantifizierung von Tetrol I-1 den induzierten Addukten in der DNA entspricht (Islam
et al., 1999).
Material und Methoden
42
4.2.8.5 HPLC-Analyse
Die HPLC-Analyse erfolgt isokratisch (55 % Methanol in Wasser) an RP-18 Säulen.
Bei den Säulen handelt es sich um eine Vorsäule (Luna RP 18, 5µm, 4,6 x 30 mm)
und eine Trennsäule (Luna RP 18, 5 µm, 4,6 x 250 mm), die über ein
Motorsäulenschaltventil gesteuert werden. Die Vorsäule wird zunächst mit dem
Fließmittel A (Wasser) für 10 min vorkonditioniert. Danach folgt die Injektion von
1000 µl Probe mit dem Autosampler und ein Waschen der Vorsäule mit dem
Fließmittel B (20 % Methanol in Wasser). Automatisch schaltet das
Motorsäulenschaltventil von der Ladestellung auf die Injektionsstellung um und die
auf der Vorsäule aufkonzentrierte Probe wird mit dem Fließmittel C (55 % Methanol
in Wasser) auf die Hauptsäule übertragen. Die Quantifizierung erfolgt über einen
Fluoreszenzdetektor bei einer Anregungswellenlänge von 344 nm und einer
Emissionswellenlänge von 398 nm. Die resultierenden Peaks werden über die Fläche
ausgewertet. Im Anhang befinden sich weitere Angaben zum HPLC-
Analysenprogramm und beispielhafte HPLC-Chromatogramme der Versuche mit 10
und 200 nM (+)-anti-BPDE in HCT116-Zellen bei 0 h und 8 h Nachinkubationszeit
(Abbildung 60) sowie die zur Auswertung verwendete Kalibriergerade von Tetrol I-1-
Standardlösungen (Abbildung 61).
Ergebnisse und Diskussion
43
5 Ergebnisse und Diskussion
5.1 Transfektionsexperimente
5.1.1 Methodenetablierung
Für die RNA-Interferenz mussten siRNA-Expressionsplasmide in kultivierte Zellen
eingebracht werden. Dafür existieren verschiedene Transfektionsmethoden. Mit der
Lipofektion wurde ein weit verbreitetes Verfahren gewählt, dessen Vorteile vor allem
durch die breite Anwendbarkeit für viele verschiedene Zelllinien, geringe Zytotoxizität,
vergleichsweise hohe Effizienz und geringen apparativen Aufwand gegeben sind
(Mülhardt, 2003). In mehreren Versuchsreihen wurden A549, HeLa S3 und MCF7
Zellen hinsichtlich ihrer Transfizierbarkeit verglichen. Verschiedene Parameter wie
DNA-Menge, Menge an Transfektionsreagenz und Konfluenz der Zellen wurden
variiert, um die bestmögliche Transfektionseffizienz zu erreichen. Dabei ergaben sich
für die untersuchten Zelllinien unter den gewählten Bedingungen sehr
unterschiedliche Effizienzen. Während für HeLa S3 Zellen die maximale
Transfektionseffizienz bei ca. 5 % lag, wurden für A549 und MCF7 Zellen Effizienzen
von bis zu 20 bzw. 40 % erreicht (siehe Abbildung 56 im Anhang).
Zur Selektion von stabil transfizierten Zellen wurde als Selektionsmarker das neo-
Gen in Kombination mit dem Aminoglykosid-Antibiotikum Geneticin (G418)
eingesetzt. Das Antibiotikum blockiert in eukaryotischen Zellen die Proteinsynthese
durch Wechselwirkung mit den 80S Ribosomen und führt so zu deren absterben
(Davies und Jimenez, 1980). Neo kodiert für eine bakterielle Phosphotransferase, die
G418 inaktivieren kann (Colbere-Garapin et al., 1981). Durch Kultivieren in
Selektionsmedium können somit nur die Zellen überleben, die das neo-Resistenzgen
exprimieren (Southern und Berg, 1982). Daher wurde zunächst in Vorversuchen die
G418-Toleranzdosis der Zelllinien bestimmt. Sie lag für HeLa S3 Zellen bei 0,6 mg/ml
und sowohl für A549 als auch für MCF7 Zellen bei 0,5 mg/ml (siehe Abbildung 54 im
Anhang). Test-Transfektionen mit dem Plasmidvektor pCI-neo führten bei den
Zelllinien im Vergleich zum Wildtyp zu einer G418-Resistenz und zur Bildung von
Kolonien nach einer Selektionsphase von ca. 14 Tagen unter den genannten
Bedingungen. Die optimierte Transfektionsmethode und die ermittelten G418-
Konzentrationen wurden bei allen folgenden Transfektionsexperimenten eingesetzt.
Ergebnisse und Diskussion
44
5.1.2 Charakterisierung der Zellen
Zunächst wurden Transfektionsexperimente mit HeLa S3, A549 und MCF7 Zellen
durchgeführt. Dabei wurde das Plasmid p53-pRNA eingesetzt, das zur Expression
von gegen p53 gerichteten siRNA führt. Zur Untersuchung des knock-down Effekts
wurden Westernblot-Analysen mit spezifischen, gegen p53 gerichteten monoklonalen
Antikörpern durchgeführt (Abbildung 11). Dabei wurde auf Proteinebene eine
deutliche Verringerung der p53-Expression bei einzelnen Klonen sichtbar. Diese in
Abbildung 11 jeweils mit Nummer 1 bezeichneten Klone wurden dann mittels Real-
Time RT-PCR auf ihre relative p53-Genexpression untersucht. Dabei ergab sich ein
bei allen drei Zelllinien vergleichbarer knock-down Effekt auf ca. 20 % im Vergleich
zu unbehandelten Kontrollen (Abbildung 12).
MCF7
wt 1 2
p53-pRNA
HeLa S3
wt2 1
p53-pRNA
A549
wt 4 3
p53-pRNA
2 1
MCF7
wt 1 2
p53-pRNA
1 2
p53-pRNA
HeLa S3
wt2 1
p53-pRNA
HeLa S3
wt2 1
p53-pRNA
A549
wt 4 3
p53-pRNA
2 1
A549
wt 4 3
p53-pRNA
2 1
Abbildung 11: Westernblot-Analyse von p53 in A549, HeLa S3 und MCF7 Zellen.
Dargestellt ist jeweils ein repräsentativer Blot. wt: Wildtypzellen, p53-pRNA (1-4): mit p53-
siRNA-Plasmid transfizierte Zellen mit unterschiedlich ausgeprägtem knock-down Effekt.
Ergebnisse und Diskussion
45
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
wt p53-pRNA
relative p53-Genexpression
A549
HeLa S3
MCF7
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
wt p53-pRNA
relative p53-Genexpression
A549
HeLa S3
MCF7
Abbildung 12: Relative p53-Genexpression in A549, HeLa S3 und MCF7 Zellen.
Logarithmisch wachsende Zellen wurden mittels Real-Time RT-PCR untersucht.
wt: Wildtypzellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen. Alle Werte wurden
normiert auf das housekeeping-Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
Bestimmungen + SD.
Für den weiteren Verlauf der Arbeit wurde entschieden, mit den A549 Zellen
weiterzuarbeiten. Da sich herausstellte, dass eine Einlagerung transfizierter Zellen in
flüssigem Stickstoff nicht ohne große Verluste des knock-down Effekts möglich ist,
wurden regelmäßig neue Transfektionsversuche durchgeführt. Dabei wurden
zusätzlich auch A549 Zellen mit dem Plasmidvektor ohne siRNA-Konstrukt
transfiziert. Die entsprechenden Klone (pRNA) wurden als Kontrollen in den
weiterführenden Versuchen verwendet. Zur Auswahl geeigneter Klone nach den
Transfektionen und zur Überprüfung ihres p53-Status wurden regelmäßig
Westernblot- und Real-Time RT-PCR-Analysen durchgeführt. In Abbildung 13 ist ein
repräsentativer Westernblot gezeigt, bei dem zusätzlich die in den späteren
Versuchen verwendeten HCT116 Zelllinien mit dargestellt sind. Während bei den
HCT116 p53-/- im Gegensatz zu den HCT116 p53+/+ Zellen kein p53-Protein
detektierbar war, konnte bei den A549 p53-pRNA eine deutliche Reduktion des
Proteins im Vergleich zu den Kontrollen festgestellt werden.
Ergebnisse und Diskussion
46
p53
Aktin
A549 wt A549 pRNA A549 p53-pRNA HCT116
p53
-/-
p53
+/+
p53
Aktin
A549 wt A549 pRNA A549 p53-pRNA HCT116
p53
-/-
p53
+/+
Abbildung 13: Westernblot-Analyse von p53 in A549 und HCT116 Zellen. Aktin wurde
als Ladekontrolle detektiert. Dargestellt ist ein repräsentativer Blot. wt: Wildtypzellen, pRNA:
mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte
Zellen, p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-defiziente Zellen.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
wt pRNA p53-pRNA
relative p53-Genexpression
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
wt pRNA p53-pRNA
relative p53-Genexpression
Abbildung 14: Relative p53-Genexpression in A549 Zellen. Logarithmisch wachsende
Zellen wurden mittels Real-Time RT-PCR untersucht. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem
Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen. Alle
Werte wurden normiert auf das housekeeping-Gen GAPDH. Dargestellt sind Mittelwerte aus
mindestens 6 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Die Untersuchung der relativen p53-Genexpression zeigte, dass die mit dem p53-
siRNA-Plasmid transfizierten A549 Zellen (p53-pRNA) einen stabilen knock-down
Effekt von ca. 80% aufwiesen (Abbildung 14). Die zur Kontrolle mit dem leeren
Ergebnisse und Diskussion
47
Plasmid transfizierten Zellen (pRNA) hatten eine mit den unbehandelten A549
Wildtypzellen (wt) vergleichbare p53-Genexpression. Dies verdeutlicht, dass es sich
bei dem erreichten Effekt nicht um unspezifische Folgen der Transfektion mit dem
Plasmid handelte, sondern um eine gezielte Verringerung der p53-Genexpression
durch RNAi.
Mehrere Arbeiten in der Literatur beschäftigen sich mit dem knock-down von p53
durch RNAi. Brummelkamp et al. (2002) beobachteten in MCF7 Zellen 60 h nach
Transfektion eines Expressionsvektors zur Bildung von p53-siRNA eine
Verminderung der p53-mRNA um ca. 90 % sowie eine deutliche Reduzierung des
p53-Proteins sowohl in unbestrahlten als auch in mit ionisierender Strahlung (IR)
behandelten Zellen. Darüber hinaus wurden nach Co-Transfektion mit einem
Selektionsmarker stabil transfizierte Klone isoliert, die auch nach 2 Monaten noch
einen deutlich veminderten p53-Spiegel aufwiesen. He et al. (2005) verwendeten die
von Brummelkamp et al. (2002) beschriebene Methode in embryonalen Stammzellen
und fanden ebenfalls eine Reduktion, aber keinen kompletten Verlust des p53-
Proteins in stabil transfizierten Zellen. In weiteren Arbeiten wurden die von
Brummelkamp et al. (2002) beschriebenen siRNA-Sequenzen benutzt, um mit viralen
Vektoren einen stabilen p53 knock-down in menschlichen Zellen zu generieren. Dies
führte in primären menschlichen Fibroblasten zu einer funktionellen p53-Defizienz
und das Protein war mittels Westernblot nicht mehr nachweisbar (Barton und
Medzhitov, 2002). In transfizierten MCF7 Zellen hingegen war p53 noch nachweisbar
und auch induzierbar, allerdings auf geringerem Niveau als bei den nicht-
transfizierten Kontrollen (Troester et al., 2006).
Die eigenen Ergebnisse, für die ebenfalls die von Brummelkamp et al. (2002)
beschriebenen siRNA-Sequenzen verwendet wurden, zeigen eine recht gute
Übereinstimmung mit den Werten aus der Literatur. Dass die Vergleichbarkeit dabei
auch von den verwendeten Zelllinien mitbestimmt wird, verdeutlichen die zitierten
Arbeiten.
Ergebnisse und Diskussion
48
5.2 Zytotoxizität
Zur Erfassung zytotoxischer Wirkungen wurde die Koloniebildungsfähigkeit sowie
zum Teil auch die Zellzahl nach entsprechender Behandlung der Zellen untersucht.
Während ein Rückgang der Zellzahl eher ein Maß für akute zytotoxische Effekte ist,
werden mit der Koloniebildungsfähigkeit vor allem solche Folgen verdeutlicht, die
sich auf die Wachstums- und Teilungsfähigkeit der Zellen nach mehreren
Teilungszyklen auswirken.
5.2.1 Cadmiumchlorid
Zur Bestimmung der Zytotoxizität von Cadmiumchlorid wurden sowohl die Zellzahl
als auch die Koloniebildungsfähigkeit nach 24-stündiger Inkubation im
Konzentrationsbereich von 0-100 µM Cd(II) untersucht. Die Zellzahl wurde in wildtyp
sowie in p53-pRNA A549 Zellen im Konzentrationsbereich bis 100 µM Cd(II) mit
einem konzentrationsabhängigen Rückgang auf ca. 60 % der Kontrolle nur mäßig
beeinflusst (Abbildung 15).
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
wt
p53-pRNA
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
wt
p53-pRNA
Abbildung 15: Zellzahl nach 24 h Inkubation von A549 Zellen mit CdCl2. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 4 unabhängigen Bestimmungen ± SD. wt: Wildtypzellen, p53-pRNA: mit p53-
siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
49
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wt
p53-pRNA
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wt
p53-pRNA
Abbildung 16: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach 24 h Inkubation mit
CdCl2. Dargestellt sind Mittelwerte aus 12 Bestimmungen ± SD. wt: Wildtypzellen, p53-
pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Bezüglich der Koloniebildungsfähigkeit zeigten wt und p53-pRNA Zellen bis 50 µM
Cd(II) keinen Unterschied; sie verringerte sich konzentrationsabhängig auf ca. 75 %
der Kontrolle (Abbildung 16). Im oberen Konzentrationsbereich ab 60 µM Cd(II)
entwickelte sie sich jedoch unterschiedlich. Während bei den wt A549 Zellen ein
deutlicher Rückgang auf etwa 20 % zu verzeichnen war, verringerte sich die
Koloniebildungsfähigkeit bei den p53-pRNA Zellen nur auf ca. 50 % der Kontrolle bei
100 µM Cd(II).
Bei den HCT116 Zellen konnten schon bei der Zellzahl nach 24 h Inkubation mit
Cadmiumchlorid Unterschiede zwischen den p53-profizienten (p53+/+) und den p53-
defizienten (p53-/-) Zellen festgestellt werden (Abbildung 17). Beide zeigten einen
konzentrationsabhängigen Rückgang der Zellzahl bis auf etwa 40 bzw. 60 % der
Kontrolle bei 100 µM Cd(II). Der Effekt fiel bei den p53+/+ Zellen über den ganzen
Konzentrationsbereich jeweils ca. 10-20 % stärker aus. Auch bei der
Koloniebildungsfähigkeit wurden diese Unterschiede deutlich (Abbildung 18). Sie lag
bei den p53-/- Zellen bei 50 µM Cd(II) noch bei 86 % und verringerte sich bis 100 µM
Cd(II) auf 54 %, während bei den p53+/+ Zellen eine Koloniebildungsfähigkeit von nur
rund 70 % bzw. 25 % bei den genannten Konzentrationen erreicht wurde.
Ergebnisse und Diskussion
50
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Zellzahl (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
Abbildung 17: Zellzahl nach 24 h Inkubation von HCT116 Zellen mit CdCl2. Dargestellt
sind Mittelwerte aus 3 unabhängigen Bestimmungen ± SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen,
p53-/-: p53-defiziente Zellen.
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
10
100
0 25 50 75 100
Cd(II) [µM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
Abbildung 18: Koloniebildungsfähigkeit von HCT116 Zellen nach 24 h Inkubation mit
CdCl2. Dargestellt sind Mittelwerte aus 9 Bestimmungen ± SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen,
p53-/-: p53-defiziente Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
51
Sowohl A549 wildtyp als auch HCT116 p53+/+ Zellen zeigen im Vergleich zu den p53-
defizienten Zellen eine Beeinträchtigung der Koloniebildungsfähigkeit nach 24 h
Inkubation mit Cadmiumchlorid insbesondere bei höheren Konzentrationen. Eine
mögliche Ursache für die beobachtete verstärkte Resistenz der A549 p53-pRNA und
der HCT116 p53-/- Zellen gegen Cd(II) könnte in einer Hemmung der p53-
abhängigen Apoptose in diesen Zellen liegen.
5.2.2 UVC-Strahlung
Bestrahlung mit UVC führte sowohl in den A549 (Abbildung 19) als auch in den
HCT116 Zelllinien (Abbildung 20) zu einem drastischen Rückgang der
Koloniebildungsfähigkeit im Dosisbereich von 5 bis 20 J/m2. Der p53-Status der
Zelllinien hatte keine wesentliche Auswirkung auf die Koloniebildungsfähigkeit. Sie
lag bei 5 J/m2 für die Zelllinien im Bereich von 83-105 % und verringerte sich bei 10
J/m2 auf Werte zwischen 32-56 % der Kontrolle. Bei der höchsten Dosis von 20 J/m2
lag die Koloniebildungsfähigkeit in allen Fällen deutlich unter 10 %.
0,1
1,0
10
100
1000
0 5 10 15 20
UVC-Dosis [J/m²]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
0,1
1,0
10
100
1000
0 5 10 15 20
UVC-Dosis [J/m²]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Abbildung 19: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach UVC-Bestrahlung.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen ± SD. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem
Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
52
1
10
100
0 5 10 15 20
UVC-Dosis [J/m²]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
1
10
100
0 5 10 15 20
UVC-Dosis [J/m²]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
Abbildung 20: Koloniebildungsfähigkeit von HCT116 Zellen nach UVC-Bestrahlung.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 9 Bestimmungen ± SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-:
p53-defiziente Zellen.
Der Einfluss von p53 auf die Überlebensfähigkeit kultivierter Zellen nach UVC-
Bestrahlung wird in der Literatur kontrovers diskutiert. Während Wani et al.(1999) von
einer gesteigerten Sensitivität menschlicher, p53-defizienter Fibroblasten gegenüber
einer Bestrahlung mit UVC berichten, stellen Ford und Hanawalt (1995) eine erhöhte
Resistenz p53-defizienter Fibroblasten im Vergleich zu p53-profizienten Zellen nach
UVC-Bestrahlung fest. In einer weiteren Arbeit wird wiederum von einer erhöhten
Empfindlichkeit von Fibroblasten mit vermindertem p53-Gehalt nach UVC-
Bestrahlung berichtet (Ford et al., 1998).
Ergebnisse und Diskussion
53
5.2.3 Benzo[a]pyrendiolepoxid
Die Untersuchung der Koloniebildungsfähigkeit erfolgte nach einstündiger Inkubation
mit dem reaktiven Benzo[a]pyren-Metaboliten (+)-anti-Benzo[a]pyrendiolepoxid
(BPDE) im Konzentrationsbereich von 0-200 nM. Ein Einfluss auf die Zellzahl war im
mikroskopischen Bild am Ende der Inkubation nicht feststellbar. Bis zu einer
Konzentration von 50 nM lag die Koloniebildungsfähigkeit der A549 Zelllinien im
Bereich von 75-104 % (Abbildung 21). Bei 200 nM BPDE wurde deutlich, dass die
p53-pRNA Zellen etwas weniger empfindlich hinsichtlich der Verringerung der
Koloniebildungsfähigkeit waren. Bei den beiden HCT116 Zelllinien verringerte sich
die Koloniebildungsfähigkeit bis 50 nM BPDE nur auf ca. 90 %, um dann bei 200 nM
für die p53-profizienten Zellen auf ca. 13% und für die p53-defizienten Zellen auf ca.
34 % zurückzugehen (Abbildung 22).
0,1
1,0
10
100
1000
0 50 100 150 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
0,1
1,0
10
100
1000
0 50 100 150 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
wtwt
pRNApRNA
p53-pRNAp53-pRNA
Abbildung 21: Koloniebildungsfähigkeit von A549 Zellen nach 1 h Inkubation mit
(+)-anti-BPDE. 100 % beziehen sich auf die Kontrolle mit 0,1 % Lösungsmittel (THF/0,5 %
Triethylamin). Die Lösungsmittelkontrolle selbst resultierte in einer Koloniebildungsfähigkeit
von > 95 %. Dargestellt sind Mittelwerte aus 9 Bestimmungen ± SD. wt: Wildtypzellen,
pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid
transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
54
1
10
100
0 50 100 150 200
p53
+/+
p53
-/-
(+)-anti-BPDE [nM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
1
10
100
0 50 100 150 200
p53
+/+
p53
-/-
(+)-anti-BPDE [nM]
Koloniebildungsfähigkeit (% der Kontrolle)
Abbildung 22: Koloniebildungsfähigkeit von HCT116 Zellen nach 1 h Inkubation mit
(+)-anti-BPDE. 100 % beziehen sich auf die Kontrolle mit 0,1 % Lösungsmittel (THF/0,5 %
Triethylamin). Die Lösungsmittelkontrolle selbst resultierte in einer Koloniebildungsfähigkeit
von > 95 %. Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen ± SD. p53+/+: p53-profiziente
Zellen, p53-/-: p53-defiziente Zellen.
Die bei höheren BPDE-Konzentrationen insbesondere bei den HCT116 Zellen
beobachtete verringerte Sensitivität der p53-defizienten Zellen gegenüber BPDE
beruht möglicherweise auf einer Hemmung p53-abhängiger apoptotischer Prozesse.
Kho et al. (2004) berichten zum Beispiel von verringerter Apoptose nach Behandlung
mit 5-Fluorouracil in HCT116 p53-/- Zellen im Vergleich zu p53-profizienten
Kontrollen. Von einer verringerten Koloniebildungsfähigkeit in p53-defizienten
menschlichen Fibroblasten im Vergleich zu Wildtyp-Fibroblasten nach Inkubation mit
(±)-anti-BPDE berichten Wani et al. (2000). Sie konnten in p53-defizienten
Fibroblasten einen erhöhten Apoptose-Index nach Inkubation mit 1,2 µM (±)-anti-
BPDE feststellen. Allerdings sind apoptotische Prozesse auch abhängig vom Zelltyp
und menschliche Fibroblasten sind bekannt für eine gewisse Apoptoseresistenz
(Wani et al., 2000).
Ergebnisse und Diskussion
55
5.3 Zellzyklusuntersuchungen
Die Bestimmung der Zellzyklusverteilung erfolgte am Durchflusszytometer. Dazu
wurden die Zellen fixiert und die DNA mit dem Fluoreszenzfarbstoff 4´,6-Diamidino-2-
phenylindol (DAPI) angefärbt. DAPI bindet bevorzugt in AT-reichen Regionen an die
kleine Furche der DNA, wodurch sich seine Fluoreszenzaktivität etwa 20-fach
verstärkt (Kubista et al., 1987; Karlsson et al., 2003). Die durch Fluoreszenzmessung
auf Einzelzellebene erhaltenen Daten wurden mittels FlowMax-Software
ausgewertet.
5.3.1 Einfluss von Cadmiumchlorid auf die Zellzykluskontrolle nach
UVC-Bestrahlung
In A549 Zellen wurden die Auswirkungen einer Inkubation mit Cadmiumchlorid auf
die Zellzykluskontrolle nach UVC-Bestrahlung und die Rolle von p53 untersucht.
Dazu wurden die Zellen nach 24 h Inkubation mit Cd(II) mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und
anschließend 9 h nachinkubiert. Aus Vorversuchen in der Arbeitsgruppe ist bekannt,
dass eine UVC-Bestrahlung zu einem S-Phasen Arrest führt, dessen Maximum nach
etwa 9 h erreicht wird.
In A549 Wildtypzellen führte die Inkubation mit Cd(II) zu einem geringfügigen Anstieg
der Zellen in der G1-Phase und einem entsprechenden Rückgang in der S-Phase
(Abbildung 23). Der Anteil der Zellen in der G2/M-Phase blieb unverändert. UVC-
Bestrahlung führte nach 9 h zu einem deutlichen S-Phasen Arrest, der sich in den mit
Cd(II) vorbehandelten Zellen konzentrationsabhängig verringerte. Der Anteil der
Zellen in der G2/M-Phase blieb nahezu konstant. Ein qualitativ vergleichbares Bild
ergab sich sowohl bei A549 pRNA Zellen (Abbildung 24) als auch bei der
Untersuchung von A549 p53-pRNA Zellen (Abbildung 25). Der veränderte p53-Status
führte somit weder zu einer Beeinflussung der Zellzyklusverteilung nach Cd(II)-
Inkubation noch änderten sich die Auswirkungen einer Kombinationsbehandlung aus
Cd(II)-Inkubation und UVC-Bestrahlung. Zudem blieb der S-Phasen Arrest nach
UVC-Bestrahlung unabhängig vom p53-Status bestehen. Dies deutet darauf hin,
dass die teilweise Aufhebung des S-Arrests duch Cd(II) nicht durch eine
Wechselwirkung des Metalls mit p53 verursacht wird.
Ergebnisse und Diskussion
56
Bislang sind nur wenige Arbeiten zum Einfluss von Cd(II) auf den Zellzyklus
veröffentlicht. Die Inkubation von MCF7 Zellen mit bis zu 30 µM CdCl2 für 4 h hatte
keine Auswirkung auf die Zellzyklusverteilung (Meplan et al., 1999). Allerdings ist der
Zeitraum von 4 h sehr kurz gewählt und lässt daher kaum Effekte erwarten. Eine
weitere Arbeit beschreibt einen S-Phasen Arrest in MCF7 Zellen nach 12 h
Inkubation mit CdCl2 (Lee et al., 2005). Yang et al. (2004) berichten von einer
konzentrationsabhängigen Zunahme der Zellen in der G2/M-Phase nach 24 h
Inkubation mit 1 µM CdCl2 in CHO Zellen. Ein spezifischer Einfluss von Cd(II) auf die
Zellzyklusverteilung ist somit nicht erkennbar und lässt vermuten, dass die
Auswirkungen eher Zelltyp-abhängig sind.
0
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0 25 50 60 0
+UVC
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+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
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+UVC
25
+UVC
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+UVC
60
+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 23: Zellzyklusverteilung von A549 Wildtypzellen nach Inkubation mit CdCl2
und UVC-Bestrahlung. Die Zellen wurden 24 h mit Cd(II) vorinkubiert, mit 5 J/m2 UVC
bestrahlt und 9 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
57
0
10
20
30
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0 25 50 60 0
+UVC
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+UVC
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+UVC
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+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
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+UVC
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+UVC
50
+UVC
60
+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 24: Zellzyklusverteilung von A549 pRNA Zellen nach Inkubation mit CdCl2
und UVC-Bestrahlung. Die Zellen wurden 24 h mit Cd(II) vorinkubiert, mit 5 J/m2 UVC
bestrahlt und 9 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen
Bestimmungen + SD.
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+UVC
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+UVC
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+UVC
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+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
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S
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0 25 50 60 0
+UVC
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+UVC
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+UVC
60
+UVC
Cd(II) [µM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 25: Zellzyklusverteilung von A549 p53-pRNA Zellen nach Inkubation mit
CdCl2 und UVC-Bestrahlung. Die Zellen wurden 24 h mit Cd(II) vorinkubiert, mit 5 J/m2
UVC bestrahlt und 9 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
58
Zur Überprüfung der mit den knock-down Zellen erhaltenen Ergebnisse wurden
Untersuchungen mit den HCT116 Zelllinien durchgeführt. Unbehandelte p53-
profiziente HCT116 Zellen unterschieden sich in ihrer Zellzyklusverteilung kaum von
p53-defizienten HCT116 Zellen (Abbildung 26). Nach Bestrahlung mit 5 J/m2 UVC
und 9 h Nachinkubationszeit zeigten beide Zelllinien einen gleich stark ausgeprägten
S-Phasen Arrest. Somit konnte in Übereinstimmung mit der Literatur keine
Beteiligung von p53 am S-Phasen Arrest festgestellt werden (Iliakis et al., 2003).
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p53
+/+
p53
-/-
p53
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-/-
+UVC
Anteil der Zellen (%)
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p53
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p53
+/+
+UVC
p53
-/-
+UVC
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 26: Zellzyklusverteilung von HCT116 Zellen nach UVC-Bestrahlung. Die
Zellen wurden mit 5 J/m2 UVC bestrahlt und 9 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte
aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-:
p53-defiziente Zellen.
In Folge einer UVC-Bestrahlung kommt es zur Hemmung der DNA-Replikation. Die
DNA-Replikation startet in eukaryotischen Zellen an vielen Replikationsursprüngen
sowohl zu Beginn als auch gegen Ende der S-Phase. UV-induzierte DNA-Schäden
behindern das Vorankommen der Replikationsgabeln durch Blockierung der
replikativen Polymerasen. Dadurch wird eine Signalkaskade ausgelöst, die zur
Hemmung der Replikon-Initiation führt. Daran beteiligt sind unter anderem der so
genannte 9-1-1-Komplex sowie ATR und Chk1. Die Aktivierung des S-Phasen-
Ergebnisse und Diskussion
59
Kontrollpunktes führt neben der Hemmung der Replikon-Initiation auch zur
Stabilisierung blockierter Replikationsgabeln. DNA-Reparaturprozesse und die TLS
(translesion synthesis) können dann zur Aufhebung des S-Phasen Arrests beitragen
(Heffernan et al., 2002; Lambert und Carr, 2005). Bei der TLS werden die blockierten
replikativen Polymerasen durch TLS-Polymerasen, die in der Lage sind,
replikationshemmende DNA-Läsionen zu überwinden, ersetzt. So wird zum Beispiel
durch die Polymerase η eine im Fall von Thymin-Dimeren fehlerfreie Replikation
ermöglicht (Kannouche und Stary, 2003).
5.3.2 Einfluss von Actinomycin D auf die Zellzyklusverteilung
Actinomycin D (ActD) ist ein Polypeptid-Antibiotikum, das auf Grund seiner
zytotoxischen Eigenschaften in der Tumortherapie eingesetzt wird. Es interkaliert in
die DNA und führt zur Hemmung der Transkription. Durch Wechselwirkungen mit
DNA-Topoisomerase I und II kann Actinomycin D zur Bildung von DNA-Einzel- und
Doppelstrangbrüchen beitragen. Topoisomerasen spielen eine wichtige Rolle bei der
Transkription und Replikation der DNA, indem sie zur Überwindung topologischer
Probleme die kontrollierte Einführung und Rückbildung von DNA-Einzel- und
Doppelstrangbrüchen ermöglichen (Wassermann et al., 1990; Li und Liu, 2001).
A549 Zellen wurden 21 h mit 5 nM ActD behandelt und auf ihre Zellzyklusverteilung
untersucht (Abbildung 27). Die Inkubationsbedingungen wurden der Literatur
entnommen (Khan und Anderson, 2001) und in Vorversuchen getestet. In der
Literatur wird für A549 Zellen nach Inkubation mit 5 nM ActD ein starker G1-Arrest
und ein leichter G2/M-Arrest beschrieben (Khan und Anderson, 2001). In den
eigenen Untersuchungen zeigten A549 wt und pRNA Zellen einen ausgeprägten G1-
und G2/M- Arrest sowie einen starken Rückgang von Zellen in der S-Phase auf unter
ein Prozent. Im Gegensatz dazu konnte in A549 p53-pRNA Zellen kein G2/M-Arrest
beobachtet werden. Zusätzlich war der G1-Phasen Arrest in den p53 knock-down
Zellen verringert. Dies lässt sich am Anteil von etwa 15 % Zellen in der S-Phase
deutlich erkennen.
Ergebnisse und Diskussion
60
0
10
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wt pRNA p53-pRNA wt
+ActD
pRNA
+ActD
p53-pRNA
+ActD
Anteil der Zellen (%)
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wt pRNA p53-pRNA wt
+ActD
pRNA
+ActD
p53-pRNA
+ActD
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 27: Zellzyklusverteilung von A549 Zellen nach Behandlung mit
Actinomycin D. Die Zellen wurden 21 h mit 5 nM ActD inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte
aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem
Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
In HCT116 p53+/+ Zellen führte die Behandlung mit ActD ebenfalls zu einem
ausgeprägten Arrest in den G1- und G2/M-Phasen des Zellzyklus, wobei hier der
Anteil der Zellen in der G2/M-Phase deutlich überwog (Abbildung 28). Zudem war
auch hier wieder ein drastischer Rückgang der Zellen in der S-Phase festzustellen. In
p53-/- Zellen war hingegen der Anteil der Zellen in der S-Phase im Vergleich zu
unbehandelten Zellen praktisch unverändert. Ein G1-Arrest konnte nicht festgestellt
werden. Der Anteil der Zellen in der G2/M-Phase war hingegen erhöht.
Ergebnisse und Diskussion
61
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p53
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p53
-/-
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+ActD
p53
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+ActD
Anteil der Zellen (%)
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p53
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+/+
+ActD
p53
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+ActD
Anteil der Zellen (%)
G1
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G2/M
Abbildung 28: Zellzyklusverteilung von HCT116 Zellen nach Behandlung mit
Actinomycin D. Die Zellen wurden 21 h mit 5 nM ActD inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte
aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-:
p53-defiziente Zellen.
Die beobachtete Beeinflussung des G1- und G2/M-Arrests in den p53-defizienten
Zellen lässt sich möglicherweise auf die Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle
zurückführen. Als Transkriptionsfaktor ist p53 unter anderem an der Regulation von
p21, 14-3-3σ und GADD45 beteiligt. Während p21 sowohl beim G1/S- als auch beim
G2/M-Übergang involviert ist, werden 14-3-3σ und GADD45 vor allem mit dem G2/M-
Arrest in Verbindung gebracht (Stewart und Pietenpol, 2001). In HCT116 Zellen
identifizierten Waldman et al. (1995) p21 als den zentralen Faktor im p53-abhängigen
G1-Arrest. Ebenfalls in HCT116 Zellen konnte die Abhängigkeit von p53 und p21 für
die Aufrechterhaltung des G2-Arrests nach DNA-Schädigung festgestellt werden
(Bunz et al., 1998).
Ergebnisse und Diskussion
62
5.3.3 Einfluss von Benzo[a]pyrendiolepoxid auf den Zellzyklus
Als weiteres schädigendes Agens wurde (+)-anti-Benzo[a]pyrendiolepoxid (BPDE)
eingesetzt, um den Einfluss auf den Zellzyklus zu untersuchen. Aus Vorversuchen in
der Arbeitsgruppe war bekannt, dass maximale Effekte auf den Zellzyklus in A549
Zellen nach 8 h Nachinkubationszeit festzustellen sind. In A549 Wildtypzellen
(Abbildung 29) trat nach Inkubation mit 10-200 nM BPDE ein
konzentrationsabhängiger S-Phasen Arrest auf, der sich im qualitativ gleichen Bild
auch in den A549 pRNA und p53-pRNA Zellen darstellte (Abbildung 30 und
Abbildung 31). Diese Untersuchungen wurden auch in den HCT116 Zelllinien
durchgeführt. Dabei zeigte sich ebenfalls ein ausgeprägter konzentrationsabhängiger
S-Phasen Arrest, der wiederum unabhängig vom p53-Status war (Abbildung 32 und
Abbildung 33).
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(+)-
anti
-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
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(+)-
anti
-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 29: Zellzyklusverteilung von A549 Wildtypzellen nach Inkubation mit BPDE.
Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE behandelt und 8 h nachinkubiert. Dargestellt sind
Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
63
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(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
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(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 30: Zellzyklusverteilung von A549 pRNA Zellen nach Inkubation mit BPDE.
Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE behandelt und 8 h nachinkubiert. Dargestellt sind
Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
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(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
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0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 31: Zellzyklusverteilung von A549 p53-pRNA Zellen nach Inkubation mit
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE behandelt und 8 h nachinkubiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
64
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(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
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10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 32: Zellzyklusverteilung von HCT116 p53+/+ Zellen nach Inkubation mit
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE behandelt und 8 h nachinkubiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
0
10
20
30
40
50
60
70
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
Anteil der Zellen (%)
G1
S
G2/M
Abbildung 33: Zellzyklusverteilung von HCT116 p53-/- Zellen nach Inkubation mit
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE behandelt und 8 h nachinkubiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
65
Das Auftreten eines S-Phasen Arrests nach Behandlung mit BPDE ist aus der
Literatur bekannt. Sowohl in MCF7 als auch in A549 Zellen wurde 21 h nach BPDE-
Inkubation eine deutliche Zunahme von Zellen in der S-Phase beschrieben (Khan
und Dipple, 2000; Khan und Anderson, 2001). Im Gegensatz zur Behandlung mit
anderen DNA-schädigenden Agenzien wurde auch in den eigenen Untersuchungen
kein G1-Arrest beobachtet. Eine weitere Arbeit mit menschlichen Epithelzellen aus
Brustgewebe zeigte 10 h nach Behandlung mit BPDE ebenfalls einen Arrest in der S-
Phase sowie in der G2/M-Phase (Wang et al., 2003). Ein G1-Arrest wurde abermals
nicht beobachtet. Mechanistische Betrachtungen von Guo et al. (2002) deuten auf
eine Beteiligung von ATR und Chk1 am S-Phasen Kontrollpunkt nach BPDE-
Inkubation hin, der als p53-unabhängig beschrieben wird. Wie schon beim UVC-
induzierten S-Phasen Arrest erläutert, wird auch hier der TLS eine wichtige Rolle bei
der Aufhebung des S-Arrests zugeschrieben. Polymerase κ ist in der Lage, die
entstandenen Guaninaddukte zu umgehen und ein Cytosin gegenüber der Läsion
einzubauen (Bi et al., 2005).
Ergebnisse und Diskussion
66
5.4 Untersuchung der Protein- und Genexpression nach BPDE-
Inkubation
5.4.1 Einfluss von BPDE auf p53 und XPC auf Proteinebene
Zur Untersuchung der Folgen einer BPDE-Inkubation auf p53 und XPC auf
Proteinebene wurden Westernblot-Analysen durchgeführt. Dazu wurden zum einen
Proben zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach BPDE-Inkubation und zum anderen
die Konzentrationsabhängigkeit nach einer bestimmten Nachinkubationszeit
untersucht. In A549 Zellen wurde die zeitabhängige Reaktion auf eine Inkubation mit
50 nM BPDE betrachtet (Abbildung 34). In wt, pRNA und p53-pRNA Zellen konnte
eine zeitabhängige Zunahme an p53-Protein festgestellt werden, die ihr Maximum
bei einer Nachinkubationszeit von 8 h erreichte und nach 24 h wieder auf das
Ausgangsniveau zurückging. In den unbehandelten Proben wurde über den
untersuchten Zeitraum keine Veränderung im p53-Proteingehalt detektiert. Die
Betrachtung des XPC-Proteins zeigte unabhängig von der BPDE-Behandlung zu
keinem Zeitpunkt eine wesentliche Veränderung.
Zusammenfassend ist in Abbildung 35 die Auswertung der p53-Westernblot-
Analysen der drei verschiedenen A549 Zelllinien zu den verschiedenen Zeitpunkten
nach BPDE-Inkubation dargestellt. Da die Westerblot-Analysen für die drei A549
Zelllinien aus technischen Gründen getrennt voneinander durchgeführt wurden, ist
der Bezug auf eine gemeinsame Kontrolle nicht möglich. Daher wurden die
Proteingehalte auch in den folgenden Abbildungen auf die jeweilige unbehandete
Kontrolle nach 0 h Nachinkubation bezogen. Dabei lässt sich übereinstimmend
erkennen, dass nach 8 h Nachinkubation ein Maximum in der p53-Proteinmenge
auftrat. Die unbehandelten Kontrollen veränderten sich über den untersuchten
Zeitraum nur wenig.
Ergebnisse und Diskussion
67
p53
XPC
Aktin
4 8 24 0 4 240
Zeit (h)
8
BPDE
- - - + + +- +
p53
XPC
Aktin
A549 wt
A549 pRNA
p53
XPC
Aktin
A549 p53-pRNA
p53
XPC
Aktin
4 8 24 0 4 240
Zeit (h)
8
BPDE
- - - + + +- +
p53
XPC
Aktin
A549 wt
A549 pRNAA549 pRNA
p53
XPC
Aktin
A549 p53-pRNAA549 p53-pRNA
Abbildung 34: Westernblot-Analyse von p53 und XPC in A549 Zellen nach Inkubation
mit 50 nM BPDE. Aktin wurde als Ladekontrolle detektiert. Die Zellen wurden 1 h mit
(+)-anti-BPDE inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Dargestellt sind repräsentative Blots von 2
unabhängigen Versuchen. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen,
p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
68
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 4 8 24 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
p53-Protein (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Nachinkubationszeit (h)
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
0 4 8 24 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
p53-Protein (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Nachinkubationszeit (h)
Abbildung 35: p53-Proteingehalt in A549 Zellen nach Inkubation mit 50 nM BPDE.
Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 2 unabhängigen Versuchen, jeweils bezogen auf die unbehandelte Kontrolle
nach 0 h. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit
p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Weiterhin wurde die konzentrationsabhängige Veränderung der p53- und XPC-
Proteinmenge betrachtet. Die A549 Zellen wurden mit Konzentrationen von 0-200 nM
BPDE behandelt und nach 8 h Nachinkubationszeit mittels Westernblot-Analyse
untersucht. Unabhängig vom p53-Status der Zellen führte die Inkubation im unteren
Konzentrationsbereich von 0-50 nM BPDE nach 8 h Nachinkubationszeit nur zu einer
mäßigen, konzentrationsabhängigen Zunahme im p53-Proteingehalt (Abbildung 36).
Erst die Inkubation mit 100 nM und vor allem 200 nM BPDE führte zu einem starken
Anstieg der p53-Proteinmenge auf das 4- bis 5,5-Fache der Kontrolle (Abbildung 37).
Im gesamten Konzentrationsbereich konnte praktisch keine Veränderung im XPC-
Proteingehalt der Zellen festgestellt werden.
Ergebnisse und Diskussion
69
p53
XPC
Aktin
0 10 20 50 100 200
BPDE [nM]
p53
XPC
Aktin
p53
XPC
Aktin
A549 wt
A549 pRNA
A549 p53-pRNA
p53
XPC
Aktin
0 10 20 50 100 200
BPDE [nM]
p53
XPC
Aktin
p53
XPC
Aktin
A549 wt
A549 pRNA
p53
XPC
Aktin
p53
XPC
Aktin
A549 wt
A549 pRNAA549 pRNA
A549 p53-pRNAA549 p53-pRNA
Abbildung 36: Westernblot-Analyse von p53 und XPC in A549 Zellen nach Inkubation
mit 0-200 nM BPDE. Aktin wurde als Ladekontrolle detektiert. Die Zellen wurden 1 h mit
(+)-anti-BPDE inkubiert und 8 h nachinkubiert. Dargestellt sind repräsentative Blots von 2
unabhängigen Versuchen. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen,
p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
70
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53-Protein (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53-Protein (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Abbildung 37: p53-Proteingehalt in A549 Zellen nach Inkubation mit 0-200 nM BPDE.
Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 8 h nachinkubiert. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 2 unabhängigen Versuchen, jeweils bezogen auf die unbehandelte Kontrolle.
wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-
Plasmid transfizierte Zellen.
Mit den HCT116 Zelllinien wurden ebenfalls Versuche zur zeitabhängigen
Veränderung der p53- und XPC-Proteinmenge nach Inkubation mit BPDE
durchgeführt. Vorversuche mit 50 nM führten zu keiner detektierbaren Veränderung,
so dass in den weiteren Versuchen mit einer Konzentration von 200 nM BPDE
gearbeitet wurde. Diese Konzentration führte in den p53-profizienten Zellen nach 4 h
Nachinkubationszeit zu einem Anstieg der p53-Proteinmenge, die bei 8 h ein
Maximum erreichte und auch nach 24 h noch nicht wieder auf das Ausgangsniveau
zurückgegangen war (Abbildung 38 und Abbildung 39). Bei den p53-defizienten
Zellen konnte erwartungsgemäß in keinem Fall p53-Protein nachgewiesen werden.
In beiden Zelllinien blieb die XPC-Proteinmenge bei allen Proben relativ konstant.
Ergebnisse und Diskussion
71
p53
XPC
Aktin
4 8 24 0 4 240
Zeit (h)
p53
XPC
Aktin
HCT116 p53
+/+
8
BPDE
- - - + + +- +
HCT116 p53
-/-
p53
XPC
Aktin
4 8 24 0 4 240
Zeit (h)
p53
XPC
Aktin
HCT116 p53
+/+
p53
XPC
Aktin
HCT116 p53
+/+
HCT116 p53
+/+
8
BPDE
- - - + + +- +
HCT116 p53
-/-
HCT116 p53
-/-
Abbildung 38: Westernblot-Analyse von p53 und XPC in HCT116 Zellen nach
Inkubation mit 200 nM BPDE. Aktin wurde als Ladekontrolle detektiert. Die Zellen wurden
1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Dargestellt sind repräsentative
Blots von 2 unabhängigen Versuchen. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-defiziente
Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
72
0
50
100
150
200
250
300
350
0 4 8 24 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
p53-Protein (% der Kontrolle)
Nachinkubationszeit (h)
0
50
100
150
200
250
300
350
0 4 8 24 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
p53-Protein (% der Kontrolle)
Nachinkubationszeit (h)
Abbildung 39: p53-Proteingehalt in HCT116 p53+/+ Zellen nach Inkubation mit 200 nM
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0-24 h nachinkubiert.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 2 unabhängigen Versuchen.
Die folgende Untersuchung der konzentrationsabhängigen Veränderung der p53-
und XPC-Proteinmenge in den HCT116 Zelllinien wurde ebenfalls im Bereich von 0-
200 nM BPDE nach 8 h Nachinkubationszeit durchgeführt. Im unteren
Konzentrationsbereich von 0-50 nM BPDE erfolgte nur eine geringe Zunahme der
p53-Proteinmenge (Abbildung 40). Eine deutliche Zunahme wurde in den p53-
profizienten Zellen erst ab 100 nM BPDE festgestellt, um bei 200 nM BPDE auf mehr
als das 4-Fache der Kontrolle anzusteigen (Abbildung 41). Auch hier konnte wie
erwartet bei den p53 knock-out Zellen in keinem Fall p53-Protein nachgewiesen
werden. Bei beiden Zelllinien konnte keine konzentrationsabhängige Veränderung
der XPC-Proteinmenge festgestellt werden.
Ergebnisse und Diskussion
73
p53
XPC
Aktin
0 10 20 50 100 2000
BPDE [nM]
HCT116 p53
-/-
p53
XPC
Aktin
HCT116 p53
+/+
p53
XPC
Aktin
0 10 20 50 100 2000
BPDE [nM]
HCT116 p53
-/-
p53
XPC
Aktin
HCT116 p53
+/+
Abbildung 40: Westernblot-Analyse von p53 und XPC in HCT116 Zellen nach
Inkubation mit 0-200 nM BPDE. Aktin wurde als Ladekontrolle detektiert. Die Zellen wurden
1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 8 h nachinkubiert. Dargestellt sind repräsentative Blots
von 2 unabhängigen Versuchen. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-defiziente Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
74
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53-Protein (% der Kontrolle)
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 50 100 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53-Protein (% der Kontrolle)
Abbildung 41: p53-Proteingehalt in HCT116 p53+/+ Zellen nach Inkubation mit 0-200 nM
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 8 h nachinkubiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus 2 unabhängigen Versuchen.
Pääjärvi et al. (2004) beobachteten in A549 Zellen 3 h nach Exposition mit 0,01-1 µM
BPDE eine konzentrationsabhängige Zunahme des p53-Proteins. In HCT116 Zellen
wurde die zeitabhängige Zunahme von p53 nach Inkubation mit 1 µM BPDE
untersucht (Wani et al., 2002). Dabei war nach 8 h eine deutliche Zunahme
erkennbar, die nach 24 h ein Maximum erreichte. Diese zeitliche Verschiebung der
maximalen Induktion von p53 ist möglicherweise auf die 5-fach höhere Konzentration
an BPDE im Vergleich zu den eigenen Ergebnissen zurückzuführen. In menschlichen
Brustepithelzellen wurde 2 h nach Behandlung mit 1 µM BPDE ein Anstieg der p53-
Menge beobachtet, der nach 10 h ein Maximum erreichte und nach 24 h noch über
dem Anfangsniveau lag (Wang et al., 2003). Weitere Arbeiten untersuchten die
Induktion von p53 in menschlichen Fibroblasten. Dabei wurde ebenfalls eine
konzentrationsabhängige Zunahme der p53-Menge 8 h nach Behandlung mit
0,3-1,2 µM BPDE (Wani et al., 2000) sowie eine Zeitabhängigkeit mit einem
Maximum bei 24 h nach Inkubation mit 1,2 µM BPDE festgestellt (Lloyd und
Hanawalt, 2000). Die in der Literatur beschriebene Konzentrations- und
Zeitabhängigkeit spiegelt sich überwiegend in den eigenen Ergebnissen wider.
Ergebnisse und Diskussion
75
Allerdings wurden in der Literatur meist wesentlich höhere BPDE-Konzentrationen
eingesetzt, die zum Teil deutlich im zytotoxischen Bereich lagen.
Für den XPC-Proteingehalt konnte weder eine Zeit- noch eine
Konzentrationsabhängigkeit nach Inkubation mit BPDE in den untersuchten Zelllinien
festgestellt werden. XPC wird als essentiell für die Schadenserkennung in der
globalen NER angesehen und unterliegt der transkriptionellen Regulation durch p53
(Adimoolam und Ford, 2002). Die p53-vermittelte, zeit- und dosisabhängige Induktion
nach UVC-Bestrahlung wurde in der Literatur auch in HCT116 Zellen beschrieben
(Adimoolam und Ford, 2002). Eine vergleichbare Abhängigkeit wurde nach BPDE-
Inkubation ebenfalls vermutet, konnte in den eigenen Versuchen aber nicht bestätigt
werden. Andererseits konnte gezeigt werden, dass selbst in den p53 knock-out
Zellen XPC nachweisbar ist. Dies deutet darauf hin, dass zumindest ein gewisser
Grundspiegel an XPC unabhängig von p53 in den Zellen vorliegt. Möglicherweise
würden höhere BPDE-Konzentrationen zur Induktion von XPC in den p53-
profizienten Zellen führen oder die in der Literatur gezeigte Induktion ist eine
spezifische Folge der UVC-Bestrahlung.
Ergebnisse und Diskussion
76
5.4.2 Einfluss von BPDE auf die Genexpression von p53, p48, p21 und
XPC
Zur Untersuchung der Genexpression wurde aus den Zellen nach Inkubation mit
BPDE und verschiedenen Nachinkubationszeiten von 0-24 h die RNA isoliert, eine
cDNA-Synthese aus der mRNA und schließlich eine Real-Time PCR-Analyse
durchgeführt. Daraus wurde die relative Genexpression der Proben, normiert auf das
housekeeping-Gen GAPDH, bestimmt.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Kontrolle 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Kontrolle 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
Abbildung 42: Relative Genexpression von p53, p48, XPC und p21 in A549
Wildtypzellen nach Inkubation mit 50 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE
inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Kontrolle: ohne BPDE-Inkubation. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD.
In A549 wt und pRNA Zellen ergab sich dabei ein vergleichbares Bild (Abbildung 42
und Abbildung 43). Bei beiden Zelltypen blieb die relative p53-Genexpression über
den gesamten Zeitraum nach Inkubation mit 50 nM BPDE nahezu konstant. Die
relative Genexpression von XPC zeigte nach 4 h eine leichte Steigerung auf das ca.
1,6-Fache im Vergleich zur Kontrolle, um sich nach 24 h Nachinkubationszeit wieder
nahezu den Ausgangswerten anzugleichen. Die Genexpression von p48 zeigte zwar
einen ganz ähnlichen Verlauf, die knapp 1,3-fache Steigerung bei 4 h war jedoch
sehr gering. Die relative Genexpression von p21 zeigte nach 4 h eine kräftige
Ergebnisse und Diskussion
77
Steigerung um das 3-Fache im Vergleich zur Kontrolle und ging nach 8 bzw. 24 h
Nachinkubationszeit wieder auf das 2,5- bzw. 2-Fache der Kontrolle zurück.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
Abbildung 43: Relative Genexpression von p53, p48, XPC und p21 in A549 pRNA
Zellen nach Inkubation mit 50 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE
inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Kontrolle: A549 Wildtypzellen ohne BPDE-Inkubation.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD.
Die relative Genexpression von p53 war in den A549 p53-pRNA Zellen im Vergleich
zu unbehandelten A549 Wildtypzellen als Kontrolle erwartungsgemäß verringert und
blieb über den betrachteten Zeitraum unabhängig von der BPDE-Behandlung relativ
konstant (Abbildung 44). Bezüglich der relativen Genexpression von p48 und XPC
ergaben sich auch bei den unbehandelten p53 knock-down Zellen keine
wesentlichen Unterschiede im Vergleich zu den A549 wt oder pRNA Zellen. Nach
Inkubation mit 50 nM BPDE war hier ebenfalls ein leichter Anstieg nach 4 h
Nachinkubationszeit und nach 24 h ein Rückgang auf das Ausgangsniveau zu
verzeichnen. Die relative Genexpression von p21 war nach 4 h ebenfalls erhöht,
allerdings nur knapp um den Faktor 2 und damit weniger als bei den wt oder pRNA
Zellen und ging nach 8 bzw. 24 h Nachinkubationszeit etwa auf das 1,3-Fache der
Kontrolle zurück.
Ergebnisse und Diskussion
78
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
Abbildung 44: Relative Genexpression von p53, p48, XPC und p21 in A549 p53-pRNA
Zellen nach Inkubation mit 50 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE
inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Kontrolle: A549 Wildtypzellen ohne BPDE-Inkubation.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD.
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Kontrolle 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
Kontrolle 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p53
p48
XPC
p21
Abbildung 45: Relative Genexpression von p53, p48, XPC und p21 in HCT116 p53+/+
Zellen nach Inkubation mit 200 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE
inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Kontrolle: ohne BPDE-Inkubation. Dargestellt sind
Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD.
Ergebnisse und Diskussion
79
Die Untersuchungen an den HCT116 Zelllinien erfolgten nach Inkubation mit 200 nM
BPDE. Dabei veränderte sich in HCT116 p53+/+ Zellen vor allem die relative
Genexpression von p21, die sich nach 4 h Nachinkubationszeit etwa auf das 3-Fache
der Kontrolle erhöhte und nach 24 h auf das 4,5-Fache anstieg (Abbildung 45). Die
relative Genexpression von p48 erhöhte sich zeitabhängig auf das 1,9-Fache der
Kontrolle nach 24 h Nachinkubationszeit. Ebenso steigerte sich die relative
Genexpression von XPC auf das 1,5-Fache in diesem Zeitraum. Die relative
Genexpression von p53 war relativ konstant über den untersuchten Zeitraum und
zeigte lediglich nach 24 h eine leichte Erhöhung auf das 1,3-Fache im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p48
XPC
p21
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Kontrolle 0 0
+BPDE
4
+BPDE
8
+BPDE
24
+BPDE
Nachinkubationszeit (h)
relative Genexpression
p48
XPC
p21
Abbildung 46: Relative Genexpression von p53, p48, XPC und p21 in HCT116 p53-/-
Zellen nach Inkubation mit 200 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE
inkubiert und 0-24 h nachinkubiert. Kontrolle: HCT116 p53+/+ Zellen ohne BPDE-Inkubation.
Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 Bestimmungen + SD.
In den HCT116 p53-/- Zellen lag das Niveau der relativen Genexpression von p48 bei
rund 50 % der unbehandelten p53-profizienten Zellen und veränderte sich auch zu
den verschiedenen Zeitpunkten nach der BPDE-Inkubation nur unwesentlich
(Abbildung 46). Ähnlich verhielt sich die relative Genexpression von XPC, die bei
rund 80 % der Kontrolle lag und zu keinem Zeitpunkt eine wesentliche Veränderung
Ergebnisse und Diskussion
80
aufwies. Die relative Genexpression von p21 lag in den unbehandelten p53-
defizienten Zellen bei etwa 20 % im Vergleich zur p53-profizienten Kontrolle. Bei 4 h
Nachinkubationszeit war sie wie bei den p53+/+ Zellen auf das 3-Fache ihres
Ausgangswertes erhöht, was einem Wert von knapp 60 % der Kontrolle entspricht.
Im Gegensatz zu den p53-profizienten Zellen war jedoch nach 24 h
Nachinkubationszeit keine weitere Erhöhung der relativen p21-Genexpression in den
p53 knock-out Zellen zu beobachten.
Mit dem Einfluss von BPDE auf die Genexpression in menschlichen Zellen haben
sich erst wenige Arbeiten beschäftigt. Mittels Genchip-Analysen wurde der Einfluss
einer BPDE-Inkubation auf die Genexpression in A549 Zellen untersucht (Dreij et al.,
2004). 12 h nach Inkubation mit 1 µM BPDE war unter anderem die Expression von
p21, XPC und p48 auf mRNA-Ebene erhöht, eine genauere Quantifizierung der
Ergebnisse wurde leider nicht angegeben. In menschlichen Brustepithelzellen wurde
mit einer speziellen PCR-Technik die Expression einer Vielzahl von Genen zu
verschiedenen Zeitpunkten nach Inkubation mit 1 µM BPDE untersucht (Wang et al.,
2003). Dabei war die Genexpression von p21 nach 4 und nach 10 h zunächst
unverändert und zeigte eine Verdoppelung nach 24 h. Mehrere untersuchte Gene mit
Bezug zur DNA-Reparatur zeigten im Zeitraum bis 24 h keine wesentliche Änderung
ihrer Expression, darunter ATM, BRCA1, p48, XPG und Polymerase η. Als einziges
Gen in dieser Gruppe konnte für XPC eine signifikante Steigerung der Expression auf
das 1,9-fache bereits nach 4 h nachgewiesen werden, die nach 24 h wieder nahezu
auf das Ausgangsniveau zurückgegangen war. Ob diese Expressionssteigerung
auch Auswirkungen auf Proteinebene hatte, wurde jedoch nicht untersucht (Wang et
al., 2003). Im Vergleich zu den Literaturwerten zeigen die eigenen Ergebnisse
insbesondere die Induktion von p21 nach BPDE-Inkubation. Die relative
Genexpression von p48 änderte sich in den eigenen Untersuchungen in den A549
Zellen nur geringfügig und in den HCT116 Zellen maximal auf das 1,9-Fache der
Kontrolle. Die in der Literatur beschriebene Expressionssteigerung in A549 Zellen
(Dreij et al., 2004) wurde allerdings bei 20-fach höheren und damit stark
zytotoxischen Konzentrationen festgestellt und ist daher nur begrenzt vergleichbar.
Bezüglich der Expression von XPC wurden in den A549 und den HCT116 Zelllinien
Steigerungen um etwa das 1,5-Fache ermittelt. Ob dies allerdings als relevante
Erhöhung angesehen werden kann ist fraglich, da auf Protein-Ebene keine
entsprechenden Veränderungen zu beobachten waren. Die hingegen in der Literatur
Ergebnisse und Diskussion
81
festgestellten Expressionssteigerungen von XPC wurden ebenfalls nach Inkubation
mit einer deutlich höheren und bereits zytotoxischen Konzentration von 1 µM BPDE
festgestellt.
Der Vergleich der HCT116 Zelllinien verdeutlicht den bereits aus der Literatur
bekannten Einfluss von p53 auf die Expression von XPC, p48 und p21 (Macleod et
al., 1995; Hwang et al., 1999; Adimoolam und Ford, 2002). So waren XPC, p48 und
p21 in den HCT116 p53-/- Zellen durch die Behandlung mit BPDE nicht oder nur
gering induzierbar und das Expressionsniveau unbehandelter Zellen lag
insbesondere bei p48 und p21 deutlich unter dem der p53-profizienten Kontrolle. Die
Ergebnisse machen aber auch deutlich, dass es für die drei Gene noch p53-
unabhängige Expressionsmechanismen gibt, die für den vorhandenen Grundspiegel
in p53-defizienten Zellen verantwortlich sind.
Ergebnisse und Diskussion
82
5.5 Einfluss von p53 auf Bildung und Reparatur BPDE-induzierter
DNA-Addukte
Die Untersuchung der Rolle des Tumorsuppressorproteins p53 bei der Bildung und
Reparatur von DNA-Addukten nach Inkubation mit (+)-anti-Benzo[a]pyrendiolepoxid
(BPDE) wurde sowohl in den A549 als auch in den HCT116 Zelllinien durchgeführt.
Nach einstündiger Inkubation mit BPDE und dem Ablauf unterschiedlicher
Nachinkubationszeiten wurde die DNA aus den Zellen isoliert und aufgereinigt. Durch
Hydrolyse wurden die BPDE-induzierten DNA-Addukte als fluoreszierende Tetrole
freigesetzt und mittels HPLC mit Fluoreszenzdetektion quantifiziert.
5.5.1 Untersuchungen in A549 Zellen
Der Einfluss von p53 auf die Induktion von DNA-Addukten wurde in A549 wt, pRNA
und p53-pRNA Zellen nach Inkubation mit 50 nM BPDE untersucht. In diesen Zellen
konnten unabhängig vom p53-Status nach einstündiger Inkubation etwa
350 Addukte/108 Basenpaare nachgewiesen werden (Abbildung 47). Ein Einfluss von
p53 auf die Adduktbildung wurde in den A549 Zellen nicht festgestellt.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
wt pRNA p53-pRNA
Addukte/10
8
Basenpaare
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
wt pRNA p53-pRNA
Addukte/10
8
Basenpaare
Abbildung 47: Bildung von DNA-Addukten in A549 Zellen nach Inkubation mit 50 nM
BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus 9
Bestimmungen + SD. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-
pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
83
Zur Untersuchung der Rolle von p53 in der Reparatur BPDE-induzierter DNA-
Addukte in den A549 Zelllinien wurden nach einstündiger Inkubation mit 50 nM
BPDE die DNA-Addukte nach 0 und 8 h Nachinkubationszeit bestimmt (Abbildung
48). Dabei ergab sich zwischen den A549 wt und pRNA Zellen auf der einen und den
A549 p53-pRNA Zellen auf der anderen Seite kein Unterschied hinsichtlich der
Reparatur der DNA-Addukte. So waren nach 8 h Nachinkubationszeit noch 55-59 %
der DNA-Addukte vorhanden.
0
20
40
60
80
100
120
wt pRNA p53-pRNA
Addukte (% der Kontrolle)
0 h Nachinkubationszeit 8 h Nachinkubationszeit
0
20
40
60
80
100
120
wt pRNA p53-pRNA
Addukte (% der Kontrolle)
0 h Nachinkubationszeit 8 h Nachinkubationszeit
Abbildung 48: BPDE-induzierte DNA-Addukte in A549 Zellen nach Inkubation mit
50 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0 h oder 8 h
nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 8 Bestimmungen + SD. wt:
Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-
Plasmid transfizierte Zellen.
Ergebnisse und Diskussion
84
5.5.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen
Auch in den beiden HCT116 Zelllinien wurde untersucht, welche Rolle das
Tumorsuppressorprotein bei der Bildung von BPDE-induzierten DNA-Addukten spielt.
Nach einstündiger Inkubation der Zellen mit 10-200 nM BPDE wurde eine
konzentrationsabhängige Zunahme der Addukte/108 Basenpaare festgestellt
(Abbildung 49). Während die Inkubation mit 10 und 20 nM BPDE rund 90
Addukte/108 Basenpaare induzierte, waren es bei 50 nM BPDE bereits etwa 400 und
bei 200 nM BPDE rund 1500 Addukte/108 Basenpaare. Dabei war die Adduktbildung
bei allen Konzentrationen zwischen den p53-profizienten und p53-defizienten Zellen
vergleichbar. Ein Einfluss von p53 auf die Bildung BPDE-induzierter DNA-Addukte
konnte somit nicht nachgewiesen werden.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
10 20 50 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53
+/+
p53
-/-
Addukte/10
8
Basenpaare
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
10 20 50 200
(+)-anti-BPDE [nM]
p53
+/+
p53
-/-
Addukte/10
8
Basenpaare
Abbildung 49: Bildung von DNA-Addukten in HCT116 Zellen nach Inkubation mit 10,
20, 50 oder 200 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert. Dargestellt
sind Mittelwerte aus 3 Bestimmungen + SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-
defiziente Zellen.
Analog zu den Untersuchungen in den A549 Zellen wurde auch in den HCT116
Zellen die Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte in Abhängigkeit vom p53-
Status untersucht und zwischen den p53-profizienten und -defizienten Zelllinien nach
Ergebnisse und Diskussion
85
Inkubation mit 50 nM BPDE und 0, 8 und 24 h Nachinkubationszeit verglichen
(Abbildung 50). Auch bezüglich der Reparatur der induzierten DNA-Addukte war
weder nach 8 h noch nach 24 h Nachinkubationszeit ein Einfluss von p53 erkennbar.
Es waren nach 8 h noch ca. 65 % und nach 24 h noch ca. 50 % der Addukte im
Vergleich zu den Kontrollen vorhanden.
Nachinkubationszeit (h)
Addukte (% der Kontrolle)
0
20
40
60
80
100
120
0 8 24
p53
+/+
p53
-/-
Nachinkubationszeit (h)
Addukte (% der Kontrolle)
0
20
40
60
80
100
120
0 8 24
p53
+/+
p53
-/-
Abbildung 50: BPDE-induzierte DNA-Addukte in HCT116 Zellen nach Inkubation mit
50 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0, 8 oder 24 h
nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 unabhängigen Bestimmungen + SD. p53+/+:
p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-defiziente Zellen.
In weiteren Versuchen wurden Konzentrationen von 10, 20 und 200 nM BPDE bei
Nachinkubationszeiten von 4 und 8 h untersucht, um zu erkennen, ob der
unterschiedliche p53-Status hier zu Veränderungen in der Reparaturleistung führen
würde. Es bestätigte sich allerdings das schon zuvor nach Inkubation mit 50 nM
BPDE erhaltene Ergebnis. Der p53-Status der Zellen nahm keinen Einfluss auf die
Reparatur der BPDE-induzierten Addukte (Abbildung 51). Nach Inkubation mit 10, 20
oder 200 nM BPDE führte eine Nachinkubationszeit von 4 h zu einem Rückgang der
DNA-Addukte auf etwa 80 %, nach weiteren 4 h lag der Adduktspiegel bei 10 und
20 nM unter 75 % der Kontrolle, bei 200 nM etwas darüber.
Ergebnisse und Diskussion
86
0
20
40
60
80
100
120
10 nM 20 nM 200 nM
Nachinkubationszeit/(+)-
anti
-BPDE
Addukte (% der Kontrolle)
0 h 4 h 8 h 0 h 4 h 8 h 0 h 4 h 8 h
p53
+/+
p53
-/-
0
20
40
60
80
100
120
10 nM 20 nM 200 nM
Nachinkubationszeit/(+)-
anti
-BPDE
Addukte (% der Kontrolle)
0 h 4 h 8 h 0 h 4 h 8 h 0 h 4 h 8 h
p53
+/+
p53
-/-
Abbildung 51: BPDE-induzierte DNA-Addukte in HCT116 Zellen nach Inkubation mit
10, 20 oder 200 nM BPDE. Die Zellen wurden 1 h mit (+)-anti-BPDE inkubiert und 0, 4 oder
8 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus 6 unabhängigen Bestimmungen + SD.
p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-defiziente Zellen.
5.5.3 Bewertung der Ergebnisse
Zusammenfassend betrachtet zeigen die Ergebnisse, dass weder bei den A549
Zellen noch bei den HCT116 Zellen p53-abhängige Unterschiede in der Bildung und
Reparatur BPDE-induzierter DNA-Schäden festzustellen waren. Im Gegensatz dazu
wurde in der Literatur eine Beeinflussung der Reparatur BPDE-induzierter DNA-
Addukte durch den p53-Status beschrieben. In menschlichen Fibroblasten
untersuchten Wani et al. (2000) die Bildung und Reparatur von DNA-Addukten nach
Inkubation mit (±)-anti-BPDE. Dabei wurden sowohl p53-profiziente Zellen (p53-wt),
als auch Zellen, die durch eine Punktmutation im p53-Gen funktionell inaktives p53
bilden (p53-mut) sowie Zellen, die durch eine Deletion kein p53-Protein bilden (p53-
null), verwendet. Die Induktion von DNA-Addukten war nach 30 min Inkubation mit
0,3-1,2 µM BPDE in allen 3 Zelllinien vergleichbar. Die Untersuchung der Reparatur
erfolgte nach Inkubation mit 1,2 µM BPDE zu unterschiedlichen
Nachinkubationszeiten bis zu 24 h. Nach 24 h hatten die p53-wt Zellen 70 % der
Addukte entfernt, während die p53-mut und p53-null Zellen erst 50 bzw. 35 % der
Ergebnisse und Diskussion
87
Addukte beseitigt hatten. Ähnliche Unterschiede waren bereits nach 4 und nach 8 h
Nachinkubationszeit aufgetreten. Weitere Untersuchungen von Wani et al. (2000) zur
Funktion von p53 in der transkriptionsgekoppelten Reparatur erbrachten ein
ähnliches Bild bezüglich der Reparatur im nicht-transkribierten Strang, wohingegen
die Reparatur im transkribierten Strang bei allen 3 Zelllinien mit vergleichbarer
Effizienz verlief. Lloyd und Hanawalt (2000) untersuchten ebenfalls die Induktion und
Reparatur von DNA-Schäden nach Inkubation mit (±)-anti-BPDE. Sie verwendeten
p53-defiziente Fibroblasten, die mit einem regulierbaren Expressionssystem für
Wildtyp p53 transfiziert wurden. Inkubation mit 0,1, 0,5 und 1,2 µM BPDE führte
unabhängig vom p53-Status jeweils zu vergleichbarer Adduktbildung, während die
Reparatur dieser Addukte bei 0,1 und 0,5 µM BPDE bei den p53-defizienten Zellen
über einen Zeitraum von 72 h deutlich vermindert war. Bei 1,2 µM BPDE konnte
allerdings kein Unterschied mehr in der Reparatur zwischen den beiden Zelllinien
festgestellt werden. Dieses Ergebnis steht damit im Widerspruch zu den zuvor
beschriebenen Resultaten von Wani et al. (2000), die in den gleichen Zellen bei
dieser Konzentration eine p53-Abhängigkeit der Reparatur festgestellt hatten. In
einer weiteren Arbeit wurde die Bildung und Reparatur BPDE-induzierter DNA-
Addukte in menschlichen Brustepithelzellen betrachtet (Wani et al., 2002). Dabei
wurden neben p53-profizienten auch Zellen verwendet, die das HPV16-E6 Protein
exprimieren. Die von humanen Papillomaviren (HPV) gebildeten Onkoproteine E6
und E6-assoziiertes Protein verursachen als E3-Ubiquitin-Ligase den beschleunigten
Abbau von p53 durch das Proteasom, so dass kein p53-Protein in den Zellen mehr
nachweisbar ist (Ciechanover, 1998). Die Induktion der DNA-Schäden war nach
30 min Inkubation mit 0,25-1 µM (±)-anti-BPDE bei beiden Zelllinien praktisch
identisch. Die Reparaturleistung war jedoch zu allen Zeitpunkten nach Inkubation mit
1 µM BPDE deutlich verschieden. Nach 24 h lag die Reparatur in den p53-
profizienten Zellen bei etwa 60 %, in den p53-defizienten Zellen bei nur 32 %. Bei
Untersuchungen zur transkriptionsgekoppelten Reparatur zeigte sich erneut, dass
der p53-Status keinen Einfluss auf die Reparatur im transkribierten Strang hatte,
während im nicht-transkribierten Strang die Reparatur bei den p53-defizienten Zellen
deutlich beeinträchtigt war (Wani et al., 2002).
Das Tumorsuppressorprotein p53 ist als Transkriptionsfaktor für die Expression der
an der Schadenserkennung in der globalen NER beteiligten Proteine p48 und XPC
mitverantwortlich (zusammengefasst in Ford, 2005). Dadurch lässt sich ein Einfluss
Ergebnisse und Diskussion
88
von p53 auf die Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte erklären. Eine mögliche
Ursache für die mit den eigenen Versuchen erzielten und im Vergleich zur Literatur
widersprüchlichen Ergebnisse könnte in den unterschiedlichen Zelllinien begründet
sein. Darüber hinaus könnten methodische Unterschiede zu den differierenden
Ergebnissen beitragen. Vorallem aber sind die in der Literatur durchgeführten
Studien überwiegend bei wesentlich höheren BPDE-Konzentrationen (0,1-1,2 µM)
durchgeführt worden als die eigenen Untersuchungen (10-200 nM). Angaben zur
Zytotoxizität der eingesetzten Konzentrationen sind dabei entweder überhaupt nicht
vorhanden oder es wurde mit stark zytotoxischen Konzentrationen
(Koloniebildungsfähigkeit < 10 %) gearbeitet (Wani et al., 2000). Im Rahmen einer
Kooperation konnten die eigenen Ergebnisse bezüglich der Reparatur BPDE-
induzierter DNA-Addukte sowohl in den HCT116 Zelllinien als auch in den A549
Zelllinien weitgehend bestätigt werden (Hockley et al., zur Veröffentlichung
eingereicht).
Ergebnisse und Diskussion
89
5.6 Einfluss von p53 und Cadmiumchlorid auf die Reparatur
UVC-induzierter DNA-Schäden
Die Untersuchung der Reparatur UVC-induzierter DNA-Schäden erfolgte mit einer
immunfluoreszenzmikroskopischen Methode. Hierzu wurden die auf Deckgläschen
wachsenden Zellen mit Cadmiumchlorid vorinkubiert, mit UVC bestrahlt und nach
unterschiedlichen Nachinkubationszeiten fixiert. Durch den anschließenden Einsatz
spezifischer Antikörper wurden die entstandenen Cyclobutanpyrimidindimere (CPD)
fluoreszenzmarkiert und nach mikroskopischer Auswertung quantifiziert.
5.6.1 Untersuchungen in A549 Zellen
Die Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Reparatur UVC-induzierter CPD
wurden nach 24 h Reparaturzeit durchgeführt. Dabei wurde auch der Einfluss einer
24-stündigen Vorinkubation mit Cadmiumchlorid untersucht. Die Versuche in den
A549 wurden mit einer UVC-Dosis von 10 J/m2 durchgeführt. Nach Inkubation mit
50 µM Cd(II) waren nach 0 h Reparatur Unterschiede zwischen A549 wt, pRNA und
p53-pRNA Zellen festzustellen (Abbildung 52). Die Menge an CPD variierte von 91
bis 116 % der jeweiligen Kontrolle. Diese Streuung liegt jedoch, wie die Fehlerbalken
verdeutlichen, im Schwankungsbereich der Methode. In allen A549 Zellen ohne
Cd(II)-Inkubation waren nach 24 h Reparatur noch 43 bis 49 % der CPD vorhanden,
ein p53-abhängiger Unterschied konnte somit nicht beobachtet werden. Die mit
50 µM Cd(II) inkubierten A549 Wildtypzellen wiesen nach 24 h mit 48 % einen
vergleichbaren Wert auf. Die entsprechend behandelten A549 pRNA und p53-pRNA
Zellen führten mit ca. 55 bzw. 61 % zu höheren Werten nach 24 h Reparatur im
Vergleich zu den jeweiligen Zellen ohne Cd(II)-Inkubation. Da allerdings diese
mögliche Reparaturhemmung sowohl bei den p53 knock-down als auch bei den als
Kontrolle mitgeführten pRNA Zellen aufgetreten war, handelt es sich möglicherweise
um eine Folge der Transfektionsprozedur. Ein eindeutiger, im p53-Status der Zellen
begründeter Effekt auf die Reparatur von CPD nach Vorinkubation mit 50 µM Cd(II)
ließ sich nicht feststellen.
Ergebnisse und Diskussion
90
0
20
40
60
80
100
120
140
0 h
0 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Zeit/Cd(II)
0
20
40
60
80
100
120
140
0 h
0 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
0
20
40
60
80
100
120
140
0 h
0 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
wt
pRNA
p53-pRNA
Zeit/Cd(II)
Abbildung 52: UVC-induzierte Cyclobutanpyrimidindimere in A549 Zellen nach
Inkubation mit Cd(II). Die Zellen wurden 24 h mit 50 µM CdCl2 inkubiert, mit 10 J/m2 UVC
bestrahlt und 0 h oder 24 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus mindestens 3
unabhängigen Bestimmungen + SD. wt: Wildtypzellen, pRNA: mit leerem Plasmid
transfizierte Zellen, p53-pRNA: mit p53-siRNA-Plasmid transfizierte Zellen.
5.6.2 Untersuchungen in HCT116 Zellen
Entsprechend der Versuche in den A549 Zellen wurden auch in beiden HCT116
Zelllinien Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Reparatur UV-induzierter CPD
durchgeführt. Dabei wurde ebenfalls eine UVC-Dosis von 10 J/m2 angewandt und die
Reparatur nach 24 h auch in Kombination mit Cd(II) betrachtet. Bezüglich der
Induktion von CPD ergaben sich bei 0 und 25 µM Cd(II) keine Differenzen zwischen
den Zelllinien (Abbildung 53). Lediglich die Inkubation mit 50 µM Cd(II) führte zu
einer leichten Erhöhung der CPD auf 109 % in p53-profizienten Zellen, allerdings
liegt dieser geringe Anstieg durchaus im Schwankungsbereich der Methode. Die
Reparaturzeit von 24 h führte unabhängig von der Cd(II)-Inkubation zu einer
Verringerung der CPD auf ca. 45 % in den p53-profizienten und auf ca. 58 % in den
p53-defizienten Zellen. In den p53 knock-out Zellen konnte somit im Vergleich zu den
Ergebnisse und Diskussion
91
p53-profizienten Zellen eine um ca. 25 % verringerte Reparatur festgestellt werden.
Ein Einfluss von Cd(II) auf die Reparatur der CPD war jedoch nicht nachweisbar.
0
20
40
60
80
100
120
0 h
0 µM
0 h
25 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
25 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
Zeit/Cd(II)
0
20
40
60
80
100
120
0 h
0 µM
0 h
25 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
25 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
0
20
40
60
80
100
120
0 h
0 µM
0 h
25 µM
0 h
50 µM
24 h
0 µM
24 h
25 µM
24 h
50 µM
CPD (% der Kontrolle)
p53
+/+
p53
-/-
Zeit/Cd(II)
Abbildung 53: UVC-induzierte Cyclobutanpyrimidindimere in HCT116 Zellen nach
Inkubation mit Cd(II). Die Zellen wurden 24 h mit 25 oder 50 µM CdCl2 inkubiert, mit 10
J/m2 UVC bestrahlt und 0 h oder 24 h nachinkubiert. Dargestellt sind Mittelwerte aus
mindestens 3 unabhängigen Bestimmungen + SD. p53+/+: p53-profiziente Zellen, p53-/-: p53-
defiziente Zellen.
5.6.3 Bewertung der Ergebnisse
Bei den Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Reparatur UVC-induzierter
Cyclobutanpyrimidindimere (CPD) konnte in den A549 Zelllinien kein Einfluss von
p53 festgestellt werden. In den HCT116 Zelllinien ergab sich eine
Reparaturhemmung bei den p53 knock-out Zellen von ca. 25 %. Eine mögliche
Erklärung für diese Beobachtungen könnten die Untersuchungen zur Genexpression
von p48 liefern, das von p53 transkriptionell reguliert wird. Als Bestandteil des DDB-
Proteinkomplexes wird p48 eine wichtige Rolle in der Schadenserkennung,
insbesondere in der Erkennung von CPD, zugesprochen (Tang und Chu, 2002).
Während in den A549 Zelllinien die Expression von p48 auf dem gleichen Niveau lag,
war sie bei den p53-defizienten HCT116 Zellen deutlich vermindert. Möglicherweise
Ergebnisse und Diskussion
92
spiegelt sich dieser Unterschied auch auf Proteinebene wider und erklärt so die
verringerte Reparatur von CPD in den HCT116 p53-/- Zellen.
In der Literatur wurde 24 h nach Bestrahlung mit 10 J/m2 UVC in p53-profizienten
HCT116 Zellen eine Reparatur von ca. 60 % und in p53-defizienten HCT116 Zellen
von ca. 30 % ermittelt (Adimoolam et al., 2001). Diese Werte zeigen somit eine
Übereinstimmung mit den eigenen Ergebnissen, obwohl hier die Differenz in der
Reparaturleistung mit nur 25 % geringer ausfiel. Dies hängt möglicherweise mit den
unterschiedlichen Nachweismethoden zusammen, die bei den Untersuchungen
angewandt wurden. Die Reparatur von 6-4-Photoprodukten (6-4-PP) war hingegen
p53-unabhängig (Adimoolam et al., 2001). Weitere Untersuchungen zur
transkriptionsgekoppelten Reparatur (TCR) von CPD ergaben nur geringe
Unterschiede im transkribierten Strang und eine verringerte Reparatur im nicht-
transkribierten Strang bei den p53-defizienten Zellen (Adimoolam et al., 2001).
Mehrere weitere Arbeiten an menschlichen Fibroblasten mit unterschiedlichem p53-
Status bestätigen diese Erkenntnisse (Ford und Hanawalt, 1995; 1997; Ford et al.,
1998; Wani et al., 1999). p53-defiziente Zellen zeigten eine reduzierte Reparatur vor
allem von CPD, aber auch von 6-4-PP im gesamten Genom, ebenso wie im nicht-
transkribierten Strang aktiver Gene. Im transkribierten Strang aktiver Gene war die
Reparatur von CPD unabhängig vom p53-Status.
Die Untersuchungen zur Reparatur UVC-induzierter CPD wurden in den A549 und
den HCT116 Zelllinien auch nach Inkubation mit Cd(II) durchgeführt. In keinem Fall
konnte eine eindeutige Reparaturhemmung durch Cd(II) nachgewiesen werden.
Möglicherweise tritt eine Reparaturhemmung in diesen Zellen erst bei höheren als
den verwendeten Konzentrationen auf oder die Effekte waren zu gering, um sie im
Rahmen der Schwankungsbreite der Methode eindeutig erfassen zu können. Eine
weitere plausible Möglichkeit besteht in der Tatsache, dass mit der angewendeten
Methode zwar die Entfernung von CPD aus der DNA nachgewiesen werden kann,
jedoch nicht der komplette und fehlerfreie Abschluss des gesamten NER-
Mechanismus. Daher lässt sich nicht ausschließen, dass Cd(II) spätere Schritte der
NER in den untersuchten Zellen beeinträchtigt. In der Literatur wurde der Einfluss
von Cd(II) auf die NER UV-induzierter DNA-Schäden im Zellkulturmodell
beschrieben. Dabei konnte auch eine Hemmung der Polymerisation und Ligation in
menschlichen Fibroblasten und in Hamsterzellen beobachtet werden (Nocentini,
1987; Fatur et al., 2003). Allerdings deuten andere Arbeiten darauf hin, dass Cd(II)
Ergebnisse und Diskussion
93
an einer Hemmung der Schadenserkennung beteiligt ist. Hartmann und Hartwig
(1998) konnten zeigen, dass bereits 0,5 µM Cd(II) in Zellextrakten von HeLa Zellen
die DNA-Protein-Wechselwirkung von an der Schadenserkennung beteiligten
Proteinen beeinträchtigt. Asmuss et al. (2000a) konnten eine Hemmung der Bindung
des XPA-Proteins an UV-geschädigte Oligonukleotide ab 100 µM Cd(II) feststellen.
Daher sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um den Einfluss von
Cd(II) auf die Reparatur von CPD aufzuklären.
Zusammenfassende Diskussion
94
6 Zusammenfassende Diskussion
In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von p53 in der DNA-Reparatur und in der
Zellzykluskontrolle untersucht, zum Teil unter dem zusätzlichen Einfluss von
Cadmiumchlorid. Zur Generierung von Zellen mit reduzierter Expression des
Tumorsuppressorgens p53 wurde die Methode der RNA-Interferenz (RNAi) genutzt.
Sie konnte in HeLa S3, MCF7 und A549 Zellen erfolgreich eingesetzt werden. In
A549 Zellen wurde eine Reduktion der relativen p53-Genexpression um ca. 80 %
erreicht, die sich auch in einem deutlich verringerten p53-Proteingehalt der Zellen
widerspiegelte.
Untersuchungen zum Einfluss von Cadmium auf die Zellzyklusverteilung in A549
Zellen ergaben einen leichten G1-Arrest unabhängig vom p53-Status der Zellen.
Nach Bestrahlung mit 5 J/m2 UVC war ein S-Phasen Arrest zu beobachten, der nach
Vorinkubation mit Cadmium konzentrationsabhängig deutlich abgeschwächt wurde.
Diese Vorgänge waren in den A549 Zellen ebenfalls unabhängig von p53. Zum
Vergleich wurden weitere Versuche mit HCT116 Zellen durchgeführt, von denen
auch eine isogene, p53-defiziente Zelllinie zur Verfügung stand (Bunz et al., 1998).
Auch bei diesen Zelllinien führte die Bestrahlung mit UVC zu einem p53-
unabhängigen Arrest in der S-Phase des Zellzyklus. In Übereinstimmung mit der
Literatur konnte damit gezeigt werden, dass p53 an der Regulation des S-Phasen
Kontrollpunktes wahrscheinlich nicht beteiligt ist (Iliakis et al., 2003). Dagegen gilt
eine Beteiligung von p53 an den Kontrollpunkten am G1/S- und G2/M-Übergang als
gesichert. Daher wurden weitere Untersuchungen zur Rolle von p53 nach
Behandlung der Zellen mit Actinomycin D durchgeführt, das in verschiedenen
Arbeiten bereits zur Induktion des G1-Arrests verwendet wurde. In den A549 und in
den HCT116 Zellen konnte dabei eine Abhängigkeit der Zellzyklusregulation von p53
festgestellt werden. A549 p53 knock-down Zellen zeigten einen verringerten G1-
Arrest und keinen G2/M-Arrest. Die HCT116 p53 knock-out Zellen wiesen keinen G1-
Arrest mehr und einen verringerten G2/M-Arrest auf. Dieser eindeutig p53-abhängige
Effekt ist ein Beweis für die funktionellen Konsequenzen des p53 knock-down in den
A549 Zellen.
Als weiteres DNA-schädigendes Agens wurde Benzo[a]pyrendiolepoxid (BPDE) für
Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Zellzykluskontrolle eingesetzt. Die
Behandlung der Zellen mit BPDE führte zu einem konzentrationsabhängigen S-
Zusammenfassende Diskussion
95
Phasen Arrest, wie er auch in der Literatur beschrieben wird (Khan und Anderson,
2001). Wie nach UVC-Bestrahlung war auch der BPDE-induzierte S-Arrest in den
untersuchten Zelllinien unabhängig vom p53-Status.
In weiteren Versuchen wurde die Expression von p53 und XPC nach Inkubation mit
BPDE zunächst auf Proteinebene in den A549 und HCT116 Zelllinien betrachtet. In
allen A549 Zelllinien und in den p53-profizienten HCT116 Zellen war nach Ende der
BPDE-Inkubation eine konzentrationsabhängige Zunahme des p53-Proteins
beginnend ab 4 h mit einem Maximum nach 8 h erkennbar. Das XPC-Protein blieb in
allen Zelllinien unabhängig von der Behandlung relativ konstant.
Die relative Genexpression zeigte in allen A549 Zelllinien und in den p53-profizienten
HCT116 Zellen insbesondere für p21 eine starke Induktion ab 4 h nach Ende der
BPDE-Inkubation und folgte damit im zeitlichen Verlauf der beginnenden
Akkumulation des p53-Proteins. Als Transkriptionsfaktor ist p53 ein wichtiger
Regulator für p21, das u. a. entscheidend für den G1/S-Zellzykluskontrollpunkt ist.
Während viele genotoxische Agenzien im Allgemeinen einen Zellzyklusarrest in der
G1-Phase verursachen, führt u. a. die Behandlung mit BPDE in verschiedenen
Zelllinien zu einem Arrest in der S-Phase (Khan und Dipple, 2000). Dies konnte auch
in den eigenen Untersuchungen bestätigt werden. Obwohl bereits ab 4 h nach Ende
der BPDE-Inkubation eine starke Induktion der relativen Genexpression von p21
auftrat, war kein G1-Arrest feststellbar. Nakanishi et al. (2000) untersuchten in A549
Zellen die Induktion von p53 und p21 nach Inkubation mit B[a]P. Sie konnten eine
zeitabhängige Akkumulation des p53-Proteins und eine entsprechende Induktion der
p21 mRNA feststellen. Auf Proteinebene war jedoch keine entsprechende p21-
Zunahme detektierbar, da es in den Zellen zu verstärkter Ubiquitinierung von p21
und nachfolgendem proteasomalem Abbau des Proteins kam. Diese Beobachtungen
liefern auch für die eigenen Untersuchungen eine plausible Erklärung, warum trotz
Induktion von p21 kein G1-Arrest nach BPDE-Inkubation auftrat.
Im nächsten Teil dieser Arbeit wurde die Bildung und Reparatur von DNA-Addukten
nach Inkubation mit BPDE untersucht. Die Induktion der Addukte war
konzentrationsabhängig aber unabhängig vom p53-Status der Zellen. Bezüglich der
Reparatur BPDE-induzierter DNA-Schäden konnte weder in den A549 noch in den
HCT116 Zellen ein Einfluss von p53 festgestellt werden. Aus der Literatur ist
hingegen aus Untersuchungen mit menschlichen Fibroblasten und Brustepithelzellen
ein Einfluss von p53 auf die Reparatur dieser DNA-Schäden bekannt
Zusammenfassende Diskussion
96
(zusammengefasst in Ford, 2005). Allerdings konnten die eigenen Ergebnisse in
Untersuchungen einer anderen Arbeitsgruppe in den gleichen Zelllinien weitgehend
bestätigt werden (Hockley et al., zur Veröffentlichung eingereicht). Möglicherweise ist
die p53-unabhängige Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte spezifisch für die
verwendeten Zellen oder es sind in den p53-defizienten Zellen andere Mechanismen
als die NER zusätzlich an der Reparatur dieser Addukte beteiligt. Ein anderer
Erklärungsansatz könnte sein, dass das XPC-Protein bei hohen BPDE-
Konzentrationen in p53-defizienten Zellen limitierend für den Reparaturprozess wird.
Die eigenen Untersuchungen zeigen, dass auch in den p53-defizienten Zellen XPC
nachweisbar war und die Genexpression von XPC nur wenig verringert war. Im
betrachteten Konzentrationsbereich ergab sich aber auch in den p53-profizienten
Zellen trotz Induktion von p53 keine Zunahme im XPC-Proteingehalt. Möglicherweise
wirkt sich die Abwesenheit von p53 erst bei noch höheren BPDE-Konzentrationen
durch eine fehlende Induzierbarkeit von XPC auf die Reparatur aus, weil zuvor der
p53-unabhängige Proteingehalt ausreicht. Tatsächlich wurde die in der Literatur
beschriebene Induktion von XPC und der Einfluss des p53-Status auf die Reparatur
der DNA-Addukte im Vergleich zu den eigenen Untersuchungen bei 5- bis 20-fach
höheren Konzentrationen ermittelt (Wani et al., 2002; Wang et al., 2003). Die
Relevanz solcher Untersuchungen ist jedoch fraglich, da sich diese Konzentrationen
im stark zytotoxischen Bereich befinden.
Die Reparatur UVC-induzierter CPD wurde untersucht, um die Rolle von p53 in der
Reparatur verschiedener DNA-schädigender Agenzien vergleichen zu können. Bei
den HCT116 Zellen ergab sich dabei ein klarer Einfluss von p53 auf die Reparatur,
die in den defizienten Zellen nach 24 h um etwa 25 % vermindert war. In der Literatur
wurde in mehreren Arbeiten mit verschiedenen Zelllinien ebenfalls eine Hemmung
der Reparatur UVC-induzierter CPD in p53-defizienten Zellen beschrieben
(zusammengefasst in Adimoolam und Ford, 2003). In den A549 Zellen hingegen
konnte kein Einfluss des p53-Status auf die Reparatur festgestellt werden.
Möglicherweise ist dies auf im Gegensatz zu den HCT116 p53 knock-out Zellen in
den knock-down Zellen noch vorhandenes p53-Protein zurückzuführen. Dadurch
könnte in den knock-down Zellen eine p53-abhängige Induktion von p48 und XPC
nach UVC-Bestrahlung noch möglich sein. Wie die Untersuchungen zur
Genexpression zeigen, waren die Expressionsniveaus von p48 und XPC in den A549
Zellen weitgehend unabhängig vom p53-Status, während die HCT116 Zellen
Zusammenfassende Diskussion
97
insbesondere für p48 eine deutliche Reduktion in den p53-defizienten Zellen
aufwiesen. Möglicherweise ist die verringerte Expression von p48 ursächlich für die
Reparaturhemmung in den p53-defizienten Zellen. So konnten Fitch et al. (2003a) in
p53-defizienten Fibroblasten durch Überexpression von p48 die Hemmung der
Reparatur von CPD fast vollständig wieder aufheben. Einen weiteren Beitrag zur
Reparaturhemmung könnte die in den p53-defizienten HCT116 Zellen stark
verringerte Induzierbarkeit von XPC durch UVC-Bestrahlung liefern (Adimoolam und
Ford, 2002). Untersuchungen zur UVC-induzierten Expression von p48 und XPC in
den A549 Zelllinien könnten zur weiteren Aufklärung beitragen.
Die zusätzliche Inkubation mit Cd(II) ergab weder in den HCT116 Zellen noch in den
A549 Zellen eine Reparaturhemmung. In der Literatur wurde die Hemmung der NER
in kultivierten Zellen nach UVC-Bestrahlung durch Cd(II) beschrieben (Nocentini,
1987; Snyder et al., 1989; Fatur et al., 2003). Ob für die unterschiedlichen
Ergebnisse möglicherweise methodische oder mechanistische Gründe eine Rolle
spielen, sollte in weiteren Untersuchungen abgeklärt werden.
Der Vergleich der Reparatur BPDE- und UVC-induzierter DNA-Schäden ergab einen
unterschiedlichen Einfluss von p53. Während die Reparatur BPDE-induzierter DNA-
Addukte in den untersuchten Zelllinien unabhängig von p53 war, war die Reparatur
der CPD in den HCT116 Zellen p53-abhängig. Für diesen Unterschied ist
möglicherweise die Funktion von p48 in der Schadenserkennung verantwortlich, wie
sie für die Reparatur von CPD beschrieben wurde (Fitch et al., 2003c; Wittschieben
et al., 2005). Eine ähnliche Funktion von p48 in der Erkennung von BPDE-
induzierten DNA-Addukten ist bislang nicht bekannt und könnte somit eine Erklärung
darstellen, warum deren Reparatur in den untersuchten Zellen unabhängig vom p53-
Status war. Zudem bestehen deutliche Unterschiede im Ausmaß der induzierten
DNA-Schäden nach UVC- bzw. BPDE-Behandlung. Die Bestrahlung mit 1 J/m2 UVC
führt zur Bildung von etwa 2-10 Läsionen/106 Basen (Ravanat et al., 2001). Dies
entspricht einer maximalen Schadensinduktion von 10000 Läsionen/108 Basen bei
der verwendeten Dosis von 10 J/m2 UVC im Vergleich zu rund 750 Addukten/108
Basen bei Inkubation mit 200 nM BPDE, der höchsten in dieser Arbeit verwendeten
Konzentration, in den HCT116 Zellen. Daher ist es durchaus denkbar, dass die
Anzahl der induzierten DNA-Schäden Einfluss auf die Abhängigkeit des
Reparaturprozesses von p53 nimmt. Wie schon zuvor erwähnt, könnte der p53-
unabhängige Grundspiegel an XPC-Protein für die Reparatur einer mäßigen Anzahl
Zusammenfassende Diskussion
98
von DNA-Schäden ausreichend sein, während es bei Auftreten einer großen Zahl an
Läsionen möglicherweise der p53-abhängigen Induktion von XPC bedarf.
Die Ergebnisse dieser Arbeit verdeutlichen zum einen, dass p53 eine wichtige Rolle
in der Zellzykluskontrolle am G1/S- sowie am G2/M-Übergang zukommt. Zum
anderen konnte gezeigt werden, dass p53 zumindest an der Reparatur von
Cyclobutanpyrimidindimeren in HCT116 Zellen beteiligt ist, während es für die
Entfernung von BPDE-induzierten DNA-Addukten in den untersuchten Zelllinien
entbehrlich war. Weitere Untersuchungen sind notwendig, um eine umfassende
Aufklärung der Rolle von p53 in der NER zu erreichen.
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Anhang
111
8 Anhang
8.1 Abkürzungsverzeichnis
(+)-anti-BPDE (+)-anti-Benzo[a]pyren-7,8-diol-9,10-
epoxid
(±)-anti-BPDE Racemat aus (+)- und (-)-anti-BPDE
6-4-PP 6-4-Photoprodukt
8-oxo-Guanin 7,8-dihydro-8-oxo-Guanin
A Adenin
A549 menschliche
Lungenadenokarzinomzelllinie
ActD Actinomycin D
AGO2 Argonaute2
Ape1 AP-Endonuklease 1
APS Ammoniumperoxodisulfat
AP-Stelle Apurin-/Apyrimidin-Stelle
ATM Ataxia telangiectasia mutated
ATP Adenosintriphosphat
ATR ATM and Rad3 related
B[a]P Benzo[a]pyren
B[g]CDE Benzo[g]chrysendiolepoxid
BER Basenexzisionsreparatur
BPDE Benzo[a]pyrendiolepoxid
BRCA-1 breast cancer protein 1
BRCT C-terminale Domäne von BRCA-1
BSA Rinderserumalbumin
C Cytosin
CAK Cdk aktivierende Kinase
Cd(II) Cadmium (II)
Cdc25A/Cdc25C cell division cycle 25 phosphatase A/C
Cdk Cyclin dependent kinase
CDKI Cdk Inhibitor
cDNA copy DNA
Anhang
112
Chk1/Chk2 checkpoint kinase 1/2
CIP Cdk-interacting protein
CPD Cyclobutanpyrimidindimere
CSA/CSB Cockayne Syndrom Protein A/B
Ct threshold cycle
DAPI 4´,6-Diamidino-2-phenylindol
DDB1/DDB2 damaged DNA binding protein 1/2
DMEM Dulbecos Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
dNTP Desoxynukleosidtriphosphat
dsRNA doppelsträngige RNA
DTT 1,4-Dithiothreitol
E Effizienz
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
ERCC1 excision repair cross-complementing
factor 1
F 12 F 12 Kulturmedium
FDP Formamid-Denaturierungspuffer
FITC Fluorescein-5-isothicyanat
FKS fötales Kälberserum
Fpg Formamidopyrimidin-DNA-Glykosylase
g Erdbeschleunigung
G Guanin
G418 Geneticin
GADD45 growth arrest DNA damage induced
gene 45
GAPDH Glycerinaldehyd-3-Phosphat-
dehydrogenase
GGR globale genomische Reparatur
HCT116 menschliche Kolonkarzinomzelllinie
HeLa S3 menschliche Zervixkarzinomzelllinie
hHR23B human homologue of Rad23 B
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie
Anhang
113
HPV humane Papillomaviren
HR Homologe Rekombination
Hus1 hydroxyurea-sensitive 1
IARC International Agency for Research on
Cancer
INK4 Inhibitor von Cdk4
IR ionisierende Strahlung
J Joule
kDa Kilodalton
KIP Kinaseinhibitor-Protein
M molar
MCF7 humane Brustkrebszelllinie
MDB membrane desalting buffer
MDM2 murine double minute 2
miRNA microRNA
MMLV Moloney Murine Leukemia Virus
MMR Mismatch-Reparatur
MMS Methylmethoxysulfonat
MNU N-Methyl-N-Nitrosoharnstoff
MOPS Morpholinopropansulfonsäure
Mre11 meiotic recombination protein 11
mRNA messenger RNA
MT Metallothionein
NADP Nicotinsäureamid-Adenin-Dinucleotid-
Phosphat
Nbs1 Nijmegen breakage syndrome protein 1
neo Neomycin
NER Nukleotidexzisionsreparatur
NES nuclear export signal
NHEJ non-homologous end joining
NLS nuclear localization signal
NRM-Komplex Nbs1/Rad50/Mre11-Komplex
nt Nukleotide
OD optische Dichte
Anhang
114
OGG1 8-Oxoguanin-DNA-Glykosylase-1
Oligo(dT) Oligodesoxythymidin
p53-pRNA pRNA mit Konstrukt zur Expression von
siRNA gegen p53
PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese
PAK Polyzyklische aromatische
Kohlenwasserstoffe
PARP Poly(ADP-Ribose)-Polymerase
PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung
PBS-T PBS mit Tween 20
PCNA proliferating cell nuclear antigen
PCR Polymerasekettenreaktion
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
pRb Retinoblastom Protein
pRNA pRNA-H1.1/neo-Plasmid
PTWI provisional tolerable weekly intake
PVDF Polyvinylidenfluorid
R relative Genexpression
Rad (1,9,17,50) bei IR-sensitiven Hefezellen fehlende
Proteine (radiation)
RFC Replikationsfaktor C
RFU relative Fluoreszenzeinheit
RIPA radioimmunoprecipitation assay
RISC RNA induced silencing complex
RNA Ribonukleinsäure
RNAi RNA Interferenz
RNA-Pol II RNA-Polymerase II
ROS reaktive Sauerstoffspezies
RP reversed phase
RPA Replikationsprotein A
rRNA ribosomale RNA
Rt Retentionszeit
RT-PCR Reverse Transkriptase-
Polymerasekettenreaktion
Anhang
115
SD Standardabweichung
SDS Natriumdodecylsulfat
shRNA short hairpin RNA
siRNA short interfering RNA
SMC1 structural maintainance of chromosomes
protein 1
SOD Superoxiddismutase
Sp1 specificity protein 1
T Thymin
TBS Tris-gepufferte Salzlösung
TCR transkriptionsgekoppelte Reparatur
TEMED N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TE-Puffer Tris-EDTA-Puffer
Tetrol I-1 r-7,t-8,t-9,c-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-
tetrahydrobenzo[a]pyren
Tetrol I-2 r-7,t-8,t-9,t-10-tetrahydroxy-7,8,9,10-
tetrahydrobenzo[a]pyren
TFIIH Transkriptionsfaktor II H
THF Tetrahydrofuran
TLS translesion synthesis
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
U Unit
Ub Ubiquitin
UV ultraviolett
V79 Lungenfibroblasten des chinesischen
Hamsters
WHO Weltgesundheitsorganisation
Wt Wildtyp
XAB2 XPA binding protein 2
X-Gal 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-
galactopyranosid
XPA bis XPG, XPV Xeroderma Pigmentosum Protein A bis
G und V
Anhang
116
8.2 Chemikalien
Bezeichnung: Lieferant:
(+)-anti-BPDE (> 99,8 %) A. Seidel (Grimmer-Stiftung,
Großharnsdorf)
2-Mercaptoethanol Serva (Heidelberg)
2-Propanol Roth (Karlsruhe)
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung
(37,5:1; 40 %)
Roth (Karlsruhe)
Actinomycin D Invitrogen (Karlsruhe)
Agarose Roth (Karlsruhe)
Alcian Blue 8GX Fluka Biochemika (Buchs, Schweiz)
AlexaFluor488-anti-Maus-Antikörper
(Ziege)
Invitrogen (Karlsruhe)
Ammoniumacetat Merck (Darmstadt)
Ammoniumperoxodisulfat (APS) Roth (Karlsruhe)
Anti-Aktin-Antikörper (Kaninchen) Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg)
Anti-Cyclobutan-Pyrimidin-Dimer-
Antikörper (Maus)
MBL (Naka-ku Nagoya, Japan)
Anti-Kaninchen-IgG-HRP-Antikörper
(Ziege)
Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg)
Anti-Maus-HRP-Antikörper (Ziege) Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg)
Anti-p53-Antikörper DO7 (Maus) Dako (Glostrup, Dänemark)
Anti-XPC-Antikörper H300 (Kaninchen) Santa Cruz Biotechnology (Heidelberg)
Aprotinin Sigma-Aldrich (Steinheim)
Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz Bio-Rad (München)
Bromphenolblau Merck (Darmstadt)
Cadmiumchlorid (99,9 %), CdCl2 Sigma-Aldrich (Steinheim)
Casyton, isotone Salzlösung Schärfe System (Reutlingen)
DAPI-Färbelösung (CyStainDNA) Partec (Münster)
dATP, dGTP, dCTP, dTTP (je 100mM) Invitrogen (Karlsruhe)
Dikaliumhydrogenphosphat,
K2HPO4 * 3 H2O
Merck (Darmstadt)
Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Anhang
117
Dinatriumhydrogenphosphat, Na2HPO4 Merck (Darmstadt)
DMEM Sigma-Aldrich (Steinheim)
ECL Western Blot Detektionsreagenzien GE Healthcare (Freiburg)
Ethanol (Rotisol) Roth (Karlsruhe)
Ethanol, p. a., 96 %, vergällt Bundesmonopolverwaltung für
Branntwein (Offenbach)
Ethidiumbromid Roth (Karlsruhe)
Ethylendiamintetraessigsäure
Dinatriumsalz-2-hydrat (EDTA)
Riedel-de Haen (Seelze)
First Strand cDNA Synthesis Kit Bio-Rad (München)
Formaldehyd, 37 % Sigma-Aldrich (Steinheim)
Formamid Fluka Biochemika (Buchs, Schweiz)
Fötales Kälberserum (FKS) Sigma-Aldrich (Steinheim)
Geneticin (G418) Invitrogen (Karlsruhe)
Giemsa, Azur-Eosin-Methylenblaulösung Roth (Karlsruhe)
Glutardialdehyd Merck (Darmstadt)
Glycerin Merck (Darmstadt)
Glycin Roth (Karlsruhe)
Immersionsöl Zeiss (Oberkochen)
iQ SYBR Green Supermix Bio-Rad (München)
Isoamylalkohol Merck (Darmstadt)
Kalbsthymus-DNA (research grade) Serva (Heidelberg)
Kaliumchlorid, KCl Merck (Darmstadt)
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4 Merck (Darmstadt)
Kaliumhexacyanoferrat(II),
K4Fe(CN)6 * 3 H2O
Merck (Darmstadt)
Kaliumhexacyanoferrat(III), K3Fe(CN)6 Merck (Darmstadt)
Kaliumhydroxid, KOH Merck (Darmstadt)
Leupeptin Sigma-Aldrich (Steinheim)
Lipofectamine Invitrogen (Karlsruhe)
Magermilchpulver Roth (Karlsruhe)
Magnesiumchlorid, MgCl2 Sigma-Aldrich (Steinheim)
Methanol Roth (Karlsruhe)
Methanol Chromasolv Sigma-Aldrich (Steinheim)
Anhang
118
Milchpulver Roth (Karlsruhe)
Molekulargewichtsmarker peqGOLD IV Peqlab (Erlangen)
Molekulargewichtsmarker RPN 800 GE Healthcare (Freiburg)
MOPS Sigma-Aldrich (Steinheim)
Natriumacetat Merck (Darmstadt)
Natriumchlorid, NaCl Roth (Karlsruhe)
Natriumdesoxycholat Fluka (Buchs, Schweiz)
Natriumhydrogencarbonat, NaHCO3 Roth (Karlsruhe)
Natronlauge, NaOH Roth (Karlsruhe)
Nutrient Mixture F12 (HAM) Sigma-Aldrich (Steinheim)
pCI-neo Promega (Mannheim)
PCR-Primer MWG Biotech (Ebersberg)
Penicillin-Streptomycin-Lösung Sigma-Aldrich (Steinheim)
Pepstatin A Sigma-Aldrich (Steinheim)
Phenol-Chloroform-Isoamylalkohol
(25:24:1)
Roth (Karlsruhe)
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Serva (Heidelberg)
Plus Reagent Invitrogen (Karlsruhe)
Primer p(DT)15 Roche (Mannheim)
pRNA-H1.1/neo GenScript Corp. (Piscataway, USA)
Proteinase K Merck (Darmstadt)
pSV-β-Gal Promega (Mannheim)
Rinderserumalbumin (BSA) Fluka Biochemika (Buchs)
RNase A Roche (Mannheim)
RNase Out Ribonuklease Inhibitor Invitrogen (Karlsruhe)
Salzsäure, HCl Kraft (Duisburg)
SDS Roth (Karlsruhe)
SDS-Lösung (10 %) Merck (Darmstadt)
Silikonfett Sigma-Aldrich (Steinheim)
Sterilium Bode Chemie (Hamburg)
Super Script II Reverse Transkriptase
0,1 M DTT
5x First Strand Buffer
Invitrogen (Karlsruhe)
TEMED Roth (Karlsruhe)
Anhang
119
Tetrahydrofuran (THF) Merck (Darmstadt)
Tetrol I-1 (HPLC grade) NCI (USA)
Trichlormethan Roth (Karlsruhe)
Triethylamin VWR (Darmstadt)
Tris Roth (Karlsruhe)
Triton X-100 Fluka (Buchs, Schweiz)
Trypsin, 10x Sigma-Aldrich (Steinheim)
Tween 20 Roth (Karlsruhe)
Tween-20 SigmaUltra Sigma-Aldrich (Steinheim)
Vectashield Mounting Medium mit DAPI Vector Laboratories (Burlingame, USA)
VenorGeM Mykoplasmen-Nachweis Minerva Biolabs (Berlin)
X-Gal Promega (Mannheim)
Anhang
120
8.3 Lösungen und Puffer
Alle Lösungen werden mit doppelt destilliertem Wasser bzw. mit Reinstwasser
angesetzt. Die Medien, Lösungen und Puffer für die Zellkultur werden zusätzlich
sterilfiltriert.
Zellkultur:
Kulturmedium für HeLa S3 Zellen Nutrient Mixture F12 (HAM),
10 % FKS
100 U Penicillin/ml
100 µg Streptomycin/ml
Kulturmedium für A549, MCF7 und
HCT116 Zellen
DMEM,
10 % FKS
100 U Penicillin/ml
100 µg Streptomycin/ml
PBS (pH 7,4) 100 mM NaCl
4,5 mM KCl
7 mM Na2HPO4
3 mM KH2PO4
PBS mit EDTA 0,5 mM EDTA in PBS
PBS mit FKS 5 % FKS in PBS
Trypsin-Lösung 0,25 % Trypsin in PBS mit EDTA
β-Galaktosidase-Aktivität:
PBS siehe oben (Zellkultur)
Glutaraldehyd-Lösung 0,25 % in PBS
Anhang
121
Reaktionspuffer 2 mM MgCl2
5 mM K4Fe(CN)6 * 3 H2O
5 mM K3Fe(CN)6 in PBS
X-Gal-Lösung 1 mg/mL X-Gal in Reaktionspuffer
RNA-Elektrophorese:
MOPS pH 7,0 (20x) 400 mM MOPS
100 mM Na-Acetat
10 mM EDTA
Formamid-Denaturierungspuffer (FDP) 54 µl Wasser
35 µl Formaldehyd (37 %)
10 µl MOPS (20x)
100 µl Formamid (rekristallisiert)
1 µl Ethidiumbromid-Lösung (10 mg/ml)
Zellextrakt:
RIPA-Puffer 10 mM Tris pH 7,6
150 mM NaCl
1 mM EDTA
1 % Triton X-100
1 % Na-Desoxycholat
0,1 % SDS
1 mM PMSF
je 1 µg/ml Leupeptin, Aprotinin,
Pepstatin A
Proteinbestimmung nach Bradford:
Bradford-Färbelösung Bio-Rad-Protein-Assay-Reagenz 1:4,5
verdünnt in Wasser
Anhang
122
Protein-Elektrophorese:
Lämmli-Ladepuffer (1x) 80 mM Tris pH 6,8
2 % SDS
10 % Glycerin
2 % Mercaptoethanol
0,01 % Bromphenolblau
Lämmli-Laufpuffer 25 mM Tris
0,1 % SDS
192 mM Glycin
Trenngel 12% 0,375 M Tris, pH 8,8
0,1 % SDS
12 % Acrylamid
0,08 % TEMED
0,1 % APS
Sammelgel 4% 0,0125 M Tris, pH 6,8
0,1 % SDS
4 % Acrylamid
0,064 % TEMED
0,1 % APS
Western Blot:
Transferpuffer 20 mM Tris
0,01 % SDS
192 mM Glycin
10 % Methanol
Blockierlösung 5 % Magermilchpulver
0,05 % Tween 20
in PBS
PBS siehe oben (Zellkultur)
Anhang
123
PBS-T PBS mit 0,05 % Tween 20
Immunfluoreszenz:
Alcian Blue 1 mg/ml in Ethanol
PBS (pH 7,4) 1,18 mM KH2PO4
0,1368 M NaCl
2,15 mM KCl
8,45 mM Na2HPO4
Blockierlösung 3 % BSA in PBS
Waschpuffer 99,5 % PBS
0,5 % BSA
0,05 % Tween 20
Postfix-Lösung 93 % PBS
7 % Formaldehyd
Fixierlösung 95 % PBS
3 % Formaldehyd
2 % Triton X-100
DNA-Isolierung:
TBS (pH 7,4) 0,0027 M KCl
0,137 M NaCl
0,025 M Tris
TE-Puffer (pH 8,0) 0,01 M Tris-HCl pH 8,0
0,001 M EDTA
Proteinase K-Lösung 20 mg/ml in H2O bidest.
(Aliquots gelagert bei -20 °C)
Anhang
124
RNase A-Lösung (DNase-frei) 10 mg/ml in H2O bidest.
1 h bei 90 °C erhitzt
(Aliquots gelagert bei -20 °C)
Extraktionspuffer (pH 8,0) 0,01 M Tris-HCl pH 8,0
0,1 M EDTA
20 µg/ml RNase A
0,5 % SDS
Fällungsreagenz 1 Vol Ethanol
0,2 Vol 10 M NH4Acetat
HPLC-Analyse:
Tetrol I-1 Stammlösung 1 mg in 10 ml THF/5 % Triethylamin,
gelagert bei -80 °C
Tetrol I-1 Standardlösungen Verdünnung der Stammlösung mit
H2O bidest., jeweils frisch zubereitet
Kalbsthymus-DNA-Lösung 1 mM in H2O bidest.,
jeweils frisch zubereitet
Anhang
125
8.4 Geräte
Bezeichnung: Modell/Hersteller:
Auflichtmikroskop Axiovert 25, Carl Zeiss (Oberkochen)
Auswertesoftware (Mikroskop) Axio Vision 4.5, Carl Zeiss (Oberkochen)
Autoklav Varioklav 75 S, H+P (Oberschleißheim)
Bildauswertesoftware Aida, Raytest (Straubenhardt)
Biophotometer Eppendorf (Hamburg)
Brutschrank B6, Heraeus (Hanau)
CO2-Inkubator Hera Cell 150, Kendro (Langenselbold)
Digitalwaage PL300, Mettler (Giessen)
Digitalwaage BP61S, Sartorius (Göttingen)
Durchflusszytometer PAS, Partec (Münster)
Elektrophoresekammer (Agarose) Modell B2, Peqlab (Erlangen)
Elektrophoresekammer (PAGE) Hoefer SE260, Amersham Scientific
(Freiburg)
Feinwaage Micro MC 5, Sartorius (Göttingen)
Fluoreszenzmikroskop Axio Imager.M1, Carl Zeiss (Oberkochen)
Geldokumentationsgerät LAS 3000, Fuji (Tokio, Japan)
Geldokumentationsgerät Easy Win, Herolab (Wiesloch)
Heißlufttrockenschrank SUT 6200, Kendro (Langenselbold)
HPLC-Autosampler Gina 50, Gynkotek (Germering)
HPLC-Datenauswertung Gynkosoft, Gynkotek (Germering)
HPLC-Degaser degasys DG 1310, Dionex (Germering)
HPLC-Fluoreszenzdetektor RF 2000, Gynkotek (Germering)
HPLC-Motorsäulenschaltventil MSV 6, Gynkotek (Germering)
HPLC-Pumpe M480, Gynkotek (Germering)
Kolbenhubpipetten Reference, Eppendorf (Hamburg)
Kühl- und Gefrierschränke Liebherr (Ochsenhausen)
Kühlzentrifuge Biofuge Pico freeze, Kendro
(Langenselbold)
Kühlzentrifuge 5810 R, Eppendorf (Hamburg)
Laborspülmaschine G7883, Miele (Bielefeld)
Mikrotiterplattenlesegerät SpectraFluor, Tecan (Crailsheim)
Anhang
126
Netzgerät Power Pac 200, Bio-Rad (München)
PCR-Thermocycler iCycler, BioRad (München)
pH-Meter pH320, WTW (Weilheim)
Pipettierhilfe pipetus akku, Hirschmann (Eberstadt)
Rotator Neolab (Heidelberg)
Schüttelinkubator CAT SH26, CAT Ingenieurbüro (Staufen)
Semi-Dry-Blotting-Apparatur TE 77, Amersham Scientific (Freiburg)
Spektralphotometer Nanodrop ND 1000, NanoDrop
Technologies (Wilmington, USA)
Sterilbank Hera Safe KS 18, Heraeus (Hanau)
Stickstoffbehälter MVE (Burnsville, USA)
Taumler 3012, GFL (Burgwedel)
Tiefkühllagergerät HFU 686 Top, Kendro (Langenselbold)
Trockenschrank T5042EK, Heraeus (Hanau)
Ultraschallgerät Sonifier 250, Branson (Danbury, USA)
UV-Lampe VL-6C, Bioblock Scientific
(Illkirch Cedex, Frankreich)
UV-Radiometer PRC Krochmann (Berlin)
Vortex Genie2, Scientific Industries
(Bohemia, USA)
Wasseraufbereitungssystem Ultra Clear UV-TM, SG (Barsbüttel)
Wasserbad Typ WB14, Memmert (Schwabach)
Zellzählgerät Casy 1 Modell TT, Schärfe System
(Reutlingen)
Zellzyklusauswertesoftware FloMax, Partec (Münster)
Zentrifuge Biofuge Pico, Kendro (Langenselbold)
Anhang
127
8.5 Verbrauchsmaterial
Bezeichnung: Lieferant:
HPLC-Trennsäule Luna 5µm C18 (2), 250 x 4,6 mm
Phenomenex (Aschaffenburg)
HPLC-Vorsäule Luna 5µm C18 (2), 30 x 4,6 mm
Phenomenex (Aschaffenburg)
RNA-Isolierungs-Kit NucleoSpin RNA II, Macherey-Nagel
(Düren)
Chromatographiepapier Whatman (Maidstone, UK)
Klonierungsringe Sigma-Aldrich (Steinheim)
6-Loch-Platten Biochrom (Berlin)
24-Loch-Platten Sarstedt (Nümbrecht)
96-Loch-Platten Sarstedt (Nümbrecht)
Casycups Schärfe System (Reutlingen)
Deckgläschen, 18 mm VWR (Darmstadt)
Dichtscheiben Sil/PTFE 1,5 mm Trott (Kriftel)
Einfrierröhrchen Greiner (Frickenhausen)
Gewindeglasfläschchen 1,5 ml, braun Trott (Kriftel)
Biophotometer-Küvetten Eppendorf (Hamburg)
Messröhrchen (3,5 ml) Sarstedt (Nümbrecht)
Objektträger, 75x25 mm VWR (Darmstadt)
PCR-Reaktionsgefäße Sarstedt (Nümbrecht)
Pipettenspitzen 0,1-10 µl VWR (Darmstadt)
Pipettenspitzen 0,5-20 µl Sarstedt (Nümbrecht)
Pipettenspitzen 100-1000 µl VWR (Darmstadt)
Pipettenspitzen 10-200 µl Roth (Karlsruhe)
Pipettenspitzen 500-5000 µl VWR (Darmstadt)
PVDF-Membran GE Healthcare (Freiburg)
Reaktionsgefäß (1,5 ml und 2,0 ml) Sarstedt (Nümbrecht)
Reaktionsgefäß (2,2 ml) Greiner (Frickenhausen)
Schraubkappen Phenolharz weiß Trott (Kriftel)
Zellkulturschalen Biochrom (Berlin)
Zentrifugenröhrchen (15 ml, 50 ml) Sarstedt (Nümbrecht)
Anhang
128
8.6 Transfektionsexperimente
8.6.1 Geneticin-Toleranzdosis
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
A549
HeLa S3
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
HeLa S3
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
HeLa S3
MCF7
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
MCF7
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
MCF7
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
0,1
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
A549
A549
HeLa S3
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
HeLa S3
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
1
10
100
1000
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
HeLa S3
MCF7
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
MCF7
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
1
10
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
G418 [mg/ml]
Zellzahl (% der Kontrolle)
MCF7
Abbildung 54: Bestimmung der G418-Toleranzdosis in A549, HeLa S3 und MCF7
Zellen. Auf der linken Seite sind die Vorversuche in 24-Loch Mikrotiterplatten dokumentiert.
Auf der rechten Seite sind die Ergebnisse der Versuche in 60 mm Schalen dargestellt.
Weitere Erläuterungen unter „Material und Methoden“.
Anhang
129
8.6.2 Verwendete Plasmide
Für die Etablierung der Transfektionsmethode wurden die Plasmide pSV-β-Gal und
pCI-neo (Promega) verwendet. Für die RNAi-Versuche wurde das Plasmid
pRNA-H1.1/neo (GenScript) mit einem DNA-Konstrukt das für shRNA kodiert, die
gegen p53 gerichtet sind, verwendet (Abbildung 55). Die Sequenz des Konstrukts
wurde der Literatur entnommen (Brummelkamp et al., 2002). Die Kontrollzellen
wurden mit dem leeren Plasmid pRNA-H1.1/neo transfiziert.
GGATCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTCCAAAAGCTTGGATCCCGACTCCAGTGGTAATCTACTTCAAGAGAGTAGATTACCACTGGAGTCTTTTTTCCAAAAGCTT
Abbildung 55: pRNA-H1.1/Neo-Plasmid mit Sequenz des DNA-Konstrukts (fett: siRNA-
Sequenz, kursiv: Haarnadelschleife).
Anhang
130
8.6.3 Transfektionseffizienz
Abbildung 56: Mikroskopische Aufnahmen zur Dokumentation der Transfektions-
effizienz. Weitere Erläuterungen unter „Material und Methoden“.
8.7 Bestimmung der relativen Genexpression
8.7.1 RNA-Integrität
Die qualitative Kontrolle der RNA-Isolierung erfolgt über eine denaturierende RNA-
Gelelektrophorese. Da die ribosomale RNA (rRNA) den größten Anteil an der
Gesamt-RNA ausmacht und eine definierte Größe besitzt, weisen die zwei scharfen
Banden der 28 S rRNA und der 18 S rRNA auf eine gute Integrität und geringe
Denaturierung der Proben hin. In Abbildung 57 ist das Beispiel einer denaturierenden
RNA-Gelelektrophorese dargestellt.
Anhang
131
28 S rRNA
18 S rRNA
28 S rRNA
18 S rRNA
Abbildung 57: Denaturierende RNA-Gelelektrophorese.
Weitere Erläuterungen unter „Material und Methoden“.
8.7.2 PCR-Analysenprogramm
Tabelle 1: Analysenprogramm der Real-Time PCR.
Zyklus (Anzahl)
Schritt Prozess Temperatur (°C) Zeit (min:s)
1 (1x) 1 Aktivierung der
Polymerase
95,0 1:30
2 (40x) 1
2
3
Denaturierung
Primer-Anlagerung
Elongation
Datengewinnung und
Echtzeitanalyse
95,0
60,0
72,0
0:30
1:00
0:15
3 (1x) 1 Denaturierung 95,0 1:00
4 (1x) 1 Zusammenlagerung 60,0 1:00
5 (70x) 1 Schmelzkurvenanalyse
und Datengewinnung
60,0
Steigerung um
0,5 °C je Schritt
0:10
6 (1x) 1 Ende 4,0 ∞
Anhang
132
8.7.3 PCR-Primersequenzen
GAPDH reverse: 5’- GGC ATG GAC TGT GGT CAT GAG -3’
GAPDH forward: 5’- CTG CAC CAC CAA CTG CTT AG -3’
p48 reverse: 5’- GCT GGC TTT CCC TCT AAC CTG -3’
p48 forward: 5’- CCT GAA CCC ATG CTG TGA TTG -3’
XPC reverse: 5’- GGC CAC GCG GTG TAG AT -3’
XPC forward: 5’- CGT GGA CGG GAA GGT GC -3’
p21 reverse: 5’- GTA CCA CCC AGC GGA CAA GT -3’
p21 forward: 5’- CCT CAT CCC GTG TTC TCC TTT -3’
p53 reverse: 5’- TGA GTT CCA AGG CCT CAT TCA -3’
p53 forward: 5’- CCC TTC AGA TCC GTG GGC -3’ (Korz et al., 2002)
8.7.4 cDNA-Verdünnungsreihen
In Abbildung 58 sind die cDNA-Verdünnnungsreihen mit den Primern für GAPDH,
p21, p48 und XPC in 1:2 Verdünnungsschritten und in Abbildung 59 am Beispiel von
p53 die resultierende Auftragung zur Ermittlung der PCR-Effizienz sowie in Tabelle 2
die ermittelten Effizienzen dargestellt.
Abbildung 58: cDNA-Verdünnungsreihen für GAPDH, p21, p48 und XPC.
Anhang
133
y = -3,8578x + 29,157
R² = 0,9965
0
5
10
15
20
25
30
35
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
log cDNA-Startmenge
Threshold cycle
p53
y = -3,8578x + 29,157
R² = 0,9965
0
5
10
15
20
25
30
35
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
log cDNA-Startmenge
Threshold cycle
y = -3,8578x + 29,157
R² = 0,9965
0
5
10
15
20
25
30
35
-0,5 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5
log cDNA-Startmenge
Threshold cycle
p53p53
Abbildung 59: cDNA-Verdünnungsreihe und Auswertung am Beispiel von p53.
Tabelle 2: PCR-Effizienzen der verwendeten Primerpaare.
Primerpaar GAPDH p21 p48 XPC p53
Effizienz 1,843 1,823 1,840 1,843 1,816
Anhang
134
8.8 HPLC-Analyse
8.8.1 Analysenprogramm
Tabelle 3: HPLC-Analysenprogramm.
Schritt Zeit (min) Anweisung
1 -10,0 Motorsäulenschaltventil aus
2 -10,0 Fluss 1,0 ml/min
100 % Fließmittel A (Wasser)
3 0,0 Fluoreszenzdetektor Nullabgleich
Ex. 344 nm, Em. 398 nm, Empfindlichkeit: hoch
4 0,0 Injektion von 1,0 ml Probe
5 0,0 Beginn der Datenaufnahme
6 5,0 Fluss 0,5 ml/min
100 % Fließmittel A (Wasser)
7 6,0 Fluss 0,5 ml/min
100 % Fließmittel B (20 % Methanol in Wasser)
8 16,0 Fluss 0,5 ml/min
100 % Fließmittel B (20 % Methanol in Wasser)
9 16,0 Motorsäulenschaltventil ein (d.h. Kopplung der
Vorsäule mit der Trennsäule)
10 16,0 Fluss 1,0 ml/min
100 % Fließmittel C (55 % Methanol in Wasser)
11 40,0 Fluss 1,0 ml/min
100 % Fließmittel C (55 % Methanol in Wasser)
12 40,0 Ende der Datenaufnahme
13 40,0 Ende des Programms
Anhang
135
8.8.2 Chromatogramme
In Abbildung 60 sind beispielhaft die HPLC-Chromatogramme der Versuche mit 10
und 200 nM (+)-anti-BPDE bei 0 h und 8 h Nachinkubationszeit in HCT116 Zellen
dargestellt.
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 32,5
A
C
Emission 398 nm
Emission 398 nm
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 32,5
B
D
Emission 398 nm
Emission 398 nm
Zeit (min)
Signal (mV)
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 32,5
A
C
Emission 398 nm
Emission 398 nm
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 32,5
B
D
Emission 398 nm
Emission 398 nm
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 33,2
Tetrol I-1
Rt. 32,5
B
D
Emission 398 nm
Emission 398 nm
Zeit (min)
Signal (mV)
Abbildung 60: HPLC-Chromatogramme der Analyse BPDE-induzierter DNA-Addukte in
HCT116 p53+/+ Zellen. Dargestellt sind die Ergebnisse nach 1 h Inkubation mit 10 nM
(+)-anti-BPDE und (A) 0 h und (B) 8 h Nachinkubationszeit sowie mit 200 nM (+)-anti-BPDE
und (C) 0 h und (D) 8 h Nachinkubationszeit. Rt: Retentionszeit.
Anhang
136
8.8.3 Kalibrierung
Die Kalibrierung der HPLC-Analyse erfolgte jeweils im Bereich von 4-100 pg/ml
Tetrol I-1. Hierzu wurden die frisch hergestellten Tetrol I-1–Standardlösungen mit
100 µg/ml Kalbsthymus-DNA versetzt, bei 90 °C mit HCl (Endkonzentration 0,1 M)
4 h hydrolysiert und anschließend bei Raumtemperatur neutralisiert. Die
Quantifizierung erfolgte über die Peakfläche. In Abbildung 61 ist die zur Auswertung
verwendete Kalibriergerade dargestellt.
y = 0,5098x
R² = 0,9997
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100
Tetrol I-1 [pg/ml]
Fläche (mV *min)
y = 0,5098x
R² = 0,9997
0
10
20
30
40
50
60
0 20 40 60 80 100
Tetrol I-1 [pg/ml]
Fläche (mV *min)
Abbildung 61: Tetrol I-1 Kalibriergerade. 100 µg Kalbsthymus DNA wurden mit 4-100 pg
Tetrol I-1 versetzt, hydrolysiert, neutralisiert und über HPLC/Fluoreszenzdetektion wie in
„Material und Methoden“ beschrieben analysiert.
137
9 Publikationsliste
Publikationen in Fachzeitschriften
Interference by toxic metal ions with zinc-dependent proteins involved in
maintaining genomic stability. Hartwig, A., Asmuss, M., Blessing, H., Hoffmann,
S., Jahnke, G., Khandelwal, S., Pelzer, A., Burkle, A., Food and Chemical Toxicology
(2002), 40(8), 1179-1184.
Impact of copper on the induction and repair of oxidative DNA damage,
poly(ADP-ribosyl)ation and PARP-1 activity. Schwerdtle, T,. Hamann, I., Jahnke,
G., Walter, I., Richter, C., Parsons, J. L., Dianov, G. L., Hartwig, A., Molecular
Nutrition and Food Research (2007), 51, 201-210.
Identification through microarray gene expression analysis of cellular
responses to benzo(a)pyrene and its diol-epoxide that are dependent or
independent of p53. Hockley, S. L., Arlt, V. M., Jahnke, G., Hartwig, A., Giddings, I.,
Phillips, D. H., zur Veröffentlichung eingereicht.
Veröffentlichte Abstracts
Genotoxizität von Cu(II) in kultivierten menschlichen Zellen. Schwerdtle, T,.
Lohter, I., Jahnke, G., Walter, I., Hartwig, A., Lebensmittelchemie (2004), 58(6), 148-
149.
Anwendung der RNA-Interferenz zur Aufklärung des Einflusses kanzerogener
Metallverbindungen auf DNA-Reparaturprozesse und Zellzykluskontrolle in
Säugerzellen. Jahnke, G., Hartwig, A., Lebensmittelchemie (2004), 58(6), 149-150.
Können Spurenelemente toxisch wirken? Lohter, I., Jahnke, G., Schwerdtle, T.,
Blessing, H., Hartwig, A., Lebensmittelchemie (2005), 59(5), 135-136.
Toxische Metalle und essentielle Spurenelemente: Molekulare Funktionen,
Wechselwirkungen und aktuelle Fragestellungen in der Lebensmittelchemie.
Hartwig, A., Schwerdtle, T,. Blessing, H., Jahnke, G., Thuy, C., Walter, I.,
Lebensmittelchemie (2006), 60(1), 10.
138
Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Cadmium-vermittelten Toxizität
mittels RNAi-Technik in menschlichen Zellen. Jahnke, G., Hartwig, A.,
Lebensmittelchemie (2006), 60(6), 160-161.
Beeinträchtigung der genomischen Stabilität nach erhöhter Kupferzufuhr.
Schwerdtle, T,. Hamann, I., Jahnke, G., Richter, C., Dianov, G. L., Hartwig, A.,
Lebensmittelchemie (2006), 60(6), 171.
Vorträge auf Fachtagungen
Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh), Lebensmittelchemische Gesellschaft,
Gemeinsame Regionalverbandstagung Nord-Ost und Süd-Ost, Berlin, 23.-24. März
2006, Untersuchungen zur Rolle von p53 in der Cadmium-vermittelten Toxizität
mittels RNAi-Technik in menschlichen Zellen. Jahnke, G., Hartwig, A.
Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh), Jahrestagung der Fachgruppe
Umweltchemie und Ökotoxikologie, Halle (Saale), 4.-6. Oktober 2006,
Untersuchungen zur Gentoxizität löslicher und partikulärer
Cadmiumverbindungen. Jahnke, G., Thuy, C., Schwerdtle,T., Hartwig, A.
Posterbeiträge auf Fachtagungen
33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Bonn, 13.-15. September 2004, Jahnke, G.,
Hartwig, A., Anwendung der RNA-Interferenz zur Aufklärung des Einflusses
kanzerogener Metallverbindungen auf DNA-Reparaturprozesse und
Zellzykluskontrolle in Säugerzellen.
33. Deutscher Lebensmittelchemikertag, Bonn, 13.-15. September 2004, Schwerdtle,
T,. Lohter, I., Jahnke, G., Walter, I., Hartwig, A., Genotoxizität von Cu(II) in
kultivierten menschlichen Zellen.
8. Tagung des DNA Reparatur Netzwerks, Ulm, 28. September – 1. Oktober 2004,
Jahnke, G., Hartwig, A., RNA interference: a method to investigate the influence
of carcinogenic metal compounds on DNA repair processes and cell cycle
control in cultured human cells.
139
21. GUM Tagung, Würzburg, 5.-8. Oktober 2004, Jahnke, G., Hartwig, A., RNA-
Interferenz: eine Methode zur Aufklärung des Einflusses kanzerogener
Metallverbindungen auf DNA-Reparaturprozesse und Zellzykluskontrolle in
Säugerzellen.
Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh), Lebensmittelchemische Gesellschaft,
Gemeinsame Regionalverbandstagung Nord und Nord-Ost, Hamburg, 8. März 2005,
Lohter, I., Jahnke, G., Schwerdtle, T., Blessing, H., Hartwig, A., Können
Spurenelemente toxisch wirken?
Gesellschaft Deutscher Chemiker (GDCh), Lebensmittelchemische Gesellschaft,
Gemeinsame Regionalverbandstagung Nord-Ost und Süd-Ost, Berlin, 23.-24. März
2006, Schwerdtle, T., Hamann, I., Jahnke, G., Richter, C., Dianov, G. L., Hartwig, A.,
Beeinträchtigung der genomischen Stabilität nach erhöhter Kupferzufuhr.
9. Tagung der Deutschen Gesellschaft für DNA-Reparaturforschung (DGDR),
Hamburg 2006, 12.-15. September 2006, Jahnke, G., Dacke, A., Schwerdtle T.,
Hartwig, A., Role of p53 on the formation and repair of BPDE-induced DNA
adducts in HCT116 p53+/+, HCT116 p53-/-, A549 and A549 p53-knockdown
cells.
Buchbeitrag
Zinkfinger-Proteine als empfindliche Angriffspunkte für toxische Metallionen
und essentielle Spurenelemente. Hartwig, A., Schwerdtle, T,. Blessing, H.,
Hamann, I., Jahnke, G., Thuy, C., Walter, I., in: Experimentelle Modelle der
Spurenelementforschung, Windisch, W., Plitzner, C. (Hrsg.), Herbert Utz Verlag,
München (2006).
140
10 Danksagung
Mein besonderer Dank gilt Frau Prof. Dr. Andrea Hartwig für die Betreuung und stete
Unterstützung meiner Arbeit.
Ebenfalls bedanken möchte ich mich bei Frau Dr. Tanja Schwerdtle, die mir oft mit
Rat und Tat zur Seite stand.
Weiterhin gilt mein Dank allen jetzigen und ehemaligen Kolleginnen und Kollegen
unseres Arbeitskreises, insbesondere Frau Dr. Christina Thuy und Herrn Dr. Ingo
Walter, mit denen mich insbesondere durch den Umzug von Karlsruhe nach Berlin
vieles verbindet sowie Frau Caroline Hall für den freundschaftlichen Zusammenhalt
innerhalb und außerhalb unseres Büros.
Danken möchte ich auch meiner Diplomandin Angela Dacke, die mit großem Fleiß
die Ergebnisse zur Reparatur BPDE-induzierter DNA-Addukte in HCT116 Zellen
erarbeitet hat.
Schließlich danke ich allen Kolleginnen und Kollegen aus dem Arbeitskreis von Herrn
Prof. Dr. Metzler aus der Zeit in Karlsruhe sowie den Mitarbeiterinnen und
Mitarbeitern aus dem Arbeitskreis von Herrn Prof. Dr. Kroh in Berlin für die stets gute
Arbeitsatmosphäre.
Bedanken möchte ich mich bei Prof. Vogelstein (Johns Hopkins University,
Baltimore, USA) und Prof. Schönfelder (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) für die
freundliche Überlassung der HCT116 Zelllinien.
Mein Dank gilt der Landesgraduiertenförderung Baden-Württemberg für die
Gewährung eines Promotionsstipendiums.
Besonderer Dank gilt meinen Eltern und meinen Großeltern, die immer für mich da
waren und mich in vielfältiger Weise auf meinem Weg unterstützt haben.
Meiner Frau Ines danke ich für ihre Liebe und für unsere wunderbare Tochter Lotta.
