Acylierung und physikochemische Charakterisierung
von Ackerbohnen-Legumin
Vom Fachbereich 15 der Technischen Universität Berlin
- Lebensmittelwissenschaft und Biotechnologie -
genehmigte Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
vorgelegt von
Diplom-Lebensmittelchemikerin
Constanze Knopfe
Gutachter: Prof. Dr. habil. Herbert Kunzek
Gutachter: Prof. Dr. habil. Klaus Dieter Schwenke
Gutachter: Priv.-Doz. Dr. Jörg-Thomas Mörsel
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 14. Juni 2000
Berlin 2000
D 83
Danksagung
Die vorliegende Dissertation entstand nach einer Themenstellung von Herrn Prof. Dr.
K. D. Schwenke in dreijähriger Forschungsarbeit (Januar 1995 bis Dezember 1996 und
November 1997 bis Oktober 1998) und basiert auf den DFG-Projekten Schw 462/4-1 und
Schw 462/4-2.
Die Arbeiten wurden, sofern nicht anders vermerkt, in der Forschungsgruppe Pflanzen-
proteinchemie am Institut für Angewandte Proteinchemie e.V., Kleinmachnow durchge-
führt.
Mein besonderer Dank gilt Herrn Prof. Dr. K. D. Schwenke für die Bereitstellung des
Themas, die vielen konstruktiven Diskussionen sowie die freundliche Betreuung.
Allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Pflanzenproteinchemie, insbesondere Frau Dr. Steffi
Dudek, Herrn Dr. Ralf Mothes, Herrn Dr. Peter Krause, Frau Angelika Krajewski, Frau
Helga Beyer und Frau Bettina Junker, danke ich für ihre hilfreiche Unterstützung, anre-
gende Diskussionen und vor allem für die angenehme Laboratmosphäre.
Mein Dank gilt allen nationalen und internationalen Kooperationspartnern für die freund-
liche Unterstützung und erfolgreiche Zusammenarbeit, insbesondere
• Frau Dr. Larissa Mikheeva am Institut für Biochemische Physik der Russischen Aka-
demie der Wissenschaften, Moskau, für die Betreuung bei den DSC-Messungen
• Herrn Dr. Eckhard Görnitz am Fraunhofer-Institut für Angewandte Polymerforschung,
Teltow-Seehof, für die Ermöglichung zahlreicher Dichte- und Ultrazentrifugations-
messungen
• Herrn Dr. Dietrich Zirwer und Herrn Dr. Klaus Gast am Max-Delbrück-Centrum, Ber-
lin-Buch, für die Einarbeitung in die CD-Spektroskopie
• Herrn Dr. Herbert Dautzenberg am Max-Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächen-
forschung, Teltow-Seehof, für die gemeinsame Durchführung der Messungen zur
Lichtstreuung
Inhaltsverzeichnis 1
INHALTSVERZEICHNIS
1 EINLEITUNG UND ZIELSTELLUNG....................................................................................4
2 THEORETISCHE GRUNDLAGEN.........................................................................................7
2.1 Pflanzliche Speicherproteine ................................................................................................7
2.1.1 Struktur pflanzlicher Speicherproteine...................................................................................7
2.1.2 11 S-Globuline..................................................................................................................9
2.1.3 Die Ackerbohne und ihr Hauptspeicherprotein (Legumin)........................................................ 10
2.2 Proteinmodifizierung......................................................................................................... 12
2.2.1 Chemische Modifizierung der Aminogruppen......................................................................... 13
2.2.1.1 Die Acylierung................................................................................................................. 13
2.2.1.2 Acetylierung von Ackerbohnen-Legumin............................................................................... 14
2.2.1.3 Succinylierung von Ackerbohnen-Legumin............................................................................ 16
2.2.1.4 Die Guanidinierung.......................................................................................................... 17
2.2.1.5 Amidinierung und Alkylierung............................................................................................. 17
2.2.2 Chemische Modifizierung der Carboxylgruppen...................................................................... 17
2.2.2.1 Die Veresterung.............................................................................................................. 18
2.2.2.2 Amidierung..................................................................................................................... 18
2.2.3 Reduktion bzw. Oxidation von Disulfid- bzw. Sulfhydrylgruppen............................................... 18
2.2.4 Hydrolyse und Desamidierung............................................................................................ 19
2.2.5 Die Glycosylierung........................................................................................................... 20
2.2.6 Die Phosphorylierung........................................................................................................ 20
3 MATERIAL UND METHODEN...........................................................................................22
3.1 Proteindarstellung............................................................................................................ 22
3.1.1 Verfahren zur Isolierung des Ackerbohnen-Legumins............................................................. 22
3.1.2 Chemische Modifizierung der Leguminproben........................................................................ 23
3.1.2.1 Acetylierung................................................................................................................... 23
3.1.2.2 Succinylierung................................................................................................................. 24
3.2 Charakterisierung des Untersuchungsmaterials ..................................................................... 24
3.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration................................................................................. 24
3.2.1.1 Mikro-Biuret-Methode....................................................................................................... 24
3.2.1.2 Proteingehalt nach KJELDAHL............................................................................................. 25
3.2.2 Methoden zur Bestimmung des Modifizierungsgrades ............................................................. 25
3.2.2.1 Bestimmung des N-Acylierungsgrades................................................................................. 25
3.2.2.2 Bestimmung des O-Acylierungsgrades................................................................................. 26
3.2.3 Größenausschluß-Chromatographie (SE-HPLC)...................................................................... 27
3.2.4 Gelelektrophorese............................................................................................................ 27
3.2.4.1 Denaturierende Gelelektrophorese (SDS-PAGE)..................................................................... 27
3.2.4.2 Native Gelelektrophorese (BN-PAGE)................................................................................... 27
3.2.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)................................................................................ 28
3.2.6 Methoden zur Untersuchung der Hydrophobizität................................................................... 28
Inhaltsverzeichnis 2
3.2.6.1 Fluoreszenzsondentechnik................................................................................................. 28
3.2.6.2 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC).............................................. 30
3.2.6.3 Verteilung im Polymer-Zweiphasensystem............................................................................ 30
3.3 Methoden zur Aufklärung von Konformationsänderungen........................................................ 31
3.3.1 Hydrodynamische Methoden.............................................................................................. 31
3.3.1.1 Kapillarviskosimetrie ........................................................................................................ 31
3.3.1.2 Präzisionsdichtemessung................................................................................................... 32
3.3.1.3 Analytische Ultrazentrifugation........................................................................................... 33
3.3.1.4 Dynamische Lichtstreuung................................................................................................. 36
3.3.2 Spektroskopische Methoden............................................................................................... 38
3.3.2.1 UV-Absorptionsspektroskopie............................................................................................. 38
3.3.2.2 Fluoreszenzemissionsspektroskopie..................................................................................... 39
3.3.2.3 Circulardichroitische Spektrometrie..................................................................................... 40
3.3.3 Methoden zur Untersuchung der Konformationsstabilität......................................................... 42
3.3.3.1 Differential Scanning-Kalorimetrie zur Untersuchung der Thermostabilität.................................. 42
3.3.3.2 Fluoreszenzspektroskopie zur Untersuchung der Denaturansstabilität........................................ 44
4 ERGEBNISSE.................................................................................................................48
4.1 Acylierung funktioneller Gruppen des Legumins..................................................................... 48
4.2 Untersuchungen zur Struktur acylierter Leguminproben.......................................................... 55
4.2.1 Veränderung der Hydrophobizität infolge Acylierung............................................................... 55
4.2.1.1 Oberflächenhydrophobizität acylierter Leguminproben............................................................ 55
4.2.1.2 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie acylierter Legumine ................................. 57
4.2.1.3 Verteilung von Leguminproben in einem Polymer-Zweiphasensystem........................................ 59
4.2.2 Dissoziation und Assoziation acylierter Leguminproben........................................................... 59
4.2.2.1 Größenausschluß-Chromatographie acylierter Leguminproben................................................. 60
4.2.2.2 Analytische Ultrazentrifugation acylierter Leguminproben........................................................ 61
4.2.2.3 Native Gelelektrophorese acylierter Leguminproben............................................................... 63
4.2.2.4 Isolierung und Charakterisierung der aggregierten Fraktion in hochacetyliertem Legumin............. 65
4.2.3 Bestimmung hydrodynamischer Größen............................................................................... 68
4.2.3.1 Viskosität acylierter Leguminproben.................................................................................... 68
4.2.3.2 Partielles spezifisches Volumen und Dichte acylierter Leguminproben........................................ 73
4.2.3.3 Sedimentationskoeffizienten von hochsuccinyliertem Legumin................................................. 75
4.2.3.4 Diffusionskonstanten von hochsuccinyliertem Legumin........................................................... 77
4.2.4 Spektroskopische Untersuchungen...................................................................................... 79
4.2.4.1 Fluoreszenzemissionsspektroskopie acylierter Leguminproben................................................. 79
4.2.4.2 UV-Absorptionsspektroskopie acylierter Leguminproben.......................................................... 85
4.2.4.3 Circulardichroitische Spektrometrie acylierter Leguminproben.................................................. 92
4.2.5 Thermostabilität acylierter Leguminproben........................................................................... 98
4.2.6 Denaturansstabilität acylierter Leguminproben.....................................................................103
5 DISKUSSION...............................................................................................................106
6 ZUSAMMENFASSUNG...................................................................................................125
7 LITERATUR.................................................................................................................130
Abkürzungsverzeichnis 3
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
ac (... % N-)acetyliert
AKF (Zeit-)Autokorrelationsfunktion
ANS 8-Anilino-1-naphtalinsulfat
AS Aminosäure
AUZ analytische Ultrazentrifugation
BN-PAGE Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese
CD Circulardichroismus
CPS Complexpuffer mit 0,5 M NaCl
DLS dynamische Lichtstreuung
DTE Dithioerythritol
GuHCl Guanidinium-Hydrochlorid
I Ionenstärke
ID Innendurchmesser der HPLC-Säule
IP isoelektrischer Punkt
Kap. Kapitel
MALDI-TOF MS Matrix-unterstützte Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit Massen-
spektrometrie
MRW mittleres molares Restgewicht
MWG Massenwirkungsgesetz
PB Phosphatpuffer
Phe Phenylalanin
Pkt. Punkt
Prot. Protein
RF Relative Fluoreszenz
RP-HPLC Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie
RSA Rinderserumalbumin
RT Raumtemperatur
SDS-PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdodecylsulfat
SE-HPLC Größenausschluß-Hochleistungsflüssigchromatographie
suc (... % N-)succinyliert
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
var. Varietät
VF Verdünnungsfaktor
N-Blockierung, N-Acylierung = Modifizierung der Protein-Aminogruppen
O-Blockierung, O-Acylierung = Modifizierung der Protein-Hydroxylgruppen
Einleitung und Zielstellung 4
1 Einleitung und Zielstellung
In der vorliegenden Arbeit wird über die chemische Modifizierung und physikochemische
Untersuchungen am nativen und acylierten Hauptspeicherprotein der Ackerbohne (Vi-
cia faba L.), einem 11 S-Globulin („Legumin“) berichtet.
Die Ackerbohne gehört zu den Leguminosen. Körnerleguminosen werden in Europa auf
etwa 3 % des Ackerlandes angebaut, in Afrika dagegen auf 8 %, in Asien auf 9 % des
Ackerlandes [1]. Nur 30 % des in Europa konsumierten Proteins werden in der EU produ-
ziert und nur 5 % stammen von in der EU produzierten Hülsenfrüchten [2]. Ackerbohnen
werden vor allem aus China nach Europa importiert [3].
Körnerleguminosen sind eine anerkannte Proteinquelle für die Human- und Tierernäh-
rung. Sie enthalten aber auch etliche für die Ernährung nachteilige Faktoren (Proteasein-
hibitoren, Lectine, kondensierte Tannine, Vicine), die jedoch mittels unterschiedlichster
Behandlungsmethoden inaktiviert oder entfernt werden können bzw. müssen [3]. In eu-
ropäischen Ländern wurden 1996 durchschnittlich 2,5 kg Hülsenfrüchte pro Jahr und
Einwohner (vgl. Brasilien 16 kg) verzehrt [4] und von 1996-1997 457 000 t Ackerbohnen
als Viehfutter produziert [5]. In Deutschland wurden 1997 auf 81 000 ha Fläche
236 000 t Hülsenfrüchte produziert; 91 % fanden Anwendung als Futtermittel, nur 4 %
als Nahrungsmittel [6].
Die große Aufmerksamkeit, die Proteinen allgemein zuteil wird, hängt mit ihrer Schlüssel-
rolle als Bestandteil vieler Lebensmittel zusammen. Ihre funktionellen Eigenschaften und
deren gezielte Beeinflussung befähigen sie zur Bildung und Stabilisierung von Gelen,
Schäumen und Emulsionen in Lebensmittelsystemen [7].
Pflanzenproteine haben neben der ernährungsphysiologischen auch eine funktionelle Be-
deutung. Die physikochemischen und funktionellen Eigenschaften von den aus Pflanzen-
teilen oder den Samen isolierten Komponenten, wie Proteine, Stärke, Rohfasern sprechen
für eine zunehmende Anwendung nicht nur im Bereich der Ernährung sondern vor allem
auch im technischen Bereich („Non-Food-Use“). Eine Hauptursache dafür ist das Anfallen
gewaltiger Mengen Protein als Nebenprodukt z. B. bei der Stärke- (im Abwasser bei der
Kartoffelstärkeproduktion) und Ölerzeugung (in den Preß- und Extraktionsrückständen
der Ölsamen). Die rasche Entwicklung neuer Technologien für pflanzliche Speicherprotei-
ne als nachwachsende und biologisch abbaubare Rohstoffe für nützliche und wichtige
industrielle Produkte mit breit gefächerter Anwendung insbesondere im „Non-Food“-
Sektor ist bereits abzusehen [6].
Einleitung und Zielstellung 5
Die Samenproteine bzw. Proteine im allgemeinen, weisen im nativen Zustand allerdings
nur selten ein Optimum an funktionellen Eigenschaften auf. Diese lassen sich z. B. durch
chemische Modifizierung beeinflussen. Dabei können die reaktiven Seitengruppen und die
Raumstruktur des Proteins verändert werden [68].
Von den vielfältigen Möglichkeiten chemischer Modifizierung werden in der vorliegenden
Arbeit die Untersuchungen zu den Veränderungen am Ackerbohnen-Legumin durch Acy-
lierung (Acetylierung und Succinylierung) beschrieben.
In der Literatur findet man ein breites Spektrum an Arbeiten, die sich mit der Acylierung
tierischer Proteine (z. B. Casein [8, 9], Rinderserumalbumin [10]) und der Acylierung von
11 S-Globuline enthaltenden Proteinisolaten, -konzentraten oder -fraktionen verschiede-
ner Ölpflanzen und Leguminosen (z. B. aus Sojabohne/Glycinin [11, 12], Raps/Cruciferin
[13, 14, 15], Sonnenblume/Heliantinin [15, 16, 141], Erdnuß/Arachin [17, 18]) befassen.
In der Arbeitsgruppe von Prof. K. D. SCHWENKE wurden umfassende Untersuchungen an
acylierten Ackerbohnen-Proteinisolaten, die zu etwa 65 % aus Legumin bestehen, durch-
geführt [19, 20, 21]. Informationen über chemische und funktionelle Eigenschaften von
Ackerbohnen-Proteinisolaten und deren Modifikaten wurden von SCHMANDKE zusam-
mengefaßt [44].
Für die gezielte Veränderung der Funktionalität eines Proteins ist es notwendig, Bezie-
hungen zwischen Struktur und Funktionalität aufzuklären. Das Verhalten während der
chemischen Modifizierung und die Auswirkungen durch die Acylierung sind jedoch nicht
ohne weiteres vom Proteinisolat auf das „reine” Ackerbohnen-Legumin übertragbar, was
durch den Vergleich der nach Acetylierung von Ackerbohnen-Proteinsolat [22] und „rei-
nem“ Ackerbohnen-Legumin [75] resultierenden Grenzflächeneigenschaften deutlich
wird. Erst die Untersuchungen an „reinen“ 11 S-Globulinen geben definierte Auskünfte
über deren Strukturveränderungen, da in den häufig untersuchten Proteinisolaten die
reichlich vorhandenen Minorkomponenten und diversen Beimengungen stören. Zusam-
menhänge zwischen Struktur und Grenzflächenverhalten von acetylierten Proteinisolaten
und einigen acetylierten Ackerbohnen-Leguminderivaten wurden von KRAUSE untersucht
[23, 75].
Die grundlegende Aufgabe im Rahmen der vorliegenden Arbeit bestand darin, das Haupt-
speicherprotein der Ackerbohne („Legumin“) möglichst rein zu isolieren und chemisch
modifizierte Präparate herzustellen. Aus dem isolierten nativen Legumin wurden acety-
lierte und succinylierte Proben mit unterschiedlichen Modifizierungsgraden präpariert.
Einleitung und Zielstellung 6
Anschließend wurden diese Derivate chemisch charakterisiert, und es erfolgten umfas-
sende, über bisherige Untersuchungen hinausgehende Studien über deren physikochemi-
sche Eigenschaften. Die physikochemischen Eigenschaften der unterschiedlich acylierten
Leguminderivate wurden mit denen des nativen Legumins verglichen.
Weiteres Ziel dieser Arbeit war die Aufklärung eintretender Struktur- bzw. Konformation-
sänderungen des Legumins in Abhängigkeit von der Art (Acetylierung, Succinylierung)
und dem Grad der Modifizierung der funktionellen Gruppen. Im Hinblick auf die Manipula-
tion der funktionellen Eigenschaften des Legumins waren Untersuchungen zur Konforma-
tionsstabilität und der Oberflächenhydrophobizität von besonderer Bedeutung.
Neben den Kenntnissen über den Zusammenhang zwischen funktionellen Eigenschaften
und Proteinstruktur, sind für die Herstellung von mittels chemischer Modifikation „maß-
geschneiderten“ Proteinen für die industrielle Anwendung auch Kenntnisse über den Ein-
fluß technologisch relevanter Faktoren wie pH-Wert, Ionenstärke und Temperatur auf die
Proteinstruktur notwendig. Aus diesem Grund wurde der Frage nach dem Einfluß der
Ionenstärke des Lösungsmittels auf die Konformation und die physikochemischen Eigen-
schaften ausgewählter Proben nachgegangen.
Die Aussagen der vorliegenden Arbeit wurden mit Hilfe chromatographischer, elektropho-
retischer, hydrodynamischer (Kapillarviskosimetrie, Präzisionsdichtemessung, analytische
Ultrazentrifugation, dynamische Lichtstreuung), spektroskopischer (Fluoreszenz-, UV-,
CD-Spektroskopie) und thermodynamischer (Entfaltung durch Erhitzen und in Gegenwart
von Denaturans) Untersuchungsmethoden getroffen.
Theoretische Grundlagen 7
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Pflanzliche Speicherproteine
Es gibt keine einheitliche systematische Klassifizierung der Proteine. Gebräuchlich ist
entweder die Einteilung nach ihrer biologischen Funktion, z. B. in Speicherproteine,
Transportproteine, Strukturproteine, Enzyme oder nach ihrem Vorkommen in pflanzliche
und tierische Proteine bzw. Muskelproteine, Plasmaproteine, Milchproteine u. s. w. Prote-
ine werden auch häufig entsprechend ihrer Struktur klassifiziert. Danach unterscheidet
man globuläre und fibrilläre Proteine.
Eine Klassifizierung der Pflanzenproteine wurde schon 1924 von OSBORNE [24] einge-
führt. Das Osborne-Schema unterscheidet die Pflanzenproteine nach ihrer Löslichkeit
entweder in Wasser (Albumine), in Salzlösungen (Globuline), in wäßrigem Alkohol (Pro-
lamine) oder in sauren oder alkalischen Lösungen (Gluteline).
Samenspeicherproteine dienen als Stickstofflieferanten für die Keimung. Im Prinzip kön-
nen alle Proteine, soweit sie bei der Keimung abgebaut werden und zur Versorgung des
Keimlings dienen, als Reserve- oder Speicherproteine bezeichnet werden. Nach
DERBYSHIRE et al. [25] sollte jedes aus reifen Samen extrahierte Protein als potentielles
Speicherprotein betrachtet werden, wenn dessen Anteil am Gesamtprotein mehr als 5 %
beträgt. Im allgemeinen wird die Bezeichnung Speicherprotein auf die in den Aleuronkör-
nern der Speichergewebe vorkommenden Globuline angewendet, allerdings unter dem
Vorbehalt, daß eine enzymatische Funktion dieser Proteine nicht mit Sicherheit ausge-
schlossen werden kann [47].
2.1.1 Struktur pflanzlicher Speicherproteine
Die typischen Speicherproteine der Cerealien sind Prolamine und Gluteline, die Samen
von Leguminosen enthalten überwiegend Globuline und Albumine.
Unter den Samenalbuminen kommen auch zwei Gruppen wasserlöslicher Proteine mit
besonderen biologischen Aktivitäten vor: Proteinaseinhibitoren, welche die Aktivität pro-
teolytischer Enzyme hemmen (z. B. Trypsin- und Chymotrypsininhibitoren) und Phyto-
hämagglutinine, die Erythrozyten agglutinieren können (z. B. Lectine).
Die meisten Speicherproteine weisen nur wenig Cystein und Methionin auf, wodurch ihre
biologische Wertigkeit limitiert wird [31].
Theoretische Grundlagen 8
Bei den anteilig überwiegenden, in den Aleuronkörnern der Kotyledonen lokalisierten
Globulinen werden zwei Hauptfraktionen unterschieden: die vicilinartigen Globuline mit
Sedimentationskoeffizienten von ungefähr 7 S (z. B. Vicilin in Ackerbohne und Erbse, β-
Conglutin in Lupine, Phaseolin in Buschbohnen) und die leguminartigen Globuline mit
Sedimentationskoeffizienten von ungefähr 11-13 S [25] (z. B. Legumin in Ackerbohne,
Glycinin in Soja, Arachin in Erdnüssen, α-Conglutin in Lupine, Cruciferin in Raps). Die
Trennung von Leguminen und Vicilinen kann durch die Ausnutzung der verschiedenen
isoelektrischen Punkte erfolgen (IPLeg = 4,7 und IPVic = 5,5). Neben den „11 S“- und den
„7 S“-Globulinen sind niedermolekulare 2 S-Globuline sind nachweisbar, die im Fall von
Raps (Napin) sogar das Hauptspeicherprotein darstellen.
Globuläre Proteine bestehen aus Polypeptidketten, die sich nach oder während der Syn-
these, entsprechend dem energetisch günstigsten Zustand, spontan zu ihrer Raumstruk-
tur falten. Ihre Raumstruktur ist bereits durch die Sequenz der Aminosäuren festgelegt.
Sie sind typischerweise recht kompakt, annähernd kugelig und enthalten hydrophobe,
sehr dicht gepackte „Kerne“ vorrangig unpolarer Aminosäurereste [26]. Dagegen befin-
den sich die polaren hydrophilen Aminosäurereste überwiegend an der Oberfläche des
Proteinmoleküls [26, 27].
Globuläre Proteine haben ein spezifisches Volumen von ungefähr 0,75 • 10-3 cm3/g. Ihr
Radius kann annähernd durch die Gleichung R = 6,7 • 10-11 • [Mr]1/3 bestimmt werden
[27], und ihre Dichte beträgt ungefähr 1,33 • 10-3 g/cm3 [28].
Vor allem große globuläre Proteine (> 150 Aminosäuren) sind oft in kleineren strukturier-
ten Domänen organisiert [26, 27]. Komplexe Proteine bestehen häufig aus Untereinhei-
ten, die über nicht kovalente Wechselwirkungen verbunden sind.
Von FREITAS et al. [29] wurde die Untereinheitenstruktur der Hauptspeicherproteine ver-
schiedener Leguminosensamen, wie z. B. Lupine, Soja, Erbse, Ackerbohne, Buschbohne,
Linse mittels Gelelektrophorese verglichen. Die Untereinheiten der 7 S-Globuline (Vicili-
ne) aus Polypeptiden mit Molekularmassen um 50 und 70 kDa enthalten kein Cystein und
bilden über nichtkovalente Wechselwirkungen eine Quartärstruktur. Sie liegen häufig zu
Trimeren mit Molekularmassen zwischen 150 und 210 kDa assoziiert vor und enthalten
keine Disulfidbrücken [25, 30, 36]. Die 11 S-Globuline (Legumine) bestehen aus einer
begrenzten Anzahl von Polypeptiden. Man unterscheidet eine Gruppe leichterer basischer
Polypeptide mit 20-25 kDa und eine mit schwereren sauren Polypeptiden (35-50 kDa).
Im Unterschied zu den Vicilinen enthalten die Untereinheiten der 11 S-Globuline in der
Regel mindestens eine Disulfidbrücke (s. Kap. 2.1.2).
Theoretische Grundlagen 9
2.1.2 11 S-Globuline
Legumine (11 S-Globuline) und Viciline (7 S-Globuline) sind die Hauptspeicherproteine in
Leguminosen; ihre Anteile variieren jedoch in Abhängigkeit vom Genotyp stark. In der
Ackerbohne ist das Legumin zu deutlich größeren Anteilen als Vicilin vorhanden [31, 47].
Da allen Untersuchungen der vorliegenden Arbeit ein 11 S-Globulin als Ausgangsmaterial
zugrunde liegt, wird nur auf diese Globulinspezies näher eingegangen.
Die 11 S-Globuline sind aus sechs Untereinheiten zusammengesetzt, die eine geordnete
Raumstruktur bilden. Die 11 S-Globuline sind dissoziierende und assoziierende Proteine
[32]. Jede Untereinheit besteht aus zwei Polypeptidketten: der sauren α-Kette und der
basischen β-Kette, die über eine Disulfidbrücke miteinander verknüpft sind [49].
Die Sekundärstruktur einiger 11 S-Globuline wurde von ZIRWER et al. [33] mittels CD-
Spektroskopie untersucht und nach der Methode von PROVENCHER & GLÖCKNER [34]
ausgewertet. Demnach weisen sie 40-50 % β-Faltblattstrukuren und nur ungefähr 10 %
helikale Strukturen auf und gehören somit zur Klasse der β-Proteine.
Die Aminosäuresequenzen der 11 S-Globuline verschiedener Leguminosen-Samen (z. B.
Pisum sativum L., Vicia faba L. und Lens culinaris L.), ebenso die der 7 S-Globuline, sind
sich jeweils ähnlich [35, 31]. Ihre Homologie ist besonders im N-Terminus ausgeprägt
[51].
Nachfolgend sind einige Eigenschaften ausgewählt, welche die Homologie der 11 S-
Globuline unterstreichen. Die 11 S-Globuline haben Molmassen zwischen 300 000 und
360 000 g/mol und Moleküldurchmesser zwischen 10 und 18 nm [36, 37]. Die Sedimen-
tationskoeffizienten S020,W schwanken zwischen 11 S und 13 S, ihre Diffusionskoeffizien-
ten D020,w werden mit 3,26 - 3,83 x 10-7 cm2 s-1 angegeben [36, 37]. Die Stokesschen
Radien der 11 S-Globuline aus Ackerbohne, Erbse und Sonnenblume betragen
5,5 - 6,45 nm [36]. Die 11 S-Globuline denaturieren (in Abhängigkeit vom Lösungsmit-
tel) bei Temperaturen zwischen 85 und 95 ° C [38, 39, 149].
Auf diesen Kenntnissen basierend entwickelten PLIETZ et al. [40, 49, 51] für die Quartär-
struktur des 11 S-Globulins folgendes Modell (Abbildung 1). Jeweils sechs Untereinhei-
ten (aus α- und β-Kette bestehend) bilden ein trigonales Antiprisma. Die konservativen
N-terminalen Sequenzbereiche von α- und β-Kette (Nα und Nβ) bilden strukturbestim-
mende Domänen im Inneren der Untereinheit. Der hydrophile C-terminale Bereich der α-
Kette (Cα) liegt an der Oberfläche. Die C-terminalen Bereiche der β-Ketten (Cβ) befinden
sich im Zentrum des trigonalen Antiprismas und stabilisieren es durch hydrophobe Wech-
selwirkungen.
Theoretische Grundlagen 10
Abbildung 1: Modell des hexameren Moleküls der 11 S-Globuline nach PLIETZ et al. [40, 51]
2.1.3 Die Ackerbohne und ihr Hauptspeicherprotein (Legumin)
Ackerbohnen gehören zu den ältesten Kulturpflanzen [41]. Archäologische Hinweise führ-
ten zu der Einschätzung, daß sie bereits 4000-3000 v. u. Z. in der Landwirtschaft ange-
baut wurde [42]. Die Ackerbohne (Vicia faba L.) gehört zur Klasse der Dikotyledonen
(Zweikeimblättrige) und der Ordnung Fabales (Leguminosen). Die Ordnung Fabales hat
nur einkeimblättrige Früchte, die sich zu den charakteristischen Hülsenfrüchten entwi-
ckeln. Ackerbohnen werden neben Erbsen, Linsen, Lupine der Familie Fabaceae (Schmet-
terlingsblütler) und der Gattung Vicieae (Wicken) zugeordnet. Durch die Möglichkeit der
Luftstickstoffbindung mit Hilfe symbiotischer Knöllchenbakterien in Wurzelknöllchen sind
einige Vertreter der Fabaceae auch auf stickstoffarmen Böden wichtige Eiweißlieferanten
[43].
Reife Ackerbohnen-Samen enthalten 44-46 % Kohlenhydrate, 20-31 % Proteine,
10-15 % Wasser und ca. 2 % Lipide [44]. Das Mehl geschälter Ackerbohnen besteht zu
ungefähr 31 % der Trockenmasse aus Proteinen [45]. Die Globulinfraktion besteht aus
vier Proteinkomponenten mit den Sedimentationskoeffizienten 2 S, 7 S, 11 S und 15 S
[46]. Ihre Mengenanteile variieren in Abhängigkeit von der Sorte, aber Legumin und Vici-
lin sind die Hauptkomponenten [44]. Die Globulinfraktion der Ackerbohnen besteht zu
etwa 70 % aus Legumin und zu etwa 30 % aus Vicilin [47].
Die Quartärstruktur des Ackerbohnen-Legumins kann mit dem Modell nach PLIETZ et al.
[40, 49, 51] (s. Kap. 2.1.2) beschrieben werden. Die Angaben über die Molmasse des
hexameren Gesamtmoleküls schwanken in einem Bereich von 350 000 ± 30 000 g/mol
[48, 49, 50]. Für die schwerere saure Polypeptidkette wurden 32 000 - 37 000 g/mol und
für die basische β-Kette etwa 20 000 g/mol ermittelt [48, 51, 52]. Das ellipsoide Molekül
Theoretische Grundlagen 11
mit Dimensionen von 12,6 x 12,6 x 8,8 nm besteht aus sechs polymorphen Untereinhei-
ten (αβ-Monomere) mit Molmassen von etwa je 60 000 g/mol. Man unterscheidet zwei
homologe Untereinheitentypen mit ca. 50 %iger Sequenzidentität. Der sogenannte Typ A
enthält Methionin, die Untereinheit vom Typ B dagegen ist methioninfrei [53, 54, 56].
Beide Untereinheiten-Typen bilden zu etwa gleichen Teilen die Quartärstruktur des Vi-
cia faba-Legumins [54, 55].
Die erste vollständige Sequenz für ein eine Untereinheit codierendes Gen (LeB4) wurde
von BÄUMLEIN et al. [56] veröffentlicht. Dabei handelt es sich um eine Untereinheit des
B-Typs. Die entsprechende saure, sehr hydrophile α-Kette besteht aus 281 Aminosäuren
und weist als N-terminale Aminosäure Threonin auf. Die basische, mäßig hydrophobe β-
Kette aus 181 Aminosäuren enthält Glycin als N-Terminus. Sie sind über eine Disulfidbrü-
cke zwischen der Aminosäure Cys87 der α-Kette und Aminosäure Cys7 der β-Kette mit-
einander verknüpft. Die Aminosäurezusammensetzung zeigt einen für pflanzliche Globuli-
ne charakteristischen hohen Arginingehalt. Desweiteren sind viel Asparagin- und Gluta-
minsäure enthalten, die zu etwa 50 % amidiert vorliegen. Die Glutaminsäurereste sind
besonders in der sauren Polypeptidkette konzentriert, die außerdem deutlich geringere
Gehalte an Alanin-, Valin- und Leucinresten als die basische β-Kette aufweist [57].
Später wurde von SCHLESIER et al. [128] ein, eine Typ A-Untereinheit des Ackerbohnen-
Legumins codierendes Gen sequenziert. Die α-Kette der Untereinheit von Typ A besteht
aus 294 Aminosäuren mit Leucin als N-Terminus, die β-Kette aus 189 Aminosäuren mit
- genau wie bei Typ B - Glycin als N-terminale Aminosäure. Das Molekül besitzt eine Di-
sulfidbrücke zwischen den Aminosäuren Cys86 der α- und Cys7 der β-Kette.
Das aus Untereinheiten zusammengesetzte Ackerbohnen-Leguminmolekül kann dissoziie-
ren und assoziieren. Von SCHWENKE [32] wurde anhand von Literaturdaten verschiede-
ner Samenglobuline das folgende allgemeine Dissoziationsschema der 11 S-Globuline
aufgestellt:
11 S ↔ 2 x 7 S → 6 x 3 S → 12 x 2 S
(300-360) (2 x 150-180) (6 x 50-60) (12 x 25-30) kDa
Neben Dissoziation und Aggregation durch Hitzeeinwirkung und alkali- bzw. säureindu-
zierter Dissoziation ist die Ionenstärke des Lösungsmittels für das Dissoziations- und As-
soziationsverhalten von immenser Bedeutung. Damit die Untereinheiten in ihre disulfid-
verbrückten konstituierenden Ketten dissoziieren, sind reduzierende Bedingungen und
Detergentien wie SDS oder andere denaturierende Agentien notwendig.
Theoretische Grundlagen 12
2.2 Proteinmodifizierung
Proteine und Proteinisolate können modifiziert werden, um sie mit wünschenswerten
funktionellen und ernährungsphysiologischen Eigenschaften für Nahrungszwecke oder im
„Non-Food“-Bereich zu versehen [6, 58, 59, 60, 61, 62]. Die gezielte Modifizierung von
Proteinen wird auch als Werkzeug für die Ableitung allgemeiner Struktur-Funktion-
Beziehungen eingesetzt [58, 59].
Um neue Anwendungsmöglichkeiten von Pflanzenproteinen zu finden, werden immer
wieder neue Methoden und Verfahren entwickelt. So werden die pflanzlichen Speicher-
proteine chemisch und enzymatisch, physikalisch oder gentechnisch modifiziert, um ihre
physikochemischen Eigenschaften und ihre Funktionalität gezielt zu verändern.
Die chemische Modifizierung schließt die Derivatisierung der Aminosäure-Seitenketten
von Proteinen und die Hydrolyse von Peptidbindungen ein. Die typischen chemischen
Reaktionen werden oft entsprechend dem zu benutzenden Reagenstyp klassifiziert und
sind in etlichen Übersichtsarbeiten zusammengestellt worden [59-62]. Die „klassische”
chemische Modifizierung (nicht enzymatische) ist in der Regel einfach und preiswert aus-
zuführen [63]. Viele der chemischen Modifizierungsmethoden sind jedoch für die Anwen-
dung im Nahrungsmittelbereich nicht geeignet [58]. Für die Derivatisierung sind ver-
schiedene reaktive Aminosäure-Seitenketten verfügbar, z. B. Amino-, Carboxyl-, Sulf-
hydryl- und Phenolgruppen. Die chemische Modifizierung richtet sich im allgemeinen ge-
zielt auf einen bestimmten Seitenketten-Typ; sie verläuft aber häufig nicht spezifisch
sondern kann mehrere funktionelle Gruppen betreffen [59]. Im Gegensatz zur chemi-
schen ist die enzymatische Modifizierung in der Regel von hoher Spezifität und kann oft-
mals unter milderen Bedingungen erfolgen. Von besonderer Bedeutung auf enzymati-
schem Gebiet sind die Hydrolyse der Peptidbindung durch Proteasen, Addition bzw. Ent-
fernung von Substituenten an bzw. aus reaktiven Gruppen der Seitenketten von Amino-
säureresten (Phosphatase/Phosphorylase-Kinase, Glycosyl-Transferase, Transamidase)
und die Vernetzung (Transglutaminase). Chemische und enzymatische Modifizierung be-
wirken mit unterschiedlichen Mechanismen ähnliche Veränderungen in der Chemie von
Proteinen (Phosphorylierung, Desamidierung, Vernetzung).
Die physikalische Modifizierung beruht vor allem auf Hochdruck- und Temperatureinwir-
kung. Die Hitzedenaturation globulärer Proteine kann zur Aggregation führen, die Protei-
ne werden unlöslich. Die Stabilität der nativen Proteinkonformation gegenüber entfalten-
den Prozessen kann durch die Bildung von Disulfidbrücken zwischen den Cysteinresten
der Peptidkette erhöht werden. Je niedriger die Temperatur ist, bei der die Entfaltung
stattfindet, um so geringer ist die Wahrscheinlichkeit, daß irreversible Reaktionen, wie
Theoretische Grundlagen 13
das Aufbrechen von Disulfidbrücken, auftreten. Diese Art der physikalischen Modifizie-
rung ist z. B. für die zunehmende Anwendung von Proteinen als Adhesiva, Überzüge und
Filme von Bedeutung [6, 64]. Druckeinwirkung führt zur vollständigen Entfaltung oder
zur partiellen Entfaltung der Proteine, die in verdünnten Lösungen oftmals reversibel ist.
Da die Proteine bei diesem Prozeß oft eine andere als die native Konformation einneh-
men, kann auch auf diesem Wege die Funktionalität modifiziert werden.
In der Biotechnologie angewendete gentechnische Verfahren zur Modifizierung basieren
auf Mutation. Eine kodierende Gensequenz wird kloniert und in einem geeigneten System
zur Expression gebracht, um genügend mutiertes Protein zu erzeugen. In der Hauptsache
werden ortsgerichtete oder gezielte Mutation (site-directed) und zufällige Mutation (ran-
dom) unterschieden. Den Samenproteinen der Leguminosen mangelt es an Methionin
und Cystein. Von den verschiedenen Strategien, die erarbeitet wurden, um die limitierte
Aminosäurezusammensetzung der Leguminosen-Samenproteine aufzuwerten, kann die
Modifizierung der die Proteine kodierenden Gene die ideale Lösung sein [65]. Ein Beispiel
dafür ist die Einführung heterologer Sequenzen von Brasilnuß und Sonnenblumensamen-
Albuminen, die besonders viel schwefelhaltige Aminosäuren enthalten, in Legumin- und
Vicilin-Gene [31, 66]. Die Möglichkeiten zur Verbesserung der funktionellen und ernäh-
rungsphysiologischen Eigenschaften auf der Grundlage gentechnischer Methoden am Bei-
spiel der Sojabohne wurden von UTSUMI & KITO [67] zusammengestellt und mit chemi-
scher und physikalischer Modifizierung verglichen.
Verschiedene Methoden der chemischen Modifizierung ermöglichen eine zielgerichtete
Verbesserung der funktionellen Eigenschaften von Proteinen durch die Veränderung der
Oberflächenladung und der nativen Konformation ohne Spaltung der Primärstruktur [68].
Die chemischen Modifizierungsmethoden beruhen auf der Modifizierung der Aminogrup-
pen (Acylierung, Alkylierung) und Carboxylgruppen (Veresterung, Amidierung), der kova-
lenten Bindung von Aminosäuren, Phosphaten und Kohlenhydraten sowie der Oxidati-
on/Reduktion von Sulfhydrylgruppen/Disulfidbrücken [58]. Die wichtigsten Strategien der
chemischen Modifizierung werden in Kapitel 2.2.1 bis 2.2.6 kurz beschrieben.
2.2.1 Chemische Modifizierung der Aminogruppen
2.2.1.1 Die Acylierung
Die Acylierung (Acetylierung, Succinylierung, Maleinylierung, Citraconylierung) ist eine
häufig angewendete Methode zur chemischen Modifizierung von Proteinen (s. z. B. [12,
69]). Als acylierende Reagenzien werden Säureanhydride wie Essigsäure-, Bernsteinsäu-
re-, Maleinsäure- und Citraconsäureanhydrid eingesetzt. Sie können prinzipiell mit allen
Theoretische Grundlagen 14
nucleophilen Gruppen reagieren [59], d. h. mit Aminogruppen (N-terminale α- und ε-
Aminogruppen der Lysine), phenolischen (Tyrosin) und aliphatischen (Serin, Threonin)
Hydroxylgruppen, Sulfhydryl- (Cystein) und Imidazolgruppen der Histidinreste (s. Kap.
2.2.1.2, Abbildung 2). Die entsprechenden Acylderivate sind jedoch von sehr unter-
schiedlicher Stabilität.
Im Gegensatz zum Essigsäureanhydrid, dessen Anwendung die Einführung neutraler Ace-
tylgruppen zur Folge hat, führt die Reaktion mit Bernsteinsäureanhydrid anionische Suc-
cinylgruppen an den α- und ε-Aminogruppen sowie den Hydroxylgruppen ein (s. Kap.
2.2.1.3, Abbildung 3). Die Nettoladung des Proteins wird negativer. Das führt zu Kon-
formationsänderungen, und diese bedingen z. B. die Erhöhung der Löslichkeit [59]. Ma-
leinsäureanhydrid reagiert mit Proteinen ähnlich wie Bernsteinsäureanhydrid, führt aber
zu Hydrolyse-labilen Produkten [59, 70] und wird daher für die reversible Modifizierung
der Aminogruppen genutzt [71]. Die bei der Citraconylierung entstehenden Produkte sind
noch labiler als die maleinylierten Derivate [72].
2.2.1.2 Acetylierung von Ackerbohnen-Legumin
Bei der Acetylierung des Legumins sind Reaktionen an den N-terminalen Aminogruppen
und den ε-Aminogruppen der Lysinreste sowie an den Hydroxylgruppen der Tyrosin-,
Serin- und Threoninreste entsprechend Abbildung 2 zu erwarten [59].
(1) Protein
O
O
C
C
CH3
CH3
NH2O
+pH >7 ProteinNH C
O
CH3CH3COO-H+
++
(2) Protein
O
O
C
C
CH3
CH3
OHO
+pH >7 ProteinOC
O
CH3CH3COO-H
+
++
Abbildung 2: Acetylierung von Aminogruppen (1) und Hydroxylgruppen (2) in Proteinen
Die Acylierung von Histidin- und Cysteinresten führt in der Regel zu instabilen N- bzw.
S-Acylderivaten [59] und wurde daher in der vorliegenden Arbeit nicht berücksichtigt.
Die nucleophile ε-Aminogruppe des Lysins läßt sich aufgrund ihres pK-Wertes und der
(zumindest überwiegend) exponierten Lage an der Moleküloberfläche besonders leicht
acylieren. In wäßriger Lösung ist bei einem pH zwischen 7 und 8 mit Essigsäureanhydrid
Theoretische Grundlagen 15
eine nahezu vollständige Blockierung der ε-Aminogruppen des Lysins im Proteinisolat aus
Ackerbohnen möglich [73].
Mit zunehmendem N-Acetylierungsgrad nimmt der Anteil der Blockierung positiv gelade-
ner ε-Aminogruppen durch neutrale Acetylgruppen zu und damit die potentielle positive
Ladung der Proteine ab. Die elektrostatischen Wechselwirkungen zwischen benachbarten
kationischen Aminogruppen und anionischen Carboxylgruppen werden verringert. Der
Anstieg der negativen Nettoladung führt zur Auffaltung der Proteinstruktur und zu Disso-
ziationsprozessen. Die funktionellen Eigenschaften derart modifizierter Ackerbohnen-
Proteine sind erwartungsgemäß verändert [44].
Umfangreiche Untersuchungen an acetyliertem Legumin in Form von Ackerbohnen-
Proteinisolaten mit einem Legumin-Anteil von etwa 65 % erfolgten von SCHWENKE et al.
[z. B. 19, 20]. Demnach erfolgt die Acetylierung dieses Isolates vorrangig an den
ε-Aminogruppen des Lysins. Bis etwa 40 % N-Acetylierung werden nur weniger als 5 %
der Hydroxylgruppen modifiziert, ab 60 % wird der Anteil der veresterten Hydroxylgrup-
pen signifikant. Der O-Acetylierungsgrad übersteigt jedoch auch bei hoher (89 %)
N-Acetylierung nicht 28 %. Mittels nativer Gelelektrophorese wurde festgestellt, daß im
Isolat das Legumin als Hauptbande erscheint, die bis 80 % N-Acetylierung erhalten bleibt
und erst bei erschöpfend acetylierten Isolaten verschwindet. Ab 60 % Acetylierung der
Aminogruppen erscheinen sowohl langsamer laufende Aggregationsprodukte als auch
eine schmale Bande aus schneller laufenden Dissoziationsprodukten, die mit zunehmen-
der Modifizierung zur Hauptbande werden. Mittels analytischer Ultrazentrifugation wurde
mit steigender Acetylierung der Isolate ebenfalls eine deutliche Abnahme des Leguminan-
teils sowie auch der höhermolekularen 15 S-Aggregate zugunsten des 2 S-
Dissoziationsproduktes gefunden. Die Oberflächenhydrophobizität veränderte sich bis zu
einem N-Acetylierungsgrad von 60 % nur geringfügig, bei fortschreitender Modifizierung
jedoch drastisch.
Von SCHMANDKE [44] sind die Auswirkungen der Acetylierung auf die funktionellen Ei-
genschaften, z. B. die Emulgieraktivität, von Ackerbohnen-Proteinisolaten zusammenge-
faßt worden. Die Acetylierung der Proteinisolate führt zu verbesserter Emulsionsstabilisie-
rung und zur Ausbildung eines festen Grenzflächenfilmes, der als mechanische Barriere
die Destabilisierung von Emulsionen verhindert [74].
Der Einfluß der Legumin-Acetylierung auf die Adsorptionskinetik, Filmdruckverhalten und
Emulsionseigenschaften in n-Decan/Wasser-Emulsionen ist von KRAUSE [75] untersucht
worden. Dabei wurde anhand von SE-HPLC-Untersuchungen gezeigt, daß hochacetylier-
tes Ackerbohnen-Legumin zur Aggregation neigt.
Theoretische Grundlagen 16
2.2.1.3 Succinylierung von Ackerbohnen-Legumin
Die Succinylierung ist prinzipiell an allen nucleophilen Gruppen der Aminosäurereste
möglich [59, 76]. Ebenso wie bei der Acetylierung sind bei der Succinylierung des Legu-
mins Reaktionen an den N-terminalen Aminogruppen und den ε-Aminogruppen der Lysin-
reste sowie an den Hydroxylgruppen der Tyrosin-, Serin- und Threoninreste zu erwarten
(Abbildung 3) [59]. Im Falle der Succinylierung von Tyrosinresten muß jedoch der In-
stabilität der O-Succinylreste aufgrund spontaner intramolekular katalysierter Hydrolyse
bei pH > 5 [59] Beachtung geschenkt werden.
(1) Protein
O
O
C
C
CH2
CH2
NH
2
O
+pH >7 Protein
NH
C
O
CH2CH2CO-H
+
+
O
(2) Protein
O
O
C
C
CH2
CH2
OHO
+pH >7 ProteinOC
O
CH2CH2CO-H
+
+
O
(3)
O
+
pH > 5
O O
Protein OH
OCH2
C CH2
C
O
C
O- CH
2
Protein O CH2
OC
--+ H+
Abbildung 3: Succinylierung von Amino- (1) und Hydroxylgruppen (2) sowie Desuccinylierung von
O-Succinyltyrosin (3) in Proteinen
Die Succinylierung eines Proteins bewirkt die Erhöhung der negativen Nettoladung des
Moleküls, was grundsätzlich die verstärkte Neigung zum Zerfall des Proteins in seine Un-
tereinheiten und Entfaltung der Polypeptidketten bedingt [12, 32].
Vielfältige Untersuchungen zur Auswirkung der Succinylierung auf die Chemie und die
Funktionalität von Ackerbohnen-Proteinisolaten sind vorgenommen worden [z. B.
77, 78]. Demnach werden bei pH 8 mit einem etwa vierfachen molaren Überschuß an
Bernsteinsäureanhydrid maximal 93 % der Aminogruppen durch Succinylgruppen blo-
ckiert. Wie bei der Acetylierung erfolgt auch durch Succinylierung die Dissoziation der
Theoretische Grundlagen 17
Globuline. Es wird beschrieben, daß die Ackerbohnen-Proteinisolate bei 93 % N-
Succinylierung in vollständig, in ihre Untereinheiten mit Sedimentationskoeffizienten von
S020,W = 2,8, dissoziierter Form vorliegen. Die Dissoziation des hexameren Moleküls in
seine 50-60 kDa schweren Untereinheiten erfolgt über das 7 S-Halbmolekül [79].
Die Succinylierung der Ackerbohnen-Proteinisolate führt aufgrund weitgehender struktu-
reller Veränderungen zu wesentlichen Änderungen der funktionellen Eigenschaften, wie
z. B. zur Verbesserung der Gelbildungseigenschaften, der Emulgiereigenschaften bei pH 7
und der Erhöhung der Schaumbildungskapazität ohne Hitzebehandlung [78, 80].
Der Einfluß der Succinylierung auf Ackerbohnen-Legumin ist ebenfalls hinsichtlich der
Bildung von Grenzflächenfilmen untersucht worden [81].
2.2.1.4 Die Guanidinierung
Stabile Proteine können bei pH > 9,5 mit S-Methylisoharnstoff oder dem stärker reakti-
ven O-Methylisoharnstoff behandelt werden, um die ε-Aminogruppen durch die sehr basi-
schen Guanidinogruppen zu ersetzen [59]. Die Guanidinierung von über 70 % der Ly-
singruppen des Rinderserumalbumins führte jedoch nur zu geringen Änderungen der
Hydrophobizität, der Schaum-, Emulsions- und Geleigenschaften [58].
2.2.1.5 Amidinierung und Alkylierung
Unter leicht alkalischen Bedingungen reagieren Imidoester mit Aminen zu Amidinen (A-
midinierung). Sowohl α- als auch ε-Aminogruppen werden modifiziert [59]. Die Amidinie-
rung bewirkt keine starke Änderung der physikochemischen Eigenschaften von Proteinen.
Nach extremer Amidinierung von RSA konnten jedoch veränderte spektroskopische und
elektrophoretische Eigenschaften sowie eine Änderung der optischen Rotation beobachtet
werden [82].
Die Alkylierung der Aminogruppen kann z. B. durch Maleimide, Acrylonitrile oder Ethyle-
nimine erzielt werden, obgleich die Reaktion im allgemeinen nur als Nebenreaktion bei
der Sulfhydrylgruppen-Modifizierung betrachtet wird [59].
2.2.2 Chemische Modifizierung der Carboxylgruppen
Die Acylierung ist zwar die am genausten untersuchte Methode der chemischen Modifizie-
rung von Nahrungsproteinen - der Nährwert acylierter Proteine ist im Vergleich zum nati-
ven Protein, einzelnen Studien zufolge (z. B. [83]), jedoch gemindert. Die Modifizierung
der β- und γ-Carboxylgruppen der nicht essentiellen sauren Aminosäuren (Asparagin- und
Theoretische Grundlagen 18
Glutaminsäure) stellt daher eine Alternative zur Acylierung dar. Sowohl die Veresterung
als auch die Amidierung der Carboxylgruppen führen zur Erhöhung der positiven Nettola-
dung des Proteins.
2.2.2.1 Die Veresterung
Die Carboxylgruppen der Proteine können durch die Behandlung mit Methanol oder Etha-
nol unter Säurekatalyse verestert werden.
Protein-COO - + ROH 0,02-0,1 M HCl Protein-COOR + H2O
Aus der Blockierung der negativ geladenen Carboxylgruppen resultiert die Zunahme der
positiven Nettoladung und die Erhöhung des isoelektrischen Punktes (IP). Die Vereste-
rung von Proteinen führt zu Konformationsänderungen, die sich in der Änderung ihrer
funktionellen Eigenschaften widerspiegelt [84].
2.2.2.2 Amidierung
Carboxylgruppen von Aspartat und Glutamat können durch die Reaktion mit nucleophilen
Reagenzien (z. B. Aminen) und wasserlöslichem Carbodiimid in Asparagin und Glutamin
umgewandelt werden [85]. Die Amidierung erfordert relativ milde wäßrige Bedingungen.
Protein-COO - + NH4+ H
+
Protein-CONH2
R-N=C=N-R’
2.2.3 Reduktion bzw. Oxidation von Disulfid- bzw. Sulfhydrylgruppen
Disulfid-Bindungen werden durch milde Reduktionsmittel zu Sulfhydrylgruppen reduziert.
Für analytische Zwecke werden Thiole mit niedriger Molmasse wie β-Mercaptoethanol und
Dithioerythritol eingesetzt. Die Reaktion ist spezifisch und in Abhängigkeit von Denatu-
rans, pH und Proteinstruktur vollständig. Die Reoxidation der entstandenen Sulf-
hydrylgruppen kann durch die Alkylierung mit Iodoacetamid oder Acrylnitril verhindert
werden [86].
Im Lebensmittel-Sektor werden Sulfit-Ionen, Wasserstoffperoxid und Ascorbinsäure als
Reagenzien zur Verbesserung der funktionellen Eigenschaften eingesetzt. So führt der
Einsatz von Ascorbinsäure z. B. zur Verringerung der Oberflächenspannung von Proteinen
[87]. Die Zugabe von Ascorbinsäure verbessert Teigbildung, Laibvolumen und Krumen-
struktur durch Thiol-Disulfid-Austauschreaktionen. Der Einsatz von Ascorbinsäure zeigt
Theoretische Grundlagen 19
positive Effekte auf die Schaum- und Geleigenschaften verschiedener globulärer Proteine
[88].
2.2.4 Hydrolyse und Desamidierung
Der Einsatz von Säuren oder alkalischen Reagenzien dient häufig der Erhöhung der Lös-
lichkeit oder der Verringerung der Viskosität von Proteinen. Die saure oder basische Hyd-
rolyse der Peptidbindungen führt zu Produkten niedrigerer Molmasse mit erhöhter Anzahl
ionisierbarer Gruppen und erhöhter Löslichkeit. Die Hydrolyse kann in Abhängigkeit von
den Produktanforderungen gut gesteuert werden. So dient die milde Hydrolyse der Her-
stellung höhermolekularer Abbauprodukte mit erhöhter Funktionalität.
Bei der milden sauren Hydrolyse wird die Peptidbindung an der Seite von Asparaginsäu-
reresten 100fach schneller gespalten als andere Peptidbindungen [89]. Die saure Hydro-
lyse unter milden Bedingungen wird von (nicht-enzymatischer) Desamidierung begleitet.
Die Desamidierung von Glutamin- und Asparaginsäureresten ist besonders im Falle der
pflanzlichen Speicherproteine von Bedeutung, weil diese sehr hohe Anteile an amidierten
Glutaminsäure- und Asparaginsäureresten haben. Das Freiwerden von Carboxylgruppen
infolge der Modifizierung bedingt die Zunahme der negativen Nettoladung und der Hydra-
tation des Proteins. Die Desamidierung von Asparagin findet schneller statt als die von
Glutamin. Sie folgt bei der sauren Hydrolyse von Asparagin zu Asparaginsäure einem
einstufigen (two-state) Mechanismus. Die Desamidierung von Soja-Proteinen führt zu
verbesserter Löslichkeit, Wasserbindung, Schaumvolumen, Emulgiervermögen und Vis-
kosität [90].
Desamidierung und Hydrolyse von Peptidbindungen durch Alkali-Behandlung erfolgen
schneller als die saure Hydrolyse. Der Einsatz von Basen erfolgt zur Isolierung von Pflan-
zenproteinen unter Ausschluß toxischer Faktoren [91], zur Produktion von Soja-Proteinen
als Fleischäquivalent und bei der Herstellung von Gelatine aus Collagen. Stark alkalische
Behandlung von Proteinen kann zur Zerstörung von Lysin, Cystin und Serin und zur Bil-
dung unverdaulicher Produkte führen. Die alkalische Hydrolyse von Asparagin zu Aspara-
ginsäure führt zunächst zu einem cyclischen intramolekularen Imid als Zwischenprodukt.
Das Imid kann dann entweder zu einem Asparaginsäurerest hydrolysiert werden oder
aber mit einer Aminogruppe unter Ausbildung eines Isopeptids reagieren. Bei hohem pH-
Wert und hoher Temperatur kann z. B. aus β-substituiertem Cystin Dehydroalanin ent-
stehen, welches mit Lysin zu Lysinoalanin reagiert, was wiederum einen Verlust an es-
sentiellen Aminosäuren bedeutet.
Theoretische Grundlagen 20
2.2.5 Die Glycosylierung
Proteine können durch die kovalente Bindung von Kohlenhydratresten unterschiedlicher
Größe modifiziert werden. Die Glycosylierung erfolgt primär an den Aminogruppen (s.
Reaktion 1), teilweise aber auch an den Hydroxyl- und Sulfhydrylgruppen. Die Glycosylie-
rung kann auch die Carboxylgruppen betreffen, z. B. wenn β-Lactoglobulin (nach Aktivie-
rung mit Carbodiimid) mit Glucosamin umgesetzt wird (s. Reaktion 2).
(1) Protein-H2N + Glyco-CHO Protein-N=CH-Glyco
NaCNBH3 Protein-N-CH2-Glyco
(2) Protein-COO- + R‘-N=C=N-R‘
pH 4-7
Protein-CO-O-C-NH-R‘
||
NR‘
↓ + Glucosamin
Protein-CO-NH-Glucose + R’-NH-CO-NH-R‘
Aus praktischer Sicht ist der einfachste Weg der Glycosylierung die Bindung von Zucker-
resten an Proteine über die Maillard-Reaktion [92].
Die Einführung von Mono- oder Oligosacchariden erhöht die Hydrophilie eines Proteins.
Glycosyliertes β-Lactoglobulin weist erhöhte Löslichkeit und Hitzestabilität im Vergleich
zum nativen Protein auf [93]. Ebenso lassen sich die Oberflächeneigenschaften von Ca-
sein durch erhöhte Flexibilität, zunehmende Entfaltung und stärkere Hydratisierung infol-
ge Glycosylierung verbessern. Durch die Glycosylierung werden bei Reaktion mit neutra-
len Zuckern das Schaumbildungsvermögen und die Schaumstabilität, im Falle der Modifi-
zierung mit geladenen Kohlenhydraten die Emulsionsstabilität verbessert [94].
2.2.6 Die Phosphorylierung
Die kovalente Bindung von Phosphatgruppen an Proteine führt zur Erhöhung ihrer nega-
tiven Ladung. In Abhängigkeit von der Natur des Proteins werden nur O- (z. B. bei Casein
[95]) oder nur N-Phosphat-Esterbindungen (z. B. bei β-Lactoglobulin [97]) oder beide
(z. B. bei der Phosphorylierung von Lysozym [95, 96]) gebildet. Bei der Bildung von
„C-O-P“-Bindungsderivaten reagiert anorganischer Phosphor mit den Hydroxylgruppen
von Serin, Threonin, Tyrosin. Bei der Bildung von „C-N-P“-Bindungsderivaten reagiert der
Phosphor mit der Aminogruppe in Lysin, der Imidazolgruppe in Histidin und der Guani-
dingruppe in Arginin. Die sauerstoffgebundenen Phosphatderivate sind säurestabiler als
Theoretische Grundlagen 21
die stickstoffgebundenen phosphorylierten Proteine. Die am häufigsten angewendete Me-
thode der chemischen Phosphorylierung ist die Reaktion mit Phosphoroxychlorid:
Protein–NH2 + POCl3 H
2
O Protein-NH-PO(O2H)- + 3H+ + 3Cl-
Protein–OH + POCl3 H
2
O Protein-O-PO(O2H)- + 3H+ + 3Cl-
Bei dieser Art der chemischen Modifizierung kann es über Phosphatbrücken oder Isopep-
tid-Bindungen zu Quervernetzungen („cross-links“) innerhalb der Proteinstruktur kom-
men, was als Ursache für die verringerte Löslichkeit in Wasser angenommen wird [96].
Die Phosphorylierung erhöht die Viskosität, Wasserabsorption, Gel- und Emulsionsbildung
von β-Lactoglobulin und anderen Proteinen [97]. Phosphorylierte Proteine sind sowohl in
vitro als auch in vivo gut verdaulich.
Material und Methoden 22
3 Material und Methoden
Als Lösungsmittel für Legumin und seine acylierten Derivate dient, unabhängig von der
Methode und wenn nicht anders beschrieben, 0,05 M Natrium-/Kalium-Phosphatpuffer
(Na2HPO4/KH2PO4) nach SÖRENSEN [98], pH 8,0, mit einer mit Natriumchlorid (NaCl) auf
I=0,5 eingestellten Ionenstärke. Er wird nachfolgend auch als „Standardpuffer“ bezeich-
net.
Für die Untersuchungen zur Ionenstärkeabhängigkeit werden neben dem Standardphos-
phatpuffer der Ionenstärke I=0,5 ein 0,025 M Natrium-/Kalium-Phosphatpuffer mit NaCl
und einer Ionenstärke von I=0,1 („niedrige Ionenstärke“) und 0,05 M SÖRENSEN-Puffer
mit einer durch entsprechend hohe NaCl-Zugabe auf I=1,0 eingestellten Ionenstärke
(„hohe Ionenstärke“) verwendet.
Zur Vermeidung bakteriellen Befalls enthalten sämtliche Puffer 0,02 % Natriumazid
(NaN3). Alle Puffersubstanzen und alle übrigen, an dieser Stelle nicht extra aufgeführten
Reagenzien sind von „p.A.“-Reinheitsgrad und stammen von MERCK, Darmstadt.
Reagenzien: Essigsäureanhydrid von FLUKA, Buchs; Bernsteinsäureanhydrid von Labor-
chemie Apolda; 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure und 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure
von SERVA, Heidelberg; Dithioerythritol und Leucin von REANAL, Budapest; Sepharose
CL 4B sowie Proteine zur Kalibrierung (Thyroglobulin, Ferritin, Katalase, Ovalbumin und
Aldolase) von PHARMACIA, Uppsala; β-Amylase, Alkohol-Dehydrogenase, RSA, Carboan-
hydrase, Cytochrom C, Aprotinin sowie DL-Tyrosinmethylester-Hydrochlorid von SIGMA-
ALDRICH, Deisenhofen.
3.1 Proteindarstellung
3.1.1 Verfahren zur Isolierung des Ackerbohnen-Legumins
Geschälte Ackerbohnen lassen sich problemlos zu Mehlen (100 µm) vermahlen, nachdem
die getrockneten Bohnen zuvor zerkleinert und die Schalen durch Windsichtung entfernt
worden sind. Das Ackerbohnenmehl der Sorte „Fribo” enthält etwa 46 % Stärke, etwa
31 % Proteine (FN→Prot = 5,8), ca. 2 % Lipide und 1 % Rohfaser in der Trockenmasse
[45]. Etwa 14 % der Trockenmasse des Mehles entfallen auf die Leguminfraktion, 7 %
der Trockenmasse sind Viciline [99]. Das zur Proteinextraktion verwendete Mehl stammt
von den Samen der Ackerbohne Vicia faba L., var. Fribo und var. Scirocco.
Die Isolierung des Legumins erfolgt durch kombinierte Salzfraktionierung und wiederholte
isoelektrische Fällung. Dabei wird die Löslichkeit des Globulins in schwach alkalischer
Lösung und in Salzlösungen ausgenutzt und das begleitende Vicilin weitgehend abge-
Material und Methoden 23
trennt (IPLeg = 4,7 und IPVic = 5,5). Dieses Verfahren zur Leguminisolierung nach
POPELLO et al. [100] ergibt ein lipidfreies Proteinpräparat mit einem geringen Vicilinge-
halt von 3-5 % [132].
Durchführung [100, 132]. Die wäßrige Extraktion des Proteins erfolgt 1 h bei 50 ° C
und pH 8,0 (Mehl:Wasser = 1:10). Nach langsamer Abkühlung wird die Suspension zen-
trifugiert (30 min, 3000 x g) und der Überstand auf eine Salzkonzentration von 0,5 M
NaCl und pH 4,8 eingestellt. Nach erneuter Zentrifugation (30 min, 3000 x g) wird im
Überstand die Salzkonzentration durch Zugabe von kaltem Wasser auf 0,3 M herabge-
setzt, wodurch die Globulinfraktion ausfällt (12 h, 4 ° C). Nach Zentrifugation (10 min,
2000 x g) wird das Präzipitat (Feuchtprotein) in Lösung hoher Ionenstärke (0,6 M NaCl,
pH 7-8) redispergiert und anschließend erneut durch das Herabsetzen der Salzkonzentra-
tion in der Lösung (Zugabe von kaltem Wasser) gefällt (pH 4,8; 0,3 M NaCl; 4 ° C; 12 h).
Nach Zentrifugation (20 min, 3000 x g) wird der Feuchtprotein-Niederschlag in Wasser
aufgenommen, mehrere Stunden bei pH 7,0 gelöst und erneut zentrifugiert (10 min,
12 000 x g). Der Überstand wird gegen Wasser dialysiert und anschließend lyophilisiert.
Die Ausbeute beträgt etwa 5 % bezogen auf eingesetztes Mehl.
3.1.2 Chemische Modifizierung der Leguminproben
3.1.2.1 Acetylierung
Bei der Acetylierung wird das Protein mit Essigsäureanhydrid bei pH 7-8 umgesetzt. Die
Acetylierung der Aminogruppen bzw. der Hydroxylgruppen verläuft entsprechend der in
Abbildung 2 beschriebenen Reaktionen.
Durchführung. Für die Herstellung acetylierter Leguminpräparate wird eine Lösung von
1-5 % Legumin in Standardphosphatpuffer hergestellt. Die Modifizierung erfolgt unter
ständigem Rühren in einem auf 20 ° C temperierten Reaktionsgefäß durch tropfenweise
Zugabe von Essigsäureanhydrid mit einer Mikroliterspritze. Der pH-Wert wird mit 0,1 N
NaOH am METROHM®-Autotitrator auf 7,7 eingestellt und während der Acetylierungs-
reaktion konstant gehalten (pH-stat-Bedingungen). Die Zugabe der je nach gewünschtem
Acetylierungsgrad gewählten Menge Essigsäureanhydrid (entsprechend der Umsatzkurve,
s. Abbildung 13) muß derart langsam erfolgen, daß der pH-Bereich von 7-8 nicht unter-
bzw. überschritten wird. Um die Einstellung des Reaktionsgleichgewichtes und damit eine
gewisse Reproduzierbarkeit der Acetylierungsgrade zu erreichen, wird nach beendeter
Reagenszugabe mindestens 1 h, bei hohen Modifizierungsgraden 3 h weiter gerührt. An-
schließend wird die Lösung je nach Verwendungszweck entweder gegen Wasser dialysiert
und lyophilisiert oder über ein AMICON®-Ultrafiltrationssystem unter Verwendung einer
DIAFLO-Ultrafiltrationsmembran (PM 10) mittels Stickstoffstrom auf etwa 5 ml eingeengt
Material und Methoden 24
und gelchromatographiert (Sepharose CL 4B), um die 11 S-Fraktion von Aggregaten zu
trennen.
3.1.2.2 Succinylierung
Bei der Succinylierung wird das Protein mit Bernsteinsäureanhydrid bei pH 7-8 umge-
setzt. Die Succinylierung der funktionellen Gruppen verläuft entsprechend der in
Abbildung 3 beschriebenen Reaktionen.
Durchführung. Für die Herstellung succinylierter Leguminpräparate wird eine Lösung
von 1 % Legumin in Standardphosphatpuffer hergestellt. Die Modifizierung erfolgt unter
ständigem Rühren in einem auf 20 ° C temperierten Reaktionsgefäß durch schrittweise
Zugabe von getrocknetem Bernsteinsäureanhydrid. Die weitere Durchführung der Succi-
nylierung erfolgt analog der Acetylierung (s. Pkt. 3.1.2.1). Abschließend wird die Lösung
nach 1-3 Stunden Reaktion gegen Wasser dialysiert und lyophilisiert.
3.2 Charakterisierung des Untersuchungsmaterials
3.2.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
3.2.1.1 Mikro-Biuret-Methode
Die Proteinkonzentrationen wurden in der Regel nach der Mikro-Biuret-Methode von
ITZHAKI & GILL [101] bestimmt. Sie beruht darauf, daß Substanzen, die zwei oder mehr
Peptidbindungen enthalten, mit Kupfer(II)-Ionen unter stark alkalischen Bedingungen
einen blauen Farbkomplex bilden. Die UV-Absorption dieses Komplexes wird bei 310 nm
gemessen. Die Methode zeichnet sich durch einfache und schnelle Handhabung sowie
ausreichend große Empfindlichkeit (0,05 mg Protein/ml) aus. Von Vorteil ist auch die ge-
ringe Spezifität bezüglich unterschiedlicher Proteintypen. Die Nachweisreaktion wird bis
zu einer NaCl-Salzkonzentration von 1,5 M nicht beeinflußt. Lediglich Ammoniumsalze
und kolloidale Trübungen wirken störend.
Bevor die Mikro-Biuret-Methode eingesetzt werden kann, muß für das jeweilige Protein
eine Eichkurve mittels KJELDAHL-Proteinbestimmung (s. Pkt. 3.2.1.2) erstellt werden.
Desweiteren wird für die Bestimmung der Proteinkonzentration ein Faktor zur Umrech-
nung von Gesamtstickstoff in Gesamtprotein benötigt. Der in der Literatur unabhängig
vom Proteintyp meist zugrunde gelegte Faktor von FN→Prot = 6,25 entspricht jedoch nicht
der Aminosäurezusammensetzung des Ackerbohnen-Legumins. Für die dieser Arbeit zu-
grundeliegenden Umrechnungen von Gesamtstickstoff in Protein wurden, ausgehend von
der experimentell bestimmten Aminosäurezusammensetzung [50] und dem Massenzu-
Material und Methoden 25
zuwachs durch die Einführung von Acetyl- bzw. Succinylgruppen während der Acylierung,
die folgenden Faktoren zugrunde gelegt:
nativ < 40 % ac < 60 % ac ≥ 60 % ac < 50 % suc < 90 % suc ≥ 90 % suc
5,55 5,60 5,65 5,70 5,60 5,70 5,90
3.2.1.2 Proteingehalt nach KJELDAHL
Zur Ermittlung des Proteingehaltes wird der Stickstoffgehalt nach schwefelsaurem, kata-
lytischen Aufschluß bestimmt [102]. Der im Protein gebundene Stickstoff wird durch kon-
zentrierte Schwefelsäure, Katalysator und Erhitzen zu Amidosulfonsäure umgesetzt, wel-
che durch Zersetzung in Ammoniumsulfat übergeht. Der daraus entstehende Ammoniak
wird nach Wasserdampfdestillation photometrisch bestimmt.
Die Bestimmung wurde nach KJELDAHL, modifiziert nach LANGE [103], durchgeführt. Zur
Berechnung des Proteingehaltes aus dem Stickstoffgehalt siehe Pkt. 3.2.1.1.
3.2.2 Methoden zur Bestimmung des Modifizierungsgrades
3.2.2.1 Bestimmung des N-Acylierungsgrades
Die Blockierung der Aminogruppen durch Acetyl- oder Succinylreste (N-Acylierung) wur-
de durch die Bestimmung der freien Aminogruppen mit Trinitrobenzensulfonsäure (TNBS)
[104], modifiziert nach [75], verfolgt. 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure setzt sich in
schwach alkalischer Lösung mit den freien Aminogruppen von Aminosäuren, Peptiden und
Proteinen, wie in Abbildung 4 dargestellt, um.
+
NO2
NO2
NO2
Protein NH SO3H-H+
+
pH > 7
Protein NH2+HO3S
NO2
NO2
NO2
Abbildung 4: Reaktion von Protein-Aminogruppen mit 2,4,6-Trinitrobenzensulfonsäure
Das bei dieser Substitutionsreaktion gebildete trinitrophenylierte Reaktionsprodukt wird
spektralphotometrisch gemessen. Durch die Bestimmung der freien Aminogruppen vor
und nach Acylierung des Proteins, kann der prozentuale Anteil acylierter Aminogruppen
(N-Blockierungsgrad) berechnet werden. Die Kalibrierung erfolgt mit Leucin.
Material und Methoden 26
Durchführung [75]. Die Lösung von etwa 1 % Protein (Konzentrationsbestimmung er-
folgt nach BIURET) wird mit dem gleichem Volumenanteil einer wäßrigen Lösung von 1 %
Natriumdodecylsulfat (SDS) in 0,2 M Borsäure-Natriumboratpuffer pH 9 versetzt und
5 min im siedenden Wasserbad denaturiert. Nach dem Abkühlen auf Raumtemperatur
wird die Lösung mit 1 % SDS enthaltendem Boratpuffer auf eine Endkonzentration von
etwa 0,05 % Protein verdünnt. Anschließend werden jeweils 0,5 ml dieser Proteinlösung
mit 0,5 ml des 1 % SDS enthaltendem Boratpuffer und mit 0,5 ml einer frisch hergestell-
ten wäßrigen Lösung von 0,1 % TNBS versetzt. Die Reaktion erfolgt genau 1 h bei
50 ° C. Nach raschem Abkühlen werden nacheinander 0,5 ml 8 % SDS-Lösung und
0,5 ml 1 N HCl zugegeben. Die Absorption wird nach 20 min bei 340 nm gemessen.
3.2.2.2 Bestimmung des O-Acylierungsgrades
Die Blockierung der Hydroxylgruppen durch Acetyl- oder Succinylgruppen (O-Acylierung)
wird nach Deacylierung mit Hydroxylamin und Umsetzung der gebildeten Hydroxamsäure
mit Eisen(III)chlorid (FeCl3) durch spektrokolorimetrische Messung des entstehenden
Fe3+-Hydroxamsäure-Komplexes [105] nach der Methode von HABEEB & ATASSI [106],
in modifizierter Form [107] bestimmt (Abbildung 5). Die Anzahl der Estergruppen wird
aus der Kalibrierung mit DL-Tyrosinmethylester-Hydrochlorid ermittelt.
Die Bestimmung von O-Acetyl-Tyrosingruppen erfolgt analog nach Spaltung mit Hydroxy-
lamin unter milden Bedingungen bei pH 8 in gepufferter Lösung und Absorptionsmessung
bei 278 nm.
Protein pH > 6
OCO CH3+NH 2OH OH
Protein +HONH CO CH3
Fe3+
gefärbter Komplex
Abbildung 5: Deacetylierung von O-Acetyltyrosinresten im Protein mit Hydroxylamin-Hydrochlorid
Im Falle der O-Succinylierung von Tyrosinresten muß der Instabilität der O-Succinylreste
(intramolekulare Hydrolyse, s. Abbildung 2) Rechnung getragen werden. Die Bestim-
mung der O-Succinylierung am Tyrosin erfolgt dementsprechend durch Verfolgung der
Absorptionsveränderung bei 278 nm während einer mehrstündigen Inkubation der Reak-
tionslösung bei RT.
Durchführung [106, 107]. 10 mg Protein werden in 2 ml 0,2 M Borsäure-Natrium-
boratpuffer pH 9 gelöst, mit 2 ml einer 2 M Hydroxylamin-Hydrochloridlösung pH 10 ver-
setzt und 2 h bei 40 ° C inkubiert. Nach rascher Abkühlung werden mit 0,8 ml 6 N HCl
ein pH-Wert von 1 eingestellt und 0,8 ml einer Lösung von 5 % FeCl3 in 0,1 N HCl zuge-
Material und Methoden 27
geben. Das Protein präzipitiert, und nach Zentrifugation wird die Absorption des Farb-
komplexes im Überstand bei 540 nm gemessen. Aus der Absorptionsdifferenz von modifi-
zierter und deblockierter Probe läßt sich mittels Kalibriergerade der prozentuale Anteil
modifizierter Hydroxylgruppen (O-Blockierungsgrad) berechnen.
3.2.3 Größenausschluß-Chromatographie (SE-HPLC)
Die Auftrennung der Proteine bzw. ihrer Bestandteile (Assoziate, Dissoziate) nach ihrer
Größe, d. h. nach ihrem Stokesschen Radius erfolgt mittels Hochleistungsflüssigchroma-
tographie (SE-HPLC). Zur Kalibrierung werden folgende Proteine verwendet: Thyroglobu-
lin, Ferritin, Katalase, Ovalbumin, Aldolase, β-Amylase, RSA und Cytochrom C.
Gerät: SCHIMADZU LC-6A
Trennsäule: BioSep 4000 (PHENOMENEX): 600 mm; ID 7,8 mm; 5 µm; 125 Å
Detektion: UV-Absorption (280 nm)
Fluß: 1 ml/min
Eluent: 0,1 M Tris-HCl mit 0,3 M NaCl; pH 7,2
3.2.4 Gelelektrophorese
3.2.4.1 Denaturierende Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
Die diskontinuierliche Polyacrylamid-Gelelektrophorese in Gegenwart von Natriumdode-
cylsulfat (SDS-PAGE) wird mit 12 %igen Gelen in Vertikalkammern (Mini-Protean-II, Bio-
Rad) mit und ohne Dithioerythritol (DTE) als Reduktionsmittel durchgeführt. Dazu wird
ein kombiniertes WEBER/OSBORN-LAEMMLI-System benutzt. Trenn- und Sammelgel
werden nach [108], Elektroden- und Probenpuffer nach [109] hergestellt. Aufgetragen
werden jeweils 10 µg Protein. Die Zuordnung der Banden erfolgt anhand der Molmassen-
bestimmung über die Proteinstandards der Standard-Mischung IV von MERCK.
3.2.4.2 Native Gelelektrophorese (BN-PAGE)
Die „Blaue Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese“ (BN-PAGE) wird unter nicht denatu-
rierenden Bedingungen im Polyacrylamid-Gradientengel (Vertikalelektrophoresekammer
Typ 2001 von LKB), wie von SCHÄGGER et al. [110] beschrieben, durchgeführt. Sie eig-
net sich zur Molekulargewichtsbestimmung von Proteinen (20-800 kDa) mit einem isoe-
lektrischen Punkt von IP ≤ 5,4 bzw. Proteinen, die Coomassie binden (IP ≤ 8,6). Als Puffer
dient Bistris/Tricin pH 7. Es werden jeweils 20 µg Protein aufgetragen.
Material und Methoden 28
3.2.5 Massenspektrometrie (MALDI-TOF MS)
Prinzip. Bei der Matrix-unterstützten Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit Massen-
spektrometrie (MALDI-TOF MS) wird die zu untersuchende Probe mit einer Matrix-Lösung
versetzt und im Vakuum verdampft. Die Analyt-Moleküle sind in den Matrix-Molekülen
(aromatische Carbonsäuren, die Energie aufnehmen können) quasi eingebettet. Diese
Mischkristalle werden mit Laserimpulsen beschossen, die Matrix absorbiert die Laser-
energie und ionisiert den Analyten.
Durchführung. Die lyophilisierte Proteinprobe wird in DHBs (9:1-Gemisch von 2,5-
Dihydroxybenzoesäure und 2-Hydroxy-5-methoxybenzoesäure) gelöst (5-10 mg/ml) und
zentrifugiert.
Die Messungen erfolgen in linearem Modus im MALDI-TOF-Massenspektrometer Reflex 2
(BRUKER-DALTONIK, Bremen).
Bei dieser Methode dissoziiert das oligomere Leguminmolekül in seine konstituierenden
Untereinheiten.
3.2.6 Methoden zur Untersuchung der Hydrophobizität
3.2.6.1 Fluoreszenzsondentechnik
Es werden zwei Methoden angewendet, um die durch Acylierung von Legumin hervorge-
rufenen Veränderungen der Hydrophobizität festzustellen: erstens die Bestimmung der
Proteinoberflächenhydrophobizität als sogenannter S0-Wert und zweitens die Abschät-
zung der Anzahl hydrophober Bindungsstellen eines Liganden am Protein (COGAN-Plot).
Dabei dient 8-Anilino-1-naphtalinsulfat (ANS) als Fluoreszenzsonde, welche hydrophobe
Wechselwirkungen mit den hydrophoben aromatischen Seitengruppen des Legumins ein-
geht. Die Messung erfolgt nach der Methode von KATO & NAKAI [129] in modifizierter
Form.
Durchführung. Zur Messung der Oberflächenhydrophobizität werden Verdünnungsrei-
hen des jeweiligen Proteins (maximale Proteinkonzentration cProt = 0,1 g/l) in Standard-
puffer bei einer ANS-Konzentration von cANS = 0,05 g/l hergestellt. Da festgestellt wurde,
daß die in der Literatur mit 15-20 min beschriebene Zeit zur Gleichgewichtseinstellung
nicht ausreicht, wird nach einer Reaktionszeit von 2 h bei 296 K (in Dunkelheit) die Fluo-
reszenz gemessen. Die Fluoreszenzintensität wird gegen die Proteinkonzentration aufge-
tragen. Der Anstieg der linearen Regression entspricht dem S0-Wert des jeweiligen Prote-
ins bei entsprechender ANS-Konzentration.
Zur Abschätzung der Anzahl von ANS-Bindungsstellen und zur Berechnung der Bindungs-
konstanten wird der COGAN-Plot [111] angewendet. Die Fluoreszenz von ANS-
Material und Methoden 29
Verdünnungsreihen (cANS = 1-10 mg/l) ohne Protein sowie mit konstanter Proteinkon-
zentration von cProt = 0,1 g/l wird gemessen:
Anregungswellenlänge: 385 nm
Emissionswellenlänge: 475 nm
Bandbreite: 8 nm
Photomultiplyerspannung: 700 V
Für die Erstellung des COGAN-Plots wird zunächst für jeden Meßpunkt der Wert
α
ermit-
telt, der den Anteil der freien Bindungsstellen für die ANS-Moleküle am Protein be-
schreibt, wobei RFmax die gemessene maximale relative Fluoreszenz ist, die durch Absät-
tigung des Proteins mit ANS erreicht wird und RF die an jedem anderen Meßpunkt ge-
messene relative Fluoreszenz. RF0 ist die relative Fluoreszenz der proteinhaltigen Probe
bei Abwesenheit von ANS.
0max
max
RFRF
RFRF
−
−
=
α
Gleichung 1
Die freie Ligandenkonzentration L ergibt sich aus der Differenz der Gesamt-
Ligandenkonzentration L0 und der Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes PL
(L = L0 – PL), wobei die Konzentration des Protein-Ligand-Komplexes, mit einer Gesamt-
Proteinkonzentration P0 und der Anzahl n von ANS-Bindungsstellen am Protein,
PL = n P0 -
α
n P0 entspricht. Man erhält Gleichung 2:
L = L0 – n P0 (1-
α
) Gleichung 2
Entsprechend dem MWG für die Dissoziation der Protein-Ligand-Bindung,
PL
LPn
Kd
⋅⋅
= ,
folgt für die Dissoziationskonstante des ANS-Protein-Komplexes:
( )
[
]
α
α
α
−−
−
=1
100 PnLKd Gleichung 3
Die Gleichung wird nach n
K
R
n
Pd
−
−
=
α
α
α
1
10
0 umgestellt, und bei der Auftragung des
COGAN-Plots
−
α
α
α
1
1
.0
0
R
n
vsP erhält man eine Gerade mit dem Anstieg
n
1 und dem
Ordinatenabschnitt
n
Kd
−.
Material und Methoden 30
3.2.6.2 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC)
Die Auftrennung der Proteine bzw. ihrer Bestandteile nach ihrer Hydrophobizität erfolgt
mittels Hochleistungsflüssigchromatographie an einer Umkehrphase (RP-4).
Gerät: SCHIMADZU LC-10A
Trennsäule: Nucleosil C4 MPN (MACHEREY-NAGEL): 250 mm; ID 4,6 mm; 5 µm; 300 Å
Detektion: UV-Absorption (280 nm)
Fluß: 1 ml/min
Eluent A: 0,05 % Trifluoressigsäure in Wasser
Eluent B: 0,05 % Trifluoressigsäure in Acetonitril
Gradient: 5 min isokratisch auf 5 % B, mit Gradientenanstieg 2 %/min auf 95 % B
3.2.6.3 Verteilung im Polymer-Zweiphasensystem
Die Verteilung von Protein in Polymer-Zweiphasensystemen ist von ALBERTSSON [112]
beschrieben worden. Für das Zweiphasensystem werden Ficoll 400 und Dextran T 70 in
Borat/Citrat/ Phosphatpuffer pH 8,0 nach THEORELL & STENHAGEN [113] mit NaCl ein-
gesetzt. Die hydrophobere Oberphase enthält angereichert Ficoll, die hydrophilere Unter-
phase angereichert Dextran.
Durchführung. Die Proberöhrchen werden mit einer Lösung von 20 % Dichlorsilan in
Chloroform silanyliert. In den silanylierten Röhrchen wird ein 4 g-Verteilungssystem be-
stehend aus Ficoll- und Dextranlösung, CP-Sstock-Puffer und Wasser so hergestellt, daß
nach Zugabe der Proteinlösung im Verteilungssystem eine Ficollkonzentration von 13,9 %
und eine Dextrankonzentration von 10,9 % vorliegt. Anschließend werden 0,8 ml Protein-
lösung (mit einer der Verdünnungsreihe entsprechenden Konzentration) darin verteilt.
Polymerlösung 1: Ficoll 400 (Lot GK 23144) PHARMACIA, Uppsala Schweden (Mw = 400 000 g/mol)
Für eine etwa 45 %ige Lösung werden 40 g Ficoll in 48 ml Wasser gelöst. Die exakte
Polymerkonzentration wird nach der Gefriertrocknung kleiner Äquivalente mittels
Wägung bestimmt.
Polymerlösung 2: Dextran T 70 (Lot FC 16108) PHARMACIA, Uppsala Schweden (Mw = 57 200 g/mol)
Für eine etwa 40 %ige Lösung werden 100 g Dextran in 130 ml Wasser gelöst und
die exakte Polymerkonzentration nach Gefriertrocknung kleiner Äquivalente mittels
Wägung bestimmt.
Puffer: 0,2 M Complex-Puffer nach THEORELL & STENHAGEN [113], pH 8,0 mit 0,2 M NaCl
(CP-Sstock) wird für die Herstellung des Zweiphasensystems benötigt. Für die Herstel-
lung der Protein-Verdünnungsreihe wird dieser 1:4 verdünnt; man erhält 0,05 M
Complexpuffer mit 0,5 M NaCl (CPS)
Proteinlösung: Aus der Protein-Stammlösung mit 15 mg/ml CPS werden nach Zentrifugation
(30 min, 17 000 x g) Verdünnungen mit 1,5-15 mg Protein/ml CPS hergestellt, was
einer Proteinkonzentration von 0,3-3,0 mg/ml im Zweiphasensystem entspricht.
Material und Methoden 31
Die Phasentrennung erfolgt über Nacht bei 296 K. Nachfolgend werden die obere und die
untere Phase voneinander getrennt, auf eine jeweils meßbare Konzentration verdünnt
(Verdünnungsfaktor VF) und bei 280 nm in 1 cm-Küvetten UV-spektroskopisch gemes-
sen.
Die Proteinkonzentrationen der Oberphasen werden gegen die der Unterphasen aufgetra-
gen und der Verteilungskoeffizient K aus dem Anstieg ermittelt.
UnterphaseUnterphase
OberphaseOberphase
Unterphase
Oberphase
VFE
VFE
c
c
K⋅
⋅
==
′280
280
Gleichung 4
Die Verteilungskoeffizienten von nativem Legumin und ausgewählten succinylierten Deri-
vaten in diesem Zweiphasensystem wurden bei 296 K bestimmt. Aus den Verteilungsko-
effizienten wird die freie Energie des Übergangs der Proteine von einer Phase in die ande-
re (∆G0transfer) nach folgender Gleichung berechnet:
∆ G0transfer = - R T ln K Gleichung 5
Die Berechnung der freien Energie des Phasenüberganges der modifizierten Proben er-
folgt dementsprechend nach Gleichung 6:
∆ G0transfer = - R T (ln Kmodifiziert – ln Knativ) Gleichung 6
3.3 Methoden zur Aufklärung von Konformationsänderun-
gen
3.3.1 Hydrodynamische Methoden
3.3.1.1 Kapillarviskosimetrie
Die dynamische Viskosität
η
gibt den Widerstand eines Stoffes an, den dieser einer ge-
genseitigen Verschiebung zweier benachbarter Schichten entgegensetzt. Die Durchfluß-
zeit t durch eine Kapillare ergibt durch Multiplikation mit der jeweiligen Kapillarenkon-
stante K unmittelbar die kinematische Viskosität
ν
in Centistokes (mm2/s).
ν
= K • t Gleichung 7
Für die relative (kinematische) Viskosität des Proteins im Lösungsmittel
ν
rel gilt dement-
sprechend bei Viskositätsmessung des Lösungsmittels (Index 0) in gleicher Kapillare, also
K=const.:
ν
rel =
ν
/
ν
0 = t / t0 Gleichung 8
Material und Methoden 32
Daraus lassen sich die spezifische
ν
sp und die reduzierte (kinematische) Viskosität
ν
red des
Proteins berechnen:
ν
sp =
ν
rel – 1 Gleichung 9
ν
red =
ν
sp / cProt Gleichung 10
Die reduzierte Viskosität jeder Meßlösung wird gegen die mit der Mikro-Biuret-Methode
ermittelte Proteinkonzentration aufgetragen und die kinematische Grenzviskosität [
ν
] aus
der Extrapolation auf cProt = 0 ermittelt.
Die kinematische Viskosität ist das Verhältnis der dynamischen Viskosität zur Dichte
ρ
.
Mit der Korrektur nach TANFORD [114] wird aus der kinematischen Grenzviskosität, die
er als [
η
]‘ bezeichnet, unter Einbeziehung der Dichte
ρ
der Lösung
(als Lösungsmittel-
Dichte
ρ
0 und partielles spezifisches Volumen ý des Proteins, s. Kap. 3.3.1.2 Gleichung
12) die dynamische Grenzviskosität [
η
] nach Gleichung 11 berechnet.
[
η
] = [
η
]‘ + [(1 - ý
ρ
0)/
ρ
0] Gleichung 11
Die Messungen erfolgen im LAUDA VISKOSIMETER S (LAUDA, Königshofen), unter Ver-
wendung von 1,5 ml-Ubbelode-Mikrokapillaren bei 20 ° C. Um mehrere Meßpunkte zu
erhalten, wird die dialysierte, anschließend durch 0,2 µm membranfiltrierte, 1-1,5 %ige
Protein-Stammlösung schrittweise verdünnt.
3.3.1.2 Präzisionsdichtemessung
Die Bestimmung der Dichte von Legumin und seinen acylierten Derivaten in Phosphatpuf-
fern unterschiedlicher Ionenstärke erfolgt mit einem Dichtemeßgerät DMA 60 (ANTON
PAAR, Graz) nach der Biegeschwingermethode. Dabei wird die zu untersuchende Sub-
stanz in ein an den offenen Enden eingespanntes U-förmiges Rohr eingefüllt, welches
elektronisch zu Eigenschwingungen angeregt wird. Die Schwingungsdauer wird sehr ex-
akt gemessen. Das Quadrat der Schwingungsdauer ist direkt proportional der Dichte der
Meßlösung im U-Rohr. Trägt man die Dichten von 10 Verdünnungen gegen die jeweilige
Konzentration der Proteinlösungen (1–10 g/l) auf, so erhält man als Geradengleichung
(y=a+bx)
ρ
=
ρ
0 + (1 - ý
ρ
0) c Gleichung 12
Dementsprechend kann man das partielle spezifische Volumen ý des Proteins nach Glei-
chung 13 berechnen:
Material und Methoden 33
ý = (1-b) / a Gleichung 13
Die Messungen wurden bei 20 ± 0,004 ° C durchgeführt.
3.3.1.3 Analytische Ultrazentrifugation
Es gibt zwei grundlegende Arten der Untersuchung mittels analytischer Ultrazentrifuge
(AUZ): die Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse und die Sedimentationsgleichge-
wichtsanalyse.
Die Sedimentation von Teilchen in einer Flüssigkeit beruht auf dem Einfluß der Erdgravi-
tation einerseits und dem Einfluß des durch Rotation erzeugten Zentrifugalfeldes ande-
rerseits. Auf ein Teilchen mit der Masse m wirken im Gravitationsfeld drei Kräfte:
1. Sedimentations- oder Gravitationskraft Fs =
ω
2r m
2. Auftriebskraft Fa = -
ω
2r m ý
ρ
0
3. Reibungskraft Fr = f (dr/dt)
Aus Gravitation und Auftrieb ergibt sich die Zentrifugalkraft mit Fz = m
ω
2r (1-ý
ρ
0),
wobei m die Masse und ý das partielle spezifische Volumen des Makromoleküls sind,
ρ
0
die Dichte des Lösungsmittels und
ω
die Winkelgeschwindigkeit, mit der die Partikel im
Abstand r von der Rotationsachse rotieren. Die Reibung wirkt der Zentrifugalkraft entge-
gen, und innerhalb sehr kurzer Zeit kommen die drei Kräfte ins Gleichgewicht:
Fs + Fa + Fr = 0.
Der Sedimentationskoeffizient s errechnet sich nach folgender Gleichung:
t
rr
dt
dr
r
s
r
r
2
12
2
)(ln11 2
1
ωω
== ∫ Gleichung 14
Die mit der Winkelgeschwindigkeit
ω
im Zentrifugenrotor bewegten Proteinmoleküle ver-
größern aufgrund der einwirkenden Zentrifugalkraft ihren Abstand vom Rotationszentrum
mit dem beliebigen Anfangswert r1 zum Endwert r2, der jeweils gemessenen radialen Po-
sition des Protein-Sedimentationsmaximums. Die Geschwindigkeit des Sedimentations-
prozesses hängt entscheidend von der Masse der Teilchen und ihrer Form ab. Kompakte,
kugelförmige Moleküle sedimentieren im allgemeinen schneller als stäbchenförmige oder
expandierte Moleküle.
Die Messung der Wanderungsgeschwindigkeit der Grenzschicht zwischen Lösungsmittel-
und Konzentrationsplateau und die Analyse ihrer Gestalt bilden die eigentliche Grundlage
der Sedimentationsgeschwindigkeitsmethode. Nachdem man aus den gemessenen Ab-
hängigkeiten der Protein-Absorption vom Logarithmus der radialen Position einer sedi-
mentierenden Grenzschicht (Abbildung 6) die Wendepunkte ermittelt hat, kann r als
Material und Methoden 34
Funktion der Meßzeit t in der Form ln(r) = f (
ω
2t) aufgetragen werden. Nach linearer Reg-
ression ermittelt man aus dem Anstieg der Ausgleichsgeraden den Sedimentationskoeffi-
zienten sapp für die jeweilige Konzentration des Proteins. Die auf diese Weise für mehrere
Konzentrationen ermittelten Sedimentationskoeffizienten können auf die Proteinkonzent-
ration cProt = 0 extrapoliert werden, wodurch man die Sedimentationskonstante s0 erhält.
Das verwendete Lösungsmittel und die Meßtemperatur werden indiziert.
1,75 1,80 1,85 1,90 1,95 2,00
ln (r)
Absorption (280 nm)
Abbildung 6: Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse mittels Absorptionsoptik am Beispiel von
99% succinyliertem Legumin in Standardpuffer (cProt = 1,5 g/l)
Der Sedimentationskoeffizient wird durch die Dichte des Lösungsmittels und die Viskosi-
tät der Lösung beeinflußt. Um bei unterschiedlichen Temperaturen in verschiedenen Lö-
sungsmedien gemessene Sedimentationskoeffizienten miteinander vergleichen zu kön-
nen, müssen sie auf Standardbedingungen reduziert werden. Bei Biopolymeren ist es
üblich, die berechneten s0-Werte auf die Dichte und Viskosität des Wassers bei 20 ° C zu
beziehen. Für die Normierung wird Gleichung 15 herangezogen:
−
−
=
ST,
W20,
,
,
,20
,
,20 v1
v1
ρ
ρ
η
η
η
η
WT
ST
W
WT
appWss Gleichung 15
s20,W = auf Standardbedingungen normierter Sedimentationskoeffizient
sapp = gemessener Sedimentationskoeffizient
η
= Viskosität von Wasser (W) bzw. Solvens (S)
ý = partielles spezifisches Volumen des Proteins
ρ
= Dichte von Wasser (W) bzw. Solvens (S)
Indices: 20 = 20 ° C; T = Meßtemperatur
0
Konzentrationsplateau
Material und Methoden 35
Sedimentationskoeffizienten makromolekularer Substanzen sind (mehr oder weniger)
konzentrationsabhängig. Die Stärke der Konzentrationsabhängigkeit wird durch die phy-
sikalischen Eigenschaften (Masse, Form, Größe, Solvatationssgrad) der sedimentierenden
Moleküle bestimmt. Es ist üblich, die Sedimentationskonstanten aus der Extrapolation der
Gleichung c
s
k
ss
s
app 00
11 += zu ermitteln [115], der zufolge der reziproke Sedi-
mentationskoeffizient eine lineare Funktion von c ist. Aus diesem Plot läßt sich die Kon-
zentrationsabhängigkeitskonstante ks ermitteln. Sie läßt Aussagen über die Form der Mo-
leküle zu. Die Konzentrationsabhängigkeit, also der ks-Wert, ist vergleichsweise klein bei
kompakten Molekülen und groß bei linearen flexiblen Polymeren [28] und expandierten
Molekülen [116].
Durchführung (1). Die Sedimentationsanalyse mit der Philpot-Svensson-Schlierenoptik
erfolgt in der analytischen Ultrazentrifuge Modell 3170-B (MOM Optische Werke, Buda-
pest) bei Geschwindigkeiten von 30 000 U/min (Philpotwinkel 44,8 °), 40 000 U/min
(Philpotwinkel 18 °) und 50 000 U/min (Philpotwinkel 30 °) und einer Temperatur von
jeweils 20 ° C.
Aus der lyophilisierten Probe wird eine Stammlösung mit einer Konzentration von 10 g/l
hergestellt, gegen den Standardphosphatpuffer dialysiert und zur Untersuchung der Kon-
zentrationsabhängigkeit der Sedimentationskoeffizienten Verdünnungen mit Konzentrati-
onen zwischen 2 und 10 g/l hergestellt. Die Proteinkonzentration wird mit der Mikro-
Biuret-Methode bestimmt. Die Untersuchung der Hauptkomponente von hochacetyliertem
Legumin (Fraktion A) erfolgt nach Rechromatographie an Sepharose CL 4B bei
30 000 U/min und einem Philpotwinkel von 25 °.
Neben den Betrachtungen zum Einfluß von Acetylierung und Succinylierung auf das A-
ckerbohnen-Legumin mit der Schlierenoptik, wird der Einfluß der Ionenstärke auf die Se-
dimentationseigenschaften einer erschöpfend (99 %) succinylierten Probe mit der Ab-
sorptionsoptik untersucht. Im Vergleich zur Schlierenoptik, bei der das dem Konzentrati-
onsgefälle dc/dr proportionale Brechzahlgefälle dn/dr aufgezeichnet wird, wird bei An-
wendung der Absorptionsoptik die der Konzentration proportionale Absorption der Mole-
küle ausgenutzt.
Durchführung (2). Die Sedimentationsanalyse wird mit der analytischen Ultrazentrifuge
BECKMANN XL-I bei 45 000 U/min durchgeführt. Die UV-Detektion erfolgt bei 280 nm,
entsprechend dem Absorptionsmaximum der Aromaten. Der Verlauf der Sedimentation
wird bei 20 ° C durch mindestens 10 Messungen im Zeitabstand von je 12 min verfolgt.
Die lyophilisierte Probe wird im Phosphatpuffer der Ionenstärke I=0,1; I=0,5 bzw. I=1,0
gelöst, gegen den jeweiligen Puffer dialysiert und anschließend die Proteinkonzentration
mit der Mikro-Biuret-Methode bestimmt. Die Konzentration der Stammlösung wird auf
Material und Methoden 36
3-4 g/l eingestellt und zur Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der Sedimenta-
tionskoeffizienten eine Verdünnungsreihe hergestellt.
3.3.1.4 Dynamische Lichtstreuung
Bei der Messung der Lichtstreuung werden zwei Methoden unterschieden: die statische
und die dynamische Lichtstreuung. Die statische Lichtstreuung dient der Bestimmung von
Molmassen, Trägheitsradien und zweiten Virialkoeffizienten als Maß intermolekularer
Wechselwirkungen von Biopolymeren in Lösung. Die dynamische Lichtstreuung (DLS)
wird zur Bestimmung der Abmessungen von Makromolekülen (z. B. Proteinmolekülen)
und Partikeln in Lösung eingesetzt. Sie gestattet die Bestimmung von Translationsdiffusi-
onskoeffizienten (D). Aus den Diffusionskoeffizienten können die hydrodynamisch effekti-
ven Abmessungen berechnet werden.
Die Konzentration von Molekülen in Lösung schwankt aufgrund der Brownschen Moleku-
larbewegung, in Abhängigkeit von Ort und Zeit, um einen Mittelwert. Diese Konzentrati-
onsschwankungen relaxieren nach den Fickschen Gesetzen der Diffusion. Die Relaxati-
onszeit
τ
hängt in der Hauptsache von der Molekülgröße und -gestalt ab, sowie auch von
der Temperatur und der Viskosität des Lösungsmittels. Durch die Messung der DLS erhält
man Informationen über die zeitlichen Schwankungen der gestreuten Lichtintensität, die
wiederum durch die Konzentrationsfluktuation der Proteinmoleküle in Lösung hervorgeru-
fen werden und die somit Rückschlüsse auf diese Moleküle zulassen. Bei der DLS wird die
Meßprobe mit der Strahlung eines Lasers beleuchtet und die Intensität der gestreuten
Strahlung bei einem bestimmten Streuwinkel Θ gemessen. Die Schwankungen des Feldes
der gestreuten Welle werden durch die Zeit-Autokorrelationsfunktion (AKF) beschrieben.
Sie enthält die Informationen über die streuenden Moleküle.
Für den Fall, daß die streuenden Moleküle identisch und kugelförmig sind, nimmt die
Zeit-Autokorrelationsfunktion die Form einer einfachen Exponentialfunktion an:
τ
τ
Dq
e2
)(g−
= Gleichung 16
g (
τ
) = Zeit-Autokorrelationsfunktion 1.Ordnung
q = Betrag des Streuvektors
D = Translationsdiffusionskoeffizient der streuenden Moleküle
τ
= Relaxationszeit
Der Steuvektor q ist folgendermaßen definiert: 2
sin
4
||
0
Θ
=≡
λ
π
n
qq
n = Brechungsindex der Probe
λ
0 = Wellenlänge der Laserstrahlung im Vakuum
Θ = Streuwinkel
Material und Methoden 37
Der Logarithmus der Zeit-Autokorrelationsfunktion ergibt mit ln
g
(
τ
) = - q2 D
τ
eine Ge-
rade. Da
λ
0, Θ und n bekannt sind bzw. gemessen werden, läßt sich aus der Auftragung
von ln
g
(
τ
) über
τ
der Diffusionskoeffizient D ermitteln.
Häufig sind neben den monomeren Proteinmolekülen jedoch Anteile von Aggregaten oder
Dissoziationsprodukten vorhanden. In diesem Fall nimmt die Zeit-Autokorrelations-
funktion die Form ττ
τ
2
2
1
2
21
)(gDqDqeaea−− += an. Darin sind ai die Amplitudenfaktoren,
die der jeweiligen Anzahl Ni von Teilchen der Masse mi pro Volumeneinheit proportional
sind.
Der Radius der streuenden Makromoleküle kann bei Kenntnis von D und der Viskosität
des Lösungsmittels nach den Beziehungen von EINSTEIN (Gleichung 17) und STOKES
(Gleichung 18) berechnet werden.
f
Tk
DB
= Gleichung 17
kB = Boltzmann-Konstante
T = Temperatur
f = Reibungskoeffizient
Der Reibungskoeffizient f einer Kugel mit dem Radius R ist definiert als
f = 6 π
η
0 R Gleichung 18
worin
η
0 der Viskosität des Lösungsmittels entspricht.
Der Stokessche Radius, auch hydrodynamisch wirksamer Radius, kann demnach mit fol-
gender Gleichung berechnet werden:
D
Tk
RB
S
0
6
ηπ
= Gleichung 19
kB = Boltzmann-Konstante
T = Temperatur
η
0 = Viskosität des Lösungsmittels
D = Diffusionskoeffizient
Der Rs-Wert schließt die den Reibungskoeffizienten maßgeblich beeinflussende Hydrathül-
le des Proteins mit ein, so daß der Stokessche Radius nur dann Aussagen über die tat-
sächlichen Abmessungen des Moleküls zuläßt, wenn die Hydratation bekannt ist.
Mittels DLS wird der Einfluß der Ionenstärke des Lösungsmittels auf den Diffusionskoeffi-
zienten einer erschöpfend succinylierten Leguminprobe untersucht.
Durchführung. Vom zu untersuchenden Protein werden je vier Lösungen mit Konzentra-
tionen zwischen 2 und 5 g/l hergestellt, um die Streuintensität auf die Konzentration
Material und Methoden 38
cProt = 0 extrapolieren zu können. Sie werden gegen den jeweiligen Phosphatpuffer (Io-
nenstärke I=0,1; I=0,5 bzw. I=1,0) dialysiert und die Proteinkonzentrationen mit der
Mikro-Biuret-Methode bestimmt. Die Lösungen werden durch Filter der Porenweite
0,2 µm direkt in die Küvetten gefüllt.
Die Lichtstreuung der Proben wird mit dem Gerät SIMULTAN (ALV-Laser, Langen), einem
Mehrfach-τ-Digitalkorrelator ALV-5000 und einem 400 mW Nd-YAG-Laser (ADLAS, Lü-
beck) gemessen.
3.3.2 Spektroskopische Methoden
3.3.2.1 UV-Absorptionsspektroskopie
Im nahen UV-Bereich absorbieren die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin (Phe),
Tyrosin (Tyr) und Tryptophan (Trp). Ihre Absorptionsspektren sind in Abbildung 7 dar-
gestellt.
Abbildung 7: UV-Absorptionsspektren der drei
aromatischen Aminosäuren Phe,
Tyr und Trp nach [117]
Der molekulare Extinktionskoeffizient
ε(λ)
ist im logarithmischen Maßstab darge-
stellt. Aus dieser Abbildung ist zu entneh-
men, daß das UV-
Spektrum eines Proteins
zwischen 240 nm und 320 nm hauptsäch-
lich von seinem Gehalt an Tryptophan und
in geringerem Maße vom Tyrosingehalt
bestimmt wird; der Gehalt an Phenylalanin
spielt nur eine untergeordnete Rolle. Diese
Aussage g
ilt streng genommen nur, wenn
die drei Aminosäurereste zu etwa gleichen
Anteilen im Protein vorliegen. Da die Le-
gumin-Untereinheiten vom Typ
A 12 bzw.
vom Typ B 13 Tyr-
Reste aber nur 2 bzw. 3
Trp-Reste enthalten, wird der Verlauf des
UV-Spektrums sowohl durch die Trp-Reste als auch durch die Tyr-Reste bestimmt.
Abbildung 7 verdeutlicht aber, daß bei einer Wellenlänge von 295 nm die UV-Absorption
vor allem durch das im Molekül vorhandene Tryptophan bestimmt wird. Die Absorption
der 17 bzw. 12 Phe-Reste beeinflußt das UV-Spektrum zwischen 240 und 320 nm nicht
maßgeblich.
Durchführung. Für die UV-spektroskopischen Untersuchungen von Legumin und seinen
acylierten Derivaten werden jeweils Lösungen mit einer Proteinkonzentration von 2 g/l
Material und Methoden 39
hergestellt, gegen den entsprechenden Puffer dialysiert und anschließend durch 0,2 µm
klar filtriert. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes mit der Mikro-Biuret-Methode
wird die Massenkonzentration mittels Wägung auf 1 g/l eingestellt. Es wird am UV/VIS
Spektralphotometer Lambda 2 (PERKIN-ELMER, Überlingen) im Wellenlängenintervall
240-400 nm (Messung bis 400 nm wegen anschließender Trübungskorrektur) gemessen.
Die UV-Absorptionsspektren (nullter Ordnung) werden mit einer Geschwindigkeit von
1 nm/s und einer Spaltbreite von 2 nm aufgenommen.
Die UV-Derivationsspektroskopie erlaubt es, störende Einflüsse, die bei Spektren nullter
Ordnung auftreten können, auszuschalten bzw. zu minimieren [118]. So können die
Streuung oder Absorption durch Puffersubstanzen und geringe Konzentrationsschwan-
kungen zwischen den Proben als Fehlerquellen eliminiert werden. Ein großer Vorteil der
Derivationsspektroskopie ist die Erfassung schon sehr geringer Veränderungen in der
Umgebung der Chromophoren. Es werden die zweiten Ableitungen (d2A/d
λ
2) der UV-
Absorptionsspektren nullter Ordnung berechnet.
Um Konformationsunterschiede zwischen nativem Legumin und den zunehmend stärker
acylierten Proben (auch in Abhängigkeit von der Ionenstärke des Puffers) aufzuzeigen,
empfiehlt es sich, zunächst die Differenzspektren aus modifizierter Probe und nativer
Probe zu berechnen. Die 2. Ableitungen dieser Differenzspektren (d2
∆
A/d
λ
2) werden als
Differenzableitungsspektren bezeichnet. Die Ableitung erfolgt über ein Intervall von
4,9 nm.
3.3.2.2 Fluoreszenzemissionsspektroskopie
Abbildung 8: Fluoreszenzemissionsspektren von 100
µ
mol Phenylalanin (Exc. 257nm), 6
µ
mol Ty-
rosin (Exc. 274 nm) und 1
µ
mol Tryptophan (Exc. 278 nm) in 0,01 M Kalium-
Phosphatpuffer nach [119]
Material und Methoden 40
Die Messung der Fluoreszenzemission erfolgt üblicherweise durch Anregung von Tyrosin
und Tryptophan bei einer Wellenlänge von 280 nm (Anregung von Tryptophan und Tyro-
sin) bzw. bei 295 nm (Anregung von Tryptophan) [119]. In Proteinen, die alle drei aro-
matischen Aminosäuren (Trp, Tyr, Phe) enthalten, wird die Fluoreszenz in der Regel
durch den Beitrag der Tryptophanreste bestimmt (s. auch Abbildung 8). Ursachen sind
die bedeutend größere Absorption bei der Anregungswellenlänge und die beträchtlich
höhere Quantenausbeute der Emission als bei Tyrosin und Phenylalanin. Die Phenylala-
nin-Fluoreszenz kann wegen ihrer zu geringen Sensitivität in nativen Proteinen in der
Regel nicht beobachtet werden. Ein anderer wichtiger Aspekt ist der Energietransfer zwi-
schen den Resten. Die Fluoreszenz von Phenylalanin z. B. kann auch deswegen kaum
beobachtet werden, weil ihre Emission effizient durch den Energietransfer zu den Tryp-
tophan- und Tyrosinresten gelöscht wird (‚Quenching‘). Diese absorbieren stark in dem
Bereich (280 nm), wo Phenylalanin Fluoreszenz emittiert.
Durchführung. Für die Untersuchung der Fluoreszenzemission von Legumin und seinen
acylierten Derivaten hinsichtlich des Einflusses von Modifizierung und Ionenstärke des
Lösungsmittels auf die Konformation, werden jeweils Proteinlösungen der Konzentration
2 g/l hergestellt, gegen den entsprechenden Puffer dialysiert und anschließend durch 0,2
µm klar filtriert. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes mit der Mikro-Biuret-Methode
wird die Massenkonzentration mittels Wägung auf 1,00 g/l eingestellt und anschließend
auf 0,10 g/l verdünnt. Die Messungen erfolgen am Fluoreszenz-Spektrometer AB 2
(AMINCO-BOWMAN, Rochester) im Wellenlängenintervall 300–450 nm. Die Fluoreszenz-
emissionsspektren werden in Schritten von 0,2 nm mit einer Geschwindigkeit von
0,2 nm/s und einer Bandbreite von 4 nm für die Anregung und 0,5 nm für die Emission
(HV 900 V) aufgenommen. Die Fluoreszenzemission jeder Probe wird sowohl nach Anre-
gung bei 280 nm (Tyr und Trp) als auch nach Anregung bei 295 nm (Trp) gemessen.
3.3.2.3 Circulardichroitische Spektrometrie
Circulardichroitische Spektrometrie ist eine häufig angewendete Technik, mit der Daten
über die Struktur (Sekundär- und Tertiärstruktur) eines Proteins in Lösung erhalten wer-
den können. Unter Circulardichroismus (CD) versteht man die Eigenschaft, links- bzw.
rechtscircularpolarisiertes Licht unterschiedlich stark zu absorbieren. Die Chiralität eines
Chromophors ist Voraussetzung.
Durchführung. Die zu untersuchenden Proteinproben werden im jeweiligen Phosphat-
puffer gelöst, dialysiert, durch 0,2 µm filtriert und anschließend die Endkonzentration auf
exakt 2,0 g/l eingestellt. Alle Messungen werden am CD-Spektropolarimeter JASCO J-720
vorgenommen. Die Untersuchungen im fernen UV (190–260 nm) erfolgen in Quarzküvet-
Material und Methoden 41
ten mit einer Schichtdicke von 0,005 cm, die Messungen im nahen UV (245–320 nm) in
1 cm-Küvetten. Die Spektren werden mit einer Geschwindigkeit von 10 nm/min und einer
Zeitkonstanten von 4 s aufgenommen und jeweils dreifach akkumuliert. Aus der Elliptizi-
tät Θ, gemessen in mdeg, wird die konzentrations- und schichtdickenunabhängige molare
Elliptizität [Θ] in [deg • cm2/dmol] berechnet. In diese Umrechnung geht die mittlere mo-
lare Masse der das Polymer konstituierenden Monomere (MRW = mean residue weight)
ein, welche in Abhängigkeit von Art und Grad der Modifizierung unterschiedlich ist.
Das MRW wird folgendermaßen berechnet: Die Aminosäurezusammensetzung von Legu-
min (Vicia faba L., var. Scirocco) ist experimentell bestimmt worden [50]. Aus den Mol-
massen der Aminosäuren werden durch Subtraktion von 18 g/mol (entsprechend der
Wasserabspaltung bei der Bildung von Peptidbindungen) die Molmassen der Aminosäure-
reste in der Polypeptidkette berechnet. Die Summe der Molmassen aller Aminosäureres-
te, dividiert durch die Anzahl der Aminosäuren aus [50], ergibt das MRW. Für die Berech-
nung des MRW von erschöpfend acetyliertem Legumin werden die zugrunde liegenden
Molmassen der Lysin-, Threonin-, Serin und Tyrosinreste um 42 g/mol erhöht. Das ent-
spricht der Einführung der Acetylgruppe -CO-CH3 unter Abspaltung eines Wasserstoff-
atoms aus der Amino- bzw. Hydroxylgruppe. Für die Berechnung des MRW von vollstän-
dig succinyliertem Legumin wird zur Molmasse der Lysin-, Threonin- und Serinreste ein
Betrag von 99 g/mol, entsprechend dem Succinylrest -CO-CH2-CH2-COO-, addiert. Die
Molmasse der Tyrosinreste wird bei dieser Berechnung wegen der Reversibilität ihrer
Succinylierung nicht verändert. Das MRW von Leguminproben mit nur teilweise acylierten
Gruppen wird mit den entsprechend anteilig erhöhten Massen, also mit 58 % der Lysin-
und 20 % der Threonin- und Serinreste im Falle 58%iger N-Acetylierung und 64 % der
Lysinreste bei der zu 64 % succinylierten Probe, berechnet. Die Ergebnisse sind Tabelle
1 zu entnehmen.
Tabelle 1: MRW ausgewählter acylierter Leguminproben zur Berechnung molarer Elliptizitäten
Mittleres Restgewicht
(MRW)
natives Legumin 113,6
58% Acetylierung 115,5
98% Acetylierung 120,9
64% Succinylierung 114,9
95% Succinylierung 127,9
Material und Methoden 42
3.3.3 Methoden zur Untersuchung der Konformationsstabilität
3.3.3.1 Differential Scanning-Kalorimetrie zur Untersuchung der Thermostabilität
Die Differential Scanning-Kalorimetrie (DSC) ist im allgemeinen eine Technik zur Unter-
suchung thermotroper Übergänge. In der vorliegenden Arbeit wurde sie zur Bestimmung
der Energetik bzw. Thermodynamik des Überganges vom gefalteten zum entfalteten Pro-
tein angewendet. Dabei wird das Protein in Lösung einem Streß in Form von permanent
steigender Temperatur ausgesetzt, bis die anfangs vorliegende „native“ Struktur kolla-
biert und das Protein im Zustand vollständiger thermischer Entfaltung vorliegt [121].
Wenn ein System bei konstantem Druck erwärmt wird und außer Volumenarbeit keine
andere Form der Arbeit zugelassen ist, so nimmt die Enthalpie H um einen Betrag zu, der
äquivalent der als Wärme zugeführten Energie ist [120]. Wird die Wärmekapazität des
Proteins als Funktion der Temperatur gemessen, kann daraus die Temperaturabhängig-
keit der Enthalpie abgeleitet werden. Aus der Definitionsgleichung der Wärmekapazität,
p
pT
H
C
∂
∂
=,
erhält man durch Integration die Enthalpiefunktion )()()( 0
0
THdTTCTHT
T
p+= ∫.
Abbildung 9 gibt die schematische Darstellung eines DCS-Thermogramms wieder. Beim
Übergang des Proteins vom Ausgangszustand in einen anderen, thermisch denaturierten
Zustand, hat die gemessene Wärmekapazitätsfunktion Cp bei einer charakteristischen
Temperatur Td ihr Maximum; es beinhaltet die Wärmekapazitäten aller beim Übergang
vorliegenden Zustandsformen. Die Differenz aus molarer Wärmekapazität des Proteins im
entfalteten Zustand Cp,u und im gefalteten („nativen“) Zustand Cp,n entspricht der Wär-
mekapazitätsänderung für den thermischen Entfaltungsprozeß ∆Cp. Die Exzess-Wärme-
kapazitätsfunktion <∆Cp> (Abbildung 10) erhält man durch Subtraktion der Wärmeka-
pazität Cp,n des Proteins im nativen Zustand von der Wärmekapazitätsfunktion Cp. Die
Basislinie des Thermogramms (<∆Cp,bl>) im Bereich der Denaturation wurde durch ‚spli-
ne‘-Interpolation zwischen Cp,n und Cp,u berechnet. Nach Abzug dieser sigmoidalen Funk-
tion erhält man die Exzess-Wärmekapazitätsfunktion des Übergangs <∆Cp,tr> die den
oder die charakteristischen Übergangspeak(s) in der Wärmekapazitätsfunktion definiert
(„normiertes Thermogramm“). Die Fläche unter dem Peak entspricht der Denaturation-
senthalpie ∆Hcal.
Material und Methoden 43
Temperatur [°C]
Cp
Temperatur [°C]
Cp
∆Hcal
Abbildung 9: Schematische Darstellung des
Funktionsverlaufes der molaren
Wärmekapazität Cp für ein typi-
sches globuläres Protein nach
[121]
Abbildung 10: Schematische Darstellung (nach
[121]) der Exzess-Wärmekapa-
zitätsfunktion <
∆
Cp> = Cp – Cp,n
sowie der Exzess-Wärmekapa-
zitätsfunktion des Überganges
vom gefalteten Zustand eines
Proteins in den denaturierten
<
∆
Cp,tr> = <
∆
Cp> - <
∆
Cp,bl>
Durchführung: Nach der Kalibrierung des Kalorimeters durch Meßzellenbeheizung (defi-
nierter Energiewert wird in definiertem Zeitintervall gemessen und mit der erhaltenen
Peakfläche korreliert) wird die Wärmekapazität des Puffers durch Differenzmessung ge-
gen Wasser ermittelt. Zur mikrokalorimetrischen Untersuchung der Probe wird eine Lö-
sung mit einer Proteinkonzentration von etwa 5 mg/ml im entsprechenden Phosphatpuf-
fer mit NaCl hergestellt, zur Einstellung des Gleichgewichtes dialysiert und anschließend
zur Abtrennung von Aggregaten 15 min bei 17 000 x g zentrifugiert. Die nun vorliegende
Proteinkonzentration wird mit der Mikro-Biuret-Methode spektrophotometrisch bestimmt.
Die DSC-Messung der Probe erfolgt gegen den Puffer in einem DASM-4-Mikrokalorimeter
(Au-Zelle mit V = 0,47 ml) der Firma BIOPRIBOR, USSR, während eines Arbeitsaufent-
haltes am Institut für Biochemische Physik der Russischen Akademie der Wissenschaften,
Moskau.
Temperaturmeßbereich: 2 bis 95 ° C
Aufheizrate: 2 ° C/min
Druck: 2 • 105 Pa
Komplexe Thermogramme können z. B. durch Denaturation verschiedener Moleküle oder
verschiedener Domänen, durch aufeinander folgende Entfaltungsstufen innerhalb einer
Domäne oder durch Dissoziation mit einher gehender Denaturation bedingt sein. Für die
Auftrennung solcher überlappender Peaks, bezeichnet als Deconvolution der Wärmekapa-
zitätsfunktion, ist ein Algorithmus entwickelt worden [122, 123]. Das Hauptziel der De-
Material und Methoden 44
convolutionsanalyse ist die Bestimmung der Anzahl von Zuständen, die während der
thermischen Entfaltung vorliegen und ihrer thermodynamischen Parameter [124]. Die
computergestützte Deconvolution der komplexen Thermogramme erfolgte in Moskau mit
dem Gausskurven-Fitting-Programm PEAK FIT 4.0.
Bei reversibler thermischer Entfaltung gilt für die freie Energie ∆G im Gleichgewicht
∆G = ∆H – Td ∆S = 0
Die freie Energie der Entfaltung - auch als molare Thermostabilität ∆G(T) bezeichnet -
kann, bei Annahme einer einstufigen Denaturation, für jede beliebige Temperatur T durch
Einsetzen der molaren thermodynamischen Parameter in Gleichung 20 berechnet werden
[125].
( )
+−∆−
−∆=∆
d
dp
d
cal T
T
TTTC
T
T
HTGln1)( Gleichung 20
3.3.3.2 Fluoreszenzspektroskopie zur Untersuchung der Denaturansstabilität
Die Methode dient der Erfassung von Unterschieden der Konformationsstabilität von Le-
guminpräparaten, aufgrund verschiedener Modifizierungsstufen. Die Stabilität der Kon-
formation eines Proteins kann durch die Veränderung der freien Energie für die folgende
Reaktion beschrieben werden [125]:
nativ (gefaltet, „f“) • denaturiert (entfaltet, „e“)
Die Konformationsstabilität, auch thermodynamische Stabilität, kann im Falle reversibler
Entfaltung als Funktion der Denaturanskonzentration bestimmt werden. Die Reversibilität
des Entfaltungsprozesses ist also stets zu prüfen [125]. Die Untersuchung der Konforma-
tionsstabilität auf diesem Wege erfordert eine Reihe von Annahmen [126]. So muß die
Entfaltung ohne Zwischenstufen von einem Ausgangszustand zu einem Endzustand erfol-
gen. Die freie Energie des Ausgangsproteins kann anhand der gemessenen Werte in Ge-
genwart von Denaturans durch Extrapolation auf die Denaturanskonzentration cDenat = 0
erhalten werden [125]. Die lineare Regression erfolgt aufgrund der Annahme, daß zwi-
schen der Exposition und der meßbaren Fluoreszenz des Tryptophans einerseits und zwi-
schen der Tryptophan-Exposition und dem Entfaltungsgrad des Proteins andererseits eine
lineare Abhängigkeit besteht.
Durchführung. Wegen des unerwünschten stabilisierenden Einflusses der Na+- und Cl--
Ionen erfolgen sämtliche Untersuchungen zur Denaturansstabilität in 0,05 M Phosphat-
puffer nach SÖRENSEN, pH 8, ohne NaCl.
Material und Methoden 45
Reversibilitätstest. Für den Nachweis der Reversibilität des Entfaltungsprozesses wird
eine Stammlösung des jeweiligen Proteins in NaCl-freiem Phosphatpuffer mit einer Kon-
zentration von 2,0 g/l hergestellt. Einerseits dient diese Protein-Stammlösung, nach Ver-
dünnung auf die Proteinkonzentration 0,1 g/l und Äquilibrierung bei 4 ° C, der Untersu-
chung der Probe im Ausgangsfaltungszustand („nativ“). Andererseits werden zu 5 ml die-
ser Protein-Stammlösung 3,2 g Guanidiniumchlorid bzw. 2,7 g Harnstoff gegeben und mit
Puffer auf 10 ml aufgefüllt, so daß eine Lösung von 1,0 g/l Protein mit 3,3 M Guanidini-
umchlorid bzw. 4,4 M Harnstoff als Denaturans-Stammlösung vorliegt. Bei diesen Dena-
turanskonzentrationen sind die untersuchten Proteine nachgewiesenermaßen vollständig
entfaltet. Nach 10facher Verdünnung mit 3,3 M Guanidiniumchlorid- bzw. 4,4 M Harn-
stofflösung und 18stündiger Äquilibrierung bei 4 ° C (Denaturation) kann die vollständig
denaturierte Probe fluoreszenzspektroskopisch vermessen werden. Aliquote der ebenfalls
18 Stunden äquilibrierten Denaturans-Stammlösung werden mit Puffer auf Proteinkon-
zentration 0,1 g/l verdünnt, so daß nur noch sehr geringe Denaturanskonzentrationen
vorliegen und die Rückfaltung erfolgen kann. Nach 18stündiger Äquilibrierung bei 4 ° C
(Renaturation) können die Fluoreszenzintensitäten der renaturierten Proteinlösungen
gemessen werden. Die Reversibilität wird aus dem Verhältnis der Fluoreszenz-Signale
von nativer und renaturierter Probe zu dem der denaturierten Probe abgeleitet.
Entfaltung. Es werden Lösungen nativer und acylierter Leguminproben der Proteinkon-
zentration 1,1 g/l in NaCl-freiem Phosphatpuffer hergestellt und durch Filter der Poren-
weite 0,2 µm klar filtriert. Nach der Bestimmung des Proteingehaltes mit der Mikro-
Biuret-Methode wird die Proteinkonzentration auf 1,0 g/l eingestellt. Für die Verfolgung
des Denaturationsprozesses werden sogenannte Denaturations- oder Entfaltungskurven
aufgenommen. Für jedes der zu untersuchenden Proteine werden Guanidiniumchlorid-
Verdünnungsreihen hergestellt (Mehrfachbestimmung): Die durch Zugabe von 6,67 M
Guanidiniumchloridlösung auf Denaturans-Endkonzentrationen von 0 bis 6 M eingestell-
ten und auf eine Protein-Endkonzentration von jeweils 0,1 g/l verdünnten Lösungen wer-
den 18-20 Stunden bei 4 ° C äquilibriert und anschließend fluoreszenzspektroskopisch
gemessen.
Die Messung der Fluoreszenzemission erfolgt nach Anregung des Tryptophans mit einer
Wellenlänge von 295 nm. Die Untersuchungen werden am Fluoreszenz-Spektro-
meter AB 2 (AMINCO-BOWMAN, Rochester) im Wellenlängenintervall 300–360 nm mit
einer Geschwindigkeit von 0,2 nm/s und einer Bandbreite von 4 nm für die Anregung
bzw. 2 nm für die Emission (HV 750 V) durchgeführt. Aus den aufgenommenen Guanidi-
niumchlorid-Verdünnungsreihen mit konstanter Proteinkonzentration werden zur Charak-
terisierung der Denaturansstabilität die Änderung der freien Energie ∆G (linear extrapo-
liert auf cGuHCl = 0) und der molare Denaturanskonzentrationswert für das zu 50 % entfal-
tet vorliegende Protein, [GuHCl]1/2, folgendermaßen ermittelt: Die maximale Differenz
Material und Methoden 46
der Fluoreszenzintensitäten von nativem und denaturiertem Protein wurde bei einer Wel-
lenlänge von 320 nm gefunden und daher der Methode zugrunde gelegt. Aus der Verän-
derung des Fluoreszenzsignals bei 320 nm während der Entfaltung wird der Anteil entfal-
tetes Protein fe am Gesamtprotein nach Gleichung 21 berechnet. Für RFf bzw. RFe wird
jeweils der Ordinatenabschnitt der Regressionsgeraden aus den Fluoreszenzwerten der
ge- bzw. entfalteten Proben eingesetzt (s. auch Abbildung 11).
ef
obsf
eRFRF
RFRF
f−
−
= Gleichung 21
0
1
2
3
4
5
0123456
GuHCl-Konzentration [M]
RF
gefaltet
Übergang
entfaltet
0
20
40
60
80
100
0123456
GuHCl-Konzentration [M]
fe [%]
Abbildung 11: Fluoreszenz (Exc. 295 nm, Em. 320 nm) bei GuHCl-induzierter Entfaltung von nativem
Legumin (links) und Darstellung des prozentualen Anteils an entfaltetem Protein fe im
Verlauf dieser Denaturation
Daraus lassen sich die Gleichgewichtskonstante K und die Änderung der freien Energie
∆G für die Entfaltungsreaktion folgendermaßen ermitteln:
e
e
f
f
K−
=1 Gleichung 22
∆G = - RT lnK Gleichung 23
Die einfachste und daher auch weit verbreitete Methode für die Bestimmung der Konfor-
mationsstabilität in Abwesenheit von Denaturans, ∆GPuffer, ist die Annahme einer linearen
Beziehung zwischen ∆G und der Denaturanskonzentration cGuHCl (s. Abbildung 12, Glei-
chung 24) und dementsprechend die Extrapolation auf cGuHCl = 0 [127]. Die Größe m ist
ein Maß für die Abhängigkeit der freien Energie der Denaturation von der Guanidiniumch-
loridkonzentration.
Material und Methoden 47
y = -15,23x + 24,64
-15
0
15
0 1 2 3
GuHCl-Konzentration [M]
∆G [kJ/mol]
Abbildung 12: Freie Energie
∆
G bei der Entfaltung
von nativem Legumin in Abhängig-
keit von der GuHCl-Konzentration
∆G = ∆GPuffer – m cGuHCl Gleichung 24
Da im Gleichgewicht ∆G = 0 gilt, wird der Gleichgewichtswert für die Entfaltung (Wende-
punkt der Entfaltungskurve), [GuHCl]1/2, nach Gleichung 25 berechnet.
m
G
GuHCl Puffer
∆
=
2/1
][ Gleichung 25
Ergebnisse 48
4 Ergebnisse
4.1 Acylierung funktioneller Gruppen des Legumins
Um die gezielte Herstellung von Leguminproben unterschiedlicher Acylierungsgrade zu
ermöglichen, wurde die Acylierung der Aminogruppen des Legumins in Abhängigkeit von
der Menge des jeweiligen Acylierungsreagens untersucht. In Abbildung 13 ist die Ab-
hängigkeit der N-Blockierung vom molaren Verhältnis Carbonsäureanhydrid/Aminogruppe
für die Reaktion mit Acet- und Bernsteinsäureanhydrid wiedergegeben.
0
20
40
60
80
100
010 20 30 40 50 60 70 80 90 100
mol Carbonsäureanhydrid / mol Aminogruppe
Blockierung der Aminogruppen [%]
Succinylierung
Acetylierung
140
Abbildung 13: Abhängigkeit der N-Acylierung vom molaren Überschuß an Carbonsäureanhydrid
Acetylierung und Succinylierung zeigen einen ähnlichen Verlauf. 98 % der Aminogruppen
werden bei einem etwa 45fachen molaren Überschuß des Reagens, 70 % der Ami-
nogruppen bei einem fünffachen Überschuß acyliert.
Wird das Ausmaß der O-Acylierung als Funktion des Blockierungsgrades der Aminogrup-
pen aufgetragen, ergibt sich die in Abbildung 14 gezeigte Abhängigkeit. Die
O-Succinylierung setzt erst ein, nachdem 93-95 % der Aminogruppen acyliert wurden.
Hingegen ist eine geringe O-Acetylierung bereits bei einer Blockierung von 30 bis 40 %
der Aminogruppen nachweisbar. Bei einer Acetylierung von 80 % der Aminogruppen lie-
gen jedoch nur 30 bis 40 % der Hydroxylgruppen des Proteins (aus Tyrosin-, Serin- und
Threoninresten) acetyliert vor. Im Extremfall lassen sich sämtliche Hydroxylgruppen ace-
tylieren bzw. succinylieren.
Ergebnisse 49
0
20
40
60
80
100
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Blockierung der Aminogruppen [%]
Blockierung der Hydroxylgruppen [%]
Succinylierung
Acetylierung
Abbildung 14: Zusammenhang zwischen dem Grad der O-Acylierung und dem Grad der N-
Acylierung
Aus den Untersuchungen zur Deblockierung können Aussagen über den Anteil und die
Bedeutung der Acylierung der phenolischen Tyrosin-Hydroxylgruppen des Legumins
abgeleitet werden. Die Bestimmung von O-Acetyl-Tyrosingruppen erfolgte nach Spaltung
mit Hydroxylamin unter milden Bedingungen bei pH 8 und Absorptionsmessung bei
278 nm. Die Veränderung des UV-Spektrums einer hochacetylierten Leguminprobe und
die Änderung der Absorption bei 278 nm im Verlauf der Hydroxylaminolyse sind in
Abbildung 15 und Abbildung 16 wiedergegeben.
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
240 250 260 270 280 290 300 310 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
nativ
98 % Ac.
1 min
10 min
50 min
Abbildung 15: Deacetylierung von Hydroxylgruppen einer hochacetylierten Leguminprobe:
UV-Spektren nach unterschiedlich langer Inkubation mit Hydroxylamin-Hydrochlorid
Entsprechend der Abspaltung der O-Acetylreste des Tyrosins nähert sich das Spektrum
mit fortschreitender Hydroxylaminolyse dem des nativen Proteins an.
Ergebnisse 50
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Zeit [min]
Absorption [278 nm / 1cm]
nativ
Abbildung 16: Deacetylierung von Hydroxylgruppen einer hochacetylierten Leguminprobe:
Zeitabhängige Zunahme der UV-Absorption bei der Deblockierung mit Hydroxylamin-
Hydrochlorid
Aus der Absorptionsdifferenz bei 278 nm ergibt sich ein Wert von 35 O-acetylierten Tyro-
sinresten pro Mol Legumin. Bei einem aus der Aminosäureanalytik ermittelten Gehalt von
64 Tyrosinresten [50] entspricht dies einer 54 %igen Blockierung des Tyrosins. Bei Be-
rücksichtigung des Tyrosinanteils von 22,4 % an der Gesamtmenge der Hydroxylgruppen
enthaltenden Aminosäuren (Tyr, Ser, Thr) ergibt sich ein Anteil von 12 % der gesamten
O-Acylierung im erschöpfend acetylierten Legumin, der auf die Blockierung von Tyrosin-
resten entfällt. Bei einem N-Blockierungsgrad von 80 % wurden 10 % (7 Reste) Tyrosin-
Acetylierung ermittelt. Die Tyrosinreste einer 58 % N-acetylierten Leguminprobe wurden
dagegen nicht modifiziert.
In Abbildung 17 ist der Verlauf der spontanen Desuccinylierung (intramolekulare Hydro-
lyse entsprechend Abbildung 3-3) von O-Succinyl-Tyrosinresten in einer erschöpfend
succinylierten Leguminprobe durch Verfolgung der Absorptionsänderung bei 278 nm wie-
dergegeben. Die Erniedrigung des Absorptionswertes bei 278 nm nach erfolgter Succiny-
lierung weist auf eine Blockierung von 36 Tyrosinresten entsprechend 56 % aller Tyrosin-
reste des Legumins hin. Nach 6tägiger Inkubation im Standardphosphatpuffer wurden 34
Tyrosinreste (94 %) desuccinyliert.
Ergebnisse 51
0,50
0,55
0,60
0,65
0,70
0,75
0,80
1 100 10000
Zeit [min]
Absorption [278nm/1cm]
nativ, vor
Succinylierung
Abbildung 17: Spontane Desuccinylierung des O-Succinyltyrosins in 99 % modifiziertem Legumin
Abbildung 18 zeigt die SDS-PAGE von nativem Legumin und seinen acylierten Derivaten
unter nichtreduzierenden Bedingungen.
a b
kDa
78
66
43
30
17
12
0 15 37 58 77 83 98 % 0 31 49 61 68 80 94 %
Abbildung 18: SDS-PAGE von acetylierten (a) und succinylierten (b) Leguminproben [% N-
Acylierung] unter nichtreduzierenden Bedingungen
Eichproteine: Cytochrom, Myoglobin, Carboanhydrase, Ovalbumin, Albumin,
Ovotransferrin
Bei der 56 kDa-Hauptbande handelt es sich um die Legumin-Untereinheiten. Die unmit-
telbar darüber befindliche Bande resultiert aus dem Vorhandensein von Vicilin (3-5 %, s.
Pkt. 3.1.1), und die beiden darüber gelegenen Banden entsprechen den schweren Legu-
min-Untereinheiten [53].
Im Falle der Acetylierung kommt es zur raschen Modifizierung der schweren Untereinhei-
ten (bereits bei 15 % N-Acetylierung) und Vicilin (ab 37 % sichtbar) und der Anteil der
Aggregate nimmt schrittweise zu.
Ergebnisse 52
Die succinylierten Proben sind charakterisiert durch den allmählichen, schrittweisen Mas-
senzuwachs der 56 kDa-Untereinheiten des Legumins, der insbesondere bei 94 % Succi-
nylierung beträchtlich ist. Die schweren Legumin-Untereinheiten und Vicilin unterliegen
bereits bei 31 % N-Succinylierung der Modifizierung.
Abbildung 19 zeigt die SDS-PAGE von nativem Legumin und seinen acylierten Derivaten
nach Reduktion mit DTE.
a b
kDa
17
12
30
43
78
66
αα
ββ
0 15 37 58 77 83 98 % 0 31 49 61 68 80 94 %
Abbildung 19: SDS-PAGE von acetylierten (a) und succinylierten (b) Leguminproben nach Reduktion
mit DTE [% N-Acylierung]
Eichproteine: Cytochrom, Myoglobin, Carboanhydrase, Ovalbumin, Albumin,
Ovotransferrin
Die Elektrophorese des nativen Leguminpräparates unter reduzierenden Bedingungen
weist vier scharfe Banden mit Molekularmassen von 63 und 45 kDa, resultierend aus dem
Vorhandensein von 3-5 % Vicilin (s. Pkt. 3.1.1), und Molekularmassen von 55 und
49 kDa (schwere α-Ketten des Legumins) auf. Es folgen die α-Ketten mit 36 bzw. 34 kDa
und die β-Ketten mit jeweils 24, 23 und 22 kDa.
Durch die Acetylierung nimmt die Molekularmasse der α-Ketten zu. Veränderungen in
Form einer dritten, etwa 4 kDa schwereren Bande im Molekularmassenbereich der α-
Ketten treten ab 37 % N-Acetylierung auf. Die Molekularmassenzunahme zwischen den
α-Ketten des nativen Proteins und denen des hochacetylierten Derivates beträgt etwa
400 Da. Die β-Ketten bleiben bis 83 % N-Acetylierung nahezu unverändert und weisen
bei 98 % N-acetylierten Aminogruppen ein diffuses Bandenmuster auf. Die für die Haupt-
banden ermittelten Massen sind etwa 1-1,5 kDa schwerer als die β-Ketten des nativen
Legumins.
Die SDS-PAGE von 31 % succinyliertem Legumin zeigt neben der Modifizierung der
schweren Untereinheiten vor allem den Massenzuwachs der α-Ketten von 36 bzw. 34 kDa
auf 37 bzw. 35 kDa. Bei 49 % Succinylierung betragen die Molekularmassen der α-Ketten
Ergebnisse 53
41 bzw. 37 kDa und eine dritte Bande entsprechend 36 kDa zeichnet sich ab. Zwischen
49 % und 80 % bewirkt die Succinylierung der Aminogruppen keine weiteren, mit dieser
Methode sichtbaren Veränderungen an den α- oder β-Ketten. Die 94 % N-succinylierte
Probe läßt im SDS-Gel nur noch jeweils eine Bande in Bereich der α-Ketten (41 kDa) und
der β-Ketten (24 kDa) erkennen.
Natives Ackerbohnen-Legumin sowie verschiedene Stufen succinylierter Präparate wur-
den mit Matrix-unterstützter Laser-Desorptions-Ionisations-Flugzeit-Massenspektrometrie
(MALDI-TOF MS) untersucht. Die Spektren des Legumins und seiner succinylierten Deri-
vate (ohne Abbildung) konnten gut ausgewertet werden, obwohl es bei großen Molekülen
(> 20 kDa) häufig Probleme mit der Auflösung (breite Peaks) gibt. Lediglich das Spekt-
rum der hochsuccinylierten Probe weist relativ breite Peaks auf. Nach erfolgter MALDI-
TOF MS wurden die Veränderungen der Massenzahlen m/z von vier Hauptpeaks vergli-
chen (Abbildung 20).
40.000
45.000
50.000
55.000
60.000
65.000
70.000
nativ 31% 49% 69% 98%
m/z
Peak 4
Peak 3
Peak 2
Peak 1
Abbildung 20: Vergleich der Massenzahlen m/z
der Hauptpeaks von Legumin und
succinylierten Derivaten nach
MALDI-TOF Massenspektrometrie
Die Molmassen der einzelnen Komponen-
ten nehmen mit zunehmender Modifizie-
rung zu. Sprunghaft erfolgt diese Zunah-
me beim Übergang von 69 % succinylier-
tem Protein zu 98 % N-Succinylierung.
Die Massenzahl von Peak 2 legt die Ver-
mutung nahe, daß es sich bei der entspre-
chenden Komponente um eine Legumin-
Untereinheit (Monomer) vom Typ B han-
delt; die Molmasse der Peak 3 zugrunde-
liegenden Komponente entspricht der der
Legumin-Untereinheit vom Typ A.
In Tabelle 2 werden die anhand ihrer Sequenz ([128], [56]) berechneten Molmassen der
Untereinheiten von nativem Legumin mit den Daten der MALDI-TOF MS verglichen.
Tabelle 2: Vergleich von, aus der Sequenz [128, 56] berechneten und mit MALDI-TOF MS ermit-
telten, Molmassen der Untereinheiten von nativem Legumin
A-Typ-Untereinheit B-Typ-Untereinheit
Berechnung aus Sequenz 54 798 g/mol 52 008 g/mol
MALDI-TOF MS 54 223 ± 32 g/mol 51 364 ± 56 g/mol
Ergebnisse 54
Die Ergebnisse der MALDI-TOF MS stimmen mit den anhand der Sequenzen berechneten
Molmassen gut überein. Die massenspektrometrisch bestimmten Werte sind etwas gerin-
ger, die Abweichung beträgt 1,0 bzw. 1,2 %.
Der Peak 1 des MALDI-TOF-Massenspektrums dürfte der leichten Untereinheit und Peak 4
der schweren Untereinheit vom B-Typ entsprechen. Die Untereinheiten vom A- und B-Typ
liegen im Leguminmolekül zu gleichen Anteilen vor [54]. Für die schwere B-Typ-
Untereinheit wurde mittels SDS-PAGE ein Anteil von 7 % am Gesamtprotein ermittelt,
wohingegen die leichte Untereinheit in so geringen Mengen vorliegt, daß sie bei der Be-
rechnung der mittleren Molekularmasse der Untereinheiten vernachlässigt werden kann.
In Tabelle 3 sind die mittels MALDI-TOF MS bestimmten Molmassen der verschiedenen
Legumin-Untereinheiten (entsprechend Peak 1-4) von unterschiedlich stark succinylierten
Präparaten zusammengestellt. Neben diesen vier Peaks weisen alle MALDI-TOF-Spektren
weitere Peaks geringerer Massenzahl auf, die nicht eindeutig zugeordnet werden können
und nicht näher betrachtet werden. Dabei könnte es sich um α- und β-Ketten handeln.
Tabelle 3: Molmassen [g/mol] von nativen und unterschiedlich stark succinylierten Legumin-
Untereinheiten ermittelt mit MALDI-TOF MS (Fehler < 0,3 %)
N-Succinylierung Leichte
Untereinheit B-Typ-
Untereinheit A-Typ-
Untereinheit Schwere B-Typ-
Untereinheit
nativ 40 758 51 364 54 223 61 568
31% 41 008 51 949 55 001 62 425
49% 41 234 52 509 55 429 63 075
69% 41 299 52 788 55 809 63 825
98% 45 500 57 000 60 000 69 500
Tabelle 4 gibt den Molmassenzuwachs der Legumin-Untereinheiten aufgrund der
schrittweisen Succinylierung von Amino- und Hydroxylgruppen wieder.
Tabelle 4: Molmassenzuwachs [g/mol] der Legumin-Untereinheiten bei zunehmender Succinylie-
rung entsprechend MALDI-TOF Massenspektrometrie
Succinylierung Berechneter*
Molmassen-
zuwachs pro
Untereinheit
Leichte
Untereinheit B-Typ-
Untereinheit A-Typ-
Untereinheit Schwere
B-Typ-
Untereinheit
31% 751 250 585 778 857
49% 1 124 476 1 145 1 206 1 507
69% 1 439 541 1 424 1 586 2 257
98% 6 532 4 742 5 636 5 777 7 932
* aus den experimentell ermittelten Blockierungsgraden der NH2-, OH-Gruppen sowie der AS-Analyse [50]
Ergebnisse 55
Für den Vergleich zwischen berechneten Untereinheiten-Massenzuwachswerten und den
aus den MALDI-TOF Massenspektren ermittelten Werten muß die Berechnung der mittle-
ren Molekularmasse der Untereinheiten unter Berücksichtigung der verkürzten bzw. ver-
längerten lysinreichen C-Termini der α-Ketten erfolgen. Die resultierenden Werte (694 für
31 %, 1199 für 49 %, 1558 für 69 % und 5862 für 98 % Succinylierung) befinden sich in
sehr guter Übereinstimmung mit den in Tabelle 4 beschriebenen Werten. Dementspre-
chend wurde für die mittlere Molmasse der hochsuccinylierten Untereinheit ein Wert von
59 000 g/mol ermittelt.
4.2 Untersuchungen zur Struktur acylierter Leguminproben
4.2.1 Veränderung der Hydrophobizität infolge Acylierung
Die N-/O-Acylierung durch hydrophobe Acetylgruppen oder hydrophile Succinylgruppen
sollte zu einer Veränderung der Hydrophobizität des Legumins führen. Für die Untersu-
chung der „effektiven“ Hydrophobizität („Oberflächenhydrophobizität“) wurden die Fluo-
reszenzsondentechnik nach NAKAI und Mitarbeitern [129, 130], die RP-HPLC und die
Verteilung in einem Polymer-Zweiphasensystem eingesetzt.
4.2.1.1 Oberflächenhydrophobizität acylierter Leguminproben
Bestimmung des S0-Wertes
Als Fluoreszenzsonde wurde 8-Anilino-1-naphtalinsulfonsäure (ANS) eingesetzt. In
Abbildung 21 ist die Abhängigkeit des S0-Wertes (ANS-Hydrophobizität) vom Ausmaß
der Acylierung für acetylierte und succinylierte Leguminproben unter Berücksichtigung
von N- und O-Blockierung dargestellt.
Wird der S0-Wert gegen den Grad der Aminogruppen-Blockierung aufgetragen, so ergibt
sich der in Abbildung 21a dargestellte Verlauf mit einer geringen Zunahme des S0-
Wertes bis etwa 60 % N-Acetylierung und einem starken Anstieg des S0-Wertes bei hö-
heren Acetylierungsgraden. Dieser Verlauf erklärt sich durch den zusätzlichen Beitrag der
O-Acetylierung, der bei Acetylierungsgraden ab 60 % relevant wird (s. Abbildung 14).
Im Falle der Succinylierung wird ein geringer, aber kontinuierlicher Anstieg des S0-Wertes
mit dem Grad der N-Acylierung festgestellt (Abbildung 21a). Bei einem Succinylie-
rungsgrad von > 95 % deutet sich eine Abnahme der Hydrophobizität an. Wird der S0-
Wert gegen die Gesamtzahl der pro Mol Legumin eingeführten, an die Amino- und Hydro-
xylgruppen gebundenen Acylreste aufgetragen, resultiert Abbildung 21b. Darin ist ein
kontinuierlicher Anstieg der Hydrophobizität der acetylierten Proben mit wachsender Zahl
eingeführter Acetylgruppen zu erkennen. Der S0-Wert nimmt durch das Einfügen von
Ergebnisse 56
Succinylgruppen zunächst leicht zu; die Hydrophobizität sinkt jedoch nach Einfügen von
etwa 370 Mol Succinylgruppen pro Mol Legumin und ist somit um ein Vielfaches geringer
als die Hydrophobizität von acetyliertem Legumin bei vergleichbarer Anzahl eingeführter
Acetylgruppen.
0
400
800
1200
1600
2000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Acylierung der Aminogruppen [%]
S0-Wert
Succinylierung
Acetylierung
a
0
400
800
1200
1600
2000
0 50 100 150 200 250 300 350 400 450
mol Acylgruppen / mol Legumin
S0-Wert
Succinylierung
Acetylierung
b
Abbildung 21: ANS-Hydrophobizität (S0-Werte) von acetyliertem und succinyliertem Legumin
a: S0-Wert in Abhängigkeit vom Grad der N-Acylierung
b: S0-Wert in Abhängigkeit von der Gesamtheit eingeführter N- und O-Acyl-
gruppen
Untersuchungen zur Bestimmung von Bindungskonstanten
Zur Bestimmung der Zahl der ANS-Bindungsstellen und der Bindungskonstanten für je
zwei acetylierte (37 %, 98 %) und succinylierte (32 %, 95 %) Proben wurde der COGAN-
Plot [111] benutzt. Die nach COGAN berechnete Zahl an hydrophoben Bindungsstellen ist
bei allen Proben stark von der Proteinkonzentration abhängig. In Tabelle 5 sind die Bin-
Ergebnisse 57
dungsstellen n und die berechneten Werte für die Dissoziationskonstante Kd des Protein-
ANS-Komplexes für eine Proteinkonzentration wiedergegeben.
Tabelle 5: Zahl der Bindungsstellen und berechnete Dissoziationskonstanten des Protein-ANS-
Komplexes nach COGAN-Plot [111] (Proteinkonzentration 1 g/l)
Anzahl Bindungsstellen
pro Molekül*
n
Dissoziationskonstante
Kd •106
natives Legumin 26,2 3,6
37 % Acetylierung 20,6 25,0
98 % Acetylierung 48,0 14,7
32 % Succinylierung 30,6 17,1
95 % Succinylierung 74,9 14,3
* Die Berechnung der Bindungsstellen n pro Molekül erfolgte unter Berücksichtigung des Mol-
massenzuwachses durch die eingeführten Acylgruppen
Danach nimmt die Zahl der Bindungsstellen bei höheren Modifizierungsgraden erwar-
tungsgemäß größere Werte an. Für die succinylierten Proben wurde eine größere Anzahl
von Bindungsstellen als für die in ähnlichem Maße acetylierten Leguminderivate ermittelt.
Diese Tendenz wurde auch bei anderen Proteinkonzentrationen festgestellt. Aus den hö-
heren Werten für die Dissoziationskonstanten sowohl nach Acetylierung als auch nach
Succinylierung folgt die allgemein deutlich schwächere Bindung des Liganden an die mo-
difizierten Proteine als an das native Legumin.
4.2.1.2 Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie acylierter Legumine
Die Ergebnisse der Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie (RP-HPLC) sind
in Abbildung 22 und Abbildung 23 dargestellt. Aufgrund der stark sauren Bedingungen
liegen die Proben in den untersuchten Lösungen in denaturierter Form vor. Nach den Er-
gebnissen dieser Methode verschieben sich die Peakpositionen der acetylierten Legumine
(Abbildung 22a) nach längeren Retentionszeiten entsprechend einer mit zunehmendem
Acetylierungsgrad (bis 80-85 %) steigenden Hydrophobizität. Bei Acetylierungsgraden
über 80 % tritt Peakverbreiterung durch mehrere schlecht voneinander getrennte Frakti-
onen auf. Eine kontinuierliche Verschiebung der Peaks nach längeren Retentionszeiten
mit steigendem Grad der Modifizierung wird auch bei den succinylierten Proben
(Abbildung 22b) beobachtet. Im Gegensatz zur Acetylierung erfolgt hierbei jedoch eine
Trennung der hochmodifzierten Proben in diskrete Fraktionen unterschiedlicher
Hydrophobizität. Abbildung 23 zeigt die Abhängigkeit der Retentionszeit der Hauptfrak-
tionen vom N-Blockierungsgrad. Die bei einer N-Acetylierung von > 84 % und einer N-
Ergebnisse 58
Succiny-lierung von > 90 % zu beobachtende Aufspaltung in mehrere Fraktionen mit
größeren Retentionszeiten kann auf den Beitrag der O-Acylierung zurückgeführt werden.
a b
15 20 25 30
Retentionszeit [min]
nativ
37% Ac.
58% Ac.
84% Ac.
90% Ac.
15 20 25 30
Retentionszeit [min]
nativ
33% Suc.
65% Suc.
95% Suc.
Abbildung 22: RP-HPLC unterschiedlich hoch acetylierter (a) und succinylierter (b) Leguminproben
an einer Nucleosil C4 MPN-Säule
21
22
23
24
25
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Acylierung der Aminogruppen [%]
Retentionszeit [min]
Succinylierung
Acetylierung
Abbildung 23: Verschiebung der Retentionszeit durch Acetylierung und Succinylierung von Legumin
bei der RP-HPLC (Nucleosil C4 MPN-Säule)
Ergebnisse 59
4.2.1.3 Verteilung von Leguminproben in einem Polymer-Zweiphasensystem
Für das Zweiphasensystem wurden Ficoll- und Dextranlösungen verwendet. Die hydro-
phobere Oberphase enthält angereichert Ficoll, die hydrophilere Unterphase angereichert
Dextran. Veränderungen der Verteilungskoeffizienten in diesem System in Richtung klei-
nerer Werte weisen dementsprechend auf eine abnehmende Hydrophobizität hin. Die für
einige unterschiedlich hoch succinylierte Proteine erhaltenen Werte sind in Tabelle 6
zusammengestellt. Darüber hinaus sind die aus den Verteilungskoeffizienten nach Glei-
chung 26 errechneten Werte für die freie Energie des Übergangs (∆G0transfer) der Proteine
von einer Phase in die andere (von Dextran nach Ficoll) angegeben.
∆G0transfer = - R T lnK Gleichung 26
Tabelle 6: Verteilungskoeffizienten (K) und freie Energie des Phasenübergangs ∆G0transfer von
nativem und succinyliertem Legumin im Zweiphasensystem:
Ficoll 400 (13,9 %) / Dextran T 70 (10,9 %) / CPS; 296 K
K ln K ∆ ln K ∆G0transfer [kJ/mol]
natives Legumin 10,10 ± 0,27 2,31 ± 0,03 0 - 5,76 ± 0,07
32 % succinyliertes Legumin 10,65 ± 0,10 2,37 ± 0,01 0,054 - 5,89 ± 0,02
33 % succinyliertes Legumin 10,04 ± 0,18 2,31 ± 0,02 -0,006 - 5,74 ± 0,05
65 % succinyliertes Legumin 7,23 ± 0,23 1,98 ± 0,03 -0,334 - 4,93 ± 0,07
95 % succinyliertes Legumin 4,04 ± 0,08 1,40 ± 0,02 -0,915 - 3,48 ± 0,05
Die K-Werte weisen auf ein praktisch unverändertes Verteilungsverhalten der Legu-
minproben nach schwacher Modifizierung (32-33 %) hin. Die bei höheren Substitutions-
graden (65 % und 95 %) abnehmenden Werte der Verteilungskoeffizienten sind Aus-
druck sinkender Hydrophobizität.
Versuche, acetylierte Leguminproben im vorliegenden System zu verteilen, scheiterten
an der thermodynamischen Unverträglichkeit der Proteine mit den Polymerkomponenten
des Zweiphasensystems, was zur Ausfällung der Proteine führte.
4.2.2 Dissoziation und Assoziation acylierter Leguminproben
Die Untersuchungen zur Dissoziation und Assoziation acylierter Leguminproben erfolgten
mittels Größenausschluß-Chromatographie (SE-HPLC), nativer Polyacrylamid-Gelelektro-
phorese im Gelgradienten (BN-PAGE) und analytischer Ultrazentrifugation.
Ergebnisse 60
4.2.2.1 Größenausschluß-Chromatographie acylierter Leguminproben
In Abbildung 24 sind die Elutionsdiagramme der SE-HPLC-Trennung für acetylierte (a)
und succinylierte (b) Leguminproben wiedergegeben.
a b
10 15 20 25
Retentionszeit [min]
nativ
37% Ac.
58% Ac.
80% Ac.
90% Ac.
10 15 20 25
Retentionszeit [min]
nativ
33% Suc.
65% Suc.
95% Suc.
Abbildung 24: SE-HPLC-Chromatogramme für acetylierte (a) und succinylierte (b) Leguminproben
an einer Bio Sep 4000-Säule
Für das unmodifizierte Legumin wurde nach Molekularmassenkalibrierung eine relative
Molekularmasse von Mr = 350 kDa, in guter Übereinstimmung mit dem Literaturwert
[49], bestimmt. Schrittweise Acetylierung der Aminogruppen auf 30-60 % führt zu einer
scheinbaren Vergrößerung der Molekularmasse der Hauptfraktion auf 380 kDa und zum
Auftreten einer Minorkomponente (Dissoziationsprodukt) mit Mr = 100 kDa. Bei N-
Acetylierungsgraden über 80 % ist der Leguminpeak nicht mehr nachweisbar. Statt des-
sen treten höhermolekulare Assoziationsprodukte neben niedermolekularen Dissoziati-
onsprodukten auf (Abbildung 24a). Erstere könnten mit relativen Molekularmassen von
900 bis 1300 kDa Tri- bis Tetrameren des Legumins entsprechen. Ihre Bildung läuft mit
der bei hohen Modifizierungsgraden eintretenden zusätzlichen Acetylierung der Hydro-
xylgruppen parallel (s. Abbildung 14) und dürfte die Folge der stärkeren Hydrophobie-
rung des Legumins sein (s. Abbildung 21). Die Zunahme der Dissoziationsprodukte
Ergebnisse 61
(scheinbare Molekularmasse Mr = 50-100 kDa) bei hohen Modifizierungsgraden (> 80 %)
läuft stets parallel mit dem Auftreten der hochmolekularen Assoziate, so daß deren Bil-
dung nach dem Schema
acetyliertes Legumin → dissoziierte Untereinheiten → Assoziat
nicht eindeutig belegt werden kann. Ebenso können Dissoziation und Assoziation als pa-
rallel laufende Prozesse angenommen werden.
Im Falle der succinylierten Proben erfolgt eine schrittweise Dissoziation des Legumins mit
zunehmendem Modifizierungsgrad ohne zusätzliche Assoziation (Abbildung 24b). Auch
hierbei kommt es zu einer scheinbaren Vergrößerung der Molekularmasse des Legumins
auf 380 kDa bei niedrigen und mittleren Modifizierungsgraden. Die für die Dissoziati-
onsprodukte bestimmten Mr-Werte liegen zwischen 115 und 170 kDa. Sie spiegeln die
Veränderung der Stokesschen Radien der stark expandierten dissoziierten Untereinheiten
und nicht die wahren Mr-Werte wider. Ähnlich sind die erhöhten Werte für den Legumin-
peak bei mäßig succinylierten und acetylierten Proben zu bewerten.
4.2.2.2 Analytische Ultrazentrifugation acylierter Leguminproben
Das native Protein enthält neben der 11 S-Hauptfraktion (s020,S = 12,0 ± 0,35) geringe
Anteile einer höhermolekularen 17 S-Komponente (s020,S = 17,8 ± 0,5 S) und einer
7 S-Komponente. Letztere besteht aus Vicilin und macht in den verwendeten Legu-
minpräparaten 2-5 % aus [132]. Die 17 S-Minorkomponente repräsentiert geringe Antei-
le aggregierten Legumins.
In Abbildung 25 sind die Sedimentationsgeschwindigkeitsdiagramme für natives Legu-
min und die abgestuft succinylierten Leguminproben schematisch dargestellt. Bereits
nach geringer Succinylierung der Aminogruppen ist eine dissoziierte Untereinheit als
3 S-Komponente nachzuweisen, deren Anteil sich mit zunehmender Modifizierung ver-
größert und bei extrem hoher Succinylierung (> 90 %) 100 % beträgt (s. Abbildung
40). Nach ca. 30 % Succinylierung nimmt auch der Anteil der 7 S-Komponente zu, die
bei 60-80 % Modifizierung ihren Maximalwert erreicht. Sie entspricht dem trimeren
Halbmolekül des hexameren 11 S-Proteins [131]. Der Anteil des hexameren 11 S-
Proteins nimmt mit steigender Succinylierung ab und ist ab einem N-Blockierungsgrad
von 80 % im Sedimentationsdiagramm nicht mehr nachweisbar. Die Ergebnisse der Se-
dimentationsanalyse der succinylierten Leguminproben sind in Abbildung 26 zusam-
mengefaßt dargestellt.
Ergebnisse 62
0
20
40
60
80
100
010 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Succinylierung der Aminogruppen [%]
Anteil der Fraktionen [%]
11 S 7 S 3 S
Abbildung 25: Schematische Darstellung der Se-
dimentationsdiagramme unter-
schiedlich succinylierter Legu-
minproben (cProt=10 g/l, 50 000
U/min)
a: nativ (28 min); b: 10% (40 min);
c: 32% (25 min); d: 49% (44 min);
e: 61% (47 min); f: 80% (73 min);
g: 95% (82 min)
Abbildung 26: Relativer Gehalt der oligomeren
Formen in succinylierten Legu-
minpräparaten als Funktion des
Succinylierungsgrades für 11 S-,
7 S- und 3 S-Fraktionen ent-
sprechend den Sedimentations-
geschwindigkeiteitsdaten
In Abbildung 27a-d sind die Schlierenoptik-Aufnahmen der Ultrazentrifugation von na-
tivem Legumin und acetylierten Leguminderivaten zusammengestellt. Im Gegensatz zur
Succinylierung ist die 11 S-Komponente bis zu einem hohen Modifizierungsgrad (83 %,
ohne Abbildung) stabil und wird kein 7 S-Produkt gefunden. Zudem erfolgt die Dissoziati-
on in die Untereinheiten (s020,S = 2,8 ± 0,34 S) erst bei höheren Modifizierungsgraden.
Die Schlierenoptik-Aufnahme einer 98 % N- und hochgradig O-acetylierten Leguminprobe
zeigt eine schnell laufende 17 S-Hauptkomponente und daneben die 3 S-Fraktion. Die
Auswertung der Flächen unter den Kurven ergab einen Anteil von 70 % 17 S-
Ergebnisse 63
Komponente und 30 % 3 S-Komponente. Die Abhängigkeit der Fraktionsanteile vom
Grad der Acetylierung ist Tabelle 7 zu entnehmen.
Sedimentationsrichtung → Sedimentationsrichtung →
7 S
17 S
11 S
a
11 S
3 S
17 S
b
11 S
17 S
3 S
c
17 S3 S
d
Abbildung 27: Sedimentationsgeschwindigkeitsdiagramme von nativem Legumin (a) sowie 37% (b),
58% (c) und 98% (d) acetyliertem Legumin
(a) 10,0 g/l; 40 000 U/min; 45 min; (b) 11,9 g/l; 40 000 U/min; 56 min
(c) 9,7 g/l; 40 000 U/min; 41 min; (d) 5,8 g/l; 30 000 U/min; 52 min
Tabelle 7: Relativer Gehalt der oligomeren Formen (17 S, 11 S und 3 S) in nativem Legumin und
acetylierten Präparaten entsprechend den Sedimentationsgeschwindigkeiteitsdaten
17 S 11 S 3 S
natives Legumin* 12 % 84 % -
37% N-acetyliert 16 % 75 % 9 %
58 % N-acetyliert 17 % 64 % 19 %
98 % N-acetyliert 70 % - 30 %
* Neben dem hexameren und aggregierten Anteil liegen etwa 4 % einer 7 S-Komponente vor
4.2.2.3 Native Gelelektrophorese acylierter Leguminproben
Abbildung 28 zeigt die BN-PAGE-Muster [110] der acetylierten und succinylierten Le-
guminproben.
Ergebnisse 64
a b
Aggregat
Legumin (11 S)
3 S-Untereinheit
7 S-Halbmolekül
1
2 3 4 5 6 7
8 9 10 1 2 3 4 5 6
7 8 9 10
Abbildung 28: BN-PAGE von acetylierten (a) und succinylierten (b) Leguminproben
1 = RSA (66 000 g/mol)
2 =
β
-Amylase (200 000 g/mol)
3 = Ovalbumin (45 000 g/mol) und Ferritin (450 000 g/mol)
a: 4 = nativ; 5 = 7 %; 6 = 37 %; 7 = 58 %; 8 = 77 %; 9 = 86 %; 10 = 98 %
b: 4 = nativ; 5 = 31 %; 6 = 49 %; 7 = 61 %; 8 = 68 %; 9 = 80 %; 10 = 95 %
Im unmodifizierten Protein tritt neben der Leguminbande („11 S-Fraktion“) das in allen
nativen 11 S-Proteinen vorhandene „15 S-Aggregat“ [132] als langsamer laufende Zone
auf. Dieses Aggregat ist im Falle des entsprechenden Sojaproteins (Glycinin) als Dimeres
der 11 S-Fraktion identifiziert worden [133].
Aus Abbildung 28a ist die Zunahme des Anteils einer hochaggregierten Fraktion bei
hoher Acetylierung als am Start liegende Bande ersichtlich. Die dem modifizierten Legu-
min (11 S-Fraktion) entsprechenden Banden sind bis zu einem Modifizierungsgrad von
ca. 60 % N-Acetylierung sichtbar. Ab etwa 30 % Modifizierung spalten sich zunehmend
Dissoziationsprodukte (entsprechend der „3 S-Fraktion“) ab, die auch in unmodifizierten
Proteinen in sehr geringen Mengen vorhanden sind. Ihr Anteil nimmt auf Kosten der
11 S-Banden mit steigendem Modifizierungsgrad zu.
Im Falle der Succinylierung (Abbildung 28b) stellen die dissoziierten Untereinheiten
bereits nach 30 % Modifizierung die Hauptfraktion dar. Entsprechend der mit zunehmen-
der Succinylierung steigenden Zahl gebundener Bernsteinsäurereste nimmt auch die rela-
tive Molekülmasse der Dissoziate zu und die Wanderungsgeschwindigkeit der Zonen ab.
Darüber hinaus entsteht bereits nach geringer Modifizierung (30 % N-Succinylierung)
eine Zwischenfraktion, die dem 7 S-Halbmolekül des Legumins [131] entsprechen dürfte.
Die Aggregat-Fraktion verschwindet nach der Succinylierung. Im Falle der 95 % succiny-
lierten Probe tritt jedoch eine am Start liegende Bande auf.
Ergebnisse 65
4.2.2.4 Isolierung und Charakterisierung der aggregierten Fraktion in hochacety-
liertem Legumin
Hochacetyliertes Legumin mit einem Modifizierungsgrad von ca. 90 % wurde an einer
Sepharose CL 4B-Säule in zwei Fraktionen, A und B, aufgetrennt. In Abbildung 29 ist
die chromatographische Trennung dargestellt.
Die Hauptfraktion A mit 70-80 % der Proteine (dabei sollte es sich entsprechend Kap.
4.2.2.2 um die 17 S-Komponente handeln) wies einen N-Acetylierungsgrad von 95-98 %
auf. Die niedermolekulare Nebenfraktion B (der 3 S-Komponente entsprechend), die
nicht frei von Fraktion A erhalten wurde, wies differierende Blockierungsgrade zwischen
50 und 90 % auf.
Von Fraktion A wurden folgende physikochemische Größen (in Standardphosphatpuffer)
bestimmt: Sedimentationskoeffizient, Grenzviskosität, Stokesscher Radius mittels Gelch-
romatographie, Molekularmasse mittels statischer Lichtstreuung.
Der Diffusionskoeffizient D wurde mit dem säulenschromatographisch ermittelten Sto-
kesschen Radius nach Gleichung 19 (S. 37) errechnet. Die Abschätzung des Stokesschen
Radius erfolgte an einer Sepharose CL 4B-Säule nach Kalibrierung mit Proteinen von be-
kanntem Stokesschen Radius [134], [135], [136] und ergab einen mittleren Wert von
Rs = 10,0 ± 0,7 nm für die frisch chromatographierte Fraktion A aus verschiedenen Prä-
parationen. Es resultiert der Wert D = (2,07 ± 0,14)·10-7 cm²/s.
In Abbildung 30 ist das Sedimentationsdiagramm von Fraktion A dargestellt. Aus der
Konzentrationsabhängigkeit der Sedimentationskoeffizienten der Komponente A wurde
ein Wert von s020,S = 16,82 ± 0,20 S ermittelt. Die Berechnung der Molekularmasse der
Fraktion A erfolgte nach der SVEDBERG-Gleichung (Gleichung 30, S. 78) [137]. Es ergibt
sich eine Molekularmasse von Ms,D = 692 ± 80 kDa für die aggregierte Fraktion A des ho-
chacetylierten Legumins.
Die Auftragung der reduzierten dynamischen Viskosität zeigte eine zu vernachlässigende
Konzentrationsabhängigkeit (Abbildung 31). Der aus der Grenzviskosität verschiedener
Präparationen ermittelte Wert beträgt [
η
] = 9,47 ± 0,65 cm3/g.
Eine Kombination von s und [
η
] zur Berechnung von M wurde von SCHACHMANN [138]
vorgeschlagen (Gleichung 27). Sie beruht auf einem Ansatz von SCHERAGA &
MANDELKERN [139] und gilt für Proteine, deren Molekülform nicht wesentlich von der
Kugelgestalt abweicht und bei Vorliegen eines prolaten oder oblaten Rotationsellipsoids
ein Achsenverhältnis von 5:1 nicht überschreitet. Dies kann aus dem Konzentrationsver-
lauf der reduzierten Viskosität als gegeben angenommen werden.
[ ]
2/3
2/12/3
,)v1(
][4690
ρ
η
η⋅−
⋅⋅
=s
Ms Gleichung 27
Ergebnisse 66
Der aus Gleichung 27 berechnete Wert für die acetylierte Leguminfraktion A beträgt
Ms,[η] = 655 ± 65 kDa. Die erhaltenen Molekularmassen belegen das Vorliegen eines di-
meren Aggregates im Falle des hochacetylierten Legumins.
Absorptionseinheiten
0 40 80 120 160 200 240 280 320 360 400
Elutionsvolumen [ml]
AbsorptionseinheitenAbsorptionseinheiten
Abbildung 29: Säulenchromatographische Trennung von hochacetyliertem Legumin an Sepharose
CL 4B
Sedimentationsrichtung →
17 S
Abbildung 30: Sedimentationsgeschwindigkeitsdiagramm von Fraktion A aus hochacetyliertem Le-
gumin (oben 6,0 g/l, unten 2,4 g/l; 30 000 U/min; 20 min)
Rechromatographie
Peak A
Rechromatographie
Peak B
acetyliertes
Legumin
A
B
Ergebnisse 67
Abbildung 31 gibt die Konzentrationsabhängigkeit der reduzierten Viskosität der Frakti-
on A nach siebentägiger Lagerung im Kühlraum (6-8 ° C) wieder. Daraus resultiert eine
Grenzviskosität von [
η
] = 14,89 cm3/g. Der negative Anstieg der Regressionsgeraden
weist auf eine zunehmende Kompaktheit der aggregierten Proteinmoleküle hin. Das ent-
sprechende Sedimentationsdiagramm ist in Abbildung 32 wiedergegeben.
Sedimentationsrichtung →
y = -0,5619x + 14,886
y = -0,0421x + 9,3571
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 2 4 6 8 10 12 14
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm 3/g]
frisch chromatographiert
7 Tage Lagerung (6-8°C)
27 S
Abbildung 31: Reduzierte Viskosität der Legumin-
fraktion A direkt nach Chroma-
tographie an Sepharose CL 4B und
nach 7tägiger Lagerung bei 6-8 ° C
Abbildung 32: Sedimentationsdiagramm von
Fraktion A nach 7tägiger Lage-
rung bei 6-8 ° C
(oben 8,0 g/l, unten 4,0 g/l;
30 000 U/min; 12 min)
Der Sedimentationskoeffizient beträgt s020,S = 27 ± 5 S. Der mittels dynamischer Licht-
streuung bestimmte Stokessche Radius beträgt Rs = 14,5 nm. Daraus resultiert für den
scheinbaren Diffusionskoeffizienten ein Wert von D = 1,43·10-7 cm²/s. Die Kombination
dieser Daten in Gleichung 27 und 30 ergibt Molekularmassen von
Ms,D = (1,61 ± 0,30)·106 Da bzw. Ms,[η] = (1,67 ± 0,32)·106 Da. Die Untersuchung mittels
statischer Lichtstreuung lieferte Werte zwischen 1,9·106 und 2,1·106 Da.
Aus diesen Ergebnissen kann geschlossen werden, daß die hochacetylierte Hauptfraktion
A des Legumins in Lösung von Standardphosphatpuffer zunächst als dimeres Assoziat
vorliegt. Bei Lagerung der Lösung erfolgt eine weitere Oligomerisierung über tetra- und
pentamere zu hexameren Legumin-Assoziaten. Obgleich die Aggregation schließlich zu
unlöslichen Produkten führte, konnten höhere Molmassen als 2,1·106 g/mol für die lösli-
chen Aggregate bisher nicht nachgewiesen werden. Es ist nicht auszuschließen, daß die
hexamere Form eine räumliche Anordnung der Legumin-Monomeren ähnlich derjenigen
der sechs Untereinheiten im Leguminmolekül [40] aufweist, die eine höchstmögliche
Kompaktheit der Assoziate gewährleisten.
Ergebnisse 68
4.2.3 Bestimmung hydrodynamischer Größen
Da sich bei der Entfaltung, Rückfaltung, Dissoziation und Assoziation von Proteinen ihre
hydrodynamischen Eigenschaften ändern, können Messungen von Viskosität, Dichte und
partiellem spezifischem Volumen, Lichtstreuung und Sedimentationsverhalten Auskunft
über den Faltungszustand bzw. die Konformation im jeweiligen Puffersystem geben.
4.2.3.1 Viskosität acylierter Leguminproben
Die Veränderung der Proteinkonformation in Standardphosphatpuffer nach unterschied-
lich hoher Acetylierung und Succinylierung wurde mit Hilfe der Kapillarviskosimetrie un-
tersucht.
In Abbildung 33 ist die Konzentrationsabhängigkeit der reduzierten Viskosität
η
sp /c von
succinylierten (a) und acetylierten (b) Leguminproben bei unterschiedlichen Modifizie-
rungsgraden wiedergegeben.
a b
0
5
10
15
20
25
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm 3/g]
nativ 31% 49% 76% 94% 99%
0
2
4
6
8
10
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm 3/g]
nativ 43% 52% 72% 97%
Abbildung 33: Bestimmung der Grenzviskositäten von Legumin unterschiedlichen Acylierungsgrades
in Standardphosphatpuffer
a: Legumin unterschiedlicher Succinylierungsgrade
b: Legumin unterschiedlicher Acetylierungsgrade
Die reduzierte Viskosität des nativen Legumins und seiner succinylierten Derivate ist bis
zu einem Modifizierungsgrad von 76 % praktisch konzentrationsunabhängig. Bei Modifi-
zierungsgraden über 90 % zeigt sich eine deutliche Konzentrationsabhängigkeit mit einer
Abnahme der reduzierten Viskosität bei niedrigen Konzentrationen.
Die Konzentrationsabhängigkeit der Viskosität
η
red der acetylierten Proben ist generell
durch einen negativen Anstieg der Regressionsgeraden gekennzeichnet.
Ergebnisse 69
In Abbildung 34 ist die Abhängigkeit der Legumin-Grenzviskositäten vom Grad ihrer
Aminogruppen-Acylierung dargestellt.
0
5
10
15
20
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Acylierung der Aminogruppen [%]
Grenzviskosität [cm3/g]
Succinylierung
Acetylierung
Abbildung 34: Abhängigkeit der Grenzviskosität vom N-Acylierungsgrad acetylierter und succinylier-
ter Leguminpräparate in Standardphosphatpuffer
Die Grenzviskosität der acetylierten Proben erreicht unter den gewählten Versuchsbedin-
gungen (I=0,5) bei Modifizierungsgraden zwischen 30 und 55 % ein schwaches Maxi-
mum, um nach Durchlaufen eines Minimums bei 70-80 % Modifizierung wieder anzustei-
gen. Die Grenzviskosität der vollacetylierten Proben erreicht Maximalwerte von
9,0 cm3/g.
Der Grenzviskositätsverlauf der succinylierten Leguminpräparate in Lösung der Standard-
ionenstärke ist durch einen langsamen Anstieg von [
η
] bis zu einem Modifizierungsgrad
von 50 % gekennzeichnet. Ein stärkerer Anstieg mit einem Maximum bei 65-70 % Modi-
fizierung und ein weiterer drastischer Anstieg der Grenzviskosität bei Succinylierungsgra-
den über 94 % kennzeichnen den weiteren Verlauf. Der letztgenannte Effekt kann als
Folge einer starken Expansion des dissoziierten Leguminmoleküls infolge der zusätzlichen
O-Succinylierung (s. Abbildung 14) interpretiert werden, während das Viskositätsmaxi-
mum bei 65-70 % Succinylierung auf vorangehende Konformationsänderung hinweist.
Die Grenzviskosität der vollsuccinylierten Probe beträgt 19,3 cm3/g.
Desweiteren wurde der Einfluß der Ionenstärke des Lösungsmittels auf natives Legumin
sowie Leguminproben unterschiedlichen Succinylierungsgrades untersucht.
Ergebnisse 70
Die Viskositätsmessung ausgewählter Proben erfolgte, außer im Standardpuffer bei Io-
nenstärke I=0,5, auch in Phosphatpuffer niedriger (I=0,1) und hoher (I=1,0) Ionenstär-
ke. Abbildung 35a, Abbildung 33a und Abbildung 35b zeigen die Konzentrationsab-
hängigkeit der reduzierten Viskositäten zunehmend succinylierter Leguminproben unter
den Bedingungen der drei unterschiedlichen Ionenstärken. In niedriger Ionenstärke zei-
gen die Regressionsgeraden der Proben mit Modifizierungsgraden ab ca. 50 % einen po-
sitiven Anstieg (mit Ausnahme der zu 80 % succinylierten Probe) und bei niedrigem Mo-
difizierungsgrad (bis ca. 30-40 %) sowie unmodifiziertem Protein einen negativen An-
stieg. Das Verhalten succinylierter Proben in Puffer der Standardionenstärke wurde be-
reits in Abbildung 33a beschrieben. In hoher Ionenstärke ist die reduzierte Viskosität
des nativen Legumins von der Proteinkonzentration unabhängig, die der hochsuccinylier-
ten (> 90 %) nimmt bei geringen Konzentrationen zu.
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm3/g]
nativ 31% 49% 80% 94% 99%
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm3/g]
Abbildung 35: Viskositäten von Ackerbohnen-Legumin unterschiedlichen Succinylierungsgrades in
Puffer der Ionenstärke I=0,1 (a) und I=1,0 (b); (für I=0,5 siehe Abbildung 33a)
Abbildung 36a-c verdeutlicht die veränderte Konzentrationsabhängigkeit der reduzier-
ten Viskositäten drei ausgewählter Proben (nativ, hoch und vollständig succinyliertes Le-
gumin) in Abhängigkeit von der Salzionenkonzentration des Lösungsmittels. Die deutli-
chen Unterschiede im Viskositätsverlauf der Proben bei unterschiedlicher Ionenstärke
belegen den starken Einfluß der Ionenstärke auf die Proteinstruktur. Im Falle des nativen
oligomeren Proteins zeigt sich der stabilisierende Effekt höherer (I=0,5) Ionenstärke.
Ergebnisse 71
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm3/g]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm3/g]
0
5
10
15
20
25
30
0 2 4 6 8 10 12 14 16
Proteinkonzentration [g/l]
Reduzierte Viskosität [cm3/g]
Abbildung 36: Konzentrationsabhängigkeit der
Viskositäten von nativem und
succinyliertem Legumin in Phos-
phatpuffern unterschiedlicher Io-
nenstärke:
(a) natives, (b) 94 % und (c) voll-
ständig (99 %) succinyliertes Le-
gumin
Die Grenzviskosität [
η
] des nativen Ackerbohnen-Legumins (Abbildung 36a) sinkt mit
steigender Ionenstärke und die Viskosität wird nahezu konzentrationsunabhängig. Die
weitere Erhöhung der Ionenstärke von I=0,5 auf I=1,0 bringt keine wesentlichen Verän-
derungen mit sich. Ähnliches gilt für die Grenzviskosität einer hochsuccinylierten (94 %)
Probe. Diese nimmt bei Erhöhung der Ionenstärke von I=0,1 auf I=0,5 deutlich ab und
bleibt bei weiterer Erhöhung nahezu unverändert. Bis zu einem Modifizierungsgrad von
94 % wird die negative Ladung der Succinylreste bei einer Ionenstärke von 0,5 abge-
schirmt. Es fällt jedoch auf, daß sich bei sehr hoher Ionenstärke (I=1,0) die Konzentrati-
onsabhängigkeit ändert: der Anstieg der Regressionsgeraden durch die Viskositätsmeß-
werte der Verdünnungsreihe wird negativ. Die Ionenstärkeabhängigkeit der Viskosität der
vollständig succinylierten Probe verhält sich ähnlich wie die der 94 % N-succinylierten
Probe. Die hochsuccinylierten Proben enthalten extrem viele negative Ladungen, wodurch
es zu großen elektrostatischen Effekten kommt. Das Lösungsmittel kann diese mehr oder
weniger abschirmen. Erst bei einer Modifizierung über 94 % der Aminogruppen, wenn
a
b
c
Ergebnisse 72
zusätzliche Succinylreste an die Hydroxylgruppen der Hydroxyaminosäuren gebunden
werden, ist eine höhere Ionenstärke zur Abschirmung der eingeführten Ladung erforder-
lich: die Grenzviskosität sinkt kontinuierlich mit der Erhöhung der Ionenstärke auf 1,0.
Molekulare Wechselwirkungen wie intermolekulare Attraktion oder Repulsion, die Bildung
von Doppelmolekülen oder hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen den Molekülen
haben Einfluß auf den Konzentrationsverlauf der Viskosität. Die nach HUGGINS [140]
benannte Konstante k‘, berechnet nach Gleichung 28, spiegelt diese Effekte wider.
η
red = [
η
] + k‘ • [
η
]2 • cProt Gleichung 28
Das Auftreten negativer HUGGINS-Konstanten im Puffer sehr hoher Ionenstärke (I=1,0)
kann demnach durch intermolekulare Abstoßung und/oder Veränderung der Molekülform
durch Expansion oder Entfaltung erklärt werden.
In Abbildung 37 ist die Änderung der Grenzviskosität mit zunehmendem Succinylie-
rungsgrad in den drei Puffersystemen dargestellt.
0
5
10
15
20
25
010 20 30 40 50 60 70 80 90 100
NH2-Succinylierung [%]
Grenzviskosität [cm 3/g]
I=0.1 I=0.5 I=1.0
Abbildung 37: Abhängigkeit der Legumin-Grenzviskosität von Succinylierungsgrad und Ionenstärke
In Lösung niedriger Ionenstärke (I=0,1) werden höhere Werte für die Grenzviskosität bei
gleichem Succinylierungsgrad entsprechend der geringeren Abschirmung elektrostati-
scher Effekte gemessen, was gleichzeitig den stabilisierenden Effekt der hohen Io-
nenstärke (Standardionenstärke) auf die Struktur der oligomeren Proteine belegt. Bis zu
einem Succinylierungsgrad von ca. 60 % ist der Grenzviskositätswert dabei kaum verän-
dert, um danach mit zunehmendem Modifizierungsgrad kontinuierlich anzusteigen. Das
vollständig succinylierte Legumin erreicht eine Grenzviskosität von 24,2 cm3/g. Die Erhö-
hung der Ionenstärke des Lösungsmittels von I=0,5 auf I=1,0 hat kaum Einfluß auf die
Ergebnisse 73
Grenzviskosität des nativen Legumins, sehr wohl aber auf die Grenzviskosität der voll-
ständig succinylierten Probe; diese sinkt von 19,3 auf 16,0 cm3/g.
Messung der Viskosität des Lösungsmittels
Die dynamische Viskosität
η
0 des Lösungsmittels bei der Temperatur T wird für die Be-
rechnung der Viskosität des Proteins im jeweiligen Lösungsmittel und für die Berechnung
der Stokesschen Radien aus den Diffusionskoeffizienten mit der STOKES-EINSTEIN-
Gleichung benötigt (siehe Kap. 4.2.3.4). Für die drei Phosphatpuffer unterschiedlicher
Ionenstärke wurden mittels Kapillarviskosimetrie folgende Werte bei einer Temperatur
von T = 293 K ermittelt:
0,025 M PB pH 8; I=0,1
ν
0 = 1,012 ± 0,002 mm2/s
0,05 M PB pH 8; I=0,5
ν
0 = 1,040 ± 0,002 mm2/s
0,05 M PB pH 8; I=1,0
ν
0 = 1,073 ± 0,002 mm2/s
Mit den aus der Dichtemessung erhaltenen Daten (siehe Kap. 4.2.3.2, Tabelle 8) konn-
ten folgende dynamische Viskositäten des Lösungsmittels berechnet werden. Die übliche
Einheit der dynamischen Viskosität sind Centipoise (cP). 1P = 10-1 kg m-1 s-1.
I=0,1 mit
ρ
0 = 1,003 g/cm3
η
0 = 1,015 ± 0,002 cP
I=0,5 mit
ρ
0 = 1,020 g/cm3
η
0 = 1,061 ± 0,002 cP
I=1,0 mit
ρ
0 = 1,040 g/cm3
η
0 = 1,116 ± 0,002 cP
4.2.3.2 Partielles spezifisches Volumen und Dichte acylierter Leguminproben
Dichtemessung
Die Präzisionsdichtemessung ist für die Umrechnung von kinematischen Viskositäten in
dynamische von Bedeutung. Auf diese Weise wurde die Dichte der drei Phosphatpuffer
unterschiedlicher Ionenstärke mit Korrelationskoeffizienten zwischen 0,9993 und 0,9999
ermittelt. Die Dichte des jeweiligen Lösungsmittels
ρ
0 wird für die Berechnung einiger
Parameter (z. B. Sedimentationskoeffizient, Molmasse) benötigt. Die Ergebnisse sind
Tabelle 8 zu entnehmen.
Ergebnisse der Bestimmung des partiellen spezifischen Volumens
Die Änderung des partiellen spezifischen Volumens ý von Legumin mit steigendem Acety-
lierungsgrad ist in Abbildung 38 und mit steigendem Succinylierungsgrad in Abbildung
39 dargestellt. Das partielle spezifische Volumen von Legumin in Standardphosphatpuffer
nimmt mit zunehmendem Acetylierungsgrad ab. Für das erschöpfend acetylierte Protein
Ergebnisse 74
wurde ein Wert von 0,701 cm3/g ermittelt, für das native Protein 0,728 cm3/g.
In der Reihe der succinylierten Proben (Standardpuffer) nimmt das partielle spezifische
Volumen des 65 % und besonders stark das des 99 % N-succinylierten Proteins ab. Diese
Werte sind mit denen der succinylierten 11 S-Proteine aus Sonnenblumensamen [141],
Erbsen [131] und succinylierter Aldolase [142] vergleichbar und weisen auf Veränderun-
gen der Proteinstruktur hin. Im Unterschied zu den acetylierten Leguminproben nimmt
das partielle spezifische Volumen der succinylierten Derivate im vergleichbaren Lösungs-
mittel jedoch nicht kontinuierlich ab. Ein maximales partielles spezifisches Volumen wur-
de bei 76 % Succinylierung ermittelt. Beim erschöpfend succinylierten Legumin fällt der
ý-Wert unabhängig vom Lösungsmittel jeweils deutlich unter den des nativen Legumins.
Abbildung 39 zeigt außerdem das partielle spezifische Volumen von nativem und hoch-
succinyliertem Legumin in sehr hoher (I=1,0) und niedrigerer (I=0,1) Ionenstärke. Mit
zunehmender Salzkonzentration verringert sich im allgemeinen das partielle spezifische
Volumen von Legumin und seinen succinylierten Derivaten. Der ermittelte Wert für nati-
ves Legumin in hoher Ionenstärke (I=1,0) unterscheidet sich lediglich im Bereich des
Fehlers der Bestimmungsmethode vom entsprechenden Wert in Standardpuffer (I=0,5).
Die niedrige Ionenstärke bedingt dagegen ein erhöhtes partielles spezifisches Volumen
von nativem Legumin. Die Meßwerte der erschöpfend succinylierten Probe stimmen in
den Puffern mit Ionenstärke I=0,5 und I=0,1 überein; in hoher Ionenstärke weist das
Protein ein deutlich geringeres spezifisches Volumen auf.
0,67
0,68
0,69
0,70
0,71
0,72
0,73
0,74
0,75
0 20 40 60 80 100
NH2-Acetylierung [%]
Part. spez. Volumen [cm3/g]
0,67
0,68
0,69
0,70
0,71
0,72
0,73
0,74
0,75
0 20 40 60 80 100
NH2-Succinylierung [%]
Part. spez. Volumen [cm3/g]
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 38: Änderung des partiellen spezifi-
sche Volumens von Legumin in
Standardpuffer durch zunehmen-
de Acetylierung
Abbildung 39: Partielles spezifisches Volumen
von Legumin in Abhängigkeit vom
Grad der Succinylierung und der
Ionenstärke des Lösungsmittels
In Tabelle 8 sind die Ergebnisse der Dichtemessung von nativem Legumin und einem
erschöpfend succinylierten Leguminpräparat in Phosphatpuffern unterschiedlicher Io-
nenstärke zusammengefaßt.
Ergebnisse 75
Tabelle 8: Ausgewählte Ergebnisse der Dichtemessung in Puffern unterschiedlicher Ionenstärke
ρ
0 [g/cm3] Korrelationskoeffizient R ý [cm3/g]
I=0,1 natives Legumin 1,0034 0,9999 0,738
99 % succinyliert 1,0034 0,9995 0,707
I=0,5 natives Legumin 1,0223 0,9993 0,725
99 % succinyliert 1,0197 0,9999 0,705
I=1,0 natives Legumin 1,0404 0,9995 0,724
99 % succinyliert 1,0400 0,9995 0,677
4.2.3.3 Sedimentationskoeffizienten von hochsuccinyliertem Legumin
Neben den Betrachtungen zum Einfluß von Acetylierung und Succinylierung auf das A-
ckerbohnen-Legumin (siehe Punkt 4.2.2.2) wurde der Einfluß der Ionenstärke des Lö-
sungsmittels auf die Sedimentationseigenschaften einer erschöpfend (99%) succinylier-
ten Probe untersucht.
Für das native Ackerbohnen-Legumin in Standardphosphatpuffer wurde ein Sedimentati-
onskoeffizient von s020,S = 12,0 ± 0,35 S [143] bestimmt. Bei 95 % N-succinyliertem Le-
gumin trat in der Ultrazentrifugationsanalyse (Schlierenoptik) ein einziger breiter Peak
auf, der als 3 S-Komponente identifiziert und dessen Sedimentationskoeffizient mit
s020,S = 2,61 ± 0,07 S bestimmt wurde. Abbildung 40 zeigt das entsprechende Sedimen-
tationsgeschwindigkeitsdiagramm.
Sedimentationsrichtung →
3 S
Abbildung 40: Sedimentationsdiagramm einer 95% N-succinylierten Leguminprobe in Standardpuffer
(9,3 g/l; 50 000 U/min; 83 min)
Ergebnisse 76
Dieses Ergebnis wurde durch die Sedimentationsanalyse des vollständig succinylierten
Legumins mittels Absorptionsoptik bestätigt, wonach in Standardpuffer der auf cProt = 0
extrapolierte Sedimentationskoeffizient s020,S = 2,68 S beträgt (Tabelle 9).
Die Form der aufgenommenen Sedimentationskurven, Absorption vs. ln(r) (als Beispiel
siehe Abbildung 6), läßt auf das Vorliegen einer einzigen Komponente schließen. Der
vor und nach dem Übergang lang auslaufende Kurvenverlauf sowie das relativ späte Er-
reichen des Nullwertes entspricht einem relativ breiten Schlierenpeak (vgl. Abbildung
40).
Abbildung 41 zeigt die Ergebnisse der Sedimentationsanalyse von hochsuccinyliertem
Legumin in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke. Aus der Geradengleichung
dieser Darstellung lassen sich einige charakteristische Parameter ablesen bzw. berech-
nen. Sie sind in Tabelle 9 zusammengefaßt.
0,025 M PB pH 8; I=0,1 0,05 M PB pH 8; I=0,5
y = 2,35E+14x + 3,94E+12
3,0E+12
3,5E+12
4,0E+12
4,5E+12
5,0E+12
00,001 0,002 0,003 0,004
c [g/ml]
1/sapp [s-1]
y = 6,62E+12x + 3,73E+12
3,0E+12
3,5E+12
4,0E+12
4,5E+12
5,0E+12
00,001 0,002 0,003 0,004
c [g/ml]
1/sapp [s-1]
0,05 M PB pH 8; I=1,0
y = 7,99E+13x + 3,57E+12
3,0E+12
3,5E+12
4,0E+12
4,5E+12
5,0E+12
00,001 0,002 0,003 0,004
c [g/ml]
1/sapp [s-1]
Abbildung 41: Konzentrationsabhängigkeit der
reziproken Sedimentationskoeffi-
zienten von hochsuccinyliertem
Legumin in Phosphatpuffern un-
terschiedlicher Ionenstärke
Ergebnisse 77
Im Standardpuffer (Abbildung 41b) ist keine Konzentrationsabhängigkeit des Sedimen-
tationskoeffizienten festzustellen. Im Plot sapp vs. cProt hat die Regressionsgerade einen
Anstieg von lediglich m = 0,0049. Zu anderen Abhängigkeiten kommt man bei der Unter-
suchung von hochsuccinyliertem Legumin in niedriger (Abbildung 41a) und hoher
(Abbildung 41c) Ionenstärke. Die größte Konzentrationsabhängigkeit tritt im Puffer
niedriger Ionenstärke auf. Der Anstieg im Plot sapp vs. cProt, als Maß für die Konzentrati-
onsabhängigkeit des Sedimentationskoeffizienten, ist mit m = 0,1225 deutlich größer.
Der Sedimentationskoeffizient der höchsten gemessenen Konzentration, cProt = 3 g/l, liegt
bei I=0,1 um immerhin 14 % niedriger als der entsprechende Extrapolationswert s0. Das
unterschiedlich stark von der Konzentration abhängige Sedimentationsverhalten des 3 S-
Proteins könnte an einer entsprechend der Ionenstärke des Lösungsmittels unterschied-
lich stark ausgeprägten Entfaltung liegen. Intermolekulare, vor allem elektrostatische
Wechselwirkungen dürften dabei die entscheidende Rolle spielen.
Tabelle 9: Ergebnisse der Ultrazentrifugationsanalyse von hochsuccinyliertem Legumin in Phos-
phatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
1/sapp = 1/s0 + ks/s0 * c
( y = n + m x ) I=0,1 I=0,5 I=1,0
ks/s0 2,348E+14 6,615E+12 7,999E+13
1/s0 3,939E+12 3,732E+12 3,566E+12
s020,S [S] 2,54 ± 0,08 2,68 ± 0,08 2,80 ± 0,08
s020,W [S] 2,61 ± 0,10 3,00 ± 0,10 3,42 ± 0,10
ks [ml/g] 59 1,8 22
Im Gegensatz zur Konzentrationsabhängigkeit ks des Sedimentationskoeffizienten ändert
sich der auf cProt = 0 extrapolierte Sedimentationskoeffizient s020,S in Abhängigkeit von der
Ionenstärke des Lösungsmittels nicht wesentlich. Nach der zum Vergleich zweckmäßigen
Normierung auf Wasser als Lösungsmittel verstärken sich die Differenzen. Der s020,W-Wert
steigt mit zunehmender Ionenstärke um etwa 0,3 S (Tabelle 9).
4.2.3.4 Diffusionskonstanten von hochsuccinyliertem Legumin
Die bei einer Temperatur von T = 293 K und einem Streuwinkel von Θ = 90 ° ermittelten
Diffusionskoeffizienten im jeweiligen Lösungsmittel, extrapoliert auf die Proteinkonzentra-
tion cProt = 0 (D020,S), sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Die auf Wasser als Lösungs-
Ergebnisse 78
mittel normierten Diffusionskoeffizienten D020,W wurden mit folgender Gleichung berech-
net:
W
S
SWDD
,20
,20
,20
0
,20
0
η
η
= Gleichung 29
Tabelle 10: Diffusionskoeffizienten* hochsuccinylierter Ackerbohnen-Legumine in Phosphatpuffern
unterschiedlicher Ionenstärke, bestimmt mit dynamischer Lichtstreuung bei T=293 K
* Fehler
±
0,05 • 10-7 [cm2/s]
I=0,1 I=0,5 I=1,0
D020,S [cm2/s] 4,04 • 10-7 3,80 • 10-7 3,65 • 10-7
D020,W [cm2/s] 4,09 • 10-7 4,02 • 10-7 4,07 • 10-7
Die D020,S-Werte des succinylierten Legumins nehmen mit zunehmender Salzkonzentrati-
on ab. Sie unterscheiden sich jedoch in Puffer der Ionenstärke I=0,5 und I=1,0 nicht
wesentlich. Im Puffer niedrigster Ionenstärke ist der Wert deutlich höher.
Der Diffusionskoeffizient nativen Legumins D020,W = (3,38 ± 0,05) • 10-7 cm2/s ist be-
stimmt worden [49]. Die für hochsuccinyliertes Legumin ermittelten und auf Wasser als
Lösungsmittel normierten Diffusionskoeffizienten unterscheiden sich nicht und liegen er-
wartungsgemäß höher als der Diffusionskoeffizient des nativen Proteins.
Mit den aus Sedimentationsgeschwindigkeitsanalyse (s020,S) und dynamischer Lichtstreu-
ung (D020,S) ermittelten hydrodynamischen Größen läßt sich die Molmasse der succinylier-
ten Legumine im jeweiligen Puffersystem berechnen. Dazu dient die SVEDBERG-
Gleichung:
)v1(0
,20
0
,20
0
,
ρ
−
=S
S
DsD
TRs
M Gleichung 30
R = universelle Gaskonstante
T = Meßtemperatur
ý = partielles spezifisches Volumen des Proteins
ρ
0 = Dichte des Lösungsmittels
Die jeweiligen Werte für ý und
ρ
0 sind Kapitel 4.2.3.2, Tabelle 8 zu entnehmen. Die aus
der Untersuchung der Lichtstreuung ermittelten hydrodynamischen Radien und die nach
SVEDBERG berechneten Molmassen für das hochsuccinylierte Legumin in Phosphatpuf-
fern unterschiedlicher Ionenstärke sind in Tabelle 11 zusammengestellt.
Ergebnisse 79
Für das hexamere native Leguminmolekül sind von PLIETZ et al. [49] die hydrodynami-
schen Größen Rs = 6,3 ± 0,2 nm und Ms,D = 350 000 ± 20 000 g/mol bestimmt worden.
Tabelle 11: Hydrodynamische Radien* und Molmassen** von hochsuccinyliertem Legumin in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke (* Fehler
±
3 % ** Fehler
±
7 %)
I=0,1 I=0,5 I=1,0
Rs [nm] 5,2 5,5 5,7
Ms,D [g/mol] 52 000 62 000 63 000
Die DLS-Messung zeigte, daß in den untersuchten Proteinlösungen, neben der Haupt-
komponente, jeweils sehr geringe Anteile einer zweiten Komponente (Minorkomponente)
vorlagen (bimodale Verteilung). Dabei dürfte es sich um Aggregate handeln (vgl. BN-
PAGE, Abbildung 28b-slot 10), deren Stokessche Radien etwa 8 nm betragen.
Die Molmassen von succinyliertem Legumin in I=0,5 und I=1,0 sind im Bereich des Meß-
fehlers identisch. Entsprechend dem verringerten Sedimentations- und gleichzeitig
erhöhten Diffusionskoeffizienten, ergibt sich für das Protein in Puffer niedrigster
Ionenstärke eine geringere Molmasse von 52 000 ± 4 000 g/mol.
4.2.4 Spektroskopische Untersuchungen
4.2.4.1 Fluoreszenzemissionsspektroskopie acylierter Leguminproben
Abbildung 42 gibt die Fluoreszenzemissionsspektren von nativem Legumin und succiny-
lierten Leguminproben in Standardpuffer wieder. Das Fluoreszenzspektrum des nativen
Proteins nach einer Anregung mit 280 nm (Tyrosin- und Tryptophan-Anregung) zeigt ein
Maximum bei 317 nm, was den dominierenden Einfluß der Tyrosin-Chromophoren belegt
[144, 145].
Das Fluoreszenzmaximum der unmodifizierten Leguminprobe nach Anregung bei 295 nm
(bevorzugte Tryptophan-Anregung) liegt bei 319 nm. Daneben ist eine Schulter im Be-
reich von 330 nm (Tryptophan-Bande) ausgebildet. Mit zunehmenden Succinylie-
rungsgrad bis zu 68 % Modifizierung nimmt die Fluoreszenzintensität ab, bei 80 % Succi-
nylierung steigt sie an, um bei 95 % Succinylierung wieder deutlich abzufallen. Der Bei-
trag der Tryptophan-Bande bei 330 nm bleibt bis zum höchsten (> 95 %) Modifizie-
rungsgrad ausgeprägt; ein Doppelmaximum (321 und 330 nm) deutet sich an. Die bei
95 % N-Succinylierung gemessene Rotverschiebung des Maximums beträgt 2 nm.
Ergebnisse 80
Exc 280 nm
0
1
2
3
4
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
nativ
31 %
49 %
68 %
80 %
95 %
Exc 295 nm
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
nativ
31 %
49 %
68 %
80 %
95 %
Abbildung 42: Fluoreszenzemissionsspektren von nativem Legumin und unterschiedlich hoch N-
succinylierten Leguminproben in Standardpuffer
Im Falle der acetylierten Proben (Abbildung 43) tritt bei 98 % N-Modifizierung eine Rot-
verschiebung des Fluoreszenzmaximums um etwa 10 nm ein. Sie entspricht Strukturver-
änderungen mit einem Übergang der aromatischen Chromophoren in eine stärker polare
Umgebung, wie sie beispielsweise für Denaturationsprozesse charakteristisch ist [145].
Die Fluoreszenzintensität erreicht Maximalwerte bei mittleren Modifizierungsgraden
(37-58 %) und zeigt die stärkste Abnahme bei Acetylierungsgraden über 90 %.
Exc 280 nm
0
1
2
3
4
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
nativ
14 %
37 %
58 %
77 %
98 %
Exc 295 nm
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
nativ
14 %
37 %
58 %
77 %
98 %
Abbildung 43: Fluoreszenzemissionsspektren von nativem Legumin und unterschiedlich hoch N-
acetylierten Leguminproben in Standardpuffer
Ergebnisse 81
Ionenstärkeabhängigkeit der Fluoreszenzemission von Legumin und acylierten Derivaten
Die Fluoreszenzemissionsspektren von nativem Ackerbohnen-Legumin in Phosphatpuffern
mit Ionenstärken zwischen I=0,1 und I=1,0 unterscheiden sich kaum (Abbildung 44).
0
1
2
3
4
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 44: Fluoreszenzemissionsspektren von nativem Legumin in Puffern unterschiedlicher
Ionenstärke nach Anregung bei 280 nm (links) und 295 nm (rechts)
In allen drei Puffersystemen wurden in den normierten Proteinlösungen nach Anregung
von Tyrosin und Tryptophan (280 nm) maximale relative Fluoreszenzen von 3,0 bei E-
missionswellenlängen zwischen 316 und 317 nm gemessen (starker Einfluß der Tyrosin-
Chromophoren). Mit einem Wert von 2,1 liegt der Wert der maximalen relativen Fluores-
zenz nach bevorzugter Anregung der Tryptophanreste (295 nm) erwartungsgemäß nied-
riger; die entsprechenden Emissionswellenlängen liegen jeweils zwischen 318 und
320 nm (s. Tabelle 12, S. 85).
In Abbildung 45 sind Fluoreszenzemissionsspektren einer 58 % N-acetylierten Legu-
minprobe dargestellt. Im Gegensatz zum nativen Legumin beeinflußt die Ionenstärke die
Konformation der teilweise acetylierten Probe deutlich. Die meßbare relative Fluoreszenz
nimmt im untersuchten Bereich, bei einer Anregungswellenlänge von 280 nm, mit stei-
gender Ionenstärke deutlich zu. Das Fluoreszenzmaximum verschiebt sich von 316 nm
bei I=0,1 und I=0,5 auf 319 nm bei I=1,0 bathochrom. Die Werte sind detailliert
Tabelle 12 (S. 85) zu entnehmen.
Ergebnisse 82
0
1
2
3
4
5
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 45: Fluoreszenzemissionsspektren von 58 % acetyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke nach Anregung bei 280 nm (links) und 295 nm (rechts)
Regt man dagegen nur die Tryptophanreste des 58 % N-acetylierten Leguminmoleküls
an, so fällt einerseits eine Fluoreszenzzunahme zwischen I=0,1 und I=0,5 auf, anderer-
seits der abweichende Verlauf des Spektrums in hoher Ionenstärke (I=1,0). Die Ausbil-
dung eines Doppelmaximums mit einer relativen Fluoreszenz von etwa 2,7 bei 321 nm
und 329 nm weist auf Veränderungen in der Umgebung des Tryptophans aufgrund von
Konformationsänderungen insbesondere im Lösungsmittel hoher Ionenstärke hin. Die
gleichzeitige Fluoreszenzzu- und UV-Absorptionsabnahme (Abbildung 55), kann als
Hinweis auf eine, durch die hohe Salzionenkonzentration forcierte, kompaktere Konfor-
mation des Moleküls interpretiert werden.
Abbildung 46 gibt die Fluoreszenzemissionsspektren einer 98 % N-acetylierten Legu-
minprobe wieder. Die relative Fluoreszenz der hochacetylierten Probe ist in allen drei Puf-
fersystemen relativ gering. Ähnlich der nur anteilig acetylierten Probe, nimmt auch bei
der vollständig modifizierten Probe die relative Fluoreszenz mit zunehmender Ionenstärke
zu (Tabelle 12). Nach Anregung des hochacetylierten Legumins im Standardpuffer
(I=0,5) mit einer Wellenlänge von 280 nm liegt das Fluoreszenzmaximum bei einer E-
missionswellenlänge von 325 nm und ist somit gegenüber dem Maximum in niedriger
Ionenstärke (I=0,1) hypsochrom verschoben. Im Puffer hoher Ionenstärke (I=1,0) kann
man, neben der Ausbildung eines zweiten Maximums bei 327 nm, eine weitere Verschie-
bung des Maximums zu etwas geringerer Wellenlänge beobachten. Das Tryptophan-
angeregte Fluoreszenzspektrum weist, ähnlich wie das Tyr/Trp-Spektrum, eine (etwas
kontinuierlichere) Fluoreszenzzunahme sowie eine Blauverschiebung des Spektrums mit
steigender Ionenstärke und die Herausbildung eines zweiten Maximums in hoher Io-
nenstärke auf.
Ergebnisse 83
0
1
2
3
4
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
1
2
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 46: Fluoreszenzemissionsspektren von 98 % acetyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke nach Anregung bei 280 nm (links) und 295 nm (rechts)
Weder die Erhöhung noch die Verringerung der Ionenstärke des Lösungsmittels, ausge-
hend von der Standardionenstärke, verhindert die stark ausgeprägte Rotverschiebung
des Fluoreszenzmaximums zwischen dem nativen und dem hochacetylierten Legumin um
8-14 nm.
Wie bereits gezeigt, nimmt die relative Fluoreszenz von (normierten) Proteinlösungen mit
fortschreitender Succinylierung im allgemeinen ab. Desweiteren wurde festgestellt, daß
die relative Fluoreszenz der acetylierten Proben mit zunehmender Ionenstärke des Puf-
fers steigt. Auch bei einer 64 % N-succinylierten Probe wurde die höchste relative Fluo-
reszenz bei Ionenstärke I=1,0 gemessen (Abbildung 47). Allerdings gibt es keine we-
sentlichen Änderungen der Fluoreszenzintensität zwischen Standard- und niedriger Io-
nenstärke (Tabelle 12). Diese Aussage gilt sowohl für die Fluoreszenzemissionsspektren
nach Tyrosin- und Tryptophan-Anregung als auch für die Spektren nach bevorzugter An-
regung des Tryptophan.
Die Fluoreszenzemissionsspektren einer vollsuccinylierten Leguminprobe sind Abbildung
48 zu entnehmen. Auf die Exponierung der Aromaten einer so hoch modifizierten Probe
hat die Ionenstärke des Puffers offensichtlich nur geringen Einfluß. Die Fluoreszenzspekt-
ren nach Anregung mit 280 nm unterscheiden sich bezüglich der Fluoreszenzintensität
und der Lage des Fluoreszenzmaximums kaum (Tabelle 12). Auffällig ist das Spektrum
in Standardpuffer nach Tryptophan-Anregung. Neben dem typischen Maximum bei
321 nm tritt ein zweites Maximum bei einer Emissionswellenlänge von 329 nm (Trp-
Bande) auf (vgl. auch das Spektrum der 95 % succinylierten Probe in Abbildung 42).
Ergebnisse 84
0
1
2
3
4
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 47: Fluoreszenzemissionsspektren von 64 % succinyliertem Legumin in Puffern unter-
schiedlicher Ionenstärke nach Anregung bei 280 nm (links) und 295 nm (rechts
0
1
2
3
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
1
2
300 320 340 360 380 400
Wellenlänge [nm]
RF
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 48: Fluoreszenzemissionsspektren von 99 % succinyliertem Legumin in Puffern unter-
schiedlicher Ionenstärke nach Anregung bei 280 nm (links) und 295 nm (rechts)
Eine mit 1-3 nm relativ geringfügige Rotverschiebung des Fluoreszenzmaximums zwi-
schen nativem und hochsuccinyliertem Legumin ist unabhängig von der Ionenstärke des
Puffers und der Anregungswellenlänge festzustellen.
Ergebnisse 85
Tabelle 12: Lage vom und relative Fluoreszenz (RF) am Fluoreszenzmaximum nativer und
acylierter Leguminpräparate in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
280 nm 295 nm
RFmax Lage von RFmax [nm] RFmax Lage von RFmax [nm]
nativ I=0,1 3,0 316 2,1 318
nativ I=0,5 3,1 316 2,1 319
nativ I=1,0 3,0 317 2,2 320
58% ac I=0,1 2,7 316 2,3 319
58% ac I=0,5 3,4 316 2,6 319
58% ac I=1,0 4,0 319 2,7 321 / 329
98% ac I=0,1 2,0 328 1,2 333
98% ac I=0,5 2,3 325 1,5 329
98% ac I=1,0 3,4 324 / 327 1,8 321 / 331
64% suc I=0,1 2,5 318 1,7 322
64% suc I=0,5 2,6 317 1,8 322
64% suc I=1,0 3,4 317 2,1 320
99% suc I=0,1 2,1 317 1,7 321
99% suc I=0,5 2,3 318 1,6 321 / 329
99% suc I=1,0 2,3 317
1,7 321
4.2.4.2 UV-Absorptionsspektroskopie acylierter Leguminproben
Die zweiten Ableitungsspektren der UV-Spektren von succinylierten und acetylierten Le-
guminproben sowie nativem Legumin sind in Abbildung 49 und Abbildung 50, die ent-
sprechenden Differenzableitungsspektren in Abbildung 51 und Abbildung 52 darge-
stellt. Die Banden der Ableitungsspektren 2. Ordnung lassen eine Blauverschiebung so-
wohl der succinylierten als auch der acetylierten Proteinproben insbesondere im Tyrosin-
bereich (275-290 nm) erkennen. Im Falle der succinylierten Proben erfolgt diese relativ
kontinuierlich mit steigendem Modifizierungsgrad. Im Falle der acetylierten Proben ist
besonders der Übergang von 77 % zu 98 % Modifizierung als deutliche spektrale Verän-
derung über den gesamten untersuchten Wellenlängenbereich zu beobachten.
Die Differenzableitungsspektren weisen deutliche Veränderungen sowohl im Bereich der
Tryptophan-Banden (> 290 nm) als auch der Tyrosin-Banden (275-290 nm) und der
Phenylalanin-Banden (< 275 nm) auf, welche die Beteiligung aller aromatischen Chro-
mophoren an der Konformationsänderung der succinylierten und acetylierten Legu-
minproben belegen. Die Differenzableitungsspektren verdeutlichen erneut einen Unter-
Ergebnisse 86
schied zwischen Acetylierung und Succinylierung: Die spektroskopischen Eigenschaften
ändern sich mit schrittweiser Succinylierung relativ kontinuierlich, die der acetylierten
Proben sind durch sprunghafte Veränderungen zwischen 77 % und 98 % gekennzeichnet.
Succinylierung
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
nativ
31%
49%
68%
80%
95%
Acetylierung
-0,15
-0,1
-0,05
0
0,05
0,1
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
nativ
7%
37%
58%
77%
98%
Abbildung 49: UV-Ableitungsspektrum (2.Ordn.)
succinylierter Leguminproben in
Standardpuffer
Abbildung 50: UV-Ableitungsspektrum (2.Ordn.)
acetylierter Leguminproben in
Standardpuffer
Succinylierung
-0,06
0
0,06
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2 A/d 2
31%
49%
68%
80%
95%
Acetylierung
-0,06
0
0,06
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2 A/d 2
7%
37%
58%
77%
98%
Abbildung 51: UV-Differenzableitungsspektren:
Succinylierte Derivate minus nati-
ves Legumin
Abbildung 52: UV-Differenzableitungsspektren:
Acetylierte Derivate minus natives
Legumin
Ergebnisse 87
Nach RAGONE et al. [146] wurde das Verhältnis der Peak-zu-Peak-Abstände zwischen
dem Maximum bei 288 nm und dem Minimum bei 285 nm einerseits (Strecke a) und dem
Maximum bei 295 nm und dem Minimum bei 291 nm andererseits (Strecke b) als Maß für
das Verhältnis der Tyrosin-Exponierung zur Tryptophan-Exponierung bestimmt
(Abbildung 53).
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
0 20 40 60 80 100
Acylierung der Aminogruppen [%]
Streckenverhältnis a/b
Succinylierung
Acetylierung
Abbildung 53: Veränderung der Tyrosin-/Tryptophan-Exponierung (Streckenverhältnis a/b aus den
UV-Ableitungsspektren 2. Ordnung [146]) in Abhängigkeit vom Grad der Acylierung
von Leguminpräparaten in Standardpuffer
Für das native Legumin ergibt sich ein Wert von a/b = 1,51. Mit fortschreitender Succiny-
lierung bis 68 % steigt er auf 1,98 an. Der a/b-Quotient fällt bei weiterer Modifizierung
(80 % Succinylierung) wieder ab, um nach 95 % Modifizierung den Höchstwert von 2,02
zu erreichen. Dies entspricht den Ergebnissen der Viskosimetrie und Fluoreszenzspektro-
skopie, aus denen im Bereich von 70-80 % N-Succinylierung das Vorliegen einer speziel-
len Konformation abgeleitet werden kann. Der Verlauf der Tyrosin-Exponierung der
acetylierten Proben ist durch ein Maximum bei 77 % Aminogruppen-Modifizierung
gekennzeichnet (a/b = 1,60). Erschöpfende Acetylierung (98 %) ergibt mit a/b = 1,35
den niedrigsten Wert.
Ionenstärkeabhängigkeit der UV-Absorption von Legumin und acylierten Derivaten
Die UV-Absorptionsspektren des nativen Legumins in Phosphatpuffern unterschiedlicher
Ionenstärke sind in Abbildung 54 dargestellt. Desweiteren gibt sie die daraus berechne-
ten Ableitungsspektren 2. Ordnung wieder.
Ergebnisse 88
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
240 260 280 300 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0,63
0,65
0,67
275 280
-0,12
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/dλ2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 54: UV-Absorptionsspektrum (links) und Ableitungsspektrum 2.Ordnung (rechts) von nati-
vem Legumin in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Die UV-Absorption des nativen Legumins ändert sich durch Variation der Lösungsmittel-
Ionenstärke von I=0,1 bis I=1,0 kaum. Es gibt weder eine Verschiebung der Banden
noch nennenswerte Unterschiede hinsichtlich der UV-Absorption. Das UV-Absorptions-
maximum liegt bei einer Wellenlänge von 278,5 nm.
Die UV-Absorptionsspektren von 58 % und 98 % acetyliertem Legumin in Phosphatpuf-
fern unterschiedlicher Ionenstärke sind in Abbildung 55 dargestellt. Die maximale UV-
Absorption der 58 % acetylierten Probe nimmt bei hoher Ionenstärke (I=1,0) geringfügig
ab. Das Absorptionsmaximum liegt unabhängig vom Puffer bei 277,5 nm. Die sehr brei-
ten UV-Absorptionsspektren der hochacetylierten Probe zeigen leichte Absorptionszu-
nahme bei Erhöhung der Ionenstärke von I=0,1 auf I=0,5 und bei weiterer Erhöhung auf
I=1,0 eine Absorptionsabnahme von A1cm[278 nm] = 0,64 auf 0,59.
In Abbildung 56 sind die entsprechenden Ableitungsspektren 2. Ordnung und in
Abbildung 57 die Differenzableitungsspektren dargestellt. Die zweite Ableitung der UV-
Absorptionsspektren (Abbildung 56) zeigt, daß es Veränderungen in der Umgebung der
Chromophoren der 58 % acetylierten Probe in Abhängigkeit von der Ionenstärke gibt. Die
UV-Banden dieses modifizierten Legumins sind in niedriger Ionenstärke blauverschoben.
Besonders deutliche, auf Tyrosinreste zurückzuführende Veränderungen sieht man im
Wellenlängenbereich 273-283 nm. Der Einfluß der niedrigen Ionenstärke auf die Konfor-
mation der 58 % acetylierten Probe wird auch durch die spektralen Veränderungen im
Differenzableitungsspektrum (Abbildung 57) deutlich. Die Ableitungsspektren und Diffe-
renzableitungsspektren des vollacetylierten Legumins sind im Gegensatz dazu nahezu
Ergebnisse 89
identisch, was bedeutet, daß die Änderung der Ionenstärke nicht zu UV-spektroskopisch
meßbaren Änderungen der Konformation führt.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
240 260 280 300 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
240 260 280 300 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 55: UV-Absorptionsspektren von 58% (links) und 98% (rechts) acetyliertem Legumin in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
-0,12
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/dλ2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-0,12
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/dλ2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 56: UV-Ableitungsspektren 2.Ordnung von 58% (links) und 98% (rechts) acetyliertem
Legumin in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Der Einfluß der Ionenstärke auf das Verhältnis der Peak-zu-Peak-Abstände im Ablei-
tungsspektrum 2. Ordnung nach RAGONE et al. [146], als Maß für die Tyro-
sin/Tryptophan-Exponierung, wurde berechnet. Die Werte sind Tabelle 13 (S. 92) zu
entnehmen. Die Abhängigkeit der a/b-Streckenverhältnisse von der Ionenstärke ist bei
nativem und acetyliertem Legumin ist nicht signifikant. Die hochmodifizierte Probe weist,
Ergebnisse 90
im Gegensatz zum nativen Legumin, in niedriger Ionenstärke den Maximalwert der Tyro-
sin-Exponierung auf. Die Tyrosin-Exponierung der 58 % N-acetylierten Probe ist durch
ein Minimum bei Standardionenstärke I=0,5 gekennzeichnet.
-0,06
0
0,06
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-0,06
0
0,06
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 57: Differenzableitungsspektren von 58% (links) und 98% (rechts) acetyliertem Legumin in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Die UV-Absorptionsspektren von 64 % und 99 % succinyliertem Legumin in Phosphatpuf-
fern unterschiedlicher Ionenstärke sind in Abbildung 58 dargestellt.
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
240 260 280 300 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
I=0,1
I=0,5
I=1,0
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
240 260 280 300 320
Wellenlänge [nm]
Absorption
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 58: UV-Absorptionsspektren von 64% (links) und 99% (rechts) succinyliertem Legumin in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Beide succinylierte Leguminproben absorbieren bei hoher Ionenstärke (I=1,0) am stärks-
ten und bei Standardionenstärke (I=0,5) am schwächsten.
Ergebnisse 91
Die Ableitungsspektren 2. Ordnung und die Differenzableitungsspektren succinylierter
Leguminderivate sind Abbildung 59 und Abbildung 60 zu entnehmen.
-0,12
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/dλ2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-0,12
-0,08
-0,04
0
0,04
0,08
270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/dλ2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 59: UV-Ableitungsspektren 2.Ordnung von 64% (links) und 99% (rechts) succinyliertem
Legumin in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Im Falle der 64 % succinylierten Probe bewirkt der Puffer niedriger Ionenstärke (I=0,1),
insbesondere zwischen 278 nm und 289 nm, eine Blauverschiebung der UV-Banden um
0,5 nm gegenüber Standard- und hoher Ionenstärke. Der nach RAGONE et al. [146] er-
mittelte a/b-Quotient (s. Tabelle 13) für 64 % succinyliertes Legumin in Puffer der Io-
nenstärke I=0,1 ist deutlich größer als in den beiden Puffern höherer Ionenstärke. Das
deutet auf ein zugunsten des Tyrosins verschobenes Verhältnis der Tyr/Trp-Exponierung
hin. Auch das Differenzableitungsspektrum verdeutlicht, daß die Unterschiede zwischen
64 % succinylierter und nativer Probe im Puffer der Ionenstärke I=0,1 am gravierends-
ten sind.
Ebenso wie die Ableitungsspektren 2. Ordnung der 64 % succinylierten Probe sind die
Ableitungsspektren des hochsuccinylierten Legumins durch eine geringfügige (1 nm) Rot-
verschiebung der UV-Banden mit steigender Ionenstärke gekennzeichnet. Die Exponie-
rung von Tyrosin und Tryptophan erfolgt in allen drei Puffern in annähernd gleicher Weise
(s. a/b-Quotienten in Tabelle 13). Auch die Differenzableitungsspektren aus hochsucci-
nyliertem und nativem Legumin weisen nur sehr geringe Unterschiede auf.
Abschließend wird darauf hingewiesen, daß ausgehend vom Standardphosphatpuffer we-
der die Erhöhung noch die Verringerung der Ionenstärke die durch die Acylierung beding-
te leichte Blauverschiebung der UV-Banden verhindert.
Ergebnisse 92
-0,05
0
0,05
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-0,08
0
0,08
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
d2A/d 2
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 60: Differenzableitungsspektren von 64% (links) und 99% (rechts) succinyliertem Legumin
in Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
Tabelle 13: Streckenverhältnis a/b berechnet aus den UV-Ableitungsspektren 2. Ordnung nach
RAGONE et al. [146]
nativ 58% ac 98% ac 64% suc 94% suc 99% suc
I=0,1 1,44 1,65 1,47 2,06 2,12 2,24
I=0,5 1,52 1,57 1,43 1,79 2,12 2,17
I=1,0 1,55 1,63 1,41 1,77 2,06 2,22
4.2.4.3 Circulardichroitische Spektrometrie acylierter Leguminproben
Circulardichroitsche Untersuchungen acetylierter Legumine erfolgten in Standardphos-
phatpuffer (I=0,5). Abbildung 61 und Abbildung 62 zeigen die entsprechenden Spekt-
ren im fernen und nahen UV. Im CD-Spektrum des nativen Legumins im fernen UV deu-
tet sich ein Doppelminimum bei 209 und 216 nm an, welches auf das Vorhandensein ei-
nes gewissen Anteils helikaler Strukturen hinweist. Die im fernen UV aufgenommenen
CD-Spektren zeigen, daß bereits bei 58 % Acetylierung Änderungen in der Sekundär-
struktur stattgefunden haben (Blauverschiebung des Minimums von 209 zu 206 nm). Die
Spektren von 58 % und 98 % acetyliertem Legumin ähneln sich sehr und lassen dement-
sprechend ähnliche Sekundärstrukturen vermuten. Berechnungen von Strukturanteilen
sind in Tabelle 14 und Abbildung 69 (S. 97) zusammengefaßt.
Ergebnisse 93
-8.000
0
8.000
190 200 210 220 230 240 250 260
Wellenlänge [nm]
[deg*cm2/dmol]
nativ
58%
98%
-110
0
110
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
nativ
58%
98%
Abbildung 61: CD-Spektren von nativem und
acetyliertem Legumin im fernen
UV und Standardpuffer
Abbildung 62: CD-Spektren von nativem und
acetyliertem Legumin im nahen
UV und Standardpuffer
Das CD-Spektrum des nativen Legumins im nahen UV weist ein Maximum bei 284 nm
und ein Maximum bei 291 nm entsprechend den Tyrosin- und Tryptophan-Chromophoren
auf. Die Acetylierung führt nicht zur Verschiebung der Maxima zwischen 280 und
300 nm. Im nahen UV nimmt die molare Elliptizität, besonders im Bereich des Tryp-
tophans (Wellenlängenbereich 288-295 nm [147]) durch Acetylierung stufenweise ab.
Das CD-Spektrum der vollständig acetylierten Probe zeigt außerdem Veränderungen im
Bereich des Tyrosins (270-280 nm [147]) und eine Zunahme der Elliptizitäten bei Wellen-
längen unter 270 nm.
Abbildung 63 und Abbildung 64 stellen die CD-Spektren succinylierter Legumine sowie
die des nativen Legumins im fernen und nahen UV-Bereich dar.
-8.000
0
8.000
190 200 210 220 230 240 250 260
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
nativ
64%
95%
-110
0
110
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
nativ
64%
95%
Abbildung 63: CD-Spektren von nativem und
succinyliertem Legumin im fernen
UV und Standardpuffer
Abbildung 64: CD-Spektren von nativem und
succinyliertem Legumin im nahen
UV und Standardpuffer
Ergebnisse 94
Mit zunehmender Succinylierung verändert sich das CD-Spektrum im fernen UV. Die Än-
derung der Sekundärstruktur zeigt sich besonders bei den für helikale Strukturanteile
typischen zwei Minima. Die Blauverschiebung der 216/209 nm-Doppelbande bis zu einer
Wellenlänge von 205 nm (hochsuccinylierte Probe) weist auf Denaturationseffekte infolge
Succinylierung hin. Auch das Maximum verschiebt sich aufgrund der Succinylierung von
64 % der Aminogruppen um 3 nm hypsochrom; das CD-Spektrum der vollständig succi-
nylierten Probe bleibt bis ≤ 190 nm ohne Maximum. Differenzierte Aussagen zur Berech-
nung der Sekundärstrukturanteile aus den Fern-UV-CD-Spektren sind Tabelle 14 und
Abbildung 69 zu entnehmen.
Die CD-Spektren im nahen UV (Abbildung 64) zeigen nach Einführung von Succi-
nylgruppen deutliche Veränderungen sowohl im Bereich der Tryptophan- als auch der
Tyrosin-Absorptionsbanden (291 nm und 284 nm). Der Verlauf der CD-Spektren von
64 % und 95 % succinylierten Leguminproben ähnelt sich, aber die Elliptizität nimmt mit
zunehmender Succinylierung des Proteins ab.
Ionenstärkeabhängigkeit des CD von nativem und succinyliertem Legumin
Unmodifiziertes, sowie teilweise succinyliertes und hochsuccinyliertes Legumin wurden in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke untersucht. In Abbildung 65 und
Abbildung 66 sind die CD-Spektren succinylierter Proben im fernen UV-Bereich, in
Abbildung 67 und Abbildung 68 die CD-Spektren im nahen UV dargestellt. Der Puffer
hoher Ionenstärke (I=1,0) ist für die Aufnahme von CD-Spektren im fernen UV relativ
ungeeignet, weil die hohe Ionendichte die Aufnahme des Spektrums unterhalb 195 nm
(hochmodifizierte Probe) bzw. 192 nm verhindert.
-14.000
-7.000
0
7.000
190 200 210 220 230 240 250 260
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-14.000
-7.000
0
7.000
190 200 210 220 230 240 250 260
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 65: Fern-UV-CD-Spektren von 64 %
succinyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke
Abbildung 66: Fern-UV-CD-Spektren von 99 %
succinyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke
Ergebnisse 95
Die CD-Spektren von nativem Legumin in den Phosphatpuffern unterschiedlicher Io-
nenstärke verlaufen im fernen UV-Bereich quasi identisch und sind daher nicht abgebildet
(zum Vergleich siehe natives Legumin in Standardpuffer in Abbildung 63).
Abbildung 65 zeigt deutlich, daß die gemessenen Elliptizitäten (Maximum und Mini-
mum) 64 % succinylierter Ackerbohnen-Legumine im fernen UV mit steigender Salzio-
nenkonzentration zunehmen. Das Minimum verschiebt sich in niedriger Ionenstärke um
3 nm zu einer Wellenlänge von 204 nm (Blauverschiebung). Auch bei 99 % Succinylie-
rung hängt die Sekundärstruktur stark von der Ionenstärke des Lösungsmittels ab
(Abbildung 66). Zu besonders deutlichen Veränderungen der Sekundärstruktur dieser
Probe kommt es in Puffer niedriger Ionenstärke. Mit dem Minimum der Elliptizität bei ei-
ner Wellenlänge von nur 199 nm entspricht das CD-Spektrum der für ungeordnete Kon-
formation bekannten Kurvenform.
Zur Ionenstärkeabhängigkeit der berechneten Sekundärstrukturanteile siehe Tabelle 15.
Im nahen UV weisen die CD-Spektren der nativen und der teilweise succinylierten Probe
in den Puffern mit I=0,1 und I=0,5 zwei Maxima auf: bei 291 nm (Trp) und 284 nm (Tyr,
Trp). Der Nah-UV-CD des nativen Legumins ist in den drei untersuchten Phosphatpuffer-
systemen quasi identisch und daher nicht abgebildet (zum Vergleich siehe natives Legu-
min in Standardpuffer in Abbildung 64).
-50
0
50
100
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
I=0,1
I=0,5
I=1,0
-50
0
50
100
250 260 270 280 290 300
Wellenlänge [nm]
[] [deg*cm2/dmol]
I=0,1
I=0,5
I=1,0
Abbildung 67: Nah-UV-CD-Spektren von 64 %
succinyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke
Abbildung 68: Nah-UV-CD-Spektren von 99 %
succinyliertem Legumin in Puffern
unterschiedlicher Ionenstärke
Die Nah-UV-CD-Spektren von 64 % N-succinyliertem Legumin (Abbildung 67) ändern
sich in Abhängigkeit von der Ionenstärke des Lösungsmittels. Die Elliptizität nimmt mit
höherer Ionenstärke zu. Bei einer Wellenlänge von 284 nm steigt der Wert der molaren
Ergebnisse 96
Elliptizität von 55 deg•cm2•dmol-1 bei niedriger Ionenstärke auf Θ = 80 deg•cm2•dmol-1 in
Phosphatpuffer der Ionenstärke 1,0.
Die CD-Spektren der hochsuccinylierten Probe (Abbildung 68), bei denen unabhängig
von der Ionenstärke ohnehin nur sehr geringe Elliptizitäten gemessen werden, verhalten
sich ähnlich. Der geringe Circulardichroismus der aromatischen Reste weist auf das Feh-
len von größeren Anteilen an geordneten Strukturen hin [119]. Die Spektren spiegeln
dennoch den stabilisierenden Effekt hoher Ionenstärke auf die übrige Tertiärstruktur wi-
der. Die molare Elliptizität bei 284 nm Wellenlänge steigt von 8 deg•cm2•dmol (I=0,1) auf
Θ = 25 deg•cm2•dmol-1 (I=1,0).
Berechnungen von Sekundärstrukturanteilen
CD-Banden im nahen UV-Bereich (250–320 nm) entstehen durch die Absorption an den
aromatischen Seitenketten. Sie wird beobachtet, wenn in den Chromophoren durch deren
unmittelbare Umgebung eine elektronische Chiralität induziert wird, z. B. durch die Fal-
tung und Entfaltung eines Proteins. Auf diese Weise enthält der Circulardichroismus In-
formationen über die Tertiärstruktur.
Es gibt eine große Anzahl an statistischen Auswerteprogrammen, um die Sekundärstruk-
turanteile eines Proteins anhand seines CD-Spektrums im fernen UV vorauszusagen, da
diese Spektren im Spektralbereich der Amidchromophore (170–250 nm) hauptsächlich
von der Sekundärstruktur der Polypeptidketten im Protein (Peptidbindungen) bestimmt
werden. Sie beruhen auf der Annahme, daß ein Protein-CD-Spektrum in diesem Bereich
als lineare Kombination der Beiträge der unterschiedlichen Sekundärstrukturen (Helix, β-
Faltblatt, turn- und nichtreguläre, auch als “Rest” bezeichnete Strukturen) dargestellt
werden kann. Die verschiedenen Methoden zur Berechnung der Sekundärstrukturanteile
unterscheiden sich vor allem durch die Anzahl und Auswahl der Basisspektren, sowie im
mathematischen Formalismus und der Auswahl der Selektionskriterien. Für die von mir
aufgenommenen Spektren bot sich die Methode nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34]
(Computerprogramm CONTIN) an, die bereits in früheren Arbeiten an ähnlichen Protei-
nen [33, 131] herangezogen worden ist. Zugrunde liegen die CD-Spektren von 17 struk-
turell aufgeklärten Proteinen als Referenzspektren. Bevorzugt wurde von mir die nach
JOHNSON [148] modifizierte CONTIN-Methode der Auswertung, die, abgesehen von der
Übereinstimmung mit den typischen Referenzspektren, die Lösung mit den geringsten
Freiheitsgraden auswählt. Für die Berechnung von Sekundärstrukturanteilen nach dieser
Methode müssen die CD-Spektren, analog den Referenzspektren, im Bereich von
190-240 nm aufgenommen werden. Da das jedoch im Phosphatpuffer der Ionenstärke
I=1,0 nicht möglich war, sind die für dieses Puffersystem dennoch angegebenen berech-
neten Strukturanteile mit großer Unsicherheit behaftet. Es wird darauf hingewiesen, daß
Ergebnisse 97
die Berechnung der Sekundärstrukturanteile generell eher den Charakter einer Abschät-
zung hat. Abbildung 69 zeigt die Änderung der berechneten Sekundärstrukturanteile
mit zunehmender Acetylierung und Succinylierung. Die entsprechenden Werte sind
Tabelle 14 zu entnehmen.
b-Faltblatt
b-turn
a-Helix
Rest
nativ
58%
98%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Strukturanteile [%]
ACETYLIERUNG
b-Faltblatt
b-turn
a-Helix
Rest
nativ
64%
95%
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Strukturanteile [%]
SUCCINYLIERUNG
Abbildung 69: Änderung der Sekundärstrukturanteile durch Acylierung von Legumin in Standardpuf-
fer, berechnet nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON
[148]
Tabelle 14: Sekundärstrukturanteile acylierter Ackerbohnen-Legumine in Standardpuffer, berech-
net nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON [148].
Der Fehler der Methode beträgt
±
1%.
β-Faltblatt [%] β-turn [%] α-Helix [%] Rest [%]
nativ 44 19 17 20
58% Acetylierung 43 21 12 24
98% Acetylierung 44 20 10 26
64% Succinylierung 43 20 13 24
95% Succinylierung 43 21 9 27
Sowohl bei der Acetylierung als auch durch die Succinylierung nimmt der Anteil an α-
helikalen Strukturen ab, während der Anteil an β-Strukturen fast konstant bleibt. Dem-
entsprechend erhöht sich der Anteil ungeordneter Strukturen.
Der Einfluß der Ionenstärke des Lösungsmittels auf die Sekundärstruktur von nativem
und succinyliertem Legumin wurde anhand der CD-Spektren im fernen UV untersucht
und ebenfalls mit dem Auswerteverfahren nach PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifi-
Ergebnisse 98
ziert nach JOHNSON [148], quantifiziert. Die Ergebnisse sind Tabelle 15 zu entnehmen.
Die für Puffer der Ionenstärke I=1,0 berechneten, in Klammern angegebenen, Werte sind
wegen der bereits beschriebenen Gründe nicht abgesichert.
Tabelle 15: Sekundärstrukturanteile von nativem Legumin und succinylierten Leguminderivaten in
Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke, berechnet nach der Methode von
PROVENCHER & GLÖCKNER [34], modifiziert nach JOHNSON [148] (Fehler
±
1 %)
β-Faltblatt [%] β-turn [%] α-Helix [%] Rest [%]
nativ I=0,1 49 25 14 13
I=0,5 44 19 17 20
I=1,0 (45) (19) (14) (22)
64% suc I=0,1 46 21 8 26
I=0,5 43 20 13 24
I=1,0 (40) (20) (17) (23)
99% suc I=0,1 44 22 5 30
I=0,5 43 21 9 27
I=1,0 (42) (23) (7) (29)
Für natives Legumin wurden höhere Anteile an β-Faltblatt und β-turns in Puffer niedriger
Ionenstärke berechnet. Der berechnete Anteil an α-Helix ist mit 17 % im Standardpuffer
(I=0,5) etwas höher als in niedriger Ionenstärke (I=0,1).
Auch bei der 64 % succinylierten Probe wird durch die Erhöhung der Ionenstärke der An-
teil an β-Faltblatt-Strukturen herabgesetzt. Unter Einbeziehung des möglichen Fehlers ist
der Unterschied jedoch nicht signifikant. In der Hauptsache ist die Abnahme α-helikaler
Strukturen entsprechend einer geringeren Stabilisierung bei niedriger Ionenstärke zu
verzeichnen.
Die Sekundärstruktur der erschöpfend succinylierten Probe ist den Fern-UV-CD-Spektren
zufolge von der Ionenstärke wenig abhängig. Die errechneten β-Strukturanteile ändern
sich lediglich im Fehlerbereich der Methode. In allen drei Puffersystemen wurden mit ei-
nem Anteil von weniger als 10 % nur sehr geringe α-Strukturbereiche (am geringsten bei
I=0,1), zugunsten erhöhter nichtregulärer Strukturanteile, berechnet.
4.2.5 Thermostabilität acylierter Leguminproben
In Abbildung 70 sind die DSC-Thermogramme von nativem Legumin bei Standardio-
nenstärke (I=0,5), mittlerer (I=0,22) und niedriger (I=0,1) Ionenstärke und in
Abbildung 71 die Ionenstärke-Abhängigkeit der Denaturationstemperatur (Td) und der
kalorimetrischen Enthalpie (∆Hcal) dargestellt.
Ergebnisse 99
Abbildung 70: Normierte Thermogramme von nativem Legumin in Na-/K-Phosphatpuffer pH 8,0 un-
terschiedlicher Ionenstärke eingestellt mit NaCl
a: 0.01 M Phosphatpuffer mit 0,076 M NaCl; I = 0,1
b: 0.05 M Phosphatpuffer mit 0,1 M NaCl; I = 0,22
c: 0.05 M Phosphatpuffer mit 0,38 M NaCl; I = 0,5
80
90
100
00,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Ionenstärke
Temperatur [°C]
0
2000
4000
6000
8000
10000
00,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6
Ionenstärke
Hcal [kJ/mol]
Abbildung 71: Abhängigkeit der Denaturationstemperatur Td (links) und der kalorimetrischen Enthal-
pie
∆
Hcal (rechts) des nativen Legumins von der Ionenstärke des Lösungsmittels (PB)
Die Denaturationstemperatur von Legumin steigt mit Erhöhung der Ionenstärke von
84,9 ° C auf 95,6 ° C und der Enthalpie-Wert von 5647 auf 8868 kJ/mol entsprechend
dem zunehmenden Stabilisierungseffekt hoher Salzionenkonzentrationen (s. dazu [149]).
Die normierten DSC-Thermogramme von nativem Legumin und einigen succinylierten
Derivaten sind in Abbildung 72, die von ausgewählten acetylierten Proben in
Abbildung 73 dargestellt.
Ergebnisse 100
0
200
400
600
800
1000
280 300 320 340 360 380
Temperatur [K]
Wärmekapazität [kJ/mol*K]
nativ
33 %
65 %
95 %
0
200
400
600
800
1000
280 300 320 340 360 380
Temperatur [K]
Wärmekapazität [kJ/mol*K]
nativ
37 %
58 %
83 %
98 %
Abbildung 72: Normierte Thermogramme von
Leguminproben unterschiedlichen
Succinylierungsgrades sowie von
nativem Legumin in 0,05 M Phos-
phatpuffer pH 8 mit 0,1 M NaCl
Abbildung 73: Normierte Thermogramme von
Leguminproben unterschiedlichen
Acetylierungsgrades sowie von
nativem Legumin in 0,05 M Phos-
phatpuffer pH 8 mit 0,1 M NaCl
Die DSC-Thermogramme zeigen, daß die Denaturation von Legumin bzw. seinen acylier-
ten Derivaten von recht komplexem Charakter ist. Das Denaturationsthermogramm von
nativem Legumin weist unter den beschriebenen Bedingungen einen asymmetrischen
Wärmeabsorptionspeak mit einer Denaturationstemperatur von 363 K auf. Das entspre-
chende Sedimentationsdiagramm (Abbildung 27a) zeigt eine Hauptkomponente mit
einem Sedimentationskoeffizienten von etwa 12 S.
Die Thermogramme der 30-80 % succinylierten und der 70-90 % acetylierten Proben
sind (mindestens) bimodal. Sie bestehen aus teilweise überlappenden Peaks, die thermo-
dynamisch differenzierten Übergängen entsprechen. Das Thermogramm der 33 % succi-
nylierten Probe zeigt einen Hauptpeak mit einer Denaturationstemperatur von 357 K und
einen Nebenpeak bei 335 K. Bei einer Probe mit 65 % succinylierten Aminogruppen ist
dagegen der Denaturationspeak bei 332 K der Hauptpeak und die Denaturationsenthalpie
des Überganges bei Td = 351 K geringer. Das Thermogramm der nahezu vollständig N-
succinylierten Leguminprobe läßt nur einen sehr breiten „Peak“ sehr geringer Fläche und
mit einer Denaturationstemperatur von etwa 333 K erkennen; bei hinzukommender voll-
ständiger Succinylierung der Hydroxylgruppen sinkt die thermodynamische Stabilität wei-
ter (Td = 327 K, ohne Abbildung).
Die Bimodalität der Thermogramme zeigt sich bei den acetylierten Leguminproben erst
ab etwa 70 % N-Blockierung. Das in Abbildung 73 gezeigte Thermogramm eines 83 %
acetylierten Präparates weist einen Hauptpeak mit einer Denaturationstemperatur von
355 K und einen Nebenpeak mit Td = 330 K auf. Die 91 % acetylierte Leguminprobe (oh-
ne Abbildung) weist neben 3-4 K geringeren Denaturationstemperaturen auch eine Ver-
Ergebnisse 101
änderung im Verhältnis der Denaturationsenthalpien auf: es verschiebt sich zugunsten
der Komponente mit Td = 327 K (∆Hcal,351K < ∆Hcal,327K). Die quasi vollständige Acetylie-
rung von Legumin führt zu einem Thermogramm mit einem extrem breiten Peak geringer
Fläche und einer Denaturationstemperatur von etwa 327 K.
Um die relative Fläche für jeden dieser Peaks zu bestimmen und daraus die „Teilenthal-
pien“ für den jeweiligen Übergang ermitteln zu können, erfolgte die formalistische ma-
thematische Auftrennung der komplexen Thermogramm-Kurven in separate, einfachere
Gausskurven (Deconvolution). Durch die Deconvolution wurde für die succinylierten (bis
etwa 60 %) und acetylierten (bis etwa 90 %) Leguminproben ein weiterer thermodyna-
mischer Übergang errechnet (Td = 356-345 K), dessen Integral jedoch nur einen gerin-
gen prozentualen Anteil (bis maximal 15 %) an der totalen Denaturationsenthalpie aus-
macht. Die Zuordnung der, durch die Aufspaltung des Legumin-Denaturationspeaks infol-
ge Acylierung entstandenen einzelnen „Teildenaturationspeaks“ kann nur im Zusammen-
hang mit den Ergebnissen der analytischen Ultrazentrifugation erfolgen (s. Diskussion).
In Übereinstimmung mit den Daten zur Legumin-Quartärstruktur (Kap. 4.2.2.2) kann
man den Peak mit einer Denaturationstemperatur von 363-351 K der Denaturation des
(modifizierten) 11 S-Hexamers und die Denaturation bei 334-327 K dem modifizierten
3 S-Monomer zuschreiben (s. auch [150]). Der kalkulierte Peak mit Denaturationstempe-
raturen, die zwischen denen des „11 S“- und des „3 S“-Proteins liegen, könnte aus der
Denaturation des 7 S-Legumin-Intermediates resultieren, was im Fall der Succinylierung
mit den Ergebnissen der Ultrazentrifugationsmessungen korreliert.
Abbildung 74 gibt die Änderungen der Denaturationstemperaturen mit fortschreitender
Succinylierung und Acetylierung für die nach Deconvolution separierten und den drei
Komponenten zugeordneten Peaks wieder.
40
50
60
70
80
90
100
020 40 60 80 100
Succinylierung der Aminogruppen [%]
Denaturationstemperatur [°C]
11S
7S
3S
40
50
60
70
80
90
100
020 40 60 80 100
Acetylierung der Aminogruppen [%]
Denaturationstemperatur [°C]
11S
7S
3S
Abbildung 74: Abhängigkeit der Denaturationstemperaturen Td der den oligomeren Formen des Le-
gumins zugeordneten Peaks nach Deconvolution vom Grad der Acylierung
(a = Succinylierung; b = Acetylierung)
a
b
Ergebnisse 102
Die Denaturationstemperatur jeder Komponente sinkt sowohl bei der Succinylierung als
auch bei der Acetylierung mit steigendem Modifizierungsgrad, wobei die Abstufung
Td (11 S) > Td (7 S) > Td (3 S) gilt.
Die Änderung der totalen spezifischen Enthalpie der Legumin-Denaturation ∆Hcal (Summe
aller „Teildenaturationsenthalpien“) in Abhängigkeit vom Grad der Proteinmodifizierung
ist in Abbildung 75 dargestellt. Die ∆Hcal-Werte fallen mit zunehmendem Acylie-
rungsgrad entsprechend sinkender Konformationsstabilität; bei vollständiger Succinylie-
rung geht ∆Hcal gegen Null.
0
5
10
15
20
020 40 60 80 100
Succinylierung der Aminogruppen [%]
Denaturationsenthalpie [J/g]
0
5
10
15
20
020 40 60 80 100
Acetylierung der Aminogruppen [%]
Denaturationsenthalpie [J/g]
Abbildung 75: Abhängigkeit der totalen spezifischen Denaturationsenthalpie
∆
Hcal vom Grad der
Acylierung (a = Succinylierung; b = Acetylierung)
Die auf der Grundlage der DSC-Messungen ermittelten thermodynamischen Parameter
von ausgewählten Proben sind Tabelle 16 zu entnehmen.
Tabelle 16: Mikrokalorimetrisch (DSC) ermittelte thermodynamische Parameter von nativem Le-
gumin und einigen ausgewählten acylierten Derivaten im Vergleich
nativ 33 % suc 37 % ac 96 % suc 98 % ac
Td [K] 363 ± 1 358 ± 1 362 ± 1 327 ± 2 327 ± 2
∆
Η
cal [J/g] 20 ± 1 11 ± 0,5 16 ± 0,5 ∼ 1 ∼ 5
∆Cp [J/g•K] 0,31 ± 0,03 0,28 ± 0,03 0,07 ± 0,01 0,02 0,23 ± 0,02
Der Wert ∆Hcal beschreibt die totale Denaturationsenthalpie des Proteins, die angegebene Denaturationstempe-
ratur bezieht sich auf den Hauptpeak des jeweiligen Thermogramms.
Die Denaturationstemperatur der 37 % N-acetylierten Leguminprobe ist in Rahmen des
Fehlers der Bestimmungsmethode gleich dem Wert des nativen Legumins. Dagegen führt
b
a
Ergebnisse 103
die Succinylierung von nur 33 % der Aminogruppen zur Herabsetzung der Konformati-
onsstabilität, die sich u. a. in der um etwa 5 K verringerten Denaturationstemperatur
äußert. Hochacetylierte und -succinylierte Legumine denaturieren bei etwa der gleichen
Temperatur und zwar bei wesentlich geringerer Temperatur als das native Legumin. Die
totale Denaturationsenthalpie ∆Hcal wird durch die Acylierung der funktionellen Gruppen
des Legumins grundsätzlich verringert. Die Succinylierung bewirkt eine stärkere Abnah-
me von ∆Hcal als die Acetylierung bei einer Modifizierung von etwa der gleichen Anzahl
Aminogruppen. Der Enthalpie-Wert der hochgradig N- und O-succinylierten Probe ist im
Vergleich zum Wert des nativen Legumins verschwindend gering. Das beweist, daß das
Protein bereits vor der thermischen Belastung in weitestgehend denaturierter Form vor-
gelegen haben muß. Ebenso nimmt die Änderung der Wärmekapazität durch die thermi-
sche Entfaltung, ∆Cp, insbesondere bei hoher Succinylierung stark ab; Wärmekapazität
von ge- und entfaltetem (3 S-)Protein sind fast gleich. Auch das zeigt, daß das Protein
weitgehend entfaltet vorliegt. Im Gegensatz dazu weisen die thermodynamischen Daten
der hochacetylierten Probe auf das Vorhandensein restlicher Strukturen hin (vgl. Nah-UV-
CD-Spektren der Proben in Abbildung 62 und Abbildung 68). Die Denaturation-
senthalpie hochacetylierter Leguminproben ist gering aber deutlich höher als nach er-
schöpfender Succinylierung, und auch die Wärmekapazitäten von ge- und entfaltetem
Protein unterscheiden sich beträchtlich.
4.2.6 Denaturansstabilität acylierter Leguminproben
Es wurde nachgewiesen, daß die Guanidiniumchlorid- (GuHCl) und die Harnstoff-
induzierte Denaturation von nativem Legumin reversibel verlaufen. Die Reversibilität der
Entfaltung acylierter Legumine mit Harnstoff konnte jedoch nicht nachgewiesen werden.
Nach erfolgter Renaturation wurden 20-30 % geringere Fluoreszenzintensitäten gemes-
sen. Die Reversibilität der Entfaltung mittels Guanidiniumchlorid wurde an folgenden Le-
guminpräparaten unterschiedlicher Acylierungsgrade untersucht: 47 %, 77 % und 98 %
N-Acetylierung sowie 32 %; 49 %; 64 %; 79 %; 98 % N-Succinylierung. Die Rückfaltung
der acetylierten Proben erfolgt zu etwa 90 %. Bei den succinylierten Präparaten konnte
die (mindestens 95 %ige) Reversibilität der Entfaltung bis zu einem Modifizierungsgrad
von einschließlich 64 % der Aminogruppen nachgewiesen werden. Bei allen höheren Suc-
cinylierungsgraden wurde nach der Rückfaltung eine Zunahme der Fluoreszenz gemes-
sen, die besonders bei vollständiger Succinylierung mit einer Fluoreszenzzunahme von
35 % beträchtlich ist. Aus diesen Gründen wurde die Untersuchung der Denaturansstabi-
lität bei den acetylierten Präparaten auf die zu etwa 50 % und die vollständig modifizierte
Probe beschränkt. Auf die Untersuchung von höher als 64 % N-succinylierten Legu-
minproben wurde verzichtet, und nur für die übrigen Proteine mit nachgewiesener Rever-
Ergebnisse 104
sibilität der Entfaltung wurden die Entfaltungskurven aufgenommen. Die jeweiligen Ver-
änderungen der freien Energie ∆G während der Entfaltung sind in Abbildung 76 und
Abbildung 77 dargestellt und die daraus berechneten charakterisierenden Größen in
Tabelle 17 zusammengefaßt.
-16
0
16
0 1 2 3 4
GuHCl-Konzentration [M]
∆G [kJ/mol]
nativ
47%
98%
-16
0
16
01234
GuHCl-Konzentration [M]
∆G [kJ/mol]
nativ
32%
64%
Abbildung 76: Änderung der freien Energie
der Entfaltung von acetyliertem
Legumin in Abhängigkeit von
der GuHCl-Konzentration
Abbildung 77: Änderung der freien Energie
der Entfaltung von succinylier-
tem Legumin in Abhängigkeit
von der GuHCl-Konzentration
Tabelle 17: Thermodynamische Parameter berechnet aus den GuHCl-Entfaltungskurven von nati-
vem und acyliertem Legumin
∆GPuffer [kJ/mol] [GuHCl]1/2 [M] m [kJ/mol/M]
Legumin 24,64 ± 1,0 1,62 ± 0,1 15,23 ± 1,0
47 % Acetylierung 25,49 ± 0,8 1,88 ± 0,1 13,57 ± 1,0
98 % Acetylierung 10,00 ± 0,4 1,51 ± 0,1 6,64 ± 0,3
32 % Succinylierung 14,83 ± 0,5 1,68 ± 0,1 8,82 ± 0,4
49 % Succinylierung 10,79 ± 0,5 1,53 ± 0,1 7,14 ± 0,3
64 % Succinylierung 11,63 ± 0,5 1,54 ± 0,1 7,56 ± 0,3
Die Acylierung von Legumin führt erwartungsgemäß zur Veränderung der Denaturanssta-
bilität.
Die Acetylierung von 47 % der Aminogruppen bewirkt kaum eine Stabilitätsänderung
gegenüber dem Denaturans. Die hohe Strukturstabilität der 47 % N-acetylierten Probe
wird vor allem durch den unverändert hohen ∆GPuffer-Wert als ein Maß der Denatu-
Ergebnisse 105
ransstabilität beschrieben. Der Wert der Denaturanshalbwertkonzentration [GuHCl]1/2 ist
gegenüber dem des nativen Legumins leicht erhöht. Die vollständig acetylierte
Leguminprobe ist gegenüber Guanidiniumchlorid wesentlich instabiler als natives oder
nur teilweise acetyliertes Legumin; ihr ∆GPuffer–Wert ist deutlich geringer. Der m-Wert als
Maß für die Abhängigkeit der Denaturansstabilität von der Denaturanskonzentration sinkt
mit zunehmender Acetylierung von 49 % auf 98 % weiter.
Im Falle der Succinylierung sinkt die Denaturansstabilität von Legumin bereits durch die
Modifizierung von 32 % der Aminogruppen stark und mit fortschreitender Succinylierung
von 32 % auf 49 % weiter. Eine Erhöhung des Anteils an Succinylgruppen auf 64 % be-
wirkt dagegen keine fortschreitende Verringerung der Denaturansstabilität. Die Denatu-
ranshalbwertkonzentrationen der 49 und 64 % succinylierten Präparate unterscheiden
sich nur im Fehlerbereich der Bestimmungsmethode. Die Abhängigkeit der Denatu-
ransstabilität von der Guanidiniumchloridkonzentration sinkt durch die Modifizierung, je-
doch auch nur bis zu einem Anteil von etwa 50 % succinylierten Aminogruppen. Aussa-
gen über die Denaturansstabilität der Konformation hochgradig succinylierter Ackerboh-
nen-Legumine können wegen der Irreversibilität der Denaturation nicht getroffen wer-
den.
Diskussion 106
5 Diskussion
• Succinylierung und Acetylierung: Dissoziation und Assoziation
Zur Interpretation der durch Acylierung bewirkten strukturellen Veränderungen im A-
ckerbohnen-Legumin werden, neben den in dieser Arbeit dargestellten Ergebnissen,
Strukturvorhersagen für das native 11 S-Protein [51, 151] sowie die Hydropathie-Profile
der konstituierenden Polypeptidketten der A- und B-Untereinheiten herangezogen. Zur
Erstellung der Hydropathie-Profile wurde die Methode von KYTE & DOOLITTLE [152] be-
nutzt. Die zugrundeliegenden Aminosäuresequenzen entstammen den Arbeiten von
SCHLESIER et al. [128] und BÄUMLEIN et al. [56]. Folgende Betrachtungen zur Acylie-
rung der Amino- (Lysin) und Hydroxylgruppen (Serin, Threonin, Tyrosin) und damit ein-
her gehenden strukturellen Veränderungen des Proteins können angestellt werden.
Von den 21 Lysinresten der A-Typ-Untereinheit des Leguminmoleküls sind 11 in der α-
Kette und 10 in der β-Kette lokalisiert. Von den insgesamt 13 Lysinresten der B-Typ-
Untereinheit befinden sich 8 in der α-Kette und 5 in der β-Kette. Nach dem von
PLIETZ et al. [51] entwickelten Strukturmodell sind die hydrophoben β-Ketten im Inneren
des Leguminmoleküls lokalisiert, während die hydrophilen C-terminalen Stränge der α-
Ketten an der Moleküloberfläche liegen. Die C-terminalen Bereiche der α-Ketten beider
Untereinheiten-Typen enthalten insgesamt 15 Lysinreste. Basierend auf der Annahme,
daß die zwei Untereinheiten-Typen A und B zu gleichen Teilen die Quartärstruktur des
Vicia faba-Legumins bilden [55, 54], entspricht der Anteil der Lysinreste im C-Terminus
44 % der gesamten Lysinreste. Auf Grund ihrer Lage in hydrophilen, unstrukturierten,
flexiblen Strukturbereichen [151] sollten mindestens 6 Lysinreste der α-A-Kette (Amino-
säurepositionen 110; 259; 268; 278; 280; 285) und mindestens 5 Lysinreste der α-B-
Kette (Aminosäurepositionen 113; 119; 187; 209; 273), also 32 % der gesamten Lysin-
reste, bevorzugt acyliert werden (vgl. Abbildung 13). Die β-Ketten der A- und B-
Untereinheiten weisen eine Verteilung der Lysinreste über den gesamten Sequenzbereich
auf. Die Acylierung dieser Reste sollte dementsprechend nur bei einer Entfaltung der glo-
bulären Struktur möglich sein bzw. als kooperativer Prozeß mit der Entfaltung einher ge-
hen.
Der Dissoziationsverlauf des 11 S-Proteins nach Succinylierung (s. Abbildung 26)
zeigt bereits bei geringen Modifizierungsgraden das Auftreten der 3 S-Untereinheit. Die
Abnahme des Anteils der 11 S-Komponente bis zu einem Blockierungsgrad von ca. 50 %
der Aminogruppen erfolgt zugunsten der Bildung gleicher Anteile des 7 S-Trimers und
3 S-Monomers. Die Dissoziation von 11 S-Globulinen über ein trimeres 7 S-Intermediat
Diskussion 107
in ihre 3 S-Untereinheiten ist bereits für das Arachin der Erdnuß [18] und das Legumin
der Erbse [131] beschrieben worden.
Maximale Mengen der 7 S-Komponente sind nach Succinylierung von 60-80 % der Ami-
nogruppen des Ackerbohnen-Legumins nachweisbar. Bei höheren Modifizierungsgraden
liegt nur noch die 3 S-Komponente vor, deren Anteil kontinuierlich mit dem Grad der Mo-
difizierung zunimmt. Während somit bei Succinylierungsgraden ab etwa 60 % eine Disso-
ziation nach dem Schema 11 S → 7 S → 3 S angenommen werden kann, weist die Disso-
ziation bis zu einem Modifizierungsgrad von etwa 50-60 % auf die parallele Bildung von
7 S- und 3 S-Komponenten hin. Die unterschiedliche Verteilung der Lysinreste in den α-
Ketten der A- und B-Untereinheiten sollte zu einer ungleichen Acylierung dieser Unter-
einheiten mit einer deutlich unterschiedlichen lokalen Häufung der eingeführten negativ
geladenen Succinylreste führen. Daraus könnte ein Dissoziationsverhalten mit gleichzeiti-
ger Bildung von 7 S-Trimer und 3 S-Monomer resultieren. Der maximale Anteil des 7 S-
Zwischenproduktes bei 60-80 % N-Succinylierung fällt mit nachweisbaren Veränderungen
in den viskosimetrischen (Konzentrationsabhängigkeit der Viskosität ab etwa 75 % Suc-
cinylierung und Diskontinuität im Verlauf der Grenzviskosität zwischen 60 und 80 %) und
spektroskopischen Eigenschaften der Proben zusammen und spiegelt einen strukturellen
Zustand wider, der sich von dem des voll modifizierten und dem des wenig modifizierten
Legumins unterscheidet.
Die Änderung der oligomeren Struktur des Legumins nach Acetylierung zeigt einen
prinzipiell anderen Verlauf als nach Succinylierung. Die 11 S-Komponente bleibt bis zu
hohen Acetylierungsgraden (83 %) erhalten, ein 7 S-Dissoziationsprodukt ist nicht nach-
weisbar (Abbildung 27). Als Dissoziationsprodukt entsteht mit einem maximalen Anteil
von 30 % die 3 S-Untereinheit. Die Bildung von Assoziationsprodukten, bei hochgradiger
Acetylierung das Hauptprodukt, ist in Kap. 4.2.2 bereits beschrieben worden. Die schon
diskutierte mögliche unterschiedliche Beteiligung der A- und B-Untereinheiten an der Dis-
soziation des succinylierten Legumins kann auch für die Dissoziation und Assoziation des
acetylierten Legumins nicht ausgeschlossen werden. Für die mögliche unterschiedliche
Beteiligung der A- und B-Untereinheiten an der Dissoziation des Legumins kommt als
Ursache neben den Unterschieden in der Ladungsverteilung auch eine unterschiedliche
Anordnung in der Quartärstruktur [153] in Betracht. Während die Succinylierung durch
die Einführung zusätzlicher Carboxylgruppen zur Erhöhung der negativen Nettoladung
führt, nimmt diese im Falle der Acetylierung nur durch die Neutralisierung der die Carbo-
xylatgruppen abschirmenden protonisierten Aminogruppen zu. Dieser insgesamt geringe-
re Ladungszuwachs bedingt eine geringere elektrostatische Abstoßung und kann so den
Verlauf der Dissoziation/Assoziation des 11 S-Moleküls infolge Acetylierung erklären.
Die Serin- und Threoninreste sind über den gesamten Sequenzbereich der α- und β-
Ketten verteilt. Ihre Succinylierung, die nach einer Blockierung von über 90 % der Ami-
Diskussion 108
nogruppen erfolgt und bei großem Reagensüberschuß alle Hydroxylgruppen erfaßt
(Abbildung 14), muß infolge elektrostatischer Abstoßung zur völligen Dissoziation und
zur Entfaltung der Ketten oder zumindest zur Expansion führen, wie die viskosimetri-
schen (Abbildung 33a, Abbildung 34) und thermodynamischen (Abbildung 75,
Tabelle 16) Daten aufzeigen.
Die Tyrosinreste der α- und β-Ketten sind im wesentlichen in N-terminalen Bereichen
und mit Ausnahme eines Restes der α-A- und α-B-Ketten, der jeweils in einem flexiblen
und exponierten Bereich [151] liegt, in strukturierten Segmenten lokalisiert. Ihre voll-
ständige Acylierung sollte dementsprechend erst nach einer Entfaltung der Ketten mög-
lich sein. In der vorliegenden Arbeit sind nach jeweils erschöpfender Modifizierung 54 %
der Tyrosinreste acetyliert und 56 % (reversibel) succinyliert worden. Da die Succinylie-
rung der Tyrosinreste nicht zur Bildung stabiler O-Succinyl-Bindungen führt, kann ihr
Einfluß auf die Nettoladung des Proteins vernachlässigt werden. Der Verlauf der O-
Acylierung entspricht den Ergebnissen anderer Autoren über die Succinylierung von Pep-
sinogen [154], Rinderserumalbumin [155] sowie Erbsen-Legumin [131], nach denen die
Hydroxyaminosäuren erst nach weitgehender Blockierung der Aminogruppen des Lysins
acyliert werden.
Die Acetylierung führt zu deutlicheren spektroskopischen Veränderungen als die Succiny-
lierung, was bei vergleichbarem N-Blockierungsgrad auf stärkere Konformationsänderung
durch Acetylierung als durch Succinylierung hinweist. Neben der Einfuhr der hydrophoben
Reste in das Leguminmolekül begünstigt insbesondere die bei der Acetylierung früher
einsetzende O-Acylierung zusätzliche hydrophobe Wechselwirkungen zwischen den N-
und O-acetylierten Resten in Konkurrenz zu den proteinstabilisierenden Wechselwirkun-
gen. Bei erschöpfender N-, O-Acetylierung, d. h. einer Verteilung der Acetylreste über die
gesamten Sequenzbereiche, müssen diese Effekte so groß sein, daß eine Assoziation be-
günstigt wird.
• Diskussion der Untersuchungen zur Hydrophobizität
Die Messungen der Hydrophobizität (Kap. 4.2.1) liefern, bis auf die Zweiphasen-
Verteilung, relative und zudem methodenspezifische Werte. Am deutlichsten treten die
Unterschiede zwischen den mit verschiedenen Methoden erhaltenen Daten bei den succi-
nylierten Leguminproben in Erscheinung. Während die Ergebnisse der Zweiphasen-
Verteilung eine mit dem Succinylierungsgrad kontinuierlich ansteigende Hydrophilie sig-
nalisiert, weisen die Untersuchungen mittels RP-HPLC und Fluoreszenzsonden-Bindung
auf eine Zunahme der Hydrophobizität hin. Nur bei extrem hoher Succinylierung ergeben
sich auch mit der Fluoreszenzsonden-Technik Hinweise auf wieder abnehmende Hydro-
phobizität. Die acetylierten Proteinproben ergeben erwartungsgemäß höhere Hydrophobi-
zitätswerte als die succinylierten Leguminderivate. Ein größerer Anstieg des S0-Wertes ab
Diskussion 109
S0-Wertes ab etwa 60 % N-Acetylierung, sowohl mit ANS als auch mit cis-Parinarsäure
als Fluoreszenzsonden, ist bereits von KRAUSE et al. [75] beschrieben worden. Er kann
auf den zunehmenden Einfluß der an den Hydroxylgruppen eingeführten Acetylreste aber
vor allem auf eine mit der Modifizierung einhergehende Proteinentfaltung zurückgeführt
werden. Im Falle der Succinylierung ist die nur geringfügige Zunahme der ANS-
Hydrophobizität mit steigender Blockierung der Aminogruppen (Abbildung 21a) auf
Konformationsänderungen des Legumins zurückzuführen. Bei extrem hoher
N-Succinylierung (> 90 %), bei der zudem die Succinylierung der Hydroxylgruppen rele-
vant wird (Abbildung 14), kann die Häufung der hydrophilen, negativ geladenen Succi-
nylreste zu einer elektrostatischen Abstoßung der ANS-Moleküle und damit zu einer ge-
ringeren Bindung des hydrophoben Liganden führen, was die Abnahme des S0-Wertes
erklärt. Daneben dürfte auch das Einführen der vielen negativen Ladungen zur Abschir-
mung der hydrophoben Bindungsstellen im Protein führen. Der unterschiedliche Einfluß
von Acetylierung und Succinylierung auf die Oberflächenhydrophobizität von Ackerboh-
nen-Legumin wird besonders in Abbildung 21b deutlich. Der Anstieg der ANS-
Hydrophobizität (S0-Wert) mit der Zahl eingeführter Acetylreste an den Amino- und
Hydroxylgruppen ist praktisch linear und weist auf Wechselwirkungen des hydrophoben
Liganden ANS mit den eingeführten Acetylresten hin bzw. auf eine mit der Zahl einge-
führter Acetylreste parallel laufende Zunahme der Exponierung hydrophober Cluster. Die
Succinylierung beeinflußt die ANS-Hydrophobizität in wesentlich geringerem Maß. Die S0-
Werte von nativem Legumin und einem Leguminderivat mit vollständig succinylierten
Amino- und Hydroxylgruppen unterscheiden sich kaum.
Die Methodenspezifität der Ergebnisse kann als Folge unterschiedlicher Mechanismen
verstanden werden. So spricht die Fluoreszenzsondentechnik nicht nur auf eingeführte
hydrophobe Gruppen sondern auch auf exponierte hydrophobe Cluster und somit deutlich
auf Konformationsänderungen der Proteine an. Dem entgegen wirkende elektrostatische
Wechselwirkungen (Abstoßung) zwischen dem negativ geladenen ANS-Sondenmolekül
und dem nach erschöpfender Succinylierung extrem geladenen Protein lassen sich jedoch
nicht ausschließen. Hier könnte die Untersuchung mit neutralen Sondenmolekülen ein-
deutigere Ergebnisse liefern. Bei der RP-HPLC wird für beide Acylierungsmethoden eine
zunehmende Bindung der Proteine an die hydrophobe Matrix (beobachtet als zunehmen-
de Retentionszeit) mit steigendem Modifizierungsgrad entsprechend zunehmender Hy-
drophobizität festgestellt. Aus früheren Untersuchungen am succinylierten Erbsen-
Legumin [156] ergeben sich Hinweise darauf, daß die so ermittelte Hydrophobizität so-
wohl auf Beiträge aus exponierten hydrophoben Clustern des Proteins als auch auf die
Beiträge der Methylengruppen der Succinylreste zurückgeführt werden könnte. Bei dieser
Methode sind neben den dominanten hydrophoben Wechselwirkungen die elektrostati-
schen (fast) ohne Bedeutung. Im Fall der Polymer-Zweiphasen-Verteilung dürfte der Ein-
Diskussion 110
fluß der mit den Succinylresten eingeführten Carboxylatgruppen, die das chemische Po-
tential der Proteine bestimmen, dominant sein. Mit dieser Methode erfaßt man sowohl die
hydrophoben Wechselwirkungen als auch die elektrostatischen. Orientierende Versuche
mit succinylierten Erbsen-Leguminproben zeigten ebenfalls eine drastische Abnahme des
Verteilungskoeffizienten nach erschöpfender Acylierung der reaktionsfähigen Gruppen.
Ergänzend lassen sich Aussagen zur Beeinflussung der Hydrophobizität durch die Acylie-
rung auf der Grundlage der Aminosäuresequenz [128, 56] des Legumins berechnen. Zu
diesem Zweck wurde nach der Methode von KYTE & DOOLITTLE [152] aus den Hydro-
pathie-Profilen der konstituierenden Polypeptidketten der A- und B-Untereinheiten der
sogenannte GRAVY-Wert (grand average of hydropathicity) berechnet. Die zugrunde lie-
genden Hydrophobizitätswerte der Aminosäuren Serin, Threonin und ggf. Tyrosin sowie
die Werte von Lysin und der jeweils N-terminalen Aminosäure wurden entsprechend dem
Grad und der Art der Modifizierung durch die Addition der Hydrophobizitätswerte für Ala-
nin bzw. Glutaminsäure korrigiert, um die Erhöhung bzw. Verringerung der Hydrophobizi-
tät durch die eingeführten Acetyl- bzw. Succinylgruppen zu simulieren. Aufgrund der An-
nahme ihrer Gleichverteilung [54] wurde Abbildung 78 der Durchschnitt der GRAVY-
Werte beider Untereinheiten-Typen dargestellt. Ausgehend vom nativen Legumin bedeu-
tet ein zunehmend negativer Hydropathiewert die Zunahme der Hydrophilie, die Verrin-
gerung der negativen Werte bis hin zu positiven Hydropathiewerten entspricht zuneh-
mender Hydrophobizität. Aus Abbildung 78 wird ersichtlich, daß zunächst (bei mittleren
Modifizierungsgraden) die exponierten α-Ketten den größeren Anteil an der Zunahme der
Hydrophilie infolge Succinylierung und der Hydrophobizität infolge Acetylierung haben.
Bei fortschreitender Acylierung, insbesondere Acylierung der Hydroxylgruppen, gewinnen
zunehmend die Änderungen der Hydrophobizität bzw. der Hydrophilie der β-Ketten an
Relevanz für die hydrophoben/hydrophilen Eigenschaften des Gesamtmoleküls.
-18
-16
-14
-12
-10
-8
-6
-4
-2
0
nativ 58% N-
Acetyl. 100% N-
Acetyl. 68% N-
Succinyl. 100% N-
Succinyl.
Hydropathie
Legumin (gesamt)
alpha-Ketten
beta-Ketten
Abbildung 78: Durchschnittliche Hydropathiewerte (GRAVY
[152]) von nativem, acetyliertem und succinylier-
tem Legumin und der entsprechenden
α
- und
β
-
Ketten
Die aus den Messungen mit
der ANS-Fluoreszenzsonden-
technik ermittelte deutliche
Zunahme der Hydrophobizität
infolge zunehmender Acetylie-
rung (Abbildung 21
), und die
aus der Verteilung in einem
Polymer-Zweiphasen-system
errechnete Zunahme der Hyd-
rophilie von Ackerbohnen-
Legumin infolge Succinylie-
rung (Kap. 4.2.1.3) korrelie-
ren gut mit den in
Diskussion 111
Abbildung 78 dargestellten, berechneten Daten zur Hydropathieänderung.
Eine sinnvolle Kombination hydrodynamischer (Viskosimetrie, Dichtemessung, Ultra-
zentrifugation), spektroskopischer (UV-, Fluoreszenz- und CD-Spektroskopie) und ther-
modynamischer (DSC, spektroskopische Denaturationsuntersuchungen) Untersuchungen
liefert auch für den strukturellen Zustand in oligomeren Proteinsystemen schlüssige Ar-
gumente. Dabei ist die Regulierung der effektiven Ladungen des modifizierten Proteins
durch Variation des Modifizierungsgrades und der Ionenstärke von Bedeutung. Ein Ver-
gleich zwischen nativer Quartärstruktur und der dissoziierten acylierten Untereinheit oder
deren Assoziaten ist schwierig, da die Daten über die Struktur der nativen Untereinheiten
nur über eine Modellbetrachtung erhältlich sind. Erschwerend für die Interpretation expe-
rimenteller Daten ist außerdem das Vorliegen einer oligomeren Struktur, dessen globulä-
re Grundeinheit, die A- oder B-Untereinheit, selbst nur nach in gewisser Weise denaturie-
renden Eingriffen in die Gesamtstruktur zu erhalten ist.
• Diskussion der hydrodynamischen Untersuchungen
Für die Interpretation des Konzentrationsverlaufs der reduzierten Viskosität sind ver-
schiedene Ansätze vorgeschlagen worden [157]. Der Ansatz von HUGGINS [140], [158],
[159] ist in der Proteinchemie häufig benutzt worden. Die HUGGINS-Konstante k‘, be-
rechnet nach Gleichung 28 (S. 72) kann die folgenden molekularen Wechselwirkungen
widerspiegeln [158], [160]:
1. Hydrodynamische Wechselwirkungen zwischen Molekülpaaren, die zu einem ([
η
]2·c
proportionalen) Anstieg des hydrodynamischen Volumens führen, wobei dieser Effekt
für dicht gepackte Kugeln größer ist als für flexible, lösungsmitteldurchströmte Knäuel
2. Bildung von Doppelmolekülen
3. Intermolekulare Attraktion oder Repulsion
Ein positiver Beitrag zu k‘ ist im Falle von Punkt 1 und 2 bei schlechten Lösungsmitteln zu
erwarten und kann bei guten Lösungsmitteln Null betragen oder negativ werden. Im Fall
3 führt eine molekulare Repulsion zu negativen und eine Attraktion zu positiven Werten
von k‘. Schlechte Lösungsmittel begünstigen die Bildung kompakter sphärischer Polymer-
strukturen und beeinflussen damit k‘.
Im vorliegenden Fall der unterschiedlich hoch succinylierten und acetylierten Legu-
minproben ist von der Überlagerung aller drei Effekte auszugehen. Der starke Einfluß der
Ladung, dominierend insbesondere nach Succinylierung aber auch bei zunehmender Ace-
tylierung durch die Demaskierung der Carboxylatgruppen, ist ebenso zu berücksichtigen
wie die Veränderung der kompakten Molekülform des Legumins durch molekulare Expan-
sion/Entfaltung, Dissoziation und Reaggregation. Die negativen HUGGINS-Konstanten der
acetylierten Proben dürften die Tendenz zur Bildung relativ kompakter Aggregate (s.
Diskussion 112
Kap. 4.2.2) der hydrophobierten Proteine widerspiegeln, für die der Standardpuffer mit
einer relativ hohen Ionenstärke von I=0,5 ein schlechtes Lösungsmittel darstellt. Beson-
ders das Viskositätsverhalten einer hochacetylierten Leguminprobe nach siebentägiger
Lagerung (Abbildung 31) - starker Anstieg der Grenzviskosität und sehr stark negative
HUGGINS-Konstante - spricht für die mit zunehmender Verdünnung eihergehende mole-
kulare Expansion der aggregierten Moleküle. Auf die Aggregation weisen bereits die SE-
HPLC-Chromatogramme (Abbildung 24a) hin; sie konnte durch die Ultrazentrifugati-
onsmessungen (Abbildung 27 und Tabelle 7) bestätigt werden. Die Ergebnisse der
Ultrazentrifugationsstudien stehen allerdings im Gegensatz zu den Ergebnissen anderer
Autoren [z. B. 161, 162], die für acetylierte 11 S-Globuline (Arachin und Glycinin) die
Dissoziation in ihre Untereinheiten beschreiben. Von YAMAUCHI [162] wird für
hochacetyliertes Soja-Glycinin neben den Dissoziationsprodukten zwar eine
hochmolekulare Protein-Hauptfraktion beschrieben aber nicht charakterisiert. Das Fehlen
von Dissoziationsprodukten nach der Acetylierung von Raps-Cruciferin ist von
GERBANOWSKI et al. [163] beschrieben worden. Wie orientierende viskosimetrische und
chromatographische Versuche zur Temperaturabhängigkeit der Aggregation des
hochacetylierten Ackerbohnen-Legumins gezeigt haben, begünstigen erhöhte
Temperaturen den Aggregationsprozeß. Dies ist ein deutlicher Hinweis auf hydrophobe
Wechselwirkungen. Die reduzierten Viskositäten der succinylierten Proben sind nahezu konzentrationsu-
nabhängig. Erst ab einer Modifizierung von 90 % der Aminogruppen werden positive k‘-
Werte ermittelt. Das zeigt, daß bei einer Ionenstärke von I=0,5 im Falle der besonders
stark geladenen Modifikate elektrostatische Effekte nicht vollständig abgeschirmt werden.
Im Gegensatz dazu sind die HUGGINS-Konstanten der hochsuccinylierten Leguminproben
im Phosphatpuffer mit der Ionenstärke I=1,0 negativ, was durch intermolekulare Absto-
ßung und/oder die Veränderung der Molekülform durch Expansion oder Entfaltung erklärt
werden kann. Die vergleichende Betrachtung einer hochsuccinylierten sowie einer er-
schöpfend succinylierten Probe in drei Phosphatpuffern unterschiedlicher Ionenstärke
(Abbildung 36b, c) beweist, daß die elektrostatischen Wechselwirkungen ganz ent-
scheidenden Einfluß auf die Konformation bzw. die hydrodynamischen Eigenschaften,
insbesondere auf das Viskositätsverhalten der succinylierten Präparate haben, was sie
vom nativen Legumin (Abbildung 36a) unterscheidet.
Die Kombination hydrodynamischer Daten, mit dem Ziel Informationen über die Mole-
külform ableiten zu können, wird von CREETH & KNIGHT [164] diskutiert. Nach YANG
[165] ergibt der Quotient aus Grenzviskosität [
η
] und partiellem spezifischen Volumen ý
die dimensionslose Größe
ν
(Gleichung 31), die als Viskositätsinkrement bezeichnet wird.
ν
= [
η
] / ý Gleichung 31
Diskussion 113
Für steife, impermeable sphärische Partikel (quasi undurchlässige starre Kugeln) erreicht
ν
einen Grenzwert von 2,5. Im Fall asymmetrischer oder expandierter Moleküle wird das
Viskositätsinkrement größer. Das Verhältnis von
ν
/2,5 kann demnach als ein Indikator
für die molekulare Expansion bzw. Kompaktheit gelten [164]. Wie bereits in Kap. 3.3.1.3
beschrieben, lassen sich auch aus der Konzentrationsabhängigkeit der Sedimentation von
Teilchen Aussagen über deren Form ableiten. Um die Information zu erhalten, ob es sich
bei den Leguminproben nach Acylierung noch um annähernd sphärische Moleküle han-
delt, können die Sedimentationsdaten mit den Ergebnissen der Viskositätsmessungen
kombiniert werden [166, 167]. Die Beziehung zwischen der Konzentrationsabhängig-
keitskonstante ks der Sedimentationsgeschwindigkeit und der Grenzviskosität des Prote-
ins hat für kompakte sphärische (globuläre) und expandierte (random coil, entfaltete)
Proteine Gültigkeit, und stellt somit ein, sowohl von der Molekülgröße als auch von der
Hydratation unabhängiges Maß für die Molekülform dar [164]. Für kompakte sphärische
Makromoleküle aber auch für entfaltete Polymere gilt ks /[
η
] ≈ 1,6. Der ks /[
η
]-Quotient
wird für asymmetrische Moleküle kleiner und tendiert für stäbchenförmige Moleküle ge-
gen Null [167].
Für natives Ackerbohnen-Legumin in Standardpuffer wurde das Viskositätsinkrement
ν
= 8,4 bzw.
ν
/2,5 = 3,4 ermittelt und ks /[
η
] = 1,15. Diese Werte entsprechen etwa
denen von γ-Globulin [164]. Das Einführen von Acetylgruppen verringert die Kompakt-
heit des Moleküls nur wenig (
ν
50% Ac.
/2,5 = 4,2). Die chromatographierte Hauptfraktion
des hochacetylierten Legumins wurde bereits in Kap. 4.2.2.4 als dimeres Assoziat be-
schrieben. Informationen über die Molekülform dieses Dimeren lassen sich aus den er-
mittelten hydrodynamischen Daten ableiten. Aus Grenzviskosität und partiellem spezifi-
schen Volumen folgt für das Viskositätsinkrement der Wert
ν
= 13,5 und
ν
/2,5 = 5,4.
Dieser Wert entspricht einer 1,5fachen Expansion des Moleküls. Aus der Konzentrations-
abhängigkeitskonstante der Sedimentation ks = 16,9 ml/g und der Grenzviskosität ergibt
sich der Molekülform-Parameter ks /[
η
] = 1,78, der für ein relativ kompaktes Makromole-
kül spricht [167]. Demnach dürfte es sich bei der Hauptfraktion des hochacetylierten Le-
gumins um ein fast sphärisches, nur leicht expandiertes dimeres Molekül (mit einer Mole-
kularmasse von ungefähr 700 kDa) handeln. Die Lagerung dieser Fraktion führt zu ei-
nem, wahrscheinlich aus sechs Leguminmolekülen bestehenden, Assoziat (s. Kap.
4.2.2.4). Das Viskositätsinkrement beträgt
ν
= 21,2 und dementsprechend
ν
/2,5 = 8,5.
Dieser Wert ist Ausdruck deutlich verringerter Kompaktheit (molekulare Expansion auf
etwa 2,5faches Volumen). Eine Betrachtung über das Verhältnis ks /[
η
] kann wegen der
großen Streuung der sapp-Werte für die 27 S-Komponente mit den vorliegenden Daten
nicht sinnvoll angestellt werden. Als Hinweis auf einen annähernd globulären Zustand
dieser löslichen Assoziate mit nicht allzu großen Abweichungen von der sphärischen Form
kann die recht gute Übereinstimmung der, zum einen aus Sedimentations- und Viskosi-
Diskussion 114
tätsdaten (nach SCHERAGA & MANDELKERN [139]) und zum anderen aus Sedimentati-
onsdaten und Messungen der Lichtstreuung (nach SVEDBERG [137]), berechneten Mol-
massen gewertet werden.
Die Betrachtung der
ν
/2,5-Quotienten von Leguminproben zunehmender Succinylie-
rung in Standardpuffer belegt, daß sich die Kompaktheit der modifizierten Moleküle zu-
nächst nur langsam verringert (von nativ = 3,4 auf 3,9 bei 33%), zwischen etwa 60 %
und 80 % entsprechend beginnender molekularer Expansion schon deutlich abnimmt
(65 % ≈ 6,1; 76 % = 6,0) aber erst nach einsetzender Succinylierung der Hydroxylgrup-
pen drastisch sinkt (
ν
/2,5 = 10,9). Der Vergleich mit den von CREETH & KNIGHT [164]
für andere Proteine berechneten Werte zeigt, daß es sich beim hochsuccinylierten Legu-
min nicht um ein kompaktes sphärisches Molekül handelt. Das Volumen des relativ ent-
falteten Proteins erhöht sich auf etwa das Dreifache des Volumens vom nativem Legu-
minmolekül. Am Beispiel einer 99 % succinylierten Leguminprobe konnte festgestellt
werden, daß die Ionenstärke des Lösungsmittels die Molekülform des hochacylierten A-
ckerbohnen-Legumins stark beeinflußt. Die Quotienten
ν
/2,5 wurden berechnet. Sie er-
geben mit steigender Ionenstärke des Lösungsmittels eine Abnahme von 13,7 (I=0,1)
über 10,9 (I=0,5) nach 9,4 (I=1,0), was einer Erhöhung der Kompaktheit des stark
expandierten Moleküls durch die stabilisierenden Effekte hoher Ionendichte entspricht.
Im Puffer der niedrigsten Ionenstärke ist die Konzentrationsabhängigkeitskonstante ks
der erschöpfend succinylierten Leguminprobe besonders groß, und der Koeffizient ks /[
η
]
nimmt mit 2,5 einen hohen Wert an, vergleichbar mit dem des Thyroglobulins aber auch
dem von Gelatine [164]. Die extrem geladene 3 S-Untereinheit ist im Puffer niedriger
Ionenstärke als Polyelektrolyt aufzufassen, was auf relativ starke elektrostatische Wech-
selwirkungen und eine daraus resultierende expandierte, asymmetrische Molekülform
hinweisen kann. Die Unterscheidung zwischen elektrostatischen und hydrodynamischen
Effekten ist jedoch problematisch [164]. Im Standardpuffer ist dagegen kaum eine
Konzentrationsabhängigkeit des Sedimentationskoeffizienten von erschöpfend
succinyliertem Legumin bestimmbar; ks ist praktisch Null, so daß ks /[
η
] nicht berechnet
werden kann. In hoher Ionenstärke (I=1,0) ergibt das Verhältnis ks /[
η
] den Wert 1,4.
Durch die hohe Ionendichte erfolgt die Abschirmung der Molekül-Ladung. Im
Zusammenhang mit dem Viskositätsinkrement weist der ks /[
η
]-Wert auf das Vorliegen
als entfaltetes Molekül hin [164]. Das 99 % succinylierte Legumin im Phosphatpuffer
hoher Ionenstärke läßt sich demnach als quasi ungeladenes, stark entfaltetes
Makromolekül auffassen.
• Diskussion der spektroskopischen Untersuchungen
Neben den Ergebnissen der hydrodynamischen Untersuchungen belegt auch die spektro-
skopische Charakterisierung das Vorhandensein deutlicher Strukturunterschiede zwischen
Diskussion 115
nativem und acyliertem Protein einerseits, andererseits auch zwischen den succinylierten
und den acetylierten Leguminderivaten bei vergleichbaren Modifizierungsgraden.
Durch die Acetylierung erfolgt eine deutliche Konformationsänderung, was sich in der
Rotverschiebung der Fluoreszenzemission (Abbildung 43) und der Blauverschiebung der
UV-Absorptionsbanden (Abbildung 50 und Abbildung 52) ausdrückt und sich durch
den Übergang der Chromophoren in eine stärker polare Umgebung, d. h. durch einen
stärker entfalteten Zustand der Moleküle begründen läßt [144, 168, 169]. Demnach dürf-
te die Änderung der Konformation zwischen 77 % und 98 % N-Acetylierung am größten
sein. An Hand vergleichender Untersuchungen der Tryptophan-Fluoreszenz von 17 nati-
ven und denaturierten Proteinen ist festgestellt worden, daß die Tryptophan-
Quantenausbeute für native Proteine größer oder kleiner sein kann als die der freien A-
minosäure, und eine einfache Beziehung zwischen Exponierung und Quantenausbeute
oder Fluoreszenzintensität der Tryptophanreste nicht abgeleitet werden kann [170]. Die
Interpretation der Fluoreszenzintensität kann daher nur äußerst zurückhaltend erfolgen.
Die Zunahme der relativen Fluoreszenzintensität bei einer Acetylierung von 37-58 % der
Aminogruppen deutet auf eine zumindest geringfügig veränderte Struktur dieser teilweise
modifizierten Leguminmoleküle hin. Das Phänomen der mit dem Acylierungsgrad zu-
nächst zu- und ab einem gewissen Grad wieder abnehmenden Fluoreszenzintensität ist
bereits am Beispiel der succinylierten 11 S-Proteine aus Erbsen [131] und Erdnüssen
[18] beschrieben und diskutiert worden. SHETTY & RAO [18] erklären diesen Effekt durch
die Bildung einer neuen Proteinstruktur, in der die Chromophoren stärker im Inneren
“vergraben” sind, wodurch eine höhere Quantenausbeute zustande kommt. Im allgemei-
nen wird die Proteindenaturation durch die Abnahme der Fluoreszenzintensität aufgrund
der Änderungen in der Umgebung der Tryptophan- und Tyrosinreste begleitet [171], was
mit der deutlichen Fluoreszenzabnahme der 98 % acetylierten Probe korreliert. Aus den
UV-Ableitungsspektren 2. Ordnung (Abbildung 52) kann die zwischen 40 % und 80 %
N-Blockierung zunehmende Exponierung von Tyrosin abgeleitet werden (Abbildung 53).
Die bei weiterer Modifizierung (98 %) zu beobachtende Abnahme des a/b-Quotienten
[146] dürfte auf die Acetylierung der phenolischen Hydroxylgruppen bei extremer Modifi-
zierung und die daraus resultierende Verringerung der Absorption des Tyrosins einerseits,
andererseits auf eine zunehmende Tryptophan-Exponierung zurückzuführen sein. Die CD-
Spektren acetylierter Leguminderivate im fernen UV (Abbildung 61) weisen bereits bei
58 % Modifizierung auf eine Änderung der Konformation gegenüber dem nativen Protein
hin. Aus der Berechnung der entsprechenden Sekundärstrukturanteile [34, 148] (Tabelle
14) kann man folgern, daß aufgrund des praktisch gleichbleibenden Gehaltes an
β-Strukturen die Sekundärstruktur des Legumins, sogar nach erschöpfender Acetylie-
rung, weitgehend erhalten bleibt. Nach ZIRWER et al. [33] und PLIETZ et al. [51] sind
die β-Strukturen für die Stabilisierung der Domänen von 11 S-Samenglobulinen entschei-
Diskussion 116
dend, so daß sich die Verringerung des ohnehin geringen α-Helix-Anteils infolge Acetylie-
rung kaum entscheidend auf die Domänenstruktur auswirken dürfte [51, 151, 172]. So-
mit kann man aus den CD-spektroskopischen Untersuchungen für die Konformation von
Legumin schlußfolgern, daß die Acetylierung zur Änderung der Tertiärstruktur führt (s.
Abbildung 62), die Sekundärstruktur dagegen weitgehend unverändert bleibt. Die Da-
ten der UV- und Fluoreszenzmessungen machen deutlich, daß die (Tertiär-)Struktur von
Ackerbohnen-Legumin insbesondere im Bereich zwischen 77 und 98 % Aminogruppen-
Acetylierung nachhaltig modifiziert wird. Die umfassenden strukturellen Änderungen kön-
nen mit der in diesem Bereich extensiv erfolgenden Acetylierung der Hydroxylgruppen
erklärt werden.
Die Succinylierung bewirkt im Unterschied zur Acetylierung lediglich eine Rotverschie-
bung der Fluoreszenzemission um 1-3 nm (Abbildung 42). Die relative Intensität der
Fluoreszenz nimmt bis 68 % N-Succinylierung ab, steigt danach nochmals an (80 %) und
fällt bei hoher Acylierung (95 % der Aminogruppen) wieder drastisch ab. Das spricht ei-
nerseits für die (unstetig) zunehmende Exponierung der Chromophoren im Verlauf der
Succinylierung und andererseits für das Vorliegen einer speziellen Konformation bei 70-
80 % N-succinylierten Proteinen. Analog zu diesen Beobachtungen ist die Unstetigkeit im
Bereich von 70-80 % N-Succinylierung auch anhand der UV-Ableitungsspektren festzu-
stellen (stetige Abnahme der UV-Absorption bis 68 %, leichter Anstieg bei 80 % und er-
neute Abnahme bei 95 % Modifizierung). Diese Veränderungen spiegeln sich auch im
Viskositätsverhalten (Anstieg der Grenzviskosität bis 68 % Succinylierung, Abnahme bei
76 % succinylierten Aminogruppen und anschließend wieder Zunahme, s. Abbildung
34) wider. Die stufenweise Succinylierung bewirkt eine Blauverschiebung der UV-Ban-
den, die im Unterschied zur Acetylierung relativ kontinuierlich erfolgt (Abbildung 49)
und besonders im Bereich der Tyrosin-Absorption deutlich wird. Sie spiegelt die zuneh-
mende Entfaltung des Proteins wider. Der Verlauf des a/b-Verhältnisses nach
RAGONE et al. [146] (Abbildung 53) als Ausdruck der Chromophoren-Exponierung un-
terstützt die Annahme bezüglich einer speziellen Konformation der 70-80 % succinylier-
ten Leguminpräparate, was im Zusammenhang mit der Dominanz der 7 S-Untereinheiten
in eben diesem Bereich der Modifizierung stehen dürfte. Die Tyrosinreste werden bis etwa
70 % Aminogruppen-Blockierung stark exponiert (viel stärker als im Falle der Acetylie-
rung), dann sinkt der a/b-Wert bis etwa 80 % wieder, um bei 95 % N-Succinylierung,
trotz der in diesem Bereich eintretenden massiven Modifizierung der Hydroxylgruppen,
weiter anzusteigen. Die starke Exponierung der Tyrosinreste des dissoziierten Legumins
liefert einen weiteren Beweis für die starke Expansion der succinylierten Legumin-Unter-
einheiten. Daneben läßt sich der Anstieg des a/b-Quotienten im hochmodifizierten Be-
reich auch durch die Instabilität der O-Succinyl-Bindung (s. Kap. 4.1) erklären. Neben
der Abnahme der Elliptizitätswerte im nahen UV-Bereich (Abbildung 64), die durch eine
Diskussion 117
erhöhte Beweglichkeit der aromatischen Reste mit steigendem Grad der Succinylierung
erklärt werden kann, zeigen die succinylierten Leguminproben (wie auch die acetylierten
Derivate) charakteristische Veränderungen des Circulardichroismus im fernen UV-Bereich
(Abbildung 63), die eine deutliche Abnahme des helikalen Konformationsanteils nach-
weisen. Kennzeichnend ist einerseits die Abnahme der positiven Elliptizität im Maximum
um 195 nm und die Blauverschiebung der Minima zu 206 nm mit leicht erhöhtem negati-
ven Elliptizitätswert andererseits [147, 173]. Nach den mit dem CONTIN-Verfahren [34]
erhaltenen Daten (s. Tabelle 14) bleibt der Anteil der domänenstabilisierenden ß-
Faltblattstruktur [51, 151, 172, 174] nach Modifizierung praktisch unverändert. Demnach
nimmt durch erschöpfende Succinylierung lediglich der Anteil an α-Helix um etwa 8 %
zugunsten ungeordneter Sekundärstrukturanteile ab. Dies würde bedeuten, daß die Suc-
cinylierung des Proteins nicht zu einem vollständig entfalteten Protein führt sondern Teile
der Sekundärstruktur erhalten bleiben. Für die Annahme, daß die vorgenommene chemi-
sche Modifizierung zu anderen Strukturen (Restsekundärstrukturen) führt als eine Dena-
turation durch Hitzebehandlung oder Einwirkung von Denaturantien gibt es Gründe
[174, 175]. Dennoch sind die errechneten Werte für die ß-Struktur-Anteile mit Zurück-
haltung zu betrachten, da die Berechnung des Anteils an ß-Faltblatt-Konformation in de-
naturierten Proteinen mittels Circulardichroismus-Spektroskopie nur mit geringerer Ge-
nauigkeit erfolgen kann als die Bestimmung des Helix-Anteils [147]. Die nach dem
CONTIN-Verfahren [34] berechneten Sekundärstrukturanteile hängen stark von den in
der Referenzdatenbank enthaltenen Standardproteinen ab und scheinen im Falle entfalte-
ter Proteine für α-Proteine realistischere Werte als für β-Proteine (wie das Ackerbohnen-
Legumin) zu liefern. Allerdings werden die hier mittels CD-Spektroskopie ermittelten Da-
ten durch die Ergebnisse der infrarotspektroskopischen Untersuchung von 95 %
N-succinyliertem Erbsen-Legumin gestützt, wonach durch die Modifizierung neben einer
Abnahme des Helix-Gehaltes von 16 % auf 6 % sogar der Anstieg des Anteils an ß-
Faltblattstruktur von 41 % auf 50 % erfolgt [176].
• Einfluß der Ionenstärke auf die Konformation (spektroskopische Betrachtungen)
Die Bedeutung elektrostatischer Wechselwirkungen für die hydrodynamischen Eigen-
schaften wie Viskosität und Sedimentationsverhalten von succinylierten Leguminderiva-
ten ist, auf der Grundlage von diversen Untersuchungen in drei Phosphatpuffersystemen
unterschiedlicher Ionenstärke, bereits beschrieben und diskutiert worden. Darüber hinaus
sollten anhand von spektroskopischen Untersuchungen (Kap. 3.3.2) ausgewählter Modifi-
kate Aussagen über den Einfluß der Ionenstärke des Lösungsmittels auf die Tertiär- und
Sekundärstruktur getroffen werden.
Die UV-Spektroskopie einer 64 % N-succinylierten Leguminprobe ergab, daß die deut-
lichsten Denaturationseffekte, einher gehend mit der stärksten Exponierung von Tyrosin,
Diskussion 118
im Puffer niedrigster Ionenstärke (I=0,1) zu beobachten sind (Tabelle 13). Mit der Fluo-
reszenzemissionsspektroskopie konnte der konformationsstabilisierende Effekt (Zunahme
der relativen Fluoreszenz, Abbildung 47) durch einen Puffer hoher Ionenstärke (I=1,0)
bestätigt werden. Die Fluoreszenz (sowohl Intensität als auch die Lage der Banden) von
hochsuccinyliertem Legumin zeigt sich dagegen von der Ionenstärke relativ unabhängig
(Abbildung 48). Unter Berücksichtigung des in dieser Arbeit nachgewiesenen starken
Einflusses der Ionenstärke auf die hydrodynamischen Eigenschaften hochsuccinylierter
Legumine, kann dieser Befund nur in der Weise interpretiert werden, daß die Exponie-
rung der Aromaten von den durch die veränderte Ionenstärke induzierten Konformation-
sänderungen des bereits stark expandierten Moleküls nur geringfügig betroffen ist. Auch
das nach RAGONE et al. [146] den UV-Ableitungsspektren 2. Ordnung zu entnehmende
Verhältnis der Tyr/Trp-Exponierung hochsuccinylierter Leguminproben ist in den drei Lö-
sungsmitteln nahezu unverändert (Tabelle 13). Die Erhöhung der Ionenstärke bewirkt
jedoch eine geringfügig bathochrome Verschiebung der UV-Absorptionsbanden succiny-
lierter Proben (Abbildung 59, Abbildung 60). Das weist auf eine, die vorhandenen
Reststrukturen stabilisierende Wirkung des Puffers hoher Ionendichte hin. Diese Annah-
me wird durch die CD-Spektroskopie im nahen UV-Bereich unterstützt. Sowohl die 64 %
(Abbildung 67) als auch die 99 % (Abbildung 68) N-succinylierte Probe, erbringen
durch die Zunahme der Elliptizitäten mit steigender Ionenstärke, entsprechend einer ver-
ringerten Beweglichkeit der aromatischen Reste, einen Nachweis über Veränderungen in
der Tertiärstruktur. Dieser Stabilisierungseffekt durch hohe Lösungsmittel-Ionenstärke
befindet sich in guter Übereinstimmung mit den Ergebnissen der hydrodynamischen Un-
tersuchungen. Der Vergleich der Nah-UV-CD-Spektren mit den entsprechenden Elliptizi-
tätswerten des nativen Proteins belegt, daß die hohe Ionenstärke (I=1,0) selbst bei mitt-
lerem Modifizierungsgrad bestenfalls eine partielle Rückfaltung des Proteins bewirkt. Die
ursprüngliche Tertiärstruktur dürfte zumindest im Fall der hochsuccinylierten Legu-
minprobe bei einer maximalen Elliptizität von 25 deg•cm2•dmol-1 (I=1,0) nur in sehr ge-
ringem Ausmaß vorhanden sein. Daneben liefert die Fern-UV-CD-Spektroskopie der
hochsuccinylierten Probe in Phosphatpuffer niedriger Ionenstärke (I=0,1) ein Spektrum,
das, mit einer Blauverschiebung des Minimums von 216/209 nm zu 199 nm, praktisch
dem eines entfalteten Proteins entspricht (Abbildung 66). Der daraus mit Hilfe des
CONTIN-Programms [34] berechnete Anteil von 30 % ungeordneten Strukturbereichen
ist, mit einer Erhöhung um weit über 100 % im Vergleich zum nativen Legumin, be-
trächtlich. Die Entfaltung bedingt den weitgehenden Verlust der α-Helix-Strukturbereiche.
Darüber hinaus nimmt der Anteil der stabilisierenden β-Strukturanteile nach CONTIN nur
im Puffer niedriger Ionenstärke durch die Succinylierung um 10 % ab (Tabelle 15).
Diskussion 119
Aus meßtechnischen Gründen konnte nur der Einfluß der Ionenstärke auf die Tertiär-
struktur (UV- und Fluoreszenzemissionsspektroskopie) acetylierter Leguminproben un-
tersucht werden. Die UV-Absorption acetylierter Derivate in Phosphatpuffern
unterschiedlicher Ionenstärke unterscheidet sich nicht wesentlich (Abbildung 55). Das
UV-Ableitungsspektrum der 58 % N-acetylierten Probe zeigt jedoch ausgehend vom
Standardpuffer eine hypsochrome Verschiebung der Tyrosin-UV-Absorptionsbanden bei
niedriger Ionenstärke (Abbildung 56). Aus dem Ableitungsspektrum der
hochmodifizierten Probe läßt sich die stärkste Exponierung von Tyrosinresten
(= maximaler a/b-Wert, s. Tabelle 13) in Puffer niedrigster Ionenstärke ableiten, was
als Hinweis auf eine begrenzte Abschwächung von Konformationsänderungen durch
erhöhte Ionenstärke (ab I=0,5) gewertet werden kann. Diese Vermutung wird durch die
beobachtete Beeinflussung der Fluoreszenzeigenschaften mäßig acetylierter (58 %,
Abbildung 45) und hochacetylierter (98 %, Abbildung 46) Leguminproben gestützt.
Die relative Fluoreszenzintensität nimmt durch die Erhöhung der Ionenstärke zu, was als
Zunahme der Kompaktheit gewertet werden kann. Besonders große
Intensitätsunterschiede wurden nach gemeinsamer Anregung von Tyrosin und
Tryptophan (280 nm) gemessen. Die Verschiebung der Fluoreszenzemissionsmaxima ist
aufgrund der sehr breiten, teilweise „inhomogenen“ Spektren nur schwer zu diskutieren.
Der Verlauf der Spektren kann durch das Vorliegen von zwei (oder mehr) Molekülen
abweichender Tertiärstruktur und dementsprechend auch unterschiedlichen (Fluoreszenz-
)Eigenschaften begründet werden. Im Falle der hochacetylierten Probe z. B. ist der
Spektrenverlauf in hoher Ionenstärke interpretierbar, wenn man bedenkt, daß in der
Probe nebeneinander 17 S-Dimere und die 3 S-Dissoziate vorliegenden. Sie weisen
Konformationsunterschiede auf, sind von unterschiedlicher Kompaktheit. Die Erhöhung
der Ionenstärke bewirkt einerseits eine Blauverschiebung des
Fluoreszenzintensitätsmaximums von 328 auf 324 nm (Exc. 280 nm) bzw. von 333 auf
321 nm (Exc. 295 nm, Abbildung 46), was auf eine Komponente mit einer stärker glo-
bulären Konformation als im Lösungsmittel niedriger Ionenstärke schließen läßt. Anderer-
seits deutet die Ausbildung eines zweiten Maximums bei 327 bzw. 331 nm auf eine Prote-
inkomponente hin, deren Chromophoren sich in vergleichsweise polarerer Umgebung
befinden. Dabei könnte es sich um eine acetylierte Proteinkomponente handeln, deren
Struktur durch die Variation der Ionenstärke zwischen I=0,1 und I=1,0 nicht wesentlich
verändert wird, deren Aromaten jedoch durch erhöhte Ionenstärke in eine zunehmend
kompaktere Struktur eingebettet werden. Die Konformation (Sekundär- und Tertiärstruktur) von nativem Legumin wird durch die
Variation der Ionenstärke zwischen I=0,1 und I=1,0 nur marginal beeinflußt.
Zusammenfassend bleibt festzustellen, daß die zunehmende Succinylierung in allen drei
Puffern in annähernd gleicher Weise zur schrittweisen Denaturation führt, was sich in
einer Rotverschiebung der Fluoreszenzemission und einer Blauverschiebung der UV-
Diskussion 120
Absorption ausdrückt. Die CD-Spektroskopie liefert den Beweis für den generell stabilisie-
renden Effekt hoher Ionenstärke auf die Tertiärstruktur, selbst auf die stark expandier-
ten, denaturierten Legumin-Untereinheiten, sowie das Forcieren der Denaturationspro-
zesse von hochsuccinyliertem Legumin in Phosphatpuffer niedriger Ionenstärke. Die stets
nachweisbare Rotverschiebung der Fluoreszenzemission infolge Acetylierung verdeutlicht,
daß unter den Bedingungen der drei untersuchten Puffersysteme die Chromophoren je-
weils in eine stärker polare Umgebung gelangen und belegt somit, die unabhängig von
der Ionenstärke, durch die zunehmende Acetylierung induzierte Expansion des Legumin-
moleküls.
• Diskussion der Untersuchungen zur Proteinstabilität
Veränderungen der Proteinstruktur haben Einfluß auf die Proteinstabilität. Diese Struktur-
bzw. Konformationsstabilitätsänderungen wurden im Rahmen dieser Arbeit als thermi-
sche Stabilität anhand von DSC-Messungen (Kap. 4.2.5) und als Stabilität gegenüber
Denaturans durch Untersuchungen der Fluoreszenzemission (Kap. 4.2.6) erfaßt.
Die Klärung der Frage, ob der Entfaltungsprozeß als einstufiger oder als mehrstufiger
Vorgang beschrieben werden kann, ist Grundvoraussetzung für die Interpretation der
thermodynamischen Daten. Die Entfaltung kleiner globulärer (Ein-Domänen-)Proteine
(Mr = 12-30 kDa) ist ein Gleichgewichtsübergang zwischen den beiden thermodynami-
schen Proteinzuständen „nativ“ und „denaturiert“ [177]. Komplexere und höhermolekula-
re Proteine wie das Ackerbohnen-Legumin weisen verschiedene strukturelle Domänen
auf, die von weniger geordneten Bereichen unterbrochen werden, deren Entfaltung sich
jedoch ebenfalls durch einen einstufigen Prozeß beschreiben läßt [178, 149]. Notwendi-
ges und hinreichendes Kriterium für eine einstufige Modellierung des Entfaltungsprozes-
ses ist die Übereinstimmung von experimentell bestimmter thermischer Entfaltung-
senthalpie ∆Hcal und der nach der VAN´T HOFF-Gleichung (Gleichung 32) berechneten
Enthalpie ∆HvH [177, 179, 180].
2
ln
TR
H
T
KvH
p
∆
=
∂
∂ Gleichung 32
Das Verhältnis ∆Hcal/∆HvH ist für eine Reihe von 11 S-Globulinen von GRINBERG et al.
[149] bestimmt worden. Der für das Ackerbohnen-Legumin ermittelte Wert von 1,01 er-
laubt die Anwendung des Einstufen-Modells auf den Entfaltungsprozeß [149, 181]. Das
Leguminmolekül läßt sich demnach in erster Näherung als eine Anordnung von 12 wei-
testgehend thermodynamisch äquivalenten Domänen, entsprechend den konstituieren-
den Polypeptidketten, beschreiben [149]. Die thermodynamische Äquivalenz dieser Do-
mänen begründet die Annahme eines hochkooperativen, näherungsweise einstufigen Le-
gumin-Entfaltungsprozesses. Der thermodynamische Beitrag, der aus den Wechselwir-
Diskussion 121
kungen zwischen den konstituierenden Polypeptidketten innerhalb der Untereinheiten
oder zwischen den Untereinheiten resultiert, ist im Vergleich zum Wärmebeitrag durch
die Entfaltung der Ketten vernachlässigbar gering [149].
Die spezifische Denaturationsenthalpie ist ein universelles Charakteristikum der unter-
suchten Proteinprobe. Die abnehmende spezifische Denaturationsenthalpie (Abbildung
75) deutet auf eine relativ kontinuierliche Abnahme der Stabilität von Legumin und sei-
nen Untereinheiten sowohl mit zunehmender Acetylierung als auch, in noch stärkerem
Maß, infolge Succinylierung hin. Der demnach kontinuierliche Verlust der kompakten glo-
bulären Struktur gibt keinen Hinweis auf das Vorhandensein von Intermediaten mit be-
sonders stabiler Konformation.
Für den Vergleich der Eigenschaften von Substanzen mit unterschiedlichen Strukturen
sind die molaren Größen oftmals informativer als die spezifischen. Im vorliegenden Fall
sollen daher die thermodynamischen Parameter auf ein Mol konstituierende Kette, also
MW/12 (s. o.), bezogen werden. Auf diese Weise zeigt man, wie die Denaturationsenthal-
pie der Legumin-Untereinheit von Art und Grad der Modifikation abhängt, und daß inter-
molekulare und „intermonomere“ Wechselwirkungen nicht in die Denaturationsenthalpie
eingeschlossen sind. Die nachfolgende Tabelle enthält die thermodynamischen Parameter
einiger Leguminproben bezogen auf ein Mol konstituierende Kette sowie die daraus nach
Gleichung 20 (S. 44) für eine Temperatur von 20 ° C berechnete molare Thermostabilität
∆G(293 K).
Tabelle 18: Mikrokalorimetrisch (DSC) ermittelte thermodynamische Parameter von nativem Le-
gumin und einigen ausgewählten acylierten Derivaten im Vergleich
nativ 33 % suc 37 % ac 96 % suc 98 % ac
Td [K] 363 ± 1 358 ± 1 362 ± 1 327 ± 2 327 ± 2
∆
Η
cal [kJ/mol] 583 ± 30 321 ± 15 467 ± 15 ∼ 29 ∼ 146
∆Cp [kJ/mol•K] 9,04 ± 0,88 8,17 ± 0,88 2,04 ± 0,29 0,58 6,71 ± 0,58
∆G(293 K) [kJ/mol] 48 7 75 2 3
Die molaren Größen wurden mit einer Molmasse von Mw = (350 000 g/mol)/12 berechnet, der Wert von ∆Hcal
beschreibt die totale molare Denaturationsenthalpie.
Die in Tabelle 16 und Tabelle 18 für natives Ackerbohnen-Legumin enthaltenen Werte
stimmen mit den von GRINBERG et al. [149] ermittelten Daten weitgehend überein. Die
Abnahme der Konformationsstabilität mit zunehmender Modifizierung, in stärkerem Maße
infolge Succinylierung, ist in Kap. 4.2.5 bereits beschrieben worden. Ebenso nimmt die
für den einfachen Fall eines Einstufenprozesses und T = 293 K berechnete molare Ther-
mostabilität, ∆G, durch die Succinylierung ab. Sie wird bereits durch die Modifizierung
von 33 % der Aminogruppen des Legumins stark verringert, sinkt jedoch bei zunehmen-
Diskussion 122
der Blockierung der funktionellen Gruppen weiter bis zum fast vollständigen Verlust der
Tertiärstruktur. Im Falle der Acetylierung fällt auf, daß die molare Thermostabilität nach
einer Modifizierung von 37 % der Aminogruppen zunächst deutlich zunimmt. Wie bereits
durch die spektroskopischen Untersuchungen gezeigt wurde (s. Abbildung 43), ändert
sich die Konformation zunächst bis 37 % Acetylierung (erhöhte Fluoreszenz entsprechend
stärkerer Vergrabung der Chromophoren) in Richtung einer Zunahme der Molekülkom-
paktheit. Nach weiterer, vor allem hoher (≥ 70 %) Modifizierung ist die Auffaltung des
Moleküls nachweisbar. In guter Übereinstimmung dazu sind die hochacetylierten Legu-
minderivate, ähnlich den hochsuccinylierten Leguminproben, nur von geringer Thermo-
stabilität. Der Vergleich der molaren thermodynamischen Denaturationsparameter von
hochsuccinylierten und hochacetylierten Proben deutet dennoch auf die Existenz einer
geringfügig höheren Konformationsstabilität der acetylierten Derivate hin.
Zur Untersuchung der Konformationsstabilität wurden die Ergebnisse der DSC für die
Charakterisierung der Tertiärstruktur [177, 178] und die der analytischen Ultrazentrifu-
gation für die Charakterisierung der Quartärstruktur eines Proteins [182] in Zusammen-
hang gebracht. Aus der Deconvolution der Ultrazentrifugationsbilder und der Thermo-
gramme wurde die Zusammensetzung der untersuchten Proben und die thermodynami-
schen Charakteristika für die Stabilität der Tertiärstruktur der verschiedenen Formen des
Proteins ermittelt. Das Auftreten verschiedener Peaks in den Thermogrammen entspre-
chend den unterschiedlichen Proteinformen (11-, 7- und 3 S) ist mit den Ergebnissen der
Ultrazentrifugation, für die in vielen Stufen untersuchte Succinylierung, gut in Einklang zu
bringen. Es wurde gefunden, daß die Succinylierung zu einer Dissoziation der hexameren
11 S-Form des Proteins in seine trimere 7 S-Form und die Untereinheiten (3 S-Form)
führt und bei steigendem Acylierungsgrad der Anteil an Untereinheiten auf Kosten der
anderen Formen (11 S und 7 S) wächst. Ausgehend vom nativen Protein (Hexamer) kor-
respondiert das Auftreten eines neuen Peaks im Thermogramm mit dem Auftreten eines
neuen Peaks im Ultrazentrifugationsbild; die Anzahl der konstituierenden Kurven der
Thermogramme stimmt mit der Anzahl der mittels Ultrazentrifugation beobachteten
Komponenten überein. Die „Identifizierung“ der deconvolutionierten Thermogrammpeaks
acetylierter Derivate ist weitaus schwieriger. Sie erfolgte einfach in Anlehnung an die
Zuordnung für die thermischen Übergänge der succinylierten Leguminderivate und steht
dadurch im Widerspruch zu den Ultrazentrifugationsdaten. Die durch Peak-Deconvolution
berechnete Denaturation einer der „7 S“-Leguminform zugeordneten Komponente ist rein
formalistisch und findet keine Bestätigung durch die Ultrazentrifugation oder andere Un-
tersuchungsmethoden. Auch wird der Aggregation keine Rechnung getragen. Die Bimo-
dalität der Thermogramme kann aber ebenso in der unterschiedlichen Konformationssta-
bilität von Polypeptidketten anderer als der zugeordneten Leguminformen begründet
Diskussion 123
sein, was für das Ergebnis der DSC-Untersuchungen nur von untergeordneter Bedeutung
ist. Es wird an dieser Stelle nochmals darauf hingewiesen, daß der KIRCHHOFF-Plot [149,
183] die Annahme einer homologen Tertiärstruktur der unterschiedlichen Leguminformen
unterstützt. Die mit zunehmender Modifizierung (stärker bei Succinylierung) und in der
Folge 11S > 7S > 3S sinkende Stabilität der Tertiärstruktur bezeichnet jeweils die Ab-
nahme der Konformationsstabilität der die unterschiedlichen Leguminformen konstituie-
renden Polypeptidketten.
Als weitere Informationsquelle für die Abschätzung des Einflusses der Acylierung auf die
Konformationsstabilität von Ackerbohnen-Legumin wurde die Entfaltung in Gegenwart
von Denaturans betrachtet. Aus den in Kap. 4.2.6 bereits genannten Gründen konnte die
Denaturansstabilität acylierter Leguminproben nur in Gegenwart von Guanidiniumchlorid,
nicht aber die Harnstoff-Denaturationsstabilität gemessen werden. Für den Mechanismus
der Proteindenaturation mit Guanidinium-Hydrochlorid werden von TANFORD [179] hyd-
rophobe und elektrostatische Wechselwirkungen mit den polaren Seitenketten diskutiert.
Die Denaturanshalbwertkonzentration [GuHCl]1/2 hängt jedoch in erster Näherung nicht
vom Entfaltungsmechanismus ab [126]. Grundlegende Voraussetzungen für diese Metho-
de sind jedoch die Annahme einer einstufigen Denaturation (s. o.) und ihre Reversibilität.
Es wurde nachgewiesen, daß neben der Denaturation mit Harnstoff auch die Guanidini-
um-Denaturation von succinylierten Proben mit Modifizierungsgraden über 64 % zu irre-
versiblen Veränderungen der Proteinkonformation führt, weshalb zu höher succinylierten
Leguminderivaten keine Aussagen getroffen werden können. Die leichte Zunahme der
Denaturanshalbwertkonzentration [GuHCl]1/2 im Vergleich zum nativen Legumin ist durch
die bei gleichbleibend hohem ∆GPuffer-Wert verringerte Abhängigkeit der Denaturansstabili-
tät von der Denaturanskonzentration bedingt. Sie allein läßt keine sichere Aussage über
eine Änderung der Konformationsstabilität zu. Die Steilheit der Entfaltungskurve, und
somit auch der Wert m, verringert sich z. B. bei Abweichungen des Entfaltungsprozesses
vom einstufigen (two-state) Modell [125]. Derartige Modellabweichungen kann man nicht
völlig ausschließen. An einer gegenüber Denaturans (Guanidinium) sehr stabilen Konfor-
mation der 47 % acetylierten Leguminprobe besteht jedoch kein Zweifel.
Die erhöhte Thermostabilität der 37 % acetylierten Probe und die mindestens mit nati-
vem Legumin vergleichbar hohe Denaturansstabilität der 47 % acetylierten Probe fallen
beide in den Bereich, in dem bereits die Ergebnisse der spektroskopischen Untersuchun-
gen auf eine veränderte, kompaktere Molekülform hindeuten. Die Untersuchungen zur
Strukturstabilität sprechen für eine gegenüber Temperatur und Denaturans erhöhte Sta-
bilität der Leguminstruktur nach Acetylierung von etwa 30-50 % der Aminogruppen, wo-
gegen durch die weitere Einfuhr von Acetylgruppen die Konformationsstabilität stark
Diskussion 124
vermindert wird. Im Unterschied dazu verringert sich die Leguminstabilität durch die Ein-
fuhr von Succinylgruppen generell, was sicher in erster Linie auf den starken Ladung-
seinfluß zurückzuführen ist.
Zusammenfassung 125
6 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wird der Einfluß einer stufenweisen Acetylierung und Succiny-
lierung des 11 S-Globulins der Ackerbohne (Legumin) auf die Struktur dieses oligomeren
350 kDa-Speicherproteins beschrieben. Erstmalig werden die Ergebnisse einer umfassen-
den physikochemischen Charakterisierung von Acyl-Leguminderiva-ten durch kombinierte
hydrodynamische, chromatographische, spektroskopische und thermodynamische Unter-
suchungen vorgestellt.
Die Acylierung erfolgt vorrangig an den ε-Aminogruppen der Lysinreste und nach deren
weitgehender Modifizierung (> 95 % N-Succinylierung; > 60 % N-Acetylierung) auch an
den Hydroxylgruppen von Serin, Threonin und Tyrosin. In erschöpfend acetyliertem oder
succinyliertem Legumin liegen 50 % der Tyrosinreste acyliert vor, wobei O-Succinyl-
Tyrosin spontan desuccinyliert wird.
Die Succinylierung führt zur stufenweisen Dissoziation des aus 6 polymorphen Unter-
einheiten aufgebauten Leguminmoleküls nach dem Schema: Hexamer
→
Trimer + Mo-
nomer
→
Monomer. Ab etwa 60 % N-Succinylierung tritt in der zweiten Dissoziationsstu-
fe nur das Trimer auf. Es konnte nachgewiesen werden, daß maximale Mengen der trime-
ren 7 S-Komponente nach 60 - 80 % Succinylierung vorliegen. Nach einer Blockierung
von 95 % der Aminogruppen liegen ausschließlich die monomeren Untereinheiten des
Legumins vor.
Die Acetylierung von Legumin bewirkt einen prinzipiell anderen Verlauf der Strukturän-
derung als die Succinylierung: Hexamer
→
Hexamer + Monomer
→
Assoziat + Monomer.
Bis zu Modifizierungsgraden von etwa 80 % bildet die 11 S-Komponente den Hauptanteil.
Erst bei höheren Modifizierungsgraden erfolgt eine partielle Dissoziation in die monome-
ren Untereinheiten (maximal 30 %). Ein 7 S-Dissoziationsprodukt ist nicht nachweisbar.
Als Hauptprodukt hochgradig acetylierter Leguminderivate treten 17 S-Assoziate auf.
Aufgrund der für sie ermittelten Molmasse von etwa 700 000 g/mol, konnte erstmals das
Vorliegen einer Hauptfraktion aus dimeren Leguminmolekülen (12 Untereinheiten) abge-
leitet werden. Dieses Phänomen der Assoziation acetylierter 11 S-Proteine ist bisher nicht
beschrieben worden. Die Untersuchungsergebnisse belegen eindeutig die schrittweise
Oligomerisierung des acetylierten Proteins nach hochgradiger N-/O-Blockierung sowie
den Zusammenhang zwischen der Zahl eingeführter hydrophober Gruppen und der Asso-
ziation über hydrophobe Wechselwirkungen. Lagerungsversuche zeigten, daß in Lösung
die weitere Oligomerisierung von hochacetyliertem Legumin bis hin zu löslichen hexame-
Zusammenfassung 126
ren Legumin-Assoziaten (36 Untereinheiten) mit Sedimentationskoeffizienten von S020,S =
27 S erfolgt.
Aus der Kombination von hydrodynamischen Untersuchungen konnten Aussagen über die
Form der acylierten Moleküle abgeleitet werden.
Es wurde gefunden, daß die Leguminmoleküle bei Succinylierungsgraden zwischen 60
und 80 % mit deutlich verringerter Kompaktheit vorliegen, doch erst nach Succinylierung
der Hydroxylgruppen eine drastische molekulare Expansion auftritt.
Durch das Einführen von Acetylgruppen verringert sich die Kompaktheit des globulären
Moleküls nur wenig. Das 17 S-Assoziat ist gegenüber dem nativem Leguminmolekül
1,5fach expandiert. Es handelt sich um ein relativ kompaktes und nahezu sphärisches
Molekül. Für die höheren Assoziate konnten eine annähernd globuläre Struktur und ge-
ringe Molekülkompaktheit abgeleitet werden.
Für die gezielte Einstellung funktioneller Eigenschaften des Legumins durch Acylierung
sind Ladungs- und Hydrophobizitätsänderungen sowie resultierende Konformationsände-
rungen entscheidend.
Die Veränderung der Hydrophobizität des Legumins infolge Acylierung wurde mit ANS-
Fluoreszenzsondentechnik, RP-HPLC und Verteilung in einem Polymer-Zweiphasensystem
untersucht. Es resultierte ein mit der Anzahl eingeführter Acetylgruppen kontinuierlich
ansteigender S0-Wert als Maß der Oberflächenhydrophobizität. Die Oberflächenhydropho-
bizität der (hoch)succinylierten Proteine ist geringer als die der (hoch)acetylierten Deri-
vate. Durch die Verteilung succinylierter Leguminderivate im Ficoll-Dextran-System wur-
de eine, ab einem Succinylierungsgrad von 65 %, kontinuierlich ansteigende Hydrophilie
nachgewiesen. Die Ergebnisse wurden durch das Erstellen von modifizierten Hydro-
pathieprofilen auf der Grundlage der Legumin-Aminosäuresequenzen untermauert.
Zur physikochemischen Charakterisierung der stufenweise acylierten Leguminderivate
wurden neben analytischer Ultrazentrifugation und dynamischer Lichtstreuung die Kapil-
larviskosimetrie und Präzisionsdichtemessung angewendet.
Die Grenzviskosität succinylierter Legumine erhöht sich ausgehend vom nativen Le-
gumin ([
η
] = 6,1 cm3/g) bis 50 % N-Succinylierung nur geringfügig und bei weiterer
Succinylierung mit einem Zwischenmaximum bei 65 - 70 % stärker. Ein drastischer An-
stieg auf Maximalwerte von [
η
] = 19,3 cm3/g wird für hochgradig N- und O-succinylierte
Derivate nachgewiesen. Die Viskosität succinylierter Legumine ist unter Standardbedin-
gungen (pH 8; I=0,5) erst ab Modifizierungsgraden von 90 % konzentrationsabhängig;
sie nimmt mit steigender Proteinkonzentration zu. Im Unterschied dazu wird eine gene-
rell negative Konzentrationsabhängigkeit der acetylierten Derivate nachgewiesen. Die
Zusammenfassung 127
Grenzviskosität von Legumin wird durch die Acetylierung weniger beeinflußt als infolge
Succinylierung. Bis 50 % N-Acetylierung sind die Werte der Grenzviskosität vergleichbar
mit denen der succinylierten Proteine. Infolge der Acetylierung von 70 - 75 % der Ami-
nogruppen werden minimale Grenzviskositäten induziert, die ab etwa 90 % N-Acety-
lierung auf Werte von maximal [
η
] = 9,0 cm3/g ansteigen.
Das partielle spezifische Volumen nimmt unter Standardbedingungen mit zunehmen-
dem Acetylierungsgrad stetig von ý
nativ = 0,728 cm3/g auf ý
98%ac = 0,701 cm3/g ab. Das
partielle spezifische Volumen succinylierter Leguminderivate ist ab etwa 65 % Modifizie-
rung gegenüber nativem Legumin geringfügig und nach erschöpfender Succinylierung mit
ý
99%suc = 0,705 cm3/g deutlich verringert. Nach der Succinylierung von 75 % Aminogrup-
pen wurde ein maximales partielles spezifisches Volumen von 0,736 cm3/g bestimmt.
Succinylierte und acetylierte Leguminproben unterscheiden sich deutlich in ihren physiko-
chemischen Eigenschaften.
Art und Ausmaß der Konformationsänderungen in Abhängigkeit von Grad und Natur
der chemischen Modifizierung wurden durch Fluoreszenzemissionsmessungen, UV-
Ableitungs- und Differenzableitungsspekten sowie circulardichroitische Spektroskopie im
nahen und fernen UV-Bereich untersucht.
Die mit zunehmender Succinylierung einhergehende Auffaltung des Legumins und der
Verlust geordneter Sekundärstrukturanteile wurden nachgewiesen. Die Fluoreszenzinten-
sität sinkt mit zunehmender Succinylierung bis 68 % kontinuierlich, steigt bei 80 % N-
Succinylierung nochmals an und fällt bei 95 % auf einen Minimalwert. Die Succinylierung
bewirkt eine geringfügige Rotverschiebung der Fluoreszenzemission. Die dementspre-
chende Blauverschiebung der UV-Absorptionsbanden bei zunehmender Modifizierung
spiegelt den mit der Succinylierung einhergehenden Entfaltungsprozeß wider. Die Diffe-
renzableitungsspektren unterstreichen die Beteiligung aller aromatischen Chromophoren
an der Konformationsänderung. Das ermittelte Verhältnis der Tyr/Trp-Exponierung steigt
ausgehend vom nativen Legumin bis 65 % Succinylierung stark an, fällt bei weiterer Mo-
difizierung und erreicht bei erschöpfender Succinylierung einen Maximalwert. Aus dem
Zusammenhang der beschriebenen physikochemischen Eigenschaften und spektroskopi-
schen Studien 60 - 80 % N-succinylierter Leguminderivate wurde ein besonderer
struktureller Zustand abgeleitet, der sich sowohl von der kompakten globulären Kon-
formation des nativen Proteins als auch von der stark expandierten Struktur des erschöp-
fend succinylierten Legumins unterscheidet. Erstmalig konnte gezeigt werden, daß diese
speziellen Eigenschaften 60 - 80 % succinylierter Derivate mit dem Auftreten maximaler
Gehalte des moderat expandierten 7 S-Halbmoleküls korrelieren.
Durch spektroskopische Untersuchungen acetylierter Legumine ließen sich ausgeprägte
Veränderungen in der Tertiärstruktur nachweisen, was mit der Hydrophobizitätserhöhung
Zusammenfassung 128
begründet wurde. Größte Konformationsänderungen treten beim Übergang zwi-
schen 80 und 98 % N-Acetylierung auf. Sie äußern sich in einer drastischen Abnahme
der Fluoreszenzintensität bei Rotverschiebung des Fluoreszenzemissionsmaximums um
etwa 10 nm sowie durch die sprunghafte Blauverschiebung sämtlicher UV-Banden. Diese
Konformationsänderungen wurden auf die Ausbildung von Assoziaten mit aufgelockerter
Molekülstruktur zurückgeführt. Aus der Begünstigung hydrophober Wechselwirkungen
und der größeren molekularen Flexibilität läßt sich für hochacetylierte Leguminderivate
eine erhöhte Grenzflächenaktivität ableiten.
Aus dem Fern-UV-CD-Spektrum von nativem Legumin sind mit 45 % ß-Faltblattstruktu-
ren und 19 % α-helikalen Anteilen für ein 11 S-Globulin typische Werte bestimmt wor-
den. Die CD-Spektren von moderat und hochacetylierten Derivaten weisen auf einen
nahezu unveränderten Anteil der domänenstabilisierenden ß-Faltblattstruktur hin und
liefern Gründe für die Annahme, daß trotz hochgradiger Acetylierung relativ geordnete
Reststrukturen vorliegen. Die in der Literatur für einige hochacylierte 11 S-Globuline
beschriebene scheinbare Zunahme des α-Helixgehaltes wurde widerlegt.
Die Konformationsstabilität der modifizierten Proteine wurde durch DSC untersucht.
Es wurden thermische Übergänge beobachtet, die den einzelnen Leguminformen zuge-
ordnet werden konnten. Die Denaturationstemperatur sinkt in der Abstufung
11 S > 7 S > 3 S und jeweils mit zunehmender Acylierung. Die spezifische Denaturati-
onsenthalpie verringert sich mit zunehmender Modifizierung weitgehend linear. Die mola-
re Thermostabilität hochmodifizierter Legumine ist im Vergleich zum nativen Protein
extrem gering. Moderat acetylierte Derivate sind deutlich thermostabiler als moderat
succinylierte Derivate.
Aussagen über die Konformationsstabilität acylierter Leguminderivate wurden durch fluo-
reszenzspektroskopische Untersuchungen der Entfaltung in Gegenwart von Denatu-
rans getroffen. Die Denaturation von unmodifiziertem Legumin verlief sowohl in Gegen-
wart von Harnstoff als auch von Guanidinium-Hydrochlorid (GuHCl) reversibel. Hingegen
ließ sich die Reversibilität der Entfaltung acylierter Leguminproben lediglich nach Denatu-
ration mit GuHCl nachweisen. Die GuHCl-Denaturation acetylierter Leguminproben ist
mindestens zu 90 % reversibel. Denaturans- und Thermostabilität von Legumin werden
durch eine etwa 50 %ige N-Acetylierung nicht verringert. Die Konformationsstabilität
sinkt nach erschöpfender Acetylierung drastisch. Für succinylierte Leguminproben wur-
de die Entfaltung bei Modifizierungsgraden bis 64 % als reversibel, bei höheren Succiny-
lierungsgraden als irreversibel nachgewiesen. Die Denaturansstabilität wird bereits durch
die Succinylierung von 32 % der Aminogruppen deutlich herabgesetzt und sinkt bei zu-
nehmender Modifizierung bis 50 % weiter. Die Denaturansstabilität von 50 % succinylier-
Zusammenfassung 129
tem Legumin entspricht etwa der verminderten Stabilität hochacetylierter Derivate und
bleibt bei weiterer Erhöhung des Blockierungsgrades auf 65 % unverändert.
Der strukturelle Zustand acylierter Leguminderivate unter wechselnden Milieubedingun-
gen (Einfluß der Ionenstärke) wurde mit hydrodynamischen und spektroskopischen
Methoden untersucht. Dabei wurde gezeigt, daß Neutralsalze einen stabilisierenden Effekt
auf die Struktur von acylierten 11 S-Globulinen ausüben.
Die Elliptizitätswerte succinylierter Derivate steigen mit der Erhöhung der Ionenstärke
von 0,1 auf 1,0 entsprechend einer abnehmenden Beweglichkeit der aromatischen Reste.
Es konnte belegt werden, daß die stärksten Denaturationseffekte im Puffer niedrigster
Ionenstärke auftreten. Die Abnahme der molaren Expansion von erschöpfend succinylier-
tem Legumin mit steigender Ionenstärke wurde nachgewiesen. Das Verringern der Io-
nenstärke von 0,5 auf 0,1 führt aufgrund starker elektrostatischer Wechselwirkungen zu
drastisch veränderten hydrodynamischen Eigenschaften dieses Legumins. Es konnte ge-
zeigt werden, daß die hohe Ionenstärke bestenfalls eine partielle Unterdrückung der
durch die Succinylierung induzierten molekularen Expansion oder Entfaltung des Proteins
bewirkt. Die strukturellen Veränderungen des Proteins können bei geringen Blockie-
rungsgraden kompensiert werden, bei hochsuccinylierten Derivaten ist der Einfluß hoher
Ionenstärke auf die Leguminstruktur geringer.
Die Erhöhung der Ionenstärke bewirkt die Zunahme der Kompaktheit acetylierter Mole-
küle mit größten Effekten nach erschöpfender Acetylierung und verstärkt die Aggregati-
onstendez. In Übereinstimmung damit führt eine Verringerung der Ionenstärke zur stär-
keren Exponierung der Chromophoren.
Literatur 130
7 Literatur
1 FAO Production Yearbook Vol. 50, Statistics Series, Rome (1996) 33
2 Pahl H.: Potential and constraints in prodction and end-uses of grain legumes in Europe. Proc. 3rd
European Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 3-4
3 Gatel F., Champ M.: Grain Legumes in Human and Animal Nutritition. Up to Date Results and Questions.
Proc. 3rd European Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 7-11
4 FAO Food Balance Sheets, Statistics Series, Rome (1996) 133
5 Bourdillon A.: Advantages and constrains of grain legumes for the feed market. Proc. 3rd European
Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 5
6 Kozlowska H., Zdunczyk Z., Honke J.: Legume grains for food and non food uses. Proc. 3rd European
Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 43-47
7 Beelitz H.D., Grosch W.: Lehrbuch der Lebensmittelchemie, Springer-Verlag, Berlin, 1987
8 Belikow W.M., Kharatyan S.G., Besrukow M.G., Wolnowa A.I.: Untersuchung des Nährwertes von selek-
tiv acyliertem Casein. Nahrung 19 (1975) 65-67
9 Schwenke K.D., Rauschal E.J., Linow K.J., Pähtz W.: Chemische Modifizierung von Proteinen. 7. Mitt.
Beinflussung physikochemischer und funktioneller Eigenschaften von Casein durch Succinylierung.
Nahrung 25 (1981) 201-212
10 Murphy M.C., Howell N.K.: Effect of succinylation on the functional and physicochemical properties of
bovine serum albumin. J. Sci. Food Agric. 51 (1990) 109-123
11 Rao A.G.A., Rao M.S.N.: Effect of succinylation on the oligomeric structure of glycinin. Int. J. Peptide
Protein Res. 14 (1979) 307-312
12 Franzen K.L., Kinsella J.E.: Functional properties of succinylated and acetylated soy protein. J. Agric.
Food Chem. 24 (1976) 788-795
13 Thompson L.U., Cho Y.S.: Chemical composition and functional properties of acylated low phytate
rapeseed protein isolate. J. Food Sci. 49 (1984) 1584-1587
14 Nitecka E., Schwenke K.D.: Functional properties of plant proteins. Part 8. Effect of succinylation on
some functional properties of the main globulin fraction from rapeseed (Brassica napus L.). Nahrung 30
(1986) 969-974
15 Schwenke K.D.: Structural studies on native and chemically modified storage proteins from rapeseed
(Brassica napus L.) and related plant proteins. Nahrung 34 (1990) 225-240
16 Canella M., Castriotta G., Bernardi A.: Functional and physicochemical properties of succinylated and
acetylated sunflower protein. Lebensm. Wiss. Technol. 12 (1979) 95-101
17 Beuchat L.R.: Functional and electrophoretic characteristics of succinylated peanut flour protein. J. Agric.
Food Chem. 25 (1977) 258-261
18 Shetty K.Y., Rao, M.S.N.: Effect of succinylation on the oligomeric structure of arachin. Int. J. Peptide
Protein Res. 11 (1978) 305-313
19 Schwenke K.D., Anders K., Junker B., Schneider C.: Chemical and gel electrophoretic characterization of
acetylated faba bean protein isolates. Nahrung 35 (1991) 759-766
20 Schwenke K.D., Dudek S., Mothes R., Raab B., Seifert A.: Physico-chemical and enzymatic studies on
acetylated protein isolates from faba beans (Vicia faba L.). Nahrung 37 (1993) 258-268
21 Schwenke K.D., Prahl L., Danilenko A.N., Grinberg V.J., Tolstoguzov V.B.: `Continuous´ conformational
change in succinylated faba bean protein isolates. Nahrung 34 (1990) 399-401
22 Krause J.-P., Schwenke K.D.: Relationships between adsorption and emulsifying of acetylated protein
isolates from fabe beans (Vicia faba L.). Nahrung 40 (1996) 12-17
23 Krause J.-P.: Grenzflächenverhalten acetylierter Globuline der Ackerbohne (Vicia faba L.). Dissertation,
Universität Potsdam 1995
24 Osborne T. B.: The vegetable proteins. Monographs in Biochemistry, Longmans, Breen & Co, London,
1924
25 Derbyshire E., Wright D.J., Boulter D.: Legumin and vicilin, storage proteins of legume seeds.
Phytochem. 15 (1976) 3-24
26 Schulz G.E.: Structural rules for globular proteins. Angew. Chem. 16 (1977) 24-33
Literatur 131
27 Ludescher R.D.: Physical and chemical properties of amino acids and proteins. In: Food proteins:
Properties and characterization, Nakai S., Modler H.W. (Hrsg.), VCH Publishers, Weinheim, 1996, 23-71
28 Tanford C.: Physical chemistry of macromolecules. Wiley & Sons, New York, 1961
29 Freitas R., Ferreira R., Teixeira A.: Structural Comparison among the major storage proteins from
legume seeds. Proc. 3rd European Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid,
Spain, 240
30 Casey R., Domoney C.: The biochemical genetics of pea storage proteins. Kulturpfl. 32 (1984) 99-108
31 Casey R.: The Seed Composition of Grain Legumes. Proc. 3rd European Conference on Grain Legumes,
14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 73-75
32 Schwenke K.D.: Pflanzliche Samenglobuline als dissoziierende und assoziierende Proteinsysteme.
Nahrung 19 (1975) 69-82
33 Zirwer D., Gast K., Welfle H., Schlesier B., Schwenke K.D.: Secundary structure of globulins from plant
seeds: A re-evaluaton from circular dichroism measurements. Int. J. Biol. Macromol. 7 (1985) 105-108
34 Provencher S.W., Glöckner J.: Estimation of globular protein secundary structure from circular dichroism.
Biochem. 20 (1981) 33-37
35 Sáenz de Miera L.E., Llorente A., Garcia P., Pérez de la Vega M.: Storage protein gene sequences in lentil
(lens). Proc. 3rd European Conference on Grain Legumes, 14-19 November 1998, Valladolid, Spain, 80-
81
36 Plietz P., Zirwer D., Schlesier B., Gast K., Damaschun G., Schwenke K.D.: Comparision of the structures
of different 11S and 7S globulins by small-angle X-ray scattering, quasi-elastic light scattering and
circular dichroism spectroscopy. Kulturpfl. 32 (1984) 159-163
37 Koshiyama I., Fukushima D.: Physico-chemical studies on the 11S globulin in soybeen seeds: Size and
shape determination of the molecule. Int. J. Pept. Prot. Res. 8 (1976) 283-289
38 Wright D.J., Bumstead M.R.: Legume proteins in food technology. Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 304
(1984) 381-393
39 Danilenko, A.N.; Bikbov, T.M.; Burova, T.V.; Grinberg, V.Y.; Tolstoguzov, V.B.: The effect of neutral
salts on the conformational stability of 11 S globulins from some seeds using differential scanning
microcalorimetry. Nahrung 30 (1986) 257-262
40 Plietz P., Damaschun G.: The structure of the 11 S seed globulins from various plant species:
Comparative investigations by physical methods. Stud. Biophys. 116 (1986) 153-173
41 Hawtin G.C., Hebblethwaite P.D.: The faba bean (Vicia faba L.). A Basis of Improvement. Butterword,
London, 1983
42 Schultze-Motel J.: Die archäologischen Reste der Ackerbohne Vicia faba und die Genese der Art. Kul-
turpfl. 19 (1971) 321-358
43 Jacob F., Jäger E.J., Ohmann E.: Kompendium der Botanik, Gustav Fischer Verlag, Jena, 1981
44 Schmandke H.: Die Ackerbohne (Vicia faba) als Lebensmittelrohstoff, Akademie-Verlag, Berlin, 1988
45 Colonna P., Gallant D., Mercier C.: Pisum sativum and Vicia faba carbohydrates: Studies of fractions
obtained after dry and wet protein extraktion processes. J. Food Sci. 45 (1980) 1629-1636
46 Utsumi S., Yokoyama Z., Mori T.: Comparative Studies of subunit compositions of legumins from various
cultivars of Vicia faba L. seeds. Agric. Biol. Chem. 44 (1980) 595-601
47 Müntz K., Horstmann C., Scholz G.: Proteine und Proteinbiosynthese in Samen von Vicia faba L. Kul-
turpfl. 20 (1972) 277-326
48 Wright D.J., Boulter D.: Purification and subunit structure of legumin of Vicia faba L. (broad bean).
Biochem. Journal 141 (1974) 413-418
49 Plietz P., Zirwer D., Gast K., Schlesier B., Damaschun G.: Shape, symmetry, hydration and secondary
structure of the legumine from Vicia faba in solution. Biochim. Biophys. Acta 784 (1984) 140-146
50 Schwenke K.D., Staatz A., Dudek S., Krause J.-P., Noack J.: Legumin-T from faba bean legumin:
isolation, partial characterization and surface functional properties. Nahrung 39 (1995) 193-202
51 Plietz P., Drescher B., Damaschun G.: Relationship between the amino acid sequence and the domain
structure of the subunits of the 11 S seed globulins. Int. J. Biol. Macromol. 9 (1987) 161-165
52 Müntz K., Jung R., Saalbach G.: Synthesis, processing and targeting of legume seed proteins. Annual
Proc. Phytochem. Soc. Europe 35 (1993) 128-146
53 Horstmann C.: Specific subunit pairs of legumin from Vicia faba. Phytochem. 22 (1983) 1861-1866
Literatur 132
54 Horstmann C., Schlesier B., Otto A., Kostka S., Müntz K.: Polymorphism of legumin subunits from field
bean (Vicia faba L. var. minor) and ist relation to the corresponding multigene family. Theoret. Appl.
Genet. 86 (1993) 867-874
55 Heim U.R., Schubert R., Bäumlein H., Wobus U.: The legumin gene family: structure and evolutionary
implications of vicia faba B-type genes and pseudogenes. Plant Mol. Biol. 13 (1989) 653-664
56 Bäumlein H., Wobus U., Pustell J., Kafatos F.C.: The legumin gene family: structure of a B type gene of
Vicia faba and a possible legumin gene specific regulatory element. Nucleic Acids Res. 14 (1986) 2707-
2720
57 Schlesier B., Manteufel R., Rudolph A.: Reinigung und Charakterisierung von Legumin aus Vicia faba L.
Biochem. Physiol. Pfl. 180 (1985) 225-237
58 Howell, N.K.: Chemical and enzymatic modifications. In: Food proteins: Properties and characterization,
Nakai S., Modler H.W. (Hrsg.), VCH Publishers, Weinheim, 1996, 235-280
59 Means G.E., Feeney R.E.: Chemical modifications of proteins. Holden-Day, San Francisco, 1971
60 Feeney R.E., Whitaker J.R.: Chemical and enzymatic modification of plant proteins. In: New protein
foods. Vol. 5, Altschul A.M., Wilcke H.L. (Hrsg.), Academic Press, London, 1985, 181-219
61 Feeney R.E.: Chemical modification of food proteins. In: Food proteins: Improvement through chemical
and enzymatic modifications. Feeney R.E., Whitaker J.R. (Hrsg.), ACS Advances in Chemistry Series 160,
American Chemical Society, Washington DC, 1977, 3-36
62 Glazer A.N., Delange R.J., Sigman D.S.: Chemical modification of proteins. Selected methods and
analytical procedures. Lab. Tech. Biochem. Mol. Biol. 4 (1976) 1-205
63 Nakai S. In: Food proteins: Properties and characterization, Nakai S., Modler H.W. (Hrsg.), VCH
Publishers, Weinheim, 1996, 12
64 Kilara A.: Effects of temperature on food proteins and ist implications on functional properties. Crit. Rev.
Food Sci. Nutr. 23 (1986) 323-395
65 Jimenez-Flores R., Bleck G.T.: Biotechnology. In: Food proteins: Properties and characterization, Nakai
S., Modler H.W. (Hrsg.), VCH Publishers, Weinheim, 1996, 505-534
66 Müntz K., Christov V., Saalbach G., Waddel D., Pickhardt T., Schieder O., Wüstenhagen T.: Genetic
engineering for high methionine grain legumes. Nahrung 42 (1998) 125-127
67 Utsumi S., Kito M.: Improvement of food protein functionality by chemical, physical and biological
modifications. Comments Agric. Food Chem. 2 (1991) 261-278
68 Schwenke K.D.: Enzyme and chemical modification. In: Food proteins and their applications, Damodaran
S., Paraf A. (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, 1997, 393-423
69 Kabirullah M., Wills R.B.H.: Functional properties of acetylated and succinylated sunflower protein
isolate. J. Food Techn. 17 (1982) 235-249
70 Butler P.J.G., Harris J.I., Hartley B.S., Lebermann R.: Reversible blocking of peptide amino groups by
maleic anhydride. Biochem. J. 103 (1967) 78-79
71 Ismond M.A.H., Murray E.D., Arntfield S.D.: Stability of vicilin, a legume seed storage protein, with step-
wise electrostatic modification. Int. J. Pept. Prot. Res. 26 (1985) 584-590
72 Dixon H.B.F., Perham R.N.: Reversible Blocking of amino groups with citraconic anhydride. Biochem. J.
109 (1968) 312-314
73 Schmandke H., Maune R., Schmidt G., Schulz M., Kroll J.: Modifizierung der funktionellen Eigenschaften
von Ackerbohnenprotein durch Acetylierung. Nahrung 21 (1977) 901-909
74 Seifert A., Schultz M., Strenge K., Muschiolik G., Schmandke H.: Mechanical barrier preventing the
centrifugal creaming of O/W food emulsions stabilized by proteins. Nahrung 34 (1990) 293-295
75 Krause J.-P., Mothes R., Schwenke K.D.: Some physicochemical and interfacial properties of native and
acetylated legumin from faba beans (Vicia faba L.). J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 429-437
76 Schwenke K.D.: Beeinflussung funktioneller Eigenschaften von Proteinen durch chemische Modifizierung.
Nahrung 22 (1978) 101-120
77 Schwenke K.D., Rauschal E.J.: Effect of succinylation on the physico-chemical properties of some food
proteins. Nahrung 24 (1980) 593-595
78 Rauschal E.J., Linow K.-J., Pähtz W., Schwenke K.D.: Chemische Modifizierung von Proteinen. 8. Mitt.
Beeinflussung physico-chemischer und funktioneller Eigenschaften von Proteinen aus Ackerbohnen durch
Succinylierung. Nahrung 25 (1981) 241-248
79 Schwenke K.D., Zirwer D., Gast K., Linow K.-J., Görnitz E., Gueguen J., Subirade M.: Dissociation of
11 S globulins from plant seeds after succinylation - a problem of subunit interaction. In: Protein Inte-
ractions, Visser H., VCH Publishers, Weinheim, 1992, 233-252
Literatur 133
80 Schwenke K.D., Rauschal E.J., Robowsky K.D.: Functional properties of plant proteins. Part IV. Foaming
properties of modified proteins from faba beans. Nahrung 27 (1983) 335-350
81 Krause J.-P., Krägel J., Schwenke K.D.: Properties of interfacial films formed by succinylated legumin
from faba beans (Vicia faba L.). Colloids Surf. B: Biointerfaces 8 (1997) 279-286
82 Wofsy L., Singer S.J.: Effects of the amidination reaction on antibody activity and on the physical
properties of some proteins. Biochem. 2 (1963) 104-116
83 Goulet G., Ponnampalam R., Amoit J., Roy A., Brisson G.J.: Nutritional value of acylated oat protein
concentrates. J. Agric. Food Chem. 35 (1987) 589-592
84 Mattarella N., Craemer L.K., Richardson T.: Amidation or esterification of bovine β-lactoglobulin to form
positively-charged proteins. J. Agric. Food Chem. 31 (1983) 968-972
85 Lewis S.D., Shafer J.A.: Conversion of exposed aspartyl und glutamyl reidues in proteins to asparginyl
and glutaminyl residues. Biochim. Biophys. Acta 303 (1973) 284-291
86 Fraenkel-Conrat H., Mohammad A., Ducay E.D., Mecham D.K.: The molecular weight of lysozyme after
reduction and alkylation of the disulfide bonds. J. Am. Chem. Soc. 73 (1951) 625-627
87 Lewin, A.: The molecular biology potential of the ascorbate system. Academic Press, London, 1974
88 Howell N.K., Taylor C.: Effect of ascorbic acid on the physicochemical and functional properties of
globular proteins. Int. J. Food Sci. Technology 30 (1989) 321-334
89 Han K.K., Richard C., Biserte G.: Current developments in chemical cleavage of proteins. Int. J. Bio-
chem. 15 (1983) 875-884
90 Shih, F.F.: Modification of proteins by non-enzymatic methods. In: Biochemistry of food proteins,
Hudson B.J.F. (Hrsg.), Elsevier Publishers, London, 1992, 235-248
91 Edwards R.H., Saunders R.M., Kohler G.O.: Pilot scale preparation of protein concentrates from wheat
millrun and wheat shorts using a wet alkaline process. J. Food Sci. 45 (1980) 860-863
92 Kato Y., Watanabe K., Sato Y.: Effect of Maillard reactions on some physical properties of ovalbumin. J.
Food Sci. 46 (1981) 1835-1839
93 Kitabatake N., Cuq J.L., Chaftel J.C.: Covalent binding of glycosyl residues to β-lactoglobulin: Effects on
solubility and heat stability. J. Agric. Food Chem. 33 (1985) 125-130
94 Baniel A., Caer D., Colas B., Gueguen J.: Functional properties of glycosylated derivatives of the 11 S
storage protein from pea (pisum sativum L.). J. Agric. Food Chem. 40 (1992) 200-205
95 Matheis G., Penner M.H., Feeney R.E., Whitaker J.R.: Phosphorylation of casein and lysozyme by
phosphorus oxychloride. J. Agric. Food Chem. 32 (1983) 379-387
96 Matheis G., Whitaker J.R.: Chemical phosphorylation of food proteins: An overview and a prospectus. J.
Agric. Food Chem. 32 (1984) 699-705
97 Woo S.L., Craemer L.K., Richardson T.: Chemical phosphorylation of bovine β-lactoglobulin. J. Dairy Sci.
66 (1983) 984-987
98 Stoll V.S., Blanchard J-S.: Buffers: Principle and practice. Meth. Enzymol. 182 (1990) 24
99 Ismond M.A.H., Murray E.D., Arntfield S.D.: The role of non-covalent forces in micelle formation by
vicilin from Vicia faba. Food Chem. 21 (1986) 27-46
100 Popello I.A., Suchkov V.V., Grinberg V.Y., Tolstoguzov V.B.: Isolation and purification of 11 S globulins
from seeds of broad beans and pea. Prikl. Biochim. Mikrobiol. 24 (1988) 50-55 (in Russisch)
101 Itzhaki R.F., Gill D.M.: A micro-biuret method for estimating proteins. Anal. Biochem. 9 (1964) 401-410
102 Matissek R., Schnepel F.-M., Steiner G.: Lebensmittelanalytik, Springer-Verlag, Berlin-Heidelberg, 1989
103 Lange R., Friebe R., Linow F., Schaffner B.: Zur Anwendung der Methodenkombination Kjeldahl-
Naßaufschluß/Berthelot-Reaktion bei der Stickstoffbestimmung in biologischen Materialien. 2. Mitt. Auf-
bau und Erprobung einer teilautomatisierten Apparatur zur routinemäßigen Bestimmung des Stickstoffs.
Nahrung 23 (1975) 549-559
104 Fields R.: The rapid determination of amino groups with TNBS. Methods Enzymol. 25 (1972) 464-468
105 Riordan J.F., Vallee B.L.: Succinylcarboxypeptidase. Biochem. 3 (1964) 1768-1774
106 Habeeb A.F.S.A., Atassi M.Z.: Enzymic and immunochemical properties of lysozyme II. Conformation,
immunochemistry and enzymic activity of a derivative modified at Tryptophan. Immunochem. 6 (1996)
555-566
107 Schwenke K.D., Knopfe C., Mikheeva L.M., Grinberg V.Y.: Structural changes of legumin from faba beans
(vicia faba L.) by succinylation. J. Agric. Food Chem. 46 (1996) 2080-2086
Literatur 134
108 Weber U., Osborne M. The reliablity of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-
polyacrylamide gel electrophoresis. J. Biol. Chem. 244 (1969) 4406-4412
109 Laemmli U.K.: Cleavage of structural proteins during the assambly of the head of bacteriophage T4.
Nature 227 (1970) 680-685
110 Schägger H., Cramer W.A., v. Jagow G.: Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein
complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-
dimensional native electrophoresis. Anal. Biochem. 217 (1994) 220-230
111 Cogan U., Kopelman M., Makady S., Shinitzky, M.: Binding affinities of retinol and related compounds to
retinol binding properties. Eur. J. Biochem. 65 (1976) 71-78
112 Albertsson P.A.: Fractionation of cell partiells and macromolecules in aqueous two phase systems.
Almquist u. Wiksell, Uppsala, 1960
113 Rauscher K., Voigt J., Wilke I., Wilke K.-T.: Chemische Tabellen und Rechentafeln für die analytische
Praxis. VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindustrie, Leipzig, 1972
114 Tanford C.: Intrinsic and kinematic viscosity. J. Phys. Chem. 59 (1955) 798-799
115 Elias H.-G.: Ultrazentrifugenmethoden. Beckmann Instruments GmbH, München, 1961
116 Comper W.D., Williams R.P.W.: Hydrodynamics of concentrated proteoglycan solutions. J. Biol. Chem.
262 (1987) 13464-13471
117 Wetlaufer D.B.: Ultraviolet spectra of proteins and amino acids. Adv. Protein Chem. 17 (1962) 303-386
118 Fell A.F.: Trends Anal. Chem. 2 (1983) 63-66
119 Schmid F.X.: Spectral methods of characterizing protein conformation and conformational changes. In:
Protein structure a practical approach, Creighton T.E. (Hrsg.), IRL press, Oxford, 1989, 251-285
120 Lehrbuch Chemische Thermodynamik, Herausgeberkollektiv, VEB Deutscher Verlag für Grundstoffindust-
rie, Leipzig, 1973
121 Freire E.: Differential scanning calorimetry. In: Methods in molecular biology, Vol. 40, Shirley B.A.
(Hrsg.), Humana Press, Toronto, 1995, 191-218
122 Freire E., Biltonen R.L.: Statistical mechanical deconvolution of thermal transitions in macromolecules. I.
Theory and application. Biopolymers 17 (1978) 463-479
123 Privalov P.L., Potekhin S.A.: Scanning microcalorimetry in studying temperatur-induced changes in
proteins. Meth. Enzymol. 131 (1986) 4-51
124 Creighton T.E.: Conformational restrictions on the pathway of folding and unfolding of the pancreatic
trypsin inhibitor. J. Mol. Biol. 113 (1977) 275-294
125 Pace C.N., Shirley B.A., Thomson J.A.: Measuring the conformational stability of a protein. In: Protein
structure – a practical approach, Creighton T.E. (Hrsg.), IRL Press, Oxford, 1989, 311-330
126 Pace C.N.: Determination an analysis of urea and guanidine hydrochloride denaturation curves. Meth.
Enzymol. 131 (1986) 266-280
127 Greene R.F., Pace C.N.: Urea and guanidine hydrochloride denaturation of ribonuclease, lysozyme, α-
chymotrypsin, and β-lactoglobulin. J. Biol. Chem. 249 (1974) 5388-5393
128 Schlesier B., Bassüner R., van Hai N., Müntz K.: The cDNA derived primary structure of two distinct
legumin A subunit precursers from field bean (Vicia faba L.). Nucleic Acid Res. 18 (1990) 7146
129 Kato A., Nakai S.: Hydrophobicity determined by fluorescence probe method and its correlation with
surface properties of proteins. Biochim. Biophys. Acta 624 (1980) 13-20
130 Li-Chan E., Nakai S., Wood D.F.: Relationship between functional (fat binding, emulsifying) and
physicochemical properties of muscle proteins. Effect of heating, freezing, pH and species. J. Food Sci.
50 (1985) 1034-1040
131 Schwenke K.D., Zirwer D., Gast K., Görnitz E., Linow K.-J., Gueguen J.: Changes of the oligomeric
structure of legumin from pea (Pisum sativum L.) after succinyliation. Eur. J. Biochem. 194 (1990) 621-
627
132 Schwenke K.D., Dudek S., Seifert A., Mothes R., Staatz A.: Isolation of faba bean legumin - a
comparative study of various methods. Nahrung 38 (1994) 559-567
133 Wolf W.J., Nelsen T.C.: Partial purification and characterization of the 15 S globulin of soybeans, a dimer
of glycinin. J. Agric. Food Chem. 44 (1996) 785-791
134 Ackers G.K.: Molecular exclusion and restricted diffusion processes in molecular-sieve chromatography.
Biochem. 3 (1964) 723-730
Literatur 135
135 Andrews P.: The gel-filtration behavior of proteins related to their molecular weights over a wide range.
Biochem. J. 96 (1965) 595-606
136 Rogers K., Hellerman L., Thompson T.E.: L-glutamate dehydrogenase. III. Molecular size of bovine
glutamate dehydrogenase and the methylmercuric bromide - activated enzyme in the concentration
range of enzymatic assay. J. Biol. Chem. 240 (1965) 198-200
137 Svedberg T., Pedersen K.D.: Die Ultrazentrifuge, Steinkopf, Dresden, Leipzig, 1940
138 Schachman H.K.: Ultracentrifugation, diffusion, and viscometry. Methods Enzymol. 4 (1957) 32-103
139 Scheraga H.A., Mandelkern L.: Consideration of the hydrodynamic properties of proteins. J. Amer. Chem.
Soc. 75 (1953) 179-184
140 Huggins M.L.: The viscosity of dilute solutions of long-chain molecules. IV. Dependence on
concentration. J. Am. Chem. Soc. 64 (1942) 2716-2718
141 Schwenke K.D., Rauschal E., Zirwer D., Linow K.J.: Structural changes of the 11 S globulin from
sunflower seed (Helianthus annuus L.) after succinylation. Int. J. Peptide Protein Res. 25 (1985) 347-
354
142 Hass L.F.: Aldolase dissociation into subunits by reaction with succinic anhydride. Biochem. 3 (1964)
535-541
143 Seifert A., Schwenke K.D.: Improved approach for characterizing the coalescence stability of legumin
stabilized O/W emulsions by analytical ultracentrifugation. Colloid Polym. Sci. 99 (1995) 31-38
144 Chen R.F., Edelhoch H., Steiner, R.F.: Fluorescence of proteins. In: Physical principles and techniques of
protein chemistry, Clach S.J. (Hrsg.), Academic Press, New York, 1969, 171-244
145 Lakowicz I.R.: Principles of fluorescence spectroscopy. 3rd. ed. Plenum Press, New York, London, 1986
146 Ragone R., Colonna G., Balestrici C., Servillo L., Irace G.: Determination of tyrosine exposure in proteins
by second-derivative spectroscopy. Biochem. 23 (1984) 1871-1875
147 Venyaminov S.Y., Yang Y.T.: Determination of Protein Secondary structure. In: Circular dichroism and
the conformational analysis of biomolecules, Fasman G.D. (Hrsg.), Plenum Press, New York, 1996, 69-
107
148 Manavalan P., Johnson W.C.: Variable selection method improves the prediction of protein secondary
structure from circular dichroism. Anal. Biochem. 167 (1987) 76-85
149 Grinberg, V.Y., Danilenko, A.N., Burova, T.V., and Tolstoguzov, V.B.: Conformational stability of 11 S
globulins from seeds. J. Sci. Food Agric. 49 (1989) 235-248
150 Danilenko A.N., Bikbov T.M., Grinberg V.Y. et. al: The effect of pH upon thermal stability of 11 S globulin
of Glycine max seeds according to differential scanning calorimetry. Biofizika 32 (1987) 402-406 (in
Russisch)
151 Dudek S., Horstmann C., Schwenke K.D.: Limited tryptic hydrolysis of legumin from faba bean (Vicia
faba L.): formation of an 'unequal‘ subunit pattern. Nahrung 40 (1996) 171-176
152 Kyte J., Doolittle R.F.: A simple method for displaying the hydropathic character of a protein. J. Mol. Biol.
157 (1982) 105-132
153 Plietz P., Damaschun G., Müller J.J., Schwenke K.D.: The structure of 11 S globulins from sunflower and
rape seed - a small angle X-ray scattering study. Eur. J. Biochem. 130 (1983) 315-320
154 Gounaris A.D., Perlman G.E.: Succinylation of pepsinogen. J. Biol. Chem. 242 (1967) 2739-2745
155 Chang T.S., Sun S.F.: Structural studies on the succinylated bovine serum albumin. Int. J. Peptide
Protein Res. 11 (1978) 65-72
156 Schwenke K.D., Mothes R., Raab B., Rawel H., Gueguen Y.: Selected physico-chemical properties of
succinylated legumin from pea (Pisum sativum L.). Nahrung 37 (1993) 519-527
157 Elias H.-G.: Makromoleküle. 3. Aufl., Hüthig & Nepf, Basel, Heidelberg, 1975
158 Cragg L.H., Bigelow C.C.: The viscosity slope constant k’ - ternary systems: polymer-polymer-solvent. J.
Polymer Sci. 26 (1955) 177-191
159 Tanford C., Kawahara K., Lapange S.: Proteins as random coils. I. Intrinsic viscosities and sedimentation
coefficients in concentrated guanidin hydrochloride. J. Am. Chem. Soc. 89 (1967) 729-736
160 Diep O., Boulet M., Castaigue F.: Effect of extreme pH and salt concentration on intrinsic viscosity and
Huggins constant (k’) of 7 S and 11 S soybean globulins. Can. Inst. Food Sci. Technol. J. 15 (1982) 316-
318
161 Shyamasundar R., Rao D.R.: Acetylated arachins. Physicochemical properties. Int. J. Pept. Prot. Res. 23
(1984) 25-31
Literatur 136
162 Yamauchi F., Ono H, Kamata Y., Shibasaki K.: Acetylation of amino groups and ist effect on the structure
of soybean glycinin. Agric. Biol. Chem. 43 (1979) 1309-1315
163 Gerbanowski A., Malabat C., Rabiller C., Gueguen J.: Grafting of aliphatic and aromatic probes on
rapeseed 2 S and 12 S: Influence on their structural and physicochemical characteristics. J. Agric. Food
Chem. 47 (1999) 5218-5226
164 Creeth J.M., Knight C.G.: On the estimation of the shape of macromolecules from sedimentation and
viscosity measurements. Biochim. Biophys. Acta 102 (1965) 549-558
165 Yang J.T.: The viscosity of macromolecules in relation to molecular conformation. Adv. Protein Chem. 16
(1961) 323-399
166 Ogston A.G.: Trans Faraday Soc. 49 (1953) 1481-1485
167 Wales M., van Holde K.E.: The concentration dependence of the sedimentation constants of flexible
macromolecules. J. Polymer Sci. 14 (1954) 81–86
168 Janary S., Bovey F.A.: Interpretation of the ultraviolet spectral changes of proteins. J. Biol. Chem. 235
(1960) 2818-2826
169 Donovan J.W.: Ultraviolet absorption. In: Physical principles and techniques of protein chemistry, Leach
S.J. (Hrsg.), Academic Press, New York, 1969, 107-170
170 Kronman M.J., Holmes L.G.: The fluorescence of native, denatured and reduced-denatured proteins.
Photochem. Photobiol. 14 (1971) 113-134
171 Teale F.W.J.: The ultraviolet fluorescence of proteins an neutral solutions. Biochem J. 76 (1960) 381-
388
172 Shutov A.D., Kakhovskaya I.A., Braun H., Bäumlein H., Müntz K.: Legumin and vicilin like storage
proteins: Evidence for a common-single domain ancestinal gene. J. Mol. Evol. 41 (1995) 1057-1069
173 Kallenbach N.R., Lyu P., Zhon H.: CD-spectroscopy and the helix-coil transition in peptides and
polypeptides. In: Circular dichroism and the conformational analysis of biomolecules, Fasman G.D.
(Hrsg.), Plenum Press, New York, 1996, 201-259
174 Richards F.M.: Folded and unfolded proteins: an introduction. In: Protein folding, Creighton T.E. (Hrsg.),
W.H. Freeman & Comp., New York, 1992, 1-58
175 Ptitsyn O.B.: The molten globule. In: Protein folding, Creighton T.E. (Hrsg.), W.H. Freeman & Comp.,
New York, 1992, 243-300
176 Schwenke K.D., Mothes R., Zirwer D., Gueguen J., Subirade M.: Modification of the structure of 11 S
globulins from plant seeds by succinylation. In: Food proteins: structure and functionality, Schwenke
K.D., Mothes R. (Hrsg), VCH Publishers, Weinheim, 1993, 143-153
177 Privalov P.L.: Stability of proteins. Small globular proteins. Adv. Protein Chem. 33 (1979) 167-241
178 Privalov P.L.: Stability of proteins. Proteins which do not present a single cooperative system. Adv. Pro-
tein Chem. 35 (1982) 1-104
179 Tanford C.: Protein denaturation. Adv. Protein Chem. 23 (1968) 121-282
180 Sturtevant J.M.: Biochemical Applications of differential scanning calorimetry. Ann. Rev. Phys. Chem. 38
(1987) 463-488
181 Privalov P.L., Khechinahvili N.N.: A thermodynamic approach to the problem of stabilization of globular
protein structure. A calorimetric study. J. Mol. Biol. 86 (1974) 665-684
182 Klotz I.M., Darnall D.W., Langerman N.R.: Quarternary structure of proteins. In: The proteins. Volume I,
Neurath H., Hill R.L. (Hrsg.), Academic Press, New York, 293-411
183 Mikheeva L.M., Grinberg N.V., Golubeva I.A., Grinberg V.Y., Knopfe C., Schwenke K.D.: Stabilty of
acylated derivatives of broad bean legumin. Poster Proc. Conference on Plant Proteins from European
Crops, 25-27 November 1996, Nantes, France, 155-157
