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[en] (orig)
Entwicklung einer robusten chemo-enzymatisch dynamisch
kinetischen Racematspaltung für die nachhaltige Synthese
chiraler α-Hydroxyketone
vorgelegt von
Master of Science Biotechnologie
René Nieguth
aus Frankfurt (Oder)
Von der Fakultät II – Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Michael Kneissl
Berichtender: Prof. Dr. Reinhard Schomäcker
Berichtende: Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 05.04.2013
Berlin 2013
D83
Danksagung
Diese Arbeit entstand im Rahmen meiner Zeit als wissenschaftlicher Mitarbeiter an der
TU Berlin am Lehrstuhl für Technische Chemie in der Arbeitsgruppe Enzymtechnologie.
Bei Frau Prof. Dr. Marion Ansorge-Schumacher möchte ich mich herzlichst für die
Überlassung des interessanten Themas, ihr großes Vertrauen in mich und ihre exzellente
Unterstützung in wissenschaftlichen Fragestellungen bedanken. Für die Übernahme des
Referats danke ich Herrn Prof. Dr. Reinhard Schomäcker, der die TU Berlin durch seine
Kompetenz und seine offene Art oft sehr viel einfacher macht.
Großer Dank gilt Herrn Prof. Dr. Ulf Hanefeld für die Bereitstellung der TUD-1 Katalysatoren,
die einen Grundstein der Ergebnisse dieser Arbeit legten und für die stete und freundliche
Diskussionsbereitschaft.
Darüber hinaus bedanke ich mich herzlich bei Patrick Enssle, Annika Petrenz, Stephan
Spindler, Viktoria Janzer, Geneviève Rey und Constanze Heise, die im Rahmen von Master-,
Diplom- , Praktikumsarbeiten oder als Hiwi bzw. Auszubildende großen Anteil am Entstehen
dieser Arbeit hatten und durch die die Laborzeit nie langweilig wurde.
Mit Freude möchte ich mich natürlich auch bei meinen einzigartigen Kollegen für die
großartige Zeit im Institut und bei lustigen Feierabenden bedanken. Ich danke dabei
besonders Alexander Scholz und Andy Maraite, die zwei wirklich tolle Bürokollegen waren.
Michel Geiger gilt ebenso Dank für die Hilfe im Labor, der unterhaltsamen Bib-Tage und für
die „Bananen im Keller“.
Abschließend gehört aber das größte „Dankeschön“ meiner lieben Familie!
Danke für die jahrelange und uneingeschränkte Unterstützung, eure Liebe und Rückhalt.
I
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis I
Abbildungsverzeichnis IV
Tabellenverzeichnis VII
Abkürzungsverzeichnis VIII
1 Einleitung 1
1.1 Enzyme in organischen Lösungsmitteln 1
1.2 Immobilisierung von Enzymen 3
1.3 Maßnahmen zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität von Enzymen in der chemischen Synthese 6
1.4 Bedeutung und Syntheserouten chiraler α-Hydroxyketone 10
1.5 Dynamisch kinetische Racematspaltung 15
1.6 Problemstellung und Zielsetzung 20
2 Material und Methoden 22
2.1 Material 22
2.1.1 Chemikalien 22
2.1.2 Geräte 23
2.2 Methoden 24
2.2.1 Immobilisierung der Lipase TL 24
2.2.2 Herstellung der statischen Suspensionen mit der Lipase TL 24
2.2.3 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford 25
2.2.4 Bestimmung der spezifischen Aktivität 25
2.2.5 Silikonbeschichtung der Lipase TL-Immobilisate 26
2.2.6 Einstellung der Wasseraktivität in THF 27
2.2.7 Bestimmung der Lagerstabilität 28
2.2.8 Bestimmung der Prozessstabilität 29
2.2.8.1 Wiederholte Batch-Versuche 29
2.2.8.2 Kontinuierliches Reaktionssystem 30
2.2.9 Untersuchung der mechanischen Stabilität 31
2.2.10 Aufnahmen am Rasterelektronenmikroskop (REM) 31
2.2.11 Modifikation der immobilisierten Lipase TL 31
II
2.2.11.1 Beschichtung mit Polyethylenimin 31
2.2.11.2 Succinylierung 32
2.2.11.3 Acylierung mit aktivierten Methoxypolyethylenglykolen (mPEG) 32
2.2.11.4 Hydroxyethylamidierung 33
2.2.11.5 Aminoethylamidierung 33
2.2.11.6 Dextranaldehyd-Modifikation 33
2.2.12 Racemisierung von (R)-Benzoin 34
2.2.13 Dynamisch kinetische Racematspaltung mit TUD-1 Katalysatoren 35
2.2.14 Rezyklierung der dynamisch kinetischen Racematspaltung 35
2.2.15 Aufreinigungen und Synthesen 36
2.2.15.1 Aufreinigung von (R)-Benzoin 36
2.2.15.2 Synthese von Benzoinbutyrat 36
2.2.15.3 Synthese von Ru-Hydroxyapatit 37
2.2.16 Parameter der HPLC-Analytik 37
3 Ergebnisse und Diskussion 39
3.1 Vorarbeiten zur Immobilisierung 39
3.1.1 Methodenauswahl 39
3.1.2 Auswahl geeigneter Trägermaterialen 42
3.2 Optimierung der Immobilisierung der Lipase TL auf Accurel MP1001 und Sepabeads EC-OD 44
3.2.1 Immobilisierungsdauer 45
3.2.2 Proteinstartkonzentration 47
3.2.3 Einfluss der Temperatur 55
3.2.4 Einfluss der Pufferkonzentrationen und des pH-Wertes 57
3.2.5 Bewertung der Immobilisierungsoptimierung 61
3.2.6 Einfluss der silcoat-Technologie 63
3.2.7 Vergleich der Acc-LipTL mit der nativen TL und Literaturdaten 66
3.3 Charakterisierung der Reaktionsparameter – Einfluss auf die Aktivität und Stabilität der Acc-LipTL 68
3.3.1 Aktivität 69
3.3.1.1 Wasseraktivität 70
3.3.1.2 Lösungsmittel 74
3.3.1.3 Temperatur 78
3.3.2 Lagerstabilität 79
3.3.2.1 Stabilität in Gegenwart der Edukte und Produkte 80
3.3.2.2 Lösungsmittel 82
III
3.3.2.3 Temperatur 83
3.3.3 Prozessstabilität 86
3.3.3.1 Wiederholte Batch-Versuche 87
3.3.3.2 Kontinuierlicher Prozess 89
3.3.3.3 Prozessstabilität im kontinuierlichem Prozess in verschiedenen Lösungsmitteln 96
3.3.4 Mechanische Stabilität 98
3.3.5 Zusammenfassung und Fazit der Charakterisierung 99
3.4 Stabilisierung der Acc-LipTL durch physikalische und chemische Modifikation 102
3.4.1 Aktivität und Lagerstabilität nach Modifikation von Acc-LipTL 103
3.4.2 Prozessstabilität der modifizierten Immobilisate im kontinuierlichen Prozess 107
3.4.3 Bewertung der Stabilisierung 109
3.5 Racemisierung 111
3.5.1 Katalysatorscreening zur Racemisierung von (R)-Benzoin 112
3.5.1.1 Optimierung der Racemisierung mit Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 117
3.5.1.2 Lösungsmittel 117
3.5.1.3 Temperatur 118
3.5.1.4 Untersuchungen zur Umesterungsaktivität und Racemisierung des Benzoinesters 121
3.6 Dynamisch kinetische Racematspaltung mit Al-TUD-1, Zr-TUD-1 und Acc-LipTL 124
3.6.1 Lösungsmittel 124
3.6.2 Temperatur 126
3.6.3 Katalysatorverhältnisse 130
3.6.4 Rezyklierung 132
4 Zusammenfassung 139
Literaturverzeichnis 143
IV
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Methoden zur Immobilisierung von Enzymen [18] ........................................................................... 4
Abbildung 2: Illustration der Chiralität am Beispiel von Benzoin .......................................................................... 11
Abbildung 3: Prinzip einer DKR ............................................................................................................................. 16
Abbildung 4: Redox Racemisierung ....................................................................................................................... 18
Abbildung 5: Racemisierung durch Keto-Enol-Tautomerie von α-Hydroxyketonen ............................................. 18
Abbildung 6: Lipase TL katalysierte DKR von Benzoin ........................................................................................... 19
Abbildung 7: Detailaufnahme einer statischen Suspension mit Lipase TL-Pulveragglomerate ............................ 41
Abbildung 8: Spez. Trägeraktivität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der Immobilisierungsdauer ........................... 46
Abbildung 9: Proteinbeladungsdichte und spez. Trägeraktivität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der
Lipasestartkonzentration ............................................................................................................... 48
Abbildung 10: Spez. Proteinaktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration ..................... 50
Abbildung 11: Faltung von Proteinen bei unterschiedlichen Beladungsdichten auf Oberflächen [120] .............. 51
Abbildung 12: Proteinbeladungsdichte und spez. Trägeraktivität von Sepabead-LipTL in Abhängigkeit der
Lipasestartkonzentration ............................................................................................................... 53
Abbildung 13: Spez. Proteinaktivität der Sepabead-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration ........... 54
Abbildung 14: Beladungsdichte und spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der
Immobilisierungstemperatur; Die Aktivitätstests wurden bei Raumtemperatur
durchgeführt. ................................................................................................................................. 56
Abbildung 15: Anordnung der wichtigsten An- und Kationen der Hofmeisterreihe ............................................. 58
Abbildung 16: Beladungsdichte der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Pufferkonzentrationen bei
verschiedenen pH-Werten ............................................................................................................. 59
Abbildung 17: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Pufferkonzentrationen bei
unterschiedlichen pH-Werten ........................................................................................................ 60
Abbildung 18: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration bei
unterschiedlichen Immobilisierungsbedingungen (Immobilisierungstemp. bei 10 mM = 21,5 °C;
200 mM = 40°C) ............................................................................................................................. 62
Abbildung 19: REM-Aufnahmen der silcoatAcc-LipTL mit verschiedenen Silikongehalten ...................................... 65
Abbildung 20: Vergleich der KR-Umsatzverläufe von Acc-LipTL mit den silcoatAcc-LipTL Varianten ...................... 66
Abbildung 21: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit von der Wasseraktivität in THF bei RT ......... 73
V
Abbildung 22: Prozentuale Restaktivität von Acc-LipTL in verschiedenen Lösungsmitteln in Abhängigkeit
der Reaktionstemperatur (Toluol: 47 mM Benzoin, 2-MeTHF und THF: 94 mM Benzoin) ............ 78
Abbildung 23: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit von Edukten und Produkten in THF bei RT............ 81
Abbildung 24: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit vom Lösungsmittel bei RT ..................................... 83
Abbildung 25: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der Temperatur in THF .......................................... 84
Abbildung 26: Prozentuale Restaktivitäten der nativen Lipase TL und der Acc-LipTL in Abhängigkeit der
Inkubationsdauer in THF bei 50 °C ................................................................................................. 85
Abbildung 27: Spez. Trägeraktivitäten der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL-Varianten in Abhängigkeit der
Zyklenzahl der wiederholten Batch-Versuche in THF bei RT ......................................................... 87
Abbildung 28: Foto des kontinuierlichen Reaktors und schematischer Aufbau ................................................... 89
Abbildung 29: Umsatzveränderung der KR im kontinuierlichen Reaktor (Durchflussrate = 1,25 mL/min;
94 mM Benzoin) ............................................................................................................................. 92
Abbildung 30: Prozessstabilität von Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit der
Durchflussrate ................................................................................................................................ 93
Abbildung 31: Prozessstabilität der Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit der
Benzoinkonzentration .................................................................................................................... 94
Abbildung 32: REM-Aufnahmen der Acc-LipTL vor (A) und nach (B) einem kontinuierlichen Prozess ................. 95
Abbildung 33: Prozessstabilität der Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit
unterschiedlicher Lösungsmittel .................................................................................................... 96
Abbildung 34: REM-Aufnahmen der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL mit 70 % Silikon vor und nach einer
mechanischen Behandlung in der Kugelmühle .............................................................................. 99
Abbildung 35: Prozentuale Restaktivitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextran-Modifikation) in
Bezug auf natives Acc-LipTL in THF bei RT ................................................................................... 103
Abbildung 36: Prozentuale Restaktivitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT ................................................................................................................ 104
Abbildung 37: Prozentuale Lagerstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextrane) in Bezug auf
natives Acc-LipTL in THF bei RT .................................................................................................... 105
Abbildung 38: Prozentuale Lagerstabilitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT ................................................................................................................ 106
Abbildung 39: Prozentuale Prozessstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextrane) in Bezug auf
natives Acc-LipTL in THF bei RT .................................................................................................... 108
Abbildung 40: Prozentuale Prozessstabilitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT ................................................................................................................ 108
Abbildung 41: Aktivierungsmechanismus des Shvo-Katalysators ....................................................................... 111
VI
Abbildung 42: Enantiomerenüberschüsse nach Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 und
Zr-TUD-1 in Abhängigkeit unterschiedlicher Lösungsmittel bei 50°C, 20h .................................. 118
Abbildung 43: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit bei
verschiedenen Temperaturen in Toluol ....................................................................................... 119
Abbildung 44: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit bei
verschiedenen Temperaturen in Toluol ....................................................................................... 119
Abbildung 45: Halbwertszeiten der Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 in
Abhängigkeit der Temperatur in Toluol ....................................................................................... 121
Abbildung 46: Spez. Aktivitäten von Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 in der KR von Benzoin mit Vinylbutyrat in
Abhängigkeit der Temperatur in Toluol ....................................................................................... 122
Abbildung 47: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit mit und
ohne 47 mM Benzoinbutyrat in Toluol bei 70 °C; ee des Benzoinbuytrat über den gesamten
Racemisierungsprozess ................................................................................................................ 123
Abbildung 48: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und Al-TUD-1 in Abhängigkeit der
Reaktionszeit bei verschiedenen Temperaturen in Toluol .......................................................... 127
Abbildung 49: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der
Reaktionszeit bei verschiedenen Temperaturen in Toluol .......................................................... 128
Abbildung 50: Entwicklung des ee des (S)-Benzoinbutyrats in der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und
Al-TUD-1 bzw. Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Temperatur in Toluol ............................................ 129
Abbildung 51: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch 20 mg/mL Acc-LipTL in Abhängigkeit
verschiedener Mengen von Zr-TUD-1 in Toluol bei 50°C ............................................................. 130
Abbildung 52: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch 40 mg/mL Zr-TUD-1 in Abhängigkeit
verschiedener Mengen von Acc-LipTL in Toluol bei 50°C ............................................................ 131
Abbildung 53: Umsatzveränderung der DKR von Benzoin mit Acc-LipTL und Zr-TUD-1 in Toluol und 2-
MeTHF bei 50°C in wiederholten Reaktionszyklen ...................................................................... 134
Abbildung 54: Umsatzveränderung nach 8 h des jeweiligen Zyklus in der Rezyklierung von Acc-LipTL sowie
der mit mPEG, PEI und Dextran modifizierten Acc-LipTL-Varianten mit Zr-TUD-1 in 2-MeTHF
bei 50°C ........................................................................................................................................ 135
Abbildung 55: Endumsatz des jeweiligen Zyklus in der Rezyklierung von Acc-LipTL sowie der mit mPEG, PEI
und Dextran modifizierten Acc-LipTL-Varianten mit Zr-TUD-1 in 2-MeTHF bei 50°C .................. 137
Abbildung 56: Vergleich der Produktivität der mit PEI modifizierten Acc-LipTL-Variante und der statischen
Suspensionen aus Hoyos et al. [89] in Abhängigkeit der Zyklenzahl [89] .................................... 138
VII
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Methoden zur Modifikation von Enzymen [50].................................................................................... 10
Tabelle 2: Zusammenfassung der wichtigsten chemischen und biotechnologischen Synthesewege von
α-Hydroxyketonen ............................................................................................................................... 14
Tabelle 3: Chemikalienliste ................................................................................................................................... 22
Tabelle 4: Geräteliste ............................................................................................................................................ 23
Tabelle 5: Strukturen der Siloxane des 2-Komponentensilikon ............................................................................ 27
Tabelle 6: Eingesetzte Dextranaldehyde ............................................................................................................... 34
Tabelle 7: Parameter der HPLC-Methode ............................................................................................................. 38
Tabelle 8: Retentionszeiten der Enantiomere von Benzoin und Benzoinbutyrat ................................................. 38
Tabelle 9: Kriterien zur Auswahl geeigneter Trägermaterialien ........................................................................... 43
Tabelle 10: Verwendete Trägermaterialen zur Immobilisierung der Lipase TL .................................................... 43
Tabelle 11: Vergleich der Acc-LipTL mit der nativen Lipase TL und den statischen Suspensionen ....................... 67
Tabelle 12: Wassergehalt (v/v%) von THF bei definierten Wasseraktivitäten ...................................................... 72
Tabelle 13: Vergleich verschiedener Lösungsmittel zur KR von Benzoin .............................................................. 76
Tabelle 14: Lagerstabilität von Acc-LipTL in verschiedenen Lösungsmitteln bei RT und 50 °C ............................. 85
Tabelle 15: Inaktivierungskonstanten und Lagerstabilitäten der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL-Varianten
nach wiederholten Batch-Versuchen ................................................................................................ 88
Tabelle 16: Katalysatorscreening zur Racemisierung von (R)-Benzoin ............................................................... 115
Tabelle 17: Vergleich der DKR von Benzoin mit Acc-LipTL und Al-TUD-1 bzw. Zr-TUD-1 in Abhängigkeit
verschiedener Lösungsmittel bei 50 °C ........................................................................................... 125
VIII
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzung
Begriff
2-MeTHF
2-Methyltetrahydrofuran
Acc-LipTL
Accurel-Lipase TL
BSSA
Bernsteinsäureanhydrid
CSTR
Kontinuierlicher Rührreaktor
DKR
Dynamisch kinetische Racematspaltung
ee
Enantiomerenüberschuss
HAP
Calcium-Hydroxyapatit
HIC
Hydrophobe Interaktionschromatographie
HWZ
Halbwertszeit
IEP
Isoelektrischer Punkt
KPi
Kalium-Phosphatpuffer
KR
Kinetische Racematspaltung
KW
Kohlenwasserstoff
MIBK
Methylisobutylketon
mPEG
Methoxypolyethylenglykol
Mw
Molekulargewicht
PEI
Polyethylenimin
REM
Rasterelektronenmikroskop
rpm
Umdrehung pro Minute
RT
Raumtemperatur
RT
Raumtemperatur
THF
Tetrahydrofuran
VB
Vinylbutyrat
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Enzyme in organischen Lösungsmitteln
Enzyme bezeichnen Proteinstrukturen mit herausragenden katalytischen Eigenschaften. Die
auch als Biokatalysatoren bekannten Moleküle setzen die Aktivierungsenergie
(bio)chemischer Reaktionen herab und beschleunigen die Reaktionen dadurch um den
Faktor 108-1014 [1]. Reaktionsbedingungen bei moderaten Temperaturen, pH-Werten im
Bereich von 5-8 und Reaktionen bei Normaldruck wirken sich bei einem industriellen Einsatz
von Enzymen positiv auf die Prozessökonomie aus. Das immense industrielle Potenzial
erreichen Enzyme allerdings vor allem aufgrund der hohen Substrat-, Regio- und
Stereoselektivitäten, die insbesondere in der chemischen Stoffproduktion zum Tragen
kommen. Die Produktion komplexer chiraler Substanzen ist mit einem verringerten Einsatz
bis hin zum vollständigen Verzicht auf Schutzgruppenchemie möglich, die in typischen
organischen Synthesen unentbehrlich ist [2, 3].
In den letzten Jahrzehnten wurden vor allem in der Herstellung von Feinchemikalien,
Pharmaprodukten und auch Treibstoffen eine Reihe neuer Synthesewege unter Verwendung
von Enzymen entwickelt, die insbesondere in Bezug auf eine nachhaltige Chemie und
höherer katalytischer Effizienz neue Maßstäbe setzten [4]. Während der Entwicklung solcher
Syntheserouten ist allerdings eine auf Wasser basierende Reaktionsführung eine der größten
Herausforderungen. Wasser weist oftmals eine sehr geringe Löslichkeit für viele Substrate
auf und vermittelt störende Nebenreaktionen [5]. Aufgrund dessen ist der Einsatz von
Enzymen in unkonventionellen (nicht wässrigen) Medien für die chemische Industrie sehr
interessant und gewinnt nach wie vor an Bedeutung im Bereich der pharmazeutischen und
chemischen Produktion.
Es wurden intensive Forschungen bezüglich eines Einsatzes unkonventioneller Medien in der
Biokatalyse unternommen und dabei unter anderem Gasphasen, überkritische Fluide,
ionische Flüssigkeiten und organische Lösungsmittel untersucht [6-8]. Letzteres stellt den
wichtigsten Forschungsbereich der letzten zwei bis drei Dekaden dar, obwohl die generelle
Einleitung
2
Machbarkeit von enzymkatalysierten Reaktionen in reinen nicht wassermischbaren Lösungs-
mitteln bereits in den 1930iger Jahren erstmalig gezeigt wurde [2]. Doch erst Arbeiten wie
die von Zaks und Klibanov [9] stellten Lipasen als eine der ersten Enzyme vor, die erfolgreich
unter Erhalt ihrer katalytischen Aktivität in diesen Reaktionssystemen eingesetzt wurden.
Das aus diesen akademischen Forschungen hervorgegangene industrielle Interesse basiert
nicht zuletzt auf den folgend Vorteilen, welche derartige Reaktionssysteme mit sich bringen.
» Die Löslichkeit unpolarer Substrate, welche in Wasser gar nicht oder nur
unzureichend löslich sind, ist in organischen Lösungsmitteln wesentlich höher.
Oftmals werden dadurch die Reaktionsrate und die maximal erreichbaren
Produktkonzentrationen deutlich verbessert.
» Das thermodynamische Gleichgewicht kann in organischen Lösungsmitteln von
hydrolytischen hin zu Kondensationsreaktionen verschoben werden. Somit ist
möglich, dass bspw. Lipasen anstatt der Hydrolyse von Estern, deren Synthese
katalysieren.
» Eine Isolierung der Produkte ist in organischen Lösungsmitteln wesentlich verein-
facht, da es sich hierbei um Medien mit teils sehr niedrigen Siedepunkten handelt.
Dadurch kann die Anzahl an notwendigen Reinigungsschritten vermindert und somit
die Gesamtausbeute der Reaktionen stark erhöht werden.
» Wasservermittelte Nebenreaktionen sind durch die äußert niedrigen Konzentrat-
ionen von Wasser in diesen Reaktionssystemen, welche zum Erhalt der katalytischen
Aktivität als notwendig angesehen werden [10], deutlich vermindert.
» Eine Rückgewinnung der Enzyme ist vereinfacht, da die meisten Enzympräparate in
organischen Lösungsmitteln nicht gelöst vorliegen und somit nach Beendigung der
Synthese vom Reaktionsansatz getrennt werden können.
» Enzyme weisen in wasserfreien organischen Lösungsmitteln oftmals eine erhöhte
Stabilität auf [7, 11-13].
Einleitung
3
» Die Substrat- Regio- und Stereospezifitäten einiger Enzyme können bei einem
Einsatz in organischen Lösungsmitteln drastisch verändert sein [14, 15].
Trotz der herausragenden Vorteile der Biokatalyse in organischen Lösungsmitteln, bringt der
Einsatz von Enzymen in diesen Systemen auch Nachteile mit sich. Die spezifische Enzym-
aktivität ist in nichtwässrigen organischen Lösungsmitteln oftmals stark reduziert. Je nach
Enzym, dem verwendeten Lösungsmittel, der eingestellten Wasseraktivität oder auch der Art
der Enzympräparation können unterschiedliche Ursachen für den Verlust der Aktivität in
Frage kommen. So ist unter anderem möglich, dass die Konformation des aktiven Zentrums
bei der Überführung in die wasserfreien Medien verändert oder sogar die Quartärstruktur
von Proteinkomplexen aufgelöst wird. Da Enzympräparationen typischerweise vor einer
Verwendung in organischen Lösungsmitteln getrocknet werden, ist auch ein Verlust
katalytischer Aktivität infolge der Lyophilisierung der Enzymlösungen möglich [8]. Die
Flexibilität der Enzyme, welche essentiell zur Ausbildung der katalytischen Fähigkeit ist, ist
vor allem in unpolaren organischen Lösungsmitteln eingeschränkt. Der jedoch am häufigsten
diskutierte Grund einer verminderten Aktivität ist der Verlust der für die Aktivität und
Strukturintegrität essentiellen Hydrathülle von der Enzymoberfläche. Dieses Phänomen tritt
vor allem bei polaren Lösungsmitteln auf [6, 10, 16].
1.2 Immobilisierung von Enzymen
Grundvoraussetzung für den Einsatz von Biokatalysatoren auf industrieller Ebene ist
aufgrund der meist hohen Enzymkosten eine hohe Wiederverwendbarkeit. Diese wird durch
eine leichte Abtrennung der Katalysatoren aus dem Reaktionsansatz nach Beendigung des
Prozesses und dem möglichst langen Erhalt der katalytischen Aktivität ermöglicht. Die in
dieser Arbeit verwendete Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri ist in der kommerziell
erhältlichen Form ein trockenes und sehr feines Pulver. Derartige Präparationen sind in den
meisten organischen Lösungsmitteln unlöslich und liegen daher bei Synthesen in diesen
Medien fein suspendiert vor. Der heterogene Charakter bietet zwar theoretisch den Vorteil
der einfachen Katalysatorabtrennung [17], ist jedoch großtechnisch mit gängigen Mitteln oft
nicht wirtschaftlich realisierbar. Ist das fein verteilte Pulver im Labormaßstab leicht durch
Einleitung
4
Zentrifugation oder Filtration vom Reaktionsmedium zu trennen, so ist dies im groß-
technischen Maßstab verbunden mit kostenintensiven Zentrifugationsanlagen oder lang-
wierigen Filtrationsschritten. Auch eine Verwendung dieser Pulverpräparate in
kontinuierlichen Reaktionssystemen ist aufgrund der Rückhalteproblematik nur bedingt
möglich. Abhilfe kann dabei durch eine Immobilisierung der Enzyme geschaffen werden.
Diese gezielte Heterogenisierung der Enzyme kann ebenso sehr hilfreich bezüglich einer
Erhöhung der Stabilität sein. So wurden dahingehend hervorragende Ergebnisse in der
Stabilisierung gegenüber Lösungsmitteln, erhöhter Temperatur und pH-Einflüssen erzielt
[18-22]. Des Weiteren kann die Auswahl der richtigen Immobilisierungstechnik zu einer
Erhöhung der katalytischen Aktivität führen [18, 23, 24].
Grundsätzlich kann zwischen drei methodischen Ansätzen zur Immobilisierung von Enzymen
unterschieden werden: (1) Der Bindung von Enzymen an ein festes Trägermaterial, (2) einer
Quervernetzung von Enzymmolekülen untereinander und einer Einkapselung in eine
Matrix (3a) bzw. Einhüllung in eine Membran (3b) (Abbildung 1).
Abbildung 1: Methoden zur Immobilisierung von Enzymen [18]
Zur näheren Klassifizierung einer Trägerbindung von Enzymen muss zwischen den
zugrundeliegenden Bindungskräften unterschieden werden. Eine vorwiegend auf
elektrostatischen Wechselwirkungen, hydrophoben Interaktionen oder der Ausbildung von
Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals-Kräften basierenden Bindung wird der
Gruppe der adsorptiven bzw. ionischen Immobilisierung zugeschrieben [24]. Diese Art der
Anheftung ist sehr schonend für das Enzym, hat jedoch oftmals den Nachteil, dass die
Einleitung
5
Bindungskräfte sehr schwacher Natur sind. Dies kann bei einem Einsatz der Immobilisate in
wässrigen oder tensidisch wirkenden Reaktionsmedien einen fortwährenden Verlust der
Enzyme von der Trägeroberfläche nach sich ziehen [25]. Bei der adsorptiven Immobilisierung
von Lipasen wird zudem oftmals von einer „Hyperaktivierung“ berichtet, die auf eine
Grenzflächenaktivierung der Lipasen zurückzuführen ist. Dabei durchläuft die Lipase eine
konformationelle Strukturänderung, sobald ein Kontakt mit einer wässrig/organischen
Grenzfläche bzw. einem hydrophoben Trägermaterial hergestellt wird. Dabei klappt eine
α-helikale Struktur, die das aktive Zentrum bedeckt und als „Lid“ bezeichnet wird, auf, da der
dem aktiven Zentrum zugewandte Teil ebenfalls hydrophob ist. Dieser Vorgang ist in der
Regel mit einer Steigerung der spezifischen Aktivität verbunden. Eine kovalente Bindung der
Enzyme auf der Trägeroberfläche basiert auf einer Reaktion von Aminosäureseitenketten
und funktionellen Gruppen auf dem Träger, die meist über Vernetzungsreagenzien
vermittelt werden. Dies verhindert zwar ein „Abwaschen“ der Enzyme, ist jedoch oftmals mit
starken Aktivitätsverlusten verbunden [26]. Diese kommen zustande, wenn die Bindungen
Konformationsänderungen verursachen oder an Seitenketten binden, die für den
katalytischen Mechanismus essentiell sind [27].
Die Bildung unlöslicher Enzymaggregate, sogenannter „CLEA’s“, beruht auf einer
Präzipitation von Enzymen ausgelöst von Salzen, organischen Flüssigkeiten oder Säuren,
gefolgt von einem Einsatz multivalenter Vernetzungsreagenzien [28, 29]. Es können
Enzymlösungen sowohl mit Fremdproteinen als auch mit Polymeren zusammen vernetzt
werden. Dabei entstehen heterogene Enzympräparate, die je nach verwendetem nicht-
katalytischen Material verschiedene Eigenschaften aufweisen können.
Einhüllungen bzw. Einkapselungen in polymere Matrices sind ebenfalls sehr schonend für
das Enzym, da keine direkten Interaktionen mit der Enzymoberfläche eingegangen werden.
Vielmehr kann eine Mikroumgebung geschaffen werden, die die Enzyme vor äußeren
Einflüssen wie bspw. einem Einsatz in organischen Lösungsmitteln schützt [24].
Hauptnachteil dieser Methoden besteht in einem eingeschränkten Massentransfer, da das
Immobilisierungspolymer als Diffusionsbarriere für die Substrate und Produkte zu
betrachten ist.
Einleitung
6
In jedem Fall bleibt festzuhalten, dass es nicht „die beste“ Immobilisierungsmethode für alle
Enzyme gibt. Viele der durchgeführten Immobilisierungen wurden ohne eine genaue
strukturelle Information der Enzyme und ohne ein Verständnis des Zusammenhangs
zwischen dem Verhalten der Immobilisate und der angewandten Methode
durchgeführt [24]. Die Immobilisierung von Enzymen ist oftmals geprägt von der Abwägung
die katalytische Aktivität und Stabilität zu erhalten oder möglichst zu verbessern und die
meist verfahrenstechnischen Vorteile einer Immobilisierung zu erreichen [30]. Eine
Möglichkeit, um beispielsweise mechanisch instabile Enzym-Polymer-Präparate für Prozesse
mit hohen Scherkräften zu stabilisieren bzw. um die generelle Prozessstabilität hochaktiver
immobilisierter Enzyme zu erhöhen, ist die rationale Kombination verschiedener Techniken.
So können zum Beispiel Enzyme zuerst quervernetzt werden, um eine hohe Stabilität zu
generieren und anschließend eine Polymereinhüllung zum Erreichen verfahrenstechnischer
Anforderungen durchgeführt werden [31]. Aber auch eine nachträgliche Modifikation der
bereits immobilisierten Enzyme kann helfen, um beispielsweise ein Abwaschen der
Katalysatoren von der Trägeroberfläche zu minimieren oder auch um die Stabilität zu
erhöhen [24]. Im folgenden Kapitel werden neben anderen Aspekten zur Verbesserung
enzymatischer Reaktionen verschiedene Methoden vorgestellt, die eine Modifikation von
Enzymen bewirken und somit Einfluss auf die Aktivität und Stabilität nehmen können.
1.3 Maßnahmen zur Erhöhung der Aktivität und Stabilität von Enzymen
in der chemischen Synthese
Obwohl Enzyme bereits in einer Vielzahl von industriellen Prozessen eingesetzt werden, ist
eine Ausweitung der Anwendungsgebiete durch fehlende Aktivitäten für spezielle Substrate,
unzureichende Stabilitäten oder Selektivitäten beschränkt [30]. Im Wesentlichen gibt es
dahingehend drei Ansätze diese Limitierungen zu überwinden und den Wirkungsbereich von
Enzymen in der chemischen Synthese zu erweitern: (1) Entwicklung modifizierter Substrate
(substrate engineering), (2) Weiterentwicklung des Reaktionsmediums (medium engineering)
und die Modifikation von Enzymen (catalyst engineering).
Einleitung
7
Substrate engineering
Der Einsatz modifizierter Substrate zielt hauptsächlich auf eine Erhöhung der Effizienz
enzymatischer Reaktionen ab [30]. Typische Beispiele sind der Einsatz fluorierter
Acyldonatoren in der lipasekatalysierten Acylierung, um eine Aufreinigung der Produkte mit
perfluorierten Lösungsmitteln zu erleichtern [32]. Dabei konnte im Vergleich zum
herkömmlichen Prozess eine erhöhte Enantioselektivität festgestellt werden. Auch eine
Verwendung alternativer Substrate kann die Ausbeute, die Enantioselektiviät und die
Stabilität der Biokatalysatoren erhöhen, wie es bei einem Einsatz von Vinyl-Estern chiraler
Carboxylsäuren gegenüber typischerweise eingesetzten Ethyl-Estern nachgewiesen wurde
[33, 34].
Medium engineering
Forschungen im Bereich der Reaktionsmedien haben seit der Entdeckung der Möglichkeit
enzymatischer Reaktionen in unkonventionellen Medien fortwährend Bestand. So unter-
suchte Klibanov bereits 1987 den Einfluss unterschiedlicher Lösungsmittel auf die Aktivität
verschiedenster enzymatischer Prozesse [35]. In den letzten Jahrzehnten wurden sowohl die
Einflüsse von Lösungsmitteln auf wässrige Reaktionen mit Cosolventien, wässrig-organische
Zweiphasensysteme und auf einphasige Lösungsmittelsysteme erforscht. Es konnten durch
die Zugabe von beispielsweise DMSO oder SDS drastisch erhöhte E-Werte (Verhältnis der
Reaktionsgeschwindigkeit zweier Enantiomere) in einer lipasekatalysierten Hydrolyse von
Phenoxypropionaten erreicht werden [36]. Zudem können Cosolventien einen Effekt auf die
Stabilität von Enzymen haben, wie eine Arbeit von Iding et al. [37] zeigt. Noch deutlicher
wird der Erfolg durchgeführter Studien zum „medium engineering“ im Bereich purer
organischer Lösungsmittel. Hier reicht die Bandbreite der Ergebnisse von einem 20-fachen
E-Wert einer durch Subtilisin katalysierten Reaktion allein durch den Wechsel des
Lösungsmittels von Acetonitril zu 1,4-Dioxan [14], bis hin zu einer vollständig invertierten
Enantioselektivität [15] als Folge des Lösungsmittelwechsels. Auch die Stabilität ist im
großen Maße vom verwendeten Lösungsmittel anhängig, wie beispielsweise die zuvor
diskutierte Neigung polarer Lösungsmittel zum Austausch oberflächengebundener Wasser-
moleküle mit Lösungsmittelmolekülen aufzeigte. Eine weitere Möglichkeit die Eigenschaften
Einleitung
8
des Reaktionsmediums entscheidend zu variieren, ist der Einsatz von ionischen
Flüssigkeiten (IL) und/oder überkritischen Fluiden. Die Auswahl der entsprechenden
Ionenpaare, der bei Raumtemperatur flüssigen ionischen Flüssigkeiten ist maßgeblich für die
Eigenschaften dieses Reaktionsmediums [38]. Durch den Einsatz von IL’s konnten bereits
bemerkenswerte Verbesserungen im Hinblick auf Ausbeuten, Enantioselektivitäten und auch
Enzymstabilitäten erreicht werden [39]. Überkritische Fluide zeigen insbesondere Vorteile in
der Produktaufarbeitung und -extraktion und zeichnen sich durch hohe Diffusionsraten aus
[40, 41].
Um für einen chemischen Prozess das passende Reaktionsmedium auszuwählen, müssen
verschiedene Aspekte berücksichtigt werden. So sollten Substrate und Produkte eine
ausreichende Löslichkeit aufweisen, das Lösungsmittel inert bezüglich jeglicher Neben-
reaktionen sein und nach Möglichkeit eine niedrige Toxizität aufweisen sowie umwelt-
verträglich sein [30].
Catalyst engineering
Das Forschungsgebiet des „catalyst engineering“ umfasst grundverschiedene Herangehens-
weisen. Das im englischen sogenannte „protein engineering“ umfasst im Wesentlichen
molekularbiologische Strategien wie das rationale Design der Enzyme oder eine gerichtete
Evolution [19, 21]. Beim rationalen Design wird versucht durch gezielte Austausche einzelner
Aminosäuren die Sequenz der Enzyme zu verändern und damit Einfluss auf die drei-
dimensionale Struktur oder auf bestimmte Wechselwirkungen beispielsweise mit Substraten
zu nehmen [6]. Eine gerichtete Evolution zielt eher darauf ab, durch zufällig eingeführte
Punktmutationen und einem nachgeschalteten Screening (bzw. Selektion) Varianten des
Enzyms zu generieren bzw. zu finden, welche verbesserte Eigenschaften aufweisen [42, 43].
Beide Methoden benötigen entweder umfassendes Wissen über Struktur-Wirkungs-
beziehungen durch das Vorhandensein von beispielsweise Kristallstrukturen oder sind
aufgrund der Anzahl an Mutanten, die einem Screening unterzogen werden müssen, sehr
arbeitsaufwändig.
Einleitung
9
Neben diesen molekularbiologischen Ansätzen stehen im Wesentlichen die im vorherigen
Kapitel bereits vorgestellte Immobilisierung, eine chemische Modifikationen von Enzymen
sowie die Zugabe stabilisierender und aktivierender Agenzien zur Verfügung. Letzteres wird
insbesondere bei einer Lyophilisierung der Enzyme angewendet, da die oftmals labilen
Proteinstrukturen während des Trocknens einer Änderung der Sekundärstruktur unterliegen,
was mit einer drastischen Abnahme der Aktivität verbunden sein kann [19]. Aber auch die
Aktivität kann durch die Zugabe niedermolekularer Additive verbessert werden. Die
Substanzen bilden die Basis für einen Effekt, der als „Imprinting“ bekannt ist und die
Beibehaltung einer aktiven Konformation auch nach einer Trocknung beschreibt. Die Stoffe,
die meist reversible Inhibitoren sind, stabilisieren das aktive Zentrum und können nach der
Lyophilisierung entfernt werden, ohne die Konformation zu verändern [44]. Für weitere
Additive wie Kronenether, Salze, Zucker, Antioxidatien oder Polyethylenglycol (PEG) wurden
ebenfalls beeindruckende Stabilisierungen beschrieben [19, 21, 45]. Diese Art der
Stabilisierung wird oft auch als physikalische Modifikationen bezeichnet. Eine chemische
Modifikation hingegen bedeutet eine kovalente Bindung chemischer Reagenzien an
funktionelle Gruppen der Aminosäureseitenketten des Enzyms. Obwohl die Zahl der zur
Verfügung stehenden Reagenzien äußert groß ist, sind die Reaktionen zur Anbindung der
Moleküle begrenzt und in der Regel unspezifisch, was den Ort der Modifikation angeht [46].
Je nach Anzahl der am Modifikationsreagenz befindlichen reaktiven Gruppen können
bi- oder multivalente Moleküle intra- oder auch intermolekulare Bindungen zwischen
verschiedenen Aminosäureseitenketten generieren. Monovalente Stoffe hingegen können
nur mit einzelnen Seitenketten reagieren und dienen eher der Veränderung der
Oberflächeneigenschaften der Enzyme [19, 21]. Auch Polymere können an Enzyme
gebunden werden, was insbesondere bei Verwendung von aktiviertem PEG zu deutlichen
Steigerungen der Stabilität gegenüber Lösungsmitteln und erhöhten Reaktionstemperaturen
geführt hat [47-49]. Tabelle 1 fasst einige der zur Verfügung stehenden Reaktionen und
entsprechende Reagenzien zusammen, mit denen verschiedene Aminosäureseitenketten
funktionalisiert werden können.
Einleitung
10
Tabelle 1: Methoden zur Modifikation von Enzymen [50]
Funktionelle Gruppe
Reaktion
Reagenzien
Aminogruppe
Amidierung
Imidoester
Reduktive Alkylierung
NaBH4
Acylierung
Anhydride
Sulfonierung
z.b. Trinitrobenzolsulfonat
Carboxygruppe
Amidierung
EDC + Nucleophil
Guanidingruppe
Alkylierung
Dicarbonyl-Derivate
Imidazolgruppe
Alkylierung
Anhydride
Indolgruppe
Oxidation
N-Bromsuccinimid
Phenolgruppe
Nitrierung
Tetranitromethan
Thiolgruppe
Alkylierung
Halogenacetat
Oxidation
Dithiobis(2-nitrobenzolsäure)
Thioethergruppe
Oxidation
H2O2
1.4 Bedeutung und Syntheserouten chiraler α-Hydroxyketone
Chiralität bezeichnet die Anordnung von Atomen in einem Molekül, die bedingt, dass sich
das Bild und Spiegelbild des Moleküls nicht zur Deckung bringen lassen. Auch als
„Händigkeit“ bezeichnet, stellen tatsächlich die menschlichen Hände das einfachste Beispiel
von Chiralität dar. Abbildung 2 zeigt das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Benzoin an
einer Spiegelebene mit seinen beiden Enantiomeren. Die physikalischen Eigenschaften
zweier Enantiomere sind in einer achiralen Umgebung identisch. Unterschiede zwischen den
Molekülen ergeben sich lediglich im Drehwinkel von polarisiertem Licht und in der
Interaktion mit anderen chiralen Molekülen. Der Umstand einer unterschiedlichen Wechsel-
wirkung in einer chiralen Umgebung wird technisch vor allem zur Trennung der Moleküle,
beispielsweise mittels einer HPLC genutzt. Aus biologischer Sicht ist die genaue Erkennung
der verschiedenen Konfigurationen die Grundlage vieler fein regulierter Abläufe im lebenden
Organismus. Dabei können verschiedene Enantiomere teils stark in ihrer physiologischen
Einleitung
11
Wirkung voneinander abweichen. Dies ist insbesondere in der Entwicklung pharma-
zeutischer Produkte von äußerster Wichtigkeit und unterstreicht das industrielle Interesse
an einer enantiomerenreinen Herstellung chiraler Substanzen.
Abbildung 2: Illustration der Chiralität am Beispiel von Benzoin
Die auch als Acyloine bezeichneten α-Hydroxyketone sind aus Sicht der pharmazeutischen
Industrie sehr interessant. Benzoin stellt das einfachste aromatische α-Hydroxyketon dar
und wird neben der Verwendung als Urease-Inhibitor [51] vor allem als Synthese-Vorstufe
für weitere heterozyklische Verbindungen verwendet [52-54]. Auch andere α-Hydroxy-
ketone sind wichtige Synthesebausteine für eine Vielzahl von Medikamenten, unter
anderem, weil sie einfach in andere mono- oder multifunktionelle Verbindungen wie Diole,
Diamine oder Epoxide umgewandelt werden können [55]. So finden Moleküle dieser
Stoffklasse Anwendung in der Herstellung von beispielsweise Cytokininhibitoren, von
Wirkstoffen in Antidepressiva, Medikamenten gegen Alzheimer oder diversen Antibiotika
[56].
Einleitung
12
Chemische Methoden zur Synthese von chiralen α-Hydroxyketonen
Zu den wichtigsten chemischen Synthesewegen gehören die direkte asymmetrische
α-Hydroxylierung von Ketonen unter Verwendung von molekularem Sauerstoff und dem
Einsatz eines organisch-inorganischen Cu-Piperazin Hybridpolymers [57] sowie die
Ketohydroxylierung von Olefinen durch RuO4 [58], sofern die Strategie eine Einführung von
Hydroxygruppen ins Molekül vorsieht. Eine andere Möglichkeit ist die Verwendung von
n-Bromsuccinimid und der Anwesenheit eines Kupferkatalysators, wodurch eine
asymmetrische Monooxidation korrespondierender 1,2-Diole durchgeführt werden
kann [59]. Bei einem Ausgang von Diketonen hingegen ist eine durch modifizierte
Platinkatalysatoren oder chirale Rutheniumkatalysatoren stereoselektive Reduktion
erfolgreich gezeigt worden [60]. Eine oxidative kinetische Racemattrennung ist durch den
Einsatz von chiralen Eisen- oder Cobalt-Katalysatoren möglich [61]. Eine andere Methode,
die nach biologischem Vorbild verläuft, ist die traditionelle Benzoinkondensation, die
stereoselektiv über chirale Thiazolium- und Triazoliumsalze durchgeführt wird [62].
Chemische Syntheserouten chiraler Acyloine sind in den meisten Fällen Multi-Schritt-
Synthesen, was oft mit einer Verringerung der Gesamtausbeute verbunden ist. Zudem steigt
durch aufwändige Syntheserouten die Abfallmenge, was vor allem ökologisch als auch
ökonomisch nachteilig ist. Da zusätzlich zum Teil nur moderate Enantioselektivitäten erreicht
werden, wurden ausgiebige Untersuchungen hinsichtlich biotechnologischer Synthesewege
unternommen.
Biotechnologische Methoden zur Synthese von chiralen α-Hydroxyketonen
Ein sehr erfolgreicher Syntheseweg für chirale α-Hydroxyketone ist der Einsatz der
Thiadimindiphosphat (ThdP)-abhängigen Benzaldehydlyase (BAL), der Pyruvatdecarboxylase
(PDC) oder der Benzoylformiatdecarboxylase (BFD). Diese Enzyme katalysieren die Bildung
einer neuen C-C Bindung durch eine vom Cofaktor ThdP vermittelten Umpolung der
Carbonylverbindung, was eine nukleophile Attacke anderer Carbonylgruppen ermöglicht. Die
BAL zeichnet sich dabei insbesondere durch ein breites Substratspektrum aus, da sowohl
gleiche als auch unterschiedliche Aldehyde als Substrat akzeptiert werden [63, 64].
Einleitung
13
Eine stereoselektive Oxidation vicinaler Diole ist durch den Einsatz einer Ganzzellsynthese
mit Bacillus stearothermophilus möglich, führt jedoch nur zu sehr niedrigen Umsätzen von
<20 % mit Enantiomerenüberschüssen (ee) von > 99% [65]. Dahingegen ist die
stereoselektive Reduktion von α-Diketonen sehr erfolgreich durchgeführt worden, wobei
sogar die Entstehung der jeweiligen Enantiomere durch die Auswahl der
Ganzzellbiokatalysatoren gesteuert werden kann [55, 66, 67]. Im Fall des Pilzes
Rhizopus oryzae kann durch die Wahl des pH-Wertes wahrscheinlich die jeweilige Aktivität
verschiedener Reduktasen geregelt werden, was bei pH-Werten von 7,5-8 zur Bildung des
(R)-Enantiomers (ee 99%) führt und bei pH-Werten von 4-5 zum (S)-Enantiomer
(ee 80%) [68]. Bei einem Einsatz von Lipasen bzw. Esterasen können sowohl racemische
Ester (mit einer Estergruppe an der α-Hydroxyfunktion) enantioselektiv hydrolysiert werden
[69], als auch durch Veresterungen bzw. Umesterungen enantioselektiv Esterbindungen an
der α-Hydroxyfunktion eingeführt werden [70]. Da die Trennung der verbleibenden
Substrate und der Ester aufgrund der unterschiedlichen Eigenschaften sehr einfach ist, kann
das gewünschte Substratenantiomer durch eine nachfolgende unspezifische Hydrolyse des
Esters einfach und in großen Ausbeuten zurückgewonnen werden. Generell sind diese
sogenannten kinetischen Racematspaltungen (KR) auf einen Umsatz von maximal 50 %
begrenzt, da aufgrund der hohen Selektivität bevorzugt nur ein Enantiomer umgesetzt wird.
Um diese Hürde zu umgehen, wurde die Strategie der dynamisch kinetischen
Racematspaltung (DKR) entwickelt. Die DKR wird im folgenden Kapitel, nicht zuletzt wegen
der hohen der Relevanz für diese Arbeit, näher vorgestellt.
Tabelle 2 fasst die vorgestellten chemischen und biotechnologischen Methoden, den jeweils
verwendeten Katalysatoren und die Ausgangsmoleküle zur Synthese von chiralen α-Hydroxy-
ketonen zusammen.
Einleitung
14
Tabelle 2: Zusammenfassung der wichtigsten chemischen und biotechnologischen Synthesewege von
α-Hydroxyketonen
Zielmoleküle
Reaktion
Ausgangsmolekül(e)
Chemische /
organochemische
Synthese
α-Hydroxylierung
Ketohydroxylierung
Asymmetrische
Oxidation
Stereoselektive
Reduktion
Oxidative
kinetische
Racemattrennung
Asymmetrische
Kondensation
Biotechnologische
Synthesen
Carboligation
Oxidation
Stereoselektive
Reduktion
Kinetische
Racemattrennung
1 Hier wurden Ganzzellsynthesen durchgeführt
Einleitung
15
1.5 Dynamisch kinetische Racematspaltung
Die Racematspaltung stellt den wichtigsten industriellen Ansatz zur Herstellung purer
enantiomerenreiner Verbindungen dar [71]. Die enzymatisch katalysierte kinetische
Racematspaltung basiert dabei auf einer bevorzugten Reaktion des Enzyms mit einem der
beiden Enantiomere. Kinetisch betrachtet bedeutet dies, dass bei einer hohen Selektivität
des Enzyms die Geschwindigkeitskonstante für die Umsetzung eines Enantiomers sehr viel
größer ist, als für das entsprechend andere Molekül (Abbildung 3). Dies erklärt auch, dass
sich die Reaktionsgeschwindigkeit bei einem Erreichen der Umsatzmarke von 50 % deutlich
verlangsamt, da das favorisierte Enantiomer nahezu verbraucht ist. Der maximal erreichbare
Umsatz von eben lediglich 50 % stellt auch den größten Nachteil der kinetischen Racemat-
spaltung dar. Zur Überwindung dieser Marke ist es nötig, das verbleibende, nicht
erwünschte Enantiomer zu racemisieren und somit neues Substrat für die stereoselektive
Umsetzung zu generieren. Die Kombination aus stereoselektiver Umsetzung eines
Enantiomers und der Racemisierung des unerwünschten Substrates wird als dynamisch
kinetische Racematspaltung (DKR) bezeichnet.
Erste Versuche, eine Trennung der Produkte vom unerwünschten Substratenantiomer
durchzuführen, das restliche Substrat in einem folgenden Schritt zu racemisieren und dann
erneut der enzymatischen Umsetzung zuzuführen, sind sehr umständlich und erfordern ein
großes Maß an experimentellem Aufwand [72]. Um dabei eine Ausbeute von bis zu 100 % zu
erreichen, müsste theoretisch eine unendliche Anzahl an Zyklen durchgeführt werden,
wobei rein rechnerisch betrachtet nach bereits fünf Durchläufen ein Umsatz von >95 %
erreicht werden kann. Gängiger hingegen ist die Durchführung einer in situ Racemisierung,
bei der das unerwünschte Enantiomer gleichzeitig zur enzymatischen Reaktion ständig
racemisiert wird, bis das komplette Substrat umgesetzt wurde. Dabei ist wichtig, dass die
Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung möglichst größer ist, als die er enzymatischen
Reaktion. So kann die hohe Selektivität der Enzyme durch den ständigen Substratnachschub
genutzt werden [71] (Abbildung 3).
Einleitung
16
Da in der Regel versucht wird eine direkte Kopplung der enzymatischen Reaktion und der
Racemisierung in einem gemeinsamen Reaktionsraum („onepot“) zu realisieren, ist die
Optimierung beider Teilreaktionen nötig. Beide Katalysatoren sollten bei gleichen
Bedingungen über eine ausreichende Stabilität und Aktivität verfügen. Ein gezieltes
Screening bzw. Neuentwicklung geeigneter Racemisierungskatalysatoren stellt somit einen
wichtigen Teil einer DKR-Prozessentwicklung dar.
Abbildung 3: Prinzip einer DKR
Ebbers et al. [73] haben eine Klassifizierung verschiedener Racemisierungsmethoden
vorgeschlagen und folgende Einteilung vorgenommen:
» Thermische Racemisierung
» Enzym-katalysierte Racemisierung
» Photochemische Racemisierung
» Redox-Racemisierung
» Säure/Basen-Racemisierung
» Nukleophile Substitution
» Bildung von Schiff’schen Basen
» Bildung von Meso-Intermediaten
Obwohl für alle Methoden durch diverse Beispielreaktionen eine generelle Eignung zur
Racemisierung chiraler Moleküle gezeigt werden konnte, sind nicht alle Strategien für eine
Kombination mit Enzymen geeignet. So sind beispielsweise die hohen Reaktions-
temperaturen der thermischen Racemisierung der Grund dafür, dass diese Methode
üblicherweise nicht im „onepot“ mit Enzymen verwendet wird. Typische Racemisierungs-
temperaturen liegen bei >100 °C [73], wobei Enzyme in der Regel bei Raumtemperatur oder
Einleitung
17
leicht erhöhten Temperaturen von 30-50 °C eingesetzt werden. Photochemische
Racemisierungen haben ein sehr begrenztes Substratspektrum, welches sich insbesondere
auf Cyclopropanderivate oder Allene beschränkt. Die Bildung von Schiff’schen Basen kann
nur mit freien primären Aminogruppen am Chiralitätszentrum durchgeführt werden und ist
daher hier nicht von Bedeutung. Nukleophile Substitutionen werden bezüglich einer
Racemisierung vor allem für Halogenide und Nitrile beschrieben und ist auch aufgrund des
Reaktionsmechanismus nicht für diese Arbeit geeignet (vgl. [73]). Die Bildung der Meso-
Intermediate bezeichnet die Racemisierung ohne eine Reaktion am chiralen Zentrum. Dabei
wird das chirale Molekül zuerst in ein achirales überführt, indem eine der funktionellen
Gruppen am chiralen Zentrum reagiert und beispielsweise eine zweite identische
Estergruppe am Stereozentrum eingeführt wird. Eine nachfolgende Hydrolyse kann dann die
Stereoinformation zurückbringen. Diese Methode ist jedoch für das hier eingesetzte Substrat
nicht relevant. Des Weiteren ist die Möglichkeit der enzymatischen Racemisierung bereits
erfolgreich durch den Einsatz verschiedener Racemasen, wie beispielsweise der
Mandelatracemase für die Racemisierung der Mandelsäure, gezeigt worden [72]. Allerdings
ist zumeist das Substratspektrum dieser Enzyme eingeschränkt und aufgrund einer oftmals
geringen Stabilität in organischen Lösungsmitteln sind diese Biokatalysatoren kaum in der
Lage mit chemischen Varianten zu konkurrieren.
Im Gegensatz zu den oben beschriebenen Racemisierungsmethoden wurde die Redox-
Racemisierung durch Übergangsmetallkatalysatoren vielfach in Kombination mit einer
enzymatischen Acylierung für sekundäre Alkohole [74-76] bzw. α-Hydroxyketone [70, 77]
beschrieben. Dabei kommen vor allem Ruthenium basierte organo-metallische Katalysatoren
zum Einsatz und ermöglichen so eine „reversible Wasserstoffübertragung“. Der
anzunehmende Reaktionsmechanismus ist in Abbildung 4 dargestellt. Maßgeblich beteiligt
am Erfolg dieser chemo-enzymatischen Kombination waren die Arbeiten der Gruppe um
Bäckvall, die den Ruthenium basierten Shvo-Katalysator erstmals in der DKR von
1-Phenylethanol unter Verwendung von Novozym 435 beschrieben [78]. Darauf folgend
wurden in den letzten 10 - 15 Jahren erstaunliche Fortschritte im Bereich der DKR durch
Übergangsmetall - Enzym-Katalyse gemacht, wobei in der Entwicklung neuer Katalysatoren
insbesondere auf eine Verkürzung der Reaktionszeit, milderen Reaktionsbedingungen und
Einleitung
18
eine möglichst einfache Handhabung hingearbeitet wurde. Die Ergebnisse dieser Studien
wurden in verschiedenen Übersichtsartikeln hervorragend zusammengetragen [79-81].
Eine zweite erfolgreich angewandte Strategie zur Racemisierung von chiralen sekundären
Alkoholen [82, 83] und Acyloinen [84] ist die säure-katalysierte Racemisierung. Hierbei
kommen hauptsächlich heterogene Katalysatoren zum Einsatz, die aus verfahrens-
technischer Sicht als sehr geeignet gelten. Durch den heterogenen Charakter wird die
Abtrennung der Katalysatoren stark vereinfacht. Folglich ist deren Wiederverwendung
erleichtert und die Reinheit der Produktlösung kann durch einen einfachen mechanischen
Prozessschritt wesentlich erhöht werden. Die Bandbreite der aciden Trägermaterialen reicht
von Ionenaustauschern [84] über Zeolithe, welche mit Aluminium und Zirconium
funktionalisiert sind [85], bis hin zu Benzylsulfonsäure-modifizierten Trägermaterialen [86].
Für Acyloine wird unter anderem vorgeschlagen, dass eine Racemisierung über die Bildung
der korrespondierenden Endiole abläuft, was in Abbildung 5 dargestellt ist [84, 87, 88].
Abbildung 4: Redox Racemisierung
Abbildung 5: Racemisierung durch Keto-Enol-Tautomerie von α-Hydroxyketonen
Die dynamisch kinetische Racematspaltung von Benzoin stellt die Zielreaktion dieser Arbeit
dar (Abbildung 6). Die Arbeitsgruppe um Prof. Dr. Andrés R. Alcántara und dabei
insbesondere Dr. Pilar Hoyos haben bereits umfassende Studien zur chemo-enzymatischen
Kopplung der Lipase TL mit einem chemischen Racemisierungskatalysator, dem Shvo-
Katalysator betrieben [70, 89, 90].
Einleitung
19
Abbildung 6: Lipase TL katalysierte DKR von Benzoin
Hoyos et al. [70] konnten erfolgreich zeigen, dass die DKR mit dem genannten Katalysator
möglich ist und Umsätze von maximal 92 % bei einem ee von >99 % in einer Reaktionszeit
von 48 h erreicht werden können. Die dort beschriebene thermische Instabilität der
Lipase TL führte dazu, dass die DKR in insgesamt drei Schritten durchgeführt werden musste.
Dabei wurde nach einer kurzen KR von ca. 3 h und einem Umsatz von 30 % das
Lösungsmittel und der Acyldonor entfernt und die DKR durch Zugabe von frischem
Lösungsmittel, Acyldonor und des Shvo-Katalysators gestartet. Der dritte Schritt bestand in
einer späteren (nach 24 h) erneuten Zugabe von Lipase TL-Pulver, um die Deaktivierung des
Enzyms auszugleichen. Eine Immobilisierung der Lipase in Silikon führte laut Hoyos et al. zu
einer Stabilisierung [89]. In dieser Einsatzform konnte ein Umsatz von maximal 87 % bei
einem ee von >99 % in einer Reaktionszeit von 20 h erreicht werden, ohne dass zusätzliche
Schritte notwendig wurden.
Einleitung
20
1.6 Problemstellung und Zielsetzung
Die Synthese chiraler α-Hydroxyketone ist für die pharmazeutische Industrie von großer
Bedeutung. Die Verwendung derartiger Verbindungen als Synthesebausteine in der
Medikamentenherstellung oder als Vorstufen anderer chiraler Moleküle hat das Bestreben
nach einer effizienten Herstellung in den letzten Jahren stark gefördert. Gegenüber
chemischen Herstellungsverfahren zeichnen sich biokatalytische Methoden insbesondere
durch ihre hohe Regio- und Stereoselektivität sowie durch milde Reaktionsbedingungen aus.
Die dynamisch kinetische Racematspaltung (DKR) beschreibt die Kombination einer
enzymatisch katalysierten Racematspaltung und der in situ Racemisierung des nicht
umgesetzten Eduktenantiomers. Der Einsatz von Hydrolasen zur Katalyse der kinetischen
Racematspaltung (KR) ist insbesondere industriell von außerordentlichem Interesse, da diese
Enzyme keine Cofaktoren benötigen und zudem eine hohe Stabilität in unkonventionellen
Medien zeigen.
Benzoin stellt das einfachste aromatische α-Hydroxyketon dar und ist das Zielsubstrat dieser
Arbeit. Stand der Technik zur Synthese von enantiomerenreinem Benzoin bzw. seiner Ester
mittels DKR ist der Einsatz einer immobilisierten Variante der kommerziellen Lipase TL aus
Pseudomonas stutzeri und eines Übergangsmetallkatalysators (Shvo-Katalysator) zur
Racemisierung. Bisherige Arbeiten zeigten neben dem immensen Potential der DKR von
Benzoin auch die Limitierungen bezüglich einer industriellen Umsetzung. Hoyos et al. [89]
beschrieben eine hohe Instabilität der Lipase TL unter den gewählten Reaktions-
bedingungen. Eine nachfolgend entwickelte Immobilisierung der Lipase TL in einer statischen
Suspension führte nach Aussage von Hoyos et al. [89] zu einer erhöhten Stabilität.
Vorexperimente zu dieser Arbeit zeigten jedoch, dass die Silikonpräparate Nachteile in ihrer
Handhabung und der reproduzierbaren Herstellung aufweisen. Der verwendete Race-
misierungskatalysator ist zudem sehr empfindlich gegenüber Sauerstoff bzw. Wasser und
kann aufgrund des homogenen Charakters nicht wiederverwendet werden.
Einleitung
21
Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines verbesserten Reaktionssystems zur DKR von
Benzoin. Hauptaugenmerk sollte dabei auf eine einfache Handhabung und hohe Robustheit
der eingesetzten Katalysatoren gelegt werden. Zielvorgabe war es, die Ergebnisse dieser
Arbeit als Grundlage zur Auslegung einer technischen Umsetzung der DKR von Benzoin in
folgenden Projekten anzuwenden. Zur Erfüllung der Zielvorgabe wurden zwei wesentliche
Teilziele formuliert und in den entsprechenden Arbeitsschritten bearbeitet:
(1) Optimierung der kinetischen Racematspaltung
» Immobilisierung der Lipase TL, bei der reproduzierbar hochaktive
Immobilisate hergestellt werden können, die den Anforderungen einer
Reaktion in unkonventionellen Medien genügen (Kapitel 3.1 und 3.2)
» Charakterisierung der Reaktionsparameter der KR zur Optimierung der
Aktivität und zur Identifikation inaktivierender Einflüsse auf die Lipase TL
(Kapitel 3.3)
» Maßnahmen zur Steigerung der Stabilität der immobilisierten Lipase TL
(Kapitel 3.4)
(2) Die Entwicklung einer alternativen Racemisierungsmethode zur „onepot“ DKR
von Benzoin.
» Screening nach alternativen, heterogenen Racemisierungskatalysatoren und
Untersuchung ihrer Eignung für die Racemisierung und DKR von Benzoin
(Kapitel 3.5)
» Charakterisierung und Optimierung der DKR von Benzoin unter Verwendung
des alternativen Reaktionssystems (Kapitel 3.6)
Material und Methoden
22
2 Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Chemikalien
Alle verwendeten Lösungsmittel und gängige Laborchemikalien wurden, wenn nicht anders
aufgeführt, über die Zulieferer Sigma Aldrich oder Carl Roth bezogen.
Tabelle 3: Chemikalienliste
Bezeichnung
Hersteller, Standort
1,4-Dioxan
Merck (Darmstadt, DE)
1-Ethyl-3-(3-dimethyl-
aminopropyl)carbodiimid
Merck (Darmstadt, DE)
2-Komponenten Silikon
Evonik Goldschmidt (Essen, DE)
2-Methyltetrahydrofuran
AppliChem (Darmstadt, DE)
Accurel MP1001
Membrana (Wuppertal, DE)
Benzoin (rac, (R), (S))
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Ethanolamin
Carl Roth (Karlsruhe, DE)
Ethylendiamin
Carl Roth (Karlsruhe, DE)
Hydroxylamin
Merck (Darmstadt, DE)
iso-Propanol
VWR (Darmstadt, DE)
Karstedt-Katalysator
Evonik Goldschmidt (Essen, DE)
Lipase TL
Meito Sangyo Co., Ldt. (Nagoya, JPN)
Methylisobutylketon
Carl Roth (Karlsruhe, DE)
Molekularsieb (4 Å)
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Palladium auf Kohlenstoff
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Polyethylenimin
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Pyridin
AppliChem (Darmstadt, DE)
Roti-Quant
Carl Roth (Karlsruhe, DE)
Sepabead EC-OD
Resindion S.R.L (Binasco, I)
Material und Methoden
23
Shvo-Katalysator
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Sulfonsäureträger
Merck (Darmstadt, DE)
Sylgard®184-Komponente A / B
Dow Corning (Wiesbaden, DE)
Syl-Off®4000
Dow Corning (Wiesbaden, DE)
TUD-1-Katalysatoren
TU Delft (Delft, NL) – AK Prof. Hanefeld
Vanadylsulfat
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
Vinylbutyrat
Sigma-Aldrich (Steinheim, DE)
2.1.2 Geräte
Tabelle 4: Geräteliste
Bezeichnung
Hersteller, Standort
Autotitrator Titroline Alpha
Schott AG (Mainz, DE)
Feinwaage CP225D
Sartorius (Göttingen, DE)
HPLC & Autosampler
Knauer (Berlin, DE)
HPLC-Pumpe K501
Knauer (Berlin, DE)
Inkubationsschüttler Unimax 1010
Heidolph (Schwabach, DE)
Magnetrührer RCT B
IKA Werk2 (Staufen, DE)
Mikrotiterplatten-Lesegerät Infinite M200
Tecan Systems Inc. (Männedorf, CH)
Multirührplatte RT15
Ika (Staufen, DE)
Peristaltikpumpe
Watson & Marlow (Falmouth, GB)
pH-Meter
Metrohm (Filderstadt Plattenhard, DE)
Schlenkline (Eigenanfertigung)
Glasbläserei TU Berlin (Berlin, DE)
Schwingmühle MM301
Retsch (Haan, Deutschland)
Thermomix-Gerät MKR 23
Ditabis AG (Pforzheim, DE)
Thermoschrank
Aqualytic (Dortmund, DE)
Vakuumpumpe MZ 2C
Vakuubrand (Wertheim, DE)
Waage U6100S
Sartorius (Göttingen, DE)
Zentrifuge Biofuge Stratos
Heraeus (Hanau, DE)
Material und Methoden
24
2.2 Methoden
2.2.1 Immobilisierung der Lipase TL
Eine Immobilisierung der Lipase TL erfolgte auf den Trägern Accurel MP1001 und
Sepabead EC-OD. Mit dem Zweck der Erhöhung der Zugänglichkeit der Poren für die
wässrige Lipaselösung [91] wurden im Fall des Accurel MP1001 500 mg Träger und bei den
Sepabead EC-OD 100 mg des Materials mit Ethanol (7,5 mL/gTräger) versetzt und für
30 Minuten inkubiert. Entsprechend der zu untersuchenden Lipasestartkonzentration wurde
das lyophilisierte Lipase TL-Pulver eingewogen und in 11 mL 10-400 mM Kaliumphosphat-
puffer unter ständigem Rühren bei Raumtemperatur (RT) gelöst. Unlösliche Bestandteile
wurden für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert. Zur Bestimmung des Proteingehalts
vor der Immobilisierung wurde der Enzymlösung eine Probe entnommen und mit der
Bradford-Methode (siehe Kapitel 2.2.3) untersucht. Zum Start der Immobilisierung wurde
das Trägermaterial, welches sich in 15 mL Glasgefäßen mit Bördelrand befand, mit 10 mL
Enzymlösung versetzt, verschlossen und 4 h bei der zu untersuchenden Temperatur auf
einem Orbitalschüttler bei 340 rpm inkubiert. Nach Ablauf der Immobilisierungsdauer wurde
eine Probe von der Reaktionslösung entnommen und erneut der Proteingehalt bestimmt.
Folgend wurden die Immobilisate zur Wäsche zweimal mit 10 mL Immobilisierungspuffer für
5 Minuten geschüttelt und abschließend nach Filtration mit Hilfe einer Vakuumpumpe im
Exsikkator im Vakuum getrocknet. Die Lagerung bis zur weiteren Verwendung erfolgte
ebenfalls im Exsikkator und unter reduziertem Druck.
2.2.2 Herstellung der statischen Suspensionen mit der Lipase TL
Die Herstellung der statischen Suspensionen erfolgte nach dem Protokoll von Hoyos et al.
[89]. Es wurden 4 g der Sylgard®184-Komponente A (Divinylsiloxan) und 0,4 g der
Komponente B (Copolymer eines Methylhydrosiloxans und Dimethylsiloxan) sowie 40 mg
Platinkatalysator Syl-Off®4000 in 1 mL Hexan homogenisiert. Folgend wurden 105 mg
Lipase TL-Pulver zugegeben, kräftig geschüttelt und anschließend durchmischt, bis die
Viskosität begann zuzunehmen. Nach sichtbarer Zunahme der Viskosität wurde das Gemisch
Material und Methoden
25
in eine stark gerührte wässrige 4 % PVA-Lösung mit einer Temperatur von 45 °C gegeben und
für weitere 2 h darin gerührt. Abschließend wurden die statischen Suspensionspartikel
abfiltriert, mit Wasser gewaschen und über Nacht bei 40 °C getrocknet. Die Lagerung bis zur
weiteren Verwendung erfolgte im Exsikkator und unter reduziertem Druck.
2.2.3 Bestimmung des Proteingehalts nach Bradford
Die Bestimmung des Gesamtproteingehalts erfolgte nach der Methode von Bradford. Diese
beruht auf der unspezifischen Komplexbildung zwischen dem Farbstoff Coomassie Brilliant
Blue G-250 und basischen sowie aromatischen Aminosäureresten der Proteine, wodurch sich
das Absorptionsmaximum von 465 nm auf 595 nm verschiebt [92]. Die Kalibrierung wurde
unter Verwendung von Rinderserumalbumin im Konzentrationsbereich von 20 µg/mL bis 100
µg/mL erstellt.
In einer 96-Well-Mikrotiterplatte wurden 50 µL verdünnte Probe vorgelegt und mit 200 µL
Bradfordreagenz, bestehend aus 5,5 Volumenanteilen dest. Wasser und 2 Volumenanteilen
Roti-Quant, versetzt. Nach einer Inkubationszeit von 5 Minuten bei RT erfolgte die Messung
der Extinktion bei 595 nm. Alle Messungen wurden mindestens im Doppelansatz
durchgeführt.
2.2.4 Bestimmung der spezifischen Aktivität
Das Standardsystem der Aktivitätsbestimmung ist die kinetische Racematspaltung von
Benzoin in Tetrahydrofuran (THF) als Lösungsmittel. Die Standard-Benzoinkonzentration
betrug 20 mg/mL (94 mM) und vom Acyldonor Vinylbutyrat (VB) wurden 6 Äquivalente
eingesetzt. Die Standardreaktionstemperatur betrug 21,5 °C, was im Folgenden auch als
Raumtemperatur (RT) bezeichnet wird. Zur Durchführung des Aktivitätstests wurden 10-
60 mg Lipase TL-Immobilisat bzw. Lipase TL-Pulver in 1,5 mL HPLC-Vials vorgelegt und mit
1 mL Benzoinlösung versetzt. Folgend wurde dieser Reaktionsansatz für 10 Minuten bei
1100 rpm in einem Thermomixer geschüttelt, um die mit Luft gefüllten Kavitäten der
Accurel-Träger mit Reaktionslösung zu benetzen. Die Reaktion wurde durch Zugabe von
Material und Methoden
26
71,6 µL Vinylbutyrat gestartet und weiterhin geschüttelt. Die Probenentnahme erfolgte nach
gewählten Zeitabständen von beispielsweise 3, 6, 9 Minuten mit einer gasdichten Spritze
durch ein Septum im Deckel des HPLC-Gefäßes. 20-30 µL Probe wurden folgend in 1 mL
iso-Propanol überführt, kräftig geschüttelt und mit Hilfe einer HPLC (siehe Kapitel 2.2.16)
analysiert. Sofern das native Lipase TL-Pulver untersucht wurde, mussten nach Verdünnung
der Probe mit iso-Propanol kleinste Mengen des Pulvers durch 1 Minute Zentrifugation bei
13000 rpm abgetrennt und der Überstand in ein leeres HPLC-Gefäß überführt werden.
Der genaue Verdünnungsfaktor ergab sich aus dem Verhältnis der Stoffmenge der Edukte
und Produkte in der verdünnten Probe zur Stoffmenge des eingesetzten Benzoins. Die
Stoffmengen der Edukte und Produkte konnten aus denen in der HPLC mittels Kalibration
aller Substanzen ermittelten Konzentrationen und dem bekannten Volumen (1 mL +
Probenmenge) errechnet werden.
Einfluss des Lösungsmittels und der Temperatur
Die Untersuchungen bezüglich einer Lösungsmittelalternative wurden analog zum
Standardaktivitätstest durchgeführt. Einzig die Benzoinkonzentration musste aufgrund der
unterschiedlichen Löslichkeit angepasst werden. Es wurden erneut 6 Äquivalente
Vinylbutyrat verwendet.
Im Rahmen der Bestimmung der spezifischen Aktivität in Abhängigkeit der Temperatur
wurde die Benzoinlösung vor Zugabe zum Lipase TL-Immobilisat bzw. zum Lipase TL-Pulver in
einem Ölbad vortemperiert und der Thermomixer auf die gewählte Temperatur eingestellt.
Alle weiteren Abläufe erfolgten analog dem Standardaktivitätstest.
2.2.5 Silikonbeschichtung der Lipase TL-Immobilisate
Die Beschichtung der Accurel-Lipase TL-Immobilisate erfolgte in Anlehnung an das
Beschichtungsprotokoll von Wiemann et al. [25]. Es wurden Ansätze von 0,5 g Lipase TL-
Immobilisat mit variierenden Silikonmengen verwendet, wobei sich die prozentualen
Angaben des Silikonanteils jeweils auf die Gesamtmasse des beschichteten (silcoat)
Präparats beziehen. Es wurde ein 2-Komponenten Silikon der Firma Evonik Goldschmidt
Material und Methoden
27
(Essen) verwendet, welches zum einen aus dem Polymermonomer Divinylsiloxan (V-Siloxan)
und zum anderen aus einem SiH-Siloxan als Vernetzer bestand (genaue Zusammensetzung
siehe Tabelle 5). Während der Polymerisierung wurde im Bezug auf die reaktiven Gruppen
ein Vinylüberschuss von 10 % verwendet. Es wurden 40 ppm Karstedt-Katalysator bezogen
auf die Platinmenge pro Gramm Silikon eingesetzt. Die Silikonkomponenten wurden
zunächst in das 2-3 fache Volumen Cyclohexan gelöst, der Polymerisationskatalysator
zugegeben und mit den Enzympräparaten einer Metallschale durchmischt. Die
Durchmischung wurde bis zum Verdampfen des Hauptteils des Cyclohexans fortgeführt. Die
beschichteten Immobilisate wurden nachfolgend noch für ca. 1 h im Abzug stehen gelassen
und dann bis zur Verwendung bei RT im Exsikkator unter vermindertem Druck gelagert.
Tabelle 5: Strukturen der Siloxane des 2-Komponentensilikon
Abkürzung
Strukturformel
Viskosität (η) und
Molekulargewicht (MW)*
Divinylsiloxane
A 100
CH2=CH-SiOMe2-(SiOMe2)98-SiOMe2-CH=CH2
η: 100-150 mPa/s
MW: 7438 g/mol
SiH-Siloxane
B 5
Me3SiO-(SiOMe2)43-(SiOMeH)5-SiOMe3
η: 50-120 mPa/s
[10 % der Siliziumatome sind funktionalisiert]
MW: 3639 g/mol
Herstellerangaben (Evonik Goldschmidt GmbH, Essen)
2.2.6 Einstellung der Wasseraktivität in THF
Zur Einstellung der Wasseraktivität wurden definierte Wassermengen zu trockenem THF
gegeben. Den Zusammenhang des Wassergehaltes und der Wasseraktivität wurde einer
Tabelle aus dem Skript zur Vorlesung Enzymtechnologie III von Frau Prof. Dr. Ansorge-
Schumacher entnommen. Um das THF zu trocknen wurde, dies über wasserfreien
Natriumsulfat über Nacht gelagert und unter verminderten Druck davon getrennt. Die
Lagerung erfolgt anschließend mit aktivierten Molsieben unter einer Argon-Atmosphäre. Der
Aktivitätstests in diesen Lösungsmitteln erfolgte nach dem Standardprotokoll und wurde
Material und Methoden
28
umgehend nach Einstellung der Wasseraktivität durchgeführt. Die Menge an zugesetztem
Wasser ist der Tabelle 12 zu entnehmen.
2.2.7 Bestimmung der Lagerstabilität
Zur Bestimmung der Halbwertszeiten der Lagerstabilität der Lipase TL-Immobilisate bzw. des
nativen Lipase TL-Pulvers wurde die Abnahme der spezifischen Aktivität über die Zeit bei
definierten Bedingungen bestimmt. Zur Durchführung dieser Untersuchung wurden Aliquots
des zu untersuchenden Enzympräparats eingewogen und unter verschiedenen Bedingungen
inkubiert. Die Restaktivität von jeweils zwei Aliqouts wurde nach gewählten Zeiträumen
nach folgenden Protokollen ermittelt. Die Vorgehensweise zur Berechnung der
Halbwertszeiten aus den ermittelten Aktivitäten kann Kapitel 3.3.2 entnommen werden.
Standardlagerstabilitätstest
5-20 mg Lipase TL-Immobilisat bzw. Lipase TL-Pulver wurde mit 500 µL THF versetzt und für
definierte Zeiträume von beispielsweise 2, 4, 6, 8 h bei 1100 rpm und 21,5 °C inkubiert.
10 Minuten vor den gewählten Zeitpunkten wurden 500 µL Benzoinlösung in THF (188 mM)
hinzugefügt. Die Reaktion wurde durch die nachfolgende Zugabe von 71,6 µL Vinylbutyrat
(6 Äquivalente) gestartet. Die Probenbehandlung erfolgte wie unter Kapitel 2.2.4
beschrieben.
Einfluss der Edukte und Produkte auf die Lagerstabilität
Zur Bestimmung der Lagerstabilität bei Anwesenheit des Benzoins wurden je 20 mg
Lipase TL-Immobilisat in 1 mL einer 94 mM Benzoinlösung (in THF) inkubiert und der
Aktivitätstest zweier Aliquots zu gewählten Zeitpunkten durch Zugabe von 71,6 µL Vinyl-
butyrat gestartet. Für die Vinylbutyrat-abhängige Lagerstabilität wurden 500 µL THF mit
35,8 µL Vinylbutyrat versetzt und je 20 mg Lipase TL-Immobilisat darin inkubiert. Der
Aktivitätstest wurde durch Zugabe von weiteren 35,8 µL Vinylbutyrat und 500 µL einer
188 mM Benzoinlösung (in THF) gestartet.
Material und Methoden
29
Zur Bestimmung der produktabhängigen Lagerstabilitäten wurden je 20 mg Lipase TL-
Immobilisat in 1 mL THF mit entweder 47 mM Benzoinbutyrat oder 47 mM Acetaldehyd
inkubiert. Dies entspricht der Konzentration an Produkt bei einem Umsatz von 50 % des
racemischen Benzoins. 10 Minuten vor den gewählten Zeitpunkten der Restaktivitäts-
bestimmung wurden dem Reaktionsansatz 500 µL einer 188 mM Benzoinlösung (in THF)
zugegeben und der Aktivitätstest durch Zugabe von 71,6 µL Vinylbutyrat gestartet.
Einfluss des Lösungsmittels
Die Bestimmung der Lagerstabilität in Abhängigkeit des Lösungsmittels erfolgte analog zum
Standardlagerstabilitätstest mit dem jeweiligen Lösungsmittel. Die Benzoinkonzentration
wurde je nach Löslichkeit im untersuchten Lösungsmittel von 23,5-188 mM variiert.
Einfluss der Temperatur
Zur Bestimmung der Lagerstabilität in Abhängigkeit der Temperatur wurden die Lipase TL-
Immobilisate während der Inkubation in 500 µL THF bei der gewählten Temperatur
(21,5-99 °C) im Thermomixer geschüttelt. Die Benzoinlösung (in THF) wurde in einem Ölbad
entsprechend temperiert und zu gewählten Zeitpunkten zur Bestimmung der Restaktivität
dem Reaktionsansatz zugegeben. Die weitere Vorgehensweise erfolgte analog zum
Standardlagerstabilitätstest.
2.2.8 Bestimmung der Prozessstabilität
2.2.8.1 Wiederholte Batch-Versuche
Die Untersuchung der Prozessstabilität der nativen sowie der mit Silikon beschichteten
Accurel-Lipase TL-Immobilisate in wiederholten Batch-Versuchen erfolgte in THF als
Lösungsmittel und bei 21,5 °C. Die Reaktionsansätze entsprachen denen des
Standardaktivitätstests, wobei je nach Silikonmenge auf den Enzympräparaten eine
entsprechende größere Menge der beschichteten Immobilisate eingewogen wurde, um
letztlich in allen Ansätzen 30 mg Lipase TL-Immobilisat vorliegen zu haben. Nach Start des
ersten Zyklus wurden zu gewählten Abständen Proben entnommen und die Zeit bestimmt,
Material und Methoden
30
bis ein Umsatz von 50 % erreicht wurde. Nach Beendigung der KR wurden die Immobilisate 2
Mal mit THF gewaschen und filtriert. Die Immobilisate wurden dann in weiteren Zyklen
eingesetzt, wobei diese jeweils nach 3 h abgebrochen wurden. Es wurden sowohl die
Anfangsreaktionsgeschwindigkeit als auch der Umsatz nach 3 h bestimmt.
2.2.8.2 Kontinuierliches Reaktionssystem
Die Bestimmung der Prozessstabilität in einem kontinuierlichen System wurde durch einen
kontinuierlichen Rührkesselreaktor (CSTR) realisiert. Der Reaktor bestand zunächst aus
einem 6 mL Schnappdeckelglas, welches mit einem Umstülpstopfen aus Silikon verschlossen
wurde. Im späteren Verlauf der Arbeit wurde ein 6 mL Glasgefäß verwendet, welches durch
das Vorhandensein eines Gewindes mit einem Deckel inkl. lösungsmittelbeständiger
Dichtungen verschlossen werden konnte (siehe Abbildung 28). Der Wechsel des Reaktors
hatte keinen Einfluss auf die bestimmten Halbwertszeiten. Die Substratlösung wurde durch
druckfeste Kunststoffkapillaren mit einem Innendurchmesser von 1 mm mit Hilfe einer
HPLC-Hochdruckpumpe gefördert. Nach einer vollständigen Füllung des Reaktors mit
Substratlösung konnte diese durch den entstehenden Überdruck über eine weitere Kapillare
in das Auffanggefäß abfließen. Die Auslasskapillare befand sich in einem Deckeleinsatz aus
Teflon, der den Reaktionsraum und die Kapillare räumlich durch einen Edelstahlfilter mit
Maschenweiten von 50 µm abgrenzte (siehe Aufbau in Abbildung 28). Probennahme erfolgte
am Ende der Auslasskapillare zu gewählten Zeitpunkten. Die Durchmischung im Reaktor
wurde durch sternförmige Reagenzglas-Rührfische sichergestellt.
In einer beispielhaften Untersuchung wurden 50 mg Lipase TL-Immobilisat im Reaktor
vorgelegt und der Rührfisch zugegeben. Nach dem Verschließen des Reaktorgefäßes wurden
die Zu- und Ablaufkapillaren angeschlossen. Das Vorratsgefäß wurde mit einer
Benzoinlösung (in THF) (23,5-94 mM) und 3 Äquivalenten Vinylbutyrat unter Verdrängung
des gesamten Luftraumes gefüllt. Die gewählte Flussrate wurde an der Pumpe eingestellt
und der Magnetrührer gestartet. In regelmäßigen Zeitabständen wurde eine Probe des
Ablaufs entnommen und in iso-Propanol überführt. Die Analyse erfolgte analog zur
Standardaktivitätsbestimmung mittels HPLC (siehe Kapitel 2.2.16) analysiert.
Material und Methoden
31
Die Vorgehensweise zur Berechnung der Halbwertszeiten aus den ermittelten Umsätzen
kann Kapitel 3.3.3 entnommen werden.
2.2.9 Untersuchung der mechanischen Stabilität
Zur Untersuchung der mechanischen Stabilität wurden die nativen sowie mit Silikon
beschichteten Accurel-Lipase TL-Immobilisate, welche einen Silikonanteil von 70 %
aufwiesen, in einer Schwingmühle zusammen mit einer definierten Menge an Glaskugeln
geschüttelt. Es wurden 1 g natives Lipase TL-Immobilisat und ca. 1,5 g beschichtetes
Lipase TL-Immobilisat mit ca. 3 g Glaskugeln (Durchmesser: 2 mm) in ein Metallgefäß
gegeben. Der Ansatz wurde bei einer Frequenz von 30 sec-1 für 5 Minuten bei
Raumtemperatur geschüttelt. Es wurden Proben der behandelten Träger rasterelektronen-
mikroskopisch untersucht.
2.2.10 Aufnahmen am Rasterelektronenmikroskop (REM)
Alle hier aufgeführten REM-Aufnahmen wurden am Zentrum für Elektronenmikroskopie der
Technischen Universität Berlin mittels eines Rasterelektronenmikroskops (Hitachi S 2700 mit
Wolfram Elektrode, Beschleunigungsspannung: 20 kV, Elektronenstrahlstärke: 500 nA)
erstellt. Die Partikel wurden mittels doppelseitig klebender Folie auf einen Aluminium-
Probenteller fixiert und für die Oberflächenaufnahmen mit Gold besputtert (Filmdicke ca.
20 nm).
2.2.11 Modifikation der immobilisierten Lipase TL
2.2.11.1 Beschichtung mit Polyethylenimin
Die Modifikation der immobilisierten Lipase TL mit Polyethylenimin wurde in Anlehnung an
die Vorschrift von Guisan et al. [93] durchgeführt. Dazu wurden 100 mg Lipase TL-
Immobilisat mit Ethanol (7,5 mL/gTräger) versetzt und für 30 Minuten inkubiert. Danach
erfolgte die Zugabe von 2 mL Polyethylenimin (PEI) in 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH
Material und Methoden
32
6,2, Endkonzentration PEI 1 %). Die Modifikation wurde für 1 h bei RT unter konstantem
Schütteln bei 340 rpm durchgeführt. Die Immobilisate wurden vom Überstand getrennt, mit
200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,2) gewaschen und nach Vakuumfiltration im Exsikkator
getrocknet. Bis zur weiteren Verwendung wurden die modifizierten Immobilisate im
Exsikkator bei reduziertem Druck gelagert. Da die Immobilisate eine Gewichtserhöhung von
ca. 10 % nach der Modifikation aufwiesen, musste in weiterführenden Untersuchungen die
Präparatmenge erhöht werden.
2.2.11.2 Succinylierung
Die Modifikation mit Bernsteinsäureanhydrid (BSSA) erfolgte nach dem Protokoll von Bianchi
et al. [94]. 100 mg Lipase TL-Immobilisat wurden mit Ethanol (7,5 mL/gTräger) versetzt und für
30 Minuten inkubiert. 20 mg BSSA wurden in 2 mL 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 8)
gelöst. Der pH-Wert wurde unter Verwendung eines Autotitrators durch Zugabe von 1 M
Kaliumhydroxidlösung konstant gehalten. Das inkubierte Immobilisat wurde mit der BSSA-
Lösung versetzt und für 2 h bei 20 °C und 340 rpm geschüttelt. Der Überstand wurde
abgetrennt und die modifizierten Immobilisate mit 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,2)
gewaschen. Nach einer Vakuumfiltration erfolgte die Trocknung im Exsikkator. Die
modifizierten Immobilisate wurden ebenfalls im Exsikkator bis zur weiteren Verwendung
unter reduziertem Druck gelagert.
2.2.11.3 Acylierung mit aktivierten Methoxypolyethylenglykolen (mPEG)
Die Modifikation mit p-Nitrophenyl-mPEGn-carbonat erfolgte in Anlehnung an die Vorschrift
von Ratzka et al. [95]. Die aktivierten mPEG's wurden arbeitsgruppenintern hergestellt und
waren identisch mit denen aus der Studie von Ratzka et al. [95]. 100 mg Lipase TL-
Immobilisat wurden mit Ethanol (7,5 mL/gTräger) versetzt und für 30 Minuten inkubiert.
Nachfolgend wurde 2 mL 200 mM Kaliumphosphatpuffers (pH 6,2) zugegeben. Zur
Reaktionslösung wurden p-Nitrophenyl-mPEG2000-carbonat bzw. p-Nitrophenyl-mPEG5000-
carbonat im molaren Überschuss von 1:100 und 1:500 (bezogen auf die Molmasse an
Protein auf den Trägern) hinzugefügt. Die Modifikation erfolgte für 2 h bei RT und 340 rpm
Material und Methoden
33
auf einem Orbitalschüttler. Der Überstand wurde abgetrennt und die modifizierten
Immobilisate mit 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,2) gewaschen. Nach einer Vakuum-
filtration erfolgte die Trocknung im Exsikkator. Die modifizierten Immobilisate wurden
ebenfalls im Exsikkator bis zur weiteren Verwendung unter reduziertem Druck gelagert.
2.2.11.4 Hydroxyethylamidierung
Die Hydroxyethylamidierung mit Ethanolamin erfolgte gemäß eines Protokolls von
Cabrera et al. [96]. Dazu wurden 100 mg Lipase TL-Immobilisat mit Ethanol (7,5 mL/gTräger)
versetzt und für 30 Minuten inkubiert. Danach erfolgte die Zugabe von 2 mL 1 M
Ethanolamin (EA) in 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH = 4,75). Im nächsten Schritt wurden
16 mg 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid (EDC) hinzugefügt und die
Reaktionslösung für 90 Minuten bei 25 °C und 340 rpm geschüttelt. Nach Entfernung des
Überstandes wurden die Immobilisate mit 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7)
gewaschen, mit 6 mL 0,1 M Hydroxylamin in 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7) versetzt
und für 4 h bei 25 °C und 340 rpm auf einem Orbitalschüttler inkubiert. Die modifizierten
Immobilisate wurden gefiltert, mit Kaliumphosphatpuffer (pH 6,2) gewaschen und nach
einer Vakuumfiltration im Exsikkator getrocknet. Die modifizierten Immobilisate wurden
ebenfalls im Exsikkator bis zur weiteren Verwendung unter reduziertem Druck gelagert.
2.2.11.5 Aminoethylamidierung
Die Aminoethylamidierung wurde analog zur Hydroxyethylamidierung (siehe Kapitel
2.2.11.4) nach einem Protokoll von Cabrera et al. [96] durchgeführt, wobei anstelle des
Ethanolamin hierbei Ethylendiamin verwendet wurde.
2.2.11.6 Dextranaldehyd-Modifikation
Die Modifikation mit Dextranaldehyden erfolgte in Anlehnung an das Protokoll von
Fernandez-Lafuente et al. [97]. Die hier verwendeten Dextranaldehyde wurden bereits in
vorherigen Studien im Arbeitskreis hergestellt und sind in Tabelle 6 zusammengefasst. Die
Material und Methoden
34
Bezeichnung des Öffnungsgrades entspricht dabei der Anzahl an Natriumperiodat-
Äquivalenten, die während der Aktivierung zugesetzt wurden.
Tabelle 6: Eingesetzte Dextranaldehyde
Molare Masse
[kDa]
Öffnungsgrad1
Verwendete Abkürzung
10
1
D10-1
10
5
D10-5
10
10
D10-10
40
1
D40-1
40
5
D40-5
40
10
D40-10
100
1
D100-1
100
5
D100-5
100
10
D100-10
100
20
D100-20
1 Entspricht der Anzahl an Natriumperiodat-Äquivalenten, die während der Aktivierung
zugesetzt wurden
Es wurden 100 mg des Lipase TL-Immobilisats mit Ethanol (7,5 mL/gTräger) versetzt und für
30 Minuten inkubiert. Im nächsten Schritt erfolgte die Zugabe von 5,2 mL einer 33,33 mg/mL
Dextranaldehydlösung (Mengenverhältnis Enzym:Dextranaldehyd 1:25). Die Reaktionslösung
wurde für 2 h bei 20 °C und 340 rpm geschüttelt. Die Immobilisate wurden vom Überstand
getrennt, mit 200 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,2) gewaschen und nach Vakuumfiltration
im Exsikkator getrocknet. Bis zur weiteren Verwendung wurden die modifizierten
Immobilisate im Exsikkator bei reduziertem Druck gelagert.
2.2.12 Racemisierung von (R)-Benzoin
Das zur Racemisierung eingesetzte (R)-Benzoin wurde im Rahmen dieser Arbeit selbst aus
einem Reaktionsgemisch der kinetischen Racematspaltung gereinigt (siehe Kapitel 2.2.15.1).
Material und Methoden
35
Die TUD-1-Katalysatoren wurden bis zur Verwendung bei 100 °C und alle weiteren
Katalysatoren bei RT gelagert. Zur Verwendung der TUD-1 Katalysatoren wurden 20 mg in
10 mL Schlenkkolben eingewogen und nochmals für mindestens 8 h bei 100 °C aufbewahrt.
Die darauffolgende Evakuierung an der Schlenkanlage erfolgte noch im heißen Zustand. Es
wurden 3 Schlenkzyklen durchgeführt. Die Temperierung der Kolben erfolgte durch ein
Ölbad. Zur Durchmischung wurden sternförmige Reagenzglas-Rührfische bereits während
der Einwaage zugeben. Die restlichen Katalysatoren wurden nach der Einwaage von 20 mg
direkt an die Schlenkanlage angeschlossen und durch 3 Schlenkzyklen für die Reaktion
vorbereitet. Die Reaktion wurde unter Stickstoffbedingungen durch die Zugabe von 500 µL
einer 94 mM (R)-Benzoinlösung im jeweiligen Lösungsmittel gestartet. Die Substratzugabe
sowie die Probenentnahme (10 µL) erfolgten im Gegenstrom. Die Proben wurden mit 1 mL
iso-Propanol verdünnt und mittels HPLC der Enantiomerenüberschuss (ee) analysiert.
2.2.13 Dynamisch kinetische Racematspaltung mit TUD-1 Katalysatoren
Analog zu den Racemisierungsversuchen wurden 6-20 mg der jeweiligen TUD-1
Katalysatoren in 10 mL Schlenkkolben eingewogen und gemeinsam mit den Rührfischen für
mindestens 8 h bei 100 °C gelagert. Die Kolben wurden heiß an die Schlenkanlage
angeschlossen und 3 Schlenkzyklen durchgeführt. Die folgende Zugabe von 5-20 mg
Lipase TL-Immobilisat erfolgte im Stickstoffgegenstrom. Es wurden erneut 3 Schlenkzyklen
durchgeführt. Im Stickstoffstrom wurden dann eine 94 mM Benzoinlösung im jeweiligen
Lösungsmittel und 35,8 µL Vinylbutyrat (6 Äquivalente) zugegeben und damit die Reaktion
gestartet. Es wurden 10 µL Proben zu geeigneten Zeitpunkten im Gegenstrom entnommen
und mit 1 mL iso-Propanol verdünnt. Die Analyse der Produktbildung und des
Enantiomerenüberschusses erfolgte mittels HPLC (siehe Kapitel 2.2.16).
2.2.14 Rezyklierung der dynamisch kinetischen Racematspaltung
In der Durchführung der Rezyklierung der DKR wurde der erste Zyklus gemäß der
Beschreibung aus Kapitel 2.2.13 durchgeführt. Nach Beendigung des ersten und analog dazu
der weiteren Zyklen wurde der Überstand abgenommen und die Lipase TL-Immobilisate
Material und Methoden
36
sowie die TUD-1 Katalysatoren zweimal mit je 5 mL des jeweiligen Lösungsmittels
gewaschen. Die Abnahme des Reaktionsgemisches und des Waschlösungsmittels erfolgte
über einen HPLC-Lösungsmittelfilter, der durch einen Schlauch mit einer 10 mL Spritze
verbunden war. Damit konnte ein Verlust der sehr feinen TUD-1 Katalysatoren verhindert
werden. Nach erneuter Zugabe von 500 µL 94 mM Benzoinlösung und 35,8 µL Vinylbutyrat
(6 Äquivalente) wurden die Zyklen neu gestartet.
2.2.15 Aufreinigungen und Synthesen
2.2.15.1 Aufreinigung von (R)-Benzoin
Zur Gewinnung von größeren Mengen an reinem (R)-Benzoin wurde der Maßstab der
kinetischen Racematspaltung mit den Lipase TL-Immobilisaten vergrößert. Es wurden pro
Ansatz 2 g racemisches Benzoin in 100 mL THF gelöst und zu 1 g Lipase TL-Immobilisat
gegeben. Die Zugabe von 3,58 mL Vinylbutyrat (3 Äquivalente) startete die Reaktion, die
über Nacht bei RT gerührt wurde. Nach Kontrolle des Umsatzes von 50 % mittels HPLC
wurde die Reaktionslösung filtriert und der Überstand am Rotationsverdampfer vom
Lösungsmittel getrennt. Das zurückbleibende Gemisch aus Vinylbutyrat, (R)-Benzoin und
(S)-Benzoinbutyrat wurde in Dichlormethan aufgenommen. Die Reinigung des (R)-Benzoins
erfolgte über eine Kieselgelsäulenchromatographie mit einem Laufmittel aus
n-Hexan/Ethylacetat (5:1). (R)-Benzoin konnte nach Abtrennung des Laufmittels als weißer
Feststoff erhalten werden. Da die HPLC-Kalibrierung zur Analyse von Benzoin durch
kommerziell erhältliche Reinsubstanzen der Benzoinenantiomere durchgeführt wurde, war
die Identifikation des (R)-Benzoins problemlos möglich. Es konnte eine Reinheit von >98 %
festgestellt werden.
2.2.15.2 Synthese von Benzoinbutyrat
Zur Identifikation und Kalibrierung der Produkte der (dynamisch) kinetischen Racemat-
spaltung in der HPLC-Analyse wurde Benzoinbutyrat chemisch nach dem Protokoll von
Hoyos et al. [70] synthetisiert. Es wurden 2 mmol Benzoin (1 Äquivalent), 2,2 mmol
Material und Methoden
37
Triethylamin (1,1 Äquivalente) und 3 mmol Butyrylchlorid (1,5 Äquivalente) in 6 mL
Dichlormethan gelöst. Das Gemisch wurde mit Argon überschichtet und bei 30 °C für 15 h
gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde mittels Kieselgelsäulenchromatographie mit dem
Laufmittel n-Hexan/Ethylacetat (5:1) getrennt und per 1H-NMR analysiert.
1H-NMR Benzoinbutyrat (CDCl3, 400 MHz):
(ppm) = 0.98 (s, 1H, 3-H), 1.69- 1.174 (d,
J= 15 Hz, 2H, 2-H), 2.4- 2.5 (s, 2H, 3-H), 6.86 (s, 1H, 4-H), 7.93 (s, 2H, 5-H), 7.36 ( s, 2H, 6-H),
7.38 (s, 3H, 7-H), 7.48 (s 2H, 7-H), 7.51 (s, 1H, 9-H).
2.2.15.3 Synthese von Ru-Hydroxyapatit
Die Herstellung des Ruthenium-Hydroxyapatits erfolgte nach einem Protokoll von
Wuyts et al. [98]. Zur Herstellung des Hydroxyapatit (HAP) wurden 0,2 mol Calciumnitrat
(Ca(NO3)24 H2O) in 100 mL dest. Wasser gelöst und durch Zugabe von ca. 4 mL 25 %
Ammoniaklösung auf pH 11 eingestellt. Es wurde eine zweite Lösung bestehend aus 0,12 mol
Ammoniumphosphat ((NH4)2HPO4) in 250 mL dest. Wasser hergestellt. Der pH-Wert dieser
Lösung wurde ebenfalls durch 25 % Ammoniaklösung auf pH 11 gebracht. Unter starkem
Rühren wurde die Phosphatlösung mit einer peristaltischen Schlauchpumpe und einer
Flussrate von 4-5 mL/h zur Ca2+-Lösung gegeben, wodurch ein weißes Präzipitat gebildet
wurde. Nach vollständiger Zugabe wurde das Gemisch für weitere 2 h bei RT gerührt und
anschließend für 1 h unter Reflux erhitzt. Nach abkühlen auf RT wurde der Ansatz für
20 Minuten bei 10000 rpm zentrifugiert und nachfolgend zweimal mit dest. Wasser
gewaschen und jeweils erneut zentrifugiert. Der Feststoff wurde abschließend lyophilisiert.
Zur Beladung mit Ruthenium wurde 1 g HAP in 45 mL dest Wasser suspendiert, welches 2 %
Rutheniumchlorid (RuCl3) enthielt. Die Suspension wurde für 24 h geschüttelt und
abschließend erneut gewaschen, zentrifugiert und lyophilisiert.
2.2.16 Parameter der HPLC-Analytik
Die Analyse der Proben der (dynamisch) kinetischen Racematspaltung bzw. der
Racemisierung erfolgte mittels HPLC. Die Trennung der Substanzen und der jeweiligen
Material und Methoden
38
Enantiomere erfolgte auf der chiralen Säule Chiralpak IA. Als Eluenten wurden n-Hexan und
iso-Propanol verwendet. Die Detektion erfolgte durch einen Diodenarraydetektor bei einer
definierten Wellenlänge von 243 nm, wobei der gesamte Wellenlängenbereich zwischen
193-400 nm erfasst wurde. Die Parameter der HPLC-Methode sind Tabelle 7 zu entnehmen.
Tabelle 7: Parameter der HPLC-Methode
Parameter
Information
Säule
Chiralpak IA, 250 x 4,6 mm ID
Detektor
Smartline UV Detector 2600 (Diodenarray -
Detektor)
Durchflussrate
1,2 mL/min
Temperatur
40 °C
Injektionsvolumen
20 µL
Die Retentionszeiten der Enantiomere des Benzoin und des Benzoinbutyrats bei den
genannten Parametern sind der Tabelle 8 zu entnehmen.
Tabelle 8: Retentionszeiten der Enantiomere von Benzoin und Benzoinbutyrat
Substanzen
Retentionszeit [min]
(R)-Benzoinbutyrat
4,75
(S)-Benzoinbutyrat
5,55
(R)-Benzoin
9,85
(S)-Benzoin
11,08
Ergebnisse und Diskussion
39
3 Ergebnisse und Diskussion
3.1 Vorarbeiten zur Immobilisierung
3.1.1 Methodenauswahl
Die Lipase TL, welche von der japanischen Firma Meito Sangyo Co., Ltd. vertrieben wird,
wurde bereits von mehreren Arbeitsgruppen in unterschiedlicher Weise immobilisiert. Die
bisherigen Arbeiten sollen hier als Ausgangspunkt zur Entwicklung einer optimierten
Immobilisierungsmethode kurz genannt und vor dem Hintergrund einer Eignung für das
Erreichen des Projektziels diskutiert werden.
Trägerlose Quervernetzung
Die Firma CLEA Technologies bietet eine trägerlos immobilisierte Variante der Lipase TL an.
Zur Herstellung der Immobilisate werden die Enzyme ausgefällt und die Aggregate mit Hilfe
multivalenter Reagenzien kovalent quervernetzt [28, 29]. Laut Hersteller werden die dabei
entstehenden „cross-linked enzyme aggregates (CLEA)“ als Suspension vertrieben und
verfügen über eine Hydrolyseaktivität von ca. 1200 TBU/mL (Tributyrin Units). Es werden
zwei Varianten angeboten, wobei eine den Zusatz trägt, besonders für den Einsatz in
organischen Medien geeignet zu sein. Es wird in den vom Hersteller bereitgestellten
Informationen nicht genauer auf die Unterschiede der Präparate eingegangen.
Nachteile dieser Methode, welche einen vielfältigen Einsatz in industriellen Synthesen
erschweren, sind die oft sehr kleinen Partikelgrößen, eine geringe mechanische Stabilität
[24] und auch die häufigen Aktivitätsverluste in der Herstellung der CLEA [99]. Die
Verwendung toxischer Reagenzien wie beispielsweise Glutardialdehyd oder Diisocyanate zur
Herstellung der Aggregate können die Verwendung dieser in pharmazeutischen
Produktionen aufgrund hoher Reinheitsanforderungen deutlich erschweren. Diese
grundlegenden Herausforderungen bei der Verwendung der Methode, aber auch angesichts
der bereits erfolgten kommerziellen Etablierung der Pseudomonas stutzeri CLEA-Immo-
bilisierung wird in diesem Projekt von einer Optimierung der Methode abgesehen.
Ergebnisse und Diskussion
40
Einbettung
Hoyos et al. [89] verwendeten verschiedene Einhüllungsmethoden, um die Lipase TL zu
immobilisieren. Dabei wurden zum einen Sol-Gele nach Protokollen von Reetz et al. [22] aus
Iso-butyltrimethoxysilan, Propyltrimethoxysilan und Tetramethoxysilan hergestellt und die
Lipase darin eingebettet. Des Weiteren entwickelten Buthe et al. [100] eine Methode zur
Herstellung statischer Emulsionen, die dann auf die Lipase TL angewandt wurde. Hierbei
wurde das Enzym, gelöst in einer wässrigen Phase, in Silikonsphären eingehüllt. Die dabei
gebildeten Immobilisate sind in Abhängigkeit ihres Trocknungsgrades auch für wasserfreie
Umesterungsreaktionen geeignet [89]. Die dritte Variante der Einhüllung stellt die Bildung
statischer Suspensionen dar. Hierbei wurde ähnlich der statischen Emulsion das Enzym in
Silikon eingebettet, wobei das trockene Enzympräparat verwendet wurde. Charakterisiert in
der kinetischen Racematspaltung (KR) von Benzoin wiesen die statischen Emulsionen eine
etwas verringerte spezifische Aktivität im Vergleich zum kommerziellen Präparat auf. Die
Sol-Gel Immobilisate zeigten eine um 40 % erhöhte und die statische Suspension sogar eine
um ca. 120 % gesteigerte, auf das immobilisierte Protein bezogene, Aktivität.
Trotz dieser signifikanten Aktivitätssteigerungen ist dieser Ansatz in wesentlichen Aspekten
zu hinterfragen. Die Methode zur Herstellung der Immobilisate basiert auf der Etablierung
einer Dispersion des noch flüssigen Silikons (inklusive der suspendierten Lipase TL) in einer
wässrigen Polyvinylalkohol-Lösung. In Vorversuchen zur Reproduktion der publizierten
Methode fiel auf, dass das Lipasepulver lediglich makroskopisch fein suspendiert im Silikon
vorliegt. Bei genauerer Betrachtung einer beispielhaft in eine Petrischale ausgegossenen
statischen Suspension war festzustellen, dass sich bei Anwendung dieser Vorgehensweise
Agglomerate des Enzympulvers unterschiedlicher Größe bildeten (Abbildung 7). Dies hat
zwangsläufig zur Folge, dass die nachfolgend gebildeten statischen Suspensionspartikel über
verschieden hohe Enzymbeladungen verfügen und somit die reproduzierbare Herstellung
von Immobilisaten ähnlicher Aktivität schwierig sein dürfte. Des Weiteren ist anzunehmen,
dass durch die Agglomeration des Pulvers Diffusionsbeschränkungen auftreten, die das
katalytische Potential der Lipase TL negativ beeinflussen. Die statischen Suspensionen sollen
Ergebnisse und Diskussion
41
daher in dieser Arbeit lediglich als Referenz dienen, um die hier entwickelten Immobilisate
zu bewerten.
Abbildung 7: Detailaufnahme einer statischen Suspension mit Lipase TL-Pulveragglomerate
Adsorptive Trägerbindung
Fauré und Illanes [101] berichteten von einer adsorptiven Bindung der Lipase aus
Pseudomonas stutzeri an verschieden funktionalisierte hydrophobe Trägermaterialen
(Sepabeads). Dabei wurden zum einen Träger mit Butyl- und zum anderen mit
Octadecylgruppen verwendet. Die Immobilisate wiesen im Vergleich zur nicht
immobilisierten Variante im Fall der Butyl-Träger eine geringere Aktivitätsausbeute (ca.
25 %) und eine um 100 % gesteigerte Ausbeute bei den Octadecylträgern auf. Eingesetzt
wurden die Immobilisate in der Umesterung von Sterolen mit Fettsäureestern in organischen
Lösungsmitteln wie tert-Butanol bzw. n-Hexan.
Das hier verwendete Immobilisierungsprotokoll ist simpel durchzuführen und eignet sich
daher sehr gut für eine großtechnische Umsetzung. Die signifikante Steigerung der
spezifischen Aktivität sowie der Verzicht auf giftige Reagenzien unterstreicht dies eindeutig.
Die Verwendung einer kovalenten Immobilisierung auf beispielsweise Amino-
funktionalisierten Trägern wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter in Betracht gezogen.
Ergebnisse und Diskussion
42
Vorversuche zu dieser Variante der Immobilisierung zeigten eine vollständige Inaktivierung
der Lipase TL im Vergleich zur nativen Form (Daten nicht gezeigt). Obwohl eine Optimierung
dieser Methode potentiell eine Verbesserung der Ergebnisse herbeiführen könnte, steht der
generelle Aktivitätsverlust einer anzunehmenden Hyperaktivierung im Fall der adsorptiven
Trägerbindung gegenüber. Zudem sollte der Vorteil eines verringerten Enzymleachings in
wässrigen Systemen als Folge einer kovalenten Trägerbindung in diesem Projekt eine
untergeordnete Rolle spielen, da die Immobilisate in organischen Lösungsmitteln eingesetzt
werden.
Fazit
Die aufgezeigten Immobilisierungsvarianten der Lipase TL aus Pseudomonas stutzeri weisen
in den meisten Fällen eine Steigerung der spezifischen Aktivität auf. Dennoch sind die
Methoden der Einhüllung sowie der kovalenten Vernetzung bzw. kovalenten Trägerbindung
in Anbetracht der Zielvorgaben dieser Arbeit kritisch zu betrachten. Die Durchführung
aufwändiger Protokolle, der potentielle Aktivitätsverlust während der Immobilisierung und
aufgrund der Agglomeration der Lipase sowie die Verwendung giftiger Reagenzien sind die
wesentlichen Nachteile dieser Methoden. Aufgrund dessen sowie der oft publizierten
Vorteile der adsorptiven Lipaseimmobilisierung auf hydrophoben Trägermaterialen
(einfaches Protokoll, potentielle Hyperaktivierung der Lipase, einfache Abtrennbarkeit) [24,
26, 27, 102] wurde diese Methode auch im Rahmen dieser Arbeit favorisiert. Da es bisher
keine Arbeiten bezüglich der optimalen Immobilisierungsparameter für eine adsorptive
Bindung der Lipase TL gibt, wurden ausgewählte Faktoren variiert und deren Einfluss auf die
Immobilisierung untersucht.
3.1.2 Auswahl geeigneter Trägermaterialen
Für die Eignung von Trägermaterialien für eine adsorptive Immobilisierung sind vor allem
physikalische und chemische Eigenschaften der jeweiligen Oberfläche bestimmend [24].
Dabei zählen die Größe der Partikel selbst, die Porendurchmesser als auch die verfügbare
Oberfläche zu den physikalischen Eigenschaften und die chemische Struktur der Träger
sowie Bindungsfunktionalitäten auf der Oberfläche zu den chemischen Begebenheiten.
Ergebnisse und Diskussion
43
Für die Trägerauswahl der hier durchzuführenden Immobilisierung wurden folgende
Kriterien zugrunde gelegt (Tabelle 9):
Tabelle 9: Kriterien zur Auswahl geeigneter Trägermaterialien
Kriterium
Erklärung
Porösität / große spezifische
Oberfläche
» Eine große Oberfläche erhöht die Beladungskapazität pro
Träger und somit evtl. die spezifische Aktivität der Träger
Ausreichende Korngröße
(Ø ≥ 100 µm)
» Gute Abtrennbarkeit am Ende der Synthese
» Größere Partikeldurchmesser verringern den Gegendruck in
Festbettreaktoren [24]
Stark hydrophober Charakter
» Bisherige Studien zeigten bereits die Möglichkeit der Hyper-
aktivierung der Lipase TL bei einem Kontakt mit hydrophoben
Oberflächen [89, 101]
Chemisch inert
» Vermeidung von Träger-katalysierten Nebenreaktionen
Hohe mechanische Stabilität /
silcoat-Eignung
» Hohe Wiederverwendbarkeit
» Einfache Abtrennbarkeit durch konstante Partikelgrößen
» Silcoat-Methode: Mechanische Stabilisierung poröser
Materialen durch eine Kompositbildung mit Silikon [25, 103]
Kommerzielle Verfügbarkeit
» Voraussetzung für einfache technische Umsetzung
Im Rahmen dieser Arbeit wurden daraufhin zwei potentiell geeignete Trägermaterialen
ausgewählt. Die Träger mit ihren wichtigsten Eigenschaften sind in Tabelle 10 aufgeführt.
Tabelle 10: Verwendete Trägermaterialen zur Immobilisierung der Lipase TL
Träger
(Hersteller)
Material
Spez. Oberfläche
Partikelgröße
Beispiele für
immobilisierte Lipasen
Accurel
MP 1001
(Membrana)
Polypropylen
35 m²/g
400-1000 µm
P. cepacia Lipase [104],
C. rugosa Lipase [105]
C. antarctica Lipase B [106]
M. javanicus Lipase [107]
Sepabead EC-OD
(Resindion)
Polymeth-
acrylat
86 m²/g
150-300 µm
P. stutzeri Lipase [101]
C. antarctica Lipase B [108]
R. miehie Lipase [93]
C. rugosa Lipase [93]
Ergebnisse und Diskussion
44
Bei beiden Trägern handelt es sich um hochporöse synthetische Polymere, welche
kommerziell erhältlich sind. Die schwammartigen Accurel MP1001 (folgend als Accurel
bezeichnet) sind aufgrund ihres Polypropylengerüsts als stark hydrophob einzustufen
Sepabead EC-OD (folgend als Sepabead bezeichnet), bestehend aus einem Polymethacrylat,
besitzt zusätzlich gebundene Octadecyl (C18)- Gruppen, die die Hydrophobizität stark
erhöhen. Die Träger unterscheiden sich zusätzlich in der mittleren Partikelgröße und der
spezifischen Oberfläche. Eine große Oberfläche, wie sie die Sepabeads aufweisen, wird als
vorteilhaft für eine Enzymimmobilisierung beschrieben [24]. Dennoch wurde das Accurel-
trägermaterial mit einer Oberfläche von nur 35 m2/g ausgewählt, da eine Vielzahl von
positiven Literaturbeispielen für eine Immobilisierung von Lipasen zu finden sind [13, 107,
109-111]. Für Sepabeads EC-OD konnten wie zuvor erwähnt, Faure und Illanes [101] eine
Eignung für die Immobilisierung der Lipase TL zeigen.
3.2 Optimierung der Immobilisierung der Lipase TL auf Accurel MP1001
und Sepabeads EC-OD
Die adsorptive Bindung einer Lipase an ein hydrophobes Trägermaterial basiert
hauptsächlich auf Wechselwirkungen zwischen hydrophoben Bereichen des Enzyms und des
verwendeten Trägers. Diese Interaktion ist sowohl von Eigenschaften des Trägers, als auch
von den Bedingungen, bei denen die Immobilisierung durchgeführt wird, abhängig [24]. Es
spielen dabei sowohl Parameter eine Rolle, die die Aktivität des Enzyms selbst beeinflussen,
aber auch solche, die die Bindungsstringenz bzw. das Bindungsverhalten von Proteinen
verändern. Im Folgenden wurde der Einfluss verschiedener Trägermaterialen, unter-
schiedlicher Verhältnisse aus eingesetztem Enzym zu Träger, variierender Pufferkonzen-
trationen und pH-Werten und der Temperatur während der Immobilisierung untersucht.
Analog zu den bisherigen Immobilisierungsstudien der Lipase TL wurde zu Beginn der
Optimierung ein Phosphatpuffer mit einem pH-Wert von 7 verwendet. Dies ist im Einklang
mit den Empfehlungen des Herstellers Meito Sangyo Co. [112], welcher ein pH-Optimum
zwischen pH 7-8 angibt. Das Lösen des Lipase TL Pulvers in Puffer führte zu einer gelblich bis
braunfarbenden Lösung, die einen deutlich sichtbaren Anteil ungelöster Bestandteile
Ergebnisse und Diskussion
45
enthielt. Die Löslichkeit konnte auch durch Veränderung des pH-Wertes bzw. durch
Erhöhung der Ionenstärke nicht beeinflusst werden. Für die Einstellung des pH-Wertes von 5
wurde ein Propionsäurepuffer, für pH 7 Kaliumphosphatpuffer und für pH 8 TRIS-Puffer
verwendet. Im Folgenden wurde die zu lösende Lipasemenge in Puffer suspendiert und nach
Abtrennung der ungelösten Bestandteile durch Zentrifugation zur Immobilisierung einge-
setzt. Es konnte bei jeder untersuchten Lipasestartkonzentration ein Proteingehalt von
durchschnittlichen 12,9 % festgestellt werden. Die entgegen der Arbeiten von Hoyos et al.
[89] und Faure und Illanes [101] (jeweils 100 mM) verwendete Pufferkonzentration von
10 mM wurde im Vorfeld an eine Studie von Bastida et al. [113] angelehnt. Eine niedrige
Ionenstärke des Puffermediums soll demnach eine Erhöhung der Adsorptionsgeschwindig-
keit [113] und der Bindungsselektivität (bezogen auf die selektivere Bindung von Lipasen
gegenüber im Präparat enthaltende Fremdproteine) bewirken [114].
3.2.1 Immobilisierungsdauer
In bisherigen Studien zur adsorptiven Bindung von Lipasen auf Accurel wurde mehrmals
beschrieben, dass es nach Exposition der Träger mit der Lipaselösung zu einer sehr schnellen
Beladung dieser mit Proteinen kommt [107, 110, 115]. Gleichzeitig wurde ein etwas
verzögerter Sättigungsverlauf der Aktivität festgestellt. Dieses Verhalten wurde mit der
unterschiedlichen Adsorptionsrate der Lipasen gegenüber denen im Präparat enthaltenen
Fremdproteinen erklärt [107]. Im weiteren Verlauf der Immobilisierung soll es laut den
Autoren dann zu einem Austausch der nur leicht gebundenen Fremdproteine mit den höher
affinen Lipasen kommen, die dann spezifischer an der Trägeroberfläche binden. Da der
Fokus dieser Arbeit auf dem Gleichgewicht aus einer optimalen Immobilisierung und einer
technisch einfach durchzuführenden Methode liegt, ist das Ziel die Dauer der
Immobilisierung so kurz wie möglich zu halten und dabei möglichst das Maximum an Lipase
zu binden. Um dieses Ziel zu erreichen und die geeignetste Immobilisierungsdauer zu
ermitteln, wurden folgend Aliquots der Immobilisierung auf Accurel nach verschiedenen
Zeitpunkten abgebrochen und nach Trocknung der Immobilisate deren spezifische
Trägeraktivität bestimmt. Die spezifische Trägeraktivität bezeichnet die katalytische Aktivität
in Units (U) [µmolProdukt/min] im Verhältnis zu der Masse der in der KR von Benzoin
Ergebnisse und Diskussion
46
eingesetzten Immobilisate [gTräger] und wird in [U/gTräger] angegeben. Die KR wurde nach dem
in Kapitel 2.2.4 aufgeführten Standardprotokoll durchgeführt.
Abbildung 8: Spez. Trägeraktivität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der Immobilisierungsdauer
Abbildung 8 zeigt eine schnelle Zunahme der spezifischen Trägeraktivität innerhalb der
ersten 30 - 60 min, die dann ab ca. 4 h in eine Sättigung übergeht. Nach 24 h Inkubationszeit
ist die spezifische Aktivität der Accurel-Lipase TL Immobilisate (im weiteren Verlauf als
Acc-LipTL bezeichnet) nicht weiter angestiegen. Auf Grundlage verschiedener Lipase-
Immobilisierungsstudien auf dem Material Accurel, die ebenfalls den Übergang in eine
Sättigung nach 2-4 h beobachten konnten [107, 110], war auch keine weitere Steigerung der
Aktivität nach einer deutlich verlängerten Inkubationszeit (24 h) zu erwarten. Im Folgenden
wurden alle Immobilisierungen auf Accurel über einen Zeitraum von 4 h durchgeführt. Die
Empfehlungen der Firma Resindion für die Immobilisierung auf den Sepadbead EC-OD gaben
einen Zeitraum von mindestens 3 h vor. Da die Inkubationszeit von 4 h das Protokoll der
Sepabead-Immobilisierung erfüllt, keine Desorption der bereits gebundenen Lipasen bei
einer verlängerten Kontaktzeit zu erwarten war, wurde die Immobilisierungsdauer für die
Sepabead ebenfalls auf 4 h festgesetzt.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Zeit [h]
Ergebnisse und Diskussion
47
3.2.2 Proteinstartkonzentration
Die Aktivität von Trägern mit adsorptiv gebundenen Enzymen hängt im Wesentlichen von
drei Aspekten ab. Zum einen ist die strukturelle Beschaffenheit des Trägermaterials dafür
ausschlaggebend, ob während der Reaktion aufgrund von strukturbedingten Diffusions-
barrieren eine scheinbar niedrigere Reaktionsrate gemessen wird [24]. Diese Limitierungen
sind hauptsächlich in der Größe der Poren und deren Zugänglichkeit begründet. Oftmals ist
dies nur durch die Auswahl geeigneter Materialen zu vermeiden und kann daher nach der
Entscheidung für ein Trägermaterial als konstant angesehen werden. Der zweite Punkt ist die
Veränderung der Konformation der immobilisierten Enzyme nach erfolgter Trägerbindung.
Diese Änderungen treten meist aufgrund von direkten Interaktionen sekundärer Struktur-
motive mit der Trägeroberfläche auf und können sowohl positive wie auch negative Effekte
auf die Aktivität haben [26]. Der dritte Faktor ist die Beladungsdichte und somit die Menge
des gebundenen Enzyms. Die Beladungsdichte ist sowohl von der zur Bindung verfügbaren
Oberfläche, als auch von der vorhandenen Menge des zu immobilisierenden Enzyms
abhängig [116]. Die maximal zur Verfügung stehende Oberfläche hängt wiederum von der
Porengröße und der Zugänglichkeit der Poren für das zu immobilisierende Enzym ab [24].
Unter Annahme der Ausbildung einer Einfachschicht aus gebundenen Enzymen auf der
Trägeroberfläche ist demnach zu erwarten, dass nach einer vollständigen Beladung der
zugänglichen Oberfläche die spezifische Trägeraktivität nicht weiter ansteigt. Hier wäre dann
das Beladungsmaximum erreicht. Binden dennoch weitere Enzyme auf der bestehenden
Enzymschicht, kommen Mehrfachschichten zustande. Diese lassen in der Regel aufgrund
gegenseitiger Wechselwirkungen der Enzyme oder auftretender Diffusionslimitierungen
keine weitere Aktivitätssteigerung zu [109]. Da sich bei einer adsorptiven Immobilisierung
ein Adsorptionsgleichgewicht aus gebundenen und gelösten Lipasemolekülen einstellt, steigt
die Beladung der Trägermaterialen, wenn die Enzymkonzentration in der
Immobilisierungslösung erhöht wird [109]. Dieser Vorgang ist wiederum durch das Erreichen
der maximalen Beladungsdichte begrenzt, die wie bereits erwähnt, ihrerseits von der
zugänglichen Trägeroberfläche limitiert wird.
Ergebnisse und Diskussion
48
Im Folgenden wurde versucht durch Steigerung der Startkonzentration der Lipaselösung die
Beladungsdichte der Accurel- und Sepabead-Träger zu maximieren. Die Beladungsdichte ist
definiert als die effektiv adsorbierte Proteinmenge bezogen auf die Menge der eingesetzten
Träger und wird im Folgenden in der Einheit [mgProtein/gTräger] angegeben. Zur Bewertung der
Beladung wurden die spezifische Aktivität der Träger und der gebundenen Proteine als
entscheidende Parameter herangezogen.
Um in weitergehenden Analysen über ausreichend Immobilisat zu verfügen, wurden 500 mg
Accurel-Träger für 10 mL der Lipaselösung verwendet. Der Einsatz der identischen Menge an
Sepabead-Trägern pro Immobilisierungsvolumen ergab eine kaum messbare Restaktivität
der Partikel, weswegen die zur Immobilisierung eingesetzte Menge an Sepabeads auf
100 mg verringert wurde. Die Steigerung des Verhältnisses aus Enzym zu Träger sollte die
Beladung und damit auch die nachzuweisende Aktivität steigern. Die Immobilisierungs-
temperatur betrug 21,5 °C und die mindestens im Doppelversuch durchgeführten Ansätze
wurden durchgehend auf einem Orbitalschüttler durchmischt.
Accurel
Abbildung 9: Proteinbeladungsdichte und spez. Trägeraktivität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der
Lipasestartkonzentration
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Beladungsdichte [mgProtein/gTräger]
Konzentration der Lipaselösung [mg/mL]
Beladungsdichte
spezifische Aktivität
Ergebnisse und Diskussion
49
Abbildung 9 stellt den Verlauf der Beladungsdichte und der spezifischen Aktivität der
Acc-LipTL über einen Konzentrationsbereich von 5 mg/mL bis 80 mg/mL der Lipaselösung
dar. Die spezifische Aktivität steigt linear bis zu einer Konzentration von 60 mg/mL auf einen
maximalen Wert von 18,4 U/gTräger an und bleibt dann im Rahmen der Messungenauigkeiten
konstant. Die Beladungsdichte steigt ebenfalls bis zu einer Startkonzentration von 60 mg/mL
auf einen maximalen Wert von 15,2 mgProtein/gTräger an. Bei einer weiteren Erhöhung der
Lipasestartkonzentration nimmt die Beladungsdichte jedoch drastisch ab. Da sich jedoch die
spezifische Trägeraktivität bei Konzentrationen >60 mg/mL nicht wesentlich verändert, ist
nicht davon auszugehen, dass sich die Menge an gebundener Lipase auf dem Träger
oberhalb dieser Konzentration verringert. Die Bildung von Multienzymschichten, die eben-
falls einen weiteren Anstieg der Aktivität verhindern könnten, sollte jedoch mit einer
Steigerung der Beladungsdichte nachzuweisen sein. Ein Zusammenhang zwischen dem
Vorhandensein von Fremdproteinen im Lipase TL-Pulver, was von Maraite et al. [117] gezeigt
werden konnte, und dem Abfall der Beladungsdichte ab 70 mg/mL konnte nicht hergestellt
werden. Da bei allen untersuchten Konzentrationen ein gleichbleibender Proteingehalt
(12,9 %) festgestellt werden konnte, ist auch von einem unterschiedlichen Löslichkeits-
verhalten verschiedener Proteine bei einer steigenden Proteinkonzentration als Ursache
abzusehen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Erzeugung hochaktiver Immobilisate, weswegen vor
allem die spezifische Trägeraktivität von Bedeutung ist. Da diese Aktivität bei einer Erhöhung
der Lipasestartkonzentration ohnehin nicht weiter stieg, wurde auf eine endgültige Klärung
der Fehlerursachen an dieser Stelle verzichtet. Die Beladungswerte der
Lipasestartkonzentration >60 mg/mL wurden folgend auf eine fehlerhafte Bestimmung der
Proteinkonzentrationen der Immobilisierungsüberstände zurückgeführt und daher nicht als
signifikant betrachtet.
Obwohl angesichts der Kurvenverläufe aus Abbildung 9 zunächst von einer simplen linearen
Abhängigkeit zwischen der Beladungsdichte und der spezifischen Trägeraktivität
ausgegangen werden kann, macht die Auftragung der spezifischen Proteinaktivität über der
Startkonzentration deutlich, welchen Einfluss die Konzentration auf die Immobilisierung der
Lipase TL hat. Die horizontale Linie in Abbildung 10 markiert die spezifische Proteinaktivität
des nicht immobilisierten Lipase TL Pulvers bei ca. 350 U/mgProtein. Bei der Berechnung dieser
Ergebnisse und Diskussion
50
wurde der per Bradford-Methode bestimmte Proteingehalt des Lipasepulvers von 12,9 % zu
Grunde gelegt. Es wurde die Annahme getroffen, dass es sich bei dem gesamten Protein um
die Lipase TL handelt. Wie erwähnt ist jedoch bekannt, dass das Lipase TL-Pulver nicht nur
die Lipase enthält, sondern auch noch eine geringe Menge an Fremdproteinen (siehe SDS-
Page in Maraite et al. [117]). Da die genaue Menge nicht bekannt ist, kann auch der exakte
Lipasegehalt des Pulvers nicht bestimmt werden. Da dieser niedriger sein dürfte, als der hier
bestimmte Proteingehalt, ist die spezifische Proteinaktivität der nativen Lipase TL tatsächlich
höher als 350 U/mgProtein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde dennoch an der beschriebenen
Annahme festgehalten, da sonst kein Referenzwert zur Bewertung der Immobilisierung
bestimmt werden konnte.
Die spezifische Proteinaktivität der Acc-LipTL ist bis zu einer Beladungsdichte von etwa
7 mgProtein/gTräger geringer als die der nicht immobilisierten nativen Lipase TL. Die Protein-
aktivität steigt dann bei einer Erhöhung der Lipasestartkonzentration bis auf mindestens
30 mg/mL weiter an und bleibt bis zu einer Konzentration von 60 mg/mL stabil bei einem
Wert um 1000-1200 U/mgProtein. Die Steigerung im weiteren Verlauf ist wie bereits erläutert
auf die als zu niedrig anzusehenden Beladungsdichten zurückzuführen und daher sehr wahr-
scheinlich deutlich zu hoch.
Abbildung 10: Spez. Proteinaktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
1800
2000
2200
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
spezifische Proteinaktivität [U/gProtein]
Konzentration der Lipaselösung [mg/mL]
Ergebnisse und Diskussion
51
Der Verlust an spezifischer Proteinaktivität bei sehr niedrigen Beladungen lässt sich
möglicherweise damit erklären, dass Enzyme bei einer adsorptiven Bindung an Oberflächen
dazu tendieren, die Kontaktfläche zum Trägermaterial zu maximieren [118]. Dabei kann es
als Folge der Ausbildung vieler Bindungsstellen zu einer Änderung der aktiven Konformation
bis hin zu einer Entfaltung des Enzyms kommen [24, 119] (Abbildung 11). Da die jedem
einzelnen Enzym zur Verfügung stehende Bindungsfläche bei höheren Beladungen geringer
wird, ist auch die Anzahl der möglichen Bindungsstellen kleiner, was der zuvor beschrie-
benen Änderung der Konformation entgegen wirkt [120].
Abbildung 11: Faltung von Proteinen bei unterschiedlichen Beladungsdichten auf Oberflächen [120]
Die Steigerung der spezifischen Proteinaktivität der Lipase TL, die ab einer Proteinstart-
konzentration von ca. 10 mg/mL auftritt, ist sehr wahrscheinlich auf einen gemischten Effekt
zweier typischer Phänomene zurückzuführen. Zum einen ist bekannt, dass sehr hydrophobe
Trägermaterialen Lipasen selektiv aus einem Gemisch verschiedener Proteine binden
können. Damit würde es sich hierbei um eine Art Reiningungseffekt der nativen Lipase TL
Lösung handeln. Da bei der Berechnung der spezifischen Proteinaktivität die gebundene
Menge Protein auf dem Träger zu Grunde gelegt wird und nicht bestimmt werden kann, ob
es sich dabei um Fremdprotein oder Lipase handelt, steigt die spezifische Proteinaktivität
wenn vorwiegend Lipase gebunden wird. Hinweis auf diesen Effekt gibt vor allem die
niedrige Immobilisierungsausbeute (bezogen auf die Bindung des eingesetzten Proteins), die
lediglich bei 10-15 % liegt. Der zweite mögliche Grund einer Steigerung der katalytischen
Wirkung der gebundenen Enzyme ist die für viele Lipasen beschriebene Grenzflächen-
aktivierung (siehe auch Kapitel 1.2). Dies deckt sich mit den in Kapitel 3.1.1 vorgestellten
bisherigen Immobilisierungen der Lipase TL, bei denen ebenfalls dieses Phänomen als Grund
für eine Steigerung der Aktivität angeführt wurde. Gestützt wird diese Begründung zum
Ergebnisse und Diskussion
52
einem dadurch, dass bei Hoyos et al. [89] das komplette Lipase TL-Pulver zur
Immobilisierung verwendet wurde und somit eine Aufreinigung weitestgehend ausge-
schlossen werden kann und aufgrund dessen, dass Fauré und Illanes Immobilisierungs-
ausbeuten von 93 % nachweisen konnten. Damit ist nur ein sehr geringer Teil nicht
gebunden worden und dieser erklärt nicht den Anstieg der spezifischen Aktivität um den
Faktor Zwei [101].
Obwohl noch keine weiteren Optimierungsschritte der Immobilisierung der Lipase TL auf
Accurel durchgeführt wurden, konnte die spezifische Proteinaktivität unabhängig von der
zugrundeliegenden Ursache um den Faktor 2,9 zwar geringfügig, aber signifikant gesteigert
werden. (Fauré und Illanes : 2,0 (Adsorption); Hoyos et al.: 2,2 (Einschluss)).
Bei der Verwendung einer Lipasestartkonzentration von 60 mg/mL konnten Immobilisate
hergestellt werden, die zu diesem Zeitpunkt der Optimierung das Maximum der spezifischen
Trägeraktivität aufwiesen. Dennoch wurde im weiteren Verlauf der Arbeit die Start-
konzentration von 30 mg/mL zur Immobilisierung der Lipase TL auf Accurel verwendet. Eine
Erhöhung der Beladung und damit der spezifischen Trägeraktivität ist bei Acc-LipTL ab einer
Konzentration von 60 mg/mL wie gezeigt nicht möglich. Daher sollte eher versucht werden
die Beladung bei 30 mg/mL durch nachfolgende Optimierungsschritte zu erhöhen und somit
die Effizienz der Immobilisierung weiter zu steigern. Unter Annahme einer auftretenden
Hyperaktivierung ist die Wahl der Startkonzentration von 30 mg/mL geeignet, da die Lipase
ab hier in ihrer optimalen katalytisch Konformation (grenzflächenaktiviert) immobilisiert ist.
Sepabead EC-OD
Analog zu Accurel wurde die Konzentration der Lipaselösung während der Immobilisierung
auf den Sepabead EC-OD Trägern schrittweise von 10 mg/mL bis 60 mg/mL erhöht. Eine
weitere Steigerung war angesichts der bereits ab 40 mg/mL stagnierenden spezifischen
Trägeraktivität nicht erfolgsversprechend. Auch bei Verwendung dieser Träger steigt die
Beladungsdichte bis 40 mg/mL linear an und erhöht sich bis 60 mg/mL nur noch minimal. Da
diese lineare Abhängigkeit nicht durch den Ursprung des Diagramms verläuft, ist
Ergebnisse und Diskussion
53
anzunehmen, dass analog zum Accurel-Träger die Beladung bei sehr niedrigen
Konzentrationen schnell ansteigt und erst dann weiter linear zunimmt.
Abbildung 12: Proteinbeladungsdichte und spez. Trägeraktivität von Sepabead-LipTL in Abhängigkeit der
Lipasestartkonzentration
Um die Beladungsdichten der beiden Trägersystem vergleichen zu können, muss die unter-
schiedliche Trägermenge pro Immobilisierungsansatz beachtet werden. Da nur ein Fünftel
des Trägermaterials bei den Sepabeads eingesetzt wurde, können allenfalls die
Konzentrationsansätze mit 50 mg/mL bei den Accurel und mit 10 mg/mL bei den Sepabeads
verglichen werden. Hierbei wird jedoch außer Acht gelassen, dass trotz der vergleichbaren
Proteinmenge pro Trägermaterial eine höhere Lipasekonzentration in der Lösung auch eine
höhere Triebkraft zur Adsorption der Lipase bewirkt [109]. Bei 50 mg/mL ist die
Beladungsdichte auf den Acc-LipTL bei 14,3 mg/g, wohingegen die Sepabead-LipTL bei
10 mg/mL 23,7 mg/g des Proteins adsorbiert haben. Da die Sepabead-Träger im Vergleich
eine mehr als doppelt so große Oberfläche besitzen (siehe Tabelle 10), ist eine höhere
Beladung das, was bei ähnlichen Bedingungen durchaus zu erwarten gewesen ist. Die
weiterführende Annahme, dass eine höhere Beladung per se auch zu einer gesteigerten
spezifischen Trägeraktivität führt, konnte am Beispiel der Sepabeads jedoch nicht bestätigt
werden. Die spezifische Trägeraktivität erhöht sich ebenfalls linear bis zu einer
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 10 20 30 40 50 60 70
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Beladungsdichte [mgProtein/gTräger]
Konzentration der Lipaselösung [mg/mL]
Beladungsdichte
spezifische Aktivität
Ergebnisse und Diskussion
54
Konzentration von 40 mg/mL auf einen Maximalwert von 7,9 U/gTräger und nimmt bei einer
Startkonzentration von 60 mg/mL wieder geringfügig ab. Der wiederholte Vergleich der
Sepabead- und Accurel- Immobilisate bei 10 mg/mL bzw. 50 mg/mL macht deutlich, dass die
spezifische Aktivität bei den Accurel um den Faktor Acht höher ist (Sepabead-LipTL:
1,9 U/gTräger; Acc-LipTL: 15,9 U/gTräger). Die geringe Aktivitätsausbeute spiegelt sich noch
deutlicher in der Auftragung der spezifischen Proteinaktivität über der Lipasestart-
konzentration wieder (Abbildung 13).
Abbildung 13: Spez. Proteinaktivität der Sepabead-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration
Die spezifische Proteinaktivität der auf den Sepabeads gebundenen Lipase TL ist mit maximal
150 U/mgProtein bei 30 mg/mL Lipasestartkonzentration deutlich niedriger als die der nicht
immobilisierten Form. Auf dem ersten Blick steht dies im Widerspruch zu den Ergebnissen
von Faure und Illanes [101], die eine Aktivierung der Lipase auf Sepabeads beschrieben. Es
ist jedoch anzumerken, dass Faure und Illanes [101] eine Erhöhung der spezifischen
Proteinaktivität bei einem 100-fach geringeren Lipase zu Träger Verhältnis nachweisen
konnten. Die Aktivitätsausbeute verringerte sich in dieser Studie zudem bei einer Erhöhung
des Lipase pro Träger Verhältnisses deutlich. So ist es nicht sonderlich überraschend, dass
bei einer weiteren Steigerung der Lipasemenge pro Träger um nochmals Faktor 10-60 eine
weitergehende Erniedrigung der spezifischen Proteinaktivität festzustellen ist.
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
500
0 10 20 30 40 50 60 70
spezifische Proteinaktivität [U/mgProtein]
Konzentration der Lipaselösung [mg/mL]
Ergebnisse und Diskussion
55
Die Theorie der Konformationsänderung der gebundenen Enzyme aufgrund der großen zur
Verfügung stehenden Bindungsfläche kann aufgrund der hohen Beladungswerte ausge-
schlossen werden. Es ist eher davon auszugehen, dass es bei den Sepabeads in dem hier
untersuchten Konzentrationsbereich zu keiner selektiven Bindung der Lipase kommt. Damit
lassen sich zum einen die hohen Beladungswerte erklären und zum anderen die daraus
resultierenden spezifischen Proteinaktivitäten. Die Annäherung an das Maximum der
Bindungskapazität hätte demnach zur Folge, dass je nach Menge an Fremdprotein im
Lipase TL-Pulver signifikant weniger Lipase auf den Sepabead-Trägern im Vergleich zu den
Accurel gebunden wird und somit auch die spezifische Trägeraktivität niedriger ist.
Bei einem Einsatz der Sepabead-LipTL in einem industriellen Prozess würde zur Aufrecht-
erhaltung einer hohen volumetrischen Aktivität des Ansatzes, eine sehr große Immobilisat-
menge benötigt werden. Insbesondere im direkten Vergleich zu den Acc-LipTL, bei denen
wesentlich weniger Material verwendet werden müsste, ist dies aus ökonomischer Sicht
nicht anstrebenswert. Daher konnte eine weiterführende Optimierung der Sepabead-
Immobilisierung nicht gerechtfertigt werden und wurde folgend hier nicht durchgeführt.
3.2.3 Einfluss der Temperatur
Im Allgemeinen ist die adsorptive Bindung von Molekülen aus Gas- oder Flüssigkeitsphasen
an Festkörperoberflächen abhängig vom Druck und der Temperatur [121]. Dabei gilt: Bei
einer Erhöhung der Temperatur verringert sich die Adsorption als Folge der erhöhten
kinetischen Energie der adsorbierenden Moleküle. Eine Steigerung der kinetischen Energie
hat aber bei Proteinen auch eine erhöhte Flexibilität und eine eventuell dadurch veränderte
Konformation zur Folge. Abgesehen vom Extremfall der vollständigen Entfaltung bei zu
hohen Temperaturen führt dies zu einer Änderung der Zugänglichkeit faltungsbedingt
verdeckter Bereiche, wie beispielsweise hydrophoben Domänen. In der hydrophoben
Interaktionschromatographie (HIC) wird dieses Phänomen dazu genutzt, um die Bindungs-
stärke und somit die Trennleistung der Chromatographie zu erhöhen [121]. Bezogen auf eine
Immobilisierung von Lipasen durch hydrophobe Wechselwirkungen kann dies bedeuten,
dass infolge der Vergrößerung der hydrophoben Kontaktfläche zwischen den Enzymen und
Ergebnisse und Diskussion
56
der Oberfläche die Affinität der Enzyme zum Trägermaterial steigt und damit auch die
Effizienz des Immobilisierungsprozesses. Die Freilegung hydrophober Domänen im Inneren
der Proteine könnte dabei jedoch auch eine negative Auswirkungen auf die Aktivität der
Enzyme haben, da sich dadurch die Konformation stark verändert. Im Folgenden wurde
untersucht, inwieweit der Einfluss einer Änderung der Temperatur auf die Immobilisierung
der Lipase TL auf Accurel genutzt werden kann. Es wurden erneut die Beladungsdichte und
die spezifischen Träger- bzw. Proteinaktivität betrachtet.
Abbildung 14: Beladungsdichte und spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Immobilisierungs-
temperatur; Die Aktivitätstests wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Die Beladungsdichte und die spezifische Aktivität der Träger steigen in proportional linearer
Abhängigkeit bis zur hier maximal untersuchten Immobilisierungstemperatur von 50 °C an
(Abbildung 14). Gegenüber der bisher verwendeten Raumtemperatur konnte somit bei 50 °C
eine um ca. 66 % gesteigerte spezifische Trägeraktivität erreicht werden. Eine Verringerung
der Temperatur auf 10 °C geht mit einer Erniedrigung der untersuchten Parameter einher.
Die spezifische Proteinaktivität verändert sich aufgrund der direkten Proportionalität der
Beladungsdichte und der spezifischen Trägeraktivität nur geringfügig. Daher kann davon
ausgegangen werden, dass die Steigerung nur auf die erhöhte Beladung zurückzuführen ist
und nicht auf eine Immobilisierung der Lipase TL in einer katalytisch aktiveren Konformation.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 10 20 30 40 50 60
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Beladungsdichte [mgProtein/gTräger]
Temperatur [°C]
Beladungsdichte
spezifische Aktivität
Ergebnisse und Diskussion
57
Aus dem Datenblatt der Lipase TL kann entnommen werden, dass eine verbesserte
Thermostabilität des Enzyms unter 40 °C gegeben ist [112]. Um eine temperaturbedingte
Inaktivierung des Enzyms während der Immobilisierung zu vermeiden, aber trotzdem von
der Erhöhung der Beladungsdichte bzw. der spezifischen Trägeraktivität zu profitieren,
wurde eine Immobilisierungstemperatur von 40 °C als optimal bestimmt. Die Steigerung der
spezifischen Trägeraktivität bei 40 °C gegenüber der zuvor verwendeten Raumtemperatur
betrug somit 43 %.
3.2.4 Einfluss der Pufferkonzentrationen und des pH-Wertes
Bei der Optimierung einer Lipaseimmobilisierung sind weitere Analogien zur HIC sehr
hilfreich. So ist bekannt, dass die Adsorption von hydrophoben Proteinen auf hydrophoben
Oberflächen bei erhöhten Salzkonzentrationen gefördert wird [122, 123]. Diese sogenannte
„Salz-vermittelte Adsorption“ [124] ist darauf zurückzuführen, dass hydrophobe Bereiche
von Proteinen mit einer geordneten Hydrathülle umgeben sind, welche eine Aggregation
dieser Regionen und damit der Proteinmoleküle untereinander verhindert. In dem Maße, in
dem bestimmte Salzionen einer solchen Proteinlösung zugeführt werden, werden Wasser-
moleküle dieser Hydrathülle entzogen, da sie zur Hydratisierung der Salzionen benötigt
werden [121]. Infolgedessen ist eine Assoziation der hydrophoben Bereiche der Proteine
untereinander, aber eben auch mit vorhandenen hydrophoben Oberflächen möglich und
wird durch steigende Salzkonzentrationen weiter forciert. Geeignet sind mehrwertige
Anionen wie beispielsweise Sulfat oder Phosphat mit dazugehörigen Kationen wie
Ammonium, Natrium oder Kalium. Die Eignung von verschiedenen Anionen und Kationen
folgt der sogenannten Hofmeisterreihe. Kosmotrope bzw. antichaotrope Salze fördern
hydrophobe Wechselwirkungen (linke Seite der Hofmeisterreihe), wohingegen chaotrope
Salze (rechts in der Hofmeisterreihe befindliche Ionen) die Löslichkeit von hydrophoben
Proteinen in Lösungen begünstigen (Abbildung 15) [125]. Der in dieser Arbeit zur
Immobilisierung verwendete Kaliumphosphatpuffer setzt sich aus stark antichaotropen
Phosphationen und Kalium-Anionen zusammen, was die Ausbildung hydrophober Wechsel-
wirkungen generell fördern sollte.
Ergebnisse und Diskussion
58
Abbildung 15: Anordnung der wichtigsten An- und Kationen der Hofmeisterreihe
Den Effekt der Pufferkonzentration auf die Immobilisierung von Lipasen wurde unter
anderem bereits am Beispiel der Lipasen aus Candida rugosa und Rhizopus oryzae in der
Studie von Lee et al. [126] demonstriert. Hier konnte ein Anstieg der Aktivität bei steigenden
Pufferkonzentrationen bis 250 mM verzeichnet werden. Bei noch höheren Konzentrationen
(bis 1,25 M) verringerten sich die Aktivitätswerte jedoch, was auf die zu starke Wasser-
subtraktion von der Enzymoberfläche durch die Ionen zurückgeführt wurde [126].
Im Folgenden wurde die Konzentration des Kaliumphosphatpuffers von 10 mM auf maximal
400 mM erhöht und der Einfluss auf die Beladungsdichte und die spezifische Trägeraktivität
bzw. Proteinaktivität untersucht. Des Weiteren sollte festgestellt werden, ob die Variation
des pH-Wertes um den Isoelektrischen Punkt (IEP) (pH 6,6 [112]) einen Einfluss auf die
untersuchten Parameter hat. Enzyme weisen am IEP eine Nettoladung von Null auf, da sich
positiv und negativ geladene Aminosäureseitenketten ausgleichen. In diesem Zustand ist
eine erfolgreiche Bindung an hydrophobe Trägermaterialien hauptsächlich den hydrophoben
Wechselwirkungen zuzuschreiben. Es wurden nachfolgend bei jeder untersuchten Puffer-
konzentration Immobilisierungen bei den pH-Werten 6,2, 6,6 und 7,0 durchgeführt. Da die
Optimierungsexperimente parallel geplant und realisiert wurden, ist zu diesem Zeitpunkt an
der Raumtemperatur als Immobilisierungstemperatur festgehalten worden. Die Kombi-
nation von allen optimierten Parametern wurde dann im Anschluss durchgeführt und wird
an gesonderter Stelle diskutiert (siehe 3.2.5).
Die Beladungsdichte steigt bei einer Pufferkonzentrationserhöhung von 10 mM auf 100 mM
deutlich von Werten um 10 mgProtein/gTräger auf ca. 21 mgProtein/gTräger an. Bei einer weiteren
Verdopplung (auf 200 mM) bzw. Vervierfachung (auf 400 mM) der Pufferkonzentration
Ergebnisse und Diskussion
59
nimmt die Beladung Werte von 23 - 25 mgProtein/gTräger an (Abbildung 16). Der pH-Wert
scheint keinen signifikanten Einfluss auf die Beladung der Accurelträger zu haben. Einzig die
Verringerung der Beladung bei einer Pufferkonzentration von 400 mM und einem pH-Wert
von 7,0 ist davon abweichend. Theoretisch wäre es möglich, dass eine zu hohe
Konzentration antichaotroper Ionen zu einer Ausfällung der Proteine durch die bereits
angesprochenen erhöhten Wechselwirkungen der hydrophoben Bereiche auf den
Proteinoberflächen führt. Dieser Effekt sollte jedoch am IEP am stärksten ausgebildet sein
(hier pH-Wert von 6,6), weil dort die hydrophoben Wechselwirkungen besonders begünstigt
sind. Da aber lediglich bei pH 7,0 eine signifikante Abnahme beobachtet werden konnte,
wird diese niedrige Beladung eher experimentellen Messfehlern zugesprochen. Generell sind
die Abweichungen in diesem erhöhten Pufferkonzentrationsbereich tendenziell stärker. Dies
dürfte vor allem an der hohen Eigenabsorbanz der Pufferlösung nach Interaktion mit dem
Bradfordreagenz liegen.
Abbildung 16: Beladungsdichte der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Pufferkonzentrationen bei verschiedenen
pH-Werten
0
5
10
15
20
25
30
0 100 200 300 400 500
Beladungsdichte [mgProtein/gTräger]
Pufferkonzentration [mM]
pH 6,2
pH 6,6
pH 7
Ergebnisse und Diskussion
60
Abbildung 17: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Pufferkonzentrationen bei unter-
schiedlichen pH-Werten
In Anbetracht der Entwicklung der spezifischen Trägeraktivität bei den verschiedenen
Pufferkonzentrationen fällt zunächst auf, dass die Aktivität bei der Erhöhung der Puffer-
konzentration nicht wie zuvor proportional der Beladungsdichte folgt (Abbildung 17). Erst
bei 200 mM steigt die Aktivität signifikant an und ändert sich dann bei 400 mM nicht mehr
wesentlich. Die Aktivität erhöht sich um den Faktor 2 - 2,2 von rund 10 - 12 U/gTräger bei
10 - 100 mM hin zu 20 - 23 U/gTräger bei 200 - 400 mM. Dies entspricht relativ gesehen dem
Wert, den auch die Beladungsdichte zwischen 10 und 100 mM ansteigt. Bei einem pH-Wert
von 6,2 und einer Konzentration von 200 mM wird die maximale Aktivität von etwa
25 U/gTräger erreicht. Die Signifikanz dieser erhöhten Aktivität gegenüber den anderen
untersuchten pH-Werten (jeweils bei 200 mM) ist genauso wie das Wertepaar pH 6,6 bei
10 mM zu hinterfragen. Bei der letztgenannten Kombination verringert sich die Aktivität um
die Hälfte auf nur noch 5 U/gTräger gegenüber den pH-Werten 6,2 und 7,0. Bei allen anderen
untersuchten Bedingungen ist analog zur Beladungsdichte kein signifikanter Zusammenhang
der Aktivität und des pH-Wertes festzustellen.
Eine hinreichende Begründung für die pH-Wert bedingten Abweichungen konnte nicht
gefunden werden. Die geringere Aktivität am IEP (pH 6,6) bei 10 mM lässt sich evtl. ähnlich
0
5
10
15
20
25
30
0 100 200 300 400
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Pufferkonzentration [mM]
pH 6,2
pH 6,6
pH 7
Ergebnisse und Diskussion
61
erklären, wie zuvor die Erniedrigung der spezifischen Proteinaktivität bei zu niedriger
Beladungsdichte (siehe Kapitel 3.2.2). Es ist denkbar, dass die Affinität der hydrophoben
Bereiche des Enzyms zur Trägeroberfläche am IEP deutlich höher ist als bei den anderen
untersuchten pH-Werten. Trotz der erhöhten Beladungsdichte bei 30 mg/mL Proteinstart-
konzentration würde dies dazu führen, dass die dann vorherrschende Konformation der
Enzyme nicht der entspricht, die die höchste Aktivität ermöglicht. Folglich könnte die
steigende Beladungsdichte bei Erhöhung der Pufferkonzentration den stabilisierenden
Einfluss und die damit verbundene aktive Konformation wieder herstellen. Um die erhöhte
Aktivität bei pH 6,2 und 200 mM zu evaluieren, wurden die Immobilisierungen bei 200 mM
bei allen pH-Werten wiederholt. Es konnte im Bereich der Fehlergrenzen der gleiche Zusam-
menhang festgestellt werden (Daten nicht gezeigt), weswegen im Folgenden diese
Bedingungen als das Optimum dieser Untersuchungen angesehen wurden. Die spezifische
Proteinaktivität beträgt hierbei 1183 U/gProtein und liegt damit im Bereich dessen, was bereits
bei der Optimierung der Proteinstartkonzentration für 30 mg/mL erreicht wurde.
Über den Grund für das unterschiedliche Verhalten der Beladungsdichte und der Aktivität
kann nur spekuliert werden. Es ist denkbar, dass sich die Freilegung der hydrophoben
Enzymdomänen durch die Erhöhung der kosmotropen Ionenkonzentration schnell in der
verbesserten Bindungsaffinität widerspiegelt, aber erst bei einer weiteren Steigerung der
Ionenkonzentration die aktive Konformation eingenommen wird. Schlussendlich ist von
besonderer Bedeutung, dass die Änderung der Pufferkonzentration einen massiven Einfluss
auf das Bindungsverhalten der Lipase TL hat.
3.2.5 Bewertung der Immobilisierungsoptimierung
Wie durch die vorausgegangenen Untersuchungen deutlich gezeigt werden konnte, haben
die Änderung der Temperatur sowie der Pufferbedingungen einen massiven Einfluss auf das
Bindungsverhalten der Lipase TL. Da es hierbei zu einer deutlichen Steigerung der
Beladungsdichte und der spezifischen Trägeraktivität bei einer Proteinstartkonzentration
von 30 mg/mL kam, sollte nun nochmals der Einfluss der Proteinstartkonzentration bei der
erhöhten Temperatur und einem optimierten Immobilisierungspuffer gezeigt werden.
Ergebnisse und Diskussion
62
Eine gegenseitige Beeinflussung der Parameter Temperatur und Puffer wurde nicht
erwartet, kann aber nicht vollständig ausgeschlossen werden. Eine Klärung möglicher
Wechselwirkungen wurde im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt.
Es wurden erneut Immobilisierungen mit Proteinstartkonzentrationen von 20, 30 und
60 mg/mL bei 40 °C in einem 200 mM KPi-Puffer mit einem pH-Wert von 6,2 durchgeführt. In
Abbildung 18 ist deutlich die Steigerung der spezifischen Trägeraktivität bei allen unter-
suchten Proteinstartkonzentrationen zu erkennen. Die massive Steigerung der
Immobilisierungseffizienz infolge der Optimierung der Temperatur und des Puffers wird
insbesondere dadurch sichtbar, dass die Aktivitätssteigerung aufgrund der Verdopplung der
Startkonzentration (von 30 mg/mL auf 60 mg/mL) bei den optimierten Bedingungen deutlich
geringer ausfällt, als es zu Beginn der Untersuchungen der Fall war.
Abbildung 18: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit der Lipasestartkonzentration bei unter-
schiedlichen Immobilisierungsbedingungen (Immobilisierungstemp. bei 10 mM = 21,5 °C; 200 mM = 40°C)
Bei den initialen Bedingungen (10 mM KPi, pH 7,0, 21,5 °C) konnte die Aktivität durch
Erhöhung der Lipasemenge um 85 % gesteigert werden, wobei es unter optimalen
Bedingungen lediglich zu einer Steigerung um knapp 13 % kommt. Der nur geringe Zuwachs
der spezifischen Trägeraktivität rechtfertigt somit nicht die Verdopplung der Lipasestart-
konzentration auf 60 mg/mL, weswegen alle weiteren Immobilisierungen im Rahmen dieser
0
5
10
15
20
25
30
0 10 20 30 40 50 60 70
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Konzentration der Lipaselösung [mg/mL]
10 mM
200 mM
Ergebnisse und Diskussion
63
Arbeit bei 40 °C, einer Proteinstartkonzentration von 30 mg/mL und unter Verwendung
eines 200 mM KPi-Puffers mit einem pH-Wert von 6,2 durchgeführt wurden.
3.2.6 Einfluss der silcoat-Technologie
Neben der in Kapitel 3.1.1 vorgestellten Verwendung von Silikon zur Einbettung von Lipasen
ist dieses Polymer nachweislich auch sehr gut geeignet, um das Leachingverhalten von
porösen Trägern mit darauf adsorptiv gebundenen Enzymen zu verbessern. Dies konnte in
einer arbeitsgruppeninternen Studie eindrucksvoll am Beispiel des kommerziellen Lipase-
präparats Novozym 435 demonstriert werden. Die Herstellung von Kompositpartikeln (im
weiteren mit dem Präfix silcoat gekennzeichnet) aus dem Novozym 435 und Silikon führte zu
einer beachtlichen Verbesserung der Leachingstabilität und erhöhte im besonderen Maße
die Belastbarkeit der Novozym 435 Partikel gegenüber mechanischen Einflüssen [25, 103].
Demonstriert in beispielhaften Synthesezyklen der chemischen Bulkindustrie konnten unter
anderem Steigerungen der Halbwertszeiten in Prozessen mit hohem Leachingpotential um
mehr als den Faktor 25 erreicht werden [127]. In ähnlichen Größenordnungen lag die
Halbwertszeitverlängerung der eingesetzten silcoatNovozym 435 in Rührwerksreaktoren, in
denen eine hohe mechanische Belastung auf die Immobilisate wirkte [127]. Die Herstellung
der Komposite bestand aus einer Inkubation poröser Trägermaterialien in einem Zwei-
komponenten-Silikon, welches mit einem leicht verdampfbaren organischen Lösungsmittel
gemischt wurde. Das Lösungsmittel dient dabei zur Verringerung der Viskosität der
Siloxanmischung und dazu, das polymerisierende Silikon gleichmäßig in den Poren der Träger
zu verteilen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels polymerisiert das Silikon vollständig aus
und umschließt die adsorptiv gebundenen Enzyme auf der Trägeroberfläche [25]. Obwohl
ein Leaching von adsorptiv gebundenen Enzymen in organischen Lösungsmitteln aufgrund
der fehlenden Löslichkeit unwahrscheinlich ist, wurde bereits gezeigt, dass reine Substrate
diesen Effekt hervorrufen können. Da bei einem Einsatz polarer Lösungsmittel ein Verlust
der Enzyme nicht ausgeschlossen werden kann, ist eine Beschichtung mit Silikon
möglicherweise ebenso hilfreich. Hauptaugenmerk sollte dennoch darauf liegen, inwiefern
sich der aktivierende Effekt des Silikonkontaktes analog zu Arbeiten von Hoyos et al. [89] auf
die hiesigen Acc-LipTL übertragen lässt. Sollte die Steigerung der Aktivität auf den Acc-LipTL
Ergebnisse und Diskussion
64
vor allem aufgrund von Aufreinigungseffekten zustande kommen, könnte der Kontakt zum
Silikon eine zusätzliche Hyperaktivierung hervorrufen. Dazu wurden Acc-LipTL mit
verschiedenen Mengen Silikon beschichtet und der Einfluss auf die spezifische Träger-
aktivität untersucht. Es wurden zwar Siloxane eines anderen Herstellers als bei
Hoyos et al. [89] verwendet, jedoch ist die Struktur des Silikons bis auf leichte Abweichungen
in der Kettenlänge identisch. Angefertigt wurden silcoatAcc-LipTL mit 30, 50 und 70 %
Silikonanteil bezogen auf die Gesamtmasse der beschichteten Partikel.
Nach Beendigung des Beschichtungsprozesses konnte festgestellt werden, dass die
silcoatAcc-LipTL mit 30 und 50 % Silikonanteil keine erkennbare Änderung ihres äußeren
Erscheinungsbildes aufwiesen. Erst die Immobilisate mit 70 % Silikon bildeten zum Teil
Agglomerate aus überschüssigem Silikon und mehreren Partikeln. Zur besseren Visuali-
sierung wurden rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen der silcoatAcc-LipTL angefertigt.
Abbildung 19 zeigt die Accurelpartikel mit den jeweiligen Silikonanteilen, wobei sehr gut die
schwammartige Struktur der Accurelträger zu erkennen ist. Die Veränderung der
Porengrößen und der Partikelform bei den verschiedenen Bildausschnitten ist aller
Wahrscheinlichkeit nach nicht dem Silcoat-Prozess zuzuschreiben, da dies auch bei
unbeschichteten Trägern beobachtet werden konnte. Die Beobachtungen aus dem
Beschichtungsprozess bestätigen sich bei Betrachtung der Aufnahmen insofern, dass erst bei
einem Silikonanteil von 70 % eine Silikonschicht auf der Oberfläche der Acc-LipTL zu
erkennen ist. Bei den Ansätzen mit einem Anteil von 30 und 50 % ist anzunehmen, dass das
Silikon in die Porositäten einzieht und diese graduell auffüllt. Dieser Effekt wurde auch für
die Novozym 435 Partikel beobachtet. Dort lag der Silikonanteil, bei dem eine äußere Schicht
zu erkennen war, bei 54 % [25].
Ergebnisse und Diskussion
65
Abbildung 19: REM-Aufnahmen der silcoatAcc-LipTL mit verschiedenen Silikongehalten
Die spezifische Trägeraktivität der silcoatAcc-LipTL ändert sich unabhängig von der
Silikonmenge nicht signifikant (Daten nicht gezeigt). In Abbildung 20 sind die Verlaufskurven
der KR von Benzoin in THF bei Raumtemperatur für die Acc-LipTL sowie der verschiedenen
silcoatAcc-LipTL aufgetragen. Im Falle des silcoatAcc-LipTL wurde entsprechend des Silikonanteils
eine erhöhte Menge Immobilisat verwendet, so dass effektiv gleich viel Acc-LipTL für alle
Reaktionen eingesetzt wurde. Der maximale Umsatz von 50 % wurde bei allen Immobilisaten
nach ca. 3 h erreicht, wobei die Verläufe der Umsatzkurven keine signifikanten Unterschiede
in Abhängigkeit der unterschiedlichen Silikonmengen aufweisen. Eine Beschichtung der
Novozym 435 mit unterschiedlichen Mengen Silikon führte zu einer signifikanten Ver-
ringerung der spezifischen Aktivität, was vor allem auf Diffusionslimitierungen durch das
Silikon zurückgeführt wurde [25, 103]. Der Grund dafür, dass in der KR von Benzoin keine
Unterschiede zwischen den verschiedenen Silikonmengen gefunden wurden, ist mit dem
Quellungsverhalten von Silikon in organischen Lösungsmitteln zu erklären. Der Einsatz von
Silikonen in organischen Lösungsmitteln resultiert in einer deutlichen Gewichts- und
Größenzunahme, was bereits in früheren Studien gezeigt werden konnte [100].
Ergebnisse und Diskussion
66
Durch das Aufquellen des Silikonnetzwerkes ist eine Verringerung von Diffusionsbarrieren
wahrscheinlich und würde die hier erhaltenen Ergebnisse erklären. Eine Erhöhung der in
Silikon eingebetteten Lipase TL, wie es in der Studie von Hoyos et al. [89] nachgewiesen
werden konnte, ist bei einer vorhergehenden Immobilisierung auf einen hydrophoben
Träger offensichtlich nicht möglich. Wenn eine Hyperaktivierung stattfindet, ist davon
auszugehen, dass die Lipase TL Moleküle infolge der Accurelimmobilisierung bereits die
grenzflächenaktivierte Konformation eingenommen haben.
Abbildung 20: Vergleich der KR-Umsatzverläufe von Acc-LipTL mit den silcoatAcc-LipTL Varianten
3.2.7 Vergleich der Acc-LipTL mit der nativen TL und Literaturdaten
Der Proteingehalt des Lipase TL Präparats lag in dieser Arbeit bei 12,9 %. In den
Immobilisierungsstudien von Faure und Illanes [101] und Hoyos et al. [89] wurden Gehalte
von 17,3 % bzw. sogar 33 % angegeben. Basierend auf den Untersuchungen von
Maraite et al. [117], die ein Vorhandensein von Fremdproteinen nachweisen konnten, liegt
die Vermutung nahe, dass diese Abweichungen chargenbedingt sind, da es sich aller
Wahrscheinlichkeit nach bei dem Präparat um ein grob gereinigtes Fermentationsextrakt
handelt. Somit können sich Schwankungen in der Fermentation direkt in der
0
10
20
30
40
50
0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200
Umsatz [%]
Zeit [min]
Acc-LipTL
silcoatAcc-LipTL 30%
silcoatAcc-LipTL 50%
silcoatAcc-LipTL 70%
Ergebnisse und Diskussion
67
Zusammensetzung der Präparate widerspiegeln. Dies wird dadurch gestützt, dass die
spezifische Proteinaktivität der hier verwendeten nativen Lipase TL im Vergleich zu der von
Hoyos et al. [89] um den Faktor 5,6 höher ist. Aufgrund dessen wurden die statischen
Suspensionen mit der hier verwendeten Charge Lipase TL hergestellt und als Vergleich für
die Acc-LipTL genutzt.
Tabelle 11: Vergleich der Acc-LipTL mit der nativen Lipase TL und den statischen Suspensionen
Präparat
Beladungsdichte
[mgProtein/gPräparat/Träger]
Spezifische
Aktivität
[U/gPräparat]
Spezifische
Proteinaktivität
[U/gProtein]
Aktivierungsfaktor [-]
Lipase TL nativ
129,0
44,6
352
1
Accurel – Lipase TL
17,8
24,7
1437
4,1
statische
Suspension1
3,1
0,95
310
0,9
statische
Suspension
(Hoyos et al. [89])
7,6
1,1
139
2,22
1 Eigens hergestellte statische Suspension 2 Ist bezogen auf die verwendete Charge Lipase TL in der Arbeit von Hoyos et al. [89]
Tabelle 11 fasst die Beladungsdichten der hergestellten Immobilisate bzw. den Proteingehalt
der nativen Lipase TL, die jeweiligen spezifischen Aktivtäten der Präparate/Träger, die
dazugehörigen spezifischen Proteinaktivitäten und den Aktivierungsfaktor bezogen auf die
native Lipase TL zusammen. Für den hier durchgeführten Vergleich wurden Acc-LipTL mit
einer Beladungsdichte von 17,8 mgProtein/gTräger zugrunde gelegt.
Die Immobilisierung der Lipase TL auf Accurel kann abschließend als sehr erfolgreich
bewertet werden, da eine um den Faktor 4,1 höhere Aktivitätsausbeute erreicht werden
konnte. Der Vergleich der statischen Suspension von Hoyos et al. [89] und der hier
hergestellten macht deutlich, dass die Aktivierung der Lipase TL nicht reproduziert werden
konnte (bezogen auf die Aktivität der hier verwendeten nativen Lipase TL). Die Synthese
wurde mit identischen Materialen (Silikon) und mehrere Male durchgeführt, was zu keiner
Änderung der Ergebnisse führte. Es kann letztendlich nicht genau geklärt werden, ob es sich
Ergebnisse und Diskussion
68
hier um einen Fehler in der Herstellung der statischen Suspensionen handelt oder ob
Unterschiede in den Enzymchargen diese Abweichungen erklären könnten.
Interessanterweise bestätigt dieses Ergebnis die fehlende Aktivierung nach einer
Beschichtung der Acc-LipTL mit Silikon. Dies stützt die Theorie der selektiven Lipase TL
Bindung und der dadurch erreichten Aufreinigung. Ungeachtet dessen weisen die Acc-LipTL
noch weitere Vorteile gegenüber den statischen Suspensionen auf. Die statischen
Suspensionen quellen bei einem Kontakt mit Lösungsmittel sehr stark, was dazu führt, dass
bei einem geringen Reaktionsvolumen nur sehr wenig dieses Präparats eingesetzt werden
kann. Dies erniedrigt die volumetrische Aktivität des Ansatzes erheblich. Die inerte
Beschaffenheit der Accurelträger und die geringe Korngröße ermöglichen auch bei geringen
Volumina eine hohe volumetrische Aktivität. Des Weiteren ist dieses Quellungsverhalten bei
den silcoatAcc-LipTL nicht zu finden, da wahrscheinlich der feste Träger ein Quellen des
Silikons weitestgehend unterbindet.
3.3 Charakterisierung der Reaktionsparameter – Einfluss auf die Aktivität
und Stabilität der Acc-LipTL
In den Arbeiten von Hoyos et al. [70, 89, 90] wurde, wie in Kapitel 1.5 vorgestellt, die
dynamisch kinetische Racematspaltung von Benzoin unter Verwendung der Lipase TL und
des Shvo-Katalysators eingehend untersucht. Es wurden dabei sowohl die Einsatzart der
Lipase TL sowie der Einfluss der Reaktionstemperatur und verschiedener Acyldonatoren auf
den jeweiligen Umsatz der KR betrachtet. Des Weiteren wurden Untersuchungen hinsichtlich
der DKR-Strategie durchgeführt, um trotz der beschriebenen Deaktivierung der Lipase TL bei
50 °C den Umsatz der DKR zu maximieren und gleichzeitig die Reaktionszeit zu minimieren.
Die Immobilisierung der Lipase TL in statischen Suspensionen führte laut Hoyos et al. [89] zu
einer Stabilisierung bei einer Reaktionstemperatur von 60 °C. Es wurden jedoch keine
Untersuchungen bezüglich des Stabilisierungsgrundes bzw. des genauen Ausmaßes der
Stabilisierung durchgeführt.
Für eine rationale Steigerung der Stabilität der Lipase TL ist es von Vorteil, wenn die
deaktivierenden Einflussfaktoren eindeutig identifiziert werden können. Es ist auf der
Ergebnisse und Diskussion
69
Grundlage der bisherigen Publikationen nicht ersichtlich, ob die Lipase TL vor allem
temperatursensitiv ist oder ob zusätzlich oder eben alleinig das verwendete Lösungsmittel
bzw. die Substrate oder Produkte eine Verminderung der Stabilität hervorrufen. Aufgrund
dessen wurde im Rahmen dieser Arbeit eine Charakterisierung der Acc-LipTL bezüglich des
Einflusses verschiedener Reaktionsparameter auf die Aktivität, die Lager- und Prozess-
stabilität durchgeführt. Zusätzlich sollten verschiedene Lösungsmittel getestet werden, um
eine potentielle Alternative zu THF aufzuzeigen. Die Aufnahme der Lagerstabilität wurde
dazu verwendet, um Einflüsse isoliert voneinander betrachten und bewerten zu können. Die
Prozessstabilität diente zur Kontrolle der in den vorherigen Versuchen ermittelten
Einflussfaktoren und zur Charakterisierung der Acc-LipTL unter den jeweiligen Einsatz-
bedingungen. Die Einflussnahme der Parameter auf die Aktivität der Acc-LipTL wurden im
weiteren Verlauf der Arbeit dazu genutzt, um optimale Arbeitsbedingungen für die DKR zu
finden.
3.3.1 Aktivität
In Anbetracht des Reaktionssystems der kinetischen Racematspaltung von Benzoin können
folgende variierbare Parameter bestimmt werden, die potentiell einen Einfluss auf die
Aktivität der Lipase TL haben: Acyldonor, Substratkonzentration, Wasseraktivität, das
verwendete Lösungsmittel und die Reaktionstemperatur.
Auf Grundlage der zur Verfügung stehenden Literaturdaten von Aoyagi et al. [128] und
Hoyos et al. [70, 89, 90] konnten Vinylester als sehr gut geeignete Acyldonatoren identifiziert
werden. Generell eignen sich diese Enolester in Umesterungsreaktionen, da die gebildeten
Enol-Nebenprodukte direkt zu Aldehyden oder Ketonen tautomerisieren [129, 130]. Die
dadurch entstehende Irreversibilität der Reaktion erhöht die Reaktionsgeschwindigkeit
enorm. Bezüglich der Aktivität wurde eine Variation des Acyldonors aufgrund dessen nicht in
Betracht gezogen und an der Verwendung von Vinylbutyrat festgehalten.
Die Substratkonzentration wurde von Hoyos et al. [90] variiert, was eine annähernd lineare
Steigerung der Aktivität bei sukzessiver Erhöhung der Substratkonzentration zur Folge hatte.
Für eine Untersuchung von Parametern, die einen direkten Einfluss auf die Aktivität haben,
Ergebnisse und Diskussion
70
ist von Vorteil, wenn die Aktivität allein vom Enzym abhängig ist [2]. Aufgrund der geringen
Löslichkeit des Benzoins ist das Erreichen einer Substratkonzentration, bei der die Aktivität
nur vom Enzym abhängt, nicht möglich und so wurde an einer definierten Konzentration
festgehalten. Um den Einfluss der sich ändernden Substratkonzentration auf die
Reaktionsgeschwindigkeit möglichst klein zu halten, wurden die Zeitpunkte der Proben-
nahmen im Aktivitätstest so gewählt, dass der Umsatz der Reaktion minimal (<10 %) blieb.
Folglich wurden die Parameter Wasseraktivität, Lösungsmittel und Reaktionstemperatur
genauer betrachtet.
3.3.1.1 Wasseraktivität
Die KR von Benzoin basiert auf der Verwendung eines nichtwässrigen, organischen
Lösungsmittelsystems. Gründe dafür sind vor allem die gute Benzoinlöslichkeit in THF und
das Fehlen einer Wasserphase, da Wasser als Konkurrenznukleophil zum Acyldonor fungiert.
Das Reaktionsgleichgewicht wird dadurch auf die Seite der Umesterungsreaktion verschoben
und damit die Hydrolyse des Acyldonors verhindert. Nichtsdestotrotz kann Wasser auch in
nicht wässrigen Reaktionssystemen eine entscheidende Rolle spielen. Nach heutigem
Kenntnisstand ist eine vom Enzym abhängige Wassermenge zur Aufrechterhaltung der
Hydrathülle notwendig, um die strukturelle Mobilität und der damit verbundenen,
aktivitätssteigernden Flexibilität des Enzyms sicherzustellen [131]. Zur Beschreibung der
Menge dieses Wassers wurde der Begriff der Wasseraktivität (aw) eingeführt. Die
Wasseraktivität ist definiert als der Wasserdampfdruck über einem Material oder einer
Flüssigkeit im Verhältnis zum Wasserdampfdruck über reinem Wasser [132]. In Bezug auf ein
enzymatisches Reaktionssystem beschreibt der aw-Wert die Menge an verfügbarem Wasser,
die nach Sättigung aller Interaktionspartner des Wassers, wie beispielsweise dem
Lösungsmittel, den Substraten, den verwendeten Reaktionsgefäßen und den Enzymen bzw.
Immobilisaten, im Reaktionssystem vorliegt.
Es wurden unterschiedliche Methoden zur Einstellung der Wasseraktivität entwickelt. Die
Inkubation des gesamten Reaktionssystems oder auch nur einzelner Komponenten über
einer gesättigten Salzlösung stellt die am weitesten verbreitete Methode dar [133]. Dabei
Ergebnisse und Diskussion
71
werden Salze verwendet, die nach Herstellung einer übersättigten Lösung einen festen
Wasseraktivitätswert aufweisen. Dieser Wert variiert zwischen 0-1, wobei 0 absolut trocken
und 1 die Wasseraktivität über reinem Wasser bedeutet. Folgend stellt sich nach einer
ausreichend langen Inkubationszeit der aw-Wert des Salzes auch im Reaktionssystem ein.
Diese Methode ermöglicht aufgrund der definierten Wasseraktivitäten eine genaue
Charakterisierung der Abhängigkeit der Aktivität von der Menge des verfügbaren Wassers.
Um einen ersten Eindruck von dieser Abhängigkeit zu bekommen, kann für bestimmte
Lösungsmittel deren Abhängigkeit zwischen dem Wassergehalt und der Wasseraktivität aus
Tabellenwerken abgelesen werden. Die definierte Zugabe einer sehr geringen Wassermenge
für theoretisch trockene Lösungsmittel ermöglicht somit die Einstellung einer gewünschten
Wasseraktivität. Bei sehr unpolaren Lösungsmitteln ist dies jedoch nur sehr schwierig
möglich, da die Wassermenge, die zugegeben werden müsste, oftmals zu klein für eine
reproduzierbare Zugabe ist. Bei polaren und wassermischbaren Lösungsmitteln wie THF ist
diese Methode leicht anwendbar und wurde in einer früheren Studie zum Einfluss des
Wassergehaltes auf die Reaktionsgeschwindigkeit einer Umesterung mittels der Protease
Subtilisin Carlsberg angewendet [134]. Die Kontrolle der Wasseraktivität bei Umesterungs-
reaktionen ist dahingehend simpel, dass bei der Reaktion kein zusätzliches Reaktionswasser
entsteht oder verbraucht wird. Offensichtliches Manko dieser Methode ist jedoch die
mögliche Diskrepanz zwischen der Wasseraktivität des Lösungsmittels und der des späteren,
sich im Gleichgewicht befindlichen Reaktionssystems. Ein Teil des Wassers interagiert auch
mit den anderen Bestandteilen des Systems (Substrat, Enzym(träger), Reaktionsgefäße). Da
die Stärke der Interaktionen nicht voraussagbar ist, ist auch keine Aussage über die
tatsächliche Wasseraktivität möglich. Aufgrund dessen ist anzunehmen, dass obwohl sich
der Wassergehalt des Reaktionsansatzes nicht ändert, die tatsächliche Wasseraktivität
geringer ist, als die durch die Wasserzugabe eingestellte. Die im Rahmen dieser Arbeit
verwendeten Komponenten wie Benzoin als Substrat und Accurel als Trägermaterial sind
sehr hydrophob, weswegen eine Aufnahme des im Lösungsmittel befindlichen Wassers eher
unwahrscheinlich ist. Das Vinylbutyrat wurde verwendet wie erworben und könnte aufgrund
seiner polaren Natur einen Teil des Wassers aufnehmen. Da die Menge des Vinylbutyrats
jedoch sehr gering ist, ist dahingehend keine wesentliche Änderung des aw-Wertes zu
Ergebnisse und Diskussion
72
erwarten. Eine höhere Wasseraktivität als eingestellt könnte ebenso auftreten, da nicht
davon ausgegangen werden konnte, dass das verwendete Lösungsmittel absolut trocken ist.
In diesem Fall ist möglich, dass eine geringe und als konstant anzusehende Menge Wasser im
THF Einfluss auf den aw-Wert nimmt. Da jedoch das THF auf Natriumsulfat getrocknet und
mehrere Tage vor Verwendung auf aktivierten Molsieben gelagert wurde, ist auch dieser
Einfluss als sehr gering einzuschätzen. Auf der Grundlage dieser Voraussetzungen kann diese
Methodik für eine Feststellung einer generellen Abhängigkeit der Enzymaktivität von der
Wasseraktivität genutzt werden. Die Möglichkeit den tatsächlichen aw-Wert des
Reaktionsansatzes mit einem Taupunkthygrometer oder einen Leitfähigkeitsmesser zu
ermitteln, ist laut Herstellerangaben nicht möglich, da die Sensibilität der verwendeten
Membranen gegenüber einer puren Lösungsmittelphase zu hoch ist.
Im Folgenden wurden verschiedene Wasseraktivitäten durch Zugabe definierter Mengen
Wasser zu THF eingestellt. Die Acc-LipTL wurden bis zur Verwendung in einem Exsikkator
unter reduziertem Druck und über Trocknungsmitteln gelagert. Tabelle 12 listet den
Wassergehalt des THF und die theoretisch dadurch eingestellte Wasseraktivität auf.
Tabelle 12: Wassergehalt (v/v%) von THF bei definierten Wasseraktivitäten
Wasseraktivität
Wassergehalt THF [%]
0,000
0
0,100
0,185
0,200
0,402
0,400
0,98
0,600
1,94
0,800
4,02
Frühere Studien belegen, dass die optimale Wasseraktivität von Enzym zu Enzym variiert,
was auf die unterschiedlichen Molekülstrukturen zurückgeführt wurde [135]. Die
aktivitätsbezogenen, optimalen Wasseraktivitäten in Ver- bzw. Umesterungsreaktionen
liegen beispielsweise bei einem aw-Wert von etwa 0,55 für die Lipase aus
Ergebnisse und Diskussion
73
Mucor miehei [131], oder bei aw=0,33 für die Lipase aus Candida rugosa [136]. Des Weiteren
konnte für eine Lipase einer Pseudomonas sp. eine stetig ansteigende Aktivität mit
zunehmender Wasseraktivität [136] und im Gegensatz dazu für die Lipase aus Rhizopus
arrhizus, bei Durchführung einer Umesterung von Ethyl Decanoat und Dodecanol zu Dodecyl
Decanoat, eine stetig abnehmende Aktivität bei steigender Wasseraktivität festgestellt
werden [136]. Des Weiteren wiesen Valivety et al. [137] nach, dass auch bei einem sehr
niedrigen aw-Wert von theoretisch 0,0001 eine signifikante Restaktivität in der gleichen
Umesterungsreaktion für die Lipase aus Mucor miehei möglich ist. Die hier erhaltenden
Daten zeigen einen ähnlichen Zusammenhang wie die letztgenannten Beispiele.
In Abbildung 21 ist die spezifische Trägeraktivität der Acc-LipTL für die KR von Benzoin in THF
über verschiedene initiale Lösungsmittel-Wasseraktivitäten aufgetragen. Wie bereits zuvor
diskutiert, ist anzunehmen, dass sich die tatsächliche Wasseraktivität von der eingestellten
unterscheidet. Nichtsdestotrotz ist deutlich zu erkennen, dass sich eine Erhöhung des
Wassergehaltes im Reaktionssystem negativ auf die katalytische Aktivität der Immobilisate
auswirkt.
Abbildung 21: Spez. Trägeraktivität der Acc-LipTL in Abhängigkeit von der Wasseraktivität in THF bei RT
0
5
10
15
20
25
30
0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
initiale THF-Wasseraktivität [-]
Ergebnisse und Diskussion
74
Die spezifische Aktivität sinkt von maximal 25,9 U/gTräger bei einer apparenten
Wasseraktivität von Null, bis auf eine fast nicht mehr nachweisbare Aktivität bei einem
apparenten aw-Wert von 0,8. Es ist bekannt, dass eine kritische Hydratisierung der
Enzymoberfläche nötig ist, um die Flexibilität zu gewährleisten. Bei einer fortwährenden
Bindung von Wassermolekülen, was bei einer steigenden Wasseraktivität anzunehmen ist,
führt dies zu einer Steigerung der Flexibilität der Enzyme im nichtwässrigen Medium [134].
Eine stark erhöhte Flexibilität ermöglicht dabei die Ausbildung unvorteilhafter
Konformationszustände, die eine Inaktivierung oder zumindest einen Verlust der Aktivität
nach sich ziehen können [8]. Es ist theoretisch auch möglich, dass sich die Steigerung des
Wassergehaltes auf das Reaktionsgleichgewicht auswirkt und deshalb die Aktivität der
Umesterung sinkt.
Letztlich kann klar herausgestellt werden, dass bei Verwendung dieses Reaktionssystems
unter den hier vorherrschenden Laborbedingungen eine Trocknung der Acc-LipTL und des
Lösungsmittels zu einer Maximierung der spezifischen Aktivität führt. Anscheinend gilt, je
trockner die Bedingungen sind, desto aktiver sind die Acc-LipTL in der KR von Benzoin. Im
weiteren Verlauf wurden alle verwendeten Lösungsmittel vor der Verwendung in der KR von
Benzoin für mehrere Tage auf aktivierten Molsieben gelagert. Die Acc-LipTL wurden wie
bereits beschrieben unter trockenen Bedingungen aufbewahrt. Die Substrate wurden wie
erworben ohne vorherige Behandlung eingesetzt, da wie bereits zuvor diskutiert, deren
Einfluss auf die Wasseraktivität als sehr gering einzuschätzen ist.
3.3.1.2 Lösungsmittel
In rein organischen Reaktionssystemen sind oftmals die intrinsischen Eigenschaften der
Lösungsmittel entscheidend für die enzymatische Aktivität [8]. Es wurde in zahlreichen
Studien versucht die Aktivität, Stabilität und Selektivität von Enzymen mit diversen
Lösungsmittelparametern, wie beispielsweise der Polarität, der Leitfähigkeit oder der Hydro-
phobizität, zu korrelieren, um Richtlinien für die Auswahl des geeignetsten Lösungsmittels zu
erstellen. Die Schlussfolgerung der Vielzahl an Untersuchungen dürfte die Erkenntnis sein,
dass es nicht „den“ Parameter gibt, der eine solche Voraussage zulässt [16, 132, 138].
Ergebnisse und Diskussion
75
Dennoch wurde oft versucht durch Verwendung des log P-Konzepts, welches ein Maß für die
Hydrophobizität eines Lösungsmittels ist, den Einfluss auf die Aktivität und Stabilität von
Enzymen zu beschreiben [139]. Das Konzept beruht auf dem dekadischen Logarithmus des
Verteilungskoeffizienten zwischen Oktanol und Wasser und beschreibt im Prinzip die
Fähigkeit des Lösungsmittels, sich mit Wasser zu mischen. Je höher der log P-Wert, desto
hydrophober das Lösungsmittel. Eine Wassermischbarkeit wird für Lösungsmittel mit einem
log P-Wert von -2,5 - 0 (vollständig mischbar) und 0 - 2 (teilweise mischbar) ange-
nommen [3].
Die Aktivität bzw. die Inaktivierung von Enzymen kann jedoch von sehr viel mehr Faktoren
abhängen, als allein von der Hydrophobizität des Lösungsmittels. Es kann zu direkten
Interaktionen der funktionellen Gruppen der Lösungsmittelmoleküle mit der Enzym-
oberfläche kommen oder die Solvatisierung der Substrate kann in verschiedenen Lösungs-
mitteln unterschiedlich sein. Je stärker ein Substrat solvatisiert vorliegt, desto geringer ist die
freie Energie des Substrates, was eine verringerte Verfügbarkeit dessen für das
katalysierende Enzym bedingt [140]. Dies kann im Folgenden durch eine Abnahme der
Reaktionsgeschwindigkeit beobachtet werden. Daher ist das log P-Konzept allein nicht
hinreichend dazu geeignet, Voraussagen zur Aktivität und Stabilität zu treffen [132]. Eine
Betrachtung der Hydrophobizität von Lösungsmitteln der gleichen Stoffklasse hingegen kann
möglicherweise Aufschluss über den Einfluss auf die Aktivität oder Stabilität geben.
Im Rahmen dieser Charakterisierung wurden Lösungsmittel ausgewählt, die in der Literatur
zur Lösung von Benzoin erwähnt wurden bzw. die in experimentellen Vorarbeiten eine
Mindestlöslichkeit von 10 mg/mL Benzoin aufwiesen. Tabelle 13 fasst die getesteten
Lösungsmittel in ihren Stoffklassen, deren log P-Wert, die maximale Löslichkeit von Benzoin
und die spezifische Trägeraktivität der Acc-LipTL in den jeweiligen Solventien zusammen.
Ergebnisse und Diskussion
76
Tabelle 13: Vergleich verschiedener Lösungsmittel zur KR von Benzoin
Stoffklasse der
Lösungsmittel
Lösungsmittel
log P
Maximale Löslichkeit
von Benzoin bei 21,5 °C
[mg/mL]
Spezifische
Aktivität
[U/gTräger] 1
Ketone
DMSO
-1,3
20
1
Aceton
-0,23
>20
12,6
MIBK
1,31
10 (20)3
13,6
Ether
1,4-Dioxan
-1,11
>20
10,9
THF
0,49
>20
13
2-MeTHF
0,72
>20
20,7
chlorierte KW2
DCM
1,25
>20
4
TCM
2
>20
4,2
Azine
Pyridin
0,71
>20
5,6
Nitrile
Acetonitril
-0,33
20
6,2
aromatische KW2
Toluol
2,5
10 (>20)3
15,2
gesättigte KW2
Hexan
3,5
-
0
Heptan
4
-
0
1 Benzoinkonzentration von 10 mg/mL; 2 Kohlenwasserstoffe; 3 Lösung des Benzoins durch leichtes Erwärmen,
bei 50 °C höhere Konzentrationen möglich
Es konnte weder ein Zusammenhang zwischen dem log P-Wert noch der verwendeten
Lösungsmittelklasse und der maximalen Löslichkeit von Benzoin festgestellt werden.
Lösungsmittel die teilweise (log P = 0-2) oder vollständig (log P = -2,5-0) mit Wasser mischbar
sind, weisen mit vereinzelten Ausnahmen eine gute Löslichkeit für Benzoin auf (> 20 mg/mL).
Einzig sehr hydrophobe Lösungsmittel (log P > 2,5) konnten kein Benzoin lösen. Im Fall des
Toluols konnte eine gute Löslichkeit durch Erhöhung der Temperatur erreicht werden. Aus
Gründen der Vergleichbarkeit wurden alle Aktivitätstests bei einer Substratkonzentration
von 10 mg/mL durchgeführt.
Innerhalb der Lösungsmittelklassen konnte durch die Untersuchung mehrerer Lösungsmittel
bei den Ketonen und den Ethern ein Zusammenhang zwischen dem log P-Wert und der
Aktivität der Acc-LipTL gefunden werden. Je höher der log P-Wert hierbei war, desto höher
die Aktivität. Es ist möglich, dass ein höherer log P-Wert eine schlechtere Löslichkeit des
Ergebnisse und Diskussion
77
Benzoins bedingt und dieses somit weniger solvatisiert vorliegt. Eine geringe Solvatisierung
bedeutet aber auch eine gute Verfügbarkeit des Substrates für das Enzym und somit eine
höhere Aktivität. Der Vergleich der log P Werte der verschiedenen Stoffklassen macht jedoch
nochmals deutlich, dass ein genereller Vergleich dieses Parameters zu keiner Korrelation
führt. Die höchste spezifische Trägeraktivität konnte in 2-MeTHF mit 20,7 U/gTräger
festgestellt werden. Auch Toluol wies mit 15,2 U/gTräger eine höhere Aktivität als das
Standardsystem in THF auf (13 U/gTräger). Chlorierte KW, Azine, Nitrile und gesättigte KW
eignen sich offenbar nicht für die KR von Benzoin mit Acc-LipTL, da hierbei jeweils signifikant
niedrigere Aktivtäten als in THF festgestellt wurden. Eine mögliche Ursache für einen Verlust
der katalytischen Aktivität ist möglicherweise in einer direkten Interaktion zwischen den
Lösungsmitteln und der Lipase TL zu finden. So ist bekannt, dass eine starke Solvatisierung
von Aminosäureseitenketten zu einem Verlust der strukturellen Integrität führt und je nach
Stärke der Interaktion in einer Verringerung der Aktivität deutlich wird [6].
Zusätzlich muss generell bedacht werden, dass trotz einer Lagerung der Lösungsmittel über
Molsieben der exakte Wassergehalt der Lösungsmittel nicht bestimmt wurde. Der Wasser-
gehalt eines Lösungsmittels ist, wie im vorherigen Kapitel diskutiert, direkt mit der
Wasseraktivität verbunden. Nach Zaks und Klibanov [141] ist der notwendige Wassergehalt
im Lösungsmittel, der erforderlich ist, um eine bestimmte Hydratisierung des Enzyms zu
erreichen, je nach Hydrophilie des Lösungsmittels verschieden. So ist beispielsweise in
hydrophoben Lösungsmitteln eine geringere Wassermenge erforderlich, um eine bestimmte
Wasseraktivität zu erreichen, als es in hydrophileren der Fall ist. Daher ist denkbar, dass
auch dieser Sachverhalt für die spezifischen Aktivitäten von Acc-LipTL in den verschiedenen
Lösungsmitteln verantwortlich ist.
Die Lagerung von Lösungsmitteln über Molsieben stellt eine gängige Methode zur
Entfernung eines Großteils des Wassers dar und ist hinsichtlich einer potentiellen
Anwendung der (D)KR von Benzoin in einem industriellen Maßstab einfach umzusetzen.
Unter den gegebenen Bedingungen können die erhaltenen Daten als signifikant betrachtet
werden, weswegen an dieser Vorgehensweise festgehalten wurde. Auf Basis dieser Daten
wurden THF, Toluol und 2-MeTHF ausgewählt, um den Einfluss der Temperatur auf die
spezifische Aktivität der Acc-LipTL zu untersuchen.
Ergebnisse und Diskussion
78
3.3.1.3 Temperatur
Eine Erhöhung der Reaktionstemperatur ist insbesondere hinsichtlich der Kombination der
Acc-LipTL mit einem chemischen Racemisierungskatalysator interessant. Häufig werden
diese in chemo-enzymatischen Reaktionssystemen bei erhöhten Temperaturen, meist um
50-80 °C eingesetzt [84, 142, 143]. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde die
Temperatur schrittweise erhöht und die spezifische Trägeraktivität der Acc-LipTL
aufgenommen.
Abbildung 22: Prozentuale Restaktivität von Acc-LipTL in verschiedenen Lösungsmitteln in Abhängigkeit der
Reaktionstemperatur (Toluol: 47 mM Benzoin, 2-MeTHF und THF: 94 mM Benzoin)
In Abbildung 22 ist die prozentuale Restaktivität der Acc-LipTL in THF, 2-MeTHF und Toluol
über unterschiedlichen Temperaturen aufgetragen. Die Bestimmung der Restaktivitäten in
Toluol als Lösungsmittel wurde bei einer Benzoinkonzentration von 10 mg/mL durchgeführt,
so dass auch Aktivitätstests bei Raumtemperatur möglich wurden. Im Fall von THF und
2-MeTHF wurde an der Standardkonzentration von 20 mg/mL festgehalten. Es ist deutlich
erkennbar, dass die Aktivität bei Verwendung des THF’s das Maximum bei 50 °C, im Fall des
2-MeTHF bei 60 °C und bei Toluol als Lösungsmittel erst bei >99 °C aufweist, was die höchste
Temperatur darstellte, die ohne Veränderung des Messsystems eingestellt werden konnte.
Die prozentuale Steigerung der Restaktivitäten betrug im Vergleich zur Raumtemperatur bei:
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
prozentuale Aktivität [%]
Temperatur [°C]
Toluol
2-MeTHF
THF
Ergebnisse und Diskussion
79
THF = 160 %; 2-MeTHF = 227 %; Toluol = 886 %. Grundsätzlich konnte eine Steigerung der
Aktivität bei Erhöhung der Temperatur erwartet werden. Die Unterschiede der prozentualen
Steigerungen in den jeweiligen Lösungsmitteln sind aller Wahrscheinlichkeit nach mit der
unterschiedlichen Thermostabilität der Lipase TL in den verschiedenen Lösungsmitteln zu
erklären. So scheint die Lipase TL in Toluol wesentlich thermostabiler zu sein als in THF und
2-MeTHF. Es ist denkbar, dass die hydrophoben Lösungsmittelmoleküle des Toluols die
Konformation der allem Anschein nach ebenso hydrophoben Lipase TL besser stabilisieren
und somit vor der temperaturbedingten Inaktivierung schützen.
Eine Verringerung der Stabilität der Enzyme wird zudem durch den jeweilig sigmoiden
Kurvenverlauf mit anschließender Verminderung der Restaktivität deutlich. Demnach ist die
Temperatur, bei der das Aktivitätsmaximum erreicht wurde, nicht zwingend die, welche für
einen technischen Prozess als optimal anzusehen ist. Um diese zu ermitteln, müsste die
jeweilige Halbwertszeit der Acc-LipTL im entsprechenden Lösungsmittel und den einzelnen
Temperaturen in Korrelation mit der spezifischen Aktivität gebracht werden. So könnte die
zu erwartende Menge an Produkt bis zur vollständigen Deaktivierung der Enzyme errechnet
werden. Diese Abschätzung ist insbesondere für eine alleinige Betrachtung der KR
interessant. Mit einem Optimierungsfokus, der sich auf die Entwicklung einer verbesserten
DKR von Benzoin richtet, sind Reaktionstemperaturen bei mindestens 50-60 °C anzustreben.
Daher schien an dieser Stelle eine Erhöhung der Stabilität der Acc-LipTL vielversprechender
zu sein, um dadurch höhere Reaktionstemperaturen und die damit verbundene höhere
spezifische Aktivität der Acc-LipTL nutzen zu können.
3.3.2 Lagerstabilität
Die Lagerstabilität bezeichnet die Abnahme der Aktivität bei einer Lagerung unter
konstanten Bedingungen über einen definierten Zeitraum und dient der isolierten
Betrachtung einzelner Parameter. Ziel der Untersuchung ist die Identifikation der Parameter,
welche einen signifikanten Anteil an der Destabilisierung der Lipase TL haben. Ausgangs-
punkt und Referenz der Untersuchung ist das Standardsystem in THF. Da nicht
auszuschließen ist, dass auch Edukte oder Produkte eine negative Wirkung auf die Stabilität
Ergebnisse und Diskussion
80
des Enzyms haben, wurde der Einfluss dieser ebenso untersucht, wie die Folge einer
erhöhten Temperatur und alternativer Lösungsmittel. Die Bewertung der Stabilität erfolgte
durch eine Ermittlung der Halbwertszeit. Durch eine Auftragung der logarithmierten
Restaktivitäten über der Zeit konnte auf Basis der Annahme einer exponentiellen
Deaktivierung der Enzyme nach dem Gesetz erster Ordnung [21] (Gleichung 1) die
Inaktivierungskonstante kI bestimmt werden. Über Gleichung 2 wurde folgend die
Halbwertszeit (HWZ) errechnet.
(Gleichung 1)
(Gleichung 2)
At und A0 = Aktivität zum Zeitpunkt t und zu Beginn (Zeitpunkt Null)
t1/2 = Halbwertzeit (Zeit nach der die Aktivität 50 % des Ausgangswertes entspricht)
3.3.2.1 Stabilität in Gegenwart der Edukte und Produkte
Die Acc-LipTL wurden jeweils unter Anwesenheit eines der Edukte (Benzoin bzw.
Vinylbutyrat) und der einzelnen Produkte (Benzoinbutyrat bzw. Acetaldehyd) in THF
inkubiert. Die Konzentrationen entsprachen im Fall der Edukte denen eines Standard-
aktivitätstests und im Fall der Produkte den Konzentrationen, die bei einem Vollumsatz einer
KR vorhanden wären. Abbildung 23 fasst die jeweiligen Halbwertzeiten im Vergleich zur
Halbwertszeit in reinem THF zusammen.
Die Halbwertszeit der Acc-LipTL in THF beträgt 12,7 h. In Anbetracht der bisher publizierten
Reaktionsdauern der DKR von Benzoin, welche mindestens 20 h betrugen [89], belegt dies
die bereits durch Hoyos et al. [70, 89] erwähnte geringe Stabilität der Lipase TL. Sowohl die
Anwesenheit der Edukte als auch der Produkte hat eine leicht stabilisierende Wirkung auf
die Immobilisate, da sich die Halbwertszeiten im Fall der Edukte auf ca. 14-15 h und bei den
Produkten sogar auf etwa 16-17 h erhöhen. Es ist nicht untypisch für Enzyme, dass diese sich
bei Anwesenheit von Substraten aufgrund der Molekülbindung im aktiven Zentrum
Ergebnisse und Diskussion
81
langsamer entfalten bzw. erst bei einer höheren Temperatur inaktivieren [2]. Aufgrund der
Standardabweichung der erhaltenden Werte ist jedoch die Frage berechtigt, wie signifikant
diese Erhöhung der Stabilität ist.
Abbildung 23: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit von Edukten und Produkten in THF bei RT
Sicher anzunehmen hingegen ist der umgekehrte Schluss, nämlich dass keines der Edukte
oder Produkte eine deaktivierende Wirkung auf die Acc-LipTL hat. Herauszuheben ist dabei
das Ergebnis nach Inkubation mit Acetaldehyd, da dies bekanntermaßen einen negativen
Effekt auf einige Lipasen haben kann [144, 145]. Es wurde in diesen Studien bereits
vermutet, dass die Sensitivität der Lipasen gegenüber Acetaldehyd unter anderem von der
mikrobiellen Herkunft abhängt [144]. Lipasen aus Pseudomonas sp. zeigen demnach eine
geringere Neigung zur Ausbildung der deaktivierend wirkenden Schiff’schen Basen, welche
sich zwischen den Lysinresten der Enzyme und den Aldehyden formen.
Auf Grundlage dieser Ergebnisse bestand folglich kein Grund, das Reaktionssystem
hinsichtlich der Edukte (Acyldonor) bzw. Produkte zu verändern. Es wurde dementsprechend
an Vinylbutyrat als Acyldonor festgehalten, gleichwohl sich Acetaldehyd als Nebenprodukt
bildet.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Halbwertszeit [h]
Ergebnisse und Diskussion
82
3.3.2.2 Lösungsmittel
Im weiteren Verlauf wurden jene Lösungsmittel aus Kapitel 3.3.1.2 hinsichtlich ihrer
Lagerstabilität getestet, die eine ausreichend hohe spezifische Aktivität der Acc-LipTL
ermöglichten (>5 U/mgTräger). Das Standardsystem mit THF als Solvens galt dabei als Referenz
und somit gleichzeitig als Gradmesser für eine potentielle Steigerung der Stabilität der
Immobilisate. Wie in Abbildung 24 ersichtlich, ist lediglich die Halbwertszeit in Pyridin mit 6 h
niedriger als in THF (12,7 h). In allen weiteren untersuchten Lösungsmitteln wiesen die
Acc-LipTL Halbwertszeiten auf, die zum Teil deutlich über der THF-Referenz lagen. Besonders
herausstechend sind dabei MIBK und Toluol, da dort Werte von über 90 h aus den
Messungen extrapoliert werden konnten. In Acetonitril, 1,4-Dioxan und 2-MeTHF konnten
Halbwertszeiten von 27,5 h, 30 h bzw. 33 h festgestellt werden, die ebenso signifikant höher
waren, als im Standardsystem. Als möglicher Erklärungsansatz gilt auch hier die unter-
schiedliche Fähigkeit verschiedener organischer Lösungsmittel die am Enzym befindlichen
Wassermoleküle zu verdrängen [10, 139]. Hydrophobe Lösungsmittel, wie beispielsweise
MIBK und Toluol haben im Gegensatz zu polaren und wassermischbaren eine geringere
Wasseraufnahmekapazität und sind daher in einem geringeren Maße dazu in der Lage,
oberflächengebundenes Wasser abzustreifen [2]. Deswegen können in diesen Lösungs-
mitteln generell höhere Enzymstabilitäten beobachtet werden [139, 146]. Da diese
Wassermoleküle essentiell für die Aktivität und die strukturelle Integrität der Enzyme sind,
sind die zum Teil drastischen Änderungen der Halbwertszeit nicht verwunderlich. Hinzu
kommt, dass bei den hier untersuchten polaren Lösungsmitteln möglicherweise auch noch
direkte Wechselwirkungen des jeweiligen Lösungsmittels mit der Lipase TL auftreten [138].
Dabei kann es zu Störungen der ionischen Interaktionen und unter Umständen sogar zu
einem Aufbrechen dieser kommen, was bis hin zu einer teilweisen Entfaltung der
molekularen Struktur führen kann [6].
Ergebnisse und Diskussion
83
Abbildung 24: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit vom Lösungsmittel bei RT
Analog zu Kapitel 3.3.1.2 muss hier jedoch ebenso kritisch bemerkt werden, dass keine
Daten über den tatsächlichen Wassergehalt der Lösungsmittel erhoben wurden und daher
auch keine belastbaren Aussagen über die tatsächlichen Wasseraktivitäten getroffen werden
können. Ob und in welchem Maße die Wasseraktivität einen Einfluss auf die Lagerstabilität
der Acc-LipTL in den verschiedenen Lösungsmitteln hat, konnte demnach nicht beurteilt
werden. Da jedoch, wie bereits zuvor festgestellt, die Trocknung der Lösungsmittel nach
dem hier durchgeführten Verfahren sehr einfach ist, sind die Ergebnisse hier als dienlich für
eine gezielte Optimierung des KR-System zu erachten. Für den weiteren Verlauf wurden
aufgrund der zuvor ermittelten hohen spezifischen Aktivität Toluol und 2-MeTHF zusammen
mit THF als Standard hinsichtlich der temperaturabhängigen Lagerstabilität untersucht.
3.3.2.3 Temperatur
Die Temperatur ist üblicherweise der Parameter mit dem stärksten Einfluss auf die Stabilität
von Enzymen [2]. Eine Erhöhung der Temperatur führt zwar zu einem Anstieg der Reaktions-
geschwindigkeit enzymatischer Reaktionen, jedoch steigert sich auch die strukturelle
Flexibilität des Enzyms. Dies hat bei zu hohen Temperaturen bzw. bei zu langen Inkubations-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Halbwertszeit [h]
Ergebnisse und Diskussion
84
zeiträumen eine Entfaltung der dreidimensionalen Struktur des Enzyms zur Folge und äußert
sich in einer Reduktion der spezifischen Aktivität. Da bereits bei der Untersuchung der
aktivitätsbezogenen Temperaturabhängigkeit ein deaktivierender Einfluss vermutet wurde,
sollte nun auch die Lagerstabilität bei erhöhten Temperaturen untersucht werden. Es
wurden zunächst die Lagerstabilitäten im THF-Standardsystem bei schrittweise um 10 °C
erhöhten Reaktionstemperaturen aufgenommen, wobei erneut 60 °C das Maximum
darstellte. Aus Abbildung 25 lässt sich eindeutig schlussfolgern, dass Acc-LipTL stark
temperatursensitiv ist. Die Halbwertszeit verringert sich von 12,7 h bei Raumtemperatur auf
lediglich 3,2 h bei 50 °C und sogar nur 2,4 h bei 60 °C. Dies bestätigt die in Kapitel 3.3.1.3
aufgestellte Vermutung, sowie die in den Arbeiten von Hoyos et al. erwähnte Inaktivierung
in Folge erhöhter Temperaturen [70, 89].
Abbildung 25: Lagerstabilität von Acc-LipTL in Abhängigkeit der Temperatur in THF
Hoyos et al. beschrieben eine Stabilisierung der in Silikon eingehüllten Lipase TL gegenüber
der nativen Formulierung [89]. Um einen möglicherweise ebenso stabilisierenden Einfluss
der adsorptiven Trägerbindung auf die Lipase TL nachzuweisen, wurden in Abbildung 26 die
Verläufe der Restaktivitäten der Acc-LipTL und der nativen Lipase TL bei 50 °C in THF
gegenüber gestellt. Die Abnahme der spezifischen Aktivität, hier als jeweilig prozentuale
Restaktivität angegeben, verläuft unabhängig von der Einsatzform der Lipase TL gleich.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 10 20 30 40 50 60 70
Halbwertszeit [h]
Temperatur [°C]
Ergebnisse und Diskussion
85
Damit konnte keine Stabilisierung der Lipase TL nach einer Bindung an Accurel MP1001
nachgewiesen werden.
Abbildung 26: Prozentuale Restaktivitäten der nativen Lipase TL und der Acc-LipTL in Abhängigkeit der
Inkubationsdauer in THF bei 50 °C
In den vorangegangenen Kapiteln wurden 2-MeTHF und Toluol aufgrund der hohen
spezifischen Aktivität und der im Vergleich zu THF erhöhten Lagerstabilität als alternative
Lösungsmittel für die KR bzw. DKR von Benzoin identifiziert. Folgend wurde auch bei diesen
Lösungsmitteln der isolierte Einfluss einer erhöhten Temperatur untersucht. Tabelle 14 fasst
die Halbwertszeiten in Toluol, 2-MeTHF und THF bei 50 °C im Vergleich zu den
Halbwertszeiten bei Raumtemperatur zusammen.
Tabelle 14: Lagerstabilität von Acc-LipTL in verschiedenen Lösungsmitteln bei RT und 50 °C
Lösungsmittel
21,5 °C
50 °C
HWZ [h]
HWZ [%THF]
HWZ [h]
HWZ [%THF]
THF
12,7
100
3,2
100
2-MeTHF
33
260
8,4
262
Toluol
99,5
752
62
1937
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4 5 6
prozentuale Restaktivität [%]
Zeit [h]
Acc-LipTL in THF
LipTL in THF
Ergebnisse und Diskussion
86
Die Halbwertszeiten für 2-MeTHF und Toluol sind mit 8,4 h und 62 h bei 50 °C stark
verringert. Die Betrachtung der prozentualen Halbwertszeiten, die jeweils auf THF bezogen
wurden, macht eine außerordentlich hohe Thermostabilität der Acc-LipTL in Toluol
gegenüber dem Standardsystem in THF deutlich. Wohingegen 2-MeTHF die gleiche relative
Stabilität gegenüber THF aufzeigt, ist in Toluol eine um den Faktor 19 höhere Halbwertzeit zu
verzeichnen. Diese ist um nochmals mehr als Faktor zwei größer als die erhöhte Stabilität bei
Raumtemperatur im direkten Vergleich von THF und Toluol. Dies könnte erklären, warum es
in Toluol möglich ist die Reaktionstemperatur bis auf über 90 °C zu erhöhen, bevor der
inaktivierende Einfluss größer wird als die Steigerung der Reaktionsgeschwindigkeit der
Acc-LipTL. Eine hinreichende Begründung für das unterschiedliche Verhalten der
unterschiedlichen Lösungsmittel konnte anhand dieser Daten jedoch nicht gefunden
werden.
3.3.3 Prozessstabilität
Als Prozessstabilität wird im Allgemeinen die Langzeitstabilität von Biokatalysatoren unter
realen Reaktionsbedingungen verstanden [21]. Im Gegensatz zur Bestimmung der Lager-
stabilität spielen hierbei Parameter wie mechanische Kräfte durch Rührer, Konzentrations-
änderungen der Substrate und Produkte, Einflüsse durch eine Vor- und Nachbereitung der
Katalysatoren und vor allem auch die fortwährenden Konformationsänderungen in Folge der
katalytischen Wirkung der Enzyme eine Rolle. Für die Durchführung der KR von Benzoin in
industriellem Maßstab ist sowohl der Einsatz der Acc-LipTL in wiederholten Batch-Versuchen
als auch ein kontinuierlicher Prozess denkbar. Daher wurden im Rahmen dieser Arbeit beide
Systeme zur Bestimmung der Prozessstabilität angewandt, um jeweils möglichst reale
Bedingungen zu simulieren. Beiden Methoden liegt die Annahme zu Grunde, dass analog zur
Bestimmung der Lagerstabilitäts-Halbwertszeit die Deaktivierung der Enzyme nach Gesetz
erster-Ordnung abläuft und aus den ermittelten Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten oder
analog dazu den Umsätzen eine Inaktivierungskonstante kI abgeleitet werden kann, aus der
wiederum die Halbwertszeit bestimmt wird (Gleichung 2).
Ergebnisse und Diskussion
87
3.3.3.1 Wiederholte Batch-Versuche
Zur Bestimmung der Prozessstabilität in wiederholten Batch-Versuchen wurden die
Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten der einzelnen Reaktionszyklen ermittelt und zur
Berechnung der Inaktivierungskonstanten verwendet. Um zusätzlich einen möglichen
stabilisierenden Einfluss einer Silikonbeschichtung auf die Acc-LipTL zu untersuchen, wurden
die in Kapitel 3.2.6 hergestellten silcoatAcc-LipTL mit 30, 50 und 70 % Silikonanteil ebenfalls
getestet. Im ersten Zyklus wurde die Zeit bestimmt, die nötig war, um einen maximalen
Umsatz von 50 % zu erreichen. Infolgedessen wurde der Zeitraum von 3 h als Reaktionszeit
für die weiteren Zyklen festgelegt.
Abbildung 27: Spez. Trägeraktivitäten der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL-Varianten in Abhängigkeit der
Zyklenzahl der wiederholten Batch-Versuche in THF bei RT
Entsprechend der Ergebnisse aus den Versuchen zur Lagerstabilität ist in Abbildung 27
deutlich zu erkennen, dass Acc-LipTL sowie alle der eingesetzten silcoatAcc-LipTL im Verlauf
der durchgeführten Zyklen deutlich an Aktivität verlieren. Da die Beschichtung der Acc-LipTL
mit Silikon auch bei einem steigenden Anteil an Silikon keinerlei stabilisierenden Einfluss auf
die Acc-LipTL aufweist, kann ein Leaching der Lipase TL in THF ausgeschlossen werden. Die
spezifische Aktivität der Immobilisate verringert sich pro Zyklus um etwa 30-35 % auf
lediglich ca. 25 % des Ausgangswertes nach dem fünften Ansatz. Der Umsatz ändert sich
0
5
10
15
20
25
30
0 1 2 3 4 5
spezifische Trägeraktivität [U/gTräger]
Zyklenzahl [-]
Acc-LipTL
silcoat Acc-LipTL (30%)
silcoat Acc-LipTL (50%)
silcoat Acc-LipTL (70%)
Ergebnisse und Diskussion
88
ebenfalls von initial 50 % auf ca. 26-28 % nach dem letzten Zyklus. Nach Bestimmung der
Inaktivierungskonstanten wurden Halbwertszeiten im Bereich von 5-6 h ermittelt
(Tabelle 15). Diese Halbwertszeiten liegen somit deutlich unter denen der Lagerstabilität in
THF. Es ist denkbar, dass die Konformationsänderungen während der Reaktion bestimmte
Areale oder Domänen der Lipase TL freilegen und diese dann mit THF interagieren können.
Eine Solvatisierung dieser Bereiche könnte eine Verringerung der Aktivität nach sich ziehen
und vor allem der Grund für die verringerte Prozessstabilität gegenüber der Lagerstabilität
sein.
Tabelle 15: Inaktivierungskonstanten und Lagerstabilitäten der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL-Varianten
nach wiederholten Batch-Versuchen
Ansatz
kI [*10-3]
HWZ [h]
Acc-LipTL
125,5
5,2
silcoatAcc-LipTL 30%
113,0
6,1
silcoatAcc-LipTL 50%
121,4
5,2
silcoatAcc-LipTL 70%
97,0
6,5
Zudem geht die Änderung des Umsatzes innerhalb eines Reaktionszyklus mit einer
Veränderung der Reaktionsbedingungen (Konzentration des Substrates und der Produkte)
für die untersuchten Immobilisate einher. Mit den Hinweisen auf einen Einfluss der
Substrate bzw. Produkte auf die Lagerstabilität, ist auch hier nicht auszuschließen, dass die
sich ändernde Konzentration einen Effekt auf die Prozessstabilität hat. Ein weiterer
möglicher Grund für die verringerte Stabilität im Prozess könnte die Handhabung der
Immobilisate während der Durchführung der Zyklen sein. Die Acc-LipTL wurden nach jedem
Zyklus einer Wäsche mit THF unterzogen, um kein anhaftendes Substrat und Produkt in den
nächsten Zyklus zu verschleppen. Obwohl versucht wurde eine Trocknung der Acc-LipTL
während dieser Wäschen zu vermeiden, ist nicht auszuschließen, dass die Immobilisate
aufgrund der leichten Flüchtigkeit des THFs getrocknet wurden. Relevanz bekommt dieser
Sachverhalt dadurch, dass im Rahmen der Immobilisierung Vorexperimente durchgeführt
wurden, um die Trocknungszeit durch eine Extraktion des Wassers aus den feuchten
Ergebnisse und Diskussion
89
Immobilisaten mit einem wassermischbaren und sehr volatilen Lösungsmittel wie THF zu
beschleunigen. Dabei wurde festgestellt, dass eine derartige Behandlung zu einer starken
Inaktivierung der Acc-LipTL führt (Daten nicht gezeigt). Daher ist nicht auszuschließen, dass
die Immobilisate infolge der Wäschen an Aktivität verloren haben.
3.3.3.2 Kontinuierlicher Prozess
Hauptvorteil der Verwendung von kontinuierlichen Reaktionssystemen zur Messung der
Prozessstabilität ist die Möglichkeit konstante Reaktionsbedingungen zu schaffen und stabil
zu halten [2]. Je nach Präparation des zu untersuchenden Enzyms sind verschiedene Reaktor-
typen geeignet. Für immobilisierte Enzyme werden oft Festbettreaktoren aufgrund der
geringen mechanischen Beanspruchung verwendet, wohingegen für lösliche Biokataly-
satoren eher kontinuierliche Rührkesselreaktoren (CSTR – continuous stirred-tank reactor)
mit einer Membran zur Rückhaltung der gelösten Enzyme zweckentsprechend sind [2].
Abbildung 28: Foto des kontinuierlichen Reaktors und schematischer Aufbau
In der hier durchgeführten Arbeit wurde für die Charakterisierung der Acc-LipTL dessen
ungeachtet ein Reaktor verwendet, der bezüglich des Aufbaus dem eines CSTR entspricht.
Ergebnisse und Diskussion
90
Dadurch war es möglich, auch den Einfluss der mechanischen Beanspruchung infolge der
Durchmischung auf die Prozessstabilität zu untersuchen. Zum Rückhalt der Immobilisate
wurde ein Edelstahlfilter vor dem Auslass des Reaktors mit Maschenweiten von 50 µm
verwendet. Abbildung 28 zeigt ein Foto sowie den schematischen Aufbau des Reaktors.
Zur Festlegung der grundlegenden Parameter des CSTR’s wurden Vorüberlegungen und
Vorexperimente durchgeführt und die Einflüsse der jeweiligen Parameter auf die
Halbwertszeit der Acc-LipTL untersucht. Zu den direkt einstellbaren Größen zählen die
Konzentrationen der Edukte sowie die Durchflussrate der Eduktlösung. Bei der Bestimmung
einer geeigneten Durchflussrate wurde besonderer Wert auf einen sich nicht zu stark
ändernden Umsatz gelegt, um die bereits im vorherigen Kapitel besprochenen Nachteile zu
minimieren. Daher wurde zum Betrieb des CSTR eine differentielle Arbeitsweise angewandt.
Ein differentielles Arbeiten bedeutet, dass für den Umsatz ein maximaler Wert von 5-10 %
festgelegt wird. Dies ermöglicht einen minimalen Einfluss der Konzentrationsänderungen der
Edukte und Produkte über der Zeit, weswegen die potentiellen Auswirkungen auf die
Prozessstabilität vernachlässigbar werden. Durch die Edukt- und Produktkonzentrationen,
welche folglich in kleinen Grenzen als konstant anzusehen sind, wurde angenommen, dass
das System in der Lage ist auch Immobilisate mit unterschiedlichen spezifischen Aktivitäten
(z.B. infolge von Modifikationen) hinsichtlich ihrer Prozessstabilität vergleichen zu können.
Der im Betrieb des Reaktor zu erreichende Umsatz wird bei volumenbeständigen Reaktionen
durch das Verhältnis von hydrodynamischer Verweilzeit zu der auf die Eingangsbedingungen
bezogenen Zeitkonstanten der Reaktion bestimmt. Dieser Zusammenhang entspricht der
ersten Damköhlerschen Zahl (DaI), die für eine irreversible Reaktion n-ter Ordnung folgend
definiert ist [147]:
(Gleichung 3)
k= Geschwindigkeitskonstante [min-1]
c0 = Anfangskonzentration
τ = Verweilzeit
X = Umsatz
Ergebnisse und Diskussion
91
Zur Ermittlung der einzustellenden Durchflussrate, muss zunächst die Verweilzeit bestimmt
werden, bei der der Umsatz im Bereich einer differentiellen Arbeitsweise liegt. Der
Zusammenhang zwischen Durchflussrate und Verweilzeit kann über das Reaktorvolumen
laut Gleichung 4 hergestellt werden:
(Gleichung 4)
V
= Durchflussrate [mL/min]
V = Volumen des Reaktors [mL] = 6 mL
Die Verweilzeit entspricht der Zeit, welche sich ein definiertes Volumen (Reaktorvolumen) in
einem kontinuierlich durchströmten Reaktor bzw. der gesamten Anlage befindet. Die
Berechnung der Verweilzeit lässt sich unter der Annahme einer ablaufenden Reaktion erster
Ordnung durchführen, indem der Quotient der Damköhlerzahl und der Geschwindigkeits-
konstante der Umesterungsreaktion von Benzoin gebildet wird (Gleichung 5).
(Gleichung 5)
Zur Berechnung der Geschwindigkeitskonstante k, kann in volumenbeständigen und
irreversiblen Reaktion die gemessene Reaktionsgeschwindigkeit r des verwendeten
Immobilisats der Stoffmengenänderungsgeschwindigkeit -R des Edukts gleichgesetzt
werden, so dass mit -R=r folgender Zusammenhang gilt:
(Gleichung 6)
Aufgrund der Zugabe des Vinylbutyrats im Überschuss wurde eine Reaktion erster Ordnung
angenommen. Unter Zuhilfenahme der Gleichungen 3-6 konnte nun bei einem maximalen
Umsatz von X = 0,1, einem Reaktorvolumen von 6 mL, einer Benzoinstartkonzentration von
94 mM sowie einer Anfangsreaktionsgeschwindigkeit der eingesetzten 100 mg Acc-LipTL von
2,17 mmol/L*min eine Durchflussrate von 1,25 mL/min und damit eine Verweilzeit von
Ergebnisse und Diskussion
92
4,8 Minuten bestimmt werden. Als Daumenregel für die Einstellung eines Gleichgewichts in
einem kontinuierlichen System wird das Fünffache der Verweilzeit angenommen [147].
Daher gilt: Je kleiner die Verweilzeit, desto schneller stellt sich das System auf äußere
Veränderungen, z.B. der Inaktivierung der Immobilisate, ein. Abbildung 29 zeigt beispielhaft
den Verlauf des Umsatzes eines kontinuierlichen Prozesses mit Acc-LipTL.
Abbildung 29: Umsatzveränderung der KR im kontinuierlichen Reaktor (Durchflussrate = 1,25 mL/min;
94 mM Benzoin)
Bereits nach nur 10 - 15 min, also sogar weniger als dem Fünffachen der Verweilzeit, stellte
sich ein stabiler Umsatz, also ein steady-state-Zustand ein. Da der Umsatz nur bei 2,3 % und
damit unter den erwarteten 10 % lag, ist davon auszugehen, dass es sich bei der Reaktion
nicht um eine Reaktion erster Ordnung handelt. Möglicherweise ist der Überschuss des
Acyldonors zu gering, was diese Abweichung erklären könnte. Da die Annahme der
Reaktionsordnung vornehmlich dazu diente, einen Eindruck über die Größenordnung der
Verweilzeit und der Durchflussrate zu erhalten, wurde trotzdem daran festgehalten. Die
Grundlage zur Charakterisierung der Acc-LipTL im kontinuierlichen System war mit dem
Erreichen eines Gleichgewichtzustandes und eines niedrigen Umsatzes erreicht. Nach
ca. 25 Minuten konnte deutlich die Inaktivierung der Immobilisate durch eine Abnahme des
Umsatzes beobachtet werden. Da hier die Bestimmung der Anfangsreaktionsgeschwindigkeit
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120
Umsatz [%]
Zeit [min]
Ergebnisse und Diskussion
93
nicht möglich ist, kann aus der Veränderung des Umsatzes über die Zeit die Inaktivierungs-
konstante und damit wiederum die Halbwertszeit des betrachteten Immobilisates errechnet
werden [2]. Die mehrfach durchgeführten Messungen in THF ergaben eine Halbwertszeit der
Acc-LipTL von 2,2 h.
Da eine Durchflussrate von 1,25 mL/min einen Umsatz weit unter 10 % ergab und dabei der
Verbrauch an Lösungsmittel sowie der eingesetzten Edukte sehr hoch war, wurde der
Einfluss einer geringeren Durchflussrate auf die Halbwertszeit der Acc-LipTL untersucht. Im
Folgenden wurden daher 1 mL/min und 0,5 mL/min getestet. In Abbildung 30 ist zu
erkennen, dass eine Verringerung der Durchflussrate keinen signifikanten Einfluss auf die
Halbwertszeit hat. Da der Umsatz auch bei 0,5 mL/min unter 10 % lag, wurde die
Durchflussrate dementsprechend in den folgenden Experimenten verringert.
Abbildung 30: Prozessstabilität von Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit der Durchflussrate
Um den Einfluss der Benzoinstartkonzentration auf die Stabilität der Acc-LipTL auch in
diesem System zu untersuchen, wurde die Konzentration auf 23,5 bzw. 47 mM verringert
und die Halbwertszeiten bestimmt. Die Hinweise darauf, dass Benzoin generell stabilisierend
wirkt (siehe Kapitel 3.3.2.1), werden anhand der erhaltenen Daten gestützt. Die
Halbwertszeit sinkt bei 23,5 mM Benzoin in THF auf 0,9 h und bei 47 mM auf 2 h ab
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,5
1
1,25
Halbwertszeit [h]
Durchflussrate [mL/min]
Ergebnisse und Diskussion
94
(Abbildung 31). Eine mögliche Begründung dafür ist, wie bereits zuvor diskutiert wurde, eine
Stabilisierung der dreidimensionalen Struktur durch das Binden des Substrates im aktiven
Zentrum, was bei höherer Konzentration wahrscheinlicher ist. Auch die Bildung einer
stabilisierenden Mikroumgebung durch direkte Wechselwirkungen der funktionellen
Gruppen des Benzoin mit Aminosäureseitenketten wäre denkbar.
Abbildung 31: Prozessstabilität der Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit der Benzoin-
konzentration
Die zuvor ermittelten Halbwertszeiten der wiederholten Batch-Versuche von 5-6 h stehen im
deutlichen Widerspruch zu einer vierfachen Wiederverwendung der Lipase TL in jeweils 20 h
Zyklen in der Studie von Hoyos et al. [89]. Da bei der Herstellung der statischen
Suspensionen das Lipase TL-Pulver unverändert eingesetzt und dementsprechend auch
vollständig immobilisiert wurde, wäre denkbar, dass die scheinbar hohe Stabilität der
Immobilisate aufgrund der Zuschlagstoffe des Pulvers auftrat. Laut Hersteller bestanden
diese vor allem aus Kohlenhydraten, Asche und Lipiden. Vor der Immobilisierung der
Lipase TL auf Accurel wurden unlösliche Bestandteile aus der Enzymlösung abzentrifugiert,
wobei es sich um einen Teil der Zuschlagstoffe gehandelt haben könnte. Zudem wird
angenommen, dass es zu einer selektiven Bindung und somit zu einer Aufreinigung der
Lipase TL auf Accurel kommt. Daher wäre denkbar, dass die fehlenden Zuschlagstoffe ihre
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
23,5
47
94
Halbwertszeit [h]
Benzoinkonzentration [mM]
Ergebnisse und Diskussion
95
potentiell stabilisierende Wirkung nicht entfalten können und daher die Prozessstabilität der
Acc-LipTL geringer ist als die des nativen Lipase TL-Pulvers oder der statischen Suspensionen.
Um einen gültigen Vergleich der unterschiedlichen Immobilisate zu ermöglichen, bei dem
keine Unterschiede in der Handhabung während der Wäschen das Ergebnis möglicherweise
verfälschen, wurden die statischen Suspensionen im kontinuierlichen Prozess untersucht. Es
konnte dabei eine Halbwertszeit von 2,9 ± 0,3 h ermittelt werden, die, hinsichtlich der
langen publizierten Laufzeiten, nur unwesentlich höher ist als die der Acc-LipTL. Auf Basis
dieser Ergebnisse konnte zwar immer noch keine ausreichende Erklärung für die langen
Laufzeiten der Immobilisate von Hoyos et al. [89] gefunden werden, jedoch kann eine
signifikant verringerte Stabilität infolge der Immobilisierung auf Accurel sicher
ausgeschlossen werden.
Um abschließend einen Eindruck von der mechanischen Beanspruchung der Immobilisate
während des kontinuierlichen Prozesses zu bekommen, wurden REM-Aufnahmen der
eingesetzten Partikel angefertigt. In Abbildung 32 werden Nahaufnahmen der äußeren
Porenstrukturen der Acc-LipTL vor (A) und nach (B) einem Einsatz im kontinuierlichen
Prozess verglichen.
Abbildung 32: REM-Aufnahmen der Acc-LipTL vor (A) und nach (B) einem kontinuierlichen Prozess
Es ist deutlich zu erkennen, dass die Träger nach der Verwendung im kontinuierlichen
System deutliche Abriebspuren aufweisen. Hierbei ist denkbar, dass die gebundene Lipase TL
Ergebnisse und Diskussion
96
aufgrund der mechanischen Einwirkungen direkt Schaden nimmt oder eine Verringerung der
Aktivität durch den Verlust „abgeriebener“ Lipase TL auftritt. In Kapitel 3.3.4 wurde die
mechanische Stabilität der Acc-LipTL sowie der silcoatAcc-LipTL näher betrachtet.
3.3.3.3 Prozessstabilität im kontinuierlichem Prozess in verschiedenen Lösungs-
mitteln
Zur Ermittlung der kontinuierlichen Prozessstabilität wurden Lösungsmittel untersucht, die
zum Teil sehr vielversprechende Lagerstabilitäten aufwiesen. Es wurden neben den bereits
zuvor favorisierten Lösungsmitteln 2-MeTHF, Toluol und THF als Standard auch noch MIBK
und 1,4-Dioxan untersucht. Alle Experimente wurden bei Raumtemperatur durchgeführt.
Um eine Löslichkeit des Substrates in allen Lösungsmitteln zu gewährleisten, wurde die
Benzoinkonzentration auf 47 mM reduziert. In Abbildung 33 sind die ermittelten Halbwerts-
zeiten zusammengefasst und erweisen sich in zweierlei Hinsicht als sehr interessant.
Abbildung 33: Prozessstabilität der Acc-LipTL im kontinuierlichen Reaktor in Abhängigkeit unterschiedlicher
Lösungsmittel
Zunächst führt sich der Trend fort, dass die ermittelten Lagerstabilitätshalbwertszeiten um
ein Vielfaches höher sind, als die Halbwertszeiten im kontinuierlichen Reaktor. Besonders
deutlich wird das bei Verwendung von Toluol und MIBK. Wohingegen die Halbwertszeit bei
0
1
2
3
4
5
6
THF
2-MeTHF
Toluol
1,4-Dioxan
MIBK
Halbwertszeit [h]
Ergebnisse und Diskussion
97
einer Lagerung in diesen Lösungsmitteln bei über 90 h lag, so sind es im kontinuierlichem
Betrieb lediglich ca. 3 h.
Dies verdeutlicht auch den zweiten interessanten Aspekt dieser Ergebnisse, die
Neubewertung der stabilisierenden Wirkung der Lösungsmittel. Die relative Erhöhung der
Stabilität bei der alternativen Verwendung von 2-MeTHF und 1,4-Dioxan anstelle des THFs
ist vergleichbar mit den Werten der Lagerstabilität. Dahingegen weisen Toluol und MIBK
eine nur geringfügig verbesserte Prozessstabilität im Vergleich zum Standard auf. Ein
inaktivierender Effekt des Toluol bzw. MIBK auf die Lipase TL, der nur während der
stattfindenden Reaktion auftritt, ist nicht auszuschließen. Es handelt sich bei Lösungsmittel
bedingten Inaktivierungen zumeist um eine Freilegung von beispielsweise hydrophoben
Domänen der Enzyme infolge der Konformationsänderungen während der Reaktion. Ebenso
hydrophobe Lösungsmittelmoleküle können während einer Reaktion an diese Bereiche
binden und somit die Entfaltung des Enzyms fördern [5]. Die wesentlich höhere
Lagerstabilität im Fall des Toluol und des MIBK könnte demnach mit der Unzugänglichkeit
eben dieser hydrophoben Domänen des Enzyms bei einer Lagerung zu erklären sein.
Der Umstand, dass das Vorratsgefäß, welches die im jeweiligen Lösungsmittel gelösten
Substrate enthielt, nicht vor der Umgebungsfeuchtigkeit geschützt wurde, lässt einen
weiteren Erklärungsansatz zu. Wie bereits in vorherigen Kapiteln ausführlich diskutiert
wurde, ist nur eine kleine Wassermenge notwendig, um die Wasseraktivität in unpolaren
Lösungsmitteln zu erhöhen. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass Umgebungsluft,
welche durch die Vorratsflaschenbelüftung in Kontakt mit dem Lösungsmittel kam, eine
Veränderung der Wasseraktivität herbeigeführt hat. Dies würde erklären, warum die
Relation der Stabilisierung in 2-MeTHF gegenüber THF bei der Lagerstabilität und der
Prozessstabilität ähnlich ist und bei Toluol und MIBK signifikant niedriger. Durch die
wesentlich höhere Aufnahmekapazität von 2-MeTHF für Wasser, hat eine geringe
Wassermenge einen unwesentlichen Einfluss auf die Wasseraktivität. Anders verhält sich das
bei hydrophoben Lösungsmitteln, die aufgrund der niedrigen Wasseraufnahmekapazität
sensitiver auf kleinste Veränderungen des Wassergehaltes reagieren. Bezogen auf die
Halbwertszeiten von Toluol und MIBK würde dies bedeutet, dass neben der Abnahme des
Umsatzes bedingt durch eine Inaktivierung des Enzyms auch eine Verringerung der Aktivität
Ergebnisse und Diskussion
98
infolge der mit der Dauer der Reaktion steigenden Wasseraktivität einen signifikanten
Einfluss auf den Umsatz gehabt haben könnte.
Abschließend ist 2-MeTHF auf Grundlage der verschiedenen Experimente zur Aktivität und
Stabilität der Lipase TL als geeignetste Lösungsmittelalternative anzusehen.
3.3.4 Mechanische Stabilität
Eine unzureichende mechanische Stabilität von porösen Immobilisatpartikeln ist oftmals
limitierend für einen großtechnischen Einsatz bei der Verwendung von Reaktoren mit
Rührwerkselementen [127]. Die bei der Durchmischung viskoser Medien auftretenden
Scherkräfte infolge hoher Leistungseinträge führen mitunter sehr schnell zu einem Verlust
der strukturellen Integrität der Immobilisate. Aber auch bei einem Einsatz der Enzym-
beladenen Trägermaterialien in organischen Lösungsmitteln, 2- oder Mehrphasensystemen
stellt die mechanische Stabilität bei langer Prozesszeit ein wichtiges Kriterium für eine
technische Umsetzung vieler Synthesen dar. Typischerweise führt eine Verringerung der
durchschnittlichen Korngröße zu verstopften Filterelementen im Abtrennschritt der
Biokatalysatoren. Des Weiteren ist ein Verlust zermahlener jedoch aktiver Immobilisate oder
sogar die direkte Schädigung der Enzyme möglich. In einer vorangegangenen Studie konnte
eine massive Erhöhung der mechanischen Stabilität durch die Verwendung von Silikon als
kompositbildende Matrix nachgewiesen werden [25, 103, 127]. Bezugnehmend auf den
Stabilitätstest von Wiemann et al. [25] wurden Acc-LipTL sowie silcoatAcc-LipTL mit einem
Silikongehalt von 70 % in einer Schwingmühle mit Glasperlen mechanisch behandelt. Die
Partikel wurden mittels REM-Aufnahmen qualitativ charakterisiert. Abbildung 34 zeigt REM-
Aufnahmen der Acc-LipTL und silcoatAcc-LipTL im unbehandelten Zustand (vorher) und nach
der mechanischen Behandlung (nachher). Aufgrund der Abbildung aller Partikel im gleichen
Größenmaßstab, wird die Verkleinerung der Partikeldurchmesser im Fall der Acc-LipTL nach
der mechanischen Belastung besonders deutlich. Die mit Silikon behandelten Partikel
behalten ihre Größe und Integrität bei, was die bereits beschriebene stabilisierende Wirkung
des Silikons auch bei einer Anwendung auf Accurel MP1001 bestätigt. Die Kombination aus
der Fähigkeit die mechanischen Stabilität zu erhöhen und dem Fakt, dass die Acc-LipTL
Ergebnisse und Diskussion
99
keinerlei Aktivität durch eine Behandlung mit dem chemisch inerten Silikon verlieren (siehe
Kapitel 3.2.6), macht einen Einsatz der silcoatAcc-LipTL in großtechnischen Synthesen
besonders interessant.
Abbildung 34: REM-Aufnahmen der Acc-LipTL und der silcoatAcc-LipTL mit 70 % Silikon vor und nach einer
mechanischen Behandlung in der Kugelmühle
3.3.5 Zusammenfassung und Fazit der Charakterisierung
Die Untersuchungen bezüglich des Einflusses der Wasseraktivität haben ergeben, dass je
trockener das Reaktionssystem ist, desto höher ist die spezifische Trägeraktivität der
Acc-LipTL. Des Weiteren ist die spezifische Aktivität stark vom Lösungsmittel abhängig, in
welchem die KR durchgeführt wird. 2-MeTHF und Toluol sind alternative Lösungsmittel, die
eine erhöhte Aktivität der Acc-LipTL bewirken. Eine steigende Temperatur bewirkt einen
starken Aktivitätsanstieg, der im Fall des Toluols bis ca. 100 °C anhält. Im Fall des THF und
des 2-MeTHF sind maximal 50 °C bzw. 60 °C möglich. Die Erhöhung der Temperatur hat
gleichzeitig eine Verringerung der Stabilität zur Folge, was in einem abgeflachten Aktivitäts-
anstieg bei Steigerung der Temperatur und durch eine abnehmende Lagerstabilität
nachgewiesen werden konnte. Die Anwesenheit einzelner Substrate und Produkte hat
Ergebnisse und Diskussion
100
keinen negativen Einfluss auf die Stabilität. Während der Bestimmung der Prozessstabilität
konnte eine stabilisierende Wirkung bei höheren Benzoinkonzentrationen festgestellt
werden. Die Acc-LipTL weisen Halbwertszeiten von 5-6 h im Batch-System und 2,2 h im
kontinuierlichen Reaktor auf (THF). Des Weiteren wurde 2-MeTHF während der
kontinuierlichen Messungen als das Lösungsmittel identifiziert, welches die höchste
Stabilität im Prozess ermöglicht. Toluol und MIBK bewirken zwar die höchsten
Lagerstabilitäten mit >90 h, jedoch ist Acc-LipTL in diesen Lösungsmitteln im
kontinuierlichem Betrieb nur geringfügig stabiler als in THF. Die statischen Suspensionen
nach Protokoll von Hoyos et al. [79] weisen mit 2,9 h eine annähernd gleiche Stabilität wie
die Acc-LipTL im kontinuierlichen Prozess auf. Die mechanische Stabilität der Acc-LipTL kann
nach einer Behandlung mit Silikon drastisch erhöht werden.
Zunächst kann festgestellt werden, dass mit Hilfe der Lagerstabilität sehr gut die isolierten
Einflüsse der Temperatur und der Substrate sichtbar gemacht werden können. Dennoch
lassen nur Messungen der Prozessstabilität Rückschlüsse auf ein Verhalten der Immobilisate
unter realen Bedingungen zu. Voraussetzung dafür ist jedoch, dass das Messsystem sehr
genau definiert und charakterisiert ist, um äußere Einflüsse auf die ermittelten
Halbwertszeiten zu minimieren. Nur so können verlässliche Aussagen über eine
Katalysatorstandzeit unter Prozessbedingungen getroffen und zur Auslegung von
technischen Synthesen genutzt werden.
Aus der Gesamtheit der Charakterisierungsergebnisse lassen sich folgende Schluss-
folgerungen formulieren:
» Eine erhöhte Temperatur und der Einfluss des THF können als die Parameter
identifiziert werden, die eine starke Inaktivierung der Acc-LipTL verursachen.
Insbesondere der durch das Lösungsmittel forcierte Verlust des Oberflächenwassers
wird als der gravierendste Inaktivierungsgrund vermutet.
» Der Wechsel des Lösungsmittels kann die Thermostabilität erhöhen (Toluol) bzw.
eine höhere Prozessstabilität ermöglichen (2-MeTHF)
Ergebnisse und Diskussion
101
» Hohe Substratkonzentrationen wurden zwar als stabilisierender Parameter gefunden,
aber hier nicht weiter betrachtet. In dieser Arbeit werden alle DKR-Untersuchungen
nur als Batch-Versuche durchgeführt. Das bedeutet in erster Linie, dass sich dabei die
Substratkonzentration über den gesamten Prozess zwangsläufig verringert. Dieser
Zusammenhang ist jedoch für spätere Umsetzungen der DKR im kontinuierlichen
Betrieb interessant und sollten dort in die Auslegung mit einfließen.
» Die Möglichkeit der Temperaturerhöhung auf 50-60 °C ist sehr aussichtsreich für eine
spätere Kombination der Acc-LipTL mit gängigen Racemisierungskatalysatoren, da
diese oftmals nur bei erhöhten Reaktionstemperaturen arbeiten.
» Das Favorisieren trockener Reaktionsbedingungen sollte für alle bekannten
Racemisierungskatalysatoren von Vorteil sein, was positiv im Hinblick auf eine
„One-pot“-Lösung der DKR zu bewerten ist.
» Der Einsatz der Acc-LipTL in wiederholten Batch-Versuchen brachte eine höhere
Halbwertszeit als in einem kontinuierlichen Reaktor hervor. Da das kontinuierliche
Messsystem zunächst als proof of principle etabliert wurde, ist die Bewertung der
absoluten Halbwertszeiten jedoch vermutlich nicht ausreichend belastbar.
» Um eine ausreichende Stabilität der Acc-LipTL für einen technischen Einsatz
sicherzustellen, müssen neben dem Wechsel des Lösungsmittels weitere Methoden
zur Stabilisierung angewandt werden.
Im weiteren Verlauf wurden das THF-Lagerstabilitätssystem und die Messung der
Prozessstabilität im kontinuierlichen Reaktor in THF als Standardsysteme angewandt, um die
modifizierten Acc-LipTL zu bewerten. Dies basiert darauf, dass der Einfluss des
Lösungsmittels als einer der stärksten inaktivierenden Parameter angesehen wird. THF soll
somit beispielhaft für die Gruppe der polaren und wassermischbaren Lösungsmittel stehen,
die eine Fähigkeit zur Dehydratisierung der Enzymoberfläche haben.
Ergebnisse und Diskussion
102
3.4 Stabilisierung der Acc-LipTL durch physikalische und chemische
Modifikation
Durch die große Vielfalt an potentiell einsetzbaren Reagenzien, sind einer gezielten
chemischen Modifikation einzelner Aminosäureseitenketten kaum Grenzen gesetzt, wie
bereits in Kapitel 1.3 umfassend vorgestellt wurde [30, 46, 47, 148]. Um zu evaluieren, ob die
Aktivitäts- bzw. Stabilitätseigenschaften der Lipase TL durch den Einsatz physikalischer und
chemischer Modifikationsmethoden verändert werden können, wurden im Folgenden
Protokolle einer Auswahl vielversprechender Modifikationen auf die Acc-LipTL angewendet.
In den Versuchen wurde die immobilisierte Form eingesetzt, weil die Lipase auf den Trägern
in der bereits optimalen Konformation gebunden ist und diese stabilisiert werden sollte. Zur
nachfolgenden Charakterisierung wurden die spezifischen Aktivitäten der behandelten
Acc-LipTL sowie die Lager- und Prozessstabilitäten in THF und bei Raumtemperatur ermittelt.
Zu den physikalischen Methoden zählt der Einsatz von Polyethylenimin (PEI) [93]. Dieses
Polymer bildet nicht kovalente Interaktionen mit der Enzymoberfläche aus und wurde bisher
als sehr geeignet für die Erhöhung der Stabilität beschrieben. Zur chemischen Modifikation
von freien Aminogruppen wurde sowohl eine Succinylierung mit Bernsteinsäureanhydrid
[94] als auch eine Acylierung mit aktivierten Methoxypolyethylenglykolketten (mPEG) [95]
durchgeführt. Im Fall der Acylierung wurden sowohl mPEG’s mit einem Molekulargewicht
von 2166 g/mol (mPEG2000) bzw. 5166 g/mol (mPEG5000) eingesetzt. Eine Anbindung von
Substituenten an Carboxygruppen wurde durch eine Amidierung mit zwei primären Aminen:
Hydroxyethylamin (HEA) [96] und Ethylendiamin (AEA) [96] realisiert. Ebenfalls zur
Modifikation primärer Aminogruppen dienten aktivierte, also mit Natriumperiodat geöffnete
Dextrane [97, 149]. Der Unterschied zur Succinylierung und zur Verwendung des mPEG lag
dabei in der wesentlich größeren Kettenlänge der Dextranpolymere und in der Möglichkeit
von intermolekularen Bindungen, durch die mehrfache Öffnung der Polymere. Es wurden
Moleküle verschiedener Molmassen im Bereich von 10 - 100 kDa verwendet und dabei der
Grad der Polymeröffnung variiert.
Ergebnisse und Diskussion
103
3.4.1 Aktivität und Lagerstabilität nach Modifikation von Acc-LipTL
Spezifische Aktivität
Die spezifische Aktivität der modifizierten Immobilisate ist mit Ausnahme der Verwendung
des mPEG2000 in jedem Fall niedriger als die Ausgangsaktivität der unbehandelten Acc-LipTL
(Abbildung 35 und Abbildung 36). Insbesondere nach Modifikation der Carboxygruppen mit
HEA und AEA sowie nach einer Anbindung jeglicher Dextrane sind Aktivitätseinbußen von ca.
25 % (HEA und AEA) und maximal 75 % im Fall des Dextrans D10-10 festzustellen.
Dextranmoleküle mit größerer Kettenlänge (D40 und D100) wiesen generell höhere
Restaktivitäten von etwa 60 - 70 % auf. Bei D100 konnte mit rund 82 % die höchste Rest-
aktivität ermittelt werden, sofern die Polymerketten mit 10 Äquivalenten des Natrium-
periodat geöffnet wurden. Nach einer Behandlung der Acc-LipTL mit mPEG2000, mPEG5000,
BSSA und PEI sind nur geringfügige Veränderungen (± 10-12 %) der Aktivität nachweisbar.
Abbildung 35: Prozentuale Restaktivitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextran-Modifikation) in Bezug
auf natives Acc-LipTL in THF bei RT
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prozentuale Restaktivität [%]
Ergebnisse und Diskussion
104
Abbildung 36: Prozentuale Restaktivitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives Acc-LipTL
in THF bei RT
Hauptgrund für die Aktivitätsveränderungen infolge der Modifikationen könnte die Reaktion
der Reagenzien mit den Aminosäureseitenketten sein, die eine katalytische und weniger eine
strukturelle Funktion im Enzym haben. Leicht reaktive oder geladene Seitenketten sind unter
anderem in Enzymen dafür verantwortlich Substrate in das aktive Zentrum zu leiten, einen
Übergangszustand im katalytischen Prozess zu stabilisieren oder auch durch ionische
Wechselwirkungen bestimmte Enzymkonformationen zu ermöglichen. Sind diese Seiten-
ketten in ihrer Ladung verändert bzw. sind Substituenten daran kovalent gebunden, so ist
abhängig von der Struktur des Enzyms, dem verwendeten Substrat oder von der eigentlichen
Reaktion, ob eine der aufgezählten Funktionen besser oder schlechter abläuft. Die
vergleichsweise großen Aktivitätsverluste der mit HEA und AEA modifizierten Acc-LipTL
lassen sich somit möglicherweise auf eine Modifikation der in der katalytischen Triade
befindlichen Asparaginsäure zurückführen.
Sowohl bei chemischen Modifikationsreagenzien als auch bei physikalischen Modifikationen
ist aber neben der direkten Interaktion mit Aminosäureseitenketten ebenso die Größe und
jeweilige Struktur der Moleküle entscheidend für den Einfluss auf die spezifische Aktivität.
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prozentuale Restaktivität [%]
Ergebnisse und Diskussion
105
Cabrera et al. [96] fanden bei der Anwendung von PEI auf Novozym 435 einen Zusammen-
hang zwischen der Größe des verwendeten Polymers und der Restaktivität der Immobilisate.
Es konnte eine positive Auswirkung der Verwendung größerer Polymere, wie das auch hier
eingesetzte PEI mit Mw=750 kDa, auf die Aktivität festgestellt werden. Begründet wurde dies
mit der Fähigkeit großer Polymere die Enzymoberfläche weitläufig abzudecken und dabei
nicht in kleineren Taschen oder Poren sterische Hinderungen der reaktionsbedingten
Konformationsänderungen des Enzyms zu verursachen. Dieser Effekt kann ebenfalls bei
einem Einsatz der Dextranaldehyde beobachtet werden. Hier wurde die höchste
Restaktivität bei der Verwendung der Polymere mit einem Molekulargewicht von 100 kDa
beobachtet (Abbildung 36).
Lagerstabilität
Die Lagerstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL sind mit Ausnahme des PEI und des
Dextranaldehyds D100-20 deutlich niedriger als die des unbehandelten Acc-LipTL
(Abbildung 37 und Abbildung 38).
Abbildung 37: Prozentuale Lagerstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextrane) in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT
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prozentuale Halbwertszeit [%]
Ergebnisse und Diskussion
106
Abbildung 38: Prozentuale Lagerstabilitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT
Die mit PEI behandelten Immobilisate wiesen wie bei der Aktivität eine nur sehr geringe
Änderung im Vergleich zur nativen Variante auf, wohingegen das mit D100-20 modifizierte
Präparat sogar eine Steigerung der Lagerstabilität um ca. 36 % zeigte. Die Verwendung des
Polyethylenimins führte somit weder zu einer signifikanten Veränderung der Aktivität noch
der Stabilität, weswegen sich hier zwangsläufig die Frage stellt, ob tatsächlich eine
Modifikation der Acc-LipTL stattgefunden hat.
Die zuvor diskutierte Abdeckung der Enzymoberfläche mit langen Polymerketten kann mit
einer veränderten Mikroumgebung einhergehen, die beispielsweise das molekular
gebundene Wasser vor dem sogenannten „stripping“ durch polare Lösungsmittel schützt.
Dies sollte insbesondere bei mPEG der Fall sein, was im Rahmen einer Studie von Rodríguez-
Martínez et al. nachgewiesen wurde [48]. Trotz der Annahme, dass THF unter anderem
aufgrund des Wasserentzuges inaktivierend wirkt, konnte ein derartiger Zusammenhang hier
jedoch für mPEG nicht festgestellt werden.
Im Fall der Dextranaldehyde ist infolge der hohen Beladungsdichte der Acc-LipTL nicht
auszuschließen, dass es zur Bildung von intermolekularen Bindungen zwischen benachbarten
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prozentuale Halbwertszeit [%]
Ergebnisse und Diskussion
107
Enzymen kommt [150]. Dies und die ebenso bestehende Möglichkeit von intramolekularen
Bindungen mehrerer Lysinreste auf der Enzymoberfläche können dabei die Flexibilität und
somit die Aktivität beeinflussen, aber vor allem die Stabilität erhöhen [150]. Diese
Vermutung wird durch die Untersuchungen zur Aufklärung der Struktur der Lipase TL durch
Maraite et al. gestützt, die mehrere Lysine in der Sequenz der Lipase TL nachweisen konnten
[117]. Der Grad der Aktivierung, also die Menge der reaktiven Aldehydgruppen könnte in
diesem Zusammenhang eine entscheidende Rolle spielen. Die Bildung von inter- bzw.
intramolekularen Enzym-Dextran-Enzymbindungen oder Enzym-Dextranbindungen sind bei
einer großen Anzahl an Aldehydgruppen wahrscheinlicher. Je länger dabei das Polymer-
molekül ist, desto eher können auch weiter entfernte Aminogruppen erreicht werden. Dies
würde die Erhöhung der Lagerstabilität bei Verwendung des D100-20 erklären.
BSSA und mPEG hingegen sind monovalente Reagenzien und können zwar die
Mikroumgebung der Enzyme beeinflussen, jedoch keine Mehrfachbindungen zwischen
unterschiedlichen Aminofunktionen herstellen.
Im Folgenden wurden die Prozessstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL im kontinuierlichen
System in THF bestimmt, um festzustellen, ob sich die Hinweise der Lagerstabilität in einer
Stabilisierung der Acc-LipTL im Prozess bestätigen lassen.
3.4.2 Prozessstabilität der modifizierten Immobilisate im kontinuierlichen
Prozess
Es ist festzustellen, dass alle durchgeführten Modifikationen eine Stabilisierung der Acc-LipTL
im kontinuierlichen Prozess bewirken (Abbildung 39 und Abbildung 40). Die erhöhte
Prozessstabilität der PEI-Acc-LipTL (203 % bezogen auf die nativen Acc-LipTL) zeigt eindeutig,
dass es trotz unveränderter Lagerstabilität zu einer signifikanten Einflussnahme des
Polymers kommt. Dies ist insbesondere aufgrund der unveränderten spezifischen Aktivität
zu bemerken, da dadurch eine effiziente Nachbehandlung der Immobilisate möglich wird.
Gleiches gilt für die mit mPEG5000 modifizierten Präparate, die trotz verringerter
Lagerstabilität aufgrund der hohen Restaktivität und einer im Vergleich sehr hohen
Prozessstabilität (243 %) vielversprechende Ergebnisse liefern.
Ergebnisse und Diskussion
108
Abbildung 39: Prozentuale Prozessstabilitäten der modifizierten Acc-LipTL (ohne Dextrane) in Bezug auf
natives Acc-LipTL in THF bei RT
Abbildung 40: Prozentuale Prozessstabilitäten der Dextran-modifizierten Acc-LipTL in Bezug auf natives
Acc-LipTL in THF bei RT
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prozentuale Halbwertszeit [%]
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250
300
prozentuale Halbwertszeit [%]
Ergebnisse und Diskussion
109
Innerhalb der untersuchten Dextrane konnte eine nur sehr schwache Tendenz dahingehend
festgestellt werden, dass eine Erhöhung der Stabilität mit Verlängerung der Polymerketten
einhergeht. Das D40-10 sticht mit einer relativen Halbwertszeit von 263 % deutlich
gegenüber den weiteren getesteten Dextranenaldehyden heraus, welche Halbwertszeiten
von 115 % bei D10-1 bis 155 % bei D100-20 aufwiesen. Somit konnte die stark erhöhte
Lagerstabilität des D100-20 unter Prozessbedingungen nicht bestätigt werden. Es ist an
dieser Stelle nicht möglich die Ursache für die hohe Stabilität des D40-10 aufzuklären, da
sich kein Zusammenhang zwischen der Kettenlänge (D10 und D100 zeigen niedrigere Werte)
oder etwa des Öffnungsgrades der Dextrane erkennen lässt.
Unabhängig von den absoluten Ergebnissen ist festzustellen, dass die Halbwertszeiten der
Prozessstabilität einen erneut grundlegend anderen Eindruck über die Stabilität der
Acc-LipTL vermitteln, als die zuvor bestimmten Lagerstabilitäten. Wohingegen bei vorherigen
Untersuchungen (vgl. Kapitel 3.3.2.2 sowie 3.3.3.3) unter anderem eine „Verfälschung“ des
Zusammenhangs zwischen Lagerstabilität und Prozessstabilität aufgrund der vermeintlich
unterschiedlichen Wasseraktivitäten in den Lösungsmitteln vermutet wurde, ist hier nicht
direkt ersichtlich, was die Ursachen für die unterschiedlichen Ergebnisse sind.
Nichtsdestotrotz sind die zum Teil im vorherigen Kapitel diskutierten Gründe für eine
Stabilisierung der Acc-LipTL gegenüber den destabilisierenden Einflüssen des Lösungsmittels
und der Gesamtreaktion auch hier anzuführen. So kann davon ausgegangen werden, dass
die Bildung einer schützenden Mikroumgebung durch gebundene Polymere wie mPEG oder
auch PEI eine direkte Interaktion des polaren und wassermischbaren THFs mit der
Hydrathülle des Enzyms erschweren. Auch eine Verringerung der Flexibilität und die damit
einhergehende Stabilisierung einer rigideren Konformation hemmt eine Entfaltung des
Enzyms, wodurch die Halbwertszeit deutlich verlängert wird.
3.4.3 Bewertung der Stabilisierung
Aufgrund der Tatsache, dass das kontinuierliche Reaktionssystem die tatsächlichen Wechsel-
wirkungen zwischen den Substraten bzw. Produkten und den modifizierten Acc-LipTL realer
abbildet, wurden nur Halbwertszeiten aus diesen Versuchen beurteilt. Eine Entscheidung
Ergebnisse und Diskussion
110
zugunsten oder gegen einen späteren Einsatz modifizierter Acc-LipTL in der DKR von Benzoin
hätte auf der Grundlage der Lagerstabilitäten bedeutet, dass nur das D100-20 eingesetzt
worden wäre. Die verbesserten Stabilitäten der anderen Immobilisate während eines
tatsächlichen Prozesses hätten somit nicht nachgewiesen werden können. Auf der Grund-
lage dieser Schlussfolgerung ist es dringend notwendig an dieser Stelle anzumerken, dass die
überwiegende Mehrzahl der experimentellen Daten der Publikationen, welche sich mit der
Stabilisierung von Enzymen durch chemische Modifikationen befassen, auf der Bestimmung
von Lagerstabilitäten basieren [94, 95, 97, 151]. Es sind somit begründete Zweifel an der
Übertragbarkeit dieser Ergebnisse auf reale Prozesse festzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die erfolgversprechendsten Modifikationen ausgewählt
und im weiteren Verlauf in der DKR eingesetzt. Die Kriterien für die Auswahl waren zum
ersten ein minimaler Abfall der spezifischen Aktivität nach der Modifikation, der nicht mehr
als 10 % betragen sollte. Zum zweiten sollte die Prozessstabilität deutlich über der von
nativen Acc-LipTL liegen. Folgend wurden die Immobilisate nach einer Modifikation mit PEI,
mPEG5000 und D40-10 ausgewählt. Das mit Dextran modifizierte Immobilisat wurde entgegen
des ersten Kriteriums ausgewählt, weil es die größte Prozessstabilität aller Modifikationen
aufwies und somit trotz des Verlustes an spezifischer Aktivität getestet werden sollte.
Herauszuheben ist vor allem die Methode der PEI-Modifikation, da es sich hierbei um ein
Verfahren mit sehr simpler Durchführung handelt. Damit birgt dies das größte Potenzial
technische Anwendung zu finden. Es sind keine vorhergehenden Syntheseschritte nötig, um
beispielsweise eine Aktivierung der Polymere zu erreichen. Dies ist wiederum bei PEG und
Dextran notwendig, was die Handhabung etwas erschwert.
Die modifizierten Acc-LipTL wurden im weiteren Verlauf in einer DKR mit erhöhter
Temperatur eingesetzt, was eine gesonderte Betrachtung der Temperatur hier ersetzen
sollte.
Ergebnisse und Diskussion
111
3.5 Racemisierung
Im Jahr 2006 wurde von Hoyos et al. [70] eine in situ Racemisierung von Benzoin zur
Durchführung einer DKR beschrieben. In jener Arbeit wurde der von Larsson et al. [78]
erstmals für die chemo-enzymatische Kombination eingesetzte Shvo-Katalysator verwendet.
Dieser auf Ruthenium basierende Homogenkatalysator wird durch erhöhte Temperaturen
aktiviert, wobei das Dimer in seine oxidierende und reduzierende Untereinheiten zerfällt
[152] (Abbildung 41).
Abbildung 41: Aktivierungsmechanismus des Shvo-Katalysators
Obwohl der Vorteil gegenüber einigen anderen auf Ruthenium basierenden Katalysatoren
darin besteht, dass die Aktivierung durch Hitze und nicht etwa durch starke Basen wie bspw.
Kalium-tert-butanolat möglich ist [153], weist Shvo’s Katalysator dennoch Nachteile im
experimentellen Umgang auf. Es ist bekannt, dass Spuren von Sauerstoff den Abbau des
Rutheniumkatalysators in DKR Reaktionen hervorrufen kann [90], was den Einsatz einer
Schutzgasatmosphäre zwingend notwendig macht. Die häufig eingesetzten Vinylester, die
die Möglichkeit zur irreversiblen Reaktionsführung bei Umesterungen bieten, können bei
einer gleichzeitigen Verwendung des Shvo-Katalysators nicht benutzt werden. Das nach der
Spaltung durch Keto-Enol-Tautomerie aus dem Enol entstehende Acetaldehyd fungiert selbst
als Substrat für den Racemisierungskatalysator [154] und würde somit die Reaktions-
geschwindigkeit des Katalysators für die eigentliche Reaktion senken. Der jedoch, zumindest
aus verfahrenstechnischer Sicht gesehen, größte Nachteil ist der homogene Charakter des
Shvo-Katalysators. Die daraus folgenden Schwierigkeiten betreffen vor allem die potentielle
Verunreinigung des Produktes, welche zumindest aufwändigere Reinigungsschritte nach sich
zieht und die nicht gegebene Wiederverwendbarkeit, welche vor allem die ökonomische
Auslegung der Prozesse betrifft.
Ergebnisse und Diskussion
112
Ziel dieser Arbeit war somit die Entwicklung einer alternativen Racemisierungsmethode für
Benzoin. Diese sollte insbesondere experimentell einfacher zu handhaben sein, um eine
spätere industrielle Umsetzung zu erleichtern. Des Weiteren sollte versucht werden, durch
eine hohe Racemisierungsgeschwindigkeit die Gesamtreaktionsdauer der DKR zu verkürzen,
um einer Deaktivierung der Acc-LipTL entgegen zu wirken. Generell wurde dabei ein
heterogener Charakter des Katalysators zugrunde gelegt, um eine Wiederverwendung
dessen zu ermöglichen.
3.5.1 Katalysatorscreening zur Racemisierung von (R)-Benzoin
Die von Hoyos et al. [70] publizierte Studie enthielt keine Daten betreffend der
Racemisierungskinetik des Shvo-Katalysators mit Benzoin als Substrat. Um dennoch einen
Referenzwert für die Optimierung der Racemisierung von (R)-Benzoin zu erhalten, wurden
Shvo-Katalysatoren zweier Bezugsquellen (Sigma-Aldrich und STREM-Chemicals) verwendet.
(R)-Benzoin wurde mittels einer KR von racemischen Benzoin mit Acc-LipTL und einer
nachfolgenden chromatographischen Trennung des (S)-Benzoinbutyrats und des verblieb-
enden (R)-Benzoins selbst dargestellt. Alle Versuche wurden an einer Schlenk-Anlage unter
Luftausschluss und der Verwendung von Argon oder Stickstoff als Inertgas durchgeführt. Mit
Annahme einer sachgerechten Durchführung der Experimente war es jedoch im Rahmen
dieser Arbeit nicht möglich, reproduzierbare Ergebnisse für die Racemisierung von
(R)-Benzoin mit einem Shvo-Katalysator zu erhalten. Die Katalysatoren beider Bezugsquellen
zeigten nicht annähernd die Aktivität, die nötig ist, um wie von Hoyos et al. [89] beschrieben
eine DKR in 20 h mit einem Umsatz von 87% abzuschließen. Der Enantiomerenüberschuss
(ee) des (R)-Benzoin lag nach 20 h bei über 80 % (Daten nicht gezeigt). Auch eingehende
Kontrollen dessen, ob das System tatsächlich unter Luftausschluss arbeitet, konnten
dahingehend keine Besserung einstellen. Es konnten bis zur Beendigung der experimentellen
Arbeit die genauen Ursachen der erhaltenden Daten nicht geklärt werden. Auf Nachfrage bei
Dr. Pilar Hoyos (Organic and Pharmaceutical Chemistry Department Madrid/ Spanien)
konnte mit dem Ziel der Fehlerbehebung festgestellt werden, dass die verwendeten
Lösungsmittel nicht wie von Hoyos über einen Natriumspiegel getrocknet wurden und somit
potentiell noch Restwasser enthielten. Dabei wurde erklärend im persönlichen Gespräch
Ergebnisse und Diskussion
113
mitgeteilt, dass neben der Sensitivität gegenüber Sauerstoff vor allem Wasser einen
negativen Einfluss auf die Aktivität von Rutheniumkatalysatoren hat. Dies unterstreicht
nochmals das offensichtlich schmale Arbeitsfenster von diesen Katalysatoren, was
nachdrücklich einen Wechsel zu einfacheren Systemen empfiehlt. Um trotzdem eine
Benchmark für die hier durchgeführte Optimierung der Racemisierung zu entwickeln, wurde
angenommen, dass eine Racemisierung innerhalb einer Reaktionszeit von 20 h in einem
ausreichenden Umsatz ablaufen muss, um einen DKR-Umsatz von mindestens 87 % zu
erreichen [89]. Nach eigener Festlegung meint ein ausreichender Umsatz in diesem Fall
einen ee von unter 20 %. Somit wurde ungeachtet dessen, dass die Länge der Reaktionszeit
in der beschriebenen Arbeit auch aufgrund einer Deaktivierung der Lipase TL begründet
gewesen sein kann, die Dauer von 20 h folgend als Maßstab verwendet.
Im hier durchgeführten Screening wurden verschiedene heterogene Katalysatoren
ausgewählt, für die bereits die Fähigkeit zur Racemisierung von sekundären Alkoholen
berichtet wurde. Dieses Kriterium wurde angewendet, da Benzoin als einfachstes
aromatisches α-Hydroxyketon prinzipiell als ein sekundärer Alkohol betrachtet werden kann
und zudem oftmals 1-Phenylethanol als Standardsubstrat in Racemisierungsstudien
verwendet wird. Ebenso wie Benzoin besitzt 1-Phenylethanol einen Phenylrest in α-Stellung
zum Chiralitätszentrum, was ähnliche sterische Voraussetzungen schafft. Da jedoch bei
α-Hydroxyketonen die Hydroxyfunktion selbst in α-Stellung zu einer Carbonylgruppe steht
und sich somit die chemischen Eigenschaften des Moleküls grundlegend verändern, konnte
nicht ohne Weiteres vorausgesagt werden, ob die beschriebenen Katalysatoren auch
Benzoin als Substrat akzeptieren.
Wuyts et al. [143] testeten verschiedene auf Vanadium basierende Katalysatoren und
konnten Vanadyl sulfat (VOSO4) als sehr gut geeigneten Racemisierungskatalysator für
1-Phenylethanol in Oktan identifizieren. Sie wiesen die Bildung eines Carbenium Ions nach,
was auf einen säurekatalysierten Racemisierungsprozess schließen lässt. In einer weiteren
Studie dieser Arbeitsgruppe wurde ein rutheniumhaltiger, heterogener Katalysator
entwickelt, der, sofern unter Sauerstoffausschluss verwendet, ebenfalls zur Racemisierung
von 1-Phenylethanol geeignet ist [98]. Folgend wurde Calcium-Hydroxyapatit (HAP) nach
Ergebnisse und Diskussion
114
dem dort beschriebenen Protokoll hergestellt und im zweiten Schritt mit
Rutheniumtrichlorid behandelt. Infolge eines Ionenaustausches wurde HAP mit Ruthenium
beladen [98]. Dieser nachweislich heterogene Katalysator wurde folgend von Wuyts et al.
mit Shvo’s Katalysator und weiteren homogenen und heterogenen Metallkatalysatoren
verglichen, was ein ähnliches Racemisierungspotenzial zum Shvo-Katalysator hervorbrachte.
Ein mit Benzylsulfonsäuren beladenes Silicat wurde von Lozano et al. [86] für die
Racemisierung von 1-Phenylethanol in überkritischem CO2 eingesetzt. Mit dem Präparat
„Sulfonic acid resin MP“ von Novabiochem kam im Rahmen dieser Arbeit ein ähnlicher
Katalysator zum Einsatz. Es wurde jedoch auf den zusätzlichen Einsatz von ionischen
Flüssigkeiten, wie es Lozano et al. beschrieben, verzichtet. Als nächster Katalysator sollte mit
Palladium beladener Kohlenstoff getestet werden. Hier wurde unter anderem aufgrund der
Arbeit von Ahn et al. [79] auf eine Eignung zur Racemisierung von Benzoin geschlossen und
als kommerzielles Präparat ebenfalls verwendet. Die größte Gruppe untersuchter
Katalysatoren sind aber die an der Technischen Universität Delft (NL) hergestellten und mit
unterschiedlichen Metallen koordinierten TUD-1. Bei TUD-1 handelt es sich um ein
schwammartiges, mesoporöses und dreidimensionales Material, dass grundsätzliche
Ähnlichkeit zu Zeolithen aufweist [155]. Das Material basiert auf der Benutzung von
Tetraethylorthosilicat als Ausgangsmaterial und als Siliziumquelle. Der wesentliche Vorteil
gegenüber eindimensionalen Zeolithen ist die Vermeidung jeglicher Diffusionsbarrieren, was
auf die Struktur und die sehr große Oberfläche des Materials zurückzuführen ist [155, 156].
Durch die einfache Einarbeitung verschiedenster Metallatome (direkt während der
Synthese) wurden drei Katalysatorengruppen von Mitarbeitern der Arbeitsgruppe von
Prof. Dr. Ulf Hanefeld für Biokatalyse und organische Chemie an der TU Delft hergestellt. Es
wurden dabei zum Teil unterschiedliche Silicium/Metall Verhältnisse verwendet. Bei den
eingesetzten Metallatomen handelte es sich um Aluminium, Zirkonium und Wolfram.
Nachweise für die Fähigkeit verschiedener Zeolithe eine säurekatalysierte Racemisierung
von Phenylethanol zu katalysieren, wurden in verschiedenen Arbeitsgruppen erbracht [82,
83, 85]. Auch diese Katalysatoren enthielten zum Teil mit Aluminium und Zirkonium
zusätzliche reaktive Gruppen. Da in fast allen der oben genannten Arbeiten unpolare
Lösungsmittel und insbesondere Toluol verwendet wurden [85, 98, 143, 156], kam dies auch
Ergebnisse und Diskussion
115
im hier durchgeführten Screening zum Einsatz. Wie aus Tabelle 16 ersichtlich wird, wurden
zunächst die TUD-1-Katalysatoren für eine Reaktionsdauer von 20 h und einer
Reaktionstemperatur von 50 °C getestet. Alle Versuche fanden unter Schlenkbedingungen
statt und die TUD-1 Katalysatoren wurden bis zur Verwendung bei >100 °C gelagert, um eine
Adsorption von Wasser zu vermeiden.
Tabelle 16: Katalysatorscreening zur Racemisierung von (R)-Benzoin
Katalysator
Lösungs
-mittel
Temp.
[°C]
Katalysator-
konzentration
[mg/mL]
Zeit
[h]
Konzentration
(R)-Benzoin
[mM]
ee Benzoin
[%]
TUD-1
Toluol
50
40
20
94
93,8
Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) 1
Toluol
50
40
20
94
1,3
Al-TUD-1 (Si/Al=4) 1
Toluol
50
40
20
94
0,2
Al-TUD-1 (Si/Al=25) 1
Toluol
50
40
20
94
23,2
W-TUD-1 (Si/W=10) 1
Toluol
50
40
20
94
65,7
W-TUD-1 (Si/W=20) 1
Toluol
50
40
20
94
43,9
W-TUD-1 (Si/W=30) 1
Toluol
50
40
20
94
63,9
W-TUD-1 (Si/W=40) 1
Toluol
50
40
20
94
73,7
W-TUD-1 (Si/W=50) 1
Toluol
50
40
20
94
71,7
Zr-TUD-1 (Si/Zr=25)
Toluol
50
40
4
94
4,4
Al-TUD-1 (Si/Al=4)
Toluol
50
40
4
94
42,8
Ru-Hydroxy-apatit2
Toluol
50
40
4
94
91,7
Pd-Kohlenstoff3
Toluol
80
40
4
94
85,0
Vanadyl sulfat
Toluol
50
40
4
94
88,5
Sulfonsäureträger4
Toluol
50
40
5,5
94
90,4
1Al=Aluminium, Zr=Zirkonium, W=Wolfram, Si=Silicium; 2Hergestellt nach [98]; 3Palladium auf Kohlenstoff;
4Markenname: „Sulfonic acid resin MP“
Bereits das TUD-1 Material ohne koordinierte Metallatome zeigte eine schwache
Veränderung des ee auf 93,8 % was auf die intrinsische Acidität des Materials
zurückzuführen ist [155]. Die W-TUD-1 zeigten mit einem steigenden Wolframanteil eine
Ergebnisse und Diskussion
116
deutliche Verringerung des ee bis auf minimal 43,9 % bei einem Si/W Verhältnis von 20. Bei
einer weiteren Steigerung hin zu einem Verhältnis von 10 stieg der ee aber wieder auf
65,7 % an. Deutlich bessere Ergebnisse zeigten hingegen die mit Aluminium und Zirconium
koordinierten TUD-1. Auch hier wirkte sich ein steigender Aluminiumgehalt positiv auf die
Racemisierung aus, so dass bei Si/Al=4 ein ee von 0,2 nachgewiesen werden konnte. Ein im
Rahmen der Messungenauigkeit identischer ee konnte für Zr-TUD-1 festgestellt werden. Ein
steigender Gehalt der Metallatome geht mit der Erhöhung der reaktiven Stellen
(„active sites“) und damit gleichzeitig mit einer erhöhten Acidität einher [156]. Da es sich bei
der Racemisierung von Benzoin unter Verwendung der X-TUD-1 um eine säurekatalysierte
Reaktion handelt, läuft die aller Wahrscheinlichkeit nach stattfindende Keto-Enol-
Tautomerie [84, 87, 157], begünstigt bei steigender Acidität ab [85, 156] (Reaktionsschema
siehe Abbildung 5).
Als Folge der hervorragenden Ergebnisse für Al-TUD-1 (Si/Al=4) und Zr-TUD-1 (Si/Zr=25)
wurde die Reaktionszeit in den folgenden Screeningexperimenten auf 4 h verkürzt und die
weiteren Katalysatoren untersucht. Wie dem unteren Teil der Tabelle 16 zu entnehmen ist,
katalysiert Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) selbst nach einer sehr kurzen Reaktionsdauer von nur 4 h
eine nahezu vollständige Racemisierung des eingesetzten (R)-Benzoins. Al-TUD-1 (Si/Al=4)
weist ebenfalls einen signifikant reduzierten ee von 42,8 % auf, der jedoch deutlich höher ist
als der des Zr-TUD-1 (Si/Zr=25). Beide Werte lassen die zunächst noch unbestätigte
Vermutung zu, dass diese Racemisierung des (R)-Benzoins deutlich schneller ist als bei einer
Verwendung des Shvo-Katalysators. Überraschenderweise wiesen alle weiteren getesteten
Racemisierungskatalysatoren lediglich ee im Bereich um 85-90 % auf. Diese Ergebnisse
lassen zwar in jedem Fall auf die Fähigkeit Benzoin zu racemisieren schließen, belegen aber
auch sehr langsame Reaktionsraten. Dies steht im ersten Moment im Gegensatz zu den
teilweise sehr guten Ergebnissen in der Racemisierung von 1-Phenylethanol. Mögliche
Gründe für die niedrigen Aktivitäten mit Benzoin als Substrat könnten unterschiedliche
Aciditäten der Katalysatoren sein, wobei aber auch Diffusionslimitierungen aufgrund der im
Vergleich zum 1-Phenylethanol wesentlich größeren Molekülstruktur des Benzoins
verantwortlich sein könnten. Bezüglich des Ru-HAP wurden im Rahmen dieser Arbeit keine
Kontrollexperimente (XRD, ICP oder XPS) zur Sicherstellung der Trägermaterialsynthese
Ergebnisse und Diskussion
117
durchgeführt, so dass eine Diskussion der Ergebnisse nur unzureichend möglich ist. Auf die
Durchführung einer Optimierung der Reaktionsbedingungen wurde aufgrund der
außerordentlich guten Ergebnisse für Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) und Al-TUD-1 (Si/Al=4) für die
Nicht-TUD-1 Katalysatoren verzichtet. Im Gegensatz dazu wurde folgend der Einfluss des
Lösungsmittels sowie der Temperatur auf die Racemisierungsgeschwindigkeit der
Al-TUD-1 (Si/Al=4) und Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) untersucht. Im weiteren Verlauf werden die
untersuchten TUD-1 Katalysatoren nur noch als Al-TUD-1 bzw. Zr-TUD-1 bezeichnet.
3.5.1.1 Optimierung der Racemisierung mit Al-TUD-1 und Zr-TUD-1
3.5.1.2 Lösungsmittel
Im Rahmen dieser Arbeit wurde für die DKR von Benzoin eine „onepot-Synthese“ angestrebt,
was voraussetzt, dass jegliche Reaktionsbedingungen für die enzymatisch katalysierte KR
auch mit denen der Racemisierung harmonieren. Es wurden im Folgenden neben dem
Standardlösungsmittel THF auch jene Lösungsmittel für die Racemisierung getestet, die
entweder die höchsten Aktivitäten und Prozessstabilitäten in der KR ermöglichten (Toluol,
2-MeTHF, MIBK) oder eine gute Löslichkeit von Benzoin bei noch ausreichend guter Aktivität
zeigten (1,4-Dioxan). Es wurden erneut alle Experimente bei einer Temperatur von 50 °C
unter Schlenkbedingungen durchgeführt.
In Abbildung 42 sind die ee des (R)-Benzoins nach der Racemisierung mit den jeweiligen
Katalysatoren in verschiedenen Lösungsmitteln aufgetragen. Obwohl die tatsächliche
Racemisierungsgeschwindigkeit für Toluol aufgrund der Reaktionszeit von 20 h nicht genau
aufgelöst wurde, so ist dennoch für alle anderen Lösungsmittel bis auf MIBK zu erkennen,
dass Al-TUD-1 eine höhere Racemisierungsgeschwindigkeit als Zr-TUD-1 aufweist. In
Übereinstimmung mit der Arbeit von Ramanathan et al. [156], die Zr-TUD-1 als Katalysator
für die Meerwein-Ponndorf-Verley (MPV) Reaktion und für die Prins-Reaktion untersucht
haben, wurde Toluol als das geeignetste Lösungsmittel für eine Verwendung der TUD-1
Katalysatoren identifiziert. Obwohl Ether als Lösungsmittel wesentlich geringer an den
„active sites“ der Katalysatoren koordinieren sollten, als es beispielsweise bei Alkoholen der
Ergebnisse und Diskussion
118
Fall ist, so ist trotzdem anzunehmen, dass das in Etherverbindungen vorhandene
Sauerstoffatom ebenfalls an Zirconium und Aluminium koordinieren kann.
Abbildung 42: Enantiomerenüberschüsse nach Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 und Zr-TUD-1
in Abhängigkeit unterschiedlicher Lösungsmittel bei 50°C, 20h
Bei einer Bewertung der untersuchten Lösungsmittel anhand der eigens definierten
Benchmark von einem ee <20 % nach 20 h Reaktionszeit, werden Toluol, 1,4-Dioxan und
2-MeTHF als Lösungsmittel für eine spätere DKR eingesetzt. Für die weiteren
Charakterisierungsexperimente wird hingegen nur Toluol aufgrund der wesentlich höheren
Racemisierungsgeschwindigkeit verwendet.
3.5.1.3 Temperatur
Die Reaktionstemperatur ist ein weiterer wichtiger Optimierungsparameter, da chemisch
katalysierte Racemisierungsreaktionen für gewöhnlich schneller ablaufen, sofern die
Temperatur erhöht wird [85]. Da für Toluol gezeigt werden konnte, dass Acc-LipTL trotz
einsetzender thermischer Deaktivierung bis zu einer Temperatur von 99 °C steigende
Aktivitäten aufzeigt, wurde die Racemisierungsgeschwindigkeit in einem Temperaturbereich
von 50 - 90 °C variiert. Um eine gleichmäßige Temperierung parallel ablaufender Reaktions-
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Toluol
1,4-Dioxan
2-MeTHF
THF
MIBK
ee [%]
Al-TUD-1
Zr-TUD-1
Ergebnisse und Diskussion
119
ansätze zu gewährleisten, wurde ein Ölbad verwendet, indem alle Ansätze über einer
Multirührplatte durchmischt wurden.
Abbildung 43: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit bei
verschiedenen Temperaturen in Toluol
Abbildung 44: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit bei
verschiedenen Temperaturen in Toluol
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4
ee [%]
Zeit [h]
50°C
70°C
90°C
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 1 2 3 4
ee [%]
Zeit [h]
50°C
70°C
90°C
Ergebnisse und Diskussion
120
Abbildung 43 und Abbildung 44 lassen eine starke Abhängigkeit der Racemisierungs-
geschwindigkeit von der Temperatur für beide Katalysatoren erkennen. Wie bereits aus den
Screeningversuchen erwartet werden konnte, katalysiert Zr-TUD-1 die Reaktion in einem
höheren Maße als Al-TUD-1. So konnte für Zr-TUD-1 eine vollständige Racemisierung des
eingesetzten (R)-Benzoins bei 90 °C bereits nach etwa 30 Minuten nachgewiesen werden.
Doch auch für Al-TUD-1 konnte mit einer benötigten Zeit von 90 Minuten bis zur
vollständigen Racemisierung ein exzellentes Ergebnis erzielt werden.
Sofern die Racemisierungsreaktion ausgehend von einem reinen Enantiomer beginnt, kann
unter Annahme dessen, dass beide Enantiomere mit der gleichen Geschwindigkeits-
konstanten reagieren, eine Kinetik erster Ordnung angenommen werden und daraus
Gleichung 7 unter der Bedingung [S]t=[R]0-[R]t abgeleitet werden:
(Gleichung 7)
[R]0 und [R]t = Die Konzentrationen des (R)-Enantiomers zum Zeitpunkt Null und t
krac = Geschwindigkeitskonstante der Racemisierung.
Die Halbwertszeit der Racemisierung, also die Zeit nach dem der ee auf 50 % des
Ausgangswertes gesunken ist, kann dann leicht aus der Gleichung 8 berechnet werden [158]:
(Gleichung 8)
Daraufhin wurden in Abbildung 45 die Halbwertszeiten der Reaktionen bei verschiedenen
Temperaturen aufgetragen und ein direkter Vergleich der Katalysatoren durchgeführt.
Wie in Abbildung 45 ersichtlich, halbiert sich der ee-Wert bei Verwendung des Zr-TUD-1
innerhalb von ca. 54 Minuten bei 50 °C, ca. 14 Minuten und ca. 4 Minuten bei 70 °C bzw.
90 °C. Demgegenüber stehen bei steigenden Temperaturen Halbwertszeiten von
197 Minuten, 71 Minuten und 20 Minuten bei Al-TUD-1. Somit lässt Zr-TUD-1 die
Racemisierung etwa um den Faktor von vier bis fünf schneller ablaufen als Al-TUD-1.
Ergebnisse und Diskussion
121
Abbildung 45: Halbwertszeiten der Racemisierung von (R)-Benzoin durch Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 in
Abhängigkeit der Temperatur in Toluol
Eine erhöhte Aktivität des chemischen Katalysators ist jedoch unter Umständen auch mit
einer erhöhten Neigung zu Nebenreaktionen verbunden. Eine typische Nebenreaktion bei
einem Einsatz saurer Racemisierungskatalysatoren ist zum einen die Racemisierung des in
der KR/DKR gebildeten Esters und die nicht selektive Umesterung selbst [158, 159]. Letztere
macht sich insbesondere durch eine Abnahme des Produkt-ee’s in der DKR bemerkbar. Im
Folgenden wurden die Neigungen von Zr-TUD-1 und Al-TUD-1 zur Umesterung und zur
Racemisierung des Esters untersucht.
3.5.1.4 Untersuchungen zur Umesterungsaktivität und Racemisierung des
Benzoinesters
Um die jeweilige Umesterungsaktivität der Racemisierungskatalysatoren zu untersuchen,
wurden Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 in der Standard-KR von Benzoin anstelle des Acc-LipTL
eingesetzt. Es wurden die Aktivitätswerte bei 50, 70 und 90 °C aufgenommen.
0
25
50
75
100
125
150
175
200
50
70
90
Halbwertszeit [min]
Temperatur [°C]
Al-TUD-1
Zr-TUD-1
Ergebnisse und Diskussion
122
Abbildung 46: Spez. Aktivitäten von Al-TUD-1 und Zr-TUD-1 in der KR von Benzoin mit Vinylbutyrat in
Abhängigkeit der Temperatur in Toluol
Abbildung 46 macht deutlich, dass die unerwünschte Umesterung bei Al-TUD-1 in einem
wesentlich höheren Umfang abläuft, als bei Zr-TUD-1. Wohingegen beim letztgenannten
Katalysator bei 50 °C und 70 °C keine nennenswerte Aktivität nachgewiesen werden konnte,
so konkurriert Al-TUD-1 mit 2,8 U/mgAl-TUD-1 bei 50 °C und 18,2 U/mgAl-TUD-1 bei 70 °C deutlich
mit Acc-LipTL um die Umesterung von Benzoin. Bei 90 °C konnte für beide Katalysatoren eine
signifikante Aktivität gefunden werden.
Eine säurekatalysierte Umesterung ist auf die Anwesenheit einer Brønstedt-Säure-
Funktionalität zurückzuführen [160], die infolge einer Protonierung der Carbonylgruppe des
Acyldonors die Reaktion einleitet. Der Gehalt von Brønstedt-Säure-Zentren ist bei Zr-TUD-1
und Al-TUD-1 sehr verschieden. Während Zr-TUD-1 fast ausschließlich Lewis-Säure- und
lediglich Spuren von Brønstedt-Säure-Stellen aufweist [156], handelt es sich bei Al-TUD-1
schon eher um eine Brønstedt-Säure [155]. Dies sollte auch das unterschiedliche Verhalten
der Katalysatoren in der KR von Benzoin erklären.
In beiden Fällen konnte sowohl (R)- als auch das (S)-Enantiomer des Esters gefunden
werden. Da sowohl eine nicht selektive Veresterung, aber auch eine Racemisierung des
0,1
0,2
6,4
2,8
18,2
66,3
0
10
20
30
40
50
60
70
50
70
90
spezifische Aktivität [U/mgTUD-1]
Temperatur [°C]
Zr-TUD-1
Al-TUD-1
Ergebnisse und Diskussion
123
gebildeten Esters stattfinden kann, wurde im nächsten Schritt eine Racemisierung von
(R)-Benzoin in Anwesenheit des (S)-Benzoinbutyrats durchgeführt. Im Rahmen dieses
Versuches konnte ebenfalls untersucht werden, ob die Racemisierungsgeschwindigkeit des
Zr-TUD-1 durch das Produkt der KR gehemmt wird.
Abbildung 47: Racemisierung von (R)-Benzoin durch Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Reaktionszeit mit und
ohne 47 mM Benzoinbutyrat in Toluol bei 70 °C; ee des Benzoinbuytrat über den gesamten
Racemisierungsprozess
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass Zr-TUD-1 nicht in der Lage ist (S)-Benzoinbutyrat zu
racemisieren, da der ee über den gesamten Prozess bei > 99 % bleibt (Abbildung 47). Des
Weiteren konnte keine signifikante Verlangsamung der Racemisierungsgeschwindigkeit
festgestellt werden.
Diese Ergebnisse unterstreichen gemeinsam mit der hohen Racemisierungsgeschwindigkeit
und der geringen Neigung zu unerwünschten Nebenreaktionen die hervorragende Eignung
des Zr-TUD-1 für die DKR von Benzoin.
0
20
40
60
80
100
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
ee [%]
Zeit [h]
Benzoin ohne Ester
Benzoin mit Ester
Ester
Ergebnisse und Diskussion
124
3.6 Dynamisch kinetische Racematspaltung mit Al-TUD-1, Zr-TUD-1 und
Acc-LipTL
Zu Beginn dieser Arbeit war Stand der Technik, dass die DKR von Benzoin mit einer
immobilisierten Variante der Lipase TL (statische Suspension) in 20 h mit einem Umsatz von
87 % bei einem ee von >99 % durchgeführt werden kann [89]. Bei Verwendung der Lipase TL
in nativer Form war durch eine stufenweise Applikation des Enzyms ein Umsatz von 92 % in
einer gesamten Reaktionsdauer von 48 h möglich. Auch hier konnten ausgezeichnete ee’s
von >99 % erreicht werden. Nachteile dieser Arbeiten bestehen aus eigener Sicht vor allem
in der Sensitivität des Reaktionssystems und der dadurch nur schwer umzusetzenden
Übertragung in einen technischen Maßstab. Dabei standen sowohl die hohe Instabilität der
Lipase TL als auch die komplexe Handhabung des Shvo-Katalysators im Fokus der hier
durchgeführten Optimierung. Bisher konnten sowohl eine aktivierende Immobilisierung,
eine Stabilisierung der Acc-LipTL und die Identifikation eines heterogenen und äußerst
aktiven Racemisierungskatalysators erfolgreich gezeigt werden. Im folgenden Abschnitt
sollen daher nun die einzeln optimierten „Bausteine“ zu einer Gesamtreaktion, der DKR von
Benzoin, zusammengefügt werden. Dabei werden erneut die Parameter Lösungsmittel und
Temperatur betrachtet, um zum einen bereits erhaltene Ergebnisse zu validieren und zum
anderen, um den Einfluss auf die „onepot“ Reaktionsführung zu untersuchen. Abschluss
findet diese Arbeit in der Evaluierung der Wiederverwendbarkeit des Reaktionssystems, was
sowohl aus ökonomischer als auch aus verfahrenstechnischer Sicht eines der wichtigsten
Parameter darstellt.
3.6.1 Lösungsmittel
Basierend auf der Untersuchung geeigneter Lösungsmittel für die Racemisierung erfolgte die
DKR in THF als Standard, 2-MeTHF, 1,4-Dioxan und Toluol. Die experimentelle
Vorgehensweise bestand in der Herstellung von Schlenkbedingungen bei Anwesenheit von
Acc-LipTL und des jeweiligen Racemisierungskatalysators. Die Zugabe von 94 mM Benzoin im
jeweiligen Lösungsmittel und 6 Äquivalenten Vinylbutyrat im Gegenstrom startete die
Reaktion, welche gerührt bei 50 °C für einen Zeitraum von 5 h durchgeführt wurde.
Ergebnisse und Diskussion
125
Tabelle 17: Vergleich der DKR von Benzoin mit Acc-LipTL und Al-TUD-1 bzw. Zr-TUD-1 in Abhängigkeit ver-
schiedener Lösungsmittel bei 50 °C
Lösungsmittel
Racemisierungs-
katalysator
Zeit
[h]
Umsatz
[%]
ee (S) Benzoin-
butyrat [%]
ee (R)
Benzoin [%]
THF
Al-TUD-1
5
25,11
84,21
16,8
2-MeTHF
Al-TUD-1
5
85,9
96,6
45,4
1,4-Dioxan
Al-TUD-1
5
73,2
79,2
12,7
Toluol
Al-TUD-1
5
93,2
83,3
42,7
THF
Zr-TUD-1
5
53,51
99,61
30,2
2-MeTHF
Zr-TUD-1
5
96,8
97
28,3
1,4-Dioxan
Zr-TUD-1
5
72,5
97,4
24,2
Toluol
Zr-TUD-1
5
98,4
98,5
12,1
Bed.: 500 µL, 94 mM (R,S)-Benzoin, 6 Äquiv. Vinylbutyrat, 50°C, N2-Athmosphäre 1 Die Trennung der Produkte von
Nebenprodukten war nicht vollständig möglich, was die Berechnung verfälschen kann
Die in Tabelle 17 zusammengefassten Ergebnisse zeigen, dass bis auf die Verwendung von
THF als Lösungsmittel alle DKR’s einen Umsatz aufweisen, der höher ist als die intrinsische
Limitierung von 50 % in der KR. Dies zeigt die generelle Machbarkeit der „onepot“-
Reaktionsführung für Acc-LipTL und den TUD-1 Katalysatoren.
Bei Verwendung des bisherigen KR-Standardsystem mit THF konnte eine starke Neben-
produktbildung nachgewiesen werden. Dies beeinträchtigte zum einen die Quantifizierung
der Produkte und Edukte und ließ zum anderen auf nicht bekannte Nebenreaktionen
zwischen Acc-LipTL, dem Lösungsmittel und insbesondere den Al-TUD-1 schließen. Der
niedrige Umsatz von 25,1 % lässt somit vermuten, dass die Aktivität des Acc-LipTL deutlich
reduziert wurde bzw. eine Deaktivierung stattgefunden haben könnte. Der niedrige ee des
Substrates hingegen zeigt, dass der Racemisierungskatalysator offenbar sehr gut
funktionierte, was ebenfalls an dem verhältnismäßig niedrigen Produkt-ee zu erkennen ist.
Dieser ist wahrscheinlich auf die nicht selektive Umesterungsaktivität von Al-TUD-1
zurückzuführen, die bereits zuvor nachgewiesen worden war. Auf eine genaue Bestimmung
der gebildeten Nebenprodukte wurde allerdings verzichtet, da nach allen bisherigen
Optimierungsschritten THF ohnehin als nicht gut geeignet angesehen werden muss und
Ergebnisse und Diskussion
126
somit eine weitere Verwendung dieses Lösungsmittels nicht empfohlen wird. 1,4-Dioxan
eignet sich zwar grundsätzlich als Lösungsmittel für die DKR, da Umsätze von >50 % darin
möglich sind, jedoch stoppte die Reaktion unabhängig vom verwendeten Racemisierungs-
katalysator bei einem Umsatz von ca. 73 % bei Produkt-ee’s von etwa 80 % bei Al-TUD-1 und
>97 % bei Zr-TUD-1. Auch hier zeigt sich die erhöhte Neigung des Al-TUD-1 zur nicht
selektiven Umesterung von Benzoin in dem erniedrigten ee-Wert. Hervorragende Ergebnisse
konnten indessen bei den DKR’s in 2-MeTHF und Toluol und der Verwendung von Zr-TUD-1
erhalten werden. Hier wurden innerhalb von nur 5 h in 2-MeTHF 96,8 % und in Toluol 98,4 %
Umsatz nachgewiesen. Der ee des gebildeten Esters ist in Toluol mit 98,5 % exzellent und mit
97 % in 2-MeTHF zwar etwas geringer, aber dennoch als sehr gut zu bewerten. Obwohl auch
Al-TUD-1 in 2-MeTHF und Toluol sehr gute Ergebnisse hervorbringt, so sind diese aufgrund
eines niedrigeren Umsatzes in 2-MeTHF und wegen des unzureichenden ee’s in Toluol
signifikant schlechter als für Zr-TUD-1.
Im Vergleich zu den zuvor aufgeführten Benchmarks von Hoyos et al. [89] konnte somit der
Umsatz weiter erhöht werden. Gleichzeitig war es möglich, die Reaktionszeit auf nur 5 h zu
verkürzen. Beide Ergebnisse unterstreichen das Potenzial des hier entwickelten DKR-Systems
im Gegensatz zum derzeitigen Stand der Technik. Hinzu kommt, dass kein Mehraufwand
gegenüber der KR zu verzeichnen ist, da beide Katalysatoren (Acc-LipTL und Zr-TUD-1) im
gleichen Arbeitsschritt für die DKR verwendet werden.
3.6.2 Temperatur
Die Verwendung von mindestens 50 °C als Reaktionstemperatur wurde ausgewählt, um
einen Vergleich zu bisherigen Arbeiten zu gewähren. Es wird davon ausgegangen, dass eine
Verringerung der Temperatur mit einer Erniedrigung der Racemisierungsgeschwindigkeit
einhergeht und dadurch dies zu dem geschwindigkeitsbestimmenden Schritt wird.
Demzufolge müsste mit einer entsprechenden Reduktion der Acc-LipTL-Menge einer
Verschlechterung des Produkt-ee entgegen gewirkt werden, da die Lipase bei einer
längerfristigen Verfügbarkeit des (R)-Benzoins dieses ebenfalls als Substrat akzeptiert.
Obwohl eine geringere Reaktionstemperatur nachweislich zu einer Erhöhung der Stabilität
Ergebnisse und Diskussion
127
von Acc-LipTL führt, destabilisiert eine verlängerte Inkubationszeit im Reaktionssystem das
Acc-LipTL-Präparat. Da eine Recyclierung des Lipase-Immobilisats angestrebt wird, ist nach
eigener Meinung eine Verkürzung der Reaktionszeit hinsichtlich einer hohen Katalysator-
standzeit zielführender. Aufgrund dessen wurde im Folgenden untersucht, inwiefern eine
Veränderung der Temperatur dazu genutzt werden kann, die Reaktionszeit der DKR noch
weiter zu verkürzen. Dazu wurden DKR’s in Toluol durchgeführt und die Temperatur von
50 °C auf 70 bzw. 90 °C erhöht. Es wurde die Zunahme des Benzoinbutyrats in kleinen
Zeitabständen bestimmt und somit der Verlauf der DKR dokumentiert (Abbildung 48 und
Abbildung 49).
Sowohl für den Al-TUD-1 (Abbildung 48) als auch für Zr-TUD-1 (Abbildung 49) konnte durch
die Erhöhung der Temperatur die Reaktionszeit bis zum Erreichen eines Umsatzes von bis zu
>99 % deutlich verkürzt werden.
Abbildung 48: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und Al-TUD-1 in Abhängigkeit der
Reaktionszeit bei verschiedenen Temperaturen in Toluol
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
Umsatz [%]
Zeit [h]
50 °C
70 °C
90 °C
Ergebnisse und Diskussion
128
Abbildung 49: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der
Reaktionszeit bei verschiedenen Temperaturen in Toluol
Dabei ist besonders auffällig, dass die Reaktionsverläufe der jeweiligen DKR’s mit den
verschiedenen Racemisierungskatalysatoren bei 50 °C und 70 °C sehr ähnlich sind, dagegen
aber bei 90 °C deutliche Unterschiede zu erkennen sind. Während die DKR mit Al-TUD-1
bereits nach 45 Minuten einen Umsatz von >99 % erreicht, ist die DKR mit Zr-TUD-1 erst
nach etwa 90 Minuten vollständig beendet. Dies widerspricht zunächst den bisher
erhaltenden Ergebnissen, in denen Zr-TUD-1 der Racemisierungskatalysator war, der eine
schnellere Reaktionsgeschwindigkeit aufwies. Dieser Zusammenhang konnte
erwartungsgemäß auch für die beiden anderen Temperaturen gefunden werden, nicht
jedoch für 90 °C.
Die Erklärung für dieses Phänomen kann bei erneuter Betrachtung der spezifischen Aktivität
der TUD-1-Katalysatoren in der KR von Benzoin (Abbildung 46) gefunden werden. Dort
konnte bereits gezeigt werden, dass Al-TUD-1 bei einer Erhöhung der Reaktionstemperatur
auf 90 °C eine sehr starke Zunahme der Umesterungsaktivität zeigt. Dies bedeutet, dass
sowohl Acc-LipTL als auch Al-TUD-1 die Umesterung von Benzoin katalysieren. Da Al-TUD-1
dies nicht stereoselektiv katalysiert, wird dieser Zusammenhang bei einer Auftragung der
Produkt-ee’s über der Temperatur besonders deutlich (Abbildung 50).
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
Umsatz [%]
Zeit [h]
50 °C
70 °C
90 °C
Ergebnisse und Diskussion
129
Abbildung 50: Entwicklung des ee des (S)-Benzoinbutyrats in der DKR von Benzoin durch Acc-LipTL und
Al-TUD-1 bzw. Zr-TUD-1 in Abhängigkeit der Temperatur in Toluol
Sofern Al-TUD-1 als Racemisierungskatalysator eingesetzt wurde, nehmen die Produkt-ee’s
sehr stark mit einer Erhöhung der Temperatur ab. Bei Zr-TUD-1 konnte ein ee von >97 %
auch bei 70 °C erreicht werden. Diese fallen dann jedoch bei 90 °C auch auf 65 % ab. Bei
Al-TUD-1 konnte bei gleicher Temperatur nur noch ein ee von ca. 13 % festgestellt werden.
Hierbei wird deutlich, dass die enzymatisch katalysierte Umesterung nur noch eine
untergeordnete Rolle spielt und der Großteil des Esters durch Al-TUD-1 gebildet wird.
Abschließend ist herauszustellen, dass wenn die Zielspezifikation der optischen Reinheit des
Produktes einen ee von >97 % zulässt, die Reaktionszeit zur vollständigen Umsetzung des
Benzoins durch eine Erhöhung der Temperatur auf 70 °C weiter auf 4 h reduziert werden
kann. Des Weiteren ist festzustellen, dass Al-TUD-1 aufgrund der hohen Neigung zur Katalyse
der nicht selektiven Umesterung nicht für einen Einsatz in der DKR von Benzoin geeignet ist.
0
20
40
60
80
100
40 50 60 70 80 90 100
ee [%]
Temperatur [°C]
Zr-TUD-1
Al-TUD-1
Ergebnisse und Diskussion
130
3.6.3 Katalysatorverhältnisse
Als Grundregel für eine DKR gilt, dass die Racemisierungsreaktion nach Möglichkeit schneller
ablaufen sollte als die zweite, meist enzymatisch katalysierte Reaktion [71]. Dies soll
verhindern, dass das unerwünschte Enantiomer als Substrat akzeptiert wird, weil die in situ
Racemisierung zu langsam abläuft. Infolge dessen würde sich der Produkt-ee merklich
verschlechtern. Aufgrund der zwar geringen, aber nachweisbaren nicht selektiven
Umesterungsaktivität des Zr-TUD-1 ist jedoch auch anzunehmen, dass eine Erhöhung der
Racemisierungsaktivität die Bildungsrate der Nebenprodukte steigert. Eine Reduktion der
Konzentration hingegen könnte eine Verbesserung des ee nach sich ziehen, steht aber in
Konkurrenz mit der oben beschriebenen enzymatischen Umesterung des unerwünschten
Enantiomers. Der einfachste Weg die jeweiligen Reaktionsgeschwindigkeiten einzustellen, ist
die Regulierung der Katalysatormenge im Reaktionsansatz. In den bisherigen DKRs wurden
die Katalysator-Konzentrationen konstant bei 40 mg/mL für den Racemisierungskatalysator
und 20 mg/mL im Fall des Acc-LipTL gehalten. Es wurde im Folgenden untersucht, wie weit
die Konzentration des Racemisierungskatalysators mit dem Ziel eines verbesserten
Produkt-ee verringert werden kann, ohne die Racemisierung dabei zum geschwindigkeits-
bestimmenden Schritt werden zu lassen.
Abbildung 51: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch 20 mg/mL Acc-LipTL in Abhängigkeit
verschiedener Mengen von Zr-TUD-1 in Toluol bei 50°C
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
Umsatz [%]
Zeit [h]
12 mg/mL Zr-TUD-1
20 mg/mL Zr-TUD-1
40 mg/mL Zr-TUD-1
Ergebnisse und Diskussion
131
In Abbildung 51 wird deutlich, dass die Verringerung der Zr-TUD-1 -Konzentration zu
reduzierten Umsätzen nach 5 h Reaktionszeit führt (88 % bei 12mg/mL; 93,4 % bei 20 mg/mL
und 98,4 % bei 40 mg/mL). Der Produkt-ee lag bei 97,6 % für 12 mg/mL und stieg auf 98,5 %
bei der höchsten untersuchten Konzentration an. Das bedeutet, dass tatsächlich bei einer
Reduktion der Zr-TUD-1 -Konzentration die Racemisierung der geschwindigkeits-
bestimmende Schritt wird. Der sinkende ee zeigt demzufolge an, dass die Lipase TL, wenn
auch nur in sehr geringem Maße, das (R)-Benzoin als Substrat akzeptiert. Wie groß der
Einfluss einer sich ändernden Acc-LipTL-Konzentration auf den ee des Esters ist, wurde in
weiteren Experimenten untersucht. Es wurde die Menge an Acc-LipTL im Vergleich zum
bisherigen Standard sowohl erhöht als auch erniedrigt und der Einfluss auf den Verlauf der
DKR dokumentiert (Abbildung 52).
Abbildung 52: Umsatzverläufe der DKR von Benzoin durch 40 mg/mL Zr-TUD-1 in Abhängigkeit verschiedener
Mengen von Acc-LipTL in Toluol bei 50°C
Zunächst ist festzustellen, dass der ee bei einer Erhöhung der Acc-LipTL-Konzentration auf
40 mg/mL auf 97,5 % absinkt (von 98,5 % bei der Standardkonzentration von 20 mg/mL).
Eine Verringerung der Enzymaktivität hat keinen Einfluss auf den ee, was im Prinzip als
weitere Bestätigung der nicht selektiven Umesterung durch Zr-TUD-1 angesehen werden
kann. Die Erhöhung der Acc-LipTL Menge hat jedoch vor allem zur Folge, dass die
0
20
40
60
80
100
0 1 2 3 4 5
Umsatz [%]
Zeit [h]
10 mg/ml Acc-LipTL
20 mg/ml Acc-LipTL
40 mg/ml Acc-LipTL
Ergebnisse und Diskussion
132
Reaktionszeit auf lediglich 3 h verkürzt werden konnte. Generell ist der Einfluss der sich
ändernden Acc-LipTL Menge sehr stark, erreicht aber offensichtlich bei etwa 40 mg/mL eine
Konzentration, die bei gegebener Zr-TUD-1 -Konzentration das Maximum zur Beibehaltung
hoher ee bedeutet.
Es lässt sich erneut besonders herausstellen, dass bei einer Produktspezifikation mit einem
gewünschtem ee von >97 %, Zr-TUD-1 eine hohe Eignung für eine technisch durchgeführte
DKR besitzt. Eine Verringerung des Zr-TUD-1 auf vergleichsweise niedrige
Katalysatorkonzentrationen führt zu sehr guten DKR-Ergebnissen. Zudem ist die
Racemisierungsgeschwindigkeit ausreichend groß, um auch bei einer Verdopplung der
Acc-LipTL-Konzentration hervorragende ee zu garantieren.
3.6.4 Rezyklierung
In den vorausgegangenen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass Acc-LipTL eine
Prozessstabilität von ca. 3,5 h in Toluol und ca. 5,5 h in 2-MeTHF aufweist. Es konnte
weiterhin nachgewiesen werden, dass die im kontinuierlichen Prozess bestimmten
Halbwertszeiten um etwa 50 % kleiner sind, als die bei wiederholten Batch-Versuchen
erhaltenen Daten.
Es wurden folgend wiederholte DKR-Batches der unterschiedlichen Acc-LipTL-Immobilisate
(modifiziert und nativ) ausgeführt. Es war dadurch möglich, einen ein direkten Vergleich zur
Arbeit von Hoyos et al. [89] herzustellen und damit das Potential des hier erarbeiteten
Reaktionssystems besser zu bewerten. In Anbetracht der Halbwertszeiten war bei der
Auslegung der Rezyklierung unter Verwendung der Standardparameter (40 mg/mL
Zr-TUD-1; 20 mg/mL Acc-LipTL, 50 °C) eine signifikante Verringerungen des Umsatzes bereits
nach dem ersten Zyklus anzunehmen, zumal die Halbwertszeitbestimmungen bei
Raumtemperatur durchgeführt wurden und die DKR bei 50 °C abläuft. In diesem Fall können
zwei unterschiedliche Strategien angewandt werden, um diesem Umstand entgegen zu
wirken:
Ergebnisse und Diskussion
133
» Zugabe einer definierten Menge Acc-LipTL nach jedem Zyklus um eine Deaktivierung
auszugleichen.
» Verlängerung der Reaktionszeit der Zyklen, um sinkende Umsätze auszugleichen.
Beendigung der Rezyklierung, wenn Umsatz unter eine definierte Grenze abfällt.
Beide Möglichkeiten haben sowohl Vor- als auch Nachteile und sind entsprechend der
Prozessvorgaben auszuwählen. Dabei spielt im größeren Maßstab vor allem die
Verfügbarkeit der Katalysatoren eine entscheidende Rolle. Da eine ressourcensparende
Arbeitsweise anzustreben ist, wurden folgend nach dem ersten Zyklus die Reaktionszeiten
der weiteren Zyklen so lange erhöht, dass entweder ein Umsatz von > 98 % nachgewiesen
werden konnte oder die Reaktionszeit eine Dauer von maximal 24 h erreicht hatte. Die zu
Beginn des ersten Zyklus hergestellten Schlenkbedingungen konnten für alle weiteren
Durchgänge nicht aufrecht erhalten werden, da ein „Lösungsmittel-Trocknen“ der
Katalysatoren durch das Anlegen des Vakuums und des darauffolgenden Verdampfen des
Lösungsmittels verhindert werden sollte. Die zu erwartende Deaktivierung der Acc-LipTL
durch ein „Trocknen“, welche sich in Vorarbeiten andeutete, wäre ein größerer Nachteil als
ein möglicher Verlust von Racemisierungsaktivität infolge fehlender Schlenkbedingungen. Es
ist zudem nicht bekannt, wie stark der Einfluss der Feuchtigkeit, welche sich maximal im
Waschprozess aus der Umgebungsluft im Reaktionsansatz festsetzen kann, tatsächlich auf
die Racemisierungsgeschwindigkeit ist.
Zunächst wurden die Ergebnisse aus den Prozessstabilitätsmessungen in verschiedenen
Lösungsmitteln in der DKR validiert. Dazu wurden mehrere DKR-Zyklen unter Verwendung
von Acc-LipTL und Zr-TUD-1 sowohl in 2-MeTHF als auch in Toluol durchgeführt. Wie oben
beschrieben, wurden die Reaktionszeiten auf den Umsatz angepasst. Dabei wurden die
Zyklen immer dann beendet, wenn die DKR in einem der Lösungsmittel den geforderten
Umsatz erreicht hat.
Ergebnisse und Diskussion
134
Abbildung 53: Umsatzveränderung der DKR von Benzoin mit Acc-LipTL und Zr-TUD-1 in Toluol und 2-MeTHF
bei 50°C in wiederholten Reaktionszyklen
Abbildung 53 zeigt die Entwicklung der DRK-Umsätze in 2-MeTHF und Toluol, welche über
der akkumulierten Reaktionszeit aufgetragen wurden. Die bereits in Kapitel 3.3.3.3
erhaltenden Ergebnisse bestätigen sich in den hier gezeigten Daten. Da aufgrund der
Arbeiten von Ramanathan et al. [156] sowie Telalovic et al. [155] von einer sehr guten
Rezyklierbarkeit des Zr-TUD-1 auszugehen ist, ist die Abnahme des Umsatzes einer
Deaktivierung der Acc-LipTL zuzuschreiben. Somit war anzunehmen, dass es gegenüber einer
DKR in Toluol eher in 2-MeTHF möglich sein sollte, über mehrere Zyklen hinweg höhere
Umsätze zu erreichen. Auffällig dabei ist jedoch, dass Halbwertszeiten von ca. 3,5 - 5,5 h und
auch wenn diese in wiederholten Batch-Versuchen um den Faktor zwei größer sind, nicht
hätten darauf schließen lassen, dass nach einer akkumulierten Reaktionsdauer von 48 h
Umsätze von 99,5 % in 2-MeTHF (ee >97 %) oder auch 83 % (ee >98 %) in Toluol möglich
sind. An dieser Stelle kommt die Frage auf, ob eventuell der Unterschied zwischen der
Prozessstabilität in wiederholten KR-Versuchen und dem kontinuierlichem Betrieb in
2-MeTHF und Toluol größer ist als in THF. Denkbar ist aber auch, dass es durch die
Anwesenheit der Zr-TUD-1 zu einer stabilisierenden Wirkung auf Acc-LipTL kommt, die
jedoch nicht ohne weiteres nachzuweisen ist. Die ausreichende Klärung dieses
stabilisierenden Phänomens konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht erbracht werden.
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20
40
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100
0 10 20 30 40 50
Umsatz [h]
akkumulierte Reaktionszeit [h]
2-MeTHF
Toluol
Ergebnisse und Diskussion
135
Nichtsdestotrotz konnte bestätigt werden, dass 2-MeTHF das Lösungsmittel mit der
höchsten Stabilität von Acc-LipTL ist. In Anbetracht dessen, dass es sich bei 2-MeTHF um ein
aus nachwachsenden Rohstoffen hergestelltes Lösungsmittel handelt [161], sind diese
Ergebnisse im Bezug auf eine technische Umsetzung des Prozesses sehr vielversprechend.
Obwohl die Racemisierungsgeschwindigkeit in 2-MeTHF niedriger ist, ist dies als Lösungs-
mittel der Wahl für eine chemo-enzymatische DKR von Benzoin mit Acc-LipTL und Zr-TUD-1
ausdrücklich zu empfehlen.
Im nächsten Schritt sollte untersucht werden, inwiefern sich die durchgeführten Modi-
fikationen des Acc-LipTL auf die Katalysatorstandzeit in der DKR auswirken. Es wurden die
mit PEI, mPEG5000 und D40-10 modifizierten Immobilisate in der Rezyklierung der DKR
verwendet. Zur besseren Vergleichbarkeit wurden neben der Einhaltung der oben
genannten Bedingungen zur Durchführung der Rezyklierung (>98 % Umsatz; max. 24h) und
der Bestimmung der Umsätze am Ende der Zyklen auch der jeweilige Umsatz nach 8 h
festgestellt und miteinander verglichen. Die Auftragung dieser 8 h-Umsätze über die
akkumulierte Reaktionszeit gibt ein genaueres Bild über den Verlust der katalytischen
Fähigkeit des jeweiligen Reaktionssystems (Abbildung 54).
Abbildung 54: Umsatzveränderung nach 8 h des jeweiligen Zyklus in der Rezyklierung von Acc-LipTL sowie
der mit mPEG, PEI und Dextran modifizierten Acc-LipTL-Varianten mit Zr-TUD-1 in 2-MeTHF bei 50°C
0
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40
60
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0 10 20 30 40 50 60 70 80
Umsatz [%]
akkumulierte Reaktionszeit [h]
Acc-LipTL
mPEG-Acc-LipTL
PEI-Acc-LipTL
Dex-Acc-LipTL
Ergebnisse und Diskussion
136
Wie in Abbildung 54 dargestellt, konnte für alle Immobilisate eine Abnahme des
8 h-Umsatzes festgestellt werden. Da auch hier davon ausgegangen wird, dass die Abnahme
des Umsatzes vor allem durch eine Inaktivierung der Lipase TL begründet ist, sind etwaige
Unterschiede einer erhöhten bzw. erniedrigten Stabilität der Acc-LipTL zuzuschreiben. So
konnte im Vergleich zur nativen Form des Acc-LipTL vor allem für PEI eine signifikante
Steigerung der Stabilität beobachtet werden. Dagegen führte die mPEG-Modifikation
lediglich zu einer sehr geringen Verbesserung der Stabilität. Die Dextranmodifikation hatte
im Vergleich gar eine Verschlechterung des Umsatzes im Verlauf der Rezyklierung zur Folge.
Da die geringere Aktivität der D40-10Acc-LipTL durch die Verwendung einer größeren
Immobilisatmenge ausgeglichen wurde, kann dies als Ursache für die geringeren Umsätze
ausgeschlossen werden. Die erhöhte Prozessstabilität der D40-10Acc-LipTL, welche im
kontinuierlichen Reaktor gefunden wurde, konnte hier nicht bestätigt werden. Über die
tatsächlichen Gründe für die Stabilisierung bzw. Destabilisierung der modifizierten Acc-LipTL
kann auch an dieser Stelle nur gemutmaßt werden. Neben den bereits zuvor diskutierten
möglichen Auswirkungen der einzelnen Modifikationen auf die Lipase TL (siehe 3.4 und
folgende Unterkapitel), soll hier ein möglicher weiterer Zusammenhang anderer Arbeiten
und der hier erhöhten Stabilität hervor gehoben werden. Torres et al. [162] beschrieben
infolge einer Beschichtung von Invertase-Immobilisaten mit PEI eine erhöhte Stabilität
gegenüber sauren Reaktionsbedingungen. Obwohl die Immobilisierung der Lipase TL eine
direkte Interaktion mit den Säurefunktionalitäten der Racemisierungskatalysatoren
vermindern sollte, wurde auch von Ödman et al. [84] beschrieben, dass saure
Racemisierungkatalysatoren eine Deaktivierung von immobilisierten Enzymen hervorrufen
können. Obwohl der Mechanismus der Deaktivierung nicht bekannt ist, könnte ein Schutz
vor eben dieser direkten Interaktion mit sauren Funktionalitäten durch das PEI den Zuwachs
an Prozessstabilität begründen.
Die Abnahme der Aktivitäten führte im Verlauf der Rezyklierung dazu, dass die Reaktionszeit
von 8 h im ersten Durchgang auf 16 h im zweiten und dann folgend auf 24 h in jedem
weiteren Zyklus erhöht wurde. Abbildung 55 zeigt die Endumsätze der einzelnen Ansätze
nach den genannten Zeiträumen über der akkumulierten Reaktionszeit. Aufgrund der
erhöhten Reaktionsdauer konnte für alle Ansätze, bis auf die DKR mit D40-10Acc-LipTL,
Ergebnisse und Diskussion
137
Umsätze von 98-99 % für die ersten drei Zyklen nachgewiesen werden. Erwartungsgemäß
konnte dann ein signifikanter Abfall des Umsatzes für die nativen Acc-LipTL und
mPEGAcc-LipTL festgestellt werden. Für die DKR mit PEIAcc-LipTL wurde auch nach der fünften
Wiederholung und einer Gesamtreaktionsdauer von 96 h keine Veränderung des Umsatzes
gefunden. Der ee des Produktes war bei allen Ansätzen mit >98 % hervorragend und sogar
geringfügig höher als in den Vorexperimenten in 2-MeTHF und Zr-TUD-1.
Abbildung 55: Endumsatz des jeweiligen Zyklus in der Rezyklierung von Acc-LipTL sowie der mit mPEG, PEI
und Dextran modifizierten Acc-LipTL-Varianten mit Zr-TUD-1 in 2-MeTHF bei 50°C
Die hier erhaltenden Ergebnisse können als Beweis für eine problemlose Rezyklierbarkeit des
Zr-TUD-1 angesehen werden. Außerdem wurden die Racemisierungskatalysatoren
gemeinsam mit den jeweiligen Acc-LipTL-Varianten im Reaktionsgefäß durch mehrmaliges
Zuführen und Abtrennen von frischem Lösungsmittel (2-MeTHF) vom vorherigen
Reaktionsansatz getrennt und durch Zugabe der Substrate der nächste Durchgang direkt
begonnen. Somit ist offensichtlich nicht zwingend notwendig, dass die DKR unter
Schlenkbedingungen ausgeführt wird. Der Erhalt der Racemisierungsaktivität und die
einfache Handhabung unterstreicht die generelle Eignung der Zr-TUD-1 für die DKR von
Benzoin und hebt das große Potenzial zur Überführung des Prozesses in einen technischen
Maßstab nochmals hervor. Die deutliche Verminderung der Deaktivierung der Acc-LipTL
bewirkt als Folge der PEI-Modifikation eine Steigerung der Katalysatorstandzeit und erhöht
0
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0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Umsatz [%]
akkumulierte Reaktionszeit [h]
Acc-LipTL
mPEG-Acc-LipTL
PEI-Acc-LipTL
Dex-Acc-LipTL
Ergebnisse und Diskussion
138
damit die insgesamt erreichbare Ausbeute des DKR-Prozesses. Hoyos et al. [89] berechneten
die Menge des synthetisierten Benzoinbutyrats im Verhältnis zur eingesetzten Protein-
menge, um somit die Steigerung der Effizienz der DKR infolge der Immobilisierung in
statischen Suspensionen zu verdeutlichen. Abbildung 56 greift diese Berechnung auf und
zeigt die Menge Benzoinbuyrat pro Menge gebundenem Protein bei Verwendung der
PEIAcc-LipTL.
Abbildung 56: Vergleich der Produktivität der mit PEI modifizierten Acc-LipTL-Variante und der statischen
Suspensionen aus Hoyos et al. [89] in Abhängigkeit der Zyklenzahl [89]
Es konnte eine deutliche Steigerung der Effizienz in der wiederholten DKR von Benzoin durch
den Einsatz von PEIAcc-LipTL erreicht werden. Dies ist zum einen auf die Erhöhung der
spezifischen Proteinaktivität nach Optimierung der Lipase TL-Immobilisierung auf Accurel
und zum anderen auf die Steigerung der Stabilität der Acc-LipTL nach Optimierung der
Reaktionsbedingungen und der Durchführung der PEI-Modifikation zurückzuführen. So ist
bei der alternativen Verwendung von PEIAcc-LipTL anstelle der Statischen Suspension und der
Verwendung von 2-MeTHF anstatt THF möglich, fast sechsmal mehr Benzoinbutyrat pro
gebundenes Protein nach vier Zyklen zu produzieren. Dabei ist nochmals darauf
hinzuweisen, dass nur die initiale Menge Zr-TUD-1 verwendet werden musste und keine
Zugabe neuen Katalysators, wie bei der Verwendung des Shvo-Katalysators, nötig wurde.
0
50
100
150
200
250
300
350
1
2
3
4
Produktivität [mgProdukt/mgProtein]
Zyklen
PEI-Acc-LipTL
SS-Lip TL
Zusammenfassung
139
4 Zusammenfassung
Die dynamisch kinetische Racematspaltung (DKR) ist eine elegante und effiziente Methode
zur Herstellung chiraler α-Hydroxyketone, welche aus Sicht der pharmazeutischen Industrie
sehr interessant sind. Zur Synthese von Benzoin, dem einfachsten aromatischen
α-Hydroxyketon, mittels DKR wurde bisher über ein System mit der in Silikon immobilisierten
Lipase TL und einem Übergangsmetallkatalysator (Shvo-Katalysator) berichtet [89]. Obwohl
hohe Umsätze (max. 87 %) bei sehr hohen ee (99%) mit diesem System erreicht werden
können, ist die technische Anwendbarkeit dieser Kombination sehr begrenzt. Die
Immobilisate weisen Schwächen in der Handhabbarkeit sowie der reproduzierbaren
Herstellung auf und der Racemisierungskatalysator ist sehr sensitiv gegenüber Sauerstoff
und Wasser.
Ziel dieser Arbeit war die Weiterentwicklung der DKR von Benzoin, was im Rahmen dieser
Studie durch zwei Teilprojekte realisiert werden sollte: (1) Die Optimierung der kinetischen
Racematspaltung sowohl auf der Seite der Biokatalysatorentwicklung als auch in der
Prozessparameteroptimierung und (2) die Entwicklung einer alternativen Racemisierungs-
methode zur „onepot“ DKR von Benzoin. Abschluss findet die Arbeit in der Charakterisierung
der DKR unter Verwendung des neuen Reaktionssystems und dem Vergleich zum bisherigen
Stand der Technik.
Für die Immobilisierung der Lipase TL wurde die Methode der adsorptiven Trägerbindung
ausgewählt und auf den hydrophoben Materialen Accurel MP1001 und Sepabeads EC-OD
angewandt. Es wurde folgend der Einfluss variabler Parameter der adsorptiven
Immobilisierung untersucht. Dazu zählten Proteinstartkonzentration, Temperatur, Puffer-
konzentration und pH-Wert der Immobilisierungslösung. Es konnte für Accurel ein starker
Anstieg der Beladungsdichte und der spezifischen Trägeraktivität bei Erhöhung der
Proteinstartkonzentration bis 60 mg/mL nachgewiesen werden. Die spezifische
Proteinaktivität der Acc-LipTL stieg bis zu einer Startkonzentration von 30 mg/mL ebenfalls
an, blieb jedoch folgend konstant. Das Sepabead-Material zeigte eine ähnliche Abhängigkeit
wie Accurel gegenüber der Proteinstartkonzentration, wies jedoch eine um den Faktor acht
niedrigere Aktivität als Acc-LipTL auf. Aufgrund dessen wurde die Immobilisierung auf
Zusammenfassung
140
Sepabeads nicht weiter betrachtet. Sowohl die Erhöhung der Temperatur, als auch die
Steigerung der Pufferkonzentration konnten die Beladungsdichte und die spezifische
Aktivität der Acc-LipTL weiter steigern. Der pH-Wert zeigte keinen signifikanten Einfluss. So
konnten letztendlich die optimalen Immobilisierungsbedingungen: 30 mg/mL Lipase-
konzentration, 40 °C Immobilisierungstemperatur, 200 mM Kaliumphosphatpuffer mit
pH 6,2 definiert werden, bei denen Acc-LipTL eine spezifische Trägeraktivität von
24,7 U/mgTräger und eine spezifische Proteinaktivität von 1437 U/mgProtein aufwies. Dies
bedeutet eine um Faktor 4,1 höhere Aktivität als das native Lipase TL-Pulver und eine
signifikante Steigerung der Aktivität gegenüber der statischen Suspension von
Hoyos et al. [89]. Die Beschichtung der Acc-LipTL mit unterschiedlichen Mengen Silikon
zeigte keine Beeinflussung der Aktivität, aber eine signifikante Stabilisierung gegenüber
mechanischen Einflüssen.
Die Charakterisierung der kinetischen Racematspaltung umfasste die Untersuchung der
Aktivität, Lagerstabilität und Prozessstabilität der Acc-LipTL. Bezüglich der Aktivität konnte
eine niedrige Wasseraktivität als positiv ermittelt werden. Die Trocknung der Lösungsmittel
über Molsieben und eine Lagerung der Acc-LipTL bei sehr trockenen Bedingungen ermög-
lichten hier das Maximum der Aktivität. In der Untersuchung alternativer Lösungsmittel
ermöglichten 2-MeTHF und Toluol höhere Aktivitäten als im Standardsystem THF. Eine
darauffolgende Untersuchung der Temperatursteigerung in diesen drei Lösungsmitteln
brachten Maxima bei 50 °C für THF, 60 °C für 2-MeTHF und sogar >99 °C für Toluol hervor.
Die Aktivität von Toluol war bei der maximalen Temperatur über 800 % höher als bei
Raumtemperatur. Eine Abschwächung des Aktivitätsanstieges wies jedoch auf eine
Deaktivierung bei hohen Temperaturen hin, was folgend in der Ermittlung der Lagerstabilität
deutlich nachgewiesen werden konnte. Die Lagerstabilitätsmessungen dienten des Weiteren
zur isolierten Betrachtung des Einflusses der Edukte und Produkte auf die Stabilität der
Acc-LipTL. Es konnte keine Inaktivierung, sondern eher eine leichte Stabilisierung in
Anwesenheit der Edukte bzw. Produkte gezeigt werden. Dabei erwies sich auch das Neben-
produkt Acetaldehyd als nicht schädlich. Die Untersuchung der Lagerstabilitäten in ver-
schiedenen Lösungsmitteln wiesen die hydrophoben Lösungsmittel MIBK und Toluol als stark
stabilisierend aus (Halbwertszeit >90 h), wobei auch alle anderen Solventien eine erhöhte
Zusammenfassung
141
Lagerstabilität im Vergleich zu THF (Halbwertszeit 12,7 h) aufwiesen. Eine erhöhte Lager-
stabilität konnte für Toluol auch bei 50 °C nachgewiesen werden. Zur Ermittlung der
Prozessstabilität wurden sowohl wiederholte Batch-Versuche als auch Versuche in einem
kontinuierlichen Prozess durchgeführt. In den wiederholten Batch-Versuchen konnte für
Acc-LipTL in THF eine Halbwertszeit von 5,5 h und in dem hier entwickelten kontinuierlichen
Reaktorsystem eine Halbwertszeit von 2,2 h ermittelt werden. Die Unterschiede zur höheren
Lagerstabilität wurden dabei vor allem den komplexen Einflüssen des Prozesses und der
nicht kontrollierten Wasseraktivität zugeschrieben. Beim Vergleich der Lösungsmittel im
kontinuierlichen Prozess erwies sich 2-MeTHF als besonders stabilisierend, indem die
Halbwertszeit auf 5,6 h erhöht werden konnte.
Zur nachträglichen Stabilisierung der Acc-LipTL wurden etablierte Protokolle genutzt, um
sowohl Amino- als auch Carboxylfunktionen der Aminosäureseitenketten zu modifizieren
und mit Polyethylenimin eine physikalische Modifikation anzuwenden. Neben überwiegend
sehr hohen Restaktivitäten nach den jeweiligen Modifikationen, konnten erneut signifikante
Unterschiede zwischen der Lager- und Prozessstabilität festgestellt werden. Auf Basis der
prozessnahen Untersuchungen im kontinuierlichen Reaktor wurden PEI, mPEG und eine
Dextranmodifikation als die Methoden identifiziert, die die Stabilität gegenüber den
komplexen Inaktivierungseinflüssen signifikant erhöhen können. Es konnten jeweils mehr als
doppelt so hohe Halbwertszeiten im Vergleich zum nativen Acc-LipTL ermittelt werden.
Das Screening nach alternativen Racemisierungskatalysatoren wurde sowohl auf Basis
publizierter heterogener Katalysatoren durchgeführt, die eine Eignung der Racemisierung
von sekundären Alkoholen zeigen, als auch auf Grundlage einer Reihe an der TU Delft (NL)
neuentwickelter Katalysatoren. Unter allen getesteten Materialen stellten sich die soge-
nannten TUD-1 Materialen und dabei insbesondere Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) und Al-TUD-1
(Si/Al=4) als außerordentlich aktiv heraus. Weitere Untersuchungen ergaben eine starke
Temperaturabhängigkeit und eine Neigung zur Katalyse einer nicht selektiven Umesterung
von Benzoin. Wohingegen Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) eine minimale Aktivität dahingehend aufwies,
wurde für Al-TUD-1 (Si/Al=4) bei erhöhten Temperaturen eine starke Umesterungsaktivität
Zusammenfassung
142
gefunden. Eine Racemisierung des gebildeten Esters konnte ausgeschlossen werden, genau
wie die Beeinflussung der Racemisierungsgeschwindigkeit durch die Anwesenheit des Esters.
Es konnte folgend erfolgreich eine „onepot“ – Kombination der TUD-1 Katalysatoren und der
Acc-LipTL in der DKR von Benzoin gezeigt werden. Dabei wurden erneut 2-MeTHF und Toluol
als die geeignetsten Lösungsmittel ermittelt. So konnte erstmals eine DKR von Benzoin
innerhalb von 5 h mit einem Umsatz von >98 % und einem ee von >98 % durchgeführt
werden. Die Erhöhung der Temperatur erniedrigte die Reaktionszeit nochmals, wobei dabei
eine Reduzierung des ee festgestellt wurde. Die Variation der Katalysatorverhältnisse
hingegen bewirkte eine minimale Reaktionszeit von 4 h bei einem Umsatz von >98 % und
einem ee von >97 % mit Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) und Acc-LipTL. Die Untersuchung der
Rezyklierung der DKR unter Verwendung des Zr-TUD-1 (Si/Zr=25) und der modifizierten Acc-
LipTL (PEI, mPEG, Dextran) sowie des nativen Acc-LipTL ergaben eine sehr gute
Wiederverwendbarkeit des Reaktionssystems. Es konnte eine Steigerung der Stabilität der
mit PEI und mPEG modifizierten Acc-LipTL nachgewiesen werden. Mit PEIAcc-LipTL konnte die
DKR unter Verlängerung der Reaktionszyklen mindestens fünfmal wiederholt werden, ohne
dass der Umsatz unter 98 % sank. Es wurden jeweils ee’s von >98 % erreicht. Der Vergleich
der Reaktionseffizienz gegenüber dem System von Hoyos et al. [89] ergab eine sechsfach
höhere Produktausbeute pro immobilisiertes Protein, wobei nur die initiale Menge
Racemisierungskatalysator verwendet wurde.
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