Extracellular Matrix- and
Pluripotent Stem Cell-based
Tissue Engineering of the Kidney
vorgelegt von
Dipl.-Ing.
Iris Fischer
an der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Jens Kurreck
Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster
Gutachter: Dr. Andreas Kurtz
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 27.11.2019
Berlin 2020
„Indes sie forschten, röntgten, filmten, funkten,
entstand von selbst die köstlichste Erfindung:
der Umweg als die kürzeste Verbindung
zwischen zwei Punkten.“
Erich Kästner
I
Zusammenfassung
Komplexe, dreidimensionale (3D) Organmodelle sind neuartige biotechnologische
Werkzeuge für die Erforschung von Regenerations- und Krankheitsmechanismen sowie für
die Medikamentenentwicklung. Ein solches Modell der Niere könnte die jahrzehntelange
Stagnation in der Entwicklung neuer Behandlungsmethoden für Patienten mit chronischem
Nierenversagen durchbrechen, sowie die hohe Durchfallrate neuer Medikamente in
klinischen Tests durch nephrotoxische Effekte reduzieren. Ziel der vorliegenden Arbeit war
daher die Entwicklung eines humanen 3D Nierenmodelles.
Ein funktionsfähiges Nierenmodell sollte die Architektur und die Zelltypen der Niere, sowie
die mechanischen Eigenschaften und die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix
nachahmen und zudem perfundiert sein. Daher wurde ein Scaffold-basierter Ansatz der
Gewebezüchtung auf der Basis von dezellularisierten ganzen Rattennieren gewählt, die mit
humanen Nierenvorläuferzellen und Endothelzellen, differenziert aus induzierten
pluripotenten Stammzellen, rezellularisiert werden sollten.
Dieser Ansatz machte die Entwicklung eines Perfusionsbioreaktors und einer
Steuerungssoftware nötig, die die De- und Rezellularisierung der Nieren sowie die
darauffolgende In-vitro-Kultivierung erst ermöglichten.
Dezellularisierung ist die Entfernung aller Zellen eines Organs, bei der die extrazelluläre
Matrix (EZM) in ihrer nativen Architektur und Zusammensetzung erhalten bleibt. In dieser
Arbeit wurde durch den Vergleich des Einflusses verschiedener Detergenzien sowie
Temperaturen gezeigt, dass für die Dezellularisierung von Nierengewebsstücken das
Untertauchen in dem milden ionischen Detergens Natriumdesoxycholat (SDC) bei 4 °C
optimal ist. Für die Dezellularisierung ganzer Nieren durch Perfusion ist jedoch das starke
ionische Detergens Natriumdodecylsulfat (SDS) nötig. Sowohl die Minimierung der SDS-
Konzentration und -Anwendungsdauer als auch der Temperatur während der
Dezellularisierung verbessern dabei die Qualität der dezellularisierten EZM. Alle Ergebnisse
wurden mittels eines punktebasierten Bewertungssystems, welches ebenfalls im Rahmen
dieser Arbeit entwickelt wurde, objektiv und standardisiert beurteilt.
Um eine effiziente Rezellularisierungsstrategie zu identifizierten wurden Zellen mit oder
ohne Hochdruck durch die Nierenarterie, mit oder ohne Vakuum durch den Ureter oder
II
durch eine direkte Injektion in die dezellularisierten Nieren eingesät. Der Gefäßbaum konnte
erfolgreich mit Endothelzellen, die durch die Nierenarterie eingesät wurden, rezellularisiert
werden. Die Rezellularisierung des Parenchyms mit Nierenvorläuferzellen resultierte jedoch
mit allen getesteten Rezellularisierungsstrategien in geringen Wiederbesiedlungs-
effizienzen. So konnten maximal 1% des Parenchyms wiederbesiedelt werden, zudem
entstanden Schäden in der Architektur und die Anordnung der Zellen entsprach nicht den
physiologischen renalen Strukturen.
Parallel dazu wurde der Einfluss der mechanischen und biochemischen Eigenschaften der
EZM auf die Ausreifung der Nierenvorläuferzellen untersucht. Dazu wurden diese auf
Oberflächen verschiedener Steifigkeiten und EZM-Beschichtungen kultiviert. Mit
steigender Steifigkeit reifen die Nierenvorläuferzellen zunehmend in renale
Tubulusepithelzellen aus, wohingegen sich die Podozytenausreifung invers verhält. Zudem
wurde nachgewiesen, dass das EZM-Protein Laminin, im Gegensatz zu Collagen IV, die
Ausreifung der Nierenvorläuferzellen in renale Tubulusepithelzellen fördert, wobei
zwischen den Laminin-Isoformen 511 und 521 kein Unterschied besteht.
Auch wenn mit den gewählten Methoden kein Nierenmodell generiert werden konnte, so
markieren doch die technischen Entwicklungen und die Erkenntnisse, die in dieser Arbeit
gewonnen worden, einen weiteren Schritt in Richtung eines humanen 3D Nierenmodells.
III
Abstract
Complex, three-dimensional (3D) organ models are novel biotechnological tools for
research on regeneration and disease mechanisms as well as drug development. An organ
model of the kidney is urgently needed to break through decades of stagnation in the
development of new treatment methods for patients with chronic kidney disease and to
reduce the high failure rate of drugs in clinical tests due to nephrotoxic effects. The aim of
this thesis was therefore the development of a human 3D kidney model.
A functional kidney model should emulate the architecture and cell types of the kidney, as
well as the mechanical properties and composition of the extracellular matrix. In order to
emulate the function of the kidney, the model must be perfused. Therefore, a scaffold-based
tissue engineering approach was chosen on the basis of decellularized whole rat kidneys,
which should be recellularized with human renal precursor cells and endothelial cells
differentiated from induced pluripotent stem cells.
This approach required the development of a perfusion bioreactor and control software,
which enabled the de- and recellularization of the kidneys as well as the subsequent in vitro
cultivation.
Decellularization is the process of removing all cells of an organ while preserving the
extracellular matrix (ECM) in its native architecture and composition. The influence of
different detergents and temperatures was analyzed, and the results showed that for the
decellularization of tissue pieces immersion in the mild ionic detergent sodium deoxycholate
(SDC) at 4 °C is optimal. However, decellularization of whole kidneys by perfusion required
the strong ionic detergent sodium dodecyl sulfate (SDS). To improve the quality of the
decellularized ECM it is beneficial to minimize the SDS concentration and application time
as well as the temperature. All results were evaluated objectively and standardized by
applying a point-based scoring system, which was also developed in the course of the thesis.
Next, an efficient recellularization strategy had to be identified. The tested strategies
included cell seeding through the renal artery with or without high pressure, seeding through
the ureter with or without vacuum and direct injection into the parenchyma with a syringe.
The vascular tree of the decellularized kidney was successfully recellularized with
endothelial cells seeded via the renal artery. However, recellularization of the parenchyma
with renal progenitor cells resulted in low seeding efficiencies in all applied seeding
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