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Molekulare Mechanismen der antiinflammatorischen und
immunsuppressiven Effekte von Interleukin-10
vorgelegt von
Diplom-Ingenieurin
Christiane Schönbein
aus Darmstadt
Von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Ingenieurwissenschaften
-Dr.-Ing.-
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster
Berichter: Prof. Dr. Peter Donner
Berichter: Prof. Dr. Ulf Stahl
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 20.06.2003
Berlin 2003
D 83
Inhaltsverzeichnis
I
I Inhaltsverzeichnis
I INHALTSVERZEICHNIS .............................................................................................I
1. ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................1
2. EINLEITUNG.................................................................................................................2
2.1 Das Immunsystem...........................................................................................................2
2.1.1 Die angeborene Immunität ...................................................................................... 2
2.1.2 Die erworbene Immunität........................................................................................ 3
2.1.3 Zellen des Immunsystems ....................................................................................... 3
2.1.4 Zytokine und das Immunsystem.............................................................................. 6
2.2 Eigenschaften von IL-10................................................................................................. 7
2.2.1 IL-10-Rezeptor und Signaltransduktion.................................................................. 7
2.2.2 Der Einfluss von IL-10 auf andere Signalwege ....................................................10
2.2.3 Biologische Wirkung von IL-10............................................................................ 10
2.2.3.1 IL-10-Effekte auf Monozyten und Makrophagen............................................11
2.2.3.2 IL-10-Effekte auf dendritische Zellen.............................................................. 11
2.2.3.3 IL-10-Effekte auf T-Zellen............................................................................... 11
2.2.3.4 IL-10-Effekte auf B-Zellen .............................................................................. 12
2.2.4 IL-10 und Erkrankungen ....................................................................................... 12
2.3 Ziel der Arbeit...............................................................................................................13
2.3.1 Arbeitsstrategie...................................................................................................... 14
3. MATERIAL ..................................................................................................................15
3.1 Chemikalien................................................................................................................... 15
3.2 Puffer und Lösungen .................................................................................................... 17
3.3 Labormaterial ...............................................................................................................20
3.4 Biologisches Material.................................................................................................... 20
3.4.1 Zellkultur Reagenzien ...........................................................................................20
3.4.2 Stimulantien........................................................................................................... 21
Inhaltsverzeichnis
II
3.4.3 Antikörper ............................................................................................................. 21
3.5 Quantitative Genexpressionsanalyse...........................................................................22
3.6 Reaktionskits................................................................................................................. 23
3.7 Weitere Materalien.......................................................................................................23
3.8 Geräte und Meßgeräte..................................................................................................24
4. METHODEN................................................................................................................. 25
4.1 Zellisolation und Behandlung......................................................................................25
4.1.1 Präparation von mononukleären Zellen des peripheren Blutes............................. 25
4.1.2 Negativ-Isolation von Zellpopulationen aus PBMCs............................................ 25
4.1.3 Kultivierung und Behandlung der Zellen..............................................................26
4.2 Quantitative Genexpressionsanalyse...........................................................................26
4.3 Proliferationsassay........................................................................................................27
4.4 Induktion eines „hyporesponsive“ Zustandes............................................................28
4.5 Technik der May-Grünwald-Giemsa Färbung.......................................................... 29
4.6 Proteingewinnung, -aufkonzentration und -konzentrationsbestimmung................29
4.7 Methoden zur Proteinanalyse...................................................................................... 30
4.7.1 Durchflusszytometrische Analyse.........................................................................30
4.7.2 Zytokinquantifizierung.......................................................................................... 30
4.7.3 Nachweis von intrazellulärem CD86 .................................................................... 32
4.7.4 Polyacrylamid-Gelelektrophorese......................................................................... 32
4.7.5 Western-Blotting ................................................................................................... 32
4.7.6 Immunpräzipitation ............................................................................................... 34
4.7.7 Signal Transduction Antibody ArrayTM und Custom Antibody Array................... 34
4.8 2-D-Gelelektrophorese..................................................................................................35
4.8.1 Isoelektrische Fokussierung ..................................................................................35
4.8.2 Zweite Dimension der Gelelektrophorese............................................................. 36
4.8.3 Silberfärbung der Gele (präparatives Gel) ............................................................ 36
4.8.4 Probenvorbereitung für die Malditof-Massenspektroskopie................................. 37
4.8.4.1 Stechen der Spots und tryptischer Verdau im Gel ...........................................37
4.8.4.2 Probenpräparation ............................................................................................ 38
4.9 HDAC kolorimetrischer Aktivitätsassay....................................................................39
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Inhaltsverzeichnis
III
4.10 HDAC-Inhibierungstest ...............................................................................................39
4.11 Statistische Analyse....................................................................................................... 39
5. ERGEBNISSE...............................................................................................................40
5.1 Untersuchung der IL-10-Signaltransduktion.............................................................40
5.1.1 Überprüfung bekannter Parameter, die durch IL-10 beeinflusst werden ..............40
5.1.2 Nach 40 min rh-IL-10-Behandlung ist ein Maximum der Phosphorylierung von
Tyrosinresten erreicht............................................................................................42
5.1.3 Humanes IL-10 verändert das Protein-Phosphorylierungsmuster in Monozyten bei
Untersuchungen mit Hilfe der 2-D-Gelelektrophorese ......................................... 43
5.1.4 Identifikation von Proteinen mit möglicher Relevanz für die IL-10-
Signaltransduktion................................................................................................. 45
5.1.5 Hsp90α, L-Plastin und α-Tubulin werden durch rh-IL-10-Behandlung nicht
Tyrosin-phosphoryliert.......................................................................................... 47
5.1.6 Untersuchungen mit dem Signal Transduction Antibody ArrayTM ....................... 50
5.1.7 Reproduktion der Ergebnisse aus dem Signal Transduction Antibody ArrayTM... 52
5.1.8 JNK1,2,3; MGMT, ICSBP und HDAC1 werden durch humane IL-10-Behandlung
Tyrosin-phosphoryliert.......................................................................................... 53
5.1.9 Die Histon-Deacetylase HDAC1 spielt eine Rolle bei der rh-IL-10-
Signalweiterleitung................................................................................................ 56
5.1.9.1 Rh-IL-10 erhöht die HDAC1-Aktivität in Monozyten ....................................56
5.1.9.2 Die Hemmung der HDAC1 führt zur Aufhebung der Effekte von IL-10 auf die
Oberflächenmoleküle HLA-DR und CD64......................................................56
5.2 Untersuchung der molekularen Effekte einer IL-10-Langzeitbehandlung auf
Monozyten .....................................................................................................................59
5.2.1 Rh-IL-10 hemmt nach kurzer und stimuliert nach langer Behandlung die
Oberflächenexpression von HLA-DR, während die CD86-Expression über den
gesamten Zeitraum der IL-10-Behandlung gehemmt bleibt ................................. 59
5.2.2 Kein intrazelluläres Reservoir an CD86-Protein in den IL-10-behandelten Zellen,
bei gesteigerter Expression von CD86 auf transkriptioneller Ebene,....................60
5.2.3 IL-10-Langzeitbehandlung generiert eine neue APC-Subpopulation................... 62
5.2.4 Charakterisierung der neuen APC-Population ...................................................... 63
5.2.5 Die neue Zellpopulation stimuliert nur schwach die Proliferation der CD4+
T-Zellen im Vergleich zu Kontroll-APCs............................................................. 65
5.2.6 Die neue APC-Population induziert einen „hyporesponsive“ Zustand in CD4+
T-Zellen................................................................................................................. 66
Inhaltsverzeichnis
IV
6. DISKUSSION................................................................................................................ 68
6.1 Untersuchung der IL-10-Signaltransduktion.............................................................68
6.2 Der Phosphorylierungsstatus von JNK, MGMT, ICSBP und HDAC1 wird durch
IL-10 verändert............................................................................................................. 70
6.2.1 IL-10 dephosphoryliert die MAP-Kinasen JNK1 und JNK2................................ 70
6.2.2 IL-10 phosphoryliert die Methylguanin-Methyltransferase (MGMT).................. 72
6.2.3 IL-10 phosphoryliert den Transkriptionsfaktor IFN Consensus Sequence binding
Protein (ICSBP) .................................................................................................... 73
6.2.4 Die Histon-Deacetylase HDAC1 wird durch IL-10 phosphoryliert...................... 74
6.2.4.1 IL-10 steigert die Aktivität der HDAC1 ..........................................................75
6.2.4.2 HDAC vermittelt einen Teil der IL-10-Effekte auf Monozyten ...................... 75
6.2.5 IL-10 Effekte auf L-Plastin und α-Tubulin assoziierte Proteine........................... 77
6.2.6 Hypothetisches Modell der IL-10-Wirkung.......................................................... 78
6.3 Untersuchung der IL-10-Langzeiteinwirkung........................................................... 80
6.3.1 Die Regulation der HLA-DR- und CD86-Expression in IL-10-langzeitbehandelten
Zellen..................................................................................................................... 80
6.3.2 Die IL-10-Langzeitbehandlung generiert eine neue APC-Population .................. 81
6.3.3 Charakterisierung der neuen APC-Population ...................................................... 81
6.3.4 Die neue Zellpopulation stimuliert nur schwach die Proliferation der CD4+ T-
Zellen und erzeugt einen „hyporesponsive“-Zustand............................................83
6.3.5 Andere IL-10-abhängige APC-Populationen ........................................................ 84
6.3.6 Biologische Wirkung der neuen APC-Population................................................. 84
6.4 Ausblick .........................................................................................................................85
7. LITERATURVERZEICHNIS..................................................................................... 87
II ABKÜRZUNGEN.......................................................................................................... A
III ANHANG........................................................................................................................ E
Anhang 1 .................................................................................................................................. E
Anhang 2 ..................................................................................................................................G
IV DANKSAGUNG.............................................................................................................. J
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