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Hybride Modellbildung zur Prozessf¨

uhrung von

Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger

vorgelegt von

Till Alexander P¨

oßel, M.Sc.

an der Fakult¨

at III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universit¨

at Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Ingenieurwissenschaften

- Dr.-Ing. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzende: Prof. Dr. Steffi Knorn

Gutachter: Prof. Dr. Rudibert King

Gutachter: Prof. Dr. Rainer Krull

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 07. Oktober 2024

Berlin 2024

Vorwort

Vor sieben Jahren machte ich mich auf den Weg nach Berlin, um als wissenschaftlicher

Mitarbeiter am Fachgebiet f¨

ur Mess- und Regelungstechnik der TU Berlin meine Promotion

anzustreben. Die Jahre am Fachgebiet und in Berlin haben mein Leben nachhaltig gepr¨

agt

und bereichert. Ich blicke auf eine spannende und intensive Zeit zur¨

uck und m¨

ochte mich

daher bei all den Menschen, die mich bei dieser Arbeit unterst¨

utzt haben, bedanken.

Der gr¨

oßte Dank gilt sicherlich Herrn Prof. Rudibert King f¨

ur die M¨

oglichkeit an diesem

uberaus spannenden Thema forschen zu d¨

urfen sowie den Freiraum, den er mir bei der

Bearbeitung des Themas zugestanden hat. Ohne die unz¨

ahligen und hilfreichen Ratschl¨

age

w¨

are diese Arbeit nicht m¨

oglich gewesen.

Zus¨

atzlich m¨

ochte ich Frau Prof. Steffi Knorn danken, die mir als Prof. Kings Nachfolge-

rin die gleiche Freiheit f¨

ur meine Forschung ließ und jetzt den Pr¨

ufungsvorsitz ¨

uber mein

Promotionsvorhaben ¨

ubernimmt.

Ein weiterer Dank richtet sich auch an Herrn Prof. Rainer Krull f¨

ur seine Bereitschaft die

Rolle als Zweitgutachter zu ¨

ubernehmen und f¨

ur die hilfreichen Ratschl¨

age und Literatur-

empfehlungen, die er mir w¨

ahrend meines Besuchs an der TU Braunschweig gab.

Diese Arbeit w¨

are ohne die zahlreichen, helfenden H¨

ande im Labor nicht zu bewerkstelligen

gewesen. Ein großer Dank geht daher an Marika Peters, Lennart Alker, Manja Laqua und

Magrit Valentin. Ein besonderer Dank gilt zudem Kevin Stegemann, der in seiner Bachelor-

arbeit einen großen Grundstein f¨

ur die praktische Umsetzung im Labor gelegt hat. Dar¨

uber

hinaus m¨

ochte ich Joachim Kraatz und Lars Paarsche f¨

ur die Unterst¨

utzung bei s¨

amtlichen

Computerproblemen danken.

Von meiner Zeit am Fachgebiet nehme ich sehr viele lustige und spannende Momente mit.

F¨

ur die sch¨

one Zeit und die kollegiale Arbeitsatmosph¨

are m¨

ochte ich mich bei allen aktuel-

len und ehemaligen Kollegen bedanken. Bei Terrance Wilms und Fabian Schwenke m¨

ochte

ich mich besonders f¨

ur das Korrekturlesen dieser Arbeit und die vielen Diskussionen bedan-

ken.

Zu guter Letzt gilt mein pers¨

onlicher Dank meinen Eltern f¨

ur die andauernde Unterst¨

utzung

auf meinem Lebensweg.

Kurzfassung

Der filament¨

os wachsende Pilz Aspergillus niger eignet sich aufgrund seiner Sekretionsf¨

ahig-

keit zur industriellen Herstellung von homologen und heterologen Proteinen. Am Beispiel

des Enzyms Glucoamylase wird in dieser Arbeit das Wachstums- und Produktbildungsver-

halten von A.niger in Fed-Batch-Kultivierungen modelliert. Da die klassische Modellierung

von Bioprozessen mit einem hohen Aufwand verbunden ist, wird ein hybrider Modellan-

satz verfolgt, der eine biologisch motivierte Modellbildung mit datenbasierten Methoden

verkn¨

upft und dabei weniger zu erfassende biologische Details ben¨

otigt.

In einem ersten Schritt wird eine haupts¨

achlich datenbasierte Methodik zur schnellen Ent-

wicklung von initialen Modellstrukturen vorgeschlagen, bei der die St¨

ochiometrie ¨

uber eine

Singul¨

arwertzerlegung gesch¨

atzt wird. ¨

Uber eine lineare Umformung werden anschließend

die Messdaten in reaktionsvariante und -invariante Zust¨

ande ¨

uberf¨

uhrt, mit denen die Ki-

netiken identifiziert werden k¨

onnen. Diese werden dabei durch eine Kombination von be-

kannten Modellanteilen und durch ein Multi-Layer Perceptron (MLP) als Black Box-Anteil

beschrieben.

Im zweiten Schritt wird ein strukturiertes, biologisches Modell f¨

ur Fed-Batch-Kultivierungen

von A.niger hergeleitet, das auch Online-Messgr¨

oßen umfasst und f¨

ur die Prozessf¨

uhrung

geeignet ist. In diesem Modell wird die Produktbildungskinetik von Glucoamylase durch

ein MLP formuliert, wobei unterschiedliche Strukturen und Strategien f¨

ur das Training des

MLPs untersucht werden. F¨

ur die Bildung von Glucoamylase kann ein Zusammenhang mit

der Glucosekonzentration im Reaktor aufgezeigt werden.

Aufbauend auf dem hergeleiteten Modell wird anschließend ein Sigmapunkt-Kalman-Filter

f¨

ur den Fed-Batch-Prozess implementiert und zus¨

atzlich eine Versuchsplanung mit dem Ziel

der Maximierung der Glucoamylaseaktivit¨

at durchgef¨

uhrt.

Abstract

Due to its high secretion capability, the filamentous growing fungus Aspergillus niger is a

promising candidate for the industrial production of homologous and heterologous proteins.

In this work, the growth and product formation of A.niger in fed-batch cultivations is

modelled by using the enzyme glucoamylase as an example product. Since classical modeling

of bioprocesses involves a great deal of effort, a hybrid modeling approach is being pursued

that combines biologically motivated modeling with data-based methods and requires fewer

biological details to be captured.

In the first part, a data-based methodology for the rapid development of initial model

structures is proposed, in which a pseudo-stoichiometry is estimated via singular value

decomposition. Then, a linear transformation is used to convert the measured data into

reaction-variant and -invariant states with which the kinetics of the model can be identified.

The kinetics are described by a combination of a mechanistic model part and a multi-layer

perceptron (MLP) as black box part.

In the second part, a structured biological model for A.niger is derived, which also includes

online measurement data and can therefore be used for process control. In this model, the

product formation kinetics are replaced by an MLP, and different structures and strategies

for training the MLP are investigated. A relationship between the glucose concentration in

the reactor and the formation of glucoamylase can be revealed.

The last part deals with an implementation of a sigma-point Kalman filter based on the

derived model for the fed-batch process. In addition, a process optimization is performed to

maximize the glucoamylase activity at the end of the cultivation.

Inhaltsverzeichnis

Symbolverzeichnis i

1 Einleitung 1

1.1 Ziele und Gliederung der Arbeit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 2

2 Theoretische Grundlagen 4

2.1 Modellidentifikation und Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.1 Allgemeine Modellstruktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4

2.1.2 Parameteridentifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

2.1.3 Latin Hypercube Sampling . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.1.4 Parameterunsicherheit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

2.1.5 Beobachtbarkeit.............................. 8

2.1.6 Identifizierbarkeit............................. 9

2.1.7 Multi-Layer Perceptron . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

2.2 Hybride Modellentwicklung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

2.2.1 Allgemeine Struktur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

2.2.2 Reaktionsschema ............................. 14

2.2.3 Reaktionsvariante Zust¨

ande ....................... 16

2.2.4 Identifikation der Kinetiken mit k¨

unstlichen Neuronalen Netzen . . . 17

2.2.5 Parameteridentifikation des gesamten Modells . . . . . . . . . . . . . 19

2.3 Prozessf¨

uhrung .................................. 20

2.3.1 Versuchsplanung ............................. 20

2.3.2 Optimale Versuchsplanung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

2.3.3 Sigmapunkt-Kalman-Filter . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22

2.4 Iterative Modellverbesserung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

3 Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger 30

3.1 Aspergillus niger ................................. 30

3.2 Glucoamylase und Analytik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

3.2.1 Analytik der Glucoamylaseaktivit¨

at................... 34

2 Inhaltsverzeichnis

3.3 Medium ...................................... 35

3.4 Versuchsaufbau und Durchf¨

uhrung ....................... 35

Nahinfrarotspektroskopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 37

3.5 Messunsicherheiten ................................ 37

3.6 Versuchs¨

ubersicht................................. 38

4 Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger 40

4.1 Interpolation der Messdaten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 40

4.2 Ergebnisse..................................... 41

4.2.1 Modell 1 - Beschreibung der Wachstumsgeschwindigkeit . . . . . . . 42

Iterative Modellverbesserung f¨

ur Modell 1 . . . . . . . . . . . . . . . 47

4.2.2 Modell 2 - Anpassung einer Produktbildungskinetik . . . . . . . . . . 49

4.2.3 Modell 3 - Parameteridentifikation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

Iterative Modellverbesserung f¨

ur Modell 3 . . . . . . . . . . . . . . . 55

4.3 Zusammenfassung und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

5 Herleitung eines strukturierten Modells 61

5.1 Einleitung und Ziele der Modellbildung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

5.1.1 Literaturmodelle ............................. 61

5.1.2 Vorgehen ................................. 62

5.1.3 Annahmen................................. 63

5.2 Mess- und Eingangsgr¨

oßen............................ 63

5.2.1 Messgr¨

oßen ................................ 63

5.2.2 Eingangsgr¨

oßen.............................. 64

5.3 Modellbeschreibung................................ 65

5.3.1 Wachstum................................. 65

5.3.2 Kohlenstofflimitierung, Inaktivierung und Erhaltungsstoffwechsel . . . 67

5.3.3 Aufnahme und Freisetzung von Ammonium und Phosphat . . . . . . 69

5.3.4 Biomasse und Substratspeicher . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

5.3.5 Substrate ................................. 71

5.3.6 Volumen der zugegebenen Base . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

5.3.7 Gel¨

ostsauerstoff im Medium . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72

5.3.8 Kohlenstoffdioxid im Abgas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

5.3.9 Glucoamylase............................... 75

5.3.10Volumen.................................. 75

5.4 Zustandsgr¨

oßen.................................. 75

5.5 Messgleichung................................... 76

5.6 Diskrete Zustands¨

anderungen .......................... 77

5.7 Modellparameter ................................. 77

Inhaltsverzeichnis 3

5.8 Ergebnisse der Modellanpassung . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

5.9 Zusammenfassung und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

6 Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung 90

6.1 Vorgehen...................................... 90

6.2 ¨

Ubersicht ¨

uber die durchgef¨

uhrten Versuche . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

6.3 Einflussfaktoren und Hypothesen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

6.4 Strukturen der hybriden Kinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

6.5 Auswahl geeigneter Eingangsdaten f¨

urdasMLP................ 94

6.6 Strategien zur Anpassung eines MLPs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

6.7 Ergebnisse..................................... 98

6.8 ¨

Uberf¨

uhrung in eine mechanistische Kinetik . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

6.9 Zusammenfassung und Diskussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

7 Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger 109

7.1 Zustandssch¨

atzung ................................109

7.1.1 Beobachtbarkeit..............................110

7.1.2 Ergebnisse.................................110

7.2 Trajektorienplanung ...............................116

7.2.1 Planung ..................................116

7.2.2 Diskussion und Ausblick . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

8 Zusammenfassung und Ausblick 122

8.1 Zusammenfassung.................................122

8.2 Ausblick und Ans¨

atze f¨

ur weitere Arbeiten . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

Literaturverzeichnis 126

A Anhang 134

A.1 Vorversuche....................................134

A.2 Unsicherheitsbestimmungen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 137

A.3 VersuchF2 ....................................140

A.4 Zustandssch¨

atzung ................................141

Symbolverzeichnis

Abk¨

urzungen

Abk¨

urzung Bedeutung

ABC Advanced Batch Control System

AFOAM Antischaummittel

BTM Biotrockenmasse

CDKF Central Difference Kalman Filter

DNA Desoxyribonukleins¨

aure

DOT Dissolved Oxygen Tension, Gel¨

ostsauerstoff

EKF Extended Kalman Filter

FIM Fisher’sche Informationsmatrix

FQ Fehlerquadrate

GA Glucoamylase

GGW Gleichgewicht

Kat Katal

LHS Latin Hypercube Sampling

MLE Maximum Likelihood Estimation

MLP Multi-Layer Perceptron

MLPCA Maximum Likelihood Principal Component Anaylsis

NIR Nahinfrarot-Spektroskopie

NMPC Nonlinear Modelpredictive Control

NN Neuronale Netze

OVP Optimale Versuchsplanung

PI Parameteridentifikation

PNPG p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

RNA Ribonukleins¨

aure

SDS-PAGE Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Electrophoresis

SPKF Sigmapunkt-Kalman-Filter

ii Symbolverzeichnis

TP Trajektorienplanung

u.d.N. unter der Nebenbedingung, dass . . .

UKF Unscented Kalman Filter

WMLE gewichtete Maximum Likelihood Estimation

Griechische Buchstaben

Symbol Bedeutung Einheit

αSignifikanzniveau beim Hypothesentest

αGA Wachstumsbezogener Faktor in Luedeking-Piret Kinetik [µKat

βGA Biomassebezogener Faktor in Luedeking-Piret Kinetik [µKat

g h ]

βCO2Stoff¨

ubergangskoeffizient von CO2f¨

ur den ¨

Ubergang von der Fl¨

ussig-

in die Gasphase [L

δDirac-Funktion

δk,l Kronecker-Delta

ϵSchwellenwert bei der Wahl der Reaktion

εAbweichung zwischen Messwert und Ausgang des stochastischen Sy-

stems

θParametervektor

θQParameter der Spektaldichtematrix des Zustandsrauschens

Θ Sigmapunkte f¨

ur die Parameterunsicherheiten

λEigenwert

µiMaximale spezifische Rate der Reaktion i[1

µmax Maximale spezifische Wachstumsrate [1

νFreiheitsgrad beim Hypothesentest

νMessrauschen

ρXBiomassedichte [ g

Σ Singul¨

arwertmatrix

σSingul¨

arwert

σStandardabweichung

Φ G¨

utefunktional

ωZustandsrauschen

Lateinische Buchstaben, klein

Symbol Bedeutung Einheit

Symbolverzeichnis iii

aGA Volumenbezogene Aktivit¨

at von GA im Medium [µKat

¯cTransportfreier Konzentrationsvektor

˜cZentrierter, transportfreier Konzentrationsvektor

ciKonzentration der Komponente iim Medium [ g

c∗

O2S¨

attigungskonzentration von Sauerstoff in Wasser [ g

eQuadratische Abweichung, Fehler

fModellgleichungen

fMLP Gleichung des Multi-Layer Perceptrons

giZellinterne Konzentration der Komponente i[g

hMessgleichungen

hAuslegungsparameter beim Sigmapunkt-Kalman-Filter

kLAStoff¨

ubergangskoeffizient von Sauerstoff [L

kij Element aus der i-ten Zeile und j-ten Spalte aus der st¨

ochiometrischen

Matrix K

miMasse der Komponente iim Medium [g]

˙nStoffstrom [mol

ncAnzahl der Komponenten

nhAnzahl der Hidden Layer

npAnzahl der Parameter

nrAnzahl der Reaktionen

nxAnzahl der Zust¨

ande

nyAnzahl der Messgr¨

oßen

npQAnzahl der Parameter der Spektraldichtematrix

pDruck im Reaktor

qVektor der zugef¨

utterten Substratstr¨

ome [ g

L h ]

rSchalter Schalterfunktion

rXWachstumsgeschwindigkeit [g

rX,in Inaktivierungsgeschwindigkeit [g

rReaktionsvektor

riAllgemein: Reaktionsgeschwindigkeit bezogen auf die Gr¨

oße i

rGA GA-Bildungskinetik [µKat

sAktivierungsfunktion

tInverse kumulierte Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der Student-t-Verteilung

tZeit [h]

t0Anfangszeitpunkt [h]

tend Zeitpunkt zum Versuchsende [h]

tSc Teststatistik f¨

ur Hypothesentest

iv Symbolverzeichnis

uStellgr¨

oßenvektor

uorthonormaler Vektor

ui,F eed Zufluss der Komponente i[L

¯xErweiterter Zustandsvektor bei ¨

Uberpr¨

ufung der Identifizierbarkeit

xZustandsvektor

xwErweiterter Zustandsvektor beim Sigmapunkt-Kalman-Filter

xin Eingangsdaten f¨

ur das MLP

yMessgr¨

oßenvektor

yiAusgabe der i-ten Schicht eines MLPs

yiv reaktionsinvarianter Zustand

yrreaktionsvarianter Zustand

Lateinische Buchstaben, groß

Symbol Bedeutung Einheit

AGA Aktivit¨

at von Glucoamylase im Reaktor [µKat]

CO2Kohlenstoffdioxid

CKovarianzmatrix der Messung

CDatenmatrix

CθθKovarianzmatrix der Parametersch¨

atzung

EErwartungswert

EFehlerterm beim Training des MLPs

FFisher’sche Informationsmatrix

FSumme aller Zu- und Abfl¨

usse aus dem Reaktor [L

F1, . . . , F11 Fermentation 1,. . . , Fermentation 11

HHesse-Matrix

Hcc Henry-Konstante [−]

H0Nullhypothese

H1Alternativhypothese

JKG¨

utefunktional f¨

ur die Anpassung der St¨

ochiometriematrix K

KKalman-Matrix

KPseudost¨

ochiometriematrix

KiHalbss¨

attigungskonstante bezogen auf Komponente i

LLie-Ableitung

MiMolmasse von Molek¨

ul i[g

mol ]

NAnzahl der Messungen eines Versuchs

Symbolverzeichnis v

NBAnzahl der durchgef¨

uhrten Pseudoversuche (Bootstrap)

NVAnzahl der Versuche

PKovarianzmatrix des aktuellen Sch¨

atzfehlers

QSpektraldichtematrix des Zustandsrauschens

RAllgemeine Gaskonstante [ J

mol K ]

RKovarianzmatrix des Messrauschens beim SPKF

TTemperatur [K]

TTransformationsmatrix zur Berechnung der reaktionsvarianten Zust¨

ande

T1Zeitkonstante des Gel¨

ostsauerstoffsensors [1

VVolumenstrom [L

VBase Volumen der zugegebenen Base [mL]

VVolumen [L]

V1, . . . , V18 Varianten der hybriden GA-Kinetik

VXZellvolumen

VP robe Probenahmevolumen [L]

WGewichtungsmatrix einer Layer

XSigmapunkt f¨

ur den Zustandsvektor bzw. f¨

ur den erweiterten Zustands-

vektor

XθZustandssensitivit¨

at bez¨

uglich der Parameter

Xin Inaktive Biomasse

YSigmapunkt f¨

ur den Messvektor

YErtrags-/Ausbeutekoeffizient

Yi,j Ertrags-/Ausbeutekoeffizient der Komponente ibezogen auf j[g

Indizes und Modifikatoren

Symbol Bedeutung

√Ai

i-te Spalte aus der Cholesky-Zerlegung der Matrix A

˙vZeitliche Ableitung

ˆvgesch¨

atzter Wert

(v)2Dyadisches Produkt

∥v∥22-Norm eines Vektors

vVektor

vTTransponierter Vektor

|v|Betrag eines Vektors

m(v) Mittelwert des Vektors v

ˆx+Zustandsvektor nach Measurement Update

ˆx−Zustandsvektor nach Time Update

Tief- und hochgestellte Zeichen

Symbol Bedeutung

add Additive Struktur

Am Ammonium

AmSp Ammoniumspeicher

aus Ausgehender Strom

BT M Biotrockenmasse, gesamte Biomasse

CSp Kohlenstoffspeicher

ein Eingehender Strom

Erh Erhaltungsstoffwechsel

gGasf¨

ormig

GA Glucoamylase

GGW Gleichgewicht

Glc Glucose

in Inaktivierung

intp interpolierte Werte

lFl¨

ussig

LP An Luedeking-Piret-Kinetik angelehnte Struktur

MHochgestellt: Gemessener Wert

MTiefgestellt: Bekannter Anteil einer Kinetik

max Maximaler Wert bzw. obere Grenze

min Minimaler Wert bzw. untere Grenze

MLP Tiefgestellt: Unbekannter Anteil einer Kinetik bzw. durch MLP be-

schriebener Anteil

Modell Hochgestellt: Simulierter Wert

mul Multiplikative Struktur

Ph Phosphat

PSp Phosphatspeicher

SSubstrat, allgemein

sensor Sauerstoffsensor

XBiomasse bzw. aktive Biomasse

Xin Inaktive Biomasse

Kapitel 1

Einleitung

In den kommenden Jahrzehnten wird die Bedeutung von biotechnologisch hergestellten Pro-

dukten wie beispielsweise Impfstoffen, Medikamenten, Biopolymeren sowie Grundchemika-

lien immer mehr zunehmen. Urs¨

achlich hierf¨

ur ist, dass durch Mikroorganismen wesentlich

komplexere Molek¨

ule wie Proteine hergestellt werden k¨

onnen als es bei etablierten, chemi-

schen Prozessen der Fall ist. Diese Prozesse werden h¨

aufig durch eine geeignete Stamm-

und Medienwahl hinsichtlich ihrer Produktivit¨

at optimiert. Daneben kann die Expression

von homologen oder heterologen Proteinen auch durch gentechnische Modifikationen, wie

durch Insertion von mehreren Kopien bestimmter Zielgene in die DNA des Wirts, gesteigert

werden.

W¨

ahrend diese Verfahren in der Biotechnologie heute vielfach angewandt werden, stellt

der Einsatz modellgest¨

utzter Methoden zur Prozessoptimierung in der Biotechnologie noch

immer eher eine Ausnahme als die Regel dar. Unter dem Stichwort Digital Twin wird

ein dynamisches Modell eines Bioprozesses verstanden, mit dem reale Versuche durch Si-

mulationen am Computer ersetzt oder erg¨

anzt werden k¨

onnen [1]. Neben der Einsparung

von Kosten f¨

ur Versuche verspricht ein dynamisches Prozessmodell auch ein tieferes Pro-

zessverst¨

andnis und eine bessere Planbarkeit von Versuchen. In Kombination mit zum Bei-

spiel der Nahinfrarot-Spektroskopie (NIR) oder der Raman-Spektroskopie stehen zudem

Technologien zur Verf¨

ugung, mit denen der Verlauf wichtiger Prozessgr¨

oßen wie den Sub-

stratkonzentrationen online ¨

uberwacht und darauf aufbauend geregelt werden kann. Intelli-

gente Regelungskonzepte versprechen dabei neben einer weiteren Produktivit¨

atssteigerung

durch ein optimiertes Substratangebot im dynamischen Verlauf des Prozesses auch die Ver-

ringerung von St¨

oreinfl¨

ussen.

In der Regelungstechnik sind modellgest¨

utzte Verfahren zur ¨

Uberwachung und Regelung von

nichtlinearen Prozessen wie die Zustandssch¨

atzung oder der nichtlinearen modellpr¨

adiktiven

Regelung (NMPC) seit Jahren etabliert. Die Anwendung in der Biotechnologie scheitert je-

2 Kapitel 1. Einleitung

doch immer wieder an der aufw¨

andigen Modellbildung von Bioprozessen. So weisen Mikro-

organismen einen komplexen Stoffwechsel auf, w¨

ahrend gleichzeitig nur wenige Online-

Messgr¨

oßen verf¨

ugbar sind, so dass viele Vorg¨

ange im Detail nicht beobachtet werden

k¨

onnen.

Als Ausweg wird in den letzten Jahren vermehrt das Konzept der hybriden Modellbildung

eingesetzt, bei der die biologisch-motivierte Modellbildung mit datenbasierten Ans¨

atzen

aus dem Machine-Learning kombiniert wird. Auf diese Weise k¨

onnen komplexe, biologische

Zusammenh¨

ange durch nichtparametrische Ans¨

atze beschrieben und automatisch gelernt

werden, ohne dass hierzu umfangreiche Experimente mit der Messung einer Vielzahl von

Komponenten notwendig sind. Viele in der Literatur beschriebene Methoden zur hybriden

Modellbildung werden jedoch h¨

aufig an simulativen Beispielen demonstriert und gehen auf

die in der Realit¨

at h¨

aufig schwierige Messsituation, die durch wenige und gleichzeitig unsi-

chere Messgr¨

oßen gekennzeichnet ist, nicht weiter ein.

Im Rahmen dieser Arbeit werden daher einige Ans¨

atze zur hybriden Modellbildung f¨

ur rea-

le Fed-Batch-Kultivierungen mit dem Pilz Aspergillus niger untersucht, um damit sowohl

die daraus erwachsenden M¨

oglichkeiten als auch die Grenzen aufzuzeigen. Der filament¨

wachsende Pilz A.niger ist ein in der Biotechnologie h¨

aufig anzutreffender Organismus, der

aufgrund seiner hohen Sekretionsf¨

ahigkeit zur Produktion des Enzyms Glucoamylase (GA)

und weiterer homologer und heterologer Proteine eingesetzt wird. Eine hybride mathema-

tische Modellierung f¨

ur den diesen industriell wichtigen Stamm wurde bisher nur anhand

einer sehr einfachen Modellstruktur und dem Zielprodukt Natriumgluconat von Dong et

al. [2] durchgef¨

uhrt. Bis dato wurde f¨

ur A.niger jedoch keine hybride Modellbildung mit

komplexeren Modellstrukturen und darauf aufbauend eine modellgest¨

utzte Prozessf¨

uhrung

f¨

ur das Produkt Glucoamylase beschrieben.

1.1 Ziele und Gliederung der Arbeit

Es stellt sich daher die Frage, ob mit Hilfe eines hybriden Modells und modellgest¨

utzter

Methoden der Regelungstechnik die erzielte Glucoamylaseaktivit¨

at in einem Fed-Batch-

Prozess mit A.niger gesteigert werden kann.

Aus biotechnologischer Sicht ergibt sich damit die Aufgabe, ein strukturiertes, hybrides Mo-

dell zur Beschreibung der Glucoamylasebildung durch A.niger in Abh¨

angigkeit des N¨

ahrstoff-

angebots aufzustellen. Anschließend soll das Modell beispielhaft zur Maximierung der Gluco-

amylaseaktivit¨

at im Rahmen einer Versuchsplanung und zur Zustandssch¨

atzung mit einem

Sigmapunkt-Kalman-Filter (SPKF) genutzt werden.

Auf methodischer Ebene verfolgt diese Arbeit dar¨

uber hinaus das Ziel, eine allgemeine Me-

thode f¨

ur die Erstellung einfacher bzw. initialer, hybrider Modellstrukturen herzuleiten und

1.1. Ziele und Gliederung der Arbeit 3

die Anwendbarkeit der hybriden Modellbildung an realen Kultivierungen zu demonstrie-

ren. Dabei sollen insbesondere L¨

osungsm¨

oglichkeiten f¨

ur die Wahl der Meta-Struktur, f¨

das Training hybrider Modellanteile ohne direkte Trainingsdaten sowie f¨

ur die schwierige

Messsituation bei realen Anwendungen aufgezeigt und diskutiert werden. Als weiteres Ziel

soll untersucht werden, wie die hybride Modellbildung zur Verbesserung einer mechanisti-

schen Modellbildung durch Offenlegung von verdeckten Zusammenh¨

angen genutzt werden

kann.

Die vorliegende Arbeit gliedert sich in folgende Abschnitte. Die f¨

ur die Modellbildung

und Prozessf¨

uhrung notwendigen mathematischen Grundlagen werden im zweiten Kapitel

”Theoretische Grundlagen“ beschrieben. Außerdem wird im Unterkapitel 2.2 ein Vorgehen

zur hybriden Modellbildung aufgezeigt und formalisiert, bei dem die Identifikation einer

Pseudost¨

ochiometrie mit einer hybriden Beschreibung der Kinetiken durch k¨

unstliche, neu-

ronale Netze kombiniert wird.

Anschließend werden der Versuchsaufbau, die Messmethoden sowie Eigenschaften des Pilzes

A.niger im Kapitel 3 ”Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger“ vorgestellt.

In Kapitel 4 ”Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger“ wird die zu-

vor beschriebene Methode zur hybriden Modellbildung auf Kultivierungen mit A.niger an-

gewandt. Neben der Modellbildung, mit der bereits anhand weniger Versuche ein erstes

initiales Modell erstellt werden kann, werden auch die Probleme bei der Anwendung ei-

ner haupts¨

achlich datenbasierten Modellbildung auf reale Kultivierungen diskutiert. Das

initiale Modell dient als Basis f¨

ur die weitere Modellbildung sowie zur Offenlegung und Un-

tersuchung von Zusammenh¨

angen zwischen dem Wachstum, der Produktbildung und den

Substratkonzentrationen.

Demgegen¨

uber steht im f¨

unften Kapitel ”Herleitung eines strukturierten Modells“ eine ver-

tiefte, biologisch-motivierte Modellbildung, in der anhand einer gr¨

oßeren Anzahl an Versu-

chen ein strukturiertes Modell f¨

ur A.niger hergeleitet wird.

Darauf aufbauend wird die Produktbildungskinetik f¨

ur Glucoamylase im sechsten Kapi-

tel ”Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung“ ebenfalls mit einem hybriden Ansatz

formuliert und mehrere Strategien zum Vorgehen bei der hybriden Modellbildung disku-

tiert.

Abschließend wird das resultierende, hybride Modell in Kapitel 7 ”Prozessf¨

uhrung mit ei-

nem hybriden Modell f¨

ur A.niger“ f¨

ur die Prozessf¨

uhrung von Fed-Batch-Kultivierungen

mit A.niger genutzt. Einerseits wird die Zustandssch¨

atzung mit einem SPKF aufgezeigt

und andererseits eine Versuchsplanung zur Maximierung der Glucoamylaseaktivit¨

at durch-

gef¨

uhrt.

Kapitel 2

Theoretische Grundlagen

Das folgende Kapitel gibt einen kurzen ¨

Uberblick ¨

uber die f¨

ur die Modellbildung und die

Prozessf¨

uhrung notwendigen Methoden. Die Darstellung beschr¨

ankt sich auf die wichtigsten

mathematischen Zusammenh¨

ange, die zum Verst¨

andnis der Arbeit notwendig sind. Eine de-

taillierte Beschreibung, wie die Methoden numerisch in dem verwendeten Advanced Batch

Control System (ABC-System) zur Modellbildung und Prozessf¨

uhrung in Matlab implemen-

tiert sind, findet sich in [3], [4] und [5].

2.1 Modellidentifikation und Analyse

2.1.1 Allgemeine Modellstruktur

Bei der Modellierung von dynamischen Bioprozessen fließt so weit wie m¨

oglich biologi-

sches Wissen ¨

uber den Prozess mit in die Modellstruktur ein. Je nach Vorwissen und

verf¨

ugbaren Messungen kann die Modelltiefe unterschiedlich detailliert ausfallen. In der Re-

gel weisen Fed-Batch-Kultivierungen von Mikroorganismen jedoch starke Nichtlinearit¨

aten

auf, so dass sie im Allgemeinen durch nichtlineare Differentialgleichungssysteme beschrieben

werden m¨

ussen. Die Bilanzgr¨

oßen eines Biomodells, auch Zustandsgr¨

oßen xgenannt, sind die

Massen der Biomasse, Substrate, Metabolite und der Produkte sowie das Fermentationsvo-

lumen. Durch regelm¨

aßige Probenahmen kann die Konzentration der Massen an diskreten

Zeitpunkten tk=t(k) bestimmt werden. Daher besteht ein Modell f¨

ur biotechnologische

Prozesse aus einem System aus Differentialgleichungen zur Beschreibung der kontinuierli-

chen Prozesse mit den rechten Seiten fund den zeitdiskreten Messgleichungen mit dem

deterministischen Anteil h.

˙x(t) = f(t, x(t), u(t), θ), x(t0) = x0(2.1)

y(tk) = h(x(tk), u(tk), θ) + ν(tk) (2.2)

2.1. Modellidentifikation und Analyse 5

In dem Modell bezeichnet tdie Zeit, x∈Rnxdie nxZustandsgr¨

oßen, udie nuStellgr¨

oßen,

mit denen das System von außen beeinflusst werden kann, ydie nyMessgr¨

oßen und θ∈Rnp

die npModellparameter, wobei diese ¨

uber eine Parameteridentifikation bestimmt werden.

Das Messrauschen ν(tk)∈Rnywird durch einen normalverteilten, mittelwertfreien, weißen

Rauschprozess beschrieben.

2.1.2 Parameteridentifikation

Uber eine Parameteridentifikation sollen die Modellparameter θso bestimmt werden, dass

das Modell die Messdaten m¨

oglichst exakt wiedergeben kann. Es existiert eine Vielzahl an

Sch¨

atzverfahren mit unterschiedlichen G¨

utekriterien Φ. In dieser Arbeit wird das G¨

ute-

funktional in Anlehnung an [3] auf Grundlage der Maximum Likelihood Estimation (MLE)

definiert [6],[7]. Die Idee der MLE besteht in der Maximierung der bedingten Wahrschein-

lichkeitsdichte p(Y|θ), die die Wahrscheinlichkeitsdichte f¨

ur die beobachteten Messwerte Y

unter der Bedingung der gew¨

ahlten Parameter θbeschreibt [8]. Wenn das Messrauschen

als mittelwertfrei, unkorreliert und normalverteilt mit bekannter Kovarianzmatrix ˜

Ckam

Zeitpunkt tkangenommen wird, entspricht das MLE-Verfahren einer Markov-Sch¨

atzung [9].

Das gleiche G¨

utefunktional wird auch erhalten, wenn bei dem gewichteten Least-Squares-

Verfahren die Gewichtung mit der Inversen der Kovarianzmatrix ˜

C−1

kerfolgt. Durch die-

se Gewichtung beeinflussen unsichere Messwerte weniger stark die Parameteridentifikation

als sichere Messwerte. Mit einer Gewichtungsmatrix Wals weiteren Freiheitsgrad k¨

onnen

dar¨

uber hinaus die zeitlichen Abst¨

ande der Messwerte und empirische ¨

Uberlegungen mit in

dem nachfolgend dargestellten G¨

utefunktional ΦW MLE ber¨

ucksichtigt werden [3].

ΦW MLE (θ) = 1

j=1

k=1 yM(tk)−h(x(tk), u(tk), θ)TWk·˜

C−1

kyM(tk)−h(x(tk), u(tk), θ)

(2.3)

In dem G¨

utefunktional wird die quadrierte, gewichtete Abweichung zwischen den gemes-

senen Gr¨

oßen yM(tk) zum Zeitpunkt tkund den berechneten Messgr¨

oßen aus dem Modell

h(x(tk), u(tk), θ) f¨

ur alle NjMesszeitpunkte und f¨

ur alle NVVersuche aufsummiert.

Die Berechnung des G¨

utefunktionals ΦW MLE(θ) erfordert die L¨

osung des Differentialglei-

chungssystems mit den aktuellen Parametern θ. Die Anpassung der Parameter geschieht

durch eine nichtlineare Optimierung, bei der das G¨

utefunktional ΦW MLE(θ) minimiert wird.

θ= argmin

ΦW MLE (θ) (2.4)

Nach der Anpassung ist eine Kreuzvalidierung sinnvoll, bei der die Modellg¨

ute auch f¨

Versuche ¨

uberpr¨

uft wird, die nicht zur Anpassung der Modellparameter genutzt werden.

Auf diese Weise wird sichergestellt, dass das Modell verallgemeinerbar ist.

6 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

2.1.3 Latin Hypercube Sampling

Die Parameteridentifikation ben¨

otigt Anfangssch¨

atzparameter θ0, mit denen die Optimie-

rung initialisiert werden kann. Nichtlineare Optimierungsprobleme sind h¨

aufig nicht kon-

vex, so dass mehrere lokale Minima auftreten k¨

onnen. Die lokalen Minima stellen gegen¨

uber

dem globalen Optimum nur suboptimale L¨

osungen dar und k¨

onnen somit die Modellg¨

ute

erheblich verschlechtern. Ob die Optimierung in einem lokalen Minimum endet, h¨

angt ent-

scheidend von der Wahl der Startparameter ab. In biologischen Modellen k¨

onnen nur wenige

Parameter a priori sinnvoll bestimmt werden. In der Regel fassen Biomodelle komplexere

Ph¨

anomene in einfacheren Modellstrukturen zusammen, so dass sich die Modellparameter

selbst nur auf Vereinfachungen beziehen und sie nicht direkt gemessen werden k¨

onnen. Da-

her k¨

onnen f¨

ur die Modellparameter meist nur zul¨

assige Parametergrenzen, in denen die

Parameter wahrscheinlich liegen, angegeben werden.

Eine globale Optimierung, die den gesamten, erlaubten Parameterraum untersucht, ist sehr

aufw¨

andig und rechenzeitintensiv. ¨

Uber Sampling-Methoden wie das Latin Hypercube Samp-

ling [10],[11] kann jedoch die Parameteridentifikation gegen¨

uber lokalen Minima robustifi-

ziert werden. Hierbei wird der Parameterraum f¨

ur jeden Parameter in gleich große Intervalle

- den sogenannten Cubes - unterteilt. Es werden dann ncubes Samples genommen, bei de-

nen die Kombination der Parameter zueinander latin ist. Latin bedeutet, dass insgesamt

jeweils nur ein Sample f¨

ur einen Parameter pro Intervall genutzt wird, so dass die Samples

gleichm¨

aßig im Parameterraum verteilt sind. F¨

ur jedes Sample wird eine Parameteridenti-

fikation durchgef¨

uhrt. Das Vorgehen wird mehrmals mit nSeeds verschiedenen Seeds f¨

ur die

Sample-Generierung wiederholt, um eine h¨

ohere G¨

ute der Anpassung zu erhalten. Die Para-

meterkombination mit der geringsten G¨

ute ¨

uber alle Cubes und Seeds n¨

ahert sich dabei dem

globalen Optimum an. Die in dieser Arbeit verwendete Implementierung von LHS basiert

auf [11].

2.1.4 Parameterunsicherheit

Da unsichere Parameter auch zu einer unsicheren Modellvorhersage in der Simulation und

Versuchsplanung f¨

uhren, ist die Bestimmung der Parameterunsicherheit wichtig. Eine ho-

he Parameterunsicherheit kann zudem auf eine mangelnde Identifizierbarkeit hindeuten, da

entweder die durchgef¨

uhrten Versuche nicht informativ genug sind (praktische Identifizier-

barkeit) oder die Parameter strukturell aufgrund fehlender Messgr¨

oßen nicht identifizierbar

sind. Die Parameterkovarianz Cθθwird in dieser Arbeit als Maß f¨

ur die Parameterunsi-

cherheit herangezogen und ¨

uber die Fisher’sche Informationsmatrix (FIM) und mit dem

Bootstrap-Verfahren abgesch¨

atzt.

2.1. Modellidentifikation und Analyse 7

Fisher’sche Informationsmatrix

Die Fisher’sche Informationsmatrix (FIM) ist ein Maß, wie informativ ein Versuch bez¨

uglich

der Parametersch¨

atzung ist. Mit der Inversen der FIM, F−1, kann zudem eine untere Grenze

f¨

ur die Parameterkovarianz Cθθbestimmt werden [8]. Dabei wird vorausgesetzt, dass der

gesch¨

atzte Parametervektor ˆ

θnahe am wahren Parametervektor θliegt. Im Vergleich zum

Bootstrap-Verfahren ist der Weg ¨

uber die FIM deutlich rechenzeiteffizienter.

Die FIM f¨

ur alle NVdurchgef¨

uhrten Versuche berechnet sich durch die Addition der FIMs

der Einzelversuche Fj. Es gilt dann f¨

ur die gesch¨

atzte Parameterkovarianz ˆ

Cθθin Abh¨

angigkeit

von F[3],[7]:

Cθθ=Eˆ

θ−θˆ

θ−θT≥F−1= NV

j=1

Fj!−1

(2.5)

Die FIM kann aufgrund der Unkenntnis des wahren Parametervektors θnur n¨

aherungsweise

berechnet werden und auch nur dann, wenn der gesch¨

atzte Paramtervektor ˆ

θausreichend

nahe am wahren Wert von θliegt. Im Folgenden wird hk=h(x(tk), u(tk), θ) als Kurz-

schreibweise f¨

ur den Modellausgang am Messzeitpunkt tkeingef¨

uhrt. Die Berechnung der

gesch¨

atzten FIM ˆ

Ferfordert neben der Messkovarianz ˜

C−1

kauch die Ausgangssensitivit¨

des Modells nach den Parametern, dhk

dθ , ausgewertet an dem gesch¨

atzten Parametervektor ˆ

und summiert ¨

uber alle NjMesszeitpunkte [3],[12]:

Fj=

k=1 "dhk

dθ T

C−1

kdhk

dθ #ˆ

.(2.6)

Da der Modellausgang von den Zust¨

anden xund somit indirekt von den Parametern θ

abh¨

angt, muss zus¨

atzlich auch die Zustandssensitivit¨

at dx(t)

dθ ˆ

θ=Xθ(t) ber¨

ucksichtigt wer-

den. F¨

ur die Ausgangssensitivit¨

at gilt [3]:

dhk

dθ ˆ

=∂hk

∂x

dx(t)

dθ ˆ

+∂hk

∂θ ˆ

(2.7)

Zur Berechnung der Zustandssensitivit¨

at Xθ(t) werden die Modellgleichungen fnach den

Parametern θabgeleitet. Die resultierende Matrixdifferentialgleichung wird gleichzeitig mit

den Modellgleichungen durch Integration gel¨

ost, wobei unter der Voraussetzung, dass x0

bekannt und nicht von dem Parameter θabh¨

angig ist, f¨

ur die Anfangsbedingung Xθ(t0) = O

gilt [3].

Xθ(t) = d

dx(t)

dθ =∂f

∂x

dx(t)

dθ +∂f

∂θ (2.8)

Bootstrap

Da die Methode ¨

uber die FIM nur bedingt f¨

ur Parameter, die nichtlinear in das Modell

eingehen, geeignet ist, wird die Parameterunsicherheit Cθθ zus¨

atzlich ¨

uber das Bootstrap-

Verfahren abgesch¨

atzt. Beim Bootstrap [13], [14] werden durch Simulationen des Modells

8 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

mit den gesch¨

atzten Parametern ˆ

θin silico zus¨

atzliche k¨

unstliche Messdaten geschaffen, die

mit dem der Messkovarianz entsprechenden Rauschen beaufschlagt werden. Anschließend

wird f¨

ur jeden Versuch eine neue Parameteridentifikation durchgef¨

uhrt und der Mittelwert

ˆmˆ

θf¨

ur jeden Parameter ¨

uber alle Pseudoversuche gebildet:

Enˆ

θo≈ˆmˆ

θ=1

i=1

θi(2.9)

Dabei bezeichnet NBdie Anzahl der Pseudoversuche. Im Anschluss kann die Parameterko-

varianz ˆ

Cθθgesch¨

atzt werden:

Eˆ

θ−θˆ

θ−θT≈ˆ

Cθθ=1

NB−1

i=1 θi−ˆmˆ

θθi−ˆmˆ

θT(2.10)

Durch die hohe Anzahl an notwendigen Parametersch¨

atzungen ben¨

otigt die Bootstrap-

Methode deutlich mehr Rechenzeit als der Weg ¨

uber die FIM.

Sowohl die Sch¨

atzung ¨

uber die FIM als auch das Bootstrap-Verfahren liefern nur aussage-

kr¨

aftige Ergebnisse, wenn die Modellstruktur und die Realit¨

at weitgehend ¨

ubereinstimmen,

da andernfalls strukturelle Abweichungen zwischen Modell und Realit¨

at nicht abgebildet

werden und die Parameterkovarianz untersch¨

atzt wird. Beide Verfahren k¨

onnen daher erst

im fortgeschrittenen Modellbildungsprozess angewandt werden.

2.1.5 Beobachtbarkeit

Die Beobachtbarkeit als Systemeigenschaft dr¨

uckt aus, ob der Anfangszustand x0eines

Systems ¨

uber die gegebene Modellstruktur und den vorhandenen Messgr¨

oßen durch einen

Beobachter in einem endlichen Zeithorizont rekonstruiert werden kann [15]. F¨

ur nichtlineare

Systeme erfordert die ¨

Uberpr¨

ufung der Beobachtbarkeit die Bildung der Lie-Ableitung von

h(x) entlang f(x):

Lfh(x) = ∂h(x)

∂x f(x, u, θ),(2.11)

bzw. f¨

ur h¨

ohere Ordnungen:

fh(x) = ∂Li−1

fh(x)

∂x f(x, u, θ) (2.12)

Mit den Lie-Ableitungen kann unter Annahme von zeitlich konstanten Eing¨

angen udie

Beobachtbarkeitmatrix OB(x) f¨

ur nichtlineare Systeme aufgestellt werden. Das System ist

lokal um xbeobachtbar, wenn die Beobachtbarkeitsmatrix OB(x) vollen Rang hat, d.h., es

2.1. Modellidentifikation und Analyse 9

gilt rang(OB(x)) = nx.

OB(x) =







∂

∂x h(x)

∂

∂x Lfh(x)

∂

∂x L2

fh(x)

∂

∂x Ln−1

fh(x)







.(2.13)

Bei zeitlich nicht konstanten Eing¨

angen treten in den Gleichungen (2.11) und (2.12) zus¨

atzlich

Zeitableitungen erster und h¨

oherer Ordnung bez¨

uglich der Stellgr¨

oße auf [16].

2.1.6 Identifizierbarkeit

Die Parameteridentifikation setzt voraus, dass die Modellparameter eindeutig identifizierbar

sind. Der Begriff der strukturellen Identifizierbarkeit bedeutet, dass bei gleicher Struktur

von Modell und Realit¨

at die Parameter eindeutig bestimmt werden k¨

onnen, so dass nur

eine L¨

osung bei der Wahl der Parameter existiert. Modellstrukturen, bei denen mehrere

Kombinationen von Modellparametern zu dem gleichen Ein- und Ausgangsverhalten f¨

uhren,

sind nicht identifizierbar. Liegt ein strukturell nicht identifizierbares Problem vor, kann die

Identifizierbarkeit nur durch neue Messgr¨

oßen erreicht werden.

Daneben existiert auch eine praktische Identifizierbarkeit. Die praktische Identifizierbarkeit

bedeutet, dass die durchgef¨

uhrten Versuche auch informativ genug sind, um die gesuch-

ten Parameter eindeutig zu identifizieren. Wenn eine Identifikationsaufgabe nicht praktisch

identifizierbar ist, sind zus¨

atzliche, informative Versuche notwendig. Eine mangelnde Identi-

fizierbarkeit zeigt sich in einer hohen Parameterunsicherheit. Eine Methode zur ¨

Uberpr¨

ufung

der praktischen Identifizierbarkeit ist die Profile Likelihood von Raue et al. [17].

Um die strukturelle Identifizierbarkeit zu ¨

uberpr¨

ufen, wird der mit den Parametern θer-

weiterte Zustandsvektor ¯xT=hxTθTieingef¨

uhrt, wobei die rechte Seite der DGL f¨

die Parameter zu Null gesetzt wird [18], [19]. Die strukturelle Identifizierbarkeit kann dann

analog zur Beobachtbarkeit ¨

uber die Bildung von Lie-Ableitungen ¨

uberpr¨

uft werden. Das

System ist strukturell beobachtbar, wenn die Identifikationsmatrix OI(¯x) vollen Rang hat

[18], also rang(OI(x)) = nx+npgilt.

OI(¯x) =







∂

∂¯xh(¯x)

∂

∂¯xLfh(¯x)

∂

∂¯xL2

fh(¯x)

∂

∂¯xLn−1

fh(¯x)







(2.14)

10 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

2.1.7 Multi-Layer Perceptron

Biologische Zusammenh¨

ange, deren mathematische Struktur unbekannt ist, k¨

onnen mit Hilfe

von nichtparametrischen Ans¨

atzen wie Support Vector Machines oder Neuronalen Netzen

beschrieben werden. In dieser Arbeit wird das Multi-Layer Perceptron (MLP) als Black

Box f¨

ur unbekannte Modellanteile verwendet. Der Vorteil eines MLPs besteht darin, dass

a priori keine mathematische Beziehung zwischen biologischen Einflussgr¨

oßen festgelegt

werden muss, da die Struktur des MLPs variabel ist und somit die unbekannte Struktur im

Laufe einer Modellidentifikation erlernt wird [20].

Ein MLP besteht aus einer Eingangs-, einer oder mehreren Zwischen- und einer Ausgabe-

schicht (Meta-Struktur). Die Anzahl der Schichten wird im Folgenden mit nLbezeichnet.

In jeder Schicht igibt es eine frei festlegbare Anzahl an Neuronen mi, deren Ausg¨

ange yi

den Eing¨

angen der n¨

achsten Schicht entsprechen [21].

In jedem Neuron jwerden die Eing¨

ange yi−1bzw. f¨

ur die Eingangsschicht die Eingangsdaten

des MLPs xin mit wj

igewichtet und um den Bias bj

iverschoben und ¨

uber die Aktivierungs-

funktion sj

iverarbeitet. F¨

ur ein einzelnes Neuron lautet die Ausgabe yj

i[21]:

i=sj

i((wj

i)T·yi−1+bj

i) mit: yi−1=





xin ,f¨

ur i= 1

yi−1,f¨

ur i > 1

.(2.15)

F¨

ur die Ausgabe yider Schicht igilt:

yi=si(Wi·yi−1+bi), Wi= [w1

i, . . . , wmi

i], bi= [b1

i,··· , bmi

i]T(2.16)

Die Gewichte aller Schichten Wiund Bias-Terme biwerden in einem Parametervektor θMLP

zusammengefasst.

θMLP =W1, . . . , WnL, b1, . . . , bnL(2.17)

Die Vorhersage des MLPs entspricht der Ausgabe der Ausgangsschicht, also der letzten

Schicht nL:

fMLP (xin, θMLP ) = ynL(xin, θMLP ) = snL(WnL·(ynnL−1(. . . )) + bnL) (2.18)

Die Parameter eines MLPs θMLP werden in einer Parameteridentifikation bestimmt, bei der

die Vorhersage des MLPs an Trainingsdaten angelernt wird.

2.2. Hybride Modellentwicklung 11

2.2 Hybride Modellentwicklung

Modellgest¨

utzte Methoden zur Regelung, Optimierung und ¨

Uberwachung von Bioprozessen

k¨

onnen deren Produktivit¨

at maßgeblich erh¨

ohen. Die dazu notwendige Modellbildung von

Fermentationsprozessen erfordert jedoch einen hohen Zeitaufwand und ein umfassendes Vor-

wissen ¨

uber den Organismus in Abh¨

angigkeit der gew¨

ahlten Prozessbedingungen und des

N¨

ahrmediums. Zudem ben¨

otigt eine gute Modellanpassung m¨

oglichst viele und informative

Messwerte. In der Realit¨

at sind aber viele Gr¨

oßen, insbesondere zellinterne Zustandsgr¨

oßen,

nicht durch Messungen zug¨

anglich, so dass h¨

aufig stark vereinfachte Prozessmodelle ausrei-

chen m¨

ussen. Die Modellbildung ist also der entscheidende Schritt bei der Anwendung von

regelungstechnischen Methoden in der Bioprozesstechnik [21].

Um eine effizientere und schnellere Modellbildung zu erreichen, werden daher vermehrt

hybride Modelle angewandt, welche die klassische, ph¨

anomenologische Modellbildung mit

datenbasierten Ans¨

atzen, wie zum Beispiel k¨

unstliche Neuronale Netze, kombinieren.

Durch den nichtparametrischen Anteil erh¨

alt das Modell eine h¨

ohere Flexibilit¨

at, um auch

komplexere biologische Vorg¨

ange oder nur schwer modellierbare Ph¨

anomene zu ber¨

ucksichti-

gen. Bei der hybriden Modellbildung wird daher weniger ph¨

anomenologisches Wissen als

bei der klassischen Modellbildung vorausgesetzt. Im Vergleich zu einem rein datenbasierten

Ansatz zeichnet sich jedoch ein hybrides Modell durch eine bessere Extrapolierbarkeit und

durch ein physikalisch plausibleres Verhalten aus [22].

Der nichtparametrische Modellanteil kann auf unterschiedliche Weise in ein hybrides Modell

integriert werden. In einer parallelen Struktur erg¨

anzt die nichtparametrische Komponente

ein bereits vorhandenes biologisches Modell, um zum Beispiel Fehler oder Abweichungen

auszugleichen. In der seriellen Anordnung ersetzt der nichtparametrische Teil unbekann-

te oder nur schwer modellierbare Modellanteile, wie beispielsweise die Kinetiken in einem

biologischen Modell. Dar¨

uber hinaus sind auch Kombinationen beider Strukturen denkbar

[22].

Eine bew¨

ahrte hybride Modellstruktur ist die Kombination von physikalisch motivierten Bi-

lanzgleichungen mit k¨

unstlichen Neuronalen Netzen zur Beschreibung der Reaktionsraten.

Neben k¨

unstlichen Neuronalen Netzen, wie beispielsweise Multi-Layer Perceptrons (MLP),

kommen auch Radial-Basis-Funktionen oder Support-Vector-Maschinen zur Anwendung. Ei-

ne umfassende ¨

Ubersicht ¨

uber hybride Modelle liefert [22].

Die Bilanzgleichungen ergeben sich aus den betrachteten und gemessenen Komponenten.

Welche Substanz und wie viel einer Substanz in einer bestimmten Reaktion verbraucht

oder produziert wird, wird durch eine Pseudost¨

ochiometrie bzw. ein Reaktionsnetzwerk be-

schrieben. Es existieren mehrere Ans¨

atze, ein Reaktionsnetzwerk datenbasiert zu sch¨

atzen.

Bonvin und Rippin [23] demonstrieren die Target Factor Analysis zur Sch¨

atzung eines Reak-

12 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

tionsschemas f¨

ur ein chemisches System. Bernard und Bastin [24] sowie Mailier und Vande

Wouver [25] verwenden eine Eigenwertzerlegung zur Bestimmung der St¨

ochiometrie. Mailier

et al. [26] nutzen dar¨

uber hinaus eine Maximum Likelihood Principal Component Analysis,

um den Einfluss des Messrauschens auf die Sch¨

atzung des Reaktionsnetzwerks zu reduzie-

ren.

Auf der einen Seite vereinfacht die Flexibilit¨

at des nichtparametrischen Anteils die struktu-

relle Modellidentifikation wesentlich. Auf der anderen Seite erschwert sie die Identifikation

der Modellparameter, da die Parameter des nichtparametrischen Anteils keine biologische

Bedeutung haben und Startwerte angesichts vieler lokaler Minima nicht sinnvoll eingegrenzt

werden k¨

onnen. Zudem muss ein geeignetes nichtparametrisches Modell ausgew¨

ahlt und die

Struktur festgelegt werden. Im Fall von k¨

unstlichen Neuronalen Netzen muss auch die An-

zahl der Hidden Layer und der Neuronen auf jeder Layer, die Aktivierungsfunktionen sowie

weitere Trainingsparameter wie Regularisierungen festgelegt werden. Zudem reagieren dy-

namische Modelle sehr sensitiv auf ¨

Anderungen des nichtparametrischen Anteils, wenn diese

in einer seriellen Anordnung in das Modell mit einfließen.

Die Herausforderung bei der hybriden Modellbildung besteht also in der Identifikation des

nichtparametrischen Anteils, um die Kinetiken bzw. Reaktionen zu beschreiben. Oliveira [21]

schl¨

agt daf¨

ur zwei unterschiedliche Strategien vor. Im ersten Fall wird direkt das gesamte

dynamische Modell inklusive des nichtparametrischen Anteils an die Messdaten angepasst.

Dieses Vorgehen ist sehr zeitintensiv und ben¨

otigt durch die notwendige Integration des

Differentialgleichungssystems einen hohen Rechenaufwand.

In einer weiteren Strategie wird zuerst der unbekannte Modellanteil gesch¨

atzt, um auf diese

Weise den nichtparametrischen Anteil direkt anzupassen. Die unbekannten Reaktionsraten

k¨

onnen bei einfachen Systemen durch Ableitung der Messwerte oder bei Vorhandensein ei-

nes initialen Modells mit einem Extended Kalman Filter gesch¨

atzt werden. Im Allgemeinen

f¨

uhrt dies jedoch zu fehlerhaften Ergebnissen [21]. Mit dem Konzept der reaktionsvarianten

Zust¨

ande, wie in [27], [28], [29] und [30] beschrieben, existiert jedoch eine lineare Trans-

formation, mit der bei bekannter St¨

ochiometrie das Integral der Reaktionsraten aus den

Konzentrationmessungen berechnet werden kann. Dieses Vorgehen erm¨

oglicht dann eine se-

parate Anpassung f¨

ur jede Kinetik außerhalb des urspr¨

unglichen Modells.

Chen et al. [31] nutzen die lineare Transformation in reaktionsvariante und reaktionsinvari-

ante Zust¨

ande, um mit einem Beobachter die unbekannten Kinetikanteile zu sch¨

atzen. An-

schließend werden die unbekannten Kinetikanteile durch Radial-Basis-Funktionen als Black

Box-Anteil beschrieben. Die gesamte Methode wird an einem Simulationsbeispiel demon-

striert.

2.2. Hybride Modellentwicklung 13

Im Folgenden wird eine Methodik zur hybriden Modellbildung beschrieben, die analog zu

Chen et al. [31] die lineare Transformation der Messdaten zur Identifikation des Black Box-

Anteils nutzt. Dazu wird zuerst ein Reaktionsschema gesch¨

atzt und anschließend ¨

uber die

Berechnung der reaktionsvarianten Zust¨

ande ein Multi-Layer Perceptron zur Beschreibung

der Reaktionsraten angepasst. Das Vorgehen wird an Fed-Batch-Kultivierungen mit A.niger

veranschaulicht und geht insbesondere auf die Probleme bei der Anwendung auf reale Kulti-

vierungen, wie beispielsweise die schwierige Messsituation, ein. Die vorgeschlagene Methode

erlaubt die schnelle und rechenzeiteffiziente Identifikation von Biomodellen unter Einbezug

von biologischen Vorwissen.

2.2.1 Allgemeine Struktur

Die vorgestellte Methode zur Identifizierung von hybriden Modellen basiert auf einem allge-

meinen Konzentrationsmodell eines Fed-Batch-Reaktors mit nyKomponenten und nrRe-

aktionen: dc(t)

dt =Kr(c(t))

|{z }

Reaktion

−F(t)

V(t)c(t)

|{z }

Verd¨

unnung

+q(t)

|{z}

Zuf¨

utterung

, c(t= 0) = c0,(2.19)

wobei c(t)∈Rnyden Konzentrationsvektor, K∈Rny×nrdie st¨

ochiometrische Matrix,

r(c(t)) ∈Rnrden Reaktionsvektor, F(t) die Summe aller Zu- und Abfl¨

usse und V(t) das

Reaktorvolumen sowie q(t) = UF eed(t)·cF eed die zugef¨

uhrten Feedings beschreiben, wobei

die Zuf¨

uttervolumenstr¨

ome ui,F eed in der Diagonalmatrix UF eed und die jeweiligen Feed-

konzentrationen ci,F eed in cF eed stehen. Mit c(t)∈Rnywird also angenommen, dass alle

Komponenten Bestandteil der Messung sind.

Das allgemeine Modell kann in einen Reaktions-, Verd¨

unnungs- und Zuf¨

utterungsanteil un-

terteilt werden. In der Regel ist der zeitliche Verlauf der Zuf¨

utterung q(t) w¨

ahrend des

Prozesses bekannt. Durch Messungen sind zudem die Konzentrationen c(tk) an den Messzeit-

punkten bzw. interpolierten Messzeitpunkten tksowie die Anfangskonzentration im Reaktor

c0bekannt. Wenn die Messwerte kleinschrittig genug interpoliert werden, kann zudem der

Verd¨

unnungsterm berechnet werden. Daher beschr¨

ankt sich die Modellbildung in dieser all-

gemeinen Struktur auf den Reaktionsterm, also auf die Identifikation der st¨

ochiometrischen

Matrix Kund der Reaktionsraten r(c(t)). Die Integration von Gleichung (2.19) und das

Umstellen nach den gemessen Konzentrationen c(tk) f¨

uhrt zu:

c(tk)

|{z}

Messung

=Ztk

Kr(c(t))dt

|{z }

unbekannt

−Ztk

0F(t)

V(t)c(t)−q(t)

|{z }

bekannt

dt +c0(2.20)

Der bekannte Transportanteil bestehend aus dem Integral des Verd¨

unnungs- und Zuf¨

ut-

terungsterms kann auf die linke Seite gebracht werden, um den ”transportfreien“ Zustands-

vektor ¯c(tk) = ¯ck(vgl. [26]) zu berechnen. Unter der Annahme, dass die st¨

ochiometrische

14 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

Matrix Kzeitinvariant ist, kann Kauch vor das Integral gestellt werden.

¯c(tk) = c(tk) + Ztk

0F(t)

V(t)c(t)−q(t)dt =c0+KZtk

r(c(t))dt (2.21)

2.2.2 Reaktionsschema

Das transportfreie System kann geometrisch so interpretiert werden, dass die Spalten der

Matrix Keine Hyperebene aufspannen, in der sich die transportfreien Konzentrationen

¯c(tk) mit der durch die Reaktionsraten r(c(t)) beschriebenen Dynamik bewegen. Die An-

fangsbedingung c0schiebt die durch Kaufgespannte Ebene aus dem Ursprung heraus (siehe

Abbildung 2.1) [26].

c3(t),¯

c3(t)

c2(t),¯

c2(t)

c1(t),¯

c1(t)

c(t) = KRt

0r(c(t))dt +c0

Abbildung 2.1: Geometrische Interpretation des transportfreien Systems: Kspannt eine Hy-

perebene auf, in der sich das System mit der durch r(c(t)) beschriebenen Dynamik bewegt. Die

Anfangsbedingung c0verschiebt die Ebene aus dem Ursprung. Die Abbildung wurde von [26]

ubernommen und angepasst.

Der Reaktionsterm mit der Anfangsbedingung c0in Gleichung (2.21) kann durch Subtraktion

von ¯c(tk) isoliert werden, wodurch die Hyperebene wieder in den Ursprung zur¨

uckverschoben

wird.

˜ck= ¯c(tk)−c0=KZtk

r(c(t))dt (2.22)

Die zentrierten, transportfreien Konzentrationen ˜ckwerden f¨

ur alle NjMesszeitpunkte eines

Versuchs anschließend in einer Datenmatrix Czusammengefasst.

Cj= [˜c0,˜c1,...,˜cNj] (2.23)

Wenn NVVersuche gleichzeitig betrachtet werden, k¨

onnen die Datenmatrizen Cjf¨

ur die

einzelnen Versuche in einer einzigen Datenmatrix Czusammengefasst werden, wobei nDaten

die Gesamtzahl an Datenpunkten in der Matrix Cbezeichnet.

C= [C1, . . . , CNV], C ∈Rny×nDaten (2.24)

2.2. Hybride Modellentwicklung 15

Eine orthonormale Basis ¯

K, die die durch Kaufgespannte Hyperebene beschreibt, kann

durch eine Singul¨

arwertzerlegung der Datenmatrix Cbestimmt werden.

C=UΣVT(2.25)

Die Singul¨

arwertzerlegung zerlegt die Datenmatrix C in eine unit¨

are Matrix U∈Rny×ny, die

adjungierte einer unit¨

aren Matrix VT∈RnDaten×nDaten sowie in die Matrix Σ ∈Rny×nDaten .

Wenn es mehr Datenpunkte als Messgr¨

oßen gibt, also nDaten > nygilt, besteht die Matrix

Σ aus einer Diagonalmatrix Σ1∈Rny×nymit den Singul¨

arwerten auf der Diagonalen und

einer Nullmatrix 0 ∈Rny×(nDaten−ny).

Σ = hΣ10i=





σ10. . . 0 0 . . . 0

0σ2. . . 0 0 . . . 0

....0.

.....

0. . . 0σny0. . . 0







(2.26)

Die orthonormal zu einander stehenden Spaltenvektoren uider Matrix U= [u1, u2, . . . , uny]

stellen dabei die Basen eines neues Koordinatensystem dar, die durch die zugeh¨

origen Sin-

gul¨

arwerte σigestaucht oder gestreckt werden. In der Matrix VT= [v1, . . . , vnDaten ]Tsind

entsprechend die transformierten Datenpunkte gespeichert.

Die Dimension der Hyperebene, also die Anzahl der Reaktionen nr, kann dann ¨

uber die

Singul¨

arwerte σabgesch¨

atzt werden. Dazu wird eine Schwelle ϵ∗als Maß f¨

ur die erkl¨

arte

Varianz definiert. Liegt die Summe der ersten nrausgew¨

ahlten Singul¨

arwerte geteilt durch

die Summe aller Singul¨

arwerte ¨

uber der Schwelle ϵ∗(siehe Gleichung (2.27)), so ist nrdie

Anzahl an m¨

oglichen Reaktionen.

ϵ=Pnr

i=1 σi

Pny

j=1 σj≥ϵ∗, σi, σj∈diag(Σ1) (2.27)

Die orthonormale Basis ¯

Kwird durch die ersten nrSpaltenvektoren u1, u2, . . . , unraus der

unit¨

aren Matrix Ubestimmt.

K= [u1, . . . , unr] (2.28)

Die Voraussetzung f¨

ur die Bestimmung von ¯

Kdurch die Singul¨

arwertzerlegung ist, dass

das Messrauschen einen m¨

oglichst geringen Einfluss auf die Datenmatrix Caus¨

ubt. Bei

einem st¨

arkeren Messrauschen schlagen [26] die Verwendung von der Maximum Likelihood

Principal Component Analysis (MLPCA, siehe [32]) vor.

Aus der orthornomalen Basis ¯

Kk¨

onnen beliebig viele unterschiedliche Kombinationen aus

einer st¨

ochiometrischen Matrix K∗und einem zugeh¨

origen Reaktionsvektor r∗(c(t)) mit

dem gleichen Ein- und Ausgangsverhalten bestimmt werden (siehe Gleichung (2.29)). Diese

aquivalenten Reaktionsschemata k¨

onnen durch eine Transformationsmatrix TK, die die Basis

16 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

von K∗in die durch ¯

Kaufgespannten Hyperebene dreht, mit K∗=¯

KTKund r∗=T−1

K¯r

ineinander umgerechnet werden [26].

K∗r∗(c(t)) = ¯

KTKT−1

K¯r(c(t)) , TK∈Rnr×nr(2.29)

Um ein biologisch aussagekr¨

aftiges Modell zu erhalten, wird daher eine St¨

ochiometrie K∗ge-

sucht, die weitgehend den theoretischen oder beobachteten Ausbeute-/ Ertragskoeffizienten

entspricht. Daf¨

ur kann eine Kandidatenst¨

ochiometrie ˜

Kformuliert werden:

K=





k11 . . . ˜

k1nr

.....

kny1. . . ˜

knynr





,˜

K∈Rny×nr(2.30)

In der Kandidatenstruktur werden einzelne Elemente ˜

kij gleich eins gesetzt, wenn die ent-

sprechende Reaktion auf diese Komponente normiert werden soll, oder auf null, falls die

jeweilige Komponente nicht von der Reaktion beeinflusst wird. Des Weiteren k¨

onnen die

einzelnen Elemente auf die beobachteten Ertragskoeffizienten gesetzt oder auch v¨

ollig offen

(˜

kij ={}) gelassen werden.

Mit einer Optimierung wird anschließend ¨

uber die Variation der Transformationsmatrix TK

eine gesch¨

atzte St¨

ochiometrie ˆ

Kgesucht, die mit dem durch die Kandidatenst¨

ochiometrie ˜

verf¨

ugbaren biologischen und dem datenbasierten Wissen aus Cweitgehend ¨

ubereinstimmt.

Als G¨

utemaß JKwird die aufsummierte, quadrierte Abweichung zwischen den festgelegten

Elementen der Kandidatenstruktur (˜

kij ={}) und den zugeh¨

origen Elementen des daten-

basierten Ansatzes ( ¯

KTK)i,j definiert:

JK=X˜

kij −(¯

KTK)i,j 2

,∀i, j :˜

kij ={} (2.31)

Als Startwert f¨

ur die Drehmatrix TK,0wird die Einheitsmatrix Inrgew¨

ahlt. Die gesch¨

atzte

St¨

ochiometrie ˆ

Kergibt sich dann aus der Drehung der Basis ¯

Kmit dem aus der Optimierung

stammenden Topt

K=¯

KT opt

Kmit Topt

K= argmin

JK, TK,0=Inr(2.32)

Entsprechend gilt dann:

r∗=Topt

K−1¯r= ˆr(2.33)

2.2.3 Reaktionsvariante Zust¨

ande

Nach der Sch¨

atzung von Kwerden die Reaktionsraten identifiziert1. Wenn Kquadratisch

und regul¨

ar w¨

are, k¨

onnte Gleichung (2.22) von links mit K−1multipliziert und das Integral

1Die folgenden Umformungen gelten sowohl f¨

ur die gesch¨

atzte St¨

ochiometrie ˆ

K, zu der eine mit dieser

Methode gesch¨

atzte Reaktionsrate ˆrgeh¨

ort, als auch f¨

ur die reale St¨

ochiometrie K. Der Einfachheit halber

wird im Folgenden nur die Darstellung mit Kund rgezeigt.

2.2. Hybride Modellentwicklung 17

der Reaktionsraten zum Zeitpunkt tkaus ˜ckberechnet werden. Da in der Regel jedoch mehr

Komponenten nygemessen werden als Reaktionen nrstattfinden, muss eine Transformation

gefunden werden, die auch im allgemeinen Fall gilt. Die Idee ist dabei eine Transformati-

onsmatrix Tzu finden, die die Konzentrationen in die reaktionsvarianten Zust¨

ande yrund

die invarianten Zust¨

ande yiv ¨

uberf¨

uhrt (siehe Gleichung (2.34)) [30].

T˜ck=TK Ztk

r(c(t))dt = Rtk

0r(c(t))dt

0!= yr(tk)

yiv(tk)!(2.34)

Rodrigues et al. ([30]) schlagen als m¨

ogliche lineare Transformationsvorschrift Tdie In-

verse der zusammengesetzten Matrix aus Kund dem Nullraum Pvon der transponierten

St¨

ochiometrie KTvor.

T=hK Pi−1="R

Q#KTP= 0nr×(ny−nr)(2.35)

Aus dem Produkt von Tund T−1folgt, dass die Untermatrizen R und Q von Tder Moore-

Penrose-Inversen von Kund des Nullraums Pentsprechen.

TT−1="R

Q#hK Pi="Inr0

0I(ny−nr)#R=K+, Q =P+(2.36)

Damit f¨

uhrt eine linksseitige Multiplikation von dem transportfreien, zentrierten Zustands-

vektor ˜ckmit Tzu einer Trennung in nrvariante und (ny−nr) invariante Zust¨

ande.

T˜ck=



yr(nr)

yiv(ny−nr)





(2.37)

Die zeitliche Ableitung von yr(t) entspricht somit den gesuchten Kinetiken r(c(t)).

dyr

dt =r(c(t)) = d

dtT˜ck(t) (2.38)

2.2.4 Identifikation der Kinetiken mit k¨

unstlichen Neuronalen Net-

zen

Da die Struktur der Kinetiken bisher noch unbekannt ist, wird im Folgenden ein hybrider

Modellansatz gew¨

ahlt. Der hybride Modellierungsansatz [21], [33] unterteilt jede Reaktions-

rate ri(c(t)) in einen bekannten Anteil ri,M (c(t)) und in einen unbekannten Part ri,MLP (c(t)),

der im Folgenden durch ein Multi-Layer Perceptron (MLP) beschrieben wird.

ri(c(t)) = ri,M (c(t)) ·ri,MLP (c(t)) (2.39)

18 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

In dem bekannten Anteil der Reaktionsrate fließt das gesamte verf¨

ugbare Wissen ¨

uber die

jeweilige Reaktion ein. In der Regel sind die Wachstumsraten und weitere Kinetiken propor-

tional zur Biomasse im Reaktor, so dass eine Multiplikation mit der Biomassenkonzentration

cXsinnvoll ist. Wenn Limitierungen auftreten, k¨

onnen diese durch Monod-Kinetiken abge-

bildet werden. Außerdem k¨

onnen weitere im Voraus strukturell bekannte Kinetikanteile,

deren Parameter θMaber noch unbekannt sind, modelliert werden. Der bekannte Anteil

einer Kinetik ri,M (c(t)) k¨

onnte beispielsweise folgendermaßen aussehen:

ri,M (c(t), θM) = cX(t). . . . (2.40)

Der unbekannte Anteil der jeweiligen Reaktion ri,MLP (c(t)) wird durch einen nichtpara-

metrischen Anteil mit variabler Struktur wie k¨

unstliche Neuronale Netze beschrieben. F¨

dynamische, biologische Modelle weisen MLPs eine ausreichende Komplexit¨

at aus, da sie

beliebige nichtlineare Beziehungen zwischen den Eingangsdaten erlernen k¨

onnen.

Es bestehen zwei Varianten eine hybride Kinetik r(c(t)) an die zuvor hergeleiteten reakti-

onsvarianten Zust¨

ande yr(t) anzupassen. Die erste M¨

oglichkeit ist die Sch¨

atzung der Reak-

tionsraten ˆr(c(t)) durch die Bildung der numerischen Ableitung in Gleichung (2.41).

dyr

dt ≈∆yr

∆t=T(˜ck+1 −˜ck)

tk+1 −tk

= ˆr(c(t)) (2.41)

Bei dieser Variante k¨

onnen die Reaktionsraten direkt an die gesch¨

atzten Kinetiken ˆr(c(t))

angepasst werden. Allerdings f¨

uhrt die Ableitung von verrauschten Messdaten in der Regel

zu einer schlechten Sch¨

atzung der Reaktionsrate ˆr(c(t)).

Die zweite M¨

oglichkeit zur Identifikation der Kinetiken r(c(t)) auf Basis der reaktionsvari-

anten Zust¨

anden yr(t) ist die Integration der modellierten Kinetik r(c(t)) und der direkte

Vergleich mit yr(t). Im Folgenden wird diese Variante f¨

ur die Modellbildung verwendet. F¨

jeden Zeitpunkt tkkann die quadrierte Abweichung von e(tk) angegeben werden mit:

e(tk) = yr(tk)−Ztk

r(tk)dt , r(t0) = 0 .(2.42)

In dieser Arbeit erfolgt die Integration der modellierten Reaktionsraten r(c(t)) mit dem

expliziten Euler-Verfahren, da es einerseits rechenzeiteffizient und andererseits f¨

ur die Vor-

anpassung der Kinetik ausreichend genau ist. Das G¨

utefunktional zum Trainieren des ML-

Ps ¨

uber alle NjZeitpunkte und ¨

uber alle NVVersuche berechnet sich dann folgenderma-

ßen:

Er=

j=1

k=0 ∥e(tk)∥2

2.(2.43)

Dar¨

uber hinaus k¨

onnen weitere biologische Zusammenh¨

ange, die in Form von Gleichungs-

oder Ungleichungsnebenbedingungen (Gl. (2.44) - (2.45)) formuliert werden k¨

onnen, mit zur

2.2. Hybride Modellentwicklung 19

Anpassung des Multi-Layer Perceptrons genutzt werden (siehe [34]). Auf diese Weise kann

weiteres Wissen neben der expliziten Aufteilung in bekannte und unbekannte Kinetikanteile

(siehe Gleichung (2.40)) implizit mit in das Modell integriert werden.

g(rMLP (c(t), θMLP )) = 0 (2.44)

h(rMLP (c(t), θMLP )) ≤0 (2.45)

Die Ungleichungsnebenbedingungen k¨

onnen als Rectifier (Gleichung (2.47)) und die Glei-

chungsnebendingungen ¨

uber die 2-Norm (Gleichung (2.46)) als Maß f¨

ur die Inkonsistenz mit

biologischen Wissen in das G¨

utefunktional mit aufgenommen werden.

Eg=

g(rMLP (c(t)), θMLP )

2

2(2.46)

Eh=∥max(0, h(rMLP (c(t), θMLP )))∥2

2(2.47)

Zus¨

atzlich ist bei der Voranpassung eine Regularisierung der Parameter sinnvoll, um zu

hohe Gewichte des MLPs w¨

ahrend des Lernvorgangs zu bestrafen.

EθMLP =∥θMLP ∥2

2(2.48)

Die gesamte G¨

utefunktion zur Anpassung des MLPs lautet dann:

min

θM,θMLP

(Er+Eg+Eh+EθMLP ).(2.49)

2.2.5 Parameteridentifikation des gesamten Modells

Im letzten Schritt wird das gesamte Modell, d.h. die St¨

ochiometrie und die Reaktionsraten

gleichzeitig, an die vorhandenen Messwerte cMangepasst. F¨

ur die Berechnung der Modell-

vorhersage cModell ist die L¨

osung des Differentialgleichungssystem aus Gleichung (2.19) in

Abh¨

angigkeit der Modellparameter θ={K, θM, θMLP }mit einem ODE-Solver notwendig.

Mit einer Optimierung wird dann die quadrierte und gewichtete Differenz zwischen Mes-

sung und Modell ¨

uber alle Messwerte N=PNjminimiert. Als Gewichte werden einerseits

die Inverse der gesch¨

atzten Messkovarianz ˜

C−1

kund andererseits ein frei w¨

ahlbares Gewicht

Wkgew¨

ahlt. Mit dem Gewicht Wkkann eine unterschiedliche Anzahl an Messwerten pro

Messgr¨

oße ausgeglichen werden.

min

k=1

[cM(tk)−cModell(tk, u, θ)]TWk˜

C−1

k[cM(tk)−cModell(tk, u, θ)] (2.50)

Um ein physikalisch plausibleres Verhalten des MLPs zu erhalten, kann entweder das G¨

ute-

funktional mit den in den Gleichungen (2.46)-(2.47) definierten G¨

uten erg¨

anzt oder eine

beschr¨

ankte Optimierung mit den in den Gleichungen (2.44) und (2.45) aufgestellten Ne-

benbedingungen durchgef¨

uhrt werden.

20 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

2.3 Prozessf¨

uhrung

Unter dem Begriff Prozessf¨

uhrung werden Methoden aus der Regelungstechnik, Verfahrens-

technik und weiteren technischen Disziplinen zum Betreiben von verfahrenstechnischen Pro-

zesses zusammengefasst. Die Prozessf¨

uhrung als ganzheitlicher Ansatz zielt auf eine effiziente

Fahrweise von Prozessen unter Ber¨

ucksichtigung von den Kosten, der Prozesssicherheit, des

Rohstoff- und Energieeinsatzes sowie von weiteren Randbedingungen. H¨

aufig werden zum

Erreichen dieser Ziele mechanistische oder datenbasierte Modelle und darauf aufbauende

Prozesssimulationen eingesetzt. Als ein wesentlicher Teil der Prozessf¨

uhrung gilt dabei die

Prozessautomatisierung zur ¨

Uberwachung, Steuerung und Regelung von verfahrenstechni-

schen Prozess [35].

Das Ziel der Prozessf¨

uhrung f¨

ur A.niger besteht im Speziellen in der Maximierung der

GA-Ausbeute durch die Einstellung entsprechender Substratverl¨

aufe. Die zugrundeliegen-

de Methode der Versuchsplanung wird im Abschnitt 2.3.1 beschrieben. Die Methode wird

dar¨

uber hinaus auch mit abgewandeltem G¨

utefunktional f¨

ur die Planung von Versuchen

genutzt, die haupts¨

achlich der Modellbildung dienen.

Eine besondere Form der Versuchsplanung stellt demgegen¨

uber die optimale Versuchspla-

nung (OVP) aus Abschnitt 2.3.2 dar. Das Ziel ist hier weniger einen effizienten Versuch in

Bezug auf die Produktausbeute, sondern viel mehr einen informativen Versuch f¨

ur die Mo-

dellbildung zu planen, mit denen die Unsicherheit der Modellparameter verringert werden

kann.

Da die zunehmende Komplexit¨

at eines Modells h¨

aufig auch Gr¨

oßen einschließt, die nicht

messtechnisch erfasst werden k¨

onnen, sind Zustandssch¨

atzverfahren wichtige Hilfsmittel f¨

die Prozessf¨

uhrung. Als sogenannte Soft-Sensoren erlauben sie bereits w¨

ahrend eines Pro-

zesses Einblicke in den Verlauf einer Kultivierung und erm¨

oglichen somit auch die Reaktion

auf St¨

oreinfl¨

usse und Abweichungen vom geplanten Verlauf. Das im Rahmen dieser Arbeit

eingesetzte Sigmapunkt-Kalman-Filter wird im Abschnitt 2.3.3 beschrieben.

Eine weitere wichtige Methode der Prozessf¨

uhrung, die jedoch außerhalb des Umfangs dieser

Arbeit liegt, ist die modellpr¨

adiktive Regelung. Sie sei dennoch erw¨

ahnt, da mit dieser Ar-

beit die Grundlagen f¨

ur zuk¨

unftige Anwendungen modellpr¨

adiktiver Regelungen f¨

ur A.niger

gelegt werden sollen.

2.3.1 Versuchsplanung

Mit Hilfe von Simulationen des identifizierten Modells k¨

onnen die Versuche ¨

uber eine opti-

mierungsbasierte Versuchsplanung geplant werden. Die Versuchsplanung ist ein Verfahren,

um ein durch ein G¨

utefunktional Φ definiertes Ziel durch Variation der Stellgr¨

oßenverl¨

aufe

u(t) und der Anfangszust¨

ande x0zu erreichen [3]. Als Nebenbedingung der Optimierung

2.3. Prozessf¨

uhrung 21

gilt, dass jederzeit die Modellgleichungen und die minimalen und maximalen Grenzen f¨

die Zust¨

ande xmin und xmax bzw. f¨

ur die Stellgr¨

oßen umin und umax erf¨

ullt sein m¨

ussen

{x∗

0, u∗(t)}= arg min

x0,u(t)

Φ (2.51)

u.d.N.: ˙x(t) = f(t, x(t), u(t), θ), x(t0) = x0(2.52)

umin ≤u(t)≤umax (2.53)

xmin ≤x(t)≤xmax ,(2.54)

wobei die Ungleichungen komponentenweise zu verstehen sind.

Das Ergebnis der Optimierung sind die optimalen Stellgr¨

oßenverl¨

aufe u∗(t) und der optimale

Startzustand x∗

0, die das G¨

utefunktional minimieren.

2.3.2 Optimale Versuchsplanung

Das Ziel der optimalen Versuchsplanung (OVP) besteht in der Planung informativer Ver-

suche, mit denen die Modellparameter gut und mit geringer Unsicherheit durch eine gradi-

entenbasierte Optimierung bestimmt werden k¨

onnen. Analog zur Versuchsplanung in Glei-

chung (2.51) wird dabei ein optimaler Verlauf der Substratzuf¨

utterung bestimmt, der ein

geeignetes G¨

utekriterium minimiert. Da das Ziel in einer Minimierung der Parameterunsi-

cherheit besteht, kann das G¨

utekriterium auf Basis der Inversen der FIM formuliert werden.

Die FIM beschreibt dar¨

uber hinaus n¨

aherungsweise die Kr¨

ummung des G¨

utefunktionals um

den identifizierten Wert herum, wobei eine starke Kr¨

ummung die Identifikation mit gradi-

entenbasierten Optimierungsverfahren erleichtert. Es existieren mehrere M¨

oglichkeiten die

FIM in ein skalares G¨

utemaß zu ¨

uberf¨

uhren [3], [36], [37], [38].

D-Kriterium:

Beim D-Kriterium wird die Determinante von der inversen FIM minimiert.

ΦOV P,D =|F−1|(2.55)

E-Kriterium:

Eine andere M¨

oglichkeit zur Formulierung des G¨

utefunktionals besteht in der Minimierung

des maximalen Eigenwerts λmax von F−1. Dieses G¨

utekriterium wird auch als E-Kriterium

bezeichnet.

ΦOV P,E =λmax(F−1) (2.56)

22 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

Modifiziertes E-Kriterium:

Beim modifizierten E-Kriterium wird wiederum das Verh¨

altnis zwischen maximalen und

minimalen Eigenwert gebildet und minimiert.

ΦOV P,E−mod =λmax(F−1)

λmin(F−1)(2.57)

2.3.3 Sigmapunkt-Kalman-Filter

In Bioprozessen k¨

onnen in der Regel nur wenige Gr¨

oßen direkt und ohne gr¨

oßeren Zeitverzug

gemessen werden. F¨

ur die Prozessf¨

uhrung oder eine modellpr¨

adiktive Regelung ist jedoch die

Kenntnis aller Modellzust¨

ande notwendig. Um die Zust¨

ande mit den gegebenen Messgr¨

oßen

rekonstruieren zu k¨

onnen, werden daher Zustandssch¨

atzer eingesetzt, die die Mess- und

Modellinformation miteinander kombinieren.

Seit Jahrzehnten ist das vom Kalman-Filter [39] abgeleitete Extended Kalman-Filter (EKF)

[40] die etablierte Methode zur Zustandssch¨

atzung von nichtlinearen Modellen. Da in dem

Verfahren die Unsicherheitsbeschreibung jedoch auf einer Linearisierung beruht, werden Un-

sicherheiten bei starken Nichtlinearit¨

aten nur unzureichend wiedergegeben. Als Alternative

werden in den letzten Jahren daher vermehrt elaboriertere Verfahren wie das Unscented

Kalman Filter (UKF) oder das Central Difference Kalman Filter (CDKF) angewendet [41],

[42]. Bei diesen Kalman-Filtern werden die Unsicherheiten ¨

uber die Propagation von Sig-

mapunkten approximiert.

Das Kalman-Filter ist ein stochastischer Ansatz, bei dem sowohl das Modell als auch die

Messung als unsicher angenommen werden. Das Messrauschen ν(tk) wird wieder als ein

mittelwertfreier, weißer Rauschprozess mit der Kovarianzmatrix R(tk) angenommen.

E{ν(tk)}= 0 (2.58)

Eν(tk)νT(tl)=R(tk)δk,l (2.59)

In oben dargestellter Formel bezeichnet δk,l das Kronecker-Delta. Die Modellunsicherheit

wird durch ein Systemrauschen w(t) beschrieben, das ebenfalls als mittelwertfreier, weißer

Rauschprozess mit der Spektraldichtematrix Q(t) angenommen wird. Es gilt daher:

E{w(t)}= 0 (2.60)

Ew(t)wT(t+τ)=Q(t)δ(τ),(2.61)

wobei δ(τ) den Dirac-Impuls bezeichnet. Beim EKF wird angenommen, dass das Zustands-

rauschen additiv in die Modellgleichungen eingeht. Im Fall des CDKFs kann das System-

rauschen beliebig in die Modellgleichungen einfließen (siehe Gleichung (2.62)). Auf diese

Weise k¨

onnen auch Modellteile wie Kinetiken oder die Parameter des Modells als unsicher

2.3. Prozessf¨

uhrung 23

aufgefasst werden. Die in dieser Arbeit genutzte Implementierung f¨

ur unsichere Parameter

basiert auf der Arbeit von Rossner [4] und Kawohl [43]. Es gilt daher in Abh¨

angigkeit des

Zustandsrauschens w(t) mit w(t)∈Rnx:

˙x(t) = f(t, x(t), u(t), θ, w(t)) , x(t0) = x0(2.62)

Das CDKF gliedert sich wie alle Kalman-Filter in ein Time Update, bei dem die Zust¨

ande

auf Grundlage des Modells gesch¨

atzt werden, und ein Measurement Update, bei dem die

Sch¨

atzung aus dem Time Update mit der vorhandenen Messung korrigiert werden. Im Fol-

genden bezeichnet ein hochgestelltes ”−“ den durch das Modell propagierten Zustandsvektor

nach dem Time Update und ein hochgestelltes ”+“ den korrigierten Zustand nach dem Mea-

surement Update. F¨

ur den ersten Schritt des CDKFs ist eine Sch¨

atzung des Anfangszustands

ˆx(t0) und der Kovarianzmatrix der Anfangssch¨

atzung P(t0) erforderlich.

Time Update:

Ausgehend vom Zustand des letzten Measurement Updates ˆx+(tk−1) bzw. im ersten Schritt

vom Anfangszustand ˆx(t0) werden im Time Update Sigmapunkte berechnet, die anschließend

mit den Modellgleichungen von tk−1nach tkintegriert werden.

Die Modellunsicherheiten werden durch den um das Systemrauschen und den Parameter-

vektor erweiterten Zustandsvektor ˆxw(t) ber¨

ucksichtigt, wobei f¨

ur die Mittelwerte des Sy-

stemrauschens mw= 0 und f¨

ur die Mittelwerte der Parameter θangenommen werden.

ˆxw(t) = 





ˆx(t)





=





ˆx(t)





(2.63)

Dementsprechend muss auch die Kovarianzmatrix des Zustands P(t) um die Spektraldich-

tematrix des Systemrauschens Q(t) und die Parameterkovarianz ˆ

Cθθzu Pw(t) erweitert

werden:

Pw(t) = 





P(t)O O

OQ(t)O

O O ˆ

Cθθ





(2.64)

Die Berechnung der Sigmapunkte und der Kovarianzmatrix beruhen beim CDKF auf der

Stirling-Polynom-Interpolation. Mit Hilfe der erweiterten Zustandskovarianz Pw(t) k¨

onnen

die 4nx+ 2np+ 1 Sigmapunkte berechnet werden. Dazu wird die i-te Spalte der Cholesky-

Zerlegung von Pw(t), pPw(t)i, ben¨

otigt. Der Parameter hist dabei ein Auslegungspa-

rameter f¨

ur den Zustandssch¨

atzer und wird h¨

aufig mit √3 angegeben [41].

X0(t) = ˆxw(t) (2.65)

Xi(t) = ˆxw(t) + hpPw(t)i∀i= 1,...,2nx+np(2.66)

Xi(t) = ˆxw(t)−hpPw(t)i∀i= 2nx+np+ 1,...,4nx+ 2np(2.67)

24 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

Jeder Sigmapunkt besteht somit aus einem Anteil f¨

ur das Modell Xx

i, einem Anteil f¨

ur das

Rauschen Xw

iund einem Anteil f¨

ur die Parameterunsicherheit Θi.

Xi(t) = 





i(t)

Θi





(2.68)

Der Anteil f¨

ur das Modell wird mit den Modellgleichungen von jedem Sigmapunkt Xx

i(tk−1)

aus ¨

uber die Zeit von tk−1bis tkintegriert:

i(t) = f(t, Xx

i(t), u(t),Θi,Xw

i(t)) (2.69)

Anschließend kann die Sch¨

atzung des Zustandsvektors nach dem Time Update ˆx−(tk)¨

uber

ein gewichtetes Mittel aller Sigmapunkte Xx

i(tk) und den Gewichten wm

0=h2−(2nx+np)

h2und

i=1

2h2f¨

ur i= 1,...,4nx+2npberechnet werden.

ˆx−(tk) =

4nx+2np

i=0

iXx

i(tk) (2.70)

Zus¨

atzlich wird aus den Sigmapunkten und den Gewichten wc1

i=1

4h2und wc2

i=h2−1

4h2die Zu-

standskovarianz nach dem Time Update P−(tk) berechnet. F¨

ur eine bessere ¨

Ubersichtlichkeit

wird im Folgenden die Schreibweise (. . .)2f¨

ur das dyadische Produkt verwendet.

P−(tk) =

2nx+np

i=1 hwc1

i(Xx

i(tk)−Xx

2nx+np+i(tk))2+wc2

i(Xx

i(tk) + Xx

(2nx+np+i)(tk)−2Xx

0(tk))2i

(2.71)

Measurement Update:

Im Measurement Update wird die a priori auf dem Modell beruhende Sch¨

atzung aus dem

Time Update ˆx−(tk) und der Kovarianz P−(tk) mit der Messinformation zum Zeitpunkt

yM(tk) aktualisiert. Die Unsicherheit durch das Messrauschen wird dabei analog zum Ti-

me Update ¨

uber Sigmapunkte des um das Messrauschen und der Parameter erweiterten

Zustandsvektors ˆxν−beschrieben, wobei der Mittelwert des Messrauschens mνmit 0 ange-

nommen wird.

ˆxν−(tk) = 





ˆx−(tk)

mν





=





ˆx−(tk)





(2.72)

Die um die Messkovarianzmatrix R(tk) und um die Parameterkovarianz Cθθerweiterte Ko-

varianzmatrix des Zustands Pν−(tk) lautet demnach:

Pν−(tk) = 





P−(tk)O O

OR(tk)O

O O Cθθ





(2.73)

2.3. Prozessf¨

uhrung 25

F¨

ur den erweiterten Zustandsvektor ˆxν−(tk) werden anschließend 2(nx+ny+np) + 1 Sigma-

punkte gebildet:

X−

0(tk) = ˆxν(tk) (2.74)

X−

i(tk) = ˆxν(tk) + hpPν−(tk)i∀i= 1,...,(nx+ny+np) (2.75)

X−

i(tk) = ˆxν(tk)−hpPν−(tk)i∀i= (nx+ny+np)+1,...,2(nx+ny+np) (2.76)

Somit setzt sich wieder jeder Sigmapunkt X−

i(t) aus einem Anteil f¨

ur die Zust¨

ande, ei-

nem Anteil f¨

ur das Messrauschen und einem Anteil f¨

ur die Parameterunsicherheit zusam-

men.

X−

i(t) = 





Xx−

i(t)

Xν−

i(t)

Θi





(2.77)

F¨

ur die Sigmapunkte kann ¨

uber die Messgleichung der Ausgang Y−

i(tk) berechnet wer-

den.

Y−

i(tk) = h(Xx−

i(tk), u(tk),Θi) + Xν−

i(tk)∀i= 0,...,2(nx+ny+np) (2.78)

Der a priori erwartete Messvektor ˆy−(tk) wird ¨

ahnlich wie im Time Update ¨

uber mit wm

h2−(nx+ny+np)

h2einen gewichtete Mittelwert berechnet.

ˆy−(tk) =

2(nx+ny+np)

i=0

iY−

i(tk) (2.79)

Die zugeh¨

orige erwartete Kovarianzmatrix der Messung P−

yy(tk) wird folgendermaßen be-

stimmt.

P−

yy(tk) =

2(nx+ny+np)

i=0 hwc1

i(Y−

i(tk)−Y−

(nx+ny+np)+i(tk))2+wc2

i(Y−

i(tk) + Y−

(nx+ny+np)+i(tk)−2Y−

0(tk))2i

(2.80)

Zus¨

atzlich muss die Kreuzkovarianz zwischen Mess- und Zustandsgr¨

oßen P−

xy bestimmt wer-

den.

P−

xy =pwc1

1P−(tk)Y−

[1:nx](tk)−Y−

[(nx+ny+np+1):(2nx+ny+np)](tk)T(2.81)

Anschließend kann die Kalman-Matrix K(tk) berechnet werden:

K(tk) = P−

xy P−

yy−1(2.82)

Durch Vergleich der gemessenen Messgr¨

oßen yM(tk) mit den erwarteten Messgr¨

oßen y−(tk)

kann die Sch¨

atzung aus dem Time Update ˆx−(tk) mit der Kalman-Matrix korrigiert werden.

Die Sch¨

atzung des Zustandsvektors nach dem Measurement Update ˆx+(tk) berechnet sich

dann folgendermaßen:

ˆx+(tk) = ˆx−(tk) + K(tk)(yM(tk)−y−(tk)) (2.83)

26 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

Die Zustandskovarianzmatrix nach dem Measurement Update P+(tk) wird ebenfalls aktua-

lisiert und lautet entsprechend:

P+(tk) = P−(tk)−K(tk)P−

yy(tk)K(tk)T(2.84)

Um zu garantieren, dass die Sch¨

atzung in jedem Fall die physikalischen Zustandsbeschr¨

ankung

einh¨

alt, findet zus¨

atzlich eine Korrektur der Sch¨

atzung bei ¨

Uberschreiten der Zustandsgren-

zen statt. Die numerische Umsetzung wird durch Rossner in [4] beschrieben.

2.4. Iterative Modellverbesserung 27

2.4 Iterative Modellverbesserung

Die Modellierung von Bioprozessen erfolgt in der Regel in einem iterativen Vorgehen, bei

dem eine initiale Modellstruktur sukzessiv erweitert wird und in jedem Schritt ¨

uberpr¨

uft

wird, ob die Modellstruktur geeignet ist, die Messdaten zu beschreiben oder ob gegebe-

nenfalls die Modellstruktur weiter angepasst werden muss. In [44] stellen Kristensen et al.

eine Methode vor, mit der eine systematisches Analyse bei der Modellverbesserung m¨

oglich

ist.

Die Idee der iterativen Modellverbesserung von Kristensen et al. besteht in der Erweite-

rung des urspr¨

unglichen Differentialgleichungssystem zu einem System aus stochastischen

Differentialgleichungen [44], [45]. Anschließend k¨

onnen strukturelle Modellfehler eingegrenzt

werden, indem die Parameter des stochastischen Anteils ¨

uber eine Parameteridentifikation

identifiziert werden und auf Signifikanz gepr¨

uft werden. Wenn die Parameter des stocha-

stischen Modellteils signifikant von Null abweichen, deutet dies bei einer diagonalen Para-

metrierung des stochastischen Modellanteils darauf hin, dass die zugeh¨

orige Gleichung die

Dynamik des realen Systems nur unzureichend beschreibt und durch den stochastischen An-

teil ausgeglichen werden muss [44]. Durch den stochastischen Modellanteil k¨

onnen zudem die

eigentlichen Modellparameter ohne Bias identifiziert werden, da sie dann keine strukturellen

Modelldefizite kompensieren m¨

ussen.

Eine effiziente L¨

osung eines stochastischen Systems ist durch das Extended Kalman-Filter

(EKF) gegeben, wobei das Zustandsrauschen w(t) den stochastischen Modellanteil repr¨

asen-

tiert [45]. Da das Extented Kalman-Filter seit Jahrzehnten etabliert ist, wird nachfolgend

auf eine ausf¨

uhrliche Beschreibung des EKFs verzichtet und auf [40] verwiesen.

F¨

ur die Analyse der einzelnen Zustandsgleichungen ist es - wie bereits erw¨

ahnt - vorteilhaft,

die Spektraldichtematrix des Zustandsrauschens Qdiagonal zu parametrieren. Die einzelnen

Parameter θQ,i auf der Diagonalen der Matrix Qwerden im Folgenden in dem Vektor θQ

zusammengefasst. Die Spektraldichtematrix lautet demnach:

Q=





θQ,10. . . 0

0θQ,2. . . .

....0

0. . . 0θQ,nx







, θQ= [θQ,1, . . . , θQ,nx]T.(2.85)

Die Parameter des stochastischen Modellanteils θQk¨

onnen mit den Modellparameter θin

einem erweiterten Parametervektor θwzusammengefasst werden.

θw="θ

θQ#(2.86)

Um diesen erweiterten Parametervektor θwzu sch¨

atzen, wird im Folgenden mit Hilfe des

Extended Kalman-Filters ein G¨

utefunktional hergeleitet.

28 Kapitel 2. Theoretische Grundlagen

Im Time Update des EKFs werden die Sch¨

atzung des Zustandsvektors ˆx−(t, θw) und die

zugeh¨

orige Kovarianzmatrix P−(t, θw) folgendermaßen berechnet:

ˆx−(t, θw) = f(ˆx−(t), u(t), θw) (2.87)

P−(t, θw) = ∂f

∂xx=ˆx−(t)

P−(t, θw) + P−(t, θw)∂f

∂x

x=ˆx−(t)

+Q(θw) (2.88)

Aus dem Time Update des EKFs folgt a priori f¨

ur den Modellausgang ˆyEKF

k|k−1(tk, θw):

ˆyEKF

k|k−1(tk, θw) = h(ˆx−(tk, θw), u(tk), θw).(2.89)

Mit dem Ausgang des EKFs aus dem Time Update ˆyEKF

k|k−1(tk, θw) kann anschließend die

Abweichung εk(θw) = ε(tk, θw) zum Messwert yM(tk) berechnet werden.

εk(θw) = yM(tk)−ˆyEKF

k|k−1(tk, θw) (2.90)

Die zu εk(θw) geh¨

orige Varianz Sk(θw) = S(tk, θw) wird w¨

ahrend des Measurement Updates

folgendermaßen berechnet:

Sk(θw) = ∂h

∂xx=ˆx−(tk)

P−(tk, θw)∂h

∂x

x=ˆx−(tk)

+R(tk),(2.91)

Auf Basis von εk(θw) und Sk(θw) wird eine Likelihood-Funktion L(θw) in Abh¨

angigkeit

des erweiterten Parametervektors θw¨

uber alle NjMesswerte und alle NVVersuche formu-

liert.

L(θw) =

j=1 



k=1

exp −1

2εT

k(θw)S−1

k(θw)εk(θw)

pdet(Sk(θw)) √2πny

p(yj(t0)|θw) (2.92)

Der erweiterte Parametervektor θwkann dann ¨

uber eine Maximum-Likelihood-Sch¨

atzung

gesch¨

atzt werden, indem der negative nat¨

urliche Logarithmus der Likelihood L(θw) mini-

miert wird [45].

θw= argmin

θw(−ln (L(θw))) (2.93)

Aus Sicht der Modellbildung sind die Parameter f¨

ur die Beschreibung der Messdaten not-

wendig, deren Wert sich signifikant von Null unterscheidet. Die Signifikanz der gesch¨

atzten

Parameter ˆ

θwkann dabei ¨

uber einen Hypothesen-Test als zweiseitiger Einstichproben-t-Test

durchgef¨

uhrt werden [44]. Die Nullhypothese H0:θw

i= 0 besagt, dass sich der Parameter

θw

iim Rahmen der Sch¨

atzunsicherheit nicht von Null unterscheidet und somit der Parame-

ter im Modell nicht ben¨

otigt wird. Die Alternativhypothese H1:θw

i= 0 lautet, dass der

Parameter θw

isich signifikant von Null unterscheidet. Bei den Parameter des stochastischen

Modellanteils deuten signifikante Parameter auf strukturelle Modelldefizite hin.

Um die Hypothesen zu testen, wird die Parameterunsicherheit des erweiterten Parameter-

vektors ben¨

otigt. Eine Absch¨

atzung der entsprechenden Kovarianzmatrix ˆ

Cθwist durch die

2.4. Iterative Modellverbesserung 29

Inverse der Hesse-Matrix Hdes G¨

utefunktionals ausgewertet am Minimum ˆ

θwanalog zur

Fisher’schen Informationsmatrix (FIM) gegeben [45].

Cθw=H|−1

θw(2.94)

Die Kovarianzmatrix ˆ

Cθwkann in eine Diagonalmatrix σθw, wobei ein Diagonalelement

jeweils der Standardabweichung σˆ

θif¨

ur den Parameter ˆ

θientspricht, und eine Korrelations-

matrix Rzerlegt werden [44].

Cθw=σθwRσθw(2.95)

Die Standardabweichung σˆ

θif¨

ur den Parameter ˆ

θiberechnet sich dabei aus der Wurzel des

zugeh¨

origen Diagonalelements hi,i ∈diag( ˆ

Cθw).

σˆ

θi=phi,i (2.96)

Anschließend kann f¨

ur den Hypothesentest eine t-verteilte Teststatistik tSc(ˆ

θi) berechnet

werden.

tSc(ˆ

θi) = ˆ

θi

σˆ

θi

(2.97)

Der Freiheitsgrad ν=PNV

jNj−npwbeim Hypothesentest berechnet sich aus der Anzahl

der verf¨

ugbaren Messpunkte ¨

uber alle NVVersuche abz¨

uglich der Anzahl der gesch¨

atzten

Parameter npw.

Die Nullhypothese H0wird auf einem Signifikanzniveau von αangenommen, d.h. der Para-

meter ist insignifikant, wenn gilt:

|tSc(ˆ

θi)| ≤ t NV

Nj−npw!,(2.98)

wobei tdie inverse kumulierte Wahrscheinlichkeitsdichtefunktion der Student-t-Verteilung

ist.

Wenn die Hypothese f¨

ur einen Parameter des stochastischen Modellanteils abgelehnt wird,

sollte die zugeh¨

orige Modellgleichung ¨

uberarbeitet und verbessert werden. Auf diese Weise

k¨

onnen Modelldefizite gezielt auf einzelne Gleichungen eingegrenzt werden.

Kapitel 3

Fed-Batch-Kultivierungen mit

Aspergillus niger

Als Fallbeispiel f¨

ur die Anwendung von Methoden zur Modellbildung und Prozessf¨

uhrung

von biotechnologischen Prozessen wird in dieser Arbeit der filament¨

os wachsende Schim-

melpilz A.niger verwendet. Das durch A.niger sekretierte Enzym Glucoamylase (GA), das

im GlaA-Gen kodiert ist, wird dabei als Beispielprodukt betrachtet. A.niger ist ein in der

Biotechnologie vielfach verwendeter Organismus, da er ¨

uber eine große Sekretionsf¨

ahigkeit

verf¨

ugt und f¨

ur die Lebensmittelindustrie als Generally Recognized As Safe (GRAS) ein-

gestuft wird [46]. Dar¨

uber hinaus verf¨

ugt A.niger als Eukaryot ¨

uber Expressionssysteme,

die auch zur Produktion von gr¨

oßeren homologen und heterologen Proteinen geeignet er-

scheinen [47], [48]. In der Industrie wird A.niger vor allem f¨

ur die Zitronens¨

aureproduktion

eingesetzt [49].

3.1 Aspergillus niger

In dieser Arbeit wird der A.niger Stamm BN 34.1 untersucht, der vom Fachgebiet Ange-

wandte und Molekulare Mikrobiologie der TU Berlin unter Leitung von Prof. Vera Meyer

zur Verf¨

ugung gestellt wurde [50]. Bei dem Stamm ist das brlA-Gen, das die Bildung von

Sporen reguliert, deaktiviert worden. Die Mutante ∆brlA bildet daher keine Sporen aus, so

dass das Wachstum nur akonidial ¨

uber die Hyphenspitzen erfolgen kann.

Grunds¨

atzlich vermehrt sich A.niger asexuell. Die Hyphe w¨

achst dabei im Mittel um die

L¨

ange einer hyphal growth unit (HGU) an, bevor sie durch Septierung geteilt wird [51],[52].

Durch Verzweigung k¨

onnen sich neue Hyphenspitzen bilden und ein exponentielles Wachs-

tum stattfinden [47], [53]. Die maximale Wachstumsrate liegt in Abh¨

angigkeit der Morpho-

logie in einem Bereich von µmax = 0.03 −0.41

h[47].

3.1. Aspergillus niger 31

In submersen Kultivierungen bildet A.niger je nach Kultivierungsbedingungen unterschied-

liche Morphologien aus. Bei einem pH-Wert von 5.5 aggregiert das Myzel zu kleinen, kompak-

ten Kugeln, die Pellets genannt werden. Eine h¨

ohere Turbulenz und ein niedriger pH-Wert

von 3 f¨

uhren dagegen zu einem Wachstum in Form von freien Myzel [54].

W¨

ahrend Pellets im Medium verteilt vorliegen und die rheologischen Eigenschaften wie die

Viskosit¨

at nicht signifikant beeinflussen, erh¨

oht sich beim Wachstum in Form von freien

Myzel die Viskosit¨

at und erfordert einen wesentlich h¨

oheren Energieeintrag f¨

ur den Stoff-

transport. Es besteht zudem ein starker Zusammenhang zwischen der durch den R¨

uhrer

verursachten Scherspannung im Reaktor und dem Wachstumsverhalten, wobei eine h¨

ohere

R¨

uhrerdrehzahl eher zu einem Wachstum als freies Myzel f¨

uhrt [47].

Bei einem pelletf¨

ormigen Wachstum kann die Biomasse leichter von der Kulturbr¨

uhe ab-

getrennt werden. Es kann dabei jedoch zu Stofftransportproblemen insbesondere bez¨

uglich

des Sauerstofftransports innerhalb eines Pellets kommen, wenn der Pelletdurchmesser eine

kritische Gr¨

oße ¨

uberschreitet. Bei einer Unterversorgung k¨

onnen Lyseprozesse im Inneren

des Pellets induziert werden. Freies Myzel weist gegen¨

uber einem pelletf¨

ormigen Wachstum

eine h¨

ohere Wachstumsgeschwindigkeit auf. Durch das freie Myzel erh¨

oht sich gleichzeitig

auch die Viskosit¨

at der Kulturbr¨

uhe, wodurch bei h¨

oheren Biomassenanteilen Probleme mit

dem Stofftransport und der Sauerstoffversorgung im Medium auftreten k¨

onnen [47].

Die Morphologie beeinflusst auch die Produktivit¨

at der Biomasse sowie die Synthese und

Sekretion von Proteinen, wobei je nach Produkt unterschiedliche Morphologien vorteilhaft

sein k¨

onnen. Beispielsweise wird eine maximale Ausbeute von Zitronens¨

aure bei Kultivie-

rungen mit kleinen Pellets erreicht [47]. Papagianni und Moo-Young [55] beobachteten eine

h¨

ohere spezifische Glucoamylaseaktivit¨

at bei der Kultivierung von großen Pellets gegen¨

uber

kleineren Pellets.

Das Wachstumsverhalten f¨

ur die Mutante ∆brlA wurde in mehreren Vorversuchen in einem

0.4-L Sch¨

uttelkolben und in einem 2-L Glasfermenter (Biostat B+, B. Braun Biotech Inc.,

Deutschland) untersucht (siehe Anhang A.1). Da die Mutante ∆brlA keine Sporen ausbildet,

wurde als Inokulum freies Myzel, das einer Agarplatte entnommen wird, verwendet. Bei

den Sch¨

uttelkolbenversuchen entstanden bei einer Sch¨

utteldrehzahl von 90 min−1mehrere

Milimeter große Pellets. Durch Einsetzen von Schikanen und Erh¨

ohung der Sch¨

uttelzahl auf

150 min−1, konnte die Gr¨

oße der Pellets reduziert werden. Die Reduzierung des pH-Werts

von 6 auf 5 f¨

uhrte zur einer weiteren Verringerung der Pelletgr¨

oße.

Bei den Versuchen in dem 2-L Glasfermenter mit einer R¨

uhrerdrehzahl von 350 rpm entstan-

den wiederum mehrere Millimeter große Pellets, die aufgrund ihrer Gr¨

oße die Probenahme-

schl¨

auche verstopften. Durch schrittweise Erh¨

ohungen der R¨

uhrergeschwindigkeit auf 1000

rpm konnte die Morphologie hin zu freien Myzel und kleineren Pellets ver¨

andert werden. In

32 Kapitel 3. Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger

einer Kultivierung bei einem pH-Wert von 3 fand nur ein schwaches Biomassenwachstum

statt, so dass die Morphologie nur eingeschr¨

ankt ¨

uber den pH-Wert gesteuert werden konn-

te. Die Verwendung einer Vorkultur aus einem Sch¨

uttelkolben erh¨

ohte das Wachstum und

verk¨

urzte somit die ben¨

otigte Versuchszeit.

Die Pelletgr¨

oße bei der akonidialen Mutante ∆brlA l¨

asst sich daher nur bedingt in einem

bestimmten Rahmen steuern, da direkt mit Biomasse anstelle einer Sporenl¨

osung angeimpft

werden muss. Es entstehen schnell große Pellets, in denen Stofftransportprobleme auftreten,

wodurch sich das Wachstum im Reaktor stark verlangsamt. Die großen Pellets erschweren zu-

dem die Probenahme, da sie Probenahmenvorrichtungen verstopfen und eine repr¨

asentative

Probenahme durch eine nicht homogene Verteilung erschweren. Ein Wachstum in Form von

freien Myzel scheint daher geeigneter, um eine gleichm¨

aßige N¨

ahrstoffversorgung sicherzu-

stellen und somit ein schnelleres Wachstum zu erm¨

oglichen sowie um Probleme bei der

Probenahme zu vermeiden. Die Kultivierungen in Form von freien Myzel sind dar¨

uber hin-

aus leichter reproduzierbar als Kultivierungen in Pelletform. Obwohl Emmler [54] von einer

h¨

oheren GA-Bildung bei pelletf¨

ormigen Wachstum berichtet, wird in dieser Arbeit daher

ein Wachstum in Form von freien Myzel angestrebt.

3.2 Glucoamylase und Analytik

Glucoamylase (auch Amyloglucosidase, γ-Amylase, 1-4-α-D-Glucan-glucohydrase oder Exo-

1,4-α-glucosidase, EC 3.2.1.3) ist ein Enzym, das β-D-Glucose von den nicht-reduzierenden

Enden von St¨

arke bzw. von anderen Glucooligo- und Polysacchariden abspaltet [54], [56]. Die

1-4-αVerbindung wird dabei bis zu 600 mal schneller als die 1-6-αhydrolisiert [54], [57]. In

der Industrie wird Glucoamylase unter anderen zur Umsetzung von St¨

arke zu Glucosesirup

angewandt [58].

Zwar wird GA von vielen Organismen synthetisiert, zur industriellen GA-Produktion wer-

den jedoch vor allem A.niger St¨

amme eingesetzt. Zudem ist das Expressions- und Sekre-

tionssystem auch f¨

ur die Produktion von heterologen Proteinen interessant [54]. Bei der

Fermentation von industriellen A.niger St¨

ammen werden Ausbeuten von bis zu 30 g

LGA

erreicht [59], w¨

ahrend Kelly [47] eine Aktivit¨

at zwischen 200−400 µKat

Lerzielte. Laut Emm-

ler [54] entspricht eine Aktivit¨

at von 1 µKat

Lungef¨

ahr 1.5mg

LGA im Medium, wobei diese

Beziehung aufgrund der zweifelhaften Reinheit der zur Ermittlung dieses Zusammenhangs

genutzten, kommerziellen GA nur als grober Richtwert anzusehen ist.

Die Menge von sekretierter GA korreliert einerseits mit der mRNA des Gens GlaA und

der Anzahl der Kopien von GlaA in der DNA [60]. Um die GA-Produktivit¨

at zu erh¨

ohen,

k¨

onnen bis zu 20 Kopien des Gens GlaA in die DNA eingef¨

ugt werden [58]. Zudem kann die

3.2. Glucoamylase und Analytik 33

Bildung von GA durch St¨

arke und in etwas geringeren Maße auch durch Glucose induziert

werden, w¨

ahrend Xylose als Substrat die GA-Bildung reprimiert [61].

A.niger bildet bis zu sechs Isoforme von GA mit einem Molekulargewicht zwischen 58 −

112 kDa aus. Bei Durchf¨

uhrung einer SDS-PAGE k¨

onnen jedoch unvollst¨

andig entfernte

Zuckerreste an der GA das Ergebnis verf¨

alschen [54]. In den meisten Literaturquellen werden

zwei GA-Formen unterschieden, wobei die erste GA-Form GA1 616 Aminos¨

auren (97 kDa)

und die zweite GA2 512 Aminos¨

auren und ein Gewicht von (65−74 kDa) aufweisen [62]. Es

wird angenommen, dass beide Formen durch das gleiche GlaA-Gen kodiert werden.

Die Form GA1 weist aufgrund einer st¨

arkebindenden Dom¨

ane (SBD) eine h¨

ohere Aktivit¨

bei St¨

arke auf [56]. GA2 fehlt diese Dom¨

ane, wobei jedoch unklar ist, wie es zu diesem Un-

terschied kommt. Es wird vermutet das GA2 aus GA1 aufgrund der Aktivit¨

at von Proteasen

oder des Spleißens der mRNA hervorgeht. Bei Di- und Trisacchariden wie Maltose ist die

Aktivit¨

at bei beiden Formen jedoch nahezu gleich groß [54].

Emmler stellt eine h¨

ohere GA-Freisetzung und Aktivit¨

at bei Lysevorg¨

angen fest [54]. Die

in dieser Arbeit durchgef¨

uhrten Versuche sind hier nicht eindeutig auszuwerten. In man-

chen Versuchen f¨

uhrte eine l¨

angere Kohlenstofflimitierung zu einer weiteren Erh¨

ohung der

GA-Aktivit¨

at, w¨

ahrend bei anderen Versuchen die Aktivit¨

at w¨

ahrend einer Kohlenstoffli-

mitierung konstant blieb. Die bei einer Kohlenstofflimitierung eintretende Expression von

Proteasen kann zudem die GA-Aktivit¨

at verringern [54].

Des Weiteren kann GA auch an der ¨

außeren Zellwand adsorbiert vorliegen. Die an der

Zellwand adsorbierte GA wird bei Lysevorg¨

angen, wenn die Funktion der Zellwand gest¨

ort

ist, freigesetzt. Emmler vermutet, dass so die GA erst bei einem N¨

ahrstoffmangel freigesetzt

werden soll [54]. Die Adsorption von GA an der Zellwand scheint dar¨

uber hinaus auch

pH-abh¨

angig zu sein, so soll bei einem pH-Wert von 5.5 die GA haupts¨

achlich adsorbiert

vorliegen und bei einem pH-Wert von 3 desorbiert werden. Der isoelektrische Punkt von

GA liegt dabei in einem Bereich von 3.4 bis 3.9. Außerdem f¨

uhrt ein Zellaufschluss zu einer

h¨

oheren Ausbeute an GA. Die Aktivit¨

at von GA hat ein Optimum bei einem pH-Wert von

3.5−5 [54].

GA wird bei einer Kultivierung auf einer Agarplatte haupts¨

achlich beim Wachstum an den

Hyphenspitzen und in einem geringeren Anteil auch in der Mitte der Kolonie sekretiert [63].

Neuere Studien stellen zudem Ansammlungen von GA an den Septen fest, was auf eine GA-

Produktion unabh¨

angig vom Wachstum hindeuten kann [64]. Mit steigenden Scherstress

kann die GA-Bildung durch A.niger abnehmen [54], wobei gleichzeitig durch die bessere

Sauerstoffversorgung ein schnelleres Wachstum erreicht werden kann.

34 Kapitel 3. Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger

3.2.1 Analytik der Glucoamylaseaktivit¨

Die Quantifizierung der gebildeten GA erfolgt ¨

uber eine Aktivit¨

atsbestimmung. Die Akti-

vit¨

at beschreibt die F¨

ahigkeit von GA β-D-Glucose von l¨

angerkettigen Zuckern abzuspalten.

Da A.niger neben GA auch α-Amylase (EC 3.2.1.1) und α-Glucosidase (EC 3.2.1.20) bil-

det, ist der GA-Aktivit¨

atsnachweis in der Regel nicht GA-spezifisch [54]. Allerdings wird in

den meisten Ver¨

offentlichungen der Einfluss von α-Amylase und α-Glucosidase nicht weiter

betrachtet und letztendlich die gesamte, erfasste Aktivit¨

at der GA zugeschrieben.

Als Substrate f¨

ur die Nachweisreaktion k¨

onnen St¨

arke, p-Nitrophenyl-α-D-glucopyranosid

(PNPG) oder Maltose genutzt werden, wobei Maltose und PNPG durch α-Amylase nicht

gespaltet werden k¨

onnen. Bei Verwendung von St¨

arke wird die GA-Aktivit¨

at dagegen durch

die Aktivit¨

at von α-Amylase beeinflusst. Im Fall von PNPG wird Nitrophenyl freigesetzt,

welches wiederum photometrisch untersucht werden kann [58].

In dieser Arbeit basiert die Bestimmung der Glucoseamylaseaktivit¨

at auf der Hydrolyse

von Maltose zu Glucose durch Glucoamylase. F¨

ur die Messung der Aktivit¨

at wird die im

Filtrat vorhandene Glucose mit einer Zentrifugaleinheit (30 kDa) entfernt. Die im Retentat

befindliche Glucoamylase wird mit 200 µL Citratpuffer wieder gel¨

ost. Anschließend wird

die aufkonzentrierte Glucoamylase zusammen mit 200 µL Maltosel¨

osung bei 50 ◦Cund

einem pH-Wert von 5 f¨

ur 30 min inkubiert und die entstandene Glucose mit einem Test-

kit (UV-Test-D-Glucose-Kit) bei einer Wellenl¨

ange von 320 nm photometrisch bestimmt.

Die Aktivit¨

at wird definiert als die entstandene Glucosemenge in mol pro Sekunde (Ka-

tal, 1 Kat =mol

s), wobei im Folgenden zur besseren ¨

Ubersicht die Aktivit¨

at aGA in µKat

angegeben wird.

F¨

ur die Berechnung der GA-Aktivit¨

at wird zuerst die in der Nachweisreaktion aus einer

250 µL Probe gebildete Glucosemenge ∆cGlc bestimmt. Die Aktivit¨

at von GA aGA wird

dann folgendermaßen berechnet:

aGA =106

60 s

min ·∆cGlc

30 min ·180.16 g

mol µKat

L,(3.1)

wobei das Molekulargewicht von Glucose ˜

MGlc = 180.16 g

mol betr¨

agt.

Da kein zuverl¨

assiger Standard mit definierter Aktivit¨

at f¨

ur Glucoamylase zur Verf¨

ugung

stand, konnte die auf PNPG beruhende Methode nicht angewandt werden. Die vergleichswei-

se niedrige Aktivit¨

at bei den Versuchen in dieser Arbeit ist wahrscheinlich darin begr¨

undet,

dass durch die Kultivierung in Form von freien Myzel bei der Sterilfiltrierung eine hohe

Menge an GA an der Biomasse adsorbiert ist und im Filterkuchen zur¨

uckbleibt. Zus¨

atzlich

wird die erzielte Aktivit¨

at durch den Stamm und die Kultivierungsbedingungen beeinflusst.

Dennoch ist die angewendete Analytik reproduzierbar, so dass eine ¨

Ubertragbarkeit gegeben

ist.

3.3. Medium 35

Zus¨

atzlich zum Aktivit¨

atsnachweis wird stichprobenartig das Sekretom mit einer SDS-PAGE

untersucht und mit gekaufter GA als Standard verglichen, um den Nachweis zu erbrin-

gen, dass die gemessene Aktivit¨

at auf sekretierte GA in der Kulturbr¨

uhe zur¨

uckzuf¨

uhren

ist.

3.3 Medium

Das Medium f¨

ur die Kultivierungen und die Vorkultur setzt sich folgendermaßen zusammen,

wobei die Anfangskonzentration von Glucose cGlc,0 bei jedem Versuch variiert wird: 1.094 ·

cGlc,0 g/L Glucose ·1 H2O (cGlc,0 g/L Glucose im Medium), 7 g/L NH4Cl (2.35 g/L NH+

4),

0.55 g/L MgSO4·7 H2O, 0.1 g/L CaCl2·2 H2O, 2.65 g/L KH2PO4(1.83 g/L PO4), 4 mL/L

Spurenelementel¨

osung, 1 mL/L P2000 (Antischaummittel, Fluka).

Die Spurenelementel¨

osung besteht aus: 100 mg/L EDTA, 44 mg/L ZnSO4, 8.3 mg/L MnCl2

·2 H2O, 3.2 mg/L CoCl2·6 H2O, 3.2 mg/L CuSO4·5 H2O, 2.2 mg/L (NH4)6Mo7O24 ·4

H2O, 14.7 mg/L CaCl2·2 H2O, 10 mg/L FeSO4·7 H2O.

3.4 Versuchsaufbau und Durchf¨

uhrung

Die Kultivierungen werden in einem 22-L Edelstahlfermenter (Biostat C, B. Braun Bio-

tech Inc., Deutschland) am Fachgebiet f¨

ur Mess- und Regelungstechnik an der Technischen

Universit¨

at Berlin durchgef¨

uhrt. Der schematische Versuchsaufbau ist in Abbildung 3.1 dar-

gestellt.

Zun¨

achst wird das Myzel von einer auf einer Agarplatte gewachsenen Kultur entnommen

und in zwei Sch¨

uttelkolben mit jeweils 0.2 L Medium als Vorkultur f¨

ur 24 h bei 30 ◦Cund

120 rpm inkubiert. Anschließend werden die Vorkulturen zusammengef¨

uhrt, dispergiert und

in den Fermenter gegeben.

Das Anfangsvolumen V0im Fermenter betr¨

agt inklusive Vorkultur bei den ersten drei Ver-

suchen (F1-F3) 10 L und bei den ¨

ubrigen Versuchen (F4-F11) 12 L. Die Temperatur wird

w¨

ahrend des Prozesses mit einem K¨

uhlmantel auf 30 ◦C geregelt. Der pH-Wert wird mit-

tels einer Glaselektrode (405-DPAS-SCK85, Mettler-Toledo International Inc., USA) ge-

messen und durch Zugabe von Schwefels¨

aure (H2SO4) und Natronlauge (NaOH) auf einen

pH-Wert von 5 geregelt. Als R¨

uhrer wird ein Rushton-Turbinen-R¨

uhrer genutzt, wobei die

R¨

uhrergeschwindigkeit 1000 rpm betr¨

agt. Das Medium wird kontinuierlich mit 15 slpm

Luft begast. Der Gel¨

ostsauerstoff im Medium wird mit einer Sauerstoffsonde (InPro 6800,

Mettler-Toledo International Inc., USA) online gemessen. Zus¨

atzlich steht f¨

ur die Mes-

sung der CO2-Konzentration im Abgas ein Gassensor (BlueInOne Cell, BlueSens gas sensor

GmbH) zur Verf¨

ugung. Im Laufe der Fermentation werden Ammonium (cAm,F eed = 30 g/L),

36 Kapitel 3. Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger

Glucose (cGlc,F eed = 450 g/L) und Phosphat (cP h,F eed = 24 g/L) jeweils ¨

uber ein Pumpe-

Waage-System zudosiert.

W¨

ahrend der Fermentationen werden regelm¨

aßig Proben (VP robe) genommen, um die Trocken-

biomassen- (cX) und um die Glucose- (cGlc), Ammonium- (cAm) und Phosphatkonzentratio-

nen (cP h), sowie die Glucoamylaseaktivit¨

at (aGA) zu messen. Die Proben werden photome-

trisch mit kommerziellen Enzymtestkits (Phosphat FS und Glucose GOD FS von DiaSys

Diagnostic Systems GmbH, Deutschland) untersucht. Die Ammoniumbestimmung erfolgt

uber die Berthelot-Reaktion. Die Biotrockenmasse wird durch Filtration (0.2µm) der Pro-

be und anschließender Trocknung in zweifacher Bestimmung durchgef¨

uhrt.

NaOH

TCR

PDR

pO2

H2SO4

QCR

Abgas

P2000

Probe

Druckluft

NH4

WCR

8888.8

WCR

8888.8

WCR

8888.8

Glc

Abbildung 3.1: Schematischer Versuchsaufbau des Bioreaktors. Abbildung ¨

ubernommen von [65]

und f¨

ur A.niger angepasst

Die Zuflussraten der Feedings ui,F eed werden zu Beginn des Versuchs festgelegt. Durch die

pH-Regelung werden zudem S¨

aure uS¨aure und Base uBase hinzugef¨

ugt. ¨

Uber die Kultivie-

rungsdauer verdampft ein Teil der Fl¨

ussigkeit im Reaktor (uAbdampf ). Bei einer starken

Schaumbildung wird ein Antischaummitel (uAF OAM ) hinzu dosiert. Das Volumen im Fer-

menter wird nicht direkt gemessen, sondern ausgehend von dem Anfangsvolumen berech-

net:

dt =Ztk

F(t)dt , V (t= 0) = V0,(3.2)

3.5. Messunsicherheiten 37

wobei F die Summe aller Zu- und Abfl¨

usse bezeichnet:

F=uAm,F eed +uP h,F eed +uGlc,F eed +uBase +uS¨aure +uAF OAM −uAbdampf (3.3)

Nach einer Probennahme verringert sich das Volumen Vum das Volumen der entnommenen

Probe VP robe, was numerisch als diskrete Zustands¨

anderung am Zeitpunkt der Probenahme

tP robe umgesetzt wird.

Um den Abdampfvolumenstrom uAbdampf zu ermitteln, wird in einem inerten Versuch bei

einer konstanten Temperatur von T= 30 ◦C und bei einer konstanten Begasung mit 15 slpm

die Gewichtsabnahme des Mediums ¨

uber mehrere Stunden erfasst und in Liter pro Stunde

umgerechnet. Der mittlere Abdampfvolumenstrom uAbdampf betr¨

agt dabei 0.0052 L

Nahinfrarotspektroskopie

Neben der nasschemischen Analytik werden zus¨

atzlich auch in jedem Versuch Spektren ¨

uber

ein Nahinfrarotspektrometer (PGS 1.7 tc 512, tec5 AG, Deutschland) und einer Transmissi-

onssonde (Excalibur 12, Hellma GmbH, Deutschland) mit einer Spaltbreite von 1 mm online

aufgenommen. Diese zus¨

atzliche Online-Messung soll eine zeitlich h¨

oher aufgel¨

oste Messung

von Biomasse und ggf. der Substrate oder gar des Produkts erlauben. In den durchgef¨

uhrten

Versuchen mit A.niger zeigt sich jedoch, dass sich die Transmissionssonde bereits bei klei-

nen Biomassekonzentrationen zusetzt und die NIR-Strahlung vollst¨

andig absorbiert wird.

Da sich somit kaum neue Erkenntnisse aus der aufw¨

andigen Auswertung der Spektren ge-

nerieren lassen, wird im Folgenden nicht weiter auf eine umfangreiche Beschreibung und

Auswertung der durchgef¨

uhrten Nahinfrarotspektroskopie eingegangen.

3.5 Messunsicherheiten

Die nasschemischen Analysen, die Biotrockenmassebestimmung sowie die online gemesse-

nen Gr¨

oßen sind mit Unsicherheiten behaftet. Es wird angenommen, dass die Standard-

abweichung der Messung linear von dem Messwert abh¨

angig ist [3]. Um die Unsicherheit

abzusch¨

atzen, werden daher bei den Versuchen F2 und F3 mehrere Proben in unterschied-

lichen Konzentrationsbereichen f¨

unffach untersucht und der Mittelwert sowie die Standard-

abweichung der jeweiligen Probe bestimmt (siehe Tabellen A.3 - A.7). Anschließend wird die

Standardabweichung in Abh¨

angigkeit des Mittelwerts aufgetragen und eine Ausgleichsgerade

bestimmt (siehe Abbildung A.1). Als Grundlage f¨

ur die Beschreibung der Messunsicherhei-

ten dient folgende Gleichung:

σi=ai·yi+bi(3.4)

F¨

ur den Faktor biwird f¨

ur die naßchemische Analytik mindestens ein Wert von 0.001 an-

gesetzt, um bei einer gemessenen Gr¨

oße von Null eine Division durch Null zum Beispiel in

Gleichung 2.3 zu verhindern.

38 Kapitel 3. Fed-Batch-Kultivierungen mit Aspergillus niger

Die Unsicherheitsbetrachtung f¨

ur die Basenzugabe in Tabelle 3.1 wird von Neddermeyer

ubernommen [65]. Bei den online-gemessenen Gr¨

oßen PO2und CO2wird keine Abh¨

angigkeit

der Messung vom aktuellen Wert, sondern nur ein statisches Rauschen angenommen. Um

das Messrauschen f¨

ur beide Messgr¨

oßen zu bestimmen, werden die Standardabweichungen

jeweils um einem station¨

aren Punkt in einem Messschrieb gesch¨

atzt.

In Tabelle 3.1 sind die Faktoren aiund bif¨

ur die einzelnen Messgr¨

oßen aufgef¨

uhrt:

Tabelle 3.1: Faktoren zur Berechnung der Standardabweichung f¨

ur die einzelnen Messgr¨

oßen

Messgr¨

oße aibiEinheit

Biomasse 0.059 0.001 g

Ammonium 0.011 0.024 g

Phosphat 0.037 0.020 g

Glucose 0.004 0.032 g

Glucoamylase 0.025 0.227 µKat

Base 0.02 3 L

PO20 0.05 %

CO20 0.009 %

3.6 Versuchs¨

ubersicht

Es wurden insgesamt elf Versuche in dem 22-L-Fermenter durchgef¨

uhrt. Eine ¨

Ubersicht ¨

uber

die einzelnen Versuche ist in Tabelle 3.2 dargestellt. Der erste Versuch F1 und in Teilen auch

der zweite Versuch F2 dienten zur weiteren Untersuchung der Prozessbedingungen und wa-

ren reine Batch-Versuche. Mit dem darauf folgenden Versuch F3 wurde das System gezielt

mittels Substratzuf¨

utterung angeregt. Um die Modellparameter des initialen Modells besser

identifizieren zu k¨

onnen, wurde der vierte Versuch F4 mit einer optimalen Versuchsplanung

geplant. Im f¨

unften Versuch F5 wurde auf Basis einer Luedeking-Piret-Kinetik versucht,

die GA-Aktivit¨

at zu maximieren. Unter der Annahme, dass eine geringe Glucosekonzetra-

tion die Expression von GA verst¨

arkt, fand im sechsten Versuch F6 eine kontinuierliche

Zuf¨

utterung statt. In der siebten Kultivierung F7 wurden die Folgen einer l¨

anger anhal-

tenden Kohlenstofflimitierung untersucht. Mit den Versuchen F8 und F9 wird der Einfluss

einer Phosphat- bzw. Ammoniumlimitation untersucht. Der zehnte Versuch F10 diente zur

Uberpr¨

ufung der GA-Bildung. Der letzte Versuch F11 hatte das Ziel, die GA-Aktivit¨

at auf

Basis eines hybriden Modells zu maximieren. Um die Freiheitsgrade einzuschr¨

anken, liegt

die maximale Versuchsdauer jeweils bei ungef¨

ahr 52 h.

3.6. Versuchs¨

ubersicht 39

Tabelle 3.2: ¨

Ubersicht ¨

uber die Versuche im 22-L-Fermenter

Versuch Dauer Volumen Bemerkung

[h] [L]

F1 45 10 Untersuchung der Kultivierungsbedingungen

F2 46 10 Batchversuch f¨

ur erste Messdaten

F3 52 10 Anregung des Systems durch Zuf¨

utterung

F4 52 12 Optimale Versuchsplanung f¨

ur Modellparameter

F5 49 12 Maximierung der Glucoamylase

F6 51 12 Versuchsdaten bei niedriger Glucosekonzentration

F7 52 12 Lyse bei Kohlenstofflimitation

F8 51 12 Einfluss einer Phosphatlimitation

F9 51 12 Einfluss einer Ammoniumlimitation

F10 51 12 ¨

Uberpr¨

ufung der GA-Bildung

F11 52 12 Maximierung GA-Aktivit¨

Kapitel 4

Anwendung der hybriden

Modellbildung auf Aspergillus

niger

Die angestrebte Maximierung der Glucoamylaseaktivit¨

at durch eine Versuchsplanung im

Rahmen der Prozessf¨

uhrung erfordert ein ausreichend genaues Modell. Da die Modellbil-

dung f¨

ur Bioprozesse mit einem sehr hohen zeitlichen Aufwand einhergeht, wird in diesem

Kapitel daher zuerst ein weitgehend datenbasierter Ansatz verfolgt. Dabei wird untersucht,

ob die Methode zur hybriden Modellbildung aus Kapitel 2.2 f¨

ur eine Versuchsplanung zur

Maximierung der Glucoamylase bereits hinreichend genau ist oder ob auch eine zus¨

atzliche,

zeitaufw¨

andigere mechanistische Modellbildung notwendig ist.

Die in Kapitel 2.2 vorgestellte Methode wird am Beispiel von mehreren Fed-Batch-Kulti-

vierungen mit A.niger demonstriert, wobei als Produkt das Enzym Glucoamylase (GA)

betrachtet wird. Die hybride Modellbildung basiert auf den ersten f¨

unf Kultivierungen, von

denen drei zur Anpassung des Modells (F2-F4) und eine Kultivierung (F5) zur Kreuzvali-

dierung genutzt werden. Als Messgr¨

oßen werden in diesem Beispiel nur die nasschemischen

Messgr¨

oßen ber¨

ucksichtigt. Der Messvektor ylautet demnach:

y= (cX, cAm, cP h, cGlc, aGA)T.(4.1)

4.1 Interpolation der Messdaten

F¨

ur die Berechnung des Verd¨

unnungsterms in Gleichung (2.19), die Berechnung des Inte-

grals in Gleichung (2.42) bzw. die Bildung der numerischen Ableitung in Gleichung (2.41)

sowie f¨

ur die Generierung von Trainingsdaten zur Anpassung des MLPs ist eine hochauf-

gel¨

oste Interpolation der Messdaten notwendig. Die folgende Interpolationsmethode basiert

4.2. Ergebnisse 41

auf der Arbeit von Herold [66]. Die vorgestellte Methode ist besonders f¨

ur die Interpolation

von Messdaten von Fed-Batch-Kultivierungen geeignet, da mit dieser Methode ¨

Anderungen

in den Konzentrationen durch Zuf¨

utterung eines Substrats oder durch Verd¨

unnung besser

abgebildet werden k¨

onnen als bei einer direkten Interpolation der Messdaten. Das Vorgehen

ahnelt vom Prinzip her der Umstellung in Gleichung (2.21) und wurde bereits durch Herold

im verwendeten ABC-System implementiert.

Zuerst werden offensichtliche Ausreißer aus den Messdaten per Hand entfernt und die

Messdaten mittels Whittaker-Smoother (siehe [67]) gegl¨

attet.

In einem zweiten Schritt werden die um die Zuf¨

utterung und Probenahmen kompensier-

ten Massen m∗

Sf¨

ur jede Komponente Snach Gleichung (4.2) berechnet. Dabei bezeichnet

cS,F eed die Konzentration einer Substanz im Feed in g

Lund uS,F eed den Volumenstrom des

entsprechenden Feeds in L

h. Die Kompensation erfolgt vom Ende eines Versuches her, so

werden die Zuf¨

utterung vom Zeitpunkt kbis zum Endzeitpunkt eines jeden Versuches Nj

f¨

ur konstante Zuflussraten im Intervall von ∆ti= [ti, ti+ ∆ti] hinzuaddiert. Auch die durch

die Probenahmen entnommene Masse jeder Substanz ∆mSwird kompensiert.

m∗

S(tk) = cS(tk)·V(tk) +

i=k

uS,F eed(ti)·cS,F eed ·∆ti−

i=k

∆mS(ti) (4.2)

Anschließend werden die ausgeglichenen Konzentrationen c∗

S=m∗

Vmit kubischen Splines

nach Akima [68] interpoliert. Die Abtastrate betr¨

agt dabei ∆t= 0.01 h.

Die tats¨

achlich gesuchten Konzentrationen c(t) k¨

onnen dann im letzten Schritt durch die

R¨

uckrechnung von Gleichung (4.2) aus den ausgeglichenen Konzentrationen c∗(t) berechnet

werden. F¨

ur eine detaillierte Darstellung sei auf [69] und [66] verwiesen. Mit den so inter-

polierten Messdaten werden nach Gleichung (2.22) die transportfreien Zust¨

ande ˜ckbzw. die

Matrix Cberechnet.

4.2 Ergebnisse

Im Folgenden wird die beschriebene Methode zur hybriden Modellentwicklung f¨

ur Kul-

tivierungen mit A.niger angewandt. Um den Prozess der Modellbildung zu beschreiben,

wird f¨

ur jeden Schritt ein eigenes Modell erstellt. Zuerst wird im ersten Modell nur die

Wachstumsgeschwindigkeit beschrieben. Darauf aufbauend wird eine Kinetik f¨

ur die Pro-

duktbildung gesucht. Im letzten Schritt wird das Modell mit einer Parameteridentifikation

angepasst.

42 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

4.2.1 Modell 1 - Beschreibung der Wachstumsgeschwindigkeit

F¨

ur die Modellbildung wird im ersten Schritt zun¨

achst eine Singul¨

arwertzerlegung auf die

mit Hilfe der interpolierten Messdaten berechneten transportfreien Zustandsmatrix Cgleich-

zeitig f¨

ur die Versuche F2-F4 durchgef¨

uhrt.

Mit Formel (2.27) wird anschließend der Anteil des ersten Singul¨

arwerts berechnet. Die-

ser liegt bereits bei ϵ= 86 % und repr¨

asentiert damit wahrscheinlich die Wachstumsge-

schwindigkeit rX. Die sichtbare ¨

Anderung in den Messdaten ist somit zu einem großen Teil

allein auf die Wachstumsgeschwindigkeit zur¨

uckzuf¨

uhren. Der restliche Anteil von 14 %

kann auf eine weitere Reaktion hinweisen. Bei der Beurteilung des Singul¨

arwertanteils sind

das Messrauschen, Fehler in der Interpolation und die Abweichung der Realit¨

at von der

Modellvorstellung zu beachten. In der Realit¨

at werden Kultivierung mit Mikroorganismen

durch eine Vielzahl einzelner und komplexer Vorg¨

ange beeinflusst. Diese ¨

Anderungen sind

aber nur sichtbar, wenn sie sich deutlich st¨

arker als das Messrauschen auf die Messdaten

auswirken. Zun¨

achst soll im Modell 1 aber nur die Wachstumsgeschwindigkeit betrachtet

werden.

Als Kandidatenstruktur ˜

K1wird eine auf die Biomasse genormte Matrix, deren restlichen

Elemente nicht festgelegt ({}) sind, vorgeschlagen:

K1=







YAm,X

YP h,X

YGlc,X

YGA,X













{}







(4.3)

Die Anpassung des ersten Spaltenvektors u1aus der Singul¨

arwertzerlegung ¨

uber Gleichung

(2.31) an die Kandidatenstruktur liefert als Sch¨

atzung f¨

ur die St¨

ochiometriematrix ˆ

K1:

K1=







YAm,X

YP h,X

YGlc,X

YGA,X













−0.1130

−0.0539

−2.1499

0.2230







(4.4)

Die gefundenen Ertragskoeffizienten Yi,X liegen dabei alle in einem biologisch sinnvollen

Bereich. Auf Grundlage von ˆ

K1wird dann mit Gleichung (2.35) die Transformationsmatrix

T1ermittelt.

T1=







0.1433 −0.0162 −0.0073 −0.3116 0.1591

0.0428 0.9987 −0.0006 −0.0256 0.0130

0.0194 −0.0006 0.9997 −0.0116 0.0059

0.8233 −0.0256 −0.0116 0.5082 0.2510

−0.4203 0.0130 0.0059 0.2510 0.8719







(4.5)

4.2. Ergebnisse 43

Im Folgenden Schritt werden mit T1die reaktionsvarianten und -invarianten Zust¨

ande f¨

die Versuche F2 bis F4 berechnet. Abbildung 4.1 zeigt diese aneinander geh¨

angt und bei

aquidistanter Zeiteinteilung. Die erste Zeile von T1¨

uberf¨

uhrt beispielsweise den transport-

freien Zustandsvektor ˜ckin einen reaktionsvarianten Zustand yr1(blaue Linie in Abb.

4.1), der dem Integral der Wachstumsgeschwindigkeit rXentspricht. Die weiteren Zust¨

ande

Abbildung 4.1: Reaktionsvariante und -invariante Zust¨

ande berechnet mit ˆ

K1f¨

ur die Versuche

F2 bis F4.

(yiv2, . . . , yiv5) w¨

urden nach Gleichung (2.37) eigentlich in den Nullraum abgebildet werden.

Da aber sehr wahrscheinlich auch weitere Reaktionen auftreten, die Modellvorstellung von

der Realit¨

at abweicht und die Messdaten durch Rauschen beeinflusst werden, werden die

reaktionsinvarianten Zust¨

ande f¨

ur das gefundene ˆ

K1nicht in den Nullraum abgebildet.

Nach der Berechnung des ersten reaktionsvarianten Zustands kann die Wachstumsgeschwindig-

keit rXanalog zur Gleichung (2.39) in einen bekannten Term rX,M und einen unbekannten

Anteil rX,MLP aufgeteilt werden.

rX(c(t)) = rX,M (c(t)) ·rX,MLP (c(t)) (4.6)

Es wird angenommen, dass die Wachstumsgeschwindigkeit proportional zur Biomassekon-

zentration cXist. Außerdem wurde bisher in keinem Versuch ein Wachstum in Abwesen-

heit von Glucose beobachtet, so dass zus¨

atzlich ein generischer Monod-Term mit einer

Halbs¨

attigungskonstante von 10−3g/L eingef¨

ugt wird. Diese sehr kleine Halbs¨

attigungskonstante

dient nur dazu, ein Wachstum ohne Glucose auszuschließen und nicht dazu, den Einfluss

44 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

von Glucose insgesamt zu modellieren. Der mechanistische Modellanteil wird daher folgen-

dermaßen modelliert:

rX,M (c(t)) = cX(t)·cGlc(t)

cGlc(t) + 10−3g

.(4.7)

F¨

ur den unbekannten Kinetikanteil der Wachstumsgeschwindigkeit rX,MLP wird ein Multi-

Layer Perceptron mit den vier Eing¨

angen Biomassen-, Glucose-, Ammonium- und Phos-

phatkonzentration verwendet. Ein Einfluss der Glucoamylaseaktivit¨

at auf die Wachstums-

geschwindigkeit wird ausgeschlossen. F¨

ur den Black Box-Anteil der Wachstumsgeschwindig-

keit gilt dann:

rX,MLP (c(t)) = fMLP (c(t)) .(4.8)

Die Eing¨

ange des MLPs werden nicht normalisiert, da die Konzentrationen eine ¨

ahnliche

Gr¨

oßenordnung besitzen und auf diese Weise eine biologische Interpretation erleichtert

wird.

Bei der Identifikation des MLPs ist zu ber¨

ucksichtigen, dass die gemessenen Konzentratio-

nen bzw. die interpolierten Konzentrationen f¨

ur Glucose trotz Zuf¨

utterung auf Null fallen,

da die hinzugegebene Glucose instantan durch den Organismus aufgebraucht wird. Daher

wird beim Anlernen des MLPs die Glucosekonzentration an den Zeitpunkten, an denen die

gemessene Glucosekonzentration auf Null f¨

allt und gleichzeitig Glucose zugef¨

uttert wird,

auf einen Wert von 10−5g

Lgesetzt. Dieser Wert wird empirisch festgelegt und f¨

uhrt zu

ausreichend genauen Ergebnissen in der Modellanpassung.

Als Aktivierungsfunktion wird in dieser Arbeit f¨

ur die Eingangsneuronen und f¨

ur die Neuro-

nen auf den Zwischenschichten der Tangens hyperbolicus genutzt. Um betragsm¨

aßig negative

Kinetiken zu verhindern, ist als Aktivierungsfunktion f¨

ur die Ausgangsneuronen ein Recti-

fier (y=max(0, x)) oder ein Soft-Plus (y=ln(1 + ex)) vorteilhaft. In dieser Studie wird

f¨

ur das Ausgangsneuron das Soft-Plus verwendet, da hier eine Ableitung ¨

uber den gesamten

Definitionsbereich gegeben ist. Die Begrenzung auf positive Raten und ein quasi linearer

Ausgang auf der Ausgangsschicht verbessern das Modellverhalten erheblich.

Die Anzahl der Neuronen auf der Eingangsschicht n1= 4 und auf der Ausgangsschicht

nL= 1 sind durch die vier Konzentrationen als Eing¨

ange bzw. durch die Wachstumsrate

als Ausgang vorgegeben. Die Zahl der Zwischenschichten (hidden layer) und der Neuronen

auf jeder Zwischenschicht (nhi) wird durch eine schrittweise Erh¨

ohung der Neuronen pro

Schicht bzw. der Schichten in einem iterativen Vorgehen festgelegt. Zu Beginn wird eine

Zwischenschicht mit einem Neuron gew¨

ahlt. Als Abk¨

urzung f¨

ur die Struktur des Netzes

wird folgende Notation genutzt: (n1= 4, nh1= 1, nL= 1) = (4,1,1).

Die G¨

ute zur Anpassung der Kinetik berechnet sich nach Formel (2.49). Es wird also die Ab-

weichung zwischen dem Integral der modellierten Kinetik rXund dem reaktionsvarianten

Zustand yr1zu jedem Zeitpunkt tkund f¨

ur jeden Versuch (siehe Gleichung (2.43)) mini-

4.2. Ergebnisse 45

miert, wobei die Integration auf dem expliziten Euler-Verfahren beruht. F¨

ur den hybriden

Modellierungsansatz wird nur wenig biologisches Vorwissen vorausgesetzt. Um die maximale

Wachstumsrate beim Training des MLPs dennoch einzugrenzen und unrealistische Ausg¨

ange

auszuschließen, wird die obere Grenze empirisch auf einen Wert von 0.31

hfestgelegt. Die-

ser Wert ist ohne weitere Vorkenntnisse aus Kapitel 3 in Anbetracht der zur Anpassung

genutzten Versuche F2-F4 als obere Grenze biologisch plausibel. Zus¨

atzlich wird angenom-

men, dass die Wachstumsrate stets gr¨

oßer bzw. gleich 0 ist. Beide Forderungen k¨

onnen ¨

uber

Gleichung (2.47) als Nebenbedingung im G¨

utekriterium formuliert werden.

Des Weiteren soll der Ausgang des MLPs f¨

ur einen Nullvektor 0 als Eingang auch zu 0

werden, so dass das Wachstum nur bei ausreichender Biomassen- oder Substratkonzentration

stattfinden kann. Zwar wird diese Forderung f¨

ur Glucose bereits durch den mechanistischen

Anteil der Kinetik rX,M erf¨

ullt, jedoch f¨

uhrt diese zus¨

atzliche Forderung beim Anlernen

des MLPs auch zu biologisch konsistenten Vorhersagen des MLPs. Dies wird durch einen

zus¨

atzlichen Term E0im G¨

utefunktional umgesetzt.

E0=∥fMLP (0)∥2(4.9)

Zus¨

atzlich wird durch diesen Term die L¨

ucke in den Trainingsdaten f¨

ur Biomassekonzentra-

tionen von 0 geschlossen, da in allen Messdaten bereits Biomasse vorhanden ist. Andernfalls

kann der Ausgang des MLPs f¨

ur kleine Biomassenkonzentrationen unrealistische Werte an-

nehmen.

Die Startwerte f¨

ur die Parameter des MLPs werden zuf¨

allig in einem Bereich von −1 bis

1 gew¨

ahlt. Um die Anpassung gegen lokale Minima zu robustifizieren, wird der m¨

ogliche

Parameterraum mittels Latin Hypercube Sampling (2 random seeds, Anzahl der cubes 10)

gesampelt. Die Minimierung des G¨

utefunktionals aus Gleichung (2.49) erfolgt mit dem Op-

timierer SNOPT7 aus der TOMLAB Optimization Toolbox [70] in MATLAB [71]. Eine

Aufteilung in Trainings- und Validierungsdaten wird nicht vorgenommen.

Da die direkte Anpassung der Kinetik an den reaktionsvarianten Zustand aufgrund der Inter-

polation und Integration mit einer hohen Unsicherheit einhergeht, sollte die Anpassung auch

durch eine Simulation des Modells mit der identifizierten Kinetik evaluiert werden.

Bereits eine Zwischenschicht mit zwei Neuronen (4,2,1) reicht f¨

ur eine ausreichend gute

Beschreibung der Wachstumsrate aus. Insgesamt besitzt das MLP bei dieser Struktur 13

Parameter. Abbildung 4.2 zeigt den mit Gleichung (2.34) berechneten reaktionsvarianten

Zustand yr1=Rtk

0ˆrXdt und das Integral der mit den Gleichungen (4.6-4.8) modellierten

Wachstumsgeschwindigkeit Rtk

0rXdt. Da auf der letzten Schicht des neuronalen Netzes ein

Soft-Plus eingesetzt wird, kann die modellierte Wachstumsgeschwindigkeit nicht negativ

werden und somit einem fallenden reaktionsvarianten Zustand nicht folgen. In der Modellie-

rung wird angenommen, dass die Wachstumsgeschwindigkeit nur positive Werte annehmen

46 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

kann. Das Fallen des reaktionsvarianten Zustands in Abbildung 4.1 k¨

onnte auch auf Mes-

sunsicherheiten und die Interpolation zur¨

uckzuf¨

uhren sein und stellt somit m¨

oglicherweise

nur ein numerisches Artefakt dar.

Abbildung 4.2: Anpassung der integrierten, modellierten Wachstumsgeschwindigkeit Rtk

0rXdt

(schwarz) an den reaktionsvarianten Zustand yr1=Rtk

0ˆrXdt (rot) f¨

ur Modell 1.

Abbildung 4.3 zeigt den Ausgang des MLPs in Abh¨

angigkeit der Biomassen- und Glucose-

konzentration bei einer konstanten Phosphat- und Ammoniumkonzentration von 1 g/L. Die

Wachstumsrate nimmt bei geringen Glucosekonzentrationen ab und ¨

ahnelt einer Monod-

Kinetik. Die identifizierte Rate verh¨

alt sich damit konsistent mit biologischen Prinzipi-

en.

In den Abbildungen 4.6, 4.7 und 4.8 sind die zur Anpassung genutzten Versuche dargestellt.

Der f¨

unfte Versuch F5 (siehe Abbildung 4.9) wird zur Kreuzvalidierung genutzt. F¨

ur alle

Versuche wurde die Anfangskonzentration der Biomasse auf Grundlage des Modells mit

einer Parameteridentifikation im ABC-System gesch¨

atzt.

Modell 1 liefert sowohl in der Auto- als auch in der Kreuzvalidierung eine zufriedenstellende

bis gute Beschreibung f¨

ur die Biomasse-, Glucose-, Phosphat- und Ammoniumkonzentration.

Die Glucoamylaseaktivit¨

at wird insbesondere bei den Versuchen F2 und F5 nur unzureichend

beschrieben.

4.2. Ergebnisse 47

Abbildung 4.3: Ausgang des MLP rX,MLP in Abh¨

angigkeit der Biomassen- und Glucosekonzen-

tration (cP h = 1 g/L, cAm = 1 g/L).

Iterative Modellverbesserung f¨

ur Modell 1

Die in Kapitel 2.4 vorgestellte Methode zur iterativen Modellverbesserung soll im Folgen-

den zus¨

atzliche Anhaltspunkte liefern, welche Gleichungen von Modell 1 erweitert werden

sollten. Im ABC-System wird aufgrund des hohen Aufwands einer vollst¨

andigen Implemen-

tierung zuerst ein vereinfachter Ansatz der Methode getestet, bei dem nur die Parameter

des stochastischen Modellanteils identifiziert werden und die eigentlichen Modellparameter

vorab gesch¨

atzt wurden. Gegen¨

uber der von Kristensen et al. beschriebenen Methode unter-

liegen die Modellparameter bei diesem Ansatz jedoch einem Bias, da sie ohne zus¨

atzlichen

stochastischen Modellanteil alle Messgr¨

oßen im Mittel mit dem kleinsten Fehler beschreiben

m¨

ussen und somit auch strukturelle Modellunsicherheiten oder stochastische Effekte kom-

pensieren m¨

ussen. Bei einer gleichzeitigen Identifikation beider Modellanteile, wie von Kri-

stensen et al. [44] demonstriert, k¨

onnen dagegen im Idealfall zumindest die Modellparameter,

die sich auf eine korrekte Modellstruktur beziehen, korrekt gesch¨

atzt werden, indem der sto-

chastische Anteil die Modelldefizite ausgleicht. Bei der hier dargestellten Variante kann es

somit neben einem Bias in den Modellparametern auch tendenziell zu einer ¨

Ubersch¨

atzung

des stochastischen Modellanteils kommen. Da die Parameteridentifikation in dieser Arbeit

aufgrund der komplexen Modellstrukturen und der Einbeziehung von Neuronalen Netzen

sehr aufw¨

andig ist, wird dennoch zur grunds¨

atzlichen Untersuchung der Methode zuerst

der vereinfachte Ansatz gew¨

ahlt. Dies erlaubt dar¨

uber hinaus die Durchf¨

uhrung von Hypo-

48 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

thesentests f¨

ur jeden Parameter einzeln, da die Parameter des stochastischen Modellanteils

dann untereinander nicht korreliert sind.

Die Parameter des stochastischen Modellanteils θQwerden in Form der Spektraldichtematrix

des Extended Kalman-Filters nach Gleichung (2.93) f¨

ur die Versuche F2 bis F4 identifiziert,

wobei bei der vereinfachten Variante θw=θQgilt. Als Startwert f¨

ur die stochastischen

Parameter wird 0.001 gew¨

ahlt. Mit der Wahl eines sehr kleinen Startwerts wird davon aus-

gegangen, dass der stochastische Anteil a priori nicht notwendig ist. Die Hesse-Matrix H

wird anschließend an dem gesch¨

atzten Parametervektor ¨

uber finite Differenzen numerisch

approximiert und f¨

ur die Berechnung der Standardabweichung der stochastischen Modell-

parameter genutzt.

Weicht ein Parameter signifikant von Null ab, so deutet dies auf eine unvollst¨

andige Beschrei-

bung durch die zugeh¨

orige Zustandsgleichung hin. Die Parameter werden daher anschließend

wie beschrieben mit einem t-Test auf Signifikanz untersucht, wobei ein Signifikanzniveau von

α= 0.05 angenommen wird. Es stehen insgesamt 266 einzelne Messpunkte zur Verf¨

ugung

und es werden 5 Parameter identifiziert, so dass der Freiheitsgrad ν= 261 betr¨

agt. Der

zugeh¨

orige t-Wert lautet demnach t(261) = 1.972. In Tabelle 4.1 sind die Werte f¨

ur die Pa-

rameter, die Standardabweichung sowie der t-Score-Wert aufgef¨

uhrt, wobei die letzte Spalte

der Tabelle Auskunft dar¨

uber gibt, ob ein Wert signifikant von Null abweicht.

Tabelle 4.1: Parameter des stochastischen Modellanteils bei Modell 1

Parameter Wert Standardabweichung t-Score Signifikanz

θQ,X 1.9771 5.3218 ·10−63.7152 ·105Ja

θQ,Am 0.4980 3.4992 ·10−10 1.4232 ·109Ja

θQ,P h 4.1279 9.2190 ·10−84.4776 ·107Ja

θQ,Glc 0.3254 2.6712 ·10−41.2181 ·103Ja

θQ,GA 8.9728 2.6514 ·10−43.3841 ·104Ja

Wie aus Tabelle 4.1 hervorgeht, ist bei Modell 1 laut dem statistischen Test der stochasti-

sche Modellanteil in jeder Zustandsgleichung f¨

ur die Beschreibung der Messdaten notwendig.

Dies liegt vor allem in der sehr kleinen berechneten Standardabweichung f¨

ur die einzelnen

Parameter, woraus auch ein hoher t-Score im Hypothesentest resultiert. Es ist also in ei-

nem fr¨

uhen Stadium der Modellbildung noch nicht m¨

oglich, mit Hilfe des Signifikanztests

die Modelldefizite auf einzelne Modellgleichungen einzugrenzen. Gleichwohl deuten die ab-

soluten Parameterwerte f¨

ur Biomasse, Phosphat und vor allem f¨

ur Glucoamylase an, dass

die zugeh¨

origen Zustandsgleichungen st¨

arker als beispielsweise die Gleichung f¨

ur Glucose

durch den stochastischen Modellanteil ausgeglichen werden m¨

ussen. Dies deckt sich auch

mit der visuellen Inspektion der Abbildung 4.6-4.8, bei denen die Glucoseverl¨

aufe deutlich

besser beschrieben sind. Die Methode von Kristensen et al. [44] liefert also zumindest Hin-

4.2. Ergebnisse 49

weise darauf, dass die Glucoamylasebildung sowie wie das Wachstum der Biomasse und der

Verbrauch von Phosphat von weiteren bisher nicht betrachteten Faktoren abh¨

angen.

4.2.2 Modell 2 - Anpassung einer Produktbildungskinetik

Da die gemessene, spezifische Aktivit¨

at im Versuch F2 (siehe Abb. 4.6) auch nach der

exponentiellen Wachstumsphase unabh¨

angig von der Wachstumsgeschwindigkeit weiter zu-

nimmt, wird Modell 1 im zweiten Schritt um eine weitere Kinetik f¨

ur die Produktbildung

der Glucoamylase rGA erweitert. F¨

ur die neue Kandidatenstruktur ˜

K2wird die von Modell

1¨

ubernommene St¨

ochiometrie ˆ

K1um eine Spalte erg¨

anzt. Zudem wird der Ertragskoef-

fizient f¨

ur die Glucoamylase f¨

ur die Wachstumsgeschwindigkeit frei gelassen ({}). F¨

ur die

Produktion von Glucoamylase wird angenommen, dass sie sich nicht auf die Biomassenkon-

zentration auswirkt und der zugeh¨

orige Eintrag k12 wird zu Null gesetzt. F¨

ur die Wahl der

Kandidatenmatrix gibt es prinzipiell mehrere Freiheitsgrade. Sinnvoll ist in diesem Fall je-

doch eine Matrix, die am Ende zu positiven reaktionsvarianten Zust¨

anden f¨

uhrt, da in dem

untersuchten biologischen System davon ausgegangen wird, dass keine Gleichgewichtsreak-

tionen auftreten und die gesuchten Kinetiken daher nur positive Werte aufweisen. F¨

ur die

Wahl von ˜

K2ist daher ein Vorgehen nach dem trial-and-error-Prinzip notwendig, da vorab

nicht abgesch¨

atzt werden kann, welche Kandidatenmatrix zu positiven reaktionsvarianten

Zust¨

anden f¨

uhrt. Folgende Kandidatenmatrix ˜

K2f¨

uhrte dabei zu ausschließlich positiven,

reaktionsvarianten Zust¨

anden:

K2=







1 0

−0.1130 {}

−0.0539 {}

−2.1499 {}

{} {}







(4.10)

Mit den Vektoren u1und u2aus der Singul¨

arwertzerlegung von Cwird ein neues Reakti-

onsschema ˆ

K∗

2gesch¨

atzt:

K∗







1.001 −0.0048

−0.1358 0.0136

−0.0586 0.0045

−2.1691 0.0057

0.0005 0.6332







.(4.11)

Mit der identifizierten St¨

ochiometrie werden die reaktionsvarianten Zust¨

ande wie bei Modell

1 berechnet. Abbildung 4.4 zeigt die berechneten varianten und invarianten Zust¨

ande. Aus

der Abbildung wird deutlich, dass ein Modell mit zwei Reaktionen geeigneter erscheint

als Modell 1. In der Abbildung f¨

allt zudem auf, dass der zweite reaktionsvariante Zu-

stand yr2, also das Integral Rtk

0rGAdt, h¨

ohere Werte aufweist als der erste reaktionsvari-

ante Zustand yr1, obwohl dieser die Wachstumsgeschwindigkeit beschreibt und somit mit

50 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

dem gr¨

oßeren Singul¨

arwert σ1verbunden ist. Dies liegt darin begr¨

undet, dass das f¨

ur das

Modell genutzte Reaktionsschema nicht mehr dem urspr¨

unglichen Reaktionsschema aus der

Singul¨

arwertzerlegung entspricht, da es mit der Drehoperation aus Gleichung (2.29) in ein

biologisch interpretierbares Reaktionssystem transformiert wurde. Die Bildungsreaktion von

Glucoamylase l¨

auft in dem gedrehten Reaktionsschema schneller als das Biomassenwachs-

tum ab, wobei zu beachten ist, dass die Einheit der Glucoamylasemessung µKat

Lim Vergleich

zu g

Lwesentlich kleinere Mengen beschreibt. Das Biomassewachstum und der zugeh¨

orige

Verbrauch der Substrate ist jedoch weiterhin die Hauptrichtung, in der sich das System

bewegt.

Die Produktbildungsgeschwindigkeit rGA wirkt sich gem¨

aß ˆ

K∗

2auch auf die Biomasse und in

geringeren Maße auch auf die Substrate aus. Da die Ertragskoeffizienten (k12 . . . k42) f¨

ur die

zweite Reaktion im Vergleich zum Koeffizienten f¨

ur Glucoamylase (k52) eher geringe Werte

aufweisen und nach obiger Annahme durch die Glucoamylase keine R¨

uckwirkung auf die

Biomasse und Substrate stattfinden sollte, wird davon ausgegangen, dass dies auf numeri-

sche Artefakte zur¨

uckzuf¨

uhren ist. Daher werden die entsprechenden Ausbeutekoeffizienten

k12 . . . k42 f¨

ur das weitere Vorgehen auf Null gesetzt. Die St¨

ochiometriematrix ˆ

K2f¨

ur das

zweite Modell lautet demnach:

K2=







1 0

−0.1358 0

−0.0586 0

−2.1691 0

0.0005 0.6332







(4.12)

Der bekannte Anteil der Wachstumsgeschwindigkeit wird von Modell 1 ¨

ubernommen. F¨

die Produktbildungsgeschwindigkeit rGA wird im Vorfeld nur eine Abh¨

angigkeit von der

Biomasse angenommen. Die unbekannten Anteile der Wachstumsgeschwindigkeit rX,MLP

und der Produktbildungsgeschwindigkeit rGA,MLP sollen durch ein einziges MLP mit zwei

Ausg¨

angen (siehe Gleichung (4.15)) beschrieben werden.

rX=cX·cGlc

10−3+cGlc ·rX,MLP (4.13)

rGA =cX·rGA,MLP (4.14)

rMLP = rX,MLP

rGA,MLP !=fMLP (c(t), θMLP ) (4.15)

Das Vorgehen zur Anpassung des Netzes erfolgt analog zum Vorgehen bei Modell 1 anhand

der reaktionsvarianten Zust¨

ande yr1und yr2. Als geeignete Struktur erwies sich ein Netz

mit vier Neuronen auf einer Zwischenschicht (4,4,2) und insgesamt 30 Parametern. Die

Anpassungen der Wachstums- und Produktbildungsgeschwindigkeit sind in Abbildung 4.5

dargestellt.

4.2. Ergebnisse 51

Abbildung 4.4: Berechnung der reaktionsvarianten und -invarianten Zust¨

ande auf Basis von ˆ

K∗

Abbildung 4.5: Anpassung der integrierten, modellierten Kinetiken (schwarz) an den ersten

reaktionsvarianten Zustand yr1=Rtk

0ˆrXdt (oben, rot) und den zweiten reaktionsvarianten Zustand

yr2=Rtk

0ˆrGAdt (unten, rot) f¨

ur Modell 2.

Das erweiterte Modell (Modell 2) kann die Glucoamylaseaktivit¨

at in den angepassten Ver-

suchen wesentlich besser beschreiben (siehe Abbildung 4.6 bis 4.8). Die in Abbildung 4.9

52 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

gezeigte Kreuzvalidierung weist f¨

ur die Biomasse und die Glucoamylaseaktivit¨

at weiterhin

eine Abweichung auf.

Abbildung 4.6: Fermentation F2: Messdaten, interpolierte Messdaten, sowie die Modelle 1,2 und

3. Hinweis: Die rote Linie wird teilweise durch die gr¨

une Linie ¨

uberdeckt.

4.2.3 Modell 3 - Parameteridentifikation

Die Parameter von Modell 2 dienen als Startwerte f¨

ur die Anpassung des gesamten Mo-

dells wie in Gleichung (2.50) beschrieben (Modell 3). Dabei werden alle Modellparamter

θ={K, θM, θMLP }, also die Parameter des MLPs θMLP , die Parameter des bekannten Ki-

netikanteils θM, sowie die St¨

ochiometriematrix K, angepasst. Der Parametervektor des be-

kannten Kinetikanteils besteht in diesem Fall nur aus der Monod-Konstante bei der Wachs-

tumsrate θM=KGlc.

rX=cX·cGlc

KGlc +cGlc

·rX,MLP (θMLP , c) (4.16)

Im Gegensatz zu Modell 1 und Modell 2 basiert die Parameteridentifikation bei Modell

3 nur auf den Messwerten und nicht auf den interpolierten Messdaten. Als Ergebnis der

Parameteridentifikation mit der Gewichtung entsprechend Gleichung (2.3) ergibt sich f¨

die Monod-Konstante ein Wert von KGlc = 0.0535 g

Lund folgende St¨

ochiometriematrix

4.2. Ergebnisse 53

Abbildung 4.7: Fermentation F3: Messdaten, interpolierte Messdaten, sowie die Modelle 1,2 und

3. Hinweis: Die rote Linie wird teilweise durch die gr¨

une Linie ¨

uberdeckt

K3:

K3=







1 0

−0.1090 0

−0.0459 0

−2.0282 0

0.0706 0.5196







(4.17)

Tabelle 4.2 zeigt einen ¨

Uberblick ¨

uber die identifizierten Modelle. Die Ergebnisse f¨

ur Modell 3

Tabelle 4.2: ¨

Ubersicht der drei Modelle

Modell St¨

ochiometrie Kinetiken Struktur des MLPs Parameteridentifikation

1ˆ

K1rX(4,2,1) Nein

2ˆ

K2rX, rGA (4,4,2) Nein

3ˆ

K3r∗

X, r∗

GA (4,4,2) Ja

sind ebenfalls in den Abbildungen 4.6 bis 4.9 dargestellt. Zus¨

atzlich sind zum Vergleich

der einzelnen Modelle in Tabelle 4.3 f¨

ur jedes Modell und jeden Versuch die Summe der

Fehlerquadrate pro Messgr¨

oße nach folgender Formel aufgetragen.

FQ =1

�

1�cM

i−cModell

i�2.(4.18)

54 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

Abbildung 4.8: Fermentation F4: Messdaten, interpolierte Messdaten, sowie die Modelle 1,2 und

Die Fehlerquadrate der Autovalidierung (AV) berechnet sich dann als Mittelwert aus den

Fehlerquadraten der zur Parameteridentifikation genutzten Versuche F2-F4 (siehe Gl. (4.19)).

FQAV =1

3(FQF2+FQF3+F QF4) (4.19)

Aus Tabelle 4.3 wird ersichtlich, dass Modell 2 aufgrund der separaten GA-Kinetik ge-

gen¨

uber Modell 1 in der Autovalidierung einen geringeren Fehler f¨

ur die GA-Aktivit¨

at auf-

weist. Allerdings weicht die Biomassenkonzentration cXbei Modell 2 in der Autovalidierung

gleichzeitig auch st¨

arker als bei Modell 1 von den gemessenen Werten ab.

Modell 3 beschreibt die Versuche F2-F4, die zur Anpassung genutzt wurden, in den mei-

sten F¨

allen mit einer geringeren Abweichung als Modell 1 und 2. In der Kreuzvalidierung

mit Versuch F5 schneidet Modell 3 jedoch bei der Biomassenkonzentration cXund der

volumenspezifische GA-Aktivit¨

at aGA deutlich schlechter ab als Modell 1 oder 2. Die Para-

meteridentifikation des gesamten Modells f¨

uhrt bei Modell 3 also zu besseren Ergebnissen

in der Autovalidierung und gleichzeitig zu einem schlechteren in der Kreuzvalidierung. Die

Ursache k¨

onnte darin liegen, dass bei Versuch F5 ein geringeres Wachstum und eine gerin-

gere Produktbildung im Vergleich zu den Versuchen F2-F4 beobachtet werden kann. Die

m¨

oglichen Gr¨

unde f¨

ur die Abweichung bei F5 werden im Abschnitt 4.3 diskutiert.

4.2. Ergebnisse 55

Abbildung 4.9: Kreuzvalidierungsexperiment Fermentation F5: Messdaten, interpolierte Messda-

ten, sowie die Modelle 1,2 und 3.

Iterative Modellverbesserung f¨

ur Modell 3

Neben der Betrachtung der Fehlerquadrate wird f¨

ur Modell 3 auch die oben beschriebe-

ne, vereinfachte Testimplementierung der Methode zur iterativen Modellverbesserung an-

gewandt, um Modelldefizite aufzudecken. Dabei werden wie in der Parameteridentifikation

nur die Versuche F2-F4 betrachtet, wobei die Parameter des stochastischen Modellanteils

jeweils mit einem Startwert von 0.001 initialisiert werden. Ansonsten gelten die gleichen

Annahmen wie bei der iterativen Modellverbesserung f¨

ur Modell 1. Die Parameter des sto-

chastischen Modellanteils θQsowie die Standardabweichung und der t-Score sind in Tabelle

4.4 aufgef¨

uhrt.

Laut dem t-Test sind bei Modell 3 ebenfalls s¨

amtliche stochastischen Parameter signifikant,

wobei dies wieder auf die sehr niedrig bestimmten Standardabweichungen und den damit

einhergehenden hohen Werten f¨

ur den t-Score zur¨

uckgef¨

uhrt werden kann. Aus den Ergeb-

nissen des t-Tests kann daher keine weitere Aussage f¨

ur die Modellbildung geschlussfolgert

werden.

Bei Betrachtung der Parameter f¨

allt der sehr niedrige Wert f¨

ur Glucose auf, was auf ei-

ne recht gute Beschreibung durch die zugeh¨

orige Modellgleichung schließen l¨

asst. Eine

ahnliche Aussage kann auch aufgrund des geringen Wertes von θQ,Am f¨

ur Ammonium ge-

troffen werden. F¨

ur Phosphat und Glucoamylase sind die entsprechenden Parameterwerte

56 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

Tabelle 4.3: Summe der Fehlerquadrate f¨

ur die drei untersuchten Modelle f¨

ur die Kultivierungen

F2-F5 pro Messgr¨

oße und der Mittelwert (¨

uber F2-F4) der Fehlerquadrate in der Autovalidierung

(AV)

gemittelte Summe der cXcAm cP h cGlc aGA

Fehlerquadrate

Modell 1

F2 0.57 0.03 0.03 0.96 13.14

F3 1.89 0.04 0.04 0.62 7.81

F4 7.64 0.21 0.06 1.08 4.66

F5 4.50 0.04 0.01 2.37 43.53

AV 3.37 0.10 0.04 0.89 8.54

Modell 2

F2 1.17 0.04 0.02 1.04 0.14

F3 2.33 0.05 0.04 0.75 0.66

F4 10.25 0.17 0.05 3.04 7.78

F5 4.77 0.04 0.02 4.69 38.18

AV 4.58 0.09 0.04 1.61 2.86

Modell 3

F2 1.20 0.01 0.02 1.79 0.44

F3 1.66 0.05 0.07 0.29 0.70

F4 3.24 0.08 0.03 0.09 0.56

F5 8.23 0.07 0.04 0.57 61.49

AV 2.03 0.05 0.04 0.72 0.57

Tabelle 4.4: Parameter des stochastischen Modellanteils bei Modell 3

Parameter Wert Standardabweichung t-Score Signifikanz

θQ,X 0.7828 3.9313 ·10−71.9911 ·106Ja

θQ,Am 0.0928 7.2317 ·10−71.2838 ·105Ja

θQ,P h 145.7767 6.7973 ·10−72.1446 ·108Ja

θQ,Glc 2.5817 ·10−44.0785 ·10−7633.0174 Ja

θQ,GA 3.3631 ·1033.8672 ·10−78.6964 ·109Ja

mit θQ,P h = 145.7767 bzw. θQ,GA = 3.3631 ·103wesentlich h¨

oher und deuten somit auf

Modelldefizite in der Beschreibung von Phosphat und Glucoamylase hin, wobei beide Werte

eigentlich unrealistisch hoch sind. Die Modellgleichungen m¨

ussen daher f¨

ur beide Gr¨

oßen

detaillierter modelliert werden. Gegebenenfalls sind auch zus¨

atzliche Zustandsgr¨

oßen f¨

ur ei-

ne bessere Beschreibung von Phosphat oder Glucoamylase notwendig. Die Ergebnisse liefern

somit insgesamt in der Anwendung f¨

ur Kultivierungen mit A.niger nur wenige zus¨

atzliche

Anhaltspunkte zur Verbesserung der Modellstruktur bei Modell 3.

4.3. Zusammenfassung und Diskussion 57

Um erste Erkenntnisse mit der iterativen Modellverbesserung aus Kapitel 2.4 zu gewinnen,

wurde in dieser Arbeit zuerst eine vereinfachte Form der Methode implementiert und ge-

testet. Bereits bei dieser Variante mit einer stark reduzierten Anzahl an freien Parametern

kam es im Measurement Update des erweiterten Kalman-Filters zu numerischen Problemen

bei der Invertierung in Gleichung (2.91). Im Vergleich zur urspr¨

unglichen Simulationsstu-

die von Kristensen et al. [44] kommt bei der Anwendung f¨

ur A.niger versch¨

arfend hinzu,

dass es durch die Einbindung von k¨

unstlichen, neuronalen Netzen sehr viel mehr zu identi-

fizierende Parameter gibt. Zudem weicht die Modellstruktur bei der Anwendung auf reale,

biologische System zwangsl¨

aufig auch stark von der Realit¨

at ab. Die genannten Probleme

werden sich vermutlich auch in einer eigenst¨

andigen Implementierung außerhalb des ABC-

Systems aufgrund der Parameterzahl und der wenigen, echten Messdaten und einem immer

nur n¨

aherungsweisen Modell nicht einfach l¨

osen lassen. Die von Kristensen et al. [72] genutz-

te und in R programmierte Software l¨

asst sich dabei nicht in das ABC-System integrieren.

Die gewonnene Erfahrung in zwei Modellans¨

atzen l¨

asst vermuten, dass sich bei realen Da-

ten aus biologischen Systemen mit sehr unsicheren Modellen der Aufwand - auch mit einer

aufzubauenden eigenen Implementierung - nicht lohnt. In dieser Arbeit wird in Anbetracht

des hohen Aufwands bei begrenztem Nutzen daher die iterative Modellverbesserung nicht

weiterverfolgt.

4.3 Zusammenfassung und Diskussion

Mit der vorgestellten Methode konnten ohne tiefergehendes Vorwissen mehrere Modelle mit

steigender Komplexit¨

at f¨

ur Kultivierungen mit A.niger erstellt werden. Die Modelltiefe be-

schr¨

ankt sich zwar auf einfache Prozessmodelle, die jedoch f¨

ur die Prozessf¨

uhrung, zum

Beispiel f¨

ur die Zustandssch¨

atzung oder die modellpr¨

adiktive Regelung, ausreichend genau

sein k¨

onnen. Der aufgezeigte Ansatz ist dabei flexibel genug, um auch Wissen aus neuen Ex-

perimenten einzubringen. Die Modelle k¨

onnen dar¨

uber hinaus einen Ausgangspunkt f¨

ur eine

mechanistische Modellbildung darstellen, wie sie im n¨

achsten Kapitel betrachtet wird.

In der Kreuzvalidierung mit Versuch F5 zeigen alle Modelle Abweichungen sowohl in der

Biomassekonzentrationen als auch in der Glucoamylaseaktivit¨

at auf. Die Abweichungen in

der Biomassekonzentration k¨

onnen auf unterschiedliche Ausbeutekoeffizienten f¨

ur die Glu-

cose in den einzelnen Versuchen zur¨

uckgef¨

uhrt werden. In dem f¨

ur die Kreuzvalidierung

benutzten Versuch F5 wird zudem wesentlich weniger Glucoamylase gebildet als in den f¨

die Anpassung genutzten Versuchen F2-F4. Untersuchungen des Sekretoms mit einer SDS-

PAGE zeigen, dass im Versuch F5 weitere Enzyme mit einer Gr¨

oße von ungef¨

ahr 50 kDa

gebildet wurden. Dies deutet auf die Bildung von Proteasen und einer damit einhergehenden

Autolyse hin. Dieses Verhalten ist in den zur Anpassung genutzten Versuchen nicht aufgetre-

58 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

ten. Mit der vorgestellten Methode ist es jedoch m¨

oglich, dieses Wissen durch Einbeziehung

des Versuchs F5 in die Parameteridentifikation mit in das Modell zu integrieren.

Des Weiteren beruht die hier durchgef¨

uhrte erste hybride Modellbildung auf nur sehr we-

nigen Datens¨

atzen. Je mehr unterschiedliche Versuchsdaten f¨

ur den Modellbildungsprozess

zur Verf¨

ugung stehen, umso bessere Ergebnisse k¨

onnen in der Modellbildung erreicht wer-

den.

Der hybride Modellanteil kann durch Untersuchung des Ausgangs des MLPs in eine me-

chanistische Modellstruktur ¨

uberf¨

uhrt werden. So ist durch das hybride Modell bekannt,

dass mindestens zwei unabh¨

angige Reaktionen stattfinden und dass die zweite Produkt-

bildung weitgehend unabh¨

angig von der Wachstumsrate und den anderen Komponenten

geschieht.

In Abbildung 4.10 sind die Ausg¨

ange des MLPs und in Abbildung 4.11 zus¨

atzlich die

vollst¨

andigen Kinetiken rXund rGA f¨

ur Modell 1, Modell 2 und Modell 3 in Abh¨

angigkeit

der Glucosekonzentration aufgetragen. W¨

ahrend bei Modell 1 und Modell 2 die Ausg¨

ange

des MLPs eine ¨

ahnliche Abh¨

angigkeit von der Glucosekonzentration wie eine Monod-Kinetik

aufweisen, ist der Ausgang des Neuronalen Netzes bei Modell 3 nahezu konstant und ent-

spricht somit eher einer maximalen Wachstumsrate µmax. Im Fall von Modell 3 wird die Glu-

coseabh¨

angigkeit wie aus Abbildung 4.11 ersichtlich anscheinend nahezu vollst¨

andig durch

die Monod-Kinetik des bekannten Kinetikanteils abgebildet.

Die Produktbildungsrate nimmt bei Modell 2 mit zunehmender Glucosekonzentration linear

ab. Aus biologischer Sicht erscheint eine Abnahme der GA-Bildung mit steigender Glucose-

konzentration sinnvoll zu sein, da bei einer hohen und ausreichenden Glucosekonzentration

die weitere Expression und Sektretion von GA und der damit einhergehende Abbau von

St¨

arke zu Glucose f¨

ur das weitere Wachstum nicht notwendig sind. Bei der Produktbil-

dungsrate rGA von Modell 3 fehlt jedoch weitgehend eine Abh¨

angigkeit von der Glucosekon-

zentration. Eine m¨

ogliche Erkl¨

arung daf¨

ur ist, dass die Anpassung der Kinetik bei Modell 3

nur anhand weniger gemessener Datenpunkte und nicht anhand der interpolierten Messda-

ten erfolgte, so dass bei Modell 3 zu wenig Daten f¨

ur das Training des Neuronalen Netzes

zur Verf¨

ugung stehen. Dies w¨

urde auch zur hohen Abweichung in der Glucoamylaseaktivit¨

f¨

ur Modell 3 in der Kreuzvalidierung (siehe Tabelle 4.3) passen.

Insgesamt deuten die Ergebnisse der hybriden Modellbildung daraufhin, dass die Wachs-

tumsrate im vorliegenden Fall mechanistisch ¨

uber eine Monod-Kinetik rX=µmax ·cGlc

cGlc+KGlc

beschrieben werden kann. Damit f¨

uhrt die hybride Modellbildung nicht nur zu einer schnel-

leren Modellierung, sondern liefert gleichzeitig ph¨

anomenologische Zusammenh¨

ange f¨

ur eine

vertiefte Modellbildung.

4.3. Zusammenfassung und Diskussion 59

Abbildung 4.10: Ausgang des Multi-Layer Perceptrons f¨

ur Modell 1, Modell 2 und Modell 3 in

Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration.

Die hier skizzierte Methode erm¨

oglicht die Identifikation eines hybriden Modells bzw. die

Festlegung von Startparametern eines hybriden Modells, ohne dass das Differentialglei-

chungssystem in jedem Anpassungsschritt aufw¨

andig gel¨

ost werden muss. Durch diese Ent-

kopplung kann das Training und die Wahl der Meta-Struktur des nichtparametrischen Parts

wesentlich schneller erfolgen.

Um die Glucoamylaseaktivit¨

at modellbasiert zu maximieren, sind jedoch noch einige Fra-

gestellungen offen. So ist der Einfluss einer Phosphat- oder Ammoniumlimitierung auf das

Wachstum und die Produktbildung durch die ersten f¨

unf durchgef¨

uhrten Versuche noch nicht

gekl¨

art. Insgesamt basiert das hergeleitete Modell auf relativ wenigen Versuchen, so dass

wahrscheinlich nicht alle Ph¨

anomene abgedeckt sind. Dies gilt insbesondere, da die zugrun-

deliegende Methode annimmt, dass alle Komponenten des Systems auch gemessen werden

und keine Speicherterme auftreten. F¨

ur die Prozessf¨

uhrung w¨

are dar¨

uber hinaus eine Inte-

gration der Online-Messgr¨

oßen in das Modell w¨

unschenswert, da ¨

uber Online-Messgr¨

oßen

eine Zustandssch¨

atzung mit einem Sigmapunkt-Kalman-Filter m¨

oglich w¨

are.

Aus diesem Grund widmet sich das folgende Kapitel diesen und weiteren Fragestellungen,

um ein aussagekr¨

aftiges Modell zu erstellen, das letztendlich f¨

ur die Maximierung der GA

und f¨

ur die Prozessf¨

uhrung genutzt werden kann. Wie im aktuellen Kapitel wird dabei ein

hybrides Modell angestrebt, bei dem ein Teil des Modells, und zwar die Produktbildung, im

daran anschließenden Kapitel mit einem neuronalen Netz beschrieben wird.

60 Kapitel 4. Anwendung der hybriden Modellbildung auf Aspergillus niger

Abbildung 4.11: Wachstums- und Produktbildungsrate rXbzw. rGA f¨

ur Modell 1, Modell 2

und Modell 3 in Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration und bei einer Biomassenkonzentration

cX= 1 g

Kapitel 5

Herleitung eines strukturierten

Modells

5.1 Einleitung und Ziele der Modellbildung

Da das in Kapitel 4 hergeleitete Modell wahrscheinlich nicht alle f¨

ur die Bildung und Se-

kretion von GA wichtigen biologischen Ph¨

anomene abbildet, wird in diesem Kapitel eine

vertiefte, strukturierte Modellbildung angestrebt. Dabei liefert das zuvor hergeleitete hybri-

de Modell erste Anhaltspunkte f¨

ur die Kinetiken und die Parameter. Das Ziel der vertief-

ten Modellbildung besteht letztendlich in der Herleitung eines strukturierten Modells, das

die Produktbildung in Abh¨

angigkeit des N¨

ahrstoffangebots und der Biomasse beschreibt.

Anschließend soll mit dem Modell die Glucoamylaseproduktion durch eine optimierte Sub-

stratzugabe maximiert werden.

5.1.1 Literaturmodelle

In der Literatur wurden bereits zahlreiche Modelle f¨

ur submerse Kultivierungen mit fila-

ment¨

os wachsenden Pilzen beschrieben. In [49] gibt Papagianni eine ¨

Ubersicht ¨

uber bisheri-

ge, einfach strukturierte Modelle f¨

ur Kultivierungen von A.niger und Zitronens¨

aure als Pro-

dukt. Liu et al. [73] modellierten die Glucons¨

aurebildung durch A.niger in Batch-Versuchen.

Ein dynamisches Modell, das die Produktion von Glucose-Oxidase als diauxischen Prozess

beschreibt, findet sich bei Mir´on et al. [74].

Cui et al. [75] stellten ein Modell f¨

ur das Wachstum und die Morphologie f¨

ur den Pilz Asper-

gillus awamori auf. Das Modell beinhaltet eine Beschreibung f¨

ur die Bildung von Biomasse

in Form von Pellets und von freien Myzel, dem Substratverbrauch und der Sauerstoffkon-

zentration. Es ber¨

ucksichtigt dar¨

uber hinaus die Autolyse der Biomasse bei unzureichender

N¨

ahrstoffversorgung und den Erhaltungsstoffwechsel. Die Modellbildung bei Cui et al. ba-

62 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

siert auf 13 Batch-Versuchen in 2-L und 100-L Fermentern. Ein Großteil der Parameter des

Modells wurde im Vorfeld durch Literatur oder Experimente bestimmt, w¨

ahrend lediglich

zwei Parameter durch eine Modellidentifikation angepasst worden sind.

In [76] ver¨

offentlichten Kelly et al. bereits ein einfaches, unstrukturiertes Modell f¨

ur Batch-

Versuche mit A.niger, das auch die Glucoamylasebildung mit einer Luedeking-Piret-Kinetik

beschreibt. Es werden neben der Biotrockenmasse, auch das Substrat in Form von Glucose,

der Sauerstoffgehalt und das Produkt bilanziert.

Bisher fehlt jedoch in der Literatur ein Modell, das die Glucoamylaseproduktion in Fed-

Batch-Kultivierungen in Abh¨

angigkeit der Substratkonzentrationen beschreibt. Ein solches

Modell ist jedoch die Voraussetzung f¨

ur die Anwendung regelungstechnischer Methoden zur

Prozessoptimierung. In Fed-Batch-Kultivierungen k¨

onnen im Gegensatz zu reinen Batch-

Prozessen Substratverl¨

aufe gezielt bei bestimmten Konzentrationen gehalten werden, so dass

beispielsweise der Einfluss einer dauerhaft, niedrigen Glucosekonzentration auf die Produkt-

bildung untersucht werden kann.

5.1.2 Vorgehen

Ein aussagekr¨

aftiges Modell ist dabei nur zu erwarten, wenn die zur Modellbildung genutz-

ten Versuche mit m¨

oglichst unterschiedlicher Zuf¨

utterung durchgef¨

uhrt werden und eine

hohe Variation bei den Substratverl¨

aufen aufweisen. Nur ¨

uber solche informativen Versu-

che k¨

onnen verschiedene Ph¨

anomene, wie Substratspeicher oder eine Produktbildung in

Abh¨

angigkeit der verf¨

ugbaren Substrate, mit in die Modellbildung einfließen.

Die Modellbildung ist ein iterativer Prozess, da mit jedem durchgef¨

uhrten Versuch neue

Erkenntnisse gewonnen werden, die in eine mathematische Beschreibung ¨

uberf¨

uhrt wer-

den m¨

ussen. Das Vorgehen besteht daher aus mehreren Schritten. In einem ersten Schritt

wird eine Modellstruktur vorgeschlagen. Im n¨

achsten Schritt werden dann die optimalen

Parameter bestimmt, mit denen die vorhandene Modellstruktur die Messdaten am besten

beschreibt. Anschließend wird evaluiert, ob die Modellstruktur grunds¨

atzlich geeignet ist

oder Erweiterungen vorgenommen werden m¨

ussen. Eine vollst¨

andige mathematische Be-

schreibung aller beobachteten Ph¨

anomene ist dabei jedoch unrealistisch, da einerseits die

Stoffwechselvorg¨

ange in Mikroorganismen zu komplex f¨

ur eine vollst¨

andige mathematische

Beschreibung sind und sie andererseits durch eine Vielzahl an Einflussfaktoren, die nicht

alle messtechnisch erfasst werden k¨

onnen, beeinflusst werden. Die Modellstruktur kann sich

daher der Realit¨

at nur stark vereinfacht ann¨

ahern.

Im folgenden Kapitel wird auf Grundlage des hergeleiteten, hybriden Modells aus Kapitel

4 und des Modells von Kelly et al. [76] ein Modell als Ausgangspunkt gebildet, mit dem

die N¨

ahrstoffe und die Biomasse auf einfache Weise miteinander verkn¨

upft werden. Aus der

5.2. Mess- und Eingangsgr¨

oßen 63

hybriden Modellbildung k¨

onnen dabei nicht nur die qualitativen Zusammenh¨

ange zwischen

der Biomasse und den Substraten, sondern auch die Parameterstartwerte und die Erkenntnis

ubernommen werden, dass die GA-Bildung zum Teil unabh¨

angig vom Wachstum erfolgt

und wahrscheinlich durch die Glucosekonzentration beeinflusst wird. Erst im letzten Schritt

wird eine Kinetik f¨

ur die Glucoamylasebildung in Abh¨

angigkeit der ¨

ubrigen Modellgr¨

oßen

modelliert.

5.1.3 Annahmen

Damit das Modell nicht zu komplex wird und die Parameter m¨

oglichst gut identifizierbar

sind, werden Annahmen zur Vereinfachung des Modells getroffen.

Es gilt keine strenge Massenerhaltung, da die bilanzierten Stoffe in andere Stoffe, die nicht

betrachtet oder gemessen werden, umgewandelt werden k¨

onnen.

Die Biomasse wird als homogene Masse betrachtet. Einzelne Hyphen werden nicht model-

liert. Der Einfluss der Morphologie fließt nicht in die Modellbildung ein, da die Bedingungen

der submersen Kultivierung so gew¨

ahlt wurden, dass die Biomasse stets als freies Myzel

vorliegt. Im Rahmen dieser Arbeit wird die Morphologie nicht weiter messtechnisch unter-

sucht.

Außerdem werden die inneren Stoffwechselvorg¨

ange durch Formalkinetiken zusammenge-

fasst. Auf eine zu detaillierte Beschreibung der inneren Stoffwechselwege wird aufgrund

mangelnder Zug¨

anglichkeit durch Messungen verzichtet.

Des Weiteren wird angenommen, dass der Reaktor ideal durchmischt sei und die Visko-

sit¨

at konstant ist. Diese Annahme ist im sp¨

ateren Verlauf von Fermentationen aufgrund

der hohen Biomassekonzentration und der damit einhergehenden h¨

oheren Viskosit¨

at und

Stofftransportprobleme nicht haltbar und f¨

uhrt bei einer hohen Biomassekonzentration zu

Mess- und Modellunsicherheiten.

Es wird angenommen, dass das Produkt Glucoamylase keinerlei R¨

uckkopplung auf das

Wachstum oder das Verhalten von A.niger aus¨

ubt. Die Produktbildung kann daher un-

abh¨

angig vom restlichen Modell modelliert werden.

5.2 Mess- und Eingangsgr¨

oßen

5.2.1 Messgr¨

oßen

Der Prozess der Modellbildung h¨

angt einerseits stark vom Verwendungszweck des Modells

und andererseits von den verf¨

ugbaren Messgr¨

oßen ab. Je mehr Informationen in Form von

64 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Tabelle 5.1: Verf¨

ugbare Messgr¨

oßen

Messgr¨

oße Einheit Bedeutung

cXg

LBiotrockenmassekonzentration im Medium

cAm g

LAmmoniumkonzentration im Medium

cP h g

LPhosphatkonzentration im Medium

cGlc g

LGlucosekonzentration im Medium

aGA µKat

LVolumenspezifische Glucoamylaseaktivit¨

at im Medium

VBase mL Volumen der zugegebenen Base

DOT % Gel¨

ostsauerstoff im Medium

CO2Vol.-% Kohlenstoffdioxidanteil im Abgasstrom

Messgr¨

oßen f¨

ur die Modellbildung zur Verf¨

ugung stehen, umso komplexer kann die Modell-

struktur aufgestellt und desto besser k¨

onnen die Parameter identifiziert werden.

Neben der Konzentration von der Biotrockenmasse cXwerden auch die Substratkonzentra-

tionen Ammonium cAm, Phosphat cP h und Glucose cGlc und die Aktivit¨

at der Glucoamylase

aGA im Medium ¨

uber Probenahmen (vgl. Kapitel 3.4) gemessen. Außerdem werden die Ba-

senzugabe VBase durch die pH-Regelung, der Gel¨

ostsauerstoffanteil (engl. Dissolved Oxygen

Tension, DOT) im Medium DOT und der CO2-Volumenanteil im Abgas CO2online erfasst.

Alle Messgr¨

oßen werden in dem Messvektor yzusammengefasst:

y= (cX, cAm, cP h, cGlc, aGA, VBase, DOT, CO2)T.(5.1)

In Tabelle 5.1 sind alle Messgr¨

oßen zus¨

atzlich nochmals in tabellarischer Form aufgef¨

uhrt.

Im Rahmen dieser Arbeit stehen außer der Biotrockenmassenkonzentration cXausschließlich

extrazellul¨

are Messgr¨

oßen f¨

ur die Modellbildung zur Verf¨

ugung. Ein strukturiertes Modell

mit vielen zellinternen Zust¨

anden w¨

are daher mit einer hohen Unsicherheit behaftet.

5.2.2 Eingangsgr¨

oßen

Alle externen Einflussgr¨

oßen, die auf den Prozess einwirken, werden in einem Vektor u

zusammengefasst. Die Zuflussraten der Feedings ui,F eed und die jeweiligen Feedkonzentra-

tionen ci,F eed werden zu Beginn des Versuchs festgelegt. Durch die pH-Regelung werden

zudem S¨

aure uS¨aure und Base uBase hinzugef¨

ugt. ¨

Uber die Kultivierungsdauer verdampft

ein Teil der Fl¨

ussigkeit im Reaktor (uAbdampf ). Bei einer starken Schaumbildung wird ein

Antischaummittel (uAF OAM ) hinzu dosiert.

u= (uAm,F eed, cAm,F eed, uP h,F eed, cP h,F eed, uGlc,F eed, cGlc,F eed, uBase, uS¨aure, uAF OAM , uAbdampf )T

(5.2)

In Tabelle 5.2 sind alle Eingangsgr¨

oßen mit ihrer Einheit und Bedeutung aufgef¨

uhrt.

5.3. Modellbeschreibung 65

Tabelle 5.2: Eingangsgr¨

oßen des Modells

Eingangsgr¨

oße Einheit Bedeutung

uAm,F eed L

hVolumenstrom der Ammoniumzuf¨

utterung

cAm,F eed g

LAmmoniumkonzentration des Feedstroms

uP h,F eed L

hVolumenstrom der Phosphatzuf¨

utterung

cP h,F eed g

LPhosphatkonzentration des Feedstroms

uGlc,F eed L

hVolumenstrom der Glucosezuf¨

utterung

cGlc,F eed g

LGlucosekonzentration des Feedstroms

uBase L

hVolumenstrom der Basenzugabe

uS¨aure L

hVolumenstrom der S¨

aurenzugabe

uAF OAM L

hVolumenstrom des hinzu dosierten Antischaummittels

uAbdampf L

hVolumenstrom des Abdampfs

5.3 Modellbeschreibung

Um ein strukturiertes Modell herzuleiten, werden im folgenden Abschnitt die einzelnen bio-

logischen Ph¨

anomene, die in den unten dargestellten Fermentationen (siehe Abschnitt 5.8)

auftreten, diskutiert und in eine mathematische Beschreibung ¨

uberf¨

uhrt.

5.3.1 Wachstum

Der zeitliche Verlauf einer Kultivierung wird wesentlich durch das Wachstum der Biomas-

se beeinflusst. Das Wachstum von filament¨

osen Organismen wie A.niger basiert auf dem

L¨

angenwachstum an den Hyphenspitzen und der Bildung neuer Spitzen [47] und ist somit

proportional zur im Reaktor vorhandenen Biomasse mX. Durch das L¨

angenwachstum und

dem Entstehen von neuen Hyphenspitzen durch Verzweigungen verl¨

auft das Wachstum von

A.niger in Form von freien Myzel wie bei Einzelzellen exponentiell, solange es nicht zu einer

Limitation kommt [75], [51].

F¨

ur den Aufbau von Biomasse ben¨

otigt A.niger neben Spurenelementen die N¨

ahrstoffe Glu-

cose, Ammonium und Phosphat sowie eine ausreichende Sauerstoffversorgung. In keinem der

durchgef¨

uhrten Versuche (siehe Abschnitt 5.8) außer in Versuch F9 konnte nach Aufbrauchen

der verf¨

ugbaren Glucose ein weiteres Biomassewachstum festgestellt werden. Das Wachs-

tum wird also durch diese Kohlenstoffquelle limitiert, was z.B. durch eine Monod-Kinetik

beschrieben werden kann. Auf das auff¨

allige Verhalten bei Versuch F9, wo m¨

oglicherweise

auch eine andere Kohlenstoffquelle beteiligt sein k¨

onnte, wird weiter unten eingegangen.

A.niger weist eine hohe Aufnahmef¨

ahigkeit von Glucose auf. In der Literatur findet sich

f¨

ur die Monod-Konstante f¨

ur Glucose KGlc bei Kelly [76] ein Wert von 10−2g

L, w¨

ahrend

die Halbs¨

attigungskonstante bei Jørgensen et al. [77] in einem Bereich zwischen 5.4·10−3g

66 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

und 4.68 ·10−2g

Lliegt. Mit den vorhandenen Versuchen ist eine praktische Identifizier-

barkeit f¨

ur eine Halbs¨

attigungskonstante in diesem Wertebereich kaum mehr gegeben, da

sich die Monod-Kinetik praktisch nur in der Limitierung auf das Wachstumsverhalten aus-

wirkt. Die in Kapitel 4 vorgestellten hybriden Modelle 1 und 2, die nur wenig biologisches

Vorwissen in die Modellbildung einbeziehen, weisen demgegen¨

uber eine deutlich h¨

ohere

Halbs¨

attigungskonstante auf. Die Gr¨

unde liegen vor allem daran, dass mit F2-F4 nur wenige

Versuche f¨

ur die Anpassung der hybriden Modelle genutzt wurden und diese gleichzeitig nur

wenige Messdaten in diesen niedrigen Konzentrationsbereich aufweisen.

Aus biologischer Sicht ist ebenfalls eine limitierende Wirkung zu erwarten, wenn w¨

ahrend

des Wachstums Phosphat, Ammonium oder Sauerstoff nicht im ausreichendem Maße zur

Verf¨

ugung stehen. F¨

ur Ammonium tritt beispielsweise im Versuch F7 eine Limitierung auf,

die das weitere Wachstum einschr¨

ankt. Andererseits findet im Versuch F9 trotz Ammo-

niumlimitierung Wachstum statt. Es wird vermutet, dass das aufgenommene Ammonium

zum Teil als Reserve gespeichert wird, bspw. in Form von Aminos¨

auren. Daher wird in der

Modellbildung ein Ammoniumspeicher mAmSp postuliert, aus dem das f¨

ur das Wachstum

ben¨

otigte Ammonium verbraucht wird. Diese Abh¨

angigkeit wird mathematisch ebenfalls

durch eine Monod-Kinetik mit dem Bezug auf die im Speicher vorhandene Ammoniumkon-

zentration gAm =mAmSp

VXausgedr¨

uckt. Das Zellvolumen VXkann unter der Annahme einer

konstanten Biomassedichte ρX= 1000 g

Lmit VX=mX

ρXberechnet werden.

Entsprechend wurde mit F8 ein Versuch entworfen, in dem es zu einer Phosphatlimitierung

kommen sollte. In Versuch F8 w¨

achst A.niger auch w¨

ahrend dieser Phosphatlimitierung wei-

ter. Da Phosphat jedoch essentiell f¨

ur den Organismus ist, muss ein interner Phosphatspei-

cher mP hSp existieren. Einen Speicher in Form von Polyphosphaten wiesen Upton et al.

[78] bei A.niger nach. F¨

ur die Modellierung der Wachstumsgeschwindigkeit rXwird der

Einfachheit halber angenommen, dass das Wachstum ausschließlich aus dem Speicher bei

ausreichender Phosphatkonzentration gP h =mP hSp

VXerfolgt.

Die Wachstumsgeschwindigkeit rXsetzt sich daher neben der Monod-Kinetik f¨

ur Gluco-

se aus den zwei Monod-Kinetiken bez¨

uglich des Ammonium- und Phosphatspeichers mit

den Monod-Konstanten KAm bzw. KP h sowie einer Monod-Kinetik f¨

ur Sauerstoff mit der

Halbs¨

attigungskonstante KO2zusammen. Es gilt:

rX=mX·µmax ·cGlc

KGlc +cGlc ·gAm

KAm +gAm ·gP h

KP h +gP h ·cO2

KO2+cO2

(5.3)

Die zeitlichen ¨

Anderungen, wie das Biomassewachstum, werden in dem Modell f¨

ur eine

leichtere Nachvollziehbarkeit abweichend von den SI-Einheiten durch die Zeiteinheit 1

hbe-

schrieben.

5.3. Modellbeschreibung 67

5.3.2 Kohlenstofflimitierung, Inaktivierung und Erhaltungsstoff-

wechsel

Wenn die gesamte verf¨

ugbare Glucose aufgebraucht wurde und gleichzeitig keine Glucose

hinzu dosiert wird, endet die exponentielle Wachstumsphase. A.niger versucht durch Re-

gulationen seinen Metabolismus an die mangelnde N¨

ahrstoffversorgung anzupassen. In den

Verl¨

aufen des Sauerstoffpartialdrucks im Medium DOT und dem Kohlenstoffdioxidanteil im

Abgas CO2ist in den unten gezeigten Versuchen auch noch bei anhaltender Kohlenstofflimi-

tierung ein Ausstoß von Kohlenstoffdioxid und somit eine Stoffwechselaktivit¨

at erkennbar.

Dies deutet auf einen endogenen Kohlenstoffspeicher, wie z.B. Glykogen, hin.

Nitzsche et al. [79] beschreiben, dass A.niger alte Hyphen recyclen kann, indem die Koh-

lenhydrate aus der Zellwand als endogene Kohlenstoffquelle genutzt werden. Es ist jedoch

unklar, ob die benachbarten Kompartimente direkt recycelt werden oder ob der Zellinhalt

zuerst ins Medium ¨

ubergeht und durch aktive Kompartimente aufgenommen wird. Das

Zellwandskelett bleibt dabei bestehen und es entstehen leere Hyphen. In der exponentiellen

Wachstumsphase konnten dagegen in den Untersuchungen von Nitzsche et al. keine leeren

Hyphen beobachtet werden [79], [50].

Zudem berichten Nitzsche et al. von einem sekund¨

aren Wachstum auf Grundlage eines

endogenen Kohlenstoffspeichers. Auch dies ist prinzipiell eine m¨

ogliche Erkl¨

arung f¨

ur den

anhaltenden Kohlenstoffdioxidausstoß. Da die Biomasse in dieser Arbeit nur auf makro-

skopischer Ebene ¨

uber die Messung der Biotrockenmasse quantifiziert wird, k¨

onnen diese

auf mikroskopischer Ebene ablaufende Prozesse, die zu keiner messbaren Zunahme der Bio-

trockenmasse f¨

uhren, f¨

ur die durchgef¨

uhrten Kultivierungen jedoch nicht weiter validiert

werden. Die Stoffwechselaktivit¨

at w¨

ahrend der Kohlenstofflimitierung deckt wahrscheinlich

haupts¨

achlich den laufenden Energiebedarf zur Erhaltung der Zellfunktionen, wie der Auf-

rechterhaltung der Membranpotentiale, dem Wiederaufbau von Zellbestandteilen und von

notwendigen Transportprozessen [80].

A.niger zeigt w¨

ahrend der anhaltenden Kohlenstofflimitierung Anzeichen von Autolyse.

Neben der Abnahme von Biomasse werden außerdem eine Freisetzung von Ammonium und

Phosphat, eine erh¨

ohte Aktivit¨

at von Proteasen sowie eine ver¨

anderte Hyphenstruktur und

ein geringeres Wachstum beobachtet [79]. Bei einer l¨

anger anhaltenden Limitierung tritt

eine gelbliche Verf¨

arbung des Mediums auf.

Auf Basis der in der Literatur beschriebenen Ph¨

anomene wird das Verhalten bei einer Koh-

lenstofflimitierung und der Erhaltungsstoffwechsel modelliert. Zuerst wird eine Schalter-

funktion in Abh¨

angigkeit der im Medium befindlichen Glucosekonzentration definiert, die

bei sehr kleinen Glucosekonzentrationen von 0 auf 1 geht; also erst bei einer Kohlenstoffli-

mitierung aktiv wird. Da mit einer Monod-Kinetik Stoffwechselvorg¨

ange modelliert werden,

68 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

die bei einer ausreichenden N¨

ahrstoffversorgung aktiv und bei unzureichender Substrat-

versorgung inaktiv sind, kann die Schalterfunktion ebenfalls mit einer leicht abgewandelten

Monod-Kinetik und der Monod-Konstante KGlc,Xin folgendermaßen formuliert werden:

rSchalter =1−cGlc

KGlc,Xin +cGlc (5.4)

Die einzelnen Kompartimente der Biomasse, wie DNA oder RNA, sind im Rahmen dieser

Arbeit nicht messtechnisch zug¨

anglich. Aus den oben genannten ¨

Uberlegungen und Beob-

achtungen erscheint jedoch eine Unterteilung der Biotrockenmasse mX,BT M in eine aktive,

wachstumsf¨

ahige Biomasse mX, in eine inaktive Biomasse mXin , einen endogenen Kohlen-

stoffspeicher mCSp, den Phosphatspeicher mP hSp sowie in einen Ammoniumspeicher mAmSp

sinnvoll. Leere Hyphen, Zellfragmente und intakte, aber nicht mehr wachsende Zellen wer-

den in der inaktiven Biomassse mXin zusammengefasst. Die inaktive Biomasse wird als Teil

der Biotrockenmasse gemessen, jedoch ist sie im Gegensatz zur aktiven Biomasse nicht mehr

wachstumsf¨

ahig. Es gilt:

mX,BT M =mX+mXin +mCSp +mP hSp +mAmSp (5.5)

Da nicht alle Effekte bei einer Kohlenstofflimitierung, wie Lyse, das Entstehen von leeren

Hyphen, Hyphenrecycling oder Regulationen, aufgrund der Komplexit¨

at und fehlender mess-

technischer Zug¨

anglichkeit differenziert betrachtet werden k¨

onnen, werden sie durch eine

allgemeine Inaktivierungskinetik rX,in modelliert. Die Inaktivierungsgeschwindigkeit rX,in

ist proportional zur aktiven Biomasse mXund die Biomasse nimmt mit einer konstanten

Rate µX,in ab, sobald die Kohlenstoffquelle aufgebraucht wurde (rSchalter).

rX,in =mX·µX,in ·rSchalter (5.6)

In den durchgef¨

uhrten Versuchen, wie zum Beispiel bei F7, zeigte sich nach einer Phase mit

anhaltender Kohlenstofflimitierung bei erneuter Kohlenstoffzufuhr ein geringeres Wachstum

und eine geringere Glucoseaufnahme als bei einer gleichbleibend aktiven Biomasse zu erwar-

ten war. Eine Verringerung des Wachstums durch eine Inaktivierung wird also experimentell

best¨

atigt.

Modellstrukturen, die einen Inaktivierungsterm aufweisen, zeigten sich zudem im iterativen

Modellbildungsprozess gegen¨

uber Modellstrukturen ohne Inaktivierung besonders f¨

ur die

Beschreibung der Messdaten im sp¨

ateren Verlauf der Kultivierung ¨

uberlegen.

Aus den vorhandenen Messdaten geht zwar die Existenz eines endogenen Kohlenstoffspei-

chers hervor, jedoch kann dieser messtechnisch nicht quantifiziert werden, was bei einer

Parameteridentifikation zu schwerwiegenden Problemen f¨

uhrt. In der Literatur wird der

Kohlenhydratgehalt von A.niger mit bis zu 28 % der Trockenmasse angegeben [81]. Um

die Freiheitsgrade der Parameteridentifikation zu reduzieren, wird daher im Modell durch

5.3. Modellbeschreibung 69

das Wachstum ein Speicher parallel zur Biomasse im Verh¨

altnis 28 : 72 aufgebaut. Es wird

davon ausgegangen, dass der Speicher nur durch das Wachstum aufgebaut und nur w¨

ahrend

der Limitierung verbraucht wird.

Der Kohlenstoffspeicher liegt biologisch gesehen in Form von eingelagerten Kohlenhydraten

bzw. als Polysaccharide vor. Van Munster et al. [50] beobachteten, dass die Kohlenhydrate

in der Zellwand sich anf¨

anglich zu 73 % aus dem Monomer Glucose zusammensetzen. Nach

einer sechst¨

agigen Kohlenstofflimitierung fiel dieser Wert auf 63 %. F¨

ur das Modell wird

daher der Kohlenstoffspeicher ¨

aquivalent zu Glucose aufgefasst, d.h. f¨

ur die Erhaltung wird

die gleiche Menge an Kohlenstoffspeicher verbraucht wie f¨

ur die Erhaltung aus freier Glucose

im Medium.

Daher besteht der Erhaltungsterm rErh aus zwei einzelnen Termen f¨

ur die Erhaltung aus der

freien Glucose im Medium rErh,Glc und der Erhaltung aus dem Kohlenstoffspeicher rErh,CSp,

die beide mit dem gleichen Faktor µErh proportional zur aktiven Biomasse mXsind. Die

Erhaltung erfolgt, solange ausreichend Glucose vorhanden ist, aus der Glucose im Medium,

was durch eine Monod-Kinetik mit der Monod-Konstante KGlc,Erh in Abh¨

angigkeit der

Glucosekonzentration cGlc ausgedr¨

uckt werden kann.

rErh,Glc =mX·µErh ·cGlc

KGlc,Erh +cGlc

(5.7)

Die Erhaltungsfunktion aus dem Kohlenstoffspeicher rErh,CSp wird erst bei einer Glucoseli-

mitierung ¨

uber die Schalter-Funktion rSchalter aktiviert. Auch hier wird durch eine Monod-

Kinetik in Abh¨

angigkeit der Kohlenstoffspeicherkonzentration gGlc =mCSp

VXsichergestellt,

dass die Erhaltung nur bei ausreichendem Speicher stattfinden kann, wobei KCSp,Erh die

zugeh¨

orige Monod-Konstante bezeichnet.

rErh,CSp =mX·µErh ·gGlc

KCSp,Erh +gGlc ·rSchalter (5.8)

Beide Terme zusammen ergeben damit die Gesamterhaltung rErh:

rErh = (rErh,Glc +rErh,CSp) (5.9)

5.3.3 Aufnahme und Freisetzung von Ammonium und Phosphat

Die Aufnahme von Phosphat und Ammonium erfolgt in allen betrachteten Versuchen paral-

lel zum Wachstum von A.niger. In der Modellbildung wird jedoch davon ausgegangen, dass

das Substrat zuerst in einem Speicher aufgenommen wird und anschließend ein Teil des im

Speicher befindlichen Substrats f¨

ur das Wachstum genutzt wird.

Daher werden zwei zus¨

atzliche Kinetiken f¨

ur die Substrataufnahmegeschwindigkeit von Am-

monium und Phosphat rAm und rP h aufgestellt. Beide Substrate werden mit den Fakto-

ren µAm bzw. µP h proportional zur Biomasse aufgenommen. Die Substrataufnahme erfolgt

70 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

nur, sofern ausreichend Substrat vorhanden ist und in Anwesenheit von Glucose, was je-

weils durch eine Monod-Kinetik mit den Halbs¨

attigungskonstanten KAmSp und KGlc,AmSp

bzw. KP hSp und KGlc,P hSp modelliert wird. F¨

ur die Aufnahme von Ammonium gilt in

Abh¨

angigkeit von cAm und cGlc:

rAm =µAm ·mX·cAm

KAmSp +cAm ·cGlc

KGlc,AmSp +cGlc

,(5.10)

wobei KAmSp und KGlc,AmSp die jeweiligen Monod-Konstanten bezeichnen.

Die Aufnahme von Phosphat in den Phosphatspeicher wird analog in Abh¨

angigkeit der

Phosphatkonzentration cP h sowie den Halbs¨

attigungskonstanten KP hSp und KGlc,P hSp for-

muliert:

rP h =µP h ·mX·cP h

KP hSp +cP h ·cGlc

KGlc,P hSp +cGlc

(5.11)

Bei einer l¨

angeren Kohlenstofflimitierung wird eine Freisetzung von Ammonium und Phos-

phat beobachtet (siehe Versuch F7). Im Modell wird die Freisetzung durch die Freisetzungs-

geschwindigkeiten rAm,in und rP h,in abgebildet. Dabei wird angenommen, dass die Freiset-

zung mit YAm,Xin und YP h,Xin proportional zur Inaktivierungsgeschwindigkeit rX,in aus den

Substratspeichern erfolgt. Da nur bei vorhandenem Substrat im Speicher eine Freisetzung

m¨

oglich ist, wird die Freisetzung jeweils durch Monod-Kinetiken in Bezug auf die Speicher-

konzentrationen gAm und gP h in Abh¨

angigkeit der Monod-Konstanten KAm,in und KP h,in

begrenzt. Es gilt f¨

ur die Freisetzungsgeschwindigkeit von Ammonium rAm,in:

rAm,in =YAm,Xin ·rX,in ·gAm

KAm,in +gAm

(5.12)

Die Freisetzungsgeschwindigkeit f¨

ur Phosphat rP h,in lautet dementsprechend:

rP h,in =YP h,Xin ·rX,in ·gP h

KP h,in +gP h

(5.13)

5.3.4 Biomasse und Substratspeicher

Mit Hilfe der aufgestellten Kinetiken k¨

onnen die einzelnen Kompartimente der Biomasse

modelliert werden. Die aktive Biomasse nimmt mit der Wachstumsgeschwindigkeit rXzu,

wobei ein Anteil von 72 % zur aktiven Biomasse und ein Anteil 28 % zum Kohlenstoffspei-

cher umgewandelt wird. Durch die Inaktivierung wird die aktive Biomasse in die inaktive

Biomasse mXin ¨

uberf¨

uhrt.

˙x1=dmX

dt = 0.72 ·rX−rX,in (5.14)

Der Kohlenstoffspeicher mCSp wird durch das Wachstum rXaufgebaut und bei einer Koh-

lenstofflimitierung durch den Erhaltungsterm rErh,CSp verbraucht:

˙x2=dmCSp

dt = 0.28 ·rX−rErh,CSp (5.15)

5.3. Modellbeschreibung 71

Der Phosphatspeicher wird mit der Phosphataufnahmegeschwindigkeit rP h gebildet. Beim

Wachstum wird der Speicher mit dem Faktor YP h,X proportional zur Wachtumsgeschwin-

digkeit rXf¨

ur den Zellaufbau verbraucht. Im Fall einer Kohlenstofflimitierung, die zu einer

Inaktivierung f¨

uhrt, wird mit rP h,in Phosphat aus dem Speicher in das Medium freigesetzt.

Die Bilanzgleichung f¨

ur den Phosphatspeicher mP hSp lautet daher:

˙x3=dmP hSp

dt =rP h −YP h,X ·rX−rP h,in (5.16)

Der Ammoniumspeicher wird entsprechend dem Phosphatspeicher modelliert. Die Bilanz-

gleichung f¨

ur den Ammoniumspeicher setzt sich somit aus der Ammoniumaufnahmege-

schwindigkeit rAm abz¨

uglich des f¨

ur das Wachstum ben¨

otigten Ammoniums YAm,X ·rXund

dem Ammoniumanteil, der bei Inaktivierung freigesetzt wird, rAm,in zusammen.

˙x4=dmAmSp

dt =rAm −YAm,X ·rX−rAm,in (5.17)

Der inaktive Teil der Biotrockenmasse nimmt mit der Inaktivierungsgeschwindigkeit rX,in

zu, wobei ein kleiner Anteil der inaktiven Biomasse mit dem Faktor YXin,Lyse lysiert.

˙x5=dmXin

dt = (1 −YXin,Lyse)·rX,in (5.18)

5.3.5 Substrate

Die Aufnahme bzw. der Verbrauch von Ammonium und Phosphat werden durch die Aufnah-

mekinetiken rAm und rP h beschrieben. Zus¨

atzlich werden die Substrate w¨

ahrend des Prozes-

ses mit dem Zuflussvolumenstrom ui,F eed und der Feedkonzentration ci,F eed zugef¨

uttert.

In den durchgef¨

uhrten Versuchen ist außerdem zu erkennen, dass bei einer anhaltenden

Kohlenstofflimitierung Ammonium und Phosphat freigesetzt werden. Daher werden beide

Zustandsgleichungen um einen Freisetzungsterm rAm,in bzw. rP h,in erweitert. Die Zustands-

gleichung f¨

ur Ammonium und Phosphat lauten demnach:

˙x6=dmAm

dt =−rAm +rAm,in +uAm,F eed ·cAm,F eed (5.19)

˙x7=dmP h

dt =−rP h +rP h,in +uP h,F eed ·cP h,F eed (5.20)

Die f¨

ur das Wachstum ben¨

otigte Glucosemenge wird proportional zur Wachstumsgeschwin-

digkeit rXmit dem Ausbeutekoeffizienten YGlc,X verbraucht. Glucose wird neben dem Wachs-

tum auch f¨

ur den Erhaltungsstoffwechsel ben¨

otigt, d.h. solange Glucose im Medium vorhan-

den ist, wird ein kleiner Teil der Glucose durch rErh,Glc verbraucht. F¨

ur Glucose kann die

Massenbilanz daher folgendermaßen angegeben werden:

˙x8=dmGlc

dt =−YGlc,X ·rX−rErh,Glc +uGlc,F eed ·cGlc,F eed (5.21)

72 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

5.3.6 Volumen der zugegebenen Base

Die Aufnahme von Ammonium w¨

ahrend des Wachstums f¨

uhrt zu einer Freisetzung von

Protonen und somit zu einer Absenkung des pH-Werts [49], [82]. Zus¨

atzlich entstehen auch

schw¨

achere organische S¨

auren wie Zitronen- oder Glucons¨

aure als Stoffwechselprodukte [49].

Die pH-Regelung regelt den pH-Wert durch Zugabe von Base konstant auf einen pH-Wert

von 5, wobei das zugegebene Basevolumen in der exponentiellen Wachstumsphase mit dem

Faktor YBase,X proportional zur Wachstumsgeschwindigkeit rXist.

˙x9=dVBase

dt =YBase,X ·rX(5.22)

Das Volumen der zugegebenen Base ist also eine wertvolle Zusatzinformation und kann

sowohl f¨

ur Modellierung als auch f¨

ur die Zustandssch¨

atzung genutzt werden.

5.3.7 Gel¨

ostsauerstoff im Medium

W¨

ahrend des Wachstums verbraucht A.niger proportional zur Wachstumsgeschwindigkeit

rXmit dem Faktor YO2,rXden im Medium gel¨

osten Sauerstoff f¨

ur den Zellaufbau. Der Er-

haltungsstoffwechsel rErh ben¨

otigt ebenso f¨

ur die Energiegewinnung aus Glucose Sauerstoff.

Der Verbrauch von Sauerstoff f¨

ur die Erhaltung wird mit YO2,X skaliert.

Durch Bel¨

uftung wird stetig neuer Sauerstoff im Medium gel¨

ost. Der Eintrag von Sauer-

stoff wird durch die Differenz der S¨

attigungskonzentration von O2im Fermentermedium

c∗

O2= 8 ·10−3g

L[75] zur aktuellen Sauerstoffkonzentration cO2=mO2

Vgetrieben und durch

den Stoff¨

ubergangskoeffizienten kLAbeschrieben. Der Parameterstartwert von kLAwird

uber einen Versuch mit abwechselnder Stickstoff- und Sauerstoffbegasung experimentell auf

den Wert 172 L

hbestimmt. Die Bilanz f¨

ur die im Medium gel¨

oste Sauerstoffmasse lautet

demnach:

˙x10 =dmO2

dt =kLA·c∗

O2−cO2−YO2,X ·rErh −YO2,rX·rX(5.23)

Der DOT-Verlauf weist beim Wachstum gegen¨

uber den CO2- und Baseverl¨

aufen eine leichte

Verz¨

ogerung auf, was auf die Tr¨

agheit des Sensors, auf die langsame Diffusion von Sauer-

stoff in den Sensor und weitere nicht modellierte Dynamiken zur¨

uckzuf¨

uhren ist. Es wird

daher ein Verz¨

ogerungsverhalten erster Ordnung f¨

ur den Sauerstoffsensor angenommen, das

durch einen weiteren Zustand f¨

ur die Sauerstoffkonzentration cO2,Sensor im Sensor beschrie-

ben wird.

˙x11 =dcO2,Sensor

dt =1

T1·(cO2−cO2,Sensor) (5.24)

Die Umrechnung der O2-Konzentration im Sensor cO2,Sensor in den DOT-Messwert erfolgt

durch Teilung mit der S¨

attigungskonzentration c∗

O2und Multiplikation mit 100 %.

y7=DOT = 100 % ·cO2,Sensor

c∗

(5.25)

5.3. Modellbeschreibung 73

Zur Modellierung des Gel¨

ostsauerstoffs ist anzumerken, dass sich im Laufe der Kultivierung

aufgrund von der dichter werdenden Biomasse auch die Viskosit¨

at des Mediums erh¨

oht.

Durch die h¨

ohere Viskosit¨

at k¨

onnen Transportprobleme auftreten und sich die L¨

oslichkeit

von Sauerstoff ¨

andern. Des Weiteren wird die Diffusion in die Sauerstoffsonde erschwert.

Zus¨

atzlich setzen sich in mehreren Versuchen die Abluftfilter mit Biomasse zu, so dass ein

Druckanstieg im Reaktor auftrat. Der h¨

ohere Reaktordruck f¨

uhrte dann zu einer h¨

oheren

L¨

oslichkeit von Sauerstoff im Vergleich zur kalibrierten S¨

attigungskonzentration. Zusam-

menfassend ist festzuhalten, dass die Sauerstoffmessung mit zunehmender Biomasse eine

h¨

ohere Unsicherheit aufweist, jedoch in der Anfangsphase eine zus¨

atzliche Information ¨

uber

das Wachstum zur Verf¨

ugung stellt.

5.3.8 Kohlenstoffdioxid im Abgas

Neben dem zugegebenen Basevolumen und der Gel¨

ostsauerstoffkonzentration liefert auch

der Kohlenstoffdioxidanteil im Abgas zus¨

atzliche Informationen f¨

ur die Modellbildung und

die Zustandssch¨

atzung. Der gemessene Kohlenstoffdioxidanteil h¨

angt kausal mit der Stoff-

wechselaktivit¨

at von A.niger zusammen.

Die Modellierung erfordert zwei weitere Massenbilanzen f¨

ur die Kohlenstoffdioxidmasse in

der Fl¨

ussigphase mCO2,l und in der Gasphase mCO2,g. In der Fl¨

ussigphase kann Kohlen-

stoffdioxid in den verschiedenen Formen CO2,H2CO3,HCO−

3und CO2−

3gel¨

ost vorliegen

[83], [84]. Daher wird die maximale L¨

oslichkeit in der Fl¨

ussigphase in der Modellbildung

vernachl¨

assigt.

Mit dem Henry-Gesetz gilt f¨

ur die Gleichgewichtskonzentration cGGW

CO2,g von CO2in der Gas-

phase in Abh¨

angigkeit der Konzentration in der Fl¨

ussigphase:

cGGW

CO2,g =Hcc ·cCO2,l mit cCO2,l =mCO2,l

V,(5.26)

wobei Hcc = 0.8317 die dimensionslose Henry-Konstante f¨

ur Kohlenstoffdioxid in 30 ◦C

warmen Wasser bezeichnet [85].

Der ¨

Ubergang von CO2aus der Fl¨

ussig- in die Gasphase wird durch die Konzentrationsdiffe-

renz zwischen der Gleichgewichtskonzentration cGGW

CO2,g und der tats¨

achlichen Konzentration

von CO2in der Gasphase cCO2,g =mCO2,g

Vgetrieben. Mit dem Stoff¨

ubergangskoeffizienten

βCO2gilt f¨

ur den Massenstrom ˙mCO2zwischen beiden Phasen:

˙mCO2=βCO2·(Hcc ·cCO2,l −cCO2,g).(5.27)

Beim Wachstum st¨

oßt A.niger durch die Verstoffwechselung von Glucose Kohlenstoffdioxid

aus. Mit dem Ausbeutekoeffizient YCO2,rXwird dabei ausgedr¨

uckt, wie viel Kohlenstoffdi-

oxid in Abh¨

angigkeit von der Wachstumsgeschwindigkeit rXin der Fl¨

ussigphase entsteht.

74 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Zus¨

atzlich wird im Erhaltungsstoffwechsel rErh Glucose durch die Zellatmung zur Energie-

gewinnung genutzt. Unter der Annahme, dass ein Glucosemolek¨

ul im Erhaltungsstoffwechsel

vollst¨

andig veratmet wird, kann die entstehende Kohlenstoffdioxidmasse abgesch¨

atzt wer-

den. Der Massenanteil von Kohlenstoff an Glucose betr¨

agt 72 gKohlenstof f

180 gGlucose . Aus einem Gramm

Kohlenstoff entstehen wiederum 44 gCO2

12 gKohlenstof f Kohlenstoffdioxid. F¨

ur den Kohlenstoffdioxi-

danteil in der Fl¨

ussigphase gilt daher:

˙x12 =dmCO2,l

dt =72 g

180 g·44 g

12 g·rErh +YCO2,rX·rX−βCO2·(Hcc ·cCO2,l −cCO2,g) (5.28)

Der Fermenter wird durchgehend mit ˙

Vein = 15 Standardlitern pro Minute bei Tein =

20 ◦Cbel¨

uftet. Der eingehende Volumenstrom ˙

Vein kann ¨

uber das ideale Gasgesetz in einen

Stoffmengenstrom ˙nein mol

humgerechnet werden.

˙nein =p·˙

Vein

R·Tein ·60 min

h,(5.29)

mit der allgemeinen Gaskonstante R= 8.314 J

molK und dem Reaktordruck p= 104925 P a.

Durch den ¨

Ubergang von Sauerstoff in das Medium verringert sich der aus dem Reaktor aus-

tretende, gasf¨

ormige Stoffmengenstrom, w¨

ahrend er sich durch Aufnahme bzw. Austrag von

Kohlenstoffdioixid vergr¨

oßert. Mit dem idealen Gasgesetz kann somit der Ausgangsvolumen-

strom ˙

Vaus bei einer Temperatur von Taus = 30 ◦Cfolgendermaßen berechnet werden:

Vaus =R·Taus

p·˙nein +βCO2

MCO2·(Hcc ·cCO2,l −cCO2,g)−kLA

MO2·c∗

O2−cO2,(5.30)

wobei ˜

MCO2= 44 g

mol und ˜

MO2= 32 g

mol die molaren Massen von Kohlenstoffdioxid bzw.

von Sauerstoff sind.

Das Volumen des Abluftkondensators und der angeschlossenen Schl¨

auche wird vernachl¨

assigt,

so dass der Bilanzraum der Gasphase aus dem Kopfraum des Fermenters (22 L−V) be-

steht, der durch Subtraktion des Fl¨

ussigkeitsvolumens Vvom Gesamtvolumen des Reaktors

von 22 Lberechnet werden kann.

Die Kohlenstoffdioxidbilanz der Gasphase setzt sich daher unter Vernachl¨

assigung des Koh-

lenstoffdioxideintrags durch die Begasung aus dem aus der Fl¨

ussigphase ¨

ubergehenden Koh-

lenstoffdioxidanteil und dem Austrag von CO2durch den austretenden Volumenstrom ˙

Vaus

zusammen.

˙x13 =dmCO2,g

dt =βCO2·(Hcc ·cCO2,l −cCO2,g)−mCO2,g

22 L−V·˙

Vaus (5.31)

Der verwendete Abgassensor ermittelt den Volumenanteil von Kohlenstoffdioxid im Abgas.

Mit dem idealen Gasgesetz kann aus der Kohlenstoffdioxidmasse das Volumen von Kohlen-

5.4. Zustandsgr¨

oßen 75

stoffdioxid VCO2berechnet werden. Es gilt mit dem idealen Gasgesetz f¨

ur das Kohlenstoff-

dioxidvolumen im Abgas VCO2:

VCO2=mCO2,g

MCO2·R·Taus

p·103L

m3,(5.32)

Der Volumentanteil von CO2in Prozent im Abgas berechnet sich dann durch die Division

mit dem Volumen des Kopfraums.

y8=CO2= 100 % ·VCO2

22 L−V(5.33)

5.3.9 Glucoamylase

Die Glucomylaseproduktion und die Sekretion in das Medium wird durch eine Vielzahl von

Regulationen gesteuert, die noch nicht alle aufgekl¨

art sind. Als erster kinetischer Ansatz,

bevor unten ein hybrides Modell folgt, wird daher analog zu [47] eine Luedeking-Piret-

Kinetik verwendet, bei der eine Produktion von GA sowohl mit dem Faktor αGA wachstums-

als auch mit dem Faktor βGA biomasseassoziiert erfolgt.

˙x14 =dAGA

dt =αGA ·rX+βGA ·mX(5.34)

5.3.10 Volumen

Das Fl¨

ussigkeitsvolumen im Reaktor wird nicht gemessen, sondern unter der Annahme, dass

keine Exzessvolumina auftreten, aus den zu- und abgef¨

uhrten Str¨

omen berechnet.

˙x15 =dV

dt =uAm,F eed +uP h,F eed +uGlc,F eed +uBase +uS¨aure +uAF OAM −uAbdampf (5.35)

5.4 Zustandsgr¨

oßen

Insgesamt besteht das Modell aus 15 Zust¨

anden, die in dem Zustandsvektor xzusammen-

gefasst werden:

x= (mX, mCSp, mP hSp, mAmSp, mXin , mAm, mP h, mGlc, VBase, mO2, cO2,Sensor,

mCO2,l, mCO2,g, AGA, V )T(5.36)

In Tabelle 5.3 sind alle Zust¨

ande mit ihrer Einheit und Bedeutung ¨

ubersichtlich darge-

stellt.

76 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Tabelle 5.3: Zustandsgr¨

oßen

Nr. Zustand Einheit Bedeutung

1mXgAktive Biomasse

2mCSp gGesamtmasse des Kohlenstoffspeichers

3mP hSp gGesamtmasse des Phosphatspeichers

4mAmSp gGesamtmasse des Ammoniumpeichers

5mXin gInaktive Biomasse

6mAm gAmmoniummasse im Medium

7mP h gPhosphatmasse im Medium

8mGlc gGlucosemasse im Medium

9VBase mL Volumen der zugegebenen Base

10 mO2gGel¨

ostsauerstoff im Medium

11 cO2,Sensor g

LSauerstoffkonzentration im Sensor

12 mCO2,l gMasse von Kohlenstoffdioxid im Medium

13 mCO2,g gMasse von Kohlenstoffdioxid im Kopfraum

14 AGA µKat Glucoamylaseaktivit¨

15 V L Fl¨

ussigkeitsvolumen im Reaktor

5.5 Messgleichung

Die Zustandsgr¨

oßen k¨

onnen ¨

uber die Messgleichung h(x) in die Messgr¨

oßen yumgerechnet

werden. Es gelten folgende Zusammenh¨

ange zwischen Zustands- und Messgr¨

oßen:

y1=cX=mX,BT M

V=1

V(mX+mXin +mCSp +mP hSp +mAmSp) (5.37)

y2=cAm =mAm

V(5.38)

y3=cP h =mP h

V(5.39)

y4=cGlc =mGlc

V(5.40)

y5=aGA =AGA

V(5.41)

y6=VBase =VBase (5.42)

y7=DOT = 100 % ·cO2,Sensor

c∗

(5.43)

y8=CO2= 100 % ·VCO2

(22 L−V)(5.44)

5.6. Diskrete Zustands¨

anderungen 77

5.6 Diskrete Zustands¨

anderungen

F¨

ur die Probenahmen wird in regelm¨

aßigen Abst¨

anden ein bestimmtes Volumen aus dem

Reaktor genommen, wodurch sich die Massen der einzelnen Bilanzgr¨

oßen ebenfalls reduzie-

ren. Daher erfolgt eine Zustandskorrektur f¨

ur die extensiven Zust¨

ande mX,mCSp,mP hSp,

mAmSp,mXin ,mAm,mP h,mGlc,AGA und Vmit Formel (5.45) nach jeder Probenahme.

i=xi·1−VP robe

V∀i={1,2,3,4,5,6,7,8,10,12,14,15}(5.45)

5.7 Modellparameter

Die Modellparameter werden ¨

uber eine Parameteridentifikation mit dem ABC-System [3]

bestimmt. Die nichtlineare Optimierung erfolgt mit der Optimierungsumgebung Tomlab

und dem Optimierer SNOPT7.

Die Anfangswerte f¨

ur die Parameter Wachstums- und GA-Kinetik (µmax,KGlc,αGA,βGA)

werden von Kelly [76] bzw. Cui [75] entnommen, w¨

ahrend die Anfangswerte der Ertrags- und

Ausbeutekoeffizienten soweit m¨

oglich von dem bereits im Kapitel 4 vorgestellten, hybriden

Modell 3 ¨

ubernommen werden. In mehreren Parameteridentifikationen werden die Parame-

ter iterativ an die Messdaten angepasst. Bei Erweiterungen der Modellstruktur wird der

Anfangswert und die Parametergrenzen empirisch festgelegt. Um den gesamten, zul¨

assigen

Parameterraum zu untersuchen, wird ein Latin Hypercube Sampling durchgef¨

uhrt [10]. Bei

der Parameteridentifikation erweist es sich zudem als vorteilhaft, wenn zuerst Parameter-

gruppen einzeln und erst anschließend alle Parameter simultan identifiziert werden. Die

Standardabweichung der Parameter wird mit dem Bootstrap-Verfahren bestimmt.

Die Modellparameter werden im letzten Schritt gleichzeitig an alle Versuche F3-F10 ange-

passt. Da mit einem einzigen Parametersatz sehr unterschiedliche Experimente beschrieben

werden, kommt es dazu, dass einzelne Gr¨

oßen in einigen Versuchen unter- und in anderen

Versuchen ¨

ubersch¨

atzt werden, wie nachfolgend zu sehen ist. Zu beachten ist auch, dass in

Abb. 5.1 bis 5.8 zwar die abschließende Anpassung mit obigen Modell dargestellt ist, dass

erste Versuche aber noch mit einem initialen, schlechteren Modell geplant wurden, siehe

unten.

Die angepassten Modellparameter sind in unten stehender Tabelle aufgef¨

uhrt. Aus Gr¨

unden

der Einheitlichkeit und besseren numerischen Nachvollziehbarkeit erfolgt die Angabe der

Parameter in Tabelle 5.4 mit vier Nachkommastellen. In der Realit¨

at sind die Parameter

des Modells nicht mit dieser Genauigkeit bestimmbar.

Der Parameter KGlc ist auf Basis der vorhandenen Versuche vermutlich nicht praktisch

identifizierbar, da nur wenige Messdaten bei sehr niedrigen Glucosekonzentrationen vor-

78 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Tabelle 5.4: Modellparameter und Parameterunsicherheiten

Parameter Wert Standardabweichung Einheit

µmax 0.2652 0.0028 1

µAm 0.0231 0.0055 1

µP h 0.0158 0.0019 1

KGlc 0.0038 4.4460 ·10−4g

KAm 0.0007 2.8240 ·10−4g

KP h 0.0006 0.0011 g

KO20.0003 1.0900 ·10−19 g

αGA 0.2764 5.0580 ·10−5µKat

βGA 0.0506 3.2770 ·10−5µKat

g h

βCO26.7432 0.0024 L

kLA74.479 4.8990 ·10−4L

YAm,X 0.0810 6.9770 ·10−4g

YP h,X 0.0215 0.0012 g

YGlc,X 1.8428 0.0163 g

YBase,X 2.2869 0.0353 mL

µX,in 0.0451 0.0014 1

YO2,X 0.0587 5.5790 ·10−17 g

YCO2,X 0.0899 4.1790 ·10−4g

YO2,rX0.0132 0.0020 g

YCO2,rX0.6819 3.5750 ·10−4g

µErh 0.0233 0.0040 1

YAm,Xin 0.0681 5.2340 ·10−5g

YP h,Xin 0.0016 1.6570 ·10−5g

YXin,Lyse 0.0547 2.179 ·10−19 g

T10.0825 2.2450 ·10−4h

KGlc,Xin 0.0001 8.3740 ·10−4g

KGlc,P hSp 0.0060 0.0048 g

KGlc,AmSp 0.0036 2.2370 ·10−4g

KCSp,Erh 0.0049 1.4720 ·10−4g

KGlc,Erh 0.00007 9.3060 ·10−4g

KP hSp 0.1032 0.0044 g

KAmSp 0.0016 5.9960 ·10−5g

KP h,in 0.0016 4.7520 ·10−5g

KAm,in 0.0023 7.0720 ·10−5g

5.8. Ergebnisse der Modellanpassung 79

liegen und die Unsicherheit bei der Glucosebestimmung gr¨

oßer ist als der in der Litera-

tur genannte Wertebereich von KGlc. Die Bestimmung der Parameterkovarianz mit dem

Bootstrap-Verfahren ergibt zwar mit 4.4460 ·10−4g

Leine sehr geringe Parameterunsicher-

heit f¨

ur KGlc, jedoch ist dies wahrscheinlich eher einem lokalen Minimum geschuldet. Es ist

dennoch festzuhalten, dass die Monod-Konstante f¨

ur Glucose einen sehr kleinen Wert auf-

weist, was durch Literaturquellen best¨

atigt wird. Der identifizierte Wert f¨

ur KGlc erscheint

daher trotz fehlender praktischer Identifizierbarkeit plausibel. Eine genauere experimentelle

Bestimmung von KGlc w¨

urde einen separaten Versuchsaufbau und eine wesentlich genauere

Analytik f¨

ur Glucose erfordern.

Neben KGlc weisen auch die weiteren Monod-Konstanten sehr kleine Werte auf. Kleine

Werte f¨

ur die Halbs¨

attigungskonstanten f¨

uhren dazu, dass die entsprechenden Kinetiken

sich ¨

ahnlich zu Kinetiken nullter Ordnung verhalten, d.h. die Aufnahme bzw. Abgabe von

N¨

ahrstoffen erfolgt bei Vorhandensein des N¨

ahrstoffs gleichbleibend nahezu unabh¨

angig von

der Bezugskonzentration. Auch diese Konstanten sind dann praktisch nur schwer identifi-

zierbar. Insgesamt erscheint es so, dass A.niger eine ausgepr¨

agte und schnelle F¨

ahigkeit zur

N¨

ahrstoffaufnahme besitzt.

5.8 Ergebnisse der Modellanpassung

In den Abbildungen 5.1-5.8 sind die simulierten Verl¨

aufe von der aktiven Biomasse mX, des

Phosphatspeichers mP hSp, des Kohlenstoffspeichers mCSp, der inaktiven Biomasse mXin ,

des Ammoniumspeichers mAmSp sowie die Verl¨

aufe der simulierten und gemessenen Mess-

gr¨

oßen und zus¨

atzlich die Feedingprofile f¨

ur die Versuche F3 bis F10 dargestellt. Die wachs-

tumsf¨

ahige, aktive Biomasse im Reaktor zu Versuchsbeginn wird f¨

ur jeden Versuch separat

uber eine Parameteridentifikation bestimmt, da diese im Allgemeinen einer starken Schwan-

kung unterliegt.

Der Versuch F1 diente ausschließlich zur Untersuchung geeigneter Prozessbedingungen. Mit

den Versuchsdaten aus dem Batch-Versuch F2 wurden die Parameter des initialen, struk-

turierten Modells angepasst, um die folgenden Fed-Batch-Versuche zu planen. Der Versuch

wurde als reiner Batch-Versuch geplant, d.h. es fand keine Zuf¨

utterung statt, wobei die ge-

plante Glucosekonzentration zu Beginn des Versuchs bei 30 g

Llag. Das initiale Modell, das

zur Planung der ersten Versuche genutzt wird, weist gegen¨

uber dem beschriebenen Modell

noch keine Speicherterme und eine vereinfachte Modellstruktur f¨

ur die Online-Messgr¨

oßen

auf. Nach der Kohlenstofflimitierung trat in dem Versuch eine Trennung von Biomasse und

Medium auf, die wahrscheinlich auf die Bildung hydrophober Proteine an den Zellw¨

anden

zur¨

uckzuf¨

uhren ist. Durch die Auftrennung k¨

onnen Messfehler bei der naßchemischen Ana-

lytik nicht ausgeschlossen werden. Daher wurde Versuch F2 im Folgenden haupts¨

achlich zur

80 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Parameteridentifkation der initialen Modelle genutzt. Der Verlauf f¨

ur den Versuch F2 mit

dem finalen Modellstand ist im Anhang in Abbildung A.2 dargestellt.

Abbildung 5.1: F3: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Der Versuch F3 (Abb. 5.1) ist im Gegensatz zu F1 und F2 ein Fed-Batch-Versuch, der mit

Hilfe des initialen Modells geplant wurde. Das Ziel der Planung bestand in der Anregung

des Wachstums mit einem exponentiellen Feeding bei einer im Vergleich zu F2 geringe-

ren Anfangsglucosekonzentration. Es traten neben zwei l¨

angeren Kohlenstofflimitierungen

auch ab t= 26 heine kurze Phase auf, in der die Glucosemenge nicht f¨

ur ein exponen-

tielles Wachstum zu reichen scheint. Die auftretenden Kohlenstofflimitierungen k¨

onnen je-

doch gut durch das Modell beschrieben werden. Das Modell und die Messwerte weisen

f¨

ur die Biotrockenmassen- und Glucosekonzentration sowie f¨

ur die Online-Messwerte eine

hohe ¨

Ubereinstimmung auf. Ammonium und Phosphat wurden w¨

ahrend des Versuches hin-

zudosiert, um zus¨

atzliche Messdaten f¨

ur die Kalibrierung einer Nahinfrarotspektroskopie

zu gewinnen. Da sich die Transmissionssonde des Nahinfrarotspektrometers jedoch bereits

5.8. Ergebnisse der Modellanpassung 81

bei kleinen Biomassenkonzentration zusetzt, konnten die gewonnenen Spektren nicht wei-

ter ausgewertet werden. Die Konzentration von Phosphat wird durch die Simulation leicht

ubersch¨

atzt, da die Parameter f¨

ur mehrere Versuche angepasst werden. Prinzipiell scheint

die aktuelle Modellstruktur jedoch geeignet zu sein, um den qualitativen Verlauf zu be-

schreiben. Die GA-Aktivit¨

at wird durch das Modell nur unzureichend beschrieben und un-

tersch¨

atzt.

Abbildung 5.2: F4: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Der Versuch F4 wurde mittels einer optimalen Versuchsplanung (OVP) mit dem D-Kriterium

geplant, um die Parameterunsicherheit des initialen Modells zu verringern. Im Versuch tre-

ten zwei Wachstumsphasen und eine l¨

angere Inaktivierungsphase auf. Die gemessene GA-

Aktivit¨

at ist mit 25.98 µKat

Lvergleichsweise hoch. In der Simulation liegt die GA-Aktivit¨

unterhalb der gemessenen Aktivit¨

at, wobei jedoch der simulative Verlauf den gemessenen

qualitativ gut beschreibt. Im sp¨

ateren Verlauf des Versuchs treten deutliche Abweichun-

gen zwischen Modell und Messwerten f¨

ur die Phosphat- und Glucosekonzentration auf. In

82 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

beiden F¨

allen ist am Ende des Versuchs der Verbrauch von Phosphat und Glucose laut Mo-

dell h¨

oher als in dem tats¨

achlichen Experiment, was auf eine erh¨

ohte Inaktivierung in der

Realit¨

at hindeutet. Beim DOT-Wert f¨

allt eine st¨

arkere Abweichung bei h¨

oheren Biomasse-

konzentrationen auf, was durch die in Unterkapitel 5.3.7 beschriebenen Transportprobleme

verursacht worden sein k¨

onnte.

Abbildung 5.3: F5: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Die optimierungsbasierte Versuchsplanung f¨

ur die f¨

unfte Fermentation F5 hatte das Ziel

die GA-Aktivit¨

at am Ende des Versuchs auf Basis des initialen Modells zu maximieren.

Das G¨

utefunktional f¨

ur die Versuchsplanung lautete also Φ = −aGA(tend), wobei die Frei-

heitsgrade in der Optimierung die Zuflussmengen von Glucose uGlc, Ammonium uAm und

Phosphat uP h waren. Um Transportprobleme bei hohen Biomassekonzentrationen zu ver-

hindern, wurde die maximale Biomassenkonzentration bei der Planung auf 15 g

Lbeschr¨

ankt.

Die modellierte GA-Bildungskinetik zum Zeitpunkt der Planung war deutlich st¨

arker mit

der Biomasse als mit dem Wachstum assoziiert, so dass in der Planung des Versuchs die Bio-

5.8. Ergebnisse der Modellanpassung 83

massekonzentration m¨

oglichst schnell bis an die zul¨

assige Konzentrationgsgrenze gefahren

wurde. Anschließend trat eine l¨

angere Kohlenstofflimitierung auf. Die gemessene volumen-

bezogene GA-Aktivit¨

at ist mit 15.15 µKat

Lgering, so dass die oben genannte Strategie nicht

erfolgreich war. Die GA-Kinetik musste demnach mit weiteren Messdaten neu angepasst

werden. Wie bereits in Kapitel 4 beschrieben wurde, konnten dar¨

uber hinaus im Sekre-

tom mit einer SDS-PAGE Proteasen nachgewiesen werden, die wiederum die gebildete GA

abbauen k¨

onnen. Im Laufe der Fermentation hatte sich zudem der Abluftfilter mit Bio-

masse zugesetzt, was zu einem Druckanstieg im Reaktor und zu einer Verf¨

alschung der

Gel¨

ostsauerstoffmessung gef¨

uhrt hat, siehe DOT > 100%.

Abbildung 5.4: F6: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Mit dem Versuch F6 sollte untersucht werden, wie sich eine niedrige Glucosekonzentration

uber den gesamten Versuchsverlauf auf die GA-Produktion auswirkt. Als Hypothese f¨

die Versuchsplanung wurde angenommen, dass eine geringe Glucosekonzentration bei aber

gleichzeitiger, ausreichender Versorgung des Erhaltungsstoffwechsels mit Glucose zu einer

84 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

erh¨

ohten GA-Produktion f¨

uhrt. Die damalige mechanistische Modellstruktur f¨

ur die Ver-

suchsplanung umfasste im Gegensatz zum endg¨

ultigen Modell noch keine Speicherterme f¨

die Substrate und auch keine Terme f¨

ur die Substratfreisetzung bei einer Inaktivierung. In

dem Versuch schien sich ab Stunde t= 42 hein Gleichgewicht zwischen der Zufuhr von Glu-

cose und dem Erhaltungsstoffwechsel einzustellen, da sowohl die Biomassenkonzentration cX

als auch die CO2-Konzentration im Abgas trotz Glucosezufuhr konstant blieben. Die GA-

Aktivit¨

at weist bei F6 mit 40.83 µKat

Lden h¨

ochsten gemessenen Wert auf. Die aufgestellte

Hypothese wird durch den Versuch F6 daher best¨

atigt.

Abbildung 5.5: F7: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Mit der siebten Kultivierung F7 sollten weitere Messdaten zur besseren Identifikation der

Inaktivierungsphase und der Freisetzung von Phosphat und Ammonium erzeugt werden.

Daher folgte nach der anf¨

anglichen, exponentiellen Wachstumsphase eine l¨

angere Phase

mit Kohlenstofflimitierung. Die erneute Glucosezufuhr nach 40 hf¨

uhrte zu einem erneuten

Wachstum, das jedoch durch eine Ammoniumlimitation gegen Versuchsende eingeschr¨

ankt

5.8. Ergebnisse der Modellanpassung 85

wurde. Die maximale GA-Aktivit¨

at in der Kultivierung liegt mit 24.78 µKat

Lvergleichswei-

se hoch. Das derzeitige Modell weist bei der Beschreibung der GA-Bildung in den ersten

36 hder Fermentation eine hohen ¨

Ubereinstimmung mit dem gemessenen Verlauf auf. Da-

nach tritt aber eine Abweichung zwischen Modell und gemessener Aktivit¨

at auf, bei der die

tats¨

achliche Aktivit¨

at deutlich h¨

oher liegt als der vorhergesagte Verlauf.

Abbildung 5.6: F8: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

In der achten Fermentation F8 wurde gezielt eine Phosphatlimitation herbeigef¨

uhrt, um den

Einfluss von Phosphat auf das Wachstum von A.niger und die GA-Produktion zu ermitteln.

Da in den vorhergehenden Versuchen nur geringe Mengen Phosphat aufgenommen wurden,

wurde die Anfangskonzentration von Phosphat auf 0.083 g

Lherabgesetzt. Trotz einer Phos-

phatlimitation in der Zeit von 18 bis 24 hwuchs die Biomasse weiter. Erst die kurzzeitige

Glucoselimitation von 22 hbis 26 hf¨

uhrte zu einer Beendigung des Wachstums. Es ist

jedoch davon auszugehen, dass Phosphat f¨

ur das Wachstum essentiell ist und A.niger f¨

das Wachstum auf endogene Phosphatreserven wie den bereits erw¨

ahnten Polyphosphaten

86 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

zur¨

uckgreifen konnte. Die Messung des Gel¨

ostsauerstoffs erschien in F8 fehlerhaft zu sein.

Die GA-Aktivit¨

at pro Lliegt mit 20.82 µKat

Leher im mittleren Bereich aller Versuche, wobei

die Modellvorhersage und die gemessene Aktivit¨

at nahe beieinander liegen.

Abbildung 5.7: F9: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Bei der neunten Kultivierung F9 (siehe Abbildung 5.7) wurde der Einfluss einer Ammoni-

umlimitierung untersucht. In der Wachstumsphase zeigte sich in den Messdaten bei einer

anf¨

anglich niedrigen Ammoniumkonzentration ein h¨

oherer Verbrauch von Glucose als bei

den vorhergehenden Versuchen. Zugleich wurde auch deutlich mehr Base durch die pH-

Regelung hinzu dosiert. In der Zeit von 20 −24 hnahm die Biotrockenmasse weiter zu,

obwohl weder Glucose noch Ammonium im Medium vorhanden waren. Gleichzeitig wurde

auch nahezu kein Phosphat mehr aufgenommen. Angesichts der nur wenigen, verf¨

ugbaren

Messwerte innerhalb dieser kurzen Zeitspanne und m¨

oglichen Messunsicherheiten ist eine In-

terpretation dieses Verhalten schwierig. Es ist weiterhin unklar, ob die beobachtete Zunahme

der Biomasse auf ein tats¨

achliches Wachstums zur¨

uckzuf¨

uhren ist. In der neunten Kultivie-

5.8. Ergebnisse der Modellanpassung 87

rung deutete demnach aber auch vieles auf eine Umstellung des Stoffwechsels aufgrund einer

Ammonium- oder einer Kohlenstofflimitierung hin. Eine m¨

ogliche Erkl¨

arung f¨

ur den h¨

oheren

Basen- und Glucoseverbrauch k¨

onnte die Produktion von organischen S¨

auren wie Glucon-,

Oxal- oder Zitronens¨

aure sein. Die Bildung von S¨

auren wird durch eine hohe Glucosekon-

zentration gef¨

ordert. Ein niedriger pH-Wert (pH ≤2) beg¨

unstigt dabei die Produktion

von Zitronens¨

aure gegen¨

uber der von Glucon- und Oxals¨

aure [86], [49]. In dem Filtrat war

mit naßchemischer Analytik jedoch keine Zitronens¨

aure nachweisbar, so dass m¨

oglicherweise

eher Glucons¨

aure gebildet wurde. Weiterhin konnten Papagianni et al. [87] die Bildung von

Glucosamin in der fr¨

uhen Phase einer Kultivierung bei niedriger Ammoniumkonzentrati-

on nachweisen. Die Bildung von Glucosamin durch A.niger wird von Artmann et al. [88]

kritisch hinterfragt, jedoch konnte nach externer Zugabe von Glucosamin ein diauxisches

Wachstum auf Glucosamin festgestellt werden. Im Filtrat von F9 war Glucosamin durch

die naßchemische Analytik ebenfalls nicht nachweisbar. Da die Fahrweise der Kultivierung

mit 18.12 µKat

Lzu einer eher geringen GA-Aktivit¨

at gef¨

uhrt hat, wird auf eine umfassende

Modellierung dieser m¨

oglichen Mechanismen und Besonderheiten verzichtet.

In Abbildung 5.8 ist der Verlauf f¨

ur den zehnten Versuch F10 aufgetragen. Die Wahl der

Anfangsglucosekonzentration orientierte sich dabei an den Versuchen F3 und F4, bei de-

nen jeweils eine relativ hohe Aktivit¨

at erreicht wurde. Das Modell weicht bei der Glucose-

und Phosphatkonzentration phasenweise deutlich von den Messdaten ab. Auffallend ist vor

allem, dass F10 mit 14.78 µKat

Ldie niedrigste GA-Aktivit¨

at aller durchgef¨

uhrten Versuche

aufweist.

In Tabelle 5.5 sind die Fehlerquadrate analog zu Gleichung (4.18) ¨

ubersichtlich f¨

ur die Ver-

suche F2 bis F10 f¨

ur alle Messgr¨

oßen des strukturierten Modells dargestellt. Aus der Tabelle

wird deutlich, dass die Versuche F3, F6 und F7 relativ gut durch das Modell beschrieben

werden k¨

onnen, wobei jedoch der Versuch F6 bei der Glucoamylaseaktivit¨

at die h¨

ochste

Abweichung aller Versuche von den Messdaten aufweist. Die Kultivierungen F5, F9 und

F10 weisen, wie bereits zuvor beschrieben, bei mehreren Messgr¨

oßen h¨

ohere Abweichungen

von den Messdaten auf und werden daher nur unzureichend durch das Modell und den

derzeitigen Parametersatz beschrieben.

88 Kapitel 5. Herleitung eines strukturierten Modells

Abbildung 5.8: F10: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

Tabelle 5.5: Summe der Fehlerquadrate f¨

ur das strukturierte Modell

Versuch cXcAm cP h cGlc aGA VBase DOT CO2

[g2

L2] [ g2

L2] [µKat2

L2] [mL2] [%2] [%2]

F2 2.77 0.09 0.03 9.29 3.13 469.86 −0.01

F3 1.28 0.14 0.03 1.98 12.47 646.01 27.21 0.01

F4 1.76 0.06 0.09 3.71 22.48 3661.26 281.57 0.02

F5 5.98 0.27 0.04 7.44 4.77 989.62 442.52 0.05

F6 2.42 0.00 0.03 0.02 102.55 62.98 14.78 0.00

F7 0.52 0.04 0.02 1.33 22.89 979.07 130.14 0.01

F8 1.96 0.02 0.02 0.20 6.90 207.71 394.92 0.02

F9 0.66 0.01 0.11 7.95 3.40 12536.51 66.04 0.01

F10 4.96 0.07 0.08 9.73 1.71 3050.3 160.81 0.05

5.9. Zusammenfassung und Diskussion 89

5.9 Zusammenfassung und Diskussion

Die gew¨

ahlte Modellstruktur beinhaltet Zust¨

ande, die nicht direkt messtechnisch zug¨

anglich

sind, und stellt eine starke Vereinfachung der komplexen Vorg¨

ange im Metabolismus von

A.niger dar. Daher ist die Identifizierbarkeit f¨

ur alle Modellparameter anzuzweifeln. Die

Berechnung der Identifizierbarkeitsmatrix mit der Toolbox Strike Gold [18] best¨

atigt, dass

das Modell als Ganzes nicht identifizierbar ist. Um die Identifizierbarkeit dennoch zu verbes-

sern, wurden bereits in der Modellbildung Annahmen getroffen, die die Freiheitsgrade der

Parameter verringern. Zus¨

atzlich konnten die Startwerte f¨

ur die Modellparameter teilweise

aus der hybriden Modellbildung ¨

ubernommen werden.

Eine weitere Einschr¨

ankung f¨

ur die Modellbildung ergibt sich aus der relativ hohen Unsicher-

heit bei der Probenahme und der Sauerstoffmessung f¨

ur h¨

ohere Biomassekonzentrationen.

Bei einer hohen Biomasse k¨

onnen aufgrund der h¨

oheren Viskosit¨

at und der schwierigen

Handhabbarkeit der Proben Fehler auftreten. Die breiartige Konsistenz f¨

uhrt dazu, dass

Fl¨

ussigkeit, Substrate oder die GA im Filterkuchen zur¨

uckbleiben und die naßchemische

Analytik verf¨

alschen.

In den Versuchen F2 (siehe Anhang A.2) und F5 trat unmittelbar nach der exponentiellen

Wachstumsphase eine Trennung von Biomasse und Medium und eine deutliche Gelbf¨

arbung

des Mediums auf. Die Biomasse schwamm dabei ¨

ahnlich zu Schaum auf dem Medium auf. Die

Vermutung liegt nahe, dass es sich um einen Lysevorgang handelt und hydrophobe Proteine

an Zellw¨

anden zu dieser Trennung f¨

uhrten. Die Umst¨

ande, die zu diesem Verhalten f¨

uhren,

sind unbekannt und daher nicht in der Modellbildung ber¨

ucksichtigt.

Das Modell stellt also nur einen Kompromiss zwischen notwendiger Modelltiefe und verf¨

ug-

baren Wissen dar. Dabei ist der Einfluss der Prozessparameter und der Morphologie auf

das Wachstum von filament¨

osen Organismen sehr spezifisch und eine ¨

Ubertragbarkeit von

Parametern aus Literaturquellen nur eingeschr¨

ankt m¨

oglich.

Insgesamt ist das Modell jedoch in der Lage, die bisherigen Versuche bis auf die Bildung von

Glucoamylase zufriedenstellend bis gut zu beschreiben. Im n¨

achsten Schritt soll daher eine

verbesserte Beschreibung f¨

ur die Produktbildung von Glucoamylase gefunden werden.

Kapitel 6

Hybride Modellierung der

Glucoamylasebildung

Die Modellierung der GA-Bildung mit der Luedeking-Piret-Kinetik stellt ¨

uber die Wachs-

tumsgeschwindigkeit nur einen indirekten Zusammenhang zwischen der GA-Bildung und

der Substratkonzentration im Fermeneter her und kann die Messdaten nur unzureichend

beschreiben. Die Bildung und die Sekretion von GA werden demnach durch weitere noch

unbekannte Faktoren beeinflusst. Im folgenden Kapitel sollen diese Einflussfaktoren unter-

sucht und anschließend eine verbesserte Produktionskinetik formuliert werden. Da die ma-

thematischen Zusammenh¨

ange zwischen den m¨

oglichen Einflussgr¨

oßen a priori unbekannt

sind, wird ein nichtparametrischer Ansatz in Form eines Multi-Layer Perceptrons (MLP) im

Rahmen der hybriden Modellbildung gew¨

ahlt.

In dieser Arbeit wird lediglich die sekretierte GA erfasst, so dass zwischen den einzelnen

Mechanismen, die zur Expression und Sekretion von GA f¨

uhren, nicht unterschieden werden

kann. Die Bildung und Sekretion von GA werden daher zusammengefasst. Wenn in diesem

Kapitel also von der Glucoamylasebildung gesprochen wird, schließt dies auch immer die

Sekretion von Glucoamylase ein.

6.1 Vorgehen

Die Formulierung einer hybriden Kinetik f¨

ur die GA-Bildung bietet viele Freiheitsgrade

bez¨

uglich der Struktur, der Eingangsgr¨

oßen und der Anpassung des MLPs. Daher werden

die Schritte f¨

ur ein systematisches Vorgehen bei der Aufstellung der hybriden Kinetik kurz

skizziert.

1. Im ersten Schritt werden die bisherigen Versuche bez¨

uglich der GA-Bildung analy-

siert. In einer ¨

Ubersichtsdarstellung wird nach Auff¨

alligkeiten und Einflussfaktoren

6.2. ¨

Ubersicht ¨

uber die durchgef¨

uhrten Versuche 91

gesucht, die zu einer vermehrten oder verminderten GA-Bildung f¨

uhren. Es werden

darauf aufbauend Hypothesen zur GA-Bildung aufgestellt und m¨

ogliche Einflussfak-

toren vorgeschlagen.

2. Anschließend werden verschiedene Strukturen f¨

ur die hybride Kinetik mit ihren Vor-

und Nachteilen aufgezeigt.

3. Danach werden m¨

ogliche Eingangsgr¨

oßen f¨

ur das MLP auf Basis der zuvor aufgestell-

ten Hypothesen diskutiert.

4. Darauffolgend werden die m¨

oglichen Strategien zum Training eines MLPs im Kon-

text eines dynamischen Biomodells vorgestellt. Dies schließt auch die Wahl der Meta-

Struktur des MLPs ein.

5. Im letzten Schritt soll eine alternative, mechanistische Kinetik mit dem Wissen aus

der hybriden Modellbildung gefunden werden.

6.2 ¨

Ubersicht ¨

uber die durchgef¨

uhrten Versuche

In Tabelle 6.1 sind die minimalen und maximalen Konzentrationen (jeweils durch ein tief-

gestelltes min bzw. max gekennzeichnet) f¨

ur die Substrate sowie die maximale Biomas-

senkonzentration und Glucoamylaseaktivit¨

at pro Liter f¨

ur alle Versuche aufgef¨

uhrt. Die

minimale Glucosekonzentration f¨

allt bei allen Versuchen zwischenzeitlich auf 0 g

L, so dass

sie nicht aufgef¨

uhrt ist. Außerdem wird das Verh¨

altnis zwischen maximaler Glucoamylase-

aktivit¨

at (AGA,max =a(tGA,max)·V(tGA,max)) und der zugeh¨

origen Biomasse (mX,GA,max =

c(tGA,max)·V(tGA,max)) im Reaktor angegeben.

Der Versuch F6 weist mit 40.83 µKat

Lmit Abstand die gr¨

oßte volumenbezogene Glucoamyla-

seaktivit¨

at aller durchgef¨

uhrten Versuche und gleichzeitig mit 14.97 g

Leine relativ geringe

Biomassenkonzentration auf. Daraus ergibt sich ein spezifischer Glucoamylasebildungsko-

effizient AGA,max

mX,GA,max von 2.90 µKat

g. Dies k¨

onnte mit der relativ geringen maximalen Gluco-

sekonzentration von 3.6g

Lzusammenh¨

angen. Bei Betrachtung des dynamischen Verlaufs

(siehe Abbildung 5.4) f¨

allt auf, dass das Wachstum bei F6 trotz stetiger Glucosezufuhr

nicht exponentiell erfolgt.

Außer bei Versuch F6 liegt die spezifische Produktion von GA auch f¨

ur die Versuche F2

und F3 vergleichsweise hoch. Allerdings k¨

onnen hier aus der Tabelle 6.1 keine besonderen

Zusammenh¨

ange hergeleitet werden. Auch scheint es bei Betrachtung der statischen Kon-

zentrationen keinen großen Einfluss durch die Ammonium- und Phosphatkonzentration zu

geben. Es ist aber gut m¨

oglich, dass die GA-Bildung durch den dynamsichen Verlauf der

Substratkonzentrationen gesteigert oder gehemmt werden kann.

92 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Tabelle 6.1: GA-Bildung und minimale und maximale Substratkonzentrationen je Kultivierung

aGA,max cX,max

AGA,max

mX,GA,max cP h,min cP h,max cAm,min cAm,max cC,max

µKat

F2 20.29 14.76 1.71 0.74 1.88 0.82 2.74 29.40

F3 29.49 18.17 1.66 1.07 2.04 0.73 2.77 12.25

F4 25.98 27.04 0.99 0.81 2.58 1.18 2.82 11.54

F5 15.15 16.84 1.13 1.09 2.41 1.05 2.98 13.84

F6 40.83 14.97 2.90 1.18 1.87 1.04 2.50 3.60

F7 24.78 23.09 1.96 0.51 1.73 0.03 2.35 17.05

F8 20.82 17.11 0.98 0.01 1.61 0.76 2.47 5.97

F9 18.12 16.77 1.20 0.76 1.39 0 0.69 10.77

F10 14.78 21.5 0.77 0.71 1.72 0.31 2.61 10.27

6.3 Einflussfaktoren und Hypothesen

Die Grundhypothese dieser Arbeit ist, dass die Bildung und Sekretion von Glucoamyla-

se durch A.niger vom N¨

ahrstoffangebot abh¨

angig ist und somit durch Einstellung eines

geeigneten N¨

ahrstoffsangebots gesteigert werden kann.

Die Modellierung der Bildungskinetik f¨

ur GA basiert dabei auf folgenden Hypothesen:

1. Die GA-Bildung ist proportional zur im Reaktor vorhandenen Biomasse mX.

2. Die GA-Produktion korreliert mit dem Wachstum, wobei die Glucoamylase vor allem

an den wachsenden Hyphenspitzen sekretiert wird.

3. GA als Enzym dient A.niger zur Erschließung von Glucose aus Polysacchariden wie

St¨

arke. Daher wirkt sich die Glucosekonzentration im Medium auf die Bildung von

GA aus.

4. Der Versuch F6 weist zum Versuchsende die h¨

ochste Glucoamylaseaktivit¨

at aller durch-

gef¨

uhrten Versuche auf. In diesem Versuch wird kontinuierlich Glucose hinzu dosiert,

wodurch A.niger stetig mit rX

mX< µmax w¨

achst. Daher wird angenommen, dass ein

Wachstum mit rX

mX< µmax zu einer erh¨

ohten Produktion und Sekretion von GA f¨

uhrt.

5. Eine zu hohe Glucosekonzetration kann die GA-Bildung herabsetzen oder gar inhibie-

ren.

6.4. Strukturen der hybriden Kinetik 93

6.4 Strukturen der hybriden Kinetik

Es gibt eine Vielzahl an M¨

oglichkeiten den mechanistischen Anteil mit dem nichtparame-

trischen Anteil zu kombinieren. Im Folgenden werden daher mehrere Varianten vorgestellt

und die Vor- und Nachteile jeder Variante diskutiert.

Im Rahmen der hybriden Modellbildung wird die Kinetik - wie bereits in Kapitel 2.2 be-

schrieben - grunds¨

atzlich in einen mechanistischen und einen Black Box-Anteil unterteilt.

Je mehr von der Struktur im mechanistischen Anteil vorgegeben ist, beispielsweise durch

eine Luedeking-Piret-Kinetik, desto geringer ist der Aufwand beim Training des nichtpara-

metrischen Anteils und umso gr¨

oßer ist die Extrapolierbarkeit der Kinetik. Nachteilig wirkt

sich dabei aus, dass die Flexibilit¨

at des hybriden Ansatzes teilweise verloren geht. Zudem

muss dann eine Grundstruktur f¨

ur die Kinetik bereits bekannt sein.

Ein großer Black Box-Anteil wiederum erh¨

oht die Flexibilit¨

at, da unbekannte Zusammen-

h¨

ange im Laufe des Trainings erlernt werden k¨

onnen. Dies bedeutet jedoch einen deutlichen

Trainingsaufwand f¨

ur die Anpassung des MLPs und erfordert ausreichend informative Trai-

ningsdaten. Andernfalls k¨

onnten die Trainingsdaten eventuell gut wiedergegeben werden,

w¨

ahrend gleichzeitig das Netz nur eine geringe Extrapolationsf¨

ahigkeit aufweist.

Strukturell kann ein MLP additiv in die Kinetik eingehen und somit den Fehler des Mo-

dells ausgleichen. Diese Struktur eignet sich besonders f¨

ur Settings mit vielen gleichartigen

Versuchen, f¨

ur die ausreichende Trainingsdaten bereit stehen. Hier ist allerdings die Gefahr

groß, dass das MLP den Fehler lediglich auswendig lernt und nur wenig Vorhersagekraft f¨

unbekannte Versuche hat. Die additive Form, Gl. (6.1), wird daher in dieser Arbeit nicht

weiterverfolgt.

rGA,add =αGA ·mX+fMLP (xMLP,in) (6.1)

Eine andere M¨

oglichkeit ist die multiplikative Form, bei der eine vorhandene Kinetik erg¨

anzt

wird. Die einfachste Variante ist die Multiplikation mit der aktiven Biomasse mX. Diese

Form bietet eine hohe Flexibilit¨

at und f¨

uhrt gleichzeitig gegen¨

uber einem reinen Black Box-

Anteil zu einer konsistenteren Pr¨

adiktion.

rGA,mul =mX·fMLP (xMLP,in) (6.2)

Alternativ ist auch die Einbettung in eine Luedeking-Piret-Kinetik (LP) m¨

oglich, da sich

die Luedeking-Piret-Kinetik f¨

ur einzelne Versuche gut zu eignen scheint und die wachstums-

und biomassebezogene Produktbildung durch Literaturquellen und durch die durchgef¨

uhrten

Experimente belegt ist. In diesem Fall w¨

urde das MLP die Parameter der LP-Kinetik in

Abh¨

angigkeit der Eingangsgr¨

oßen pr¨

adizieren. Sowohl ein MLP, das beide Parameter (αGA

und βGA) pr¨

adiziert, als auch zwei, separate MLPs, die die Parameter einzeln beschrei-

ben, sind m¨

oglich. Der Nachteil dieses Ansatzes ist jedoch, dass hier bereits eine relativ

94 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

starre Struktur in Abh¨

angigkeit der Biomasse und Wachstumsgeschwindigkeit vorgegeben

wird.

yMLP = yMLP,1

yMLP,2!=fMLP (xMLP,in) (6.3)

rGA,LP =yMLP,1·mX+yMLP,2·rX(6.4)

6.5 Auswahl geeigneter Eingangsdaten f¨

ur das MLP

Die Wahl geeigneter Eingangsdaten f¨

ur das Neuronale Netz ist keineswegs trivial. Prinzipiell

k¨

onnen alle verf¨

ugbaren Modellgr¨

oßen wie beispielsweise die Substratkonzentrationen im

Medium oder in den Speichern sowie die Wachstumsrate als Eing¨

ange f¨

ur das Netz dienen.

Es besteht aber die Gefahr, dass bei einer ungeeigneten oder zu weit gefassten Wahl der

Eingangsgr¨

oßen die Trainingsdaten durch das Netz auswendig gelernt werden. Zudem stehen

f¨

ur Biomodelle in der Regel nicht ausreichend Trainingsdaten zur Verf¨

ugung, um das Netz

f¨

ur alle m¨

oglichen Wertebereiche der Eingangsgr¨

oßen ausreichend zu trainieren. Dies kann

im schlimmsten Fall zu v¨

ollig unrealistischen Pr¨

adiktionen des MLPs f¨

uhren. Daher gilt f¨

die Wahl der Eingangsgr¨

oßen, dass m¨

oglichst nur notwendige Eingangsgr¨

oßen f¨

ur das MLP

genutzt werden, um die Komplexit¨

at des MLPs m¨

oglichst gering zu halten.

Anhand der zuvor aufgestellten Hypothesen kann f¨

ur die GA-Bildung eine Abh¨

angigkeit

von der Glucosekonzentration angenommen werden. Im einfachsten Fall wird also einzig die

Glucosekonzentation cGlc als Eingangsgr¨

oße xMLP,in f¨

ur das MLP genommen.

Die vierte Hypothese sagt aus, dass bei einem Wachstum unterhalb der maximalen Wachs-

tumsrate die GA-Produktion st¨

arker angeregt wird. Daher wird f¨

ur die Glucoseabh¨

angigkeit

der GA-Bildung erwartet, dass sie bei kleinen Glucosekonzentrationen um cGlc =KGlc ma-

ximal wird und bei h¨

oheren Konzentrationen abf¨

allt. Bei einer Glucosekonzentration von

Null findet nur eine geringe GA-Produktion statt. Aufgrund der F¨

ahigkeit eines MLPs bei

einer entsprechenden Struktur beliebige Funktionen ann¨

ahern zu k¨

onnen, sollte das MLP

die erwartete Glucoseabh¨

angigkeit prinzipiell nur auf Basis von cGlc lernen k¨

onnen.

Da die Halbs¨

attigungskonstante f¨

ur Glucose mit KGlc = 0.0038 g

Leinen sehr kleinen Wert

aufweist und in diesem niedrigen Konzentrationsbereichen keine validen Messdaten f¨

ur Glu-

cose erhoben werden k¨

onnen, ist die Halbs¨

attigungskonstante und damit die Identifizier-

barkeit f¨

ur die GA-Kinetik jedoch nicht gegeben. Es werden daher zus¨

atzliche Eing¨

ange auf

Basis von cGlc und der modellierten Wachstumsrate ausgetestet. Diese zus¨

atzlichen Eing¨

ange

bilden m¨

ogliche Zusammenh¨

ange der GA-Bildung von der Glucosekonzentration bereits auf

der Eingangsschicht ab und entlasten somit das Training des MLPs und k¨

onnen die Struktur

des MLPs reduzieren.

6.5. Auswahl geeigneter Eingangsdaten f¨

ur das MLP 95

Es bietet sich insbesondere an, die Monod-Kinetik f¨

ur Glucose aus der Wachstumsrate rGlc

als zus¨

atzlichen Eingang zu nutzen, da auf diese Weise der Einfluss der Wachstumsrate in

Bezug zur Glucosekonzentration auf die GA-Bildung durch das MLP ber¨

ucksichtigt werden

kann.

rGlc

X=cGlc

KGlc +cGlc

(6.5)

Die Definition von 1−rGlc

Xals weiteren Eingang bietet sich an, um niedrige Konzentrati-

onsbereiche von Glucose im Wertebereich von KGlc verst¨

arkt abzubilden.

1−rGlc

X= 1 −cGlc

KGlc +cGlc

(6.6)

Die Kombination von rGlc

Xund 1−rGlc

Xbetont niedrige Konzentrationsbereiche von Glu-

cose, bei denen noch Wachstum (cGlc = 0) m¨

oglich ist. Es wird also besonders der Bereich

abgebildet, bei dem A.niger mit rX

mX< µmax w¨

achst.

rGlc

X1−rGlc

X=1−cGlc

KGlc +cGlc ·cGlc

KGlc +cGlc

(6.7)

Der Verlauf dieses Eingangs in Abh¨

angigkeit von der Glucosekonzentration und der identi-

fizierten Halbs¨

attigungskonstante KGlc ist in Abbildung 6.1 dargestellt. Die Funktion weist

bei einer Konzentration cGlc =KGlc ein Maximum auf und f¨

allt dann kontinuierlich ab.

Die vorgeschlagenen Eing¨

ange f¨

ur das MLP sind nur von der Glucosekonzentration als Ein-

gang abh¨

angig und k¨

onnen beliebig miteinander kombiniert werden. Der Vorteil dieser For-

mulierung liegt darin, dass die zur Verf¨

ugung stehenden Messwerte f¨

ur Glucose einen Groß-

teil des f¨

ur das Training relevanten Konzentrationsbereichs von 0 bis 30 g

Labdecken, wobei

sehr kleine Glucosekonzentration mit der vorhandenen Messtechnik nicht erfasst werden

k¨

onnen.

Neben einer Abh¨

angigkeit von der Glucosekonzentration k¨

onnen sich auch die Biomasse-,

Phosphat- und Ammoniumkonzentration auf die GA-Bildung auswirken. Es werden da-

her zus¨

atzlich mehrere Kombinationen zwischen diesen Einflussfaktoren untersucht. Zwar

erh¨

oht sich mit der Anzahl der Eing¨

ange auch die Flexibilit¨

at des MLPs, da auch unbe-

kannte Einfl¨

usse durch die Phosphat-, Ammonium- und Biomassenkonzentration gelernt

werden k¨

onnen, jedoch liegen gleichzeitig die meisten Trainingsdaten f¨

ur die Phosphat- und

Ammoniumkonzentration in einem Wertebereichen von 0.7g

Lbis 2.5g

L. Außerhalb des Wer-

tebereichs k¨

onnen die Modellvorhersagen weniger aussagekr¨

aftig sein oder im Widerspruch

zu biologischen Vorstellungen stehen.

96 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Abbildung 6.1: Darstellung des Verlaufs der Gleichung (6.7) in Abh¨

angigkeit der Glucosekon-

zentration

6.6 Strategien zur Anpassung eines MLPs

Neben der Wahl der grunds¨

atzlichen Struktur des hybriden Ansatzes und der Eingangs-

gr¨

oßen f¨

ur das MLP m¨

ussen auch die Meta-Struktur und die Parameter des MLPs festge-

legt werden. Da es sich bei einem MLP um einen Black Box-Ansatz handelt, kann f¨

ur die

Wahl der Meta-Struktur oder der Parameter nicht auf biologisches Wissen zur¨

uckgegriffen

werden. Zudem sind die Parameter eines MLPs hochgradig miteinander korreliert und es

gibt eine Vielzahl an m¨

oglichen Parametern, die ein ¨

ahnliches Ein- und Ausgangsverhalten

erzeugen, so dass die Parameter eines MLPs nicht eindeutig identifizierbar sind.

Eine Voraussetzung f¨

ur eine gute Anpassung der Kinetik ist, dass ausreichend viele und

informative Trainingsdaten zur Verf¨

ugung stehen. Die Einbettung des MLPs in ein dynami-

sches System erschwert dabei die Identifikation, da die gesuchten Zusammenh¨

ange von dem

zeitlichen Verlauf abh¨

angig sind.

6.6. Strategien zur Anpassung eines MLPs 97

Um ein Overfitting auszuschließen, wird außerdem der Versuch F4 zur Kreuzvalidierung

genutzt und nicht in der Parameteridentifikation verwendet. Der Versuch F4 wird gew¨

ahlt,

da mit Versuch F4 im Gegensatz zum Beispiel zu Versuch F7 keine speziellen Ph¨

anomene

wie Lysevorg¨

ange untersucht werden sollten. Ein besonderes Augenmerk bei der Anpassung

liegt zudem auf Versuch F6, da dieser zum einem eine sehr hohe GA-Produktion aufweist

und zum anderen sich die Fahrweise des Versuchs von den anderen Versuchen unterscheidet.

Daher wird dieser Versuch in der Anpassung h¨

oher gewichtet.

Die Meta-Struktur des MLPs besteht aus einer Eingangsschicht, einer Zwischenschicht (hid-

den layer) und der Ausgangsschicht (n1,nh1,nL). Prinzipiell wird davon ausgegangen, dass

eine Schicht f¨

ur die Beschreibung der GA-Bildung ausreichend ist und eine komplexere

Struktur die Ergebnisse nicht wesentlich verbessert. Die Anzahl der Neuronen auf der Ein-

und der Ausgangschicht bestimmt sich aus der Anzahl der gew¨

ahlten Eingangsgr¨

oßen bzw.

der Ausg¨

ange in Abh¨

angigkeit der gew¨

ahlten Struktur. Die Anzahl der Neuronen auf der

Zwischenschicht sollte so gering wie m¨

oglich gew¨

ahlt werden, um die Komplexit¨

at des Net-

zes gering zu halten. Als Aktivierungsfunktion wird auf den Zwischenschichten der Tangens

hyperbolicus und auf der Ausgangsschicht ein Soft-Plus verwendet.

Da in einem untrainierten MLP die Parameter keine biologische Bedeutung haben, werden

die Startparameter des MLPs zuf¨

allig in einem Bereich zwischen −1 und 1 gew¨

ahlt.

Die Annahme, dass GA nicht das Wachstum oder anderweitig den Organismus beeinflusst,

erlaubt die Entkopplung der GA-Bildungskinetik vom ¨

ubrigen Modell, so dass durch die

Entkopplung ein Vortraining des Netzes außerhalb des dynamischen Modells m¨

oglich ist.

Da ein Training ohne die L¨

osung des Differentialgleichungssystems in jeder Iteration re-

chenzeiteffezienter durchgef¨

uhrt werden kann, kann ein Vortraining gegebenenfalls die Wahl

der Meta-Struktur erleichtern.

Das Vortraining erfordert Trainingsdaten, an denen die Produktkinetik angepasst werden

kann. Als Eingangsdaten k¨

onnen entweder interpolierte Messdaten oder mit dem Modell

simulierte Werte genutzt werden. Beide Varianten wurden in dieser Arbeit ausprobiert. Bei

der Verwendung von interpolierten Messdaten sind jedoch niedrige Konzentrationen von

Glucose wie in Versuch F6 mit hoher Unsicherheit behaftet.

Außerdem werden zur Voranpassung des Netzes gesch¨

atzte Werte f¨

ur die gesuchte Kinetik

ben¨

otigt, wobei mehrere Vorgehensweisen in Betracht kommen. Die erste M¨

oglichkeit ist

die Sch¨

atzung der GA-Kinetik mit einem Kalman-Filter f¨

ur jeden Versuch. Dieses Vorgehen

f¨

uhrt in der Regel jedoch zu einer schlechten Sch¨

atzung der Produktkinetik [21]. Die zweite

M¨

oglichkeit besteht in der Integration der modellierten Kinetik und dem anschließenden

direkten Vergleich von der Modellvorhersage mit den Messdaten. Dieser Schritt erfordert

wiederum eine Integration, so dass auch eine direkte Integration im dynamischen Modell

98 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

durchgef¨

uhrt werden kann. Die ersten beiden Varianten wurden daher im Rahmen dieser

Arbeit nicht weiterverfolgt. Die dritte Variante, die auch in dieser Arbeit ausgetestet wurde,

ist die Sch¨

atzung der Kinetik anhand der numerischen Ableitung von interpolierten Messda-

ten f¨

ur Glucoamylase. Die durchgef¨

uhrten Untersuchungen haben aber gezeigt, dass dieses

Vortraining f¨

ur die GA-Bildung nicht notwendig ist, da es letztendlich weder den Rechenauf-

wand f¨

ur die Identifikation reduziert noch zu besseren Ergebnissen gef¨

uhrt hat. F¨

ur andere

Problemstellungen kann ein solches Vortraining dagegen sinnvoll sein. Im weiteren Verlauf

wird daher auf ein Vortraining verzichtet und das MLP nochmals direkt im dynamischen

Modell ¨

uber eine Parameteridentifikation trainiert.

6.7 Ergebnisse

Das Vorgehen zur Wahl einer geeigneten Struktur der hybriden Kinetik, einer Meta-Struktur

und der Eing¨

ange gliedert sich in drei Schritte. Im ersten Schritt, siehe Tabelle 6.2, werden

mehrere Varianten (V1-V7) mit unterschiedlicher Anzahl an Neuronen auf der Zwischen-

schicht und der Glucosekonzentration cGlc als Eingang untersucht. Anschließend wird die

multiplikative Form rGA,mul (V3) mit der Struktur auf Basis der Luedeking-Piret-Kinetik

rGA,LP (V8) verglichen. Bei V8 wird ein Netz mit den beiden Ausg¨

angen yMLP,1und yMLP,2

entsprechend Gleichung 6.4 verwendet. Im letzten Schritt werden unterschiedliche Eingangs-

gr¨

oßen ausgetestet (V9-V18). In Tabelle 6.2 sind die untersuchten Varianten aufgef¨

uhrt.

Neben diesen Varianten gibt es noch unz¨

ahlige weitere M¨

oglichkeiten eine hybride Kinetik

zu formulieren, die jedoch im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht werden k¨

onnen.

Um einen Vergleich der Varianten zu erm¨

oglichen, wird der Normalized Root Mean Squa-

re Error (NRMSE) nach folgender Formel als G¨

ute f¨

ur die Anpassung f¨

ur jeden Versuch

genommen:

NRMSE = 100 % · 1−

aM

GA −aGA,MLP 

2

∥aM

GA −m(aM

GA) 1∥2!,(6.8)

wobei aM

GA und aGA,MLP die gemessenen bzw. simulierten Werte f¨

ur die Glucoamylaseakti-

vit¨

at pro L und maM

GAden Mittelwert von aM

GA darstellen. Ein NRMSE von 100 % sagt

somit aus, dass die gemessenen Werte von dem Modell exakt beschrieben werden k¨

onnen.

Bei 0 % ist die Anpassung dagegen nicht besser als nur den Mittelwert zu betrachten.

F¨

ur die Versuche, die zur Autovalidierung genutzt werden (F2, F3, F5, F6, F7, F8, F9,

F10), wird der durchschnittliche NRMSE pro Versuch angegeben. Der Versuch F6 ist f¨

die Anpassung von besonderer Bedeutung, so dass der NRMSE von Versuch F6 noch mal

zus¨

atzlich angegeben wird. Der NRMSE von Versuch F4 stellt die Kreuzvalidierung dar und

gibt somit Auskunft ¨

uber die Anpassungsg¨

ute von Versuchen, die nicht f¨

ur das Training ge-

nutzt werden. In Tabelle 6.3 sind die NRMSE-Werte f¨

ur die einzelnen Varianten aufgef¨

uhrt.

6.7. Ergebnisse 99

Tabelle 6.2: ¨

Ubersicht der ausgetesteten hybriden Kinetiken

Variante Struktur Meta-Struktur Eing¨

ange Parameter

V1 rGA,mul (1,1,1) cGlc 4

V2 rGA,mul (1,3,1) cGlc 10

V3 rGA,mul (1,5,1) cGlc 16

V4 rGA,mul (1,7,1) cGlc 22

V5 rGA,mul (1,9,1) cGlc 28

V6 rGA,mul (1,12,1) cGlc 37

V7 rGA,mul (1,16,1) cGlc 49

V8 rGA,LP (1,5,2) cGlc 22

V9 rGA,mul (2,5,1) cGlc,rGlc

X21

V10 rGA,mul (2,5,1) cGlc,rGlc

X(1 −rGlc

X) 21

V11 rGA,mul (1,5,1) rGlc

X16

V12 rGA,mul (3,5,1) cGlc,rGlc

X,rGlc

X(1 −rGlc

X) 26

V13 rGA,mul (1,5,1) rGlc

X(1 −rGlc

X) 16

V14 rGA,mul (2,5,1) cGlc,cX21

V15 rGA,mul (3,5,1) cGlc,cP h,cAm 26

V16 rGA,mul (4,5,1) cGlc,cP h,cAm,cX31

V17 rGA,mul (2,5,1) rGlc

X, 1 −rGlc

X21

V18 rGA,mul (2,5,1) cGlc, 1 −rGlc

X21

Neben dem NRMSE werden zus¨

atzlich der Ausgang des MLPs in Abh¨

angigkeit der Glu-

cosekonzentration (siehe Abbildung 6.4 und 6.6) und der zeitliche Verlauf der Simulation

im Vergleich zu den Messdaten (siehe Abbildung 6.2 und 6.3) zur Bewertung der einzelnen

Varianten genutzt.

Bei der Wahl der Meta-Struktur (V1-V7) wird die Anzahl der Neuronen auf der Zwischen-

schicht zwischen einem Neuron (V1) und 16 Neuronen (V7) variiert. Es zeigt sich, dass die

Erh¨

ohung der Neuronen auf der Zwischenschicht die Ergebnisse in der Auto- und Kreuzva-

lidierung nicht automatisch verbessert. Teilweise liegen die erreichten NRMSE in der Auto-

und Kreuzvalidierung f¨

ur Strukturen mit weniger Neuronen h¨

oher als f¨

ur MLPs mit einer

h¨

oheren Anzahl an Neuronen. Die Ursache kann darin liegen, dass das Training f¨

ur die Vari-

anten teilweise in lokalen Minima endet, da nicht f¨

ur jede Variante eine globale Optimierung

durchgef¨

uhrt werden kann. Da mit den Ergebnissen keine eindeutige Aussage zur Wahl der

Meta-Struktur getroffen werden kann, wird in den folgenden Tests eine Struktur mit f¨

unf

Neuronen verwendet. Dies stellt einen Kompromiss zwischen einer Struktur mit m¨

oglichst

geringer Komplexit¨

at und einem dennoch flexiblen MLP dar.

100 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Tabelle 6.3: NRMSE der Autovalidierung und der Versuche F4 und F6 f¨

ur die getesteten Vari-

anten. Der h¨

ochste Wert in einer Spalte ist jeweils hervorgehoben

Variante NRMSE [%]

Autovalidierung F6 F4

V1 45.86 69.94 63.99

V2 51.22 76.49 54.21

V3 45.51 70.55 65.21

V4 44.6 72.06 62.81

V5 45.81 69.91 64.34

V6 50.39 74.44 58.16

V7 49.26 88.95 44.92

V8 61.03 86.39 58.46

V9 63.83 72.29 42.08

V10 57.15 86.02 53.26

V11 57.79 80.80 47.79

V12 62.41 91.79 48.11

V13 60.82 85.88 53.99

V14 57.64 72.09 53.64

V15 53.00 79.78 71.44

V16 66.1 78.39 53.21

V17 56.68 83.09 56.17

V18 58.06 81.67 48.48

Der n¨

achste Schritt ist der Vergleich zwischen der multiplikativen Struktur (V3) und der

Struktur auf Grundlage der Luedeking-Piret-Kinetik rGA,LP (V8). Die Variante V8 weist

mit 61.03 % gegen¨

uber 45.51 % bei der Variante V3 eine deutlich bessere Anpassungsg¨

ute

f¨

ur die Autovalidierung auf. Insbesondere wird durch die Variante V8 der Versuch F6 mit

einem NRMSE von 86.39 % deutlich besser beschrieben als bei Variante V3 mit 70.55 %.

Der Kreuzvalidierungsversuch F4 wird durch die Variante V3 mit 65.21 % etwas besser

erkl¨

art als mit Variante V8 (58.46 %). Insgesamt scheint die an die Luedeking-Piret-Kinetik

angelehnte Kinetik geeigneter zu sein, um die GA-Bildung zu beschreiben.

Mit den Varianten V9 bis V18 soll der Einfluss unterschiedlicher Eingangsgr¨

oßen unter-

sucht werden. Neben den Eing¨

angen, die nur von Glucose abh¨

angen (cGlc,rGlc

X, 1 −rGlc

rGlc

X(1−rGlc

X)) werden auch die anderen Substratkonzentrationen (cAm,cP h) und die Biomasse

cXals Eingang getestet. Es werden f¨

ur jede Variante f¨

unf Neuronen auf der Zwischenschicht

gew¨

ahlt. Die NRMSE-Werte f¨

ur die Autovalidierung liegen bei den Varianten V9-V18 in

einem Bereich von 53 % bis 66.1 %. Bei genauerer Betrachtung f¨

ur den Versuch F6 f¨

allt

jedoch auf, dass Varianten mit den Eingangsgr¨

oßen 1 −rGlc

Xbzw. rGlc

X(1 −rGlc

X) deutlich

6.7. Ergebnisse 101

bessere NRMSE-Werte erreichen als Varianten ohne diese Eing¨

ange. In den Kreuzvalidie-

rungen weisen die Varianten V9-V18 mit Ausnahme von V15 im Vergleich zu V1 und V3-V5

geringere NRMSE-Werte auf. Dies wird aber durch deutlich h¨

ohere Werte in der Autovali-

dierung und F6 aufgehoben. Zwar hat die Variante V15 den h¨

ochsten NRMSE-Wert f¨

ur die

Kreuzvalidierung aller getesteten Varianten, jedoch ist gleichzeitig die Anpassungsg¨

ute f¨

die Autovalidierung und f¨

ur F6 geringer als bei V9-V18.

Auf Basis des NRMSE kann also keine eindeutige Entscheidung f¨

ur eine Variante hergeleitet

werden. Die Varianten V8, V12 und V13 zeigen in der Autovalidierung und bei F6 hohe

NRMSE-Werte und werden daher weiter untersucht. Zus¨

atzlich werden zum Vergleich auch

die Varianten V3, V9-V11 sowie V14-16 weiter untersucht, da diese ebenfalls hohe NRMSE-

Werte aufweisen.

F¨

ur die weitergehenden Untersuchungen werden f¨

ur die Varianten V3, V8-V16 sowohl die

gemessenen und simulierten Verl¨

aufe der GA-Aktivit¨

at als auch der Ausgang des Netzes

betrachtet. Die Verl¨

aufe der gemessenen und simulierten GA-Aktivit¨

at f¨

ur die Versuche F2-

F10 sind in den Abbildungen 6.2 und 6.3 dargestellt. Die Abbildungen 6.4 und 6.6 zeigen

dagegen die Ausg¨

ange des MLPs in Abh¨

angigkeit von der Glucosekonzentration.

Die simulierten GA-Konzentrationen weichen bei Variante V3 in den Versuchen F2, F5 und

F10 (siehe Abbildung 6.2) stark von den gemessenen Konzentrationen ab, so dass sich Vari-

ante V3 f¨

ur die Beschreibung der GA-Bildung als nicht geeignet erweist. Bei Variante V16

(siehe Abbildung 6.6) steigt die GA-Bildung oberhalb einer Glucosekonzentration von 9 g

an, wof¨

ur es keine biologisch motivierte Erkl¨

arung gibt, weswegen diese Variante ebenfalls

verworfen wird. Bei den Varianten V9, V10 und V12 bewirkt die Glucosekonzentration cGlc

(siehe Abbildung 6.4) als Eingang des Netzes einen leichten Anstieg der GA-Bildung bei

h¨

oheren Glucosekonzentrationen, was ebenfalls nicht sinnvoll erscheint.

Zwischen den Varianten V8-V14 treten insgesamt aber nur geringf¨

ugige Unterschiede auf

und die Ausg¨

ange der Neuronalen Netze zeigen das im Vorfeld erwartete Verhalten, dass die

GA-Bildung bei Glucosekonzentration nahe 0 g

Lansteigt und mit h¨

oheren Glucosekonzentra-

tionen abf¨

allt. Insofern stimmen die Ausg¨

ange des MLPs mit den biologischen Vorstellungen

zur GA-Bildung ¨

uberein. Prinzipiell scheinen also mehrere Varianten zur Beschreibung der

GA-Bildung geeignet zu sein. Nach der Gesamtbetrachtung wird f¨

ur das folgende Kapitel

letztendlich Variante V12 exemplarisch als Kinetik f¨

ur die GA-Bildung gew¨

ahlt, um die

Methodik zu verdeutlichen.

102 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Abbildung 6.2: Simulierte und gemessene Verl¨

aufe der Glucoamylaseaktiv¨

at f¨

ur die Versuche

F2 bis F10 f¨

ur ausgew¨

ahlte Varianten (V3, V8, V9, V10, V11) der hybriden Bildungskinetik. Der

Versuch F4 dient zur Kreuzvalidierung und wird nicht in der Parameteridentifikation genutzt.

6.7. Ergebnisse 103

Abbildung 6.3: Simulierte und gemessene Verl¨

aufe der Glucoamylaseaktiv¨

at f¨

ur die Versuche F2

bis F10 f¨

ur ausgew¨

ahlte Varianten (V12, V13, V14, V15, V16) der hybriden Bildungskinetik. Der

Versuch F4 dient zur Kreuzvalidierung und wird nicht in der Parameteridentifikation genutzt.

104 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Abbildung 6.4: Ausgang des MLPs fMLP in Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration f¨

ur die

Varianten V3, V9, V10, V11 und V12

Abbildung 6.5: Ausgang des MLPs fMLP in Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration f¨

ur die

Varianten V3, V9, V10, V11 und V12 (vergr¨

oßerte Darstellung f¨

ur Glucosebereich 0 g

L< cGlc <

6.7. Ergebnisse 105

Abbildung 6.6: Ausgang des MLPs fMLP in Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration f¨

ur die

Varianten V13, V14, V16 und V17

Abbildung 6.7: Ausgang des MLPs fMLP in Abh¨

angigkeit der Glucosekonzentration f¨

ur die

Varianten V13, V14, V16 und V17 (vergr¨

oßerte Darstellung f¨

ur Glucosebereich 0 g

L< cGlc <1g

106 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

6.8 ¨

Uberf¨

uhrung in eine mechanistische Kinetik

Mit den gewonnenen Erkenntnissen kann auf Grundlage der nichtparametrischen Kinetik

auch eine mechanistische Kinetik f¨

ur die GA-Bildung neu formuliert werden. Ausgangspunkt

ist wieder eine Luedeking-Piret-Kinetik, bei der die GA-Bildung sowohl mit dem Wachstum

als auch mit der Biomasse im Reaktor assoziiert wird.

Zus¨

atzlich wird ein dritter Kinetikanteil rGA,γ analog zu Gleichung 6.7 definiert, der bei

kleinen Glucosekonzentrationen aktiv ist und bei hohen Konzentrationen oder bei Abwe-

senheit von Glucose gegen Null strebt. F¨

ur die Formulierung dieses Zusammenhangs k¨

onnen

zahlreiche Funktionen eingesetzt werden. Die hier genutzte Variante basiert wieder auf einer

Monod-Kinetik mit Bezug auf Glucose und lautet folgendermaßen:

rGA,γ =γGA ·cGlc

KGlc +cGlc ·1−cGlc

KGlc +cGlc ·mX(6.9)

Der Verlauf entspricht wieder der in Abbildung 6.1 dargestellten Funktion, wobei der Kineti-

kanteil rGA,γ zus¨

atzlich mit der Biomasse und dem Faktor γGA skaliert wird. Das Maximum

der Funktion liegt bei einer Glucosekonzentration, die der Halbs¨

attigungskonstante KGlc ent-

spricht. Mit diesem zus¨

atzlichen Kinetikanteil wird die vierte Hypothese, nach der die Pro-

duktbildung bei einem Wachstum unterhalb der maximalen Wachstumsrate angeregt wird,

mit in die mechanistische Kinetik integriert. Mit einer gesonderten Halbs¨

attigungskonstante

als zus¨

atzlichem Freiheitsgrad f¨

ur die GA-Kinetik konnte keine weitere Verbesserung der er-

zielten Ergebnisse erreicht werden, so dass letztendlich trotz fehlender Identifizierbarkeit die

Monod-Konstante KGlc von der Wachstumsrate ¨

ubernommen wird.

Die gesamte, mechanistische Kinetik f¨

ur Produktion und Sekretion von GA lautet dement-

sprechend:

rGA =αGA ·rX+βGA ·mX+γGA ·cGlc

KGlc +cGlc ·1−cGlc

KGlc +cGlc ·mX(6.10)

Die neu identifizierten Parameter der modifizierten GA-Kinetik sind in Tabelle 6.4 auf-

gef¨

uhrt, wobei die Angabe von vier Nachkommastellen f¨

ur die Parameter ausschließlich zur

besseren Nachvollziehbarkeit aufgrund der h¨

oheren, numerischen Genauigkeit erfolgt. In An-

betracht der Messsituation sind die Parameter in der Realit¨

at nicht mit dieser Genauigkeit

bestimmbar.

Abbildung 6.8 zeigt die Anpassung der mechanistischen Kinetik f¨

ur alle Versuche inklusive

von Versuch F4, der f¨

ur die Kreuzvalidierung genutzt wird. Bei den Versuchen F2, F7 und F8

wird die GA-Bildung anfangs relativ gut und im sp¨

ateren Verlauf der Kultivierung nur noch

unzureichend beschrieben. Daf¨

ur weisen insbesondere bei Versuch F6 die simulierten und

gemessenen GA-Konzentrationen eine hohe ¨

Ubereinstimmung auf. Eine gute Beschreibung

6.8. ¨

Uberf¨

uhrung in eine mechanistische Kinetik 107

Tabelle 6.4: Parameter der hergeleiteten mechanistischen Kinetik

Parameter Wert Standardabweichung Einheit

αGA 0.3251 0.00877 µKat

βGA 0.0315 0.00118 µKat

g h

γGA 0.6291 0.00803 µKat

g h

f¨

ur den Versuch F6 ist besonders wichtig, da in diesem Versuch die Bildung und Sekretion

von GA am st¨

arksten induziert wird.

Die Anpassungsg¨

ute f¨

ur die mechanistische Kinetik liegt in einem ¨

ahnlichen Bereich wie

bei den nichtparametrischen Ans¨

atzen. Bei der Autovalidierung wird durchschnittlich pro

Versuch ein NRMSE von 58.38 % erreicht. F¨

ur den Versuch F6 liegt der NRMSE bei 88.68 %

und f¨

ur Versuch F4 bei 62.63 % (siehe auch Tabelle 6.5).

Abbildung 6.8: Simulierte und gemessene Verl¨

aufe der Glucoamylaseaktiv¨

at f¨

ur die Versuche F2

bis F10 f¨

ur das mechanistische Modell

In Tabelle 6.5 sind zum Vergleich der hergeleiteten mechanistischen Kinetik aus diesem

Abschnitt auch die NRMSE-Werte f¨

ur die Luedeking-Pirekt-Kinetik aus Kapitel 5.3.9 auf-

gef¨

uhrt. W¨

ahrend in der Autovalidierung beide Varianten einen nahezu gleichen NRMSE-

108 Kapitel 6. Hybride Modellierung der Glucoamylasebildung

Wert aufweisen, kann die neu hergeleitete Kinetik den Versuch F6 deutlich besser beschrei-

ben als die urspr¨

ungliche Luedeking-Piret-Kinetik.

Tabelle 6.5: NRMSE der Autovalidierung und der Versuche F4 und F6 f¨

ur die Luedeking-Piret-

Kinetik aus Abschnitt 5.3.9 und der angepassten Kinetik aus Abschnitt 6.8

Modell NRMSE [%]

Autovalidierung F6 F4

Angepasste Kinetik (Abschnitt 6.8) 58.38 88.68 62.63

Luedeking-Piret-Kinetik (Abschnitt 5.3.9) 57.70 21.91 49.59

Die mechanistische Kinetik erscheint somit in der Gesamtbetrachtung geeignet zu sein,

die GA-Bildung zu beschreiben, und stellt insbesondere gegen¨

uber der zuvor genutzten

Luedeking-Piret-Kinetik auch einen direkten Zusammenhang zur im Reaktor vorhandenen

Glucose her. Damit ist es m¨

oglich, Versuche zur Maximierung von GA durch Anpassung

des N¨

ahrstoffangebots zu planen.

6.9 Zusammenfassung und Diskussion

Mit der hybriden Modellbildung ist es m¨

oglich, die Glucoamylasebildung in Abh¨

angigkeit der

Glucosekonzentration im Medium zu beschreiben. Basierend auf dem hybriden Modellansatz

kann zudem eine mechanistische Kinetik f¨

ur die Produktbildung hergeleitet werden, die eine

vermutlich bessere Beschreibung liefert als der urspr¨

ungliche Ansatz mit einer einfachen

Luedeking-Piret-Kinetik.

Die G¨

ute der Anpassung einer hybriden Kinetik h¨

angt entscheidend von den Parametern

des MLPs ab. Da die Parameter in einem MLP keine biologische Bedeutung haben, erfordert

ein gutes Training der Parameter eine Vielzahl an Trainingsdurchl¨

aufen mit verschiedenen

Startparametern. F¨

ur die Wahl der Struktur der Kinetik, der Meta-Struktur des Netzes

sowie die Wahl der Eing¨

ange kann auf Grundlage der Ergebnisse keine allgemeing¨

ultige

Methodik angegeben werden. Zuk¨

unftige Arbeiten k¨

onnten das Vorgehen bei der hybriden

Modellbildung daher weiter verbessern und formalisieren.

Auch wenn sich im Fall der GA-Bildung ein Vortraining als nicht notwendig erwiesen hat,

ist grunds¨

atzlich in biotechnologischen Anwendung mit einem Mangel an Trainingsdaten zu

rechnen, so dass Methoden wie ein Vortraining dennoch das Training eines MLPs vereinfa-

chen k¨

onnen.

Da nur wenige Messdaten f¨

ur niedrige Glucosekonzentrationen zur Verf¨

ugung stehen, sind

weitere Versuche vor allem f¨

ur diesen Konzentrationsbereich notwendig, um die GA-Bildungs-

kinetik und das gesamte Modell weiter zu verbessern.

Kapitel 7

Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden

Modell f¨

ur A.niger

Im folgenden Kapitel soll die Anwendung des hybriden Modells f¨

ur die Prozessf¨

uhrung

untersucht werden. Daher wird das entwickelte strukturierte Modell mit der hybriden Pro-

duktbildungskinetik aus Variante V12 f¨

ur die Prozessf¨

uhrung von Fed-Batch-Kultivierungen

mit A.niger genutzt. Das Ziel der Prozessf¨

uhrung ist letztendlich die Maximierung der Pro-

duktausbeute von Glucoamylase durch eine optimierte Fahrweise des Prozesses.

In Fed-Batch-Kultivierungen treten dabei h¨

aufig Abweichungen vom geplanten Verlauf auf.

Bei den Kultivierungen mit A.niger unterliegt beispielsweise die Startbiomasse von Versuch

zu Versuch gr¨

oßeren Schwankungen. Wenn die tats¨

achliche Startbiomasse niedriger ist als

urspr¨

unglich geplant, kann es zu einer Akkumulation von Glucose im Reaktor kommen, wo-

durch die GA-Bildung nach der modellierten GA-Kinetik herabgesetzt wird. Um auf diese

St¨

orungen manuell oder durch eine nichtlineare, modellpr¨

adiktive Regelung (NMPC) reagie-

ren zu k¨

onnen, ist eine Sch¨

atzung der Modellzust¨

ande mit einem Zustandssch¨

atzverfahren,

wie einem SPKF, notwendig.

Im ersten Teil des Kapitels wird daher die M¨

oglichkeit, die Zust¨

ande mit einem SPKF

w¨

ahrend Fed-Batch-Kultivierungen zu sch¨

atzen, untersucht. Anschließend wird im zweiten

Teil eine Versuchsplanung und -durchf¨

uhrung mit dem Ziel der Produktmaximierung be-

schrieben und diskutiert.

7.1 Zustandssch¨

atzung

Die Zustandssch¨

atzung kombiniert die Modell- mit der Messinformation, so dass nicht ge-

messene Prozessgr¨

oßen online gesch¨

atzt werden k¨

onnen. Da die naßchemische Analytik dabei

mit einem erheblichen Zeitverzug verbunden ist, stehen f¨

ur die Zustandssch¨

atzung nur die

109

110 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

online gemessenen Messgr¨

oßen Gel¨

ostsauerstoff DOT, die CO2-Konzentration im Abgas so-

wie das Volumen der zugegebenen Base VBase zur Verf¨

ugung. Der Messvektor yonline lautet

demnach:

yonline = (VBase, DOT, CO2)T(7.1)

7.1.1 Beobachtbarkeit

Die ¨

Uberpr¨

ufung der Beobachtbarkeit mit der Toolbox Strike Goldd [18] ergibt, dass das

System mit der hybriden Kinetik aus Variante V12 als Ganzes global nicht beobachtbar ist.

So sind die GA-Aktivit¨

at AGA und die inaktive Biomasse mXin grunds¨

atzlich auf Basis der

Online-Messgr¨

oßen nicht beobachtbar. Dies ist zu erwarten, da sowohl die GA-Aktivit¨

at als

auch die inaktive Biomasse nicht gemessen werden und sich gleichzeitig auch nicht auf eine

der gemessenen Gr¨

oßen auswirken. Demnach kann bei einer falschen Anfangsaktivit¨

at von

GA bzw. einer falschen inaktiven Biomassenkonzentration im Fermenter oder bei Modellun-

sicherheiten keine Korrektur erfolgen.

Bei den ¨

ubrigen Zust¨

anden ist laut der ¨

Uberpr¨

ufung mit Strike Goldd zumindest eine lokale

Beobachtbarkeit um die Anfangsbedingung x0von Versuch F6 gegeben, wobei zu beachten

ist, dass bei der Berechnung der Beobachtbarkeitsmatrix mit Strike Goldd von konstanten

Eing¨

angen ausgegangen wird. Bei zeitlich-variierenden Eingangsgr¨

oßen oder stark abwei-

chenden Anfangsbedingungen k¨

onnte die lokale Beobachtbarkeit jedoch gegebenenfalls auch

nicht mehr vorliegen. Eine Aussage ¨

uber die globale Beobachtbarkeit ist allgemein nicht

m¨

oglich.

Obwohl somit streng genommen keine vollst¨

andige Beobachtbarkeit f¨

ur das gesamte Modell

vorliegt, kann das SPKF dennoch wertvolle Informationen ¨

uber den Verlauf der nicht online-

gemessenen Zust¨

ande insbesondere ¨

uber die Biomassenkonzentration cXliefern.

Um die Auswirkungen der Beobachtbarkeit auf die Ergebnisse der Zustandssch¨

atzung weiter

zu untersuchen, werden im n¨

achsten Abschnitt die Ergebnisse einer Zustandssch¨

atzung am

Beispiel von Versuch F6 diskutiert.

7.1.2 Ergebnisse

Die Auslegung des SPKFs orientiert sich an den Parameter- und Messunsicherheiten. Anstel-

le eines Zustandsrauschens werden also nur die Modellparameter als unsicher angenommen,

wobei die Parameterunsicherheit ¨

uber das Bootstrap-Verfahren bestimmt wird (siehe Tabel-

le 5.4). F¨

ur die Parameter des MLPs werden keine Unsicherheiten ber¨

ucksichtigt, um die

Anzahl der Sigmapunkte nicht zu groß werden zu lassen, und um numerische Probleme bei

der Zustandssch¨

atzung zu minimieren. Die Unsicherheitsbeschreibung des Messrauschens

7.1. Zustandssch¨

atzung 111

basiert auf den im Kapitel 3.5 ”Messunsicherheiten“ beschriebenen Unsicherheitsbetrach-

tungen. Der Auslegungsparameter des SPKFs wird mit h=√3 angenommen.

F¨

ur die Initialisierung der Kovarianzmatrix der Anfangssch¨

atzung P(t0) wird angenommen,

dass die Varianz der einzelnen Zust¨

ande ungef¨

ahr dem Quadrat von 5 % des identifizierten

Anfangswertes x0entspricht.

P(t0) = diag (0.05 ·x0)2(7.2)

Um die Auslegung des SPKFs zu ¨

uberpr¨

ufen, werden exemplarisch am Versuch F6 mehre-

re F¨

alle mit abweichenden Anfangsbedingungen f¨

ur Glucose und Biomasse untersucht. Im

nominellen, ungest¨

orten Fall startet das SPKF mit dem bekannten Anfangszustand. An-

schließend werden die Anfangszust¨

ande von Glucose und Biomasse auf jeweils 50 % bzw.

150 % des nominellen Wertes gesetzt. In Tabelle 7.1 sind die f¨

unf untersuchten F¨

alle auf-

gef¨

uhrt.

Tabelle 7.1: Untersuchte F¨

alle f¨

ur die Zustandssch¨

atzungen mit gest¨

orten Anfangsbedingungen

Fall Biomasse Glucose

SPKF1 mX,0mGlc,0

SPKF2 0.5·mX,0mGlc,0

SPKF3 1.5·mX,0mGlc,0

SPKF4 mX,00.5·mGlc,0

SPKF5 mX,01.5·mGlc,0

Abbildung 7.1 zeigt die Zustandssch¨

atzung und die reine Simulation ohne Korrektur durch

das SPKF mit den nominellen Anfangsbedingungen (SPKF1). Es werden nur die online-

gemessenen Messwerte f¨

ur die Zustandssch¨

atzung genutzt, wobei die zus¨

atzliche Darstel-

lung der Messungen aus der nasschemischen Analytik ausschließlich zur Bewertung der

Zustandssch¨

atzung dient.

Im nominellen Fall korrigiert die Zustandssch¨

atzung auf Basis der Online-Messwerte die ak-

tive Biomasse mXin der Anfangsphase der Kultivierung auf eine gegen¨

uber der Simulation

niedrigere Konzentration, wodurch auch die Substratverl¨

aufe im weiteren Verlauf angepasst

werden. Dies ist m¨

oglich, da die Online-Messwerte (CO2,PO2und die Basenzugabe VBase)

uber die Modellgleichungen an die Wachstumsgeschwindigkeit rXbzw. an die aktive Bio-

masse mXgekoppelt sind und somit eine Korrelation besteht. Im sp¨

ateren Verlauf weicht

die simulierte Biotrockenmassekonzentration cXjedoch signifikant von der gemessenen Bio-

trockenmasse ab, was auf die fehlende Kopplung der Inaktivierungs- und Lysevorg¨

ange mit

den Online-Messwerten zur¨

uckzuf¨

uhren ist.

Die Phosphatkonzentration weicht im sp¨

ateren Verlauf der Fermentation deutlich von der

gemessenen Konzentration ab und wird durch das SPKF nicht korrigiert. Demnach ist Phos-

112 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

phat in dem entsprechenden Konzentrationsbereich nicht lokal beobachtbar. Eine lokale

Beobachtbarkeit von Phosphat k¨

onnte gegebenenfalls w¨

ahrend einer Phosphatlimitierung

vorliegen, da sich in dem Fall die Phosphatkonzentration auf das Wachstum und somit indi-

rekt auf die Online-Messgr¨

oßen auswirkt. Insgesamt ist es aber unwahrscheinlich, dass eine

stark abweichende Anfangskonzentration von Phosphat durch das SPKF korrigiert werden

kann. F¨

ur Ammonium wird ein ¨

ahnliches Verhalten der Beobachtbarkeit wie bei Phosphat

erwartet.

In den Kultivierungen weist die Startbiomasse eine hohe Varianz auf, so dass eine sp¨

atere

NMPC den Verlauf der Substratzuf¨

utterung an die tats¨

achliche Biomasse anpassen k¨

onnen

sollte. Es stellt sich daher die Frage, ob die aktive Biomasse durch das SPKF auch in diesen

F¨

allen richtig gesch¨

atzt werden kann. In Abbildung 7.2 ist der Verlauf f¨

ur das SPKF und die

Simulation bei einer Startbiomasse von 50 % gegen¨

uber dem nominellen Wert dargestellt

(SPKF2). Der Fall SPKF3 mit einer h¨

oheren Startbiomasse ist im Anhang in Abbildung

A.3 abgebildet.

In beiden F¨

allen kann das SPKF den Verlauf der Biomasse und der Glucosekonzentration ge-

gen¨

uber einer reinen Simulation genauer pr¨

adizieren. Die aktive Biomasse wird wahrschein-

lich wie im nominellen Fall durch die Korrelation zwischen Online-Messgr¨

oßen und aktiver

Biomasse ¨

uber die Wachstumsgeschwindigkeit n¨

aher an den tats¨

achlichen Wert korrigiert.

In Folge des korrigierten Verlaufs f¨

ur die aktive Biomasse weist auch die Sch¨

atzung der Glu-

cosekonzentration eine h¨

ohere ¨

Ubereinstimmung mit den Messwerten auf. Bei der reinen

Simulation mit einer zu niedrigen Startbiomasse wird die Glucosekonzentration hingegen

unzureichend beschrieben, da mit einer geringeren Glucoseaufnahme zu rechnen ist.

In F¨

allen, bei denen der Anfangswert f¨

ur Glucose (SPKF4 und SPKF5) vom nominellen

Fall abweicht, verschlechtert sich die Vorhersage des SPKFs deutlich, obwohl der Verbrauch

von Glucose ¨

uber die Abgaskonzentration von CO2mit einer Online-Messgr¨

oße gekoppelt

ist. Der Fall SPKF5 ist in Abbildung 7.3 und der Fall SPKF4 in Abb. A.4 im Anhang

dargestellt. Bei Betrachtung der F¨

alle SPKF4 und SPKF5 f¨

allt auf, dass die Korrektur

der Glucosekonzentration durch das SPKF in beiden F¨

allen auf der Korrektur der aktiven

Biomasse zu niedrigeren Werten beruht. Der identifizierte Wert f¨

ur die auf Glucose bezoge-

ne Halbs¨

attigungskonstante KGlc der Wachstumsgeschwindigkeit rXzeigt zudem, dass sich

nur eine Glucosekonzentration nahe 0 g

Leinen Einfluss auf die Wachstumsgeschwindigkeit

und somit auf die Online-Messgr¨

oßen aus¨

ubt. Es kann also nur eine lokale Beobachtbarkeit

w¨

ahrend einer Kohlenstofflimitierung vorliegen.

Zusammenfassend kann also vor allem die aktive Biomasse zuverl¨

assig mit dem SPKF

gesch¨

atzt werden. Die Sch¨

atzung der aktiven Biomasse f¨

uhrt im Time Update des SPKFs

aber auch gleichzeitig dazu, dass die Verl¨

aufe von nicht beobachtbaren oder von nur lokal

beobachtbaren Zust¨

anden besser gesch¨

atzt werden k¨

onnen. So weist beispielsweise die GA-

7.1. Zustandssch¨

atzung 113

Aktivit¨

at im Fall SPKF2 und SPKF4 durch die Korrektur der aktiven Biomasse auch eine

h¨

ohere ¨

Ubereinstimmung mit den gemessenen Werten auf als die reine Simulation.

Die Zustandssch¨

atzung kann insgesamt nur verbessert werden, indem zus¨

atzliche Online-

Messgr¨

oßen genutzt werden. Ein vielversprechender Ansatz ist die Raman-Spektroskopie,

mit der voraussichtlich auch die Glucosekonzentration online gemessen werden kann. Den-

noch kann auch im vorliegenden Setting die Anwendung eines SPKF und einer NMPC

sinnvoll sein, da so eine optimierte Zuf¨

utterung auch bei einer abweichenden Startbiomasse

neu berechnet werden kann.

Abbildung 7.1: Fall SPKF1: Zustandssch¨

atzung (rot) und Simulation (blau) f¨

ur den Versuch

F6 im nominellen Fall

114 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

Abbildung 7.2: Fall SPKF2: Zustandssch¨

atzung (rot) und Simulation (blau) f¨

ur den Versuch

F6 mit einer geringeren Startbiomasse

7.1. Zustandssch¨

atzung 115

Abbildung 7.3: Fall SPKF5: Zustandssch¨

atzung (rot) und Simulation (blau) f¨

ur den Versuch

F6 mit einer h¨

oheren Startkonzentration f¨

ur Glucose

116 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

7.2 Trajektorienplanung

Im Laufe der Modellentwicklung werden mehrere Versuche ¨

uber eine Trajektorienplanung

oder mit einer Optimalen Versuchsplanung geplant, um beispielsweise die Unsicherheit der

Parameter des jeweiligen Modellstands zu verringern. Die durchgef¨

uhrten Planungen orien-

tieren sich dabei an die im Kapitel 2.3 ”Prozessf¨

uhrung“ beschriebene Vorgehensweise. In

diesem Kapitel soll speziell auf die Versuchsplanung zur Maximierung der Glucoamylase als

zentrales Ziel dieser Arbeit eingegangen werden. Die Planung basiert dabei wieder auf dem

hybriden Modell V12.

7.2.1 Planung

Die Planung f¨

ur den Versuch F11 zielt darauf ab, die volumenbezogene Aktivit¨

at von Glu-

coamylase aGA zum Versuchsende nach tend = 52 hzu maximieren. Das G¨

utefunktional Φ

f¨

ur die Trajektorienplanung kann daher folgendermaßen formuliert werden:

Φ = −aGA(tend).(7.3)

Die Freiheitsgrade f¨

ur die Optimierung sind die hinzugegebenen Volumenstr¨

ome von Glu-

cose uGlc,F eed, Ammonium uAm,F eed sowie Phosphat uP h,F eed, wobei die Zuf¨

utterung von

Ammonium und Phosphat vor allem eine Limitierung des jeweiligen Substrats verhindern

bzw. die Einhaltung der unten aufgef¨

uhrten Beschr¨

ankungen sicherstellen soll.

Bei der Optimierung gibt es mehrere Beschr¨

ankungen f¨

ur die Zustands-, Mess- und Stell-

gr¨

oßen, die im Einzelnen in Tabelle 7.2 aufgelistet sind. Die Feedstr¨

ome ui,F eed k¨

onnen

maximal mit 0.1L

hgepumpt werden. Des Weiteren soll das Volumen Vjederzeit zwischen

5 und 14 Lbetragen.

Tabelle 7.2: Beschr¨

ankungen f¨

ur die Mess- und Stellgr¨

oßen sowie f¨

ur die Zust¨

ande bei der Tra-

jektorienplanung f¨

ur Versuch F11

Variabel untere Grenze obere Grenze Einheit

cX0 25 g

cAm 0.7 2.5g

cP h 0.7 2.5g

cGlc 0 1 g

V5 14 L

uGlc,F eed 0 0.1L

uAm,F eed 0 0.1L

uP h,F eed 0 0.1L

Die Konzentration der Biotrockenmasse cXsoll maximal bei 25 g

Lliegen, um Stofftrans-

portprobleme zu vermeiden. Um eine m¨

ogliche Limitierung von Ammonium und Phosphat

7.2. Trajektorienplanung 117

zu verhindern, werden die unteren Grenzen von den jeweiligen Konzentrationen auf 0.7g

festgelegt, w¨

ahrend gleichzeitig die obere Grenze jeweils bei 2.5g

Lliegt.

Aus der Modellierung der GA-Kinetik ist bekannt, dass eine niedrige Glucosekonzentration

die Produktion und Sekretion von GA verst¨

arkt anregt. Da die Glucosemenge im Reaktor

nur durch das Wachstum und nicht von außen verringert werden kann, sollte eine Akkumu-

lation von Glucose im Reaktor vermieden werden. Der in der Biotechnologie h¨

aufig verfolgte

Ansatz, zun¨

achst die Biomasse zu maximieren und anschließend die Produktbildung zu in-

duzieren, scheint f¨

ur die GA-Bildung durch A.niger nicht erfolgsversprechend zu sein, da

nach der vierten Hypothese und den modellierten Kinetiken (vgl. Abb. 6.5) GA vor allem

bei einer Wachstumsrate gebildet wird, die kleiner als die maximale Wachstumsrate µmax

ist. Bei einem zu schnellen Wachstum kann ansonsten die gew¨

ahlte Beschr¨

ankung f¨

ur die

Biomasse die weitere Produktion von Glucoamylase limitieren. Als weitere Beschr¨

ankung

gilt daher, dass die Glucosekonzentration stets unter 1 g

Lliegen sollte.

Aus dieser Sicht scheint auch eine m¨

oglichst niedrige Glucosekonzentration zu Beginn des

Versuchs erstrebenswert. Eine niedrige Startkonzentration erlaubt dabei auch eine gr¨

oßere

Freiheit bei der Wahl der Verl¨

aufe f¨

ur die Glucosezuf¨

utterung durch den Optimierer, da so

unterschiedliche Zuf¨

utterungskonzepte, wie beispielsweise ein exponentielles Feeding, reali-

siert werden k¨

onnen. Der Vergleich der Versuche F8 und F10 mit dem Versuch F6, bei dem

wesentlich mehr GA gebildet wurde, zeigt zudem, dass eine hohe Anfangskonzentration von

Glucose eher mit einer geringeren GA-Ausbeute einhergeht.

Dies wird jedoch dadurch eingeschr¨

ankt, dass eine anf¨

angliche Kohlenstofflimitierung zu Be-

ginn der Kultivierung das weitere Wachstum durch die Inaktivierung stark abschw¨

achen und

den Verlauf des Versuchs negativ beeinflussen w¨

urde. Dies ist vor allem problematisch, da

die aktive, wachstumsf¨

ahige Startbiomasse von Versuch zu Versuch st¨

arkeren Schwankun-

gen unterliegt. Die Anfangsglucosekonzentration cGlc,0wird daher auf die obere Grenze von

Lgesetzt. Diese relativ niedrige Anfangskonzentration stellt eine ausreichende Glucosever-

sorgung auch bei einer schwankenden Startbiomasse sicher und verhindert eine anf¨

angliche

Kohlenstofflimitierung.

Als weitere Einschr¨

ankung wird die gesamte w¨

ahrend der Kultivierung zugef¨

utterte Glu-

cosemenge auf 450 gbeschr¨

ankt. Dies entspricht in etwa der durchschnittlichen Glucose-

menge aller bisherigen Versuche. Letztendlich soll hiermit eine bessere Vergleichbarkeit aller

Versuche erm¨

oglicht werden, um die modellierte GA-Kinetik evaluieren zu k¨

onnen. Die Be-

grenzung der Gesamtmenge an Glucose im Reaktor verhindert dar¨

uber hinaus neben der

Begrenzung der Biomasse in der Planung auch ein unkontrolliertes Wachstum und damit

einhergehende Transportprobleme bei Modellunsicherheiten. Es gilt daher die Nebenbedin-

118 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

gung:

450 g

L·Ztend

uGlc,F eed(t)dt ≤450g(7.4)

F¨

ur die Anfangsbedingung der aktiven Biomasse wird ein Wert von 0.7gangenommen, der

der durchschnittlichen Startbiomasse der bisherigen Versuche entspricht. Die Anfangskon-

zentrationen von Ammonium und Phosphat betragen dabei 2.5g

Lbzw. 1.83 g

Das Ergebnis der Trajektorienplanung ist in Abbildung 7.4 in rot dargestellt. Das Profil der

Glucosezuf¨

utterung steigt bis zur Kultivierungszeit 36 hexponentiell an, um ein schnelles

Wachstum der Biomasse zu erm¨

oglichen. Anschließend wird eine geringe, nahezu konstante

Glucosemenge zugef¨

uhrt, mit der haupts¨

achlich die Erhaltung und ein leichtes Wachstum

erreicht werden soll. In der Planung liegt die Glucosekonzentration nach Verbrauch der An-

fangsglucose konstant bei Werten nahe 0, wodurch auf Grundlage des hergeleiteten Modells

die GA-Bildung induziert wird. Da die Phosphat- und Ammoniumkonzentrationen laut der

Planung lediglich nicht unter die Grenze von 0.7g

Lfallen sollen, ist ein zus¨

atzliches Feeding

von Phosphat und Ammonium w¨

ahrend der Kultivierung durch die Trajektorienplanung

nicht vorgesehen.

Die Messdaten f¨

ur den Versuch sind ebenfalls in Abbildung 7.4 mit schwarzen Kreisen

dargestellt. Der CO2-Sensor f¨

ur die Abgaskonzentration ist in dem Versuch ausgefallen, so

dass f¨

ur F11 keine Messwerte f¨

ur die CO2-Abgaskonzentration vorliegen.

Die Messdaten f¨

ur die Biotrockenmassenkonzentration cX, der Konzentrationen von Am-

monium cAm und Phosphat cP h sowie das Basenvolumen VBase und der DOT-Wert weisen

eine hohe ¨

Ubereinstimmung mit dem geplanten Verlauf auf. Bei der Glucosekonzentration

cGlc kommt es zu Beginn des Versuchs zu einer etwas gr¨

oßeren Abweichung vom geplanten

Verlauf, wobei die genaue Ursache nicht eingegrenzt werden konnte. Zum Beispiel w¨

are es

m¨

oglich, dass der Dampfausgleich nach dem Autoklavieren der Glucosel¨

osung nicht ausrei-

chend erfolgte oder aber Einwaagefehler beim Ansetzen der L¨

osung auftraten.

Die gemessene volumenspezifische Aktivit¨

at aGA liegt mit 30.75 µKat

Ldeutlich unter der durch

das Modell pr¨

adizierten Aktivit¨

at von 63.82 µKat

L. Allerdings weist Versuch F11 im Vergleich

aller durchgef¨

uhrten Versuche (siehe Tabelle 6.1) die zweith¨

ochste, gemessene Aktivit¨

at auf.

Das Verh¨

altnis zwischen maximaler Aktivit¨

at und Biomasse AGA,max

mX,GA,max ist mit 1.93 µKat

vergleichsweise hoch.

7.2.2 Diskussion und Ausblick

Trotz der erzielten Aktivit¨

at aGA von 30.75 µKat

Lverlief die Maximierung der GA mit dem

Versuch F11 damit nicht erfolgreich. Bei Betrachtung der Versuchsplanung f¨

allt auf, dass

nach der exponentiellen Wachstumsphase durch das Modell ein weiteres, leichtes Wachstum

unterhalb der maximalen Wachstumsrate µmax vorhergesagt wird. Im Versuch ist dagegen

7.2. Trajektorienplanung 119

Abbildung 7.4: Geplante Trajektorie (rote Linie) und tats¨

achlicher Verlauf (schwarze Kreise)

f¨

ur den Versuch F11, bei dem die volumenspezifische GA-Aktivit¨

at maximiert werden soll. Die

Planung basiert auf dem hybriden Modell V12.

eine leichte Abnahme der Biomassenkonzentration erkennbar, so dass die zugef¨

uhrte Gluco-

semenge nicht f¨

ur die Erhaltung und ein weiteres Wachstum ausreicht. Infolgedessen weicht

wahrscheinlich auch die gemessene GA-Aktivit¨

at nach der Wachstumsphase vom geplanten

Verlauf ab.

120 Kapitel 7. Prozessf¨

uhrung mit einem hybriden Modell f¨

ur A.niger

Da zur Parameteridentifikation und beim Trainieren des MLPs nur wenige Trainingsdaten

mit einer Glucosekonzentration nahe Null zur Verf¨

ugung stehen, sind die Vorhersagen des

Modells auch mit einer Unsicherheit behaftet. Um die Pr¨

adiktion zuk¨

unftig weiter zu verbes-

sern, sind weitere Versuche mit einer geringen Glucosekonzentration und eine anschließende

Parameteridentifikation notwendig.

Der Vergleich der hybriden Herangehensweise von Variante V12 mit der mechanistischen

Kinetik aus Kapitel 6.8 ist in Abbildung 7.5 dargestellt. Diese zeigt die simulierten Verl¨

aufe

beider Modelle, wobei die Anfangskonzentration von Glucose in der Simulation auf den ge-

messenen Wert gesetzt wird. Da beide Modelle sich nur in der GA-Kinetik unterscheiden,

liegen die Verl¨

aufe außer f¨

ur die GA-Aktivit¨

at ¨

ubereinander. Bei der GA-Bildung beschreibt

die Kinetik bei Variante V12 die GA-Bildung w¨

ahrend der exponentiellen Wachstumsphase

besser als der mechanistische Ansatz, w¨

ahrend es im weiteren Verlauf aufgrund der oben

genannten Gr¨

unde zu einer ¨

Ubersch¨

atzung der GA-Bildung kommt. Zwar weicht die GA-

Aktivit¨

at bei der mechanistischen Kinetik w¨

ahrend der exponentiellen Phase von den gemes-

senen Werten ab, jedoch weist der simulierte Verlauf ¨

uber die gesamte Kultivierungsdauer

eine relative hohe ¨

Ubereinstimmung mit der gemessenen Aktivit¨

at auf. Die aus der hybriden

Kinetik hergeleitete mechanistische Kinetik liefert demnach eine realistischere Vorhersage

als der hybride Ansatz und ist damit geeigneter f¨

ur die Versuchsplanung als der hybride

Ansatz.

7.2. Trajektorienplanung 121

Abbildung 7.5: Simulierte Verl¨

aufe f¨

ur Variante V12 (blaue Linie) und f¨

ur die mechanistische

Kinetik (rote Linie) sowie Messdaten f¨

ur den Versuch F11 (schwarze Kreise).

Kapitel 8

Zusammenfassung und Ausblick

8.1 Zusammenfassung

In dieser Arbeit konnten erfolgreich mehrere hybride Modellierungsans¨

atze f¨

ur Fed-Batch-

Kultivierungen mit A.niger demonstriert werden, wobei die Modellbildung die Grundlage

f¨

ur zuk¨

unftige Anwendungen in der Prozessf¨

uhrung darstellt.

F¨

ur die Modellbildung wurde zuerst ein datenbasierter, hybrider Ansatz gew¨

ahlt, bei dem

im ersten Schritt ¨

uber eine Singul¨

arwertzerlegung eine st¨

ochiometrische Matrix gesch¨

atzt

wurde. Anschließend konnten aus den Messwerten mit der gesch¨

atzten St¨

ochiometrie re-

aktionsvariante Zust¨

ande berechnet werden, mit denen die Parameter der Kinetiken ohne

L¨

osen des zugrundeliegenden Differentialgleichungssystems angepasst worden sind. Die Ki-

netiken bestanden dabei aus einem mechanistischen Anteil und einem Neuronalen Netz f¨

die unbekannten Kinetikanteile.

Die hybride Modellbildung erfolgte iterativ, so wurde im ersten Modell nur die Wachstums-

rate betrachtet. Da die experimentellen Daten f¨

ur die Glucoamylaseaktivit¨

at jedoch nur

unzureichend mit nur einer Kinetik beschrieben werden konnten, wurde ein zweites Mo-

dell mit einer weiteren Kinetik f¨

ur die Produktbildung hergeleitet. In einem letzten Schritt

wurden die Parameter des zweiten Modells zus¨

atzlich in einer klassischen Parameteridentifi-

kation an die vorhandenen Messwerte angepasst. Aus der hybriden Modellbildung l¨

asst sich

also folgern, dass die Bildung von Glucoamylase auch unabh¨

angig vom Wachstum stattfin-

det.

Der hybride Modellansatz f¨

uhrte zu einer deutlich schnelleren Modellbildung als eine tiefer-

gehende biologisch motivierte Modellierung und hilft durch Offenlegung von Zusammen-

h¨

angen zwischen den Einflussgr¨

oßen auch bei der Entwicklung bzw. ¨

Uberf¨

uhrung der hybri-

den Kinetik in eine mechanistische Form. Als Nachtteil erweist sich jedoch, dass bei der vor-

122

8.1. Zusammenfassung 123

gestellten Methode nur Messgr¨

oßen als Zustandsgr¨

oßen in das Modell aufgenommen werden

k¨

onnen, so dass nicht messtechnisch erfasste Gr¨

oßen, wie beispielsweise Substratspeicher,

nicht als Zust¨

ande modelliert werden k¨

onnen.

Da die Modelltiefe des hybriden Modells noch nicht f¨

ur die Planung von Versuchen zur Ma-

ximierung der Produktausbeute ausreichte, wurde anschließend ein strukturiertes, biologisch

motiviertes Modell f¨

ur A.niger aufgestellt. Dieses Modell beinhaltet zus¨

atzlich die Online-

Messgr¨

oßen VBase, DOT, CO2, wodurch es sich auch f¨

ur die Online-Zustandssch¨

atzung

eignet. Aus weiteren Versuchen ging dar¨

uber hinaus auch die Existenz von endogenen Spei-

chern f¨

ur Ammonium, Phosphat und Kohlenstoff hervor, die in das Modell integriert wurden.

Als ersten Ansatz f¨

ur die Glucoamylasebildung wurde eine Luedeking-Piret-Kinetik gew¨

ahlt.

Das entwickelte, mechanistische Modell ist dabei in der Lage, die Messdaten mit Ausnahme

der Glucoamylaseaktivit¨

at zufriedenstellend bis gut zu beschreiben.

Um die Bildung und Sekretion von Glucoamylase besser vorhersagen zu k¨

onnen, wurde

anschließend die Kinetik f¨

ur die Produktbildung durch einen hybriden Ansatz mit einem

k¨

unstlichen neuronalen Netz modelliert. Dabei konnte f¨

ur die GA-Bildung ein Zusammen-

hang mit der Glucosekonzentration aufgezeigt werden. Damit wird die Arbeitshypothese,

dass durch Beeinflussung der Glucosekonzentration im Reaktor die Produktausbeute von

GA erh¨

oht werden kann, best¨

atigt.

Die mit einer Trajektorienplanung versuchte Maximierung der Glucoamylaseaktivit¨

at erziel-

te im Experiment eine geringere volumenspezifische Aktivit¨

at als vom Modell vorhergesagt

wurde. Dennoch konnte in dem Versuch die Glucoamylaseaktivit¨

at durch eine Optimierung

der Substratzuf¨

uhrung erh¨

oht werden. Dies unterstreicht abermals, dass die Anwendung

von regelungstechnischen Methoden in der Biotechnologie sinnvoll ist. Zudem erscheint es

prinzipiell m¨

oglich, die GA-Aktivit¨

at durch eine Versuchsplanung zu maximieren. Daf¨

w¨

aren jedoch weitere Versuchsdaten bei geringen Glucosekonzentrationen und ein erneutes

Training des k¨

unstlichen neuronalen Netzes notwendig.

Auf Grundlage des strukturierten, hybriden Modells und der Online-Messgr¨

oßen konnte eine

Zustandssch¨

atzung mit einem Sigmapunkt-Kalman-Filter durchgef¨

uhrt werden. W¨

ahrend

die Glucoamylaseaktivit¨

at dabei nicht mal lokal beobachtbar ist, kann zumindest in der

Anfangsphase einer Kultivierung die aktive Biomasse anhand der Online-Messgr¨

oßen kor-

rigiert werden. Die Zustandssch¨

atzung durch das SPKF gleicht daher einer Simulation mit

korrigierter aktiver Biomasse, wodurch auch die Verl¨

aufe der Substrate bzw. der nicht-

beobachteten Zust¨

ande gegen¨

uber einer reinen Simulation durch das SPKF besser wieder-

gegeben werden k¨

onnen. Zwar liegt somit f¨

ur das System aus systemtheoretischer Sicht

keine vollst¨

andige Beobachtbarkeit vor, aber die zumindest eingeschr¨

ankte Anwendung von

modellbasierten Regelungsmethoden auf Grundlage des hergeleiteten Modells ist dennoch

m¨

oglich.

124 Kapitel 8. Zusammenfassung und Ausblick

8.2 Ausblick und Ans¨

atze f¨

ur weitere Arbeiten

Die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse bieten ein großes Potential f¨

ur zuk¨

unftige For-

schungsvorhaben und k¨

onnen als Ausgangspunkt f¨

ur weitere Arbeiten dienen.

Die ¨

Ubertragbarkeit der in Kapitel 2.2 vorgestellten Methode zur hybriden Modellbildung

auf Kultivierungen mit anderen Organismen ist prinzipiell gegeben und kann in weiteren

Arbeiten als Grundlage f¨

ur ein initiales Modell dienen. Die einzelnen Schritte der Methode,

wie die Sch¨

atzung der St¨

ochiometrie, k¨

onnen dabei erweitert werden. Auch bietet die hybri-

de Beschreibung und das Training der Kinetiken eine Vielzahl m¨

oglicher Varianten an, so

k¨

onnten beispielsweise auch rekurrente neuronale Netze oder Radial-Basis-Funktionen f¨

unbekannte Kinetikanteile genutzt werden. Die Idee der hybriden Modellbildung ist l¨

angst

nicht ausgereizt und liefert ein vielversprechendes Potential f¨

ur zuk¨

unftige Forschungsvor-

haben.

Das entwickelte mechanistische Modell vernachl¨

assigt bisher den Einfluss der Morphologie

auf das Wachstum und die Glucoamylasebildung. Hier k¨

onnten zuk¨

unftig Erweiterungen in

das Modell integriert werden, die auch ein pelletf¨

ormiges Wachstum oder die Bildung an-

derer Produkte beschreiben. Des Weiteren w¨

are es denkbar, die Speicher von Ammonium,

Phosphat und Kohlenstoff differenzierter zu betrachten, wobei dies je nach Differenzierungs-

grad auch eine deutlich aufw¨

andigere Analytik erfordert.

Die Unsicherheiten der Modellstruktur und der Modellparameter sollten dar¨

uber hinaus

durch weitere informative Versuche verringert werden. Insbesondere sind Versuche bei einer

niedrigeren Glucosekonzentration notwendig, um die Ergebnisse f¨

ur die GA-Bildungskinetik

zu verbessern. Außerdem kann die optimale Versuchsplanung genutzt werden, um die Mo-

dellparameter des letzten Modellstands besser zu identifizieren.

Weiterer Forschungsbedarf besteht auch beim Einsatz von spektroskopischen Messmetho-

den f¨

ur Kultivierungen mit A.niger. Die Raman-Spektroskopie ist eine vielversprechende

Alternative bzw. Erg¨

anzung zur NIR-Spektroskopie, mit der m¨

oglicherweise auch die Sub-

stratkonzentrationen online gemessen werden k¨

onnen. Insbesondere die Online-Messung der

Substrate, vor allem von Glucose, w¨

urde eine Prozessf¨

uhrung der Kultivierungen mit A.niger

deutlich erleichtern, da so fr¨

uhzeitig mit einem Zustandssch¨

atzverfahren Abweichungen vom

geplanten Verlauf der Fermentation detektiert werden k¨

onnen und entsprechend manuell

oder durch eine Regelung auf diese St¨

orung reagiert werden kann.

Die Prozessf¨

uhrung konnte in dieser Arbeit nur angeschnitten werden. In Zukunft kann auf

Grundlage des Modells und einer eventuellen Anwendung der Raman-Spektroskopie sowohl

eine elaborierte Zustandssch¨

atzung mit dem bereits beschriebenen Sigmapunkt-Kalman-

Filter oder anderen Sch¨

atzverfahren als auch der Einsatz nichtlinearer modellpr¨

adiktiver

Regelungsans¨

atze erfolgen. Insbesondere die Anwendung von Online-Optimierungsverfahren

8.2. Ausblick und Ans¨

atze f¨

ur weitere Arbeiten 125

wie der NMPC erlaubt es auf St¨

orungen des Prozesses, wie zum Beispiel eine stark abwei-

chende Startbiomasse, noch w¨

ahrend des Prozesses zu reagieren. Robuste Verfahren zur

modellpr¨

adiktiven Regelung, wie das durch Lucia beschriebene Multi-stage NMPC [89],

k¨

onnen dar¨

uber hinaus auch Modellunsicherheiten ber¨

ucksichtigen.

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Anhang A

A.1 Vorversuche

134

A.1. Vorversuche 135

Tabelle A.1: ¨

Ubersicht ¨

uber die Vorversuche im 2-L-Fermenter

Kultivierung Dauer Volumen R¨

uhrerdrehzahl Vorkultur pH-Wert cX,max aGA,max

h L rpm g

µKat

VF1 72 1 350 nein 6 − −

VF2 72 1 750 nein 6 4.47 16.82

VF3 47 1.5 1000 nein 6 0.8 3.77

VF4 51 1.5 1000 ja 5 10.76 9.86

VF5 48 1.5 1000 ja 3 4.69 −

VF6 42 1.5 1000 ja 5 17.38 6.85

VF7 46 1.7 1000 ja 5 16.38 4.41

136 Anhang A. Anhang

Tabelle A.2: ¨

Ubersicht ¨

uber die Vorversuche im Sch¨

uttelkolben

Bezeichnung Dauer Einbauten Kohlenstoffquelle Sch¨

utteldrehzahl pH-Wert pH-Wert cX,max

bei t0bei tend

h rpm g

G1 71.3 - Glucose 90 6 2.01 4.8

M1 71.3 - Matlose 90 6 2.32 3.11

G2.1 72.1 Spirale Glucose 120 6 1.45 11.16

G2.2 72.1 Spirale Glucose 120 6 1.39 12.26

M2.1 72.1 Spirale Maltose 120 6 1.34 11.1

M2.2 72.1 Spirale Maltose 120 6 1.4 10.7

G3.1 72.25 Spirale Glucose 150 6 1.39 12.92

G3.2 72.25 Spirale Glucose 150 6 1.38 11.72

M3.1 72.25 Spirale Maltose 150 6 1.5 10.17

M3.2 72.25 Spirale Maltose 150 6 1.48 9.85

G4.1 23.5 Spirale, Schikane Glucose 120 5 2.78 1.5

G4.2 23.5 Spirale, Schikane Glucose 120 6 3.12 1.24

G4.3 23.5 Spirale Glucose 120 5 2.87 1.32

G4.4 23.5 Spirale Glucose 120 6 3.45 0.86

A.2. Unsicherheitsbestimmungen 137

A.2 Unsicherheitsbestimmungen

Tabelle A.3: Unsicherheitsbestimmung f¨

ur die Biomasse

Fermentation F2 F2 F2 F3 F3 F3

Probe 7 11 17 3 8 12

Messung 1 1.66 11.38 11.67 0.48 2.94 14.31 g

Messung 2 1.55 11.23 11.38 0.41 2.93 12.78 g

Messung 3 1.71 11.49 12.64 0.64 3.12 13.70 g

Messung 4 1.59 10.8 12.84 0.36 3.05 13.73 g

Messung 5 1.69 9.88 −0.43 2.98 13.56 g

Mittelwert 1.64 10.96 12.13 0.46 3.00 13.61 g

Standardabweichung 0.07 0.66 0.72 0.11 0.08 0.55 g

Tabelle A.4: Unsicherheitsbestimmung f¨

ur die Ammoniummessung

Fermentation F2 F2 F2 F3 F3 F3

Probe 2 10 16 2 10 15

Messung 1 2.61 1.80 1.23 2.68 1.84 0.71 g

Messung 2 2.64 1.84 1.19 2.74 1.88 0.71 g

Messung 3 2.68 1.86 1.16 2.80 1.87 0.73 g

Messung 4 2.71 1.85 1.17 2.75 1.94 0.75 g

Messung 5 2.68 1.78 1.18 2.76 1.66 0.71 g

Mittelwert 2.66 1.83 1.19 2.74 1.84 0.72 g

Standardabweichung 0.04 0.03 0.03 0.04 0.10 0.02 g

Tabelle A.5: Unsicherheitsbestimmung f¨

ur die Phosphatmessung

Fermentation F2 F2 F2 F3 F3 F3

Probe 2 10 16 2 10 15

Messung 1 1.85 1.28 1.14 2.01 1.49 1.05 g

Messung 2 1.85 1.32 1.22 2.01 1.52 1.02 g

Messung 3 1.85 1.27 1.25 1.95 1.52 1.15 g

Messung 4 1.84 1.24 1.19 1.96 1.57 1.08 g

Messung 5 1.85 1.38 1.21 2.00 1.55 1.09 g

Mittelwert 1.85 1.30 1.20 1.99 1.53 1.08 g

Standardabweichung 0.01 0.05 0.04 0.03 0.03 0.05 g

138 Anhang A. Anhang

Tabelle A.6: Unsicherheitsbestimmung f¨

ur die Glucosemessung

Fermentation F2 F2 F2 F3 F3 F3

Probe 2 10 16 2 10 15

Messung 1 27.73 11.32 0.00 12.35 5.30 0.01 g

Messung 2 29.61 11.42 0.00 12.35 5.30 0.00 g

Messung 3 29.35 11.32 0.00 12.15 5.23 0.01 g

Messung 4 29.43 11.39 0.00 12.13 5.50 0.01 g

Messung 5 −11.24 0.00 12.08 5.27 0.01 g

Mittelwert 29.46 11.34 0.00 12.18 5.32 0.01 g

Standardabweichung 0.13 0.07 0.00 0.12 0.10 0.00 g

Tabelle A.7: Unsicherheitsbestimmung f¨

ur die Glucoamylaseaktivit¨

Fermentation F2 F2 F2 F3 F3 F3

Probe 2 10 16 2 10 15

Messung 1 0.00 2.92 16.08 0.00 4.41 11.72 µKat

Messung 2 0.00 2.73 16.10 0.12 3.59 12.03 µKat

Messung 3 0.00 2.82 16.40 0.15 4.15 9.94 µKat

Messung 4 0.00 2.63 15.79 0.14 3.97 12.21 µKat

Messung 5 0.07 2.86 16.11 0.15 2.96 12.64 µKat

Mittelwert 0.01 2.79 16.10 0.11 3.82 11.71 µKat

Standardabweichung 0.03 0.11 0.21 0.06 0.56 1.04 µKat

A.2. Unsicherheitsbestimmungen 139

Abbildung A.1: Standardabweichungen f¨

ur die Biomassen-, Ammonium-, Phosphat- und Gluco-

sekonzentration sowie f¨

ur die Glucoamylaseaktivit¨

at in Abh¨

angigkeit des jeweiligen Messwerts.

140 Anhang A. Anhang

A.3 Versuch F2

Abbildung A.2: F2: Messdaten (schwarze Kreise) und Simulation (rot)

A.4. Zustandssch¨

atzung 141

A.4 Zustandssch¨

atzung

Abbildung A.3: Fall SPKF3: Zustandssch¨

atzung (rot) und Simulation (blau) f¨

ur den Versuch

F6 mit einer h¨

oheren Startkonzentration f¨

ur die aktive Biomasse

142 Anhang A. Anhang

Abbildung A.4: Fall SPKF4: Zustandssch¨

atzung (rot) und Simulation (blau) f¨

ur den Versuch

F6 mit einer niedrigeren Startkonzentration f¨

ur Glucose