Funktion, Modifikation und Anwendung von O2-toleranten,
NAD(P)+-reduzierenden [NiFe]-Hydrogenasen
Vorgelegt von
Dipl. Biol. (t.o.)
Janina Preissler
geb. in Siegen
von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
Dr. rer. nat.
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Martin Lerch
Gutachter: Prof. Dr. Peter Hildebrandt
Gutachterin: Prof. Dr. Silke Leimkühler
Gutachter: Dr. Oliver Lenz
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 12. Juli 2018
Berlin 2018
I
Zusammenfassung
Lösliche, NAD(P)+-abhängige [NiFe]-Hydrogenasen („Soluble Hydrogenase“, SH)
katalysieren die reversible Spaltung von H2 in jeweils zwei Elektronen und Protonen sowie die
damit gekoppelte Reduktion des Pyridinnukleotid-Kofaktors. Die beiden Reaktionen erfolgen
in zwei unterschiedlichen Modulen, dem Hydrogenasemodul HoxHY, das das H2-spaltende
aktive [NiFe]-Zentrum trägt, und dem flavinhaltigen NAD+-Reduktasemodul HoxFU. Die
beiden aktiven Zentren sind über eine Reihe von [FeS]-Zentren elektronisch verbunden. Neben
dem H2-Oxidierer Ralstonia eutropha H16 besitzen auch andere Knallgasbakterien wie
Rhodococcus opacus und Hydrogenophilus thermoluteolus NAD+-abhängige Hydrogenasen,
die aufgrund ihrer ungewöhnlichen Sauerstofftoleranz von besonderem Interesse sind. Für die
SH aus Ralstonia eutropha (ReSH) wurde gezeigt, dass sie biotechnologisch für die H2-
getriebene Regeneration von NADH eingesetzt werden kann. Allerdings ist die ReSH
hochspezifisch für NAD+, während das phosphorylierte Derivat NADP+ nur in Spuren
umgesetzt wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde das Substratspektrum der ReSH mithilfe
gezielter Mutagenese auf NADP+ erweitert, was zu einer 240-fachen Erhöhung der
katalytischen Effizienz für das neue Substrat führte. Die SH-Varianten mit synthetischer
NADP+-Reduktionsaktivität wurden eingehend biochemisch und elektrochemisch
charakterisiert und ihre Funktionalität in gekoppelten Enzymreaktionen gezeigt.
Für die biotechnologische Anwendung der SH sind neben der Substratspezifität noch weitere
Eigenschaften wie Thermostabilität und Salztoleranz von Bedeutung. Die heterologe
Produktion der SH aus dem thermophilen Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus
(HtSH) in Ralstonia eutropha und die anschließende Reinigung ermöglichte erstmals
eingehende biochemische und spektroskopische Untersuchungen dieser Hydrogenase mit
besonderer Thermostabilität. Dabei zeigte sich im Vergleich zur ReSH ein höheres
Temperaturoptimum von 80 °C und ein niedrigerer optimaler pH-Wert von 6.5.
Infrarotspektroskopische Untersuchungen ergaben, dass auch die Streckschwingungen der für
[NiFe]-Hydrogenasen typischen CN-- und CO-Liganden des aktiven Zentrums von denen der
ReSH abweichen, was auf alternative Strukturen und/oder Redox-Zustände des aktiven
Zentrums hindeutet.
Im Falle der HtSH und der SH aus Rhodococcus opacus wurden Ähnlichkeiten hinsichtlich
ihrer Reaktivität aufgedeckt. Im Gegensatz zur ReSH zeigten beide Enzyme nur in
Anwesenheit von zweiwertigen Kationen wie Ni2+ und Mg2+ im Reaktionsansatz die typische
H2-abhängige Reduktion von NAD+. Diese Kationen-Abhängigkeit wurde mit in dieser Arbeit
konstruierten SH-Hybriden näher untersucht. Hierfür wurden die Hydrogenase- bzw. NAD+-
Reduktase-Module von H. thermoluteolus und R. opacus heterolog in ∆hoxH- bzw. ∆hoxFU-
Deletionsstämmen von R. eutropha produziert und durch die jeweiligen R. eutropha-eigenen
Module zur vollständigen, chimären SH komplementiert. Durch diese Strategie konnte die
Abhängigkeit für die zweiwertigen Ni2+- und Mg2+-Ionen eindeutig den Hydrogenasemodulen
von H. thermoluteolus und R. opacus zugeordnet werden. Hybride, die das
Hydrogenasemodule aus R. eutropha trugen zeigten H2-getriebene NAD+-Reduktaseaktivität
auch ohne Zugabe dieser Kationen. Mit Ausnahme der SH-Variante aus HtHydrogenase und
II
ReNAD+-Reduktase sind alle SH-Chimären in der Lage, autotrophes Wachstum von R.
eutropha in einer Atmosphäre aus H2, O2 und CO2 zu vermitteln. Die Funktionalität dieser
Hybridtechnik ermöglicht die Anpassung der biochemischen Eigenschaften entsprechend der
gewünschten Reaktionsbedingung durch geeignete Modulkombination. Beispielsweise kann
die im Vergleich zur ReSH höhere NAD+-Affinität der RoNAD+-Reduktase mit der aktiveren
ReHydrogenase kombiniert werden, sodass ein SH-Hybrid entsteht, das im Gegensatz zur
RoSH nicht abhängig von Kationen ist.
Summary
Soluble, NAD(P)-dependent hydrogenases (SHs) catalyse the reversible splitting of H2 into
two electrons and two protons followed by the reduction of the pyridine nucleotide cofactor.
The two reactions take place in two different enzyme modules. The hydrogenase module
consists of the subunits HoxHY and contains the active [NiFe]-center. The NAD+ reductase
module comprised of HoxFU harbours a flavin close to the active site. A chain of [FeS] clusters
electronically links both catalytic centers. Apart from the aerobic H2 oxidizer Ralstonia
eutropha H16, there are further Knallgasbacteria such as Rhodococcus opacus and
Hydrogenophilus thermoluteolus that possess SHs with extraordinary O2 tolerance, a very
appealing feature for biotechnological applications. It has been shown that the SH from
R. eutropha is well applicable for H2-driven cofactor recycling. While highly specific towards
NAD+, its reactivity with NADP+ is very low. As a part of this work, the substrate spectrum of
the ReSH was extended to NADP+ by rational mutagenesis resulting in a 240-fold higher
catalytic efficiency for the new substrate. The SH variants with synthetic NADP+-reducing
activity were characterized biochemically and electrochemically, and their functionality was
challenged in coupled enzyme reactions.
Apart from substrate specificity, improved thermostability and, e.g., salt tolerance is crucial for
biotechnological application of SH. The thermophilic organism Hydrogenophilus
thermoluteolus contains an SH (HtSH) with remarkable activity and stability at high
temperatures. The HtSH was heterologously produced in R. eutropha, which enabled the first
comprehensive enzymatic and spectroscopic study of this particular hydrogenase. In contrast
to ReSH, the HtSH showed highest H2-dependent NAD+-reduction activity at 80°C and at
pH 6.5. Infrared spectroscopic measurements revealed unusual vibrational stretching
frequencies for the typical CO and CN- ligands of the H2-activating catalytic center, which
differ from those known for ReSH. This indicates partially different structures/redox states of
the active site.
In case of the SHs from H. thermoluteolus and Rhodococcus opacus the H2-driven NAD+-
reducing activity was found to depend strongly on the presence of divalent cations such as Ni2+
and Mg2+ in the enzyme assay. To obtain insight into this cation dependence, SH chimeras with
mixed compositions of NAD+ reductase (HoxFU) and hydrogenase (HoxHY) modules of
R. eutropha, R. opacus, and H. thermoluteolus were constructed. It turned out that the variants
containing hydrogenase modules from either H. thermoluteolus or R. opacus in combination
with the NAD+ reductase from R. eutropha showed cation-dependent, H2-driven NAD+
reduction activities. SH, chimeras carrying the hydrogenase module from R. eutropha were
III
fully active also without additional Ni2+ and Mg2+. This identified the hydrogenase module to
be responsible for the cation dependence. With exception of the SH-variant, which contains
the hydrogenase module from H.thermoluteolus all chimeric SHs were able to facilitate
autotrophic growth in R. eutropha under an atmosphere of H2, O2 and CO2. This subunit mixing
system allows the optimization of biochemical features of the SH according to the desired
reaction conditions. For example, the combination of highly NAD+-affine RoNAD+ reductase
with the more active Rehydrogenase results in a chimeric SH that is not dependent on divalent
cations in contrast to RoSH.
IV
Publikationen
Janina Preissler, Stefan Wahlefeld, Christian Lorent, Christian Teutloff, Marius Horch,
Lars Lauterbach, Stephen P. Cramer, Ingo Zebger, and Oliver Lenz (2018) “Enzymatic
and spectroscopic properties of a thermostable [NiFe]-hydrogenase performing H2 -
driven NAD+-reduction in the presence of O2.” Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Bioenergetics 1859 (1). 8–18. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.09.006
Janina Preissler, Holly A. Reeve, Tianze Zhu, Kouji Urata, Lars Lauterbach, Luet L. Wong,
Kylie A. Vincent, and Oliver Lenz (expected 2018) “H2-driven NADPH recycling in
P450-catalyzed oxidations mediated by an engineered O2-tolerant hydrogenase”
in preparation
Poster und Vorträge
1) „Extension of the substrate spectrum of the NAD+-reducing hydrogenase from
Ralstonia eutropha for cofactor regeneration“
gemeinsame Tagung der VAAM & DHGM in Dresden 2014
Posterpräsentation
2) „Biochemistry of a thermostable, O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase”
Konferenz der European Federation of Biotechnology (EFB): “Bacterial Electron
Transfer Processes and Their Regulation” in Vimeiro (Portugal) 2014
Posterpräsentation
3) „Application and biochemistry of oxygen-tolerant, NAD+-reducing hydrogenases”
ICIQ-UniCat Summer School in Berlin 2015
Posterpräsentation
4) „Altering substrate specificity of soluble, NAD+-reducing hydrogenase for H2-
driven cofactor regeneration in cytochrome P450-catalyzed selective oxidations”
Tagung der VAAM in Jena 2016
Posterpräsentation
5) „Biochemical properties of a thermostable, O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-
hydrogenase”
11. internationale Hydrogenase Konferenz (CNRS) in Marseille (Frankreich) 2016
flash-Session-Vortrag
V
Danksagung
Ich möchte mich gerne bei allen Menschen bedanken, die mir während meiner Doktorarbeit
zur Seite standen und mich unterstützt haben. Dazu zählen, neben meiner Familie und
Freunde, die Kollegen des Max-Volmer-Laboratoriums. Insbesondere folgenden Personen
gilt mein Dank:
Dr. Oliver Lenz: für die Möglichkeit, diese Arbeit in einem angenehmen Umfeld
eigenständig und dennoch unter sehr guter Betreuung anzufertigen.
Prof. Dr. Peter Hildebrandt: für die Funktion als Gutachter sowie für die
unterstützende Bereitschaft, eine mikrobiologisch-orientierte Arbeitsgruppe im MVL
aufzunehmen.
Prof. Dr. Silke Leimkühler: für die Bereitschaft als Gutachterin meiner Arbeit zu
fungieren.
Prof. Dr. Thomas Friedrich: für die Übernahme der Rolle als Vorsitzender des
Promotionsausschusses.
Janna Schoknecht und Sven Hartmann: besonderer Dank für eure tatkräftige
Unterstützung in allen Lebenslagen und eure ständige Hilfsbereitschaft. Eure
Erfahrungen und Kenntnisse haben des Öfteren maßgeblich zur Problemlösung
beigetragen und mir vermutlich einige Fehler erspart.
Drs. Lars Lauterbach und Stefan Frielingsdorf: für die Vorarbeiten zur
Bindestellenumwandlung der SH und für die bereitwillige Weitergabe eurer
Expertise sowie hilfreicher Diskussionen.
Stefan Wahlefeld, Christian Lorent, Catharina Kulka, Dr. Marius Horch und Dr. Ingo
Zebger: für eine angenehme, unkomplizierte Zusammenarbeit und der effizienten
Verwendung zahlreicher SH-Proben.
Andrea Schmidt und Dr. Patrick Scheerer: für die unermüdliche Geduld bei der SH-
Kristallisation und das Ansetzen unzähliger Kristallisationsplatten.
Dr. Holly Reeve und Prof. Dr. Kylie Vincent: für die hilfreichen Diskussionen,
vielseitigen Ideen und elektrochemischen Experimente mit SH-Präparationen.
Allen ehemaligen und aktuellen Mitarbeiter des MVLs und der AG Lenz:
hervorzuheben sind Dr. Katja Karstens für die Vorarbeiten an der R.opacus-SH und
Dr. Caspar Schäfer für sein stets offenes Ohr und seine Hilfsbereitschaft.
Meinen Eltern, meinem Bruder, meiner Großmutter, meiner Tante, meinem Onkel
und Ronja: Ohne ihren Zuspruch und die Unterstützung in jeglicher Form wäre
Vieles nicht möglich gewesen.
VI
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung.................................................................................................................... I
Summary .................................................................................................................................. II
Publikationen.......................................................................................................................... IV
Danksagung ............................................................................................................................. V
Inhaltsverzeichnis .................................................................................................................. VI
Abkürzungsverzeichnis .......................................................................................................... X
1 Einleitung ....................................................................................................................... 1
1.1 Wasserstoff .................................................................................................................. 1
1.2 Hydrogenasen .............................................................................................................. 2
1.3 Einteilung der Hydrogenasen anhand des aktiven Zentrums ...................................... 2
1.4 [NiFe]-Hydrogenasen .................................................................................................. 4
1.5 Katalytischer Mechanismus der [NiFe]-Hydrogenasen .............................................. 5
1.6 Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha H16 ................................................................ 7
1.7 Sauerstofftoleranz der [NiFe]-Hydrogenasen ............................................................. 9
1.8 Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha H16 .................................... 10
1.9 Andere lösliche, bidirektionale [NiFe]-Hydrogenasen ............................................. 12
1.10 Kofaktorregeneration ................................................................................................ 14
1.11 Wasserstoffgetriebene Kofaktorregeneration ............................................................ 15
1.12 Fragestellung und Zielsetzung .................................................................................. 17
2 Material und Methoden .............................................................................................. 19
2.1 Stämme und Plasmide ............................................................................................... 19
2.2 Zellkultivierung ......................................................................................................... 23
2.2.1 Nährmedien ........................................................................................................ 23
2.2.2 Bestimmung der Wachstumsparameter ............................................................. 25
2.2.3 Kultivierung und Wachstum von Ralstonia eutropha ....................................... 25
2.2.4 Zellernte ............................................................................................................. 26
2.2.5 Lagerung und Konservierung von Bakterienstämmen ...................................... 26
2.3 Proteinreinigung ........................................................................................................ 26
2.3.1 Aerobe Affinitätschromatographie zur Isolierung von StrepII®-tag-tragenden
SH-Derivaten .................................................................................................................... 26
2.3.2 Anaerobe Affinitätschromatographie zur Isolierung von StrepII®-tag-tragenden
HtSH-Derivaten und der HtHY/ReFU-Chimäre .............................................................. 28
VII
2.3.3 Größenausschlusschromatographie der HtSH ................................................... 28
2.4 Probenanalytik ........................................................................................................... 29
2.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration .............................................................. 29
2.4.2 Messung der H2-abhängigen NAD(P)+-Reduktionsaktivität ............................. 29
2.4.3 Messung der NAD(P)H-abhängigen Benzylviologen-Reduktionsaktivität ....... 31
2.4.4 Messung der H2-abhängigen Benzylviologen-Reduktionsaktivität ................... 31
2.4.5 Messung der NADH-abhängigen H2-Produktion .............................................. 31
2.4.6 Aufnahme von UV/Vis Absorptionsspektren .................................................... 32
2.4.7 Bestimmung des FMN-Gehalts.......................................................................... 32
2.4.8 Bestimmung des Metallgehalts .......................................................................... 32
2.4.9 Kristallisation ..................................................................................................... 33
2.5 Elektrochemische Untersuchung der ReSH .............................................................. 34
2.5.1 Elektrochemische Aktivitätsmessung der löslichen, NAD+-reduzierenden
Hydrogenase ..................................................................................................................... 34
2.5.2 Zyklische Voltammetrie..................................................................................... 35
2.5.3 Chronoamperometrie ......................................................................................... 35
2.6 Spektroskopische Untersuchungen der HtSH ........................................................... 36
2.6.1 IR-Spektroskopie ............................................................................................... 36
2.6.2 IR-Spektroelektrochemische Untersuchung ...................................................... 36
2.6.3 EPR-Spektroskopie ............................................................................................ 37
2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) ............................................. 37
2.7.1 SDS-PAGE ........................................................................................................ 37
2.7.2 Coomassie-Färbung ........................................................................................... 39
2.7.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen nach dem Western-Blot-Verfahren ...
............................................................................................................................ 39
2.8 DNA-Grundtechniken ............................................................................................... 40
2.8.1 Behandlung von Geräten und Lösungen ............................................................ 40
2.8.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren ................................................ 41
2.8.3 Restriktionsverdau ............................................................................................. 41
2.8.4 Ligation .............................................................................................................. 42
2.9 DNA-Isolierung ......................................................................................................... 42
2.9.1 Plasmidisolation: Mini-Präparation ................................................................... 42
2.9.2 Isolierung von low-copy-Plasmiden mithilfe von Anionenaustauschersäulen .. 43
2.9.3 Agarosegelelektrophorese .................................................................................. 43
2.10 Plasmidtransfer .......................................................................................................... 44
VIII
2.10.1 Herstellung chemokompetenter E. coli-Zellen .................................................. 44
2.10.2 Transformation von E. coli ................................................................................ 45
2.10.3 Herstellung elektrokompetenter R. eutropha-Zellen ......................................... 45
2.10.4 Elektroporation von R. eutropha........................................................................ 46
2.10.5 Konjugation........................................................................................................ 46
2.10.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)..................................................................... 47
2.10.7 Homologe Rekombination ................................................................................. 50
2.11 Sequenzierung ........................................................................................................... 51
2.12 Enzyme und Chemikalien ......................................................................................... 51
2.13 Dokumentation und Datenverarbeitung .................................................................... 51
3 Ergebnisse .................................................................................................................... 53
3.1 Charakterisierung der thermostabilen SH aus Hydrogenophilus thermoluteolus TH-
1T (Ht) .................................................................................................................................. 53
3.2 Die thermostabile HtSH kann in Ralstonia eutropha heterolog produziert werden . 54
3.3 Die thermostabile SH unterscheidet sich biochemisch von der ReSH ...................... 56
3.3.1 Temperatur- und pH-Optimum .......................................................................... 56
3.3.2 Kinetische Parameter ......................................................................................... 58
3.3.3 O2-Toleranz ........................................................................................................ 59
3.3.4 Metall- und Kofaktor-Gehalt ............................................................................. 60
3.3.5 Reaktivierungsverhalten .................................................................................... 61
3.3.6 Langzeitstabilität; Ionenabhängigkeit ................................................................ 62
3.3.7 Phylogenetische Beziehung zu anderen löslichen [NiFe]-Hydrogenasen ......... 64
3.3.8 Spektroskopische Eigenschaften der thermostabilen SH ................................... 64
3.3.9 Reduktion synthetischer Kofaktoren mithilfe der thermostabilen Hydrogenase ...
............................................................................................................................ 67
3.4 SH-Chimäre bestehend aus SH-Modulen verschiedener Organismen ...................... 69
3.4.1 Chimäre SH-Varianten können lithoautotrophes Wachstum von R. eutropha
vermitteln .......................................................................................................................... 71
3.4.2 Immunologischer Nachweis der SH-Untereinheiten ......................................... 74
3.4.3 Aktivitäten im löslichen Extrakt ........................................................................ 76
3.4.4 Reinigung der SH-Chimären mittels Affinitätschomatographie........................ 77
3.5 Umwandlung der NAD+-Bindestelle in ReHoxF zur Erhöhung der Spezifität für
NADP+ ................................................................................................................................. 83
3.5.1 Die NAD(H)-Bindetasche in HoxF unterscheidet sich von der in NADP(H)-
spezifischen Enzymen ...................................................................................................... 84
IX
3.5.2 Durch gezielten Austausch einzelner Aminosäuren in der NAD(H)-Bindetasche
von HoxH lässt sich die Substratspezifität der SH verändern .......................................... 86
3.5.3 Die SH-Varinaten mit veränderter Substrataffinität vermitteln kein
lithoautotrophes Wachstum des Wirtsstammes ................................................................ 88
3.5.4 Die NADP(H)-umsetzenden SH-Varianten sind auch in Gegenwart von O2
aktiv ............................................................................................................................ 90
3.5.5 Kinetische Parameter der SH-Varianten mit Veränderungen in der NAD(H)-
Bindetasche ....................................................................................................................... 91
3.5.6 Die NADP+-spezifischen SH-Varianten können auf einer Elektrode adsorbiert
werden und sind katalytisch aktiv .................................................................................... 93
3.5.7 SH E341A/S342R als Teil NADPH-abhängiger Redoxenzym-Kaskaden ................ 94
4 Diskussion .................................................................................................................... 97
4.1 Charakterisierung der thermostabilen SH aus Hydrogenophilus thermoluteolus TH-
1T ................................................................................................................................... 97
4.1.1 Die HtSH katalysiert die H2-abhängige NAD+-Reduktion kontinuierlich bei
hohen Temperaturen ......................................................................................................... 97
4.1.2 Die Sauerstofftoleranz der HtSH ..................................................................... 101
4.1.3 Die Struktur der HtSH ..................................................................................... 104
4.1.4 Dissoziation von FMN aus der HtSH unter reduzierenden Bedingungen:
Schutzmechanismus vor ROS-Bildung? ........................................................................ 104
4.1.5 Mögliche Auswirkungen der Bindung von Glutamat an das Nickel im
katalytischen Zentrum im oxidierten Zustand ................................................................ 107
4.2 Chimäre SHs zusammengesetzt aus den Modulen verschiedener Mikroorganismen ...
................................................................................................................................. 110
4.2.1 Die Hyp-Maschinerie des Megaplasmids ermöglicht die Maturation und
Produktion heterologer Hydrogenasen in Ralstonia eutropha ....................................... 110
4.2.2 Die Hydrogenase-Module aus Rhodococcus opacus und Hydrogenophilus
thermoluteolus benötigen zweiwertigen Kationen für die H2-Konversion .................... 112
4.3 ReSH: Umwandlung der NAD+-Bindestelle in eine NADP+-Bindetasche ............. 116
4.3.1 Das Substratspektrum der ReSH lässt sich durch den Austausch eines Glutamats
und das Einfügen eines Arginins zugunsten von NADP+ verschieben .......................... 116
4.3.2 Die synthetische NADP+-Reduktionsaktivität der neuen SH-Varianten
ermöglicht eine H2-getriebene Kofaktorregeneration ..................................................... 118
4.3.3 Ein veränderter Bias zugunsten der NAD(P)H-Oxidation könnte hilfreich für
die SH-abhängige H2-Produktion sein ............................................................................ 121
5 Anhang ....................................................................................................................... 123
6 Literatur..................................................................................................................... 128
7 Tabellenverzeichnis................................................................................................... 144
8 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. 145
X
Abkürzungsverzeichnis
% (v/v) Volumenprozent
% (w/v) Gewichtsprozent
ADH Alkohol-Dehydrogenase
Amp Ampicillin
APS Ammoniumperoxodisulfat
AS Aminosäuren/Aminosäurereste
ATP Adenosin-5`-triphosphat
AUT Minimalmedium für autotrophe Anzucht
BCA Bicinchoninsäure
BCIP 5-Brom-4-chlor-3-indolyl-phosphat-p-toluidinsalz
bp Basenpaare
BSA Rinderserumalbumin
BV Benzylviologen
CIP Alkalische Phosphatase (Calf Intestinal Phosphatase)
CTAB Cetyltrimethylammoniumbromid
DFT Diskrete Fourier-Transformation
DMF N,N-Dimethylformamid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DNase Desoxyribonuklease
dNTP 2'-Desoxynucleosid-5'-triphosphat
εx molarer Extinktionskoeffizient bei einer Wellenlänge von x nm
EC engl.: „Enzyme Commission numbers”
EDTA Ethylendiamintetraacetat
EPR Elektronen-Paramagnetische-Resonanz
et al., et alteri (und andere)
FCN Ferricyanid
XI
FDH Formiat-Dehydrogenase
FGN Fruktose-Glycerol-Minimalmedium
FMN Flavinmononukleotid
FN Fruktose-Minimalmedium
FTIR Fourier-Transform-Infrarot-Spektroskopie
ICP-OES engl.: „inductively coupled plasma optical emission spectrometry”; optische
Emissionsspektrometrie mittels induktiv gekoppelten Plasma
kbp Kilobasenpaare
kDa Kilodalton
kJ Kilojoule
Km Kanamycin
LB lysogeny broth
LE Löslicher Extrakt
MBH engl.: „membrane bound hydrogenase“; membrangebundene Hydrogenase
MCS engl.: „multi cloning site”
mol 6,022 ∙ 1023 Teilchen
MV Methylviologen
NAD+ Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid
NADH Nikotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid (reduziert)
NADP+ Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat
NADPH Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-Phosphat (reduziert)
NBT Nitroblautetrazoliumchlorid
NCBI National Center for Biotechnology Information
ODX Optische Dichte bei einer Wellenlänge von x nm
PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PCR engl.: „polymerase chain reaction“; Polymerase-Kettenreaktion
PDB engl.: „protein data bank“
PEG Ployethylenglykol
pH pH-Wert
pKs pKs-Wert; negativer Logarithmus der Säurekonstante Ks
XII
ppm engl.: „parts per million” (10-6)
psi engl.: „pounds per squareinch“
QM/MM Quantenmechanik/ Molekularmechanik
RH engl.: „regulatory hydrogenase“; Regulatorische Hydrogenase
RNase Ribonuklease
ROS reaktive Sauerstoffspezies
rpm Umdrehungen pro Minute
RT Raumtemperatur
SDS engl.: „sodium dodecyl sulfate“; Natriumdodecylsulfat
SH engl.: „soluble hydrogenase“; lösliche, NAD+-reduzierende Hydrogenase
SHE engl.: „standard hydrogen electrode“; Standardwasserstoffelektrode
Tet Tetracyclin
TCEP Tris-(2-carboxyethyl)-phosphin
TEMED N,N,N´,N´-Tetramethylendiamin
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Tween Polyoxyethylensorbitanmonolaurat
U Unit (µmol ∙ min-1) [Einheit der Enzymaktivität]
UE Untereinheit
Upm Umdrehungen pro Minute
UV Ultraviolett
VE voll entmineralisiert
WT Wildtyp
∙ g Erdbeschleunigung
1
1 Einleitung
1.1 Wasserstoff
Bereits Paracelsus dokumentierte im frühen 16. Jahrhundert bei dem Lösen von Eisen in
Schwefelsäure die Entstehung von Gas. Auch Robert Boyle (1671) und später Henry
Cavendish (1766) erzeugten durch das Experimentieren mit Metallen wie Eisen, Zink oder
Zinn und Säure das entflammbare Gasgemisch, welches als „entzündbare Luft“ bekannt wurde.
Antoine Laurent de Lavoisier zeigte 1783 schließlich, dass bei der Verbrennung von diesem
Gas lediglich Wasser entsteht und nannte es fortan „hydro-gen“, aus dem Griechischen für
„Wasser-formend“.
Dabei liefert die Oxidation von H2, die „Knallgasreaktion“, aufgrund der hohen Enthalpie etwa
-286 kJ pro mol H2O. Dank des niedrigen Redoxpotentials E0‘ (½ H2/H+) = -0,42 V kann diese
Energie in einer Vielzahl von Redoxsystemen genutzt werden und macht molekularen
Wasserstoff zu einem attraktiven, emmissionsfreien Energieträger.
Elementarer Wasserstoff ist das häufigste Element des Weltalls, jedoch auf der Erde nur mit
etwa 1% am Aufbau der Erdrinde beteiligt und in seiner molekularen Form als H2 zu etwa
5 ∙ 10-5 Vol.% in der Atmosphäre vorhanden (Paneth, 1937; Schmidt, 1974). Dennoch spielt er
eine bedeutende Rolle im Stoffwechsel einiger Mikroorganismen. Als Abfallprodukt kann er
beim anaeroben Abbau von organischen Substanzen von fermentativen Mikroorganismen
produziert werden, oder als Nebenprodukt der Stickstofffixierung (Evans et al., 1987; Schubert
& Evans, 1976) und der Phosphitoxidation (Yang & Metcalf, 2004) entstehen. Andere
Mikroorganismen, häufig Methanogene, Azetogene oder Sulfatreduzenten, hingegen, können
H2 aufnehmen und die Energie der Spaltung für ihren anaeroben Stoffwechsel nutzen (Conrad,
1996). Die langjährige Annahme, der H2-Metabolismus beschränke sich auf überwiegend
anaerobe Lebensräume wurde widerlegt und die Bedeutung des Wasserstoffs für das Überleben
und Wachstum auch von bodenlebenden Bakterien betont (Greening et al., 2014). Auch
Organismen in aeroben Habitaten sind in der Lage, die dort vorhandenen geringen Mengen an
H2 in Anwesenheit von O2 umzusetzen und werden daher auch als Knallgasbakterien
bezeichnet (Conrad, 1996).
Trotz der unterschiedlichen Habitate und Stoffwechseltypen ist diesen Mikroorganismen ein
zentrales Enzym gemein, die Hydrogenase.
2
1.2 Hydrogenasen
Hydrogenasen katalysieren die reversible Spaltung von Wasserstoff nach folgender
Reaktionsgleichung: 𝐻2⇄ 2 𝑒−+ 2 𝐻+ (1)
Dabei erfolgt die H2-Spaltung am bimetallischen aktiven Zentrum. Da die Hydrogenasen im
Stoffwechsel der Mikroorganismen (über-)lebenswichtige Funktionen einnehmen und an
wichtige Prozesse wie die Photosynthese und Atmungskette gekoppelt sind, ist ihre
Funktionsfähigkeit und Stabilität entscheidend. Die häufig niedrige Wasserstoffkonzentration
in der Umgebung hat im Laufe der Evolution auch Hydrogenasen mit besonders hoher Affinität
entstehen lassen. Dabei werden niedrige KM-Werte von etwa 10-70 nM für H2 als Substrat
angegeben (Constant et al., 2010).
Insbesondere im Hinblick auf technische Anwendungen des regenerativen Energieträgers H2
erscheinen Hydrogenasen demnach interessant. Die H2-Spaltung oder -produktion mithilfe
metallischer Katalysatoren erfolgt unter hohem Energie- und Kostenaufwand und im Falle des
bei Brennstoffzellen häufig verwendeten Platins kann es zu Nebenreaktionen mit
Verunreinigungen wie CO oder H2S kommen, was zur Inaktivierung des Katalysators führt
(Karyakin et al., 2005; Tye et al., 2005).
Die Selektivität und hohe Affinität der Hydrogenasen könnte diese Problematik umgehen und
ermöglicht die Anwendung bei Umgebungstemperaturen.
1.3 Einteilung der Hydrogenasen anhand des aktiven Zentrums
Hydrogenasen, die die vollständige Umwandlung von H2 katalysieren, können anhand der
Zusammensetzung der Metallatome im aktiven Zentrum in zwei phylogenetisch nicht
verwandte Hauptklassen der Hydrogenasen unterschieden werden (Vignais & Billoud, 2007).
Die phylogenetisch größere und vielfältigere Klasse wird von den [NiFe]-Hydrogenasen
gebildet. Die Kristallstruktur des Kernmoduls konnte u. a. aus Desulfovibrio-Spezies, aus
Allochromatium vinosum, Escherichia coli und Ralstonia eutropha aufgeklärt werden
(Volbeda et al., 1995; Higuchi et al., 1997; Matias et al., 2001; Stadler et al., 2002; Volbeda
et al., 2005; Fritsch et al., 2011; Schäfer et al., 2013).
Die Hydrogenase wird hierbei von zwei unterschiedlich großen Untereinheiten gebildet
(Abbildung 1). Die große Untereinheit ist etwa 60 kDa schwer und beinhaltet das aktive
3
Zentrum, das sich aus je einem Nickel- und einem Eisenatom zusammensetzt. Die kleinere
Untereinheit ist etwa 30 kDa schwer und beinhaltet die für den Elektronentransport wichtigen
[FeS]-Zentren. Über eine große Kontaktfläche können diese Untereinheiten stark interagieren
und formen somit ein globuläres heterodimeres Protein mit einem tief im Inneren liegenden
aktiven Zentrum. Das Nickelatom wird durch vier Thiolgruppen von Cysteinen des
Proteinrückgrates koordiniert. Die Koordination des Fe-Atoms erfolgt durch zwei dieser
Cysteine und zusätzliche Liganden. Durch Infrarotspektroskopie konnte die Identität dieser
Liganden weitestgehend aufgeklärt werden (Happe et al., 1997; Pierik et al., 1999). Es handelt
sich demnach um zwei CN-- sowie eine CO-Gruppe. Im oxidierten Zustand ergänzt eine
Sauerstoffspezies diese Liganden und wirkt wie zwei der Cysteine als Brückenligand zwischen
dem Nickel- und dem Eisenatom (Ogata et al., 2005; Volbeda et al., 2005, 2015).
Abbildung 1. Struktur der sogenannten Standard-[NiFe]-Hydrogenase bestehend aus einer
großen (rot; engl.: „large subunit") und kleinen (grün, engl.: „small subunit") Untereinheit nach
M. Horch et al. (2010). X stellt einen austauschbaren Brückenliganden dar. Die hellgrünen Moleküle
repräsentieren [FeS]-Cluster.
Obwohl die Reaktion in beide Richtungen katalysiert werden kann, überwiegt bei den [NiFe]-
Hydrogenasen die H2-Oxidation.
Hydrogenasen, deren aktives Zentrum aus zwei Eisenatomen gebildet wird, werden der [FeFe]-
Klasse zugeordnet. Vorrangig sind sie in H2-produzierenden Mikroorganismen zu finden. Das
aktive Zentrum wird dabei als „H-cluster“ bezeichnet (Peters et al., 1998). Es besteht aus dem
binukleären [FeFe]-Zentrum, das über die Thiolgruppe eines Cysteinrestes an einen [4Fe4S]-
Cluster gebunden ist. Auch hier sind weitere Ligandengruppen, CN-und CO, an der
Koordination des [FeFe]-Zentrums beteiligt (Garcin et al., 1999; Peters et al, 1999).
4
In allen Hydrogenasen ermöglichen hydrophobe Gaskanäle die Diffusion der H2-Moleküle
zum aktiven Zentrum (Volbeda et al., 1995; Montet et al., 1997; Nicolet et al., 1999, 2001;
Hiromoto et al., 2009; Kalms et al., 2016). Durch diese Kanäle können jedoch auch andere
kleine Gasmoleküle, wie O2 oder CO, zum aktiven Zentrum gelangen. Während die Reaktion
des O2 mit dem aktiven Zentrum bei [FeFe]-Hydrogenasen zur irreversiblen Zerstörung des
„H-Clusters“ führt (De Lacey et al., 2007; Goldet et al., 2009), werden [NiFe]-Hydrogenasen
durch O2-Anwesenheit lediglich reversibel inaktiviert. Eine kleine Gruppe der [NiFe]-
Hydrogenasen ist sogar in der Lage, in der Anwesenheit von Sauerstoff die
Wasserstoffumwandlung zu katalysieren. Daher werden sie auch als „sauerstofftolerant“
bezeichnet (Burgdorf et al., 2005; Vincent et al., 2005; Goldet et al., 2008; Lenz et al., 2010;
Krassen et al., 2011; Fritsch et al., 2013).
1.4 [NiFe]-Hydrogenasen
Anhand von Sequenzvergleichen, der Genomorganisation und der physiologischen
Funktion ist eine weitere Einteilung der [NiFe]-Hydrogenasen möglich (Greening et al., 2016;
Vignais & Billoud, 2007). Dabei lassen sich die folgenden vier Gruppen unterscheiden: Die
erste Gruppe umfasst membrangebundene Hydrogenasen, die zumeist der H2-Aufnahme
dienen und die Elektronen aus der H2-Oxidation für die Reduktion von Chinonen in der
Atmungskette verwenden.
In der zweiten Gruppe werden Hydrogenasen zusammengefasst, die nicht über ein Signalpeptid
an der kleinen Untereinheit verfügen und daher im Cytosol lokalisiert sind. Bei dieser Gruppe
handelt es sich um Hydrogenasen aus Cyanobakterien sowie Hydrogenasen, die als H2-
Sensoren fungieren (Tamagnini et al., 2007). Letztere wirken in Abhängigkeit der H2-
Konzentration regulatorisch auf die Biosynthese von Hydrogenasen zur H2-Aufnahme (Lenz
et al., 2002).
Die Hydrogenasen der dritten Gruppe befinden sich ebenfalls im Cytoplasma. Jedoch sind im
Gegensatz zu den vorherigen Gruppen weitere Untereinheiten an das Hydrogenase-Modul
assoziiert. Diese Untereinheiten ermöglichen die Bindung und reversible Reduktion von
löslichen Kofaktoren, wie F420 (8-hydroxy-5-deazaflavin) (Kulkarni et al., 2009; Mills et al.,
2013), NAD+ (Burgdorf, van der Linden, et al., 2005; Houchins & Burris, 1981; Rákhely et
al., 2004) oder NADP+ (Ma et al., 1993; Kanai et al., 2011; Greening et al., 2014). Aufgrund
der reversiblen Katalyse der H2-Spaltung werden sie auch als bidirektionale Hydrogenasen
5
bezeichnet. Der vierten Gruppen werden multimere, membranständige Hydrogenasen
zugeordnet, die überschüssige Reduktionsäquivalente über H2-Produktion abführen.
Die außergewöhnlich hohe H2-Affinität, die für verschiedene Aktinobakterien gefunden
wurde, veranlasste zu tiefergehenden Untersuchungen und Vergleichen der dafür
verantwortlichen Gensequenzen (Constant et al., 2010). Diese führten zur Identifizierung einer
Klasse von [NiFe]-Hydrogenasen, die sich durch außergewöhnlich hohe H2-Affinität
auszeichnen. Charakteristisch sind zwei konservierte Konsensussequenzen, L1 und L2, die sich
in der großen Untereinheit dieser Hydrogenasegruppe befinden und Cysteine für die
Koordination der H2-bindenden Metalle enthalten (Constant et al., 2011; Vignais & Billoud,
2007). Vorerst wurden sie als eigene, fünfte Gruppe der [NiFe]-Hydrogenasen postuliert, die
aktuell aber der Gruppe 1 untergeordnet werden (Greening et al., 2016).
1.5 Katalytischer Mechanismus der [NiFe]-Hydrogenasen
[NiFe]-Hydrogenasen sind aus mindestens zwei Untereinheiten aufgebaut; einer großen
Untereinheit mit dem katalytischen Nickel-Eisen-Zentrum, an dem die H2-Spaltung erfolgt,
und einer kleineren Untereinheit, die Kofaktoren zur Weiterleitung der Elektronen beinhaltet.
Dabei wird das [NiFe]-Zentrum von anorganischen Liganden wie CN- und CO koordiniert
(Happe et al., 1997; Volbeda et al., 2005). Die Anwesenheit und die Redoxzustände der
metallhaltigen Kofaktoren in den [NiFe]-Hydrogenasen lassen sich gut mithilfe
spektroskopischer Methoden untersuchen, so dass bereits Einsichten in den Mechanismus der
H2-Katalyse gewonnen werden konnten. Mit der Fourier-Transform-Infrarotspektroskopie
(FTIR) lassen sich die CO- und CN--Bindungen der koordinierenden Ligandenmoleküle nach
Absorption von Infrarotlicht untersuchen. Die Absorption führt zur Schwingung der
Bindungen, deren Frequenzen abhängig von den beteiligten Atomen und ihrer Masse, sowie
der Bindungsstärke sind. Somit gibt das Spektrum Auskunft über die Identität der Liganden.
Da die Bindungsstärke auch von den umgebenden Atomen beeinflusst wird, können die
Schwingungsmodi auch Informationen zum Zustand der Metalle im aktiven Zentrum liefern.
Freie, ungepaarte Elektronen, wie sie z.B. in reduzierten [4Fe4S]- und [2Fe2]-Zentren sowie
in Ni+/3+ auftreten, können mittels Elektronenspinresonanz-Spektroskopie (EPR, engl.:
„electron paramagnetic resonance“) detektiert werden.
Bei der Wasserstoffumsetzung am aktiven Zentrum einer „Standard“-Hydrogenase (1.3;
Abbildung 1; Volbeda et al., 1995) verbleibt das Eisenatom in einer Fe(II)-„low-spin“-
Konfiguration, während das Nickelatom redoxaktiv ist (Armstrong & Fontecilla-Camps,
6
2008). Nähere Untersuchungen dieser Redoxzustände wurden u.a. von Albracht et al.
durchgeführt und vermittelten Einsicht in den Katalysemechanismus (Albracht et al., 1984;
Albracht et al., 1982; Cammack et al., 1982; Horch et al., 2011; Lacey et al., 1997; LeGall et
al., 1982). Bereits 1982 zeigten Albracht et al. mithilfe der EPR-Spektroskopie, dass das Nickel
der Hydrogenase reversibel paramagnetische, detektierbare Redoxzustände (EPR-aktiv)
aufweist (Albracht et al., 1982). Diese wurden als Ni-A, Ni-B, Ni-C und Ni-L bezeichnet
(Albracht, 1994; Lubitz et al., 2007). Die EPR-inaktiven Zustände des aktiven Zentrums
wurden später durch Messung mittels FTIR (Fourier-Transform-Infrarot)-Spektrometrie
genauer untersucht (Happe et al., 1997). Dabei zeigten sich anhand der Streckschwingungen
der anorganischen CN-- und CO-Liganden verschiedene Redoxzustände. Die beiden EPR-
aktiven Zustände Ni-A und Ni-B stellen oxidierte, reversibel inaktive Zustände dar
(Abbildung 2). Sie unterscheiden sich in der Kinetik, mit der sie reaktiviert werden können
(Fernandez et al., 1985; Kurkin et al., 2004). Während Ni-B (auch Nir-B mit „r“ für „ready“)
in der Gegenwart von Wasserstoff schnell (re-) aktiviert werden kann (< 1 min), benötigt die
Aktivierung von Ni-A (auch Niu-A mit „u“ für „unready“) weit mehr Zeit (> ~1 h). Dieses
Verhalten wird auf unterschiedliche, sauerstoffmodifizierte Strukturen des aktiven Zentrums
zurückgeführt. Im Fall von Ni-B befindet sich eine OH-Gruppe zwischen den beiden
Metallatomen, bei Ni-A handelt es sich eventuell um eine Peroxidspezies (Pandelia et al., 2010;
Shafaat et al., 2013). Die Reduktion der beiden Zustände mit jeweils einem Elektron führt zu
den EPR-inaktiven Varianten Nir-S und Niu-S, in denen Nickel nun die Oxidationsstufe (+II)
hat. Auch diese Zustände sind nicht katalytisch aktiv. Erst durch die Freisetzung eines Wasser-
Moleküls wird Nir-S aktiviert und in den Nia-S-Zustand („a“ für „active“) überführt. Die
weitere Reduktion des Nia-S mit einem Elektron führt jedoch zum Nia-C-Zustand, der als
Brückenligand ein Hydridion enthält. Dieses Intermediat ist in „Standard“-Hydrogenasen
zentral an der Wasserstoffumwandlung beteiligt. Bei sehr niedrigen Temperaturen und unter
Bestrahlung mit weißem Licht dissoziiert das Hydridion aus der Brückenposition und führt so
zu dem EPR-aktiven Ni-L-Zustand. Nia-C kann jedoch auch unter der Aufnahme eines
Elektrons weiter reduziert werden. Dieser Zustand wird als Ni-R bezeichnet und enthält
ebenfalls ein Hydridion in der Brückenposition (Lubitz et al., 2014).
7
Abbildung 2. Schema des allgemeinen katalytischen Zyklus von [NiFe]-Hydrogenasen für die
Umwandlung von H2 (linke Seite) sowie die oxidative Inaktivierung des aktiven Zentrums
(rechte Seite). Ausgehend von Nia-S werden abhängig von der Verfügbarkeit an Elektronen die
inaktiven Ni(III)-Zustände Nir-B und Niu-A gebildet. Während Nir-B schnell reaktiviert werden kann,
erfordert die Reaktivierung von Niu-A mehr Zeit. Die Identität des Brückenliganden in Niu-A ist noch
nicht eindeutig geklärt; es handelt sich sehr wahrscheinlich um OOH- oder OH—Molekül. Die
Abbildung wurde basierend auf den von Siegbahn et al. (2007) und Armstrong et al. (2009)
publizierten Mechanismen erstellt.
1.6 Hydrogenasen aus Ralstonia eutropha H16
Wasserstoff ist in seiner molekularen Form nur in geringen Mengen in der Atmosphäre
vorhanden. Zwar wird H2 auch natürlicherweise durch Mikroorganismen produziert, geschieht
dies jedoch größtenteils im anaeroben Milieu, in dem er schnell von Archaeen, Azetogenen,
Sulfatreduzierern und anderen anaeroben Organismen wieder verbraucht wird (Burgdorf et al.,
2005). So gelangt nur wenig H2 in aerobe Lebensräume, in denen Ralstonia eutropha offenbar
besonders gut an die knappe und stark schwankende H2-Verfügbarkeit sowie die O2-
Anwesenheit angepasst erscheint. Aufgrund der Eigenschaft, aus explosiven H2-O2-
Gasmischungen seinen Energiehaushalt zu bestreiten, wird R. eutropha auch als
„Knallgasbakterium“ bezeichnet (Wilde, 1962). Die Nutzung von H2 als einziger Energiequelle
wird durch vier unterschiedliche, sauerstofftolerante [NiFe]-Hydrogenasen (Abbildung 3)
8
ermöglicht, die sämtlich auf einem Megaplasmid, genannt pHG1, kodiert sind (Kortlüke et al.,
1992; Schwartz et al., 2003; Tran-Betcke et al., 1990).
Die membranständige Hydrogenase (MBH) ist in die Cytoplasmamembran integriert, wobei
das katalytische Zentrum ins Periplasma ragt. Sie überträgt Elektronen aus der H2-Spaltung auf
Cytochrome der Atmungskette (Bernhard et al., 1997; Kortlüke et al., 1992; Schink &
Schlegel, 1978). Zugeordnet wird sie der Gruppe 1 der [NiFe]-Hydrogenasen.
Bei der löslichen, NAD+-reduzierenden Hydrogenase („soluble hydrogenase“, SH), die im
Cytoplasma der Zelle lokalisiert ist, werden die freiwerdenden Elektronen der H2-Spaltung
direkt auf NAD+ übertragen. Sie gehört somit zur Gruppe 3 der bidirektionalen [NiFe]-
Hydrogenasen.
Die regulatorische Hydrogenase (RH) reguliert die Expression der Hydrogenase-Gene in
Abhängigkeit von der H2-Konzentration. Sie beeinflusst dabei den Phosphorylierungsgrad
einer Histidin-Protein-Kinase, die wiederum mittels Phosphorylierung/Dephosphorylierung
die Aktivität eines Response-Regulators steuert (Lenz et al., 2002). Die RH übt somit eine
sensorische Funktion aus und ist daher nur indirekt an der Energiegewinnung durch
Wasserstoffspaltung beteiligt. Das Gen für die Histidinkinase weist in dem Wildtypstamm
R. eutropha H16 eine Punktmutation auf, die die Hydrogenasegenexpression unabhängig von
der Anwesenheit von H2 macht (Lenz & Friedrich 1998). Während Hydrogenasegenexpression
bei Wachstum auf bevorzugten Energie- und Kohlenstoffquellen wie Pyruvat, Succinat oder
Fruktose unterdrückt wird, erfolgt bei Wachtum auf schlechter verwertbaren Substraten wie
Glycerin eine starke Synthese der Hydrogenasen (Friedrich et al., 1981; Friedrich et al., 1982).
Eine vierte Hydrogenase (Actinomyceten Hydrogenase, AH), die Ähnlichkeit zu den in
Aktinobakterien verbreiteten Hydrogenasen hat, wurde zunächst Gruppe 5 der [NiFe]-
Hydrogenasen zugeordnet (Constant et al., 2010; Schäfer et al., 2013).
9
Abbildung 3. Schematische Darstellung der vier [NiFe]-Hydrogenasen aus R. eutropha H16
basierend auf Kapitel 4 in Rögner „Biohydrogen“ (Krassen et al., 2011). Mithilfe der MBH und
der SH als Energie konservierende Hydrogenasen ist R. eutropha zum chemolithoautotrophen
Wachstum fähig.
1.7 Sauerstofftoleranz der [NiFe]-Hydrogenasen
Die Hydrogenasen aus R. eutropha zählen zu den O2-toleranten Enzymen, da sie H2 sogar
in Gegenwart von O2 umsetzen können, was sie von den meisten anderen Hydrogenasen
unterscheidet. Daher sind sie insbesondere für O2-abhängige biotechnologische Prozesse
interessant (siehe unten).
Es gibt verschiedene Hypothesen, die die Sauerstofftoleranz erklären. Im Falle der
regulatorischen Hydrogenasen aus R. eutropha und Rhodobacter capsulatus wurde vermutet,
dass die Diffusion von O2-Molekülen zum reaktiven Zentrum durch einen verengten Gaskanal
verhindert wird und somit die katalytische Aktivität erhalten bleibt (Buhrke et al., 2005; Duché
et al., 2005). Mittlerweile konnte jedoch gezeigt werden, dass O2 und auch CO zum aktiven
Zentrum der RH aus R. eutropha gelangen (Ash et al., 2015). Für die MBH ergaben
spektroskopische und kristallographische Untersuchungen einen Zusammenhang zwischen der
Sauerstofftoleranz und dem ungewöhnlichen [FeS]-Zentrum, das proximal zum [NiFe]-
Zentrum orientiert ist. (Fritsch et al., 2011; Goris et al., 2011). Bei diesem [FeS]-Zentrum
handelt es sich nicht um einen [4Fe4S]-Cluster, wie er bei meist sauerstoffempfindlichen
10
Hydrogenasen gefunden wird, sondern um ein [4Fe3S]-Zentrum, das durch insgesamt sechs
Cysteinreste im Proteinrückgrat verankert ist. In Abhängigkeit vom Redoxzustand ändert sich
die Struktur und Koordination dieses Clusters. Dadurch kann der proximale Cluster insgesamt
drei verschiedene Redoxzustände unter physiologischen Bedingungen einnehmen und so zwei
Elektronen gleichzeitig lagern und übertragen, was ihn von konventionellen [FeS]-Clustern
unterscheidet, die lediglich ein Elektron tragen können. Bindet O2 an das aktive Zentrum,
können diese Elektronen zusammen mit je einem Elektron des NiII-Ions und des medialen
[3Fe4S]0-Clusters zur vollständigen Reduktion des O2 zu H2O genutzt werden und verhindern
so die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies (Cracknell et al., 2009; Evans et al., 2013; Goris et
al., 2011). Zur Ableitung der entstehenden Wassermoleküle besitzt die MBH Hohlräume, die
in sauerstoffempfindlichen Hydrogenasen fehlen (Fritsch et al., 2011).
Für die SH konnte erstmals experimentell gezeigt werden, dass sie neben Hydrogenase- auch
Oxidase-Aktivität zeigt (Lauterbach & Lenz, 2013; Schneider & Schlegel, 1981). Sauerstoff
wird katalytisch unter intermediärer Bildung von Cysteinsulfenaten entgiftet (Horch et al.,
2015; Lauterbach & Lenz, 2013). Die Hauptprodukte der SH-vermittelten Oxidase-Aktivität
sind Wasserstoffperoxid und Wasser (Lauterbach & Lenz, 2013). Ein Vergleich der
Umsatzraten für H2 und O2 ergab, dass in der Anwesenheit von 40% O2 - bis zu 3% der durch
H2-Oxidation erzeugten Elektronen als "Schutz" dienen und für die O2-Reduktion
wiederverwendet werden (Lauterbach & Lenz, 2013).
1.8 Die NAD+-reduzierende Hydrogenase aus R. eutropha H16
In der Zelle sorgt die NAD+-reduzierende Hydrogenase (SH, EC 1.12.1.2) aus R. eutropha
H16 für die Übertragung der Elektronen aus der H2-Oxidation auf NAD+ und sorgt damit für
Reduktionsäquivalente, die u.a. dem Aufbau der protonenmotorischen Kraft dienen (Cramm,
2009). Herrscht dagegen ein Überfluss an Energie in Form von reduzierten Kofaktoren, kann
die SH diese durch die Rückreaktion, nämlich der NADH-abhängigen Reduktion von H+ zu H2
abführen (Kuhn et al., 1984). Die SH gehört zu den sogenannten bidirektionalen
[NiFe]-Hydrogenasen der Gruppe 3d (Schneider & Schlegel, 1981; Burgdorf et al., 2005).
Die SH ist ein ca. 208 kDa großes Heterohexamer, das aus zwei Funktionsmodulen aufgebaut
ist. Während das Heterodimer, HoxHY, das Hydrogenase-Modul bildet, welches sowohl H2-
Spaltung als auch –Bildung katalysiert, ist das Heterodimer aus den Untereinheiten HoxF und
HoxU für die reversible Reduktion des NAD+ zuständig. Daher wird letzteres auch als NAD+-
11
Reduktasemodul bezeichnet, an das zusätzlich noch zwei HoxI-Proteineinheiten assoziiert sind
(Abbildung 3).
Die heterotetramere SH weist große Ähnlichkeiten zu mitochondrialem und bakteriellen
Proteinen des Komplex I auf, die schon früh Indizien für die Anwesenheit von [FeS]-, FMN-
Kofaktoren und Pyridinnukleotid-Bindestelle lieferten (Albracht & Hedderich, 2000; Albracht,
1993; Albracht et al., 2003; Sazanov, 2006). Das Diaphorase-Modul weist eine hohe
Sequenzähnlichkeit zu den Untereinheiten Nqo1, Nqo2 und Nqo3 des respiratorischen
Komplex 1 auf.
Die H2-Spaltung findet am [NiFe]-Zentrum des Hydrogenase-Moduls statt. Danach werden die
zwei Elektronen einzeln über eine Serie von [FeS]-Clustern und Flavinen zu der
NAD+-Bindestelle in der HoxF-Untereinheit geleitet. Dort erfolgt anschließend die
Übertragung eines Hydrids auf NAD+. Bei dieser FMN-haltigen Bindestelle handelt es sich um
eine besondere Struktur, auch Rossmannfalte genannt. Diese unterscheidet sich in einigen
Schleifen und kurzen α-Helix-Teilbereichen von der in Nqo1.
Eine Elektronenübertragung auf die phosphorylierte Version von NAD+, NADP+, konnte
bisher nicht experimentell nachgewiesen werden. Es wurde jedoch vermutet, dass eine Bindung
des reduzierten Kofaktors NADPH an HoxI, zur reduktiven Reaktivierung oxidierter SH führen
könnte (Burgdorf et al., 2005).
Die Sequenzähnlichkeit des NAD+-Reduktasemoduls der SH und der Nqo1-Untereinheit aus
Komplex I (Albracht & Hedderich, 2000) sowie spektroskopische Messungen am
entsprechenden NAD+-Reduktasemodul aus dem Streptomyceten R. opacus (Schneider et al.,
1984) identifizieren einen der Flavinmononukleotide als Bestandteil der HoxF Untereinheit,
der als FMN-b bezeichnet wird.
In Komplex I wirkt er analog zur Funktion in der SH somit als Verbindung zwischen ein-
Elektronen-Zentren, Fe-S-Cluster, und zwei-Elektronen-Zentren, NADH (Berrisford &
Sazanov, 2009). Bei dem FMN-a, das sich in der HoxY-Untereinheit befindet, wird vermutet,
dass es als Elektronenspeicherung dient, für die „Entgiftung“ von O2 zu Wasser (Lauterbach
& Lenz, 2013).
Neben NAD+ akzeptiert die SH auch andere Elektronenakzeptoren und -donoren als Substrat.
Sie kann auch mit Methylviologen (MV), Benzylviologen (BV), Ferricyanid (FCN),
Methylenblau, Phenazinmethosulfat (PMS), Flavomononukleotid (FMN), Cytochrom c oder
mit Sauerstoff reagieren (Schneider & Schlegel, 1976). Diese Eigenschaft ermöglicht es, die
Teilreaktionen der beiden SH-Module getrennt voneinander zu untersuchen. So kann z.B. die
Wasserstoffproduktion durch das Hydrogenase-Modul unter Zugabe von reduziertem MV
12
nachverfolgt werden. Die Teilreaktion des NAD+-Reduktasemoduls lässt sich durch die
NADH-abhängige Reduktion von BV nachweisen (Lauterbach et al., 2011).
Bei EPR-Untersuchungen zur Aufklärung des katalytischen Mechanismus am [NiFe]-Zentrum
der SH konnten zunächst keine oder nur kaum Nickel (+III)-Signale detektiert werden
(Schneider et al., 1979; Schneider et al., 1984; Zaborosch et al., 1995; Serebryakova et al.,
1996; Happe et al., 2000; van der Linden et al., 2006; Germer et al., 2009). In „Standard“-
Hydrogenasen befindet sich das katalytisch aktive Nickelatom jedoch in dieser
Oxidationsstufe. Während IR-Messungen treten zwei zusätzliche Absorptionssignale auf, die
CN--Liganden zugeordnet wurden. Anhand der Vermutung, dass zusätzliche CN--Gruppen an
der Koordination des aktiven Zentrums beteiligt sind, wurde ein alternativer katalytischer
Zyklus postuliert, bei dem das Nickel in der Oxidationsstufe (+II) verbleibt. In späteren Studien
in ganzen Zellen wurde der paramagnetische Nia-C-Zustand und weitere Redoxzustände, die
Ähnlichkeiten mit denen in „Standard“-Hydrogenasen haben, nachgewiesen (Horch et al.,
2011; Horch et al., 2010). Dies demonstriert, dass die Beteiligung zusätzlicher CN-Gruppen
ausgeschlossen werden kann und das [NiFe]-Zentrum der SH eine starke Ähnlichkeit zu
anderen [NiFe]-Hydrogenasen aufweist, bei denen ein CO-und nur zwei CN--Liganden das
aktive Zentrum koordinieren (Horch et al., 2011; Horch et al., 2010).
1.9 Andere lösliche, bidirektionale [NiFe]-Hydrogenasen
Neben Ralstonia eutropha H16 gibt es viele weitere Bakterien, die die Energie der H2-
Oxidation zum Wachstum nutzen können. Die Organismen dieser physiologischen Gruppe der
„Knallgasbakterien“ sind phylogenetisch nicht verwandt, und so finden sich Vertreter in
grampositiven, gramnegativen Bakterien und auch in Archaeen (Rosenberg et al., 2013). In
den meisten Fällen besitzen diese Organismen mindestens eine membranständige Hydrogenase
(Grzeszik et al., 1997). Eine besondere Ausnahme ist das grampositive Bakterium
Rhodococcus opacus MR11 (ehemals Nocardia opaca 1b), welches nur über eine
cytoplasmatische, NAD+-reduzierende [NiFe]-Hydrogenase verfügt. Die Untereinheiten
HoxF, HoxU, HoxH und HoxY, die auf dem Megaplasmid pHG201 kodiert werden, weisen
eine hohe Ähnlichkeit zu den entsprechenden Proteinen in R.eutropha auf (Zaborosch et al.,
1989). Dennoch unterscheidet sich die SH aus R. opacus deutlich in ihren biochemischen
Eigenschaften (Schneider et al., 1984). In der Abwesenheit von Nickel- oder Magnesiumionen,
bei niedriger Ionenstärke oder in basischen pH-Werten dissoziiert die heterotetramere RoSH in
13
die zwei Module HoxFU und HoxHY. Daneben wirken die zweiwertigen Ionen Ni2+ oder Mg2+
stimulierend auf die H2-abhängige Reduktionsaktivität von NAD+, ein Effekt, der bei der ReSH
nicht zu beobachten ist (Schneider et al., 1984). Da die Produktion der SH in R. opacus auf
lithoautotrophe Bedingungen beschränkt ist, wurden die Gene hoxFUHY sowie das Gen der
spezifischen Endopeptidase HoxW unter Kontrolle des ReSH-Promotors gestellt und konnten
in R. eutropha heterolog exprimiert werden (Porthun et al., 2002; Schwartz et al., 1998). Das
hoxI Gen liegt bei R. opacus nur als verkürztes 5‘-Fragment vor (Grzeszik et al., 1997).
Andere bidirektionale, cytoplasmatische [NiFe]-Hydrogenasen finden sich auch in
Cyanobakterien wie Anabeana variabilis ATC 29413 (Schmitz et al., 1995; Serebryakova et
al., 1996) und Synechocystis sp. PCC 6803 (Appel et al., 2000; McIntosh et al., 2011), wo sie
vermutlich als ein Ventil zur Ableitung überschüssiger Energie unter anaeroben Bedingungen
in Form von H2 wirken. Die cyanobakteriellen Hydrogenasen weisen eine zusätzliche
Untereinheit HoxE auf, die homolog zu NuoE des Komplex I ist, ein [2Fe2S]-Zentrum
beinhaltet und an HoxFU bindet (Schmitz et al., 2002). Möglicherweise ist HoxE an Membran-
Interaktionen oder einer elektronenleitenden Verbindung zwischen HoxFU und HoxHY
beteiligt (Tamagnini et al., 2007).
Auch im hyperthermophilen Archaeon Pyrococcus furiosus (Ma et al., 1993, 2000) und
Thermococcus litoralis (Rákhely et al., 1999) konnten lösliche, bidirektionale [NiFe]-
Hydrogenasen identifiziert werden. Sie sind aus den vier Untereinheiten HydA, HydD, HydB
und HydG aufgebaut und verwenden NADPH sowie ein gebundenens Molekül FAD als
Elektronenmediatoren. Besonders ihre Thermostabilität macht sie attraktiv für
biotechnologische Anwendungen.
Sowohl für strukturelle und biochemische Untersuchungen der löslichen, bidirektionalen
[NiFe]-Hydrogenasen sowie deren potentielle Anwendung ist eine effiziente Produktion im
größeren Maßstab erstrebenswert. Der komplexe Reifungsprozess des aktiven Zentrums, die
Anwesenheit der [FeS]- und Pyridinnukleotid-Kofaktoren und die strenge Genregulation
erschweren jedoch die Übertragung in heterologe Über-Expressionssysteme. Die SH aus R.
eutropha sowie die Pyrococcus furiosus-SH konnten zwar in E.coli exprimiert werden
(Schiffels et al., 2013; Sun et al., 2010), waren jedoch mit Einbußen der Aktivität bzw.
Thermostabilität verbunden.
14
1.10 Kofaktorregeneration
Da Enzyme hochselektiv und -aktiv viele verschiedene Reaktionen katalysieren können,
sind chemische Firmen zunehmend daran interessiert, sie als Biokatalysatoren bei der
industriellen Synthese von Feinchemikalien einzusetzen. Enzyme beschleunigen chemische
Reaktionen auch unter milden Reaktionsbedingungen und weisen eine hohe Substrat-, Stereo-
und Regiospezifität auf, die insbesondere bei der Herstellung von pharmazeutischen
Grundstoffen erforderlich ist.
Sie sind zum Beispiel von der Synthese von Steroidhormonen oder Penicillinantibiotika,
Aminosäuren (L-Glutaminsäure, L-Lysin), Carbonsäuren (L-Milchsäure, L-Zitronensäure),
Vitaminen (Vitamin B2, Vitamin C) und Alkoholen nicht mehr wegzudenken.
Den Hauptanteil der dabei verwendeten Enzyme stellen die Klassen der Hydrolasen sowie die
Oxidoreduktasen. Als Beispiele der Oxidoreduktasen finden verschiedene Dehydrogenasen,
Oxidasen oder Reduktasen häufige Anwendung bei der Katalyse von reduktiven
Aminierungen, Hydrierungen von Ketonen und Reduktionen von
Kohlenstoffdoppelbindungen. Diese Reaktionen sind wichtige Bestandteile bei der
industriellen Herstellung von optisch reinen Aminosäuren wie z.B. L-tert-Leucin (Hall &
Bommarius, 2011) oder der Synthese von Statinen wie z.B. Ethyl-4-(S)-
Chlor-3-Hydroxybutyrat (Kataoka et al., 1997).
Für die Aktivität der meisten Oxidoreduktasen sind jedoch „freie“ Kofaktoren, die Elektronen
aufnehmen können und nur locker an das Enzym binden, essentiell. Bei diesen Kofaktoren
handelt es sich meist um NAD(H) und NADP(H), deren stöchiometrische Zugabe bei
industriellen Synthesen allerdings aufgrund ihrer geringen Stabilität und hoher Kosten nicht
wirtschaftlich ist (van der Donk & Zhao, 2003). Daher wurden Methoden entwickelt, die die
Regeneration der „verbrauchten“ Kofaktoren in-situ ermöglichen (Chenault & Whitesides,
1987; Chenault et al., 1988).
Die Regeneration kann nach verschiedenen Strategien erfolgen, die in vier Gruppen eingeteilt
werden. Neben der chemischen, elektrochemischen und photochemischen Erneuerung der
Kofaktoren, ist auch die enzymatische Regeneration möglich. Bei letzterer werden die
Kofaktoren entweder durch das gleiche Enzym, das auch die produktbildende Reaktion
katalysiert, wieder oxidiert bzw. reduziert. Oder aber es wird ein zweites Enzym an die
produktbildende Reaktion gekoppelt. Ein Beispiel ist die Regeneration von NADH mithilfe der
Formiatdehydrogenase (FDH; EC 1.2.1.2) aus Candida boidinii (Vasič-Racki et al., 1989). Der
15
große Vorteil dieser Dehydrogenase ist die Verwendung des preisgünstigen Reduktionsmittel
Formiat zur Reduktion von NAD+. Da als Produkt gasförmiges CO2 entsteht, wird die Reaktion
in Richtung der Kofaktorregeneration verschoben und die Reinigung des gewünschten
Produktes erleichtert. Die FDH weist jedoch nur eine geringe spezifische Aktivität von
6 U ∙ mg-1 für die NADH-Bildung und eine geringe Stabilität in organischen Lösungsmitteln
auf (Slusarczyk et al., 2000; V. Tishkov & Popov, 2006). Durch gezielten Austausch von
Cysteinresten der FDH konnten jedoch deutliche Verbesserungen der Stabilität erreicht
werden.
Neben der FDH werden auch Alkohol-Dehydrogenasen (ADH) zur Regeneration der
reduzierten Kofaktoren eingesetzt (Weckbecker et al., 2010). Dabei oxidieren sie gleichzeitig
Alkohole zu Ketonen. Für die Regeneration der Kofaktoren wird häufig Isopropanol als
Reduktionsmittel eingesetzt. Das entstehende Aceton wird durch Pervaporation abgetrennt. Es
gibt zwei Klassen der ADH, die sich anhand des Substratspektrums unterscheiden. ADH der
EC-Gruppe 1.1.1.1 sind NAD+-abhängig, die der EC-Gruppe 1.1.1.2 verwenden NADP+. ADH
aus Lactobacillus kefir und L. brevis weisen besonders hohe spezifische Aktivität für
NADP+ -Reduktion auf (100-500 U ∙ mg-1).
Ebenfalls häufig zur Kofaktorregeneration wird die Glukose-Dehydrogenase (GDH;
EC 1.1.1.47) verwendet, da sie das kostengünstige Substrat Glukose verwendet und eine hohe
spezifische Aktivität von bis zu 550 U ∙ mg-1 aufweist (Hall & Bommarius, 2011). Die Glukose
wird dabei zu Glukonolakton umgesetzt, das spontan zu Glukonsäure hydrolysiert und so die
Kofaktorreduktion begünstigt. Die Glukonsäure muss jedoch aus dem Reaktionsansatz entfernt
werden und erschwert somit die Produktreinigung.
1.11 Wasserstoffgetriebene Kofaktorregeneration
Wasserstoff, das Substrat der SH, ist ein preiswerter Energieträger der Zukunft und bei der
Spaltung und Elektronenübertragung auf NAD+ entstehen keine zusätzlichen, schädlichen
Nebenprodukte außer H+. Die Atome des Wasserstoffs werden vollständig auf das Substrat
übertragen und es ist keine aufwändige Trennung überflüssiger Nebenprodukte nötig
(Lauterbach, Lenz & Vincent, 2013)(Abbildung 4).
16
Abbildung 4. Schema der H2-abhängigen NADH-Regeneration
Diese Problematik tritt bei Verwendung der sauerstofftoleranten löslichen Hydrogenase aus
R. eutropha nicht auf.
Dabei konnte bereits gezeigt werden, dass die katalytische Effizienz sowie die spezifische
Aktivität der SH sogar die der häufig verwendeten Formiatdehydrogenase aus Candida boidii
übertreffen (Ratzka et al., 2012). Ein Nachteil ist allerdings die geringe Stabilität, die sich
vermutlich auf den komplexen molekularen Aufbau der SH aus verschiedenen Untereinheiten,
sowie die Anwesenheit mehrerer [FeS]-Clustern, Flavinen und des aktiven [NiFe]-Zentrums
zurückführen lässt. So weist die gereinigte SH unter den üblichen Reaktionsbedingungen von
35 °C bei pH 8 eine Halbwertszeit von 5,3 h auf. Erschwerend hinzu kommt die Sensibilität
der SH gegenüber Scherkräften und erhöhten Salzkonzentrationen.
Die Verringerung der SH-Aktivität und der Stabilität in verschiedenen organischen
Lösungsmitteln konnte durch Modifikation der SH mithilfe von methoxy-poly(Ethylen)-
Glykol (mPEG) bereits verbessert werden (Ratzka et al., 2012). Die mit mPEG-modifizierte
SH weist eine größere Toleranz gegenüber Lösungsmittel auf, die für den Einsatz in
technischen Anwendungen von Vorteil ist.
Auch Experimente mit den isolierten, an Graphit-Partikel adsorbierten NAD+-Reduktasemodul
der SH führten zur erfolgreichen Regeneration von NADH in Kombination einer ebenfalls
adsorbierten Hydrogenase (Reeve et al., 2015; Reeve et al., 2011). Dazu wurden die
Untereinheiten HoxFU der SH von dem Hydrogenasemodul getrennt isoliert und an
Graphitpartikel adsorbiert. Anstelle der SH-Hydrogenase wurde die stabilere Hydrogenase
Hyd2 aus E. coli ebenfalls an die Partikel adsorbiert. Da die Partikel elektrisch leitfähig sind,
können die Elektronen aus der Wasserstoffoxidation durch die Hydrogenase an das SH-NAD+-
Reduktasemodul weitergeleitet werden und dienen dort der Reduktion von NAD+. Dieser
modulare Aufbau ermöglicht die effiziente Regeneration von NADH, das dann für die Katalyse
einer Oxidoreduktase zur Verfügung steht.
17
Zur Regeneration von NADPH stehen bisher erst wenige Enzyme zur Verfügung. Beispiele
sind die Alkoholdehydrogenase aus Thermoanaerobium brockii (Lamed & Zeikus, 1981) oder
die Glucose-6-Phosphatdehydrogenase aus Bacillus (Wong et al., 1985).
In Folge der fortschreitenden Entwicklung von molekularen Methoden zur Proteinoptimierung
und –anpassung an „unnatürliche“ Substrate ergeben sich in der Biotechnologie viele neue
Möglichkeiten (Bornscheuer, 2001; Bornscheuer et al., 2012; Nestl et al., 2011). Diese werden
auch im Rahmen der Kofaktorregeneration genutzt, um das Substratspektrum bekannter
NAD(H)-abhängiger Dehydrogenasen zu erweitern. So wurden bereits mithilfe von
Strukturvergleichen und Aminosäureaustauschen Derivate der FDH entwickelt, die NADP(H)
als neues Substrat verwenden (Hoelsch et al., 2013; Tishkov & Popov, 2006; Tishkov et al.,
1999).
1.12 Fragestellung und Zielsetzung
Der Einsatz der SH als O2-tolerantes, kofaktorregenerierendes Enzym zeigte sich in
mehreren Beispielen erfolgreich, beschränkte sich aber auf die H2-abhängige Regeneration des
natürlichen Substrates NADH (Ratzka et al., 2011; Reeve et al., 2011, 2015; Lauterbach, Lenz
& Vincent, 2013; Holzer et al., 2015; Lonsdale et al., 2015). Das Ziel dieser Arbeit war die
SH-katalysierte, synthetische NADP+-Reduktionsaktivität weiter zu verbessern und ihre
Anwendung in enzym-gekoppelten Reaktionen zu testen. Im Vorfeld zeigten bereits
verschiedene SH-Derivate mit einzelnen Aminosäureaustauschen in der NAD+-Bindestelle ein
verändertes Substratspektrum (L. Lauterbach, 2013). Zusätzliche Optimierung des
Produktionssystems sowie das Einfügen konservierter Aminosäuremotive aus NADP(H)-
spezifischen Enzymen brachten die Anwendung der SH zur H2-abhängigen NADPH-
Regeneration weiter vor. Die kinetischen Parameter der resultierenden SH-Derivate sollten
bestimmt werden und einen Einblick in das Substratspektrum ermöglichen. Die Funktionalität
ausgewählter SH-Varianten mit synthetischer Affinität zu NADP+ wurde beispielhaft in
Kombination mit NADPH-abhängigen Enzymen belegt.
Die große Ähnlichkeit der Gensequenzen von bidirektionalen, löslichen [NiFe]-Hydrogenasen
sowie deren häufig konservierte Operonstruktur ermöglichte die Identifizierung von SH-
spezifischen Genen in Organismen besonderer Herkunft. So wurden HoxFUHYW-kodierende
Sequenzen in dem Genom des thermophilen Organismus Hydrogenophilus thermoluteolues
gefunden (L. Lauterbach, persönliche Mitteilung). Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die
18
heterologe Produktion der thermostabilen SH in Ralstonia eutropha und die anschließende
Proteinreinigung. Das isolierte Enzym wurde biochemisch und spektroskopisch charakterisiert.
Dies sollte das Verständnis über Vielfalt und Besonderheiten löslicher, bidirektionaler [NiFe]-
Hydrogenasen erweitern und damit helfen, grundlegende, gemeinsame Eigenschaften wie die
O2-Toleranz besser zu verstehen.
Um die charakteristischen, biochemischen Unterschiede zwischen SHs aus verschiedenen
Organismen näher zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit außerdem ein Produktionssystem
entworfen werden, welches die Kombination von HoxFU- und HoxHY-Modulen aus
verschiedenen Organismen zu heterotetrameren SH-Hybriden ermöglicht. Die heterologe
Produktion der heterotetrameren SH sowie deren getrennte Dimere aus Rhodococcus opacus
MR11 in Ralstonia eutropha wurde bereits erfolgreich durchgeführt (Porthun et al., 2002; K.
Karstens, 2014). Auf dieser Grundlage sollten die vorhandenen Plasmide zusätzlich zu
entsprechenden Konstrukten mit Ralstonia eutropha- und Hydrogenophilus thermoluteolus-
spezifischen Vektoren auf ihre Fähigkeit zur Bildung von funktionsfähigen SH-Hybriden
getestet werden.
19
2 Material und Methoden
2.1 Stämme und Plasmide
Die Stämme und Bakterienstämme, die im Rahmen dieser Arbeit verwendet wurden, sind
in Tabelle 1 aufgeführt. Für einfache Klonierungen wurden die E. coli-Stämme JM109
(Yanisch-Perron et al., 1985) und NEB-10beta (New England Biolabs) eingesetzt. Für den
konjugativen Plasmidtransfer wurde E. coli S17-1 (Simon et al., 1983) als Donor gebraucht.
Der Rezipientenstamm ist ein Derivat von R. eutropha H16, der durch die Buchstaben HF
gekennzeichnet ist.
Tabelle 1. Übersicht über die verwendeten Plasmide
Bezeichnung
Eigenschaften
Referenz
pLO1/pLO2
KmR, sacB, RP4 oriT, ColE1 ori
O. Lenz (1994)
pCM62
TetR, Plac , ColE1 ori, oriV, oriT
Marx (2001)
pCM66
KmR , Plac , ColE1 ori, oriV, oriT
Marx (2001)
Litmus 28
AmpR, ColE1 ori, M13 ori, Plac-lacZ’, BglII-KpnI-MCS
New England
Biolabs
pCH552
AmpR, lacZ‘ T7; ɸ10 Promoter, f1 ori; 15.0-kbp HindIII-Fragment von
pGE15 in pKS+ mit Deletion von 1.2-kbp-EcoRI-Fragment in hoxH
C. Massanz
(1998)
pCH591
AmpR, lacZ’, ColE1 ori; 0.26-kbp HindIII-NdeI-Fragment mit SH
Promoter (PSH)
L. Kleihues
(2000)
(#2904)
AmpR, ColE1 ori, M13 ori, 14.9-kbp-HindIII-Fragment mit strep-
hoxFUYHWhypA2B2F2CDEXhoxA’ aus R.e. H16 in LITMUS28/HindIII
J. Hamann/O.
Lenz
(unveröffentlicht)
pDAK94
TetR, 7.2 kbp-HpaI-FseI-Fragment aus pDAK91b mit PSH-strep-
RehoxF’-’RohoxFUYHWI’-RehypA2B2’in #3001/FseI+ScaI mit
Rehyp’B2F2CDEX
K. Karstens
(2014)
pDAK113.o1
TetR, 2.9 kbp-SpeI-Fragment aus pDAK109 mit PSH-strep- hoxFU’ aus
R.o. MR11 in XbaI-pEDY309 (TetR downstream der
Expressionskassette und in sense)
J. Hamann/ K.
Karstens (2014)
pDAK113.o2
TetR, 2.9 kbp-SpeI-Fragment aus pDAK109 mit PSH-strep- hoxFU aus
R.o. MR11 in XbaI-pEDY309 (TetR upstream der Expressionskassette
und in antisense)
J. Hamann/ K.
Karstens (2014)
pDAK114
TetR, 3 kbp-SpeI-Fragment aus pDAK110 mit PSH-strep- hoxYHW aus
R.o. MR11 in XbaI-pEDY309 (TetR downstream der
Expressionskassette und in sense)
J. Hamann/ K.
Karstens (2014)
pLL2000
KmR, ColE1 ori, M13 ori, PSH-hoxStrepFUYHW aus H.t. in pGE837
mittels Gibson Assembly
L. Lauterbach
(2018)
pJP09
TetR, 5.7 kbp-XbaI-Eco53KI-Fragment aus pLL2000 in XbaI-ScaI
pEDY309,PSH-hoxStrepFUYHW aus H.t.
Diese Arbeit
20
pJP66
KmR ; NdeI-ScaI-XbaI-BamHI-Fragment mit RehoxStrepFU aus (#2904)
in XbaI-BamHI-geschnittenen pCM 66
Diese Arbeit
pJP10
AmpR, XbaI-NcoI verdautes PCR-Produkt; #2904 als template
(RehoxHYW) in XbaI-NcoI-geschnittenen Vektor pCH591 (PSH)
Diese Arbeit
pJP62.2
TetR, 2.8 kbp-XbaI-HindIII-Fragment aus pJP10 in XbaI pCM62; PSH-
hoxYH aus R.e.
Diese Arbeit
pJP66.6
KmR, 2.8 kbp-XbaI-HindIII-Fragment aus pJP10 in XbaI pCM66; PSH-
hoxYHW aus R.e.
Diese Arbeit
pJP01
pJP66 mit hoxFD467S
Diese Arbeit
pJP02
pJP66 mit hoxFE341A
Diese Arbeit
pJP03
pJP66 mit hoxFE341A D467S
Diese Arbeit
pJP04
pJP66 mit hoxFE341A S342R
Diese Arbeit
pJP05
pJP66 mit hoxFE341A S342R D467S
Diese Arbeit
pJP06
pJP66 mit hoxFE341A S342R K358R
Diese Arbeit
pJP09 HY a
Deletion von 2.5 kbp- Fragment (∆hoxFU) in pLL2000 mittels
MegaWHOP-PCR
Diese Arbeit
pJP09 HY
TetR, 3.2 kbp xbaI-Eco53KI-Fragment aus pJP09 HY a in xbaI-scaI
pEDY309
Diese Arbeit
pJP09 FU a
Deletion von 2.1 kbp- Fragment (∆hoxHY) in pLL2000 mittels
MegaWHOP-PCR
Diese Arbeit
pJP09 FU
TetR, 3.6 kbp XbaI-Eco53KI-Fragment aus pJP09 FU a in XbaI-ScaI
pEDY309
Diese Arbeit
pJP11
1.2 kbp PCR-Produkt (∆hoxH) mit template pCH552 in EcoRV-pLO2
Diese Arbeit
pJP12 a
pLL2000 mit PSH-hoxStrepFUHis6YHW aus H.t.
Diese Arbeit
pJP12
TetR, 5.7 kbp xbaI-Eco53KI-Fragment aus pJP12 a in xbaI-scaI
pEDY309 PSH-hoxStrepFU His6YHW aus H.t.
Diese Arbeit
pJP13 a
pLL2000 mit PSH-hoxStrepFE319AS320RUYHW aus H.t.
Diese Arbeit
pJP13
TetR, 5.7 kbp xbaI-Eco53KI-Fragment aus pJP13 a in xbaI-scaI
pEDY309 PSH- hoxStrepFE319AS320RUYHW aus H.t.
Diese Arbeit
pJP14 a
pLL2000 mit PSH-hoxStrep*FUYHW aus H.t. (verkürzter N-terminaler
Linker zwischen strepII und hoxF)
Diese Arbeit
pJP14
TetR, 5.7 kbp xbaI-Eco53KI-Fragment aus pJP14 a in xbaI-scaI
pEDY309 PSH-hoxStrep*FUYHW aus H.t. (verkürzter n-terminaler Linker
zwischen strepII und hoxF)
Diese Arbeit
21
Tabelle 2. Übersicht über die verwendeten Bakterienstämme
Bezeichnung
Eigenschaften
Referenz
E. coli
NEB10-beta
recA1 endA1 fhuA lacX74 araD139, ∆(ara,leu)7697
lacZ∆M15 galE15 galK16 nupG rpsL::StrepR mrcA
∆(mrr-hsdRMS-mcrBC), F-
New England
Biolabs
JM109
recA1 endA1 supE44 gyrA96 thi hsdR17(rK - mK +)
relA1 ∆(lac-proAB) e14- mcrB+ F‘[traD36 proAB+ lacq
lacZ∆M15]
Yanisch-Perron et al.
(1985)
S17-1
StrepR, TetR, recA1 pro thi hsdR17(rK- mK +); RP4-2
tra-Gen chromosomal integriert
Simon et al. (1983)
Ralstonia eutropha
HF 500
∆hoxH, ∆hoxG, ∆hoxC (SH-,MBH-,RH-)
L. Kleihues (2000)
HF 500 (pJP62.2)
∆hoxH, ∆hoxG, ∆hoxC (SH-,MBH-,RH-)
RePSH-hoxHYW
Diese Arbeit
HF 500 (pJP66.6)
∆hoxH, ∆hoxG, ∆hoxC (SH-,MBH-,RH-)
RePSH-hoxHYW
Diese Arbeit
HF 500 (pJP 09 HY)
∆hoxH, ∆hoxG, ∆hoxC (SH-,MBH-,RH-)
RePSH-HthoxStrep-YHW
Diese Arbeit
HF 500 (pDAK114)
∆hoxH, ∆hoxG, ∆hoxC (SH-,MBH-,RH-)
RePSH-RohoxStrep-YHW
Diese Arbeit
HF 798
∆hoxG; ∆hoxC (MBH -SH+)
Horch und
Lauterbach (2010)
HF 903
∆hoxFU (MBH-SH-)
Lauterbach (2011)
HF 903 (pJP66)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP01)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFD467SU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP02)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFE341AU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP03)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFE341A D467SU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP04)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFE341A S342RU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP05)
∆hoxFU (MBH-SH-)
Diese Arbeit
22
RePSH-hoxStrepFE341A S342R D467SU
HF 903 (pJP06)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-hoxStrepFE341A S342R K358RU
Diese Arbeit
HF 903 (pDAK113.o1)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-RohoxStrepFU
Diese Arbeit
HF 903 (pDAK113.o2)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-RohoxStrepFU
Diese Arbeit
HF 903 (pJP09 FU)
∆hoxFU (MBH-SH-)
RePSH-HthoxStrepFU
Diese Arbeit
HF 1009
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, strep-hoxF
K. Karstens (2015)
HF 1009 ∆hoxH
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, ∆hoxH, strep-hoxF
Diese Arbeit
HF 1009 ∆hoxH (pJP62.2)
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, ∆hoxH, strep-hoxF
RePSH-hoxHYW (um 46 bp verkürztes hoxY)
Diese Arbeit
HF 1009 ∆hoxH (pJP66.6)
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, ∆hoxH, strep-hoxF
RePSH-hoxHYW (um 46 bp verkürztes hoxY)
Diese Arbeit
HF 1009 ∆hoxH (pJP09 HY)
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, ∆hoxH, strep-hoxF
RePSH-HthoxStrep-YHW
Diese Arbeit
HF 1009 ∆hoxH (pDAK114)
∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, ∆hoxH, strep-hoxF
RePSH-RohoxStrep-YHW
Diese Arbeit
HF 1054
∆hoxG, ∆hoxFUYHW‘, ∆hoxI (Deletion von 330 bp
zwischen NarI und MroI)
J. Hamann/ K.
Karstens/ L.
Lauterbach
(unveröffentlicht)
HF 1054 (pJP09)
∆hoxG, ∆hoxFUYHW‘, ∆hoxI (Deletion von 330 bp
zwischen NarI und MroI)
RePSH-HthoxStrep-FUYHW
Diese Arbeit
23
2.2 Zellkultivierung
2.2.1 Nährmedien
Die Kultivierung und Anzucht von Escherichia coli-Stämmen wurden stets in sterilen,
autoklavierten Schüttel-oder Schikanekolben durchgeführt, deren Größe etwa dem fünffachen
Volumen des Mediums entspricht. Dieses Verhältnis gewährleistet eine optimale
Sauerstoffversorgung der Zellen während der Kultivierung auf dem Schüttler.
Um gewünschte Plasmide zu amplifizieren und anschließend zu isolieren wurden Kulturen mit
den entsprechenden E. coli-Stämmen, die das Plasmid enthalten, in LB-Medium angeimpft. Je
nachdem welche Antibiotikaresistenz von dem Plasmid codiert wird, wurde das jeweilige
Antibiotikum zum Medium zugegeben (Tabelle 4). Handelte es sich bei dem Plasmid um ein
low-copy-Plasmid wurden 100 mL-Kulturen in 500 mL-Schüttelkolben angezogen. Bei high-
copy-Plasmiden genügten 10 mL-Kulturen in 100 mL-Schüttelkolben, um bei der Isolierung
eine ausreichend hohe Konzentration des Plasmids zu erhalten.
Die Anzucht von Kulturen für die Herstellung kompetenter Zellen wird unter 2.9. beschrieben.
Die Kolben werden bei 37 °C und 250 rpm geschüttelt.
Für das heterotrophe Wachstum von Ralstonia eutropha-Stämmen wurde NB-, LSLB-Sac-
(Lenz et al., 1994), Fruktose- (FN) oder Fruktose-Gylcerin-Minimalmedium (FGN) (Friedrich
et al., 1982) verwendet. Autotrophes Wachstum wurde in Mineralmedium ohne Zusatz einer
Kohlenstoffquelle getestet (AutN).
Zur Herstellung fester Medien wurde 1,2 % (w/ v) Agar-Agar (Roth) bzw. für Minimalmedien
Reinst-Agar (Difco Bacto™ Agar) zu dem Ansatz des flüssigen Mediums zugesetzt und durch
Autoklavieren gelöst, so dass es danach in Platten gegossen werden konnte.
Die verschiedenen Medien setzen sich, wie in folgender Tabelle ersichtlich, zusammen:
24
Tabelle 3. Zusammensetzung der Kultivierungsmedien
Medium
Substanzen
Finale Konzentration
LB
Bacto Trypton
1 % w/v
Bacto Yeast Extract
0.5 % w/v
NaCl
0.5 % w/v
ad 1000 mL ddH2O
LSLB
Bacto Trypton
1 % w/v
Bacto Yeast Extract
0.5 % w/v
NaCl
0.25 % w/v
ad 1000 mL ddH2O
LB-Sac
Bacto Trypton
1 % w/v
Bacto Yeast Extract
0.5 % w/v
NaCl
0.25 % w/v
Saccharose
15 % w/v
ad 1000 mL ddH2O
NB
Nutrient Broth
0.8 % w/v
ad 1000 mL ddH2O
SOC
Bacto Trypton
2 % w/v
Bacto Yeast Extract
0.5 % w/v
NaCl
0.05 % w/v
KCl
2.5 mM
MgCl2
0.01 M
Glukose
0.02 M
ad 1000 mL ddH2O
AutN
Na2HPO4 x 12 H2O
25.1 mM
KH2PO4
11 mM
MgSO4 x 7 H2O
0.81 mM
CaCl2 x 2 H2O
0.068 mM
FeCl3 x 6 H2O
18 µM
NiCl2 x 6 H2O
1 µM
NH4Cl
37. 4 mM
FN
Fruktose
0.4 % w/v
FGN
Fruktose
0.2 % w/v
Glycerin
0.2 % w/v
FGNmod
Fruktose
0.05 % w/v
Glycerin
0.4 % w/v
ad 1000 mL ddH2O
25
Tabelle 4. Konzentrationen der verwendeten Antibiotika
Antibiotikum
Abkürzung
Arbeitskonzentration [µg ∙ mL-1]
Stammlösungskonzentration [mg ∙ mL-1]
E. coli
R. eutropha
Ampicillin
Amp
50
-
100 in ddH2O
Kanamycin
Km
50
350
30 oder 100 in ddH2O
Tetrazyklin
Tet
10
10-15
10-15 in 80 % v/v Ethanol
2.2.2 Bestimmung der Wachstumsparameter
Das Wachstumsverhalten von flüssigen Kulturen wurde durch Absorptionsmessung bei
einer geeigneten Wellenlänge im Spektrophotometer (Hitachi, U-2000) beobachtet. Die
optische Dichte von E. coli-Lösungen wurde bei 578 oder 600 nm nach Messung der
Absorption des unbewachsenen Mediums bestimmt. Für Kulturen mit R. eutropha wurde die
Wellenlänge 436 nm und H16-Puffer als Leerwert verwendet. Es wurden 1 mL Probenvolumen
in Küvetten mit einer Schichtdicke von 1 cm benutzt. Die Zellproben wurden gegebenenfalls
verdünnt, so dass die Absorption unter 0.5 liegt.
2.2.3 Kultivierung und Wachstum von Ralstonia eutropha
Bei der Kultivierung von Ralstonia eutropha wurden unterschiedliche Medien
verwendet, die an die gewünschte Wachstumsart angepasst wurden. Für heterotrophes
Wachstum, das z.B. zur nachfolgenden Isolierung von Plasmiden geeignet ist, wurde LSLB-,
NB- oder FN-Medium verwendet. Da das Wachstum in FN langsamer erfolgt als in NB wurden
über-Nachtkulturen häufig in NB angeimpft. Sollte jedoch die Aktivität der löslichen
Hydrogenase bestimmt werden, wurde die Kultivierung auf deren Expression in der späten
Wachstumsphase ausgerichtet. Die Vorkultur wurde dazu in FN angezogen, aus der nach 2-3
Tagen Wachstum bei 30 °C die FGN-Hauptkultur im Verhältnis 1:100 angeimpft und mit einer
Füllhöhe von 80 % bei 120 rpm und 30 °C inkubiert wird. Nach erneutem Wachstum für etwa
7 Tage sollte die OD436 dann über 10 liegen und die Zellen können geerntet werden.
Das autotrophe Wachstum, bei dem CO2-als einzige C-und H2 als Energiequelle dienen,
erfolgte auf Platten aus Minimalmedium in einem Exsikkator, der mit den entsprechenden
Gasen gefüllt wurde. Die Zusammensetzung betrug dabei 10 % CO2, 10 % O2, 10 % H2 und
70 % N2.
26
Da die verwendeten R. eutropha – Stämme bereits eine Kanamycin-Resistenz genomisch
kodieren, musste nach dem Einbringen von Plasmiden mit zusätzlichem Kanamycin-
Resistenzgen die Antibiotikakonzentration im Medium erhöht werden, um die Selektion des
Plasmides zu gewährleisten. So wurde die Arbeitskonzentration von Kanamycin im Medium
auf 350 µg ∙ mL-1 erhöht.
2.2.4 Zellernte
Die Ernte der Zellkulturen erfolgte stets in gekühlten Zentrifugen. Kulturen mit
Volumina bis 3 mL wurden in 1.5- oder 2 mL-Eppendorf-Gefäßen in einer Tischzentrifuge
(Heraeus™ Fresco™ 17) für 2 min bei 13000 rpm geerntet. Zellkulturen mit größeren
Volumina bis 50 mL wurden in Falcon-Gefäßen in einer Megafuge (Thermo Scientific™
Heraeus™ Megafuge™ 16) bei 5800 ∙ g für 15 min abzentrifugiert. Große Kulturvolumina
wurden bei 6800 ∙ g für 16 min in einer Standzentrifuge (Beckman Coulter Avanti® J-20 XP)
geerntet und nach dem Wiegen des Pellet-Nassgewichtes in flüssigem N2 schockgefroren.
2.2.5 Lagerung und Konservierung von Bakterienstämmen
Die geernteten Zellen wurden bei -80 °C gelagert. Auf LB-Platten ausgestrichene E. coli-
Stämme wurden etwa 4 Wochen gekühlt bei 4 °C aufbewahrt. R. eutropha-Stämme, die auf
Minimalmedien gewachsen sind, konnten längere Zeit bei 4 °C gelagert werden. Von
Einzelkolonien angeimpfte Flüssigkulturen in Selektionsmedium wurden nach 1- 2 Tagen
Wachstum zum Herstellen eines Glycerinstocks verwendet. Dazu wurden 1.65 mL der
Bakterienkultur mit 0.35 mL Glycerin in sterilen 2 mL-Cryo-Glasröhrchen gemischt und bei -
80 °C gelagert. Mit einer sterilen Impföse wurde dieses Zellmaterial zum Animpfen von
Vorkulturen genutzt.
2.3 Proteinreinigung
2.3.1 Aerobe Affinitätschromatographie zur Isolierung von StrepII®-tag-tragenden
SH-Derivaten
Die Reinigung verschiedener StrepII-tag-tragender SH-Varianten mittels Strep-Tactin-
Affinitätschromatographie erfolgte nach Anzucht der entsprechenden Stämme aus Tabelle 2
unter heterotrophen Wachstumsbedingungen bis eine OD436>10 erreicht wurde. Die geernteten
Zellen wurden auf Eis mit dem jeweiligen Puffer unter Rühren mithilfe eines Rührfischs
27
resuspendiert. Dazu wurden pro 1 g Zellmaterial 3 mL des Puffers verwendet. Je nach SH-
Derivat wurde das jeweilige Puffersystem angepasst und der entsprechende Puffer verwendet
(Tabelle 5). Alle Schritte der Reinigung erfolgten unter gekühlten Bedingungen bzw. wurden
im Kühlraum durchgeführt.
Die resuspendierten Zellen wurden mit 2-3 Passagen durch die gekühlte French-press-Zelle
mit 125 MPa aufgeschlossen und der lösliche Extrakt durch anschließende Zentrifugation bei
72500 ∙ g und 4°C für 45 min in der Ultrazentrifuge (Beckman Coulter Optima XE-90) von
den Zelltrümmern getrennt. Der lösliche Extrakt wurde vorsichtig in ein Gefäß überführt und
auf eine mit dem Grundpuffer äquilibrierte Strep-Tactin-Superflow oder -High-Capacity-Säule
(IBA Göttingen) aufgetragen. Pro 20 mL löslicher Extrakt wurde 1 mL Bettvolumen
verwendet. Der Durchlauf wurde insbesondere für die SH-Chimären und die HtSH ein weiteres
Mal auf die Säule aufgebracht, um die Ausbeute zu erhöhen. Danach erfolgte das Waschen der
Säule mit mind. 10 Säulenvolumina des Waschpuffers. Eluiert wurde mit einem Puffer, der 3-
5 mM Desthiobiotin enthält. Das SH- enthaltende Eluat wurde mittels Ultrafiltration in
Filtereinheiten mit einem molekularen Ausschlussvolumen (MWCO „molecular weight cut
off“) von 100 kDa bei maximal 3200 ∙ g konzentriert und in Aliquotes nach Einfrieren in
flüssigem N2 bei -80 °C gelagert.
Die Regeneration der Strep-Tactin-Säulen erfolgt mit 10 Säulenvolumen 0.1 M NaOH und dem
nachfolgenden Waschen mit 50 mM Tris pH 8 bzw. 50 mM KPOi pH 7.
Tabelle 5. Verwendete Puffer und Lösungen für die Reinigung verschiedener SH-Derivate
ReSH (heterotetramer)
HtSH
SH-Chimäre
Anaerob
(HtSH und HtHY/
ReFU)
Reinigungsschritt
Grundpuffer (GP)
50 mM Tris, pH 8, 5 %
(v/v) Glycerin, 150 mM
KCl
50 mM KPOi, pH 7.2,
15–20 % (v/v) Glycerin,
5mM MgCl2, 0.5 mM
NiCl2
50 mM KPOi, pH 7, 15
%(v/v) Glycerin
50 mM KPOi, pH 7, 15–
20 %(v/v) Glycerin,
5mM MgCl2, 0.5 mM
NiCl2
Resuspension
GP
+ 5 mM NAD+, EDTA-
freier Protease-Inhibitor
(Roche)
GP
+ 5 mM NAD+, EDTA-
freier Protease-Inhibitor
(Roche)
GP
+ EDTA-freier
Protease-Inhibitor
(Roche)
GP
+ 3 mM Na-Dithionit
EDTA-freier Protease-
Inhibitor (Roche)
Elution
GP
+ 5 mM Desthiobiotin
GP
+ 5 mM Desthiobiotin
GP
+ 3 mM Desthiobiotin
GP
+ 3 mM Desthiobiotin
Säulen-
Regeneration
0.1 M NaOH
0.1 M NaOH
0.1 M NaOH
0.1 M NaOH
28
2.3.2 Anaerobe Affinitätschromatographie zur Isolierung von StrepII®-tag-tragenden
HtSH-Derivaten und der HtHY/ReFU-Chimäre
Für die anaerobe Reinigung der löslichen Hydrogenase aus Hydrogenophilus
thermoluteolus wurde zu dem Zellpellet mit N2 anaerobisierter Resuspensionspuffer
zugegeben und die Zellen auf Eis unter Überschichtung mit Argon aufgetaut. Ein Gefäß für die
Ultrazentrifuge, sowie zwei 50 mL-Falcon-Gefäßen werden mit Argon gefüllt und dicht
verschlossen.
Die Zellsuspension wurde dreimal durch die Presse passagiert und nach jeder Passage in ein
frisches, anaerobes Gefäß überführt. Nach der letzten Passage wurde das
Ultrazentrifugenröhrchen nochmal mit Argon überschichtet. Anschließend erfolgt die
Ultrazentrifugation wie unter 2.3.1 beschrieben.
Parallel zur Zentrifugation wurden eine Strep-Tactin-Säule sowie die benötigten Puffer in der
anaeroben Box äquilibriert. Nach der Zentrifugation wurde der lösliche Extrakt in ein mit
Argon gefülltes Gefäß überführt und in die anaerobe Box eingeschleust. Die Reinigung über
die Strep-Tactin-Säulen erfolgt wie in 2.3.1 angegeben, jedoch innerhalb der anaeroben Box
bei etwa 9 °C in einer Atmosphäre aus 95% N2 und 5 % H2.
2.3.3 Größenausschlusschromatographie der HtSH
Da die Untereinheiten der eluierten HtSH nach der Affinitätschromatographie nicht
stöchiometrisch homogen im SDS-Gel erschienen, wurde anschließend eine
Größenausschlusschromatographie durchgeführt. Insbesondere für die Proben, die zur
Kristallisation und Spektroskopie verwendet werden sollten, ist eine hohe Reinheit der
heterotetrameren HtSH wichtig. Für die Größenausschlusschromatographie, die Proteinproben
anhand ihres Molekulargewichtes auftrennt, wurden 200 µL-Aliquotes der konzentrierten
HtSH-Probe (etwa 20 mg ∙ mL-1) nach Affinitätschromatographie auf eine äquilibrierte
Superdex 200 10/300 GL Säule aufgetragen. Mithilfe des ÄKTA pure Systems wurde eine
Flussrate von 0.2 mL ∙ min-1 eingestellt. Die Elution der heterotetrameren HtSH nach etwa
0.3 Säulenvolumina wurde durch UV/Vis Absorptionsmessung bei den Wellenlängen 280 nm
und 420 nm beobachtet. Fraktionen, die sowohl proteinspezifisch bei 280 nm wie auch für
[FeS]-Zentren typisch bei 420 nm hohe Absorptionssignale zeigten, wurden in 400 µL-
Aliquotes gesammelt und die spezifische, H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität gemessen
sowie die Zusammensetzung der Untereinheiten durch SDS-Gelelektrophorese analysiert.
29
Fraktionen mit höchsten spezifischen Reduktionsaktivitäten wurden vereinigt und mithilfe der
Filtrationseinheiten wie unter 2.3.1 beschrieben konzentriert.
Sollten die Proben biochemisch oder spektroskopisch untersucht werden, wurde zur
Größenausschlusschromatographie der gleiche Puffer wie zur Affinitätschromatographie
verwendet. Proben, die für die Kristallisation verwendet wurden, wurden überwiegend in Tris-
basierten Puffern gereinigt, um die spätere Bildung von Phosphatkristallen zu verhindern.
2.4 Probenanalytik
2.4.1 Bestimmung der Proteinkonzentration
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration in den verschiedenen Fraktionen des
Reinigungsprotokolls wurde der BCA-Assay durchgeführt. Das BCA™Kit (Pierce, Thermo
Fisher Scientific, USA) wurde nach Herstellerangaben verwendet. Die Proben wurden
gegebenenfalls verdünnt und parallel zu einer Standardreihe aus BSA-Lösungen mit bekannter
Konzentration in eine 96-well-Mikrotiterplatte pipettiert. Die Zugabe von je 200 µL der frisch
angesetzten Mischung aus Reagenz A und B startet die proteinabhängige Farbreaktion. Dabei
werden Cu2+-Ionen der Lösung zu Cu+-Ionen reduziert, die mit Bicinchoninsäure (BCA) einen
violetten Farbkomplex bilden. Die Auswertung erfolgte durch Absorptionsmessung bei
562 nm im Mikrotiterplattenlesegerät SpectraMax 340 (Molecular Devices, USA). Anhand der
erstellten Eichgerade konnten die entsprechenden Konzentrationen durch Drei-oder
Mehrfachbestimmung ermittelt werden.
2.4.2 Messung der H2-abhängigen NAD(P)+-Reduktionsaktivität
Die Messung der H2-abhängigen NAD(P)+-Reduktionsaktivitäten wurde je nach
Akzeptor der beobachteten Reaktion in 2 mL-bzw. 200 µL-Reaktionsansätzen mit
entsprechenden Küvetten durchgeführt. Beobachtet wurde die SH-spezifische reduzierende
Aktivität von NAD+ bzw. NADP+ zu NADH bzw. NADPH bei 365 nm (εNAD(P)H =
3.43 mL ∙ cm-1 µmol-1, Bergmeyer, H. U., 1983) unter H2-Spaltung (Schneider & Schlegel,
1976). Bei der Verwendung von NADP+ als Substrat wurde häufig der kleinere
Reaktionsansatz gewählt. Die Messung erfolgte hierbei im UV-Vis-Spektrophotometer des
Typs Cary 300 von Varian™.
Die Untersuchung der Reaktionen mit NAD+ als Substrat erfolgte in 2 mL-Reaktionsansätzen
im UV-Vis-Spektrophotometer des Typs Cary 50 ebenfalls von Varian™.
30
Die Messungen der H2-abhängigen Kofaktorreduktion erfolgte in verschlossenen Küvetten mit
H2-gesättigtem Puffer. Für die SH-Varianten von Ralstonia eutropha sowie Rhodococcus
opacus und die entsprechenden chimären SH-Derivate wurde 50 mM Tris-HCl, pH 8 mit 1 mM
DTT oder 0.75 mM TCEP, 1 µM FMN sowie 1 mM NAD+ bzw. 2 mM NADP+ bei 30 °C
verwendet. Die Aktivitätsmessungen der SH aus Hydrogenophilus thermoluteolus wurden in
50 mM Bis-Tris, pH 6.5 mit 0.75 mM TCEP, 0.5 mM NiCl2, 5 mM MgCl2 und 2 µM FMN bei
50 °C durchgeführt.
Wurden zusätzliche Salzlösungen zu den Reaktionsansätzen zugefügt, wurde stets TCEP
verwendet, um ein Ausfällen der Salze durch DTT zu verhindern.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5-25 µL der SH-Probe gestartet.
Die Messung der SH-spezifischen Reduktion von NAD+ unter H2-Spaltung mit CTAB-
lysierten Zellen wurde nach dem Protokoll von Friedrich et al. (1981) mit etwa 1 OD436-
Äquivalenten durchgeführt.
Nach der Messung wurde die Steigung im linearen Bereich des Reaktionsverlaufes bestimmt.
Sie gibt die zeitliche Veränderung der Absorption wieder. Daraus lässt sich anschließend unter
Berücksichtigung des Extinktionskoeffizienten und der verwendeten Proteinmenge die
spezifische Aktiviät (U ∙ mg-1) berechnen. Dazu wurde die folgende Formel angewendet:
𝑠𝑝𝑒𝑧𝑖𝑓𝑖𝑠𝑐ℎ𝑒 𝐴𝑘𝑡𝑖𝑣𝑖𝑡ä𝑡 (𝑈 ∙ 𝑚𝑔−1)=
𝑉
𝑔𝑒𝑠𝑎𝑚𝑡
𝑉𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒 ∙ A
𝑡
ε ∙ cm ∙ 𝑐𝑃𝑟𝑜𝑏𝑒
Vgesamt= Volumen des Reaktionsansatzes; VProbe= Volumen der eingesetzten Probe; A/t= Absorptionsänderung;
ε= Extinktionskoeffizient bei der verwendeten Wellenlänge; cProbe= Proteinkonzentration der verwendeten Probe
Zur Auswertung der Messungen wurde das Programm CaryWin (Varian™) verwendet. Die
Angabe von Enzymaktivitäten erfolgte in internationalen Einheiten (Units/ U). Eine Einheit
(U) ist definiert als die Enzymmenge, die 1 μmol Substrat pro min umsetzt, bzw. 1 μmol
Produkt pro min bildet.
Um den KM-Wert der Reaktion zu erhalten, wurden die Messungen mit variierender
Substratkonzentration wiederholt und mithilfe des Programms „SigmaPlot“ ausgewertet.
31
2.4.3 Messung der NAD(P)H-abhängigen Benzylviologen-Reduktionsaktivität
Für die Messung der NAD(P)H-abhängigen Reduktion von Banzylviologen (BV)
wurde 5 mM Benzylviologen als Elektronenakzeptor dem Reaktionsansatz zugefügt. Dieser
enthielt außerdem 90 µM Dithionit und die Substrate 1 mM NADH bzw. NADPH. Um den
Ansatz anaerob zu halten, wurde nach Verschließen der Küvette mit N2 begast. Der Puffer
wurde der SH-Variante angepasst, d.h. 50 mM Tris pH 8 für ReSH, RoSH und die
entsprechenden Chimären und 50 mM Bis-Tris pH 6.5 für HtSH-Proben.
Die Reaktionen wurden durch Zugabe von 0.4-5 µg der Hydrogenaseprobe gestartet und
spektroskopisch bei einer Wellenlänge von 578 nm (εBV= 8.9 mL ∙ cm-1 µmol-1) bei 30 °C bzw.
50 °C verfolgt.
2.4.4 Messung der H2-abhängigen Benzylviologen-Reduktionsaktivität
Die Hydrogenaseaktivität der SH-Derivate wurde als H2-abhängige Benzylviologen
(BV)- Reduktionsaktivität photometrisch bei 578 nm (εBV = 8.9 mL ∙ cm-1 µmol-1) und 30 °C
bzw. 50 °C bestimmt (Schneider und Schlegel, 1976). Die mit Septen luftdichtverschlossenen
Küvetten enthielten 2 ml-Ansätze mit 25 µM NADH, 2,4 mM BV und isolierter SH-Probe in
H2-gesättigtem Puffer.
2.4.5 Messung der NADH-abhängigen H2-Produktion
Die H2-Produktion wurde amperometrisch in der invertierten Clark-Elektrode
(modifizierter Oxygraph, Hansatech Instruments) verfolgt (Wang et al., 1971). Dazu wurde die
Reaktionskammer vollständig mit 1.3 mL N2-gesättigter Puffer mit 5 mM NADH, 7 mM
Natriumdithionit (DT) und 1-5 µg Proteinkomplex gefüllt und die H2-Entstehung online
verfolgt. Eine Kalibrierung erfolgte durch die Messung der Stromstärken-Zunahme bei Zugabe
von 100 µL H2-gesättigter Puffer zu 1.2 mL N2-gesättigtem Reaktionsansatz.
32
2.4.6 Aufnahme von UV/Vis Absorptionsspektren
Die Aufnahme von UV-VIS-Spektren erfolgte im Zweistrahl-UV-VIS-Spektrometer
(Referenz-UV-Vis/NIR-Spektrophotometer des Typs Cary 5000 von Varian™, Palo Alto,
USA). Die Messung erfolgte in 100-µL-Quarzküvetten (Varian, optische Weglänge 1 cm) bei
RT und einer Scangeschwindigkeit von 600 nm pro min im Wellenlängenbereich von 200 –
700 nm. Als Leerwert diente der jeweilige Lagerungspuffer. Für Messungen des Spektrums
einer oxidierten Probe wurden 100 µL der Probe direkt nach der Reinigung (as isolated)
eingesetzt. Zur Reduktion wurde die gleiche Probe mit einem Gummiseptum luftdicht
verschlossen und mit N2 begast. Dann wurden 1 mM NADH und 0.75 mM TCEP zugefügt.
Alternativ erfolgt die Reduktion durch Begasung von H2.
2.4.7 Bestimmung des FMN-Gehalts
Für die Bestimmung des FMN-Gehalts isolierter SH-Proben wurde nach einem
modifizierten Protokoll von Schneider und Schlegel (1976) vorgegangen. Durch Fällung der
Proteine mit Trichloressigsäure wurden die FMN-Kofaktoren aus dem Proteinkomplex
extrahiert. Hierzu wurden 45 µL Probe mit dem gleichen Volumen an 20 %-iger (w/v)
Trichloressigsäure versetzt und 15 min auf Eis inkubiert. Nach 5-minütiger Zentrifugation bei
10000 ∙ g wurden 80 µL des Überstand durch Zugabe von 30 µL KH2PO4-Lösung (4 M)
neutralisiert. Die FMN- Konzentration der Extrakte wurde im direkten Vergleich mit einer
ebenso behandelten Standardreihe aus kommerziell erhältlichem FMN (0.05-20 µM FMN)
bestimmt. Hierzu wurde die Fluoreszenz der neutralisierten Extrakte mit dem Infinite 200
Plattenleser (Tecan, USA) bei einer Anregungswellenlänge von 430 nm und einer
Emissionswellenlänge von 526 nm (cut-off bei 515 nm, bottom-read) in einer
schwarzwandigen Mikrotiterplatte (BRAND platesTM) gemessen. Die ermittelte FMN-
Konzentration wurde mit der Konzentration der für die Extraktion eingesetzten Proteinlösung
ins Verhältnis gesetzt.
2.4.8 Bestimmung des Metallgehalts
Der Gehalt der Metalle Eisen und Nickel in gereinigten Proteinproben der HtSH wurde
durch optische Emissionsspektrometrie mittels induktiv gekoppeltem Plasma (ICP-OES;
Optima 2100 DV, Perkin Elmer) unter Verwendung einer Multi-Element Standardlösung XVI
33
(Merck) als Referenz quantifiziert. Die Bestimmungen wurden von der Arbeitsgruppe Prof.
Silke Leimkühler, Universität Potsdam, durchgeführt.
2.4.9 Kristallisation
Um die Proteinstruktur der SH mittels Röntgenstrukturanalyse zu lösen, sind
Proteinkristalle notwendig. Diese entstehen durch die langsame Präzipitation des gelösten,
gereinigten Proteins mithilfe von anorganischen Salzen oder/ und organischen Verbindungen.
Dabei gibt es zwei unterschiedliche Methoden, die zum Herabsetzen der Proteinlöslichkeit
genutzt werden. Je nach Position des Tropfens, der die Proteinlösung und das
Präzipitationsmittel enthält, wird zwischen hängendem („hanging drop“) und sitzendem
(„sitting drop“) Tropfen unterschieden. Die Kristallisationsplatte enthält mehrere Kammern,
die mit der Präzipitationslösung gefüllt und nach Ansetzen der Kristallisationstropfen luftdicht
verschlossen werden. Der hängende Tropfen befindet sich dabei auf dem Deckglas, das zum
Verschließen der Kammer genutzt wird. Zum Ansetzen eines sitzenden Tropfens wird eine
Mikro-Brücke in die Kammer gestellt und der Tropfen darauf in einer Vertiefung aufgebracht.
Da die Atmosphäre in der luftdicht verschlossenen Kammer mit dem Präzipitationsmittel
gesättigt ist, werden der Proteinlösung H2O-Moleküle entzogen, was so zum langsamen
Ausfallen der Proteine führt.
Die Kristallisation der frischen HtSH-Proben nach Strep-Tactin- und
Größenausschlusschromatographie wurde in Kooperation mit Dr. Patrick Scheerer und Andrea
Schmidt am Institut für Medizinische Physik und Biophysik der Charité-Universitätsmedizin
Berlin durchgeführt. Zunächst wurden verschiedene kommerziell erhältliche Puffersysteme
wie JBScreen Classic, Cryo2, Basic, Wizard, Kinase etc. (Jena Bioscience), Index, PEGRx und
Crystal (Hampton Research) sowie die in Taketa et al. (2015) publizierten Bedingungen für
die Kristallisation getestet. Es wurden 24-well-Linbro-Kristallisationsplatten unter aeroben
Bedingungen bei 4, 6, 8, 10, 18, 25 und 45 °C sowie anaerob bei 9.2- 10 °C inkubiert. Die
getesteten Konzentrationen der HtSH-Proben waren 7-25 mg ∙ mL-1.
Bei Verwendung von 0.1M HEPES Puffer, pH 7.0-7.8 und verschiedenen Polyethylenglycolen
(PEG3350-6000) bei 5-15% im Verhältnis 1:1.25 (Präzipitanz:Proteinlösung) sind Kristalle
nach frühestens zwei Wochen bei 4°C (aerob) erkennbar gewesen. Anaerob bildeten sich
stäbchenförmige Kristalle nach 3 Monaten bis zu einem Jahr Inkubationszeit.
34
Die Kristalle wurden mit 0.2 – 1.0 mm Nylonschlingen mit Magnetbasis, die man zur
Kristalljustage auf einem Goniometerkopf benötigt, geerntet und in flüssigem Stickstoff
eingefroren. Messung der Röntgenbeugung der Proteinkristalle erfolgte am European
Synchrotron Radiation Facility (ESRF, Grenoble) mit der Beamline ID23_2 (Gabadinho et. al,
2010).
2.5 Elektrochemische Untersuchung der ReSH
Die elektrochemischen Experimente zur Untersuchung der katalytischen Eigenschaften
der ReSH-Varianten wurden in Kooperation mit der AG von Prof. Kylie Vincent am
Department of Chemistry der University of Oxford durchgeführt.
2.5.1 Elektrochemische Aktivitätsmessung der löslichen, NAD+-reduzierenden
Hydrogenase
Die Umsetzung der Substrate NAD(P)+/ NAD(P)H durch die NAD+-reduzierende
Hydrogenase kann neben der photometrischen Messung auch mithilfe elektrochemischer
Methoden verfolgt werden. Fraser Armstrong führte zur Untersuchung der Katalyse durch
Redoxenzyme die Proteinfilmvoltametrie ein, die den direkten Elektronentransport durch das
Enzym an einer Elektrodenoberfläche messbar macht (Armstrong, 2002). Dazu wird das
gereinigte Protein an eine Elektrode adsorbiert und eine geeignete Spannung angebracht.
Vorausgesetzt die Katalyse durch das Enzym ist nicht von intramolekularem
Elektronentransfer oder Massentransport des Substrats/ Produkts limitiert, kann die gemessene
Stromstärke als Maß der katalytischen Aktivität betrachtet werden. Je höher der auftretende
Strom, desto höher ist die Enzymaktivität.
Der Aufbau der Messapparatur besteht aus verschiedenen Elektroden, die in einer
Anaerobenbox (O2 < 2 ppm; M. Braun, Deutschland) aufgebaut und an einen Potentiostat
(Autolab PGstat128N, EcoChemie, Niederlande), der die elektrischen Parameter kontrolliert,
angeschlossen werden. Die Messelektrode, ein dünner Draht aus Platin, misst die entstehenden
Ströme, die von Redoxreaktionen an der pyrolythischen Graphitelektrode (engl.: „pyrolitic
graphite electrode“, PGE) resultieren. Eine Referenzelektrode, deren Spannung während der
Messung konstant bleibt, wird ebenfalls benötigt. Für die Adsorption des Enzyms wird die
PGE-Arbeitselektrode zunächst mit einer wässrigen α-Aluminiumoxid-Suspension (1 μm,
Buehler, Germany) poliert, in einem Wasserbad für etwa 30 s sonifiziert und mit
35
demineralisiertem Wasser abgespült. Auf die trockene, etwa 0.03 cm2 große Elektrodenfläche
werden dann 0.7 µL der Proteinlösung aufgebracht.
In einem speziellen Glasgefäß mit drei Öffnungen werden 3 mL des Reaktionspuffers (50 mM
Bis-Tris, pH 6) vorgelegt und die Elektroden angebracht. Um eine gute Verteilung des
Substrats bzw. Produkts in dem Reaktionsansatz während der Messung zu gewährleisten wird
die Arbeitselektrode mithilfe eines Rotators (Autolab RDE, EcoChemie, Niederlande) mit etwa
1800 rpm rotiert.
Durch Verbindung des Potentiostat an einen Computer werden mithilfe der Software GPES
(EcoChemie) die elekrochemischen Parameter eingestellt, kontrolliert und die gemessenen
Werte in Diagrammen dargestellt.
2.5.2 Zyklische Voltammetrie
Eine Anwendung der Proteinfilmvoltammetrie ist die zyklische Voltammetrie (engl.:
„cyclic voltammetry“, CV), bei der die angelegte Spannung der Arbeitselektrode auf der das
Enzym adorbiert ist, kontinuierlich variiert wird und die resultierende Stromstärke
aufgenommen wird. Dadurch ändert sich das Redoxpotential für das adsorbierte Enzym. Wird
bei höheren Elektrodenpotentialen ein positiver Stromfluss gemessen, deutet dies auf die
Oxidation des Substrates hin. Wird das Elektrodenpotential verringert, so nimmt auch die
Stromstärke ab und es erfolgen zunehmend reduzierende Reaktionen.
Mit dieser Methode können die Potentiale ermittelt werden, die nötig sind um die enzymatische
Katalyse der Reduktion oder Oxidation zu ermöglichen. Durch den Vergleich mehrerer
aufeinanderfolgender Zyklen eines Proteinfilms kann zudem die Stabilität des Enzyms
abgeschätzt bzw. mögliche Reaktivierungsprozesse offenbart werden.
Bei der Untersuchung der löslichen Hydrogenase wird üblicherweise in einem Potentialbereich
von -800 mV bis 200 mV mit einer Scanrate von 0.01 V ∙ s-1 gemessen.
2.5.3 Chronoamperometrie
Bei der Chronoamperometrie wird die Spannung der Arbeitselektrode während der
Messung konstant gehalten. Die angelegte Spannung wird so gewählt, dass das Redoxpotential
des Enzyms für die Katalyse geeignet ist. Nun wird Substrat zu dem Reaktionsansatz zugefügt,
so dass sich infolge der ablaufenden Redoxreaktionen die gemessene Stromstärke ändert. Die
36
Messung der Stromstärken bei verschiedenen Substratkonzentrationen kann durch Auswertung
mithilfe der Michaelis-Menten-Kinetik zur Bestimmung der KM-Werte dienen.
Das bei der Chronoamperometrie verwendete Potential beträgt für die reduzierenden
Reaktionen -0.65 mV für die Oxidationen -0.1 mV.
2.6 Spektroskopische Untersuchungen der HtSH
Alle spektroskopischen Experimente mit Proben der isolierten HtSH wurden in
Zusammenarbeit mit Stefan Wahlefeld und Christian Lorent aus der AG Hildebrandt
durchgeführt.
2.6.1 IR-Spektroskopie
Für die Fourier-Transform-Infrarot (FTIR)-Schwingungsspektroskopie wurden je 8 µL
der 0.3 mM SH-Proben im Luft-oxidierten („as-isolated“) und chemisch reduzierten Zustand
in eine gasdichte, temperaturkontrollierte IR-Flüssigkeitszelle mit CaF2-Fenster (optische
Länge 50 µm) überführt. Die FTIR-Spektren mit einer spektralen Auflösung von 2 cm-1 wurden
mit einem Bruker Tensor 27 FTIR Spektrometer (Bruker, Deutschland), das mit einer
gobalTM-Infrarotlichtquelle, einem ROCKSOLIDTM- Interferometer sowie mit einem durch
flüssigen N2 gekühlten Mercury-Cadmium-Tellurid (MCT)-Detektor ausgestattet ist,
aufgenommen. Die Probenkammer wurde mit einem Peltierelement auf 10 °C temperiert. Je
200 Scans wurden zu einem Spektrum zusammengefasst. Zur Verbesserung des Signal-zu-
Rausch-Verhältnisses wurden die zweiten Ableitungen der aufgezeichneten
Absorptionsspektren gebildet und interpretiert. Dazu wurde die Bruker Opus Software Version
5.5 oder höher verwendet.
2.6.2 IR-Spektroelektrochemische Untersuchung
Für die spektroelektochemischen Experimente wurde die 0.3 mM HtSH-Probe zunächst
anaerob mit 2 mM TCEP in einer OTTLE (engl.: „optically transparent thin layer
electrochemical“)- Zelle (Moss et al., 1990) mit einer optischen Weglänge unter 10 µm
aktiviert. Zur Vermeidung der Protein-Adsorption wurde die Goldnetz-Arbeitselektrode mit
einem selbst-assemblierenden Monolayer aus 1 mM Cysteamin und 1 mM
Mercaptopropionsäure (in Ethanol) anaerob für 30 min inkubiert. Die Vorbereitung der
37
OTTLE-Zelle erfolgte anaerob in einer Argon-gefüllten Box. Zur schnellen Äquivilibrierung
des jeweils angebrachten Potentials wurden folgende, verschiedene Redox-Mediatoren mit
einer Konzentration von je 0.5 mM zur Proteinlösung verwendet: TMPPO (+262 mV),
1,2-Naphthoquinon (+145 mV), 1,4-Naphthoquinon (+60 mV), Methylenblau (+11 mV),
IndigoTrisulfat (−80 mV), Indigo Disulfat (−130 mV), 2-hydroxy-1,2-Naphthoquinon
(−139 mV), Resorufin (−195 mV), Anthraquinone-2-sulfonat (−225 mV), Safranin T
(−290 mV), Benzylviologen (−358 mV), Methylviologen (−446 mV).
Die Potential-abhängigen IR-Spektren wurden mit einer spektralen Auflösung von 2 cm-1
mithilfe eines Bruker IFS 66 FTIR Spektrometers, ausgestattet mit einem flüssig N2-gekühlten
MCT- Detektor, bei 30 °C aufgenommen. Zur Potentialkontrolle wurde ein Model 263 A
Potentiostat (Princeton Applied Science) mit der PARControl 1.05 Software verwendet. Die
Äquilibrierung der Potentiale erfolgte für mindestens 3 min bis keine Veränderung im IR-
Spektrum zu beobachten war.
2.6.3 EPR-Spektroskopie
Die 9.29 GHz-X-Band-Spektren der HtSH-Proben wurden mit einem Bruker EMXplus
Spektrometer in Kombination mit einem ER 4122 SHQE Resonator und einem Oxford EPR
900 Helium Flusscryostaten bei Temperaturen zwischen 5 und 310 K aufgenommen. Die
Basislinien-Korrektur des Spektrums erfolgte durch Messen des Puffers unter gleichen
Bedingungen und Abziehen des resultierenden Hintergundspektrums. Simulationen der
Spektren wurden mit der MATLAB Toolbox EasySpin Version 5.1.7 durchgeführt.
2.7 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE)
2.7.1 SDS-PAGE
Benötigte Puffer und Lösungen:
SDS-Probenpuffer:
125 mM Tris-HCl, 40 % w/v Glycerin, 500 mM DTT, 0.1 %
Bromphenolblau, 5 % w/v SDS; pH 6.8
Tris/Glycin-Laufpuffer:
25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0.1 % w/v SDS, pH 8.3
Mit der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese nach Laemmli (1970) können Proteine durch
Anlegen eines elektrischen Feldes aufgetrennt werden. Aufgrund der Anlagerung von SDS
38
(engl.: „sodium dodecyl sulfate“) erfolgt die Wanderung in dem Gel fast ausschließlich
proportional zu den Molekulargewichten der Proteine.
Die SDS-Polyacrylamidgele beinhalten zwei Phasen, die sich in ihrerm Acrylamidanteil und
damit ihrem Polymerisierungsgrad unterscheiden. Auch die pH-Werte sind unterschiedlich.
Die obere Phase, das Sammelgel, ist weniger polymerisiert, so dass die Proteine leichter das
Gel durchwandern, bis sie sich an der Grenze zu der dichteren, unteren Phase sammeln. Dort
ist der Polymerisierungsgrad höher und die Wanderung durch das Gel erschwert.
Beim Gießen der Gele werden zunächst ca. 5 ml des Trenngels in die Kammern gefüllt und mit
1 ml Isopropanol überschichtet, damit Luftblasen und ungerade Lauffronten verhindert
werden. Nachdem das Gel ausgehärtet ist, wird das Isopropanol entfernt und das Sammelgel
darüber geschichtet. Um Taschen für die Proteinproben zu formen wird ein Kamm in das noch
flüssige Gel eingesetzt. Diese Taschen werden, nach der vollständigen Polymerisierung und
dem Einsetzen in die Vorrichtung der Laufkammer, mit den Proben beladen. Zur Vorbereitung
der Proben werden jeweils 0.25 Volumen SDS-Probenpuffer zugegeben und die Proben
zweimal 5 min. im Wasserbad bei 90-100 °C aufgekocht und anschließend kurz in einer
Tischzentrifuge abzentrifugiert. Die Kammer wird mit SDS-haltigem Tris/Glycin-Laufpuffer
befüllt und die Elektrophorese nach Beladen des Geles bei 35 mA für 40 min durchgeführt.
Zur Größenabschätzung wird ein Proteinmarker mit aufs Gel aufgetragen (Precision Plus
Protein™ Standards Dual Color, Bio-Rad). Die genauen Zusammensetzungen der beiden Gele
sind in Tabelle 6 ersichtlich.
Tabelle 6. Zusammensetzung des Trenn-und Sammelgels für die Durchführunge einer SDS-
Gelelektrophorese
Komponente
12.5 %-iges Trenngel für 2 Gele
[mL]
Sammelgel für 2 Gele
[mL]
1.5 M Tris-HCl pH 8.8
5
-
0.5 M Tris-HCl pH 6.8
-
2.5
Rotiphorese Gel A 30 % Acrylamid
4.05
1.62
Rotiphorese Gel B 2 % Bisacrylamid
1.69
0.675
10 % w/v SDS
0.1
0.05
10 % w/v APS
0.1
0.07
TEMED
0.005
0.007
39
2.7.2 Coomassie-Färbung
Benötigte Puffer und Lösungen:
Färbelösung:
0.5 g Coomassie Brilliant Blue G-250, 2 g Coomassie Brillant Blue R-250,
425 mL Ethanol, 100 mL Eisessig, 50 mL Methanol; ad 1000 mL ddH2O
Entfärberlösung
250 mL Methanol, 50 mL Eisessig; ad 1000 mL ddH2O
Nach der elekrophoretischen Auftrennung können die Proteine in dem Polyacrylamidgel
mithilfe einer Färbelösung sichtbar gemacht werden. Die Methode beruht auf der Anlagerung
des Farbstoffs Coomassie Brilliant Blue an Proteine. Insbesondere die Bindung an basische
Aminosäuren durch elektrostatische Kräfte und van-der-Waals-Wechselwirkungen stabilisiert
den anionischen, blaugefärbten Zustand des Farbmoleküls (Meyer und Lambert, 1965). Die
Detektionsgrenze liegt dabei bei etwa 0.1 µg Protein.
Die Färbung erfolgt durch Schwenken des Gels in der Färbelösung für etwa 30 min bei RT.
Nach Entfernen der Farblösung erfolgt die Entfärbung durch Zugabe der Entfärbelösung. Die
Entfärbelösung wird 2-3 mal gewechselt, bis der Hintergrund vollständig farblos ist.
2.7.3 Immunologischer Nachweis von Proteinen nach dem Western-Blot-Verfahren
Benötigte Puffer und Lösungen:
„fast semidry transfer“ Puffer:
48 mM Tris-HCl, 20 mM HEPES
TBS-T
50 mM Tris-HCl, 270 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 0.05 % (w/v)
Tween®20, pH 8.0
Blocking-Lösung
TBS-T mit 5% (w/v) Milchpulver
Entwickler-Lösung
100 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 pH 9,5
BCIP
50 mg ∙ mL-1 in 100 % DMSO
NBT
50 mg ∙ mL-1 in 70 % DMSO
Nachdem die Proteine mittels SDS-Gelelektrophorese anhand ihrer Größe aufgetrennt wurden,
können sie auf eine Nitrozellulosemembran (BioTrace™, Pall Corporation, Dreieich,
Deutschland) übertragen und anschließend spezifisch mithilfe von Antikörpern detektiert
werden. Die elektrophoretische Übertragung aus dem SDS-Polyacrylamidgel auf die Membran
40
wurde nach dem semi-dry-Verfahren in einem Trans-Blot®Turbo™ Transfer System (BioRad)
bei 1.3 A und 25 V für 10 min durchgeführt. Die Membran sowie zwei Whatmanpapiere (3 mm
Dicke) wurden zuvor in einem Puffer aus 48 mM Tris und 20 mM HEPES (Garić et al., 2013)
getränkt.
Nach dem Transfer wird die Nitrozellulosemembran über Nacht oder mindestens für 1 h bei
RT in der Blockinglösung geschwenkt, um unspezifische Antikörperbindungen an die
Membran zu verringern. Danach wird die Membran 3-mal für etwa 10 min in TBS-T
gewaschen. Anschließend erfolgt die Inkubation mit einer geeigneten Verdünnung des
primären Antikörpers (Tabelle 7) für mindestens 1 h bei RT. Der primäre Antikörper bindet
spezifisch an eine der SH-Untereinheiten und stammt aus Kaninchenserum. Nach dem erneuten
Waschen der Membran für 3 mal 10 min in TBS-T erfolgt die Bindung des sekundären
Antikörper-Konjugats für 1 h bei RT. Dieses Konjugat, welches den primären Kaninchen-
Antikörper bindet, ist an eine alkalische Phosphatase gekoppelt. Nach erneutem Waschen wird
die Färbereagenz aus 90 μL BCIP und 70 μL NBT in 20 mL Entwicklerlösung frisch angesetzt
und auf die Membran gegeben. Die alkalische Phosphatase des sekundären Antikörpers setzt
das Substrat BCIP zu einem violetten Indigofarbstoff um. Die Membran wird nun im Dunkeln
bei RT so lange inkubiert, bis deutliche Proteinbanden zu erkennen sind.
Tabelle 7. Übersicht über die verwendeten Antikörper
Antikörper
Verwendete Verdünnung
α-HoxF (AK61)
1:2500 in TBS-T
α-HoxU (AK60)
1:3300 in TBS-T
α-HoxH (AK59)
1:25000 in TBS-T
α-HoxY (AK62)
1:5000 in TBS-T
α-Kaninchen-AK-AP- Konjugat (Dianova)
1:10000 in TBS-T
2.8 DNA-Grundtechniken
2.8.1 Behandlung von Geräten und Lösungen
Die Sterisilierung von verwendeten Geräten und Lösungen erfolgte durch
Autoklavieren bei 121 °C in gesättigtem Wasserdampf für 20 min. Das Trocknen erfolgte im
Trockenschrank bei 70 °C für 1-2 Tage. Chemikalien, die hitzelabil sind wurden mit Filtern
der Porengröße ≤ 0.2 µm sterilfiltriert und in autoklavierte Behälter überführt.
41
2.8.2 Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren
Die Bestimmung von DNA-Mengen erfolgte entweder visuell durch Vergleich der
Bandenintensität mit dem verwendeten Standard im Agarosegel oder durch
Absorptionsmessung einer gelösten DNA-Probe im NanoDrop bei 260 nm.
2.8.3 Restriktionsverdau
Für die Konstruktion von Plasmiden mit gewünschten DNA-Sequenzen müssen die
Strangenden der Insertfragmente kompatibel mit denen des Vektors sein, damit die Ligation
erfolgen kann. Dazu werden die Plasmide, aus denen die zu verknüpfenden Fragmente
stammen, mit Restriktionsendonukleasen behandelt. Der Ansatz wird dafür wie folgt
zusammenpipettiert: zwischen 5-20 µL des isolierten Plasmides (max. 1 µg) werden zusammen
mit 5 Units Restriktionsenzym und 3 µL des entsprechenden Puffers mit autoklavierten,
DNase-freiem ddH2O auf ein Gesamtvolumen von 30 µL aufgefüllt. Abhängig von dem
Temperaturoptimum der Restriktionsendonuklease werden die Ansätze bei 37 °C mind. 1 h im
Wasserbad inkubiert. Auch das als Vektor dienende Plasmid wird mit Restriktionsenzymen
geschnitten und zusätzlich mit 1 U einer alkalischen Phosphatase (engl.: „calf intestinal
phosphatase“, CIP, New England Biolabs) behandelt, die durch die Dephosphorylierung der
entstehenden 5‘-DNA-Enden eine Rezirkulation verhindern soll. Die entstandenen Fragmente
wurden nach dem Verdau mithilfe der Gel-Elektrophorese anhand ihrer Größe und
Konformation aufgetrennt. Die gewünschten Abschnitte wurden unter der UV-Lampe aus dem
Gel ausgeschnitten und mithilfe eines Extraktionskits (QIAEX II® Gel Extraction Kit) aus dem
Gel gereinigt.
42
2.8.4 Ligation
Die geschnittenen und gereinigten Vektoren und die Insertfragmente wurden für die
Ligation zusammen mit T4-Ligasepuffer und der T4-DNA-Ligase (New England Biolabs) in
einem Eppendorfgefäß angesetzt. Dabei wurde ein Verhältnis von 3:1-Insert zu Vektor gewählt
und entsprechende Mengen der jeweiligen Fragmente eingesetzt. Die Ligation erfolgt dann bei
16 °C über Nacht.
2.9 DNA-Isolierung
2.9.1 Plasmidisolation: Mini-Präparation
Je nach Art und Ursprung des Plasmides sowie der weiteren Verwendung wurde die
Methode der Isolierung ausgewählt. Für high-copy Plasmide aus E. coli genügen bereits wenige
mL der entsprechenden LB-Übernachtkultur zur Isolierung mithilfe des Invisorb Kits
(Invisorb® Spin Plasmid Mini Two). Dabei wurde besonders für größere Fragmente jedoch
nicht mit dem mitgelieferten Elutionspuffer sondern mit vorgewärmten 1 mM Tris eluiert.
Alternativ kann eine größere Zahl von Kulturen schnell nach einer abgeänderten Methode von
Birnboim und Doly (1979) alkalisch lysiert und die Plasmide isoliert werden.
Benötigte Puffer und Lösungen:
P1-Puffer:
50 mM Glukose; 25 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA, pH 8; 100 μg ∙ mL-1 RNase A
P2-Puffer:
0.2 N NaOH; 1 % (w/v) SDS
P3-Puffer:
3 M Kaliumacetat pH 4.8
Dazu wurden 1.5 mL der Übernachtkultur durch einminütige Zentrifugation bei maximaler
Geschwindigkeit (13.800 rpm) geerntet und das Pellet mit 100 µL P1-Puffer resuspendiert.
Nach der Zugabe von 200 µL P2 wurde durch vorsichtiges Schwenken des Eppis der Ansatz
gemischt und eine Minute bei Raumtemperatur zur vollständigen Lyse inkubiert. Dann erfolgte
die Zugabe von 200 µL des P3-Puffers und es wurde erneut vorsichtig durch 5-6-maliges
Invertieren des Eppendorfgefäßes gemischt. Durch Zentrifugation bei vmax für 5 min wurden
die Zelltrümmer abgetrennt und der Überstand in ein neues Eppi überführt. Nach erneutem
Zentrifugieren und Überführen des Überstandes wurde durch Zufügen von 1 mL eiskaltem,
96%-igem Ethanol die DNA ausgefällt. Anschließend wurde für 15 Minuten bei vmax
zentrifugiert und der Überstand dann gut entfernt. Mit 0.5 mL eiskaltem, 70%-igem Ethanol
wurde das Pellet gewaschen und nochmals 5 Minuten zentrifugiert. Der Ethanol wurde danach
43
gut entfernt und das Pellet 10 Minuten vakuumgetrocknet. Das transparente bis leicht weißliche
Pellet wurde mit 50 µL autoklaviertem, DNase-freiem Wasser resuspendiert und bei -20 °C
gelagert.
2.9.2 Isolierung von low-copy-Plasmiden mithilfe von Anionenaustauschersäulen
Benötigte Puffer und Lösungen:
P1-Puffer:
50 mM Tris-HCl; 10 mM EDTA, pH 8; 100 μg ∙ mL-1 RNase
A
P2-Puffer:
0.2 N NaOH; 1 % w/v SDS
P3-Puffer:
3 M Kaliumacetat pH 5.5
Puffer FWB2
(QIAfilter wash buffer):
1 M Kaliumacetat pH 5
Puffer QBT
(equilibration buffer):
750 mM NaCl; 50 mM MOPS, pH 7; 15% v/v Isopropanol;
15% v/v Triton® X-100
Buffer QC (wash buffer):
1.0 M NaCl; 50 mM MOPS, pH 7; 15% v/v Isopropanol
Buffer QF (elution buffer):
1.25 M NaCl; 50 mM Tris-HCl, pH 8.5; 15% v/v Isopropanol
Low-copy Plasmide wurden hingegen aus 100 mL Übernachtkultur mithilfe einer QIAGEN®
TIP 100-Säule isoliert, so dass eine ausreichend hohe Konzentration des Plasmides erhalten
wird. Für anschließende Klonierungen, z B. mit pEDY, wurde diese Methode gewählt. Auch
für die Isolierung von Plasmiden aus R. eutropha wurde nach diesem Protokoll vorgegangen.
Die Durchführung erfolgte nach Angabe des Herstellers mit den mitgelieferten Lösungen
(QIAGEN® Plasmid Midi Kit). Zur Steigerung der Ausbeute kann das Eluat nach dem
Durchlaufen der Säule ein zweites Mal aufgetragen werden.
2.9.3 Agarosegelelektrophorese
Benötigte Puffer und Lösungen:
TPE-Puffer:
80 mM Tris; 8 mM EDTA; pH 7.6
Schwere Lösung:
20 % w/ v Ficoll 400; 0.05 % v/ v Bromphenolblau
Nukleinsäuren verschiedener Größe und Herkunft lassen sich mithilfe der
Agarosegelelektrophorese voneinander trennen und identifizieren. Dazu wurde zunächst
44
Agarose in Elektrophoresepuffer aufgekocht, ein Gelfärbemittel wie z. B. GelRed hinzugefügt
und dieses Gemisch in eine Gelkammer geschüttet. Ein Kamm wurde eingesetzt und nach
Aushärten des Geles konnte die Kammer mit Puffer gefüllt und die Geltaschen mit den Proben
beladen werden. Davor wurden die Proben noch mit Schwerer Lösung versetzt, die zum
Beschweren der Probenlösung dient und ein Auslaufen aus der Tasche verhindert. Die Menge
der eingesetzten Agarose richtete sich nach der Größe der Fragmente, die aufgetrennt werden
sollen. Handelt es sich um große DNA-Fragmente, wurde weniger Agarose eingesetzt, so dass
der Widerstand im Gel abnimmt und kleinere Fragmente wesentlich schneller im Gel wandern
können als die größeren. Sollten kleine Fragmente voneinander getrennt werden, wurden die
Agarosemenge und damit der resultierende Wanderungswiderstand erhöht. Für die spätere
Größenzuordnung der Banden werden zwischen 6-8 µL des 2-log-Markers (New England
Biolabs) aufs Gel aufgetragen.
Das Gel wurde gestartet und lief bei 90 V und 400 mA etwa 45 min.
Nach dem Stoppen der Elektrophorese sind die Banden der DNA-Fragmente unter der UV-
Lampe im Gel zu erkennen und das Gel kann fotografiert werden.
2.10 Plasmidtransfer
2.10.1 Herstellung chemokompetenter E. coli-Zellen
Benötigte Puffer und Lösungen:
TFB 1:
10 mM CaCl2; 15 % (v/v) Glycerin; 30 mM Kaliumacetat pH 5.8; 100 mM RbCl2; 50 mM
MnCl2
TFB2:
10 mM MOPS pH 7; 10 mM RbCl2; 15 % (v/ v) Glycerin; 75 mM CaCl2
Für die Transformation von Plasmiden in E. coli-Zellen müssen die Zellen des zu
transformierenden Stammes zunächst kompetent gemacht werden. Dies kann chemisch ähnlich
wie bei der Calciumchlorid-Methode auch durch die Behandlung mit Rubidiumchlorid
erfolgen. Dazu wurde eine 10 mL-Übernachtkultur mit dem entsprechenden Stamm in LB-
Medium angeimpft. Mit 1 mL dieser Kultur wurde am folgenden Tag die Hauptkultur
angeimpft und ebenfalls bei 30 °C und 170 rpm geschüttelt. Das für die Hauptkultur
verwendete LB-Medium sollte beim Beimpfen vorgewärmt sein und das Wachstum der Zellen
wurde durch Messung der OD verfolgt. Erreichte die Kultur eine OD600 von etwa 0.5 wurden
die Zellen in ein steriles 50 mL-Falcon-Gefäßen überführt und auf Eis für 5 min. gekühlt. Von
45
hier an wurde nur noch auf Eis und in vorgekühlten Zentrifugen bei 4 °C gearbeitet. So erfolgte
das Ernten durch Zentrifugation bei 4000 ∙ g für 5 min und bei 4 °C. Der Überstand wurde
vorsichtig verworfen und das Zellpellet mit 30 mL gekühltem TFB1-Puffer resuspendiert.
Danach wurden die Zellen für 90 min auf Eis inkubiert, bevor sie erneut durch Zentrifugation
bei 4000 ∙ g für 5 min gewaschen werden. Der Überstand wurde wieder verworfen und das
Pellet nun in 4 mL eiskaltem TFB2-Puffer aufgenommen. Von der Suspension wurden 100 µL-
Aliquots auf 2 mL-Eppendorfgefäße verteilt und sofern sie nicht sofort verwendet werden
sollten noch mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.
2.10.2 Transformation von E. coli
Die Transformation von Plasmiden aus E. coli in die vorbereiteten chemokompetenten
Zellen erfolgt nach dem „high efficiency transformation protocol“ aus dem New England
Biolabs-Katalog. Dazu wurden die eingefrorenen Zellen auf Eis aufgetaut und zwischen 2-
15 µL des Ligationsansatzes oder des isolierten Plasmides hinzugefügt. Die eingesetzte Menge
richtet sich dabei nach der Art des Plasmides. Bei großen Vektoren wird mehr eingesetzt, bei
den kleineren genügen wenige µL um eine ausreichend hohe Anzahl der Konstrukte zu
übertragen. Es folgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis und der anschließende Hitzeschock
bei 42 °C für maximal 3 min sorgt für die erhöhte Aufnahmefähigkeit von DNA in die Zellen.
Bevor 950 µL SOC-Medium zugegeben werden, erfolgte eine 5-minütige Inkubation auf Eis.
Zur Regeneration in dem Vollmedium wird der Transformationsansatz daraufhin eine Stunde
bei 30 °C geschüttelt. Nun wurden von dem Ansatz etwa 800 µL und 150 µL auf je eine LB-
Agarplatte mit entsprechendem Antibiotika zur Selektion der Transformanten ausplattiert und
bei 37 °C inkubiert.
2.10.3 Herstellung elektrokompetenter R. eutropha-Zellen
Auch bei der Transformation von Plasmiden in R. eutropha-Zellen mittels
Elektroporation ist eine Vorbehandlung der entsprechenden Zellkulturen nötig. Dafür wurde
aus einer 10 mL NB-R. eutropha-Übernachtkultur mit 100 µL die Hauptkultur von 100 mL
NB-Medium angeimpft. Das Wachstum erfolgte bei 30 °C, bis eine OD436 zwischen 0.3-0.5
erreicht ist. Dann wird die Kultur in 50 mL-Falcon-Gefäßen überführt und auf Eis abgekühlt.
Durch Zentrifugation bei 4000 ∙ g und 4 °C für 10 min wurden die Zellen geerntet. Das Pellet
wurde nach Entfernen des Überstandes in 100 mL sterilem 10%-igem, eiskaltem Glycerin
resuspendiert und erneut bei gleichen Bedingungen zentrifugiert. Dieser Waschschritt wurde
46
noch zweimal wiederholt. Das Pellet wurde dann in etwa 2 mL 10%-igem Glycerin
aufgenommen und die Zellsuspension in 40 µL-Aliquots auf 2 mL Eppendorfgefäße verteilt.
Die Zellen können entweder direkt für die Elektroporation verwendet werden oder durch
schockfrieren mit flüssigem Stickstoff bei -80 °C gelagert werden. Wie auch bei der
Herstellung chemokompetenter Zellen sinkt durch das Einfrieren jedoch die Kompetenz, d.h.
die Anzahl der zu erwartenden Transformanten nimmt deutlich ab.
2.10.4 Elektroporation von R. eutropha
Das Einbringen von Plasmiden und DNA-Konstrukten in R. eutropha kann neben der
Konjugation auch mithilfe der Elektroporation geschehen. Die dafür vorbereiteten Zellen, die
durch die Waschschritte möglichst frei von Salzen sein sollten, wurden dazu auf Eis aufgetaut
und mit 1-5 µL der DNA-Lösung vermischt. Nach einer Minute Inkubation auf Eis wurde die
Zelllösung in eine gekühlte Elektroporationsküvette mit 2 mm Elektrodenabstand überführt
und mit einem elektrischen Puls von 2500 Volt, 25 µF und 200 Ω versetzt. So schnell wie
möglich wurde 1 mL NB-Medium hinzugegeben und die Lösung mit den Zellen zur
Regeneration der beschädigten Zellwand 1 h bei 30 °C in einem Glasröhrchen geschüttelt.
Danach wurden 800 µL und 200 µL auf je eine Agarplatte mit dem jeweiligen Antibiotikum
ausplattiert und 2-3 Tage bei 37 °C wachsen gelassen.
2.10.5 Konjugation
Für den Austausch von Plasmiden aus E. coli S 17-1 in R. eutropha durch Konjugation
nach dem Spot-mating-Verfahren (Simon et al., 1983) wurden zunächst 10 mL über Nacht-
Kulturen angezogen. Nach dem Ernten von je 1.5 mL durch Zentrifugation bei 4000 ∙ g für 10
min und dem 3-maligen Waschen in 1 ml H16-Puffer wurden 200 µL der resuspendierten
Pellets auf einer NB-Agarplatte ohne Antibiotika ausplattiert und mind. 5 h wachsen gelassen.
Danach wurde der Rasen von der Platte abgeschabt und in 1 mL H16-Puffer resuspendiert.
Nach erneutem Waschen durch Zentrifugation bei 4000 ∙ g für 10 min und dem Resuspendieren
in 1 mL H16-Puffer werden Verdünnungen der Zellsuspension angesetzt. Pro Verdünnung
wurden nun 350 µL auf einer FN-Agarplatte mit Antibiotika zur Selektion ausplattiert und etwa
3 Tage bei 37 °C wachsen gelassen.
47
2.10.6 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Mithilfe der PCR (Mullis & Faloona, 1987) wurden zum Einen genetische
Veränderungen wie Basenaustausche oder Deletionen in Plasmiden vorgenommen. Zum
anderen wurde sie auch zur Überprüfung und Amplifizierung von DNA-Sequenzen genutzt.
Eine Liste der verwendeten Oligonukleotide ist in Tabelle 8 aufgeführt. Je nach Zweck der
PCR wurden 25 µL- oder 50 µL-Ansätze in PCR-tubes angesetzt und nach Zugabe der
Polymerase im Thermocycler C1000 (Bio-Rad) mit einem entsprechenden Protokoll inkubiert.
Tabelle 8. Liste der verwendeten Oligonukleotide
Primerbezeichnung
5’ 3’
pCM66 fwd
CACTTTATGCTTCCGGCTCG
pCM66 rev
CCTCTTCGCTATTACGCCAG
RehoxFU fwd
GAT CGA ACG ATG GCA GC
RehoxFU rev
GTT ATC GCC GCG TAT GC
RehoxF D467S
CGC AAG CTC GCG TAC GAA TCG CTT TCG TGC AAT GGC GCC
RehoxF E341A
ATC TGC GGC GAC GCA TCG GCG CTC ATC
RehoxF S342R fwd
CTTATATCTGCGGCGACGCACGCGCGCTCATCGAGTCCTGCG
RehoxF S342R rev
CGCAGGACTCGATGAGCGCGCGTGCGTCGCCGCAGATATAAG
RehoxF K358R fwd
CCTTGCTGCACCGGGAACGGAGGGCGCACCCGTGGCGTGCC
RehoxF K358R rev
GGCACGCCACGGGTGCGCCCTCCGTTCCCGGTGCAGCAAGG
HthoxU rev
GAACGTGACCCACTCTG
HthoxF fwd
GATGCCCCGACTCGAC
HthoxF E319AS320R xhoI fwd
CGCGTACGTCTGCGGCGAAGCTCGAGCATTGATCGAATCGCTGGAA
GGAAAACC
HthoxF rev E319AS20R xhoI rev
GGTTTTCCTTCCAGCGATTCGATCAATGCTCGAGCTTCGCCGCAGAC
GTACGCG
HtHoxY 6-His fwd
CTGAAGCGATGAGCGACAAGGAGCGCTACACATGCATCATCACCATC
ACCACACCTCTGCCGCACCCTCCGCGATGCCTCCCCGAAAAATC
HtHoxY 6-His rev
GATTTTTCGGGGAGGCATCGCGGAGGGTGCGGCAGAGGTGTGGTGA
TGGTGATGATGCATGTGTAGCGCTCCTTGTCGCTCATCGCTTCAG
HtHoxY fwd
ACTTCAAAGCGGCGGGATTC
HtHoxY rev
CGAGCCAGATGGTGACCTTG
HtHoxY fwd 2
CAGTCTGGCCGAAGGGAAAG
HtHoxFU invPCR rev
GCCGTTCCGGGTACTGAGTTGTCATGTGTAGCGCTCCTTGTCGC
HtHoxFU invPCR fwd
CAACTCAGTACCCGGAACGGCC
HtHoxHY invPCR rev
GAGGGTGCGGCAGAGGTCATGGTTCCTCCTCCTCGTGTTGCG
HtHoxHY invPCR fwd
ATGACCTCTGCCGCACCCTC
ReHoxY NcoI fwd
CTGCGACGCCCATGGATCCGG
ReHoxW XbaI rev
CGCGTTCTCCTTCTAGATGATTTCACGAGGTTTGACG
ReHoxH QxxQ106ExxE fwd
CTACGCGGAGATGCTCGAGTCCCATACGAC
ReHoxH Q106E fwd
CTACGCGGAGATGCTCCAGTCCCATACGAC
48
Re delta HoxHY SacI fwd
GCCTGAATGTCGAGCTCAACGACC
Re delta HoxHY XbaI rev
CAAAGACCGAGATCTCCAGCG
2.10.6.1 Kolonie-PCR
Sollten ganze Zellen bzw. Kolonien auf die Anwesenheit eines Ligationsproduktes oder einer
genomischen Deletion überprüft werden, wurde typischerweise auf die Taq-Polymerase
zurückgegriffen und 25 µL-Ansätze gewählt, in die Zellmaterial mit sterilen Pipettenspitzen
eingebracht wurde. Die Ansätze wurden wie in Tabelle 9 und Tabelle 10 aufgeführt, angesetzt.
Tabelle 9. PCR-Ansätze mit der Taq-Polymerase
Komponente
25 μL
Reaktion
50 μL
Reaktion
Finale
Konzentration
10X ThermoPol
Reaktionspuffer
2.5 µL
5 µL
1X
10 mM dNTPs
0.5 µL
1 µL
200 µM
10 µM Forward
Primer
0.5 µL
1 µL
0.2 µM (0.05–1 µM)
10 µM Reverse
Primer
0.5 µL
1 µL
0.2 µM (0.05–1 µM)
Template DNA
variabel
2 µL
<1,000 ng
Taq DNA
Polymerase
0.125 µL
0.25 µL
1.25 U pro 50 µL
PCR
Nuklease-freies
ddH2O
ad 25 µL
ad 50 µL
Tabelle 10. PCR-Protokoll der Taq-Polymerase
Schritt
Temperatur
Dauer
Initiale
Denaturierung
95°C
30 s -3 min
30 Zyklen
Denaturierung
95°C
15-30 s
Primer
Anlagerung
45-68°C
15-60 s
Verlängerung
68°C
1 min pro
kbp
Finale
Verlängerung
68°C
5 min
Lagerung
4-10°C
2.10.6.2 Ortsgerichtete Mutagenese
Für die Amplifizierung von DNA-Fragmenten, die zur Klonierung eingesetzt werden sollten
oder Basenaustausche enthalten, wurde die Q5® High-Fidelity-Polymerase verwendet, da sie
49
eine geringere Fehlerrate besitzt und auch für längere PCR-Produkte geeignet ist. Die Ansätze
und Protokolle der Polymerasen sind in Tabelle 11 und Tabelle 12 aufgeführt. Einfache
Basenaustausche wurden überwiegend nach einem modifizierten QuikChange™-Protokoll
(Pfirrmann et al., 2013) in Plasmide eingebracht. Längere Deletionen, Insertionen von Protein-
tag-kodierenden Sequenzen oder Basenaustausche in größere Plasmide wurden mithilfe der
MEGAWHOP-Klonierung (Miyazaki, 2011) vorgenommen. Hierbei wurde der zu
verändernde DNA-Bereich zunächst mit einem Primerpaar in einer gewöhnlichen PCR
amplifiziert. Dabei beinhaltet einer der Primer den Basenaustausch oder die Deletion. In einer
zweiten, anschließenden PCR (Tabelle 13) diente das PCR-Produkt der ersten PCR als
Megaprimer für die Amplifikation des vollständigen Plasmids. Nach Restriktionsverdau des
methylierten Templates mit DpnI, kann das PCR-Produkt transformiert werden.
Tabelle 11. PCR-Ansätze mit der Q5-Polymerase
Komponente
25 μL
Reaktion
50 μL Reaktion
Finale
Konzentration
5X Q5 Reaktionspuffer
5 µL
10 µL
1X
10 mM dNTPs
0.5 µL
1 µL
200 µM
10 µM Forward Primer
1.25 µL
2.5 µL
0.5 µM
10 µM Reverse Primer
1.25 µL
2.5 µL
0.5 µM
Template DNA
variable
2 µL
< 250 ng
5X Q5 High GC Enhancer
(optional)
(5 µL)
(10 µL)
1x
Q5 Hot Start High-Fidelity DNA
Polymerase
0.25 µL
0.5 µL
1.0 U pro 50 µL
PCR
Nuklease-freies ddH2O
ad 25 µL
Ad 50 µL
Tabelle 12. PCR-Protokoll der Q5-Polymerase
Schritt
Temperatur
Dauer
Initiale
Denaturierung
98°C
60 s
25-35
Zyklen
Denaturierung
98°C
5–10 s
Primer
Anlagerung
64°C
10–30 s
Verlängerung
72°C
20–30 s pro
kbp
Finale
Verlängerung
72°C
2 min
Lagerung
4–10°C
50
Tabelle 13. PCR-Protokoll der MEGAWHOP-Klonierung
Schritt
Temperatur
Dauer
Initiale
Denaturierung
98°C
3 min
Denaturierung
98°C
30 s
5 Zyklen
Primer
Anlagerung
55°C
60 s
Verlängerung
72°C
60 s
25 Zyklen
Denaturierung
98°C
30 s
Verlängerung
72°C
20–30 s pro
kbp
Finale
Verlängerung
72°C
5-10 min
Lagerung
4–10°C
2.10.7 Homologe Rekombination
Für den Allelaustausch durch homologe Rekombination wurden die Vektoren pLO1
und pLO2 (O Lenz et al., 1994) verwendet. Diese basieren auf dem ColE1-Replikon und tragen
neben dem Gen für Kanamycinresistenz auch das für die meisten gramnegativen Bakterien
letale Gen sacB. Dieses kodiert das Enzym Levansucrase aus Bacillus subtilis, welches aus
Saccharose unter Glukosefreisetzung entstehende Fruktosylreste zu Levan polymerisiert.
Dieses sammelt sich im Periplasma gramnegativer Bakterien an und führt zur Lysis der Zellen
(Gay et al., 1985).
In die Multi-Cloning-Site dieser Plasmide wurden DNA-Fragmente mit homologen Bereichen
(etwa 500 bp – 2 kbp) zu dem auszutauschenden Allel eingebracht. Das Plasmid wurde dann
von E. coli S17-1 nach R. eutropha transferiert. Erst die Integration des Plasmids ins Genom
ermöglicht die stabile Replikation, sodass auf FN-Selektionsplatten nur Klone mit integriertem
Plasmid wachsen können. Diese wurden dann in NB-Medium ohne Antibiotikum wachsen
gelassen, so dass eine zweite Rekombination d.h. die Exzision des integrierten Plasmids
stattfinden kann. Verdünnungen aus diesen Kulturen wurden auf Saccharose-haltigen LSLB-
Platten (Tabelle 3) ausgestrichen und 3 Tage bei 37 °C inkubiert. Gewachsene Kolonien, die
nach Ausplattieren auf Selektionsplatten keine Resistenz mehr zeigten, wurden mittels
Kolonie-PCR (2.10.6.1) überprüft und unter autotrophen Wachstumsbedingungen (2.2.3) auf
die Abwesenheit der SH getestet.
51
2.11 Sequenzierung
Die Sequenzierung von Kolonien der Transformanten erfolgte durch die Firma
Sequenzierservice ABI BigDye-Terminator-Chemie SMB Services in Molecular Biology
durchgeführt.
2.12 Enzyme und Chemikalien
Chemikalien und Biochemikalien wurden von den folgenden Firmen bezogen: Bioline
GmbH, (Luckenwalde), BIO-RAD (München), Boehringer (Mannheim), DIFCO (Detroit,
USA), Merck (Darmstadt), Roche Diagnostics (Mannheim), Roth (Karlsruhe), Serva
(Heidelberg) und Sigma-Aldrich (München). Nitrocellulosemembranen und Blotpapier
stammten von Schleicher & Schüll (Dassel). Ultrafiltrationseinheiten lieferte die Firma
Millipore (Eschborn). Gase lieferte die Firma Air Liquide (Düsseldorf). Deionisiertes und
gereinigtes Wasser (Millipore-H2O) wurde mit einem MembraPure Aquintus (membraPure,
Bodenheim) bei einem spezifischen Widerstand von 18,2 MΩ · cm-1 hergestellt.
Kristallisationspuffer und –platten wurden von Hampton Research (USA) und Jena Bioscience
(Jena) bezogen. Restriktionsendonukleasen, Polymerasen und andere DNA-modifizierende
Enzyme lieferten New England Biolabs (Frankfurt) und Invitrogen (Karlsruhe).
Oligonukleotide wurden von MWG Biotech (München) und Sigma (München) bezogen.
2.13 Dokumentation und Datenverarbeitung
Die Betrachtung von DNA-Sequenzen und Plasmiden sowie die Ausarbeitung von
Klonierungsstrategien erfolgten mithilfe der Software VectorNTI, CLC sequence viewer und
ApE. Vergleiche von Nukleotid-und Aminosäuresequenzen der SH Varianten wurden online
mit den Programmen BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/), ClustalW (Goujon et
al., 2010) und ClustalΩ (Sievers et al., 2014) erstellt bzw. mit Jalview
(http://www.jalview.org/) oder TCOFFEE (http://tcoffee.crg.cat/) durchgeführt.
SDS-PAGE-Gele und Western-Blots, sowie Agarplatten wurden abfotografiert und mithilfe
von Adobe Photoshop X4 und Microsoft PowerPoint 2010 oder höher digital bearbeitet.
52
Zur Ermittlung der KM-Werte wurden die spezifischen Aktivitäten mithilfe von CaryWin 3.0
und Microsoft Excel 2010 oder höher aus den erhaltenen Messwerten berechnet und die
entsprechenden Kinetiken durch Origin 2016 dargestellt.
Zum strukturellen Vergleich und der Darstellung von Kristallstrukturen wurde mit PyMOL
1.8.4.1 gearbeitet. Die pdb-Dateien der Kristallstrukturen wurden von der Datenbank
http://www.rcsb.org/ bezogen. Homologiemodelle wurden mithilfe des SWISS-MODEL-
Servers (swissmodel.expasy.org) erstellt.
Die Erstellung der Strukturformeln zum katalystischen Zyklus erfolgt mithilfe von ChemDraw
Professional 17.0.
53
3 Ergebnisse
3.1 Charakterisierung der thermostabilen SH aus Hydrogenophilus thermoluteolus
TH-1T (Ht)
Neben der löslichen Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16 wurde im Rahmen dieser
Arbeit auch mit einer thermostabilen löslichen [NiFe]-Hydrogenase aus dem thermophilen
Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T gearbeitet. Dieser Organismus ist wie
Ralstonia eutropha zu chemolithoautotrophen Wachstum mit der Verwendung von H2 als
Energie- und CO2 als Kohlenstoffquelle fähig (Goto et al., 1977; Hayashi et al., 1999). Diese
Fähigkeit lässt auf die Anwesenheit von Hydrogenasen schließen, die gemäß dem
Wachstumsoptimum dieses Stammes von 52 °C Thermostabilität aufweisen müssten. Nach der
Sequenzierung des Genoms von H. thermoluteolus (L. Lauterbach) konnte durch Suche nach
hox-ähnlichen Genen eine entsprechende Operonstruktur identifiziert werden. Dabei wurden
unter anderem die Strukturgene hoxFUHY sowie daran anschließend hoxW gefunden. Diese
wurden wie folgt amplifiziert und in einen geeigneten Vektor kloniert, der erfolgreich in
Ralstonia übertragen wurde, um die Gene heterolog zu exprimieren. Es wurden Primer erstellt,
mit denen die Gene hoxFUHYW genomischen DNA aus Hydrogenophilus thermoluteolus TH-
1T amplifiziert wurden (s. unten).
5’-agaacctgtacttccagggcgcaacacgaggaggaggaac-3’
5’-ctcggtacccggggatccatacctcctcttcgtgggtgaaaaaac-3’
Die unterstrichenen, überhängenden Sequenzen dieser Primer sind komplementär zu einem
pCM66-Derivat (pGE837), das eine Sequenz trägt, die PSH-StrepII-TEV-HoxF kodiert. Nach
der Linearisierung des Empfänger-Plasmids durch inverse PCR mit den Primern
5’-atggatccccgggtaccga-3’ und 5’-gccctggaagtacaggttctcg-3’ wurde der amplifizierte Hthox-
Cluster entsprechend dem „Gibson Assembly“-Protokoll inseriert (New England Biolabs). Das
so entstandene PSH-HoxStrepIIFUHYW-kodierende Plasmid wurde mit den
Restriktionsenzymen Eco53KI und XbaI geschnitten, so dass das resultierende 5.7-kb-
Fragment mit dem ScaI-XbaI-verdauten Vektor pEDY309 ligiert werden konnte. Das erhaltene
Plasmid (pJP09) wurde in den HoxI-freien Ralstonia eutropha-Stamm HF1054 (Massanz et
al., 1998) konjugativ übertragen.
54
3.2 Die thermostabile HtSH kann in Ralstonia eutropha heterolog produziert werden
In den ersten Versuchen zur Reinigung der heterolog produzierten HtSH nach dem
Standard-Reinigungsprotokoll für ReSH konnte zunächst eine geringe H2-abhängige
Reduktion von NAD+ im löslichen Extrakt nachgewiesen werden, allerdings wurde keine
Aktivität mehr nach Affinitätschromatographie detektiert. Erst die Zugabe der zweiwertigen
Ionen Ni2+ und Mg2+ (2.3.1, Abbildung 5) führte in den nachfolgenden Reinigungen zu einer
nachweisbaren, H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivität. Da sich demnach die
biochemischen Eigenschaften der HtSH von denen der ReSH unterscheiden, wurde zunächst
versucht, die Reinigungsbedingungen weiter zu optimieren. Die Beobachtung, dass Nickel-
und Magnesium-Ionen die Ausbeute sowie die Aktivität deutlich verbessern, führte dazu, dass
sie in folgenden Reinigungen standardmäßig allen Puffern zugesetzt wurden.
Daneben wurde zunächst getestet, ob die HtSH eine ähnliche Empfindlichkeit gegenüber
Natriumionen aufweist wie die ReSH (Keefe et al., 1995). Es zeigte sich in der Tat eine
hemmende Wirkung der Natrium-Ionen auf die NAD+-Reduktionsaktivität (Abbildung 5). Die
Proteinausbeute nach Affinitätschromatographie wurde hingegen nicht durch die Anwesenheit
von NaCl verringert. KCl beeinflusste die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität nicht,
führte jedoch zu etwas geringeren Proteinausbeuten. Wurde während der Reinigung komplett
auf zusätzliche Salze neben NiCl2 und/ oder MgCl2 verzichtet, konnten die höchsten Aktivitäten
und Proteinausbeuten erreicht werden.
55
Abbildung 5: Einfluss von NaCl und KCl auf die H2-abhängige Reduktion von NAD+ der
gereinigten HtSH bei 50 °C. Die Reinigungen wurden in 50 mM KPOi pH 7.4 mit Ni2+- und Mg2+-
Ionen ohne, sowie entweder mit 150 mM KCl oder 150 mM NaCl durchgeführt.
Neben der zunächst ausbleibenden H2- abhängigen NAD+-Reduktionsaktivität aufgrund der
Abwesenheit von Nickel- und Magnesium-Ionen wurde auch ein dissoziatives Verhalten der
heterotetrameren SH beobachtet, in dessen Verlauf sich die Hydrogenase- und NAD+-
Reduktase-Einheiten trennten. Die Zugabe zweiwertiger Ionen und ein relativ hoher Gehalt an
Glycerin im Reinigungspuffer konnte die daraus folgende unausgeglichene Stöchiometrie der
Untereinheiten nicht verhindern. Aufgrund des Strep-tagII an HoxF des NAD+-
Reduktasemoduls zeigten sich in der eluierten Probe nach Affinitätschromatographie größere
Mengen von HoxFU als von HoxHY (Abbildung 6). Durch eine anschließende
chromatographische Größenauftrennung des Eluats konnte allerdings weit homogenere HtSH
gereinigt werden (Abbildung 6). Die entsprechende Fraktion zeigte die höchste, H2-abhängige
NAD+-Reduktionsaktivität von 30-40 U · mg-1.
-Salze +KCl +NaCl
6
7
8
9
10
11
12
13
14
Spezifische Aktivtäten (U mg-1)
Reinigungsbedingungen
56
Abbildung 6. Reinigung der HtSH aus dem Stamm HF1054 (pJP09). 30 µg Gesamtprotein vom
löslichen Extrakt (SE) und je 5 µg der verschiedenen Fraktionen wurden im SDS-Gel aufgetragen und
elektrophoretisch aufgetrennt. Die Färbung erfolgte mit Coomassie-Blau. AC, nach
Affinitätschromatographie; M Markerprotein; SEC „size exclusion chromatographie“,
Größenausschlusschromatographie
Tabelle 14. Reinigung der HtSH aus R. eutropha HF 1054 (pJP09) mittels Affinitäts- und
Größenausschlusschromatographie (AC, SEC). Die angegebenen Werte stammen aus einer
repräsentativen Reinigung, wie sie mehrfach wiederholt wurde.
Fraktion
Volumen
(mL)
Protein-
konzentration
(mg/mL)
Gesamt-
protein
(mg)
Spezifische
Aktivität
(U∙mg-1)*
Gesamt-
aktivität
(U)
Ausbeute
(%)
Konzentrations-
faktor
Löslicher
Extrakt
40
29.2
1168
2.50 ± 0.13
2920
100
1
AC
1.4
29.7
41.6
12.07 ± 0.14
502
17
4.8
SEC
2.4
4.9
11.7
33.41 ± 0.61
391
13
13.4
*Die spezifische Aktivität der H2-abhängigen NAD+-Reduktion wurde wie in 2.4.2 beschrieben gemessen
und ist als Mittelwert aus mind. 2-3 Replikaten angegeben.
3.3 Die thermostabile SH unterscheidet sich biochemisch von der ReSH
3.3.1 Temperatur- und pH-Optimum
Anders als Ralstonia eutropha wächst Hydrogenphilus thermoluteolus optimal bei
einer Temperatur von 52°C. Dementsprechend ist die HtSH bei hohen Temperaturen über 50°C
besonders aktiv (Abbildung 7). Höchste Aktivität von 71.0 ± 0.3 U∙mg-1 konnte bei einer
Temperatur von 80°C gemessen werden.
57
Abbildung 7. H2-abhängige NAD+ Reduktionsaktivität der HtSH bei verschiedenen
Temperaturen. Für alle Messreihen wurde ein Puffer aus 50 mM Bis-Tris pH 6.5 mit 0.5 mM NiCl2,
5 mM MgCl2, 2 µM FMN und 0.75 mM TCEP verwendet, der bei den entsprechenden Temperaturen
auf den pH-Wert 6.5 titriert wurde.
Auch das pH-Optimum der HtSH unterscheidet sich von dem der ReSH deutlich. Maximale
H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität der ReSH wurden bei leicht basischem pH von 7.5-
8.5 gemessen (Keefe et al., 1995), dagegen liegt der optimale pH-Wert der HtSH eher im leicht
sauren Bereich von 6.0-6.5 (Abbildung 8). Bei der Untersuchung der einzelnen Teilreaktionen,
die von Hydrogenase- bzw. NAD+-Reduktasemodul katalysiert werden, konnte ein deutlicher
Unterschied in den pH-Optima beobachtet werden. Das pH-Optimum der vom Hydrogenase-
Modul katalysierten H2-abhängigen Reduktion von Benzylviologen liegt mit einem pH-
Optimum von 6.0-7.5 in einem ähnlichen Bereich wie das Optimum der Gesamtreaktion von
H2NAD+. Die NADH-abhängige Reduktion von BV, die von dem NAD+-Reduktasemodul
katalysiert wird, ist jedoch besonders bei basischen pH-Werten hoch und erreicht ein Maximum
von 63.7 ± 5.3 U ∙ mg-1 bei pH 10.5. Das pH-Optimum der Gesamtreaktion scheint demnach
durch die Aktivität des Hydrogenasedimers vorgegeben bzw. limitiert zu sein.
30 40 50 60 70 80 90
10
20
30
40
50
60
70
80
Spezifische Aktivität (U mg-1)
Temperatur (°C)
58
Abbildung 8. Aktivität der HtSH bei verschiedenen pH-Werten. Die grauen Balken repräsentieren
die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität. In blau ist die NADH abhängige BV-Reduktion durch
das NAD+-Reduktasemodul (HoxFU) dargestellt. Orange Symbole geben die Werte der H2 Oxidation
und Reduktion von BV, die durch das Hydrogenasedimer (HoxHY) katalysiert wird, wieder. Alle
Messungen wurden in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2, 5 mM MgCl2, 2 µM FMN und 0.75 mM TCEP,
1 mM NAD+ oder NADH und 5 mM BV in einem Universalpuffer bestehend aus 16 mM Citrat, 16
mM Tris und 16 mM Glycin bei 50 °C gemessen.
3.3.2 Kinetische Parameter
Neben dem Temperatur- und pH-Optimum wurden auch die KM-Werte als Maß für die
Affinität der HtSH zu ihren natürlichen Substraten NAD+, NADH und H2 untersucht
(Abbildung 9). Der erhaltene KM Wert für NAD+ liegt bei 474 µM und damit geringfügig
niedriger als der KMNAD+ von 560 µM für die ReSH mit ( Schneider & Schlegel, 1976). Die
Affinität der HtSH zu NADH liegt mit 1.11 mM deutlich über dem KMNADH von 80 µM der
ReSH (Schneider & Schlegel, 1976). H2 als Substrat wird von beiden SHs ähnlich affin
gebunden. Der KMH2 der HtSH liegt bei 42 µM, der KMH2 der ReSH wurde mit 37 µM bestimmt
(Schneider & Schlegel, 1976). Die Kinetik der H2-Aufnahme durch die HtSH folgt dabei einem
sigmoidalen Kurvenverlauf, wie es für kooperative Bindungsmechanismen typisch ist, die
mithilfe der Hill-Gleichung beschrieben werden.
5 6 7 8 9 10 11
0
10
20
30
40
50
60
70
pH
Spezifische Aktivität (U mg-1)
59
Abbildung 9. Michaelis-Menten Kinetiken der HtSH für die Substrate NAD+ (a), NADH (b), H2
(c). Während die Bestimmung der KM-Werte für die Pyridindinukleotide photometrisch bestimmt
wurde, erfolgte die Messung der H2-Oxidation amperometrisch mit einer modifizierten Clark-
Elektrode. Für alle Messreihen wurde ein Puffer aus 50 mM Bis-Tris pH 6.5 mit 0.5 mM NiCl2, 5 mM
MgCl2, 2 µM FMN und 0.75 mM TCEP verwendet.
3.3.3 O2-Toleranz
Der thermophile Organismus Hydrogenophilus thermoluteolus wächst
chemolithoautotroph in einer Atmosphäre aus H2 und CO2 und O2 (Goto et al., 1977). Die
Hydrogenase(n), die dieses Wachstum ermöglichen, sollten demnach sauerstofftolerant sein.
Um diese O2-Toleranz zu bestätigen und genauer zu untersuchen, wurde die H2-abhängige
NAD+-Reduktionsaktivität der gereinigten HtSH in Anwesenheit verschiedener O2-
Konzentrationen bestimmt. Dabei zeigte sich eine deutlich weniger ausgeprägte
Sauerstofftoleranz als sie für die ReSH beobachtet wurde (Lauterbach & Lenz, 2013). Bereits
eine vergleichweise geringe O2-Konzentration von 18.8 µM verringerte die Aktivität um etwa
50 % (Tabelle 15).
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6
0
5
10
15
20
25
30
35
40
Spezifische Aktivität (U mg-1)
[NAD+] (mM)
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Spezifische Aktivität (U mg-1)
[NADH] (mM)
0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
Spezifische Aktivität (U mg-1)
[H2] (mM)
a
b
c
60
Eine Untersuchung der Sauerstofftoleranz der HtSH unter physiologischen Bedingungen in
Form von chemolithoautotrophen Wachstumstests in Anwesenheit verschiedener O2-
Partialdrücke war leider nicht möglich. Die bevorzugte Wachstumstemperatur des
Produktionsstammes R. eutropha liegt mit 30 °C offenbar zu stark unterhalb des
Temperaturoptimums der HtSH-Aktivität. Somit ist die HtSH nicht in der Lage, ausreichend
Reduktionsäquivalente für chemolithoautotrophes Wachstum bereitzustellen.
Tabelle 15. H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität der HtSH in Anwesenheit verschiedener
O2-Konzentrationen.
O2 / H2 / N2
(% v/v)a
[O2]
(µM)
Hydrogenase-Aktivität
(U ∙ mg-1)
kcat
(s-1)
Hydrogenase-Aktivität
(%)
0 / 33.33 / 66.66
0.00
16.3 ± 1.5
45.9
100
0.2 / 33.33 / 66.46
1,9
15.4 ± 3.8
43.0
94.2
2 / 33.33 / 64.66
18,8
7.7 ± 0.3
21.5
49.8
10 / 33.33 / 56.66
94,0
1.3 ± 0.5
3.6
16.6
aAlle Messreihen wurden in einem Puffer aus 50 mM Bis-Tris pH 6.5 mit 0.5 mM NiCl2, 5 mM MgCl2, 2 µM
FMN, 0.75 mM TCEP und 1 mM NAD+ bei 50 °C gemessen.
3.3.4 Metall- und Kofaktor-Gehalt
Bidirektionale, Pyridinnukleotid-abhängige [NiFe]-Hydrogenasen wie die SHs aus R.e.
und R.o. beinhalten ein fest gebundenes FMN-Molekül als Kofaktor in der zugehörigen
Bindetasche von HoxF. Zusätzlich wurde ein weiteres FMN-Molekül in HoxY der ReSH
vermutet (Lauterbach, Liu, et al., 2011; Schneider & Schlegel, 1978; Van Der Linden et al.,
2004).
Mithilfe einer abgeänderten Methode nach Schneider und Schlegel (Schneider & Schlegel,
1976) (2.4.7) wurden mittels Fluoreszenzmessung 1.07 FMN-Molekülen pro HtSH-
Heterotetramer bestimmt. Neben FMN sind weitere Kofaktoren, vorrangig Fe-S-Zentren, in
Pyridinnukleotid-abhängigen [NiFe]-Hydrogenasen zu finden. Aufgrund der hohen
Aminosäuresequenzähnlichkeit der HtSH zur ReSH und der gemeinsamen Homologie zu
Komplex I lassen sich konservierte, Metallzentren koordinierende Cystein-Reste identifizieren
(Anhang). Diese lassen einen Gehalt von 19 Eisenatomen sowie einem Nickelatom pro SH-
Molekül vermuten.
61
Um welche Art von Fe-S-Zentren es sich in der HtSH handeln könnte, sollte mittels
Kernresonanz-Schwingungsspektroskopie („Nuclear Resonance Vibrational Spectroscopy“,
NRVS) untersucht werden. Die entsprechenden NRVS-Messungen ergaben ein Spektrum, das
denen ähnelt, die bereits für DvSH und ReSH beobachtet wurden (Kamali et al., 2013;
Lauterbach et al., 2015). Dieses legt die Vermutung nahe, dass 16 der erwarteten 19 Fe-Atome
an der Bildung von vier [4Fe4S]-Zentren beteiligt sind. Daneben zeigte sich ein für [2Fe2S]-
Cluster typisches Signal bei 414 cm-1. Zusätzlich wurden mittels ICP-OES 14.2 ± 0.19 Fe und
2.4 ± 0.1 Ni pro HtSH gemessen.
3.3.5 Reaktivierungsverhalten
Bei der standardmäßigen Messung der H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivität der HtSH bei
50 °C war eine ausgeprägte Anlaufphase zu beobachten, bevor das Enzym Aktivität zeigte.
Über eine solche verzögerte Kinetik wurde zuvor auch für die RoSH berichtet (Aggag &
Schlegel, 1974). Es wurde ebefalls beobachtet, dass die Anlaufphase durch Zugabe
katalytischer Mengen von NADH erfolgte oder höhere Proteinkonzentrationen deutlich
verkürzt wurde. Entsprechende Aktivierungsversuche wurden auch für die H2-abhängige
NAD+-Reduktion durch die HtSH vorgenommen. Eine besonders signifikante Verkürzung der
Anlaufphase sowie Erhöhung der Aktivität konnte durch Zugabe von 0.75 – 1 mM TCEP
erreicht werden (Abbildung 10). Ohne die Zugabe von TCEP trat die H2-abhängige Reduktion
von NAD+ erst nach einer Anlaufphase von fast 25 Minuten ein. Auch der Zusatz von NADH
verkürzte die Anlaufphase, es wurde aber nicht die maximale Aktivität wie bei Zugabe von
TCEP erreicht. Ebenso verkürzte die Erhöhung der eingesetzten Proteinmenge die
Anlaufphase, hatte ebenfalls aber keinen positiven Einfluss auf die spezifische Aktivität. Auch
FMN zur Rekonstitutuion der SH führte zu einer verkürzten Anlaufphase (Anhang).
62
Abbildung 10. Reaktivierungsverhalten der HtSH mit verschiedenen Reduktionsmitteln bzw.
Proteinmengen. Die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität wurde in 50 mM Bis-Tris pH 6.5 bei
50°C in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2 gemessen. Als Lag-Zeit (Anlaufphase)
wurde die Zeit gemessen, die verging, bevor ein linearer Anstieg der Absorption wahrgenommen
wurde.
Die stark schwankende Ausprägung der Anlaufphase zwischen Proben unterschiedlicher
Reinigungen veranlasste zu der Vermutung, dass die HtSH eine stärkere Empfindlichkeit
gegenüber Sauerstoff zeigt. Je nach Inkubationsdauer der Probe unter sauerstoffhaltiger Luft
wiesen die Proben eine längere oder kürzere Anlaufphase auf. Daraufhin wurde ein Protokoll
zur anaeroben Reinigung der HtSH entworfen, welches in der Tat auch ohne Zugabe von
Reduktionsmitteln im Reaktionsassay in eine deutlich verkürzte Anlaufphase resultierte. Dies
war die Reinigung der HtSH unter aneroben Bedingung (2.3.2), wobei die Menge von ca. 5 %
H2 in der Formiergasatmosphäre für die Aktivierung des Enzyms (Reduktion) ausreichte und
alternative Reduktionsmittel nicht mehr notwendig waren.
3.3.6 Langzeitstabilität; Ionenabhängigkeit
Da die HtSH besonders bei hohen Temperaturen katalytisch aktiv ist, sollte ihre
Stabilität bei längerer Lagerung unter kalten Bedingungen genauer untersucht werden. Dazu
wurde eine Probe des gereinigten Enzyms nicht eingefroren, sondern bei 4 °C gelagert. Nach
1, 2, 3 und 9 Tagen wurde die H2-abhängige NAD+-Reduktion unter gleichbleibenden
-25
-20
-15
-10
-5
0
5
10
15
20
Lag-Zeit Spezifische Aktivität
(min) (U mg-1)
Menge SH 74 µg 74 µg 74 µg 74 µg 37 µg 111 µg 148 µg
TCEP + - - - - - -
NADH - - 5 µM 25 µM 2.5 µM 2.5 µM 2.5 µM
63
Bedingungen gemessen. Auch nach 9 Tagen Lagerung bei 4 °C nahm die Aktivität nur um
etwa 15 % ab (Abbildung 11).
Abbildung 11. H2-abhängige Reduktion von NAD+ zu verschiedenen Zeitpunkten nach der
Reinigung (a) und in Gegenwart verschiedener Metallsalze (b). Die Aktivitäten wurde in 50 mM
Bis-Tris Puffer pH 6.5 unter Zugabe von 0.75 mM TCEP und 2 µM FMN gemessen. Die Verwendeten
Konzentrationen der verschiedenen Salze waren (von links nach rechts): 0.5 mM NiCl2 + 5 mM
MgCl2, 0.5 mM NiCl2, 5 mM MgCl2, 5 mM FeCl2, 5 mM MnSO4, 5 mM CaCl2, 5 mM MoCl5, 1 mM
VCl2
n.d. nicht detektierbar
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Spezifische Aktivität (U mg-1)
Tage nach der Reinigung
+NiCl2 +MgCl2
NiCl2
MgCl2
FeCl2
MnSO4
CaCl2
MoCl5
VCl2
ohne
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
Spezifische Aktivität (U mg-1)
n.d.
a)
a)
b)
64
3.3.7 Phylogenetische Beziehung zu anderen löslichen [NiFe]-Hydrogenasen
Abbildung 12. Phylogenetische Bäume zur Darstellung der Verwandtschaft zwischen den
Aminosäure-Sequenzen der SH-Untereinheiten aus verschiedenen Organismen. Die
phylogenetischen Bäume wurden nach dem multiplen Sequenzvergleich mithilfe der Software
„Phylodendron“ (http://iubio.bio.indiana.edu/) visualisiert.
Die phylogenetischen Bäume basieren auf den Proteinsequenzen der einzelnen Untereinheiten
und zeigen die besondere Stellung der HtSH auf. Während alle vier Untereinheiten der RoSH
und ReSH starke Verwandtschaft aufzeigen, zeigt die HtSH - besonders die Untereinheiten
HoxY und HoxF – verwandtschaftliche Nähe eher zu den SHs von Synechocystis sp. sowie
P. furiosus.
3.3.8 Spektroskopische Eigenschaften der thermostabilen SH
Um einen genaueren Einblick in die Struktur und Funktion der Metallkofaktoren im
aktiven Zentrum zu erlangen, wurden Proben der gereinigten HtSH mittels IR und EPR
spektroskopisch charakterisiert. Dazu wurden die Proben für beide Methoden identisch mit
verschiedenen Reduktionsmitteln behandelt und vorbereitet. Die spektroskopischen
Messungen wurden von Stefan Wahlefeld und Christian Lorent aus der AG Hildebrandt
durchgeführt.
65
Das IR-Spektrum, das als zweite Ableitung dargestellt wird, zeigt für die frisch isolierte Probe
der HtSH im unbehandelten Zustand drei deutliche Absorptionssignale bei 1993, 1964, und
1936 cm−1 (Abbildung 13). Banden in diesem Bereich des Spektrums sind charakteristisch für
Streckschwingungen des CO-Liganden im aktiven [NiFe]-Zentrum. Die einzelnen Maxima
sind dabei etwa 30 cm-1 voneinander entfernt, so wie es typisch für [NiFe]-Hydrogenasen im
oxidierten Zustand ist. Für eine vereinfachte Zuordnung der Redoxzustände wird im Folgenden
nur auf die CO-Streckschwingungen eingegangen. Die Schwingungen der CN-Liganden sind
Tabelle 16 zu entnehmen. Dieses Spektrum suggeriert das Vorhandensein dreier verschiedener
Zustände des Zentrums. Das Signal bei 1964 cm-1 entspricht dabei dem „Nir-B“-ähnlichen
Zustand, der bereits bei ReSH und anderen NAD(P)+-reduzierenden Hydrogenasen beobachtet
wurde (Germer et al., 2009; Greene et al., 2015; Horch et al., 2011; Horch et al., 2010; Karstens
et al., 2015; van der Linden et al., 2006). Die Absorptionsbande bei 1936 cm-1 kann dem Nir-
S-Zustand zugeordnet werden. Das außergewöhnliche Signal bei 1993 cm-1 wurde bisher noch
nicht bei [NiFe]-Hydrogenasen beobachtet und ist demzufolge auch nicht für die SH aus R.
eutropha beobachtet worden (Happe et al., 2000; Lauterbach, Liu, et al., 2011).
Unter reduzierenden Bedingungen, d.h. durch Behandlung der Probe mit TCEP und NADH,
verschwinden die Absorptionsbanden bei 1993 und 1964 cm-1 und es treten Signale bei 1971
und 1951 cm−1 auf. Diesen werden die Zustände Nia-C und Nia-S zugeordnet. Die Intensität
der Bande bei 1936 cm-1 nimmt unter Inkubation der Probe mit NADH und TCEP an Intensität
zu, was auf einen teilweise reduzierten Zustand mit NiII hindeutet.
Wird die Probe der HtSH zusätzlich mit H2 reduziert, verstärkt sich das Nia-C Signal bei 1971
cm-1 und es können die Streckschwingungen der CN-Liganden bei 2076 und 2089 cm−1
identifiziert werden.
Daneben formiert sich ein deutliches Absorptionssignal bei 1958 cm-1. Spektro-
elektrochemische Messungen zeigten, dass das Erreichen dieses Zustandes niedrigere
Redoxpotentiale als der Nia-C-Zustand erfordert. Demnach wird dieses Signal dem vollständig
reduzierten Nia-SR-Zustand zugeordnet. Die entsprechenden CN-Streckschwingungen sind bei
2076 und 2062 cm−1 zu beobachten. Zwei weitere reduzierte Zustände Nia-SR' und Nia-SR''
sind mit den etwas schwächeren Signalen bei 1943 und 1934 cm-1 assoziiert. Diese
Bandenzuordnung ähnelt dem Spektrum der PfSH1, die wie die HtSH generell höhere
Frequenzen der CO-Streckschwingungen aufweist als die ReSH (Greene et al., 2015).
66
Abbildung 13. IR- (links) und EPR- (rechts) Spektren der gereinigten HtSH in verschiedenen Zuständen.
Die Proben wurden im unbehandelten, oxidierten (“as-isolated”) Zustand gemessen (schwarze Linien;
a, d) und unter reduzierenden Bedingungen (rote Linien b, d, mit TCEP und NADH; blaue Linien c,
f, mit H2, TCEP, NADH). IR Spektren wurden bei 10 °C aufgenommen, während EPR Spektren
entweder bei 10 K (d) oder 35 K (e, f) gemessen wurden.
Neben IR wurden die Proben der HtSH auch mittels EPR untersucht (Abbildung 13). Dabei
weist das Spektrum der unbehandelten Probe nur ein schwaches Signal auf, welches im
Gegensatz zu dem erwarteten [4Fe4S]- einem [3Fe4S]-Cluster zugeschrieben wird und auf
mögliche oxidative Beschädigung zurückzuführen ist. Wie auch bei anderen NAD(P)+-
reduzierenden Hydrogenasen konnte kein Signal eines oxidierten Zustandes des aktiven
Zentrums detektiert werden (Germer et al., 2009; Happe et al., 2000; Horch et al., 2010;
Karstens et al., 2015; van der Linden et al., 2006).
Nach Reduktion der HtSH mit TCEP und NADH zeigt das EPR-Spektrum, welches bei 35 K
aufgenommen wurde, Signale des Hydrid-bindenden Nia-C-Zustandes, korrespondierend mit
der IR-Absorptionsbande bei 1971 cm-1. Daneben treten auch Signale eines [2Fe2S]-Clusters
sowie eines Flavin-Radikals auf. Messungen, die bei 10 K durchgeführt wurden (Anhang),
zeigen zusätzlich ein breites Signal bei g = 1.85, welches möglicherweise einem [4Fe4S]-
Cluster entspricht.
Nach Inkubation mit H2 dominiert das Signal des [2Fe2S]-Cluster im EPR-Spektrum bei 35 K.
Erst die Aufnahme eines Spektrums bei 6.5 K zeigt auch Signale, die charakteristisch für den
2800 3000 3200 3400 36001950200020502100
1934
1943
1971
1958
1993
1951
1936
1964
2048
2062
2076
2090
2081
2098
Absorption, 2. Ableitung (a.u.)
Wellenzahl (cm-1)
2089
2071
2058
Intensität (a.u.)
d
f
e
Feld (G)
8x
a
b
c
FMN
Nia-C
2Fe2S
3Fe4S
2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8
g-Wert
as-isolated
reduziert
(NADH, TCEP)
reduziert
(H2, NADH, TCEP)
67
Nia-C Zustand sind (Anhang). Daneben sind auch Signale von [4Fe4S]-Zentren zu
identifizieren.
Auch hier zeigt die PfSH1 (Bryant & Adams, 1989) Ähnlichkeit mit der HtSH. Für beide SHs
können deutliche Nia-C-Signale erst bei sehr niedrigen Temperaturen detektiert werden, sodass
eine starke magnetische Kopplung zwischen Fe/S-Kofaktoren und [NiFe]-Zentrum vermutet
wird, die zu einer Signalverbreiterung führt.
Tabelle 16. Redoxzuständen des aktiven Zentrums zugeordnete Wellenzahlen für gereinigte HtSH
Redoxzustand
ν(CO)
(cm-1)
ν(CN)
(cm-1)
Nicht zugeordnet
1993
2081
2090
Nir-B-like
1964
2087
2098
Nir-S
1936
2058
2071
Nia-S
1951
2076
2089
Nia-C
1971
2076
2089
Nia-SR
1958
2062
2076
Nia-SR'
1943
2048
2062
Nia-SR''
1934
2048
2062
Tabelle 17. Auf der Basis von EPR-Spektroskopie zugeordnete g-Werte der Kofaktoren in HtSH
g1
g2
g3
[3Fe4S]
2.004
1.982
[2Fe2S]
2.026
1.935
[NiFe]: Nia-C
2.210
2.139
2.013
[NiFe]: nicht zugeordnet NIIII
2.260
2.127
2.034
FMN
2.003
3.3.9 Reduktion synthetischer Kofaktoren mithilfe der thermostabilen Hydrogenase
Da die thermostabile SH eine NAD+-Reduktionsaktivität bei höheren Temperaturen
zeigt und auch in Gegenwart von geringen Konzentrationen an Sauerstoff aktiv bleibt, erscheint
sie sehr interessant für die Anwendung als kofaktorregenerierendes Enzym. Im Gegensatz zur
ReSH könnte die HtSH auch in Kombination mit produktbildenden, Pyridinnukleotid-
abhängigen Enzymen angewendet werden, die ebenfalls aus thermophilen Organismen
stammen und somit ein erhöhtes Temperaturoptimum aufweisen, so wie z.B. einige „old yellow
68
enzymes“. Für solche wurde vor kurzem ein alternatives Kofaktorsystem etabliert, welches auf
synthetisierten Derivaten der Pyridinnukleotide basiert (Okamoto et al., 2016; Paul et al.,
2013). Diese synthetischen Kofaktoren sind strukturell mit NAD+ verwandt, können jedoch
einfach chemisch hergestellt werden und sind kostengünstiger. Allerdings fehlt es noch an
effizienten Regenerationssystemen dieser Derivate, da sie durch ihre strukturellen
Unterschiede zum natürlichen Kofaktor NAD+ nicht von den gewöhnlichen
kofaktorreduzierenden Enzymen, wie der Formiat- und der Glukosedehydrogenase (FDH,
GDH) gebunden werden können. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof. Kylie
Vincent konnte gezeigt werden, dass die HtSH jedoch zur Reduktion der artifiziellen
Kofaktoren fähig ist (Tabelle 18). Während für die kommerziell erhältlichen Dehydrogenasen
keine Aktivität in Anwesenheit der synthetischen Kofaktoren zu beobachten war, konnte für
die HtSH eine Aborptionszunahme und damit Reduktion verschiedener Derivate detektiert
werden.
Tabelle 18. Vergleich der HtSH mit kommerziell erhältlichen, kofaktorregenerierenden Dehydrogenasen.
NAD
+
R =
Adenosindinukleotid
X=CONH
2
BNA
+
R = CH
2
Ph
X = CONH
2
mCN
R = CH
2
Ph
X = CN
mCOOH
R = CH
2
Ph
X = COOH
HtSH
✓
✓
✓
✓
Glukosedehydrogenase
✓
✕
✕
✕
Formiatdehydrogenase
✓
✕
n.g.
n.g.
Es wurden die Aktivitäten für verschiedene Derivate von NAD+ (jeweils 1 mM) in 50 mM Tris-HCl
pH 8 bei 40°C mittels UV-Vis Spektroskopie getestet. In Ansätzen der GDH und FDH wurden
zusätzlich 10 mM Glukose bzw. Formiat hinzugefügt. Reaktionsansätze der HtSH wurden mit H2
begast und gasdicht verschlossen.
n.g. = nicht gemessen
✕ = keine Aktivität beobachtet (über einen Zeitraum von 24 h)
✓ = deutliche Aktivität (innerhalb von 4 h beobachtet)
69
3.4 SH-Chimäre bestehend aus SH-Modulen verschiedener Organismen
In Arbeiten von Schneider (1984) und Zaborosch (1989) wurde bereits über die
Dissoziation der tetrameren SH aus Rhodococcus opacus in die zwei Heterodimere HoxFU und
HoxHY berichtet. Diese Dissoziation wurde beobachtet, wenn die Enzymreinigung in
Abwesenheit von zweiwertige Kationen wie Ni2+ oder Mg2+ durchgeführt wurde. Die dadurch
getrennten Hydrogenase- und NAD+-Reduktasemodule waren jedoch stabil und katalytisch
aktiv (H2 BV, bzw. NADH BV). Lediglich die Gesamtreaktion, d.h. die H2-abhängige
Reduktion von NAD+ gemessen werden, war nicht mehr möglich, da der Elektronentransport
vom aktivem [NiFe]- Zentrum der Hydrogenase zur Nicotinamidbindestelle im NAD+-
Reduktasemodul unterbrochen war.
Erste Reinigungsversuche der heterolog produzierten SH aus H.t. in R.e. basierten auf
Protokollen zur Reinigung der ReSH. Es konnte zwar Protein im Eluat nach der
Affinitätschromatographie nachgewiesen werden, eine H2-abhängige Reduktion von NAD+
wurde jedoch nicht festgestellt. Aufgrund der Kenntnis von der dissoziativen Eigenschaft der
RoSH wurde daraufhin der Puffer mit NiCl2 supplementiert. Dieser Zusatz führte tatsächlich
zur einer erhöhten Proteinausbeute und einer höheren NAD+-reduzierende Aktivität der HtSH.
Dass sich auch die SH-Module aus Ralstonia eutropha einzeln reinigen lassen und auch aktiv
und stabil bleiben, konnte von (Lauterbach & Idris, et al., 2011; Lauterbach & Liu, et al., 2011)
gezeigt werden. Dabei beruhte die Isolierung der getrennten Module nicht auf der
biochemischen Eigenschaft der SH, sondern wurde durch ein geeignetes Expressionssystem
erzielt. Dieses erlaubt die Produktion nur eines Heterodimers in einem R.e.-Stamm, bei dem
SH-spezifische Strukturgene deletiert wurden und die Module dabei von einem Plasmid kodiert
werden.
Trotz der hohen Ähnlichkeit der Aminosäuresequenzen von ReSH, RoSH und HtSH weisen
die jeweils isolierten heteroterameren Proteine unterschiedliche biochemische Charakteristika
auf. So unterscheiden sich neben dem Dissoziationsverhalten z.B. auch die KM-Werte für die
natürlichen Substrate NAD+, NADH und H2 sowie die Temperatur- und pH-Optima.
Um die möglichen strukturellen und biochemischen Ähnlichkeiten zwischen den löslichen
Hydrogenasen aus unterschiedlichen Organismen zu untersuchen, wurde ein
Komplementationssystem entworfen. Hierfür wurden Produktionssysteme in R. eutropha
konstruiert, die verschiedenen Zusammensetzungen der heterotetrameren SH aus
70
Hydrogenase- und NAD+-Reduktasemodule von R. eutropha, R. opaccus und
H. thermoluteolus erlauben sollen.
Dazu wurde zum einen der Stamm R. eutropha HF903 (∆hoxG, ∆hoxC) verwendet, der eine
Leseraster erhaltende Deletion in hoxFU trägt (Lauterbach et al., 2011). Daneben wurde im
Stamm R. eutropha HF1009 (∆hoxG, ∆hoxC, ∆hofG, strep – hoxF; Karstens et al., 2015) eine
Leseraster erhaltende Deletion in hoxHY vorgenommen. Diese beiden Stämme dienten
zunächst als Produktionsstämme für ReHoxHY bzw. Strep-ReHoxFU, in die die
entsprechenden fehlenden, heterologen SH-Module über Plasmide eingebracht wurden. Für die
Produktion R. opacus-spezifischer SH-Module wurde auf Plasmide von K. Karstens (2014)
zurückgegriffen. Eine Übersicht der Kombinationen und Plasmide ist in Tabelle 19 dargestellt.
Tabelle 19. Übersicht über verwendete Stämme und chimäre SH-Varianten. Die Proteine wurden
entsprechend der Genherkunft farblich markiert: R.e. blau, H.t. rot, R.o. grün.
Ausgangsstamm
Relevanter
Genotyp
Eingebrachtes
Plasmid
Plasmidbezeichnung
Resultierende SH-
Zusammensetzung
Position des StrepII-
tag
HF1009∆hoxHY
pJP62.2
pRehoxHY 1
SHReFUYH
n-terminal HoxF
HF1009∆hoxHY
pJP66.6
pRehoxHY 2
SHReFUYH
n-terminal HoxF
HF1009∆hoxHY
pJP09 HY
pHthoxHY
SHReFUHtYH
n-terminal HoxF und
HoxY
HF1009∆hoxHY
pJP09a (KmR)
pHthoxHY
SHReFUHtYH
n-terminal HoxF und
HoxY
HF1009∆hoxHY
pDAK114o1
pRohoxHY
SHReFURoYH
n-terminal HoxF und
HoxY
HF500 ∆hoxH
pJP62.2
pRehoxHY
SHReFUYH
Nicht vorhanden
HF500 ∆hoxH
pJP66.6
pRehoxHY
SHReFUYH
Nicht vorhanden
HF500 ∆hoxH
pJP09 HY
pHthoxHY
SHReFUHtYH
n-terminal HoxY
HF500 ∆hoxH
pJP09a (KmR)
pHthoxHY
SHReFUHtYH
n-terminal HoxY
HF500 ∆hoxH
pDAK114o1
pRohoxHY
SHReFURoYH
n-terminal HoxY
HF903 ∆hoxFU
pJP66
pRehoxFU
SHReFUYH
n-terminal HoxF
HF903 ∆hoxFU
pJP09 FU
pHthoxFU
SHHtFUReYH
n-terminal HoxF
HF903 ∆hoxFU
pDAK113o1
pRohoxFU 1
SHRoFUReYH
n-terminal HoxF
HF903 ∆hoxFU
pDAK113o2
pRohoxFU 2
SHRoFUReYH
n-terminal HoxF
71
3.4.1 Chimäre SH-Varianten können lithoautotrophes Wachstum von R. eutropha
vermitteln
Um zu überprüfen, ob die heterologen Gene funktionell exprimiert werden, d.h. die
Deletionen der Gene hoxHY bzw. hoxFU in den Stämmen R. eutropha HF1009 (∆hoxHY),
HF500 und HF903 komplementiert werden können, wurden die entsprehenden
Transkonjuganten auf chemolithoautotrophes Wachstum getestet.
Die Ausgangsstämme HF903 (∆hoxFU) und HF1009 (∆hoxHY) sowie HF500 (∆hoxH) sind
aufgrund der fehlenden, vollständigen SH nicht in der Lage, lithoautotroph zu wachsen.
Porthun und Mitarbeiter (2002) haben zuvor gezeigt, dass heterolog produzierte SH aus
R. opacus lithoautotrophes Wachstum von R. eutropha vermitteln kann. Obwohl nach dem
Transfer der verschiedenen Plasmide in den Stamm R. eutropha HF1009 ∆hoxHY die
genetische Information für alle Untereinheiten der SH vorhanden ist, wird bei diesem Stamm
offensichtlich nicht genügend funktionale Hydrogenase produziert, um lithoautotrophes
Wachstum zu ermöglichen.
Um auszuschließen, dass die mangelnde Produktion der Hydrogenasemodule in dem Stamm
HF1009 ∆hoxHY auf Fehlern in den Plasmidkonstruktion oder auf Plasmidinstabilität beruht,
wurden die Hydrogenase-kodierenden Vektoren ebenfalls in den Stamm R. eutropha HF500
(MBH-, RH-, ∆hoxH) transferiert. Nach Konjugation der verschiedenen HoxHY-kodierenden
Plasmide, konnte bei den Transkonjuganten das Wachstum unter Verwendung von H2 als
Energie- und CO2 als Kohlenstoffquelle beobachtet werden (Abbildung 14 a). Demzufolge
lässt sich ReHoxHY durch RoHoxHY soweit ersetzen, dass ein Elektronentransfer vom
Hydrogenasemodul von R. opacus zum NAD+-Reduktasemodul von R. eutropha und damit die
H2-abhängige NAD+-Reduktion möglich ist. Die Hydrogenase-Untereinheit des thermophilen
Organismus scheint unter den gegebenen Wachstumsbedingungen jedoch nicht über
ausreichend Aktivität oder Stabilität zu verfügen, um mit dem NAD+-Reduktasemodul in ras
zu interagieren und das autotrophe Wachstum zu vermitteln (Abbildung 14 b).
Auch HoxFU von R.e. in dem Stamm R. eutropha HF903 kann durch die heterologen NAD+-
Reduktasemodule ersetzt werden. Nach Einbringen der verschiedenen HoxFU-kodierenden
Plasmide in diesen Stamm, wurde ausreichend rekombinante, heterotetramere SH produziert
werden, um lithoautotrophes Wachstum zu ermöglichen (Abbildung 14 b).
72
Abbildung 14. Lithoautotrophes Wachstum von HF903 (∆hoxFU) (a) bzw. HF500 (∆hoxH) (b) mithilfe
chimärer Hydrogenase-Varianten. In dem Stamm HF903 wurde die Deletion von hoxFU durch
heterologe HoxFU-Module aus den Organismen R. opacus oder H. thermoluteolus komplementiert.
Die Deletion von hoxH in HF500 wurde durch Transfer HoxHY-kodierender Plasmide
komplementiert. Die Platten wurden 5 Tage in einer Atmosphäre aus 10% H2, 5 % O2, 10 % CO2 und
75% N2 bei 30 ° C inkubiert.
Um genauere Einblicke in die physiologische Funktionalität der chimären Hydrogenase-
Varianten in R. eutropha zu erhalten, wurde das Wachstumsverhalten auch in flüssigem
Nährmedium verfolgt (Abbildung 15). Nach Ermittlung der Wachstumsraten und
Verdopplungszeiten wurden unterschiedliche Wachstumsverhalten der verschiedenen Stämme
aufgezeigt. So wuchsen die Stämme HF903 und HF500, in die ReSH homologe Untereinheiten
eingebracht wurden mit Verdopplungszeiten von 79.5 h und 74.1 h am schnellsten. Danach
folgte Stamm R. eutropha HF903 mit dem heterologen NAD+-Reduktasemodul aus
H. thermoluteolus mit einer Verdopplungszeit von 96.9 h. Deutlich langsamer wuchsen die
Stämme HF903 und HF500, die HoxFU bzw. HoxHY aus R. opacus synthetisieren. Der Stamm
HF500, in den das Hydrogenase-Dimer aus H.t. eingebracht wurde wuchs kaum nachweisbar,
und eine Bestimmung der Wachstumsrate war aufgrund der sehr niedrigen OD-Werte nicht
möglich.
HF500
pRoHoxHY
HF500
pReHoxHY
HF500
pHtHoxHY
HF903
pReHoxFU
HF903
pHtHoxFU
HF903
pHtHoxFU
b)
a)
73
Abbildung 15. Lithoautotrophes Wachstum der verschiedenen HF903 (∆hoxFU)- und HF500 (∆hoxH)-
Stämme in Minimalmedium unter einer Atmosphäre aus 10% H2, 5 % O2, 10 % CO2 und 75% N2 bei 30 °
C.
Tabelle 20. Wachstumsraten und Verdopplungszeiten der verschiedenen Transkonjuganten basierend auf
den R. eutropha Stämme HF903 (∆hoxFU) und HF500 (∆hoxH) unter lithoautotrophen
Wachstumsbedingungen. Die angegebenen Mittelwerte wurden aus zwei unabhängigen
Kultivierungsexperimenten ermittelt.
HF903 +
pRehoxFU
HF903 +
pRohoxFU 1
HF903 +
pHthoxFU
HF500 +
pRehoxHY 1
HF500 +
pRohoxHY
HF500 +
pHthoxFU
SH-Variante
SHReFUYH
SHRoFUReYH
SHHtFUReYH
SHReFUYH
SHReFURoYH
SHReFURoYH
Wachstumsrate µ
(h-1)
0.0087
0.0063
0.0072
0.0094
0.0051
-
Verdopplungszeit
(h)
79.5
110.8
96.6
74.1
135.2
-
0 5 10 15 20 25
0,01
0,1
1
10
HF903 + ReHoxFU
HF903 + RoHoxFU
HF903 + HtHoxFU
HF500 + ReHoxHY
HF500 + RoHoxHY
HF500 + HtHoxHY
OD 436 nm
Zeit (Tage)
74
3.4.2 Immunologischer Nachweis der SH-Untereinheiten
Die Produktion der Module in den rekombinanten R.-eutropha-Stämmen wurde mittels
SDS-PAGE-Gelelektrophorese und der anschließenden immunologischen Detektion über
ReSH-spezifische Antikörper nachgewiesen. In Transkonjuganten des Stammes R.e.∆hoxHY
mit Plasmiden, die HoxHY-Module verschiedenen Ursprungs kodieren, konnte lediglich eine
Bande in Proben des löslichen Extraktes detektiert werden, die nicht einer SH-Untereinheit
zuzuordnen war (Abbildung 16 c), d.h. die SH-Untereinheiten sind in diesem
Stammhintergrund nicht nachweisbar. Eine Ausnahme bilden diejenigen Transkonjuganten,
die das R.e.-eigene HY-Modul trugen. In diesen konnte die große Hydrogenaseuntereinheit,
HoxH, in Spuren detektiert werden (Abbildung 16 c).
Die oben erwähnte, kreuzreagierende Bande wurde ebenfalls in löslichen Extrakten von
R.e.∆hoxH-Stämmen nachgewiesen, die Plasmide mit hoxHY-Genen trugen (Abbildung 16c).
Allerdings wurden hier auch alle SH-Untereinheiten, d. h. HoxF, HoxH, HoxU und HoxY
detektiert. Dies galt sowohl für R.e.∆hoxH mit pRehoxHY, pRohoxHY sowie pHthoxHY,
wobei im letzteren Fall nur sehr schwache Banden für HoxH und HoxY zu erkennen waren.
Im löslichen Extrakt des R.e.-Stammes ∆hoxFU, der pRehoxFU trug, lassen sich sowohl HoxH
wie auch HoxY deutlich nachweisen (Abbildung 16 a, b). Die Anwesenheit des Plasmids
pJP66 resultierte in der Produktion aller vier SH-Untereinheiten, die sich mithilfe der ReSH-
spezifischen Antikörper deutlich detektieren ließen. Konjugation mit pRohoxFU- sowie
pHthoxFU führte ebenfalls zu immunologisch nachweisbaren Mengen von HoxFU.
75
Abbildung 16. Immunulogische Nachweis der SH-Untereiheiten in rekombinanten R.-eutropha-Stämmen,
die SH-Hybridproteine synthetisieren. Abbildung a) zeigt den R. eutropha-Stamm HF903, der aufgrund
von ∆hoxFU nur die SH-Untereinheiten HoxH und HoxY produziert. Die Transkonjuganten HF903
mit pRehoxFU und pHthoxFU (a), sowie pRohoxFU 1 und 2 (b) besitzen alle vier SH-Untereinheiten.
In Abbildung c) ist der R.eutropha-Stamm HF1009 als WT mit allen vier SH-Untereinheiten
abgebildet. Die Deletion von hoxHY führt zum Verlust der entsprechenden Untereinheiten.
Transkonjuganten basierend auf dem R.e.-Stamm HF500 mit pRehoxHY, pRohoxHY und pHthoxHY
zeigen die Anwesenheit aller vier SH-Untereinheiten. Proben der löslichen Extrakte wurden mittels
SDS-Gelelektrophorese in 12%-igen Acrylamidgelen aufgetrennt und anschließend im „Semi-dry
Western blot“-Verfahren auf Nitrocellulose übertragen. ReHoxHYFU-spezifische Antikörper wurden
zur Detektion der SH-Untereinheiten verwendet.
a)
b)
c)
76
3.4.3 Aktivitäten im löslichen Extrakt
Im Anschluss zu den physiologischen Wachstumstests und dem immunologischen
Nachweis der vier SH-Untereinheiten wurden die SH-Aktivitäten in den R. eutropha-
Transkonjuganten bestimmt. Zunächst wurden die Aktivitätsmessungen auf Proben des
löslichen Extraktes beschränkt, da nicht für alle SH-Hybridproteine mittels
Affinitätschromatographie gereinigt werden konnten (3.4, Tabelle 19). Alle Stämme wurden
in modifiziertem FGN-Medium über einen Zeitraum von 7 Tagen bei 30°C bis zu einer OD436nm
von etwa 10 kultiviert. Nach dem Aufschluss der Zellen und anschließender
Ultrazentrifugation wurde die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität bei 30 °C in den
resultierenden löslichen Extrakten gemessen. Um den von Aggag und Schlegel (1974)
beobachteten stimulierenden Effekt von Ni2+ und Mg2+ auf die Aktivität der RoSH einem der
beiden SH-Dimere genau zuordnen zu können, wurden alle Messungen zusätlich auch in
Anwesenheit von NiCl2 und MgCl2 durchgeführt.
Die höchsten spezifischen Aktivitäten von etwa 1- 1.2 U · mg-1 wurden im löslichen Extrakt
der Transkonjugante des R. eutropha-Stammes HF903 mit pRehoxFU sowie der
Transkonjugante mit pHthoxFU ohne Zugabe von NiCl2 und MgCl2 gemessen (Abbildung
17). Mit 0.6-0.8 U · mg-1 etwas geringer waren die Aktivitäten der Transkonjugante des
R. eutropha-Stammes HF903 mit pRohoxFU. Dass neben der nativen ReSH auch das
HtHoxFU-Modul hohe SH-Aktivität im löslichen Extrakt vermittelt, deckt sich mit der
Beobachtung aus den lithoautotrophen Wachstumstests. Auch dabei zeigte die
Transkonjugante des R. eutropha-Stammes HF903 mit pHthoxFU nach der Transkonjugante
HF903 mit pRehoxFU die schnellste Wachstumsrate.
Die Supplementierung des Reaktionsansatzes mit NiCl2 und MgCl2 führte erstaunlicherweise
bei fast allen auf HF903 basierenden Trankonjuganten zu einer Abnahme der H2-abhängigen
NAD+-Reduktionsaktivität (Abbildung 17).
Deutlich niedriger waren die H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivitäten der
Transkonjuganten basierend auf dem R. eutropha-Stamm HF500. Die höchste Aktivität wies
auch hier die Transkonjugante des R.e.-Stammes HF500 mit pRehoxHY auf. Aktivitäten der
HF500 Stämme mit den Hydrogenasemodulen RoHoxHY sowie HtHoxHY waren mit etwa
0.04 U · mg-1 sehr gering. Unter Zugabe der zweiwertigen Kationen war eine leichte Zunahme
der Aktivitäten erkennbar, jedoch war dieser Effekt sehr schwach. Wurde die Aktivität des
thermostabilen Hydrogenasemoduls im löslichen Extrakt von HF500 bei einer erhöhten
77
Temperatur von 50 °C gemessen, war der stimulierende Effekt von NiCl2 und MgCl2 dagegen
deutlicher sichtbar, was in einer insgesamt höheren H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität
resultierte.
Abbildung 17. Spezifische H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten in den löslichen Extrakten der
Transkonjuganten der R. eutropha-Stämme HF903 (∆hoxFU) bzw. HF500 (∆hoxH) mit den angegebenen
Plasmiden ohne und in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2. Die Aktivitäten wurden bei 30
°C bzw. 50 °C (*) in 50 mM Tris, pH 8 mit 1 mM NAD+, 0.75 mM TCEP und 2 µM FMN gemessen.
Die Werte stammen aus mindestens zwei biologischen Replikaten. Bei den Transkonjuganten des
Stammes HF903 mit pRehoxFU und pHthoxFU wurden vier unterschiedliche biologische Replikate
getestet.
3.4.4 Reinigung der SH-Chimären mittels Affinitätschomatographie
Um den stimulierenden Effekt von Nickel- und Magnesiumionen auf die H2-abhängige
NAD+-Reduktion genauer zu untersuchen, sollten die chimären SH-Varianten über die Strep-
Tactin-Affinitätschromatographie gereinigt werden. Da sich der Stamm HF1009 ∆hoxHY
(StrepII-hoxF) für die Produktion der heterologen Hydrogenase-Module nicht eignete, wurde
auf den Stamm HF500 ∆hoxH ausgewichen. Dieser kodiert jedoch keine Strep-tag II-Sequenz
pRehoxFU
pRohoxFU 1
pRohoxFU 2
pHthoxFU
pRehoxHY
pRohoxHY
pHthoxHY
pHthoxHY 50°C
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
HF903
HF500
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
Spezifische Aktivität (U mg-1)
ohne NiCl2, MgCl2
mit NiCl2, MgCl2
*
78
an einer der SH-Untereinheiten, so dass aus den Transkonjuganten des R. eutropha- Stammes
HF500 mit pRehoxHY 1 sowie pRehoxHY 2 keine lösliche Hydrogenase über die
Affinitätschromatographie isoliert werden konnte. Bei den Transkonjuganten des R. e.-
Stammes HF500 mit pHthoxHY und pRohoxHY befindet sich ein StrepII-tag an HoxY, sodass
dieser die Reinigung mittels Affinitätschromatographie ermöglichte. Heterotetramere,
homogene ReSH als Kontrolle wurde durch die Proteinreinigung aus der Transkonjuganten des
R.e.-Stammes HF903 mit pRehoxFU erhalten.
Für die Reinigungen der chimären SHs wurde zunächst ein Puffersystem (50 mM KPOi, pH 7,
15 % Glycerin) ohne Salze gewählt, um störende Effekte wie z.B. die zuvor beobachtete
Sensibilität der ReSH auf Natriumionen (Keefe et al., 1995) oder eine niedrige Ausbeute der
HtSH bei Anwesenheit von Kaliumionen auszuschließen (3.2). Dieser Puffer erscheint
geeignet für die Reinigung der Ro-Module und der HtHoxFU-Untereinheiten, eignete sich
jedoch nicht für die Isolierung von HtHoxHY zusammen mit ReHoxFU. Bei dieser chimären
SH-Variante wurde zwar Protein im Eluat nachgewiesen, das zugehörige SDS-Gel zeigte
jedoch nur Banden, die sich in Laufhöhe der Untereinheiten HoxF und HoxU befinden
(Abbildung 18 a). Der immunologische Nachweis der HoxFUHY-Untereinheiten mittels ReSH-
spezifischer Antikörper wurde für die Reinigung der Transkonjugante HF500 mit pHthoxHY
mit Proben des löslichen Extraktes, des Durchflusses nach Auftragen auf die Streptactinsäule
und des eluierten Proteins durchgeführt. Dabei zeigten sich insbesondere im Durchfluss
Banden in den Laufhöhen aller vier SH-Untereinheiten. Im Eluat waren diese Banden
wesentlich schwächer, und das HoxF-spezifische Signal war scheinbar ganz verschwunden
(Abbildung 18 b). Das Fehlen bzw. der Mangel an HoxF erklärt die sehr geringe H2- abhängige
NAD+-spezifische Aktivität dieser Fraktion. Auch die Supplementation des Aufschlusspuffers
mit NiCl2 und MgSO4 konnte die Proteinausbeute nicht verbessern (Abbildung 18 a, b). Das
Eluat der Transkonjugante HF500 mit pHthoxHY wies lediglich bei 50 °C und in Anwesenheit
von Nickel- und Magnesiumionen eine nur sehr geringe H2-abhängige NAD+-
Reduktionsaktivität auf. Im löslichen Extrakt dieser Transkonjugante wurde dagegen eine
höhere Aktivität nachgewiesen.
Deutliche Verbesserung der Aktivität der chimären ReFU HtHY-Variante konnte durch die
Vermeidung von Sauerstoff während der Reinigung erzielt werden. Die
Affinitätschromatographie wurde hierbei in der Anaerobenbox mit einer Atmosphäre aus
Formiergas mit etwa 4.5-5% H2 durchgeführt (2.3.2). Die zusätzliche Inkubation von eluierten
79
Proteinproben in der Atmosphäre der Anaerobenbox verkürzte die zunächst beobachtete
Lagphase von 120 Minuten (Abbildung 5).
Abbildung 18. SDS-Gel (a) und Western-Blot (b) der gereinigten SH-Chimären aus HF903 (∆hoxFU) bzw.
HF500 (∆hoxH). Es wurden etwa 30 µg löslicher Extrakt (SE) sowie 6 µg der gereinigten
Proteinproben (El) nach Affinitätschromatographie aufgetragen und mittels Gelelektrophorese in
einem 12 %-igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Für die immunologische Detektion der SH -
Untereinheiten wurden etwa 10 µg der gereinigten Proteinproben (El) sowie 30 µg des löslichen
Extraktes (SE) und des Durchflusses während der Affinitätschromatographie (FT) aufgetragen und
elektrophoretisch aufgetrennt.
Da sich insbesondere für die Proben der löslichen Extrakte der Transkonjuganten basierend auf
dem R.eutropha-Stamm HF500 nur eine sehr geringe H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität
ermitteln lies, wurden die entsprechenden SH-Varianten über Strep-Tactin-
Affinitätschromatographie gereinigt. Um eine Aussage über den Effekt der Ni2+- und Mg2+-
Zugabe treffen zu können, wurden alle Aktivitäten auch in Reaktionsansätzen mit und ohne die
zweiwertigen Kationen gemessen. Wie auch in Abschnitt 3.5.2 gezeigt, wurde die homogene
ReSH aus der Transkonjuganten des R.e.-Stammes HF903 mit pRehoxFU mit einer hohen
spezifischen Aktivität isoliert werden. Dabei werden standardmäßig NAD+-
Reduktionsaktivitäten von etwa 100 U · mg-1 isoliert.
Die höchste spezifische Aktivität einer chimären SH mit 30.8 U · mg-1 wurde für die Variante
bestehend aus RoHoxFU und ReHoxHY in Abwesenheit von Ni2+ und Mg2+ festgestellt
(Abbildung 19). Dieser Wert liegt sogar um etwa 30 % über der Aktivität der heterolog
a)
b)
80
produzierten heterotetrameren RoSH (K. Karstens, 2014). Die biochemisch betrachtet gleiche
Chimäre, die aber von einem anderen Plasmidkonstrukt kodiert wird, zeigte niedrigere
spezifische Aktivitäten um 19.2 U · mg-1. Die Aktivitäten beider SH-Varianten sind durch die
Zugabe der Ionen kaum beeinflusst und mit 26.6 bzw. 19 U · mg-1 vergleichsweise hoch.
Bei der Kombination des Hydrogenasedimers aus R.eutropha mit dem thermostabilen NAD+-
Reduktasedimer aus H. thermoluteolus wurde ebenfalls eine hohe H2-abhängige NAD+-
Reduktionsaktivität von 25.7 U · mg-1 gemessen. Auch die Aktivität dieser Chimäre ist höher
als die heterolog produzierte tetramere HtSH und nimmt nur um etwa 5 U · mg-1 ab, wenn Ni2+
und Mg2+ im Reaktionsansatz anwesend sind (Abbildung 19).
Abbildung 19. Spezifische H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten der gereinigten SH-Chimären aus
den Stämmen HF903 bzw. HF500 ohne und in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2. Die
Aktivitäten wurden bei 30°C bzw. 50°C in 50 mM Tris, pH 8 mit 1 mM NAD+, 0.75 mM TCEP und
2 µM FMN gemessen. Die Werte repräsentieren Mittelwerte aus mindestens 2 unabhängigen
Reinigungen mit 2-3 Messungen pro Variante und Reaktionsbedingung.
n.d. nicht detektierbar
Die gereinigten SH-Hybride, die aus einem heterologen Hydrogenasedimer und der Re-eigenen
NAD+-Reduktase bestehen, wiesen wesentlich geringere spezifische Aktivitäten auf. Die SH-
Variante mit RoHoxHY und ReHoxFU zeigte in Abwesenheit der Kationen eine niedrige
Aktivität von 2.1 U · mg-1. Erst durch Zugabe von Ni2+ und Mg2+ konnte die Aktivität auf
6.1 U · mg-1 erhöht werden.
pRohoxFU 1
pRohoxFU 2
pHthoxFU
pRohoxHY
pHthoxHY
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
HF903
HF500
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
1
2
3
4
5
6
7
18
20
22
24
26
28
30
32
34 ohne NiCl2, MgCl2
mit NiCl2, MgCl2
Spezifische Aktivität (U mg-1)
n.d.
*
81
Für die Variante aus HtHoxHY und ReHoxFU war eine genaue Messung der spezifischen
Aktivität kaum möglich. Erst eine Temperaturerhöhung sowie die Zugabe der Kationen
ermöglichte die Bestimmung der H2- abhängigen NAD+-Reduktionsaktivität. Diese lag mit
einem Wert von etwa 0.02 U · mg-1 aber sogar noch unter der Aktivität des Konstrukts im
löslichen Extraktes (s. auch Abbildung 17).
3.4.4.1 Analyse der Kationenabhängigkeit der chimären SHs bestehend aus ReHoxFU und
fremden HoxHY-Modulen
Nachdem die Aktivitätsmessungen der gereinigten chimären SHs bestehend aus
RoHoxHY bzw. HtHoxHY und dem NAD+-Reduktase-Modul aus R.e. einen stimulierenden
Effekt von Nickel- und Magnesiumionen aufzeigten, sollte die Kationenabhängigkeit näher
untersucht werden. Dazu wurden die H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivitäten in
Anwesenheit verschiedener Metallionenkonzentrationen gemessen. Wie zuvor für die
heterotetrameren SHs aus R.o. und H.t. beobachtet (Schneider & Schlegel, et al. 1984; 3.3.6),
zeigte die Supplementierung des Reaktionspuffers mit Nickelionen die stärkste Wirkung.
Bereits die Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 führte zu etwa 87 % bzw. 86 % der Aktivitäten,
die bei Zugabe beider Kationen für die SH-Varianten aus ReHoxFU und RoHoxHY bzw.
HtHoxHY gemessen wurden. Eine weitere Erhöhung der NiCl2-Konzentration führte zu keiner
weiteren Steigerung der Aktivität. Wurde dem Reaktionsansatz lediglich MgCl2 zugefügt, so
erreichte das SH-Hybrid mit RoHoxHY-Modul etwa 56 % der Maximalaktivität. Die
heterotetramere HtSH sowie die SH-Chimäre mit HtHoxHY-Modul erreichen unter MgCl2-
Zusatz 22 % bzw. etwa 8 % der jeweils maximalen Aktivität. Ohne die Zugabe der Metallionen
lagen die H2-abhängigen NAD+-Reduktionsaktivitäten der RoHoxHY-ReHoxFU- und der
HtHoxHY-ReHoxFU-Chimäre bei etwa 34 % bzw. 64 % der Maximalaktivität in Gegenwart
beider Kationen (Abbildung 19). Im Gegensatz zu den heterotetrameren SHs aus R.o. und H.t.
war also trotz Abwesenheit von Kationen noch eine Aktivität zu messen. Im Fall der SH-
Chimäre „HtHoxHY –ReHoxFU“ war diese Aktivität erstaunlicherweise sogar höher als unter
Zugabe von MgCl2, was auf eine eher hemmende Wirkung von MgCl2 auf diese SH-Variante
hindeutet.
82
Abbildung 20. H2-abhängige Reduktion von NAD+ katalysiert von der heterotetrameren HtSH
(grau) und den SH-Varianten bestehend aus ReHoxFU und HtHoxHY (rot) bzw. RoHoxHY
(orange) in Gegenwart von verschiedenen Salzen. Die Aktivitäten der HtSH und der SH-Variante
mit dem HtHoxHY-Modul wurden bei 50°C in 50 mM BisTris, pH 6.5, gemessen. Die Aktivitäten der
SH-Chimäre aus ReHoxFU und RoHoxHY wurden bei 30 °C in 50 mM Tris pH 8 untersucht. Die
Proben der SH-Chimäre aus ReHoxFU mit HtHoxHY wurden unter anaeroben Bedingungen gereinigt
und nach einer zweitägigen Inkubation in der Anaerobenbox zur Messung verwendet. Die Aktivitäten
in Anwesenheit der Salze und ohne die Salzzugabe beziehen sich auf die maximale Aktivität der
jeweiligen Variante bei Zugabe von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2. Die getesteten Konzentrationen
waren 5 mM MgCl2, 0.5 mM NiCl2 und 1 mM NiCl2 (entspricht NiCl2x2).
* nicht gemessen
n.d. nicht detektierbar
Da für die aerob gereinigte SH-Variante bestehend aus HtHoxHY und ReHoxFU auch bei
Zugabe der IMetallionen im Aufschluss- und Reinigungspuffers zunächst keine deutliche
Aktivität gemessen werden konnte, wurde ein Protokoll zur anaeroben Reinigung des Chimärs
herangezogen (2.3.2). Dieses sollte die Oxidation und eine damit verbundene mögliche
strukturelle Veränderung der chimären SH, die zur Dissoziation der HoxHY- und HoxFU-
Module führt, verhindern. Die Analyse der anaerob-gereinigten Proben im SDS-PAGE-Gel
zeigte das gleiche Laufmuster der SH-spezifischen Banden wie für das aerob gereinigte
Protein. Allerdings konnte nach der langen Inkubationsdauer unter den anaeroben,
reduzierenden Reinigungsbedingungen eine deutliche Verkürzung der Anlaufphase beobachtet
werden (Abbildung 21). Nach Zugabe der beiden Salze NiCl2 und MgCl2 und zweitägiger
Inkubation in der anaeroben Box in einer Formiergas-Atmosphäre mit 5% H2 bei etwa 9°C
verschwand diese Verzögerung in der Aktivitätsausprägung sogar völlig. Die maximale
spezifische Aktivität veränderte sich dabei nicht wesentlich. Nach mehrtägiger Inkubation
+NiCl2 +MgCl2
MgCl2
NiCl2
NiCl2 x 2
ohne
25
75
0
50
100
HtSH
HtHoxHY
RoHoxHY
n. d.
Spezifische Aktivität (%)
*
83
unter reduzierenden Bedingungen wurde für diese Proben sofort deutliche Aktivitäten
gemessen werden. Dieses Phänomen verdeutlicht die lange Anlaufphase dieser chimären SH-
Variante und erklärt rückblickend geringe/ausbleibende Aktivitäten für aerob gereinigtes
Protein.
Abbildung 21. H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten (%) und Anlaufphase (Lagtime/ min)
der SH-Chimäre bestehend aus HtHoxHY und ReHoxFU in Anwesenheit von verschiedenen
Salzen nach Reinigung und Inkubation unter reduzierenden Bedingungen in einer anaeroben
Box (ABox). Die Reduktionsaktivitäten der SH-Variante mit dem HtHoxHY-Modul wurden bei 50°C
in 50 mM BisTris, pH 6.5, gemessen. Die getesteten Konzentrationen waren 5 mM MgCl2 und/ oder
0.5 mM NiCl2. Als Anlaufphase (lagtime) wird die Zeit bezeichnet, die nach Zugabe des Enzyms zum
Reaktionsassay während der photometrischen Aktivitätsmessung vergeht, bevor eine
Absorptionszunahme bzw. Aktivität beobachtet werden kann.
3.5 Umwandlung der NAD+-Bindestelle in ReHoxF zur Erhöhung der Spezifität für
NADP+
Die Biokatalyse zur Herstellung industriell relevanter, chemischer Verbindungen
gewinnt zunehmend an Bedeutung (Michael & Abraham, 1992; Nestl, Nebel & Hauer, 2011).
Besonders die enzymkatalysierte asymmetrische Reduktion von Ketonen, Alkenen und Iminen
sowie die kontrollierte Oxidation terminaler Alkohole kann mit der traditionellen chemischen
Synthese konkurrieren (Kroutil et al., 2004; Muñoz Solano et al., 2012). Die dabei
verwendeten Oxidoreduktasen benötigen ihrerseits allerdings Reduktionsäquivalente wie
NiCl2 +MgCl2
ohne
NiCl2 +MgCl2
ohne
NiCl2
MgCl2
1 Tag in ABox
2 Tage in ABox
-175
-125
-75
-25
25
75
125
-150
-100
-50
0
50
100
Lagtime (min) Spezifische Aktivität (%)
84
NAD(P)+ oder NAD(P)H (Bernhardt & Urlacher, 2014). Der Zusatz dieser Kofaktoren in
stöchiometrischen Mengen wäre wirtschaftlich nicht sinnvoll. Um dieses Problem zu umgehen,
gibt es verschiedene Möglichkeiten die Kofaktoren zu regenerieren (Zhao et al., 2003).
Die SH aus R. eutropha wurde bereits in mehreren Experimenten erfolgreich zur H2-
getriebenen Regeneration von NADH verwendet (Ratzka et al., 2011; Reeve et al., 2011, 2015,
2017; Lauterbach, Lenz & Vincent, 2013; Lonsdale et al., 2015). Da es neben den NAD(H)-
abhängigen Oxidoreduktasen aber auch Enzyme gibt, die die phosphorylierte Form NADP(H)
bevorzugen, sollte die NAD(H)-Bindetasche der SH durch gerichtete Mutagenese so angepasst
werden, dass auch NADP+ als Substrat akzeptiert wird.
3.5.1 Die NAD(H)-Bindetasche in HoxF unterscheidet sich von der in NADP(H)-
spezifischen Enzymen
Die kofaktorbindende Untereinheit HoxF von löslichen, bidirektionalen [NiFe]
Hydrogenasen der Gruppe 3d weist eine hohe Sequenzähnlichkeit auf mit Nqo1der Nqo1-
Untereinheit von Komplex 1 aus Thermus thermophilus (Pilkington et al., 1991; Friedrich et
al., 1995; Lauterbach & Idris, et al., 2011). Mit Hilfe der Kristallstruktur von Komplex I
(Berrisford & Sazanov, 2009; Sazanov, 2006) ließ sich ein Homologiemodell von HoxF aus
Ralstonia eutropha erstellen, welches einen detaillierten Einblick in die Bindung der
Kofaktoren FMN und NAD+ in der Rossmannfalte ermöglicht. Im Vergleich zu anderen
Pyridinnukleotid-abhängigen Enzymen ließen sich Gemeinsamkeiten und Unterschiede in der
Aminosäurezusammensetzung ausmachen. So sind in NAD(H)-abhängigen Enzymen
vorrangig Aminosäuren mit einer negativ geladenen Seitengruppe wie Aspartat und Glutamat
an der direkten Wasserstoffbrückenbindung mit den 2‘- und 3‘-Hydroxylgruppen der Ribose
beteiligt. Im Fall von NADP(H)-affinen Enzymen sind an den äquivalenten Positionen häufig
ein konserviertes Arginin und/ oder nur Aminosäuren mit neutralen, kleinen Seitengruppen auf
(Cahn et al., 2017; Lerchner et al., 2013). Die Guanidino-Seitengruppe des Arginins trägt zur
Stabilisierung der negativ-geladenen Phosphatgruppe des NADP(H) bei, während negativ
geladene bzw. große Seitengruppen diese abstoßen oder sterisch hindern würden. Im Modell
für HoxF interagiert die Säuregruppe des Glutamats an Position 341 mit den Hydroxylgruppen
der Ribose im gebundenen Kofaktor NAD+ (Abbildung 22 c). An der benachbarten Position
340 befindet sich ein Aspartat, welches jedoch keine offensichtlichen Wechselwirkungen mit
dem Substrat eingeht. Positiv geladene Aminosäuren sind NADP(H)-Bindetaschen
85
offensichtlich nicht vorhanden. Tatsächlich führte der Austausch des Glutamats an Position
341 in der Wildtypform von HoxF zu einer verringerten Affinität für das natürliche Substrat
NAD+ (L. Lauterbach, 2013). Das Einfügen einer Aminosäure mit positiver Seitenkette konnte
die Bindung von NADP+ weiter verbessern.
Abbildung 22. Darstellungen der Untereinheiten- und Kofaktorzusammensetzung der löslichen, NAD+-
reduzierenden [NiFe]-Hydrogenase aus R. eutropha H16. (A) Vereinfachte Darstellung des Hydrogenase
(HoxHY in orange dargestellt) und NAD+-Reduktase (HoxFU in blau dargestellt)-Moduls. An dem NAD+-
Reduktase-Modul gebunden ist das HoxI-Dimer, in hellblau eingefärbt. Die Eisen-Schwefel-Zentren, die die
beiden Module elektronisch miteinander verbinden sind als gelb-orange Sphären abgebildet. (B)
Homologiemodell der Untereinheit HoxF (blau) basierend auf der Kristallstruktur von Nqo1 (violett) des
Komplex I aus Thermus thermophilus (2FUG). Das Flavinmononukleotid und NADH sind als Stäbchen von dem
pdb-Eintrag 3IAM übernommen. (C) Die NAD(H)-Bindetasche der nativen SH.Wichtige H-Bindungen und π-π-
Interaktionen sind als gestrichelte Linie angedeutet. (D) Modell der NAD(P)(H)-Bindetasche mit den
Aminosäureaustauschen E341A und S342R (Die Kohlenstoffatome der Aminosäurenn sind in cyan gezeigt).
86
3.5.2 Durch gezielten Austausch einzelner Aminosäuren in der NAD(H)-Bindetasche
von HoxH lässt sich die Substratspezifität der SH verändern
Die Aminosäuren in HoxF, die vermutlich eine tragende Rolle bei der Koordination
von NAD(H) in der Bindetasche spielen, wurden mittels zielgerichteter Mutagenese
ausgetauscht. Hierzu Vektor konstruiert, der auf der Basis von pCM66 beruht und auf dem die
Gene hoxFU unter Kontrolle des SH-Promotors vorliegen. Zudem trägt der 5‘-Terminus von
hoxF eine den Strep-tagII kodierende Sequenz. Die entsprechenden Basenaustausche in hoxF
wurden durch Sequenzierung bestätigt. Die verwendeten Plasmide und die von ihnen kodierten
HoxF-Varianten sind in Tabelle 21 aufgeführt.
Tabelle 21. Verwendete Plasmidkonstrukte, die HoxF-Varianten mit Aminosäureaustausche in der
NAD(H)-Bindetasche kodieren.
Plasmidname
Aminosäureaustausch(e) in
HoxF
Bezeichnung derSH-
Variante
pJP66
-
SH
pJP01
E341A
SHE341A
pJP02
D467S
SHD467S
pJP03
E341A, D467S
SHE341A/D467S
pJP04
E341A, S342R
SHE341A/S342R
pJP05
E341A, S342R, K358R
SHE341A/S342R/K358R
pJP06
E341A, S342R, D467S
SHE341A/S342R/D467S
Nach der Konjugation dieser Plasmide in HF903 wurden die resultierenden Stämme in
modifiziertem FGN-Medium über 7 Tage bei 30 °C kultiviert. Aus etwa je 5-10 g Zellen
wurden nach Strep-Tactin-Affinitätschromatographie (2.3.1) routinemäßig 6-12 mg der
heterotetrameren SH-Varianten gereinigt.
87
Abbildung 23. SDS-PAGE der verschiedenen, mittels Affinitätschromatographie gereinigten SH-Derivate.
Pro Spur wurden 5 µg Protein aufgetragen und elektrophoretisch aufgetrennt.
Die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität der gereinigten SH-Varianten wurde
standardmäßig in 50 mM Tris, pH 8, bei 30° C bestimmt. Die native SH zeigte mit 95 U∙ mg-1
die höchste Aktivität (Abbildung 24). Etwas weniger als 50 % der Aktivität der nativen SH
besitzt die Variante mit dem Austausch D467S in HoxF. Wesentlich niedrigere NAD+-
Reduktionsaktivitäten von 12-20 U · mg-1 wurden für die übrigen SH-Varianten ermittelt. Im
Gegensatz zur nativen SH zeigen diese jedoch messbare H2-abhängige NADP+-
Reduktionsaktivität. Dabei erreicht die SHE341A/S342R -Variante mit etwa 1 U · mg-1 die bis dahin
höchste H2-abhängige NADP+-Reduktionaktivität.
Die SH-Varianten katalysierten auch die Rückreaktionen, nämlich die NAD(P)H-abhängige
Reduktion des artifiziellen Akzeptors Benzylviologen. Hierbei zeigte für NADH ebenfalls die
native SH die höchste Aktivität von etwa 56 U · mg-1 (Abbildung 24). Die niedrigste NADH-
Oxidationsaktivität mit einem Wert von nur noch 8 U · mg-1 wies die SHE341A/S342R/D467S-
Variante auf. Interessanterweise sind bei der Variante SHE341A/S342R/K358R sowohl die NADH-
als auch die NADPH-Oxidationsaktivität, höher als die entsprechenden Reduktionsaktivitäten.
Die Werte liegen bei dieser Variante bei 13 (NADHBV) bzw. 1.4 (NADPHBV) U· mg-1
im Vergleich zu 8 (H2NAD+) bzw. 0.5 U· mg-1 (H2 NADP+) (s. auch Tabelle 23) .
88
Abbildung 24. Spezifische Aktivitäten der SH-Derivate mit Aminosäureaustauschen in HoxF. Die
Aktivitäten wurden in 50 mM Tris pH 8 mit 2 µM FMN und 1 mM Dtt im Reaktionsansatz bei 30 °C
photometrisch gemessen. Dunkel graue Balken stellen die H2-abhängige Reduktion von NAD+
(1 mM), hell graue Balken die H2-abhängige Reduktion von NADP+ (1 mM) dar. Balken mit Schraffur
repräsentieren die Rückreaktionen, d.h. die NAD(P)H-abhängige Reduktion von Benzylviologen (0.6
mM).
3.5.3 Die SH-Varinaten mit veränderter Substrataffinität vermitteln kein
lithoautotrophes Wachstum des Wirtsstammes
Die Auswirkung der Aminosäureaustausche in HoxF auf die In-vivo-Aktivität der SH
wurde über das Wachstumsverhalten unter lithoautotrophen Bedingungen getestet. Der
verwendete Expressionsstamm R. eutropha HF903 weist Deletionen in hoxG (MBH-), hoxC
(RH-) und hoxF (SH-) auf und ist daher nicht in der Lage, H2 als Energiequelle für
lithoautotrophes Wachstum zu nutzen (Lauterbach & Idris, et al., 2011). Die hoxF-Deletion
kann jedoch durch den Transfer des Plasmids pJP66 (hoxFU) komplementiert werden, so dass
der resultierende Stamm zum Wachstum mit H2,CO2 und O2 fähig war (Abbildung 25). Auch
die SHD467S-Variante ermöglicht das Wachstum mit H2. Die Auswirkungen durch den
Austausch anderer oder zusätzlicher Aminosäuren auf die Bereitstellung nötiger
Redukionsäquivalente durch die SH waren schwerwiegend. Die entsprechenden R.-eutropha-
WT
D467S
E341A
E341A D467S
E341A S342R
E341A S342R K358R
E341A S342R D467S
0
20
40
60
80
100
120
Spezifische Aktivität (U mg-1)
H2 NAD+
NADH BV
H2 NADP+
NADPH BV
E341A D467S
E341A S342R
E341A S342R K358R
E341A S342R D467S
0
1
2
3
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
Spezifische Aktivität (U mg-1)
89
Transkonjuganten waren nicht oder nur kaum (für SHE341A sowie SHE341A/D467S) in der Lage,
chemolithoautotroph zu wachsen (Abbildung 25).
Abbildung 25. Fähigkeit der SH-Varianten mit Aminosäureaustauschen in HoxF lithoautotrophes
Wachstum mit H2, CO2 und O2 zu vermitteln. Transkonjuganten von R. eutropha HF903 mit den in Tabelle
21 aufgeführten Plasmiden wurden auf festes Minimalmedium ausgestrichen und für 5 Tage bei 30 °C
in einer Atmosphäre bestehend aus 10% O2, 10% CO2, 5 % H2 und 75% N2 inkubiert.
90
3.5.4 Die NADP(H)-umsetzenden SH-Varianten sind auch in Gegenwart von O2 aktiv
Um einen Einfluss der Aminosäureaustausche in HoxF auf die Sauerstofftoleranz der
SH zu untersuchen, wurde die H2-abhängige NAD(P)+-Reduktion in Anwesenheit von 230 µM
(20 % vol/vol) O2 gemessen.
Tabelle 22. H2-abhängige NAD(P)+-Reduktionsaktivität in Anwesenheit von O2 der SH-Varianten mit
Austauschen in der NAD(H)-Bindetasche von HoxF.
SH Variante
O2
Aktivität (U · mg-1)a
Aktivität (%)
SH
–
53.6 ± 2.3 †
100
+
46.9 ± 0.5 †
87
SHE341A
–
0.78 ± 0.01
100
+
0.43 ± 0.01
56
SHD467S
–
0.22 ± 0.07
100
+
0.10 ± 0.02
46
SHE341A/D467S
–
0.93 ± 0.01
100
+
0.83 ± 0.01
89
SHE341A/S342R
–
1.22 ± 0.01
100
+
1.15 ± 0.02
94
SHE341A/S342R/D467S
–
0.11 ± 0.02
100
+
0.06 ± 0.0004
56
SHE341A/D467S/K358R
–
0.56 ± 0.02
100
+
0.31 ± 0.04
55
aAktivitäten wurden bei 30 °C in 50 mM Tris/HCl, pH 8, mit etwa 40 nM SH-Protein in Gegenwart
von entweder 50% H2/50% N2 (–O2) oder 50% H2/30% N2/20% O2 (+O2) gemessen.† Da für die native
SH keine NADP+-Reduktionsaktivität messbar war, wurde NAD+ als Substrat verwendet. Die
angegebenen Werte repräsentieren arithmetische Mittelwerte und Standardabweichungen aus drei
unabhängigen Experimenten.
Dabei zeigte sich im Vergleich zu den Messungen unter anaeroben Bedingungen für die native
SH sowie die SHE341A/D467S- und SHE341A/S342R–Varianten mit 6-13 % nur eine relative geringe
Abnahme der NAD(P)+-Reduktionsaktivität durch O2 (Tabelle 22). Im Fall der anderen SH-
Varianten war die Aktivitätsabnahme in Anwesenheit von O2 prägnanter. Sie Betrug für die
91
SHD467S–Variante sogar ca. 50 %. Dieser Effekt kann aber auch durch die insgesamt niedrigen
Aktivitäten dieser SH-Derivate zustande kommen.
3.5.5 Kinetische Parameter der SH-Varianten mit Veränderungen in der NAD(H)-
Bindetasche
Im Anschluss an die In-vivo-Untersuchung der Auswirkungen von Aminosäureaustauschen in
HoxF und ersten Aktivitätsmessungen wurden die Affinitäten der SH-Varianten für die
Substrate NAD(H) und NADP(H) bestimmt. Diese wurden in Form von Michaelis-Menten-
Konstanten, KM , gemessen und sind in Tabelle 23 aufgeführt. Demnach wies die native SH
mit einem KM-Wert von 0.55 mM die höchste Affinität zu dem natürlichen Substrat NAD+ auf.
Im Falle der Varianten mit einfachen Aminosäureaustauschen sowie dem SHE341A/D467S-Protein
lagen die KMNAD+-Werte mit 0.61 – 0.66 mM in einem ähnlichen Bereich. Mit einem Wert von
1.32 mM mehr als doppelt so hoch war der KMNAD+ der SHE341A/S342R. Die Bindungsaffinität zu
dem natürlichen Substrat hat sich demzufloge durch den zweifachen Austausch deutlich
verringert. Im Gegensatz dazu war der KM-Wert für das alternative Substrat, NADP+, mit
0.6 mM nun geringer als der KM-Wert für das natüliche Substrat (Tabelle 23). Durch die
Aminosäureaustausche E341A und S342R in HoxF wurde demnach ein Wechsel der Spezifität
von NAD+ zu NADP+ erreicht. KMNADP+-Werte der anderen SH-Varianten.
Wird lediglich die Wechselzahl (molekulare Aktivität, kcat) für den NADP+-Umsatz betrachtet,
so erreichen die SHE341A- und SHE341A/D467S-Proteine mit 3.3 und 3.0 s-1 die höchsten Werte.
Da die NADP+-Bindung jedoch weniger spezifisch ist als bei der Variante SHE341A/S342R-
Variante, weisen die beiden Proteine auch noch relative hohe Wechselzahlen für NAD+ auf
(19.9 – 54.8 s-1). Diese ist für die SHE341A/S342R-Variante mit 8.8 s-1 weit geringer. Welches Substrat
von den einzelnen Varianten bevorzugt wird, wird durch das Verhältnis der kinetischen
Parameter deutlich (Tabelle 23, letzte Spalte). Im Vergleich mit der nativen SH wird deutlich,
dass sich die Werte für SHE341A/S342R zugunsten von NADP+ verschoben haben.
92
Tabelle 23. KM- und kcat- Werte der SH-Varianten für die H2-abhängige NAD(P)+-Reduktion
SH-Variante
NAD+ NADH
NADP+ NADPH
Verhältnis
KM (mM)
kcat (s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
KMNAD+/
KMNADP+
kcat NAD+/ kcatNADP+
SHWT
0.55 ±
0.08
690
> 50
< 0.1
>91
<0.001
SHE341A
0.61 ±
0.11
19.9
4.83 ± 1.70
3.3
7.9
0.17
SHD467S
0.66 ±
0.18
54.8
3.39 ± 0.98
0.2
5.1
0.09
SHE341A D467S
0.65 ±
0.18
24.3
2.25 ± 1.05
3
3.5
0.12
SHE341A S342R
1.32 ±
0.29
8.8
0.60 ± 0.33
2.1
0.5
0.24
SHE341A S342R D467S
n.g.
42.9
0.25 ± 0.03
1.7
-
0.04
SHE341A S342R K358R
n.g.
23.2
0.27 ± 0.05
1.5
-
0.06
Reaktionsbedingungen: 780 µmol H2, 0.1 – 6 mM NAD(P)+, ca. 40 nM Enzym in 50 mM Tris-HCl,
pH 8.0, bei 30 °C. Jede KM-Wertbestimmung wurde mindestens zweimal durchgeführt n.g. nicht
gemessen
Im Anschluss wurden die kinetischen Parameter für die entprechenden Rückreaktionen der SH-
Varianten bestimmt, d.h. die NAD(P)H-abhängige Reduktion von Benzylviologen, die durch
das HoxFU-Modul der SH katalysiert wird. Besonders interessant war das Verhalten der
SHE341A/S342R/K358R-Variante deren NADPH-Oxidations- größer als die NAD+-
Reduktionsaktivität war.
Tabelle 24. KM- und kcat- Werte der SH-Varianten für die NAD(P)H- abhängige Reduktion von BV
SH
NADHBV
NADPHBV
Verhältnis
KM (mM)
kcat (s–1)
KM (mM)
kcat (s–1)
kcatNADPH/kcatNADH
SHWT
0.13 ± 0.02
159.3
7.06 ± 3.68
0.2
0.001
SHE341A D467S
1 ± 0.18
40.8
0.21 ± 0.02
8.6
0.21
SHE341A S342R
n.g.
37.6
n.g.
1.1
0.03
SHE341A S342R D467S
n.g.
22.8
n.g.
2.3
0.1
SHE341A S342R K358R
n.g.
37.4
0.062 ± 0.003
3.9
0.1
93
Reaktionsbedingungen: 483 µmol N2, 0.1 – 8 mM NAD(P)H, 0.6 mM BV, ca. 40 nM Enzym in 50 mM
Tris-HCl, pH 8.0 at 30 °C. [Jede Messreihe wurde mindestens zweimal durchgeführt].n.g. nicht
gemessen
Die kinetischen Parameter der SH-Derivate wurden auch elektrochemisch in der Arbeitsgruppe
von Prof. Kylie Vincent (Department of Chemistry, University of Oxford) bestimmt. Nach
Adsorption der SH-Proben auf einer Graphitelektrode erfolgte die Messung der SH-Aktivität
bei verschiedenen NAD(P)+-Konzentrationen mit Hilfe der Chronoamperometrie. Dabei ist die
SH-Aktivität ist direkt proportional zum gemessenen Strom, der durch die direkte NAD(P)H-
getriebene Elektronenübertragung vom Enzym auf die Elektrode zustande kommt. Somit kann
der gemessene Strom zur Bestimmung der Michaelis-Menten-Konstante herangezogen
werden. Diese Methode ist einerseits genauer als die biochemische Bestimmung der Aktivität,
da sie unabhängig von Diffusionsereignissen ist und die misst. Andererseits ist bei dieser
Messmethode unklar, wieviel Protein tatsächlich auf der Elektrodenoberfläche haften bleibt,
und eine Bestimmung des Parameters kcat ist daher nur schätzungsweise möglich. Unter
anderem aus diesen Gründen wurden bei den elektrochemischen Messungen deutlich
niedrigere kinetische Werte festgestellt als bei der biochemischen Messung der kinetischen
Parameter (4.3.1). Die elektrochemische Studie bestätigte jedoch, dass die SHE341A/S342R-
Variante die bis dahin höchste Affinität zu für NADP+ aufweist.
3.5.6 Die NADP+-spezifischen SH-Varianten können auf einer Elektrode adsorbiert
werden und sind katalytisch aktiv
Der Austausch verschiedener Aminosäuren in HoxF erfolgte mit dem Vorhaben, die SH auch
für die H2- abhängige NADPH-Regeneration einzusetzen. Dass die Austausche tatsächlich zu
einem veränderten Substratspektrum der SH führten, wurde biochemisch bestätig (3.5.2.).
Neben den biochemischen Methoden zur Charakterisierung des Substratspektrums, bietet auch
die Elektrochemie alternative Möglichkeiten, um die SH-Varianten eingehender zu
untersuchen (Vincent et al., 2005, 2007). Diese Methode hat den Vorteil, dass der
Substratumsatz als Strom gemessen werden kann, der über direkten Elektronentransfer vom
Enzym auf die einer Elektrode generiert wird. In Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Prof.
Kylie Vincent (University of Oxford) wurden die verschiedenen SH-Varianten
elektrochemisch auf ihre kofaktorreduzierenden Aktivitäten getestet. Hierfür wurden sie auf
94
einer Graphitelektrode immobilisiert und mittels zyklischer Voltametrie in Gegenwart der
Substrate NAD(P)+ auf ihre Katalyseeigenschaften getestet. Bei einem Elektrodenpotential von
weniger als -300 mV (EoNAD(P)H/NAD(P)+= -320 mV) wurde eine Zunahme der Stromstärke
beobachtet, die proportional zur NAD(P)+-Reduktionsaktivität der SH ist. Bei allen SH-
Varianten wurde diese Zunahme in Anwesenheit von NAD+ detektiert, wobei die native SH
sowie die SHD467S-Variante die größten Ströme zeigten (Abbildung 26). In Anwesenheit von
NADP+ verhielt es sich anders. Mit abnehmendem Potential war eine hohe Stromstärke
besonders für die auf der Elektrode immobilisierten Varianten SHE341A/D467S, SHE341A und
SHE341A/S342R zu beobachten. Quantitative Aussagen, wie z.B. die Berechnung der Umsatzrate
kcat, sind bei diesen Experimenten nicht möglich, da keine genaue Information über die Menge
immobilisierter und aktiver SH-Moleküle vorliegt.
Abbildung 26. Zyklische Voltamogramme der SH-Varianten in Gegenwart von NAD(P)+. Die
SH-Derivate wurden auf einer pyrolytischen Graphitelektrode immobilisiert und in Anwesenheit von
5 mM NAD(P)+ in 100 mM Tris-HCl-buffer, pH 8.0, mit einer Scan-Rate von 10 mV· s–1 bei 30 °C
gemessen. Als Kontrolle („Blank“) diente eine nicht mit Protein beschichtete Graphitelektrode.
3.5.7 SH E341A/S342R als Teil NADPH-abhängiger Redoxenzym-Kaskaden
Nachdem sowohl bio- wie auch elektrochemisch die H2-abhängige NADP+-
Reduktionsaktivität SH-Varianten bestätigt wurde, sollte die neu erworbene Reaktivität in
gekoppelten Enzymreaktionen getestet werden. Diese Experimente wurden von Dr. Holly
Reeve (Department of Chemistry, University of Oxford) mit SH-Proben aus mindestens 3
unabhängigen Reinigungen durchgeführt.
Zunächst wurde die H2-getriebene NADPH-Regeneration in einem Modellsystem bestehend
aus SH E341A/S342R und der kommerziell erhältlichen Enreduktase PETNR getestet. Diese
95
Pentaerythritol-Tetranitrat-Reduktase gehört zur Familie der „old yellow enzymes“, die die
asymmetrische Reduktion einer Vielzahl von industriell relevanten, ungesättigten Alkenen wie
z.B. 2-Cyclohexenon katalysiert. Die vollständige Reduktion des Substrates der NADPH-
abhängigen PETNR erfolgte in Anwesenheit der SH-Variante und der Begasung des
Reaktionsansatzes mit H2 (Abbildung 27). Dazu wurden 5 mM NADP+ als
Kofaktorkonzentration eingesetzt. Im Ansatz mit 1.5 mM NADP+ erfolgte die Konversion des
Alkens zum Alkan noch zu 95%.
Abbildung 27. Reduktion der C=C-Doppelbindung von Cyclohexenon in einer gekoppelten Enzymreaktion
mit SHE341/S342R und der Enreduktase PETNR. In Gegenwart von H2 und 5 mM NADP+ erfolgte die 99%ige
Konversion von Cyclohexenon.
Die SHE341A/S342R ließ sich also erfolgreich für die NADPH-Kofaktorregeneration in einer
gekoppelten enzymatischen Reaktion einsetzen. Nun sollte zudem die Eigenschaft ausgenutzt
werden, die H2-abhängige Reduktion von NADP+ auch in Gegenwart von 20 % Sauerstoff zu
katalysieren. Dies ist besonders interessant für die Bereitstellung von NADPH für O2-
abhängige Enzyme, wie beispielsweise Cytochrom-P450-Monooxygenasen (CYP). Diese
komplexen Biokatalysatoren katalysieren die Oxidation von nicht-aktivierten CH-Bindungen
und besitzen ein großes Potential für die Synthese pharmazeutischer Wirkstoffe und
Feinchemikalien. Eine gut untersuchte Monooxygenase dieser Klasse ist die Fettsäure-
Hydroxylyase CYP102A1 aus Bacillus megaterium (Whitehouse et al., 2008, 2012). Dieses
Enzym katalysiert die NADPH-abhängige Oxidation von verschiedenen Fettsäuren mit
unterschiedlicher Selektivität. Das Substratspektrum der CYP102A1 wurde in der
Arbeitsgruppe von Luet-Lok Wong (University of Oxford) mittels zufälliger Mutagenese
erweitert und sowohl das Produktspektrum verändert als auch die Aktivität erhöht (Whitehouse
et al., 2008). Eine dieser Varianten, CYP102A1A330P, basierte auf einem einzigen
96
Aminosäuraustasch und zeigte für das Substrat Octon eine wesentlich erhöhte Aktivität und
ein alternatives Produktspektrum verglichen mit dem nativen Enzym. Sowohl native
CYP102A1 als auch die CYP102A1A330P-Variante wurden in einer vergleichenden Studie für
die Oktan-Oxidation mit der SHE341A/S342R als NADPH-regenerierendes Enzym getestet. Neben
der SHE341A/S342R als H2-abhängiges Kofaktorregenerationssystem wurde parallel der
Industriestandard, die Glucose-abhängige Glukosedehydrogenase (GDH) für die
Rückgewinnung von NADPH getestet. Wie in Abbildung 28 gezeigt wurde das Oktan in allen
vier Reaktionsansätzen vollständig umgesetzt.
CYP
Variante
NADPH-
regenerierendes
Enzymsystem
Produkt der Oktanoxidation
(%)*
3-
on
2-
on
4-
ol
3-
ol
2-
ol
CYP102A1
GDH/Glukose
43
40
17
CYP102A1
SHE341A S342R/H2
44
41
15
CYP102A1A330P
GDH/Glukose
1
3
13
29
54
CYP102A1A330P
SHE341A S342R/H2
1
3
13
29
54
Abbildung 28. NADPH- sowie O2-abhängige Oktanoxidation durch P450-Monooxygenasen unter
Verwendung der der Kofaktorregenerationssysteme H2/SHE341A/S342R sowie Glukose/GDH. Die Reaktionen
wurden in H2-gesättigtem 100 mM Phosphatpuffer pH 7.4 mit 0.5 µM P450, 20 mg ∙ mL-1 Katalase,
1 mM NADP+, 5 mM Oktan und 1 U ∙ mL-1 SH (rote Linie) oder 10 U ∙ mL-1 Glukose-Dehydrogenase
mit 0.2 M Glukose (blaue Linie) durchgeführt. Analyse mittels GC. Die Kontrollreaktion ohne
Substrat NADP+ ist durch die schwarze Linie dargestellt. In blau ist das Profil der Produkte aus der
Reaktion unter Zugabe der Glukose-Dehydrogenase (10 U ∙ mL-1) abgebildet.
97
4 Diskussion
4.1 Charakterisierung der thermostabilen SH aus Hydrogenophilus thermoluteolus
TH-1T
4.1.1 Die HtSH katalysiert die H2-abhängige NAD+-Reduktion kontinuierlich bei
hohen Temperaturen
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, die thermostabile SH aus Hydrogenophilus
thermoluteolus TH-1T heterolog in Ralstonia eutropha zu produzieren und ein geeignetes
Protokoll zur Proteinreinigung zu entwerfen. Anhand dieses Protokolls war es möglich, die
HtSH routinemäßig nach Strep-Tactin-Affinitätschromatographie mit Ausbeuten von etwa
2 mg Protein/ g Zellen und einer spezifischen Aktivität von 12- 18 U · mg-1 zu isolieren. Nach
zusätzlicher Größenausschlusschromatographie war es möglich, die spezifische Aktivität auf
über 30 U · mg-1 zu erhöhen. Diese Erhöhung ist darauf zurückzuführen, dass die Stöchiometrie
der Untereinheiten in den Proben nach Affinitätschromatographie nicht äquimolar ist und erst
nach der Auftrennung mittels Größenausschlusschromatographie homogene, heterotetramere
SH vorliegt. Selbst die Anwesenheit der zweiwertigen Ni2+- und Mg2+-Ionen kann das
dissoziative Verhalten der HtSH nicht vollständig verhindern, sodass sich das Hydrogenase-
Modul, HoxHY, während der Reinigung über den N-terminalen Strep-tagII an HoxF vom
HoxFU-Modul ablöst. Wie auch bei der Reinigung der SH aus Rhodococcus opacus MR11 ist
die Supplemenierung der für die Reinigung verwendeten Puffer mit NiCl2 und MgCl2 essentiell
für H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität (Schneider & Schlegel, et al., 1984). Diese liegt
mit einem maximalen Wert von 33.4 U · mg-1 bei 50 °C und pH 6.5 in einer ähnlichen
Größenordnung wie die NAD+-Reduktionsaktivität der RoSH mit 27.7 – 45 U · mg-1 (Katja
Karstens, 2014; Schneider & Schlegel, et al., 1984).
Das thermophile Bakterium Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T wächst optimal bei einer
optimalen Temperatur von 52 °C. Darüber hinaus zeigt die lösliche, NAD+-reduzierende
Hydrogenase aus diesem Organismus zeigt aber sogar noch bei Temperaturen über 80 °C hohe,
H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität. Höchste Aktivität von 71 U · mg-1 wurde bei 80 °C
gemessen werden. Deutlich geringer waren die Aktivitäten unterhalb von 50 °C. Eine weitere
Besonderheit dieser Hydrogenase ist ihr pH-Optimum, welches bei einem Wert von 6.5 liegt
und somit niedriger als das der ReSH (pH 8.0, Keefe et al., 1995) ist. Dieser Wert scheint dabei
hauptsächlich durch die Aktivität des HoxHY-Dimers reguliert zu werden, das höchste H2-
abhängige BV-Reduktionsaktivitäten im sauer-neutralen pH-Bereich von 6-7 aufweist. Im
98
Gegensatz dazu ist das HoxFU-Dimer auch noch bei basischen pH-Werten von über 10 höchst
aktiv in der Katalyse der NADH-abhängigen BV-Reduktion. Diese beiden Eigenschaften
machen die HtSH besonders interessant für die Anwendung in der Biokatalyse, wo häufig
thermostabile, NADH-abhängige Oxidoreduktasen für die Synthese chiraler Feinchemikalien
im neutralen pH-Bereich eingesetzt werden. Tabelle 25 zeigt einen Vergleich der
grundlegenden biochemischern Charakteristika verschiedener löslicher, NAD(P)+-
reduzierenden Hydrogenasen der Gruppe 3.
Tabelle 25. Vergleich der biochemischen Eigenschaften von löslichen, NAD(P)+-reduzierenden
[NiFe]- Hydrogenasen aus verschiedenen Mikroorganismen.
Herkunft
H. thermoluteolus
R. eutropha
R. opaccus
Synechocystis sp.
PCC 6803
Pyrococcus
furiosus
Bezeichnung
SH
SH
SH
Bi-
direktionale
Hydrogenase
SH1
Untereinheiten-
Zusammensetzung
HoxHYFU
HoxHYFUI2
(Burgdorf et al.,
2005)
HoxHYFU
HoxFHUYE
(Schmitz et al.,
2002)
αδβγ
(Ma et al., 2000)
Scheinbares
Molekulargewicht
(kDa)
168
(diese Arbeit)
207
(Burgdorf et al.,
2005)
172
(Johannssen et al.,
1991)
180
(Schmitz et al.,
2002)
153.3
(Ma et al., 2000)
Dissoziations-
verhalten
Stabilitätserhöhung
durch Zusatz von
Ni2+ und Mg2+
(diese Arbeit)
stabil ohne
Zusatz von
divalenten
Kationen
Stabilitätserhöhung
durch Zusatz von
Ni2+ und Mg2+
(Schneider,
Cammack, et al.,
1984)
Dissoziation der
Modulbestandteile
beobachtet
(Long et al., 2006;
Palágyi-Mészáros
et al., 2009;
Serebriakova &
Sheremet’eva,
2006)
stabil ohne
Zusatz von
divalenten
Kationen
KMH2
(µM)
42
(diese Arbeit)
37
(Schneider &
Schlegel, 1976)
63
(Aggag & Schlegel,
1974)
11.3
von Anabeana
variabilis
(Serebryakova et
al., 1996)
(Schmitz et al.,
1995)
140
(Ma et al., 2000)
(Van Haaster et
al., 2008)
99
KMNAD(P)+
(µM)
469 (NAD+)
(diese Arbeit)
560 (NAD+)
(Aggag &
Schlegel, 1974)
150 (NAD+)
(Schneider &
Schlegel, et al.,
1984)
n.p.
40 (NADP+)
(Ma et al., 2000)
n.p. (NAD+)
Physiologische
Elektronen-
mediatoren
NAD+
NAD+
NAD+
NAD+, NADP+/
NAD(P)H,
ferredoxinredflavod
oxinred
NADP+, NAD+
TOF NAD/P+
(s-1)
150
(diese Arbeit)
485
(van der Linden
et al., 2006)
84400 h-1
(Reeve et al.,
2015)
211
(Zaborosch et al.,
1989)
n.p.
99 (NAD+)
(Ma et al., 2000)
38.3 - 88.6
(NADP+)
(Chandrayan et
al., 2012)
VmaxH2 Produktion
(mit NADH)
0.9 U · mg-1
(diese Arbeit)
1.2 U · mg-1
3.49 U · mg-1
2.81 U · mg-1
(Schmitz et al.,
2002)
1.5-2 U · mg-1
(NADPH)
Topt
(°C)
80
(diese Arbeit)
35
(Ratzka et al.,
2011)
30
60
(Schmitz et al.,
2002)
80
(Ma et al., 1993)
(Bryant &
Adams, 1989)
pHopt
6.5
(diese Arbeit)
8
(Ratzka et al.,
2011)(Schneider
& Schlegel,
1976)
7.8-8
(+NiCl2)
<7
(- NiCl2) (Schneider
& Schlegel, et al.,
1984)
6.3
(Schmitz et al.,
2002)
8.4
(Ma et al., 1993)
Verhalten
gegenüber O2
Ca. 50 % in
Anwesenheit von
18.8 µM O2
Ca. 85% in
Anwesenheit von
470 µM O2
(Lauterbach &
Lenz, 2013)
n.p.
O2-sensitiv
(Chandrayan et al.,
2012)
Ca. 25% H2-
Oxidationsaktivit
ät auf Elektrode
(Kwan et al.,
2015)
† n.p. nicht publiziert
100
Die SH aus Ralstonia eutropha sowie die SH aus Rhodococcus opacus wurden für den
Vergleich in der oben aufgeführten Tabelle ausgewählt, da sie ein Forschungsschwerpunkt der
Arbeitsgruppe darstellen und auch im Rahmen dieser Dissertation eingehender untersucht
werden sollten. Neben den löslichen [NiFe]-Hydrogenasen der Gruppe 3d, zu denen die ReSH,
RoSH und HtSH zugeordnet werden, gibt es auch gut untersuchte Beispiele anderer löslicher
Hydrogenasen. Besonders im Hinblick auf die potentielle Anwendung in der Biotechnologie
sind die entsprechenden Hydrogenasen aus Synechocystis sp. sowie Pyrococcus furiosus
interessant. Synechocystis sp. PC6803 ist ein Cyanobakterium, welches mithilfe der löslichen,
„bidrektionalen“ Hydrogenase das Redoxpotential der Zelle beim Übergang zwischen Licht-
und Dunkelphase stabil hält (Khanna & Lindblad, 2015; McIntosh et al., 2011), was durch die
Produktion von H2 aus überschüssigen Reduktionsäquivalenten bewerkstellig wird. Im
Gegensatz zu den löslichen [NiFe]-Hydrogenasen anderer Subgruppen katalysiert die
bidirektionale Hydrogenase aus Synechocystis eher die Protonenreduktion als die H2-Oxidation
(McIntosh et al., 2011). Demnach besteht großes Interesse an dieser SH im Hinblick auf die
lichtgetriebene H2-Produktion (Krassen et al., 2011).
Neben der cyanobakteriellen SH weist auch die lösliche Hydrogenase SHI aus dem
hyperthermophilen, anaeroben Archaeon Pyrococcus furiosus besondere Merkmale auf. Da sie
aus einem thermophilen Organismus stammt, der sogar bei Temperaturen bis 100 °C wachsen
kann, wird ihr eine besondere Stabilität zugeschrieben (Ma et al., 2000; Wu et al., 2015).
Obwohl die SH1 aus einem strikten Anaerobier stammt, zeigt sie eine Sauerstofftoleranz
(Kwan et al., 2015). Neben der ausgeprägten Thermostabilität ist ihre Eigenschaft interessant,
vorrangig NADP+ als Elektronenakzeptor zu verwenden. Aufgrund ihrer besonderen
Eigenschaften wurde die SH1 aus P. furiosus sowohl für die biotechnologische H2-Produktion
als auch für die H2-getriebene NADPH-Regeneration eingesetzt (Wu et al., 2015).
Das auffällige Verhalten der Dissoziation in die zwei funktionalen Module in Abwesenheit
zweiwertiger Kationen zeigen sowohl die HtSH wie auch die RoSH. Auch bei verschiedenen
cyanobakteriellen SHs wurde die Dissoziation in Hydrogenase- und HoxFUE- Modul
mehrmals beobachtet, konnte jedoch nicht bestimmten Reaktions- oder Pufferbedingungen
zugeschrieben werden (Long et al., 2006; Palágyi-Mészáros et al., 2009; Serebriakova &
Sheremet’eva, 2006). Das pH-Optimum der Protonenreduktion liegt bei etwa 6.3 (Schmitz et
al., 2002) und auch die SsSH zeigt gute Aktivitäten bei erhöhten Temperaturen. Allerdings ist
101
die H2-Produktionsrate der SsSH etwa dreifach höher (Schmitz et al., 2002). Die HtSH verfügt
dagegen über eine moderate Sauerstofftoleranz, die der SsSH fehlt. Schon geringe
Sauerstoffkonzentrationen führen zur Inaktivierung, was die biotechnologische Anwendung
erschwert.
Im Hinblick auf eine mögliche Anwendung der thermostabilen HtSH ist ein Vergleich mit der
PfSH als Kofaktorregenerationssystem bei hohen Temperaturen naheliegend. Zwar weist die
PfSH einen um Faktor 10 niedrigeren KMNADP+ auf, ihre Wechselzahl für NADP+ ist aber
deutlich geringer. Das Temperaturoptimum liegt für beide Hydrogenasen bei etwa 80 °C. Ein
Vorteil den die HtSH bietet, ist die gute Aktivität bei neutral bis schwach sauren pH-Werten.
Um optimale Aktivität der PfSH zu erhalten, ist dagegen ein Ansatz mit basischen pH-Werten
oberhalb von 8 nötig. Wenn das Substratspektrum der HtSH ebenso wie das der ReSH durch
zielgerichtete Mutagenese verändert werden kann, wäre dies eine gute Alternative zum
NADPH-Regenerationssystem basierend auf PfSH.
4.1.2 Die Sauerstofftoleranz der HtSH
Neben der besonderen Abhängigkeit der HtSH von zweiwertigen Kationen in Salzen wie NiCl2
oder MgCl2 unterscheidet sich diese Hydrogenase auch in ihrem Verhalten gegenüber
Sauerstoff deutlich von der ReSH. So ist die H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität der
HtSH bereits bei vergleichsweise niedrigen Konzentrationen von gelöstem Sauerstoff im
Reaktionsansatz (18.8 µM) um etwa 50 % herabgesetzt. Insbesondere im Kontext der
Sauerstofftoleranz der löslichen [NiFe]-Hydrogenasen erscheint die genauere Untersuchung
konservierter, [FeS]-Zentren koordinierender Cysteinreste in HoxY interessant (Abbildung
29). Speziell die Koordination und Konformation des [FeS]-Zentrums, das proximal zum
[NiFe]-Zentrum positioniert ist, zeigte sich am Beispiel der MBH als ausschlaggebend für die
besondere Sauerstofftoleranz (Fritsch et al., 2011; Goris et al., 2011). Dieses ungewöhnliche,
proximale [FeS]-Zentrum der MBH liefert die Elektronen zur Reaktivierung des oxidierten
[NiFe]-Zentrum und ist nicht in der SH-Struktur vorhanden. Die Herkunft der Elektronen zur
Reduktion von Sauerstoffspezies am [NiFe]-Zentrum ist bei der SH bisher nicht eindeutig
geklärt. Bei dem Sequenzvergleich der HoxY-Untereinheiten von SHs aus R. eutropha,
R. opacus sowie dem Cyanobakterium Synechocystis sp. PCC 6803 und dem thermophilen
Organismus Pyrococcus furiosus können [FeS]-koordinierende Cysteine identifiziert werden
(Abbildung 29).
102
Position (HoxY)
34-57
76-88
99-118
177-188
39 41 43
79
104 113
179
R. eutropha
ATIGLCGCWGCTLSFLDMDERLL
PERCAIGFVEGGV
HFRENCDILISVGACAVWGG
PGCPPDGDAIFK
H. thermoluteolus
ATASLAGCFGCHMSFADIDTRLL
GE-CDIALIEGGV
AYRRAARILVAVGACAINGG
PGCPPTAEVIWT
R. opacus
AMIGLCGCWGCTLSFLDMDERLL
TERCAIGFIEGGV
HYRENCDVLISVGACAVWGG
PGCPPDADAIFK
S. sp PC6803
ATVWLAGCSGCHMSFLDMDEWLI
PDNVDVCLVEGAI
ELRQKTKVVISFGDCAVTAN
PGCPPDAHRIRA
P. furiosus
GFYALTSCYGCQLQLAMMDELLQ
DEKVDIAFIEGSV
KIRENAKIVVAVGACAVQGG
YGCPPEKKDFLY
Abbildung 29. Ausschnitte aus einem multiplen Sequenzvergleich der HoxY-Proteine aus verschiedenen
Organismen. Die Positionen bezihen sich auf die Sequenzangaben von ReHoxY (HOXY_CUPNH, UniProt:
P22319). HOXY_HYDTE Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T, UniProt: A0A077L7R5;
HOXY_RHOOP Rhodococcus opaus MR11, UniProt: P72306; HOXY_SYNY3 Synechocystis sp. PCC
6803, UniProt: P74024; HYD1D_PYRFU Pyrococcus furiosus, UniProt: E7FHU4). Gelb markiert sind die
konservierten Cysteine, die bei der Koordination des [FeS]-Clusters in HoxY beteiligt sind. Grau hinterlegt
sind Cysteine, die insbesondere bei den löslichen Hydrogenasen der Gruppe 3d vorhanden sind.
Aminosäuren mit roter Schrift zeigen ähnliche Aminosäuren der HtSH und der SsSH.
Besonders die Aminosäuresequenzen um die konservierten Cysteine C41 und C43
unterscheiden sich zwischen den Hydrogenasen unterschiedlicher Gruppen. Während bei den
HoxY-Sequenzen der sauerstofftoleranten Hydrogenasen aus R. eutropha und R. opacus ein
zusätzliches Cystein an Position 39 zu finden ist, weisen die sauerstoffempfindlichen,
cyanobakteriellen Hydrogenasen dort kleinere Aminosäuren wie Alanin und Glycin auf. Auch
bei der HtSH ist an dieser Stelle kein zusätzliches Cystein, sondern ein Alanin lokalisiert.
Weitere strukturelle Gemeinsamkeiten zwischen HtHoxY- und SsHoxY-Sequenz sind an den
Positionen 44, 45 sowie 104 zu finden. Anstelle des T44L45-Motivs in den HoxY-Sequenzen
von R. eutropha und R. opacus befinden sich bei SsHoxY und HtHoxY hier die
Aminosäurereste H44M45. Das ebenfalls im sauerstofftoleranten HoxY-Typ konservierte
C104 ist sowohl bei der HtSH wie auch den cyanobakteriellen und der thermostabilen PfSH
nicht vorhanden.
Um einen möglichen Einfluss dieser Positionen auf die Sauerstofftoleranz bzw. –
empfindlichkeit der HtSH zu untersuchen, können gezielt Austausche dieser Aminosäuren
hilfreich sein. Dazu wurden bereits Primer entworfen (s. Anhang). So wäre z. B. der Austausch
des Alanins an Position 39 gegen ein Cystein möglich, um der Sequenz von ReHoxY und
RoHoxY zu entsprechen. Ebenso wäre dazu ein Austausch des Histidin 44 sinnvoll. Das
Entfernen der aromatischen Aminosäure F41 gegen ein Serin würde dagegen eine Annäherung
103
an das Motiv aus SsHoxY bedeuten. Da ein entsprechendes pCM-basiertes Konstrukt zur
Expression der HtSH oder des solitären HtHoxHY-Dimers zur Verfügung steht (Tabelle 1, 2.1),
könnten entsprechende Mutagenese-Experimente schon bald neue Einblicke in die
Sauerstofftoleranz löslicher, NAD+-reduzierender Hydrogenasen ermöglichen.
Auch bei dem Sequenzvergleich der HoxH-Untereinheiten zeigen sich an einzelnen Positionen
um konservierte Motive Ähnlichkeiten zwischen der HtHoxH Sequenz und den Sequenzen von
Hydrogenasen aus anderen Untergruppen der Gruppe 3-Hydrogenasen.
Position (HoxH)
12-16
59-74
110-120
390-396
454-465
* * *
*
*
* *
R. eutropha
VTRIEGHGK
QRICGICFVSHHLCG
HYAQMLQSH
PRGTLLH
RAYDPCLSCATH
H. thermoluteolus
LSRVEGHGK
QRLCGICPVSHHLAA
HYGQVLQSH
PRGTLIH
RAFDPCLSCATH
R. opacus
VTRIEGHGK
QRICGICFVSHHLCG
HYAQMLQSH
PRGTLHH
RAYDPCLSCATH
S. sp PC6803
VTRIEGHAK
ARICGICPVSHLLCA
NLGQITQSH
PRGTLFH
RCYDPCLSCSTH
P. furiosus
IARVEGKGG
PRICSFCSAAHKLTA
YIGDMIESH
PRGILVY
RAYDPCISCSVH
Abbildung 30. Ausschnitte aus dem multiplen Sequenzvergleich von HoxH aus verschiedenen
Organismen. Die Positionen beziehen sich auf die Sequenzangaben von ReHoxH (HOXY_CUPNH,
UniProt: P22320). HOXY_HYDTE Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1T, UniProt: A0A077LAI5;
HOXY_RHOOP Rhodococcus opaus MR11, UniProt: P72306; HOXY_SYNY3 Synechocystis sp. PCC
6803, UniProt: E7FI44; HYD1D_PYRFU Pyrococcus furiosus, UniProt: P74018). Gelb sind
besonders konservierte Aminosäuren markiert, die sehr wahrscheinlich an der Koordination des
aktiven Zentrums beteiligt sind. In grün sind Aminosäuren hinterlegt, die besonders bei den
Hydrogenasen der Gruppe 3d zu finden sind, jedoch nicht in der Sequenz von HoxH der Pyrococcus
furiosus Hydrogenase erscheinen, die der Gruppe 3b zugeordnet wird. Die Sternchen markieren
Aminosäuren, deren Austausch im Rahmen von gezielter Mutagenese von Tanja Burgdorf (Burgdorf
et al., 2002) dazu führten, dass ein SH-basiertes lithoautotrophes Wachstum mittels dieser Varianten
nicht mehr möglich ist. Aminosäuren mit roter Schrift sind Positionen, an denen sich die HtSH von
den Sequenzen der ReSH und RoSH unterscheidet. In grau hinterlegt ist das QxxQ-Motiv, das bei
Hydrogenasen der Gruppe 3d zu finden ist und an deren Position bei den Hydrogenasen der Gruppe
3b häufig ein D/ExxE-Motiv auftritt.
104
4.1.3 Die Struktur der HtSH
Um die Mechanismen der Sauerstofftoleranz von löslichen Hydrogenasen besser zu
verstehen, ist ein Einblick in die Proteinstruktur und die Konformation der Kofaktoren
unerlässlich. Vor Kurzem ist es der Arbeitsgruppe um Y. Higuchi gelungen, die Kristallstruktur
der HtSH zu lösen (Shomura et al., 2017; Taketa et al., 2015). Auch im Rahmen dieser Arbeit
konnten Kristalle der HtSH sowohl unter reduzierenden wie auch oxidierenden Bedingungen
gewonnen werden. Allerdings konnte aus den erhaltenen Datensätze nach Messung der
Röntgenbeugung keine Struktur ermittelt werden, da die Auflösung noch zu gering war und es
an ausreichend homologen Strukturen fehlte. Anhand der nun öffentlich zugänglichen
Proteinstrukturen ist ein Abgleich der Datensätze nach dem Ansatz des molekularen Ersatzes
möglich, um Elektronendichtekarten zu erzeugen.
In den veröffentlichen Strukturen liegt die HtSH als Dimer aus zwei HoxFHUY-Einheiten vor.
Dabei stehen die folgenden Untereinheiten in der oxidierten Struktur in Kontakt miteinander:
HoxU–Y (1071 Å2), HoxU–H (774 Å2) und HoxF–Y (Shomura et al., 2017).
4.1.4 Dissoziation von FMN aus der HtSH unter reduzierenden Bedingungen:
Schutzmechanismus vor ROS-Bildung?
Besonders zwei Eigenschaften der HtSH scheinen in den Strukturen auffällig. Zum
einen besitzt das Nickel des [NiFe]-aktiven Zentrums im oxidierten Kristall die Carboxygruppe
eines Glutamats als Ligand. Ebenfalls nur im oxidierten Kristall zu beobachten ist ein FMN-
Molekül als Kofaktor in HoxF. In der Struktur der H2-reduzierten HtSH fehlt dagegen das FMN
(Shomura et al., 2017). Assoziiert mit der Bindung von FMN wird die Bewegung des C-
Terminus von HoxF. Dieser C-Terminus, der etwa 38 Aminosäuren umfasst, nimmt in der
Struktur des reduzierten Kristalls eine andere Position ein als im oxidierten. In der reduzierten
Struktur steht er in Kontakt mit HoxY und reicht armförmig fast über HoxY hinweg bis zur
HoxH-Untereinheit (Abbildung 31C). Im oxidierten Zustand knickt der C-Terminus dagegen
ein und ist im nahen Umfeld der FMN-Bindetasche zu finden. Von den Autoren der
Veröffentlichung (Shomura et al., 2017) wird mit der Dissoziation des FMNs im reduzierten
Zustand ein Mechanismus vorgeschlagen, der vor der Bildung von radikalen Sauerstoffspezies
105
schützen soll. Überschüssige Elektronen, die nicht direkt auf NAD+ übertragen werden, sollen
so nicht durch reduziertes FMN zur Bildung von Sauerstoffspezies beitragen können.
Vor dem Hintergrund, dass in lebenden Zellen von R. eutropha ein reduzierendes Milieu
herrscht und das aktive Zentrum der ReSH im zellulären Hintergrund verschiedene reduzierte
Zustände einnimmt (Horch et al., 2010) erscheint diese Erklärung für das Fehlen des FMN-
Moleküls in der Kristallstruktur als unzureichend. Es ist sehr wahrscheinlich, dass auch im
Zellinneren von H.t. überwiegend reduzierende Bedingungen vorliegen. So müsste, der
Hypothese folgend, die HtSH stets inaktiv ohne gebundenes FMN vorliegen. Da die gelöste
Struktur bislang nur auf einem einzigen gemessenen Kristall beruht, bleibt abzuwarten, ob das
FMN-Molekül generell unter reduzierendenden Bedingungen fehlt.
Eine reversible Dissoziation des FMN-Moleküls wurde auch für NuoE des Komplex I aus E.
coli unter reduzierenden Bedingungen beobachtet (Holt et al., 2016). In diesem Fall ist eine
Abnahme der ROS-Bildung mit der Dissoziation des FMN aus der mit NADH-reduzierten
Untereinheit NuoE nachgewiesen. Begründet wird die Dissoziation des FMN aus der
reduzierten NuoE-Untereinheit mit der starken Abnahme der Bindungsaffinität nach Reduktion
der beiden nahestehenden [FeS]-Zentren N1a und N3. Eine Änderung der FMN-
Bindungsaffinität und eine daraus folgende schnelle Dissoziation von FMN ist im homologen
Protein NqoI aus T. thermophilus nicht zu beobachten (Holt et al., 2016). Dieser Unterschied
wird mit dem ungewöhnlich hohen Mittelpunktpotential von N1a in NuoE aus E. coli
begründet, der somit sensibler gegenüber reduzierenden Bedingungen reagiert (Gnandt et al.,
2017; Holt et al., 2016; Leif et al., 1995). Die Autoren schlussfolgern, dass FMN eine Rolle
als Redox-Mediator übernimmt und die feste Bindung von NAD+, die nach Reduktion der
[FeS]-Zentren N1a und N3 erfolgt, die Reduktion von FMN durch NADH bzw. die Bindung
von O2 an FMN verhindert. Das [FeS]-Zentrum, welches in diesem Beispiel hauptsächlich an
dem Schutzmechanismus beteiligt ist, ist in der HtSH jedoch nicht vorhanden, sodass der
Mechanismus der FMN-Dissoziation aus HoxF näher untersucht werden muss.
106
Abbildung 31. Verschiedene Ansichten der HtSH Struktur unter reduzierenden Bedingungen
(pdb 5xf9). FMN wurde aus der Struktur der oxidierten HtSH (pdb 5xfa) in die Bindetasche eingefügt.
NAD+ als Kofaktor wurde aus einem Homologiemodell der ReSH eingefügt, welches wiederum auf
der Kristallstruktur des Komplex I basiert (pdb 2fug und 3iam). Die [FeS]-Cluster sowie das [NiFe]-
Zentrum und das Magnesiumatom sind in Sphärendarstellung, die Kofaktoren FMN und NAD+ als
sticks abgebildet. Die Untereinheit HoxH mit dem [NiFe]-Zentrum ist orange, HoxY hellorange,
HoxU hellblau und HoxF dunkelblau dargestellt. a) Ansicht der tetrameren HtSH als
Cartoondarstellung mit eingebetteten Kofaktoren und transparenter Oberfläche. b) Ansicht der
tetrameren HtSH mit transparenter Oberfläche ohne Cartoondarstellung des Proteinrückgrates um die
Anordnung der Kofaktoren aufzuzeigen. c) Ansicht der tetrameren HtSH 90°C um die Längsachse
rotiert. d) Vereinfachte Darstellung der Kofaktorzusammensetzung in den Untereinheiten und ihrer
Anordnung zueinander. Mit der Besonderheit des C-Terminus, der nur in der Struktur des reduzierten
Kristalls auch in Kontakt mit der Untereinheit HoxY steht.
d)
107
4.1.5 Mögliche Auswirkungen der Bindung von Glutamat an das Nickel im
katalytischen Zentrum im oxidierten Zustand
Infolge der Strukturaufklärung wurde die HtSH auch EPR-spektroskopisch untersucht
(Shomura et al., 2017). Dabei zeigten sich zwei verschiedene EPR-aktive Zustände, deren g-
Werte gut mit den im Rahmen dieser Arbeit erzielten Werten übereinstimmen. Nach Reduktion
durch H2/BV, ließ sich der Nia-C-Zustand mit ähnlichen g-Werten detektieren, wie sie auch bei
der ReSH und der Standard-Hydrogenasen gefunden wurden (Tabelle 26). Interessanterweise
wurde das Nia-C-spezifische Signal der H2-reduzierten HtSH nur bei Temperaturen unterhalb
von 10 K gemessen werden. Dies könnte einen Hinweis darauf geben, warum es bislang nicht
gelang, paramagnetische Ni-Spezies in anderen löslichen, bidirektionalen Hydrogenasen zu
detektieren (Germer et al., 2009; Horch et al., 2011).
Tabelle 26. Übersicht über die EPR-Zustände des [NiFe]-aktiven Zentrums in der HtSH im Vergleich zu
ReSH und der Standard-[NiFe]-Hydrogenase aus Allochromatium vinosum.
Zuordnung
g1
g2
g3
Literatur
HtSH
[NiFe]: NiIII, unbekannter Zustand
2.260
2.127
2.034
diese Arbeit
[NiFe]: Nia-C
2.210
2.139
2.013
[NiFe]: NiIII, unbekanner Zustand in Luft-oxidiertem
Enzym
2.25
2.26
2.13
2.04
(Shomura et al., 2017)
[NiFe]: Nia-C nach Reduktion durch H2
2.21
2.14
-
ReSH
Nia-C
2.2
2.14
2.01
(Horch et al., 2010)
Nia-L
2.27
2.1
2.05
Std Hyd
(Bleijlevens et al., 2001)
Nia-C
2.21
2.15
2.01
Nia-L
2.28
2.12
2.05
108
Abbildung 32. Darstellungen des oxidierten (links) und reduzierten (rechts) [NiFe]-Zentrums in der
HoxH-Untereinheit der HtSH, die mithilfe der pdb-Einträge 5XF9 und 5XFA erstellt wurden (nach
Shomura et al. (2017)).
Der im Rahmen dieser Arbeit erstmalig detektierte Zustand des aktiven Zentrums in frisch
isolierter, oxidierter HtSH mit den Werten g1 = 2.26, g2 = 2.217 und g3 = 2.034 wurde auch
von Shomura et. al in der Luft-oxidierten Probe der Hydrogenase festgestellt und könnte auf
das Glutamat-gebundene Ni(III) zurückzuführen sein.
Neben den EPR-aktiven Zuständen des aktiven Zentrums wurden von Christian Lorent (AG
Hildebrandt) mit Hilfe der EPR-Spektroskopie die Anwesenheit von FMN sowie von [2Fe2S]-
und [4Fe4S]-Zentren in der HtSH-Enzym nachgewiesen (3.3.4). IR-Spektroskopie
(durchgeführt von Stefan Wahlefeld, AG Hildebrandt) ermöglichte zudem die Identifikation
weiterer Redoxzustände des aktiven Zentrums (Tabelle 16). Darunter befindet sich der Nir-B-
ähnliche Zustand des oxiderten Enzyms sowie die Intermediate der H2-Umwandlung,
namentlich Nia-S, Nia-C und Nia-SR (Horch et al., 2010, 2015). Mit Ausnahme des Nia-C-
Zustandes, der sowohl mittels IR und auch EPR nachgewiesen werden konnte, sind alle
anderen Zustände EPR-inaktiv.
109
Tabelle 27. Vergleich der CO-Streckschwingungen (angegeben in cm-1) verschiedener NAD(P)-
reduzierender Hydrogenasen der Gruppe 3 in unterschiedlichen Redoxzuständen.
Herkunfta
Niu-?
Nir-
B-
like
Nir-
S
Nia-
SI
Nia-
C
Nia-L
Nia-
LII
Nia-
SR
Nia-
SR2
Nia-
SR‘
Nia-
SR‘‘
HtSH
1993
1964
1936
1951
1971
-
-
1958
-
1943
1934
diese
Arbeit
RoSH
-
-
-
-
1956
-
-
-
1958
1922
1913
(K.
Karstens
2014)
ReSH
-
1957
-
-
1961
-
-
1946
1958
1922
1913
(Horch et
al., 2010,
2015)
PfSH
(SH1)
-
1960
1931
1950
1967
1917
1922
1954
-
1940
1931
(Greene
et al.,
2015,
2016)
SsSH
-
1957
-
1947
1968
-
-
1955
-
-
(Germer
et al.,
2009)
aHt Hydrogenophilus thermoluteolus, Ro Rhodococcus opacus MR11, Re Ralstonia eutropha H16, Pf Pyrococcus
furiosus, Ss Synechocystis sp. PCC 6803
Den CO-Schwingungen bei 1964 und 1936 cm-1 wurden Zustände Nir-B-like und Nir-S
zugeordnet, die nicht Teil des katalytischen Zyklus der H2-Konversion sind. Diefür die HtSH
beobachteten CO-Banden bei 1951, 1971 und 1958 cm-1 stehen dagegen für die Zustände Nia-
S, Nia-C und Nia-SR, die Intermediate der H2-Konversion darstellen.
Neben den bislang zugeordneten Zuständen wurde in der unbehandelten, Luft-oxidierten Probe
der HtSH eine dominante CO-Bande bei 1993 cm-1 beobachtet. Diese konnte vor
Bekanntwerden der Kristallstruktur keinem Zustand des aktiven Zentrums zugeordnet werden.
Vermutlich ist sie eine starke strukturelle Abweichung in der Geometrie des oxidierten
Zentrums im Vergleich zu anderen Hydrogenasen zuzuordnen. Tatsächlich wurde in der
Kristallstruktur der oxidierten HtSH eine Koordination Nickels durch die Carboxylgruppe
eines Glutamats beobachtet (Shomura et al., 2017), die diese ungewöhnlich hochfrequente CO-
Schwingung erklären könnte. Über den Wahrheitsgehalt dieser Annahme könnten QM/MM-
sowie DFT-Rechnungen Aufschluss geben.
110
Im Vergleich zu den entsprechenden Signalen der ReSH und RoSH liegen die CO-
Schwingungen der HtSH insgesamt bei höheren Frequenzen. In einem ebenso erhöhten
Frequenzbereich finden sich auch die CO-Streckschwingungen der PfSH. Die HtSH scheint in
diesem Zusammenhang größere Ähnlichkeit zur PfSH als zu den beiden bakteriellen SHs
aufzuweisen, obwohl das [NiFe]-Zentrum in allen Hydrogenasen in gleicher Weise aufgebaut
und koordiniert zu sein scheint. Auf welche strukturelle Unterschieden die verschiedenen
Frequenzbereiche zurückzuführen sind, bleibt demnach noch offen.
4.2 Chimäre SHs zusammengesetzt aus den Modulen verschiedener Mikroorganismen
4.2.1 Die Hyp-Maschinerie des Megaplasmids ermöglicht die Maturation und
Produktion heterologer Hydrogenasen in Ralstonia eutropha
Dass die vollständige funktionsfähige, heterotetramere SH aus dem Actinobakterium
Rhodococcus opacus heterolog in dem β-Proteobakterium Ralstonia eutropha produziert
werden kann, wurde bereits von Porthun et al. (2002) gezeigt. Hierfür wurden lediglich die vier
Strukturgene hoxFUYH sowie das für die Endopeptidase codierende Gen hoxW aus R. opacus
in R. eutropha übertragen. Die Reifung und der Einbau des Nickel-Eisen-Zentrums in die apo-
Form der RoHoxH-Untereinheit wurde dabei von der megaplasmidständigen Hyp-Maschinerie
von R. eutropha bewerkstelligt (2002). Im Rahmen dieser Arbeit wurde die gleiche Strategie
verwendet, um mit Erfolg die Strukturgene der thermostabilen SH aus Hydrogenophilus
thermoluteolus heterolog in R. eutropha zu exprimieren, was zur Isolation von katalytisch
aktivem Enzym führte. Die Hyp-Maschinerie in Ralstonia eutropha scheint demnach nicht
spezifisch auf die Reifung der eigenen Hydrogenasen beschränkt zu sein.
Die Expressionsstrategie wurde ebenfalls verwendet, um chimäre SHs aus den HoxFU- und
HoxHY-Modulen verschiedener Mikroorganismen herzustellen. Bei dieser Studie fielen
jedoch Unterschiede bezüglich der Fähigkeit der verschiedenen HoxHY-Module zur
Komplementation eines entsprechenden Deletionsstamms von R. eutropha auf.
Zunächst wurde die Produktion aller vier Untereinheiten der SH-Chimären mittels Western-
Blot-Analyse nachgewiesen. Besonders die Untereinheiten der heterologen HoxHY-Module
waren in den R. eutropha Stämmen mit ∆hoxH-Hintergrund nur schwach sichtbar, wohingegen
das R.-eutropha-eigene HoxHY-Modul in wildtypähnlichen Mengen synthetisiert wurde (3.4.2
Abbildung 16). Für heterologe Produktion der HoxFU-Module in R. eutropha-Stämmen mit
111
∆hoxFU-Hintergrund wurde dieses Phänomen jedoch nicht beobachtet. Abgesehen von der
Tatsache, dass die Antikörper gegen die SH-Untereinheiten von R. eutropha hergestellt wurden
und möglicherweise eine geringere Spezifität für die heterologen Untereinheiten besitzen, lässt
sich diese Beobachtung auf die Reifung zurückführen. Der Einbau des [NiFe]-Zentrums in die
HoxH-Untereinheit erfordert neben der spezifischen Endopeptidase HoxW, sieben weitere
Hyp-Proteine, nämlich HypA, B, C, D, E, F und X, die in einem vollständigen Satz im Operon
der MBH kodiert sind (hypA1, hypB1, hypF1, hypC1, hypD1, hypE1, hypX)(Dernedde et al.,
1996; Schwartz et al., 2003). Eine Teilkopie in Form von hypA2, hypB2 und hypF2 findet sich
auch im SH-Operon von R. eutropha, diese ist allerdings nicht ausreichend für die vollständige
Reifung der SH und muss durch die fehlenden hyp-Gene des MBH-Operons ersetzt werden
(Dernedde et al., 1996; Wolf et al., 1998). In dieser Arbeit waren für die Herstellung der SH-
Chimäre lediglich die im MBH-Operon kodierten Hyp-Proteine zugegen. Tatsächlich konnte
im Falle der heterologen Expression der tetrameren RoSH in R. eutropha eine deutliche
Erhöhung der spezifischen Aktivität erzielt werden, wenn zusätzlich die Gene hypA2, hypB2
und hypF2 co-exprimiert wurden (Porthun et al., 2002). Diese Strategie könnte auch für die
Produktion aktiverer SH-Chimäre erfolgreich sein. Denkbar ist auch eine unvollständige
Reifung der apo-HoxH-Proteine aufgrund einer mögliche Kreuzreaktion der jeweils doppelt
vorhandenen Endopeptidasen.
Nichtsdestotrotz scheint die Synthese und Reifung der chimären SH-Varianten ausreichend zu
sein, um lithoautotrophes Wachstum der plasmidtragenden Stämme mit ∆hoxFU- und ∆hoxH-
Hintergrund zu vermitteln (3.4.1 Abbildung 14). Mit Ausnahme des HoxHY-Moduls aus H.
thermoluteolus kann dabei jedes heterolog synthetisierte Modul das entsprechende SH-Modul
aus R. eutropha ersetzen. Jedoch sind die Wachstumsraten der Expressionsstämme mit
chimären SHs niedriger als die der Stämme, die beide Module der ReSH besitzen.
Dass sogar die chimäre SH bestehend aus ReHoxHY und HtHoxFU lithoautotrophes
Wachstum ermöglichen kann, war insofern überraschend, als das die Wachstumstemperatur in
diesem Experiment mit 30°C deutlich unter der optimalen Wachstumstemperatur von 52°C
von H. thermoluteolus liegt. Im Gegensatz dazu erscheint die SH bestehend aus HtHoxHY und
ReHoxFU deutlich labiler. Lithoautotrophes Wachstum mit dieser chimären SH-Variante im
∆hoxH-Stamm war bei 30°C nicht möglich, da die Hydrogenase-Aktivität offensichtlich zu
gering ist, um der Zelle ausreichend Reduktionsäquivalente zur Verfügung zu stellen.
112
Auch Proben des löslichen Extraktes dieses Stammes besaßen vergleichsweise geringe
Hydrogenase-Aktivität (3.4.3 Abbildung 17). Selbst unter Zugabe der zweiwertigen Ni2+- und
Mg2+-Ionen und der Erhöhung der Reaktionstemperatur auf 50 °C, wurde nur etwa 10 % der
spezifischen Aktivität erreicht, die für die SH-Variante bestehend aus ReHoxHY und HtHoxFU
gemessen wurde.
Die Produktion der HoxHY- und HoxFU- Module aus unterschiedlichen Organismen in R.
eutropha führte zu aktiven, chimären SHs, die sich in ihrern biochemischen Eigenschaften von
den wildtypischen SHs unterscheiden. Dieses Baukasten-Prinzip könnte zukünfitg noch um
weitere SH-spezifische Module aus anderen Organismen wie z.B. P. furiosus oder
Synechocystis sp. erweitert werden und ermöglicht die Erzeugung synthetischer SHs. Diese
könnten dann durch die geeignete Modul-Kombination wunschgemäß optimiert und den
wildtypische SHs womöglich überlegen sein.
4.2.2 Die Hydrogenase-Module aus Rhodococcus opacus und Hydrogenophilus
thermoluteolus benötigen zweiwertigen Kationen für die H2-Konversion
Nachdem die in Kapitel 3.4 beschriebenen Untersuchungen der transkonjuganten
Stämme ∆hoxFU bzw. ∆hoxH signifikante Unterschiede in den H2-abhängigen NAD+-
Reduktionsaktivitäten der chimären SH-Varianten ergaben, sollten die gereinigten Enzyme
eingehender analysiert werden. Die Reinigungen chimärer SH-Varianten, die Module aus
R. opacus enthielten, erbrachten etwa 0.9-1 mg gereinigtes Protein pro Gramm Zellen, und alle
vier SH-Untereinheiten waren nach Elektrophorese deutlich im SDS-Gel zu identifizieren
(Abbildung 18). Zwar konnten auch die chimären SH-Derivate mit den Modulen aus H.
thermoluteolus mit ähnlichen Ausbeuten gereinigt werden, allerdings waren nur für die SH
bestehend aus HtHoxFU und ReHoxHY alle vier charakteristischen Banden der Hydrogenase-
Untereinheiten im SDS-Gel sichtbar (Abbildung 18). Das Eluat der SH-Variante bestehend aus
HtHoxHY und ReHoxFU zeigte auch nach Supplementation des Reinigungspuffers mit
zweiwertigen Metallionen nur zwei undeutliche Banden für HoxH und HoxY im SDS-Gel
(Abbildung 18). Diese Beobachtung sowie die immunologische Analyse der entsprechenden
Proben lassen vermuten, dass es trotz der Ionen-Supplementation zu einer Dissoziation der
beiden SH-Module kommt. Die Interaktion zwischen dem HtHoxHY-Modul und ReHoxFU ist
demnach zu schwach, um das heterotetramere Chimär stabil zusammenzuhalten. Daher konnte
auch nach Erhöhung der Temperatur und unter Zugabe von Mg2+- und Ni2+-Ionen nur eine sehr
geringe spezifische H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität für diese Variante festgestellt
113
werden. Es ist wichtig zu erwähnen, dass ohne Zugabe der zweiwertigen Ionen nur Spuren von
Aktivität gemessen werden konnten (Abbildung 19).
Auch bei für die SH-Variante bestehend aus ReHoxFU und RoHoxHY wurde eine deutliche
Erhöhung der Aktivität nach Zugabe von Ni2+ und Mg2+ festgestellt (Abbildung 19). Daraus
kann gefolgert werden, dass die Hydrogenase-Module aus R. opacus und H. thermoluteolus die
Anwesenheit zweiwertiger Metallionen benötigen, um einen effektiven Elektronentransport
zwischen HoxHY und HoxFU zu ermöglichen. Dies wird auch dadurch belegt, dass SH-
Chimäre, die das ReHoxHY-Modul tragen, volle Aktivität auch ohne Zugabe der Ionen zeigten
(Abbildung 19). Der Einfluss der Ionen kann sich dabei auf verschiedenen Ebenen auswirken.
Es ist denkbar, dass die Bindung der Ionen an Oberflächenstrukturen von HoxH oder HoxY
Konformationsänderungen bewirken, die den Kontakt zu HoxFU stabilisieren. Auch die
Wechselwirkungen zwischen HoxHY und HoxFU selbst könnten so durch ein Netzwerk aus
ionischen und Wasserstoffbrückenbindungen verstärkt werden, wenn die Ionen als
Ladungsträger das geeignete Umfeld schaffen.
Für diese Hypothese, dass die Ionen stabilisierend auf den Zusammenhalt der zwei Module der
SHs aus R. opacus und H. thermoluteolus wirken, sprechen mehrere Beobachtungen. Zum
einen ist das Ausmaß der Kationenabhängigkeit der SH-Chimären aus ReFU-RoHY und
ReHoxFUHtHY geringer als die der nativen SHs aus R.o. bzw. H.t., die in Abwesenheit der
Salze NiCl2 und MgCl2 keine H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität zeigen. Hingegen ist
bei den chimären SHs auch ohne die Zugabe der Salze eine Restaktivität vorhanden, da das
FU-Dimer aus der kationenunabhängigen ReSH stammt. Außerdem konnte insbesondere bei
der SH-Chimäre HtHY-ReFU, die unter anaeroben, reduzierenden Bedingungen gereinigt
wurde, eine drastische Verkürzung der Anlaufphase festgestellt werden, wenn der
Reaktionsassay mit NiCl2 und MgCl2 supplementiert wurde (Abbildung 21). Die Interaktionen
zwischen dem HoxFU- und HoxHY-Modul in der SH aus H.t. könnte durch den C-Terminus
von HoxF stabilisiert werden, der armförmig bis zur HoxY-Untereinheit ragt (Abbildung 31),
wie es deutlich in der Kristallstruktur der reduzierten HtSH zu erkennen ist (Shomura et al.,
2017). Das Fehlen dieser Interaktion im oxidierten Zustand (Shomura et al., 2017) könnte dann
die leichte Dissoziation der Module voneinander sowie die daraus resultierende
vergleichsweise niedrige H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität erklären. Da diese C-
terminale Extension in HoxF von R. eutopha fehlt, ist auch die Stabilität der chimären SH
HtHY-ReFU besonders in Abwesenheit der zweiwertigen Metallionen limitiert.
114
Daneben wäre es auch denkbar, dass das Mg2+-Ion, welches vielfach auch in der Nähe des
[NiFe]-Zentrums gefunden wurde (Volbeda & Charon, et al., 1995; Higuchi et al., 1997;
Fritsch et al., 2011; Schäfer et al., 2016) , direkt an der Katalyse bzw. am Protonentransfer um
das [NiFe]-aktive Zentrum beteiligt ist. Von Higuchi et al. wurde ein dementsprechender
Mechanismus für die Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris Miyazaki vorgeschlagen
(Higuchi et al. 1997). Ein Mg2+-Ion findet sich auch in der Kristallstruktur der MBH aus R.e.
(pdb 4IUD). Die MBH und auch die Hydrogenase aus Desulfovibrio vulgaris benötigen jedoch
keine Supplementation des Reaktionsansatzes mit Mg2+, um katalytisch voll aktiv zu sein. Die
Bindung des Mg2+ könnte aber im Gegensatz zu den SHs aus R.o. und H.t. auch sehr viel stärker
sein. Ein Indiz dafür ist die Position des Ions in der Struktur. Zwar wird das Mg2+ von ähnlichen
Aminosäuresequenzen koordiniert. Es befindet sich bei der MBH sowie der Hydrogenase aus
Desulfovibrio (pdb 1YQ9) viel tiefer in der Struktur verborgen als im Falle der HtSH, wo es
eher an der Oberfläche von HoxH lokalisiert und nur etwa 8 Å von HoxY entfernt ist
(Abbildung 33c). Homologiemodelle für die ReHoxH- sowie RoHoxH-Untereinheit
suggerieren ebenfalls die Anwesenheit eines Magnesiumions. Dieses erscheint im Fall von
RoHoxH ebenso an der Oberfläche lokalisiert zu sein, verbirgt sich bei dem Modell von
ReHoxH dagegen hinter einer Schleife (Abbildung 33a, b).
115
Abbildung 33. Darstellung der HoxH-Untereinheit aus. R. eutropha (a), R. opacus (b) und H.
thermoluteolus (c, d). Für die Strukturen der ReHoxH und RoHoxH-Untereinheiten wurden
Homologiemodelle verwendet, die mithilfe der pdb-Datei 5xf9 erstellt wurden. d) Zusätzlich zu
HtHoxH wurde HoxY in gelb zur Abbildung hinzugefügt. Das Mg2+-Ion ist als Kugel dargestellt, das
Proteinrückgrat ist in der Cartoon-Darstellung dargestellt. Aminosäuren, die sich innerhalb eines
Radius von 6 Å (a, b, c) bzw. 8 Å (d) um das Magnesiumion befinden wurden rot eingefärbt.
Auch wenn sich in den Strukturen nur das zusätzliche Magnesium-Ion findet, ist der
stimulierende Effekt von Ni2+ im Reaktionsassay stärker. Bereits niedrige Konzentrationen von
0.5 mM NiCl2 führten zu 80% der maximalen spezifischen NAD+-Reduktionsaktivität der
nativen HtSH (Abbildung 21). Dagegen konnten mit einer hohen Konzentration von 5 mM
Mg2+ im Reaktionsassay nur etwa 65 % der maximalen Aktivität gemessen werden. Die
Differenz zwischen den Aktivitäten beträgt etwa 15% und deckt sich gut mit früheren
Beobachtungen, die für die Aktivitätsmessungen der RoSH gemacht wurden (Schneider,
a
b
c
d
116
Schlegel, et al., 1984). Auch bei der RoSH war die Erhöhung der Aktivität durch Zugabe
niedriger NiCl2-Konzentrationen (0.1 mM) etwa um 14% höher als in Anwesenheit von 2.5
mM MgCl2.
Die zweiwertigen Ionen Mg2+ und Ni2+ unterscheiden sich in ihren Ionenradien abhängig von
ihrer Koordination. So beträgt z.B. für eine tetraedrische Koordination der Radius des Nickels
63 pm und der des Magnesium 71 pm. Für eine oktaedrische Koordination sind es 83 pm bzw.
103 pm. Dies bedeutet, dass das Magnesium-Ion einen größeren Ionenradius aufweist, was eine
Diffusion zur Bindestelle in HoxH erschweren würde.
4.3 ReSH: Umwandlung der NAD+-Bindestelle in eine NADP+-Bindetasche
4.3.1 Das Substratspektrum der ReSH lässt sich durch den Austausch eines Glutamats
und das Einfügen eines Arginins zugunsten von NADP+ verschieben
Da sich die ReSH in vorherigen Arbeiten bereits als geeignetes Enzym für die H2-abhängige
Regeneration von NADH gezeigt hat (Holzer et al., 2015; Lonsdale et al., 2015; Ratzka et al.,
2011; Reeve et al., 2015; Reeve et al., 2011; Wang et al., 2017), sollte ihre Anwendung zur
Reduktion des phosphorylierten Version von NADH, nämlich NADPH ausgeweitet werden.
Dazu wurde ein geeignetes Plasmid zur Expression des SH-Moduls HoxFU konstruiert, in
welches Basenaustausche in kurzer Zeit mithilfe einer modifizierten Quikchange-Methode
eingebracht werden konnten. So wurden verschiedene Derivate der SH effizient mit einzelnen,
doppelten oder dreifachen Aminosäureaustauchen in HoxF erstellt, die nachfolgend auf ihre
Affinität für NADP+ getestet wurden. Hierfür wurden auch Aminosäuren ausgetauscht, die sich
zuvor als förderlich für den Affinitätswechsel zu NADP+ erwiesen haben (L. Lauterbach, 2013;
J. Preissler, 2013). Im Rahmen dieser Arbeit zeigten sich insbesondere durch Austausch des
Glutamats an der Position 341 zu Alanin und dem Einfügen eines Arginins statt eines Serin an
Position 340 von HoxF signifikante Änderungen im Substratspektrum. Die Kombination
beider Austausche bewirkte mit einem KM-Wert von 0.6 mM eine signifikante erhöhte Affinität
zu NADP+, wohingegen die Affinität zu dem natürlichen Substrat NAD+ (KM-Wert 1.32 mM
im Vergleich zu 0.55 mM für native SH) deutlich abnahm. Gleichzeitig sank auch die
Umsatzrate, sodass nur noch etwa 9 Moleküle NAD+ pro Sekunde umgesetzt wurden. Dies
entspricht etwa nur noch 1.2 % nativer SH. Eine Verringerung der Aktivität wird allerdings
häufig beobachtet, wenn durch gerichtete Mutagenese die Substratspezifität von Enzymen
verändert wird (Cahn et al., 2017; Mesecar et al., 1997; Woodyer et al., 2003).
117
Ein Wechsel der Substrataffinität von NAD+ zu NADP+ (und umgekehrt) durch gentechnische
Methoden ist vielfach molekularbiologisch und auch auf Strukturebene untersucht worden.
Besonders bei biotechnologisch interessanten Oxidoreduktasen gibt es zahlreiche Beispiele für
ein solches„Cofactor engineering“ (Cahn et al., 2017; Khoury et al., 2009; Marohnic et al.,
2003). Auch wenn sich die SH aufgrund ihrer Kombination aus NAD+-und FMN-Bindetasche
und der Anwesenheit von [FeS]-Zentren strukturell von den meisten anderen NAD(P)(H)-
abhängigen Enzymen unterscheidet, so sind ähnliche Aminosäuren an der Koordination der
Pyridinnukleotid-Kofaktoren beteiligt. Dabei zeigten sich besonders ein oder mehrere
konservierte Argininreste in den Bindetaschen NADP(H)-spezifischer Enzyme, während in
den Bindetaschen NAD(H)-spezifischer Enzyme Glutamate oder Aspartate zu finden sind
(Cahn et al., 2017). Dieses Muster konnte auch auf die SH angewendet werden und belegt trotz
ferner Verwandtschaft die Ähnlichkeit zwischen den NAD(P)(H)-Bindestellen
unterschiedlicher Enzymklassen.
Physioloische Studien an den die SH-Varianten tragenden Transkonjuganten des R. eutrohpa-
Deletionsstamms HF903 (∆hoxFU) waren mit Ausnahme des die SHD467S tragenden Stammes
nicht mehr in der Lage, in einer Atmosphäre aus 5% H2, 10% O2, 10% CO2 mit 75% N2 zu
wachsen (Abbildung 25). Offensichtlich war die Restaktivität für die NAD+-Reduktion zu
gering, um lithoautotrophes Wachstum zu ermöglichen. Die H2-abhängige Reduktion von
NADP+, die mit Ausnahme der nativen SH für alle Derivate gemessen werden konnte, scheint
den Verlust der NAD+-Reduktionsaktivität jedoch nicht kompensieren zu können. Der die
SHD467S tragende Stamm war mit einer spezifischen Aktivität von 54.8 U ∙ mg-1 für das
gereinigte Enzym gerade noch in der Lage, genügend NADH bereitstellen zu können.
Um die NADP+-Reduktionsaktivität der verschiedenen SH-Varianten weiter zu verbessern,
wäre ein Ansatz basierend auf zufälliger Mutagenese denkbar. Neueste rechenbasierte
Strategien zur Änderung des Substratspektrums und der anschließenden Optimierung der
Stabilität und Aktivität könnten ebenfalls auf die SH-Derivate angewendet werden. Ein solcher
vielversprechender Ansatz ist beispielsweise die CSR-SLD-Methode die von J. Cahn et al.
kürzlich veröffentlicht wurde (2017). Um eine Bibliothek vieler verschiedener SH-Derivate
schnell zu untersuchen, könnte ein SH-spezifischer Aktivitätsassay im
Hochdurchsatzverfahren in 96-well Platten hilfreich sein.
118
4.3.2 Die synthetische NADP+-Reduktionsaktivität der neuen SH-Varianten
ermöglicht eine H2-getriebene Kofaktorregeneration
Die synthetische NADP+-Reduktionsaktivität der SH-Variante mit dem doppelten Austausch
E341A und S342R in HoxF ist mit einem kcatNADP+ von 2.1 s-1 in Kombination mit der hohen
Spezifität zu NADP+ (KMNADP+ = 0.6 mM) vielversprechend für die Anwendung als
kofaktorregenerierendes Enzym und kann diesbezüglich durchaus mit bereits etablierten
NADPH-regenerierenden Enzymen verglichen werden (Tabelle 28).
Zwar bestechen sowohl die Glukose-Dehydrogenase (GDH) als auch die Formiat-
Dehydrogenase (FDH) mit hohen Umsatzraten von bis zu 493 Molekülen NADP+ pro Minute,
jedoch produzieren sie unerwünschte Nebenprodukte (Weckbecker et al., 2010). Im Fall der
GDH entsteht Glukonolacton, welches zur Verunreinigung des Produktes führt und daher meist
mithilfe aufwändiger Methoden entfernt werden muss (Weckbecker et al., 2010). Bei der
Kofaktorregenerierung mittels FDH entsteht CO2, welches einerseits die Reduktion des
Kofaktors thermodynamisch begünstigt, andererseits zur Ansäuerung des Reaktionsmediums
führt und aus ökologischen Gründen ungünstig ist (Tishkov & Popov, 2004; Wang et al., 2017).
Die Kofaktorregenerierung durch die Verwendung der Phosphit-Dehydrogenase (PDH) wird
durch ihre niedrige Aktivität und das vergleichsweise teure Kosubstrat Phosphit limitiert
(Relyea & van der Donk, 2005). Die Alkohol-Dehydrogenase (ADH) besitzt zwar eine hohe
Umsatzrate von 264 min-1, aber auch hier muss das entstehende Nebenprodukt, d.h. das
entsprechende Keton oder Aldehyd, abgetrennt werden. Zudem könnte der Einsatz von
Alkoholen das produktbildende Enzym inhibieren (Hollmann et al., 2011).
Im Vergleich dazu hat die NAD(P)+-reduzierende Hydrogenase den Vorteil, dass sie mit H2
ein kostengünstiges, anorganisches Kosubstrat mit 100%iger Atomeffizienz verwendet und es
dementsprechend keine Nebenprodukte gibt (Lauterbach, Lenz & Vincent, 2013).
119
Tabelle 28. Übersicht über kinetische Parameter einiger Dehydrogenasen, die für die Kofaktorregeneration
verwendet werden
Enzym
KMNADP+
[mM]
kcat
[min-1]
Kosubstrat/
Nebenprodukt
Referenz
Lösliche Hydrogenase
SHE341A S342R
(Ralstonia eutropha)
0.6
126
H2
H2O
Diese Arbeit
Formiat-Dehydrogenase
FDHC145S D221Q C255V
(Mycobacterium vaccae
N10)
0.92
493.2
Formiat
CO2
(Hoelsch et al., 2013b)
Phosphit-Dehydrogenase
(Pseudomonas stutzeri)
H3PO3
H3PO4
Nativ
2.51
85
(Woodyer et al., 2003)
Variante E175A A176R
0.0035
114
Glukose-Dehydrogenase
(Bacillus subtilis)
0.26
n.p.†
Glukose
Glukonolacton
(Fujita et al., 1977)
Glucose-Dehydrogenase
(Bacillus
amyloliquefaciens SB5)
0.05
420
Glukose
Glukonolacton
(Pongtharangkul et al., 2015)
Alkohol-Dehydrogenase
(Lactobacillus brevis)
0.015
264
Alkohol
Aldehyd
(Schlieben et al., 2005)
† n.p. nicht publiziert
Dass die Variante SHE341A S342R für die Anwendung als kofaktorregenerierendes Enzym
geeignet ist, konnte u. a. durch verschiedene Tests, die am Department of Chemistry der
University of Oxford durchgeführt wurden, belegt werden.
Dabei gelang es erstmalig, nach Adsorption verschiedener SH-Derivate auf einer
Graphitelektrode, die NADP+-Reduktion katalysiert von der SH mittels Proteinfilmvoltametrie
zu beobachten (Abbildung 26). Auch die KM-Werte der SHE341A, SHD467S, SHE341A D467S und
SHE341A S342R konnten mithilfe der Chronoamperometrie elektrochemisch bestimmt werden.
Die dabei gemessenen Werte sind deutlich niedriger als die biochemisch gemessenen
Parameter, zeigen aber einen ähnlichen Trend auf. Das SHE341A S342R-Protein hat dabei mit
einem KM von 0.353 mM die höchste Affinität zum Kofaktor NADP+, gefolgt von der Variante
SHE341A D467S (1.018 mM), SHE341A (1.322 mM), SHD467S (3.695 mM) und schließlich der
nativen HoxFWT, die keine nachweisbare Aktivität mit NADP+ zeigt (Tabelle 29).
Die biochemisch bestimmten kcatNADP+-Werte der Varianten SHE341A D467S und SHE341A sind
höher als die des SHE341A S342R-Proteins (Tabelle 29). Dies könnte durch die noch
vergleichsweise hohe Affinität der SH-Varianetn zu dem natürlichen Substrat NAD+ begründet
sein. Bei den biochemischen Messungen wurde kommerziell erhältliches NADP+ verwendet,
welches die Verunreinigung NAD+ in Spuren enthalten kann und demzufolge die Messungen
insbesondere bei den Varianten mit breitem Substratspektrum und vergleichsweise hoher
120
Affinität für NAD+ verfälschen kann. Leider konnten die individuelle Umsatzraten (kcat) nicht
mittels Elektrochemie gemessen werden, da keine genaue Bestimmung der adsorbierten und
aktiven SH-Moleküle möglich ist.
Tabelle 29. Übersicht über die kinetischen Parameter der SH-Varianten für die Substrate NAD+ und
NADP+, die sowohl biochemisch (s. 3.5.4) als auch wie elektrochemisch gemessen wurden.
KM (mM)
KM (mM)
kcat (s-1)
kcat/ KM (mM-1 s-1)
SH Variante
H2 → NAD+
Biochemischa
Elektrochemischb
Biochem./
elektrochem.
Biochem./ Biochem.
SH
0.55
± 0.08
0.12
± 0.13
689,5
1254
5843
SHE341A
0.61
± 0.11
0.77
± 0.20
19,9
32.62
25.7
SHD467S
0.66
± 0.18
0.11
± 0.12
54,8
83.03
517
SHE341A D467S
0.65
± 0.18
1.77
± 0.32
24,3
37.4
13.7
SHE341A S342R
1.32
± 0.29
0.65
± 0.23
8.8
6.7
13.6
H2 → NADP+
SH
50
8.00
0.1
0.00
0.01
SHE341A
4.83
± 1.7
1.32
± 0.36
3.3
0.68
2.50
SHD467S
3.4
± 1.0
3.70
± 0.33
0.2
0.06
0.05
SHE341A D467S
2.3
± 1.1
1.02
± 0.2
3.0
1.33
2.95
SHE341A S342R
0.60
± 0.33
0.353
± 0.104
2.1
3.50
5.95
a 50 mM Tris-HCl, pH 8.0, 30 °C
b 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 30 °C
Diskrepanzen zwischen den kinetischen Parametern, die aus verschiedenen Messverfahren
gewonnen wurden, können auch auf Reinheit der verwendeten Kofaktoren zurückzuführen
sein. Die Kofaktoren, die in den elektrochemischen Versuchen verwendet wurden stammten
von einem anderen Hersteller und wurden vor den Messungen chromatografisch gereinigt
(Holly Reeve, persönliche Mitteilung). Dementsprechend kann die tatsächliche Kofaktor-
Konzentration im Reaktionsassay von der rechnerischen abweichen. Der Einfluss der
Aminosäureaustausche auf die Proteinstabilität kann bei den verschiedenen Varianten
121
schwanken. Demzufolge unterschiedlich empfindlich könnten sie sich gegenüber der
Adsorbtion und Rotation der Graphitelektrode während der Proteinfilmvoltametrie zeigen. Die
Aminosäureaustausche können auch Einfluss auf das pH-Optimum für die H2-abhängige
NAD(P)+-Reduktion haben. So entspricht beispielsweise ein pH-Wert von 7 eher dem
Optimum für die NADP+-Reduktion durch die SHE341A S342R, wohingegen die NAD+-Reduktion
bevorzugt bei pH 8 katalysiert wird. Die Bestimmung der KMNAD(P)+-Werte der für die SH-
Derivate in Puffern mit geeigneteren pH-Werten wurde von Anna Koczula im Rahmen eines
Projektpraktikums getestet. Tatsächlich zeigte sich für die Variante SHE341A S342R ein in den
sauren Bereich verschobenes pH-Optimum (Anna Koczula, persönliche Mitteilung).
In einem ersten Modellsystem, bestehend aus einer kommerziell erhältlichen En-Reduktase
und der SHE341A S342R konnte nach H2-Begasung die vollständige Umsetzung des Substrates
Cyclohexenon zu Cyclohexenol in nur wenigen Minuten erreicht werden (Abbildung 27). Eine
Kofaktorkonzentration von 5 mM NADP+ führte zu einer 99%igen Substratkonversion. Selbst
eine Konzentration von nur 1.5 mM NADP+ führte im gleichen Zeitraum zu einem 95%igen
Umsatzes von Cyclohexenon zu Cyclohexenol (Abbildung 27).
Im Vergleich lieferte die SH E341A S342R ähnliche Resultate für die Oktan-Oxidation durch die
NADPH-abhängige P450-Monooxygenase wie die GDH als kofaktorregenerierendes Enzym.
Obwohl nur etwa 1 U ∙ mL-1 der SHE341A S342R und 1 mM NADP+ verwendet wurden, waren
keine deutlichen Unterschiede zur Verwendung der kommerziell erhältlichen GDH (10 U
∙ mL-1) bei der Reduktion von Oktan zu beobachten (3.5.7).
Diese Versuche belegen die Funktionalität des SHE341A S342R-Proteins als H2-abhängiges,
NADPH-regenerierendes Enzym, das selbst in Anwesenheit von O2 und organischen
Lösemitteln ausreichend aktiv bleibt, um z. B. eine Monooxygenase mit den nötigen
Reduktionsäquivalenten zu versorgen.
4.3.3 Ein veränderter Bias zugunsten der NAD(P)H-Oxidation könnte hilfreich für die
SH-abhängige H2-Produktion sein
Da sich insbesondere die Anwesenheit eines Arginins in der NAD+-Bindetasche der SH
als sehr vorteilhaft für die NADP+-Affinität erwiesen hat, sollte getestet werden, ob die
synthetische NADP+-Reduktionsaktivität durch das Einfügen eines weiteren Arginins noch
122
verbessert werden kann. Daher wurde die Kombination der Aminosäureaustausche E341A,
D467S und S342R in HoxF hinsichtlich der Auswirkungen auf das Substratspektrum der SH
getestet. Durch den Dreifachaustausch konnten die H2-abhängigen NADP+-
Reduktionsaktivitäten der Varianten SHE341A D467S und SHE341A S342R jedoch nicht übertroffen
werden (Tabelle 23). Verglichen mit den SH-Varianten mit zwei Aminosäureaustauschen
wurden etwas niedrigere KMNADP+-Werte für die SH-Derivate mit dreifachen Substitutionen
gemessen. Hinsichtlich der NAD(P)H-Oxidationsaktivität zeigten sich jedoch Unterschiede.
Besonders die SH-Variante mit dem A341/R342/R358-Motiv in HoxF katalysierte diese
Reaktionen mit höheren spezifischen Aktivitäten als die NADP+-Reduktionen. Der KMNADPH–
Wert der Variante SHE341A S342R D467S liegt mit 0.062 mM tatsächlich etwa um den Faktor 100
niedriger als der entsprechende Wert für die native SH (KMNADPH = 7.06 mM, Tabelle 24). Die
Bestimmung der kinetischen Parameter aller SH-Varianten für die Substrate NAD(P)+ sowie
NAD(P)H ist wichtig für das Verständnis der katalytischen Eigenschaften hervorgerufen durch
die Aminosäureaustausche. Ob der niedrige KMNADPH-Wert und der Bias zugunsten der
NAD(P)H-Oxidation, wie sie bei der SHE341A S342R D467S beobachtet wurden, nützlich ist für die
In-vivo/In-vitro-Verwendung der SH zur H2-Produktion ist, stellt dabei eine interesannte
Fragestellung für zukünftige Arbeiten dar.
123
5 Anhang
HOXF_CUPNH MDSR-ITTILERYRSDRTRLIDILWDVQHEYGHIPD-AVLPQLGAGLKL-
HOXF_HYDTE MTTE-------RQRTA-PGLLAALHQARSRFGRPLDAQALAELSTAFSL-
HOXF_RHOOP MSGD-IKAILERNGSERTRLIDILWDVQHLYGHIPD-EVLPQLADELNL-
HOXF_SYNY3 MDIKELKEIATKSREKQT--------------------------------
HYD1B_PYRFU MRYVKL--PKENTYEFL----ERLKDW-------------------GKLY
* .
HOXF_CUPNH SPLDIRETASFYHFFLDKPSGKYRIYLCNSVIAKINGYQAVREAL-----
HOXF_HYDTE PPGEIAATASFYHFFQT-PPARYQIHFVDHVVDHHAGVAALCNHL-----
HOXF_RHOOP SPLDILETASFYHFFHRKPSGKYRIYLSDTVIAKMNGYQAVHDSL-----
HOXF_SYNY3 ---------------------KIRIRCCSAAGCLSSEGETVKKNL-----
HYD1B_PYRFU APVKI--SDKFYDFREIDDVRKIEFHYNRTIMPPKKFFFKPREKLFEFDI
: .: . *
HOXF_CUPNH ----ERETGIRFGETDPNGMFGLFDTPCIGLSDQEPAMLIDK--VVFTRL
HOXF_HYDTE ----CAAFAIQPGQRTADARLFVGWTACAGLSDQAPAALING--RPMPRL
HOXF_RHOOP ----ERETGARFGGTDKTGMFGLFETPCIGLSDQEPAMLIDN--VVFTRL
HOXF_SYNY3 ----TTAIAAA-GLEEK---VEVCGVGCMKFCGRGPLVAVDDRNQLYEFV
HYD1B_PYRFU SKPEY---REVIEEVEPFIIFGVHACDI----------------------
. :
HOXF_CUPNH RPGKITDIIAQLKQGRSPAEIANPAGLPSQDIAYVDAMVES--NVRTKGP
HOXF_HYDTE DAARIDALIEKIQ-AQ----------IPMDQWPTEWFAVTN--AIHRHGP
HOXF_RHOOP RPGTIVDIITQLRQGRSPEDIANPAGLPSDDVAYVDGVVES--NVRTKGP
HOXF_SYNY3 TPDQVGDIVKKLQKPDAVAETGLISGDPH----HPFYALQR--NIALENS
HYD1B_PYRFU ------------------------YGLKILDTVYLDEFPDKYYKVRREKG
: .
HOXF_CUPNH --V-----F-FRGRTDLRSLLDQCLLLKPEQVIETIVDSRLRGRGGAGFS
HOXF_HYDTE --L-----LTWLDTTPAEAVFEHPTAHDPDAILQAVTDAGLRGRGGAGFP
HOXF_RHOOP --V-----F-FRGLTDYGRLLELCLALRPEQIIDRIIESKLRGRGGAGFS
HOXF_SYNY3 GRIDPESIDEYIALGGYEQLHKVVYEMTPEEVIVEMNKSGLRGRGGGGYP
HYD1B_PYRFU --I-----II----------------------------------------
:
HOXF_CUPNH TGLKWRLCRDAESEQKYVICNADEGEPGTFKDRVLLTRAPKKVFVGMVIA
HOXF_HYDTE TATKWRFCRENADPERFLICNADEGEPGTFKDRVLLTRYPEHLFAGMILA
HOXF_RHOOP TGLKWQLCRTAVSDDKYIICNADEGEPGTFKDRVLLTRSPKKVFMGMIIA
HOXF_SYNY3 TGLKWATVAKMPGQQKYVICNADEGDPGAFMDRSVLESDPHRILEGMAIA
HYD1B_PYRFU -G-------ISCMPDEYCFCNLRETDFAD---------------------
. :.: :** * : .
HOXF_CUPNH AYAIGCRKGIVYLRGEYFYLKDYLERQLQELREDGLLGRAIGGRAGFDFD
HOXF_HYDTE ARAIGADKAILYLRYEYQYLLPQLEAA----RERIASAQATV-PQAERVT
HOXF_RHOOP ARAIGSRNGILYLRWEYIYLKDYLERQLQELRDEGLLGARIGGQSGFDFD
HOXF_SYNY3 AYAVGANHGYIYVRAEYPLAIQRLQKAIQQAKRYGLMGTQIF-DSPIDFK
HYD1B_PYRFU ---------------------DGFDLFFHEL-------------------
::
HOXF_CUPNH IRIQMGAGAYICGDESALIESCEGKRGTPRVKPPFPVQQGYLGKPTSVNN
HOXF_HYDTE LEIALGAGAYVCGEESALIESLEGKPGRPRVRPPYPVTQGYLGHPTVVNN
HOXF_RHOOP IRIQMGAGAYICGDESALIESCEGKRGTPRVKPPFPVQEGYLGKPTCVNN
HOXF_SYNY3 IDIRVGAGAFVCGEETALIASVEGKRGTPRPRPPYPAQSGLWQSPTLINN
HYD1B_PYRFU --------------------------------------------------
HOXF_CUPNH VETFAAVSRIMEEGADWFRAMGTPDSAGTRLLSVAGDCSKPGIYEVEWGV
HOXF_HYDTE VETLVAVAAIVGNGAAWWRALGTPDSSGPKLFCVSGDVAQPGLYEFPYGV
HOXF_RHOOP VETFAAAARIMEEGPNWFRALGTPESTGTRLLSVAGDCSRPGIYEVEWGV
HOXF_SYNY3 VETYANVVPIIREGGDWYGSIGTEKSKGTKVFALTGKVENAGLIEVPMGT
HYD1B_PYRFU -------------PDGWLVRVGTP--TGHRLVD--------------KNI
* :** * ::. .
HOXF_CUPNH TLNEVLAMVGAR-----DARAVQISGPSGECVSVA-KDGERKLAY-----
HOXF_HYDTE ALGDVVTAARPL----GTRYAVQVSGPSGTLLPATPEQLARPLAF-----
HOXF_RHOOP TLNEVLTTVGAR-----DARAVQISGPSGQCVSVA-EDGERRMAY-----
HOXF_SYNY3 TVRQVVEEMGGGVPNGGQVKAVQTGGPSGGCIPA-D-KLDTPIEYDTLLA
HYD1B_PYRFU KLFEEVT------DKD---------------ICAFR-DFEKR----RQQA
: : : : . .
HOXF_CUPNH -EDLSCNGAFTIFNCKRDLLEIVRDHMQFFVE----ESCGIC----VPCR
HOXF_HYDTE -EALPCNGTVMVFDVRRDPVAIVHHFARFFAH----ESCGFC----TPCR
HOXF_RHOOP -EDISCNGAFTIFNTERDLLEIVKDFMQFFVD----ESCGIC----VPCR
124
HOXF_SYNY3 LGTMMGSGGMIVMDESTNMVDVAQFYMDFCKS----ESCGKC----IPCR
HYD1B_PYRFU FKYHE------DWGNLRYLLELEMEHPMWDEEADKCLACGICNTTCPTCR
. : : . : :** * .**
HOXF_CUPNH AGNVDLHRKVEWVIAG-----KACQKDLDDMVSWGALVRRTSRCGLGATS
HOXF_HYDTE VGTQLIAKTFEKIAAG-----YATRFDLERLAPALEAMRLASNCGFGLSA
HOXF_RHOOP VGNIDLHKKVELVIAG-----KACQKDLDDVVSWGALVKKTSRCGLGATS
HOXF_SYNY3 AGTVQLYDLLTRFLEG-----EATQEDLIKLENLCHMVKETSLCGLGMSA
HYD1B_PYRFU CYEVQDIVNLDGVTGYRERRWDSCQFRSH---------------GLVAGG
. . : : *: .
HOXF_CUPNH PKPILTTLEKFPEIYQNKLVRHEG-PLLPSF-------------------
HOXF_HYDTE GNPVRDLIAHFRQQLEAQLQPH---DFIPAF-------------------
HOXF_RHOOP PNPILTTLDKFPEIYTKRLRKQKKEALLLSF-------------------
HOXF_SYNY3 PNPVISTLRYFRHEYEELL-------------------------------
HYD1B_PYRFU HNFRPTKKDRFRNRYLCKNAYNEK--LGLSYCVGCGRCTAFCPANISFVG
: * .
HOXF_CUPNH DLDTALGGYEKALKDL---------------------EEVTR
HOXF_HYDTE SLDAELAATRR-LTGRDDPHAHLA---------QFEQPEVTR
HOXF_RHOOP DLDAALGGYEKALEGLA--------------------KEEIK
HOXF_SYNY3 ----------------------------------------KV
HYD1B_PYRFU NLRRILGLEENKCPPTVS-----EEIPKRGFAYSSNIRGDGV
Abbildung 34. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxF aus
verschiedenen Organismen. CUPNH Ralstonia eutropha H16, HYDTE Hydrogenophilus
thermoluteolus TH-1T, RHOOP Rhodococcus opaus MR11, SYNY3 Synechocystis sp. PCC 6803,
HYD1B_PYRFU Pyrococcus furiosus
HOXH_CUPNH M------------------SRKLVIDPVTRIEGHGKVVVHLDDDNKVVDA
HOXH_HYDTE MTQHAPQAVSPRPSLPANATRRVAIDPLSRVEGHGKVTIWLDDDGQVVEA
HOXH_RHOOP M------------------STKLVIDPVTRIEGHGKVTVHLDDNNNVVDA
HOXH_SYNY3 M------------------SKTIVIDPVTRIEGHAKISIFLNDQGNVDDV
HYD1A_PYRFU MKN---------------LYLPITIDHIARVEGKGGVEIIIGDDG-VKEV
* :.** ::*:**:. : : :.*:. * :.
HOXH_CUPNH KLHVVEF-RGFEKFVQGHPFWEAPMFLQRICGICFVSHHLCGAKALDDMV
HOXH_HYDTE RLHIVEF-RGFEAFIVGRPYWEAPVVVQRLCGICPVSHHLAAAKALDRLV
HOXH_RHOOP HLHVVEF-RGFEKLVQGHPFWEAPMLMQRICGICFVSHHLCGAKALDDMV
HOXH_SYNY3 RFHVVEY-RGFEKFCEGRPMWEMAGITARICGICPVSHLLCAAKTGDKLL
HYD1A_PYRFU KLNIIEGPRFFEAITIGKKLEEALAIYPRICSFCSAAHKLTALEAAEKAV
:::::* * ** : *: * . *:*.:* .:* * . :: : :
HOXH_CUPNH GVGLKSGIHVTPTAEKMRRLGHYAQMLQSHTTAYFYLIVPEMLFGMDAPP
HOXH_HYDTE GVT-----QLPPTAEKMRRLMHYGQVLQSHALHFFYLAAPDLLLGFSADP
HOXH_RHOOP GVGLKSGIDVTPTAEKIRRLGHYAQMLQSHATAYFYLIVPEMLFGMDAAP
HOXH_SYNY3 AV------QIPPAGEKLRRLMNLGQITQSHALSFFHLSSPDFLLGWDSDP
HYD1A_PYRFU GFVP------REEIQALREVLYIGDMIESHALHLYLLVLPDY-RGYSSPL
.. : :*.: .:: :**: : * *: * .:
HOXH_CUPNH AQRNVLGLIEANPDLVKRVVMLRKWGQEVIKAVFGKKMHGINSVPGGVNN
HOXH_HYDTE AQRNVFGLAAQKRELARQGILVRQFGQECIEATAGKRIHGTSAVPGGIHK
HOXH_RHOOP EQRNVLGLIEANPELVKRVVMLRKWGQEVIKAVFGRRMHGISSVPGGVNK
HOXH_SYNY3 ATRNVFGLIAADPDLARAGIRLRQFGQTVIELLGAKKIHSAWSVPGGVRS
HYD1A_PYRFU KMVN------EYKREIEIALKLKNLGTWMMDILGSRAIHQENAVLGGFGK
* . : ::: * :. .: :* :* **. .
HOXH_CUPNH NLSIAERDRFLNGEEGLLSVDQVIDYAQDGLRLFYDFHQKHRAQVDSFAD
HOXH_HYDTE NLSRRERMALLSR---APE---IRSWCEAAVALIERLFTEHAPFFAQFGS
HOXH_RHOOP NLSVAECQRFLKGEEGLPSVDEVIEYAQEGVQLFYDFHEQNRVQVDSFAN
HOXH_SYNY3 PLSEEGRQWIVDR---LPE---AKETVYLALNLFKNMLDRFQTEVAEFGK
HYD1A_PYRFU LPEKSVLEKM---K---AELREALPLAEYTFELFAKL--------EQYSE
. : . . *: : .:..
HOXH_CUPNH V--PALSMCLVGDDDNVDYYHGRLRIIDDDKHIV-REFDYHDYLDHFSEA
HOXH_HYDTE F--QTKTFSLVAADGSLDLYDGTFRVKEANGAILIDHYDPNDYDQLLVEA
HOXH_RHOOP V--SALSMSLVDADGNVDYYHGKLRIIDDDKNVV-QEFDYHDYLDHFSEA
HOXH_SYNY3 F--PSLFMGLVGKNNEWEHYGGSLRFTDSEGNIVADNLSEDNYADFIGES
HYD1A_PYRFU VEGPITHLAVKPRGDAYGIYGDYIKASDG------EEFPSEKYRDYIKEF
. : : .. * . :: : . ..* : : *
125
HOXH_CUPNH VEEWSYMKFPYLKELGREQGSVRVGPLGRMNVTKSLPTPLAQEALERFHA
HOXH_HYDTE VRPWSYMKFPYLKAYGEPDGFYRVGPSARLINCDRLTTARAEAARQRFLT
HOXH_RHOOP VEEWSYMKFPFLKALGRERGSVRVGPLGRLNVTNSLSTPLAQEALERFHA
HOXH_SYNY3 VEKWSYLKFPYYKSLGYPDGIYRVGPLARLNVCHHIGTPEADQELEEYRQ
HYD1A_PYRFU VVEHSFAKHSHYKG--R---PFMVGAISRVINNADLLYGKAKELYEANKD
* *: *... * **. .*: : *. :
HOXH_CUPNH YTKGRTNNMTLHTNWARAIEILHAAEVVKELLHDPDLQKDQLVLTPPPNA
HOXH_HYDTE FDQGTVAHSTLGYHWARLIEMLHCAELIEALLTDADLEGGELRARG---Q
HOXH_RHOOP YTNGKANNMTLHTNWARAIEILHAAELIKELLNDPDLQKEQLLLTPADNA
HOXH_SYNY3 RAGGV-ATSSFFYHYARLVEILACLEAIELLMADPDILSKNCRAKAE--I
HYD1A_PYRFU LLKG---TNPFANNLAQALEIVYFIERAIDLLD-EALAKWPIKPRDEVEI
* .: : *: :*:: * *: :
HOXH_CUPNH WTGEGVGVVEAPRGTLLHHYRADERGNITFANLVVATTQNNQVMNRTVRS
HOXH_HYDTE RQHRGVGVIEAPRGTLIHHYEVGDDDLITYCNLIVSTTHNNAVMNQAVTT
HOXH_RHOOP WTGEGVGVVEAPRGTLLHHYRADQEGDITFANLVVATTQNNQVMNRTVRS
HOXH_SYNY3 NCTEAVGVSEAPRGTLFHHYKIDEDGLIKKVNLIIATGNNNLAMNKTVAQ
HYD1A_PYRFU KDGFGVSTTEAPRGILVYALKV-ENGRVSYADIITPTAFNLAMMEEHVRM
.*.. ***** *.: . : . :. ::: .* * *:. *
HOXH_CUPNH VAEDYLGGHGEITEGMMNAIEVGIRAYDPCLSCATHALGQMPLVVSVFDA
HOXH_HYDTE AAKAFLSGV-TLTEALLNHIEVAVRAFDPCLSCATHALGQMPLVVSLHHK
HOXH_RHOOP VAEDYLGGQGEVTEGMMNAIEVGIRAYDPCLSCATHALGQMPLIVSVHDT
HOXH_SYNY3 IAKHYIRNH-DVQEGFLNRVEAGIRCYDPCLSCSTHAAGQMPLMIDLVNP
HYD1A_PYRFU MAEKHYNDD---PERLKILAEMVVRAYDPCISCSVHVV------------
*: . . * : * :*.:***:**:.*.
HOXH_CUPNH A---------------------GRLIDE-RAR
HOXH_HYDTE DVPTPIDMLVRHSDGTIERPTAAPALGT-KGT
HOXH_RHOOP E---------------------GHVINE-RVR
HOXH_SYNY3 Q---------------------GELIKSIQRD
HYD1A_PYRFU ------------------------------RL
Abbildung 35. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxH aus
verschiedenen Organismen. CUPNH Ralstonia eutropha H16, HYDTE Hydrogenophilus
thermoluteolus TH-1T, RHOOP Rhodococcus opaus MR11, SYNY3 Synechocystis sp. PCC 6803,
HYD1B_PYRFU Pyrococcus furiosus
HOXU_CUPNH MSI-----------------------------------------------
HOXU_HYDTE MRPTTPPFA-----------------------------------------
HOXU_PYRFU MGKVRIGFYALTSCYGCQLQLAMMDELLQLIPNAEIVCWFMIDRDSIEDE
HOXU_RHOOP MSI-----------------------------------------------
HOXU_SYNY3 MSV-----------------------------------------------
*
HOXU_CUPNH --QITIDGKTLTTEEGRTLVDVAAENGVYIPTLCYLKDKPCLGTCRVCSV
HOXU_HYDTE SETFTLDEESIPFVPGQTVLEAALAAGRYIPHLCWHPEMGNHGSCRLCVV
HOXU_PYRFU KVDIAFIEGSVSTEEEVELVKKIRENAKIVV-------------------
HOXU_RHOOP --EIEIDGVTVTTEESRTLVDVAAEAGVYIPTLCYLKGKPSLGTCRVCSV
HOXU_SYNY3 -VTLTIDDKAIAIEEGASILQAAKEAGVPIPTLCHLEGISEAAACRLCMV
: : ::. ::. . :
HOXU_CUPNH KVNGN--VAAACTVRVSKGLNVEVNDPEL-------------VDMRKALV
HOXU_HYDTE EANGR--IQASCALPAQPGLQVVSKSETL-------------TRVRRTLL
HOXU_PYRFU ---------AVGACAVQGGVQSWSEKPLEELWKKVYGDAKVKFQPKKAEP
HOXU_RHOOP KLNGT--VVAACTIRVANGMKIEVDEPEV-------------VDMRKANV
HOXU_SYNY3 EVEGTNKLMPACVTAVSEEMVVHTNTEKL-------------QNYRRMTV
. . . : . ::
HOXU_CUPNH EFLFAEGNHNCPSCEKSGRCQLQAVGY-EVDMMVSRFP-YRFPVRVVDHA
HOXU_HYDTE EMLFAEGNHFCPGCEKSGDCLLQALAY-AHGMTASHFD-PFYPQRRIDAS
HOXU_PYRFU VSKYIKVDYNIYGCPPEKKDFLYALGTFLIGSWPEDIDYPVCLECRLN-G
HOXU_RHOOP ELLFAEGNHNCPSCEKSGRCKLQAVGY-EVDMMVSRFQ-YRFPERVQDHA
HOXU_SYNY3 ELLFSEGNHVCAICVANGNCELQDMAI-TVGMDHSRFK-YQFPKREVDLS
: : :: * . * :. . . : : .
HOXU_CUPNH SEKIWLERDRCIFCQRCVEFIRD-KASGRKIFSISHRGPESRIE--IDAE
HOXU_HYDTE HPDLWLDPNRCILCGLCVRA--S-LAEGKEALVIGGRGIASRLLATSASG
HOXU_PYRFU HPCILLEKGEPCL-GPVTRAGCNARCPGFGVACIGCRGA-----IGYDVA
HOXU_RHOOP SETIWLERDRCIFCQRCVEFVRD-KATGKKIFSISNRGGDSRIE--IDAD
126
HOXU_SYNY3 HPMFGIDHNRCILCTRCVRV-CD-EIEGAHVWDVAYRGAECKIVSGLNQP
: :: .. : .. . * :. **
HOXU_CUPNH LANAMPPEQVKEAVAICPVGTILEKRVGYDDPIGRRK-Y------EIQSV
HOXU_HYDTE RLGDTALAATDRAARICPVGALNFKAAGFTTPIGKRR-F------DHRPP
HOXU_PYRFU WFD--------------SLAKVFKEKGMTKEEIIERMKMFNGHDERVEKM
HOXU_RHOOP LANAMPPEQVREAVAICPVGTIIEKRVGYDDPIGRRK-Y------EIETV
HOXU_SYNY3 WGTVDACTSCGKCVDACPTGSIFHKGETTAEKIGDRR-K------VEFLA
. . : : * *
HOXU_CUPNH RARALEGEDK
HOXU_HYDTE EAMSDKERYT
HOXU_PYRFU VEKIFSGGEQ
HOXU_RHOOP RARALGGEEE
HOXU_SYNY3 TARKEKEWVR
Abbildung 36. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxU aus
verschiedenen Organismen. CUPNH Ralstonia eutropha H16, HYDTE Hydrogenophilus
thermoluteolus TH-1T, RHOOP Rhodococcus opaus MR11, SYNY3 Synechocystis sp. PCC 6803,
HYD1B_PYRFU Pyrococcus furiosus
HOXY_CUPNH MRAPHKDEIASHELPATPMDPALAANREGKIKVATIGLCGCWGCTLSFLDMDERLLPLLE
HOXY_HYDTE MTSAA-----------------PSAMPPRKIRIATASLAGCFGCHMSFADIDTRLLALAE
HOXY_RHOOP MKHSEKNEIASHELPTTPLDPVLAAGRESKIKVAMIGLCGCWGCTLSFLDMDERLLVLLD
HOXY_SYNY3 ---------------------------MAKIRFATVWLAGCSGCHMSFLDMDEWLIDLAQ
HYD1D_PYRFU ---------------------------MGKVRIGFYALTSCYGCQLQLAMMDELLQ-LIP
HOXY_CUPNH KVTLLRSSL-TDIKRI-PERCAIGFVEGGVSSEENIETLEHFRENCDILISVGACAVWGG
HOXY_HYDTE WVTFDRSPL-TDWKTV-GE-CDIALIEGGVCNAENVEVLRAYRRAARILVAVGACAINGG
HOXY_RHOOP KVTLHRSSL-SDIKRI-TERCAIGFIEGGVANEENIETLEHYRENCDVLISVGACAVWGG
HOXY_SYNY3 KVDVVFSPVGSDLKEY-PDNVDVCLVEGAIANEENLELALELRQKTKVVISFGDCAVTAN
HYD1D_PYRFU NAEIVCWFM-IDRDSIEDEKVDIAFIEGSVSTEEEVELVKKIRENAKIVVAVGACAVQGG
HOXY_CUPNH VPAMRNVFELKD-CLAEAYVNSATAVPGAKAVVPFHPD-IPRITTKVYPCHEVVKMDYFI
HOXY_HYDTE LPAQRNQHRVER-LLTQVFEADRHLAPGS--RVPNDPE-LPLLLEHVHPIHEIVRVDYYL
HOXY_RHOOP VPAMRNVFELKD-CLSEVYIDSATSVPGAKPVVPFHPD-IPRITDKVYPCHEVVKMDYFI
HOXY_SYNY3 VPGMRNMLKGSDPVLRRAYIELGDGTP----QLPDEPGIVPPLLDKVIPLHEVIPVDIFM
HYD1D_PYRFU VQSWSE-KPLEE-LWKKVYGDAK---------VKFQP-------KKAEPVSKYIKVDYNI
HOXY_CUPNH PGCPPDGDAIFK -----------------------------
HOXY_HYDTE PGCPPTAEVIWT-----------------------------
HOXY_RHOOP PGCPPDADAIFK -----------------------------
HOXY_SYNY3 PGCPPDAHRIRA-----------------------------
HYD1D_PYRFU YGCPPEKKDFLY
Abbildung 37. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxY aus
verschiedenen Organismen. CUPNH Ralstonia eutropha H16, HYDTE Hydrogenophilus
thermoluteolus TH-1T, RHOOP Rhodococcus opaus MR11, SYNY3 Synechocystis sp. PCC 6803,
HYD1B_PYRFU Pyrococcus furiosus
127
Abbildung 38. EPR-Spektrum der as-isolated (a), mit TCEP/NADH-reduzierten (b) und mit
TCEP/NADH/H2-reduzierten (c) HtSH. Die Spektren wurden bei 35 K (a), 10 K (b) und 6.5 K (c)
aufgenommen.
128
6 Literatur
Abraham, M. H. (1993). Scales of solute hydrogen-bonding: their construction and application to
physicochemical and biochemical processes. Chemical Society Reviews, 22(2), 73.
Aggag, M., & Schlegel, H. G. (1974). Studies on a gram-positive hydrogen bacterium, Nocardia
opaca 1 b. Archives of Microbiology, 100(1), 25–39.
Albracht, S. P.J. & Hedderich, R. (2000). Learning from hydrogenases: location of a proton pump
and of a second FMN in bovine NADH--ubiquinone oxidoreductase (Complex I). FEBS letters,
485(1), 1–6.
Albracht, S. P. J. (1993). Intimate relationships of the large and the small subunits of all nickel
hydrogenases with two nuclear-encoded subunits of mitochondrial NADH: ubiquinone
oxidoreductase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1144(2), 221–224.
Albracht, S. P. J. (1994). Nickel hydrogenases: in search of the active site. Biochimica et Biophysica
Acta (BBA) - Bioenergetics, 1188(3), 167–204.
Albracht, S. P. J., Graf, E.-G., & Thauer, R. K. (1982). The EPR properties of nickel in
hydrogenase from Methanobacterium thermoautotrophicum. FEBS Letters, 140(2), 311–313.
Albracht, S. P. J., Van Der Linden, E., & Faber, B. W. (2003). Quantitative amino acid analysis of
bovine NADH:ubiquinone oxidoreductase (Complex I) and related enzymes. Consequences for
the number of prosthetic groups. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1557(1–
3), 41–49.
Albracht, S. P. J., Van Der Zwaan, J. W., & Fontijn, R. (1984). EPR Spectrum at 4, 9 and 35 GHz
of hydrogenase from Chromatium vinosum. Direct evidence for spin-spin interaction between
Ni(III) and the ironsulphur cluster. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics,
766(1), 245–258.
Appel, J., Phunpruch, S., Steinmüller, K., & Schulz, R. (2000). The bidirectional hydrogenase of
Synechocystis sp. PCC 6803 works as an electron valve during photosynthesis. Archives of
Microbiology, 173(5), 333–338.
Armstrong, F. A. (2002). Protein Film Voltammetry: Revealing the Mechanisms of Biological
Oxidation and Reduction. Russian Journal of Electrochemistry, 38(1), 49–62.
Armstrong, F. A., Belsey, N. A., Cracknell, J. A., Goldet, G., Parkin, A., Reisner, E., … Wait, A.
F. (2009). Dynamic electrochemical investigations of hydrogen oxidation and production by
enzymes and implications for future technology. Chemical Society Reviews, 38(1), 36–51.
Armstrong, F. A., & Fontecilla-Camps, J. C. (2008). A Natural Choice for Activating Hydrogen.
Science, 321(5888), 498–499.
Ash, P. A., Liu, J., Coutard, N., Heidary, N., Horch, M., Gudim, I., … Vincent, K. A. (2015).
Electrochemical and Infrared Spectroscopic Studies Provide Insight into Reactions of the NiFe
Regulatory Hydrogenase from Ralstonia eutropha with O 2 and CO. The Journal of Physical
Chemistry B, 119(43), 13807–13815.
Bernhard, M., Benelli, B., Hochkoeppler, A., Zannoni, D., & Friedrich, B. (1997). Functional and
structural role of the cytochrome b subunit of the membrane-bound hydrogenase complex of
Alcaligenes eutrophus H16. European journal of biochemistry, 248(1), 179–86.
129
Bernhardt, R., & Urlacher, V. B. (2014). Cytochromes P450 as promising catalysts for
biotechnological application: chances and limitations. Applied Microbiology and Biotechnology,
98(14), 6185–6203.
Berrisford, J. M., & Sazanov, L. a. (2009). Structural Basis for the Mechanism of Respiratory
Complex I. Journal of Biological Chemistry, 284(43), 29773–29783.
Birnboim, H. C., & Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant
plasmid DNA. Nucleic acids research, 7(6), 1513–23.
Bleijlevens, B., Faber, B. W., & Albracht, S. P. J.(2001). The [NiFe] hydrogenase from
Allochromatium vinosum studied in EPR-detectable states: H/D exchange experiments that yield
new information about the structure of the active site. Journal of Biological Inorganic
Chemistry, 6(8), 763–769.
Bornscheuer, U. (2001). Directed evolution of enzymes for biocatalytic applications. Biocatalysis
and Biotransformation, 19, 85–97.
Bornscheuer, U. T., Huisman, G. W., Kazlauskas, R. J., Lutz, S., Moore, J. C., & Robins, K.
(2012). Engineering the third wave of biocatalysis. Nature, 485(7397), 185–194.
Bryant, F. O., & Adams, M. W. W. (1989). Characterization of Hydrogenase from the
Hyperthermophilic Arhaebacterium, Pyrococcus furiosus. Journal of Biological Chemistry,
264(9), 5070–5079.
Buhrke, T., Lenz, O., Krauss, N., & Friedrich, B. (2005). Oxygen tolerance of the H2-sensing
[NiFe] hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 is based on limited access of oxygen to the
active site. Journal of Biological Chemistry, 280(25), 23791–23796.
Burgdorf, T., De Lacey, A. L., & Friedrich, B. (2002). Functional analysis by site-directed
mutagenesis of the NAD+-reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha. Journal of
Bacteriology, 184(22), 6280–8.
Burgdorf, T., Lenz, O., Buhrke, T., van der Linden, E., Jones, A. K., Albracht, S. P. J., &
Friedrich, B. (2005). [NiFe]-Hydrogenases of Ralstonia eutropha H16: Modular Enzymes for
Oxygen-Tolerant Biological Hydrogen Oxidation. Journal of Molecular Microbiology and
Biotechnology, 10(2–4), 181–196.
Burgdorf, T., van der Linden, E., Bernhard, M., Yin, Q. Y., Back, J. W., Hartog, A. F., …
Friedrich, B. (2005). The Soluble NAD+-Reducing [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia
eutropha H16 Consists of Six Subunits and Can Be Specifically Activated by NADPH. Journal
of Bacteriology, 187(9), 3122–3132.
Cahn, J. K. B., Werlang, C. A., Baumschlager, A., Brinkmann-Chen, S., Mayo, S. L., & Arnold,
F. H. (2017). A General Tool for Engineering the NAD/NADP Cofactor Preference of
Oxidoreductases. ACS Synthetic Biology, 6(2), 326–333.
Cammack, R., Patil, D., Aguirre, R., & Hatchikian, E. C. (1982). Redox properties of the ESR-
detectable nickel in hydrogenase from Desulfovibrio gigas. FEBS Letters, 142(2), 289–292.
Chandrayan, S. K., McTernan, P. M., Hopkins, R. C., Sun, J., Jenney, F. E., & Adams, M. W.
W. (2012). Engineering hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus to overproduce its
cytoplasmic [NiFe]-hydrogenase. The Journal of Biological Chemistry, 287(5), 3257–64.
Chenault, H. K., Simon, E. S., & Whitesides, G. M. (1988). Cofactor Regeneration for Enzyme-
130
Catalysed Synthesis. Biotechnology and Genetic Engineering Reviews, 6(1), 221–270.
Chenault, H. K., & Whitesides, G. M. (1987). Regeneration of nicotinamide cofactors for use in
organic synthesis. Applied biochemistry and biotechnology, 14(2), 147–97.
Conrad, R. (1996). Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, CH4,
OCS, N2O, and NO). Microbiological reviews, 60(4), 609–40.
Constant, P., Chowdhury, S. P., Hesse, L., Pratscher, J., & Conrad, R. (2011). Genome data
mining and soil survey for the novel group 5 [NiFe]-hydrogenase to explore the diversity and
ecological importance of presumptive high-affinity H2-oxidizing bacteria. Applied and
environmental microbiology, 77(17), 6027–35.
Constant, P., Chowdhury, S. P., Pratscher, J., & Conrad, R. (2010). Streptomycetes contributing
to atmospheric molecular hydrogen soil uptake are widespread and encode a putative high-
affinity [NiFe]-hydrogenase. Environmental Microbiology, 12(3), 821–829.
Cracknell, J. a, Wait, A. F., Lenz, O., Friedrich, B., & Armstrong, F. a. (2009). A kinetic and
thermodynamic understanding of O2 tolerance in [NiFe]-hydrogenases. Proceedings of the
National Academy of Sciences, 106(49), 20681–20686.
Cramm, R. (2009). Genomic View of Energy Metabolism in Ralstonia eutropha H16. Journal of
Molecular Microbiology and Biotechnology, 16(1–2), 38–52.
De Lacey, A. L., Fernandez, V. M., Rousset, M., & Cammack, R. (2007). Activation and
Inactivation of Hydrogenase Function and the Catalytic Cycle: Spectroelectrochemical Studies.
ChemInform, 38(51), no-no.
Dernedde, J., Eitinger, T., Patenge, N., & Friedrich, B. (1996). hyp gene products in Alcaligenes
eutrophus are part of a hydrogenase-maturation system. Eur.J.Biochem., 235(0014–2956
(Print)), 351–358.
Duché, O., Elsen, S., Cournac, L., & Colbeau, A. (2005). Enlarging the gas access channel to the
active site renders the regulatory hydrogenase HupUV of Rhodobacter capsulatus O2 sensitive
without affecting its transductory activity. FEBS Journal, 272(15), 3899–3908.
Evans, H. J., Harker, A. R., Papen, H., Russell, S. A., Hanus, F. J., & Zuber, M. (1987).
Physiology, Biochemistry, and Genetics of the Uptake Hydrogenase in Rhizobia. Annual Review
of Microbiology, 41(1), 335–361.
Evans, R. M., Parkin, A., Roessler, M. M., Murphy, B. J., Adamson, H., Lukey, M. J., …
Armstrong, F. A. (2013). Principles of sustained enzymatic hydrogen oxidation in the presence
of oxygen -the crucial influence of high potential Fe-S clusters in the electron relay of [NiFe]-
hydrogenases. Journal of the American Chemical Society, 135(7), 2694–2707.
Fernandez, V. M., Hatchikian, E. C., & Cammack, R. (1985). Properties and reactivation of two
different deactivated forms of Desulfovibrio gigas hydrogenase. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Protein Structure and Molecular Enzymology, 832(1), 69–79.
Friedrich, B., Heine, E., Finck, A., & Friedrich, C. G. (1981). Nickel requirement for active
hydrogenase formation in Alcaligenes eutrophus. Journal of Bacteriology, 145(3), 1144–9.
Friedrich, C. G., Schneider, K., & Friedrich, B. (1982). Nickel in the catalytically active
hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. Journal of Bacteriology, 152(1), 42–8.
131
Friedrich, T., Steinmüller, K., & Weiss, H. (1995). The proton-pumping respiratory complex I of
bacteria and mitochondria and its homologue in chloroplasts. FEBS Letters, 367(2), 107–111.
Fritsch, J., Lenz, O., & Friedrich, B. (2013). Structure, function and biosynthesis of O2-tolerant
hydrogenases. Nature Reviews Microbiology, 11(2), 106–114.
Fritsch, J., Scheerer, P., Frielingsdorf, S., Kroschinsky, S., Friedrich, B., Lenz, O., & Spahn, C.
M. T. (2011). The crystal structure of an oxygen-tolerant hydrogenase uncovers a novel iron-
sulphur centre. Nature, 479(7372), 249–52.
Fujita, Y., Ramaley, R., & Freese, E. (1977). Location and properties of glucose dehydrogenase in
sporulating cells and spores of Bacillus subtilis. Journal of Bacteriology, 132(1), 282–93.
Gabadinho, J., Beteva, A., Guijarro, M., Rey-Bakaikoa, V., Spruce, D., Bowler, M. W., …
McSweeney, S. M. (2010). MxCuBE : a synchrotron beamline control environment customized
for macromolecular crystallography experiments. Journal of Synchrotron Radiation, 17(5), 700–
707.
Garcin, E., Vernede, X., Hatchikian, E. C., Volbeda, A., Frey, M., & Fontecilla-Camps, J. C.
(1999). The crystal structure of a reduced [NiFeSe] hydrogenase provides an image of the
activated catalytic center. Structure, 7(5), 557–566.
Garić, D., Humbert, L., Fils-Aimé, N., Korah, J., Zarfabian, Y., Lebrun, J.-J., & Ali, S. (2013).
Development of buffers for fast semidry transfer of proteins. Analytical Biochemistry, 441(2),
182–184.
Gay, P., Le Coq, D., Steinmetz, M., Berkelman, T., & Kado, C. I. (1985). Positive selection
procedure for entrapment of insertion sequence elements in gram-negative bacteria. Journal of
Bacteriology, 164(2), 918–21.
Germer, F., Zebger, I., Saggu, M., Lendzian, F., Schulz, R., & Appel, J. (2009). Overexpression,
isolation, and spectroscopic characterization of the bidirectional [NiFe] hydrogenase from
Synechocystis sp. PCC 6803. Journal of Biological Chemistry, 284(52), 36462–36472.
Gnandt, E., Schimpf, J., Harter, C., Hoeser, J., & Friedrich, T. (2017). Reduction of the off-
pathway iron-sulphur cluster N1a of Escherichia coli respiratory complex I restrains
NAD+dissociation. Scientific Reports, 7(1), 13–20.
Goldet, G., Brandmayr, C., Stripp, S. T., Happe, T., Cavazza, C., Fontecilla-Camps, J. C., &
Armstrong, F. A. (2009). Electrochemical Kinetic Investigations of the Reactions of [FeFe]-
Hydrogenases with Carbon Monoxide and Oxygen: Comparing the Importance of Gas Tunnels
and Active-Site Electronic/Redox Effects. Journal of the American Chemical Society, 131(41),
14979–14989.
Goldet, G., Wait, A. F., Cracknell, J. A., Vincent, K. A., Ludwig, M., Lenz, O., … Armstrong, F.
A. (2008). Hydrogen Production under Aerobic Conditions by Membrane-Bound Hydrogenases
from Ralstonia Species. Journal of the American Chemical Society, 130(33), 11106–11113.
Goris, T., Wait, A. F., Saggu, M., Fritsch, J., Heidary, N., Stein, M., … Lenz, O. (2011). A unique
iron-sulfur cluster is crucial for oxygen tolerance of a [NiFe]-hydrogenase. Nature chemical
biology, 7(5), 310–8.
Goto, E., Kodama, T., & Minoda, Y. (1977). Isolation and Culture Conditions of Thermophilic
Hydrogen Bacteria. Agricultural and Biological Chemistry, 41(4), 685–690.
132
Goujon, M., McWilliam, H., Li, W., Valentin, F., Squizzato, S., Paern, J., & Lopez, R. (2010). A
new bioinformatics analysis tools framework at EMBL-EBI. Nucleic Acids Research, 38(Web
Server), W695–W699.
Greene, B. L., Wu, C.-H., McTernan, P. M., Adams, M. W. W., & Dyer, R. B. (2015). Proton-
coupled electron transfer dynamics in the catalytic mechanism of a [NiFe]-hydrogenase. Journal
of the American Chemical Society, 137(13), 4558–66.
Greene, B. L., Wu, C.-H., Vansuch, G. E., Adams, M. W. W., & Dyer, R. B. (2016). Proton
Inventory and Dynamics in the Ni a -S to Ni a -C Transition of a [NiFe] Hydrogenase.
Biochemistry, 55(12), 1813–1825.
Greening, C., Berney, M., Hards, K., Cook, G. M., & Conrad, R. (2014). A soil actinobacterium
scavenges atmospheric H2 using two membrane-associated, oxygen-dependent [NiFe]
hydrogenases. Proceedings of the National Academy of Sciences, 111(11), 4257–4261.
Greening, C., Biswas, A., Carere, C. R., Jackson, C. J., Taylor, M. C., Stott, M. B., … Morales,
S. E. (2016). Genomic and metagenomic surveys of hydrogenase distribution indicate H2 is a
widely utilised energy source for microbial growth and survival. The ISME journal, 10(3), 761–
77.
Greening, C., Villas-Bôas, S. G., Robson, J. R., Berney, M., & Cook, G. M. (2014). The Growth
and Survival of Mycobacterium smegmatis Is Enhanced by Co-Metabolism of Atmospheric H2.
PLoS ONE, 9(7), e103034.
Grzeszik, C., Lubbers, M., Reh, M., & Schlegel, H. G. (1997). Genes encoding the NAD-reducing
hydrogenase of Rhodococcus opacus MR11. Microbiology, 143(4), 1271–1286.
Grzeszik, C., Roß, K., Schneider, K., Reh, M., & Schlegel, H. G. (1997). Location, catalytic
activity, and subunit composition of NAD-reducing hydrogenases of some Alcaligenes strains
and Rhodococcus opacus MR22. Archives of Microbiology, 167(2–3), 172–176.
Hall, M., & Bommarius, A. S. (2011). Enantioenriched Compounds via Enzyme-Catalyzed Redox
Reactions. Chemical Reviews, 111(7), 4088–4110.
Happe, R. P., Roseboom, W., Egert, G., Friedrich, C. G., Massanz, C., Friedrich, B., &
Albracht, S. P. J. (2000). Unusual FTIR and EPR properties of the H 2 -activating site of the
cytoplasmic NAD-reducing hydrogenase from Ralstonia eutropha. FEBS Letters, 466(2–3),
259–263.
Happe, R. P., Roseboom, W., Pierik, A. J., Albracht, S. P. J., & Bagley, K. A. (1997). Biological
activition of hydrogen. Nature, 385(6612), 126–126.
Hayashi, N. R., Ishida, T., Yokota, A., Kodama, T., & Igarashi, Y. (1999). Hydrogenophilus
thermoluteolus gen. nov., sp. nov., a thermophilic, facultatively chemolithoautotrophic,
hydrogen-oxidizing bacterium. International Journal of Systematic Bacteriology, 49(2), 783–
786.
Higuchi, Y., Yagi, T., & Yasuoka, N. (1997). Unusual ligand structure in Ni-Fe active center and an
additional Mg site in hydrogenase revealed by high resolution X-ray structure analysis.
Structure, 5(12), 1671–80.
Hiromoto, T., Warkentin, E., Moll, J., Ermler, U., & Shima, S. (2009). The Crystal Structure of an
[Fe]-Hydrogenase-Substrate Complex Reveals the Framework for H 2 Activation. Angewandte
Chemie International Edition, 48(35), 6457–6460.
133
Hoelsch, K., Sührer, I., Heusel, M., & Weuster-Botz, D. (2013). Engineering of formate
dehydrogenase: synergistic effect of mutations affecting cofactor specificity and chemical
stability. Applied Microbiology and Biotechnology, 97(6), 2473–2481.
Hollmann, F., Arends, I. W. C. E., & Holtmann, D. (2011). Enzymatic reductions for the chemist.
Green Chemistry, 13(9), 2285.
Holt, P. J., Efremov, R. G., Nakamaru-Ogiso, E., & Sazanov, L. A. (2016). Reversible FMN
dissociation from Escherichia coli respiratory complex I. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-
Bioenergetics, 1857(11), 1777–1785.
Holzer, A. K., Hiebler, K., Mutti, F. G., Simon, R. C., Lauterbach, L., Lenz, O., & Kroutil, W.
(2015). Asymmetric Biocatalytic Amination of Ketones at the Expense of NH 3 and Molecular
Hydrogen. Organic Letters, 17(10), 2431–2433.
Horch, M. (2015). Structure-function Relationships of Metalloenzymes. Dissertation.
Horch, M., Lauterbach, L., Lenz, O., Hildebrandt, P., & Zebger, I. (2011). NAD(H)-coupled
hydrogen cycling - structure-function relationships of bidirectional [NiFe] hydrogenases. FEBS
Letters, 586(5), 545–556.
Horch, M., Lauterbach, L., Mroginski, M. A., Hildebrandt, P., Lenz, O., & Zebger, I. (2015).
Reversible active site sulfoxygenation can explain the oxygen tolerance of a NAD+-reducing
[NiFe] hydrogenase and its unusual infrared spectroscopic properties. Journal of the American
Chemical Society, 137(7), 2555–2564.
Horch, M., Lauterbach, L., Saggu, M., Hildebrandt, P., Lendzian, F., Bittl, R., … Zebger, I.
(2010). Probing the active site of an O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from
Ralstonia eutropha H16 by in situ EPR and FTIR spectroscopy. Angewandte Chemie
International Edition, 49(43), 8026–9.
Houchins, J. P., & Burris, R. H. (1981). Occurrence and localization of two distinct hydrogenases in
the heterocystous cyanobacterium Anabaena sp. strain 7120. Journal of Bacteriology, 146(1),
209–14.
Johannssen, W., Gerberding, H., Rohde, M., Zaborosch, C., & Mayer, F. (1991). Structural
aspects of the soluble NAD-dependent hydrogenase isolated from Alcaligenes eutrophus H16
and from Nocardia opaca 1b. Archives of Microbiology, 155(3), 303–308.
Kalms, J., Schmidt, A., Frielingsdorf, S., Van Der Linden, P., Von Stetten, D., Lenz, O., …
Scheerer, P. (2016). Krypton Derivatization of an O2-Tolerant Membrane-Bound [NiFe]
Hydrogenase Reveals a Hydrophobic Tunnel Network for Gas Transport. Angewandte Chemie -
International Edition, 55(18), 5586–5590.
Kamali, S., Wang, H., Mitra, D., Ogata, H., Lubitz, W., Manor, B. C., … Cramer, S. P. (2013).
Observation of the Fe-CN and Fe-CO Vibrations in the Active Site of [NiFe] Hydrogenase by
Nuclear Resonance Vibrational Spectroscopy. Angewandte Chemie International Edition, 52(2),
724–728.
Kanai, T., Matsuoka, R., Beppu, H., Nakajima, A., Okada, Y., Atomi, H., & Imanaka, T. (2011).
Distinct Physiological Roles of the Three [NiFe]-Hydrogenase Orthologs in the
Hyperthermophilic Archaeon Thermococcus kodakarensis. Journal of Bacteriology, 193(12),
3109–3116.
Karstens, K. (2014). Untersuchungen zur Funktion sauerstofftoleranter , NAD + -reduzierender
134
Hydrogenasen und ihrer Anwendung in der lichtgetriebenen Wasserstoffproduktion in
Cyanobakterien. Dissertation.
Karstens, K., Wahlefeld, S., Horch, M., Grunzel, M., Lauterbach, L., Lendzian, F., … Lenz, O.
(2015). Impact of the iron-sulfur cluster proximal to the active site on the catalytic function of an
O2-tolerant NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase. Biochemistry, 54(2), 389–403.
Karyakin, A. A., Morozov, S. V, Karyakina, E. E., Zorin, N. A., Perelygin, V. V, & Cosnier, S.
(2005). Hydrogenase electrodes for fuel cells. Biochemical Society transactions, 33, 73–75.
Kataoka, M., Rohani, L. P., Yamamoto, K., Wada, M., Kawabata, H., Kita, K., … Shimizu, S.
(1997). Enzymatic production of ethyl (R)-4-chloro-3-hydroxybutanoate: asymmetric reduction
of ethyl 4-chloro-3-oxobutanoate by an Escherichia coli transformant expressing the aldehyde
reductase gene from yeast. Applied microbiology and biotechnology, 48(6), 699–703.
Keefe, R. G., Axley, M. J., & Harabin, A. L. (1995). Kinetic mechanism studies of the soluble
hydrogenase from Alcaligenes eutrophus H16. Archives of biochemistry and biophysics, 317(2),
449–56.
Khanna, N., & Lindblad, P. (2015). Cyanobacterial hydrogenases and hydrogen metabolism
revisited: Recent progress and future prospects. International Journal of Molecular Sciences,
16(5), 10537–10561.
Khoury, G. A., Fazelinia, H., Chin, J. W., Pantazes, R. J., Cirino, P. C., & Maranas, C. D.
(2009). Computational design of Candida boidinii xylose reductase for altered cofactor
specificity. Protein Science, 18(10), 2125–2138.
Kleihues, L., Lenz, O., Bernhard, M., Buhrke, T., & Friedrich, B. (2000). The H2 sensor of
Ralstonia eutropha is a member of the subclass of regulatory [NiFe] hydrogenases. Journal of
Bacteriology, 182(10), 2716–2724.
Kortlüke, C., Horstmann, K., Schwartz, E., Rohde, M., Binsack, R., & Friedrich, B. (1992). A
gene complex coding for the membrane-bound hydrogenase of Alcaligenes eutrophus H16.
Journal of bacteriology, 174(19), 6277–89.
Krassen, H., Ott, S., & Heberle, J. (2011). In vitro hydrogen production—using energy from the
sun. Phys. Chem. Chem. Phys., 13(1), 47–57.
Kroutil, W., Mang, H., Edegger, K., & Faber, K. (2004). Biocatalytic oxidation of primary and
secondary alcohols. Advanced Synthesis & Catalysis, 346(2–3), 125–142.
Kuhn, M., Steinbüchel, A., & Schlegel, H. G. (1984). Hydrogen evolution by strictly aerobic
hydrogen bacteria under anaerobic conditions. Journal of bacteriology, 159(2), 633–9.
Kulkarni, G., Kridelbaugh, D. M., Guss, A. M., & Metcalf, W. W. (2009). Hydrogen is a preferred
intermediate in the energy-conserving electron transport chain of Methanosarcina barkeri.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 106(37),
15915–20.
Kurkin, S., George, S. J., Thorneley, R. N. F., & Albracht, S. P. J. (2004). Hydrogen-Induced
Activation of the [NiFe]-Hydrogenase from Allochromatium vinosum as Studied by Stopped-
Flow Infrared Spectroscopy. Biochemistry, 43(21), 6820–6831.
Kwan, P., McIntosh, C. L., Jennings, D. P., Hopkins, R. C., Chandrayan, S. K., Wu, C. H., …
Jones, A. K. (2015). The [NiFe]-Hydrogenase of Pyrococcus furiosus Exhibits a New Type of
135
Oxygen Tolerance. Journal of the American Chemical Society, 137(42), 13556–13565.
Lacey, A. L. De, Hatchikian, E. C., Volbeda, A., Frey, M., Fontecilla-Camps, J. C., Fernandez,
V. M., & de Lacey, A. L. (1997). Infrared-Spectroelectrochemical Characterization of the
[NiFe] Hydrogenase of Desulfovibrio gigas⊥. Journal of the American Chemical Society,
119(31), 7181–7189.
Laemmli, U. K. (1970). Cleavage of Structural Proteins during the Assembly of the Head of
Bacteriophage T4. Nature, 227(5259), 680–685.
Lamed, R. J., & Zeikus, J. G. (1981). Novel NADP-linked alcohol--aldehyde/ketone oxidoreductase
in thermophilic ethanologenic bacteria. The Biochemical journal, 195(1), 183–90.
Lauterbach, L. (2013). Die Analyse der Sauerstofftoleranz und biotechnologische Anwendung der
NAD+-reduzierenden Hydrogenase aus Ralstonia eutropha H16. Dissertation
Lauterbach, L., Idris, Z., Vincent, K. a, & Lenz, O. (2011). Catalytic Properties of the Isolated
Diaphorase Fragment of the NAD-Reducing [NiFe]-Hydrogenase from Ralstonia eutropha. PloS
one, 6(10), e25939.
Lauterbach, L., & Lenz, O. (2013). Catalytic Production of Hydrogen Peroxide and Water by
Oxygen-Tolerant [NiFe]-Hydrogenase during H 2 Cycling in the Presence of O 2. Journal of the
American Chemical Society, 135(47), 17897–17905.
Lauterbach, L., Lenz, O., & Vincent, K. a. (2013). H 2 -driven cofactor regeneration with NAD(P)
+ -reducing hydrogenases. FEBS Journal, 280(13), 3058–3068.
Lauterbach, L., Liu, J., Horch, M., Hummel, P., Schwarze, A., Haumann, M., … Zebger, I.
(2011). The Hydrogenase Subcomplex of the NAD+-Reducing [NiFe] Hydrogenase from
Ralstonia eutropha - Insights into Catalysis and Redox Interconversions. European Journal of
Inorganic Chemistry, 2011(7), 1067–1079.
Lauterbach, L., Wang, H., Horch, M., Gee, L. B., Yoda, Y., Tanaka, Y., … Cramer, S. P. (2015).
Nuclear resonance vibrational spectroscopy reveals the FeS cluster composition and active site
vibrational properties of an O 2 -tolerant NAD + -reducing [NiFe] hydrogenase. Chemical
Science, 6(2), 1055–1060.
LeGall, J., Ljungdahl, P. O., Moura, I., Peck, H. D., Xavier, A. V., Moura, J. J. G., …
DerVartanian, D. V. (1982). The presence of redox-sensitive nickel in the periplasmic
hydrogenase from Desulfovibriogigas. Biochemical and Biophysical Research Communications,
106(2), 610–616.
Leif, H., Sled, V. D., Ohnishi, T., Weiss, H., & Friedrich, T. (1995). Isolation and Characterization
of the Proton-translocating NADH:ubiquinone Oxidoreductase from Escherichia coli. European
Journal of Biochemistry, 230(2), 538–548.
Lenz, O., Bernhard, M., Buhrke, T., Schwartz, E., & Friedrich, B. (2002). The hydrogen-sensing
apparatus in Ralstonia eutropha. Journal of molecular microbiology and biotechnology, 4(3),
255–62.
Lenz, O., Ludwig, M., Schubert, T., Bürstel, I., Ganskow, S., Goris, T., … Friedrich, B. (2010).
H2 conversion in the presence of O2 as performed by the membrane-bound [NiFe]-hydrogenase
of Ralstonia eutropha. Chemphyschem : a European journal of chemical physics and physical
chemistry, 11(6), 1107–19.
136
Lenz, O., Schwartz, E., & Dernedde, J. (1994). The Alcaligenes eutrophus H16 hoxX gene
participates in hydrogenase regulation. Journal of Bacteriology, 176(14), 4385–4393.
Lerchner, A., Jarasch, A., Meining, W., Schiefner, A., & Skerra, A. (2013). Crystallographic
analysis and structure-guided engineering of NADPH-dependent Ralstonia sp. Alcohol
dehydrogenase toward NADH cosubstrate specificity. Biotechnology and Bioengineering,
110(11), 2803–2814.
Long, M., Liu, J., Chen, Z., Bleijlevens, B., Roseboom, W., & Albracht, S. P. J. (2006).
Characterization of a HoxEFUYH type of [NiFe] hydrogenase from Allochromatium vinosum
and some EPR and IR properties of the hydrogenase module. JBIC Journal of Biological
Inorganic Chemistry, 12(1), 62–78.
Lonsdale, T. H., Lauterbach, L., Honda Malca, S., Nestl, B. M., Hauer, B., & Lenz, O. (2015). H
2 -driven biotransformation of n -octane to 1-octanol by a recombinant Pseudomonas putida
strain co-synthesizing an O 2 -tolerant hydrogenase and a P450 monooxygenase. Chem.
Commun., 51(90), 16173–16175.
Lubitz, W., Ogata, H., Rüdiger, O., & Reijerse, E. (2014). Hydrogenases. Chemical Reviews,
114(8), 4081–4148.
Lubitz, W., Reijerse, E., & van Gastel, M. (2007). [NiFe] and [FeFe] hydrogenases studied by
advanced magnetic resonance techniques. Chemical reviews, 107(10), 4331–65.
Ma, K., Schichot, R. N., Kellyt, R. M., & Adams, M. W. W. (1993). Hydrogenase of the
hyperthermophile Pyrococcus furiosus is an elemental sulfur reductase or sulfhydrogenase:
Evidence for a sulfur-reducing hydrogenase ancestor. Biochemistry, 90(June), 5341–5344.
Ma, K., Weiss, R., & Adams, M. W. (2000). Characterization of hydrogenase II from the
hyperthermophilic archaeon Pyrococcus furiosus and assessment of its role in sulfur reduction.
Journal of bacteriology, 182(7), 1864–71.
Marohnic, C. C., Bewley, M. C., & Barber, M. J. (2003). Engineering and characterization of a
NADPH-utilizing cytochrome b5 reductase. Biochemistry, 42(38), 11170–82.
Marx, C., & Lidstrom, M. (2001). Development of improved versatile broad-host-range vectors for
use in methylotrophs and other Gram-negative bacteria. Microbiology, 2065–2075.
Massanz, C., Schmidt, S., & Friedrich, B. (1998). Subforms and in vitro reconstitution of the NAD-
reducing hydrogenase of Alcaligenes eutrophus. Journal of bacteriology, 180(5), 1023–9.
Matias, P. M., Soares, C. M., Saraiva, L. M., Coelho, R., Morais, J., Le Gall, J., & Carrondo, M.
A. (2001). [NiFe] hydrogenase from Desulfovibrio desulfuricans ATCC 27774: gene
sequencing, three-dimensional structure determination and refinement at 1.8 A and modelling
studies of its interaction with the tetrahaem cytochrome c3. Journal of biological inorganic
chemistry : JBIC : a publication of the Society of Biological Inorganic Chemistry, 6(1), 63–81.
McIntosh, C. L., Germer, F., Schulz, R., Appel, J., & Jones, A. K. (2011). The [NiFe]-
hydrogenase of the cyanobacterium Synechocystis sp. PCC 6803 works bidirectionally with a
bias to H2 production. Journal of the American Chemical Society, 133(29), 11308–11319.
Mesecar, A. D., Stoddard, B. L., & Koshland, D. E. (1997). Orbital steering in the catalytic power
of enzymes: small structural changes with large catalytic consequences. Science (New York,
N.Y.), 277(5323), 202–6.
137
Mills, D. J., Vitt, S., Strauss, M., Shima, S., & Vonck, J. (2013). De novo modeling of the F420-
reducing [NiFe]-hydrogenase from a methanogenic archaeon by cryo-electron microscopy.
eLife, 2(2), 1–21.
Miyazaki, K. (2011). MEGAWHOP Cloning. In Methods in Enzymology (1st ed., Vol. 498, pp. 399–
406). Elsevier Inc.
Montet, Y., Amara, P., Volbeda, A., Vernede, X., Hatchikian, E. C., Field, M. J., … Fontecilla-
Camps, J. C. (1997). Gas access to the active site of Ni-Fe hydrogenases probed by X-ray
crystallography and molecular dynamics. Nature Structural Biology, 4(7), 523–526.
Moss, D., Nabedryk, E., Breton, J., & Mantele, W. (1990). Redox-linked conformational changes
in proteins detected by a combination of infrared spectroscopy and protein electrochemistry.
Evaluation of the technique with cytochrome c. European Journal of Biochemistry, 187(3), 565–
572.
Mullis, K. B., & Faloona, F. A. (1987). Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase-
catalyzed chain reaction. In Methods in Enzymology (Vol. 155, pp. 335–350).
Muñoz Solano, D., Hoyos, P., Hernáiz, M. J., Alcántara, A. R., & Sánchez-Montero, J. M.
(2012). Industrial biotransformations in the synthesis of building blocks leading to enantiopure
drugs. Bioresource Technology, 115, 196–207.
Nestl, B., Nebel, B., & Hauer, B. (2011). Recent progress in industrial biocatalysis. Current opinion
in chemical biology, 15(2), 187–193.
Nicolet, Y., De Lacey, A. L., Vernède, X., Fernandez, V. M., Hatchikian, E. C., & Fontecilla-
Camps, J. C. (2001). Crystallographic and FTIR spectroscopic evidence of changes in Fe
coordination upon reduction of the active site of the Fe-only hydrogenase from Desulfovibrio
desulfuricans. Journal of the American Chemical Society, 123(8), 1596–1601.
Nicolet, Y., Piras, C., Legrand, P., Hatchikian, C. E., & Fontecilla-Camps, J. C. (1999).
Desulfovibrio desulfuricans iron hydrogenase: The structure shows unusual coordination to an
active site Fe binuclear center. Structure, 7(1), 13–23.
Ogata, H., Hirota, S., Nakahara, A., Komori, H., Shibata, N., Kato, T., … Higuchi, Y. (2005).
Activation Process of [NiFe] Hydrogenase Elucidated by High-Resolution X-Ray Analyses:
Conversion of the Ready to the Unready State. Structure, 13(11), 1635–1642.
Okamoto, Y., K??hler, V., Paul, C. E., Hollmann, F., & Ward, T. R. (2016). Efficient in situ
regeneration of NADH mimics by an artificial metalloenzyme. ACS Catalysis, 6(6), 3553–3557.
Palágyi-Mészáros, L. S., Maróti, J., Latinovics, D., Balogh, T., Klement, É., Medzihradszky, K.
F., … Kovács, K. L. (2009). Electron-transfer subunits of the NiFe hydrogenases in Thiocapsa
roseopersicina BBS. FEBS Journal, 276(1), 164–174.
Pandelia, M., Fourmond, V., Tron-Infossi, P., Lojou, E., Bertrand, P., Leger, C., … Lubitz, W.
(2010). Membrane-Bound Hydrogenase I from the Hyperthermophilic Bacterium Aquifex
aeolicus : Enzyme Activation, Redox Intermediates and Oxygen Tolerance. Journal of the
American Chemical Society, 132(20), 6991–7004.
Paneth, F. A. (1937). The chemical composition of the atmosphere. Quarterly Journal of the Royal
Meteorological Society, 63(271), 433–443.
Paul, C. E., Gargiulo, S., Opperman, D. J., Lavandera, I., Gotor-Fernández, V., Gotor, V., …
138
Hollmann, F. (2013). Mimicking nature: Synthetic nicotinamide cofactors for C=C bioreduction
using enoate reductases. Organic Letters, 15(1), 180–183.
Peters, J. W. (1999). Structure and mechanism of iron-only hydrogenases. Current opinion in
structural biology, 9(6), 670–6.
Peters, J. W., Lanzilotta, W. N., Lemon, B. J., & Seefeldt, L. C. (1998). X-ray crystal structure of
the Fe-only hydrogenase (CpI) from Clostridium pasteurianum to 1.8 angstrom resolution.
Science (New York, N.Y.), 282(5395), 1853–8.
Pfirrmann, T., Lokapally, A., Andréasson, C., Ljungdahl, P., & Hollemann, T. (2013). SOMA: a
single oligonucleotide mutagenesis and cloning approach. PloS one, 8(6), e64870.
Pierik, A. J., Roseboom, W., Happe, R. P., Bagley, K. A., & Albracht, S. P. J. (1999). Carbon
Monoxide and Cyanide as Intrinsic Ligands to Iron in the Active Site of [NiFe]-Hydrogenases.
Journal of Biological Chemistry, 274(6), 3331–3337.
Pilkington, S. J., Skehel, J. M., Gennis, R. B., & Walker, J. E. (1991). Relationship between
mitochondrial NADH-ubiquinone reductase and a bacterial NAD-reducing hydrogenase.
Biochemistry, 30(8), 2166–2175.
Pongtharangkul, T., Chuekitkumchorn, P., Suwanampa, N., Payongsri, P., Honda, K., &
Panbangred, W. (2015). Kinetic properties and stability of glucose dehydrogenase from
Bacillus amyloliquefaciens SB5 and its potential for cofactor regeneration. AMB Express, 5(1),
68.
Porthun, A., Bernhard, M., & Friedrich, B. (2002). Expression of a functional NAD-reducing
[NiFe] hydrogenase from the gram-positive Rhodococcus opacus in the gram-negative Ralstonia
eutropha. Archives of Microbiology, 177(2), 159–166.
Preissler, J. (2013). Erweiterung des Substratspektrums der NAD+-reduzierenden
Hydrogenase aus R. eutropha H16 für die Kofaktorregeneration. Diplomarbeit.
Preissler, J., Wahlefeld, S., Lorent, C., Teutloff, C., Horch, M., Lauterbach, L., … Lenz, O.
(2018). Enzymatic and spectroscopic properties of a thermostable [NiFe]‑hydrogenase
performing H 2 -driven NAD + -reduction in the presence of O 2. Biochimica et Biophysica Acta
(BBA) - Bioenergetics, 1859(1), 8–18.
Rákhely, G., Kovács, Á. T., Maróti, G., Barna, D., Csanádi, G., Latinovics, D., … Kova, T.
(2004). Cyanobacterial-Type , Heteropentameric , NAD + -Reducing NiFe Hydrogenase in the
Purple Sulfur Photosynthetic Bacterium Thiocapsa roseopersicina. Applied and Environmental
Microbiology, 70, 722–728.
Rákhely, G., Zhou, Z. H., Adams, M. W., & Kovács, K. L. (1999). Biochemical and molecular
characterization of the [NiFe] hydrogenase from the hyperthermophilic archaeon, Thermococcus
litoralis. European journal of biochemistry, 266(3), 1158–65.
Ratzka, J., Lauterbach, L., Lenz, O., & Ansorge-Schumacher, M. B. (2011). Systematic
evaluation of the dihydrogen-oxidising and NAD + -reducing soluble [NiFe]-hydrogenase from
Ralstonia eutropha H16 as a cofactor regeneration catalyst. Biocatalysis and Biotransformation,
29(6), 246–252.
Ratzka, J., Lauterbach, L., Lenz, O., & Ansorge-Schumacher, M. B. (2012). Stabilisation of the
NAD+-reducing soluble [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha H16 through modification
with methoxy-poly(ethylene) glycol. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 74(3–4),
139
219–223.
Reeve, H. A., Ash, P. A., Park, H., Huang, A., Posidias, M., Tomlinson, C., … Vincent, K. A.
(2017). Enzymes as modular catalysts for redox half-reactions in H 2 -powered chemical
synthesis: from biology to technology. Biochemical Journal, 474(2), 215–230.
Reeve, H. A., Lauterbach, L., Lenz, O., & Vincent, K. A. (2015). Enzyme-Modified Particles for
Selective Biocatalytic Hydrogenation by Hydrogen-Driven NADH Recycling. ChemCatChem,
7(21), 3480–3487.
Reeve, H. a, Lauterbach, L., Ash, P. a, Lenz, O., & Vincent, K. a. (2011). A modular system for
regeneration of NAD cofactors using graphite particles modified with hydrogenase and
diaphorase moieties. Chemical communications (Cambridge, England), 1–3.
Relyea, H. A., & van der Donk, W. A. (2005). Mechanism and applications of phosphite
dehydrogenase. Bioorganic Chemistry, 33(3), 171–189.
Rosenberg, E., DeLong, E. F., Stackebrandt, E., Lory, S., & Thompson, F. (2013). The
Prokaryotes Vol 5 - Prokaryotic Physiology and Biochemistry. Springer-Verlag Berlin
Heidelberg.
Sazanov, L. a. (2006). Structure of the Hydrophilic Domain of Respiratory Complex I from Thermus
thermophilus. Science, 311(5766), 1430–1436.
Schäfer, C., Bommer, M., Hennig, S. E., Jeoung, J. H., Dobbek, H., & Lenz, O. (2016). Structure
of an Actinobacterial-Type [NiFe]-Hydrogenase Reveals Insight into O2-Tolerant H2 Oxidation.
Structure, 24(2), 285–292.
Schäfer, C., Friedrich, B., & Lenz, O. (2013). Novel, oxygen-insensitive group 5 [NiFe]-
hydrogenase in Ralstonia eutropha. Applied and Environmental Microbiology, 79(17), 5137–
5145.
Schiffels, J., Pinkenburg, O., Schelden, M., Aboulnaga, E.-H. a a, Baumann, M. E. M., &
Selmer, T. (2013). An Innovative Cloning Platform Enables Large-Scale Production and
Maturation of an Oxygen-Tolerant [NiFe]-Hydrogenase from Cupriavidus necator in
Escherichia coli. PLoS ONE, 8(7), e68812.
Schink, B., & Schlegel, H.-G. (1978). Hydrogen metabolism in aerobic hydrogen-oxidizing bacteria.
Biochimie, 60(3), 297–305.
Schlieben, N. H., Niefind, K., Müller, J., Riebel, B., Hummel, W., & Schomburg, D. (2005).
Atomic resolution structures of R-specific alcohol dehydrogenase from Lactobacillus brevis
provide the structural bases of its substrate and cosubstrate specificity. Journal of molecular
biology, 349(4), 801–13.
Schmidt, U. (1974). Molecular hydrogen in the atmosphere. Tellus, 26(1–2), 78–90.
Schmitz, O., Boison, G., Hilscher, R., Hundeshagen, B., Zimmer, W., Lottspeich, F., & Bothe, H.
(1995). Molecular Biological Analysis of a Bidirectional Hydrogenase from Cyanobacteria.
European Journal of Biochemistry, 233(1), 266–276.
Schmitz, O., Boison, G., Salzmann, H., Bothe, H., Schütz, K., Wang, S., & Happe, T. (2002).
HoxE—a subunit specific for the pentameric bidirectional hydrogenase complex (HoxEFUYH)
of cyanobacteria. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Bioenergetics, 1554(1–2), 66–74.
140
Schneider, K., Cammack, R., & Schlegel, H. G. (1984). Content and localization of FMN, Fe-S
clusters and nickel in the NAD-linked hydrogenase of Nocardia opaca 1b. European journal of
biochemistry, 142(1), 75–84.
Schneider, K., Cammack, R., Schlegel, H. G., & Hall, D. O. (1979). The iron-sulphur centres of
soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) -
Protein Structure, 578(2), 445–461.
Schneider, K., & Schlegel, H. G. (1976). Purification and properties of soluble hydrogenase from
Alcaligenes eutrophus H 16. Biochimica et biophysica acta, 452(1), 66–80.
Schneider, K., & Schlegel, H. G. (1978). Identification and quantitative determination of the flavin
component of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochemical and Biophysical
Research Communications, 84(3), 564–571.
Schneider, K., & Schlegel, H. G. (1981). Production of superoxide radicals by soluble hydrogenase
from Alcaligenes eutrophus H16. The Biochemical journal, 193(1), 99–107.
Schneider, K., Schlegel, H. G., & Jochim, K. (1984). Effect of nickel on activity and subunit
composition of purified hydrogenase from Nocardia opaca 1 b. European journal of
biochemistry, 138(3), 533–41.
Schubert, K. R., & Evans, H. J. (1976). Hydrogen evolution: A major factor affecting the efficiency
of nitrogen fixation in nodulated symbionts. Proceedings of the National Academy of Sciences,
73(4), 1207–1211.
Schwartz, E., Gerischer, U., & Friedrich, B. (1998). Transcriptional Regulation of Alcaligenes
eutrophus Hydrogenase Genes. J. Bacteriol., 180(12), 3197–3204.
Schwartz, E., Henne, A., Cramm, R., Eitinger, T., Friedrich, B., & Gottschalk, G. (2003).
Complete nucleotide sequence of pHG1: A Ralstonia eutropha H16 megaplasmid encoding key
enzymes of H2-based lithoautotrophy and anaerobiosis. Journal of Molecular Biology, 332(2),
369–383.
Serebriakova, L. T., & Sheremet’eva, M. E. (2006). Characterization of catalytic properties of
hydrogenase isolated from the unicellular cyanobacterium Gloeocapsa alpicola CALU 743.
Biochemistry. Biokhimiia, 71(12), 1370–1376.
Serebryakova, L. T., Medina, M., Zorin, N. A., Gogotov, I. N., & Cammack, R. (1996).
Reversible hydrogenase of Anabaena variabilis ATCC 29413: catalytic properties and
characterization of redox centres. FEBS Letters, 383(1–2), 79–82.
Shafaat, H. S., Rüdiger, O., Ogata, H., & Lubitz, W. (2013). [NiFe] hydrogenases: a common
active site for hydrogen metabolism under diverse conditions. Biochimica et biophysica acta,
1827(8–9), 986–1002.
Shomura, Y., Taketa, M., Nakashima, H., Tai, H., Nakagawa, H., Ikeda, Y., … Higuchi, Y.
(2017). Structural basis of the redox switches in the NAD + -reducing soluble [NiFe]-
hydrogenase. Science, 357(6354), 928–932.
Siegbahn, P. E. M., Tye, J. W., & Hall, M. B. (2007). Computational studies of [NiFe] and [FeFe]
hydrogenases. Chemical reviews, 107(10), 4414–35.
Sievers, F., Wilm, A., Dineen, D., Gibson, T. J., Karplus, K., Li, W., … Higgins, D. G. (2014).
Fast, scalable generation of high-quality protein multiple sequence alignments using Clustal
141
Omega. Molecular Systems Biology, 7(1), 539–539.
Simon, R., Priefer, U., & Pühler, A. (1983). A Broad Host Range Mobilization System for In Vivo
Genetic Engineering: Transposon Mutagenesis in Gram Negative Bacteria. Bio/Technology,
1(9), 784–791.
Slusarczyk, H., Felber, S., Kula, M., & Pohl, M. (2000). Stabilization of NAD-dependent formate
dehydrogenase from Candida boidinii by site-directed mutagenesis of cysteine residues.
European Journal of Biochemistry, 267(5), 1280–1289.
Stadler, C., de Lacey, A. L., Montet, Y., Volbeda, A., Fontecilla-Camps, J. C., Conesa, J. C., &
Fernández, V. M. (2002). Density Functional Calculations for Modeling the Active Site of
Nickel−Iron Hydrogenases. 2. Predictions for the Unready and Ready States and the
Corresponding Activation Processes. Inorganic Chemistry, 41(17), 4424–4434.
Sun, J., Hopkins, R. C., Jenney, F. E., McTernan, P. M., & Adams, M. W. W. (2010).
Heterologous Expression and Maturation of an NADP-Dependent [NiFe]-Hydrogenase: A Key
Enzyme in Biofuel Production. PLoS ONE, 5(5), e10526.
Taketa, M., Nakagawa, H., Habukawa, M., Osuka, H., Kihira, K., Komori, H., … Higuchi, Y.
(2015). Crystallization and preliminary X-ray analysis of the NAD+-reducing [NiFe]
hydrogenase from Hydrogenophilus thermoluteolus TH-1. Acta crystallographica. Section F,
Structural biology communications, 71(Pt 1), 96–9.
Tamagnini, P., Leitão, E., Oliveira, P., Ferreira, D., Pinto, F., Harris, D. J., … Lindblad, P.
(2007). Cyanobacterial hydrogenases: diversity, regulation and applications. FEMS
microbiology reviews, 31(6), 692–720.
Tishkov, V. I., Galkin, A. G., Fedorchuk, V. V, Savitsky, P. A., Rojkova, A. M., Gieren, H., &
Kula, M.-R. (1999). Pilot scale production and isolation of recombinant NAD+- and NADP+-
specific formate dehydrogenases. Biotechnology and Bioengineering, 64(2), 187–193.
Tishkov, V. I., & Popov, V. O. (2004). Catalytic mechanism and application of formate
dehydrogenase. Biochemistry. Biokhimii
a, 69(11), 1252–67.
Tishkov, V., & Popov, V. (2006). Protein engineering of formate dehydrogenase. Biomolecular
engineering, 23, 89–110.
Tran-Betcke, A., Warnecke, U., Böcker, C., Zaborosch, C., & Friedrich, B. (1990). Cloning and
nucleotide sequences of the genes for the subunits of NAD-reducing hydrogenase of Alcaligenes
eutrophus H16. Journal of bacteriology, 172(6), 2920–9.
Tye, J. W., Hall, M. B., & Darensbourg, M. Y. (2005). Better than platinum? Fuel cells energized
by enzymes. Proceedings of the National Academy of Sciences, 102(47), 16911–16912.
van der Donk, W. A., & Zhao, H. (2003). Recent developments in pyridine nucleotide regeneration.
Current Opinion in Biotechnology, 14(4), 421–426.
van der Linden, E., Burgdorf, T., de Lacey, A. L., Buhrke, T., Scholte, M., Fernandez, V. M., …
Albracht, S. P. J. (2006). An improved purification procedure for the soluble [NiFe]-
hydrogenase of Ralstonia eutropha: new insights into its (in)stability and spectroscopic
properties. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 11(2), 247–260.
Van Der Linden, E., Faber, B. W., Bleijlevens, B., Burgdorf, T., Bernhard, M., Friedrich, B., &
Albracht, S. P. J. (2004). Selective release and function of one of the two FMN groups in the
142
cytoplasmic NAD+-reducing [NiFe]-hydrogenase from Ralstonia eutropha. European Journal of
Biochemistry, 271(4), 801–808.
Van Haaster, D. J., Silva, P. J., Hagedoorn, P. L., Jongejan, J. A., & Hagen, W. R. (2008).
Reinvestigation of the steady-state kinetics and physiological function of the soluble NiFe-
hydrogenase I of Pyrococcus furiosus. Journal of Bacteriology, 190(5), 1584–1587.
Vasič-Racki, D., Jonas, M., Wandrey, C., Hummel, W., & Kula, M. R. (1989). Continuous (R)-
mandelic acid production in an enzyme membrane reactor. Applied Microbiology and
Biotechnology, 31(3), 215–222.
Vignais, P. M., & Billoud, B. (2007). Occurrence, Classification, and Biological Function of
Hydrogenases: An Overview. Chemical Reviews, 107(10), 4206–4272.
Vincent, K. a, Cracknell, J. a, Parkin, A., & Armstrong, F. a. (2005). Hydrogen cycling by
enzymes: electrocatalysis and implications for future energy technology. Dalton transactions
(Cambridge, England : 2003), (21), 3397–403.
Vincent, K. a, Parkin, A., & Armstrong, F. a. (2007). Investigating and exploiting the
electrocatalytic properties of hydrogenases. Chemical reviews, 107(10), 4366–413.
Vitt, S., Ma, K., Warkentin, E., Moll, J., Pierik, A. J., Shima, S., & Ermler, U. (2014). The F420-
reducing [NiFe]-Hydrogenase complex from Methanothermobacter marburgensis, the first X-
ray structure of a group 3 family member. Journal of Molecular Biology, 426(15), 2813–2826.
Volbeda, A., Charon, M.-H., Piras, C., Hatchikian, E. C., Frey, M., & Fontecilla-Camps, J. C.
(1995). Crystal structure of the nickel–iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature,
373(6515), 580–587.
Volbeda, A., Martin, L., Barbier, E., Gutiérrez-Sanz, O., De Lacey, A. L., Liebgott, P. P., …
Fontecilla-Camps, J. C. (2015). Crystallographic studies of [NiFe]-hydrogenase mutants:
Towards consensus structures for the elusive unready oxidized states. Journal of Biological
Inorganic Chemistry, 20(1), 11–22.
Volbeda, A., Martin, L., Cavazza, C., Matho, M., Faber, B. W., Roseboom, W., … Fontecilla-
Camps, J. C. (2005). Structural differences between the ready and unready oxidized states of
[NiFe] hydrogenases. JBIC Journal of Biological Inorganic Chemistry, 10(3), 239–249.
Wang, R., Healey, F. P., & Myers, J. (1971). Amperometric measurement of hydrogen evolution in
chlamydomonas. Plant physiology, 48, 108–110.
Wang, X., Saba, T., Yiu, H. H. P., Howe, R. F., Anderson, J. A., & Shi, J. (2017). Cofactor
NAD(P)H Regeneration Inspired by Heterogeneous Pathways. Chem, 2(5), 621–654.
Weckbecker, A., Gröger, H., & Hummel, W. (2010). Regeneration of nicotinamide coenzymes:
principles and applications for the synthesis of chiral compounds. Advances in biochemical
engineering/biotechnology, 120, 195–242.
Whitehouse, C. J. C., Bell, S. G., Tufton, H. G., Kenny, R. J. P., Ogilvie, L. C. I., & Wong, L.-L.
(2008). Evolved CYP102A1 (P450BM3) variants oxidise a range of non-natural substrates and
offer new selectivity options. Chemical Communications, (8), 966.
Whitehouse, C. J. C., Bell, S. G., & Wong, L.-L. (2012). P450 BM3 (CYP102A1): connecting the
dots. Chem. Soc. Rev., 41(3), 1218–1260.
143
Wilde, E. (1962). Untersuchungen über Wachstum und Speicherstoffsynthese von Hydrogenomonas.
Archives of Microbiology, 43(2), 109–137.
Wolf, I., Buhrke, T., Dernedde, J., Pohlmann, A., & Friedrich, B. (1998). Duplication of hyp
genes involved in maturation of [NiFe] hydrogenases in Alcaligenes eutrophus H16. Archives of
Microbiology, 170(6), 451–459.
Wong, C., Drueckhammer, D. G., & Sweers, H. M. (1985). Enzymatic vs. fermentative synthesis:
thermostable glucose dehydrogenase catalyzed regeneration of NAD(P)H for use in enzymatic
synthesis. Journal of the American Chemical Society, 107(13), 4028–4031.
Woodyer, R., van der Donk, W. A., & Zhao, H. (2003). Relaxing the Nicotinamide Cofactor
Specificity of Phosphite Dehydrogenase by Rational Design. Biochemistry, 42(40), 11604–
11614.
Wu, C.-H., McTernan, P. M., Walter, M. E., & Adams, M. W. W. (2015). Production and
Application of a Soluble Hydrogenase from Pyrococcus furiosus. Archaea, 2015, 1–8.
Yang, K., & Metcalf, W. W. (2004). A new activity for an old enzyme: Escherichia coli bacterial
alkaline phosphatase is a phosphite-dependent hydrogenase. Proceedings of the National
Academy of Sciences, 101(21), 7919–7924.
Yanisch-Perron, C., Vieira, J., & Messing, J. (1985). Improved M13 phage cloning vectors and
host strains: nucleotide sequences of the M13mpl8 and pUC19 vectors. Gene, 33(1), 103–119.
Zaborosch, C., Köstert, M., Bill, E., Schneider, K., Schlegel, H., & Trautweint, A. (1995). EPR
and Mössbauer spectroscopic studies on the tetrameric, NAD-linked hydrogenase of Nocardia
opaca 1b and its two dimers: 1. The βγ-dimer - a prototype of a simple hydrogenase. Biometals,
8(2), 149–162.
Zaborosch, C., Schneider, K., SC, H. G., & KRATZIN, H. (1989). Comparison of the NH2-
terminal amino acid sequences of the four non-identical subunits of the NAD-linked
hydrogenases from Nocardia opaca 1b and Alcaligenes eutrophus H16. European Journal of
Biochemistry, 181(1), 175–180.
Zhao, H., Donk, W. A. Van Der, & van der Donk, W. a. (2003). Regeneration of cofactors for use
in biocatalysis. Current Opinion in Biotechnology, 14(6), 583–589.
144
7 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1. Übersicht über die verwendeten Plasmide ........................................................................................... 19
Tabelle 2. Übersicht über die verwendeten Bakterienstämme .............................................................................. 21
Tabelle 3. Zusammensetzung der Kultivierungsmedien ....................................................................................... 24
Tabelle 4. Konzentrationen der verwendeten Antibiotika .................................................................................... 25
Tabelle 5. Verwendete Puffer und Lösungen für die Reinigung verschiedener SH-Derivate .............................. 27
Tabelle 6. Zusammensetzung des Trenn-und Sammelgels für die Durchführunge einer SDS-Gelelektrophorese
..................................................................................................................................................................... 38
Tabelle 7. Übersicht über die verwendeten Antikörper ........................................................................................ 40
Tabelle 8. Liste der verwendeten Oligonukleotide ............................................................................................... 47
Tabelle 9. PCR-Ansätze mit der Taq-Polymerase ................................................................................................ 48
Tabelle 10. PCR-Protokoll der Taq-Polymerase .................................................................................................. 48
Tabelle 11. PCR-Ansätze mit der Q5-Polymerase ............................................................................................... 49
Tabelle 12. PCR-Protokoll der Q5-Polymerase .................................................................................................... 49
Tabelle 13. PCR-Protokoll der MEGAWHOP-Klonierung .................................................................................. 50
Tabelle 14. Reinigung der HtSH aus R. eutropha HF 1054 (pJP09) mittels Affinitäts- und
Größenausschlusschromatographie (AC, SEC) ........................................................................................... 56
Tabelle 15. H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivität der HtSH in Anwesenheit verschiedener O2-
Konzentrationen. .......................................................................................................................................... 60
Tabelle 16. Redoxzuständen des aktiven Zentrums zugeordnete Wellenzahlen für gereinigte HtSH .................. 67
Tabelle 17. Auf der Basis von EPR-Spektroskopie zugeordnete g-Werte der Kofaktoren in HtSH .................... 67
Tabelle 18. Vergleich der HtSH mit kommerziell erhältlichen, kofaktorregenerierenden Dehydrogenasen. ....... 68
Tabelle 19. Übersicht über verwendete Stämme und chimäre SH-Varianten. Die Proteine wurden entsprechend
der Genherkunft farblich markiert: R.e. blau, H.t. rot, R.o. grün. ................................................................ 70
Tabelle 20. Wachstumsraten und Verdopplungszeiten der verschiedenen Transkonjuganten basierend auf den R.
eutropha Stämme HF903 (∆hoxFU) und HF500 (∆hoxH) unter lithoautotrophen Wachstumsbedingungen.
..................................................................................................................................................................... 73
Tabelle 21. Verwendete Plasmidkonstrukte, die HoxF-Varianten mit Aminosäureaustausche in der NAD(H)-
Bindetasche kodieren. .................................................................................................................................. 86
Tabelle 22. H2-abhängige NAD(P)+-Reduktionsaktivität in Anwesenheit von O2 der SH-Varianten mit
Austauschen in der NAD(H)-Bindetasche von HoxF. ................................................................................. 90
Tabelle 23. KM- und kcat- Werte der SH-Varianten für die H2-abhängige NAD(P)+-Reduktion ........................... 92
Tabelle 24. KM- und kcat- Werte der SH-Varianten für die NAD(P)H- abhängige Reduktion von BV ................. 92
Tabelle 25. Vergleich der biochemischer Eigenschaften von löslichen, NAD(P)+-reduzierenden [NiFe]-
Hydrogenasen aus verschiedenen Mikroorganismen. .................................................................................. 98
Tabelle 26. Übersicht über die EPR-Zustände des [NiFe]-aktiven Zentrums in der HtSH im Vergleich zu ReSH
und der Standard-[NiFe]-Hydrogenase aus Allochromatium vinosum. ...................................................... 107
Tabelle 27. Vergleich der CO-Streckschwingungen (angegeben in cm-1) verschiedener NAD(P)-reduzierender
Hydrogenasen der Gruppe 3 in unterschiedlichen Redoxzuständen. ......................................................... 109
145
Tabelle 28. Übersicht über kinetische Parameter einiger Dehydrogenasen, die für die Kofaktorregeneration
verwendet werden ...................................................................................................................................... 119
Tabelle 29. Übersicht über die kinetischen Parameter der SH-Varianten für die Substrate NAD+ und NADP+, die
sowohl biochemisch (s. 3.5.4) als auch wie elektrochemisch gemessen wurden. ...................................... 120
8 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1. Struktur der sogenannten Standard-[NiFe]-Hydrogenase bestehend aus einer großen (rot; engl.:
„large subunit") und kleinen (grün, engl.: „small subunit") Untereinheit nach M. Horch et al. (2010).. ...... 3
Abbildung 2. Schema des allgemeinen katalytischen Zyklus von [NiFe]-Hydrogenasen für die Umwandlung von
H2 (linke Seite) sowie die oxidative Inaktivierung des aktiven Zentrums (rechte Seite). .............................. 7
Abbildung 3. Schematische Darstellung der vier [NiFe]-Hydrogenasen aus R. eutropha H16 basierend auf
Kapitel 4 in Rögner „Biohydrogen“ (2011). .................................................................................................. 9
Abbildung 4. Schema der H2-abhängigen NADH-Regeneration .......................................................................... 16
Abbildung 5: Einfluss von NaCl und KCl auf die H2-abhängige Reduktion von NAD+ der gereinigten HtSH bei
50 °C. ........................................................................................................................................................... 55
Abbildung 6. Reinigung der HtSH aus dem Stamm HF1054 (pJP09). ................................................................. 56
Abbildung 7. H2-abhängige NAD+ Reduktionsaktivität der HtSH bei verschiedenen Temperaturen. ................. 57
Abbildung 8. Aktivität der HtSH bei verschiedenen pH-Werten ......................................................................... 58
Abbildung 9. Michaelis-Menten Kinetiken der HtSH für die Substrate NAD+ (a), NADH (b), H2 (c) ................ 59
Abbildung 10. Reaktivierungsverhalten der HtSH mit verschiedenen Reduktionsmitteln bzw. Proteinmengen. 62
Abbildung 11. H2-abhängige Reduktion von NAD+ zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Reinigung (a) und in
Gegenwart verschiedener Metallsalze (b) .................................................................................................... 63
Abbildung 12. Phylogenetische Bäume zur Darstellung der Verwandtschaft zwischen den Aminosäure-
Sequenzen der SH-Untereinheiten aus verschiedenen Organismen ............................................................. 64
Abbildung 13. IR- (links) und EPR- (rechts) Spektren der gereinigten HtSH in verschiedenen Zuständen. ....... 66
Abbildung 14. Lithoautotrophes Wachstum von HF903 (∆hoxFU) (a) bzw. HF500 (∆hoxH) (b) mithilfe
chimärer Hydrogenase-Varianten ................................................................................................................ 72
Abbildung 15. Lithoautotrophes Wachstum der verschiedenen HF903 (∆hoxFU)- und HF500 (∆hoxH)-Stämme
in Minimalmedium unter einer Atmosphäre aus 10% H2, 5 % O2, 10 % CO2 und 75% N2 bei 30 ° C. ...... 73
Abbildung 16. Immunulogische Nachweis der SH-Untereiheiten in rekombinanten R.-eutropha-Stämmen, die
SH-Hybridproteine synthetisieren.. ............................................................................................................. 75
Abbildung 17. Spezifische H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten in den löslichen Extrakten der
Transkonjuganten der R. eutropha-Stämme HF903 (∆hoxFU) bzw. HF500 (∆hoxH) mit den angegebenen
Plasmiden ohne und in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2.. ............................................. 77
Abbildung 18. SDS-Gel (a) und Western-Blot (b) der gereinigten SH-Chimären aus HF903 (∆hoxFU) bzw.
HF500 (∆hoxH). .......................................................................................................................................... 79
Abbildung 19. Spezifische H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten der gereinigten SH-Chimären aus den
Stämmen HF903 bzw. HF500 ohne und in Anwesenheit von 0.5 mM NiCl2 und 5 mM MgCl2. ................ 80
146
Abbildung 20. H2-abhängige Reduktion von NAD+ katalysiert von der heterotetrameren HtSH (grau) und den
SH-Varianten bestehend aus ReHoxFU und HtHoxHY (rot) bzw. RoHoxHY (orange) in Gegenwart von
verschiedenen Salzen ................................................................................................................................... 82
Abbildung 21. H2-abhängige NAD+-Reduktionsaktivitäten (%) und Anlaufphase (Lagtime/ min) der SH-
Chimäre bestehend aus HtHoxHY und ReHoxFU in Anwesenheit von verschiedenen Salzen nach
Reinigung und Inkubation unter reduzierenden Bedingungen in einer anaeroben Box (ABox). ................. 83
Abbildung 22. Darstellungen der Untereinheiten- und Kofaktorzusammensetzung der löslichen, NAD+-
reduzierenden [NiFe]-Hydrogenase aus R. eutropha H16. .......................................................................... 85
Abbildung 22. SDS-PAGE der verschiedenen, mittels Affinitätschromatographie gereinigten SH-Derivate ...... 87
Abbildung 23. Spezifische Aktivitäten der SH-Derivate mit Aminosäureaustauschen in HoxF. ......................... 88
Abbildung 24. Fähigkeit der SH-Varianten mit Aminosäureaustauschen in HoxF lithoautotrophes Wachstum mit
H2, CO2 und O2 zu vermitteln. ..................................................................................................................... 89
Abbildung 26. Zyklische Voltamogramme der SH-Varianten in Gegenwart von NAD(P)+. ............................... 94
Abbildung 27. Reduktion der C=C-Doppelbindung von Cyclohexenon in einer gekoppelten Enzymreaktion mit
SHE341/S342R und der EnreduktasePETNR. .................................................................................................... 95
Abbildung 28. NADPH- sowie O2-abhängige Oktanoxidation durch P450-Monooxygenasen unter Verwendung
der der Kofaktorregenerationssysteme H2/SHE341A/S342R sowie Glukose/GDH ............................................ 96
Abbildung 29. Ausschnitte aus einem multiplen Sequenzvergleich der HoxY-Proteine aus verschiedenen
Organismen ................................................................................................................................................ 102
Abbildung 30. Ausschnitte aus dem multiplen Sequenzvergleich von HoxH aus verschiedenen Organismen .. 103
Abbildung 31. Verschiedene Ansichten der HtSH Struktur unter reduzierenden Bedingungen (pdb 5xf9) ....... 106
Abbildung 32. Darstellungen des oxidierten (links) und reduzierten (rechts) [NiFe]-Zentrums in der HoxH-
Untereinheit der HtSH. .............................................................................................................................. 108
Abbildung 33. Darstellung der HoxH-Untereinheit aus. R. eutropha (a), R. opacus (b) und H. thermoluteolus (c,
d). ............................................................................................................................................................... 115
Abbildung 34. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxF aus verschiedenen
Organismen ................................................................................................................................................ 124
Abbildung 35. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxH aus verschiedenen
Organismens .............................................................................................................................................. 125
Abbildung 36. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxU aus verschiedenen
Organismens .............................................................................................................................................. 126
Abbildung 37. Multipler Aminosäuresequenzvergleich der SH-Untereinheit HoxY aus verschiedenen
Organismen. s ............................................................................................................................................ 126
Abbildung 38. EPR-Spektrum der as-isolated (a), mit TCEP/NADH-reduzierten (b) und mit TCEP/NADH/H2-
reduzierten (c) HtSH. ................................................................................................................................. 127
147
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Arbeit selbstständig verfasst und keine
weiteren als die angegebenen Hilfsmittel verwendet habe.
Berlin, den
Janina Preissler
