Ex vivo Charakterisierung von humanen
Autoantigen-spezifischen CD4
+
T-Zellen
mit Fokus auf Multiple Sklerose
vorgelegt von
Diplom Hum.-Biol.
Stefanie Gamradt
geb. in Berlin
von der Fakultät III - Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doctor rerum naturalium (Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss
Vorsitzender: Prof. Dr. Peter Neubauer
Gutachter: Prof. Dr. Roland Lauster
Gutachter: Prof. Dr. Alexander Scheffold
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 4. Juli 2017
Berlin 2017
Für Roman
und meine Eltern
Inhaltsverzeichnis
I
Inhaltsverzeichnis
Zusammenfassung ........................................................................................................................... VI
Abstract .......................................................................................................................................... VIII
1
Einleitung .................................................................................................................................... 1
1.1
Grundzüge des Immunsystems......................................................................................... 1
1.2
T-Lymphozyten .................................................................................................................. 2
1.2.1
Entwicklung und primäre Aktivierung .................................................................... 2
1.2.2
CD4
+
T-Zell Differenzierung .................................................................................... 4
1.3
Toleranz und Autoimmunität ........................................................................................... 9
1.3.1
Zentrale und periphere Toleranzmechanismen ..................................................... 9
1.3.2
CD4
+
T-Zellen und Autoimmunität....................................................................... 11
1.4
Diabetes Mellitus Typ I .................................................................................................... 13
1.5
Myasthenia gravis ............................................................................................................. 14
1.6
Multiple Sklerose .............................................................................................................. 15
1.6.1
Mögliche Ursachen und Pathogenese .................................................................... 15
1.6.2
Die Rolle von CD4
+
T-Zellen .................................................................................. 18
1.6.3
Die Rolle von Myelin-spezifischen CD4
+
T-Zellen .............................................. 19
1.7
Methoden zur Detektion von Autoantigen-spezifischen CD4
+
T-Zellen .................. 21
2
Zielstellung ................................................................................................................................ 24
3
Material ..................................................................................................................................... 25
3.1
Patienten- und Kontrollproben ...................................................................................... 25
3.2
Geräte ................................................................................................................................. 27
3.3
Verbrauchsmaterial .......................................................................................................... 28
3.4
Chemikalien, Medien und Zusätze ................................................................................. 29
3.5
Zusammensetzung verwendeter Puffer und Medien ................................................... 30
Inhaltsverzeichnis
II
3.5.1
Puffer .......................................................................................................................... 30
3.5.2
Medien ....................................................................................................................... 30
3.6
Kits ...................................................................................................................................... 31
3.7
Antikörper ......................................................................................................................... 31
3.8
Antigene ............................................................................................................................. 33
3.9
Software ............................................................................................................................. 34
4
Methoden .................................................................................................................................. 35
4.1
Direkte ex vivo Charakterisierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen ........................ 35
4.1.1
Isolierung von PBMCs mittels Dichtegradienten-Zentrifugation ...................... 36
4.1.2
Oberflächenfärbung von CXCR3 und CCR6 ........................................................ 36
4.1.3
Stimulation von PBMCs .......................................................................................... 37
4.1.4
Magnetische Anreicherung von CD154
+
und CD137
+
T-Zellen ........................ 37
4.1.5
Markierung der Zellen mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern ................ 38
4.1.5.1
Oberflächenfärbung ......................................................................................... 38
4.1.5.2
Intrazelluläre CD154 und Zytokinfärbung .................................................... 39
4.1.5.3
Intranukleäre FoxP3-Färbung ......................................................................... 39
4.1.6
Durchflusszytometrische Messung......................................................................... 40
4.1.6.1
Gating-Strategie und Auswertung .................................................................. 41
4.1.6.2
Boolesche Analyse ............................................................................................ 42
4.2
In vitro Generierung von autoreaktiven T-Zell-Klonen und T-Zell-Linien ............. 43
4.2.1
Generierung von allogenen Feederzellen .............................................................. 44
4.2.2
Anreicherung von CD154
+
T-Zellen und Färbung von
Oberflächenmolekülen ............................................................................................. 45
4.2.3
FACS-Sortierung und in vitro Expansion ............................................................. 45
4.2.4
Generierung von CD3-depletierten Antigen-präsentierenden Zellen ............... 47
4.2.5
Restimulation, Markierung mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern und
durchflusszytometrische Analyse ........................................................................... 47
Inhaltsverzeichnis
III
4.2.5.1
Validierung der Spezifität ................................................................................ 47
4.2.5.2
Untersuchung auf Kreuzreaktivität ................................................................ 49
4.2.5.3
Bestimmung der funktionellen Avidität ........................................................ 49
4.3
T-Zell-Rezeptor-Sequenzierung ..................................................................................... 50
4.3.1
Isolierung der genomischen DNA .......................................................................... 50
4.3.2
Hochdurchsatz-Sequenzierung ............................................................................... 51
4.4
Statistik und Berechnungen ............................................................................................ 51
4.4.1
Berechnung der Frequenzen von Antigen-spezifischen T-Zellen ...................... 51
4.4.2
Statistische Tests ....................................................................................................... 51
4.4.3
Spearman-Korrelation ............................................................................................. 52
4.5
Angaben zu Kollaborationen .......................................................................................... 52
5
Ergebnisse ................................................................................................................................. 53
5.1
Implementierung und Validierung einer Methode zur direkten ex vivo Detektion
von Autoantigen-spezifischen CD4
+
T-Zellen .............................................................. 53
5.1.1
Anreicherung von autoreaktiven CD154
+
CD4
+
T-Zellen .................................. 53
5.1.2
Prävalenz von autoreaktiven T-Zellen in Gesunden ............................................ 55
5.1.3
Generierung von Autoantigen-spezifischen T-Zell-Klonen ............................... 57
5.1.3.1
Klonierungseffizienzen .................................................................................... 58
5.1.3.2
Validierung der Spezifität ................................................................................ 58
5.1.4
Einfluss von in vitro Expansion auf die Klonalität von Antigen-spezifischen
T-Zell Populationen ................................................................................................. 60
5.2
Multiparameter-Charakterisierung von Autoantigen-spezifischen T-Zellen in
gesunden Individuen ........................................................................................................ 63
5.2.1
Untersuchung des Phänotyps und der Zytokinproduktion ................................ 63
5.2.2
Vergleich der Expression von CD45RO im autoreaktiven und im
Gesamt-T-Zell-Repertoire ....................................................................................... 67
5.2.3
Bestimmung der funktionellen Avidität autoreaktiver T-Zell-Linien ............... 69
Inhaltsverzeichnis
IV
5.2.4
Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen ....................................................... 71
5.3
Charakterisierung von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in MS-Patienten .............. 75
5.3.1
Quantifizierung und Phänotypisierung ................................................................. 75
5.3.1.1
Bestimmung der Frequenz .............................................................................. 76
5.3.1.2
Untersuchung des Phänotyps ......................................................................... 77
5.3.1.3
Korrelationen mit klinischen Parametern ..................................................... 78
5.3.2
Funktionelle Charakterisierung .............................................................................. 80
5.3.2.1
Expression von inflammatorischen Zytokinen ............................................. 81
5.3.2.2
Expression von Chemokinrezeptoren ............................................................ 84
5.3.2.3
Bestimmung der funktionellen Avidität Myelin-reaktiver T-Zell Klone .. 87
5.3.3
Myelin-spezifische regulatorische T-Zellen .......................................................... 90
6
Diskussion ................................................................................................................................. 93
6.1
Die Anreicherung von CD154
+
T-Zellen ermöglicht eine spezifische und
detaillierte ex vivo Charakterisierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen ................. 93
6.2
Autoreaktive naive und Memory T-Zellen können in Gesunden detektiert
werden ................................................................................................................................ 95
6.3
Keine Hinweise auf Autoantigen-induzierte Expansion von Memory T-Zellen ..... 97
6.4
Autoreaktive T-Zellen kreuzreagieren mit mikrobiellen Antigenen ......................... 98
6.5
Gleiche Prävalenz von Myelin-reaktiven T-Zellen in Gesunden und
MS-Patienten ................................................................................................................... 101
6.6
Myelin-spezifische T-Zellen von MS-Patienten und Gesunden zeigen nur
geringe funktionelle Unterschiede ............................................................................... 102
6.7
Myelin-reaktive T-Zellen zeigen eine geringe Antigensensitivität ........................... 105
6.8
Myelin-reaktive regulatorische T-Zellen lassen sich mit Hilfe des
Aktivierungsmarkers CD137 detektieren und charakterisieren ............................... 107
6.9
Generelle statt Myelin-spezifische Verschiebung des Differenzierungs- und
Funktionsstatus von CD4
+
T-Zellen............................................................................. 111
Inhaltsverzeichnis
V
6.10
Limitationen, Schlussfolgerung und Ausblick ............................................................ 114
7
Literaturverzeichnis ............................................................................................................... 118
8
Anhänge .................................................................................................................................. 141
I.
Abbildungsverzeichnis ................................................................................................... 141
II.
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................ 143
III.
Abkürzungsverzeichnis .................................................................................................. 144
IV.
Danksagung ..................................................................................................................... 147
V.
Eidesstattliche Erklärung ............................................................................................... 148
VI.
Lebenslauf ........................................................................................................................ 149
VII.
Publikationsliste .............................................................................................................. 151
Zusammenfassung/Abstract
VI
Zusammenfassung
Trotz intensiver Forschung ist unklar, ob Myelin-reaktive CD4
+
T-Zellen in der Pathogenese
der Multiplen Sklerose (MS) eine relevante Rolle spielen. Ein Grund dafür ist das Fehlen
einer Methode für ihre direkte Analyse. In dieser Arbeit ist es mit Hilfe der magnetischen
Anreicherung von spezifisch-aktivierten CD154
+
konventionellen und CD137
+
regulato-
rischen T-Zellen in Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie gelungen,
seltene autoreaktive CD4
+
T-Zellen aus dem peripheren Blut von gesunden Personen und
MS-Patienten direkt ex vivo zu detektieren und detailliert zu charakterisieren.
Im ersten Teil dieser Arbeit wurden autoreaktive CD4
+
T-Zellen von gesunden Individuen
bezüglich ihrer Frequenz, ihres Phänotyps und ihrer Funktion untersucht. Anschließend
wurde der Fokus auf die vergleichende Analyse von T-Zellen mit Spezifität für das Myelin
basische Protein (MBP), das Myelin-Oligodendrozyten Protein (MOG) und das
Proteolipidprotein (PLP) aus MS-Patienten und passenden gesunden Kontrollen gelegt.
CD4
+
T-Zellen mit Spezifitäten für Multiple Sklerose-, Diabetes mellitus Typ I- und
Myasthenia gravis-assoziierte Antigene waren in allen gesunden Individuen nachweisbar
und sind somit ein Bestandteil des normalen T-Zell-Repertoires. Die Frequenz von Myelin-
reaktiven T-Zellen unterschied sich dabei zwischen MS-Patienten und gesunden Personen
nicht. Ein deutlicher, aber variabler Anteil der Autoantigen-spezifischen T-Zellen wies einen
Memory-Phänotyp (CD45RO
+
) auf. Interessanterweise korrelierte der Anteil an
autoreaktiven Memory-T-Zellen in beiden Probandengruppen mit dem Anteil an
CD4
+
Memory T-Zellen innerhalb der Gesamt-T-Zell-Population. Diese Assoziation war
auch für Neoantigen-spezifische T-Zellen ersichtlich. Diese Tatsache spricht gegen eine
Autoantigen-induzierte klonale Expansion von Memory T-Zellen und weist auf eine initiale
Aktivierung durch ein mögliches Fremdantigen hin. In dieser Hinsicht konnte demonstriert
werden, dass autoreaktive T-Zell-Linien (TZL) mit verschiedenen, zufällig gewählten
mikrobiellen Antigenen kreuzreagieren können, wobei aus dem Memory-Repertoire
generierte TZL vorrangig auf virale Antigene reagierten.
Zusammenfassung/Abstract
VII
Autoantigen-spezifische Memory-T-Zellen waren in der Lage, inflammatorische (TNF-α,
IFN-γ, IL-17, GM-CSF) oder B-Zell-aktivierende (IL-4, IL-21) Zytokine zu produzieren. Sie
wiesen jedoch im Vergleich zum Recall-Antigen Mannoprotein 65 (MP65) von Candida
albicans eine deutlich geringere Antigensensitivität auf. Dies weist auf eine eingeschränkte
Selektion hochaffiner autoreaktiver T-Zell-Klone oder alternativ eine limitierte funktionelle
Aviditätsreifung im Laufe der Immunantwort hin. Zwischen MS-Patienten und gesunden
Kontrollen konnten nur wenig ausgeprägte funktionelle Unterschiede innerhalb der Myelin-
reaktiven Memory T-Zellen gefunden werden. Ein signifikant erhöhter Anteil an Memory
T-Zellen sowie CXCR3
+
/CCR6
+
(Th1/Th17) Zellen im Myelin-spezifischen Repertoire von
MS-Patienten spiegelte sich aber auch in der totalen CD4
+
T-Zell-Population wieder und
lässt daher eher auf generelle Veränderungen im Differenzierungs- und Funktionsstatus der CD4
+
T-Zellen von MS-Patienten und weniger auf eine Autoantigen-spezifische Modulation schließen.
Neben Myelin-spezifischen konventionellen CD154
+
T-Zellen konnten in dieser Arbeit in
einer kleinen Probandengruppe Myelin-reaktive regulatorische CD137
+
T-Zellen direkt
ex vivo detektiert werden. Diese Tatsache eröffnet neue Möglichkeiten für die Erforschung
von Toleranzmechanismen auf Antigen-spezifischer Ebene.
Insgesamt konnte die ex vivo Charakterisierung von Myelin-reaktiven T-Zellen aus dem
peripheren Blut keine Anhaltspunkte für ihre mögliche Schlüsselrolle bei MS liefern. Diese
Ergebnisse können zum Teil die mangelnde Wirksamkeit von spezifischen Immun-
therapeutika bei MS erklären, deren Einsatz vorranging auf der immunpathologischen
Relevanz Myelin-reaktiver CD4
+
T-Zellen im Tiermodell der MS (experimentelle
autoimmune Enzephalomyelitis = EAE) basierte. Der Erkrankungsverlauf im Menschen
wird im EAE-Modell unzureichend dargestellt. Der Fokus der Forschung sollte demnach
stärker auf die Suche nach relevanten Zielantigenen oder alternativen Tiermodellen und
Pathomechanismen gerichtet sein, um die Entwicklung neuer zielgerichteter Therapien zu
ermöglichen. Zukünftige Untersuchungen sollten weiterhin klären, ob und inwieweit
autoreaktive T-Zellen mit geringer Antigensensitivität zur Pathogenese von Autoimmun-
erkrankungen beitragen können.
Zusammenfassung/Abstract
VIII
Abstract
Despite extensive research, it is unclear whether myelin reactive CD4
+
T cells are key players
in the pathogenesis of multiple sclerosis (MS). This is mainly due to the lack of an
appropriate method for their direct identification. In this dissertation, a sensitive method
was applied to detect and systematically characterize rare myelin reactive CD4
+
T cells
directly ex vivo in the peripheral blood of healthy control subjects and MS patients. The
method is based on the magnetic enrichment of specifically activated CD154
+
T cells in
combination with multiparametric flow cytometry.
The first part of the dissertation focused on the analysis of the frequency, phenotype and
function of auto-reactive CD4
+
T cells in healthy individuals. Subsequently, the focus was set
on the comparative analysis of T cells specific for myelin basic protein (MBP ), myelin
oligodendrocyte protein (MOG) and proteolipid protein (PLP) from MS patients and
matched healthy control subjects.
CD4
+
T cells with specificities for multiple sclerosis-, diabetes- and myasthenia gravis-
associated antigens were detected in all healthy control subjects and are therefore part of a
normal T cell repertoire. The frequency of myelin reactive T cells did not differ between MS
patients and healthy control subjects. A distinct, but variable, quantity of autoantigen-
specific T cells presented a memory phenotype (CD45RO
+
). Interestingly, the proportion of
autoreactive memory T cells correlated with the proportion of memory T cells within the
entire CD4
+
T cell population in both cohorts. This association was also seen in neoantigen
specific T cells. This observation does not support autoantigen induced clonal expansion of
memory T cells and suggests an initial activation by a potential foreign antigen. In this
regard, it was demonstrated that autoreactive T cells lines can cross-react with different
randomly chosen microbial antigens, with memory-derived T cell lines predominantly
reacting to viral antigens.
Zusammenfassung/Abstract
IX
Autoantigen-specific memory T cells were able to produce inflammatory (TNF-α, IFN-γ,
IL-17, GM-CSF) or B cell activating (IL-4, IL-21) cytokines. However, compared to the recall
antigen Mannoprotein 65 (MP65) from Candida albicans, they revealed notably decreased
antigen sensitivity. This indicates a restricted selection of autoreactive T cell clones with high
affinity or, alternatively, a limited functional avidity maturation in the course of the immune
response. In MS patients and healthy control subjects, only minimal functional differences
within the myelin reactive memory T cells were found. A significantly increased proportion
of memory T cells as well as CXCR3
+
/CCR6
+
(Th1/Th17) cells in the myelin-specific
repertoire in MS patients was also reflected in the total CD4
+
T cell population. This finding
is indicative of more general changes in the differentiation and functional state of CD4
+
T cells in MS patients, rather than of an autoantigen-specific modulation.
In addition to myelin-specific conventional CD154
+
T cells, autoreactive CD137
+
regulatory
T cells could be detected directly ex vivo in a small group of study subjects. This opens up
new possibilities for the investigation of tolerance mechanisms at the antigen-specific level.
Conclusively, the ex vivo characterization of myelin specific T cells from the peripheral
blood did not provide profound evidence of them being key players in MS. These results can
in part explain the decreased efficacy of selective immune therapies in MS, which are mainly
based on the immunopathological relevance of myelin specific CD4
+
T cells in the animal
model of MS (experimental autoimmune encephalomyelitis = EAE). The disease course in
human is insufficiently presented in the EAE model. Therefore, the focus of research should
more strongly be on finding relevant target antigens or alternative animal models and
pathomechanisms in order to allow the development of new target-driven therapies. Future
analyses should furthermore determine whether autoreactive T cells with low antigen
sensitivity are able to contribute to the pathogenesis of autoimmune diseases.
Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Grundzüge des Immunsystems
Der Begriff Immunsystem bezeichnet die Gesamtheit aller Zellen, Gewebe, Organe und
Moleküle eines Organismus, welche zur Abwehr von infektiösen Organismen wie Bakterien,
Viren oder Parasiten beitragen. Zu den weiteren Funktionen gehört die Eliminierung von
körpereigenen Zellen, welche überaltert oder neoplastisch entartet sind, sowie die
Immunregulation. Das Immunsystem wird in die Mechanismen der angeborenen und der
adaptiven Immunität unterteilt, bei welcher jeweils zellvermittelte und humorale (nicht-
zellvermittelte) Prozesse zusammenwirken (Übersicht in [1]).
Überwinden Pathogene die natürlichen Schutzbarrieren des Körpers, wie die Haut oder
Schleimhäute, werden im Gewebe innerhalb kürzester Zeit die Zellen des angeborenen
Immunsystems aktiv. Phagozytierende Makrophagen und neutrophile Granulozyten
erkennen und eliminieren Mikroorganismen, welche bestimmte konservierte Strukturen auf
der Oberfläche tragen (pathogen-associated molecular patterns = PAMPs). Daneben
markieren die humoralen Komponenten des Komplementsystems Pathogene für die
anschließende Aufnahme durch Phagozyten. Natürliche Killerzellen (NK-Zellen) erkennen
virusinfizierte und entartete Zellen und können diese abtöten. Die angeborenen
Mechanismen sind hocheffektiv, aber relativ unspezifisch, sodass ihnen einige Pathogene
entkommen und nicht beseitigt werden können.
Dendritische Zellen sind auf die Präsentation von Bruchstücken (Peptid-Antigenen) der
zuvor aufgenommenen Mikroorganismen auf ihrer Zelloberfläche spezialisiert und bilden
die Schnittstelle zwischen der angeborenen und der adaptiven Immunantwort. Die präsen-
tierten Antigene werden von T-Lymphozyten, welche ein hoch-diverses Repertoire an
spezifischen Rezeptoren besitzen, erkannt. Anschließend können T-Lymphozyten infizierte
Zellen direkt eliminieren oder weitere Immunzellen rekrutieren und aktivieren. Die
Einleitung
2
humoralen Mechanismen der adaptiven Immunantwort werden durch lösliche Antikörper-
moleküle (Immunglobuline), welche von aktivierten B-Lymphozyten sekretiert werden,
vermittelt. Die Antikörper binden spezifisch an Pathogenstrukturen und führen zur Phago-
zytose, Zell-Lyse oder Inaktivierung. Eine wesentliche Eigenschaft des adaptiven Immun-
systems ist die Ausbildung eines immunologischen Gedächtnisses (Memory), wodurch eine
erneute Infektion mit dem gleichen Pathogen häufig schwächer oder subklinisch verläuft.
1.2 T-Lymphozyten
1.2.1 Entwicklung und primäre Aktivierung
Die Vorläufer der T-Lymphozyten (im Folgenden: T-Zellen) entstehen im Knochenmark
und bilden während ihrer Reifung im Thymus Rezeptoren zur Erkennung von Antigenen
aus. Diese T-Zell-Rezeptoren (TCRs) bestehen bei einem Großteil der T-Zellen (>85%) aus
einer α- und einer β-Kette. Ein kleinerer Teil der T-Zellen exprimiert γ:δ-TCRs. TCRs
besitzen eine konstante und eine variable Region, wobei letztere die Antigenbindungsstelle
enthält. Der TCR ist mit einer Gruppe von integralen Membranproteinen, dem CD3-
Komplex, assoziiert. Dieser besteht aus je einem γ- und δ-Molekül, zwei ε-Molekülen und
zwei ζ-Ketten, welche an der Signalweiterleitung beteiligt sind (Übersicht in [2] und Abb. 1).
Die beträchtliche Diversität des TCR-Repertoires, welche mit >10
20
theoretischen und
mindestens 2,5x10
7
tatsächlich ausgeprägten Spezifitäten beziffert wird [3], entsteht vor
allem durch den Prozess der somatischen Rekombination. Dabei werden V- (variable), D-
(diversity) und J-(joining) DNA-Segmente des α- und β-Genlokus zufällig zusammengefügt,
sodass TCRs mit einzigartigen Spezifitäten entstehen, welche die Erkennung und
Bekämpfung des vielfältigen Spektrums an Pathogenen ermöglichen (Übersicht in [4]).
T-Zellen gelangen nach ihrer Reifung im Thymus als naive Zellen in die Peripherie. Dort
zirkulieren sie durch das Blut und die Lymphgefäße zu den sekundären lymphatischen
Organen (Lymphknoten, Milz und Mukosa-assoziiertes lymphatisches Gewebe). In den
Einleitung
3
sekundären lymphatischen Organen erkennen T-Zellen Antigene nur, wenn sie von profes-
sionellen Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) nach Bindung an den Major Histocom-
patibility Complex (MHC) präsentiert werden. Dabei werden zwei Gruppen von T-Zellen
unterschieden: Zytotoxische CD8
+
T-Zellen erkennen auf MHC-I präsentierte intrazelluläre
Antigene wie z. B. Viren [5]. Virale Proteine werden dabei in einzelne Peptide zerlegt und
auf das MHC-I-Molekül geladen. Nach der Erkennung des Antigens können CD8
+
T-Zellen
virusinfizierte Zellen durch die Sekretion von zytotoxischen Molekülen töten und damit
einer Verbreitung des Virus entgegenwirken. CD4
+
T-Helferzellen (im Folgenden: CD4
+
T-Zellen) erkennen dagegen extrazelluläre Pathogene wie z. B. bestimmte Bakterien, welche
zuvor von APCs endozytiert, prozessiert und auf MHC-II-Molekülen präsentiert worden
sind (Abb. 1 und Übersicht in [6]). Sie regulieren die Aktivierung weiterer Immunzellen, um
Pathogene möglichst effektiv eliminieren zu können. Im Menschen werden die MHC-
Moleküle auch als Human Leukocyte Antigen (HLA) bezeichnet.
Abb. 1: Schematische Darstellung der Interaktion einer APC und einer CD4
+
T-Zelle.
CD4
+
T-Zellen erkennen extrazelluläre Antigene, welche von APCs aufgenommen, prozessiert und
auf MHC-II-Molekülen präsentiert werden, mit Hilfe ihres TCR. Dieser besteht aus einer α- und
einer β-Kette, welche jeweils eine konstante (c) und eine variable (v) Region enthalten. Die
variable Region enthält die Antigenbindungsstelle. Eine Aktivierung der T-Zelle erfolgt, wenn
zusätzliche kostimulatorische Signale durch Interaktion der Moleküle CD28 auf der T-Zelle mit
CD80/86 auf der APC geliefert werden. Nach ihrer Aktivierung exprimieren T-Zellen transient das
Molekül CD40L (CD154) auf ihrer Oberfläche, welches durch Interaktion mit CD40 auf der APC zu
ihrer Kostimulation beiträgt. (Abb. modifiziert nach [1]).
CD4
+
T- Zelle
MHC
II
CD28
CD8 0/ 86
CD4
V
α
V
β
C
α
δε
ζ ζ
εγ
C
β
CD40
CD3 CD3
AP Z
CD40L
(CD154)
Einleitung
4
Neben der passenden Peptid-MHC-Kombination (pMHC) benötigen T-Zellen zusätzliche
kostimulatorische Signale, um aktiviert zu werden. Diese erhalten sie vorrangig durch die
Interaktion der Oberflächenmoleküle CD28 auf der T-Zelle mit CD80/86 auf der APC.
Aktivierte T-Zellen exprimieren transient das Molekül CD154 (CD40L) auf ihrer
Oberfläche, welches durch Bindung an seinen Liganden CD40 die Funktion der APC
reguliert. Zusätzlich erhalten T-Zellen Differenzierungssignale durch die APC (siehe 1.2.2).
Aktivierte T-Zellen produzieren den Wachstumsfaktor Interleukin (IL)-2, welcher durch
autokrine positive Rückkopplung über den IL-2-Rezeptor zu ihrer Proliferation führt.
1.2.2 CD4
+
T-Zell Differenzierung
Abhängig von der Qualität und der Stärke des aktivierenden Signals sowie dem lokalen
Zytokinmilieu differenzieren naive (T
N
) CD4
+
T-Zellen zu verschiedenen Effektor-T-Zell-
Populationen (Zusammenfassung in Tab. 1). Diese Zellen übernehmen jeweils spezifische
Effektor-Funktionen und können in entzündetes Gewebe migrieren (= Homing), wo sie
weitere Immunzellen anlocken und aktivieren. Die unterschiedlichen CD4
+
T-Zell-
Subpopulationen sind durch die Expression spezifischer Transkriptionsfaktoren (TF) und
-regulatoren, Zytokinen und Oberflächenmolekülen charakterisiert [7-9]. Daneben
exprimieren sie verschiedene Chemokinrezeptoren, welche nach Interaktion mit ihren
entsprechenden Liganden die Migration regulieren [10-12].
Nach der erfolgreichen Eliminierung des Antigens, wie beispielweise einem extrazellulären
Bakterium, verbleiben einige der Antigen-spezifischen Zellen als Gedächtnis-T-Zellen (im
Folgenden: Memory T-Zellen) im Körper, um bei einer erneuten Infektion eine schnellere
und effizientere Immunantwort zu gewährleisten. Naive und Memory T-Zellen können
anhand der Expression bestimmter Oberflächenmarker charakterisiert werden (Tab. 1 und
[13, 14]). So tragen naive T-Zellen die Isoform CD45RA der Protein-Tyrosinkinase CD45
sowie den Chemokinrezeptor CCR7, welcher den Eintritt in die sekundären lymphatischen
Organe vermittelt, auf ihrer Zelloberfläche. Nach ihrer Aktivierung und Differenzierung zu
Einleitung
5
Memory T-Zellen exprimieren sie statt CD45RA die kürzere Isoform CD45RO. Während
zentrale Memory T-Zellen (T
CM
) CCR7 weiterhin exprimieren und eine limitierte
Effektorfunktion sowie eine hohe Proliferationskapazität aufweisen, sind Effektor-Memory
T-Zellen (T
EM
) negativ für CCR7 und nehmen in peripheren Geweben schnell ihre
Effektorfunktion auf. Terminale Effektor-Memory T-Zellen (T
EMRA
), welche CD45RA re-
exprimieren, besitzen Eigenschaften von seneszenten Zellen und weisen eine geringe
proliferative und funktionelle Kapazität auf [14].
Tab. 1: Charakteristika von CD4
+
T-Zell-Subpopulationen. Modifiziert nach [8, 10, 14]
Subtyp Induzierende
Zytokine
Transkrip-
tionsfaktor
Charakteristi-
sche Zytokine
Phänotyp Funktion
T
N
IL-2 CD45RA
+
,
CCR7
+
Vorläuferzellen
T
CM
IL-2, IL-21 CD45RO
+
,
CCR7
+
B-Zell-Hilfe, sekundäre
Expansion
T
EM
TNF-α, IFN-γ,
IL-4, IL-5,
IL-17
CD45RO
+
,
CCR7
−
Schutz in Geweben,
B-Zell-Hilfe
T
EMRA
TNF-α, IFN-γ CD45RA
+
,
CCR7
−
terminal differenzierte
Zellen
Th1 IL-12 T-bet IFN-γ,
GM-CSF
CXCR3
+
,
CCR5
+
Schutz gegen
intrazelluläre
Pathogene
Th2 IL-4 GATA-3 IL-4, IL-5,
IL-10, IL-13
CCR4
+
,
CRTh2
+
Schutz gegen
extrazelluläre Parasiten
Th17 TGF-β, IL-6,
IL-1β, IL-23
RORC2 IL-17,
GM-CSF
CCR6
+
,
CCR4
+
Schutz gegen
extrazelluläre Pilze und
Bakterien
Tfh IL-6, IL-21 Bcl-6 IL-21, IL-4 CXCR5
+
,
ICOS
+
, PD-1
+
B-Zell-Hilfe
nTreg - FoxP3 TGF-β CD25
+
,
CD127
−
(Selbst-)Toleranz
T
N
naive T-Zellen; T
CM
zentrale Memory T-Zellen; T
EM
Effektor-Memory T-Zellen; T
EMRA
terminale Effektor-
Memory T-Zellen; Th1/2/17 T-Helfer-Zellen Typ 1/2/ 17; Tfh follikuläre T-Helfer-Zellen; nTreg natürliche
regulatorische T-Zellen
Einleitung
6
Th1-Zellen
Naive CD4
+
T-Zellen, welche in Gegenwart des Zytokins IL-12 aktiviert werden, entwickeln
sich zu T-Helfer-Zellen Typ 1 (Th1-Zellen; zusammengefasst in [8, 15]). Th1-Zellen
exprimieren den TF T-bet und produzieren vorrangig IFN-γ. Gleichzeitig unterdrückt T-bet
die Expression von IL-4. Daneben ist im Menschen die Ko-Expression von GM-CSF durch
einen Teil der Th1-Zellen beschrieben worden [16]. Th1-Zellen vermitteln die zelluläre
Immunität nach Infektionen mit intrazellulären Bakterien und Viren durch die
Rekrutierung und Aktivierung von Makrophagen. IFN-γ hemmt darüber hinaus die virale
Replikation und stimuliert die zytolytische Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK-
Zellen) [14]. Über die Expression des Chemokinrezeptors CXCR3 wird ihre Migration in
Gewebe mit Th1-vermittelter Inflammation gesteuert [17].
Th2-Zellen
Die Anwesenheit von IL-4 führt nach Aktivierung von naiven CD4
+
T-Zellen zur
Differenzierung von Th2-Zellen, welche hauptsächlich IL-4, IL-5, IL-10 und IL-13
produzieren (zusammengefasst in [18]). IL-4 induziert die Produktion von IgE durch
B-Zellen, welches zur Eliminierung extrazellulärer Parasiten wie Helminthen (Würmern)
beiträgt. Daneben spielt IgE eine wichtige Rolle im Zuge der Entwicklung von allergischen
Reaktionen wie Asthma oder atopischer Dermatitis. Th2-Zellen werden durch den TF
GATA-3 reguliert und tragen die Moleküle CCR4 und CRTH2 auf ihrer Oberfläche,
wodurch sie in Gewebe mit allergischer Inflammation migrieren können [19].
Th17-Zellen
Eine Kombination aus den Zytokinen IL-6, TGF-β, IL-1β und IL-23 induziert die Entwick-
lung von Th17-Zellen nach Aktivierung naiver CD4
+
T-Zellen, allerdings ist die
Einflussstärke der einzelnen Faktoren im humanen System noch nicht vollständig geklärt
(zusammengefasst in [8]). Th17-Zellen exprimieren den TF RORC2 (das humane Analog zu
Einleitung
7
RORγ-t in der Maus) und spielen eine wichtige Rolle bei der Bekämpfung von
extrazellulären Pilzen und Bakterien. Die von Th17-Zellen exprimierten
Chemokinrezeptoren CCR4 und CCR6 vermitteln ihre Migration in Haut und Schleimhäute
[20]. Das charakteristische Zytokin der Th17-Zellen ist IL-17, jedoch ist insbesondere in der
Maus die Expression von GM-CSF von einem Teil der Zellen beschrieben [21, 22].
Tfh-Zellen
Follikuläre T-Helfer-Zellen (Tfh) sind ein spezialisierter Subtyp, welcher die Antigen-
spezifische B-Zell-Immunität reguliert (zusammengefasst in [23]). Die induzierenden
Zytokine IL-6 und IL-21 regulieren die Expression des Tfh-spezifischen Transkriptions-
faktors Bcl-6. Sie tragen u.a. durch die Expression der Zytokine IL-21 und IL-4 zu einer
Differenzierung und Aktivierung von B-Zellen und schließlich zur Produktion von
Antikörpern bei (B-Zell-Hilfe). Tfh-Zellen exprimieren den Chemokinrezeptor CXCR5, mit
dessen Hilfe sie zu den B-Zell-Follikeln des lymphatischen Gewebes migrieren können. Da
Tfh-Zellen in der Lage sind, Th1-, Th2- und Th17-assoziierte Zytokine zu produzieren, ist
momentan noch unklar, ob sie eine eigenständige Subpopulation bilden oder aus den
anderen T-Helfer-Zell-Populationen hervorgehen [24].
Neben Th1-, Th2-, Th17- und Tfh-Zellen sind zudem weitere Subtypen wie Th9 und Th22-
Zellen beschrieben, deren Funktion und Regulation aktuell untersucht wird [24]. Es wird
weiterhin darüber spekuliert, ob CD4
+
T-Zellen, welche GM-CSF in der Abwesenheit
weiterer charakteristischer Effektor-Zytokine produzieren, einen eigenen Subtyp darstellen
[16, 25].
Regulatorische T-Zellen
Regulatorische T-Zellen (Tregs) können Immunantworten der konventionellen CD4
+
T-Zell-Populationen (Tcons) eindämmen oder unterdrücken und tragen zur peripheren
Toleranz bei. Natürliche Tregs (nTregs oder tTregs) entstehen im Thymus nach mittel- bis
Einleitung
8
hochaviden Interaktionen mit Selbst-Peptid-MHC-Komplexen (Abb. 2 und [26]). nTregs
exprimieren den TF FoxP3 konstitutiv und tragen zudem CD25, die α-Untereinheit des
hochaffinen IL-2-Rezeptors, auf ihrer Oberfläche [27]. Daneben exprimieren sie im
Vergleich zu Tcons wenig bis keinen IL-7-Rezeptor (CD127) [28]. Mutationen im FoxP3-
Lokus führen zur Dysfunktion oder zum kompletten Verlust von Tregs, was in der Folge
schwere systemische Autoimmunität, Allergien und Inflammation hervorruft [29]. nTregs
exprimieren unterschiedliche Chemokinrezeptoren, um lokale Inflammation direkt im
Gewebe regulieren zu können [10]. Funktionell spielen dabei u.a. direkte Zell-Zell-Kontakte
sowie die Ausschüttung von anti-inflammatorischen Zytokinen wie TGF-β eine Rolle [30].
Zusätzlich können Tregs in einer bestimmten Zytokinumgebung in der Peripherie oder in
vitro aus T
N
induziert werden (pTregs oder iTregs). Im Gegensatz zu nTregs zeigen vor
allem iTregs eine sehr unstabile Expression von FoxP3 [31].
Funktionelle Plastizität
Trotz ihrer Spezialisierung unterliegen die CD4
+
T-Zell-Subpopulationen einer gewissen
Instabilität und Plastizität [24, 32]. Dies trifft insbesondere auf den Th-17-Subtyp zu.
In vitro-Experimente konnten zeigen, dass sich Th17-Zellen direkt zu IFN-γ-
produzierenden, T-bet
+
Th1-Zellen (exTh17-Zellen oder nicht-klassische Th1-Zellen)
entwickeln können [9]. Sie unterschieden sich von konventionellen Th1-Zellen durch die
Expression von CD161 [33]. Die Differenzierung kann zudem über eine Zwischenstufe von
T-bet
+
/RORγ-t
+
Th1/Th17-Zellen erfolgen, welche in der Lage sind, sowohl IL-17 als auch
IFN-γ zu produzieren [8, 33]. ExTh17-Zellen und Th1/Th17-Zellen sind im peripheren Blut
nachweisbar, exprimieren die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CCR6 und weisen
polyfunktionale Zytokinprofile auf [12, 33].
Einleitung
9
1.3 Toleranz und Autoimmunität
Zwischen "selbst" und "fremd" unterscheiden zu können, ist eine wesentliche und wichtige
Eigenschaft des adaptiven Immunsystems. Trotz zahlreicher Mechanismen, die zur Toleranz
von T-Zellen gegenüber körpereigenen Antigenen beitragen, kommt es manchmal zur
Entstehung von organspezifischen oder systemischen Autoimmunerkrankungen.
1.3.1 Zentrale und periphere Toleranzmechanismen
Um zu verhindern, dass T-Zellen durch körpereigene Strukturen aktiviert werden, wird ihre
Toleranz gegenüber Selbst-Antigenen zunächst durch zentrale Toleranzmechanismen
während ihrer Reifung im Thymus sichergestellt. Dort können kortikale und medulläre
Thymus-Epithelzellen (cTECs bzw. mTECs) endogene Proteine prozessieren und auf MHC-
Molekülen präsentieren. Daneben werden Antigene, welche normalerweise nur lokal in
peripheren Geweben und Organen vorkommen, ektopisch von mTECs mit Hilfe des
Transkriptionsfaktors AIRE (Autoimmun-Regulator) exprimiert werden [34, 35].
T-Vorläuferzellen (Thymozyten), welche nicht in der Lage sind, an MHC-Moleküle zu
binden, erhalten keine Überlebenssignale (Abb. 2). Daneben werden T-Zellen, welche ein
Autoantigen in Kombination mit dem MHC-Komplex mit hoher Affinität binden, durch
negative Selektion in Apoptose geleitet und deletiert. Allerdings werden autoreaktive
T-Zellen nicht, wie ursprünglich angenommen, komplett aus dem Repertoire entfernt.
Niedrig-affine autoreaktive T-Zellen sowie T-Zellen, deren Antigene nicht oder nur schwach
im Thymus exprimiert werden, entkommen dem Selektionsprozess und gelangen als naive
T-Zellen in die Peripherie [36, 37].
Mittel- bis hochaffine TCR-pMHC-Interaktionen, welche zwischen den Signalstärken liegen,
die positive und negative Selektion steuern, führen darüber hinaus zur Ausbildung von
FoxP3
+
nTregs [38]. Insgesamt verlassen nur etwa 2-4% der Thymozyten den Thymus als
reife T-Zellen.
Einleitung
10
Abb. 2: Das Affinitätsmodell der T-Zell-Selektion im Thymus. Im Thymus bestimmt die Stärke
der Wechselwirkung des TCR mit dem Selbst-Peptid-MHC-Komplex die Entwicklung der T-Zellen.
Können diese nicht an den MHC-Komplex binden, erhalten sie keine Überlebenssignale. Eine zu
starke Affinität für den Selbst-Peptid-MHC-Komplex führt dagegen zur Eliminierung durch
negative Selektion. Nur T-Zellen, welche mit niedriger Affinität binden, erhalten positive Signale
und verlassen den Thymus als naive T-Zellen. Mittel- bis hochaffine Interaktionen können
daneben zur Entwicklung von nTregs führen, wobei es Bereiche mit stochastischer Überlappung
gibt, die entweder zur Deletion oder zur Ausbildung von Tregs führen. (Abb. modifiziert nach [39])
Es gibt zunehmende Hinweise darauf, dass autoreaktive CD4
+
T-Zellen mit einem breiten
Spektrum an Spezifitäten zum normalen T-Zell-Repertoire von gesunden Individuen
gehören. Da ein individueller TCR eine Vielzahl an Selbst- und Fremdpeptiden erkennen
kann (sog. Polyreaktivität oder degenerierte Antigenerkennung [40]), wird angenommen,
dass das Vorkommen von niedrig-affinen autoreaktiven T-Zellen in der Peripherie zu einem
breiten T-Zell Repertoire zur effektiven Detektion und Eliminierung von Pathogenen
beiträgt [41]. In murinen CD4
+
T-Zellen wurde gezeigt, dass eine zu stringente negative
Selektion im Thymus durch bestimmte Selbst-Peptide auch die Größe des T-Zell-
Repertoires spezifisch für Fremdpeptide reduziert [40, 42]. Daneben scheinen periphere
selbst-spezifische T-Zellen nützliche physiologische Funktionen in Bezug auf die
Gewebehomöostase und die Wundheilung zu haben [40].
In der Peripherie werden autoreaktive T-Zellen im gesunden Organismus durch die
Mechanismen der peripheren Toleranz unter Kontrolle gehalten [43]. Dazu gehört die
induzierte funktionelle Inaktivierung (Anergie), beispielsweise durch fehlende
kostimulatorische Signale, sowie die aktive Suppression durch Tregs. Wird das spezifische
keine Bindung
an MHC
naive T-Zelle
T
Reg
N
egati
v
e Selektion
Affinität
stochastische
Überlappung
Einleitung
11
Antigen nur in sehr geringer Dichte auf der Oberfläche von APCs oder von T-Zellen
räumlich isoliert in einem sog. immunprivilegierten Gewebe oder Organ exprimiert, so
bleibt die T-Zelle in einem inaktivierten Zustand (Ignoranz) [34].
1.3.2 CD4
+
T-Zellen und Autoimmunität
Unter noch ungeklärten Bedingungen können normalerweise selbst-tolerante T-Zellen
aktiviert werden und lokale Inflammation und Gewebeschädigung verursachen. Etwa 5-10%
der Bevölkerung in Industrieländern ist von Autoimmunerkrankungen wie Diabetes
mellitus Typ I (T1D), Rheumatoide Arthritis (RA) oder Multiple Sklerose (MS) betroffen
[44]. Die Inzidenz ist in den letzten Jahrzehnten stetig angestiegen [45, 46]. Obwohl ein
direkter Auslöser nicht bekannt ist, sprechen viele Daten für ein komplexes Zusammenspiel
aus genetischen Faktoren, Umwelteinflüssen und Immundysregulation.
Dass CD4
+
T-Zellen und insbesondere Autoantigen-spezifische T-Zellen eine Schlüsselrolle
innerhalb der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen spielen, konnte in verschiedenen
Tiermodellen durch adoptive Transferexperimente demonstriert werden (siehe 1.6.2 und
[47]). Im Menschen konnte die Relevanz von CD4
+
T-Zellen, welche im betroffenen Gewebe
zumeist angereichert sind, bisher nur indirekt bewiesen werden und ihre Zielantigene sind
teilweise noch nicht abschließend identifiziert (siehe 1.4-1.6). Potentiell pathogene CD4
+
T-Zell-Populationen sind intensiv charakterisiert worden. Vielfach wurde dabei eine
Verringerung der Anzahl oder Einschränkungen der suppressiven Funktion von FoxP3
+
Tregs beschrieben [48]. Da der größte Teil der FoxP3
+
Tregs im Thymus selektiert wird und
somit für Selbst-Spezifitäten angereichert ist, kann dies zu einem Bruch der Selbst-Toleranz
und zur Aktivierung autoreaktiver Tcons führen.
Th1- und Th-17-Zellen werden mit der Pathogenese von Autoimmunerkrankungen in
Verbindung gebracht (zusammengefasst in [49]). Ihre charakteristischen Zytokine IFN-γ
und IL-17 führen u.a. zur Rekrutierung und Aktivierung von Immunzellen des angeborenen
Einleitung
12
Immunsystems, wie Makrophagen und neutrophilen Granulozyten. Weiterhin verstärken sie
die Antigenpräsentation, die Funktion von B-Zellen und die Ausschüttung von weiteren
inflammatorischen Mediatoren wie Prostaglandin E2 oder Matrix-Metalloproteinasen,
welche zur Gewebeschädigung beitragen. Seit kurzem stehen darüber hinaus GM-CSF-
produzierende T-Zellen im Fokus der Forschung, da dieser Faktor essentiell an der
Entstehung der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), dem Tiermodell
der Multiplen Sklerose, beteiligt ist und seine Überexpression in transgenen Mäusen eine
spontane Erkrankung des zentralen Nervensystems (ZNS) auslösen kann [21, 22, 50]. Selbst-
spezifische CD4
+
T-Zellen, welche eines oder mehrere dieser entzündungsfördernden
Zytokine produzieren, konnten in Autoimmunpatienten detektiert werden (siehe 1.4-1.6.).
Es gibt Hinweise darauf, dass Infektionen mit der Aktivierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen in Verbindung stehen. Die Theorie der molekularen Mimikry geht davon aus, dass
(pathogene) Mikroorganismen Strukturen tragen, welche den Autoantigenen ähnlich sind
und dadurch kreuzreaktive T-Zellen aktivieren [37, 51, 52]. Mittlerweile ist klar, dass
molekulare Mimikry relativ häufig auftritt und nur im Kontext von chronisch entzündlichen
Prozessen und einer erhöhten Freisetzung und Präsentation von Gewebeantigenen zu einem
Verlust der Toleranz und Autoimmunität führt [53]. Darüber hinaus können autoreaktive
T-Zellen im inflammatorischen Kontext unspezifisch durch Zytokine aktiviert werden
(Bystander Aktivierung) [54].
In der Peripherie können posttranslationale Modifikation von Selbst-Antigenen zu einer
veränderten Präsentation und Immunogenität des Antigens beitragen. Normalerweise
niedrig affine, tolerante T-Zellen könnten den veränderten pMHC-Komplex mit hoher
Affinität binden und aktiviert werden [34]. So führt beispielsweise die Citrullinierung
bestimmter Strukturproteine zu verstärkten T-Zell-Antworten in RA-Patienten [55].
Einleitung
13
1.4 Diabetes Mellitus Typ I
Diabetes mellitus Typ I (T1D) ist eine chronische Autoimmunerkrankung, welche durch
Insulinmangel und einem daraus resultierenden erhöhten Blutglukosespiegel
gekennzeichnet ist [56]. T1D-Betroffene sind auf eine lebenslange exogene Insulingabe
angewiesen [57]. In der westlichen Welt liegt die Prävalenz bei etwa 40 pro 100.000
Individuen, wobei ein ansteigender Trend zu verzeichnen ist [58]. Der Insulinmangel
resultiert aus der Zerstörung von Insulin-produzierenden β-Zellen der Langerhans-Inseln
des Pankreas, welche in 70-90% der Fälle autoimmun vermittelt und mit dem Vorkommen
von spezifischen Autoantikörpern gegen Inselzell-Antigene, wie der 65 kDa Glutamat-
Decarboxylase (GAD65), Insulin oder dem Zink-Transporter 8 (ZNT8), assoziiert ist [56].
Autoantikörper können bereits Jahre vor der Erkrankung im Serum gefunden werden und
erscheinen sequentiell, allerdings entwickeln nicht alle Personen mit nachweisbaren
Autoantikörpern T1D [59, 60]. Obwohl die Autoantikörperproduktion durch B-Zellen
momentan der beste Biomarker der Erkrankung ist, scheinen autoreaktive T-Zellen eine
Hauptrolle bei der Zerstörung der β-Zellen zu spielen [61, 62].
Charakteristisch für T1D ist die Einwanderung von inflammatorischen Lymphozyten und
Makrophagen in die Langerhans-Inseln (sog. Insulitis). Freigesetzte Selbst-Antigene können
anschließend durch APCs in den lokalen Lymphknoten T-Zellen präsentiert werden [60]. Es
wurde demonstriert, dass sowohl gesunde Personen als auch T1D-Patienten Inselzell-spezi-
fische CD4
+
T-Zellen besitzen, wobei diese in Erkrankten jedoch einen Memory-Phänotyp
sowie eine höhere Avidität für den pMHC-Komplex aufweisen [62-64]. Darüber hinaus
konnte sowohl innerhalb der autoreaktiven T-Zell-Population als auch in der Gesamt-
population der CD4
+
T-Zellen eine erhöhter Anteil an inflammatorischen Zytokinprodu-
zenten (IL-17, IFN-γ) sowie IL-21-Produzenten festgestellt werden [65]. Weitere Studien
weisen darauf hin, dass sich Effektor-T-Zellen
von T1D-Patienten schlechter durch Tregs
supprimieren lassen [66, 67] oder Tregs intrinsische funktionelle Defekte aufweisen [68].
Einleitung
14
1.5 Myasthenia gravis
Myasthenia gravis (MG) gehört zu den neurologischen Erkrankungen und zeichnet sich
durch belastungsabhängige Muskelschwäche und schnelle muskuläre Ermüdung aus. Frauen
zeigen zumeist vor ihrem 40. Lebensjahr Symptome, während Männer oft erst nach dem
40. Lebensjahr erkranken [69]. MG dient als Prototyp für Antikörper-vermittelte
Autoimmunerkrankungen. Bei etwa 85% der Patienten können Autoantikörper gegen den
Acetylcholinrezeptor (AChR) im Serum nachgewiesen werden [70]. Diese führen zur
Inaktivierung des Rezeptors, vorrangig durch Internalisierung und Komplement-vermittelte
Gewebeschädigung [71]. Daneben weist ein kleinerer Teil der Patienten Autoantikörper
gegen die Muskel-spezifische Rezeptor-Tyrosinkinase (MuSK) und das low-density
lipoprotein receptor-related protein 4 (LRP4) auf [69]. Die essentielle Rolle von
Autoantikörpern in der Pathogenese von MG konnte im Tiermodell durch den passiven
Transfer von Autoantikörpern aus dem Serum von MG-Patienten unter der Entwicklung
einer MG-ähnlichen Erkrankung demonstriert werden [72-74].
Die zugrunde liegenden Mechanismen der Autoantikörperproduktion sind wenig erforscht.
Wie bei den meisten Autoimmunerkrankungen sind die Ursachen von MG multifaktoriell
und umfassen sowohl genetische Faktoren als auch Umwelteinflüsse. Einige Studien weisen
darauf hin, dass AChR-spezifische CD4
+
T-Zellen mit der Pathogenese von MG assoziiert
sein könnten. AChR-reaktive T-Zellen können in gesunden Personen und MG-Patienten
nachgewiesen werden [71, 75]. In einer aktuellen Studie fanden Cao et al. nach AChR-
Peptidstimulation einen erhöhten Anteil an proliferierenden CCR6
+
Memory T-Zellen in
MG-Patienten. Diese Zellen produzierten mehr IFN-γ, IL-17 und GM-CSF und weniger
IL-10 im Vergleich zu proliferierenden Zellen gesunder Kontrollen [71]. Weitere Unter-
suchungen zeigten darüber hinaus generelle Defekte innerhalb der Treg-Population [76, 77]
und eine erhöhte Anzahl an zirkulierenden follikulären T-Helferzellen (Tfh), welche zur
Aktivierung und Reifung der Antikörper-produzierenden B-Zellen beitragen könnten [78-80].
Einleitung
15
1.6 Multiple Sklerose
Multiple Sklerose (MS) ist eine chronisch inflammatorische und neurodegenerative
Erkrankung des ZNS [81]. Charakteristisch sind inflammatorische Zellinfiltrate,
Demyelinisierung und im weiteren Verlauf ein irreversibler Verlust von Axonen, welcher
einhergeht mit Hirnatrophie, einer zunehmenden neurologischen Dysfunktion und einem
steigenden Grad an körperlichen und kognitiven Einschränkungen. Weltweit sind etwa 2,4
Millionen Menschen von MS betroffen. Das Durchschnittalter bei Diagnosestellung liegt bei
ungefähr 30 Jahren [82]. Frauen erkranken etwa zwei- bis dreimal so häufig wie Männer [81,
83].
MS kann in unterschiedlichen Varianten auftreten. Die schubförmig-remittierende Form
(RRMS) ist die häufigste und kommt bei etwa 85% der Patienten vor. Charakteristisch sind
Krankheitsschübe, die sich zwischenzeitlich komplett oder nur unvollständig zurückbilden
[81]. Diese akuten Exazerbationen sind assoziiert mit dem Auftreten neuer Läsionen in der
weißen Gehirnsubstanz, welche vorrangig durch eingewanderte Immunzellen und aktivierte
Mikrogliazellen hervorgerufen werden und mit Hilfe der Magnetresonanztomographie
(MRT) sichtbar gemacht werden können [84, 85]. Der RRMS-Subtyp geht in den meisten
Fällen in eine sekundär-progressive Form über, die nun v.a. durch Hirnatrophie und
Vergrößerung der Ventrikel sowie kontinuierlicher Verschlechterung neurologischer
Funktionen gekennzeichnet ist. Ungefähr 10% der Erkrankten sind von der primär-
progressiven Variante betroffen, die ohne Schübe und von Beginn an progredient verläuft
[82, 84].
1.6.1 Mögliche Ursachen und Pathogenese
Die genaue Ursache von MS ist nicht bekannt. Epidemiologische und genetische Studien
lassen jedoch auf ein Zusammenspiel aus erblich bedingten Faktoren und Umwelteinflüssen
schließen, welche zur Immunpathologie der Erkrankung beitragen.
Einleitung
16
Genetische Prädisposition
Obwohl MS keine klassische Erbkrankheit ist, geben das vermehrte Auftreten in bestimmten
Abstammungsgruppen sowie familiäre Häufungen der Erkrankung Hinweise auf eine
genetische Komponente [86]. Die Konkordanzrate beträgt in eineiigen Zwillingen etwa 25%
und ist damit fünfmal höher als in zweieiigen Zwillingen [87]. Genomweite
Assoziationsstudien (GWAS) konnten auf Grundlage der Analyse von natürlich
vorkommenden genetischen Varianten, so genannten Einzelnukleotid-Polymorphismen
(Single Nucleotide Polymorphisms, SNPs), mehr als 100 krankheitsassoziierte
chromosomale Regionen identifizieren. Diese betreffen vorrangig Gene und Signalwege,
welche die Immunfunktion und insbesondere die Differenzierung und Modulierung von
CD4
+
T-Zellen sowie ihre Effektorfunktion beeinflussen, wie das IL-2- und IL7-Rezeptor-α-
Gen [88-92]. Neueste Untersuchungen in einer großen deutschen Kohorte fanden zudem
Unterschiede in einem Gen, welches für die epigenetische Regulation der Gene durch DNA-
Methylierung zuständig ist und somit eine Schnittstelle zwischen genetischen und
Umweltfaktoren darstellt [91]. Den stärksten genetischen Einfluss auf das Erkrankungsrisiko
vermitteln jedoch Varianten des HLA-II-Komplexes. Insbesondere der HLA-DR2-Haplotyp
(HLA-DRB*1501-Allel) ist in der kaukasischen Bevölkerung mit dem Auftreten von MS
assoziiert [34, 88].
Infektionen
Epidemiologische Studien konnten zeigen, dass der Entstehung von MS bzw. einem akuten
Krankheitsschub oft eine virale oder bakterielle Infektion vorausgeht [93-95]. Die
deutlichsten Hinweise für eine pathogenetische Relevanz konnten für das Epstein-Barr-
Virus (EBV) gefunden werden. Das relative Risiko an MS zu erkranken ist bei Individuen
nach symptomatischer EBV-Infektion (infektiöser Mononukleose) etwa doppelt so hoch wie
bei Kontrollpersonen [96]. Da EBV-Infektionen in den frühen Lebensjahren nahezu
symptomlos verlaufen, stellt eine späte Infektion im Jugend- und frühen Erwachsenenalter
Einleitung
17
somit einen relevanten Risikofaktor dar. Nahezu 100% aller MS-Patienten sind seropositiv
für EBV-Antikörper im Vergleich zu 90-95% der erwachsenen Normalbevölkerung [97]. Das
Risiko für die Entwicklung einer MS-Erkrankung ist bei jungen Erwachsenen mit der Höhe
des Antikörpertiters gegen das Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA-1) im Serum
assoziiert [98, 99]. EBNA-1-spezifische Antikörper konnten zudem in der Zerebrospinal-
flüssigkeit von MS-Patienten nachgewiesen werden.
Es existieren unterschiedliche Hypothesen dazu, auf welche Weise Infektionen zum
Pathomechanismus von MS beitragen. Dazu gehört die bereits erwähnte Bystander
Aktivierung oder die molekulare Mimikry Hypothese (siehe 1.3.2). Es wurde gezeigt, dass
MS-Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen eine verstärkte CD4
+
T-Zell-Antwort
gegen EBNA-1 ausbilden [100]. EBNA-1-spezifische T-Zellen konnten darüber hinaus mit
Myelin-Antigenen kreuzreagieren und in der Folge proinflammatorische Zytokine
produzieren [97]. Zusätzlich wurde demonstriert, dass CD8
+
T-Zellen von MS-Patienten
virusinfizierte Zellen schlechter kontrollieren können [101].
Weitere Umwelteinflüsse
Es ist bekannt, dass MS in den südlichen und nördlichen geographischen Breiten häufiger
auftritt als in Regionen nahe des Äquators [87]. Hier wird ein Zusammenhang mit der
verringerten UV-Licht-Exposition und dem daraus resultierenden niedrigem Vitamin-D-
Spiegel bei Personen in äquatorfernen Gebieten vermutet. In einer prospektiven Studie
konnte gezeigt werden, dass sich das Risiko, an MS zu erkranken, mit einem steigendem
Vitamin-D-Spiegel im Serum verringert [102]. Weiterhin scheint Vitamin D die Schubrate
und die Entwicklung der körperlichen Beeinträchtigung bei MS positiv zu beeinflussen [103,
104] und konnte im EAE-Modell die Entstehung der ZNS-Erkrankung oder ihre Progression
verhindern [105, 106]. Untersuchungen zu funktionellen Mechanismen weisen deutlich auf
einen direkten immunmodulierenden Effekt hin. Danach beeinflusst die biologisch aktive
Form von Vitamin D die Entwicklung und Aktivität von APCs, erhöht die Anzahl an Th2-
Einleitung
18
Zellen, CD25
+
Tregs und IL-10-Produzenten und supprimiert die Produktion des
proinflammatorischen Zytokins IL-17 [107-109].
Einen weiteren Risikofaktor stellt das Rauchen dar. Raucher erkranken bis zu 50% häufiger
an MS als Nichtraucher, wobei die Menge und die Dauer des Zigarettenkonsums direkt mit
dem Erkrankungsrisiko assoziiert ist [87]. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind nicht
eindeutig geklärt, diskutiert werden jedoch u.a. direkte immunmodulierende Effekte [110,
111], ein Einfluss auf die Integrität der Blut-Hirn-Schranke [112] sowie Effekte auf die
Demyelinisierung [113, 114].
1.6.2 Die Rolle von CD4
+
T-Zellen
Im EAE-Modell kann in empfänglichen Mäusen oder Ratten nach einer Immunisierung mit
Myelin-Bestandteilen ein MS-ähnliches Krankheitsbild induziert werden. Die
Übertragbarkeit der Erkrankung auf gesunde Tiere mittels adoptivem CD4
+
T-Zell-Transfer
war ein Meilenstein in der MS-Forschung und weist auf eine Schlüsselrolle von
CD4
+
T-Zellen in der Pathogenese von EAE hin [115].
Vieles deutet darauf hin, dass CD4
+
T-Zellen auch bei MS von wichtiger Bedeutung sind. Im
humanen System ist jedoch von deutlich komplexeren Mechanismen und einem
Zusammenspiel unterschiedlicher Immunzellen und Subpopulationen auszugehen. CD4
+
T-Zellen kommen in erhöhter Anzahl in Läsionen des ZNS und im Liquor vor, allerdings
findet man auch weitere Immunzellen, wie B-Zellen und CD8
+
T-Zellen. Makrophagen
dominieren in den inflammatorischen Infiltraten [82, 116]. Weitere Evidenz liefert die
Assoziation mit HLA-II Molekülen, welche das größte genetische Risiko für die Erkrankung
darstellt (siehe 1.6.1). Da HLA-Moleküle zur Präsentation von prozessiertem Antigen
beitragen (siehe 1.2.1), unterstützt dieser Zusammenhang die Hypothese, dass Antigen-
spezifische Mechanismen bei MS eine Rolle spielen.
Einleitung
19
Fast alle Therapien, die aktuell bei MS eingesetzt werden, richten sich direkt oder indirekt
gegen CD4
+
Zellen. Dazu zählen immunmodulierende Medikamente mit pleiotropem
Wirkprofil wie IFN-β, Glatirameracetat oder Dimethylfumarat [117]. Ein besonders
effektives Medikament ist Natalizumab (Tysabri), ein monoklonaler Antikörper, welcher das
Adhäsions-Moleküls α4β1 (VLA-4; CD49d) auf Leukozyten bindet und blockiert und damit
eine Migration von T-Zellen durch die Blut-Hirn-Schranke in das ZNS verhindert [118].
Jedoch ist zu bemerken, dass die genannten Therapien vorranging während der frühen,
schubförmigen Krankheitsphase wirksam sind und lediglich die Krankheitsprogression
verlangsamen, aber nicht komplett aufhalten können [82]. Daneben konnte eine klinische
Phase II Studie, welche unter Anwendung monoklonaler Antikörper auf die partielle
Depletion von CD4
+
T-Zellen abzielte, keine positiven Effekte auf den Krankheitsverlauf
belegen [119].
Wie bei weiteren Autoimmunerkrankungen wurden bei MS-Patienten Defekte in den
peripheren Toleranzmechanismen, insbesondere in Bezug auf die suppressive Funktion von
CD4
+
CD25
++
Tregs, mehrfach beschrieben [120, 121]. Normalerweise selbst-tolerante CD4
+
T-Zellen könnten somit aktiviert werden und grundlegend zum Pathomechanismus der
Erkrankung beitragen.
1.6.3 Die Rolle von Myelin-spezifischen CD4
+
T-Zellen
Obwohl klonal expandierte CD4
+
T-Zellen in Läsionen des ZNS [117] und oligoklonale
Immunglobulin-Banden in der Zerebrospinalflüssigkeit nachgewiesen wurden [84, 122],
konnte bislang kein einzelnes Zielantigen als Auslöser von MS definiert werden. Bei anderen
neurologischen Erkrankungen wie der bereits beschriebenen Myasthenia gravis oder
Neuromyelitis optica ist hingegen der Nachweis einer spezifischen Immunantwort in Form
einer Autoantikörperproduktion gegen Selbst-Antigene (Acetylcholinrezeptor bzw.
Aquaporin-4) [84] bereits ein hilfreicher Bestandteil der Diagnostik.
Einleitung
20
Im Bestreben danach, relevante T-Zell Antigene zu identifizieren, fokussierten sich in den
letzten Jahrzehnten zahlreiche Untersuchungen auf die Rolle von Myelin-reaktiven T-Zellen
bei MS. Dies beruhte zum einen auf histologischen Analysen von frühen Läsionen, welche
als Hauptmerkmal eine immunvermittelte Demyelinisierung unter Aussparung der Axone
zeigten [123]. Zum anderen war es das EAE-Modell selbst, bei welchem eine aktive
Immunisierung mit ZNS-Gewebe oder Myelin-Antigenen sowie der adoptive Transfer von
Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in unterschiedlichen Spezies das Potenzial besitzen, eine
MS-ähnliche Erkrankung auszulösen [124, 125]. Dabei standen das Myelin basische Protein
(MBP), das Myelin-Oligodendrozyten Protein (MOG) und das Proteolipidprotein (PLP) im
Fokus. Es wurde zudem gezeigt, dass HLA-II-transgene Mäuse, welche zusätzlich den TCR
eines humanen MBP-spezifischen CD4
+
T-Zell-Klons exprimierten, eine spontane ZNS-
Erkrankung entwickeln können [126]. Im EAE-Modell sind vor allem entzündungs-
fördernde Th1 und Th17-Zellen beteiligt [127].
Basierend auf Tierstudien existieren zwei Haupthypothesen zur initialen Aktivierung von
Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen innerhalb der Pathogenese von MS. Die erste Theorie geht
davon aus, dass die primäre Aktivierung von ZNS-spezifischen T-Zellen in der Peripherie,
wie beispielsweise im Darm, durch Pathogene oder Kommensalen mittels Bystander
Aktivierung oder molekularer Mimikry [54, 128] erfolgt. Die aktivierten Zellen können
anschließend die Blut-Hirn-Schranke überwinden. Dabei können Interaktionen zwischen
dem Chemokinrezeptor CCR6 und seinem Liganden CCL20 eine Rolle spielen [129]. Im
ZNS kommt es im weiteren Verlauf zu einer Myelin-spezifischen T-Zell Antwort [54, 82].
Inflammatorische Mediatoren locken danach zusätzliche Entzündungszellen wie Monozyten
sowie weitere Lymphozyten an, welche zur Gewebeschädigung beitragen [54]. Die zweite
Theorie geht von einem primären, bislang ungeklärten Ereignis im ZNS selbst aus. Hierbei
stehen virale Infektionen im Verdacht. Nach einer darauffolgenden Schädigung von
Oligodendrozyten richten sich aktivierte Mikrogliazellen gegen Myelin-Bestandteile,
nehmen diese auf und präsentieren sie, was sekundär zur Aktivierung von T-Zellen führt.
Einleitung
21
Auch hier werden weitere Immunzellen rekrutiert [54]. Erst kürzlich wurde ein bisher
unentdecktes funktionelles lymphatisches Drainagesystem im ZNS beschrieben, welches in
direkter Verbindung zu den tiefen zervikalen Lymphknoten steht und somit als
Eintrittspforte für ZNS-reaktive T-Zellen dienen kann [130].
Obwohl in zahlreichen Studien die CD4
+
T-Zell-Antwort auf die „klassischen“ Myelin-
Proteine MOG, MBP und PLP intensiv untersucht wurde, ist deren Relevanz bei MS jedoch
keinesfalls geklärt und bestenfalls nur indirekt bewiesen. Ein Großteil der Arbeiten, welche
die Eigenschaften von humanen Myelin-reaktiven T-Zellen untersucht haben, basierte auf
einer Vorexpansion der Zellen und teilweise unspezifischen funktionellen Analysen wie
Messungen der Proliferation und der Zytokinexpression (siehe folgender Abschnitt 1.7.).
Die Ergebnisse der Studien lassen sich wie folgt zusammenfassen: 1) Myelin-spezifische
CD4
+
T-Zellen weisen im peripheren Blut von MS-Patienten die gleichen oder leicht erhöhte
Frequenzen im Vergleich zu Gesunden auf [131-134]. 2) In verschiedenen Individuen und
im Verlauf der Erkrankung können Myelin-reaktive T-Zellen mit unterschiedlichen
Spezifitäten detektiert werden [135, 136]. 3) Myelin-spezifische T-Zellen zeigen in MS-
Patienten einen veränderten Aktivierungs- und Differenzierungsstatus und einen
inflammatorischen Phänotyp (IFN-γ, IL-17, GM-CSF) [133, 137-141]. Ein Grund für
teilweise inkonsistente Forschungsergebnisse und wenig Fortschritt bei der Suche nach
potentiellen T-Zell-Zielantigenen bei MS ist das Fehlen einer Methode zur direkten ex vivo
Detektion von seltenen Autoantigen-spezifischen T-Zellen. Nur eine Charakterisierung von
Myelin-reaktiven T-Zellen ohne vorherige in vitro Manipulation kann zuverlässig dazu
beitragen, ihre mögliche pathogene Rolle innerhalb der Pathogenese von MS aufzuklären.
1.7 Methoden zur Detektion von Autoantigen-spezifischen
CD4
+
T-Zellen
Die bislang am häufigsten verwendeten Methoden zur Detektion von seltenen Autoantigen-
spezifischen T-Zellen basieren auf funktionellen Analysen wie der Messung der
Zellproliferation (z.B. durch
3
H-Thymidin) oder der Zytokinproduktion (ELISA, ELISpot)
Einleitung
22
nach Antigen-stimulation (Tab. 2). Die Generierung von T-Zell-Bibliotheken (T cell
libraries [142]), welche aus je 2000 Zellen bestehen, erlaubt beispielsweise in Verbindung mit
Proliferationsmessungen die Berechnung von Vorläuferfrequenzen aus vorher sortierten
Subpopulationen und wurde kürzlich für funktionelle Analysen von Myelin- und AChR-
reaktiven T-Zellen verwendet [71, 137]. Begründet durch das geringe Vorkommen von
autoreaktiven T-Zellen im peripheren Blut wurde in solchen Studien jedoch ein
obligatorischer Expansionsschritt einer Analyse vorangestellt. Nach längerer in vitro Kultur
sind jedoch Verschiebungen der klonalen Zusammensetzung sowie funktionelle und
phänotypische Veränderungen der Zellen kaum zu vermeiden. Darüber hinaus kann es in
einer bestimmten Zytokinumgebung zu einer unspezifischen Aktivierung weiterer
unbeteiligter T-Zellen kommen (Bystander Aktivierung) [143], was zu einer Verfälschung
der Ergebnisse beitragen kann.
Tab. 2: Methoden zur Detektion von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen.
indirekt, in vitro Expansion
populationsbasiert einzelzellbasiert
ELISA Zytokin-
sekretion ELISPOT Zytokin-
sekeretion
3
H-
Thymidin Proliferation CFSE Proliferation
direkt, einzelzellbasiert
in vitro Expansion ex vivo Analyse
Tetramer TCR-
Bindung
CD154
+
/CD137
+
Anreicherung
spezifische
Aktivierung
Demgegenüber erlaubt die Tetramer-Technologie aufgrund der direkten Bindung des TCR
durch multimerisierte MHC/Peptid-(pMHC)-Komplexe eine hochspezifische und
aktivierungsunabhängige Detektion von Antigen-spezifischen T-Zellen (Übersicht in [144]).
Allerdings ist hier die Kenntnis über das immunogene Peptid sowie das MHC-
Restriktionselement eine wesentliche Voraussetzung. Technische Weiterentwicklungen
Einleitung
23
haben in den letzten Jahren durch die Implementierung der magnetischen Anreicherung
oder die Entwicklung von pMHC-II-Multimeren zu einer verbesserten Sensitivität geführt
[145]. Obwohl MHC-I- und MHC-II-Tetramere in Kombination mit durchfluss-
zytometrischer Analyse erfolgreich für die Detektion von Pathogen-spezifischen T-Zellen
sowie zur Untersuchung von Vakzinierungsantworten eingesetzt werden [146-149], ist die
Verwendung von MHC-II-Tetrameren zur Detektion von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen vor
allem aufgrund der niedrigen TCR-Affinität und Prävalenz dieser Zellen sowie durch
technische Hindernisse bei der Herstellung limitiert [150]. Eine direkte Markierung von
seltenen Autoantigen-spezifischen CD4
+
T-Zellen ohne vorherige in vitro Expansion ist im
Vergleich zum CD8
+
T-Zell-Repertoire bisher kaum beschrieben.
Bacher et al. stellten 2013 eine neue Methode zur direkten ex vivo Detektion von spezifisch
aktivierten CD4
+
T-Zellen vor [151]. Dabei dient das kostimulatorische Molekül CD154
(CD40L), welches nach Kurzzeitstimulation ausschließlich von Antigen-aktivierten T-Zellen
exprimiert wird ([152, 153] und Abb. 1), als Zielstruktur für eine nachfolgende magnetische
Anreicherung (antigen-reactive T cell enrichment = ARTE [151]). Diese ermöglicht in
Verbindung mit einer durchflusszytometrischen Analyse eine sensitive Quantifizierung und
detaillierte Charakterisierung von Antigen-spezifischen T-Zellen sowohl aus dem naiven als
auch aus dem Memory-Repertoire und eignet sich damit besonders für die Untersuchung
von autoreaktiven T-Zell-Antworten. Zur Stimulation können Peptide, Proteine oder Lysate
eingesetzt werden. Die Kenntnis über den MHC-Hintergrund sowie eine vorherige in vitro
Expansion ist nicht notwendig. Diese Methode ermöglicht ebenso die Detektion von
Antigen-spezifischen Tregs. Diese exprimieren nach 6-7 h den Aktivierungsmarker CD137
auf ihrer Oberfläche [154]. Nach längerer Stimulation wird CD137 auch auf Tcons
exprimiert.
Zielstellung
24
2 Zielstellung
Die Regulation von Immuntoleranz und Autoimmunität ist auf der Ebene von Autoantigen-
spezifischen CD4
+
T-Zellen bisher unzureichend erforscht. Ein Grund dafür ist das Fehlen
einer verlässlichen Methode für ihre direkte Identifizierung ohne vorherige in vitro
Manipulation. In Bezug auf die Pathogenese der Multiplen Sklerose (MS) existieren daher
nur indirekte Hinweise darauf, dass T-Zellen mit Spezifität für Myelin-Antigene zur
Gewebezerstörung und -inflammation beitragen. Obwohl Myelin-Proteine die Ziel-
strukturen von pathogenen T-Zellen im Tiermodell der MS (experimentelle autoimmune
Enzephalomyelitis = EAE) darstellen, zeigten selektive, gegen Myelin-reaktive T-Zellen
gerichtete Immuntherapien in MS-Patienten jedoch nicht den erhofften Erfolg. Es ist nicht
abschließend geklärt, welche Eigenschaften und Mechanismen zur möglichen Pathogenität
von Myelin-spezifischen T-Zellen bei MS beitragen können.
Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher die magnetische Anreicherung von Antigen-
aktivierten CD154
+
konventionellen und CD137
+
regulatorischen T-Zellen (antigen-reactive
T cell enrichment = ARTE) in Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie
für eine sensitive und ausführliche ex vivo Charakterisierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen angewendet werden. Zunächst sollte die Methode mit herkömmlichen in vitro
Expansions-Assays verglichen und ihre Anwendbarkeit durch Spezifitätstestungen validiert
werden. Anschließend sollten die Eigenschaften (Frequenz, Phänotyp, Funktion) von
T-Zellen mit Spezifität für Diabetes-, Myasthenie- und MS-assoziierte Autoantigene im
gesunden Organismus untersucht werden. Der Hauptfokus dieser Arbeit lag jedoch auf der
vergleichenden Analyse von Myelin-spezifischen T-Zellen von MS-Patienten und passenden
Kontrollpersonen. Im Speziellen sollte überprüft werden, ob Veränderungen im Hinblick
auf ihre Frequenz, die Expression von Differenzierungsmarkern, Chemokinrezeptoren und
inflammatorischen Zytokinen oder ihre funktionelle Avidität die Hypothese bezüglich ihrer
möglichen Schlüsselrolle bei MS stützen können. Die Erkenntnisse würden das Verständnis
der Immunpathologie der Erkrankung weiter fördern und für die Entwicklung
zielgerichteter Therapieoptionen von Bedeutung sein.
Material
25
3 Material
3.1 Patienten- und Kontrollproben
23 Patienten (14 weibliche und 9 männliche) mit schubförmig-remittierender MS (RRMS)
wurden aus der MS-Ambulanz der Klinik für Neurologie der Charité Berlin Mitte rekrutiert.
Das Alter der Patienten betrug im Durchschnitt 35 Jahre (Spannweite 25-56 Jahre). Alle
Patienten wurden mit Natalizumab (Tysabri) behandelt. Nach der Aufklärung und dem
Einverständnis zur Studie wurden ihnen vor der routinemäßigen Infusion des Medikaments
50 ml Blut abgenommen. Bei einigen, zufällig gewählten, Patienten erfolgte eine zweite
Blutentnahme zu einem späteren Zeitpunkt (> 6 Wochen), um weitere experimentelle
Parameter zu bestimmen oder zur Generierung von Antigen-präsentierenden-Zellen (APCs)
für in vitro Expansions-Versuche. Die Proben und Daten wurden in anonymisierter Form
verwendet. Die detaillierten Charakteristika der MS-Patienten sind in Tab. 3 dargestellt.
Die Blutproben der gesunden Kontrollen (GK) wurden in Form von Buffy Coats vom DRK
Blutspendedienst Dresden oder in Form von Leukozyten-Reduktionsfiltern vom
Blutspendedienst der Charité bezogen. Für Vergleiche mit MS-Patienten wurden diese
Proben nach Alter (± 3 Jahre) und Geschlecht entsprechend zugeordnet.
Die Studie wurde durch die Ethikkommission der Charité genehmigt (Ethikvotum
EA1/250/13).
Material
26
Tab. 3: Charakteristika der MS-Patienten
Kürzel Geschlecht
Alter (J)
Krankheitsdauer
(M)
Natalizumab
seit (M) EDSS-Wert
a)
MS1 w 38 59 13 1
MS2 w 35 59 46 5
MS3 m 34 28 24 4,5
MS4 m 29 78 11 6,5
MS5 m 43 187 23 3,5
MS6 m 26 24 5 1
MS7 w 40 31 9 6
MS8 w 28 53 42 3,5
MS9 w 35 174 61 4,5
MS10 m 25 94 52 3
MS11 m 36 42 27 3
MS12 w 31 138 20 1,5
MS13 m 30 110 22 1,5
MS14 w 27 148 84 0
MS15 m 44 215 40 k.D.
b)
MS16 w 56 151 92 5
MS17 w 27 39 14 1
MS18 w 36 78 7 2,5
MS19 w 31 164 5 3
MS20 w 31 140 1 2
MS21 w 34 141 12 3
MS22 w 38 65 4 1,5
MS23 m 56 42 1 6
MS24
c)
w 25 k.D.
b)
- -
a) Die EDSS-Skala reicht von 0-10 Punkten und beschreibt den Grad der Behinderung eines
Patienten unter Berücksichtigung verschiedener funktioneller Systeme des Körpers
b) k. D. = keine Daten
c) Patientin der Uniklinik Hamburg, Proben verwendet zur TCR-Sequenzierung im Rahmen
einer Kooperation mit Prof. Stefan Gold, Charité Berlin
Material
27
3.2 Geräte
Tab. 4: Geräte
Gerätebezeichnung Hersteller / Bezugsquelle
Bestrahlungsgerät Gammacell 40 Exactor Best Theratronics, Kanata, ON, Kanada
Brutschrank CB150 Binder, Tuttlingen, Deutschland
Durchflusszytometer MACSQuant Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
MACS Magnethalter Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Mikroskop Leitz DM IL Leica Microsystems, Wetzlar, Deutschland
Mikrotiter-Plattenschüttler Titramax 101 Heidolph, Schwabach , Deutschland
Multikanalpipette Finnpipette 50 / 300 µl Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
Nanodrop ND-1000 Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA
Pipetten 10 / 20 / 100 / 200 / 1000 μl Gilson, Middleton, WI, USA
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Pipettierhilfe accu-jet pro Brand, Wertheim, Deutschland
Sterilbank BioWizard Silver SL-130
Blue Series
Kojair, Vilppula, Finnland
Vortex Genie 2 Scientific Industries, New York, NY, USA
Wasserbad Modell 1083
Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel,
Deutschland
Zellseparator QuadroMACS und
OctoMACS
Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Zellsorter BD Influx (FACS) BD, Heidelberg, Deutschland
Zentrifuge 5424 R Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Zentrifuge Allegra X-15R Beckman Coulter, Krefeld, Deutschland
Material
28
3.3 Verbrauchsmaterial
Tab. 5: Verbrauchsmaterial
Materialbezeichnung Hersteller / Bezugsquelle
20 ml Spritze mit Luer-Ansatz BD, Heidelberg, Deutschland
384-Well-Zellkulturplatte Costar Corning, New York, NY, USA
48-, 24-, 12-, 6-Well- Zellkulturplatten Costar Corning, New York, NY, USA
96-Well-Zellkulturplatte Flachboden Costar Corning, New York, NY, USA
96-Well-Zellkulturplatte Rundboden Costar Corning, New York, NY, USA
Blutentnahmeröhrchen Vacutainer,
heparinisiert, 10 mL
BD Vacutainer Systems, Plymouth, UK
FACS-Röhrchen 5 ml Costar Corning, New York, NY, USA
Kryoröhrchen 2 ml Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
MACS Cell-Separation Columns
Typ LD und MS
Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Pipettenspitzen 10 / 200 / 1000 μl Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Kisker, Steinfurt, Deutschland
Reagenzreservoirs Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Reaktionsgefäße 1,5 / 2 / 5 ml Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Röhren 15 ml und 50 ml Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Serologische Pipetten 5 / 10 / 25 / 50 ml Costar Corning, New York, NY, USA
Material
29
3.4 Chemikalien, Medien und Zusätze
Tab. 6: Chemikalien, Medien und Zusätze
Name/Kürzel Produktbezeichnung Hersteller / Bezugsquelle
AB-Serum Humanes AB-Serum Lonza, Basel, Schweiz
Sigma-Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
Bref A Brefeldin A Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
BSA Bovines Serumalbumin Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
DMSO Dimethylsulfoxid Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
EDTA Ethylendiamintetraessig-
säure
Sigma-Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
EtOH 99,8% Ethanol 99,8 % Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
FcR-Block FcR Blocking Reagent Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
Ficoll Biocoll-Trennlösung Biochrom, Berlin, Deutschland
IL-2 Proleukin (rekombinantes
humanes IL-2)
Novartis, Basel, Schweiz
Inside Perm 10x Inside Perm Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
Lebend-Tot-Farbstoff
(LD)
Viobility 405/520 Fixable
Dye
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
PBS Phosphate Buffered Saline DRFZ, Berlin, Deutschland
Pen/Strep Penicillin/Streptomycin GIBCO, Life Technologies,
Darmstadt, Deutschland
PI Propidiumiodid Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland
Material
30
Name/Kürzel Produktbezeichnung Hersteller / Bezugsquelle
RPMI -1640
RPMI 1640 Medium mit
GlutaMAX
TM
GIBCO, Life Technologies,
Darmstadt, Deutschland
TexMACS TexMACS Medium Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
β-ME β-Mercaptoethanol Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
3.5 Zusammensetzung verwendeter Puffer und Medien
3.5.1 Puffer
Tab. 7: Zusammensetzung Puffer
Name/Kürzel Zusammensetzung
PBS, pH 7,2 137 mM NaCl + 2,7 mM KCl + 1,5 mM KH2PO4 +
8 mM Na2HPO4 x 2 x H2O
PE-Puffer 2 mM EDTA in PBS
PEB-Puffer 2 mM EDTA + 0,2% BSA (w/v) in PBS
Alle Chemikalien zur Herstellung von PBS wurden über Sigma Aldrich, Schnelldorf,
Deutschland bezogen.
3.5.2 Medien
Tab. 8: Zusammensetzung Medien
Name Zusammensetzung
Stimulationsmedium RPMI-1640 + 5% humanes AB-Serum (v/v)
Expansionsmedium TexMACS + 5-10% humanes AB-Serum (v/v) + 200 IU/ml IL-2 +
30 ng/ml α-CD3 (OKT-3) + β-ME + 100 U/ml Penicillin +
100 g/ml Streptomycin
Einfriermedium 70% TexMACS + 20% humanes AB-Serum (v/v) +
10% DMSO (v/v)
Material
31
3.6 Kits
Tab. 9: Kits
Produktbezeichnung Kit-Bestandteile Hersteller
CD137 MicroBead Kit CD137-PE,
α-PE-MicroBeads
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
CD154 MicroBead Kit CD154-Biotin, α-Biotin-
MicroBeads
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
DNeasy Blood and
Tissues Kit
Lyse-, Wasch-, Elutionspuffer,
Säulen, Auffangröhrchen,
Proteinase K
Qiagen, Hilden, Deutschland
FoxP3 Staining Buffer Set Fix/Perm-Lösung, Perm-
Puffer
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
Inside Stain Kit Inside Fix / Inside Perm Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
3.7 Antikörper
Tab. 10: Antikörper
Antikörper Klon Hersteller
CCR4-APC
a)
REA279 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CCR6-Brilliant-Violet 421 G034E3 BioLegend, San Diego, CA, USA
CCR7 FR 11-11E8 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD127 FITC MB15-18C9 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD137-PE / VioBright FITC 4B4-1 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD14-VioGreen TÜK4 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD154-VioBlue / FITC /
PEVio770
5C8 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD20-VioGreen LT20 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Material
32
Antikörper Klon Hersteller
CD25-Brilliant-Violet 421 BC96 BioLegend, San Diego, CA, USA
CD28 pure – functional
grade
15E8 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD3 MicroBeads - Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD3 pure – functional grade OKT-3 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD40 pure – functional
grade
HB14 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD45RA-VioBlue T6D11 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD45RO-PerCP UCHL1 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD45RO-PE-Vio770 UCHL1 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD4-APC-Vio770 Vit4 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD69-FITC FN50 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CD8-VioGreen BW135/80 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
CXCR3-PE-Vio770 REA232 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
FOXP3-PE 3G3 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
GM-CSF-APC BVD2-21C11 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Helios-FITC 22F6 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
IFN-γ-PerCP-Cy5.5 4S.B3 BioLegend, San Diego, CA, USA
IL-17A-FITC CZ8-23G1 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
TNF-α-PE cA2 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
α-Biotin PE Bio3-18E7 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
a) Die ausgeschriebenen Bezeichnungen der Fluorochrome erscheinen aus Gründen der
Übersichtlichkeit nur im Abkürzungsverzeichnis.
Wenn nicht anders angegeben, wurden die Antikörper in der vom Hersteller angegebenen
Verdünnung eingesetzt.
Material
33
3.8 Antigene
Tab. 11: Antigene
Name/Kürzel Produktbezeichnung Hersteller / Bezugsquelle
A. fumigatus Aspergillus fumigatus ATCC, Manassas, VA, USA
AChR Acetylcholinrezeptor JPT Peptide Technologies, Berlin,
Deutschland
BRLF-1 EBV Replication and
Transcription Activator
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
C. albicans Candida albicans Greer Laboratories, Lenoir, NC,
USA
CMV Zytomegalie-Virus Siemens Healthcare Diagnostics
E. coli Escherichia coli ATCC, Manassas, VA, USA
EBNA-1 Epstein–Barr Nuclear Antigen 1 Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
GAD65 Glutamat-Dacarboxylase 65 Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
HSV-1 Herpes-Simplex-Virus 1 antibodies-online, Aachen,
Deutschland
KLH (Immucothel) Keyhole Limpet Hemocyanin biosyn Corporation, Carlsbad
CA, USA
MBP Myelin-Basisches-Protein Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
MOG Myelin-Oligodendrozyten-
Glykoprotein
Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
PLP Proteolipid-Protein Miltenyi Biotec, B. Gladbach,
Deutschland
Material
34
3.9 Software
Tab. 12: Software
Bezeichnung Hersteller
BD FACS Sortware 1.2.0.142 BD, Heidelberg, Deutschland
FlowJo 7.6.5 und 10.2 Treestar, Ashland, OR, USA
GraphPad Prism 5, 6 und 7 GraphPad Software, LaJolla, CA, USA
MACSQuantify 2.6 Miltenyi Biotec, B. Gladbach, Deutschland
Microsoft Office 2010 Microsoft, Redmond, WA, USA
Methoden
35
4 Methoden
4.1 Direkte ex vivo Charakterisierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen
Für die direkte ex vivo Analyse von seltenen autoreaktiven T-Zellen wurde die magnetische
Anreicherung von Antigen-aktivierten CD154
+
konventionellen T-Zellen (Tcons) oder
CD137
+
regulatorischen T-Zellen (Tregs) mit multiparametrischer Durchflusszytometrie
kombiniert. In unterschiedlichen Experimenten wurde dabei neben ihrer Frequenz und
ihrem Phänotyp die Chemokinrezeptor-Expression sowie die Expression von
inflammatorischen Zytokinen untersucht. Um Zellverluste durch Zentrifugationsschritte zu
vermeiden, wurden Oberflächen- und intrazelluläre Moleküle direkt auf der
Separationssäule gefärbt. Der im Folgenden detailliert beschriebene Versuchsablauf ist
schematisch in Abb. 3 dargestellt.
Abb. 3: Schematischer Versuchsablauf zur direkten ex vivo Charakterisierung von
autoreaktiven T-Zellen. PBMCs wurden von MS-Patienten und gesunden Spendern isoliert und
für 6-7 h mit MP65 oder Autoantigenen stimuliert. Aktivierte CD154
+
Tcons und CD137
+
Tregs
wurden mittels magnetischer Zellseparation angereichert. Die Markierung von
Oberflächenmolekülen mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern für durchflusszytometrische
Analysen erfolgte direkt auf der Separationssäule. Für die Untersuchung intrazellulärer Moleküle
wurden die Zellen außerhalb der Säule fixiert und direkt auf einer zweiten sequentiellen
Separationssäule gefärbt.
PBMC Isolierung
Stimulation
CD154
+
/ CD137
+
Anreicherung
1. Separationssäule
Oberflächenfärbung
2. Separationssäule
Intrazelluläre
Zytokinfärbung
Fixierung
6-7 h
durchfluss-
zytometrische Analyse
Zytokinexpression
S N NS
Oberflächen-
färbung
CXCR3 und
CCR6
durchfluss-
zytometrische Analyse
Chemokinrezeptor-Expression
Methoden
36
4.1.1 Isolierung von PBMCs mittels Dichtegradienten-Zentrifugation
Die Isolierung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes (peripheral blood
mononuclear cells; PBMCs) wurde in der Sterilbank durchgeführt. Zellen aus
Leukozytenreduktionsfiltern wurden zunächst mit Hilfe einer Spritze und PE-Puffer aus
diesen herausgespült und in 50 ml-Röhrchen aufgefangen. Buffy Coats und Blutproben aus
Vacutainer-Röhrchen wurden ebenfalls in 50 ml-Röhrchen überführt und gegebenenfalls
durch Ausspülen mit PE-Puffer verdünnt bzw. auf 35 ml je Röhrchen aufgefüllt.
Anschließend wurden je 35 ml des verdünnten Blutes vorsichtig auf 15 ml Ficoll
TM
geschichtet. Die Dichtegradienten-Zentrifugation erfolgte danach bei 450 x g und RT ohne
Bremse für 30 min. Die PBMCs, welche sich in der Interphase befanden, wurden mit einer
Pipette entnommen und in ein frisches 50 ml-Röhrchen überführt. Die Zellen wurden
zweimal mit kaltem PBS gewaschen und dafür 15 min bei 300 x g und 4°C zentrifugiert, der
zweite Waschschritt erfolgte bei 200 x g, um restliche Thrombozyten zu entfernen. Nach der
Zellzahlbestimmung am MACSQuant unter Zugabe von Propidiumiodid zur Exklusion
toter Zellen wurden die PBMCs in Stimulationsmedium (siehe Tab. 8) aufgenommen und je
nach Zellzahl mit einer Konzentration von 2 x 10
7
/ ml und einer Dichte von 5 x 10
6
/ cm
2
in
6-, 12-, 24 oder 48-Well-Platten ausgesät. Die Zellen wurden über Nacht bei 37°C und
5% CO
2
inkubiert.
4.1.2 Oberflächenfärbung von CXCR3 und CCR6
Da die Chemokinrezeptoren CXCR3 und CCR6 bereits nach kurzer in vitro-Kultivierung
herunterreguliert werden [155], wurden diese Moleküle direkt nach der Isolierung der
PBMCs auf der Oberfläche der Zellen mit Hilfe Fluorochrom-gekoppelter Antikörper
markiert. Dazu wurde die Antikörperfärbelösung (α-CXCR3 und α-CCR6 in PBS) zu den
gewaschenen PBMCs hinzugefügt und für 30 min bei RT inkubiert. Danach wurden die
Zellen mit PBS gewaschen und wie oben beschrieben in Medium aufgenommen und in
Zellkulturplatten ausgesät.
Methoden
37
4.1.3 Stimulation von PBMCs
Zur Etablierung der Methode und für die Analyse von autoreaktiven T-Zellen in Gesunden
wurden PBMCs mit MOG, MBP, PLP, MP65, GAD65 oder EBNA-1 Peptid Pools
(0,6 nmol/ml/Peptid), AChR Peptid Pool (1 µg/ml/Peptid) oder KLH (200 µg/ml) unter
Zugabe von 1 µg/ml α-CD40 Antikörper stimuliert. PBMCs von MS-Patienten und
Kontrollen wurden mit einer Kombination aus MOG, MBP und PLP stimuliert (=Myelin).
Für jeden Spender wurde zusätzlich eine unstimulierte Probe mitgeführt. Die Stimulations-
zeit betrug 6 h für die Analyse der Chemokinrezeptor-Expression und 7 h unter Zugabe von
2 µg/ml Brefeldin A während der letzten 2 h für die Analyse intrazellulärer Zytokine und
FoxP3. Ausschließlich spezifisch aktivierte T-Zellen exprimierten in dieser Zeit die
Aktivierungsmarker CD154 (Tcons) und CD137 (Tregs) auf der Zelloberfläche.
4.1.4 Magnetische Anreicherung von CD154
+
und CD137
+
T-Zellen
Nach der Kurzzeitstimulation wurden die PBMCs aus den Zellkulturplatten in 5 ml
Reaktionsgefäße (bis 2x10
7
Zellen) oder 15 ml Röhrchen (2x10
7
- 10
8
Zellen) überführt.
CD154
+
bzw. CD137
+
Zellen wurden in zwei Schritten indirekt magnetisch markiert. Nach
einer Zentrifugation bei 300 x g und 4°C für 10 min erfolgte der erste Markierungsschritt
mittels CD154-Biotin und/oder CD137-PE-Antikörpern (in PEB-Puffer), welche für 10 min
bei 4°C inkubiert wurden. Anschließend wurden die Zellen für 10 min bei 300 x g und 4°C
mit PEB-Puffer gewaschen. Im nächsten Schritt wurden die Zellen durch α-Biotin-
MicroBeads oder α-PE-MicroBeads magnetisch markiert und für 15 min bei 4°C inkubiert.
Nach einem erneuten Waschschritt wurden die Zellen in PEB-Puffer aufgenommen.
10-20 µl der Zellsuspension wurden für Kontrollfärbungen abgenommen
(= Originalfraktion).
Die magnetisch-markierten Zellen wurden auf eine Zellseparationssäule (Typ MS)
aufgetragen, welche zuvor mit PEB-Puffer äquilibriert und an einem starken Magneten
Methoden
38
(OctoMACS) angebracht worden war. Die magnetisch markierten Zellen wurden dadurch in
der Säule zurückgehalten, während sich unmarkierte Zellen im Durchfluss befanden. Es
folgten zwei Waschschritte mit PBS bevor mit der Oberflächenfärbung direkt auf der Säule
fortgefahren wurde.
4.1.5 Markierung der Zellen mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern
4.1.5.1 Oberflächenfärbung
Um Oberflächenmoleküle auf den separierten Zellen mit Hilfe von Fluorochrom-
gekoppelten Antikörpern zu markieren, wurde die zuvor hergestellte Antikörper-
Färbelösung (Antikörper in PBS) direkt auf die Separationssäule aufgetragen und für 15 min
bei RT inkubiert. Tab. 13 gibt Aufschluss über die unterschiedlichen Antikörper-
kombinationen (Panels), welche für die Analyse a) der Funktion und des Phänotyps, b) der
Chemokinrezeptor-Expression, c) der Expression von FoxP3 sowie d) der Originalfraktion
verwendet wurden. Die Färbung von CD154 auf der Zelloberfläche in Panel b) und d)
erfolgte aufgrund der vorhergehenden magnetischen Markierung mittels Biotin-FITC-
Antikörpern. Zur Lebend-Tot-Diskriminierung enthielt die Lösung einen Farbstoff (LD),
welcher die spezifische Markierung toter Zellen erlaubt. Anschließend wurde die Säule
zweimal mit PEB-Puffer gewaschen und die Zellen mit PEB-Puffer aus der Säule in ein
1,5 ml Reaktionsgefäß eluiert. Für die Untersuchung der Chemokinrezeptor-Expression
wurden die Zellen nun für 5 min bei 300 x g und 4°C zentrifugiert und für die
durchflusszytometrische Analyse in PEB aufgenommen.
Zusätzlich wurden die zuvor abgenommenen Zellen der Originalfraktion mit der
Antikörper-Färbelösung versetzt (Tab. 13), für 15 min bei RT im Dunkeln inkubiert, mit
PEB-Puffer gewaschen und in diesem für die durchflusszytometrische Analyse
aufgenommen.
Methoden
39
4.1.5.2 Intrazelluläre CD154 und Zytokinfärbung
Für die intrazelluläre Zytokinfärbung mussten die Zellen zuvor fixiert und permeabilisiert
werden. Dazu wurden die Zellen nach der Oberflächenfärbung aus der Separationssäule
eluiert, 1:1 mit Fixierlösung (Inside Fix) versetzt und für 15 min bei RT im Dunkeln
inkubiert (Abb. 3). Im Anschluss wurde die Zellsuspension direkt auf eine zweite
äquilibrierte Säule aufgetragen. Dies führte außerdem zu einer gesteigerten Reinheit der
Zielzellen. Die Säule wurde zweimal mit PEB-Puffer und einmal mit der
Permeabilisierungslösung (Inside Perm) gewaschen. Danach wurde die Antikörper-
Färbelösung (Antikörper in Inside Perm, Tab. 13) aufgetragen und für 15 min bei RT
inkubiert. Die Säule wurde noch einmal mit Inside Perm gewaschen bevor die Zellen in ein
1,5 ml Reaktionsgefäß eluiert wurden. Nach einem Zentrifugationsschritt für 5 min bei 300 x
g und 4°C wurden die Zellen in PEB-Puffer für die durchflusszytometrische Analyse
aufgenommen.
4.1.5.3 Intranukleäre FoxP3-Färbung
Die intranukleäre Färbung des Transkriptionsfaktor FoxP3 fand nicht auf der
Separationssäule, sondern in einem 1,5 ml Reaktionsgefäß statt. Dazu wurde das FoxP3
Staining Buffer Set verwendet, welches eine Permeabilisierung des Zellkerns ermöglichte.
Die Fix/Perm-Lösung sowie der Perm-Puffer wurden nach Beschreibung des Herstellers
frisch vorbereitet und gekühlt verwendet. Nach der Oberflächenfärbung wurden die aus der
Separationssäule eluierten Zellen für 5 min bei 300 x g und 4°C zentrifugiert, mit Fix/Perm-
Lösung versetzt und für 30 min bei 4°C inkubiert. Nach einem Zentrifugationsschritt
wurden die Zellen in Perm-Puffer aufgenommen und sofort erneut zentrifugiert.
Anschließend wurde FcR-Blockierreagenz in Perm-Puffer hinzugefügt und für 5 min bei 4°C
inkubiert. Danach wurden FoxP3- und Helios-Antikörper (Tab. 13) direkt hinzugegeben
und für weitere 25 min inkubiert. Für die letzten 15 min der Inkubationszeit wurden
Methoden
40
schließlich CD154- und IFN-γ-Antikörper hinzugefügt. Die Zellen wurden mit Perm-Puffer
gewaschen und in PEB-Puffer für die durchflusszytometrische Analyse aufgenommen.
Tab. 13: Antikörper-Panels für die ex vivo Analyse von CD154
+
und CD137
+
T-Zellen
Funktion und
Phänotyp (Tcons)
Chemokinrezeptoren
(Tcons / Tregs)
FoxP3
(Tcons / Tregs)
Original-
fraktion
Fluorochrom Spezifität
VioGreen CD8/CD14/
CD20/LD
CD8/CD14/
CD20/LD
CD8/CD14/
CD20/LD
CD8/CD14/
CD20/LD
VioBlue/BV421
a)
CD154 CCR6 CD25 CCR6
d)
FITC GM-CSF
b)
CD154
c)
Helios CD154
c)
PE TNF-α CD137 CD137 CD137
d)
PerCP (Cy5.5)
a)
IFN-γ CD45RO IFN-γ CD45RO
PEVio770 CD45RO
CXCR3 CD154 CXCR3
d)
APC IL-17 CCR4 FoxP3 CCR4
d)
APCVio770 CD4
CD4 CD4
CD4
a) verwendetes Fluorochrom siehe Tab. 10
b) kursiv gedruckte Antikörper wurden für die intrazelluläre Färbung verwendet
c) via CD154-Biotin/α-Biotin-FITC
d) nur gefärbt mit der entsprechenden angereicherten Fraktion (Chemokinrezeptor-Panel)
4.1.6 Durchflusszytometrische Messung
Nach der magnetischen Anreicherung und Markierung mit Fluorochrom-gekoppelten
Antikörpern wurden die Antigen-spezifischen CD154
+
und/oder CD137
+
T-Zellen sowie die
Originalfraktion im Durchflusszytometer (MACSQuant) analysiert. Für jedes Antikörper-
Panel wurden zuvor Basis- und Kompensations-Einstellungen am Gerät durchgeführt, um
für die Überlappung der Emissionsspektren der einzelnen Fluorochrome zu korrigieren.
Anschließend wurde das gesamte Volumen der Proben aufgenommen.
Methoden
41
4.1.6.1 Gating-Strategie und Auswertung
Die Auswertung der generierten durchflusszytometrischen Daten erfolgte mit der Software
Flowjo. Die Analysestrategie ist in Abb. 4 am Beispiel der CD154
+
Tcons dargestellt. Die
Zielpopulationen wurden durch die Erstellung sequentieller Analysefenster („Gates“)
definiert. Dabei wurden nacheinander Lymphozyten, Einzelzellen und CD4
+
T-Zellen unter
Ausschluss von toten Zellen und weiteren PBMCs (CD8
+
T-Zellen, CD20
+
B-Zellen,
CD14
+
Monozyten) markiert. Anschließend wurden CD154
+
Zellen definiert, welche
weiterhin auf die Expression des Memory-T-Zell-Markers CD45RO und die Expression von
Chemokinrezeptoren (CXCR3, CCR6, CCR4; Abb. 4A) oder Zytokinen (TNF-α, IFN-γ,
IL-17, GM-CSF; Abb. 4B) untersucht wurden. Die Chemokinrezeptor-Expression auf
CD137
+
T-Zellen wurde in entsprechender Weise analysiert (siehe Abb. 25; zeigt ebenfalls
FoxP3-Färbung).
Abb. 4: Gating-Strategie für die ex vivo Analyse von autoreaktiven CD154
+
T-Zellen.Nach
der Messung der magnetisch angereicherten CD154
+
T-Zellen am Durchflusszytometer wurden
zur Auswertung sequentiell Lymphozyten, Einzelzellen, CD4
+
T-Zellen und CD154
+
T-Zellen unter
Ausschluss von toten und CD8
+
/14
+
/20
+
Zellen definiert. Diese Zellen wurden weiterhin (A) auf
die Expression von CD45RO und Zytokinen oder (B) CD45RO und Chemokinrezeptoren
untersucht. Angegeben ist der prozentuale Anteil innerhalb des vorhergehenden Analysefensters
und/oder die absolute Zellzahl.
FSC-A
SSC-A
FSC-A
FSC-H
CD4
CD8/14/20/LD
CD4
CD154
Chemokin-
rezeptor
CD45RO
FSC-A
SSC-A
FSC-A
FSC-H
CD4
CD8/14/20/LD
CD4
CD154
Zytokin
CD45RO
2,6%
97,4%
18,3%
47,9%
900
316 75
501 8
A
B
71,1%
98,7%
52,7%
1,94%
1981
Lymphozyten Einzelzellen CD4
+
Zellen CD154
+
Zellen CD45RO/Zytokin
Lymphozyten Einzelzellen CD4
+
Zellen CD154
+
Zellen
CD45RO/
Chemokinrezeptor
577 844
551 9
Methoden
42
Für die weitere Auswertung wurde die Anzahl an unspezifisch aktivierten Hintergrund-
Zellen in der unstimulierten Probe jeweils vom Signal der stimulierten Probe abgezogen und
prozentuale Anteile erst danach berechnet.
Für die Berechnung der Frequenz von autoreaktiven T-Zellen (siehe 4.4.1) sowie für
Vergleiche des Memory-Phänotyps und der Chemokinrezeptor-Expression innerhalb der
CD154
+
und der gesamten CD4
+
T-Zellen wurden in der Originalfraktion zunächst PBMCs,
Einzelzellen und schließlich CD4
+
T-Zellen unter Ausschluss von CD8
+
T-Zellen, B-Zellen,
Monozyten und toten Zellen definiert (Abb. 5). Anschließend wurde der prozentuale Anteil
an CD45RO
+
Zellen und die Expression der Chemokinrezeptoren CXCR3, CCR6 und CCR4
innerhalb der CD4
+
T-Zellen untersucht.
Abb. 5: Gating-Strategie für die Analyse der Originalfraktion. Innerhalb der gemessenen
Probe wurden PBMCs von Zelldebris unterschieden sowie Einzelzellen und CD4
+
T-Zellen unter
Ausschluss von toten und CD8
+
/14
+
/20
+
Zellen definiert. Auf den CD4
+
T-Zellen wurde weiterhin
die Expression von CD45RO und in einigen Experimenten die Expression der
Chemokinrezeptoren CXCR3, CCR6 und CCR4 untersucht. Angegeben ist jeweils der prozentuale
Anteil innerhalb des vorhergehenden Analysefensters.
4.1.6.2 Boolesche Analyse
Die Analyse der Ko-Expression kann sich für Kombinationen der hier untersuchten
Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-17 und GM-CSF durch sequentielles manuelles Gating sehr
komplex gestalten. Daher wurde der in der Software FlowJo enthaltene kombinatorische
Ansatz nach Boole gewählt, mit welchem auf der Basis der logischen Operatoren UND,
ODER und NICHT der Anteil an Zytokinproduzenten innerhalb der Autoantigen-
spezifischen Memory T-Zellen (CD154
+
/CD45RO
+
) für alle möglichen Kombination
FSC-A
SSC-A
FSC-A
FSC-H
CD4
CD8/14/20/LD
Chemokin-
rezeptor
CD45RO
PBMC Einzelzellen CD4
+
Zellen
CD45RO/
Chemokinrezeptor
77,1%
96,8%
33,8%
19,0% 27,3%
52,9% 0,9%
Methoden
43
automatisch berechnet werden konnte (Abb. 6). Auch hier wurde zunächst das Signal der
unstimulierten Probe vom Signal der stimulierten Probe abgezogen bevor prozentuale
Anteile berechnet wurden.
Abb. 6: Boolesche Gating-Strategie für die Analyse der Zytokinproduktion durch CD154
+
T-Zellen. Für die kombinatorische (boolesche) Analyse wurden innerhalb der CD154
+
/CD45RO
+
T-
Zellen totale TNF-α- (rot), IFN-γ- (gelb), IL-17- (blau) und GM-CSF-Produzenten (grün) markiert. Mit
Hilfe boolescher Operatoren (Software FlowJo) konnte anschließend für alle Kombinationen
dieser vier Zytokine der Anteil an Vierfach-, Dreifach-, Doppel-, Einzel-, und Nicht-Produzenten
berechnet werden.
4.2 In vitro Generierung von autoreaktiven T-Zell-Klonen und T-Zell-
Linien
Für Spezifitätstestungen, zur Bestimmung der funktionellen Avidität sowie für Studien zur
Kreuzreaktivität von autoreaktiven T-Zellen wurden T-Zell-Linien (TZL) und T-Zell-Klone
(TZK) aus angereicherten, FACS-sortierten CD4
+
/CD154
+
naiven und Memory T-Zellen
generiert. Der Versuchsablauf ist schematisch in Abb. 7 dargestellt und wird in den
folgenden Abschnitten im Einzelnen erläutert.
IFN-γ
TNF-α
GM-CSF
IL-17
TNF-α + + + + - + + + - - - + - - - -
IFN-γ + + - + + + - - + + - - + - - -
IL-17 + + + + - + - + - + - - + - -
GM-CSF + - + + + - - + - + + - - - + -
kombinatorische (boolesche) Analyse
CD154
+
/CD45RO
+
Methoden
44
Abb. 7: Schematischer Versuchsablauf zur in vitro Generierung von autoreaktiven T-Zell-
Klonen und -Linien. 1-2x10
8
isolierte PBMCs von gesunden Personen oder MS-Patienten wurden
für 6h mit Autoantigenen oder MP65 stimuliert. Antigen-aktivierte, CD154
+
T-Zellen wurden
anschließend mittels magnetischer Zellsortierung angereichert, mit Flurochrom-gekoppelten
Antikörpern gefärbt und zur weiteren Erhöhung der Reinheit bzw. zur Vereinzelung FACS-sortiert.
TZL oder TZK wurden über 2-6 Wochen mit allogenen Feederzellen, IL-2 und OKT-3 expandiert
bevor sie nach einer zweitägigen Ruhephase unter Zugabe von autologen APCs mit dem initialen
Antigen, irrelevanten Kontrollantigenen oder potentiell kreuzreaktiven mikrobiellen Antigenen
restimuliert wurden. Die Re-Expression von CD154 und TNF-α wurde durchflusszytometrisch
analysiert. APCs = Antigen-präsentierende Zellen.
4.2.1 Generierung von allogenen Feederzellen
Für die in vitro Expansion von autoreaktiven TZK und TZL wurden sog. Feederzellen
benötigt, welche als Wachstumsmatrix dienten und die Zellproliferation durch die Sekretion
von Zytokinen unterstützten. Als Feederzellen wurden gemischte PBMCs von drei bis vier
gesunden Spendern verwendet, welche in einer Bestrahlungsanlange mit 30 gy (γ-Strahler)
bestrahlt wurden, um ein Auswachsen dieser Zellen in Kultur zu verhindern. Die
Feederzellen wurden in einer Konzentration von 1-2x10
7
/ml mit Einfriermedium versetzt
(siehe Tab. 8) und bis zur Verwendung bei -80°C gelagert. Für die Expansion von
autoreaktiven TZK wurden die Zellen aufgetaut und 1x10
5
Feederzellen/Well in 100 µl
Expansionsmedium (siehe Tab. 8) in einer 96-Well-Zellkulturplatte (Rundboden) vorgelegt.
Für die Expansion von autoreaktiven TZL wurden 2,5x10
5
Feederzellen/Well in 250 µl
Expansionsmedium in einer 48-Well-Zellkulturplatte vorgelegt.
PBMC Isolierung
Stimulation
CD154
+
Anreicherung
Oberflächenfärbung
FACS-
Sortierung
CD4
+
/CD154
+
/CD69
+
6 h
S N
Expansion
Restimulation
durchfluss-
zytometrische
Analyse
Re-Expression
CD154, TNF-α
2-6 Wochen
+ allogene
Feederzellen
IL-2, α-CD3
7 h
+ autologe
APC
Methoden
45
4.2.2 Anreicherung von CD154
+
T-Zellen und Färbung von
Oberflächenmolekülen
1-2x10
8
isolierte PBMCs wurden für 6 h mit den Autoantigenen MOG, MBP, PLP oder
GAD65 oder mit dem Kontrollantigen MP65 (jeweils 0,6 nmol/ml/Peptid) unter Zugabe von
1 µg/ml α-CD40 stimuliert (siehe 4.1.3). Anschließend wurden aktivierte CD154
+
T-Zellen
magnetisch angereichert wie in 4.1.4 beschrieben. Die Markierung von
Oberflächenmolekülen für die nachfolgenden FACS-Sortierung erfolgte auf der
Separationssäule (siehe 4.1.5.1 und Tab. 14), wobei der bereits mit Biotin/α-Biotin-
MicroBeads markierte Aktivierungsmarker CD154 mittels α-Biotin-PE gefärbt wurde. Die
angereicherten und gefärbten Antigen-spezifischen T-Zellen wurden mit PEB-Puffer aus der
Separationssäule in 5 ml FACS-Röhrchen eluiert.
Tab. 14: Antikörper-Panels für die in vitro Expansion
FACS-Sortierung Restimulation
Fluorochrom Spezifität
VioGreen CD8/CD14/CD20/LD CD14
VioBlue CD45RA CD154
a)
FITC CD69 IL-17
b)
PE CD154 TNF-α
PerCP Cy5.5 - IFN-γ
b)
PEVio770 CCR7 -
APC - GM-CSF
b)
APCVio770 CD4
CD4
a) kursiv gedruckte Moleküle wurden intrazellulär angefärbt
b) nicht in allen Experimenten verwendet
4.2.3 FACS-Sortierung und in vitro Expansion
Da die magnetisch angereicherte Zellfraktion aufgrund der geringen Frequenz von CD154
+
T-Zellen noch einen hohen Anteil an weiteren PBMCs enthielt, welche unspezifisch in der
Methoden
46
Separationssäule zurückgehalten wurden, schloss sich eine Zellsortierung am BD Influx Zell-
sorter (FACS) an. Für die Generierung von Autoantigen-spezifischen TZL wurden
CD154
+
/CD69
+
/CD45RA
+
/CCR7
+
naive und/oder CD154
+
/CD69
+
/CD45RA
‒
Memory
T-Zellen in mit Expansionsmedium befüllte FACS-Röhrchen sortiert (Abb. 8). Pro naiver
TZL wurden dabei im Durchschnitt 540 MP65-reaktive T-Zellen und 610 autoreaktive
T-Zellen je Antigen sortiert. Pro Memory TZL wurden durchschnittlich 860 MP65-reaktive
T-Zellen und 530 autoreaktive T-Zellen sortiert. Die sortierten Zellen wurden in die
vorbereiteten 48-Well-Zellkulturplatten (4.2.1) überführt, sodass ein Endvolumen von
1 ml/Well erreicht wurde. Für die Generierung von Autoantigen-spezifischen naiven und
Memory TZK wurden Einzelzellen direkt zu den Feederzellen in die vorbereiteten 96-Well-
Zellkulturplatten sortiert.
Abb. 8: Analysestrategie für die FACS-Sortierung von autoreaktiven T-Zellen. Für die
Generierung Autoantigen-spezifischer TZL und TZK wurden magnetisch angereicherte und mit
Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markierte CD154
+
Zellen zur weiteren Erhöhung der
Reinheit FACS-sortiert. Nachdem Lymphozyten, Einzelzellen und CD4
+
T-Zellen wie in Abb. 4
definiert wurden, wurde das Analysefenster auf CD154
+
/CD69
+
T-Zellen gelegt. Aus dieser
Population hervorgehende naive (CD45RA
+
/CCR7
+
) und Memory (CD45RA‒) T-Zellen wurden
anschließend als Gesamtpopulation (TZL) oder Einzelzellen (TZK) sortiert und in vitro expandiert.
Die Autoantigen-spezifischen TZL und TZK wurden nach Bedarf mit frischem
Expansionsmedium (ohne Zugabe von α-CD3 (OKT-3)) versorgt und subkultiviert. TZK
erhielten nach einer Woche in Kultur frische Feederzellen in 100 µl Expansionsmedium.
Ab Tag 14 konnten expandierte Klone, welche deutlich am Farbumschlag des Mediums und
am vergrößerten Zellpellet zu erkennen waren, in eine 96-Well-Zellkulturplatte mit
Flachboden überführt werden. Die TZL und TZK wurden für 2-6 Wochen expandiert bis, je
nach Experiment, eine Zellzahl von 1-5 x 10
6
Zellen erreicht war.
CD69
CD154
CD45RA
CCR7
CD154
+
/CD69
+
5,4%
T
Memory
72,9%
T
Naiv
20,6%
Methoden
47
4.2.4 Generierung von CD3-depletierten Antigen-präsentierenden Zellen
Zur Restimulation der expandierten autoreaktiven TZL und TZK wurden autologe Antigen-
präsentierende Zellen (APCs) benötigt. Diese wurden aus PBMCs des gleichen Spenders
durch die Depletion von CD3
+
T-Zellen generiert. Dazu wurden 1-3x10
8
PBMCs mit α-CD3-
MicroBeads (in PE-Puffer) nach Herstellerangaben magnetisch markiert und in PE-Puffer
auf eine äquilibrierte Depletionssäule (Typ LD), welche an einem starken Magneten
angebracht war, aufgetragen. Die Säule wurde zweimal mit PE-Puffer gespült. Während die
markierten Zellen auf der Säule zurückgehalten wurden, enthielt der Durchfluss die
gewünschten CD3-depletierten APCs mit einer durchschnittlichen Reinheit von 98%. Die
APCs wurden bis zu ihrer Verwendung entweder in Einfriermedium (1-2x10
7
/ml) bei -80°C
gelagert oder frisch verwendet.
4.2.5 Restimulation, Markierung mit Fluorochrom-gekoppelten
Antikörpern und durchflusszytometrische Analyse
Zwei Tage vor Restimulation der expandierten TZL und TZK wurde das
Expansionsmedium, welches 200 IU/ml proliferationsförderndes IL-2 enthielt, entfernt und
die Zellen wurden in Stimulationsmedium aufgenommen (Tab. 8). Somit kamen die
T-Zellen in ein Ruhestadium, wodurch unspezifische Hintergrundaktivierung verhindert
wurde. Am Tag der Restimulation wurden die Zellen einer TZL oder eines TZK gezählt.
Je nach Zellzahl wurden 5x10
4
- 1x10
5
T-Zellen/Well in einem Verhältnis von 1:1 mit
autologen APCs in 70 µl Stimulationsmedium in einer 384-Well-Zellkulturplatte
zusammengesetzt. Anschließend wurden die Zellen wie im Folgenden beschrieben stimuliert
und durchflusszytometrisch analysiert.
4.2.5.1 Validierung der Spezifität
Zur Validierung der Spezifität des CD154-Anreicherungsassays wurden MP65-, MOG- und
GAD65-reaktive Memory TZK mit dem initialen Antigen sowie mit einem irrelevanten
Methoden
48
Antigen unter Zugabe von 1 µg/ml CD28-Antikörpern stimuliert (Konzentrationsangaben
siehe 4.1.3). Als Negativkontrolle wurde kein Antigen zu den Zellen gegeben. Die Zellen
wurden für 7 h stimuliert, unter Zugabe von 2 µg/ml Brefeldin A während der letzten 4 h.
Anschließend wurden Oberflächen- und intrazelluläre Moleküle (Tab. 14) direkt in der
Zellkulturplatte nach dem modifizierten "Rapid Cytokine Inspector" Protokoll
1
(Miltenyi
Biotec) gefärbt. Dazu wurden die Wells der Zellkulturplatte nach Ende der Stimulationszeit
mit PEB-Puffer aufgefüllt und für 10 min bei 300 x g und 4°C zentrifugiert. Der
Zellkulturüberstand wurde abgenommen und 20 µl Antikörperfärbelösung, welche sowohl
die Oberflächen- als auch die intrazellulären Antikörper enthielt (Tab. 13), in jedes Well
pipettiert. Nach einer Inkubationszeit von 10 min bei RT im Dunkeln wurden zur Fixierung
der Zellen 15 µl Inside Fix/Well direkt hinzugegeben und für weitere 15 min inkubiert.
Schließlich wurden die Zellen durch Hinzufügen von 7 µl 10x Inside Perm/Well
permeabilisiert, sodass die intrazellulären Antikörper an ihre Zielstrukturen binden
konnten. Nach einer Inkubationszeit von 10 min bei RT im Dunkeln wurden 40 µl PEB-
Puffer hinzugegeben und die Zellkulturplatte bei 300 x g und RT für 10 min zentrifugiert.
Der Überstand wurde entfernt und die Zellen in 60 µl PEB-Puffer/Well für die Analyse im
Durchflusszytometer aufgenommen.
Nach der Optimierung der Geräte- und Kompensationseinstellungen am MACSQuant
Durchflusszytometer (siehe 4.1.6) wurden die restimulierten und mit Flurochrom-
gekoppelten Antikörpern markierten Zellen direkt aus der Zellkulturplatte aufgenommen
und analysiert. Die Re-Expression von CD154 und TNF-α auf den expandierten TZL und
TZK zeigte dabei eine spezifische Re-Aktivierung an. Zur Auswertung wurde das Signal der
unstimulierten Probe vom spezifischen Signal abgezogen.
1
http://www.miltenyibiotec.com/en/products-and-services/macs-flow-cytometry/reagents/kits-and-
assays/rapid-cytokine-inspector-cd4-t-cell-kit-human.aspx
Methoden
49
4.2.5.2 Untersuchung auf Kreuzreaktivität
Zur Untersuchung der Kreuzreaktivität wurden expandierte MP65-, MOG-, MBP-, PLP-
und GAD65-reaktive naive und Memory TZL mit verschiedenen mikrobiellen Antigenen
unter Zugabe von 1 µg/ml CD28-Antikörper stimuliert. Folgende Antigene wurden
verwendet: CMV Lysat (20 µg/ml), A. fumigatus Lysat (40 µg/ml), C. albicans Lysat
(20 µg/ml), E. coli (40 µg/ml), BRLF-1 Peptid-Pool (0,6 nmol/ml), EBNA-1 Peptid-Pool
(0,6 nmol/ml) und HSV-1 Lysat (20 µg/ml). Der experimentelle Ablauf glich dem in
Abschnitt 4.2.5.1 beschriebenen.
4.2.5.3 Bestimmung der funktionellen Avidität
Zur Bestimmung der funktionellen Avidität wurden MP65- oder autoreaktive TZL (MOG,
MBP, PLP, GAD65) oder TZK (MOG) mit einer absteigenden Menge des initialen Antigens
stimuliert. Hierzu wurde eine Verdünnungsreihe mit PBS angesetzt, sodass die finalen
Konzentrationen 3 nmol/ml - 6x10
-6
nmol/ml betrugen. Die Zellen wurden wie in 4.2.5.1
beschrieben stimuliert, mit Fluorochrom-gekoppelten Antikörpern markiert und im
Durchflusszytometer analysiert.
Zur Auswertung wurden Dosis-Antwort-Kurven mit Hilfe der Software GraphPad Prism
erstellt. Dazu wurde der Anteil an aktivierten CD154
+
/TNF-α
+
Zellen gegen die
Antigenkonzentration aufgetragen und eine 3-Parameter-Fit Kurvenanpassung
durchgeführt. Aus der so erstellten Dosis-Antwort-Kurve konnte die halbmaximale effektive
Antigenkonzentration (EC50) berechnet werden, nachdem das Minimum und das
Maximum der Kurve auf 0 bzw. 100 beschränkt wurde. Hohe EC50-Werte definierten
hierbei eine geringe funktionelle Avidität bzw. Antigensensitivität.
Methoden
50
4.3 T-Zell-Rezeptor-Sequenzierung
Für die Hochdurchsatz-Sequenzierung der T-Zell-Rezeptoren (TCRs) wurden EBNA-1 und
Myelin-spezifische TZL wie in den Abschnitten 4.2.1-4.2.5.1 beschrieben und in Abb. 7
dargestellt aus PBMCs einer RRMS-Patientin (MS24) generiert. Nach der Expansion und
Restimulation mit dem initialen Antigen wurden die Zellen jedoch nicht am
Durchflusszytometer analysiert, sondern ein zweites Mal FACS-sortiert um reaktivierte
(CD154
+
/TNF-α
+
) T-Zellen gezielt zu separieren. Etwa 2500 Myelin-spezifische und 1000
EBNA-1 spezifische T-Zellen sowie 5x10
5
der ursprünglichen PBMCs wurden als Zellpellet
in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Weiterverwendung bei -80°C gelagert.
4.3.1 Isolierung der genomischen DNA
Die Isolation der totalen genomischen DNA (gDNA) erfolgte mit Hilfe des DNeasy Blood
and Tissue Kits nach den Angaben des Herstellers Qiagen. Dazu wurden die Zellpellets auf-
getaut, mit ATL-Puffer und Proteinase K versetzt und bis zur kompletten Zell-Lyse für 3h
bei 56°C inkubiert. Die nachfolgenden Schritte wurden bei RT durchgeführt. Nach einer
Zentrifugation bei 20.000 x g für 3 min wurde der Überstand mit AL-Puffer und Ethanol
(99,8%) versetzt und zur Aufreinigung der gDNA auf eine Säule aufgetragen. Die Säule
wurde für 1 min bei 6000 x g zentrifugiert und anschließend mit AW1-Puffer und AW2-
Puffer gewaschen (Zentrifugation bei 6000 x g für 1 min bzw. bei 20.000 x g für 3 min).
Schließlich wurde die Säule durch Zentrifugation bei 20.000 x g für 1 min getrocknet und die
gDNA mit AE-Puffer durch Zentrifugation in ein neues Auffangröhrchen eluiert. Der DNA-
Gehalt wurde im Nanodrop bestimmt und die gDNA wurde bis zur Weiterverwendung bei
-20°C gelagert.
Methoden
51
4.3.2 Hochdurchsatz-Sequenzierung
Die Sequenzierung der CDR3-Region der TCR β-Kette erfolgte unter Anwendung des
ImmunoSeq
™
-Assays durch Adaptive Biotechnologies (Seattle, USA). Die extrahierte gDNA
wurde dabei in einer Bias-kontrollierten Multiplex-PCR amplifiziert, gefolgt von einer
Hochdurchsatz-Sequenzierung wie zuvor beschrieben [156-158].
4.4 Statistik und Berechnungen
4.4.1 Berechnung der Frequenzen von Antigen-spezifischen T-Zellen
Zur Berechnung der Frequenz von Antigen-spezifischen Tcons und Tregs wurde die
absolute Anzahl an CD4
+
/CD154
+
bzw. CD4
+
/CD137
+
T-Zellen nach Anreicherung durch
die absolute Anzahl an CD4
+
T-Zellen innerhalb der totalen PBMCs vor Anreicherung
geteilt. Letzteres wurde durch die Bestimmung des prozentualen Anteils an CD4
+
T-Zellen
innerhalb der Originalfraktion ermittelt. Bsp.: Nach Anreicherung von CD154
+
T-Zellen aus
5x10
7
stimulierten PBMCs und Messung der gesamten Probe am Durchflusszytometer wird
nach Abzug des Hintergrundsignals der unstimulierten Probe eine absolute Anzahl von 900
CD4
+
/CD154
+
Antigen-spezifischen T-Zellen bestimmt. In der Originalfraktion machen
CD4
+
T-Zellen 40% der lebenden PBMCs aus. 40% von 5x10
7
sind 2x10
7
. Die Frequenz der
Antigen-spezifischen T-Zellen beträgt demnach 900/2x10
7
= 4,5x10
-5
.
4.4.2 Statistische Tests
Zur Bestimmung der Signifikanzwerte von unabhängigen Stichproben wurde der Mann-
Whitney-U-Test verwendet. Mit diesem Test werden die Rangsummen von Stichproben
verglichen, sodass eine Normalverteilung und eine Varianzhomogenität der Daten innerhalb
der Stickprobe nicht vorausgesetzt wird. Für Vergleiche gepaarter Daten wurde der
Wilcoxon-Rangsummentest verwendet. Eine Normalverteilung der Daten innerhalb der
Stichprobe sowie eine Varianzhomogenität ist dabei ebenfalls nicht erforderlich. Die
Methoden
52
Berechnung erfolgte mit der Software GraphPad Prism. Statistische Signifikanz wurde
festgelegt auf p<0,05,*; p<0,01,**; p<0,001,***.
4.4.3 Spearman-Korrelation
Zur Untersuchung eines statistischen Zusammenhanges zwischen zwei Merkmalen wurde
die Spearman-Korrelation verwendet. Auch bei dieser Methode werden die Daten nach
Rängen geordnet, sodass eine Normalverteilung der Daten und eine Varianzhomogenität
nicht erforderlich ist. Der Korrelationskoeffizient r
s
umfasst dabei Werte von -1 bis +1 und
zeigt Stärke und Richtung des statistischen Zusammenhanges an. Der p-Wert gibt an, ob
sich r
s
signifikant von 0 unterscheidet, wobei ein p-Wert < 0,05 als statistisch signifikant
bezeichnet wurde.
4.5 Angaben zu Kollaborationen
Die Daten zu GAD65-reaktiven T-Zellen in gesunden Individuen (Frequenz,
Zytokinproduktion, Phänotyp) sind zu einem Teil in Zusammenarbeit mit der von mir
betreuten Masterstudentin Franziska Hahn entstanden und in ihrer Masterarbeit mit dem
Titel: "Ex vivo Charakterisierung von Diabetes mellitus Typ I-assoziierten Autoantigen-
spezifischen CD4
+
T-Zellen von gesunden Individuen" veröffentlicht (FU Berlin). Dies
betrifft Ergebnisse aus Abschnitt 5.1.2, 5.1.3, 5.2.1 und 5.2.2.
Die Daten zur Prävalenz von KLH-reaktiven T-Zellen aus Abschnitt 5.1.2 wurden für sechs
von neun Spendern von der Wissenschaftlerin Dr. Petra Bacher aus unserer Arbeitsgruppe
generiert.
Die Daten zur TCR-Sequenzierung wurden im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Stefan
Gold, Leiter der AG Neuropsychiatrie der Klinik für Psychiatrie und Psychotherapie
(Charité Berlin), generiert. Dabei erfolgte die Sequenzierung der von mir generierten Proben
durch das Unternehmen Adaptive Biotechnologies in Seattle, WA, USA.
Ergebnisse
53
5 Ergebnisse
5.1 Implementierung und Validierung einer Methode zur direkten ex
vivo Detektion von Autoantigen-spezifischen CD4
+
T-Zellen
Der direkte Nachweis von Autoantigen-spezifischen T-Zellen gestaltet sich aufgrund ihres
geringen Vorkommens im peripheren Blut (<1 Zelle in 10.000 CD4
+
T-Zellen) schwierig
[143]. Im Jahr 2013 entwickelten Bacher et al. eine sensitive Methode zur magnetischen
Anreicherung von Antigen-aktivierten CD4
+
T-Zellen auf Grundlage der Expression des
Aktivierungsmarkers CD154 (CD40L) (antigen-reactive T cell enrichment = ARTE [151]).
Diese ermöglicht die Detektion seltener Autoantigen-spezifischer T-Zellen direkt ex vivo,
ohne vorherige langandauernde Manipulation, wie beispielsweise durch Expansion. In der
vorliegenden Arbeit wurde diese Methode in Kombination mit multiparametrischer
Durchflusszytometrie mit dem Ziel angewandt, das Vorkommen, die Funktion und den
Phänotyp von Autoantigen-reaktiven T-Zellen detailliert zu untersuchen. Im Speziellen
sollten Krankheits-assoziierte Myelin-reaktive T-Zellen von Patienten mit Multipler Sklerose
(MS) und gesunden Kontrollen charakterisiert und verglichen werden, um ihre vermutliche
Schlüsselrolle innerhalb der Immunpathogenese der Erkrankung zu überprüfen.
5.1.1 Anreicherung von autoreaktiven CD154
+
CD4
+
T-Zellen
Das kostimulatorische Molekül CD154 gehört zur TNF-Superfamilie und wird bereits 4-12 h
nach Antigenkontakt transient auf der Oberfläche von aktivierten CD4
+
T-Zellen exprimiert
[143, 152, 153]. Seltene Antigen-spezifische CD154
+
CD4
+
T-Zellen (im Folgenden: CD154
+
T-Zellen) können nach Aktivierung mit Hilfe eines magnetischen Anreicherungsschrittes
mit hoher Spezifität und Sensitivität detektiert und ausführlich charakterisiert werden [151].
Um die Anwendbarkeit dieser Methode für quantitative phänotypische und funktionelle
Untersuchungen von Autoantigen-reaktiven T-Zellen zu bestätigen, wurden 1x10
8
PBMCs
mit dem MS-assoziierten Autoantigen Myelin-Oligodendrozyten Protein (MOG) sowie mit
Ergebnisse
54
dem Kontrollantigen Mannoprotein 65 (MP65), stimuliert. Das Protein MP65 ist ein T-Zell-
Zielantigen von Candida albicans, einem fakultativ pathogenen aber normalerweise
harmlosen kommensalen Hefepilz. Es gehört zu den sog. „Recall-Antigenen“, da es bei
nahezu 100% der gesunden Probanden durch eine vorangegangene Sensibilisierung eine
deutliche spezifische Immunantwort auslöst. Antigen-aktivierte CD154
+
T-Zellen wurden
anschließend magnetisch angereichert und nach Markierung mit Fluoreszenz-gekoppelten
Antikörpern im Durchflusszytometer analysiert.
Abb. 9: Anreicherung von CD154
+
Autoantigen-spezifischen T-Zellen. Isolierte PBMCs
wurden mit MP65 oder MOG für 7h stimuliert. CD154
+
Zellen wurden magnetisch angereichert.
Anschließend wurde die Expression von CD154 und TNF-α durchflusszytometrisch analysiert.
Exemplarische Dot Plots eines gesunden Spenders sind dargestellt (Analysefenster auf CD4
+
T-Zellen). Absolute Zellzahlen und Frequenzen (A) der CD154
+
T-Zellen innerhalb der CD4
+
T-Zellen von 3x10
5
gemessenen PBMCs ohne Anreicherung bzw. (B) der CD154
+
T-Zellen inner-
halb der totalen eingesetzten CD4
+
T-Zellen nach Anreicherung aus 1x10
8
PBMCs sind gezeigt.
Ohne magnetische Anreicherung ist unter Beachtung des Detektionslimits der
Durchflusszytometrie (etwa 0,01%) und der begrenzten Aufnahmegeschwindigkeit
konventioneller Geräte (etwa 10
6
Zellen in 8-10 min) eine weiterführende Analyse von
CD154
+
Autoantigen-spezifischen T-Zellen praktisch nicht möglich. Nach Aufnahme von
3x10
5
PBMCs ohne Anreicherung konnten 4 Zellen Hintergrundsignal, 49 MP65-spezifische
und 19 MOG-spezifische T-Zellen detektiert werden (Abb. 9A). Dies ergab einen
TNF-α
CD154
TNF-α
CD154
unstimuliert MP65 MOG
ohne
Anreicherung
mit
Anreicherung
4
0,004%
0
0,0%
17
0,016%
32
0,03%
16
0,015%
3
0,003%
113
0,0003%
20
5x10
-5
%
547
0,001%
2688
0,007%
685
0,002%
438
0,001%
A
B
Ergebnisse
55
prozentualen Anteil von 0,046% MP65- bzw. von 0,018% MOG-spezifischen T-Zellen
innerhalb der totalen CD4
+
T-Zellen. Demgegenüber waren nach der Anreicherung von
aktivierten CD154
+
Zellen aus 1x10
8
stimulierten PBMCs (40% CD4
+
T-Zell-Anteil)
deutliche CD154
+
Populationen zu erkennen (MP65 ≈ 3000 Zellen, MOG ≈ 1000 Zellen), die
anschließend quantitativ aussagekräftig auf weitere Parameter wie Phänotyp oder die
Produktion von Zytokinen untersucht werden können (Abb. 9B). Der prozentuale Anteil
innerhalb der totalen eingesetzten CD4
+
T-Zellen betrug hier 0,008% für MP65- bzw. 0,003%
für MOG-reaktive T-Zellen. Auch das Verhältnis von Signal zu Hintergrund wurde durch
den Anreicherungsschritt verbessert, in diesem Beispiel für beide Antigene etwa um den
Faktor 2, was zu exakteren und verlässlicheren Ergebnissen führt (siehe auch [151]).
Diese ersten Daten bestätigten die Anwendbarkeit der Anreicherung von aktivierten CD154
+
Zellen nach Kurzzeitstimulation zur direkten ex vivo Analyse autoreaktiver T-Zellen.
5.1.2 Prävalenz von autoreaktiven T-Zellen in Gesunden
In verschiedenen Studien wurde gezeigt, dass autoreaktive T-Zellen zum normalen T-Zell
Repertoire von gesunden Individuen gehören [71, 159, 160]. Angaben zu ihren (Vorläufer-)
Frequenzen sind jedoch durch die Anwendung unterschiedlicher Detektionsmethoden und
vorausgehenden Expansionsschritten z.T. stark abweichend. Mit Hilfe der Anreicherung von
CD154
+
T-Zellen konnten in dieser Arbeit die Frequenzen von Autoantigen-spezifischen
CD4
+
T-Zellen direkt aus dem peripheren Blut bestimmt werden.
Um das Vorkommen von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen in gesunden Probanden zu unter-
suchen wurden 4x10
7
-1x10
8
PBMCs mit den mit MS-assoziierten Myelin-Antigenen MOG,
Myelin basisches Protein (MBP) und Proteolipidprotein (PLP) stimuliert. Weiterhin wurden
die bekannten Haupt-Autoantigene der Muskelschwäche-Erkrankung Myasthenia gravis
(MG), der Acetylcholinrezeptor (AChR), und Diabetes mellitus Typ I (T1D), die 65-kD-
Isoform der Glutamat-Decarboxylase (GAD65), sowie das Kontrollantigen MP65 und das
aus der Hämolymphe der Schlitzschnecke gewonnene Neoantigen Keyhole Limpet
Ergebnisse
56
Hemocyanin (KLH) verwendet. Abb. 10A-C zeigen exemplarisch die absolute Anzahl an re-
aktiven Zellen nach Antigenstimulation von 4x10
7
-1x10
8
PBMCs und nachfolgender Anrei-
cherung aktivierter CD154
+
T-Zellen. Aus diesen Zellzahlen wurde anschließend nach Ab-
zug des Hintergrundsignals die Frequenz innerhalb der totalen eingesetzten CD4
+
T-Zellen
berechnet (Berechnung siehe 4.4.1). Das Detektionslimit wurde dabei auf 20 CD154
+
T-Zellen
Abb. 10: Frequenzen von Autoantigen-spezifischen T-Zellen in gesunden Individuen.
4x10
7
-1x10
8
PBMCs wurden mit MP65 (n=38), KLH (n=9) oder mit Krankheits-assoziierten
Autoantigenen für (A) MS (MOG, MBP oder PLP; n=12-16), (B) Myasthenia gravis (AChR; n=12)
und (C) Typ I Diabetes mellitus (GAD65; n=22) für 7 h stimuliert. CD154
+
Zellen wurden
magnetisch angereichert und durchflusszytometrisch analysiert (Analysefenster auf CD4
+
T-Zellen). Dargestellt sind die absoluten Zellzahlen nach Anreicherung aus der jeweils unten
rechts angegebenen Anzahl an PBMCs. (D) Zusammenfassende Darstellung der Frequenzen von
CD154
+
T-Zellen nach Anreicherung bezogen auf die absolute Anzahl an CD4
+
Zellen vor
Anreicherung und der (E) normalisierten Frequenzen unter Beachtung der Anzahl an
Einzelpeptiden pro Peptid-Pool. Der Median und das Detektionslimit von 2x10
-7
ist
gekennzeichnet. Signifikanzwerte beziehen sich auf das Kontrollantigen MP65.
unstimuliert MP65 MOG MBP1 PLP
1221 388 6575562
A
B
CD4
CD154
C
unstimuliert GAD65
CD4
CD154
CD4
CD154
unstimuliert AChR
49
25 832
1619
99
4x10
7
1x10
8
5x10
7
D
Frequenz pro Peptid
Frequenz
E
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
10
- 9
10
- 8
10
- 7
10
- 6
10
- 5
***
***
*** *** ***
Zellzahl CD154
+
/
Zellzahl CD4
+
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
KLH
10
- 7
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
***
***
***
**
***
***
Zellzahl CD154
+
/
Zellzahl CD4
+
Ergebnisse
57
innerhalb von 10
7
CD4
+
T-Zellen festgelegt. Zusätzlich sollte das positive Signal mindestens
zweifach über dem Hintergrundsignal liegen. Während MP65-spezifische T-Zellen mit einer
medianen Häufigkeit von 84 Zellen pro 10
6
CD4
+
T-Zellen detektiert werden konnten,
waren autoreaktive T-Zellen mit einer medianen Frequenz von 54 Zellen pro 10
7
CD4
+
T-Zellen (MBP) bis 41 Zellen pro 10
6
CD4
+
T-Zellen (AChR) deutlich seltener im peripheren
Blut zu finden (Abb. 10D). Neoantigen-spezifische T-Zellen konnten mit einer medianen
Frequenz von 42 Zellen pro 10
7
CD4
+
T-Zellen bei allen getesteten Individuen nachgewiesen
werden. Die für Myasthenie und Diabetes verantwortlichen Autoantigene erzeugten stärkere
T-Zell-Antworten als die Myelin-Antigene. Von den Myelin-Antigenen stimulierte MBP
signifikant weniger T-Zellen als MOG und PLP. Nach Normalisierung der Frequenzen auf
die Anzahl an Peptiden innerhalb eines Peptid-Pools näherten sich die medianen
Frequenzen mit der Ausnahme von MBP-spezifischen T-Zellen (7,3x10
-8
) für alle
Autoantigene an (2,4-3,6x10
-7
) (Abb. 10E). Da sich die tatsächliche Immunogenität einzelner
Peptide für einzelne Spender unterscheiden kann und nicht abschätzbar war, diente dies als
grobes Näherungsverfahren um die T-Zell-Antworten vergleichbarer darzustellen.
5.1.3 Generierung von Autoantigen-spezifischen T-Zell-Klonen
Um die Methode zur Detektion von Autoantigen-reaktiven T-Zellen zu validieren und die
Spezifität der Zellen zu überprüfen wurden T-Zell-Klone (TZK) generiert und expandiert.
Dazu wurden PBMCs mit MP65 sowie mit den Autoantigenen MOG und GAD65 für 6 h
stimuliert. Anschließend wurden mittels Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS)
CD4
+
/CD154
+
/CD69
+
/CD45RA‒Einzelzellen in Zellkulturplatten sortiert und mit Hilfe von
allogenen, bestrahlten PBMCs als Feederzellen sowie IL-2 und α-CD3 expandiert, bis eine
Zellzahl >10
6
erreicht war.
Ergebnisse
58
5.1.3.1 Klonierungseffizienzen
Nach 14 Tagen konnten expandierte von nicht-expandierten Klonen sowohl durch den
Farbumschlag des Mediums als auch durch die Größe der Zellpellets deutlich voneinander
unterschieden werden. Aus dem Verhältnis der Anzahl von gewachsenen Klonen zur Anzahl
an zuvor FACS-sortierten T-Zellen wurde die Klonierungseffizienz errechnet. Für alle
Antigene konnte eine Klonierungseffizienz von rund 31% bestimmt werden (MP65 31%,
MOG 29%, GAD65 34%). Die Klone wurden weiterhin nach Bedarf mit frischem Medium
versorgt und subkultiviert.
5.1.3.2 Validierung der Spezifität
Nach einer Expansionszeit von 4-6 Wochen wurden die TZK unter Zugabe von zuvor
kryopräservierten autologen CD3-depletierten PBMCs zur Überprüfung der Spezifität mit
dem initialen Antigen restimuliert. Als Kontrolle diente ein irrelevantes Antigen (MOG, PLP
oder Insulin (Ins)).
Reaktive TZK waren von nicht-reaktiven deutlich durch die Re-Expression von CD154 und
TNF-α zu unterscheiden (Abb. 11A und B). Der Anteil an reaktiven Zellen nach
Restimulation der expandierten Klone variierte jedoch zwischen dem Kontrollantigen und
den Autoantigenen (Abb. 11B). Während von MP65-reaktiven TZK im Mittel 85% aller
Zellen eines Klons reagierten, zeigten durchschnittlich 53% aller Zellen der MOG- bzw. 39%
der GAD65-reaktiven Klone eine Re-Expression der Aktivierungsmarker. Auch Klone mit
einem geringen Anteil an reaktiven Zellen wurden als spezifisch gewertet, wenn das
spezifische Signal deutlich (>15x) über dem Hintergrundsignal lag. Die
Hintergrundaktivierung war bei allen Klonen sehr gering. Darüber hinaus reagierte keiner
der Klone auf die Zugabe eines irrelevanten Antigens, mit Ausnahme eines MOG-
spezifischen Klons, welcher eine Aktivierung nach Stimulation mit PLP zeigte.
Ergebnisse
59
Insgesamt konnte eine hohe Spezifität von CD154-sortierten Autoantigen-reaktiven TZK
festgestellt werden (Abb. 11C). Diese betrug für MOG- und GAD65-reaktive Klone 73%
bzw. 87% und für das Kontrollantigen MP65 sogar 96%.
Abb. 11: Spezifität von Autoantigen-reaktiven T-Zell Klonen. MP65-, MOG, und GAD65-
reaktive CD4
+
Memory T-Zell Klone von gesunden Individuen wurden mittels FACS Einzelzell-
Sortierung aus 2x10
8
stimulierten, CD154
+
-angereicherten PBMCs generiert. Nach 4-6 Wochen
Expansionszeit wurden die Klone auf ihre Spezifität getestet und dafür nach Zugabe von
autologen APCs mit dem initialen Antigen sowie einem irrelevanten Antigen stimuliert und
durchflusszytometrisch auf Re-Expression von CD154 und TNF-α analysiert. (A) Repräsentative
Dot Plots nach Restimulation (Analysefenster auf CD4
+
T-Zellen). (B) Anteil an reaktiven Zellen
nach Restimulation. Jedes Symbol repräsentiert einen Klon, rote Symbole markieren nicht-
reaktive Klone. (C) Zusammenfassende Darstellung der Gesamtspezifität aller analysierten Klone.
MP65
n=26
MOG
n=26
GAD65
n=30
MP65-
reaktiv
MOG-
reaktiv
GAD65-
reaktiv
unstimuliert
reaktiv
nicht-reaktiv
A C
CD154
B
0,60%
0,05% 97,86%
0,07%
0,11%
0,95%
0,17%
89,67%
58,61%
irrelevantes
Antigen
spezifisches
Antigen
TNF-α
Restimulation
MP65-reaktive Klone
wo
MOG
MP65
0
20
40
60
80
100
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
Restimulation
MOG-reaktive Klone
w/o
PLP
MOG
0
20
40
60
80
100
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
Restimulation
GAD65-reaktive Klone
wo
Ins
GAD65
0
20
40
60
80
100
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
Ergebnisse
60
5.1.4 Einfluss von in vitro Expansion auf die Klonalität von Antigen-
spezifischen T-Zell Populationen
Aufgrund des geringen Vorkommens von Autoantigen-spezifischen T-Zellen im peripheren
Blut basierten bisherige Untersuchungen zur ihrer Bedeutung bei gesunden Personen und
Autoimmunpatienten fast ausschließlich auf vorangehender polyklonaler oder Antigen-
vermittelter in vitro Expansion. Zahlreiche Faktoren wie der funktionelle Status oder eine
unspezifische Aktivierung durch andere reaktive Zellen (Bystander Aktivierung)
beeinflussen jedoch das Wachstumsverhalten einzelner Zellen in Kultur [143] und führen
somit zwangsläufig zu unvorhersehbaren Verschiebungen in der klonalen
Zusammensetzung. Schlussfolgerungen über Prävalenz, Funktion und Phänotyp sind somit
nur bedingt aussagekräftig.
Um gezielt zu untersuchen, auf welche Weise die klonale Zusammensetzung von Antigen-
spezifischen T-Zell-Populationen durch längere in vitro Kultivierung verändert wird,
wurden im Rahmen einer Kooperation mit Prof. Stefan Gold (Klinik für Psychiatrie und
Psychotherapie, Charité Berlin) Antigen-reaktive T-Zell-Linien (TZL) aus PBMCs einer MS-
Patientin generiert. Dazu wurden die Zellen zunächst mit einem Pool aus den Myelin-
Antigenen MOG, MBP und PLP oder mit dem Epstein-Barr Nuclear Antigen 1 (EBNA-1),
einem wichtigen CD4
+
-T-Zell-Antigen des Epstein-Barr-Virus (EBV), für 6 Stunden
stimuliert. Anschließend wurden aktivierte CD154
+
T-Zellen angereichert, FACS-sortiert
(≈ 2500 Myelin-reaktive und ≈ 1000 EBNA-1-reaktive CD4
+
T-Zellen) und über 10 Tage
unter Zugabe von bestrahlten, allogenen PBMCs als Feederzellen, IL-2 und α-CD3 (OKT-3)
expandiert. Nach Restimulation mit dem initialen Antigen wurden die Zellen ein zweites
Mal FACS-sortiert um nicht-reaktive Zellen auszuschließen (≈ 50%). Schließlich wurde das
T-Zell-Rezeptor-(TCR)-Repertoire dieser expandierten Antigen-reaktiven Zellen mittels
Hochdurchsatz-Sequenzierung (Next-Generation Sequencing = NGS) analysiert
(ImmunoSEQ®, Adaptive Biotechnologies). Dazu wurde die CDR3-Region der TCR-β-Kette
nach Isolation der genomischen DNA sequenziert. Die CDR3-Region stellt den
Ergebnisse
61
Hauptkontakt mit dem auf dem MHC-Molekül präsentierten Peptid her und ist einzigartig
für jeden T-Zell-Klon (TZK). Die Frequenz einer spezifischen CDR3-Sequenz korreliert
dabei mit der Häufigkeit des dazugehörigen TZK.
Tab. 15: Proben-Charakteristika zur TCR-Hochdurchsatz-Sequenzierung.
Ex vivo PBMC Myelin-spezifische TZL EBNA-1-spezifische TZL
Sequenziert (Zellzahl) 5x10
5
1,5x10
5
1,5x10
5
Klonalität
a)
0,0269 0,498 0,6448
Maximalfrequenz
b)
(%) 0,33 50,8 51,7
a) 0-1, wobei 0 = absolute Gleichverteilung, d.h. alle Klone sind proportional gleich vertreten; 1 = absolute
Ungleichverteilung, d.h. ein Klon dominiert die Population
b) Frequenz des am häufigsten vorkommenden Klons
Mit Hilfe des ImmunoSEQ
®
Analyzers wurde anschließend nach Übereinstimmungen der
Nukleotid-Sequenzen innerhalb der expandierten Zellen und innerhalb von frisch isolierten
PBMCs gesucht, um spezifische T-Zell-Klone in der der ursprünglichen PBMC-Probe
wiederzufinden. Der Anteil an überlappenden Sequenzen sowie deren Häufigkeit wurden
analysiert und verglichen (Abb. 12).
Tab. 15
fasst die Charakteristika der sequenzierten
Proben zusammen.
Innerhalb der expandierten, Myelin-reaktiven T-Zellen konnten 231 produktive einzigartige
Sequenzen, d.h. TZK, identifiziert werden (Abb. 12A). Von diesen TZK konnten 15 (6,5%)
in den ursprünglich isolierten PBMCs wiedergefunden werden. Von insgesamt 256
unterschiedlichen EBNA-1-spezifischen TZK waren 24 (9,4%) in der Ausgangsprobe zu
finden. Sechs Sequenzen (2,6% der Myelin-reaktiven TZK) stimmten sowohl innerhalb der
Myelin-spezifischen als auch in der EBNA-1-spezifischen T-Zell-Population überein, wovon
drei Sequenzen auch in der Ausgangsprobe vorhanden waren. Dies könnte ein Indiz für
Kreuzreaktivität von autoreaktiven TZK mit mikrobiellen Antigenen sein (weiterführende
Untersuchungen zur Kreuzreaktivität siehe 5.2.4).
Ergebnisse
62
Abb. 12: TCR-Repertoire von Myelin- und EBNA-1-spezifischen T-Zellen nach in vitro
Expansion. PBMCs einer MS-Patientin wurden mit einer Kombination von Myelin-Antigenen
(MOG, MBP, PLP) oder EBNA-1 stimuliert. CD154
+
T-Zellen wurden angereichert, FACS-sortiert und
für 10 Tage expandiert. Nach spezifischer Restimulation wurden reaktivierte T-Zellen
(CD154
+
/TNF-α
+
) erneut FACS-sortiert. Aus diesen Proben sowie aus den ursprünglichen PBMCs
wurde gDNA isoliert und die CDR3 Region der TCR β-Kette mittels Hochdurchsatzsequenzierung
sequenziert. Für detaillierte Proben-Charakteristika siehe Tab. 15. (A) Dargestellt ist die Anzahl an
einzigartigen Nukleotid-Sequenzen, d.h. T-Zell-Klonen, und deren Übereinstimmung innerhalb
der einzelnen Proben sowie (B) die normalisierten Frequenzen von Myelin- und EBNA-1-reaktiven
T-Zell-Klonen vor und nach in vitro Expansion.
Abb. 12B veranschaulicht die normalisierten Frequenzen aller Myelin- und EBNA-1-
reaktiven T-Zell-Klone, welche in der Ursprungsprobe wiederzufindenden waren, vor und
nach in vitro Expansion. Man erkennt deutlich das stark unterschiedliche
Wachstumsverhalten einzelner Klone innerhalb einer polyklonalen Population durch in
vitro Kultivierung. Während die Frequenzen von Myelin- und EBNA-1-reaktiven T-Zell-
Klonen innerhalb frisch isolierter PBMCs relativ homogen verteilt waren und sich um
maximal eine Zehnerpotenz unterschieden, kam es nach 10 Tagen in vitro Kultivierung zu
einer Expansion weniger Klone und einer relativen Abnahme der Frequenzen eines
Großteils der Klone, was zu einer breiteren Streuung der Frequenzen führte.
Interessanterweise expandierte jeweils derjenige Klon besonders stark, der auch ex vivo den
größten Anteil ausmachte: Der Anteil des häufigsten Myelin- und EBNA-1-reaktiven Klons
erhöhte sich von 12,5% auf 78,3% bzw. von 14,1% auf 64,5%. Die weitere Verteilung
korrelierte jedoch nicht mit der Häufigkeit in der Ursprungsprobe. Sequenzen, welche in
A
B
55974
213 229
3
3
12 21
ex vivo PBMC
Myelin EBNA-1
ex vivo PBMC
nach Expansion
0.01
0.1
1
10
100
Myelin
normalisierte
Frequenz (%)
ex vivo PBMC
nach Expansion
0.001
0.01
0.1
1
10
100
EBNA-1
normalisierte
Frequenz (%)
B
Ergebnisse
63
allen drei Proben vorkamen, waren nach Expansion mit geringer Häufigkeit vertreten
(0,009%-2%). Die Sequenzierung der ebenfalls in der Kultur vorhandenen bestrahlten,
allogenen Feederzellen konnte ein Auswachsen dieser Zellen ausschließen.
Zusammenfassend demonstriert dieser Versuch deutlich, dass Ergebnisse, welche durch
T-Zell-Expansionsstudien gewonnen wurden, immer kritisch beurteilt werden sollten und
unterstreicht die wichtige Bedeutung eines verlässlichen Assays zur direkten Analyse von
seltenen Antigen-spezifischen T-Zellen.
5.2 Multiparameter-Charakterisierung von Autoantigen-spezifischen
T-Zellen in gesunden Individuen
Nachdem das Vorkommen von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen im peripheren Blut von
gesunden Individuen nachgewiesen und die Spezifität des CD154
+
Anreicherungs-Assays
bestätigt worden war, sollten diese Zellen im nächsten Schritt detaillierter charakterisiert
werden. Dabei ermöglichte die Anreicherung von CD154
+
T-Zellen in Kombination mit der
Multiparameter-Durchflusszytometrie eine ausführliche Analyse der Funktion und des
Phänotyps. Des Weiteren wurden Studien zur funktionellen Avidität und Kreuzreaktivität
von Autoantigen-spezifischen T-Zellen durchgeführt, welche Hinweise auf den Ursprung
autoreaktiver Memory T-Zellen in Gesunden geben sollten.
5.2.1 Untersuchung des Phänotyps und der Zytokinproduktion
Zahlreiche tierexperimentelle Untersuchungen konnten eine entscheidende Rolle von Th1-
und Th17-Zellen und ihren entzündungsfördernden Mediatoren bei autoimmun-
vermittelten Erkrankungen wie EAE belegen [21, 22, 161]. Studien mit Autoimmun-
patienten geben ebenfalls Hinweise auf eine verstärkte Aktivierung und Expansion dieser
Zellen innerhalb der Pathogenese von MS, T1D und MG, sowohl auf globaler als auch auf
Antigen-spezifischer Ebene [49, 68, 71, 137]. Da jedoch sehr wenig über das
inflammatorische Zytokinprofil frisch isolierter autoreaktiver CD4
+
T-Zellen in gesunden
Individuen bekannt ist, wurde in der vorliegenden Arbeit die Expression von TNF-α, IFN-γ,
Ergebnisse
64
IL-17 und GM-CSF mittels intrazytoplasmatischer Antikörper-Färbung durchfluss-
zytometrisch analysiert. Daneben wurde die Expression des klassischen Memory T-Zell
Markers CD45RO [14] auf der Oberfläche der T-Zellen untersucht, um den Anteil von
naiven und Memory T-Zellen zu bestimmen. Aufgrund des begrenzten Blutvolumens und
technischer Limitationen konnte leider kein zusätzlicher Marker wie CCR7 zur genaueren
Bestimmung von naiven und Memory T-Zell-Subpopulationen mit in das Färbepanel (siehe
Tab. 13 und 1.2.2) integriert werden. Da MG stark mit dem Vorkommen AChR-spezifischer
Autoantikörper assoziiert ist, wurden zusätzlich die Zytokine IL-4 und IL-21 analysiert,
welche B-Zell-Proliferation und -Differenzierung regulieren.
Abb. 13 zeigt den Anteil und Zytokinproduzenten (Abb. 13A-C) bzw. Memory T-Zellen
(Abb. 13D) innerhalb der CD154
+
Autoantigen-reaktiven bzw. MP65-reaktiven T-Zellen. In
Abb. 13A ist zu erkennen, dass alle untersuchten Zytokine mit Ausnahme von TNF-α
ausschließlich von CD45RO
+
Memory T-Zellen produziert wurden. TNF-α wurde dagegen
nach Stimulation auch rasch von naiven, CD45RO
−
T-Zellen exprimiert. Innerhalb der
MP65-spezifischen T-Zellen konnte ein erwartungsgemäß hoher Anteil an Memory-Zellen
(50-96%, Mittelwert 79%) detektiert werden (Abb. 13D). Der Anteil an autoreaktiven
Memory-Zellen variierte dagegen je nach verwendetem Antigen stark. Während dieser für
die Myelin-Antigene 15-82% und für GAD65 5-54% betrug, machten Memory-T-Zellen
62-96% des AChR-spezifischen T-Zell-Repertoires aus (Mittelwerte 34-45%, 30%, 80%).
Interessanterweise konnte selbst für KLH-spezifische T-Zellen ein Memory-T-Zell-Anteil
von 30-78% (Mittelwert 55%) ermittelt werden.
MP65-reaktive T-Zellen zeigten sowohl eine Th1- als auch eine Th17-spezifische Zytokin-
Signatur (Abb. 13B). Neben einem hohen Anteil von TNF-α (Mittelwert 82%) produzierten
im Mittel 13% aller Zellen IL-17, 37% GM-CSF und 13% IFN-γ. Im Vergleich zum
Kontrollantigen produzierten Autoantigen-spezifische T-Zellen, auch aufgrund des zum Teil
geringeren Memory Anteils, insgesamt weniger inflammatorische Zytokine und zeigten
heterogene Expressionsmuster.
Ergebnisse
65
Abb. 13A und B: Legende und Fortführung auf der nächsten Seite.
Myelin-reaktive T-Zellen produzierten vorrangig TNF-α (im Mittel 50-54%), weniger IFN-γ
und GM-CSF (im Mittel 7-12% bzw. 6-11%) und kaum IL-17 (im Mittel 1-2%). MBP-
spezifische T-Zellen teilten sich dabei allerdings in zwei Gruppen mit geringer (4-6%) und
hoher IFN-γ-Expression (28-34%) auf. Vergleichsweise wenig Zytokinproduzenten waren
innerhalb der GAD65-spezifischen T-Zellen zu finden (im Mittel 31% TNF-α, 5% IFN-γ,
5% GM-CSF, 1% IL-17). Dagegen zeigten AChR-reaktive T-Zellen mit durchschnittlich
74,3 2,0
23,5 0,2
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
CD45RO
TNF-α IFN-γ IL-17
GM-CSF
9,5 79,5
4,4 6,6
IL-4 IFN-γ IL-17
IL-21
CD45RO
A
73,6 15,4
10,9 0,1
48,1 40,9
8,6 2,4
71,4 17,6
10,4 0,6
16,6 39,0
29,5 15,0
46,6 8,9
44,5 0,0
37,3 18,2
41,5 3,0
52,9 2,6
44,5 0,0
16,4 43,6
24,6 15,4
35,2 24,8
40,0 0,0
33,7 26,3
38,6 1,5
38,0 17,8
43,2 1,0
53,2 2,6
44,2 0,1
15,0 40,7
27,3 16,9
10,7 12,7
56,1 20,6
20,4 3,0
75,9 0,7
20,1 3,3
75,0 1,6
57,3 19,0
22,7 0,9
73,4 3,0
23,2 0,5
57,6 2,4
40,0 0,0
42,6 13,1
44,0 0,2
22,6 0,7
76,6 0,0
74,5 1,9
23,7 0,0
B
Ergebnisse
66
17% den höchsten Anteil an IFN-γ-Produzenten innerhalb aller getesteten Antigene. IL-17-
Produzenten waren, bis auf einen Ausreißer, kaum zu detektieren (im Mittel 4%). Die
TNF-α- und GM-CSF-Expression wurde für dieses Autoantigen nicht analysiert. Stattdessen
konnte bei zwei Dritteln der gesunden Probanden eine Produktion von IL-4 ermittelt
werden (1-8%, Mittelwert 2%). Das Zytokin IL-21, welches eine Schlüsselrolle in der
Differenzierung von B-Zellen spielt und vorrangig von follikulären T-Helferzellen (Tfh)
produziert wird [162], exprimierten 6-18% (Mittelwert 13%) der AChR-reaktiven T-Zellen.
Abb. 13: Funktionelle und phänotypische Charakterisierung von Autoantigen-spezifischen
T-Zellen aus gesunden Individuen. 4x10
7
-1x10
8
PBMCs wurden mit MP65 (n>18), KLH (n=3)
oder Autoantigenen assoziiert mit MS (MOG, MBP, PLP; n=6-17), Diabetes mellitus Typ I (GAD65;
n=22) oder Myasthenia gravis (AChR; n>4) für 7 h stimuliert. CD154
+
Zellen wurden magnetisch
angereichert und durchflusszytometrisch auf Zytokinproduktion (TNF-α, IFN-γ, GM-CSF, IL-17;
IL-4, IL-21) und Memory-Phänotyp (CD45RO) untersucht. (A-B) Repräsentative Dot Plots
(Analysefenster auf CD4
+
/CD154
+
T-Zellen). Zusammenfassend dargestellt ist der prozentuale
Anteil an (C-D) Zytokinproduzenten bzw. (E) CD45RO
+
Memory-T-Zellen innerhalb der CD154
+
Zellen. Die Mittelwerte sind jeweils markiert.
TNF-α
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
0
20
40
60
80
100
Zytokinproduzenten
innerhalb CD154
+
(%)
IFN-γ
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
0
10
20
30
40
50
GM-CSF
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
0
20
40
60
80
Zytokinproduzenten
innerhalb CD154
+
(%)
IL-17
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
0
10
20
30
40
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
AChR
KLH
0
20
40
60
80
100 Memory
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
AChR
IL-4
IL-21
0
5
10
15
20
25
Zytokinproduzenten
innerhalb CD154
+
(%)
C
D E
Ergebnisse
67
Zusammenfassend wiesen Autoantigen-spezifische T-Zellen von gesunden Kontrollen einen
erstaunlich hohen Anteil an Memory-T-Zellen von teilweise über 50% auf. Diese Zellen
waren in der Lage, Effektor-Zytokine zu produzieren und zeigten je nach Antigen
unterschiedliche Zytokinmuster, wobei die Gesamtexpression im Vergleich zum
Kontrollantigen zumeist schwächer ausgeprägt war.
5.2.2 Vergleich der Expression von CD45RO im autoreaktiven und im
Gesamt-T-Zell-Repertoire
Mit zunehmendem Alter erhöht sich der Anteil von CD45RO
+
Zellen innerhalb der CD4
+
T-Zellen [163, 164]. Dies ist eine Folge der kontinuierlichen Auseinandersetzung des
reifenden bzw. alternden Immunsystems mit neuen Antigenen, beispielsweise durch
Impfungen, die Besiedlung mit Kommensalen oder den Kontakt zu Umweltantigenen und
Pathogenen und einer damit verbundenen Differenzierung von naiven zu Memory T-Zellen.
Mit diesem Parameter, der zusammen mit weiteren Faktoren das so genannte
immunologische Alter bestimmt, wurde der Anteil an autoreaktiven Memory T-Zellen
korreliert, um Hinweise auf ihren Ursprung in gesunden Individuen zu erhalten.
Erwartungsgemäß sollten Memory-T-Zellen bei einer spezifischen Antigen-induzierten
T-Zell-Antwort, wie sie z.B. für Recall-Antigene auftritt, durch klonale Selektion und
Expansion in der Antigen-spezifischen Fraktion angereichert sein.
Für das Kontroll-Antigen MP65 zeigten diese Analysen keine statistisch signifikante
Korrelation der Expression von CD45RO auf CD154
+
und totalen CD4
+
T-Zellen (r
s
= 0,27;
p = 0,09) (Abb. 14A). Wie erwartet dominierte hier unabhängig vom Differenzierungsstatus
der totalen CD4
+
T-Zellen eine stark ausgeprägte MP65-spezifische Memory T-Zell-
Antwort, vermutlich durch Selektion und Expansion weniger hochaffiner Klone. Dies ist
typisch für Antigene, mit welchen das Immunsystem bereits früh und regelmäßig
konfrontiert wurde. Im Gegensatz dazu korrelierte der Anteil an KLH-reaktiven Memory
T-Zellen fast perfekt mit dem immunologischen Alter (r
s
> 0,99; p < 0,0001) (Abb. 14B).
Ergebnisse
68
Abb. 14: Korrelation der Expression von CD45RO in autoreaktiven CD154
+
und totalen CD4
+
T-Zellen. 4x10
7
-1x10
8
PBMCs von gesunden Spendern wurden mit (A) dem Kontrollantigen
MP65, (B) dem Neoantigen KLH oder (C) den Autoantigenen MOG, MBP und PLP (in Kombination
= Myelin), GAD65 oder AChR stimuliert. Nach Anreicherung von CD154
+
T-Zellen wurde die
Expression von CD45RO innerhalb der angereicherten, CD154
+
und der totalen CD4
+
T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt und gegeneinander aufgetragen. Die Regressionsgeraden
wurden zu Darstellungszwecken ermittelt. r
s
= Spearman-Korrelationskoeffizient.
Ein breiteres CD4
+
Memory T-Zell-Repertoire mit steigendem Alter erhöht demnach die
Wahrscheinlichkeit, dass ein neues Fremdantigen von kreuzreaktiven, vermutlich
vorranging niedrig affinen Memory T-Zellen erkannt wird. Ein ähnliches Bild ergab sich bei
Betrachtung der Autoantigen-reaktiven Memory T-Zellen. Für die getesteten Myelin-
Antigene (r
s
= 0,79; p < 0,0001), GAD65 (r
s
= 0,72; p = 0,0001) und AChR (r
s
= 0,76;
p = 0,004) korrelierte ihr Anteil ebenfalls deutlich mit der Expression von CD45RO
innerhalb der totalen CD4
+
Zellen. Diese Ergebnisse können darauf hindeuten, dass
autoreaktive naive T-Zellen ähnlich wie Neoantigen-spezifische T-Zellen in gesunden
Individuen in vivo ursprünglich durch ein anderes Antigen aktiviert wurden und nun als
Memory-Zellen auf die Autoantigene lediglich kreuzreagieren. Somit liegt keine "klassische",
durch spezifischen Antigenkontakt klonal expandierte Memory T-Zell-Population vor.
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,27
p = 0,09
n = 40
CD45RO
+
Zellen innerhalb
CD4
+
(%)
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
> 0,99
p < 0,0001
n = 3
CD45RO
+
Zellen innerhalb
CD4
+
(%)
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,79
p < 0,0001
n = 40
CD45RO
+
Zellen innerhalb
CD4
+
(%)
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,72
p = 0,0001
n = 22
CD45RO
+
Zellen innerhalb
CD4
+
(%)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,76
p = 0,004
n = 12
CD45RO
+
Zellen innerhalb
CD4
+
(%)
C
A B
MP65 KLH
Myelin GAD65 AChR
Ergebnisse
69
5.2.3 Bestimmung der funktionellen Avidität autoreaktiver T-Zell-Linien
Im Gegensatz zu B-Zellen, welche durch Affinitätsreifung ihres B-Zell-Rezeptors eine
effizientere Immunantwort nach initialem Antigenkontakt generieren können, besitzen
T-Zellen einen unveränderlichen T-Zell-Rezeptor mit definierter Affinität für den MHC-
Peptid-Komplex. Neben der selektiven Expansion von Klonen mit hochaffinem TCR kann
die T-Zell-Antwort durch so genannte funktionelle Aviditätsreifung optimiert werden.
Hierbei spielen v.a. strukturelle Anpassungen der T-Zell- und Ko-Rezeptor-Expression
sowie Veränderungen im Signaltransduktionsapparat nach initialem und wiederholtem
Antigenkontakt eine Rolle. Dies ermöglicht durch Senkung der Aktivierungsschwelle und
der benötigten Menge an Antigen eine Erhöhung der Antigensensitivität und somit eine
schnellere und stärkere Aktivierung [165, 166].
Im vorherigen Abschnitt (siehe 5.2.2) gaben die Ergebnisse der Korrelationsanalysen
Hinweise auf einen kreuzreaktiven Ursprung von Autoantigen-spezifischen Memory
T-Zellen in gesunden Probanden. Im nächsten Schritt sollte durch funktionelle Messungen
überprüft werden, ob sich diese Zellen zu Memory T-Zellen mit hoher Antigensensitivität
entwickelt haben. Im Gegensatz zur Tetramer-Technologie erlaubt die Anreicherung von
CD154
+
T-Zellen eine unvoreingenommene Erfassung des vollen Aviditätsspektrums
Antigen-aktivierter T-Zellen. Zur Bestimmung der funktionellen Avidität waren Titrationen
notwendig, die eine große Menge an autoreaktiven Zellen (>10
6
) erforderlich machten.
Daher wurden für diese Untersuchungen TZL aus CD154
+
Antigen-spezifischen naiven
(CD45RA
+
CCR7
+
= TZL
N
) und Memory (CD45RA
−
= TZL
M
) T-Zellen nach Stimulation mit
MP65 oder den Autoantigenen MOG, MBP, PLP oder GAD65 durch magnetische
Anreicherung mit anschließender FACS-Sortierung und Kurzzeitexpansion generiert. Nach
7-10 Tagen in vitro Expansion wurde jede TZL unter Zugabe autologer APCs mit einer
abnehmenden Menge des ursprünglichen Antigens (3 nmol/ml - 6x10
-6
nmol/ml) stimuliert.
Die Re-Expression von CD154 und TNF-α wurde am Durchflusszytometer bestimmt.
Ergebnisse
70
Abb. 15: Funktionelle Avidität von Autoantigen-spezifischen naiven und Memory TZL.
1-2x10
8
PBMCs gesunder Individuen wurden mit MP65 (n=7) oder den Autoantigenen MOG
(n>7), MBP (n=5), PLP (n>7) und GAD65 (n>6) für 6 h stimuliert. CD154
+
T-Zellen wurden
magnetisch angereichert. Anschließend wurden CD154
+
/CD69
+
naive (CD45RA
+
/CCR7
+
) und
Memory (CD45RA
‒
) TZL FACS-sortiert. Nach 7-10 Tagen in vitro Expansion wurden die TZL mit
absteigenden Konzentrationen des initialen Antigens restimuliert. (A) Die Reaktivität wurde
durch Re-Expression von CD154 und TNF-α bestimmt und mit Hilfe von Dosis-Antwort-Kurven
dargestellt, der Mittelwert ± SEM ist gekennzeichnet. (B) Daraus konnte die halbmaximale
effektive Antigen-Konzentration (EC50) berechnet und aufgetragen werden. Der Median ist
jeweils gekennzeichnet. Signifikanzen beziehen sich auf das Kontrollantigen MP65. TZL
N
= aus
naiven T-Zellen generierte Linien. TZL
M
= aus Memory T-Zellen generierte Linien.
Abb. 15A zeigt zusammenfassende Dosis-Antwort-Kurven für alle generierten TZL
N
und
TZL
M
. Der größte Anteil an reaktiven Zellen nach Restimulation wurde für MP65-
spezifische TZL
M
gemessen. Durchschnittlich 79,7% aller Zellen re-exprimierten CD154 und
TNF-α, während autoreaktive TZL nur eine maximale Reaktivität von 47,4% erreichten
ursprl. naiv
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
EC50 (nmol/ml/Peptid)
ursprl. memory
MP65
MOG
MBP1
PLP
GAD65
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
*** **
*
EC50 (nmol/ml/Peptid)
A
B
TZL
M
TZL
N
MP65
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
MOG
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
10
1
0
20
40
60
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
GAD65
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
10
1
0
20
40
60
TZL
N
TZL
M
MBP1
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
10
1
0
20
40
60
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
PLP
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
10
- 2
10
- 1
10
0
10
1
0
20
40
60
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
Ergebnisse
71
(GAD65-spezifische TZL
M
). Auffällig war darüber hinaus, dass MP65-reaktive TZL
N
auf
jegliche Konzentration des Antigens schwächer reagierten als TZL
M
, während für die
Autoantigene tendenziell das Gegenteil erkennbar war oder es kaum Unterschiede gab. Aus
den Dosis-Antwort-Kurven ließ sich die halbmaximale effektive Antigen-Konzentration
(EC50) berechnen und auftragen (Abb. 15B). Niedrige EC50-Werte definierten hierbei hohe
funktionelle Avidität bzw. Antigensensitivität. Für alle generierten TZL
N
deckten diese
Werte eine breite Spanne von bis zu 4 log-Stufen ab. Zwischen dem Kontrollantigen MP65
(EC50
Med
= 1,8x10
-2
nmol/ml) und den Autoantigenen (EC50
Med
= 1,1-6,9x10
-2
nmol/ml)
konnten dabei keine signifikanten Unterschiede gefunden werden. Im Gegensatz dazu
wiesen Myelin- und GAD65-spezifische TZL
M
(EC50
Med
= 5,6-12,1x10
-2
nmol/ml) eine
signifikant geringere Antigensensitivität als MP65-reaktive TZL
M
(EC50
Med
= 0,9x10
-2
nmol/ml) auf. Insgesamt ließen sich autoreaktive TZL
M
schlechter restimulieren und
benötigten für eine halbmaximale Reaktion deutlich höhere Antigendosen als MP65-reaktive
TZL
M
. Dies deutet auf eine limitierte funktionelle Aviditätsreifung von autoreaktiven
Memory T-Zellen und/oder eine eingeschränkte Selektion von hochaffinen TZK im Laufe
der Immunantwort von Gesunden hin und unterstreicht gleichzeitig die Bedeutung der
Bewahrung von Selbst-Toleranz nach mutmaßlicher kreuzreaktiver T-Zell-Aktivierung.
5.2.4 Kreuzreaktivität mit mikrobiellen Antigenen
Die bisherigen Ergebnisse konnten zeigen, dass autoreaktive Memory T-Zellen in gesunden
Spendern keine Aviditätsreifung durchlaufen haben und womöglich kreuzreaktiven
Ursprungs sind. Verschiedene Publikationen konnten Kreuzreaktivität zwischen
autoreaktiven CD4
+
T-Zellen und Umweltantigenen, bestimmten Herpesviren oder
Bakterien dokumentieren [167-169]. Myelin-spezifische T-Zellen reagieren z.B. auf
Bestandteile des Epstein-Barr-Virus (EBV) und eine symptomatische Infektion mit diesem
Virus wird als ein möglicher Auslöser von MS diskutiert [169].
Ergebnisse
72
Um zu untersuchen, ob CD154
+
-sortierte, autoreaktive CD4
+
T-Zellen prinzipiell auf
mikrobielle Antigene reagieren können und wie häufig dies vorkommt, wurden MP65-,
Myelin- und GAD65-spezifische TZL aus naiven und Memory T-Zellen generiert (siehe
5.2.3). Die Analyse von aktivierten CD154
+
T-Zellen ermöglichte hierbei ein direktes und
unvoreingenommenes Screening auf Kreuzreaktivität, wobei kein Wissen über das
Restriktionselement oder die Aminosäuresequenz einzelner T-Zell-Epitope notwendig war.
Nach in vitro Expansion erfolgte die Restimulation mit dem initialen Antigen sowie mit
verschiedenen viralen, bakteriellen und Pilzantigenen (Zytomegalie-Virus- (CMV) und
Herpes-Simplex Typ 1- (HSV-1) Lysat, EBNA-1 und BRLF-1 Peptid Pools, E. coli Lysat,
A. fumigatus und C. albicans Lysat). EBNA-1 und BRLF-1 sind wichtige Regulatoren des
EBV-Replikationszyklus. Für jedes getestete mikrobielle Antigen fanden 2-8 Wieder-
holungen in vier unabhängigen Experimenten mit jeweils 2-3 gesunden Individuen statt.
Abb. 16: Kreuzreaktivität von Autoantigen-spezifischen TZL mit bakteriellen, viralen und
Pilz-Antigenen. Autoantigen-reaktive TZL wurden nach Stimulation von 1-2x10
8
PBMCs mit
MOG, MBP, PLP und GAD65 aus CD154
+
/CD69
+
naiven und Memory T-Zellen durch FACS-
Sortierung generiert, expandiert und mit den initialen Antigenen sowie mit bakteriellen (E. coli),
viralen (CMV, HSV-1, EBNA-1, BRLF-1) und Pilzantigenen (A. fumigatus, C. albicans) restimuliert.
Zebra Plots aller kreuzreaktiven TZL sind dargestellt (Analysefenster auf CD4
+
T-Zellen). Für eine
Zusammenfassung der Reaktivitäten aller TZL siehe Tab. 16. Insgesamt wurden vier unabhängige
Experimente mit jeweils 2-3 gesunden Spendern durchgeführt. TZL
N
= aus naiven T-Zellen
generierte Linien. TZL
M
= aus Memory T-Zellen generierte Linien.
C. albicans
A. fumigatus
7,06%
0,55%
63,6%
0,39%
BRLF-1
7,53%
0,83%
10,3%
0,18%
EBNA-1
MOG MBP1 GAD65
E. coli
3,29%
1,12%
49,4%
0,49%
C. albicans
TZL
N
un-
stimuliert
spez.
Antigen
kreuz-
reaktives
Antigen
unspez.
Antigen
CD154
TNF
-
α
HSV-1
CMV
14,8%
1,36%
27,3%
0,40%
MOG MBP1 PLP GAD65
CMV
HSV-1
12,5%
1,76%
58,3%
1,29%
HSV-1
CMV
10,3%
1,30%
45,2%
1,08%
CMV
HSV-1
3,67%
1,19%
20,1%
0,49%
TZL
M
Ergebnisse
73
Kreuzreaktivität bzw. Reaktivierung wurde anhand der Re-Expression von CD154 und
TNF-α bewertet. Tab. 16 enthält eine Zusammenfassung aller getesteten TZL und
mikrobiellen Antigene, wobei kreuzreaktive TZL grau hervorgehoben sind. Dot Plots aller
kreuzreagierenden autoreaktiven TZL sind zusätzlich in Abb. 16 dargestellt. Die Ergebnisse
für das Kontrollantigen verdeutlichen, dass alle MP65-reaktiven TZL wie erwartet nach
Restimulation mit dem C. albicans Lysat reagierten. Zusätzlich ließ sich eine von sieben
MP65-reaktiven TZL
M
durch Stimulation mit CMV aktivieren, während TZL
N
auf kein
Antigen kreuzreagierten.
Tab. 16: Kreuzreaktivität von Autoantigen-spezifischen TZL mit bakteriellen, viralen und
Pilz-Antigenen.
a)
auf Kreuzreaktivität getestetes Antigen
TZL
C.
albicans
A.
fumigatus E. coli CMV HSV-1 EBNA-1 BRLF-1 total (%)
TZL
N
MP65 (2/2)
b)
0/2 0/2 0/7 0/2 0/3 0/3 0
MOG 0/2 1/2 0/2 0/7 0/3 0/3 0/3 4,5
MBP - - - 0/5 0/3 0/3 1/3 7,1
PLP 0/2 0/2 0/2 0/7 0/3 0/2 0/2 0
GAD65 0/2 0/2 1/2 0/6 0/2 - - 7,1
total (%)
c)
4,3
TZL
M
MP65 (2/2)
b)
0/2 0/2 1/7 0/5 0/2 0/2 5,0
MOG 0/2 0/2 0/2 1/8 0/6 0/3 0/3 3,8
MBP - - - 1/5 0/5 0/2 0/2 7,1
PLP 0/2 0/2 0/2 0/8 1/6 0/2 0/2 4,2
GAD65 1/2 0/2 0/2 0/7 1/5 - - 11,1
total (%)
c)
6,5
a) dargestellt ist die Anzahl an reaktiven TZL innerhalb der entsprechenden Anzahl getesteter TZL von
unterschiedlichen gesunden Personen; positive Reaktionen sind grau unterlegt
b) MP65 ist ein T-Zell-Zielantigen von C. albicans und daher reagieren alle MP65-reaktiven TZL auch auf
C albicans-Stimulation, d.h. es liegt keine Kreuzreaktivität i.e.S. vor
c) nur autoreaktive TZL
Ergebnisse
74
Autoreaktive TZL
N
reagierten auf Stimulation mit A. fumigatus (MOG, 1 von 2), BRLF-1
(MBP, 1 von 3) oder E. coli (GAD65, 1 von 2). Auch ein geringer Anteil an CD154
+
/TNF-α
+
T-Zellen wurde als positive Reaktion gewertet, wenn eine deutliche Population zu erkennen
war und das Signal klar über der Hintergrundaktivierung lag. Autoreaktive TZL
M
kreuzreagierten v.a. mit viralen Antigenen des CMV (MOG, 1 von 8; MBP, 1 von 5) und
HSV-1 (PLP, 1 von 6; GAD65, 1 von 5). Zusätzlich konnte eine GAD65-spezifische TZL
auch durch Zugabe des C. albicans Lysates aktiviert werden (1 von 2). Obwohl die TCR-
Sequenzierungsdaten Hinweise auf Kreuzreaktivität zwischen Myelin-reaktiven und
EBNA-1 reaktiven TZL gaben (siehe 5.1.4), reagierte in diesen Versuchen keine der
getesteten TZL auf Restimulation mit EBNA-1. Unter Berücksichtigung aller getesteten
Antigene lag der Anteil an kreuzreaktiven Autoantigen-spezifischen TZL
N
zwischen
0% (PLP) und 7,1% (MOG, GAD65) und für TZL
M
zwischen 3,8% (MOG) und 11,1%
(GAD65).
Insgesamt reagierten 4,3% der ursprünglich naiven und 6,5% der autoreaktiven Memory
TZL auf Restimulation mit einem von sieben zufällig ausgewählten mikrobiellen Antigenen,
welche nicht auf der Grundlage von Sequenzhomologien ausgewählt wurden. Da das
Ausmaß der Kreuzreaktivität abhängig von der Anzahl an ursprünglich sortierten T-Zellen
pro Linie, der Klonalität und ihrer Verschiebung durch Expansion (siehe 5.1.4) und der
Menge und Ähnlichkeit von potentiellen T-Zell-Epitopen ist, sollen diese Ergebnisse in
erster Linie einen qualitativen Überblick bieten. Dennoch lässt sich schlussfolgern, dass
autoreaktive T-Zellen, welche mit mikrobiellen Antigenen kreuzreagieren können, ein Teil
des normalen T-Zell-Repertoires sind und ihre Existenz per se nicht zu Autoimmunität
führt. In nachfolgenden Versuchen könnte überprüft werden, inwieweit sich diese T-Zell-
Antworten funktionell unterscheiden, um eine effiziente Kontrolle von Pathogenen
einerseits und den Erhalt der Selbsttoleranz andererseits zu gewährleisten.
Ergebnisse
75
5.3 Charakterisierung von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in MS-
Patienten
Nachdem autoreaktive T-Zellen in gesunden Personen detailliert charakterisiert worden
waren, sollte im Folgenden untersucht werden, inwieweit sich Myelin-spezifische T-Zellen
aus dem peripheren Blut von MS-Patienten und passenden gesunden Kontrollen (GK)
bezüglich ihrer Frequenz, ihres Phänotyps und ihrer Funktion unterscheiden. In den letzten
Jahrzehnten wurden hierzu bereits Studien von anderen Arbeitsgruppen in
unterschiedlichem Umfang durchgeführt. Da diese fast ausnahmslos auf der Analyse in vitro
expandierter Zellen beruhten, ist es nachvollziehbar, dass die Ergebnisse oftmals
voneinander abwichen und bisher immer noch Unklarheit über die Relevanz von Myelin-
reaktiven T-Zellen bei MS herrscht. Deshalb sollte in diesem Teil der Arbeit mit Hilfe der
Anreicherung von CD154
+
T-Zellen erstmalig eine umfassende ex vivo Charakterisierung
von autoreaktiven CD4
+
naiven und Memory T-Zellen von MS-Patienten mit Fokus auf die
vielfach untersuchten „klassischen“ Myelin-Antigene durchgeführt werden. Da die zur
Verfügung stehende Blutmenge von Patienten ein limitierender Faktor für die Analyse war,
wurden für diese Versuche die Myelin-Antigene MOG, MPB und PLP zumeist in
Kombination verwendet (im Folgenden mit „Myelin“ bezeichnet). Dies ermöglichte eine
simultane Analyse aller potentiell relevanten Epitope und einen unvoreingenommenen und
umfassenden Einblick in die individuelle, Myelin-spezifische T-Zell Antwort, welche im
Krankheitsverlauf zumeist nicht auf ein Epitop oder Antigen begrenzt bleibt (sog.. „Epitope
Spreading“) [135, 170].
5.3.1 Quantifizierung und Phänotypisierung
Zunächst sollte überprüft werden, ob Myelin-reaktive CD4
+
T-Zellen häufiger im peripheren
Blut von MS-Erkrankten vorkommen und ob der Anteil an autoreaktiven Memory T-Zellen
im Vergleich zu Gesunden erhöht ist. Dies könnte auf eine klonale Expansion dieser Zellen
und eine pathologische Relevanz hinweisen.
Ergebnisse
76
5.3.1.1 Bestimmung der Frequenz
Um das Vorkommen von Myelin-reaktiven T-Zellen in MS-Patienten zu untersuchen,
wurden 2x10
7
-1x10
8
PBMCs für 7 h mit Myelin-Antigenen stimuliert. Gesunde Kontrollen
wurden nach Alter und Geschlecht entsprechend zugeordnet. CD154
+
T-Zellen wurden
magnetisch angereichert und am Durchflusszytometer analysiert.
Abb. 17: Frequenzen von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in MS-Patienten und Gesunden.
2x10
7
-1x10
8
PBMCs von MS-Patienten (n=22) und passenden gesunden Kontrollen (n=25) wurden
mit einem Pool der Myelin-Antigene MOG, MBP und PLP für 7h stimuliert. CD154
+
T-Zellen
wurden magnetisch angereichert und durchflusszytometrisch analysiert. Exemplarische Dot Plots
zeigen die absolute Anzahl an Myelin-spezifischen T-Zellen nach Stimulation der oben rechts
angegebenen Zellzahl (Analysefenster auf CD4
+
T-Zellen). Zahlen in Klammern geben die
Hintergrundaktivierung an. Zur Berechnung der Frequenz wurde die absolute Anzahl an CD154
+
T-Zellen nach Abzug des Hintergrundsignals durch die absolute Anzahl CD4
+
T-Zellen innerhalb
der nicht-angereicherten Fraktion geteilt. GK = Gesunde Kontrolle
Myelin-reaktive T-Zellen konnten in allen getesteten MS-Patienten und gesunden
Kontrollen detektiert werden. Die mediane Frequenz betrug in Patienten 36 Myelin-
spezifische T-Zellen (Spannweite 13 - 213) und in Gesunden 33 Myelin-spezifische T-Zellen
(Spannweite 16 - 185) innerhalb von 10
6
CD4
+
T-Zellen (Abb. 17). Somit kamen Myelin-
reaktive T-Zellen mit der gleichen Häufigkeit im peripheren Blut beider Gruppen vor. Die
Frequenzen der Myelin-reaktiven T-Zellen in Gesunden entsprachen dabei der Summe der
Frequenzen für die Einzelantigene (siehe 5.1.2). Aus diesen Daten lässt sich schließen, dass
die Häufigkeit von Myelin-spezifischen T-Zellen im peripheren Blut von MS-Patienten nicht
zu ihrer mutmaßlichen pathologischen Bedeutung beträgt. Im Folgenden wurde daher
überprüft, ob stattdessen phänotypische und/oder funktionelle Unterschiede innerhalb der
Myelin-reaktiven T-Zell-Population eine Rolle spielen könnten.
2289 1221
CD4
CD154
GK MS
(85)(99)
4x10
7
10
8
GK MS
10
- 6
10
- 5
10
- 4
10
- 3
Zellzahl CD154
+
/
Zellzahl CD4
+
Ergebnisse
77
5.3.1.2 Untersuchung des Phänotyps
Im nächsten Schritt wurde die Expression von CD45RO durchflusszytometrisch analysiert
um den Anteil an Memory-Zellen innerhalb der Myelin-reaktiven und der totalen CD4
+
T-Zellen zu bestimmen.
Wie schon für die einzelnen Myelin-Antigene zu beobachten war (siehe 5.2.1), variierte der
prozentuale Anteil an Myelin-spezifischen Memory T-Zellen in gesunden Individuen stark
(21,6% - 85,9%, Mittelwert 43,0%), und dies war auch für die Proben von MS-Patienten
ersichtlich (28,4 - 86,8%, Mittelwert 59,3%) (Abb. 18A). Insgesamt zeigten MS-Patienten
jedoch eine signifikant erhöhte Expression von CD45RO innerhalb der CD154
+
Fraktion
(p = 0,001). Allerdings überwog in Patienten der Memory-Phänotyp bereits in den totalen
CD4
+
T-Zellen mit einem Mittelwert von 51,3% im Vergleich zu 40,3% bei Gesunden
(p = 0,03; Abb. 18B). Im Hinblick auf das chronologische Alter weist dies auf einen
verstärkten kumulativen Antigen-Kontakt über die Lebensdauer und/oder eine vorzeitige
Alterung von CD4
+
T-Zellen hin. Diese Ergebnisse stellten deshalb einen Antigen-
spezifischen Effekt in Form von selektiver Expansion Myelin-reaktiver Memory T-Zellen in
Frage.
Um dieser Vermutung weiter nachzugehen, wurden Korrelationsanalysen durchgeführt. Die
phänotypischen Analysen autoreaktiver T-Zellen von gesunden Individuen hatten bereits
gezeigt, dass die Expression von CD45RO innerhalb der Autoantigen-spezifischen und der
gesamten CD4
+
T-Zellen deutlich miteinander korrelierte (siehe 5.2.2). Passende gesunde
Kontrollpersonen wurden nun den Proben der MS-Patienten zugeordnet. Die Ergebnisse
bestätigten, dass auch in Patienten der Anteil an Myelin-reaktiven Memory T-Zellen mit
dem globalen Differenzierungsstatus von CD4
+
T-Zellen und somit einem Antigen-
erfahrenen Immunsystem korrelierte (r
s
= 0,82; p < 0,0001; Abb. 18C). Gleichzeitig konnte
kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen der Frequenz und dem Anteil an
Myelin-spezifischen Memory-Zellen gefunden werden (r
s
= 0,39; p = 0,07; Abb. 18D).
Ergebnisse
78
Abb. 18: Expression von CD45RO in Myelin-reaktiven und totalen CD4
+
T-Zellen von MS-
Patienten. 2x10
7
-1x10
8
PBMCs von MS-Patienten (n=22) und passenden gesunden Kontrollen
(GK; n = 25) wurden mit einer Kombination der Myelin-Antigene MOG, MBP und PLP für 7 h
stimuliert. Nach der Anreicherung von CD154
+
T-Zellen wurde die Expression von CD45RO
innerhalb der (A) Myelin-spezifischen, CD154
+
T-Zellen und (B) der totalen CD4
+
T-Zellen
durchflusszytometrisch bestimmt. (C) Zur Analyse der Korrelation wurden diese Werte
gegeneinander aufgetragen. (D) Zusätzlich wurde auch die Frequenz der Myelin-reaktiven
CD154
+
T-Zellen mit dem Anteil an Memory-Zellen innerhalb der CD4
+
T-Zellen korreliert. Die
Regressionsgerade wurde jeweils für jede Gruppe zu Darstellungszwecken ermittelt.
r
s
= Spearman Korrelationskoeffizient.
Eine klare Antigen-induzierte Expansion von Memory T-Zellen, wie sie am Beispiel des
Recall-Antigens MP65 stattgefunden hatte (siehe 5.2.2) konnte demnach für Myelin-reaktive
T-Zellen von MS-Patienten nicht nachgewiesen werden.
5.3.1.3 Korrelationen mit klinischen Parametern
Im Anschluss an die Analysen der Prävalenz und des Phänotyps von Myelin-spezifischen
T-Zellen in MS-Patienten sollten die gewonnenen Ergebnisse mit den klinischen Parametern
„Krankheitsdauer“, „Behandlungsdauer mit Natalizumab“ und „Expanded Disability Status
Scale“ (EDSS) korreliert werden um eventuelle Zusammenhänge zu erkennen. Die EDSS-
Skala reicht von 0-10 Punkten und beschreibt den Grad der Behinderung eines Patienten
38,7 12,6
48,1 0,6
31,9 19,4
48,6 0,0
IFN-γ
CD45RO
GK MS
0
20
40
60
80
100
**
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
GK MS
A B
GK MS
0
20
40
60
80
100
*
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD4
+
(%)
C D
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
rs= 0,82
p< 0,0001
n = 22
rs= 0,90
p < 0,0001
n = 25
MS
GK
CD45RO+Zellen innerhalb CD4+ (%)
CD45RO+ Zellen
innerhalb CD154+ (%)
0 20 40 60 80 100
-5.5
-5.0
-4.5
-4.0
-3.5
-3.0 GK
MS
rs= 0,39
p = 0,07
n = 22
rs= 0,3
p= 0,16
n = 25
CD45RO+Zellen innerhalb CD154+ (%)
log(CD154+/CD4+)
Ergebnisse
79
unter Berücksichtigung verschiedener funktioneller Systeme des Körpers, die durch die
Erkrankung beeinträchtigt sein können.
Abb. 19: Zusammenhang von Frequenz und Phänotyp Myelin-reaktiver T-Zellen mit
klinischen Parametern. (A und B) Die Frequenz von Myelin-spezifischen T-Zellen aus dem
peripheren Blut von 22 MS-Patienten sowie der Anteil an reaktiven Memory T-Zellen wurde mit
der Krankheitsdauer, der Behandlungsdauer mit Natalizumab und dem EDSS-Wert korreliert.
Weiterhin wurde überprüft, ob Zusammenhänge zwischen dem EDSS-Wert und der (C) Frequenz
an totalen CD4
+
Memory T-Zellen, (D) dem Alter oder (E) der Krankheitsdauer bestehen. Die
Regressionsgeraden wurden jeweils zu Darstellungszwecken ermittelt. r
s
= Spearman
Korrelationskoeffizient.
Die Korrelationsanalysen konnten keinen statistisch signifikanten Zusammenhang zwischen
der Frequenz von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen im peripheren Blut und der Dauer der
Erkrankung, der Behandlungsdauer mit Natalizumab oder dem EDSS-Wert aufzeigen (Abb.
19A). Da es sich bei der vorliegenden Studie um eine Querschnittsanalyse handelte, ist für
0 50 100 150 200 250
-5.5
-5.0
-4.5
-4.0
-3.5
-3.0 r
s
= 0,06
p = 0,78
Krankheitsdauer (Monate)
log (Zellzahl CD154
+
/
Zellzahl CD4
+
)
0 50 100 150 200250
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,08
p = 0,71
Krankheitsdauer (Monate)
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD154
+
(%)
0 20 40 60 80 100
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,08
p = 0,70
Natalizumab (Monate)
02468
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,49
p = 0,02
EDSS
A
B
CE
D
0 20 40 60 80 100
-5.5
-5.0
-4.5
-4.0
-3.5
-3.0 r
s
= -0,15
p = 0,87
Natalizumab (Monate)
02468
-5.5
-5.0
-4.5
-4.0
-3.5
-3.0 r
s
= 0,07
p = 0,75
EDSS
0 50 100 150 200
0
2
4
6
8r
s
= -0,04
p = 0,84
Krankheitsdauer (Monate)
EDSS
0 2 4 6 8
0
20
40
60
80
100
r
s
= 0,57
p = 0,007
EDSS
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD4
+
(%)
20 30 40 50 60 70
0
2
4
6
8r
s
= 0,21
p = 0,20
Alter (Jahre)
EDSS
Ergebnisse
80
die einzelnen Patienten jedoch nicht auszuschließen, dass sich die Reaktivität auf Myelin-
Antigene während der Erkrankung verändert bzw. verstärkt (beschrieben bei [135, 171]).
Weiterhin korrelierte der Anteil an CD154
+
Memory T-Zellen weder mit der
Erkrankungsdauer noch mit der Behandlungsdauer (Abb. 19B). Ein positiver
Zusammenhang ließ sich aber mit dem EDSS-Wert herstellen (r
s
= 0,49; p = 0,02). Dies war
allerdings auch für die totalen CD4
+
Memory T-Zellen erkennbar (r
s
= 0,57; p = 0,007; Abb.
19C). Nachdem für den im letzten Abschnitt (5.3.1.2) beschriebenen linearen
Zusammenhang von Myelin-reaktiven und totalen CD4
+
Memory T-Zellen korrigiert
worden war (partielle Korrelation), konnte kein signifikanter Antigen-spezifischer Effekt
mehr gefunden werden (r
s
= 0,02; p = 0,60). Der EDSS-Wert korrelierte für das
Patientenkollektiv nicht mit dem Alter oder der Krankheitsdauer (Abb. 19D und E).
Darüber hinaus konnte ein Einfluss auf die Memory T-Zell-Frequenz durch längerfristige
Natalizumab-Behandlung ausgeschlossen werden (Daten nicht gezeigt). Aus diesen Daten
lässt sich schlussfolgern, dass der Grad der Behinderung mit dem generellen
Differenzierungsstatus der CD4
+
T-Zellen assoziiert ist.
5.3.2 Funktionelle Charakterisierung
Da zwischen MS-Patienten und gesunden Kontrollen keine Abweichungen in der Prävalenz
von Myelin-spezifischen T-Zellen und keine Autoantigen-induzierte Expansion von
Memory T-Zellen nachgewiesen werden konnten, sollte im Folgenden überprüft werden, ob
funktionelle Unterschiede zwischen den Gruppen bestehen. Der Fokus lag dabei
insbesondere auf Untersuchungen zur differentiellen Zytokin- und Chemokinrezeptor-
Expression sowie auf der Bestimmung der Antigensensitivität von Myelin-reaktiven
T-Zellen in MS-Patienten.
Ergebnisse
81
5.3.2.1 Expression von inflammatorischen Zytokinen
Autoreaktiven Th1 und Th17-Zellen sowie ihren Effektor-Zytokinen wird im Tiermodell
von MS eine essentielle Rolle zugeschrieben [161]. Demgegenüber existieren uneinheitliche
Daten zur differentiellen Zytokinexpression von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen bei MS-
Patienten [137, 140]. In dieser Arbeit sollten deshalb inflammatorische Zytokinprofile
erstmals direkt, ohne den Einfluss vorheriger in vitro Expansion, für die Gesamtproteine
untersucht werden.
Abb. 20: Expression von inflammatorischen Zytokinen durch Myelin-reaktive T-Zellen in
MS-Patienten. 2x10
7
-1x10
8
PBMCs von MS-Patienten (n=13) und gesunden Kontrollen (GK; n=18)
wurden mit Myelin-Antigenen (MOG, MBP, PLP) für 7 h stimuliert. CD154
+
Zellen wurden
angereichert und durchflusszytometrisch auf die Expression der Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-17 und
GM-CSF untersucht. Aufgetragen wurde die Frequenz der Zytokin-Produzenten innerhalb der
Myelin-reaktiven CD4
+
Memory T-Zellen.
Zunächst wurde die Gesamtexpression der Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-17 und GM-CSF
innerhalb der CD154
+
/CD45RO
+
T-Zellen nach Stimulation mit den Myelin-Antigenen
mittels multiparametrischer Durchflusszytometrie bestimmt. Hierbei konnten keine
signifikanten Unterschiede zwischen Patienten und entsprechenden Kontrollen gefunden
werden, jedoch zeigte sich für TNF-α, IFN-γ und GM-CSF eine Tendenz in Richtung einer
erhöhten Expression in MS-Patienten (Abb. 20). Die durchschnittliche TNF-α-Produktion
von Myelin-reaktiven Memory T-Zellen betrug in Gesunden 47,4% und in MS-Patienten
57,1% (p = 0,1). Die mit dem Th1- bzw. Th17-Subtyp assoziierten Zytokine IFN-γ und IL-17
exprimierten im Mittel 14,7% bzw. 2,4% der Zellen von gesunden Kontrollen und 20,2%
bzw. 4,6% der Zellen von Patienten (p = 0,07 bzw. p = 0,17). MS-Patienten erreichten dabei
TNF-α
GK MS
0
20
40
60
80
100
p= 0,10
Zytokinproduzenten inner-
halb CD154
+
/CD45RO
+
(%)
IFN-γ
GK MS
0
20
40
60
p= 0,07
IL-17
GK MS
0
5
10
15
p= 0,17
GM-CSF
GK MS
0
20
40
60
80
100
p= 0,08
Ergebnisse
82
Maximalwerte von 49,7% (IFN-γ) und 13,7% (IL-17). GM-CSF-Produzenten machten in
MS-Patienten einen Anteil von bis zu 78,8% der Myelin-spezifischen T-Zellen aus
(Mittelwert 28,3% bzw. 17,6% in Gesunden; p = 0,08).
Abb. 21: Untersuchung der Zytokinproduktion von Myelin-spezifischen T-Zellen mittels
Boolescher Methode. (A und B) Unter Anwendung der booleschen Gating-Strategie für Zytokin-
Kombinationen aus TNF-α, IFN-γ, IL-17 und GM-CSF wurde der Gesamtanteil bzw. mittlere Anteil
an polyfunktionalen Myelin-reaktiven T-Zellen, welche mindestens zwei Zytokine gleichzeitig
exprimierten, sowie Einzel- und Nicht-Produzenten für MS-Patienten (n=13) und gesunde
Kontrollen (GK; n=18) bestimmt. (A und C) Zusätzlich wurden aus dieser Analyse hervorgehende
signifikante Unterschiede für einzelne Zytokin-Kombinationen sowie Korrelationen mit dem
EDSS-Wert dargestellt. Zu Darstellungszwecken wurde die Regressionsgerade ermittelt. Für
Vergleiche aller Kombinationen siehe Tab. 17. r
s
= Spearman-Korrelationskoeffizient.
Im nächsten Schritt wurde mit Hilfe der Booleschen Methode (beschrieben in [172]) der
Anteil an polyfunktionalen Zellen, welche zwei oder mehr inflammatorische Zytokine
gleichzeitig exprimierten, innerhalb der CD154
+
Memory T-Zellen bestimmt. Dabei konnten
keine Hinweise auf eine gesteigerte Polyfunktionalität dieser Zellen bei MS-Patienten
gefunden werden (durchschnittlich 29% vs. 34%; Abb. 21A und B). Weiterhin wurden keine
Unterschiede im Hinblick auf den Gesamtanteil an Zytokin-Einzelproduzenten (im Mittel
39% vs. 33%) oder Nicht-Produzenten (im Mittel 32% vs. 33%) ermittelt. Die Einzelanalyse
B
polyfunktional
GK MS
0
20
40
60
80
100 n.s.
Zytokinproduzenten inner-
halb CD154+/CD45RO+ (%)
TNF-α + IFN-γ
GK MS
0
5
10
15
*
IL-17
Einzelproduzenten
GK MS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
**
A
C
TNF-α + IFN-γ
0 2 4 6 8
0
5
10
15
r
s
=0,62
p = 0,02
EDSS
Zytokinproduzenten inner-
halb CD154
+
/CD45RO
+
(%)
IFN-γ
Einzelproduzenten
0 2 4 6 8
0
1
2
3
4
r
s
=0,79
p = 0,001
EDSS
Ergebnisse
83
Tab. 17: Boolesche Analyse der Zytokinexpression von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen.
a) M = Mittelwert
b)
SD = Standardabweichung
aller möglichen Zytokin-Kombinationen ergab allerdings einen signifikant erhöhten Anteil
an TNF-α/IFN-γ-Doppelproduzenten (im Mittel 2,9% vs. 5,7%; p = 0,03) sowie IL-17-
Einzelproduzenten in MS-Patienten, dies jedoch auf einem insgesamt sehr niedrigem Niveau
(im Mittel 0,08% vs. 0,6%; p = 0,005; Abb. 21A und Tab. 17). Demgegenüber konnte eine
tendenzielle Abnahme der TNF-α-Einzelproduzenten beobachtet werden (Mittelwert 36,9%
vs. 29,9%; p = 0,06). Die Frequenz der TNF-α/IFN-γ-Doppelproduzenten sowie der IFN-γ-
Einzelproduzenten korrelierte positiv mit dem EDSS-Wert (Abb. 21C). Für weitere
TNF-α IFN-γ IL-17 GM-
CSF
GK MS
p-Wert
M
a)
SD
b)
M SD
Nicht
-
Produzenten − − − − 32,63 12,54 33,88 16,55 0,73
Einzel
-
Produzenten
x
−
−
−
35
,
95
12
,
25
29
,
91
6
,
58
0
,
06
−
x
−
−
0
,
40
0
,
73
0
,
87
0
,
96
0
,
09
−
−
x
−
0,08 0,15 0,60 0,68 0,005
−
−
−
x
2
,
46
4
,
72
2
,
02
3
,
87
0
,
26
Doppel
-
Produzenten
x
x
−
−
2,86 2,61 5,72 2,77 0,03
x
−
x
−
0
,
90
1
,
11
1
,
69
1
,
74
0
,
18
x
−
−
x
12
,
51
6
,
86
11
,
46
11
,
47
0
,
27
−
x
x
−
0
0
0
0
>0
,
99
−
x
−
x
0
,
37
1
,
08
0
,
03
0
,
08
0
,
70
−
−
x
x
0
,
02
0
,
07
0
,
01
0
,
04
>0
,
99
Dreifach
-
Produzenten
x
x
x
−
0
,
06
0
,
18
0
,
58
1
,
79
0
,
47
x
x
−
x
11
,
01
13
,
50
12
,
66
10
,
83
0
,
35
x
−
x
x
1
,
20
1
,
49
1
,
68
2
,
28
0
,
48
−
x
x
x
0
0
0
0
>0
,
99
Vierfach
-
Produzenten x x x x 0,20 0,31 0,46 0,58 0,27
Ergebnisse
84
Kombinationen konnten keine relevanten Abweichungen zwischen den Gruppen und keine
signifikanten Zusammenhänge mit klinischen Daten (EDSS-Wert, Krankheitsdauer und
Dauer der Natalizumab-Behandlung) ermittelt werden. In der Gesamtheit machten neben
den TNF-α-Einzelproduzenten in beiden Gruppen TNF-α/GM-CSF-Doppelproduzenten
(12,5% vs. 11,5%) und TNF-α/IFN-γ/GM-CSF-Dreifachproduzenten (11,0% vs. 12,7%) den
größten Anteil aus. Diese Daten verdeutlichen, dass sich die inflammatorischen
Zytokinmuster von Myelin-spezifischen T-Zellen aus dem peripheren Blut von MS-
Patienten und gesunden Kontrollen nur im geringen Maße voneinander unterscheiden.
5.3.2.2 Expression von Chemokinrezeptoren
Neben der Produktion von verschiedenen Effektor-Zytokinen können CD4
+
T-Zell-
Subpopulationen anhand der differentiellen Expression der Chemokinrezeptoren CXCR3,
CCR6 und CCR4 charakterisiert werden [10, 173]. Diese Chemokinrezeptoren beeinflussen
durch Interaktion mit ihren Liganden die Migration von T-Zellen zu Entzündungsherden.
Daten aus humanen und tierexperimentellen Studien zeigen, dass CXCR3 und CCR6
v.a. in
der Initial- und aktiven Phase von MS eine wichtige Rolle spielen könnten und den Eintritt
von potentiell pathogenen T-Zellen ins ZNS ermöglichen [129, 174-176]. In der
vorliegenden Arbeit sollte daher die Expression dieser Chemokinrezeptoren auf globaler
CD4
+
T-Zell-Ebene sowie auf Myelin-spezifischen T-Zellen analysiert werden.
Im ersten Schritt der Analyse wurde die Gesamtexpression der Chemokinrezeptoren
bestimmt. Die Expression war streng mit dem Memory-Phänotyp assoziiert. Die Frequenz
an CXCR3
+
Zellen war innerhalb der totalen CD4
+
Memory T-Zellen von MS-Patienten
tendenziell (Mittelwert 38,1% vs. 44,4%; p = 0,06) und innerhalb der Myelin-reaktiven
Memory T-Zellen signifikant (40,4% vs. 51,6%; p
=
0,047) erhöht (Abb. 22A). Die Expression
von CCR4 war dagegen in den totalen Memory T-Zellen vermindert (39,6% vs. 27,9%;
p = 0,03) (Abb. 22B). Daraus ergab sich ein deutlich erhöhtes Verhältnis von CXCR3
+
zu
CCR4
+
Zellen (p = 0,003; Abb. 22D). Dieser Unterschied konnte für Myelin-spezifische
Ergebnisse
85
Abb. 22: Gesamtexpression von Chemokinrezeptoren auf Myelin-spezifischen und totalen
CD4
+
Memory T-Zellen. Myelin-reaktive CD154
+
T-Zellen von MS-Patienten (n=14) und
gesunden Kontrollen (GK; n=15-17) wurden nach Stimulation mit einer Kombination aus MOG,
MBP und PLP magnetisch angereichert. Autoreaktive und totale CD4
+
Memory T-Zellen wurden
anschließend durchflusszytometrisch auf die Expression der Chemokinrezeptoren (A) CXCR3, (B)
CCR4 und (C) CCR6 untersucht. (D) Zusätzlich wurde das Verhältnis von CXCR3
+
zu CCR4
+
Zellen
analysiert.
T-Zellen nicht nachgewiesen werden. Gesunde Kontrollen und MS-Patienten zeigten einen
ähnlichen mittleren Anteil an CCR6
+
Zellen in der CD4
+
Gesamtpopulation (32,9% vs.
36,2%) sowie in der Antigen-spezifischen Fraktion (38,3% vs. 40,9%; Abb. 22C).
Im nächsten Schritt wurden in Anlehnung an die Veröffentlichungen von Duhen et al. [10,
12] CD4
+
T-Zell-Subpopulationen durch Kombination verschiedener Chemokinrezeptoren
definiert: Th1-Zellen (CXCR3
+
/CCR6
−
), Th17-Zellen (CCR6
+
/CXCR3
−
/CCR4
+
) sowie
Th1/Th17-Zellen (CXCR3
+
/CCR6
+
). Abb. 23A und B zeigen die Analyse-Strategie anhand
beispielhafter Dot Plots sowie die Frequenz der verschiedenen Subtypen innerhalb der
totalen und der Myelin-spezifischen CD4
+
Memory T-Zellen. Das Verteilungsmuster der
einzelnen Subpopulationen ähnelte sich in beiden Fraktionen sehr, mit dem Unterschied
einer breiteren Streuung aller Parameter innerhalb der Myelin-spezifischen T-Zellen. Der
Anteil an Th1 und Th17-Zellen war in gesunden Kontrollen und MS-Patienten gleich groß.
GK MS
0
20
40
60
80
CXCR3
+
innerhalb
CD4
+
/CD45RO
+
GK MS
0
20
40
60
80
100 *
CXCR3
+
innerhalb
CD154
+
/CD45RO
+
GK MS
0
20
40
60
80 *
CCR4
+
innerhalb
CD4
+
/CD45RO
+
GK MS
0
20
40
60
80
CCR4
+
innerhalb
CD154
+
/CD45RO
+
GK MS
0
20
40
60
CCR6
+
innerhalb
CD4
+
/CD45RO
+
GK MS
0
20
40
60
80
CCR6
+
innerhalb
CD154
+
/CD45RO
+
GK MS
0
1
2
3
4**
CXCR3
+
/ CCR4
+
(CD4
+
CD45RO
+
)
GK MS
0
2
4
6
8
10
CXCR3
+
/ CCR4
+
(CD154
+
CD45RO
+
)
CXCR3 CCR4
A B
C D
CCR6 CXCR3/CCR4
Ergebnisse
86
Abb. 23: Charakterisierung von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zell-Subpopulationen anhand der
Chemokinrezeptor-Expression. (A) Exemplarische Dot Plots von totalen und Myelin-reaktiven
CD4
+
Memory T-Zellen zeigen die Analyse-Strategie zur Definition von Th1-, Th17- und Th1/17-
Subpopulationen anhand der Expression von CXCR3, CCR6 und CCR4. (B) Die Frequenz der
verschiedenen Subpopulationen innerhalb der totalen und innerhalb der Myelin-spezifischen
CD4
+
Memory T-Zellen wurde anschließend in 14 MS-Patienten und 15 gesunden Kontrollen (GK)
miteinander verglichen. (C) Korrelation von Th1/Th17-Zellen in totalen CD4
+
Memory T-Zellen
und CD4
+
/CD154
+
Memory T-Zellen für alle getesteten MS-Patienten und GK. r
s
= Spearman-
Korrelationskoeffizient. Zu Darstellungszwecken wurde die Regressionsgerade ermittelt.
Die Mittelwerte betrugen 19,8% vs. 20,2% (Th1) bzw. 14,5% vs. 12,0% (Th17) für die
gesamten CD4
+
Memory T-Zellen (Abb. 23A) und 19,7% vs. 21,1% (Th1) bzw. 17,6% vs.
10,4% (Th17) für die Myelin-reaktiven Memory T-Zellen (Abb. 23B). Im Gegensatz dazu
konnte ein deutlich erhöhter Anteil an Th1/Th17-Zellen innerhalb der totalen CD4
+
Memory T-Zellen von Patienten gefunden werden (im Mittel 18,4% vs. 24,2%; p = 0,009).
Dieser Unterschied war auch in den Myelin-spezifischen T-Zellen nachzuweisen (im Mittel
20,7% vs. 30,5%; p = 0,02), wobei der Anteil an Th1/Th17-Zellen in dieser Fraktion für alle
getesteten Individuen deutlich mit dem Anteil in den totalen CD4
+
Memory T-Zellen
assoziiert war (Abb. 23C).
nach
Anreicherung
CD154
+
/
CD45RO
+
ohne
Anreicherung
CD4
+
/
CD45RO
+
CXCR3
CCR6
CD4
CCR4
CXCR3
CCR6
CD4
CCR4
32,0 15,1
31,3 21,6 22,5 30,1
20,7 26,7
14,0 9,5
Th1/
Th17
Th1
Th17
B
A
C
0 10 20 30 40
0
20
40
60 rs = 0,59
p = 0,0001
Th1/Th17 innerhalb CD4+/CD45RO+
(%)
Th1/Th17 innerhalb
CD154+/CD45RO+ (%)
Ergebnisse
87
Diese Ergebnisse weisen auf eine generelle Überrepräsentation einer potentiell
inflammatorischen CD4
+
T-Zell-Subpopulation in MS-Patienten hin. Diese Unterschiede
werden im Myelin-spezifischen Repertoire lediglich widergespiegelt und geben keinen
Anhaltspunkt für eine Autoantigen-induzierte Verschiebung der T-Zell-Zusammensetzung.
Korrelationen mit klinischen Parametern konnten für keine Subpopulation gefunden
werden (nicht gezeigt).
5.3.2.3 Bestimmung der funktionellen Avidität Myelin-reaktiver T-Zell Klone
In Abschnitt 5.2.3 dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass aus Memory-Zellen generierte
autoreaktive TZL von gesunden Personen eine geringe Antigensensitivität für Diabetes-,
MS- und Myasthenie-assoziierte Autoantigene aufwiesen. Verschiedene Untersuchungen
mit transgenen Mäusen unterstützen diese Beobachtung von selbst-spezifischen T-Zellen
mit niedriger Avidität in der Peripherie [37, 177, 178]. Ob Myelin-reaktive T-Zellen von MS-
Patienten jedoch eine höhere Avidität im Vergleich mit Gesunden aufweisen, ist unklar.
Nachdem die ex vivo Analysen Myelin-spezifischer T-Zellen von MS-Patienten keine
Unterschiede bezüglich der Frequenz bzw. Antigen-unabhängige Veränderungen des
Phänotyps und der Funktion ergeben hatten, sollte deshalb abschließend die funktionelle
Avidität dieser Zellen überprüft werden.
Um diese mit hoher Genauigkeit zu bestimmen, wurden in diesem Experiment einzelne
Aviditäten von T-Zell-Klonen ermittelt. Die Klone wurden aus naiven und Memory
T-Zellen von vier Gesunden und zwei MS-Patienten durch Stimulation mit MP65 oder
MOG und darauffolgender magnetischer Anreicherung und FACS-Einzelzell-Sortierung
von CD4
+
/CD154
+
T-Zellen generiert. Nach Expansion wurden die Klone anschließend mit
einer absteigenden Menge des initialen Antigens stimuliert und die Re-Expression von
CD154 sowie TNF-α im Durchflusszytometer gemessen. Dosis-Antwort-Kurven für MP65-
reaktive Memory T-Zell-Klone (TZK
M
) eines Gesunden sowie beispielhafte Dosis-Antwort-
Kurven für MOG-reaktive naive (TZK
N
) und Memory T-Zell-Klone von jeweils einer
Ergebnisse
88
gesunden Kontrolle und einem MS-Patienten sind in Abb. 24A und B dargestellt. Aus diesen
wurde die halbmaximale effektive Antigen-Konzentration (EC50) für jeden Klon berechnet
und aufgetragen (Abb. 24C).
Abb. 24: Funktionelle Avidität von Myelin-reaktiven T-Zell-Klonen in MS-Patienten. Myelin-
spezifische CD4
+
T-Zell-Klone (TZK) wurden aus naiven (TZK
N
, offene Symbole) und Memory
T-Zellen (TZK
M
, geschlossene Symbole) nach Stimulation mit MOG oder MP65 und anschließender
Anreicherung und FACS-Einzelzell-Sortierung von CD154
+
T-Zellen generiert. Nach Expansion
wurden die TZK mit einer absteigenden Menge des ursprünglichen Antigens restimuliert und die
Re-Expression von CD154 und TNF-α durchflusszytometrisch bestimmt. (A und B) Beispielhafte
Dosis-Antwort-Kurven reaktiver TZK einzelner Spender. (C) EC50-Werte reaktiver TZK aller
Kontrollen und Patienten. Gleiche Symbole (offen/geschlossen) kennzeichnen die gleiche Person.
Gestrichelte Linien kennzeichnen willkürlich definierte Bereiche hoher, mittlerer und niedriger
funktioneller Avidität. Der Median ist gekennzeichnet. Signifikanzen beziehen sich auf das
Kontrollantigen, wenn nicht anders angegeben. GK = Gesunde Kontrolle.
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
CD154
+
/TNFα
+
Zellen (%)
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
0
20
40
60
80
100
Konzentration (nmol/ml/Peptid)
A
B
C
TZK
N
TZK
N
TZK
M
TZK
M
TZK
M
GK
MS
TZK
M
TZK
N
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
10
-2
10
-1
10
0
10
1
10
2
EC50 (nmol/ml/Peptid)
TZK
M
TZK
N
TZK
M
MOG
hoch
mittel
niedrig
MP65
MSGK
** *** **** **** ****
**** ****
*******
*
**
MP65
MOG MOG
funktionelle
Avidität
Ergebnisse
89
Für die Gesamtheit der MP65-spezifischen TZK
M
war eine funktionelle Aviditätsreifung
offensichtlich, da mehr als ein Drittel der Klone (6/16) EC50-Werte unter 0,1 pmol/ml
aufwiesen, was zur besseren Vergleichbarkeit als Grenze für hohe Avidität definiert wurde.
Diese Werte wurden aus extrapolierten Dosis-Wirkungs-Kurven berechnet, da selbst nach
Zugabe der geringsten Antigen-Konzentration (0,06 pmol/ml) die Reaktivität der Zellen sehr
hoch war (50%-90% CD154
+
/TNF-α
+
) und der untere Schwellenwert nicht erreicht wurde
(Abb. 24A). Der größere Teil der MP65-reaktiven TZK
M
zeigte eine intermediäre
Antigensensitivität, welche EC50-Werte zwischen 0,1 nmol/ml und 0,1 pmol/ml
(EC50
Med
= 2,2 pmol/ml) umfasste, während keine Klone mit geringer funktioneller Avidität
(EC50 > 0,1 nmol/ml) identifiziert werden konnten. Im Gegensatz dazu schwankten die
medianen EC50-Werte von MOG-spezifischen TZK von gesunden Individuen, unabhängig
von ihrem Ursprung, zwischen intermediärer und niedriger funktioneller Avidität
(EC50
Med
= 0,07-0,21 nmol/ml). Für gepaarte Daten einer gesunden Kontrolle konnten
TZK
M
mit signifikant geringerer Antigensensitivität (EC50
Med
= 0,21 nmol/ml) im Vergleich
zu TZK
N
(EC50
Med
= 0,09 nmol/ml; p = 0,02) nachgewiesen werden. Diese Beobachtung war
bei TZK von MS-Patienten noch ausgeprägter: Während MOG-spezifische TZK
N
eine
niedrige bis mittlere funktionelle Avidität aufwiesen (EC50
Med
= 0,07 nmol/ml) konnten
mehr als 90% der TZK
M
(48/50 bzw. 28/31) dem niedrigen Aviditätsbereich zugeordnet
werden (EC50
Med
= 1,1-1,9 nmol/ml) und demonstrierten somit eine noch viel geringere
Antigensensitivität (p < 0,001), welche sich von MP65-reaktiven hochaviden TZK
M
sogar um
etwa fünf log-Stufen unterschied.
Diese Ergebnisse stützen die Erkenntnisse aus Abschnitt 5.2.3 und belegen nun auch auf
monoklonaler Ebene, dass Myelin-reaktive Memory T-Zellen aus gesunden Spendern im
Gegensatz zu Recall-Antigen-spezifischen Memory T-Zellen keine hohe funktionelle
Avidität erlangt haben. Noch interessanter ist aber das Resultat, dass Myelin-reaktive
Memory T-Zellen von MS-Patienten sogar noch höhere Antigenkonzentrationen benötigten
Ergebnisse
90
um aktiviert zu werden. Dies stellt MOG als auslösendes Antigen und Faktor zur
Aufrechterhaltung der hier beschriebenen Myelin-spezifischen Memory T-Zell-Antwort in
Frage.
5.3.3 Myelin-spezifische regulatorische T-Zellen
Die Suppression von autoreaktiven T-Zellen durch regulatorische CD4
+
CD25
+
FoxP3
+
T-Zellen (Tregs) ist ein wichtiger Mechanismus zur Erhaltung der peripheren Toleranz
[179]. Funktionelle Defekte sowie quantitative Veränderungen von Treg-Subpopulation
wurden mehrfach in Patienten mit schubförmig-remittierender MS (RRMS) beschrieben
und mit der Pathogenese der Erkrankung in Verbindung gebracht [120, 180-182]. In Bezug
auf autoreaktive und, im Speziellen, Myelin-spezifische Tregs ist jedoch aufgrund des
Fehlens direkter und sensitiver Detektionsmethoden bisher wenig bekannt. In Pilot-
experimenten sollte daher überprüft werden, ob die Verwendung des Aktivierungsmarkers
CD137, welcher nach Kurzzeitstimulation vorrangig auf Tregs exprimiert wird und kürzlich
bereits erfolgreich für die Charakterisierung von Alloantigen-, Umweltantigen- und
Pathogen-spezifischen Tregs verwendet wurde [154, 183, 184], grundsätzlich zur ex vivo
Detektion von Myelin-reaktiven Tregs geeignet ist.
Myelin-aktivierte CD154
+
konventionelle T-Zellen (Tcons) und CD137
+
Tregs wurden
gemeinsam magnetisch angereichert und durchflusszytometrisch analysiert. Abb. 25A
demonstriert beispielhaft die verstärkte, etwa 1,5-fach höhere Hintergrundaktivierung von
CD137 im Vergleich zu CD154 innerhalb der unstimulierten Probe. Darüber hinaus war das
Verhältnis von Signal-zu-Hintergrund für autoreaktive CD137
+
Tregs deutlich geringer als
für CD154
+
Tcons, in diesem Beispiel etwa um den Faktor 3. Zur weiteren Auswertung
wurden deshalb nur Proben herangezogen, für welche das CD137
+
Signal der stimulierten
Probe mindestens anderthalbmal so hoch wie das Hintergrundsignal ausfiel (Stimulations-
Index > 1,5). Des Weiteren wurden 10 CD137
+
T-Zellen innerhalb von 10
6
eingesetzten
CD4
+
T-Zellen als Detektionslimit festgelegt (nach Abzug des Hintergrundsignals).
Ergebnisse
91
CD137
+
T-Zellen exprimierten einen hohen Anteil an FoxP3 und CD25 (Spannweite
52%-88%), wohingegen CD154
+
T-Zellen negativ für beide Marker waren (Abb. 25B). Die
Prävalenz von Myelin-spezifischen Tregs im peripheren Blut unterschied sich zwischen MS-
Patienten und gesunden Personen nicht (Abb. 25D). Interessanterweise war die mediane
Häufigkeit mit 40 (Spannweite 14 bis 506) bzw. 37 (Spannweite 6 bis 573) Myelin-reaktiven
Tregs innerhalb von 10
6
CD4
+
Zellen mit der Frequenz von Tcons vergleichbar (5.3.1.1).
Abb. 25: Ex vivo Charakterisierung von Myelin-reaktiven Tregs.PBMCs von gesunden
Kontrollen (GK; n=5-16) und MS-Patienten (n=11) wurden mit einer Kombination aus MOG, MBP
und PLP stimuliert. (A) Exemplarische Dot Plots eines MS-Patienten zeigen die absolute Anzahl an
aktivierten CD4
+
Zellen nach gleichzeitiger Anreicherung von CD154
+
Tcons und CD137
+
Tregs
aus 5x10
7
PBMCs. CD137
+
T-Zellen wurden weiterhin auf die Expression von (B) FoxP3 und (C) der
Chemokinrezeptoren CXCR3, CCR6 und CCR4 hin untersucht (exemplarische Dot Plots). (D) Die
Frequenz, (E) der Phänotyp und (F) Subpopulationen von CD137
+
Tregs, definiert durch die
differentielle Chemokinrezeptor-Expression (siehe Abb. 23), wurden zwischen GK und MS-
Patienten verglichen.
A B
C
D E
CD4
CCR6
CD45RO
CCR4
CXCR3
CCR6
CD137
CD154
CD137
CD154
170 57
290
1730 253
846
44,4% 12,6%
21,4% 21,6%
unstimuliert Myelin
74,0% 80,2%
Frequenz Memory Chemokinrezeptoren
Treg
Treg
GK
MS
F
Tcon
FoxP3
CD25
88,1%
0,57%
GK MS
10
-6
10
-5
10
-4
10
-3
Zellzahl CD137
+
/
Zellzahl CD4
+
GK MS
0
20
40
60
80
100
CD45RO
+
Zellen
innerhalb CD137
+
(%)
0
20
40
60
80
100
Th1-
ähnlich
Th17-
ähnlich
Th1/
Th17-
ähnlich
Anteil innerhalb
CD137
+
/CD45RO
+
(%)
p=0,07
Ergebnisse
92
Des Weiteren wurde der Phänotyp und die Expression der Chemokinrezeptoren CXCR3,
CCR6 und CCR4 von Myelin-reaktiven Tregs bestimmt. Im Mittel konnten 63% der CD137
+
T-Zellen von MS-Patienten (Spannweite 17% - 86%) und 77% der CD137
+
T-Zellen von
Gesunden (Spannweite 41% - 95%) anhand der Expression von CD45RO als Memory-Zellen
definiert werden (Abb. 25E). Dabei war der Anteil an Memory Tregs bei Patienten
tendenziell vermindert (p = 0,07). Die Expression der Chemokinrezeptoren unterschied sich
zwischen beiden Gruppen nicht, allerdings ließ die geringe Spenderzahl keine
aussagekräftigen Vergleiche zu (Abb. 25F). Die häufigste Subpopulation waren
CCR6
+
/CCR4
+
Tregs (Th17-ähnlich), welche bis zu 69% der Myelin-spezifischen Tregs in
Gesunden (Mittelwert 48%) und bis zu 82% in MS-Patienten (Mittelwert 37%) ausmachte.
Diese ersten Daten veranschaulichen das Potential der Anreicherung von CD137
+
Zellen zur
direkten Detektion und funktionellen Charakterisierung seltener Autoantigen-spezifischer
Tregs im Rahmen verschiedener Autoimmunerkrankungen. Vorläufige Versuche mit
PBMCs von Myasthenie-Patienten konnten ebenfalls vielversprechende Ergebnisse liefern.
Diskussion
93
6 Diskussion
6.1 Die Anreicherung von CD154
+
T-Zellen ermöglicht eine
spezifische und detaillierte ex vivo Charakterisierung von
autoreaktiven CD4
+
T-Zellen
Bisherige Untersuchungen von seltenen autoreaktiven CD4
+
T-Zellen basierten auf der
Analyse vorexpandierter Zellen. Die polyklonale in vitro Expansion kann jedoch, wie in
dieser Arbeit eindrucksvoll demonstriert werden konnte, gerade bei heterogenen T-Zell-
Populationen zu einer deutlichen Verschiebung des Repertoires und somit zu verzerrten
Ergebnissen führen. Daneben sind anschließende indirekte Proliferations- oder
Zytokinmessungen anfällig für unspezifische Hintergrundsignale durch Bystander
Aktivierung. Durch das Fehlen einer Methode für die direkte ex vivo Identifizierung von
CD4
+
Autoantigen-spezifischen T-Zellen ist daher im Menschen nicht abschließend geklärt,
auf welche Weise ihre Toleranz gegenüber körpereigenem Gewebe und Organen reguliert
wird und unter welchen Umständen Autoimmunität entsteht.
Aufgrund ihrer Schlüsselrolle im Tiermodell der Multiplen Sklerose (MS) wird vermutet,
dass T-Zellen mit Spezifität für Myelin-Antigene auch in der Pathogenese von MS eine
entscheidende Rolle spielen. Bisherige Analysen führten jedoch, auch aufgrund der
Verwendung unterschiedlicher Antigene (Einzelpeptide/Proteine/Peptid Pools), vielfach zu
inkonsistenten Ergebnissen bezüglich ihrer (Vorläufer-)Frequenzen, ihres Phänotyps und
ihrer funktionellen Kapazität. So wurden gleiche oder leicht erhöhte Frequenzen sowie die
mögliche Relevanz unterschiedlicher (inflammatorischer) Subpopulationen im Vergleich zu
gesunden Kontrollen beschrieben. Spezifische Immuntherapien, welche selektiv gegen
Myelin-reaktive CD4
+
T-Zellen gerichtet waren, zeigten in klinischen Studien allerdings nur
begrenzte Wirksamkeit (zusammengefasst in [127]).
Diskussion
94
In dieser Arbeit konnte die Anreicherung von aktivierten CD154
+
T-Zellen (antigen-reactive
T cell enrichment - ARTE) erfolgreich für die spezifische ex vivo Detektion und ausführliche
Charakterisierung von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen mit Spezifität für MS-, Diabetes
mellitus Typ I (T1D)- und Myasthenia gravis (MG)-assoziierte Antigene sowohl in gesunden
Individuen als auch in Autoimmunpatienten angewendet werden. Auch weiterführende
Untersuchungen von phänotypischen oder funktionellen Subpopulationen waren durch die
Kombination mit multiparametrischer Durchflusszytometrie realisierbar. Diese Methode
wurde in unserer Arbeitsgruppe zuvor bereits für die umfassende Analyse von T-Zell-
Antworten gegen Allergene sowie virale, bakterielle, Pilz- und Impfantigene eingesetzt [151,
183-185]. Die Vermeidung eines in vitro Expansionsschrittes ist ein wesentlicher Vorteil im
Vergleich zu den bisherigen Standardmethoden. Zudem ist die Anreicherung von
aktivierten CD154
+
T-Zellen unabhängig vom MHC-Restriktionselement und der TCR-
Affinität. Die Stimulation mit Gesamtproteinen oder Peptid Pools ermöglicht einen
unvoreingenommenen Einblick in das komplette reaktive T-Zell-Repertoire.
Die im Folgenden detailliert besprochenen Ergebnisse dieser Arbeit können somit
maßgeblich zum Verständnis der physiologischen Eigenschaften von autoreaktiven T-Zellen
in gesunden Personen beitragen. Zudem konnte die Frequenz, der Differenzierungsstatus
und die Funktion von Myelin-reaktiven T-Zellen aus MS-Patienten und passenden
Kontrollpersonen erstmalig direkt ex vivo bestimmt werden, um die Hypothese bezüglich
ihrer potentiellen Schlüsselrolle bei MS zu überprüfen. Dies ist insbesondere im Hinblick auf
die (Weiter-)Entwicklung zielgerichteter Immuntherapien von zentraler Bedeutung.
Diskussion
95
6.2 Autoreaktive naive und Memory T-Zellen können in Gesunden
detektiert werden
Unter Anwendung des CD154
+
T-Zell-Anreicherungs-Assays konnten in dieser Arbeit
CD4
+
autoreaktive T-Zellen mit den untersuchten Spezifitäten für Myelin-Antigene (MOG,
MBP, PLP) sowie T1D- und Myasthenie-assoziierte Antigene (GAD65 und AChR) in jedem
getesteten gesunden Individuum nachgewiesen werden. Dabei war die Frequenz dieser
Zellen im peripheren Blut mit derer von Neoantigen-spezifischen T-Zellen vergleichbar.
Anschließende phänotypische Analysen haben gezeigt, dass im peripheren Blut von
gesunden Personen ein teils erheblicher Anteil an selbst-reaktiven Memory T-Zellen
vorzufinden ist. Interessanterweise zeigte sich auch für KLH-reaktive T-Zellen ein variabler
Anteil von T-Zellen mit Memory-Phänotyp. Darüber hinaus waren aktivierte selbst-reaktive
T-Zellen nach Stimulation in der Lage, inflammatorische Zytokine zu produzieren.
Das Vorkommen von selbst-reaktiven T-Zellen im normalen Repertoire von Gesunden
wurde vielfach beschrieben [40]. Verschiedene Arbeitsgruppen fanden unter Verwendung
von Tetrameren oder T-Zell-Bibliotheken zudem ein bestehendes Memory T-Zell-
Repertoire für unterschiedliche Selbst-Antigene sowie virale und Neoantigene in zuvor
nicht-exponierten Personen [186, 187]. Analysen des TCR-Vβ-Repertoires ergaben, dass
diese Zellen in einem Großteil der Probanden klonal expandiert waren, wobei zumeist ein
Klon dominierte. Die Daten von Su et al. bestätigten außerdem, dass sich die Frequenzen
und der Memory-Anteil von T-Zellen, welche Autoantigene oder neue Fremdantigene
erkennen, in Gesunden nicht unterscheiden [187]. Die von ihnen ermittelten Häufigkeiten
für T-Zellen spezifisch für Fibrinogen, Präproinsulin und gp100 lagen jedoch mit 1-10
spezifischen T-Zellen pro 10
6
CD4
+
Zellen etwa zehnfach unter den in dieser Arbeit
bestimmten Frequenzen für autoreaktive CD154
+
Zellen. Dies ist wahrscheinlich bedingt
durch die fehlende Detektion von niedrig-affinen T-Zellen durch MHC-II-Tetramere.
So führt die ex vivo Analyse von Autoantigen-spezifischen T-Zellen durch MHC-II-
Tetramere zumeist zu einer Unterschätzung der Frequenzen, wie auch Sabatino et al.
Diskussion
96
herausstellten [188]. Eine weitere Ursache könnte die Verwendung von Gesamtproteinen
(Peptid Pools) für die Detektion CD154
+
T-Zellen sein, wodurch das gesamte reaktive
Repertoire, und nicht nur wenige selektierte Spezifitäten, erfasst werden konnte.
Die Tatsache, dass autoreaktive T-Zellen ohne weiteres in jedem gesunden Menschen
nachzuweisen sind, unterstützt die vorherrschende Meinung, dass selbst-spezifische Zellen
nicht vollständig im Thymus deletiert werden [36, 177]. Diese Zellen müssen durch die
Mechanismen der peripheren Toleranz unter Kontrolle gehalten werden. In zwei
aufschlussreichen Studien von Legoux et al. und Malhotra et al. wurden diese kürzlich in
transgenen Mäusen, welche die Modell-Selbst-Antigene Cre-Rekombinase bzw. eGFP, eYFP
oder CFP unter der Kontrolle verschiedener gewebsspezifischer Promotoren oder dem
Ubiquitin-Promotor exprimierten, untersucht [189, 190]. Sie fanden heraus, dass ein
Großteil der T-Zellen mit Spezifität für ubiquitär-exprimierte Proteine durch Deletion im
Thymus eliminiert wird. Dies beruht wahrscheinlich auf der starken Expression dieser
Proteine durch eine Vielzahl von Thymusepithelzellen. Im Gegensatz dazu werden
bestimmte gewebsspezifische T-Zellen kaum bis gar nicht deletiert. Diese Zellen verhalten
sich bei fehlender thymischer Antigen-Expression in der Peripherie vorrangig ignorant.
Dagegen wird die Toleranz für Gewebe-Antigene, welche gering im Thymus exprimiert
werden, in erster Linie durch Antigen-spezifische regulatorische T-Zellen (Tregs)
aufrechterhalten. Dieser Toleranzmechanismus spielt eventuell auch für die in der
vorliegenden Arbeit untersuchten Autoantigene eine Rolle. Mit Hilfe der Anreicherung von
CD137
+
T-Zellen konnten Myelin-reaktive Tregs erstmalig direkt detektiert und
charakterisiert werden (siehe 6.8). Die Protein- bzw. mRNA-Expression der Myelin-
Antigene MOG, MBP und PLP sowie des AChR in humanen medullären
Thymusepithelzellen ist in der Literatur beschrieben worden [35, 191-193]. Unklarheit
besteht dagegen über die Expression von GAD65, welche in murinen aber nicht in humanen
Thymi nachgewiesen werden konnte [35, 192].
Diskussion
97
6.3 Keine Hinweise auf Autoantigen-induzierte Expansion von
Memory T-Zellen
Um Hinweise auf den Ursprung von Autoantigen-spezifischen Memory T-Zellen in
gesunden Personen zu erhalten, wurden Korrelationsanalysen durchgeführt, welche
offenbarten, dass der Memory T-Zell-Anteil innerhalb der jeweiligen autoreaktiven T-Zell-
Population mit dem Memory T-Zell-Anteil innerhalb der CD4
+
T-Zell- Gesamtpopulation
assoziiert ist. Das gleiche Bild ergab sich für das Neoantigen KLH und sogar für Myelin-
reaktive T-Zellen von MS-Patienten. Im Kontrast dazu zeigten Recall-Antigen-reaktive
T-Zellen eine ausgeprägte Memory-Antwort unabhängig vom Gesamt-Memory-Anteil.
Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass Memory T-Zellen für die getesteten Autoantigene
nicht nach Aktivierung durch eben diese entstehen und klonal expandieren, sondern aus
einem vorhandenen kreuzreaktiven Memory-Repertoire hervorgehen. Durch den Kontakt
mit unterschiedlichen Fremdantigenen und nachfolgender Aktivierung naiver T-Zellen
vergrößert sich dieses Repertoire kumulativ über die Lebenszeit, was sich in einem
zunehmenden Anteil an CD4
+
Memory T-Zellen und somit auch Autoantigen-spezifischen
Memory T-Zellen widerspiegelt.
Es wird angenommen, dass Kreuzreaktivität von TCRs ein relativ häufiges Phänomen
darstellt [93] und ein einzelner TCR über 10
6
unterschiedliche Peptide in Kombination mit
einem individuellen MHC-Molekül erkennen kann [194]. Die theoretische Anzahl an
möglichen Fremdpeptid-MHC-Komplexen überschreitet die tatsächliche Größe des realen
TCR-Repertoires bei weitem [194, 195]. Daneben kann auch die gleichzeitige Expression
von zwei TCRs mit unterschiedlichen α-Ketten durch eine fehlende allele Exklusion (= duale
TCRs) zu Kreuzreaktivität führen. Schätzungen zufolge können solche poly-spezifischen
T-Zellen bis zu 30% des T-Zell-Repertoires ausmachen [3]. Somit ist Kreuzreaktivität eine
wesentliche und physiologische Eigenschaft des Immunsystems um eine hocheffektive
Detektion und Kontrolle von Pathogenen zu gewährleisten und führt per se nicht zu
Autoimmunität. Autoreaktive Memory T-Zellen, welche durch Fremdantigene aktiviert
Diskussion
98
wurden, sind daher ein essentieller Bestandteil des normalen T-Zell-Repertoires. Erst ein
weiteres Ereignis wie eine vermehrte Präsentation von Selbst-Antigenen im
inflammatorischen Kontext kann die Entstehung von Autoimmunität begünstigen.
Alternativ könnte sich der Memory-Phänotyp durch Mechanismen der homöostatischen
Proliferation ausgebildet haben, welche bisher jedoch vorrangig im Tiermodell untersucht
worden sind. Die Aufrechterhaltung einer konstanten Anzahl an peripheren T-Zellen wird
durch extrem niedrig-affine Interaktionen mit Selbst-Peptid-MHC-Komplexen in
Verbindung mit den homöostatischen Zytokinen IL-7 und IL-15 reguliert [195, 196]. Dies
sichert auch das Überleben von ruhenden, naiven T-Zellen ohne gleichzeitig eine
Aktivierung und Differenzierung hervorzurufen. Stärkere Signale, welche beispielsweise im
Zusammenhang mit Lymphopenie auftreten, können hingegen zur Proliferation und zur
direkten Ausbildung des Memory-Phänotyps führen [195]. Insgesamt reagieren
CD8
+
T-Zellen und höher affine T-Zellen am sensitivsten auf homöostatische Signale [195].
Da in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, dass trotz eines stetig ansteigenden Anteils an
autoreaktiven Memory T-Zellen die Gesamtfrequenz der Autoantigen-spezifischen T-Zellen
nicht zunahm und die Memory-Zellen eine niedrige Avidität aufwiesen, kommt dieser
Mechanismus wahrscheinlich nicht als Haupt-Triebkraft für die Ausbildung des
autoreaktiven Memory-Repertoires in Frage.
6.4 Autoreaktive T-Zellen kreuzreagieren mit mikrobiellen Antigenen
Die initiale Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen durch Umweltantigene wird als eine von
mehreren Ursachen für verschiedene Autoimmunerkrankungen diskutiert. Diese Annahme
wird durch zahlreiche murine und humane Studien sowie epidemiologische
Untersuchungen unterstützt: So entwickelten Mäuse nach Infektion mit dem HSV-1 eine
autoimmune Augenerkrankung nach Aktivierung von kreuzreaktiven selbst-spezifischen
CD4
+
T-Zellen [197]. In Skandinavien kam es 2009 nach der saisonalen Grippeimpfung,
welche Bestandteile des Virusstamms H1N1 enthielt, zu einer erhöhten Prävalenz von
Diskussion
99
Narkolepsiefällen. Diese Erkrankung ist stark HLA-assoziiert und basiert auf einem Mangel
des Neuropeptids Hypocretin, welches den Schlafrhythmus reguliert. De la Hérran-Arita
et al. konnten daraufhin kreuzreaktive CD4
+
T-Zellen identifizieren, welche gleichzeitig
Hypocretin und ein homologes Virus-Epitop erkannten und zur Initiierung der Erkrankung
führen könnten [198]. Ebenso lässt die starke Assoziation von MS mit einer
symptomatischen EBV-Infektion und die nahezu 100%ige Seropositivität für EBV-
spezifische Antikörper in MS-Patienten auf einen infektiösen Hintergrund schließen [97].
Um zu untersuchen, inwieweit mikrobielle Antigene zuvor sortierte CD154
+
autoreaktive
T-Zellen aktivieren können, wurden in dieser Arbeit Myelin- und GAD65-reaktive T-Zell-
Linien (TZL) von gesunden Individuen mit sieben viralen, bakteriellen und Pilz-Antigenen
restimuliert. Alle getesteten Antigene führten in naiven und/oder Memory TZL mindestens
einmal zu einer kreuzreaktiven T-Zell-Antwort, allerdings reagierte keine von 15 TZL auf
Restimulation mit EBNA-1. Aus Memory-Zellen generierte autoreaktive TZL reagierten in
insgesamt 6,5% der Fälle und vorrangig auf virale Stimulation. Dagegen zeigten TZL mit
naivem Ursprung in 4,3% der Tests eine Reaktion. In einer größeren publizierten Studie mit
umgekehrtem Ansatz kreuzreagierten 3,4% von 444 EBNA-1-spezifischen TZL mit Myelin-
Antigenen [97]. Diese Unterschiede beruhen wahrscheinlich auch auf der geringeren
Probandenzahl in den hier gezeigten Untersuchungen.
Ursprünglich wurde angenommen, dass Peptide eine ausgeprägte Sequenzhomologie
aufweisen müssen um kreuzreaktive T-Zell-Antworten auszulösen. Verschiedene Studien
bezifferten das Ausmaß an Kreuzreaktivität in HIV-spezifischen CD4
+
und CD8
+
T-Zellen
auf Basis vorheriger Sequenzanalysen und der Selektion geeigneter Kandidaten-Peptide von
unterschiedlichen Bakterien, Algen und Pflanzen bzw. nach dem Austausch einzelner
Aminosäuren (sog. altered peptide ligands = APLs) auf 21-33% [187, 199]. Mittlerweile
wurde gezeigt, dass nur wenige TCR-Kontaktpositionen des Antigens relativ konserviert
gebunden werden und Substitutionen von Peptidresten außerhalb der TCR-Kontaktregion
Diskussion
100
bzw. im MHC-Kontaktbereich weitestgehend toleriert werden [200]. Jedoch wurde auch
eine Aktivierung durch gänzlich verschiedene Epitope beschrieben [201]. Die Tatsache, dass
in der hier durchgeführten Testreihe sechs von sieben mikrobiellen Antigenen, welche
zufällig und ohne vorherige Sequenzanalyse ausgewählt wurden, in gesunden Personen zu
einer Reaktivierung autoreaktiver T-Zellen geführt haben, unterstützt die Vermutung, dass
Auto- und Neoantigen-spezifische Memory T-Zellen ursprünglich durch Umweltantigene
oder Kommensalen aktiviert worden sein könnten. Gleichzeitig stellt dies die Bedeutung von
Kontrollmechanismen zur Aufrechterhaltung der Balance zwischen effektiver Bekämpfung
von Pathogenen, Toleranz von Kommensalen und der Vermeidung von Autoimmunität heraus.
Im Hinblick auf die intestinale Mikrobiota (Darmflora) geben einige Studien Hinweise
darauf, dass diese eine essentielle Rolle für die Entwicklung und den Verlauf von
Autoimmunerkrankungen spielt. Im Mausmodell ist eine normale Darmflora
Voraussetzung für die Entstehung der spontanen EAE, denn keimfrei aufgezogene TCR-
transgene Mäuse entwickeln keine Erkrankung [128]. Des Weiteren wurde gezeigt, dass der
Beginn der Erkrankung mit einer erhöhten Darmpermeabilität, verbunden mit
morphologischen Veränderungen und Inflammation, assoziiert ist [202]. Im humanen
System wurde erst kürzlich eine veränderte Zusammensetzung der Darmflora in MS- und
T1D-Patienten beschrieben [203, 204]. Interessanterweise konnten die Ergebnisse der
vorliegenden Arbeit Kreuzreaktivität zwischen einer GAD65-reaktiven TZL und dem
fakultativ pathogenen Darmbakterium E. coli aufzeigen. E. coli exprimiert ein ähnliches
Enzym (GadA/B), welches eine gewisse Sequenzhomologie aufweist [205]. In diesem
Kontext ist es wichtig herauszustellen, dass das Darm-Mikrobiom auch eine wichtige Rolle
im Zuge der Toleranzinduktion und Homöostase von CD4
+
T-Zellen spielt und
Veränderungen der Zusammensetzung sowohl zu positiven als auch negativen
Auswirkungen führen können [206]. Neben Antigen-spezifischen Mechanismen sind hierbei
aber vor allem mikrobielle Metabolite, welche Frequenzen und Funktion von autoreaktiven
T-Zellen beeinflussen können, relevant [207].
Diskussion
101
6.5 Gleiche Prävalenz von Myelin-reaktiven T-Zellen in Gesunden und
MS-Patienten
Für die ex vivo Detektion von Myelin-reaktiven T-Zellen in MS-Patienten und gesunden
Kontrollen wurden in dieser Arbeit PBMCs mit einer Kombination aus MOG, MBP und
PLP Peptid Pools stimuliert. Da longitudinale Analysen mit Patienten ergaben, dass sich die
T-Zell-Spezifitäten über die Zeit und mit neuen Schüben verändern können [135, 171],
wurde so ein breites Spektrum potentieller Myelin-Epitope, die im Verlauf der Erkrankung
eine Rolle spielen können, abgedeckt. Die Frequenz der Myelin-spezifischen CD4
+
T-Zellen
betrug in Gesunden 16-185 Zellen pro 10
6
CD4
+
Zellen und 13-213 pro 10
6
CD4
+
Zellen in
MS-Patienten und unterschied sich entgegen der Erwartung zwischen den Gruppen nicht.
Diese Beobachtung steht im Gegensatz zu einigen Studien, welche eine erhöhte Frequenz
von Myelin-reaktiven T-Zellen im peripheren Blut von MS-Patienten beschrieben haben
[136, 138, 208-210]. Daneben registrierten weitere Arbeitsgruppen jedoch keine
Veränderungen [133, 211-213]. Diese Unterschiede können durch die Verwendung sehr
heterogener Methoden wie Proliferationsmessungen, ELISPOT oder MHC-II-Tetramere
und zumeist expandierter Zellen erklärt werden. Durch die bereits erörterten Nachteile einer
vorangestellten Expansion in Verbindung mit unspezifischen Proliferations- oder
Zytokinmessungen ist so eine exakte Frequenzbestimmung nicht möglich. Darüber hinaus
kann die Art und die Konzentration des Antigens sowie die Inkubationszeit mit dem
Antigen die Frequenz stark beeinflussen. In vielen Querschnittsstudien wurden
ausschließlich vordefinierte Peptide verwendet, welche in Tiermodellen als immundominant
identifiziert wurden (siehe z.B. [131, 140]). Da sich die T-Zell-Reaktivität für einzelne
Epitope innerhalb eines Proteins interindividuell stark unterscheidet, wie Daten von Pender
et al. und Pelfrey et al. für verschiedene PLP-Peptide belegen [136, 138], kann dieser Ansatz
nur einen begrenzten Ausschnitt der Gesamtantwort abbilden. Weiterhin selektiert die
Stimulation mit hohen Proteinkonzentrationen eine erhöhte Anzahl an reaktiven Zellen mit
unterschiedlichen Spezifitäten im Vergleich zur Stimulation mit niedrigen Antigendosen
[214].
Diskussion
102
In verschiedenen Studien wurde das Vorkommen von MBP- oder PLP-spezifischen Zellen
(Gesamtproteine) im peripheren Blut von MS-Patienten und Kontrollen mittels
limitierender Verdünnung und nachfolgendem Proliferationsassay durchschnittlich mit
0,7-6 Zellen pro 10
6
PBMCs angegeben [132-134, 136, 211]. Dabei konnten nur Chou et al.
eine signifikant erhöhte Frequenz im Vergleich zur Kontrollgruppe detektieren [132]. Die
hier gezeigten Daten für MBP-spezifische T-Zellen sind zwar mit diesen Frequenzen
vergleichbar, eine hohe Spezifität und Effektivität dieser Methode ist jedoch zweifelhaft:
Da auf der einen Seite nicht-proliferierende Zellen unentdeckt bleiben, führt andererseits
Antigen-unabhängige Bystander-Aktiverung zur Proliferation von unspezifischen Zellen.
Noch drastischer wird dies in Bezug auf die Analyse der Zytokinproduktion mittels
ELISPOT. Die Frequenzen von IFN-γ-produzierenden Zellen nach Stimulation mit MBP
[212] oder einzelnen MBP-Peptiden [131] lagen mit 41 Zellen bzw. 104-225 Zellen pro
10
6
PBMCs deutlich über dem hier beschriebenen Bereich (im Mittel 12,2% IFN-γ-
Produzenten innerhalb von 54 MBP-spezifischen Zellen pro 10
7
CD4
+
Zellen).
Insgesamt offenbaren die hier gezeigten Ergebnisse, dass allein das Vorhandensein von
Myelin-reaktiven T-Zellen keine pathologische Relevanz besitzt. Sollten Myelin-spezifische
T-Zellen dennoch maßgeblich an der Pathogenese von MS beteiligt sein, so ist von
funktionellen Veränderungen innerhalb dieser Population und/oder lückenhaften
Kontrollmechanismen auszugehen. Im Folgenden soll auf die funktionelle Charakterisierung
dieser Zellen in MS-Patienten eingegangen werden.
6.6 Myelin-spezifische T-Zellen von MS-Patienten und Gesunden
zeigen nur geringe funktionelle Unterschiede
INF-γ- bzw. IL-17-produzierende Th1-Zellen und Th17-Zellen spielen in der Pathogenese
von EAE eine wichtige Rolle. Für die Induktion der ZNS-Entzündung sind im Mausmodell
jedoch GM-CSF-produzierende T-Helferzellen essentiell [21, 22]. Auch bei MS sind
inflammatorische T-Zell-Infiltrate im ZNS charakteristisch für die Erkrankung [215]. In der
Diskussion
103
vorliegenden Arbeit wurde daher untersucht, inwieweit sich die Zytokinexpressions-Muster
von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in MS-Patienten und gesunden Kontrollen
unterscheiden. Im Hinblick auf die Gesamtexpression der Zytokine TNF-α, IFN-γ, IL-17
und GM-CSF konnten nach ex vivo Analyse überraschenderweise keine Unterschiede
zwischen beiden Gruppen gefunden werden. Dies steht im Widerspruch zu früheren
Studien, welche unter Verwendung unspezifischer Methoden wie der Analyse von
Autoantigen-induzierter Zytokinproduktion mittels ELISPOT oder durch kombinierte
Zytokin-/Proliferationsmessungen eine gesteigerte Produktion von IL-17 oder eine erhöhte
Frequenz an IFN-γ-Produzenten nach Stimulation mit MOG-, MBP- oder PLP-Antigenen
beschrieben haben [131, 138, 210, 216]. Diese Methoden sind jedoch, wie oben beschrieben,
besonders anfällig für Antigen-unabhängige Bystander-Aktivierung und daher nur bedingt
geeignet für eine spezifische Zytokinquantifizierung. Zudem wurden dabei totale PBMCs
stimuliert, sodass die Unterschiede in der Zytokinproduktion durch weitere Immunzellen
wie NKT- oder CD8
+
T-Zellen verursacht worden sein könnten.
T-Helfer-Zell-Subpopulationen unterliegen einer gewissen funktionellen Plastizität. Die aus
Th17-Zellen hervorgehenden Th1/Th17-Zellen sind so z.B. in der Lage IFN-γ, IL-17 und
GM-CSF gemeinsam zu produzieren [8]. Solche polyfunktionellen Zellen sollen mit
verschiedenen Autoimmunerkrankungen assoziiert sein [12, 217]. In einer aktuellen Studie
untersuchten Cao et al. in MS-Patienten die Expression der Zytokine IFN-γ, IL-17, GM-CSF
und IL-10 unter Anwendung der Library-Methode (siehe 1.7). Die Analyse zeigte, dass
Myelin-reaktive Einzelzell-Klone aus dem CCR6
+
-Repertoire (assoziiert mit dem Th17-
Phänotyp) im Vergleich zur gesunden Kontrollgruppe für IL-17/GM-CSF-
Doppelproduzenten sowie für GM-CSF- und IFN-γ-Einzelproduzenten angereichert waren
[137]. Im totalen Myelin-spezifischen Memory-Repertoire konnten diese Unterschiede in
den hier beschriebenen Analysen nicht nachgewiesen werden, jedoch gab es eine Tendenz
zur erhöhten IFN-γ-Produktion bzw. eine signifikant erhöhte Produktion in Kombination
mit TNF-α. Trotz der Unterschiede machten diese Zytokinproduzenten allerdings nur einen
Diskussion
104
äußerst geringen Anteil an der Gesamtpopulation aus. Eine gesteigerte Polyfunktionalität in
MS-Patienten konnte zudem nicht nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten für
jegliche Kombinationen mit dem Zytokin GM-CSF keine Expressionsunterschiede
identifiziert werden, was eine pathogene Rolle dieses Zytokins zumindest auf Myelin-
spezifischer Ebene ausschloss. Interessanterweise produzierte in beiden Gruppen rund ein
Drittel der Myelin-reaktiven Zellen überhaupt keine Zytokine. Die in dieser Arbeit
durchgeführten Zytokinanalysen beschränkten sich jedoch auf die Memory-Population als
Ganzes, sodass eventuelle Abweichungen innerhalb von Subpopulationen wie beispielsweise
Th1/Th17-Zellen, die im peripheren Blut von MS-Patienten angereichert waren, eventuell
undetektiert blieben. Nichtsdestotrotz sind die funktionellen Unterschiede zwischen Myelin-
reaktiven T-Zellen aus dem peripheren Blut von MS-Patienten und gesunden Individuen
wenig ausgeprägt und können die inflammatorischen Vorgänge im Gehirn nicht erklären.
Bei Betrachtung der CD4
+
Gesamt-T-Zell-Population gibt es dagegen Hinweise darauf, dass
bereits auf polyklonaler Ebene eine Dysregulierung der Zytokinexpression in MS-Patienten
vorliegt. Paroni et al. stellten in Patienten mit schwerem Erkrankungsverlauf nach
polyklonaler T-Zell-Stimulation eine erhöhte Expression von IFN-γ, IL-17 und GM-CSF fest
[218]. Ähnliche Veränderungen wie ein erhöhter Anteil an GM-CSF- und IFN-γ-
Produzenten bzw. GM-CSF/IFN-γ-Koproduzenten innerhalb der CD4
+
T-Zellen im
peripheren Blut oder in der Zerebrospinalflüssigkeit von Patienten wurden durch weitere
Arbeitsgruppen beschrieben [16, 219]. In dieser Arbeit wurde die Zytokinproduktion nur
auf Autoantigen-spezifischer T-Zell-Ebene untersucht, allerdings ließen weitere Versuche
vermuten, dass Unterschiede im Myelin-reaktiven T-Zell-Repertoire auch in der Gesamt-
T-Zell-Population widergespiegelt werden, was gegen eine Autoantigen-induzierte
Modulation spricht (siehe 6.9).
Diskussion
105
6.7 Myelin-reaktive T-Zellen zeigen eine geringe Antigensensitivität
Es ist bekannt, dass die Mechanismen der funktionellen Aviditätsreifung nach initialem und
konsekutivem Fremdantigenkontakt durch eine gesteigerte Antigensensitivität zu einer
schnelleren und effektiveren T-Zell-Antwort führen [166]. Im Zuge der primären
Immunantwort geht dieser Prozess jedoch nicht mit einer Selektion von hoch-affinen
T-Zell-Klonen einher, sondern basiert vorrangig auf einer optimierten Signaltransduktion
und der Dominanz von niedrig-affinen CD4
+
und CD8
+
T-Zellen [188, 220-222]. Es wird
vermutet, dass hoch-affine T-Zell-Klone im weiteren Verlauf der Immunantwort einen
Proliferationsvorteil haben [223-225]. Jedoch wurde auch kürzlich beschrieben, dass das
Überleben und die Proliferationskapazität affinitätsunabhängig sind [220]. Die hier
vorgestellten und im Folgenden diskutierten Untersuchungen zur funktionellen Avidität von
Antigen-spezifischen Memory-T-Zellen lassen somit nur begrenzte Rückschlüsse auf die
TCR-Affinität zu.
Die Analyse von MP65-spezifischen und autoreaktiven CD4
+
T-Zellen aus dem naiven
Repertoire gesunder Individuen ergab keine Unterschiede in der funktionellen Avidität.
Demgegenüber stieg diese für das Recall-Antigen MP65 erwartungsgemäß vom naiven zum
Memory-Repertoire deutlich an, wobei einzelne Memory-T-Zell-Klone auf Antigen-
Konzentrationen bis in den pM-Bereich reagierten. Autoreaktive Memory T-Zellen zeigten
dagegen keine Veränderungen und wiesen die gleiche niedrige bis mittlere
Antigensensitivität wie das entsprechende naive Repertoire auf. Diese Beobachtung deckt
sich mit den Erkenntnissen aus verschiedenen murinen Studien zur Avidität von
autoreaktiven T-Zellen in der Peripherie [37, 177, 178, 226]. Danach entkommen niedrig-
avide T-Zellen der negativen Selektion im Thymus und werden durch periphere
Toleranzmechanismen unter Kontrolle gehalten [36, 190, 227]. Gebe et al. immunisierten
HLA-transgene Mäuse mit humanem Selbst-Antigen oder einem Fremdantigen und
erkannten, dass autoreaktive CD4
+
T-Zellen im Gegensatz zu fremd-reaktiven T-Zellen
nicht in der Lage waren, Tetramere zu binden oder zu proliferieren [178].
Diskussion
106
Man vermutet, dass es nun im Rahmen von Infektionen zu einem Bruch der Toleranz und
zur Initiation von Autoimmunerkrankungen wie MS kommt. Im murinen Modell wurde
demonstriert, dass niedrig-avide autoreaktive CD8
+
T-Zellen durch Selbst-Peptide im
infektiösen Kontext oder durch APLs aktiviert werden können [36, 37, 228]. Als mögliche
auslösende Faktoren werden dabei eine verstärkte Antigendichte und -präsentation,
wiederholte Stimulation und Inflammation genannt [36, 37]. Es ist jedoch noch unklar,
welche Mechanismen schließlich zur Entwicklung von Autoimmunität beitragen. So
könnten diese voraktivierten Zellen anschließend hochsensitiv auf kleinste Mengen an
Selbst-Antigen reagieren und Autoimmunität verursachen [194]. Überraschenderweise
zeigten aus dem Memory-Repertoire generierte MOG-reaktive T-Zell-Klone (TZK
M
) von
MS-Patienten in den hier dargestellten Versuchen jedoch eine äußerst geringe funktionelle
Avidität und benötigten zur Aktivierung vergleichsweise hohe Antigendosen. Sollten diese
Zellen aus einer kreuzreaktiven T-Zell-Antwort hervorgegangen sein, wie die weiteren
Versuche vermuten ließen (siehe 6.3), spricht dies eher für einen strikten Erhalt der Selbst-
Toleranz und gegen eine pathogene Relevanz. Tatsächlich kann sich die Antigensensitivität
und die Stärke der Antwort eines einzelnen TZK für unterschiedliche Peptidvarianten
deutlich unterscheiden [194, 196, 229], sodass effektive T-Zell-Antworten gegen Pathogene
bei gleichzeitiger Vermeidung von Autoimmunität gewährleistet sind. Diese Tatsache wird
auch durch zwei aktuelle Studien anhand der Charakterisierung von Diabetes- und MS-
assoziierten CD4
+
und CD8
+
T-Zell-Klonen, welche pathogen-assoziierte Peptide mit
deutlich höherer Affinität bzw. Avidität als das spezifische Autoantigen binden konnten,
verdeutlicht [229, 230].
Die Arbeitsgruppe um Roland Martin bestimmte die funktionelle Avidität von Myelin-
reaktiven TZL und TZK in MS-Patienten und Gesunden nach spezifischer Expansion und
Restimulation anhand von Proliferationsmessungen. Mazzanti et al. konnten dabei
vorrangig Zellen mit niedriger Avidität in beiden Gruppen detektieren [214]. Muraro et al.
untersuchten CD45RA
+
und CD45RO
+
T-Zellen von MS-Patienten getrennt voneinander
Diskussion
107
und ermittelten eine höhere funktionelle Avidität im naiven Repertoire im Vergleich zum
Memory-Repertoire [231]. Dies deckt sich mit den in dieser Arbeit gemachten
Beobachtungen. Im Kontrast dazu fanden Bielekova et al. nach Primärstimulation mit sehr
niedriger Antigenkonzentration (1 µM) TZL mit höherer funktioneller Avidität in MS-
Patienten [140]. Sie hatten erkannt, dass die Stimulation mit zu hohen Antigenmengen
in vitro zu einer Expansion von T-Zellen mit vorrangig niedriger Avidität führt. Obwohl in
der vorliegenden Arbeit eine noch geringere Antigenmenge eingesetzt wurde (0,6 µM),
konnten mit Bezug zum Kontrollantigen keine hoch-aviden TZK im Vergleich zu TZK aus
gesunden Individuen detektiert werden. Diese Unterschiede könnten methodisch bedingt
sein, da die hier durchgeführte Analyse von TZK im Vergleich zur Analyse von polyklonalen
TZL eine deutlich sensitivere Bestimmung auf monoklonaler Ebene zulässt.
Es kann nicht komplett ausgeschlossen werden, dass die Frequenz von Myelin-reaktiven
T-Zellen mit hoher Antigensensitivität im peripheren Blut der Probanden so gering war,
dass die Menge der generierten Klone zur Detektion nicht ausreichte oder dass sie zum Ort
der Entzündung, d.h. ins Gehirn, migriert sein könnten. Für MBP-reaktive T-Zellen wurde
im EAE-Modell jedoch demonstriert, dass sich die funktionelle Avidität dieser Zellen im
Blut und im Gehirn während der akuten und chronischen Krankheitsphase nicht unter-
scheidet und dass hochaffine T-Zellen nicht selektiv im Gehirn angereichert werden [232].
6.8 Myelin-reaktive regulatorische T-Zellen lassen sich mit Hilfe des
Aktivierungsmarkers CD137 detektieren und charakterisieren
Ein wichtiges Ziel in der Entwicklung von Immuntherapien ist die Erzeugung einer
spezifischen Immuntoleranz durch selektive Inhibition pathogener T-Zellen ohne
physiologische Reaktionen zu beeinflussen [43]. Dies könnte u.a. durch den Einsatz von
Antigen-spezifischen Tregs erreicht werden, welche in der Lage sind, dauerhafte Toleranz zu
induzieren [233]. Insbesondere im Hinblick auf Autoimmunerkrankungen wie Myasthenie
oder Neuromyelitis Optica, bei welchen die krankheitsassoziierten Antigene eindeutig
Diskussion
108
identifiziert sind, wäre ein Verständnis des Zusammenspiels von zellvermittelter spezifischer
Toleranz und Autoreaktivität für die Entwicklung von zielgerichteten immunmodulierenden
Therapien von großem Nutzen. Auch wenn die hier vorliegenden Daten keine deutlichen
Hinweise auf eine pathogene Rolle von Myelin-reaktiven T-Zellen bei MS erbracht haben,
kann die realisierte ex vivo Charakterisierung von Myelin-spezifischen CD137
+
Tregs als
wichtiger Schritt in diesem Prozess gewertet werden. Aufgrund der geringen Probandenzahl
waren jedoch noch keine aussagekräftigen Vergleiche zwischen MS-Patienten und gesunden
Kontrollen möglich. Unter Anwendung des CD137
+
Anreicherungs-Assays konnte unsere
Arbeitsgruppe erst kürzlich Tregs mit Spezifität für Pathogene und Allergene wie z. B. Pollen
nachweisen [183]. Auch für die Regulierung von Autoimmunität scheinen Tregs mit der
gleichen Spezifität für Gewebe-Antigene wie konventionelle T-Zellen (Tcons) eine
herausragende Rolle zu spielen [189].
Durch das Fehlen geeigneter Methoden zur direkten Analyse humaner Autoantigen-
spezifischer Tregs, konzentrierten sich zahlreiche Untersuchungen bisher vorrangig auf die
vergleichende Analyse der totalen Tregs in Patienten mit schubförmig-remittierender MS
(RRMS) und gesunden Personen. Dabei wurden im peripheren Blut von Patienten normale
Frequenzen von CD4
+
CD25
++
T-Zellen beschrieben, welche allerdings weniger FoxP3
exprimierten und schlechter supprimierten [120, 121, 234]. Nach Ausschluss von CD127
+
T-Zellen, welche sich vorrangig aus aktivierten Tcons zusammensetzen, konnten jedoch
keine Unterschiede zwischen den Gruppen bezüglich Frequenz und Suppressionsfähigkeit
mehr gefunden werden [235]. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zeigten ebenfalls eine
gleiche Prävalenz von Myelin-reaktiven Tregs in MS-Patienten und Kontrollen.
Interessanterweise waren diese Zellen jedoch mit ähnlicher Häufigkeit wie Myelin-
spezifische Tcons im peripheren Blut vorhanden, obwohl Tregs normalerweise weniger als
5% der gesamten CD4
+
T-Zellen ausmachen [236]. Ein Einfluss der Natalizumab-
Behandlung kann hier ausgeschlossen werden, da diese die Frequenzen und deren
suppressive Kapazität nicht verändert [237, 238]. Daraus ist zu schließen, dass Myelin-
Diskussion
109
reaktive Zellen im Treg-Repertoire angereichert und womöglich expandiert sind und dort
etwa 20 Mal häufiger als im Tcon-Repertoire vorkommen. Dies unterstreicht die Bedeutung
einer strengen Regulation von selbst-spezifischen Immunantworten und weist gleichzeitig
erneut darauf hin, dass in MS-Patienten höchstwahrscheinlich keine Myelin-induzierte
Expansion von konventionellen Memory T-Zellen stattgefunden hat. Erst kürzlich wurde
diesbezüglich mittels magnetischer Anreicherung von Tetramer
+
CD4
+
T-Zellen gezeigt,
dass Antigen-Exposition und nachfolgende klonale Expansion von Tcons das Verhältnis von
FoxP3
+
Tregs zu Tcons deutlich verringert [239].
Die tendenziell verminderte Expression von CD45RO und der damit erhöhte Anteil an
naiven Myelin-reaktiven Tregs in MS-Patienten steht im Kontrast zu mehreren Studien,
welche in der Treg-Gesamtpopulation einen erhöhten Anteil an CD45RO sowie weniger
CD31
+
und kürzlich aus dem Thymus emigrierte Zellen (recent thymic emigrants)
beschrieben haben [180, 181]. Naive Tregs exprimieren weniger FoxP3 und zeigen eine
geringere Suppression in in vitro Versuchen [179]. Weitere Untersuchungen könnten hier
ansetzen und die FoxP3-Expression sowie die spezifische suppressive Kapazität von Myelin-
reaktiven Tregs in einer größeren Studienkohorte überprüfen.
Anhand der Expression von Chemokinrezeptoren können Tregs in verschiedene
Subpopulationen unterteilt werden, welche Effektor T-Zellen phänotypisch ähneln und diese
durch Ko-Lokalisation spezifisch regulieren können [10]. In den hier beschriebenen
Experimenten zeigten Myelin-reaktive Tregs im Vergleich zu Tcons unterschiedliche
Chemokinrezeptor-Expressionsmuster. Auffällig war ein hoher Anteil an CCR6
+
/CCR4
+
Th17-ähnlichen Tregs sowohl in MS-Patienten als auch in Kontrollen, wohingegen diese
Subpopulation etwa dreimal seltener in den Tcons vertreten war. Dies ermöglicht ihre
Migration in Gewebe mit Th17-vermittelter Inflammation, wie im EAE-Modell
demonstriert werden konnte [240]. Einiges deutet darauf hin, dass die Spezifität von Tregs
die Expression von Chemokinrezeptoren und somit ihre Migration beeinflusst.
Diskussion
110
So exprimieren A. fumigatus-spezifische Tregs vorrangig CCR4, CCR5, CCR6 und CXCR6,
welche den Eintritt in die Lunge ermöglichen. A. fumigatus-reaktive Tcons zeigen hingegen
deutliche Unterschiede in der Chemokinrezeptorexpression [183].
Da in den Versuchen mit Peptid-Pools stimuliert wurde, sind einzelne Spezifitäten und die
klonale Zusammensetzung der Treg- und Tcon-Populationen unbekannt und könnten in
weiteren Versuchen z.B. mittels TCR-Sequenzierung untersucht werden. Im Modell der
MOG-induzierten EAE konnte nur eine geringfügige Überlappung des TCR Repertoires von
(polyklonalen) Tregs und Tcons beobachtet werden [241]. In MS-Patienten wurde
demgegenüber ein vermindertes Tregs TCR Repertoire beschrieben [181], was zu einer
Suppressions-„Lücke“ und der Entstehung der Erkrankung führen könnte.
In zukünftigen Versuchen sollte die Spezifität der autoreaktiven CD137
+
Tregs, wie auch
schon für die CD154
+
Tcons beschrieben (siehe 5.1.3.2), überprüft werden. Daneben eignet
sich die hier angewendete Methode für durchflusszytometrische Zytokin- und
Aviditätsbestimmungen, welche hilfreiche Rückschlüsse auf die Funktion autoreaktiver
Tregs geben könnten. Im Tiermodell wurde demonstriert, dass FoxP3
+
Tregs durchaus
funktionelle Plastizität zeigen und unter bestimmten Umständen und abhängig von der
Mikroumgebung inflammatorische Zytokine wie IL-17 und IFN-γ produzieren können
[242-244]. Ein höherer Anteil an CXCR3
+
IFN-γ-produzierenden Tregs mit verminderter
suppressiver Kapazität wurde in unbehandelten RRMS-Patienten beschrieben [244].
Darüber hinaus scheint die funktionelle Avidität von spezifischen Tregs eine große
Bedeutung für ihren protektiven Effekt zu haben, wie im MOG-induzierten EAE-Modell
herausgestellt wurde [245].
Diskussion
111
6.9 Generelle statt Myelin-spezifische Verschiebung des
Differenzierungs- und Funktionsstatus von CD4
+
T-Zellen
Die in dieser Arbeit beschriebenen phänotypischen Analysen haben gezeigt, dass MS-
Patienten im Vergleich zu gesunden Kontrollen gleichen Alters und Geschlechts einen
erhöhten Anteil an totalen CD4
+
Memory T-Zellen aufwiesen. Dieser Differenzierungsstatus
bestimmt zusammen mit der Telomer-Länge und der Thymus-Aktivität, welche durch die
Quantifizierung von T-cell receptor excision circles (TRECs) ermittelt werden kann, das
immunologische Alter [246]. Bei RRMS-Patienten scheint ein verfrühter
Zellalterungsprozess stattzufinden, wie verschiedene Arbeitsgruppen ebenfalls belegen
konnten: Bereits in jungen Betroffenen konnte eine Memory-T-Zell-Frequenz beobachtet
werden, welche nicht dem chronologischen Alter entsprach [247]. Auch die Anzahl an
TRECs ist in MS Betroffenen vermindert, was auf eine vorzeitige Thymusinvolution und
eine veränderte T-Zell-Homöostase hindeutet [248, 249]. Als Ursachen für diese
beschleunigte immunologische Alterung werden chronische Antigenstimulation durch
bestimmte Viren oder eine durch Lymphopenie verursachte übermäßige kompensatorische
homöostatische Proliferation diskutiert [250]. Da das Risiko für die Entwicklung einer
Autoimmunerkrankung, wie z.B. Rheumatoide Arthritis, normalerweise mit zunehmenden
Alter ansteigt [250], könnten diese Veränderungen ein Grund dafür sein, dass sich MS oft
schon im Alter von 20-40 Jahren manifestiert.
Ein erhöhter Anteil an Memory-Zellen zeigte sich in MS-Patienten außerdem im Myelin-
reaktiven Repertoire, wobei dieser, genau wie bei Gesunden, mit dem Gesamt-
Differenzierungsstatus assoziiert war und daher auf keine Myelin-induzierte klonale
Expansion hinwies. Dieser Zusammenhang könnte auch die Ursache dafür sein, dass
manche Arbeitsgruppen Myelin-reaktive T-Zellen vorrangig im Memory-Repertoire von
MS-Patienten vorfanden [251], während andere wiederum eine Dominanz des naiven
Repertoires beschrieben haben [231].
Diskussion
112
Dass die Behandlung mit Natalizumab einen Einfluss auf den Phänotyp der CD4
+
T-Zellen
hatte, ist unwahrscheinlich, kann jedoch nicht gänzlich ausgeschlossen werden. Jilek et al.
berichteten von einem erhöhten Anteil an zentralen Memory T-Zellen 12 Monate nach
Behandlungsbeginn ohne Veränderung der Effektor-Memory-Population [252], wohingegen
Bornsen et al. eine Erhöhung der absoluten Anzahl an Effektor-Memory-Zellen im
Vergleich zu unbehandelten RRMS-Patienten feststellten [253]. In einer aktuellen
Veröffentlichung konnten jedoch keine Anhaltspunkte für eine Verschiebung der CD4
+
Subpopulationen gefunden werden [254]. Auch unsere eigenen Korrelationsanalysen zeigten
keinen Zusammenhang der Behandlungsdauer mit der Ausprägung des CD45RO
+
-
Phänotyps auf.
Neben einem veränderten Differenzierungsstatus konnte bei MS-Patienten innerhalb der
CD4
+
Memory-Zellen ein deutlich erhöhter Anteil an Th1/Th17-Zellen (CXCR3
+
/CCR6
+
)
gefunden werden, welcher sich ebenfalls in der Myelin-spezifischen Fraktion widerspiegelte.
Zusätzlich war das Verhältnis von CXC3
+
- zu CCR4
+
-Zellen erhöht. Einige Arbeitsgruppen
konnten ähnliche Beobachtungen machen: Ein erhöhter Anteil an CXCR3
+
T-Zellen bzw.
eine Dominanz von Th1- (CXCR3
+
) über Th2-Zellen (CCR4
+
) wurde im peripheren Blut
von unbehandelten oder mit IFN-β behandelten MS-Patienten in der aktiven
Krankheitsphase beobachtet [255, 256]. Daneben scheinen Th1/Th17-Zellen, welche
gleichzeitig IFN-γ und IL-17 produzieren können, in Gehirnläsionen von MS-Patienten
angereichert zu sein [257]. In der Initialphase von EAE ermöglicht der von diesen Zellen
exprimierte Chemokinrezeptor CCR6 den Eintritt von pathogenen Zellen in das ZNS, mit
nachfolgender Rekrutierung weiterer inflammatorischer Zellen wie Monozyten und
neutrophiler Granulozyten [129]. Der Ligand von CCR6, CCL20, wird konstitutiv auf
Epithelzellen des Plexus choroideus von MS-Patienten exprimiert, was auch im humanen
System zur Einwanderung von Th1/Th17-Zellen führen könnte [258]. Weiterhin wurde
gerade gezeigt, dass Th1/Th17 zentrale Memory-Zellen in Patienten mit schwerer
Diskussion
113
Erkrankung systemisch expandiert sind, wobei eine Behandlung mit Natalizumab diesen
Effekt verstärkte [218].
Interessanterweise ist das Th1/Th17-Repertoire für Zellen angereichert, welche vorrangig
Mukosa-assoziierte Bakterien erkennen und in der Lage sind, in das Darmgewebe zu
migrieren, wie Duhen et al. herausfanden [12]. Somit könnte in MS-Patienten, z.B. durch
Veränderungen der Intestinalflora wie in Abschnitt 5.4. beschrieben, eine verstärkte
Th1/Th17-Zell-Differenzierung im Darm stattgefunden haben, von denen ein Teil auf
Myelin-Antigene kreuzreagiert. Dies würde das ähnliche Chemokinrezeptor-
Expressionsmuster in der Autoantigen-spezifischen Fraktion erklären.
Th1/Th17 Zellen produzieren darüber hinaus größere Mengen des Zytokins GM-CSF ([12]
und Erkenntnisse unserer Arbeitsgruppe), welches entscheidend zu ihrer Pathogenität
beiträgt [21, 22]. Nach neuesten Erkenntnissen aus einem transgenen Mausmodell führt eine
dysregulierte Expression von GM-CSF durch periphere CD4
+
T-Zellen antigenunabhängig
zu einer Einwanderung myeloider Zellen in das ZNS. Die Aktivierung myeloider Zellen ruft
schließlich spontane, gewebsspezifische Entzündungen im ZNS und neurologische Verände-
rungen hervor [50]. Diese Beobachtungen unterstützen die Vermutung, dass Myelin-
reaktive T-Zellen keine Schlüsselrolle in der Pathogenese von MS spielen und eher weiter
gefasste Immundysfunktionen vorliegen könnten. Im Krankheitsverlauf ist auch das Zusam-
menspiel von T-Zellen und weiteren Immunzellen von wichtiger Bedeutung, was auch durch
die hohe Wirksamkeit des kurz vor der Zulassung stehenden monoklonalen Antikörpers
Ocrelizumab bezüglich der Schubrate, der Progression der körperlichen Einschränkung und
MRT-Aktivität belegt wird [259]. Dieser Antikörper depletiert CD20
+
B-Zellen, welche
durch ihre Fähigkeit zur Antigen-Präsentation sowie durch die Expression von
inflammatorischen Zytokinen direkt und indirekt mit T-Zellen interagieren können [259].
Diskussion
114
6.10 Limitationen, Schlussfolgerung und Ausblick
In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass Myelin-spezifische T-Zellen im peripheren Blut von
MS-Patienten mit der gleichen Häufigkeit wie in Kontrollpersonen vorzufinden waren. Die
Zytokinprofile dieser autoreaktiven T-Zellen ähnelten sich in beiden Gruppen sehr, wobei
nur minimale funktionelle Unterschiede nachgewiesen werden konnten. Ein erhöhter Anteil
an Myelin-spezifischen Memory T-Zellen sowie CXCR3
+
/CCR6
+
Th1/Th17-Zellen spiegelte
sich auch in der CD4
+
Gesamt-T-Zell-Population wieder, was gegen eine Myelin-induzierte
Modulierung spricht. Diese Ergebnisse stellen die fundamentale Auffassung von MOG-,
MBP- und PLP-reaktiven T-Zellen als Auslöser und Triebkraft von MS in Frage und lenken
den Fokus mehr in Richtung einer globalen Dysregulation innerhalb der CD4
+
T-Zell-
Population, welche in Verbindung mit weiteren Faktoren wie Infektionen zur Initiierung
und Propagierung der Erkrankung führen kann. Diese Erkenntnis hat wichtige
Implikationen für die Erforschung der Grundlagen von MS, welche ausgehend vom EAE-
Modell jahrzehntelang auf die klassischen Myelin-Antigene fokussiert war. Dabei stellt sich
auch die Frage, inwieweit das EAE-Modell überhaupt die tatsächlichen Vorgänge bei MS
widerspiegeln kann. Auch wenn sich einzelne Parameter für die Erforschung grundlegender
Mechanismen der Einwanderung von Immunzellen in das ZNS, Inflammation und
Demyelinisierung eignen, so scheint der Erkrankungsverlauf im Menschen im EAE-Modell
unzureichend dargestellt zu werden.
In zukünftigen Versuchen ist es wichtig zu überprüfen, ob die beschriebenen Veränderun-
gen im CD4
+
T-Zell-Repertoire ebenfalls in unbehandelten Patienten in aktiver Krankheits-
phase oder Remission zu beobachten sind, um einen Einfluss der Natalizumab-Behandlung
definitiv auszuschließen. Zudem war es leider im Patientenkollektiv aufgrund der limitierten
Blutmenge nicht möglich, ein Kontrollantigen in den Analysen mitzuführen. In bisherigen
Studien anderer Arbeitsgruppen wurden zumeist Recall-Antigene wie Tetanus Toxoid,
C. albicans oder Influenza Hämagglutinin verwendet um die pathogenetische Relevanz einer
Diskussion
115
veränderten Myelin-spezifischen T-Zell-Antwort zu belegen (siehe z.B. [136, 137, 140]).
Unter Berücksichtigung der Ergebnisse dieser Arbeit, welche auf eine initiale Aktivierung
von autoreaktiven T-Zellen durch Fremdantigene hinwiesen, könnte in vielen Studien
jedoch lediglich das Abbild eines veränderten CD4
+
T-Zell-Gesamtrepertoires in Form von
kreuzreaktiven Myelin-spezifischen T-Zellen untersucht worden sein. Als Kontrolle muss
demnach zwangsläufig ein irrelevantes Autoantigen oder ein Neoantigen dienen. Zeigen sich
auch hier die gleichen funktionellen und phänotypischen Muster wie im Myelin-reaktiven
T-Zell-Repertoire, so weist dies auf Myelin-unabhängige Effekte hin.
Es ist nicht auszuschließen, dass pathogene T-Zellen andere als die untersuchten klassischen
Myelin-Antigene als Zielstruktur erkennen. Tatsächlich wurden neben weiteren Myelin-
bestandteilen wie dem Myelin-assoziierten Glykoprotein (MAG) oder der 2',3'-cyclic-
nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNPase) zusätzliche potenziell relevante Antigene wie das
Chlorid-Kanal-Protein Anoctamin 2 (ANO2), S-Arrestin oder Alpha-Crystallin beschrieben
[260, 261]. Zudem können proteomische Ansätze auf Basis von Hochdurchsatz-Screenings
für Antigenspezifitäten, welche gleichzeitig die physiologische Konformation und die
posttranslationale Modifikation von Antigenen berücksichtigen, die Chance erhöhen, neue
Zielantigene zu identifizieren [54].
Zu den weiteren Erkenntnissen dieser Arbeit zählte die Tatsache, dass autoreaktive Memory
T-Zellen mit unterschiedlichen Spezifitäten ein Bestandteil des normalen T-Zell-Repertoires
von gesunden Personen sind. Es wurden im Vergleich zum Recall-Antigen MP65 keine
Hinweise für eine klonale Expansion oder eine erhöhte funktionelle Avidität gefunden,
sodass die niedrige Sensitivität für Autoantigene nach ihrer Aktivierung durch ein mögliches
Fremdantigen erhalten blieb. Die gleichen Beobachtungen konnten für Myelin-spezifische
Memory T-Zellen von MS-Patienten gemacht werden. Um dies eindeutig zu belegen, sollte
die Diversität und Klonalität des TCR-Repertoires von autoreaktiven CD154
+
T-Zellen in
weiteren Analysen, beispielsweise durch TCR-Sequenzierung, untersucht werden. Dabei ist
Diskussion
116
eine ex vivo Analyse unabdingbar, welche jedoch durch die geringe Frequenz der Zellen
erschwert wird. Die Bestimmung der funktionellen Avidität von Memory TZK spezifisch für
weitere Selbst- und Neoantigene könnte zudem Hinweise darauf geben, ob die
Aviditätsreifung von ursprünglich Fremdantigen-aktivierten T-Zellen generell durch Selbst-
Antigen-Expression und -Erkennung limitiert ist, wie im transgenen Mausmodell für CD8
+
T-Zellen beschrieben wurde [262].
Vor dem Hintergrund der Ergebnisse lässt sich auch die mangelnde Wirksamkeit von
spezifischen Immuntherapeutika und -interventionen bei RRMS, wie die T-Zell-
Vakzinierung mit autologen Myelin-spezifischen Zellen oder die Injektion von APLs in
klinischen Phase-II- und III-Studien erklären, obwohl diese zuvor präklinisch in
Tiermodellen erfolgreich geprüft worden waren (zusammengefasst in [127]). Auf der
anderen Seite stellte sich jedoch auch die partielle Depletion von totalen CD4
+
T-Zellen in
einer Phase-II-Studie als wirkungslos heraus [119]. Hierbei könnte die geringe Dosierung
des verwendeten monoklonalen Antikörpers oder eine Dominanz anderer Immunzellen im
weiteren Verlauf der Erkrankung eine Rolle spielen. Es bleibt weiterhin abzuwarten,
inwiefern sich die Antikörper-vermittelte Blockierung von GM-CSF in aktuell laufenden
klinischen Studien als effektiv herausstellt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass
Th1/Th17-Zellen, welche eine deutliche Menge dieses Zytokins produzieren, in MS-
Patienten angereichert sind.
Obwohl die Analyse von Myelin-reaktiven CD137
+
Tregs nur in einer kleinen
Probandengruppe realisiert werden konnte, eröffnet diese Methode neue Möglichkeiten für
die Erforschung von Toleranzmechanismen auf Antigen-spezifischer Ebene. Die direkte
Untersuchung von autoreaktiven Tregs und ihr Vergleich mit Tcons kann, v.a. in
Verbindung mit Aviditätsbestimmungen und weiteren Technologien wie der TCR-
Sequenzierung, grundlegend zum Verständnis ihrer Funktion und Regulationsmechanismen
beitragen und neue Ansätze für immunmodulierende Therapieoptionen schaffen.
Diskussion
117
Es gilt zu überprüfen, inwiefern autoreaktive T-Zellen trotz ihrer geringen Antigen-
sensitivität in der Pathogenese von MS eine Rolle spielen könnten. So wäre es beispielsweise
vorstellbar, dass in der Peripherie aktivierte kreuzreaktive Memory T-Zellen durch die
erhöhte Expression von CCR6 vermehrt in das ZNS migrieren (siehe 6.9). Dort könnten
lokale Veränderungen im Gewebe, wie eine gesteigerte Präsentation von pMHC, erhöhte
Antigenkonzentrationen und/oder Inflammation, dazu führen, dass die hohe
Aktivierungsschwelle überschritten wird und dadurch Myelin-reaktive T-Zellen aus dem
physiologischen Repertoire zur Immunpathologie der Erkrankung beitragen. Der zukünftige
Fokus der Forschung sollte vor allem auf die Frage gerichtet sein, ob und wie generelle
Verschiebungen des Differenzierungs- und Funktionsstatus von CD4
+
T-Zellen im weiteren
Verlauf zu Organ-spezifischer Autoimmunität führen, um die Entwicklung neuer
zielgerichteter Therapien zu ermöglichen.
Literaturverzeichnis
118
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Abbildungsverzeichnis
141
8 Anhänge
I. Abbildungsverzeichnis
Abb. 1: Schematische Darstellung der Interaktion einer APC und einer CD4
+
T-Zelle. ...... 3
Abb. 2: Das Affinitätsmodell der T-Zell-Selektion im Thymus. ............................................ 10
Abb. 3: Schematischer Versuchsablauf zur direkten ex vivo Charakterisierung von
autoreaktiven T-Zellen. .................................................................................................. 35
Abb. 4: Gating-Strategie für die ex vivo Analyse von autoreaktiven CD154
+
T-Zellen. ..... 41
Abb. 5: Gating-Strategie für die Analyse der Originalfraktion. ............................................. 42
Abb. 6: Boolesche Gating-Strategie für die Analyse der Zytokinproduktion durch
CD154
+
T-Zellen. ............................................................................................................ 43
Abb. 7: Schematischer Versuchsablauf zur in vitro Generierung von autoreaktiven
T-Zell-Klonen und -Linien. ........................................................................................... 44
Abb. 8: Analysestrategie für die FACS-Sortierung von autoreaktiven T-Zellen. ................. 46
Abb. 9: Anreicherung von CD154
+
Autoantigen-spezifischen T-Zellen. ............................. 54
Abb. 10: Frequenzen von Autoantigen-spezifischen T-Zellen in gesunden Individuen. ..... 56
Abb. 11: Spezifität von Autoantigen-reaktiven T-Zell Klonen. ............................................... 59
Abb. 12: TCR-Repertoire von Myelin- und EBNA-1-spezifischen T-Zellen nach
in vitro Expansion. .......................................................................................................... 62
Abb. 13: Funktionelle und phänotypische Charakterisierung von Autoantigen-
spezifischen T-Zellen aus gesunden Individuen. ........................................................66
Abb. 14: Korrelation der Expression von CD45RO in autoreaktiven CD154
+
und
totalen CD4
+
T-Zellen. ................................................................................................... 68
Abb. 15: Funktionelle Avidität von Autoantigen-spezifischen naiven und Memory TZL. .. 70
Abb. 16: Kreuzreaktivität von Autoantigen-spezifischen TZL mit bakteriellen,
viralen und Pilz-Antigenen. .......................................................................................... 72
Abbildungsverzeichnis
142
Abb. 17: Frequenzen von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen in MS-Patienten und
Gesunden. ........................................................................................................................ 76
Abb. 18: Expression von CD45RO in Myelin-reaktiven und totalen CD4
+
T-Zellen
von MS-Patienten. .......................................................................................................... 78
Abb. 19: Zusammenhang von Frequenz und Phänotyp Myelin-reaktiver T-Zellen mit
klinischen Parametern. .................................................................................................. 79
Abb. 20: Expression von inflammatorischen Zytokinen durch Myelin-reaktive
T-Zellen in MS-Patienten. ............................................................................................. 81
Abb. 21: Untersuchung der Zytokinproduktion von Myelin-spezifischen T-Zellen
mittels Boolescher Methode. ......................................................................................... 82
Abb. 22: Gesamtexpression von Chemokinrezeptoren auf Myelin-spezifischen und
totalen CD4
+
Memory T-Zellen. ................................................................................... 85
Abb. 23: Charakterisierung von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zell-Subpopulationen
anhand der Chemokinrezeptor-Expression. ............................................................... 86
Abb. 24: Funktionelle Avidität von Myelin-reaktiven T-Zell-Klonen in MS-Patienten. ...... 88
Abb. 25: Ex vivo Charakterisierung von Myelin-reaktiven Tregs. ........................................... 91
Tabellenverzeichnis
143
II. Tabellenverzeichnis
Tab. 1: Charakteristika von CD4
+
T-Zell-Subpopulationen. ...................................................... 5
Tab. 2: Methoden zur Detektion von autoreaktiven CD4
+
T-Zellen. ...................................... 22
Tab. 3: Charakteristika der MS-Patienten................................................................................... 26
Tab. 4: Geräte .................................................................................................................................. 27
Tab. 5: Verbrauchsmaterial.......................................................................................................... 28
Tab. 6: Chemikalien, Medien und Zusätze ................................................................................. 29
Tab. 7: Zusammensetzung Puffer ................................................................................................ 30
Tab. 8: Zusammensetzung Medien .............................................................................................. 30
Tab. 9: Kits ...................................................................................................................................... 31
Tab. 10: Antikörper .......................................................................................................................... 31
Tab. 11: Antigene ............................................................................................................................. 33
Tab. 12: Software .............................................................................................................................. 34
Tab. 13: Antikörper-Panels für die ex vivo Analyse von CD154
+
und CD137
+
T-Zellen ....... 40
Tab. 14: Antikörper-Panels für die in vitro Expansion ............................................................... 45
Tab. 15: Proben-Charakteristika zur TCR-Hochdurchsatz-Sequenzierung. ........................... 61
Tab. 16: Kreuzreaktivität von Autoantigen-spezifischen TZL mit bakteriellen, viralen
und Pilz-Antigenen. ......................................................................................................................... 73
Tab. 17: Boolesche Analyse der Zytokinexpression von Myelin-reaktiven CD4
+
T-Zellen. ... 83
Abkürzungsverzeichnis
144
III. Abkürzungsverzeichnis
− negativ
+ positiv
Abb. Abbildung
APC Allophycocyanin
APC Antigenpräsentierende Zelle
APL Altered Peptide Ligand
CCL CC-Motiv-Ligand
CCR CC-Motiv-Chemokinrezeptor
CD Cluster of Differentiation
cTEC kortikale Thymus-Epithelzelle
CXCR CXC-Motiv-Chemokinrezeptor
Cy5.5 Cyanin 5.5
DRFZ Deutsches Rheumaforschungszentrum
EAE Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis
FACS Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung
Fc Fragment crystallisable
FcR Fc-Rezeptor
FITC Fluoresceinisothiocyanat
FSC Vorwärtsstreulicht
GATA3 GATA Binding Protein 3
gDNA genomische Desoxiribonukleinsäure
GK Gesunde Kontrolle
Abkürzungsverzeichnis
145
gy Gray
h Stunde
HLA Humanes Leukozytenantigen
i.e.S. im eigentlichen Sinne
IFN Interferon
IL Interleukin
J Jahr
kDa Kilodalton
LD Lebend-Tot-Farbstoff
M Monat
MACS Magnetische Zellsortierung
Med Median
MHC Major Histocompatibility Complex
min Minute
MS Multiple Sklerose
mTEC medulläre Thymus-Epithelzelle
PBMC Peripheral Blood Mononuclear Cells
PE Phycoerythrin
PerCP Peridinin-Chlorophyll-Protein-Komplex
pMHC Peptid-MHC
RORγ-t Retinoic Acid Receptor Related Orphan Receptor γ
RRMS schübförmig-remittierende MS
RT Raumtemperatur
Abkürzungsverzeichnis
146
SSC Seitwärtsstreulicht
T1D Diabetes mellitus Typ I
Tab. Tabelle
Tbet T-box expressed in T cells
Tcon konventionelle T-Zelle
TCR T-Zell-Rezeptor
TF Transkriptionsfaktor
Th1/2/17-Zellen T-Helfer-Zellen Typ 1/2/17
TNF Tumornekrosefaktor
Treg regulatorische T-Zelle
TZK
M
Memory T-Zell-Klon
TZK
N
naiver T-Zell-Klon
TZL
M
Memory T-Zell-Linie
TZL
N
naive T-Zell-Linie
v/v volume per volume
w /v weight per volume
ZNS zentrales Nervensystem
α Anti-
Danksagung
147
IV. Danksagung
Ich möchte an dieser Stelle allen Personen danken, die zum Gelingen dieser Arbeit
beigetragen haben und die mich in der Zeit ihrer Erstellung begleitet haben.
An erster Stelle bedanke ich mich bei Roland Lauster für seine Bereitschaft, diese Arbeit zu
betreuen und für seine freundliche Unterstützung im Rahmen des Promotionsverfahrens.
Alex Scheffold gilt mein herzlicher Dank für die Überlassung des hochinteressanten
Promotionsthemas, seine kontinuierlichen Anregungen und hilfreichen Diskussionen. Auch
für die mühevolle Arbeit des Korrekturlesens möchte ich mich bedanken.
Allen ehemaligen und derzeitigen Mitarbeitern der AG Scheffold möchte ich ganz besonders
für die außerordentlich gute Zusammenarbeit und Unterstützung danken. Insbesondere
bedanke ich mich bei: Thordis Hohnstein, Jonas Ahlers, Petra Bacher, Christian Neumann,
Frederik Heinrich, Anna Nowak und Franziska Hahn.
Meinen Kollegen der Rheumaforschungslabore der Charité und des DRFZ danke ich
vielmals für die freundliche Atmosphäre und große Hilfsbereitschaft. Dies gilt im
Besonderen für Timo Gaber und Jeannine Günther.
Ich danke Stefan Gold und meinen Kollegen Aline Tänzer, Helge Hasselmann und Sabrina
Golde für die zahlreichen konstruktiven Ratschläge und den motivierendem Zuspruch
während der intensiven Schreibphase meiner Promotion.
Mein herzlichster Dank gilt auch meinen fleißigen Korrekturlesern Helge, Aline und Timo.
Carolin Oelsner danke ich vielmals für ihre professionelle Hilfe bei der Illustrierung.
Ganz besonders danke ich meinen Eltern, die mich stets motiviert haben und helfend zur
Seite standen. Daneben möchte ich meinen Freunden für ihr Verständnis und ihre
motivierenden und aufbauenden Worte meinen herzlichsten Dank aussprechen.
Roman, dir gilt mein größter Dank dafür, dass du mich allzeit bedingungslos unterstützt!
Ohne dich hätte ich die anstrengende Phase der Promotion nicht gemeistert. Mein größter
Wunsch ist es, dass du gesund wirst und bleibst. Alles andere schaffen wir gemeinsam.
Eidestattliche Erklärung
148
V. Eidesstattliche Erklärung
Hiermit erkläre ich, Stefanie Gamradt, geboren am 05.11.1986 in Berlin, die vorliegende
Dissertation mit dem Titel: "Ex vivo Charakterisierung von humanen Autoantigen-
spezifischen CD4
+
T-Zellen mit Fokus auf Multiple Sklerose" selbstständig und ohne
unerlaubte Hilfe angefertigt zu haben und alle verwendeten Hilfsmittel und Inhalte aus
anderen Quellen als solche kenntlich gemacht zu haben. Des Weiteren versichere ich, dass
die vorliegende Arbeit nie in dieser oder anderer Form Gegenstand eines früheren
Promotionsverfahrens war.
Berlin, im Mai 2017
Lebenslauf
149
VI. Lebenslauf
Persönliche Angaben
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Schulische und universitäre Laufbahn
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Praktische Erfahrungen während des Studiums
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Berufliche Erfahrungen
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Lebenslauf
150
Preise/Auszeichnungen
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Weitere Tätigkeiten
NUR IN PRINTVERSION VERFÜGBAR
Berlin, im Mai 2017
Publikationsliste
151
VII. Publikationsliste
S. Gamradt, F. Hahn, B. Rosche, M. Assenmacher, S. Gold, P. Bacher, A. Scheffold. 2017. Ex
vivo characterization of autoreactive T cells provides no evidence for myelin-induced
alterations in the CD4
+
T cell population in multiple sclerosis (in Vorbereitung)
C. Ramien, E.C. Yusko, K. Patas, S. Gamradt, J.B. Engler, A. Willing, S.C. Rosenkranz, A.
Diemert, A. Fischer, M. Vignali, C. Sanders, H.S. Robins, C. Heesen, P.C. Arck, A. Scheffold,
K. Chan, R.O. Emerson, M.A. Friese, S.M. Gold. 2017. Pregnancy alters clonal composition
of the T cell repertoire in multiple sclerosis (eingereicht)
