Document [original]

Bestimmung von Chlortetracyclinrückständen

in biologischen Proben aus der landwirtschaftlichen

Tierhaltung mit HPLC-UV-MS/MS

- Methodenentwicklung und Anwendung in Medikationsstudien -

Der Fakultät für Naturwissenschaften

Department Chemie

der Universität Paderborn

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

genehmigte Dissertation

von Diplom-Chemikerin

Andrea Vockel

aus Detmold

Paderborn 2005

Die vorliegende Arbeit basiert auf Untersuchungen, die in der Zeit von Mai 2000 bis Januar

2004 unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. M. Grote, Universität Paderborn, Fakultät für Na-

turwissenschaften, Department Chemie (Anorganische und Analytische Chemie) überwiegend

am Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt, SVUA Detmold durchgeführt worden sind.

1. Referent: Prof. Dr. M. Grote

2. Referent: Prof. Dr. M. Weiß

Eingereicht am 23.05.2005

Tag der mündlichen Prüfung: 08.07.2005

Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit:

A. Vockel, H.-A. Wagener, W. Klemm, K. Röwer, A. Mehlich, M. Grote; Bestimmung von

Tetracyclinrückständen mit LC-MSMS in lebensmittelliefernden Schweinen; Lebensmittel-

chemie 55 (2001), 67-68

A. Vockel, K. Röwer, A. Mehlich, M. Grote; Bestimmung von Tetracyclinrückständen mit

LC-MSMS in lebensmittelliefernden Schweinen; 5 th International Symposium Extraction for

Sample Preparation - SFE - (X)SE - SPME, 5. – 7. Mai 2001; Siegen (Posterbeitrag)

A. Vockel, K. Röwer, A. Mehlich, M. Grote; Quantifizierung von Chlortetracyclin mit LC-

MSMS in biologischen Proben von lebensmittelliefernden Schweinen; DVG-LChG-

Symposium, "Lebensmittel - Mittel zum Leben", 8. – 10. April 2002; Münster (Posterbeitrag)

A. Vockel, K. Röwer, A. Mehlich, M. Grote; Bedeutung von Umwandlungsprodukten bei der

quantitativen Chlortetracyclinanalytik in biologischen Proben mit LC-MSMS; Analytica, 18.

Internationale Fachmesse und Analytica Conference; 23. – 26. April (2002) München (Pos-

terbeitrag)

A. Mehlich, A. Vockel, M. Grote; Quantitative Analysis of chlortetracycline and its degrada-

tion products in biological samples by LC-MSMS; Euroanalysis-12, European Conference on

Analytical Chemistry, Dortmund, Germany, September 8 - 13, 2002 (Posterbeitrag)

M. Grote, A. Vockel, D. Schwarze, A. Mehlich, M. Freitag; Fate of Antibiotics in food chain

and environment originating from pigfattening (Part 1); Fresenius Envir. Bull.; 13 (11 b)

(2004) 1216-1224

A. Vockel, K. Röwer, K. Vogel, A. Mehlich, M.Stolz, B. Brand, M. Grote; Sonderprogramm

Verbraucherschutz 2000-2002; Abschlußbericht: „Resistenzentwicklung und Rückstände in

der landwirtschaftlichen Tierhaltung“; Hrsg.: Ministerium für Umwelt und Naturschutz,

Landwirtschaft und Verbraucherschutz des Landes NRW, Düsseldorf (2004) www.lej.nrw.de

DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. M. Grote danke ich sehr herzlich für die interessante Themenstellung, stete

Diskussionsbereitschaft und für die engagierte Unterstützung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. M. Weiß (Fakultät für Naturwissenschaften, Department Sport & Gesundheit,

Sportmedizin, Universität Paderborn) danke ich für die freundliche Übernahme des Korrefera-

tes.

Mein weiterer Dank gilt Herrn Dr. M. Stolz (Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Det-

mold), Herrn Dr. A. Mehlich sowie allen Mitarbeitern des Staatlichen Veterinäruntersu-

chungsamtes Detmold, die durch ihr Mitwirken und ihr kollegiales Verhalten zum Gelingen

dieser Arbeit beigetragen haben. Besonders möchte ich mich bei Karin Röwer und Kerstin

Tingelhoff bedanken.

Weiterhin möchte ich allen Mitwirkenden des Verbraucherschutzprojektes, die die Durchfüh-

rung der Medikationsstudien begleitet haben, für die gute Zusammenarbeit danken, die damit

zum Erfolg dieser Arbeit beigetragen haben.

Weiterhin gilt mein besonderer Dank all den jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des Ar-

beitskreises Analytische und Anorganische Chemie, insbesondere Rolli Knaup, Dr. Detlef

Schwarze und Dr. Heike Wollersen.

Meinen ganz besonderen Dank möchte ich darüber hinaus all denjenigen aussprechen, die in

fachlicher wie auch privater Hinsicht diese Arbeit auf vielfältige Art und Weise unterstützten.

Ich danke all meinen Freunden, die mir stets zur Seite standen und durch ihre Diskussionsbe-

reitschaft eine große Hilfestellung waren. Besonders danke ich auch meinem Vater, in Erinne-

rung an meine Mutter, für die jahrelange Geduld und Unterstützung.

Für meinen Vater

in Erinnerung an meine Mutter

INHALTSVERZEICHNIS

1 Einleitung..........................................................................................................................................1

2 Problemstellung und Zielsetzung....................................................................................................4

3 Theoretische Grundlagen................................................................................................................6

3.1 Klassifizierung von Antibiotika.............................................................................................6

3.1.1 Definition, Wirkungstypen und Klassifizierungsmöglichkeiten ....................................6

3.1.2 Aufbau von Bakterienzellen...........................................................................................8

3.1.3 Wirkmechanismen, Struktur-Wirkungsbeziehungen und Wirkungsspektren ..............10

3.1.3.1 Einteilung der Antibiotika nach Wirkmechanismen ...............................................10

3.1.3.2 Wirkungsspektrum von Antibiotika........................................................................11

3.1.3.3 Wirkmechanismus der Tetracycline........................................................................12

3.2 Struktureller Aufbau und Struktur-Wirkungsbeziehungen der Tetracycline................12

3.2.1 Struktur und Nomenklatur............................................................................................12

3.2.2 Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Tetracyclinen....................................................14

3.3 Pharmakologie der Tetracycline .........................................................................................14

3.4 Resistenzmechanismen, Gefährdung des Verbrauchers und Rechtliche Bewertung.....16

3.4.1 Resistenzmechanismen.................................................................................................16

3.4.1.1 Definition und Möglichkeiten der Resistenzentstehung..........................................16

3.4.1.2 Resistenzeigenschaften gegenüber Tetracyclinen ...................................................17

3.4.2 Gefährdung des Verbrauchers durch den Einsatz von Antibiotika ..............................18

3.4.3 Rechtliche Bewertung von pharmakologisch wirksamen Stoffen in Lebensmitteln

tierischen Ursprungs.....................................................................................................20

3.5 Eigenschaften der Tetracycline ...........................................................................................22

3.5.1 Physikalische und chemische Eigenschaften................................................................22

3.5.2 Komplexbildung...........................................................................................................23

3.5.3 Umwandlungs- und Abbaureaktionen..........................................................................24

3.5.3.1 Epimerisierung ........................................................................................................24

3.5.3.2 Isomerisierung.........................................................................................................25

3.5.3.3 Keto-Enol-Tautomerie.............................................................................................26

3.5.3.4 Dehydratation..........................................................................................................27

4 Stand der Tetracyclin-Analytik ....................................................................................................29

5 Ergebnisse und Diskussion............................................................................................................33

5.1 Untersuchungsmethodik und Projektverlauf.....................................................................33

5.1.1 Haus Düsse-Studie........................................................................................................34

5.1.2 FAL-Studie .................................................................................................................. 35

5.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von CTC und Metabolite in biologischen

Proben ................................................................................................................................... 37

5.2.1 Entwicklung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens ....................................................... 37

5.2.1.1 Auswahl der mobilen und stationären Phase.......................................................... 37

5.2.1.2 Entwicklung der MS/MS-Detektion....................................................................... 39

5.2.1.3 Stabilität von CTC und e-CTC in Lösung.............................................................. 41

5.2.2 Entwicklung und Optimierung der Probenvorbereitung.............................................. 44

5.2.2.1 Auswahl des SPE-Materials ................................................................................... 46

5.2.2.2 Einfluß der Zusammensetzung des Extraktionsmittels........................................... 46

5.2.2.3 Wiederfindungsstudien mit CTC und e-CTC......................................................... 47

5.2.2.4 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung................. 48

5.2.2.5 Urin, Plasma und Faeces......................................................................................... 49

5.2.2.6 Muskulatur, Leber und Niere.................................................................................. 52

5.2.2.7 Optimierung der Probenvorbereitung für Muskulatur............................................ 54

5.2.2.8 Knochen.................................................................................................................. 56

5.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Verfahrensentwicklung .................................. 58

5.3 Validierung des Analysenverfahrens zur Bestimmung von CTC und e-CTC................ 60

5.3.1 Kalibrierung................................................................................................................. 61

5.3.1.1 Wahl des Arbeitsbereiches ..................................................................................... 61

5.3.1.2 Linearität................................................................................................................. 62

5.3.2 Nachweis- und Bestimmungsgrenze............................................................................ 64

5.3.3 Selektivität des Verfahrens zur Bestimmung von CTC und e-CTC in Muskulatur..... 65

5.3.3.1 Selektivitätstest durch Peaklöschung nach alkalischer Behandlung....................... 66

5.3.3.2 Selektivitätsstest durch Vergleich der Retentionszeiten......................................... 66

5.3.3.3 Selektivitätstest durch Vergleich der UV- und MS-Spektren................................. 67

5.3.4 Systematische und zufällige Fehler ............................................................................. 69

5.3.4.1 Richtigkeit .............................................................................................................. 69

5.3.4.2 Matrixbedingte Signalbeeinflussung bei der ESI-MS/MS-Detektion .................... 72

5.3.4.3 Präzision ................................................................................................................. 74

5.3.5 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse für die Bestimmung von CTC und e-

CTC in Muskulatur...................................................................................................... 76

5.3.6 Validierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens für die Bestimmung von CTC und e-

CTC in Urin, Faeces, Plasma, Knochen, Leber und Niere .......................................... 77

5.4 Anwendung des Analysenverfahrens auf Proben der Medikationsstudien.................... 79

5.4.1 Haus Düsse-Studie....................................................................................................... 79

5.4.1.1 Ausscheidungsverhalten von CTC in Urin............................................................. 79

III

5.4.1.2 CTC-Gehalte in Schlachtproben..............................................................................81

5.4.1.3 Resistenzuntersuchungen ........................................................................................82

5.4.1.4 Zusammenfassung...................................................................................................83

5.4.2 FAL-Studie...................................................................................................................83

5.4.2.1 CTC und e-CTC in Urin, Faeces und Plasma..........................................................84

5.4.2.2 Bilanzierung (Applikation-Exkretion) ....................................................................87

5.4.2.3 Schlachtproben........................................................................................................88

5.4.2.4 Zusammenfassung...................................................................................................89

5.4.3 Ergebnisse der Studien und Konsequenzen..................................................................89

5.5 Identifizierung von Tautomeren..........................................................................................90

5.6 In vitro- und in vivo-Bildung von Metaboliten des CTC ...................................................93

5.6.1 In vitro-Bildung............................................................................................................93

5.6.2 In vivo-Bildung.............................................................................................................94

5.7 Antibiotische Aktivitäten .....................................................................................................96

5.7.1 Agar-Diffusionstest ......................................................................................................96

5.7.2 Bildung von Abbauprodukten während des Agar-Diffusionstests...............................98

5.7.3 Zusammenfassung der Ergebnisse und Konsequenzen ..............................................100

5.8 Methodenentwicklung zur quantitativen Bestimmung weiterer CTC-Metabolite.......100

5.8.1 HPLC-UV-MS/MS-Verfahren ...................................................................................101

5.8.1.1 Stabilität der Metabolite in Lösung.......................................................................101

5.8.1.2 Kalibrierung ..........................................................................................................102

5.8.2 Probenvorbereitung ....................................................................................................103

5.8.2.1 Wiederfindung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC .....................103

5.8.2.2 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung................104

5.8.2.3 iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter....................................................105

5.8.3 Zusammenfassung ......................................................................................................106

5.9 Anwendung des erweiterten Analysenverfahrens auf Proben der FAL-Studie............107

5.9.1 Schlachtproben ...........................................................................................................107

5.9.2 Gebundene CTC-Rückstände in Knochen..................................................................109

5.9.2.1 Freisetzung von CTC aus Knochen.......................................................................111

5.9.2.2 Fluoreszenz-Screening-Test ..................................................................................114

5.9.2.3 Applikation von CTC und Ablagerungsmuster in Knochen .................................114

5.9.3 Bilanzierungsstudie von Tier 95.................................................................................116

5.9.3.1 Urin und Faeces.....................................................................................................116

5.9.3.2 Schlachtproben......................................................................................................118

5.9.3.3 Bilanzierung ..........................................................................................................119

5.9.4 Konsequenzen............................................................................................................ 122

6 Zusammenfassung und Ausblick ............................................................................................... 123

7 Experimenteller Teil.................................................................................................................... 128

7.1 Chemikalien........................................................................................................................ 128

7.2 Geräte.................................................................................................................................. 128

7.2.1 HPLC-UV-MS/MS Triple Quadrupol-System .......................................................... 128

7.2.2 Probenzerkleinerung.................................................................................................. 129

7.2.3 Probenhomogenisierung ............................................................................................ 129

7.2.4 Zentrifugen ................................................................................................................ 129

7.2.5 SPE-Extraktionseinheit.............................................................................................. 129

7.2.6 TurboVap................................................................................................................... 129

7.2.7 pH-Meter.................................................................................................................... 130

7.2.8 UV-Lampe ................................................................................................................. 130

7.3 Lösungen/Reagenzien ........................................................................................................ 130

7.3.1 Mobile Phase ............................................................................................................. 130

7.3.2 McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,1 moL/L EDTA............................................................ 130

7.3.3 Stammlösungen.......................................................................................................... 130

7.3.4 Standardlösungen....................................................................................................... 130

7.3.5 Kalibrierlösungen ...................................................................................................... 131

7.4 Medikationsstudien............................................................................................................ 131

7.4.1 Haus Düsse-Studie..................................................................................................... 131

7.4.2 FAL-Studie ................................................................................................................ 133

7.5 Methodenentwicklung ....................................................................................................... 135

7.5.1 Chromatographische Bestimmung............................................................................. 135

7.5.2 Stabilität von CTC und e-CTC in Lösung ................................................................. 137

7.5.3 Entwicklung und Optimierung der Probenvorbereitung............................................ 137

7.5.3.1 Auswahl der SPE-Materials.................................................................................. 137

7.5.3.2 Einfluß der Zusammensetzung des Extraktionsmittels......................................... 137

7.5.3.3 Wiederfindungsstudien mit CTC und e-CTC....................................................... 138

7.5.3.4 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung von CTC

und e-CTC............................................................................................................................ 138

7.5.3.5 Zusammenfassung des SPE-Verfahrens ............................................................... 138

7.5.4 Probenvorbereitung verschiedener Matrices.............................................................. 138

7.5.4.1 Urin, Plasma und Kot ........................................................................................... 138

7.5.4.2 Muskulatur, Leber und Niere................................................................................ 139

7.5.4.3 Optimierung des Extraktionsverfahrens für Muskulatur ...................................... 140

7.5.4.4 Knochen ................................................................................................................140

7.6 Validierung des Analysenverfahrens ................................................................................141

7.6.1 Linearer Bereich .........................................................................................................141

7.6.2 Kalibriergeraden.........................................................................................................141

7.6.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze...........................................................................142

7.6.4 Selektivität..................................................................................................................142

7.6.4.1 Selektivitätstest durch Peaklöschung nach alkalischer Behandlung .....................142

7.6.4.2 Selektivitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten .........................................142

7.6.4.3 Selektivitätstest durch Vergleich der UV- und MS-Spektren ...............................142

7.6.5 Richtigkeit ..................................................................................................................142

7.6.6 Matrixbedingte Signalbeeinflussung bei der massenspektrometrischen Detektion....143

7.6.6.1 Matrixkalibrierung.................................................................................................143

7.6.6.2 Kontinuierliche Nachsäulen-Injektion von CTC...................................................143

7.6.7 Präzision .....................................................................................................................143

7.6.7.1 Meßpräzision.........................................................................................................143

7.6.7.2 Methodenpräzision................................................................................................143

7.6.8 Validierungsparameter für Urin, Kot, Plasma, Knochen, Leber und Niere................144

7.7 Identifizierung tautomerer Verbindungen von CTC ......................................................144

7.8 In vitro-Bildung von Metaboliten des CTC ......................................................................144

7.9 Antibiotische Aktivitäten ...................................................................................................145

7.9.1 Agar-Diffusionstest ....................................................................................................145

7.9.2 Abbaureaktionen während des Agar-Diffusionstestes................................................145

7.10 Methodenentwicklung zur quantitativen Bestimmung weiterer CTC-Metabolite.......146

7.10.1 Herstellung einer Standardlösung aus iso-CTC und e-iso-CTC.................................146

7.10.2 Linearer Bereich .........................................................................................................146

7.10.3 iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter.........................................................147

7.10.4 Wiederfindung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ..........................147

7.10.5 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung von iso-CTC,

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ..........................................................................147

7.11 Gebundene CTC-Rückstände in Knochen .......................................................................147

7.11.1.1 Freisetzung von CTC aus Knochen.......................................................................147

7.11.1.2 Fluoreszenz-Screening-Test ..................................................................................148

8 Literatur........................................................................................................................................149

A Anhang...........................................................................................................................................A 1

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

Allgemeine Abkürzungen

AMG Arzneimittelgesetz

APCI atmospheric pressure chemical ionisation

ASE Accelerated Solvent Extraction

AU Absorption Units

β Massenkonzentration

BfR Bundesinstitut für Risikobewertung

BG Bestimmungsgrenze

c0 molare Ausgangskonzentration der Lösung

CI Chemical Ionisation

ci Analyt-Konzentration der Lösung zum Zeitpunkt i

DAD Dioden-Array-Detektor

di Residuen

DIN Deutsche Industrie Norm

DPT Drei-Platten-Test

DS2 Differenz der Varianzen

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EMEA Europäische Arzneimittelbehörde

ESI Electrospray Ionisation

FAB Fast Atom Bombardment

FAL Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

FDA Food and Drug Administration

FlHG Fleischhygienegesetz

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography)

I intermediär

ICH International Conference on the Harmonisation of technical requirements for the

registration of pharmaceuticals for human use

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

K Kontrolltier

KG Körpergewicht

LEJ Landesamt für Ernährungswirtschaft und Jagd

LMBG Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz

m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis

MeOH Methanol

VII

MHK Minimale Hemmkonzentration

MRL Maximum Residue Limit

MRPL Minimum Required Performance Limit

MS Massenspektrometrie

MSPD Matrix Solid Phase Extraction

MUNLV Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz

n Anzahl der Meßwerte

nn nicht nachweisbar

NWG Nachweisgrenze

P Signifikanzniveau

p.a. pro analysi

PG Prüfgröße

R resistent

r Wiederholdifferenz

R2 Bestimmtheitsmaß

rM statistischer Tabellenwert für den GRUBBS-Test

RP Reversed Phase (Umkehrphase)

Rt Retentionszeit [min]

RT Raumtemperatur

S sensibel

s Standardabweichung

SPE Festphasenextraktion (Solid Phase Extraction)

SPME Festphasenmikroextraktion (Solid Phase Micro Extraction)

srel relative Standardabweichung

Sxo Verfahrensstandardabweichung

t Zeit

TMP Trimethoprim

VB Vertrauensbereich

Vxo relative Verfahrensstandardabweichung

WF Wiederfindung

x Konzentration

y Detektorsignal

VIII

Tetracycline

Anhydro-CTC Anhydrochlortetracyclin

CTC Chlortetracyclin

DMCTC Desmethylchlortetracyclin

DC Doxycyclin

e-Anhydro-CTC epi-Anhydrochlortetracyclin

e-CTC epi-Chlortetracyclin

e-iso-CTC epi-Isochlortetracyclin

iso-CTC Isochlortetracyclin

MC Minocyclin

OTC Oxytetracyclin

RTC Rolitetracyclin

TC Tetracyclin

1 Einleitung 1

1 Einleitung

Antibiotika gehören zu den bedeutendsten und am häufigsten eingesetzten human- und veterinärmedi-

zinischen Therapeutika [1]. In der landwirtschaftlichen Tierhaltung finden Antibiotika zum einen zu

therapeutischen, also medizinischen, Zwecken, zum anderen aber auch zur Leistungsförderung An-

wendung. Der therapeutische Einsatz von Antibiotika erfolgt neben der Behandlung einzelner erkrank-

ter Tiere bei landwirtschaftlichen Nutztieren aufgrund der Haltungsbedingungen in Form von „Mas-

senbehandlungen“, bestandsweise über ganze Lebensabschnitte hinweg, wobei die Medikation meist

über das Futter oder Trinkwasser erfolgt. Leistungsförderer sind dagegen im Sinne des Futtermittelge-

setzes keine Arzneimittel, sondern „Werkstoffe der Tierernährung“, die oral wirksam sind und bei

Nutztieren zu einer Steigerung der Wachstumsrate und der Futterverwertung führen. Die auch als Fut-

terzusatzstoffe bezeichneten Leistungsförderer fallen damit auch nicht unter die Bestimmungen des

Arzneimittelgesetzes [2], obwohl sie eine pharmakologische Wirkung aufweisen können. Zur mastlei-

stungssteigernden Wirkung werden auch therapeutisch wichtige Antibiotika in niedriger, subtherapeu-

tischer Dosis verfüttert. In der Europäischen Union stehen derzeit etwa 650 Wirksubstanzen zur An-

wendung bei Lebensmittel liefernden Tieren zur Verfügung [3]. Daten über die zur Anwendung kom-

menden Mengen dieser Arzneimittel existieren in den Ländern der Europäischen Union nur in be-

grenztem Ausmaß. Die FEDESA (Federation Européenne de la Santé Animale) publizierte für das Jahr

1997 Daten über das europaweite Verkaufsvolumen von Antibiotika. Hiernach beträgt der Einsatz von

Antibiotika in der Humanmedizin mit 5400 t 52 %, in der Veterinärmedizin mit 3494 t 33 % und der

Einsatz als Leistungsförderer in der Landwirtschaft mit 1599 t 12 %. Von den insgesamt EU-weit

5093 t eingesetzten Tierarzneimitteln im Bereich der Veterinärmedizin und der Leistungsförderung

entfallen ca. 80 % auf Nutztiere, wobei die Tierarten Schwein, Rind/Kalb, Geflügel, Schaf und Ziege

eine besonders große Rolle spielen. Aufgrund einer möglichen resistenzfördernden Wirkung wird der

nutritive Einsatz von antibakteriell wirksamen Leistungsförderern stark kritisiert und ist in den letzen

Jahrzehnten erheblich eingeschränkt worden. Der Einsatz von Antibiotika als Leistungsförderer ist

inzwischen bis auf die vier antimikrobiell wirksamen Substanzen Avilamycin, Monensin-Natrium,

Salinomycin-Natrium und Flavophospholipol verboten [2]. Ein kompletter Verzicht auf den Einsatz

von Futtermittelzusatzstoffen zur Leistungsförderung wird angestrebt. Von den 3494 t eingesetzten

Antibiotika in der Veterinärmedizin entfielen nach der Studie der FEDESA im Jahr 1997 EU-weit die

in Abb. 1 dargestellten Mengen [4].

Abb. 1: Mengen der EU-weit in der Tiermedizin eingesetzten Wirkstoffgruppen im Jahre 1997 (in

Tonnen), (FEDESA) [4]

Fluorchinolone

43 t

Sulfonamide/

Trimethoprim

75 t

Sonstige

182 t

Aminoglycoside

154 t

ß-Lactame

322 t

Makrolide

424 t

Tetracycline

2294 t

1 Einleitung

Unter den in der Veterinärmedizin gebräuchlichen Antibiotikagruppen machen die Tetracycline mit

einem relativen Gesamtverkaufsvolumen von 66 % (2294 t) weit vor den Makroliden (12 %, 424 t)

und ß-Lactamen (9 %, 322 t) den größten Anteil aus [5, 6]. Für den Einsatz als Leistungsförderer sind

Tetracycline bereits seit über 25 Jahren verboten und dürfen seitdem nur noch zu therapeutischen

Zwecken eingesetzt werden. Dennoch kommt gerade dieser Wirkstoffgruppe eine besondere Bedeu-

tung zu, da es sich um kostengünstige Antibiotika handelt und sie daher vor allem der therapeutischen

Anwendung bei Tieren dienen. In der Veterinärmedizin werden im wesentlichen dieselben Wirkstoff-

gruppen wie in der Humanmedizin angewendet, wobei jedoch einige Vertreter einer Wirkstoffgruppe

weitestgehend der Humanmedizin vorbehalten sind. Während von den Tetracyclin-Derivaten in der

Humanmedizin über 90 % der verordneten Präparate auf den Wirkstoff Doxycyclin entfallen [7], ist in

der veterinämedizinischen und landwirtschaftlichen Anwendung Chlortetracyclin der bedeutendste

Wirkstoff [8-12]. Chlortetracyclin wird oft auch in Kombination mit Sulfonamiden zur Behandlung

von Schweinen eingesetzt.

Die sich anfänglich einstellende Euphorie nach Beginn der breiten Antibiotika-Anwendung in den

30er und 40er Jahren wurde sehr bald durch Beobachtungen einer erhöhten Häufigkeit resistenter Bak-

terienstämme gedämpft. Die rasante zunehmende Verbreitung von Antibiotikaresistenzen hat zu einer

Abnahme des medizinischen Behandlungserfolges geführt. Im Bereich von Kliniken, Landwirtschaft

und Umwelt ist es zunehmend zu multiplen mobilen Resistenzgenen gekommen. Heutzutage besteht

kein Zweifel an der Verbreitung von Resistenzen über Krankenhäuser und in der Umwelt und ist daher

als ein globales Problem zu betrachten [13]. Das BfR, ehemals BgVV, erfaßt seit 1992 Resistenzen als

Risiko einer Arzneimittelwirkung auf der Grundlage der Allgemeinen Verwaltungsvorschrift in Er-

gänzung des § 56 des AMG. An diesem Erfassungsprogramm sind verschiedene veterinärmedizinische

Untersuchungsinstitute beteiligt, die Bakterienstämme aus diagnostischem Material auf antimikrobiel-

le Resistenz geprüft haben. Diese Untersuchungen zeigen eine deutliche Zunahme von resistenten

pathogenen Erregern, wobei der höchste Anteil resistenter Keime für Sulfonamide und Tetracycline

bei Schweinen zu verzeichnen ist [14-17]. Bemerkenswert ist daher der hohe Verbrauch an Tetracycli-

nen trotz ihrer ungünstigen Resistenzsituation [6, 18]. Für den Anstieg der Resistenzen in der Veteri-

närmedizin wird der breite Einsatz von Arzneimittelvormischungen als Fütterungsarzneimittel verant-

wortlich gemacht. Insbesondere die Behandlung ganzer Tierbestände über Lebensabschnitte hinweg

durch Arzneimittelfütterung birgt ein besonders hohes Risiko der Resistenzentwicklung in sich, da

hierbei eine Vielzahl von Tieren einer Langzeitexposition von häufig zu niedrigen Wirkstoffkonzen-

trationen ausgesetzt ist [4]. Die Bildung von Kreuzresistenzen innerhalb einer Wirkstoffgruppe sowie

das breite Wirkungsspektrum der meisten Antibiotika führt zu einem erhöhten Risiko der Resistenz-

ausbildung. Resistenz ist heute ein generelles klinisches Problem, so daß in vielen nationalen und in-

ternationalen Expertenvereinigungen daher Strategien zum gezielteren Einsatz von Antibiotika in der

Medizin und Landwirtschaft erarbeitet werden [19-22]. Die Entstehung und Verbreitung von Resisten-

zen wird heutzutage zunehmend in einem mikrobiell-ökologischen Zusammenhang gesehen [23-26].

Dies bedeutet, daß pathogene Bakterien, die eine Resistenz erlangen, nicht isoliert in ihrem Lebens-

raum betrachtet werden dürfen, sondern vielmehr als Teil einer Lebensgemeinschaft zwischen

Mensch, Tier, Pflanze und Umwelt zu verstehen sind. Deshalb gibt es vermehrt Untersuchungen zum

Verbleib der den Tieren applizierten Wirkstoffe unter besonderer Beachtung des Umwelteintrages [27-

36]. Dennoch gibt es noch keine valide Daten hinsichtlich des Antibiotikaeintrages in die Umwelt und

die Nahrungskette. Nach dem derzeitigen Wissensstand kann daher keine klare Einschätzung des Ge-

fährdungspotentials für den Verbraucher durch Antibiotika aus veterinärmedizinischer Anwendung

1 Einleitung 3

und deren Resistenzproblematik gegeben werden.

Im Hinblick auf die rasante Entstehung von Antibiotikaresistenzen bei Mikroorganismen ergab sich

die Notwendigkeit, immer neue Wirkstoffe entwickeln zu müssen. Dabei sollte die antibakterielle

Wirkung neuer Präparate in Relation zu den bisher wirksamsten Substanzen geprüft werden. Wichtige

Beurteilungskriterien sind dabei die Wirkungsintensität, ausgedrückt im MHK-Wert in µg/mL Sub-

strat, der Wirkungstyp, die Resistenzsituation sowie pharmakokinetische Parameter wie Inaktivierung,

Um- und Abbau und Stabilität in verschiedenen pH- und Temperaturbereichen und gegenüber Meta-

bolisierunsprozessen in vivo [50]. Zwischen 1940 und 1960 sind die meisten Antibiotika, die heute

eine bedeutende therapeutische Rolle spielen, entdeckt worden. Obwohl die Zahl neu entdeckter mi-

krobiell wirksamer Substanzen seitdem nicht abgenommen hat, sind in den letzten Jahrzehnten nur

wenige strukturell neuartige Antibiotika zur Anwendung gekommen. Insbesondere auf dem Tierarz-

neimittelmarkt zeigt sich ein deutlicher Rückgang von Neuentwicklungen für Nutztiere. Der Haupt-

grund liegt darin, daß die Anforderungen an ein neues Antibiotikum ständig gestiegen sind [37]. Die

Zeit und die Kosten für eine Neuentwicklung haben enorm zugenommen. Für viele Präparate im Be-

reich der Tierarzneimittel ist von der pharmazeutischen Industrie aufgrund der hohen Nachzulassungs-

kosten kein Antrag auf Festsetzung einer Rückstandshöchstmenge gestellt worden. Trotz weltweiter

Bestrebungen zur chemischen Modifikation natürlicher Antibiotika zur Optimierung der Eigenschaften

wie ein erweitertes Wirkungsspektrum, bessere pharmakokinetische und toxikologische Eigenschaften

sind bei vielen Infektionskrankheiten die herkömmlichen Ausgangswirkstoffe der Penicilline, Sulfo-

namide und Tetracycline das Mittel der Wahl [2, 48], wodurch die Bedeutung der klassischen Antibio-

tika verdeutlicht wird.

Aus dem unvermindert hohen Einsatz von Chlortetracyclin in der Schweinemast und der ungenügen-

den Datenlage über die hieraus entstehenden möglichen Auswirkungen für den Verbraucher resultiert

Forschungsbedarf hinsichtlich des Eintrages dieses Antibiotikums sowie dessen Metabolite in die Nah-

rungskette. Neben dem direkten Eintrag von Chlortetracyclinrückständen in tierische Lebensmittel

sind auch indirekte Eintragspfade über die Einbringung von Chlortetracyclin in die Umwelt von Be-

deutung.

2 Problemstellung und Zielsetzung

Während früher zum Schutz des Verbrauchers zur Vermeidung von Tierazneimitteln in Lebensmitteln

lediglich die Einhaltung von Wartezeiten herangezogen worden ist, so dürfen mit Einführung der

Rückstandshöchstmengenregelung im Jahre 1990 in zur Lebensmittelgewinnung dienenden Tieren in

verschiedenen Matrices bestimmte Grenzwerte (MRL ≜maximum residual limit) nicht überschritten

werden. Darüber hinaus weisen aber LANGEWISCHE et al. auf eine resistenzfördernde Wirkung von

Antibiotikarückständen bei lebensmittelliefernden Tieren hin, die unterhalb der gesetzlich festgelegten

Rückstandshöchstmengen, den MRL-Werten, liegen [38]. Bei der Festlegung der MRL-Werte gehen

die mikrobiologischen Eigenschaften eines Antibiotikums nur bedingt mit ein, was dazu führt, daß

viele MRL-Werte unterhalb der MHK-Werte, den minimalen Hemmstoffkonzentrationen, liegen. Der

Konsum tierischer Erzeugnisse kann demzufolge zu einer Resistenzbildung beitragen, da das Wach-

stum der Keime nicht vollständig verhindert wird und damit eine Promotion resistenter Keime erfolgt.

Obwohl es eine Vielzahl von Untersuchungen zur Metabolisierung und zum Verbleib der in der Tier-

mast eingesetzten Tetracycline gibt [39-46], fehlt eine genaue Kenntnis über die daraus resultierende

Gefährdung für den Verbraucher, insbesondere im Hinblick darauf, daß auch geringe unterhalb der

MRL-Werte liegende Arzneimittelgehalte in tierischen Produkten eine Gefährdung für den Verbrau-

cher darstellen können. Bei vielen Veröffentlichungen zur analytischen Bestimmung von Tetracycli-

nen in Muskulatur, Leber und Niere erfolgt die Festlegung der Bestimmungsgrenze unter Zugrundele-

gung der MRL-Werte, so daß mit vielen veröffentlichten Verfahren eine Bestimmung von Antibioti-

kagehalten unterhalb der MRL-Werte nicht zuverlässig möglich ist [185, 210, 239, 310].

Tetracycline besitzen die chemische Eigenschaft, in wäßriger Lösung antibiotisch aktive Epimere,

siehe Abb. 7, zu bilden, weshalb im Rahmen der MRL-Verfahren festgelegt wurde, den Tetracyclin-

Gehalt als Summe von Muttersubsstanz und Epimeren zu ermitteln. Zusätzlich bildet vor allem Chlor-

tetracyclin in Abhängigkeit vom pH-Wert weitere Umwandlungs- und Abbauprodukte wie Isochlorte-

tracyclin und Anhydrochlortetracyclin, die in den meisten Fällen in der Literatur wie auch bei der

Festlegung der MRL-Werte unberücksichtigt bleiben [172, 194, 195]. Weiterhin erfolgte bei den in der

Literatur beschriebenen Analysenverfahren zumeist nur eine ungenügende Überprüfung der Zuverläs-

sigkeit der Verfahren. Es werden zwar teilweise einzelne Validierungsparamter angegeben, jedoch

fehlt eine ausführliche Validierung [170, 173, 210]. Eine weitere charakteristische Eigenschaft von

Tetracyclinen ist ihre Komplexbildung mit verschiedenen Matrixkomponenten wie z.B. Proteine und

Metallkationen, die zu einer Einlagerung von Tetracyclinen in Knochen führt [37, 48]. Es ist umstrit-

ten, ob diese gebundenen Tetracyclinrückstände unbedenklich für den Verbraucher sind. Diese Arbeit

verfolgte daher folgende Ziele:

Um nähere Erkenntnisse über die Aufnahme, die Metabolisierung und den Verbleib von Arzneimitteln

in der Tiermast zu erlangen, wurde vom MUNLV (Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Land-

wirtschaft und Verbraucherschutz NRW) im Jahre 2000 ein Verbraucherschutzprogramm gegründet.

Ein Schwerpunkt dieses Verbraucherschutzprogrammes sollte hierbei auf der Untersuchung von

Chlortetracyclin in der Schweinemast liegen. Ziel dieses Projektes „Resistenzentwicklung und Rück-

stände in der landwirtschaftlichen Tierhaltung“ war es, den durch die häufige Anwendung von Chlor-

tetracyclin in der Schweinemast resultierenden Eintrag von Chlortetracyclin in die Nahrungskette so-

wie das Ausscheidungsverhalten von Chlortetracyclin bei Schweinen und damit den Umwelteintrag zu

untersuchen. Die hierbei gewonnenen Erkenntnisse sollten dazu dienen, eine Gefährdung für den Ver-

2 Problemstellung und Zielsetzung 5

braucher durch den Einsatz von Chlortetracyclin in der Schweinmast besser beurteilen zu können. Bei

der Ermittlung der Chlortetracyclingehalte galt besonderes Augenmerk möglichen Umwandlungs- und

Abbauprodukten von Chlortetracyclin. (Anmerkung: Zur Vereinfachung werden alle Umwandlungs-

und Abbauprodukte von Chlortetracyclin nachfolgend als „Metabolite“ bezeichnet und für die einzel-

nen Substanzen die im Abkürzungsverzeichnis aufgeführten Abkürzungen verwendet.)

In einer ersten Medikationsstudie sollten in Zusammenarbeit mit dem Landwirtschaftszentrum Haus

Düsse (Haus-Düsse-Studie) Schweine, die unter üblichen landwirtschaftlichen Bedingungen in einer

Gruppe von 40 Tieren gehalten wurden, definiert medikamentiert werden und das Ausscheidungsver-

halten von CTC in Urin sowie die verbleibenden Rückstände in den Schlachtproben untersucht wer-

den. Zur besseren Beurteilung, welche Mengen der den Tieren applizierten Wirkstoffe wieder ausge-

schieden werden, erfolgte in einer zweiten Medikationsstudie an der Bundesforschungsanstalt Braun-

scheig-Völkenrode (FAL-Studie) eine individuelle Arzneimittelfütterung von fünf Schweinen in Ein-

zelhaltung und eine individuelle Sammlung von Faeces und Urin. Vier dieser Tiere sind nach Ablauf

der Wartezeit geschlachtet worden, eines zur Durchführung einer Bilanzierung direkt nach Absetzen

der Medikation.

Hieraus ergaben sich im Einzelnen folgende Aufgabenstellungen:

• Zur Untersuchung der in den Medikationsstudien entnommenen Proben sollte in einem ersten

Schritt ein HPLC-UV-MS/MS-Verfahren für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Urin, Fae-

ces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen entwickelt werden. Neben der quantitativen

Bestimmung von CTC und e-CTC sollte dieses Verfahren auch die qualitative Bestimmung der

weiteren Metabolite iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ermöglichen.

• Ein weiteres Ziel war, das entwickelte Verfahren zur Überprüfung der Zuverlässigkeit des unter

Berücksichtigung der gültigen Normen und Richtlinien, insbesondere der für Tierarzneimittel gül-

tigen Richtlinie 2002/657/EG, einer ausführlichen Validierung zu unterwerfen.

• Im Anschluß daran war geplant, den CTC-Gehalt in den bei den Medikationsstudien entnomme-

nen Proben gemäß der EU-Verordnung EWG Nr. 2377/90 als Summe von CTC und e-CTC zu

ermitteln. Neben der Quantifizierung von CTC und e-CTC in den genannten Matrices galt es, zu

prüfen, welche weiteren Metabolite von CTC in diesen Proben noch vorkommen.

• Im nächsten Schritt sollte überprüft werden, welche der in den Proben nachgewiesenen Metaboli-

te von CTC bei der Ermittlung des CTC-Totalgehaltes mit einbezogen werden müssen.

• Erweiterung des validierten Analysenverfahrens auf die quantitative Bestimmung anderer Meta-

bolite

• Quantifizierung von CTC und weiterer Metabolite in Schlachtproben

• Bilanzierung von CTC anhand eines Tieres unter Berücksichtigung weiterer Metabolite

• Untersuchung gebundener Tetracyclinrückstände in Knochen

3 Theoretische Grundlagen

3.1 Klassifizierung von Antibiotika

3.1.1 Definition, Wirkungstypen und Klassifizierungsmöglichkeiten

Der Begriff der Chemotherapeutika wurde 1906 von Paul Ehrlich geprägt und umfaßte synthetisch

hergestellte Produkte mit antibiotischer Wirkung, wie die Sulfonamide. Die später entdeckten, von

Pilzen produzierten, antimikrobiell wirkenden Substanzen wurden Antibiotika genannt. Der Begriff

Antibiotika bezeichnet nach seiner ursprünglichen Definition niedermolekulare, mikrobielle Stoff-

wechselprodukte, die das Wachstum anderer Mikroorganismen inhibieren, jedoch auf den Produzenten

selbst nicht wirken [13, 47]. Antibiotika zeichnen sich durch eine geringe erforderliche Wirkstoffkon-

zentration, die Spezifität ihres Wirkmechanismus und eine geringe Toxizität aus [48-50]. Mit der Auf-

klärung der chemischen Struktur und den Möglichkeiten der totalen oder partiellen Synthese der Anti-

biotika und der Darstellung von Derivaten konnte der Begriff der Antibiotika als reine Stoffwechsel-

produkte nicht mehr aufrecht erhalten werden. Zu den Antibiotika zählen heute alle biosynthetisch,

halb- und vollsynthetisch hergestellten antibiotisch wirksamen Substanzen [50].

Allgemein lassen sich in der antibakteriellen Wirkung der Antibiotika verschiedene Wirkungstypen

unterscheiden, die als Bakteriostase und Bakteriozidie bezeichnet werden. Während bakteriostatische

Antibiotika lediglich das Bakterienwachstum hemmen, führt die Behandlung mit bakteriziden Antibio-

tika zu einer raschen irreversiblen Keimschädigung [48, 50]. Die meisten Antibiotika zeigen eine bak-

teriostatische Wirkung, wobei der Wirkungstyp abhängig vom Stadium des Zellwachstums und der

Konzentration des eingesetzten Antibiotikums ist. Eine Reihe von Antibiotika wirken auf im Wach-

stum befindliche Zellen bakterizid, hingegen bei ruhenden Keimen bakteriostatisch. Ebenso können

primär bakteriostatisch wirksame Präparate mit einem Vielfachen ihrer minimalen Hemmkonzentrati-

on bakterizide Eigenschaften zeigen.

Die unterschiedlichen Wirkungstypen der Chemotherapeutika haben praktische therapeutische Bedeu-

tung. Bakterizide Antibiotika sind bei allen Infektionen indiziert, bei denen die körpereigene Abwehr

geschwächt ist, da bei einer Therapie mit bakteriostatischen Antibiotika körpereigene Abwehrmecha-

nismen zur Elimination der Infektionserreger eine entscheidende Rolle spielen. Eine lang anhaltende

bakteriostatische Wirkung führt bei empfindlichen Keimen zu einer sekundären Keimabtötung. Daher

erfordert die Therapie mit bakteriostatisch wirksamen Substanzen die Aufrechterhaltung eines wirk-

samen Dauerspiegels in Blut und Gewebe. Zur Therapie von Infektionen mit bakteriziden Präparaten

sind oft intermittierende Gaben ausreichend. Körpereigene Abwehrmechanismen sind bei bakteriziden

Substanzen nur zur Elimination sogenannter Persister erforderlich. Das Persistenzphänomen führt zum

Überleben einzelner Keime trotz optimaler, bakterizide Wirkstoffkonzentration am Infektionsort und

trotz unveränderter Empfindlichkeit der Keime [50]. Die Persistenz muß grundsätzlich vom Phänomen

der Resistenz, bei der Keime eine verminderte Empfindlichkeit aufweisen, unterschieden werden.

Eine Klassifizierung von Antibiotika kann unter Berücksichtigung der Herkunft, der biologischen

Wirkung, der therapeutischen Anwendung, der chemischen Struktur, des Biosyntheseweges und des

zellulären Wirkmechanismus erfolgen [47]. Zunächst werden Antibiotika nach ihrer chemischen

Struktur klassifiziert. In Abb. 2 sind die Strukturen der gebräuchlichen Antibiotikaklassen dargestellt

3 Theoretische Grundlagen 7

HCHO

H3C

CH3NH

CH2OH

H2NCNH

NH NHCNH2

NO2

HOCH

HCNHCOCHCl2

CH2OH

SCH3

OH H

CH3

HCONH

CH3CH2CH2

NO2N

CH2CH2N

OH O OH O

CONH2

N(CH3)2

CH3

ABCD

[2, 13, 48, 49].

Penicilline

(Benzylpenicillin)

Cephalosporine

(Cephalosporin C)

Sulfonamide

(Sulfadiazin)

Trimethoprim

Tetracycline

(Chlortetracyclin)

Ansamycine

(Rifaximin)

Makrolide

(Erythromycin)

Nitrofurane

(Nitrofurantoin)

Nitroimidazole

(Nimorazol)

Aminoglycoside

(Streptomycin)

Lincosamide

(Lincomycin)

Amphenicole

(Chloramphenicol)

Chinolone

(Ciprofloxacin)

Abb. 2: Struktureller Aufbau der Antibiotikasubstanzklassen [2, 13, 48, 49]

Darüberhinaus kann eine weitere Klassifizierung der Antibiotikasubstanzklassen nach dem Wirkme-

chanismus erfolgen. Zur Wachstumshemmung von pathogenen Mikroorganismen muß das Antibioti-

NNH

NH2

OCH3

H3CO

CH3

COOH

CH2

COOH

(CH2)3

COOH

H2N

CH2OCOCH3

H2NSO

2NH

CH3

CH3O

H3C

CH3COO

H3C

CH3

OH O

CH3

OCH3

CH3

H3C

CH2

CH3

H3C

CH3

HO CH3

CH3

H3C

CHO2NO NN NH

COOH

3 Theoretische Grundlagen

kum in die Zelle eindringen, spezifisch an eine für den Erhalt von Lebensprozessen erforderliche Zell-

struktur binden und deren Funktion unterbinden. Zum besseren Verständnis der molekularen Grundla-

gen der antibiotischen Wirkung wird nachfolgend zunächst der Aufbau von Bakterienzellen erläutert.

3.1.2 Aufbau von Bakterienzellen

Unter dem Begriff Mikroorganismen werden einzellige Lebewesen, die aufgrund ihrer geringen Größe

nur mit mikroskopischen Verfahren erkannt werden können, zusammengefaßt. Mikroorganismen las-

sen sich aufgrund ihrer einfachen morphologischen Merkmale weder den Pflanzen noch den Tieren

eindeutig zuordnen. Sie werden in sogenannte höhere und niedere Protisten unterteilt. Zu den höheren

Protisten gehören Pilze und Algen, zu den niederen Bakterien. Der Zellbau der höheren Protisten ist

ähnlich dem der Pflanzen und Tiere. Aufgrund des Vorhandenseins eines Zellkerns gehören sie zu den

Eukaryonten. Bakterien hingegen besitzen einen anderen Zellaufbau. Ihnen fehlt insbesondere ein

typischer, durch eine Zellmembran gegen den übrigen Zellinhalt abgegrenzter, Zellkern sowie Mito-

chondrien und Chloroplasten und daher zählen sie zur Gruppe der Prokaryonten [51]. Der anatomische

Aufbau einer Bakterienzelle ist in Abb. 3 schematisch dargestellt. Bakterien bestehen aus dem Nu-

kleoid als Kernäquivalent, dem Zytoplasma mit Ribosomen, der Zytoplasmamembran und einer relativ

starren Zellwand.

Abb. 3: Schematische Darstellung einer Bakterienzelle [52]

Bakterien besitzen nicht diffus im Zytoplasma verteilte DNA, sondern diese ist in diskreten Bereichen,

dem Nukleoid, lokalisiert [53]. Das Nukleoid enthält ein ringförmig geschlossenes DNA-Molekül als

Genom, dem sogenannten Bakterienchromosom. Es liegt in stark gefalteteter und verdrillter Form

ohne Abgrenzung durch eine Kernmembran frei im Zytoplasma. Das Nukleoid kann einzeln oder in 2-

4 Kopien vor der Zellteilung im Zytoplasma vorliegen. Außer dem Bakterienchromosom können im

Zytoplasma noch extrachromosomale ringförmig geschlossene, kleine Satelliten-DNA-Moleküle vor-

kommen. Diese sogenannten Plasmide können Träger von Genen sein, die den Bakterienzellen zusätz-

liche Eigenschaften verleihen wie z.B. Antibiotikaresistenz. Das von der Zytoplasmamembran um-

schlossene Zytoplasma enthält neben Wasser, Salzen, Enzymen Stoffwechselintermediärprodukte,

3 Theoretische Grundlagen 9

Proteine und Ribonukleinsäure (mRNA, rRNA und tRNA). Zusätzlich findet sich im Zytoplasma eine

große Anzahl von Ribosomen, die Orte der Proteinbiosynthese. Eine Bakterienzelle enthält ungefähr

5000-50000 Ribosomen. Aufgrund ihrer Funktion der Proteinbiosynthese besitzen sie eine komplizier-

te Struktur. Ribosomen bestehen aus etwa 60 % RNA und 40 % Protein, wobei etwa 80-85 % der Bak-

terien-RNA in den Ribosomen enthalten sind. Die intakten Ribosomen sedimentieren in einer Ultra-

zentrifuge mit einer Geschwindigkeit von 70 SVEDBERG-Einheiten (Sedimentationskonstante: 70 S)

und haben daher auch die Bezeichnung 70 S-Ribosomen im Gegensatz den etwas größeren 80 S-

Ribosomen der Eukaryonten. Jedes Ribosom setzt sich aus einer großen und einer kleinen Untereinheit

zusammen, deren Sedimentationskoeffizient bei 50 S und 30 S liegt. Die Aufklärung der strukturellen

Zusammensetzung der Ribosomen aus RNA und Basensequenz der Proteine sowie deren Funktion

ermöglichte weitgehend die Aufdeckung des Wirkmechanismus von Antibiotika, die mit der Protein-

biosynthese interferieren.

Die zytoplasmatische Membran besteht aus einer Lipiddoppelschicht, deren hydrophobe Enden der

Phospholipide und Triglyceride nach innen und die hydrophilen Enden nach außen der Zelle weisen.

In diese Doppelschicht sind Proteine eingelagert, die die Membran ganz durchkreuzen oder nur teil-

weise eintauchen können. Die Zytoplasmamembran hat entscheidende Stoffwechselfunktionen. Sie ist

die Permeabilitäts-Barriere der Zelle und kontrolliert Stoffaufnahme und –abgabe. Enzymsysteme in

der Zytoplasmamembran bewirken z.B. den Elektronentransport, die Atmungsketten-

Phosphorylierung, die Biosynthese von Lipiden und der Zellwand und die Replikation der DNA. Die

Zellwand von Bakterien kann unterschiedlich aufgebaut sein. Es werden nach dem Färbeverfahren von

GRAM grampositive (blau-schwarz gefärbte Zellen) und gramnegative (rot-gefärbte Zellen) Bakterien

unterschieden [51, 53, 54]. Das Grundgerüst sowohl grampositiver als auch gramnegativer Bakterien

basiert auf einer netzartigen Struktur von Polysaccharidketten, dem Glykan, die über kurze Peptidket-

ten miteinander verknüpft sind. Dieses auch als Murein bezeichnete Peptidoglykan bildet auf diese

Weise ein dreidimensionales Makromolekül, das sich über die gesamte Zelloberfläche erstreckt. Da

diese Mureinstruktur der bakteriellen Zelle nicht bei Pflanzen und Tieren anzutreffen ist, können Anti-

biotika, die mit der Biosynthese des Peptidoglykans interferieren, angewendet werden, ohne daß die

Zellen des Makroorganismus geschädigt werden. Der Hauptbestandteil grampositiver Bakterien ist

das Peptidoglykan. Auf der Mureinhülle befindet sich eine Schicht aus sauren Polysacchariden, wo-

durch die Permeabilität durch die Zellwand grampositiver Bakterien sehr gut ist [49]. Die Zellwand

gramnegativer Bakterien enthält weniger Peptidoglykan und ist komlexer in ihrer Struktur. Die zyto-

plasmatische Membran und die Mureinhülle sind durch einen sogenannten periplasmatischen Spalt

getrennt, der Enzyme und andere Proteine enthält. Eine äußere Membran, die aus vielschichtigen Li-

popolysacchariden und Lipoproteinen besteht, umhüllt die Zellwand. Diese äußere Membran ist für

die geringe Permeabilität der gramnegativen Zellwand verantwortlich, da Antibiotika nur über die

engen Porin-Poren in die Zelle eindringen können. Aufgrund der höheren Permeabilität der Zellwand

grampositiver gegenüber der gramnegativer Bakterien haben die meisten Antibiotika gegen gramposi-

tive Bakterien eine höhere Wirksamkeit als gegen gramnegative Bakterien [49, 53].

3 Theoretische Grundlagen

3.1.3 Wirkmechanismen, Struktur-Wirkungsbeziehungen und Wirkungs-

spektren

3.1.3.1 Einteilung der Antibiotika nach Wirkmechanismen

Antibiotika wechselwirken in Zellen mit Nucleinsäuren (DNA, messenger-RNA (mRNA), ribosomale

RNA (rRNA), transferRNA (tRNA)), Proteine und Biomembranen. Durch Bindung des Wirkstoffes an

den Wirkort wird die normale Funktion des jeweiligen Biomoleküls inhibiert bzw. qualitativ so verän-

dert, daß es seine Aufgabe innerhalb der Zelle nicht mehr wahrnehmen kann [47].

Die Bindung kann durch chemische Reaktion des Antibiotikums mit reaktionsfähigen Gruppen des

Biomoleküls sowie durch zwischenmolekulare Wechselwirkungen, die den konformativen und energe-

tischen Zustand von Makromolekülen wie z.B. Nucleinsäuren oder Enzymen verändern, erfolgen.

Häufig werden in einem ersten Schritt durch die Wechselwirkungen zwischen Antibiotikum und Bio-

molekül Konformationsveränderungen und Bindungsinstabilitäten ausgelöst, die schließlich zu irre-

versiblen chemischen Strukturveränderungen des Makromoleküls führen, z.B. Strangbrüche der DNA,

Substitution reaktiver Gruppen in Enzymzentren. Die resultierende Hemmung der zellulären Prozesse

kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen [47]:

• direkte Unterbrechung des biologischen Informationsflusses von der DNA über die RNA zu

den Proteinen

• Inhibierung von Stoffwechselleistungen, die den Informationsfluß indirekt durch Bausteinbe-

reitstellung und Energieversorgung gewährleisten

• Veränderung der Wechselwirkungen der Zellen mit ihrer Umgebung: Beeinflussung der

Struktur und Funktion der Zellbegrenzung (Zellwand, biologische Membranen), der Penetrati-

on und des Transportes von Metaboliten

Diese Möglichkeiten des zellulären Eingriffs sind eng miteinander verknüpft, und es ist daher nicht

immer möglich, einen spezifischen Wirkort anzugeben. Häufig erfolgen auf zellulärer Ebene mehrere

verschiedene Veränderungen bei Einwirkung von Antibiotika. Üblicherweise werden Antibiotika über

eine strukturelle Zuordnung hinaus, siehe Kap. 3.1.1, anhand ihrer Wirkmechanismen klassifiziert

[47, 49]. In Abb. 4 sind die einzelnen Wirkmechanismen bzw. Wirkorte aufgeführt.

Die synthetischen Chemotherapeutika mit spezifischen Wirkmechanismen (Folsäurestoffwechsel,

DNA-Replikation) werden aus historischen Gründen zu einer Gruppe zusammengefaßt. Hierzu zählen

Sulfonamide, Trimethoprim, Nitrofurane und Chinolone [2, 49]. Sulfonamide zeigen mit Trimetho-

prim eine synergistische Wirkung, indem sie aufeinanderfolgende Schritte der Folsäuresynthese hem-

men, und deshalb haben sie vor allem in Kombination in der Veterinärmedizin therapeutische Bedeu-

tung [13]. Nitrofurane beeinträchtigen die Protein- und Nucleinsäuresynthese und bewirken eine

Schädigung der DNA in Form von Doppelstrangbrüchen und gestörter Energiebilanz. Nitroimidazole

und Chinolone wirken als Hemmstoffe des bakteriellen Enzyms Gyrase, was eine Zerstörung der su-

perhelikalen Form der DNA-Stränge bewirkt.

Zu den zellwandwirksamen Antibiotika zählen die zu den β-Lactam-Antibiotika gehörenden Penicilli-

ne, Cephalosporine und Glykopeptidantibiotika. Die β-Lactam-Antibiotika stellen heute die wichtigste

Wirkstoffgruppe gegen bakterielle Infektionen im humanmedizinischen Bereich dar, weil sie eine sehr

geringe Toxizität aufweisen. Sie wirken bei wachsenden Keimen bakterizid, bei ruhenden nur bakte-

3 Theoretische Grundlagen 11

riostatisch. Alle β-Lactam-Antibiotika inhibieren das Endstadium der Peptidoglykansynthese und ver-

hindern damit die Schließung der Peptidbrücke zwischen den Glykansträngen, was zu einer mechani-

schen Instabilität der Zellwand führt. Die Zellwand kann demzufolge dem osmotischen Druck des

Zytoplamas nicht standhalten, und es erfolgt der Zelltod durch Plasmolyse.

Abb. 4: Wirkmechanismen oder Wirkorte von Antibiotika [49, 55]

Zur Gruppe der zytoplasmamembranwirksamen Antibiotika gehören Polypeptidantibiotika, die sich in

die Zytoplasmamembran einlagern und mit Phospholipidkomponenten der Zellmembran reagieren. Als

Folge davon wird die Permeabilität der Zellmembran erhöht, was schließlich zum Verlust von essenti-

ellen Plasmabestandteilen führt, und die Zellen sterben ab. Daher sind Polypeptidantibiotika vom Wir-

kungstyp bakterizid.

Eine wichtige Rolle spielen Antibiotika, die auf die Proteinsynthese einwirken. Dies sind die Ansamy-

cine, Tetracycline, Aminoglycoside, Amphenicole, Makrolide und Lincosamide. Bis auf die bakterizid

wirksamen Aminoglycoside zeigen alle anderen Antibiotika einen bakteriostatischen Wirkungstyp.

Alle Antibiotika dieser Gruppe inhibieren letztendlich die Proteinbiosynthese auf unterschiedlichen

Stufen. Ansamycine hemmen die DNA-abhängige RNA-Polymerase. Amphenicole, Makrolide und

Lincosamide binden reversibel an die 50 S-Untereinheit der Ribosomen. Durch eine Hemmung der

Peptidyltransferase wird die Peptidkettenbildung verhindert. Die Wirkung von Tetracyclinen und

Aminoglycosiden beruht auf einer Bindung des Antibiotikums an die 30 S-Untereinheit der Riboso-

men. Tetracycline werden reversibel, Aminoglycoside irreversibel gebunden. Deshalb wirken Tetracy-

cline bakteriostatisch und Aminoglycoside bakterizid.

3.1.3.2 Wirkungsspektrum von Antibiotika

Das Wirkungsspektrum ist für jedes einzelne Antibiotikum individuell sehr verschieden und hängt von

dem Wirkungstyp, der Wirkung in der Vermehrungs-oder Ruhephase, der extra- und intrazellulären

Wirkung und des Resistenztyps ab. Durch total- oder partialsynthetische strukturelle Modifikationen

von Wirkstoffen lassen sich auch innerhalb einer Substanzklasse Antibiotika mit unterschiedlichen

-Replikation

Nitrofurane

Nitroimidazole

Chinolone

RNA-Polymerase

Ansamycine

Proteinsynthese

50s-Inhibitoren

Amphenicole

Makrolide

Lincosamide

Proteinsynthese

30s-Inhibitoren

Tetracycline

Aminoglycoside

Zytoplasmamembran

Polypeptide

Folsäurestoffwechsel

Trimethoprim

Sulfonamide

Zellwandsynthese

Penicilline

Cephalosporine

Glycopeptide

3 Theoretische Grundlagen

Wirkungsspektrum herstellen [37, 47, 50]. Zur Erzielung eines therapeutischen Erfolges sollten Anti-

biotika gegen möglichst viele Keime wirken, also ein möglichst breites Wirkungsspektrum aufweisen.

Um die Ausbildung resistenter Keime dagegen möglichst gering zu halten, sollten Antibiotika ein

eingeschränktes Wirkungsspektrum besitzen. Antibiotika mit begrenztem Wirkungsbereich vorwie-

gend gegenüber grampositive Keimarten sind die klassischen Penicilline, Cephalosporine und Makro-

lide. Vorwiegend gegen gramnegative Keime wirksam sind die Polypeptidantibiotika. Obwohl das

Wirkungsspektrum von Aminoglycosidantibiotika eine Vielzahl von Erregern umfaßt, spielen sie ins-

besondere aufgrund ihrer bakteriziden Wirkung bei der Bekämpfung von Infektionen mit gramnegati-

ven Erregern ein große Rolle. Zu den klassischen Breitbandantibiotika gehören die Sulfonamide, Te-

tracycline, Amphenicole und einige partialsynthetische Penicilline. Sie wirken gegen zahlreiche gram-

positive und gramnegative sowie aerobe und anaerobe Infektionserreger. Als empfindlich gegenüber

Tetracyclinen gelten Keime mit einer MHK von 0,1-5,0 µg/mL. Die Unterschiede in der Wirkungsin-

tensität der einzelnen Tetracycline spielen in vivo keine wesentliche Rolle. Tetracycline wirken gegen

extra- und intrazelluläre Erreger, allerdings besser auf Keime im Wachstumsstadium als auf ruhende

Keime.

3.1.3.3 Wirkmechanismus der Tetracycline

Tetracycline erreichen passiv über Porin-Proteine den periplasmatischen Raum und passieren an-

schließend durch aktive Transportsysteme die innere Membran. Obwohl mehrwertige Metall-Kationen

die Tetracyclin-Wirkung durch Bildung antibakteriell unwirksamer Chelate antagonisieren, wird ver-

mutet, daß zweiwertige Metall-Ionen, insbesondere Mg2+-Ionen, durch reversible Bildung von Kom-

plexen beim Transport des Antibiotikums durch die Zellmembran in die Bakterienzelle eine Rolle

spielen [2, 37]. Eine Voraussetzung der Wirkung von Tetracyclinen beruht darauf, daß eine Akkumu-

lation von Tetracyclinen im Zellinneren stattfindet. Obwohl Tetracycline bei erstmaligem Kontakt mit

einem Bakterium die äußere Zellwand und die Zytoplasmamembran in beide Richtungen passieren

können, wird nach Eindringen des Tetracyclins ein Mechanismus induziert, wodurch eine Akkumula-

tion hervorgerufen wird, so daß schließlich die Proteinbiosynthese völlig zum Erliegen kommt [47,

48]. In der Bakterienzelle erfolgt dann die reversible Bindung an die ribosomale 30 S-Untereinheit der

70 S-Ribosomen mit einhergehender Hemmung der Anlagerung der Aminoacyl-tRNA an die Akzepto-

region der Ribosomen, was zum Abbruch der Kettenverlängerung führt [49, 53]. Tetracycline wirken

deshalb bakteriostatisch. Bakterielle Ribosomen verfügen über eine deutlich höhere Affinfität zu Te-

tracyclinen als die 80 S-Ribosomen der eukaryontischen Zellen, was die geringe Toxizität für den

Menschen erklärt [48].

3.2 Struktureller Aufbau und Struktur-Wirkungsbeziehungen der

Tetracycline

3.2.1 Struktur und Nomenklatur

Unter dem Begriff Tetracycline wird eine Reihe von antibiotisch wirksamen Verbindungen zusam-

mengefaßt, die sich vom Grundgerüst des Tetracyclins ableiten. Das Tetracyclin besteht aus einem

System aus vier linear anellierten sechsgliedrigen Ringen, dem 4-Dimethylamino-

1,4,4a,5,5a,6,11,12a-oktahydro-3,6,10,12,12a-penta-hydroxy-6-methyl-1,11-dioxo-2-naphthacencarb-

3 Theoretische Grundlagen 13

OH O OH O

CONH2

R2N(CH3)2

R4H

ABCD 4a

5a6a

10a 11a

12a

BCD-Chromophor A-Chromophor

oxamid. Unterschiedliche Substituenten (R1-R4) an den Positionen 5, 6 und 7 konstituieren die heute

handelsüblichen Präparate. Aufgrund der charakteristischen Anordnung der Doppelbindungen werden

die beiden durch das sp3-Kohlenstoffatom 12a getrennten chromophoren Bereiche A und BCD unter-

schieden. Die Kohlenstoffatome 4, 4a, 5, 5a, 6 und 12a sind bei entsprechender Substitution asymme-

trisch. OTC besitzt sechs, TC, CTC und DMCTC dagegen besitzen fünf chirale Zentren mit (S)-

Konfiguration, die das Molekül optisch aktiv machen. Die absolute Konfiguration des Systems ist

durch Röntgenstrukturuntersuchungen, NMR- sowie CD-Messungen ermittelt worden [49, 57, 56]. In

Abb. 5 sind die wichtigsten Vertreter der Tetracyclin-Antibiotika zusammengefaßt.

Chlortetracyclin war das erste isolierte Antibiotikum der Tetracyclinreihe und wurde 1947 von B.M.

Duggar in den Lederle Laboratories entdeckt. Er erkannte das als Aureomycin bezeichnete Chlortetra-

cyclin als eine neue von Bodenbakterien (Actinomyceten = Strahlenpilze) erzeugte antibiotische Sub-

stanz und isolierte sie daraus [57]. „Terramycin“ wurde 1950 von FINLAY et al. bei der Firma Chas.

Pfizer and Co. aus Streptomyces rimosus isoliert und strukturell als Oxytetracyclin aufgeklärt. Tetra-

cyclin wurde 1953 entdeckt und zunächst partialsynthetisch durch katalytische Hydrierung von dem

als Chlortetracyclin identifizierten Aureomycin hergestellt.

Substanz Abkürzung R1 R2 R3 R4

Tetracyclin TC H OH CH3 H

Oxytetracyclin OTC H OH CH3 OH

Chlortetracyclin CTC Cl OH CH3 H

Desmethyl-

chlortetracyclin DMCTC Cl OH H H

Doxycyclin DC H H CH3 OH

Rolitetracyclin RTC H OH CH3

Minocyclin MC N(CH3)2 H H H

Abb. 5: Struktur der Tetracyclin-Derivate [48, 49]

Die erste Totalsynthese des DL-6-Desmethyl-6-desoxytetracyclin gelang Woodward und einer Arbeit-

gruppe der Firma Chas. Pfizer and Co. im Jahre 1962. Tetracyclin wurde erstmals im Jahre 1968 von

Muxfeldt synthetisiert. Aufgrund des Aufwandes der Totalsynthesen haben diese keinen Eingang in

die industrielle Herstellung finden können. Die meisten modifizierten Tetracyclinderivate werden da-

her partialsynthetisch aus den fermentativ erhältlichen Grundtetracyclinstrukturen gewonnen [58, 59,

3 Theoretische Grundlagen

60]. Chemische Modifikation von den klassischen Tetracyclinen dienen dazu, die pharmakologischen

Eigenschaften zu verbessern. Dazu gehören Rolitetracyclin, Doxycyclin und Minocyclin.

3.2.2 Struktur-Wirkungs-Beziehungen von Tetracyclinen

Für die antibiotische Wirkung spielt die Struktur der Tetracycline eine wichtige Rolle. Eine grundle-

gende strukturelle Voraussetzung für eine antibiotische Wirksamkeit ist die lineare Anordnung der

vier Ringe und die beiden chromophoren Keto-Enol-Systeme im Ring A und den Ringen BCD (siehe

Abb. 5). Alle Derivate mit weniger als vier Ringen sind wirkungslos. Der Austausch der Dimethyla-

minogruppe durch eine primäre Aminogruppe beeinflußt die Wirksamkeit nicht, hingegen führen alle

anderen Veränderungen der basischen Dimethylaminofunktion am Ring A zu einem Verlust der anti-

biotischen Wirkung. Während der Amidwasserstoff sich durch eine Methylgruppe ersetzen läßt, wir-

ken sich größere Reste negativ aus. Die Konfiguration an den Asymmetriezentren C4, C4a und C12a

ist essentiell, dagegen kann sie an C5, C5a und C6 variiert werden. Der hydrophobe Teil des Moleküls

von C5 bis C9 ist in vielfältiger Weise modifizierbar, die zu Produkten mit größerer Stabilität, höherer

Wirkungsintensität und günstigeren pharmakokinetischen Eigenschaften führen [37, 48]. Im Gegen-

satz zu den Tetracyclinen selbst zeigen die Anhydrotetracycline als Dehydratationsprodukte, siehe

Kap. 3.5.3.4, einen vollkommen anderen Wirkungsmechanismus. Sie interferieren mit der Cytoplas-

mamembran und verursachen so Zellschäden, die zur Lyse und damit zum Tod der Zelle führen. Ihre

Wirkung ist also bakterizid. Die Verabreicherung von Anhydrotetracyclinen führt zu schweren Ne-

benwirkungen aufgrund ihrer mangelnden Spezifität infolge ihrer Interferenz mit der Cytoplasma-

membran prokaryotischer und eukaryotischer Zellen [61, 62].

3.3 Pharmakologie der Tetracycline

Die verschiedenen Tetracyclin-Derivate unterscheiden sich in ihrer enteralen Resorbierbarkeit, ihrer

Plasmaeiweißbindung, der Eliminationsgeschwindigkeit, dem Ausscheidungsweg und ihrer Neigung

zur Komplexbildung. Während CTC, TC, OTC und DMTC nur unvollständig resorbiert werden, eine

geringe Plasmaproteinbindung und Serumhalbwertzeiten zeigen, ergibt sich für Doxycyclin und Mi-

nocyclin aus ihren vergleichsweise hydrophoberen Eigenschaften eine fast vollständige, enterale Re-

sorption, eine höhere Eiweißbindung, eine bessere Diffusion in die Gewebe und eine längere Wir-

kungsdauer [48, 49, 63]. Das Wirkungsoptimum liegt für TC, OTC, CTC und DC in einem pH-

Bereich von 6,1-6,6, für DMTC zwischen pH 6,6 - 7,3 [2, 50, 337]. Die Komplexbildungseigenschaf-

ten der Tetracycline führen sowohl beim Menschen als auch bei Tieren zur Anreicherung als Calcium-

phosphat-Komplexe in Gewebe, die reich an Ca2+-Ionen sind, wie Knochen und Zähnen. Insbesondere

bei Kindern in der Wachstumsphase können hohe Tetracyclindosen zu Wachstumsverzögerungen und

Schädigungen von Knochen und Zähnen führen [37, 64, 65]. Die Menge der eingelagerten Tetracycli-

ne nimmt mit steigender Dosis zu, wobei als limitierender Faktor die mögliche Resorptionsrate zu

berücksichtigen ist, was insgesamt zu keinem linearen Zusammenhang zwischen verabreichter Dosis

und Tetracyclingehalt in den Knochen führt. Im humanmedizinischen Bereich wird wegen der günsti-

gen pharmakokinetischen Eigenschaften bei gleichwertiger antibiotischen Wirksamkeit Doxycyclin

der Vorzug gegeben [129, 337].

Im veterinärmedizinischen Bereich kommen überwiegend die Tetracyclin-Derivate TC, OTC und CTC

zur Anwendung, wobei aufgrund der Behandlung ganzer Tierbestände in der Massentierhaltung die

3 Theoretische Grundlagen 15

Applikation meist oral über das Futter erfolgt. Nach oraler Gabe werden Serummaxima von TC, OTC

und CTC nach 3-4 Stunden, von DMTC erst nach 5-6 Stunden erreicht. Eine bei oraler Gabe gleich-

zeitige Aufnahme von Metallionen wie Ca2+ und Mg2+ mit der Nahrung führt zu einer Komplexierung

der Tetracycline und verhindert die Resorption. Die Unsicherheit der Resorption aus dem Magen-

Darm-Kanal kann durch parenterale (intravenös, intramuskulär) Gabe vermieden werden, wobei eine

Reduzierung der Dosis auf 25 % der oralen Dosis möglich ist. Es werden schnell und zuverlässig hohe

Serumkonzentrationen erreicht. Zur intravenösen Anwendung eignen sich die in wäßrigen Lösungs-

mittel gut löslichen hydrophilen Wirkstoffe wie Rolitetracyclin und Oxytetracyclin. Von einer intra-

muskulären Gabe ist aufgrund von Entzündungen des Gewebes und daher schmerzhaften Anwendung

abzusehen [48, 337]. Neben der intravenösen Anwendung von Tetracyclinen spielt trotz schlechterer

Resorption die orale Applikation aufgrund der einfach durchführbaren Anwendung die größte Rolle.

Hohe Konzentrationen werden in Leber, Lungen, Niere, Milz und Skelettmuskulatur erreicht, geringe

Konzentrationen in Fettgewebe und Speichel [48]. Während Tetracycline die Placenta passieren und in

die Muttermilch übergehen, können sie die Blut-Hirn-Schranke nicht passieren [2].

Die pharmakokinetischen Eigenschaften hängen dabei stark vom Tetracyclinderivat ab, siehe Tab. 1

[2, 66-72].

Tab. 1: Pharmakokinetische Kenndaten der Tetracycline bei Tieren [2, 48, 49, 50]

Wirkstoff

Enterale

Resorption

[%]

Eliminations-

halbwertzeit

[h]

Proteinbindung

[%]

Ausscheidung

im Urin [%]

Tetracyclin 50-80 5-10 40-80 50-85

Chlortetracyclin 30 5-9 45-60 20

Oxytetracyclin 60 8-11 30-40 30

Doxycyclin 70-90 8-18 80-90 40

Minocyclin 90 12-18 70-80 10-15

In den veterinärmedizinischen Lehrbüchern gibt es widersprüchliche Angaben über eine mögliche

Metabolisierung von Tetracyclinen. Während in einigen Lehrbüchern kaum von einer Metabolisierung

ausgegangen wird [2], wird in anderen Büchern angegeben, daß Tetracycline in unterschiedlichem

Ausmaß zwischen 30 % und 50 % im tierischen Organismus „metabolisiert“ und inaktiviert werden

[48]. Es erfolgt jedoch keine genaue Angabe über mögliche Metabolisierungsreaktionen. Daher ist

davon auszugehen, daß bei den in veterinärmedizinischen Lehrbüchern angegebenen pharmakokineti-

schen Kenndaten [2, 48, 49, 50] mögliche Metabolite wie Epimere, Isomere und Anhydroverbindun-

gen unberücksichtigt bleiben. In neueren Veröffentlichungen von KENNEDY et al. [143] und

ZURHELLE et al. [178, 229] werden als Hauptmetabolite von Chlortetracyclin neben dem Epimeren

auch iso-CTC und e-iso-CTC beschrieben, wobei jedoch bis heute Uneinigkeit über die Mechanismen

der Metabolisierung herrscht. Während einige Autoren eine rein pH-Wert abhängige Inaktivierung

ohne enzymatischen Einfluß beschreiben [73, 337], gehen andere Arbeitgruppen wie ZURHELLE et al.

von einer tatsächlichen enzymatischen Metabolisierung aus [153].

3 Theoretische Grundlagen

Die den Tieren applizierten Tetracycline werden aber auch in hohem Maße unverändert wieder ausge-

schieden [73, 74]. Die Exkretion der Tetracycline erfolgt dabei durch glomuläre Filtration über die

Niere und über die Galle. In der Galle sind die Konzentration hoch und betragen bis zum 10fachen der

Plasmawerte. Die über Faeces ausgeschiedenen Tetracycline stammen aus der Galle und, insbesondere

bei oraler Gabe, aus dem nicht resorbierten Anteil. Die Ausscheidungsquoten für Urin sind unabhän-

gig vom pH-Wert des Urins. Nach intravenöser Injektion werden nur 6 % der applizierten Wirkstoffe

über Faeces und 20-70 % über Urin, dagegen nach oraler Gabe nur 10-25 % über Urin und zwischen

50 % und 70 % über Faeces ausgeschieden [48, 337]. Maximale Urinspiegel werden bei einer Einzel-

dosierung nach 8-9 h erreicht.

3.4 Resistenzmechanismen, Gefährdung des Verbrauchers und

Rechtliche Bewertung

3.4.1 Resistenzmechanismen

3.4.1.1 Definition und Möglichkeiten der Resistenzentstehung

Mikroorganismen entwickeln Antibiotikaresistenzen als Teil ihres genetischen Anpassungsmechanis-

mus an wechselnde Umweltbedingungen unter Dauereinwirkung subletaler Antibiotikakonzentratio-

nen. Ein pathogener Mikroorganismus wird dann als resistent bezeichnet, wenn die in vitro ermittelte

minimale Hemmkonzentration (MHK) höher ist als die in vivo am Infektionsort erreichbare Serum-

bzw. Gewebekonzentration [48]. Ein urprünglich empfindlicher Keim wird also durch den Wirkstoff

in Höhe der MHK nicht mehr inhibiert. Während einer Antibiotikabehandlung erreicht die Wirksub-

stanz die Mikroorganismen in Form eines Konzentrationsgradienten. Nur im sogenannten selektiven

Bereich werden sensitive Bakterien abgetötet bzw. gehemmt [75]. In subinhibitorischen Konzentrati-

onsbereichen finden Mikroorganismen ideale Bedingungen vor, um verschiedene Resistenzstrategien

zu entwickeln. Eine Resistenz entwickelt sich dann, wenn Genkomplexe vorhanden sind, die eine Re-

sistenzsteigerung bewirken oder wenn Organismen Fremdgene aufnehmen und exprimieren. Ist ein

diesbezüglicher Selektionsdruck vorhanden, so erhalten diese resistenten Krankheitserreger Wach-

stumsvorteile und können sich dementsprechend ausprägen. Durch die Anwendung von Chemothera-

peutica bei Mensch oder Tier wird dieser Selektionsdruck ausgeübt, so daß jede Anwendung antibak-

teriell wirksamer Substanzen Resistenzentwicklungen fördert [2]. Ein allgemeines Dogma besagt, daß

Resistenzen solange erhalten bleiben, wie entsprechende Antibiotika einwirken und verloren gehen,

wenn kein Selektionsdruck mehr vorliegt. In vielen Fällen zeigt sich jedoch die Ungültigkeit dieses

Dogmas. So ist heute eine bekannte Tatsache, daß viele Resistenzen auch nach Absetzen des Antibio-

tikums nicht bzw. kaum verschwinden [13].

Der Begriff der Resistenz beschreibt eine graduell variierende Unempfindlichkeit eines Keimes ge-

genüber Antibiotika, wobei das Resistenzniveau abhängig ist vom Bakterium selbst, vom Resistenz-

mechanismus und von der Art des Antibiotikums. Grundsätzlich lassen sich intrinsische und erworbe-

ne Resistenzen unterscheiden. Eine intrinsische, also natürliche Resistenz basiert auf den spezifischen

Eigenschaften eines Antibiotikums selbst. So sind z. B. Penicilline gegen gramnegative Bakterien

kaum wirksam, da sie die äußere Zellmembran nicht passieren können [2]. Durch solche Eigenschaf-

ten entstehen Lücken im Wirkungsspektrum eines Antibiotikums. Im Gegensatz dazu beruhen erwor-

3 Theoretische Grundlagen 17

bene Resistenzen auf Mutationen des chromosomalen oder extrachromosomalen Erbgutes oder dem

Erwerb resistenzvermittelnder mobiler genetischer Elemente [13]. Zu den erworbenen Resistenzen

gehören die Primär- und Sekundäresistenz sowie die infektiöse übertragbare Resistenz. Primärresi-

stent sind Einzelorganismen aus einer Antibiotika-empfindlichen Kultur, die ohne vorherigen Kontakt

mit einem Antibiotikum eine verringerte oder fehlende Empfindlichkeit zeigen. Die sekundäre und

infektiös übertragbare Resistenz tritt durch Selektion und Mutation unter Antibiotikaeinwirkung auf

[48, 50]. Die übertragbare Resistenz basiert auf der Übertragung genetischen Materials von einer Bak-

terienzelle auf eine andere. Diese Resistenz geht von sogenannten Resistenz (R)-Faktoren aus, die

auch als Resistenzplasmide bezeichnet werden. Die größeren dieser Plasmide enthalten neben den r-

Genen (Resistenzgenen) einen Resistenzübertragungsfaktor (RTF, Resistance Transfer Factor). Die

RTF-Region des Plasmids ermöglicht die interzelluläre Übertragung. Auf einem R-Faktor können

mehrere Gene für eine Resistenz gegen verschiedene Antibiotika lokalisiert sein, so daß dann eine

multiple Resistenz vorliegt [76]. Der Transfer eines solchen Plasmids führt dann zur Weitergabe der

multiplen Resistenz. Durch enzymatische Inaktivierung des Antibiotikums können auch Resistenzei-

genschaften vermittelt werden. Hierfür verantwortlich sind ebenfalls die R-Faktoren, da die in diesen

Plasmiden enthaltenen r-Gene Enzyme codieren, die bestimmte Medikamente durch chemische Modi-

fikation inaktivieren, z.B. durch Phosphorylierung, Acetylierung oder hydrolytische Spaltung [77].

Eine weitere Möglichkeit der Resistenzentstehung besteht in einer verminderten intrazellulären Kon-

zentration des Antibiotikums, hervorgerufen durch eine verminderte Wirkstoffaufnahme oder einen

verstärkten Efflux durch die Zytoplasmamembran. Resistenz kann also auf unterschiedliche Art und

Weise vermittelt werden, wobei in der Zelle oft eine Kombination verschiedener Resistenzmechanis-

men vorliegt: Die durch R-Faktoren übertragenen Resistenzeigenschaften können nach mehreren Ge-

nerationen in einer Population durch Austausch von Plasmiden wieder verloren gehen.

Die aus einer Resistenzentwicklung gegenüber einem ersten Antibiotikum resultierende gleichzeitige

Resistenz gegen ein zweites oder mehrere andere Antibiotika wird als Kreuz- oder Parallelresistenz

bezeichnet. Eine Kreuzresistenz zwischen Antibiotika gibt einen Hinweis auf ähnliche chemische

Struktur oder einen ähnlichen Wirkungsmechanismus [48, 50]. Kreuzresistenz zeigen dementspre-

chend verwandte Substanzen einer Antibiotikaklasse. Zwischen den klassischen Tetracyclinen Tetra-

cyclin, Oxytetracyclin, Chlortetracyclin und Demethylchlortetracyclin besteht vollständige Kreuzresi-

stenz [47, 48, 50, 78].

3.4.1.2 Resistenzeigenschaften gegenüber Tetracyclinen

Resistenzeigenschaften gegenüber Tetracyclinen können sowohl chromosomal als auch extrachromo-

somal, auf R-Plasmiden in Form von DNA-Nukleotidsequenzen, bedingt sein. Bezüglich der bakteriel-

len Resistenz gegenüber Tetracyclinen sind bisher drei Mechanismen bekannt.

Das wichtigste Resistenzkriterium ist die Reduktion der intrazellulären Tetracyclinkonzentration, die

entweder durch eine verminderte Permeabilität der Zytoplasmamembran oder durch einen verstärkten

Efflux aus der Zelle verursacht werden kann [79]. Im ersteren selteneren Fall gelangen die Tetracycli-

ne erst gar nicht ins Zellinnere. Auslöser für den wichtigeren zweiten Mechanismus sind membrange-

bundene Resistenzgene, die einen aktiven energieabhängigen Transport aus der Zelle bewirken und

damit den Wirkmechanismus umkehren. Die Wirkung von Tetracyclinen beruht darauf, daß eine Ak-

kumulation von Tetracyclinen im Zellinneren stattfindet, so daß schließlich die Proteinbiosynthese

völlig zum Erliegen kommt, siehe Kap. 3.1.3.3. Entwickelt die Zelle Mechanismen, mit der das Tetra-

3 Theoretische Grundlagen

cyclin wieder aus der Zelle heraustransportiert werden kann, so wird die Wirkung der Tetracycline

aufgehoben.

Der Schutz der Ribosomen vor einem Angriff der Tetracycline wurde erstmals von BURDETT et al.

beschrieben [80]. Er entdeckte, daß resistente Streptokokken ein Protein produzieren, welches die

bakteriellen Ribosomen vor der Tetracyclineinwirkung bewahrt. Der genaue Mechanismus ist nicht

bekannt, es wird jedoch vermutet, daß eine Funktion als Tetracyclin-resistenter Verlängerungsfaktor

oder die kompetitive Hemmung der Bindung von Tetracyclin an das Ribosom eine Rolle spielt. Eine

Inaktivierung der Tetracycline durch modifizierende Enzyme ist relativ selten, erscheint aber möglich.

GUINEY et al. übertrugen ein Resistenzgen von Bacteroides fragilis auf Escherichia coli, mit der Fol-

ge, daß diese Stämme Tetracycline inaktivieren können [81]. SPEER et al. zeigten, daß dieses Protein

Tetracyclin in Anwesenheit von Sauerstoff und NADPH chemisch verändert [82].

Untersuchungen von Tetracyclinen und deren Umwandlungs- und Abbauprodukten auf eine Resi-

stenzentwicklung geben Hinweise darauf, daß die Intensität der antibiotischen Aktivität nicht zwangs-

läufig mit dem Ausmaß der Resistenzausbildung konform geht. So ist die Bindungsfähigkeit von epi-

Tetracyclin an den entsprechenden Tet Repressor um den Faktor 300 höher als von Tetracyclin selbst.

Das Anhydrotetracyclin zeigt zwar eine geringere antibiotische Aktivität, aber eine 30-fach höhere

Bindungsfähigkeit an den Tet Repressor [83, 84].

3.4.2 Gefährdung des Verbrauchers durch den Einsatz von Antibiotika

Um das Risiko einer Resistenzentstehung beim Menschen durch den Einsatz von Antibiotika in der

landwirtschaftlichen Tierhaltung abschätzen zu können, ist es notwendig, mögliche Beeinflussungen

und Interaktionen zwischen Mensch, Tier und Umwelt zu berücksichtigen. Obwohl schwer zu beurtei-

len ist, inwieweit die in der Veterinärmedizin eingesetzten Antibiotika zur allgemeinen Resistenzent-

wicklung beitragen, gibt es Untersuchungen, die einen ursächlichen Zusammenhang zwischen resi-

stenten vom Tier stammenden Erregern und Infektionskrankeiten beim Menschen belegen [85, 86].

Eine Resistenzentwicklung beim Menschen durch in der Tiermast eingesetzte Chemotherapeutica ist

auf zwei Wegen möglich. Zum einen kann eine direkte Übertragung resistenter Mikrorganismen statt-

finden, zum anderen ist durch Aufnahme von Antibiotikarückständen die Auslösung einer Resistenz-

bildung möglich. Im letzteren Fall ist das Tier lediglich das Übertragungsmedium von Antibiotika-

rückständen, Ort der Resistenzentstehung ist der Mensch selbst [13]. Die möglichen Gefährdungspo-

tentiale des Menschen durch die in der Tiermast eingesetzten Antibiotika sind in Abb. 6 dargestellt.

Bei der Aufnahme von Antibiotikarückständen ist die Übertragung durch tierische Lebensmittel in

Betracht zu ziehen [87, 88]. GROßKLAUS et al. berichten über die Entstehung plasmidbedingter Resi-

stenz bei sensibilisierten Personen nach dem Genuß penicillinhaltiger Milch [89].WOLTERSDORF et

al. weisen auf mögliche Antibiotikarückstände in Fleisch hin, die nach ungenügender Erhitzung erhal-

ten bleiben [87]. Darüber hinaus können nach veterinärmedizinischer Applikation die verabreichten

Antibiotika in aktiver Form über Urin und Faeces wieder ausgeschieden werden. Die ausgeschiedenen

Wirkstoffe und Metabolite können über den Austrag von Gülle auf landwirtschaftlich genutzte Felder

gelangen und dadurch aquatische und terrestrische Umweltkompartimente belasten. Es wird zuneh-

mend diskutiert, ob Arzneimittelrückstände in güllebeaufschlagten Böden für Nutzpflanzen bioverfüg-

bar sind und auf diesem Wege in die Nahrungskette eingetragen werden können [90-93]. Das Vor-

kommen, die Ausbreitung und der Abbau der in die Umwelt eingebrachten Antibiotika ist abhängig

3 Theoretische Grundlagen 19

von deren chemophysikalischen Eigenschaften [13]. Während bei einigen bisher untersuchten antibio-

tisch wirksamen Substanzen biologische Abbaubarkeit bzw. Photodegradation beobachtet wurde,

scheinen andere biologisch schwer abbaubar zu sein [25, 94]. Zu den schwer abbaubaren Antibiotika

gehören Cefotiam, Ciproflaxin, Sulfamethoxazole und Tetracycline. Über eine mögliche Resistenzent-

stehung hinaus sind durch die dauerhafte Aufnahme von Tetracyclinspuren auch mögliche Risiken wie

Allergien, Lichtdermatosen bzw. Photosensibilisierung, Schwindel, Gleichgewichtsstörungen sowie

die Unwirksamkeit oraler Kontrazeptiva zu nennen.

Abb. 6: Gefährdungspotentiale des Menschen durch den veterinärmedizinischen Einsatz von

Antibiotika

Eine Übertragung resistenter Mikroorganismen ist wie die Übertragung von Antibiotikarückständen

auch über kontaminierte tierische Lebensmittel sowie nach Gülleausbringung und Umwelteintrag

durch Trinkwasser und Pflanzen möglich [13, 95]. Darüberhinaus können resistente Mikroorganismen

auch über direkten Tierkontakt übertragen werden. Das Vorkommen resistenter Mikroorganismen

auch in aquatischen Systemen konnte bereits mehrfach belegt werden [96-98]. Allerdings ist nichts

über deren Bedeutung hinsichtlich einer Resistenzentwicklung bei Mensch oder Tier bekannt. Entge-

gen der allgemeinen Meinung, daß Resistenzen einzig bei Mensch und Tier gebildet werden können,

beschreiben FARNLEITNER et al. darüberhinaus die Möglichkeit einer in situ Resistenzentwicklung in

aquatischen Systemen [13]. Die im Wasser enthaltenen Antibiotika besitzen in bestimmten Anlagenbe-

reichen, in denen aufgrund des vorhandenen Konzentrationsgradienten subinhibitorische Konzentra-

tionen vorliegen, das Potential, mikrobielle Resistenzbildung im aquatischen Milieu zu fördern. Damit

können auch aquatische Systeme in bestimmten Bereichen zu einer verstärkten Resistenzgenerierung

beitragen.

Ein weiterer Beitrag zur Resistenzbildung wird von KAMPHUES et al. beschrieben [99]. Da im Be-

reich der landwirtschaftlichen Tierhaltung viele Tierarzneimittel über das Futter verabreicht werden,

besteht die Gefahr einer Arzneimittelverschleppung in den Tierbeständen. Die Herstellung von Misch-

Veterinärpharmaka

tierische Lebensmittel

Mensch

Tierkontakt

Antibiotikarückstände

Exkr

Gü

Umwelt

Schlachtung

resistente Keime

3 Theoretische Grundlagen

futter ist aus technischen Gründen (Nutzung desselben Mischers für antibiotikahaltiges und antibioti-

kafreies Mischfutter) ebenfalls eine potentielle Quelle für Wirkstoffverschleppung, wodurch es zu

Arzneimittelrückständen bei unbehandelten Schweinen kommen kann [100, 101]. Diese subtherapeuti-

schen Arzneimittelgehalte leisten in erhöhtem Maße einer Resistenzentwicklung Vorschub.

Aufgrund der dargestellten komplexen Resistenzproblematik und der vielfältigen Risikofaktoren für

den Verbraucher, kann basierend auf dem derzeitigen Wissensstand keine eindeutige Antwort auf die

Frage der Bedeutung des veterinärmedizinischen und landwirtschaftlichen Einsatzes von Antibiotika

und der daraus resultierenden Resistenzentwicklung beim Menschen gegeben werden.

3.4.3 Rechtliche Bewertung von pharmakologisch wirksamen Stoffen in

Lebensmitteln tierischen Ursprungs

Aufgabe des Gesetzgebers und der für die Lebensmittelüberwachung zuständigen Behörden ist, zu

gewährleisten, daß Lebensmittel keine gesundheitsbeeinträchtigenden Rückstandskonzentrationen

enthalten [102]. Nach § 4 des Fleischhygienegesetzes (FlHG) sind Rückstände Stoffe mit pharmakolo-

gischer Wirkung und deren Umwandlungsprodukte sowie von anderen Stoffen, die in Lebensmittel

übergehen und gesundheitlich bedenklich sein können [103]. Früher sind zur Vermeidung von Tier-

arzneimitteln in Lebensmitteln lediglich die Festsetzung und Einhaltung von Wartezeiten herangezo-

gen worden. Nach § 4 Abs. 12 des Arzneimittelgesetzes (AMG) ist die Wartezeit als die Zeit definiert,

innerhalb der bei bestimmungsgemäßer Anwendung von Arzneimitteln bei Tieren mit Rückständen

nach Art und Menge nicht unbedenklicher Stoffe in tierischen Lebensmitteln gerechnet werden muß

[104]. Die hieraus resultierende Forderung nach Rückstandsfreiheit tierischer Lebensmittel ließ sich

dabei mit dem schnellen Fortschritt der instrumentellen Analytik, die den Nachweis immer geringerer

Rückstandskonzentrationen ermöglicht, nicht mehr aufrechterhalten. So wurde diese Regelung im

Jahre 1990 durch die Einführung der Höchstmengenregelung innerhalb der EU abgelöst. Anstelle der

Forderung nach Rückstandsfreiheit ist vielmehr eine Rückstandsbewertung getreten. Wartezeiten wer-

den nach der Europäischen Arzneimittelbehörde (EMEA) durch den Zeitpunkt bestimmt, nach dem die

Rückstandskonzentration unterhalb eines zulässigen Höchstwertes liegt [105, 106].

Für einen wirksamen Verbraucherschutz müssen daher folgende Bedingungen erfüllt sein [102]:

• Beurteilung der Rückstände der in Tierarzneimitteln verwendeten pharmakologischen Wirkstoffen

• Bestimmung einer zulässigen für den Verbraucher ungefährlichen Aufnahmemenge sowie von

Höchstmengen für zum Verzehr bestimmte Nahrungsmittel

• Festlegung von Wartezeiten, um sicherzustellen, daß die von behandelten Tieren gewonnenen

Nahrungsmittel keine über den festgelegten Höchstwerten liegenden Rückstände enthalten

• Durchführung von Routinekontrollen, um zu gewährleisten, daß die Rückstandshöchstwerte nicht

überschritten werden und verbotene oder nicht zugelassene Stoffe keine Anwendung finden

Bereits bei der Zulassung eines Tierarzneimittels müssen innerhalb der EG folgende Voraussetzungen

erfüllt sein: Der Antragsteller hat den Nachweis der Qualität, der Unbedenklichkeit und der Wirksam-

keit des Arzneimittels zu erbringen [102]. Insbesondere der Nachweis der Unbedenklichkeit umfaßt

den Menschen als Verbraucher von Lebensmitteln tierischen Ursprungs, die Tierart, den Tierhalter,

den Tierarzt und seit 1992 vor allem auch Umweltaspekte. Darüberhinaus müssen für alle Nahrungs-

mittel tierischen Ursprungs nach der Verordnung Nr. 2377/90 EWG vom 26.06.1990 Höchstmengen

3 Theoretische Grundlagen 21

für Rückstände pharmakologisch wirksamer Stoffe, die in Tierarzneimitteln Anwendung finden, fest-

gesetzt werden [107]. Die Festlegung von Rückstandshöchstmengen ist EU-einheitlich geregelt und

wird von der EMEA vorgenommen. Die internationale Fachkommisson für Tierarzneimittel CVMP

(Comittee for Veterinary Medicinal Products) der EMEA beurteilt die meist von der pharmazeutischen

Industrie eingehenden Gutachten [116]. Diese Unbedenklichkeitsprüfung eines Tierarzneimittels er-

folgt in mehreren Stufen. Zunächst werden die durchgeführten pharmakologischen und toxikologi-

schen Studien, die insbesondere Untersuchungen zur Mutagenität, Toxizität, Cancerogenität und Tera-

togenität umfassen, bewertet. In der nächsten Stufe wird die Wirkstoffdosis ermittelt, die keine sub-

stanzspezifische Wirkung mehr hervorruft, also den „no-observed-effect-level“ (NOEL). Der NOEL

wird dann zur Berechnung des ADI-Wertes, der zulässigen täglichen Aufnahmemenge (acceptable

daily intake), herangezogen. Der ADI-Wert ist eine Rückstandsmenge, angegeben in g oder mg pro kg

Körpergewicht, die zeitlebens ohne erkennbares Risiko aufgenommen werden kann [108]. Aus dem

ADI-Wert wird unter Berücksichtigung der relativen Verteilung der Gesamtrückstände auf die eßbaren

Gewebe und die täglich verzehrte Menge dieser Gewebe die Rückstandshöchstwerte, MRLs (MRL =

maximum residue limit), in µg/kg für das jeweilge Zielgewebe abgeleitet. Da die verabreichten Sub-

stanzen im Stoffwechsel der Tiere verändert werden können, bezieht sich der festgesetzte MRL-Wert

immer auf einen geeigneten „Marker“. Dieser kann entweder die Ursprungssubstanz, ein Metabolit

oder auch die Summe aus beiden beinhalten.

Nach den Ergebnissen der MRL-Verfahren werden die pharmakologischen Wirkstoffe in die Anhänge

I bis IV der Verordnung Nr. 2377/90 EWG eingeordnet [109]. Bei Lebensmittel liefernden Tieren

dürfen seit dem 1.1.2000 in der gesamten EU nur noch Arzneimittel angewendet werden, die aus-

schließlich Wirkstoffe enthalten, die in den Anhängen I bis III dieser Verordnung aufgeführt sind

[110]. Für Stoffe in Anhang I ist die Bewertung und Festlegung endgültiger MRL-Werte abgeschlos-

sen. Für Stoffe im Anhang II gelten aufgrund ihrer für den Verbraucher in allen Konzentrationen ein-

gestuften Unbedenklichkeit keine MRL-Werte. Im Anhang III sind Stoffe mit vorläufigen MRL-

Werten mit einer Gültigkeit von maximal fünf Jahren aufgeführt. Gemäß § 15 Abs. 1 des Lebensmit-

tel- und Bedarfsgegenständegesetzes (LMBG) ist es verboten, vom Tier gewonnene Lebensmittel in

den Verkehr zu bringen, wenn Stoffe mit pharmakologischer Wirkung nachweisbar sind, die die fest-

gesetzten Höchstmengen überschreiten [111]. Für Stoffe in Anhang IV können keine für den Verbrau-

cher unbedenklichen Höchstmengen festgelegt werden. Ihre Anwendung bei Lebensmittel liefernden

Tieren ist daher verboten [112, 113]. Um eine einheitliche Beurteilung nachweisbarer Rückstände in

Lebensmitteln zu gewährleisten, wird eine EU-weite Festlegung der minimal zu bestimmenden Wirk-

soffmenge angestrebt, wobei unterhalb dieses Grenzwertes ein Lebensmittel tierischer Herkunft als

rückstandsfrei gilt. Von den Europäischen Gemeinschaften sind für einige Substanzen bereits Richtli-

nien verfaßt worden, in denen minimal zu erreichende Wirkstoffkonzentrationen, auch MRPL-Werte

(minimum required performance limits) angegeben werden, welche als Ergänzung der Richtlinie

2002/657/EC zu verstehen sind [114].

Tetracycline waren bis zum Jahre 1976 nach dem Futtermittelrecht als Leistungsförderer in Form von

Futtermittelzusatzstoffen für Saugferkel zugelassen. Aufgrund mehrfacher Diskussionen über die

Möglichkeit einer Resistenzentwicklung bei humanpathogenen Mikroorganismen wurde die subthera-

peutischer Anwendung von Tetracyclinen über das Futter EU-weit gestoppt. Seitdem werden Tetracy-

cline nur noch nach tierärztlicher Verschreibung auf Grundlage des Arzneimittelrechtes angewendet

[106, 107, 115]. Nach dem Lebensmittelrecht galt in der Bundesrepublik Deutschland bis zum Jahre

1992 ein „Beurteilungswert“ von 10 µg/kg Muskulatur, der lediglich zur Entscheidung diente, ob die

3 Theoretische Grundlagen

nach dem Arzneimittelrecht festgelegten Wartezeiten eingehalten wurden. Diese Regelung wurde

durch die Einführung der strengeren EU-weiten Höchstmengenregelung abgelöst. Basierend auf einem

NOEL von 2 mg/Person/Tag wurde daraus unter Zugrundelegung der gleichen antimikrobiellen Wirk-

intensität ein für alle Tetracycline gültiger ADI-Wert von 0-3 µg/kg/Tag ermittelt [116]. In der Ver-

ordnung (EWG) Nr. 2377/90 sind daraus für die Tetracycline CTC, TC, OTC und DC folgende MRL-

Werte festgelegt worden, die für alle zur Lebensmittelerzeugung genutzten Tiere gelten (Tab. 2)

[109].

Tab. 2: MRL-Werte für die Tetracycline CTC, TC, OTC und DC in unterschiedlichen Matrices

nach VO (EWG) Nr. 2377/90

Zielgewebe Muskulatur Leber Niere Milch Eier

MRL [µg/kg] 100 300 600 100 200

Diese Werte beziehen sich auf die Summe von Muttersubstanz und ihrem 4-Epimeren und gelten für

CTC, TC, OTC und DC allein oder in Kombination. Die WHO schlug aufgrund weitergehender Studi-

en 1999 vor, diese Werte zu verdoppeln [117]. In den USA gelten bereits deutlich höhere von der

FDA festgelegte MRL-Werte für eßbares Gewebe vom Rind, von nicht laktierenden Milchkühen, Käl-

bern, Schweinen, Schafen und Geflügel, die für Muskulatur bei 2000 µg/kg, für Leber bei 6000 µg/kg

und für Niere und Fett bei 12000 µg/kg liegen [118, 170].

3.5 Eigenschaften der Tetracycline

3.5.1 Physikalische und chemische Eigenschaften

Tetracycline sind gelbe, kristalline, geruchlose Substanzen. Die UV-Spektren der Tetracycline sind

charakteristisch und vom pH-Wert anhängig. Der BCD-Chromophor, siehe Abb. 5, absorbiert bei 225,

285, 320 und 360 nm, der A-Chromophor bei 260 nm. Eine Bande bei 275 nm setzt sich aus mehreren

Absorptionen zusammen. OTC und TC haben zusätzlich eine Bande bei 360 nm, CTC bei 370 nm [37,

57], zu dem nur das BCD-Ringsystem beiträgt, wobei dieses Absorptionsmaximum allerdings eine

deutlich geringere Intensität zeigt als das bei 275 nm.

Die freien Basen der Tetracycline sind in wäßriger Lösung im physiologischen pH-Bereich nur sehr

wenig löslich (ca. 1 mg/mL) [49, 37, 57]. Aufgrund der sauren Gruppen und des basischen Dimethy-

lamino-Restes besitzen sie amphotere Eigenschaften und bilden mit Säuren und Basen in Wasser lösli-

che, stabile Salze. Insbesondere die Tetracyclin-Hydrochloride zeigen als Festsubstanz eine hohe Sta-

bilität. Der pH-Wert der rein wäßrigen Lösungen liegt zwischen 2-3 [50, 37, 57]. Die freien Basen

sowie die Hydrochloride sind in Alkoholen gut, in anderen organischen Lösungsmitteln weniger gut

löslich.

Tetracycline sind in wäßrigen Lösungen instabil und verlieren rasch einen Teil oder die gesamte anti-

biotische Wirksamkeit. Die Stabilität in wäßrigen Lösungsmitteln hängt in hohem Maße vom pH-Wert

und der Temperatur ab und ist für die einzelnen Tetracycline sehr unterschiedlich. Im sauren bis neu-

tralen Milieu sind TC und OTC deutlich stabiler als CTC. Während OTC im alkalischen Medium die

höchste Stabilität zeigt, ist CTC besonders alkaliempfindlich. DMTC ist wie auch die anderen 6-

3 Theoretische Grundlagen 23

Desmethyltetracycline im Vergleich zu den anderen Tetracyclinen auch bei extremen pH- und Tempe-

raturverhältnissen am stabilsten [119-122].

Tetracycline reagieren als Säuren mit einem pKa1-Wert von 3,3 aufgrund der OH-Gruppe am C-3-

Atom [49, 123]. Eine zweite Deprotonierung erfolgt an der OH-Gruppe des C-12-Atoms der vinylogen

Carbonsäurestruktur (pKa2-Wert = 7,6). Basische Eigenschaften beruhen auf dem Dimethylamino-

Restes, so daß der dritte pKa3-Wert von 9,7 einem protonierten N-4-Atom zuzuordnen ist [124, 125].

DUARTE et al. ordnen einen weiteren pKa4-Wert von 12 der phenolischen OH-Gruppe am C-10-Atom

zu [126].

In Abhängigkeit von den Substituenten, der Metallkomplexierung und dem Lösungsmittel, insbeson-

dere dem pH-Wert des Lösungsmittels, können Tetracycline in zwei unterschiedlichen Konformatio-

nen vorliegen. In saurem und neutralen Medium nehmen Tetracycline eine „twisted“ Konformation

an, bei der die protonierte Dimethylaminogruppe aus sterischen Gründen oberhalb des BCD-

Ringsystems liegt. In basischem Milieu oder nichtwäßrigen Lösungsmitteln verschiebt sich das

Gleichgewicht zu einer „extended“ Konformation, wobei die Dimethylaminogruppe unterhalb des

planaren BCD-Ringsystems liegt [127]. Möglicherweise beeinflußt die Konformation auch die phar-

makokinetischen Eigenschaften der Tetracycline [124, 128].

3.5.2 Komplexbildung

Tetracycline zeigen eine große Tendenz zur reversiblen Bildung antibiotisch inaktiver Komplexe mit

Kationen und Anionen sowie nieder- und hochmolekularen Stoffen (siehe Tab. 3) [37]. Während die

hydrophoben Tetracycline Doxycyclin und Minocyclin kaum komplexieren, neigen die hydrophileren

Tetracycline OTC, TC und Rolitetracyclin stark, CTC und DMTC sehr stark zur Komplexierung

[129].

Tab. 3: Komplexbildner für Tetracycline

Metall-Kationen Fe2+/3+, Cu2+, Ni2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Mg2+, Ca2+, Be2+, Al3+, Zr3+, Zr4+

Anionen Phosphat, Citrat, Salicylat, ß-Hydroxybenzoat

Neutralstoffe Coffein, Harnstoff, Thioharnstoff, Polyvinylpyrrolidon

Makromolekulare

Substanzen Serumalbumine, Lipoproteine, Globuline, RNA

In Abhängigkeit von der Art und Ladung des Kations und dem pH-Wert der Lösung bilden Tetracy-

cline mit Metall-Kationen Komplexe im stöchiometrischen Metall:Ligand-Verhältnis von 1:1, 2:1 und

1:2 [130-134]. Unterhalb pH 3 komplexieren Tetracycline nicht. Im pH-Bereich zwischen 3 und 7,5

bindet das Phenol-Diketon-System der Ringe BCD ein Kation. Oberhalb von pH 7,5 wird die Di-

methylaminogruppe deprotoniert und es kann so ein weiteres Kation von dieser Gruppe und der dazu

cis-ständigen 12a-Hydroxygruppe gebunden werden. Anhydrotetracycline, 4-epi-Tetracycline, deren

4- und 12a-Substituenten trans-ständig sind, sowie die iso-Tetracycline (zur Bildung von Abbau- und

Umwandlungsprodukten von Tetracyclinen siehe Kap. 3.5.3.1-3.5.3.2) bilden nur 1:1-Komplexe [37,

124, 135]. Oxytetracyclin bildet oberhalb pH 7 aufgrund ihres zusätzlichen Liganden mit Metallkatio-

nen zwischen der 5- und 12a-Hydroxygruppe ein Chelat.

Tetracyclinkomplexe mit Metallkationen zeigen charakteristische UV-Spektren und besitzen Maxima

3 Theoretische Grundlagen

bei 275 nm und in Abhängigkeit von der Metallkationenkonzentration zwischen 370-390 nm. Eine

Besonderheit fanden WESSELS et al., die die UV-Spektren von TC-Komplexen mit unterschiedlichen

Ca2+-Konzentrationen untersuchten. Sie fanden zwei isosbestische Punkte, einen bei 366 nm für ein

molares Verhältnis TC: Ca2+ ≥ 15,8 und einen zweiten bei 382 nm für TC: Ca2+ < 15,8, d.h. trotz Ver-

änderung der Ca2+-Konzentration blieb der Extinktionskoffizient bei diesen Wellenlängen gleich

[124]. Darüberhinaus zeigen Tetracycline eine Fluoreszenz, die durch Komplexierung mit Kationen

verstärkt wird, was zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Tetracyclinen ausgenutzt wer-

den kann.

Mit Anionen wie Phosphat und Citrat sowie Naturstoffen wie Coffein und Harnstoff bilden Tetracycli-

ne schwache Komplexe, die die Löslichkeit der Tetracycline erhöhen. Die reversible Bindung der Te-

tracycline an makromolekulare Substanzen im Blut und Gewebe ist von großer Bedeutung für die

Phamakokinetik und die Wirksamkeit im Körper. Solche Gleichgewichte sind mit Ausnahme der

Plasmaproteinbindung, die durch Methoden wie Dialyse, Ultrafiltration und Elektrophorese bestimmt

werden können, schwer quantitativ zu erfassen. Tetracycline binden sowohl an Albumin, dem Haupt-

protein des Serums, als auch an Globuline und Lipoproteine. Die Proteinbindung ist pH-Wert- und

Temperaturabhängig. Der Einfluß der Serumbindung auf die chemotherapeutische Wirksamkeit ist bis

heute nicht bekannt [37]. Ein positiver Effekt einer hohen, reversiblen Eiweißbindung an Serumpro-

teine könnte in ihrer Transportfunktion für den Wirkstoff in das Gewebe gesehen werden. Dennoch

gilt nach bisherigem Kenntnisstand, daß nur das ungebundene Antibiotikum in der unmittelbaren Um-

gebung des Bakteriums im infizierten Bereich eine antibiotische Wirkung ausübt [50].

3.5.3 Umwandlungs- und Abbaureaktionen

Tetracycline gehen in Lösung in Abhängigkeit vom Lösungsmittel, von der Temperatur und insbeson-

dere vom pH-Wert eine Reihe von Abbau- und Umwandlungsreaktionen ein, wobei deutliche Unter-

schiede zwischen den einzelnen Vertretern dieser Substanzklasse zu beobachten sind [50, 57]. Unter

den Umwandlungsreaktionen werden Isomerisierungen verstanden, die zu einer Veränderung der Kon-

figuration bei gleicher Summenformel führen. In der Literatur beschränkt sich üblicherweise der Be-

griff Isomerisierung auf die alkalische Umwandlung der Tetracycline zu den iso-Tetracyclinen und

wird so von der Epimerisierung und Keto-Enol-Tautomerie unterschieden. Zum leichteren Verständnis

werden diese in der Literatur konventionell verwendeten Begriffsbestimmungen übernommen. Neben

diesen Umlagerungsreaktionen können Tetracycline einer Dehydratation, also einer Abbaureaktion,

unterliegen.

3.5.3.1 Epimerisierung

In schwach saurer Lösung zwischen pH 2 und 6 unterliegen Tetracycline einer Isomerisierung am

asymmetrischen C-4-Atom (siehe Abb. 7). Derartige Isomerisierungen, bei denen eine Konfigurati-

onsänderung an einem von mehreren asymmetrischen C-Atomen stattfindet, werden als Epimerisie-

rung bezeichnet [49, 57, 136]. Diese Epimerisierung verläuft nach einer Reaktion erster Ordnung, ist

reversibel und wird durch Phosphat, Citrat, mehrwertige Kationen und Neutralstoffe wie Harnstoff

katalysiert [37, 137]. Sowohl die Reaktionsgeschwindigkeit als auch die Gleichgewichtslage hängt in

hohem Maße vom pH-Wert ab. Während unterhalb von pH 1,5 keine Epimerisierung stattfindet, stellt

sich je nach den gewählten Bedingungen das Gleichgewicht bei einer Epimerisierungsrate zwischen

40 % und 68 % ein, wobei die Geschwindigkeit mit steigendem pH-Wert zunimmt [138-140].

3 Theoretische Grundlagen 25

CONH2

OHO

CH3

H3C

CONH2

CH3

H3C

H+

CONH2

CH3

H3C

+ H+

- H+

Abb. 7: Epimerisierung von Chlortetracyclin in schwach saurer Lösung [136, 141]

Die epimeren Verbindungen weisen im Vergleich zu den jeweiligen Muttersubstanzen eine bessere

Löslichkeit in den meisten Lösungsmitteln auf und sind beständiger gegenüber saurer oder alkalischer

Einwirkung [57]. Darüberhinaus wirkt sich die Konfigurationsänderung an der C-4-Position erheblich

auf die antibiotische Aktivität aus. Verschiedene Autoren beschreiben entweder gar keine oder eine

um 90-99 % verminderte antibiotische Wirksamkeit der Epimere in Bezug auf die Muttersubstanz,

wobei unklar ist, ob die Epimere überhaupt antibiotisch wirksam sind oder die antibiotische Aktivität

auf eine Rückepimerisierung zurückzuführen ist [49, 57, 138].

Die Epimere zeigen in dem Wellenlängenbereich, in dem die chromophore Gruppe A ihren Beitrag

leistet, einen signifikanten Unterschied zum Ausgangsprodukt. Während eine Unterscheidung vom

Epimer zum Ausgangsprodukt bei einer Wellenlänge von 275 nm möglich ist, kann eine Quantifizie-

rung des Epimers auch über die Ausgangssubstanz im Wellenlängenbereich von 350-370 nm erfolgen,

da dieser Teil der Absorption trotz Epimerisierung unverändert bleibt [57, 137, 142].

3.5.3.2 Isomerisierung

Die alkalische Behandlung von Tetracyclinen mit einer Hydroxygruppe am C-6-Atom führt durch

Aufbrechen des Ringes C zu decyclisierten Produkten mit einer Lactonen entsprechenden Phthalid-

struktur, den iso-Tetracyclinen, über [37, 57, 122] (siehe Abb. 8). Während TC und OTC erst oberhalb

von pH 9-10 isomerisieren, zeigt sich CTC besonders labil und geht bereits ab pH 7 ins Isochlortetra-

cyclin über. Auch die Isotetracycline können analog den Tetracyclinen im schwach sauren Bereich

zwischen pH 2 und pH 6 zu den 4-epi-Isotetracyclinen epimerisieren. Bei der Isomerisierung der Te-

tracycline spielen mehrere konkurrierende Reaktionen wie Epimerisierung und Isomerisierung eine

Rolle. Bei der Isomerisierung im alkalischen Milieu handelt es sich um eine irreversible Reaktion, die

zu Produkten mit gar keiner oder sehr geringen antibiotischen Aktivität führt [143-146].

CONH2

ClHO CH3

OHOOHO

HN(CH3)2

CONH2

ClHO CH3

OHOOHO

HN(CH3)2

Chlortetracyclin (CTC) 4-e

Chlo

tet

clin

(

e-CTC

)

pH 2-6

4 4

3 Theoretische Grundlagen

Cl CH3

OO OH

Cl CH3

Cl OCH3

- H2O

+OH-

+ H2O

-OH-

Cl CH3

OOH

Abb. 8: Isomerisierung von Chlortetracyclin im alkalischem Milieu [136, 141]

Die Bildung von Isotetracyclinen geht einher mit einer pH-abhängigen Änderung der UV-Absorption

bei 320-380 nm. Isotetracycline besitzen nur im alkalischen Milieu eine UV-Absorption im Bereich

von 320-380 nm [137, 143]. Durch die Isomerisierung von Tetracyclinen wird die natürliche Fluores-

zenz deutlich verstärkt, was zur analytischen Bestimmung der Tetracycline ausgenutzt werden kann

[136, 147, 148].

3.5.3.3 Keto-Enol-Tautomerie

In Abhängigkeit vom pH-Wert und der Polarität des Lösungsmittels können Tetracycline verschiedene

tautomere Formen annehmen. Je nach Dissoziationsgrad sind unter Zugrundelegung von vier den pKa-

Werten entsprechenden Protonierungen bzw. Deprotonierungen 64 tautomere Formen möglich. Für

vollständig protonierte Tetracycline beschreiben DUARTE et al. neun verschiedene Tautomere, wobei

die tatsächliche Struktur als Gleichgewicht aller möglichen Keto-Enol-Tautomeren aufzufassen ist

[126].

Tautomere Umlagerungen können am C1-, C2- und C3-Atom des Ringes A, am C10-, C10a- und C11-

Atom der Ringe CD sowie am C11-, C11a- und C12-Atom der Ringe BC stattfinden. NAIDONG et al.

gelangen erstmals die chromatographische Trennung von Tautomeren des CTC und DC an Polymer-

phasen, wobei mittels NMR nachgewiesen werden konnte, daß diese Tautomerie am C11-, C11a- und

C12-Atom stattfindet (Abb. 9) [149, 150].

Durch Ausbildung der Ketoform kann das H-Atom des C11a-Atoms sowohl cis- als auch trans-ständig

zum H-Atom des C5a-Atoms stehen, woraus sich eine cis-Ketoform und eine trans-Ketoform ableiten

läßt. Grundsätzlich kann die Keto-Enol-Tautomerie durch Säuren oder Basen katalysiert werden, wo-

bei für CTC nur der säurekatalysierte Prozeß eine Rolle spielt, da im alkalischen Milieu Isochlortetra-

cyclin entsteht und somit eine Tautomerie am C11-, C11a- und C12-Atom nicht mehr möglich ist.

CONH2

ClHO CH3

OHOOHO

HN(CH3)2

Chlortetracyclin (CTC)

CONH2

OHOO

CH3N(CH3)2

Isochlortetracyclin (iso-CTC)

pH > 7

3 Theoretische Grundlagen 27

HO CH3

+ H+

HO CH3

- H+

Carbeniumion

Cl OCH3

OHO

- H2O

OHO

H3CH

- H+

OHO

CH3

+ H+

- H+

Abb. 9: Keto-Enol-Tautomerie von Chlortetracyclin [149]

3.5.3.4 Dehydratation

Bei Tetracyclinen mit einer Hydroxygruppe am C-6-Atom wie Chlortetracyclin spaltet sich unterhalb

pH 1,5 leicht Wasser ab und es entstehen unter Aromatisierung von Ring C Anhydrotetracycline (sie-

he Abb. 10).

Abb. 10: Dehydratation von Chlortetracyclin in stark saurem Medium [136, 141]

Diese Eliminierungsreaktion wird durch die trans-Stellung der tertiären Hydroxylgruppe am C-6-

Atom zum Wasserstoffatom des C-5a-Kohlenstoffs ermöglicht und stellt eine irreversible Reaktion

zweiter Ordnung dar [37, 122, 136]. Die Anhydrotetracycline können ihrerseits analog den Tetracycli-

nen im schwach sauren Bereich zwischen pH 2 und 6 zu den 4-epi-Anhydrotetracyclinen epimerisie-

ren. Die Zersetzung der Tetracycline kann durch konkurrierende Abbaureaktionen der primären Zer-

Enolform von CTC bzw. e-CTC Ketoform von CTC bzw. e-CTC

CONH2

ClHO CH3

OHOOHO

HN(CH3)2

CONH2

ClHO CH3

OHOO

HN(CH3)2

11a

11 11

CONH2

ClHO CH3

OHOOHO

HN(CH3)2

Chlortetracyclin

(CTC)

CONH2

OHO

CH3N(CH3)2

OOH

Anhydrochlortetracyclin

(Anhydro-CTC)

pH < 1,5

-H2O

5a 5a

3 Theoretische Grundlagen

setzungsprodukte überlagert sein. So verläuft die Epimerisierung der Anhydrotetracycline schneller

und die Dehydrierung der 4-epi-Tetracycline langsamer als die entsprechende Reaktion der unverän-

derten Tetracycline [122].

Die Anhydroverbindungen besitzen eine gegenüber den Ausgangsverbindungen um 70 % reduzierte

antibiotische Aktivität. Trotz ihrer antibiotischen Aktivität finden sie jedoch wegen ihrer deutlich toxi-

scheren Eigenschaften gegenüber den Tetracyclinen keine klinische Anwendung. Anhydrotetracycline

rufen schwere Nebenwirkungen hervor, die auf ihrer nicht selektiven Wirkung auf alle Zellmembra-

nen, also auch auf die von eukaryontischen Zellen, beruhen [151, 124].

Die durch die Dehydratation hervorgerufene Veränderung des BCD-Ringsystems wirkt sich in erheb-

lichem Maße auf die UV-Absorption aus und führt zu einer deutlichen Verminderung der Absorpti-

onsintensität im Wellenlängenbereich zwischen 320-380 nm. Die Quantifizierung der Anhydroverbin-

dungen wird bei unterschiedlichen Wellenlängen durchgeführt, da die Absorptionsprofile von den

gewählten Bedingungen abhängig ist [151-154].

4 Stand der Tetracyclin-Analytik 29

4 Stand der Tetracyclin-Analytik

Zum Nachweis von Tetracyclinen existieren eine Vielzahl von Untersuchungsmethoden und Verfah-

ren, weshalb in diesem Zusammenhang nur ein kurzer Überblick gegeben werden soll. Die Struktur-

aufklärung der Tetracycline erfolgte durch die Aufnahme von Massen-, Kernresonanz-, Infrarot- und

UV-Spektren [47]. Von mehr historischem Interesse sind Verfahren zur Messung des Zirkular-

Dichroismus, volumetrische, kolorimetrische und polarographische Verfahren ebenso wie dünn-

schicht- und papierchromatographische Methoden [122]. Heutzutage werden vor allem mikrobiologi-

sche Verfahren wie der Agardiffusionstest und der PREMI-Test als Screening-Test eingesetzt [155,

156, 157]. Die Vorteile dieser Verfahren liegen in der einfachen und schnellen Durchführung der

Tests, wobei allerdings keine Unterscheidung der einzelnen Tetracyclinderivate möglich ist. Darüber

hinaus werden auch immunologische Verfahren wie ELISA [158] und Rezeptortests wie der Charm®-

Test beschrieben [122].

Chromatographische Methoden

Die gaschromatographische Bestimmung von Tetracyclinen ist zwar nach Derivatisierung zu den Tri-

methylsilyl-Derivaten möglich [159], hat aber wegen der hohen Siedepunkte der Tetracycline keine

praktische Bedeutung. Seit Anfang der 90er Jahre werden außerdem verschiedene kapillarelektropho-

retische [160, 161, 162] und mizellarelektrokinetische chromatographische [163, 164] Methoden, die

zur pharmazeutischen Reinheitsbestimmung eingesetzt werden, beschrieben. Neuere Veröffentlichun-

gen beschreiben die Bestimmung der Tetracycline mittels Chemilumineszenz [165, 166, 167].

Das in den letzten Jahren dominierende Verfahren ist die Hochdruckflüssigkeitschromatographie

(HPLC), welches gegenüber den anderen chromatographischen Methoden den Vorteil einer wesentlich

höheren Trennleistung und Nachweisempfindlichkeit aufweist [122, 168]. In der Literatur werden

zahlreiche Säulenmaterialien und Fließmittelgemische zur chromatographischen Trennung beschrie-

ben, wobei die Reversed-Phase-Verfahren überwiegen und die Fließmittel in der Regel Säuren oder

EDTA-Zusätze enthalten. Als Säulenmaterialien kommen vor allem auf Silicagel basierende Phasen

wie C18- [169, 170, 171], C8- [172, 173] und Phenyl-Materialien [174, 175] sowie organische Poly-

mermaterialien, häufig auf Basis von Polystyrol-Divinylbenzol (PS-DVB), [176, 177, 178] zum Ein-

satz. Als zugrunde liegender Retentionsmechanismus wird für diese Trennverfahren eine Wechselwir-

kung zwischen der stationären Phase und einem Tetracyclin-EDTA-Ionenpaar, entstanden durch

Komplex- bzw. Ionenpaarbildung zwischen dem protonierten Tetracyclin und dem EDTA- bzw. Säu-

reanion, diskutiert. Bei den Phenyl- und organischen Polymermaterialien wird zusätzlich die Bildung

von π-π-Komplexen zwischen den Phenylresten bzw. dem Polystyrol-Divinylbenzol-Copolymer und

den Tetracyclinen angenommen [122, 149]. Die chromatographische Trennung der Tetracycline kann

bei Verwendung von alkyl- oder phenylmodifizierten Umkehrphasen wegen des möglichen Metallio-

nengehaltes durch die ausgeprägten Komplexbildungseigenschaften mit Metallkationen gestört wer-

den. Da Tetracycline nur in einem pH-Wert-Bereich von 3-7,5 komplexieren, kann zur Vermeidung

einer Komplexierung entweder der pH-Wert der Fließmittel kleiner als drei eingestellt werden oder es

können die Metallionen durch den Einsatz von Komplexbildnern wie Oxalsäure, Phosphorsäure und

EDTA-Zusatz abgefangen werden [179]. Da Tetracycline zudem eine hohe Tendenz haben, sich irre-

versibel an die verbleibenden Silanol-Gruppen zu binden, kann es bei Einsatz von silica-basierenden

stationären Phasen durch sekundäre Wechselwirkungen zu einem Peak-Tailing kommen. Diese Wech-

selwirkungen können durch einen Zusatz von Oxalsäure zum Fließmittel unterbunden werden oder

4 Stand der Tetracyclin-Analytik

durch den Einsatz von organischen Polymerphasen als stationäre Phase von vornherein vermieden

werden [11].

Detektion

Die Detektion der Tetracycline kann auf unterschiedliche Art und Weise erfolgen, wobei die am häu-

figsten verwendete Methode die UV-Detektion mittels Diodenarray-Detektor ist [180-185]. Obwohl

die Tetracycline im Wellenlängenbereich von 270-280 nm ein höheres UV-Absorptionsmaximum

aufweisen, siehe Kap. 3.5.1, bietet die Detektion bei Wellenlängen von 350-370 nm den Vorteil einer

höheren Selektivität. Deutlich empfindlichere Detektionsmethoden stellen die elektrochemische [186]

und die fluorimetrische Detektion dar. Da Tetracycline selbst nur eine geringe Fluoreszenz zeigen, ist

für diese Detektionsart eine Nachsäulenderivatisierung zur Überführung der Tetracycline in die stark

fluoreszierenden Tetracyclin-Metallkation-Komplexe oder iso-Tetracycline notwendig. Hierbei wer-

den die Tetracycline entweder mit Calcium-, Aluminium- oder Zirkoniumsalzlösungen in schwach

saurer Lösung in die entsprechenden Komplexe [187, 188] oder im alkalischen Milieu in die iso-

Tetracycline [189, 190] überführt. Letztgenannte Methode ist besonders für CTC geeignet, da es unter

diesen Bedingungen leicht isomerisiert. Beide Methoden eignen sich nur für die Nachsäulenderivati-

sierung, da zum einen Komplexierungen die chromatographische Trennung negativ beeinflussen und

zum anderen die iso-Tetracycline nur in alkalischem Medium fluoreszieren.

In den letzten Jahren hat sich vor allem die Detektion mittels Massenpektrometrie durchgesetzt [191-

200]. Diese Detektionsart hat gegenüber den anderen Methoden zum einem den Vorteil einer höheren

Selektivität und zum anderen in den meisten Fällen eine höhere Empfindlichkeit. Aufgrund der Mög-

lichkeit, nur bestimmte Massen „isolieren“ zu können, kann hierbei häufig auf eine aufwendige Pro-

benvorbereitung verzichtet werden [201, 202]. Daher ist besonders die Tandemmassenspektrometrie

(LC-MS/MS) im MRM-Mode (Multiple Reaction Monitoring) ein hoch selektives und sensitives Ver-

fahren zum quantitativen Nachweis von Antibiotika in komplexen biologischen Matrices [203, 204].

Vor allem ist mit diesem Verfahren die Bestimmung mehrerer, auch co-eluierender, Substanzen ne-

beneinander mit kurzen Analysenzeiten möglich [205, 206, 207, 208]. Die Ionisation der Tetracycline

ist mit verschiedenen Techniken möglich: Atmospheric pressure chemical ionization (APCI), Particle

Beam Ionization (PB), Fast Atom Bombardment (FAB) und Electrospray Ionization (ESI). Die am

häufigsten eingesetzte Technik ist die Electrospray Ionization, die sowohl im positiven als auch im

negativen Mode betrieben werden kann. Vorwiegend wird die Electrospray-Technik im positiven

Mode (ESI+) genutzt, da die Tetracycline in den meisten Fällen in Abhängigkeit von den gewählten

chromatographischen Bedingungen bei dieser Ionisierung im Vergleich zu den anderen Techniken die

höchste Sensitivität aufweisen [172, 209, 210].

Probenvorbereitung

Für die Aufarbeitung biologischer Proben zur Bestimmung von Tetracyclinen werden in der Literatur

eine Vielzahl unterschiedlicher Methoden beschrieben: Flüssig-Flüssig-Extraktion [211-213], Festpha-

senextraktion (SPE) [12, 214-221], Festphasenmikroextraktion (SPME) [222, 223] Metall-Chelat-

Affinitäts-Extraktion [224-227], Matrix-Solid-Phase-Dispersion (MSPD) [168, 228] und Extraktion

mit Dialyse [177, 229, 230].

Zunächst ist bei allen Methoden eine Homogenisierung der entnommenen Proben vorzunehmen. Dies

geschieht bei festem Probenmaterial wie Gewebeproben in einem ersten Schritt durch Einsatz einer

Moulinette. Anschließend erfolgt in einem zweiten Schritt, mit Ausnahme der MSPD, eine Fest-

4 Stand der Tetracyclin-Analytik 31

Flüssig-Extraktion der Tetracycline mit einem wäßrigen Lösungsmittel aus der zerkleinerten Probe,

wobei in den meisten Fällen der EDTA-McIlvain-Puffer verwendet wird, der als Chelatisierungsrea-

genzien Citronensäure und EDTA enthält und damit eine Komplexierung der Tetracycline an Kationen

aus der Matrix verhindert [170, 231, 239, 243, 232]. Hierbei wird, um eine vollständige Homogenisie-

rung der Probe zu gewährleisten und eine quantitative Extraktion zu erzielen, ein Ultra-Turrax einge-

setzt. Im Anschluß daran kann eine Aufreinigung dieses so gewonnenen Extraktes mit den oben er-

wähnten Methoden erfolgen. Die klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion ist durch verschiedene

Festphasenextraktions-Methoden (SPE, SPME) verdrängt worden, wobei für die Tetracyclinanalytik

als Sorbentien ebenso wie für die chromatographische Bestimmung sowohl Reversed-Phase-Systeme,

basierend auf Silicagel, wie C18-, C8-, die zum Teil speziell zur Tetracyclinbestimmung modifiziert

sind [217], organische Polymermaterialien [192, 233-237] als auch Kationenaustauschersäulen [219,

238] von Bedeutung sind. Genauso wie bei der chromatographischen Trennung können freie Silanol-

gruppen bei alkylmodifizierten Säulenmaterialien die Elution der Analyten verhindern. Bei der Metall-

Chelat-Affinitäts-Extraktion wird die Eigenschaft der Tetracycline, mit verschiedenen Metallionen

Komplexe zu bilden, zur selektiven Aufarbeitung genutzt, beispielsweise setzen FARRINGTON et al.

[224, 225] eine mit Kupfer beladene Chelating-Sepharose-Säule zur Komplexierung der Tetracycline

ein. Häufig werden auch zwei verschiedene Aufreinigungsmethoden, gekoppelt, um saubere Meßpro-

ben zu erhalten. So umfaßt die amtliche Untersuchungsmethode nach § 35 LMBG sowohl eine Metall-

Chelat-Affinitäts-Extraktion als auch eine Festphasenextraktion [226]. Die Aufarbeitung mit MSPD

bietet den Vorteil, daß die zerkleinerte Probe direkt mit dem Festphasenmaterial gemischt wird und

daher keine Fest-Flüssig-Extraktion erforderlich ist, um die Analyten in einem ersten Schritt aus der

Probe herauszuextrahieren. Die Aufreinigung mit Dialyse hat den Nachteil, daß das erhaltene Dialysat

aufgrund des hohen Extraktvolumens zusätzlich aufkonzentriert werden muß, wobei hier meist ein

Festphasenextraktionsschritt nachgeschaltet wird. Eine Automatisierung der Probenvorbereitungsme-

thoden SPE, SPME, Metall-Chelat-Affinitäts-Extraktion und Dialyse in Form einer On-line-Kopplung

mit dem HPLC-System ist zwar grundsätzlich möglich und wird auch von verschiedenen Autoren

beschrieben [177, 225, 229, 239], ist aber bei der Aufarbeitung komplexer biologischer Proben oft

schwer zu realisieren.

Von den beschriebenen Probenvorbereitungstechniken ist die Festphasenextraktion die am häufigsten

eingesetzte Methode, wobei zunehmend organische Polymermaterialien als Sorbentien verwendet

werden [192, 233-235]. Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren, die häufig auch zur Be-

stimmung mehrerer Tetracyclinderivate dienen, umfaßt die Quantifizierung der Tetracycline meist

lediglich die jeweiligen Wirkstoffe. Verfahren, die Abbau- oder Umwandlungsprodukte der Tetracy-

cline berücksichtigen, beschränken sich dabei auf die Epimere. Auf die besondere Bedeutung der

Epimere bei der Bestimmung von Tetracyclinen in Lebensmitteln tierischer Herkunft weisen

verschiedene Autoren wie BERGNER-LANG et al. [240] und KÜHNE et al. [322] hin. Da die Epimere

entweder bereits im Probenmaterial vorhanden sein können oder auch während der

Probenvorbereitung entstehen können, ist die Berücksichtigung der Epimere unbedingt erforderlich.

Vor allem bei der Extraktion mit McIlvain-Puffer, der meist auf pH 4 eingestellt wird, ist von einer

Epimerisierung auszugehen. Aufgrund der besonders großen pH-Instabilität von CTC im Vergleich zu

den anderen Tetracyclinen ist besonders bei der Bestimmung von CTC auf mögliche Abbau- und

Umwandlungsreaktionen zu achten. Neben den epimeren Verbindungen können in Abhängigkeit vom

pH-Wert auch Isomere, Keto-Enol-Tautomere sowie Anhydroverbindungen, siehe Kap. 3.5.3,

auftreten.

4 Stand der Tetracyclin-Analytik

Es gibt jedoch nur wenige Untersuchungen zu weiteren Metaboliten von CTC in biologischen Proben.

ZURHELLE et al. und KENNEDY et al., die Hühnereier auf CTC und mögliche Abbau- und Umwand-

lungsprodukte untersuchten, belegen, daß neben den Epimeren auch iso-CTC und e-iso-CTC vor-

kommen [143, 229].

Im Rahmen dieser Arbeit sollte daher ein HPLC-UV-MS/MS-Verfahren zur Bestimmung von CTC in

Urin, Faeces, Plasma, Knochen und Schlachtproben entwickelt und validiert werden, wobei ein beson-

deres Augenmerk den möglichen Metaboliten von CTC galt. Dieses Verfahren sollte die Extraktion

der Proben mit EDTA-McIlvain-Puffer und einen anschließenden Aufreinigungs- und Aufkonzentrie-

rungsschritt durch eine off-line Festphasenextraktion beinhalten. Die Kopplung dieser beiden Detekti-

onsarten hat den Vorteil, einerseits die hohe Selektivität und Empfindlichkeit der Massenspektrometrie

und andererseits die hohe Reproduzierbarkeit und Präzision der UV-Detektion auszunutzen. Insbeson-

dere werden bei der UV-Detektion auch matrixbedingte signalsupressive oder

-verstärkende Detektionseffekte vermieden.

5 Ergebnisse und Diskussion 33

5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Untersuchungsmethodik und Projektverlauf

Die Zielsetzungen des vom MUNLV gegründeten Projektes „Resistenzentwicklung und Rückstände

in der landwirtschaftlichen Tierhaltung“ resultierten aus der ungenügenden Datenlage über die

Aufnahme, der Metabolisierung und Verbleib von Arzneimitteln, die in der Tiermast eingesetzt wer-

den. Zum Zeitpunkt des Projektbeginns war keine sichere Aussage über den durch die in der Tiermast

eingesetzten Arzneimittel verursachten Eintrag in die Nahrungskette und Expositionspfad in die Um-

welt sowie das damit verbundene Verbraucherrisiko möglich. Von zentraler Bedeutung war dabei die

Frage, in welchem Maße neben den Wirkstoffen auch Metabolite sowie Abbau- und Umwandlungs-

produkte vorkommen und inwieweit diese ein Verbraucherrisiko darstellen können. Die besondere

Verbraucherschutzrelevanz dieser Fragestellung wird durch die zunehmende Ausbreitung von Antibio-

tika-Resistenzen verstärkt. Das hier beschriebene Projekt sollte einen Beitrag zur Aufklärung der Ein-

tragspfade antibiotisch wirksamer Pharmakarückstände in die Nahrungskette und zur Abschätzung der

Umweltbelastung liefern, um das Gefährdungspotential für den Verbraucher besser beurteilen zu kön-

nen. In diesem Projekt wurde das Verhalten der auf Grund ihrer Anwendungsbreite bei Schweinen

besonders relevanten Antiinfektiva Chlortetracyclin (CTC) und Sulfadiazin (SFD) kombiniert mit

Trimethoprim (TMP) als potenziertem Sulfonamid untersucht. Auf die Analyse der Sulfadiazin- und

Trimethoprim-Gehalte wird im Rahmen dieser Arbeit nicht weiter eingegangen.

In einer ersten Medikationsstudie erfolgte in Zusammenarbeit mit dem Landwirtschaftszentrum Haus

Düsse, Bad Sassendorf (Haus Düsse-Studie) die Durchführung eines Mastdurchganges mit definierter

Medikation unter praxisnahen Bedingungen. Es wurden 40 Schweine in einer Gruppe gehalten und

den Tieren über Längströge eine definierte Menge an CTC, SFD und TMP verfüttert. Die Schlachtung

der Tiere erfolgte drei Monate nach der Arzneimittelfütterung. Diese Studie diente dazu, das Auschei-

dungsverhalten der applizierten Antiinfektiva in Urin zu untersuchen und anhand der entnommenen

Schlachtproben festzustellen, mit welchem Eintrag in die Nahrungskette unter landwirtschaftlich übli-

chen Bedingungen zu rechnen ist.

Da unter diesen Bedingungen nicht beurteilt werden kann, wieviel der applizierten Wirkstoffe ausge-

schieden werden und welche Menge im Tierkörper verbleibt, war in einer zweiten Medikationsstudie

in Kooperation mit der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft, Braunschweig-Völkenrode (FAL-

Studie) und der Universität Paderborn im Projekt: „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in

terrestrische und aquatische Kompartimente“, die Durchführung eines Mastdurchganges von fünf

Schweinen unter definierteren Bedingungen in Einzelhaltung geplant. In dieser Studie wurden

Schweine während der Medikation in Stoffwechselkäfigen gehalten, wobei eine individuelle Arznei-

mittelfütterung und eine individuelle Sammlung von Kot und Urin erfolgte. Die Arzneimittelfütterung

erfolgte in zwei Medikationsphasen. Die in diesem Versuch anfallende Gülle wurde für weitergehende

Freilandversuche im Rahmen des „Antiinfektiva“-Projektes der Universität Paderborn [93, 277], ein-

gesetzt. Die Schlachtung der Tiere erfolgte mit Ausnahme eines Tieres nach Ablauf der Wartezeit von

vierzehn Tagen, wobei die Tiere nach der Arzneimittelfütterung ebenfalls in einer Gruppe gehalten

wurden. Anhand dieser Studie sollte beurteilt werden, wieviel des applizierten Wirkstoffes wieder

ausgeschieden wird und wie hoch die Wirkstoffgehalte in den Schlachtproben nach Ablauf der Warte-

zeit sind. Eines dieser Tiere wurde direkt nach der Arzneimittelfütterung geschlachtet, um eine Bilan-

5 Ergebnisse und Diskussion

zierung vorzunehmen.

Besonderes Augenmerk galt dem Metabolismus von CTC. In einem ersten Schritt wurde der CTC-

Gehalt in den bei den Medikationsstudien entnommenen Proben, entsprechend der EU-Verordnung

EWG Nr. 2377/90, als Summe von CTC und e-CTC ermittelt. Darüber hinaus sollte geklärt werden,

inwieweit neben dem Epimeren weitere Abbau- und Umwandlungsprodukte in den einzelnen Matrices

nachzuweisen sind und ob diese bei der Ermittlung des CTC-Gehaltes mit berücksichtigt werden müs-

sen. In den Schlachtproben sowie aller entnommen Proben des „Bilanzierungstieres“ der FAL-Studie

sollte eine Quantifzierung weiterer Metabolite von CTC erfolgen.

Die im Rahmen des Projektes gewonnenen Erkenntnisse dienen dazu, den Eintragspfad der den

Schweinen applizierten Wirkstoffe sowie deren Metabolite in die Nahrungskette und die daraus resul-

tierende Gefährdung für den Verbraucher besser abschätzen zu können.

5.1.1 Haus Düsse-Studie

Zu Beginn des Mastdurchganges wurden 80 nicht medikamentiv vorbehandelte Schweine im Alter

von zwei Monaten im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse aus deren eigener Sauenhaltung aufge-

stallt. Die Tiere standen in Ställen mit Spaltenboden und das Stallabteil war mit einer Zwangslüftungs-

anlage versehen. Von diesen Tieren erhielten 40 Tiere (Versuchsgruppe) über einen Zeitraum von

zwei Wochen Antibiotika über das Trockenfutter (Getreide-Sojamischung), wobei den Tieren das

Futter trocken von Hand vorgelegt wurde. Es wurde insgesamt 1 t antibiotikahaltiges Mischfutter her-

gestellt, wovon 852 kg an die Tiere der Versuchsgruppe verfüttert wurde. Die 40 Versuchstiere haben

eine Arzneimittelwirkstoffmenge von 369 g CTC aufgenommen, womit sich pro Versuchstier eine

durchschnittliche Aufnahmemenge über den gesamten Medikationszeitraum von 9,21 g ergeben hat.

Auf die zusätzlich verabreichten Sufadiazin- und Trimethoprim-Mengen wird in dieser Arbeit nicht

eingegangen. Für die 40 medikamentiv unbehandelten Tiere (Kontrollgruppe) wurde ebenfalls 1 t

Mischfutter ohne Antibiotika erstellt und über den gleichen Zeitraum bei gleicher Vorlagesystematik

verfüttert. Die Kontrolltiere hatten hiervon 751 kg aufgenommen. Nach Medikationsende wurden bei-

de Gruppen mit einem Flüssigfutter aus einer zentral steuerbaren Futteranlage weitergefüttert.

Die 40 Tiere wurden mit einer Ohrmarkennummer gekennzeichnet und in Buchten zu je acht Tieren

rechts und links von einem Kontrollgang aufgestallt und an Längströgen gefüttert. Eine Seite erhielt

das Kontrollfutter, die andere das Versuchsfutter. Bei der ersten Urinprobenahme wurden willkürlich

auf jeder Seite Tiere beprobt, bis die Anzahl der am Versuch beteiligten Tiere erreicht war. Anschlie-

ßend wurden die am Versuch beteiligten Tiere zusätzlich gekennzeichnet. Damit ergab sich ein Ver-

suchskollektiv von 24 Tieren, zwölf Kontrolltiere und zwölf Versuchstiere. Vor Beginn der Medikati-

on sowie im Anschluß an die Medikation erfolgten mit Unterstützung des Personals vom LEJ, Düssel-

dorf (Landesamt für Ernährungswirtschaft und Jagd) über einen Zeitraum von drei Monaten in Ab-

ständen von vierzehn Tagen Probenahmen von Urin. Versuchstier 3 ist während des Mastdurchganges

erkrankt und mußte mehrfach zusätzlich medikamentiert werden (s. Kap. 7.4). Im Alter von fünf Mo-

naten erfolgte die Schlachtung der Tiere, wobei den Tieren am Schlachttag außer Urinproben, dies war

allerdings nicht bei allen Tieren möglich, zusätzlich Muskel-, Leber-, Nieren-, Knochen- und Blutpro-

ben entnommen wurden. In Abb. 11 ist die Durchführung der Medikationsstudie schematisch darge-

stellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 35

Einstallung medikamentiv unbehandelter Schweine

Schlachtung der Tiere

Probenahme von Urin, Muskulatur, Leber, Niere, Knochen und Blut

12 Versuchstiere

Antibiotikafütterung

Beprobung aller Tiere (Urin) in Abständen von zwei Wochen

nach Medikationsende über einen Zeitraum von drei Monaten

erste Probenahme von Urin bei allen Tieren

zwei Wochen 12 Kontrolltiere

Fütterung mit antibiotika-

freiem Mischfutter

Abb. 11: Schematischer Ablauf des Mastdurchganges im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse

5.1.2 FAL-Studie

Fünf medikamentiv unbehandelte Börgen, also Kastraten, mit einem Gewicht von 71-89 kg wurden in

Stoffwechselkäfigen aufgestallt. Zur Erfassung des Grundstatus wurden am 1. Versuchstag vor Beginn

der Medikation Urin-, Faeces- und Blutproben genommen. Nach der Einstallung der Tiere in Stoff-

wechselkäfigen erfolgten zwei Medikationsphasen von jeweils zehn Tagen (Versuchstag 1-10 und 22-

31), unterbrochen von einer aus Tierschutzgründen notwendigen Pause von elf Tagen (Versuchtag 11-

21). Die Medikation der Tiere erfolgte unter therapieüblichen Bedingungen. Dabei wurden den Tieren

das Arzneimittel Chlortetracyclin 100 (Wirkstoff: Chlortetracyclin, 1000 g Präparat enthalten 100 g

Chlortetracyclin) oral über das Trockenfutter verabreicht. Die Dosierung entsprach der maximal übli-

chen therapeutischen Anwendung. Die Applikationsmenge des Wirkstoffes richtete sich nach dem

Körpergewicht der Tiere, wobei die Dosierung jeden zweiten Tag unter Berücksichtigung der Ge-

wichtszunahme erhöht wurde. Die Dosierung der Arzneimittel ist im einzelnen in Tab. A. 3 und Tab.

A. 4 im Anhang aufgeführt. Neben Chlortetracyclin sind den Tieren noch Sulfadiazin und Trimetho-

prim verabreicht worden, die im Rahmen dieser Arbeit nicht mitberücksichtigt wurden. In Abb. 12 ist

der Ablauf der Studie schematisch dargestellt.

In den Stoffwechselkäfigen wurden Urin und Faeces separat aufgefangen und täglich tierweise zu

Gülle zusammengeführt. Es erfolgten tägliche Probenahmen von Urin und Faeces. Zusätzlich wurden

am Anfang, in der Mitte und am Ende jeder Medikationsphase Blutproben entnommen. Während der

Medikationspause wurden die fünf Tiere in einem separaten Stall in Einzelbuchten gehalten. Der in

5 Ergebnisse und Diskussion

Aufzucht von Ferkeln

Haltung der Tiere in der Gruppe

getrennte Sammlung von

Faeces und Urin

Tötung eines Tieres

direkt nach Medikationsende

1. Medikationsphase

Haltung der Tiere

in Stoffwechselkäfigen

Medikationspause von elf Tagen

Haltung der Tiere in der Gruppe

Schlachtung von vier Tieren

nach Ablauf der Wartezeit

Versuchstag 1-10

Versuchstag 11-21

Versuchstag 22-31 2. Medikationsphase

Haltung der Tiere

in Stoffwechselkäfigen

getrennte Sammlung von

Faeces und Urin

dieser Zeit angefallene Kot und Urin wurde verworfen. Am Ende der Studie, also nach der zweiten

Medikationsphase, wurden die täglichen Güllesammlungen der ersten und zweiten Medikationsphase

jeweils zu einem Güllepool zusammengeführt.

Abb. 12: Schematischer Ablauf der Medikationstudie an der FAL

Tier 95 wurde zur Durchführung einer Bilanzierung etwa drei Stunden nach der letzten Antibiotkafüt-

terung der zweiten Medikationsphase am Versuchstag 31 geschlachtet. Bei der Schlachtung wurde

dem Tier Urin-, Faeces-, Blut-, Muskulatur-, Leber-, Niere- und Knochenproben entnommen. Die

übrigen vier Tiere wurden während der Wartezeit von vierzehn Tagen in einem separatem Stall in

Einzelbuchten gehalten und am 46. Versuchstag geschlachtet. Die Tiere wurden entsprechend dem

Tier 95 beprobt.

5 Ergebnisse und Diskussion 37

5.2 Methodenentwicklung zur Bestimmung von CTC und Metabolite

in biologischen Proben

5.2.1 Entwicklung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens

Ziel war es, ein chromatographisches Verfahren mit HPLC-UV-MS/MS für die quantitative Bestim-

mung von CTC und e-CTC in den Matrices Urin, Plasma, Faeces, Muskulatur, Leber, Niere und Kno-

chen zu entwickeln. Neben diesen Verbindungen sollte zusätzlich zunächst nur eine qualitative Be-

stimmung von iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC möglich sein. Die zur Me-

thodenentwicklung eingesetzten Standardsubstanzen wiesen eine minimale Reinheit von 97 % auf.

Außer e-iso-CTC sind die Verbindungen CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

kommerziell erhältlich. Das nicht erhältliche e-iso-CTC wurde durch Epimersierung von iso-CTC in

schwach saurer Lösung hergestellt (siehe Kap. 7.10.1).

Im Rahmen der Methodenentwicklung wurden die nachfolgend aufgeführten Untersuchungen durch-

geführt:

• Aufnahme der UV-Spektren von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC unter den gegebenen chromatographischen Bedingungen (Lösungsmittel:

H2O/CH3CN/0,5 % HCOOH (v/v), pH 2,5): Für CTC und e-CTC wurden zwei UV-

Absorptionsmaxima ermittelt, die bei 275 nm und 370 nm liegen, wobei die erste Bande die

intensivere ist, siehe auch Abb. 29. Bei allen übrigen Verbindungen konnte nur ein Absorpti-

onsmaximum bei 275 nm festgestellt werden, da bei ihnen eine Modifikation des BCD-Ringes

erfolgt ist, die zur Auslöschung der UV-Absorption im Wellenlängenbereich oberhalb von 300

nm führt, siehe Kap. 3.5.1. Die jeweiligen Epimere zeigen weitestgehend identische UV-

Spektren.

• Auswahl der mobilen und stationären Phase zur chromatographischen Trennung von CTC und

Metabolite

• Entwicklung der MS/MS-Detektion durch Aufnahme von Precursor- und Produkt-Ionen-Scans

aller Verbindungen

• Untersuchung der Stabilität der zu quantifizierenden Substanzen CTC und e-CTC in Lösung

im Hinblick auf die Herstellung und Lagerung von Kalibrierlösungen

5.2.1.1 Auswahl der mobilen und stationären Phase

In Abhängigkeit von der Detektionsart sind in der Literatur eine Vielzahl verschiedener mobiler Pha-

sen beschrieben worden. Sowohl für die UV-Detektion als auch für die Fluoreszenzdetektion werden

in den meisten Fällen Gemische aus Acetonitril-Methanol-Oxalsäure pH 2 verwendet, wobei manch-

mal der mobilen Phase EDTA zugesetzt wird [142, 180, 183, 187]. Des weiteren wird auch der Einsatz

von Acetat-Puffer und Phosphat-Puffer beschrieben [186, 188, 189]. Puffer-Lösungen sowie EDTA-

Zusätze eignen sich aufgrund ihrer schweren Verdampfbarkeit und möglichen Clusterbildungen nicht

für die massenspektrometrische Detektion. Zudem kann es zum Auskristallisieren der Puffersalze im

Interface und Ablagerungen im MS-Analysatorteil kommen. Daher kommen für diese Detektionsart

Gemische aus Acetonitril-Methanol-Oxalsäure pH 2 [170], Trifluoressigsäure-Acetonitril [172], Essig-

säure-Acetonitril [209] oder Ameisensäure-Acetonitril [195] in Frage. Für die eigenen Untersuchun-

5 Ergebnisse und Diskussion

5 7,5 10 12,5 15 17,5 20

Zeit [min]

YMC-Pack Phenyl

150 x 2,1 mm, 3 µm

Fluß: 0,2 mL/min

RSC-Gel 120 C18L

125 x 4 mm, 5 µm

Fluß: 1 mL/min

RSC-Gel 120 C18Aq

250 x 4 mm, 5 µm

Fluß: 0,8 mL/min

YMC ODS-AM

150 x 3 mm, 5 µm

Fluß: 0,4 mL/min

1) e-iso-CTC, 2) keto-e-CTC. 3) iso-CTC, 4) e-CTC, 5) CTC, 6) e-Anhydro-CTC, 7) Anhydro-CTC

3456

100

[%]

100

[%]

100

[%]

100

[%]

5 7,5 10 12,5 15 17,5 20

Zeit [min]

YMC-Pack Phenyl

150 x 2,1 mm, 3 µm

Fluß: 0,2 mL/min

RSC-Gel 120 C18L

125 x 4 mm, 5 µm

Fluß: 1 mL/min

RSC-Gel 120 C18Aq

250 x 4 mm, 5 µm

Fluß: 0,8 mL/min

YMC ODS-AM

150 x 3 mm, 5 µm

Fluß: 0,4 mL/min

1) e-iso-CTC, 2) keto-e-CTC. 3) iso-CTC, 4) e-CTC, 5) CTC, 6) e-Anhydro-CTC, 7) Anhydro-CTC

3456

100

[%]

100

[%]

100

[%]

100

[%]

gen wurde als mobile Phase das von LOCK et al. [195] beschriebene Gemisch aus Ameisensäure-

Acetonitril (H2O/CH3CN/HCOOH, 0,5 % HCOOH, (v/v), pH 2,8) ausgewählt. Dieses Fließmittelge-

misch hat zum einen den Vorteil einer einfachen Herstellung und zum anderen sind aufgrund des nied-

rigen pH-Wertes (< 3) keine Komplexbildner erforderlich. Die Elution der Tetracycline erfolgt in den

in der Literatur beschriebenen Verfahren je nach Fragestellung entweder isokratisch oder mit einer

Gradientenmethode. Die Elution kann wegen der ähnlichen chromatographischen Eigenschaften von

CTC und seiner Metabolite nicht isokratisch erfolgen. Daher wurde für die Bestimmung von CTC und

seiner Metabolite eine Gradientenmethode entwickelt, mit der eine chromatographische Trennung aller

Verbindungen, insbesondere der schwer trennbaren Verbindungen e-CTC und iso-CTC, möglich ist.

Zur Auswahl einer stationären Phase wurden verschiedene analytische Säulen auf ihre Eignung zur

Trennung von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC hin überprüft.

Es wurden vier verschiedene analytische Säulen eingesetzt: YMC-ODS-AM (150 x 3 mm, 3 µm),

RSC-Gel C18 Aq (250 x 4 mm, 5 µm), RSC-Gel 120 C18 L (125 x 4 mm, 5 µm), YMC-Phenyl (150 x

2,1 mm, 3 µm). Die mit diesen analytischen Säulen erhaltenen Chromatogramme sind in Abb. 13 ab-

gebildet.

Abb. 13: Trennung von CTC und seiner Metabolite mit verschiedenen analytischen Säulen

(β = 10 mg/L) (HPLC-UV, 275 nm)

Die YMC-ODS-AM-Säule zeichnet sich sowohl durch ein besonders gutes end-capping als auch einen

sehr geringen Metallionen-Gehalt aus und wird zum Einsatz für die Tetracyclinbestimmung bereits

5 Ergebnisse und Diskussion 39

von OKA et al. beschrieben [170]. Da bei der Retention der Tetracycline sekundäre Wechselwirkun-

gen und damit das end-capping eine große Rolle spielt, wurde zum einen die Trennung auf einer Säule

mit hydrophilem end-capping, RSC-Gel C18 Aq, und zum anderen mit hydrophobem end-capping,

RSC-Gel 120 C18 L, untersucht. Während letztgenannte Säule für alle Verbindungen zwar zu einer

Trennung aller Verbindungen, aber zu einem starken Peak-Tailing, besonders für Anhydro-CTC und

e-Anyhdro-CTC, führte, ergab sich mit RSC-Gel C18 Aq eine mit der YMC-ODS-AM-Säule ver-

gleichbar gute Trennung mit basisliniengetrennten, schmalen und symmetrischen Peaks für alle Sub-

stanzen. HELLER et al. und JÜRGENS et al. beschreiben den Einsatz einer Säule mit Alkyl-Phenyl-

Belegung, die vor allem bei Verbindungen mit höherer Retentionszeit wie Anhydro-CTC zu einer

geringeren Bandenverbreiterung führen soll [174, 175]. Der Einsatz der YMC-Phenyl-Säule führte

zwar zu einer Verkürzung der Retentionszeiten um zwei Minuten und schmalen, symmetrischen Peaks

für Anhydro- und e-Anhydro-CTC, jedoch konnte keine Trennung von e-CTC und iso-CTC mehr

erzielt werden. Von den erprobten Säulen erwies sich neben der YMC-ODS-AM-Säule mit einer Di-

mension von 150 x 3 mm, 5 µm nur die RSC-Gel C18 Aq für die Trennung von CTC und seiner Ab-

bau- und Umwandlungsprodukte als geeignet. Da mit der RSC-Gel C18 Aq-Säule keine wesentlich

bessere Trennung als mit der YMC-ODS-AM-Säule erzielt wurde, ist der Einsatz der YMC-Säule

beibehalten worden.

5.2.1.2 Entwicklung der MS/MS-Detektion

Zur Entwicklung der MS/MS-Detektionsmethode mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometer wur-

de zunächst überprüft, welche der Ionisationstechniken APCI oder ESI sich bei den gewählten chroma-

tographischen Bedingungen am besten eignet. In Übereinstimmung mit den Literaturverfahren zeigten

alle Verbindungen bei der Electrospray-Ionisation eine bessere Sensitivität. Die höchste Sensitivität

konnte bei der ESI-Detektion im positiven Mode (ESI+) erzielt werden. CTC und e-CTC bilden mit

einer Molmasse von 478 g/mol das Precursor-Ion [M + H]+ mit m/z 479 (35Cl-Isotop). Das Fragmen-

tierungsmuster dieses Precursor-Ions ist in Abb. 14 a dargestellt, wobei dieser Zerfallsweg, basierend

auf verschiedenen Angaben in der Literatur, postuliert wurde. Der genaue Mechanismus ist nicht be-

kannt. Das Molekülion zerfällt in einem ersten Schritt unter Abspaltung von NH3 in das Produkt-Ion

mit m/z 462 ([M + H - NH3]+), welches dann im nächsten Schritt unter Wasserabspaltung zum Pro-

dukt-Ion mit m/z 444 ([M + H - NH3- H2O]+ fragmentiert [143, 172, 194, 195].

Für das CTC- und e-CTC-Molekül, welches das 37Cl-Isotop enthält, mit m/z 481 als Precursor-Ion

finden sich dieselben Fragmentierungsmuster, denn es entstehen als Produkt-Ionen die Fragmente mit

m/z 464 und m/z 446. Das Isotopenverhältnis des Chlors kann somit zusätzlich zur Identifizierung

herangezogen werden. Neben diesen Hauptfragmenten bilden CTC und e-CTC die Produkt-Ionen mit

m/z 371 und 154 aus dem Precursor-Ion mit m/z 479. Während das Produkt-Ion mit m/z 371 ein Fol-

gefragment des Produkt-Ions 444 ist, stellt die Bildung von m/z 154 über m/z 171 eine eigenständige

Zerfallsreaktion dar [175, 241-243]. Iso-CTC und e-iso-CTC lassen sich nur mit hoher Energie

fragmentieren und bilden aus dem Precursor-Ion mit m/z 479 ([M + H]+) von den für CTC und e-CTC

typischen Fragmenten hauptsächlich nur das Produkt-Ion mit m/z 462 ([M + H - NH3]+), geringfügig

auch m/z 154. Wegen der Phthalidstruktur von Ring C kann das Produkt-Ion m/z 444 ([M + H - NH3-

H2O]+ nicht, dagegen bei höherer Kollisionsenergie ein charakteristisches Fragment mit m/z 197 ge-

bildet werden, dessen Struktur nicht bekannt ist. Das Fehlen des Produkt-Ions mit m/z 444 ist also ein

wesentliches Unterscheidungsmerkmal für iso-CTC und e-iso-CTC [143].

5 Ergebnisse und Diskussion

ClHO CH3

OHOOHO

NH2

H3CCH

-NH3

ClHO CH3

OHOOHO

H3CCH

-H2O

OHOOHO

H3CCH

CH3+

m/z 371

OHOOHO

CH3

-28

-43

-171

-17

CH3

H3C

HNH

C7H11N2O3

entweder

C7H8NO3

CH3

CH2

H3C

N(CH3)2

O+

bzw.

oder

C8H12NO2

H3CCH

CH3

+NO

H3CCH

CH3

m/z 479

m/z 462

m/z 444

m/z 401

m/z 171

m/z 154

-17

-43

-30

-308

CH2

H3C

CH3

H3C

bzw.

m/z 154

Abb. 14: a) Fragmentierungsreaktionen von CTC und e-CTC [102, 241, 242], b) Struktur des

Produkt-Ions von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit m/z 98 [242]

Der Zerfall der Abbauprodukte Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit einem Precursor-Ion von m/z

461 ([M + H]+) erfolgt im ersten Schritt in einer NH3-Abspaltung und führt zu dem für CTC und e-

CTC charakteristischen Fragment mit m/z 444 ([M + H - NH3]+). Ebenso entsteht das Produkt-Ion mit

m/z 154, dagegen nicht das Produkt-Ion mit m/z 371. Neben diesen für CTC und e-CTC typischen

Fragmenten bilden Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ein zusätzliches Produkt-Ion mit m/z 98, für

das die in Abb. 14 b dargestellten Strukturen angenommen werden [242].

Zur Identifizierung der Substanzen wurden die Retentionszeiten, die UV-Spektren und die bei der

5 Ergebnisse und Diskussion 41

massenspektrometrischen Detektion mittels Triple-Quadrupol-Massenspektrometer im MRM-Modus

erhaltenen Fragmentierungsmuster, insbesondere die relativen Intensitäten der einzelnen Fragmentio-

nen herangezogen. Die Quantifizierung erfolgte für CTC und e-CTC mit der UV-Detektion aus

Gründen der Selektivität bei 370 nm, für alle übrigen Verbindungen bei 275 nm, da diese im Bereich

von 320-380 nm keine UV-Absorption aufweisen. Bei der massenspektrometrischen Detektion erfolg-

te die Quantifizierung über den Totalionenstrom (TIC) der einzelnen Fragmentionen, da der TIC im

Vergleich zur höchsten Massenspur eine höhere Intensität aufwies. Die zur Identifizierung und Quanti-

fizierung herangezogenen Retentionszeiten, UV-Maxima und Fragmentierungsmuster sind für alle

Substanzen in Tab. 4 zusammengefaßt.

Tab. 4: Retentionszeiten, UV-Maxima und Fragmentierungsmuster von CTC und Metabolite

Fragmentierungsmuster (MS/MS-Detektion)

Produkt-Ionen [m/z] Substanz Rt

[min]

UV-

Maxima

[nm] Precursor-Ion

[m/z] Peakintensitäten [%]

462 444 371 154

479 60 100 13 48

464 446 -- --

CTC 9,9 275

370 481 47 100 -- --

462 444 371 154

479 63 100 2 7

446 464 -- --

e-CTC 8,2 275

370 481 52 100 -- --

462 371 197 154

479 100 -- 2 4

464 -- -- --

iso-CTC 7,4 275

481 100 -- -- --

462 371 197 154

479 100 -- 4 2

464 -- -- --

e-iso-CTC 6,2 275

481 100 -- -- --

444 154 98

461 100 55 3

446 -- --

Anhydro-

CTC 18,5 275

463 100 -- --

444 154 98

461 100 5 4

446 -- --

e-Anhydro-

CTC 16,7 275

463 100 -- --

Die dargestellten Fragmentierungsmuster der jeweiligen Epimere lassen erkennen, daß jeweils beide

Substanzen zwar dieselben Produkt-Ionen bilden, sich aber in ihrem Intensitätsverhältnis unterschei-

den, was zur Identifizierung der beiden Epimere genutzt werden kann. Von den in Tab. 4 dargestellten

Substanzen werden nachfolgend CTC und e-CTC quantifiziert, alle übrigen Verbindungen vorerst nur

qualitativ bestimmt.

5.2.1.3 Stabilität von CTC und e-CTC in Lösung

Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren werden häufig keine genauen Angaben darüber ge-

5 Ergebnisse und Diskussion

macht, wie die Kalibrierung durchgeführt wurde, vor allem fehlen Angaben über die Bildung mögli-

cher Abbau- und Umwandlungsprodukte in Kalibrierlösungen. Insbesondere ist in wäßrigen Lösungen

bei schwach saurem pH-Wert mit einer Epimerisierung zu rechnen. Ziel war es daher, nach Auswahl

des Lösungsmittels die Stabilität der Analyten in Lösung im Hinblick auf die Kalibrierung zu überprü-

fen. Es wurden die nachfolgend aufgeführten Untersuchungen durchgeführt:

• Untersuchung der Epimerisierung von CTC in Lösung bei verschiedenen Temperaturen

• Vergleich der Stabilität von CTC in Einzelstandardlösung mit der von CTC in Mischstandard-

lösung zusammen mit e-CTC

• Langzeitstabilität von CTC und e-CTC in Kalibrierlösung

Zunächst galt es, das optimale Lösungsmittel zur Herstellung der Kalibrierlösungen für CTC und e-

CTC auszuwählen. Dabei zu berücksichtigen waren die Löslichkeit der Analyten, die chromatographi-

schen Bedingungen im Hinblick auf die Peakform sowie die Stabilität der Substanzen in dem gewähl-

ten Lösungsmitel. Als Lösungsmittel erwies sich MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) (Fließ-

mittel A: H2O/CH3CN/HCOOH (10 % CH3CN (v/v), 0,5 % HCOOH, (v/v)) als geeignet. Aufgrund

einer möglichen Epimerisierung bei diesem pH-Wert wurde vermutet, daß bei Einsatz von Einzelstan-

dardlösungen die Gefahr der Epimerisierung besteht und somit undefinierte Mengen an CTC und e-

CTC in den jeweiligen Kalibrierlösungen vorliegen. Neben der Untersuchung der Stabilität sollte da-

her auch bewußt eine Epimerisierung herbeigeführt werden, um das Massenverhältnis von CTC und e-

CTC zur ermitteln, bei dem sich keine Konzentrationsänderung von CTC und e-CTC ergibt. Ziel war

es, Mischstandardlösungen herzustellen, da CTC und e-CTC in Mischstandardlösungen im Vergleich

zu Einzelstandardlösungen eine höhere Stabilität aufweisen sollten. In Mischstandardlösungen sollten

beide Verbindungen ein deutlich geringeres Bestreben ausfweisen, zu epimerisieren, da sie sich näher

am Gleichgewichtszustand befinden. Daher wurde zunächst die Stabilität von CTC in diesem Lö-

sungsmittelgemisch bei Temperaturen von 5 °C, 25 °C und 40 °C untersucht. In Abb. 15 ist der Kon-

zentrationsverlauf von CTC bei den verschiedenen Temperaturen über einen Zeitraum von 60 h darge-

stellt. In Einzelstandardlösungen zeigt CTC bei allen Temperaturen unter Zugrundelegung der Wie-

derholpräzision [244] nach 60 h eine signifikante Konzentrationsabnahme. Während bei einer Tempe-

ratur von 5 °C CTC über einen Zeitraum von 24 h stabil ist, ist bereits bei einer Temperatur von 25 °C

eine wesentlich höhere Konzentrationsabnahme über einen Zeitraum von 60 h zu beobachten. Bei

einer Temperatur von 25 °C sind CTC-Lösungen nur 12 h stabil, bei 40 °C kommt es schon nach 3 h

zu Umwandlungsreaktionen.

Das Massenverhältnis von CTC und e-CTC, bei dem sich keine Konzentrationsänderung mehr ergibt,

wurde bei einer Temperatur von 40 °C zu 1:1 ermittelt. Erst bei dieser Lagerungstemperatur nimmt die

CTC-Ausgangskonzentration exponentiell ab und nach einem Zeitraum von 50 h ergab sich bei einer

Konzentrationsabnahme von etwa 50 % keine Konzentrationsänderung. Neben der erwarteten Epime-

risierung sind allerdings bei dieser Temperatur noch weitere Umwandlungsreaktionen aufgetreten

(siehe Kap. 5.6.1). Aus diesem Grund und wegen der Temperaturabhängigkeit der Gleichgewichts-

konstanten konnte der Gleichgewichtszustand bei einer Temperatur von 5-25 °C, entsprechend der

Arbeitsbedingungen, nur vermutet werden. In der Literatur wird das Ausmaß der Epimerisierung bei

einem pH-Wert von 3,2 zu 55 % angegeben [138, 139, 140], so daß in guter Übereinstimmung das

Gleichgewicht unter diesen Bedingungen bei einer Epimerisierungsrate von 50 % angenommen wur-

de.

5 Ergebnisse und Diskussion 43

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60

Zeit [h]

Konzentration [mg/L]

CTC in Einzellösung, 5 °C

CTC in Einzellösung, 25 °C

CTC in Einzellösung, 40 °C

CTC in Mischlösung, 5 °C

Nachfolgend wurde die Stabilität von CTC in einer Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC in Me-

OH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) über einen Zeitraum von 60 h untersucht und mit der Stabili-

tät von CTC in der Einzelstandardlösung verglichen. In Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC

im Massenverhältnis 1:1 zeigt CTC bei einer Temperatur von 5°C keine Konzentrationsabnahme, ent-

sprechend dem in Abb. 15 dargestellten obersten Kurvenverlauf. Die Stabilitätsuntersuchungen in

diesem Lösungsmittel belegen die Vermutung, daß CTC und e-CTC in Mischstandardlösungen im

Massenverhältnis 1:1 stabiler sind als in den entsprechenden Einzelstandardlösungen. Die Kalibrie-

rung wird daher mit einer Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50)

(v/v) (pH 2,8) im Massenverhältnis 1:1 durchgeführt.

Abb. 15: Änderung der Konzentration von CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) als Funktion

von Temperatur und Zeit (β = 10 mg/L) (CTC in Mischlösung: CTC: e-CTC = 1:1 (w/w))

(370 nm)

Im Hinblick auf die Lagerung von Kalibrierlösungen wurde abschließend die Langzeitstabilität von

CTC und e-CTC in Mischstandardlösungen in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) im Mas-

senverhältnis 1:1 bei einer Lagerung von -80 °C und Konzentrationen von 1 und 10 mg/L über einen

Zeitraum von sechs Monaten untersucht. Zum Vergleich wurden entsprechende Langzeitstabilitätsun-

tersuchungen mit CTC und e-CTC in Einzelstandardlösungen durchgeführt. Die für diese Untersu-

chungen hergestellten Lösungen wurden aliquotiert, bei -80 °C eingefroren, und in Zeitabständen von

zwei Wochen wurde jeweils ein Aliquot entnommen und chromatographisch vermessen. In Misch-

standardlösungen erwiesen sich CTC und e-CTC mit einer maximalen Konzentrationsabnahme von

2,5 % für CTC und 2 % für e-CTC unter Zugrundelegung der für beide gültigen Wiederholpräzision

(Berechnung siehe Kap. A. 2 im Anhang) von 7,2 % über den untersuchten Zeitraum von sechs Mo-

naten als stabil (siehe Abb. A. 1 und Abb. A. 2 im Anhang). Die Stabilitätsuntersuchungen von CTC

und e-CTC in den Einzelstandardlösungen ergaben, daß für beide Substanzen die maximalen Konzen-

trationsabnahmen nach sechs Monaten mit 3 % für CTC und 3,5 % für e-CTC etwas höher lagen als

bei den entsprechenden Mischstandardlösungen. Es handelt sich jedoch nicht um eine signifikante

Konzentrationsabnahme, so daß CTC und e-CTC auch unter diesen Bedingungen über diesen Zeit-

raum als stabil zu betrachten sind.

5 Ergebnisse und Diskussion

5.2.2 Entwicklung und Optimierung der Probenvorbereitung

Ziel der Probenvorbereitung war, CTC und e-CTC aus den Matrices Urin, Plasma, Faeces, Muskula-

tur, Leber, Niere und Knochen möglichst quantitativ zu extrahieren. Da hierbei meist eine Reihe von

Probenbestandteilen mitextrahiert werden, ist sowohl für die UV-Detektion als auch für die MS/MS-

Detektion zur Vermeidung von Matrixeffekten eine Aufreinigung der erhaltenen Extrakte notwendig.

Dazu wurde der Extraktion aus der Matrix ein Festphasenextraktionsschritt nachgeschaltet. Eine Auf-

konzentrierung der Extrakte war erforderlich, um im Rahmen der durchgeführten Medikationsstudien

das Ausscheidungsverhalten von CTC und e-CTC in Urin und Faeces so weit wie möglich verfolgen

zu können sowie auch geringe Gehalte in den Schlachtproben im Hinblick auf eine mögliche Resi-

stenzbildung nachweisen zu können. Das entwickelte Analysenverfahren schließt unter Zugrundele-

gung der Rückstandshöchstmengenverordnung [116] die quantitative Bestimmung von e-CTC mit ein,

da eine Epimerisierung bereits während der Probenvorbereitung stattfinden kann. Daher wird bei allen

nachfolgend beschriebenen Wiederfinungsversuchen, bei denen CTC zudotiert wurde, die Wiederfin-

dung als Summe aus CTC und e-CTC angegeben. Da während der Probenvorbereitung neben einer

Epimersierung möglicherweise auch mit einer Isomerisierung zu rechnen war, wie die Stabilitätsunter-

suchungen in Kap. 5.2.1.3 gezeigt haben, war besonders auf mögliche Abbau- bzw. Umwandlungsre-

aktionen zu achten. Des weiteren war die hohe Tendenz zur Komplexbildung sowie in biologischen

Proben eine Protein-Analyt-Bindung zu berücksichtigen.

In der Literatur wird von einigen Autoren der Einsatz eines internen Standards zur Bestimmung der

Tetracycline OTC, TC und CTC in biologischen Proben beschrieben, wobei oft ein anderes Tetracy-

clinderivat, meist Demethylchlortetracyclin (DMCTC), als interner Standard verwendet [245, 246,

247] wird. Dies ist jedoch als kritisch zu betrachten, da sich DMCTC in seinen chemischen Eigen-

schaften bezüglich der Neigung zur Bildung von Metaboliten von den anderen Tetracyclinderivaten

unterscheidet. DMCTC zeigt eine vergleichsweise hohe Stabilität hinsichtlich der Bildung von Epime-

ren und Isomeren, die während der Probenvorbereitung entstehen können. Damit verhält sich DMCTC

nicht wie die anderen Tetracycline und ist daher als interner Standard ungeeignet. Darüber hinaus soll-

te bei der MS/MS-Detektion der interne Standard und der Analyt coeluieren, da die Ionisation im In-

terface durch die Fließmittelzusammensetzung beeinflußt wird [248]. Dies ist jedoch meist nur bei

isotopenmarkierten Standards gegeben. Da isotopenmarkierte Tetracyclin-Standardsubstanzen kom-

merziell nicht erhältlich sind, wurde auf den Einsatz eines internen Standards verzichtet.

Nach Extraktion der Analyten aus der zerkleinerten und homogenisierten Matrix mit McIlvain-Puffer

(pH 4) erfolgte die Aufreinigung und Aufkonzentrierung des Extraktes mit SPE. Das hierbei erhaltene

Eluat wurde zur weiteren Aufkonzentrierung in einem sogenannten „TurboVap“ eingeengt. Hierbei

wurde das in spezielle Reagenzgläser aufgefangene Eluat in einem Wasserbad unter Stickstoff- oder

Luftstrom in Abhängigkeit von der Stabilität der Analyten entfernt. Einengen im Stickstoffstrom ist

nicht notwendig, da festgestellt wurde, daß die Wiederfindung sowohl bei einer Temperatur von 30 °C

als auch 40 °C unabhängig von dem gewählten Gas ist und in beiden Fällen bei ca. 95 % liegt. Die

Temperatur des Wasserbades darf jedoch 40 °C nicht überschreiten, um zu gewährleisten, daß keine

Verluste der Analyten auftreten. Zur Aufnahme des Rückstandes nach Einengen des Eluates erwies

sich eine Mischung aus MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) als geeignet.

In Abb. 16 ist der Analysenablauf zur Bestimmung von CTC und e-CTC in biologischen Proben

schematisch dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 45

Abb. 16: Schematische Darstellung der Probenvorbereitung zur Bestimmung von CTC und e-CTC in

biologischen Proben

Bei der Entwicklung und Optimierung der Probenvorbereitung wurden folgende Untersuchungen

durchgeführt:

• Auswahl des SPE-Materials ohne biologische Matrix mit dotiertem Extraktionsmittel, dem

EDTA-McIlvain-Puffer

• Einfluß des pH-Wertes des Extraktionsmittels und eines EDTA-Zusatzes zum Extraktionsmit-

tel auf die Wiederfindung

• Überprüfung der Übertragbarkeit des entwickelten Verfahrens für CTC und e-CTC auf die

Bestimmung der weiteren Abbau- und Umwandlungsprodukten iso-CTC, Anhydro-CTC und

e-Anhydro CTC

• Ermittlung des Einflusses einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung

• Entwicklung der Probenvorbereitung für Urin, Plasma, Faeces, Muskulatur, Leber, Niere und

Knochen, wobei der Schwerpunkt der Methodenentwicklung auf der zur Lebensmittelgewin-

nung dienenden wichtigsten Matrix Muskulatur liegen sollte.

Zerkleinerung und Homogenisierung der Probe

(Proteinfällung)

Extraktion mit EDTA-McIlvain-Puffer pH 4

Extraktion der Analyten aus der Matrix

Einstellung des pH-Wertes für die SPE

SPE

Aufreinigung und Aufkonzentrierung

mit Festphasenextraktion (SPE)

Herstellung der Meßprobe

Einengen des Eluates bis zur Trockne

Aufnahme des Rückstandes in MeOH/Fließmittel A (50/50)

HPLC-UV-MS/MS

Konzentrationsbestimmung von CTC und e-CTC entweder über

UV (370 nm) oder MS/MS (TIC)

5 Ergebnisse und Diskussion

5.2.2.1 Auswahl des SPE-Materials

Es wurden drei verschiedene Sorbentien auf auf ihre Eignung zur Bestimmung von CTC und e-CTC

überprüft: Chromabond Tetracycline, Oasis HLB und Nexus. Bei dem Sorbens der Chromabond Te-

tracyclin-Kartusche handelt es sich um eine für die Tetracyclinanalytik modifizierte C18-

Umkehrphase, das Oasis HLB- und Nexus-Material basiert auf einem Copolymer. Zur Ermittlung der

Wiederfindung von CTC mit diesen SPE-Materialien wurde zu 10 mL EDTA-McIlvain-Puffer (pH 4)

2 µg bzw. 20 µg CTC zudotiert und aufgearbeitet, wobei die Elution in drei Fraktionen von jeweils 2

mL erfolgte und das Endvolumen der Meßproben 200 µL betrug. Die erzielten Wiederfindungen sind

in Tab. 5 zusammengefaßt, wobei sich die Wiederfindungen auf die Summengehalte (Σ CTC + e-

CTC) beziehen.

Tab. 5: Wiederfindungen (Σ CTC + e-CTC) mit verschiedenen SPE-Phasen (dotierter EDTA-

McIlvain-Puffer pH 4, Fraktionsvolumina: 2 mL, 370 nm, n = 3)

SPE-Kartusche stationäre

Phase

Wiederfindung [%]

2 µg (VEnd = 200 µL)

Wiederfindung [%]

20 µg (VEnd = 200 µL)

1. Fraktion 75 1. Fraktion 79

2. Fraktion 7 2. Fraktion 8

3. Fraktion 0 3. Fraktion 0

Chromabond

Tetracycline C 18

Σ 82 Σ 87

1. Fraktion 106 1. Fraktion 103

2. Fraktion 0 2. Fraktion 2

3. Fraktion 0 3. Fraktion 0

Oasis HLB Copolymer

Σ 106 Σ 105

1. Fraktion 89 1. Fraktion 87

2. Fraktion 10 2. Fraktion 15

3. Fraktion 0 3. Fraktion 0

Nexus Copolymer

Σ 99 Σ 102

Während mit dem Chromabond-Tetracycline-Material nur Wiederfindungen zwischen 82 % und 87 %

erreicht wurden, konnten mit den anderen beiden Säulenmaterialien quantitative Werte um 100 %

erzielt werden. Die Untersuchung der einzelnen Fraktionen ergab, daß bei Einsatz der NEXUS-

Kartusche ein größeres Elutionsvolumen notwendig war, so daß die Oasis-HLB-Kartusche am besten

geeignet war. Ein Elutionsvolumen von 2 mL reicht bei dieser SPE-Kartusche aus, um CTC und e-

CTC fast vollständig zu eluieren. Da jedoch bei der höheren Konzentration ein Restgehalt an CTC und

e-CTC in der zweiten Fraktion festgestellt wurde, wurden zur Gewährleistung einer vollständigen

Elution bei den weiteren Analysen 3 mL verwendet.

5.2.2.2 Einfluß der Zusammensetzung des Extraktionsmittels

Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren wird zur Extraktion von Tetracyclinen aus biologi-

schen Materialien meist McIlvain-Puffer pH 4 mit einem EDTA-Zusatz verwendet [170, 172, 180].

Systematische Untersuchungen des Einflusses vom pH-Wert und des EDTA-Zusatzes sind jedoch

nicht bekannt. Da die Wiederfindung der Tetracycline einerseits aufgrund ihres amphoteren Charak-

ters stark pH-Wert-abhängig sein sollte und andererseits wegen einer möglichen Komplexbildung auch

der EDTA-Zusatz einen Einfluß ausüben könnte, wurden McIlvain-Puffer der pH-Werte 2, 3, 4, 5 und

6 ohne und mit einem EDTA-Zusatz (0,01 moL/L) hergestellt, zu 10 mL dieser Lösungen CTC zudo-

tiert und mit SPE aufgearbeitet.

5 Ergebnisse und Diskussion 47

Tab. 6: SPE-Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) mit der Oasis HLB-Kartusche in Abhängigkeit vom pH-

Wert und EDTA-Zusatz des McIlvain-Puffers (dotierter McIlvain-Puffer, 370 nm, n = 3)

Wiederfindung [%]

McIlvain-Puffer CTC-Zusatz [µg]

(VEnd = 200 µL) pH 2 pH 3 pH 4 pH 5 pH 6

ohne EDTA 2 105 92 80 60 0

0,01 moL/L EDTA 2 110 108 101 67 30

Die in Tab. 6 dargestellten Wiederfindungen zeigen, daß die Extraktion mit McIlvain-Puffer im pH-

Bereich von 2-4 mit EDTA-Zusatz zu Wiederfindungen von etwa 100 % führten. Ohne EDTA-Zusatz

zeigte sich jedoch bereits ab pH 3 eine deutlich verringerte Wiederfindung. Maximale Wiederfindun-

gen von 110 % konnten bei der SPE-Extraktion mit McIlvain-Puffer pH 2 mit 0,01 moL/L EDTA

erreicht werden.

Tetracycline liegen, entsprechend der pKs-Werte, siehe Kap. 3.5.1, bei pH 2 als Kation, bei pH 5,5 als

Zwitterion und bei pH 8,7 als Monoanion vor [123, 152, 179]. Eine zunehmende Deprotonierung der

OH-Gruppen am C3- und C12-Atom führt offenbar zu einer Schwächung der Wechselwirkung zwi-

schen der ionisierten Tetracycline und der unpolaren Festphase und damit zu einem geringeren Sorpti-

onsgrad. Die Dimethylaminogruppe liegt dagegen im pH-Bereich von 2-6 weitgehend protoniert vor.

Mit sinkendem pH-Wert und abnehmendem Dissoziationsgrad verschiebt sich die bevorzugte Kon-

formation von der „extended“-Form zur „twisted“-Form. Möglicherweise trägt eine Abschirmung der

positiven Ladung in der „twisted“-Konformation zu einer verstärkten Wechselwirkung zwischen Te-

tracyclinmolekül und unpolarer Festphase bei. Ein EDTA-Zusatz wirkt sich ebenfalls günstig auf die

Wiederfindung aus. Ursächlich hierfür könnte der von JÜRGENS et al. angenommene Retentionsme-

chanismus sein, der auf einer Komplex- bzw. Ionenpaarbildung zwischen dem protonierten Tetracy-

clin und dem anionischen EDTA-Molekül beruht [174]. Es bleibt zu überprüfen, ob sich ähnliche Ab-

hängigkeiten der Wiederfindung auch bei der Aufarbeitung von Realproben ergeben.

5.2.2.3 Wiederfindungsstudien mit CTC und e-CTC

Da während der Probenvorbereitung eine Epimerisierung stattfindet, wurde überprüft, ob sich das

SPE-Verfahren für e-CTC ebenso wie für CTC eignet. Hierzu wurden jeweils 10 mL Puffer mit 2 µg

bzw. 20 µg CTC oder e-CTC dotiert, diese Lösungen mit SPE aufgearbeitet und die Konzentrationen

der zudotierten Substanz und dem jeweiligen Epimeren ermittelt. Die hierbei erhaltenen Wiederfin-

dungen sind in Tab. 7 dargestellt.

Die durchgeführten Untersuchungen haben gezeigt, daß sich sowohl CTC als auch e-CTC mit diesem

SPE-Verfahren quantitativ extrahieren lassen. Unter Berücksichtigung des jeweiligen Epimers wurden

Wiederfindungen zwischen 97 % und 104 % ermittelt. Neben einer Epimerisierung konnten keine

weiteren Abbau- und Umwandlungsreaktionen festgestellt werden. Die Epimerisierungsraten sind

unabhängig von der zugesetzten Konzentration und liegen für CTC bei durchschnittlich 17 % und für

e-CTC bei 20 %, wobei sich die Epimerisierungsrate als Quotient aus dem Gehalt von dem jeweiligen

Epimeren und der Summe von Muttersubstanz und Epimer ergab.

5 Ergebnisse und Diskussion

Tab. 7: Wiederfindung von CTC und e-CTC nach der SPE-Aufarbeitung von dotierten EDTA-

McIlvain-Puffern (Oasis HLB, McIlvain-Puffer mit 0,1 moL/L EDTA, 370 nm, n = 6)

dotierte

Substanz

Wiederfindung [%]

Zusatz: 2 µg, VEnd = 200 µL

Wiederfindung [%]

Zusatz: 20 µg, VEnd = 200 µL

CTC e-CTC

Σ (CTC+e-CTC) CTC e-CTC

Σ (CTC+e-CTC)

CTC 83 16 99 80 17 97

e-CTC CTC

Σ (e-CTC+CTC) e-CTC CTC

Σ (e-CTC+CTC)

e-CTC 81 23 104 80 18 98

5.2.2.4 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung

Um zu überprüfen, in welchem Schritt der Probenvorbereitung die Epimerisierung stattfindet, wurden

einzelne Schritte der Probenvorbereitung simuliert und in den hierbei erhaltenen Proben der Gehalt der

zudotierten Substanz und dem entsprechenden Epimeren ermittelt. Aus diesen Gehalten wurden an-

schließend die Epimerisierunsraten berechnet. Die Untersuchungen erfolgten sowohl für CTC als auch

für e-CTC. Die einzelnen Versuchsbedingungen und die ermittelten Epimerisierungsraten sind in Tab.

8 zusammengestellt.

Tab. 8: Epimerisierung von CTC und e-CTC unter verschiedenen simulierten Extraktions- und SPE-

Bedingungen (Oasis HLB, 370 nm, n = 4)

Epimerisierung

[%]

Simulierter Schritt der

Probenvorbereitung Versuch

CTC e-CTC

1 Extraktion aus der

Matrix

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 20 µg Substanz,

2 h Stehenlassen bei RT 8 12

2 SPE

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 20 µg Substanz,

SPE, Verdünnung des Eluates mit 3 mL Fließmittel A 5 8

3 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen des Eluates

durch Lyophilisierung, Aufnahme des Rückstandes in

200 µL MeOH/Fließm. A (50/50) (v/v)

∼ 0 ∼ 0

4 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen im TurboVap

(30 °C) (Dauer: 30 min), Aufnahme des Rückstandes in

200 µL MeOH/Fließm. A (50/50) (v/v)

10 8

5 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen im TurboVap

(40 °C) (Dauer: 20 min), Aufnahme des Rückstandes in

200 µL MeOH/Fließm. A (50/50) (v/v)

10 8

SPE +

Weiterverarbeitung

des Eluates

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 2 µg Substanz,

SPE, Einengen des Eluates durch Lyophilisierung, Auf-

nahme des Rückstandes in 200 µL MeOH/Fließm. A

(50/50) (v/v)

5 6

SPE +

Weiterverarbeitung

des Eluates

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 2 µg Substanz,

SPE, Einengen des Eluates im TurboVap (30 °C), Auf-

nahme des Rückstandes in 200 µL MeOH/Fließm. A

(50/50) (v/v)

12 13

5 Ergebnisse und Diskussion 49

Die Ergebnisse des ersten Versuches zeigen, daß eine Epimerisierung besonders durch die Einwirkung

des schwach sauren McIlvain-Puffers bei der Extraktion aus der Matrix begünstigt wird, da alleine das

Stehenlassen eines dotierten McIlvain-Puffers über einen Zeitraum von 2 h eine Epimerisierung von 8

% für CTC und 12 % für e-CTC verursacht. Ein Vergleich des ersten Versuches mit dem zweiten Ver-

such zeigt, daß offensichtlich die Dauer der Puffer-Einwirkung eine große Rolle spielt. Die Durchfüh-

rung der SPE im zweiten Versuch, bei der McIlvain-Puffer dotiert und sofort weiterverarbeitet wurde,

führt zwar bereits zu einer Epimerisierung, die Werte liegen jedoch mit 5 % für CTC und 8 % für e-

CTC niedriger als die ermittelten Epimerisierungen des ersten Versuches.

Die Simulation der Weiterverarbeitung des Eluates in den Versuchen 3-5 ergab, daß eine Epimerisie-

rung nur durch Lyophilisierung des Eluates vermieden werden kann. Ein Einengen im TurboVap unter

erhöhter Temperatureinwirkung führt unabhängig von der Temperatur (30°C, 40 °C) zu einer Epimeri-

sierung von 8 % bis 10 %. Der fünfte und sechste Versuch umfaßt sowohl die SPE als auch die Wei-

terverarbeitung des Eluates. Die Ergebnisse dieser Versuche verdeutlichen, daß die Epimerisierung

während der Probenvorbereitung dadurch minimiert werden kann, indem die Weiterverarbeitung des

Eluates durch Lyophilisierung anstatt durch Eineengen im TurboVap erfolgt.

Insgesamt kann gesagt werden, daß eine Epimerisierung vor allem durch die Extraktion mit dem

schwach sauren McIlvain-Puffer (pH 4) verursacht wird. Die Durchführung der SPE ohne einen weite-

ren Aufkonzentrierungsschritt führt daher bereits zu einer Epimerisierung. Erfolgt die Weiterverarbei-

tung des Eluates durch Einengen im TurboVap, so erhöht sich die Epimerisierungsrate nochmals. Da-

her kann eine Epimerisierung während der Probenvorbereitung nicht vollständig vermieden werden.

Dies bestätigt die Notwendigkeit, den CTC-Gehalt als Summe von CTC und e-CTC zu ermitteln. Wei-

terhin zeigt ein Vergleich der Epimerisierungsraten von CTC und e-CTC in den durchgeführten Ver-

suchen, daß sich beide Verbindungen weitgehend identisch verhalten.

5.2.2.5 Urin, Plasma und Faeces

Urin

In der Literatur werden verschiedene Verfahren für die Bestimmung von Tetracyclinen in Urin be-

schrieben, wobei die Urinproben entweder direkt ohne Aufarbeitung zur HPLC-Analyse eingesetzt

werden, eine Aufreinigung mittels Flüssig-Flüssig-Extraktion oder Festphasenextraktion erfolgt oder

Säulenschaltsysteme verwendet werden [249-252, 257]. Bei der Aufarbeitung von Urin mit Festpha-

senextraktion wird als Festphasenmaterial meist eine herkömmliches C18-Phase eingesetzt.

Das für Urin entwickelte eigene Extraktionsverfahren umfaßt eine pH-Wert-Einstellung der Probe und

eine Festphasenextraktion mit der Oasis HLB-Kartusche, welches als Sorbens ein Copolymer enthält.

Zu 5 mL Urin werden zur Einstellung des pH-Wertes 5 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 gegeben

und mittels SPE weiter aufgearbeitet. Wiederfindungsversuche mit Urinproben, die auf Gehalte von 10

µg/L und 100 µg/L dotiert wurden, haben gezeigt, daß mit diesem Extraktionsverfahren durchschnitt-

liche Wiederfindungen von 97 % für CTC mittels LC-MS/MS erzielt werden. Eine Quantifizierung

von CTC und e-CTC mit UV-Detektion ist aufgrund der geringen Spezifität der UV-Absorption nicht

möglich, da der CTC- und e-CTC-Peak von Peaks anderer störender Substanzen überlagert wird.

Plasma

Bei der Bestimmung von Tetracyclinen in Plasma ist vor allem die Protein-Analyt-Bindung zu be-

rücksichtigen. Plasma-Proteine können durch unspezifische Bindung an der stationären Phase oder

5 Ergebnisse und Diskussion

durch organische Lösungsmittel hervorgerufene Ausfällungen zu Störungen sowohl bei der Proben-

vorbereitung als auch bei der chromatographischen Bestimmung führen. Daher war nach Gewinnung

des Plasmas vor der weiteren Aufarbeitung zunächst eine Abtrennung der Proteine notwendig.

Nachteil einer Proteinfällung ist jedoch, daß möglicherweise auch Analyten mit den Proteinen ausge-

fällt werden.

Die Gewinnung des Plasmas erfolgt durch Abzentrifugieren des Vollblutes. Plasma ist dabei der

annähernd zellfreie Überstand des zentrifugierten Vollblutes, dessen Gerinnungsfähigkeit sofort bei

der Blutentnahme durch Zusätze von Na2-EDTA oder Li-Heparin gehemmt wird [253]. Heparin ver-

hindert die Blutgerinnung, indem es die Umwandlung von Prothrombin zu Thrombin und damit des-

sen Wirkung auf Fibrinogen sowie die Aggregation der Thrombozyten hemmt. EDTA komplexiert die

an der Bildung des Thrombins beteiligten Ca2+-Ionen und verhindert so die Koagulation des Blutes

[254]. Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren [152, 258, 259, 262] wird in den meisten Fäl-

len nicht angegeben, wie die Plasmaproben gewonnen wurden und welches Antikoagulantium einge-

setzt wurde. EDTA sollte besser geeignet sein, da es mit Komplexbildungskonstanten in Abhängigkeit

vom Zentralatom zwischen K = 108,7 und K = 1010,7 [255] die im Plasma vorhanden Metallkationen

abfängt und damit eine Komplexierung der Tetracycline, deren Komplexbildungskonstanten mit Wer-

ten zwischen K = 105,8 bis K = 109,4 [130, 131] für das jeweilige Zentralatom niedriger liegen, verhin-

dert. Das in den nachfolgenden Versuchen eingesetzte Plasma stammte aus der Medikationsstudie im

Landwirtschaftszentrum Haus Düsse und wurde aus den genannten Gründen aus EDTA-Vollblut ge-

wonnen.

Zur Abtrennung der Proteine gibt es verschiedene Möglichkeiten. Durch Erhitzen oder Einwirkung

von Säuren, Laugen oder hohen Salzlasten lassen sich Proteine ausfällen. Denaturierende Agentien

wie starke Säuren, z.B. Perchlorsäure und Metaphosphorsäure, oder saure Pufferlösungen, die häufig

zur Entfernung von Proteinen aus biologischen Proben eingesetzt werden, führen zu einer irreversiblen

Ausfällung der Proteine. Durch Anlagerung von Protonen an das Protein bildet sich ein Polykation,

wodurch es zu starken intramolekularen Abstoßungen kommt und die Sekundär-, Tertiär- und Quartär-

struktur der Proteine verloren gehen. Das Säureanion lagert sich zusätzlich an das Protein, so daß ein

unlösliches, nach außen neutrales, Salz entsteht und die Proteine vollständig ausfallen. Schonendere

Ausflockungen ohne Denaturierung werden durch Alkohole, Acetonitril und Ammoniumsalze erreicht.

Bei diesen Ausfällungen erfolgt eine Schwächung der Hydrathülle der Proteine, die zu einer Herabset-

zung der Löslichkeit führt [54, 256]. Während bei einigen Literaturverfahren zur Bestimmung von

Tetracyclinen in Plasma auf eine Proteinabtrennung vollständig verzichtet [257-259] wird, verwenden

andere Autoren zur Proteinfällung saure Pufferlösungen [260-263], Ammoniumsalze [264] oder Ace-

tonitril [265-268]. Bei der Entscheidung, welches Reagenz zur Proteinfällung eingesetzt wird, ist die

Stabilität in dem jeweiligen Fällungsreagenz zu berücksichtigen.

Um zu überprüfen, welches Fällungsreagenz sich für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Plasma

am besten eignet, wurden als Fällungsreagenzien Acetonitril, Methanol, 6% HClO4 (w/w) sowie eine

Mischung aus Perchlorsäure und Metaphosphorsäure, 6% HClO4 (w/w)/2% HPO3 (w/w), eingesetzt.

Anhand der SPE-Aufarbeitung von dotierten Acetonitril- bzw. Methanol-McIlvain-Puffer-Gemischen

wurde zunächst nachgewiesen, daß der organische Anteil im McIlvain-Puffer 25 % nicht überschreiten

darf, damit die Analyten vollständig auf der SPE-Phase retardieren. Die Aufarbeitung der Plasmapro-

ben erfolgte, indem zu 5 mL mit CTC dotiertem Plasma 5 mL Fällungsreagenz gegeben, die Proben

geschüttelt, die ausgefällten Proteine abzentrifugiert und zum Überstand zur pH-Wert-Einstellung

5 Ergebnisse und Diskussion 51

EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 gegeben wurde. Der so erhaltene Extrakt wurde durch SPE mit Oasis

HLB aufgereinigt. Die mit den unterschiedlichen Fällungsreagenzien erhaltenen Wiederfindungen sind

in Tab. 9 dargestellt.

Tab. 9: Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) in Plasma nach Proteinabtrennung durch verschiedene Fäl-

lungsreagenzien und anschließender SPE mit Oasis HLB (β = 400 µg CTC/L Plasma,

370 nm, n = 4)

Fällungsreagenz CH3CN MeOH

6% HClO4 (w/w) /

2% HPO3 (w/w) 6% HClO4 (w/w)

Wiederfindung [%] 46 51 61 68

Die mit den untersuchten Fällungsreagenzien erzielten Wiederfindungen lagen für Acetonitril bei 46

% und für Methanol bei 51 %. Die höchsten Wiederfindungen wurden mit 6 % HClO4 als Fällungsrea-

genz erzielt und lagen mit 68 % etwas höher als die mit der Mischung aus 6 % HClO4/2 % HPO3 er-

haltenen Werte. Eine Säurefällung der Proteine ist damit günstiger als die schonende Ausflockung mit

organischen Lösungsmitteln. Da CTC zwischen 45 % und 60 % an Plasma-Proteine gebunden wird,

siehe Kap. 3.3, und die Wiederfindung von CTC nach Säurefällung zwischen 61 % und 68 % liegt,

wird durch den Zusatz von Säure die Bindung der Tetracycline an den Proteinen zumindest teilweise

gelöst. Es kann jedoch nicht beurteilt werden, ob der Säurezusatz eine bessere Lösung der Tetracyclin-

Protein-Bindung als der Zusatz organischer Lösungsmittel bewirkt oder die Bedingungen bei der nach-

folgenden Festphasenextraktion im Falle der Säurefällung bei der Plasmaaufarbeitung günstiger ist.

Als optimales Fällungsreagenz zur Proteinabtrennung hat sich damit 6 % HClO4 ergeben. Mit diesem

Verfahren ist eine Quantifizierung von CTC und e-CTC in Plasma sowohl mit HPLC-UV als auch mit

LC-MS/MS möglich.

Faeces

Es gibt nur wenig Veröffentlichungen über die Bestimmung von Arzneimitteln in Faeces [269-271],

wobei kein LC-MS/MS-Verfahren bekannt ist. SUNDERLAND et al. beispielsweise nutzen zur Be-

stimmung von CTC in Faeces vom Schwein die HPLC-UV [272]. Daneben wird die Quantifizierung

von Tetracyclinen in Gülle bzw. güllegedüngten Böden beschrieben [273-277]. Diese Verfahren zur

Probenvorbereitung umfassen die Extraktion der Gülleproben mit Citrat-Puffer und zur Aufreinigung

die Flüssig-Flüssig-Extraktion. Die chromatographische Bestimmung erfolgt meist durch LC-MS/MS.

Bei dem eigenen entwickelten Verfahren erfolgt die Exktraktion der Analyten, indem zu 0,5 g Faeces

10 mL McIlvain-Puffer zugegeben wurde. Anschließend wurden die Proben geschüttelt und zentrifu-

giert. Nach weiteren zwei Extraktionsschritten wurden die vereinigten Überstände mittels SPE mit

Oasis HLB aufgereinigt. Da die ermittelten Konzentrationen von CTC in Faeces sehr hoch waren,

erfolgte keine weitere Aufkonzentrierung, sondern das bei der SPE erhaltene Eluat wurde mit Fließ-

mittel A im Verhältnis 1:2 verdünnt. Auf diese Art und Weise wurden Meßproben mit sehr geringen

Matrixanteilen erhalten. Daher war eine Auswertung der Chromatogramme sowohl mittels UV- als

auch MS/MS-Detektion möglich.

Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurde überprüft, ob die für Standardlösungen fest-

gestellte Abhängigkeit der Wiederfindung vom pH-Wert des Extraktionsmittels, siehe Kap. 5.2.2.2,

5 Ergebnisse und Diskussion

auch bei Realproben auftritt, wurden EDTA-McIlvain-Puffer verschiedener pH-Werte als Extrakti-

onsmittel auf ihre Eignung zur Extraktion von CTC und e-CTC aus Faeces untersucht. Analog Kap.

5.2.2.2 wurde zusätzlich der Einfluß der EDTA-Konzentration im Extraktionsmittel auf die Wieder-

findung bei der Bestimmung von CTC in Faeces überprüft. Dazu wurde Faeces (Nullprobe) aus der

Medikationsstudie an der FAL Braunschweig, in denen kein CTC nachweisbar war, mit einer CTC-

Lösung dotiert, mit dem jeweiligen Extraktionsmittel extrahiert und mittels SPE mit Oasis HLB aufge-

reinigt.

Tab. 10: Wiederfindung von (Σ CTC + e-CTC) in Faeces nach Extraktion mit McIlvain-Puffer unter-

schiedlicher pH-Werte und anschließender SPE mit Oasis HLB (β = 500 mg/kg Faeces, 370

nm, n = 4)

McIlvain-Puffer

pH 2

0,01 moL/L EDTA

pH 3

0,01 moL/L EDTA

pH 4

0,01 moL/L EDTA

pH 4

0,1 moL/L EDTA

Wiederfindung

[%] 85 83 88 92

Die in Tab. 10 aufgeführten Wiederfindungen zeigen, daß sich als optimales Extraktionsmittel für

Faeces der EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 mit einer EDTA Konzentration von 0,1 moL/L ergab.

5.2.2.6 Muskulatur, Leber und Niere

Die Matrices Muskulatur, Leber und Niere werden in der Literatur meist zu Geweben zusammenge-

faßt, da die Aufarbeitung dieser Matrices auf gleiche Art und Weise erfolgt. Bei den in der Literatur

beschriebenen Verfahren wird zur Extraktion von Gewebeproben entweder McIlvain-Puffer, pH 4 mit

einem Zusatz von EDTA (0,1 moL/L) [173, 210, 221, 239], Glycin-HCl-Puffer [210], Succinat-Puffer

[278, 279] oder Oxalsäure [176] als Extraktionsmittel eingesetzt. Einige Autoren verwenden zur Ex-

traktion von Gewebeproben auch Pufferlösungen mit niedrigeren pH-Werten von 2-3 und einem ge-

ringeren oder gar keinem EDTA-Zusatz [280, 281]. Das von OKA et al. mehrfach beschriebene Ex-

traktionsverfahren beinhaltet eine Extraktion mit McIlvain-Puffer, pH 4 und 0,1 moL/L EDTA [170,

172, 180, 221, 282, 283]. Von einigen Autoren wird außerdem ein Gemisch aus MeOH und McIlvain-

Puffer pH 4 zur Extraktion eingesetzt [245, 284].

Zur Wahl des Extraktionsmittels wurde analog zum vorherigen Kapitel überprüft, ob es eine Abhän-

gigkeit der Wiederfindung vom pH-Wert des McIlvain-Puffers gibt und ob die EDTA-Konzentration

im Extraktionsmittel die Wiederfindung bei der Bestimmung von CTC in Gewebeproben beeinflußt.

Zusätzlich wurden Mischungen aus Methanol und McIlvain-Puffer, MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer

(0,01 moL/L) (20/80, v/v), eingesetzt. Diese Wiederfindungsversuche erfolgten durch zweimalige

Extraktion von 5 g CTC-dotiertem Probenmaterial (Muskulatur, Leber oder Niere) mit 15 mL des

jeweiligen Extraktionsmittels und Homogenisierung der Proben mit einem Ultra-Turrax. Die erhalte-

nen vereinigten Überstände wurden mittels SPE mit Oasis HLB aufgereinigt. Die hierbei erzielten

Wiederfindungen sind in Tab. 11 dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 53

Tab. 11: Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) in Leber, Niere und Muskulatur nach Extraktion mit

unterschiedlichen McIlvain-Puffer-Gemischen und anschließender SPE mit Oasis HLB

(β = 400 µg CTC/kg Matrix, LC-MS/MS, n = 4)

Extraktionsmittel Wiederfindung [%]

Puffer-Gemisch pH-Wert

EDTA-Zusatz

[moL/L] Muskulatur Leber Niere

McIlvain-Puffer 2 0,01 32 13 35

McIlvain-Puffer 3 0,01 45 26 55

McIlvain-Puffer 4 --- 49 33 64

McIlvain-Puffer 4 0,01 51 35 64

McIlvain-Puffer 4 0,1 55 43 72

MeOH/McIlvain-

Puffer (20/80, v/v) 2 0,01 43 18 35

MeOH/McIlvain-

Puffer (20/80, v/v) 3 0,01 57 27 43

MeOH/McIlvain-

Puffer (20/80, v/v) 4 0,01 86 39 68

Die Ergebnisse lassen erkennen, daß mit steigender EDTA-Konzentration im McIlvain-Puffer die

Wiederfindung geringfügig steigt. Einen wesentlich höheren Einfluß hat der pH-Wert des Extrakti-

onsmittels. Mit steigendem pH-Wert wurden deutlich höhere Wiederfindungen erzielt. Die entspre-

chenden Untersuchungen mit dotierten McIlvain-Puffern verschiedener pH-Werte, siehe Kap. 5.2.2.2,

führte dagegen zu genau gegenteiligen Ergebnissen. Mit steigendem pH-Wert wurde eine Erniedri-

gung der Wiederfindung festgestellt. Als Ursache der sinkenden Wiederfindungen von CTC mit stei-

gendem pH-Wert nach Extraktion dotierter McIlvain-Puffer wurde eine zunehmende Dissoziation und

dadurch bedingte Konformationsänderung angenommen. Faktoren, die die Wiederfindung bei der

Aufarbeitung von Matrixproben beeinflussen, sind sicherlich Proteine, Fette und Metallkationen.

Denkbar ist, daß Matrixkomponenten die Konformation der Tetracycline beeinflussen. Darüber hinaus

könnte es möglich sein, daß mit steigendem pH-Wert die Komplexierungsfähigkeit von EDTA zu-

nimmt und damit die in den Proben vorhandenen Metallkationen besser abgefangen werden, denn

EDTA komplexiert am besten bei pH 10 [255].

Die Extraktion mit Methanol-McIlvain-Puffer-Gemischen führte für Leber und Niere im Vergleich zu

den reinen McIlvain-Puffern zu keiner Verbesserung der Wiederfindung. Als optimales Extraktions-

mittel ergab sich damit für Leber und Niere mit Wiederfindungen von 43 % und 72 % der McIlvain-

Puffer, pH 4 mit einer EDTA-Konzentration von 0,1 moL/L. Für Muskulatur wirkt sich ein Methanol-

Anteil im McIlvain-Puffer günstig auf die Extraktion aus. Es konnten mit dem Methanol-McIlvain-

Puffer-Gemisch maximale Wiederfindungen von 86 % erzielt werden. Damit ergab sich für die Aufar-

beitung von Muskulatur als optimales Extraktionsmittel MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 (0,01

moL/L) (20/80, v/v). Der Einsatz dieses Extraktionsmittels hat gegenüber den Literaturverfahren, die

Methanol-McIlvain-Puffer-Gemische zur Extraktion einsetzen, den Vorteil, daß keine zusätzliche

wäßrige Verdünnung des Extraktes für die SPE erforderlich ist. In der Literatur beschriebenen Verfah-

ren [245, 284] setzen Methanol im Überschuß ein, so daß dieses vor der Festphasenextraktion erst

5 Ergebnisse und Diskussion

wieder entfernt werden muß. Allerdings darf der Methanol-Anteil im McIlvain-Puffer 25 % nicht

überschreiten, um eine vollständige Retardation der Analyten auf der SPE-Phase zu gewährleisten.

Um zu klären, ob die Ursache für die niedrige Wiederfindung für Leber an einer mangelnden Extrakti-

onsausbeute oder einer starken Signal-Supression bei der ESI-MS/MS-Detektion liegt, wurden nicht

belastete Leberproben aufgearbeitet und der Endextrakt mit CTC-Standardlösungen auf einen Gehalt

von 20 µg/kg, 100 µg/kg und 800 µg/kg dotiert, analysiert und mit den entsprechenden wäßrigen

Standardlösungen verglichen. Bei allen Gehalten konnte eine starke Signal-Supression von 50 % bis

60 % festgestellt werden, was beweist, daß die tatsächliche Extraktionsausbeute fast bei 100 % liegt

und die Extraktion von CTC und e-CTC aus der Probe somit fast quantitativ erfolgt. Auf eine weitere

Optimierung des Verfahrens für Leber zur Reduktion der Matrixeffekte wurde in diesem Rahmen ver-

zichtet.

Mit der UV-Detektion ist zwar eine Quantifizierung von CTC in Leber und Niere möglich, aber der

e-CTC-Peak ist von Peaks anderer Substanzen überlagert, somit kann eine Quantifizierung nur mit

MS/MS erfolgen. In Muskulatur können CTC und e-CTC sowohl mit den durch UV-Detektion als

auch MS/MS-Detektion erhaltenen Daten quantifiziert werden.

5.2.2.7 Optimierung der Probenvorbereitung für Muskulatur

Für die zur Lebensmittelgewinnung dienende wichtigste Matrix Muskulatur wurde das Extraktionsver-

fahren weiter optimiert.

Extraktion

Einige Autoren wie OKA et al. führen bei der Aufarbeitung von Gewebeproben drei Extraktionsschrit-

te mit McIlvain-Puffer, pH 4 durch [221]. Andere gebräuchliche Verfahren für die Bestimmung von

Tetracyclinen in Muskulatur beschränken sich auf zwei Schritte. Zur Untersuchung, wie viele Extrak-

tionsschritte notwendig sind, um CTC und e-CTC quantitativ aus der Matrix herauszuextrahieren,

wurden Muskulaturproben dreimal mit MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,01 moL/L) (20/80, v/v)

extrahiert und die bei den einzelnen Extraktionsschritten erhaltenen Extrakte mit SPE aufgereinigt.

Diese Untersuchung wurde, da es Unterschiede zwischen dotierten Kontrollproben und gewachsenen

Proben geben kann, sowohl mit dotierten unbelasteten Muskulaturproben als auch mit CTC-haltigem

Probenmaterial duchgeführt. In Tab. 12 sind die hierbei erhaltenen Wiederfindungen zusammenge-

faßt.

Tab. 12: Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) in Muskulaturproben nach mehreren Extraktionsschritten,

a) dotierte Kontrollproben (400 µg/kg), b) gewachsene Proben (Extraktionsmittel:

MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,01 moL/L) (20/80, v/v), SPE, 370 nm, n = 4)

Extraktionsschritt Wiederfindung [%]

dotierte Muskulaturproben

CTC-Gehalt [µg/kg]

gewachsene Muskulaturproben

1 67 82,3

2 23 54,7

3 6 12,3

Die Ergebnisse zeigen, daß zwei Extraktionsschritte ausreichen, um 90 % der zudotierten CTC-Menge

5 Ergebnisse und Diskussion 55

zu erfassen. Ein weiterer Extraktionsschritt erhöht die Wiederfindung um 6 % auf 94 %. Wird bei den

Ergebnissen der Extraktionen gewachsener Proben als Bezugspunkt die Summe der Gehalte der drei

Extraktionsschritte als 100 % gesetzt, so werden nach zwei Extraktionsschritten bereits 92 % der Ge-

samt-CTC-Menge erfaßt. Ein Unterschied der Extrahierbarkeit zwischen dotierten und gewachsenen

Proben konnte damit nicht festgestellt werden. Da ein dritter Extraktionsschritt die Wiederfindung nur

geringfügig erhöht, wurde aufgrund der ohnehin aufwendigen Probenvorbereitung, der Homogenisie-

rung mit dem Ultra-Turrax, bei den weiteren Analyen darauf verzichtet.

SPE

Zur Erhöhung der Selektivität des SPE-Verfahrens wurde eine Wasch-Elutions-Studie durchgeführt.

Diese Studie diente dazu, den erforderlichen Methanol-Anteil für den Wasch- und Elutionsschritt zu

ermitteln. Diese Vorgehensweise ermöglicht es, durch einen höheren Anteil an organischem Lö-

sungsmittel während des Waschschrittes störende Interferenzen zu entfernen. Bei der Elution ist der

organische Anteil möglichst gering zu halten, damit Matrixkomponenten auf der SPE-Kartusche retar-

dieren und selektiv der Analyt eluiert wird.

Die Durchführung der Wasch-Elutions-Studie erfolgte, indem CTC-dotierte Muskulaturproben mit

MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 (0,01 moL/L) (20/80, v/v) extrahiert und der hierbei erhaltene

Extrakt auf die Oasis HLB-Kartusche aufgegeben wurde. Anschließend wurde ein erster Wasch-

Elutions-Schritt mit Methanol-Wasser-Gemischen, deren Methanol-Anteil von 0 % bis 100 % stufen-

weise erhöht wurde, durchgeführt. Hierdurch sollte ermittelt werden, wie hoch der Methanol-Anteil in

der Waschlösung sein darf, damit die Analyten noch vollständig auf der Kartusche retardieren und wie

hoch der Methanol-Anteil im Elutionsmittel sein muß, um die Analyten vollständig zu eluieren. Im

Anschluß daran folgte ein zweiter Elutionsschritt mit reinem Methanol. Diese methanolischen Extrak-

te wurden mit HPLC-UV vermessen. Die hierbei erhaltenen Wiederfindungen sind in Tab. 13 darge-

stellt.

Tab. 13: Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) in Muskulatur nach der Festphasenextraktion mit unter-

schiedlichen Wasch-Elutions-Lösungen (β = 400 µg CTC/kg, 370 nm, n = 4)

Anteil an Methanol in der

Wasch-Elutions-Lösung (v/v)

[%]

Wiederfindung

[%]

0 76

5 74

10 79

20 83

30 86

40 58

50 19

60 14

70 7

80 5

90 3

100 2

5 Ergebnisse und Diskussion

Die Ergebnisse zeigen, daß mit steigendem Methanol-Anteil in der Waschlösung von 0 % bis 30 %

eine Erhöhung der Wiederfindung erreicht werden konnte. Ein höherer Methanol-Anteil führt jedoch

zu einer deutlichen Verringerung der Wiederfindung. Der Einsatz von reinem Methanol als Waschlö-

sung zeigte mit 2 % nachweisbaren Analyten im zweiten methanolischen Eluat, daß sich CTC und e-

CTC schwer von der SPE-Kartusche eluieren lassen, so daß als Elutionsmittel 100 % Methanol beibe-

halten wurde.

5.2.2.8 Knochen

Die Bestimmung von CTC in Knochen ist schwierig, da Tetracycline im Knochen als Calcium-

Phosphat-Komplex vorliegen, siehe auch Kap. 5.9.2 und diese deshalb erst aufgeschlossen werden

müssen. KÜHNE et al. beschreiben [344, 285, 286] zum Aufschluß der Tetracycline aus dem Knochen

im wesentlichen zwei verschiedene Methoden: Die Extraktion der Analyten erfolgt entweder mit Suc-

cinat-Puffer oder mit Salzsäure. Die anschließende Aufarbeitung der Extrakte ist in beiden Fällen

gleich und umfaßt eine zweifache Aufreinigung mit SPE durch eine chelatisierenden Sepharose-Säule

und eine C18-Säule. Mit steigender Affinität zur Chelatbildung mit Ca2+-Ionen in der Reihenfolge

OTC < TC < CTC [50] wird es schwieriger, die entsprechenden Komplexe aufzuschließen. Dies ist der

Grund, warum KÜHNE et al. in ihren Untersuchungen mit dem Salzsäure-Aufschluß deutlich höhere

CTC-Gehalte ermittelten als mit der Extraktion mit Succinat-Puffer.

Basierend auf dem Verfahren von KÜHNE et al. und dem selbst entwickelten SPE-Verfahren wurde

eine Probenvorbereitung für die Bestimmung von CTC in Knochen entwickelt. Für die nachfolgenden

Versuche wurde CTC-haltiges Probenmaterial der behandelten Versuchstiere aus der Medikationsstu-

die im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse eingesetzt. Auf eine Bestimmung der Wiederfindung wur-

de verzichtet, da durch Dotieren von Knochenproben keine annähernd realen Bedingungen nachge-

stellt werden können. In Anlehnung an die für die anderen Matrices durchgeführten Extraktionsversu-

che wurde überprüft, welchen Einfluß der pH-Wert des McIlvain-Puffers auf die Extraktion ausübt.

Da Tetracycline unterhalb pH 3 nicht mehr komplexieren, siehe Kap. 3.5.2, wurde vermutet, daß die

Extraktionsausbeuten mit sinkendem pH-Wert des McIlvain-Puffers steigen. Zusätzlich wurde über-

prüft, ob ein höherer EDTA-Zusatz zum McIlvain-Puffer die als Komplexe eingelagerten Tetracycline

aus dem Knochen verstärkt herauslöst.

Der Aufschluß der Komplexe erfolgte, indem zu 1 g zerkleinertem Knochenmaterial das Extraktions-

mittel, EDTA-McIlvain-Puffer unterschiedlicher pH-Werte oder 1 moL/L Salzsäure, zugegeben wurde

und die Proben über Nacht stehen gelassen wurden. Im Falle des Salzsäureextraktes wurde der pH-

Wert mit 2 moL/L Natronlauge auf pH 4 eingestellt. Alle Proben wurden nach der Extraktion zentrifu-

giert und die erhaltenen Überstände mittels SPE mit Oasis HLB aufgereinigt. Die Ergebnisse in Tab.

14 entsprechen denen von KÜHNE et al. und belegen, daß maximale CTC-Gehalte durch den Auf-

schluß mit Salzsäure gefunden werden können.

Der Einsatz von McIlvain-Puffer eignet sich nicht zum Aufschluß, da zwar mit sinkendem pH-Wert

höhere CTC-Konzentrationen gefunden wurden, jedoch auch mit McIlvain-Puffer pH 2 keine voll-

ständige Extraktion von CTC aus dem Knochen erfolgt, obwohl unterhalb von pH 3 keine Komplexie-

rung der Tetracycline stattfinden soll [37]. Eine Erhöhung der EDTA-Konzentration im Extraktions-

mittel wirkt sich zwar günstig aus, die ermittelten Gehalte mit dem EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,1

moL/L EDTA) liegen aber dennoch deutlich unterhalb der mit dem HCl-Aufschluß erhaltenen Werte.

5 Ergebnisse und Diskussion 57

Damit ergab sich als optimales Extraktionsmittel 1 moL/L Salzsäure zum Aufschluß der in Knochen

eingelagerten Tetracycline. In den Extrakten können CTC und e-CTC sowohl durch UV-Detektion als

auch MS/MS-Detektion quantifiziert werden.

Tab. 14: Ermittelte CTC-Gehalte in Knochenproben nach Aufschluß mit verschiedenen Extraktions-

mitteln (Σ CTC + e-CTC, 370 nm, n = 4)

Extraktionsmittel CTC-Gehalt

[mg/kg]

pH 2 mit 0,01 moL/L EDTA 7,92

pH 3 mit 0,01 moL/L EDTA 5,48

pH 4 mit 0,01 moL/L EDTA 4,59

pH 5 mit 0,01 moL/L EDTA 2,70

McIlvain-Puffer

pH 4 mit 0,1 moL/L EDTA 7,08

1 moL/L HCl 16,32

Da unter den salzsauren Aufschlußbedingungen die Bildung von Anhydro-CTC zu erwarten ist, siehe

Kap. 3.5.3.4, wurde die Stabilität von CTC und e-CTC in salzsaurer Lösung überprüft. Zur Überprü-

fung, ob neben einer Dehydratation auch eine Epimerisierung unter diesen Bedingungen stattfindet,

wurde in einem ersten Schritt die Stabilität von CTC in 1 moL/L salzsaurer Lösung überprüft. Um

zusätzlich die Stabilität von e-CTC zu prüfen, erfolgte anschließend die Stabilitätsuntersuchung von

CTC und e-CTC in einer 1 moL/L salzsaurer Mischlösung. Diese Lösungen wurden bei einer Tempe-

ratur von 5 °C aufbewahrt und über einen Zeitraum von 12 h stündlich mit HPLC-UV vermessen. Die

Stabilitätsuntersuchungen ergaben, daß sich CTC und e-CTC mit Konzentrationsabnahmen nach 12 h

von 4,3 % für CTC und 6,8 % für e-CTC entgegen den Erwartungen unter Zugrundelegung der Wie-

derholpräzision von 7,2 % als stabil erwiesen. Es konnten nur geringe Anteile an Abbau- und Um-

wandlungsprodukten festgestellt werden. Deren Konzentrationsverlauf als Funktion der Zeit ist in

Abb. 17 dargestellt.

Die Stabilitätsuntersuchung von CTC in Einzellösung hat gezeigt, daß nach einem Zeitraum von 12 h

bezogen auf die Ausgangskonzentration von 10 mg/L nur 1 % Anhydro-CTC entstanden ist. Bereits

bei der ersten Messung konnte ein geringer e-CTC-Gehalt in Höhe von 1,8 % der Ausgangskonzentra-

tion festgestellt werden, der jedoch im Laufe der Untersuchung noch um 16 % abgenommen hat. Dies

belegt, daß in 1 moL/L salzsaurer Lösung unterhalb von pH 1,5 keine Epimerisierung stattfindet, siehe

auch Kap. 3.5.3.1.

Ein Vergleich der Stabilität von CTC und e-CTC in 1 moL/L salzsaurer Lösung zeigt, daß die Kur-

venverläufe für die Bildung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ähnlich sind, sich aber in der

erreichten Endkonzentration nach 12 h unterscheiden. Die Dehydratation von CTC ist nach einem

Zeitraum von 12 h doppelt so hoch wie beim e-CTC. Da keine Epimerisierung bei diesem pH-Wert

stattfindet, kann Anhydro-CTC nur aus CTC und e-Anhydro-CTC nur aus e-CTC entstanden sein.

Während nach 12 h die Anhydro-CTC-Konzentration 1 % der Ausgangs-CTC-Konzentration beträgt,

entstehen aus e-CTC nach diesem Zeitraum nur 0,5 % e-Anhydro-CTC. Neben den Anhydro-

Verbindungen traten geringfügig noch weitere Isomere von CTC und e-CTC auf, auf dessen Identifi-

zierung in Kap. 5.5 eingegangen wird.

5 Ergebnisse und Diskussion

Abb. 17: Stabilität salzsaurer Standardlösungen: a) CTC-Standard; b) CTC/e-CTC-Standard -

Bildung der Anhydroverbindungen als Funktion der Zeit (1 moL/L HCl, β = 10 mg/L, 5 °C)

Insgesamt kann festgestellt werden, daß sich CTC und e-CTC trotz der geringfügigen Bildung von

Metaboliten unter Zugrundelegung der Wiederholpräzision in 1 moL/L salzsaurer Lösung als stabil

erwiesen. Da der Dehydratationsanteil maximal nur 1 % betrug, wurde auf eine zusätzliche Quantifi-

zierung der Anhydro-Verbindungen nach der Aufarbeitung von Realproben verzichtet.

5.2.3 Zusammenfassung der Ergebnisse der Verfahrensentwicklung

Es wurde ein HPLC-UV-MS/MS-Verfahren entwickelt und optimiert, welches sich für die quantitative

Bestimmung von CTC und e-CTC sowie den qualitativen Nachweis der Metabolite iso-CTC, e-iso-

CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC eignet. Zur chromatograhischen Bestimmung erwies sich

als analytische Säule die YMC-ODS-AM (150 x 3 mm, 3 µm) unter Einsatz von einem Gemisch aus

Ameisensäure und Acetonitril (H2O/CH3CN/HCOOH, 0,5 % HCOOH, (v/v)), pH 2,8 als mobile Phase

als geeignet. Die zur Kalibrierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens eingesetzten Standardlösungen

wurden als Mischung aus CTC und e-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) im Massen-

verhältnis 1:1 hergestellt. Kalibrierlösungen können bei einer Temperatur von -80 °C sechs Monate

aufbewahrt werden. Bei Temperaturen höher als 5 °C kommt es rasch zu Abbau- und Umwandlungs-

reaktionen. Für die Routineanalytik empfiehlt sich in jedem Fall, Kalbrierlösungen zu aliquotieren und

einzufrieren, um häufiges Auftauen und Einfrieren zu vermeiden. Gegebenenfalls sind Regelkarten zur

Kontrolle der Stabilität von CTC und e-CTC zu führen.

Zur Probenvorbereitung wurde ein Verfahren mittels Festphasenextraktion mit Oasis HLB-Kartuschen

entwickelt. Das zunächst für Standardlösungen entwickelte SPE-Extraktionsverfahren wurde an die

unterschiedlichen Matrices angepaßt. Dieses Verfahren ermöglicht die quantitative Bestimmung von

CTC und e-CTC in Urin, Plasma, Faeces, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen mit hoher Sensitivi-

tät mittels Tandemmassenspektrometrie im MRM-Mode. Während CTC und e-CTC in Muskulatur,

Plasma, Faeces und Knochen zusätzlich in Abhängigkeit von der Höhe des CTC-Gehaltes auch mit

den durch UV-Detektion erhaltenen Daten quantifiziert werden können, wird bei Leber und Niere der

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0123456789101112

Zeit [h]

Konzentration [mg/L]

e-CTC Anhydro-CTC

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0123456789101112

Zeit [h]

Konzentration [mg/L]

Anhydro-CTC e-Anhydro-CTC

a) b)

(Konz.-Verlauf von CTC nicht dargestellt.) (Konz.-Verlauf von CTC und e-CTC nicht dargestellt.)

5 Ergebnisse und Diskussion 59

e-CTC-Peak grundsätzlich durch andere Substanzen gestört. Die Aufarbeitung von Urin führt zu kei-

ner ausreichenden Aufreinigung, so daß weder CTC noch e-CTC mit Daten der UV-Detektion aus-

wertbar sind. Der schematische Ablauf des Verfahrens ist in Abb. 18 dargestellt.

Abb. 18: Schematische Darstellung des Analysenverfahrens zur Bestimmung von CTC und e-CTC in

biologischen Proben

Das für Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen entwickelte Analysenverfahren

wurde im nächsten Schritt - vor Einführung in die Routineanalytik - zum Nachweis der Zuverlässig-

keit einer ausführlichen Validierung unterworfen.

Urin

(

5 mL

)

Herstellung der Meßprobe

Plasma

5 mL

Faeces

0,5 g

Muskulatur

5 g

Leber

5 g

Niere

5 g

Knochen

1 g

Muskulatur:

2 x mit 30 % MeOH in H2O

Extraktion mit

McIlvain-Puffer, pH 4 (0,1 moL/L EDTA)

Proteinfällung mit

6%iger HClO4 (w/w)

Extraktion mit

MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer,

pH 4 (0,01 moL/L) (20/80, v/v)

Aufschluß mit

1 moL/L HCl

pH-Wert-Einstellung

mit 2 moL/L NaOH

Probenextrakt

EDTA-

Vollblut

Zentrifugieren

Konditionierung der Oasis HLB-SPE-Kartusche

Probenaufgabe

Elution mit 3 mL MeOH

HPLC-UV-MS/MS

Einengen des Eluates bis zur Trockne

Aufnahme des Rückstandes in 200 µL

OH/Fließmittel A (50/50)

a) 3 mL MeOH

b) 3 mL H2O

Quantifizierung:

UV (370 nm) oder MS/MS, ESI+ (TIC)

Waschschritt alle übrigen Matrices:

2 x mit 5 % MeOH in H2O

Chromatographie

Analytische Säule:

YMC-ODS-AM, 150 x 3 mm

Mobile Phase:

A: H2O/CH3CN/HCOOH

(89,5/10/0,5 (v/v/v))

B: H2O/CH3CN/HCOOH

(39,5/60/0,5 (v/v/v))

5 Ergebnisse und Diskussion

5.3 Validierung des Analysenverfahrens zur Bestimmung von CTC

und e-CTC

Eine Validierung dient der analytischen Qualitätssicherung eines Analysenverfahrens für den Einsatz

in der Routineanalytik, zu dem die Probenahme, Probenvorbereitung, Analysenmethode, Kalibrierung

sowie die Ergebnisauswertung und -darstellung gehört. Validierung bedeutet durch systematische

Überprüfung und Dokumentation nachzuweisen, daß ein Analysenverfahren für die Erfüllung einer

Aufgabe geeignet ist und den Anforderungen des Anwenders gerecht wird [244, 287, 288]. Die Vali-

dierung eines Analysenverfahrens ist eine fehlertheoretische Systemanalyse der angewendeten chemi-

schen, physikalischen und mathematischen Grundlagen, der verwendeten Meßsysteme, der Datenge-

winnung und Datenverarbeitung einschließlich der notwendigen Kalibrierung. Je nach Anwendungs-

bereich werden an ein Analysenverfahren unterschiedliche Anforderungen gestellt, die in verschiede-

nen Richtlinien dokumentiert sind. Es gibt daher keine allgemeingültige Vorschrift, welche einzelnen

Parameter eine Validierung umfassen muß. Bei den in der Literatur beschriebenen Verfahren für die

Bestimmung von Tetracyclinen [170, 173, 210] erfolgte keine Angabe, welche mathematischen Mo-

delle zur Berechnung der angegebenen Validierungsparameter zugrunde liegen. Zudem werden Vali-

dierungsdaten nur in begrenztem Ausmaß beschrieben, wodurch die Vergleichbarkeit der Analysen-

verfahren erschwert wird. Die heute gültigen Richtlinien beziehen sich im Wesentlichen auf die von

KROMIDAS und FUNK et al. beschriebenen Validierungsmethoden [244, 288, 289, 290]. Die Einfüh-

rung neuer Vorschriften dient dazu, Validierungsmethoden zu vereinheitlichen und damit eine Ver-

gleichbarkeit von Analysenverfahren zu ermöglichen. So ist im Jahre 2000 eine für alle europäischen

Prüf- und Kalibrierlaboratorien international gültige Norm, die DIN EN ISO/IEC 17025 [291], verab-

schiedet worden. Weitere Richtlinien und Normen basieren auf Vorgaben der FDA [292] sowie den

Richtlinien der DIN 32645 [293] und der ICH-Richtlinien Q2A und Q2B der Indurstrie [294, 295].

Darüber hinaus gelten für einzelne Anwendungsbereiche spezielle Richtlinien. Von den Europäischen

Gemeinschaften ist im Jahr 2002 die EU-Richtlinie 2002/657/EG [296, 297] eingeführt worden, nach

der die Durchführung von Analysenmethoden sowie die Auswertung von Ergebnissen für die Bestim-

mung von Tierarzneimitteln geregelt ist.

Eine Validierung besteht im Wesentlichen aus der kritischen Untersuchung der einzelnen Analysen-

schritte auf systematische und zufällige Fehler. Nach Festlegung, in welcher Probenmatrix welche

Komponenten bestimmt werden sollen, erfolgt die Auswahl der Bestimmungsmethode und Erstellung

einer detaillierten Arbeitsvorschrift. Im Anschluß daran werden nachfolgend aufgeführte Validie-

rungsparameter ermittelt [244, 288, 289, 290]:

• Wahl des Arbeitsbereiches

• Linearität

• Nachweis- und Bestimmungsgrenze

• Selektivität, Spezifität

• Richtigkeit und Präzision

Ziel war es, das für die unterschiedlichen Matrices entwickelte Analysenverfahren für die Bestimmung

von CTC und e-CTC sowohl mit der UV-Detektion als auch MS/MS-Detektion zu validieren, wobei

5 Ergebnisse und Diskussion 61

der Schwerpunkt auf der Matrix Muskulatur lag. Daher ist nachfolgend beispielhaft die Validierung

für die Bestimmung von CTC und e-CTC mit HPLC-UV-MS/MS in Muskulatur dargestellt.

5.3.1 Kalibrierung

5.3.1.1 Wahl des Arbeitsbereiches

Die Wahl des Arbeitsbereiches erfolgte unter Berücksichtigung folgender Parameter:

• Es sollte ein möglichst linearer Zusammenhang zwischen der Analyt-Konzentration und dem

Detektorsignal vorliegen.

• Die untere Arbeitsbereichsgrenze muß oberhalb der Bestimmungsgrenze liegen.

• Die Analysenpräzision muß im gesamten Arbeitsbereich erreichbar im Hinblick auf die Be-

stimmungsgrenze und vor allem konstant sein.

• praxisorientiertes Anwendungsziel: Die Arbeitsbereichskonzentrationen sollten den Konzen-

trationen in den Realproben entsprechen.

Zunächst wurde der funktionale Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche für

CTC und e-CTC ermittelt.

HPLC-UV

Dazu wurden Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v),

künftig nur noch „Kalibrierlösungen“ genannt, mit Konzentrationen von 0,1 mg/L bis 100 mg/L

chromatographisch mittels HPLC-UV vermessen und bei einer Wellenlänge von 370 nm die Peakflä-

chen und ihre relativen Standardabweichungen der Peakflächen bestimmt (s. Tab. A. 12 im Anhang).

Durch Auftragung der Peakflächen y als Funktion von der Konzentration x und linearer Regression

wird eine Geradengleichung mit folgender Formel erhalten:

Gleichung 1: y = a+bx

Für CTC wurden die Konstanten a = -25,57 mAU min und b = 911,20 mAU min/ (mg/L) mit einem

Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9999, für e-CTC die Konstanten a = -21,93 mAU min und b = 910,50

mAU min/ (mg/L) mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9999 ermittelt. Damit kann für den ge-

wählten Konzentrationsbereich sowohl für CTC als auch für e-CTC von einem linearen Zusammen-

hang zwischen Konzentration und Detektorsignal (Peakfläche) ausgegangen werden.

LC-MS/MS

Zur Feststellung des funktionalen Zusammenhanges zwischen der Konzentration und der Peakfläche

für CTC und e-CTC mit der MS/MS-Detektion wurden Kalibrierlösungen mit Konzentrationen von

0,001 mg/L bis 100 mg/L chromatographisch mittels LC-MS/MS vermessen und die Mittelwerte der

Peakflächen sowie die relativen Standardabweichungen der Peakflächen ermittelt (s. Tab. A. 11 im

Anhang). Die Durchführung einer Regressionsanalyse durch Auftragung der Peakflächen y gegen die

Konzentrationen x ergibt, daß über diesen großen Konzentrationsbereich kein linearer Zusammenhang

zwischen Peakfläche und Konzentration mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9927 für CTC und

R2 = 0,9832 für e-CTC vorliegt. Der funktionale Zusammenhang zwischen Peakfläche und Kon-

5 Ergebnisse und Diskussion

zentration kann vielmehr durch eine polynomische Funktion 2. Grades beschrieben werden, die ein

Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9999 für CTC und R2 = 0,9997 für e-CTC liefert, was visuell bestätigt

werden kann (s. Kap. A. 5.2 im Anhang).

Zur Festlegung der unteren Grenze des Arbeitsbereiches war es erforderlich, die Bestimmungsgren-

ze des Analysenverfahrens zu ermitteln. Die Ermittlung erfolgte als eigener Validierungsparameter

(siehe Kap. 5.3.2). Als Bestimmungsgrenze des Verfahrens und damit untere Grenze des Arbeitsberei-

ches ergab sich für die UV-Detektion für CTC und e-CTC eine Konzentration von 0,18 mg/L, für die

MS/MS-Detektion für beide Verbindungen eine Konzentration von 0,005 mg/L.

Für die Analysenpräzision gilt nach KROMIDAS für medizinische Anwendungen eine maximal zu-

lässige Standardabweichung von 10 % [298]. Nach der EU-Richtlinie 657 gilt für die Mehrfachbe-

stimmung einer Probe sogar ein Grenzwert von 20 % [296]. Da sich dieser Grenzwert aber auf die

Messung von Realproben bezieht, wurde der von KROMIDAS festgelegte Grenzwert von 10 %

zugrunde gelegt. Damit ergab sich eine untere Arbeitsbereichsgrenze für CTC und e-CTC mit der UV-

Detektion von 0,18 mg/L, für die MS/MS-Detektion eine Grenze von 0,005 mg/L. Als obere Grenze

des Arbeitsbereiches wurde für die UV-Detektion eine Konzentration von 100 mg/L festgesetzt, für

die MS/MS-Detektion eine Konzentration von 50 mg/L, da oberhalb dieser Konzentration eine Sätti-

gung bei der massenspektrometrischen Detektion auftritt.

In Bezug auf das praxisorientierte Anwendungsziel sollten die Arbeitsbereichskonzentrationen den

Konzentrationen in den Realproben entsprechen. Da sowohl bei der Ermittlung des Ausscheidungs-

verhaltens von CTC im Urin und Faeces als auch in Knochen mit hohen CTC-Gehalten sowie im Ge-

gensatz dazu in Plasma und den Schlachtproben mit geringen CTC-Gehalten zu rechnen ist, sollte der

Arbeitsbereich möglichst groß gewählt werden. Er wurde für die UV-Detektion von 0,1 mg/L bis 100

mg/l und für die MS/MS-Detektion von 0,005 mg/L bis 50 mg/L festgesetzt.

5.3.1.2 Linearität

HPLC-UV

Zur Erstellung einer Kalibrierfunktion mittels HPLC-UV wurden zehn über den festgelegten Arbeits-

bereich von 0,18 mg/L bis 100 mg/L verteilte Konzentrationen von CTC und e-CTC in Kalibrierlö-

sungen zehnfach chromatographisch vermessen und die Peakflächen ermittelt. Nachdem mittels

GRUBBS-Test [288] (s. Anhang Kap. A. 4) sichergestellt wurde, daß die einzelnen Meßreihen keine

Ausreißer enthalten, wurden die jeweiligen Mittelwerte der Peakflächen und relativen Standardabwei-

chungen ermittelt (s. Tab. A 12 im Anhang). Neben der Überprüfung der Linearität durch einen einfa-

chen Visualitätstest (s. Kap. A. 5.2 im Anhang) ist eine mathematische Prüfung notwendig. Zur stati-

stischen Absicherung der Kalibrierfunktionen wurde der Anpassungstest nach MANDEL (s. Anhang

Kap. A 5.3) die Residualanalyse (s. Anhang Kap. A. 5.4), die Ermittlung der Varianzhomogenität

(s. Anhang Kap. A. 5.5) und die Absicherung der unteren Arbeitsgrenze (s. Anhang Kap. A. 5.6)

herangezogen [244, 288, 290]. Mit den durchgeführten Untersuchungen konnte die Linearität im Kon-

zentrationsbereich von 0,1 mg/L bis 100 mg/L (y = 910,49 x -20,96, R2 = 0,9999) bestätigt werden.

Die Regressionsanalyse liefert die Kalibrierfunktion mit verschiedenen Verfahrenskenndaten [244,

288, 289]. Eine wichtige Kenngröße ist die Reststandardabweichung sy, die die Streuung der Meß-

werte um die Regressionsgerade angibt und somit ein Präzisionsmaß für die Messung ist. Wird nun die

Reststandardabweichung auf die Mitte des Arbeitsbereiches normiert durch Division mit der Steigung,

5 Ergebnisse und Diskussion 63

so kann die Verfahrenstandardabweichung sx0 errechnet werden (s. Anhang Kap. A. 5.7). Die Stei-

gung der Regressionsgeraden entspricht bei linearen Kalibrierfunktionen der Empfindlichkeit, worun-

ter die Änderung des Meßwertes bei einer Änderung der Konzentration verstanden wird. Ein Verfah-

ren ist also um so leistungsfähiger, je größer die Steigung und je kleiner die Reststandardabweichung

ist. Die Verfahrensstandardabweichung sx0 ist somit ein Maß für die Leistungsfähigkeit eines Analy-

senverfahrens. Eine Normierung der Verfahrensstandardabweichung durch Division mit dem Mittel-

wert der Konzentrationen und Multiplikation mit 100 liefert den Verfahrenvariationskoeffizienten

oder relative Verfahrensstandardabweichung Vx0, welche einen Vergleich verschiedener Verfahren

erlaubt. Die maximal zulässige relative Verfahrenstandardabweichung hängt von der Anzahl der Kali-

brierkonzentrationen und der Ausdehnung des Arbeitsbereiches ab. Mit abnehmender Anzahl an Kali-

brierstandards und zunehmender Ausdehnung des Arbeitsbereiches nimmt die maximal zulässige Ver-

fahrensstandardabweichung ab, d.h. die Anforderungen an die Kalibrierfunktion nehmen zu. Für einen

Arbeitsbereich mit einer Ausdehnung vom 20fachen der unteren Arbeitsbereichsgrenze, d.h. die höch-

ste Konzentration beträgt das 20fache der geringsten Konzentration des Arbeitsbereiches, und zehn

Kalibrierkonzentrationen wird von KROMIDAS eine maximal zulässige Verfahrenstandardabweichung

von 1,8 % angegeben [289]. Für größere Arbeitsbereiche werden zwar keine Angaben gemacht, aber

näherungsweise kann dieser Wert als maximal zulässige Verfahrenstandardabweichung gesetzt wer-

den. Die ermittelten Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC sind in Tab. A.

17 im Anhang zusammengefaßt. Die relativen Verfahrensstandardabweichungen für das HPLC-UV-

Verfahren lagen mit 1,7 % für CTC und 1,4 % für e-CTC unterhalb des Grenzwertes von 1,8 %.

LC-MS/MS

Die mit LC-MS/MS erhaltenen Kalibrierfunktionen wurden ebenfalls durch den Anpassungstest nach

MANDEL (s. Anhang Kap. A. 5.3) die Residualanalyse (s. Anhang Kap. A. 5.4), die Ermittlung der

Varianzhomogenität (s. Anhang Kap. A. 5.5) und die Absicherung der unteren Arbeitsgrenze (s.

Anhang Kap. A. 5.6) statistisch abgesichert [244, 288, 290, 299, 300, 301]. Die Durchführung des

Linearitätstests nach MANDEL für die Kalibrierfunktion der MS/MS-Detektion bezogen auf einen

Arbeitsbereich von 0,005 mg/L bis 50 mg/L bestätigte rechnerisch, daß durch eine Kalibrierfunktion 2.

Grades eine signifikant bessere Anpassung erreicht werden kann als mit der 1. Grades. Durch Auftei-

lung des Arbeitsbereiches in drei Teilbereiche konnte ein linearer Zusammenhang zwischen Konzen-

tration und Peakfläche für CTC und e-CTC erzielt werden, was rechnerisch mittels des MANDEL-

Testes bestätigt werden konnte. Damit ergaben sich die in Tab. 15 dargestellten linearen Arbeitsberei-

che.

Für die drei Kalibrierfunktionen der MS/MS-Detektion wurden analog die Verfahrenskenndaten ermit-

telt, die in Tab. A. 18 bis Tab. A. 20 zusammengefaßt sind. Die relativen Verfahrensstandardabwei-

chungen belegen mit Werten zwischen 2,1 % und 6,2 % die gute Leistungsfähigkeit des Analysenver-

fahrens, weil aufgrund der Einschränkung des Arbeitsbereiches in drei Teilbereiche nach KROMIDAS

eine maximal zulässige Verfahrensstandardabweichung von 6,4 % angenommen werden kann [289].

5 Ergebnisse und Diskussion

Tab. 15: Ermittelte lineare Bereiche für die Bestimmung von CTC und e-CTC mittels LC-MS/MS

Kalibrierfunktionen/Korrelationskoeffizienten

Linearer

Bereich

[mg/L] CTC e-CTC

0,005-0,08 y = 4158,035 + 1182783,981 x

R2 = 0,9985

y = 13875,111 + 836366,874 x

R2 = 0,9981

0,1-0,5 y = 12247,543 + 1121152,553 x

R2 = 0,9996

y = 19111,349 + 799036,245 x

R2 = 0,9995

1-50 y = 591645,743 + 812434,819 x

R2 = 0,9998

y = 484980,264 + 589292,935 x

R2 = 0,9996

Da ein linearer Zusammenhang zwischen Konzentration und Peakfläche bei der MS/MS-Detektion nur

in einem begrenztem Konzentrationsbereich der in Tab. 15 angegebenen Bereiche gegeben ist, ist bei

der Ermittlung der CTC-Gehalte in Realproben darauf zu achten, daß die Konzentrationen der Kali-

brierstandardlösungen im Bereich der Realprobe liegen.

5.3.2 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Die Nachweisgrenze ist die kleinste quantitativ noch nachweisbare Konzentration ohne Forderung

einer bestimmten Präzision. Die Nachweisgrenze ist damit ein Entscheidungskriterium für das Vor-

handensein eines Analyten. Im Gegensatz dazu wird als Bestimmungsgrenze die kleinste mit einer

vorgegebenen Richtigkeit und Präzision quantifizierbare Konzentration verstanden [244, 288, 293].

Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze werden in der Literatur verschiedene Verfah-

ren beschrieben, wobei in der Regel die Nachweis- und Bestimmungsgrenze über das Signal-Rausch-

Verhältnis bestimmt werden. Dieses Verfahren entspricht der EU-Richtlinie 2002/657/EG, der IUPAC

zur Nomenklatur in der Chromatographie sowie der FDA [293, 296, 292, 302, 302].

Nach den Definitionen der EU-Richtlinie 2002/657/EG, der IUPAC-Richtlinien zur Nomenklatur in

der Chromatographie und von KROMIDAS [296, 244, 288] ist die Nachweisgrenze definiert ist als

das Dreifache, die Bestimmungsgrenze als das Neunfache des Signal-Rausch-Verhältnisses. Zur Er-

mittlung des Signal-Rausch-Verhältnisses in Standardlösungen wurden Kalibrierlösungen aus CTC

und e-CTC in der Nähe der Nachweisgrenze sechsfach chromatographisch vermessen. Die Bestim-

mung der Nachweis- und Bestimmungsgrenze in Muskulatur erfolgte, indem unbelastete Muskulatur-

proben (Sechsfach-Bestimmung) auf Gehalte in der Nähe der Nachweisgrenze dotiert wurden, nach

der Analysenvorschrift, siehe Kap. A. 9 im Anhang, aufgearbeitet, mit HPLC-UV-MS/MS gemessen

und anschließend das Signal-Rausch-Verhältnis ermittelt wurde. Für die Ermittlung des Grundrau-

schens wurde die zehnfache Peakbreite genommen.

In Standardlösungen lagen die mittels UV-Detektion erhaltenen Nachweisgrenzen für CTC und e-CTC

bei 0,06 mg/L und die Bestimmungsgrenzen bei 0,18 mg/L. Die mit der MS/MS-Detektion ermittelten

Nachweisgrenzen betrugen 0,002 mg/L und die Bestimmungsgrenzen 0,005 mg/L für CTC und

e-CTC. Die in Muskulatur ermittelte Nachweis- und Bestimmungsgrenzen sind in Tab. 16 zusammen-

gefaßt. Diese lagen deutlich unterhalb der in Literaturverfahren angegebenen Werte. Für die Bestim-

mung von CTC in Muskulatur mittels UV-Detektion werden Nachweisgrenzen von 10-24 µg/kg und

Bestimmungsgrenzen von 20-47 µg/kg beschrieben [210, 239], für die MS/MS-Detektion werden in

der Literatur Nachweisgrenzen von 3-4 µg/kg und Bestimmungsgrenzen von 10-15 µg/kg angegeben

5 Ergebnisse und Diskussion 65

[176, 224, 279].

Tab. 16: Nachweis- und Bestimmungsgrenze von CTC und e-CTC in Muskulatur (HPLC-UV-MS/MS)

(n = 7)

Nachweisgrenze [µg/kg] Bestimmungsgrenze [µg/kg]

Substanz UV-Detektion MS/MS-Detektion UV-Detektion MS/MS-Detektion

CTC 3 0,1 8 0,3

e-CTC 3 0,1 8 0,3

5.3.3 Selektivität des Verfahrens zur Bestimmung von CTC und e-CTC in

Muskulatur

Unter der analytischen Spezifität wird die Fähigkeit eines Untersuchungsverfahrens verstanden, nur

den gesuchten Analyten zu erfassen, wobei andere anwesende Bestandteile in der Probe das Analysen-

ergebnis nicht beeinflussen [288, 289, 290, 296]. Die Selektivität beschreibt das Ausmaß, mit dem

mehrere Substanzen in einer komplexen Mischung ohne Interferenzen in Gegenwart weiterer Mi-

schungskomponenzen bestimmt werden können. Grundsätzlich gilt, daß auf eine Prüfung der Selekti-

vität verzichtet werden kann, wenn die Richtigkeit bereits bewiesen wurde, denn wenn ein Vorliegen

systematischer Fehler ausgeschlossen werden kann, so muß das Verfahren auch selektiv sein. Die Ü-

berprüfung der Selektivität eines HPLC-UV-Verfahrens ist besonders wichtig, da die Identifizierung

der Analyten hauptsächlich über die Retentionszeit erfolgt, wobei vor allem bei der Untersuchung

komplexer biologischer Proben die Gefahr von Überlagerungen des Analyt-Peaks durch Begleitkom-

ponenten in der Probe besteht und somit eine Verfälschung des Ergebnisses eintritt. Aber auch bei der

massenspektrometrischen Detektion ist eine Prüfung der Selektivität erfoderlich, da eine Quantifizie-

rung mit Triple-Quadrupol-Geräten ausschließlich im MRM-Mode durch Aufnahme von meist nur

zwei bis maximal vier Massenspuren erfolgt und es somit auch zu Überlagerungen durch Begleitkom-

ponenten kommen kann. Nach der EU-Richtlinie 657 [296] ist die Selektivität von Verfahren im ersten

Schritt durch Retentionszeitvergleich der Analyten in der Probe mit denen in einem entsprechenden

Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedingungen zu prüfen, wobei eine Retentionszeitstole-

ranz von 5 % nicht überschritten werden darf. Weiterhin muß bei HPLC-DAD-Verfahren ein UV-

Spektrenvergleich erfolgen. Die Absorptionsmaxima der Analyten müssen unter Berücksichtigung

einer durch das Auflösungsvermögen des Detektionssystems vorgegebenen Toleranz bei denselben

Wellenlängen wie bei den Kalibrierstandards liegen. Beim massenspektrometrischen Nachweis mit

Triple-Quadrupol-Geräten im MRM-Modus müssen die relativen Intensitäten der nachgewiesenen

Produkt-Ionen innerhalb einer Toleranz, ausgedrückt in Prozent der Intensität des intensivsten Ions,

auch Basis-Peak, denjenigen des Kalibrierstandards entsprechen, wobei die Konzentration des Kali-

brierstandards der der Probe entsprechen muß. Die zulässige Höchsttoleranz für die relativen Ionenin-

tensitäten ist nach relativer Intensität des Produkt-Ions bezogen auf den Basis-Peak gestaffelt, darf

aber ± 50 % nicht überschreiten. Weiterhin gilt für alle massenspektrometrische Verfahren, bei denen

Fragmente nicht im Full-Scan-Modus gemessen werden, zur Identifizierung ein Punktesystem, wobei

zur Bestätigung von Analyten mindestens vier Identifizierungspunkte benötigt werden. Ein LC-

MS/MS-Verfahren, mit dem ein Precursor-Ion und zwei Produkt-Ionen gemessen werden, liefert vier

5 Ergebnisse und Diskussion

Punkte, zwei Precursur-Ionen mit einem Produkt-Ion fünf Punkte. Bei dem entwickelten HPLC-UV-

MS/MS-Verfahren wird ein Identifizierungspunkt durch die UV-Detektion und vier Identifizierungs-

punkte durch die MS/MS-Detektion erhalten, womit CTC und e-CTC mit einer Gesamtpunktzahl von

fünf eindeutig identifizierbar sind.

Im Rahmen dieser Arbeit erfolgte die Selektivitätsprüfung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens durch

eine für CTC und e-CTC charakteristischen Peaklöschung nach alkalischer Behandlung der Probe

sowie durch einen Vergleich der Retentionszeiten, der UV-Spektren, der MS-Spektren und der Pro-

dukt-Ionen-Intensitäten.

5.3.3.1 Selektivitätstest durch Peaklöschung nach alkalischer Behandlung

Zur Absicherung der Selektivität wurde in einem ersten Schritt eine Muskulaturprobe alkalisch behan-

delt, was die Isomerisierung von CTC und e-CTC zu iso-CTC und e-iso-CTC bewirkt und damit zu

einer Peaklöschung führt. Ist das Verfahren selektiv, so muß es zu einer vollständigen Löschung des

CTC- und e-CTC-Peaks kommen. Wie in Abb. 19 anhand der UV- und MS-Chromatogramme darge-

stellt, kommt es nach alkalischer Behandlung der Muskulaturprobe zu einer vollständigen Auslö-

schung der CTC und e-CTC-Peaks und zur Umwandlung in die isomeren Verbindungen.

Abb. 19: UV- und MS-Chromatogramme einer Muskulaturprobe: Aufarbeitung nach dem allgemeinen

Extraktionsverfahren (unten), Aufarbeitung mit alkalischer Behandlung (oben)

5.3.3.2 Selektivitätsstest durch Vergleich der Retentionszeiten

Die weitere Selektivitätsprüfung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens erfolgte durch einen Vergleich

der Retentionszeiten [295] von CTC und e-CTC in einer Muskulaturprobe mit denen in einer Kali-

brierlösung. Hierzu wurde sowohl eine gewachsene Muskulaturprobe des Tieres 95 der Tierstudie an

der FAL aufgearbeitet als auch eine Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC (β = 1 mg/L) ver-

messen. Die in Abb. 20 dargestellten Chromatogramme für die UV-Detektion und MS/MS-Detektion

zeigen, daß die Retentionszeiten von CTC und e-CTC in der Muskulaturprobe exakt mit denen im

Standard übereinstimmen und damit das Richtigkeitskriterium aufgrund der Retentionszeiten mit einer

maximalen Toleranz von 5 % erfüllt ist. Da der Retentionszeitvergleich als einziges Selektivitätskrite-

51015

min

100

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

51015

min

100

4: Diode Array

370

4: Diode Array

370

CTC

e-CTC

51015

min

100

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

51015

min

100

4: Diode Array

370

4: Diode Array

370

CTC

e-CTC

51015

min

100

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

51015

min

100

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

1: MRM of 6 Channels ES+

TIC

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

51015

min

100

4: Diode Array

370

4: Diode Array

370

CTC

e-CTC

51015

min

100

4: Diode Array

370

4: Diode Array

370

CTC

e-CTC

5 Ergebnisse und Diskussion 67

rium nicht ausreicht, wurden weitere Selektivitätstests durchgeführt.

Abb. 20: Selektivitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten: HPLC-Chromatogramm eines Kali-

brierstandards und einer Muskulaturprobe mit MS/MS-Detektion (a) und UV-Detektion (b)

5.3.3.3 Selektivitätstest durch Vergleich der UV- und MS-Spektren

Als weiteres Kriterium für die Selektivität eines Verfahrens gilt die Übereinstimmung der Spektren der

Analyt-Peaks in Standardlösungen mit denen in der Probe [288, 290]. Dazu wurden die UV- sowie die

MS-Spektren der Analyten in der Standardlösung mit denen in der Muskulaturprobe verglichen.

Abb. 21: Selektivitätstest durch Vergleich der UV-Spektren von CTC und e-CTC in Standardlösung

(β = 1 mg/L) und in einer Muskulaturprobe (Tier 95, FAL)

Ein Vergleich der normierten UV-Spektren, siehe Abb. 21, zeigt deutlich, daß eine Selektivität dieser

Detektionsart nur in einem Wellenlängenbereich von etwa 350 nm bis 400 nm gegeben ist. Im Wellen-

längenberich von 250 nm bis 350 nm kommt es in Realproben zu Überlagerungen von Störsubstanzen,

100

0min

MRM of 6 Channels ES+

9.97

8.23

Retentionszeit

5 7,5 10 12,5 15

Intensität

CTC

e-CTC

Kalibrierstandard

Probe

min

Diode Array

5 7,5 10 12,5 15

Retentionszeit

100

Intensität

Probe

Kalibrierstandard

CTC

e-CTC

9.97

8.22

a) b)

100

0min

MRM of 6 Channels ES+

9.97

8.23

Retentionszeit

5 7,5 10 12,5 15

Intensität

CTC

e-CTC

Kalibrierstandard

Probe

min

Diode Array

5 7,5 10 12,5 15

Retentionszeit

100

Intensität

Probe

Kalibrierstandard

CTC

e-CTC

9.97

8.22

a) b)

100

0min

MRM of 6 Channels ES+

9.97

8.23

Retentionszeit

5 7,5 10 12,5 15

Intensität

CTC

e-CTC

Kalibrierstandard

Probe

100

0min

MRM of 6 Channels ES+

100

0min

MRM of 6 Channels ES+

9.97

8.23

Retentionszeit

5 7,5 10 12,5 15

Intensität

CTC

e-CTC

Kalibrierstandard

9.97

8.23

Retentionszeit

5 7,5 10 12,5 15

Intensität

CTC

e-CTC

Kalibrierstandard

Probe

min

Diode Array

5 7,5 10 12,5 15

Retentionszeit

100

Intensität

Probe

Kalibrierstandard

CTC

e-CTC

9.97

8.22

min

Diode Array

min

Diode Array

5 7,5 10 12,5 15

Retentionszeit

100

Intensität

Probe

Kalibrierstandard

CTC

e-CTC

5 7,5 10 12,5 15

Retentionszeit

100

Intensität

Probe

Kalibrierstandard

CTC

e-CTC

9.97

8.22

a) b)

250 275 300 325 350 375 400

100

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

250 275 300 325 350 375 400

100

%e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

250 275 300 325 350 375 400

100

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

250 275 300 325 350 375 400

100

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

250 275 300 325 350 375 400

100

%e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

250 275 300 325 350 375 400

100

%e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

5 Ergebnisse und Diskussion

die zu einer erheblichen Differenz der UV-Spektren in Standardlösungen im Vergleich zu denen in der

Realprobe führen. Daher darf eine Quantifizierung von CTC und e-CTC nur bei einer Wellenlänge

von 370 nm erfolgen.

Zum Vergleich der MS-Spektren wurden sowohl von einer Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC

(β = 1 mg/L) als auch von einer Muskulaturprobe Produkt-Ionen-Scans des Precursor-Ions mit m/z

479 bei einer Kollisionsenergie von 25 eV aufgenommen. Die in Abb. 22 dargestellten MS-Spektren

belegen für beide Substanzen, daß in der Standardlösung als auch in der Muskulaturprobe dieselben

Fragmente entstehen. Das Fragment mit m/z 371 von e-CTC ist als schwächstes Produkt-Ion im Full-

Scan-Modus nicht mehr zu erkennen. Darüberhinaus muß nach der EU-Richtlinie 657 auch das Inten-

sitätsverhältnis der einzelnen Fragmente zueinander identisch sein. Unter Zugrundelegung der gültigen

zulässigen Höchsttoleranz von 50 % sind auch die Fragmentmuster von CTC und e-CTC in der Stan-

dardlösung und in der Muskulaturprobe als gleich zu betrachten.

Abb. 22: Selektivitätstest durch Vergleich der MS-Spektren (Produkt-Ionen-Scan des Precursor-Ions

mit m/z 479) von CTC und e-CTC in Standardlösung (β = 1 mg/L) und in einer Muskulatur-

probe (Tier 95, FAL)

Die durchgeführten Spektren-Vergleiche von CTC und e-CTC zeigen sowohl für die UV-Detektion als

auch für die massenspektrometrische Detektion eine gute Übereinstimmung zwischen Standardlösung

und Muskulaturprobe und geben damit deutliche Hinweise auf die Selektivität des Verfahrens.

Darüberhinaus muß die Peakreinheit über den gesamten Peak gewährleistet sein. Hierzu wurden

Chromatogramme einer Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC und einer Muskulaturprobe aufge-

nommen. Die Aufnahme der Spektren erfolgte für die UV-Detektion im Bereich von 250 nm bis 400

nm, für die Produktionen-Spektren im Bereich von m/z 100 bis m/z 500. Zur Bestimmung der Peak-

Reinheit wurden jeweils fünf über den nicht geglätteten Peak verteilte Spektren miteinander vergli-

chen. Die Übereinstimmung der einzelnen Spektren wird prozentual angegeben, wobei eine Peakrein-

heit von 100 % völlig identische und 0 % völlig verschiedene Spektren bedeutet. Die Peak-Reinheiten

wurden für CTC und e-CTC für beide Detektionsarten ermittelt und lagen für beide Substanzen so-

wohl bei der UV-Detektion als auch bei der MS-Detektion zwischen 92 % und 98 %. Damit wurde

100 200 300 400 500

m/z

100

444

371 462

154

444

462

371

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

100 200 300 400 500

m/z

100

444

154

462

444

154

462

e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

100 200 300 400 500

m/z

100

444

371 462

154

444

462

371

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

100 200 300 400 500

m/z

100

444

371 462

154

444

462

371

CTC in Standardlösung

CTC in der Probe

100 200 300 400 500

m/z

100

444

154

462

444

154

462

e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

100 200 300 400 500

m/z

100

444

154

462

444

154

462

e-CTC in Standardlösung

e-CTC in der Probe

5 Ergebnisse und Diskussion 69

eine nahezu völlige Peak-Reinheit ermittelt.

Zusammenfassend kann mit den in Kap. 5.3.3.1 und Kap. 5.3.3.2 erhaltenen Ergebnissen die Selekti-

vität des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Mukulatur als

gesichert angesehen werden.

5.3.4 Systematische und zufällige Fehler

Einzelne Verfahrensschritte wie z. B. Probenaufschluß, Probenextraktion und Derivatisierung sowie

Matrixeinflüsse und Reagenzien sind in ihrem Einfluß auf die Präzision und Richtigkeit zu überprüfen

[244, 288, 289]. Dementsprechend ist zwischen systematischen und zufälligen Fehlern zu differenzie-

ren. Die Richtigkeit von Werten bezieht sich auf die Übereinstimmung des Mittelwertes aus vielen

Messungen mit dem wahren Wert. Das Maß für die Richtigkeit ist eine theoretische Größe. Als Maß

für die Richtigkeit wird jedoch im allgemeinen die systematische Ergebnisabweichung verwendet.

Diese Abweichungen können durch Berechnung der Wiederfindungsfunktion ermittelt werden. Wäh-

rend die Richtigkeit das Ausmaß des systematischen Fehlers beschreibt, ist die Präzision eine qualita-

tive Bezeichnung für das Ausmaß der gegenseitigen Annäherung voneinander unabhängiger Ergebnis-

se bei mehrfacher Anwendung eines Verfahrens unter vorgegebenen Bedingungen und somit ein Maß

für den zufälligen Fehler. Der Begriff Genauigkeit beschreibt qualitativ die gesamten systematischen

und zufälligen Abweichungen vom wahren Wert, da jedes Analysenverfahren mit einer gewissen Un-

sicherheit behaftet ist. Die Genauigkeit definiert die Annäherung von einzelnen Meßergenissen an den

wahren Wert. Sie wird bestimmt, indem die Richtigkeit und Präzision ermittelt werden.

Einzelne Verfahrensschritte und Matrixeffekte können sich in einer Erhöhung der Unpräzision

und/oder als konstant- oder proportional-systematische Fehler der Analysenergebnisse von den „wah-

ren“ Werten äußern. Bei konstant-systematischen Fehlern ist der Analysenfehler unabhängig von der

Konzentration der Analyten, was zu einer Parallelverschiebung der Kalibriergeraden in der Matrix

gegenüber der Kalibriergeraden mit reinen Standardlösungen führt. Proportional-systematischen Feh-

ler sind abhängig von der Konzentration der analysierten Komponente. Dies führt zu einer Änderung

der Steigung der Kalibriergeraden in Matrix im Vergleich zu der mit reinen Standardlösungen. Sowohl

zur Überprüfung einzelner Verfahrensschritte als auch zur Feststellung von Matrixbeeinflussung kann

die Berechnung der Wiederfindungsfunktion herangezogen werden, die es erlaubt, systematische Feh-

ler aufzudecken [289, 290]. Neben der Matrixbeeinflussung bei der Probenvorbereitung sind bei LC-

MS/MS-Verfahren vor allem Matrixeffekte bei der ESI-Ionisierung zu berücksichtigen [303, 309].

5.3.4.1 Richtigkeit

Ziel der Wiederfindungsexperimente und der Aufstellung der Wiederfindungsfunktion ist die Ermitt-

lung des Einflusses einzelner Verfahrensschritte auf das Analysenverfahren. Die Untersuchungen er-

folgten über den gesamten Arbeitsbereich. Zur Aufdeckung systematischer Fehler wurden in einem

ersten Schritt jeder einzelne Kalibrierstandard der Probenvorbereitung unterzogen. Hierzu wurde Me-

OH/EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,01 mol/L) (20/80) (v/v), das Extraktionsmittel für Muskulatur,

mit 0,005; 0,02; 0,1; 0,2; 0,5; 1 und 2 µg CTC dotiert, mittels SPE aufgearbeitet und mit HPLC-UV-

MS/MS vermessen. In einem zweiten Schritt erfolgte zur Aufdeckung matrixbedingter systematischer

Fehler die Aufarbeitung und Messung CTC dotierter Muskulaturproben der Gehalte 0,001; 0,004;

0,02; 0,04; 0,1; 0,2 und 0,4 mg/kg. Aus den erhaltenen Ergebnissen wurden die Wiederfindungsfunk-

5 Ergebnisse und Diskussion

tionen und daraus die Wiederfindungen berechnet. Die CTC-Gehalte in den Meßproben sowie die

Wiederfindungen wurden als Summe von CTC und e-CTC ermittelt.

Aufarbeitung CTC-dotierter Extraktionsmittel

Mit der in Kap. A. 6 im Anhang beschriebenen Berechnung haben sich für die UV- und MS/MS-

Detektion folgende Wiederfindungsfunktionen für die Extraktion mit Standardlösungen ergeben (Abb.

A. 9 im Anhang):

xf = 0,0393 mg/L + 1,0466 xc R2 = 0,9999 (UV-Detektion)

xf = 0,0394 mg/L + 1,0061 xc R2 = 0,9999 (MS/MS-Detektion)

Bei den ermittelten Wiederfindungsfunktionen beziehen sich die xc-Werte auf die zudotierten CTC-

Konzentrationen. Die xf-Werte setzen sich aus den ermittelten CTC- und e-CTC-Gehalten zusammen.

Eine wichtige Voraussetzung für die Aussagefähigkeit der Wiederfindungsfunktion ist die Gleichwer-

tigkeit der Verfahrensstandardabweichungen sx0 der Kalibrierfunktion des analytischen Grundverfah-

rens und der Wiederfindungsfunktion. Einzelne Probenvorbereitungsschritte können zu deutlich höhe-

rer Unpräzision der Kalibrierung führen, so daß eventuell vorliegende systematische Fehler verdeckt

werden. Daher werden die Verfahrensstandardabweichung der Kalibrierfunktion des Grundverfahrens

sx0 und die Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion syf mittels F-Test auf signifikanten

Unterschied geprüft. Ist PG > F (f1 = f2 = Nc-2, P = 99%), so liegt ein signifikanter Unterschied zwi-

schen den beiden Standardabweichungen vor und es kann keine Aussage über das Nicht-

Vorhandensein systematischer Abweichungen gemacht werden. Die Reststandardabweichungen be-

trugen für die Wiederfindungsfunktion der UV-Detektion syf = 0,280 mg/L und der MS/MS-Detektion

syf = 0,040 mg/L. Die Verfahrensstandardabweichungen der Kalibrierfunktionen wurden für die UV-

Detektion zu sx0c = 0,312 mg/L und für die MS/MS-Detektion zu sx0c = 0,068 mg/L ermittelt. Die er-

mittelten Prüfwerte lagen mit PG = 0,1103 für die UV-Detektion und PG = 0,2052 für die MS/MS-

Detektion unterhalb der Tabellenwerte von F = 29,17 (Nc =5) und F = 10,97 (Nc =7) und damit liegt

kein signifikanter Unterschied der Analysenpräzision von den analytischen Grundverfahren und den

Wiederfindungsfunktionen vor, womit die Gleichwertigkeit der Analysenpräzision der jeweiligen Ka-

librierfunktion und der Wiederfindungsfunktion belegt worden ist.

Aufgrund von zufälligen Fehlern, also einer Streuung der Meßwerte, ergeben sich als Achsenabschnitt

und Steigung der Wiederfindungsfunktion niemals die Idealwerte af = 0 und bf = 1. Zur Beurteilung

des Vorliegens sytematischer Fehler müssen daher die Vertrauensbereiche von af und bf ermittelt wer-

den. Eine konstant-systematische Fehler liegt mit 95%iger statistischer Sicherheit vor, wenn der

Vertrauensbereich VB(af) nicht den Wert af = 0 einschließt. Entsprechend gilt, daß eine proportional-

systematische Fehler mit 95%iger Sicherheit vorliegt, wenn der Vertrauensbereich VB (bf) den Wert

bf = 1 nicht einschließt. Es wurden folgende Vertrauensbereiche für die Steigung bf und den Achsen-

abschnitt af ermittelt:

UV-Detektion: MS/MS-Detektion:

VB (af) = 0,0393 ± 0,2987 mg/L VB (af) = 0,0394 ± 0,0501 mg/L

VB (bf) = 1,0466 ± 0,0580 VB (bf) = 1,0061 ± 0,0115

Für beide Detektionsarten schließen die Vertrauensbereiche für af den Wert Null und für bf den Wert

1 mit ein, weshalb das Vorliegen von konstant-systematischen und proportional-systematischen Feh-

5 Ergebnisse und Diskussion 71

lern ausgeschlossen werden kann. Anhand der Wiederfindungsfunktion läßt sich bei Ausschluß kon-

stant-systematischer Fehlern die Wiederfindung von CTC nach der im Anhang angegebenen Formel,

siehe Kap. A. 6.7, berechnen und sie betrug für die UV-Detektion 104,7 % und für die MS/MS-

Detektion 100,6 %.

Aufarbeitung CTC-dotierter Muskulaturproben

Entsprechend der Vorgehensweise für dotierte Extraktionsmittel wurde für Muskulatur sowohl für

UV-Detektion als auch für MS/MS-Detektion die Wiederfindungsfunktionen ermittelt (Abb. A. 10 im

Anhang), deren Bestimmtheitsmaß R2 = 0,9998 (UV-Detektion) und R2 = 0,9988 (MS/MS-Detektion)

betrugen. Die Reststandardabweichungen betrugen für die UV-Detektion syf = 0,281 mg/L und für die

MS/MS-Detektion syf = 0,0947 mg/L. Um zu überprüfen. ob die erhaltenen Reststandardabweichungen

gleichwertig mit den Verfahrensstandardabweichungen sx0 der Kalibrierfunktionen des analytischen

Grundverfahrens sind, wurden wiederum beide Standardabweichungen mittels F-Test auf signifikan-

ten Unterschied geprüft. Die ermittelten Prüfgrößen lagen mit PG = 0,14 für die UV-Detektion und PG

= 1,33 für die MS/MS-Detektion unterhalb der tabellierten Werte von F = 29,17 (Nc =5) und F = 10,97

(Nc =7), womit kein signifikanter Unterschied der Analysenpräzision von den analytischen Grundver-

fahren und den Wiederfindungsfunktionen vorliegt. Zur Prüfung auf systematische Fehler sind sowohl

für die UV-Detektion als auch für die MS/MS-Detektion die Vertrauensbereiche von dem Achsenab-

schnitt af und der Steigung bf berechnet worden. Es wurden folgende Vertrauensbereiche für die Stei-

gung bf und den Achsenabschnitt af ermittelt:

UV-Detektion: MS/MS-Detektion:

VB (af) = 0,0218 ± 0,2852 mg/L VB (af) = -0,0576 ± 0,1182 mg/L

VB (bf) = 0,8590 ± 0,0554 VB (bf) = 0,6880 ± 0,0272

Für beide Detektionsarten wurde kein konstant-systematischer Fehler festgestellt, jedoch ergaben die

Vertrauensbereiche der Steigung bf im Gegensatz zu den Untersuchungen mit Standardlösungen Hin-

weise auf einen proportional-systematischen Fehler, da die Vertrauensbereiche von bf den Wert 1 nicht

einschließen. Bei Vorliegen von ausschließlich proportional-systematischen Abweichungen ist af ≈ 0,

also die Wiederfindung unabhängig von xc und damit allein durch bf bestimmt, so daß die Wiederfin-

dung nach der in Kap. A. 6.7 im Anhang angegebenen Formel berechnet werden kann. Die Wieder-

findungen von CTC liegen für die UV-Detektion bei 86 % und für die MS/MS-Detektion bei 73 %

und unterscheiden sich damit deutlich. Möglicherweise spielen im Gegensatz zu der UV-Detektion bei

der MS/MS-Detektion signalsupressive Effekte eine Rolle.

Bei sehr vielen Analysenverfahren liegt ein proportional-systematischer Fehler vor, da in den meisten

Fällen, insbesondere bei der Aufarbeitung komplexer biologischer Proben, keine vollständige Extrak-

tion der Analyten erfolgt. Nach der EU-Richtlinie sind Meßwerte als richtig zu betrachten, wenn die

Wiederfindung zwischen 70 % und 110 % liegt. Daher können sowohl die Ergebnisse, ermittelt mit

UV-Detektion, als auch mit MS/MS-Detektion unter Berücksichtigung der statistischen Streuung als

richtig angesehen werden. Die Kalibrierung mittels externer Standardmethode kann deshalb beibehal-

ten werden.

Die ermittelten Wiederfindungen liegen im Bereich der in der Literatur beschriebenen Werte. Für

Muskulatur werden Wiederfindungen im Bereich von 55 % bis 83 % angegeben [170, 194, 210, 304],

wobei einerseits die zugrunde liegende Berechnung nicht ersichtlich ist und andererseits bei vielen

5 Ergebnisse und Diskussion

Verfahren nur der Wirkstoff, das Epimere nicht bestimmt wird.

Im Rahmen dieser Untersuchungen konnte trotz des Ausschließens eines konstant-systematischen

Fehlers für Muskulaturproben eine Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung von CTC bei der

MS/MS-Detektion, nicht jedoch bei der UV-Detektion, festgestellt werden (siehe Tab. 17), was deut-

liche Hinweise auf signalsupressive Matrixeffekte bei der ESI-MS/MS-Detektion gibt.

Tab. 17: Ermittelte Wiederfindungen (Σ CTC + e-CTC) nach Extraktion von CTC-dotierter

Muskulaturproben (HPLC-UV-MS/MS) (n = 7)

Konzentration

[µg/kg]

Wiederfindung

UV-Detektion

[%]

Wiederfindung

MS/MS-Detektion

[%]

2 --- 97

8 --- 80

40 86 72

80 89 69

200 82 67

400 80 66

800 88 60

Eine Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung bei der MS/MS-Detektion wird in der Literatur

ebenfalls beschrieben. Während bei der Bestimmung von CTC in Gewebeproben mit der UV-

Detektion unabhängig von der Konzentration meist gleiche Wiederfindungen ermittelt werden [176,

224, 279], stellten BLANCHFLOWER et al. für CTC in Muskulatur mit der MS-Detektion ebenfalls

mit zunehmender Konzentration geringere Wiederfindungen fest [210].

Auf supressive Matrixeffekte bei der massenspektrometrischen Detektion während der Ionisierung in

der ESI-Quelle, insbesondere bei komplexen biologischen Proben, weisen verschiedene Autoren hin

[305, 306, 307]. Als Ursache für diese Matrixeffekte können neben einer Co-Elution der Analyten mit

Matrixkomponenten auch eine Überladung der analytischen Säule mit Matrixkomponenten, die zu

einer verschleppten Co-Elution führt, eine Rolle spielen [308]. Daher wurde nachfolgend untersucht,

ob die festgestellte Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung von CTC bei der ESI-MS/MS-

Detektion auf signalsupressive Matrixeffekte zurückzuführen ist.

5.3.4.2 Matrixbedingte Signalbeeinflussung bei der ESI-MS/MS-Detektion

Zur Aufdeckung von Matrixeffekten bei der ESI-MS/MS-Detektion gibt es hauptsächlich zwei Mög-

lichkeiten:

• „Post column“-Infusion des Analyten in das HPLC-Eluat

• Vergleich von Kalibrierstandards in Matrix mit denen in Solvent

Kontinuierliche „post-column“-Infusion von CTC

Eine Möglichkeit zur Aufdeckung von Matrixeffekten bei der ESI-MS/MS-Detektion ist die kontinu-

ierliche „post column“-Infusion einer Standardlösung zum HPLC-Fluß vor der ESI-MS/MS-

5 Ergebnisse und Diskussion 73

Detektion. Durch Vergleich der Chromatogramme, erhalten durch Nullinjektion, mit den nach Injekti-

on einer aufgearbeiteten unbelasteten Muskulaturprobe können Matrixeinflüsse aufgezeigt werden.

Treten keine Matrixeffekte auf, so sollten die erhaltenen Chromatogramme der Nullinjektion sowie der

Muskulaturextraktinjektion identisch aussehen. In Abb. 23 sind die durch Nullinjektion und Injektion

einer Muskulaturprobe und „post-column“-Infusion von CTC erhaltenen Chromatogramme dargestellt.

Es wurde während des gesamten Chromatographielaufes (Gradientenmethode) kontinuierlich über

eine Spritzenpumpe eine CTC-Standardlösung der Konzentration 10 mg/L „post column“ zum HPLC-

Fluß zugeführt. Die MS/MS-Detektion erfolgte durch Aufnahme eines Produkt-Ionen-Scans des Pre-

cursor-Ions m/z 479.

Abb. 23: MS-Chromatogramme (Produkt-Ionen-Scan des Precursuor-Ions m/z 479), aufgenommmen

durch kontinuierliche post column-Infusion einer CTC-Lösung (β = 10 mg/L) während des

HPLC-Laufes: Nullinjektion (oben) und Injektion eines Muskulaturextrakts (unten)

Die Ergebnisse verdeutlichen, daß es ab einer Retentionszeit von vier Minuten zu einer Signalsupres-

sion kommt, da sich im Falle der Injektion eines Muskulaturextrakts im Gegensatz zur Nullinjektion

ein abfallender Kurvenverlauf ergibt.

Vergleich von Kalibrierstandards in Matrix mit denen in Solvent

Zur Überprüfung einer Signalbeeinflussung durch Matrixkomponenten während der Ionisierung in der

ESI-Quelle bei der MS/MS-Detektion wurden in einem ersten Schritt Matrixstandards hergestellt und

diese mit den entsprechenden Solventstandards verglichen. Zur Herstellung der Matrixstandards wur-

den unbelastete Muskulaturproben aufgearbeitet und die hierbei erhaltenen Extrakte vor der LC-

MS/MS-Analyse mit CTC dotiert. In Tab. 18 sind die Wiederfindungen von CTC in Matrixstandards

bezogen auf CTC in Solventstandards dargestellt.

Die durchgeführten Untersuchungen bestätigen, daß mit der UV-Detektion konstante Wiederfindun-

gen erzielt werden. Es konnte weiterhin gezeigt werden, daß es bei der Detektion mit ESI-MS/MS mit

Zeit [min]

Daughters of 479ES+

TIC

Daughters of 479ES+

TIC

Nullinjektion

Injektion einer unbelasteten Muskulaturprobe

100

[%]

100

[%]

02 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Anfang der Signalsupression

Zeit [min]

Daughters of 479ES+

TIC

Daughters of 479ES+

TIC

Nullinjektion

Injektion einer unbelasteten Muskulaturprobe

100

[%]

100

[%]

02 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Anfang der Signalsupression

5 Ergebnisse und Diskussion

zunehmender Konzentration zu einer verstärkten Signalsupression kommt.

Tab. 18: Wiederfindung (Σ CTC + e-CTC) in aufgearbeiteten Muskulaturproben, vor der HPLC-UV-

MS/MS-Analyse mit CTC dotiert (n = 5)

Wiederfindung [%]

CTC-Konzentration

[µg/kg] UV MS/MS

20 82 82

80 85 74

800 83 65

Zusammenfassend konnte anhand der „post-column“-Infusion von CTC gezeigt werden, daß es zu

einer Signalsupression kommt. Darüber hinaus verdeutlichte der Vergleich von Matrixstandards mit

Solventstandards, daß mit zunehmender Konzentration eine höhere Signalsupression auftritt, was die

Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung erklärt. Zur Kompensation dieser Matrixeffekte eignet

sich nur die Kalbrierung nach dem Standardadditionsverfahren [309], die jedoch sehr zeitaufwendig

ist. Bei diesem LC-MS/MS-Verfahren sind insgesamt jedoch signalsupressive Effekte für die Bestim-

mung von CTC in Muskulatur mit diesem Verfahren zu vernachlässigen, da die Richtigkeit des Ver-

fahrens bereits in Kap. 5.3.4.1 bewiesen wurde. Diese Untersuchungen zeigen darüber hinaus, daß

auch bei der MS/MS-Detektion ein „clean up“ der Proben sowie eine chromatographische Trennung

der Analyten, insbesondere von Matrixkomponenten, von entscheidender Bedeutung ist.

5.3.4.3 Präzision

Unter der Präzision wird die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse verstanden und gibt

die Streuung einzelner Ergebnisse als Folge von zufälligen Fehlern an. Als Maß für zufällige Fehler

gilt die Meß- und Methodenpräzision, wobei sich die Meßpräzision auf zufällige Fehler, die durch das

Analysengerätes selbst bedingt sind, und die Methodenpräzision auf zufällige Fehler bei der Durch-

führung des gesamten Analysenverfahrens bezieht. Die Präzision wird meist in Form der relativen

Standardabweichung srel ausgedrückt.

Meßpräzision

Die Ermittlung der Meßpräzision in Standardlösungen ist bereits bei der Aufstellung der Kalibrierge-

raden in Kap. 5.3.1.1 erfolgt. Sie liegt für CTC und e-CTC zwischen 1 % und 3 % mit UV-Detektion

und zwischen 2 % und 6 % mit MS/MS-Detektion. Zur Ermittlung der Meßpräzision in Realproben

wurden fünf CTC-haltige Muskulaturproben der Tiere 93-97 aus der Medikationsstudie FAL aufgear-

beitet und mittels HPLC-UV-MS/MS achtfach analysiert. Da die erhaltenen CTC-Gehalte bis auf die

des Tieres 95 unterhalb der Nachweisgrenze der UV-Detektion lagen, erfolgte die Auswertung aus-

schließlich über MS/MS-Daten. Die erhaltenen Mittelwerte der Konzentrationen sowie die relativen

Standardabweichungen für CTC und e-CTC sind in Tab. 19 dargestellt. Mit Werten zwischen 3 % bis

8 % entsprechen die relativen Standardabweichungen der für CTC und e-CTC in Standardlösungen

ermittelten Werten von 2 % bis 6 % und belegen damit die hohe Präzision des LC-MS/MS-

Verfahrens. Die ermittelten Meßpräzisionen liegen damit weit unter den in der EU-Richtlinie 657 ak-

zeptierten Grenze von 20 % für die wiederholte Analyse von Realproben [296].

5 Ergebnisse und Diskussion 75

Tab. 19: Meßpräzision der CTC- und e-CTC-Bestimmung in Muskulatur mit LC-MS/MS

(FAL-Proben, n = 8)

Muskelprobe Tier 93 Tier 94 Tier 95 Tier 96 Tier 97

(CTC) [µg/kg] 3,04 2,26 100,80 2,95 3,13

srel (CTC) [%] 5 6 3 5 5

(e-CTC) [µg/kg] 1,26 1,23 45,20 1,24 1,35

srel (e-CTC) [%] 6 5 3 8 7

Methodenpräzision

Zur Bestimmung der Methodenpräzision wurden ebenfalls fünf CTC-haltige Muskulaturproben der

Tiere 93-97 aus der Medikationsstudie FAL eingesetzt. Die Muskulaturproben wurden in fünfmal acht

Aliquote aufgeteilt, getrennt aufgearbeitet und der CTC-Gehalt mittels LC-MS/MS bestimmt. Die

berechneten Mittelwerte der Konzentrationen und die relativen Standardabweichungen sind in Tab. 20

aufgeführt.

Tab. 20: Methodenpräzision der CTC- und e-CTC-Bestimmung in Muskulatur mit LC-MS/MS

(FAL-Proben, n = 8)

Muskelprobe

(CTC)

[µg/kg]

srel

(CTC)

[%]

(e-CTC)

[µg/kg]

srel

(e-CTC)

[%]

(Σ CTC + e-CTC)

[µg/kg]

srel

(Σ CTC + e-CTC)

[%]

Tier 93 2,94 7 1,24 9 4,18 9

Tier 94 2,08 8 1,36 9 3,45 8

Tier 95 97,90 7 53,64 6 151,54 6

Tier 96 2,58 6 1,38 8 3,96 7

Tier 97 3,14 7 1,64 9 4,78 8

Die Methodenpräzisionen sind mit Werten zwischen 6 % und 9 % nur geringfügig größer als die Meß-

präzisionen. Damit liegen die Werte weit unterhalb der Angaben in Literaturverfahren, für die Metho-

denpräzisionen bis zu 40 % beschrieben werden [172, 210, 221, 239]. Da die Epimerisierungsrate in

Abhängigkeit von der Temperatur und der Dauer der Probenvorbereitung zwischen 10 % und 20 %

differieren kann, siehe Kap. 5.2.2.4, könnte dies bei der Aufarbeitung der Proben an unterschiedlichen

Tagen beispielsweise zu deutlich schlechteren Methodenpräzisionen führen. Möglicherweise ist das

der Grund, warum OKA et al. für die Bestimmung von CTC in Muskulatur und Niere mit UV-

Detektion deutlich höhere Methodenpräzisionen von bis zu 40 % fanden [172]. Zudem bleiben bei den

meisten in der Literatur beschriebenen Verfahren die Epimere unberücksichtigt.

Dies belegt die Notwendigkeit, einerseits den CTC-Gehalt selbst sowie andererseits auch die Metho-

denpräzision aufgrund der nicht immer konstanten Epimerisierungsrate als Summe von CTC und e-

CTC anzugeben.

5 Ergebnisse und Diskussion

5.3.5 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse für die Bestimmung

von CTC und e-CTC in Muskulatur

Im Rahmen der für Muskulatur durchgeführten Validierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens ergab

sich für die UV-Detektion ein linearer Bereich von 0,1 mg/L bis 100 mg/L. Für die MS/MS-Detektion

ergab sich im untersuchten Konzentrationsbereich von 0,005 mg/L bis 50 mg/L kein linearer Zusam-

menhang zwischen Analyt-Konzentration und dem Detektorsignal, sondern eine polynomische Funk-

tion 2. Grades. Durch Aufteilung des Arbeitsbereiches in drei Teilbereiche (0,005-0,08 mg/L, 0,1-0,5

mg/L und 1-50 mg/L) konnte eine Linearität erreicht werden. Die relativen Verfahrensstandardabwei-

chungen Vx0 lagen für die UV-Detektion bei 1,7 % für CTC und 1,4 % für e-CTC. Für die MS/MS-

Detektion wurden Werte zwischen 2,1 % und 6,2 % erhalten. Damit konnte die gute Leistungsfähig-

keit des Analysenverfahrens für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Muskulatur sowohl für die

UV- als auch MS/MS-Detektion belegt werden.

Als Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden für CTC und und e-CTC mit der UV-Detektion 3

µg/kg (= 0,08 mg/L) und 8 µg/kg (= 0,2 mg/L), mit der MS/MS-Detektion 0,1 µg/kg (= 0,003 mg/L)

und 0,3 µg/kg (= 0,008 mg/L) ermittelt.

Der Selektivitätsnachweis des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens erfolgte nach den in der EU-Richtlinie

2002/657/EG geforderten Kriterien [296] durch einen Vergleich der Retentionszeiten, der UV-

Spektren, der MS-Spektren, der Produkt-Ionen-Intensitäten der Analyten in einer Standardlösung und

in einer Realprobe sowie durch eine für CTC und e-CTC charakteristische Peaklöschung nach alkali-

scher Behandlung der Probe. Bei der UV-Detektion ist jedoch einschränkend zu erwähnen, daß eine

Quantifizierung von CTC und e-CTC nur bei einer Wellenlänge von 370 nm (zweites Absorptionsma-

ximum) erfolgen darf, da es unterhalb einer Wellenlänge von 350 nm zur Überlagerung von störenden

Begleitkomponenten kommt und damit in diesem Wellenlängenbereich keine Selektivität mehr gege-

ben ist.

Zur Beurteilung der Richtigkeit der Analysenergebnisse wurden die Wiederfindungsfunktionen ermit-

telt. Proportional-systematische Fehler konnten ausgeschlossen werden. Es ergab sich sowohl mit der

UV- als auch mit der MS/MS-Detektion ein Hinweis auf einen proportional-systematischen Fehler.

Die aus den Wiederfindungsfunktionen berechneten Wiederfindungen betrugen für die UV-Detektion

86 % und für die MS/MS-Detektion 73 %. Da die ermittelten Wiederfindungen in dem in der EU-

Richtlinie 2002/657/EG [296] angegebenen akzeptierten Bereich von 70 % bis 110 % liegen, wurde

somit die Richtigkeit des Verfahrens nachgewiesen. Dennoch wurde eine Konzentrationsabhängigkeit

der Wiederfindung festgestellt. Es wurde gezeigt, daß die Ursache hierfür in einer Signalsupression

bei der ESI-MS/MS-Detektion, die mit steigender Konzentration zunimmt, liegt.

Die Charakterisierung der Präzision erfolgte durch Ermittlung der Meß- und Methodenpräzision mit

der MS/MS-Detektion. Dabei wurden für die Meßpräzision Werte um 5 % für CTC und 6 % für e-

CTC ermittelt. Für die Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen ergaben sich Werte von 7 %

für CTC und 8 % für e-CTC und sind nur geringfügig höher als die Meßpräzisionen.

Das entwickelte HPLC-UV-MS/MS-Verfahren wurde einer ausführlichen Validierung unterworfen,

wodurch eine qualitative Bewertung der damit erzielten Ergebnisse ermöglicht wird. Erstmalig erfolg-

te hierbei auch eine Berücksichtigung des Epimers. Eine Besonderheit dieses Analysenverfahrens

stellt die Kopplung der UV- mit der MS/MS-Detektion dar. Ein Leistungsvergleich beider Detektion-

5 Ergebnisse und Diskussion 77

sarten zeigt, daß mit der UV-Detektion eine Selektivität nur im begrenztem Ausmaß gegeben ist und

darüber hinaus die erzielten Bestimmungsgrenzen deutlich höher liegen als bei der MS/MS-Detektion.

Aus diesen Gründen werden signalsupressive Effekte bei der MS/MS-Detektion in Kauf genommen

und dieser Detektionsart meist der Vorzug gegeben.

5.3.6 Validierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens für die Bestimmung

von CTC und e-CTC in Urin, Faeces, Plasma, Knochen, Leber und

Niere

Für Urin, Faeces, Plasma, Knochen, Leber und Niere wurden als Validierungsparameter die Wieder-

findung auf zwei Konzentrationsstufen, die Methodenpräzision sowie die Nachweis- und Bestim-

mungsgrenze ermittelt. Als Probenmaterial für diese Validierungsuntersuchungen diente, mit Aus-

nahme von Faeces, die im Rahmen der Haus Düsse-Studie entnommenen Proben der unbehandelten

Kontrolltiere. Die eingesetzten Faecesproben stammten aus der FAL-Studie, wobei als unbelastetes

Probenmaterial die vor Beginn der Medikation entnommenen Nullproben zur Verfügung standen. Die

erhaltenen Validierungsparameter für die verschiedenen Matrices sind in Tab. 21 zusammengefaßt.

Die in Tab. 21 angegebenen Wiederfindungen beziehen sich ausschließlich auf MS/MS-Daten, da

eine Auswertung der durch UV-Detektion erhaltenen Chromatogramme nicht für alle Matrices im

gewählten Konzentrationsbereich aufgrund einer mangelnden Selektivität möglich war.

Tab. 21: Validierungsparameter des Verfahrens für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Urin-,

Plasma-, Faeces- und Schlachtproben (LC-MS/MS) (n = 6)

Matrix CTC-Konz.

(Σ CTC + e-CTC)

[%]

Methoden-

präzision

(Σ CTC + e-CTC)

srel [%]

NWG* BG*

10 µg/L 107

Urin 100 µg/L 86 6 0,1 µg/L 0,3 µg/L

10 µg/L 74

Plasma 100 µg/L 62 6 0,1 µg/L 0,3 µg/L

50 mg/kg 93

Faeces 500 mg/kg 91 6 70 µg/kg 140 µg/kg

10 µg/kg 40

Leber 100 µg/kg 36 5 0,3 µg/kg 0,5 µg/kg

10 µg/kg 72

Niere 100 µg/kg 61 7 0,3 µg/kg 0,5 µg/kg

Knochen

(CTC-

haltige Pro-

ben)

-- 19 2,5 µg/kg 5 µg/kg

* Die angegebenen Nachweis- und Bestimmungsgrenzen gelten sowohl für CTC als auch für e-CTC.

Die ermittelten Wiederfindungen lagen mit Werten von 36 % bis 107 % im Bereich der Wiederfin-

dungen, die auch in der Literatur angegeben werden [252, 258, 272, 285, 310]. Die Wiederfindungen

5 Ergebnisse und Diskussion

für Leber sind mit Werten von 36 % bis 40 % sehr niedrig, entsprechen aber den Ergebnissen von

CHERLET et al. [310], die in Schweineleber für CTC und e-CTC Wiederfindungen von nur 15 % bis

20 % angeben, hingegen in Muskulatur und Niere 45 % bis 50 % wiederfanden. Hervorzuheben ist die

Aufarbeitung von Urin und Faeces, für die Wiederfindungen zwischen 91 % und 107 % erzielt werden

konnten. Nach der EU-Richtlinie 2002/657/EG sind Analysenergebnisse dann als richtig zu betrach-

ten, wenn die Wiederfindung in Abhängigkeit von der Konzentration zwischen 70 % und 110 % liegt.

Dies ist jedoch insbesondere bei der MS/MS-Detektion aufgrund signalsupressiver Effekte oft nicht

gegeben, so daß auch Wiederfindungen, die darunter liegen, aber reproduzierbar sind, als akzeptabel

zu betrachten sind.

Im Rahmen der durchgeführten Wiederfindungsuntersuchungen wurde ebenso wie für Muskulatur

mit Ausnahme von Faeces eine Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung festgestellt. Für Mus-

kulatur konnte in Kap. 5.3.4.2 gezeigt werden, daß es sich hierbei um signalsupressive Effekte bei der

ESI-MS/MS-Detektion, die mit steigender Konzentration zunehmen, handelt. Möglicherweise treten

bei den anderen Matrices ähnliche Effekte auf. Auf entsprechende Untersuchung der übrigen Matrices

wurde in dieser Arbeit verzichtet. Lediglich für Leber erfolgte aufgrund der geringen Wiederfindung

eine Untersuchung der Signal-Supression bei der MS/MS-Detektion, die zwischen 50 % und 60 % lag.

Eine weitere Aufreinigung der erhaltenen Leberextrakte erfolgte trotz der hohen Supression im Rah-

men dieser Arbeit nicht. Bei der Bestimmung von CTC und e-CTC in Faeces konnte als einzige Ma-

trix keine Konzentrationsabhängigkeit der Wiederfindung festgestellt werden. Grund hierfür könnte

sein, daß das Eluat der SPE verdünnt wird und damit signalsupressive Effekte bei der MS/MS-

Detektion keine Rolle mehr spielen.

Für die Methodenpräzision wurden mit Ausnahme von Knochen Werte von 5 % bis 7 % erhalten, die

nur geringfügig oberhalb der Meßpräzision von 2 % bis 5 % für CTC und e-CTC in Standardlösungen

lagen. Im Vergleich mit den in der Literatur gemachten Angaben für die Methodenpräzision in den

unterschiedlichen Matrices von 4 % bis 18 % zeichnet sich das entwickelte Analysenverfahren durch

eine hohe Präzision aus. Die Methodenpräzision für die Bestimmung von CTC und e-CTC in Knochen

liegt mit 19 % sehr hoch und ist etwa doppelt so hoch wie die von KÜHNE et al. [285] ermittelten

Werte von 8,8 %. Ursache hierfür ist vermutlich der Mahlgrad der Knochen, da mit der eingesetzten

Knochenmühle nur ein geringer Mahlgrad erzielt wurde und damit die Reproduzierbarkeit der Extrak-

tion niedrig war.

Die Bestimmungsgrenzen für Urin, Plasma, Leber und Niere lagen im Bereich von 0,3-0,5 µg/L oder

µg/kg und entsprachen damit Literaturverfahren, bei denen Bestimmungsgrenzen von 10-125 µg/L für

Urin [213, 247, 252], 10-20 µg/L für Plasma [152, 233, 258] und von 2-230 µg/kg für Leber und Niere

[147, 177, 187, 224, 239, 279, 310] angegeben werden. Die für Knochen ermittelte Bestimmungsgren-

ze von 5 µg/kg stimmt gut mit den Angaben von KÜHNE et al. überein, die für die Bestimmungsgren-

ze von CTC in Knochen ebenfalls 5 µg/kg angeben [285]. Die hohe Nachweis- und Bestimmungs-

grenze von 140 µg/kg für CTC und e-CTC in Faeces ist dadurch bedingt, daß das Eluat der Festpha-

senextraktion nicht eingeengt, sondern aufgrund der hohen Gehalte in Realproben verdünnt wurde.

Diese Bestimmungsgrenze liegt aber immer noch unterhalb der von SUNDERLAND et al. für die Be-

stimmung von CTC in Faeces mit HPLC-UV angegebenen Bestimmungsgrenze von 3,5 mg/kg [272].

Das hier vorgestellte HPLC-UV-MS/MS-Verfahren zeichnet sich durch eine umfassende Validierung

unter Berücksichtigung des Epimers aus. Das Analysenverfahren ist gleichermaßen auf die Matrices

Muskulatur, Urin, Plasma, Faeces, Leber, Niere und Knochen anwendbar. Neben einer quantitativen

5 Ergebnisse und Diskussion 79

Bestimmung von CTC und e-CTC ermöglicht dieses Verfahren erstmals den simultanen Nachweis von

iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC in den verschiedenen Probenarten und es

kann daher eine Beurteilung weiterer in Realproben vorkommenden Abbau- und Umwandlungspro-

dukte von CTC erfolgen. Dieses Analysenverfahren wurde nachfolgend auf Proben der durchgeführten

Medikationsstudien angewendet.

5.4 Anwendung des Analysenverfahrens auf Proben der Medikati-

onsstudien

5.4.1 Haus Düsse-Studie

Im Rahmen dieser Medikationstudie wurde ein Mastdurchgang unter praxisüblichen Bedingungen mit

definierter Medikation durchgeführt. Die Versuchdurchführung wurde bereits in Kap. 5.1.1 beschrie-

ben. Ziel dieser Studie war es, anhand der entnommenen Urinproben der Versuchstiere das Auschei-

dungsverhalten von CTC zu untersuchen. Daneben sollten die CTC-Rückstände in den Schlachtproben

ermittelt werden. Zunächst wurde der CTC-Gehalt gemäß der EU-Verordnung EWG Nr. 2377/90 als

Summe von CTC und e-CTC bestimmt. Darüber hinaus sollte geprüft werden, welche weiteren Meta-

bolite von CTC in den Proben nachzuweisen sind.

5.4.1.1 Ausscheidungsverhalten von CTC in Urin

Es erfolgten während des gesamten Mastdurchganges sieben Probennahmen. In den entnommenen

Urinproben wurde mit LC-MS/MS der CTC- und e-CTC-Gehalt sowie die Summe beider Verbindun-

gen ermittelt. Aus den für die einzelnen Tiere ermittelten Gehalten wurde der Mittelwert gebildet

(Einzeldaten siehe Tab. A. 1 im Anhang) und als Funktion der Zeit in Abb. 24 dargestellt.

Abb. 24: Gesamt-CTC-, CTC- und e-CTC-Gehalte in Urin der Versuchstiere (Mittelwert aller Tiere)

(LC-MS/MS) (n = 12)

Eins tallu ng 0 2 4 6 8 10

CTC

e-CTC

Gesamtgehalt

Konzentration [mg/L]

Anzahl der Wochen nach Absetzen der Medikation

100

200

300

400

500

600

246810

Konzentration [µg/L]

Anzahl der Wochen nach

bsetzen der Medikation

Eins tallu ng 0 2 4 6 8 10

CTC

e-CTC

Gesamtgehalt

Konzentration [mg/L]

Anzahl der Wochen nach Absetzen der Medikation

100

200

300

400

500

600

246810

Konzentration [µg/L]

Anzahl der Wochen nach

bsetzen der Medikation

100

200

300

400

500

600

246810

Konzentration [µg/L]

Anzahl der Wochen nach

bsetzen der Medikation

5 Ergebnisse und Diskussion

Zur Veranschaulichung ist der Konzentrationsverlauf ab der zweiten Woche nach Absetzen der Medi-

kation nochmals in einer kleineren Abbildung dargestellt. Vor der Medikation konnte, wie erwartet,

bei keinem der 24 Tiere CTC oder e-CTC in Urin nachgewiesen werden. Bei den Versuchstieren zeig-

te sich erwartungsgemäß direkt nach Medikationsende der höchste CTC-Gehalt mit durchschnittlich

9,17 mg/L, der bereits zwei Wochen später auf 0,51 mg/L gefallen ist. Bis zur Schlachtung drei Mona-

te später nahm der CTC-Gehalt weiter ab, betrug aber selbst am Tag der Schlachtung noch 66 µg/L

und lag damit im Bereich der MRL-Werte für andere Matrices. Zu ähnlichen Befunden sind

RAMAZZA et al. [43] gekommen, die das Ausscheidungsverhalten von Oxytetracyclin in Urin nach

mehrwöchiger oraler Medikation untersuchten. Sie fanden ebenfalls auch vier Monate nach Absetzen

der Medikation noch Oxytetracyclin in Urin.

Werden die CTC-Gehalte der einzelnen Tiere miteinander verglichen, so sind starke individuelle Un-

terschiede festgestellbar. In Abb. 25 sind die Gehalte der Urinproben nach Medikationsende und vor

der Schlachtung dargestellt.

Abb. 25: CTC-Gehalte (

∑

CTC+e-CTC) in Urin der einzelnen Versuchstiere nach Medikationsende

und vor der Schlachtung (LC-MS/MS, n =2)

Ursache für die unterschiedlichen CTC-Gehalte kann einerseits die unterschiedliche Futteraufnahme-

menge der einzelnen Tiere sein, da die Schweine an Längströgen gefüttert wurden und daher die indi-

viduelle Aufnahmemenge nicht bekannt ist, und andererseits variiert die ausgeschiedene Urinmenge

der Schweine pro Tag individuell. Beim Versuchstier 3 lassen sich sowohl direkt nach Absetzen der

Medikation, Probenahme 0, sowie auch kurz vor der Schlachtung drei Monate später, Probenahme 10,

wesentlich geringere Gehalte feststellen als bei den anderen Tieren. Vermutlich hat dieses Tier eine

geringere Futtermenge aufgenommen, da es während des Mastdurchganges erkrankt ist.

In den Urinproben der als unbehandelte Kontrollgruppe mitgeführten Tiere konnten größtenteils keine

CTC-Gehalte nachgewiesen werden. Es wurden jedoch bei sieben der zwölf Kontrolltiere in einigen

Urinproben CTC oder e-CTC gefunden, wobei die Summe beider Verbindungen etwa 0,03 % bis 1,7

% der CTC-Gehalte in Urin der Versuchstiere bei den jeweiligen Probenahmen entsprachen. Nachge-

100

120

V1 V2 V3 V4 V5 V6 V7 V8 V9 V10 V11 V12

Versuchstier-Nummer

Konzentration (CTC+e-CTC) in Urin

[mg/L bzw. µg/L]

Probenahme nach

Medikationsende

Probenahme vor der

Schlachtung

5 Ergebnisse und Diskussion 81

wiesenes CTC in den Kontrolltierproben deuten darauf hin, daß auch die unbehandelten Tiere CTC

aufgenommen haben müssen. Mögliche Eintragsquelle könnte eine Verschleppung bei der Herstellung

des Mischfutters in den Mischgefäßen, eine Verschleppung über das Futter im Stall sowie eine Anti-

biotikaübertragung über Stallstaub sein. Auf diese Problematik der Arzneimittelverschleppung haben

bereits verschiedene Autoren wie KAMPHUES et al. und DORN et al. hingewiesen [99, 100, 101].

Darüber hinaus wiesen HAMSCHER et al. im Staub von Ställen, in denen Schweine gehalten wurden,

denen oral über das Futter Antibiotika verabreicht wurde, Tetracycline nach [311].

In allen Urinproben konnten iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen werden [312], dagegen Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC nicht. Zudem war in den Proben ein weiteres Produkt mit demselben Pre-

cursor-Ion [M+H]+ von 479 und den Produkt-Ionen m/z 462 und 444 nachweisbar, auf dessen Identifi-

zierung in Kap. 5.5 eingegangen wird.

5.4.1.2 CTC-Gehalte in Schlachtproben

In den bei der Schlachtung entnommenen Proben von Urin, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und

Knochen wurde mit LC-MS/MS der CTC-Gehalt ermittelt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tab. 22

zusammengefaßt.

Tab. 22: CTC-Gehalte (

∑

CTC und e-CTC) in Urin-, Plasma- und Schlachtproben der Versuchstiere

(Probenahme bei der Schlachtung, LC-MS/MS, n = 2)

Tier Urin

[µg/L]

Plasma

[µg/L]

Muskulatur

[µg/kg]

Niere

[µg/kg]

Leber

[µg/kg]

Knochen

[mg/kg]

V 1 39 0,8 7,9 12,1 5,0 12,1

V 2 47 0,7 4,5 11,1 2,9 11,9

V 3 6 2,7 11,4 5,9 9,5 12,5

V 4 39 0,6 5,6 8,1 2,2 3,9

V 5 96 1,0 6,9 13,8 6,1 13,9

V 6 46 1,9 5,5 11,8 2,5 15,8

V 7 100 0,8 10,1 12,8 6,6 21,2

V 8 105 0,9 6,7 13,5 4,3 11,7

V 9 76 0,7 21,6 10,1 7,9 16,6

V 10 75 0,9 7,2 11,8 5,8 13,6

V 11 97 1,1 9,4 14,9 4,9 10,8

V 12 65 0,8 8,0 10,5 5,4 5,0

In allen Proben der Versuchstiere konnten CTC-Gehalte festgestellt werden, wobei die in Muskulatur,

Leber und Niere ermittelten Gehalte weit unterhalb der MRL-Werte lagen, für die anderen Matrices

existieren keine MRL-Werte. Die ermittelten Gehalte für Muskulatur betrugen durchschnittlich 8,7

µg/kg, für Leber 5,3 µg/kg und für Niere 11,4 µg/kg. Die höchsten CTC-Gehalte wurden in Knochen

mit Werten zwischen 5,0 mg/kg und 21,2 mg/kg gefunden, da sie dort in gebundener Form vorliegen,

siehe Kap. 5.9.2. Aber auch in Urin und Plasma konnte selbst am Schlachttag noch CTC nachgewie-

sen werden.

In den Proben der Kontrolltiere konnten in Urin, Plasma, Muskulatur, Leber und Niere kein CTC ge-

funden werden. Dagegen aber wurden in den Knochenproben der Kontrolltiere CTC-Gehalte ermittelt,

die etwa 1% der Gehalte in Knochen der Versuchstiere entsprachen (s. Tab. A. 2 im Anhang). Die

5 Ergebnisse und Diskussion

Knochenproben wurden zusätzlich mit dem Fluoreszenz-Screeningtest (s. Kap. 5.9.2.2) untersucht.

Sie ergaben für die Kontrolltierknochen im Gegensatz zu den Ergebnissen mit der LC-MS/MS-

Untersuchung ausschließlich negative Befunde. Diese Resultate entsprechen den Ergebnissen von

KÖRNER et al., die in Fleischknochenmehlen, die keine Fluoreszenz zeigten, mittels HPLC-UV Tetra-

cycline nachweisen konnten [285]. Die in den Kontrolltierknochenproben nachgewiesenen Gehalte

sind möglicherweise, ebenso wie bereits für die Gehalte in den Urinproben der Kontrolltiere diskutiert,

auf eine Arzneimittelverschleppung im Stall oder während der Mischfutterherstellung zurückzuführen.

Wie in den Urinproben konnten auch in den Schlachtproben sowie den Knochen- und Plasmaproben

iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen werden, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC spurenweise nur

in Knochen. Ebenso wie in den Urinproben war in den meisten Proben noch ein weiteres Produkt mit

demselben Precursor-Ion [M+H]+ von 479 und den Produkt-Ionen m/z 462 und 444 vorhanden, auf

dessen Identifizierung in Kap. 5.5 eingegangen wird. In Abb. 26 ist beispielhaft ein MS-

Chromatogramm einer Muskulaturprobe von einem Versuchstier dargestellt.

Abb. 26: MS-Chromatogramm (TIC) der Muskulaturprobe von Versuchstier 11 der Haus Düsse-Studie

(*siehe Kap. 5.5)

5.4.1.3 Resistenzuntersuchungen

Ziel des Verbraucherschutzprojektes „Resistenzentwicklung und Rückstände in der landwirtschaftli-

chen Tierhaltung“ war neben der rückstandsanalytischen Bestimmung der CTC-Gehalte die Resistenz-

entwicklung der unter definierten Bedingungen gehaltenen Tiere festzustellen. Aus diesem Grund sind

im Rahmen der Haus Düsse-Studie neben Urinproben auch Faecesproben genommen worden, hieraus

E.-coli-Bakterien isoliert und diese anschließend mittels Breakpoint-Verfahren auf Resistenz geprüft

worden. Eine genaue Beschreibung der Versuchsdurchführung sowie eine detaillierte Darstellung der

Ergebnisse dieser Untersuchungen ist im Abschlußbericht des Projektes erfolgt [313]. An dieser Stelle

soll hier nur eine kurze Zusammenfassung gegeben werden.

Bei der Einstallung wiesen die Schweine bereits eine E.-coli-Population mit hohem Resistenzanteil

gegenüber Tetracyclin, vollständige Kreuzresistenz mit Chlortetracyclin vorausgesetzt, auf. Der Aus-

gangsstand von 80 % steigt bis zum Ende der Behandlung in der Gruppe der Versuchstiere auf 94 %.

Der Anteil resistenter Keime geht auch innerhalb von drei Monaten nach Medikationsende nicht we-

V11

Zeit [min]

100

[%]

MRM of 6 Channels ES+

TIC

4 6 8 10 12 14

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

unbekanntes Produkt

V11

Zeit [min]

100

[%]

MRM of 6 Channels ES+

TIC

4 6 8 10 12 14

CTC

e-CTC

iso-CTC

e-iso-CTC

unbekanntes Produkt*

5 Ergebnisse und Diskussion 83

sentlich zurück. Dies verdeutlicht die besondere Bedeutung der Tetracycline, deren Ausgangsresi-

stenzsituation unbehandelter Schweine bereits so hoch ist, daß insgesamt gesehen eine Resistenzab-

nahme nach der Medikation kaum zu beobachten ist. Auch bei den unbehandelten Schweinen der

Kontrolltiergruppe zeigten sich im Laufe des Versuches kaum geringere Resistenzen als bei der be-

handelten Versuchstiergruppe. Nach der Medikation der Versuchstiergruppe stieg auch in der Kon-

trolltiergruppe der Anteil tetracyclinresistenter E.-coli-Keime in Faeces erheblich an und blieb bis zur

Schlachtung auf einem hohem Niveau. Die Annahme, daß sich während des Einwirkens von Antibio-

tika Resistenzen ausbilden und über die Dauer der Medikation bestehen bleiben, danach jedoch wieder

verloren gehen, wenn kein Selektionsdruck mehr besteht, siehe Kap. 3.4.1, konnte damit nicht bestä-

tigt werden. Es ist um so bedenklicher, daß alle Tiere des Versuchskollektivs bei Einstallung hohe

Anteile resistenter Keime aufwiesen. Dies verdeutlicht die komplexe Problemdarstellung der Resi-

stenzsituation als Resultat der allgemein häufigen Anwendung von Tetracyclinen.

5.4.1.4 Zusammenfassung

Die durchgeführten Untersuchungen des Ausscheidungsverhaltens zeigen, daß die CTC-Gehalte nach

Medikationsende zunächst abfallen, aber noch drei Monate nach der Medikation im Urin aller Tiere

nachweisbar sind. In den Schlachtproben sind ebenfalls noch CTC und e-CTC nachzuweisen. Die

Gehalte liegen zwar weit unterhalb der entsprechenden MRL-Werte, spielen aber möglicherweise im

Hinblick auf eine Resistenzentwicklung gerade aufgrund der geringen Gehalte eine Rolle. Die festge-

stellten CTC-Gehalte in den Knochenproben sowie einiger Urinproben der Schweine der Kontrolltier-

gruppe sind Indiz dafür, daß die allgemein häufige Anwendung von Tetracyclinen in der Schweine-

mast bei den üblichen landwirtschaftlichen Haltungsbedingungen von Mastschweinen dazu führt, daß

auch unbehandelte Tiere Antibiotikaspuren durch eine Arzneimittelverschleppung im Stall aufnehmen

können, die gerade aufgrund der subtherapeutischen Dosis Resistenzen fördern können. Insbesondere

weisen LANGEWISCHE et al. darauf hin, daß auch Gehalte unterhalb der MRL-Werte Resistenzen

fördern können, weil die MRL-Werte häufig unterhalb der MHK-Wete liegen und damit nicht alle

Bakterien abgetötet werden können, so daß resistente Bakterien entstehen können [38]. Die durchge-

führten mikrobiologischen Resistenzuntersuchungen unterstützen diese Annahme. Es konnte kein

direkter Zusammenhang zwischen der Medikation der Schweine und der Resistenzlage der E.-coli.-

Keime in Faeces der Tiere festgestellt werden. Vielmehr war auch bei unbehandelten Tieren 80 %

resistenter E.-coli.-Keime nachgewiesen worden, zurückzuführen auf die häufige Anwendung von

Tetracyclinen in der landwirtschaftlichen Tierhaltung.

In allen Proben konnten neben CTC und e-CTC die Umwandlungsprodukte iso-CTC und e-iso-CTC

nachgewiesen werden. Die Knochenproben enthielten zusätzlich Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC.

Weiterhin trat in vielen Proben ein weiteres Produkt mit dem Precursor-Ion [M+H]+ von 479 und den

Produkt-Ionen m/z 462 und 444 auf, siehe Kap. 5.5.

5.4.2 FAL-Studie

Die Einzelhaltung der Tiere in Stoffwechselkäfigen ermöglicht eine Bilanzierung der applizierten und

ausgeschiedenen Wirkstoffe. Die Durchführung dieser Studie ist bereits in Kap. 5.1.2 beschrieben

worden. Darüber hinaus wurde der CTC-Gehalt in den Schlachtproben der Tiere, die nach Ablauf der

Wartezeit von vierzehn Tagen geschlachtet wurden, ermittelt. Die Konzentrationsbestimmung von

CTC und e-CTC in den Urin-, Faeces-, Plasma- und Schlachtproben erfolgte mit LC-MS/MS.

5 Ergebnisse und Diskussion

5.4.2.1 CTC und e-CTC in Urin, Faeces und Plasma

Zunächst wurde der CTC-Gehalt in den täglich entnommenen Urin- und Faecesproben untersucht. Aus

den Gehalten wurde mit den ermittelten ausgeschiedenen Urin- und Faecesmengen, siehe Tab. A. 5

und Tab. A. 6 im Anhang, die täglichen CTC-Ausscheidungsmengen berechnet.

Nach einer oralen Gabe von CTC werden maximale Serumkonzentrationen nach 3-4 Stunden und die

höchsten Urinspiegel nach etwa 8-9 Stunden erreicht, siehe Kap. 3.3. Mit einer Dosissteigerung von

CTC läßt sich kein proportionaler Anstieg der Serumkonzentration feststellen, sondern bleibt ab einer

bestimmten Dosis konstant [68, 314]. Daher war zu erwarten, daß nach mehrfacher Medikation die

Ausscheidungsmenge zuerst ansteigt und nach Erreichen eines bestimmten Plasmaspiegels anschlie-

ßend konstant bleibt. Ein derartiges Ausscheidungsverhalten haben BRÜGGEMANN et al. im Rahmen

einer ausführlichen Bilanzierung an Legehennen nach mehrtägiger Fütterungsdosierung gefunden

[319]. Sie stellten bei einer 15-tägigen Medikation von Legehennen mit C14-markiertem CTC einen

Anstieg der Ausscheidungsmenge in den ersten drei Medikationstagen mit anschließenden konstanten

Werten über einen Zeitraum von dreizehn Tagen fest. Für Schweine sind keine entsprechenden Anga-

ben in der Literatur bekannt. Es gibt zwar eine Reihe durchgeführter pharmakokinetischer Studien,

wobei aber meist Ratten, Hunde und Hühner [42, 67, 70, 74, 315, 316], weniger Schweine untersucht

wurden [68]. Diese Studien beschränken sich zudem auf eine einmalige Gabe des Arzneimittels. Die

Verhältnisse der Antibiotikafütterung in der landwirtschaftlichen Tierhaltung fanden bisher wenig

Beachtung. Darüber hinaus erfolgt die Gehaltsbestimmung bei den bereits beschriebenen pharmakoki-

netischen Studien häufig über mikrobiologische Verfahren sowie der Radioaktivitätsmessung [315,

316, 319], so daß Metabolite nur im Falle einer mikrobiologischen Aktivität bzw. einer Radioaktivität

mit erfaßt werden. Eine quantitative Berücksichtigung von Metaboliten ist daher nicht erfolgt.

In Abb. 27 sind die CTC-Ausscheidungsmengen in Urin, angegeben als Summe von CTC und e-CTC,

der einzelnen Tiere über beide Medikationsphasen dargestellt (s. auch Tab. A. 7 im Anhang).

Abb. 27: Ausscheidungsmenge (Σ CTC + e-CTC) in Urin der einzelnen Tiere (LC-MS/MS) (n =2)

0 1 2 3 4 5 6 7 8 910 22232425262728293031

2. Medikationsphase1. Medikationsphase

Tag

Tier 93

Tier 94

Tier 95

Tier 96

Tier 97

Mittelwert (93-97)

Menge (CTC + e-CTC) in Urin [mg]

5 Ergebnisse und Diskussion 85

Bei Einstallung der Tiere in die Stoffwechselkäfige, also bei der ersten Probenahme, konnte erwar-

tungsgemäß kein CTC nachgewiesen werden. Zu Beginn der ersten Medikationsphase steigt die Aus-

scheidungsmenge in Urin zunächst auf 28 mg am vierten Versuchstag und in der zweiten Medikati-

onsphase von 7 mg am 22. Versuchstag bis auf 24 mg am 27. Versuchstag an, nimmt dann aber noch

während der Medikation bis zum Absetzen des Arzneimittels wieder auf Werte von 20 mg am zehnten

Versuchstag und 5 mg am 31. Versuchstag ab, wobei sich ein individuell unterschiedlich stark ausge-

prägtes Maximum ergab. Auffällig ist, daß die maximalen CTC-Ausscheidungsmengen während der

zweiten Medikationsphase geringere Werte erreichten als bei der ersten. Zu bedenken ist, daß sich

aufgrund möglicher Isomerisierungen unter Einbeziehung von iso-CTC und e-iso-CTC ein anderer

Kurvenverlauf ergeben könnte.

Ein Vergleich der Ausscheidungsmengen in Urin der einzelnen Tiere zeigt, daß sich weitestgehend

sehr ähnliche Kurvenverläufe ergaben, da eine individuelle auf das Gewicht des jeweiligen Tieres

abgestimmte Medikation erfolgt ist. Unterschiede im Ausscheidungsverhalten sind aufgrund der indi-

viduellen Fütterung der Tiere auf eine unterschiedliche Verstoffwechselung des Antibiotikums zu-

rückzuführen.

Die Ergebnisse der Faecesuntersuchungen sind in Abb. 28 dargestellt (s. auch Tab. A. 8 im Anhang).

Abb. 28: Ausscheidungsmenge (Σ CTC + e-CTC) in Faeces der einzelnen Tiere (LC-MS/MS, n =2)

Aufgrund der phamakologischen Eigenschaften von CTC sollten die Konzentrationen von CTC in

Faeces deutlich höher liegen als in Urin, siehe Kap. 3.3. Während die resorbierten Anteile von CTC

über Urin wieder ausgeschieden werden, stammt das in Faeces nachweisbare CTC überwiegend aus

dem nicht resorbierten Anteil, weniger aus der Galle, also nach Resorption. Daher lagen die ermittel-

ten CTC-Ausscheidungsmengen in Faeces deutlich höher als in Urin und unterstützen damit frühere

Befunde [74, 317]. Im Unterschied zum Kurvenverlauf der CTC-Ausscheidungsmenge in Urin ergibt

sich in Faeces in beiden Medikationsphasen kein Maximum. In der ersten Medikationsphase stieg die

CTC-Ausscheidungsmenge auf Werte von durchschnittlich 570 mg am dritten Versuchstag an. Wäh-

rend der fortlaufenden Medikation bleibt die CTC-Ausscheidungsmenge nach dem dritten Versuchstag

012345678910 22232425262728293031

200

400

600

800

1000

1200

2. Medikationsphase1. Medikationsphase

Tag

Tier 93

Tier 94

Tier 95

Tier 96

Tier 97

Mittelwert (93-97)

Menge (CTC + e-CTC) in Faeces [mg]

5 Ergebnisse und Diskussion

annährend konstant, fällt aber nach Absetzen der Medikation stark ab, was früheren Befunden ent-

spricht [318]. In der zweiten Medikationsphase ergab sich ein ähnlicher Kurvenverlauf. Nachdem die

Ausscheidungsmengen bis zum 24. Versuchstag auf Werte von 711 mg stiegen, blieben sie anschlie-

ßend, abgesehen von einer Streuung, annähernd konstant. Ebenso wie für Urin waren für die einzelnen

Tiere sehr ähnliche Kurvenverläufe der CTC-Ausscheidungsmengen in Faeces, jedoch mit individuel-

len Unterschieden, erkennbar.

Da über Faeces überwiegend der nicht resorbierte Anteil wieder ausgeschieden wird, sinkt die Aus-

scheidungsmenge in Faeces schnell von einem Gehalt von 638 mg am zehnten Versuchstag innerhalb

der Medikationspause auf 1 mg am 22. Versuchstag ab. In Urin beträgt die Ausscheidungsmenge am

zehnten Versuchstag 20 mg und am 22. Versuchstag 7 mg. Trotz der insgesamt geringeren Ausschei-

dungsmenge in Urin sind also die nach der elftägigen Medikationspause ermittelten Auscheidungs-

mengen in Urin höher als in Faeces.

Das im Rahmen dieser Studie ermittelte Ausscheidungsverhalten von CTC in Urin und Faeces ent-

sprach damit dem von BRÜGGEMANN et al. [319] an Legehennen nach mehrtägiger Medikation fest-

gestellten Verlauf. Auch sie fanden einen Anstieg der Ausscheidungsmenge in Urin und Faces inner-

halb der ersten zwei Tage. Das festgestellte Verhältnis der Ausscheidungsmengen von CTC in Urin

und Faeces von etwa 1:30 wurde ebenfalls von EISNER et al. [74] nach einmaliger oraler CTC-

Verabreicherung bei Ratten gefunden.

Blut wurde den Tieren lediglich am Anfang und am Ende der ersten und zweiten Medikationsphase

entnommen und analysiert (Tab. 23).

Tab. 23: CTC-Gehalte (Σ CTC + e-CTC) in Plasma der einzelnen Tiere (LC-MS/MS, n = 2)

Tier 93 Tier 94 Tier 95 Tier 96 Tier 97

Medik.-

phase

Versuchs-

tag [µg/L]

0 nn nn nn nn nn

10 132,7 93,96 87,12 89,96 81,24

21 3,44 3,68 4,48 3,08 7,04

31 74,32 89,12 53,12 72,04 94,64

Aufgrund der wenigen Probenahmen läßt sich lediglich ein Anstieg des CTC-Gehaltes auf durch-

schnittlich 97 µg/L am zehnten Versuchtag feststellen. Nach der elftägigen Medikationspause sind

relativ zum CTC-Gehalt am zehnten Versuchstag, noch hohe CTC-Gehalte von 4,4 µg/L nachweisbar.

Am Ende der zweiten Medikationsphase ließen sich mit Werten von durchchnittlich 77 µg/L etwas

geringere CTC-Gehalte feststellen als in der ersten Medikationsphase. Diese Ergebnisse entsprechen

den Ergebnissen der Urinuntersuchungen, bei denen gezeigt wurde, daß die maximale CTC-

Konzentration in der zweiten Medikationsphase niedriger lag als in der ersten. Auch in Plasma lassen

sich individuelle Unterschiede feststellen.

5 Ergebnisse und Diskussion 87

5.4.2.2 Bilanzierung (Applikation-Exkretion)

Um zu beurteilen, wieviel der zugeführten Arzneimittelmenge wieder ausgeschieden wird und wieviel

im Tier verbleibt, wurden die Ausscheidungsraten der einzelnen Tiere berechnet. Die prozentuale

Ausscheidungsrate bezogen auf die täglich zugeführte Wirkstoffmenge liegt für Urin durchschnittlich

bei 1 % bis 3 % und bleibt über beide Medikationsphasen annähernd konstant, entsprechend einem

sich einstellenden Plasmaspiegel. Bei Faeces steigt die Ausscheidungsrate in beiden Medikationspha-

sen mit weitergehender Medikation stark an von 0 % bis 2 % am Anfang der Medikationsphasen über

31 % bis 40 % am zweiten Medikationstag bis auf 90 % bis 100 % nach sieben Medikationstagen.

Nach Einstellung eines bestimmten Plasmaspiegels wird nicht mehr so viel CTC resorbiert, was zu

einer erhöhten Ausscheidung von CTC über Faeces führt. Der ermittelte Verlauf der Ausscheidungsra-

ten entsprach dem, den KELLY et al. [349] an Ratten nach einmaliger oraler Verabreicherung von

C14-markiertem CTC fanden. Sie geben Ausscheidungsraten von 4 % in Urin und 10 % bis 24 % in

Faeces nach 24 h und nach 48 h 4 % in Urin und 72 % bis 79 % in Faeces an. Unterschiede in der

maximalen Ausscheidungsrate in Faeces können methodisch analytisch (Bestimmungsmethode, unge-

nügende Berücksichtigung von Metabolite) und tierphysiologisch (andere Tierarten) bedingt sein.

Über beide Medikationsphasen verteilt haben alle fünf Tiere insgesamt eine CTC-Wirkstoffmenge von

84,6 g aufgenommen, von der 1,7 g über Urin und 58,8 g über Faeces während der Medikationsphasen

wieder ausgeschieden wurden. Durchschnittlich haben die Tiere damit von der insgesamt zugeführten

Wirkstoffmenge bereits noch während der Medikation 2 % über Urin und 70 % über Faeces wieder

ausgeschieden. Es verbleibt eine CTC-Wirkstoffmenge von 24,4 g, entsprechend 28 % der applizierten

Menge, die entweder zwischen den beiden Medikationsphasen, in den zwei Wochen zwischen Abset-

zen der Medikation und Schlachtung der Tiere noch ausgeschieden wurde oder in den Tierkörpern bei

der Schlachtung verblieben ist. Die in diesem Versuch ermittelte Resorptionsrate von 30 % und Aus-

scheidungsrate von 70 % über Faeces stimmt gut mit den Angaben in der Literatur überein [2, 48, 74].

Wird über jedes einzelne Tier bilanziert, siehe Tab. 24, so zeigt sich, daß der Ausscheidungsgrad über

den gesamten Medikationszeitraum von CTC in Urin, ermittelt als Summe von CTC und e-CTC, mit

1 % bis 4 % sehr gering ist und kaum individuelle Unterschiede festzustellen sind.

Tab. 24: Bilanzierung über die zugeführte CTC-Wirkstoffmenge und ausgeschiedene Menge als CTC

und e-CTC bei den einzelnen Tieren

Ausscheidungsgrad

(Σ CTC + e-CTC) [%]

Tier

Applizierte CTC-

Wirkstoffmenge [g]

≜100 % Urin Faeces

verbleibender

Anteil der zugeführten

CTC-Menge

[%]

93 16,4 2 55 43

94 16,3 2 74 24

95 17,6 1 70 29

96 17,3 2 83 15

97 17,0 4 65 31

Die Ausscheidungsrate von CTC in Faeces liegt zwischen 55 % und 83 % und es lassen sich damit

deutlich stärker ausgeprägte individuelle Unterschiede erkennen als bei der Betrachtung der Ausschei-

dungsmengen, siehe Abb. 28. Während den dargestellten Ergebnissen in Abb. 28 lediglich die absolu-

5 Ergebnisse und Diskussion

te ausgeschiedene CTC-Menge zugrunde liegt, geht in die Berechnung des Ausscheidungsgrades die

tägliche zugeführte Arzneimittelmenge und damit auch indirekt das Körpergewicht mit ein.

Während der Medikation wurden zwischen 57 % und 85 % der zugeführten Wirkstoffmenge über Urin

und Faeces ausgeschieden. Die hierbei nicht erfaßten 15 % bis 43 % der zugeführte Wirkstoffmenge

können entweder während der Medikationspause oder der Wartezeit ausgeschieden worden sein oder

tatsächlich im Tier selbst verblieben sein.

In den Urin-, Faeces- und Plasmaproben kamen neben CTC und e-CTC auch iso-CTC und e-iso-CTC

sowie in Faeces zusätzlich Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC vor. Das im Rahmen der Haus Düsse-

Studie festgestellte weitere Produkt ist auch in den meisten Proben dieser Studie aufgetreten, siehe

Kap. 5.5. Es bleibt zu prüfen, inwiefern sich die im Rahmen dieser Bilanzierung erhaltenen Werte

unter Berücksichtigung der Metabolite erhöhen würden.

5.4.2.3 Schlachtproben

Die in den Schlachtproben der nach Ablauf der Wartezeit geschlachteten Tiere ermittelten CTC-

Gehalte als Summe von CTC und e-CTC sind in Tab. 25 dargestellt.

Tab. 25: CTC-Gehalte (

∑

CTC und e-CTC) in Urin-, Faeces-, Plasma- und Schlachtproben der

Versuchstiere (Probenahme bei der Schlachtung, LC-MS/MS, n = 2)

Matrix Einheit Tier 93 Tier 94 Tier 96 Tier 97 MRL

Muskulatur µg/kg 4,2 3,3 3,4 3,8 100

Leber µg/kg 3,2 7,9 6,1 9,5 300

Niere µg/kg 19,6 15,3 16,6 23,0 600

Knochen mg/kg 26,1 24,8 21,3 21,8 --

Urin µg/L 253,4 418,5 70,1 -- --

Faeces mg/kg 0,8 2,2 1,1 0,8 --

Plasma µg/L 3,2 3,0 4,0 26,6 --

In den Knochenproben wurden die höchsten Gehalte gefunden. Mit durchschnittlichen Werten von

23,5 mg/kg liegen diese Knochengehalte höher als bei den Schweinen der Haus Düsse-Studie mit

Durchschnittswerten von 12,4 mg/kg, korrelieren aber mit der applizierten Wirkstoffmenge. Die

Schweine der Haus Düsse-Studie haben durchschnittlich 9,2 g CTC aufgenommen, die der FAL-

Studie 16,9 g.

In Urin, Faeces und Plasma können ebenfalls CTC nachgewiesen werden, wobei die Gehalte in Urin

und Plasma dieser Tiere deutlich höher liegen als bei den Tieren der Haus Düsse-Studie, da die

Schweine der FAL-Studie vierzehn Tage, die der Haus Düsse-Studie erst nach drei Monaten ge-

schlachtet worden sind. Die CTC-Gehalte in Muskulatur, Leber und Niere liegen unterhalb der MRL-

Werte, entsprechend früheren Befunden von MCEVOY et al. [320]. Bemerkenswert ist, daß die in

dieser Studie ermittelten Gehalte in Muskulatur, Leber und Niere sich kaum von den Werten unter-

scheiden, die bei den Proben der Haus Düsse-Studie nachgewiesen wurden, obwohl die Schlachtung

der Schweine in der Haus Düsse-Studie zehn Wochen später, bezogen auf den Zeitpunkt des Medika-

tionsendes, erfolgte.

In Muskulatur, Leber, Niere und Knochen konnten ebenfalls iso-CTC und e-iso-CTC sowie ein weite-

5 Ergebnisse und Diskussion 89

res Produkt, siehe Kap. 5.5, nachgewiesen werden. In Knochen waren darüber hinaus in Spuren auch

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC feststellbar.

5.4.2.4 Zusammenfassung

Die durchgeführten Untersuchungen zum Ausscheidungsverhalten von CTC, Gehalte ermittelt als

Summe von CTC und e-CTC, haben gezeigt, daß innerhalb der ersten drei Medikationstage die Au-

scheidungsmenge in Urin und Faeces steigt. Während die Ausscheidungsmenge in Faeces an den wei-

teren Medikationstagen annähernd konstant bleibt, nimmt sie in Urin wieder ab. Die Bilanzierungser-

gebnisse zeigen, daß von der applizierten Wirkstoffmenge nur 1 % bis 4 % über Urin und 55 % und 83

% über Faeces während der Medikation als CTC und e-CTC wieder ausgeschieden wird. In den

Schlachtproben der Tiere, die nach Ablauf der Wartezeit geschlachtet wurden, ließen sich ebenfalls

CTC-Gehalte feststellen, die jedoch unterhalb der MRL-Werte lagen. In Urin, Faeces, Plasma, Musku-

latur, Leber, Niere und Knochen konnten neben CTC und e-CTC die Metabolite iso-CTC und e-iso-

CTC, in Faeces und Knochen auch Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC nachgewiesen werden.

5.4.3 Ergebnisse der Studien und Konsequenzen

Die im Rahmen der Medikationsstudien durchgeführten Untersuchungen zum Ausscheidungsverhalten

von CTC in Urin haben gezeigt, daß die CTC-Gehalte nach Absetzen einer Medikation stark abfallen,

jedoch noch drei Monate nach der Medikation CTC und e-CTC feststellbar sind. Während über Urin

nur ein geringer Anteil von 1% bis 4 % ausgeschieden wird, erfolgt die hauptsächliche Ausscheidung

über Faeces zu 55 % bis 83 %. Einschränkend zu erwähnen ist, daß der CTC-Gehalt lediglich als

Summe von CTC und e-CTC ermittelt wurde und außerdem die Haltung der Schweine nach der Medi-

kation in der Gruppe ohne weitere Probenahmen bis zur Schlachtung erfolgt ist. Daher ist eine exakte

Bilanzierung unter diesen Bedingungen nicht möglich gewesen. Die Untersuchung der Schlachtproben

ergab, daß nach Ablauf der Wartezeit die Gehalte in Muskulatur, Leber und Niere weit unterhalb der

MRL-Werte lagen. Aber auch nach einem dreimonatigen medikationsfreien Zeitraum finden sich in

diesen Matrices nur geringfügig niedrigere CTC-Gehalte. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß auch

unbehandelte Schweine, die unter landwirtschaftlich üblichen Bedingungen gehalten werden, Antibio-

tikaspuren durch eine Arzneimittelverschleppung im Stall aufnehmen können. Es sei nochmals darauf

hingewiesen, daß auch Arzneimittelrückstände unterhalb der MRL-Werte Resistenzen fördern können,

wenn diese unterhalb der MHK-Werte liegen.

In Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen kamen neben CTC und e-CTC die

Metabolite iso-CTC und e-iso-CTC, in Faeces und Knochen auch in Spuren Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC vor. Weiterhin trat in vielen Proben ein weiteres Produkt mit dem Precursor-Ion

[M+H]+ von 479 und den Produkt-Ionen m/z 462 und 444 auf.

In den nachfolgenden Kapiteln wird eine Identifizierung des weiteren aufgetretenen Produktes ange-

strebt. Darüber hinaus sollte geprüft werden, ob es notwendig ist, bei der Ermittlung des CTC-

Gehaltes über die gesetzlich vorgeschriebene Regelung hinaus, die eine Bestimmung des CTC-

Gehaltes als Summe von CTC und e-CTC vorsieht, auch die weiteren aufgetretenen Metabolite mit

einzubeziehen. Um dies beurteilen zu können, ist zunächst untersucht worden, welche dieser Metaboli-

te in vitro und welche in vivo entstehen. Darüber hinaus spielt neben der Toxizität und der Fähigkeit

zur Resistenzbildung vor allem die antibiotische Wirkung bei der Entscheidung, welche Metabolite in

5 Ergebnisse und Diskussion

den CTC-Gehalt mit einbezogen werden müssen, eine große Rolle. Daher ist mittels Dreiplatten-Tests

die antibiotische Aktivität der nachgewiesenen Substanzen CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC

sowie e-Anhydro-CTC untersucht worden.

5.5 Identifizierung von Tautomeren

Die Tatsache, daß das zusätzlich auftretende Produkt genauso wie CTC das Precursor-Ion [M+H]+ mit

m/z 479 und die Produkt-Ionen mit m/z 462 und m/z 444 bildet, gibt deutliche Hinweise darauf, daß es

sich hierbei um ein Umwandlungsprodukt, also einem Strukturisomeren, handelt. Als mögliche Struk-

turisomere kommen bereits in der Literatur beschriebene tautomere Verbindungen von CTC in Be-

tracht.

Von verschiedenen Autoren wird das Auftreten von Keto-Enol-Tautomeren bei Chlortetracyclin be-

schrieben [136, 143, 149, 210, 321]. NAIDONG et al. untersuchten 1990 erstmals den strukturellen

Aufbau der Tautomere mittels HPLC-UV-NMR und bewiesen damit die Existenz derartiger Verbin-

dungen. Sie zeigten, daß eine Keto-Enol-Tautomerie am C11-, C11a- und C12-Atom stattfindet

(Struktur siehe Abb. 9) [149]. Aufgrund der β-Diketon-Struktur liegt CTC bevorzugt in der normaler-

weise weniger begünstigten Enol-Form unter Ausbildung einer vinylogen Carbonsäure vor. Dafür

verantwortlich ist die Ausbildung eines konjugierten Enols sowie eine intramolekulare Wasserstoff-

brücken-Bindung zwischen dem Enol-Wasserstoffatom und dem Sauerstoffatom der verbliebenen

Carbonylgruppe. NAIDONG et al. fanden in salzsaurer Lösung mit steigendem pH-Wert von 2 bis 4

eine Verschiebung des Keto-Enol-Gleichgewichtes in Richtung der Keto-Form, also dem β-Diketon.

Mit abnehmendem pH-Wert nimmt die Geschwindigkeit der Gleichgewichtseinstellung der Keto-

Enol-Tautomerie zu. Sie konnten jedoch nicht feststellen, welche Konfiguration das neu entstandene

asymmetrische Zentrum am C11a-Atom besitzt, so daß davon ausgegangen werden muß, daß mit

Ausbildung der Keto-Form ein Gemisch aus dem cis- und trans- β -Diketon vorliegt. Dieselben Auto-

ren wiesen Keto-Enol-Tautomere nur bei CTC und e-CTC, nicht jedoch bei iso-CTC und Anhydro-

CTC nach. Dies scheint insofern plausibel, da beim iso-CTC durch die Ausbildung des Lactons am

Ring C keine vinyloge Carbonsäure mehr vorliegt, siehe Kap. 3.5.3.2, und damit am C11a- und C12-

Atom die Keto-Form überwiegt. Die Entstehung des Anhydro-CTC ist nach der Eliminierung von

Wasser am C5a- und C6-Atom mit einer Verschiebung der Enolstruktur vom C11a- und C12-Atom

zum C11- und C11a-Atom und damit einer Aromatisierung des Ringes C verbunden, siehe Kap.

3.5.3.4, wodurch die Ausbildung der Keto-Form unterbunden wird. Nach NAIDONG et al. liegen in

verdünnter Salzsäure (0,01 moL/L) 20 % des CTC und 50 % des e-CTC als Keto-Form vor. Bei An-

wesenheit von Methanol im Lösungsmittel verschiebt sich das Gleichgewicht in Richtung Enol-Form,

also vinyloger Carbonsäure. Verschiedene eigene Untersuchungen legen unter Zugrundelegung der

Ergebnisse von NAIDONG et al. die Vermutung nahe, daß es sich bei der in den Proben vielfach fest-

gestellten unbekannten Komponente um die Keto-Form von e-CTC handelt:

5 Ergebnisse und Diskussion 91

• Stabilitätsuntersuchungen der einzelnen Verbindungen CTC, e-CTC und iso-CTC in Me-

OH/Fließmittel A (50/50) (v/v) belegen, daß die unbekannte Komponente in schwach saurer me-

thanolischer Lösung nur aus CTC und e-CTC, nicht aber aus iso-CTC entsteht. Dabei ist die Peak-

fläche größer, wenn als Ausgangssubstanz e-CTC anstelle von CTC eingesetzt wird. Allerdings

sind in diesem Lösungmittel die Epimerisierung und Tautomerie konkurrierende Reaktionen. Dies

bedeutet, daß nicht eindeutig festgestellt werden kann, ob die unbekannte Komponente aus CTC

oder aus e-CTC entstanden ist.

• Eine alkalische Behandlung von aufgearbeiteten Muskulaturproben, siehe Kap. 5.8.2.3, in denen

die Substanzen CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC und das unbekannte Strukturisomer nachgewie-

sen werden konnten, führt zur Auslöschung von CTC, e-CTC sowie des Peaks der unbekannten

Substanz. Dies deutet ebenfalls auf eine Keto-Form von CTC oder e-CTC hin, die im alkalischen

Milieu ebenfalls isomerisiert.

• In salzsaurer Lösung entstehen sowohl aus CTC als auch aus e-CTC neben Spuren von Anhydro-

und e-Anhydro-CTC zusätzliche Substanzen. Unter diesen Bedingungen kann eine Epimerisierung

ausgeschlossen werden, siehe Kap. 5.2.2.8.

• Ein Vergleich der relativen Peakflächen läßt erkennen, daß aus e-CTC größere Anteile der neuen

Komponente entstehen als aus CTC. Dies entspricht den Ergebnissen von NAIDONG et al., nach

dem sich e-CTC deutlich stärker in das β-Diketon umwandelt als CTC.

• In salzsaurer Lösung ist die Peakfläche der unbekannten Komponente höher als in methanolischer

Lösung, bestehend aus MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v). Auch NAIDONG et al. stellten bei

50%igem Zusatz von Methanol zur Säure eine Verschiebung des Keto-Enol-Gleichgewichtes in

Richtung der Enol-Form, also der vinylogen Carbonsäure, fest.

Abb. 29: a) UV-Chromatogramm von CTC und e-CTC sowie der Keto-Verbindungen in 1 moL/L HCl

(β = 10 mg/L), UV-Spektren von CTC, keto-CTC (b), e-CTC und keto-e-CTC (c); UV-

Spektren von CTC, keto-CTC (d), e-CTC und keto-e-CTC (e) von NAIDONG et al. [149]

250 300 350 400

100

CTC

250 300 350 400

100

keto-CTC

e-CTC

keto-e-CTC

Zeit

[min]

468101214

100

[%]

CTCe-CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

250

300

350

400

CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

e-CTC

250 300 350 400

100

CTC

250 300 350 400

100

keto-CTC

e-CTC

keto-e-CTC

Zeit

[min]

468101214

100

[%]

CTCe-CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

Zeit

[min]

468101214

100

[%]

CTCe-CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

468101214

100

[%]

CTCe-CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

250

300

350

400

CTC

keto-CTC

keto-e-CTC

e-CTC

a) b)

5 Ergebnisse und Diskussion

Ein Vergleich der normierten UV-Spektren der nachgewiesenen Substanzen mit den UV-Spektren von

NAIDONG et al. gibt jedoch deutliche Hinweise auf die Keto-Form von CTC und e-CTC (siehe Abb.

29) [149]. Die UV-Spektren der Keto-Form von CTC und e-CTC unterscheiden sich erheblich von

denen der Enol-Form. Die durch eigene Untersuchungen ermittelten UV-Spektren der unbekannten

Substanzen entsprechen denen von NAIDONG et al., so daß davon ausgegangen werden kann, daß es

sich bei den zusätzlich auftretenden Strukturisomeren um keto-CTC und keto-e-CTC handelt.

Durchgeführte massenspektrometrische Untersuchungen der unbekannten Komponenten unterstützen

die Annahme einer Keto-Form von CTC oder e-CTC. Die Produkt-Ion-Scans von CTC, e-CTC, iso-

CTC, e-iso-CTC und des unbekannten Stereoisomeres lassen eine Unterscheidung anhand des Frag-

mentierungsmusters zu. In Abb. 30 sind die Produkt-Ionen-Scans von e-CTC, e-iso-CTC und e-keto-

CTC gegenübergestellt. Es wurden die epimeren Verbindungen gewählt, da e-CTC in höherem Aus-

maß zum keto-e-CTC tautomerisiert als CTC zum keto-CTC.

Abb. 30: Produkt-Ion-Scans des Precursor-Ions m/z 479 von e-CTC, e-iso-CTC und keto-e-CTC

(MS/MS-Bedingungen: Kapillar-Spannung: 3,5 kV, Cone-Spannung: 20 V, Kollisionsener-

gie: 30 eV)

Das Fragmentierungsmuster von CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC wurde bereits in Kap. 5.2.1.2

100 200 300 400 500

m/z

100

444

[M + H - NH3 -H

2O]+

371

[M + H - NH3-H

2O - 73]+

462

[M + H - NH3]+

e-CTC

154

[M + H - 325]+

100 200 300 400 500

m/z

100

462

[M + H - NH3]+

197

[M + H - 282]+

CH3

CONH2

OHO

HN(CH3)2

C13H17N2O5 281.11C9H6O3Cl 197.00

e-iso-CTC

100 200 300 400 500

m/z

100

462

[M + H - NH3]+

444

[M + H - NH3 -H

2O]+

198

[M + H - 281]+

CONH2

OHO

HN(CH3)2

ClHO CH3

C13H16N2O5 280.11C9H7O3Cl 198.01

keto-e-CTC

100 200 300 400 500

m/z

100

444

[M + H - NH3 -H

2O]+

371

[M + H - NH3-H

2O - 73]+

462

[M + H - NH3]+

e-CTC

154

[M + H - 325]+

100 200 300 400 500

m/z

100

444

[M + H - NH3 -H

2O]+

371

[M + H - NH3-H

2O - 73]+

462

[M + H - NH3]+

e-CTC

154

[M + H - 325]+

100 200 300 400 500

m/z

100

462

[M + H - NH3]+

197

[M + H - 282]+

CH3

CONH2

OHO

HN(CH3)2

C13H17N2O5 281.11C9H6O3Cl 197.00

100 200 300 400 500

m/z

100

462

[M + H - NH3]+

197

[M + H - 282]+

CH3

CONH2

OHO

HN(CH3)2

C13H17N2O5 281.11C9H6O3Cl 197.00

e-iso-CTC

100 200 300 400 500

m/z

100

462

[M + H - NH3]+

444

[M + H - NH3 -H

2O]+

198

[M + H - 281]+

CONH2

OHO

HN(CH3)2

ClHO CH3

C13H16N2O5 280.11C9H7O3Cl 198.01

keto-e-CTC

5 Ergebnisse und Diskussion 93

erläutert, so daß in diesem Zusammenhang nur die Unterschiede in der Fragmentierung der einzelnen

Verbindungen verdeutlicht werden. Insbesondere ist auf das nur bei iso-CTC und e-iso-CTC auftre-

tende Produkt-Ion mit m/z 197 hinzuweisen. Für dieses Produkt-Ion kann die in Abb. 30 dargestellte

Spaltung der Ausgangsverbindung postuliert werden. Bei der Kollision des unbekannten Sterioisomers

ist ein Produkt-Ion mit m/z 198 entstanden, dessen Bildung aus CTC bzw. e-CTC nur bei Vorliegen

der β-Diketon-Form wahrscheinlich ist, da eine Spaltung der Ringe B und C bei Vorliegen einer viny-

logen Carbonsäure am C11-, C11a- und C12-Atom aufgrund des konjugierten Systems und der Aus-

bildung eines relativ spannungsfreien sechsgliedrigen Ringes über Wasserstoffbrückenbindung als

wenig günstig erscheint. Deshalb kann davon ausgegangen werden, daß es sich bei Auftreten des Pro-

dukt-Ions mit m/z 198 um die Keto-Form von CTC oder e-CTC handelt. Tritt dieses Produkt-Ion nicht

auf, ist auf die Enol-Form zu schließen.

Auf diese Art und Weise ist erstmals auch eine massenspektrometrische Unterscheidung der Keto-

Enol-Tautomere möglich. Die durchgeführten Untersuchungen erlauben jedoch keine Aussage dar-

über, ob bei den Keto-Formen das H-Atom des C11a-Atoms cis- oder trans-ständig zum H-Atom des

C5a-Atoms steht.

5.6 In vitro- und in vivo-Bildung von Metaboliten des CTC

5.6.1 In vitro-Bildung

In der Literatur werden in Abhängigkeit vom Lösungsmittel und vom pH-Wert, die Bildung verschie-

dener Abbauprodukte von CTC beschrieben (siehe Kap. 3.5.3) [37, 126, 122, 136, 137, 149, 150].

Nach den Angaben in der Literatur entsteht unterhalb pH 1 das Anhydro-CTC und oberhalb pH 8 das

iso-CTC. Im schwach sauren Milieu (pH 2-6) epimerisieren CTC, iso-CTC und Anhydro-CTC. In

salzsaurer Lösung lassen sich die Keto-Enol-Tautomere von CTC chromatographisch nachweisen. Bei

den Epimerisierungsreaktionen sowie den Keto-Enol-Tautomerien handelt es sich um Gleichgewichts-

reaktionen, dagegen ist die Bildung von iso-CTC und Anhydro-CTC aus CTC irreversibel.

Um zu überprüfen, welche Abbauprodukte in saurer methanolischer Lösung, entsprechend der Kali-

brierlösung für CTC und e-CTC, entstehen können, wurden analog Kap. 5.2.1.3 die Abbaureaktionen

einzeln von CTC-, e-CTC-, iso-CTC-, Anhydro-CTC- und e-Anhydro-CTC in MeOH/Fließmittel A

(50/50) (v/v) (pH 2,8) (ß = 10 mg/L) bei einer Temperatur von 40 °C über einen Zeitraum von 60 h

verfolgt. Aus iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC entstehen ausschließlich die jeweiligen

Epimere. Dies entspricht den Angaben in der Literatur, wonach es sich bei der Bildung von iso-CTC

und Anhydro-CTC aus CTC um irreversible Reaktionen handelt.

CTC und e-CTC zeigten neben der bei diesem pH-Wert erwarteten Epimerisierung zusätzlich die Ent-

stehung von iso-CTC, e-iso-CTC und keto-e-CTC (siehe Abb. 31). CTC tendiert deutlich geringer

dazu, Keto-Enol-Tautomere zu bilden, siehe Kap. 5.5, möglicherweise würde aber ein entprechender

Peak mit dem iso-CTC-Peak, siehe Abb. 29 und Abb. 31 koeluieren. Dies könnte der Grund sein,

warum im Produkt-Ion-Scan von iso-CTC in Spuren das Produkt-Ion mit m/z 444 auftritt, welches aus

iso-CTC nicht entstehen kann. Allerdings konnte das für keto-CTC charakteristische, aber auch weni-

ger intensive Produkt-Ion mit m/z 198 nicht mehr nachgewiesen werden. Damit kann eine mögliche

Bildung von keto-CTC als vernachlässigbar eingestuft werden.

Entgegen den Literaturangaben werden also iso-CTC und e-iso-CTC nicht nur im alkalischen Milieu,

5 Ergebnisse und Diskussion

sondern auch in saurer methanolischer Lösung bei pH 2,8 gebildet. Darüber hinaus können unter die-

sen Bedingungen auch Tautomere von e-CTC entstehen.

Abb. 31: MS-Chromatogramm (TIC) von CTC und Metabolite nach Lagerung einer CTC-Lösung in

MeOH/Fließmittel A (pH 2,8) (β = 10 mg/L) über 60 h bei einer Temperatur von 40 °C

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß unter den üblichen Bedingungen der Probenvorbereitung

bei Raumtemperatur eine Isomerisierung von CTC in Lösung zwar unwahrscheinlich ist, wie die Wie-

derfindungsversuche mit Standardlösungen in Kap. 5.2.2.3 ergaben, jedoch bei höheren Temperaturen

nicht auszuschließen ist. Die Stabilitätsuntersuchungen von CTC und e-CTC haben gezeigt, daß in

saurer methanolischer Lösung bei einer Temperatur von 40 °C neben den isomeren Verbindungen

auch keto-e-CTC gebildet wird. Die Produkte Anhydro-CTC, e-Anhydro-CTC und keto-CTC entste-

hen in vitro unter diesen Bedingungen nicht.

5.6.2 In vivo-Bildung

Eine in vivo-Bildung von Umwandlungs- und Abbauprodukten des CTC in Muskulatur, Eiern, Plasma

und Niere wurde bereits von verschiedenen Autoren diskutiert [143, 178, 210, 322, 323]. Nach PETZ

et al. beträgt die Epimerisierungsrate während der Aufarbeitung für CTC in Muskulatur im Rahmen

einer Laborvergleichsuntersuchung im Durchschnitt 10-15 %, in Niere bis zu 40 %, wobei die Proben-

vorbereitung auf dem Verfahren von FARRINGTON et al. bzw. auf der § 35 LMBG-Methode basiert

[224, 226] und sowohl eine Metall-Chelat-Affinitäts-Extraktion als auch eine Festphasenextraktion

umfaßt. Nach KÜHNE et al. beträgt die Epimerisierungsrate von CTC in dotierten Muskulaturproben

nach der Probenvorbereitung durch Extraktion mit Phosphat-Puffer und anschließender Festphasenex-

traktion 24,1 %. Im Gegensatz ermittelten sie in gewachsenen Muskulaturproben eine Epimerisie-

rungsrate von 41,6 %, was auf eine zusätzliche in vivo-Bildung von e-CTC schließen läßt [322]. Ähn-

liche Ergebnisse haben ZURHELLE et al. [178] und BLANCHFLOWER et al. [210] erhalten. Letztge-

nannte Arbeitsgruppe beschreibt die in vivo-Bildung von e-CTC sowie der Tautomere in Muskulatur

und schließt eine in vitro-Bildung dieser Produkte aus, wobei die Extraktion mit Glycin-Puffer und

anschließend eine Festphasenextraktion durchgeführt wurde. ZURHELLE et al. wenden eine on-line-

Dialyse und on-line Festphasenextraktion für die Aufarbeitung von Hühnereiern an und schließen

keto-e-CTC

e-iso-CTC

iso-

CTC

e-CTC

2 4 6 8 10 12 14

Zeit [min]

100

[%]

MRM of 6 Channels ES+

TIC

keto-e-CTC

e-iso-CTC

iso-

CTC

e-CTC

2 4 6 8 10 12 14

Zeit [min]

100

[%]

MRM of 6 Channels ES+

TIC

MRM of 6 Channels ES+

TIC

5 Ergebnisse und Diskussion 95

sowohl die Bildung von e-CTC als auch von iso-CTC und e-iso-CTC in vitro aus. Die in den Eierpro-

ben nachgewiesenen e-CTC-, iso-CTC- und e-iso-CTC-Gehalte waren demnach ausschließlich in vivo

entstanden.

Um zu beurteilen, in welchem Maße weitere Metabolite unter dem in dieser Arbeit entwickelten Ana-

lysenverfahren in vitro und in vivo entstanden sind, wird die Epimerisierungrate von dotierten Proben

mit der von gewachsenen Proben für die Matrices Urin, Plasma, Faeces, Muskulatur, Leber und Niere

verglichen (siehe Tab. 26). Die Extraktion CTC dotierter Pufferlösungen, also ohne biologische Ma-

trix, führt zu Epimerisierungsraten von etwa 17 %, siehe Kap. 5.2.2.3.

Tab. 26: Epimerisierungsrate von CTC in CTC-dotierten und gewachsenen biologischen Proben (LC-

MS/MS, n = 12)

% e-CTC

dotierte Proben (n = 6)

Matrix

10 µg/ kg

oder L

100 µg/ kg

oder L

Mittelwert

dotierte Proben

(n = 12)

gewachsene Proben

(n = 12)

Muskulatur 13 17 15 42

Leber 28 26 27 33

Niere 30 26 28 24

Urin 27 31 29 43

Faeces 11 12 12 34

Plasma 30 24 27 35

Knochen nicht bestimmt 22

Den in Tab. 26 angegebenen Epimerisierungsraten für dotierte Matrixproben liegen die Ergebnisse

aus Tab. 21 zu Grunde, die sich auf Wiederfindungsstudien mit auf zwei Konzentrationsstufen dotier-

tem Probenmaterial beziehen. Für die Angaben der gewachsenen Proben wurden die ermittelten Ge-

halte in den Schlachtproben der Haus Düsse-Studie, siehe Tab. 22, herangezogen. Es zeigte sich, daß

die Epimerisierungsrate unabhängig von der Konzentration ist, sondern vielmehr von der Matrix sowie

den äußeren Einflüssen während der Probenvorbereitung wie Zeitdauer der Aufarbeitung und Tempe-

ratur abhängt. PETZ et al. stellten ebenfalls bei einer Laborvergleichsuntersuchung für verschiedene

Tetracyclin-Derivate in Muskulatur und Niere fest, daß die Epimerisierungsrate von den äußeren La-

borbedingungen abhängt [323].

Die Epimerisierungsrate liegt in dotierten Matrixproben mit Werten zwischen 15 bis 29 % bereits hö-

her als in dotierten Pufferlösungen, die 10 % bis 14 % e-CTC enthalten. In gewachsenen Proben wer-

den nochmals höhere Epimerisierungsraten mit Werten zwischen 22 % und 43 % gefunden. Nur bei

der Matrix Niere ergeben sich vergleichbar große Epimerisierungsraten sowohl bei dotiertem als auch

gewachsenem Probenmaterial. Ein Vergleich der Epimerisierungsrate in dotierten Matrixproben mit

denen in gewachsenen Proben deutet auf eine in vivo-Bildung von e-CTC hin, da die relativen Anteile

in gewachsenen Proben größer sind als in dotierten. In Abhängigkeit von den Bedingungen der Pro-

benvorbereitung (z.B. Dauer, Temperatur) enthalten Meßlösungen, wie bereits erwähnt, nach der Pro-

benvorbereitung von mit CTC dotierten Pufferlösungen 10 bis 14 % e-CTC, aber kein keto-e-CTC,

iso-CTC und e-iso-CTC. In dotierten biologischen Proben konnten nur sehr geringe Gehalte an keto-e-

5 Ergebnisse und Diskussion

CTC, iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen werden, so daß davon ausgegangen werden kann, daß

diese Produkte überwiegend in vivo entstehen. In Faeces und Knochen wurden in geringen Mengen

auch Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC nachgewiesen. Dabei handelt es sich in Faeces um in vivo

gebildete Abbauprodukte, da weder bei der Probenvorbereitung mit dotierten Pufferlösungen noch mit

dotierten Matrixproben diese Produkte entstanden sind. In Knochen kann die Bildung von Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC sowohl in vivo als auch in vitro durch die Extraktion mit Salzsäure erfolgt

sein.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß e-CTC sowohl in vivo als auch in vitro entsteht, aber iso-

CTC und e-iso-CTC hauptsächlich in vivo. Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC spielen als Abbaupro-

dukte eine untergeordnete Rolle, da sie lediglich in Faeces und Knochen in Spuren nachweisbar sind.

In Faeces werden Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC in vivo gebildet, in Knochen sowohl in vitro als

auch in vivo.

5.7 Antibiotische Aktivitäten

5.7.1 Agar-Diffusionstest

Zur Beurteilung der antibiotischen Aktivität von CTC und seinen Umwandlungs- und Abbauproduk-

ten wurden Standardlösungen der Substanzen CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC mittels Agar-Diffusionstest unter Zugrundelegung der Allgemeinen Verwaltungsvorschrift (AVV

Fleischhygiene) [324] und der DIN 58940 [325] untersucht. Bei dem Agar-Diffusionstest handelt es

sich um ein Screening-Verfahren, das in Deutschland als Dreiplattentest (DPT) zur Untersuchung auf

antibakteriell wirksame Stoffe (Hemmstoffe) eingesetzt wird. Neben diesem DPT-Test wird häufig

auch der EG-Vierplatten-Test eingesetzt, bei dem zusätzlich eine weitere Agar-Platte, pH 8, beschickt

mit Micrococcus luteus als Testkeim, verwendet wird. Der DPT kann für die Untersuchung von Ge-

webeproben sowie für flüssige Proben mit Nachweisgrenzen zwischen 30 und 190 µg/L oder µg/kg

eingesetzt werden [145, 324, 325, 326]. Unter dem Agar-Diffusionstest wird eine mikrobiologische

Untersuchungsmethode verstanden, bei der sich durch die Diffusion eines Wirkstoffes in festen be-

impften Kulturmedien wachstumsfreie Hemmhöfe ergeben. Beim DPT werden Agar-Nährboden-

Platten auf die pH-Werte 6, 7.2 und 8 eingestellt und mit Bacillus subtilis BGA als Testkeim be-

schickt. Die zu untersuchende Probe wird auf die Agar-Platten aufgebracht und bei einer Temperatur

von 30 °C 18 bis 24 Stunden bebrütet [324].

Für die Untersuchung von Lösungen mit dem Agar-Diffusions-Test gibt es zwei Möglichkeiten der

Durchführung. Die Lösungen können entweder mittels Testblättchen auf den Agar aufgebracht werden

oder aber in ausgestanzte Löcher hineingegeben werden. Die Nachweisgrenze für den „Agarlochtest“

liegt mit 0,044 mg/L deutlich unterhalb derer für den „Blättchentest“ mit 0,19 mg/L und ist deshalb

vorzuziehen [327]. Während der Bebrütung diffundieren Hemmstoffe in den Nährboden und verursa-

chen in der Umgebung der Probe eine Wachstumshemmung. Diejenige Fläche, die sich aufgrund der

Diffusion des Wirkstoffes in das Kulturmedium als wachstumsfreie Zone zeigt, wird als Hemmhof

bezeichnet. Die Auswertung des Testes erfolgt durch Ausmessen der Hemmzonenbreite zwischen dem

Rand der aufgegebenen Probe und der Wachstumsgrenze des Testkeimes. Der Hemmhof wird angege-

ben als Radius in vollen mm. Je nach Größe des Hemmhofes wird als Beurteilungskriterium die Ein-

stufung: positiv (≥ 2 mm), zweifelhaft (1-2 mm) oder negativ (< 1mm) vorgenommen. Der Radius

5 Ergebnisse und Diskussion 97

wird bei der Agar-Loch-Methode vom Rand des ausgestanzten Lochs bis zum Beginn der Bakterien-

kolonnie gemessen.

Bei der Auswahl eines geeigneten Lösungsmittels ist zu beachten, daß auch Lösungsmittel eine hem-

mende Wirkung im Hemmstofftest zeigen können, z. B. ist bekannt, daß das Vorhandensein von Des-

infektionsmitteln in der Probe zu falsch positiven Ergebnissen führen kann. Daher wurden zunächst

verschiedene Lösungsmittel mittels der Agar-Loch-Methode auf eine hemmende Wirkung im DPT

untersucht, wobei sich Fließmittel A als ungeeignet erwies, als optimales Lösungsmittel ergab sich

Methanol. Zur Prüfung der hemmenden Wirkung von CTC und seiner Umwandlungs- und Abbaupro-

dukte wurden methanolische Lösungen von CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC hergestellt und mittels dem DPT und der Agar-Loch-Methode untersucht. Die Konzentrationen

wurden so gewählt, daß sich gut auswertbare Hemmhöfe ergaben. In der Allgemeinen Verwaltungs-

vorschrift [324] werden für eine Aufgabemenge von 0,01 µg ein Hemmhof von 7-9 mm für CTC an-

gegeben. Da erwartungsgemäß die Metabolite von CTC eine geringere hemmende Wirkung zeigen

sollten, siehe Kap. 3.5.3, wurden erheblich höhere Mengen der entsprechenden Substanzen von 2,5 µg

aufgetragen. In Tab. 27 sind die mittels DPT und der Agar-Loch-Methode erhaltenen Hemmhöfe für

die einzelnen Substanzen zusammengefaßt.

Tab. 27: Untersuchung von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC, e-Anhydro-CTC und iso-CTC in methanoli-

scher Lösung mittels DPT (Agar-Loch-Methode) (n = 8)

Aufgabemenge: 2,5 µg

pH 6 pH 7,2 pH 8

Substanz

Hemmhof [mm]

CTC 23 20 11

e-CTC 13 10 5

Anhydro-CTC 17 14 8

e-Anhydro-CTC 9 7 3

iso-CTC 0 0 0

Die Ergebnisse belegen, daß außer dem iso-CTC alle Substanzen eine hemmende Wirkung im DPT

zeigen. Anhydro-CTC besitzt im Vergleich zum CTC eine verminderte antibiotische Wirkung um

30 % bis 40 %. Ebenso zeigen die jeweiligen Epimere im Vergleich zu ihren Muttersubstanzen, also

e-CTC und e-Anhydro-CTC im Vergleich zu CTC und Anhydro-CTC, eine um die Hälfte

abgeschwächte antibiotische Aktivität. Diese Untersuchungen widerlegen eindeutig die in der Literatur

häufig getroffene Behauptung der antibiotischen Unwirksamkeit von e-CTC sowie der Anhydro-

Verbindungen [48, 49, 57, 138].

Verschiedene Studien aus neuerer Zeit belegen, ebenso wie die eigenen Untersuchungen, die besonde-

re Bedeutung der Metabolite e-CTC, Anhydro-CTC sowie e-Anhydro-CTC hinsichtlich der antibioti-

schen Wirksamkeit, dagegen ist iso-CTC bezüglich der antibiotischen Wirkung bedeutungslos [124,

143, 145, 328]. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde weiterhin festgestellt, daß mit steigendem

pH-Wert die Hemmzonen abnehmen, entsprechend dem Wirkungsoptimum von CTC bei einem pH-

Wert von 6,1-6,6 (siehe Kap. 3.3), was deutliche Hinweise auf mögliche Abbaureaktionen während

5 Ergebnisse und Diskussion

des Agar-Diffusionstestes gibt.

5.7.2 Bildung von Abbauprodukten während des Agar-Diffusionstests

Ziel dieser Untersuchung war es, mögliche Abbaureaktionen der antibiotisch aktiven Substanzen CTC,

e-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC während der Testdauer aufzudecken. Entsprechende Un-

tersuchungen wurden bereits von HALLING-SØRENSEN et al. durchgeführt [328], die feststellten, daß

es während der Durchführung des Toxizitätstestes (Hemmstofftest) nach ISO 15522, bei dem ebenfalls

Agar-Platten eingesetzt werden, zu einem Abbau der Substanzen CTC, e-CTC und e-Anhydro-CTC

kommt und die Wiederfindungen dieser Produkte nach dem Test zwischen 82 % und 91 % liegen,

wobei ein Verlust von Substanzen während des Testes von bis zu 20 % allgemein akzeptiert wird.

Zur Untersuchung von Abbaureaktionen während des DPT wurde der Test mit methanolischen Stan-

dardlösungen von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC und unterschiedliche Bebrü-

tungszeiten von 1, 2, 3, 18, 20, 22 und 24 Stunden durchgeführt, der resultierende Hemmhof gemes-

sen, die Agar-Platten mit Methanol extrahiert und die so erhaltenen methanolischen Extrakte mittels

LC-MS/MS analysiert. Eine vollständige Extraktion der Analyten aus den Agar-Platten nach dem

Test, also nach Diffusion der Substanzen in die Platten, kann hierbei nicht gewährleistet werden, da

nicht die gesamten Agar-Platten mit Methanol extrahiert wurden, sondern nur der Agarbereich, bei

dem ein Hemmhof entstanden ist. Die durchgeführten Untersuchungen mittels DPT ergaben, daß sich

innerhalb der ersten drei Stunden kein Hemmhof ausgebildet hatte. Nach Bebrütungszeiträumen von

18, 20, 22 und 24 Stunden haben sich jeweils identische Hemmhöfe ergeben, die den in Tab. 27 ange-

geben Radien entsprachen. Die LC-MS/MS-Untersuchungen der methanolischen Extrakte zeigten, daß

aus Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC während der gesamten Bebrütungszeit keine Abbauprodukte

entstanden. Aus CTC und e-CTC wurden, wie erwartet, in hohem Maße die isomeren Verbindungen

gebildet. Entgegen den Erwartungen konnte im Falle von e-CTC neben der Bildung von iso-CTC auch

geringfügig eine Epimerisierung zum CTC sowie eine Tautomerisierung zum keto-e-CTC beobachtet

werden. Die schnellere Bildung der antibiotisch inaktiven isomeren Verbindungen während des Testes

kann Ursache für die mit dem DPT festgestellten geringeren Hemmzonen und damit geringere antibio-

tische Aktivität von e-CTC im Vergleich zum CTC sein. Im Gegensatz dazu wurde beim CTC als

Umwandlungsprodukt nur das Isomere, also iso-CTC, nachgewiesen. Da die isomeren Verbindungen

von CTC und e-CTC antibiotisch inaktiv sind, führt dies zu einer verminderten Hemmwirkung im

DPT.

Eine Aussage über das Maß des Abbaus während der Testdauer ist aufgrund der nicht vollständigen

Extraktionsausbeute schwierig. Für die Untersuchung von CTC kann jedoch das Verhältnis der Kon-

zentration von iso-CTC zu CTC als Maß für die Abbaurate herangezogen werden, da ausschließlich

dieses Produkt entstanden ist. Liegt dieser Quotient unterhalb von 0,2, so liegt die Abbaurate in dem

allgemein akzeptierten Rahmen von 20 % [328], oberhalb dessen ist von einer signifikanten Verfäl-

schung des Ergebnisses auszugehen. Beim e-CTC kann diesbezüglich keine Aussage getroffen wer-

den, da eine Quantifizierung aller entstandenen Produkte nicht möglich ist und damit auch kein ent-

sprechender Quotient berechnet werden kann. Die für CTC ermittelten Quotienten belegen, daß es in

Abhängigkeit vom pH-Wert rasch zu einem signifikanten Abbau von CTC während der Durchführung

des DPT kommt, siehe Abb. 32.

5 Ergebnisse und Diskussion 99

0,08 0,11 0,14

0,39 0,41 0,43

0,48

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0 1 2 3 18 20 22 24

pH 6

Bebrütungsdauer [h]

Quotient (iso-CTC/CTC)

01,07 2,62 3,54

150,70

166,84 165,55

194,16

100

120

140

160

180

200

0 1 2 3 18 20 22 24

pH 8

Bebrütungsdauer [h]

Quotient (iso-CTC/CTC)

00,39 0,90 1,23

11,06

13,40

22,14

23,96

0 1 2 3 18 20 22 24

pH 7,2

Bebrütungsdauer [h]

Quotient (iso-CTC/CTC)

Abb. 32: Berechnete Quotienten (Verhältnis der Konzentration von iso-CTC:CTC) nach Durchfüh-

rung des DPT mit unterschiedlicher Bebrütungsdauer

Bei pH 6 wird nach 18 h der Grenzwert von 0,2 überschritten, bei pH 7,2 und 8 bereits nach einer

Bebrütungsdauer von einer Stunde. Deutlich zu erkennen ist, daß mit steigendem pH-Wert die Um-

wandlung von CTC ins Isomere zunimmt. Bei pH 8 ist CTC fast vollständig umgewandelt worden.

Aus der Umwandlung von CTC in iso-CTC resultiert eine Abnahme der antibiotischen Aktivität, da

die isomeren Verbindungen keine hemmende Wirkung zeigen. Möglicherweise kann diese Tatsache

auch zu falsch negativen Ergebnissen führen. Bemerkenswert ist, daß trotz zunehmender Umwandlung

von CTC in iso-CTC nach einer Bebrütungszeit von 18 h bis 24 h der gemessene Hemmhof nach den

entsprechenden Testzeiträumen identisch ist.

5 Ergebnisse und Diskussion

100

5.7.3 Zusammenfassung der Ergebnisse und Konsequenzen

Das in den Proben der Medikationstudien aufgetretene, zunächst unbekannte Produkt konnte als keto-

e-CTC identifiziert werden. Zur Beurteilung, welche Metabolite in die Ermittlung des CTC-Gehaltes

mit einbezogen werden müssen, wurde nachfolgend untersucht, welche Metabolite in vitro und welche

in vivo entstehen. Weiterhin wurde die antibiotische Aktivität von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC, e-

Anhydro-CTC und iso-CTC geprüft. Als wichtigstes Umwandlungsprodukt ist das e-CTC zu nennen,

welches sowohl in vitro zwischen 12 % und 29 % auch in vivo zwischen 6 % und 27 % entsteht. Das

e-CTC zeigt zwar im Vergleich zum CTC eine antibiotische Wirkung von 50 %, aber eine um den

Faktor 300 höhere Fahigkeit, Resistenzen auszubilden (siehe Kap. 3.4.1). Dies verdeutlicht die Wich-

tigkeit, e-CTC bei der Ermittlung des CTC-Gehaltes zu berücksichtigen. Die Umwandlungsprodukte

iso-CTC und e-iso-CTC entstehen nicht unter den üblichen in vitro-Bedingungen der Probenvorberei-

tung. Sie werden in überwiegendem Maße in vivo gebildet. Jedoch können diese Produkte bei bei hö-

heren Temperaturen auch in Lösung vorkommen. Iso-CTC und e-iso-CTC zeigen keine antibiotische

Wirkung und besitzen im Vergleich zum CTC nur eine geringfügige Fähigkeit, Resistenzen auszubil-

den [328]. Über die Toxizität dieser Verbindungen ist wenig bekannt. Da nicht vollständig ausge-

schlossen werden kann, daß diese Verbindungen auch während der Probenvorbereitung, also in vitro,

entstehen, sind diese Substanzen bei der Ermittlung des CTC-Gehaltes mit zu berücksichtigen. Als

weiteres Umwandlungsprodukt tritt das keto-e-CTC auf. Es wurde gezeigt, daß dieses Tautomer ü-

berwiegend in vivo, aber auch in vitro entstehen kann. Ein Vergleich der Peakfläche von keto-e-CTC

und den anderen nachgewiesenen Substanzen (siehe Abb. 26) zeigt, daß dieses Umwandlungsprodukt

eher eine geringe Rolle spielt. Ebenfalls eine untergeordnete Rolle spielen die Abbauprodukte Anhy-

dro-CTC und e-Anhydro-CTC, da diese in biologischen Proben nur in geringer Menge in Faeces und

Knochen vorkommen. Aufgrund ihrer antibiotischen Aktivität, die 60 % bis 70 % der des CTC beträgt

und ihrer hohen Humantoxizität, siehe Kap. 3.5.3.4, sowie der Tatsache, daß Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC in Knochen auch in vitro entstehen können, ist aber eine Quantifizierung dieser Sub-

stanzen trotzdem erforderlich. Dies wird unterstützt durch die Eigenschaft von Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC, in der im Vergleich zum CTC 30-fach ausgeprägteren Fähigkeit, Resistenzen zu för-

dern [83, 84, 328].

Als Resultat dieser Ergebnisse wird die Empfehlung von KENNEDY et al. [143], die Hühnereier unter-

suchten, bestätigt, daß Chlortetracyclinrückstände nicht nur auf die Summe des antibiotisch aktiven

CTC und e-CTC beschränkt bleiben sollten, sondern auch weniger antibiotisch aktive potentiell toxi-

sche sowie resistenzfördernde Metabolite wie iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC mit einbezogen werden sollten.

Nachfolgend wurden daher auch für diese Verbindungen Quantifizierungsmethoden entwickelt.

5.8 Methodenentwicklung zur quantitativen Bestimmung weiterer

CTC-Metabolite

Ziel war es, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung der Metabolite iso-CTC, e-iso-CTC, Anhy-

dro-CTC und e-Anhydro-CTC zu entwickeln. Das für CTC und e-CTC entwickelte und validierte

Analysenverfahren ermöglicht bisher nur die qualitative Bestimmung der genannten Verbindungen.

Zur quantitativen Bestimmung muß die Stabilität der Analyten in Kalibrierlösungen gewährleistet

sein. Daher erfolgte in einem ersten Schritt die Untersuchung der Stabilität von iso-CTC, e-iso-CTC,

5 Ergebnisse und Diskussion 101

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC in Kalibrierlösungen analog der für CTC durchgeführten Unter-

suchungen, siehe Kap. 5.2.1.3. Die Quantifizierung von e-iso-CTC erweist sich dabei als schwierig,

da es als Standardsubstanz kommerziell nicht erhältlich ist. Dieses Umwandlungsprodukt sollte durch

Epimerisierung in schwach saurer Kalibrierlösung, MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8), herge-

stellt werden. Nach Überprüfung der Linearität des Verfahrens wurde untersucht, ob sich das für CTC

und e-CTC entwickelte Extraktionsverfahren auch für die anderen Metabolite eignet. Darüber hinaus

wurde die Möglichkeit untersucht, iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter zu nutzen, indem

CTC und e-CTC durch alkalische Behandlung der Proben in die isomeren Verbindungen überführt

werden.

5.8.1 HPLC-UV-MS/MS-Verfahren

5.8.1.1 Stabilität der Metabolite in Lösung

iso-CTC und e-iso-CTC

Von einigen Autoren wie KENNEDY et al. wird auf die Möglichkeit, iso-CTC einer Epimerisierung zu

unterwerfen, um e-iso-CTC zu erhalten, hingewiesen [143]. Sie nutzten jedoch einen epimerisierten

iso-CTC-Standard nur zur qualitativen Bestimmung. Um darüber hinaus eine Quantifizierung mit ei-

nem solchen Standard durchzuführen, muß die Stabilität der Komponenten bekannt sein. Ziel war es,

das sich unter den gewählten Bedingungen einstellende Gleichgewicht von iso-CTC und e-iso-CTC in

Kalibrierlösung zu ermitteln, um eine möglichst hohe Stabilität zu gewährleisten. Hierzu wurde das

Mischungsverhältnis von iso-CTC und e-iso-CTC bestimmt, bei dem sich keine Konzentrationsände-

rung mehr ergibt. Zur Beurteilung der Stabilität von iso-CTC in Kalibrierlösung wurden die Untersu-

chungergebnisse zum Abbauverhalten von iso-CTC, Kap. 5.6.1, ausgenutzt. Es zeigte sich, daß wäh-

rend der Lagerung einer iso-CTC-Standardlösung in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) (β =

10 mg/L) bei einer Temperatur von 40 °C über einen Zeitraum von 60 h schnell eine Epimerisierung

stattfindet. Nach zwölf Stunden war keine Konzentrationsänderung mehr festzustellen. Weitere Ab-

bauprodukte konnten nicht nachgewiesen werden. Um die Einstellung eines äquimolaren Verhältnisses

von iso-CTC und e-iso-CTC zu beschleunigen, wurde eine iso-CTC-Standardlösung in Me-

OH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) (β = 10 mg/L) bei einer Temperatur von 60 °C über einen

Zeitraum von 60 h gelagert und mittels HPLC-UV in Intervallen von 15 Minuten die Konzentrationen

von iso-CTC und e-iso-CTC ermittelt, siehe Abb. 33. Es zeigte sich, daß bereits nach 90 Minuten ein

äquimolares Verhältnis beider Verbindungen erreicht ist.

Die genaue Konzentrationsbestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC in der epimerisierten iso-CTC-

Standardlösung erfolgte durch Vergleich der frisch angesetzten iso-CTC-Lösung mit der epimerisier-

ten iso-CTC-Lösung über Differenzbildung. Die so erhaltene Mischstandardlösung aus iso-CTC und

e-iso-CTC kann zur Kalibrierung des Verfahrens eingesetzt werden.

5 Ergebnisse und Diskussion

102

Abb. 33: Epimerisierung von iso-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) bei 60 °C als Funktion von

der Zeit (HPLC-UV, 275 nm, β = 10 mg/L)

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Zur Beurteilung der Stabilität von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC wurde anhand der in Kap.

5.6.1 durchgeführten Untersuchungen zum Abbauverhalten von Anhydro-CTC in MeOH/Fließmittel

A (50/50) (v/v) (pH 2,8) (β = 10 mg/L) bei einer Temperatur von 40 °C über einen Zeitraum von 60 h

das sich unter den gewählten Bedingungen einstellende Gleichgewicht abgeschätzt. Bei der Bildung

der Anhydro-Verbindungen aus CTC handelt es sich ebenfalls um irreversible Reaktionen, so daß

neben der entsprechenden Epimerisierung von Anhydro- bzw. e-Anhydro-CTC keine weiteren Reak-

tionen stattfinden. Das Konzentrationsverhältnis von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC, bei dem

sich keine weitere Konzentrationsveränderung mehr ergab, wurde zu 1:1 ermittelt (siehe Abb. A. 13

im Anhang). Die Kalibrierung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC kann also mit Mischstandard-

lösungen aus Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) im Konzentra-

tionsverhältnis 1:1 erfolgen.

5.8.1.2 Kalibrierung

iso-CTC und e-iso-CTC

Nach Ermittlung der Bestimmungsgrenzen, die für iso-CTC und e-iso-CTC mit der UV-Detektion bei

0,05 mg/L und mit der MS/MS-Detektion bei 0,01 mg/L lagen, erfolgte die Erstellung einer Kalibrier-

funktion im Konzentrationsbereich von 0,05 mg/L bis 10 mg/L für die UV-Detektion und 0,01 mg/L

bis 10 mg/L für die MS/MS-Detektion.

Die Kalibrierung des UV-Verfahrens ergibt einen linearen Zusammenhang zwischen der Konzentrati-

on und der Peakfläche sowohl für iso-CTC als auch für e-iso-CTC im gewählten Konzentrationsbe-

reich (s. Abb. A. 11 im Anhang). Die ermittelten Konzentrationen, die Peakflächen, relativen Stan-

dardabweichungen und die Flächenverhältnisse sind in Tab. A. 21 im Anhang dargestellt. Bei der

Kalibrierung des MS/MS-Verfahrens im Konzentrationsbereich von 0,01 mg/L bis 10 mg/L liegt kein

linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche von iso-CTC sowie e-iso-

0123

Zeit [h]

Konzentration [mg/L]

iso-CTC

e-iso-CTC

5 Ergebnisse und Diskussion 103

CTC vor. Der funktionale Zusammenhang wird wie bei der Bestimmung von CTC und e-CTC durch

eine polynomische Funktion 2. Grades beschrieben (s. Abb. A. 12 im Anhang). Die ermittelten Kon-

zentrationen, Peakflächen, relativen Standardabweichungen und Flächenverhältnisse für die MS/MS-

Detektion sind in Tab. A. 22 im Anhang dargestellt. Durch Einschränkung des Arbeitsbereiches und

Aufteilung in drei Teilbereiche (0,01-0,1 mg/L; 0,1-0,5 mg/L und 0,5-10 mg/L) konnte eine Linearität

erreicht werden.

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Die Bestimmungsgrenzen wurden für Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit der UV-Detektion zu

0,025 mg/L und mit der MS/MS-Detektion zu 0,01 mg/L ermittelt. Die Erstellung der Kalibrierfunkti-

on erfolgte mit der UV-Detektion im Konzentrationsbereich von 0,025 mg/L bis 10 mg/L und mit der

MS/MS-Detektion von 0,01 mg/L bis 10 mg/L. Sowohl bei der UV-Detektion als auch bei der

MS/MS-Detektion läßt sich im gewählten Konzentrationsbereich der funktionale Zusammenhang zwi-

schen der Konzentration und der Peakfläche durch einen linearen Zusammenhang beschreiben (Abb.

A. 14 und Abb. A. 15 im Anhang ). Im Gegensatz zu der Quantifizierung von CTC, e-CTC, iso-CTC

und e-iso-CTC läßt sich bei der MS/MS-Detektion keine bessere Anpassung der Kalibriergeraden für

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC durch eine polynomische Funktion erreichen. Trotz des großen

Kalbrierbereiches genügt die Kalibriergerade einer linearen Funktion. Die Konzentrationen, ermittel-

ten Peakflächen und relativen Standardabweichungen sind in Tab. A. 23 im Anhang dargestellt.

5.8.2 Probenvorbereitung

5.8.2.1 Wiederfindung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Ziel war es, die Übertragbarkeit des entwickelten SPE-Verfahrens für CTC und e-CTC auf die Meta-

bolite iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro CTC zu überprüfen. Hierzu wurde 10 mL EDTA-

McIlvain-Puffer, pH 4 mit 2 µg bzw. 20 µg CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC oder e-Anhydro-

CTC dotiert, diese Lösungen mit SPE aufgearbeitet und mit HPLC-UV analysiert. Die mit diesem

Verfahren erzielten Wiederfindungen sind in Tab. 28 zusammengefaßt.

Tab. 28: Wiederfindung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC nach der Aufarbeitung mit

SPE von dotierten EDTA-McIlvain-Puffern (Oasis HLB, McIlvain-Puffer mit 0,1 moL/L

EDTA, 275 nm, n = 6)

dotierte

Substanz

Wiederfindung [%]

Zusatz: 2 µg, VEnd = 200 µL

Wiederfindung [%]

Zusatz: 20 µg, VEnd = 200 µL

iso-CTC e-iso-CTC

Σ iso-CTC e-iso-CTC

iso-CTC 58 44

102 49 48

Anhydro-CTC e-Anhydro-

CTC Σ Anhydro-CTC e-Anhydro-

CTC Σ

Anhydro-

CTC 77 19

96 75 24

e-Anhydro-

CTC Anhydro-CTC Σ e-Anhydro-

CTC Anhydro-CTC Σ

e-Anhydro-

CTC 75 20

95 70 26

Für e-iso-CTC konnten keine Wiederfindungsversuche durchgeführt werden, da diese Substanz kom-

5 Ergebnisse und Diskussion

104

merziell nicht erhältlich ist. Die ermittelten Wiederfindungen belegen, daß während der Arbeitsschritte

zur Festphasenextraktion große Anteile der dotierten Substanz epimerisiert werden. Ein Vergleich der

Epimerisierungsraten von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit denen von CTC und e-CTC, siehe

Tab. 7, zeigt daß Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC in ihrem Epimerisierungsverhalten CTC und e-

CTC sehr ähnlich sind. Die Epimerisierungsrate dieser Verbindungen liegt bei etwa 20 %. Dagegen

epimerisiert iso-CTC mit Epimerisierungsraten von 46 % in deutlich größerem Ausmaß.

Es konnte gezeigt werden, daß unter Berücksichtigung der jeweiligen Epimere mit Wiederfindungen

zwischen 95 % und 102 % eine quantitative Extraktion mit dem SPE-Verfahren für iso-CTC, Anhy-

dro-CTC und e-Anhydro-CTC möglich ist. Zu bemerken ist, daß zur Elution der hydrophoberen Sub-

stanzen Anhydro-CTC und e-Anyhdro-CTC das Elutionsvolumen von 3 mL auf 6 mL erhöht werden

mußte.

5.8.2.2 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung

Analog der für CTC und e-CTC durchgeführten Untersuchungen, wurde überprüft, in welchem Schritt

der Probenvorbereitung eine Epimerisierung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anyhdro-CTC statt-

findet. Hierzu wurden die gleichen Versuche wie für CTC und e-CTC durchgeführt. Es wurden ein-

zelne Schritte der Probenvorbereitung simuliert und in den erhaltenen Proben der Gehalt an zudotierter

Substanz und dem Epimeren ermittelt. Aus den Gehalten wurden die Epimerisierungsraten berechnet,

siehe Tab. 29. Die Ergebnisse dieser Epimerisierungsexperimente führten zu identischen Ergebnissen

wie die Untersuchungen mit CTC und e-CTC.

Es wurde gezeigt, daß eine Epimerisierung besonders durch die Einwirkung des schwach sauren McIl-

vain-Puffers bei der Extraktion aus der Matrix begünstigt wird, wobei die Dauer der Puffer-

Einwirkung eine große Rolle spielt. Das Stehenlassen eines dotierten McIlvain-Puffers über einen

Zeitraum von 2 h führt zu einer Epimerisierung von 30 % für iso-CTC, 12 % für Anhydro-CTC und

14 % für e-Anhydro-CTC (Versuch 1). Bei der Weiterverarbeitung des Eluates kann eine Epimerisie-

rung nur durch Lyophilisierung des Eluates vermieden werden (Versuche 3-5). Einengen im Turbo-

Vap unter erhöhter Temperatur führt für alle Verbindungen (30°C, 40 °C) zu einer erheblichen Epime-

risierung von 6 % bis 8 % für Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC und 19 % bis 24 % für iso-CTC.

Eine Epimerisierung während der Probenvorbereitung kann dadurch minimiert werden kann, indem

die Weiterverarbeitung des Eluates durch Lyophilisierung anstatt durch Einengen im TurboVap erfolgt

(Versuche 6 und 7).

Auch bei diesen Metaboliten kann jedoch eine Epimerisierung während der Probenvorbereitung nicht

vollständig vermieden werden. Dies zeigt, daß auch die iso-CTC- und Anhydro-CTC-Gehalte immer

als Summe aus iso-CTC und Anhydro-CTC und ihrem Epimeren ermittelt werden müssen. Ein Ver-

gleich der Ergebnisse der Epimerisierungsexperimente von CTC, e-CTC, iso-CTC, Anhydro-CTC und

e-Anhydro-CTC belegt, daß CTC, e-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ein ähnliches Epimeri-

sierungsverhalten zeigen. Hingegen epimerisiert iso-CTC deutlich schneller als die anderen Substan-

zen.

5 Ergebnisse und Diskussion 105

Tab. 29: Epimerisierung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC unter verschiedenen simu-

lierten Extraktions- und SPE-Bedingungen (Oasis HLB, 275 nm, n = 4)

Epimerisierung [%]

Simulierter Schritt der

Probenvorbereitung Versuch iso-

CTC

Anhydro-

CTC

e-Anhydro-

CTC

1 Extraktion aus der

Matrix

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 +

20 µg Substanz, 2 h Stehenlassen bei RT 30 12 14

2 SPE

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 +

20 µg Substanz, SPE, Verdünnung des

Eluates mit 3 mL Fließmittel A

24 9 10

3 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen

des Eluates durch Lyophilisierung, Auf-

nahme des Rückstandes in 200 µL Me-

OH/Fließm. A (50/50) (v/v)

∼ 0 ∼ 0 ∼ 0

4 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen

im TurboVap (30 °C) (Dauer: 30 min),

Aufnahme des Rückstandes in 200 µL

MeOH/Fließm. A (50/50) (v/v)

19 7 6

5 Weiterverarbeitung

des Eluates

3 mL MeOH + 2 µg Substanz, Einengen

im TurboVap (40 °C) (Dauer: 20 min),

Aufnahme des Rückstandes in 200 µL

MeOH/Fließm. A (50/50) (v/v)

24 8 8

SPE +

Weiterverarbeitung

des Eluates

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 2

µg Substanz, SPE, Einengen des Eluates

durch Lyophilisierung, Aufnahme des

Rückstandes in 200 µL MeOH/Fließm. A

(50/50) (v/v)

18 6 7

SPE +

Weiterverarbeitung

des Eluates

10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 + 2

µg Substanz, SPE, Einengen des Eluates

im TurboVap (30 °C), Aufnahme des

Rückstandes in 200 µL MeOH/Fließm. A

(50/50) (v/v)

29 16

5.8.2.3 iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter

Ziel der Untersuchung war, die Anzahl der zu quantifizierenden Analyten zu reduzieren, indem CTC

und e-CTC durch alkalische Einwirkung in die entsprechenden Isomere iso-CTC und e-iso-CTC über-

führt werden. Iso-CTC und e-iso-CTC dienen dabei als Summenparameter für die CTC-Komponenten.

Diese Möglichkeit wurde bereits von ZURHELLE et al. vorgeschlagen, die in Hühnereiern neben CTC

und e-CTC auch iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen hatten [178, 229].

Zur Überführung von CTC und e-CTC in die isomeren Verbindungen wurde der Rückstand des einge-

engten Eluates der Festphasenextraktion in methanolischer Natronlauge, Methanol/1%ige NaOH, w/v

(50/50) (v/v, pH 11,5), aufgenommen und mit LC-UV-MS/MS analysiert. In einem ersten Schritt er-

folgte die Überprüfung der Eignung dieses Verfahrens anhand von Standardlösungen, anschließend

die Übertragung auf Muskulatur.

Die Untersuchung von Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC in MeOH/(1%ige NaOH, w/v)

(50/50) (v/v), die sowohl ohne Erwärmung als auch nach 30-minütiger Erwärmung bei Temperaturen

5 Ergebnisse und Diskussion

106

von 60, 70, 80 und 90 °C analysiert wurden, ergab, daß bereits ohne Erwärmen eine 96%ige Isomeri-

sierung stattgefunden hat. Zur vollständigen Isomerisierung von CTC und e-CTC ist eine Erwärmung

von 60 °C über einen Zeitraum von 30 Minuten ausreichend.

Dieses Verfahren kam anschließend für verschiedene Muskulaturproben zur Anwendung, für Proben

einiger Versuchstiere des Haus Düsse-Versuches, nachfolgend als HD-V (Nummer des Tieres) be-

zeichnet, und für das Tier 95 des FAL-Versuches. Im Gegensatz zu den mit Standardlösungen durch-

geführten Versuchen lassen sich CTC und e-CTC in Muskulatur nicht quantitativ in die Isomere über-

führen, siehe Tab. 30. Nach der Alkalibehandlung ist zwar kein CTC und e-CTC mehr nachweisbar,

jedoch werden nur etwa 30 % des CTC-Gehaltes als iso-CTC und e-iso-CTC, wiedergefunden.

Tab. 30: CTC-, e-CTC-, iso-CTC- und e-iso-CTC-Gehalte in Muskulatur nach Aufarbeitung nach dem

Standardverfahren und mit alkalischer Behandlung (LC-MS/MS, n = 2)

CTC-Gehalt [µg/kg]

Probe CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC Σ

HD-V1 5,07 5,34 8,12 10,41 28,94

HD-V3 5,68 5,91 8,50 11,59 31,68

HD-V7 6,78 6,73 10,34 11,51 35,36

HD-V9 12,62 10,21 6,24 7,79 36,86

HD-V12 5,79 4,06 10,10 11,85 31,80

Aufarbeitung

nach dem

Standardverfahren

FAL-Tier 95 90,04 55,04 22,60 15,5 183,18

HD-V1 -- -- 5,67 2,83 8,50

HD-V3 -- -- 8,73 4,55 13,28

HD-V7 -- -- 7,28 3,18 10,46

HD-V9 -- -- 8,69 4,79 13,48

HD-V12 -- -- 6,41 3,43 9,84

Aufarbeitung

mit alkalischer

Behandlung

FAL-Tier 95 -- -- 48,32 18,68 67,00

Prinzipiell scheint die Überführung von CTC und e-CTC mittels Alkalibehandlung in die Isomere

durch Aufnahme des eingeengten Eluates nach der Festphasenextraktion mit MeOH/1%ige NaOH,

w/v (50/50) (v/v) zwar möglich, wie die Versuche mit Standardlösungen gezeigt haben. Es bedarf

jedoch für Muskulatur noch weiterer Optimierungen, auf die in diesem Rahmen verzichtet wurde.

5.8.3 Zusammenfassung

Im Gegensatz zu den meisten in der Literatur beschriebenen Verfahren ermöglicht das erweiterte

HPLC-UV-MS/MS-Verfahren neben CTC und e-CTC auch eine quantitative simultane Bestimmung

von iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC.

Es wurde die Möglichkeit aufgezeigt, das kommerziell nicht erhältliche Umwandlungsprodukt e-iso-

CTC durch Epimerisierung einer iso-CTC-Standardlösung in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH

2,8) zu erhalten, wobei das Konzentrationsverhältnis zur Gewährleistung der Stabilität beider Verbin-

dungen 1:1 betragen sollte. Ebenso können Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC durch Kalibrierung

mit einem Mischstandard in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (pH 2,8) aus beiden Verbindungen im

5 Ergebnisse und Diskussion 107

Konzentrationsverhältnis 1:1 quantifiziert werden. Die Kalibrierung kann mit der UV-Detektion in

einem Konzentrationsbereich von 0,05 mg/L bis 10 mg/L für iso-CTC und e-iso-CTC und 0,025 mg/L

bis 10 mg/L für Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC erfolgen. Die Kalibrierung mit der MS/MS-

Detektion ist im Konzentrationsbereich von 0,01 mg/L bis 10 mg/L für iso-CTC und e-iso-CTC und

0,01 mg/L bis 10 mg/L für Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC möglich. Weitergehende Validierung-

suntersuchungen sowie Langzeitstabilitiätsmessungen stehen noch aus.

Es wurde gezeigt, daß das für CTC und e-CTC entwickelte Extraktionsverfahren auch für die Metabo-

lite iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC anwendbar ist, wobei die Gehalte auch als Summe

von iso-CTC und e-iso-CTC sowie Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ermittelt werden müssen.

Das Ziel, die Substanzen CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC durch alkalische Behandlung als

Summenparameter über iso-CTC und e-iso-CTC zu ermitteln, konnte für Standardlösungen erreicht

werden, für Muskulatur erneut jedoch nicht.

5.9 Anwendung des erweiterten Analysenverfahrens auf Proben der

FAL-Studie

Das erweiterte HPLC-UV-MS/MS-Verfahren, welches sich für die quantitative Bestimmung von CTC,

e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC eignet, wurde auf Proben der FAL-

Studie angewendet. In den Schlachtproben der nach Ablauf der Wartezeit geschlachteten Tiere wurde

der CTC-Total-Gehalt ermittelt sowie anhand eines Tieres eine ausführliche Bilanzierung vorgenom-

men. Darüber hinaus erfolgte die Untersuchung von Knochen mittels Fluoreszenz-Screening-Tests und

eine Überprüfung, ob aus den gebundenen Tetracyclin-Rückständen im Knochen eine Gefährdung für

den Verbraucher resultieren könnte.

5.9.1 Schlachtproben

Die Schlachtproben der Tiere, die bereits auf CTC und e-CTC untersucht wurden, siehe Kap. 5.4.2.3,

wurden nochmals mit dem erweiterten Analysenverfahren auf CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC,

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC (CTC-Total-Gehalt) analysiert. Insbesondere sollte geprüft wer-

den, inwieweit sich die CTC-Gehalte unter Berücksichtigung der weiteren Metabolite erhöhen. In

Tab. 31 sind die mit LC-MS/MS ermittelten Gehalte zusammengefaßt. In Muskulatur, Leber und Nie-

re konnten die Substanzen CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC und in Knochen zusätzlich Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC nachgewiesen werden. Unter Berücksichtigung von iso-CTC und e-iso-

CTC erhöhen sich die Gesamt-CTC-Gehalte zum Teil erheblich. Im Vergleich des CTC-Gehaltes,

ermittelt als Summe von CTC und e-CTC, zum CTC-Totalgehalt ergibt sich für Muskulatur eine pro-

zentuale Erhöhung von durchschnittlich 71 %. Eine Berücksichtigung von iso-CTC und e-iso-CTC

wirkt sich damit für diese Matrix am stärksten aus. Für Leber erhöhen sich die Gesamt-CTC-Gehalte

prozentual durchschnittlich um 38 %, für Niere um 8 % und Knochen um 6 %. Die Abbauprodukte

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC spielen nur eine untergeordnete Rolle, da diese Verbindungen nur

in Knochen nachweisbar sind und nur 0,1 % des Gesamt-CTC-Gehaltes darstellen.

5 Ergebnisse und Diskussion

108

Tab. 31: CTC-, e-CTC-, iso-CTC-, e-iso-CTC-, Anhydro-CTC- und e-Anhydro-CTC-Gehalte in

Schlachtproben (LC-MS/MS, n =2)

Prozentuale Er-

höhung

(Vergleich CTC-

Gehalt und CTC-

Total-Gehalt)

66 %

55 %

7 %

8 %

63 %

32 %

9 %

5 %

72 %

44 %

6 %

4 %

106 %

28 %

7 %

11 %

CTC-Total-

Gehalt

6,8

7,0

20,9

27,9

5,4

10,4

16,7

26,2

5,9

8,7

17,7

22,2

7,8

12,2

24,6

24,3

e-Anhydro-

CTC

0,01

Anhydro-

CTC

0,01

0,02

0,01

e-iso-

CTC

1,1

1,0

0,4

1,0

1,2

0,3

1,2

0,1

1,8

1,2

0,5

iso-CTC

1,6

1,3

1,4

1,5

1,1

1,4

1,1

1,2

1,5

1,0

0,7

2,2

1,5

1,7

1,9

Summe

CTC + e-CTC

4,1

3,2

19,6

25,9

3,3

7,9

15,3

24,8

3,4

6,1

16,6

21,3

3,8

9,5

22,9

21,8

e-CTC

1,5

1,7

10,8

6,4

1,3

1,5

9,1

4,9

1,4

2,9

9,1

3,4

1,5

4,8

12,5

5,5

CTC

2,6

2,5

8,8

19,6

2,0

6,4

6,2

19,8

2,1

3,2

7,5

17,9

2,3

4,7

10,5

16,4

Einheit

µg/kg

mg/kg

µg/kg

mg/kg

µg/kg

mg/kg

µg/kg

mg/kg

Matrix

Muskulatur

Leber

Niere

Knochen

Muskulatur

Leber

Niere

Knochen

Muskulatur

Leber

Niere

Knochen

Muskulatur

Leber

Niere

Knochen

Tier

5 Ergebnisse und Diskussion 109

Die Untersuchung der Schlachtproben zeigt, daß nach Ablauf der Wartezeit von 14 Tagen die CTC-

Total-Gehalte in allen Matrices stark gesunken sind und mit Werten von durchschnittlich 3,65 µg/kg

für Muskulatur, 6,91 µg/kg für Leber und 18,60 µg/kg für Niere lediglich maximal 4 % der MRL-

Werte betragen. Eine Berücksichtigung der isomeren Verbindungen iso-CTC und e-iso-CTC führt

zwar, insbesondere für Muskulatur, zu erheblich höheren Werten von durchschnittlich 6,47 µg/kg für

Muskulatur, 9,45 µg/kg für Leber und 19,98 µg/kg für Niere, die aber immer noch deutlich unterhalb

der MRL-Werte liegen. Dennoch könnte es unter Einbeziehung von iso-CTC und e–iso-CTC, weil

dadurch die Gesamt-CTC-Gehalte bis zu 71 % steigen, deutlich häufiger zu einer Überschreitung der

MRL-Werte kommen.

Ein Vergleich der Verteilung der nachgewiesenen Substanzen bei den einzelnen Tieren zeigt, daß das

Verhältnis der einzelnen Verbindungen zueinander individuell sehr unterschiedlich ist. Die prozentua-

le Erhöhung des CTC-Total-Gehaltes unter Berücksichtigung der Verbindungen iso-CTC, e-iso-CTC,

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC im Vergleich zum CTC-Gehalt, ermittelt als Summe von CTC

und e-CTC, liegt für Muskulatur zwischen 49 % und 106 %, für Leber zwischen 28 % und 55 %, für

Niere zwischen 6 % und 8 % und für Knochen zwischen 3 % und 11 %. Die relative Verteilung der

einzelnen Verbindungen in den unterschiedlichen Matrices bleibt jedoch annähernd konstant. In Mus-

kulatur lassen sich die höchsten Anteile an iso-CTC und e-iso-CTC feststellen, in Leber die zweit-

höchsten, und am niedrigsten sind sie in Niere und Knochen.

5.9.2 Gebundene CTC-Rückstände in Knochen

Tetracycline in Knochen stellen eine Besonderheit dar, weil sie dort gebunden an Matrixbestandteile,

wie z. B. Proteine oder in Form von Calcium-Komplexen vorliegen, was offensichtlich zu einer Ak-

kumulation von Tetracyclinen im Knochen führt [37, 285, 286, 329, 330].

Zum besseren Verständnis wird nachfolgend der Aufbau und die Funktionen von Knochen beschrie-

ben. Der Aufbau des Schweineskeletts ist dem des Menschen sehr ähnlich [331]. Die Knochen des

Schweines bestehen zu 65 % aus anorganischen Bestandteilen und 35 % organischen Bestandteilen.

Die organischen Bestandteile setzen sich wiederum aus 80-95 % Kollagenfasern und 5-20 % Interzel-

lularsubstanz zusammen [332, 333]. Je nach Funktion werden verschiedene Formen von Knochen

unterschieden, wie z. B. lange und kurze Röhrenknochen, platte und breite Knochen, kurze Wurzel-

und unregelmäßige Wirbelknochen [331, 334].

Knochen üben hauptsächlich vier Funktionen aus [334, 335]: Mechanische Stützfunktion des Körpers,

Schutzfunktion für lebenswichtige Körperteile, Blutbildung im Knochenmark, Regulierung des Mine-

ralstoffhaushalts im Körper. Die notwendige Festigkeit gegen Druck, Zug, Biegung und Torsion wird

dem Knochen durch die Einlagerung von anorganischen Calcium-Salzen in Form von Apatit verlie-

hen, wobei es sich hierbei in erster Linie um Hydroxylapatit der Formel Ca10(PO4)6(OH)2 handelt.

Daneben finden sich noch Fluorapatit, Carbonatapatit, Calciumcarbonat und Magnesiumcarbonat. Die

Knochensubstanz in ihrer morphologischen Struktur steht in einem dynamischen Stoffwechselgleich-

gewicht von Synthese und Abbau. Im wachsenden Organismus laufen neben den hormonell gesteuer-

ten Aufbauvorgängen auch Abbauprozesse ab, um eine fortlaufende übermäßige Verdickung der Kno-

chen zu vermeiden. Neben dem Längenwachstum wird das Dickenwachstum, „appositionelles Wach-

stum“, enzymatisch verhindert. Beim adulten Skelett findet nur noch ein hormongesteuertes appositio-

nelles Wachstum statt [332]. Das Knochengewebe stellt aufgrund des hohen Calcium-Gehaltes ein

Speicherorgan dar, aus dem Calcium durch hormonelle Steuerung in das Blut übertreten kann, es fin-

5 Ergebnisse und Diskussion

110

det also eine ständige Regulierung des Blut-Calcium-Spiegels statt, wobei die Knochen je nach Bedarf

Calcium aufnehmen oder abgeben können [336]. Da sowohl Calcium als auch Phosphat, aber auch

andere Ionen wie Magnesium nicht nur wesentliche Bestandteile des Knochens sind, sondern für viele

Funktionsabläufe im Gesamtorganismus eine essentielle Bedeutung haben, sind alle Regulationssy-

steme des Knochenstoffwechsels gleichzeitig eingeschlossen in die Regulation des Gesamtkörpers und

seiner einzelnen Organe und Gewebe. In dieses System ist der Knochen als Mineraldepot einbezogen,

so daß eine Wechselwirkung zwischen den einzelnen Teilkomponenten des gesamten Mineralhaus-

halts besteht [253]. Dies legt die Vermutung nahe, daß mit dem Calcium die als Calcium-Phosphat-

Chelate in Knochen eingelagerten Tetracycline auch aus dem Knochen freigesetzt werden können. Die

Ergebnisse der Medikationsstudie in Haus Düsse unterstützen diese Annahme, da auch drei Monate

nach Absetzen der Medikation in Urin, Plasma sowie in sämtlichen Schlachtproben noch CTC und e-

CTC nachweisbar waren.

Gebundene Tetracyclinrückstände in Knochen wurden bisher als unbedenklich für den Verbraucher

eingestuft, da von einer irreversiblen Tetracyclineinlagerung in Knochen bzw. von einer Zerstörung

der Tetracyclinrückstände bei der Zubereitung durch Braten oder Kochen von knochenhaltigen tieri-

schen Lebensmitteln ausgegangen wurde [48, 87, 337]. Neuere Untersuchungen von KÜHNE et al.

[338] belegen jedoch, daß auch gebundene Tetracyclinrückstände unter bestimmten Bedingungen bio-

verfügbar sein können. Sie wiesen eine in vitro-Freisetzung durch Simulation der Verdauung von te-

tracyclinhaltigen Fleischknochenmehlen nach, indem sie CTC-haltige Hühnerknochen mit 0,3 moL/L

HCl versetzten, die so erhaltenen Proben 30 Minuten schüttelten und den Extrakt chromatographisch

untersuchten. Zum Nachweis einer in vivo-Freisetzung untersuchten KÜHNE et al. Knochen von Hüh-

nern, die CTC-haltiges Knochenmehl mit der Nahrung aufgenommen hatten. Unter den beschriebenen

Versuchsbedingungen wurden offensichtlich Tetracyclin-Calcium-Phosphat-Einlagerungen aufge-

schlossen, da beide Versuche eine saure Behandlung der Knochen beinhalten, entweder in vitro durch

Zugabe von 0,3 moL/L HCl oder in vivo durch die im Magen enthaltene Salzsäure.

Bei der Zubereitung von knochenhaltigen Fleischteilen stellten BRÜGGEMANN et al. [339] fest, daß

nach 60-minütigem Kochen der CTC-Gehalt im Knochen, ermittelt durch die antibiotische Aktivität,

stark abnimmt, wobei sie keine antibiotische Aktivität in den Knochen umgebenden Geweben fest-

stellten. Sie betrachteten daher die gelösten Tetracyclinrückstände als zerstört und damit bedeutungs-

los. KÜHNE et al. [340] zeigten, daß eine Verarbeitung von tetracyclinhaltigen Knochen durch Erhit-

zen nicht zur vollständigen Zerstörung der Tetracycline führt, sondern es zum Abbau der Tetracycline

zu den Anhydroverbindungen kommt, die im Vergleich zur Muttersubstanz zwar eine geringere anti-

biotische Aktivität aufweisen, jedoch eine deutlich höhere Toxizität besitzen.

Die von KÜHNE et al. durchgeführten Untersuchungen zur in vitro- und in vivo-Freisetzung von Te-

tracyclinen aus Knochen beinhalten in jedem Fall eine salzsaure Behandlung der Knochen, wodurch

ein Aufschluß der eingelagerten Tetracyclin-Komplexe erfolgt. Ziel war es daher, zu untersuchen, ob

die mit der Nahrung aufgenommenen und in Knochen eingelagerten Tetracycline auch unter den nicht

sauren Bedingungen im Körper wieder freigesetzt werden können. Der Nachweis einer in vivo-

Freisetzung ist dabei nicht möglich, da den Tieren das Arzneimittel in irgendeiner Form verabreicht

werden muß und damit nicht gewährleistet werden kann, daß die im Gewebe nachweisbaren Rück-

stände tatsächlich aus einer Freisetzung aus dem Knochen stammen. Der Nachweis einer Freisetzung

kann daher nur unter in vitro-Bedingungen anhand von Modellansätzen erfolgen.

5 Ergebnisse und Diskussion 111

5.9.2.1 Freisetzung von CTC aus Knochen

Zur Simulation des physiologischen Effektes einer Freisetzung von CTC aus Knochen in Blut wurde

ein Modell auf der Grundlage der Eluierbarkeit durch Plasma entwickelt.

Hierzu wurde CTC-haltiges gemahlenes Knochenmaterial mit unbelastetem Plasma versetzt und über

einen Zeitraum von neun Tagen aufbewahrt. An den Versuchtagen 1, 2, 3, 4, 5, 8 und 9 wurden diese

„Knochen-Plasma-Gemische“ beprobt und mit LC-MS/MS analysiert. Dieser Versuch wurde zur

Überprüfung eines Temperatureinflusses bei zwei verschiedenen Temperaturen durchgeführt, zum

einen bei 5 °C und zum anderen unter annähernd physiologischen Bedingungen bei 39,5 °C, entspre-

chend der mittleren Körpertemperatur von Schweinen [341]. Zur Beurteilung der Stabilität von CTC

unter diesen Versuchsbedingungen erfolgte die Durchführung des Versuches mit CTC-dotiertem unbe-

lasteten Plasma ohne Knochenmaterial. Das für diese Versuche eingesetzte Plasma wurde aus Voll-

blut, dem zur Gerinnungshemmung Li-Heparin zugesetzt wurde, gewonnen. Das für die sonstige

Plasmagewinnung eingesetzte Antikoagulantium EDTA war für diese Untersuchung ungeeignet, da es

als starker Chelatbildner die im Knochen als Komplex eingelagerten Tetracycline wieder herauslösen

könnte. Als Knochenmaterial diente die Knochenprobe des Tieres 95 aus der Medikationsstudie FAL,

da in dieser Probe die höchsten CTC-Gesamt-Gehalte von 54,27 mg/kg ermittelt wurden (Tab. 32).

Tab. 32: Gehalte [mg/kg] von CTC-Komponenten in Knochen des Tieres 95 (FAL, LC-MS/MS, n = 2)

CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC

Anhydro-

CTC

e-Anhydro-

CTC

Summe der CTC-

Komponenten

43,6 9,2 1,2 0,2 0,03 0,03 54,27

Die im Rahmen der Stabilitätsuntersuchungen erhaltenen Konzentrationsverläufe der Tetracycline in

den dotierten Plasmaproben sind in Abb. 34 dargestellt.

Abb. 34: Konzentrationsverlauf der CTC-Komponenten in dotierten Plasmaproben als Funktion der

Zeit und Temperatur (LC-MS/MS, n = 2)

1234589

Versuchstag

Konzentration im Plasma [µg/mL]

e-iso-CTC

iso-CTC

e-CTC

CTC

1234589

Versuchstag

Konzentration im Plasma [µg/mL]

5 °C 39,5 °C

a) b)

5 Ergebnisse und Diskussion

112

Am ersten Versuchtag konnten bezogen auf die Summe von CTC und e-CTC bei einer Lagertempera-

tur von 5 °C Gehalte von 4,51 µg/mL und bei 39,5 °C 4,38 µg/mL ermittelt werden. Unter Berück-

sichtigung der Wiederholpräzision von 16,8 % bezogen auf eine Methodenpräzision für die Bestim-

mung von CTC und e-CTC in Plasma von 6 % ist CTC, ermittelt als Summe von CTC und e-CTC, bei

einer Temperatur von 5 °C nur zwei Tage, bei 39,5 °C nur einen Tag stabil. Ursache hierfür ist die

rasche Isomerisierung von CTC und e-CTC zum iso-CTC und e-iso-CTC, wobei erwartungsgemäß bei

einer Lagertemperatur von 39,5 °C die Geschwindigkeit der Reaktion deutlich höher ist als bei 5 °C.

Die iso-CTC- und e-iso-CTC-Gehalte resultieren überwiegend aus der Umwandlung im Plasma, da

eine Isomerisierung während der Probenvorbereitung weitestgehend ausgeschlossen werden kann.

Bereits am ersten Versuchstag konnten in den Plasmaproben iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen

werden. Bei einer Temperatur von 39,5 °C ließen sich schon am zweiten Versuchstag überwiegend nur

noch iso-CTC und e-iso-CTC nachweisen. Bis zum Ende des Versuches hatte schließlich eine fast

vollständige Umwandlung in die isomeren Verbindungen stattgefunden. Bezogen auf die Summe aller

CTC-Komponenten konnten am ersten Versuchtag etwa 5 µg/mL festgestellt werden. Unter Berück-

sichtigung von iso-CTC und e-iso-CTC ist CTC über einen Zeitraum von fünf Tagen bei beiden La-

gertemperaturen mit Gesamtgehalten von 4,98 µg/mL (5 °C) und 5,53 µg/mL (39,5 °C) stabil. Am

achten Versuchstag konnte mit einer CTC-Gesamtkonzentration von 4,01 µg/mL (5 °C) und 3,48

µg/mL (39,5 °C) eine signifikante Konzentrationsabnahme festgestellt werden (Abb. 34 a und b).

Die in den Plasmaproben der „Knochen-Plasma-Gemische“ ermittelten CTC-Gehalte sind in Abb.

35 dargestellt.

Abb. 35: Konzentrationsverlauf der CTC-Komponenten in Plasma der „Knochen-Plasma-Gemische“

als Funktion der Zeit und Temperatur (LC-MS/MS, n = 2)

Bereits am ersten Versuchstag konnten im Plasma CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC nachgewie-

sen werden. Aus dem Gesamt-CTC-Gehalt in Knochen von 54,27 µg/kg, siehe Tab. 32, ergibt sich bei

vollständiger Elution eine maximal zu erwartende CTC-Konzentration von 32,56 µg/ml in Plasma. Mit

Gesamtgehalten von etwa 35 ng/mL wurden am ersten Versuchstag 0,1 % der CTC-Komponenten aus

dem Knochen freigesetzt. Die freigesetzte Gesamtmenge steigt über den Versuchszeitraum kontinuier-

lich an, obwohl nach den Stabilitätsuntersuchungen CTC in Plasma unter diesen Bedingungen nur

100

120

1234589

Versuchstag

Konzentration im Plasma [ng/mL]

100

120

1234589

Versuchstag

Konzentration im Plasma [ng/mL]

e-iso-CTC

iso-CTC

e-CTC

CTC

5 °C 39,5 °C

a) b)

5 Ergebnisse und Diskussion 113

über einen Zeitraum von fünf Tagen stabil ist und nach diesem Zeitraum mit einem Abbau von CTC

zu rechnen wäre. Es spielen also zwei gegenläufige Prozesse, zum einen das Herauslösen von CTC aus

dem Knochen und zum anderen der Abbau von CTC eine Rolle. Am letzten Versuchstag wurden mit

Konzentrationen von 101 ng/mL (5 °C) und 120 ng/mL (39,5 °C) 0,4 % (5 °C) und 0,4 % (39,5 °C)

der im Knochen gespeicherten Substanzen freigesetzt (Abb. 35 a und b). Ein Temperatureinfluß auf

die Freisetzung der im Knochen enthaltenen Tetracycline war also gering. Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC konnte in keiner der Plasmaproben festgestellt werden. Die in diesem Versuch ermittel-

ten freigesetzten CTC-Gehalte lagen mit duchschnittlich 0,4 % deutlich unterhalb der Werte, die

KÜHNE et al. [340] bei ihren in vitro-Versuchen ermittelt haben. So eluierte 0,3 moL/L HCl aus Kno-

chen mit einem CTC-Gehalt von 41,80 mg/kg 35,3 % aus dem Knochen, wobei sie den CTC-Gehalt

als Summe von CTC und e-CTC ermittelten.

Über die von KÜHNE et al. gewonnenen Erkenntnisse hinaus konnte durch die eigenen Untersuchun-

gen belegt werden, daß auch unter nicht sauren Bedingungen eine Freisetzung aus dem Knochen in

vitro möglich ist, wenn auch nur mit einem vergleichsweise geringen Freisetzungsgrad von 0,5 % bei

ähnlichen CTC-Gehalten in Knochen. Diese Versuche erlauben jedoch keine Aussage darüber, ob die

im Plasma der „Knochen-Plasma-Gemische“ nachgewiesenen CTC-Komponenten aus einer Freiset-

zung aus dem Knochen resultieren oder auf einer Metabolisierung bei der Lagerung der „Knochen-

Plasma-Gemische“ und Aufarbeitung der Plasmaproben beruhen. Aufgrund der Produktverteilung im

Knochen, siehe Tab. 32, und der Stabilitätsuntersuchungen von CTC in Plasma ist es aber wahr-

scheinlich, daß überwiegend CTC aus dem Knochen freigesetzt wurde, welches anschließend im

Plasma isomeriserte und während der Probenvorbereitung epimerisierte.

Zusammenfassend konnte mit den durchgeführten Versuchen anhand des Modellansatzes eine in vitro-

Freisetzung von CTC und/oder den Umwandlungsprodukten e-CTC und iso-CTC aus dem Knochen

auch unter nicht sauren Bedingungen nachgewiesen werden. Dies gibt deutliche Hinweise darauf, daß

eine Freisetzung von CTC auch in vivo stattfinden kann. Dies bedeutet, daß durch den intensiven Ein-

satz von Tetracyclinen in der Schweinemast auch bei bestimmungsgemäßer Anwendung mit einem

Eintrag in die Nahrungskette zu rechnen ist. Auch nach einer Medikation ist eine Kontamination von

zur Lebensmittelgewinnung dienenden Matrices wie Muskulatur, Leber und Niere in vivo möglich.

Möglicherweise kann auch bei der Schlachtung, also der Zerteilung von Schweinen, sowie bei der

Aufbewahrung von Fleisch, welches nicht vom Knochen abgetrennt wird, wie Koteletts etc., CTC

freigesetzt werden und in andere Matrices übergehen. Damit ist durch Tetracyclinrückstände in Kno-

chen auch mit einer Kontamination von knochenhaltigen Lebensmitteln zu rechnen. Insbesondere ist

die Verwendung von Separatorenfleisch unter diesen Aspekten als bedenklich einzustufen, da dieses

Fleisch geringe Tetracyclingehalte aufweisen kann und damit durch eine subtherapeutische Aufnahme

beim Menschen zu einer Resistenzausbildung führen könnte. Bei der Verarbeitung von knochenhalti-

gen Lebensmitteln spielen neben CTC vor allem auch die Bildung von Metaboliten eine Rolle.

Bei der Verarbeitung von knochenhaltigen Lebensmitteln reicht eine Erhitzung auch über 100 °C nicht

aus, um sämtliche Tetracyclinrückstände zu zerstören, sondern führt, wie bereits am Anfang des Kapi-

tels erwähnt, zur Bildung der im Vergleich zu den Muttersubstanzen toxischeren und stärker resistenz-

fördernden Anhydroverbindungen. Darüber hinaus werden zunehmend auch sogenannten Sekundär-

kreisläufen Beachtung geschenkt. Von KÜHNE et al. [342] wird darauf hingewiesen, daß nach der

Fleischgewinnung eine Weiterverarbeitung der Knochen zu Fleischknochenmehl erfolgt, welches zu-

nehmend auch Verwendung als Düngemittel für landwirtschaftlich genutzte Flächen findet. Hieraus

5 Ergebnisse und Diskussion

114

resuliert ein indirekter Eintrag in die Nahrungskette.

5.9.2.2 Fluoreszenz-Screening-Test

Neben der quantitativen chromatographischen Bestimmung der Tetracycline in Knochen, kann auch

als Screening-Test die Fluoreszenz der Komplexe herangezogen werden. Die in Knochen eingelager-

ten Tetracycline zeigen bei Bestrahlung mit einer UV-Lampe bei einer Wellenlänge von 366 nm eine

gelbe Fluoreszenz, siehe Abb. 36, was dem qualitativen Nachweis der Tetracycline in Knochen dienen

kann. Dies stellt eine einfache Methode dar, um festzustellen, ob eine Behandlung der Tiere stattge-

funden hat. In der Vergangenheit wurden zahlreiche Untersuchungen durchgeführt, um einen Zusam-

menhang zwischen der Fluoreszenzstärke und dem Tetracyclingehalt herzustellen [285, 343, 344]. In

neuerer Zeit gab es zunehmend Bestrebungen, über diesen qualtitativen Nachweis hinaus, die Fluores-

zenz der Knochen für eine semiquantitative Bestimmung mittels Fluoreszenzspektroskopie zu nutzen

[345]. Die Schwierigkeit einer (semi)-quantitativen Bestimmung der Fluoreszenz liegt vor allem in der

intrinsischen Fluoreszenz durch endogene Fluorphore in biologischen Matrices begründet, die zu Ü-

berlagerungen im Gesamtspektrum führt. So wird durch das im Knochen enthaltene Kollagen eine

bläuliche Fluoreszenz hervorgerufen [346].

Aufgrund der Komplexizität einer semiquantitativen Bestimmung von Tetracyclinen in Knochen sollte

im Rahmen dieser Arbeit nur eine qualitative Fluoreszenzuntersuchung der während der Medikations-

studien entnommenen Knochenproben durch Bestrahlung mit einer UV-Lampe und eine einfache vi-

suelle Beurteilung der Fluoreszenzstärke und ein Vergleich dieser Befunde mit den Ergebnissen der

LC-MS/MS-Untersuchung erfolgen. Eine Beurteilung der Fluoreszenzstärke und der Tetracyclingehal-

te wird vor allem auch dadurch erschwert, daß häufig mehrere Tetracyclin-Derivate gleichzeitig einge-

setzt werden und damit ein Vergleich nicht mehr möglich ist. Daher eignen sich die Proben der Medi-

kationsstudien besonders gut für diesen Vergleich, da sichergestellt werden kann, daß nur CTC zum

Einsatz kam.

Die zu untersuchenden Knochen wurden in Scheiben geschnitten, von Fleischresten befreit und an-

schließend mit einer UV-Lampe bei 366 nm bestrahlt. Die durchgeführten Untersuchungen haben

gezeigt, daß die Knochen der Tiere der FAL-Studie mit Gehalten zwischen 21,3 mg/kg und 54,3

mg/kg am stärksten fluoreszierten. Die Knochenproben der Versuchstiere der Haus Düsse Studie wie-

sen CTC-Gehalte zwischen 3,9 mg/kg und 21,2 mg/kg auf. Anhand der Knochenproben der Haus

Düsse Studie, deren CTC-Gehalte zwischen 3,9 mg/kg und 21,2 mg/kg lagen, konnte belegt werden,

daß mit steigendem CTC-Gehalt auch die Fluoreszenz sichtbar zunimmt. Die Untersuchung der Kno-

chenproben der Kontrolltiere mit dem Fluoreszenz-Screening-Test ergab ausschließlich negative Be-

funde. Obwohl keine Fluoreszenz sichtbar war, konnten mit LC-MS/MS CTC-Gehalte im Bereich von

163 µg/kg bis 219 µg/kg nachgewiesen werden. Diese Befunde entsprechen denen von KÜHNE et al.,

die ebenfalls in nicht fluoreszierenden Knochen mittels HPLC-UV Tetracyclin-Gehalte fanden [285].

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß der Fluoreszenz-Screening-Test als einfache und schnelle

Methode zum Nachweis einer Tetracyclinbehandlung dienen kann, wobei jedoch Knochen auch ohne

sichtbare Fluoreszenz Tetracycline in geringen Mengen enthalten können.

5.9.2.3 Applikation von CTC und Ablagerungsmuster in Knochen

In der Literatur wird beschrieben, daß über den qualitativen Nachweis von Tetracyclinen hinaus mit

5 Ergebnisse und Diskussion 115

dem Fluoreszenz-Screening-Test anhand des Ablagerungsmusters von Tetracyclinen in Knochen auch

eine Beurteilung des Applikationszeitpunktes möglich sei [339, 343, 344]. Einen großen Einfluß auf

die Menge der eingelagerten Tetracycline hat der Zeitpunkt der Verabreicherung in Bezug auf das

Stadium des Knochenwachstums. Junge Tiere, die sich zum Zeitpunkt der Tetracyclinverabreicherung

im Stadium der Knochenmineralisierung befinden, lagern eine größere Menge des Wirkstoffes im

Knochen ein als ältere Tiere [339]. Hat die letzte Applikation von Tetracyclinen erst kurz vor der

Schlachtung stattgefunden, so zeigt sich eine zunehmende Fluoreszenz auf der Knochenoberfläche.

Eine innere Ringbildung weist dagegen auf eine frühere Behandlung hin. Eigene Untersuchungen

ergaben adäquate Befunde. In Abb. 36 sind Knochenproben der Medikationsstudien bei UV-

Bestrahlung dargestellt.

Abb. 36: Fluoreszenz von Knochenproben bei UV-Bestrahlung (366 nm) (links: Kontrolltier 4 aus

Haus Düsse, Mitte: Versuchstier 7 aus Haus Düsse, rechts: Tier 95 aus der FAL)

Die linke Knochenprobe stammt von einem Kontrolltier aus der Haus Düsse-Studie und zeigte wie

auch alle anderen Kontrollproben keine gelbe Fluoreszenz. Erkennbar ist die durch Kollagen hervor-

gerufene bläuliche Fluoreszenz. Die mittlere Knochenprobe stammt von einem Versuchstier der Haus

Düsse-Studie, bei der Schweine mit CTC medikamentiert und drei Monate später geschlachtet wurden.

Diese Knochenproben zeigten eine innere fluoreszierende Schicht, an der sich nach außen aufgrund

des weiteren Wachstums eine nicht fluoreszierende Schicht anschließt. Die rechte Knochenprobe des

Tieres 95 stammt aus der FAL-Studie. Da dieses Tier bis zur Schlachtung mit CTC medikamentiert

wurde, zeigte sich im gesamten Knochengewebe, insbesondere auf der Knochenaußenseite, eine starke

Fluoreszenz. Vier Tiere der FAL-Studie wurden nach Ablauf der Wartezeit von zwei Wochen ge-

schlachtet. Die Knochenproben dieser Tiere zeigten ebenfalls eine vollständige Fluoreszenz im gesam-

ten Knochen, wobei die Knochenprobe des Tieres 95 stärker fluoreszierte als die der anderen Tiere.

Die durchgeführten Untersuchungen bestätigen, daß das Ablagerungsmuster von Tetracyclinen Rück-

schlüsse auf den Zeitpunkt der letzten Wirkstoffapplikation erlaubt. Eine fluoreszierende Knochenau-

ßenseite deuten auf eine erst kurz vor der Schlachtung stattgefundene Medikation hin, während eine

innere Ringbildung auf eine frühere Behandlung hinweist. Das Ablagerungsmuster kann jedoch nicht

zur Überprüfung der Einhaltung von Wartezeiten herangezogen werden, da auch die Knochenproben

der Tiere, die nach Ablauf der Wartezeit geschlachtet wurden, eine Fluoreszenz im gesamten Knochen

aufwiesen.

5 Ergebnisse und Diskussion

116

5.9.3 Bilanzierungsstudie von Tier 95

Ziel dieser Studie war es, exemplarisch anhand der Proben des Tieres 95, das direkt nach Medikation-

sende geschlachtet wurde, eine Bilanzierung vorzunehmen. Der CTC-Gehalt sollte hierbei über die in

Kap. 5.4 durchgeführten Untersuchungen hinaus nicht nur als Summe von CTC und e-CTC, sondern

als Total-Gehalt aus CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC ermittelt

werden. Diese Ergebnisse sollten dazu dienen, den Eintrag von CTC sowie insbesondere auch der

Metabolite in die Nahrungskette nach praxisüblicher Medikation von Schweinen in der Masttierhal-

tung bessser beurteilen zu können. Neben der Untersuchung der Produktverteilung in den einzelnen

Matrices sollte überprüft werden, ob möglicherweise noch weitere Metabolite eine Rolle spielen.

Das Tier 95 wurde drei Stunden nach der letzten Antibiotikafütterung zur Erreichung einer maximalen

Plasmakonzentration geschlachtet, da nach dieser Zeit die maximalen Plasmaspiegel erreicht werden,

siehe Kap. 3.3. Weil damit die gesetzlich vorgeschriebene Wartezeit von vierzehn Tagen nicht ein-

gehalten wurde, konnte dieses Tier nicht der Lebensmittelgewinnung dienen, so daß diese Studie als

anzeigepflichtiger Tierversuch durchgeführt wurde. Aus tierschutzrechtlichen Gründen blieb diese

Bilanzierungsstudie auf ein Tier beschränkt. Eine statistische Absicherung der Daten kann daher nicht

gewährleistet werden.

5.9.3.1 Urin und Faeces

Die in Urin ermittelten Ausscheidungsmengen während den beiden Medikationsphasen sind in Abb.

37 dargestellt (Einzeldaten siehe Tab. A. 9 im Anhang).

Abb. 37: Ausscheidungsmenge von CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC in Urin von Tier 95

(LC-MS/MS, n =2)

In den Urinproben konnten CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC sowie in Spuren keto-e-CTC nachge-

wiesen werden. Die Abbauprodukte Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC traten dagegen nicht auf. Die

Ausscheidungsmengen von iso-CTC und e-iso-CTC überschreiten mit Werten von maximal 23,51 mg

und 32,21 mg dabei weit die Ausscheidungsmengen von CTC und e-CTC mit Maximalwerten von

14,05 mg und 9,63 mg. Werden die Ausscheidungsmengen der einzelnen Verbindungen betrachtet, so

01234567891022232425262728293031Tag

Ausscheidungsmenge [mg]

e-iso-CTC

iso-CTC

e-CTC

CTC

2. Medikationsphase1. Medikationsphase

5 Ergebnisse und Diskussion 117

wird ersichtlich, daß sich das Produktverhältnis während der Medikationsphasen verändert. In Bezug

auf die jeweiligen Epimerenpaare zeigte sich in beiden Medikationsphasen, daß mit steigenden Ge-

samt-CTC-Ausscheidungsmengen zunächst die prozentualen Anteile von CTC/e-CTC (Summe beider

Verbindungen) an der Gesamt-CTC-Ausscheidungsmenge von etwa 30 % am ersten Medikationstag

auf etwa 45 % nach fünf Medikationstagen steigt. Mit weitergehender Medikation nimmt der relative

Anteil von CTC/e-CTC bis auf etwa 15 % stark ab und der Anteil von iso-CTC/e-iso-CTC bis auf

etwa 85 % am jeweils letzten Medikationstag stark zu. Nach der Medikationspause von elf Tagen ist

die Ausscheidungsmenge mit einem Wert von 17 mg immer noch verhältnismäßig hoch, wobei CTC,

e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC nachgewiesen werden konnten.

Die in Kap. Kap. 5.4.2.1 festgestellten Maxima im Kurvenverlauf des CTC-Gehaltes, ermittelt als

Summe von CTC und e-CTC, siehe auch

Abb. 27, lassen sich unter Einbeziehung von iso-CTC und e-iso-CTC nicht mehr erkennen. Die in

Kap. 5.4.2.1 beschriebenen vermeintlichen Maxima resultieren demzufolge aus einer zunehmenden

Isomerisierung von CTC und e-CTC während der Medikation. Ein Vergleich der Gesamt-

Ausscheidungsmenge, ermittelt als CTC-Total-Gehalt, und der Ausscheidungsmenge, bestimmt als

Summe von CTC und e-CTC, zeigt, daß sich die Ausscheidungsmengen unter Berücksichtigung der

isomeren Verbindungen erheblich erhöhen. Während die durchschnittlichen Maximalwerte in Kap.

5.4.2.1 zu 28 mg ermittelt wurden, beträgt die maximale Ausscheidungsmenge unter Berücksichtigung

der Metabolite 67 mg.

Die in Faeces ermittelten Ausscheidungsmengen der CTC-Komponenten sind in Abb. 38 dargestellt

(Einzeldaten siehe Tab. A. 10 im Anhang).

Abb. 38: Ausscheidungsmenge von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC in Faeces von Tier 95 (LC-MS/MS, n =2)

In Faeces konnten hauptsächlich CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, in geringen Mengen Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC sowie in Spuren keto-e-CTC nachgewiesen werden. Die prozentualen An-

teile der Verbindungen CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC am Total-Gehalt stellen sich in Faeces

völlig anders dar als in Urin. Während Urin bis zu 90 % iso-CTC und e-iso-CTC enthält, lassen sich in

200

400

600

800

1000

1200

1400

01234567891022232425262728293031Tag

Ausscheidungsmenge [mg]

e-Anhydro-CTC

Anhydro-CTC

e-iso-CTC

iso-CTC

e-CTC

CTC

2. Medikationsphase1. Medikationsphase

5 Ergebnisse und Diskussion

118

Faeces maximal 22 % dieser Isomere nachweisen. Der erheblich geringere relative Gehalt an iso-CTC

und e-iso-CTC ist sicherlich darauf zurückzuführen, daß die in Faeces enthaltenen CTC-Gehalte größ-

tenteils aus dem nicht resorbierten Anteil stammen und damit stoffwechselbedingte Umwandlungen

keine so erhebliche Rolle spielen.

Am ersten Versuchstag sind die CTC-Ausscheidungsmengen noch gering und betragen nur 1,2 mg

CTC und 0,35 mg e-CTC. Weitere Produkte waren an diesem Versuchstag nicht feststellbar. In beiden

Medikationsphasen steigt die Gesamt-CTC-Ausscheidungsmenge innerhalb der ersten drei Medikati-

onstage zunächst an und bleibt dann annähernd konstant. Nach der Medikationspause von elf Tagen ist

die Ausscheidungsmenge stark auf 1,75 mg gesunken und es konnten nur noch CTC, e-CTC und iso-

CTC nachgewiesen werden. Innerhalb der ersten drei Medikationstage verschiebt sich die Produktver-

teilung der einzelnen CTC-Komponenten in Richtung der isomeren Verbindungen und bleibt an-

schließend mit gleichbleibenden Gesamtausscheidungsmengen ebenfalls konstant. Die relativen Antei-

le der CTC-Komponenten an der Gesamtausscheidungsmenge betragen dann etwa 55 % für CTC, 25

% für e-CTC, 10 % für iso-CTC, 8 % für e-iso-CTC, 1 % für Anhydro- und 1 % für e-Anhydro-CTC.

Das hier festgestellte Ausscheidungsprofil, ermittelt als CTC-Total-Gehalt, entspricht dem in Kap

5.4.2.1 als Summe von CTC und e-CTC ermittelten Ausscheidungsverhalten. Lediglich die Maximal-

ausscheidungsmengen sind unter Berücksichtigung der Metabolite mit Werten von 1273 mg (CTC-

Totalgehalt) größer als die in Kap 5.4.2.1 festgestellten maximalen Ausscheidungsmengen von durch-

schnittlich 983 mg.

Insgesamt zeigen die durchgeführten Urin- und Faecesuntersuchungen, daß unter Berücksichtigung

der weiteren Metabolite deutlich höhere Ausscheidungsmengen gefunden werden.

5.9.3.2 Schlachtproben

Die in den Schlachtproben ermittelten Gehalte sind in Tab. 33 aufgeführt. In Muskulatur und Leber

lassen sich neben CTC und e-CTC die Metabolite iso-CTC und e-iso-CTC nachweisen, in Niere nur

iso-CTC. In Knochen konnte zusätzlich zu CTC, e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC auch geringfügig die

Dehydratationsprodukte Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC festgestellt werden. Eine Berücksichti-

gung der Metabolite führt zu einer prozentualen Erhöhung des CTC-Gehaltes um 49 % für Muskula-

tur, 30 % für Leber, 8 % für Niere und 3 % für Knochen im Vergleich zum CTC-Gehalt, ermittelt als

Summe von CTC und e-CTC.

Tab. 33: CTC-, e-CTC-, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC-Gehalte in den

Schlacht- und Knochenproben von Tier 95 (LC-MS/MS, n =2)

Matrix Einheit CTC e-

CTC

∑ CTC+

e-CTC

iso-

CTC

e-iso-

CTC

Anhydro-

CTC

e-Anhydro-

CTC

∑total

CTC

Muskulatur µg/kg 98,0 43,1 141,1 39,7 29,6 nn nn 210,4

Leber µg/kg 210,4 90,5 301,0 53,9 37,3 nn nn 392,2

Niere µg/kg 314,2 294,8 609,0 50,0 nn nn nn 659,0

Knochen mg/kg 43,6 9,2 52,8 1,2 0,2 0,03 0,03 54,3

Die CTC-Gehalte, ermittelt als Summe von CTC und e-CTC, liegen in Höhe der MRL-Werte bzw.

überschreiten diese geringfügig. Eine Berücksichtigung der isomeren Verbindungen führt zu einer

5 Ergebnisse und Diskussion 119

deutlichen Überschreitung der MRL-Werte. Ein Vergleich des Knochengehaltes dieses Tieres mit

denen in den anderen Tieren der FAL-Studie, die vierzehn Tage später geschlachtet wurden, siehe

Tab. 31, zeigt, daß die CTC-Gehalte im Knochen des Tieres 95 deutlich größer sind als in den anderen

Knochenproben. Dies gibt Hinweise darauf, daß nach Medikationsende nicht die vollständige Menge

des adsorbierten CTC im Knochen verbleibt, sondern durch Diffusion an das Blut abgegeben wird.

Auf eine derartige Freisetzung von CTC aus dem Knochen weisen BRÜGGEMANN et al. in verschie-

denen Studien hin [319, 339, 347].

5.9.3.3 Bilanzierung

Wie bereits in Kap. 5.4.2.1 erwähnt, existieren eine Reihe von pharmakokinetischen Studien [42, 67,

68, 70, 74, 315, 316], basierend auf mikrobiologischen Bestimmungsmethoden sowie der Radioaktivi-

tätsmessung nach Verabreicherung von C14-markierten Tetracyclinen. Mit erstgenannter Methode

lassen sich die applizierten Wirkstoffe nur unzureichend wiederfinden, da die entstehenden Metabolite

nur eine geringe oder gar keine antibiotische Aktivität aufweisen. Mit der Radioaktivitätsmessung

wird die zugeführte Wirkstoffmenge zwar quantitativ erfaßt, wobei mit dieser Methode keine Aussage

über die Struktur entstandener Metabolite möglich ist. Es werden vielmehr auch undefinierbare

„Bruchstücke“ des Antibiotikums erfaßt. Daher sollte mit dem entwickelten LC-MS/MS-Verfahren

anhand eines Tieres eine ausführliche Bilanzierung, die auch die quantitative Bestimmung der Meta-

bolite umfaßt, erfolgen. Eine Bestimmung mit HPLC-UV ist nicht möglich, da ihr Absorptionsmaxi-

mum von 275 nm in Realproben durch Begleitkomponenten gestört wird.

Es lassen sich mit den in Kap. 5.9.3.1 aufgeführten Ausscheidungsmengen an CTC, e-CTC, iso-CTC,

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC die insgesamt während beider Mediaktionsphasen ausgeschiede-

nen Mengen an CTC und Metaboliten berechnen, siehe Tab. 34.

Tab. 34: Bilanzierung über die zugeführte CTC-Wirkstoffmenge und ausgeschiedene Menge als CTC

oder Metabolite bei Tier 95

Applizierte CTC-

Menge 17,6 g

CTC e-CTC

iso-

CTC

e-iso-

CTC

Anhydro-

CTC

e-Anhydro-

CTC

∑total

CTC

Urin 0,14 0,09 0,27 0,32 nn nn 0,82

Ausscheidungsmenge

[g]

Faces 8,3 4,0 1,6 1,4 0,07 0,1

15,5

∑ (Urin+Faeces) 16,32 g ≜93 %

Tier 95 hat über den gesamten Medikationszeitraum von der aufgenommenen CTC-Menge von 17,6 g

über Urin 0,82 g und über Faeces 15,5 g in Form der oben aufgeführten Verbindungen wieder ausge-

schieden hat. Insgesamt wurden 93 % der applizierten CTC-Wirkstoffmenge bereits während der Me-

dikation über Urin und Faeces wieder ausgeschieden.

Zur Beurteilung der im Tierkörper verbleibenden Arzneimittelmenge können die in Kap. 5.9.1 ermit-

telten Gehalte in den Schlacht- und Knochenproben herangezogen werden. Darüber hinaus wurde der

5 Ergebnisse und Diskussion

120

Gehalt der einzelnen Verbindungen im Plasma der am Schlachttag entnommenen Blutprobe dieses

Tieres bestimmt. Das Plasma enthielt 38,2 µg/L CTC, 15 µg/L e-CTC, 40,8 µg/L iso-CTC und 33,1

µg/L e-iso-CTC. Als Zusammensetzung der Schweine wurden statistische Auswertungen umfangrei-

cher Versuche an der Bundesforschungsanstalt Braunschweig-Völkenrode zugrunde gelegt. Hiernach

bestehen die im Versuch eingesetzten Kastraten aus 71,2 % Fleisch und Fett, 10,5 % Magen, Darm,

Lunge, Leber und Niere, 8,7 % Knochen und 3,5 % Blut [348]. Da zur Analyse kein Vollblut, sondern

Plasma eingesetzt wurde, erfolgte zunächst die Bestimmung des Hämatokrit-Wertes von 0,5 in Anleh-

nung an die Zentrifugationsmethode [253]. Als Blutdichte wurde hierbei näherungsweise ein Wert von

1 g/mL angenommen [253]. Mit den so ermittelten Daten läßt sich in Form einer Hochrechnung eine

Bilanzierung vornehmen, siehe Abb. 39.

Von der als CTC aufgenommenen Arzneimittelmenge von 17,6 g wurden 16,3 g, also 93 %, über Urin

und Faeces als CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC oder e-Anhydro-CTC wieder ausge-

schieden, wobei hauptsächlich die Ausscheidung über Faeces zu 88 % erfolgt ist und nur 5 % über

Urin wieder ausgeschieden wurde. Diese Resultate stimmen gut mit den Ergebnissen von

BRÜGGEMANN et al. [319] und KELLY et al. [349] überein. BRÜGGEMANN et al. fanden bei Lege-

hennen und KELLY et al. bei Ratten und Hunden 90 % bis 95 % der applizierten C14-CTC bzw. C14-

TC-Menge, gemessen an der Radioaktivität, in Urin und Kot wieder. Lediglich 0,5 g, also 3 % der

Arzneimittelmenge verbleiben im Tierkörper, wovon ein Großteil (2,75 %) im Knochen eingelagert

wird. Auch diese Befunde stimmen mit den Angaben der oben genannten Autoren gut überein. Damit

wurden von der zugeführten Arzneimittelmenge 16,81 g, entsprechend 96 %, analytisch erfaßt. Ein

Vergleich dieser Bilanz mit den ermittelten CTC-Gehalten in Urin und Faeces des Tieres 95 in Kap.

5.4.2.1 zeigt, daß sich unter Berücksichtigung von iso-CTC und e-iso-CTC der erfaßbare CTC-Gehalt

erheblich erhöht. Mit den als Summe aus CTC und e-CTC ermittelten CTC-Gehalten wurden nur 70 %

in Faeces und 2 % in Urin wiedergefunden. In den Schlachtproben spielt dagegen die Berücksichti-

gung von iso-CTC und e-iso-CTC für die Bilanzierung keine große Rolle, trotz zum Teil erheblich

höherer Gesamtgehalte in den verschiedenen Matrices, siehe Tab. 31, da ohnehin auch unter Einbe-

ziehung dieser Verbindungen nur ein geringer prozentualer Anteil von 3 % der zugeführten Arzneimit-

tel im Tierkörper verbleibt. Es ist darauf hinzuweisen, daß die im Tier verbleibende Arzneimittelmen-

ge auch aus einer Rückresorption der ausgeschiedenen Wirkstoffe im Darm, dem sogenannten entero-

hepatischen Kreislauf, resultieren kann [350]. Insbesondere können hierdurch auch

Metabolisierungsprodukte wieder rückresorbiert werden.

Unter Berücksichtigung der Analysenpräzision, der Wiederfindung und der Genauigkeit der Hoch-

rechnung bei der Bilanzierung in Bezug auf die Zusammensetzung des Schweines läßt sich sagen, daß

nahezu die gesamte verfütterte Wirkstoffmenge wiedergefunden wurde. Es ist jedoch darauf hinzuwei-

sen, daß zwischen den beiden Medikationsphasen eine Pause von elf Tagen eingehalten wurde, in der

keine Probenahmen von Urin oder Faeces stattgefunden haben. Die in diesem Zeitraum ausgeschiede-

ne Arzneimittelmenge kann demzufolge nicht abgeschätzt werden. Es ist jedoch zu erwarten, daß die

CTC-Gehalte in Faeces schnell abnehmen, da es sich hauptsächlich um nicht resorbiertes CTC han-

delt. Die in Urin vorhandenen CTC-Mengen sind ohnehin deutlich geringer als in Faeces, so daß die

Urinausscheidung während der Medikationspause wahrscheinlich eine vernachlässigbare Rolle spielt.

Mit dieser Bilanzierungsstudie konnte gezeigt werden, daß dieses LC-MS/MS-Verfahren erstmals eine

umfassende Bilanzierung unter Berücksichtigung von Metaboliten ermöglicht. Insbesondere können

mit diesem Verfahren auch die Metabolite quantitativ bestimmt werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 121

Abb. 39: CTC-Bilanzierung für Tier 95

ZUGEFÜHRTE ARZNEIMITTELMENGE

(über 1. und 2. Medikationsphase)

17,6 g CTC (100 %)

KG zu Beginn der 1. Medikation: 75 kg

KG zu Be

inn der 2. Medikation: 93 k

Tier 95

AUSSCHEIDUNG

Urin

1. Med.-Phase: 454,8 mg

2. Med.-Phase: 363,7 mg

Summe Urin: 818,5 mg

≙

5 %

Faeces

1. Med.-Phase: 7,1 g

2. Med.-Phase: 8,4 g

Summe Faeces: 15,5 g

≙88

⇒ Σ (Urin + Faeces): 16,3 g ≜93 %

VERBLEIBENDE CTC-KOMPONENTEN IM TIERKÖRPER

Matrix CTC-Total-

Gehalt

Menge

bezogen auf KG

Menge bezogen auf die zuge-

führte Arzneimittelmenge

[%]

Plasma 127 µg/L 0,229 mg 0,0013

Muskulatur 210,4 µg/kg 15,40 mg 0,0875

Leber 392 µg/kg 0,804 mg 0,0046

Niere 659 µg/kg 0,163 mg 0,0009

Knochen 54,3 mg/kg 484,7 mg 2,75

⇒ Σ (Plasma+Muskulatur+Leber+Niere+Knochen): 0,5 g ≜3 %

Schlachtung

Körpergewicht: 102,6 kg

(Lebendmasse nach Nüchterung)

Gewicht (Leber): 1,937 kg

Gewicht (Nieren): 0,248 kg

Zusammensetzung des Schweines

Matrix % Anteile bezogen auf KG

Plasma 1,8

Muskulatur 71,2

Leber 2,0

Niere 0,24

Knochen 8,7

5 Ergebnisse und Diskussion

122

5.9.4 Konsequenzen

Zusammenfassend läßt sich sagen, daß ohne Berücksichtigung von iso-CTC und e-iso-CTC von der

zugeführten Arzneimittelmenge nur 13 g, also 74 %, entweder als Ausscheidungsprodukte oder als

verbleibende Arzneimittelrückstände im Tierkörper erfaßt werden, unter Einbeziehung dieser Produkte

96 %. Damit ist eine quantitative Erfassung des Verbleibs des zugeführten Wirkstoffes erfolgt. Die bei

der Bilanzierung mit berücksichtigten Abbauprodukte Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC für die

Matrices Knochen und Faeces spielen mit prozentualen Anteilen am Gesamt-CTC-Gehalt von 0,1 %

für Knochen und 0,5 % für Faeces nur eine untergeordnete Rolle. Dennoch bleibt zu diskutieren, ob

diese Verbindungen aufgrund ihres 30-fach höheren Potentials, Resistenzen auszubilden, siehe Kap.

3.4.1, zur allgemeinen Resistenzsituation beitragen. Nach den Ergebnissen der Bilanzierungstudie ist

davon auszugehen, daß 88 % der applizierten CTC-Menge über Faeces und 5 % über Urin als CTC, e-

CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC oder e-Anhydro-CTC ausgeschieden werden. Damit ist mit

einem hohen Eintrag von CTC-Komponenten in die Umwelt und dadurch auch mit einem indirekten

Eintrag in die Nahrungskette zu rechnen.

Lediglich 3 % der aufgenommenen Wirkstoffmenge verbleiben im Tierkörper. Dennoch überschreiten

die Gehalte in den Schlachtproben des Tieres 95, siehe Tab. 31, die entsprechenden MRL-Werte.

Nach Ablauf der Wartezeit von 14 Tagen ließen sich in den übrigen vier Tieren durchschnittlich noch

1,4 % der applizierten Wirkstoffmenge nachweisen. Innerhalb der Wartezeit sind die Gesamt-CTC-

Gehalte in Muskulatur um den Faktor 30 von 15,4 mg auf 0,5 mg, in Leber um den Faktor 40 von

804,4 µg auf 20,42 µg und in Niere um den Faktor 32 von 163,4 µg auf 5,2 µg gesunken. Nach diesem

Zeitraum betrugen die Gehalte in den Schlachtproben bezogen auf die Summe von CTC, e-CTC, iso-

CTC und e-iso-CTC für Muskulatur 6 %, für Leber und Niere 3 % der jeweiligen MRL-Werte.

Insgesamt zeigen die in Kap. 5.4.2 und Kap. 5.9.3 beschriebenen Bilanzierungsstudien, daß auch bei

bestimmungsgemäßer Anwendung mit einem erheblichen Eintrag von CTC entweder in Form des

ursprünglichen Wirkstoffes oder von Metabolite in die Nahrungskette zu rechnen ist. Als Hauptmeta-

bolite treten hierbei e-CTC, iso-CTC sowie e-iso-CTC auf. Daneben lassen sich zum Teil auch Anhy-

dro-CTC und e-Anhydro-CTC nachweisen. Auch wenn diese Gehalte unterhalb der MRL-Werte lie-

gen, so können sie trotzdem zu einer Resistenzbildung führen. Gerade geringe Gehalte, die unterhalb

der MHK-Werte liegen, tragen zu einer Resistenzbildung bei [38]. Neben dem direkten Eintrag über

tierische Lebensmittel sind auch indirekte Eintragpfade zu nennen. Zu diesen sogenannten Sekundär-

kreisläufen gehört der Eintrag von CTC über Gülleausbringung in die Umwelt sowie die Weiterver-

wendung und Weiterverarbeitung von knochenhaltigen Lebensmitteln z.B. als Düngemittel [342].

Darüber hinaus kann es bei der Zubereitung von tetracyclinhaltigen tierischen Lebensmitteln durch

Braten oder Kochen zur Entstehung von Abbauprodukten mit im Vergleich zum Muttersubstanz toxi-

scheren und stärker resistenzfördernden Eigenschaften kommen [339, 340]. Dies verdeutlicht die

Notwendigkeit, in die Ermittlung des CTC-Gehaltes neben dem Epimeren auch die Metabolite iso-

CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit einzubeziehen. Als Resultat dieser Untersu-

chungen sollten die MRL-Werte unter Berücksichtigung der Metabolite sowie der MHK-Werte noch-

mals überprüft werden.

6 Zusammenfassung und Ausblick 123

6 Zusammenfassung und Ausblick

Chlortetracyclin (CTC) gehört zur Gruppe der Tetracyclin-Antibiotika, die häufig zur therapeutischen

Behandlung in der Schweinemast eingesetzt werden. Das Antibiotikum wird den Tieren meist oral

über das Futter verabreicht. Der hohe Einsatz von CTC in der Schweinemast in Form von Arzneimit-

telvormischungen als Fütterungsarzneimittel führte zu einem signifikanten Anstieg von Resistenzen.

Die Entstehung und Verbreitung von Resistenzen wird dabei heutzutage zunehmend in einem mikro-

biell-ökologischen Zusammenhang zwischen Mensch, Tier, Pflanze und Umwelt gesehen. Nach dem

derzeitigen Wissensstand kann jedoch noch keine klare Einschätzung des Gefährdungspotentials für

den Verbraucher durch die veterinärmedizinische Anwendung von Tetracyclinen gegeben werden.

Es ist gesetzlich durch den MRL-Wert vorgeschrieben, den Tetracyclin-Gehalt als Summe der Mutter-

substanz CTC und des Epimeren e-CTC zu ermitteln. Darüber hinaus bildet CTC in Abhängigkeit vom

pH-Wert weitere Umwandlungs- und Abbauprodukte wie Isochlortetracyclin und Anhydrochlortetra-

cyclin, die ebenfalls epimerisieren können. Bei den in der Literatur beschriebenen Analysenverfahren

zur Bestimmung von Tetracyclinen findet nur eine ungenügende Berücksichtigung dieser Metabolite

statt. Bis zum heutigen Zeitpunkt ist kein vollständig validiertes HPLC-Verfahren zur quantitativen

Bestimmung von Tetracyclinen, welches auch die Metabolite umfaßt, bekannt. Als Ursache hierfür ist

vor allem ein Mangel an kommerziellen Referenzsubstanzen für e-iso-CTC zu sehen. Weiterhin wur-

den diese Metabolite meist als unbedenklich für den Verbraucher eingestuft, da angenommen wurde,

daß sie nur eine geringe oder gar keine antibiotische Wirksamkeit haben. Erst in neuerer Zeit findet

neben der antibiotischen Aktivität auch die Toxizität und die resistenzfördernde Wirkung der Metabo-

lite Beachtung. Der Einfluß der Metabolite auf die zunehmende Resistenzentwicklung ist aber bis

heute nicht umfassend geklärt. Diese Arbeit verfolgte daher folgende Ziele:

Um nähere Erkenntnisse über die Aufnahme und den Verbleib des in der Schweinemast eingesetzten

Antibiotikums Chlortetracyclin zu gewinnen, sollte im Rahmen eines Verbraucherschutzprojektes des

MUNLV NRW in Zusammenarbeit mit verschiedenen Forschungsanstalten anhand von Mastdurch-

gängen unter kontrollierten Bedingungen das Ausscheidungsverhalten und die Rückstände in

Schlachtproben untersucht werden. Im Rahmen einer ersten Medikationsstudie wurden in Zusammen-

arbeit mit dem Landwirtschaftszentrum Haus Düsse, Bad Sassendorf, Schweine unter landwirtschaft-

lich üblichen Bedingungen in einer Gruppe von 40 Tieren gehalten, definiert medikamentiert und das

Ausscheidungsverhalten von CTC in Urin sowie die CTC-Rückstände in den Schlachtproben unter-

sucht. Zur besseren Beurteilung, welche Menge der applizierten Wirkstoffe wieder ausgeschieden

wird, erfolgte in einer zweiten Medikationsstudie an der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft

(FAL), Braunschweig-Völkenrode, die Haltung von fünf Schweinen in Stoffwechselkäfigen, in denen

die Tiere individuell gefüttert wurden und Urin und Faeces separat gesammelt wurde. Vier Tiere wur-

den nach Ablauf der Wartezeit von vierzehn Tagen geschlachtet. Nach Überprüfung, welche Metaboli-

te in den Proben vorkommen, sollte anhand eines Tieres dieser Studie, das direkt nach Medikationsen-

de geschlachtet wurde, eine Bilanzierung unter Berücksichtigung weiterer Metabolite erfolgen.

Im Einzelnen haben sich hieraus folgende Aufgabenstellungen ergeben:

6 Zusammenfassung und Ausblick

124

• Entwicklung eines HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von CTC

und e-CTC in Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen und qualitativer

Nachweis der Umwandlungs- und Abbauprodukte iso-CTC und Anhydro-CTC sowie deren

Epimere

• Umfassende Validierung des Verfahrens unter Zugrundelegung der gültigen Richtlinien und

Normen

• Ermittlung des CTC-Gehaltes in den bei den Medikationsstudien entnommenen Urin-, Faeces-

, Plasma-, Muskulatur-, Leber-, Niere- und Knochenproben gemäß der EU-Verordnung EWG

Nr. 2377/90 als Summe von CTC und e-CTC

• Feststellung, welche Metabolite neben e-CTC in den Proben zusätzlich vorkommen und Beur-

teilung, ob die in den Proben nachgewiesenen Metabolite in die Ermittlung des CTC-Total-

Gehaltes mit einbezogen werden müssen

• Erweiterung des validierten Analysenverfahrens für die quantitative Bestimmung der weiteren

Metabolite

• Quantifizierung von CTC und weiterer Metabolite in Schlachtproben

• CTC-Bilanzierung anhand eines Tieres unter Berücksichtigung weiterer Metabolite

• Untersuchung gebundener Tetracyclinrückstände in Knochen

Zur chromatographischen Bestimmung von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC mit HPLC-UV-MS/MS erwies sich die YMC-ODS-AM-Trennsäule, basierend auf

einem C 18-Material mit einem sehr geringen Metallionen-Gehalt, als optimal. Zur Trennung dieser

Verbindungen mit einer guten symmetrischen Peakform zeigte sich ein Ameisensäure/Acetonitril-

Gradient als geeignet. Zur Identifizierung der Substanzen wurden die Retentionszeiten, die UV-

Maxima und mittels ESI-Triple-Quadrupol-Massenspektrometrie erhaltenen Fragmentierungsmuster

der einzelnen Verbindungen herangezogen. Die MS/MS-Detektion wurde im MRM-Modus und die

Quantifizierung über den Totalionenstrom (TIC) der aufgenommenen Massenspuren durchgeführt.

Zur Probenvorbereitung von Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen wur-

de ein Verfahren entwickelt, welches nach Extraktion der Probe mit McIlvain-Puffer eine Aufreini-

gung mittels Festphasenextraktion umfaßt. Dieses Verfahren eignet sich gleichermaßen für die oben

angegebenen CTC-Komponenten. Als SPE-Sorbens erwies sich die Oasis HLB-Kartusche, basierend

auf einem Copolymer-Material als optimal. Es wurde gezeigt, daß es während der Probenvorbereitung

durch die Extraktion mit dem McIlvain-Puffer im schwach sauren Bereich zu einer erheblichen Epi-

merisierung kommt. Die Quantifizierung von CTC und e-CTC kann in Muskulatur, Plasma, Faeces

und Knochen sowohl mit UV- als auch MS/MS-Detektion erfolgen, für Urin, Leber und Niere ist sie

aufgrund einer mangelnden Selektivität nur mit MS/MS-Detektion möglich.

Die umfassende Validierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens erfolgte nach den gültigen Normen

und Richtlinien der DIN EN ISO/IEC 17025, der FDA sowie der EU-Richtlinie 2002/657/EG. Es

wurden die Validierungsparameter Linearität, Selektivität, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Rich-

tigkeit und Präzision bestimmt. Die Bestimmungsgrenzen für die Bestimmung von CTC und e-CTC

mit der MS/MS-Detektion lagen in Urin und Plasma bei 0,3 µg/L, in Leber und Niere bei 0,5 µg/kg, in

Faeces bei 140 µg/kg und in Knochen bei 5 µg/kg. Für Muskulatur konnten mit der UV-Detektion

Bestimmungsgrenzen von 8 µg/kg und für die MS/MS-Detektion 0,3 µg/kg erzielt werden. Die Über-

6 Zusammenfassung und Ausblick 125

prüfung der Linearität ergab, daß für die Bestimmung von CTC und e-CTC mit der UV-Detektion

die Kalbrierfunktionen auch in einem großen Konzentrationsbereich von 0,1 mg/L bis 100 mg/L einer

linearen Funktion genügen, bei der MS/MS-Detektion eine Linearität aber nur in einem begrenztem

Konzentrationsbeeeich gegeben ist. Für die Bestimmung von CTC und e-CTC mit der MS/MS-

Detektion mußte daher der Arbeitsbereich von 0,005 mg/L bis 50 mg/L in drei Teilbereiche aufgeteilt

werden. Die Selektivität des Verfahrens wurde durch einen Vergleich der Retentionszeiten, der UV-

Spektren, der MS-Spektren, der Produkt-Ionen-Intensitäten sowie durch eine für CTC und e-CTC

charakteristische Peaklöschung bewiesen. Die Bestimmung der Richtigkeit erfolgte über die Ermitt-

lung der Wiederfindung, die aus der Wiederfindungsfunktion berechnet wurde. Die Wiederfindungen

wurden in Abhängigkeit von der Matrix zwischen 36 % und 107 % ermittelt. Sie lagen damit teilweise

unterhalb des akzeptierten Bereiches von 70 % und 110 %, können aber dennoch als akzeptabel be-

trachtet werden, da eine ausreichende Reproduzierbarkeit gegeben ist. Die Meßpräzision für die Be-

stimmung von CTC und e-CTC in Muskulatur mit der MS/MS-Detektion betrug durchschnittlich 5 %

und ist damit deutlich geringer als die geforderten 20 %. Die Methodenpräzision unter Wiederholbe-

dingungen lag mit Werten von 6 % bis 8 % für Muskulatur, Urin, Plasma, Faeces, Leber und Niere nur

geringfügig oberhalb der für Muskulatur ermittelten Meßpräzision. Für Knochen wurde aufgrund der

Schwierigkeit, homogenes Probenmaterial zu gewinnen, eine höhere Methodenpräzision von 19 %

ermittelt.

Im nächsten Schritt wurde das für die verschiedenen Matrices entwickelte und validierte Verfahren im

Rahmen der Medikationsstudien angewendet. In der Medikationsstudie im Landwirtschaftszentrum

Haus Düsse wurden Schweine mit einer definierten Menge Chlortetracyclin medikamentiert und in

regelmäßigen Abständen Urinproben zur Untersuchung des Ausscheidungsverhaltens genommen. Eine

Versuchstiergruppe wurde mit CTC medikamentiert und eine unbehandelte Tiergruppe zur Kontrolle

mitgeführt. Drei Monate nach Absetzen der Medikation erfolgte die Schlachtung aller Tiere, wobei

den Tieren Muskulatur-, Leber-, Niere-, Knochen- und Blutproben entnommen wurden. Die während

des Mastdurchganges durchgeführten Resistenzuntersuchungen haben gezeigt, daß die aus Faeces der

Tiere isolierten E. coli-Bakterien hohe Anteile resistenter Keime aufwiesen. Die Untersuchung der

Urinproben der Versuchstiere ergab, daß nach Absetzen der Medikation der CTC-Gehalt zwar zu-

nächst stark abnahm, aber auch zum Zeitpunkt der Schlachtung im Urin CTC nachweisbar war. In

allen bei der Schlachtung genommenen Proben konnten ebenfalls geringe CTC-Gehalte festgestellt

werden, obwohl die Medikation drei Monate zurücklag. In Knochen konnten aber konnten hohe Ge-

halte von bis zu 21 mg/kg festgestellt werden. In den Knochenproben der Kontrolltiere konnten eben-

falls CTC-Gehalte ermittelt werden, die etwa 1 % der Gehalte in den Versuchstierknochenproben ent-

sprachen, wobei als mögliche Eintragsquelle von CTC bei den Kontrolltieren eine Arzneimittelver-

schleppung im Stall diskutiert wurde. Anhand der Urin- und Faecesuntersuchungen der Proben aus der

Medikationsstudie an der Bundesforschungsanstalt für Landwirtschaft (FAL) konnte gezeigt wer-

den, daß über Urin 1% bis 4 % und über Faeces 55 % bis 83 % der applizierten CTC-Menge als CTC

und e-CTC wieder ausgeschieden wird. Die Gehalte in Faeces waren deutlich höher als in Urin, da

CTC nur zu etwa 30 % resorbiert wird und die in Faeces nachgewiesenen CTC-Gehalte daher über-

wiegend aus dem nicht resorbierten Anteil des Arzneimittels stammen. Die ermittelten CTC-Gehalte in

den Schlachtproben der Tiere, die nach Ablauf der Wartezeit geschlachtet wurden, lagen unterhalb der

MRL-Werte. Die Höhe der CTC-Gehalte in Muskulatur, Leber und Niere war in beiden Medikations-

studien vergleichbar, obwohl die Schlachtung der Tiere in der Haus Düsse-Studie drei Monate, in der

FAL-Studie zwei Wochen nach Medikationsende erfolgte.

6 Zusammenfassung und Ausblick

126

Neben CTC und e-CTC wurden in Urin, Faeces, Plasma, Muskulatur, Leber, Niere und Knochen iso-

CTC und e-iso-CTC, in Faeces und Knochen in Spuren auch Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

nachgewiesen. Darüber hinaus konnte in vielen Proben noch ein weiteres zunächst noch unbekanntes

Produkt festgestellt werden.

In guter Übereinstimmung mit Angaben in der Literatur konnte dieses zusätzlich in den Proben auf-

tretende Produkt anhand der UV- und Massenspektren als keto-e-CTC mit cis- oder trans-

Konfiguration identifiziert werden. Es wurde erstmals die Möglichkeit einer massenspektrometrischen

Unterscheidung der Keto-Enol-Tautomere anhand typischer Fragmetierungsreaktionen bzw. charakte-

ristischer Produkt-Ionen aufgezeigt.

Nachfolgend wurde geprüft, ob es notwendig ist, bei der Ermittlung des CTC-Gehaltes über die

gesetzlich vorgeschriebene Regelung hinaus, die eine Bestimmung des CTC-Gehaltes als Summe von

CTC und e-CTC vorsieht, auch die weiteren aufgetretenen Metabolite mit einzubeziehen. Für diese

Beurteilung wurde untersucht, welche Metabolite in vivo oder in vitro entstehen. Darüber hinaus er-

folgte die Prüfung der antibiotische Aktivität. Es wurde gezeigt, daß e-CTC, iso-CTC und e-iso-CTC

in allen Matrices sowohl in vivo als auch in vitro entstehen können. Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC kommen nur in Faeces und Knochen vor, wobei diese Verbindungen in Faeces ausschließlich in

vivo entstehen, in Knochen ist auch eine in vitro-Bildung aufgrund des salzsauren Aufschlusses bei der

Probenvorbereitung möglich. Die Prüfung der antibiotischen Aktivität ergab eine antibiotische Un-

wirksamkeit von iso-CTC, alle übrigen Verbindungen sind antibiotisch aktiv. Damit wurde verdeut-

licht, daß die Ermittlung des CTC-Gehaltes neben CTC und e-CTC auch die Metabolite iso-CTC, e-

iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit einschließen sollte.

Zur Untersuchung der antibiotischen Aktivität wurde der Dreiplattentest angewendet, wobei eine

abnehmende antibiotische Aktivität in der Reihenfolge CTC, Anhydro-CTC, e-CTC, e-Anhydro-CTC

festgestellt wurde. Es konnte gezeigt werden, daß es während der Durchführung des Testes zu einer

erheblichen Umwandlung von CTC in die antibiotisch inaktive Verbindung iso-CTC kommt, was

möglicherweise zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen kann.

Eine weitere Zielsetzung dieser Arbeit lag auf der quantitativen Bestimmung der Metabolite iso-

CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC. Das für CTC und e-CTC validierte Analy-

senverfahren wurde für die Bestimmung dieser Metabolite optimiert. Insbesondere wurde gezeigt, daß

das kommerziell nicht erhältliche e-iso-CTC durch Epimeriserung von iso-CTC in schwach saurer

Lösung hergestellt werden kann. Mit diesem erweiterten HPLC-UV-MS/MS ist erstmals eine simulta-

ne quantitative Bestimmung der genannten CTC-Komponenten möglich.

Das Ziel, CTC und e-CTC durch alkalische Behandlung der Meßprobe in die isomeren Verbindungen

zu überführen und damit über iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter zu bestimmen, konn-

te für Standardlösungen erreicht werden. Die Übertragung dieser Methode auf Muskulatur erbrachte

keine quantitative Umwandlung von CTC und e-CTC in iso-CTC und e-iso-CTC.

Im Anschluß daran erfolgte die Ermittlung des CTC-Total-Gehaltes in den Schlachtproben der

Tiere der FAL-Studie, die nach Ablauf der Wartezeit geschlachtet wurden. Es wurde gezeigt, daß sich

die CTC-Gehalte unter Einbeziehung von iso-CTC und e-iso-CTC erheblich erhöhen. Vor allem für

Muskulatur konnte eine prozentuale Erhöhung des CTC-Gehaltes um 70 % festgestellt werden. Jedoch

lagen auch die CTC-Total-Gehalte unterhalb der MRL-Werte. Dennoch könnte es unter Einbeziehung

von iso-CTC und e-iso-CTC häufiger zu einer Überschreitung der MRL-Werte kommen. Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC kommen nur in Knochen vor und spielen mit prozentualen Anteilen von 0,1

6 Zusammenfassung und Ausblick 127

% am CTC-Gesamt-Gehalt nur eine untergeordnete Rolle.

Da die Gehalte in Knochen mit Werten bis zu 28 mg/kg sehr hoch waren, wurde nachfolgend unter-

sucht, ob durch diese gebundenen Tetracyclinrückstände eine Gefährdung für den Verbraucher

resultieren kann. Die Ergebnisse des durchgeführten „Knochen-Plasma-Modellversuches“ belegen,

daß CTC aus Knochen wieder herausgelöst werden und ins Plasma übergehen kann. Als Resultat die-

ses Versuches erscheint auch eine in vivo Freisetzung von CTC aus Knochen als sehr wahrscheinlich.

Mit diesen Untersuchungen konnte die Annahme, daß Tetracycline irreversibel im Knochen eingela-

gert werden, widerlegt werden. Somit kann nicht davon ausgegangen werden, daß Tetracyclinrück-

stände in Knochen unbedenklich sind für den Verbraucher.

Bei der durchgeführten Bilanzierung des Tiere 95 der FAL-Studie wurde festgestellt, daß Urin ne-

ben CTC und e-CTC auch große Mengen an iso-CTC und e-iso-CTC enthält. Der prozentuale Anteil

dieser Metabolite am CTC-Gesamtgehalt betrug in Urin bis zu 90 %. In Faeces war der Anteil dieser

isomeren Verbindungen am Gesamt-Gehalt mit Maximalwerten von 22 % deutlich geringer. Darüber

hinaus ließen sich in dieser Matrix auch Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC nachweisen, die aber nur

einen prozentualen Anteil von 2 % am CTC-Gesamtgehalt darstellen. Die CTC-Gehalte in den

Schlachtproben dieses Tieres überschritten unter Einbeziehung von iso-CTC und e-iso-CTC den

MRL-Wert deutlich, während die CTC-Gehalte, ermittelt als Summe von CTC und e-CTC, etwa in

Höhe der MRL-Werte lagen. Die Bilanzierung ergab, daß von der applizierten Wirkstoffmenge 88 %

über Faeces und 5 % über Urin wieder ausgeschieden wurden. Von der im Tierkörper verbleibenden

Wirkstoffmenge wurde 2,75 % im Knochen eingelagert und nur 0,1 % verteilt in den übrigen Matrices

wiedergefunden. Damit wurde gezeigt, daß von der applizierten Wirkstoffmenge 93 % über Urin und

Faeces wieder ausgeschieden werden und damit mit einem erheblichen Umwelteintrag zu rechnen ist.

Die im Tier verbleibende Arzneimittelmenge ist mit 3 % vergleichsweise gering. Von der applizierten

Wirkstoffmenge wurde unter Einbeziehung von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC

oder Anhydro-CTC 96 % analytisch erfaßt. Damit konnte unter Berücksichtigung möglicher Fehler-

quellen wie z.B. der Analysenpräzision, der Wiederfindung und der Genauigkeit der Zusammenset-

zung des Schweines die gesamte gefütterte Wirkstoffmenge wiedergefunden werden. Es wurde erst-

mals die Möglichkeit aufgezeigt, eine Bilanzierung, die eine quantitative Bestimmung der Metabolite

von CTC mit einschließt, durchführen zu können. Es konnte somit eine umfassende Abschätzung des

Rückstandsverhaltens des in der Schweinmast häufig eingesetzten Chlortetracyclin erfolgen.

Die durchgeführten Untersuchungen belegen, daß auch bei bestimmungsgemäßer Anwendung von

CTC bei Schweinen Rückstände in tierischen Lebensmitteln unvermeidbar sind. Die den Schweinen

applizierten Wirkstoffe können als ursprünglicher Wirkstoff oder als Metabolit in antibiotisch wirk-

samer, resistenzfördernder oder sonstiger toxischer Form in die Umwelt und die Nahrungskette gelan-

gen. Die Ermittlung von Chlortetracyclinrückständen sollte daher nicht nur auf die Summe von CTC

und e-CTC beschränkt bleiben, sondern es sollten auch die Metabolite iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-

CTC und e-Anhydro-CTC mit einbezogen werden. Vor dem Hintergrund, daß auch CTC-Gehalte un-

terhalb der MRL-Werte Resistenzen fördern können, sollten die MRL-Werte nochmals überprüft wer-

den. Darüber hinaus ist vor allem ein nachhaltigerer Einsatz von Tetracyclinen in der Schweinemast

anzustreben. Weiterführende Arbeiten sollten dazu dienen, basierend auf diesem HPLC-UV-MS/MS-

Verfahren, die möglichen Einträge in Umweltkompartimente und die Nahrungskette weiter zu verfol-

gen.

7 Experimenteller Teil

128

7 Experimenteller Teil

7.1 Chemikalien

Die im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen eingesetzten Chemikalien sind nachfolgend al-

phabetisch geordnet aufgeführt.

Acetonitril (HPLC Gradient Grade; Roth/Karlsruhe)

Ameisensäure reinst, 98-100 % (Merck/Darmstadt)

Anhydrochlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros/Schwerte)

Chlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros/Schwerte)

Citronensäure (p. a.; Merck /Darmstadt)

Dinatriumhydrogenphosphat, wasserfrei (p. a.; Merck/Darmstadt)

Epianhydrochlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros/Schwerte)

Epichlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros/Schwerte)

Ethylendiamintetraessigsäure Dihydrat, EDTA (extra pure; Riedel-de-Haën /Seelze)

Isochlortetracyclin Hydrochlorid, ≥ 97 % (Acros/Schwerte)

Kaliumdihydrogenphosphat (reinst; Merck/Darmstadt)

Methanol (p. a.; Merck/Darmstadt)

Metaphosphorsäure; 40-50 % (w/w; p. a.; Merck/Darmstadt)

Natriumchlorid (reinst; Fluka/Taufkirchen)

Natriumdihydrogenphosphat Dihydrat (reinst; Merck/Darmstadt)

Natriumhydroxid, Plätzchen, ≥ 99 % (p. a.; Merck/Darmstadt)

Perchlorsäure; 60 % (w/w; p. a.; Merck/Darmstadt)

Pufferlösungen, pH 2 und pH 7 (gebrauchsfertig; Merck/Darmstadt)

Salzsäure, 37 % (w/w; p. a.; Merck/Darmstadt)

Wasser (bidestilliert über Quarzglas mit Destamat Bidest von Heraeus/Hanau)

7.2 Geräte

7.2.1 HPLC-UV-MS/MS Triple Quadrupol-System

Sämtliche HPLC-UV-MS/MS-Untersuchungen wurden an einem System, bestehend aus einer HPLC-

Anlage, der Alliance 2690, und einem Massenspektrometer, dem Quattro Ultima, der Firma Wa-

ters/Eschborn mit Ion-Spray-Interface und MassLynx-Auswertesoftware durchgeführt. Die Ionisierung

erfolgte durch Electrospray-Ionisation im positiven Meßmodus.

LC-System: Alliance 2690 (Waters)

Chromatographische Bedingungen:

Fließmittel: A: H2O/CH3CN/HCOOH (89,5/10/0,5 (v/v/v)

B: H2O/CH3CN/HCOOH (39,5/60/0,5 (v/v/v)

Flußrate: 0,4 mL/min

Vorsäule: YMC-ODS-AM, 19 x 3 mm, 5 µm (YMC)

7 Experimenteller Teil 129

Säule: YMC-ODS-AM, 150 x 3 mm, 5 µm (YMC)

Autosampler: 4 °C

Injektionsvolumen: 20 µL

Detektion: UV (PDA 996, Waters); Meßbereich: 200-400 nm

MS/MS (Quattro Ultima, Micromass/Waters) (ESI+)

allgemeingültige Tune-Page-Parameter:

Capillary Voltage [kV]: 3,5 Desolvation Gas Flow [L/h]: 500

Cone [V]: 20 Ion Energy [V]: 1

Source Temperature [°C]: 125 Entrance Potential [V]: 50

Desolvation Temperature [°C]: 270 Exit Potential [V]: 50

Cone Gas Flow [L/h]: 100 Multiplier [V]: 650

Kompressor: SF 1 (Atlas Copco/Wilrijk, Belgium)

Stickstoffgenerator: NGM-11 vin (CMC/Eschborn)

Auswertng: MassLynxTM, Version 3.5; Micromass/Eschborn

Die angegebenen Tune-Page-Parameter gelten für alle durchgeführten massenspektrometrischen Un-

tersuchungen. Messungen wurden sowohl im Full-Scan-Modus, Precursor-Ion-Scans und Produkt-Ion-

Scans, als auch im MRM-Modus durchgeführt:

7.2.2 Probenzerkleinerung

Moulinette

Ultra-Turrax T 25; Dispergiergerät (Ika Labortechnik/Staufen)

Schneidmühle , Typ SM 2000 (Retsch/Haan)

7.2.3 Probenhomogenisierung

Horizontalschüttler HS 501 digital (Ika Labortechnik/Staufen)

Vortex-Rüttler, Minishaker MS 2 (Ika Labortechnik/Staufen)

7.2.4 Zentrifugen

Minifuge T (Heraeus Sepatech/Osterode)

Varifuge 3.OR (Heraeus Sepatech/Osterode)

7.2.5 SPE-Extraktionseinheit

Zur Durchführung der Festphasenextraktion wurde ein Vakuumfiltrationsgerät mit 12 Steckplätzen

J.T. Baker spe-12 G (Baker/Gross-Gerau) eingesetzt. Die Durchflußgeschwindigkeit wurde über auf-

gesetzte Kunststoffhähne reguliert und gegebenfalls durch Anlegen eines Vakuums über eine Wasser-

strahl- oder Membranpumpe erhöht.

7.2.6 TurboVap

Zum Einengen von Lösungen wurde ein TurboVap® LV Evaporator, Typ ZW 7001 (Zymark/Idstein)

eingesetzt. Hierzu wurden die Lösungen in spezielle Reagenzgläser (Vap-Gläser) gefüllt, in einen ent-

sprechenden Einsatz in einem Wasserbad temperiert und das Lösungsmittel im Luft- oder Stickstoff-

7 Experimenteller Teil

130

strom abgeblasen.

7.2.7 pH-Meter

Es wurde ein Digital-Mikroprozessor-pH-Meter der Firma Knick/Berlin eingesetzt. Vor jeder Messung

erfolgte eine Kalibrierung des Gerätes mit gebrauchsfertigen Pufferlösungen der pH-Werte 2 und 7.

7.2.8 UV-Lampe

Zur Bestrahlung der Proben mit UV-Licht wurde eine UV-Lampe REPROSTAR II Transilluminator

mit variabler Wellenlänge der Firma Camag/Berlin eingesetzt. Zur Sichtbarmachung der Fluoreszenz

wurde eine Wellenlänge von 366 nm eingestellt.

7.3 Lösungen/Reagenzien

7.3.1 Mobile Phase

Fließmittel A: In einen 1000 mL-Meßkolben wurden etwa 700 mL bidest. H2O vorgelegt und 100 mL

Acetonitril (HPLC Gradient Grade) sowie 5 mL konzentrierte Ameisensäure (reinst) zugegeben. An-

schließend wurde mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt und gut gemischt. Der pH-Wert des Fließmittels

betrug 2,2.

Fließmittel B: In einen 1000 mL-Meßkolben wurden etwa 200 mL bidest. H2O vorgelegt und 600 mL

Acetonitril (HPLC Gradient Grade) sowie 5 mL konzentrierte Ameisensäure (reinst) zugegeben. An-

schließend wurde mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt und gut gemischt. Der pH-Wert des Fließmittels

betrug 2,6.

7.3.2 McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,1 moL/L EDTA

McIlvain-Stammlösung: Es wurden 284 g Na2HPO4 (≜2 Mol) und 210 g Zitronensäure Monohydrat

(≜1 Mol) mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt. Die Lösung wurde bei einer Temperatur von 4 °C bis

8 °C im Kühlschrank aufbewahrt.

EDTA-McIlvain-Puffer: 100 ml McIlvain-Stammlösung wurden mit 800 mL bidest. H2O versetzt

und 37,2 g EDTA (≜0,1 mol/L) darin aufgelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wurde mit Salzsäure

(6 mol/L) auf 4 eingestellt und mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt.

7.3.3 Stammlösungen

Die Stammlösungen aller eingesetzten Substanzen wurden als Einzellösungen hergestellt und aliquo-

tiert bei einer Temperatur von -80 °C aufbewahrt. Zur Herstellung der Stammlösung wurden 10 mg

der Festsubstanz in einen 10 mL-Meßkolben eingewogen und mit Methanol (p. a.) auf 10 mL aufge-

füllt. Diese Lösung (β = 1 g/L) wurde dann in Aliquoten von 1 mL aufgeteilt und sofort tiefgefroren.

7.3.4 Standardlösungen

Die für die Versuche eingesetzten Standardlösungen in Form von Einzelstandardlösungen wurden

durch Verdünnung aus den Stammlösungen mit Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v), pH 2,8 herge-

7 Experimenteller Teil 131

stellt, entsprechend der Stammlösung aliquotiert und ebenfalls bei einer Temperatur von -80 °C auf-

bewahrt.

7.3.5 Kalibrierlösungen

Die Kalibrierlösungen der jeweiligen Epimerenpaaren (CTC/e-CTC, Anhydro-CTC/e-Anhydro-CTC,

epimerisiertes iso-CTC) wurden aufgrund der Stabilität, bedingt durch die leichte Epimerisierung in

schwach saurer Lösung, im Verhältnis 1:1 durch Verdünnung der Stammlösungen mit Metha-

nol/Fließmittel A (50/50) (v/v) hergestellt, anschließend entsprechend der Stammlösungen aliquotiert

und bei einer Temperatur von -80 °C eingefroren.

7.4 Medikationsstudien

7.4.1 Haus Düsse-Studie

Der Versuchablauf des Mastdurchganges im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse sowie die entnom-

menen Proben sind in Tab. 35 tabellarisch dargestellt. Versuchstier 3 mußte während der Mastphase

zusätzlich 2 x mit Tardomyocel und 5 x mit Baytril behandelt werden: 6 mL Tardomyocel am

17./19.6. und 5 mL Baytril am 20./21./22./24./28.6.

Tab. 35: Versuchsdurchführung und Beprobungsplan

Datum Bemerkung Matrix Menge

26.05.2000 Einstallung der Tiere - -

29.05.2000 1. Probenahme

(zur Erfassung des Grundstatus) Urin 10-100 mL

30.05.2000 Beginn der Medikation - -

13.06.2000 Ende der Medikation - -

14.06.2000 2. Probenahme (erste Probenahme nach

Medikationsende) Urin 10-100 mL

27.06.2000 3. Probenahme Urin 10-100 mL

11.07.2000 4. Probenahme Urin 10-100 mL

25.07.2000 5. Probenahme Urin 10-100 mL

08.08.2000 6. Probenahme Urin 10-100 mL

22.08.2000 7. Probenahme Urin 10-100 mL

28.08.2000 Probenahme bei

der Schlachtung

Urin

Muskulatur

Knochen

Blut

Leber

Niere

20-50 mL

ca. 200 g

Unterschenkel

ca. 500 mL

150 - 200 g

In den nachfolgenden Tabellen sind einzelne Daten zum Alter, Geschlecht und Schlachtgewicht der

am Versuch beteiligten Tiere sowie Angaben zur Versuchsdurchführung wie Buchtnummer des Stalls

und Kennzeichnung der Tiere aufgeführt.

7 Experimenteller Teil

132

Tab. 36: Einzelne Daten zu den Kontrolltieren

Versuchstier

nummer Geschlecht Geburts-

datum

Schlacht-

datum

Bucht-

nummer

Ohr-

marke

Schlachtge-

wicht [kg]

1 Börge 10.03.2000 24.08.2000 49 1194 74.4

2 Börge 10.03.2000 24.08.2000 49 1175 77.2

3 Börge 16.03.2000 24.08.2000 49 1107 76.0

4 Börge 13.03.2000 24.08.2000 49 1217 75.8

5 Sauschwein 13.03.2000 24.08.2000 43 1220 74.0

6 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 43 1204 86.6

7 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 43 1289 79.6

8 Sauschwein 09.03.2000 24.08.2000 43 1082 78.0

9 Börge 10.03.2000 24.08.2000 41 1171 81.8

10 Börge 16.03.2000 24.08.2000 41 1138 87.8

11 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 47 1086 76.8

12 Börge 16.03.2000 24.08.2000 45 1141 88.8

durchschnittliches Schlachtgewicht [kg]: 79,7

Tab. 37: Einzelne Daten zu den Versuchstieren

Versuchstier

nummer Geschlecht Geburts-

datum

Schlacht-

datum

Bucht-

nummer

Ohr-

marke

Schlachtge-

wicht [kg]

1 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 44 1181 87.4

2 Sauschwein 04.03.2000 24.08.2000 44 1046 87.2

3 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 44 1182 33.0

4 Sauschwein 09.03.2000 24.08.2000 44 1079 71.8

5 Sauschwein 13.03.2000 24.08.2000 48 1223 76.6

6 Sauschwein 20.02.2000 24.08.2000 48 1218 82.0

7 Sauschwein 17.03.2000 24.08.2000 48 1123 83.6

8 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 44 1195 88.4

9 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 44 1176 92.4

10 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 44 1206 79.0

11 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 48 1193 84.8

12 Sauschwein 10.03.2000 24.08.2000 48 1089 77.0

durchschnittliches Schlachtgewicht [kg]: 78,6

Die im Rahmen der Medikationsstudie durchgeführten Probenahmen erfolgten mit Unterstützung des

LEJ und fanden an den jeweils angegebenen Tagen vormittags statt. Die Proben wurden nach der Ent-

nahme gekühlt zum SVUA Detmold transportiert und dort mit Ausnahme der Blutproben ohne weitere

Bearbeitung bis zur Analyse tiefgefroren. Die Blutentnahme erfolgte in 500 mL-Gefäßen, die 7,5 mL

einer gesättigten EDTA-Lösung (107 g Ethylendiamintetraessigsäure Dihydrat in 1 L bidest. Wasser)

enthielten. Nach dem Transport zum SVUA Detmold wurden die Blutproben zur Gewinnung des

Plasmas sofort bei 3300 g 15 Minuten ungebremst zentrifugiert und das Plasma als zellfreier Über-

stand abgenommen. Das so gewonnene Plasma wurde ebenfalls bis zur Analyse tiefgefroren. Die zur

7 Experimenteller Teil 133

Analyse notwendige Homogenisierung von Muskulatur, Leber und Niere erfolgte, wie in der Analy-

senvorschrift in Kap. A. 9 im Anhang beschrieben. Die Knochenproben wurden zunächst im SVUA

Detmold in der Sektion in Scheiben geschnitten, von Fleischresten befreit und anschließend im SVUA

Krefeld in einer Knochenmühle (S. Kap. 7.2.2) gemahlen, wobei die Knochenproben beim Transport

gekühlt wurden. Die Analyse der innerhalb der Studie entnommenen und gegebenenfalls homogeni-

serten Proben erfolgte nach der Analysenvorschrift (s. Kap. A. 9 im Anhang) in einer Zweifach-

Bestimmung. Die Konzentrationsbestimmung von CTC und e-CTC erfolgte ausschließlich über die

massenspektrometrische Detektion.

7.4.2 FAL-Studie

Aufzucht der Tiere: Zunächst wurden Ferkel in einer Gruppe auf dem Flatdeck im Institut für Tier-

zucht, FAL Mariensee, ohne Arzneimitteleinsatz aufgezogen. Die Ferkel wurden mit einer Ohrmarke

gekennzeichnet. Fünf Börgen, also Kastraten, wurden in der 18. KW 2001 zur Bundesforschungsan-

stalt für Landwirtschaft in Braunschweig transportiert. Die Haltung in Stoffwechselkäfigen mit einer

separaten Sammlung von Urin und Kot ist nur mit Börgen möglich. In der FAL wurden die Tiere bis

zum Versuchsbeginn am 16.07.01 in einem separaten Stall in Einzelbuchten gehalten, um die Arznei-

mittelfreiheit der Tiere zu gewährleisten. Nachdem die Tiere ein Gewicht von 71-89 kg erreicht hatten,

wurden die Tiere in Stoffwechselkäfigen aufgestallt.

Haltung der Tiere in Stoffwechselkäfigen: Nach der Einstallung in die Stoffwechselkäfige erfolgten

zwei Medikationsphasen von jeweils zehn Tagen, unterbrochen von einer aus Tierschutzgründen not-

wendigen Pause von elf Tagen. Die Medikationen erfolgten vom 16.-26.07.2001 und 06.-16.08.2001.

Urin und Kot wurden separat aufgefangen und täglich tierweise zu Gülle zusammengeführt. Zusätzlich

wurden am Anfang, in der Mitte und am Ende der jeweiligen Medikationsphase Blutproben entnom-

men. Während der Medikationspause wurden die fünf Tiere in einem separaten Stall in Einzelbuchten

gehalten, wobei der hierbei angefallende Kot und Urin verworfen wurde.

Medikation der Tiere: Die Medikation der Tiere, Art und Dauer, erfolgte unter praxisnahen therapie-

üblichen Bedingungen. Den Tieren wurde das Arzneimittel Chlortetracyclin 100 oral über das Trok-

kenfutter (Mischung aus Gerste, Weizen, Sojaschrot, Mineralstoffzusammensetzung, 1% Sojaöl) ver-

abreicht. Die Dosierung entsprach der maximal üblichen therapeutischen Anwendung, wobei sich die

Applikationsmenge des Wirkstoffes nach dem Körpergewicht der Tiere richtete. Chlortetracyclin 100

enthält pro 1000 g Präparat 100 g des Wirkstoffes Chlortetracyclin (Hersteller: BELAPHARM), wobei

nach Vorschrift pro kg Körpergewicht 100 mg des Präparates als Pulver eingesetzt wurden (also tägli-

che Dosis: 7 g Pulver/Tier (70 kg KGW). Unter Berücksichtigung der Gewichtszunahme der Tiere

während des Versuches wurde die Dosierung jeden zweiten Tag erhöht. Die Dosierung der Arzneimit-

tel ist im einzelnen in Tab. A. 2 und Tab. A. 3 im Anhang aufgeführt. Die Fütterung der Tiere mit

Antibiotika fand zweimal täglich, morgens und nachmittags, statt. Die Fütterungen mit Arzneimittel

erfolgten vom 16.07.01 (nachmittags) bis zum 26.07.01 (vormittags) sowie vom 06.08.01 (nachmit-

tags) bis zum 16.08.01 (vormittags).

Einmischung in das Futter: Die Einmischung der Arzneimittel in das Trockenfutter erfolgte in der

FAL Braunschweig. Damit gewährleistet war, daß die Tiere tatsächlich die gesamte Arzneimittelmen-

ge aufnehmen, wurden die Antibiotika täglich neu in das Futter eingemischt: Dazu wurde das Arznei-

mittel bei der täglichen Fütterung in die Mitte des Futters eingemischt, so daß das Tier zuerst das „An-

7 Experimenteller Teil

134

tibiotikafutter“ frißt. Dabei wurde von der Annahme einer durchschnittlichen täglichen Futteraufnah-

me von 2,5 kg pro Tier ausgegangen.

Schlachtung der Tiere: Das Tier mit der Tiernummer 95 wurde mit dem Ziel einer Bilanzierung di-

rekt nach Medikationsende am 16.08.2001 geschlachtet. Da die maximale Serumkonzentration ca. 3-4

h nach einer oralen Verabreichung erreicht wird, erfolgte die Schlachtung ungefähr 3 h nach der letz-

ten Fütterung. Die letzte Fütterung fand um ca. 7.00 Uhr statt, die Schlachtung des Tieres um 10.00

Uhr. Nach der bei der Schlachtung durchgeführten Probenahmen von Leber, Niere, Muskulatur, Kno-

chen, Blut, Urin und Kot erfolgte die Beseitigung des verbleibenden Tierkörpers durch die FAL

Braunschweig-Völkenrode. Die übrigen vier Tiere wurden bis zum Ablauf der Wartezeit von 14 Ta-

gen in einem separatem Stall in Einzelbuchten gehalten. Anschließend erfolgte am 30.08.2001 die

Schlachtung und Beprobung (Leber, Niere, Muskulatur, Knochen, Blut, Urin und Kot) der Tiere.

Probenahmen und Lagerung der Proben: Zur Erfassung des Grundstatus wurden am Montag, den

16.07.01, vor Beginn der ersten Medikation Urin-, Kot- und Blutproben genommen. Die Probennahme

fand am Vormittag statt. Am Montag Nachmittag wurde mit der Medikation der Tiere begonnen. Die

folgenden Probenahmen von Urin und Kot erfolgten täglich nachmittags. Blutproben können bei

Schweinen nicht so häufig entnommen werden, weshalb diese Probenahmen nur am Anfang, in der

Mitte und am Ende einer jeden Medikationsphase durchgeführt wurden. Die Urin- und Kotproben

wurden bis zur Abholung in der FAL tiefgefroren. Blutproben wurden in von der FAL zur Verfügung

gestellten EDTA-Röhrchen entnommen, anschließend in der FAL zentrifugiert und die so erhaltenen

Plasmaproben ebenfalls bis zur Abholung in der FAL tiefgefroren. Die tiefgefrorenen Proben wurden

am Ende der ersten und zweiten Medikationsphase abgeholt. Die bei der Schlachtung des Tieres 95

entnommenen Proben wurden direkt nach Detmold zum SVUA Detmold transportiert. Die Schlacht-

proben der 14 Tage später geschlachteten Tiere wurden zunächst in der FAL bis zur Abholung tiefge-

froren. Alle entnommenen Proben wurden beim Transport gekühlt, homogenisiert und anschließend

bis zur Aufarbeitung wieder tiefgefroren. Die Homogenisierung der Proben erfolgte mit Ausnahme

von Knochen im SVUA Detmold. Die Knochenproben wurden im SVUA Krefeld in einer Knochen-

mühle (s. Kap. 7.2.2) zerkleinert, wobei die Proben während des Transportes gekühlt wurden.

Das Alter und Schlachtgewicht der am Versuch beteiligten Börgen ist in Tab. 38 zusammengefaßt.

Tab. 38: Alter und Schlachtgewicht der Versuchstiere (Börgen)

Versuchstiernummer Geburtsdatum Schlachtdatum Schlachtgewicht [kg]

93 19.02.2001 16.08.2001 105,6

94 16.02.2001 30.08.2001 104,0

95 19.02.2001 30.08.2001 102,6

96 16.02.2001 30.08.2001 110,2

97 19.02.2001 30.08.2001 111,2

Die Analyse der innerhalb der Studie entnommenen und gegebenenfalls homogeniserten Proben er-

folgte nach der allgemeinen Analysenvorschrift (s. Kap. A. 9) in einer Zweifach-Bestimmung. Die

Konzentrationsbestimmung aller Verbindungen erfolgte ausschließlich über die MS/MS-Detektion.

Der Versuchablauf des Mastdurchganges an der FAL sowie die entnommenen Proben sind in Tab. 39

tabellarisch dargestellt.

7 Experimenteller Teil 135

Tab. 39: Versuchsdurchführung und Beprobungsplan

Ver-

suchstag Datum Bemerkung Matrix Menge

0 16.07.2001

Einstallung der Tiere

in Stoffwechselkäfige

(Probenahme zur Erfassung des Grund-

status)

Blut

Urin

Kot

20 30 mL

50-100 mL

20-30 g

1-10 17.07.-

26.07.2001

1. Medikationsphase

(Haltung der Tiere

in Stoffwechselkäfigen)

tägliche Probenahme

Urin

Kot

50-100 mL

20-30 g

4, 10 20./26.07.

2001 Probenahme Blut 20 30 mL

11-21 27.07.-

05.08.2001

Medikationspause

(Haltung der Tiere außerhalb der

Stoffwechselkäfige)

-- --

21 06.08.2001 erneute Einstallung der Tiere

in Stoffwechselkäfige

Blut

Urin

Kot

20 30 mL

50-100 mL

20-30 g

22-31 06.08.-

16.08.2001

2. Medikationsphase

(Haltung der Tiere

in Stoffwechselkäfigen)

tägliche Probenahme

Urin

Kot

50-100 mL

20-30 g

25, 31 10./16.08.

2001 Probenahme Blut 20 30 mL

31 16.08.2001 Schlachtung eines Tieres

direkt nach Medikationsende

Blut

Urin

Kot

Leber

Niere

Muskulatur

Knochen

20 30 mL

50-100 mL

20-30 g

vollständig

Oberschenkel

31-46 16.08.-

30.08.2001

Haltung von vier Tieren bis zum

Ablauf der Wartezeit

außerhalb der Stoffwechselkäfige

-- --

46 30.08.2001 Schlachtung der Tiere

Blut

Urin

Kot

Leber

Niere

Muskulatur

Knochen

20 30 mL

50-100 mL

20-30 g

vollständig

Oberschenkel

7.5 Methodenentwicklung

7.5.1 Chromatographische Bestimmung

Zur Entwicklung der Gradientenmethode wurden Standardlösungen aus CTC, e-CTC, iso-CTC und

Anhydro-CTC (β = 10 mg/L) einzeln sowie auch als Mischlösung in Methanol/Fließmittel A (50/50)

(v/v), pH 2,8 mit der in Kap. 7.2.1 beschriebenen Gerätekombination chromatographisch unter Ein-

satz von Ameisensäure und Acetonitril als Fließmittel (Fließmittel A: H

2O/CH3CN/HCOOH

7 Experimenteller Teil

136

(89,5/10/0,5 (v/v/v); B: H2O/CH3CN/HCOOH (39,5/60/0,5 (v/v/v)) untersucht. Der unter Verwendung

der C-18-HPLC-Säule YMC-ODS-AM (150 x 3 mm, 3 µm; RSC Chromatographie/Reinhardshagen)

entwickelte und optimierte Gradientenverlauf ist in Tab. 40 aufgeführt.

Tab. 40: Zeitlicher Verlauf des Ameisensäure-Acetonitril-Gradienten

Zeit [min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%]

0 90 10

1,5 80 20

12 60 40

15 40 60

18 0 100

22 0 100

25 90 10

29 90 10

Zur Auswahl der chromatographischen Trennsäule wurden die in Tab. 41 aufgeführten RP-Säulen auf

ihre Eignung zur Trennung von CTC sowie der Abbau- und Umwandlungsprodukte hin untersucht.

Hierzu wurden Mischstandardlösungen aus CTC, e-CTC, iso-CTC und Anhydro-CTC (β = 10 mg/L)

in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v), pH 2,8 mit der in Tab. 40 dargestellten Gradientenmethode

jeweils dreimal chromatographisch untersucht.

Tab. 41: Eingesetzte Reversed-Phase-HPLC-Säulen

Bezeichnung Phase

End-

capping

Dimension

[mm]

Partikel-/

Porengröße Hersteller

YMC-ODS-AM C 18 unpolar 150 x 3 3 µm, 120 Å YMC Europe/Schermbeck

RSC-Gel C 18 Aq C 18 polar 250 x 4 5 µm, 120 Å RSC/Reinhardshagen

RSC-Gel 120 C 18 L C 18 unpolar 125 x 4 5 µm, 120 Å RSC/Reinhardshagen

YMC-Pack Phenyl Phe-

nyl unpolar 150 x 2,1 3 µm, 120 Å YMC Europe/Schermbeck

Zur Ermittlung der UV-Absorptionsmaxima unter den gegebenen chromatographischen Bedingungen

wurden mittels UV-Detektion der in Kap. 7.2.1 beschriebenen Gerätekombination die UV-Spektren

von CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC, injiziert als Mischlösung

(β = 10 mg/L) in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v), pH 2,8, im Wellenlängenbereich von 200-400

nm aufgenommen.

Zur Ermittlung des Fragmentierungsmusters bei der massenspektrometrischen Detektion mit dem Tri-

ple Quadrupol-System erfolgte die Aufnahme von Precursor- und Produkt-Ionen-Scans im Bereich

von m/z 100-800 und m/z 60-500 durch Direktinjektion von Standardlösungen über eine Spritzen-

pumpe (Havard Apparatus von Applied Biosystems/Darmstadt) mit einer Fließgeschwindigkeit von 10

µL/min. Die hierzu eingesetzten Standardlösungen (10 mg/L) wurden zur Annäherung an die HPLC-

Elutionsbedingungen durch Verdünnung der Stammlösungen mit Fließmittel A/Fließmittel B (50/50)

(v/v) hergestellt. Anschließend erfolgte für die Messung im MRM-Modus die Optimierung der Ein-

stellungen im Interface (Erzeugung des Precursor-Ions) sowie der Kollisionsenergien (Erzeugung der

Produkt-Ionen). Die hierbei erhaltenen optimalen Parameter sind in der Analysenvorschrift in Kap. A.

9 aufgeführt.

7 Experimenteller Teil 137

7.5.2 Stabilität von CTC und e-CTC in Lösung

Zur Untersuchung der Stabilität und der Epimerisierungsrate von CTC wurde zunächst eine Standard-

lösung von CTC in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v) (β = 10 mg/L) bei Temperaturen von 5 °C,

25 °C und 40 °C über einen Zeitraum von 60 h aufbewahrt und die Konzentration mittels HPLC-UV

bei einer Wellenlänge von 275 nm in Zeitintervallen von 3 h bestimmt. Zusätzlich wurde eine Misch-

standardlösung aus CTC und e-CTC im Verhältnis 1:1 in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v) (β = 10

mg/L) bei einer Temperatur von 5 °C über einen Zeitraum von 60 h aufbewahrt und ebenso wie bei

den Einzelstandardlösungen die Konzentrationen mit HPLC-UV in Intervallen von 3 h ermittelt. Zur

Untersuchung der Langzeitstabilität von CTC und e-CTC in Kalibrierlösungen (s. Kap. 7.3.5) wurden

aliquotierte Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC im Verhältnis 1:1 in Methanol/Fließmittel A

(50/50) (v/v) (β = 10 mg/L) bei einer Temperatur von -80 °C über einen Zeitraum von sechs Monaten

gelagert. In Zeitabständen von zwei Wochen wurde ein Aliquot entnommen und die Konzentration

von CTC und e-CTC mit HPLC-UV ermittelt.

7.5.3 Entwicklung und Optimierung der Probenvorbereitung

7.5.3.1 Auswahl der SPE-Materials

Zur Auswahl eines geeigneten SPE-Materials für die Bestimmung von CTC und e-CTC wurden zu 10

mL EDTA-McIlvain-Puffer 200 µL CTC-Standardlösungen der Massenkonzentrationen 10 mg/L und

100 mg/L zudotiert und mit den in Tab. 42 angegebenen SPE-Kartuschen Festphasenextraktionen

durchgeführt. Alle Kartuschen wurden zunächst mit 3 mL Methanol und 3 mL bidest. H2O konditio-

niert. Anschließend erfolgte die Aufgabe der EDTA-McIlvain-Puffer-CTC-Lösung und ein Wasch-

schritt, bestehend aus 2 x 3 mL 5%igem Methanol. Die Elution erfolgte fraktioniert mit 3 x 2 mL Me-

thanol, die Fraktionen wurden im TurboVap bei einer Temperatur von 30 °C eingeengt und der Rück-

stand mit 200 µL MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) wieder aufgenommen.

Tab. 42: Untersuchte SPE-Phasen

Bezeichnung Phase

Festbett-

menge [mg]

Dimension der

Kartusche [mL] Hersteller

Chromabond

Tetracycline C 18 500 6 Macherey &Nagel/

Düren

Oasis HLB Copolymer 200 6 Waters/Eschborn

Nexus Copolymer 200 6 Varian/Darmstadt

7.5.3.2 Einfluß der Zusammensetzung des Extraktionsmittels

Zur Untersuchung des pH-Wert-Einflusses des Extraktionsmittels und des EDTA-Zusatzes auf die

Wiederfindung wurden McIlvain-Puffer der pH-Werte 2, 3, 4, 5 und 6 hergestellt, indem zu 100 mL

McIlvain-Stammlösung 800 mL bidest. H2O gegeben wurde, dem EDTA-McIlvain-Puffer zusätzlich

3,72 g (0,01 moL/L) EDTA. Der pH-Wert der Pufferlösungen wurde mit HCl (6 mol/L) oder NaOH (2

moL/L) eingestellt und die Lösung mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt. Zu 10 mL des jeweiligen Puf-

fers wurden 200 µL einer CTC-Standardlösung (β = 10 mg/L) zudotiert und die SPE wie folgt durch-

geführt: Die Kartuschen wurden mit 3 mL Methanol und 3 mL bidest. H2O konditioniert, anschließend

die dotierten Pufferlösungen auf die Kartuschen aufgegeben und die Kartuschen 2 x mit 3 mL 5%igem

7 Experimenteller Teil

138

Konditionierung der SPE-Kartusche (Oasis HLB)

1. 3 mL MeOH 2. 3 mL bidest H2O

Probenaufgabe

Waschschritt (2 x mit 3 mL 5 % MeOH in bidest. H2O)

Elution mit 3 mL MeOH

Einengen des Eluates im TurboVap (30 °C)

Aufnahme des Rückstandes in 200 µL MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v)

Methanol gewaschen. Die Elution der Analyten erfolgte mit 3 mL Methanol. Das erhaltene Eluat wur-

de im TurboVap (s. Kap. 7.2.6) bei einer Temperatur von 30 °C eingeengt und der Rückstand mit 200

µL MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) wieder aufgenommen.

7.5.3.3 Wiederfindungsstudien mit CTC und e-CTC

Zu 10 mL EDTA-McIlvain-Puffer (0,1 moL/L EDTA) wurden 200 µL von Einzelstandardlösungen

der Substanzen CTC und e-CTC (β = 10 mg/L) zudotiert und die SPE wie unter Kap. 7.5.3.5 be-

schrieben durchgeführt.

7.5.3.4 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisierung

von CTC und e-CTC

Um zu überprüfen, in welchem Schritt der Probenvorbereitung eine Epimerisierung stattfindet, wurden

anhand von Standardlösungen von CTC und e-CTC Teilschritte des SPE-Verfahrens durchgeführt und

die resultierenden Gehalte der jeweiligen Epimerenpaare mittels HPLC-UV (s. Kap. 7.2.1) ermittelt.

Die Durchführung der einzelnen Versuche wurde bereits in Kap. 5.2.2.4 beschrieben (s. Tab. 8).

7.5.3.5 Zusammenfassung des SPE-Verfahrens

Abb. 40: Vorgehensweise bei der Festphasenextraktion

7.5.4 Probenvorbereitung verschiedener Matrices

Für die nachfolgend beschriebenen Wiederfindungsstudien von CTC in Urin, Plasma, Faeces, Musku-

latur, Leber und Niere wurde nicht belastetes Probenmaterial aus den durchgeführten Medikationsstu-

dien verwendet.

7.5.4.1 Urin, Plasma und Kot

Urin: Es wurden 5 mL Urin in ein 10 mL-PP-Röhrchen (Merck/Darmstadt) gegeben. Nach Zugabe

7 Experimenteller Teil 139

von 4 mL EDTA-McIlvain-Puffer wurde 15 Minuten bei 3300 g bei einer Temperatur von 10 °C zen-

trifugiert. Der Überstand wurde zur SPE eingesetzt und wie unter Kap. 7.5.3.5 beschrieben aufgear-

beitet.

Plasma: Das für die nachfolgend beschriebenen Versuche eingesetzte Plasma wurde aus EDTA-

Vollblut der im Rahmen der Medikationsstudie im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse entnommenen

Blutproben der unbehandelten Kontrolltiere gewonnen. Die Gewinnung des Plasmas ist in Kap. 7.4

beschrieben. Zur Ermittlung eines geeigneten Fällungsreagenzes für die Proteinabtrennung wurden zu

5 mL Plasma in einem verschließbaren 10 mL-PP-Röhrchen (Merck/Darmstadt) 200 µL einer CTC-

Lösung (β = 10 mg/L) zudotiert und 5 mL eines Fällungsreagenzes zugegeben. Als Fällungsreagenzien

wurden Acetonitril, Methanol, 6%ige HClO4 (w/w) sowie eine Mischung aus Perchlorsäure und Meta-

phosphorsäure eingesetzt. (6%ige HClO4 (w/w): Zu 50 g bidest H2O werden 10 g 60%ige Perchlorsäu-

re gegeben und mit bidest. H2O auf 100 g aufgefüllt; 6% HClO4 (w/w) / 2% HPO3 (w/w): Zu 50 g bi-

dest H2O werden 4 g Metaphosphorsäure und 10 g 60%ige Perchlorsäure gegeben und mit bidest. H2O

auf 100 g aufgefüllt.) Die Proben wurden 30 min auf einem Horizontalschüttler (s. Kap. 7.2.3) bei 250

Schübe/min geschüttelt und danach 15 Minuten bei 3300 g und einer Temperatur von 10 °C zentrifu-

giert. Der Überstand wurde zur pH-Wert-Einstellung für die SPE mit EDTA-McIlvain-Puffer pH 4

versetzt, indem der Überstand in ein Zentrifugenglas überführt, anschließend das PP-Röhrchen mit 5

mL EDTA-McIlvain-Puffer gespült, ebenfalls in das Zentrifugenglas überführt und schließlich weitere

20 mL EDTA-McIlvain-Puffer zugegeben wurde. Anschließend erfolgte die Festphasenextraktion

nach dem allgemeinen Extraktionsverfahren (s. Kap. 7.5.3.5).

Faeces: Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurden analog Kap. 7.5.3.2 EDTA-

McIlvain-Puffer der pH-Werte 2, 3 und 4 mit 0,01 moL/L EDTA sowie EDTA-McIlvain-Puffer pH 4

mit 0,1 moL/L EDTA hergestellt, jeweils 10 mL zu mit 200 µL einer CTC-Lösung (β = 10 mg/L) do-

tierten Kotproben (Einwaage: 0,5 g) (Nullproben aus der Medikationsstudie an der FAL) in ein ver-

schließbares 10 mL-PP-Röhrchen (Merck/Darmstadt) gegeben und 15 Minuten bei 260 Schübe/min

auf einem Horizontalschüttler (s. Kap. 7.2.3) geschüttelt. Anschließend wurde 15 min bei 3300 g und

10°C zentrifugiert. Der Überstand wurde in ein 30 mL-Zentrifugenglas gegeben. Das Pellet wurde

noch zweimal mit 10 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA extrahiert. Die Extrakte wurden je-

weils 15 Minuten bei 260 Schübe/min auf dem Schüttler geschüttelt und anschließend 15 min bei 3300

g und 10°C zentrifugiert. Die vereinigten Überstände wurden nochmals 10 min bei 3300 g zentrifu-

giert und der Überstand zur Festphasenextraktion (s. Kap. 7.5.3.5) verwendet.

7.5.4.2 Muskulatur, Leber und Niere

Muskulatur: Zur Wahl des Extraktionsmittels wurden analog Kap. 7.5.3.2 EDTA-McIlvain-Puffer (s.

Kap. 7.3.2) pH 2, 3 und 4 mit 0,01 moL/L und 0,1 moL/L EDTA, McIlvain-Puffer pH 4 ohne EDTA

sowie Mischungen aus Methanol und McIlvain-Puffer pH 2, 3 und 4 mit 0,1 moL/L EDTA im Ver-

hältnis 20/80 (v/v) hergestellt. Muskulatur wurde in einer Moulinette zerkleinert, 5 g dieser zerkleiner-

ten Matrix in ein 80 mL-Zentrifugenglas eingewogen und mit 200 µL einer CTC-Lösung (β = 10

mg/L) dotiert. Zu den Proben wurden 15 mL der oben genannten Extraktionsmittel gegeben und 1 min

(nach Stoppuhr) mit dem Ultraturrax bei 8000 U/min homogenisiert. Die homogenisierte Probe wurde

25 min bei 3300 g zentrifugiert (gekühlte Zentrifuge: 10 °C). Das Pellet wurde mit weiteren 15 mL

Extraktionsmittel erneut 1 min mit dem Ultraturrax bei 8000 U/min homogenisiert und 25 min bei

3300 g zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und wiederum 15 min bei 3300 g zentrifugiert.

7 Experimenteller Teil

140

Der so erhaltene Probenextrakt wurde mittels SPE gereinigt und aufkonzentriert (s. Kap. 7.5.3.5).

Leber: Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurden dieselben Extraktionsmittel wie für

die Aufarbeitung von Muskulatur untersucht (s. oben). Die Probenzerkleinerung und weitere Aufarbei-

tung entsprach der von Muskulatur. Die Aufreinigung mittels SPE erfolgte nach dem allgemeinen

Verfahren (s. Kap. 7.5.3.5). Die Überprüfung von Matrixeffekten bei der massenspektrometrischen

Detektion erfolgte durch jeweils dreifache Aufarbeitung nicht belasteter Leberproben nach dem Stan-

dardverfahren (s. Analysenvorschrift in Kap. A. 9 im Anhang). Die Aufnahme des eingeengten Elua-

tes der SPE wurde jedoch nicht in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v), sondern in einer CTC-

Standardlösung in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v) aufgenommen. Die Konzentration in den

Meßproben entsprachen Gehalten von 20 µg/kg, 100 µg/kg und 800 µg/kg. Diese Matrixstandards

wurden mit den Solventstandards verglichen und damit der Matrixeinfluß ermittelt.

Niere: Zur Ermittlung eines geeigneten Extraktionsmittels wurden dieselben Extraktionsmittel wie für

die Aufarbeitung von Muskulatur untersucht (s. vorne). Die Probenzerkleinerung und weitere Aufar-

beitung entsprach der von Muskulatur. Die Aufreinigung mittels SPE erfolgte nach dem allgemeinen

Verfahren (s. Kap. 7.5.3.5).

7.5.4.3 Optimierung des Extraktionsverfahrens für Muskulatur

Extraktion aus der Matrix: Zur Ermittlung der notwendigen Anzahl von Extraktionsschritten erfolg-

te zum einen die Aufarbeitung von mit 200 µL einer CTC-Lösung (β = 10 mg/L) dotierten Muskula-

turproben, zum anderen wurden CTC-haltige Proben untersucht, indem alle Proben dreimal mit 15 mL

des Extraktionsmittels MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,01 moL/L) (20/80, v/v) extrahiert wur-

den und die drei einzelnen erhaltenen Extrakte nach dem SPE-Verfahren (s. Kap. 7.5.3.5) weiter bear-

beitet worden sind. Als Probenmaterial für die Dotierungsversuche diente Muskulatur aus der Medika-

tionsstudie in Haus Düsse, als CTC-haltige Proben wurde Muskulatur des Tieres 95 der Medikations-

studie an der FAL Braunschweig eingesetzt.

SPE-Verfahren: Zur Optimierung der SPE-Bedingungen erfolgte die Dotierung von 36 nicht belaste-

ten Muskulaturproben mit 200 µL einer CTC-Standardlösung (β = 10 mg/L). Die Proben wurden wie

oben beschrieben mit Methanol/McIlvain-Puffer pH 4 (20/80) (v/v) als Extraktionsmittel aufgearbeitet

und nach dem SPE-Verfahren (s. Kap. 7.5.3.5) aufgereinigt mit Ausnahme der Waschlösung, für des-

sen Optimierung Methanol/Wasser-Mischungen der Verhältnisse 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,

90 und 100 hergestellt und eine Dreifach-Bestimmung durchgeführt wurde.

7.5.4.4 Knochen

Für die nachfolgend beschriebenen Versuche dienten als Probenmaterial CTC-haltige Knochen aus der

Medikationsstudie in Haus Düsse sowie an der FAL. Zur Zerkleinerung wurden diese zunächst von

Fleischresten befreit, mit einer Knochensäge in der Pathologie des SVUA Detmold in Scheiben gesägt,

und am SVUA Krefeld mit einer Knochenmühle (s. Kap. 7.2.2) gemahlen. Die Proben wurden beim

Transport gekühlt und bis zur Analyse im SVUA Detmold tiefgefroren.

Zur Wahl eines geeigneten Extraktionsmittels wurden EDTA-McIlvain-Puffer pH 2, 3 und 4 mit 0,01

moL/L EDTA analog Kap. 7.5.3.2 hergestellt sowie HCl (1 moL/L) als Extraktionsmittel eingesetzt. 1

g mit einer Knochenmühle (s. Kap. 7.2.2) gemahlene Knochen (Medikationsstudie im Landwirt-

schaftszentrum Haus Düsse) wurden in ein 10 mL verschließbares Reagenzglas aus Polypropylen ge-

7 Experimenteller Teil 141

geben. Nach Zugabe von 15 mL des Extraktionsmittels wurde die Probenlösung über Nacht in den

Kühlschrank gestellt. Am nächsten Tag wurde 45 min bei 260 Schübe/min auf einem Horizontal-

schüttler (s. Kap. 7.2.3) geschüttelt und der Extrakt über einen Faltenfilter (595 ½ von Schleicher &

Schüll/Dassel) in ein 10 mL-Zentrifugenglas filtriert. Das PP-Röhrchen wurde mit 6 mL bidest. H2O

gespült und über den Faltenfilter zum Probenextrakt gegeben. Im Falle des Einsatzes von 1 moL/L

HCl als Extraktionsmittel wurde anschließend der pH-Wert mit 2 mol/L NaOH auf ca. 4 eingestellt.

Der durch 15-minütige Zentrifugation (gekühlte Zentrifuge: 10 °C) bei 3300 g erhaltene Überstand

aller Filtrate wurde zur Festphasenextraktion verwendet.

Die Überprüfung der Stabilität von CTC und e-CTC im salzsauren Extraktionsmittel erfolgte durch

Lagerung einer CTC-Einzelstandardlösung (β = 10 mg/L) und einer Mischstandardlösung aus CTC

und e-CTC (ß = 10 mg/L) in 1 moL/L HCl bei einer Temperatur von 5 °C über einen Zeitraum von 12

h und einer Konzentrationsbestimmung in Intervallen von 1 h mittels HPLC-UV (275 nm).

7.6 Validierung des Analysenverfahrens

Die nachfolgend beschriebenen Validierungsuntersuchungen wurden mit der in Kap. 7.2.1 angegebe-

nen HPLC-Anlage mit der Kopplung aus UV- und massenspektrometrischen Detektion (MS/MS)

durchgeführt. Die beschriebenen Validierungsparameter wurden sowohl für die UV- als auch für die

MS/MS-Detektion ermittelt. Die Aufarbeitung von Muskulaturproben erfolgte nach der Beschreibung

in Kap. 7.5.4.2. Um für die Validierung ausreichend unbelastetes Probenmaterial zu erhalten, wurde

Fleisch von einem Bio-Metzger bezogen und vorab auf nachweisbare CTC-Rückstände geprüft.

7.6.1 Linearer Bereich

Zur Bestimmung des linearen Bereiches für das HPLC-UV-Verfahren wurden Kalibrierlösungen aus

CTC und e-CTC, siehe Kap. 7.3.5, der Konzentrationen 0,1 mg/L; 0,18 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1

mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L; 10 mg/L; 25 mg/L; 50 mg/L und 100 mg/L hergestellt und zehnfach analy-

siert. Für die massenspektrometrische Detektion wurden Konzentrationen von 0,001 mg/L; 0,0025

mg/L; 0,005 mg/L; 0,01 mg/L; 0,02 mg/L; 0,04 mg/L; 0,05 mg/L 0,06 mg/L; 0,08 mg/L; 0,1 mg/L;

0,12 mg/L; 0,14 mg/L; 0,16 mg/L; 0,18 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L; 10

mg/L; 25 mg/L; 50 mg/L und 100 mg/L ausgewählt.

7.6.2 Kalibriergeraden

Der Arbeitsbereich mit der UV-Detektion wurde nach Überprüfung der Linearität mittels linearer Re-

gression mit einer Massenkonzentration von 0,18 mg/L bis 100 mg/L festgelegt. Zur Ermittlung der

Kalibriergeraden wurde eine Zehnfach-Bestimmung von zehn über den Arbeitsbereich verteilte Kon-

zentrationen von 0,18 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L; 10 mg/L; 25 mg/L; 50

mg/L und 100 mg/L durchgeführt.

Die Regressionsanalyse ergab für den gewählten vorläufigen Arbeitsbereich mit der massenspektrome-

trisache Detektion keinen linearen Zusammenhang, so daß der Arbeitsbereich in drei Teilbereiche

aufgeteilt wurde. Zur Ermittlung der drei Kalibriergeraden wurden mit jeweils sieben über die Ar-

beitsteilbereiche verteilte Konzentrationen von 0,005 mg/L bis 0,08 mg/L (0,005 mg/L; 0,01 mg/L;

0,02 mg/L; 0,04 mg/L; 0,05 mg/L 0,06 mg/L; 0,08 mg/L), von 0,1 mg/L bis 0,5 mg/L (0,1 mg/L; 0,12

7 Experimenteller Teil

142

mg/L; 0,14 mg/L; 0,16 mg/L; 0,18 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L) und von 1 mg/L bis 50 mg/L (1 mg/L;

2,5 mg/L; 5 mg/L; 7,5 mg/L; 10 mg/L; 25 mg/L; 50 mg/L) zehn Bestimmungen durchgeführt.

7.6.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

Zur Ermittlung der Nachweis- und Bestimmungsgrenzen wurden Kalibrierlösungen sowie mit CTC

dotierte Muskulaturproben in der Nähe der Nachweisgrenze jeweils sechsfach analysiert. Die Konzen-

trationen der Standardlösungen betrugen 0,0025 mg/L; 0,005 mg/L; 0,075 mg/L; 0,01 mg/L; 0,025

mg/L; 0,05 mg/L; 0,075 mg/L; 0,1 mg/L und 0,2 mg/L, die Muskulaturproben wurden mit 200 µL von

CTC-Standardlösungen der angegebenen Konzentrationen auf Gehalte von 0,1 µg/kg; 0,2 µg/kg; 0,3

µg/kg; 0,4 µg/kg; 0,8 µg/kg; 2 µg/kg; 3 µg/kg; 4 µg/kg und 8 µg/kg dotiert und nach dem im Anhang

in der Analysenvorschrift beschriebenen Verfahren aufgearbeitet.

7.6.4 Selektivität

7.6.4.1 Selektivitätstest durch Peaklöschung nach alkalischer Behandlung

Zur Löschung des CTC- und e-CTC-Peaks wurde Muskulatur (Tier 95, FAL) zunächst nach der im

Anhang beschriebenen Analysenvorschrift aufgearbeitet, wobei der Endrückstand des eingeengten

Eluates der SPE nicht in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v), sondern in 100 µl MeOH + 100 µL

1%ige NaOH (w/w), pH 12 aufgenommen und anschließend 30 Minuten im Wasserbad bei 60°C er-

wärmt wurde. Zum Vergleich wurde dieselbe Muskulaturprobe nach der allgemeinen Analysenvor-

schrift aufgearbeitet und analysiert.

7.6.4.2 Selektivitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten

Zum Vergleich der Retentionszeiten des CTC- und e-CTC-Peaks wurde Muskulatur nach der im An-

hang beschriebenen Analysenvorschrift aufgearbeitet und analysiert. Zusätzlich wurde eine Kalibrier-

lösung der Massenkonzentration 1 mg/L und mit der in Kap. 7.2.1 beschriebenen HPLC-UV-MS/MS-

Gerätekombination chromatographiert.

7.6.4.3 Selektivitätstest durch Vergleich der UV- und MS-Spektren

Zuim Vergleich der UV- und MS-Spektren dienten die in Kap. 7.6.4.2 angegebene Probe und Stan-

dardlösung. Die Aufnahme der Spektren erfolgte bei der UV-Detektion in einem Wellenlängenbereich

von 250 nm bis 400 nm, bei der MS/MS-Detektion wurde ein Produkt-Ionen-Scan des Precursor-Ions

mit m/z 479 im Massenbereich von m/z 100 bis m/z 500 aufgenommen.

7.6.5 Richtigkeit

Zur Ermittlung der Wiederfindungsfunktion wurden CTC-Standardlösungen dem kompletten Analy-

senverfahren unterzogen. Dazu wurden zu 9 mL des Extraktionsmittels MeOH/EDTA-McIlvain-

Puffer, pH 4 (0,01 mol/L) (20/80) (v/v) 200 µL von CTC-Lösungen der Konzentrationen 0,025, 0,1,

0,5, 1, 2,5, 5 und 10 mg/L zudotiert, nach der allgemeinen Analysenvorschrift aufgearbeitet und mit

HPLC-UV-MS/MS vermessen. Es wurde jeweils eine siebenfache Bestimmung durchgeführt. Für die

UV-Detektion ergaben sich aufgrund der Bestimmungsgrenze von CTC und e-CTC von 0,18 mg/L

7 Experimenteller Teil 143

fünf Konzentrationstufen von 0,5 mg/L bis 10 mg/L, für die massenspektrometrische Detektion lagen

alle sieben Konzentrationen oberhalb der Bestimmungsgrenze. Anschließend wurde die Wiederfin-

dungsfunktion für Muskulatur aufgestellt, indem zu jeweils 5 g Muskulatur 200 µL von CTC-

Standardlösungen der Konzentrationen 0,025, 0,1, 0,5, 1, 2,5, 5 und 10 mg/L zudotiert, nach der Ana-

lysenvorschrift im Anhang aufgearbeitet und mittels HPLC-UV-MS/MS vermessen wurde.

7.6.6 Matrixbedingte Signalbeeinflussung bei der massenspektrometri-

schen Detektion

7.6.6.1 Matrixkalibrierung

Zur Überprüfung von supressiven Effekten bei der MS/MS-Detektion wurde nicht belastete Muskula-

tur in fünfzehn Aliquote aufgeteilt und nach der im Anhang beschriebenen Vorschrift aufgearbeitet,

wobei der Endrückstand des eingeengten Eluates der SPE nicht in Methanol/Fließmittel A (50/50)

(v/v), sondern in CTC-Standardlösungen in Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v) der Massenkonzen-

trationen 0,25 mg/L; 1 mg/L und 10 mg/L, entsprechend einer Fünf-Fach-Bestimmung, aufgenommen

wurde.

7.6.6.2 Kontinuierliche Nachsäulen-Injektion von CTC

Zur weiteren Aufdeckung von Matrixeffekten erfolgte die kontinuierliche Zuführung einer CTC-

Standardlösung zum HPLC-Fluß während des gesamten Chromatographielaufes nach Injektion einer

unbelasteten Muskulaturprobe. Der Gradientenverlauf sowie die Flußrate entsprachen der allgemeinen

Analysenvorschrift im Anhang. Über ein T-Stück wurde dem HPLC-Fluß „post-column“ eine CTC-

Standardlösung der Massenkonzentration 10 mg/L über eine Spritzenpumpe (Havard Apparatus der

Firma Applied Biosystems/Darmstadt) mit einer Flußrate von 2,5 µL/min zugeführt. Die massenspek-

trometrische Detektion erfolgte durch Aufnahme eines Produktionen-Scans im Massenbereich m/z von

100 bis m/z 500 des Precursor-Ions m/z 479.

7.6.7 Präzision

7.6.7.1 Meßpräzision

Zur Ermittlung der Meßpräzision wurden fünf Muskulaturproben der Tiere 93-97 aus der Medikati-

onsstudie in der FAL in Braunschweig nach der allgemeinen Analysenvorschrift im Anhang aufgear-

beitet und achtfach mittels HPLC-UV-MS/MS chromatographisch vermessen.

7.6.7.2 Methodenpräzision

Zur Ermittlung der Methodenpräzision wurden die Muskulaturproben der Tiere 93-97 aus der Medika-

tionsstudie an der FAL in Braunschweig in jeweils acht Aliquote von 5 g aufgeteilt, nach der allge-

meinen Analysenvorschrift im Anhang aufgearbeitet und mittels HPLC-UV-MS/MS vermessen.

7 Experimenteller Teil

144

7.6.8 Validierungsparameter für Urin, Kot, Plasma, Knochen, Leber und

Niere

Analog der in den vorangehenden Kapiteln beschriebene Vorgehensweise sind für Urin, Kot, Plasma,

Knochen, Leber und Niere einzelne Validierungsparameter für die MS/MS-Detektion ermittelt wor-

den. Als Probenmaterial diente mit Ausnahme von Faeces, wofür die Nullprobe der Medikationsstudie

an der FAL in Braunschweig eingesetzt wurde, die unbelasteten Proben der Kontrolltiere aus der Me-

dikationstudie im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse. Zur Ermittlung der Wiederfindung wurde zu 5

mL Urin, 5 mL Plasma, 5 g Niere und 5 g Leber 200 µL CTC-Standardlösung der Massenkonzentra-

tionen 250 µg/L und 2,5 mg/L auf Gehalte von 10 µg/kg und 100 µg/kg zudotiert und nach dem all-

gemeinen Verfahren analysiert. Im Falle von Faeces wurde zu 0,5 g Probenmaterial 400 µL CTC-

Standardlösung der Konzentrationen 62,5 mg/L und 625 mg/L auf Gehalte von 50 µg/kg und 500

µg/kg zudotiert und entsprechend aufgearbeitet und vermessen. Für alle Matrices erfolgte für jede

Konzentrationsstufe eine sechsfache Bestimmung. Zur Ermittlung der Validierungsparameter für Kno-

chen wurde CTC-haltiges Probenmaterial aus der Medikationsstudie in Haus Düsse eingesetzt, wobei

die Probeneinwaage 1 g betrug. Anhand der hierbei erhaltenen Analysenergebnisse erfolgte die Be-

rechnung der Methodenpräzision als Mittelwert beider Konzentrationsstufen. Der Ermittlung der

Nachweis- und Bestimmungsgrenze lag das Signal-Rausch-Verhältnis zugrunde, wobei analog Kap.

5.3.2 die Nachweisgrenze das dreifache und die Bestimmungsgrenze das neunfache Grundrauschen

beträgt. Die Ermittlung des Signal-Rausch-Verhältnisses erfolgte anhand von jeweils zwölf ausge-

wählten Chromatogrammen der untersuchten Proben der Medikationsstudie im Landwirtschaftszen-

trum Haus Düsse.

7.7 Identifizierung tautomerer Verbindungen von CTC

Zur Überprüfung, aus welchen Substanzen die weitere in Realproben auftretende Verbindung entsteht,

wurden Einzelstandardlösungen aus CTC, e-CTC und iso-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v)

(β = 10 mg/L) bei einer Temperatur von 80 °C zwei Stunden im Wasserbad erwärmt und anschließend

chromatographisch mittels HPLC-UV-MS/MS vermessen. Zur Identifizierung tautomerer Verbindun-

gen mit HPLC-UV wurde eine Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC in 1 moL/L HCl (β = 10

mg/L) nach einer Lagerung von 12 Stunden bei einer Temperatur von 5 °C chromatographisch ver-

messen. Zur Identifzierung tautomerer Verbindungen von CTC mittels MS/MS wurde eine Mischstan-

dardlösung aus CTC und e-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (β = 10 mg/L) bei einer Tempe-

ratur von 80 °C zwei Stunden im Wasserbad erwärmt. Die so erhaltene Lösung enthält neben CTC, e-

CTC, iso-CTC und e-iso-CTC auch die zusätzlich in Realproben auftretende isomere Verbindung.

Diese Lösung wurde chromatographisch mit LC-MS/MS durch Aufnahme von Produkt-Ionen-Scans

von m/z 100-500 des Precursor-Ions mit m/z 479 bei verschiedenen Kollisionsenergien von 25 eV, 30

eV, 35 eV und 40 eV vermessen.

7.8 In vitro-Bildung von Metaboliten des CTC

Zur Untersuchung, von Umwandlungsreaktionen wurden analog Kap. 7.5.2 Einzelstandardlösungen

von CTC-, e-CTC-, iso-CTC-, Anhydro-CTC- und e-Anhydro-CTC-Lösungen (β = 10 mg/L) in Me-

OH/Fließmittel A (50/50) (pH 2,8) bei einer Temperatur von 40 °C über einen Zeitraum von 60 h auf-

7 Experimenteller Teil 145

bewahrt und in Zeitintervallen von einer Stunde mit HPLC-UV-MS/MS chromatographisch vermes-

sen.

7.9 Antibiotische Aktivitäten

7.9.1 Agar-Diffusionstest

Nährboden: Zur Nährbodenherstellung wurde ein Trockennährboden der Zusammensetzung: 3,45 g

Fleischpepton; 3,45 g Caseinpepton; 5,1 g NaCl und 13 g Agar verwendet. Der Trockennährboden

wurde in 1 L bidest. H2O aufgelöst und zur Pufferung 0,1 % KH2PO4 hinzugefügt. Anschließend er-

folgte die Einstellung der pH-Werte (6; 7,2; und 8) mit 0,1 moL/L HCl oder 0,1 moL/L NaOH. Der

pH-Wert der Nährböden wurde nach dem zur Sterilisation durchgeführten Autoklavieren (15 Minuten,

T = 121 °C) überprüft. Zur Vorbereitung des Nährbodens auf den DPT wurden 500 mL des so verflüs-

sigten Nährbodens auf eine Temperatur von 50 °C abgekühlt und mit 0,5 mL einer Sporensuspension

unter Schütteln gleichmäßig vermischt und 15 mL Petrischalen gegossen, so daß nach dem Erstarren

eine gleichmäßige Schichtdicke von 2 mm vorhanden war. Nach dem Erstarren des Nährbodens wur-

den die Petrischalen sofort bei einer Temperatur von 3 °C bis 5 °C gekühlt und innerhalb von drei

Tagen verwendet.

Testkeim und Sporensuspension: Als Testkeim wurde Bacillus subtilis BGA (Merck/Darmstadt)

verwendet. (Die Testkeime sind einer Überprüfung der Sensibilität sowie der Resistenzeigenschaften

unterzogen worden.) Zur Herstellung der Sporensuspension wurde ein Nährboden mit der oben ge-

nannten Zusammensetzung auf einen pH-Wert von 7 eingestellt und nach Überschichten mit 1 mL der

bezogenen Keimsuspension zehn Tage bei einer Temperatur von 30 °C bebrütet. Danach wurde der

Testkeim mit steriler physiologischer NaCl-Lösung abgeschwemmt. Die Abschwemmung wurde 10

Minuten bei 2500 g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgegossen, dem Sediment nochmals NaCl-

Lösung zugegeben und 10 Minuten bei 2500 g zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt und die

Suspension 30 Minuten bei einer Temperatur von 70 °C erhitzt. Die so gewonnene Sporensuspension

wurde mit NaCl-Lösung so verdünnt, daß eine Keimdichte von 107/mL resultierte. Die Überprüfung

der Keimdichte erfolgte als kulturelle Keimzählung im Oberflächenverfahren.

Dreiplattentest (DPT): Zur Durchführung des Dreiplattentestes nach der Agar-Loch-Methode wurde

mit einem Probenstanzgerät ein Loch mit einem Durchmesser von 8 mm in die Agarplatten gestanzt

und 25 µL einer methanolischen Standardlösung von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC, e-Anhydro-CTC

und iso-CTC (ß = 100 mg/L) in das Loch gegeben. Die mit der Standardlösung beschickten Agarplat-

ten wurden im Brutschrank bei einer Temperatur von 30 °C 18 bis 24 Stunden bebrütet.

Auswertung: Die Hemmzone wurde als Radius in mm angegeben und zwischen dem Lochrand und

der Wachstumsgrenze ausgemessen. Vollständige Wachstumshemmung mit einer Hemmzone von

mindestens 2 mm ist als positiver Befund, eine Hemmzone von 1 mm bis 2 mm als zweifelhafter Be-

fund anzusehen.

7.9.2 Abbaureaktionen während des Agar-Diffusionstestes

Zur zeitabhängigen Untersuchung von Abbaureaktionen während des DPT wurde der Test mit metha-

nolischen Standardlösungen von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC und unterschiedli-

7 Experimenteller Teil

146

che Bebrütungszeiten durchgeführt, indem zu Agar-Platten der pH-Werte 6; 7,2 und 8, siehe Kap.

7.9.1, 25 µL methanolischer Einzellösung von CTC, e-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC einer

Konzentration von 100 mg/L gegeben und die Agar-Platten bei einer Temperatur von 30 °C über Zeit-

räume von 1, 2, 3, 18, 20, 22 und 24 Stunden bebrütet wurden. Nach Ausmessen der Hemmhöfe er-

folgte die Extraktion der Agar-Platten mit Methanol. Es wurden zweimal 50 µL Methanol in die aus-

gestanzten Löcher gegeben und anschließend in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß (2 mL) überführt. Da-

nach wurde der Agar, bei dem ein Hemmhof entstanden ist, ausgeschnitten und ebenfalls in das Ep-

pendorf-Reaktionsgefäß gegeben. Nach weiterer Zugabe von 900 µL Methanol wurde die so erhaltene

Agar-Methanol-Mischung gut geschüttelt. Nach Abzentrifugieren des Agars bei 4100 g für 15 min.

wurden die Extrakte ohne weitere Aufarbeitung mittels LC-MS/MS vermessen.

7.10 Methodenentwicklung zur quantitativen Bestimmung weiterer

CTC-Metabolite

7.10.1 Herstellung einer Standardlösung aus iso-CTC und e-iso-CTC

Zur Herstellung einer Mischstandardlösung aus iso-CTC und e-iso-CTC wurde eine Standardlösung

von iso-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (β = 100 mg/L) hergestellt, in verschraubbare PP-

Röhrchen (14 mL, 16 x 100 mm; Merck/Darmstadt) gefüllt, verschraubt und 90 Minuten im Wasser-

bad bei einer Temperatur von 60 °C erwärmt. Die so erhaltene Mischstandardlösung enthielt iso-CTC

und e-iso-CTC in einem Massenverhältnis von etwa 1:1. Ein Teil der iso-CTC-Lösung wurde nicht

erwärmt, um die Konzentration von iso-CTC in dem epimerisierten Standard ermitteln zu können.

Beide Lösungen wurden 1:10 verdünnt und mittels HPLC-UV-MS/MS vermessen. Der Gehalt an e-

iso-CTC im epimerisierten Standard ergibt sich als Differenz des iso-CTC-Gehaltes in beiden Lösun-

gen. Durch Verdünnen dieses epimerisierten Standards kann dann eine Kalibriergerade von iso-CTC

und e-iso-CTC aufgenommen werden.

7.10.2 Linearer Bereich

iso-CTC und e-iso-CTC: Zur Bestimmung des linearen Bereiches für das HPLC-UV-Verfahren wur-

den Kalibrierlösungen aus iso-CTC und e-iso-CTC, siehe Kap. 7.10.1, der Konzentrationen 0,05

mg/L; 0,1 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L und 10 mg/L hergestellt und acht-

fach analysiert. Für die massenspektrometrische Detektion wurden Konzentrationen von 0,01 mg/L;

0,025 mg/L; 0,05 mg/L; 0,1 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L und 10 mg/L

ausgewählt.

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC: Zur Bestimmung des linearen Bereiches für das HPLC-UV-

Verfahren wurden Kalibrierlösungen aus Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC im Massenverhältnis 1:1

in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) der Konzentrationen 0,025 mg/L; 0,05 mg/L; 0,1 mg/L; 0,25

mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L und 10 mg/L hergestellt und achtfach analysiert. Für die

massenspektrometrische Detektion wurden Konzentrationen von 0,01 mg/L; 0,025 mg/L; 0,05 mg/L;

0,1 mg/L; 0,25 mg/L; 0,5 mg/L; 1 mg/L; 2,5 mg/L; 5 mg/L und 10 mg/L ausgewählt.

7 Experimenteller Teil 147

7.10.3 iso-CTC und e-iso-CTC als Summenparameter

Standardlösungen: Zur Untersuchung, unter welchen Bedingungen eine vollständige Isomerisierung

von CTC und e-CTC stattfindet, wurden Mischstandardlösungen aus CTC und e-CTC in Me-

OH/(1%ige NaOH, w/v) (50/50) (v/v) (pH 11,5) (jeweils: β = 10 mg/L) über einen Zeitraum von 30

Minuten bei Temperaturen von 60, 70, 80 und 90 °C im Wasserbad erwärmt (n = 5) und chromato-

graphisch vermessen. Zum Vergleich wurde eine entsprechende Mischstandardlösung ohne Erwärmen

(β = 10 mg/L) sowie eine Mischstandardlösung aus CTC und e-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50)

(v/v) (β = 10 mg/L) vermessen (n = 5).

Muskulatur: Die Muskulaturproben der Versuchstiere 1, 3 7, 9 und 12 der Medikationsstudie im

Landwirtschaftszentrum Haus Düsse sowie die des Tieres 95 aus der Medikationsstudie an der FAL

wurden zunächst nach der allgemeinen Analysenvorschrift (siehe Anhang) aufgearbeitet. Das Eluat

der Festphasenextraktion wurde in 200 µL Methanol aufgenommen und der so erhaltene Probenextrakt

halbiert. Zu der einen Hälfte der Probenextrakte wurden 100 µL Fließmittel A, zur anderen Hälfte der

Proben wurden zur alkalischen Behandlung 100 µL 1%ige NaOH (w/v) (pH 11,5) gegeben. Die alka-

lisch behandelten Proben wurden 30 Minuten im Wasserbad bei einer Temperatur von 60 °C erwärmt.

Alle erhaltenen Extrakte wurden mittels HPLC-UV-MS/MS chromatographisch vermessen.

7.10.4 Wiederfindung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Zu 10 mL EDTA-McIlvain-Puffer, pH 4 (0,1 moL/L EDTA) wurden 200 µL von Einzelstandardlö-

sungen der Substanzen iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC (β = 10 mg/L) zudotiert und die

SPE wie unter Kap. 7.5.3.5 beschrieben durchgeführt.

7.10.5 Einfluß einzelner Probenvorbereitungsschritte auf die Epimerisie-

rung von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Um zu überprüfen, in welchem Schritt der Probenvorbereitung eine Epimerisierung stattfindet, wurden

anhand von Standardlösungen von iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC Teilschritte des SPE-

Verfahrens durchgeführt und die resultierenden Gehalte der jeweiligen Epimerenpaare mittels HPLC-

UV (s. Kap. 7.2.1) ermittelt. Die Quantifizierung von e-iso-CTC erfolgte durch externe Kalibrierung

mit einer iso-CTC-Standardlösung bei einer Wellenlänge von 275 nm. Die Durchführung der einzel-

nen Versuche wurde bereits in Kap. 5.8.2.2 beschrieben (s. Tab. 8).

7.11 Gebundene CTC-Rückstände in Knochen

7.11.1.1 Freisetzung von CTC aus Knochen

Zur Überprüfung einer in vitro-Freisetzung von CTC aus Knochen wurde CTC-haltiges gemahlenes

Knochenmaterial mit unbelastetem Plasma gemischt, über mehrere Tage aufbewahrt und in verschie-

denen Zeitabständen der Gehalt an CTC, e-CTC, iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC und e-Anhydro-

CTC ermittelt. Das für den Versuch eingesetzte Plasma wurde aus Heparin-Vollblut gewonnen. Die

Blutproben wurden vom Schlachthof Paderborn (Westfleisch) bezogen, wobei zunächst mehrere Blut-

proben auf nachweisbare Rückstände von CTC mit dem in Kap. A. 9 im Anhang beschriebenen Ver-

fahren untersucht wurden. Die zur Probenahme notwendigen Gefäße mit der Heparin-Lösung wurden

7 Experimenteller Teil

148

uns von der Firma Kabe zur Verfügung gestellt. Die Gefäße enthielten 41 i.U./mL Li-Heparin, gelöst

in bidest. Wasser (5%ig), entsprechend der entnommenen Blutmenge von 1 L. Als Knochenmaterial

dienten die Knochenproben des Tieres 95 aus der Medikationsstudie an der FAL. Die Zerkleinerung

der Knochen erfolgte, wie in Kap. 7.5.4.4 beschrieben. Nach Bestimmung der Gehalte von CTC und

Metabolite im Knochen (siehe Kap. A. 9 im Anhang) und der Gewinnung des Plasmas erfolgte die

Inkubation von vier Knochen-Plasmaproben. Von den durch Versetzen von 15 g Knochen mit 25 mL

Plasma hergestellten Knochen-Plasmaproben wurden zwei bei einer Temperatur von 5 °C und zwei

bei einer Temperatur von 39,5 °C aufbewahrt.

Um die Stabilität von CTC in Plasma unter diesen Bedingungen zu überprüfen, wurden folgende vier

Plasmaproben hergestellt: Zu 20 mL Plasma wurde 200 µg CTC, entsprechend einer Konzentration

von 10 µg CTC/mL Plasma, zudotiert. Zwei dieser Proben wurden entsprechend der Knochen-Plasma-

Proben bei einer Temperatur von 5 °C aufbewahrt, die anderen beiden bei 39,5 °C. Der pH-Wert aller

Proben betrug 7,6. Über einen Versuchszeitraum von neun Tagen wurden den Proben an den Ver-

suchstagen 1, 2, 3, 4, 5, 8 und 9 jeweils 1 mL Plasma entnommen und mit dem in Kap. A. 9 im An-

hang aufgeführten Verfahren analysiert.

7.11.1.2 Fluoreszenz-Screening-Test

Die in Scheiben geschnittenen und von Fleischresten befreiten Knochenproben der Medikationsstudi-

en im Landwirtschaftszentrum Haus Düsse und an der FAL wurden zur Untersuchung der Fluoreszenz

der in den Knochen eingelagerten Calcium-Tetracyclin-Komplexe mit einer UV-Lampe (s. Kap.

7.2.8) bei einer Wellenlänge von 366 nm bestrahlt.

8 Literatur 149

8 Literatur

[1] R. Sattelberger; Arzneimittelrückstände in der Umwelt - Bestandsaufnahme und Problemdarstellung; Bericht des Um-

weltbundesamtes; Wien; 1999

[2] H.-H. Frey, W. Löscher; in: Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie für die Veterinärmedizin; Enke Verlag, Stutt-

gart; 2. Aufl.; 2002; 592-597

[3] I. Schmerold; in: Wiener Mitteilungen: Arzneimittel in der aquatischen Umwelt: Umwelttoxikologische Risikoabschät-

zung bei Tierarzneimitteln; 2002; 178; 83-89

[4] F.R. Ungemach; Einsatz von Antibiotika in der Veterinärmedizin: Konsequenzen und rationaler Umgang; 1999; Tie-

rärztl. Prax.; 27 (G); 335-340

[5] F. Ungemach; Figures on the quantities of antibacterials used for different purposes in the EU countries and interpreta-

tion; 2000, Acta vet. scand.; suppl. 93; 89-98

[6] H. Trolldenier, R. Kroker; Übersicht verfügbarer Chemotherapeutika in der Veterinärmedizin; Dtsch. Tierärztebl.; 1998;

10; 996-997

[7] W. Schmitz; Antibiotika und Chemotherapeutica; in: Arzeimittelverordnungsreport `97; Gustav Fischer Verlag Stuttgart;

1997; 64-81

[8] D.G. Kennedy, A. Cannavan, R.J. McCracken; Regulatory problems caused by contamination, a frequently overlooked

cause of veterinary drug residues; 2000; J. Chromatogr. A; 882; 37-52

[9] G.K. Poon, G. Kwei, R. Wang, K. Lyons, Q. Chen, V. Didolkar, C.E.C.A. Hop; Intergarting Qualitative and Quantitative

Liquid Chromatography/Tandem Mass Spectrometric Analysis to Support Drug Discovery; 1999; Rapid. Commun. Mass

Spectrom.; 13; 1943-1950

[10] H. Trolldenier; Antibiotika in der Tierhaltung; 1998; Dtsch. Tierärztebl.; 4; 352-353

[11] F.J. Schenck, P.S. Gallery; Chromatographic methods of analysis of antibiotics in milk; 1998; J. Chromatogr. A; 812;

99-109

[12] A.D. Cooper, C.S. Creaser, W.H.H. Farrington, J.A. Tarbin, G. Shearer; Development of multi-residue methodology for

the HPLC-Determination of veterinary drugs in animal tissues; 1995; Food Addit. Contam.; 12 (2); 167-176

[13] A.H. Farnleitner, R:L: Mach; in: Wiener Mitteilungen: Antibiotika und Resistenzproblematik in aquatischen Systemen ;

2002; 178; 151-178

[14] H. Trolldenier; Überblick zum Resistenzgeschehen schweinepathogener Erreger von 1976-1998 in der ehemaligen DDR

und in den jetzigen Neuen Bundesländern; 2001; Tierärztl. Umschau; 56; 292-298

[15] Zwischenbericht zum Forschungsvorhaben: Erfassung phänotypischer und genotypischer Resistenzeigenschaften bei

Salmonella- und E. coli-Isolaten vom Tier, Lebensmitteln, Futtermitteln und der Umwelt

[16] ANON.; Resistenzerfassung und –auswertung in der Veterinärmedizin; 1997; Bundesgesundheitsbl.; 11; 431-434

[17] Komission zur Prüfung von Rückständen in Lebensmitteln (Deutsche Forschungsgemeinschaft): Die Verwendung von

Tetracyclinen bei lebensmittelliefernden Tieren; Harald Boldt Verlag; 1978

[18] K.A. Dawson, B.E. Langlois, T.S. Stahly, G.L. Cromwell; Multiple antibiotic resistance in fecal, cecal and colonic

coliforms from pigs fed therapeutic and subtherapeutic concentrations of chlortetracycline; 1983; J. animal science; 57

(5); 1225-1234

[19] L.H. Wieler, G. Baljer; Rationaler Umgang mit Antibiotika in der Veterinärmedizin; Dtsch. Tierärztebl.; 47 (3); 227

[20] R. Helmuth; Molekulare Mechanismen der Resistenz und ihrer Ausbreitung am Beispiel der Salmonellen; 1999; Tie-

rärztl. Prax.; 27 (G); 306-309

[21] G. Pschorn; Bericht zur Lage; 2000; Dtsch. Tierärztebl.; 48 (1); 8-12

[22] L.H. Wieler, G. Baljer; Antibiotika und Resistenzproblematik: hygenische und immunologische Alternativen; 1999;

Tierärztl. Prax.; 27 (G); 341-347

[23] A.O. Summers; Generally overlooked fundamentals of bacterial genetics and ecology; 2002; Clin. Infect. Dis.; 34 (3);

85-92

[24] B. Schlatterer; Bakterielle Resistenzen – Stand und Entwicklungen bei Isolaten aus Mensch und Tier; 1995; Dtsch.

tierärztl. Wochenschr.; 102; 251-256

[25] B. Halling-Sørensen, S.N. Nielsen, P.F. Lanzky, F. Ingerslev, H.C. Holten Lützhoft, S.E. Jorgensen; Occurence, Fate

and Effects of Pharmaceutical Substances in the Environment – A Review; 1998; Chemosphere; 36 (2); 357-393

[26] A.S. Ahl, B. Buntain; Risk and the food safety chain: animal health, public health and the environment; 1997; Rev. sci.

Off. int. Epiz.; 16 (1); 322-330

[27] R. Hirsch, T.A. Ternes, K. Haberer, A. Mehlich, F. Ballwanz, K.-L. Kratz; Determination of antibiotics in different

water compartments via liquid chromatography-electrospray tandem mass spectrometry; 1998; J. Chromatogr. A; 815;

213-223

[28] R. Hirsch, T.A. Ternes, K.-L. Kratz; Occurence of antibiotics in the aquatic environment; 1999; Sci. Total Environ.;

225; 109-118

[29] M.-L. Loke, S. Jespersen, R. Vreeken, B. Halling-Sørensen, J. Tjørnelund; Determination of oxytetracycline and its

degradation products by high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in manure-containing

anaerobic test systems; 2003; J. Chromatogr. B; 783; 11-23

[30] G. Hamscher, S. Sczesny, A. Abu-Qare, H. Höper, H. Nau; Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich hor-

8 Literatur

150

monell aktiver Substanzen in der Umwelt: Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden; 2000; Dtsch. Wschr.;

107 (8); 332-334

[31] BLAC-Arbeitsgruppe ( Bund/Länderausschuß für Chemikaliensicherheit): Auswirkungen der Anwendung von Clofibrin-

säure und anderer Arzneimittel auf die Umwelt und Trinkwasserversorgung; Hamburg; 1998

[32] B. Halling-Sørensen, G. Sengelov, F. Ingerslev, L.B. Jensen; Reduced Antimicrobial Potencies of Oxytetracycline,

Tylosin, Sulfadiazin, Streptomycin, Ciprofloxacin, and Olaquindox Due to Environmental Processes; 2003; Arch. Envi-

ron. Contam. Toxicol.; 44; 7-16

[33] A.B.A. Boxall, D.W. Kolpin, B. Halling-Sørensen, J. Tolls; Are VeterinaryMedicines Causing Environmental Risks?;

2004; Environmental Science; August 1; 287 A-294 A

[34] L. Nozal, L. Arce, B.M. Simonet, A. Rios, M. Valcarcel; Rapid determination of trace levels of tetracyclines in surface

water using continuous flow manifold coupled to a capillary electrophoresis system; 2004; Anal. Chim. Acta; 517; 89-

[35] M. Silvia Diaz-Cruz; Environmental behavior and analysis of veterinary and human drugs in soils, sediments and

sludge; 2003; Trends in Analytical Chemistry; 22 (6); 340-351

[36] S. Thiele-Bruhn; Pharmaceutical antibiotic compounds in soils – a review; 2003; J. Plant Nutr. Soil Sci.; 166; 145-167

[37] W. Dürckheimer; Tetracycline: Chemie, Biochemie und Struktur-Wirkungsbeziehungen; 1975; Angew. Chem.; 87 (21);

751-784

[38] M.E. Langewische, H. Bottermann; Bedeutung von Arzneimittel-Rückständen für das Resistenzgeschehen und die Ex-

pression von Virulenzfaktoren unterhalb der MRL-Werte/subhinibitorischer Konzentrationen antimikrobieller Wirkstof-

fe; 2003; Amtstierärztlicher Dienst und Lebensmittelkontrolle; 10 (3); 300-309

[39] H.J.C.F. Nelis, A.P. De Leenheer; Metabolism of Minocycline in Humans; 1982; Drug Metabolism Disposition; 10 (2);

142-146

[40] R.G. Kelly, L.M. Peets, K.D. Hoyt; A Fluorometric Method of Analysis for Tetracycline; 1969; Anal. Biochem.; 28;

222-229

[41] A. Reja, L.Moreno, J.M. Serrano, D. Santiago; Concentration-Time Profiles of Oxytetracycline in Blood, Kidney, and

Liver of Tench (Tinca Tinca L) After Intramuscular Administration; 1996; Vet. Human. Toxicol:; 38 (5); 344-347

[42] C.G. Durbin, J.J. DiLorenzo, W.A. Randall, J. Wilner; Antibiotic Concentration and Duration in Animal Tissues and

Fluids II. Chicken Blood, Tissue, and Eggs; Antibiotics Annual 1953-1954; 428-432

[43] V. Ramazza, M. Zucchi, A. Lanzoni, C. Bianchi; Presence of oxitetracycline in pig farming after higher dosages and

longer administration times in comparison to the suggested ones; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.2): Conference on

Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Netherlands); 814-818

[44] S. Croubels, K. Baert, J. De Busser, P. De Backer; Residue Study of doxycycline and 4-epidoxycyclinein pigs medicated

via drinking water; 1998; Analyst; 123; 2733-2736

[45] R. Lindberg, P.-A. Jarnheimer, B. Olsen, M. Johansson, M. Tysklind; Determination of antibiotic substances in hospital

sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal

standards; 2004; Chemosphere; 57; 1479-1488

[46] R. Ueno, A. Kinoshita, J. Wakabayashi; Comparative pharmacokinetics of oxytetracycline in eel and its fate in a closed

aquatic environment; 2004; Aquaculture; 235; 53-63

[47] U. Gräfe; in: Biochemie der Antibiotika: Struktur-Biosynthese-Wirkmechanismus; Spektrum Akademischer Verlag,

Heidelberg; 1. Aufl.; 1992; 1-40

[48] W. Forth, D. Henschler, W. Rummel; in: Allgemeine und spezielle Phamakologie und Toxikologie; Wissenschaftsverlag,

Mannheim; 5. Aufl.; 1988; 580-715

[49] H. Auterhoff, J. Knabe, H.-D. Höltje; in: Lehrbuch der pharmazeutischen Chemie; Wissenschaftliche Verlagsgesell-

schaft, Stuttgart; 13. Aufl.; 1994; 741-795

[50] A.M. Walter, L. Heilmeyer; in: Antibiotika-Fibel; Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 4. Aufl.; 1975; 2-108, 319-361

[51] H. Brandis, G. Pulverer; in: Lehrbuch der medizinischen Mikrobiologie; Gustav Fischer Verlag, Stuttgart; 6. Aufl.;

1988; 13-64

[52] Aufbau von Bakterienzellen; Abbildung von der homepage: http://mi-staging.svhfi.securitas.net/sicherheitsnet/-

shop/content/3-935658-40-0/lese probe/ bakterienzelle.htm

[53] H.G. Schlegel; in: Allgemeine Mikrobiologie; Georg Thieme Verlag, Stuttgart; 5. Aufl.; 1981; 13-56

[54] N.A. Campbell; in: Biologie; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg; 1. Aufl.; 1997, 546-566

[55] Homepage der Paul-Ehrlich-Gesellschaft; Abbildung der Wirkmechansimen von Antibiotika; aus: http://www.p-e-g.de

[56] L.A. Mitscher, A.C. Bonacci, T.D. Sokoloski; Circular Dichroism and Solution Conformation of the Tetracycline Anti-

biotics; 1968; Tetrahedron Lett.; 51; 5361-5364

[57] R. Brunner, A. Rank, K. Riedl et al.; in: Die Antibiotica-Tetracycline; Verlag Hans Carl, Nürnberg; Band 1, Teil 2;

1962; 311-625

[58] J. Koza; Synthesis of 7-Substituted Tetracycline Derivatives; 2000; Org. Lett.; 2 (6); 815-817

[59] H. Muxfeldt; Synthese eines Terramycin-Bausteins; 1962; Angew. Chem.; 21; 825-828

[60] H. Muxfeldt; Synthesen in der Tetracyclin-Reihe; 1962; Angew. Chem; 13; 443-478

[61] M.C. Roberts; Tetracycline resistance determinants: mechanisms of action, regulation of expression, genetic mobility

and distribution; 1996; FEMS Micribiol. Rev.; 19; 1-24

8 Literatur 151

[62] D. Schnappinger, W. Hillen; Tetracyclines: antibiotic action, uptake and resistance mechanism; 1996; Arch. Microbiol.;

165; 359-369

[63] P.H. List, L. Hörhammer; in: Hagers Handbuch der Pharmazeutischen Praxis; Springer-Verlag; Berlin; 4. Aufl.; 1967;

1090-1117

[64] A.H. Kline, R.J. Blattner, M. Lunin; Transplacental Effect of Tetracyclines on Teeth; 1964; JAMA; 188 (2); 178-180

[65] S. Tanase, H. Tsuchiya, J. Yao, S. Ohmoto, N. Takagi, S. Yoshida; Reversed-phase ion-pair chromatographic analysis

of tetracycline antibiotics – Application to discolored teeth;1998; J. Chromatogr. B; 706; 279-285

[66] S. Pfeifer, B. Gildemeister, H.-H. Borchert, M. Otto; in: Biotransformation von Arzneimitteln; Verlag Chemie; Wein-

heim; Band 3; 1979; 9-454

[67] A. Anadon, M.R. Martinez-Larranaga, M.J. Diaz, P. Bringas, M.C. Fernandez, M.L. Fernandez-Cruz, J. Iturbe, M.A.

Martinez; Pharmakokinetics of doxycycline in broiler chickens; 1994; Avian Pathol.; 23; 79-90

[68] H.J. Eisner, F.E. Stirn, A.C. Dornbush, J.J. Oleson; The enhancement of serum levels of Aureomycin in experimental

animals; 1953; J. Pharm. Exp. Ther.; 108; 442-449

[69] A. Marzo, L. Dal Bo; Chromatography as an analytical tool for selected antibiotic classes: a reappraisal addressed to

pharmacokinetic application; 1998; J. Chromatogr. A; 812; 17-34

[70] R.A. Pollet, C.E. Glatz, D.C. Dyer, H.J. Barnes; Pharmacokinetics of chlortetracycline potentiation with citric acid in

the chicken; 1983; Am. J. Vet. Res.; 44; 1718-1721

[71] J. Fabre, J.S. Pitton, J.P. Kunz; Distribution and Excretion of Doxycyclin in Man; 1966; Chemotherapia; 11; 73-85

[72] A.M. Doi, M.K. Stoskopf, G.A. Lewbart; Pharmacokinetics of oxytetracycline in the red pacu (Colossoma brachy-

pomum) following different routes of administration; 1998; J. Vet. Pharmacol. Therap.; 21;364-368

[73] E. Pittenauer; in: Wiener Mitteilungen: Abbau und Verhalten von Arzneimittelwirkstoffen in der Umwelt; 2002; 178; 17-

[74] H.K. Eisner, R.J. Wulf; The metabolic Fate of Chlortetracycline and some comparisons with other Tetracyclines; 1963;

J. Pharmaceutical Experimental Therapeutics; 142; 122-131

[75] F. Baquero; Antibiotic-selective environments; 1998; Clin. Infect. Dis.; 27 (1); 5-11

[76] L.A. Mitscher, S.P. Pillai, E.J. Gentry, D.M. Shankel; Multiple Drug Resistance; 1999; Med. Res. Rev.; 19 (6); 477-496

[77] L. Stryer; Biochemie; Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg; 4. Aufl.; 1996, 861-873

[78] G. Breitfellner, R. Neuhold; Untersuchungen zur Frage der Kreuzresistenz von Tetracyclin, Oxytetracyclin, Chlortetra-

cyclin und Demethylchlortetracyclin an 40 Staphylokokkenstämmen; 1964; Chemotherapia; 8; 30-40

[79] W. Hinrichs, C. Kisker, M. Düvel, A. Müller, K. Tovar, W. Hillen, W. Saenger; Structure of the Tet Repressor-

Tetracycline Complex and Regulation of Antibiotic Resistance; 1994; Science; 264; 418-419

[80] V. Burdett; Streptococcal tetracycline resistance mediated at a level of protein synthesis; 1986; J. Bacteriol.; 165; 564-

569

[81] G.G. Guiney Jr.; P. Hasegawa, C.E. Davis; Expression in Escherichia coli of cryptic tetracycline resistance genes from

Bacteroides R plasmids; 1984; Plasmid; 11; 248-252

[82] B.S. Speer, L. Bedzyk, A.A. Salyers; Evidence that novel tetracycline resistance gene found on two Bacteroides trans-

posons encodes an NADP-requiring oxidase; 1991; J. Bacteriol.; 173; 176-183

[83] T. Lederer, M. Kintrup, M. Takahashi, P.-E. Sum, G. A. Ellestad, W. Hillen; Tetracycline Analogs Affecting Binding to

Tn10-Encoded Tet Repressor Trigger the Same Mechanism of Introduction; 1996; Biochemistry; 35; 7439-7446

[84] J. Degenkolb, M. Takahashi, G. A. Ellestad W. Hillen; Structural requirements of tetracycline-Tet repressor interac-

tion: Determination of equilibrium binding constants for tetracycline analogs with the Tet repressor; 1991; Antimicrob.

Agents Chemother.; 35 (8); 1591-1595

[85] BgVV; Antibiotikaresistenzen; 1997; Dtsch. Tierärztebl.; 45 (6); 532

[86] G.K. Jim, P.T. Guichon, O.C. Schunicht, B.K. Wildman, C.W. Booker; Introduction of the Issues Related to Antimicro-

bial Resistance in Beef Prduction; 1999; The Bovine Proceedings 32; 71-72

[87] W. Woltersdorf, U. Schmidt; Einfluß von Be- und Verarbeitungstechnologien auf Antibiotika-Rückstände im Fleisch; in:

Rückstände in Fleisch und Fleischerzeugnissen; Forschungsbericht der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG); Ha-

rald Boldt Verlag KG Boppard; 1975; 60-72

[88] U. Schmidt, W. Woltersdorf; Rückstände im Fleisch nach therapeutischer oder nutritiver Verabreicherung von Antibio-

tika; in: Rückstände in Fleisch und Fleischerzeugnissen; Forschungsbericht der Deutschen Forschungsgemeinschaft

(DFG); Harald Boldt Verlag KG Boppard; 1975; 73-83

[89] D. Großklaus; in: Rückstände in von Tieren stammenden Lebensmitteln; Verlag Paul Parey Berlin; 1. Aufl.; 1989, 35-39

[90] C.T. Chiou, G. Sheng, M. Manes; A partition-limited model for the plant uptake of organic contaminants from soil and

water; 2001; Environ. Sci. Technol.; 35; 1437-1444

[91] H. Hung, D. Mackay; A novel and simple model of zhe uptake of organic chemicals by vegetation from air and soil;

1997; Chemosphere; 35 (5); 959-977

[92] J.P. Langhammer, F. Führ, H. Büning-Pfaue; Verbleib von Sulfonamid-Rückständen aus der Gülle in Boden und Nutz-

pflanzen; 1989; Lebensmittelchem. Gerichtl. Chem.; 44; 93

[93] M. Grote; Forschungsauftrag: Versuche und Untersuchungen zur umweltverträglichen und standortgerechten Landwirt-

schaft; Abschlußbericht vom 14.01.2005: „Antiinfektivaeinträge aus der Tierproduktion in terrestrische und aquatische

Kompartimente“; Hrsg.: Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz des Landes

8 Literatur

152

NRW, Düsseldorf

[94] C.G. Daughton, T.A. Ternes; Pharmaceuticals and personal care products in the environment: agents of subtle change;

1999; Enivron. Health Perspec; 107 (6); 907-939

[95] B. Gooß; Erstellung des internetbasierten Antibiotika-Informationssystems „VetAbis“ für einen verantwortungsvollen

Umgang mit Antibiotika in der Rinderpraxis; 2001; Dissertation; Freie Universität Berlin

[96] E. Alcaide, E. Garay; R-plasmid transfer in Salmonella spp. isolated from wastewater and sewage-contaminated surface

waters; 1984; Appl. Environ. Microbiol.; 48; 435-438

[97] E. Tzelepi; Antibiotic susceptibilities of Yersinia enterocolitica and Y. intermedia isolates from aquatic environments;

1999; J. Med. Microbiol.; 48; 157-160

[98] P.M. Koenraad; Antibiotic susceptibility of camphylobacter isolates from sewage and poultry abattoir drain water;

1995; Epidemiol. Infect.; 115; 475-483

[99] J. Kamphues; Risiken der Medikatierung von Futter und Wasser in Tierbeständen; 1996; Deutsche tierärztl. Wochen-

schrift; 103; 250-256

[100] M. Kietzmann, W. Markus, J. Chavez, W. Bollwahn; Arzneimittelrückstände in unbehandelten Schweinen; 1995;

Dtsch. tierärztl. Wochenschr.; 102; 441-442

[101] P. Dorn, J. Neudegger, H.O. Knöppler; Zur Problematik der Wirkstoffverschleppung bei der Mischfutterherstellung am

Beispiel Nicarbazin; 1988; Tierärztl. Umsch.; 43; 524-529

[102] B. Jülicher; Tierarzneimittelrückstände und Lebensmittelüberwachung – Auswirkungen des EG-Rechts; Bundesge-

sundhbl.; 1992; 6; 281-286

[103] Fleischhygienegesetz (FlHG) vom 8.7.1993 (BGBl. I, S. 1189) in der Fassung vom 22.12.1997 (BGBl. I, S. 3224,

3240)

[104] Gesetz über den Verkehr mit Arzneimitteln (AMG) vom 19.10.1994 (BGBl. I, S. 3018) in der Fassung vom 5.11.1997

(BGBl. I, S. 2631, 2638)

[105] A. Somogyi, Gesundheitliche Bedeutung von Rückständen pharmakologisch wirksamer Substanzen in der Tierhaltung;

Bundesgesundhbl.; 1982; (25) 11; 365-370

[106] EMEA, The Eurpean Agency for the Evaluation of Medicinal Products: Committee for Veterinary Medicinal Prod-

ucts, „Note for guidance: approach towards harmonisation of withdrawal periods“; EMEA/CVMP/036/95

(http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/swp/003695en.pdf)

[107] BgVV, BTK; Verbot der Anwendung von bestimmten Arzneimitteln bei Lebensmittel liefernden Tieren; 1997; Dtsch.

Tierärztebl.; 45 (5); 434-436

[108] G. Eisenbrand, M. Metzler; in: Toxikologie für Chemiker: Stoffe, Mechanismen, Prüfverfahren, Georg Thieme Verlag,

Stuttgart; 1. Aufl.; 1994; 148-172

[109] VO Nr. 2377/90 (2000): Verordnung (EWG) Nr. 2377/90 des Rates zur Schaffung eines Gemeinschaftsverfahrens für

die Festsetzung von Höchstmengen für Tierarzneimittelrückstände in Nahrungsmitteln tierischen Ursprungs

[110] W. Prügner; Anwendung von Arzneimitteln bei lebensmittelliefernden Tieren: gesetzliche Aspekte; 1994; Tierärztl.

Umschau; 49; 647-653

[111] Lebensmittel- und Bedarfsgegenständegesetz (LMBG) (Gesetz über den Verkehr mit Lebensmitteln, Tabakerzeugnis-

sen, kosmetischen Mitteln und sonstigen Bedarfsgegenständen) in der Fassung vom 25.2.1998

[112] I. Schmerold, S. Scheid; Rückstandsproblematik beim Einsatz von Tierarzneimitteln: Höchstmengen und Wartezeit;

1994; Tierärztl. Umsch.; 49 (11); 709-713

[113] I. Schmerold, F.R. Ungemach; Das neue Konzept zur Festlegung von Rückstandshöchstmengen für Futterzusatzstoffe

in Lebensmitteln tierischen Ursprungs; 1998; Wiener Tierärztliche Monatsschrift; 85; 267-272

[114] Official Journal of the European Union; amending Decision 2002/657/EC as regards the setting of minimum required

performance limits (MRPLs) for certain residues in food of animal origin (2004/25/EC); 2004

[115] U. Körner; Tetracyclin-Rückstände in Tiermehlen und Fleischknochenmehlen; 2000; Dissertation, Tierärztliche Hoch-

schule Hannover

[116] EMEA, The Eurpean Agency for the Evaluation of Medicinal Products: Committeee for Veterinary Medicinal Prod-

ucts; Oxytetracycline, Tetracycline, Chlortetracycline-Summary Report (1-3) in: EMEA (Hrsg.)/MRL/023/95; 1995;

(http://www.emea.eu.int/pdfs/vet/mrls/Tetracyclines(3)02395.pdf)

[117] Evaluation of certain drug residues in food; Fiftieth report of the Joint FAO/WHO Committee on Food Aditives;

WHO; Geneva; 50-54; 1999

[118] Food and Drug Administration; Tolerances of residues of new animal drugs in food; Subpart B: Specific tolerances for

residues of new animal drugs; 1996

[119] Y. Liang, M.B. Denton, R.B. Bates; Stability studies of tetracycline in methanol solution; 1998; J. Chromatogr. A; 827;

45-55

[120] V. Naggar, N.A. Daabis, M.M. Motawi; Effect of Solubilizers on the Stability of Tetracycline; 1974; Pharmazie; 29;

H.2; 126-129

[121] V. Naggar, N.A. Daabis, M.M. Motawi; Solubilization of Tetracycline and Oxytetracycline; 1974; Pharmazie; 29; H.2;

122-125

[122] T. Strittmatter, M. Siewert; Zur Qualitätsbeurteilung der Tetracycline: Übersicht zur Stabilität und Analytik der Tetra-

cyclinderivate; 1981; Pharm. Ztg.; 126 (39); 1951-1954

8 Literatur 153

[123] C.R. Stephens, K. Murai, K.J. Brunings, R.B. Woodward; Acidity Constants of the Tetracycline Antibiotics; 1956; J.

Am. Chem. Soc.; 4155-4158

[124] J.M. Wessels, W.E. Ford, W. Szymczak, S. Schneider; The Complexation of Tetracycline and Anhydrotetracycline

with Mg2+ and Ca2+: A Spectroscopic Study; 1998; J. Phys. Chem. B; 102; 9323-9331

[125] J.L. Claizzi, P.R.Klink; pH-Partition behavior of Tetracyclines; 1969; J. Pharm. Sci.; 58; 1184-1189

[126] H.A. Duarte, S. Carvalho, E.B. Paniago, A.M. Simas; Importance of Tautomers in the Chemical Behavior of Tetracy-

clines; 1999; J. Pharm. Sci.; 88 (1); 111-120

[127] H. Lanig, M. Gottschalk, S. Schneider, T. Clark; Conformational Analysis of Tetracycline using Molecular Mechanical

and Semiempirical MO-Calculations; 1999; J. Mol. Model.; 5; 46-62

[128] H.F. Dos Santos, W.B. De Almeida, M.C. Zerner; Conformational Analysis of the Anhydrotetracycline Molecule: A

Toxic Decomposition Product of Tetracycline; 1998; J. Pharm. Sci.; 87 (2); 190-195

[129] G. Kuschinsky, H. Lüllmann; in: Kurzes Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie; Georg Thieme Verlag, Stutt-

gart; 12. Aufl.; 1989; 451-453

[130] A. Albert; Avidity of Terramycin and Aureomycin for Metallic Cations; 1953; Nature; 4370; 201

[131] A. Albert, C.W. Rees; Avidity of the Tetracyclines for the Cations of Metals; 1956; Nature; 4505; 433-434

[132] W.A. Baker, P.M. Brown; Metal Binding in Tetracyclines. Cobalt(II) and Nickel(II) Complexes; 1966; J. Am. Chem.

Soc.; 88 (6); 1314-1317

[133] M. Navak-Pekli, M. E.-H. Mesbah, G. Pethö; Equilibrium studies on tetracycline-metal ion systems; 1996; 14; 1012-

1029

[134] F.C.S. de Paula, S. Carvalho, H.A. Duarte, E.B. Paniago, A.S. Mangrich, E.C. Pereira-Maia; A physiochemical study of

the tertacycline coordination to oxovanadium(IV); 1999; J. Inorg. Biochem.; 76; 221-230

[135] W.B. De Almeida, H.F. Dos Santos, M.C. Zerner; Atheoretical Study of the Interaction of Anhydrotetracycline with

Al(III); 1998; J. Pharm. Sci.; 87 (9); 1101-1108

[136] P.D. Bryan, K.R. Hawkins, J.T. Stewart, A.C. Capomacchia; Analysis of Chlortetracycline by High Performance Liq-

uid Chromatography with Postcolumn Alkaline-induced Fluorescence Detection; 1992; Biomed. Chromatogr.; 6; 350-

310

[137] J.R.D. McCormick, S.M. Fox, L.L. Smith, B.A. Bitler, J. Reichenthal, V.E. Origoni, W.H. Muller, R. Winterbottom,

A.P.Doerschuk; Studies of the Reversible Epimerization Occurring in the Tetracycline Family. The Preparation, Prop-

erties and Proof of Structure of Some 4-epi-Tetracyclines; 1957; J. Am. Chem. Soc.; 79; 2849-2858

[138] D.A. Hussar, P.J. Niedergall, E.T. Sugita, J.T.Doluisio, Aspects of the epimerization of certain tetracycline derivatives;

1968; J. Pharm. Pharmac.; 20; 539-546

[139] E.G. Remmers, G.M. Sieger, A.P. Doerschuk; Some Observations on the Kinetics of the C-4 Epimerization of Tetracy-

cline; 1963; J. Pharm. Sci.; 52; 752-756

[140] E.E. Martinez, W. Shimoda; Liquid Chromatographic Determination of Epimerization of Chlortetracycline Residue to

4-epi-Chlortetracycline Residue in Animal Feed, Using McIlvain`s Buffer as Extractant; 1989; J. Assoc.Off. Anal.

Chem.; 72 (5); 848-850

[141] Homepage der Universität Freiburg; Eigenschaften von Tetracyclinen: http://www.fschemie.uni-freiburg.de/pharmi/

Pharm.Chem.64-73.pdf

[142] S.A. Barker, C.C. Walker, Chromatographic methods for tetracycline analysis in foods; 1992; J. Chromatogr.; 624;

195-209

[143] D.G. Kennedy, R.J. McCracken, M.P. Carey, W.J. Blanchflower, S.A. Hewitt; Iso-and epi-iso-chlortetracycline are

the principal metabolites of chlortetracycline in the hen`s egg; 1998; J. Chromatogr. A; 812; 327-337

[144] D.G. Kennedy, R.J. McCracken, S.A. Hewitt, J.D.G. McEvoy; Metabolism of chlortetracycline: drug accumulation

and excretion in the hen`s egg; 1998; Analyst; 123; 2443-2447

[145] S.Sczesny; Analytik von Tetracyclinen in Umwelt- und Lebensmittelproben mittels selektiver Extraktionsverfahren und

sensitivem Nachweis durch HPLC gekoppelt mit mikrobiologischem Assay und Tandem-Massenspektrometrie; 2001;

Dissertation; Tierärztliche Hochschule Hannover

[146] S. Sceszny, H. Nau, G. Hamscher; Residue Analysis of Tetracyclines and Their Metabolites in Eggs and in the Envi-

ronment by HPLC Coupled with a Microbiological Assay and Tandem Mass Spectrometry; 2003; J. Agric. Food

Chem.; 51; 697-703

[147] W.J. Blanchflower, R.J. McCracken, D.A. Rice; Determination of Chlortetracycline Residues in Tissues Using High-

Performance Liquid Chromatography With Fluorescence Detection; 1989; Analyst; 114; 421-423

[148] Y. Zhao, Y. Ci, W. Chang; Fluorescence enhancing by alkaline degradation of tetracycline antibiotics and its applica-

tion; 1997; Science in China B; 40 (4); 434-441

[149] W. Naidong, E. Roets, R. Busson, J. Hoogmartens; Separation of keto-enol-tautomers of chlortetracycline and 4-

epichlortetracycline by liquid chromatography on poly(styrene-divinylbenzene)copolymer; 1990; J. Pharm. Biomed.

Anal.; 8 (8); 881-889

[150] W. Naidong, S. Hua, E. Roets, R. Busson, J. Hoogmartens; Investigation of keto-enol tautomerism and ionization of

doxycycline in aqueous solutions; 1993; Int. J. Pharm.; 96; 13-21

[151] E. Weidenberg; Vergleich verschiedener Aufschlußverfahren zur Herstellung von Gelatine aus Knochen im Hinblick

auf Rückstände von Tetracyclinen; 2002; Dissertation; Tierärztliche Hochschule Hannover

8 Literatur

154

[152] F. Krämer-Horaczynska; High-Performance Liquid Chromatographic Procedures for the Quantitative Analysis of 15

Tetracycline Derivatives in Small Blood Samples; 1991; J. Chromatogr. Sci.; 29; 107-113

[153] G. Zurhelle; Entwicklung und Anwendung einer automatisierten HPLC-Methode mit gekoppelter on-line Dialyse:

Metabolismus, Verteilung und Elimination dreier Tetracycline bei Legehennen; 2000; Dissertation; Bergische Univer-

sität-Gesamt-hochschule Wuppertal

[154] K. De Braekeleer, A. de Juan, D.L. Massart; Purity assessment and resolution of tetracycline hydrochloride samples

analysed using high-performance liquid chromatography with diode array detection; 1999; J. Chromatogr. A; 832; 67-

[155] K. Dierick, N. Hamers; Preparation and evaluation of control samples used for the microbiological screening tests on

antibiotic residues; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.1): Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food

(Veldhoven, The Netherlands); 377-381

[156] L. Okerman, K. De Wasch, J. Van Hoof; An inhibition test intended to detect and to differentiate between penicillins,

cephalosporins, tetracyclines and quinolones, for use in muscle tissue from different animal species; 2000; in:

EURORESIDUE IV (Vol.2): Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Netherlands);

802-808

[157] H. Offereins, I. Engelen, B.G.M. Jongerius-Gortemaker, E.M.L. Geijp, F.M.P. de Bruijn, J. Stark, A.A. Bergwerff;

Premi®-Test for screening for antimicrobial substances in fish fillets; 2000; in: EURORESIDUE IV (Vol.2): Confer-

ence on Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Netherlands); 786-791

[158] S. Croubels, L. Okerman, K. Vanoosthuyze, J. Van Hoof, C. Van Peteghem; Confirmation of tetracycline residues ba

HPLC after microbiological and ELISA screening of kidney and meat tissue; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.1):

Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Netherlands); 362-366

[159] K. Tsuji, J.H. Robertson; Formation of trimethylsilyl derivatives of tetracyclines for separation and quantification ba

gas-liquid chromatography; 1973; Analytical Chemistry; 45; 2136-2140

[160] C.-X. Zhang, Z.-P. Sun, D.-K. Ling, Y.-J. Zhang; Separation of tetracycline and its degradation products by capillary

zone electrophoresis; 1992; J Chromatogr.; 627; 281-286

[161] Y.M. Li, V. Schepdael, E. Roets, J. Hoogmartens; Capillary zone electrophoresis of minocycline; 1996; J. Pharm.

Biomed. Anal.; 14; 1095-1099

[162] J. Zhou, G.C. Gerhardt, A. Baranski, R. Cassidy; Capillary electrophoresis of some tetracycline antbiotics coupled

with reductive fast cyclic voltammetric detection; 1999; J. Chromatogr. A; 839; 193-201

[163] M.J. Ruiz-Angel, R.D. Caballero, E.F. Simo-Alfonso, M.C. Garcia-Alvarez-Coque; Micellar liquid chromatography:

suitable technique for screening analysis; 2002; J. Chromatogr. A; 947; 31-45

[164] Y.-C. Chen, C.-E. Lin; Migration behavior and separation of tetracycline antibiotics by micellar electrokinetic chro-

matography; 1998; J Chromatogr. A; 802; 95-105

[165] A. Pena, L.P. Palilis, C.M. Lino, M.I. Silveira, A.C. Calokerinos; Detrmination of tetracyline and its major degrada-

tion products by chemiluminescence; 2000; Anal. Chim Acta; 405; 51-56

[166] S. Marczynski; Chemiluminescent Method for Determination of Tetracycline, Chlortetracycline, Minocycline, Doxycy-

cline, and Demeclocycline; 2000; Biopolymers (Biospectroscopy); 57; 365-372

[167] J. Kurittu, M. Karp, M. Korpela; Detection of tetracyclines with luminescent bacterial strains; 2000; Lumin.; 15; 291-

297

[168] S.A. Barker, C.C. Walker; Chromatographic methods for tetracycline analysis in foods; 1992; J. Chromatogr.; 624;

195-209

[169] P.J. Kijak, M.G. Leadbetter, M.H. Thomas, E.A. Thompson; Confirmation of Oxytetracycline, Tetracycline and Chlor-

tetracycline Residues in Milk by Particle Beam Liquid Chromatography/Mass Spectrometry; 1991; Biolog. Mass Spec-

trom.; 20; 789-795

[170] H. Oka, Y. Ito, H. Matsumoto; Chromatographic analysis of tetracycline antibiotics in food; 2000; J. Chromatogr. A;

882; 109-133

[171] B. Axisa, A.R. Naylor, P.R.F. Bell, M.M. Thompson; Simple and reliable method of doxycycline determination in

human plasma and biological tissues; 2000; J. Chromatogr. B; 744; 329-365

[172] H. Oka, Y. Ito, Y. Ikai, T. Kagami, K. Harada; Mass spectrometric analysis of tetracycline antibiotics in foods; 1998;

J. Chromatogr. A; 812; 309-319

[173] J.D. MacNeil, V.K. Martz, G.O. Korsrud, C.D.C. Salisbury, H. Oka, R.L. Epstein, C.J. Barnes; Chlortetracycline,

Oxytetracycline, and Tetracycline in Edible Animal Tissues, Liquid Chromatographic Method: Collaborative Study;

1996; J. of AOAC international; 79 (2); 405-417

[174] U. Jürgens, Zur hochdruckflüssigchromatographischen Analyse von Arzneimitelrückständen in Honig; 1981; Z. Le-

bensm. Unters. Forsch.; 173; 356-358

[175] D.N. Heller; Structure Elucidation of Tetracycline Antibiotics Using Electrospray Ionization and Multiple Stages of

Mass Spectrometry; 1992; U.S. Food & Drug Administration, Center for Veterinary Medicine; Laurel, MD 20708

[176] A. Posyniak, J. Zmudzki, S. Semeniuk, J. Niedzielska, R. Ellis; Determination of Tetracycline Residues in Animal

Tissues by Liquid Chromatography; 1998; Biomed. Chromatogr.; 12; 294-299

[177] T. Agasoster, Automated determination of oxytetracycline residues in muscle, liver, milk and egg by on-line dialysis

and post-column reaction detection; 1992; 9 (6); 615-622

[178] G. Zurhelle, E. Müller-Seitz, M. Petz; Automated residue analysis of tetracyclines and their metabolites in whole egg,

8 Literatur 155

egg white, egg yolk and hen´s plasma utilizing a modified ASTED system; 2000; J. Chromatogr. B; 739; 191-203

[179] J.H. Knox, J. Jurand; Mechanism of reversed-phase separation of tetracyclines by high-performance liquid chromatog-

raphy; 1979; J. Chromatogr.; 186; 763-782

[180] H.Oka, Y. Ikai, N. Kawamura, K. Uno, M. Yamada, K.-I. Harada, M. Uchiyama, H. Asukabe, M. Suzuki; Determina-

tion of eight tetracyclines using thin-layer and high-performance liquid chromatography; 1987; J. Chromatogr.; 393;

285-296

[181] Y. Vander Heyden, D.L. Mussart, Y. Zhu, J. Hoogmartens; J. De Beer; Ruggedness tests on the high performance

liquid chromatography assay of the United States Pharmacopeia 23 for tetracycline.HCl: comparison of different col-

umns in an interlaboratory approach; 1996; J. Pharm. Biomed. Anal.; 14; 1313-1326

[182] N.H. Khan, P. Wera, E. Roets, J. Hoogmartens; Quantitative analysis of tetracycline by high performance liquid chro-

matography on polystyrene-divinylbenzene packing materials; 1990; J. Liquid Chromatogr.; 13 (7); 1351-1374

[183] H. Oka, M. Suzuki; Comparison of analytical methods for determination of impurities in tetracycline pharmaceutical

preparations; 1984; J. Chromatogr.; 314; 303-311

[184] X. Ding, S. Mou; Ion chromatographic analysis of tetracyclines using polymeric column and acidic eluent; 2000; J.

Chromatogr. A; 897; 205-214

[185] J. Diana, G. Ping, J. Hoogmartens; Development and Validation of an Improved Liquid Chromatographic Method for

the Analysis of Oxytetracycline; 2002; Chromatographia; 56; 313-318

[186] A.G. Kazemifard, D.E. Moore; Evaluation of amperometric detection for the liquid-chromatographic determination of

tetracycline antibiotics and their common contaminants in pharmaceutical formulations; 1997; J. Pharm. Biomed.

Anal.; 16; 689-696

[187] R.J. McCracken, W.J. Blanchflower, S.A. Haggan, D.G. Kennedy; Simultaneous Determination of Oxytetracycline,

Tetracycline and Chrlotetracycline in Animal Tissues Using Liquid Chromatography, Post-column Derivatization With

Aluminium, and Fluorescence Detection; 1995; Analyst; 120; 1763-1766

[188] D.S. Vienneau, C.G. Kindberg; Development and Validation of a sensitive method for tetracycline in gingival crevicu-

lar fluid by HPLC using fluorescence detection; 1997; J. Pharm. Biomed. Anal.; 16; 111-117

[189] K. Iwaki, N. Okumura, M. Yamazaki; Determination of tetracycline antibiotics by reversed-phase high-performance

liquid chromatography with fluorescence detection; 1992; J. Chromatogr.; 623; 153-158

[190] A. Pena, A. Carmona, A. Barbosa, C. Lino, I. Silveira, B. Castillo; Determination of tetracycline and its major degra-

dation products by liquid chromatography with fluorescence detection; 1998; J. Pharm. Biomed. Anal.; 18; 839-845

[191] W.M.A. Niessen; Analysis of antibiotics by liquid chromatography-mass spectrometry; 1998; J. Chromatogr. A; 812;

53-75

[192] L. Romanyshyn, P.R. Tiller; C.E.C.A. Hop; Bioanalytical applications of fast chromatography to high-throughput

liquid chromatography/tandem mass spectrometric quantitation; 2000; Rapid. Commun. Mass. Spectrom.; 14; 1662-

1668

[193] A.L. Burlingame, R.K. Boyd, S.J. Gaskell; Mass spectrometry; 1998; Anal. Chem.; 70; 647R-705R

[194] D.G. Kennedy, R.J. McCracken, A, Cannavan, S.A. Hewitt; Use of liquid chromatography-mass spectrometry in zhe

analysis of residues of antibiotics in meat and milk; 1998; J. Chromatogr. A; 812; 77-98

[195] C.M. Lock, L. Chen, D.A. Volmer; Rapid Analysis of Tetracycline Antibiotics by Combined Solid Phase Microextrac-

tion/High Performance Liquid Chromatography/Mass Spectrometry; 1999; Rapid. Commun. Mass. Spectrom.; 13;

1744-1754

[196] W.M.A. Niessen; State-of-art in liquid chromatography-mass spectrometry; 1999; J. Chromatogr. A; 856; 179-197

[197] A.K. Lykkeberg, B. Halling-Sørrensen, C. Cornett, J. Tjørnelund, S.H. Hansen; Quantitative analysis of oxytetracy-

cline and its impurities by LC-MS-MS; 2004; J. Pharm. Biomed. Anal.; 34; 325-332

[198] B. Halling-Sørrensen, A. Lykkeberg, F. Ingerslev, P. Blackwell, J. Tjørnelund; Characterization of the abiotic degra-

dation pathways of oxytetracyclines in soil interstitial water using LC-MS-MS; 2003; Chemosphere; 50; 1331-1342

[199] W.C. Andersen, J.E. Roybal, S.A. Gonzales, S.B. Turnipseed, A.P. Pfenning, L.R. Kuck; U.S Food and Drug Admini-

stration: Determination of tetracycline residues in shrimp and whole milk using liquid chromatography with ultraviolet

detection and residue confirmation by mass spectrometry; 2005; Analytica Chimica Acta; 529 (1-2) 145-150

[200] G. Alfredsson, C. Branzell, K. Granelli, A. Lundstroem; Simple and rapid screening and confirmation of tetracyclines

in honey and egg by dipstick test and LC-MS/MS; 2005; Analytica Chimica Acta; 529 (1-2); 47-51

[201] R. Willoughby, E. Sheehan, S. Mitrovich; in: A Global View of LC-MS; Global View Publishing, Pittsburgh; 2nd Edi-

tion; 2002

[202] H. Budzikiewicz; in: Massenspektrometrie; Wiley-VCH, Weinheim; 4. Aufl.; 1998; 74-75

[203] R.A. Bethem, R.K. Boyd; Mass Spectrometry in Trace Analysis; 1998; J. Am. Soc. Mass Spectrom.; 9; 643-648

[204] F.W. McLafferty; Tandem mass spectrometric analysis of complex biological mixtures; 2001; J. Mass. Spectrom.; 212;

81-87

[205] X. Tong, I.E. Ita, J. Wang, J.V. Pivnichny; Characterization of a technique for rapid pharmacokinetic studies of multi-

ple co-eluting compounds by LC-MS/MS; 1999; J. Pharm. Biomed. Anal.; 20; 773-784

[206] W. Mück; Quantitative analysis of pharmacokinetic study samples by liquid chromatography coupled to tandem mass

spectrometry (LC-MS/MS); 1999; Pharmazie; 54 (9); 639-644

[207] E. Gelpi; Biomedical and biochemical applications of liquid chromatography-mass spectrometry; 1995; J. Chroma-

8 Literatur

156

togr. A; 703; 59-80

[208] H. Oka, H. Nakazawa, K.I. Harada, J.D. MacNeil; Chemical Analysis for Antibiotics Used in Agriculture; AOAC

International, Arlington; 1995

[209] A.M. Kamel, P.R. Brown, B. Munson; Electrospray Ionization Mass Spectrometry of Tetracycline, Oxytetracycline,

Chlorotetracycline, Minocycline, and Methacycline; 1999; Anal. Chem.; 71; 968-977

[210] W.J. Blanchflower, R.J. McCracken, A.S. Haggan, D.G. Kennedy; Confirmatory assay for the determination of tetra-

cycline, oxytetracycline, chlortetracycline and its isomers in muscle and kidney using liquid chromatography-mass

spectrometry; 1997; J. Chromatogr. B; 692; 351-360

[211] H. De Ruyck, H. De Ridder, R. Van Renterghem, F. Van Wambeke; Validation of HPLC method of analysis of tetra-

cycline residues in eggs and broiler meat and its application to feeding trial; 1999; Food Addit. Contam.; 16 (2); 47-

[212] C.R. White, W.A. Moats, K.L. Faecesula; Optimization of a liquid chromatographic method for the determination of

oxytetracycline, tetracycline, and chlortetracycline in milk; 1993; AOAC international; 76; 549-554

[213] J.P. Sharma, R.F. Bevill; Improved high-performance liquid chromatographic procedure for the determination of

tetracyclines in plasma, urine and tissues; 1978; J. Chromatogr.; 166;213-220

[214] J. Scheurer, C.M. Moore; Solid-Phase Extraction of Drugs from Biological Tissues-A Review; 1992; J. Anal. Toxicol.;

16; 264-269

[215] E.J. Mulders, D. Van De Lademaat; Determination of residues of Tetracycline antibiotics in anmial tissues by high-

performance liquid chromatography; 1990; J Pharmaceutical and Biomedical Analysis; 7 (12) 1829-1835

[216] N. Furusawa; High-Performance Liquid Chromatographic Determination/Identification of Oxytetracycline and Sul-

phadimidine in Meat and Eggs; 1999; 49 (7); 369-373

[217] Macherey-Nagel SPE Applikation 203; Tetracycline aus Muskulatur; 1998

[218] Y. Ikai, H. Oka, N. Kawamura, M. Yamada, K.-I. Harada, M. Suzuki; Systematic simultaneous Analysis of residual

tetracyclines in animal tissues using thin-layer and high-performance liquid chromatography; 1987; J. Chromatogr.;

411; 313-323

[219] H. Oka, Y. Ikai, N. Kawamura; A simple method for residual tetracyclines analysis in honey using tandem cartridge

clean up system; 1987; J. Chromatogr.; 389; 417-426

[220] H. Oka, H. Matsumoto, K. Uno, K.-I. Harada, S. Kadowaki, M. Suzuki; Application of prepacked C18 cartridge for the

analysis of tetracycline residues in animal liver; 1985; J. Chromatogr.; 325;265-274

[221] H. Oka, Y. Ikai, Y. Ito, J. Hayakawa, K.-I. Harada, M. Suzuki, H. Odani, K. Maeda; Identification of residual tetracy-

clines in bovine tissues by electrospray high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry; 1997; J.

Chromatogr. B; 693; 337-344

[222] H. Kataoka, H.L. Lord, S. Yamamoto, S. Narimatsu, J. Pawliszyn; Development of Automated In-Tube SPME/LC/MS

Method for Drug Analysis; 2000; J. Microcolumn Seperations; 12 (9); 493-500

[223] D.A. Volmer; Neue Methoden in der MS für die schnelle Analyse biomedizinisch relevanter Wirkstoffe; 1998; Chemie

in Labor und Biotechnik, 49 (11); 414-420

[224] W.H.H. Farrington, J. Tarbin, J. Bygrave, G.Shearer; Analysis of trace residues of tetracyclines in animal tissues and

fluids using metal chelate affinity chromatography/HPLC; 1991; Food Addit. Contam.; 8 (1); 55-64

[225] A.D. Cooper, G.W.F. Stubbings, M. Kelly, J.A. Tarbin, W.H.H. Farrington, G. Shearer; Improved method for the on-

line metal chelat affinity chromatography-high-performance liquid chromatographic determination of tetracycline an-

tibiotics in animal products; 1998; J. Chromatogr. A; 812; 321-326

[226] Bestimmung von Rückständen an Oxytetracyclin, Tetracyclin, Chlortetracyclin und deren Epimeren, Doxycyclin und

Demeclocyclin in Milch-HPLC-Methode; in: Amtliche Sammlung von Untersuchungsverfahren nach § 35 LMBG;

2000

[227] BgVV; Nachweismethoden für Rückstände von Tierarzneimitteln: Bestimmung der Rückstände von Oxytetracyclin,

Tetracyclin und Chlortetracyclin in eßbaren Geweben von Rind, Schaf, Schwein, Pute, Forelle, Karpfen sowie in

Kuhmilch und Hühnerei (Routineverfahren); 1995; Bundesgesundheitsbl.; 10; 410-413

[228] A.R. Long, L.C. Hsieh, M.S. Malbrough, C.S. Short, S.A. Barker; Matrix solid phase dispersion and liquid chroma-

tographic determination of oxytetracycline in catfish (Ictalurus punctatus) muscle tissue; 1990; J. Assoc. Off. Anal.

Chem.; 73; 864-867

[229] G. Zurhelle, M. Petz, E. Müller-Seitz, E. Siewert; Tetracyclines and their metabolites in egg white and yolk; 1999; Z.

Lebensm. Unters. Forsch. A; 208; 299-300

[230] H.W.M. Bisschop, D.J. Radstake, A.G. Stern; On-line dialyse as a tool in the analysis of residues of veterinary drugs;

2000; in: EURORESIDUE IV (Vol.1): Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Nether-

lands); 220-225

[231] R.W. Fedeniuk, P.J. Shand; Theory and methodology of antibiotic extraction from biomatrices; 1998; J. Chromatogr.

A; 812; 3-15

[232] P. Vinas; N. Balsalobre, C. Lopez-Erroz, M. Hernandez, Cordoba; Liquid chromatography with ultraviolet absorbance

detection for the analysis of tetracycline residues in honey; 2004; J. Chromatogr. A; 1022; 125-129

[233] J. Ding, U.D. Neue; A New Approach to the Effective Preparation of Plasma Samples for Rapid Drug Quantitation

Using On-line Solid-Phase Extraction Mass Spectrometry; 1999; Rapid. Commun. Mass Spectrom.; 13; 2151-2159

[234] N.C. Dias, C.F. Poole; Mechanistic Study of the Sorption Properties of Oasis® HLB and its Use in Solid-Phase Extrac-

8 Literatur 157

tion; 2002; Chromatographia; 56; 269-275

[235] J. Zhu, D.D. Snow, D.A. Cassada, S.J. Monson, R.F. Spalding; Analysis of oxytetracycline, tetracycline, and chlortet-

racycline in water using solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry; 2001; J.

Chromatogr. A; 928; 177-186

[236] S. Reverte, F. Borrull, E. Pocurull, R.M. Marce; Determination of antibiotic compounds in water by solid-phase ex-

traction-high-performance liquid chromatography-(electrospray) mass spectrometry;2003, J. Chromatogr. A; 1010;

225-232

[237] S.-P. Khong, Y.-A. Hammel, P.A. Guy; Analysis of tetracyclines in honey by high-performance liquid chromatogra-

phy/tandem mass spectrometry; 2005; Rapid Commun. Mass Spectrom.; 19 (4); 493-502

[238] N. Haagsma, M.J.B. Marcel; A rapid fluorimetric screning method for chlortetracycline, oxytetracycline, and tetrac-

cline in pig meat and kidney tissues; 1989; Zeitsch. für Lebensmitteluntersuchung und Forschung; 188 (3); 227-231

[239] N. Van Eeckhout, J. Castro Perez, J. Cllaereboudt, R. Vandeputte, C. Van Peteghem; Determination of tetracyclines in

bovine kidney by liquid chromatography/tandem mass spectrometry with on-line extraction and clean-up; 2000;

Rapid. Commun. Mass. Spectrom.; 14; 280-285

[240] B. Bergner-Lang, E. Mikisch; Zur Bedeutung von Oxytetracyclin-, Tetracyclin- und Chlortetracyclin-Rückständen bei

der HPLC-Bestimmung in Lebensmitteln tierischer Herkunft; 1994; Deutsch. Lebensm. Rundsch.; 90 (2); 39-41

[241] G. Schwartzman, L. Wayland, T. Alexander, K. Furnkranz, G. Selzer; Chlortetracycline Hydrochloride; 1979; Ana-

lytical Profiles of Drug Substances; Vol. 8; Academic Press; 101-137

[242] V.H. Vartanian, B. Goolsby, J.S.Brodbelt; Identification of Tetracycline Antibiotics by Electrospray Ionization in a

Quadrupole Ion Trap; 1998; J. Am. Soc. Mass Spectrom.; 9; 1089-1098

[243] A. Di Corcia, M. Nazzari; Liquid chromatographic-mass spectrometric methods for analyzing antibiotic and antibacte-

rial agents in animal food products; 2002; J. Chromatogr. A; 974; 53-89

[244] S. Kromidas; in: Qualität im analytischen Labor; VCH-Verlagsgesellschaft mbH, Weinheim; 1. Aufl.; 1995; 181-206

[245] S. Horii; Liquid chromatographic Determination of Oxytetracycline and Chlortetracycline Residues in Animal Tissues;

1994; J. Liquid Chromatogr.; 17 (1); 213-221

[246] J. Hoogmartens; Liquid Chromatography of Chlortetracycline; 1993; Pharmeuropa; 5 (2); 149-150

[247] F. Kondo, S. Morikawa, S. Tateyama; Simultaneous Determination of Six Tetracyclines in Bovine Tissue, Plasma and

Urine by Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography; 1989; J. Food Protection; 52 (1); 41-44

[248] R.K. Boyd; Quantitative Trace Analysis by Combined Chromatography and Mass Spectrometry Using External and

Internal Standards; 1993; Rapid Commun. Mass Spectrom.; 7; 257-271

[249] B.W. LeDuc, D.J. Greenblatt, H. Friedman; Automated high-performance liquid chromatographic analysis of tetracy-

cline in urine; 1989; J. Chromatogr.; 490; 474-477

[250] B.G. Charles, J.J. Cole, P.J. Ravenscroft; Method for rapid dtermination of urinary tetracycline by high-performance

liquid chromatography; 1981; J. Chromatogr.; 222; 152-155

[251] C. Eckers, J.D. Henion, G.A. Maylin, D.S. Skrabalak, J. Vessman, J.C. Greenfield; Micro LC/MS Applications: Ster-

oids, Antibiotics and other biological active compounds; 1983; Int. J. Mass Spectrom.; 46; 205-208

[252] A. Weimann, G. Bojesen; Analysis of tetracyclines in raw urine by column-switching high-performance liquid chroma-

tography and mass spectrometry; 1999; J. Chromatogr. B; 721; 47-54

[253] H. Greiling, A. M. Gressner; in: Lehrbuch der Klinischen Chemie und Pathobiochemie; Schattauer Verlag, Stuttgart; 2.

Aufl.; 1989; 31-38, 928-940

[254] W. Pschyrembel; in: Klinisches Wörterbuch; de Gruyter Verlag, Berlin; 257. Aufl.; 1994

[255] G. Jander; in: Maßanalyse; Walter de Gruyter Verlag; 14. Aufl.; 1986

[256] R.J. Henry, D.C. Cannon, J.W. Winkelman; in: Clinical Chemistry; Harper & Row Publisher Hagerstowns, 2. Aufl.;

1974

[257] J.M. Prevosto, B. Beraud, V. Cheminel, Y. Gaillard, C. Mounier, J.F. Chaulet; Determination of doxycycline in human

plasma and urine samples by high-performance liquid chromatography. Application for drug monitoring in malaria

chemoprophylaxis; 1995; Ann. Biol. Clin.; 53; 29-32

[258] A. Weimann, G. Bojesen; Analysis of tetracycline, Oxytetracycline and chlortetracycline in Plasma Extracts by elec-

trospray tandem mass-spectrometry and liquid chromatography; 1998; Anal. Lett.; 31 (12); 2053-2066

[259] M. Hernandez, F. Borrull, M. Calull; Detrmination of Oxytetracycline and Some Impurities in Plasma by Non-Aqeous

Cappilarry Electrophoresis Using Solid-Phase Extraction; 2000; Chromatographia; 52; 279-284

[260] X.-H. Chen, J.-P. Franke, K. Ensing, J. Wijsbeek, R.A. de Zeeuw; Pitfalls and Solutions in the Development of a Fully

Automated Solid-Phase Extraction Method for Drug Screening Purposes in Plasma and Whole Blood; 1993; J. Anal.

Toxicol.; 17; 421-426

[261] M.D.F. Santos, H. Vermeersch, J.P. Remon, M. Schelkens, P. De Backer, R. Ducatella, F. Haesebrouck; Validation of

a high-performance liquid chromatographic method for the determination of doxycycline in turkey plasma; 1996; J.

Chromatogr. B; 682; 301-308

[262] D. Farin, G. Piva, I. Gozlan, R. Kitzes; High Performance Liquid Chromatography Method for the Determination of

Doxycycline in Human Plasma; 1998; Chromatographia; 47; 547-549

[263] H.J. Mascher; Determination of minocycline in human plasma by high-performance liquid chromatography with UV

detection after liquid-liquid extraction; 1998; J. Chromatogr. A; 812; 339-342

8 Literatur

158

[264] S.P. Katrukha, E.T. Gneushev, V.G. Kukes; Determination of tetracyclines in plasma by high-performance liquid

chromatography; 1981; Siberian Scientific-Research Institute of Pulp and Paper; 3; 379-383

[265] M.A. Rudek, C.L. March, K.S. Bauer Jr., J.M. Pluda, W.D. Figg; High-performance liquid chromatography with mass

spectrometry detection for quantitating COL-3, a chemically modified tetracycline, in human plasma; 2000; J. Pharm.

Biom. Anal.; 22; 1003-1014

[266] W. Naidong, H. Bu, Y.-L. Chen, W.Z. Shou, X. Jiang, T.D.J. Halls; Simultaneous development of six LC-MS-MS

methods for the determination of multiple analytes in human plasma; 2002; J. Pharm. Biomed. Anal.; 28; 1115-1126

[267] Y. Hsieh, M.S. Bryant, G. Gruela, J.-M. Brisson, W.A. Korfmacher; Direct analysis of plasma samples for drug dis-

covery compounds using mixed-function column liquid chromatography tandem mass spectrometry; 2000; Rapid.

Commun. Mass Spectrom.; 14; 1384-1390

[268] W.A. Moats; Determination of tetracycline antibiotics in tissues and blood serum of cattle and swine by high-

performance liquid chromatography;1986; J. Chromatogr.; 358 (1); 253-259

[269] C.A. Kan, H.J. Keukens, E. Boers; Nicarbazin Residues in Broiler Muscle, Liver and Litter/Faeces: Early Exposure or

Recirculation; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.2): Conference on Residues of Veterinary Drugs in Food (Veldho-

ven, The Netherlands); 591-595

[270] T. Hamoir, D. Courtheyn, H. De Brabander, P. Delahaut, F. Smets, L. Hendriks, G. Pottie; Recent Developments in the

Isolation and Detection of Anabolics in Faeces; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.1): Conference on Residues of

Veterinary Drugs in Food (Veldhoven, The Netherlands); 471-475

[271] J. van Dijk, H.J. Keukens; The stability of some veterinary drugs and coccidiostats during composting and storage of

laying hen and broiler faeces; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.2): Conference on Residues of Veterinary Drugs in

Food (Veldhoven, The Netherlands); 357-360

[272] J. Sunderland, A.M. Lovering, C.M. Tobin, A.P. MacGowan, J.M. Roe, A.A. Delson; Determination by HPLC of

chlortetracycline in pig feces; 2003: Journal of Antimicrobial Chemotherapy; 52 (1); 135-137

[273] G. Hamscher, S. Sczesny, H. Höper, H. Nau; Determination of Persistent Tetracycline Residues in Soil Fertilized with

Liquid Manure by High-Performance Liquid Chromatography with Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrome-

try; 2002; Anal. Chem.; 74, 1509-1518

[274] R. Böhm; Auswirkungen von Rückständen von Antiinfektiva in tierischen Ausscheidungen auf die Güllebehandlung

und den Boden; 1996; Dtsch. tierärztl. Wschr.; 103; 264-268

[275] G. Hamscher, S. Sczesny, A. Abu-Qare, H. Höper, H. Nau; Stoffe mit pharmakologischer Wirkung einschließlich

hormonell aktiver Substanzen in der Umwelt: Nachweis von Tetracyclinen in güllegedüngten Böden; 2000; Dtsch. tie-

rärztl. Wschr.; 107; 332-334

[276] M.-L. Loke, S. Jespersen; R. Vreeken, B. Halling-Sørensen; J. Tjørnelund; Determination of oxytetracycline and its

degradation products by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry in manure-containing

anaerobis test saystems; 2003; J. Chromatogr. B; 783; 11-23

[277] M. Grote, A. Vockel, D. Schwarze, A. Mehlich, M. Freitag; Fate of Antibiotics in food chain and environment origi-

nating from pigfattening (Part 1); 2004; Fresenius Envir. Bull.; 13 (11 b); 1216-1224

[278] A.D. Cooper, J.A. Tarbin, W.H.H. Farrington, G. Shearer; Effects of extraction and spiking procedures on the determi-

nation of incurred residues of oxytetracycline in cattle kidney; 1998; Food Addit. Contam.; 15 (6); 645-650

[279] J.M. Degroodt, B. W. De Bukanski, S. Srebrnik; Multiresidue Analysis of tetracyclines in kidney by HPLC and Photo-

diode Array Detection; 1993; J. Liquid Chromatogr.; 16 (16); 3515-3529

[280] E.E. Martinez, W. Shimoda; Liquid Chromatographic Determination of Tetracycline Residues in Animal Feeds; 1987;

Food and Drug Administration; Animal Drug Research Center; Denver; CO 80225

[281] R.D. Caballero, J.R. Torres-Lapasio, M.C. Garcia-Alvarez-Coque; G. Ramis-Ramos; Rapid Liquid Chromatographic

Determination of Tetracyclines in Animal Feeds Using a Surfactant Solution as Mobile Phase; 2002; Anal. Lett.; 35

(4); 687-705

[282] H. Oka, H. Matsumoto, K. Uno, K.-I. Harada, S. Kadowaki, M. Suzuki; Improvemnet of Chemical Analysis of Antibiot-

ics- VIII. Application of Prepacked C18 Cartridge for the Analysis of Tetracycline Residues in Animal Liver;1985; J.

Chromatogr.; 325; 265-274

[283] H. Oka, K. Uno, K.-I. Harada, K. Yasaka, M. Suzuki; Improvemnet of Chemical Analysis of Antibiotics- V. A Simple

Method for the analysis of Tetracyclines using reversed-phase high-performance liquid chromatography; 1984; ; J.

Chromatogr.; 298; 435-443

[284] K. Frgalova, A. Hera, J. Valova; Determination of oxytetracycline in tissue of veal calves by high performance liquid

chromatography and ELISA; 1996; in: EURORESIDUE III (Vol.1): Conference on Residues of Veterinary Drugs in

Food (Veldhoven, The Netherlands); 407-410

[285] U. Körner, M. Kühne, S. Wenzel; Tetracycline residues in meat and bone meals. Part 1: Methodology and examina-

tion of field samples; 2001; Food Addit. Contam.; 18 (4); 293-302

[286] M. Kühne, U. Körner, S. Wenzel; Tetracycline residues in meat and bone meals. Part 2: The effect of heat treatments

on bound tetracycline residues; 2001; Food Addit. Contam.; 18 (7); 593-600

[287] V. Neitzel, K. Middeke; in: Praktische Qualitätssicherung in der Analytik; VCH-Verlag mbH, Weinheim; 1. Aufl.;

1994

[288] S. Kromidas; in: Validierung in der Analytik; WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim; 1. Aufl.; 1999

[289] S. Kromidas; in: Handbuch Validierung in der Analytik; WILEY-VCH Verlag GmbH, Weinheim; 1. Aufl.; 2000

8 Literatur 159

[290] W. Funk, V. Dammann, G. Donnevert; in: Qualitätssicherung in der Analytischen Chemie; VCH-Verlagsgesellschaft

mbH, Weinheim; 1. Aufl.; 1992

[291] Deutsche Institut für Normung e.V.; DIN EN ISO/IEC 17025; Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf-

und Kalibrierlaboratorien; 2000

[292] FDA, Center for Drug Evaluation and Research (CDER); Reviewer Guidance – Validation of Chromatographic Meth-

ods; 1994

[293] Deutsche Institut für Normung e.V.; DIN 32645; Nachweis-, Erfassungs- und Bestimmungsgrenze, Ermittlung unter

Wiederholbedingungen – Begriffe, Verfahren, Auswertung; 1994

[294] ICH: Q2A; Guideline for industry, text on validation of analytical procedures: definitions and tenninology; 1995;

International Conference on the Harmonisation of technical requirements for the registration of pharmaceuticals for

human use

[295] ICH: Q2B; Guidance for industry, validation of analytical procedures: methodology; 1996; International Conference

on Harmonisation

[296] EU-Richtlinie 2002/657/EG; Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften L 221; Umsetzung der Richtlinie 96/23/EG

des Rates betreffend die Durchführung von Analysemethoden und die Auswertung von Ergebnissen; 2002

[297] Empfehlung der Lebensmittelchemischen Gesellschaft auf Vorschlag ihrer Arbeitsgruppe „Pharmakologisch wirksame

Stoffe”: Validierung von Verfahren zur Untersuchung auf pharmakologisch wirksame Stoffe im Routinelabor; 2003;

Lebensmittelchemie; 57; 73-104 (Anlage 3)

[298] S. Kromidas, R. Klinkner, R. Mertens; Methodenvalidierung im analytischen Labor; 1995; Nachr. Chem. Tech. Lab.;

43 (6); 669-676

[299] V. Neitzel; Die Kalibration von Analysenverfahren (Teil 1): Lineare Kalbrierfunktionen; 2002; CLB Chemie in Labor

und Biotechnik; 53 (1); 9-13

[300] V. Neitzel; Die Kalibration von Analysenverfahren (Teil 2): Nicht lineare Kalbrierfunktionen; 2002; CLB Chemie in

Labor und Biotechnik; 53 (2); 44-47

[301] V. Neitzel; Die Kalibration von Analysenverfahren (Teil 3): Besondere Kalbrierfunktionen; 2002; CLB Chemie in

Labor und Biotechnik; 53 (3); 90-93

[302] IUPAC; Richtlinien zur Nomenklatur in der Chromatographie; 1993; Pure and Applied Chemistry; 65; 819-872

[303] F. Mandel; LC/MS(/MS)-Kopplung; 2001; Labo Trend; 66; 40-46

[304] A.L. Cinquina, F. Lomgo, G. Anastasi, L. Giannetti, R. Cozzani; Validation of a high performance liquid chromatog-

raphy method for the determination of oxytetracycline, tetracycline, chlortetracycline and doxycycline in bovine milk

and muscle; 2003; J. Chromatogr. A; 987; 227-233

[305] B.K. Choi, D.M. Hercules, A.I. Gusev; Effect of liquid chromatography separation of complex matrices on liquid

chromatography-tandem mass spectrometry signal supression; 2001; J. Chromatogr. A; 907; 337-342

[306] B. Law, D. Temesi; Factors to consider in the development of generic bioanalytical high-performance liquid chroma-

tographic-mass spectrometric methods to support drug discovery; 2000; J. Chromatogr. B; 748; 21-30

[307] G. Balizs, A. Hewitt; Determination of veterinary drug residues by liquid chromatography and tandem mass spec-

trometry; 2003; Analytica Chimica Acta; 492; 105-131

[308] R.E. Ardrey; in: Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: An Introduction; WILEY-VCH Verlag GmbH, Wein-

heim; 1. Aufl.; 2003

[309] M. Stüber, T. Reemtsma; Evaluation three calibration methods to compensate matrix effects in environmental analysis

with LC-ESI-MS; 2004; 378 (4); 910-916

[310] M. Cherlet, M. Schelkens, S. Croubels, P. De Backer; Quantitative multi-residue analysis of chlortetracyclines and

their 4-epimers in pig tissues by high-performance liquid chromatography combined with positive-ion electrospray

ionization maß spectrometry; 2003; Anal. Chim. Acta; 492; 199-213

[311] G. Hamscher, H.T. Pawelzick, S. Szesny, H. Nau, J. Hartung; Antibiotics in dust originating from a pig-fattening farm:

a new source of health hazard for farmers?; 2003; Environmental Health Perspective; 111 (13); 1590-1594

[312] A. Vockel, H.-A. Wagener, W. Klemm, K. Röwer, A. Mehlich, M. Grote; Bestimmung von Tetracyclinrückständen

mittels LC-MSMS in lebensmittelliefernden Schweinen; 2001; Lebensmittelchemie; 55; 67-68

[313] A. Vockel, K. Röwer, K. Vogel, A. Mehlich, M.Stolz, B. Brand, M. Grote; Sonderprogramm Verbraucherschutz 2000-

2002; Abschlußbericht: „Resistenzentwicklung und Rückstände in der landwirtschaftlichen Tierhaltung“; 2004; Hrsg.:

Ministerium für Umwelt und Naturschutz, Landwirtschaft und Verbraucherschutz des Landes NRW, Düsseldorf;

www.lej.nrw.de

[314] C.R. Kilroy, W.F. Hall, D.P. Bane, R.F. Bevill, G.D. Koritz; Chlortetracycline in swine - bioavailability and pharma-

cokinetics in fasted and fed pigs; 1990; J. Vet. Pharmacol. Therap.; 13 (1); 49-58

[315] R.G. Kelly, L.A. Kanegis; Tissue Distribution of Tetracycline; 1967; Toxicol. Appl. Pharmacol.; 11 (1); 114-120

[316] R.G. Kelly, L.A. Kanegis; Metabolism and tissue distribution of radioisotopically labeled minocyclin; 1967; Toxicol.

Appl. Pharmacol.; 11 (1); 171-183

[317] R. Kroker; Aspects of the elimination of antibiotics after treatment of domestic animals; 1983; Wissenschaft und Um-

welt; 4; 305-308

[318] C. Winckler, A. Grafe; Use of veterinary drugs in intensive animal production; evidence for persistence of tetracycline

in pig slurry; 2001; J. soils sed.; 1 (2); 66-70

8 Literatur

160

[319] J. Brüggemann, M. Merkenschlager, K.-H. Niesar; Bilanzstudien mit C14-Chlortetracyclin an der Legehenne unter den

Bedingungen der Antibiotikafütterung; 1963; Zbl. Vet. Med.; Reihe B; Band 10 (7); 631-648

[320] J.D.G. McEvoy, S.R.H. Crooks, C.T. Christopher, W.J. McCaughey, D.G. Kennedy; Origin of chlortetracycline in pig

tissue; 1994; Analyst; 119 (12); 2603-2606

[321] B. Halling-Sørensen, G. Sengelov, J. Tjørnelund; Toxicity of Tetracyclines and Tetracycline Degradation Products to

Environmentally Relevant Bacteria, Including Selected Tetracycline-Resistant Bacteria; 2002; Arch. Environ. Contam.

Toxicol.; 42; 263-271

[322] M. Kühne, S.Wenzel; 4-epi chlortetracycline residues in muscle; 2001; Arch. Lebensmittelhyg.; 52; 25-48

[323] M. Petz; Bestimmung von Rückständen an Oxytetracyclin, Tetracyclin und Chlortetracyclin in Muskulatur und Niere

vom Schwein; 1996; Lebensmittelchemie; 50; 33-38

[324] Bundesanzeiger Jg. 54 Nr. 44: Allgemeine Verwaltungsvorschrift über die Durchführung der amtlichen Überwachung

nach dem Fleischhygienegesetz und dem Geflügelfleischhygienegesetz (AVV Fleischhygiene - AVVFIH) (05.03.2002)

[325] DIN 58940 Teil 1-6: Medizinische Mikrobiologie: Empfindlichkeitsprüfung von mikrobiellen Krankheitserregern

gegen Chemotherapeutika

[326 ] 45. Arbeitstagung des Arbeitskreises Lebensmittelhygienischer Tierärztlicher Sachverständiger (ALTS), Berlin, 15.-

16.06. 1992

[327] 47. Arbeitstagung des Arbeitskreises Lebensmittelhygienischer Tierärztlicher Sachverständiger (ALTS), Berlin, 21.-

23.06. 1994

[328] B. Halling-Sørensen, G. Sengelov, J. Tjørnelund; Toxicity of Tetracyclines and Tetracycline Degradation Products to

Environmentally Relevant Bacteria, Including Selected Tetracycline-Resistant Bacteria; 2002; Arch. Environ. Contam.

Toxicol.; 42; 263-271

[329] T. Sasaki, N.S. Ramamurthy, L.M. Golub; Bone Cells and Matrix Bind Chemically Modified Non-Antimicrobial Tetra-

cycline; 1994; Bone; 15 (3); 373-375

[330] D.A. Buyske, H.J. Eisner, R.G. Eisner; Concentration and persistence of tetracycline and chlortetracycline in bone;

1960; J. Pharmacol. Exp. Therap.; 130; 150-156

[331] Ellenberger, Baum; in: Handbuch der vergleichenden Anatomie der Haustiere; Springer Verlag, Berlin; 18. Aufl.;

1977

[332] G. Thews, E. Mutschler, P. Vaupel; in: Anatomie, Physiologie und Pathophysiologie des Menschen; Wissenschaftliche

Verlagsgesellschaft mbH, Stuttgart; 2. Aufl.; 1982; 27-53

[333] R. Ramounet; P. Fritsch, The distribution of plutonium between the mineral and organic components of rat bones: a

biochemical study after in vivo and in vitro contamination; 1998; Int. J. Radiat. Biol.; 73; 83-88

[334] R. Nickel, A. Schummer, E. Seiferle; in: Lehrbuch der Anatomie der Haustiere; Paul Parey Verlag für Landwirtschaft,

Veterinärmedizin, Gartenbau und Forstwesen, Berlin; Band 1; 3. Aufl.; 1968

[335] G. Kullmer; in: Fortschritt-Berichte VDI: Biomechanische Analysen des menschlichen Bewegungsapparats mit Hilfe

der Finite-Elemente-Methode; VDI-Verlag, Düsseldorf; 2000; 10-15

[336] H. Plonait; in: Lehrbuch der Schweinekrankheiten; Parey Buchverlag, Berlin; 2. Aufl.; 1997

[337] H. Helwig; Antibiotika-Chemotherapeutika-Grundlagen-Anwendung-Gefahren-Ein Leitfaden für die Praxis; Georg

Thieme Verlag, Stuttgart; 3. Aufl.; 1976; 235-244

[338] M. Kühne, U. Körner; Bound chlortetracycline residues in bones: release under acidic conditions; 2001; Fd. Chem.;

72; 41-44

[339] J. Brüggemann, U. Lösch, M. Merkenschlager, I. Offterdinger; Ablagerung von Tetracyclin im Knochengewebe von

Tieren bei dem Zusatz von Tetracyclin zum Futter; 1966; Zentralbl. Veterinarmed. A.; 13; 59-74

[340] M. Kühne, G. Hamscher, D. Schedl, S. Wenzel; Formation of anhydrotetracycline during a high-temperature treat-

ment of animal-derived feed contaminated with tetracycline; 2001; Food Chemistry; 75; 423-429

[341] H. Spörri, H. Stünzi; in: Pathophysiologie der Haustiere; Paul Parey Verlag für Landwirtschaft, Veterinärmedizin,

Gartenbau, Forst- und Jagdwesen, Berlin; 1. Aufl.; 1969; 554-580

[342] M. Kühne, A.T. Mitscherling; Zum Eintrag von gebundenen Tetracyclin-Rückständen in die Nahrungskette- Ein Bei-

trag zur Gefahrenindentifikation; 2004; Berl. Münch. Tierärztl. Wschr.; 117; 201-206

[343] M. Kühne; Untersuchungen zum Vorkommen von Tetracyclin-Rückständen bei Puten; 1998; Fleischwirtschaft; 78 (4);

369-370

[344] M.Kühne, S. Wegmann, A. Kobe, R. Fries; Tetracycline residues in bones of slaughtered animals; 2000; Food Con-

trol; 11; 175-180

[345] A. Klein; Untersuchung zur fluoreszenzspektroskopischen Erfassung von Tetracyclin; 2004; Dissertation; Tierärztliche

Hochschule Hannover

[346] C.H. Bachmann, E.H. Ellis; Fluorescence of bone; 1965; Nature; 206; 1328-1331

[347] J. Brüggemann, U. Lösch, M. Merkenschlager, I. Offterdinger; Deposition of tetracycline in the bones of animals given

it in their food; 1966; Zbl. Vet. Med.; 13 (1); 59-74

[348] persönliche Mitteilung; Herr Dr. A. Berk; Bundesforschungsanstalt Braunschweig-Völkenrode (FAL)

[349] R.G. Kelly, D.A. Buyske, Lederle Labs.; Metabolism of tetracycline in rat and dog; 1960; J. Pharmacol. Experim.

Therapeutics; 130; 144-149

[350] H. Bader; in: Lehrbuch der Pharmakologie und Toxikologie; VCH Verlag, Weinheim; 2. Aufl.; 1985; 4-32

Anhang A 1

A Anhang

INHALTSVERZEICHNIS

A.1 Medikationsstudien .........................................................................................................................3

A. 1.1 Haus Düsse-Studie..................................................................................................................3

A. 1.2 FAL-Studie..............................................................................................................................4

A.2 Wiederholpräzision .........................................................................................................................9

A.3 Langzeitstabilität von CTC und e-CTC ........................................................................................9

A.4 Ausreißertest nach GRUBBS .......................................................................................................10

A.5 Linearität des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens zur Bestimmung von CTC und e-CTC.........11

A. 5.1 Kalibrierdaten ......................................................................................................................11

A. 5.2 Kalibriergeraden..................................................................................................................12

A. 5.3 Anpassungstest nach MANDEL .........................................................................................14

A. 5.4 Residualanalyse ....................................................................................................................18

A. 5.5 Varianzhomogenität.............................................................................................................19

A. 5.6 Absicherung der unteren Arbeitsgrenze............................................................................21

A. 5.7 Verfahrenskenndaten...........................................................................................................22

A.6 Wiederfindungsfunktion...............................................................................................................24

A. 6.1 Berechnung der Wiederfindungsfunktion .........................................................................24

A. 6.2 Wiederfindungsfunktionen von CTC dotierter Extraktionsmittel..................................25

A. 6.3 Wiederfindungsfunktionen von CTC dotierter Muskulaturproben ...............................25

A. 6.4 Interpretation der Wiederfindungsfunktion und Kontrolle der Analysenpräzision .....26

A. 6.5 Ermittlung der Vertrauensbereiche für af und bf.............................................................26

A. 6.6 Prüfung auf systematische Abweichungen.........................................................................26

A. 6.7 Wiederfindung......................................................................................................................27

A.7 Kalibrierung des HPLC-UV-Verfahrens zur Bestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC ......28

A.8 Kalibrierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens zur Bestimmung von Anhydro-CTC und e-

Anhydro-CTC.................................................................................................................................30

A.9 Analysenvorschrift zur Bestimmung von CTC und Metabolite in Muskulatur, Leber, Niere,

Urin, Plasma, Knochen und Faeces..............................................................................................32

A. 9.1 Zweck und Anwendungsbereich.........................................................................................32

Anhang

A 2

A. 9.2 Liste der erfaßbaren Stoffe................................................................................................. 32

A. 9.3 Prinzip .................................................................................................................................. 32

A. 9.4 Reagenzien............................................................................................................................ 32

A. 9.5 Geräte ................................................................................................................................... 33

A. 9.6 Probenvorbereitung ............................................................................................................ 33

A. 9.7 HPLC-UV-MS/MS-Messung.............................................................................................. 35

Anhang A 3

A.1 Medikationsstudien

A. 1.1 Haus Düsse-Studie

Tab. A. 1: CTC-Gehalt (

∑

CTC + e-CTC) in Urin der Versuchstiere (LC-MS/MS) (n = 2)

CTC-Gehalt (∑ CTC + e-CTC) [µg/L]

Wochen nach Medikation

Tier

Einst.allung 0 2 4 6 8 10

V 1 0 13530 493 166 122 95 39

V 2 0 18080 401 125 143 51 47

V 3 0 441 63 46 20 10 6

V 4 0 3241 374 125 89 68 39

V 5 0 6551 355 165 313 126 96

V 6 0 11676 743 290 203 116 46

V 7 0 21990 889 503 384 199 100

V 8 0 11618 646 199 442 118 105

V 9 0 8487 397 254 115 112 76

V 10 0 3298 563 - - - 75

V 11 0 3944 430 426 315 283 97

V 12 0 8576 734 146 256 87 65

Tab. A. 2: CTC-Gehalte (

∑

CTC + e-CTC) in Knochen der Kontrolltiere (LC-MS/MS) (n = 2)

Tier Konzentration [µg/kg]

K 1 185

K 2 163

K 3 219

K 4 170

K 5 184

K 6 185

K 7 199

K 8 193

K 9 188

K 10 194

K 11 195

K 12 201

Anhang

A 4

A. 1.2 FAL-Studie

Tab. A. 3: Dosierung des eingesetzten Arzneimittels in der 1. Medikationsphase

Tiernummer 93 94 95 96 97

Körpergewicht am 16.7. [kg] 68,0 68,0 74,6 73,8 72,6

Fütterungszeitpunkt Arzneimittelmenge pro Mahlzeit [g]

16.07.01 Nachmittag 3,40 3,40 3,73 3,69 3,63

Vormittag 3,40 3,40 3,73 3,69 3,63

17.07.01 Nachmittag 3,40 3,40 3,73 3,69 3,63

Vormittag 3,40 3,40 3,73 3,69 3,63

18.07.01 Nachmittag 3,50 3,50 3,83 3,79 3,73

Vormittag 3,50 3,50 3,83 3,79 3,73

19.07.01 Nachmittag 3,50 3,50 3,83 3,79 3,73

Vormittag 3,50 3,50 3,83 3,79 3,73

20.07.01 Nachmittag 3,60 3,60 3,93 3,89 3,83

Vormittag 3,60 3,60 3,93 3,89 3,83

21.07.01 Nachmittag 3,60 3,60 3,93 3,89 3,83

Vormittag 3,60 3,60 3,93 3,89 3,83

22.07.01 Nachmittag 3,70 3,70 4,03 3,99 3,93

Vormittag 3,70 3,70 4,03 3,99 3,93

23.07.01 Nachmittag 3,70 3,70 4,03 3,99 3,93

Vormittag 3,70 3,70 4,03 3,99 3,93

24.07.01 Nachmittag 3,80 3,80 4,13 4,09 4,03

Vormittag 3,80 3,80 4,13 4,09 4,03

25.07.01 Nachmittag 3,80 3,80 4,13 4,09 4,03

26.07.01 Vormittag 3,80 3,80 4,13 4,09 4,03

Arzneimittel: Chlortetracyclin 100 (1000 g des Präparates enthält 100 g des Wirkstoffes CTC)

Tab. A. 4: Dosierung des eingesetzten Arzneimittels in der 2. Medikationsphase

Tiernummer 93 94 95 96 97

Körpergewicht am 06.08. [kg] 88,2 87,0 93,0 91,4 91,2

Fütterungszeitpunkt Arzneimittelmenge pro Mahlzeit [g]

06.08.01 Nachmittag 4,41 4,35 4,65 4,57 4,56

Vormittag 4,41 4,35 4,65 4,57 4,56

07.08.01 Nachmittag 4,41 4,35 4,65 4,57 4,56

Vormittag 4,41 4,35 4,65 4,57 4,56

08.08.01 Nachmittag 4,51 4,45 4,75 4,67 4,66

Vormittag 4,51 4,45 4,75 4,67 4,66

09.08.01 Nachmittag 4,51 4,45 4,75 4,67 4,66

Vormittag 4,51 4,45 4,75 4,67 4,66

10.08.01 Nachmittag 4,61 4,55 4,85 4,77 4,76

Vormittag 4,61 4,55 4,85 4,77 4,76

11.08.01 Nachmittag 4,61 4,55 4,85 4,77 4,76

Vormittag 4,61 4,55 4,85 4,77 4,76

12.08.01 Nachmittag 4,71 4,65 4,95 4,87 4,86

Vormittag 4,71 4,65 4,95 4,87 4,86

13.08.01 Nachmittag 4,71 4,65 4,95 4,87 4,86

Vormittag 4,81 4,75 5,05 4,97 4,96

14.08.01 Nachmittag 4,81 4,75 5,05 4,97 4,96

Vormittag 4,81 4,75 5,05 4,97 4,96

15.08.01 Nachmittag 4,81 4,75 5,05 4,97 4,96

16.08.01 Vormittag 4,81 4,75 5,05 4,97 4,96

Arzneimittel: Chlortetracyclin 100 (1000 g des Präparates enthält 100 g des Wirkstoffes CTC)

Anhang A 5

Tab. A. 5: Zugeführte Futtermengen und ausgeschiedene Mengen an Urin und Faeces der einzelnen

Tiere in der 1. Medikationsphase

Mittel

Pro Tag

2400

1259

1722

2400

1512

2378

2400

1549

1790

2400

1350

3245

2400

1535

3684

26.07.

2400

1405

2466

2400

1628

2289

2400

1589

1702

2400

1320

2749

2400

1306

4008

25.07.

2400

1444

1763

2400

1523

2574

2400

1590

2297

2400

1529

3192

2400

1672

3468

24.07

2400

949

1993

2400

1501

2709

2400

1597

1378

2400

1680

3875

2400

1693

3257

23.07.

2400

1654

1993

2400

1683

1834

2400

1408

1950

2400

1682

4150

2400

1392

4009

22.07.

2400

1517

2089

2400

1553

2520

2400

1683

1479

2400

945

2804

2400

1746

4299

21.07.

2400

1516

963

2400

1470

2097

2400

1270

2149

2400

1414

2900

2400

1303

3734

20.07.

2400

1355

1673

2400

1512

2323

2400

1628

1946

2400

1586

4308

2400

1822

3681

19.07.

2400

712

1096

2400

2145

2042

2400

1990

2200

2400

924

2667

2400

1483

3138

18.07.

2400

1165

2268

2400

1786

2972

2400

1893

1524

2400

1215

3953

2400

1194

3672

17.07.

2400

868

913

2400

323

2416

2400

843

1277

2400

1200

1848

2400

1741

3577

Tier 93

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 94

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 95

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 96

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 97

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Anhang

A 6

Tab. A. 6: Zugeführte Futtermengen und ausgeschiedene Mengen an Urin und Faeces der einzelnen

Tiere in der 2. Medikationsphase

Mittel

Pro Tag

2500

1399

1955

2500

1452

2468

2500

1534

2096

2500

1343

3687

2500

1468

3757

16.08.

2500

1893

1388

2500

2117

1676

2500

1784

1656

2500

1610

2637

2500

1330

2745

15.08.

2500

1375

928

2500

1597

2917

2500

1737

2031

2500

1582

4367

2500

1607

3790

14.08.

2500

1161

2313

2500

1011

2812

2500

1295

2966

2500

1135

4324

2500

966

3965

13.08.

2500

2019

2373

2500

1718

2697

2500

1649

1435

2500

1536

3395

2500

2097

2927

12.08.

2500

1410

2663

2500

1083

3353

2500

1686

2091

2500

1212

4586

2500

1727

3829

11.08.

2500

1124

1391

2500

1634

1944

2500

993

1663

2500

934

4307

2500

1193

3959

10.08.

2500

1852

2770

2500

1296

2952

2500

1504

2665

2500

1724

4657

2500

1579

4103

09.08.

2500

1652

2174

2500

1816

2078

2500

1421

2116

2500

1418

4127

2500

1720

3927

08.08.

2500

880

2395

2500

2120

2527

2500

2013

2804

2500

1899

4099

2500

1328

4673

07.08.

2500

623

1154

2500

127

1719

2500

1254

1531

2500

381

374

2500

1134

3656

Tier 93

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 94

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 95

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 96

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Tier 97

Futter [g]

Faeces [g]

Urin [g]

Anhang A 7

Tab. A. 7: CTC-Gehalt (

∑

CTC + e-CTC) in Urin der in der FAL eingestallten Schweine während der

Medikationsphasen (LC-MS/MS) (n = 2)

CTC-Gehalt (∑ CTC + e-CTC) [mg]

Versuchstag Tier 93 Tier 94 Tier 95 Tier 96 Tier 97

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1 0,86 5,60 7,79 8,65 21,56

2 15,04 14,57 11,90 11,30 28,74

3 13,78 19,05 20,73 13,09 34,30

4 22,84 21,82 17,55 28,24 49,97

5 11,99 15,65 23,52 16,50 32,49

6 21,54 28,81 21,53 18,33 47,69

7 18,63 23,24 15,81 21,62 47,97

8 14,26 27,09 6,87 18,99 34,43

9 14,59 17,35 4,38 19,94 39,73

10 20,99 19,93 9,49 16,01 35,17

22 3,32 10,38 4,48 0,51 14,89

23 6,00 13,24 6,13 5,21 23,74

24 13,76 12,82 5,43 14,15 29,12

25 26,96 13,72 12,33 16,97 28,24

26 14,27 13,23 13,53 18,24 22,15

27 21,61 15,63 20,45 28,33 38,50

28 23,39 8,35 8,11 10,05 29,45

29 17,97 11,29 8,10 12,03 31,05

30 5,68 1,55 6,31 3,76 12,94

31 8,40 0,33 3,05 5,36 7,60

Tab. A. 8: CTC-Gehalt (

∑

CTC + e-CTC) in Faeces der in der FAL eingestallten Schweine während

der Medikationsphasen (LC-MS/MS) (n = 2)

CTC-Gehalt (∑ CTC + e-CTC) [mg]

Versuchstag Tier 93 Tier 94 Tier 95 Tier 96 Tier 97

0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

1 0,3 0,0 2,0 0,6 55,5

2 228,9 169,5 221,4 438,0 355,1

3 237,2 670,3 768,1 604,7 569,5

4 367,4 562,2 580,9 644,7 639,3

5 483,8 688,5 542,7 841,4 491,3

6 521,0 544,5 750,5 490,8 678,2

7 561,7 694,5 600,5 1027,5 498,9

8 309,1 547,5 651,8 1082,9 684,3

9 577,4 598,0 878,0 851,0 801,2

10 584,2 675,0 698,2 907,9 322,9

22 0,4 1,5 1,2 1,0 0,6

23 2,6 258,0 589,9 237,0 322,9

24 765,4 979,6 583,0 717,0 509,8

25 873,0 681,6 724,4 732,8 738,5

26 509,7 762,3 500,8 560,8 657,9

27 508,1 694,1 1051,6 932,8 897,5

28 1001,8 1081,3 727,4 1175,9 929,1

29 451,3 743,8 598,8 757,1 543,0

30 664,8 728,3 817,4 1194,1 749,7

31 1011,9 1027,5 989,4 1196,7 535,3

Anhang

A 8

Tab. A. 9: Gehalt von CTC und seinen Umwandlungs- und Abbauprodukten in Urin des Tieres 95

während der Medikationsphasen (LC-MS/MS) (n = 2)

Gehalt [mg]

Versuchstag CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC

Summe aller

Verbindungen

0 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00

1 4,80 2,98 4,90 8,08 20,76

2 7,19 4,71 8,42 11,36 31,67

3 12,00 8,73 13,81 19,61 54,15

4 11,06 6,49 13,35 22,49 53,38

5 13,89 9,63 15,11 28,38 67,01

6 14,05 7,48 11,71 15,66 48,90

7 9,50 6,31 13,23 13,91 42,94

8 3,64 3,23 10,48 11,86 29,21

9 3,14 1,24 23,51 32,21 60,10

10 5,23 4,26 16,58 20,64 46,70

22 2,28 2,20 5,81 7,15 17,43

23 3,29 2,83 17,93 18,79 42,85

24 3,05 2,38 15,44 13,45 34,32

25 6,61 5,72 18,68 19,21 50,22

26 8,63 4,91 9,03 8,08 30,64

27 8,51 6,94 13,79 8,22 37,46

28 5,43 2,69 10,15 8,81 27,07

29 5,09 3,01 23,87 18,92 50,90

30 4,08 2,23 16,89 17,65 40,85

31 1,82 1,24 14,14 14,67 31,86

Tab. A. 10: Gehalt von CTC und seinen Umwandlungs- und Abbauprodukten in Faeces des Tieres 95

während der Medikationsphasen (LC-MS/MS) (n = 2)

Gehalt [mg]

Versuchs-

tag CTC e-CTC iso-CTC e-iso-CTC a-CTC e-a-CTC

Summe aller

Verbindungen

0 0 0 0 0 0 0 0,00

1 1,20 0,35 0,00 0,00 0,00 0,00 1,56

2 153,31 68,08 19,06 9,91 3,84 6,02 260,21

3 547,19 220,94 83,58 52,90 4,39 6,52 915,52

4 411,90 169,01 76,42 51,49 3,93 5,49 718,24

5 385,82 156,85 73,81 57,67 3,20 4,34 681,69

6 519,18 231,30 104,90 74,70 4,00 5,74 939,82

7 404,30 196,20 92,62 70,32 3,35 4,73 771,52

8 441,86 209,94 85,20 57,77 3,76 5,39 803,92

9 589,59 288,43 130,79 109,45 3,84 5,36 1127,46

10 447,55 250,67 107,18 80,87 3,76 5,34 895,36

22 0,78 0,68 0,29 0,00 0,00 0,00 1,75

23 376,86 213,06 51,98 33,42 4,20 6,52 686,04

24 380,57 202,44 60,59 36,81 3,29 4,72 688,42

25 488,56 235,82 92,73 72,40 3,61 5,11 898,22

26 332,10 168,72 74,69 55,62 2,44 3,41 636,98

27 712,43 339,17 121,11 136,30 4,35 6,07 1319,42

28 469,52 257,91 119,46 151,80 4,20 5,80 1008,69

29 383,51 215,31 99,17 120,58 3,12 4,44 826,15

30 534,25 283,17 99,85 116,47 3,54 5,61 1042,89

31 674,41 315,01 118,22 156,25 3,94 5,91 1273,75

Anhang A 9

A.2 Wiederholpräzision

Zur Beurteilung der Stabilität wird die Wiederholpräzision [288, 289] herangezogen. Durch die Be-

rechnung der Wiederholpräzision r erfolgt die Ermittlung der Wiederholgrenze, die zur Beurteilung

benötigt wird, ob es sich bei der Differenz zwischen zwei Einzelmeßwerten um eine signifikante Än-

derung handelt. Für die Wiederholpräzision gilt:

Gleichung A. 1: r = s 2 f ⋅

mit: r

Wiederholpräzision

Standardabweichung

empirisch ermittelter Zahlenwert

Die Variable f hängt von dem gewählten Signifikanzniveau P und der Verteilung der Meßwerte ab.

Für P = 90 % gilt f = 2,3, für P = 99 % gilt f = 3,65 und für ein Signifikanzniveau von P = 95 % ein

Faktor von 1,96. Gemäß KROMIDAS [244, 288] wird ein Signifikanzniveau von P = 95 % angenom-

men, so daß sich für die Wiederholpräzision r95 folgende Formel ergibt:

Gleichung A. 2: r95 = s 8,2 s 77,2 s 2 96,1 ⋅≈⋅=⋅⋅

A.3 Langzeitstabilität von CTC und e-CTC

Abb. A. 1: Konzentrationsverlauf von CTC (β = 1 und 10 mg/L) in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v)

bei einer Lagerung von -80 °C (Mischstandard: CTC: e-CTC = 1:1 (w/w)) (HPLC-UV,

n = 3)

024681012141618202224

Zeit [Wochen]

Konzentration CTC [mg/L]

10 mg/L

1 mg/L

Anhang

A 10

Abb. A. 2: Konzentrationsverlauf von e-CTC (β = 1 und 10 mg/L) in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v)

bei einer Lagerung von -80 °C (Mischstandard: CTC: e-CTC = 1:1 (w/w)) (HPLC-UV,

n = 3)

A.4 Ausreißertest nach GRUBBS

Der Ausreißertest nach GRUBBS wird zur Aufdeckung einzelner Ausreißerwerte in einer Analysense-

rie genutzt [288, 290, 296]. Hierzu wird der Mittelwert x der Meßwerte einer Analysenserie gebildet

und die Standardabweichung s der Analysendaten berechnet.

Gleichung 1: ∑

⋅= N

Durch Einsetzen des Mittelwertes x wird für den Analysenwert x* mit der größten Differenz zum

Mittelwert überprüft, ob es sich um einen Ausreißer handelt.

Gleichung 2: s

*−

Der ermittelte Prüfwert PW wird mit den statistischen Tabellenwerten rM für den GRUBBS-Test ver-

glichen [288, 290]. Das Testergebnis ist wie folgt zu bewerten:

PW ≤ rM (f, P = 90 %): kein Ausreißer

rM (f, P = 90 %) < PW ≤ rM (f, P = 95 %): wahrscheinlich Ausreißer

PW > rM (f, P = 95 %): Ausreißer

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24

Zeit [Wochen]

Konzentration e-CTC [mg/L]

10 mg/L

1 mg/L

Anhang A 11

A.5 Linearität des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens zur Bestim-

mung von CTC und e-CTC

A. 5.1 Kalibrierdaten

Tab. A. 11: Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Peakflächen von CTC und e-CTC in

Kalibrierlösungen bei der Bestimmung mittels LC-MS/MS (n = 10)

Konzentration

[mg/L]

Peakfläche CTC

y (n = 10)

[mAU min]

srel, CTC

(n = 10)

[%]

Peakfläche e-CTC

y (n = 10)

[mAU min]

srel, e-CTC

(n = 10)

[%]

0,001 7641 11 13836 16

0,0025 8424 9 14992 11

0,005 10503 7 18098 5

0,01 17966 6 25314 7

0,02 25687 6 29659 5

0,04 51817 5 45730 3

0,05 62980 5 54088 4

0,06 72739 5 61578 4

0,08 100852 4 84296 4

0,1 128725 2 101489 2

0,12 147414 3 113079 4

0,14 164361 4 134837 3

0,16 196902 2 146809 3

0,18 212616 4 157086 3

0,25 286257 2 219958 3

0,5 575129 3 419124 4

1 1024770 2 772677 4

2,5 2408886 3 1861274 2

5 4771595 4 3634713 4

10 9134133 4 6708979 5

25 21171256 3 15097022 2

50 41001890 4 29934106 3

100 69155647 3 45987774 2

Anhang

A 12

Tab. A. 12: Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Peakflächen von CTC und e-CTC in

Kalibrierlösungen bei der Bestimmung mittels HPLC-UV (370 nm, n = 10)

Konzentration

[mg/L]

Peakfläche CTC

y (n = 10)

[mAU min]

srel, CTC

(n = 10)

[%]

Peakfläche e-CTC

y (n = 10)

[mAU min]

srel, e-CTC

(n = 10)

[%]

0,10 109 12 104 11

0,18 162 6 163 7

0,25 231 4 225 3

0,50 468 3 464 3

1,00 868 3 864 2

2,50 2234 3 2208 2

5,00 4482 1 4496 3

10,00 8674 3 8714 3

25,00 22751 3 22852 3

50,00 46225 1 46036 2

100,00 90794 2 90774 2

A. 5.2 Kalibriergeraden

Abb. A. 3: Visueller Linearitätstest der Kalibrierfunktion für die Bestimmung von CTC mittels

HPLC-UV (n = 10)

y = 911,18x - 24,901

= 0,9999

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 20406080100

Konzentration [mg/L]

Fläche [mAU min]

Anhang A 13

Abb. A. 4: Visueller Linearitätstest der Kalibrierfunktion für die Bestimmung von e-CTC mittels

HPLC-UV (n = 10)

Abb. A. 5: Visueller Linearitätstest der Kalibrierfunktion für die Bestimmung von CTC mittels

LC-MS/MS (n = 10)

y = 910,49x - 20,963

= 0,9999

10000

20000

30000

40000

50000

60000

70000

80000

90000

100000

0 20406080100

Konzentration [mg/L]

Fläche [mAU min]

y = -2383,8x2 + 930292x + 30502

R2 = 0,9999

10000000

20000000

30000000

40000000

50000000

60000000

70000000

80000000

020406080100

Konzentration [mg/L]

Fläche

Anhang

A 14

Abb. A. 6: Visueller Linearitätstest der Kalibrierfunktion für die Bestimmung von e-CTC mittels

LC-MS/MS (n = 10)

A. 5.3 Anpassungstest nach MANDEL

Zur rechnerischen Überprüfung der Linearität kann der Anpassungstest nach MANDEL herangezogen

werden. Zunächst werden aus den erhaltenen Messwerten die Kalibrierfunktionen 1. und 2. Grades

(mit xi = Konzentration und yi = Detektorsignal) sowie die jeweiligen Reststandardabweichungen sy1

und sy2 berechnet. Durch Vergleich der Kalibrierfunktion 1. und 2. Grades wird die Verringerung der

Reststandardabweichung, die sich durch die Wahl des Regressionsmodells 2. Ordnung gegenüber der

1. Ordnung ergibt, mittels F-Tests auf Signifikanz geprüft [244, 288, 290].

Für eine Funktion 1. Grades gilt:

Gleichung A. 3: y = a+bx

Der Ordinatenabschnitt a stellt dabei den errechneten Blindwert dar, die Steigung b ist ein Maß für

die Empfindlichkeit. Die Steigung b wird nach folgender Formel berechnet:

Gleichung A. 4:

()()

[]

()

∑

−

−−

yyxx

Die hierzu benötigten Mittelwerte des Detektorsignals ( y) werden mit Gleichung 1 und die Mittel-

werte der Konzentration (

) mit nachfolgender Formel berechnet:

Gleichung A. 5: ∑

⋅= N

y = -2442,4x2 + 705243x + 14208

R2 = 0,9994

5000000

10000000

15000000

20000000

25000000

30000000

35000000

40000000

45000000

50000000

0 20406080100

Konzentration [mg/L]

Fläche

Anhang A 15

Der Schnittpunkt mit der Ordinate a (errechneter Blindwert) ergibt sich dann wie folgt:

Gleichung A. 6: xbya

−

Weiterhin wird für die statistische Beurteilung der Linearität die Reststandardabweichung benötigt.

Diese gibt die Streuung der Meßwerte um die Regressionsgerade an und ist somit ein Maß für die Prä-

zision der Kalibrierung. Für die Reststandardabweichung einer Funktion 1. Grades gilt:

Gleichung A. 7:

()

y1−

−

=∑

mit: ii bxay

ˆ+= (berechnete Peakfläche)

y Mittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche

Für eine Funktion 2. Grades gilt:

Gleichung A. 8: 2

cxbxay ++=

Die Regressionsanalyse liefert die Kalibrierfunktion 2. Grades mit ihren Funktionskoeffizienten a, b

und c. Diese können mit Gleichung A. 9 bis Gleichung A. 11 berechnet werden:

Gleichung A. 9: N

xcxby

iii ⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛−−

=∑∑∑

===

Gleichung A. 10:

QcQ

⋅−

Gleichung A. 11:

yxx

QQQ

QQQQ

c⋅−

⋅−⋅

mit:

∑∑

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−= N

ixx N

()

∑∑∑

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−⋅= N

iixy N

yxQ

Anhang

A 16

∑∑∑

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−= N

xQ 3

∑∑

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−= N

xQ 4

()

∑∑∑

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

−⋅= N

yx N

yxQ 2

Für die Reststandardabweichung einer Funktion 2. Grades gilt:

Gleichung A. 12:

()

y2−

−

=∑

mit: 2

iii cxbxay

ˆ++= (berechnete Peakfläche)

y Mittelwert der experimentell ermittelten Peakfläche

Aus den Reststandardabweichungen sy1 und sy2 wird die Differenz der Varianzen DS2 ermittelt:

Gleichung A. 13:

()

(

)

21 s 3Ns 2NDS −−−= mit dem Freiheitsgrad f = 1

Anschließend wird die Prüfgröße PG berechnet:

Gleichung A. 14: 2

PG =

Diese Prüfgröße wird dann mit dem Tabellenwert F(f1 = 1, f2 = N – 3, P = 99 %) verglichen. Dabei

können folgende Fälle eintreten:

:FPG ≤ Durch die Kalibrierfunktion 2. Grades wird keine signifikant bessere Anpassung er-

reicht, also ist die Kalibrierfunktion linear.

PG>:F Die Kalibrierfunktion ist im untersuchten Arbeitsbereich nicht linear, entweder kann

durch Einengung des Arbeitsbereiches eine Linearität erreicht werden oder die Kali-

brierfunktion muß nach einem Regressionsmodell höherer Ordnung berechnet werden.

Zur Durchführung des Anpassungstests nach MANDEL werden die Kalibrierfunktionen 1. und 2.

Grades und die dazugehörigen Reststandardabweichungen sy1 und sy2 benötigt. Anschließend wird

Anhang A 17

mittels F-Test überprüft, ob sich bei der Wahl des Regressionsmodells 2. Ordnung gegenüber dem 1.

Ordnung eine signifikante Verringerung der Reststandardabweichung ergibt. Aus den erhaltenen Rest-

standardabweichungen wird die Differenz der Varianzen DS2 und daraus die Prüfgröße PG berechnet

und mit dem Tabellenwert verglichen.

HPLC-UV

Der Vergleich der ermittelten Prüfgrößen 3,953 für CTC und 5,145 für e-CTC mit dem Tabellenwert

F(f1 = 1, f2 = N – 3, P = 99 %) von 12,223 zeigt, daß durch die Kalibrierfunktion 2. Grades gegenüber

der 1. Grades keine signifikant bessere Anpassung erreicht wird, da die berechneten Prüfgrößen klei-

ner sind als der Tabellenwert. Die angenommene lineare Kalibrierfunktion wird somit für CTC und e-

CTC rechnerisch bestätigt. Die ermittelten Kenndaten der Anpassungstests für CTC und e-CTC für die

UV-Detektion sind in Tab. A. 13 zusammengefaßt.

Tab. A. 13: Anpassungstest nach MANDEL: Ermittelte Konstanten der Kalibrierfunktionen 1. und 2.

Grades und Prüfgröße PG für CTC und e-CTC (HPLC-UV)

1. Grades

yabx

2. Grades

yabxcx=+ + 2

funktionaler Zusammenhang

CTC e-CTC CTC e-CTC

Konstante a [mAU min] -28,356 -23,872 -126,536 -111,379

Konstante b [mAU min/(mg/L) ] 911,241 910,532 930,015 927,265

Konstante c [mAU min/(mg/L)2 ] --- --- -0,2013 -0,179

Korrelationskoeffizient (r) 0,9999 0,9999 0,9999 0,9999

Reststandardabweichung sy [mAU min] 304,758 250,716 260,456 203,486

CTC e-CTC

PG 3,953 5,145

F-Wert (f1 = 1, f2 = N – 3, P = 99 %) 12,223 12,223

LC-MS/MS

Die Durchführung des Linearitätstests nach MANDEL für die Kalibrierfunktionen der MS/MS-

Detektion bezogen auf einen Arbeitsbereich von 0,005 mg/L bis 50 mg/L bestätigte rechnerisch, daß

durch eine Kalibrierfunktion 2. Grades eine signifikant bessere Anpassung erreicht werden kann als

mit der 1. Grades. Die Aufteilung des Arbeitsbereiches in drei Teilbereiche erbrachte einen linearen

Zusammenhang zwischen Konzentration und Peakfläche für CTC und e-CTC, was rechnerisch mittels

des MANDEL-Testes bestätigt werden konnte, siehe Tab. A. 14.

Anhang

A 18

Tab. A. 14: Anpassungstest nach MANDEL: Ermittelte Prüfgrößen PG für CTC und e-CTC

(LC-MS/MS)

Linearer

Bereich

[mg/L] CTC e-CTC

F-Wert (f1 = 1, f2 = N – 3, P = 99 %)

0,005-0,08 2,211 7,648 21,198

0,1-0,5 2,649 0,320 21,198

1-50 7,805 0,255 34,132

A. 5.4 Residualanalyse

Die Residualanalyse ist eine weitere Möglichkeit, zu prüfen, ob der gewählte funktionale Ansatz des

Kalibriermodells die Meßergebnisse hinreichend genau beschreibt. Die Residuen di ergeben sich dabei

als vertikale Abstände der Meßwerte von der Regressionskurve. Für die Residuen gilt:

Gleichung A. 15: iii y

yd −

mit: i = 1 bis N

mit: i

y= Meßwert der Peakfläche

ˆ= zu i

y gehöriger Schätzwert aus der Regressionsfunktion

Ist der gewählte Modellansatz richtig, weisen die Residuen eine Normalverteilung auf. Läßt sich je-

doch ein Trend feststellen, so ist der zugrunde gelegte Regressionsansatz zu überprüfen und gegebe-

nenfalls gewichtete Regressionsmodelle heranzuziehen [244, 288, 289, 290].

Die in Abb. A. 7 dargestellten Residuen zeigen, daß der gewählte lineare Regressionsansatz für die

UV-Detektion zwar richtig ist, jedoch ansteigende Varianzen zu erkennen sind und damit eine Inho-

mogenität der Varianzen vorliegen könnte.

Abb. A. 7: Graphische Darstellung der Residuen in Abhängigkeit von der Konzentration für die CTC-

Bestimmung (a) und e-CTC-Bestimmung (b) mit HPLC-UV (370 nm)

-600

-400

-200

200

400

600

800

0 102030405060708090100

Konzentration [m g/L]

d (CTC) [mAU min]

-600

-400

-200

200

400

600

0 102030405060708090100

Konzentration [m g/L]

d (e-CTC) [mAU min]

)

Anhang A 19

Die Residualanalysen für die MS/MS-Detektion ergaben für CTC und e-CTC für die drei aufgeteilten

Arbeitsbereiche eine Normalverteilung, dessen graphische Darstellung in Abb. A. 8 erfolgte.

Arbeitsbereich von 0,005-0,08 mg/L

Arbeitsbereich von 0,1-0,5 mg/L

Arbeitsbereich von 1-50 mg/L

Abb. A. 8: Graphische Darstellung der Residuen in Abhängigkeit von der Konzentration für die CTC-

Bestimmung und e-CTC-Bestimmung mit LC-MS/MS

A. 5.5 Varianzhomogenität

Die lineare Regressionsrechung geht von einer konstanten (homogenen) Varianz der Meßwerte (Un-

präzision) über den Arbeitsbereich aus. Eine Inhomogenität der Varianzen führt über eine höhere Un-

präzision hinaus zu einer möglichen Veränderung der Geradensteigung und damit zu einer höheren

Ungenauigkeit. Zur Überprüfung der Varianzhomogenität werden aus den zehn Meßwerten für die

-3000

-2500

-2000

-1500

-1000

-500

500

1000

1500

2000

2500

0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100

Konzentration [mg/L]

d [I min]

CTC

-3000

-2000

-1000

1000

2000

3000

4000

0,000 0,020 0,040 0,060 0,080 0,100

Konzentration [mg/L]

d [I min]

e-CTC

-8000

-6000

-4000

-2000

2000

4000

6000

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

Konzentration [mg/L]

d [I min]

CTC

-8000

-6000

-4000

-2000

2000

4000

6000

0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60

Konzentration [mg/L]

d [I min]

e-CTC

-500000

-400000

-300000

-200000

-100000

100000

200000

300000

400000

500000

0 102030405060

Konzentration [mg/L]

d [I min]

CTC

-400000

-300000

-200000

-100000

100000

200000

300000

400000

0 102030405060

Konzentration [mg/L]

d [I min]

e-CTC

Anhang

A 20

niedrigste und die höchste Konzentration des Arbeitsbereiches die Varianzen 2

s und 2

s gebildet

und einem F-Test unterworfen. Es werden 2·n (n = 10) Meßwerte erhalten. Für die Varianz gilt:

Gleichung A. 16:

()

in,i

i−

−

=∑

mit:

n,i

∑

= für n = 1 bzw. n = 10

Anschließend wird die Prüfgröße PG wie folgt berechnet:

Gleichung A. 17: 2

PG = für 2

10 ss >

oder

Gleichung A. 18: 2

PG = für 2

1ss >

Die berechnete Prüfgröße wird mit dem tabellierten F-Wert (f1 = f2 = N – 1 = 9) für einen Vertrauens-

bereich von 99 % verglichen. Ist PG < F, so ist kein signifikanter Unterschied zwischen den Varian-

zen 2

s und 2

s feststellbar und es ist damit eine Homogenität der Varianzen gegeben. Wenn PG > F

ist, besteht ein signifikanter Unterschied der Varianzen und somit eine Inhomogenität der Varianzen,

so daß durch Einschränken des Arbeitsbereiches versucht werden sollte, eine Varianzhomogenität zu

erreichen. Ist dies nicht möglich, müssen gegebenenfalls gewichtete Regressionsmodelle angewendet

werden.

Die Prüfwerte für die UV-Detektion wurden zu 45,55 für CTC und 13,19 für e-CTC ermittelt und la-

gen damit weit oberhalb des Tabellenwertes von 5,35. Damit ist rechnerisch die bereits durch die Re-

sidualanalyse festgestellte Inhomogenität bestätigt worden.

Zur Überprüfung der Varianzhomogenität bei der MS/MS-Detektion wurden entsprechend die Varian-

zen der niedrigsten und höchsten Konzentration für CTC und e-CTC der drei Arbeitsbereiche ermittelt

und die drei Wertepaare einem F-Test unterworfen, siehe Tab. A. 15.

Tab. A. 15: Prüfung auf Varianzhomogenität: Ermittelte Prüfgrößen PG für CTC und e-CTC

(LC-MS/MS)

Linearer

Bereich

[mg/L] CTC e-CTC

F-Wert (f1 = f2 = N – 1 = 9)

0,005-0,08 29,45 14,83 5,35

0,1-0,5 62,96 50,51 5,35

1-50 507,49 943,14 5,35

Anhang A 21

Sowohl für CTC als auch für e-CTC wurde bei allen drei Teilbereichen trotz starker Einschränkung

des Arbeitsbereiches eine Varianzinhomogenität festgestellt, obwohl mittels Residualanalyse eine

Normalverteilung ermittelt wurde. Eine Varianzinhomogenität kann möglicherweise durch weitere

Einschränkung der gewählten Arbeitsbereiche sowie Anwendung gewichteter Regressionsmodelle

vermieden werden ist aber im Rahmen dieser Arbeit nicht durchgeführt worden, zumal auch in der

Routineanalytik oft eine Inhomogenität der Varianzen bei linearem Regressionsansatz in Kauf ge-

nommen wird. Der Test auf Varianzhomogenität ist zudem als kritisch zu betrachten, da nicht die rela-

tiven, sondern die absoluten Standardabweichungen in die Berechnung der Varianzen eingehen, so daß

die absolute Standardabweichung bei hohen Konzentrationen wesentlich höher ist als bei niedrigen,

obwohl die prozentuale Abweichung vom Sollwert mit zunehmender Konzentration meistens kleiner

wird. Aus diesen Gründen wurden weder der Regressionsansatz geändert noch die Arbeitsbereiche

weiter eingeschränkt.

A. 5.6 Absicherung der unteren Arbeitsgrenze

Eine Kalibrierfunktion ist nur dann für quantitative Analysen anwendbar, wenn sich alle später mit ihr

berechneten Analysenergebnisse signifikant von Null unterscheiden. Die untere Arbeitsgrenze muß,

um sich mit einer vorgegebenen Präzision signifikant von Null zu unterscheiden, über der Bestim-

mungsgrenze liegen. Zur Absicherung der unteren Arbeitsgrenze wird zunächst nach FUNK der Prüf-

wert xp mit t (f = N-2, P = 95 %) berechnet [289, 290]. Für diesen gilt:

Gleichung A. 19:

(

)

()

∑

−

++⋅⋅= N

0xp

xxb

ts2x

mit:

()

∑

−

++⋅+= N

1yp

tsay

Ist xp ≤ x1, so ist der gesamte gewählte Arbeitsbereich abgesichert, und die untere Arbeitsgrenze un-

terscheidet sich signifikant von Null. Liegt xp oberhalb von x1, so ist der Arbeitsbereich erst für Kon-

zentrationen größer statistisch abgesichert und der Arbeitsbereich muß eingeschränkt werden.

Die Prüfwerte xp ergaben sich für die UV-Detektion zu 2,07 für CTC und 1,70 für e-CTC und liegen

oberhalb der gewählten unteren Arbeitsbereichsgrenze von 0,18 mg/L. Die ermittelten Prüfwerte xp

sind aber als kritisch zu betrachten, weil diese Berechnung eine Varianzhomogenität voraussetzt. Dies

ist notwendig, da bei der Berechnung des Prüfwertes xp die nicht normierten Größen der Verfahrens-

standardabweichung sx0 sowie der Reststandardabweichung sy1 einen großen Einfluß haben. Mit ei-

nem Bestimmtheitsmaß der Regressionsgeraden für CTC und e-CTC von R2 = 0,9999 kann trotzdem

von einer hohen Präzision auch im unteren Konzentrationsbereich ausgegangen werden. Die Arbeits-

grenze von 0,18 mg/L kann außerdem als abgesichert gelten, da dieser Grenzwert zum einen oberhalb

der Bestimmungsgrenze, ermittelt über das Signal-Rausch-Verhältnis, liegt und zusätzlich eine mini-

male Meßpräzision von 10 % ab der gewählten unteren Arbeitsbereichsgrenze von 0,18 mg/L erfüllt

ist. Deshalb erfolgt keine Einschränkung des Arbeitsbereiches.

Anhang

A 22

Zur Absicherung der unteren Arbeitsgrenze der MS/MS-Detektion wurde für CTC und e-CTC der

Prüfwert xp für die jeweiligen Arbeitsteilbereiche berechnet und mit den entsprechenden untersten

Konzentrationen x1 verglichen. Nur für den mittleren Arbeitsteilbereich von 0,1-0,5 mg/L konnten xp-

Werte unterhalb von x1 ermittelt werden, so daß nur dieser Arbeitsteilbereich ab x1, die anderen erst ab

den deutlich höher ermittelten xp-Werten, siehe Tab. A. 16.

Tab. A. 16:Absicherung der unteren Arbeitgrenze: xp-Werte für das LC-MS/MS-Verfahren

xp [mg/L]

Konzentrationsbereich

[mg/L] CTC e-CTC

0,005-0,08 0,013 0,024

0,1-0,5 0,035 0,035

1-50 3,660 3,697

Trotz der fehlenden Absicherung der unteren Arbeitsgrenzen wurden diese Bereiche aus den bereits

oben für die UV-Detektion genannten Gründen beibehalten.

A. 5.7 Verfahrenskenndaten

Aus der Empfindlichkeit läßt sich die Verfahrensstandardabweichung und die relative Verfahrensstan-

dardabweichung ableiten. Unter der Empfindlichkeit wird die Änderung des Meßwertes bei einer Än-

derung der Konzentration verstanden. Bei linearen Kalibrierfunktionen sind die Empfindlichkeiten

konstant und entsprechen der Steigung der Regressionsgeraden.

Gleichung A. 20: Verfahrensstandardabweichung: b

s1y

0x =

Gleichung A. 21: relative Verfahrensstandardabweichung: x

%100s

V0x

⋅

Die ermittelten Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC sind in Tab. A. 17

zusammengefaßt. Die relativen Verfahrensstandardabweichungen für das HPLC-UV-Verfahren lagen

mit 1,7 % für CTC und 1,4 % für e-CTC unterhalb des Grenzwertes von 1,8 %.

Für die drei Kalibrierfunktionen der MS/MS-Detektion wurden analog die Verfahrenskenndaten ermit-

telt, die in Tab. A. 18 bis Tab. A. 20 zusammengefaßt sind. Die relativen Verfahrensstandardabwei-

chungen belegen mit Werten zwischen 2,1 % und 6,2 % die gute Leistungsfähigkeit des Analysenver-

fahrens, weil aufgrund der Einschränkung des Arbeitsbereiches in drei Teilbereiche nach KROMIDAS

eine maximal zulässige Verfahrensstandardabweichung von 6,4 % angenommen werden kann [288].

Da ein linearer Zusammenhang zwischen Konzentration und Peakfläche bei der MS/MS-Detektion nur

in einem begrenztem Konzentrationsbereich der oben aufgeführten Bereiche gegeben ist, ist bei der

Ermittlung der CTC-Gehalte in Realproben darauf zu achten, daß die Konzentrationen der Kalibrier-

standardlösungen im Bereich der Realprobe liegen.

Anhang A 23

Tab. A. 17: Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC (HPLC-UV, 370 nm)

Parameter CTC e-CTC

Empfindlichkeit [mAU min/(mg/L) ] 911,200 910,504

Verfahrensstandardabweichung sx0 [mg/L] 0,335 0,276

rel. Verfahrensstandardabweichung Vx0 [%] 1,72 1,42

Tab. A. 18: Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC im Konzentrations-

bereich 0,005-0,08 mg/L (LC-MS/MS)

Parameter CTC e-CTC

Reststandardabweichung sy [I min] 1940,850 2606,243

Empfindlichkeit [I min/(mg/L) ] 1182783,981 836366,874

Verfahrensstandardabweichung sx0 [mg/L] 0,002 0,003

rel. Verfahrensstandardabweichung Vx0 [%] 4,12 6,23

Tab. A. 19: Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC im Konzentrations-

bereich 0,1-0,5 mg/L (LC-MS/MS)

Parameter CTC e-CTC

Reststandardabweichung sy [I min] 4847,790 3475,410

Empfindlichkeit [I min/(mg/L) ] 1121152,553 799036,245

Verfahrensstandardabweichung sx0 [mg/L] 0,004 0,004

rel. Verfahrensstandardabweichung Vx0 [%] 2,09 2,10

Tab. A. 20: Verfahrenskenndaten der Kalibrierfunktionen für CTC und e-CTC im Konzentrationsbe-

reich 1-50 mg/L (LC-MS/MS)

Parameter CTC e-CTC

Reststandardabweichung sy [I min] 351877,160 257871,467

Empfindlichkeit [I min/(mg/L) ] 812434,819 589292,935

Verfahrensstandardabweichung sx0 [mg/L] 0,433 0,438

rel. Verfahrensstandardabweichung Vx0 [%] 2,78 2,81

Anhang

A 24

A.6 Wiederfindungsfunktion

A. 6.1 Berechnung der Wiederfindungsfunktion

Ziel der Wiederfindungsexperimente und der Aufstellung der Wiederfindungsfunktion ist die Ermitt-

lung des Einflusses einzelner Verfahrensschritte sowie einer Verfahrens- oder Probenmodifikation auf

das Analysenverfahren. Die Untersuchungen erfolgen über den gesamten Arbeitsbereich [290]. Zu-

nächst wird die Kalibrierfunktion des analytischen Grundverfahrens ermittelt, für die gilt:

Gleichung A. 22: y = c

a+ cc xb

Zur Aufdeckung von Fehlern in der Probenvorbereitung wird jeder einzelne Kalibrierstandard der

gesamten Probenvorbereitung unterzogen. Die Analysenergebnisse xf werden mit Hilfe der Analysen-

funktion, nach x aufgelöste Kalibrierfunktion, berechnet:

Gleichung A. 23:

−

Die Wiederfindungsgerade stellt die Auftragung der „gefundenen“ Konzentrationen (xf) auf der Ordi-

nate gegen die zudotierte Konzentration (xc) auf der Abszisse dar. Die Wiederfindungsfunktion läßt

sich mathematisch folgendermaßen beschreiben:

Gleichung A. 24: cfff xbax

⋅

Im Idealfall ergibt die Wiederfindungsfunktion eine Gerade mit dem Achsenabschnitt af = 0 und der

Steigung bf = 1 sowie einer Reststandardabweichung syf, die der Verfahrensstandardabweichung des

analytischen Grundverfahrens sx0c entspricht. Für die Reststandardabweichung der Wiederfindungs-

funktion gilt:

Gleichung A. 25:

()

[]

xbax

icffif

yf −

⋅+−

=∑

mit: Nf =Anzahl der Konzentrationsniveaus

Anhang A 25

A. 6.2 Wiederfindungsfunktionen von CTC dotierter Extraktionsmittel

Abb. A. 9: Wiederfindungsfunktion von CTC nach Aufarbeitung mit SPE von CTC-dotierter

Lösungsmittel (MeOH/EDTA-McIlvain-Puffer pH 4 (0,01 mol/L) (20/80) (v/v))

A. 6.3 Wiederfindungsfunktionen von CTC dotierter Muskulaturproben

Abb. A. 10: Wiederfindungsfunktion von CTC nach Aufarbeitung von CTC-dotierter Muskulaturpro-

ben

y = 1,0466x + 0,0393

012345678910

Kalibrierkonz. xc des CTC-

Dotierstandards [mg/L]

gefundene Konz. xf [mg/L]

(Σ CTC + e-CTC)

UV-Detektion

y = 1,0061x + 0,0394

012345678910

Kalibrierkonz. xc des CTC-

Dotierstandards [mg/L]

gefundene Konz. xf [mg/L]

(Σ CTC + e-CTC)

MS/MS-Detektion

y = 0,859x + 0,0219

012345678910

Kalibrierkonz. xc des CTC-

Dotierstandards [mg/L]

gefundene Konz. xf [mg/L]

(Σ CTC + e-CTC)

UV-Detektion

y = 0,6884x - 0,0575

012345678910

Kalibrierkonz. xc des CTC-

Dotierstandards [mg/L]

gefundene Konz. xf [mg/L]

(Σ CTC + e-CTC)

MS/MS-Detektion

Anhang

A 26

A. 6.4 Interpretation der Wiederfindungsfunktion und Kontrolle der Ana-

lysenpräzision

Eine wichtige Voraussetzung für die Aussagefähigkeit der Wiederfindungsfunktion ist die Gleichwer-

tigkeit der Verfahrensstandardabweichungen sx0 der Kalibrierfunktion des analytischen Grundverfah-

rens und der Kalibrierfunktion für die aufgestockte Matrix bzw. der Kalibrierfunktion. Einzelne Pro-

benvorbereitungsschritte wie z.B. Extraktion. Matrixeffekte und Probenvorbereitungsschritte können

zu deutlich höherer Unpräzision der Kalibrierung führen, so daß eventuell vorliegende systematische

Fehler verdeckt werden. Daher werden die Verfahrensstandardabweichung der Kalibrierfunktion des

Grundverfahrens sx0 und die Reststandardabweichung der Wiederfindungsfunktion syf mittels F-Test

auf signifikanten Unterschied geprüft.

Für die Prüfgröße PG gilt:

Gleichung A. 26:

PG ⎟

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛

Ist PG > F (f1 = f2 = Nc-2, P = 99%), so liegt ein signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stan-

dardabweichungen vor und es kann keine Aussage über das Nicht-Vorhandensein systematischer Ab-

weichungen gemacht werden.

A. 6.5 Ermittlung der Vertrauensbereiche für af und bf

Aufgrund von zufälligen Fehlern, also einer Streuung der Meßwerte ergeben sich als Achsenabschnitt

und Steigung der Wiederfindungsfunktion niemals die Idealwerte af = 0 und bf = 1. Zur Beurteilung

des Vorliegens sytematischer Abweichungen müssen daher zunächst die Vertrauensbereiche von af

und bf ermittelt werden.

Für den Vertrauensbereich von af gilt:

Gleichung A. 27:

()

∑−

+⋅⋅±= 2

cc,i

yf)f,P(ff xx

sta)a(VB

mit: t = Student-t-Faktor: P = 95 %, f = Nf-2

Für den Vertrauensbereich von bf gilt:

Gleichung A. 28:

()

∑−

⋅

±= 2

cc,i

yf)f,P(

b)b(VB

A. 6.6 Prüfung auf systematische Abweichungen

Mit Hilfe der berechneten Vertrauensbereiche für af und bf kann das Vorliegen systematischer Abwei-

chungen statistisch überprüft werden. Eine konstant-systematische Abweichung liegt mit 95%iger

statistischer Sicherheit vor, wenn der Vertrauensbereich VB(af) nicht den Wert af = 0 einschließt.

Anhang A 27

Entsprechend gilt, daß eine proportional-systematische Abweichung mit 95%iger Sicherheit vor-

liegt, wenn der Vertrauensbereich VB (bf) den Wert bf = 1 nicht einschließt. Beim Nachweis systema-

tischer Abweichungen hinsichtlich einzelner Verfahrensschritte ist das Analysenverfahren zu optimie-

ren und eine wiederholte Bestimmung der Wiederfindungsfunktion durchzuführen. Lassen sich die

systematischen Abweichungen nicht eliminieren, so ist in der Beschreibung des Verfahrens deutlich

darauf hinzuweisen. Bei proportional-systematischen Abweichungen muß eine Kalibrierung entweder

über das Gesamtverfahren, einschließlich Probenvorbereitung, erfolgen oder es ist das Verfahren der

Standardaddition anzuwenden. Beim Vorliegen konstant-systematischer Abweichungen genügt gege-

benenfalls auch ein Warnvermerk in der Analysenvorschrift.

A. 6.7 Wiederfindung

Die Wiederfindung ist ebenfalls ein Beurteilungskriterium für die Richtigkeit eines Analysenverfah-

rens. Die Wiederfindung läßt sich anhand der Wiederfindungsfunktion nach folgender Formel ermit-

teln:

Gleichung A. 29: 100

f⋅= % mit cfff xbax

⋅

ergibt sich

⇔ 100b

f⋅

⎟

⎠

⎞

⎜

⎝

⎛+= %

Ist das Analysenverfahren frei von konstant- und/oder proportional-systematischen Abweichungen, so

beträgt af = 0 und bf = 1 und die Wiederfindung ist 100 %. Bei Vorliegen von ausschließlich propor-

tional-systematischen Abweichungen ist af ≈ 0, also die Wiederfindung unabhängig von xc und damit

allein durch bf bestimmt. In diesem Fall gilt:

Gleichung A. 30: 100bWF f⋅= %

Bei einer ausschließlich proportional-systematischen Abweichung kann daher ebenfalls eine Wieder-

findung angegeben werden. Wurden jedoch zusätzlich zu proportional-systematischen Abweichungen

oder ausschließlich konstant-proportionale Abweichungen festgestellt, so führt die Beschreibung der

Richtigkeit des Analysenverfahrens allein mit Hilfe der Wiederfindung zu Falschaussagen.

Anhang

A 28

A.7 Kalibrierung des HPLC-UV-Verfahrens zur Bestimmung von

iso-CTC und e-iso-CTC

Abb. A. 11: Funktionaler Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche für die

Bestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC mit HPLC-UV (270 nm) (n = 8)

Abb. A. 12: Funktionaler Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche für die

Bestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC mit LC-MS/MS (n = 8)

e-iso-CTC

y = 1476,4x + 41,247

= 0,9992

iso-CTC

y = 1475,7x + 35,882

= 0,9992

1000

2000

3000

4000

5000

6000

7000

8000

012345

Konzentration [mg/L]

Fläche [mAU min]

iso-CTC

e-iso-CTC

y = -10486x

+ 365818x + 631,3

= 0,9994

iso-CTC

y = -9873,6x

+ 366087x + 3389,4

= 0,9996

200000

400000

600000

800000

1000000

1200000

1400000

1600000

1800000

012345

Konzentration [mg/L]

Fläche [I min]

iso-CTC

e-iso-CTC

Anhang A 29

Tab. A. 21: Konzentrationen, Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Peakflächen für die

Bestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC mittels HPLC-UV (275 nm) (n = 8)

Konz.

iso-CTC

[mg/L]

Peakfläche iso-

CTC

y (n = 8)

[mAU min]

srel, iso-CTC

(n = 8)

[%]

Konz.

e-iso-CTC

[mg/L]

Peakfläche e-iso-

CTC

y (n = 8)

[mAU min]

srel, e-iso-CTC

(n = 8)

[%]

0,046 76,75 8 0,054 89,75 4

0,11 170,63 3 0,14 211,25 3

0,23 350,38 3 0,27 412,75 2

0,46 686,63 2 0,54 806,25 1

1,16 1794 1 1,34 2076,25 2

2,29 3551 2 2,71 4200,13 1

4,59 6735 1 5,41 7941,13 1

Tab. A. 22: Konzentrationen, Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Peakflächen für die

Bestimmung von iso-CTC und e-iso-CTC mittels LC-MS/MS (n = 8)

Konz.

iso-CTC

[mg/L]

Peakfläche iso-

CTC

y (n = 8)

[I min]

srel, iso-CTC

(n = 8)

[%]

Konz.

e-iso-CTC

[mg/L]

Peakfläche e-iso-

CTC

y (n = 8)

[I min]

srel, e-iso-CTC

(n = 8)

[%]

0,011 7052,38 9 0,014 7811,38 7

0,022 12098,38 7 0,028 13306,75 6

0,046 21481,38 9 0,054 23853,25 9

0,11 49179,25 7 0,14 57276,25 9

0,23 93024,38 6 0,27 106031,38 6

0,46 162757,75 5 0,54 182434,25 9

1,16 396051,50 7 1,34 444983,63 6

2,29 804916,38 6 2,71 937561,88 5

4,59 1473231,13 7 5,41 1668910,63 5

Anhang

A 30

A.8 Kalibrierung des HPLC-UV-MS/MS-Verfahrens zur Be-

stimmung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Abb. A. 13: Epimerisierung von Anhydro-CTC in MeOH/Fließmittel A (50/50) (v/v) (β = 10 mg/L) bei

einer Temperatur von 40 °C: Verlauf der Anhydro-CTC- und e-Anhydro-CTC-Konzen-

tration als Funktion von der Zeit (HPLC-UV, 275 nm)

Abb. A. 14: Funktionaler Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche für die Be-

stimmung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit HPLC-UV (275 nm) (n = 8)

0 102030405060

Zeit [h]

Konzentration [mg/L]

Anhydro-CTC

e-Anhydro-CTC

Anhydro-CTC

y = 4948,7x - 29,902

= 0,9999

e-Anhydro-CTC

y = 4876,8x - 142,02

= 0,9999

5000

10000

15000

20000

25000

30000

35000

40000

45000

50000

0246810

Konzentration [mg/L]

Fläche [mAU min]

Anhydro-CTC

e-Anhydro-CTC

Anhang A 31

Abb. A. 15: Funktionaler Zusammenhang zwischen der Konzentration und der Peakfläche für die Be-

stimmung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mit LC-MS/MS (n = 8)

Tab. A. 23: Konzentrationen, Mittelwerte und relative Standardabweichungen der Peakflächen für die

Bestimmung von Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC mittels HPLC-UV-MS/MS (n = 8)

Peakfläche

Anhydro-CTC

y (n = 8)

srel, Anhydro-CTC

(n = 8)

[%]

Peakfläche

e-Anhydro-CTC

y (n = 8)

srel, e-Anhydro-CTC

(n = 8)

[%]

Konz.

[mg/L]

[mAU min]

MS/MS

[I min] UV MS/MS UV

[mAU min]

MS/MS

[I min] UV MS/MS

0,01 -- 623 -- 9 -- 551 -- 11

0,025 132 2234 7 12 112 1474 5 8

0,05 249 4814 6 10 210 4289 7 7

0,1 466 10189 5 8 424 6701 4 8

0,25 1105 27078 7 6 1025 24136 6 7

0,5 2283 46486 4 7 2177 41142 6 6

1 4775 81486 1 5 4582 72911 1 8

2,5 12486 182849 2 4 11999 161682 2 5

5 25137 381526 1 6 24293 347369 1 6

10 49235 761503 2 5 48634 672679 2 4

Anhydro-CTC

y = 75732x + 2693,1

= 0,9997

e-Anhydro-CTC

y = 67273x + 2548,7

= 0,9994

100000

200000

300000

400000

500000

600000

700000

800000

0246810

Konzentration [mg/L]

Fläche [I min]

Anhydro-CTC

e-Anhydro-CTC

Anhang

A 32

A.9 Analysenvorschrift zur Bestimmung von CTC und Metabolite

in Muskulatur, Leber, Niere, Urin, Plasma, Knochen und

Faeces

A. 9.1 Zweck und Anwendungsbereich

Die Methode dient der Identifizierung und Quantifizierung von CTC und seiner Umwandlungs- und

Abbauprodukte („Metabolite“) aus Muskulatur, Leber, Niere, Urin, Plasma, Knochen und Faeces. Aus

dem Endextrakt erfolgt die Identifizierung und Quantifizierung mit HPLC-UV und/oder LC-MS/MS.

A. 9.2 Liste der erfaßbaren Stoffe

Chlortetracyclin (CTC), epi-Chlortetracyclin (e-CTC), iso-Chlortetracyclin (iso-CTC), e-iso-

Chlortetracyclin (e-iso-CTC), Anhydrochlortetracyclin (Anhydro-CTC) und e-Anhydro-

chlortetracyclin (e-Anhydro-CTC)

A. 9.3 Prinzip

Nach der Extraktion der Analyten aus der Matrix bzw. Einstellung des pH-Wertes der Probe mit McIl-

vain-Puffer wird der so erhaltene Extrakt über eine Polymerphasen-Kartusche gereinigt und angerei-

chert. Die Konzentrationsbestimmung der Analyten erfolgt mit HPLC-UV-MS/MS.

A. 9.4 Reagenzien

a) Methanol, p. A.

b) Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz-2-hydrat, (EDTA) reinst

c) Dinatriumhydrogenphosphat Dihydrat, p. A. oder reinst

d) Natriumhydroxid, granuliert, p. A.

e) Perchlorsäure, 60%ige (p.a)

f) Salzsäure, 1 mol/L

g) Wasser, bidestilliert über Quarzglas

h) Zitronensäure Monohydrat, p. A.

i) McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,01 mol/L EDTA

McIlvain-Stammlösung (Gefäßbeschriftung: McIlvaine-Stammlösung): Zunächst wird

eine McIlvain-Stammlösung hergestellt, die bei einer Temperatur von 4 °C bis 8 °C im

Kühlschrank aufzubewahren ist. Dazu wurden 284 g Na2HPO4 (≜2 Mol) und 210 g

Zitronensäure Monohydrat (≜1 Mol) mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt.

100 ml McIlvain-Stammlösung wird mit 800 mL bidest. H2O versetzt und 3,72 g

EDTA (≜0,01 mol/L) darin aufgelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit HCl (6

mol/L) auf 4 eingestellt. Die resultierende Lösung wird mit bidest. H2O auf 1 L aufge-

füllt. Gefäßbeschriftung: McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,01 mol/L EDTA

j) McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,1 mol/L EDTA

McIlvain-Stammlösung (Gefäßbeschriftung: McIlvain-Stammlösung): Zunächst wird

eine McIlvain-Stammlösung hergestellt, die bei einer Temperatur von 4 °C bis 8 °C im

Kühlschrank aufzubewahren ist. Dazu werden 284 g Na2HPO4 (≜2 Mol) und 210 g

Zitronensäure Monohydrat (≜1 Mol) mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt.

Anhang A 33

100 ml McIlvain-Stammlösung werden mit 800 mL bidest. H2O versetzt und 37,2 g

EDTA (≜0,1 mol/L) darin aufgelöst. Der pH-Wert dieser Lösung wird mit HCl (6

mol/L) auf 4 eingestellt. Die resultierende Lösung wird mit bidest. H2O auf 1 L aufge-

füllt. Gefäßbeschriftung: McIlvain-Puffer, pH 4 mit 0,1 mol/L EDTA

k) Extraktionsmittel M

Methanol/McIlvain-Puffer pH 4 mit 0,01 mol/L EDTA (20/80) (v/v)

l) Perchlorsäure 6% (w/w)

Zu 50 g bidest Wasser werden 10 g 60%ige Perchlorsäure gegeben und mit bidestil-

liertem Wasser auf 100 g aufgefüllt.

m) Fließmittel A

In einen 1000 mL-Meßkolben werden etwa 700 mL bidest. H2O vorgelegt und 100

mL Acetonitril (HPLC Gradient Grade) sowie 5 mL konzentrierte Ameisensäure

(reinst) zugegeben. Anschließend wird mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt und gut ge-

mischt.

n) Fließmittel B

In einen 1000 mL-Meßkolben werden etwa 200 mL bidest. H2O vorgelegt und 600

mL Acetonitril (HPLC Gradient Grade) sowie 5 mL konzentrierte Ameisensäure

(reinst) zugegeben. Anschließend wird mit bidest. H2O auf 1 L aufgefüllt und gut ge-

mischt.

A. 9.5 Geräte

a) Handelsübliche Labor- und Glasgeräte

b) Ultra-Turrax, T 25 (Janke & Kunkel)

c) Zentrifuge, Megafuge 2.0R (Heraeus Sepatech/Osterode)

d) Polymerphasen-Kartuschen: Oasis HLB (Waters, Art.Nr.: WAT106202)

e) Vakuumfiltrationsgerät J.T. Baker spe-12 G (Baker/Gross-Gerau)

f) TurboVap® LV Evaporator, Typ ZW 7001 (Zymark/Idstein)

g) Vortex-Rüttler, Minishaker MS 2 (Ika Labortechnik/Staufen)

h) Moulinette SE (Moulinex)

i) Horizontalschüttler HS 501 digital (Ika Labortechnik/Staufen)

j) Knochenmühle, Typ SM 2000 (Retsch/Haan)

A. 9.6 Probenvorbereitung

A 9.6.1 Herstellung der Probenextrakte

Herstellung des Probenextraktes aus Muskulatur: Muskulatur wird in einer Moulinette zerkleinert.

5 g dieser zerkleinerten Matrix werden in ein 80 mL Zentrifugenglas eingewogen. Zu den Proben wer-

den 15 mL Extraktionsmittel M gegeben. Anschließend wird 1 min (nach Stoppuhr) mit dem Ultratur-

rax bei 8000 U/min homogenisiert. Die so homogenisierte Probe wird 25 min bei 3300 g zentrifugiert.

Der Turraxstab wird mit 15 mL Extraktionsmittel M gespült. Das Pellet wird mit den 15 mL Extrakti-

onsmittel M erneut 1 min mit dem Ultraturrax bei 8000 rpm homogenisiert und 25 min bei 3300 g

zentrifugiert. Die Überstände werden vereinigt, nochmals 15 min bei 3300 g zentrifugiert und der

Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

Herstellung des Probenextraktes aus Leber und Niere: Leber oder Niere wird in einer Moulinette

zerkleinert. 5 g dieser zerkleinerten Matrix werden in ein 80 mL Zentrifugenglas eingewogen. Zu den

Anhang

A 34

Proben werden 15 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA gegeben. Anschließend wird 1 min (nach

Stoppuhr) mit dem Ultraturrax bei 8000 U/min homogenisiert. Die so homogenisierte Probe wird 25

min bei 3300 g zentrifugiert. Der Turraxstab wird mit 15 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA

gespült. Das Pellet wird mit den 15 mL McIlvain-Puffer erneut 1 Min mit dem Ultraturrax bei 8000

rpm homogenisiert und 25 min bei 3300 g zentrifugiert. Die Überstände werden vereinigt, nochmals

15 min bei 3300 g zentrifugiert und der Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

Herstellung des Probenextraktes aus Urin: 5 mL Urin werden in ein 10 mL Zentrifugenglas gege-

ben. Nach Zugabe von 4 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA wird 15 Minuten bei 3300 g bei

Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

Herstellung des Probenextraktes aus Plasma: 5 mL Plasma werden in ein 10 mL verschließbares

Reagenzglas aus Kunststoff gefüllt. Es werden zur Proteinfällung 5 mL 6%ige Perchlorsäure zugege-

ben und 30 min auf einer Rüttelmaschine bei 250 Schübe/min geschüttelt. Danach werden die gefäll-

ten Proteine 15 min in einer Zentrifuge bei 3300 g abzentrifugiert (gekühlte Zentrifuge: 10 °C). Der

Überstand wird in ein Zentrifugenglas überführt, anschließend das Reagenzglas mit 5 mL McIlvain-

Puffer mit 0,1 mol/L EDTA gespült, ebenfalls in das Zentrifugenglas überführt und schließlich weitere

20 mL McIlvain-Puffer zugegeben. Danach wird 15 Minuten bei 3300 g zentrifugiert (gekühlte Zentri-

fuge: 10 °C). und der Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

Herstellung des Probenextraktes aus Knochen: 1 g mit einer Knochenmühle gemahlene Knochen

werden in ein 10 mL verschließbares Reagenzglas aus Kunststoff gegeben. Nach Zugabe von 15 mL

1 moL/L HCl wird die Probenlösung über Nacht in den Kühlschrank gestellt. Am nächsten Tag wird

45 min bei 260 Schübe/min auf dem Schüttler geschüttelt und der Extrakt über einen Faltenfilter in ein

10 mL-Zentrifugenglas filtriert. Das Reagenzglas aus Kunststoff wird mit 6 mL bidestilliertem Wasser

ausgespült und zum Probenextrakt gegeben. Anschließend wird der pH-Wert mit 2 mol/L NaOH auf

etwa 4 eingestellt. Die Probenextrakte werden mit bidestilliertem Wasser für die Austarierung der

Zentrifuge auf ein bestimmtes Gewicht aufgefüllt. Danach wird 15 Minuten bei 3300 g zentrifugiert

(gekühlte Zentrifuge: 10 °C). und der Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

Herstellung des Probenextraktes aus Kot: 0,5 g Faeces werden in ein 10 mL verschließbares Rea-

genzglas aus Kunststoff gegeben. Nach Zugabe von 10 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA wird

15 Minuten bei 260 Schübe/min auf dem Schüttler geschüttelt. Anschließend wird 15 min bei 3300 g

und 10 °C zentrifugiert. Der Überstand wird in ein 30 mL Sammelzentrifugenglas gegeben. Das Pellet

wird noch zweimal mit 10 mL McIlvain-Puffer mit 0,1 mol/L EDTA extrahiert. Die Extrakte werden

jeweils 15 Minuten bei 260 Schübe/min auf dem Schüttler geschüttelt und anschließend 15 min bei

3300 g und 10 °C zentrifugiert. Die vereinigten Überstände im Sammelgefäß werden nochmals 10 min

bei 3300 g zentrifugiert und der Überstand zur Festphasenextraktion verwendet.

A 9.6.2 Aufreinigung durch Festphasenextraktion

Der Probenextrakt wird manuell mittels Festphasenextraktion gereinigt und aufkonzentriert, wozu

Oasis HLB- Festphasenkartuschen verwendet werden.

Konditionierung der Kartuschen:

Die Kartusche wird mit 3 mL Methanol und anschließend mit 3 mL bidest. Wasser konditioniert.

(Nach der Konditionierung darf die Kartusche nicht trockengesaugt werden!)

Anhang A 35

Probenaufgabe:

Der Probenextrakt wird sofort nach der Konditionierung langsam durch die Festphasenkartusche ge-

saugt. Nach der Probenaufgabe wird die Kartusche für Muskulaturextrakt zweimal mit 3 mL Me-

OH/bidest. H2O (30/70) und für die anderen Probenextrakte zweimal mit 3 mL MeOH/bidest. H2O

(5/95) gespült und anschließend kurz trockengezogen.

Elution:

Die langsame, tropfenweise Elution der Analyten erfolgt mit 3 ml Methanol in ein 10 mL Turbovap-

glas. (Bemerkung: Für die Bestimmung von Anhydrochlortetracyclin und e-Anhydrochlortetrayclin

mit 6 mL Methanol eluieren!)

A 9.6.3 Herstellung des Endextraktes

Das Eluat wird im TurboVap bei 30°C Badtemperatur bis zur Trockene eingeengt. Der Rückstand

wird in 200 µL Methanol/ Fließmittel A (50/50) (v/v) aufgenommen. Kann der Extrakt nicht sofort

vermessen werden, wird der Extrakt im Tiefkühlschrank bei -26°C bis zur Messung gelagert.

A. 9.7 HPLC-UV-MS/MS-Messung

A 9.7.1 Standardlösungen

Stammlösungen: Die Stammlösungen aller eingesetzten Substanzen werden als Einzellösungen her-

gestellt und aliquotiert bei einer Temperatur von -80 °C aufbewahrt. Zur Herstellung der Stammlösung

werden 10 mg der Festsubstanz in einen 10 mL-Meßkolben eingewogen und mit Methanol (p. a.) auf

10 mL aufgefüllt. Diese Lösung (β = 1g/L) werden in Aliquoten von 1 mL aufgeteilt und sofort tiefge-

froren.

Kalibrierlösungen: Die Kalibrierlösungen der jeweiligen Epimerenpaaren (CTC/e-CTC, Anhydro-

CTC/e-Anhydro-CTC, epimerisiertes iso-CTC) wurden aufgrund der Stabilität, bedingt durch die

leichte Epimerisierung in schwach saurer Lösung, im Verhältnis 1:1 durch Verdünnung der Stammlö-

sungen mit Methanol/Fließmittel A (50/50) (v/v) hergestellt, anschließend entsprechend der Stammlö-

sungen aliquotiert und bei einer Temperatur von -80 °C eingefroren.

A 9.7.2 Analysengeräte

HPLC-UV-MSMS-Anlage (Alliance 2690, Waters/Quattro Ultima, Micromass) mit Ion-Spray Inter-

face, MassLynx-Auswertesoftware.

A 9.7.3 HPLC-UV-Einstellungen

Flußrate: 0,4 mL/min

Injektionsvolumen: 20 bzw. 40 µL

Fließmittel: A, B

Vorsäule: YMC-ODS-AM, (19 x 3 mm, 5 µm)

Trennsäule YMC ODS-AM (150 x 3 mm, 3 µm)

Anhang

A 36

Detektionswellenlänge: 370 nm (CTC, e-CTC)

275 nm (iso-CTC, e-iso-CTC, Anhydro-CTC, e-Anhydro-CTC)

Gradient:

Zeit [min] Fließmittel A [%] Fließmittel B [%]

0 90 10

1,5 80 20

12 60 40

15 40 60

18 0 100

22 0 100

25 90 10

29 90 10

A 9.7.4 LC-MS/MS-Einstellungen

Die Detektion der Analyten mittels Tandemmassenspektrometer erfolgt mit der Electrospray-

Ionisation im positiven Meßmodus (ESI+). Die MS/MS-Detektion erfolgt dabei im MRM-Modus.

Instrument-Parameter

Polarity ESI+

Calibration Static 2

Capillary (kV) 3.50

Cone (V) 50

Hex 1 (V) 0.0

Aperture (V) 0.0

Hex 2 (V) 0.5

Source Temperature (°C) 125

Desolvation Temperature (°C) 270

Cone Gas Flow (L/h) 100

Desolvation Gas Flow (L/h) 500

LM 1 Resolution 10.0

HM 1 Resolution 10.0

Ion Energy 1 1.0

Entrance 15

Collision 25

Exit 15

LM 2 Resolution 10.0

HM 2 Resolution 10.0

Ion Energy 2 1.0

Multiplier (V) 650

Anhang A 37

MS/MS-Methode

CTC und e-CTC

Precurser-Ion

m/z

Cone

[V]

Produkt-Ion

m/z

Dwell Time

[sec]

Collision

[eV]

154,0 0,4 30

370,5 0,5 30

443,7 0,2 20

478,9

462,0 0,3 20

464,1 0,3 20

480,5

446,1 0,3 20

iso-CTC und e-iso-CTC

Precurser-Ion

m/z

Cone

[V]

Produkt-Ion

m/z

Dwell Time

[sec]

Collision

[eV]

154,0 0,4 30

197,0 0,5 40

478,9

462,3 0,3 20

480,6

464,2 0,3 20

Anhydro-CTC und e-Anhydro-CTC

Precurser-Ion

m/z

Cone

[V]

Produkt-Ion

m/z

Dwell Time

[sec]

Collision

[eV]

98,0 0,4 30

154,0 0,5 25

461,5

443,9 0,2 25

462,7

445,8 0,3 25

A 9.7.5 Identitätsnachweis

Die Identifizierung erfolgt über die UV-Spektren, sowie über die Massenspuren der Fragmentionen,

ihre relativen Intensitäten und Retentionszeiten.

A 9.7.6 Quantifizierung

Die Quantifizierung kann mit HPLC-UV oder mit LC-MS/MS in Plasma, Faeces, Muskulatur und

Knochen erfolgen. Für Urin, Leber und Niere ist eine Auswertung über die UV-Chromatogramme

nicht möglich. Zur Quantifizierung wird mit Hilfe von Standardlösungen eine Kalibriergerade erstellt

(externe Standardmethode) und der Stoffgehalt der Proben in ng pro Probeninjektionsvolumen ermit-

telt. Anschließend erfolgt die Berechnung der Analytmenge in der Probe in µg/L bzw. µg/kg Matrix.