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Bestimmung und Identifizierung von

Flavonoiden in Gerste mit HPLC-DAD-MS/MS

Der Fakultät für Naturwissenschaften

Department Chemie

der Universität Paderborn

zur Erlangung des Grades eines

Doktors der Naturwissenschaften

Dr. rer. nat.

vorgelegte Dissertation

von Diplom-Chemikerin

Heike Wollersen

aus Hameln

Paderborn 2004

Die vorliegende Arbeit entstand in der Zeit von Januar 1999 bis April 2004 an der Universität

Paderborn im Fach Anorganische und Analytische Chemie (Department Chemie, Fakultät für

Naturwissenschaften) unter der Leitung von Herrn Prof. Dr. M. Grote in Zusammenarbeit mit

Herrn Prof. Dr. H. Heseker, Fachgruppe Ernährung und Verbraucherbildung (Department

Sport und Gesundheit, Fakultät für Naturwissenschaften).

Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit:

H. Wollersen, M. Grote, H. Heseker; Methodenentwicklung zur Quantifizierung ausgewählter

Flavonoide in Gerste mit HPLC und UV/EC-Detektion, Posterpräsentation 5 th International

Symposium Extraction for Sample Preparation - SFE - (X)SE - SPME, Siegen, Book of Abs-

tracts Vol.I, S. PA4/28, Mai 2001

H. Wollersen, M. Grote, H. Heseker; Method for quantification of selected flavonoids in barley

by hplc with UV/EC detection; Posterpräsentation 25 th International Symposium on High Per-

formance Liquid Phase Separations: HPLC 2001, Maastricht, Niederlande, Juni 2001

H. Wollersen, M. Grote, H. Heseker; Methodenentwicklung zur Quantifizierung ausgewählter

Flavonoide in Gerste mit HPLC und UV/EC-Detektion; Lebensmittelchemie 55 (2001) 65 - 66

H. Wollersen, M. Grote, H. Heseker; Methodenentwicklung, Identifizierung und Quantifizie-

rung von Flavonoiden in Gerste mit HPLC/UV und LC-MS/MS; Posterpräsentation DVG-

LChG-Symposium "Lebensmittel - Mittel zum Leben", Münster, April 2002

H. Wollersen, M. Grote, H. Heseker, Einsatz der LC-MS/MS und der HPLC/UV zur Identifi-

zierung und Quantifizierung von Flavonoiden in Gerste; Analytica, 18. Internationale Fach-

messe und Analytica Conference, München, April 2002

1. Referent: Prof. Dr. M. Grote

2. Referent: Prof. Dr. H. Heseker

Eingereicht am 03.03.2004

Tag der mündlichen Prüfung: 16.04.2004

DANKSAGUNG

Herrn Prof. Dr. M. Grote danke ich sehr herzlich für die interessante Themenstellung, stete

Diskussionsbereitschaft und für die engagierte Betreuung dieser Arbeit.

Herrn Prof. Dr. H. Heseker danke ich für die Zusammenarbeit, die Bereitstellung von

Arbeitsmitteln und die Unterstützung bei der Erstellung dieser Arbeit sowie für die freundliche

Übernahme des Korreferates.

Der Warsteiner Brauerei möchte ich für die Bereitstellung von Probenmaterial sowie für ihre

Hilfsbereitschaft danken.

Der Kommission für Forschung und wissenschaftlichen Nachwuchs der Universität Pader-

born möchte ich für die finanzielle Unterstützung danken.

Herrn Dr. M. Stolz (Staatliches Veterinäruntersuchungsamt Detmold) möchte ich für die

Bereitstellung von Arbeitsmitteln danken.

Weiterhin gilt mein besonderer Dank all den jetzigen und ehemaligen Mitarbeitern des

Arbeitskreises Analytische und Anorganische Chemie wie auch der Fachgruppe Ernährung

und Verbraucherbildung, insbesondere Markus Borges, Rolli Knaup, Claudia Markus, Dr.

Almut Schmid, Birgit Schmidt, Dr. Detlef Schwarze und Andrea Vockel.

Mein ganz besonderer Dank gilt darüber hinaus allen, die außerhalb des Arbeitskreises in

irgendeiner Form zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen haben. Hierbei möchte ich mich

besonders bei meiner Familie, bei Tobias und allen Freunden, die immer für mich da waren,

für ihre große Geduld und die vielfältige Unterstützung jeglicher Art bedanken.

„Let me entertain you…“

(Robert Peter Williams)

Meinen Eltern

in Dankbarkeit

gewidmet

1 Einleitung I

INHALTSVERZEICHNIS

1 EINLEITUNG................................................................................................................1

2 PROBLEMSTELLUNG UND ZIELSETZUNG...............................................................4

3 STRUKTURELLER AUFBAU, PHARMAKOLOGISCHE WIRKUNG UND

METABOLISMUS DER FLAVONOIDE.........................................................................6

3.1 Struktureller Aufbau...............................................................................................6

3.1.1 Struktur und Nomenklatur der monomeren Flavonoide .....................................6

3.1.2 Struktur und Nomenklatur der Proanthocyanidine .............................................7

3.2 Pharmakologische Wirkung und Metabolismus beim Menschen.....................10

3.2.1 Pharmakologische Wirkung.............................................................................10

3.2.2 Metabolismus ..................................................................................................13

4 VORKOMMEN, BEDEUTUNG UND ANALYTIK VON FLAVONOIDEN IN

BRAUPROZESSPROBEN..........................................................................................15

4.1 Flavonoide in Gerste............................................................................................15

4.2 Die Rolle der Flavonoide im Brauprozess..........................................................18

4.3 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben......................................22

4.3.1 Stand der Flavonoid-Analytik in Gerste und Malz ............................................23

4.3.2 Stand der Flavonoid-Analytik in Proben des Brauprozesses............................26

5 ERGEBNISSE UND DISKUSSION.............................................................................28

5.1 Versuche zur Darstellung von Procyanidin B3 als Referenzsubstanz.............28

5.2 Bestimmung von (+)-Catechin in Gerste mittels HPLC-DAD.............................31

5.2.1 Mobile Phase...................................................................................................31

5.2.2 Einfluss des Lösemittels der (+)-Catechin-Messprobe.....................................32

5.2.3 Vorauswahl der analytischen Säule.................................................................33

5.3 Bestimmung von Flavonoiden in Gerste mittels HPLC-DAD ............................38

5.3.1 Probenahme und Probenvorbereitung.............................................................38

5.3.1.1 Extraktion mit dem Ultra-Turrax................................................................39

5.3.1.2 Mikrowellengestützte Extraktion (MSS).....................................................40

5.3.2 Optimierung der HPLC-DAD-Bedingungen......................................................41

5.3.2.1 Optimierung des Gradientenverlaufes ......................................................41

5.3.2.2 Leistungsvergleich der analytischen Säulen .............................................41

5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenentwicklung .......................46

5.5 Validierung des entwickelten HPLC-DAD-Verfahrens.......................................48

1 Einleitung II

5.5.1 Wahl des Arbeitsbereiches..............................................................................49

5.5.1.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2...........................................................49

5.5.1.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2.....................................................50

5.5.2 Linearität..........................................................................................................50

5.5.2.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2...........................................................51

5.5.2.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2.....................................................54

5.5.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze................................................................54

5.5.3.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2...........................................................54

5.5.3.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2.....................................................55

5.5.4 Stabilität...........................................................................................................55

5.5.4.1 Stabilität von (+)-Catechin in Kalibrierlösungen.........................................56

5.5.4.2 Stabilität von (+)-Catechin in Realproben..................................................59

5.5.5 Spezifität..........................................................................................................60

5.5.5.1 Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten ................................60

5.5.5.2 Spezifitätstest durch Vergleich der UV-Spektren ......................................62

5.5.5.3 Spezifitätstest durch Vergleich der Massenspektren (LC-ESI-MS)............64

5.5.6 Präzision..........................................................................................................65

5.5.6.1 Messpräzision...........................................................................................65

5.5.6.2 Methodenpräzision....................................................................................66

5.5.6.3 Tag-zu-Tag-Präzision ...............................................................................67

5.5.7 Richtigkeit........................................................................................................68

5.5.7.1 Wiederfindung ..........................................................................................68

5.5.8 Robustheit .......................................................................................................69

5.5.8.1 Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule.......................................69

5.5.8.2 Einfluss des pH-Wertes der mobilen Phase..............................................70

5.5.9 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse..............................................71

5.6 Identifizierung in Gerste enthaltener Flavonoide mittels

LC-DAD-MS/MS-Kopplung...................................................................................73

5.6.1 Kollisionsexperimente mit monomeren Flavonoiden........................................74

5.6.2 Precursor-Ion-Scan-Experimente mit Gerstenextrakten...................................77

5.6.3 Identifizierung einzelner Gersteninhaltsstoffe mittels MSn-Untersuchungen ....84

5.6.3.1 Monomere Flavonoide ..............................................................................84

5.6.3.2 Dimere Flavonoide....................................................................................85

5.6.3.3 Trimere Flavonoide...................................................................................91

5.6.3.4 Tetramere Flavonoide...............................................................................96

5.6.4 Zusammenfassung der LC-MS-Identifizierungsergebnisse:

Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2..............................................................97

1 Einleitung III

5.6.5 Zusammenfassung der LC-MS-Identifizierungsergebnisse:

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P2......................................................101

5.7 Bestimmung von Flavonoiden in Realproben..................................................103

5.7.1 Bestimmung von Flavonoiden in Sommergersten mittels HPLC-DAD ...........104

5.7.2 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben mittels

LC-DAD-MS/MS ............................................................................................106

5.7.2.1 Kalibrierung des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens ........................................106

5.7.2.2 Bestimmung der Flavonoide in Brauprozessproben................................108

6 ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK ................................................................118

7 EXPERIMENTELLER TEIL ......................................................................................123

7.1 Chemikalien........................................................................................................123

7.2 Geräte..................................................................................................................123

7.2.1 HPLC-DAD-System.......................................................................................123

7.2.2 LC-DAD-MS/MS Ion-Trap-System.................................................................124

7.2.3 LC-MS/MS Triple-Quadrupol-System ............................................................124

7.2.4 NMR-Spektrometer........................................................................................125

7.2.5 Spektrophotometer........................................................................................125

7.2.6 Mikrowellen-System.......................................................................................125

7.2.7 pH-Meter .......................................................................................................125

7.3 Lösungen............................................................................................................126

7.3.1 Mobile Phasen...............................................................................................126

7.3.2 (+)-Catechin-Stammlösung............................................................................126

7.4 Versuche zur Darstellung von Procyanidin B3 ................................................126

7.5 Methodenentwicklung........................................................................................129

7.5.1 Entwicklung der HPLC-DAD-Bedingungen für (+)-Catechin..........................129

7.5.1.1 UV-Absorptionsmaximum.......................................................................129

7.5.1.2 pKs-Wert ................................................................................................129

7.5.1.3 Mobile Phase..........................................................................................129

7.5.1.4 Lösemittel der Messprobe.......................................................................130

7.5.1.5 Vorauswahl der analytischen Trennsäule................................................130

7.5.2 Optimierung der Probenvorbereitung.............................................................131

7.5.2.1 Extraktion mit dem Ultra-Turrax..............................................................131

7.5.2.2 Mikrowellengestützte Extraktion (MSS)...................................................132

7.5.3 Optimierung der HPLC-DAD-Bedingungen....................................................132

7.5.3.1 Gradientenverlauf...................................................................................132

1 Einleitung IV

7.5.3.2 Analytische Trennsäulen.........................................................................133

7.5.3.3 Zusammenfassung der Methodenentwicklung: Allgemeingültige

Vorgehensweise zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste..............................133

7.6 Validierung des HPLC-DAD-Verfahrens............................................................134

7.6.1 Linearer Bereich............................................................................................134

7.6.2 Kalibriergerade..............................................................................................134

7.6.3 Stabilität von (+)-Catechin in Kalibrierlösungen .............................................134

7.6.4 Stabilität von (+)-Catechin in Realproben ......................................................135

7.6.5 Spezifität........................................................................................................135

7.6.5.1 Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten ..............................135

7.6.5.2 Spezifitätstest durch Vergleich der Massenspektren...............................135

7.6.6 Präzision........................................................................................................135

7.6.6.1 Messpräzision.........................................................................................135

7.6.6.2 Methodenpräzision..................................................................................135

7.6.6.3 Tag-zu-Tag-Präzision .............................................................................136

7.6.7 Wiederfindung...............................................................................................136

7.6.8 Robustheit .....................................................................................................136

7.6.8.1 Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule.....................................136

7.6.8.2 Einfluss des pH-Wertes der mobilen Phase............................................136

7.7 Identifizierung in Gerste enthaltener Flavonoide mittels LC-DAD-MS/MS-

Kopplung.............................................................................................................136

7.7.1 Kollisionsexperimente mit monomeren Flavonoiden......................................136

7.7.2 Precursor-Ion-Scan-Experimente mit Gerstenextrakten.................................137

7.7.3 Identifizierung einzelner Gersteninhaltsstoffe durch MSn-Untersuchungen....137

7.8 Bestimmung von Flavonoiden in Realproben..................................................137

7.8.1 Bestimmung von Flavonoiden in Sommergersten mittels HPLC-DAD ...........137

7.8.2 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben mittels

LC-DAD-MS/MS ............................................................................................137

7.8.2.1 Kalibrierung des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens.........................................137

7.8.2.2 Bestimmung der Flavonoide in Brauprozessproben................................138

8 LITERATUR..............................................................................................................141

A ANHANG................................................................................................................... A-1

1 Einleitung V

ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS

a, b, c Koeffizienten aus Geradengleichungen

APCI Atmospheric Pressure Chemical Ionisation

arb relative Flussrate angegeben in arbitrary units

ASE Accelerated Solvent Extraction

AU Absorption Units

β Massenkonzentration

β0 Ausgangskonzentration

C (+)-Catechin

c0 Ausgangskonzentration der Lösung

ci Analyt-Konzentration der Lösung zum Zeitpunkt i

CGp Catechin-Glucopyranosid (2R:3S-Catechin-7-O-β-D-glucopyranosid)

CID Collision Induced Dissociation

d Tag

dc Säulendurchmesser [mm]

di Residuen

dp Teilchendurchmesser [µm]

DAD Dioden-Array-Detektor

DDQ 2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon

DIN Deutsche Industrie Norm

DMACA 4-Dimethylaminozimtaldehyd

DMAP 4-Dimethylaminopyridin

DMF N,N-Dimethylformamid

DNA Desoxyribonucleinsäure

DS2 Differenz der Varianzen

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

EpiC (-)-Epicatechin

EpiGC (-)-Epigallocatechin

ESI Electrospray Ionisation

f empirisch ermittelter Zahlenwert

F Flussrate der mobilen Phase [mL/min]

FAB Fast Atom Bombardment

FDA Food and Drug Administration

g Gramm

GC (-)-Gallocatechin

h Stunde

h reduzierte Trennstufenhöhe (dimensionslos)

hL Hektoliter

1 Einleitung VI

HPLC Hochleistungsflüssigchromatographie (high performance liquid chromatography)

HR-MAS High Resolution Magic Angle Spinning

ICH International Conference on the Harmonisation of technical requirements for the

registration of pharmaceuticals for human use

IUPAC International Union of Pure and Applied Chemistry

k. A. keine Angabe

kg Kilogramm

kV Kilovolt

L Liter

Lc Säulenlänge [mm]

LAMMA Impact Laser Spectroscopy

LDL Lipoproteine geringer Dichte (low density lipoproteins)

mg Milligramm

min Minute

mL Milliliter

mm Millimeter

MS Massenspektrometrie

MSS Microwave Solvent Supported Extraction

m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis

n Anzahl

N Bodenzahl

n. b. nicht bestimmt

n. d. nicht detektiert

NL normalisierter Y-Achsen Modus

nm Nanometer

ν reduzierte Fließgeschwindigkeit (dimensionslos)

P Signifikanzniveau

PVP Polvinylpyrrolidon

PVPP Polyvinylpolypyrrolidon

PW Prüfwert

Q berechneter Quotient aus der Peakbreite und der Retentionszeit

Qxx Koeffizient zur Berechnung der Geradengleichung 2. Ordnung

r Wiederholdifferenz

R2 Bestimmtheitsmaß

Rt Retentionszeit [min]

rM statistischer Tabellenwert für den GRUBBS-Test

RP Reversed Phase (Umkehrphase)

RT Raumtemperatur

s Sekunde

1 Einleitung VII

s Standardabweichung

si2 Varianz einer Datenserie

srel relative Standardabweichung

Sxo Verfahrensstandardabweichung

sy1 Reststandardabweichung, Geradengleichung 1. Ordnung

sy2 Reststandardabweichung, Geradengleichung 2. Ordnung

SPE Festphasenextraktion (solid phase extraction)

t Zeit

TSP Thermospray Interface

u. B. unterhalb der Bestimmungsgrenze

U/min Umdrehungen pro Minute

V Volt

Vxo relative Verfahrensstandardabweichung

w Peakbreite [min]

x Konzentration

Mittelwert der Konzentrationen

xp Prüfwert für die Absicherung der unteren Arbeitsgrenze

y Detektorsignal

y* Detektorsignal mit größter Differenz zum Mittelwert einer Serie

y Mittelwert der Detektorsignale

ˆ aus Geradengleichung berechneter Messwert

1 Einleitung 1

1 Einleitung

In den letzten Jahren ist die Zahl der ernährungsbedingten Erkrankungen in den Industrie-

ländern der Welt, wie z. B. Krebs, Diabetes Mellitus, kardiovaskuläre Erkrankungen, Hyper-

tonie, Adipositas, Hypercholesterinämie und Hyperurikämie, deutlich angestiegen [1-4]. Zahl-

reiche Studien [5-9] belegen, dass eine Prävention dieser Krankheiten, die u. a. durch Um-

welteinflüsse und veränderte Lebensbedingungen hervorgerufen sein können, durch ausrei-

chende körperliche Bewegung aber auch durch eine „gesunde“ und ausgewogene Ernäh-

rung erreicht werden kann. In der Literatur existieren die unterschiedlichsten Ernährungs-

empfehlungen. Allen gemein ist aber, dass ein hoher Verzehr von Obst und Gemüse ange-

raten wird, um eine fettarme, ballaststoffreiche Nahrung reich an essentiellen Vitaminen und

Mineralstoffen aufzunehmen [10]. In Obst und Gemüse finden sich darüber hinaus auch se-

kundäre Pflanzenstoffe, deren Wirkung im menschlichen Stoffwechsel lange Zeit unbekannt

war, obwohl der Mensch sie täglich mit der Nahrung aufnimmt. Forschungsergebnisse der

letzten zehn Jahre sowohl aus epidemiologischen als auch aus in vitro- und in vivo-Studien

deuten darauf hin, dass diese sekundären Pflanzenstoffe präventiv wirksam sind [11-14].

Der Begriff der sogenannten bioaktiven sekundären Pflanzenstoffe wurde erstmals im Jahr

1910 von KOSSEL eingeführt [15]. Dabei handelt es sich um Stoffe, welche nicht unmittelbar

im Energiestoffwechsel von Pflanzen erforderlich sind, sondern unterschiedlichste Funktio-

nen im Sekundärstoffwechsel übernehmen. Sie können u. a. zur UV-Protektion [16], als Ab-

wehrstoffe gegen Schädlinge und Krankheiten sowie als Wachstumsregulatoren dienen [15-

18]. Weiterhin sind sie für wesentliche Eigenschaften wie Farbe oder Geschmack der jewei-

ligen Pflanze oder Frucht mitbestimmend. Obwohl bis heute weder eine einheitliche Definiti-

on der Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe noch eindeutige Kriterien für die Unterschei-

dung zwischen primären und sekundären Pflanzenstoffen bestehen, erfolgte durch die Deut-

sche Gesellschaft für Ernährung (DGE) eine Unterteilung in neun Gruppen: Carotinoide,

Saponine, Glucosinoate, Polyphenole, Protease-Inhibitoren, Terpene, Phytosterine, Phyto-

östrogene und Sulfide [19]. Insgesamt existieren etwa 60.000 - 100.000 dieser Substanzen,

die auch als Phytochemicals bezeichnet werden [17, 20].

Eine wichtige Bedeutung kommt der Gruppe der Polyphenole und hier im besonderen den

Flavonoiden zu. Sie stellen eine umfangreiche Stoffklasse mit bisher mehr als 5000 identifi-

zierten Verbindungen dar [15, 21]. Die Entdeckung und Erforschung der Flavonoide ist histo-

risch eng mit der der Ascorbinsäure und der Krankheit Skorbut verbunden [22, 23]. Im Jahr

1933 extrahierte und identifizierte SZENT-GYÖRGYI [24] Ascorbinsäure aus Zitronen. Zeit-

gleich entdeckte BEZSSONOFF et al. [25] in Zitronensaft zwei antiskorbutisch wirksame

Substanzen. SZENT-GYÖRGYI postulierte, dass Skorbut auf einen doppelten Vitaminmangel

zurückzuführen sei, der Unterversorgung an Ascorbinsäure, dem Vitamin C und einem so-

genannten Vitamin C2 bzw. Vitamin P (P für Permeabilität) [26]. Diesem Stoff wurde die Fä-

higkeit zugesprochen, die Permeabilität der Blutgefäße im menschlichen Körper zu unter-

drücken [27, 28]. In den 50’er Jahren wurde die Zugehörigkeit der gefäßbeeinflussenden

Substanzen zur Gruppe der Vitamine vom Joint Committee on Nomenclature of the Ameri-

1 Einleitung 2

can Society of Biological Chemists und vom American Institute of Nutrition (AIN) dementiert

[29]. Untersuchungen zeigten, dass diese Stoffe eine Polyphenol-Struktur aufweisen und ein

Großteil von ihnen zur Gruppe der Flavonoide (s. Kapitel 3.1.1) zuzuordnen ist. Ihre essen-

tielle Bedeutung für die menschliche Ernährung, vor allem aber ihre unterschiedlichen pro-

tektiven Wirkungsweisen im menschlichen Organismus und folglich ihre präventiven Eigen-

schaften bezüglich der Entstehung verschiedenster Krankheiten, wurden in den folgenden

Jahren erkannt.

Trotz der ständig wachsenden Möglichkeiten in der organischen und analytischen Chemie

besteht noch großer Untersuchungsbedarf auf dem Gebiet der Flavonoid-Forschung. In vie-

len Pflanzenarten [30] sind weder das genaue Flavonoid-Muster noch die Gehalte der ein-

zelnen Verbindungen bzw. der Gesamtflavonoid-Gehalt vollständig geklärt. Dies hat zur Fol-

ge, dass in den daraus hergestellten Lebensmitteln ebenfalls nur begrenzte Aussagen über

Art und Gehalt der Inhaltsstoffe getroffen werden können. Daher ist für ernährungsphysiolo-

gische Untersuchungen ihre Identifizierung und Quantifizierung in pflanzlichen Bestandteilen

und in Lebensmitteln von großer Bedeutung [31]. Viele epidemiologische Verzehrs-Studien

sind nämlich fehlerbehaftet und die genauen Wirkmechanismen der Flavonoide im mensch-

lichen Körper bisher unbekannt.

Die Gewinnung allgemeingültiger Daten über den Gehalt an Flavonoiden in Obst und Gemü-

se ist auf Grund verschiedener Einflussfaktoren aber schwierig. So unterscheiden sich z. B

Genotypen einer Art durch ihre Fähigkeit zur Bildung bzw. Akkumulation von Flavonoiden,

woraus erhebliche Unterschiede der Gehalte zwischen Sorten einer Art resultieren. Weiter-

hin wird der Flavonoid-Gehalt auch von Umweltbedingungen beeinflusst, wobei insbesonde-

re, neben dem Bodentyp, die Witterung während der Wachstumsphase eine Rolle spielt. Der

Zeitpunkt der Ernte und auch die Lagerungsdauer des Obstes oder Gemüses haben eben-

falls einen Einfluss [30, 32-35]. Da Teile der Flavonoid-Biosynthese lichtinduziert ablaufen,

wird ein erhöhter Anteil von Flavonoiden in den Randschichten und Blättern gefunden wird

[36].

Neben der Bestimmung des Flavonoid-Gehaltes in Obst und Gemüse ist aber auch die Er-

mittlung der Gehalte in verarbeiteten pflanzlichen Lebensmitteln von großem Interesse. Die

technologische Verarbeitung hat oft eine Verminderung der Flavonoid-Konzentration zur

Folge, vor allem durch das Entfernen der Schale bzw. Haut von Gemüse und Früchten [37],

sowie durch Erhitzen [38], Auspressen oder Lagerung [32]. Häufig führen aber auch Produk-

tionsschritte wie das Zerkleinern und Fermentieren zu einer Oxidation oder Polymerisation

der monomeren Inhaltsstoffe und damit zu einer Änderung des Flavonoid-Profils des End-

produktes [39]. Eine Bilanzierung vom Rohprodukt über den Verarbeitungsprozess bis hin

zum Endprodukt liefert wichtige Daten über die Zu- oder Abnahme der Flavonoide während

der technologischen Verarbeitung und damit auch über Möglichkeiten, den Flavonoid-Gehalt

des Endproduktes zu steigern.

In diesem Zusammenhang ist die Bestimmung von Flavonoiden in Gerste besonders be-

deutsam, denn Gerste dient als Rohprodukt für viele verschiedene Lebensmittel wie Brot

1 Einleitung 3

oder Müsli, und sie ist neben Hopfen, Hefe und Wasser eine der vier Grundzutaten von Bier.

Jährlich werden weltweit 150 Mio. Tonnen Gerste geerntet. 10 - 15 % dieser weltweiten

Gerstenproduktion nimmt die Braugerste ein [40].

In Gerste sind bisher eine Vielzahl verschiedenartiger Flavonoide identifiziert worden. Hier-

bei handelt es sich zum einen um monomere Flavonoide, die sogenannten Catechine (s.

Abbildung 1), welche ansonsten besonders in Tee, Früchten und daraus hergestellten Ge-

tränken enthalten sind. Zum anderen enthält Gerste auch eine Vielzahl oligomeren Flavo-

noide, die sogenannten Proanthocyanidine (s. Abbildung 3), die aus kondensierten Monome-

ren-Einheiten aufgebaut sind. Sie finden sich unter anderem in hoher Konzentration in Äp-

feln und dunkler Schokolade, und ihr Vorkommen in Rotwein wird neben weiteren Faktoren

unter Umständen für das sogenannte „French Paradox“ verantwortlich gemacht [41].

Sowohl die Proanthocyanidine als auch die Catechine können aufgrund ihrer antioxidativen

Eigenschaften und zahlreichen Reaktionsmöglichkeiten sowohl eine pharmakologische Wir-

kung beim Menschen (s. Kapitel 3.2.1), aber auch einen Einfluss auf den Prozess des Bier-

brauens bzw. auf das Endprodukt Bier selber haben (s. Kapitel 4.2). So sollen sie beispiels-

weise im Bier einen Beitrag zur Geschmacksbildung hinsichtlich Adstringens und eventuell

Bitterkeit ausüben. Weiterhin kann die Fähigkeit der Proanthocyanidine mit Proteinen Kom-

plexe zu bilden zu unerwünschten Trübungserscheinungen im Bier führen. Aus diesem

Grund ist die qualitative und quantitative Bestimmung der monomeren und oligomeren Fla-

vonoide in Gerste und in Bier bzw. in verschiedenen Proben des Brauprozesses sowohl aus

wirtschaftlicher als auch ernährungsphysiologischer Sicht von großem Interesse.

2 Problemstellung und Zielsetzung 4

2 Problemstellung und Zielsetzung

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist kein vollständig validiertes HPLC-Verfahren zur qualitativen

und quantitativen Bestimmung von Flavonoiden in Gerste bekannt. Als ein Grund hierfür ist

die Tatsache zu sehen, dass, abgesehen von einigen monomeren Flavonoiden, keine der in

Gerste bisher detektierten höhermolekularen Verbindungen, die Proanthocyanidine, kom-

merziell als Referenzsubstanzen erhältlich sind. In der Literatur werden verschiedene Ansät-

ze zur Gewinnung von Referenzsubstanzen zum einen durch die Isolierung im präparativen

Maßstab aus Gerste [42-45] oder durch die Synthese der Verbindungen ausgehend von den

Monomeren beschrieben [46-48]. Da sie bisher aber nicht in einem größeren Maßstab zu

Verfügung stehen, ist die Quantifizierung wie auch die Identifizierung der Analyten bei der

HPLC durch Vergleich mit Referenzsubstanzen nicht oder nur schwer möglich.

Da sich die Proanthocyanidine nur durch Anzahl und Sequenz der monomeren Bausteine

(+)-Catechin und (-)-Gallocatechin unterscheiden, sind zudem ihre UV-Spektren als auch ihr

elektrochemisches Verhalten sehr ähnlich. Eine Unterscheidung mit den in der HPLC übli-

cherweise eingesetzten DAD- oder elektrochemischen Detektoren ist nicht bzw. nur sehr

begrenzt möglich. Bis heute ist weder geklärt, welche Flavonoide überhaupt in Gerste vorlie-

gen, noch besteht Einigkeit über den strukturellen Aufbau bereits nachgewiesener höhermo-

lekularer Verbindungen [49-52].

Die bisher bekannten Verfahren zur Bestimmung in Gerste, Malz und verschiedenen Proben

des Brauprozesses beschränken entweder auf die Ermittlung eines Polyphenol-

Summenparameters z. B. zur Prozesskontrolle oder auf die Analyse der Monomeren. Die

HPLC-Verfahren [53-57] sind jedoch vielfach mit chemisch-analytischen Defiziten behaftet.

Dazu zählen eine fehlende oder zumeist ungenügende Überprüfung der einzelnen Arbeits-

schritte des jeweiligen Verbundverfahrens (Probenahme, Probenvorbereitung und chroma-

tographische Bestimmung mit der HPLC) hinsichtlich ihrer analytischen Zuverlässigkeit. Oft

werden nur einzelne Validierungsparameter wie z. B. die Wiederfindung oder die Messpräzi-

sion untersucht, eine vollständige Validierung der Analysenmethode erfolgte bisher nicht.

Aus diesem Grund war das erste Ziel dieser Arbeit die Entwicklung und Validierung eines

HPLC-DAD-Verfahrens (Probenahme, Probenvorbereitung und chromatographische Be-

stimmung) zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von (+)-Catechin in Gerste, wel-

ches sich durch einfache Handhabung in der Praxis sowie gute Wiederholbarkeit der Analy-

senergebnisse auszeichnen sollte. Die Entwicklung des chromatographischen Systems soll-

te hierbei so erfolgen, dass auch eine Detektion mittels Massenspektrometrie erfolgen konn-

te, da das zweite Ziel dieser Arbeit die Identifizierung der in Gerste enthaltenen Flavonoide

war. Die relativ neue Möglichkeit des Einsatzes der Massenspektrometrie als Online-

Detektor in der HPLC sollte hier durch Fragmentierungsexperimente sowohl die Sequen-

zermittlung der Substanzen als auch eine direkte Identifizierung der Verbindungen während

der analytischen Bestimmung ermöglichen. Das abschließende Untersuchungsziel war die

Anwendung des entwickelten Verfahrens zur Verfolgung des Flavonoid-Spektrums während

eines Bierbrauprozesses. Zur Realisierung der gesetzten allgemeinen Untersuchungsziele

2 Problemstellung und Zielsetzung 5

sollte wie folgt vorgegangen werden:

• Es sollte versucht werden, das dimere Flavonoid Procyanidin B3 als Referenzsubstanz zu

synthetisieren.

• Anschließend sollte ein HPLC-DAD-Verfahren mit (+)-Catechin als Modellsubstanz entwi-

ckelt und optimiert werden. Bei der Auswahl der mobilen Phase war hierbei zu beachten,

dass die chromatographischen Bedingungen auf eine LC-DAD-MS/MS-

Gerätekombination zur Identifizierung der Flavonoide in Gerste übertragbar sein sollten.

• Basierend auf den für (+)-Catechin durchgeführten Voruntersuchungen, war geplant im

nächsten Schritt ein HPLC-Verfahren (Probenahme, Probenvorbereitung und analytische

Bestimmung) zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste entwickelt werden. Ziel der Op-

timierung der Probenvorbereitung war, die Analyten möglichst quantitativ, schonend,

schnell und selektiv, d. h. ohne störende Begleitsubstanzen aus Gerste zu extrahieren.

Zum Einsatz sollte hier neben einer klassischen Fest-Flüssig-Extraktion ein, bisher nicht

für Flavonoide in Gerste angewandtes, mikrowellengestütztes Extraktionsverfahren

(MSS) kommen. Weiterhin sollte das bereits für die Modellsubstanz (+)-Catechin entwi-

ckelte chromatographischen System sowohl bezüglich der Auswahl einer geeigneten

Trennsäule als auch eines Gradienten für die Detektion der Flavonoide in Gerste ange-

passt werden.

• Zur Dokumentation der Zuverlässigkeit war beabsichtigt, das entwickelte und optimierte

HPLC-DAD-Analysenverfahren einer ausführlichen Validierung anhand der Parameter Li-

nearität, Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Stabilität, Spezifität, Präzision, Richtigkeit

und Robustheit zu unterwerfen.

• Im nächsten Schritt war vorgesehen, in Gerste enthaltene Flavonoide durch mas-

senspektrometrische Untersuchungen zu identifizieren. Der Einsatz einer Ionenfalle als

Massendetektor (LC-DAD-MS/MS) sollte hier Möglichkeit einer gezielten Fragmentierung

der detektierten Precursor-Ionen durch MSn-Experimente eröffnen. Basierend auf Unter-

suchungen der monomeren Flavonoide sollten durch MSn-Experimente mit Gerstenex-

trakt Rückschlüsse auf die Fragmentierungsmechanismen der detektierten di-, tri- und

tetrameren Flavonoiden erhalten und somit eine Identifizierung dieser Verbindungen er-

reicht werden. Ziel war hierbei, neben der Identifizierung einzelner Substanzen, ein all-

gemeingültiges systematisches Vorgehensschema zur Zuordnung relevanter „Product-

Ionen“ zu erarbeiten.

• Um die Anwendbarkeit des entwickelten und validierten HPLC-DAD-Verfahrens zu de-

monstrieren, war geplant es abschließend zur Bestimmung der Flavonoid-Gehalte in ver-

schiedenen Braugersten einzusetzen. Darüber hinaus sollte in einem exemplarisch

durchgeführten Brauprozesses der Flavonoid-Fluss in verschiedenen Brauprozessstufen

mit LC-DAD-MS/MS verfolgt werden.

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 6

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung

und Metabolismus der Flavonoide

3.1 Struktureller Aufbau

3.1.1 Struktur und Nomenklatur der monomeren Flavonoide

Die Flavonoide, deren Name auf die Gelbfärbung dieser Verbindungen (lat. flavus = gelb)

zurückgeht, bilden die größte Gruppe der Pflanzenphenole. Die Grundstruktur aller Flavo-

noide gründet sich auf ein Diphenylpropan- bzw. Flavangerüst (C6-C3-C6-Körper), dessen B-

Ring biosynthetisch von einem Zimtsäurederivat abstammt [58, 59]. Aufgrund des Oxidati-

onszustandes im mittleren Pyran-Ring des C15-Gerüstes erfolgt eine Unterteilung der Flavo-

noide in verschiedene Untergruppen (s. Abbildung 1). Hierbei wird zwischen Flavanen, Ca-

techinen, Flavanonen, Flavanonolen, Flavonen, Flavonolen, Flavandiolen, Anthocyanidinen

und Chalkonen unterschieden [60, 61].

Flavangerüst

2' 3'

R = H: Flavone

R = OH: Flavonole

R = H: Flavanone

R = OH: Flavanonole

R = H: Flavane

R = OH: Catechine

2OH

Flavandiole Anthocyanidine Chalkone

Abbildung 1: Struktureller Aufbau der einzelnen Flavonoid-Klassen

Bislang konnten über 5000 verschiedene Flavonoide nachgewiesen werden. Die große Zahl

an Verbindungen ergibt sich durch die vielfältige Möglichkeit der Derivatisierung der jeweili-

gen Grundstruktur, dem sogenannten Aglykon, beispielsweise durch Glykosylierung, Hydro-

xylierung, Methylierung oder andere Modifizierungen [62]. Eine Übersicht über die verschie-

denen Stoffklassen wird in dem mehrbändigen Werk von HARBORNE [49-52] gegeben.

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 7

3.1.2 Struktur und Nomenklatur der Proanthocyanidine

Zusätzlich zu den monomeren Flavonoiden finden sich im Pflanzenreich auch die sogenann-

ten Proanthocyanidine. Diese entstehen durch Kondensation von Flavan-3-olen (Catechi-

nen), Flavan-3,4-diolen oder Flavan-4-olen zu linearen oder verzweigten Ketten, die zwi-

schen 2 und etwa 50 Flavan-Einheiten enthalten können, wobei die monomeren Bausteine in

der Natur überwiegend in der 2R-Konfiguration vorliegen [63]. Die Bezeichnung „Proantho-

cyanidine“ leitet sich nicht von einer biochemischen Vorstufe der Anthocyanidine ab, sondern

resultiert aus der Eigenschaft dieser Verbindungen, beim Erhitzen mit Säuren in die entspre-

chenden Anthocyanidine überzugehen. Es werden unterschiedliche Proanthocyanidin-

Klassen abhängig von dem Substitutionsmuster des Monomeren-Bausteins definiert. Tabelle

1 gibt einen Überblick über die bekanntesten Vertreter dieser Substanzklasse [64, 65].

Tabelle 1: Substitutionsmuster der bekanntesten Proanthocyanidine

Proanthocyanidin-Klasse Monomeren-Einheit

(2R:3S-Stereochemie)

Substitutionsmuster

5 7 3’ 4’ 5’

Procyanidin Catechin OH OH OH OH H

Prodelphinidin Gallocatechin OH OH OH OH OH

Propelargonidin Afzelechin OH OH H OH H

Profisetinidin Fisetinidol H OH OH OH H

Die Procyanidine sind die in der Natur am weitesten verbreiteten Vertreter der Proanthocya-

nidine. Bei ihren Monomeren-Bausteinen handelt es sich hauptsächlich um die Stereoisome-

ren (+)-Catechin und (-)-Epicatechin. Liegen zusätzlich im Molekül die Monomeren-

Bausteine (-)-Gallocatechin oder (-)-Epigallocatechin vor, so werden die Verbindungen als

Prodelphinidine bezeichnet (s. Abbildung 2) [66-68].

Abbildung 2: Struktur der Monomeren-Bausteine von Procyanidinen und Prodelphinidinen

Die einzelnen Verbindungen innerhalb einer Proanthocyanidin-Klasse können sich in ihrer

Stereochemie, im Polymerisationsgrad sowie in der Art der Interflavanverknüpfung unter-

R1 R2 R

3 Trivialname Konfiguration

OH H H (+)-Catechin 2R:3S

H OH H (-)-Epicatechin 2R:3R

OH H OH (-)-Gallocatechin 2S:3R

H OH OH (-)-Epigallocatechin 2R:3R

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 8

scheiden. Letztere bildet die Grundlage zur Differenzierung zwischen A-Typen (doppelt ver-

knüpft) und B-Typen (einfach verknüpft) (s. Abbildung 3). Procyanidine vom A-Typ konnten

bisher nur von wenigen Arbeitsgruppen isoliert werden [69]. Für die Procyanidine A1 und A2

wurde eine dimere zweiarmig verknüpfte Struktur nachgewiesen. Es wurden auch trimere,

tetramere und pentamere Komponenten dieses Typs charakterisiert. Die Procyanidine vom

B-Typ sind einfach 4,8- bzw. 4,6-verknüpfte Komponenten, die weitaus häufiger in der Natur

vorkommen als die des A-Typs [70-72].

OH OHHO

a) Procyanidin B3 (B-Typ) b) Procyanidin C2 (B-Typ)

c) Procyanidin B5 (B-Typ) d) Procyanidin A2 (A-Typ)

Abbildung 3: Strukturen dimerer und trimerer Procyanidine: a) Procyanidin B3 (Catechin-

→8)-catechin); b) Procyanidin C2 (Catechin-(4

→8)-catechin-

→8)-catechin; c) Procyanidin B5 (Epicatechin-(4β→6)-epicatechin);

d) Procyanidin A2 (Epicatechin-(2β→O→7),(4β→8)-epicatechin);

(T = top-unit, M = middle-unit, B = base-unit)

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 9

Aufgrund der steigenden Zahl der in Pflanzen identifizierten Verbindungen wurde 1988 von

PORTER [65] eine einheitliche Nomenklatur der Procyanidine basierend auf den Ansätzen

von HEMINGWAY [73] und HASLAM [74] entwickelt. Die Nomenklatur basiert auf der Nomen-

klatur für Kohlenhydrate und stellt eine sehr präzise Alternative zur systematischen IUPAC-

Nomenklatur dar [75]. Die Monomeren-Einheiten werden, wenn sie in der 2R-Konfiguration

vorliegen, mit ihren Trivialnamen (Catechin, Epicatechin) bezeichnet. Flavan-3-ol-Einheiten

mit 2S-Konfiguration, die in der Natur allerdings sehr selten vorkommen, wird ein enantio-

Präfix vorangestellt ((+)-Epicatechin = ent-Epicatechin). Die Interflavonoid-Bindung der ein-

zelnen Monomere wird entsprechend dem System bei Polysacchariden gekennzeichnet: die

Bindungsstelle und die Bindungsrichtung werden in einer Klammer angegeben. Die

Konfiguration der Bindung wird analog der IUPAC-Nomenklatur [75] durch die Symbole α

oder β definiert. In Tabelle 2 sind die Trivialnamen der bekanntesten Procyanidine gemäß

der Nomenklatur nach PORTER [65] aufgeführt.

Um eine Unterscheidung der einzelnen Monomeren-Einheiten innerhalb einer Kettenstruktur

zu ermöglichen, wurde von PORTER eine weitergehende Nomenklatur basierend auf der

Substitution des A- und C-Ringes der Flavanol-Einheiten entwickelt. Erfolgt eine Verknüp-

fung einer Monomeren-Einheit ausschließlich an C-4, so wird diese Einheit als T-Unit (top)

bezeichnet (s. Abbildung 3). Findet eine weitere zweite Verknüpfung an C-6 oder C-8 statt,

handelt es sich um eine M-Unit (middle). Eine J-Unit liegt vor, sobald alle drei möglichen

Positionen (C-4, C-6, C-8) im Molekül für eine Interflavan-Bindung genutzt werden. Eine Mo-

nomeren-Einheit mit nur einer Bindung an C-6 oder C-8 wird als B-Unit (base) bezeichnet

[65, 67].

Tabelle 2: Trivialnamen der bekanntesten di- und trimeren Procyanidine nach der

Nomenklatur von PORTER [65]

Trivialnamen Nomenklatur nach PORTER

Procyanidin B1 Epicatechin-(4β→8)-catechin

Procyanidin B2 Epicatechin-(4β→8)-epicatechin

Procyanidin B3 Catechin-(4α→8)-catechin

Procyanidin B4 Catechin-(4α→8)-epicatechin

Procyanidin B5 Epicatechin-(4β→6)-epicatechin

Procyanidin B6 Catechin-(4α→6)-catechin

Procyanidin B7 Epicatechin-(4β→6)-catechin

Procyanidin B8 Catechin-(4α→6)-epicatechin

Procyanidin A1 Epicatechin-(2β→O→7),(4β→8)-catechin

Procyanidin A2 Epicatechin-(2β→O→7),(4β→8)-epicatechin

Procyanidin C1 Epicatechin-(4β→8)-epicatechin-(4β→8)-epicatechin

Procyanidin C2 Catechin-(4α→8)-catechin-(4α→8)-catechin

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 10

3.2 Pharmakologische Wirkung und Metabolismus beim

Menschen

3.2.1 Pharmakologische Wirkung

Wie bereits in Kapitel 1 erwähnt, existiert eine kaum zu überschauende Anzahl an Untersu-

chungen über gesundheitsfördernde Wirkungen von Flavonoiden im menschlichen Orga-

nismus. In zahlreichen epidemiologischen Studien werden dieser Substanzklasse präventive

Wirkungen gegenüber der Entstehung verschiedenster Krankheiten, wie Herz-Kreislauf-

Erkrankungen, Atherosklerose, Diabetes, zentraler Ischämie, Alterungsprozesse, im beson-

deren aber auch vor verschiedenen Krebserkrankungen zugeschrieben [15]. Vielfache Be-

achtung finden die Flavonoide in letzter Zeit vor allen Dingen aufgrund ihrer möglichen prä-

ventiven Wirkung gegenüber Herz-Kreislauf-Erkrankungen. In diesem Zusammenhang wird

diskutiert, ob neben einer moderaten Alkoholaufnahme [76, 77] und einem mediterranen

Lebensstil [78] auch Flavonoide verantwortlich für das sogenannte „French Paradox“ sind

[79-81].

Die vom Menschen täglich mit der Nahrung aufgenommene Flavonoidmenge ist aufgrund

differierender Ernährungsgewohnheiten individuell sehr unterschiedlich. In einer

internationalen epidemiologischen Langzeitstudie stellten HERTOG et al. [82] 1995 fest, dass

die Flavonoidzufuhr in Japan mit durchschnittlich 68 mg pro Tag, hervorgerufen durch einen

hohen Teekonsum, weit über der in Finnland mit 2,6 mg pro Tag liegt. Die durchschnittliche

Aufnahme von Flavonen und Flavonolen beträgt in den Niederlanden 26 mg pro Tag, wobei

Tee, Zwiebeln und Äpfel die Hauptflavonoidquellen darstellen [83]. KÜHNAU [58] postulierte

für die USA eine tägliche Zufuhr von 1 g Flavonoidglykosiden pro Person. Durch Umrech-

nung dieses Wertes auf die von HERTOG et al. [82] berechneten Flavon- und Flavonol-

Aglyka ergibt sich eine Größenordnung von 115 mg pro Tag.

Diese signifikanten Unterschiede der Flavonoid-Aufnahme beim Menschen ergeben sich

zum einen aus den landestypischen Ernährungsgewohnheiten sowie Verarbeitungsverfahren

der Lebensmittel [84], zum anderen liegen sie auch in dem Mangel an zuverlässigen Analy-

senverfahren zur quantitativen und qualitativen Flavonoid-Bestimmung in Obst, Gemüse und

den daraus gewonnenen Lebensmitteln begründet.

Die Ergebnisse vieler epidemiologischer in vivo-Studien sind aufgrund dieses Mangels, aber

auch wegen fehlender oder nicht valider Bestimmungsmethoden von Flavonoiden im

menschlichen Blutplasma kritisch zu betrachten. Hinzu kommt, dass die Resorption der

Flavonoide bisher nur begrenzt aufgeklärt ist. Zudem lassen viele Autoren die Halbwertszeit

und die Kumulation im menschlichen Körper, sowie die Ausscheidungsprodukte und -dauer

in ihren Untersuchungen außer Acht. Daher und aufgrund der Vielzahl an Studien wird in

diesem Kapitel in erster Linie auf jene pharmakologische Wirkungen von Catechinen und

Proanthocyanidinen eingegangen, die diesen eindeutig zuzuordnen sind. Diese können

selbstverständlich mit den Wirkungen anderer Flavonoide identisch sein. Für detaillierte

Aussagen hinsichtlich der antioxidativen, antimutagenen und antiinflammatorischen Wirkun-

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 11

gen der anderen Flavonoid-Klassen, wird hier auf Übersichtsarbeiten in der Literatur verwie-

sen [15, 59, 61, 85-92].

Eine besondere Rolle in der präventiven Wirkung der Flavonoide gegenüber der Entstehung

von Krankheiten spielt ihre antioxidative Wirkung, welche bereits vielfach in in vitro-Studien

[93-98] und auch in einigen in vivo-Studien [99] nachgewiesen wurde. Der menschliche Kör-

per unterliegt permanent dem Einfluss reaktiver Sauerstoffspezies (z. B. H2O2, OH•, 1O2), die

dem Körper von außen zugeführt oder von ihm selbst produziert werden können [100]. Diese

können im Körper eine Schädigung verschiedenster Zellbestandteile hervorrufen. So unter-

liegt jede Zelle im Körper täglich etwa 10.000 mutagen wirkenden oxidativen Angriffen [101].

Freie Sauerstoffradikale können auch ungesättigte Fettsäuren der Zellmembran und Li-

poproteine niedriger Dichte (LDL, low density lipoproteins) angreifen. Dies führt zu einer

Veränderung der Fließeigenschaften, der Durchlässigkeit und Erregbarkeit der Zellmembran

und damit zur Beeinträchtigung der Interaktion zwischen Zelle und Mikroumgebung. Weiter-

hin kann oxidiertes LDL wesentlich schneller und in größeren Mengen über den Acetyl-LDL-

Rezeptor aufgenommen werden, welches zu Schaumzellen und letztendlich zur Bildung von

Ablagerungen in den Arterien führt und damit zur Grundlage von Atherosklerose. Die Oxida-

tionsangriffe reaktiver Sauerstoffspezies können also zur Entstehung und dem Fortschreiten

verschiedenster Krankheiten führen und den Alterungsprozess des Menschen beschleuni-

gen. Dies ist im besonderen zu erwarten, wenn die antioxidativen Abwehrmechanismen des

Körpers überfordert sind („oxidativer Stress“) [102-104].

Flavonoide übernehmen durch ihre antioxidative Wirkung eine Schutzfunktion gegen diesen

„oxidativen Stress“ und scheinen so vor allem in der Genese von Tumoren und arteriosklero-

tischen Gefäßveränderungen eine Rolle zu spielen. In vitro-Studien belegen, dass Flavonoi-

de in der Lage sind, die Oxidation von LDL zu hemmen und damit die Entstehung von Athe-

rosklerose zu unterdrücken oder zumindest zu vermindern (kardioprotektive Wirkung) [60,

105-108]. Allerdings steht der Nachweis durch entsprechende in vivo-Studien noch aus.

Studien belegen, dass die antioxidative Aktivität der in Bier enthaltenen phenolischen Ver-

bindungen größer als die von Rotwein ist [109]. Übertroffen wird sie nur von schwarzem Tee.

Bei vielen Studien blieb aber der absolute Gehalt der Polyphenole im Lebensmittel unbe-

rücksichtigt. Untersuchungen der in vivo-Serumaktivität führten zu gegensätzlichen Ergeb-

nissen bei Wein und Tee. Die höhere Zufuhr an Polyphenolen in grünem und schwarzen

Tee im Vergleich zu Wein führte zu geringen bis nicht-signifikanten Effekten auf die antioxi-

dative Aktivität des Serums [110-112].

Strukturelle Voraussetzungen für den antioxidativen Wirkmechanismus von Flavonoiden sind

in erster Linie orthoständige Hydroxylgruppen am B-Ring sowie eine Doppelbindung zwi-

schen den C-Atomen 2 und 3 des C-Ringes. Eine Steigerung der Kapazität erfolgt durch

eine Carbonylgruppe am C-Atom 4 und deren Wechselwirkung mit benachbarten Hydro-

xylgruppen [113].

In wässriger Phase liegt das Optimum für die antioxidative Wirkung bei 4 bis 6 Hydro-

xylgruppen im Flavonoid-Gerüst, wobei vor allem orthoständige Hydroxylgruppen eine stark

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 12

antioxidative Kapazität bedingen. Einen großen Einfluss hat auch das Vorhandensein einer

freien Hydroxylgruppe in Position 3: Methylierung und Glykolysierungen an dieser OH-

Gruppe führt zu einem extremen Verlust der antioxidativen Kapazität. Durch verschiedene

Untersuchungen konnte auch gezeigt werden, dass in wässriger Phase oligomere Flavonoi-

de gegenüber den monomeren Verbindungen eine deutlich höhere antioxidative Kapazität

aufweisen [94, 114].

Während Catechine in wässriger Phase eine wesentlich geringere antioxidative Kapazität

aufweisen als z. B. das häufig untersuchte Flavonol Quercetin, zeigen sie in lipophiler Phase

vergleichbare Eigenschaften. Generell sind die strukturellen Voraussetzungen für eine star-

ke antioxidative Kapazität in lipophiler Phase ähnlich denen in wässriger Phase. Zusätzlich

bedingen orthoständige Hydroxylgruppen am A-Ring eine Steigerung der antioxidativen Wir-

kung. Trotz der Vielzahl an Untersuchungen ist der Zusammenhang zwischen der chemi-

schen Struktur und der antioxidativen Aktivität nicht vollständig aufgeklärt. Für zusätzliche

Verwirrung sorgen verschiedene Testsysteme, die gerade bei Catechin zu unterschiedlichen

Ergebnissen führen [94, 97, 113].

Eine indirekte antioxidative Wirkung können die Flavonoide im menschlichen Körper durch

Ihre Fähigkeit, prooxidativ wirkende Metall-Ionen zu chelatisieren, ausüben. In verschiede-

nen in vitro- und auch in in vivo-Untersuchungen zeigt Catechin eine hohe Affinität, mit Kup-

fer- [115, 116], Eisen- [117, 118] oder Aluminium-Ionen [119] Chelat-Komplexe zu bilden,

und sie auf diese Weise als Prooxidans unwirksam zu machen. FERNANDEZ et. al [120]

konnten dabei durch massenspektrometrische Studien sowohl Komplexe mit einer 1:1-

Stöchiometrie als auch darüber hinaus mit 1:2-, 2:2- und 2:3-Stöchiometrie detektieren. Die

Ausbildung der Komplexe erfolgt vermutlich bei pH-Werten zwischen 5 und 7 über die freien

Hydroxylgruppen an C3 und C4 des B-Ringes. Im Sauren dagegen sind sie nicht stabil [121].

Ein weiterer interessanter Aspekt hinsichtlich der pharmakologischen Wirkung von Flavonoi-

den ist die Wechselwirkung mit Ascorbinsäure, einem für den menschlichen Organismus

wichtigen wasserlöslichen Vitamin [122, 123]. Pflanzen mit einem hohen Ascorbinsäure-

Gehalt weisen auch hohe Konzentrationen an Flavonoiden auf. Experimente zeigen, dass

Flavonoide die Aufnahme von Ascorbinsäure im menschlichen Körper unterstützen und so

zu einer erhöhten Ascorbinsäure-Konzentration in verschiedenen Organen führen. Zusätz-

lich sind Flavonoide in der Lage, durch Hemmung einiger Enzyme wie z. B. Ascorbat-

Oxidase die Oxidation von Ascorbinsäure zu unterdrücken [113, 124, 125].

Die Ergebnisse epidemiologischer Studien in bezug auf die antikanzerogene Wirkung von

Flavonoiden sind nicht eindeutig. Aus in vitro- und in vivo-Untersuchungen ergeben sich je-

doch zahlreiche Hinweise darauf, dass eine hohe Aufnahme an Flavonoiden durch verschie-

dene Obst- und Gemüsesorten mit einem geringeren Risiko, an Magen-, Dickdarm- und

Brustkrebs zu erkranken, verbunden ist [59, 86, 126-129]. Des weiteren stellten LE MAR-

CHAND et al. [130] eine negative Korrelation zwischen der Entstehung von Lungen-

Kanzerogenen und dem hohen Konsum von Zwiebeln und Äpfeln fest. Zu ähnlichen Ergeb-

nissen kamen auch KNEKT et al. [131].

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 13

Aus medizinischer Sicht wird angenommen, dass die Hemmung der Kanzerogenese über

verschiedene Mechanismen ablaufen kann. Flavonoide können die Aktivität der Phase-I-

Enzyme hemmen und damit die Umwandlung eines inaktiven in ein aktives Kanzerogen ver-

hindern. Phase-I-Enzyme katalysieren Reaktionen, bei denen Substanzen mit Hydroxylgrup-

pen angereichert werden, wodurch die daraus entstehenden hydrophilen Produkte leichter

ausgeschieden werden können. Als Zwischenprodukte können dabei Kanzerogene entste-

hen. Phase-II-Enzyme wandeln diese aktiven Kanzerogene in inaktive um; ihre Wirkung wird

durch die Aufnahme von Flavonoiden verstärkt [132]. Weiterhin können Flavonoide auch in

direkte Wechselwirkung mit der menschlichen DNA treten. Aufgrund ihrer strukturellen Ähn-

lichkeit mit Nucleotiden maskieren sie die Bindungsstelle für Kanzerogene und verhindern so

das Wachstum DNA-geschädigter Zellen [92, 133, 134]. Durch ihre Fähigkeit zur Induktion

von Apoptose wird in den Tumorzellen der programmierte Zelltod eingeleitet [135].

Eine weitere Fähigkeit, die den Flavonoiden zugeschrieben wird und sowohl einen hemmen-

den Einfluss auf die Kanzerogenese als auch auf dem gesamten menschlichen Organismus

hat, ist ihre immunmodulierende Wirkung. Sie sind in der Lage, verschiedene Enzyme wie

beispielsweise Proteinkinasen oder Phospholipasen zu inhibieren. Dabei kann die Bildung

von Zellen der Immunabwehr, wie T-Lymphocyten oder Makrophagen, sowohl gehemmt als

auch stimuliert werden [136-139].

Eine große Anzahl an Studien über antivirale Effekte von Flavonoiden legt nahe, dass eini-

ge Vertreter prophylaktische Wirkungen gegenüber bestimmten viralen Infektionen haben

[139]. Durch die Bindung zu den viralen Proteinen können sie die Nuclein-Synthese indirekt

unterbrechen. Es gibt sogar Hinweise in der Literatur, dass die Replikation des HIV-Viruses

beeinflusst wird [140, 141].

Weitere nachgewiesene pharmakologische Wirkungen von Flavonoiden werden auf ihre

antiinflammatorischen [137], antimikrobiellen [142] und blutdrucksenkenden Eigen-

schaften [70] zurückgeführt.

3.2.2 Metabolismus

Die systematische Erforschung des Flavonoid-Metabolismus begann in den fünfziger Jah-

ren. Trotz umfangreicher pharmakokinetischer Studien existiert bis heute jedoch zu keinem

Flavonoid eine Untersuchung, in der vollständige Daten zur Resorptionsrate, zum Plas-

maspiegel, zur Metabolisierung sowie zur Elimination an einem größeren Kollektiv bestimmt

wurde [61].

In der Vergangenheit wurde besonders die Biotransformation von (+)-Catechin an verschie-

denen Säugetieren untersucht. Dabei zeigte sich, dass abhängig von der Spezies unter-

schiedliche Verstoffwechselungen stattfinden. Beim Menschen konnten BELL et al. [143] und

andere Autoren [144-147] nach Applikation von Rotwein, schwarzem oder grünem Tee so-

wohl im Blutplasma als auch im Urin die intakte Verbindung nachweisen. Daneben wurden

auch Phase II-Konjugate, d. h. 3’-Methoxycatechin ebenso wie verschiedene Sulfat- und

3 Struktureller Aufbau, Pharmakologische Wirkung und Metabolismus der Flavonoide 14

Glucuronid-Konjugate im Plasma sowie im Urin humaner Probanden gefunden. Eine Ring-

spaltung des Catechins ist nur bei einer freien Hydroxylgruppe an C-3 möglich. Bemerkens-

wert ist der Nachweis von verschiedenen δ-Phenyl-γ-valerolactonen (s. Abbildung 4), einer

Klasse von Metaboliten, die bei anderen Flavonoiden bisher nicht detektiert worden ist. Un-

tersuchungen mit Antibiotika zeigten, dass Valerolactone Stoffwechselprodukte der gastroin-

testinalen Mikroflora darstellen, woraus sich auch die gefundene speziesabhängige

Verstoffwechselung erklärt [61].

(+)-Catechin

Phloroglucin

CH3O

δδ

δ-(3-Hydroxy-4-methoxyphenyl)-

γγ

γ-valerolacton

δδ

δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-

γγ

γ-valerolacton

δδ

δ-(3-Hydroxyphenyl)-

γγ

γ-valerolacton

HO COOH

3-Hydroxyphenyl-

propionsäure

Abbildung 4: Mögliche Verstoffwechselung von (+)-Catechin beim Menschen durch

Mikroorganismen des Gastrointestinaltraktes [61]

Die Verstoffwechselung der Proanthocyanidine durch Mikroorganismen des Gastrointesti-

naltraktes wurde bisher nur in vitro mit Procyanidin B3 untersucht. Nach Inkubation mit der

Mikroflora aus Rattenfaeces konnten GROENEWOUD et al. [148] neben δ-(3-

Hydroxyphenyl)-γ-valerolacton im wesentlichen Phenylpropionsäuren sowie unterschiedlich

hydroxylierte Benzoesäuren nachweisen. Hieraus schlossen die Autoren, dass aus dem

Procyanidin zuerst Catechin gebildet wird, welches dann auf dem in Abbildung 4 dargestell-

ten Weg weiter verstoffwechselt wird. In vivo-Untersuchungen zur Verstoffwechselung von

Proanthocyanidinen beschränken sich zumeist auf die Verfütterung von radioaktiv markier-

ten Substanzgemischen ohne definierte Zusammensetzung an verschiedene Tierspezies

[149]. Obwohl davon auszugehen ist, dass ein erheblicher Teil der Proanthocyanidine resor-

biert wird, ist bis heute nicht geklärt, zu welchen Stoffwechselprodukten sie in vivo umge-

setzt werden, in welchem Ausmaß eine Resorption der Stoffwechselprodukte oder sogar der

intakten Verbindungen stattfinden kann und über welchen Ausscheidungsweg sie eliminiert

werden [61].

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 15

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavo-

noiden in Brauprozessproben

4.1 Flavonoide in Gerste

Ein Gerstenkorn, schematisch dargestellt in Abbildung 5, ist aus einer Schale, dem Keimling

und dem Mehlkörper aufgebaut.

Abbildung 5: Schematischer Aufbau eines Gerstenkorns [151]

Der Keimling besteht aus kleinen, dünnwandigen, eckigen Zellen, die feinkörniges Plasma

und den Zellkern enthalten. Das Embryonalgewebe des Keimes ist wachstumsfähig und

reich an Eiweiß, Fett, Vitaminen, Enzymen und Mineralstoffen. Der Mehlkörper des Kornes

ist aus großen, dünnwandigen Zellen aufgebaut, die Stärkekörner in eine strukturlose Ei-

weißsubstanz eingebaut enthalten. In den Zellen werden die für das Wachstum der Pflanze

notwendigen Nährstoffe gespeichert. Die äußere Schicht des Mehlkörpers besteht aus einer

ein- oder mehrfach mineralstoffreichen Schicht großer wabenförmiger Zellen, der sogenann-

ten Aleuronschicht. Das gesamte Korn wird von einer inneren Samenschale (Farbstoff-

schicht und hyaline Membran), der Testa-Layer, und einer äußeren Fruchtschale (Oberhaut

mit Längszellen, Querzellen und Schlauchzellen) umschlossen. Die Fruchtschale ist bei der

Gerste sehr eng mit einer dem Schutz während des Wachstums dienenden Spelze umhüllt,

die nicht beim Dreschen abfällt, sondern durch einen besonderen Schälvorgang abgetrennt

werden muss [150-153].

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 16

Gerste enthält ein komplexes Gemisch an phenolischen Substanzen, hierzu zählen insbe-

sondere Flavonoide sowie phenolische Säuren und Cumarine. Die Phenolcarbonsäuren lie-

gen in Gerste gewöhnlich gebunden an Zellwandbestandteilen der Schale vor. Die höchste

Konzentration weisen Vanillinsäure (50 mg/kg Gerste), cis/trans-p-Cumarsäure (350 mg/kg

Gerste) und Ferulasäure (1500 mg/kg Gerste) auf [154]. Weiterhin konnten Gallussäure,

Protocatechusäure, Gentisinsäure, p-Hydroxybenzoesäure, Diferulasäure, Kaffeesäure, Sy-

ringasäure, Sinapinsäure, Zimtsäure und Chlorogensäure identifiziert werden [155-157].

Während der allgemeine Biosyntheseweg der Flavonoide im Sekundärstoffwechsel von

Pflanzen als weitgehend aufgeklärt gilt [158-162], ist bei der Biosynthese der in Gerste vor-

kommenden Flavonoide der detaillierte Ablauf einiger Schlüsselreaktionen sowie die Beteili-

gung verschiedener Enzyme bisher noch nicht vollständig bekannt [163, 164]. Mögliche Me-

chanismen sind bei STAFFORD [69, 165] und KRISTIANSEN [166, 167] postuliert.

Verschiedene Untersuchungen haben ergeben, dass die Flavonoide in den Gerstenkörnern

in erster Linie in der Samenschale (Testa-Layer) konzentriert sind, aber auch in den Spelzen

und in der Aleuronschicht vorliegen. Allerdings werden diese Ergebnisse von einigen Auto-

ren dahingehend kritisiert, dass die Flavonoide ausschließlich in der Testa-Layer lokalisiert

sind und ein Vorkommen in den drei Kompartimenten des Korns einzig auf ein mangelhaftes

Untersuchungsverfahren mit unzureichender Trennung der einzelnen Teile des Gersten-

korns zurückzuführen sei [168-172]. In welcher Bindungsform die Flavonoide in den Zellen

vorliegen, ist bisher ungeklärt. Möglicherweise sind sie, ähnlich wie die Phenolcarbonsäuren,

an Zellwandbestandteilen der Schale gebunden. Denkbar ist aber auch, dass ein kleiner

Prozentsatz in Form von Metall-Chelat-Komplexen vorliegt, da Gerste eine Vielzahl von Mi-

neralien und Spurenelementen wie z. B. Eisen, Kobalt, Kupfer enthält [173].

In Gerste sind neben den Monomeren Catechin und Gallocatechin bisher 6 Proanthocyani-

dine identifiziert und charakterisiert worden. Dabei handelt es sich um zwei Dimere und vier

Trimere, die aus Catechin- und Gallocatechin-Einheiten aufgebaut sind. In Tabelle 3 sind die

bisher in Gerste identifizierten Flavonoide und ihre durchschnittlich gefundenen Gehalte auf-

geführt.

In nahezu allen Untersuchungen wurde (+)-Catechin als Monomer in Gerste nachgewiesen,

während JENDE-STRID [174], WHITTLE et al. [181] und BRANDON et al. [175] Hinweise auf

das Vorkommen von Gallocatechin und Epigallocatechin fanden. Die beiden Letztgenannten

konnten zudem ein nur aus Gallocatechin-Einheiten aufgebautes Trimer isolieren. Eine bis-

her ausschließlich in Buchweizen und Rhabarber-Arten detektierte Verbindung, ein Cate-

chin-Glucopyranosid, konnte ebenfalls in Gerste und Malz im Jahr 2000 erstmalig von

FRIEDRICH [183] isoliert und identifiziert werden. Es fehlen hier jedoch aber Bestätigungen

weiterer Arbeitsgruppen. Auch hinsichtlich der in Gerste enthaltenen Proanthocyanidine

besteht Uneinigkeit in der Literatur. Eine ausführliche Strukturaufklärung bezüglich der

Sequenzzuordnung der enthaltenen Monomeren der bisher sechs beschriebenen Haupt-

proanthocyanidine ist bisher nicht bekannt geworden. Darüber hinaus finden sich in der Lite-

ratur auch Hinweise auf die Existenz weiterer oligomere Flavonoide in Gerste. So stellten

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 17

WHITTLE et al. [181] 1999 nach ihren Untersuchungen mittels Electrospray-LC-MS die Ver-

mutung auf, dass neben den sechs Hauptproanthocyanidinen in Gerste weitere 50 oligo-

mere Flavanole bis hin zu Pentameren vorliegen.

Tabelle 3: In Gerste identifizierte Flavonoide mit Konzentrationsbereichen

Trivialname bzw.

Nomenklatur nach

PORTER [65]

in Klammern

Literatur Konzentration

(mg/kg Trockensubstanz

Gerste)

Monomere

(+)-Catechin

(C)

[174-180, 181-183*, 184] [178]: 26-33; [179]: 10-14;

[180]: 30-95; [183*]: 25-50;

[184]: 15-64

Catechin-Glucopyranosid

(CGp)

[183*] [183*]: 6-38

(-)-Epicatechin

(EpiC)

[181, 184, 185] [184]: < 3

(-)-Gallocatechin

(GC)

[174, 175, 181*] k. A.

(-)-Epigallocatechin

(EpiGC)

[174, 181] k. A.

Dimere

Procyanidin B3

(C(4α→8)C)

[174, 175#, 176-180,

181-183*, 186#, 187#]

[178]: 136-270; [179]: 97-142;

[180]: 65-350

Prodelphinidin B3

(GC(4α→8)C)

[174, 175#, 176-180,

181-183*, 186#, 187#]

[178]: 272-362; [179]: 229-

234; [180]: 108-450

Trimere

Procyanidin C2

(C(4α→8)C(4α→8)C)

[174-178, 181*, 183*, 186#,

187#]

[178]: 27-110

Prodelphinidin C2

(GC(4α→8)GC(4α→8)C)

[174-178, 181*, 183*, 186,

187#]

[178]: 135-243

(GC(4α→8)C(4α→8)C) [174-178, 181*, 183*, 186,

187#]

[178]: 114-245

(C(4α→8)GC(4α→8)C) [174-178, 181*, 183*, 186,

187#]

[178]: 59-138

(GC-GC-GC) [175, 181] k. A.

Propelargonidine [176, 186] k. A.

Tetramere/Pentamere [181*] k. A.

# Absicherung über NMR-Untersuchungen

* Absicherung über MS-Untersuchungen

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 18

4.2 Die Rolle der Flavonoide im Brauprozess

Bier wird heutzutage in Deutschland zumeist nach dem bayerischen Reinheitsgebot aus dem

Jahr 1516 gebraut, welches als einzige Grundzutaten Gerste, Hopfen, Wasser und Hefe

vorsieht. Als Braugerste wird vor allem die zweizeilig nickende Sommergerste (Hordeum

distichum nutans) verwendet, aber auch die sechszeilige Wintergerste gewinnt an Bedeu-

tung. Relevante Kriterien für die Qualität von Braugerste sind u. a. die Beschaffenheit des

Mehlkörpers, der Vollgerstenanteil, die Keimenergie und -fähigkeit, der Wassergehalt (Soll <

14 %) sowie der Eiweißgehalt (Soll < 11,5 %). Eiweißarme Gersten sind nötig für die Herstel-

lung heller Malze und Biere, ein hoher Proteingehalt dagegen ergibt Biere mit dunkler Farbe

[152, 188].

Die Bierherstellung gliedert sich in die drei Bereiche Mälzen, Würzbereitung und Gärung

(s. Abbildung 6). Beim Mälzen wird die Gerste unter künstlichen oder gesteuerten Umwelt-

bedingungen zum Keimen gebracht. Durch vorheriges Einweichen der Gerste mit Wasser

werden während des Keimvorgangs Enzyme aktiviert und gebildet, die später im eigentli-

chen Brauprozess am Abbau hochmolekularer Stoffe wie z. B. Stärke und Eiweiß beteiligt

sind. Um optimale Keimbedingungen (hoher Sauerstoffgehalt, 15 - 20 °C) zu erzielen, erfolgt

während des Mälzens das Einblasen von feuchter Luft. Im weiteren Verlauf der Keimung

wird der Mehlkörper, der vor allem aus Stärke besteht, allmählich abgebaut. Die Zellwände

werden aufgelöst und die Eiweiße und Fette partiell abgebaut, es bildet sich das sogenannte

Grünmalz. Durch schonendes Trocknen wird es zum Darrmalz. Die Keimung wird an dieser

Stelle unterbrochen und die typischen Aroma- und Farbstoffe werden gebildet.

Weichen

Gerste Keimen Darren Malz Schroten Maischen Läutern

Kochen

Hopfen Klären Kühlen Gären Klären Abfüllen

Läuterwürze

Wasser Wasser

Mälze

zbe

eitung

Gärung

Bier

Abbildung 6: Der Prozess des Bierbrauens [189]

Bevor das Malz nun weiterverarbeitet wird, erfolgt zunächst seine Schrotung, wobei die

Spelzen nach Möglichkeit intakt bleiben sollten, um beim Läutern als Filterschicht eingesetzt

werden zu können. Der Mehlkörper wird fein zermahlen und mit Wasser gemischt (Mai-

schen). Das Maischen bildet zusammen mit den Prozessen des Abläuterns und des Ko-

chens den Prozess der Würzbereitung. Ziel des Maischens ist, die Inhaltsstoffe des Malzes

in Lösung zu bringen. Dabei ist es erforderlich, diese mit Hilfe der malzeigenen Enzyme so

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 19

weit abzubauen, dass sie in Wasser löslich sind. Da die enzymatischen Vorgänge tempera-

turabhängig sind, wird die Maische auf verschiedene Temperaturen erwärmt. Durch den

Abbau der Stärke durch Amylasen werden der Hefe vergärbare Zucker zur Verfügung ge-

stellt. Im Anschluss an das Maischen erfolgt das sogenannte Läutern, die Abtrennung der

Würze von den als Trebern bezeichneten unlöslichen Rückständen durch Filtration.

Die erhaltene Läuterwürze wird mit dem Hopfen oder Hopfenprodukten (Extrakt/Pellets) in

der sogenannten Würzpfanne gekocht, um die Würze auf die gewünschte Konzentration

einzudampfen, Enzyme zu inaktivieren und um das Eiweiß zu koagulieren. Die im Hopfen

enthaltenen Inhaltsstoffe (z. B. Humulone) werden herausgelöst und durch das Kochen

chemisch verändert. Sie sind verantwortlich für den späteren, typisch bitteren Geschmack

des Bieres. Die nach der Würzbereitung erhaltene geklärte Würze wird dann durch Zugabe

von Hefe der Gärung unterworfen. Im Anschluss an die Gärung wird die Hefe abgetrennt,

das Bier filtriert und anschließend abgefüllt [152, 190, 191].

Unter quantitativen Aspekten sind Flavonoide beim Brauprozess nicht von besonderer Be-

deutung. Qualitativ gesehen wird ihnen hingegen eine wichtige Rolle zugemessen, da sie

durch ihre chemischen Eigenschaften direkt oder indirekt Einfluss auf die Herstellung und

die Qualität des Bieres ausüben können (s. Abbildung 7) [192].

Polyphenole

kolloidale

Stabilität

Schaum-

haltbarkeit

Filt

barkeit

Geschmack Reduktions

vermögen

Farbe

Abbildung 7: Die Bedeutung der Polyphenole für die Bierqualität [192]

Die im Bier nachweisbaren Polyphenole stammen zu etwa 70 bis 90 % aus dem Malz, also

der Gerste, und zu 10 bis 30 % aus dem Hopfen. Die Flavonoide, insbesondere die Pro-

anthocyanidine, werden von einigen Autoren [193, 194] als unverzichtbarer Bestandteil des

Biergeschmackes angesehen. Wegen ihrer relativ geringen Flüchtigkeit treten sie jedoch

nicht mit einer deutlichen Flavournote hervor, sondern stellen einen gewissen Hintergrund-

geschmack dar [195, 196]. Bei Proanthocyanidinen mit bis zu vier Catechin-Einheiten ent-

steht ein bitterer, bei Oligomeren mit etwa 6 bis 10 Catechin-Einheiten ein adstringierender

Geschmack. Bei mehr als 10 verknüpften Einheiten nimmt der adstringierende Geschmack

wieder ab [197]. Bei Verwendung gentechnisch veränderter, proanthocyanidinfreier Gersten

wurden hingegen von vielen Autoren [198-200] keine Beeinträchtigung des Geschmackes

beschieben, was aber nicht immer bestätigt wird [201].

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 20

Neben der Beeinflussung des Biergeschmackes steht auch zur Diskussion, ob Flavonoide

die Geschmacksstabilität des Bieres beeinträchtigen. Für den abgestandenen Geschmack

gealterten Bieres sind vor allem gesättigte und ungesättigte Carbonylverbindungen (Alte-

rungscarbonyle) wie trans-2-Nonenal oder Undecanal verantwortlich. Ihre Entstehung wird

vermutlich durch Oxidation verschiedener Bierinhaltsstoffe durch reaktiven Sauerstoff

(Hydroxylradikale, Hyperoxidradikale) sowohl während der unterschiedlichen Produktions-

schritte, als auch im fertigen Bier hervorgerufen [202]. WALTERS et al. [203, 204] konnten in

Modellversuchen mit gealtertem Bier zeigen, dass bei geringen Sauerstoffkonzentrationen

bevorzugt trans-2-Nonenal und bei einem hohen Sauerstoffgehalt eher langkettige Carbo-

nylverbindungen gebildet werden. Durch Zugabe von Antioxidantien wie z. B. Ascorbinsäure

kann der Alterungsprozess des Bieres verlangsamt werden. Aufgrund ihres Reduktions-

vermögens wird den Flavonoiden eine ähnliche Wirkungsweise zugeschrieben, wobei der

exakte Mechanismus ungeklärt ist. In Modellversuchen wurde gezeigt, dass durch Zugabe

von (+)-Catechin die Bildung längerkettiger Carbonylverbindungen unterdrückt wird [193,

195]. Ähnliche Ergebnisse erzielten KANEDA et al. [205], die durch eine Steigerung des Po-

lyphenols-Gehaltes im Bier eine Erhöhung der Reduktionswirkung feststellen konnten. Bis-

her sind die Zusammenhänge zwischen der Geschmacksstabilität von Bier und der Redukti-

onskraft im Detail aber weiterhin ungeklärt [206-208].

Bei hellen Bieren sind, neben den Produkten der Maillard-Reaktion, Polyphenole die wesent-

lichen Farbbildner. Polyphenolarme Biere haben daher eine besonders helle Farbe. Weisen

die Polyphenole einen hohen Polymerisationsgrad auf, erhält das Bier einen eher rötlichen

Farbton [184]. Bezüglich des Einflusses der Polyphenole auf die Schaumhaltbarkeit des

Bieres konnten WILSON et al. [209] aufzeigen, dass verschiedene Hopfenflavonoide (u. a.

Xanthohumol) die Schaumhaltbarkeit des Bieres nachhaltig verbessern. Dagegen sprechen

Untersuchungen von SCHUR [192], der keinen Einfluss zwischen Polyphenolgehalt und

Schaumhaltbarkeit feststellen konnte. Durch Entfernung der Polyphenole durch Filtration

können auch sogenannte Schaumträger eliminiert werden, der sich auswirkende Effekt auf

die Schaumhaltbarkeit ist aber nur sehr gering [195].

Beim Bierbrauen gilt als besonderes Problem die Trübung („Haze-Formation“) des Bieres.

Bis heute ist noch nicht vollständig geklärt, wodurch diese kolloidale Instabilität des Bieres

hervorgerufen wird. In der Literatur existieren eine beachtliche Anzahl an Veröffentlichungen

zu diesem Thema mit verschiedenen Erklärungsansätzen. Es werden zwei Arten der Trü-

bung unterschieden: die biologische Trübung, welche auf der Verunreinigung des Bieres

durch Mikroorganismen beruht und bei der heutigen Art des Bierbrauens nur noch eine un-

tergeordnete Rolle spielt, sowie die nicht-biologische Trübung. Die nicht-biologische Trübung

entsteht durch die Bildung von wasserunlöslichen Komplexen aus Proteinen der Gerste und

Polyphenolen. Hier wird wiederum zwischen der sogenannten „Kältetrübung“ und der „Dau-

ertrübung“ unterschieden. Die Kältetrübung tritt auf, wenn das Bier auf Temperaturen unter

0 °C abgekühlt wird. Beim Erwärmen löst sie sich häufig wieder auf. Unterliegen die an der

Kältetrübung beteiligten Komponenten aber nach dem Abfüllen des Bieres in solcher Weise

einer Veränderung, dass sie sich bei Raumtemperatur zu unlöslichen Komplexen zusam-

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 21

menlagern, so bildet sich die sogenannte Dauertrübung aus. Die Kältetrübung kann also als

Vorläufer der Dauertrübung angesehen werden [195, 210-212].

Die monomeren Flavonoide sind zwar in der Lage, sich über Wasserstoffbrückenbindungen

an Proteine anzulagern. Dies führt aber nicht zu einer Trübungserscheinung, da sie nicht in

der Lage sind, einzelne Proteinmoleküle zu verbinden. Der Trübung geht eine Polymerisie-

rung der Flavonoid-Monomere voraus, um ein aktives Polymer zu bilden, welches sich dann

entweder über Wasserstoffbrückenbindungen, über schwache hydrophobe Bindungen mit

den Prolin-Abschnitten der Polypeptidketten oder über ionische Bindungen mit ε-Amino-

gruppen der Lysinsequenz mit den Proteinen zusammenlagert [192]. Des weiteren wird

diskutiert, ob sich auch Komplexe mit α- und β-Glucanen, mit Melanoiden oder mit

Hopfenharzen bilden. Die Identifizierung der an der Komplexbildung beteiligten Polypeptide

ist schwierig, da eine hydrolytische Behandlung der Komplexe mit einer Spaltung der Peptid-

Bindung einhergeht. Eine Aussage bezüglich der Beteiligung polymerer Flavonoide an der

Komplexbildung ist nur durch eine vorherige komplette Entfernung der Flavonoide aus dem

Bier, gefolgt von einer gezielten Zugabe der jeweiligen Substanzen möglich [192, 213, 214].

Es existieren verschiedene Methoden zur präventiven Unterdrückung von Trübungserschei-

nungen in Bier. Die erste besteht darin, das gebraute Bier zu kühlen. Dabei entwickelt sich

zunächst die oben beschriebene Kältetrübung. Wenn die Temperatur über einen längeren

Zeitraum gering gehalten wird, bilden sich größere Aggregate der permanenten Trübung

aus, welche durch Filtration entfernt werden können. Weitere Möglichkeiten zur Herabset-

zung der Trübung sind das Brauen unter Stickstoff- oder Kohlendioxid-Atmosphäre, um so

die Oxidation bzw. Polymerisation der Flavonoide zu verhindern und der Zusatz proteolyti-

scher Enzyme, die die Größe der Polypeptid-Ketten verringern [195].

Ein wirkungsvolles in der Praxis zumeist angewandtes Stabilisierungsverfahren beruht auf

der Entfernung der an der Trübung beteiligten Stoffe, den Proteinen oder den Polyphenolen.

Um die Proteine zu isolieren, können Bentonite [215] oder Kieselgelpräparate [216, 217]

eingesetzt werden. Bentonite haben gegenüber Kieselgelen den Nachteil, dass sie unspezi-

fisch auch schaumstabilisierende Polypeptide entfernen. Dagegen hat der Einsatz von Kie-

selgelen eine Beeinflussung des Polyphenol-Gehaltes zur Folge, da die Polyphenole über

Wasserstoffbrücken an die gefällten Proteine gebunden vorliegen und so einer Mitfällung

unterliegen können [195].

Zur Entfernung der Polyphenole wurde in der Literatur bereits 1954 der Einsatz des wasser-

löslichen Polyvinylpyrrolidon (PVP) beschrieben, 1960 wurde darauf basierend das wasser-

unlösliche Polymer Polyvinylpolypyrrolidon (PVPP) entwickelt [192, 195]. Zahlreiche Unter-

suchungen belegen, dass PVPP die Proanthocyanidine und Catechine nahezu quantitativ

aus dem Bier entfernt, ohne dass dabei andere Eigenschaften, wie Farbe, Schaum oder

Geschmack eine Veränderung erfahren [218-223].

Neueste Entwicklungen auf Basis von Ionenaustauscherharzen [224] oder dem gekoppelten

Einsatz von mehreren Adsorbern [225, 226] eröffnen die Möglichkeit, durch gleichzeitige

Eliminierung von Teilen der Protein- als auch der Polyphenol-Fraktion sehr gute Stabilisie-

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 22

rungsergebnisse des Bieres zu erzielen. Ein weiterer vielfach beschriebener Ansatz ist der

Einsatz gentechnisch veränderter, polyphenolfreier Hopfenextrakte oder Malze [227-231].

Brauversuche führten zu stabilen Bieren, deren Geschmack nur unwesentlich von denen mit

polyphenolhaltigen Malzen gebrauten Bieren abwich.

Eine Ursache für die in diesem Kapitel geschilderten, häufig widersprüchlichen Aussagen

bezüglich der in Abbildung 7 dargestellten Bedeutung der Polyphenole für die Bierqualität

liegt darin begründet, dass bisher wenige Untersuchungen über den ausschließlichen Ein-

fluss der Stoffgruppe der Proanthocyanidine oder einzelner Substanzen erfolgt sind. In den

Brauereien wird heutzutage standardmäßig der Gesamtpolyphenol-Gehalt mittels UV-

photometrischer Methoden bestimmt [232]. Differenzierte Aussagen über den Einfluss der

Proanthocyanidine auf beispielsweise die Bieralterung oder die Trübungsbildung sind nur

durch gezielte Einzelstoffanalytik sowohl in den Braugrundstoffen als auch in Proben des

Brauprozesses möglich. Es herrscht aber bis heute noch ein Mangel an analytischen Metho-

den zur quantitativen und qualitativen Bestimmung der Einzelsubstanzen. Im folgenden Ka-

pitel 4.3 wird ein Überblick über die bisher in der Literatur beschriebenen Methoden zur Be-

stimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben gegeben.

4.3 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben

Aufgrund der großen Bedeutung der Flavonoide sowohl im Hinblick auf die pharmakologi-

sche Wirkung beim Menschen (s. Kapitel 3.2.1) als auch auf die technologische Beeinflus-

sung des Brauprozesses und die damit verbundenen Auswirkungen auf das Endprodukt Bier

(s. Kapitel 4.2) ist ihre analytische Bestimmung von großem Interesse. Die bisher in der Lite-

ratur beschriebenen Methoden zur Bestimmung des Flavonoid-Gehaltes in Gerste

(s. Tabelle 3), Malz und in verschiedenen Proben des Brauprozesses sind vielfach mit che-

misch-analytischen Defiziten behaftet. Aus diesem Grund existieren sehr widersprüchliche

Aussagen hinsichtlich des enthaltenen Flavonoid-Spektrums und den Mengenangaben der

einzelnen Verbindungen.

Während in der Literatur verschiedene Methoden zur Bestimmung der Flavonoide in Gerste

und Malz sowie auch in Bier beschrieben sind [53-57, 179], finden sich nur sehr wenige Un-

tersuchungen über die Verfolgung des Flavonoid-Gehaltes in Proben des Brauprozesses

[233]. In den folgenden Kapiteln 4.3.1 und 4.3.2 soll ein Überblick über die bisher in der Lite-

ratur beschriebenen Verfahren zur Flavonoid-Bestimmung in Gerste und Malz sowie in ver-

schiedenen Proben des Brauprozesses gegeben werden.

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 23

4.3.1 Stand der Flavonoid-Analytik in Gerste und Malz

Die analytischen Methoden zur Bestimmung der Flavonoide in Gerste und Malz können wie

allgemein üblich in die Bereiche Probenahme, Probenvorbereitung und die eigentliche analy-

tische Bestimmung unterteilt werden.

Probenahme:

Die Probenahme umfasst den gesamten Vorgang von der Entnahme der Proben und gege-

benenfalls dem Zerkleinern, dem Mischen und Teilen des Probengutes bis zum Vorliegen

der Analysenprobe [234]. In den in der Literatur beschriebenen Verfahren liegen keine An-

gaben über die Durchführung der Probenahme und der damit gewährleisteten statistischen

Absicherung vor. Es wird lediglich eine Beschreibung der untersuchten Gersten- bzw. Malz-

sorten angeführt [168, 185, 235, 236]. Im ersten Verfahrensschritt werden die jeweiligen

Proben zu einem feinen Pulver vermahlen und im Anschluss der Probenvorbereitung unter-

worfen. Einzig bei den von OUTTRUP et al. [187] durchgeführten Untersuchungen schließt

sich an das Zerkleinern eine Siebung des Probengutes an, um die Homogenität der Probe

abzusichern.

Probenvorbereitung:

Ziel der Probenvorbereitung ist es, die Flavonoide (Monomere und Oligomere) quantitativ,

schnell, schonend und selektiv aus der Probenmatrix zu extrahieren. In der Literatur wird der

Einsatz unterschiedlicher Extraktionsmethoden beschrieben. Die am häufigsten eingesetzte

Methode ist die klassische Fest-Flüssig-Solvent-Extraktion mit Hilfe eines Mixers [178, 182]

oder eines Hochtouren-Zerkleinerers (Ultra-Turrax) [185], um eine vollständige Homogeni-

sierung des Probenmaterials und damit eine möglichst quantitative Extraktion der Flavonoide

zu erzielen. Dagegen setzte FRIEDRICH [183] nach einer Zerkleinerung der Gerste mittels

einer Kugelmühle die Soxhlet-Extraktion zur Probenvorbereitung ein, während ZIMMERMANN

et al. [237] gute Ausbeuten mit der ASE (Accelerated Solvent Extraction) erzielen konnten.

Als Extraktionsmittel wird in den meisten Fällen Aceton/Wasser (75:25, v/v) eingesetzt [174,

176, 178-180, 238]. Die Extraktion mit Methanol oder Methanol-Wasser-Gemischen dage-

gen führt zu wesentlich geringeren Ausbeuten [235, 239]. Andere Mischungsverhältnisse

von Aceton mit Wasser, reines Aceton sowie Gemische von Wasser mit Dioxan oder Essig-

säureethylester sind ebenfalls weniger gut geeignet [176, 177]. KALUZA et al. [239] erzielten

für die Extraktion aus Hirse mit wässrigem N,N-Dimethylformamid (DMF) gute Ergebnisse,

allerdings ist eine nachfolgende Aufkonzentrierung der Analyten durch Eindampfen der Lö-

sung hier schwierig.

Die Probenaufbereitung zur quantitativen Bestimmung der Flavonoide ist unter schonenden

Bedingungen durchzuführen, da insbesondere die Proanthocyanidine bei erhöhten Tempe-

raturen (> 50 °C) unter Luft- und Lichteinfluss oxidationslabil sind [240]. Um die Oxidation zu

verhindern bzw. zu unterdrücken, geben einige Autoren Antioxidantien wie z. B. Ascorbin-

säure zu den Extraktions-Gemischen oder arbeiten unter Schutzgasatmosphäre [177, 185].

Die so gewonnenen Rohextrakte werden vor ihrer chromatographischen Untersuchung noch

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 24

einer weiteren Aufreinigung unterworfen. Diese dient sowohl zur Abtrennung von störenden

gelösten Matrixbestandteilen sowie zur Aufkonzentrierung der Analyten. Zur Abtrennung

lipophiler Substanzen (z. B. Carotinoiden), die sich störend auf die chromatographische

Trennung auswirken können, wird der Einsatz einer Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Chloro-

form, Hexan oder Petrolether empfohlen [185, 236]. Häufig wird auch die Überführung der

Flavonoide aus den Rohextrakten in Ethylacetat beschrieben [174]. Dieses Verfahren hat

aber den Nachteil, dass die polaren Proanthocyanidine nicht quantitativ übergehen [236].

Andere Möglichkeiten zur Aufreinigung und Aufkonzentrierung der Rohextrakte eröffnet die

Extraktion an Festphasenmaterialien (SPE; Solid Phase Extraction), wie z. B. an Polyamid,

an Ionenaustauschermaterialien oder an Umkehrphasen. Die SPE bietet eine schnelle und

selektive Methode der Probenvorbereitung. Neben der Aufreinigung und Aufkonzentrierung

ist sie auch zur Überführung eines Analyten in ein anderes Lösemittel oder zur Derivatisie-

rung einsetzbar. Weiterhin eignet sie sich zur Vorfraktionierung einer Probe z. B. in unter-

schiedliche Verbindungsklassen [241].

Analytische Bestimmung:

Zur Quantifizierung der Proanthocyanidine werden z. B. zur Prozesskontrolle häufig photo-

metrische Methoden eingesetzt. In der Regel beruhen diese Verfahren auf der Wechselwir-

kung von Polyphenolen mit Eiweißen und anschließender nasschemischer Reaktion [63]. Da

so der Gesamt-Polyphenol-Gehalt als Summenparameter in der Probe erfasst wird, sind

diese Methoden sehr unspezifisch. Bei einem anderen beschriebenen Verfahren werden

ausschließlich die Proanthocyanidine als Summenparameter gemessen. Es wird ihre Um-

setzung zu Anthocyanidinen mit butanolischer Salzsäurelösung [242] und die Reaktion mit

aromatischen Aldehyden (z. B. Vanillin) [243] zu rotgefärbten Produkten genutzt. Eine ähnli-

che Reaktion wie das Vanillin, allerdings zu blauen Kondensationsprodukten, geht DMACA

(4-Dimethylaminozimtaldehyd) ein, welches mit der terminalen Einheit der Proanthocyanidi-

ne reagiert [244]. Um Aussagen über detaillierte Struktur-Wirkungsbeziehungen sowohl hin-

sichtlich der pharmakologischen Wirkung als auch bei der Beeinflussung der technologi-

schen Prozesse zu treffen, ist die Ermittlung des Flavonoid-Gehaltes in Form eines Sum-

menparameters aber nicht ausreichend.

Zur Identifizierung und Strukturaufklärung der Proanthocyanidine bezüglich Anzahl und Art

der Monomeren-Einheiten, sequenzieller Aufbau und Stereochemie der Verknüpfungsstelle

der Monomeren werden in der Literatur verschiedene chemisch- und strukturanalytische

Methoden beschrieben [63]. Eine Möglichkeit besteht in der säurekatalysierten Hydrolyse mit

z. B. Schwefelsäure. Hierbei erfolgt eine Spaltung der Interflavan-Bindung, bei der das ent-

stehende Carbokation in alkoholischer Lösung zum Anthocyanidin reagiert. Das Chinon-

methid als zweites Hydrolyseprodukt kann durch nucleophile Reagenzien abgefangen wer-

den. Dadurch sind die enthaltenen Bausteine identifizierbar, und die Position der Interflavan-

Bindung kann bestimmt werden. Diese Methode ist aber sehr aufwendig, fehlerbehaftet, und

es können keine Aussagen über die Stereochemie der Interflavan-Bindung getroffen werden

[175, 245, 248].

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 25

In den achtziger Jahren eröffnete der Einsatz der 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie eine neue

Möglichkeit der Strukturaufklärung. OUTTRUP et al. [187] und MULKAY et al. [186] konnten in

Gerste zwei dimere und vier trimere Proanthocyanidine mittels NMR identifizieren und cha-

rakterisieren. Mittels 13C-NMR lässt sich hierbei die absolute und die relative Stereochemie

des heterocyclischen Ringes der einzelnen Monomeren-Einheit, das Verhältnis von Cate-

chin/Epicatechin- zu Gallocatechin-Einheiten, sowie indirekt das Molekulargewicht der unter-

suchten Verbindung bestimmen. Eine Aussage über die Monomeren-Sequenz, abgesehen

von der top und der base-Einheit, ist mit dieser Methode aber nur schwer möglich [67, 246].

Heutzutage werden für die quantitative Bestimmung von Flavonoiden in Gerste und Malz

hauptsächlich flüssig-chromatographische Verfahren beschrieben, wobei die Dünnschichtch-

romatographie (DC) [247] weitestgehend von der HPLC abgelöst wurde. Häufig werden

C18-Umkehrphasen (Reversed Phase, RP-C18-HPLC) mit binären wässrigen Gradienten-

systemen (Methanol oder Acetonitril) [174, 176, 180, 183-186, 235, 236, 248] und UV-

Detektion bei 280 nm eingesetzt. Durch Zugabe von Essig- oder Ameisensäure wird die

Trennleistung verbessert und Peaktailing unterdrückt; seltener wird auch der Zusatz von

organischen Modifiern wie 2-Propanol, Tetrahydrofuran oder Isooctan zur mobilen Phase

empfohlen [174, 181, 184, 185, 249].

Die Detektion der Flavonoide mit Dioden-Array-Detektoren (DAD) bietet gegenüber den her-

kömmlichen Festwellenlängen-UV-Detektoren die Möglichkeit, die chromatographischen

Peaks anhand ihrer UV-Spektren zu charakterisieren [185, 235]. Des weiteren wird die auf-

wendige Nachsäulenderivatisierung mit DMACA beschrieben, wobei die gebildeten blauen

Kondensationsprodukte mit großer Empfindlichkeit bei einer Wellenlänge von 640 nm detek-

tiert werden [72]. Der Einsatz eines coulometrischen Detektors führt gegenüber der UV-

Detektion zu niedrigeren Nachweisgrenzen [183].

Ein großes Problem bei der Bestimmung von Flavonoiden in Gerste und Malz besteht aber

darin, dass für die bisher beschriebenen Proanthocyanidine keine Standardsubstanzen

kommerziell erhältlich sind. Da sich die Proanthocyanidine nur durch Anzahl und Sequenz

der monomeren Bausteine (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin unterscheiden und damit so-

wohl in ihren UV-Spektren als auch in ihrem elektrochemischen Verhalten sehr ähnlich sind

[183], kann eine sichere Unterscheidung der einzelnen Substanzen nicht über DAD- oder

elektrochemische Detektion erfolgen. Bei der UV-Detektion wird durch die Spektrenähnlich-

keit allerdings die Möglichkeit der sogenannten indirekten Quantifizierung über (+)-Catechin

genutzt [183].

In den späten neunziger Jahren eröffnete die Entwicklung neuer Kopplungsmethoden mit

der HPLC Möglichkeiten zur Identifizierung der Proanthocyanidine. Die Technik der HPLC-

NMR [250], der Einsatz der NMR-Spektroskopie als Online-Detektor, wurde dabei z. B. für

die Bestimmung von Flavonoidglykosiden [251, 252] oder zur Bestimmung der Phenolsäuren

in Hopfen und Bier beschrieben [253].

Eine weitere, relativ neue Analysentechnik, stellt die Verwendung eines Massenspektrome-

ters als Detektor in der HPLC, die sogenannte LC-MS/MS-Kopplung, dar. Sie bietet einer-

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 26

seits die Möglichkeit zur Online-Identifizierung der Proanthocyanidine über ihre Molmassen.

Durch gezielte Fragmentierungsuntersuchungen (MS/MS) können Hinweise über die se-

quenzielle Verknüpfung der Monomeren in den oligomeren Verbindungen getroffen werden.

Bisher existieren aber nur sehr wenige Veröffentlichungen auf dem Gebiet der Gersten-,

Malz- sowie der Bieranalytik [181-183, 249]. WHITTLE et al. [181] führten 1999 Untersu-

chungen mit LC-MS-Kopplung an Gerste und Bierproben durch, allerdings erfolgte keine

Verifizierung der getroffenen Zuordnungen über Fragmentierungsuntersuchungen. Erste

Ansätze hinsichtlich einer Strukturaufklärung bzw. Identifizierung der in Gerste und Gers-

tenmalz enthaltenen Proanthocyanidine lieferte FRIEDRICH [183]. Im Rahmen dieser Arbeit

soll daher die LC-DAD-MS/MS-Kopplung eingesetzt werden, um zum einen neue Erkennt-

nisse über das in Gerste enthaltene Flavonoid-Profil zu erlangen und zum anderen eine bis-

her nicht oder nur ansatzweise durchgeführte Sequenzermittlung der Proanthocyanidine

durchzuführen.

4.3.2 Stand der Flavonoid-Analytik in Proben des Brauprozesses

Die Einteilung der Arbeitsschritte zur Analyse der Flavonoide in Proben des Brauprozesses

und des Bieres erfolgt analog der Bestimmung in Gerste und Malz (s. Kapitel 4.3.1).

Probenahme:

Bei den Untersuchungen von Bier [53, 55, 57, 179] erfolgt zumeist keine Beschreibung einer

statistisch abgesicherten Probenahme. Einzig werden die Sorte bzw. Marke des Bieres

und/oder die Bedingungen des Brauens und die damit verbundenen Proben des Braupro-

zesses näher definiert.

Probenvorbereitung:

Bei den beschriebenen Probenvorbereitungsmethoden wird zwischen flüssigen Proben (z. B.

Bier und Würze) und Proben mit Feststoffanteil (z. B. Maische) unterschieden [178].

Die flüssigen Proben werden, wenn sie eine Trübung aufweisen, im ersten Schritt gefiltert

[54, 56]. Handelt es sich um Proben nach dem Gärungsprozess, so wird im nächsten Schritt

die Kohlensäure durch Entgasen entfernt [55, 57]. Die analytische Bestimmung erfolgt direkt

oder erst nach weiteren Aufkonzentrierungs- und Aufreinigungsschritten. So extrahierten

beispielsweise WICHERN und DILLY [254] bei der Flavonoid-Bestimmung zum Nachweis von

Rohfruchtbieren das Bier mit Hexan, um lipophile Substanzen abzutrennen. ROEDER et al.

[249] lyophilisierten das Bier, um es anschließend über Festphasenextraktionen (SPE) an

einem Polyamid-Material aufzureinigen und vor der analytischen Bestimmung in zwei Frakti-

onen, eine Monomer- und eine Oligomer-Fraktion, aufzutrennen. KIRBY und WHEELER [55]

setzten als SPE-Material Sephadex LH 20 ein. Zur Entfernung lipophiler Substanzen wurde

im Anschluss an die SPE mit Petrolether extrahiert und vor der analytischen Bestimmung

eine Flüssig-Flüssig-Extraktion mit Ethylacetat durchgeführt.

4 Vorkommen, Bedeutung und Analytik von Flavonoiden in Brauprozessproben 27

Für die Bestimmung der Flavonoide in Proben des Brauprozesses mit Feststoffanteil (z. B.

Maische) wird eine klassische Flüssig-Flüssig-Extraktion wie für die Gersten- und Malzpro-

ben beschrieben (s. Kapitel 4.3.1) durchgeführt [154].

Analytische Bestimmung:

Für die analytische Bestimmung der Flavonoide in Proben des Brauprozesses und in Bier

werden prinzipiell die schon unter Kapitel 4.3.1 beschriebenen Methoden angewendet. Die

Ermittlung eines Summenparameters, dem Gesamtpolyphenolgehalt, findet für einfache

Fragestellungen z. B. hinsichtlich der Trübungsbildung in Bier über UV-photometrische Me-

thoden Anwendung [255, 256]. Bei der quantitativen Bestimmung mittels HPLC werden als

stationäre Phasen RP-C18-Materialien, als mobile Phasen binäre wässrige Gradientensys-

teme unter Zusatz von Methanol, Acetonitril oder von Modifiern wie Essig- bzw. Ameisensäu-

re und zur Detektion häufig UV- bzw. DAD-Detektoren [53, 55, 56, 178, 233, 254] verwen-

det. Zusätzlich erfolgt auch die elektrochemische Detektion aufgrund ihrer vergleichsweise

niedrigeren Nachweisgrenze [54, 57, 179].

Der Mangel an kommerziell erhältlichen Standardsubstanzen der Proanthocyanidine führt

auch hier zu den bereits beschriebenen Problemen (s. Kapitel 4.3.1). Die Möglichkeit einer

Identifizierung der Verbindungen in Bier oder in Brauprozessproben mittels LC-DAD-MS/MS-

Kopplung wurde bisher nur wenig eingesetzt [181, 249].

5 Ergebnisse und Diskussion 28

5 Ergebnisse und Diskussion

5.1 Versuche zur Darstellung von Procyanidin B3 als Refe-

renzsubstanz

Zur Gewinnung von Pflanzeninhaltsstoffen als Referenzsubstanzen gibt es prinzipiell zwei

unterschiedliche aufwendige Methoden:

1. Isolierung im präparativen Maßstab aus Pflanzenmaterial

2. Organische Synthese

Bei der nach Literaturangaben [42-45, 178, 183, 185, 257] präparativen Isolierung von Pro-

anthocyanidinen erfolgt im ersten Schritt eine Fest-Flüssig-Extraktion aus Gerste. Der so

gewonnene Gerstenrohextrakt wird dann über geeignete Säulenmaterialien mehrstufig in

seine Einzelkomponenten aufgetrennt. Hierzu wird der Einsatz unterschiedlicher Säulenma-

terialien beschrieben. Neben Polyamid-Materialen, wie z. B. Nylon-66 [178, 183, 257], findet

das poröse Vinyl-Copolymer Toyopearl HW 40 [42, 185] und sehr häufig auch das Dextran-

material Sephadex LH 20 [43-45] Anwendung.

Die organische Synthese zur Darstellung der dimeren und höher molekularer Flavonoide

erfolgt entweder ausgehend von den Monomeren (+)-Catechin und (-)-Epicatechin [46] oder

von dem Edukt (+)-Dihydroquercetin [47, 48].

Im Rahmen dieser Arbeit sollte Procyanidin B3 (Catechin-(4α→8)-catechin) analog zu einem

in der Literatur [46] beschriebenen Syntheseweg zum Procyanidin B2 (Epicatechin-

(4β→8)-epicatechin) dargestellt werden. Die geplante Synthesestrategie wird in Abbildung 8

schematisch gezeigt. Ausgehend vom (+)-Catechin (1) erfolgte im ersten Schritt der Schutz

der phenolischen Hydroxylgruppe durch Umsetzung mit Benzylbromid zum Benzylether. Der

Einsatz anderer Schutzgruppen wie z. B. Methoxy- oder Benzyloxymethylgruppen war nicht

möglich, da das Zielmolekül für die erforderlichen Bedingungen zur nachfolgenden Abspal-

tung („Entschützung“) wahrscheinlich zu instabil wäre. Die durchgeführte Umsetzung mit

Benzylbromid zeigte, dass neben dem gewünschten 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin (2)

auch das fünffach benzylierte 3,5,7,3’,4’-Penta-O-benzylcatechin entsteht. Die Trennung

dieser Reaktionsprodukte erfolgte säulenchromatographisch auf Kieselgel mit Dichlormethan

als Eluent. Dabei lagen die erreichten Ausbeuten für das vierfach benzylierte Produkt (2) bei

über 50 % und die des fünffach benzylierten bei 10 % der Theorie.

Die Bildung der Produkte wurde mittels 1H- und 13C-NMR- (s. Kapitel 7.4) sowie LC-MS/MS-

Messungen bestätigt. Der Precursor-Ion-Scan (s. Abbildung 9) ergab Signale von (2) bei m/z

651 ([M+H]+), m/z 673 (Natrium-Addukt [M+Na]+) und m/z 689 (Kalium-Addukt [M+K]+). Die

Fragmentmuster des Product-Ion-Scans konnten dann sowohl dem vierfach als auch dem

fünffach benzylierten Produkt zugeordnet werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 29

HO 4'

(+)-Catechin (1)

OBn

BnO

5,7,3',4'-Tetra-O-benzylcatechin (2)

ii.

OBn

BnO

OBn O OH

5,7,3',4'-Tetra-O-benzyl-4-

(2-hydroxyethoxy)-catechin (3)

OBn

BnO

5,7,3',4'-Tetra-O-benzylcatechin (2)

iii.

OBn

BnO

OBn

BnO

5,7,3',4'-Tetra-O-benzylcatechin-4α

αα

α,8-

(5,7,3',4'-tetra-O-benzylcatechin) (4)

iv.

Catechin-4α

αα

α,8-catechin,

Procyanidin B3 (5)

Abbildung 8: Reaktionsweg zur Synthese von Procyanidin B3

i. Benzylierung der phenolischen Hydroxylgruppen

ii. Oxidation mit Ethylenglycol an C4

iii. Knüpfung der Interflavan-Bindung (4

→8)

iv. Abspaltung der benzylischen Schutzgruppe

5 Ergebnisse und Diskussion 30

Abbildung 9: Full-Scan Massenspektrum von 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin (2)

(ESI, positive-Mode)

Im nächsten Schritt erfolgte die Oxidation des geschützten, vierfach benzylierten Catechins

(2) an dem C4-Atom mit Ethylenglykol, DDQ (2,3-Dichloro-5,6-dicyano-1,4-benzochinon)

und DMAP (4-Dimethylaminopyridin) zum 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzyl-4-(2-hydroxyethoxy)-

catechin (3). Dadurch wird die C4-Position für die anschließende C-C-Knüpfung der Interfla-

van-Bindung mit 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin (2) zusätzlich aktiviert. Das oxidierte Pro-

dukt (3) konnte nach zweifacher säulenchromatographischer Aufreinigung in Ausbeuten von

ca. 40 % erhalten werden (spektroskopische Daten s. Kapitel 7.4).

Im nachfolgenden Reaktionsschritt sollte das 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzyl-4-(2-hydroxyethoxy)-

catechin (3) dann mit dem Produkt (2) C-C-verknüpft werden und abschließend die Abspal-

tung der Benzyl-Schutzgruppen mit Pd/C/H2 zum Zielmolekül Procyanidin B3 (5) erfolgen.

Um die Ausbeute des gewünschten Dimeren (4) im dritten Reaktionsschritt der Synthese,

der Kupplung, zu erhöhen und die intermolekulare Reaktion des oxidierten Catechins (3) zu

unterdrücken, wurde ein vierfacher Überschuss an geschütztem Catechin (2) eingesetzt. Bei

der Durchführung dieses Reaktionsschrittes kam es aber nicht zu der erwarteten Umsetzung

zu dem Produkt (4). Die Versuchsansätze zur Kondensation der beiden Moleküle unter Zu-

satz von Titantetrachlorid in Dichlormethan und Tetrahydrofuran als Lösungsmittel zeigten

keine einheitliche Produktbildung. Es gelang also nicht, die in der Literatur [46] beschriebene

Knüpfung der Interflavan-Bindung des Epimeren 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylepicatechin mit Epi-

catechin auf die geplante Synthese des Procyanidin B3 zu übertragen. Versuche, durch Va-

riation der Reaktionsbedingungen das Dimer zu erhalten, zeigten nach der säulenchroma-

tographischen Aufarbeitung ein breites Produktspektrum.

Möglicherweise könnte der Einsatz anderer Kopplungsbedingungen zu dem gewünschten

Produkt führen. Alternativ könnten auch andere in der Literatur [258] beschriebene Synthe-

sestrategien auf ihre Übertragbarkeit hin untersucht werden. Im zeitlich begrenzten Rahmen

dieser Arbeit wurde aber auf weitere Versuche verzichtet, die Synthese noch erfolgreich zu

beenden, um schließlich die Untersuchungen auf die Entwicklung der HPLC-Methoden zu

konzentrieren.

5 Ergebnisse und Diskussion 31

5.2 Bestimmung von (+)-Catechin in Gerste mittels HPLC-

DAD

Zur Entwicklung und Optimierung des HPLC-DAD-Verfahrens zur Bestimmung von

(+)-Catechin in Gerste wurden die im folgenden aufgeführten Untersuchungen durchgeführt:

• Aufnahme des UV-Spektrums von (+)-Catechin (Lösemittel: Essigsäure (2,5 %; v/v),

Phosphatpuffer pH 2 und ein DMF/H2O-Gemisch (2:1; v/v)): Die UV-Absorptions-

maxima lagen bei 235 nm und 280 nm. Um möglichst selektiv zu arbeiten, da bei

Wellenlängen um 230 nm u. a. viele phenolische Säuren absorbieren, wurde als De-

tektionswellenlänge 280 nm gewählt.

• Ermittlung einer geeigneten mobilen Phase: Bestimmung des pKs-Wertes von

(+)-Catechin sowie Einfluss verschiedener mobiler Phasen auf die Retentionszeit,

Peakbreite und -symmetrie des (+)-Catechin-Peaks.

• Einfluss des Lösungsmittels der (+)-Catechin-Messprobe auf die Peakbreite und

-symmetrie und auf die Analyt-Stabilität

• Vorauswahl einer analytischen Säule

5.2.1 Mobile Phase

In der Literatur (s. Kapitel 4.3.1) wird bei der Bestimmung von Flavonoiden mit RP-

Säulenmaterialien hauptsächlich der Einsatz binärer wässriger Gradientensysteme unter

Zusatz von Methanol oder Acetonitril als mobile Phasen beschrieben. Darüber hinaus wer-

den häufig noch Essig- oder Ameisensäure, seltener organische Lösemittel wie 2-Propanol,

Tetrahydrofuran oder Isooctan als Modifier hinzugefügt.

Eine wichtige Rolle spielt die Einstellung des pH-Wertes der mobilen Phase, da ausschließ-

lich undissoziierte Analyt-Moleküle mit dem unpolaren RP-Material in Wechselwirkung treten

können. Im allgemeinen sollte daher der pH-Wert der mobilen Phase etwa in der Größen-

ordnung 2 pH-Einheiten unterhalb des pKs-Wertes der Analyten liegen [259]. Für die

(+)-Catechin-Bestimmung ist daher die Kenntnis des pKs-Wertes von (+)-Catechin erforder-

lich, um eine Deprotonierung der im Molekülgerüst vorhandenen Phenolgruppen zu unter-

drücken. Der pKs1-Wert von (+)-Catechin sollte aufgrund der vorhandenen phenolischen

Gruppen im Bereich von 9,89, entsprechend dem für Phenol tabellierten Wert, liegen [260].

Die Bestimmung des pKs1-Wertes von (+)-Catechin erfolgte photometrisch durch Aufnahme

von E-pH-Diagrammen zu 10,9 (siehe Anhang A.1).

Zur Optimierung der mobilen Phase wurden (+)-Catechin-Standard-Lösungen der Massen-

konzentration β = 250 mg/L unter Verwendung eines Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten

P1 (s. Kapitel 7.5.1.3, Tabelle 27) mit einem pH von 2 als mobile Phase chromatographiert.

Die Einstellung des pH-Wertes auf 2 gewährleistet sowohl das Vorliegen von (+)-Catechin in

5 Ergebnisse und Diskussion 32

undissoziierter Form als auch die Stabilität in der mobilen Phase, denn in einem basischen

bzw. schwach sauren pH-Bereich kann es zu Ringöffnungsreaktionen des Polyphenolgerüs-

tes kommen [261, 262]. Der erhaltenen (+)-Catechin-Peak (s. Abbildung 10a) wies bei hoher

Peaksymmetrie eine durchschnittliche Basislinienbreite von nur 2,5 Minuten auf. Variationen

der Pufferkonzentration sowie eine Erhöhung des pH-Wertes auf 3 zeigten weder einen Ein-

fluss auf die Peakfläche, -höhe, Retentionszeit oder Basislinienbreite des (+)-Catechin-

Peaks in der Standard-Lösung noch auf das Peakmuster des ebenfalls chromatographierten

Gerstenextraktes (s. Kapitel 5.3.2). Im Gegensatz zu den in der Literatur beschriebenen mo-

bilen Phasen (z. B. Essigsäure mit Zusatz verschiedener genau dosierter organischer Modi-

fier [180, 184]) ist der Phosphatpuffer pH 2 einfacher zusammengesetzt und ermöglichte

eine gute Basislinientrennung der einzelnen Analyt-Peaks.

Abbildung 10: Chromatogramme von (+)-Catechin in DMF/H2O (2:1; v/v),

= 250 mg/L,

Detektionswellenlänge 280 nm, a) Gradient P1; b) Gradient E1

Zusätzlich wurde ein Essigsäure-Gradient E1 (2,5 % und 8 %; v/v) auf seine Eignung hin

überprüft. Die chromatographische Untersuchung einer (+)-Catechin-Standard-Lösung mit

dem in Tabelle 28 (s. Kapitel 7.5.3.1) beschriebenen Gradienten E1 ergab das in Abbildung

10b) dargestellte Chromatogramm mit einer durchschnittlichen Basislinienbreite des

(+)-Catechin-Peaks von 4,3 min. Für die weiteren Untersuchungen wurden sowohl der

Phosphatpuffer-Gradient als auch der Essigsäure-Gradient eingesetzt, obgleich Phosphat-

puffer aufgrund seiner geringen Verdampfbarkeit und seiner Neigung zu Clusterbildung nicht

oder nur sehr schlecht für den späteren Einsatz in der Massenspektrometrie geeignet ist. Er

wies aber für die Methode gegenüber des Essigsäure-Gradienten eine geringere Basisli-

nienbreite bei höherer Peaksymmetrie des (+)-Catechin-Peaks auf.

5.2.2 Einfluss des Lösemittels der (+)-Catechin-Messprobe

Das wichtigste Kriterium bei der Auswahl eines geeigneten Lösemittels ist die vollständige

Löslichkeit der Analyten. Weiterhin müssen die Analyten in dem gewählten Medium stabil

[mAU]

200

160

120

0 10 20 30 40

Retentionszeit [min]

[mAU]

0 10 20 30 40

Retentionszeit [min]

a) b)

5 Ergebnisse und Diskussion 33

sein und bei der HPLC-Bestimmung schmale Peaks mit einer hohen Symmetrie ergeben. Es

wurden Methanol, Ethanol, Ethylacetat, 2,5 %ige und 8 %ige Essigsäure sowie ein

DMF/H2O-Gemisch (2:1; v/v) eingesetzt. In allen zeigte (+)-Catechin eine hohe Löslichkeit.

Bei der nachfolgenden chromatographischen Bestimmung mit der HPLC-DAD ergaben aus-

schließlich das DMF/H2O-Gemisch und die 8 %ige Essigsäure (+)-Catechin-Peaks der ge-

forderten Symmetrie, wobei die erhaltene Basislinienbreite des Peaks bei Verwendung des

DMF/H2O-Gemisches deutlich geringer war. Lösungsversuche mit Gerstenextrakt (s. Kapitel

5.3.2) zeigten, dass bei Einsatz von DMF/H2O eine klare Lösung erhalten wurde. Für die

weiteren Untersuchungen wurde daher das DMF/H2O-Gemisch als Lösungsmittel für die

jeweilige Messprobe eingesetzt. Die Untersuchungen bezüglich der Analyt-Stabilität wurden

im Rahmen der Methodenvalidierung durchgeführt (s. Kapitel 5.5.4).

5.2.3 Vorauswahl der analytischen Säule

In der Literatur [174, 176, 178-181, 184, 249] wird der Einsatz herkömmlicher C18-

Materialien zur Bestimmung der Flavonoide in Gerste beschrieben. Häufig wird hier aber

keine chromatographische Trennung der einzelnen Analyten erzielt, so dass keine basisli-

nien-getrennten Peaks erhalten werden.

Daher sollten im Rahmen dieser Arbeit neben der in den Voruntersuchungen eingesetzten

Nucleosil RP-18 Säule sieben weitere C18-Phasen mit unterschiedlichen Säulendimensio-

nen, eine C8-Phase sowie sieben neuartige endgruppen-modifizierte RP-Materialien

(s. Tabelle 4) erprobt werden. Hierzu wurde mit einer (+)-Catechin-Standard-Lösung

(β = 250 mg/L) der Einfluss der Flussrate auf die Retentionszeit, die Peakfläche, die Peak-

form und die Basislinienbreite des (+)-Catechin-Peaks ermittelt. Um Aussagen bezüglich der

Struktur-Wechselbeziehung des Analyten mit den unterschiedlichen eingesetzten stationä-

ren Phase treffen zu können, wurden basierend auf den ermittelten chromatographischen

Daten die theoretische Bodenzahl N, die reduzierte Trennstufenhöhe h und die reduzierte

Fliessgeschwindigkeit ν berechnet (s. Anhang A.2, Tabelle A.1 und A.2). Diese erlauben

einen absoluten Vergleich der unterschiedlichen Trennsäulen [263].

Eine hohe Affinität zwischen Analyt und der stationären Phase liegt vor, wenn eine hohe

Bodenzahl N erzielt wird. Im allgemeinen beruhen die Wechselwirkungen der Analyten mit

C18-Materialien fast ausschließlich auf Van-der-Waals-Wechselwirkungen, während bei den

Phenyl- oder gemischten Phenyl-Hexyl-Materialien in besonderem Maße π-π-

Wechselwirkungen zum Tragen kommen. Ein Vergleich der für die einzelnen Säulen be-

rechneten Kenngrößen zeigte, dass mit den Phenyl- bzw. Phenyl-Hexyl-Phasen gegenüber

den Alkyl-Phasen keine wesentlich größeren Bodenzahlen erzielt wurden. Eine besonders

geringe Affinität wies (+)-Catechin zu der C8-, der C16-Amid- sowie der Cyano-Trennsäule

auf. Dies konnte sowohl bei Einsatz des Gradienten E1 als auch beim Gradienten P1 be-

obachtet werden. Bei allen Säulen wurden mit dem Gradienten P1 höhere Bodenzahlen und

somit geringere reduzierte Trennstufenhöhen erreicht.

5 Ergebnisse und Diskussion 34

Um vergleichende Aussagen über die Leistungsfähigkeit der verschiedenen Trennsäulen

bezüglich der Trennleistung und der Packungsqualität treffen zu können, gilt als Richtwert,

dass bei einer reduzierten Fließgeschwindigkeit ν = 3 die reduzierte Trennstufenhöhe h nicht

größer als 3 bis 4, und bei ν = 100 kleiner als 20 sein sollte [263]. Am besten erfüllten bei

Einsatz der Gradienten E1 und P1 die YMC C18-, die Chromolith C18- und die Discovery

Polyethylenglycol-Säule diese Vorraussetzung.

Zur Beurteilung der Leistungsfähigkeit der jeweiligen Trennsäule bezüglich des Einsatzes

zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste, wurde für jede Flussrate der Quotient QF aus

der ermittelten Peakbreite w und der Retentionszeit Rt des (+)-Catechin-Peaks berechnet:

Gleichung 1: (Catechin) t

(Catechin)

= Q

In Gerste existieren neben (+)-Catechin, wie in Kapitel 4.1 beschrieben, mindestens zwei

dimere-, fünf trimere Flavonoide sowie zusätzlich weitere phenolische Säuren. Da diese

Komponenten polarer als (+)-Catechin sind und bei Einsatz eines Reversed-Phase-Materials

früher eluieren werden, musste QF ≤ 0,10 sein, um eine Basislinien-Trennung der Kompo-

nenten des Gerstenextraktes überhaupt zu ermöglichen, bei gleichzeitiger Minimierung der

Gesamtdauer eines Chromatographielaufes.

Tabelle 4: Bezeichnung, Material und Dimensionen der eingesetzten Säulen

Bezeichnung der Säule Endgruppe Dimension [mm]

Wakosil II 3C18 RS C18 100 x 4,0

Nautilus, Nucleosil 100-5C C18 125 x 2,0

YMC-Pack ODS-AM C18 150 x 3,0

Synergi 4µ Hydro RP C18 250 x 2,0

Omnispher 5 C18 C18 250 x 3,0

Nucleosil 100 C18 C18 250 x 4,0

Chromolith Performance RP-18e C18 100 x 4,6

Nucleosil 50-5 C8 eC C8 125 x 2,0

Synergi 4µ Polar-RP Phenyl 150 x 2,0

Zorbax Phenyl 150 x 2,0

Luna 5µ Phenyl-Hexyl Phenyl-Hexyl 250 x 2,0

Discovery RP-Amide C16 C16, Amid 150 x 2,1

Discovery Cyano Cyano 150 x 2,1

Discovery HS PEG Polyethylenglycol 250 x 4,6

Discovery HS F5 Pentafluorophenyl 250 x 4,6

In Abbildung 11 und Abbildung 12 sind die errechneten Quotienten als Funktion der Flussra-

te für die Alkyl-modifizierten Säulen bei Verwendung des Essigsäure-Gradienten E1 und des

5 Ergebnisse und Diskussion 35

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P1 graphisch dargestellt. Es zeigt sich, dass bei Ein-

satz des Gradienten P1 unabhängig vom Säulenmaterial kleinere Quotienten erhalten wur-

den. Die Retentionszeiten des (+)-Catechin-Peaks waren bei Verwendung des Gradienten

P1 ähnlich oder sogar höher als die bei dem Gradienten E1. Daraus folgt, dass die mit dem

Gradienten P1 ermittelten Basislinienbreiten wesentlich geringer, die Peaks also deutlich

schmaler waren.

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

0,3

0,35

0,4

200 400 600 800 1000 1200

Flussrate [µL/min]

QF-Wert

Wakosil C18

Nautilus C18

YMC C18

Synergi C18

Omnispher C18

Nucleosil C18

Chromolith C18

Nucleosil C8

Abbildung 11: QF-Werte für den (+)-Catechin-Peak (

= 250 mg/L, DMF/H2O, 2:1 (v/v)) in

Abhängigkeit der Flussrate des Gradienten E1 für Alkyl-modifizierte RP-

Säulen (n = 4)

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

200 400 600 800 1000 1200

Flussrate [µL/min]

QF-Wert

Wakosil C18

Nautilus C18

YMC C18

Synergi C18

Omnispher C18

Nucleosil C18

Chromolith C18

Nucleosil C8

Abbildung 12: QF-Werte für den (+)-Catechin-Peak (

= 250 mg/L, DMF/H2O, 2:1 (v/v)) in

Abhängigkeit der Flussrate des Gradienten P1 für Alkyl-modifizierte RP-

Säulen (n = 4)

5 Ergebnisse und Diskussion 36

Bei dem Nucleosil C8-Material ergaben sich für beide Gradienten bei allen eingestellten

Flussraten QF-Werte, die über dem definierten Grenzwert von 0,10 lagen. Der Analyt wurde

auf diesem Material im Vergleich zu den anderen C18-Materialien nur unzureichend retar-

diert, was schon aufgrund der geringen Bodenzahl erwartet wurde. Hinzu kam, dass das

gewählte Säulenvolumen von etwa 400 mm3 sehr gering war. Die Nautilus C18-Säule mit

den gleichen Dimensionen zeigte für den Gradienten E1 ebenfalls sehr geringe Retentions-

zeiten mit großen Peakbreiten und dadurch auch hohe Quotienten. Bei Verwendung des

Phosphatpuffers P1 wurden hingegen QF-Werte berechnet, die deutlich < 0,10 lagen. Neben

diesen beiden Säulen ergaben sich bei dem Gradienten E1 im Vergleich zu den anderen

Materialien auch für die Wakosil C18 vergleichsweise große QF-Werte bis zu 0,12 bei Fluss-

raten bis 500 µL/min. In der gleichen Größenordnung lagen auch die Quotienten der Nucle-

osil C18-Säule, die bei Verwendung höherer Flussraten aber unter 0,10 sanken. Da der

Quotient über dem gesetzten Grenzwert von 0,10 lag und eine weitere Steigerung der Fluss-

rate aufgrund des maximalen Grenzwertes der Druckbelastung der Säulen nicht möglich

war, wurde darauf verzichtet die Säulen Nucleosil C8, Nautilus C18 und Wakosil C18 auf die

Analyse von Realproben (Gerstenextrakten) anzuwenden.

Die QF-Werte der anderen untersuchten C18-Materialien lagen deutlich unter dem Grenz-

wert. Eine Besonderheit stellte die Chromolith-Säule, ein neuartiges makroporöses Material,

das ohne hohe Druckbelastung hohe Flussraten bis zu 2400 µL/min erlaubt, mit QF-Werten

kleiner 0,1 dar. Die Anwendbarkeit Untersuchung der fünf ausgewählten C18-Säulen auf die

Trennung der Bestandteile von Gerstenextrakt wird in Kapitel 5.3.2.2 beschrieben.

In Abbildung 13 und Abbildung 14 sind die Verläufe der QF-Werte für die funktionell-

modifizierten RP-Säulen bei Verwendung des Essigsäure-Gradienten E1 und des Phosphat-

puffer/Acetonitril-Gradienten P1 dargestellt. Analog zu den Alkyl-modifizierten Säulen trat

auch hier wieder die Besonderheit auf, dass die (+)-Catechin-Peaks bei dem Phosphatpuffer

höhere Retentionszeiten, aber wesentlich geringere Peakbreiten aufwiesen.

Das Cyano-modifizierte Material zeigte die geringste Wechselwirkung mit dem Analyten, was

zu Retentionszeiten von 5 bis 7 min bei großen Peakbreiten, und damit zu Quotienten bis

0,4 führte. Ein ähnliches Trennverhalten zeigte auch die Amid-modifizierte Säule, welche mit

dem Gradienten E1 bei einer Flussrate von 400 µL/min Peaks mit Basislinienbreiten von bis

zu 7 min erreichte und daher nicht für einen Einsatz geeignet war. Während sich die Cyano-

und die Amid-modifizierten Säulen somit als ungeeignet erwiesen haben, wurden die drei

Phenyl-, die Polyethylenglycol- sowie die Pentafluorophenyl-modifizierten Säulen nach die-

sen Untersuchungen mit den erreichten QF-Werte ≤ 0,1 als „brauchbar“ zur Untersuchung

von Realproben eingestuft (s. Kapitel 5.3.2.2).

Zusammenfassend ergaben sich aus diesen Untersuchungen fünf herkömmliche C18-

modifizierte Materialien mit unterschiedlichen Säulendimensionen, zwei Phenyl-modifizierte,

eine Phenyl-Hexyl-modifizierte, eine Polyethylenglycol- sowie eine Pentafluorophenyl-Phase,

die hinsichtlich ihres chromatographischen Trennvermögens bei Realproben eingesetzt und

untersucht werden sollten.

5 Ergebnisse und Diskussion 37

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

200 400 600 800 1000 1200

Flussrate [µL/min]

QF-Wert

Synergi Phenyl

Zorbax Phenyl

Luna Phenyl-Hexyl

Discovery Amid

Discovery Cyano

Discovery PEG

Discovery HS F5

Abbildung 13: QF-Werte für den (+)-Catechin-Peak (

= 250 mg/L, DMF/H2O, 2:1 (v/v)) in

Abhängigkeit der Flussrate des Gradienten E1 für verschieden funktionell-

modifizierte RP-Säulen (n = 4)

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

200 400 600 800 1000 1200

Flussrate [µL/min]

QF-Wert

Synergi Phenyl

Zorbax Phenyl

Luna Phenyl-Hexyl

Discovery Amid

Discovery Cyano

Discovery PEG

Discovery HS F5

Abbildung 14: QF-Werte für den (+)-Catechin-Peak (

= 250 mg/L, DMF/H2O, 2:1 (v/v)) in

Abhängigkeit der Flussrate des Gradienten P1 für verschieden funktionell-

modifizierte RP-Säulen (n = 4)

5 Ergebnisse und Diskussion 38

5.3 Bestimmung von Flavonoiden in Gerste mittels HPLC-

DAD

5.3.1 Probenahme und Probenvorbereitung

Ziel der Probenvorbereitung war es, die in Gerste enthaltenen Flavonoide möglichst voll-

ständig, unzersetzt und ohne störende Matrixbestandteile zu extrahieren. Die Flavonoide,

insbesondere die Proanthocyanidine, zeigen bei erhöhten Temperaturen und unter Luftein-

fluss oxidative Instabilität, des weiteren kann es bei UV-Licht-Einwirkungen zu Ring-

Spaltungsreaktionen kommen [240]. Dies war bei der gesamten Extraktion der Proanthocy-

anidine zu berücksichtigen, deshalb sollten die Analyten bei der Probenvorbereitung mög-

lichst nicht oder wenig dem UV-Licht ausgesetzt werden, d.h. es sollten Braunglas-Gefäße

verwendet werden. Weiterhin sollte die Probenvorbereitung so durchgeführt werden, dass

die Temperaturen bei den einzelnen Extraktionsschritten (z. B. Entfernung von Lösungsmit-

tel) < 60 °C gehalten werden.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche Extraktionsmethoden erprobt, zum

einen eine Fest-Flüssigextraktion mit einem Ultra-Turrax, zum anderen ein Mikrowellen-

gestütztes Extraktionsverfahren (MSS, Mikrowave Supported Solvent Extraction). In

Abbildung 15 ist der Ablauf der Probenvorbereitung schematisch dargestellt.

Extraktion

(Aceton/H2O)

Extraktion

(Aceton/H2O)

DMF/H2O

Zerkleinerung

(Getreidemühle)

Zerkleinerung

(Getreidemühle)

Gefriertrocknung

Mikrowelle (MSS)

Ultra-Turrax

Entfernung

des Acetons

Entfernung

des Acetons

Gefriertrocknung

HPLC/DAD oder

HPLC-DAD-MS-Bestimmung

HPLC/DAD oder

HPLC-DAD-MS-Bestimmung

Gerstenprobe

Extraktion

(Aceton/H2O)

Extraktion

(Aceton/H2O)

DMF/H2O

Zerkleinerung

(Getreidemühle)

Zerkleinerung

(Getreidemühle)

Gefriertrocknung

Mikrowelle (MSS)

Ultra-Turrax

Entfernung

des Acetons

Entfernung

des Acetons

Gefriertrocknung

HPLC/DAD oder

HPLC-DAD-MS-Bestimmung

HPLC/DAD oder

HPLC-DAD-MS-Bestimmung

Gerstenprobe

Abbildung 15: Schematische Darstellung der Probenvorbereitung zur Bestimmung von

Flavonoiden in Gerste

5 Ergebnisse und Diskussion 39

5.3.1.1 Extraktion mit dem Ultra-Turrax

Zur Isolierung der Flavonoide wurde in Anlehnung an literaturbekannte Verfahren [185] das

im folgenden beschriebene Extraktionsverfahren entwickelt. Im ersten Schritt der Proben-

vorbereitung erfolgte die Zerkleinerung und Homogenisierung der Gerstenprobe in einer

Getreidemühle. Im Anschluss wurde das Probenmaterial gefriergetrocknet und danach mit

Hilfe eines Ultra-Turrax unter Eiskühlung mit einem Aceton/Wasser-Gemisch extrahiert. Auf

die Erprobung anderer Extraktionsmittel wurde verzichtet, da zahlreiche beschriebene Un-

tersuchungen [176, 183] belegen, dass mit Aceton/Wasser die höchsten Extraktionsausbeu-

ten erzielt werden. Um die Oxidation der Analyten zu verhindern, erwies sich die Zugabe von

Natriumdisulfit als Antioxidans gegenüber dem Einsatz von Ascorbinsäure [177] als vorteil-

hafter, da Ascorbinsäure zu Peaküberlagerungen im Chromatogramm führt.

Um den Einfluss der Anzahl der Extraktionsschritte auf die Extraktionsausbeute zu untersu-

chen, wurde die Probenvorbereitung zweimal mit jeweils sieben Extraktionsschritten durch-

geführt. Die Ausbeute jedes Extraktionsschrittes wurde aus der Summe der ermittelten

Peakflächen des (+)-Catechin-, des Procyanidin B3- und des Prodelphinidin C2-Peaks (Iden-

tifizierung s. Kapitel 5.6.3.4) berechnet und auf die Gesamtausbeute der ersten Extraktion

mit dem Ultra-Turrax bezogen (normiert auf 100 %, s. Abbildung 16, 1a). Wie in Abbildung

16 (1a und b) dargestellt, lag die Extraktionsausbeute nach vier Durchgängen deutlich über

95 %, so dass auf die Durchführung weiterer Extraktionsschritte verzichtet wurde.

100

1a 1b 2a 2b 3a 3b

Extraktionsausbeute [%]

Extraktionsschritt 5-7

Extraktionsschritt 4

Extraktionsschritt 3

Extraktionsschritt 2

Extraktionsschritt 1

Abbildung 16: Extraktionsausbeuten und prozentuale Verteilung über die einzelnen Extrak-

tionsschritte. 1a,b: Ultra-Turrax; 2a,b: Mikrowelle (30 °C); 3a,b: Mikrowelle

(50 °C) (n = 2)

Im nächsten Schritt der Probenvorbereitung wurde das Aceton schonend aus den vereinig-

ten Fraktionen am Rotationsverdampfer abgetrennt. Zur Isolierung der Flavonoide aus der

verbleibenden Wasserphase ist häufig ihre Überführung in Ethylacetat beschrieben [174,

5 Ergebnisse und Diskussion 40

185, 236]. Eigene Untersuchungen zeigten aber, dass es hierbei etwa zu 20 %igen Verlus-

ten an polaren Proanthocyanidinen kam, da diese nicht quantitativ extrahiert wurden. Versu-

che, eine Aufkonzentrierung der Analyten mittels SPE zu erreichen, lieferten keine zufrie-

denstellenden Ergebnisse. Hierfür wurden verschiedene Festphasenmaterialien (RP-18-

Materialien, Anionen- und Kationenaustauscher-Materialien, polymere Mischphasen) auf ihre

Eignung hin untersucht. Während mit (+)-Catechin-Standard-Lösungen Wiederfindungsraten

um die 90 % erzielt wurden, wurden die Proanthocyanidine bei Aufgabe von Gerstenextrak-

ten im Durchschnitt nur zu 20 % retardiert. Ein Grund hierfür kann sein, dass das große Vo-

lumen der Extraktionslösung (ca. 100 mL) zum Durchbruch der Analyten führte. Zur

quantitativen Erfassung der Analyten wurden die wässrigen Proben daher in

lichtgeschützten Gefäßen gefriergetrocknet und der erhaltene Rückstand zur Analyse in ein

DMF/H2O-Gemisch (s. Kapitel 5.2.2) aufgenommen.

5.3.1.2 Mikrowellengestützte Extraktion (MSS)

Neben der Extraktion mit dem Ultra-Turrax wurde zusätzlich der Einsatz einer für Flavonoide

bisher ausschließlich aus Gemüse und Gewürzen [264, 265] beschriebenen mikrowellenge-

stützten Extraktion (MSS; Microwave Supported Solvent Extraction) erprobt. Ziel war es, mit

dieser relativ neuen Technik große Probenmengen (> 30 g) effektiver zu extrahieren und

gleichzeitig den zeitlichen Aufwand der Probenvorbereitung zu minimieren.

Nach der Zerkleinerung und Gefriertrocknung der Gerste erfolgte die Extraktion wie in Kapi-

tel 5.3.1.1 beschrieben mit dem Aceton/Wasser-Gemisch unter Zugabe von Natriumdisulfit

in der Mikrowelle. Hierbei wurden verschiedene Extraktionstemperaturen (30 °C und 50 °C)

eingestellt. In Abbildung 16 (2a und b, 3a und b) sind die erhaltenen Ergebnisse der MSS-

Technik der „Ultra-Turrax-Methode“ zum Vergleich gegenübergestellt. Bei einer Temperatur

von 30 °C entsprachen die erhaltenen Extraktionsausbeuten nach vier Extraktionsschritten

mit ca. 95 % etwa denen, die mit dem Ultra-Turrax erzielt wurden. Nach Durchführung der

Extraktion bei 50 °C lagen die erzielten Ausbeuten bei nur etwa 80 % bezogen auf die Aus-

beuten der Ultra-Turrax-Methode. Die Flavonoide unterlagen wahrscheinlich während der

höheren Extraktionstemperatur einer Zersetzung. Die weitere Probenvorbereitung wurde

dann entsprechend, wie bereits in Kapitel 5.3.1.1 beschrieben, durchgeführt.

Zusammenfassend kann durch den Einsatz der Mikrowelle zwar nicht, wie erhofft, eine Mi-

nimierung des Zeitaufwandes der Probenvorbereitung gegenüber dem Einsatz eines Ultra-

Turrax erreicht werden. Eine 95 %ige Extraktionsausbeute wurde mit beiden Extraktionsver-

fahren nach vier Extraktionsdurchgängen, einer Dauer von 10 min mit der Ultra-Turrax-

Methode und 15 min mit der MSS-Technik erhalten. Dennoch bietet die MSS den Vorteil,

dass die zu extrahierenden Probenmengen an Gerste bei gleicher Extraktionseffektivität

größer sein können. Die eingesetzte Probenmenge von 30 g Gerste ist zwar für eine analyti-

sche Bestimmung ausreichend. Da aber mit der MSS-Technik bis zu 500 g Gerste pro An-

satz extrahierbar sind, eröffnet sich hier für zukünftige Arbeiten die Möglichkeit einer Isolie-

rung der Flavonoide aus Gerste im präparativen Maßstab.

5 Ergebnisse und Diskussion 41

5.3.2 Optimierung der HPLC-DAD-Bedingungen

Ausgehend von den chromatographischen Bedingungen für (+)-Catechin als Modellsubstanz

(s. Kapitel 5.2) sollten im folgenden die HPLC-DAD-Bedingungen auf Realproben übertra-

gen und optimiert werden. Da die in Gerste enthaltenen höher-molekularen Flavonoide ähn-

liche Eigenschaften wie (+)-Catechin zeigen und (+)-Catechin als Monomeren-Baustein ent-

halten ist, wurde sowohl das für (+)-Catechin ermittelte UV-Maximum von 280 nm als Detek-

tionswellenlänge übernommen, als auch DMF/H2O als Lösungsmittel für die Messprobenlö-

sung, in dem der Gerstenextrakt vollständig löslich ist.

5.3.2.1 Optimierung des Gradientenverlaufes

Ziel der Optimierung war, durch Variation der beiden entwickelten Gradienten (Essigsäure-

Gradient E1 bzw. Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P1) für alle relevanten Peaks eine op-

timale Basislinientrennung zu erreichen. Hierzu wurde als analytische Säule, wie auch be-

reits für die (+)-Catechin-Bestimmung, die Nucleosil C18-Säule als sogenannte Basissäule

mit einer Flussrate von 1 mL/min verwendet.

Der Gradient E1 konnte nicht in seinem ursprünglichen Verlauf für die Analyse der Realpro-

ben eingesetzt werden, da seine Elutionskraft nicht ausreichte, um die im Gerstenextrakt

vorhandenen unpolaren Komponenten vollständig von der analytischen Säule zu eluieren.

Es war deshalb die Zugabe von Acetonitril zur mobilen Phase erforderlich. Der Schwerpunkt

der Optimierungsuntersuchungen bezüglich der Basislinientrennung der Peaks lag im vorde-

ren Bereich des HPLC-Chromatogrammes, da die Proanthocyanidine aufgrund ihrer im Ver-

gleich zu (+)-Catechin größeren Polarität schneller von der HPLC-Säule eluieren. Der zeitli-

che Verlauf des durch verschiedene Experimente ermittelten und erfolgreich zur Trennung

einsetzbaren Gradienten E2 ist in Kapitel 7.5.3.1 beschrieben. Ein repräsentatives HPLC-

Chromatogramm eines Gerstenextraktes zeigt Abbildung 29 in Kapitel 5.5.5.1.

Bei Einsatz des Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P1 wurden für (+)-Catechin im Ver-

gleich zum Gradienten E1 wesentlich schmalere und symmetrischere Peaks erhalten. Zur

Erzielung einer Basislinientrennung der Analyten und einer Verkürzung der Analysenzeiten

wurde auch dieser Gradient in mehreren Versuchen variiert. Erstaunlicherweise führte der

Einsatz des resultierenden Gradienten P2 (s. Kapitel 7.5.3.1) im Vergleich zum Gradienten

E2 zu einem völlig anderen Peakmuster (s. Kapitel 5.5.5.1, Abbildung 28), was auf die un-

terschiedliche Wechselwirkung Analyt-Fließmittel zurückzuführen ist. Beide Gradienten er-

wiesen sich als geeignet, Flavonoide in Gerstenextrakten basisliniengetrennt zu chroma-

tographieren, so dass sich die Wahl des Fließmittels nach dem geforderten Anwendungsziel

bzw. der Detektionsart (UV, MS) orientieren kann.

5.3.2.2 Leistungsvergleich der analytischen Säulen

Die für die Basissäule Nucleosil C18 entwickelten Gradienten E2 und P2 sollten auf die in

5 Ergebnisse und Diskussion 42

den Voruntersuchungen (s. Kapitel 5.2.3) ausgewählten analytischen Säulen übertragen und

optimiert werden. Abhängig von der maximalen Druckbelastung der jeweiligen Säule wurden

systematische Versuche mit unterschiedlichen Flussraten durchgeführt.

In Abbildung 17 sind die Chromatogramme eines Gerstenextraktes bei Verwendung der Sy-

nergi Hydro RP-Phase und der anderen nicht-Alkyl-modifizierten Phasen gegenübergestellt.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

a) Discovery HS F5

1200 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

1000 µl/min

b) Discovery PEG

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

500 µl/min

400 µl/min

c) Synergi Phenyl

200 µl/min

500 µl/min

400 µl/min

d) Zorbax Phenyl

150 µl/min

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

e) Luna Phenylhexyl

400 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

f) Synergi C18

200 µl/min

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

a) Discovery HS F5

1200 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

1000 µl/min

b) Discovery PEG

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

500 µl/min

400 µl/min

c) Synergi Phenyl

200 µl/min

500 µl/min

400 µl/min

d) Zorbax Phenyl

150 µl/min

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min] 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

e) Luna Phenylhexyl

400 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

f) Synergi C18

200 µl/min

[mAU][mAU]

Abbildung 17: Einfluss unterschiedlicher analytischer Säulen und Flussraten auf die HPLC-

UV-Chromatogramme (

= 280 nm) eines Gerstenextraktes (Gradient E2)

(* Peak-Markierung zur Verfolgung des Effektes der Flussratenänderung)

5 Ergebnisse und Diskussion 43

Bei den drei Phenyl-modifizierten Säulenmaterialien wurde keine Basislinientrennung er-

reicht. Zudem waren die Retentionszeiten sehr lang. Eine Erhöhung der Flussrate war, be-

dingt durch die maximale Druckbelastung der Säule, nicht möglich. Bei der Pentafluorophe-

nylphase wurden, abgesehen von drei polaren Analyten-Peaks, die anderen Analyten nicht

bzw. sehr spät eluiert. Ebenso war die Polyethylenglykolphase nicht für die Bestimmung in

Gerste geeignet, da im vorderen Bereich des Chromatogramms keine Basislinientrennung

der Peaks erreicht wurde. Das beste Trennergebnis wurde mit der Synergi C18-Säule

(s. Abbildung 17f) erhalten, doch zeigen sich auch hier Peaküberlappungen in Form von

Schultern, sowie deutliches Peaktailing. Versuche, durch Variation des eingesetzten Gra-

dienten die Trennung zu verbessern, führten zu keinem zufriedenstellenden Ergebnis.

In Abbildung 18 sind die mit den analytischen Säulen erhaltenen Chromatogramme darge-

stellt, die ein vergleichbares Trennverhalten wie das Nucleosil C18-Material zeigten. Sowohl

bei der Omnispher C18-, der YMC C18- als auch bei der Chromolith C18-Säule wurden ba-

sisliniengetrennte Analyten-Peaks bei kurzen Analysenzeiten erhalten. Die Peakform war bei

Verwendung der Chromolith C18-Säule etwas schlechter als bei der Omnispher C18- und

der YMC C18-Säule. Dennoch stellen diese drei C18-Säulen neben der Nucleosil C18 eine

Alternative zur Trennung von Flavonoiden in Gerste bei Verwendung des Essigsäu-

re/Acetonitril-Gradienten E2 dar.

0 1020304050[min]

b) Chromolith C18

[mAU]

01020304050[min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

a) YMC C18

[mAU]

0 1020304050[min]

200 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

c) Omnispher C18

[mAU]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

0 1020304050[min]

b) Chromolith C18

[mAU]

01020304050[min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

a) YMC C18

[mAU]

0 1020304050[min]

200 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

c) Omnispher C18

[mAU]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

200 µl/min

Abbildung 18: Einfluss unterschiedlicher RP-C18-Säulen und Flussraten auf die HPLC-UV-

Chromatogramme (

= 280 nm) eines Gerstenextraktes (Gradient E2)

Die aus den Untersuchungen der Realproben mit dem Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten

P2 erhaltenen Chromatogramme sind in Abbildung 19 und Abbildung 20 dargestellt. Es zeig-

te sich, dass hier ebenso wie bei Verwendung des Gradienten E2 die drei Phenyl-

modifizierten Materialien wie auch die Pentafluorophenyl- und die Polyethylenglykol-Säule

nicht für die Trennung der Analyten in Realproben geeignet waren (s. auch Abbildung 19).

5 Ergebnisse und Diskussion 44

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

b) Discovery PEG

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

a) Discovery HS F5

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

c) Synergi Phenyl

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

600 µl/min

800 µl/min

d) Zorbax Phenyl

200 µl/min

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

300 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

e) Luna Phenyl-Hexyl

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

f) YMC C18

150 µl/min

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

800 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

b) Discovery PEG

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

a) Discovery HS F5

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

c) Synergi Phenyl

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

600 µl/min

800 µl/min

d) Zorbax Phenyl

200 µl/min

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

300 µl/min

600 µl/min

400 µl/min

e) Luna Phenyl-Hexyl

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

f) YMC C18

150 µl/min

[mAU][mAU]

Abbildung 19: Einfluss unterschiedlicher analytischer Säulen und Flussraten auf die HPLC-

UV-Chromatogramme (

= 280 nm) eines Gerstenextraktes (Gradient P2)

Das erhaltene Peakmuster wies bei keiner der Säulen eine Basislinientrennung auf. Beson-

ders das Trennverhalten der Polyethylenglycol-Säule (s. Abbildung 19b) war erstaunlich; bei

Verwendung des Gradienten E2 wurden kurze Retentionszeiten beobachtet, bei Verwen-

dung des Gradienten P2 erfolgte bis 55 min keine Elution der relevanten Analyten. Als einzi-

ges C18-Material konnte die YMC C18-Säule für die geplante Anwendung ausgeschlossen

werden, obwohl bei der analytischen Trennung mit dem Gradienten E2 gute Ergebnisse er-

5 Ergebnisse und Diskussion 45

zielt wurden. Limitierend waren hier die hohen Säulen-Drücke, weshalb nicht versucht wur-

de, durch Erhöhung der Flussrate bessere Trennungen zu erzielen.

In Abbildung 20 sind Chromatogramme zusammengestellt, die mit den Säulen erhaltenen

wurden, welche neben der Nucleosil- C18-Säule bei Verwendung des Gradienten P2 ein-

setzbar waren. Besonders hervorzuheben war hier die Säule Chromolith C18. Durch die

makroporöse Trägermatrix bietet diese Säule nur einen geringen Gegendruck, es sind des-

halb Flussraten bis zu 3 mL/min realisierbar. Als Nachteil ist aber der hohe Lösemittel-

verbrauch zu sehen. Zudem kann sie in der LC-DAD-MS/MS nur bei gleichzeitiger Verwen-

dung eines Split-Einlasses eingesetzt werden.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

400 µl/min

b) Omnispher C18

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

400 µl/min

300 µl/min

c) Synergi C18

[mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

600 µl/min

800 µl/min

d) Nucleosil C18

400 µl/min

[mAU]

600 µl/min

1000 µl/min

1200 µl/min

1400 µl/min

1800 µl/min

a) Chromolith C18

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

400 µl/min

b) Omnispher C18

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

1000 µl/min

800 µl/min

600 µl/min

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

200 µl/min

400 µl/min

300 µl/min

c) Synergi C18

[mAU][mAU]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 [min]

600 µl/min

800 µl/min

d) Nucleosil C18

400 µl/min

[mAU][mAU]

600 µl/min

1000 µl/min

1200 µl/min

1400 µl/min

1800 µl/min

a) Chromolith C18

Abbildung 20: Einfluss unterschiedlicher RP-C18-Säulen und Flussraten auf die HPLC-UV-

Chromatogramme (

= 280 nm) eines Gerstenextraktes (Gradient E2)

Zusammenfassend zeigten die neuartig modifizierten Säulenmaterialien nicht die für die Fla-

vonoid-Bestimmung erhofften Trenneigenschaften. Besonders erstaunlich war das chroma-

tographische Verhalten der drei Säulen mit Phenyl- bzw. Phenyl-Hexyl-Endgruppen. Die π-π-

Wechselwirkungen, auf denen die Retardierung der Analyten auf diesen stationären Phase

beruhen, führten im Vergleich zu den bei den herkömmlichen C18-Materialien wirksamen

Van-der-Waals-Wechselwirkungen zu keinem selektiveren Trennverhalten. Auch die Pen-

tafluorophenyl- und die Polyethylenglykol-Phase eigneten sich nicht für einen Einsatz in der

5 Ergebnisse und Diskussion 46

Flavonoid-Analytik, wobei einschränkend zu sagen ist, dass ausschließlich Essigsäu-

re/Acetonitril bzw. Phosphatpuffer/Acetonitril als mobile Phasen eingesetzt wurden. Bei Ver-

wendung anderer mobiler Phasen ist ihr Einsatz unter Umständen möglich. Im Rahmen die-

ser Arbeit wurde aber auf die Erprobung anderer Elutionsmittel verzichtet.

Vergleichbar gute Trenneigenschaften mit der Nucleosil C18-Säule wurden mit den anderen

C18-modifizierten Säulen YMC, Omnispher und Chromolith erzielt. Die Untersuchung mach-

te aber noch mal deutlich, welchen großen Einfluss die Wahl der mobilen Phase auf die er-

haltenen Chromatogramme ausübt. Während beispielsweise die YMC C18-Säule für den

Gradienten E2 gute Trennergebnisse lieferte, ist ihr Einsatz bei dem Phosphatpuf-

fer/Acetonitril-Gradienten P2 nicht empfehlenswert.

5.4 Zusammenfassung der Ergebnisse der Methodenent-

wicklung

Zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste wurde ein HPLC-Verfahren (Probenvorbereitung

und chromatographische Trennung) entwickelt und optimiert, welches sich sowohl für die

UV-Detektion als auch für die Online-Detektion mittels MS eignen sollte. Der schematische

Ablauf des Verfahrens ist in Abbildung 21 dargestellt.

In einem ersten Schritt wurde mit dem monomeren Flavonoid (+)-Catechin als Modellsub-

stanz ein chromatographisches System entwickelt. Hierbei wurden mit einer Nucleosil C18-

Säule erfolgreich zwei mobile Phasen, ein Essigsäure-Gradient E1 sowie ein Phosphatpuf-

fer-Gradient P1 erprobt. Als optimales Lösemittel der Messprobe stellte sich ein DMF/H2O-

Gemisch (2:1; v/v) heraus. In weiteren Voruntersuchungen wurden dann fünfzehn verschie-

dene analytische Trennsäulen, basierend auf herkömmlichen C18-Phasen sowie neuartig

modifizierten Materialien auf ihre Einsetzbarkeit für die Bestimmung von (+)-Catechin und

der in Gerste enthaltenen Flavonoide untersucht. Es zeigte sich, dass neben der Säule Nuc-

leosil C18 bei Verwendung des Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2 sowohl die Säulen

YMC C18, Omnispher C18 als auch die aus einem makroporösem Material bestehende Säu-

le Chromolith C18 gute Trenneigenschaften bei Realproben aufzeigten. Bei Einsatz des

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P2 erwiesen sich ebenfalls nur die C18-modifizierten

Säulenmaterialien als geeignet. Da die Säule Nucleosil C18 eine gute reproduzierbare Tren-

nung der Analyten-Peaks bei Einsatz des Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P2 und des

Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2 lieferte, sie in der Anschaffung kostengünstig ist und

sich durch eine große Robustheit bei hohem Probendurchsatz auszeichnete, wurde sie für

die weiteren Untersuchungen eingesetzt.

Zur Isolierung der Flavonoide aus Gerste wurden zwei verschiedene Arten der Probenvorbe-

reitungen entwickelt und optimiert (s. Abbildung 21). Die Extraktion mit einem Ultra-Turrax

zeigte hierbei gute Ausbeuten, die mit denen durch die Mikrowellen-gestützte Extraktion

(MSS) bei 30 °C erzielten vergleichbar sind [266]. Der Einsatz der MSS bietet den Vorteil,

dass auch Probenmengen bis zu 500 g extrahiert werden können.

5 Ergebnisse und Diskussion 47

Das entwickelte Analysenverfahren zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste sollte nun im

nächsten Schritt zur Dokumentation der Zuverlässigkeit einer ausführlichen Validierung un-

terworfen werden.

gemahlene Braugerste

Mikrowelle (MSS)Ultra-Turrax

vereinigte Filtrate

wässriger Rückstand

HPLC

Braugerste

Probenahme,

Mahlung in der Getreidemühle

Entfernung von Aceton am Rotationsverdampfer

(Wasserbad-Temperatur < 40 °C)

4 h bei -80 °C einfrieren,

Lyophilisierung unter Lichtausschluss

Lösen in 3 ml DMF/H2O (2:1; v/v)

DAD-Detektion MS-Detektion, ESI negativ

Probenahme

Proben-

vorbereitung

Analyse

IdentifizierungQuantifizierung

+ 0,5 g Na-disulfit, Lösen in 100 ml

Aceton/H2O (3:1; v/v; 4 °C)

4x bei 24.000 U/min extrahieren

Dunkles Gefäß, Temperatur < 30 °C

1. Extraktion 1 min,

2.-4. Extraktion 10 min

gelbbrauner Feststoff

Absaugen über Schwarzband-Papierfilter

(Wasserstrahlpumpenvakuum)

4x unter Rühren extrahieren

Temperaturprogramm:

5 min auf 30 °C erwärmen, 10 min bei 30 °C

- Säule: Nucleosil 100 C18, 250 x 4 mm, 5 µm, 100 Å

- Flussrate: 1 ml/min

- Autosampler: 4 °C

- Säulenofen: 30 °C

- Mobile Phase: Gradient E2 bzw. P2

- Injektion: 40 µl

- Detektionswellenlänge: 280 nm

- Injektion: 10 µl

- Massenbereich: m/z 50 - 1000

4 h bei -80 °C einfrieren,

Lyophilisierung unter Lichtausschluss

30 g homogene Substanz

+ 0,5 g Na-disulfit,

Lösen in 100 ml Aceton/H2O (3:1; v/v)

Extraktion

gemahlene Braugerste

Mikrowelle (MSS)Ultra-Turrax

vereinigte Filtrate

wässriger Rückstand

HPLC

Braugerste

Probenahme,

Mahlung in der Getreidemühle

Entfernung von Aceton am Rotationsverdampfer

(Wasserbad-Temperatur < 40 °C)

4 h bei -80 °C einfrieren,

Lyophilisierung unter Lichtausschluss

Lösen in 3 ml DMF/H2O (2:1; v/v)

DAD-Detektion MS-Detektion, ESI negativ

Probenahme

Proben-

vorbereitung

Analyse

IdentifizierungQuantifizierung

+ 0,5 g Na-disulfit, Lösen in 100 ml

Aceton/H2O (3:1; v/v; 4 °C)

4x bei 24.000 U/min extrahieren

Dunkles Gefäß, Temperatur < 30 °C

1. Extraktion 1 min,

2.-4. Extraktion 10 min

gelbbrauner Feststoff

Absaugen über Schwarzband-Papierfilter

(Wasserstrahlpumpenvakuum)

4x unter Rühren extrahieren

Temperaturprogramm:

5 min auf 30 °C erwärmen, 10 min bei 30 °C

- Säule: Nucleosil 100 C18, 250 x 4 mm, 5 µm, 100 Å

- Flussrate: 1 ml/min

- Autosampler: 4 °C

- Säulenofen: 30 °C

- Mobile Phase: Gradient E2 bzw. P2

- Injektion: 40 µl

- Detektionswellenlänge: 280 nm

- Injektion: 10 µl

- Massenbereich: m/z 50 - 1000

4 h bei -80 °C einfrieren,

Lyophilisierung unter Lichtausschluss

30 g homogene Substanz

+ 0,5 g Na-disulfit,

Lösen in 100 ml Aceton/H2O (3:1; v/v)

Extraktion

Abbildung 21: Schematischer Arbeitsablauf des optimierten Analyseverfahrens zur

Bestimmung von Flavonoiden aus Brauprozessproben

5 Ergebnisse und Diskussion 48

5.5 Validierung des entwickelten HPLC-DAD-Verfahrens

Um das neu entwickelte Analysenverfahren (s. Abbildung 21) in die Routine-Analytik einzu-

führen, sowie zum Leistungsvergleich mit anderen Verfahren und zur Beurteilung der erhal-

tenen Analysenergebnisse, muss es einer Validierung unterworfen werden. Unter dem Beg-

riff Validierung versteht man die Prüfung, ob eine analytische Methode für die Erfüllung einer

ganz bestimmten Aufgabe geeignet ist, also den Nachweis und die Dokumentation der Zu-

verlässigkeit einer Methode [267-269]. Eine genauere Definition wurde neben vielen anderen

1992 von EBEL [270] gemacht: „Die Validierung eines Analysenverfahrens ist im Prinzip eine

fehlertheoretische Systemanalyse der angewandten chemischen, physikalischen und ma-

thematischen Grundlagen, der verwendeten Messsysteme, der Datengewinnung und Daten-

verarbeitung einschließlich der notwendigen Kalibrierung.“

Es existiert bislang keine einheitliche, universell anwendbare Validierungsvorschrift für Labo-

ratorien. Im Jahr 1999 wurde ein Entwurf einer internationalen Norm, der DIN EN ISO/IEC

17025 [271] „allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaborato-

rien“ verabschiedet. Mit der Übernahme dieser DIN-Norm als europäische Norm gilt künftig

international eine einheitliche Grundlage zum Nachweis der technischen und fachlichen

Kompetenz von Prüf- und Kalibrierlaboratorien. Hier versteht man unter Validierung „...die

Bestätigung durch Untersuchung und Bereitstellung eines Nachweises, dass die besonderen

Anforderungen für einen speziellen beabsichtigten Gebrauch erfüllt werden“.

Die Validierung eines Analysenverfahrens umfasst eine Vielzahl von Einzelschritten. Nach

Feststellung, in welcher Probenmatrix die gewählte Komponente bestimmt werden soll, er-

folgt die Wahl der Bestimmungsmethode und die Erstellung einer Arbeitsvorschrift. Dabei ist

die Bestimmung folgender Validierungsparameter relevant [267-269, 272-274]:

• Wahl des Arbeitsbereiches • Spezifität

• Linearität • Präzision

• Nachweis- und Bestimmungsgrenze • Richtigkeit

• Stabilität • Robustheit

Laut DIN EN ISO/IEC 17025 [271] muss der Bereich und die Genauigkeit der mit validierten

Verfahren erreichbaren Werte hinsichtlich Ergebnisunsicherheit, Nachweisgrenze usw. den

Erfordernissen des Anwenders gerecht werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Validie-

rung des entwickelten HPLC-DAD-Verfahrens zur quantitativen Bestimmung von

(+)-Catechin und ausgewählten Flavonoiden in Gerste (s. Abbildung 21) in Anlehnung an die

im folgenden aufgeführten Richtlinien und Normen durchgeführt.

• DIN EN ISO/IEC 17025, Allgemeine Anforderungen an die Kompetenz von Prüf- und

Kalibrierlaboratorien (1999) [271]

• Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften, L221 (2002) [275]

• FDA, Reviewer Guidance Validation of Chromatographic Methods (1994) [276]

• ICH, Guidance for Industry, Q2A (1995) und Q2B (1996) [277, 278]

5 Ergebnisse und Diskussion 49

5.5.1 Wahl des Arbeitsbereiches

Die Validierung beginnt mit der Wahl des vorläufigen Arbeitsbereiches, welcher sich wieder-

um nach dem praxisorientierten Anwendungsziel und den technisch realisierbaren Möglich-

keiten richtet. Für den Arbeitsbereich eines Analysenverfahrens müssen folgende Voraus-

setzungen erfüllt sein [267, 272]:

• Linearer Zusammenhang zwischen der Konzentration der Lösung (Analyt-

Konzentration) und dem Detektorsignal, in diesem Fall der Peakfläche

• Signifikante Unterscheidbarkeit der Messwerte vom Blindwert, d. h. die untere Arbeits-

bereichsgrenze muss gleich oder größer der Bestimmungsgrenze sein

• Erreichbarkeit der geforderten Analysenpräzision im gesamten Arbeitsbereich

• Bezugnahme auf das praxisorientierte Anwendungsziel, d. h. die zu erwartende

(+)-Catechin-Konzentration in den Realproben

5.5.1.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2

Linearer Bereich

Um den linearen Bereich der (+)-Catechin-Bestimmung zu ermitteln, wurden Standard-

Lösungen der Konzentrationen β von 0,125 mg/L bis 2500 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) her-

gestellt, jeweils zehnmal chromatographisch vermessen und bei der Detektionswellenlänge

von 280 nm die Peakflächen und -höhen bestimmt (s. Anhang A.3, Tabelle A.3). Aus den

erhaltenen Datenpaaren (x = Konzentration und y = Detektorsignal bzw. Peakfläche) kann

die Funktion, die den linearen Zusammenhang zwischen der Konzentration x als unabhängi-

ger Variablen und dem gemessenen Wert y als abhängiger Variablen beschreibt sowie das

Bestimmtheitsmaß berechnet werden. Die durch lineare Regression erhaltene Geradenglei-

chung lautet

y = a + bx

mit den Konstanten a = - 0,5376 mAU⋅min, b = 0,4582 mAU⋅min/(mg/L) sowie dem Be-

stimmtheitsmaß R2 = 0,9999. Für den gesamten Konzentrationsbereich von 0,125 mg/L bis

2500 mg/L konnte somit von einem linearen Zusammenhang zwischen der Peakfläche und

der (+)-Catechin-Konzentration ausgegangen werden.

Bestimmungsgrenze

Zur Festlegung des Arbeitsbereiches war es außerdem erforderlich, die Bestimmungsgrenze

des Verfahrens zu ermitteln, da die untere Grenze des Arbeitsbereiches gleich oder größer

der Bestimmungsgrenze zu wählen ist. Die Bestimmung erfolgte als eigener Validierungspa-

rameter (s. Kapitel 5.5.3.1). Als Bestimmungsgrenze des Verfahrens und somit als Mindest-

Konzentration der unteren Grenze des Arbeitsbereiches ergab sich eine (+)-Catechin-

Konzentration von 1,25 mg/L.

5 Ergebnisse und Diskussion 50

Analysenpräzision

Die ermittelte Bestimmungsgrenze konnte aber nicht als untere Arbeitsbereichsgrenze ge-

setzt werden, da über den gesamten Arbeitsbereich die relativen Standardabweichungen srel

der ermittelten Peakflächen ≤ 3 % liegen sollten [272]. Erst ab (+)-Catechin-Konzentrationen

von β ≥ 2,5 mg/L war diese Anforderung erfüllt (s. Anhang A.3, Tabelle A.3).

Praxisorientiertes Anwendungsziel

Abschließend sollte bei der Wahl des Arbeitsbereiches aber noch das praxisorientierte An-

wendungsziel in Betracht gezogen werden. Die in der Literatur angegebenen (+)-Catechin-

Gehalte in Gerste von etwa 30 µg/g Trockenmasse (s. Tabelle 3) entsprechen in etwa einer

Analyt-Konzentration von 300 mg/L in der Messprobe.

Aus allen vier aufgeführten Anforderungen an den Arbeitsbereich und um einen möglichst

großen Konzentrationsbereich abzudecken, wurde als vorläufige untere Arbeitsbereichs-

grenze eine (+)-Catechin-Konzentration von 5 mg/L und als obere Arbeitsbereichsgrenze

eine Konzentration von 2500 mg/L gewählt.

5.5.1.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2

Zur Ermittlung des linearen Bereiches bei Einsatz des Phosphatpuffer/Acetonitril-

Gradienten P2 wurde analog Kapitel 5.5.1.1 vorgegangen. Im Anhang A.3, Tabelle A.4 sind

die ermittelten Peakhöhen, Peakflächen sowie die relativen Standardabweichungen der

Peakflächen aufgeführt. Die Konstanten der durch lineare Regression erhaltenen Gera-

dengleichung ergaben sich zu a = 0,1800 mAU⋅min, b = 0,4478 mAU⋅min/(mg/L) mit dem

Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9999. Als Bestimmungsgrenze wurde eine Konzentration

von 1,25 mg/L ermittelt (s. Kapitel 5.5.3.2). Aufgrund des praxisorientierten Anwendungs-

zieles der Methode und der Anforderung an die Analysenpräzision (srel der ermittelten

Peakflächen ≤ 3 %) wurde bei Einsatz des Gradienten P2 als vorläufige untere Arbeitsbe-

reichsgrenze ebenso eine Konzentration von 5 mg/L und als obere Arbeitsbereichsgrenze

eine Konzentration von 2500 mg/L gewählt.

5.5.2 Linearität

Der Validierungsparameter Linearität beinhaltet im ersten Schritt die Erstellung einer Kalib-

rierfunktion für den gewählten Arbeitsbereich und die Ermittlung der Verfahrenskenndaten

dieses funktionellen Zusammenhanges. Um den gewählten Ansatz zu überprüfen, wurden

dann die im folgenden aufgeführten statistischen Berechnungen durchgeführt:

• Prüfung auf Linearität: Anpassungstest nach MANDEL [279]

• Residualanalyse

• Prüfung auf Varianzinhomogenität

5 Ergebnisse und Diskussion 51

• Absicherung der unteren Grenze des Arbeitsbereiches

• Überprüfung der Empfindlichkeit

5.5.2.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2

Zur Ermittlung der Kalibrierfunktion bei Einsatz des Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2

als mobile Phase wurden zehn gleichmäßig über den gewählten Arbeitsbereich verteilte

Konzentrationen an (+)-Catechin-Standard-Lösungen in DMF/H2O angesetzt und jeweils

zehnmal mittels HPLC-DAD chromatographisch vermessen [272, 280]. Da die Kalibrierfunk-

tion keine Ausreißer enthalten darf, wurden zunächst die einzelnen Messreihen mittels des

GRUBBS-Testes (s. Anhang A.4) untersucht und als frei von Ausreißern bestätigt [267, 272,

281]. Im Anschluss wurden für die erhaltenen Flächen der (+)-Catechin-Peaks die jeweiligen

Mittelwerte, Standardabweichungen und relativen Standardabweichungen berechnet (s. An-

hang A.3, Tabelle A.5).

Zur rechnerischen Überprüfung, ob es sich um eine lineare Kalibrierfunktion handelt, wurde

der Anpassungstest nach MANDEL [272, 273, 279] durchgeführt (s. Anhang A.5). Hierzu

wurden aus den für die Standardproben ermittelten Messwerten die Reststandardabwei-

chungen sy1 und sy2 der linearen Kalibrierfunktion 1. Grades und der Kalibrierfunktion 2.

Grades herangezogen, die Differenz der Varianzen DS2 ermittelt und anschließend einem

F-Test unterworfen (Erläuterungen der statistischen Berechnung s. Anhang A.5). Der hier-

aus berechnete Prüfwert PW lag mit 0,39 weit unterhalb des tabellierten F-Wertes von 12,25

(f1 = 1, f2 = N - 3, P = 99 %). Durch die Kalibrierfunktion 2. Grades wurde keine signifikant

bessere Anpassung erreicht, die Kalibrierfunktion war somit linear (berechneter Korrela-

tionskoeffizient R2 = 0,9999). In Tabelle 5 sind alle ermittelten Kenngrößen der Kalibrierfunk-

tionen 1. und 2. Grades gegenübergestellt.

Tabelle 5: Ergebnisse des Anpassungstests nach MANDEL für die Bestimmung von

(+)-Catechin (Kalibrierlösungen

= 5 bis 2500 mg/L, Gradient E2)

Kalibrierfunktion

1. Grades

y = a + bx

2. Grades

y = a + bx + cx2

Konstante a [mAU⋅

⋅⋅⋅min] 3,7450 - 0,2353

Konstante b [mAU⋅

⋅⋅⋅min / (mg/L)] 0,4527 0,4633

Konstante c [mAU⋅

⋅⋅⋅min / (mg/L)2] - - 4,21 ⋅ 10-6

Reststandardabweichung [mAU⋅

⋅⋅⋅min] 7,03 7,31

Prüfwert PW 0,39

F (f1 = 1, f2 = N - 3, P = 99 %) 12,25

Neben dem Anpassungstest nach MANDEL ist die Residualanalyse eine weitere Möglichkeit

zu überprüfen, ob der gewählte funktionale Ansatz des Kalibriermodells, hier die lineare

5 Ergebnisse und Diskussion 52

Funktion, die Messergebnisse hinreichend beschreibt. Die Residuen sind die vertikalen Ab-

stände der Messwerte von der Regressionsgerade. In der graphischen Darstellung

(s. Abbildung 22) sind auf der Abzisse der Arbeitsbereich sowie als Ordinaten-Abschnitt die

positive bzw. negative Abweichung aufgetragen.

-20

-15

-10

-5

0 500 1000 1500 2000 2500

(+)-Catechin-Konzentration [mg/L]

Residuen [mAU * min] .

Abbildung 22: Graphische Darstellung der Residuen in Abhängigkeit der Konzentration der

(+)-Catechin-Standard-Lösungen (Gradient E2)

Bei einem richtig gewählten mathematischen Modell sind die Residuen um das Nullniveau

normalverteilt [267, 272]. Mit einer statistischen Verteilung der berechneten Residuen um

den Mittelwert Null konnte die angenommene lineare Funktion bestätigt werden.

Die beschriebene lineare Regression geht von einer konstanten (homogenen) Unpräzision

(Varianz der Messwerte) über den Arbeitsbereich aus. Varianzinhomogenität führt nicht nur

zu einer höheren Unpräzision, sondern durch mögliche Veränderungen der Geradenstei-

gung auch zu einer höheren Ungenauigkeit [272]. Zur Überprüfung, ob die Standardabwei-

chungen aus zwei unterschiedlichen Messreihen vergleichbar sind, wurden jeweils zehn

(+)-Catechin-Standard-Lösungen der niedrigsten (x1) sowie der höchsten Konzentration (x10)

des vorläufigen Arbeitsbereiches analysiert und für beide Datensätze die Varianzen 2

s und

s berechnet. Diese wurden anschließend mittels F-Test auf Homogenität überprüft (s. An-

hang A.7).

Für die Messwerte ergab sich bei einem Arbeitsbereich von 5 mg/L bis 2500 mg/L

(+)-Catechin eine Inhomogenität der Varianzen. Durch Erhöhung der unteren Arbeitsgrenze

auf 250 mg/L würde Homogenität erzielt werden, dies erschien aber nicht erstrebenswert, da

die (+)-Catechin-Konzentrationen in den Realproben häufig unter diesem Wert liegen

(s. Kapitel 4.1, Tabelle 3). In der Routine-Analytik werden oft Verfahren eingesetzt, die eine

Inhomogenität der Varianzen aufweisen. Das Problem der Überprüfung der Varianzinhomo-

genität liegt darin begründet, dass in die Berechnung des Prüfwertes die Absolutwerte der

Standardabweichungen und nicht die prozentualen Abweichungen eingehen. Um eine Ein-

schränkung des Arbeitsbereiches zu vermeiden, könnten zur Beschreibung des funktionalen

5 Ergebnisse und Diskussion 53

Zusammenhanges auch gewichtete Regressionsmodelle herangezogen werden. Dies würde

aber im Routinebetrieb einen nicht akzeptablen Rechenaufwand bedeuten. Daher wurde der

Arbeitsbereich von 5 mg/L bis 2500 mg/L (+)-Catechin trotz der Konzentrationsabhängigkeit

der Messpräzision beibehalten.

Als nächster Schritt erfolgte die Absicherung der unteren Arbeitsgrenze. Eine Kalibrier-

funktion ist nur dann für quantitative Analysen einsetzbar, wenn sich alle später mit ihr be-

rechneten Analysenergebnisse signifikant von Null unterscheiden. Die gewählte untere

Grenze des Arbeitsbereiches mit einer Konzentration von 5 mg/L (+)-Catechin lag um den

Faktor 4 höher als die aus dem Signal-Rausch-Verhältnis ermittelte Bestimmungsgrenze von

1,25 mg/L (s. Kapitel 5.5.3.1) und konnte aufgrund der Erfüllung der von KROMIDAS [268,

269] gestellten Anforderung für die Bestimmungsgrenze als statistisch abgesichert ange-

nommen werden.

Zusätzlich sollte hier aber noch eine von FUNK et al. [272] empfohlene Überprüfungsmetho-

de zur Absicherung der unteren Arbeitsgrenze angewandt werden. Ist die aus dieser Be-

rechnung ermittelte Größe xp ≤ x1, so ist der gesamte gewählte Arbeitsbereich statistisch

abgesichert (Berechnung s. Anhang A.8). Der hier berechnete Wert für xp lag mit 72,29 mg/L

(+)-Catechin oberhalb der gewählten unteren Grenze des Arbeitsbereiches. Der Arbeitsbe-

reich wäre somit erst für diese Konzentration statistisch abgesichert. Bei der Berechnung

von xp hat die ermittelte Verfahrensstandardabweichung sxo einen sehr großen Einfluss, ob-

wohl es sich hierbei aber um eine nicht normierte Größe handelt. Da die erstellte Kalibrierge-

rade mit einem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9999 eine hohe Genauigkeit aufwies und weil

die erhaltene Peakfläche (2,49 mAU⋅min) bei einer Konzentration von 5 mg/L deutlich größer

als Null war, erfolgte keine Verkleinerung des Arbeitsbereiches.

Das Maß für die Empfindlichkeit einer Methode ergibt sich aus der Änderung des Messwer-

tes bei einer Änderung der Konzentration. Vereinfacht gilt, dass eine Methode um so leis-

tungsfähiger ist, je größer die Steigung b der Kalibriergeraden und je kleiner die Reststan-

dardabweichung sy1 ist. Die Reststandardabweichung gibt die Streuung der Messwerte um

die Regressionsgerade an. Wird die Reststandardabweichung auf die Mitte des Arbeitsbe-

reiches korreliert, so kann die Verfahrensstandardabweichung sxo errechnet werden (s. An-

hang A.9, Gleichung A.30). Durch Normierung der Verfahrensstandardabweichung sxo wird

die relative Verfahrensstandardabweichung Vxo erhalten, die als Kenngröße zur Qualitäts-

kontrolle bei Routineanalysen Einsatz findet und einen schnellen und einfachen Vergleich

verschiedener Verfahren erlaubt [273]. Für die Verfahrensstandardabweichung sxo ergab

sich eine Konzentration von 15,53 mg/L, als relative Verfahrensstandardabweichung Vxo ein

Wert von 1,32 %. Damit genügte das Verfahren den in der Literatur [273, 282] beschriebe-

nen Anforderungen an die Kalibrierpräzision für eine 10-Punkt-Kalibrierung mit Vxo < 3,4 %.

Daraus ergab sich, dass der vorläufig gewählte Arbeitsbereich von 5 mg/L bis 2500 mg/L

(+)-Catechin für das HPLC-DAD-Verfahren beibehalten werden konnte. Die ermittelte lineare

Kalibrierfunktion y = 0,4527x + 3,7450 wurde durch verschiedene Modellrechnungen über-

prüft und statistisch abgesichert.

5 Ergebnisse und Diskussion 54

5.5.2.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2

Zur Ermittlung der Kalibrierfunktion wurden zehn (+)-Catechin-Lösungen in DMF/H2O mit

gleichmäßig über den gewählten Arbeitsbereich verteilten Konzentrationen vermessen

(s. Anhang A.3, Tabelle A.6) und anschließend die Linearität der Kalibrierfunktion mittels des

Anpassungstestes nach MANDEL [279] überprüft (s. Tabelle 6). Die ermittelte Funktion

erwies sich als linear, was durch eine Residualanalyse, auf deren Darstellung hier verzich-

tet wird, bestätigt wurden.

Wie auch beim Einsatz des Essigsäure/Acetonitril-Gradienten als mobile Phase zeigten die

Messwerte eine Varianzinhomogenität über den gewählten Arbeitsbereich (berechneter

Prüfwert 256,03; statistischer Grenzwert 5,35 [272]). Der gewählte Arbeitsbereich wurde

dennoch beibehalten. Der bei der Absicherung der unteren Arbeitsgrenze berechnete

Wert für xp lag hier mit 0,14 mg/L (+)-Catechin niedriger als die gewählte untere Grenze des

Arbeitsbereiches. Mit einer relativen Verfahrensstandardabweichung Vxo von 0,87 %

(s. Tabelle 6) entsprach das Verfahren den in der Literatur [282] beschriebenen Anforderun-

gen und die ermittelte Kalibrierfunktion war statistisch abgesichert.

Tabelle 6: Ergebnisse des Anpassungstests nach MANDEL für die Bestimmung von

(+)-Catechin (Kalibrierlösungen

= 5 bis 2500 mg/L, Gradient P2)

Kalibrierfunktion

1. Grades

y = a + bx

2. Grades

y = a + bx + cx2

Konstante a [mAU⋅

⋅⋅⋅min] 5,3661 0,3709

Konstante b [mAU⋅

⋅⋅⋅min / (mg/L)] 0,4345 0,4477

Konstante c [mAU⋅

⋅⋅⋅min / (mg/L)2] - - 5,28 ⋅ 10-6

Reststandardabweichung [mAU⋅

⋅⋅⋅min] 4,45 3,06

Prüfwert PW 9,89

F (f1 = 1, f2 = N - 3, P = 99 %) 12,25

Verfahrensstandardabweichung sxo [mg/L] 10,24

rel. Verfahrensstandardabweichung Vxo [%] 0,87

5.5.3 Nachweis- und Bestimmungsgrenze

5.5.3.1 Essigsäure/Acetonitril-Gradient E2

Die Nachweisgrenze ist definiert als die kleinste qualitativ noch nachweisbare Analyt-Menge.

Unter der Bestimmungsgrenze wird im allgemeinen die kleinste noch quantifizierbare Analyt-

Menge verstanden, die mit einer vorgegebenen Richtigkeit und Präzision erfasst werden

kann [267]. In der DIN Norm 32645 [283] wurde neben diesen beiden Validierungsparame-

tern zusätzlich der Begriff Erfassungsgrenze eingeführt. Sie ist definiert als der geringste

Gehalt, der bei tatsächlicher Anwesenheit des Analyten identifiziert werden kann, bzw. als

5 Ergebnisse und Diskussion 55

Mindestmenge, die mit vorgegebener Wahrscheinlichkeit nachgewiesen werden kann. Laut

ISO 11843-1 (DIN 55350) [267] wird der Signalwert, dessen oberer Abstand vom geschätz-

ten Blindwert so groß ist, dass seine rein zufällige Überschreitung durch einen Messwert der

Blindprobe unwahrscheinlich ist, als Erkennungsgrenze bezeichnet. Damit entspricht der

Begriff Erkennungsgrenze der Definition für die Nachweisgrenze in DIN 32645.

Aufgrund der Vielzahl an Definitionen existieren auch verschiedenste Berechnungsverfahren

für die Nachweis- und die Bestimmungsgrenze. Zur Bestimmung der Nachweisgrenze wurde

in dieser Arbeit die Definition aus den IUPAC-Richtlinien zur Nomenklatur in der Chroma-

tographie [284] herangezogen, welche mit der im Amtsblatt L221 der Europäischen Gemein-

schaften [275] und der von KROMIDAS [267] beschriebenen einhergeht. Dabei ist die Nach-

weisgrenze definiert als der 3-fache Wert des Grundrauschens des Detektorsignals. Das

Grundrauschen wird durch das Analysieren von 20 Leerwertproben pro Matrix berechnet.

Für die DAD-Detektion erfolgte die Ermittlung des Grundrauschens anhand von 20 willkürlich

ausgewählten Chromatogrammen von Gerstenproben sowie Standard-Leerwertproben. Das

Grundrauschen des Detektorsignals betrug 0,032 mAU, damit ergab sich als Nachweisgren-

ze des HPLC-DAD-Verfahrens zur Bestimmung von (+)-Catechin in Gerste eine Konzentra-

tion von β = 0,25 mg/L (s. Anhang A.3, Tabelle A.3). Die Erfassungsgrenze laut DIN 32645

[283] lag dann bei einer Konzentration von 0,5 mg/L (+)-Catechin.

Zur Ermittlung der Bestimmungsgrenze wurden die selben Richtlinien und Normen wie für

die Nachweisgrenze herangezogen [267, 275, 283, 284], als Konzentration an der Bestim-

mungsgrenze wurde ein Signal/Rausch-Verhältnis von 9:1 festgesetzt. Damit ergab sich als

Bestimmungsgrenze des Verfahrens eine (+)-Catechin-Konzentration von 1,25 mg/L.

5.5.3.2 Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2

Das Grundrauschen des Detektorsignals bei Einsatz des Gradienten P2 betrug 0,03 mAU,

damit ergab sich als Nachweisgrenze analog zum Essigsäure/Acetonitril-Gradienten eine

(+)-Catechin-Konzentration von β = 0,25 mg/L, als Erfassungsgrenze 0,5 mg/L und als Be-

stimmungsgrenze 1,25 mg/L.

5.5.4 Stabilität

Dem Validierungsparameter Stabilität kommt eine sehr große Bedeutung zu, denn häufig

führt eine unzureichende Stabilität des Analyten in der Probe während der Lagerung oder

der Analyse selbst zu erheblichen Fehlern im Analysenergebnis. Weiterhin ist auch die

Stabilität der Analyten in Kalibrierlösungen unter verschiedenen Lagerungsbedingungen

abzusichern. Eine Stabilitätsprüfung umfasst verschiedene Lagerungsbedingungen und

-zeiträume in Bezug auf die Kalibrierlösungen sowie Realproben bei unterschiedlichen

Analyt-Konzentrationen [275]. Die Zerfallserscheinungen sind als (%)-Restanalyt (s. Anhang

A.10) zu dokumentieren, die schließlich Aussagen über die maximale Lagerungszeit und die

optimalen Lagerungsbedingungen erlauben.

5 Ergebnisse und Diskussion 56

Die Stabilität von (+)-Catechin in Kalibrierlösungen und im Gerstenextrakt wurde bei Lage-

rungstemperaturen von 5 °C, 25 °C und -80 °C geprüft. Dabei wurde ermittelt, über welchen

Zeitraum die Proben ohne signifikante Änderung der (+)-Catechin-Konzentration gelagert

werden können. Zur Beurteilung der Signifikanz wurde die Definition des „kritischen Wieder-

holgrenzbetrages“ bzw. „Ermittlung der Wiederholgrenze“ von KROMIDAS [267, 269] heran-

gezogen. Diese gibt den Grenzwert an, unterhalb dessen die Differenz zwischen zwei ein-

zelnen Messergebnissen mit einer statistischen Wahrscheinlichkeit von 95 % nicht unter-

schieden werden kann. Eine signifikante Änderung liegt demnach vor, wenn der Konzentra-

tionsunterschied von (+)-Catechin in der jeweiligen Lösung zwischen Beginn und Ende des

Untersuchungszeitraumes größer als der 2,8fache Wert der Messpräzision der (+)-Catechin-

Bestimmung wird (s. Anhang A.10).

5.5.4.1 Stabilität von (+)-Catechin in Kalibrierlösungen

Um die Stabilität von (+)-Catechin in der Kalibrierlösung zu untersuchen, wurden Lösungen

mit drei über den Arbeitsbereich verteilten Konzentrationen (β = 5, 250 und 500 mg/L) in

DMF/H2O (2:1; v/v) frisch angesetzt und über einen Zeitraum von 72 h unter Lichtausschluss

bei 5 °C und 25 °C gelagert. Innerhalb dieses Zeitraumes wurde in Intervallen von 140 min

der (+)-Catechin-Gehalt chromatographisch bestimmt. In Abbildung 23 und Abbildung 24

sind die verschiedenen (+)-Catechin-Konzentrationen in den Kalibrierlösungen in Abhängig-

keit von der Lagerungsdauer aufgetragen. Es ergab sich mit der Definition aus der Messprä-

zision für die (+)-Catechin-Bestimmung (srel ≤ 3 %, s. Kapitel 5.5.1) ein maximal zulässiger

Grenzwert von 8,4 % als Kriterium für nicht-signifikante Konzentrationsänderungen.

0,1

100

1000

0 10203040506070

Zeit [h]

Peakfläche [mAU * min]

5 mg/L 250 mg/L 500 mg/L

Abbildung 23: Stabilität von (+)-Catechin-Kalibrierlösungen (DMF/H2O, 2:1; v/v) über einen

Zeitraum von 70 h unter Lichtausschluss bei 25 °C

5 Ergebnisse und Diskussion 57

0,1

100

1000

0 10203040506070

Zeit [h]

Peakfläche [mAU * min]

5 mg/L 250 mg/L 500 mg/L

Abbildung 24: Stabilität von (+)-Catechin-Kalibrierlösungen (DMF/H2O, 2:1; v/v) über einen

Zeitraum von 70 h unter Lichtausschluss bei 5 °C

Bei einer Lagerungstemperatur von 25 °C trat bis zu einem Zeitraum von 12 h, bei 5 °C bis

zu 18 h keine signifikante Abnahme der (+)-Catechin-Konzentration auf. Erst ab diesen Zeit-

punkten konnte von einer Instabilität der Lösung gesprochen werden. Der berechnete Wert

für den Restanalyt (s. Anhang A.10) sank ab hier für alle drei Konzentrationen und bei bei-

den Temperaturen auf < 92 %. Die Konzentrationsabnahme erfolgte, wie in den beiden Ab-

bildungen ersichtlich, erwartungsgemäß bei der höheren Lagerungstemperatur deutlich

schneller, denn nach 72 h konnten bei einer Ausgangskonzentration von 5 mg/L

(+)-Catechin nur noch 26 % Restanalyt, bei 250 mg/L 70 % und bei 500 mg/L 80 % nachge-

wiesen werden. Dagegen ergaben sich bei 5 °C jeweils deutlich höhere Restanalyt-Werte

von 60 %, 80 % und 87 %.

Da der Analyt üblicherweise bei der Probenvorbereitung selbst dem Tageslicht ausgesetzt

ist, war es wichtig, die Stabilität unter Licht-Einwirkung zu untersuchen. Daher wurden zwei

(+)-Catechin-Standard-Lösungen der Konzentrationen β = 125 und 250 mg/L hergestellt, in

spezielle UV-Vis-durchlässige Vials gefüllt und bei 5 °C die Konzentration über einen Zeit-

raum von 9 h bei Tageslichteinwirkung verfolgt. In Abbildung 25 sind die erhaltenen Peakflä-

chen gegen die Lagerungsdauer aufgetragen. Bei beiden Lösungen konnte bis zum Unter-

suchungsende keine signifikante Änderung der (+)-Catechin-Konzentration festgestellt wer-

den. Die über alle Messwerte einer Konzentration ermittelten relativen Standardabweichun-

gen lagen mit 0,4 % für 125 mg/L und 0,2 % für 250 mg/L sogar weit unter den geforderten

3 % für die Messpräzision.

Zusammenfassend zeigten die erhaltenen Ergebnisse, dass die Stabilität von (+)-Catechin

erwartungsgemäß in besonderem Maße von der Lagerungstemperatur abhängig ist. Der

Lichteinfluss ist dagegen, zumindest bei Temperaturen unterhalb Raumtemperatur, vernach-

lässigbar.

5 Ergebnisse und Diskussion 58

100

110

120

0123456789

Zeit [h]

Peakfläche [mAU * min]

125 mg/L 250 mg/L

Abbildung 25: Stabilität von (+)-Catechin-Kalibrierlösungen (DMF/H2O, 2:1; v/v) über einen

Zeitraum von 9 h unter Tageslichteinwirkung bei 5 °C (n = 2)

Die Langzeitstabilität der (+)-Catechin-Lösungen wurde anhand von (+)-Catechin-

Standard-Lösungen der Konzentrationen β = 125 und 250 mg/L über insgesamt 219 Tage

bei -80 °C untersucht. Während der Lagerungszeit wurden in Intervallen (s. Kapitel 7.6.3)

Proben entnommen und der (+)-Catechin-Gehalt durch sechsfach-Injektion bestimmt. Wäh-

rend der Messung wurden die Messproben im Autosampler bei 5 °C gehalten. Abbildung 26

zeigt die Mittelwerte der Peakflächen über eine Dauer von 125 Tagen. Es konnte über den

gesamten Versuchszeitraum keine signifikante Änderung der Konzentration festgestellt wer-

den, der zulässige Grenzwert von 8,4 % [267] wurde nicht überschritten.

100

110

120

0 20 40 60 80 100 120

Zeit [d]

Peakfläche [mAU * min] .

125 mg/L 250 mg/L

Abbildung 26: Langzeitstabilität von (+)-Catechin-Kalibrierlösungen (DMF/H2O, 2:1; v/v)

über 125 Tage unter Lichtausschluss bei -80 °C (n = 6)

5 Ergebnisse und Diskussion 59

Aufgrund der Ergebnisse der durchgeführten Stabilitätsuntersuchungen wird empfohlen, die

Kalibrierlösungen während einer Messreihe gekühlt zu halten (gekühlter Autosampler), um

Verfälschungen der Analysenergebnisse zu vermeiden. Darüber hinaus zeigte die Untersu-

chung der Langzeitstabilität, dass die Kalibrierlösungen entweder täglich frisch anzusetzen

oder nach Ansetzen bis zur Verwendung bei -80 °C zu lagern sind.

5.5.4.2 Stabilität von (+)-Catechin in Realproben

Neben der ausreichenden Stabilität von (+)-Catechin in den Kalibrierlösungen musste auch

die Stabilität des Analyten in Realproben überprüft werden. Hierzu wurden drei Gerstenex-

trakte bei -80 °C, 5 °C und 25 °C unter Lichtausschluss gelagert und die (+)-Catechin-

Konzentration über einen Zeitraum von 50 h in Abständen von 160 min mittels HPLC-DAD

bestimmt (s. Abbildung 27).

110

120

130

140

150

160

170

180

190

200

0 1020304050

Zeit [h]

(+)-Catechin-Konzentration

[mg/L]

25 °C 5 °C -80 °C

Abbildung 27: Stabilität von (+)-Catechin in Gerstenextrakt über einen Zeitraum von 50 h

unter Lichtausschluss bei -80 °C, 5 °C und 25 °C

Bei einer Lagerungstemperatur von -80 °C konnte, wie auch bei den Kalibrierproben, über

den gesamten Zeitraum keine signifikante Abnahme der Analyt-Konzentration beobachtet

werden. Im Gegensatz hierzu zeigten die Proben bei Lagerungstemperaturen von 5 °C so-

wie 25 °C ab einer Lagerungsdauer von 16 h einen signifikanten Konzentrationsabfall von

ca. 8 %. Der Zerfall von (+)-Catechin verlief, wie sich auch bereits bei den Ergebnissen der

Stabilitätsprüfung der Kalibrierproben gezeigt hatte, bei höheren Temperaturen deutlich

schneller. So wurde bei 25 °C eine kontinuierliche relative Abnahme der Analyt-

Konzentration bis auf etwa 70 % Restanalyt nach 50 h ermittelt, während bei 5 °C der Rest-

gehalt bei etwa 90 % stabil blieb. Die Lagerungsbedingungen der Gerstenproben sind erwar-

tungsgemäß genauso zu wählen wie bei den Kalibrierproben. Die aufgearbeiteten Realpro-

5 Ergebnisse und Diskussion 60

ben sollten daher entweder direkt vermessen und während der Messung auf 5 °C gekühlt

werden, oder gegebenenfalls, um eine längerfristige Stabilität zu gewährleisten, bis zur Ver-

wendung bei -80 °C gelagert werden.

5.5.5 Spezifität

Unter dem Begriff Spezifität wird die Fähigkeit einer Methode verstanden, eine Substanz

oder eine Substanzklasse ohne Verfälschung durch andere in der Probe vorhandene Kom-

ponenten zu erfassen und sie somit eindeutig zu identifizieren [267, 268, 275]. Die Überprü-

fung der Spezifität eines chromatographischen Verfahrens ist besonders wichtig, da die

Identifizierung der Analyten in der HPLC-Routineanalytik mit UV-Detektion in erster Linie

über deren Retentionszeiten erfolgt. Dabei besteht vor allem bei der Analyse komplexer bio-

logischer Matrices die Gefahr, dass ein Analyt-Peak von Begleitkomponenten mit gleicher

Retentionszeit überlagert wird und somit eine Verfälschung der Analysenergebnisse eintritt

[122]. Laut dem Amtsblatt der Europäischen Gemeinschaften [275] muss die Spezifität eines

HPLC-DAD-Verfahrens zum einen durch einen Retentionszeitvergleich mit geeigneten Stan-

dardmaterialien erfolgen. Der Analyt muss bei der Retentionszeit eluieren, die für den ent-

sprechenden Kalibrierstandard unter den gleichen Versuchsbedingungen typisch ist. Zum

anderen muss ein UV-Spektren-Vergleich erfolgen, die Absorptionsmaxima im Spektrum

des Analyten müssen mit einer Toleranz, die durch das Auflösungsvermögen des Detekti-

onssystems bestimmt wird, bei denselben Wellenlängen wie bei den Kalibrierstandards

liegen.

Im Rahmen dieser Arbeit sollte die Untersuchung der Spezifität des HPLC-DAD-Verfahrens

sowohl durch einen Vergleich der Retentionszeiten als auch durch einen Vergleich der UV-

Spektren erfolgen. Um die Peak-Reinheit zu bestätigen, sollte zusätzlich noch der Vergleich

von MS-Spektren des Analyten mit dem Kalibrierstandard erfolgen.

5.5.5.1 Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten

Die Überprüfung der Spezifität des hier angewendeten Analysenverfahrens erfolgte im ers-

ten Schritt über einen Vergleich der Retentionszeiten [278]. Hierzu wurde ein, wie unter Ka-

pitel 5.3.1.1 beschrieben, aufgearbeiteter Gerstenextrakt direkt und anschließend nach Zu-

dotierung einer reinen (+)-Catechin-Standard-Lösung mittels HPLC-DAD analysiert. Bei der

Zudotierung halbierten sich alle Peaks der im Gerstenextrakt-Chromatogramm sichtbaren

Inhaltsstoffe im Vergleich zum Chromatogramm des nicht-dotierten Gerstenextraktes bis auf

den (+)-Catechin-Peak mit der Retentionszeit von 39,5 min (Gradient P2, s. Abbildung 28)

bzw. 35 min (Gradient E2, s. Abbildung 29). Da aber nicht auszuschließen war, dass sich

andere Begleitsubstanzen unter den jeweiligen Peaks befinden, wurden weitere Spezifitäts-

Untersuchungen durchgeführt.

5 Ergebnisse und Diskussion 61

Intensität

(+)-Catechin

mAU

300

250

200

150

100

Retentionszeit

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 min

Intensität

(+)-Catechin

mAU

300

250

200

150

100

Retentionszeit

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 min

Abbildung 28: Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten; Gerstenextrakt in

DMF/H2O (2:1; v/v) ohne (oben) und mit Zudotierung (unten) einer

(+)-Catechin-Standard-Lösung, Gradient P2

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 min

(+)-Catechin

350

300

250

200

150

100

mAU

Intensität

Retentionszeit

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 min

(+)-Catechin

350

300

250

200

150

100

mAU

Intensität

Retentionszeit

Abbildung 29: Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten; Gerstenextrakt in

DMF/H2O (2:1; v/v) ohne (oben) und mit Zudotierung (unten) einer

(+)-Catechin-Standard-Lösung, Gradient E2

5 Ergebnisse und Diskussion 62

5.5.5.2 Spezifitätstest durch Vergleich der UV-Spektren

Die Spezifität eines HPLC-Verfahrens mit UV-Detektion kann durch den Vergleich der UV-

Spektren des Analyt-Peaks in einer Kalibrierprobe und einer Realprobe erfolgen [268]. Hier-

zu wurden jeweils Chromatogramme einer (+)-Catechin-Standard-Lösung und einer Gers-

tenextrakt-Probe sowohl mit dem Gradienten E2 als auch mit dem Gradienten P2 als mobile

Phase mittels HPLC-DAD aufgenommen. Zur Absicherung der Peak-Reinheit („Peak Purity“)

wurden die UV-Spektren der jeweiligen (+)-Catechin-Peaks am Anfang, im Maximum und

am Peak-Ende miteinander verglichen. Zur Charakterisierung der Übereinstimmung der drei

UV-Spektren wurde der sogenannte Match-Faktor [285] herangezogen. Durch die Berech-

nung der mittleren quadratischen Abweichungen zwischen den Kurven konnte somit ein

Übereinstimmungskriterium gebildet werden. Ein Match-Faktor von 0 bedeutet völlig ver-

schiedene, ein Match Faktor von 1000 identische UV-Spektren. Sowohl bei den Kalibrierpro-

ben als auch bei den Realproben wurden bei beiden Gradienten Match-Faktoren zwischen

990 und 999 und somit eine nahezu vollständige Peak-Reinheit ermittelt.

Zum Vergleich der Analyt-Peaks in Kalibrierlösung und in Realproben wurde der Match-

Faktor der normierten UV-Spektren am jeweiligen (+)-Catechin Peak-Maximum gebildet. Die

normierte Darstellung der UV-Spektren war erforderlich, um die Vergleichbarkeit, z. B. durch

unterschiedliche Absorptionswerte am UV-Maximum, die durch unterschiedliche Analyt-

Konzentrationen in den Proben bedingt sind, zu gewährleisten. In Abbildung 30 sind die für

den Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2 erhaltenen Chromatogramme sowie die zugehöri-

gen normierten UV-Spektren dargestellt. Der berechnete Match-Faktor betrug 983. Für die

hier nicht dargestellten UV-Spektren bei Verwendung des Gradienten P2 wurde der Match-

Faktor zu 976 berechnet. Somit war bei beiden Gradienten eine sehr gute Übereinstimmung

der UV-Spektren und damit ein deutlicher Hinweis auf die Spezifität des Analysenverfahrens

gegeben.

5 Ergebnisse und Diskussion 63

-15

mAU

0 10,0 20,0 30,0 40,0 min

12,5

25,0

37,5

mAU

0 10,0 20,0 30,0 40,0 min

-10

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm

235.1

278.7

(+)-Catechin-Kalibrierlösung

Gerstenextrakt

a) (+)-Catechin-Kalibrierlösung

b) Gerstenextrakt

c) UV-Peak-Reinheit

-15

mAU

0 10,0 20,0 30,0 40,0 min

12,5

25,0

37,5

mAU

0 10,0 20,0 30,0 40,0 min

-10

200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 nm

235.1

278.7

(+)-Catechin-Kalibrierlösung

Gerstenextrakt

a) (+)-Catechin-Kalibrierlösung

b) Gerstenextrakt

c) UV-Peak-Reinheit

Abbildung 30: Spezifitätstest durch Vergleich der DAD-Spektren des (+)-Catechin-Peaks

aus Kalibrierlösung (

= 30 mg/L) und einem Gerstenextrakt (280 nm,

Gradient E2)

5 Ergebnisse und Diskussion 64

5.5.5.3 Spezifitätstest durch Vergleich der Massenspektren (LC-ESI-

MS)

Eine weitere Möglichkeit, die Peak-Reinheit und damit die Spezifität des Analysenverfahrens

zu überprüfen, ist die Aufnahme von MS-Spektren in aufsteigender/abfallender Peak-Flanke

sowie im Peak-Maximum [268]. Nähere Angaben zu den Messbedingungen des LC-MS-

Systems siehe Kapitel 7.2.2. In Abbildung 31 sind die MS-Spektren (ESI, negative-Mode),

summiert über die Basislinienbreite der (+)-Catechin-Peaks, einer (+)-Catechin-Standard-

Lösung und eines Gerstenextraktes bei Einsatz des Gradienten E2 als mobile Phase, sowie

eines Gerstenextraktes unter Verwendung des Gradienten P2 gegenübergestellt.

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 [m/z]

696,5

194,8

816,4

576,6 936,3

289,8

1056,3

718,6

674,5

388,1

864,9

456,7 1176,21266,5

100

Relative Abundance

c) (+)-Catechin in Realprobe

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient

RT: 40,01-42,53 min

ESI-Full ms-negativ [100,00-2000,00]

NL: 8,95E4

b) (+)-Catechin in Realprobe

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,63-35,64 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 2,56E5

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

348,8

289,2

325,0 430,8

386,9

210,9 576,6

118,9

100

Relative Abundance

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

289,0

118,7

348,6

324,8

178,5 349,6430,5 578,6 848,4

100

Relative Abundance

a) (+)-Catechin-Kalibrierlösung

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,15-35,12 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 1,48E6

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 [m/z]

696,5

194,8

816,4

576,6 936,3

289,8

1056,3

718,6

674,5

388,1

864,9

456,7 1176,21266,5

100

Relative Abundance

c) (+)-Catechin in Realprobe

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient

RT: 40,01-42,53 min

ESI-Full ms-negativ [100,00-2000,00]

NL: 8,95E4

200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 [m/z]

696,5

194,8

816,4

576,6 936,3

289,8

1056,3

718,6

674,5

388,1

864,9

456,7 1176,21266,5

100

Relative Abundance

100

Relative Abundance

100

Relative Abundance

c) (+)-Catechin in Realprobe

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient

RT: 40,01-42,53 min

ESI-Full ms-negativ [100,00-2000,00]

NL: 8,95E4

b) (+)-Catechin in Realprobe

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,63-35,64 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 2,56E5

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

348,8

289,2

325,0 430,8

386,9

210,9 576,6

118,9

100

Relative Abundance

b) (+)-Catechin in Realprobe

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,63-35,64 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 2,56E5

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

348,8

289,2

325,0 430,8

386,9

210,9 576,6

118,9

100

Relative Abundance

100

Relative Abundance

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

289,0

118,7

348,6

324,8

178,5 349,6430,5 578,6 848,4

100

Relative Abundance

a) (+)-Catechin-Kalibrierlösung

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,15-35,12 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 1,48E6

100 200 300 400 500 600 700 800 900 [m/z]

289,0

118,7

348,6

324,8

178,5 349,6430,5 578,6 848,4

100

Relative Abundance

100

Relative Abundance

100

Relative Abundance

a) (+)-Catechin-Kalibrierlösung

Essigsäure/Acetonitril-Gradient

RT: 33,15-35,12 min

ESI-Full ms-negativ [80,00-1000,00]

NL: 1,48E6

Abbildung 31: Vergleich der LC-ESI-Massenspektren (MS1-Scan) von (+)-Catechin:

a) (+)-Catechin-Standard-Lösung (

= 125 mg/L, Gradient E2);

b) Gerstenextrakt (Gradient E2); c) Gerstenextrakt (Gradient P2)

Das Massenspektrum der Standard-Lösung ergab Signale bei m/z 289,0 (Precursor-Ion

[M-H]-), bei m/z 348,6 (Acetat-Addukt [M+Acetat-H]-) und bei m/z 118,7 (Lösungsmittel-

5 Ergebnisse und Diskussion 65

Dimer [Acetat-Dimer-2H]-). Die Zuordnung konnte durch die Fragmentmuster der ebenfalls

aufgenommenen Product-Ion-Scans (s. Kapitel 5.6.3) der jeweiligen Ionen bestätigt werden.

Das MS-Spektrum des (+)-Catechin-Peaks in der Realprobe bei Einsatz des Gradienten E2

war identisch mit dem der Standard-Lösung mit Ausnahme der Intensitätsverhältnisse der

Signale bei m/z 289,2 und m/z 348,8. Durch diese massenspektrometrische Bestätigung der

Peak-Reinheit war die Spezifität des Analysenverfahrens bei Einsatz des Essigsäu-

re/Acetonitril-Gradienten E2 gewährleistet.

Die Aufnahme eines Massenspektrums mit Phosphatpuffer als mobile Phase ist aufgrund

seiner schlechten Verdampfbarkeit und seiner Eigenschaft, mit den Analyt-Molekülen Cluster

zu bilden, schwierig. Die Signale des erwarteten (+)-Catechin-Precursor-Ions [M-H]- bei m/z

289,8 und des Phosphat-Addukts [M+PO43--H]- bei m/z 388,1 wiesen nur eine relative Inten-

sität von 45 % auf. Bei dem intensivsten Massen-Signal mit m/z 194,8 handelte es sich um

ein Lösungsmittel-Dimer [Phosphat-Dimer-2H]-. Auf eine weitere Zuordnung der detektierten

Signale wurde verzichtet. Zusammenfassend mit den unter Kapitel 5.5.5.1 und Kapitel

5.5.5.2 erhaltenen Ergebnissen konnte die Spezifität des Analysenverfahrens bei Verwen-

dung des Gradienten P2 als gesichert angesehen werden.

5.5.6 Präzision

Die Präzision ist das Maß für die Übereinstimmung unabhängiger Analysenergebnisse un-

tereinander. Sie gibt die Streuung von Analysenergebnissen an und wird durch zufällige

Fehler entweder durch das Analysengerät selbst (Messpräzision bzw. Systempräzision)

oder bei der Durchführung des gesamten Analysenverfahrens (Methodenpräzision) her-

vorgerufen [267, 268, 272]. Dabei wird je nach Art und Weise der Wiederholung zwischen

verschiedenen Arten der Präzision unterschieden. Die Ermittlung der Wiederholpräzision

erfolgt in kurzen Zeitabständen mit demselben Verfahren, an identischen Proben, in dem-

selben Labor, durch den gleichen Bearbeiter und mit derselben Geräteausrüstung. Bei der

Vergleichspräzision werden die Ermittlungsergebnisse mit demselben Verfahren, an identi-

schen Proben, aber in verschiedenen Laboratorien, von verschiedenen Bearbeitern und mit

verschiedener Geräteausrüstung bestimmt. Die Angabe der Tag-zu-Tag-Präzision be-

schreibt die Streuung der Analysenergebnisse bei Untersuchung der Proben unter sonst

gleichen Bedingungen, aber an verschiedenen Tagen. Als Präzisionsmaß wird im allgemei-

nen die Standardabweichung s, die relative Standardabweichung srel, und seltener die Vari-

anz s2 verwendet.

5.5.6.1 Messpräzision

Die Messpräzision des HPLC-Verfahrens mit UV-Detektion wurde im ersten Schritt durch

jeweils zehnfach-Injektion von drei unterschiedlich konzentrierten (+)-Catechin-Standard-

Lösungen bestimmt. Die in Tabelle 7 aufgeführten ermittelten relativen Standardabweichun-

gen waren bei Verwendung des Gradienten E2 geringfügig größer (0,95 bis 1,89 %) als die

5 Ergebnisse und Diskussion 66

mit dem Gradienten P2 erhaltenen (0,87 bis 1,66 %). Die bereits unter Kapitel 5.5.1 gestellte

Anforderung an die Analysenpräzision ≤ 3 % [272] wurde für alle Bestimmungen daher noch

einmal bestätigt. Um zu überprüfen, ob die Standardabweichungen der unterschiedlichen

Messreihen miteinander vergleichbar sind, wurde weiterhin die Varianzinhomogenität

(s. Anhang A.7) untersucht. Für jede der drei Messreihen lag der ermittelte Prüfwert unter-

halb des tabellierten F-Wertes von 3,18 (f1 = f2 = f = N - 1 = 9, P = 95 %).

Tabelle 7: Vergleich der Messpräzisionen bei der Bestimmung der (+)-Catechin-

Konzentration in Kalibrierlösungen, Gradienten E2 und P2 (n = 10)

Gradient E2 Gradient P2

Probe

[mg/L]

srel

[%]

[mg/L]

srel

[%]

1 50,38 0,95 1,89 51,34 0,85 1,66

2 185,26 1,76 0,95 185,25 1,04 0,56

3 1286,36 14,15 1,10 1284,56 11,23 0,87

Zur Ermittlung der Messpräzision von Realproben wurden zwei verschiedene Gerstenextrak-

te jeweils zehnfach mittels HPLC-DAD unter Verwendung der Gradienten E2 und P2 unter-

sucht. Die ermittelten Messpräzisionen waren mit Werten für srel um 2 % geringfügig größer

als bei den Standard-Lösungen, lagen aber allesamt im Bereich der geforderten Analysen-

präzision [272]. Die beiden mit unterschiedlichen Gradienten ermittelten Messreihen zeigten

Varianzhomogenität, d. h., die mit ihnen detektierten Ergebnisse sind vergleichbar.

Tabelle 8: Vergleich der Messpräzisionen bei der Bestimmung der (+)-Catechin-

Konzentration in Gerstenextrakten, Gradienten E2 und P2 (n = 10)

Gradient E2 Gradient P2

Probe

[mg/L] in

Messprobe

[mg/L]

srel

[%]

[mg/L] in

Messprobe

[mg/L]

srel

[%]

1 106,75 2,02 2,35 108,35 2,15 1,98

2 205,38 4,13 2,01 204,74 5,26 2,57

5.5.6.2 Methodenpräzision

Die Bestimmung der Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen erfolgte mit zwei un-

terschiedlichen Gerstenproben. Nach Zerkleinerung und Lyophilisierung wurden die Gers-

tenproben in zweimal sechs Aliquote aufgeteilt, diese sowohl mittels Ultra-Turrax (s. Kapitel

5.3.1.1) und MSS (s. Kapitel 5.3.1.2) getrennt aufgearbeitet und der (+)-Catechin-Gehalt

mittels HPLC-DAD unter Verwendung des Gradienten E2 bestimmt. Die berechneten Mittel-

werte für die Konzentrationen, die Standardabweichungen und die relativen Standardabwei-

chungen sind in Tabelle 9 dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 67

Der Ausreißer-Test nach GRUBBS [272, 281] belegte, dass alle Datenreihen frei von Ausrei-

ßern waren. Die ermittelten Standardabweichungen lagen zwischen 5 und 9 % und sind auf

zufällige Fehler bei der Probenvorbereitung zurückzuführen.

Tabelle 9: Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen für die Bestimmung von

(+)-Catechin in Gerstenextrakten nach Aufarbeitung mittels Ultra-Turrax und

MSS, Gradient E2 (n = 6)

Aufarbeitung mittels Ultra-Turrax Aufarbeitung mittels MSS

Probe

[mg/L] in

Messprobe

[mg/L]

srel

[%]

[mg/L] in

Messprobe

[mg/L]

srel

[%]

1 109,38 8,74 7,75 108,35 6,76 6,24

2 208,75 11,75 5,63 204,74 17,91 8,75

5.5.6.3 Tag-zu-Tag-Präzision

Die Beurteilung der Tag-zu-Tag-Präzision kann durch die Angabe des sogenannten Ver-

trauensbereiches bzw. der Wiederholbarkeit r95 (s. Anhang A.11) erfolgen. Dies ist eine im

Vergleich zur Standardabweichung aussagekräftigere Größe [269]. Wiederholt ein Labor

eine Messung am gleichen Objekt an zwei unterschiedlichen Tagen, so sind die beiden er-

haltenen Ergebnisse mit 95 % Sicherheit als gleich zu betrachten, wenn die Differenz kleiner

ist als die Wiederholbarkeit des Verfahrens. Um zu überprüfen, ob das entwickelte HPLC-

DAD-Verfahren dieser Anforderung genügt, wurden aus den Messwerten zur Auswahl einer

analytischen Säule (s. Kapitel 5.2.3) die Standardabweichungen der bei der (+)-Catechin-

Bestimmung ermittelten Peakflächen herangezogen, der Wert für die Wiederholbarkeit r95

berechnet und mit der größten Differenz verglichen (s. Tabelle 10).

Tabelle 10: Vergleich der Standardabweichungen s und srel sowie der Wiederholbarkeit

r95 mit der größten Differenz der Peakflächen bei Injektion einer (+)-Cate-

chin-Standard-Lösung (Probe 1:

= 125 mg/L; Probe 2:

= 250 mg/L)

Probe Flussrate

[µL/min]

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

srel

[%]

r95

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

größte Differenz

der Peakflächen

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

1a 200 2,30 3,41 6,44 6,05

1b 400 1,19 3,64 3,33 3,71

1c 600 0,83 3,79 2,32 2,24

1d 800 0,65 3,98 1,82 1,80

1e 1000 0,44 3,33 1,23 1,07

2a 200 2,11 1,53 5,91 5,56

2b 400 1,89 2,79 5,29 5,01

2c 600 1,37 3,10 3,84 3,07

2d 800 0,73 2,16 2,04 1,79

2e 1000 0,89 3,46 2,49 2,09

5 Ergebnisse und Diskussion 68

Abgesehen von dem ermittelten Wert für die (+)-Catechin-Standard-Lösung (β = 125 mg/L)

bei einer Flussrate von 400 µL/min waren die Differenzen der Peakflächen jeweils kleiner als

r95. Die ermittelten Ergebnisse bei den Messungen an verschiedenen Tagen waren also mit

95 % Sicherheit als gleich zu betrachten. Das Verfahren erfüllte damit die Anforderung an

die Tag-zu-Tag-Präzision [269].

5.5.7 Richtigkeit

Die Richtigkeit von Analysenergebnissen ist ein Maß für die Abweichung des Messwertes

vom Bezugswert (Sollwert) und repräsentiert die systematischen Fehler des Analysenverfah-

rens. Voraussetzung für die Richtigkeit ist die Selektivität des Verfahrens sowie eine Wieder-

findungsrate von 100 % nach jedem Schritt der Probenvorbereitung bzw. eine konstante,

rechnerisch korrigierbare Wiederfindungsrate. Die Überprüfung der Richtigkeit kann anhand

von Referenzmaterialien durch Vergleich mit einer unabhängigen validierten Methode oder

durch die Methode der Standardaddition erfolgen [268, 272, 273]. In der Literatur wird all-

gemein zwischen Referenzsubstanzen und zertifizierten Referenzmaterialien unterschie-

den. Referenzmaterialien müssen sich laut ISO Guide 30 [286, 287] durch eine definierte

Reinheit und Homogenität auszeichnen, damit sie für die Überprüfung der Richtigkeit von

Methoden einsetzbar sind. Erst durch eine belegte Strukturaufklärung sowie die Absicherung

verschiedener Prüfpunkte (Stabilität, etc.) kann das Material durch eine Organisation (z. B.

BAM, Bundesamt für Materialforschung, Berlin) zertifiziert werden. Da kein zertifiziertes Re-

ferenzmaterial erhältlich ist und bisher keine validierte Methode zur (+)-Catechin-

Bestimmung in Gerste existiert, sollte die Richtigkeit im Rahmen dieser Arbeit über die Wie-

derfindung bestätigt werden.

5.5.7.1 Wiederfindung

Die Wiederfindung ist das Verhältnis des unter Wiederholbedingungen gemessenen Mittel-

wertes zum richtigen Wert des Analyten in der Probe. Es können so Verluste an den zu ana-

lysierenden Substanzen während der Probenvorbereitung aufgedeckt werden. Bei der Be-

stimmung der Wiederfindung für (+)-Catechin wurden identische Aliquote einer gemahlenen

Gerstenprobe zweimal mit jeweils 0 (β0, „Blindwert“), 10, 20 und 30 mg (+)-Catechin als Tro-

ckensubstanz dotiert und anschließend sowohl mittels MSS als auch mit dem Ultra-Turrax,

wie unter Kapitel 5.3.1 beschrieben, aufgearbeitet und mit der HPLC-DAD bestimmt. Die in

Tabelle 11 dargestellten Ergebnisse der Untersuchungen wiesen für die Aufarbeitung mit

dem Ultra-Turrax einen Mittelwert der Wiederfindungen von 90,1 % und für die MSS von

84,1 % auf. Während der Probenvorbereitung traten also geringfügige Verluste an

(+)-Catechin auf, bedingt durch die aufwendigen Extraktionsschritte.

5 Ergebnisse und Diskussion 69

Tabelle 11: Wiederfindungen für (+)-Catechin beim Aufstocken von Gerste (Gradient E2)

Wiederfindung [%]

Probe

β0((+)-Catechin) in

Trockenmasse Gerste

[mg/30 g]

10 mg

(+)-Catechin

zudotiert

20 mg

(+)-Catechin

zudotiert

30 mg

(+)-Catechin

zudotiert

Aufarbeitung mit Ultra-Turrax

1 0,321 89,3 88,5 91,2

2 0,316 86,7 91,7 93,1

Aufarbeitung mit MSS

1 0,301 81,3 82,4 87,9

2 0,308 85,7 86,1 81,3

5.5.8 Robustheit

Die Robustheit ist nach KROMIDAS [267] die Fähigkeit eines Verfahrens, ein Ergebnis zu

liefern, das durch variierende Bedingungen nicht oder nur unwesentlich verfälscht wird. Die

Robustheit beschreibt somit das Ausmaß der Unabhängigkeit eines Ergebnisses von Ände-

rungen aller relevanter Einflussparameter. Wie auch bei den anderen Validierungsparame-

tern existieren in der Literatur vielfältige Definition. Die wohl treffendste gibt die FDA [276]:

„Die Robustheit ist die Prüfung der Fähigkeit einer Methode, ein Ergebnis zu liefern, das von

kleinen aber realistischen und eindeutig definierbaren Änderungen der Methodenparameter

wie pH-Wert, Temperatur, Extraktionszeit, chromatographische Säule (Charge, Hersteller)

u.s.w. unbeeinflusst bleibt.“ Um die Robustheit des HPLC-DAD-Verfahrens zu ermitteln,

wurde der Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule und des pH-Wertes der mobilen

Phase auf die Chromatogramme untersucht.

5.5.8.1 Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule

Um den Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule auf die Peakfläche des

(+)-Catechin-Peaks zu testen, wurde die Peakfläche bei Verwendung verschiedener Alkyl-

modifizierter Säulenmaterialien (s. Tabelle 4) mittels Vierfach-Bestimmung ermittelt. Als Pro-

belösung wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung (β = 250 mg/L) eingesetzt. Für die je-

weilige Flussrate wurde die Peakfläche bezüglich der Peakfläche des (+)-Catechin-Peaks

der Nucleosil C18-Säule normiert. Das Ergebnis ist in Abbildung 32 dargestellt. Ein Vergleich

des Retentionsverhaltens des Analyten, wie in der Literatur [122] beschrieben, war aufgrund

der differierenden Säulendimensionen der untersuchten Säulen sowie der in Kapitel 5.2.3

genannten Gründen nicht sinnvoll. Die mit den verschiedenen Trennsäulen ermittelten

(+)-Catechin-Peakflächen zeigten bezogen auf die Nucleosil C18-Säule nur eine geringe

Abweichung von weniger als 6,5 %. Dies bedeutet, dass das Packungsmaterial keinen we-

sentlichen Einfluss auf das Retentionsverhalten bzw. das Detektionsverhalten unter den ge-

wählten chromatographischen Bedingungen ausübt.

5 Ergebnisse und Diskussion 70

0,90

0,92

0,94

0,96

0,98

1,00

1,02

1,04

1,06

1,08

1,10

200 400 600 800 1000

Flussrate [µl/min]

QF-Wert

Nucleosil C18

Wakosil C18

Nautilus C18

YMC C18

Synergi C18

Omnispher C18

Chromolith C18

Nucleosil C8

Abbildung 32: QF-Werte (auf Säule Nucleosil C18 normiert) für den (+)-Catechin-Peak

(

= 250 mg/L, DMF/H2O, 2:1; v/v) für RP-C18-Säulen in Abhängigkeit der

Flussrate des Gradienten E2 (n = 4)

5.5.8.2 Einfluss des pH-Wertes der mobilen Phase

Um den Einfluss des pH-Wertes und der Konzentration der mobilen Phase zu untersuchen,

wurde für den Einsatz eines 0,01 mol/L Phosphatpuffers pH 2 (Pa), eines 0,005 mol/L Phos-

phatpuffers pH 2 (Pb), eines 0,01 mol/L Phosphatpuffers pH 3 (Pc) und eines Phosphatpuf-

fers pH 2 ohne Zugabe von EDTA (Pd) die Retentionszeit sowie die Peakfläche für

(+)-Catechin bestimmt. Dazu wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung (β = 125 mg/L) je-

weils zehnmal injiziert und für die genannten Parameter der Mittelwert, die Standardabwei-

chung s sowie die relative Standardabweichung srel berechnet (s. Tabelle 12).

Tabelle 12: Vergleich verschiedener Kenngrößen des (+)-Catechin-Peaks bei

Verwendung unterschiedlicher Phosphatpuffer als mobile Phase.

Pa: 0,01 mol/L, pH 2; Pb: 0,005 mol/L, pH 2; Pc: 0,01 mol/L, pH 3;

Pd: Phosphatpuffer pH 2 ohne Zugabe von EDTA (n = 10)

a P

b P

c P

Retentionszeit

[min] 39,45 38,78 39,58 38,76

s [min] 0,24 0,05 0,16 0,03

srel [%] 0,60 0,13 0,40 0,01

Peakfläche

[mAU⋅

⋅⋅⋅min] 55,01 55,21 55,03 54,08

s [mAU⋅

⋅⋅⋅min] 0,78 0,52 0,68 0,70

srel [%] 1,41 0,95 1,24 1,30

5 Ergebnisse und Diskussion 71

Ein Vergleich der Retentionszeiten und der Peakflächen unter Bezug auf die Wiederholbar-

keit r95 [269] zeigte, dass bei Einsatz der unterschiedlichen Puffer-Konzentration die für den

Analyt-Peak erhaltenen Retentionszeiten nicht mit 95 % Sicherheit als gleich zu betrachten

sind. Dadurch wird die Quantifizierung von (+)-Catechin aber nicht beeinflusst. Da die erhal-

tenen Peakflächen keinen signifikanten Unterschied aufwiesen und die Differenz kleiner als

die Wiederholbarkeit des Verfahrens ist, hatte sowohl der pH-Wert als auch die Variation der

Puffer-Konzentration keinen Einfluss auf die Präzision der Messergebnisse.

5.5.9 Zusammenfassung der Validierungsergebnisse

Das entwickelte HPLC-DAD-Verfahren (s. Kapitel 5.4, Abbildung 21) wurde einer Validierung

unterworfen, wodurch die qualitative Bewertung der damit erzielten Analysenergebnisse

möglich ist. Eine zusammenfassende Bewertung des neuen HPLC-DAD-Verfahrens im Ver-

gleich zu bereits publizierten Verfahren war nicht möglich, da in der Literatur keine oder nur

sehr unvollständige Validierungsdaten angegeben sind.

Im Rahmen der Validierung des HPLC-DAD-Verfahrens ergab sich sowohl für den Essigsäu-

re/Acetonitril-Gradienten E2 als auch für den Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P2 unter

Berücksichtigung des linearen Zusammenhanges der Analyt-Konzentration mit dem Detek-

torsignal, der geforderten Analysenpräzision und dem praxisorientierten Anwendungsziel ein

vorläufiger Arbeitsbereich von 5 bis 2500 mg/L. Die untere Grenze des Arbeitsbereiches ist

durch die Bestimmungsgrenze festgelegt. Diese lag bei beiden Gradienten bei einer

(+)-Catechin-Konzentration von 1,25 mg/L (≙ 50 ng absolut). Ihre Bestimmung erfolgte, wie

auch die der Nachweis- (0,25 mg/L ≙ 10 ng absolut) und Erfassungsgrenze (0,5 mg/L ≙

20 ng absolut) nach der für die Chromatographie üblichen Ermittlung des Signal/Rausch-

Verhältnisses [267, 275, 284]. In der Literatur wird als Nachweisgrenze 5,8 ng (+)-Catechin

absolut und als Bestimmungsgrenze 8,6 ng (+)-Catechin absolut angegeben [183]. Es wer-

den aber keine Angaben über die methodische Vorgehensweise angeführt.

Die im nächsten Schritt der Validierung erstellten Kalibrierfunktionen wurden mittels statis-

tischer Berechnungen abgesichert, wobei die gewählten Ansätze mit einer relativen Verfah-

rensstandardabweichung Vxo von 1,3 % (E2) und 0,9 % (P2) weit unterhalb des in der Lite-

ratur [273, 282] geforderten Wertes von 3,4 % lagen. Untersuchungen bezüglich der Stabili-

tät des Analyten ergaben, dass sowohl die Kalibrierlösungen als auch die Realproben

entweder direkt vermessen und während der Messung auf 5 °C gekühlt, oder, um eine län-

gerfristige Stabilität zu gewährleisten, bei einer Temperatur von -80 °C gelagert werden

müssen. Obwohl der Validierungsparameter „Stabilität“ von großer Bedeutung ist, da eine

mangelnde Stabilität der Proben zu extremen Fehlern im Analysenergebnis führen kann,

wird ihm in der Literatur nur wenig Beachtung geschenkt. Systematische Stabilitätsuntersu-

chungen blieben bisher aus. FRIEDRICH [183] spricht die Empfehlung aus, dass die Bestim-

mung in Realproben innerhalb von 24 h erfolgen sollte, da er zeigen konnte, dass die

Peakfläche von (+)-Catechin bei 10 °C über 24 h in Realproben unverändert blieb.

5 Ergebnisse und Diskussion 72

Zur Überprüfung der Spezifität des Verfahrens wurden, wie im Amtsblatt der Europäischen

Gemeinschaften [275] gefordert, Dotierungsexperimente an Realproben zum Retentionszeit-

vergleich durchgeführt und die UV-Spektren des (+)-Catechin-Peaks einer Kalibrierlösung

und einer Realprobe (Gerste) miteinander verglichen. Es ergab sich eine sehr gute Überein-

stimmung der UV-Spektren (Match-Faktor von 983 (E2) bzw. 976 (P2)). Zusätzlich erfolgte

ein Spezifitätstest zur Bestätigung der Peak-Reinheit durch Aufnahme von MS-Spektren

(LC-ESI-MS) über die gesamte Peakbreite. Bei Verwendung des Gradienten E2 konnte so-

wohl das Precursor-Ion [M-H]- bei m/z 289 als auch ein Acetat-Addukt [M+Acetat-H]- bei m/z

349 nachgewiesen werden. Aufgrund seiner schlechten Eignung für die Massenspektro-

metrie wurde bei dem Gradienten P2 das Signal des Precursor-Ions erwartungsgemäß nur

schwach detektiert.

Zur Charakterisierung der Präzision der Analysenergebnisse wurden die Messpräzision, die

Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen sowie die Tag-zu-Tag-Präzision herange-

zogen. Dabei wurden für die Messpräzision bei beiden Gradienten Werte um 2 % sowie für

die Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen Werte zwischen 5,6 % und 8,8 % er-

mittelt, wobei die Aufarbeitung mittels MSS gegenüber dem Ultra-Turrax geringfügig höhere

Abweichungen zeigte. In der Literatur existieren nur sehr wenige Angaben zur Methodenprä-

zision. Die ermittelten Werte sind aber deutlich geringer als z. B. die von ROEDER et al.

[249] publizierten Daten (22 - 40 %) aus Untersuchungen von Malz. WHITTLE et al. [181]

geben einen Variationskoeffizienten von 17 % (n = 6) nach einmaliger acetonischer Extrakti-

on und Bestimmung des Rohextraktes an. GOUPY et al. [185] erzielten Werte von 8 %

(n = 5) und JERUMANIS [178] von 5 - 6 %, jedoch bleibt dabei eine möglicherweise schlechte

Wiederfindungsrate unberücksichtigt. Dies trifft vor allen Dingen für die von GOUPY et al.

durchgeführte Ethylacetat-Extraktion zur Überführung der Flavonoide im letzten Probenvor-

bereitungsschritt zu (s. Kapitel 4.3).

Im nächsten Schritt der Validierung wurde zur Beurteilung der Tag-zu-Tag-Präzision die

Wiederholbarkeit r95 zur laborinternen Qualitätskontrolle herangezogen. Es wurde bestätigt,

dass die an unterschiedlichen Tagen durchgeführten Messungen mit 95 % Sicherheit als

gleich zu betrachten sind.

Die Überprüfung der Richtigkeit der Analysenergebnisse erfolgte durch die Bestimmung der

Wiederfindung, da systematische Fehler ausgeschlossen werden können, wenn die Selek-

tivität des Verfahrens sowie eine konstante, rechnerisch korrigierbare Wiederfindungsrate

gegeben ist. Die Mittelwerte der gefundenen Wiederfindungsraten lagen für die Aufarbeitung

der Realproben mit dem Ultra-Turrax bei 90,1 % und für die MSS bei 84,1 %. In der Literatur

existieren sehr unterschiedliche Angaben über die Wiederfindungsraten. Die von FRIEDRICH

[183] ermittelten Wiederfindungen von 87 % für (+)-Catechin bei der Aufarbeitung von Malz

an Polyamid lagen in der gleichen Größenordnung. Eine wesentlich geringere Wiederfin-

dungsrate erzielte dagegen ROEDER [249] bei der Aufarbeitung von Malz und Bier.

Die Robustheit des Analysenverfahrens wurde anhand von Veränderungen verschiedener

Parameter bei der chromatographischen Bestimmung untersucht. Der Einsatz verschiedener

5 Ergebnisse und Diskussion 73

Alkyl-modifizierter RP-Säulen beeinflusste die Peakfläche nur unwesentlich. Die hierzu an

mehreren Tagen durchgeführten Untersuchungen zeigten bezüglich der Nucleosil C18-Säule

Abweichungen < 6,5 %. Die Änderung des pH-Wertes sowie der Konzentration des Gradien-

ten P2 hatte nur einen geringen Einfluss auf die Retentionszeit des (+)-Catechin-Peaks, die

Peakflächen sind mit 95 % Sicherheit als gleich zu betrachten.

Das hier vorgestellte HPLC-DAD-Verfahren zeichnet sich durch eine bisher noch nie in der

Literatur beschriebene umfassende Validierung aus. Es wurde damit erstmals die Möglich-

keit zur validierten quantitativen Bestimmung von (+)-Catechin in Gerste eröffnet. Das Ver-

fahren kann zum einen als Grundlage für epidemiologische Untersuchungen eingesetzt wer-

den, weiterhin können auch, basierend auf diesem Verfahren, Untersuchungen über das

Verhalten von (+)-Catechin im Brauprozess und seinen Einfluss auf die Bierqualität (s. Kapi-

tel 4.2) durchgeführt werden.

5.6 Identifizierung in Gerste enthaltener Flavonoide mittels

LC-DAD-MS/MS-Kopplung

Zur Identifizierung von schwerflüchtigen Verbindungen ohne vorherige Derivatisierung

kommt der Technik der Kopplung der HPLC mit einem Massenspektrometer, der LC-MS-

Kopplung, immer größere Bedeutung zu. Seit den achtziger Jahren wurden als Ionisierungs-

techniken neben der chemischen Ionisation (CI), der Impact Laser Spectroscopy (LAMMA)

[48] und dem Fast Atom Bombardment (FAB) [288, 289] vor allen Dingen das Thermospray-

Interface (TSP) [249, 290-293] zur Analytik von Flavonoiden in biologischen Proben einge-

setzt. Nachteilig bei Einsatz des TSP ist aber, dass aus einer hohen Fragmentierungsrate oft

nur sehr kleine Signale des Precursor-Ions resultieren.

Eine schonendere Ionisierung der Analyten mit höheren Signalintensitäten der Precursor-

Ionen eröffnet die Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (APCI) [182, 294, 295] sowie

die Electrospray Ionisation (ESI) [296-299], die in den letzten Jahren immer häufiger Anwen-

dung finden. Die APCI-Technik ist dabei tendenziell eher für unpolare Moleküle geeignet,

während sich mit der ESI bevorzugt Ionen von thermolabilen, nicht-flüchtigen, polaren Ver-

bindungen erzeugen und detektieren lassen [259]. Hierbei können entweder positiv gelade-

ne ([M+H]+) oder negativ geladene Ionen ([M-H]-) entstehen. In der Literatur [181, 300] wird

die Identifizierung der Proanthocyanidine meist ausschließlich über die Precursor-Ionen be-

schrieben. Bei höhermolekularen Verbindungen konnte auch die Existenz mehrfach gelade-

ner Precursor-Ionen ([M-2H]2-, [M-3H]3-) durch die Isotopenverteilung der einzelnen Signale

nachgewiesen werden [294, 301]. Als schwach saure Verbindungen (s. pKs-Wert-

Bestimmung, Anhang A.1) lassen sich Polyphenole im negativen Mode besser erfassen, da

die Deprotonierung der Verbindungen leichter stattfindet als ihre Protonierung. Es wird eine

hohe Ionenausbeute erzielt, wobei die Verwendung einiger Säurezusätzen zur mobilen Pha-

se allerdings zur Addukt-Bildung mit den Precursor- oder Product-Ionen führen kann. Da

dadurch die Anzahl an Precursor- und Product-Ionen zunimmt, können komplizierte Spek-

5 Ergebnisse und Diskussion 74

tren entstehen. Deshalb arbeiten viele Arbeitsgruppen [181, 302] im positiven Mode, obwohl

die Detektion negativ geladener Ionen empfindlicher ist.

Zur Identifizierung von Molekülen bietet eine Ionenfalle (Ion-Trap) gegenüber einem

Quadrupol oder Triple-Quadrupol als Massenanalysator wesentliche prinzipielle Vorteile.

Denn durch gezielte Isolierung von Precursor-Ionen in der Ionenfalle können durch Kollision

mit einem Inertgas Product-Ionen erzeugt werden, welche erneut isoliert und fragmentiert

werden können. Diese MSn-Experimente ermöglichen die Bestimmung von Folgefragmentie-

rungen und damit Ansätze zur Strukturaufklärung der Moleküle. Die Fragmentierung kann

aber auch bereits zwischen der Ionenquelle und der Ionenfalle durch Anlegen einer Be-

schleunigungsspannung nach Stoß mit neutralen Molekülen (stoßinduzierte Fragmentierung,

CID, Collision Induced Dissociation) hervorgerufen werden. Die Product-Ionen können dann

weiter in der Ionenfalle analysiert werden [259]. Bisher sind in der Literatur nur wenige mas-

senspektrometrische Untersuchungen von Flavanolen und Proanthocyanidinen mit einem

ESI-Interface in Kombination mit der Ionenfalle beschrieben worden [183, 298, 303]. Eine

umfassende Identifizierung der in Gerste enthaltenen Flavonoide durch MS3-Experimente ist

bisher nicht bekannt geworden.

Ziel der massenspektrometrischen Untersuchungen im Rahmen dieser Arbeit war die Identi-

fizierung von Flavonoiden in Gerste. Folgende Vorgehensweise wurde angestrebt:

• MSn-Kollisionsexperimente mit den Monomeren (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin.

Hierdurch sollten Hinweise auf das Fragmentierungsverhalten der höhermolekularen

Verbindungen, die nicht kommerziell erhältlich sind, erlangt werden.

• MS1-Scan-Experimente mit Gerstenextrakt. Die durch die MS-Chromatogramme erhal-

tenen Massenspektren im Bereich von m/z 50 - 2000 sollten zu einer vorläufigen Iden-

tifizierung der Inhaltsstoffe dienen.

• MS3-Kollisionsexperimente mit Gerstenextrakt zur Identifizierung der detektierten Fla-

vonoide und zur Absicherung der getroffenen Zuordnung.

5.6.1 Kollisionsexperimente mit monomeren Flavonoiden

Es wurden Standard-Lösungen der monomeren Flavanole (+)-Catechin, (-)-Epicatechin,

(-)-Gallocatechin und (-)-Epigallocatechin (β = 125 mg/L) in DMF/H2O hergestellt und das

Fragmentierungsverhalten durch MSn-Experimente während verschiedener Chroma-

tographieläufe unter Verwendung des Gradienten E2 untersucht. Bei dem Monomeren

(+)-Catechin (Rt = 34,0 min) und seinem Epimeren (-)-Epicatechin (Rt = 62,1 min) wurde das

Precursor-Ion [M-H]- m/z 289,2 sowie das Acetat-Addukt [M+Acetat-H]- m/z 348,6 detektiert

(s. Kapitel 5.5.5.3, Abbildung 31a). Bei (-)-Gallocatechin (Rt = 12,5 min) und

(-)-Epigallocatechin (Rt = 64,3 min) hingegen konnte keine Addukt-Bildung mit dem Fließmit-

tel beobachtet werden. Diese beiden Moleküle neigten jedoch zur Dimeren-Bildung ([2M-H]-

m/z 610,9).

5 Ergebnisse und Diskussion 75

Zur Untersuchung des Fragmentierungsverhaltens wurden die jeweiligen Precursor-Ionen in

der Ionenfalle isoliert und schrittweise die Kollisionsenergie erhöht, bis nur noch ein Signal

geringer Intensität detektiert werden konnte. Die entstandenen Product-Ionen (in Tabelle 13

fett markiert) wurden erneut isoliert und als Precursor-Ionen nochmals durch kontinuierliche

Erhöhung der Energie fragmentiert. In Tabelle 13 (ausführlichere Darstellung s. Anhang

A.12, Tabelle A.7 und A.8) sind die entstandenen Product-Ionen der vier Monomeren in ab-

nehmender Intensitätsreihenfolge aufgeführt. In Abbildung 33 sind die aus dem Fragmentie-

rungsmuster abgeleiteten und basierend auf bereits veröffentlichten Untersuchungsergeb-

nissen [48, 298] möglichen Zerfallswege am Beispiel des (+)-Catechins dargestellt.

Tabelle 13: Fragmentierungsprodukte der Monomeren (+)-Catechin,

(-)-Epicatechin, (-)-Gallocatechin und (-)-Epigallocatechin mittels

LC-MSn-Experimenten (Gradient E2)

(+)-Catechin /

(-)-Epicatechin

(-)-Gallocatechin /

(-)-Epigallocatechin

Experi-

ment

Precursor-Ion

[M-H]- mit m/z

Product-Ion

[M-H]- mit m/z

Precursor-Ion

[M-H]- mit m/z

Product-Ion

[M-H]- mit m/z

MS2 289,2 245,3/ 205,3/ 179,2/

271,1/ 231,3/ 165,2/

125,1

304,9 179,0/ 261,1/ 220,9/

287,0/ 219,1/ 165,0/

124,9/ 137,1

MS3 - -

287,0 242,9/ 269,3/ 244,9/

218,9/ 203,0

245,3 203,3/ 227,1/ 187,2/

161,2/ 175,1

261,1 218,9/ 243,1/ 202,9/

177,1/ 192,1

205,3 161,2/ 187,3/ 177,2 220,9 202,9/ 176,9/ 192,9

179,2 163,9/ 135,1/ 151,1 179,0 163,9/ 150,8/ 134,8

MS4 203,3 175,1/ 185,2/ 161,2/

109,1

218,9 176,9 /125,1/ 192,1

161,2 109,1 176,9 125,1

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente bzw.

Product-Ionen MS3-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS4-Experimente

Das Fragmentierungsmuster der vier Verbindungen ist nahezu identisch. Die Precursor-

Ionen fragmentieren hauptsächlich in drei Product-Ionen, abhängig von der Position der im

Molekül erzeugten negativen Ladung. Das Product-Ion m/z 245,3 entsteht vermutlich durch

das Aufbrechen des heterocyclischen C-Ringes, gefolgt von einer Abspaltung eines Acetal-

dehyds und wies für das Precursor-Ion mit m/z 289,2 die höchste Intensität auf. Im Gegen-

satz dazu war die Intensität der auf dem äquivalenten Weg entstandenen Product-Ionen m/z

261,1 für die Gallocatechine kleiner, als Product-Ion mit der höchsten Intensität wurde hier

das Ion mit m/z 179,0 (Abspaltung des Phenylringes B) detektiert. Die Abspaltung des

A-Ringes aus dem Chroman-Gerüst führte für das Precursor-Ion mit m/z 289,2 zu einem

Product-Ion mit m/z 205,3, für das Precursor-Ion m/z 304,9 zu dem Product-Ion m/z 220,9.

5 Ergebnisse und Diskussion 76

-C

OH O

(+)-Catechin [M-H]

m/z = 289,2

-C

m/z = 179,2

m/z = 205,3

-C

O-C

m/z = 245,3 m/z = 161,2

m/z = 203,3

-C

m/z = 227,1 -H

-CO

m/z = 175,1

m/z = 187,2 ?

-C

m/z = 109,1

-CH

m/z = 163,9

-CO

m/z=151,1

-C

-CO

m/z = 177,2

m/z = 135,1

m/z=187,3

-H

-C

OH O

(+)-Catechin [M-H]

m/z = 289,2

-C

m/z = 179,2

m/z = 205,3

-C

OH O

(+)-Catechin [M-H]

m/z = 289,2

-C

m/z = 179,2

m/z = 205,3

-C

O-C

m/z = 245,3 m/z = 161,2

m/z = 203,3

-C

m/z = 227,1 -H

-CO

-C

O-C

m/z = 245,3 m/z = 161,2

m/z = 203,3

-C

m/z = 227,1 -H

-CO

m/z = 175,1

m/z = 187,2 ?

-C

m/z = 109,1

-CH

m/z = 163,9

-CO

m/z=151,1

-C

-CO

m/z = 177,2

m/z = 135,1

m/z=187,3

-H

m/z = 175,1

m/z = 187,2 ?

-C

m/z = 109,1

-CH

m/z = 163,9

-CO

m/z=151,1

-C

-CO

m/z = 177,2

m/z = 135,1

m/z=187,3

-H

-C

Abbildung 33: Mögliche Fragmentierungen der Flavanole am Beispiel (+)-Catechin,

Stoßfragmentierung in der Ionenfalle (ESI, negative-Mode)

5 Ergebnisse und Diskussion 77

Mit den intensivsten Product-Ionen der MS2-Experimente (in Tabelle 13 fett markiert) wurden

MS3-Fragmentierungsexperimente durchgeführt. Bei dem Product-Ion mit m/z 179 konnte

keine strukturelle Zuordnung der erhaltenen Ionen getroffen werden. Bei beiden durch Ab-

spaltung des A-Ringes resultierenden Product-Ionen (m/z 205,3 bzw. 220,9) kam es zu ei-

nem Aufbrechen des C-Ringes (resultierende Product-Ionen m/z 161,2 bzw. 176,9), und

schließlich entstand als Product-Ion ein di- oder trisubstituierter Phenylring mit m/z 109,1

bzw. 125,1. Die Fragmentierungsuntersuchungen der Product-Ionen mit m/z 245,3 bzw.

261,1 führten zu keinem einheitlichen Ergebnis. So konnte nicht unterschieden werden, ob

die Product-Ionen ausschließlich über die Zwischenstufe des Fragmentes m/z 203,3 bzw.

218,9 oder direkt in die Product-Ionen mit m/z 161,2 bzw. 176,9 und m/z 175,1 bzw. 192,1

zerfielen. Sowohl bei dem Stoßexperiment mit dem ersten als auch dem zweiten Product-Ion

wurden die entsprechenden Fragmente detektiert. Für die weiteren in Tabelle 13 aufgeführ-

ten Product-Ionen konnte bisher keine Zuordnung getroffen werden.

5.6.2 Precursor-Ion-Scan-Experimente mit Gerstenextrakten

Es wurden MS1-Scan-Untersuchungen (ESI, negative-Mode) eines Gerstenextraktes, gelöst

in DMF/H2O, in einem Massenbereich von m/z 50 - 2000 durchgeführt. Zur Zuordnung der

einzelnen Gersteninhaltsstoffe wurden die entsprechenden Signale in den MS-

Chromatogrammen herangezogen. In Tabelle 14 sind jeweils die Bruttoformel, die mit dem

Programm ChemSketch [304] berechnete Molmasse, die Masse des erwarteten Precursor-

Ions [M-H]- sowie die Sequenz der Monomeren der in Gerste (s. Kapitel 4.1, Tabelle 3) iden-

tifizierten Flavonoide zusammengestellt.

Tabelle 14: Zusammenstellung der Bruttoformel, der Molmasse, sowie der erwarteten

Masse der Precursor-Ionen [M-H]- der in Gerste identifizierten Flavonoide

Trivialname Brutto-

formel

Monomeren-

Sequenz

Molmasse

[g/mol]

Precursor-Ion

[M-H]- [m/z]

(+)-Catechin/

(-)-Epicatechin C15H14O6 C/

EpiC 290,268 289,07

(-)-Gallocatechin/

(-)-Epigallocatechin C15H14O7 GC/

EpiGC 306,267 305,07

(+)-Catechin-Glucopyranosid C21H24O11 CGp 452,537 451,12

Procyanidin B3 C30H26O12 C-C 578,520 577,13

Prodelphinidin B3 C30H26O13 GC-C 594,520 593,14

Prodelphinidin Dimer C30H26O14 GC-GC 610,530 609,12

Procyanidin C2 C45H38O18 C-C-C 866,772 865,21

Prodelphinidin Trimer 1a C45H38O19 GC-C-C 882,772 881,19

Prodelphinidin Trimer 1b C45H38O19 C-GC-C 882,772 881,19

Prodelphinidin C2 C45H38O20 GC-GC-C 898,771 897,19

Prodelphinidin Trimer 2a C45H38O21 GC-GC-GC 914,772 913,18

5 Ergebnisse und Diskussion 78

Im ersten Schritt erfolgte die Zuordnung der Monomeren, hierzu sind in Abbildung 34 ein

UV-Chromatogramm (λmax = 280 nm), die MS-Chromatogramme (m/z 288,5 - 289,5 und m/z

304,5 - 305,5) der monomeren Flavonoide sowie das MS-Chromatogramm des Acetat-

Addukts von Catechin/Epicatechin [M+Acetat-H]- (m/z 348,5 - 349,5) dargestellt.

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

Intensität [mAU]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

NL: 4,94E5

nm = 279,5 - 280,5

NL: 2,83E5

Base Peak

m/z 288,5 - 289,5

NL: 1,54E5

Base Peak

m/z 348,5 - 349,5

NL: 7,89E5

Base Peak

m/z 304,5 - 305,5

12,52

1,84

112,48

127,15

1,93

33,99

34,12

27,44

14,01

66,55

107,57

27,45

34,13

13,75

21,83

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

Intensität [mAU]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

NL: 4,94E5

NL: 2,83E5

Base Peak

m/z 288,5 - 289,5

NL: 1,54E5

Base Peak

m/z 348,5 - 349,5

NL: 7,89E5

Base Peak

m/z 304,5 - 305,5

12,52

1,84

112,48

127,15

1,93

33,99

34,12

27,44

14,01

66,55

107,57

27,45

34,13

13,75

21,83

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

Intensität [mAU]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

NL: 4,94E5

nm = 279,5 - 280,5

NL: 2,83E5

Base Peak

m/z 288,5 - 289,5

NL: 1,54E5

Base Peak

m/z 348,5 - 349,5

NL: 7,89E5

Base Peak

m/z 304,5 - 305,5

12,52

1,84

112,48

127,15

1,93

33,99

34,12

27,44

14,01

66,55

107,57

27,45

34,13

13,75

21,83

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

Intensität [mAU]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

NL: 4,94E5

NL: 2,83E5

Base Peak

m/z 288,5 - 289,5

NL: 1,54E5

Base Peak

m/z 348,5 - 349,5

NL: 7,89E5

Base Peak

m/z 304,5 - 305,5

12,52

1,84

112,48

127,15

1,93

33,99

34,12

27,44

14,01

66,55

107,57

27,45

34,13

13,75

21,83

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

Abbildung 34: UV- und MS-Chromatogramme (Precursor-Ion-Scan-Experimente, ESI,

negative-Mode) eines Gerstenextraktes: a) UV-Chromatogramm (280 nm);

b)-d) MS-Chromatogramme monomerer Flavonoide (m/z 289, 349 und 305)

Bei einer Retentionszeit von 34 min wurde ein Peak mit m/z 289,2 und m/z 348,5 detektiert,

bei dem es sich um (+)-Catechin bzw. das Acetat-Addukt handelt. Entgegen den Untersu-

chungen anderer Arbeitsgruppen [181, 185] konnte in dem Gerstenextrakt kein

(-)-Epicatechin nachgewiesen werden, da bei einer, aus Versuchen mit Standard-Lösungen

ermittelten Retentionszeit für (-)-Epicatechin von etwa 60 min, kein Peak im MS-

Chromatogramm (m/z 289 oder m/z 348) detektiert wurde. Die Signale bei Rt = 14,01 und

27,44 min sind Catechin/Epicatechin-Einheiten aus Flavonoid-Dimeren bzw. -Trimeren zu-

zuordnen (s. Kapitel 5.6.3). Unter Umständen resultieren sie aus dem Bruch einer Interfla-

vonoid-Bindung bei der Ionisierung oder im Massenanalysator.

Im MS-Chromatogramm m/z 304,5 - 305,5 konnte der Peak mit Rt = 12,52 min als

(-)-Gallocatechin identifiziert werden. Erstaunlicherweise konnte bei einer Retentionszeit von

5 Ergebnisse und Diskussion 79

127,15 min ein Signal mit einer für Gallocatechin/Epigallocatechin typischen Masse m/z 305

festgestellt werden. Aufgrund der hohen Retentionszeitverschiebung gegenüber der unter-

suchten Standard-Lösung (s. Kapitel 5.6.1) handelt es sich hierbei aber nicht um das Mono-

mer (-)-Epigallocatechin. Zudem konnte auch die für Epigallocatechine charakteristische

Dimerenbildung ([2M-H]- m/z 610,9) nicht beobachtet werden.

Entsprechend den Untersuchungen von FRIEDRICH [183], der erstmals (+)-Catechin-

Glucopyranosid (2R:3S-Catechin-7O-β-D-glucopyranosid) in Gerste gefunden hat, konnte

ebenfalls ein Ion mit derselben Masse m/z 451 im MS-Chromatogramm (nicht abgebildet)

bei einer Retentionszeit von 20,53 min ermittelt werden. Die Bestätigung der Existenz dieser

Verbindung in Gerste erfolgt später durch MS/MS-Kollisionsexperimente (s. Kapitel 5.6.3.1).

Neben den Monomeren (+)-Catechin, (-)-Gallocatechin und dem (+)-Catechin-

Glucopyranosid konnte in Gerste das dimere Flavonoid Procyanidin B3 (m/z 576,5 - 577,5)

sowie das entsprechende Acetat-Addukt bei einer Retentionszeit Rt = 27,47 min detektiert

werden (s. Abbildung 35). Weiterhin wurden drei Peaks bei den Retentionszeiten Rt = 13,77,

Rt = 14,98 und Rt = 21,08 min mit einer Masse von m/z 592,9 gefunden, die Prodelphinidin

B3 entsprechen könnten.

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 4,70E6

Base Peak

m/z 576,5 - 577,5

NL: 5,12E6

Base Peak

m/z 592,5 - 593,5

NL: 3,13E5

Base Peak

m/z 608,5 - 609,5

12,58 111,98

14,98

13,77

27,47

2,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

21,08

8,31

2,30

109,32

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 4,70E6

Base Peak

m/z 576,5 - 577,5

NL: 5,12E6

Base Peak

m/z 592,5 - 593,5

NL: 3,13E5

Base Peak

m/z 608,5 - 609,5

12,58 111,98

14,98

13,77

27,47

2,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

21,08

8,31

2,30

109,32

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 4,70E6

Base Peak

m/z 576,5 - 577,5

NL: 5,12E6

Base Peak

m/z 592,5 - 593,5

NL: 3,13E5

Base Peak

m/z 608,5 - 609,5

12,58 111,98

14,98

13,77

27,47

2,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

21,08

8,31

2,30

109,32

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 4,70E6

Base Peak

m/z 576,5 - 577,5

NL: 5,12E6

Base Peak

m/z 592,5 - 593,5

NL: 3,13E5

Base Peak

m/z 608,5 - 609,5

12,58 111,98

14,98

13,77

27,47

2,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

21,08

8,31

2,30

109,32

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

21,08

8,31

2,30

109,32

Abbildung 35: Precursor-Ion-Scan-Experimente eines Gerstenextraktes:

a)-c) MS-Chromatogramme dimerer Flavonoide (m/z 577, 593 und 609)

(ESI, negative-Mode)

Anhand der hier durchgeführten Precursor-Ion-Scan-Untersuchungen konnte jedoch nicht

festgestellt werden, bei welchem Peak es sich um das bereits in der Literatur [185] be-

schriebene Prodelphinidin B3 mit der Monomeren-Sequenz GC-C handelt, ob zusätzlich das

Dimer mit der umgekehrten Monomeren-Sequenz vorliegt, oder ob hierbei Bruchstücke einer

5 Ergebnisse und Diskussion 80

höhermolekularen Verbindung detektiert wurden. Um Aussagen darüber treffen zu können,

waren weitere MS/MS-Untersuchungen erforderlich (s. Kapitel 5.6.3.2). Ein Signal bei einer

Retentionszeit von 8,31 min mit einer Masse m/z 609,1 deutete auf ein ausschließlich aus

Gallocatechin-Einheiten aufgebautes Dimer hin, was allerdings ebenfalls durch weitere Un-

tersuchungen bestätigt werden musste.

In Abbildung 36 sind die vier MS-Chromatogramme der trimeren Flavonoide Procyanidin C2

(m/z 864,5 - 865,5), der beiden Prodelphinidin Trimere 1a und 1b (m/z 880,5 - 881,5), die

jeweils aus einer Gallocatechin- und zwei Catechin-Einheiten aufgebaut sind, sowie Pro-

delphinidin C2 (m/z 896,5 - 897,5) dargestellt. Zudem konnten, wie auch bei den aus den

Monomeren Gallocatechin und Catechin aufgebauten Dimeren, weitere bisher nicht in der

Literatur beschriebene Precursor-Ionen [M-H]- mit der Masse m/z 881,0 (Rt = 29,05 min) und

m/z 897,0 (Rt = 20,89 min) detektiert werden. Die Frage, ob es sich hierbei um Prodelphini-

dine, die eine bisher noch nicht beschriebene Verknüpfung der Monomeren aufweisen, oder

um Fragmente höhermolekularer Verbindungen handeln könnte, war mit Precursor-Ion-

Scan-Experimenten nicht zu lösen. Eine eindeutige Zuordnung der erhaltenen Signale zu

den jeweiligen Verbindungen war erst durch weitere Kollisionsexperimente möglich (s. Kapi-

tel 5.6.3.3).

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

32,04

27,78

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,13E6

Base Peak

m/z 880,5 - 881,5

NL: 1,35E5

Base Peak

m/z 896,5 - 897,5

NL: 7,99E4

Base Peak

m/z 912,5 - 913,5

16,80

11,76

19,42

17,86

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

20,89

7,69

13,77 124,64

NL: 8,17E5

Base Peak

m/z 864,5 - 865,5

100

29,05

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

32,04

27,78

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,13E6

Base Peak

m/z 880,5 - 881,5

NL: 1,35E5

Base Peak

m/z 896,5 - 897,5

NL: 7,99E4

Base Peak

m/z 912,5 - 913,5

16,80

11,76

19,42

17,86

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

20,89

7,69

13,77 124,64

NL: 8,17E5

Base Peak

m/z 864,5 - 865,5

100

29,05

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

32,04

27,78

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,13E6

Base Peak

m/z 880,5 - 881,5

NL: 1,35E5

Base Peak

m/z 896,5 - 897,5

NL: 7,99E4

Base Peak

m/z 912,5 - 913,5

16,80

11,76

19,42

17,86

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

20,89

7,69

13,77 124,64

NL: 8,17E5

Base Peak

m/z 864,5 - 865,5

100

29,05

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

32,04

27,78

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,13E6

Base Peak

m/z 880,5 - 881,5

NL: 1,35E5

Base Peak

m/z 896,5 - 897,5

NL: 7,99E4

Base Peak

m/z 912,5 - 913,5

16,80

11,76

19,42

17,86

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

20,89

7,69

13,77 124,64

NL: 8,17E5

Base Peak

m/z 864,5 - 865,5

100

29,05

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

20,89

7,69

13,77 124,64

NL: 8,17E5

Base Peak

m/z 864,5 - 865,5

100

29,05

Abbildung 36: Precursor-Ion-Scan-Experimente eines Gerstenextraktes:

a)-d) MS-Chromatogramme trimerer Flavonoide (m/z 865, 881, 897 und

913) (ESI, negative-Mode)

5 Ergebnisse und Diskussion 81

Neben diesen trimeren Verbindungen wurde bei einer Retentionszeit von 7,69 min ein Signal

mit m/z 912,9 detektiert. Vermutlich handelt es sich hierbei um ein bisher nur von BRANDON

et al. [175] isoliertes Trimer, welches ausschließlich aus Gallocatechin-Einheiten aufgebaut

ist. Obwohl die Existenz dieser Verbindung noch nicht durch andere Arbeitsgruppen bestä-

tigt wurde, steht die vergleichsweise niedrige Retentionszeit von 7,69 min mit der im Ver-

gleich zu den anderen trimeren Flavonoiden höheren Polarität in Einklang. Zur Bestätigung

der Existenz dieser Verbindung im Gerstenextrakt wurden aber noch weiterführende Kollisi-

onsexperimente durchgeführt (s. Kapitel 5.6.3.3).

Darüber hinaus detektierten WHITTLE et al. [181] mittels Electrospray-LC-MS (positive-

Mode) in Gerste neben den dimeren und trimeren Proanthocyanidinen Precursor-Ionen

[M+H]+, die tetrameren und pentameren Verbindungen entsprechen, jedoch nur in sehr un-

tergeordneter Menge vorkommen. Eine Identifizierung anhand von Fragmentierungsexperi-

menten führte die Arbeitsgruppe allerdings nicht durch. GUYOT et al. [301] zeigten bei ihren

Untersuchungen über Proanthocyanidine aus Äpfeln mit ESI-LC-MS, dass die höhermoleku-

laren Proanthocyanidine sowohl als einfach, aber auch als doppelt oder dreifach geladene

Spezies vorliegen können. HAMMERSTONE et al. [294] konnten 1999 diese Beobachtung

mittels APCI-LC-MS anhand von Schokoladenproben bestätigen. In Tabelle 15 sind die

Molmassen der einfach, doppelt und dreifach geladenen Precursor-Ionen der möglicherwei-

se in Gerstenextrakt vorliegenden tetra- bis hexameren Proanthocyanidine aufgelistet.

Tabelle 15: Bruttoformel, Molmasse und erwartete Massen der Precursor-Ionen [M-H] -,

[M-2H]2- und [M-3H]3- der tetrameren bis hexameren Proanthocyanidine

Verbindung

(Monomeren-Sequenz)

Brutto-

formel

Molmasse

[g/mol]

Precursor-

Ion [M-H]-

[m/z]

Precursor-

Ion [M-2H]2-

[m/z]

Precursor-

Ion [M-3H]3-

[m/z]

C-C-C-C C60H50O24 1154,27 1153,26 576,13 383,75

GC-C-C-C C60H50O25 1170,26 1169,26 584,12 389,08

GC-GC-C-C C60H50O26 1186,26 1185,25 592,12 394,41

GC-GC-GC-C C60H50O27 1202,25 1201,25 600,12 399,74

GC-GC-GC-GC C60H50O28 1218,25 1217,24 609,12 405,08

C-C-C-C-C C75H62O30 1442,33 1441,32 720,16 479,77

GC-C-C-C-C C75H62O31 1458,33 1457,32 728,16 485,10

GC-GC-C-C-C C75H62O32 1474,32 1473,31 736,15 490,43

GC-GC-GC-C-C C75H62O33 1490,32 1489,31 744,15 495,77

GC-GC-GC-GC-C C75H62O34 1506,31 1505,30 752,15 501,10

GC-GC-GC-GC-GC C75H62O35 1522,31 1521,30 760,15 506,43

C-C-C-C-C-C C90H74O36 1730,40 1729,39 864,19 575,79

GC-C-C-C-C-C C90H74O37 1746,39 1745,38 872,19 581,12

GC-GC-C-C-C-C C90H74O38 1762,39 1761,38 880,19 586,45

GC-GC-GC-C-C-C C90H74O39 1778,38 1777,37 888,18 591,79

GC-GC-GC-GC-C-C C90H74O40 1794,38 1793,37 896,18 597,12

GC-GC-GC-GC-GC-C C90H74O41 1810,37 1809,36 904,18 602,45

GC-GC-GC-GC-GC-GC C90H74O42 1826,37 1825,36 912,18 607,79

5 Ergebnisse und Diskussion 82

Bei den durchgeführten Untersuchungen konnten in Gerste die Precursor-Ionen [M-H]- aller

fünf möglichen tetrameren Verbindungen nachgewiesen werden. In Abbildung 37 sind die

erhaltenen MS-Chromatogramme dargestellt. Abweichend von den in der Literatur beschrie-

benen MS-Untersuchungen mit Proanthocyanidinen aus Äpfeln oder Schokolade [294, 301]

konnten die doppelt geladenen Spezies ([M-2H]2-) dieser Verbindungen nur schwach und die

dreifach geladenen Precursor-Ionen ([M-3H]3-) gar nicht gefunden werden. Für die weiteren

höhermolekularen Proanthocyanidine wurden, aufgrund der kleinen Konzentration in Gerste,

nur Signale sehr geringer Intensität bei Retentionszeiten um 90 - 100 min erhalten. Es erga-

ben sich auch hier keine Hinweise auf doppelt oder dreifach geladene Spezies.

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

34,52

32,58

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 5,01E5

Base Peak

m/z 1168,5 - 1169,5

NL: 9,15E5

Base Peak

m/z 1184,5 - 1185,5

NL: 9,00E5

Base Peak

m/z 1200,5 - 1201,5

35,52

15,91

27,90

23,52

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

18,04

11,28

NL: 2,55E5

Base Peak

m/z 1152,5 - 1153,5

100

46,45

100

rel. Abundance

NL: 8,98E4

Base Peak

m/z 1216,5 - 1217,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

9,37

110,47

38,51

57,64

64,56 70,60

62,36 68,41

38,96 55,41 66,48

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

34,52

32,58

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 5,01E5

Base Peak

m/z 1168,5 - 1169,5

NL: 9,15E5

Base Peak

m/z 1184,5 - 1185,5

NL: 9,00E5

Base Peak

m/z 1200,5 - 1201,5

35,52

15,91

27,90

23,52

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

18,04

11,28

NL: 2,55E5

Base Peak

m/z 1152,5 - 1153,5

100

46,45

100

rel. Abundance

NL: 8,98E4

Base Peak

m/z 1216,5 - 1217,5

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160

Retentionszeit [min]

9,37

110,47

38,51

57,64

64,56 70,60

62,36 68,41

38,96 55,41 66,48

Abbildung 37: Precursor-Ion-Scan-Experimente eines Gerstenextraktes:

a)-e) MS-Chromatogramme tetramerer Flavonoide (m/z 1153, 1169, 1185,

1201 und 1217) (ESI, negative-Mode)

5 Ergebnisse und Diskussion 83

Bei dem Retentionsverhalten der di-, tri- und tetrameren Flavonoide ließen sich zwei Trends

beobachten. Innerhalb einer Gruppe mit gleicher Anzahl an Monomeren-Bausteinen verrin-

gerte sich die Retentionszeit mit steigender Zahl an Gallocatechin-Einheiten aufgrund zu-

nehmender Polarität der Verbindungen. So ist das aus drei Catechin-Einheiten aufgebaute

Procyanidin C2 (Rt = 32,04 min) durch die geringere Anzahl an Hydroxylgruppen unpolarer

gegenüber den Trimeren mit einer (z. B. GC-C-C, Rt = 17,86 min), zwei (z. B. GC-GC-C,

Rt = 11,76 min) bzw. drei Gallocatechin-Einheiten (GC-GC-GC, Rt = 7,69 min), und eluierte

deshalb später als diese von der Säule (s. Abbildung 36).

Neben der Polarität hat aber auch scheinbar die Molekülgeometrie der Flavonoide einen

Einfluss auf das Retentionsverhalten. Das Monomer (+)-Catechin wies eine Retentionszeit

von 34 min, das aus zwei Catechin-Einheiten aufgebaute Procyanidin B3 eine Retentionszeit

von 27 min auf, wohingegen bei dem Trimer Procyanidin C2 wieder ein Anstieg der Retenti-

onszeit auf 32 min beobachtet und das aus vier Catechin-Einheiten aufgebaute Tetramer

schließlich bei einer Retentionszeit von 38 min detektiert wurde. Der Trend, dass es bei zu-

nehmender Anzahl von Monomeren zuerst zu einer Verringerung und dann zu einem An-

stieg der Retentionszeit kam, konnte auch für die ausschließlich aus Gallocatechin-Einheiten

aufgebauten Flavonoide beobachtet werden. Fundierte Aussagen bezüglich der strukturellen

Wechselwirkung zwischen den Flavonoid-Molekülen und stationärer sowie mobiler Phase

sind aber nur in Verbindung mit rechnerischen Methoden (Molecular Modeling) oder experi-

mentellen Methoden wie Röntgenstrukturanalyse oder HR-MAS-Suspensions-NMR-

Spektroskopie [305] möglich.

Im MS-Chromatogramm m/z 1152,5 - 1153,5 konnten neben dem Signal bei der Retentions-

zeit von 38 min noch weitere beobachtet werden, welche u. a. mit der Retentionszeit des

Trimeren C-C-C (Rt = 32 min) übereinstimmen. Die Detektion von Ionen, deren Masse

Tetrameren entsprechen, aber eine für Trimere typische Retentionszeit zeigten, war ein

möglicher weiterer Hinweis darauf, dass es bei Ionisierung oder im Massenanalysator unter

Umständen zu Spaltungen der Interflavonoid-Bindung aber auch zu Rekombination einzel-

ner Fragmente kommen kann.

In Abbildung 37 wurden für die aus unterschiedlichen Monomeren aufgebauten Tetrameren,

wie auch bei den Trimeren, erneut mehrere Signale bei den einzelnen MS-

Chromatogrammen beobachtet. Beispielsweise fanden sich im MS-Chromatogramm m/z

1168,5 - 1169,5 neben einem Signal hoher Intensität bei der Retentionszeiten Rt = 23,52 min

auch Signale geringerer Intensität bei 27,90 min, 46,45 min, 62,36 min und 68,41 min. Dabei

könnte es sich unter Umständen um Artefakte handeln, die bei der Probenvorbereitung ent-

stehen. Wahrscheinlicher ist jedoch, dass es sich hierbei um Precursor-Ionen von Verbin-

dungen handelt, die zwar die gleiche Masse (m/z) des Precursor-Ions aufweisen, sich aber

in der Sequenz der Monomeren-Bausteine unterscheiden.

5 Ergebnisse und Diskussion 84

5.6.3 Identifizierung einzelner Gersteninhaltsstoffe mittels MSn-

Untersuchungen

5.6.3.1 Monomere Flavonoide

Zur Identifizierung der monomeren Flavonoide im Gerstenextrakt wurden Kollisionsexperi-

mente durchgeführt. Bei der stoßinduzierten Fragmentierung des Precursor-Ions mit m/z

289,2 ([M-H]-, (+)-Catechin) mit einer Kollisionsenergie von 40 % konnten hauptsächlich die

schon aus den Voruntersuchungen bekannten Product-Ionen m/z 245,3 und m/z 205,3, so-

wie die aus erneuter Fragmentierung resultierenden Product-Ionen (s. Kapitel 5.6.1, Tabelle

13) detektiert und der gefundene Peak bei Rt = 34,12 min somit als (+)-Catechin identifiziert

werden.

Die Kollisionsexperimente des Precursor-Ions bei Rt = 12,52 min im MS-Chromatogramm

m/z 304,5 - 305,5 (s. Abbildung 34d) führten zu identischen Product-Ionen wie bei den Vor-

untersuchungen mit der (-)-Gallocatechin-Standard-Lösung (s. Tabelle 13). Somit konnte die

Existenz beider Monomere durch die Kollisionsexperimente abgesichert werden.

Bei der Untersuchung des Signals bei einer Retentionszeit von 20,53 min, das vermutlich

von dem aus (+)-Catechin und Glucose aufgebauten (+)-Catechin-Glucopyranosid ([M-H]-,

m/z 451,0) resultiert, wurden bei einer Stoßenergie von 30 % als Product-Ionen Signale mit

m/z 289,0 ([Catechin-H]-) sowie m/z 160,9 ([Glucose-H]-) erhalten (s. Abbildung 38). Die

Identifizierung des Product-Ions m/z 289,0 als Catechin konnte durch MS3-Experimente bes-

tätigt werden. Die weitere Fragmentierung des Ions mit m/z 160,9 führte zu nicht charakteris-

tischen Product-Ionen. Basierend auf den von FRIEDRICH [183] durchgeführten FAB-MS-

Untersuchungen kann es demnach als sicher angesehen werden, dass das (+)-Catechin-

Glucopyranosid, welches ursprünglich ausschließlich in Buchweizen [306] und in Rhabarber-

Arten [307] gefunden wurde, ebenfalls in Gerste vorkommt.

Abbildung 38: LC-ESI-Massenspektrum (Product-Ion-Scan) eines Gerstenextraktes nach

stoßinduzierter Fragmentierung in der Ionenfalle: Identifizierung des

(+)-Catechin-Glucopyranosids (m/z 451,0; Kollisionsenergie: 30 %)

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

m/z

100

rel. Abundance

289,0

298,7 451,0

160,9

120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500

m/z

100

rel. Abundance

289,0

298,7 451,0

160,9

(+)-Catechin-

Glucopyranosid

ESI-Full ms2 451,00@30,00

RT: 20,13 - 20,67

NL: 3,71E4

CH2OH

1''

3''

4''

5 Ergebnisse und Diskussion 85

5.6.3.2 Dimere Flavonoide

Analog der Untersuchungen für die monomeren Flavonoide wurden zur Identifizierung der

dimeren Flavonoide ebenfalls Fragmentierungsexperimente durchgeführt. Bei der nachfol-

genden Interpretation der massenspektrometrischen Daten ist aber zu berücksichtigen, dass

Diastereomere massenspektrometrisch nicht unterschieden werden können, was auch

schon die unter Kapitel 5.6.1 durchgeführten Untersuchungen mit Standard-Substanzen ge-

zeigt haben.

In Tabelle 16 sind die jeweils sechs intensivsten Product-Ionen des MS2-Experimentes (fett

markiert) der Precursor-Ionen Procyanidin B3 ([M-H]- mit m/z 576,9) und Prodelphinidin Di-

mer mit m/z 609,1, sowie die daraus resultierenden im MS3-Experiment ermittelten Fragmen-

te aufgeführt. Eine detaillierte Übersicht über die Fragmentierung mit den jeweils abgespal-

tenen Massen findet sich im Anhang A.12, Tabelle A.9 und A.13.

Tabelle 16: Ergebnisse der MS3-Experimente von Procyanidin B3 und dem Prodelphini-

din Dimer GC-GC (Auflistung der Product-Ionen in absteigender Intensitäts-

reihenfolge)

Precursor-Ion [m/z] Product-Ion [M-H]- [m/z]

Procyanidin B3; Sequenz (MT→

→→

→MB): C-C; Rt: 27,47 min (s. Abbildung 35 a)

MS2-Experiment:

[M-H]- 576,9 424,9/ 407,1/ 451,0/ 559,0/ 286,9/ 289,0/ 532,9

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 559,0 541,0/ 289,0/ 406,9/ 286,9

[M-C6H6O3-H]- 451,0 433,0/ 409,0/ 286,9

[(BT/CT-Produkt)-H]- 424,9 299,0/ 283,0/ 285,0/ 255,0/ 407,0/ 243,0/ 333,0/ 269,9

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 407,0

285,0/ 281,1/ 297,0/ 389,1/ 339,0/ 255,1/ 243,0/ 363,0/

321,1/ 176,0

[MB-H]- 289,0 245,1

[MT-3H]- 286,9 243,1/ 269,2/ 259,0

Prodelphinidin Dimer; Sequenz (MT→

→→

→MB): GC-GC; Rt: 8,31 min (s. Abbildung 35 c)

MS2-Experiment:

[M-H]- 609,1 423,0/ 440,9/ 483,0/ 305,0/ 591,0/ 303,0/ 272,9/ 521,8

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 591,0 464,9/ 453,1/ 376,9/ 422,9/ 425,1/ 572,5/ 282,9/ 285,1

[M-C6H6O3-H]- 483,0 464,9/ 422,/ 399,1/ 349,0/ 301,0/ 251,0/ 440,9

[(BT/CT-Produkt)-H]- 440,9 423,0/ 397,0/ 273,0

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 423,0 297,0/ 282,9/ 285,1/ 243,0/ 255,1/ 405,1/ 387,1/ 361,0

[MB-H]- 305,0 179,0/ 221,0/ 261,0/ 247,0/ 287,0/ 218,9/ 176,9/ 125,1

[MT-3H]- 303,0 259,1/ 244,9/ 177,1/ 284,9/ 218,9/ 217,1

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente

5 Ergebnisse und Diskussion 86

Die wichtigste Fragmentierungsreaktion für die Identifizierung der dimeren Proanthocyanidi-

ne ist die Abspaltung des B-Ringes zusammen mit Teilen des C-Ringes der oberen Mono-

meren-Einheit MT (s. Abbildung 39), die zum Product-Ion m/z 424,9 (MT = Catechin) oder

m/z 440,9 (MT = Gallocatechin) führt. Die daraus nach Wasserabspaltung resultierenden

Product-Ionen weisen häufig hohe Intensitäten auf [183].

In Abbildung 39 sind zwei mögliche Fragmentierungswege A und B gegenübergestellt.

FRIEDRICH [303] schlägt eine Retro-Diels-Alder-Reaktion (RDA-Reaktion) als Mechanismus

vor (Weg A). Hierbei definiert er die Position der im Precursor-Ion durch Abspaltung eines

Protons erzeugten negativen Ladung nicht (A1). Eine Alternative zu diesem Ansatz stellt der

Fragmentierungsmechanismus B dar. Ausgehend von einer Deprotonierung der Hydro-

xylgruppe an C-5 der unteren Monomeren-Einheit MB (B1) kommt es zu einem Bruch des

C-Ringes, gefolgt von der Abspaltung des Fragmentes mit m/z 152. Das Produkt B2 ist

mesomeriestabilisiert, so dass die Struktur dieser Verbindung so dargestellt werden kann,

dass die negative Ladung in der ursprünglichen Position lokalisiert bleibt.

In der Literatur besteht Uneinigkeit darüber, ob die beschriebene Abspaltung in der oberen

oder in der unteren Monomeren-Einheit MB stattfindet. STEVENS et al. [308] postulierten

1997 basierend auf LC-MS/MS von Proanthocyanidinen mit APCI (positive-Mode), dass die

Abspaltung bevorzugt in der unteren MB-Einheit stattfindet. Dieses hatten 1987 schon MEL-

LON et al. [291] aufgrund ihrer mit TSP-MS-Spektrometrie im negativen Mode erhaltenen

Fragmenten behauptet. Die Daten beider Autoren basieren jedoch auf der Spaltung des Di-

mers Procyanidin B3. Bei diesem aus identischen Monomeren-Bausteinen aufgebauten Di-

meren kann aufgrund der erhaltenen Product-Ionen aber keine Aussage darüber getroffen

werden, ob die Abspaltung des B-Ringes zusammen mit Teilen des C-Ringes in der oberen

oder unteren Einheit eintritt, da sich unabhängig vom Ort der Spaltung keine unterschiedli-

chen Massen der Fragment-Ionen ergeben. Eine Bestätigung der Lokalisierung der negati-

ven Ladung an der Hydroxylgruppe C-5 der unteren Einheit MB, gefolgt von der Abspaltung

in der oberen Monomeren-Einheit MT sollten die im folgenden beschriebenen Fragmentie-

rungsuntersuchungen an Dimeren mit den Precursor-Ionen [M-H]- m/z 592,9 geben.

In dem MS-Chromatogramm m/z 592,5 - 593,5 konnten drei Signale bei den Retentionszei-

ten 13,77, 14,98 und 21,08 min erfasst werden (s. Kapitel 5.6.2, Abbildung 35b). In Tabelle

17 sind die Ergebnisse aus den MS3-Experimenten mit den Precursor-Ionen m/z 592,9 bei

Rt = 13,77 und 14,98 min dargestellt (ausführliche MS-Daten s. Anhang A.12, Tabelle A.10

und A.11). Mit den intensivsten Product-Ionen der MS2-Experimente (in Tabelle 17 fett mar-

kiert) wurden MS3-Fragmentierungsexperimente durchgeführt. Der Peak mit Rt = 13,77 min

wurde durch den Vergleich mit publizierten Daten [303] als Dimer Prodelphinidin B3, aufge-

baut aus den Monomeren-Bausteinen mit der Sequenz GC-C, identifiziert. Die charakteristi-

sche Abspaltung des B-Ringes zusammen mit Teilen des C-Ringes erfolgt ausschließlich in

der oberen MT-Einheit. Ein identisches Fragmentierungsverhalten, Deprotonierung in der

Basiseinheit mit nachfolgender Abspaltung aus der oberen Einheit, zeigte die bei einer

Retentionszeit von 14,98 min detektierte Verbindung; diese konnte somit als Dimer mit der

Sequenz C-GC identifiziert werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 87

HO R

-H

HO R

-H

RDA-Reaktion B

-H

HO R

BT/CT-Abspaltungsprodukt

m/z 152

HO R

m/z 152

Abbildung 39: Mögliche Fragmentierungsreaktionen dimerer Proanthocyanidine zur

Abspaltung des B-Ringes und Teilen des C-Ringes der oberen Monomeren-

Einheit MT (ESI, negative-Mode) (R = H oder OH)

5 Ergebnisse und Diskussion 88

Das im MS-Chromatogramm gefundene Signal bei Rt = 21,08 min war einem Molekülion mit

der Sequenz GC-C zuzuordnen. Dieses Dimer könnte aus einem Interflavonoid-Bindungs-

bruch eines höhermolekularen Proanthocyanidins (Tri- oder Tetramer) resultieren oder das

Dimer ist aus den Diastereomeren (-)-Epicatechin und (-)-Epigallocatechin aufgebaut. Für

die Existenz einer solchen Verbindung fanden sich in der Literatur aber keine Hinweise.

Tabelle 17: Ergebnisse der MS3-Experimente von Prodelphinidin B3 und dem Prodelphi-

nidin Dimer C-GC (Auflistung der Product-Ionen in absteigender Intensitäts-

reihenfolge)

Precursor-Ion [m/z] Product-Ion [M-H]- [m/z]

Prodelphinidin B3; Sequenz (MT→

→→

→MB): GC-C; Rt: 13,77 min (s. Abbildung 35 b)

MS2-Experiment:

[M-H]- 592,9 424,9/ 467,0/ 407,0/ 289,0/ 302,9/ 575,0/ 440,9

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 575,0

437,1/ 449,0/ 407,3/ 424,9/ 476,0/ 287,0/ 394,9

[M-C6H6O3-H]- 467,0

289,0/ 314,8/ 287,1/ 449,3/ 245,2/ 205,0/ 177,0/ 423,2

[(BT/CT-Produkt)-H]- 424,9

299,0/ 283,0/ 285,0/ 255,0/ 407,0/ 243,0/ 333,0/ 269,9

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 407,0

285,0/ 281,1/ 297,0/ 389,1/ 339,0/ 255,1/ 243,0/ 363,0/

321,1/ 176,0

[MT-3H]- 302,9

177,0/ 259,0/ 125,0/ 285,3/ 219,1/ 191,0

[MB-H]- 289,0

245,1/ 205,0/ 178,9/ 203,2

Prodelphinidin Dimer; Sequenz (MT→

→→

→MB): C-GC; Rt: 14,98 min (s. Abbildung 35 b)

MS2-Experiment:

[M-H]- 592,9 423,0/ 440,9/ 467,0/ 305,0/ 575,0/ 424,9/ 407,1/ 287,0

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 575,0

453,0/ 305,0/ 449,1/ 437,1/ 423,0/ 465,1/ 327,2/ 475,9/

283,0/ 177,0

[M-C6H6O3-H]- 467,0

304,9/ 289,0/ 448,8/ 423,1/ 260,8/ 245,2/ 179,0/ 205,0

[(BT/CT-Produkt)-H]- 440,9

423,0/ 397,0/ 273,0

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 423,0

297,0/ 282,9/ 285,1/ 243,0/ 255,1/ 405,1/ 387,1/ 361,0

[MB-H]- 305,0

179,0/ 261,1/ 220,9/ 287,0

[MT-3H]- 287,0

243,1

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente

Die begründete Annahme, dass die Fragmentierungsreaktion nicht in der unteren Einheit MB

der Dimeren stattfindet und dass sie bei den monomeren Flavonoiden gar nicht zu beobach-

ten war, deutet auf eine Beteiligung der unteren Einheit und somit auf den in Abbildung 39

postulierten Reaktionsweg B hin. Eine weitere Bestätigung dieses Fragmentierungsmecha-

nismus wurde durch die Kollisionsexperimente der trimeren Verbindungen (s. Kapitel

5.6.3.3) erhalten.

5 Ergebnisse und Diskussion 89

Neben dieser für die Identifizierung der Monomeren-Sequenz wichtigen Fragmentierungsre-

aktion wurde bei allen vier detektierten Dimeren Fragmente auch beobachtet, die aus einem

möglichen Bruch der Interflavonoid-Bindung stammen könnten. In der Literatur besteht aber

keine einheitliche Meinung über die Struktur dieser Fragmente. Während KARCHESY et al.

[288] im FAB-MS-System keine Zuordnung der gefundenen Product-Ionen treffen, zeigen

KIEHNE et al. [292] mit TSP (positive-Mode), dass bei der Spaltung der Interflavonoid-

Bindung einfach positiv geladene Product-Ionen [MT/B+H]+ sowohl der oberen als auch der

unteren Monomeren-Einheit entstehen.

Die hier durchgeführten Untersuchungen der dimeren Flavonoide führten zu den Product-

Ionen [MT-3H]- und [MB-H]-, wahrscheinlich aus einer direkten Spaltung des jeweiligen Pre-

cursor-Ions in 4→8-Richtung. Ein möglicher Mechanismus, ausgehend von einer Deproto-

nierung der Hydroxylgruppe an C-5 der oberen Monomeren-Einheit MT, ist in Abbildung 40

als C’ gekennzeichnet. Die resultierenden Product-Ionen wiesen allerdings nur eine geringe

Intensität auf, können aber als Hinweis auf die angenommene Monomeren-Abfolge gewertet

werden.

Neben der direkten Spaltung des Precursor-Ions kann die Bildung der Fragmente [MT-3H]- -

abgesehen von dem Dimer GC-GC - alternativ auch als Folgefragment des unspezifischen

Product-Ions [M-C6H6O3-H]- gedeutet werden. Das Product-Ion [M-C6H6O3-H]- entsteht durch

die Abspaltung eines Phloroglucin-Fragmentes der Masse 126, welche nur aus der oberen

Monomeren-Einheit MT ohne Interflavonoid-Bindungsbruch erfolgen kann. In Abbildung 40

(Weg A’) ist der hierfür von FRIEDRICH [183] postulierte Mechanismus dargestellt.

FRIEDRICH [183] postuliert keine definierte Position der Ladung im Molekül, sondern geht

von einer Übertragung eines Protons und somit einer - im negativen Mode eher unwahr-

scheinlichen - Ladungstrennung aus (A1’). Daraus werden nach der Phloroglucin-Abspaltung

zwei im Gleichgewicht stehende Product-Ionen (A2’ und das Abspaltungs-Produkt) erhalten.

Eine andere mögliche mechanistische Erklärung ist in Abbildung 40 (Weg B’) aufgezeigt.

Die Deprotonierung findet hier wieder an der Hydroxylgruppe an C-5 der unteren Monome-

ren-Einheit MB statt (B1’). Über eine instabile chinoide Zwischenstufe (B2’) erfolgt im nächs-

ten Schritt die Abspaltung des Phloroglucins und das Product-Ion, welches allerdings ein

freies nicht-bindendes Elektronenpaar aufweist, wird erhalten. Durch die Übertragung eines

Protons innerhalb des Moleküls entstehen die Abspaltungs-Produkte analog zu FRIEDRICHS

[183] Mechanismus. Da die Untersuchung aber im negativen Mode durchgeführt wurde, ist

eine solche Reaktion eher unwahrscheinlich.

Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Sequenzermittlung der Dimeren primär

über die charakteristische ermittelte Masse (m/z) des Product-Ions [(BT/CT-Abspaltungs-

Produkt)-H]-, über die m/z-Daten der Fragmente der direkten Interflavonoid-

Bindungsspaltung ([MT-3H]- und [MB-H]-), sowie über die auf die Phloroglucin-Abspaltung

folgenden Product-Ionen [M-C6H6O3-H]- ermöglicht wird.

5 Ergebnisse und Diskussion 90

HO R

[MT-3H]-

-H

HO R

[MB-H]-

HO R

[M-C6H6O3-H]-

Phloroglucin-

Abspaltungs-Produkt

8B B

-H

HO R

A' B' C'

A1'

B2'

C1'

B1'

A2'

-H

Abbildung 40: Phloroglucin-Abspaltung (A-Ring) der oberen Monomeren-Einheit MT (Weg

A’ und B’) [183] und Interflavonoid-Spaltung dimerer Proanthocyanidine

(Weg C’) (ESI, negative-Mode; R = H oder OH)

5 Ergebnisse und Diskussion 91

5.6.3.3 Trimere Flavonoide

Eine ausführliche Übersicht über die zur Sequenzermittlung der trimeren Verbindungen

durchgeführten Kollisionsexperimente und die hierbei ermittelten Product-Ionen ist im An-

hang A.12, Tabelle A. 14 bis A.18 dargestellt. In Tabelle 18 sind die aus den MS2- und MS3-

Experimenten erhaltenen Product-Ionen der beiden Precursor-Ionen mit m/z 864,5 und m/z

912,9, den ausschließlich aus identischen Monomeren aufgebauten Trimeren, aufgelistet. In

Tabelle 19 sind die Fragmente der im MS-Chromatogramm m/z 880,5 - 881,5 erhaltenen

beiden größten Peaks (Rt = 17,86 und 19,42 min), und in Tabelle 20 die Fragmente des Sig-

nals bei Rt = 11,76 min des Precursor-Ions mit m/z 897,0 zusammengestellt. Mit den fett

markierten Product-Ionen der MS2-Experimente wurden MS3-Fragmentierungsexperimente

durchgeführt.

Tabelle 18: Ergebnisse der MS3-Experimente von Procyanidin C2 und dem Prodelphini-

din Trimer GC-GC-GC (Auflistung der Product-Ionen in absteigender Inten-

sitätsreihenfolge)

Precursor-Ion [m/z] Product-Ion [M-H]- [m/z]

Procyanidin C2; Sequenz (MT→

→→

→MM→

→→

→ MB): C-C-C; Rt: 32,04 min (s. Abbildung 36 a)

MS2-Experiment:

[M-H]- 864,9 694,9/ 738,9/ 576,9/ 712,8/ 846,9/ 574,8/

586,9/ 424,9/ 407,0/ 298,8/ 286,9/ 781,0/

677,0/ 618,9/ 542,9/ 532,8/ 767,1

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 846,9 695,0/ 677,3/ 559,1/ 557,0/ 598,6/ 407,0/

787,1/ 764,6/ 726,9/ 289,2

[M-C6H6O3-H]- 738,9 451,1/ 568,9/ 587,0/ 289,2/ 628,4/ 657,0

[(BT/CT-Produkt)-H]- 712,8 694,9/ 614,7/ 561,0/ 406,9/ 289,0/ 653,0/

424,9/ 668,9

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 694,9 542,9/ 451,0/ 677,0/ 404,8/ 289,2/ 525,0/

499,1/ 461,3/ 613,0/ 363,0/ 391,1

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- 586,9 n. b.

[MM-MB-H]- 576,9 424,9/ 407,1/ 451,0/ 289,0/ 559,1

[MT-MM-3H]- 574,8 448,9/ 422,9/ 287,0/ 405,1/ 556,9/ 514,8/

269,1/ 243,1/ 389,1/ 289,1/ 430,8

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H2O-H]- 542,9 525,0/ 391,1/ 285,2

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-3H2O-H]- 532,8 407,0/ 245,1/ 375,1

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- 424,9 407,0

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H2O-H]- 407,0 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

[MT-3H]-; [MM-3H]- 286,9 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

5 Ergebnisse und Diskussion 92

Fortsetzung von Tabelle 18:

Prodelphinidin Trimer; Sequenz (MT→

→→

→MM→

→→

→MB): GC-GC-GC; Rt: 7,69 min

(s. Abbildung 36 d)

MS2-Experiment:

[M-H]- 912,9 726,9/ 786,9/ 895,0/ 744,9/ 608,9/ 558,9/

482,9/ 440,9/ 423,0/ 618,9/ 606,9/ 540,9/

302,9/ 814,9/ 391,0

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 895,0 726,9/ 877,1/ 835,1/ 465,0/ 314,9/ 410,3/

423,1/ 663,1

[M-C6H6O3-H]- 786,9 646,8/ 625,0/ 383,0/ 442,8/ 704,8/ 727,1/

741,7/ 748,7/ 305,0

[(BT/CT-Produkt)-H]- 744,9 727,0/ 662,3/ 685,1/ 644,0/ 477,0/ 465,2

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 726,9 558,9/ 483,1/ 645,1/ 708,9/ 543,1/ 666,7

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- 618,9 n. b.

[MM-MB-H]- 608,9 siehe Dimer GC-GC (s. Tabelle 16)

[MT-MM-3H]- 606,9 546,9/ 524,7/ 571,1/ 357,6/ 303,0/ 589,1/

509,1/ 466,4/ 427,4/ 197,2/ 217,1

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H2O-H]- 558,9 459,1/ 527,0/ 374,8/ 497,6/ 477,6/ 305,0/

386,8/ 525,1/ 516,6/ 415,1/ 392,8

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-2H2O-H]- 540,9 496,8/ 458,9/ 523,1/ 414,9/ 504,9

[M-C6H6O3-(MT-H)-H]- 482,9 465,0/ 305,1/ 357,1/ 422,9

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- 440,9 423,0/ 405,1/ 297,2/ 243,0/ 283,1

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H2O-H]- 423,0 405,1/ 283,1/ 243,0/ 297,2

[MT-3H]-; [MM-3H]- 302,9 siehe Dimer GC-GC (s. Tabelle 16)

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente

Bei allen nachgewiesenen Precursor-Ionen wurde sowohl eine Wasserabspaltung als auch

die unspezifische Abspaltung von Phloroglucin (s. Abbildung 40) beobachtet. Das erste für

die Sequenzermittlung relevante Product-Ion, analog der dimeren Verbindungen, ist die in

Abbildung 39 beschriebene Abspaltung des B-Ringes zusammen mit Teilen des C-Ringes

der oberen Monomeren-Einheit MT zu den Product-Ionen [(BT/CT-Produkt)-H]- bzw. nach

Wassereliminierung zu [(BT/CT-Produkt)-H2O-H]-. Bei den Trimeren mit m/z 864,5 (C-C-C)

und m/z 912,9 (GC-GC-GC) konnte bei den erhaltenen Fragmenten allerdings nicht unter-

schieden werden, ob die Abspaltung auch aus der mittleren Monomeren-Einheit MM erfolgt

ist. Die Masse der erhaltenen Fragmente wäre dann identisch. Unter der Annahme, dass die

Abspaltung in der oberen Einheit erfolgt, konnte bei den Signalen mit m/z 881,0 und m/z

897,0 schon eine erste Zuordnung erfolgen. So deutet das [(BT/CT-Produkt)-H]- mit m/z

712,8 des Precursor-Ions m/z 881,0 bei Rt = 17,86 min auf ein Gallocatechin als obere Mo-

nomeren-Einheit hin. Damit wäre die Sequenz (MT→MM→MB) für dieses Precursor-Ion auf

GC-C-C festgelegt. Bei dem zweiten Peak mit Rt = 19,42 min liegt dann ein Catechin in der

MT-Einheit vor, als Sequenz wäre noch C-GC-C oder C-C-GC möglich. Mit der gleichen Be-

5 Ergebnisse und Diskussion 93

gründung wird dem Trimer mit m/z 897,0 als oberes Monomer ein Gallocatechin zugeordnet,

es wäre dann noch über die Abfolge GC-GC-C oder GC-C-GC zu entscheiden.

Ein bei den Dimeren nicht zu beobachtendes Product-Ion [(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- ent-

steht durch die Abspaltung des B-Ringes und Teilen des C-Ringes der mittleren Monome-

ren-Einheit MM zusammen mit Phloroglucin der oberen Einheit MT. Diese Product-Ionen be-

legen die oben gemachte Annahme der Zuordnung GC-C-C für m/z 881,0 bei

Rt = 17,86 min. Des weiteren handelt es sich bei dem zweiten Peak mit m/z 881,0 bei

Rt = 19,42 min um ein Ion der Sequenz C-GC-C, sowie bei dem Peak mit m/z 897,0 bei

Rt = 11,76 min um GC-GC-C.

Tabelle 19: Ergebnisse der MS3-Experimente von Prodelphinidin Trimer 1a und 1b

(Auflistung der Product-Ionen in absteigender Intensitätsreihenfolge)

Precursor-Ion [m/z] Product-Ion [M-H]- [m/z]

Prodelphinidin Trimer 1a; Sequenz (MT→

→→

→MM→

→→

→MB): GC-C-C; Rt: 17,86 min

(s. Abbildung 36 b)

MS2-Experiment:

[M-H]- 881,0 694,9/ 576,9/ 754,9/ 542,9/ 590,9/ 407,0/

862,8/ 424,9/ 405,9/ 602,9/ 712,8/ 728,8/

465,8/ 363,0/ 289,0/ 303,0/ 286,9

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 862,8 783,3/ 773,1/ 753,2/ 710,7/ 558,8/ 516,6/

694,7/ 273,1

[M-C6H6O3-H]- 754,9 576,9/ 736,9/ 464,9/ 602,8/ 423,0/ 286,8/

284,5/ 711,4

[(BM/CM-Produkt)-H]-, gering 728,8 711,0

[(BT/CT-Produkt)-H]- 712,8 694,9/ 651,1/ 652,7/ 561,0/ 318,7/ 380,9/

408,9/ 517,2

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 694,9 542,9/ 451,1/ 677,0/ 390,9/ 289,1/ 243,0/

525,0/ 363,1/ 404,8/ 659,0

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- 602,9 n. b.

[MT-MM-3H]- 590,9 529,0/ 464,9/ 422,9/ 412,9/ 547,8/ 302,9/

325,0

[MM-MB-H]- 576,9 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H2O-H]- 542,9 siehe Trimer C-C-C (s. Tabelle 18)

[M-(MB-H)-C6H6O3-H]- 465,8 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- 424,9 407,0

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H2O-H]- 407,0 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

[(BT/CT-Produkt) )-(MB-H)-H2O-H]- 405,9 n. b.

[MT-3H]- 303,0 siehe Dimer GC-GC (s. Tabelle 16)

[MB-H]- 289,0 siehe Monomer C (s. Tabelle 13)

[MM-3H]- 286,9 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

5 Ergebnisse und Diskussion 94

Fortsetzung von Tabelle 19:

Prodelphinidin Trimer 1b; Sequenz (MT→

→→

→MM→

→→

→MB):C-GC-C; Rt: 19,42 min

(s. Abbildung 36 b)

MS2-Experiment:

[M-H]- 881,0 710,9/ 754,9/ 592,9/ 591,5/ 542,9/ 586,9/

694,9/ 424,9/ 407,0/ 728,8/ 525,0/ 561,1/

466,9/ 862,9/ 289,0/ 286,9/ 302,8/ 394,9

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 862,9 694,7/ 407,2/ 395,1/ 725,0/ 574,8/ 542,8/

524,9/ 535,2/ 814,7/ 764,7/ 676,7

[M-C6H6O3-H]- 754,9 586,8/ 593,3/ 736,9/ 569,0/ 289,0/ 407,1/

425,0/ 302,9/ 694,3/ 477,1/ 466,9/ 464,8

[(BT/CT-Produkt)-H]- 728,8 710,9/ 668,7/ 542,9/ 646,9/ 585,5/ 289,0/

560,8/ 464,4

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 710,9 692,7/ 542,8/ 525,0/ 467,2/ 289,0/ 667,1/

585,0

[(BM/CM-Produkt)-H2O-H]-, gering 694,9 543,0/ 568,9/ 677,1

[MM-MB-H]- 592,9 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[MT-MM-3H]- 591,5 529,0/ 464,9/ 422,9/ 412,9/ 548,2/ 394,9

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- 586,9 n. b.

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H]- 561,1 542,6/ 517,9/ 246,4/ 271,0/ 525,0/ 408,9/

457,1/ 390,9/ 506,9/ 402,7/ 405,1/ 280,7/

481,9

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H2O-H]- 542,9 siehe Trimer C-C-C (s. Tabelle 18)

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-2H2O-H]- 525,0 siehe Trimer C-C-C (s. Tabelle 18)

[M-(MB-H)-C6H6O3-H]- 466,9 siehe Dimer C-GC (s. Tabelle 17)

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- 424,9 407,0

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H2O-H]- 407,0 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

[MM-3H]- 302,8 siehe Dimer GC-GC (s. Tabelle 16)

[MB-H]- 289,0 siehe Monomer C (s. Tabelle 13)

[MT-3H]- 286,9 siehe Dimer C-C (s. Tabelle 16)

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente

Um die getroffene Zuordnung zu verifizieren, wurden im folgenden die allerdings nur in ge-

ringer Intensität detektierten Fragmente des Bruches der verschiedenen Interflavonoid-

Bindungen herangezogen. Abgesehen von den Fragmenten [MB-H]-, die bei den Kollisions-

experimenten mit den Precursor-Ionen mit m/z 864,9 und m/z 912,9 erst nach Phloroglucin-

Abspaltung erhalten wurden, erfolgten alle Spaltungen wie bei den Dimeren direkt aus den

unfragmentierten Ionen und, wie in Abbildung 40 dargestellt, in 4→8-Richtung. Damit konnte

die getroffene Zuordnung bestätigt werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 95

Tabelle 20: Ergebnisse der MS3-Experimente von Prodelphinidin C2 (Auflistung der

Product-Ionen in absteigender Intensitätsreihenfolge)

Precursor-Ion [m/z] Product-Ion [M-H]- [m/z]

Prodelphinidin C2; Sequenz (MT→

→→

→MM→

→→

→MB): GC-GC-C; Rt: 11,76 min (s. Abbildung 36 c)

MS2-Experiment:

[M-H]- 897,0 710,9/ 543,0/ 592,9/ 770,9/ 728,9/ 407,1/

424,9/ 467,0/ 878,9/ 835,1/ 391,0/ 289,0/

302,9/ 602,9/ 853,1/ 633,0/ 606,9

MS3-Experimente:

[M-H2O-H]- 878,9 861,1/ 541,0/ 410,7/ 407,3/ 693,2/ 711,1/

288,8/ 589,1/ 718,4/ 284,8

[M-C6H6O3-H]- 770,9 n. b.

[(BT/CT-Produkt)-H]- 728,9 710,9/ 542,9/ 407,0/ 646,8/ 561,8/ 424,8/

390,9/ 288,9/ 315,0/ 524,9/ 585,1/ 602,4/

281,1/ 667,4/ 466,8

[(BT/CT-Produkt)-H2O-H]- 710,9 542,9/ 525,0/ 288,8/ 407,2/ 420,8/ 693,1/

667,1/ 558,7/ 467,1/ 243,0/ 484,6/ 315,0/

302,5

[MT-MM-3H]- 606,9 481,1/ 428,9/ 420,5/ 302,8/ 297,1/ 362,8/

378,9/ 578,1

[(BM/CM-Produkt)-C6H6O3-H]- 602,9 n. b.

[MM-MB-H]- 592,9 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[(BT/CT und BM/CM-Produkt)-H2O-H]- 543,0 525,0/ 391,2/ 461,0/ 305,1/ 289,1/ 456,8/

315,0

[M-C6H6O3-(MT-H)-H]- 467,0 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- 424,9 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H2O-H]- 407,1 siehe Dimer GC-C (s. Tabelle 17)

[MT-3H]-; [MM-3H]- 302,9 siehe Dimer GC-GC (s. Tabelle 16)

[MB-H]- 289,0 siehe Monomer C (s. Tabelle 13)

fett: Product-Ionen MS2-Experiment, eingesetzt als Precursor-Ionen MS3-Experimente

Neben diesen Product-Ionen konnten für alle Precursor-Ionen auch weitere relevante Frag-

mente detektiert und strukturell zugeordnet werden, die aus einer Abspaltung des B-Ringes

und Teilen des C-Ringes der mittleren Monomeren-Einheit oder der mittleren und oberen

Einheiten zusammen mit anderen Molekülresten wie z. B. [(BM/CM-Produkt)-(MT-H)-H]- resul-

tieren. Eine BB/CB-Abspaltung in der unteren Einheit konnte nicht zweifelsfrei ausgeschlos-

sen werden. Die bei den MS3-Experimenten erhaltenen Fragment-Massen stimmen aber mit

denen der Dimeren überein und das Product-Ionen-Muster der Precursor-Ionen untereinan-

der ist ähnlich, so dass diese Fragmentierung nicht wahrscheinlich ist. Dies belegt noch

einmal den unter Kapitel 5.6.3.2 beschriebenen und in Abbildung 39 dargestellten Fragmen-

tierungsweg B, der eine Interflavonoid-Bindung (4→8) für die Spaltung voraussetzt.

5 Ergebnisse und Diskussion 96

Im MS-Chromatogramm mit m/z 880,5 - 881,5 (s. Kapitel 5.6.2, Abbildung 36b) wurden, ab-

gesehen von den bereits diskutierten Signalen, zusätzliche Peaks geringer Intensität bei

Rt = 24,13 min und 29,05 min beobachtet. Basierend auf der oben beschriebenen

Vorgehensweise der Identifizierung relevanter Product-Ionen zur Sequenzermittlung des

Moleküls wiesen die bei Kollisionsexperimenten mit diesen Verbindungen erhaltenen

Fragmente auf die Monomeren-Abfolge GC-C-C hin. Ob es sich hierbei um Bruchstücke

höhermolekularer Verbindungen handelte oder um ein aus den Monomeren (-)-Epicatechin

bzw. (-)-Epigallocatechin aufgebautes Trimer, konnte nicht entschieden werden. Das gleiche

trifft auf den Peak im MS-Chromatogramm mit m/z 896,5 - 897,5 (s. Kapitel 5.6.2, Abbildung

36c) bei einer Retentionszeit von 20,89 min zu. Das Precursor-Ion zerfiel nach dem für eine

Monomeren-Abfolge GC-GC-C typischen Fragmentierungsmuster (s. Tabelle 20).

5.6.3.4 Tetramere Flavonoide

Zur Identifizierung der tetrameren Proanthocyanidine waren im zeitlichen Rahmen dieser

Arbeit nur MS2-Experimente der Signale mit der größten Intensität (s. Kapitel 5.6.2,

Abbildung 37) möglich. Es konnten daher für die aus unterschiedlichen Monomeren-

Einheiten aufgebauten Verbindungen (m/z 1169,3, m/z 1185,4 und m/z 1201,1) nur erste

vorläufige Struktur-Zuordnungen getroffen werden. In Tabelle 21 wird eine Übersicht über

einige ausgewählte Product-Ionen der tetrameren Proanthocyanidine gegeben.

Die Tetrameren C-C-C-C (m/z 1153,1) und GC-GC-GC-GC (m/z 1217,0) zeigten das schon

für die entsprechenden Trimere beschriebene, typische Fragmentierungsverhalten. Die aus-

schließlich aus Gallocatechin-Einheiten aufgebaute Verbindung liegt, wie auch schon die

entsprechende trimere Verbindung, nur in sehr geringer Konzentration in Gerste vor.

Tabelle 21: Ergebnisse der MS2-Experimente ausgewählter tetramerer Proanthocyanidine

Precursor-Ion [M-H]- [m/z] (s. Abbildung 37)

Product-Ionen

[m/z]

1153,1

Rt: 38,51

min

1169,3

Rt: 23,52

min

1169,3

Rt: 27,90

min

1184,5

Rt: 15,91

min

1184,5

Rt: 18,04

min

1201,3

Rt: 11,28

min

1217,0

Rt: 9,37

min

[M-H2O-H]+ 1135,1 1151,2 1151,2 1167,1 1167,1 1183,2 1199,0

[M-C6H6O3-H]- 1027,1 1043,3 1043,2 1059,3 1059,2 1075,1 1091,3

[(BT/CT-

Produkte)-H]- 1001,1 1001,1/

1017,3

1001,1/

1017,2 1017,2 1017,2 1033,2 1049,1

[(BT/CT-Pro-

dukte)-H2O-H]- 983,3 983,2/

999,3

983,2/

999,2 999,3 999,2 1015,3 1031,0

[MM1-MM2-MB-H]- 865,2 865,2/

881,3

865,2/

881,3 881,2 881,2 897,2 913,2

[MT-MM-3H]- 573,5 n. d. n. d. 606,1 606,1 606,3 606,1

[MT-3H]- 287,3 n. d. n. d. 303,3 303,3 303,1 303,0

[MB-H]- 289,1 n. d. n. d. 305,3 305,0 289,1 305,3

5 Ergebnisse und Diskussion 97

Das für das tetramere Prodelphinidin mit m/z 1201,3 detektierte Product-Ion [(BT/CT-

Produkt)-H2O-H]- deutet auf ein Gallocatechin als obere Monomeren-Einheit MT hin. Die

Fragmente aus dem Interflavonoid-Bindungsbruch zeigten ein Catechin als Basis-Einheit. Da

die Intensität der Ionen aus der Spaltung der C-C-Bindungen im Molekül, wie bei den Dime-

ren bereits beobachtet, sehr gering war und die Gesamtzahl der bei den Kollisionsexperi-

menten erhaltenen Fragmente sehr groß war, kann die Struktur GC-GC-GC-C nur vermutet

werden. Das gleiche gilt für die vier weiteren tetrameren Verbindungen. Die unter Kapitel

5.6.3.3 beschriebenen, für die Sequenzermittlung relevanten Product-Ionen konnten eben-

falls nur in einer sehr geringen Intensität erhalten werden. So kann bei beiden Precursor-

Ionen mit m/z 1184,5 eine Abspaltung des B-Ringes und Teilen des C-Ringes der oberen

Monomeren-Einheit angenommen werden, die auf Gallocatechin als MT-Einheit hinweist.

Zusätzlich zu den in Tabelle 21 aufgeführten Product-Ionen [MB-H]- mit m/z 305,0 wurden

auch Signale mit m/z 289,0 gefunden. Abgesehen von Gallocatechin als oberer Monomeren-

Einheit war also keine weitere Strukturzuordnung möglich. Ähnliches galt auch für die Pre-

cursor-Ionen mit m/z 1169,3. Neben der Abspaltung des Fragmentes 168 g/mol, welches

dem Product-Ion [(BT/CT-Produkt)-H]-, resultierend aus einem Tetramer mit einer Gallocate-

chin-Einheit als oberes Monomer, entspricht, wurden auch Signale gefunden, die für ein Ca-

techin sprechen. Signale der Product-Ionen der Interflavonoid-Bindungsspaltung konnten in

den erhaltenen MS-Spektren nicht detektiert werden.

Zusammenfassend zeigten die Untersuchungen, dass in Gerste neben den beschriebenen

monomeren, dimeren und trimeren auch tetramere Verbindungen vorliegen. Eine weitere

Bestätigung der Struktur durch MS3-Kollisionsexperimente steht noch aus.

5.6.4 Zusammenfassung der LC-MS-Identifizierungsergebnisse:

Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2

Ziel der massenspektrometrischen Untersuchungen war die Identifizierung einiger in Gerste

enthaltener Flavonoide. In Tabelle 22 ist eine Zusammenstellung der ermittelten UV- und

MS-Daten aufgeführt, in Abbildung 41 ist ein Ausschnitt des UV-Chromatogrammes mit ei-

ner Zuordnung der identifizierten Verbindungen dargestellt.

Zur Identifizierung wurden Fragmentierungsuntersuchungen mit den vier Monomeren

(+)-Catechin, (-)-Epicatechin, (-)-Gallocatechin sowie (-)-Epigallocatechin in Standard-

Lösungen durchgeführt. Anhand des hieraus ermittelten Fragmentierungsverhaltens konnten

dann ausschließlich (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin in Gerste nachgewiesen werden.

Weiterhin konnte auch die Existenz eines bisher nur von FRIEDRICH [183] beschriebenen

(+)-Catechin-Glucopyranosids bestätigt werden. Die Identifizierung höhermolekularer Flavo-

noide erfolgte im ersten Schritt über Precursor-Ion-Scan-Experimente (MS-Chromato-

gramme). Zur Aufklärung der Monomeren-Sequenz der einzelnen Verbindungen wurden

nachfolgend MS3-Untersuchungen durchgeführt. Die schematische Vorgehensweise zur

Identifizierung der di-, tri- und tetrameren Verbindungen ist in Abbildung 42 dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 98

Tabelle 22: Zusammenstellung der mit LC-DAD-MS/MS ermittelten Daten

Retentionszeit

DAD-Detektion

[min]

UV-

Maximum

[nm]

Precursor-

Ion [M-H]-

[m/z]

zugeordnete Verbindung

2,41 228; 285 401,3 / 563,1 n. b.

2,67 223; 272 236,9 / 266,8 n. b.

3,47 237; 267 188,9 / 221,0 n. b.

4,00 232 175,1 / 230,9 n. b.

4,67 220; 275 202,8 / 221,0 n. b.

6,13 223; 283 221,0 / 241,0 n. b.

6,72 224; 307 156,9 / 195,0 n. b.

7,69 (Rt in MS) 223; 285 912,9 Prodelphinidin Trimer 2a (GC-GC-GC)

8,31 (Rt in MS) 223; 270 609,1 Prodelphinidin Dimer (GC-GC)

9,37 (Rt in MS) 230; 285 1217,0 Prodelphinidin Tetramer (GC-GC-GC-GC)

10,92 223; 284 216,9 / 684,7 n. b.

11,28 (Rt in MS) 223; 278 1201,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-GG-GC-C)#

11,76 223; 276 897,0 Prodelphinidin C2 (GC-GC-C)

12,52 220; 272 304,9 / 610,9 (-)-Gallocatechin

13,77 223; 276 592,9 Prodelphinidin B3 (GC-C)

14,98 219; 276 592,9 Prodelphinidin Dimer (C-GC)

15,91 (Rt in MS) 223; 276 1184,5 Prodelphinidin Tetramer (GC-GC-C-C)#

16,57 220; 284 97,3 n. b.

17,86 (Rt in MS) 223; 278 881,0 Prodelphinidin Trimer 1a (GC-C-C)

18,04 (Rt in MS) 220; 276 1184,5 Prodelphinidin Tetramer (GC-GC-C-C)#

19,42 (Rt in MS) 223; 278 881,0 Prodelphinidin Trimer 1b (C-GC-C)

20,13 (Rt in MS) 220; 276 451,0 (+)-Catechin-Glucopyranosid

20,89 (Rt in MS) 223; 276 897,0 Bruchstück (GC-GC-C)

21,08 (Rt in MS) 223; 276 592,9 Bruchstück (GC-C)

23,52 (Rt in MS) 224; 277 1169,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-C-C-C)#

27,45 223; 278 567,9 Procyanidin B3 (C-C)

27,90 (Rt in MS) 223; 278 1169,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-C-C-C)#

29,05 (Rt in MS) 224; 279 881,0 Bruchstück (GC-C-C)

32,04 219; 279 864,9 Procyanidin C2 (C-C-C)

34,12 219; 278 289,2 / 348,5 (+)-Catechin

35,52 (Rt in MS) 223; 285 1201,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-GG-GC-C)#

38,51 (Rt in MS) 219; 275 1153,1 Procyanidin Tetramer (C-C-C-C)

38,96 (Rt in MS) 220; 276 1184,5 Prodelphinidin Tetramer (GC-GC-C-C)#

46,45 (Rt in MS) 219; 275 1169,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-C-C-C)#

62,36 (Rt in MS) 219; 275 1169,3 Prodelphinidin Tetramer (GC-C-C-C)#

66,48 (Rt in MS) 223; 285 1184,5 Prodelphinidin Tetramer (GC-GC-C-C)#

# Monomeren-Sequenz nicht geklärt

5 Ergebnisse und Diskussion 99

Abbildung 41: Ausschnitt eines DAD-Chromatogrammes (

= 280 nm) mit Zuordnung der

identifizierten Flavonoide, Gradient E2

Neben den bereits literaturbekannten Dimeren Procyanidin B3 (C-C) und Prodelphinidin B3

(GC-C) konnte ein bisher nur von FRIEDRICH [183] in Malz detektiertes, aus zwei Gallocate-

chin-Einheiten aufgebautes Dimer auch in Gerste nachgewiesen werden. Durch die hierzu

erforderliche Aufklärung des für alle Dimeren typischen Fragmentierungsmusters bzw. die

Identifizierung relevanter Product-Ionen gelang auch der Nachweis des dimeren Prodelphi-

nidins mit der Sequenz C-GC sowie einer weiteren Spezies [M-H]- mit der Masse m/z 592,9

noch ungeklärter Struktur.

Im Anschluss erfolgte die Sequenzermittlung der in den MS-Chromatogrammen der trimeren

Verbindungen detektierten Peaks. Die ausführlichen MS3-Untersuchungen bestätigten die

für die Dimeren postulierten Fragmentierungsreaktionen. Durch die Zuordnung weiterer für

die Trimeren typischen Product-Ionen konnte erstmals eine systematische Vorgehensweise

zur Identifizierung der Monomeren-Abfolge erarbeitet werden. Es zeigte sich, dass zusätzlich

zu den bisher in Gerste vermuteten Trimeren Procyanidin C2 (C-C-C), den Prodelphinidin-

Trimeren GC-C-C und C-GC-C, sowie dem Prodelphinidin C2 (GC-GC-C) weitere Signale

mit derselben Sequenz identifiziert wurden. Hierbei könnte es sich sowohl um Teilfragmente

aus höhermolekularen Verbindungen handeln, die aus einem möglichen Bruch der Interfla-

vonoid-Bindungen resultieren, als auch unter Umständen um Spezies, die aus einer Rekom-

bination einzelner Fragmente resultieren.

6,7

(a) Prodelphinidin Trimer 2a (e) Prodelphinidin Dimer (C-GC)

(b) Prodelphinidin Dimer (f) Prodelphinidin Tetramer

(GC-GC-GC-GC) (g) (+)-Catechin-Glucopyranosid

(d) (-)-Gallocatechin (h) Prodelphinidin Tetramer/Bruchstücke

Prodelphinidin B3

Intensität [mAu]

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Retentionszeit [min]

2,67

3,47

4,00

4,7

6,1

(a)

(b)

(c)

Prodelphinidin

Tetramer

Prodel

hinidin

(d)

Procyanidin B3

Prodelphinidin

Tetramer

Procyanidin

Tetramer

(+)-Catechin

Procyanidin C2

(e)

(f)

Prodelphinidin

Trimer 1a Prodelphinidin

Trimer 1b

(g) (h)

5 Ergebnisse und Diskussion 100

Precursor-Ionen-Experimente

⇒Zuordnung Dimere, Trimere, Tetramere

⇒mögliche Monomeren-Bausteine

-Experimente: Dimere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

a) m/z 451 ⇒C-C

b) m/z 483 ⇒GC-GC

c) m/z 467 ⇒GC-C oder C-GC

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

c1) m/z 425 ⇒GC-C

c2) m/z 441 ⇒C-GC

3. Bestätigung durch Interflavonoid-Spaltung:

m/z 289 ⇒[M

-H]

⇒C base-unit

m/z 305 ⇒[M

-H]

⇒GC base-unit

m/z 287 ⇒[M

-3H]

⇒C top-unit

m/z 303 ⇒[M

-3H]

⇒GC top-unit

-Experimente: Dimere

⇒Bestätigung der Zuordnung

-Experimente: Trimere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

a) m/z 739 ⇒C-C-C

b) m/z 787 ⇒GC-GC-GC

c) m/z 755 ⇒GC-C-C / C-GC-C / C-C-GC

d) m/z 771 ⇒C-GC-GC / GC-C-GC / GC-GC-C

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

c1) m/z 713 ⇒GC-C-C

c2) m/z 729 ⇒C-GC-C oder C-C-GC

d1) m/z 729 ⇒GC-GC-C oder GC-C-GC

d2) m/z 745 ⇒C-GC-GC

3. Interflavonoid-Spaltung:

m/z 289 ⇒[M

-H]

⇒C base-unit

m/z 305 ⇒[M

-H]

⇒GC base-unit

4. Bestätigung durch weitere Product-Ionen

-Experimente: Trimere

⇒Bestätigung der Zuordnung

-Experimente: Tetramere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

3. Interflavonoid-Spaltung

4. Bestätigung durch weitere Product-Ionen

-Experimente: Tetramere

⇒Bestätigung der Zuordnung

Precursor-Ionen-Experimente

⇒Zuordnung Dimere, Trimere, Tetramere

⇒mögliche Monomeren-Bausteine

-Experimente: Dimere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

a) m/z 451 ⇒C-C

b) m/z 483 ⇒GC-GC

c) m/z 467 ⇒GC-C oder C-GC

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

c1) m/z 425 ⇒GC-C

c2) m/z 441 ⇒C-GC

3. Bestätigung durch Interflavonoid-Spaltung:

m/z 289 ⇒[M

-H]

⇒C base-unit

m/z 305 ⇒[M

-H]

⇒GC base-unit

m/z 287 ⇒[M

-3H]

⇒C top-unit

m/z 303 ⇒[M

-3H]

⇒GC top-unit

-Experimente: Dimere

⇒Bestätigung der Zuordnung

-Experimente: Trimere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

a) m/z 739 ⇒C-C-C

b) m/z 787 ⇒GC-GC-GC

c) m/z 755 ⇒GC-C-C / C-GC-C / C-C-GC

d) m/z 771 ⇒C-GC-GC / GC-C-GC / GC-GC-C

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

c1) m/z 713 ⇒GC-C-C

c2) m/z 729 ⇒C-GC-C oder C-C-GC

d1) m/z 729 ⇒GC-GC-C oder GC-C-GC

d2) m/z 745 ⇒C-GC-GC

3. Interflavonoid-Spaltung:

m/z 289 ⇒[M

-H]

⇒C base-unit

m/z 305 ⇒[M

-H]

⇒GC base-unit

4. Bestätigung durch weitere Product-Ionen

-Experimente: Trimere

⇒Bestätigung der Zuordnung

-Experimente: Tetramere

Vorgehensweise:

1. Phloroglucin-Abspaltung:

Product-Ion: [M-C

-H]

2. Entscheidung oberes Monomer:

Product-Ion: [(B

-Produkt)-H]

3. Interflavonoid-Spaltung

4. Bestätigung durch weitere Product-Ionen

-Experimente: Tetramere

⇒Bestätigung der Zuordnung

Abbildung 42: Systematische Vorgehensweise zur Identifizierung der di-, tri- und

tetrameren Flavonoide in Gerste mit LC-MSn

5 Ergebnisse und Diskussion 101

Die Möglichkeit der Existenz bisher nicht in der Literatur beschriebener Proanthocyanidine,

welche aus den Monomeren (-)-Epicatechin bzw. (-)-Epigallocatechin aufgebaut sind, kann

aber auch nicht ausgeschlossen werden. Weiterhin wurde ein bisher nur von BRANDON et

al. [175] als Gersteninhaltsstoff erwähntes Trimer der Monomerenfolge GC-GC-GC identifi-

ziert, obwohl es nur in sehr geringer Konzentration in Gerste vorliegt.

Eine ebenfalls, unter quantitativen Aspekten gesehen, untergeordnete Rolle stellen die hö-

hermolekularen Flavonoide in Gerste dar. Hier gelang der Nachweis von tetrameren Verbin-

dungen. Die Zuordnung der bei den Kollisionsexperimenten erhaltenen Product-Ionen führ-

ten zu ersten Ansätzen der Sequenzermittlung der Tetrameren. Hiermit konnte gezeigt wer-

den, dass das entwickelte Vorgehensschema (s. Abbildung 42) auch für höhermolekulare

Verbindungen anwendbar ist.

Zusammenfassend ist festzustellen, dass das Spektrum der in Gerste enthaltenen Flavo-

noide sehr vielfältig ist. Die Problematik in der Identifizierung liegt zum einen darin begrün-

det, dass die Verbindungen in Gerste in den nur sehr geringen Konzentrationen vorliegen,

zum anderen in der strukturellen Ähnlichkeit der Flavonoide, da sie ausschließlich aus den

Monomeren (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin aufgebaut sind. Mit den hier durchgeführten

Untersuchungen mit einer Ionenfalle als Massendetektor im negativen ESI-Mode gelang

erstmals eine umfassende und grundlegende Identifizierung der di- und trimeren wie auch

zum Teil höhermolekularen Flavonoide in Gerste basierend auf einer systematischen Vorge-

hensweise der Zuordnung relevanter Product-Ionen.

5.6.5 Zusammenfassung der LC-MS-Identifizierungsergebnisse:

Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradienten P2

Eine Identifizierung der einzelnen Flavonoide in Gerste, wie unter Kapitel 5.6.2 bei Einsatz

des Gradienten E2 beschrieben, war bei Verwendung von Phosphatpuffer als mobile Phase

nur eingeschränkt durchführbar. Die bei der massenspektrometrischen Detektion erhaltenen

Signale der relevanten Precursor-Ionen wiesen nur eine geringe Intensität auf. In Abbildung

43 sind beispielhaft die MS-Chromatogramme m/z 576,5 - 577,5 ([M-H]-, Procyanidin B3)

und m/z 880,5 - 881,5 ([M-H]-, Prodelphinidin Trimer 1a und 1b) sowie die entsprechenden

Massenspektren der HPLC-Trennung eines Gerstenextraktes mit dem Gradienten P2 (UV-

Chromatogramm s. Abbildung 44) abgebildet.

Die Chromatogramme zeigen im Vergleich zum Einsatz des Essigsäure/Acetonitril-

Gradienten E2 ein wesentlich höheres Grundrauschen. Während mit dem Gradienten E2 die

Bildung von Acetat-Addukten ([M+Acetat]-) zu beobachten war, kam es bei Verwendung des

Gradienten P2 zur Anlagerung von Phosphat. Neben dem einfachen Phosphat-Addukt

[M+Phosphat]- mit m/z 674,6 konnten im MS-Spektrum des Procyanidin B3 (Abbildung 43

1b) auch Phosphat-Cluster der Form [M+Natriumphosphat]- mit m/z 696,5 [M+2Natrium-

phosphat]- mit m/z 816,4, [M+3Natriumphosphat]- mit m/z 936,3, sowie [M+4Natrium-

phosphat]- mit m/z 1056,3 detektiert werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 102

Im Gegensatz zum Procyanidin B3 beschränkte sich die Addukt-Bildung bei dem Prodelphi-

nidin Trimer 1a (Abbildung 43 2b) auf das einfache Phosphat-Addukt mit m/z 978,6. Im MS-

Spektrum wurde zusätzlich ein Ion mit m/z 576,6 detektiert, welches aus dem schon bei den

unter Kapitel 5.6.3 durchgeführten Kollisionsexperimenten beobachteten Bruch der Interfla-

vonoid-Bindung der oberen Monomeren-Einheit MT resultiert. Bei diesem Product-Ion han-

delt es sich um das Bruchstück C-C, welches dann erneut der oben beschriebenen Cluster-

Bildung mit Phosphat unterlag.

1a)

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

Retentionszeit [min]

32,48

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,14E5

RT: 31,67-32,90

m/z 100-2000

NL: 1,21E5

Base Peak

m/z 880,5-881,5

NL: 1,01E5

RT: 26,87-27,52

m/z 100-2000

576,8

194,8

1b)

2a)

2b)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

m/z

Retentionszeit [min]

m/z

27,00

NL: 1,76E5

Base Peak

m/z 576,5-577,5

100

674,6696,5816,4

28,16

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

1056,3

936,3

576,6

194,8

696,5816,4

978,6

936,3

880,9

1a)

rel. Abundance

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

Retentionszeit [min]

32,48

100

rel. Abundance

100

rel. Abundance rel. Abundance

100

NL: 1,14E5

RT: 31,67-32,90

m/z 100-2000

NL: 1,21E5

Base Peak

m/z 880,5-881,5

NL: 1,01E5

RT: 26,87-27,52

m/z 100-2000

576,8

194,8

1b)

2a)

2b)

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

m/z

Retentionszeit [min]

m/z

27,00

NL: 1,76E5

Base Peak

m/z 576,5-577,5

100

674,6696,5816,4

28,16

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

1056,3

936,3

576,6

194,8

696,5816,4

978,6

936,3

880,9

Abbildung 43: Precursor-Ion-Scan-Experimente eines Gerstenextraktes:

1a), 2a) MS-Chromatogramme (m/z 577 und 881)

1b), 2b) zugehörige LC-ESI-Massenspektren (ESI, negative-Mode)

Zur Identifizierung der einzelnen Analyten wurden MS2-Experimente durchgeführt. Aufgrund

der geringen Signalintensität wurde auf MS3-Untersuchungen verzichtet. Das Fragmentie-

rungsverhalten der Precursor-Ionen ist identisch mit dem bereits bei Verwendung des Gra-

dienten E2 beschriebenen. Aufgrund der geringen Empfindlichkeit unter Einsatz des Phos-

phatpuffers sowie ihrer geringen Konzentration in Gerste, konnten nur zwei tetramere Flavo-

noide detektiert werden. In Abbildung 44 ist ein Ausschnitt des DAD-Chromatogrammes mit

den identifizierten Analyten dargestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 103

Zusammenfassend beurteilt ist ein Phosphatpuffer-Gradient für den Routine-Einsatz in der

Massenspektrometrie nicht geeignet. Aufgrund seiner schlechten Verdampfbarkeit kam es

zu Ablagerungen in der Ionenquelle und auch in der Detektionseinheit. Neben einem erhöh-

ten Reinigungsaufwand zog dies ein hohes Grundrauschen nach sich, welches in einer ge-

ringen Signalintensität der Precursor-Ionen resultierte. Zusätzlich erschwerte das hohe Maß

an Cluster-Bildung die Identifizierung der Analyten, da ein hoch komplexes Spektrum an

Product-Ionen im MS-Spektrum entstand. Trotz dieser Schwierigkeiten gelang die Identifizie-

rung der di- und trimeren Flavonoide in Gerste. Damit wurde erstmals die Möglichkeit eröff-

net, die Detektion und Quantifizierung der in Gerste enthaltenen Flavonoide mittels DAD und

dem aufgrund seiner wie unter Kapitel 5.3.2.1 beschriebenen für die Chromatographie gut

geeigneten Phosphatpuffer als mobile Phase durchzuführen.

Abbildung 44: Ausschnitt eines DAD-Chromatogrammes (

= 280 nm) mit Zuordnung der

identifizierten Flavonoide, Gradient P2

5.7 Bestimmung von Flavonoiden in Realproben

Im ersten Teil der Arbeit wurde ein HPLC-DAD-Verfahren zur quantitativen Bestimmung von

Flavonoiden in Gerste entwickelt und validiert, sowie eine Identifizierung von Proanthocyani-

dinen mittels LC-DAD-MS/MS erreicht. Dieses DAD-Verfahren sollte dann zur Untersuchung

des Flavonoid-Gehaltes in verschiedenen Braugerstensorten eingesetzt werden.

0 5 10 15 20 25 30 35 40 45

Retentionszeit [min]

1300

1200

1100

1000

900

800

700

600

500

400

300

200

100

Procyanidin B3

Prodelphinidin

Dimer (GC-GC)

Prodelphinidin B3

(c)

Procyanidin C2

23,2

32,2

25,0

34,9

17,8

(b)

21,8

27,0

Prodelphinidin

Trimer 1a

28,2

(+)-Catechin

(a)

Procyanidin

Tetramer

(d)

(a) Prodelphinidin Trimer (GC-GC-GC)

(b) Prodelphinidin C2

(d) Prodelphinidin Trimer 1b

Intensität [mAU]

5 Ergebnisse und Diskussion 104

Die in der Braugerste enthaltenen Flavonoide spielen beim Bierbrauprozess eine wichtige

Rolle (s. Kapitel 4.2), für den Bierbrauer, aber auch für den Verbrauer ist die Verfolgung des

Flavonoid-Gehaltes während des Brauprozesses und die Bestimmung im Endprodukt Bier

von großem Interesse. Daher sollte, über die Analyse von Braugersten hinaus, an einer ex-

emplarisch durchgeführten Untersuchung der Flavonoid-Fluss in verschiedenen Braupro-

zessstufen verfolgt werden.

Hierzu war in einem ersten Schritt die Übertragung der für Gerste entwickelte Methode der

Probenvorbereitung (s. Kapitel 5.4, Abbildung 21) auf die verschiedenen Zwischenprodukte

des Brauprozesses und des Endproduktes Bier erforderlich. Die analytische Bestimmung

sollte mit der LC-DAD-MS/MS-Gerätekombination durchgeführt werden. Dies eröffnete die

Möglichkeit einer Online-Identifizierung der einzelnen Substanzen, da nicht ausgeschlossen

werden konnte, dass es bei der analytischen Bestimmung der Brauprozessproben durch

Matrixeinflüsse zu Retentionszeit-Verschiebungen der Analyten-Peaks im Vergleich zu den

Gerstenextrakt-Chromatogrammen kommt.

5.7.1 Bestimmung von Flavonoiden in Sommergersten mittels

HPLC-DAD

Es wurden die Flavonoid-Gehalte in den drei Braugerstensorten „Annabell“, „Henni“ und

„Viskosa“ bestimmt. Hierzu wurden die Proben, wie in Kapitel 5.4, Abbildung 21 schematisch

dargestellt, aufgearbeitet und mit dem HPLC-DAD-System analysiert. Da abgesehen von

den monomeren Flavonoiden keine Referenzsubstanzen kommerziell erhältlich waren, er-

folgte die Quantifizierung der Proanthocyanidine indirekt über die für (+)-Catechin ermittelte

Kalibriergerade (s. Kapitel 5.5.2.1), wie auch bereits in der Literatur [183] beschrieben. Diese

Bestimmung basiert auf der Tatsache, dass sich die Proanthocyanidine nur durch Anzahl

und Sequenz der Monomeren-Bausteine (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin (s. Kapitel 3.1.2,

Abbildung 3) unterscheiden, und somit ihre UV-Spektren sehr ähnlich der Monomeren sind.

In Tabelle 23 sind die in den Braugersten bestimmten Flavonoid-Gehalte der jeweiligen

Doppelbestimmung aufgeführt.

Die Summe der bestimmten Flavonoid-Gehalte betrug für die Gerstensorte „Annabell“

441 mg/kg. Die für die beiden weiteren Sorten „Henni“ und „Viskosa“ ermittelten Gehalte

lagen mit 607 mg/kg und 729 mg/kg etwas höher. In der Literatur [183, 185, 235] variieren

die Angaben der ermittelten Summenwerte sehr stark, was darin begründet liegt, dass von

den verschiedenen Autoren jeweils eine unterschiedliche Anzahl Analyten in die Berechnung

miteinbezogen wurden. Ein Vergleich der hier für die drei Braugerstensorten gemessenen

Werte mit bereits publizierten Daten ist daher nur bezogen auf den jeweiligen Einzel-

Analyten sinnvoll (s. Kapitel 4.1, Tabelle 3). So lag die für die Gerste „Annabell“ erhaltene

Catechin-Konzentration mit 22,2 mg/kg, für die Gerste „Henni“ mit 42,6 mg/kg und für die

Gerste „Viskosa“ mit 16,0 mg/kg in der Größenordnung der in anderen Gerstensorten be-

schriebenen. Beispielsweise bestimmte BELLMER et al. [184] Catechin-Konzentrationen von

5 Ergebnisse und Diskussion 105

14-64 mg/kg, FRIEDRICH [183] wie auch GOUPY [185] von 25 - 50 mg/kg. Geringere Kon-

zentrationen mit 10-14 mg/kg detektierte MADIGAN et al. [179] 1994 mittels elektro-

chemischer Detektion.

Neben (+)-Catechin als Monomer, welches nahezu in allen bisher durchgeführten Untersu-

chungen in Gerste detektiert wurde, wiesen einige Autoren [181, 184, 185] auch (-)-Epicate-

chin, wenn auch nur in einer sehr geringen Konzentration von < 3 mg/kg [184] nach. In den

drei Braugersten konnte die Existenz dieses Monomers allerdings nicht bestätigt werden

(s. Kapitel 5.6.2). Darüber hinaus fanden JENDE-STRID [174], WHITTLE et al. [181] und

BRANDON et al. [175] Hinweise auf das Vorkommen von (-)-Epigallocatechin und (-)-Gallo-

catechin. Letztgenanntes konnte ebenfalls in den untersuchten Sorten „Annabell“, „Henni“

und „Viskosa“ gefunden und quantifiziert werden, die Gehalte von 1 - 2 mg/kg waren aber

deutlich geringer als die für (+)-Catechin. Ebenfalls konnte die von FRIEDRICH [183] publi-

zierte Untersuchung bestätigt werden, der erstmals ein Catechin-Glucopyranosid in Gerste

und Malz isolierte, identifizierte und Gehalte von 6 - 38 mg/kg ermittelte.

Tabelle 23: Flavonoid-Gehalte in verschiedenen Braugerstensorten; HPLC-DAD-

Verfahren (n = 2)

mg/kg Trockenmasse Gerste

Analyt „Annabell“ „Henni“ „Viskosa“

(+)-Catechin 22,20 42,67 16,08

(+)-Catechin-Glucopyranosid 21,26 25,72 38,55

(-)-Gallocatechin 1,11 1,54 1,69

Procyanidin B3 (C-C) 66,47 135,25 189,81

Prodelphinidin B3 (GC-C) 116,14 129,26 150,64

Prodelphinidin Dimer (C-GC) 13,43 8,92 18,79

Prodelphinidin Dimer (GC-GC) 3,22 5,70 2,88

Procyanidin C2 (C-C-C) 52,28 89,64 107,23

Prodelphinidin Trimer 1a (GC-C-C) 39,79 43,44 61,73

Prodelphinidin Trimer 1b (C-GC-C) 24,56 37,00 48,68

Prodelphinidin C2 (GC-GC-C) 77,67 81,32 89,46

Prodelphinidin Trimer 2a (GC-GC-GC) 3,05 7,10 4,27

Summe der Analyt-Gehalte 441,27 607,55 729,82

Als dimere Flavonoide wurden in Gerste bisher hauptsächlich Procyanidin B3 (C-C) und

Prodelphinidin B3 (GC-C) beschrieben [178-180, 183, 185], wobei mit wenigen Ausnahmen

in den meisten Gerstensorten das Prodelphinidin B3 höhere Gehalte aufweist. MADIGAN et

al. [179] ermittelte beispielsweise in verschiedenen Gersten Gehalte an Prodelphinidin B3

von 229 - 234 mg/kg und an Procyanidin B3 von 88 - 142 mg/kg. Dieses Verhältnis konnte

ausschließlich für die Sorte „Annabell“ mit einem im Vergleich zum Procyanidin B3 40 mg/kg

größeren Wert für den Prodelphinidin-Gehalt bestätigt werden.

5 Ergebnisse und Diskussion 106

Neben dem Prodelphinidin B3 wurde im Rahmen dieser Arbeit auch ein Prodelphinidin

Dimer mit der Sequenz C-GC bei einer Retentionszeit von 15 min identifiziert (s. Kapitel

5.6.3.2), welches ebenfalls von FRIEDRICH [183] gefunden, aber nicht quantifiziert wurde.

Die Gehalte für dieses Dimer lagen in den Gersten mit 8,9 - 18,8 mg/L aber wesentlich

niedriger als die des in umgekehrter Sequenz aufgebauten Prodelphinidin B3. Mit Gehalten

zwischen 2,8 - 5,7 mg/kg fanden sich in den untersuchten Sorten das Prodelphinidin Dimer

GC-GC. Vergleichswerte in der Literatur existieren für diese Verbindung aber ebenfalls nicht.

Die nachgewiesenen trimeren Verbindungen liegen tendenziell in geringerer Menge als die

dimeren Verbindungen vor. Bei allen drei Gerstensorten stellten die Verbindungen Procyani-

din C2 (C-C-C) und Prodelphinidin C2 (GC-GC-C) die Hauptvertreter mit Gehalten von 52,2 -

107,2 mg/kg und 77,6 - 89,4 mg/kg dar, was mit Daten aus literaturbekannten Untersuchun-

gen [178, 183, 185] korreliert. Die in Kapitel 5 5.6.2 zusätzlich detektierten Signale in den

MS-Chromatogrammen für die trimeren Verbindungen, welche bei Kollisionsexperimenten

Molekülionen der Sequenz GC-GC-C (Abbildung 36 c) und GC-C-C (Abbildung 36b) zuge-

ordnet werden konnten (s. Kapitel 5.6.3.3), wurden in allen Gerstensorten in geringen Kon-

zentrationen unterhalb der Bestimmungsgrenze aber oberhalb der Nachweisgrenze des Ver-

fahrens detektiert. Das ausschließlich aus Gallocatechin-Einheiten aufgebaute Prodelphini-

din Trimer 2a wurde, entsprechend der Untersuchung von WHITTLE et al. [181], nur in einer

sehr geringen Konzentration zwischen 3,0 und 7,1 mg/L detektiert.

Die Einsetzbarkeit des entwickelten und validierten HPLC-DAD-Verfahrens konnte somit

gezeigt werden. Bereits in der Literatur veröffentlichte Gehalte einzelner Flavonoide stimm-

ten mit den hier erhaltenen Ergebnissen überein. Darüber hinaus gelang erstmalig die Quan-

tifizierung bisher nicht quantifizierte oder noch nicht beschriebener Verbindungen.

5.7.2 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben mittels

LC-DAD-MS/MS

5.7.2.1 Kalibrierung des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens

Zur Bestimmung der Flavonoide in Brauprozessproben mit der LC-DAD-MS/MS-

Gerätekombination war eine vorherige Kalibrierung erforderlich. Neben der Kalibrierung für

die Detektion mit DAD wurde hier auch eine Kalibrierung der MS-Detektion angestrebt, wo-

bei analog zu Kapitel 5.5 vorgegangen wurde.

Wahl des Arbeitsbereiches

Zur Ermittlung des linearen Bereiches für die DAD- sowie die MS-Detektion wurden

(+)-Catechin-Standard-Lösungen (β = 0,0625 mg/L bis 2500 mg/L) in DMF/H2O (2:1; v/v)

hergestellt und jeweils zehnmal chromatographisch vermessen. In Anhang A.13, Tabelle

A.19 sind die erhaltenen Mittelwerte sowie die relative Standardabweichung der Peakflächen

der DAD- und der MS-Detektion bei den verschiedenen Konzentrationen gegenübergestellt.

5 Ergebnisse und Diskussion 107

Die durch lineare Regression erhaltene Geradengleichung für die Detektion mittels DAD

lautet: y = 236550,8 + 26906,5x mit dem Bestimmtheitsmaß von R2 = 0,9997. Somit konnte

für den untersuchten Konzentrationsbereich von einem linearen Zusammenhang zwischen

Detektorsignal und Konzentration ausgegangen werden. Die Nachweisgrenze ergab sich zu

0,125 mg/L, die Bestimmungsgrenze für die DAD-Detektion zu 0,25 mg/L (s. Kapitel 5.5.3.1)

[267, 275, 284]. Die geforderte Analysenpräzision von srel ≤ 3 % [272] ist ab einer

(+)-Catechin-Konzentration von 0,625 mg/L gegeben. Um eine Vergleichbarkeit der beiden

HPLC-DAD-Verfahren (s. Kapitel 5.5.9) bezüglich ihrer Leistungsfähigkeit zu ermöglichen

und gleichzeitig den Anforderungen des praxisorientierten Anwendungszieles, d. h. der

Quantifizierung der Flavonoide in den Brauprozessproben und in Bier zu genügen, wurde als

vorläufige untere Arbeitsbereichsgrenze eine (+)-Catechin-Konzentration von 1,875 mg/L

und als obere Arbeitsbereichsgrenze eine Konzentration von 2500 mg/L gewählt.

Für die Quantifizierung mittels MS-Detektion wurden die Mittelwerte und rel. Standardab-

weichungen der Summe der Peakflächen des (+)-Catechin-Precursor-Ions [M-H]- mit m/z

289,2 und des ebenfalls entstehenden Precursor-Acetat-Addukts [M+Acetat-H]- mit m/z

348,6 herangezogen (s. Anhang A.13, Tabelle A.19). Bei der Ermittlung des linearen Zu-

sammenhanges zwischen Detektorsignal und (+)-Catechin-Konzentration konnte keine Fest-

legung auf eine der beiden Precursor-Ionen erfolgen, da die Bildung des Acetat-Adduktes

nicht ausreichend reproduzierbar war: So lag das Verhältnis der Peakflächen in den MS-

Chromatogrammen m/z 349 und m/z 289 zwischen 0,65 und 0,77. Daher wurde auf eine

Quantifizierung über die Summe der Product-Ionen der beiden Precursor-Ionen verzichtet.

Die Überprüfung des linearen Bereiches über die Summe der Precursor-Ionen ergab eine

Funktion 2. Grades (polynomisch): y = 9809561,7 + 1712779,8x - 297,4x2 mit einem Be-

stimmtheitsmaß von R2 = 0,9998. Für die lineare Regression gilt dagegen R2 = 0,9871. Im

Vergleich zur DAD-Detektion lag die Nachweisgrenze des MS-Verfahrens deutlich niedriger

bei 0,0625 mg/L (+)-Catechin und die Bestimmungsgrenze bei 0,1875 mg/L (+)-Catechin (s.

Kapitel 5.5.3.1). Die berechneten relativen Standardabweichungen der Peakflächen entspra-

chen erst ab β ≥ 2,5 mg/L der geforderten Analysenpräzision von srel ≤ 3 % [272]. Aufgrund

dieser im Vergleich zur DAD-Detektion höheren Grenze des unteren Arbeitsbereiches wurde

auf eine weitere Kalibrierung der MS-Detektion verzichtet. Der Einsatz der MS-Detektion für

die Identifizierung der verschiedenen Flavonoide in den Realproben blieb aber unerlässlich.

Linearität

Zur Ermittlung der Kalibrierfunktion für die Detektion mittels DAD wurden zehn gleich-

mäßig über den gewählten Arbeitsbereich verteilte Konzentrationen an (+)-Catechin-

Standard-Lösungen in DMF/H2O jeweils zehnmal mit der LC-DAD-MS/MS-Geräte-

kombination chromatographisch vermessen (s. Kapitel 5.5.2). Für die in den DAD-Chromato-

grammen erhaltenen Flächen der (+)-Catechin-Peaks wurden die jeweiligen Mittelwerte,

Standardabweichungen und relativen Standardabweichungen berechnet (s. Anhang A.13,

Tabelle A.20) und die einzelnen Messreihen durch Überprüfung mittels des GRUBBS-Testes

(s. Anhang A.2) als frei von Ausreißern bestätigt [267, 272].

5 Ergebnisse und Diskussion 108

Zur rechnerischen Prüfung der Linearität wurde der Anpassungstest nach MANDEL [273,

279] (s. Anhang A.5) durchgeführt. Anschließend wurde die Homogenität der Varianzen, die

Empfindlichkeit und anschließend die Absicherung der unteren Grenze des Arbeitsbereiches

überprüft. In Tabelle 24 sind alle ermittelten Kenngrößen dargestellt. Die berechnete Kalib-

rierfunktion ist linear, der Prüfwert PW liegt mit einem Wert von 0,016 weit unterhalb des

tabellierten F-Wertes von 12,25 [272]. Eine Homogenität der Varianzen wurde nicht erreicht,

ebenso war, wie auch bei dem unter Kapitel 5.5 beschriebenen HPLC-DAD-Verfahren, keine

statistische Absicherung der unteren Grenze des Arbeitsbereiches gegeben. Die relative

Verfahrensstandardabweichung ist mit 1,09 % aber sehr gering und entspricht den in der

Literatur beschriebenen Anforderungen für validierte Analysenverfahren [273]. Das LC-DAD-

MS/MS-Verfahren konnte deshalb zur Identifizierung und Quantifizierung der Flavonoide in

den Realproben eingesetzt werden.

Tabelle 24: Ergebnisse des Anpassungstests nach MANDEL für die Bestimmung von

(+)-Catechin (Kalibrierlösungen

= 1,875 bis 2500 m/L) LC-DAD-MS/MS-

Gerätekombination, Gradient E2

Kalibrierfunktion

1. Grades

y = a + bx

2. Grades

y = a + bx + cx2

Konstante a [µAU⋅

⋅⋅⋅min] 341016,14 322566,95

Konstante b [µAU⋅

⋅⋅⋅min/(mg/L)] 36900,50 26956,37

Konstante c [µAU⋅

⋅⋅⋅min/(mg/L)2] - - 0,023

Reststandardabweichung [µAU⋅

⋅⋅⋅min] 338167,75 361117,75

Prüfwert (PW) 0,016

F(f1 = 1, f2 = N - 3, P = 99 %) 12,25

Homogenität der Varianzen (PW) nicht gegeben

Verfahrensstandardabweichung sxo [mg/L] 12,57

rel. Verfahrensstandardabweichung Vxo [%] 1,09

untere Arbeitsgrenze xp [mg/L] 65,01

5.7.2.2 Bestimmung der Flavonoide in Brauprozessproben

Zur Untersuchung des Flavonoid-Flusses von Malz über verschiedene Brauprozessproben

bis hin zum fertigen Bier wurden Proben aus dem Brauprozess zur Herstellung eines Pilse-

ner Bieres (Warsteiner-Brauerei) entnommen. Die Probenahme erfolgte in verschiedenen

Stufen des Prozesses (dem Maischen, dem Läutern, dem Würzekochen, dem Prozess im

Whirlpool, der Kühlung, der Gärung) und schließlich im Bier selber. Eine Übersicht über

alle entnommenen Brauprozessproben wird in Abbildung 47 gegeben.

Die Untersuchung des Flavonoid-Gehaltes beginnt mit dem zum Brauen eingesetzten Malz.

Eine Bestimmung der für den Brauprozess relevanten Gerstensorten war nicht möglich, da

5 Ergebnisse und Diskussion 109

die Brauerei bereits gemälzte Gerste als Braurohstoff bezog und zudem eine Mischung aus

verschiedenen Malzen zum Brauen einsetzte. Im ersten Schritt des Brauens erfolgt das

Maischen. Der im Maischbottich gefahrene Temperaturverlauf sowie die Zeitpunkte der

Probenahmen sind in Abbildung 45 dargestellt. Im Anschluss wurde die Maische zum Läu-

tern, dem Filtern der Maische, in den sogenannten Läuterbottich gepumpt und drei Proben,

eine der Vorderwürze und zwei der Nachgüsse, gezogen. Die Vorderwürze und die Nach-

güsse wurden dann in der Würzpfanne gesammelt und gekocht. Der Temperaturverlauf des

Würzekochens sowie die Zeitpunkte der Probenahmen sind in Abbildung 46 abgebildet.

60,0

62,5

65,0

67,5

70,0

72,5

75,0

0 20406080100

Zeit [min]

Temperatur [°C]

Maischen AusschubEinmaischen

1. Probenahme 2. Probenahme

60,0

62,5

65,0

67,5

70,0

72,5

75,0

0 20406080100

Zeit [min]

Temperatur [°C]

Maischen AusschubEinmaischen

1. Probenahme 2. Probenahme

Abbildung 45: Temperaturverlauf des Maischens

95,0

97,5

100,0

102,5

105,0

107,5

110,0

020406080

Zeit [min]

Temperatur [°C]

Kocher-

temperatur

Pfannen-

temperatur

1. und 2. Probenahme 3. Probenahme

95,0

97,5

100,0

102,5

105,0

107,5

110,0

020406080

Zeit [min]

Temperatur [°C]

Kocher-

temperatur

Pfannen-

temperatur

1. und 2. Probenahme 3. Probenahme

Abbildung 46: Temperaturverlauf des Würzekochens

5 Ergebnisse und Diskussion 110

Schroten von Malz

Mischen mit Wasser

(Hauptguss und Glattwasser)

Mischen mit Wasser

(Hauptguss und Glattwasser)

93-minütiges Maischen

(Temperaturprogramm)

93-minütiges Maischen

(Temperaturprogramm)

2. Probe „Ende Einmaischen“: nach 16 min

3. Probe „Ende Maischen“: nach 93 min

Abläutern (Filterung) der Maische

(Vorderwürze und Nachguss)

Abläutern (Filterung) der Maische

(Vorderwürze und Nachguss)

4. Probe „Mitte Vorderwürze“: nach 130 hl

5. Probe „Mitte Nachguss“: nach 160 hl

6. Probe „Ende Nachguss“: nach 380 hl

1. Probe „Malz“

62-minütiges Würzekochen

(Temperaturprogramm)

62-minütiges Würzekochen

(Temperaturprogramm)

20-minütiger Prozess

im Whirlpool (Klären der Würze)

20-minütiger Prozess

im Whirlpool (Klären der Würze)

7. Probe „Anfang Kochen“: nach 5 min

8. Probe „Mitte Kochen“: nach 30 min

9. Probe „Ende Kochen“: nach 62 min

10. Probe „Whirlpool Rast Anfang“: nach 5 min

11. Probe „Whirlpool Rast Ende“: nach 20 min

52-minütiges Abkühlen

der Würze auf 12 °C

52-minütiges Abkühlen

der Würze auf 12 °C

12. Probe „Kühlen Anfang“: nach 5 min

13. Probe „Kühlen Mitte“: nach 25 min

14. Probe „Kühlen Ende“: nach 50 min

Zusetzen von Hefe,

6-tägige Gärung

Zusetzen von Hefe,

6-tägige Gärung

15. Probe „Gärung 1. Tag“

16. Probe „Gärung 3. Tag“

17. Probe „Gärung 6. Tag“

Abpumpen des Bieres in Lagertanks

10-stündiges Schlauchen (Klären)

Abpumpen des Bieres in Lagertanks

10-stündiges Schlauchen (Klären) 18. Probe „Schlauchen“: nach 5 Stunden

Filtration des Bieres über Kieselgur,

PVPP und einen Schichtenfilter

Filtration des Bieres über Kieselgur,

PVPP und einen Schichtenfilter

19. Probe „unfiltriertes Bier“: vor Kieselgelfiltration

20. Probe „nach Kieselgurfilter“

21. Probe „nach PVPP“

22. Probe „nach Schichtenfilter“

Flaschenabfüllung,

fertiges Bier

Flaschenabfüllung,

fertiges Bier 23. Probe „abgefülltes Bier“

Schroten von Malz

Mischen mit Wasser

(Hauptguss und Glattwasser)

Mischen mit Wasser

(Hauptguss und Glattwasser)

93-minütiges Maischen

(Temperaturprogramm)

93-minütiges Maischen

(Temperaturprogramm)

2. Probe „Ende Einmaischen“: nach 16 min

3. Probe „Ende Maischen“: nach 93 min

Abläutern (Filterung) der Maische

(Vorderwürze und Nachguss)

Abläutern (Filterung) der Maische

(Vorderwürze und Nachguss)

4. Probe „Mitte Vorderwürze“: nach 130 hl

5. Probe „Mitte Nachguss“: nach 160 hl

6. Probe „Ende Nachguss“: nach 380 hl

1. Probe „Malz“

62-minütiges Würzekochen

(Temperaturprogramm)

62-minütiges Würzekochen

(Temperaturprogramm)

20-minütiger Prozess

im Whirlpool (Klären der Würze)

20-minütiger Prozess

im Whirlpool (Klären der Würze)

7. Probe „Anfang Kochen“: nach 5 min

8. Probe „Mitte Kochen“: nach 30 min

9. Probe „Ende Kochen“: nach 62 min

10. Probe „Whirlpool Rast Anfang“: nach 5 min

11. Probe „Whirlpool Rast Ende“: nach 20 min

52-minütiges Abkühlen

der Würze auf 12 °C

52-minütiges Abkühlen

der Würze auf 12 °C

12. Probe „Kühlen Anfang“: nach 5 min

13. Probe „Kühlen Mitte“: nach 25 min

14. Probe „Kühlen Ende“: nach 50 min

Zusetzen von Hefe,

6-tägige Gärung

Zusetzen von Hefe,

6-tägige Gärung

15. Probe „Gärung 1. Tag“

16. Probe „Gärung 3. Tag“

17. Probe „Gärung 6. Tag“

Abpumpen des Bieres in Lagertanks

10-stündiges Schlauchen (Klären)

Abpumpen des Bieres in Lagertanks

10-stündiges Schlauchen (Klären) 18. Probe „Schlauchen“: nach 5 Stunden

Filtration des Bieres über Kieselgur,

PVPP und einen Schichtenfilter

Filtration des Bieres über Kieselgur,

PVPP und einen Schichtenfilter

19. Probe „unfiltriertes Bier“: vor Kieselgelfiltration

20. Probe „nach Kieselgurfilter“

21. Probe „nach PVPP“

22. Probe „nach Schichtenfilter“

Flaschenabfüllung,

fertiges Bier

Flaschenabfüllung,

fertiges Bier 23. Probe „abgefülltes Bier“

Abbildung 47: Schematischer Überblick über die Probenahme während des Brauprozesses

Nach dem Ausschlagen der Würze erfolgte die Abtrennung der Eiweiß- und Hopfenbestand-

teile im sogenannten Whirlpool. Es wurden während dieses Prozesses zwei Proben ent-

5 Ergebnisse und Diskussion 111

nommen. Vor der anschließenden Gärung wurde das Bier dann einer Kühlung unterworfen

und durch Zugabe von Hefe der Gärprozess gestartet. Während der Hauptgärung erfolgten

drei Probenahmen über sechs Tage hinweg, bis das Bier dann zur weiteren Reifung in La-

gertanks gepumpt wurde, das sogenannte „Schlauchen“. Diese Reifung im Lagertank wurde

nicht mit in die Untersuchung einbezogen. Eine weitere Probe wurde dann von dem gereif-

ten Bier genommen. Um dieses trübe Bier zu Klären, wurden dann verschiedene Filtrations-

schritte durchgeführt. Der Flavonoid-Gehalt wurde im Anschluss an die Kieselgur-Filtration,

die Filtration über PVPP und nach Einsatz eines Schichtenfilters untersucht. Abschließend

erfolgte noch eine Gehaltsbestimmung in dem fertig abgefüllten Bier.

Alle Proben, abgesehen von dem Malz selber und den Proben der Maische, wurden lyophili-

siert und direkt mit der LC-DAD-MS/MS-Gerätekombination analysiert. Da Maische einen

sehr hohen Feststoffanteil aufwies, wurden diese Proben vor der Flavonoid-Bestimmung,

wie unter Kapitel 5.3.1.1 für Gerste beschrieben, aufgearbeitet. In der Tabelle 25 und

Tabelle 26 sind die für die Proben erhaltenen Ergebnisse zusammengefasst. Die Quantifizie-

rung erfolgte indirekt über die für (+)-Catechin bestimmte Kalibriergerade (s. Kapitel 5.7.2.1),

die Identifizierung der Verbindungen mittels MSn-Detektion. Um eine Vergleichbarkeit der

Ergebnisse zu ermöglichen, wurden die Gehalte der Proben der Maische, um die Verdün-

nung durch die Wasserzugabe zu berücksichtigen, auf Malz bezogen. Weiterhin wurden die

Proben des Würzekochens, um die Aufkonzentrierung durch Wasserverluste während des

Kochens zu berücksichtigen, auf eine Stammwürze von 11,6 % bezogen. In Abbildung 48 ist

der Verlauf der Gehalte (Summe der mono-, di- und trimeren Flavonoide) während des Bier-

brauprozesses dargestellt.

Bei der nachfolgenden Interpretation der Flavonoid-Konzentrationen in den Brauprozesspro-

ben ist zu berücksichtigen, dass nur eine einfache Probenahme mit anschließender

Doppelbestimmung erfolgte. Es können also lediglich Trends aufgezeigt werden.

Flavonoid-Gehalt in Malz:

Die in Malz bestimmten Gehalte der Monomeren (+)-Catechin mit 1,60 mg/kg und

(-)-Gallocatechin mit 2,12 mg/kg lagen in der Größenordnung der bereits in der Literatur

beschriebenen Werte [183, 185]. McMURROUGH [309] dagegen erhielt bei seinen Untersu-

chungen 1979 in Malz eine (+)-Catechin-Konzentration von 30 mg/kg, konnte aber kein

(-)-Gallocatechin detektieren. Nur BELLMER et al. [184] konnten in verschiedenen Malzsor-

ten bis zu 36 mg/kg (+)-Catechin nachweisen. Darüber hinaus fanden sie auch das Mono-

mer (-)-Epicatechin, welches nicht in dem untersuchten Malz nachzuweisen war. Die von

mehreren Autoren [154, 184, 233] beschriebene Beobachtung, dass sich beim Mälzen der

Gerste der (+)-Catechin-Gehalt im Durchschnitt um die Hälfte reduziere, während der Gehalt

der Di- und Trimeren konstant bliebe, konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht untersucht wer-

den, da die Rohgersten der zum Brauen eingesetzten Malzmischung nicht zur Verfügung

standen.

5 Ergebnisse und Diskussion 112

Tabelle 25: Flavonoid-Gehalte in den Proben des Maischens, des Läuterns, des Würze-

kochens und im Whirlpool (LC-DAD-MS/MS, Gradient E2) (n = 2)

11. Probe

Rast

Ende

2,93

1,04

u. B.

34,03

4,64

1,34

30,61

0,59

0,62

13,80

n. d.

89,60

Whirlpool

[mg/L]

10. Probe

Rast

Anfang

1,80

0,71

u. B.

24,04

4,99

1,34

30,02

0,51

0,43

20,09

n. d.

83,93

9. Probe

Ende

Kochen

1,92

1,25

2,25

38,82

8,02

1,73

40,43

0,48

0,44

21,93

n. d.

117,27

8. Probe

Mitte

Kochen

1,22

0,93

1,11

24,38

5,77

1,48

20,90

0,21

0,28

16,90

u. B.

73,18

Würzekochen

[mg/L]

7. Probe

Anfang

Kochen

1,21

1,29

1,10

30,55

6,99

1,64

48,36

0,82

0,68

28,14

u. B.

120,78

6. Probe

Ende

Nachguss

0,59

0,41

0,29

2,38

1,99

0,92

4,58

0,49

0,35

1,28

0,13

13,41

5. Probe

Mitte

Nachguss

0,56

0,41

0,85

5,08

3,44

0,93

12,53

0,40

0,26

4,45

0,21

29,12

Läutern

[mg/L]

4. Probe

Mitte

Vorder-

würze

1,26

1,72

1,82

14,56

9,46

1,99

34,28

0,80

0,62

22,11

0,43

89,05

3. Probe

Ende

Maischen

7,02

14,53

11,02

201,42

70,61

15,68

168,12

14,48

10,03

85,33

2,46

600,70

2. Probe

Ende

Einmai-

schen

3,23

17,27

5,65

117,66

78,05

18,81

170,53

14,55

9,16

81,73

2,13

518,77

Maischen

[mg/kg]

1. Probe

Malz

1,60

13,64

2,12

107,55

74,96

5,66

134,20

17,55

9,09

47,44

1,02

414,83

Analyt

(+)-Catechin

(C)

(+)-Catechin-

Glucopyranosid

(-)-Gallocatechin

(GC)

Procyanidin B3

(C-C)

Prodelphinidin B3

(GC-C)

Prodelphinidin

Dimer (GC-GC)

Procyanidin C2

(C-C-C)

Prodelphinidin

Trimer 1a (GC-C-C)

Prodelphinidin

Trimer 1b (C-GC-C)

Prodelphinidin C2

(GC-GC-C)

Prodelphinidin

Trimer 2a

(GC-GC-GC)

Summe

n. d.: nicht detektiert; u. B.: unterhalb der Bestimmungsgrenze

5 Ergebnisse und Diskussion 113

Tabelle 26: Flavonoid-Gehalte in den Proben der Kühlung, der Gärung und des Bieres

(LC-DAD-MS/MS, Gradient E2) (n = 2)

23. Probe

abge-

fülltes

Bier

0,53

0,66

n. d.

17,16

1,63

n. d.

19,98

22. Probe

nach

Schich-

tenfilter

0,40

1,05

n. d.

19,71

2,89

n. d.

24,05

21. Probe

nach

PVPP-

Filter

0,34

0,98

n. d.

18,37

0,72

n. d.

20,41

20. Probe

nach

Kiesel-

gurfilter

1,43

0,95

n. d.

28,49

1,80

u. B.

11,42

0,43

0,53

4,51

n. d.

49,56

Bier

[mg/L]

19. Probe

unfiltrier-

tes Bier

1,65

1,06

u. B.

25,76

2,84

0,43

12,83

0,50

0,67

4,56

n. d.

50,30

18. Probe

Schlau-

chen

3,56

0,40

u. B.

15,07

1,47

0,75

5,71

1,00

0,81

3,38

n. d.

32,15

17.

Probe

6. Tag

1,15

0,88

u. B.

15,13

1,64

0,71

3,16

0,67

4,93

n. d.

28,94

16.

Probe

3. Tag

1,13

0,81

u. B.

16,32

1,23

0,81

5,10

0,54

0,42

6,93

n. d.

33,29

Gärung

[mg/L]

15.

Probe

1. Tag

1,40

0,33

u. B.

11,23

1,48

0,95

6,59

0,56

0,51

9,57

n. d.

32,62

14.

Probe

Ende

2,48

1,65

u. B.

51,41

3,51

1,61

28,82

1,15

0,80

13,99

n. d.

105,41

13.

Probe

Mitte

1,81

1,23

u. B.

30,21

2,51

1,61

27,35

0,73

0,51

12,87

n. d.

78,83

Kühlung

[mg/L]

12.

Probe

Anfang

1,62

1,17

u. B.

16,67

2,23

1,56

30,99

0,36

12,37

n. d.

67,33

Analyt

(+)-Catechin

(C)

(+)-Catechin-

Glucopyranosid

(-)-Gallocatechin

(GC)

Procyanidin B3

(C-C)

Prodelphinidin B3

(GC-C)

Prodelphinidin

Dimer (GC-GC)

Procyanidin C2

(C-C-C)

Prodelphinidin

Trimer 1a (GC-C-C)

Prodelphinidin

Trimer 1b (C-GC-C)

Prodelphinidin C2

(GC-GC-C)

Prodelphinidin

Trimer 2a

(GC-GC-GC)

Summe

n. d.: nicht detektiert; u. B.: unter der Bestimmungsgrenze

5 Ergebnisse und Diskussion 114

Neben den Monomeren (+)-Catechin und (-)-Gallocatechin wurden auch die Dimere Procya-

nidin B3 und Prodelphinidin B3, wie in bereits in der Literatur [183, 185, 247, 249] beschrie-

ben, in Malz detektiert. Die Konzentration von Procyanidin B3 lag mit 107,55 mg/kg deutlich

über der für Prodelphinidin B3 (74,96 mg/kg). Wie auch für die Monomeren variieren die in

anderen Untersuchungen bestimmten Konzentrationen stark. Zusätzlich zu dem Signal für

Prodelphinidin B3 konnten, wie schon bei der Untersuchung des Gerstenextraktes (s. Kapitel

5.6.2, Abbildung 35b), im MS-Chromatogramm m/z 592,5 - 593,5 zwei weitere Signale bei

Rt = 15 und 21 min erfasst werden. Durch MSn-Experimente wurde das erste Signal auch

hier dem Dimer mit der Sequenz C-GC und das zweite Signal einem Molekülion mit der Se-

quenz GC-C zugeordnet. Darüber hinaus wurde das von FRIEDRICH [183] erstmalig in Malz

identifizierte, dort aber nicht quantifizierte, aus zwei (-)-Gallocatechin-Einheiten aufgebaute

Dimer (m/z 609) mit einer Konzentration von 5,66 m/kg in Malz detektiert. Anders verhält es

sich mit dem aus (+)-Catechin und Glucose aufgebauten (+)-Catechin-Glucopyranosid

([M-H]-, m/z 451,0). Dieses von ihm erstmalig in Malz identifizierte Flavonoid konnte in ver-

schiedenen Malzsorten in der Größenordnung von 25 - 45 mg/kg detektiert werden. Die ei-

genen Untersuchungsergebnisse mit 13,64 mg/kg liegen also darunter.

Bezüglich des Gehaltes der Flavonoid-Trimere in Malz gibt es bisher nur sehr wenige Arbei-

ten. GOUPY et al. [185] bestimmten 1999 die Konzentration des Trimers Procyanidin C2 mit

der Sequenz C-C-C in einer Größenordnung von 5 mg/kg. FRIEDRICH [183] ermittelte für

das Trimer Procyanidin C2 Werte von 31 - 78 mg/kg, für die Prodelphinidin Trimere (m/z

881) mit der Sequenz GC-C-C und C-GC-C 39 - 103 mg/kg und für Prodelphinidin C2 (m/z

897) 50 - 80 mg/kg. In dem hier untersuchten Malz konnte Procyanidin C2 in einer Konzent-

ration von 134,20 mg/kg bestimmt werden. Die Werte für die Trimere GC-C-C und C-GC-C

lagen dagegen mit 17,55 mg/kg und 9,09 mg/kg deutlich darunter (s. Tabelle 25).

Im MS-Chromatogramm m/z 880,5 - 881,5 wurden wie beim Gerstenextrakt (s. Kapitel 5.6.2,

Abbildung 36b) zusätzliche Peaks geringer Intensität bei Rt = 24 und 29 min beobachtet.

Basierend auf der in Kapitel 5.6.3.3 beschriebenen Vorgehensweise der Identifizierung rele-

vanter Product-Ionen zur Sequenzermittlung des Moleküls, weisen die bei Kollisionsexperi-

menten mit diesen Verbindungen erhaltenen Fragmente auch hier auf die Monomeren-

Abfolge GC-C-C hin. Eine Quantifizierung dieser Verbindungen konnte aber nicht erfolgen,

da die Signale unterhalb der Bestimmungsgrenze des Verfahrens lagen. Im MS-

Chromatogramm m/z 896,6 - 897,5 wurde neben dem Signal für Prodelphinidin C2 (GC-GC-

C) bei Rt = 12 min, welches in einer Konzentration von 47,44 mg/kg in dem untersuchten

Malz vorliegt, wie auch in Gerste (s. Kapitel 5.6.2, Abbildung 36c) ein weiterer Peak bei einer

Retentionszeit von 21 min mit der gleichen Monomeren-Sequenz GC-GC-C detektiert. Die-

ses Signal, vermutlich aus einer höhermolekularen Verbindung durch Bruch der Flavonoid-

Bindung resultierend, konnte aufgrund der geringen Konzentration aber auch keiner Quanti-

fizierung unterworfen werden. Als weiteres trimeres Flavonoid wurde abschließend die bis-

her erstmals von BRANDON [175] in Gerste beschriebene Verbindung mit der Abfolge GC-

GC-GC gefunden und durch MSn-Experimente bestätigt. Ihre Konzentration von 1,02 mg/kg

ist mit der des Monomeren (+)-Catechin vergleichbar.

5 Ergebnisse und Diskussion 115

100

200

300

400

500

600

1. Probe

3. Probe

7. Probe

8. Probe

9. Probe

10.-11.* Probe

12.-14.* Probe

15.-18.* Probe

20. Probe

21. Probe

22. Probe

23. Probe

Gehalt [mg/kg bzw. mg/L]

Summe

Flavonoide

Summe

Trimere

Summe

Dimere

Summe

Monomere

Abbildung 48: Verlauf der Gehalte der monomeren, dimeren und trimeren Flavonoide

während des Brauprozesses (* Mittelwerte der jeweiligen Proben)

Verlauf der Flavonoid-Gehalte während des Brauprozesses:

Ausgehend von den in Malz ermittelten Werten für die einzelnen Flavonoide sollte nun das

Flavonoid-Muster in den verschiedenen Brauprozessproben verfolgt werden. In der Literatur

werden zumeist nur Untersuchungen in Proben des Maischens, des Würzekochens und des

Bieres direkt durchgeführt, wobei dann häufig auch keine Differenzierung der einzelnen

Substanzen erfolgt. So gaben McMURROUGH et al. [154] in Bier die Summe der Monomere

mit 9 mg/L, die der Dimere mit 2,6 mg/L und die der Trimere mit 3,2 mg/L an. MOLL et al.

[233] postulierten basierend auf ihren Untersuchungen einen Gesamt-Flavonoid-Gehalt von

10 mg/g und PAPP et al. [218] von 8,5 mg/L.

Aufgrund der vom Verbraucher nicht erwünschten Trübung des Bieres (Haze-Formation),

verursacht durch die Bildung von Komplexen aus Proteinen und Polyphenolen (s. Kapitel

4.2), haben sich in der Vergangenheit viele Arbeitsgruppen [56, 57, 221] mit dem Einfluss

der Filtration des Bieres über PVPP und auf den daraus resultierenden Flavonoid-Gehalt im

Bier beschäftigt. Beispielweise stellten McMURROUGH et al. [57] im Mittel eine Halbierung

der Konzentration der Monomere (+)-Catechin und (-)-Epicatechin sowie der Dimere Procy-

anidin B3 und Prodelphinidin B3 fest. Neben der Reduktion des Flavonoid-Gehaltes durch

Filtration des Bieres über PVPP wurde in mehreren unabhängigen Studien [154, 212, 233,

247] postuliert, dass beim Kochen der Würze der Gehalt der höhermolekularen Flavonoide

sinkt, während gleichzeitig die Konzentration der Monomeren steigt. Grund hierfür sei, dass

es bei den Temperaturen des Kochens zu einem Bruch der Interflavonoid-Bindung käme. In

der Literatur wurden bisher keine Hinweise über eine Gesamt-Bilanzierung des Flavonoid-

Flusses während eines Brauprozesses gefunden.

5 Ergebnisse und Diskussion 116

Die eigenen Untersuchungsergebnisse (s. Tabelle 25 und 26) zeigen, dass es im ersten

Schritt, dem Maischen zu einer 400 bis 500 %igen Zunahme des Gehaltes der Monomeren

(+)-Catechin und (-)-Gallocatechin kam. Bei den höhermolekularen Flavonoiden konnte nur

bei dem Dimeren Procyanidin B3 (C-C), dem Prodelphinidin Dimer (GC-GC) und dem Trime-

ren Prodelphinidin C2 (GC-GC-C) eine Erhöhung festgestellt werden. Diese Beobachtung

deutet darauf hin, dass es beim Maischen unter Umständen zu einem Bruch der Interflavo-

noidbindung höhermolekularer Flavonoide gefolgt von einer Erhöhung der Monomeren-

Gehalte kommt. Im nächsten Schritt, dem Läutern der Maische, waren in der 4. Probe Mitte

Vorderwürze erwartungsgemäß die höchsten Konzentrationen zu finden, in der 5. Probe

Mitte Nachguss und der 6. Probe Ende Nachguss wurden durch das Nachspülen der Mai-

sche nur noch geringe Konzentrationen detektiert. Entgegen den Angaben in der Literatur

[154, 212, 233, 247] kann aber beim anschließenden Würzekochen eine signifikante Ab-

nahme der Konzentration der höhermolekularen Flavonoide, verbunden mit einer Zunahme

der Monomeren, nicht bestätigt werden. Die Untersuchung der 9. Probe Ende Kochen zeigte

im Gegensatz zur 7. Probe Anfang Kochen vergleichsweise hohe Gehalte. Bei den nachfol-

genden Brauprozessstufen, d. h. in der 10. Probe Whirlpool Rast Anfang und der 11. Probe

Whirlpool Rast Ende sowie der 12. Probe Kühlung Anfang und der 13. Probe Kühlung Mitte

waren keine signifikanten Unterschiede des Gesamtgehaltes feststellbar. Die erhaltenen

Werte liegen zwischen 67 und 89 mg/L. In der 14. Probe Kühlung Ende wurde ein Anstieg

auf 105,31 mg/L verzeichnet. Ein Vergleich der Gehalte der Einzelverbindungen zeigt, dass

dieser Anstieg in erster Linie auf einer Zunahme der Konzentration des Dimers Procyanidin

B3 beruht. Dieses Ergebnis sollte daher in einer weiteren Untersuchung noch einmal über-

prüft werden, zumal der für die 15. Probe Gärung 1. Tag erhaltene Wert mit 11,23 mg/L

deutlich geringer ist. In den drei Proben der Gärung ist eine deutliche Abnahme des Flavo-

noid-Gehaltes auf etwa 30 mg/L festzustellen. Diese könnte einerseits auf eine Verdünnung

durch die Hefe-Zugabe andererseits auch auf Zerfallsprozesse während der sechs-tägigen

Gärungsphase zurückgeführt werden.

Das fertige Bier wurde in einem ersten Filtrationsschritt dann über einen Kieselgurfilter ge-

geben, hierbei zeigte sich keine auffällige Änderung des Flavonoid-Gehaltes. Im nächsten

Filtrationsschritt über PVPP halbierte sich der Gehalt, wie auch bereits in der Literatur [56,

57, 221] beschrieben. Die letzte Brauprozessprobe, das abgefüllte Bier, wies einen Gesamt-

Flavonoid-Gehalt von 20 mg/L auf, der geringfügig über den in der Literatur angegebenen

Ergebnissen von 13 mg/L [55], 12 mg/L [57], 8,5 mg/L [218] und 5,4 mg/L [221] vornehmlich

für Lager Bier lag. Die Tatsache, dass die ermittelten Gesamt-Gehalte in den untersuchten

Proben der Würze- und der Bierproben im Durchschnitt höher als die in der Literatur bisher

angegebenen Gehalte waren, könnte unter Umständen daraus resultieren, dass hier keine

Probenvorbereitung erfolgte. Die flüssigen Proben wurden gefriergetrocknet, die jeweiligen

erhaltenen Feststoffe ohne weitere Aufarbeitung in DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst und anschlie-

ßend direkt mit der LC-DAD-MS/MS analysiert. McMURROUGH et al. [57] beispielsweise

führten zur Aufreinigung bzw. Abtrennung von Zuckern einen Extraktionsschritt durch, bei

dem aber nicht überprüft wurde, ob es zu Verlusten der Analyten kam. Ein weiterer Grund

5 Ergebnisse und Diskussion 117

könnte sein, dass die Proben der Warsteiner-Brauerei im Vergleich mit anderen Brauereien

während des gesamten Brauprozesses nur sehr wenig mit Luftsauerstoff in Verbindung

kommen [310], eine Oxidation zu höhermolekularen Substanzen somit unterbunden wird.

Die in der 23. Probe Bier für (+)-Catechin ermittelte Konzentration mit 0,53 mg/L (Tabelle 26)

liegt innerhalb der in der Literatur [53, 57, 218] beschriebenen Größenordnung. Der Gehalt

während des Brauens reduzierte sich etwa auf ein Drittel. Im Vergleich dazu konnte das Mo-

nomer (+)-Gallocatechin nur bis zur 9. Probe Ende Kochen quantifiziert werden, da die Kon-

zentration ab der 10. Probe Rast Anfang unterhalb der Bestimmungsgrenze lag. Qualitativ

war (-)-Gallocatechin noch bis zur Kieselgur-Filtration des Bieres nachweisbar. Als weiteres

Monomer wurde erstmalig in Bier das (+)-Catechin-Glucopyranosid mit 0,66 mg/L detektiert.

Von den dimeren Flavonoiden lagen im Bier nur noch Procyanidin B3 und Prodelphinidin B3

vor. Die Konzentration des Prodelphinidin B3 nahm während des Brauprozesses auf ca. 2 %

der Ausgangskonzentration in Malz, die des Procyanidin B3 auf ca. 15 % ab. Durch die

PVPP-Filtration wurden sowohl Dimere GC-GC (m/z 609) als auch die Dimeren mit der Se-

quenz C-GC (Rt = 15 min, m/z 593) und GC-C (Rt = 21 min, m/z 593) aus dem Bier abge-

trennt. Ein Zerfall der Dimeren in die Monomere während des Kochprozesses durch einen

Bruch der Interflavonoid-Bindung konnte nicht bestätigt werden.

Im Gegensatz zu den Dimeren konnte in der Probe nach Filtration mit PVPP im Bier kein

Trimer detektiert werden. Procyanidin C2 (C-C-C) wies in Malz mit 134,20 mg/kg zwar die

höchste Konzentration der Flavonoide auf, der Gehalt reduzierte sich aber bei der Gärung

auf eine Konzentration von 6,59 mg/L. Die weiteren trimeren Verbindungen mit der Sequenz

GC-C-C (Rt = 24 und 29 min, m/z 881) und auch die Verbindung GC-GC-C (Rt = 21 min, m/z

897) konnten bereits in den Proben der Gärung nicht mehr nachgewiesen werden. Der Ge-

halt an dem ausschließlich aus Gallocatechin-Einheiten aufgebautem Prodelphinidin-Trimer

lag schon am Ende des Läuterns unterhalb der Bestimmungsgrenze. Die für die Trimeren

erhaltenen Ergebnisse entsprachen damit nicht den von McMURROUGH et al. [154, 221], die

Summengehalte von 3,2 - 5,4 mg/L angeben. Andere Autoren [55, 233] konnten mittels

HPLC-DAD ebenfalls keine Trimere nachweisen. Der Befund, dass nach PVPP-Filtration in

der Bierprobe keine Trimere mehr nachzuweisen sind, bestätigt nochmals die bereits in

mehreren Untersuchungen [154, 212, 233, 247] herausgestellte Sorptions-Effektivität des

Polymers, die schließlich zur vergleichsweisen „Flavonoid-Armut“ des Endproduktes Bier

führt.

6 Zusammenfassung und Ausblick 118

6 Zusammenfassung und Ausblick

Flavonoide zählen zur Gruppe der sekundären Pflanzenstoffe, und sie stellen eine umfang-

reiche Stoffklasse polyphenolischer Verbindungen dar, die in Lebensmitteln pflanzlicher Her-

kunft ubiquitär vorkommen. In zahlreichen epidemiologischen Studien konnten im menschli-

chen Organismus viele unterschiedliche protektive Wirkungsweisen (antioxidativ, antiathe-

rosklerotisch usw.) dieser Substanzen nachgewiesen werden. In diesem Zusammenhang ist

die Identifizierung und Quantifizierung von Flavonoiden in Gerste von besonderer Bedeu-

tung, da dieses heimische Getreide als Ausgangsstoff bei der Herstellung verschiedenster

Produkte (Brot, Müsli) so z. B. auch von Bier dient. Hier führen die oligomeren Flavonoide

durch Komplexbildung mit Proteinen während des Brauprozesses zu einer vom Verbraucher

unerwünschten Trübung des Bieres.

Bis zum heutigen Zeitpunkt ist kein vollständig validiertes HPLC-Verfahren zur qualitativen

und quantitativen Bestimmung von Flavonoiden in Gerste bekannt. Als Ursache hierfür ist

zum einen ein Mangel an kommerziellen Referenzsubstanzen der in Gerste bisher detektier-

ten höhermolekularen Verbindungen, der Proanthocyanidine, zu sehen. Weiterhin ist das in

Gerste enthaltene, vielfältige Stoffspektrum an Flavonoiden bisher nur teilweise aufgeklärt.

Da Gerste neben Hopfen, Malz und Wasser als eine der vier Grundzutaten zur Bierherstel-

lung fungiert, hat dies zur Folge, dass bislang keine systematischen Untersuchungen über

den Flavonoid-Fluss während des Bierbrauprozesses möglich sind.

Die bisher beschriebenen Verfahren zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste, Malz und

verschiedenen Proben des Brauprozesses beschränken sich entweder auf die Ermittlung

eines Polyphenol-Summenparameters z. B. zur Prozesskontrolle oder auf die Analyse der

monomeren Flavonoide. Diese Arbeit verfolgte daher folgende Ziele:

• Synthese des dimeren Flavonoids Procyanidin B3 als Referenzsubstanz

• Entwicklung und Optimierung eines HPLC-DAD-Verfahrens (Probenahme, Probenvor-

bereitung und chromatographische Trennung) zur Quantifizierung ausgewählter Fla-

vonoide in Gerste

• Umfassende Validierung des Analyseverfahrens

• Identifizierung weiterer Verbindungen in Gerste mittels LC-DAD-MS/MS

• Anwendung des validierten HPLC-DAD-Verfahrens zur Bestimmung von Flavonoiden

in Gerste und zur Verfolgung des Flavonoid-Flusses während eines Bierbrauprozesses

Die Darstellung des Procyanidin B3 sollte in Anlehnung an bereits in der Literatur be-

schriebene Synthesewege für andere dimere Flavonoide erfolgen. Die Synthese konnte er-

folgreich bis zur zweiten Stufe durchgeführt werden. Die Realisierung des letzten Reaktions-

schrittes gelang nicht und konnte aus Zeitgründen nicht weiter verfolgt werden. Die gelunge-

nen Umsetzungen der neuen Synthesestrategie sollten aber im Rahmen weiterer Untersu-

chungen prinzipiell zur Darstellung von Referenzsubstanzen der Proanthocyanidine führen.

6 Zusammenfassung und Ausblick 119

Die Entwicklung eines HPLC-DAD-Verfahrens zur Bestimmung von Flavonoiden erfolgte

mit dem kommerziell erhältlichen Monomeren (+)-Catechin als Modellsubstanz. Hierbei

zeigten sich sich sowohl ein Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P1 als auch ein Essigsäure-

Gradient E1 als mobile Phasen geeignet, wobei der Einsatz des Gradienten E1 die Über-

tragbarkeit des Verfahrens auf die zur späteren Identifizierung eingesetzte Detektion mittels

Massenspektrometer sicherstellte. Als optimales Lösemittel der Messprobe stellte sich ein

DMF/H2O-Gemisch (2:1; v/v) heraus.

Ein besonderer Schwerpunkt bei der Methodenentwicklung lag auch auf der systematischen

Erprobung verschiedenartiger stationärer Phasen bzw. analytischer Trennsäulen. Es wurden

sowohl acht herkömmliche C18-Materialien mit unterschiedlichen Säulendimensionen, ein

C8-Material sowie sieben verschieden neuartig endgruppen-modifizierte Reversed-Phase-

Materialien hinsichtlich Trennleistung und Packungsqualität untersucht. Darüber hinaus er-

folgte zur Beurteilung der jeweiligen Säule bezüglich ihres späteren Einsatzes bei Realpro-

ben die Einführung eines Quotienten QF aus der ermittelten Peakbreite und der Retentions-

zeit des (+)-Catechin-Peaks. Es erwiesen sich fünf herkömmliche C18-Materialien, zwei

Phenyl-, eine Phenyl-Hexyl-, eine Polyethylenglycol- sowie eine Pentafluorophenyl-Phase als

geeignet, deren chromatographisches Trennvermögen dann bei Realproben untersucht

wurde.

Zur Entwicklung des HPLC-DAD-Verfahrens zur Bestimmung der Flavonoide in Gerste

erfolgte eine systematische Optimierung aller Probenvorbereitungsschritte zur Isolierung der

Flavonoide (s. Abbildung 15). Es wurden zwei verschiedene Methoden der Probenvorberei-

tung, eine klassische Fest-Flüssig-Extraktion mit Ultra-Turrax-Unterstützung und eine Mik-

rowellen-gestützte Extraktion (MSS, Microwave Supported Solvent Extraction) eingesetzt.

Mit beiden Extraktionsverfahren wurde eine 95 %ige Extraktionsausbeute nach vier Extrakti-

onsdurchgängen bei einer Dauer von 10 min mit der Ultra-Turrax-Methode und 15 min mit

der MSS-Technik (Extraktionstemperatur: 30 °C) erhalten. Die MSS bietet gegenüber der

Extraktion mit dem Ultra-Turrax den Vorteil, in einem Extraktionsdurchgang bis zu 500 g

Gerste aufarbeiten zu können. Damit eröffnet sie die Möglichkeit für weiterführende Arbei-

ten, um die in Gerste enthaltenen höhermolekularen, nicht kommerziell erhältlichen Pro-

anthocyanidine im präparativen Maßstab isolieren zu können.

Die durchgeführten Untersuchungen zur Einsetzbarkeit der zuvor ausgewählten analytischen

Trennsäulen für den Gerstenextrakt sowie Variationen der eingesetzten Gradienten führten

dann zu dem in Abbildung 21 schematisch dargestellten Analysenablauf. Zusammenfassend

hat sich zur quantitativen Bestimmung von Flavonoiden in Gerste die Reversed-Phase

Chromatographie mit einem chromatographischen System bestehend aus einer RP-18

Trennsäule und einem Phosphatpuffer/Acetonitril-Gradient P2 oder einem Essigsäu-

re/Acetonitril-Gradient E2 als optimal erwiesen. Die Detektion erfolgte mit einem DAD-

Detektor bei einer Wellenlänge von 280 nm.

Bei der umfassenden Validierung des optimierten HPLC-DAD-Verfahrens nach den gül-

tigen Richtlinien der DIN EN ISO/IEC 17025, der FDA, der ICH sowie nach dem Amtsblatt

6 Zusammenfassung und Ausblick 120

der Europäischen Gemeinschaften wurden die Validierungsparameter Linearität, Spezifität,

Nachweis- und Bestimmungsgrenze, Präzision, Richtigkeit, Robustheit und Stabilität be-

stimmt. Die Validierung wurde sowohl für den Einsatz des Gradienten E2 als auch für den

Gradienten P2 durchgeführt.

Die Bestimmungsgrenze des Verfahrens lag mit beiden Gradienten bei einer (+)-Catechin-

Konzentration von 1,25 mg/L (≙ 50 ng absolut), die Nachweisgrenze bei einer Konzentration

von 0,25 mg/L (≙ 10 ng absolut). Die relative Verfahrensstandardabweichung Vxo der erstell-

ten und statistisch abgesicherten Kalibrierfunktionen wurde zu 1,3 % (E2) und 0,9 % (P2)

bestimmt und war damit geringer als die geforderten 3 %. Im weiteren wurde der Validie-

rungsparameter Stabilität untersucht. Es zeigte sich, dass die Realproben entweder direkt

vermessen und während der Messung auf 5 °C gekühlt, oder, um eine längerfristige Stabili-

tät zu gewährleisten, bei einer Temperatur von -80 °C gelagert werden sollten. Für die

Messpräzision wurden mit beiden Gradienten Werte um 2 % ermittelt. Die Methodenpräzisi-

on unter Wiederholbedingungen zeigte für die Aufarbeitung mittels MSS und mittels Ultra-

Turrax Werte zwischen 5,6 % und 8,8 %.

Zur laborinternen Qualitätskontrolle konnte bestätigt werden, dass die an unterschiedlichen

Tagen durchgeführten Messungen mit 95 % Sicherheit als gleich zu betrachten sind (Tag-

zu-Tag-Präzision). Die Bestimmung der Richtigkeit erfolgte hier indirekt über die Ermittlung

der Wiederfindung, wobei diese in erster Linie reproduzierbar sein muss. Die Mittelwerte der

gefundenen Wiederfindungsraten lagen für die Aufarbeitung der Realproben mit dem Ultra-

Turrax bei 90,1 % und für die MSS bei 84,1 %. Somit konnte die Richtigkeit des Verfahrens

bestätigt werden. Abschließend wurde noch die Robustheit des Analysenverfahrens anhand

von Veränderungen verschiedener Parameter bei der chromatographischen Bestimmung

bestätigt.

Ein weitere Zielsetzung dieser Arbeit lag auf der Identifizierung in Gerste enthaltener Fla-

vonoide mittels LC-DAD-MSn. In Gerste sind neben den Monomeren (+)-Catechin und

(-)-Gallocatechin bisher 6 Proanthocyanidine beschrieben worden (s. Tabelle 3). Dabei han-

delt es sich um zwei Dimere und vier Trimere, die aus Catechin- und Gallocatechin-Einheiten

aufgebaut sind. Zur Identifizierung wurden im ersten Schritt MSn-Untersuchungen mit den

Monomeren (+)-Catechin (C), (-)-Epicatechin, (-)-Gallocatechin (GC) und (-)-Epigallo-

catechin durchgeführt. Es zeigte sich, dass die jeweiligen Epimeren das gleiche Fragmentie-

rungsmuster aufweisen. Durch MS1-Untersuchungen (Precursor-Ionen-Experimente) erfolgte

eine erste Zuordnung der erhaltenen Massensignale bezüglich der möglichen Monomeren-

Sequenz der höhermolekularen Flavonoide (Di-, Tri- und Tetramere). Gezielte MSn-Unter-

suchungen führten dann, unter Berücksichtigung typischer Fragmentierungsreaktionen bzw.

charakteristischer Product-Ionen zur erstmaligen Erarbeitung einer systematischen Vorge-

hensweise zur Identifizierung der verschiedenen Proanthocyanidine.

Auf diese Weise konnten neben den bisher beschriebenen Dimeren Procyanidin B3 (Se-

quenz C-C) und Prodelphinidin B3 (GC-C) auch dimere Verbindungen der Sequenz C-GC

und GC-GC nachgewiesen werden. Hinweise in der Literatur über die Existenz der Trimeren

6 Zusammenfassung und Ausblick 121

mit der Monomeren-Abfolge C-C-C (Procyanidin C2), GC-GC-C (Prodelphinidin C2) sowie

GC-C-C und C-GC-C wurden ebenfalls bestätigt. Darüber hinaus wurde auch eine aus-

schließlich aus Gallocatechin-Einheiten aufgebaut trimere Verbindung GC-GC-GC identifi-

ziert. Zur Identifizierung der erstmals in Gerste gefundenen tetrameren Proanthocyanidine

waren im zeitlichen Rahmen dieser Arbeit nur MS2-Experimente der Signale mit der größten

Intensität möglich. Es konnte daher nur eine erste vorläufige Struktur-Zuordnung getroffen

werden (s. Tabelle 21). Zu einer umfassenden Strukturaufklärung dieser tetrameren Flavo-

noide sowie zur Untersuchung der möglichen Existenz weiterer höhermolekularer Verbin-

dungen (Pentamere, Hexamere usw.) in Gerste besteht weiterer Untersuchungsbedarf. Da-

bei sollten neben der Massenspektrometrie auch andere Methoden wie z. B. die on-line-

LC-NMR-Spektroskopie eingesetzt werden, die eine Unterscheidung von Diastereoisomeren

der Monomeren-Bausteine ermöglicht.

Die Anwendung des HPLC-DAD-Verfahrens wurde anhand der quantitativen Bestimmung

der Flavonoid-Gehalte in den drei Braugerstensorten „Annabell“, „Henni“ und „Viskosa“

demonstriert. Die Quantifizierung der Proanthocyanidine erfolgte hierbei indirekt über

(+)-Catechin. Die ermittelten Flavonoid-Gehalte für die monomeren, dimeren und trimeren

Flavonoide zeigen eine gute Übereinstimmung mit Literaturdaten. Des weiteren gelang auch

die Quantifizierung der erstmals in Gerste durch MSn-Untersuchungen identifizierten di- und

trimeren Verbindungen. Somit konnte die Einsatzfähigkeit des entwickelten und validierten

HPLC-DAD-Verfahrens gezeigt werden.

Darüber hinaus wurden dann, zur Verfolgung des Flavonoid-Flusses während eines Bier-

brauprozesses, verschiedene Prozessproben eines Braudurchganges mittels LC-DAD-

MS/MS untersucht. Ausgehend von Malz als Braugrundstoff wurden bei den jeweiligen

Braustufen, dem Maischen, dem Läutern, dem Würzekochen, der Kühlung, der Gärung, der

Filtration sowie dem Bier verschiedene Proben genommen. Die Identifizierung der einzelnen

Substanzen erfolgte durch MSn-Untersuchungen unter Anwendung der zuvor erarbeiteten

systematischen Vorgehensweise, die Quantifizierung mittels DAD-Detektion indirekt über

(+)-Catechin. Durch die Untersuchung konnte sowohl die Abnahme der Flavonoid-

Konzentration ausgehend vom Malz als Braugrundstoff bis zum fertigen Bier, als auch die

Veränderung des Flavonoid-Musters in den jeweiligen Stufen des Brauprozesses nachge-

wiesen werden.

Zu einer deutlichen Reduzierung des Flavonoid-Gehaltes führten neben der Gärung des

Bieres, besonders die am Ende stattfindenden Filtrationsschritte des gebrauten Bieres über

einen Kieselgur- einen PVPP- und einen Schichtenfilter. Besonders effektiv wirkt die PVPP-

Filtration. Dies soll selektiv Polyphenole aus dem Bier absorbieren, um die für den Verbrau-

cher unerwünschte Trübung, hervorgerufen durch Komplexbildung der Polyphenole mit Pro-

teinen, zu vermindern. Die Effektivität dieses Filtrationsschrittes konnte also bestätigt wer-

den, da im fertigen Bier nur noch monomere und dimere, aber keine höhermolekularen Fla-

vonoide mehr nachweisbar waren. Bei zukünftigen Arbeiten sollten dann, um noch detaillier-

tere Informationen zu erhalten, auch die Flavonoide aus dem Hopfen mit einbezogen wer-

den, die in dieser Untersuchung nicht mit berücksichtigt werden konnten.

6 Zusammenfassung und Ausblick 122

Mit dem in dieser Arbeit entwickelten, optimierten und validierten HPLC-DAD-Verfahren ist

eine zuverlässige quantitative Bestimmung von Flavonoiden in Gerste möglich. Die chroma-

tographischen Bedingungen zeichnen sich dadurch aus, dass auch die massenspektrometri-

sche Detektion einsetzbar ist. Durch die massenspektrometrischen MSn-Stoßexperimente

wurde erstmals ein systematisches Vorgehensschema zur Identifizierung höhermolekularer

Flavonoide entwickelt, welches auch für andere Probenarten eingesetzt werden kann. Dar-

über hinaus konnte der Flavonoid-Fluss in Proben eines Bierbrauprozesses verfolgt werden.

Das Ziel weiterführender Arbeiten sollte primär, basierend auf der Gewinnung von Referenz-

substanzen der oligomeren Proanthocyanidine, eine direkte Quantifizierung mittels MS-

Detektion durch das hier entwickelte HPLC-Verfahren sein.

7 Experimenteller Teil 123

7 Experimenteller Teil

7.1 Chemikalien

Die im Rahmen der durchgeführten Untersuchungen eingesetzten Chemikalien sind im

folgenden alphabetisch geordnet aufgeführt.

Aceton (p. a.; Merck/Darmstadt)

Acetonitril (HPLC-Grade; Merck/Darmstadt)

Benzylbromid, ≥ 98,0 % (purum; Fluka/Taufkirchen)

(+)-Catechin Hemihydrat, ≥ 98 % (Sigma/Deisenhofen)

2,3-Dichlor-5,6-dicyan-p-benzochinon, DDQ, 97 % (purum; Fluka/Taufkirchen)

Dichlormethan, ≥ 99,8 % (p. a.; Fluka/Taufkirchen)

4-Dimethylaminopyridin, ≥ 99,0 % (puriss.; Fluka/Taufkirchen)

Eisessig (HPLC-Grade; Merck/Darmstadt)

(-)-Epicatechin (Sigma/Deisenhofen)

(-)-Epigallocatechin, min. 98 % (Sigma-Aldrich/Steinheim)

Ethanol (HPLC-Grade; Merck/Darmstadt)

Ethylacetat (p. a.; Merck/Darmstadt)

Ethylenglycol, 99,8 % (wasserfrei; Sigma-Aldrich/Steinheim)

(-)-Gallocatechin Hydrat, H2O-Gehalt 1,3 mol/mol (Sigma-Aldrich/Steinheim)

Methanol (HPLC-Grade; Merck/Darmstadt)

Natriumchlorid, (reinst; Fluka/Taufkirchen)

Natriumdihydrogenphosphat Monohydrat (p. a.; Merck/Darmstadt)

Natriumdisulfit, trocken (p. a.; Merck/Darmstadt)

Natriumhydrid, 60 % (Suspension in Öl; Fluka/Taufkirchen)

Natriumhydroxid, Plätzchen, ≥ 99 % (p. a.; Merck/Darmstadt)

N,N-Dimethylformamid (p. a.; bzw. puriss., absolut wasserfrei; Fluka/Taufkirchen)

ortho-Phosphorsäure, 85 % (p. a.; Merck/Darmstadt)

Pufferlösungen, pH 1 und pH 7 (gebrauchsfertig; Merck/Darmstadt)

Titriplex III, Ethylendiamintetraessigsäure, EDTA (p. a.; Merck/Darmstadt)

Trifluoressigsäure, 99 % (p. a.; Sigma-Aldrich/Steinheim)

Wasser (bidestilliert mit Destamat; Heraeus/Hanau)

7.2 Geräte

7.2.1 HPLC-DAD-System

Pumpe: P 580 A mit integriertem Degasser; Gynkotek HPLC (Dionex/Idstein)

Injektionsautomat: Autosampler GINA 50 T (gekühlt, 5 °C); Gynkotek HPLC

(Dionex/Idstein)

Injektionsvolumen: 40 µL

Trennsäule: Nucleosil® 100, 250 x 4 mm, RP-C18, 5 µm (Macherey-Nagel)

7 Experimenteller Teil 124

Säulenofen: Säulentemperatur: 30 °C

Detektor: UVD 340 S, Gynkotek HPLC (Dionex/Idstein)

Messbereich: 220 - 400 nm, ausgewählte Messwellenlängen:

220, 250, 280 und 320 nm

Auswertung: Gynkosoft Chromeleon-Chromatographie-Datensystem,

PCD Version 5.50, Gynkotek HPLC, Peakflächenmethode (Dio-

nex/Idstein)

Flussrate: 1 mL/min

Mobile Phase: s. Kapitel 7.5.1.3 bzw. 7.5.3.1

7.2.2 LC-DAD-MS/MS Ion-Trap-System

Die Untersuchungen wurden mit einem LCQ-Advantage Ion-Trap Komplettsystem der Firma

Thermo Finnigan/Egelsbach durchgeführt.

HPLC-System:

Degasser: SCM 1000 Vakuum Membrane Degasser

Pumpe: P 4000 Gradient Pumpe

Injektionsautomat: AS 3000, Autosampler (gekühlt, 4 °C) mit integriertem

Säulenofen (temperiert: 30 °C)

Injektionsvolumen: 10 µL und 40 µL

Trennsäule: Nucleosil® 100, 250 x 4 mm, RP-C18, 5 µm (Macherey-Nagel)

Detektor: UV 6000 LP, DHA

Messbereich: 190 - 800 nm

Auswertung: Xcalibur™, Version 1.3, Thermo Finnigan/Egelsbach 1998-2001

Flussrate: 1 mL/min

Mobile Phase: s. Kapitel 7.5.1.3 bzw. 7.5.3.1

LCQ-Advantage Ion-Trap:

Ionisierungsmethode: Electrospray ionisation (ESI, negative-Mode)

Tune-Page-Parameter:

Mass Range: 50 - 1000 [m/z] Capillary Voltage: -11 [V]

Sheat Gas Flow Rate: 60 [arb] Tube Lens Offset: -5 [V]

Auxillary Gas Flow Rate: 5 [arb] Multipole 1 Offset: 1,75 [V]

Ion Spray Voltage: 4,5 [kV] Lens Voltage: 14 [V]

Capillary Temperature: 280 [°C] Multipole 2 Offset: 6,5 [V]

7.2.3 LC-MS/MS Triple-Quadrupol-System

Die Massenspektren zur Charakterisierung der in Kapitel 5.1 beschriebenen Synthesepro-

dukte wurden im Staatlichen Veterinäruntersuchungsamt SVUA Detmold an einem Mas-

senspektrometer Quattro Ultima mit Ion-Spray Interface und MassLynx-Auswertesoftware

der Firma Micromass/Eschborn aufgenommen.

7 Experimenteller Teil 125

Quattro Ultima Triple Quadrupol:

Ionisierungsmethode: Electrospray ionisation (ESI, positive-Mode)

Tune-Page-Parameter:

Mass Range: 100 - 1000 [m/z] Capillary Voltage: 3,5 [kV]

Cone Gas Flow: 100 [L/h] Cone Voltage: 50 [V]

Desolvation Gas Flow: 500 [L/h] Entrance: 50

Source Temperature: 125 [°C] Exit: 50

Desolvation Temperature: 250 [°C] Multiplier Voltage: 650 [V]

7.2.4 NMR-Spektrometer

Die 1H-, 13C- und DEPT135-NMR-Spektren wurden an einem AMX 300 Spektrometer der

Firma Bruker/Rheinstetten (Magnetfeldstärke 7,05 T, 1H-Resonanzfrequenz 300,13 MHz,

13C-Resonanzfrequenz 75,43 MHz) mit einem 5mm inversen Dual-Probenkopf aufgenom-

men. Die Spektren wurden auf die jeweiligen Restlösemittelsignale von Aceton-d6 (1H: 2,04

ppm, 13C: 29,8 und 206,2 ppm) bzw. CD2Cl2 (1H: 5,35 ppm, 13C: 53,8 ppm) referenziert.

7.2.5 Spektrophotometer

V-550 UV-VIS Spektrophotometer (Jasco/Groß-Umstadt):

Parameter: Photometric Mode: Abs

Response: Medium

Band Width: 1,0 nm

Scanning Speed: 100 nm/min

Bereich: 200 - 400 nm

Data Pitch: 0,5 nm

Küvetten: Helma (optisches Glas); Nr. 6030, Durchmesser 10 mm

7.2.6 Mikrowellen-System

Die Microwave Solvent Supported Extraction (MSS) aus Gerste (s. Kapitel 7.5.2.2) wurde mit

einer Mikrowelle ETHOS 1600 (MLS Mikrowellenlaborsysteme GmbH/Leutkirch) unter Ver-

wendung der Software EASYWAVE® (Version 3.1.3.0, MLS GmbH/Leutkirch) durchgeführt.

7.2.7 pH-Meter

Es wurde ein Digital-pH-Meter 646 der Firma Knick/Berlin unter Verwendung einer Ingold

Elektrode 402-M6-S7, nach vorheriger Kalibrierung mit 2 Pufferlösungen (pH-Werte 1 und

7), eingesetzt. Während der Messung wurde die jeweilige Lösung gerührt.

7 Experimenteller Teil 126

7.3 Lösungen

7.3.1 Mobile Phasen

Phosphatpuffer: In einem Becherglas wurden 1,38 g (10 mmol) NaH2PO4*H2O in 1000 mL

bidest. Wasser gelöst und der Lösung 0,0744 g (0,3 mmol) EDTA (Titriplex III) zugefügt.

Anschließend wurde die Lösung mit 14 %iger Phosphorsäure (w/w) auf pH 2 eingestellt.

Dazu wurden 164,6 g (1,68 mol) 85 %ige Phosphorsäure (w/w) mit bidest. Wasser auf 1000

mL aufgefüllt. Der Phosphatpuffer wurde durch einen 0,2 µm Filter (Phenome-

nex/Aschaffenburg) filtriert und täglich frisch angesetzt.

Essigsäure (2,5 %; v/v und 8 %; v/v): Zur Herstellung der 2,5 %igen und 8 %igen Essig-

säure wurden Eisessig und bidest. Wasser im Verhältnis 2,5:97,5 (v/v) bzw. 8:92 (v/v) ge-

mischt und mit einem Magnetrührer gerührt. Im Anschluss wurden die beiden Lösungen

durch einen 0,2 µm Filter (Phenomenex/Aschaffenburg) filtriert.

7.3.2 (+)-Catechin-Stammlösung

Es wurden 125 mg (+)-Catechin in 50 mL DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst. Die Lösung wurde di-

rekt nach ihrer Herstellung verwendet oder, falls erforderlich, bei -80 °C bis zur Messung

gelagert. Alle weiteren im Rahmen dieser Arbeit verwendeten (+)-Catechin-Standard-

Lösungen wurden durch Verdünnen dieser Stammlösung hergestellt.

7.4 Versuche zur Darstellung von Procyanidin B3

Darstellung von 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin (2)

In einem Dreihalskolben, versehen mit Tropftrichter, Blasenzähler und Stickstoffballon, wur-

den 1,186 g (29,24 mmol) NaH unter Rühren in 30 mL wasserfreiem DMF gelöst. Hierzu

wurde eine Lösung von 2 g (6,80 mmol) (+)-Catechin (20 h getrocknet im Ölpumpenvakuum

bei 80 °C, 0,2 mbar) in 30 mL DMF tropfenweise innerhalb von 30 min zugegeben. Die

braune Reaktionslösung wurde weitere 30 min gerührt und anschließend mit einem

NaCl/Eiskältebad abgekühlt. Zu der abgekühlten Lösung wurden 30,60 mmol (4,5 eq.) Ben-

zylbromid tropfenweise über eine Dauer von 20 min zugegeben, und die dunkelbraune Re-

aktionslösung im auftauenden Kältebad über 12 h gerührt. Anschließend wurde das DMF bei

38 °C und 4 mbar unter Vakuum abdestilliert und der erhaltene bräunliche Rückstand (4,6 g)

20 h im Ölpumpenvakuum getrocknet. Zur Isolierung des Produktes wurde eine Kieselgel-

Säule (40 x 5 cm) mit Ethylacetat/Dichlormethan (1:5; v/v) als Laufmittel eingesetzt. Die

Ausbeute an dem weißen Feststoff 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin betrug 2,27 g ≙

51,35 % der Theorie.

7 Experimenteller Teil 127

Charakterisierung:

1. (+)-Catechin

NMR-Spektroskopie:

1H-NMR (Aceton-d6); chemische Verschiebungen δ in ppm:

6,91 (d, 2 Hz, 1H, H2’), 6,81 (d, 8 Hz, 1H, H5’), 6,77

(dd, 2 und 8 Hz, 1H, H6’), 6,03 (d, 2 Hz, 1H, H8), 5,89

(d, 2 Hz, 1H, H6), 4,57 (d, 7 Hz, 1H, H2), 4,01 (ddd, 4 -

7 Hz, 1H, H3), 2,92 (dd, 4 und 9 Hz, 1H, H4α), 2,54

(dd, 4 und 9 Hz, 1H, H4β).

13C-NMR (Aceton-d6); δ in ppm:

156,9 (C7), 156,7 (C5), 156,6 (C9), 145,2 (C3’,C4’), 131,8 (C1’), 119,7 (C6’), 115,3 (C5’),

114,9 (C2’), 100,2 (C10), 95,7 (C6), 95,0 (C8), 82,4 (C2), 67,9 (C3), 28,7 (C4).

2. 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin

NMR-Spektroskopie:

1H-NMR (CD2Cl2); chemische Verschiebun-

gen δ in ppm:

7,47 - 7,34 (m, 20H, H2’’ - H4’’), 7,07 (d, 2 Hz,

1H, H2’), 6,98 (m, 2H, H5’ und H6’), 6,29 (d,

2 Hz, 1H, H8), 6,21 (d, 2 Hz, 1H, H6), 5,14 -

5,02 (4s, 8H, O-CH2), 4,66 (d, 8 Hz, 1H, H2),

4,04 (ddd, 5 - 14 Hz, 1H, H3), 3,07 (dd, 5 und

14 Hz, 1H, H4α), 2,63 (dd, 8 und 14 Hz, 1H,

H4β).

13C-NMR (CD2Cl2); δ in ppm:

158,9 (C7), 157,9 (C5), 155,5 (C9), 149,3 (C3’), 149,1 (C4’), 137,5 - 137,2 (4C, C1’’),

131,3 (C1’), 128,7 - 127,3 (20C, C2’’ - C4’’), 120,6 (C6’), 114,7 (C5’), 113,8 (C2’), 102,5 (C10),

94,5 (C6), 93,8 (C8), 81,6 (C2), 71,2 - 70,0 (4C, O-CH2), 68,0 (C3), 27,8 (C4).

Massenspektrometrie (ESI, positive-Mode):

5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin wurde in Ethylacetat/Methanol/Ameisensäure im Verhältnis

3:1:0,5 (v/v/v) gelöst (β = 0,1 µg/µL) und mittels Direktinjektion vermessen (s. Kapitel 7.2.3).

Full-Scan 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin: m/z 651: Precursor-Ion [M+H]+

m/z 673: Natrium-Addukt [M+Na]+

m/z 689: Kalium-Addukt [M+K]+

Product-Scan von m/z 651: m/z 291: (+)-Catechin [M+H]+

m/z 319: Spaltung C-Ring

3,5,7,3’,4’-Penta-O-benzylcatechin: m/z 741: Precursor-Ion [M+H]+

m/z 763: Natrium-Addukt [M+Na]+

m/z 779: Kalium-Addukt [M+K]+

510

CH2

2''

3''

1''

4''

7 Experimenteller Teil 128

Darstellung von 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzyl-4-(2-Hydroxyethoxy)-catechin (3)

In einem Dreihalskolben mit Tropftrichter, Blasenzähler und Stickstoffballon wurden 3 g

(4,62 mmol) 5,7,3’,4’-Tetra-O-benzylcatechin in 30 mL wasserfreiem Dichlormethan gelöst.

Bei Raumtemperatur wurden unter Rühren nacheinander zuerst 1,5 mL (24,70 mmol) Ethy-

lenglycol gefolgt von 2,1 g (9,24 mmol) DDQ zugegeben. Hierbei fand ein Farbumschlag der

Reaktionslösung von schwarz-grün nach dunkelbraun statt, während schrittweise der Ausfall

eines hellgrauen Niederschlages in der Ethylenglycol-Phase zu beobachten war.

Nachfolgend wurde das Reaktionsgemisch 110 min bei RT stark durchmischt, mit 1,1 mL

(9,21 mmol) 4-Dimethylaminopyridin versetzt und erneut 5 min gerührt. Die nun intensiv

dunkelgrün gefärbte Reaktionslösung wurde mit 25 g Kieselgel versetzt und am Rotations-

verdampfer bei einer Wasserbadtemperatur von 35 °C bis zur Trockne eingeengt. Der

Rückstand wurde auf eine Kieselgelsäule (40 x 5 cm) aufgetragen und alle mobilen Produkte

mit dem Laufmittel Ethylacetat/Hexan (1:1; v/v) eluiert. Um das Produkt zu erhalten, wurde

mit Kieselgel und dem Laufmittel Ethylacetat/Hexan (2:3; v/v) rechromatographiert. Das Elu-

at wurde am Rotationsverdampfer eingeengt und der erhaltene kristalline weiße Feststoff in

Petrolether unter Zugabe von Dichlormethan umkristallisiert. Die erhaltene Ausbeute betrug

1,4 g ≙ 42,68 % der Theorie.

Charakterisierung:

NMR-Spektroskopie:

1H-NMR (CD2Cl2); chemische Verschiebungen δ in ppm:

7,48 - 7,33 (m, 20H, H2’’ - H4’’), 7,15 (d, 2 Hz,

1H, H2’), 7,00 (dd, 2 und 8 Hz, 1H, H6’), 6,97

(d, 8Hz, 1H, H5’), 6,29 (d, 2 Hz, 1H, H8), 6,16

(d, 2 Hz, 1H, H6), 5,28 (d, 8 Hz, 1H, H2), 5,14 -

5,01 (4s, 8H, O-CH2), 4,81 (d, 5 Hz, 1H, H4),

4,10 (dd, 5 und 12 Hz, 1H, H3), 3,83 (m, 1H,

H11), 3,62 (t, 5 Hz, 1H, H12).

13C-NMR (CD2Cl2); δ in ppm:

160,8 (C7), 158,6 (C5), 155,9 (C9), 149,0 (C3’),

148,8 (C4’), 137,3 - 136,8 (4C, C1’’), 131,5 (C1’),

128,7 - 127,5 (20C, C2’’ - C4’’), 122,0 (C6’),

114,8 (C5’), 114,1 (C2’), 104,2 (C10), 94,9 (C6),

94,0 (C8), 77,5 (C2), 73,5 (C11), 71,7 - 70,6

(4C, O-CH2), 71,6 (C3), 71,2 (C4), 62,7 (C12).

Massenspektrometrie (ESI, positive-Mode):

5,7,3’,4’-Tetra-O-benzyl-4-(2-Hydroxyethoxy)-catechin wurde in Acetonitril/Ameisensäure

5:0,1 (v/v) gelöst (β = 100 ng/µL) und mittels Direktinjektion vermessen (s. Kapitel 7.2.3).

Full-Scan: m/z 733: Natrium-Addukt [M+Na]+

Product-Scan von m/z 733: m/z 671: Abspaltung C2H5O2

510

CH2

2''

3''

1''

4''

7 Experimenteller Teil 129

7.5 Methodenentwicklung

7.5.1 Entwicklung der HPLC-DAD-Bedingungen für (+)-Catechin

7.5.1.1 UV-Absorptionsmaximum

Es wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung der Massenkonzentration β = 250 mg/L so-

wohl in Phosphatpuffer (pH 2) als auch in Essigsäure (2,5 %; v/v) und in DMF/H2O (2:1; v/v)

hergestellt (s. Kapitel 7.3.2) und diese mit dem in Kapitel 7.2.5 beschriebenen Spektropho-

tometer gegen die jeweilige Blindlösung vermessen.

7.5.1.2 pKs-Wert

In Vorversuchen wurde der Zusammenhang zwischen UV-Absorption und Konzentration der

(+)-Catechin-Lösung ermittelt. Die Endkonzentration der Messlösung wurde auf 200 mg/L

und somit auf eine Absorption von 1 eingestellt. Zur Herstellung der Messlösungen wurden

70 mL bidest. Wasser in einem Becherglas vorgelegt und mit 1 mL (+)-Catechin-Standard-

Lösung in DMF/H2O (2:1; v/v) der Konzentration 15 g/L versetzt. Unter Rühren erfolgte durch

tropfenweise Zugabe von Natronlauge (0,025; 0,05; 0,1 und 1 mol/L) die Einstellung der pH-

Werte von 9 bis 13 in 0,125er-Schritten (pH-Meter s. Kapitel 7.2.7). Die Herstellung der

Referenzlösung erfolgte äquivalent zur Messlösung, ohne Zusatz der (+)-Catechin-Lösung.

Die UV-Messung der jeweiligen Lösung gegen die Referenz erfolgte bei einer Wellenlänge

von 280 nm und wurde dreimal durchgeführt (Spektrophotometer s. Kapitel 7.2.5).

7.5.1.3 Mobile Phase

Zur Ermittlung einer geeigneten mobilen Phase wurde eine (+)-Catechin-Lösung der Mas-

senkonzentration β = 250 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst und mit der unter Kapitel 7.2.1

beschriebenen Gerätekombination zehnmal chromatographisch vermessen. In einer ersten

Versuchsreihe wurde als mobile Phase ein wie in Kapitel 7.3.1 beschriebener 0,01 molarer

Phosphatpuffer, weiterhin ein halb konzentrierter 0,005 molarer Phosphatpuffer sowie ein

0,01 molarer Phosphatpuffer ohne Zugabe von EDTA hergestellt und nacheinander vermes-

sen. Für den jeweiligen Phosphatpuffer (pH 2) und Acetonitril wurde der in Tabelle 27 be-

schriebene Gradientenverlauf eingesetzt (Gradient P1).

Tabelle 27: Zeitlicher Verlauf des Gradienten P1

Zeit [min] Mobile Phase A [%]

(Phosphatpuffer)

Mobile Phase B [%]

(Acetonitril)

0 100 0

30 90 10

40 100 0

45 100 0

7 Experimenteller Teil 130

In einer weiteren Versuchsreihe wurde die (+)-Catechin-Lösung der Massenkonzentration

β = 250 mg/L mittels HPLC-DAD unter Verwendung von Essigsäure der Konzentrationen

2,5 % (v/v) und 8 % (v/v) als mobile Phase chromatographisch vermessen. Hierzu wurden

die beiden Essigsäure-Lösungen wie in Kapitel 7.3.1 beschrieben hergestellt (Gradient E1).

Tabelle 28: Zeitlicher Verlauf des Gradienten E1

Zeit [min] Mobile Phase A [%]

(Essigsäure, 2,5 %; v/v)

Mobile Phase B [%]

(Essigsäure, 8 %; v/v)

0 95 5

5 90 10

30 70 30

35 50 50

40 95 5

45 95 5

7.5.1.4 Lösemittel der Messprobe

Es wurden (+)-Catechin Standard-Lösungen der Massenkonzentrationen β = 250 mg/L und

125 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v), Methanol, Ethanol, Ethylacetat und Essigsäure (2,5 % und

8 %; v/v) hergestellt und jeweils fünfmal mittels HPLC-DAD bei einer Wellenlänge von

280 nm untersucht. Für die Messungen wurden die in Tabelle 27 und 28 beschriebenen

Gradienten P1 und E1 eingesetzt.

7.5.1.5 Vorauswahl der analytischen Trennsäule

Um den Einfluss der Flussrate auf die Retentionszeit und die Basislinienbreite von

(+)-Catechin zu untersuchen, wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung der Konzentration

β = 250 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) mit den in Tabelle 29 aufgeführten Reversed-Phase-

Säulenmaterialien bei Flussraten von 150 µL/min bis maximal 2400 µL/min der Gradienten

P1 (s. Tabelle 27) und E1 (s. Tabelle 28) jeweils viermal chromatographisch untersucht.

Tabelle 29: Bezeichnung, Material, Dimension und Hersteller der eingesetzten

Reversed-Phase-Säulen

Bezeichnung Phase Particle Size/

Pore Size

Dimension

[mm]

Hersteller

Wakosil II 3C18 RS C18 3 µm, 120 Å,

unpolar endcapped

100 x 4,0 SGE Chromatographie-

Produkte/Darmstadt

Nautilus, Nucleosil,

100-5 C18

C18 5 µm, 100 Å,

polar endcapped

125 x 2,0 Macherey-Nagel/

Düren

YMC-Pack ODS-AM C18 5 µm, 120 Å,

unpolar endcapped

150 x 3,0 YMC Europe/

Schermbeck

Synergi 4µ Hydro RP C18 4 µm, 80 Å,

polar endcapped

250 x 2,0 Phenomenex/

Aschaffenburg

7 Experimenteller Teil 131

Fortsetzung von Tabelle 29:

Omnispher 5 C18 C18 5 µm, 110 Å,

nicht endcapped

250 x 3,0 Varian/

Darmstadt

Nucleosil 100 C18 C18 5 µm, 100 Å,

unpolar endcapped

250 x 4,0 Macherey-Nagel/

Düren

Chromolith

Performance RP-18e

C18 2 µm Macroporen,

Mesoporen,

unpolar endcapped

100 x 4,6 Merck/

Darmstadt

Nucleosil 50-5 C8 eC C8 5 µm, 50 Å,

unpolar endcapped

125 x 2,0 Macherey-Nagel/

Düren

Synergi 4µ Polar-RP Phenyl 4 µm, 80 Å,

polar endcapped

150 x 2,0 Phenomenex/

Aschaffenburg

Zorbax Phenyl 5 µm, 100 Å,

nicht endcapped

150 x 2,0 Phenomenex/

Aschaffenburg

Luna 5µ Phenyl-Hexyl Phenyl-

Hexyl

5 µm, 100 Å,

encapped

250 x 2,0 Phenomenex/

Aschaffenburg

Discovery RP-Amide

C16

C16,

Amid

5 µm, 180 Å,

encapped

150 x 2,1 Supelco/

Taufkirchen

Discovery Cyano CN 5 µm, 180 Å,

encapped

150 x 2,1 Supelco/

Taufkirchen

Discovery HS PEG Poly

ethylen

glycol

5 µm, 120 Å,

nicht endcapped

250 x 4,6 Supelco/

Taufkirchen

Discovery HS F5 Penta

fluoro

phenyl

5 µm, 120 Å,

encapped

250 x 4,6 Supelco/

Taufkirchen

7.5.2 Optimierung der Probenvorbereitung

7.5.2.1 Extraktion mit dem Ultra-Turrax

Für einen Extraktionsansatz zur Analyse wurde eine repräsentative 30 g Probe Braugerste

eingewogen, mit einer Getreidemühle (Modell 862; Jupiter/Schorndorf) fein gemahlen und

unter Lichtausschluss mit Hilfe der Gefriertrocknungsanlage Alpha 1-4 (Anlagensteuerung

LCD 1M; Christ/Osterode am Harz) lyophilisiert. Anschließend wurde die gemahlene Gerste

einmal unter Zusatz von 0,5 g (2,6 mmol) Natriumdisulfit mit 100 mL eines auf 4 °C gekühl-

ten Aceton/Wasser-Gemisches (3:1; v/v) versetzt und unter Kühlung (NaCl/Eiskältebad) mit

einem Ultra-Turrax (T25, mit Aufsatz SN 25, IKA-Labortechnik/Staufen) 1 min bei 24.000

U/min in einem Braunglas-Gefäß extrahiert. Der Extrakt wurde dann unter Wasserstrahl-

pumpenvakuum über eine Nutsche mit einem Schwarzband-Papierfilter (Schleicher &

Schüll/Dassel) abgesaugt. Die Extraktion wurde noch dreimal mit jeweils 100 mL des auf

4 °C temperierten Aceton/Wasser-Gemisches für jeweils 10 min wiederholt. Während der

Extraktion wurde die Temperatur des Extraktes mittels des NaCl/Eiskältebad auf maximal

30 °C gehalten. Die erhaltenen Filtrate wurden vereinigt und das Aceton am Rotationsver-

dampfer (Wasserbadtemperatur bis maximal 40 °C) entfernt. Die wässrige Phase wurde 4 h

7 Experimenteller Teil 132

bei -80 °C eingefroren und anschließend unter Lichtausschluss lyophilisiert. Der erhaltene

gelb-bräunliche Feststoff wurde entweder für eine längere Lagerungsdauer bei -80 °C einge-

froren oder für die chromatographische Bestimmung in DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst. Bei Ex-

traktionen mit größeren Ausgangsvolumina muss die Anzahl der Extraktionsschritte sowie

die Extraktionsmittelmenge äquivalent erhöht werden.

7.5.2.2 Mikrowellengestützte Extraktion (MSS)

Wie unter Kapitel 7.5.2.1, wurden für einen Extraktionsansatz 30 g einer repräsentativen

Gerstenprobe mit der Getreidemühle fein gemahlen. Anschließend wurde die gemahlene

Gerste in einem Rundkolben mit Flachboden mit 100 mL eines Aceton/Wasser-Gemisches

(3:1; v/v) unter Zusatz von 0,5 g (2,6 mmol) Natriumdisulfit in der Mikrowelle (s. Kapitel

7.2.6) unter Rühren extrahiert. Die Gesamtdauer des Extraktionsprogrammes betrug 15 min,

wobei nach einer fünf-minütigen Aufwärmphase der Mikrowelle auf 30 °C eine zehn-minütige

Extraktion bei 30 °C folgte. Der erhaltene Extrakt wurde abgesaugt und danach erneut noch

dreimal mit jeweils 100 mL Aceton/Wasser (3:1; v/v) aufgeschlämmt, erneut in der Mikrowel-

le extrahiert und abgesaugt. Die anschließenden Schritte der Extraktion wurden wie unter

Kapitel 7.5.2.1 beschrieben durchgeführt.

7.5.3 Optimierung der HPLC-DAD-Bedingungen

7.5.3.1 Gradientenverlauf

Zur Optimierung des Gradientenverlaufes wurden sowohl der mit dem Ultra-Turrax (s. Kapi-

tel 7.5.2.1) als auch der mittels MSS (s. Kapitel 7.5.2.2) gewonnene Gerstenextrakt mit der

unter Kapitel 7.2.1 beschriebenen Gerätekombination chromatographisch untersucht. Die

ausgehend von den Gradienten E1 und P1 (s. Kapitel 7.5.1.3) entwickelten und optimierten

Gradienten E2 und P2 sind in Tabelle 30 und Tabelle 31 aufgeführt.

Tabelle 30: Zeitlicher Verlauf des Essigsäure/Acetonitril-Gradienten E2

Zeit

[min]

Mobile Phase A [%]

(Essigsäure, 2,5 %; v/v)

Mobile Phase B [%]

(Essigsäure, 8 %; v/v)

Mobile Phase C [%]

(Acetonitril)

0 95 5 0

20 90 10 0

50 70 30 0

55 50 50 0

60 0 100 0

100 0 50 50

110 0 0 100

120 0 0 100

135 95 5 0

140 95 5 0

7 Experimenteller Teil 133

Tabelle 31 Zeitlicher Verlauf des Phosphatpuffer (pH 2)/Acetonitril-Gradienten P2

Zeit

[min]

Mobile Phase A [%]

(Phosphatpuffer)

Mobile Phase B [%]

(Acetonitril)

0 100 0

55 90 10

100 50 50

110 0 100

120 0 100

135 100 0

140 100 0

7.5.3.2 Analytische Trennsäulen

Zur Auswahl einer analytische Trennsäule wurden die in Tabelle 29 aufgeführten RP-Säulen

(mit Ausnahme der Säulen Wakosil II 3C18 RS; Nautilus, 100-5C; Nucleosil 50-5 C8 eC;

Discovery RP-Amide C16 und Discovery Cyano) auf ihre Eignung zur Trennung der Flavo-

noide in Gerstenextrakt untersucht. Hierzu wurden aufgearbeitete Gerstenproben bei Fluss-

raten von 150 µL/min bis maximal 2400 µL/min der Gradienten E2 (s. Tabelle 30) und P2

(s. Tabelle 31) jeweils viermal chromatographisch mit der unter Kapitel 7.2.1 beschriebenen

Gerätekombination untersucht.

7.5.3.3 Zusammenfassung der Methodenentwicklung: Allgemeingültige

Vorgehensweise zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste

Probenvorbereitung

Analyse

Mikrowelle (MSS)

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.2

Mikrowelle (MSS)

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.2

Ultra-Turrax

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.1

Ultra-Turrax

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.1

HPLC-DAD-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.1

HPLC-DAD-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.1

30 g Gerstenprobe

HPLC-DAD-MS/MS-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.2

HPLC-DAD-MS/MS-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.2

Probenvorbereitung

Analyse

Mikrowelle (MSS)

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.2

Mikrowelle (MSS)

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.2

Ultra-Turrax

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.1

Ultra-Turrax

Durchführung s. Kapitel 7.5.2.1

HPLC-DAD-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.1

HPLC-DAD-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.1

30 g Gerstenprobe

HPLC-DAD-MS/MS-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.2

HPLC-DAD-MS/MS-System

Durchführung s. Kapitel 7.2.2

Abbildung 49: Vorgehensweise zur Bestimmung von Flavonoiden in Gerste

7 Experimenteller Teil 134

7.6 Validierung des HPLC-DAD-Verfahrens

Die im folgenden beschriebenen Validierungsschritte des HPLC-DAD-Verfahrens zur Be-

stimmung von (+)-Catechin wurden mit der unter Kapitel 7.2.1 beschriebenen HPLC-Anlage

mit DAD-Detektor durchgeführt. Als mobile Phasen wurde sowohl der Essigsäure-Gradient

E2 als auch der Phosphatpuffer-Gradient P2 eingesetzt (s. Tabelle 30 und Tabelle 31). Die

Herstellung der mobilen Phasen erfolgte wie unter Kapitel 7.3.1 beschrieben. Eine zusam-

menfassender Überblick über die schematische Vorgehensweise ist in Abbildung 15 (s. Ka-

pitel 5.4.) dargestellt.

7.6.1 Linearer Bereich

Zur Bestimmung des linearen Bereiches wurden (+)-Catechin-Standard-Lösungen der Kon-

zentrationen 0,125 mg/L; 0,1875 mg/L; 0,25 mg/L; 0,625 mg/L; 1,25 mg/L; 1,875 mg/L;

2,5 mg/L; 6,25 mg/L; 12,5 mg/L; 18,75 mg/L; 25 mg/L; 62,5 mg/L; 125 mg/L; 187,5 mg/L;

250 mg/L; 625 mg/L; 1250 mg/L; 1875 mg/L und 2500 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) herge-

stellt und eine Zehnfach-Bestimmung durchgeführt.

7.6.2 Kalibriergerade

Der Arbeitsbereich wurde mit einer Massenkonzentration von 5 mg/L bis 2500 mg/L

(+)-Catechin in DMF/H2O (2:1; v/v) für die (+)-Catechin-Standard-Lösungen festgelegt. Mit

zehn gleichmäßig über diesen Bereich verteilten Konzentrationen (5 mg/L; 250 mg/L;

500 mg/L; 750 mg/L; 1000 mg/L; 1250 mg/L; 1500 mg/L; 1750 mg/L; 2250 mg/L und 2500

mg/L) wurden zur Ermittlung der Kalibriergeraden jeweils zehn Bestimmungen durchgeführt.

7.6.3 Stabilität von (+)-Catechin in Kalibrierlösungen

Zur Untersuchung der Stabilität von (+)-Catechin wurden Standard-Lösungen mit den Mas-

senkonzentrationen 5 mg/L, 250 mg/L und 500 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) hergestellt und

bei Temperaturen von 5 °C und 25 °C über 72 h unter Lichtausschluss gelagert. Die Kon-

zentrationen wurden in Intervallen von 140 min bestimmt.

Um die Stabilität unter Licht-Einwirkung zu untersuchen, wurden zwei Standard-Lösungen

(β = 125 und 250 mg/L) (+)-Catechin in UV-durchlässige Vials gefüllt, in einem

NaCl/Eiskältebad auf 5 °C temperiert, dem Sonnenlicht ausgesetzt und die Konzentrationen

mittels HPLC-DAD über 9 h verfolgt.

Die Untersuchung der Langzeitstabilität wurde wie im folgenden beschrieben durchgeführt:

es wurden zwei (+)-Catechin-Lösungen der Konzentrationen 125 mg/L und 250 mg/L in

DMF/H2O (2:1; v/v) angesetzt, bei -80 °C gelagert und in Zeitabständen von 1, 2, 8, 16, 22,

36, 65, 95, 99, 123, 165, 179, 190 und 219 Tagen bei einer Wellenlänge von 280 nm chro-

matographisch vermessen.

7 Experimenteller Teil 135

7.6.4 Stabilität von (+)-Catechin in Realproben

Zur Untersuchung der Stabilität von (+)-Catechin im Gerstenextrakt wurden drei Gerstenpro-

ben wie unter Kapitel 7.5.2.1 beschrieben aufgearbeitet. Zwei Analysenproben wurden bei

5 °C und 25 °C unter Lichtausschluss gelagert und in Zeitabständen von 160 min die

(+)-Catechin-Konzentration mittels HPLC-DAD bestimmt. Die dritte Analysenprobe wurde in

Aliquote aufgeteilt und diese bei einer Temperatur von -80 °C gelagert. Jedes zur Analyse

entnommene Aliquot wurde vor der HPLC-DAD-Bestimmung 2 h auf 5 °C temperiert.

7.6.5 Spezifität

7.6.5.1 Spezifitätstest durch Vergleich der Retentionszeiten

Zum Vergleich der Retentionszeiten des (+)-Catechin-Peaks wurde Gerste wie unter Kapitel

7.5.2.1 beschrieben aufgearbeitet, in zwei Aliquote zu 500 µL geteilt, und sowohl unter Ver-

wendung des Gradienten E2 (s. Tabelle 30) als auch des Gradienten P2 (s. Tabelle 31) mit-

tels HPLC-DAD vermessen. Zu 500 µL des zweiten Aliquotes Gerstenextrakt wurden 500 µL

einer (+)-Catechin-Standard-Lösung der Massenkonzentrationen β = 250 mg/L in DMF/H2O

(2:1; v/v) zudotiert und erneut injiziert.

7.6.5.2 Spezifitätstest durch Vergleich der Massenspektren

Es wurde eine Gerstenprobe wie unter Kapitel 7.5.2.2 beschrieben aufgearbeitet, in 3 mL

DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst und mit dem Gradienten E2 (s. Tabelle 30) sowie mit dem Gra-

dienten P2 (s. Tabelle 31) mit der unter Kapitel 7.2.2 beschriebenen LC-DAD-MS/MS-

Gerätekombination chromatographiert. Zusätzlich wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung

(β = 125 mg/L) mit dem Gradienten E2 analysiert.

7.6.6 Präzision

7.6.6.1 Messpräzision

Zur Ermittlung der Messpräzision wurden drei (+)-Catechin-Standard-Lösungen sowie zwei

Gerstenproben (s. Kapitel 7.5.2.1) jeweils unter Verwendung des Gradienten E2 (s. Tabelle

30) sowie des Gradienten P2 (s. Tabelle 31) zehnmal injiziert und mittels HPLC-DAD (s. Ka-

pitel 7.2.1) vermessen.

7.6.6.2 Methodenpräzision

Zur Ermittlung der Methodenpräzision unter Wiederholbedingungen wurden 360 g Gerste

der Sorte „Annabell“ sowie „Viskosa“ fein gemahlen und in Aliquote zu 30 g aufgeteilt. Sechs

Aliquote wurden dann wie unter Kapitel 7.5.2.1 und die weiteren sechs wie unter Kapitel

7.5.2.2 beschrieben aufgearbeitet. Der jeweils erhaltene Rückstand wurde für die chroma-

7 Experimenteller Teil 136

tographische Bestimmung in DMF/H2O (2:1; v/v) gelöst und mit der unter Kapitel 7.2.1 be-

schriebenen Gerätekombination mit dem Gradienten E2 (s. Tabelle 30) vermessen.

7.6.6.3 Tag-zu-Tag-Präzision

Zur Ermittlung der Tag-zu-Tag-Präzision wurden zwei (+)-Catechin-Standard-Lösungen der

Konzentration β = 125 mg/L und 250 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) mit den in Tabelle 29 auf-

geführten Alkyl-modifizierten RP-Säulenmaterialien bei Flussraten von 200 µL/min bis 1000

µL/min des Gradienten E1 (s. Tabelle 28) jeweils viermal chromatographisch untersucht.

7.6.7 Wiederfindung

Zur Ermittlung der Wiederfindungsrate wurden 480 g Gerste „Annabell“ mit der Getreide-

mühle fein gemahlen und in 16 Aliquote aufgeteilt. Zu je vier Aliquoten wurden 10 mg, 20 mg

und 30 mg (+)-Catechin-Trockensubstanz zudotiert. Jeweils zwei dieser Aliquote sowie je

zwei undotierte Proben wurden mit dem Ultra-Turrax (s. Kapitel 7.5.2.1) und parallel dazu

die anderen Proben mit der MSS (s. Kapitel 7.5.2.2) aufgearbeitet und anschließend unter

Einsatz des Gradienten E2 (s. Tabelle 30) mit der HPLC-DAD chromatographiert.

7.6.8 Robustheit

7.6.8.1 Einfluss des Packungsmaterials der Trennsäule

Es wurden die erhaltenen Messwerte aus Kapitel 7.5.1.5 herangezogen.

7.6.8.2 Einfluss des pH-Wertes der mobilen Phase

Es wurde eine (+)-Catechin-Standard-Lösung (β = 125 mg/L) mit der unter Kapitel 7.2.1 be-

schriebenen Gerätekombination jeweils zehnmal chromatographisch untersucht. Dazu wur-

de der Gradient P2 (s. Tabelle 31) mit der unter Kapitel 7.3.1 beschriebenen Phosphatpuf-

fer-Zusammensetzung eingesetzt. Zusätzlich wurden ein 0,005 mol/L Phosphatpuffer pH 2

(0,69 g NaH2PO4*H2O in 1000 mL bidest. Wasser), ein 0,01 mol/L Phosphatpuffer pH 3 und

ein 0,01 mol/L Phosphatpuffer pH 2 ohne Zusatz von EDTA verwendet.

7.7 Identifizierung in Gerste enthaltener Flavonoide mittels

LC-DAD-MS/MS-Kopplung

7.7.1 Kollisionsexperimente mit monomeren Flavonoiden

Es wurden Lösungen mit (+)-Catechin, (-)-Epicatechin, (-)-Gallocatechin und (-)-Epigallo-

catechin (β = 125 mg/L) in DMF/H2O (2:1; v/v) hergestellt und diese durch Direktinjektion

7 Experimenteller Teil 137

sowie durch chromatographische Bestimmungen mit dem Gradienten E2 (s. Tabelle 30) mit

der unter Kapitel 7.2.2 beschriebenen Gerätekombination untersucht. Für die MSn-

Untersuchungen wurde die Kollisionsenergie in 10er-Schritten von 10 % auf 60 % erhöht, die

MS3-Experimente wurden mit einer CID-Energie von 30 % sowie 50 % durchgeführt.

7.7.2 Precursor-Ion-Scan-Experimente mit Gerstenextrakten

Zur Identifizierung der einzelnen Gersteninhaltsstoffe wurde Gerste, wie unter Kapitel 7.5.2.1

beschrieben, aufgearbeitet und die Messproben mit den Gradienten E2 und P2 mittels LC-

DAD-MS/MS (s. Kapitel 7.2.2) über einen Massenbereich von m/z 50 - 2000 gescannt.

7.7.3 Identifizierung einzelner Gersteninhaltsstoffe durch MSn-

Untersuchungen

Die Kollisionsexperimente wurden an wie unter Kapitel 7.5.2.1 beschrieben aufgearbeiteten

Gerstenextrakten durchgeführt. Als mobile Phase wurden die Gradienten E2 und P2 einge-

setzt. Für die MSn-Untersuchungen wurde die Energie in 10er-Schritten von 10 % auf 60 %

erhöht, die MS3-Experimente wurden mit CID-Energien von 30 % und 50 % durchgeführt.

7.8 Bestimmung von Flavonoiden in Realproben

7.8.1 Bestimmung von Flavonoiden in Sommergersten mittels

HPLC-DAD

Es wurden jeweils repräsentative 30 g Proben Braugerste der Sorten „Annabell“ (Tausend-

Korn-Gewicht: 54,5 g; Keimfähigkeit: 96), „Henni“ (Tausend-Korn-Gewicht: 42,8 g; Keim-

fähigkeit: 98) und „Viskosa“ (Tausend-Korn-Gewicht: 51,2 g; Keimfähigkeit: 97) des Ernte-

jahres 2000, bezogen von der Hordsaat Saatzucht GmbH/Böhnshagen, fein gemahlen,

lyophilisiert und anschließend wie unter Kapitel 7.5.2.1 beschrieben aufgearbeitet. Der erhal-

tene Rückstand wurde in 3 mL DMF/H2O (2:1; v/v) aufgenommen und mit der unter Kapitel

7.2.1 beschriebenen Gerätekombination jeweils fünfmal (Gradient E2, s. Tabelle 30) chro-

matographisch vermessen.

7.8.2 Bestimmung von Flavonoiden in Brauprozessproben mittels

LC-DAD-MS/MS

7.8.2.1 Kalibrierung des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens

Die Kalibrierungsuntersuchungen des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens zur Bestimmung von

(+)-Catechin wurden mit der unter Kapitel 7.2.2 beschriebenen HPLC-Anlage mit DAD- und

MS-Detektor mit dem Gradienten E2 als mobile Phase durchgeführt (s. Tabelle 30).

7 Experimenteller Teil 138

Zur Bestimmung des linearen Bereiches wurden (+)-Catechin-Standard-Lösungen der

Konzentrationen 0,0625 mg/L; 0,125 mg/L; 0,1875 mg/L; 0,25 mg/L; 0,625 mg/L; 1,25 mg/L;

1,875 mg/L; 2,5 mg/L; 6,25 mg/L; 12,5 mg/L; 18,75 mg/L; 25 mg/L; 62,5 mg/L; 125 mg/L;

187,5 mg/L; 250 mg/L; 1250 mg/L; 1875 mg/L und 2500 mg/L in DMF/H2O (2:1; v/v) herge-

stellt und jeweils eine Zehnfach-Bestimmung durchgeführt. Nach Festlegung des Arbeitsbe-

reiches von 1,875 mg/L bis 2500 mg/L (+)-Catechin wurden zur Ermittlung der Kalibrier-

funktion mit zehn gleichmäßig über diesen Bereich verteilten Konzentrationen jeweils zehn

Analysen durchgeführt: 1,875 mg/L; 50 mg/L; 500 mg/L; 750 mg/L; 1000 mg/L; 1250 mg/L;

1500 mg/L; 1750 mg/L; 2250 mg/L und 2500 mg/L.

7.8.2.2 Bestimmung der Flavonoide in Brauprozessproben

Zur Flavonoid-Bestimmung in verschiedenen Brauprozessproben wurde von der Warsteiner-

Brauerei (Warstein) ein Bierbrauprozess exemplarisch nachgestellt. Die während des Brau-

prozesses gezogenen Proben sind in Tabelle 32 zusammengestellt.

Tabelle 32: Brauprozessproben: Bezeichnung, entnommenes Probevolumen, Gewicht

sowie erhaltene Menge an Trockensubstanz nach Lyophilisierung

Probenbezeichnung Volumen [mL] Gewicht [g] Trockensubstanz nach

Lyophilisierung [g]

Maischen

1. Malz - 30 -

2. Ende Einmaischen 480 518,8 114,9

3. Ende Maischen 480 506,0 109,1

Läutern

4. Mitte Vorderwürze 475 506,7 68,6

5. Mitte Nachguss 480 481,6 10,6

6. Ende Nachguss 480 472,8 3,0

Würzekochen

7. Anfang Kochen 460 472,8 51,6

8. Mitte Kochen 411 430,2 28,2

9. Ende Kochen 420 420,0 46,9

Whirlpool

10. Whirlpool Rast Anfang 420 443,0 50,8

11. Whirlpool Rast Ende 430 442,2 50,4

Kühlung

12. Kühlen Anfang 440 457,8 39,5

13. Kühlen Mitte 400 400,9 21,1

14. Kühlen Ende 440 457,8 60,2

Gärung

15. Gärung 1. Tag 510 563,8 22,6

16. Gärung 3. Tag 585 589,9 22,4

17. Gärung 6. Tag 560 563,8 22,0

18. Schlauchen 510 501,7 16,0

7 Experimenteller Teil 139

Fortsetzung von Tabelle 32:

Bier

19. unfiltriertes Bier 438 440,3 16,5

20. nach Kieselgurfilter 465 467,2 15,9

21. nach PVPP 500 501,1 18,3

22. nach Schichtenfilter 449 449,3 16,7

23. abgefülltes Bier 500 501,3 19,2

Prozessführung und Probenahme:

Das für einen Braudurchgang eingesetzte Malz (9450 kg) setzte sich, wie in Tabelle 33

aufgeführt, aus 10 verschiedenen Malzsorten zusammen.

Tabelle 33: Zusammensetzung des zum Brauen eingesetzten Malzes

Sorte Menge [kg] Sorte Menge [kg]

Soufflet 1150 Durst 1300

Mainmalz 550 Malteurop 2000

Schweinfurt 600 Palatia a 500

Bamberger 850 Palatia b 950

Weissheimer 550 Thywissen 1000

Maischen: Zum Maischen wurde eine Gesamtschüttung von 9450 kg Malz mit 358 hL Was-

ser, dem sogenannten Hauptguss, und 65 hL Glattwasser eingesetzt. Die Maischzeit betrug

insgesamt 93 min. Der hierbei eingesetzte Temperaturverlauf ist in Abbildung 45 (s. Kapitel

5.7.2.2) dargestellt. Die erste Probenahme erfolgte am Ende des Einmaischens (2. Probe

Ende Einmaischen) und die zweite Probenahme am Ende des Maischens jeweils mit einer

Schöpfkelle direkt aus dem Maischbottich (3. Probe Ende Maischen).

Läutern: Zum sogenannten Abläutern, dem Filtern der Maische, um Treber (feste Bestand-

teile) und Würze (Flüssigkeit) vollständig voneinander abzutrennen, wurde die Maische in

den sogenannten Läuterbottich gepumpt. Die Vorderwürze bestand hierbei aus 260 hL

Wasser. Nach 130 hL wurde die 4. Probe Mitte Vorderwürze direkt mit einer Schöpfkelle

entnommen. Der Nachguss bestand aus 380 hL Wasser. Die Probenahme erfolgte hier ein-

mal nach 160 hL (5. Probe Mitte Nachguss) sowie nach 380 hL am Ende des Nachgusses

(6. Probe Ende Nachguss). Die letzten Nachgüsse (32 hL) heißen Glattwasser, sind kaum

noch würzehaltig, und wurden deshalb zum Einmaischen des nächsten Sudes verwendet.

Würzekochen: Die Vorderwürze und die Nachgüsse wurden in der Würzpfanne (Würzkes-

sel) gesammelt, und am Ende des Läutervorganges, dem sogenannten Zeitpunkt „Pfanne

voll“, wurde damit begonnen, die Würze zu kochen. Die Hopfengabe (CO2- und Ethanol-

Extrakt) erfolgte in mehreren Schritten. Der Temperaturverlauf des insgesamt 62-minütigen

Würzekochens ist in Abbildung 46 (s. Kapitel 5.7.2.2) dargestellt. Die Probenahmen über

einen Auslasshahn erfolgten nach fünf-minütigem (7. Probe Anfang Kochen), nach

30-minütigem (8. Probe Mitte Kochen) sowie nach 62-minütigem (9. Probe Ende Kochen)

Kochen der Würze.

7 Experimenteller Teil 140

Whirlpool: Nach dem Hopfensud wurde die Würze ausgeschlagen. Dann wurde die heiße

Würze (bei etwa 98 °C) in den sogenannten Whirlpool transferiert, und es wurden die Ei-

weiß- und Hopfenbestandteile (Heißtrub) abgetrennt. Der Vorgang dauerte 20 min und es

wurde zu Beginn (10. Probe Whirlpool Rast Anfang) und am Ende (11. Probe Whirlpool

Rast Ende) eine Probe entnommen.

Kühlung: Nachfolgend wurde die Würze über einen Zeitraum von 52 min auf eine Tempera-

tur von etwa 12 °C abgekühlt. Die Probenahme erfolgte nach 5 Minuten (12. Probe Kühlen

Anfang), nach 25 Minuten (13. Probe Kühlen Mitte) und nach 50 min (14. Probe Kühlen

Ende).

Gärung: Nach Beendigung des Kühlvorganges wurde die Würze in die sogenannten Gär-

bottiche bzw. Gärtanks gepumpt und Hefe zugesetzt, um die Gärung, die Umwandlung des

Malzzuckers in Alkohol und Kohlensäure, zu starten. Während der Gärung wurden Proben

am ersten Tag (15. Probe Gärung 1. Tag), am dritten Tag (16. Probe Gärung 3. Tag) und

am sechsten Tag (17. Probe Gärung 6. Tag), dem Ende der Hauptgärung, gezogen. Zur

Reifung wurde das Bier dann in Lagertanks abgefüllt. Bei diesem sogenannten zehnstündi-

gen „Schlauchen“ wird die Hefe abgetrennt. Hierbei erfolgte erneut eine Probenahme

(18. Probe Schlauchen).

Bier: Im Anschluss an die Reifung des Jungbieres wurden drei Filtrationsschritte des gereif-

ten Bieres durchgeführt. Um den Einfluss dieser Schritte auf die Flavonoid-Abtrennung zu

untersuchen, wurden Proben des unfiltrierten Bieres (19. Probe unfiltriertes Bier), im An-

schluss an die Kieselgurfiltration (20. Probe nach Kieselgurfilter), im Anschluss an die Filt-

ration über PVPP (21. Probe nach PVPP) und im Anschluss an die abschließende Filtration

über einen Schichtenfilter (22. Probe nach Schichtenfilter) entnommen. Das nun fertige

Bier wurde in Flaschen abgefüllt und abschließend der Flavonoid-Gehalt bestimmt (23. Pro-

be abgefülltes Bier).

Probenvorbereitung: Nach der Probenahme wurden die Proben des Maischens und des

Läuterns 10 min in einem Wasserbad (15 °C) auf RT abgekühlt, bei -80 °C eingefroren und

anschließend lyophilisiert. Bei den Proben des Würzekochens, aus dem Prozess im Whirl-

pool, sowie beim Kühlen wurde vor dem Abkühlen auf RT ein Zentrifugationsschritt zur Ab-

trennung der festen Bestandteile vorgeschaltet. Die Proben der Gärung und des gebrauten

Bieres wurden ohne Vorbehandlung direkt bei -80 °C eingefroren und lyophilisiert.

Zur chromatographischen Bestimmung wurden die jeweiligen Proben in DMF/H2O (2:1;

v/v) gelöst, und unter Verwendung der in Kapitel 7.2.2 beschriebenen LC-DAD-MS/MS Gerä-

tekombination mit dem Gradienten E2 (s. Tabelle 30) analysiert, mit Ausnahme der Malz-

probe und der Proben der Maische. Hier wurden für jede Doppelbestimmung 30 g Trocken-

substanz eingewogen und mit der Getreidemühle Jupiter fein gemahlen. Anschließend wur-

den die gemahlenen Proben wie unter Kapitel 7.5.2.1 beschrieben aufgearbeitet, die erhal-

tenen Feststoffe in DMF/H2O (2:1; v/v) aufgenommen und mittels HPLC-DAD-MS/MS unter-

sucht.

8 Literatur 141

8 Literatur

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A Anhang A-1

A Anhang

INHALTSVERZEICHNIS

A ANHANG...................................................................................................................A-1

A.1 Bestimmung des pKs-Wertes von (+)-Catechin................................................A-2

A.2 Säulentest............................................................................................................A-3

A.3 Kalibrierdaten des HPLC-DAD-Verfahrens .......................................................A-6

A.4 Ausreißertest nach GRUBBS.............................................................................A-8

A.5 Anpassungstest nach MANDEL [279]...............................................................A-8

A.6 Residualanalyse................................................................................................A-11

A.7 Test auf Homogenität der Varianzen...............................................................A-11

A.8 Absicherung der unteren Arbeitsgrenze ........................................................A-12

A.9 Empfindlichkeit .................................................................................................A-12

A.10 Stabilitätsberechnungen ..................................................................................A-13

A.11 Tag-zu-Tag-Präzision........................................................................................A-13

A.12 Übersicht der Messdaten der MSn-Untersuchungen .....................................A-14

A.13 Kalibrierdaten des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens .............................................A-36

A Anhang

A-2

A.1 Bestimmung des pKs-Wertes von (+)-Catechin

Die Bestimmung der pKs-Werte von (+)-Catechin erfolgte photometrisch durch Ermittlung von

A-pH-Diagrammen. Am Wendepunkt der ermittelten Titrationskurve ist die Konzentration der

Säure äquivalent ihrer korrespondierenden Base, daher gilt hier: pH = pKs. In Abbildung A.1

ist die ermittelte Absorption gegen den pH-Wert der jeweiligen Messlösung aufgetragen. In

dem pH-Bereich von 10,9 zeigen die Absorptionswerte eine sprunghafte Zunahme. Dieser

Kurvenverlauf lässt sich durch die sigmoidale Boltzmann Funktion

y = (a1 - a2) / 1 + exp ((x - xo) / dx) + a2

mit den Koeffizienten a1 = 0,8924; a2 = 1,2558 und dx = 0,0212 beschreiben [311]. Zur Er-

mittlung des pKs-Wertes von (+)-Catechin wurde der Wendepunkt dieser Funktion über die 2.

Ableitung berechnet. Der Wendepunkt liegt bei einem pH-Wert von 10,9 und entspricht damit

dem pKs1-Wert.

Abbildung A.1: A-pH-Diagramm einer (+)-Catechin-Lösung (

= 200 mg/L) bei 280 nm

(n = 3)

Da das Gerüst des (+)-Catechin-Moleküls insgesamt fünf Hydroxylgruppen beinhaltet, sollte

der Kurvenverlauf, wenn sich die pKs-Werte signifikant unterscheiden, erwartungsgemäß vier

weitere sprunghafte Änderungen des Absorptionsverhalten bei Erhöhung des pH-Wertes und

damit vier weitere pKs-Werte aufzeigen. Bei der Einstellung auf pH-Werte > 12 zeigten die

Absorptionswerte der (+)-Catechin-Lösungen einen starken Anstieg ohne sichtbare Wende-

punkte, d.h. eine Bestimmung der anderen pKs-Werte konnte nicht erfolgen.

pH-Wert

Absorption

9 10 11 12 13

2,4

2,2

2,0

1,8

1,6

1,4

1,2

1,0

0.8

A Anhang A-3

A.2 Säulentest

Zum absoluten Vergleich von Trennsäulen erweisen sich dimensionslose Größen als am

besten geeignet [263]. Hierzu erfolgt im ersten Schritt die Berechnung der Bodenzahl N (s.

Gleichung A.1). Mit Gleichung A.2 lässt sich die reduzierte Trennstufenhöhe h ermitteln.

Gleichung A.1:

5,54 N 













mit: Rt = Retentionszeit [min]

= Peakbreite [min]

Gleichung A.2:

d N

L 1000

⋅

mit: Lc = Säulenlänge [mm]

p = Teilchendurchmesser [µm]

Anstelle der Flussrate F der mobilen Phase wird die reduzierte Fließgeschwindigkeit ν be-

rechnet. Hierzu wird die für Umkehrphasen vereinfachte Gleichung A.3 herangezogen.

Gleichung A.3:

()

F d

27 ⋅

≈

mit: F = Flussrate der mobilen Phase [mL/min]

c = Säulendurchmesser [mm]

In Tabelle A.1 und A.2 sind die berechneten Kenngrößen für die analytischen Trennsäulen

bei Verwendung des Gradienten E1 und P1 zusammengestellt.

Tabelle A.1: Ermittelte Kenngrößen der analytischen Trennsäulen (Gradient E1)

Analytische

Trennsäule

Flussrate

[µL/min]

[min]

N h ν

νν

Wakosil C18 200

400

500

15,6

11,5

9,8

2,1

1,0

0,8

900

2027

2770

37,0

16,0

12,0

1,0

2,0

2,5

Nautilus C18 200

400

600

800

17,5

13,9

11,5

8,8

13,4

7,1

2,8

1,5

271

530

917,0

409,0

92,0

47,0

6,8

13,5

20,3

27,0

YMC C18 200

400

600

800

1000

38,5

23,5

17,2

13,5

11,1

1,6

0,9

0,7

0,5

9094

9933

11221

10199

9276

3,3

3,0

2,7

2,9

3,2

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Synergi C18 200

400

500

46,8

26,3

21,8

1,4

1,0

0,9

18121

11519

10079

3,5

5,4

6,2

5,4

10,8

13,5

A Anhang

A-4

Fortsetzung von Tabelle A.1:

Omnispher C18 200

400

600

800

1000

55,9

20,5

14,8

12,4

10,2

4,7

1,3

1,1

0,8

0,9

2226

4337

3006

3812

2102

22,5

11,5

16,6

13,1

23,8

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Nucleosil C18 200

400

600

800

1000

1200

90,3

67,2

45,1

40,9

33,8

28,9

15,1

8,0

5,2

3,7

3,0

2,3

579

1129

1302

1955

2034

2531

86,2

44,2

38,4

25,5

24,5

19,7

1,7

3,4

5,1

6,8

8,4

10,1

Chromolith C18 200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

32,2

20,9

14,8

11,3

9,2

7,3

6,7

5,9

5,2

4,7

4,1

2,3

1,1

0,7

0,5

0,4

0,3

0,2

3194

6027

7187

7394

6974

5953

6360

6109

5974

5671

5664

15,7

8,3

7,0

6,8

7,2

8,4

7,9

8,2

8,4

8,8

0,5

1,0

1,5

2,0

2,6

3,1

3,6

4,1

4,6

5,1

5,6

Nucleosil C8 200

400

600

800

6,6

3,7

2,8

2,1

1,9

1,4

0,8

0,6

183

107

176

195

137,0

234,0

142,0

128,0

6,8

13,5

20,3

27,0

Synergi Phenyl 200

400

600

800

21,1

12,3

8,3

6,2

3,3

1,4

0,9

0,7

667

1171

1466

1437

56,3

32,0

25,6

26,1

5,4

10,8

16,2

21,6

Zorbax Phenyl 200

400

600

800

30,1

12,1

8,4

6,3

1,9

1,0

0,6

0,5

4202

2319

2911

2401

7,1

12,9

10,3

12,5

6,8

13,5

20,3

27,0

Luna Phenyl-Hexyl 200

400

600

38,2

19,9

13,5

1,3

0,8

0,6

13836

9643

7612

3,6

5,2

6,6

6,8

13,5

20,3

Discovery

C16 Amid

200

400

600

800

24,2

14,2

9,5

7,3

7,9

2,6

1,2

0,8

148

487

1090

1227

202,4

61,6

27,5

24,5

6,1

12,2

18,4

24,5

Discovery Cyano 200

400

7,0

3,2

2,2

1,3

157

191,0

322,4

6,1

12,2

Discovery

Polyethylenglycol

600

800

1000

1200

50,5

38,6

31,6

26,1

1,8

1,2

1,1

1,0

12320

15503

13219

11596

4,1

3,2

3,8

4,3

3,8

5,1

6,4

7,7

Discovery

Pentafluorophenyl

600

800

27,4

15,9

2,7

2,2

1669

813

30,0

61,5

3,8

5,1

A Anhang A-5

Tabelle A.2: Ermittelte Kenngrößen der analytischen Trennsäulen (Gradient P1)

Analytische

Trennsäule

Flussrate

[µL/min]

[min]

N h ν

νν

Wakosil C18 200

300

400

34,6

32,5

28,0

3,8

0,7

0,6

1311

39073

38230

25,1

0,9

1,0

1,5

2,0

Nautilus C18 200

400

600

800

44,6

31,5

24,7

20,8

2,3

0,9

6165

17956

12100

8930

4,0

1,4

2,0

2,8

6,8

13,5

20,3

27,0

YMC C18 200

400

600

800

1000

49,7

35,5

29,3

25,4

22,5

1,0

0,4

39795

119836

97573

80703

66109

0,8

0,3

0,4

0,5

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Synergi C18 200

300

400

500

49,9

42,0

36,0

32,3

1,1

0,5

0,4

32870

117366

106483

99068

1,9

0,5

0,6

5,4

8,1

10,8

13,5

Omnispher C18 200

400

600

800

1000

20,2

32,9

27,4

25,0

23,3

3,3

0,7

0,9

0,7

0,6

598

32692

15652

22246

28042

83,7

1,5

3,2

2,3

1,8

3,0

6,0

9,0

12,0

15,0

Nucleosil C18 200

400

600

800

1000

1200

65,1

49,3

42,5

36,5

34,2

31,3

8,1

4,5

3,6

2,4

1,8

1,2

1057

1897

2304

3702

5715

10850

473,0

26,3

21,7

13,5

8,7

4,6

1,7

3,4

5,1

6,8

8,4

10,1

Chromolith C18 200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

49,6

34,1

27,6

23,5

20,8

18,9

17,3

16,3

15,2

14,3

13,7

12,9

1,8

0,5

0,4

0,3

12434

63962

57739

52417

46625

41507

39142

36302

32843

31444

30898

27388

4,0

0,8

0,9

1,0

1,2

1,3

1,4

1,5

1,6

1,8

0,5

1,0

1,5

2,0

2,6

3,1

3,6

4,1

4,6

5,1

5,6

6,1

Nucleosil C8 200

400

600

800

6,8

10,0

6,9

5,3

5,4

2,6

1,5

1,1

246

331

350

955,5

101,6

75,5

71,4

6,8

13,5

20,3

27,0

Synergi Phenyl 200

400

600

800

35,7

21,5

15,8

12,0

4,0

0,9

0,8

0,7

1251

8890

6895

5341

30,0

4,2

5,4

7,0

5,4

10,8

16,2

21,6

Zorbax Phenyl 200

400

600

800

37,8

23,8

17,9

14,2

3,7

0,8

0,7

1664

13112

9400

6937

18,0

2,3

3,2

4,3

6,8

13,5

20,3

27,0

A Anhang

A-6

Fortsetzung von Tabelle A.2:

Luna Phenyl-Hexyl 200

300

400

500

600

45,6

37,5

31,8

13,7

17,7

1,5

0,6

0,5

4,8

1,6

15360

64485

62107

130

1930

3,3

0,8

384,6

25,9

6,8

10,1

13,5

16,9

20,3

Discovery

C16 Amid

200

400

600

800

45,9

27,3

21,0

17,2

2,7

0,7

0,6

4772

24402

17561

13883

6,3

1,2

1,7

2,2

6,1

12,2

18,4

24,5

Discovery Cyano 200

400

5,4

3,4

2,8

1,4

508,2

316,0

6,1

12,2

Discovery

Polyethylenglycol

400

600

800

1000

1200

56,3

43,6

35,8

30,5

26,9

0,8

0,7

83204

52706

36533

30324

25847

0,6

1,0

1,4

1,7

1,9

2,6

3,8

5,1

6,4

7,7

Discovery

Pentafluorophenyl

200

400

600

800

1000

75,3

56,2

46,8

41,0

36,8

0,6

0,4

269371

332000

269996

207642

158128

0,2

0.2

0,2

0,3

1,3

2,6

3,8

5,1

6,4

A.3 Kalibrierdaten des HPLC-DAD-Verfahrens

Tabelle A.3: Mittelwerte und relative Standardabweichungen srel für Peakflächen sowie

Peakhöhen zur Bestimmung des linearen Bereiches (Gradient E2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

Peakhöhe

[mAU]

Peakfläche y

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche srel

[%]

0,125 0,03 0,05 29,03

0,1875 0,07 0,09 25,46

0,25 0,11 0,13 199,33

0,625 0,16 0,24 115,45

1,25 0,25 0,38 59,88

1,875 0,40 0,65 5,69

2,5 0,67 0,92 2,49

6,25 1,66 2,49 1,98

12,5 3,41 5,29 0,54

18,75 5,11 7,91 1,90

25 6,92 10,80 1,36

62,5 17,05 27,66 0,26

125 34,51 55,74 0,34

187,5 53,05 85,75 0,14

250 70,04 113,51 0,21

625 170,69 279,78 0,12

1250 367,08 575,94 0,13

1875 521,10 862,79 0,06

2500 645,97 1141,53 0,03

A Anhang A-7

Tabelle A.4: Mittelwerte und relative Standardabweichungen srel für Peakflächen sowie

Peakhöhen zur Bestimmung des linearen Bereiches (Gradient P2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

Peakhöhe

[mAU]

Peakfläche y

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche srel

[%]

0,125 0,09 0,04 125,35

0,1875 0,12 0,05 24,45

0,25 0,13 0,06 18,92

0,625 0,28 0,15 8,08

1,25 0,76 0,55 5,00

1,875 1,04 0,74 3,62

2,5 1,43 1,04 2,93

6,25 3,65 2,61 0,83

12,5 8,49 6,10 1,40

18,75 11,73 8,35 1,16

25 16,28 11,16 0,30

62,5 40,86 28,17 1,44

125 79,95 55,81 1,06

187,5 123,04 84,55 0,56

250 160,97 112,74 0,57

625 384,02 278,98 0,62

1250 704,06 563,51 0,91

1875 949,31 842,07 0,63

2500 1152,46 1116,36 0,31

Tabelle A.5: Mittelwerte, Standardabweichungen und relative Standardabweichungen srel

der Peakflächen zur Bestimmung der Kalibrierfunktion (Gradient E2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

Peakfläche y

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche s

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche srel

[%]

5 2,49 0,04 1,61

250 113,51 0,24 0,21

500 229,75 0,51 0,22

750 346,54 0,59 0,17

1000 457,85 0,27 0,06

1250 575,94 0,75 0,13

1500 684,81 0,34 0,05

1750 800,91 1,84 0,23

2250 1005,85 0,80 0,08

2500 1141,53 0,34 0,03

A Anhang

A-8

Tabelle A.6: Mittelwerte, Standardabweichungen und relative Standardabweichungen srel

der Peakflächen zur Bestimmung der Kalibrierfunktion (Gradient P2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

Peakfläche y

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche s

[mAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche srel

[%]

5 2,43 0,03 1,23

250 112,51 0,56 0,50

500 223,07 2,10 0,94

750 332,28 1,46 0,44

1000 441,14 3,22 0,73

1250 553,74 8,31 1,50

1500 660,62 3,90 0,59

1750 770,03 10,86 1,41

2250 974,79 5,07 0,52

2500 1090,33 18,72 1,64

A.4 Ausreißertest nach GRUBBS

Der Ausreißertest nach GRUBBS [272, 281] wird zur Aufdeckung einzelner Ausreißerwerte in

einer Analysenserie genutzt. Hierzu wird der Mittelwert y (s. Gleichung A.4) der Messwerte

einer Analysenserie gebildet und die Standardabweichung s der Analysendaten berechnet.

Durch Einsetzen in Gleichung A.5 wird für den Analysenwert y* mit der größten Differenz

zum Mittelwert überprüft, ob es sich um einen Ausreißer handelt.

Gleichung A.4: ∑

⋅=

Gleichung A.5: s

*−

Der ermittelte Prüfwert PW wird mit den statistischen Tabellenwerten rM für den GRUBBS-

Test [267, 281] verglichen. Das Test-Ergebnis ist wie folgt zu bewerten [275]:

PW ≤ rM (f, P = 90 %): kein Ausreißer

rM (f, P = 90 %) < PW ≤ rM (f, P = 95 %): wahrscheinlich Ausreißer

PW > rM (f, P = 95 %): Ausreißer

A.5 Anpassungstest nach MANDEL [279]

Zur Durchführung des Testes werden 10 Proben einer Konzentrationsreihe vermessen, de-

ren Konzentrationen möglichst äquidistant über den gewählten Arbeitsbereich verteilt liegen.

Zunächst werden aus den erhaltenen Messwerten die Kalibrierfunktionen 1. und 2. Grades

(mit xi = Konzentration und yi = Detektorsignal), sowie die jeweiligen Reststandardabwei-

A Anhang A-9

chungen sy1 und sy2 berechnet. Durch Vergleichen der Kalibrierfunktionen 1. und 2. Grades

wird die Verringerung der Reststandardabweichung, die sich aufgrund der Wahl des Regres-

sionsmodells 2. Ordnung gegenüber dem 1. Ordnung ergibt, auf Signifikanz geprüft [272,

273, 281].

Kalibrierfunktion 1. Grades: y = a + bx

Die Steigung b ist ein Maß für die Empfindlichkeit und wird nach Gleichung A.6 ermittelt. Die

hierzu benötigten Mittelwerte der Konzentration (

) und des Detektorsignals ( y) werden mit

Gleichung A.4 und A.7 berechnet.

Gleichung A.6:

()()

[]

()

∑

−

−−

yyxx

Gleichung A.7: ∑

⋅=

Der Schnittpunkt mit der Ordinate a (errechneter Blindwert) ergibt sich dann aus Gleichung

A.8:

Gleichung A.8: xbya −=

Die Reststandardabweichung sy1 gibt die Streuung der Messwerte um die Regressionsge-

rade an, sie ist ein Präzisionsmaß für die Kalibrierung:

Gleichung A.9:

()

1−

−

∑

mit:

Gleichung A.10: ii bxay

ˆ+=

Kalibrierfunktion 2. Grades: y = a + bx + cx2

Die Regressionsanalyse liefert die Kalibrierfunktion 2. Grades mit ihren Funktionskoeffizien-

ten a, b und c. Diese können mit Gleichung A.11 bis A.13 berechnet werden:

Gleichung A.11: N

xcxby

iii 











−−

∑∑∑

===111

Gleichung A.12:

QcQ

⋅−

Gleichung A.13:

yxx

QQQ

QQQQ

c⋅−

⋅−⋅

A Anhang

A-10

mit:

Gleichung A.14: ∑

∑

























−=

ixx N

Gleichung A.15:

()

∑

∑∑

























⋅













−⋅=

iixy N

yxQ

Gleichung A.16: ∑

∑∑

























⋅













−=

Gleichung A.17: ∑

∑

























−=

Gleichung A.18:

()

∑

∑∑

























⋅













−⋅=

yx N

yxQ

Die Reststandardabweichung sy2 berechnet sich nach Gleichung A.19 und A.20:

Gleichung A.19:

()

2−

−

∑

Gleichung A.20: 2

iii cxbxay

ˆ++=

Aus den Reststandardabweichungen sy1 und sy2 wird die Differenz der Varianzen DS2 ermit-

telt:

Gleichung A.21:

()()

222

21 3 2 yy sNsNDS −−−= mit dem Freiheitsgrad f = 1

Anschließend wird für den F-Test der Prüfwert PW berechnet und mit dem Tabellenwert

F(f1 = 1, f2 = N - 3, P = 99 %) verglichen [272].

Gleichung A.22: 2

PW =

Es können zwei Fälle auftreten:

A Anhang A-11

F PW ≤: Der errechnete Prüfwert ist kleiner oder gleich dem tabellierten F-Wert. Durch die

Kalibrierfunktion 2. Grades wird keine signifikant bessere Anpassung erreicht, die

Kalibrierfunktion ist linear.

F PW >: Der ermittelte Prüfwert ist größer als der F-Wert. Es sollte versucht werden, durch

eine Verbesserung der Einzelschritte des Analysenverfahrens eine Verkleinerung

zu erzielen. Gelingt dies nicht, so könnte durch Einengung des Arbeitsbereiches

eine ausreichende Linearität erhalten werden. Letztendlich bleibt die Möglichkeit

einer Auswertung der Messergebnisse über die Kalibrierfunktion 2. Grades.

A.6 Residualanalyse

Die Residualanalyse ist eine Möglichkeit zu überprüfen, ob der gewählte funktionale Ansatz

des Kalibriermodells die Messergebnisse hinreichend beschreibt. Dabei ergeben sich die

Residuen di als vertikale Abstände der Messwerte von der Regressionskurve [272].

Gleichung A.23: iii y

yd −=

Die Residuen di sind bei richtig gewähltem Modellansatz normalverteilt. Weisen die Residu-

en jedoch einen Trend auf, so ist der zugrunde gelegte Regressionsansatz zu überprüfen.

A.7 Test auf Homogenität der Varianzen

Zur Überprüfung der Varianzinhomogenität werden jeweils Standard-Lösungen der niedrigs-

ten (x1) sowie der höchsten Konzentration (x10) des vorläufigen Arbeitsbereiches getrennt

analysiert. Man erhält 20 Messwerte (yi,j) aus diesen Messwertserien. Für beide Datensätze

werden die Varianzen 2

s und 2

s nach folgender Formel berechnet [272, 283]:

Gleichung A.24:

−

∑

ij,i

)yy(

Gleichung A.25:

j,i

∑

= für i = 1 bzw. i = 10

Aus den ermittelten Varianzen der beiden Messwertserien wird anschließend der Prüfwert

PW berechnet.

Gleichung A.26: 2

PW = für 2

10 ss >

oder

Gleichung A.27: 2

PW = für 2

1ss >

A Anhang

A-12

Der ermittelte Prüfwert wird mit dem Wert aus der F-Tabelle für f1 = f2 = f = N - 1 = 9 bei ei-

nem Vertrauensbereich von 99 % verglichen [272]. Dabei können folgende Fälle auftreten:

F PW <: kein signifikanter Unterschied zwischen den Varianzen 2

s und 2

s feststellbar

(Homogenität der Varianzen).

F PW ≥: signifikanter Unterschied zwischen den Varianzen 2

s und 2

s (Inhomogenität der

Varianzen). Es sollte ein engerer Arbeitsbereich gewählt und die Varianzinho-

mogenität erneut überprüft werden, bis FPW < gilt, oder es müssen gewichtete

Regressionsmodelle angewendet werden.

A.8 Absicherung der unteren Arbeitsgrenze

Eine Kalibrierfunktion ist nur dann für quantitative Analysen verwendbar, wenn sich alle spä-

ter mit ihr berechneten Analysenergebnisse signifikant von Null unterscheiden [272, 273].

Daher ist zu prüfen, ob diese Unterscheidung für die gewählte untere Arbeitsgrenze gegeben

ist. Die Berechnungsformel für den Prüfwert xp mit t(f = N - 2, P = 95 %) ist im folgenden auf-

geführt:

Gleichung A.28:

∑

−

++⋅⋅= N

xop

)xx(b

)yy(

tsx

mit:

Gleichung A.29:

∑

−

++⋅⋅+= N

)xx(

tsay

Es können zwei Fälle auftreten:

1 x ≤p

: Der gesamte gewählte Arbeitsbereich ist statistisch abgesichert, d. h. die untere

Grenze des Arbeitsbereiches x1 unterscheidet sich signifikant von Null.

1 x >p

Die untere Grenze des Arbeitsbereiches x1 unterscheidet sich nicht signifikant von

Null. Der Arbeitsbereich muss eingeschränkt und erneut berechnet werden.

A.9 Empfindlichkeit

Das Maß für die Empfindlichkeit ergibt sich aus der Änderung des Messwertes bei einer

Änderung des Konzentrationswertes. Liegt für das Analysenverfahren eine lineare Kalibrier-

funktion vor, ist die Empfindlichkeit im gesamten Arbeitsbereich konstant und entspricht dem

Regressionskoeffizienten b. Mit Hilfe der Empfindlichkeit kann dann die Verfahrensstan-

dardabweichung sxo und die relative Verfahrensstandardabweichung Vxo ermittelt wer-

den [267, 272].

A Anhang A-13

Gleichung A.30: b

Gleichung A.31:

Vxo

100⋅

A.10 Stabilitätsberechnungen

Zur Beurteilung der Stabilität nach [275] erfolgt die Berechnung des Restanalyt nach der im

folgenden aufgeführten Formel:

Gleichung A.32: Restanalyt (%) =

c100

⋅

mit: ci = Analyt-Konzentration zum Zeitpunkt i

c0 = Ausgangskonzentration der Lösung

Die Ermittlung der Wiederholgrenze [267, 269] für die Beurteilung, ob es sich bei der Diffe-

renz zwischen zwei Einzelmesswerten um eine signifikante Änderung handelt, erfolgt durch

die Berechnung der Wiederholdifferenz r.

Gleichung A.33 r = s 2 ⋅f

mit: r = Wiederholdifferenz

s = Standardabweichung

f = empirisch ermittelter Zahlenwert

Die Variable f hängt von dem gewählten Signifikanzniveau P und der Verteilung der Mess-

werte ab. Für P = 90 % gilt f = 2,3, für P = 99 % gilt f = 2,3 und für ein Signifikanzniveau von

P = 95 % ein Faktor von 1,96; damit erhält man für die Wiederholdifferenz:

Gleichung A.34: r = s 82 s 772 s 2 961 ⋅≈⋅=⋅⋅ ,,, .

A.11 Tag-zu-Tag-Präzision

Bei der Beurteilung der Tag-zu-Tag-Präzision erfolgt die Angabe des Vertrauensbereiches.

Der Vertrauensbereich beschreibt die Abweichung von einem gegeben Sollwert, innerhalb

derer die zu erwartenden Messergebnisse mit einer bestimmten statistischen Sicherheit

(Wahrscheinlichkeit) liegen. In der Regel werden die Vertrauensbereiche für 95 % Sicherheit

angegeben. Diese bezeichnet man als Wiederholbarkeit r95:

Gleichung A.35: r95 = f

⋅

s 2 ⋅

Wobei der Faktor f gemäß der DIN ISO 5727 [267, 269] für die Beurteilung der Präzisionser-

gebnisse als 2 gesetzt und das Produkt 2 · 2 auf 2,8 gerundet. Es ergibt sich also.

Gleichung A.36: r95 = 2,8

⋅

A Anhang

A-14

A.12 Übersicht der Messdaten der MSn-Untersuchungen

Tabelle A.7: Fragmentierung von (+)-Catechin / (-)-Epicatechin (Precursor-Ion [M-H] - mit

m/z 289,2)

Product-

Ion

[m/z]

109,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C3HO

Product-

Ion

[m/z]

185,2

175,1

161,2

109,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4/CO

C2H2O

C5H2O2

C3HO

Product-

Ion

[m/z]

227,1

203,3

187,2

187,3

177,2

161,2

163,9

151,1

135,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H2O

C2H2O2

H2O

C2H4/CO

C2H4O

CH3

C2H4/CO

C2H4O

Product-

Ion

[m/z]

271,1

245,3

231,3

205,3

179,2

165,2

125,1

Masse

[g/mol]

110

124

164

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C2H2O2

C4H4O2

C6H6O2

C7H8O2

C9H8O3

A Anhang A-15

Tabelle A.8: Fragmentierung von (-)-Gallocatechin / (-)-Epigallocatechin (Precursor-Ion

[M-H] - mit m/z 304,9)

Product-

Ion

[m/z]

125,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C3HO

Product-

Ion

[m/z]

177,0

125,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H2O

C3HO

Product-

Ion

[m/z]

269,3

244,9

242,9

218,9

203,0

243,1

218,9

202,9

192,9

176,9

177,0

163,9

150,8

134,8

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H2O

C2H4O

C4H4O/

CH2O3

C4HO2

H2O

C2H2O

C2H2O2

H2O

C2H4/CO

C2H4O

C2H2O

CH3

C2H4/CO

C2H4O

Product-

Ion

[m/z]

287,0

261,1

220,9

219,1

179,0

165,0

137,1

124,9

Masse

[g/mol]

126

140

168

180

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C4H4O2

C6H6O3

C7H8O3

C8H8O4

C9H8O4

A Anhang

A-16

Tabelle A.9: Fragmentierung von Procyanidin B3 (Rt = 27,47 min): Dimer Catechin-

Catechin (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 576,9)

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

H2O 18

559,0 H2O 18

541,0

C8H8O3 152 406,9

C15H10O5 270 289,0 C2H4O 44 245,1

C15H12O5 272 286,9 H2O 18

269,2

CO 28

259,0

C2H4O 44 532,9 C8H14O3/

C7H10O4 158 374,6

C6H6O3 126 451,0 H2O 18

433,0

C2H2O 42 409,0

C9H8O3 164 286,9 H2O 18

269,2

CO 28

259,0

C8H8O3 152 424,9 H2O 18

407,0 H2O 18

389,1

C2H4O 44 363,0

C4H4O 68 339,0

C4H6O2 86 321,1

C6H6O2 110 297,0

C7H6O2 122 285,0

C6H6O3 126 281,1

C8H8O3 152 255,1

C9H8O3 164 243,0

C12H7O5 231 176,0

C3H8O3/

C6H4O 92 333,0

C6H6O3 126 299,0

C7H8O3 140 285,0

C7H10O3 142 283,0

C7H7O4 155 269,9

C8H10O4 170 255,0

C9H10O4 182 243,0

C8H10O4 170 407,1

C15H12O6 288 289,0 C2H4O 44 245,1

C15H14O6 290 286,9 C2H4O 44 243,1

A Anhang A-17

Tabelle A.10: Fragmentierung von Prodelphinidin B3 (Rt = 14,98 min): Dimer Catechin-

Gallocatechin (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 592,9)

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

H2O 18

575,0 C5H7O2 99 475,9

C6H6O2 110 465,1

C7H6O2 122 453,0

C6H6O3 126 449,1

C7H6O3 138 437,1

C8H8O3 152 423,0

C13H12O5 248 327,2

C15H10O5 270 305,0

C15H16O6 292 283,0

C22H22O7 398 177,0

C6H6O3 126 467,0 H2O 18

448,8

C2H4O 44 423,1

C9H6O3 162 304,9

C9H6O4 178 289,0 C2H4O 44 245,2

C4H4O2 84 205,0

C6H6O2 110 179,0

C11H10O4 206 260,8

C8H8O3 152 440,9 H2O 18

423,0 H2O 18

405,1

H4O2 36

387,1

C2H6O2 62 361,0

C6H6O3 126 297,0

C7H6O3 138 285,1

C7H8O3 140 282,9

C8H8O4 168 255,1

C9H8O4 180 243,0

C2H4O 44 397,0

C8H8O4 168 273,0

C8H8O4 168 424,9 H2O 18

407,1

C8H10O4 170 423,0

C15H12O6 288 305,0 H2O 18

287,0

C2H4O 44 261,1

C4H4O2 84 220,9

C6H6O3 126 179,0

C15H14O7 306 287,0 C2H4O 44 243,1

A Anhang

A-18

Tabelle A.11: Fragmentierung von Prodelphinidin B3 (Rt = 13,77 min): Dimer Gallo-

catechin-Catechin (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 592,9)

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

H2O 18

575,0 C5H7O2 99 476,0

C6H6O3 126 449,0

C7H6O3 138 437,1

C8H6O3 150 424,9 H2O 18

407,3

C9H8O4 180 394,9

C15H12O6 288 287,0

C6H6O3 126 467,0 H2O 18

449,3

C2H4O 44 423,2

C8H8O3 152 314,8

C9H6O4 178 289,0

C9H8O4 180 287,1

C11H10O5 222 245,2

C13H10O6 262 205,0

C15H14O6 290 177,0

C8H8O3 152 440,9

C8H8O4 168 424,9 H2O 18

407,0 H2O 18

389,1

C2H4O 44 363,0

C4H4O 68 339,0

C4H6O2 86 321,1

C6H6O2 110 297,0

C7H6O2 122 285,0

C6H6O3 126 281,1

C8H8O3 152 255,1

C9H8O3 164 243,0

C12H7O5 231 176,0

C3H8O3 92 333,0

C6H6O3 126 299,0

C7H8O3 140 285,0

C7H10O3 142 283,0

C7H7O4 155 269,9

C8H10O4 170 255,0

C9H10O4 182 243,0

C8H10O5 186 407,0

C15H14O6 290 302,9 H2O 18

285,3

C2H4O 44 259,0

C4H4O2 84 219,1

C5H4O3 112 191,0

C6H6O3 126 177,0

C9H6O4 178 125,0

C15H12O7 304 289,0 C2H4O 44 245,1 C2H2O 42 203,1

C4H4O2 84 205,0

C6H6O2 110 178,9

A Anhang A-19

Tabelle A.12: Fragmentierung von Prodelphinidin B3 (Rt = 21,08 min): Dimer Gallo-

catechin-Catechin (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 592,9)

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Masse

[g/mol]

Product-

Ion

[m/z]

O 18

575

0 C

82 492

C7H4O2 120 455,0 H2O 18

437,1

C8H6O3 150 424,9

C8H8O4 168 407,3

C9H8O4 180 394,9

C10H11O5 211 364,2

C15H12O6 288 287,0

C6H6O3 126 467,0 H2O 18

448,9

C2H4O 44 423,0

C9H6O4 178 288,9

C9H8O4 180 287,1

C11H10O5 222 245,2

C13H10O6 262 205,0

C15H14O6 290 177,1

C8H8O3 152 440,9

C8H8O4 168 424,9 H2O 18

407,0 H2O 18

389,1

C2H4O 44 363,0

C4H4O 68 339,0

C4H6O2 86 321,1

C6H6O2 110 297,0

C7H6O2 122 285,0

C6H6O3 126 281,1

C8H8O3 152 255,1

C9H8O3 164 243,0

C12H7O5 231 176,0

C3H8O3 92 333,0

C6H6O3 126 299,0

C7H8O3 140 285,0

C7H10O3 142 283,0

C7H7O4 155 269,9

C8H10O4 170 255,0

C9H10O4 182 243,0

C8H10O5 186 407,0

C15H14O6 290 302,9 H2O 18

285,3

C2H4O 44 259,0

C3H8O3 92 220,9

C6H6O3 126 177,0

C9H6O4 178 125,0

C15H12O7 304 289,0 C2H4O 44 245,1 H2O 18

227,0

C2H2O 42 203,1

C4H4O2 84 205,1

C6H6O2 110 178,9

A Anhang

A-20

Tabelle A.13: Fragmentierung von Prodelphinidin Dimer Gallocatechin-Gallocatechin

(Rt = 8,31 min) (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 609,1)

Product-

Ion

[m/z]

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

[m/z]

422,9

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

[m/z]

572,5

464,9

453,1

425,1

422,9

376,9

285,1

282,9

503,8

441,0

421,0

398,1

464,9

440,9

399,1

349,0

301,0

251,0

Masse

[g/mol]

126

138

166

168

214

306

308

101

124

134

182

232

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C6H6O3

C7H6O3

C8H6O4

C8H8O4

C10H14O5

C15H14O7

C15H16O7

H2O

C4HO2

C4H5O3

C6H4O3/

C7H8O2

H2O

C2H2O

C4H4O2

C8H6O2

C9H10O4

C12H8O5

Product-

Ion

[m/z]

591,0

521,8

483,0

Masse

[g/mol]

126

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C3H3O3/

C4H7O2

C6H6O3

A Anhang A-21

Fortsetzung von Tabelle A.13:

Product-

Ion

[m/z]

387,1

125,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C3HO

Product-

Ion

[m/z]

405,1

361,0

297,0

285,1

282,9

255,1

243,0

218,9

176,9

217,1

Masse

[g/mol]

126

138

140

168

180

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H6O2

C6H6O3

C7H6O3

C7H8O3

C8H8O4

C9H8O4

C2H2O

C2H4O

C2H2O

Product-

Ion

[m/z]

423,0

397,0

273,0

287,0

261,0

247,0

221,0

179,0

284,9

259,1

244,9

218,9

177,1

Masse

[g/mol]

168

126

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C8H8O4

H2O

C2H4O

C2H2O2

C4H4O2

C6H6O3

H2O

C2H4O

C2H2O2

C4H4O2

C6H6O3

Product-

Ion

[m/z]

440,9

423,0

305,0

303,0

272,9

Masse

[g/mol]

168

186

304

306

336

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H8O4

C8H10O5

C15H12O7

C15H14O7

C16H16O8

A Anhang

A-22

Tabelle A.14: Fragmentierung von Procyanidin C2 (Rt = 32,04 min): Trimer Catechin-

Catechin-Catechin (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 864,9)

Product-

Ion

525,0

499,1

461,3

391,1

Masse

[g/mol]

152

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C4H2O2

C8H8O3

Product-

Ion

677,3

568,9

677,0

613,0

542,9

Masse

[g/mol]

152

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C4H2O2

C8H8O3

Product-

Ion

787,1

764,6

726,9

695,0

598,6

559,1

557,0

407,0

289,2

699,0

341,0

657,0

628,4

587,0

451,1

289,2

694,9

Masse

[g/mol]

120

152

248

288

290

440

558

440

110

152

288

450

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H4O2

C4H2O2

C7H4O2

C8H8O3

C13H12O5

C15H12O6

C15H14O6

C22H16O10

C30H22O11

C4H2O2

C22H16O10

C4H2O2

C6H6O2

C8H8O3

C15H12O6

C24H18O9

H2O

Product-

Ion

846,9

781,0

767,1

738,9

712,8

Masse

[g/mol]

126

152

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C4H4O2

C4H2O3

C6H6O3

C8H8O3

A Anhang A-23

Fortsetzung von Tabelle A.14:

Product-

Ion

245,1

389,1

245,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H4O

H2O

C2H4O

Product-Ion

451,0

404,8

363,0

289,2

542,9

406,9

540,9

514,5

449,0

437,0

407,0

289,0

269,0

433,1

406,9

289,0

Masse

[g/mol]

244

290

332

406

110

122

152

270

290

162

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C13H8O5

C15H14O6

C17H16O7

C22H14O8

H2O

C2H4O

C6H6O2

C7H6O2

C8H8O3

C15H10O5

C15H14O6

H2O

C2H4O

C9H6O3

Product-

Ion

668,9

653,0

614,7

561,0

424,9

289,0

677,0

559,1

451,0

Masse

[g/mol]

152

288

424

126

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H4O

C2H4O2

C4H2O3

C8H8O3

C15H12O6

C22H16O9

H2O

C6H6O3

Product-

Ion

694,9

677,0

618,9

586,9

576,9

Masse

[g/mol]

170

188

246

278

288

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H10O4

C8H12O5

C12H6O6

C14H14O6

C15H12O6

A Anhang

A-24

Fortsetzung von Tabelle A.14:

Product-

Ion

389,1

297,3

285,1

243,1

Masse

[g/mol]

110

122

164

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C6H6O2

C7H6O2

C9H8O3

Product-

Ion

407,0

430,8

389,1

289,1

405,1

269,1

243,1

Masse

[g/mol]

160

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O2

C9H4O3

H2O

C2H4O

Product-

Ion

424,9

407,1

289,0

556,9

514,8

448,9

422,9

287,0

525,0

391,1

285,2

407,0

375,1

245,1

407,0

Masse

[g/mol]

152

170

288

126

152

288

152

288

126

158

288

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H8O3

C8H10O4

C15H12O6

H2O

C2H4O2

C6H6O3

C8H8O3

C15H12O6

H2O

C8H8O3

C15H12O6

C6H6O3

C7H10O4

C15H12O6

H2O

Product-

Ion

574,8

542,9

532,8

424,9

407,0

298,8

286,9

Masse

[g/mol]

290

322

332

440

458

566

578

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C15H14O6

C16H18O7

C17H16O7

C22H16O10

C22H18O11

C29H26O12

C30H26O12

Ausführlicher Zerfall m/z 425 und m/z 407 s. Tabelle A.9.

A Anhang A-25

Tabelle A.15: Fragmentierung von Prodelphinidin Trimer Catechin-Gallocatechin-Catechin

(Rt = 19,42 min) (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 881,0)

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

676,7

524,9

569,0

407,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

814,7

764,7

725,0

694,7

676,7

574,8

542,8

535,2

407,2

395,1

736,9

694,3

593,3

586,8

569,0

477,1

466,9

464,8

425,0

407,1

302,9

289,0

Masse

[g/mol]

138

168

186

288

320

328

456

468

162

168

186

278

288

290

330

348

452

466

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

CH4O2

C5H6O2

C7H6O3

C8H8O4

C8H10O5

C15H12O6

C15H12O8

C17H12O7

C22H16O11

C23H16O11

H2O

C2H4O2

C9H6O3

C8H8O4

C8H10O5

C14H14O6

C15H12O7

C15H14O6

C17H14O7

C17H16O8

C24H20O9

C24H18O10

Product-

Ion

862,9

754,9

Masse

[g/mol]

126

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C6H6O3

A Anhang

A-26

Fortsetzung von Tabelle A.15:

Product-

Ion

506,9

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

692,7

667,1

585,0

542,8

525,0

467,2

289,0

542,9

529,0

394,9

Masse

[g/mol]

126

168

186

254

422

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C6H6O3

C8H8O4

C8H10O5

C12H14O6

C22H14O9

H2O

Product-

Ion

710,9

668,7

646,9

585,5

560,8

542,9

464,4

289,0

677,1

568,9

543,0

548,2

464,9

422,9

412,9

Masse

[g/mol]

144

168

186

264

440

126

152

126

168

178

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O2

C4H2O2

C6H8O4

C8H8O4

C8H10O5

C13H12O6

C22H16O10

H2O

C6H6O3

C8H8O3

C2H4O

C6H6O3

C8H8O4

C9H6O4

Product-

Ion

728,8

710,9

694,9

592,9

591,5

Masse

[g/mol]

152

170

186

288

290

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H8O3

C8H10O4

C8H10O5

C15H12O6

C15H14O6

A Anhang A-27

Fortsetzung von Tabelle A.15:

Product-

Ion

506,9

481,9

405,1

402,7

280,7

Masse

[g/mol]

120

122

244

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H3O

C7H4O2

C7H6O2

C14H12O4

Product-

Ion

525,0

457,1

390,9

Masse

[g/mol]

152

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C4H6O2

C8H8O3

H2O

Product-

Ion

542,6

517,9

408,9

390,9

271,0

246,4

525,0

407,0

Masse

[g/mol]

152

170

290

316

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H3O

C8H8O3

C8H10O4

C15H14O6

C16H12O7

H2O

Product-

Ion

586,9

561,1

542,9

525,0

466,9

424,9

407,0

394,9

302,8

289,0

286,9

Masse

[g/mol]

294

320

338

356

414

456

474

486

578

592

594

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C15H18O6

C16H16O7

C16H18O8

C16H20O9

C21H18O9

C22H16O11

C22H18O12

C23H18O12

C30H26O12

C30H24O13

C30H26O13

Ausführlicher Zerfall m/z 593, m/z 425 und m/z 407 s. Tabelle A.11.

A Anhang

A-28

Tabelle A.16: Fragmentierung von Prodelphinidin Trimer Gallocatechin-Catechin-Catechin

(Rt = 17,86 min) (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 881,0)

Product-

Ion

659,0

525,0

390,9

Masse

[g/mol]

152

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C8H8O3

Product-

Ion

677,0

542,9

451,1

404,8

361,1

289,1

243,0

Masse

[g/mol]

152

244

290

334

406

452

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C8H8O3

C13H8O5

C15H14O6

C17H18O7

C22H14O8

C24H20O9

Product-

Ion

783,3

773,1

753,2

710,7

694,7

558,8

516,6

273,1

736,9

711,4

602,8

576,9

464,9

423,0

286,8

284,5

711,0

694,9

Masse

[g/mol]

110

152

168

304

346

590

152

178

290

332

468

470

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C5H4O

C3H6O3

C6H6O2

C8H8O3

C8H8O4

C15H12O7

C18H18O7

C30H22O13

H2O

C2H4O

C8H8O3

C9H6O4

C15H14O6

C17H16O7

C24H20O10

C24H22O10

H2O

Product-

Ion

862,8

754,9

728,8

712,8

Masse

[g/mol]

126

152

168

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C6H6O3

C8H8O3

C8H8O4

A Anhang A-29

Fortsetzung von Tabelle A.16:

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

529,0

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

652,7

651,1

561,0

517,2

408,9

380,9

318,7

547,8

464,9

422,9

412,9

325,0

302,9

407,0

Masse

[g/mol]

152

196

304

332

394

126

168

178

266

288

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H4O2

C2H6O2

C8H8O3

C9H8O5

C15H12O7

C17H16O7

C22H18O7

C2H4O

C6H6O3

C8H8O4

C9H8O4

C13H14O6

C15H12O6

H2O

Product-

Ion

694,9

602,9

590,9

576,9

542,9

465,8

424,9

407,0

405,9

363,0

303,0

289,0

286,9

Masse

[g/mol]

186

278

290

304

338

415

456

474

475

518

578

592

594

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H10O5

C14H14O6

C15H14O6

C15H12O7

C16H18O8

C21H19O9

C22H16O11

C22H18O12

C22H19O12

C24H22O13

C30H26O12

C30H24O13

C30H26O13

Ausführlicher Zerfall m/z 577, m/z 425 und m/z 407 s. Tabelle A.9.

A Anhang

A-30

Tabelle A.17: Fragmentierung von Prodelphinidin Trimer Gallocatechin-Gallocatechin-

Catechin (Rt = 11,76 min) (Precursor-Ion [M-H] - mit m/z 897,0)

Product-

Ion

525,0

461,0

456,8

391,2

315,0

305,1

289,1

Masse

[g/mol]

152

228

238

254

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C4H2O2

C4H6O2

C8H8O3

C11H16O5

C12H14O5

C12H14O6

Product-

Ion

693,2

693,1

667,1

558,7

543,0

Masse

[g/mol]

152

168

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C8H8O3

C8H8O4

Product-

Ion

861,1

718,4

711,1

693,2

589,1

541,0

410,7

407,3

288,9

284,8

835,1

710,9

Masse

[g/mol]

160

168

186

290

338

468

472

590

594

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C7H12O4

C8H8O4

C8H10O5

C15H14O6

C16H18O8

C23H16O11

C22H16O12

C30H22O13

C30H26O13

H2O

Product-

Ion

878,9

853,1

835,1

770,9

728,9

Masse

[g/mol]

126

168

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O

C2H6O2

C6H6O3

C8H8O4

A Anhang A-31

Fortsetzung von Tabelle A.17:

Product-

Ion

467,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

525,0

484,6

420,8

407,2

315,0

302,5

288,8

243,0

585,1

542,9

524,9

407,0

Masse

[g/mol]

186

226

290

304

396

408

422

468

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H10O5

C11H14O5

C15H14O6

C15H12O7

C22H20O7

C22H16O8

C22H14O9

C24H20O10

H2O

Product-

Ion

667,4

646,8

602,4

561,8

542,9

466,8

424,8

407,0

390,9

315,0

288,9

281,1

693,0

Masse

[g/mol]

126

168

186

262

304

322

338

414

440

448

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C2H6O2

C4H2O2

C6H6O3

C8H8O4

C8H10O5

C14H14O5

C15H12O7

C15H14O8

C16H18O8

C21H18O9

C22H16O10

C23H12O10

H2O

Product-

Ion

710,9

633,0

Masse

[g/mol]

186

264

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C8H10O5

C14H16O5

A Anhang

A-32

Fortsetzung von Tabelle A.17:

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

578,1

481,1

428,9

420,5

378,9

362,8

302,8

297,1

407,1

Masse

[g/mol]

126

178

186

228

244

304

310

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

CHO

C6H6O3

C9H6O4

C8H10O5

C10H12O6

C10H12O7

C15H12O7

C15H18O7

H2O

Product-

Ion

606,9

602,9

592,9

543,0

467,0

424,9

407,1

391,0

302,9

289,0

Masse

[g/mol]

290

294

304

354

430

472

490

506

594

608

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C15H14O6

C14H14O7

C15H12O7

C16H18O9

C22H22O9

C22H16O12

C22H18O13

C22H18O14

C30H26O13

C30H24O14

Ausführlicher Zerfall m/z 593, m/z 425 und m/z 407 s. Tabelle A.11.

A Anhang A-33

Tabelle A.18: Fragmentierung von Prodelphinidin Trimer Gallocatechin-Gallocatechin-

Gallocatechin (Rt = 7,69 min) (Precursor-Ion [M-H]- mit m/z 912,9)

Product-

Ion

527,0

525,1

516,6

497,6

477,6

459,1

415,1

392,8

386,8

374,8

305,0

525,0

Masse

[g/mol]

100

144

166

172

184

254

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

CH4O

H2O2

C2H2O

C2H6O2

C4H2O2

C4H4O3

C6H8O4

C8H6O4

C7H8O5

C8H8O5

C14H6O5

H2O

Product-

Ion

708,9

666,7

645,1

558,9

543,1

483,1

Masse

[g/mol]

168

184

244

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O2

C4H2O2

C8H8O4

C8H8O5

C13H8O5

Product-

Ion

877,1

835,1

726,9

663,1

465,0

423,1

410,3

314,9

Masse

[g/mol]

168

232

430

472

485

580

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C2H4O2

C8H8O4

C12H8O5

C21H18O10

C23H20O11

C24H21O11

C30H12O13

Product-

Ion

895,0

814,9

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C4H2O3

A Anhang

A-34

Fortsetzung von Tabelle A.18:

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

571,1

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

Product-

Ion

748,7

741,7

727,1

704,8

646,8

625,0

442,8

383,0

305,0

727,0

685,1

662,3

644,0

477,0

465,2

589,1

546,9

524,7

509,1

466,4

Masse

[g/mol]

140

162

344

404

482

101

268

280

140

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C3H2

C2H5O

C2H4O2

C4H2O2

C7H8O3

C9H6O3

C18H16O7

C22H12O8

C24H18O11

H2O

C2H4O2

C4H2O2

C4H5O3

C13H16O6

C14H16O6

H2O

C2H4O2

C4H2O2

C4H2O3

C7H8O3

Product-

Ion

786,9

744,9

726,9

618,9

608,9

606,9

Masse

[g/mol]

126

168

186

294

304

306

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C6H6O3

C8H8O4

C8H10O5

C14H14O7

C15H12O7

C15H14O7

A Anhang A-35

Fortsetzung von Tabelle A.18:

Product-

Ion

Masse

[g/mol]

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

Product-

Ion

504,9

405,1

297,2

283,1

243,0

Masse

[g/mol]

126

140

180

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

H2O

C6H6O3

C7H8O3

C9H8O4

Product-

Ion

427,4

357,6

303,0

217,1

197,2

523,1

496,8

458,9

414,9

465,0

422,9

357,1

305,1

423,0

Masse

[g/mol]

180

250

304

390

410

126

178

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C9H8O4

C13H14O5

C15H12O7

C19H18O9

C22H18O8

H2O

C2H4O

C4H2O2

C6H6O3

H2O

C2H4O2

C6H6O3

C9H6O4

H2O

Product-

Ion

558,9

540,9

482,9

440,9

423,0

391,0

302,9

Masse

[g/mol]

354

372

430

472

490

522

610

Neutral-

verlust/

Summen-

formel

C19H14O7

C19H16O8

C21H18O10

C23H20O11

C23H22O12

C27H22O11

C30H26O14

Ausführlicher Zerfall m/z 609, m/z 441 und m/z 423 s. Tabelle A.13.

A Anhang

A-36

A.13 Kalibrierdaten des LC-DAD-MS/MS-Verfahrens

Tabelle A.19: Mittelwerte und relative Standardabweichungen für die Peakflächen (MS:

Summe m/z 289 und m/z 348; DAD: 280 nm) bei der Bestimmung des linea-

ren Bereiches (Gradient E2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

MS-Peakfläche

y [µAU⋅

⋅⋅⋅min]

MS-Peakfläche

srel [%]

DAD-Peakfläche

y [µAU⋅

⋅⋅⋅min]

DAD-Peakfläche

srel [%]

0,0625 218990 20,17 2201 29,24

0,125 231270 21,85 2867 15,87

0,1875 317982 12,39 4345 9,11

0,25 472833 12,58 5766 3,39

0,625 1155686 4,44 17915 2,67

1,25 2331955 5,30 36036 1,07

1,875 4503467 4,13 64821 0,52

2,5 6384149 3,75 81885 1,22

6,25 15253028 1,62 224499 1,86

12,5 29984367 0,98 407233 1,93

18,75 43145821 1,95 688594 1,40

25 53972105 1,99 907591 1,56

62,5 133326585 0,51 2197724 2,73

125 240959783 0,65 4100618 2,55

187,5 342124095 0,80 6208107 1,84

250 434378948 1,66 8432005 1,15

625 995087636 0,39 16525200 1,16

1250 1668976522 0,45 33344130 0,66

1875 2144524084 0,71 50648264 0,81

2500 2452298224 0,23 67679731 1,27

Tabelle A.20: Mittelwerte, Standardabweichungen und relative Standardabweichung srel

der Peakflächen (280 nm) bei der Bestimmung der Kalibrierfunktion mittels

LC-DAD-MS/MS-Gerätekombination (Gradient E2) (n = 10)

ββ

β((+)-Catechin)

[mg/L]

Peakfläche y

[µAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche s

[µAU⋅

⋅⋅⋅min]

Peakfläche srel

[%]

1,875 65221 851 1,31

50 1751806 14910 0,85

500 14192275 140928 0,99

750 20921364 323976 1,56

1000 26795668 209166 0,78

1250 33644129 350774 1,04

1500 40774580 325231 0,80

1750 47685107 354979 0,74

2250 60591539 563501 0,93

2500 67739731 239596 0,35