Galanthamin als Leitstruktur – Weiterenwicklung von
Therapeutika gegen die Alzheimer’sche Demenz
Vom Fachbereich Chemie und Chemietechnik
der Universität Paderborn
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
– Dr. rer. nat. –
genehmigte Dissertation
von
Elmar Linnemann
aus Lippstadt
Paderborn 2002
Eingereicht am: 13.03.2002
Mündliche Prüfung am: 27.03.2002
Referent: Prof. Dr. G. Fels
Korreferent: Prof. Dr. K. Krohn
Die vorliegende Arbeit wurde in dem Zeitraum von Januar 1999 bis März 2002 im Fach
Organische Chemie des Fachbereichs 13 der Universität Paderborn angefertigt.
Herrn Prof. Dr. G. Fels danke ich für die interessante Themenstellung und seine ständige Diskus-
sionsbereitschaft, die sehr zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen hat.
Herrn Prof. Dr. K. Krohn danke ich für die bereitwillige Übernahme des Korreferats.
Gabi Bixel danke ich für die Einführung in die biochemischen Arbeitsmethoden.
Ingo Brunberg danke ich für die vielen Tipps sowie für seine Geduld und Bereitschaft alle meine
Fragen im Bezug auf Molecular Modelling zu beantworten.
Mario Paul Kröger danke ich für das anregende Laborklima und das Korrekturlesen dieser Ar-
beit.
Christian Pilger danke ich für die Einführung in das Themengebiet „Galanthamin“.
Klaus Steingröver und Henry Hildebrandt danke ich für das Korrekturlesen dieser Arbeit.
Ferner möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Organischen Chemie für deren Hilfsbereit-
schaft und das angenehme Betriebsklima bedanken.
Meinen Eltern
in Dankbarkeit
i
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung.............................................................................................................................1
1.1 Grundlagen der Neurotransmission ................................................................................1
1.2 Die Alzheimer’sche Demenz..........................................................................................5
1.2.1 Epidemiologie.........................................................................................................5
1.2.2 Klinisches Bild........................................................................................................6
1.2.3 Molekulare Pathologie............................................................................................6
1.2.4 Genetische Faktoren................................................................................................9
1.2.5 Advanced Glycosylation End Products ................................................................10
1.2.6 Therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD.................................................11
2 Aufgabenstellung...............................................................................................................17
3 Diskussion der Ergebnisse.................................................................................................19
3.1 3H-Markierung von (–)-Galanthamin ...........................................................................19
3.1.1 Route A.................................................................................................................20
3.1.2 Route B .................................................................................................................22
3.1.3 Route C .................................................................................................................25
3.2 Tritiierung von (–)-Galanthamin via Route C ..............................................................28
3.3 Aufreinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin...................................................................32
3.3.1 Grundlagen des β-Zerfalls von Tritium................................................................32
3.3.2 Reinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin mit präperativer HPLC..........................33
3.4 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR.........................................................................35
3.4.1 Der nicotinische Acetylcholinrezeptor (nAChR)..................................................35
3.4.2 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanthamin ...................37
3.5 Synthese von bisfunktionalen Galanthamin-Derivaten ................................................40
3.5.1 Synthese von Propylbisgalanthamin.....................................................................41
3.5.2 Synthese von Propylgallamingalanthamin............................................................43
3.6 Molecular-Modelling Arbeiten.....................................................................................46
3.6.1 Strukturbasiertes Wirkstoffdesign ........................................................................46
3.6.2 Die Acetylcholinesterase ......................................................................................47
3.6.3 Analyse der bekannten TcAChE-Komplexe.........................................................49
3.6.4 Das Docking Programm QXP...............................................................................51
3.6.5 Reproduktion der Röntgenstruktur des TcAChE/(–)Galanthamin-Komplexes....53
ii
3.6.6 Crossdocking von Galanthamin in verschiedenen TcAChE-Strukturen..............56
3.6.7 Entwicklung eines neuen bisfunktionalen Liganden............................................58
3.6.8 Docking von potentiellen bisfunktionalen Galanthamin-Derivaten.....................61
3.6.9 Docking der CSD-Datenbank mit Flexx ..............................................................67
3.6.10 Vorhersage der Röntgenstruktur des TcAChE/sph1371-Komplexes...................69
4 Zusammenfassung.............................................................................................................72
5 Ausblick ............................................................................................................................75
6 Experimenteller Teil..........................................................................................................76
6.1 Synthesen......................................................................................................................76
6.1.1 Analytische Methoden..........................................................................................76
6.1.2 Lösungsmittel und Chemikalien...........................................................................76
6.1.3 Versuchsvorschriften............................................................................................77
6.2 HPLC Trennungen .......................................................................................................92
6.2.1 Verwendete Geräte...............................................................................................92
6.2.2 Laufmittel und Gradientenprogramme.................................................................93
6.2.3 Analyse von (–)-3-[3H]-Galanthamin...................................................................93
6.2.4 Aufreinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin ..........................................................93
6.3 Biologische Arbeiten....................................................................................................94
6.3.1 Verwendete Geräte...............................................................................................94
6.3.2 Verwendete Lösungen, Puffer und SDS-PAGE...................................................94
6.3.3 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanthamin...................95
7 Literaturverzeichnis...........................................................................................................96
8 Abkürzungen...................................................................................................................106
9 Anhang A ........................................................................................................................108
1 Einleitung
1
1 Einleitung
1.1 Grundlagen der Neurotransmission
Das Nervensystem ist Träger der interzellulären Kommunikation im Organismus. Sein Auf-
bau ist ungleich komplizierter als der anderer Organe. Nirgendwo in der belebten Natur sind
Zellen höher und komplexer organisiert als im Nervengewebe.[1] Seine zellulären Bausteine,
die Neuronen, nehmen Informationen auf, verarbeiten sie und leiten sie weiter. Für diese
Kommunikation befinden sich an jeder Nervenzelle zwei Arten von Ausläufern. Bei der einen
Form von Ausläufern handelt es sich um Dendrite, über die Impulse von benachbarten Neu-
ronen einlaufen, bei der zweiten um Axone, die für den Transport der Signale zu den nächsten
Zellen zuständig ist. Axone und Dendrite sind über Synapsen miteinander verbunden. An
diesen Schnittstellen findet die Informationsübertragung von einem Neuron zum anderen statt
(Abbildung 1.1.1).
Das gesamte Neuron ist von einer Plasmamembran umschlossen, die gegen die extrazelluläre
Flüssigkeit abgrenzt. Durch eine Ungleichverteilung der Ionen (die Konzentration von Natri-
umionen ist außerhalb der Neuronen etwa zehnmal so groß wie im Inneren, bei Kaliumionen
verhält es sich umgekehrt) ergibt sich eine chemisches Potential über die Membran hinweg.
Für den Aufbau dieses Konzentrationsgradienten sind spezifische membranständige Proteine,
die Ionenpumpen, verantwortlich. Das Innere der Zelle steht durch ionenspezifische Kanäle
mit der Umgebung in Kontakt. Durch diese Kanäle verlassen Kaliumionen die Zelle um den
vorhandenen Konzentrationsgradienten abzubauen und ein Gleichgewicht herzustellen. Da es
sich bei den intrazellulären Gegenionen des Kaliums um negativ geladene Makromoleküle
handelt, welche die Zellmembran nicht durchdringen können und die Zellmembran im Ruhe-
zustand nur wenig durchlässig für Natriumionen ist, baut sich ein elektrisches Potential auf.
Dieses sogenannte Ruhepotential beträgt etwa –70 mV. Durch Signale, die über die Synapsen
in das Neuron einlaufen, wird das Ruhepotential lokal abgebaut (Depolarisation). Wird hier-
bei ein bestimmter Schwellenwert (etwa –50 mV) überschritten, so öffnen sich kurzzeitig bis
dahin geschlossene Natriumionenkanäle und Natriumionen strömen in die Zelle. Das
Membranpotential kehrt sich in der Nähe des Kanals um und induziert bei einem in der
Nachbarschaft liegenden Natriumionenkanal die Überschreitung des Schwellenwertes. Auf
diese Weise breitet sich die Umkehrung des Membranpotentials, auch Aktionspotential
genannt, entlang der Membran des Zellkörpers aus. Das Aktionspotential beträgt etwa
1 Einleitung
2
+30 mV. Erreicht das Aktionspotential den Anfang des Axons, wird es nach dem selben Me-
chanismus bis zu den Synapsen weitergeleitet. Die durch das Einströmen von Natriumionen
hervorgerufene Umkehr der Potentialdifferenz, führt zu einer Öffnung von ebenfalls span-
nungsabhängigen Kaliumionenkanälen. Kaliumionen fließen aus dem Inneren des Zellkörpers
bzw. des Axons heraus und machen so den Überschuss an positiven Ladungen innerhalb
weniger Millisekunden wieder rückgängig (Abbildung 1.1.1, oben rechts).[2] Anschließend
wird der Konzentrationsgradient der Natrium- und Kaliumionen durch die Ionenpumpen
wieder aufgebaut und das Ruhepotential bildet sich erneut aus, so dass ein neuer Nervenim-
puls weitergeleitet werden kann.
Abbildung 1.1.1: Weiterleitung von Impulsen zwischen Neuronen[1]
Das bei den Synapsen ankommende Aktionspotential bewirkt eine Öffnung von Calcium-
ionenkanälen. Die aufgrund eines Konzentrationsgradienten zwischen Synapse und ihrer Um-
gebung einströmenden Calciumionen lösen über komplexe biochemische Vorgänge die Frei-
setzung des in den synaptischen Vesikeln gespeicherten Neurotransmitters aus (Abbildung
1 Einleitung
3
1.1.2). Im Fall cholinerger Synapsen handelt es sich hierbei um Acetylcholin (ACh) (3),
andere wichtige Transmitter sind Dopamin, Noradrenalin und Adrenalin.
Abbildung 1.1.2: Cholinerge Synapse beim Freisetzen von ACh (3) in den synaptischen Spalt[3]
ACh (3) wird nahe am präsynaptischen Ende eines Neurons synthetisiert und zwar durch die
Übertragung einer Acetylgruppe des Acetyl-Coenzyms-A (1) auf Cholin (2). Die Reaktion
wird von dem Enzym Cholin-Acetyltransferase katalysiert (Schema 1.1.1).[4] Während Ace-
tyl-CoA neuronal in den Mitochondrien gebildet wird, muss Cholin (2) aktiv in die Nerven-
zelle aufgenommen werden und stammt zum Teil aus dem Acetylcholinabbau.[5] Die Spei-
cherung des so hergestellten ACh (3) erfolgt in den schon erwähnten synaptischen Vesikeln.
Sie haben einen Durchmesser von ca. 40 nm und enthalten jeweils ca. 104 ACh-Moleküle.[6]
Cholin-
Acetyltransferase
H3CCS
O
CoA + HO CH2CH2N(CH3)3
Acetyl-CoA (1)Cholin (2)
Acetylcholin (3)
H3CCO
O
CH2CH2N(CH3)3 + HS CoA
Coenzym-A (4)
Schema 1.1.1: Synthese von ACh (3) im präsynaptischen Ende von Neuronen
1 Einleitung
4
Das ACh (3) diffundiert durch den synaptischen Spalt zur postsynaptischen Membran, wo es
reversibel an den Acetylcholin-Rezeptor (AChR) bindet. Über das Öffnen des AChR inhe-
renten Ionenkanals wird der Impuls dann in das nächste Neuron weitergeleitet (Abbildung
1.1.3). Der Acetylcholin-Rezeptor besitzt zwei aktive Zentren: Eine anionische Bindungs-
stelle, über die ACh (3) mit seinem quartären Stickstoff durch Ionenbindung fixiert wird, und
eine esterophile Bindungsstelle, an die der Ester- oder Carbonylsauerstoff über Wasserstoff-
brücken gebunden wird. Die für die Reaktion mit dem Rezeptor wichtigen Strukturmerkmale
des ACh (3) sind der quartäre Stickstoff sowie zwei Sauerstoffatome, ein Ester- und ein Car-
bonylsauerstoff, die einen Abstand von 0.44 nm bzw. 0.59 nm zum quartären Stickstoff
besitzen und Wasserstoffbrücken eingehen können.
AChR werden in zwei Klassen unterteilt. Nicotinische AChR (nAChR) können neben ACh
(3) auch durch Nikotin aktiviert werden, muscarinische AChR (mAChR) sprechen auch auf
Muskarin an. Nikotin und Muskarin binden an der selben Stelle der entsprechenden AChRs
an der auch das ACh (3) bindet, sind also beide kompetitive Agonisten.
Abbildung 1.1.3: Aktivierung des AChR und Abbau des ACh (3) durch AChE[3]
Ein ACh-Molekül, das an der Übertragung eines Nervenimpulses mitgewirkt hat, muss inner-
halb der wenigen Millisekunden abgebaut werden, die bis zum Eintreffen des nächsten Im-
pulses vergehen. Für diesen Prozess ist die Acetylcholinesterase (AChE) zuständig. AChE
spaltet ACh (3) in Acetat (5) und Cholin (2) (Schema 1.1.2), welche zum Teil wieder in das
präsynaptische Nervenende transportiert und dort zum erneuten Aufbau von ACh (3) ver-
1 Einleitung
5
wendet werden. Die AChE ist ein hoch aktives Molekül. Es spaltet rund 25000 ACh-
Moleküle pro Sekunde, womit die katalytische Effizienz des Enzyms dicht an der durch
Diffusion vorgegebenen Grenze liegt.[6]
Acetylcholin-
esterase
H3CCO
O
CH2CH2N(CH3)3 + H2O
Acetylcholin (3)
H3C C O + HO
O
CH2CH2N(CH3)3 + H
Acetat (5)Cholin (2)
Schema 1.1.2: Abbau von ACh (3) durch das Enzym AChE
1.2 Die Alzheimer’sche Demenz
1907 beschrieb Alois Alzheimer erstmals eingehend die präsenile Demenz einer 51 Jahre al-
ten Patientin.[7] Bei der fortan als Morbus Alzheimer bzw. Alzheimer’sche Demenz (AD) be-
zeichneten Erkrankung handelt es sich um eine neurodegenerative Erkrankung mit bisher
nicht vollständig geklärter Ätiologie.
1.2.1 Epidemiologie
Die AD ist die häufigste Ursache einer Demenz bei älteren Menschen. Sie ist für annähernd
zwei Drittel aller Demenzen bei den über 65jährigen verantwortlich.[8] Ihr Vorkommen ist
stark altersabhängig. Während bei den 70-74jährigen ca. 2% von einer AD betroffen sind,
sind es bei den 75-79jährigen ca. 4% und bei den 80-84jährigen ca. 11%.[1] Anfang der 80er
Jahre betrug die Anzahl demenzkranker Patienten in Westdeutschland ca. 680 000, hiervon
litten ca. 420 000 an einer AD. Inzwischen wird in Deutschland von etwa 1 bis 1.2 Millionen
Demenzpatienten ausgegangen, davon 800 000 Alzheimer Patienten.[9]
Die AD stellt eine hohe Belastung für das Gesundheitswesen dar. Die Kosten für Behandlung
und Pflege Demenzkranker in Deutschland werden auf etwa 15 Milliarden € jährlich ge-
schätzt.[9] In den Vereinigten Staaten wurden die durch Alzheimer Patienten bedingten Ge-
sundheitskosten auf bis zu 100 Milliarden US$ pro Jahr geschätzt.[10]
1 Einleitung
6
1.2.2 Klinisches Bild
Klinisch ist das Anfangsstadium der Alzheimer’schen Demenz durch eine fortschreitende Ab-
nahme sowohl der Gedächtnisfunktion als auch der Fähigkeit zur Lösung komplexer Auf-
gaben gekennzeichnet. Die Betroffenen neigen zunehmend dazu sich zu wiederholen, sie
werden verwirrt und erscheinen verloren. Persönlichkeit, Urteilsvermögen und die Fähigkeit
mit anderen umzugehen, können langsam abnehmen, während emotionale Störungen wie Ag-
gressivität, Apathie, Depressionen und Ängste zunehmen. Ferner treten Sprachstörungen
(Aphasie), Störungen der Motorik (Apraxie), Störungen bei der Objektidentifizierung durch
Berührung (Agnosie) sowie Schlafstörungen auf.[11] Die Alzheimer’sche Demenz ist eine fort-
schreitende Erkrankung mit progressiver Verschlechterung des Zustandes der Betroffenen.
Während die ersten Symptome noch leicht ausgeprägt sein können, kommt es später zum
Versagen der Sprache und motorischer Fähigkeiten. Schließlich fallen die Patienten ins Koma
und versterben.[12]
1.2.3 Molekulare Pathologie
Die typischen, schon von Alzheimer beschriebenen, neuropathologischen Befunde der AD
sind die senilen Plaques und die neurofibrillären Bündel.[4]
Neurofibrilläre Bündel aus fadenförmigen Proteinmolekülen sind charakteristische Ab-
lagerungen im Gehirn von Alzheimer-Patienten. Sie liegen im Inneren der Nervenzellen und
bestehen hauptsächlich aus dem Tau-Protein, das in Neuronen vorkommt.[13] Es handelt sich
um Konglomerate von Proteinfasern, die sich jeweils paarweise umeinander winden. Dies ist
auf eine Fehlfunktion des Tau-Proteins zurückzuführen. Das Protein bindet an Tubulin, den
Grundbaustein der Mikrotubuli, welche wichtige Stützstrukturen der Zelle sind und ein Netz
von Transporttrassen in der Zelle bilden. Die Anzahl der Bündel korreliert mit dem Krank-
heitsverlauf, jedoch kommen sie in geringer Anzahl auch bei gesunden Menschen vor. Ferner
treten die Neurofibrillären Bündel im Verlauf der AD erst nach den Plaque Ablagerungen auf.
Der Hauptbestandteil (ca. 90%) der Plaques ist das in Fibrillen vorliegende Beta-Amyloid-
Protein (A
β
), genauer eine A
β
Spezies mit einer Länge von 42 Aminosäuren (A
β
1-42).[14] A
β
entsteht durch enzymatische Spaltung aus einem viel größeren transmembranen Glycoprotein,
welches als
β
-APP (engl.: beta-amyloid precursor protein) bezeichnet wird. Es besteht aus
einem kurzen Abschnitt, der die Membran der Nervenzellen durchquert, sowie einem langen
1 Einleitung
7
extra- und einem kurzen interzellulären Bereich.[15] Es existieren sechs verschiedene Formen
des
β
-APP, die sich in der Anzahl der Aminosäuren aus denen sie aufgebaut sind unterschei-
den. Dieses Variationen entstehen durch alternative Verbindungen der mRNA (engl.: messan-
ger Ribo Nucleic Acid).[16] Das Gen des
β
-APP konnte auf dem menschlichen Chromosom 21
lokalisiert werden.[17] Die Funktion des Proteins konnte bis heute nicht geklärt werden, der
hohe Konservierungsgrad der
β
-APP bei Säugetieren lässt aber auf eine wichtige physiologi-
sche Rolle schließen.[8]
β
-APP wird in vielen Zellen des menschlichen Körpers produziert,
wobei in Neuronen vornehmlich die Spezies mit einer Länge von 695 Aminosäuren vor-
kommt.[18] Diese Form des
β
-APP kann auf zwei unterschiedlichen Reaktionspfaden gespal-
ten werden, den α-Secretase Pfad oder den β-Secretase Pfad (Abbildung 1.2.1).
Abbildung 1.2.1: Enzymatische Spaltung von
β
-APP695 durch verschiedene Secretasen[19]
Der schwarz markierte Bereich in Abbildung 1.2.1 stellt die A
β
-Domäne des
β
-APP dar.
Beim α-Secretase Pfad findet die Spaltung innerhalb der A
β
-Domäne statt, so dass kein voll-
ständiges A
β
entstehen kann. Das entstehende C-Terminus Fragment kann durch
γ
-Secretase
weiter zerlegt werden und es entsteht ein A
β
Fragment, das A
β
17-42. Beim β-Secretase Pfad
enthält das C-Terminus Fragment noch die vollständige A
β
-Domäne. Durch Spaltung dieses
Fragments durch
γ
-Secretase, welche an zwei Stellen erfolgen kann, entstehen zwei Formen
des A
β
. Eine Form mit 40 Aminosäuren (A
β
1-40) und eine längere mit 42 Aminosäuren (A
β
1-
42). Welche Proteine sich hinter den am Abbau des
β
-APP beteiligten Secretasen verbergen,
konnte noch nicht abschließend geklärt werden, es existieren aber Vermutungen um welche
Enzyme es sich hierbei handeln könnte.[14, 16] Das Verhältnis von A
β
1-40 zu A
β
1-42 beträgt bei
gesunden Menschen ca. 90 zu 10.
1 Einleitung
8
Die Aggregation der löslichen A
β
zu den unlöslichen, fibrillären A
β
-Plaques wird als ein ent-
scheidendes Ereignis in der Pathogenese einer AD angesehen.[14] Die Veränderung der sekun-
dären Struktur des A
β
von einer α-helikalen Struktur hin zu einer
β
-Faltblattstruktur ist hier-
bei wichtiger Zwischenschritt auf dem Weg zum aggregierten A
β
. Die Neigung eine
β
-Falt-
blattstruktur auszubilden ist beim A
β
1-42 signifikant größer als beim A
β
1-40 und diese Eigen-
schaft korreliert mit der erhöhten Neigung Aggregate zu bilden. A
β
1-42 aggregiert in Lösung
ca. 70 Mal schneller als A
β
1-40.[20]
Die genauen Mechanismen die zur Aggregation von A
β
führen, konnten noch nicht vollstän-
dig aufgeklärt werden, auch wenn der Einfluss einiger Faktoren schon bekannt ist.[16] In vitro
kommt es ab einer kritischen A
β
1-42 Konzentration von 0.1 mM zur Bildung von Micellen,
einer Vorstufe der Plaques. Neben dieser Selbstassoziation scheint die A
β
-Plaquebildung
durch hydrophobe Oberflächen induziert zu werden.[16] Ferner konnte gezeigt werden, dass
verschiedene Proteine, welche sich auch in den Plaques nachweisen lassen, die Aggregation
von A
β
fördern.[14] Neue Forschungsergebnisse zeigen, dass auch die AChE zu diesen Pro-
teinen gehört.[21, 22, 23] Durch den Einsatz verschiedener AChE-Antikörper und Inhibitoren
konnte gezeigt werden, dass die periphere anionische Bindungsstelle (PAS, engl.: peripheral
anionic site)[24] der AChE für die aggregationsfördernde Wirkung des Enzyms verantwortlich
ist.[25, 25, 26, 27] Diese Erkenntnis stellt einen ganz neuen Ansatz für die Entwicklung von AD
Therapeutika dar.
Im Gegensatz zu der löslichen Form des A
β
wirkt fibrilläres A
β
1-42 direkt toxisch auf Nerven-
zellen.[28] Fibrilläres A
β
1-42 scheint den Calcium-Haushalt der Nervenzellen so massiv zu stö-
ren, dass diese absterben. Ferner gibt es Hinweise, dass es die Mitochondrien der Zelle schä-
digt. Dabei entstehende Radikale können weitere Zellbestandteile schädigen und auf diese
Weise zum Tod der Nervenzellen führen. Es wurde beobachtet, dass Nervenzellen zwischen
denen amyloide Plaques liegen aufgequollen und deformiert wirken. Um die Ablagerungs-
herde sammeln sich Mikroglia-Zellen (Teile des Gehirn-Immunsystems) und rufen
Entzündungsreaktionen hervor, was zu weiteren Schädigungen der Nervenzellen führen
kann.[14]
Gegen die Hypothese, dass A
β
-Bildung und -Ablagerung ein ursächlicher Faktor bei der AD
ist spricht, dass die meisten älteren Menschen Plaqueablagerungen im Gehirn haben, unab-
hängig von einer AD. Auch der Grad der Demenz korreliert nur schwach mit der Menge an
Plaques, jedoch sehr gut mit der Menge an gelöstem A
β
.[8]
1 Einleitung
9
Für die Hypothese, dass A
β
-Bildung und -Ablagerung ein ursächlicher Faktor bei der AD ist,
spricht, dass die A
β
-Ablagerungen bei AD-Patienten besonders massiv im Hippocampus und
der Großhirnrinde vorkommen. Diese Regionen des Gehirns steuern Gedächtnis, Sprache und
Denkfähigkeit, ferner ist hier der Nervenzelluntergang bei einer AD besonders ausgeprägt.[16]
Ein weiteres Indiz für die A
β
-Hypothese sind die genetischen Veränderungen, die das Risiko
eine AD auszubilden erhöhen.
1.2.4 Genetische Faktoren
Mutationen im
β
-APP Gen auf Chromosom 21 sind für 5 bis 20% der Fälle früher AD ver-
antwortlich. Diese Form der AD tritt schon zwischen dem 30. und 60. Lebensjahr auf, macht
jedoch nur ca. 10% der gesamten AD-Erkrankungen aus. Die Mutationen des
β
-APP Gens
führt zu einer veränderten Primärsequenz des
β
-APP. Das mutierte Protein besitzt an genau
den Stellen andere Aminosäuren, an denen die drei Secretasen es spalten. Infolgedessen wird
mehr A
β
1-40 und A
β
1-42 produziert und/oder das Verhältnis der beiden A
β
-Spezies wird zu-
gunsten der längeren verschoben.
Presenilin 1 (PS-1) und Presenilin 2 (PS-2) sind transmembrane Proteine mit nicht vollständig
bekannter Funktion. Mutationen des PS-1 Gens sind mit mehr als 50% die häufigste Ursache
einer frühen AD, PS-2-Gendefekte treten nur sehr selten auf. Die Wirkung der Mutation ist
jedoch in beiden Fällen identisch. Es tritt eine Steigerung der Schnittrate durch
γ
-Secretase
auf, wobei auch hier neben der gehäuften Bildung von A
β
1-40 und A
β
1-42 das Verhältnis der
beiden Proteine zugunsten von A
β
1-42 verschoben ist.
Im Gegensatz zu den bisher beschriebenen Mutationen, die alle für den Ausbruch einer frühen
AD verantwortlich sind, zeichnet ein Polymorphismus des Apoliprotein E (ApoE) Gens auf
Chromosom 19 verantwortlich für ein erhöhtes Risiko, an einer späten AD zu erkranken. Das
Protein ist normalerweise für den Cholesterintransport zuständig. Das Gen dieses Proteins
kommt in drei Versionen oder Allelen vor. Eine der drei Varianten, dass ApoE4 kommt bei
ca. 40% aller AD-Kranken vor, während es bezogen auf die gesamt Bevölkerung viel seltener
vorkommt. Der Mechanismus über den diese Form des ApoE die Ausbildung einer AD för-
dert sind noch unklar. Eine diskutierte Möglichkeit ist, dass ApoE4 mit A
β
um den Abtrans-
port aus den Zellzwischenräumen konkurriert und somit zu einer Anhäufung des letzteren
1 Einleitung
10
führt. Es konnte gezeigt werden, dass ein bestimmtes für solche Transporte zuständiges Mo-
lekül das ApoE4-Protein deutlich effektiver entfernt als A
β
.
1.2.5 Advanced Glycosylation End Products
Als weiterer Faktor bei der Entstehung einer AD wird seit neustem der Einfluss von AGEs
(Advanced Glycosylation End Products) diskutiert, da ihre neurobiochemischen Eigenschaf-
ten viele pathologische Veränderungen bei AD-Patienten erklären können und das Verständ-
nis über die Interaktion zwischen Amyloidablagerung, oxidativem Stress und der Bildung
neurofibrillärer Bündel erleichtern.[29] Die AGEs sind eine Gruppe heterogener Substanzen.
Sie entstehen durch die irreversible Glykosilierung von Proteinen. Dabei reagieren Keton-
oder Aldehydgruppen eines Zuckers mit freien Aminogruppen von Aminosäuren. Durch eine
Vielzahl von Reaktionen wie Dehydrierung, Kondensation, Fragmentation, Oxidation und
Zyklisierungsreaktionen werden hochmolekulare Heterozyklen gebildet, die an Proteine
gebunden sind. AGEs können aus Aminosäuren, Proteinen und Lipoproteinen entstehen. Vor
allem langlebige Proteine werden so verändert. Das Gewebe des zentralen Nervensystems
(ZNS) ist der wichtigste Ort für die AGE-Bildung. AGEs sind gegenüber proteolytischen
Prozessen resistent, und sie können die Vernetzung von Polypeptiden induzieren und mit
zahlreichen physiologischen Funktionen interferieren. Ihre Wirkung entfalten AGEs entweder
direkt aufgrund ihrer chemischen Eigenschaften oder indirekt durch rezeptorvermittelte
Prozesse. Histochemische und immunoquantitative Untersuchungen haben gezeigt, dass in
den senilen Plaques und den neurofibrillären Bündeln hohe Konzentrationen an AGEs auftre-
ten. Des weiteren können AGEs oxidativen Stress auslösen.[30]
Ob und welche der beobachteten Veränderungen Ursache oder nur Symptome der AD sind,
konnte bis heute noch nicht eindeutig geklärt werden.[31] Es besteht inzwischen ein breiter
wissenschaftlicher Konsens, dass es für die Ausbildung einer AD keinen einzelnen einzu-
grenzenden Grund gibt, sondern das komplexe Zusammenspiel vieler Faktoren die Krankheit
auslöst, was die Ursachenforschung sehr schwierig macht. Diese Erkenntnis wird auch durch
neuere Studien an Affen belegt.[14] Während die Injektion von fibrillärem A
β
nicht toxisch auf
das Gehirn junger Rhesusaffen ist, ruft die Injektion bei alten Rhesusaffen einen deutlichen
Verlust an Neuronen, die Bildung von neurofibrillären Bündeln sowie die Ansammlung von
Mikroglia-Zellen hervor. Diese Befunde führen zur Vermutung, dass noch unbekannte, alters-
1 Einleitung
11
bedingte Veränderungen in der Zusammensetzung der Cerebralen-Matrix an der Ätiologie
einer AD beteiligt sein müssen.
1.2.6 Therapeutische Ansätze zur Behandlung der AD
Auch wenn es bislang noch keine Möglichkeit gibt, die AD zu heilen, existieren eine Vielzahl
von Therapien bzw. Therapieansätzen, die auf eine Bekämpfung der AD-Symptome hinzielen
und/oder die versuchen, den Verlauf der Krankheit hinauszuzögern um den Patienten
möglichst lange ein selbstbestimmtes, eigenständiges Leben zu ermöglichen.[32]
In der folgenden Übersicht werden die derzeit wichtigsten Behandlungsansätze kurz erläutert.
Die vorhandenen Therapien bzw. Therapieansätze lassen sich grob in 8 Klassen unterteilen:
1. Entzündungshemmer
2. Radikalfänger/Antioxidanzien
3. Neurotrophische Mittel
4. Hormone
5. Antiamyloid Konzepte
6. Cholesterinsenker
7. Konzepte zur Verbesserung des Energiestoffwechsels
8. Cholinerge Therapie
1.2.6.1 Entzündungshemmer
Die bei einer AD auftretenden entzündlichen Prozesse und eine daraus resultierende Schädi-
gung von Nervenzellen sind Angriffspunkte für eine mögliche Therapie mit entzündungs-
hemmenden Mittel.[33] Zwei nichtsteroidale endzündungshemmende Mittel (engl.: nonsteroi-
dal anti-inflammatory drugs (NSAIDs)) befinden sich in klinischen Tests (Rofecoxib (Vi-
oxx®), Naproxen (Aleve®)).[34] Ferner wurde berichtet, dass einige NSAIDs in der Lage sind,
die Bildung von A
β
1-42 zu verringern.[35]
1.2.6.2 Radikalfänger/Antioxidanzien
Es gibt Hinweise, dass bei einer AD vermehrt Radikale im Gehirn entstehen, die zu soge-
nanntem oxidativen Stress führen und so Nervenzellen schädigen. Die Radikalbildung resul-
1 Einleitung
12
tiert einerseits aus der Eigenschaft der Aβ-Plaques Sauerstoffradikale zu generieren, ander-
seits entstehen sie durch den gestörten Calciumhaushalt der Neuronen und ihrer Mitochond-
rien. Neben anderen Radikalfängern befindet sich Vitamin E in klinischen Tests. Das Ginkgo
Biloba, ein Extrakt aus Blättern des Ginkgobaums ist ein weiteres Therapeutikum, welches im
Augenblick untersucht wird. Es gibt jedoch bisher noch keinen Beweis für eine heilende oder
schützende Wirkung. Weitere Stoffe, die in die Gruppe der Antioxidanzien fallen sind Mono-
amin Oxidase Inhibitoren und das Selegilin.[19]
1.2.6.3 Neurotrophische Mittel
Neurotrophische Faktoren (z.B. NGF) sind Polypeptide, die das Wachstum und die Differen-
zierung von Neuronen während der Entwicklung des Nervensystems unterstützen, sowie das
Überleben von Neuronen Erwachsener verbessern. Es ist bekannt, dass NGF die Größe und
Aktivität noch vorhandener cholinerger Neuronen erhöht. Obwohl bei Alzheimer-Patienten
kein generelles Defizit an NGF vorhanden ist, könnte eine Erhöhung dieser Faktoren die cho-
linergen Funktionen verbessern. Eine direkte Gabe von NGF scheidet aus, da die Proteine
nicht in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Die in der Entwicklung bzw.
in klinischen Tests befindlichen Substanzen haben entweder die Erhöhung der natürlichen
NGF zum Ziel oder wirken als NGF-Mimetika.[36]
1.2.6.4 Hormone
Epidemiologische Studien haben einen Zusammenhang zwischen Östrogen-Mangel bei
Frauen und AD gezeigt. Die Gabe von Östrogen kann möglicherweise das Risiko an einer AD
zu erkranken mindern bzw. den Krankheitsverlauf verlangsamen.[19] Ferner ist Östrogen auch
ein sehr guter Radikalfänger.
1.2.6.5 Antiamyloid Konzepte
Es befindet sich ein Impfstoff (AN-1792) in klinischen Tests der Phase IIa. Bei AN-1792
handelt es sich um eine synthetische Form des Aβ-Proteins. Es soll das Immunsystem aktivie-
ren, die Aβ-Plaques anzugreifen und abzubauen.[37] Ein anderer Ansatz ist die Hemmung der
Enzymaktivität von γ- und β-Secretase durch entsprechende Inhibitoren. Der dritte Weg, der
1 Einleitung
13
auf eine Verringerung der Plaquebildung abzielt, ist der Einsatz von Anti-Aggregationsmit-
teln.[38]
1.2.6.6 Cholesterinsenker
Viele Beobachtungen bringen den Cholesterin-Metabolismus mit der AD in Verbindung.[14]
Epidemiologische Studien haben gezeigt, dass Statine die den Cholesterin Spiegel senken, mit
einem verringerten AD Risiko in Verbindung stehen. Die Statine sind in vitro in der Lage die
Bildung von Aβ zu reduzieren, während die Zugabe von Cholesterin die neuronale Aus-
schüttung von Aβ erhöht.[14]
1.2.6.7 Konzepte zur Verbesserung des Energiestoffwechsels
In vitro Untersuchungen haben gezeigt, dass Störungen des mitochondrialen Energiestoff-
wechsels einen Anteil am neuronalen Zelltod bei der AD haben.[39] Als Therapeutika werden
hier verschiedene Koenzyme getestet, die eine Verbesserung der mitochondrialen Atmungs-
kette zum Ziel haben.
1.2.6.8 Cholinerge Therapien
Der Nervenzelluntergang bei der AD betrifft unter anderem cholinerge Neuronen, insbe-
sondere im Nucleus basalis Meynert, der im basalen Vorderhirn liegt.[40] Ferner kommt es zu
einer signifikant verringerten Konzentration von Cholin-Acetyltransferase (ChAT) in der
Großhirnrinde sowie im Hippocampus und Neokortex von AD-Patienten. Hierdurch wird die
Herstellung von ACh (3) herabgesetzt und in den entsprechenden Regionen des Gehirns
entsteht ein Mangel an diesem wichtigen Neurotransmitter. Zudem ist die Aktivität der AChE
herabgesetzt, sowie die Anzahl der nAChR vermindert.[41, 42] Die Verminderung der nAChR
korreliert sehr gut mit der Stärke der AD. Die nAChR werden daher als der wichtigste biolo-
gischer Marker für den Grad der Demenz bei AD-Patienten angesehen.[43] Das cholinerge
System spielt eine wesentliche, wenn auch bis heute noch nicht vollständig verstandene Rolle
bei Lern- und Erinnerungsfunktionen des Gehirns.[44]
Die auf diesen Erkenntnissen aufbauende cholinerge Hypothese der AD geht nun davon aus,
dass der mit der Krankheit verbundene kognitive Verlust mit einem ACh-Mangel und des-
wegen verminderter cholinerger Neurotransmission in der Hirnrinde zusammenhängt. Die Be-
1 Einleitung
14
hebung bzw. Verminderung des Defizits müsste zu einer Verbesserung der Signalübertragung
führen und dadurch die kognitive Leistungsfähigkeit steigern.
In den letzten Jahrzehnten war daher die bedeutendste Strategie zur Behandlung der AD die
Verbesserung des cholinergen Defizits, das vor ungefähr 20 Jahren zum ersten mal beobachtet
wurde. Dementsprechend gibt es eine größere Anzahl an Medikamenten, die diese Strategie
verfolgen. Hierunter befinden sich auch die vier Medikamente, die bisher zur Behandlung der
AD zugelassen wurden (Abbildung 1.2.2). Bei diesen handelt es sich um reversible bzw.
pseudoirreversible AChE-Inhibitoren.[45] Ziel dieser Inhibitoren ist es die bei der AD
verringerte Konzentration des Neurotransmitters ACh (3) im synaptischen Spalt zu erhöhen,
um die Signalübertragung im cholinergen System zu verbessern. AChE-Inhibitoren wirken
allerdings nur in einem frühen Stadium der AD. Im fortgeschrittenem Stadium sind für eine
Wirksamkeit nicht mehr ausreichend intakte cholinerge Synapsen vorhanden.[43]
Der Neurotransmitter Acetylcholin wird im menschlichen Körper durch zwei unterschiedliche
Cholinesteraseformen gespalten, zum einen durch die überwiegend im ZNS lokalisierte Ace-
tylcholinesterase (AChE), zum anderen durch die überwiegend in der Peripherie aktive Buty-
rylcholinesterase (BuChE), auch Pseudocholinesterase genannt. Die Hemmung der BuChE
durch nicht ausreichend selektive AChE-Inhibitoren wird für eine Vielzahl der teilweise
schweren Nebenwirkungen dieser Substanzen verantwortlich gemacht.[46]
Als Maß für die Stärke der Enzymhemmung einer Substanz wird die mittlere Konzentration
(IC50) bestimmt, die zu einer Verringerung der Enzymaktivität um 50% führt. Zwar erscheint
es auf den ersten Blick sinnvoll, möglichst effektive AChE-Inhibitoren einzusetzen, es darf
aber nicht vergessen werden, dass die AChE eine lebenswichtige Aufgabe erfüllt. Bei einer zu
starken Inhibierung würden Nervensignale nicht mehr terminiert und ein geregelter
neuronaler Informationsfluss wäre nicht mehr möglich. Dies würde zum Tod führen. Viele
Schlangengifte, Nervengase und Insektizide sind irreversible AChE-Inhibitoren. Die
Schwierigkeit bei einem therapeutischen Einsatz von reversiblen AChE-Inhibitoren liegt also
darin, ein Gleichgewicht zwischen der Inhibierung auf der einen Seite und einer
ausreichenden Restaktivität der AChE auf der anderen Seite zu finden. Als problematisch
beim Einsatz von AChE-Inhibitoren werden ferner die noch nicht völlig verstandenen nicht
cholinergen Funktionen der AChE angesehen.[23]
Durch den Einsatz von Cholinesterase-Hemmern verbessern sich die Gesamtsymptome bei
einer AD. Der Verfall der kognitiven Leistungsfähigkeit lässt sich ungefähr ein Jahr aufhal-
ten, die Patienten bleiben dadurch länger selbstständig. Zu den Langzeiterfolgen gibt es noch
1 Einleitung
15
keine genauen Voraussagen, da die Medikamente erst seit relativ kurzer Zeit auf dem Markt
sind.
Als erste Vertreter dieser Stoffklasse wurde 1995 das Aminoacridin-Derivat Tacrin (6)
(Cognex®) in Deutschland zugelassen. Aufgrund seiner schweren Nebenwirkungen wurde es
weitgehend durch AChE-Inhibitorennhibitoren der „zweiten Generation“ abgelöst. 1997
wurde mit Donepezil (7) (Aricept®), einem Piperidinderivat, ein weiterer AChE-Inhibitore in
Deutschland zugelassen. Donepezil (7) zeichnet sich gegenüber Tacrin (6) durch eine 1000-
fach höhere Spezifität gegenüber der AChE im Vergleich zur zentralnervös weniger bedeut-
samen BuChE aus. Auch ist die Spezifität für das Hirngewebe von Donepezil (7) größer als
von Tacrin (6). Rivastigmin (8) (Exelon®) ein hirnselektiver, pseudoirreversibler AChE-Inhi-
bitor vom Carbamat-Typ wurde 1999 zur Behandlung der AD zugelassen. Der letzte AChE-
Inhibitor, dass Galanthamin (9) (Reminyl®) erhielt Anfang 2001 die Zulassung für die Be-
handlung der AD. Galanthamin (9) ist ein tertiäres Alkaloid mit einem pka von 8.32. Es
kommt in verschiedenen Amaryllidacae Arten vor, wurde 1950 zufällig von einem bulgari-
schen Pharmakologen in den Zwiebeln von kaukasischen Schneeglöckchen (Galanthus woro-
nowi) entdeckt und wird seit über 40 Jahren in der Anästhesie eingesetzt.[47]
O
O
OH
N
N
NH2
O
O
ONON
O
H
N
Tacrin (6)Donepecil (7)Galanthamin (9)Rivastigmin (8)
Abbildung 1.2.2: In Deutschland zugelassene Medikamente zur Behandlung der AD
Galanthamin (9) nimmt eine Sonderstellung in der Gruppe der zugelassenen AChE-Inhibito-
ren ein, da es neben der AChE-Inhibition eine Modulation von prä- und postsynaptischen
nAChR bewirkt. Präsynaptische nAChR regulieren die Freisetzung von ACh (3) und beein-
flussen eventuell andere wichtige Neurotransmitter wie Glutamat oder γ-Aminobuttersäure.[48]
Die schon erwähnte Funktion postsynaptischer nAChR besteht in der Induzierung eines Ner-
venimpulses im postsynaptischen Neuron.
In Abbildung 1.2.3 sind die Ergebnisse von in vitro elektrophysiologischen Untersuchungen
an menschlichen nAChR-Zelllinien dargestellt. Mit der sog. Patch-Clamp Technik wurden die
Stromflüsse gemessen, die unter dem Einfluss von Galanthamin (9) (GAL) und/oder ACh (3)
1 Einleitung
16
auftreten.[48] Galanthamin (9) erhöht die Sensibilität des nAChR auf ACh (3), ohne um dessen
Bindungsstelle zu konkurrieren, ist also ein allosterisch potenzierender Ligand (APL) des
nAChR. Der allosterische Effekt ist vermutlich auf eine Konformationsveränderung des
nAChR zurückzuführen, welche bei der Aktivierung des Ionenkanals durch ACh (3) einen
erhöhten Ionenfluss bewirkt. Wie in Abbildung 1.2.3 zu erkennen ist, führt die Zugabe von
0.4 μM Galanthamin (9) und 100 μM ACh (3) (Abbildung 1.2.3, B) zu einer deutlichen Erhö-
hung des Stromflusses im Vergleich zur ausschließlichen Applikation von 100 μM ACh
(Abbildung 1.2.3, A). In höherer Konzentration führt Galanthamin (9) auch in Abwesenheit
von ACh (3) zu einer Aktivierung des nAChR, ist also auch ein nichtkompetitiver Agonist
(Abbildung 1.2.3, D). Diese Modulation von nAChR stellt eine bisher einmalige Erweiterung
der cholinergen Therapie mit AChE-Inhibitoren dar.
Abbildung 1.2.3: ACh (3) induzierter Stromfluss in Abhängigkeit einer Galanthamin (9) Applika-
tion[48]
In den letzten zehn Jahren hat es große Fortschritte auf dem Gebiet der AD-Forschung ge-
geben. Aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse wurden neue Medikamente entwickelt, von
denen einige schon auf dem Markt verfügbar sind, weitere befinden sich in den unterschied-
lichsten Entwicklungsstufen. Keines der vorhandenen Mittel bewirkt jedoch eine Heilung.
Auch die Nebenwirkungen sind oftmals noch erheblich. Daher bedarf es noch weiteren An-
strengungen zur Ursachenforschung sowie zur Entwicklung neuer Medikamente unternom-
men werden.[8, 31] Die duale Wirkung von Galanthamin (9) im cholinergen System macht es
nicht nur zu einem vielversprechenden AD-Therapeutikum, sondern auch zu einer sinnvollen
Leitstruktur für die Entwicklung von AD-Medikamenten der nächsten Generation.
2 Aufgabenstellung
17
2 Aufgabenstellung
Ziel dieser Arbeit war es, durch biochemische Untersuchungen, Synthesen und theoretische
Methoden Beiträge zur Optimierung und Weiterentwicklung von cholinergen Therapeutika
zur Behandlung der Alzheimer’schen Demenz auf Grundlage der Leitstruktur (–)-Galanth-
amin (9) zu leisten.
Die Identifizierung aller Aminosäuren des nicotinischen Acetylcholin-Rezeptors (nAChR) die
an der Bindung von Liganden beteiligt sind, ist entscheidend für das Verständnis der Zu-
sammenhänge zwischen strukturellen Komponenten und physiologischen Funktionen.
Die Bindungsstelle des AChR für die Gruppe der allosterisch potenzierenden Liganden (APL)
ist bisher nur an einem Beispiel grob bestimmt worden. Für den Einsatz eines computerge-
stützten, rezeptorbasierten Designs neuer APL sind die vorhandenen Strukturdaten noch zu
ungenau. Dies ist darauf zurückzuführen, dass der AChR seine charakteristische tertiäre
Struktur verliert, wenn er aus der Membran in die er eingebettet ist herausgelöst wird. Daher
ist er einer Röntgenstrukturanalyse bisher nicht zugänglich. Alle bisherigen Beiträge zur
Strukturaufklärung stammen aus elektronenmikroskopischen Untersuchungen, der Auf-
klärung der Primärsequenz, Photoaffinitätsmarkierungen, Mutagenese-Studien und Protein-
Modelling.[49]
Durch Photoaffinitätsmarkierungn des nAChR mit (–)-Galanthamin (9) soll ein weiterer
Beitrag zur Struktur- und Funktionsaufklärung geleistet werden. Da das hierfür benötigte,
radioaktiv markierte (–)-Galanthamin (9) kommerziell nicht erhältlich ist, muss zunächst eine
geeignete Synthese für [3H]-(–)-Galanthamin ausgearbeitet und durchgeführt werden.
Die von der Acetylcholinesterase (AChE) induzierte Aggregation von beta-Amyloid-Protein
(Aβ) und die Möglichkeit diese Aggregation durch Liganden der peripheren anionischen Bin-
dungsstelle (PAS, engl.: peripheral anionic site) der AChE zu inhibieren, ist die Grundlage für
eine mögliche Weiterentwicklung vorhandener AChE-Inhibitorennhibitoren. Die Modifika-
tion eines kompetitiven Antagonisten der AChE wie zum Beispiel des (–)-Galanthamins (9)
dahingehend, dass er gleichzeitig im Bereich der Acetylcholin-Bindungsstelle und an der PAS
von AChE bindet, würde zu einem bisfunktionalen Liganden mit möglicher Inhibierung des
Acetylcholin-Abbaus und der Aβ-Aggregation führen. Daher sollen Synthesen für die
Darstellung potentieller bisfunktionaler Galanthamin-Derivate erarbeitet werden.
Durch Docking-Studien sollen die molekularen Wechselwirkungen von Galanthamin (9) und
Galanthamin-Derivaten mit der AChE untersucht werden, um Hinweise auf mögliche Kandi-
2 Aufgabenstellung
18
daten mit einer potentiellen bisfunktionalen Wirkung zu erhalten. Durch die korrekte Vorher-
sage der aktiven Konformation von Liganden der AChE könnte ferner die Aufstellung drei-
dimensionaler quantitativer Struktur-Wirkungsbeziehungen (QSAR, engl.: quantitative struc-
ture-activity relationship) ermöglicht werden.
Zusammenfassend lassen sich die in dieser Arbeit gestellten Aufgaben in vier Bereiche glie-
dern.
1. Synthese von spezifisch tritiummarkiertem (–)-Galanthamin (9)
2. Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-[3H]-Galanthamin
3. Entwicklung von Synthesewegen zur Darstellung bisfunktionaler Galanthamin-Derivate
4. Molecular-Modelling Studien von Galanthamin (9) und Galanthamin-Derivaten
3 Diskussion der Ergebnisse
19
3 Diskussion der Ergebnisse
3.1 3H-Markierung von (–)-Galanthamin
Ziel dieser Teilaufgabe war die Darstellung eines spezifisch markierten (–)-[3H]-Galanth-
amins für die Durchführung von Photoaffinitätsmarkierungen. Eine weitere Vorgabe bei der
Synthese war, dass eine spätere Derivatisierung durch Substitution der Stickstoff-Methyl-
gruppe möglich sein sollte. Es wurden drei Wege zur spezifischen Tritiummarkierung von
(–)-Galanthamin (9) untersucht. Die Schlüsselschritte der drei Routen sind in Schema 3.1.1
dargestellt.
Route A: Katalytische Hydrogenolyse eines aromatischen Halogens mit Tritium-Gas
O
O
OH
N
BOCBr
O
O
O
OH
N
BOCT
O
Pd/C, T2
10 11
Route B: Hydrogenolyse eines aromatischen Halogens mit Lithiumaluminiumtritid
O
O
OH
N
Br
O
O
OH
N
T
LiAlT4
12 13
Route C: Diastereoselektive Reduktion einer Carbonyl Gruppe
O
O
N
O
O
OH
N
Li(sec.-Bu)3BT
OT
14 15
Schema 3.1.1: Potentielle Synthesewege zu (–)-[3H]-Galanthamin
3 Diskussion der Ergebnisse
20
3.1.1 Route A
Die Hydrogenolyse von aromatischen Verbindungen durch Halogenaustausch mit Tritiumgas
in Gegenwart eines Palladium-Katalysators ist eine weit verbreitete und erprobte Methode für
Tritiierungen. Der erste Versuch zur Synthese von (–)-[3H]-Galanthamin basierte daher auf
der Tritiierung eines (–)-8-Bromgalanthamin-Derivats ausgehend von (–)-Galanthamin-
Hydrobromid (19) (Reminyl®). In Schema 3.1.2 ist die Synthesestrategie in Form einer Retro-
synthese dargestellt.
O
O
OH
N
O
O
OPG
N
T
O
O
OPG
N
BOCTT
O
O
OH
N
BOCT
O
O
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N
BOC
O
Br
iii
iii iv v
O
O
OH
N
H
vi O
O
OH
N
O
O
OH
N
Br
H
vii
Br
O
Br
1011
13 16 17
18 12 19
Schema 3.1.2: Retrosynthese von (–)-8-[3H]-Galanthamin (13)
Für diese Reaktionsführung ist es notwendig die im (–)-Galanthamin (9) vorhandene Doppel-
bindung zu schützen. Eine Möglichkeit stellt die Umwandlung der Doppelbindung in ein
Epoxid mit Hilfe von Persäuren dar (Schritt v, Schema 3.1.2). Da die tertiäre Amino-Gruppe
des (–)-Galanthamins unter dem Einfluss von Persäuren in das Aminoxid übergeführt wird,
muss diese vorher in einer Form geschützt werden, die keine Reaktion mit Persäuren eingeht.
Hier bietet sich eine Demethylierung mit anschließendem Schutz des sekundären Amins als
BOC-Derivat an (Schritt vi, Schema 3.1.2). Dieser Schutz ist notwendig, da das Amin sonst
das im nächsten Schritt synthetisierte Epoxid nucleophil öffnen kann. Nach der Tritiierung
3 Diskussion der Ergebnisse
21
(Schritt iv, Schema 3.1.2) könnte die Doppelbindung aus dem Epoxid zum Beispiel durch
Reaktion mit Cr(ClO4)2 wieder hergestellt werden.[50] Im nächsten Schritt müsste die Alkohol-
Funktion geschützt werden (Schritt iii, Schema 3.1.2), um zu verhindern, dass diese bei der
folgenden Methylierung des Amins verethert wird. Jetzt könnte die BOC-Schutzgrupe ab-
gespalten und das Amin methyliert werden (Schritt ii, Schema 3.1.2). Nach dem Entschützen
der Alkohol-Gruppe (Schritt i, Schema 3.1.2) würde das markierte (–)-Galanthamin erhalten.
(–)-Galanthamin-Hydrobromid (19) wird mit Wasserstoffperoxid in Ameisensäure mono-
bromiert. Anschließend wird das tertiäre Amin mit m-Chlorperbenzoesäure zuerst in das N-
Oxid übergeführt und dann durch Zugabe von Eisen-II-sulfat demethyliert.[51] Die Reaktion
führt gemäß des postulierten Mechanismus[52] zu einer Mischung aus 8-Bromgalanthamin
(12) und (–)-8-Brom-11-demethylgalanthamin (18). Das Verhältnis der beiden Produkte
wurde durch GC Analysen zu 13:87 bestimmt. Die in Schema 3.1.3 angegebene Ausbeute von
74% bezieht sich auf das erwünschte (–)-8-Brom-11-demethylgalanthamin (18).
O
O
OH
N
O
O
OH
N
Br
O
O
OH
N
HBr
Br
H
iii
19 12 18
Schema 3.1.3: Synthese von (–)-8-Brom-11-demethylgalanthamin (18), i) H2O2, HCOOH,
100 °C, 0.33 h (82%), ii) 1. m-CPBA, RT, 0.75 h, 2. FeSO4, RT, 0.3 h (74%)
Die Mischung wurde direkt für den nachfolgenden Schutz des sekundären Amins (18) als
BOC-Derivat (20) benutzt. Der Versuch, die Doppelbindung der Verbindung zu epoxidieren,
führte jedoch zur Zersetzung des Eduktes (20) (Schema 3.1.4).
Neben den aufgetretenen Schwierigkeiten bei der Epoxidierung müssten bei dieser Reaktions-
sequenz nach Einführung des Tritiums in das Molekül noch fünf Reaktionsschritte bis zum
(–)-Galanthamin durchgeführt werden. Aufgrund dieses Nachteils und der im folgenden
aufgeführten, parallel erarbeiteten Synthesen, wurde die hier aufgezeigte Route zur
spezifischen Markierung von (–)-Galanthamin (9) nicht weiter verfolgt.
3 Diskussion der Ergebnisse
22
O
O
OH
N
H
O
O
OH
N
BOCBr
O
O
OH
N
BOCBr
iii
O
Br
18 20 10
Schema 3.1.4: Versuch zur Epoxidierung eines Galanthamin-Derivates (20), i) BOC2O, RT, 16 h
(62%), ii) m-CPBA, 62 °C, 4 h
3.1.2 Route B
Eine Alternative zur Tritiierung durch katalytische Reduktion mit Tritiumgas stellt die Sub-
stitution eines aromatischen Bromatoms durch Lithiumaluminiumtritid dar. Die Reduktion
aromatischer Halogene erfordert große Überschüsse an Hydridreagenz und lange Reaktions-
zeiten, andererseits erfordert diese Reaktionsführung keinen Schutz der Doppelbindung.
Ferner wird das Tritium im letzten Reaktionsschritt in die Verbindung eingeführt, was auch
hinsichtlich der Wirtschaftlichkeit günstig ist.
Die Reduktion von (–)-8-Bromgalanthamin (12) mit 4 Äquivalenten LiAlH4 führte innerhalb
von 23 h zu einem vollständigen Umsatz des Eduktes (12) und lieferte (–)-[1H]-Galanthamin
(9) mit einer Ausbeute von 79% (Schema 3.1.5).[53]
O
O
OH
N
Br
O
O
OH
N
H
i
12 9
Schema 3.1.5: Synthese von (–)-[1H]-Galanthamin (9), i) 1. LiAlH4, THF, 67 °C, 23 h, 2. H2O
(79%)
Um mögliche Isotopeneffekte zu untersuchen wurde LiAlH4 durch LiAlD4 ersetzt. Unter Bei-
behaltung aller übrigen Parameter lieferte die Reaktion nach 52 h (–)-8-[2H]-Galanthamin
(21) mit einer Ausbeute von 74% (Schema 3.1.6).
3 Diskussion der Ergebnisse
23
O
O
OH
N
Br
O
O
OH
N
D
i
12 21
Schema 3.1.6: Synthese von (–)-8-[2H]-Galanthamin (21), i) 1. LiAlD4, THF, 67 °C, 52 h, 2. D2O
(74%)
In Diagramm 3.1.1 ist der zeitliche Verlauf der beiden Reaktion dargestellt. Die quantitative
Bestimmung des Produkt/Edukt Verhältnisses erfolgte durch GC-Analytik. Offensichtlich ist
der Isotopeneffekt verantwortlich für die Erhöhung der Reaktionszeit um mehr als 100%.
Beim Übergang vom LiAlD4 zum LiAlT4 muss mit einer weiteren Verlängerung der benötig-
ten Reaktionszeit gerechnet werden. Auch ein völliges Ausbleiben der Reaktion kann nicht
ausgeschlossen werden.
Diagramm 3.1.1: Zeitlicher Verlauf der Reduktion von (–)-8-Bromgalanthamin (12) mit LiAlD4
und LiAlH4
Um die Reaktionszeit zu reduzieren wurde der Einfluss verschiedene Parameter untersucht. In
der Literatur[54] ist die Beschleunigung der Reduktion von aromatischen Halogenen mit
LiAlH4 durch Ultraschall beschrieben. Die Reaktionszeit konnte so sowohl bei Verwendung
von LiAlH4 als auch von LiAlD4 etwas mehr als halbiert werden (Tabelle 3.1.1). Im
3 Diskussion der Ergebnisse
24
Gegensatz zu in der Literatur[54] beschriebenen Reaktionen von aromatischen Halogen-
verbindungen konnte unter Einfluss von Ultraschall jedoch keine Verbesserung der Ausbeu-
ten beobachtet werden, was vermutlich darauf zurückzuführen ist, dass in der Literatur mit
äquimolaren Mengen Hydrid gearbeitet wurde. Einen ähnlichen Effekt auf die Reaktionszeit
hatte die Verdopplung der Menge an eingesetztem Reduktionsmittel. Die Halbierung der ver-
wendeten Menge an Lösungsmittel reduzierte die benötigte Reaktionszeit bei beiden unter-
suchten Reduktionsmitteln um ca. 20%. Die durchgeführten Untersuchungen zur Reaktions-
zeitverkürzung zeigen, dass sowohl die Verwendung von Ultraschall als auch eine möglichst
geringe Lösungsmittelmenge im Hinblick auf die radioaktive Synthese sinnvoll ist. Die Er-
höhung der Menge an Reduktionsmittel kann die Reaktionszeiten zwar ebenfalls deutlich ver-
kürzen, für die geplante Radiosynthese ist dies wegen der dann erheblich höheren Menge an
benötigtem Tritium jedoch nicht sinnvoll.
Tabelle 3.1.1:Ergebnisse der Reduktion von (–)-8-Bromgalanthamin (12) mit LiAlH4 bzw. LiAlD4
bei unterschiedlichen Reaktionsführungen.
Bromgalanthamin (12)[LiAl] THF Heizung/Rührer Reaktionszeit Ausbeute
0,07 g ; 0,19 mmol [H4] 0,030 g ; 0,76 mmol 20 ml Ölbad/Magnetrührer 20 h 79%
0,07 g ; 0,19 mmol [D4] 0,032 g ; 0,76 mmol 20 ml Ölbad/Magnetrührer 52 h 74%
0,07 g ; 0,19 mmol [H4] 0,030 g ; 0,76 mmol 10 ml Ölbad/Magnetrührer 17 h 81%
0,07 g ; 0,19 mmol [D4] 0,032 g ; 0,76 mmol 10 ml Ölbad/Magnetrührer 42 h 72%
0,07 g ; 0,19 mmol [H4] 0,030 g ; 0,76 mmol 20 ml Ultraschallbad 9 h 75%
0,07 g ; 0,19 mmol [D4] 0,032 g ; 0,76 mmol 20 ml Ultraschallbad 23 h 70%
0,07 g ; 0,19 mmol [H4] 0,060 g ; 1,52 mmol 20 ml Ölbad/Magnetrührer 10 h 77%
0,07 g ; 0,19 mmol [D4] 0,064 g ; 1,52 mmol 20 ml Ölbad/Magnetrührer 24 h 73%
Um einen hohen Deuterierungsgrad (> 85%) beim synthetisierten (–)-8-[2H]-Galanthamin
(21) zu erzielen, ist es notwendig die Reaktion mit Deuteriumoxid zu quenchen. Bei Ver-
wendung von Wasser wird nur ein Deuterierungsgrad von 20% erhalten. Diese Ergebnisse
decken sich mit der literaturbekannten[55] Deuterierung von Anthracen-Derivaten.
Sowohl die Notwendigkeit von Deuteriumoxid zum Quenchen der Reaktion als auch der hohe
Überschuss an LiAlH4 bzw. LiAlD4, der für eine vollständige Reaktion benötigt wird, lassen
sich mit dem Mechanismus[55] der aromatischen Halogensubstitution durch Lithiumalumini-
umhydrid erklären. Die Reaktion verläuft über einen viergliedrigen Übergangszustand
(Schema 3.1.7). Dieser Übergangszustand wird erst durch das Quenchreagenz geöffnet. Die
eingesetzte Lewis-Säure beeinflusst daher beim Einsatz von LiAlD4 den Einbau von Deute-
rium in das Molekül, so dass dieser Schritt für den geringen Deuterierungsgrad bei der Ver-
3 Diskussion der Ergebnisse
25
wendung von Wasser statt Deuteriumoxid verantwortlich ist. Aus sterischen Gründen ist es
unwahrscheinlich, dass sich weitere (–)-8-Bromgalanthamin-Moleküle an den in Schema
3.1.7 gezeigten Übergangszustand anlagern können. Daher werden vermutlich nicht alle Hy-
dride die theoretisch zur Verfügung stehen genutzt. Bei der hier durchgeführten Reaktion wird
ein weiteres äquivalent Hydrid benötigt um die Hydroxyl-Gruppe zu deprotonieren, da auf die
Einführung einer Schutzgruppe verzichtet wurde. Aus diesen beiden Umständen lassen sich
die benötigten Überschüsse an Reduktionsmittel erklären.
O
O
OH
N
Li
H
Al
Br
H
H
H
Schema 3.1.7: Übergangszustand der Reduktion eines aromatischen Halogens mit LiAlH4 am
Beispiel von (–)-8-Bromgalanthamin (12)
Bei der entsprechenden Tritiierung müsste also Tritiumoxid zum quenchen verwendet wer-
den. Aufgrund des Gefahrenpotentials bei der Handhabung von Tritiumoxid wäre ein hoher
Sicherheitsaufwand notwendig. Neben der schwer zu kalkulierenden Reaktionszeit beim
Übergang zum LiAlT4 und der Gefahr, dass eine Reaktion ganz ausbleiben könnte, ist auch
das zu erwartende Verhältnis von eingebautem zu verwendetem Tritium-Atomen ein weiterer
Nachteil. Bei den hier verwendeten Mengen würden theoretisch 32 Tritium-Atome benötigt
um 1 Tritium-Atom einzubauen. Es erschien daher sinnvoll weitere Wege zur spezifischen
Markierung von (–)-Galanthamin (9) zu erarbeiten.
3.1.3 Route C
Bei der großtechnischen Synthese von (–)-Galanthamin (9) wird im letzten Schritt (–)-Nar-
wedin (14) mit Lithium-tri-sec.-buthylborhydrid (L-Selectrid®) diastereoselektiv zu (–)-Ga-
lanthamin (9) reduziert. Diese Reaktion zeichnet sich durch kurze Reaktionszeiten bei Aus-
beuten von bis zu 98% aus.[56] Es muss zwar davon ausgegangen werden, dass die Ausbeuten
3 Diskussion der Ergebnisse
26
bei der Durchführung im kleineren Maßstab geringer ausfallen, dennoch scheint diese Reak-
tion für die geplante Synthese von (–)-[3H]-Galanthamin geeignet zu sein. Eine Synthese des
benötigten tritiierten L-Selectrids® (24) ist in der Literatur[57] beschrieben (Schema 3.1.8).
n-BuLi LiT Li(sec.-Bu)3BT
T2(sec.-Bu)3B
22 23 24
Schema 3.1.8: Synthese von tritiierten L-Selectrid® (24)
Um die Reaktion auf ihre Eignung für die Synthese von tritiierten (–)-Galanthamin zu unter-
suchen, wurde zuerst unmarkiertes L-Selectrid® (26) synthetisiert. Eine Lösung von n-Butyl-
lithium (22) in Hexan und Tetramethylethylendiamin werden in einer Wasserstoffatmosphäre
gerührt, wobei ein weißer Niederschlag aus gebildetem Lithiumhydrid (25) entsteht. Nach der
Zugabe von tri-sec.-Butylboran löst sich der Niederschlag unter Bildung von L-Selectrid®
(26) auf (Schema 3.1.9).
n-BuLi LiH Li(sec.-Bu)3BH
iii
22 25 26
Schema 3.1.9: Synthese von L-Selectrid® (26), i) H2, TEMEDA, Hexan, RT, 2 h, ii)
(sec.-Bu)3B, THF, RT, 5 min
Die so erhaltene Lösung wird direkt für die Reduktion von (–)-Narwedin (14) zu (–)-Ga-
lanthamin (9) eingesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 1 h wurde ein vollständiger Umsatz
erreicht und (–)-[1H]-Galanthamin (9) mit einer Ausbeute von 81% (Schema 3.1.10) erhalten.
O
O
O
N
O
O
OH
N
i
H
14 9
Schema 3.1.10: Synthese von (–)-[1H]-Galanthamin (9), i) Li(sec.-Bu)3BH (26), THF, –20 °C,
0.5 h, RT, 0.5 h (81%)
3 Diskussion der Ergebnisse
27
Um diese Reaktion auf mögliche Isotopeneffekte hin zu untersuchen, wurde deuteriertes L-
Selectrids® durch Substitution des Wasserstoffgases durch Deuteriumgas dargestellt (Schema
3.1.11).
n-BuLi LiD Li(sec.-Bu)3BD
iii
22 27 28
Schema 3.1.11: Synthese von deuteriertem L-Selectrid® (28), i) D2, TEMEDA, Hexan, RT, 2 h, ii)
(sec.-Bu)3B, THF, RT, 5 min
Die anschließende Reaktion mit (–)-Narwedin (14) wurde unter identischen Bedingungen
durchgeführt wie die vorangegangene Reduktion mit unmarkiertem L-Selectrid® (26). Nach
einer Reaktionszeit von 1 h und ebenfalls identischer Aufarbeitung wurde (–)-3-[2H]-Ga-
lanthamin (29) mit einer Ausbeute von 84% (Schema 3.1.12) erhalten.
O
O
O
N
O
O
OH
N
i
D
14 29
Schema 3.1.12: Synthese von (–)-3-[2H]-Galanthamin (29), i) Li(sec.-Bu)3BD (28), THF, –20 °C,
0.5 h, RT, 0.5 h (84%)
Sowohl im Hinblick auf die benötigten Reaktionszeiten als auch auf die erzielten Ausbeuten
konnte keine signifikante Veränderung beim Übergang vom Wasserstoff zum Deuterium beo-
bachtet werden. Zur Überprüfung der erhaltenen Stereochemie wurden Drehwertmessungen
durchgeführt. Die gemessenen Werte des synthetisierten (–)-3-[2H]-Galanthamins (29) wei-
chen von denen des (–)-[1H]-Galanthamins (9) aus der vorangegangenen Reaktion nur gering-
fügig ab, diese wiederum stimmen gut mit dem Literaturwert überein. Die NMR-Analyse des
Reaktionsproduktes zeigte, dass der Einbau von Deuterium nur an der erwarteten Position
stattgefunden hat, der Deuterierungsgrad beträgt > 95% (NMR). Im 13C-NMR ist die 13C, 2H
Kopplung (triplett) zu erkennen, die Kopplungskonstante beträgt 21 Hz (Abbildung 3.1.1).
3 Diskussion der Ergebnisse
28
Abbildung 3.1.1: 13C-NMR (Bereich von Atom C3) von (–)-[1H]-Galanthamin (9) (links), (–)-Nar-
wedin (14) (Mitte) und (–)-3-[2H]-Galanthamin (29) (rechts)
Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse bei den drei Synthesemöglichkeiten, wurde der Weg über
Route C für die Synthese von spezifisch markiertem (–)-[3H]-Galanthamin ausgewählt.
3.2 Tritiierung von (–)-Galanthamin via Route C
Die Darstellung von tritiiertem L-Selectrid® (24) beinhaltet die Verwendung von Tritiumgas,
wofür spezielle Geräte und Sicherheitseinrichtungen benötigt werden. Diese Voraussetzungen
sind im Radioisotopenlabor an der Universität Paderborn nicht gegeben. Die Synthese von
tritiiertem (–)-Galanthamin wurde daher in den Laboratorien der RC Tritec AG (Teufen,
Schweiz) zusammen mit einem Mitarbeiter der Firma durchgeführt. Abbildung 3.2.1 zeigt ein
Photo der Tritiierungsanlage bei der RC Tritec AG, Abbildung 3.2.2 zeigt den schematischen
Aufbau der Anlage.
3 Diskussion der Ergebnisse
29
Abbildung 3.2.1: Tritiierungsanlage (Photo) der RC Tritec AG
Septum
Reaktionskolben
Dewar
Pumpe
N2 / H2 - Anschluss
Uran-Traps
Drucksensor
Pirani
zur Vakuum-
pumpe
T2T2T2
99% 70% 20%
>~~T2-Abfall
Abbildung 3.2.2: Tritiierungsanlage (Schema) der RC Tritec AG
Das Tritium wird in Behältern (Uran-Traps) aufbewahrt, in denen es als Urantritid gebunden
ist. Da die Reaktion von Tritium mit Uran zu Urantritid reversibel ist, kann durch Erhitzen der
Uran-Traps Tritiumgas freigesetzt werden bzw. bei einer Reaktion nicht reagiertes Tritiumgas
wieder aufgenommen und somit sicher gelagert werden (Schema 3.2.1).
3 Diskussion der Ergebnisse
30
2U + 3T22UT3
T < 80 °C
T > 400 °C
Schema 3.2.1: Reaktion von Tritium mit Uran
Wie bei den nicht radioaktiven Synthesen die nach Route C durchgeführt wurden, muss zuerst
ein entsprechendes L-Selectrid® (24) hergestellt werden (Schema 3.2.2). Hierzu wird das Re-
aktionsgefäß evakuiert und mit Tritiumgas gefüllt. Die Bildung des Lithiumtritids (23) wird
hierbei durch Druckmessung verfolgt. Die Reaktion wird als beendet angesehen, wenn der
Druck im Reaktionsgefäß für 30 min konstant bleibt. Die Suspension wird anschließend ent-
gast und lyophilisiert (gefriergetrocknet). Nach Zugabe des tri-sec.-Butylboran löste sich das
suspendierte Lithiumtritid (23) erwartungsgemäß auf.
n-BuLi LiT Li(sec.-Bu)3BT
iii
22 23 24
Schema 3.2.2: Synthese von tritiiertem L-Selectrid® (24), i) T2, TEMEDA, Hexan, RT, 2 h, ii)
(sec.-Bu)3B, THF, RT, 5 min
Mit dem so synthetisierten tritiierten L-Selectrid® (
24) wurden 126 mg (0.442 mmol)
(–)-Narwedin (14) reduziert (Schema 3.2.3). Nach der Aufarbeitung wurden 77.8 mg (–)-3-
[3H]-Galanthamin (15) erhalten.[58] Die Vermessung eines Dünnschichtchromatogramms mit
einem Radiochromatogrammscanner ergab eine radiochemische Reinheit von ca. 97%.
O
O
O
N
O
O
OH
N
i
T
14 15
Schema 3.2.3: Synthese von [3H]-(–)-Galanthamin (15), i) Li(sec. Bu)3BT (24), THF, –20 °C,
0.5 h, RT, 1 h (61%)
Die Gesamtradioaktivität des (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) wurde durch LSC-Messung (LCS,
engl.: Liquid Scintillisation Counter) bestimmt und betrug 6.4 Ci (2.37*1011 Bq). Für die Be-
3 Diskussion der Ergebnisse
31
stimmung der spezifischen Radioaktivität wurde ein Massenspektrum aufgenommen
(Abbildung 3.2.3).
Abbildung 3.2.3: MS-Spektrum von (–)-[3H]-Galanthamin (15) (Region des Molekül-Peaks)
Das MS-Spektrum von (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) weist im Bereich des Molekül-Peaks drei
signifikante Signale auf. Die Zuweisung der Peaks und ihr Verhältnis zueinander sind in
Tabelle 3.2.1 aufgeführt.
Tabelle 3.2.1: Zuordnung der Signale aus dem MS-Experiment
M/z Verbindung % rel. Häufigkeit
288 (–)-[1H]-Galanthamin (9) 17.8
290 (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) 82.2
Das Signal bei m/z 291 gehört zum (–)-[3H, 13C]-Galanthamin. Da das korrespondierende
Signal des (–)-[1H, 13C]-Galanthamins bei m/z 289 zu schwach für eine verlässliche Integra-
tion ist, wurden diese Signale nicht in die Berechnungen einbezogen. Auf der Basis einer ma-
ximalen spezifischen Aktivität von 29 Ci/mmol (1.07*1012 Bq/mmol) wurde die spezifische
Aktivität des synthetisierten (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) zu 23.8 Ci/mmol (8.81*1011
Bq/mmol) bestimmt. Zusammen mit der Gesamtradioaktivität kann errechnet werden, dass
bei der Synthese eine Mischung von 64.9 mg (0.221 mmol) (–)-[3H]-Galanthamin (15) und
3 Diskussion der Ergebnisse
32
13.8 mg (0.048 mmol) (–)-[1H]-Galanthamin (9) erhalten wurde. Die Gesamtmenge von 0.326
mmol ergibt eine Ausbeute von 60.8%.
3.3 Aufreinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin
3.3.1 Grundlagen des β-Zerfalls von Tritium
Tritium ist ein schwacher β-Strahler mit einer Halbwertszeit von 12.3 a. Die maximale Ener-
gie der beim Zerfall emitierten Elektronen beträgt 0,0186 MeV, die durchschnittliche Energie
0.0056 MeV. Die Reichweite der Elektronenstrahlung beträgt in Luft maximal 5 mm, in bio-
logischem Gewebe maximal 6 µm. Beim β-Zerfall wird ein Neutron (n) des Atomkerns in ein
Positron (p), ein Elektron (e) und ein elektrisches Antineutrino (νe) umgewandelt, wobei das
Elektron und das Antineutrino den Kern verlassen. Die so entstehende Elektronen-Strahlung
wird als β-Strahlung bezeichnet (Schema 3.3.1).
np + e +
νe
Schema 3.3.1: Allgemeine Form des β-Zerfalls
Auf das Tritium angewendet bedeutet dies, dass bei Zerfall eines Tritium-Atoms ein Helium
Atom, ein Elektron sowie ein elektrisches Antineutrino entsteht (Schema 3.3.2).
1H2He + e + νe
33
Schema 3.3.2: β-Zerfall des Tritiums
Wenn Tritium kovalent an andere Atome gebunden ist, entstehen beim Zerfall Radikale.
Durch diese Radikale induzierte Reaktionen, sind die Hauptursache für die entstehenden Ver-
unreinigungen bei tritiierten Verbindungen. Um die Zerstörung der markierten Moleküle
möglichst gering zu halten, werden die Substanzen bei tiefen Temperaturen in Radikale ab-
3 Diskussion der Ergebnisse
33
fangenden Lösungsmitteln gelagert. Die Lagerung des (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) erfolgt
bei –28 °C in Methanol.
3.3.2 Reinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin mit präperativer HPLC
Um mögliche Effekte von Zerfallsprodukten des (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) bei den durch-
geführten Photoaffinitätsmarkierungen auszuschließen, wurden regelmäßig Teile des Vorrats
aufgereinigt. Alle Photoaffinitätsmarkierungen wurden mit (–)-3-[3H]-Galanthamin (15)
durchgeführt, dessen Aufreinigung nicht länger als zwei Monate zurücklag. In Diagramm
3.3.1 ist das Ergebniss einer kombinierten UV/Radio-HPLC Untersuchung des (–)-3-[3H]-
Galanthamin-Vorrats dargestellt. Die Probennahme erfolgte nach einer zwölfmonatigen
Lagerung.
Diagramm 3.3.1: Kombinierte UV/Radio-HPLC des (–)-3-[3H]-Galanthamin-Vorrats
Die Retentionszeit von (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) beträgt hier 8 min. Wie ersichtlich ist,
haben sich eine Vielzahl nicht identifizierbarer Verunreinigungen gebildet, die alle größere
Retentionzeiten als (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) aufweisen. Da eine Reversed-Phase-HPLC-
Säule verwendet wurde sind die entstandenen Verunreinigungen entweder unpolarer und/oder
haben ein weitaus höheres Molekulargewicht als (–)-3-[3H]-Galanthamin (15). Wird die
Radioaktivität unter dem (–)-3-[3H]-Galanthamin-Peak addiert, ist es möglich auf die noch im
Vorrat befindliche Menge zu schliessen. Diese Berechnung ergab, dass sich zu diesem
3 Diskussion der Ergebnisse
34
Zeitpunkt noch (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) mit einer Gesamtaktivität von 0.95 Ci im Vorrat
befand. Dies entspricht ca. 15% der ursprünglich synthetisierten Menge.
Die Reinigung von Teilen des (–)-3-[3H]-Galanthamin-Vorrats erfolgte mit einer halb-
präperativen HPLC-Säule. Das Chromatogramm einer repräsentativen Aufreinigung ist in
Diagramm 3.3.2 dargestellt.
Diagramm 3.3.2: Chromatogramm der Trennung eines Teils des (–)-3-[3H]-Galanthamin-Vorrats
Die veränderte Retentionszeit im Vergleich zu Diagramm 3.3.1 ist zum einen auf den
Wechsel von einer analytischen auf eine halbpräperative HPLC Säule, zum anderen auf die
Verwendung eines anderen Gradientenprogramms zurückzuführen. Die Fraktion von 29 -
33 min wurde aufgefangen und das darin enthaltene (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) durch
Extraktion isoliert. Vermutlich auf Grund der sehr geringen Menge an (–)-3-[3H]-Galanth-
amin (15) und möglicher Adsorption an verwendeten Geräten, konnte bei der Aufreinigung
nur eine Ausbeute von 35% erzielt werden.
In Diagramm 3.3.3 ist das Chromatogramm einer kombinierten UV/Radio-HPLC Unter-
suchung von aufgereinigtem (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) dargestellt. Zum Vergleich wurde
es noch mit dem Chromatogramm von unmarkiertem (–)-Galanthamin (9) überlagert. Es ist
ersichtlich, dass sowohl die vorhandene UV-Aktivität als auch die Radioaktivität von (–)-3-
[3H]-Galanthamin (15) nahezu vollständig im Bereich des Galanthamin-Peaks lokalisiert ist.
3 Diskussion der Ergebnisse
35
Diagramm 3.3.3: Kombinierte UV/Radio-HPLC von aufgereinigtem (–)-[3H]-Galanthamin (15)
3.4 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR
Ziel von Photoaffinitätsmarkierungen ist die Untersuchung von Ligand-Rezeptor Wechsel-
wirkungen. Durch Bestrahlung einer Ligand-Rezeptor Lösung mit Licht im ultravioletten
(UV) oder sichtbaren Bereich, wird versucht durch photochemische Prozesse eine kovalente
Bindung zwischen dem Liganden und dem Rezeptor zu erreichen. Falls der verwendete Li-
gand eine Affinität zu bestimmten Bereichen des Proteins besitzt, ist es möglich ihn durch die
Radioaktivität dort nachzuweisen.
Mit Hilfe des synthetisierten (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) sollte die APL-Bindungsstelle am
nAChR untersucht werden.
3.4.1 Der nicotinische Acetylcholinrezeptor (nAChR)
Der nAChR ist ein membrangebundener, ligandengesteuerter Kationenkanal. Er spielt eine
wichtige Rolle bei der Neurotransmission im zentralen und peripheren Nervensystem (siehe
Einleitung) sowie an der neuromuskulären Endplatte.[59] Aufgrund ihrer Lokalisation erfolgt
eine Unterscheidung in muskuläre und neuronale nAChR.
3 Diskussion der Ergebnisse
36
nAChR wurden zuerst aus den elektrischen Organen (degenerierte Muskeln) von Zitteraalen
der Spezies Elektrophorus electricus isoliert, später auch aus denen von Zitterrochen der Spe-
zies Torpedo Californica und Torpedo marmorata.[60]
Abbildung 3.4.1: Aufbau des muskulären nAChR[60]
Der gereinigte Rezeptor aus Muskelgewebe hat ein Molekulargewicht (MW) von 255 kD. Er
ist ein Pentamer mit der Zusammensetzung
α
2
βγδ
(Abbildung 3.4.1, links unten). Obwohl die
Untereinheiten
α
(MW 40 kD),
β
(MW 48 kD),
γ
(MW 58 kD) und
δ
(MW 64 kD) von vier
verschiedenen Genen codiert werden, sind sie hochgradig homolog (zu ca. 50%) und weisen
eine ähnliche Struktur auf.[44] Ein großer, hydrophiler N-terminaler Bereich jeder Untereinheit
ist extrazellulär platziert (Abbildung 3.4.1, rechts). Dieser Bereich ist bei der
α
-Untereinheit
für die Bindung von ACh (3) verantwortlich. An den extrazellulären Bereich schließen sich
bei jeder Untereinheit vier hydrophobe Transmembranbereiche (M1-M4) an (Abbildung
3.4.1, Mitte). Der Ionenkanal wird von den fünf M2 Bereichen gebildet.
Durch elektronenmikroskopische Untersuchungen wurde für den Rezeptor eine Gesamtlänge
von ca. 115 Å und ein Durchmesser von 80 Å ermittelt. Der extrazelluläre Teil ragt ca. 60 Å
in den synaptischen Spalt und ca. 15 Å in das Innere der Zelle, woraus eine Länge von ca.
40 Å für den transmembranen Bereich resultiert. Der Ionenkanal hat an seiner breitesten
Stelle einen Durchmesser von ca. 25-30 Å.[61]
Der nAChR ist Zielmolekül einer Vielzahl unterschiedlicher Effektoren.[49, 62]
3 Diskussion der Ergebnisse
37
• Die den Ionenkanal öffnenden Aktivatoren (Agonisten) binden kooperativ mit einer Stö-
chiometrie von 2 Molekülen pro Rezeptor an die beiden
α
-Untereinheiten. Zu den Ago-
nisten des nAChR zählen neben ACh (3) und Nikotin eine Reihe weiterer Verbindungen
wie Cystiin, Dimethylphenylpiperazinium, Anatoxin-a und Epibatidin.
• Kompetitive Inhibitoren (Antagonisten) wie zum Beispiel d-Tubocurarin,
α
-Cobratoxin,
α
-Bungarotoxin oder Hexamethonium binden an dieselbe Stelle wie die Agonisten und
unterbinden die Aktivierung des Rezeptors.
• Nichtkompetitive Antagonisten gehören wie auch die kompetitiven Antagonisten zur
Gruppe der Liganden, welche die Öffnung des Ionenkanals blockieren. Die Bindungsstel-
len dieser Inhibitoren sind einerseits im Bereich der Membrangrenzfläche des Rezeptors
zu finden, andererseits im geöffneten Ionenkanal des nAChR. Zu diesen „open channel
blockers“ gehören Chlorpromazin, Histrionicotoxin sowie die beiden Lokalanästhetika
Lidocain und Dibucain.
• Die letzte Gruppe der nAChR Effektoren sind Substanzen, die über eine allosterische Bin-
dungsstelle sowohl als schwache nichtkompetitive Agonisten (NCA) als auch als alloste-
risch potenzierende Liganden (APL) wirken.[63] Zu dieser Gruppe von Liganden gehören
(–)-Physostigmin, Codein und (–)-Galanthamin (9). Die Wirkung der APL wird auf die
Induzierung einer Konformationsänderung des nAChR in Richtung des geöffneten Kanals
zurückgeführt. Die Bindungsstelle von (–)-Physostigmin konnte durch Photoaffinitäts-
markierungen in der extrazellulären Domäne der
α
-Untereinheit von Torpedo marmorata
nAChR im Bereich der Aminosäuren 109-151, genauer bei Lys 125, lokalisiert werden.[64]
Diese Bindungsstelle überlappt zumindest partiell mit der des monoklonalen Antikörpers
FK1.[65]
3.4.2 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanth-
amin
Für die Markierungen wurden Membranfragmente aus dem Gewebe des elektrische Organs
von Zitterrochen der Spezies Torpedo Californica verwendet. Diese sogenannten Torpedo
Membran Fragmente (TMF) wurden uns freundlicherweise von der Arbeitsgruppe Prof. Dr. F.
Hucho (FU Berlin) zur Verfügung gestellt. Die Präparationen wurden dort nach einer litera-
turbekannten Methode[66] durchgeführt. Die Proteinkonzentration der TMF betrug 2 mg/mL.
3 Diskussion der Ergebnisse
38
Da das (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) keine photolabilen Gruppen trägt, sind lange Bestrah-
lungszeiten mit UV-Licht notwendig, um eine kovalente Vernetzung mit dem Protein zu
erreichen. Um die nicht zu verhindernden Schäden am Protein so gering wie möglich zu hal-
ten, ist der Einsatz von UV-Filtern sinnvoll. Wichtig ist vor allem die Filterung von extrem
kurzwelliger Strahlung im Bereich von 200-250 nm, da diese die größten Schäden am Protein
hervorruft. Obwohl beim Einsatz von Filtern möglicherweise eine längere Bestrahlungszeit
notwendig ist, um genügend Liganden mit dem Protein zu vernetzen, werden geringere Schä-
den am Protein verursacht als ohne Filter.[67]
Diagramm 3.4.1: UV-Spektrum von (–)-Galanthamin (9)
Wie das UV-Spektrum von (–)-Galanthamin (9) zeigt (Diagramm 3.4.1), liegt die Absorpti-
onsbande zwischen 260 und 300 nm mit einem Maximum bei 288 nm.[68] Aufgrund dieser
Daten wurde ein Filter eingesetzt der Licht nur im Bereich von 265-360 nm passieren lässt.
So wird extrem kurzwelliges UV-Licht eliminiert, der für die Aktivierung des (–)-Galanth-
amins (9) wichtige Bereich des UV-Lichts kann nahezu vollständig passieren.
Als UV-Lichtquelle wurde eine Xenonlampe verwendet, die Lichtenergie hinter dem Filter
betrug im UV-A Bereich (325 - 400 nm) 25 mW/cm2. Da mit der verwendeten Lampe noch
keine Photoaffinitätsmarkierungen durchgeführt wurden und bei vergleichbaren Versuchen in
der Literatur[67, 64, 64, 69] große Unterschiede bezüglich der Bestrahlungszeit, dem Wellenlän-
genbereich und der Lichtenergie vorhanden sind, wurde zunächst die optimale Bestrahlungs-
3 Diskussion der Ergebnisse
39
zeit ermittelt. Diese Untersuchung ergab, dass eine Bestrahlungszeit von 3 min benötigt wird
um einen signifikanten Einbau von Radioaktivität in das Protein zu erzielen.
Die bei der Markierung eingesetzte Proteinkonzentration beträgt 0.5 mg/mL (ca.
0.001 mmol/L), die Konzentration des (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) 0.055 mmol/L. Bei den
beiden Versuchen zur Verdrängung des markierten (–)-Galanthamins (15) durch unmar-
kiertes, wurde mit Konzentrationen von 1 mmol/L bzw. 50 mmol/L an unmarkiertem (–)-
Galanthamin (9) gearbeitet. Je 100 μL der Lösungen werden in eine Suprasil Küvette gegeben
und für 3 min mit UV-Licht bestrahlt. Um nicht gebundenes (–)-3-[3H]-Galanthamin (15)
weitgehend zu entfernen, werden mehrere Waschschritte durchgeführt. Die markierten TMF
werden durch Verkochen in einem reduzierenden SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektophorese
(SDS-PAGE) Probenpuffer für die anschließende Elektrophorese vorbereitet. Nach der Tren-
nung durch ein SDS-Gel werden die Proteine zur Analyse mittels Western-Blott auf eine
Nitrocellulose-Membran übertragen und mit Ponceau-Rot angefärbt. Die Membran wird in
2 mm große Stücke geschnitten[70] und in einer Mischung aus Aceton/Isopropanol im Ver-
hältnis 1:1 aufgelöst. Die so erhaltenen Lösungen werden zur quantitativen Bestimmung der
enthaltenen Radioaktivität mit einem Scintillationscocktail versetzt und im Beta-Counter
vermessen.
Um eine ausreichende statistische Sicherheit bei den Ergebnissen zu erreichen, wurden die
Markierungen für jede (–)-Galanthamin-Konzentration vier mal durchgeführt. Für die in
Diagramm 3.4.2 gezeigte Auswertung wurden die Mittelwerte aus den vier Messungen ver-
wendet.
Im oberen Bereich von Diagramm 3.4.2 sind zwei Nitrocellulose-Membranen abgebildet. Bei
der Oberen handelt es sich um das Ergebnis einer SDS-PAGE-Trennung mit anschließendem
Western-Blott des verwendeten Molekularstandards, bei der Unteren um das Ergebnis der
Trennung der verwendeten TMF. Die hohe Aktivität am Anfang der Nitrocellulose-Membran
ist auf nicht gebundenes (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) zurückzuführen, dass durch die Wasch-
schritte nicht vollständig entfernt werden konnte. Es konnte gezeigt werden, dass beim Ein-
satz von unverdünntem (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) neben unspezifischer Bindung in erster
Linie die
α
-Untereinheit markiert wurde. Aufgrund der erhaltenen Ergebnisse kann auch eine
schwachen Markierung der
β
-Untereinheit nicht völlig ausgeschlossen werden, wobei hier die
Ungenauigkeit in Erwägung gezogen werden muss, die sich Aufgrund des manuellen Schnei-
dens der Nitrocellulose Membran in 2 mm Stücke ergibt. Es wurden 0.037% der eingesetzten
Radioaktivität im Bereich der
α
-Untereinheit eingebaut, was im Bereich vergleichbarer Mar-
kierungen liegt. Bei Affinitätsuntersuchungen wird von ca. 4% Bindung und einer Vernetzung
3 Diskussion der Ergebnisse
40
von 1% ausgegangen, was einem spezifischen Einbau von 0.04% entspricht. Wie die
Ergebnisse der Markierungen unter Einsatz eines Überschusses an unmarkiertem (–)-Ga-
lanthamin (9) zeigen, konnte das (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) vollständig von der
α
-Unter-
einheit verdrängt werden. Aufgrund diese Sachverhalts kann auf eine spezifische Bindung im
Bereich der
α
-Untereinheit geschlossen werden.
Diagramm 3.4.2: Ergebnis der Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanthamin
(15)
3.5 Synthese von bisfunktionalen Galanthamin-Deriva-
ten
Wie in der Aufgabenstellung beschrieben, sollten Synthesewege für potentielle bisfunktionale
AChE-Inhibitoren ausgearbeitet werden, die sowohl im Bereich der ACh-Bindungsstelle als
auch im Bereich der PAS von AChE binden. Solche bisfunktionalen Liganden der AChE
könnten neben der Inhibierung des ACh-Abbaus unter Umständen auch zu einer verringerten
Aggregation des Aβ führen (siehe Kapitel 1).
3 Diskussion der Ergebnisse
41
Die Zielstrukturen sind in ihrer allgemeinen Form in Schema 3.5.1 dargestellt, wobei im Fall
von A die Moleküle mit n = 2 - 4 und für B die Moleküle mit n = 2 - 8 in biologischen Essays
evaluiert werden sollen.
O
O
O
O
OH
N
N
N
nn
AB
O
O
O
OH
N
O
O
HO
N
Schema 3.5.1: Allgemeine Form der Zielmoleküle
Bei Verbindungsklasse A handelt es sich um eine Kombination des AChE-Inhibitors (–)-Ga-
lanthamin (9) und einem Derivat des PAS Inhibitors Gallamin (46), Verbindungsklasse B ist
eine Kombination von zwei (–)-Galanthamin-Molekülen (9). Die beiden Fragmente der je-
weiligen Moleküle sollen durch Alkylketten verschiedener Länge miteinander verbunden
werden. Im folgenden werden Verbindungen des Typs A als Alkylgallamingalanthamin, die
des Typs B als Alkylbisgalanthamin bezeichnet. Für die Ausarbeitung einer Synthesestrategie
wurde zur Verbindung der jeweiligen Molekülfragmente eine Propylkette ausgewählt.
Synthetisiert werden soll also ein Propylgallamingalanthamin (33) sowie ein Propylbisga-
lanthamin (32). Die Gründe für die Auswahl der eingesetzten Fragmente werden in Kapitel
3.6 beschrieben.
3.5.1 Synthese von Propylbisgalanthamin (32)
Derivatisierungen des (–)-Galanthamins (9) am Stickstoff sind in der Literatur[71, 72] beschrie-
ben. Sie beruhen in den meisten Fällen auf der Alkylierung von (–)-11-Demethylgalanthamin
(30) mit Halogenalkanen. Daher wurde versucht Propylbisgalanthamin durch Alkylierung von
2 Äquivalenten (–)-11-Demethylgalanthamin (30) mit 1,3-Dibrompropan zu synthetisieren.
Hierfür wurde (–)-Galanthamin (9) auf die selbe Weise demethyliert wie für das (–)-8-Brom-
galanthamin (12) bei der Ausarbeitung der Radiosynthese in Abschnitt 3.1.1 beschrieben.[51,
3 Diskussion der Ergebnisse
42
52] Die Reaktion führte nach Abtrennung von (–)-Galanthamin (9) mit einer Ausbeute von
76% zum gewünschten (–)-11-Demethylgalanthamin (30) (Schema 3.5.2).
O
O
OH
N
O
O
OH
N
H
i
930
Schema 3.5.2: Darstellung von (–)-11-Demethylgalanthamin (30), i) 1. m-CPBA, RT, 0.75 h, 2.
FeSO4, 0.3 h (76%)
Im nächsten Schritt wurde versucht, zwei äquivalente (–)-11-Demethylgalanthamin (30) mit
1,3-Dibrompropan (31) unter Verwendung von Kaliumcarbonat als Base umzusetzen
(Schema 3.5.3, Reaktion i).
O
O
OH
N
H
+
iO
O
OH
N
O
O
HO
N
BrBr
2ii
30 31 32
Schema 3.5.3: Darstellung von Propylbisgalanthamin (32), i) K2CO3, CH3CN, 82 °C, 24 h, ii)
Et3N, CH3CN, 82 °C, 24 h (56%)
Bei der Analyse des erhaltenen Produktgemisches zeigte sich, dass nicht das gewünschte Pro-
pylbisgalanthamin (32) entstanden war. Bei den enthaltenen Verbindung handelte es sich zum
einen um nicht umgesetztes Edukt 30, zum anderen um wasserlösliche, stark polare Verbin-
dungen welche nicht näher charakterisiert wurden. Vermutlich hat eine Quaternisierung des
Stickstoffs stattgefunden. Dies würde sowohl den nicht vollständigen Umsatz des (–)-11-De-
methylgalanthamins (30) erklären, als auch die beobachtete hohe Polarität und die Wasser-
löslichkeit der Verbindungen.
3 Diskussion der Ergebnisse
43
In zweiten Versuch wurde die schwächere Base Triethylamin verwendet (Schema 3.5.3, Re-
aktion ii).[73] Die Reaktion führte mit einer Ausbeute von 56% zum gewünschten Propylbis-
galanthamin (32).
3.5.2 Synthese von Propylgallamingalanthamin (33)
In Schema 3.5.4 ist die geplante Synthesestrategie in Form einer Retrosynthese dargestellt.
OH
OH
OH
OBn
O
O
O
OH
O
O
N
N
O
O
O
N
N
Cl
O
O
O
O
O
OH
N
N
N
iii
iii iv
33 34
35 36 37
Schema 3.5.4: Retrosynthese von Propylgallamingalanthamin (33)
Im ersten retrosynthetischen Schritt (Schema 3.5.4, Schritt i) wird eine Spaltung an der Ami-
nofunktion des Propylgallamingalanthamins (33) vorgenommen. In der Synthese kann so
wieder von einem (–)-11-Demethylgalanthamin (30) als einem der beiden zu verbindenden
Bausteine ausgegangen werden. Für den nächsten Schnitt gibt es theoretisch zwei
Möglichkeiten. Zum einen könnte die Chlorpropyl-Gruppe abgespalten werden, zum anderen
die beiden N,N-Diethylpropylamin-Gruppen. Letztere Möglichkeit würde bei der Synthese im
folgenden Schritt jedoch zu einer intramolekularen Veretherung einer freien Hydroxyl-
Gruppe durch die Chlorpropyl-Gruppe führen. Folglich muss zuerst die Chlorpropyl-Gruppe
abgespalten werden (Schema 3.5.4, Schritt ii). Jetzt erfolgt die Abspaltung der beiden N,N-
Diethylpropylamin-Gruppen (Schema 3.5.4, Schritt iii). Um die zwei Hydroxyl-Gruppen in
der Synthese selektiv umsetzen zu können, muss zuvor die dritte Hydroxyl-Gruppe geschützt
3 Diskussion der Ergebnisse
44
werden. Dies ist möglich, indem ausgehend von dem kommerziell erhältliche Pyrogallol (37)
zuerst zwei Hydroxyl-Gruppen durch ein cyclisches Orthoameisensäureethylester-Derivat
geschützt werden und dann die verbleibende Hydroxyl-Funktion benzyliert wird (Schema
3.5.4, Schritt iv). Nach der Abspaltung des cyclischen Orthoameisensäureethylester-Derivats
wird ein Pyrogallol-Derivat (39) erhalten, in dem eine Hydroxyl-Gruppe als Benzylether
geschützt ist.
Bei der Umsetzung des Pyrogallols (37) mit Orthoameisensäuretriethylester wird das entste-
hende Ethanol dem Reaktionsgemisch durch azeotrope Destillation entzogen. Nach anschlie-
ßender Destillation des Rohproduktes im Hochvakuum wird das geschützte cyclische Ortho-
ameisensäureethylester-Derivat des Pyrogallols (38) mit einer Ausbeute von 48% (Schema
3.5.5, Schritt i) erhalten.[74] Die geringe Ausbeute ist auf die Möglichkeit zurückzuführen,
dass die in Verbindung 38 noch vorhandenen Ethylester-Gruppe mit der freien Hydroxyl-
Gruppe eines anderen Moleküls reagieren kann. Bei Temperaturen über 120 °C wurde eine
nahezu vollständige Polymerisation der Verbindung 38 beobachtet. Auch bei den Temperatu-
ren die für eine Destillation im Hochvakuum benötigt werden (ca. 90 °C) findet diese Neben-
reaktion in geringerem Maß statt.
OH
O
O
O
OH
OH
OH
OBn
O
O
O
iii
38 3637
Schema 3.5.5: Synthese von 4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]dioxol (36), i) CH(OC2H5)3, Ben-
zol, 80 °C, 15 h (48%), ii) (C6H5)CH2Br, K2CO3, Aceton, 56 °C, 24 h (92%)
Die Benzylierung der freien Hydroxyl-Gruppe des cyclischen Orthoameisensäureethylester-
Derivats 38 führt mit einer Ausbeute von 92% zur Verbindung 36 (Schema 3.5.5, Schritt
ii).[74] Mit p-Toluolsulfonsäure wurde das cyclische Orthoameisensäureethylester-Derivat 36
gespalten und es wird das einfach benzylierte Pyrogallol-Derivat 39 mit einer Ausbeute von
98% (Schema 3.5.6, Schritt i) erhalten.
Die Reaktion von Verbindung 39 mit 2-Diethylaminoethylchlorid in Gegenwart von Kalium-
carbonat und Kaliumjodid führte nicht zum erwarteten Produkt 41 sondern neben erheblichen
Mengen an Nebenprodukten zur Verbindung 40 (Schema 3.5.6, Schritt ii). Die Basizität von
Kaliumcarbonat ist offensichtlich nicht ausreichend, die aufgrund der Benzyl-Schutzgruppe
sterisch gehinderte Hydroxyl-Gruppe der Verbindung 49 zu deprotonieren. Bei den entstan-
3 Diskussion der Ergebnisse
45
dene Nebenprodukten handelt es sich vermutlich um quartäre Stickstoffverbindungen, die
durch nucleophile Substitutionsreaktion von 2-Diethylaminoethylchlorid, welches ja nur zur
Hälfte abreagiert ist, mit dem Stickstoff eines schon umgesetzten 2-Diethylaminoethyl-
chlorids entstanden sind. Durch den Einsatz von Natriumhydrid als Base konnte Verbindung
41 mit einer Ausbeute von 64% synthetisiert werden (Schema 3.5.6, Schritt iii).
OBn
O
O
Oi
iii
OBn
OH
OH
OBn
O
O
N
N
OBn
O
OH
N
ii
36 39
40
41
Schema 3.5.6: Synthese von 2-Benzyloxy-6-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (41), i) p-TosOH,
MeOH, H2O, RT, 8 h (98%), ii) N(C2H5)2(CH2CH2Cl), K2CO3, KI, Aceton, 56 °C,
24 h (16%), iii) N(C2H5)2(CH2CH2Cl), NaH, DMF, 100 °C, 18 h (64%)
Nach Abspaltung der Benzyl-Schutzgruppe von 41 (Schema 3.5.7, Schritt i) wird die letzte
noch nicht umgesetzte Hydroxyl-Gruppe der Verbindung 42 mit 1-Brom-3-chlorpropan ve-
rethert (Schema 3.5.7, Schritt ii).
OH
O
O
N
N
O
O
O
N
N
Cl
OBn
O
O
N
N
iii
41 42 43
Schema 3.5.7: Synthese von {2-[3-(3-Chlorpropoxy)-2-(2-diethylaminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-
diethylamin (43), i) Pd/C, H2, MeOH, RT, 4 h (98%), ii) ClCH2CH2CH2Br, NaH,
DMF, RT, 18 h (43%)
3 Diskussion der Ergebnisse
46
Auf diese Weise konnte das Fragment 43 mit einer Ausbeute von 43% erhalten werden. Auch
bei dieser Reaktion wurde eine baseninduzierte Quaternisierung der Amino-Gruppen
beobachtet, was wahrscheinlich zu der niedrigen Ausbeute führte.
Das Fragment 43 wird im letzten Schritt mit (–)-11-Demethylgalanthamin (30), unter Ver-
wendung von Triethylamin als Base, umgesetzt. Mit dieser Reaktion konnte Propylgallamin-
galanthamin (33) mit einer Ausbeute von 42% dargestellt werden.
O
O
O
N
N
Cl
O
O
OH
N
H
+
O
O
O
O
O
OH
N
N
N
i
30 43 33
Schema 3.5.8: Synthese von Propylgallamingalanthamin (33), i) KI, Et3N, CH3CN, 82 °C, 24 h
(42%)
3.6 Molecular-Modelling Arbeiten
3.6.1 Strukturbasiertes Wirkstoffdesign
Das strukturbasierte Wirkstoffdesign geht von der Annahme aus, dass ein Arzneimittel an ein
definiertes molekulares Target bindet. Diese Target wird auch als Rezeptor bezeichnet. Die
zum Wirkstoffdesign benötigten Rezeptorstrukturen werden meist durch Röntgenstruktur-
analyse bestimmt, wobei angenommen wird, dass die erhaltenen Kristallstrukturen mit den in
Lösung vorliegenden Strukturen weitgehend übereinstimmen. Strukturbasiertes Wirkstoff-
design ist nun die Suche nach einem kleinen Molekül, dass möglichst perfekt in die Bindeta-
sche des Zielproteins hineinpasst und dort in der Lage ist, energetisch günstige Wechselwir-
kungen mit dem Protein auszubilden.[75] Eine Möglichkeit solche komplementären Liganden
aufzufinden, ist das computersimulierte Einpassen von Substanzen in entsprechende Rezep-
torstrukturen und die Bewertung der so erhaltenen Komplexe. Dieses kombinierte Verfahren
3 Diskussion der Ergebnisse
47
aus Einpassen und Bewerten wird als Docking bezeichnet. Für diese Aufgabe wurden eine
Reihe von Programmen entwickelt (z. B. Dock[76], FlexX[77], QXP[78], AutoDock[79] und
Gold[80]). In dieser Arbeit wurden die Programme QXP und FlexX verwendet.
Wie schon in der Aufgabenstellung beschrieben, sollten bisfunktionale Liganden der AChE
mit möglicher Inhibierung des ACh-Abbaus und Verminderung der Aβ-Aggregation entwi-
ckelt werden. Als Ansatzpunkt für die Entwicklung solcher Liganden dienten zwei bereits
bekannte AChE-Inhibitoren, die im Bereich der Active-Site und der PAS an die AChE bin-
den. Bei diesen beiden Verbindungen handelt es sich um Bw284C51 (44) und Decametho-
nium (45) (Schema 3.6.1). Beide Verbindungen zeigen in vitro eine Hemmung der Aβ-Pla-
que-Bildung.[81, 21] Aufgrund der quatären Stickstoff-Gruppen sind sie allerdings nicht für
einen Einsatz im ZNS geeignet, da geladene Moleküle nicht in der Lage sind, die Blut-Hirn-
Schranke zu überwinden. Daher sollte versucht werden mit Hilfe von Docking-Methoden
neue bisfunktionale Liganden auf der Basis von (–)-Galanthamin (9) zu entwickeln.
O
NN
NN
Bw24C51 (44)Decamethonium (45)
Schema 3.6.1: Bekannte bisfunktionale Liganden der AChE
3.6.2 Die Acetylcholinesterase
In der Brookhaven Protein Data Bank[82, 75] sind vierzig AChE- bzw. AChE/Ligand-
Strukturen hinterlegt, welche röntgenkristallographisch aufgeklärt wurden. Bei den meisten
Strukturen handelt es sich um AChE der Spezies Torpedo californica (
TcAChE), weshalb
sich alle Erläuterungen und Untersuchungen im weiteren Verlauf der Arbeit auf diese Form
der AChE beziehen.
Die AChE gehört zur Familie der Serin-Proteasen Die biologische Aufgabe des Enzyms be-
steht in der Terminierung der chemischen Reizübertragung in cholinergen Synapsen durch
Hydrolyse des Neurotransmitters ACh (3) (siehe Kapitel 1).[83] Bei der AChE handelt sich um
ein ellipsenförmiges Molekül mit einer Ausdehnung von ca. 45 x 60 x 65 Å.[84] Das Monomer
3 Diskussion der Ergebnisse
48
des Enzyms ist aus 537 Aminosäuren aufgebaut. Durch unterschiedliche Studien konnten
mehrere wichtige Domänen innerhalb des Proteins identifiziert werden.
Die katalytisch aktive Region wird aus einem anionischen und einem esteratischen Bereich
aufgebaut. Der anionische Bereich besteht aus den Aminosäuren Trp 84, Phe 330 und Phe
331.[85] Er ist für die Orientierung des geladenen Teils im ACh-Molekül bei der Annäherung
an das katalytische Zentrum zuständig.[84] Im esteratischen Teil findet die Spaltung des Sub-
strats statt. Hierfür ist eine katalytische Triade zuständig, welche aus den Aminosäuren Ser
200, His 400 und Glu 327 aufgebaut wird. Essentiell für die Esterspaltung ist die Hydroxyl-
Gruppe des Serins, deren Nucleophilie durch den Imidazolring des Histidins noch verstärkt
wird. Während der Esterspaltung entsteht intermediär durch Umesterung ein acetyliertes este-
ratisches Zentrum, das sehr schnell hydrolytisch regeneriert wird. Diese Hydrolyse ist der
geschwindigkeitsbestimmende Schritt bei der Regeneration der AChE (Abbildung 3.6.1).[5]
Abbildung 3.6.1: Schematische Darstellung der Spaltung von ACh (3) durch die AChE[40]
Die katalytische Triade der AChE, auch als Active-Site bezeichnet, befindet sich in am Ende
einer 20 Å in das Protein hineinragenden schlauchartigen Vertiefung. Die Oberfläche der
Vertiefung, die auch als aromatischer Schlauch bzw. Aromatic-Gorge bezeichnet wird, ist zu
40% aus 14 aromatischen Aminosäuren aufgebaut.[86]
Eine weitere Bereich der AChE wird als periphere anionische Bindungsstelle (PAS, engl.:
peripheral anionic site) bezeichnet. Sie ist am äußeren Rand des aromatischen Schlauchs loka-
3 Diskussion der Ergebnisse
49
lisiert und besteht aus den Aminosäuren Trp 279, Tyr 70, Tyr 121, Glu 282, Asp 72 und Tyr
334.[24] Die PAS ist in der Lage eine Vielzahl unterschiedlicher Liganden zu binden. Über die
Induzierung von Konformationsveränderungen der Active-Site haben diese Liganden einen
Einfluss auf die Funktionalität des Enzyms.[87, 88]
3.6.3 Analyse der bekannten TcAChE-Komplexe
In der Brookhaven Protein Database (PDB) sind dreißig TcAChE-Strukturen hinterlegt. Diese
Strukturen lassen sich in vier Klassen einteilen. Zum einen Strukturen des freien Enzyms, En-
zym/Ligand-Komplexe ohne kovalente Bindung des Liganden an das Enzym, Enzym/Ligand-
Komplexe mit kovalenter Bindung des Liganden an das Enzym und Enzym/Protein-Kom-
plexe
In Tabelle 3.6.1 sind die Vertreter der ersten beiden Klassen aufgeführt, sowie die bereits ge-
löste aber noch nicht veröffentlichte Struktur mit dem Arbeitsnamen 1371. Bei den weiteren
Untersuchungen wurden nur diese Strukturen betrachtet, da kovalent gebundene Liganden
bzw. angelagerte Proteine zu erheblichen Veränderungen der Proteinstruktur führen können.
Tabelle 3.6.1: Untersuchte TcAChE-Röntgenstrukturen der PDB
PDB-Eintrag Ligand Auflösung [Å] RMSD zu 1QTI [Å]
1QTI Galanthamin 2.50 0.000
1ACJ Tacrin 2.80 0.334
1ACL Decamethonium 2.80 0.374
1AX9 Edrophonium 2.80 0.271
1DX6 Galanthamin 2.30 0.183
1E3Q Bw284C51 2.85 0.394
1E66 Huprin 2.10 0.293
1EA5 - 1.80 0.233
1EVE E2020 2.50 0.248
1HBJ Quinolin 2.50 0.393
1VOT Huperzin A 2.50 0.412
2ACE - 2.50 0.267
2ACK Edrophonium 2.40 0.255
1371 sph1371 n.b. 0.216
Um die konformative Flexibilität der TcAChE zu untersuchen wurden alle in Tabelle 3.6.1
aufgeführten Strukturen übereinandergelegt. Als Templat diente das Peptidgerüst von 49
Aminosäuren der Struktur 1QTI. Diese 49 Aminosäuren bilden die Wand der Active-Site und
der Aromatic-Gorge. Es sind die Aminosäuren, bei denen sich mindestens ein Atom innerhalb
3 Diskussion der Ergebnisse
50
eines Radius von 6 Å um eines der Atome der co-kristallisierten Liganden befindet. In Tabelle
3.6.1 sind die RMSD-Werte (RMSD, engl.: Root Mean Squared Deviation) des Peptidgerüsts
der 49 ausgewählten Aminosäuren aufgeführt, die sich nach dem Übereinanderlegen ergaben.
RMSD-Werte sind ein Maß für den mittleren Abstand der Atome zweier Moleküle. Wie die
Werte zeigen, ist das Peptidgerüst der Strukturen im betrachteten Bereich weitgehend konser-
viert. Als nächstes wurden die RMSD-Werte für alle 49 Aminosäuren berechnet, wobei dies-
mal auch die Seitenketten mit einbezogen wurden. Hier zeigt sich, das die betrachteten Ami-
nosäuren in einigen Strukturen teilweise erheblich andere Lagen einnehmen als bei der
Templatstruktur 1QTI. Zu erwähnen sind hier vor allem die Aminösauren Gln 74, Ile 287 und
das Phe 330. Sie haben im Durchschnitt der 14 untersuchten Strukturen eine RMSD-Abwei-
chung von mehr als 1 Å. Insgesamt 17 der Aminosäuren weichen bei mindestens einem der
Enzyme soweit von der Templatstruktur ab, dass sich eine RMSD-Abweichung von mehr als
1 Å ergibt.
Das Ausmaß der konformativen Flexibilität der TcAChE-Strukturen kann aber auch so noch
nicht korrekt wiedergegeben werden. Der verwendete RMSD-Wert hat für die Beschreibung
der unterschiedlichen Lagen von Aminosäuren einen Nachteil. Durch die Mittelung über alle
Atome einer Aminosäure können große Abweichungen einzelner Atome bzw. Atomgruppen
durch geringe Abweichungen der Mehrzahl von Atomen „maskiert“ werden. Wie die Berech-
nungen des Abstandes für jedes Atom der 49 ausgewählten Aminosäuren zeigten, gibt es eine
Vielzahl von Atomen bzw. Atomgruppen die in einzelnen Enzymen erheblich von der
Templatstruktur abweichen. Dies gilt auch für Atome von Aminosäuren, die bei den voran-
gegangenen RMSD-Berechnungen nicht durch große Abweichungen aufgefallen sind. Als ein
Beispiel soll hier der Hydroxyl-Sauerstoff des Ser 200 aufgeführt werden. Bei der Be-
rechnung des RMSD-Wertes für die gesamte Aminosäure ergibt sich ein durchschnittlicher
Wert von 0.434 Å, bei einem maximal Wert von 0.895 Å. Für den Hydroxyl-Sauerstoff des
Ser 200 ergibt sich ein durchschnittlicher Wert von 0.766 Å, bei einem maximal Wert von
2.098 Å. Dieser Sauerstoff ist unter anderem an der Bindung von (–)-Galanthamin (9)
beteiligt. Wie aus der Röntgenstruktur 1QTI ersichtlich ist, verbindet eine Wasserstoffbrücke
die Hydroxyl-Gruppe des Ser 200 mit dem Sauerstoff der Methoxy-Gruppe des (–)-
Galanthamins (9) (Abbildung 3.6.2). Beim Docken von Verbindungen in ein starres Enzym
besteht die Möglichkeit, das die energiegünstigste Enzym/Ligand-Anordnung nicht gefunden
werden kann, da hierfür eine konformative Anpassung des Enzyms an den Liganden
notwendig ist (induced-fit).
3 Diskussion der Ergebnisse
51
Abbildung 3.6.2: Bindungen von (–)-Galanthamin (9) in der TcAChE (1QTI)
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass unter dem Einfluss von Liganden einige
Aminosäuren bzw. einzelne Atome ihrer Lage teilweise deutlich verändern, auch wenn das
Proteingerüst der TcAChE-Enzyme weitgehend konserviert ist.
3.6.4 Das Docking Programm QXP
Das Docking Programm QXP (engl.: quick explore) basiert auf dem MCFSM (Monte Carlo
pertubation/Fast Search/Energy Minimisation) Algorithmus. Bei diesem Algorithmus wird
zuerst eine modifizierte Monte Carlo Methode zur Konformationssuche verwendet. Hierbei
wird der Ligand Rotationen und Translationen unterworfen, ferner werden Torsionswinkel
variiert. Im nächsten Schritt (Fast Search) wird für die so erhaltene Konformation des Ligan-
den eine energiegünstige Orientierung an der Bindestelle des Enzyms gesucht. Um diese Su-
che zu Beschleunigen wird der Ligand hierbei als starrer Körper behandelt (rigid-body). In
der so gefundenen Lage wird dann eine Energieminimierung des Liganden durchgeführt. Bei
dieser Energieminimierung wird der Ligand wieder als flexibles Molekül behandelt. Neben
der Möglichkeit, das Protein während der Energieminimierung starr zu halten, können ein-
zelnen Teilen der Enzym-Struktur zwei Arten von Flexibilität zugewiesen werden. Zum einen
ist eine eingeschränkte Flexibilität der Aminosäurebausteine möglich, bei der jede Bewegung
mit einer Energiestrafe von 5 kJ/(Å2 mol) bedacht wird, zum anderen die völlig freie Be-
weglichkeit von definierten Teilen des Enzyms. Zur Bewertung der erhaltenen En-
3 Diskussion der Ergebnisse
52
zym/Ligand-Komplexe wird ein modifiziertes Amber-Kraftfeld[89] verwendet. Als Ergebnis
eines Docking-Laufs gibt QXP die 25 energiegünstigsten Enzym/Ligand-Komplexe aus. Die
Angaben der relativen Energien erfolgt in kJ/mol.
Die Energieberechnung erfolgt bei QXP mit der sogenannte Gridmethode. Bei dieser Me-
thode wird ein dreidimensionales Gitter generiert, auf dessen Gitterpunkten van der Waals
und elektrostatische Wechselwirkungen berechnet werden. Auf diese Weise wird ein Abbild
des Enzyms erzeugt, welches für das Docken verwendet wird. Für die Erzeugung dieses Git-
ters müssen einige Atome des Enzyms markiert werden. Ausgehend von diesen Atomen gene-
riert QXP ein dreidimensionales Netz aus sogenannten „Guide Atoms“. Für das gesamte En-
zym wird ein Gitter mit einer Maschenweite von 0.6 Å erzeugt. Alle Punkt dieses Gitters, die
weniger als 3 Å von einem der „guide-atoms“ entfernt sind, bilden die Grundlage für ein fei-
neres Gitter mit einer Maschenweite von 0.3 Å. Die postulierte Bindungsstelle muss sich in-
nerhalb dieses feinen Gitters befinden.
Abbildung 3.6.3: „Guide Atoms“ in der Enzymstruktur 1QTI
In Abbildung 3.6.3 ist ein Netz aus „Guide Atoms“ dargestellt. Es wurde ausgehend von vier
Atomen der TcAChE-Struktur 1QTI generiert. Durch dieses „Guide Atoms“-Netz wird der
gesamte Bereich des katalytischen Zentrums, sowie des aromatischen Schlauchs als poten-
tielle Region für eine Bindung definiert.
3 Diskussion der Ergebnisse
53
3.6.5 Reproduktion der Röntgenstruktur des TcAChE/(–)Galanthamin-
Komplexes
Um das Programm QXP auf seine Eignung zur korrekten Vorhersage von TcAChE/Galanth-
aminderivat-Komplexen hin zu untersuchen, wurde zuerst versucht die Röntgenstruktur des
Komplexes 1QTI zu reproduzieren. Da QXP nur mit maximal 2000 Atomen arbeitet, wurden
zuerst alle Aminosäuren der Struktur 1QTI entfernt, von denen nicht mindestens ein Atom
innerhalb eines Radius von 21 Å um das Stickstoff-Atom des (–)-Galanthamins (9) liegt. In
einem zweiten Schritt wurden alle Aminosäuren entfernt, die sich in einem isolierten Strang
mit weniger als drei Aminosäuren befinden. Nachdem die polaren Wasserstoffe angefügt
wurden, erhält man 1901 Atome, die zum Docken herangezogen wurden.
Beim (–)-Galanthamin (9) kann die N-Methylgruppe des Siebenrings eine axiale oder
equatoriale Stellung einnehmen (Abbildung 3.6.4). In der Realität kann zwischen diesen
beiden Konformationen nicht unterschieden werden, da bei Raumtemperatur eine schnelle
Inversion von Aminen stattfindet. Da QXP nicht in der Lage ist, Ringkonformationen zu
ändern, bei denen im Modell ein Bindungsbruch notwendig wird, müssen die beiden
Stellungen der N-Methylgruppe beim Docken getrennt voneinander betrachtet werden. Ferner
wurden beide Konfomere noch mit protoniertem Stickstoff gedockt. Insgesamt wurden also
vier Docking-Läufe mit (–)-Galanthamin (9) durchgeführt.
Abbildung 3.6.4: Equatoriale (links) und axiale (rechts) Stellung der N-Methylgruppe in
(–)-Galanthamin (9)
Als Maß für die Güte der Reproduktion des (–)-Galanthamins (9) der Röntgenstruktur 1QTI
wurde die RMSD-Abweichung zum gedockten (–)-Galanthamin (9) berechnet. Ein gedocktes
(–)-Galanthamin (9) mit einer RMSD-Abweichung von weniger als 1 Å wurde als korrekte
Reproduktion der Röntgenstruktur gewertet. Eine solche Struktur wird im folgenden als Hit
bezeichnet. Die Ergebnisse sind in den ersten vier Zeilen der Tabelle 3.6.2 (Seite 57) aufge-
3 Diskussion der Ergebnisse
54
führt. In der Tabelle sind ferner auch die Ergebnisse des Crossdockings dargestellt, welches
im nächsten Kapitel beschrieben wird. In der ersten Spalte ist die gedockte Enzym/Ligand-
Kombination näher spezifiziert. Die ersten vier Zeichen entsprechen dem PDB-Code der ver-
wendeten TcAChE-Struktur. Durch Unterstriche voneinander getrennt, folgt die Abkürzung
der gedockten Verbindung (hier: GNT für (–)-Galanthamin (9)), die Art des N-Atoms (N3 für
unprotonierten Stickstoff, N4 für protonierten Stickstoff) und die Konformation der Methyl-
gruppe am N-Atom (eq. für eine equatoriale, ax. für eine axiale Stellung). In den weiteren
Spalten wird die RMSD-Abweichung der energetisch günstigsten Struktur, die relative Ener-
gie der energetisch günstigsten Struktur, der Platz des ersten Hits, die RMSD-Abweichung
des ersten Hits, die relative Energie des ersten Hits, der Platz der Struktur mit der geringsten
RMSD-Abweichung, die geringste RMSD-Abweichung und die relative Energie der ent-
sprechenden Struktur gezeigt. Wie aus den Ergebnissen ersichtlich, wird die Röntgenstruktur
von QXP korrekt reproduziert. Die energetisch günstigste Konformation, die von QXP
ermittelt wurde, ist bei allen vier gedockten Formen des (–)-Galanthamins (9) einer der Hits.
Auch die Lage der N-Methylgruppe wird richtig reproduziert, da die equatoriale Stellung so-
wohl bei Verwendung eines nicht protonierten als auch eines protonierten Stickstoffs eine
kleinere relative Energie aufweist. Der Unterschied der Energie des ersten Platzes zwischen
equatorialer und axialer Stellung der N-Methylgruppe ist allerdings sehr gering. Sie beträgt
sowohl beim N3- als auch beim N4-Stickstoff nur 0.4 KJ/mol. Daraus kann gefolgert werden,
dass die N-Methylgruppen in beiden Fällen keine großen Wechselwirkungen mit der Struktur
1QTI ausbildet. Es muss allerdings darauf hingewiesen werden, dass in allen vier Fällen die
beste Übereinstimmung mit der Röntgenstruktur einmal auf dem dritten Platz und dreimal auf
dem zweiten Platz gefunden wird. Dies stellt jedoch kein Problem dar, da für die geplanten
Untersuchungen nur wichtig ist, dass eine Struktur mit einer RMSD-Abweichung von
weniger als 1 Å zur Röntgenstruktur auf dem ersten Rang gefunden wird. Ein direkter Ver-
gleich der Energien von geladenem und nicht geladenem
(–)-Galanthamin (9) ist nicht sinnvoll, da das Einbringen einer Ladung das Gesamtsystem
verändert.
In Abbildung 3.6.5 ist die energetisch günstigste Konformation des Dockens mit N3-Stick-
stoff (weiß) über das (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur 1QTI (grün) gelegt. Wie
hieraus ersichtlich ist, sind die beiden Strukturen, abgesehen von einer leichten Spreizung des
Stickstoff-Siebenrings, deckungsgleich.
Wie auch schon andere Untersuchungen in unserem Arbeitskreis gezeigt haben, scheint (–)-
Galanthamin (9) nicht nur eine Affinität zur Active-Site der TcAChE aufzuweisen, sondern
3 Diskussion der Ergebnisse
55
auch zur PAS.[90, 91] Auch diese Docking-Studie liefert einen Hinweis auf eine solche Affini-
tät, denn QXP findet ebenfalls zwei Bindungsstellen von (–)-Galanthamin (9) an der TcAChE.
In Abbildung 3.6.5 ist die energiegünstigste der gefundenen Lagen des (–)-Galanthamins (9)
im Bereich der PAS dargestellt. Es handelt sich um eine Konformation, die beim Docken mit
N3-Stickstoff und equatorialer N-Methylgruppe auf dem neunten Platz mit einer Energie von
–26.7 kJ/mol gefunden wurde. Die Lage relativ zum Trp 279 lässt darauf schließen, dass diese
Aminosäure wesentlich an der Bindung des (–)-Galanthamins (9) im Bereich der PAS be-
teiligt ist. Der aromatische Ring des Trp 279 und der des (–)-Galanthamins (9) ordnen sich so
zueinander an, dass intensive van der Waals-Wechselwirkungen ausgebildet werden können.
Abbildung 3.6.5: Ergebnisse des Dockens von (–)-Galanthamin (9) in die Enzymstruktur 1QTI
Aufgrund einer möglichen Interaktion von (–)-Galanthamin (9) mit der Active-Site und der
PAS von TcAChE, könnte eine Verbindung, die aus zwei Galanthamin-Fragmenten aufgebaut
ist, ein potentieller bisfunktionaler Ligand mit Inhibierung der ACh-Spaltung und der Aβ-
Aggregation sein. Wie aus der Abbildung 3.6.5 ersichtlich ist, sind die Amino-Funktionen des
(–)-Galanthamins (9) in beiden Lagen zueinander gewandt. Eine sinnvoller Verknüpfungs-
punkt wären folglich die beiden Stickstoff-Atome. Denkbar ist hier die Verbindung über eine
Alkylkette. Eine eingehende Untersuchung solcher Alkylbisgalanthamine (B) ist in Kapitel
3.6.9 beschrieben.
3 Diskussion der Ergebnisse
56
3.6.6 Crossdocking von (–)-Galanthamin in verschiedenen TcAChE-
Strukturen
Inwieweit es trotz der konformativen Flexibilität von TcAChE sinnvoll ist, beim Docken von
einer starren Enzymstruktur auszugehen, soll im folgenden untersucht werden, inwieweit
QXP geeignet ist, die Röntgenstruktur des (–)-Galanthamins (9) auch bei Verwendung ande-
rer Enzymstrukturen als der von 1QTI korrekt vorherzusagen. Neben den TcAChE-Strukturen
wurde bei dieser Untersuchung auch die Struktur 1B41 mit einbezogen. Hierbei handelt es
sich um die einzige verfügbare Struktur der menschlichen AChE (co-kristallisiert mit Fasci-
culin). Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind in Tabelle 3.6.2 dargestellt. Bei Verwendung
von Strukturen bei denen (–)-Galanthamin (9) oder ein Galanthamin-Derivat co-kristallisiert
ist (1DX6, 1371), konnte die Röntgenstruktur immer korrekt auf dem ersten Platz reproduziert
werden. Allerdings ist bei Verwendung eines N3-Stickstoffs, abweichend von der Rönt-
genstruktur, in beiden Fällen die axiale Stellung der N-Methylgruppe energetisch geringfügig
günstiger als die equatoriale. Bei Verwendung des N4-Stickstoffs verhält es sich umgekehrt.
Bei den übrigen 11 TcAChE-Strukturen konnte bei 8 der 22 gedockten Strukturen mit N3-
Stickstoffs eine korrekte Lage auf dem ersten Platz gefunden werden, bei Verwendung des
N4-Stickstoff nur 3. Wenn man die Konformationen mit axialer und equatorialer Stellung der
N-Methylgruppe als nur eine Struktur betrachtet und die Docking-Ergebnisse entsprechend
auswertet, wird die korrekte Lage bei 3 (N3_Stickstoff) bzw. 1 (N4-Stickstoff) der 11 Enzym-
strukturen korrekt vorhergesagt. Bei weiteren 7 (N3-Stickstoff) bzw. 9 (N4-Stickstoff) von 22
gedockten Konformationen konnte die Röntgenstruktur zwar reproduziert werden, aber sie
wurde energetisch nicht auf den ersten Platz gesetzt. Bei 7 (N3-Stickstoff) bzw. 10 (N4-Stick-
stoff) von 22 gedockten Konformationen wurde auf keinem der 25 Plätze die korrekte Lage
gefunden. Bei Verwendung der Enzymstruktur 1B41 konnte die korrekte Lager bei Verwen-
dung eines N3-Stickstoffs reproduziert werden, bei Verwendung eines N4-Stickstoffs wurde
bei der axialen Konformation keine korrekte Lage gefunden, bei der equatorialen nicht auf
dem ersten Platz.
Da bei Verwendung eines N3-Stickstoffs die Röntgenstruktur in 27% der Fälle korrekt repro-
duziert wurde, bei Einsatz eines N4-Stickstoffs nur in 9% der Fälle, werden alle weiteren
Untersuchungen mit nicht geladenem Stickstoff durchgeführt.
3 Diskussion der Ergebnisse
57
Tabelle 3.6.2: Ergebnisse des Crossdockings von (–)-Galanthamin (9)
Name RMSD Pl. 1 E. Pl. 1 Pl. 1. Hit RMSD 1. Hit E. 1. Hit Pl. b. Hit RMSD b. Hit E. b. Hit
1QTI_GNT_N3_ax 0,82 -39,9 1 0,82 -39,9 3 0,44 -38,1
1QTI_GNT_N3_eq. 0,46 -40,3 1 0,46 -40,3 2 0,32 -38,2
1QTI_GNT_N4_ax. 0,57 -41,3 1 0,57 -41,3 2 0,45 -38,9
1QTI_GNT_N4_eq. 0,61 -41,7 1 0,61 -41,7 2 0,27 -39,1
1ACJ_GNT_N3_ax. 2,10 -34,9 17 0,92 -25,3 17 0,92 -25,3
1ACJ_GNT_N3_eq. 2,04 -29,2 - - - 16 1,86 -22,5
1ACJ_GNT_N4_ax. 1,86 -35,8 - - - 1 1,86 -35,8
1ACJ_GNT_N4_eq. 2,29 -34,9 - - - 18 1,95 -28,6
1ACL_GNT_N3_ax. 7,21 -32,7 - - - 22 1,67 -25,6
1ACL_GNT_N3_eq. 7,20 -30,2 - - - 18 1,92 -24,9
1ACL_GNT_N4_ax. 2,20 -30,7 - - - 16 1,77 -27,3
1ACL_GNT_N4_eq. 8,51 -35,9 - - - 20 2,14 -28,9
1AX9_GNT_N3_ax. 8,83 -25,0 - - - 20 6,36 -22,5
1AX9_GNT_N3_eq. 0,79 -28,5 1 0,79 -28,5 1 0,79 -28,5
1AX9_GNT_N4_ax. 0,92 -22,1 1 0,92 -22,1 1 0,92 -22,1
1AX9_GNT_N4_eq. 7,21 -29,3 2 0,79 -29,3 8 0,29 -26,4
1DX6_GNT_N3_ax. 0,58 -40,3 1 0,58 -40,3 2 0,41 -37,1
1DX6_GNT_N3_eq. 0,43 -39,7 1 0,43 -39,7 2 0,29 -38,8
1DX6_GNT_N4_ax. 0,55 -40,3 1 0,55 -40,3 2 0,38 -39,0
1DX6_GNT_N4_eq. 0,49 -40,8 1 0,49 -40,8 2 0,25 -39,5
1E3Q_GNT_N3_ax. 1,05 -31,5 3 0,92 -28,9 3 0,92 -28,9
1E3Q_GNT_N3_eq. 2,57 -32,8 2 0,78 -32,4 2 0,78 -32,4
1E3Q_GNT_N4_ax. 1,57 -33,0 3 0,91 -30,5 3 0,91 -30,5
1E3Q_GNT_N4_eq. 2,61 -33,5 2 0,80 -32,2 2 0,80 -32,2
1E66_GNT_N3_ax. 2,12 -32,6 - - - 25 1,96 -24,0
1E66_GNT_N3_eq. 2,04 -31,5 - - - 16 2,00 -25,6
1E66_GNT_N4_ax. 2,11 -39,2 - - - 14 2,00 -30,0
1E66_GNT_N4_eq. 2,32 -38,4 - - - 11 2,05 -34,8
1EA5_GNT_N3_ax. 0,91 -31,0 1 0,91 -31,0 1 0,91 -31,0
1EA5_GNT_N3_eq. 2,36 -32,3 4 0,90 -29,7 24 0,85 -24,7
1EA5_GNT_N4_ax. 2,74 -32,8 - - - 20 1,66 -28,0
1EA5_GNT_N4_eq. 2,39 -33,8 15 0,92 -30,1 15 0,92 -30,1
1EVE_GNT_N3_ax. 0,75 -34,7 1 0,75 -34,7 22 0,60 -26,0
1EVE_GNT_N3_eq. 2,21 -35,2 2 0,75 -33,6 4 0,53 -30,1
1EVE_GNT_N4_ax. 2,30 -32,4 2 0,67 -32,4 8 0,62 -30,0
1EVE_GNT_N4_eq. 2,87 -35,9 9 0,74 -33,0 13 0,60 -31,0
1HBJ_GNT_N3_ax. 1,94 -30,1 5 0,86 -25,9 5 0,86 -25,9
1HBJ_GNT_N3_eq. 2,01 -34,6 12 0,68 -25,6 12 0,68 -25,6
1HBJ_GNT_N4_ax. 1,87 -34,5 - - - 12 1,79 -32,1
1HBJ_GNT_N4_eq. 2,07 -41,7 - - - 13 1,87 -31,4
1VOT_GNT_N3_ax. 0,95 -27,6 1 0,95 -27,6 1 0,95 -27,6
1VOT_GNT_N3_eq. 7,16 -28,2 21 0,85 -22,9 21 0,85 -22,9
1VOT_GNT_N4_ax. 1,93 -29,6 14 0,95 -22,3 14 0,95 -22,3
1VOT_GNT_N4_eq. 2,09 -39,0 15 0,87 -25,0 15 0,87 -25,0
2ACE_GNT_N3_ax. 0,95 -28,0 1 0,95 -28,0 1 0,95 -28,0
2ACE_GNT_N3_eq. 7,05 -26,7 - - - 16 1,43 -23,7
2ACE_GNT_N4_ax. 2,87 -27,8 13 0,98 -22,6 18 0,97 -22,0
2ACE_GNT_N4_eq. 2,00 -31,7 - - - 8 1,46 -27,3
2ACK_GNT_N3_ax. 0,97 -31,4 1 0,97 -31,4 3 0,83 -23,9
2ACK_GNT_N3_eq. 0,78 -30,9 1 0,78 -30,9 1 0,78 -30,9
2ACK_GNT_N4_ax. 0,96 -24,1 1 0,96 -24,1 1 0,96 -24,1
2ACK_GNT_N4_eq. 0,79 -31,2 1 0,79 -31,2 1 0,79 -31,2
1371_GNT_N3_ax. 0,59 -38,3 1 0,59 -38,3 3 0,46 -35,9
1371_GNT_N3_eq. 0,45 -37,9 1 0,45 -37,9 2 0,29 -36,3
1371_GNT_N4_ax. 0,67 -38,9 1 0,67 -38,9 3 0,40 -37,7
1371_GNT_N4_eq. 0,63 -39,2 1 0,63 -39,2 2 0,34 -37,3
1B41_GNT_N3_ax. 0,93 -30,0 1 0,93 -30,0 2 0,73 -27,2
1B41_GNT_N3_eq. 0,68 -29,3 1 0,68 -29,3 1 0,68 -29,3
1B41_GNT_N4_ax. 6,54 -31,6 - - - 11 1,01 -27,1
1B41_GNT_N4_eq. 1,16 -26,9 5 0,84 -24,3 5 0,84 -24,3
3 Diskussion der Ergebnisse
58
Zusammenfassend ist festzustellen, das QXP die Röntgenstruktur zu 27% bei Verwendung
einer fremden Enzymstruktur und zu 100% bei Verwendung einer Enzymstrukturen mit co-
kristallisiertem (–)-Galanthamin (9) reproduzieren kann. Da keine direkt vergleichbaren
Untersuchungen mit anderen Dockingprogrammen vorliegen, ist eine Bewertung der
Ergebnisse in dieser Hinsicht nicht möglich. Da die Röntgenstruktur in allen Enzymstruktur
mit co-kristallisiertem (–)-Galanthamin (9) reproduziert werden konnte, ist das Problem beim
Docken mit QXP nicht die verwendete Bewertungsfunktion sondern vielmehr die
Verwendung starrer Enzymstrukturen.
3.6.7 Entwicklung eines neuen bisfunktionalen Liganden
Einen theoretischer Ansatz zur Entwicklung von neuen bisfunktionalen Liganden der AChE,
stellt die Verknüpfung von (–)-Galanthamin (9) mit einem bekannten Inhibitor der PAS dar.
In Schema 3.6.2 sind zwei Inhibitoren der PAS dargestellt. Beide Inhibitoren sind in der Lage
die Aβ-Plaqubildung in vitro zu hemmen.[81, 21]
O
O
O
NN N
N
NH2
NH2
N
Gallamin (46)Propidium (47)
Schema 3.6.2: PAS-Inhibitoren
Für diesen ersten Ansatz wurde das Gallamin (46) ausgewählt. Zuerst wurde Gallamin (46)
mit QXP in die TcAChE-Struktur 1QTI gedockt, um einen Verknüpfungspunkt mit dem (–)-
Galanthamin (9) zu ermitteln. Bei allen PAS Inhibitoren handelt es sich um quartäre
Ammoniumverbindungen. Da geladene Moleküle nicht in der Lage sind, die Blut-Hirn-
Schranke zu passieren, sind solche Verbindungen für den geplanten Einsatz als Inhibitor der
AChE im ZNS nicht geeignet. Daher wurde ferner ein nicht geladenes Gallamin-Derivat mit
nur zwei Ethylgruppen an jedem Stickstoff und somit nicht geladenen Stickstoff-Atomen
3 Diskussion der Ergebnisse
59
gedockt. Die relative Energie der besten Gallamin-Struktur beträgt –31.3 kJ/mol, die der
besten Gallamin-Derivat-Struktur –37.5 kJ/mol. Aus diesen Energiewerten kann geschlossen
werden, dass auch das verwendete Gallamin-Derivat eine hohe Affinität zu TcAChE besitzt.
Die beiden Lagen sind in Abbildung 3.6.6 dargestellt. Im linken Bild ist Gallamin (46) (weiß)
zusammen mit dem (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur 1QTI (grün) dargestellt, im
rechten Bild das Gallamin-Derivat (weiß), ebenfalls mit dem (–)-Galanthamin (9) der
Röntgenstruktur 1QTI (grün).
Es zeigt sich, dass eine der Amino-Funktionen bei beiden der untersuchten Strukturen eine
Affinität zum Trp 279 hat. Ferner ist ersichtlich, das jeweils eine der Aminogruppen sich in
Richtung der Active-Site ausrichtet. Eine der N,N-Diethylpropylamin-Gruppen stellt folglich
einen geeigneten Verknüpfungspunkt mit der Aminofunktion des (–)-Galanthamins (9) (grün)
dar.
Abbildung 3.6.6: Ergebnisse des Dockens von Gallamin (44) (rechts) und einem Gallamin-Derivat
(links)
Als nächstes sollte nun die optimale Anzahl von Methyleneinheiten ermittelt werden, aus der
die verbindende Kette aufgebaut sein muss, um eine Verbindung mit maximalen Wechsel-
wirkungen zu erhalten. Aus Abstandsmessungen zwischen dem dedockten Gallamin-Derivat
und dem (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur wäre eine Verbindung mit drei Methylen-
3 Diskussion der Ergebnisse
60
einheiten sinnvoll. Daher wurde die Verbindungsklasse A (Schema 3.6.3) mit den Werten
zwei, drei und vier für n, in die TcAChE-Struktur 1QTI gedockt.
O
O
O
O
OH
N
N
N
n
A
O
Schema 3.6.3: Allgemeinen Form der gedockten Alkylgallamingalanthamine
Die Ergebnisse der Docking-Läufe sind in Tabelle 3.6.3 aufgeführt. Die geringste relative
Energie ergibt sich bei einem Butylgallamingalanthamin mit equatorialer Stellung der Alkyl-
kette am N-Atom des Galanthamin-Fragments.
Tabelle 3.6.3: Ergebnisse der Docking-Läufe mit unterschiedlichen Alkylkettenlängen bei
Gallamingalanthaminen
Name E (ax.) E (eq.)
1QTI_GAL_02 -49,2 -49,2
1QTI_GAL_03 -58,4 -52,5
1QTI_GAL_04 -63,0 -64,4
In Abbildung 3.6.7 sind die beiden energetisch günstigsten Lagen des axialen Butylgallamin-
galanthamins (weiß, linkes Bild) und des equatorialen Buthylgallamingalanthamins (weiß,
rechtes Bild), sowie jeweils das (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur 1QTI (grün)
dargestellt. Im rechten Bild wurde noch die energiegünstigste Lage des gedockten Gallamin-
Derivats mit nicht geladenem Stickstoff (blau) hinzugefügt. Die Lage des Galanthamin-
Fragments ist in beiden Fällen mit der des (–)-Galanthamins (9) der Struktur 1QTI nahezu
identisch. Während beim Docken mit der axialen Form das Gallamin-Fragment dieselbe Lage
einnimmt, wie beim Docken des Gallamin-Derivats mit nicht geladenem Stickstoff, ist dies
bei der energetisch günstigeren, equatorialen Form nicht der Fall. Dies ist vermutlich auf den
Einfluss der Alkylkette zurückzuführen. Welche Lage die beiden Fragmente einnehmen, wird
nicht unerheblich durch die Möglichkeit der Alkylkette bestimmt, eine energiegünstige
Konformation innerhalb des Enzyms einzunehmen.
3 Diskussion der Ergebnisse
61
Abbildung 3.6.7: Ergebnisse des Dockens von 3 verschiedenen Alkylgallamingalanthaminen
3.6.8 Docking von potentiellen bisfunktionalen Galanthamin-Deriva-
ten
In diesem Kapitel werden die Ergebnisse des Dockens von vier Reihen verschiedener Verbin-
dungsklassen diskutiert. Alle untersuchten Verbindungsklassen sind aus zwei Fragmenten
aufgebaut, die über verschieden lange Alkylketten miteinander verbunden sind.
O
O
OH
N
n
N
O
O
C
Schema 3.6.4: Verbindungsklasse C (Phthalimidoalkylgalanthamin)
3 Diskussion der Ergebnisse
62
Bei einem der Fragmente handelt es sich jeweils um (–)-Galanthamin (9). Ziel ist es zu
ermitteln, bei welcher Alkylkettenlänge maximale Wechselwirkungen mit der Enzymstruktur
ausgebildet werden. Als erstes wurde eine Verbindungsklasse mit einem Phthalimid als
zweitem Fragment untersucht (Schema 3.6.4).
Verbindungen des Typs C wurden mit den Werten 2, 4, 6, 8 und 10 für n, gedockt. Die Er-
gebnisse sind in Diagramm 3.6.1 dargestellt. Die niedrigste relative Energie ergibt sich bei
einer Kettenläge von 8 Methyleneinheiten. Da für diese Verbindungen IC50-Werte in der Lite-
ratur[92] veröffentlicht wurden, sind diese ebenfalls in das Diagramm 3.6.1 aufgenommen. Es
zeigt sich, dass der Verlauf der IC50-Werte mit denen der relativen Energien korreliert. Es
muss allerdings erwähnt werden, das die IC50-Werte mit AChE der Spezies Elektrophorus
electricus bestimmt wurden, während für das Docken TcAChE verwendet wurde.
Diagramm 3.6.1: Ergebnisse des Docken von Verbindungsklasse C
In Abbildung 3.6.8 sind die energiegünstigsten Verbindungen jeder gedockten Alkylketten-
länge dargestellt. Hier zeigt sich erneut der Einfluss des Trp 279 auf die Bindung von bis-
funktionalen Liganden. Während das Phthalimidobutylgalanthamin (weiß) nicht in der Lage
ist, an das Trp 279 heranzureichen, ist dies bei den Derivaten mit 6 (gelb) bzw. 8 (rot) Me-
thyleneinheiten möglich. Die Seitenkette des Trp 279 und die Phthalimido-Gruppen orientie-
ren sich nahezu parallel zueinander. Aufgrund der beobachteten relativen Energien, sind die
hieraus resultierenden Wechselwirkung bei einer aus 8 Methyleneinheiten bestehenden Al-
kylkette maximal. Das Derivat mit 6 Methyleneinheiten (gelb) kann diese weitgehend opti-
3 Diskussion der Ergebnisse
63
male Lage der Phthalimido-Gruppe nicht erreichen, da die Alkylkette zu stark gestreckt und
somit energieungünstig würde. Bei dem Derivat mit 10 Methyleneinheiten (blau) würde die
Spannung der Alkylkette bei einer Interaktion mit dem Trp 279 vermutlich zu groß, und die
Phthalimido-Gruppe bildet Wechselwirkungen zu anderen Aminosäuren im oberen Bereich
des aromatischen Schlauchs aus. Diese sind aber offensichtlich nicht so stark wie die poten-
tiellen Wechselwirkungen mit Trp 279, so dass sich eine höhere relative Energie ergibt. Bei
allen energetisch günstigen Phthalimidoalkylgalanthaminen nimmt das Galanthamin-Frag-
ment die selbe Lage ein, wie das (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur 1QTI (grün).
Abbildung 3.6.8: Ergebnisse des Docken von Verbindungsklasse C
n
B
O
O
OH
N
O
O
HO
N
Schema 3.6.5: Verbindungsklasse B (Alkylbisgalanthamin)
3 Diskussion der Ergebnisse
64
Als nächstes wurde eine Reihe von Verbindungen des Typs B gedockt. Hierbei handelt es
sich um zwei Galanthamin-Fragmente die durch Alkylketten miteinander verbunden sind
(Schema 3.6.5).
Die Ergebnisse des Dockens von Verbindungsklasse B mit Alkylketten, die aus 2 bis 10 Me-
thyleneinheiten bestehen, sind in Diagramm 3.6.2 dargestellt. Die Lage mit der geringsten
Energie wird bei equatorialer Stellung der N-Alkylgruppe bei beiden Galanthamin-Frag-
menten und einer Kettenlänge von 5 Methyleneinheiten gefunden.
Diagramm 3.6.2: Ergebnisse des Docken von Verbindungsklasse B
Bei der nächsten untersuchten Verbindungsklasse D handelt es sich beim nicht Galanthamin-
Fragment um eine Indanongruppe.
O
O
OH
N
n
O
D
O
O
Schema 3.6.6: Verbindungsklasse D (Indanonalkylgalanthamin)
3 Diskussion der Ergebnisse
65
Da diese Gruppe ein Stereozentrum besitzt, wurden in diesem Fall zusätzlich zu den
Konformationen der N-Alkylgruppe des Galanthamin-Fragments noch die beiden Stereo-
isomere (R und S) betrachtet. So ergaben sich insgesamt vier unterschiedliche Strukturen pro
Alkylkettenlänge.
Auch diese Verbindungsklasse wurde mit Alkylkettenlängen von 2 bis 10 Methyleneinheiten
gedockt. Die Ergebnisse sind in Diagramm 3.6.3 dargestellt. Die niedrigste relative Energie
und somit die intensivste Wechselwirkung mit dem Enzym ergab sich bei beiden Stereoiso-
meren, wenn die beiden Fragmente durch 5 Methyleneinheiten miteinander verbunden waren
und die N-Alkylkette am Galanthamin-Fragment eine equatoriale Stellung einnimmt.
Diagramm 3.6.3: Ergebnisse des Docken von Verbindungsklasse D
Bei der letzten untersuchten Verbindungsklasse E wurde das Galanthamin-Fragment mit einer
Piperidino-Gruppe verknüpft.
O
O
OH
N
n
E
N
Schema 3.6.7: Verbindungsklasse E (Piperidinoalkylgalanthamin)
3 Diskussion der Ergebnisse
66
Auch in diesem Fall wurden Alkylkettenlängen von 2 bis 10 Methyleneinheiten betrachtet
(Diagramm 3.6.4). In diesem Fall wurde die günstigste Energie bei einer Kettenlänge beste-
hend aus 8 Methyleneinheiten und axialer Stellung der Alkylgruppe gefunden.
Diagramm 3.6.4: Ergebnisse des Dockens von Verbindungsklasse E
In Abbildung 3.6.9 sind die ermittelten energiegünstigsten Verbindungen der Klassen B
(gelb), D (rot) und E (blau) sowie das (–)-Galanthamin (9) der Röntgenstruktur 1QTI (grün)
dargestellt. Auch hier zeigt sich, dass Trp 279 offensichtlich hauptverantwortlich für die
Wechselwirkungen der untersuchten Verbindungen im Bereich der PAS ist. Bei allen
gefundenen energiegünstigsten Lagen orientiert sich ein Fragment zu dieser Aminosäure.
Ferner ist auch bei diesen Verbindungen die Lage des Galanthamin-Fragments nahezu
identisch mit der des (–)-Galanthamins (9) der Röntgenstruktur 1QTI.
Bei allen hier untersuchten Verbindungsklassen zeigte sich, dass die optimale Struktur sich
immer aus einem Wechselspiel zwischen maximaler möglicher Interaktion des nicht Ga-
lanthamin-Fragments mit dem Trp 279 und einer energetisch günstigen Konformation der
Alkylkette ergab.
3 Diskussion der Ergebnisse
67
Abbildung 3.6.9: Ergebnisse des Dockens der Verbindungsklassen B, D, E
3.6.9 Docking der CSD-Datenbank mit Flexx
Eine Möglichkeit weitere Wirkstoffe zu finden, die eine Affinität zur PAS haben und so als
Fragment für potentielle bisfunktionale Liganden der AChE geeignet sind, ist das Docken
einer Datenbank mit organischen Molekülen in den PAS-Bereich der AChE-Struktur 1QTI.
Da QXP für die Untersuchung einer so großen Anzahl von Verbindungen zu langsam ist,
wurde hierfür das Programm FlexX benutzt. Wie Untersuchungen[93] mit diesem Programm
gezeigt haben, ist es ebenfalls in der Lage die Röntgenstruktur von (–)-Galanthamin (9) in
1QTI korrekt zu reproduzieren. Alle verwendeten Strukturen stammen aus der CSD-
Datenbank, die den Anforderungen entsprechend aufgearbeitet wurde. Zum Docken wurden
nur solche Verbindungen benutzt, die ausschließlich Kohlenstoff, Wasserstoff, Stickstoff,
Schwefel und Halogene enthalten und eine molare Masse von weniger als 300 g/mol
aufweisen. Letztere Einschränkungen wurde vorgenommen, da Medikamente im allgemeinen
ein molare Masse von weniger als 650 g/mol haben müssen, um im Körper an ihren Wirkort
transportiert werden zu können. Bei Verbindung mit einem (–)-Galanthamin (9) als erstem
Fragment sind daher 300 g/mol die Obergrenze für das zweite Fragment. So aufgearbeitet
standen 28388 Verbindungen zum Docken zur Verfügung. Der Bereich in dem das Docken
mit FlexX stattfindet, wurde auf die Region der PAS einschränkt. So ist es zwar möglich, dass
3 Diskussion der Ergebnisse
68
an einer anderen Stelle des Enzyms eine höhere Affinität vorhanden sein könnte, das ist
allerdings für die Zielsetzung dieser Untersuchung nicht von Bedeutung. 27708 der 28388
Verbindungen konnten erfolgreich gedockt werden. Dies entspricht 97.6%. Bei den übrigen
Strukturen war FlexX nicht in der Lage ein geeignetes Basisfragment zu identifizieren, was
für einen automatischen Docking-Prozess jedoch essentiell ist. In Abbildung 3.6.10 sind die
drei Strukturen mit der geringsten relativen Energie dargestellt (Platz 1 (grün), Platz 2 (blau),
Platz 3 (rot)). Die Strukturformeln der 24 energiegünstigsten Verbindungen sind in Anhang A
aufgeführt. Abgesehen von zwei Verbindungen, handelt es sich um Möleküle mit mindestens
einem aromatischen Ringsystem und einer größeren Anzahl von Heteroatomen.
Diese Verbindungen können als Grundlage für die Entwicklung weiterer potentielle bisfunk-
tionaler Liganden der AChE dienen.
Abbildung 3.6.10: Die drei energiegünstigsten Verbindungen des Dockens der CSD-Datenbank
3 Diskussion der Ergebnisse
69
3.6.10
Vorhersage der Röntgenstruktur des TcAChE/sph1371-Kom-
plexes
Da bekannt war, dass an der Aufklärung eines TcAChE/(–)-Galanthamin-Derivat-Komplexes
gearbeitet wurde, sollte versucht werden, die Struktur des Komplexes vorherzusagen. Bei dem
Galanthamin-Derivat handelt es sich um ein eine Verbindung der bereits untersuchten Klasse
E (Schema 3.6.8).
O
O
OH
N
47
N
Schema 3.6.8: Piperidinopropylgalanthamin (sph1371) (47)
Da im Verlauf der Arbeit eine weitere TcAChE-Struktur mit co-kristallisierten (–)-Galanth-
amin (9) und höherer Auflösung aufgeklärt werden konnte, wurde Verbindung 47 in beide
Enzymstrukturen (1QTI und 1DX6) gedockt. Bei beiden Enzymstrukturen wird die
energetisch beste Lage bei equatorialer Stellung der Alkylkette gefunden. Das Docken mit der
Enzymstruktur 1DX6 führte zu zwei Konformationen mit identischer Energie auf dem ersten
Platz. Somit wurden drei potentielle Hits erhalten. Beim Vergleich mit der inzwischen
aufgeklärten Struktur des TcAChE/sph1371-Komplexes zeigte sich, dass zwei der drei
postulierten Konformationen gut mit der Röntgenstruktur übereinstimmt (Tabelle 3.6.4).
Tabelle 3.6.4: Ergebnisse des Dockens von sph1371 in 1QTI und 1DX6
Name RMSD Pl. 1 E. Pl. 1 Pl. 1. Hit RMSD 1. Hit E. 1. Hit Pl. b. Hit RMSD b. Hit E. b. Hit
1DX6_sph1371_a 1,01 -42,7 2 0,82 -42,3 2 0,82 -42,3
1DX6_sph1371_e 0,52 -45,6 1 0,52 -45,6 1 0,52 -45,6
2,13 -45,6
1QTI_sph1371_a 1,56 -45,7 2 0,79 -45,4 2 0,79 -45,4
1QTI_sph1371_e 0,92 -45,9 1 0,92 -45,9 4 0,51 -45
Die Verbindung 47 wurde anschließend auch noch in die TcAChE-Röntgenstruktur 1371 ge-
dockt, also in das Protein, in dem Piperidinopropylgalanthamin (47) co-kristallisiert vorliegt.
3 Diskussion der Ergebnisse
70
Das Docken mit equatorialen Form der Alkylkette am N-Atom führte wie bei 1DX6 zu zwei
Konformationen mit identischer Energie auf dem ersten Platz (Tabelle 3.6.5). Auch die
RMSD-Abweichungen sind hier nahezu identisch. Allerdings ist beim diesem Docking-Lauf
die axialer Form der Alkylkette am N-Atom insgesamt energetisch günstiger als die equatori-
ale. Mit einer RMSD-Abweichung von 0.85 Å kann auch hier von einer erfolgreichen Repro-
duktion der Röntgenstruktur gesprochen werden.
Tabelle 3.6.5: Ergebnisse des Dockens von sph1371 in 1371
Name RMSD Pl. 1 E. Pl. 1 Pl. 1. Hit RMSD 1. Hit E. 1. Hit Pl. b. Hit RMSD b. Hit E. b. Hit
1371_sph1371_a 0,85 -45,2 1 0,85 -45,2 1 0,85 -45,2
1371_sph1371_e 0,54 -44,4 1 0,54 -44,4 1 0,54 -44,4
2,09 -44,4
In Abbildung 3.6.11 sind die beiden Lagen des sph1371, die beim Docken mit der Enzym-
struktur 1DX6 auf den ersten Platz gesetzt wurden (rot und blau) und die Lage des sph1371
der Röntgenstruktur (grün) dargestellt.
Abbildung 3.6.11: Ergebnisse des Dockens von sph1371 in 1DX6
3 Diskussion der Ergebnisse
71
Wie ersichtlich ist, liegt der Piperidin-Rest bei der Röntgenstruktur nicht wie vermutet im
Schlauch, sondern verbleibt vollständig in der Active-Site des Enzyms. Beim Docken wurden
diese beiden möglichen Lagen als energetisch gleichwertig angesehen.
Das Ergebnis zeigt, wie schon das Crossdocking in Abschnitt 3.6.6, dass die größte Schwie-
rigkeit in der korrekten Vorhersage der Lage einer Verbindungen in „fremden“ Enzymstruktu-
ren besteht. Das QXP in der Lage war, die korrekte Lage bei Verwendung der Enzymstruktur
1DX6 mit einer weiteren Lage zusammen auf den ersten Platz zu setzen, ist daher als Erfolg
zu werten. Im Hinblick auf die Vorhersage der optimalen Alkylkettenlänge bei den unter-
suchten Verbindungsklassen erscheint es sinnvoll, die Untersuchungen auf die Enzymstruktu-
ren 1DX6 und 1371 auszudehnen. Falls in allen drei Enzymstrukturen ähnliche energetisch
günstige Verbindungen gefunden würden, würde das die Sicherheit der Vorhersage erheblich
erhöhen.
4 Zusammenfassung
72
4 Zusammenfassung
In der vorliegenden Arbeit wurden durch Synthesen, biochemische Verfahren und theoreti-
sche Untersuchungen Beiträge zur Weiterentwicklung von Therapeutika gegen die Alzhei-
mer‘sche Demenz (AD) geleistet. Als Leitstruktur für die durchgeführten Untersuchungen
diente das Amaryllidaceen Alkaloid (–)-Galanthamin (9).
(–)-Galanthamin (9) ist ein selektiver Inhibitor des Enzyms Acetylcholinesterase (AChE). Die
AChE ist für die Terminierung der chemischen Reizweiterleitung in cholinergen Synapsen
zuständig. Dies geschieht durch die Spaltung des Neurotransmitters Acetylcholin (ACh).
Durch die reversible Inhibierung der AChE soll die bei der Alzheimer‘schen Demenz (AD)
verringerte cholinerge Aktivität verbessert werden. (–)-Galanthamin (9) ist ferner der einzige
zugelassene AChE-Inhibitor der zusätzlich ein allosterisch potenzierender Ligand (APL) des
nicotinischen Acetylcholinrezeptors (nAChR) ist, wodurch die Wirkung im cholinergen Sys-
tem noch verstärkt wird.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden Photoaffinitätsmarkierungen mit tritiiertem (–)-Galanth-
amin am nAChR durchgeführt um die APL-Bindungsstelle zu lokalisieren. Da tritiummar-
kiertes (–)-Galanthamin kommerziell nicht erhältlich war, wurden drei Synthesewege zur Dar-
stellung von spezifisch tritiummarkiertem (–)-Galanthamin erarbeitet und evaluiert. Am
besten geeignet erwies sich eine Einschrittreaktion, bei der das Tritium durch stereospezifi-
sche Reduktion der Carbonylgruppe des (–)-Galanthamin-Vorläufers (–)-Narwedin mit
tritiiertem L-Selektrid® in das Molekül eingebracht wird. Auf diese Weise konnten 77.8 mg
(0.326 mmol) (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) mit einer spezifischen Aktivität von 23.8 Ci/mmol
(8.81*1011 Bq/mmol) und einer Gesamtaktivität von 6.4 Ci (2.37*1011 Bq) synthetisiert wer-
den. Für die notwendige regelmäßige Analyse des (–)-3-[3H]-Galanthamins (15) und zur prä-
perativen Abtrennung von Zerfallsprodukten wurden HPLC-Protokolle entwickelt.
Für die Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) wurde zu-
nächst eine Optimierung der erforderlichen Bestrahlungszeit durchgeführt. Bei den Photo-
affinitätsmarkierungen konnte ein deutlicher Einbau von Radioaktivität in die
α
-Untereinheit
des nAChR beobachtet werden, während die übrigen Untereinheiten nicht oder nur unwesent-
lich markiert wurden. Durch Verdrängungsexperimente mit unmarkiertem (–)-Galanthamin
(9) wurde gezeigt, dass es sich um eine spezifische Bindung an die
α
-Untereinheit des
nAChR handelt. Die durchgeführte Photoaffinitätsmarkierungen lieferten somit einen Hinweis
4 Zusammenfassung
73
dafür, dass die Bindungsstelle des APL (–)-Galanthamin (9) im Bereich der
α
-Untereinheit
des nAChR der Spezies Torpedo Californica lokalisiert ist.
In Molecular-Modelling Teil der Arbeit wurden auf Basis des bekannten TcAChE/(–)-Ga-
lanthamin-Komplexes neue Liganden entwickelt und evaluiert, die potentielle Wechselwir-
kungen im Bereich der Active-Site und der PAS (engl.: peripheral anionic site) von TcAChE
ausbilden können. Aus diese Weise sollte man zu bisfunktionalen Liganden gelangen können,
die sowohl den ACh-Abbau inhibieren als auch die Aβ-Aggregation hemmen. Als Ansatz-
punkt für die Entwicklung solcher Liganden dienten zwei bereits bekannte AChE-Inhibitoren,
die im Bereich der Active-Site und der PAS an die AChE binden. Bei diesen beiden Verbin-
dungen handelt es sich um Bw284C51 (44) und Decamethonium (45). Beide Verbindungen
zeigten in vitro eine Hemmung der Aβ-Plaque-Bildung.[81, 21] Aufgrund der quatären Stick-
stoff-Gruppen sind sie allerdings nicht für einen Einsatz im ZNS geeignet, da geladene Mole-
küle nicht in der Lage sind, die Blut-Hirn-Schranke zu überwinden. Daher wurden mit Hilfe
von Docking-Methoden neue bisfunktionale Liganden auf der Basis von (–)-Galanthamin (9)
entwickelt.
Zunächst wurde eine Analyse der konformativen Flexibilität aller bekannten TcAChE-Kom-
plexe ohne oder mit nicht kovalent gebundenen Liganden durchgeführt. Hierbei zeigte sich
eine starke Konservierung des Peptidgerüsts. Einzelne Seitenketten oder auch einzelne Atome
von Seitenketten unterschieden sich in ihren Lagen jedoch teilweise erheblich.
Mit dem Programm QXP konnte die Lage des (–)-Galanthamins (9) innerhalb der TcAChE-
Struktur 1QTI korrekt reproduziert werden. Ferner zeigte sich, dass auch (–)-Galanthamin (9)
eine Affinität zur PAS aufweist. Eine durchgeführte Crossdocking-Studie, bei der (–)-
Galanthamin (9) in 14 verschiedene TcAChE-Strukturen gedockt wurde, zeigte, dass QXP in
der Lage ist die Röntgenstruktur auch in einigen „fremden“ TcAChE-Strukturen korrekt zu
ermitteln. Bei diesen Untersuchungen wurden allerdings auch die Grenzen des Dockens mit
starren Enzymstrukturen aufgezeigt.
Mit dem so erarbeiteten Docking-Verfahren wurde ein neuer bisfunktionaler Ligand auf der
Grundlage von (–)-Galanthamin (9) und dem bekannten PAS-Liganden Gallamin (46) entwi-
ckelt und optimiert.
Aufgrung der gefundenen Affinität von (–)-Galanthamin (9) zur PAS wurden verschiedenen
Alkylbisgalanthamine (B) auf eine mögliche bisfunktionale Wirkung hin untersucht und eine
für die gewünschte Wechselwirkung optimale Struktur postuliert. Das so erarbeitete Verfah-
ren wurde auf drei weitere Verbindungsklassen angewendet. Die bei einer der Verbindungs-
4 Zusammenfassung
74
klassen vorhandenen Aktivitätsdaten zur AChE-Inhibierung zeigten eine Korrelation mit den
beim Docken erhaltenen Affinitätswerten. Dies bestätigt, dass mit Hilfe der verwendeten
Methode sinnvolle Ergebnissen erzielt werden können.
Mit dem Programm FlexX wurde die CSD-Datenbank nach neuen Leitstrukturen für kombi-
nierte Active-Site/PAS-Inhibitoren durchsucht. Die gefundenen Strukturen können als Ansatz
für die Entwicklung weiterer bisfunktionaler Liganden dienen.
Die Güte der Ergebnisse zeigt sich auch durch die erfolgreiche Vorhersage der Lage eines
Galanthamin-Derivats, dessen Röntgenstruktur im Verlauf der Arbeit aufgeklärt werden
konnte. Die korrekte Lage des Galanthamin-Derivats stimmte mit zwei von drei gemachten
Vorschlägen sehr gut überein.
Für zwei Verbindungen, die im Molecular Modelling Teil der Arbeit evaluiert wurden, konn-
ten beispielhafte Synthesen entwickelt werden. Diese Synthesen eröffnen den Zugang zu
weiteren Verbindungen der entsprechenden Klassen. Bei den synthetisierten Verbindungen
handelt es sich um Propylbisgalanthamin (32) und Propylgallamingalanthamin (33). Propyl-
bisgalanthamin (32) konnte in einer zweistufigen Synthese ausgehend von (–)-Galanthamin-
Hydrobromid (19) und 2,3-Dibrompropan dargestellt werden.
Propylgallamingalanthamin (33) wurde ausgehen von den kommerziell erhältlichen Verbin-
dungen Pyrogallol (37) und (–)-Galanthamin-Hydrobromid (19) in einer achtstufigen
Synthese dargestellt. Da die Alkylkette erst im zweitletzten Schritt in das Molekül eingeführt
wird, ist dieser Syntheseweg auch im Hinblick auf die Darstellung weiterer Alkylgallamin-
galanthamine geeignet.
5 Ausblick
75
5 Ausblick
Bei den Photoaffinitätsmarkierungen muss als nächstes eine Validierung der erhaltenen Er-
gebnisse durch weitere Verdrängungsexperimente erfolgen. Anschließend könnten durch
weitergehende Untersuchungen einzelne Aminosäuren der
α
-Untereinheit identifiziert wer-
den, an denen die Radioaktivität gebunden wurde, um so die Bindungsstelle des (–)-Ga-
lanthamins (9) so weit wie möglich einzugrenzen.
Die beim Molecular-Modelling untersuchten Verbindungsklassen sollten in weitere Enzym-
strukturen gedockt werden, um die Sicherheit der gemachten Voraussagen zu erhöhen. All-
gemein muss versucht werden, eine Lösung für das Problem der starren Enzymstruktur zu
finden. Ein Ansatz könnte die Kombination von Dockingverfahren mit starrer Enzymstruktur
und der Verwendung von Molecular-Dynamics-Verfahren sein, da hier sowohl eine Flexibi-
lität des Enzyms als auch der Einfluss von Wasser berücksichtigt werden kann.
Mit Hilfe der beispielhaft erarbeiteten Synthesen können die aus den Dockingstudien resultie-
renden Alkylbisgalanthaminen und Alkylgallamingalanthaminen dargestellt und in biologi-
schen Assays auf ihre postulierten Wirkungen hin getestet werden. So könnten ferner die mit
Hilfe von Dockingstudien gemachten Vorraussagen validiert werden.
6 Experimenteller Teil
76
6 Experimenteller Teil
6.1 Synthesen
6.1.1 Analytische Methoden
LSC: Packard Tri-Carb 4530
Drehwerte: Perkin Elmer 241 Polarimeter (Küvetten 10 mm, Wellenlänge 589 nm)
IR-Spektoskopie: FT-IR Spektrometer NICOLET 510 P
Elementaranalyse: Perkin-Elmer Elementar-Analysator 240
NMR-Spektroskopie: Bruker ARX 200 (200/50 MHz)
Massenspektrometer: Finnegan MAT 8200, Fiso MD 800
DC:Kieselgelfolien (Kieselgel 60 F254, Merck, Art.No 1.05554)
Färbemethoden: UV-Licht (λ = 254 nm)
Cer(IV)molybdatophosphorsäure-Reagenz: Cer(IV)sulfat (10 g) Moly-
bdatophosphorsäure (25 g), konz. H2SO4 (60 mL), H2O (940 mL)
6.1.2 Lösungsmittel und Chemikalien
Alle Lösungsmittel wurden vor Gebrauch frisch destilliert.
Die Trocknung der verwendeten Lösungsmittel erfolgte nach gängigen Methoden.[94]
Kieselgel für die Säulenchromatographie: Kieselgel 60, 0.040 - 0.063nm (Merck)
Die verwendeten Chemikalien wurden aus dem Fachhandel bezogen (Fluka, Sigma-Aldrich,
Acros, W. H. Biesterfeld)
(–)-Galanthamin-Hydrobromid wurde uns freundlicherweise von der Sanochemia Pharma-
zeutika AG (Wien) zur Verfügung gestellt.
Für die Aufnahme des Massenspektrums von (–)-3-[3H]-Galanthamin bedanke ich mich bei
Dr. U. Pleiss, Bayer AG (Wuppertal).
Für die Durchführung der Massenspektrometrie danke ich Herrn E. Jonk, für die Durchfüh-
rung der Elementaranalysen bedanke ich mich bei Frau K. Stolte.
6 Experimenteller Teil
77
6.1.3 Versuchsvorschriften
[4aS,6R,8aS)-1-Brom-3-methoxy-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-11-methyl-6H-benzofuro-
[3a,3,2-ef][2]benzazepin-6-ol ((–)-8-Bromgalanthamin) (12)
O
O
OH
N
Br
Zu einer Lösung von (–)-Galanthamin Hydrobromid (19) (4 g, 10.8 mmol) in Ameisensäure
(40 mL) wird H2O2-Lösung (40 mL, 35%, v/v) zugegeben. Die Mischung wird unter rühren
für 20 min auf 100 °C erhitzt. Der Reaktionskolben wird in einem Eisbad auf RT abgekühlt
und der pH-Wert mit konz. NH3-Lösung (25%, v/v) auf pH 10 eingestellt. Die Lösung wird
mit EtOAc (3 x 50 mL) ausgeschüttelt, die vereinigten organische Phasen mit ges. NaCl-Lö-
sung gewaschen (50 mL), über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel abrotiert. Der gelb-
liche, feste Rückstand wird chromatographisch gereinigt (Kieselgel 150 g, LM: CHCl3 92%,
MeOH 8%). Das gewünschte (–)-8-Bromgalanthamin (12) (2.22 g, 6.08 mmol = 56.3% der
Theorie, Lit.[53]: 64%) wird als weißer Schaum erhalten.
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.62 (d, 1H, H-9, J = 13.9 Hz), 1.97 – 2.15 (m, 2H,
H-9, H-5), 2.45 (s, 3H, NCH3), 2.67 (d, 1H, H-5’, J = 15.9 Hz), 2.98 (d, 1H, H-10, J =
14.2 Hz), 3.23 (d, 1H, H-10’, J = 13.8 Hz), 3.84 (s, 3H, OCH3), 3.96 (d, 1H, H-12, J =
15.7 Hz), 4.16 (s, 1H, H-6), 4.32 (d, 1H, H-12’, J = 15.7 Hz), 4.63 (s, 1H, H-4a), 5.99 – 6.13
(m, 2H, H-8, H-7), 6.93 (s, 1H, H-1).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz) δ [ppm] = 30.21 (t, C-5), 34.03 (t, C-9), 42.52 (q, NCH3), 49.17
(s, C-8a), 53.88 (t, C-10), 56.55 (q, OCH3), 62.28 (t, C-12), 89.23 (d, C-4a), 114.94 (d, C-1),
116.19 (d, C-8), 126.68 (t, C-2), 127.89 (s, C-12a), 128.54 (t, C-7), 134.55 (s, C-12b), 144.66
(s, C-3a), 145.88 (s, C-3).–
6 Experimenteller Teil
78
[4aS,6R,8aS)-1-Brom-3-methoxy-5,6,9,10,11,12-hexahydro-4aH-[1]-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-ol ((–)-8-Brom-11-demethylgalanthamin) (18)
O
O
OH
N
HBr
Zu einer Lösung von (–)-8-Bromgalanthamin (12) (1.83 g, 5.0 mmol) in CH2Cl2 (50 mL) wird
eine Lösung von m-CPBA (70%, 1.23 g, 5.0 mmol) in CH2Cl2 (20 mL) gegeben und die Mi-
schung für 40 min bei RT gerührt. Eine Lösung von FeSO4 (0.8 g, 2.5 mmol) in MeOH
(20 mL) wird zugegeben und die Mischung 17 min bei RT gerührt. Es wird HCl-Lösung
(2 mol/L, 25 mL) zugegeben und die organischen Lösungsmittel abrotiert. Die wässrige Phase
wird mit Et2O (3 x 25 mL) ausgeschüttelt und die etherischen Phasen verworfen. Mit konz.
NH3-Lösung (25%) wird die wässrige Phase auf pH 10 gebracht und mit CH2Cl2 (3 x 25 mL)
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit ges. NaCl-Lösung (40 mL)
gewaschen, über MgSO4 getrocknet und das Lösungsmittel wird entfernt. Das erwünschte
Produkt wird in einer Mischung von (–)-8-Bromgalanthamin (12) (13%) and (–)-8-Bromo-11-
demethylgalanthamin (18) (87%) (% Angaben aus GC Messung) als leicht gelblicher Schaum
(1.50 g) erhalten. Die Mischung wird ohne weitere Reinigung in der folgenden Reaktion ein-
gesetzt.
Tert-butyl-(4aS,6R,8aS)-1-brom-6-hydroxy-3-methoxy-5,6,9,10-tetrahydro-4aH-[1] ben-
zofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepine-11(12H)-carboxylat ((–)-8-Brom-11-carbonsäure-tert-
butylestergalanthamin) (20)
O
O
OH
N
BOCBr
Zu einer Lösung von (–)-8-Bromgalanthamin (12) (13%, 0.243 g, 0.664 mmol) und (–)-8-
Brom-11-demethylgalanthamin (18) (87%, 1.627 g, 4.62 mmol) (% Angaben aus GC
6 Experimenteller Teil
79
Messung) in abs. THF (25 mL) wird abs. Et3N (0.794 g, 7.85 mmol) gegeben und die Lösung
auf 0 °C abgekühlt. Innerhalb von 30 min wird eine Lösung von (BOC)2O (1.210 g,
5.54 mmol) in abs. THF (10 mL) zugetropft. Nach weiteren 10 min wird die Kühlung entfernt
und die Mischung wird für 48 h bei RT gerührt. Das Lösungsmittel wird entfernt und der
zurückbleibende Feststoff in EtOAc (50 mL) gelöst. Die organische Phase wird mit HCl
(1 mol/L, 15 mL), mit ges. NaHCO3 Lösung (3 x 20 mL), mit ges. NaCl-Lösung (20 mL)
gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und der
zurückbleibende Feststoff chromatographisch gereinigt (Kieselgel, 90.0 g, LM: CHCl3 92%,
MeOH 8%). Das gewünschte (–)-8-Brom-11-carbonsäure-tert-butylestergalanthamin (20)
(1.119 g, 2.474 mmol, 53.5% der Theorie) wird als leicht gelblicher Schaum erhalten.
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz) δ [ppm] = 1.28 – 1.55 (m, 9 H, t-butyl), 1.73 – 1.82 (m, 1 H, 9-
H), 1.99 (s, 1 H, 5-H), 2.02 – 2.09 (m, 1 H, 9-H’), 2.35 (dd, 1 H, 5-H’, J = 18.6 Hz, J =
18.9 Hz), 2.70 (dd, 1 H, 10-H, J = 13.7 Hz, J = 13.8 Hz), 3.30 (dd, 1 H, 10-H’, J = 11.5 Hz, J
= 11.9 Hz) 3.86 (s, 3 H, OCH3), 3.95-4.30 (m, 3 H, 6-H, 12-H, 12-H’), 4.63 – 4.75 (m, 1 H,
4a-H), 5.92 – 6.25 (m, 2 H, 7-H, 8-H), 6.93 (s, 1 H, 2-H).-
Tert-butyl-(1aS,3R,4bR)-9-brom-3-hydroxy-11-methoxy-2,3,3a,4a,5,6-hexahydro-1aH-
oxireno[2',3':4,5][1]benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepine-7(8H)-carboxylat ((–)-1,2-Epoxi-
8-brom-11-carbonsäure-tert-butylestergalanthamin) (10)
O
O
OH
N
BOCBr
O
Zu einer Lösung von (–)-8-Brom-11-carbonsäure-tert-butylestergalanthamin (20) (0.586 g,
1.57 mmol) in CHCl3 (50 mL) wird m-CPBA (70%, 1.533 g, 5,5 mmol) gegeben. Die Mi-
schung wird 5 h unter Rückfluss gerührt. Die organische Phase wird mit ges. NaHCO3 Lö-
sung (3 x 50 mL) und mit ges. Kochsalzlösung (25 mL) gewaschen und das Lösungsmittel
entfernt. NMR Analyse des Rohproduktes zeigte, das nicht das gewünschte Produkt entstan-
den war.
6 Experimenteller Teil
80
[4aS,6R,8aS)-3-Methoxy-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-ol ((–)-[1H]-Galanthamin) (9)
O
O
OH
N
H
H
Methode A:
LiAlH4 (0.030 g, 0.76 mmol) wird in abs. THF (15 mL) suspendiert. Bei 0 °C wird (–)-8-
Bromgalanthamin (12) (0.070 g, 0.19 mmol) gelöst in abs. THF (5 mL) langsam zugegeben.
Nach 20 h wurde ein vollständiger Umsatz erreicht (GC). Nach Zugabe von H2O (1 mL) wird
das Lösungsmittel entfernt und der verbleibende Rückstand chromatographisch gereinigt
(Kieselgel 15 g, LM: CHCl3 96%, MeOH 4%). Das erwünschte (–)-[1H]-Galanthamin (9)
(0.522 g, 0.15 mmol, 79% der Theorie, Lit.[53]: 49%) wird als weißer Schaum erhalten.
Methode B:
Eine Lösung von n-Butyllithium (1.4 mol/L in Hexan, 0.63 mL, 0.884 mmol) und N,N,N’N’-
Tetramethylethylendiamin (0.16 mL, 1.061 mmol) wird in einer Wasserstoff-Atmosphäre
(1013 mbar) für 2 h bei RT gerührt, wobei sich eine ein weiße Suspension bildet. Der Wasser-
stoff wird durch Argon ersetzt und tri-sec.-Butylboran Lösung (1.0 M in THF, 0,89 mL,
0.884 mmol) zugegeben. Bei –30 °C wird zu der klaren Lösung langsam eine Suspension von
(–)-Narwedin (14) (0.126 g, 0.442 mmol) in THF (0.5 mL) gegeben. Die Reaktion wird 0.5 h
bei –20 °C und 0.5 h bei RT gerührt. Überschüssiges Reduktionsreagenz wird bei 0 °C durch
Zugabe von MeOH zerstört. Das Lösungsmittel wird entfernt, der verbleibende Feststoff in
EtOH (4 mL) gelöst, mit HBr-Lösung (48%, w/v) auf pH 1 gebracht und für 8 h bei 0 °C
gelagert. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert, mit EtOH (1 mL) gewaschen und im Va-
kuum getrocknet. Der verbleibende Feststoff wird in H2O (4 mL) gelöst, mit NH3-Lösung
(25%, v/v) auf pH 10 gebracht und mit EtOAc (4 x 2.5 mL) extrahiert. Die vereinigten orga-
nischen Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung (2 mL) gewaschen und über MgSO4 getrock-
net. Das Lösungsmittel wird entfernt und der verbleibende Feststoff im Vakuum getrocknet.
Das erwünschte (–)-[1H]-Galanthamin (9) (0.103 g, 0.358 mmol, 81.1% der Theorie) wird als
weißer Schaum erhalten.
6 Experimenteller Teil
81
M.p.: 128 °C (Lit.[56]: 128-129 °C)
[]
α
D
20 = -95.9 (c=1.5 ; CHCl3) (Lit.[53]:
[]
α
D
20 = -93.4 (c=1.0 ; CHCl3))
Rf = 0.46 (THF 93% : EtOH 4% : Et3N 3%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.56 – 1.64 (m, 1 H, 9-H), 1.97 – 2.18 (m, 2 H, 5-H,
9-H’), 2.42 (s, 3 H, NCH3), 2.66 – 2.75 (m, 1 H, 5-H’), 2.97 – 3.11 (m, 1 H, 10-H), 3.23 –
3.40 (m, 1 H, 10-H’), 3.70 (d, 1 H, 12-H, J = 15.2 Hz), 3.85 (s, 3 H, OCH3), 4.08 – 4.18 (m, 2
H, 6-H, 12-H’), 4.63 (s, 1 H, 4a-H), 5.97 – 6.11 (m, 2 H, 7-H, 8-H), 6.62 – 6.71 (m, 2 H, 1-H,
2-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 30.37 (t, C-5), 34.21 (t, C-9), 42.52 (q, NCH3), 48.63
(s, C-8a), 54.25 (t, C-10), 56.30 (q, OCH3), 61.03 (t, C-12), 62.48 (d, C-6), 89.13 (d, C-4a),
111.55 (d, C-2), 122.48 (d, C-1), 127.27 (d, C-8), 128.04 (d, C-7), 129.69 (s, C-12a), 133.43
(s, C-12b), 144.51(s, C-3a), 146.21 (s, C-3).–
[4aS,6R,8aS)-1-D-3-methoxy-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-ol ((–)-8-[2H]-Galanthamin) (21)
O
O
OH
N
D
H
LiAlD4 (0.030 g, 0.76 mmol) wird in abs. THF (15 mL) suspendiert. Bei 0 °C wird (–)-8-
Bromgalanthamin (12) (0.07 g, 0.19 mmol) gelöst in abs. THF (5 mL) langsam zugegeben.
Nach 52 h wurde ein vollständiger Umsatz erreicht (GC). Nach Zugabe von D2O (1 mL) wird
das Lösungsmittel entfernt und der verbleibende Rückstand chromatographisch gereinigt
(Kieselgel 15 g, LM: CHCl3 96%, MeOH 4%). Das gewünschte (–)-8-[2H]-Galanthamin (21)
(0.407 g, 0.141 mmol, 74% der Theorie) wird als weißer Schaum erhalten.
Deuterierungsgrad >85% (NMR)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.55 – 1.80 (m, 1 H, 9-H), 1.96 – 2.17 (m, 2 H, 5-H,
9-H’), 2.34 (s, 3 H, NCH3), 2.64 – 2.74 (m, 1 H, 5-H’), 3.06 (d, 1 H, 10-H, J = 14.4 Hz), 3.28
(t, 1 H, 10-H’, J = 12.8 Hz), 3.60 – 3.80 (m, 1 H, 12-H), 3.84 (s, 3 H, OCH3), 4.06 – 4.14 (m,
6 Experimenteller Teil
82
2 H, 6-H, 12-H’), 4.62 (s, 1 H, 4a-H), 5.96 – 6.10 (m, 2 H, 7-H, 8-H), 6.61 – 6.73 (m, 1.48 H,
1-H, 2-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 30.37 (t, C-5), 34.16 (t, C-9), 42.46 (q, NCH3), 48.59
(s, C-8a), 54.22 (t, C-10), 56.30 (q, OCH3), 60.92 (t, C-12), 62.45 (d, C-6), 89.10 (d, C-4a),
111.57 (d, C-2), 122.51 (d, C-1), 127.23 (d, C-8), 128.03 (d, C-7), 129.44 (s, C-12a), 133.42
(s, C-12b), 144.51 (s, C-3a), 146.20 (s, C-3).–
[4aS,6R,8aS)-3-Methoxy-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-d-6-ol ((–)-3-[2H]-Galanthamin) (29)
O
O
OH
N
D
Eine Lösung von n-Butyllithium (1.4 mol/L in Hexan, 0.63 mL, 0.884 mmol) und N,N,N’N’-
Tetramethylethylendiamin (0.16 mL, 1.061 mmol) wird in einer Deuterium-Atmosphäre
(1013 mbar) für 2 h bei RT gerührt, wobei sich eine ein weiße Suspension bildet. Das Deute-
rium wird durch Argon ersetzt und tri-sec.-Butylboran Lösung (1.0 M in THF, 0.89 mL,
0.884 mmol) zugegeben. Bei –30 °C wird zu der klaren Lösung langsam eine Suspension von
(–)-Narwedin (14) (0.126 g, 0.442 mmol) in THF (0.5 mL) gegeben. Die Reaktion wird 0.5 h
bei –20 °C und 0.5 h bei RT gerührt. Überschüssiges Reduktionsreagenz wird bei 0 °C durch
Zugabe von MeOH zerstört. Das Lösungsmittel wird entfernt, der verbleibende Feststoff in
EtOH (4 mL) gelöst, mit HBr Lösung (48%, w/v) auf pH 1 gebracht und für 8 h bei 0 °C
gelagert. Der ausgefallene Feststoff wird abfiltriert, mit EtOH (1 mL) gewaschen und im Va-
kuum getrocknet. Der verbleibende Feststoff wird in H2O (4 mL) gelöst, mit NH3-Lösung
(25%, v/v) auf pH 10 gebracht und 4 mal mit EtOAc (2.5 mL) extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden 1 mal mit ges. NaCl-Lösung (2 mL) gewaschen und über MgSO4
getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und der verbleibende Feststoff im Vakuum ge-
trocknet. Das gewünschte (–)-3-[2H]-Galanthamin (29) (0.108 g, 0.375 mmol, 85% der Theo-
rie) wird als weißer Schaum erhalten.
Deuterierungsgrad: >85% (NMR)
6 Experimenteller Teil
83
Smp.: 128 °C (Lit.[56] ((–)-[1H]-Galanthamin (9)): 128-129 °C)
Rf = 0.46 (LM: THF 93%, EtOH 4%, Et3N 3%)
[]
α
D
20 = -96.3 (c=1.5 ; CHCl3) (Lit.[53] ((–)-[1H]-Galanthamin (9)):
[]
α
D
20 = -93.4 (c=1.0,
CHCl3))
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.49 – 1.76 (m, 1 H, 9-H), 1.94 – 2.07 (m, 2 H, 5-H,
9-H’), 2.39 (s, 3 H, NCH3), 2.62 – 2.76 (m, 1 H, 5-H’), 3.01 – 3.09 (m, 1 H, 10-H), 3.25 (t, 1
H, 10-H’, J = 12.9 Hz), 3.60 – 3.82 (m, 1 H, 12-H), 3.81 (s, 3 H, OCH3), 4.06 – 4.16 (m, 1 H,
12-H’), 4.59 (s, 1 H, 4a-H), 5.89 – 6.12 (m, 2 H, 7-H, 8-H), 6.58 – 6.68 (m, 2 H, 1-H, 2-H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 30.28 (t, C-5), 34.20 (t, C-9), 42.48 (q, NCH3), 48.59
(s, C-8a), 54.43 (t, C-10), 56.26 (q, OCH3), 60.99 (t, C-12), 61.99 (D-Triolett, C-6), 89.06 (d,
C-4a), 111.50 (d, C-2), 122.43 (d, C-1), 127.31 (d, C-8), 127.94 (d, C-7), 129.71 (s, C-12a),
133.41 (s, C-12b), 144.52 (s, C-3a), 146.20 (s, C-3).–
C17H20DNO3 [288.36] ber.: C 70.81 H 7.06 N 4.86
gef.: C 70.30 H 7.46 N 4.86
[4aS,6R,8aS)-3-Methoxy-4a,5,9,10,11,12-hexahydro-11-methyl-6H-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-t-6-ol ((–)-3-[3H]-Galanthamin) (15)
O
O
OH
N
T
Das Reaktionsgefäß wird evakuiert und mit Tritiumgas gefüllt. Eine Lösung von n-Butylli-
thium (1.6 mol/L in Hexan, 0.63 mL, 1.0 mmol) und N,N,N’N’-Tetramethylethylendiamin
(0.16 mL, 1.061 mmol) wird zugegeben und solange gerührt bis der Druck für 30 min kon-
stant bleibt, wobei sich eine ein weiße Suspension bildet. Die Mischung wird entgast und ly-
ophilisiert. Das Reaktionsgefäß wird bis zu einem Druck von 784 mbar mit Stickstoff gefüllt
und tri-sec.-Butylboran Lösung (1.0 M (THF), 0.89 mL, 0.884 mmol) zugegeben, wobei sich
der gebildete Niederschlag auflöst. Bei –30 °C wird langsam eine Suspension von (–)-Narwe-
din (14) (0.126 g, 0.442 mmol) in THF (1.0 mL) zugegeben. Die Reaktion wird 0.5 h bei –
20 °C und 1 h bei RT gerührt. Überschüssiges Reduktionsreagenz wird bei 0 °C durch Zugabe
6 Experimenteller Teil
84
von MeOH zerstört. Die Lösung wird entgast und das Lösungsmittel durch Lyophilisation
entfernt. Der erhaltene Feststoff wird zur Entfernung von nicht gebundenem Tritium zweimal
in MeOH aufgelöst und lyophilisiert. Der verbleibende Feststoff in EtOH (4 mL) gelöst, mit
HBr Lösung (48%, w/v) auf pH 1 gebracht und für 8 h bei 0 °C gelagert. Der ausgefallene
Feststoff wird abfiltriert, mit EtOH (1 mL) gewaschen, im Vakuum getrocknet, in Wasser
(4 mL) gelöst, mit NH3-Lösung (25%, v/v) auf pH 10 gebracht und mit EtOAc (4 x 2.5 mL)
extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung (2 mL) gewa-
schen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und der verbleibende
Feststoff im Vakuum getrocknet. Das gewünschte (–)-3-[3H]-Galanthamin (15)[58] (77.8 mg,
0.269 mmol, 60.8% der Theorie) wird als weißer Schaum erhalten.
Spezifische Aktivität (MS): 23.8 Ci/mmol (0.881 TBq/mmol)
Gesamtaktivität (LSC): 6.4 Ci (0.237 TBq).
Rf = 0.46 (LM: THF 93%, EtOH 4%, Et3N 3%)
Radiochromatogrammscanner: 97% der Radioaktivität bei Rf = 0.46
[4aS,6R,8aS)-3-Methoxy-5,6,9,10,11,12-hexahydro-4aH-[1]-benzofuro[3a,3,2-
ef][2]benzazepin-6-ol ((–)-11-Demethylgalanthamin) (30)
O
O
OH
N
H
Zu einer Lösung von (–)-Galanthamin (9) (2.5g, 8.7 mmol) in CH2Cl2 (25 mL) wird eine
Lösung von m-CPBA (70%, 2.1 g, 8.7 mmol) in CH2Cl2 (25 mL) gegeben und die Mischung
für 40 min bei RT gerührt. Eine Lösung von FeSO4•7 H2O (1.21 g, 4.35 mmol) in MeOH
(12 mL) wird zugegeben und die Mischung 17 min bei RT gerührt. Es wird HCl-Lösung
(2 mol/L, 25 mL) zugegeben und die organischen Lösungsmittel abrotiert. Die wässrige Phase
wird mit Diethylether (3 x 15 mL) ausgeschüttelt und die etherischen Phasen verworfen. Mit
konz. NH3-Lösung (25%) wird die wässrige Phase auf pH 10 gebracht und mit CH2Cl2 (3 x
15 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden einmal mit ges. NaCl-Lösung
(25 mL) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und der
6 Experimenteller Teil
85
Rückstand säulenchromatographisch geeinigt (Kieselgel 150 g, LM: PE 70%, CH2Cl2
19.25%, MeOH 10%, Et3N 0.75%). Das gewünschte (–)-11-Demethylgalanthamin (30)
(1.85 g, 6.79 mmol, 78% der Theorie, Lit.[95]: 76%) wird als weißer Schaum erhalten.
Rf = 0.14 (LM: PE 70%, CH2Cl2 19.25%, MeOH 10%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.92 - 2.06 (m, 2 H), 2.21 – 2.39 (m, 1 H), 2.76 (d, 1
H, J = 15.8 Hz), 3.38 (t, 1 H, J = 13.1 Hz), 3.68 – 3.80 (m, 2 H), 3.89 (s, 3 H), 4.09 - 4.38 (m,
4 H), 4.71 (s, 1 H), 5.92 - 6.16 (m, 2 H), 6.68 – 6.82 (m, 2 H).–
13C-NMR (DMSO, 50 MHz): δ [ppm] = 31.64 (CH2), 35.17 (C), 45.34 (CH2), 48.12 (CH2),
50.33 (CH2), 56.51 (CH3), 60.36 (CH), 87.25 (CH), 112.62 (CH(arom.)), 122.48 (CH(arom.)),
127.27 (CH), 128.04 (CH), 129.69 (CHarom.), 133.34 (CHarom.), 144.51 (CH(arom.)), 146.21
(CHarom.).–
C16H19NO3 [273.33] ber.: C 70.31 H 7.01 N 5.12
gef.: C 69.12 H 7.14 N 5.23
(4aS,6R,8aS)-11-{3-[(4aS,6R,8aS)-6-hydroxy-3-methoxy-5,6,9,10-tetrahydro-4aH-
[1]benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-11(12H)-yl]propyl}-3-methoxy-5,6,9,10,11,12-he-
xahydro-4aH-[1]benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-6-ol (Propylbisgalanthamin) (32)
O
O
OH
N
O
O
HO
N
(–)-11-Demetylgalanthamin (30) (0.5 g, 1.83 mmol) und abs. Triethylamin (1.388 g,
13.725 mmol, 1.91 mL) werden in abs. CH3CN (10 mL) gelöst und unter Rückfluss auf Sie-
detemperatur erhitzt. 1,3-Dibrompropan (0.185 g, 0.913 mmol, 0.09 mL) in abs. CH3CN
(10 mL) wird langsam zugetropft und die Lösung 24 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungs-
mittel wird entfernt und der verbleibende Rückstand über Kieselgel (15 g, LM: CH2Cl2
96.75%, MeOH 2.5%, Et3N 0.75%) filtriert. Der gelbe Rückstand wird aus EtOH umkristalli-
siert. Das gewünschte Propylbisgalanthamin (0.297 g, 0.511 mmol, 55.9% der Theorie) wird
als weißer Feststoff erhalten.
6 Experimenteller Teil
86
Rf = 0.36 (LM: CH2Cl2 96.75%, MeOH 2.5%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.74 – 1.82 (m, 2 H), 1.99 – 2.17 (m, 6H), 2.71 (d, 2
H, J = 15.8 Hz), 2.93 (t, 4 H, J = 7.0 Hz), 3.41 – 3.67 (m, 4 H), 3.86 (s, 6 H), 4.08 – 4.19 (m,
4 H), 4.38 (d, 2 H, J = 15.4 Hz), 4.62 (s, 1 H), 5.95 – 6.12 (m, 4 H), 6.70 – 6.83 (m, 4 H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 21.58 (CH2), 30.17 (2xCH2), 31.73 (C), 48.09 (CH2),
48.86 (2xCH2), 52.05 (2xCH2), 56.42 (2xCH3), 62.05 (2xCH), 88.91 (2xCH), 112.23 (2x
CH(arom.)), 122.37 (2x CH(arom.)), 123.84 (2xCH), 125.62 (2xCH), 129.49 (2x CH(arom.)), 133.19
(2x CH(arom.)), 144.89 (2x CH(arom.)), 146.64 (2x CH(arom.)).–
C35H42N2O6 [586.72] ber.: C 71.65 H 7.22 N 4.77
gef.: C 70.01 H 6.89 N 4.02
2-Ethoxybenzo[1,3]dioxol-4-ol (38)
OH
O
O
O
Pyrogallol (37) (50 g, 0.395 mol), Orthoameisensäuretriethylester (79 g, 0.533 mol) und
Ionenaustauscherharz (Amberlyst IR 120) werden in Benzol (900 mL) suspendiert. Über
einen Zeitraum von 15 h wird das entstehende EtOH azeotrop abdestilliert, wobei die Lö-
sungsmittelmenge durch Zugabe von Benzol konstant gehalten wird. Nach dem Abkühlen
wird die Lösung durch Celite filtriert. Das Lösungsmittel wird entfernt und der rote, zähflüs-
sige Rückstand im Vakuum destilliert. Das gewünschte 4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]-
dioxol (38) (34.52 g, 0.190 mol, 48.1% der Theorie, Lit.[74]: 70%) wird als farblose viskose
Flüssigkeit erhalten.
Sdp.: 100 °C (0.28 mbar)
Rf = 0.47 (LM: CHCl3 95%, MeOH 5%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.29 (t, 3 H, J = 7.1 Hz), 3.78 (q, 2 H, J = 7.1 Hz),
5.93 (s, 1 H, OH), 6.53 – 6.58 (m, 2 H), 6.74 – 6.83 (m, 1 H), 6.92 (s, 1 H).–
6 Experimenteller Teil
87
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 15.20 (CH3), 60.05 (CH2), 101.95 (CH(arom.)), 111.44
(CH(arom.)), 119.49 (CH), 122.54 (CH(arom.)), 133.24 (C(arom.)), 139.29 (C(arom.)), 147.46
(C(arom.)).–
4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]dioxol (36)
OBn
O
O
O
4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]dioxol (38) (32.985 g, 181.18 mmol), Benzylbromid
(31.989 g, 181.18 mmol), K2CO3 (30.047 g, 217.42 mmol) und tert-Butylammoniumiodid
(1.338 g, 3.62 mmol) werden in abs. Aceton (250 mL) gelöst und 24 h unter Rückfluss erhitzt.
Das Lösungsmittel wird entfernt und das zurückbleibende braune Öl chromatographisch ge-
reinigt (Kieselgel 75 g, LM: CHCl3). Das gewünschte 4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]dioxol
(36) (45.423 g, 0.167 mol, 92% der Theorie) wird als gelbes Öl erhalten.
Rf = 0.87 (LM: CHCl3)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.33 (t, 3 H, J = 7.1 Hz), 3.79 (q, 2 H, J = 7.1 Hz),
5.27 (s, 2 H), 6.56 – 6.93 (m, 2 H), 6.80 – 6.89 (m, 1 H), 6.96 (s, 1 H), 7.35 – 7.55 (m, 5 H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 15.38 (CH3), 59.73 (CH2), 71.96 (CH2(Bn)), 102.68
(CH(arom.)), 110.33 (2xCH(arom.)), 119.66 (CH(arom.)), 122.41 (CH), 128.07 (2xCH(Bn)), 128.54
(CH(Bn)), 129.05 (2xCH(Bn)), 134.97 (C(arom.)), 137.50 (C(Bn)) 142.93 (C(arom.)), 148.00
(C(arom.)).–
3-Benzyloxybenzol-1,2-diol (39)
OBn
OH
OH
4-Benzyloxy-2-ethoxybenzo[1,3]dioxol (36) (20 g, 73.45 mmol) und p-Toluolsulfonsäure-
Monohydrat (0.9 g, 4.73 mmol) werden in einer Mischung aus MeOH (75 mL) und H2O
(4 mL) gelöst. Die Mischung wird 8 h bei RT gerührt, die Lösung mit NaHCO3 neutralisiert
6 Experimenteller Teil
88
und das Lösungsmittel entfernt. Der zurückbleibende Feststoff wird chromatographisch gerei-
nigt (Kieselgel 65 g, LM: PE 90%, EE 10%). Das gewünschte 3-Benzyloxybenzol-1,2-diol
(39) (15.63 g, 72.27 mmol, 98.39% der Theorie) wird als hell gelber Feststoff erhalten.
Rf = 0.10 (LM: PE 90%, EE 10%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 5.14 (s, 2 H), 6.60 – 6.97 (m, 3 H), 7.41 – 7.47 (m, 5
H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 71.81 (CH2(Bn)), 105.28 (CH(arom.)), 109.75 (CH(arom.)),
120.36 (CH(arom.)), 128.37 (2xCH(Bn)), 128.88 (CH(Bn)), 129.22 (2xCH(Bn)), 133.37 (C(arom.)),
136.93 (C(Bn)), 144.75 (C(arom.)), 146.87 (C(arom.)).–
2-Benzyloxy-6-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (40)
OBn
O
OH
N
3-Benzyloxybenzol-1,2-diol (39) (1.000 g, 4.63 mmol), 2-Diethylaminoethylchlorid (1.383 g,
10.2 mmol), K2CO3 (4.300 g, 31.11 mmol) und KI (2.300 g, 13.89 mmol) werden in abs.
Aceton (50 mL) gelöst und 24 h unter Rückfluss erhitzt. Die Lösung wird filtriert und das
Lösungsmittel entfernt. Der zurückbleibende Rückstand wird chromatographisch gereinigt
(Kieselgel 50 g, LM: PE 99.25%, Et3N 0.75% → EE 99.25%, Et3N 0.75%). Das gewünschte
2-Benzyloxy-6-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (40) (0.236 g, 0.748 mmol, 16,2% der Theo-
rie) wird als gelbes Öl erhalten.
Rf = 0.81 (LM: EE 99.25%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.02 – 1.31 (m, 6 H), 2.64 – 2.82 (m, 6 H), 4.14 (t, 2
H, J = 5.0 Hz), 5.14 (s, 2 H), 6.45 – 6.73 (m, 2 H), 6.88 – 7.02 (m, 1 H), 7.30 – 7.51 (m, 5
H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 10.76 (CH3), 46.96 (CH2), 53.14 (CH2), 70.99 (CH2)
71.67 (CH2(Bn)), 104.65 (CH(arom.)), 111.19 (2xCH(arom.)), 124.81 (CH(arom.)), 127.64 (2xCH(Bn)),
128.20 (CH(Bn)), 128.92 (2xCH(Bn)), 136.91 (C(Bn)), 137.83 (C(arom.)), 153.20 (2xC(arom.)).–
6 Experimenteller Teil
89
{2-[3-Benzyloxy-2-(2-diethylaminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-diethylamin (41)
OBn
O
O
N
N
3-Benzyloxybenzol-1,2-diol (40) (7.50 g, 34.69 mmol) wird in abs. DMF (200 mL) gelöst und
mit NaH (50% in Weißöl, 3.84 g, 79.79 mmol) versetzt. Die Mischung wird 1 h bei 100 °C
gerührt. Bei 40 °C wird eine Lösung von 2-Diethylaminoethylchlorid (10.82 g, 79.79 mmol)
in abs. DMF (50 mL) zugegeben und die Mischung 18 h bei 100 °C gerührt. Das Lösungs-
mittel wird entfernt und der erhaltene Rückstand chromatographisch gereinigt (Kieselgel
375 g, LM: PE 99.25%, Et3N 0.75% → EE 99.25%, Et3N 0.75%). Das gewünschte {2-[3-
Benzyloxy-2-(2-diethylaminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-diethylamin (41) (9.207 g, 22.31 m-
mol, 64.02% der Theorie) wird als gelbes Öl erhalten.
Rf = 0.27 (LM: EE 99.25%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz):
δ
[ppm] = 0.95 – 1.14 (m, 12 H), 2.52 – 2.76 (m, 8 H), 2.82 –
3.01 (m, 4 H), 4.02 – 4.15 (m, 4 H), 5.14 (s, 2 H), 6.60 – 6.96 (m, 2 H), 6.95 (t, 1 H, J =
8.3 Hz), 7.33 – 7.50 (m, 5 H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 12.31 (2xCH3), 12.49 (2xCH3), 47.89 (2xCH2), 48.26
(2xCH2), 52.31 (CH2), 52.93 (CH2), 68.14 (CH2(Bn)), 71.49 (CH2), 71.62 (CH2), 107.49
(CH(arom.)), 107.97 (CH(arom.)), 123.80 (CH(arom.)), 127.76 (2xCH(Bn)), 128.17 (CH(Bn)), 128.83
(2xCH(Bn)), 137.72 (C(Bn)), 138.91 (C(arom.)), 153.34 (C(arom.)), 153.60 (C(arom.)).–
C25H38N2O3 [414.58] ber.: C 72.43 H 9.24 N 6.76
gef.: C 72.01 H 9.13 N 7.65
6 Experimenteller Teil
90
2,3-Bis-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (42)
OH
O
O
N
N
{2-[3-Benzyloxy-2-(2-diethylaminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-diethylamin (41) (2 g, 4.824 m-
mol) wird in MeOH (100 mL) gelöst, mit Palladium-Kohle (10%, 250 mg) in einer Wasser-
stoff-Atmosphäre versetzt und 4 h bei RT gerührt. Die Lösung wird über Celite filtriert und
das Lösungsmittel entfernt. Das gewünschte 2,3-Bis-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (42)
(1.534 g, 4.728 mmol, 98.0% der Theorie) wird als gelbes Öl erhalten.
Rf = 0.34 (LM: EE 98.25%, MeOH 1%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 1.09 – 1.18 (m, 12 H), 2.69 – 2.79 (m, 10 H), 2.97 –
3.01 (m, 2 H), 4.06 – 4.16 (m, 4 H), 6.50 (dd, 2 H, J = 8.2 Hz, J = 8.1 Hz), 6.92 (t, 1 H, J =
8.2 Hz).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 10.80 (2xCH3), 12.42 (2xCH3), 46.86 (2xCH2), 48.24
(2xCH2), 52.19 (CH2), 52.15 (CH2), 67.60 (CH2), 71.70 (CH2), 103.88 (CH(arom.)), 110.79
(CH(arom.)), 124.75 (CH(arom.)), 136.59 (C(arom.)), 153.19 (C(arom.)), 153.33 (C(arom.)).–
C18H32N2O3 [324.34] ber.: C 66.63 H 9.94 N 8.63
gef.: C 66.13 H 10.30 N 9.33
{2-[3-(3-Chlorpropoxy)-2-(2-diethylaminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-diethylamin (43)
O
O
O
N
N
Cl
2,3-Bis-(2-diethylaminoethoxy)-phenol (42) (1.000 g, 3.082 mmol) wird in abs. DMF
(15 mL) gelöst, bei 0 °C mit NaH (50% in Weißöl, 0.185 g, 3.853 mmol) versetzt und 1 h bei
6 Experimenteller Teil
91
RT gerührt. Die erhaltene Suspension wird langsam zu einer Lösung von 3-Chlorbrompropan
(2.426 g, 15.41 mmol, 1.52 mL) in abs. DMF (15 mL) getropft und 18 h bei RT gerührt. Das
Lösungsmittel wird entfernt und der ölige Rückstand chromatographisch gereinigt (Kieselgel
10 g, LM: EE 99.25%, Et3N 0.75%). Das gewünschte {2-[3-(3-Chlorpropoxy)-2-(2-diethyl-
aminoethoxy)-phenoxy]-ethyl}-diethylamin (43) (0.535 g, 1.334 mmol, 43.0% der Theorie)
wird als gelbes Öl erhalten.
Rf = 0.35 (LM: EE 98.25%, MeOH 1%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (MeOD, 200 MHz): δ [ppm] = 1.08 – 1.17 (m, 12 H), 2.16 – 2.32 (m, 2 H), 2.67 –
2.70 (m, 8 H), 2.89 – 2.92 (m, 4 H), 3.66 – 3.79 (m, 2 H), 4.04 – 4.13 (m, 6 H), 6.65 (d, 2 H, J
= 8.2 Hz), 6.95 – 7.01 (m, 1 H).–
13C-NMR (MeOD, 50 MHz): δ [ppm] = 9.00 (2xCH3), 9.19 (2xCH3), 31.11 (CH2), 39.86
(CH2), 45.73 (2xCH2), 46.16 (2xCH2), 50.15 (CH2), 50.63 (CH2), 64.06 (CH2), 65.79 (CH2),
68.97 (CH2), 105.47 (CH(arom.)), 110.79 (CH(arom.)), 122.60 (CH(arom.)), 136.71 (C(arom.)), 151.69
(2xC(arom.)).–
C21H37ClN2O3 [400.98] ber.: C 62.90 H 9.30 N 6.99
gef.: C 61.99 H 9.19 N 8.01
(4aS,6R,8aS)-11-(3-{2,3-bis[2-(diethylamino)ethoxy]phenoxy}propyl)-3-methoxy-5,6,9,-
10,11,12-hexahydro-4aH-[1]benzofuro[3a,3,2-ef][2]benzazepin-6-ol (Propylgallamin-
galanthamin) (33)
O
O
O
O
O
OH
N
N
N
(–)-11-Demethylgalanthamin (30) (0.250 g, 0.915 mmol), KI (0.366 g, 2.288 mmol) und abs.
Et3N (1.389 g, 13.725 mmol, 1.91 mL) werden in abs. CH3CN (10 mL) suspendiert. Die
Lösung wird unter Rückfluss erhitzt und {2-[3-(3-Chlorpropoxy)-2-(2-diethylaminoethoxy)-
phenoxy]-ethyl}-diethylamin (43) (0.367 g, 0.915 mmol) in abs. CH3CN (10 mL) langsam
zugetropft. Es wird noch 24 h unter Rückfluss erhitzt, die Lösung filtriert und das Lösungs-
6 Experimenteller Teil
92
mittel entfernt. Der verbleibende Rückstand wird säulenchromatographisch gereinigt (Kiesel-
gel 87 g, LM: PE 70%, CH2Cl2 19.25%, MeOH 10%, Et3N 0.75%). Das gewünschte Propyl-
gallamingalanthamin (33) (0.246 g, 0.386 mmol, 42.2% der Theorie) wird als farbloser Fest-
stoff erhalten.
Rf = 0.27 (LM: PE 70%, CH2Cl2 19.25%, MeOH 10%, Et3N 0.75%)
1H-NMR (CDCl3, 200 MHz): δ [ppm] = 0.96 – 1.23 (m, 12 H), 1.54 (d, 1 H, J = 13.7 Hz),
1.92 - 2.16 (m, 4 H), 2.656 – 2.76 (m, 12 H), 2.90 – 2.96 (m, 4 H), 3.12 (t, 1 H, J = 6.5 Hz),
3.33 – 3.50 (m, 1 H), 3.80 – 3.88 (m, 4 H), 4.01 – 4.21 (m, 8 H), 4.64 (s, 1 H), 5.98 – 6.15 (m,
2 H), 6.56 – 6.71 (m, 4 H), 6.90 – 6.98 (m, 1 H).–
13C-NMR (CDCl3, 50 MHz): δ [ppm] = 12.22 (2xCH3), 12.38 (2xCH3), 27.76 (CH2), 30.39
(CH2), 33.48 (CH2), 47.84 (2xCH2), 48.18 (2xCH2), 48.81 (C), 52.24 (CH2), 52.81 (CH2),
56.27 (2xCH2), 58.02 (CH3), 62.45 (CH), 67.37 (CH2), 67.97 (CH2), 71.34 (2xCH2), 89.11
(CH) 106.96 (CH(arom.)), 107.11 (CH(arom.)), 111.50 (CH(arom.)), 122.37 (CH(arom.)), 123.83
(CH(arom.)), 127.34 (CH(arom.)), 128.01 (CH), 129.85 (CH), 133.55 (C(arom.)), 138.33 (C(arom.)),
144.47 (C(arom.)), 146.22 (C(arom.)), 153.41 (C(arom.)), 153.49 (C(arom.)).–
MS (DCI (+), NH3, 8 mA/s), m/z (%): 638.6 (25) [M++H+]
C37H55N3O6 [637.85] ber.: C 69.67 H 8.69 N 6.59
gef.: C 69.46 H 8.54 N 6.33
6.2 HPLC Trennungen
6.2.1 Verwendete Geräte
HPLC: Injektor: Autosampler AS 2000A (Merck Hitachi); Volumen: 20 µl
Pumpe: 655 A-11 Liquid Chromatograph
L-5000 LC Controller (Merck Hitachi)
Detektor: 655A Variable Wavelength UV Monitor (Merck Hitachi)
Analytische Säule: LiChrosphere, 60RP Select B, 250x4.6 mm
Preperative Säule: LiChrosphere, 60RP Select B,
6 Experimenteller Teil
93
6.2.2 Laufmittel und Gradientenprogramme
Laufmittel 1: Methanol
Laufmittel 2: Puffer (0.04 M Na2HPO4 in H2O, pH 3.0)
Gradientenprogramm 1: Zeit [min] Laufmittel 1 [%] Laufmittel 2 [%]
01585
10 15 85
45 100 0
50 100 0
Gradientenprogramm 2: Zeit [min] Laufmittel 1 [%] Laufmittel 2 [%]
01090
25 10 90
90 100 0
100 100 0
6.2.3 Analyse von (–)-3-[3H]-Galanthamin
Es werden 50 μL aus dem (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) Vorrat entnommen und mit MeOH
auf 500 μL aufgefüllt. Von dieser Lösung werden mit dem Autosampler 20 μL auf die analy-
tische HPLC Säule gegeben. Der Laufmittel-Fluss betrug 1 mL/min unter Verwendung von
Gradientenprogramm 1.
6.2.4 Aufreinigung von (–)-3-[3H]-Galanthamin
Es werden 3 mL aus dem (–)-3-[3H]-Galanthamin-Vorrat entnommen und einrotiert. Der
Rückstand wird mit 4 mal 50 μL MeOH über ein Rehodyne Ventil auf die preperative Säule
gegeben. Der Laufmittel-Fluss betrug 7.5 mL/min unter Verwendung von Gradientenpro-
gramm 2. Die Fraktion von 29.5 – 33 min wird aufgefangen und am Rotationsverdampfer bis
auf 7 mL eingeengt. Die Lösung wird mit NH3-Lösung (25%, v/v, 1 mL) versetzt mit EtOAc
(4 x 1.5 mL) extrahiert. Die vereinigten organischen Phasen werden mit ges. NaCl-Lösung
(1 mL) gewaschen und über MgSO4 getrocknet. Das Lösungsmittel wird entfernt und der
6 Experimenteller Teil
94
Rückstand in MeOH (1 mL) aufgenommen. Die erzielte Ausbeute beträgt 35%. Die Lagerung
des aufgereinigten (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) erfolgt (15) bei –25°C.
6.3 Biologische Arbeiten
6.3.1 Verwendete Geräte
Elektrophorese: Novex XCell II, Mini Cell
Blotting: Novex XCell Blott Modul
Xenon UV-Lampe: Osram XBO 150W/1 Xenon Kurzbogenlampe
Lampengehäuse: Müller Elektronik Optik, Lampengehäuse Typ LAX
Stromversorgung: Müller Elektronik Optik, Xenon Lampenversorgung Typ SVX 1450
Zentrifuge: Heraus Varifuge 3.2 RS
6.3.2 Verwendete Lösungen, Puffer und SDS-PAGE
Torpedo Ringer Lösung: 250 mM NaCl, 5 mM KCl, 4 mM CaCl2·2H2O, 2 mM MgCl2·6H2O,
5mM Tris, pH 7.4 (HCl), Lsm. Bidest. H2O
Tris-Glycin SDS Probenpuffer: 63 mM Tris HCl, 10% Glycin, 2% SDS, 0.0025% Bromphe-
nol Blau, Lsm. Bidest. H2O, pH 6.8
Tris-Glycin SDS Laufpuffer: 25 mM Tris Base, 192 mM Glycin, 0.1% SDS, Lsm. Bidest.
H2O, pH 8.3
Tris-Glycin Transferpuffer: 12 mM Tris Base, 96 mM Glycin, 20% Methanol, Lsm. Bidest.
H2O, pH 8.3
Färbelösung: 0.2% (w/v) Ponceau Rot S, 0.2% (w/v) Trichloressigsäure, Lsm. Bidest.
Molekular Standard: SeeBlue Pre-Stained Marker (Invitrogen)
SDS-PAGE Gel: Tris-Glycin SDS Gel, 1.0 mm, 8% Polyacrylamid
Nitrocellulosemembran; 0.2 μm
Scintillationscocktail: Rotisint eco plus
6 Experimenteller Teil
95
6.3.3 Photoaffinitätsmarkierung des nAChR mit (–)-3-[3H]-Galanth-
amin
Das aufgereinigte 3-[3H]-(–)-Galanthamin (15) (0.055 μmol) in MeOH wird in ein Eppendorf-
Cup gegeben und das Lösungsmittel entfernt. Zu dem Rückstand wird eine nAChR-Suspen-
sion (1.5 mg/mL, 0.165 mL) gegeben und mit Ringer-Lösung auf 1000 μL aufgefüllt (Protein
Konzentration: 0.5 mg/mL, (–)-3-[3H]-Galanthamin-Konzentration: 0.055mM). Die Suspen-
sion wird gevortext und 30 min bei RT inkubiert. Für die Bestrahlung wird ein Teil der Sus-
pension (100 μL) in eine Suprasil-Küvette (d = 1 mm) übergeführt und für 3 min in den Licht-
strahl der UV-Lampe gebracht (Abstand zum Filter 2 cm). Die Rezeptor-Suspension wird aus
der Küvette in ein Eppendorf-Cup übergeführt, mit (–)-Galanthamin·HBr-Lösung (900 μL,
10 mM) versetzt und 30 min bei RT inkubiert. Die Rezeptor-Suspension wird für 20 min bei
5000 g zentrifugiert. Die über dem entstandenen Protein-Pellet befindliche Lösung wird ab-
genommen, das Pellet in (–)-Galanthamin·HBr-Lösung (900 μL, 10 mM) aufgenommen und
für 30 min bei RT inkubiert. Die Rezeptor-Suspension wird für 20 min bei 5000 g pelletiert.
Der Zyklus aus Waschen, Inkubieren und Pelletieren wird noch einmal mit
(–)-Galanthamin·HBr-Lösung (19) (900 μL, 10 mM) und weitere zweimal mit Bidest. H2O
durchlaufen. Das letzte Pellet wird in reduzierendem SDS-PAGE Probenpuffer (20 μL) auf-
genommen und für 10 min bei 80 °C verkocht. Die so erhaltene SDS-PAGE Probenlösung
wird auf ein SDS-PAGE Gel gegeben und die Elektrophorese bei einer konstanten Spannung
von 125 V durchgeführt. Das SDS-PAGE Gel wird nach der Elektrophorese auf eine Nitro-
cellulose-Membran geblottet. Das Blotting wird bei einer konstante Spannung von 25 V über
einen Zeitraum von 1 h durchgeführt.
Für die Versuche zur Verdrängung des (–)-3-[3H]-Galanthamin (15) mit unmarkiertem (–)-
Galanthamin (9) wird eine (–)-Galanthamin·HBr-Stammlösung angesetzt (575 mg (–)-Ga-
lanthamin·HBr in 25 mL Ringer Lösung, entspricht 62.5 mM (–)-Galanthamin·HBr). Die
Vorgehensweise bei der Markierung ist weitgehend identisch. Vor Zugabe der nAChR-Sus-
pension wird (–)-Galanthamin·HBr-Stammlösung (16 μL, entspricht (1mM (–)-Galanth-
amin·HBr bzw. 800 μL, entspricht 50mM (–)-Galanthamin·HBr) zugegeben.
Zur quantitativen Bestimmung der an das Protein gebundenen Radioaktivität werden die Spu-
ren der Nitrocellulose-Membran in 2 mm lange Stücke geschnitten und in einem Ace-
ton/Isopropanol Gemisch (1:1, v/v, 5 mL) aufgelöst. Die Lösung wird mit Scintillations-
cocktail (2.5 mL) versetzt und 5 mal für 5 min im Beta-Counter vermessen.
7 Literaturverzeichnis
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8 Abkürzungen
106
8 Abkürzungen
A
β
Beta Amyloid Protein
ACh Acetylcholin
AChE Acetylcholinesterase
AChR Acetylcholin-Rezeptor
AD Alzheimer’sche Demenz
AGEs Advanced Glycosylation End Produkts
APL allosterisch potenzierender Ligand
ApoE Apoliprotein E
arom. aromatisch
Asp Asparagin
Bn Benzyl
BOC tert.-Butoxycarbonyl
BOC2Otert.-Butoxycarbonylanhydrid
β
-APP Beta Amyloid Precursor Protein
BuChE Butyrylcholinesterase
ChAT Cholin-Acetyltransferase
d dublett
dd doppeldublett
DMF N,N-Dimethylformamid
DMSO Dimethylsulfoxid
e Elektron
GAL Galanthamin
Gln Glutamin
Glu Glutaminsäure
Gly Glycin
GNT Galanthamin
His Histidin
Ile Isoleucin
JKopplungskonstante
LCS Liquid Scintillisation Counter
m-CPBA meta-Chlorperbenzoesäure
8 Abkürzungen
107
mAChR muskarinischer Acetylcholin-Rezeptor
mRNA messenger RNA
MwMolekulargewicht
nNeutron
NCA nichtkompetitiver Agonist
νeelektrisches Antineutrino
nAChR nicotinsicher Acetylcholin-Rezeptor
NSAIDs nonsteroidal anti-inflammatory drugs
p Positron
PS-1 Presenilin 1
PS-2 Presenilin 2
s singulett
Ser Serin
t triplett
THF Tetrahydrofuran
Trp Tryptophan
Tyr Tyrosin
ZNS Zentrales Nervensystem
9Anhang A
108
9 Anhang A
N
H
N
NH
O
O
O
1.
HO N
O
O
HN
HN
2.
HN
N
O
NH2
NH2
SH2N
O
O
3.
NH2
OHN
O
OHHO
O
4.
N
H
O
OOH
5.
NH2
N
H
H
N
HN
N
H
NH2
6.
N+
NH
N
NH
O
-O
O
7.
C+
N+N+
HO
O
O-
O
-O
O
8.
9Anhang A
109
N
N
N
N
N
NH
9.
O
H2N
O
O
10.
N
H
N
N
N
N
11.
S
O
O
HN
HN
HN
12.
N
NH
N+
-O
O
N+
-O
O
13.
N
N
N
N
H
N
14.
O
N
HN
N
NH2
15.
O
-O
N+
O
N
NHN
16.
Cl
O
HO
OH
O
17.
H2N
O
HO
O
18.
9Anhang A
110
O
N
NNH
NH
N
N
19.
O
O
NO
OH
20.
OOH
O
OH
O
HO
OHO
21.
HN
O
N
N
NH
N
H
S
NH2
22.
NH2
H2NN
N
23.
O
HN
N
N
N
H2N
24.
Aus der vorliegenden Dissertation sind folgende Veröffentlichungen hervorgegangen:
- Linnemann E., Fels G.; Synthesis of 3H-(-)-galanthamine, Journal of Labelled
Compounds & Radiopharmaceuticals (2001), 44 (9), 661-669
- Luttmann E., Linnemann E., Fels G.; Galanthamine as Bis-Functional Ligand for the
Acetylcholinesterase, Journal of Molecular Modeling, ( 2002), 8 (6), 208-216
- Luttmann E., Linnemann E., Fels G.; Exploring the Binding-Site Gorge of Acetyl-
cholinesterase, Posterbeitrag, 15. CIC-Workshop (2001), Leipzig
- Linnemann E., Luttmann E., Fels G.; Exploring the Binding-Site Gorge of Acetyl-
cholinesterase, Posterbeitrag, 15. Molecular Modelling Workshop (2001), Darmstadt
- Linnemann E., Luttmann E., Fels G.; Exploring the AChE-Gorge with Galanthamine,
Posterbeitrag, XI th International Symposium on Cholinergic Mechanisms – Function and
Dysfunction (2002), St. Moritz
