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Schwermetalle in Raps und Sonnenblumen

- ihre Verteilung und Bindungsformen -

Dissertation zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- Dr. rer. nat. -

des Fachbereichs Chemie und Chemietechnik

der Universität Paderborn

von

Stefan Wittke

Paderborn, 2002

„Wer nichts als Chemie versteht,

versteht auch die nicht recht.“

Georg Christoph Lichtenberg

Für Simone

Danksagung

Herrn Prof. Dr. M. Grote danke ich für die Überlassung des überaus

interessanten Themas, die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit sowie

für sein Verständnis und seine Geduld in einigen schwierigen Situationen

während dieser Zeit.

Herrn Dir. u. Prof. Dr. Th. Betsche von der Bundesanstalt für Getreide-,

Kartoffel- und Fettforschung (BAGKF) in Detmold danke ich für die

Übernahme des Korreferates, für die vielen hilfreichen Diskussionen und

seinen Ideenreichtum.

Herrn Dr. J. Brüggemann von der Bundesanstalt für Getreide-, Kartoffel- und

Fettforschung (BAGKF) in Detmold danke ich für seine praktischen

Ratschläge und die stete Diskussionsbereitschaft, welche wesentlichen

Anteil am Gelingen dieser Arbeit hat.

Bei den Mitarbeitern des Institutes II der BAGKF in Detmold möchte ich mich

für das ausgezeichnete Arbeitsklima und die tatkräftige Unterstützung

während meiner Tätigkeit bedanken. Insbesondere danke ich Frau M.–T.

Hanneforth.

Den Mitarbeitern des Arbeitskreises Analytische Chemie der Universität

Paderborn danke ich für ihre Anteilnahme am Gelingen dieser Arbeit und für

ihre moralische Unterstützung.

Ich danke Herrn Dr. W. Sailmeier von der Deutschen Forschungsanstalt für

Lebensmittelchemie in München-Garching für die Durchführung der

Aminosäureanalysen.

Der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) danke ich für die finanzielle

Unterstützung.

Die vorliegende Arbeit wurde im Fachbereich 13 Chemie und Chemietechnik

der Universität Paderborn, Fachgebiet Analytische Chemie und an der

Bundesanstalt für Getreide-, Kartoffel- und Fettforschung (BAGKF), Institut

für Biochemie von Getreide und Kartoffel, in Detmold in der Zeit von März

1999 bis Januar 2002 unter Leitung von Prof. Dr. Manfred Grote erstellt.

Referent: Prof. Dr. M. Grote

Korreferent: Direktor und Prof. Dr. habil. Th. Betsche

Datum der Abgabe: 23.01.2002

Datum der mündlichen Prüfung: 09.04.2002

Veröffentlichungen im Zusammenhang mit der vorliegenden Arbeit

1. 49. Tagung für Getreidechemie, Arbeitsgemeinschaft Getreideforschung e.V.,

17.-18.06.1998, Detmold. S. Wittke, J. Brüggemann, Th. Betsche, M. Grote.

Abstract: Schwermetallbindende Substanzen in heimischen Ölpflanzen.

(Poster)

2. Symposium ”European Research towards Safer and Better Foods”,

18.-20.10.1998, Karlsruhe. J. Brüggemann, Th. Betsche, H. Ditters, H.-P. Thier,

N. Tümmers, S. Wittke, M. Grote. Binding forms of Cd and other heavy metals

in staple foods in the view of bioavailability, Abstract Nr. 2.2.24, 50. (Poster)

3. ANAKON 99, Gesellschaft Deutscher Chemiker, Fachgruppe Analytische

Chemie, 07.-10.04.1999, Konstanz. S. Wittke, J. Brüggemann, Th. Betsche,

M. Grote. Why is the Cadmium and Nickel content in sunflower seeds ten or five

times higher than in rape seeds?, Abstract Nr. S60, 186. (Poster)

4. Die biologische Bedeutung der Mengen- und Spurenelemente, 19. Arbeits-

tagung, 03.-04.12.1999, Jena. J. Brüggemannn, S. Wittke, M. Grote, Th.

Betsche. Bindungsformen von Schwermetallen in Weizen und Ölsaaten.

Abstract in: Mineralstoffe, Mengen- und Spurenelemente in der Prävention.

Hrsg.: M. Anke, R. Müller, U. Schäfer, Wissenschaftl. Verlagsgesellschaft,

Stuttgart, 2001, 94 - 105. (Poster)

5. Euroanalysis XI, 03.-09.09.2000, European Conference on Analytical

Chemistry, Division of Analytical Chemistry, Federation of European Chemical

Societies, FECS Event n° 246, Lissabon. S. Wittke, M. Grote, J. Brüggemann,

Th. Betsche. Heavy metal binding compounds in seeds, leaves, stems and

roots of sunflower and rape plants: a comparative investigation.

Abstract Nr. OC 74. (Vortrag)

6. Botanikertagung 2000, 17.-22.09.2000, Jahrestagung der Deutschen

Botanischen Gesellschaft und der Vereinigung für Angewandte Botanik, Jena.

S. Wittke, Th. Betsche, J. Brüggemann, M. Grote. Schwermetallbindende

Substanzen in Sonnenblumen und Raps, Abstract Nr. P 14-10, 224. (Poster)

7. Botanikertagung 2000, 17.-22.09.2000, Jahrestagung der Deutschen

Botanischen Gesellschaft und der Vereinigung für Angewandte Botanik, Jena.

Th. Betsche, J. Brüggemann, M. Grote, H.P. Thier, N. Tümmers, S. Wittke.

Schwermetalle und ihre Bindungsformen: Lokalisierung, Transport, Analyse,

Abstract Nr. P 14-11, 225. (Poster)

8. Regionalverbandstagung 2001 der Lebensmittelchemischen Gesellschaft,

Gesellschaft Deutscher Chemiker, Regionalverband NRW, 15.03.2001

Paderborn, M. Grote, S. Wittke, J. Brüggemann, Th. Betsche, Schwermetalle

und ihre Bindungsformen in Sonnenblumen und Raps. Abstract in:

Lebensmittelchemie 55. 70, 2001. (Vortrag)

Inhaltsverzeichnis I

Inhaltsverzeichnis

1 Einleitung und Aufgabenstellung 001

1.1 Schwermetalle in der Umwelt 002

1.2 Physiologische Wirkung von Schwermetallen 002

1.3 Wirkungspfade für Schwermetalle 005

1.4 Aufnahme und Transport von Schwermetallen in Pflanzen 006

1.5 Elementspeziesanalytik - Bindungsformen 008

1.6 Wie schützen sich Pflanzen vor Schwermetallen? 009

1.6.1 Immobilisierung 0010

1.6.2 Vermeidung 010

1.6.3 Aktiver Efflux 010

1.6.4 Komplexierung: Zelluläre Komplexbildner 011

1.6.4.1 Nicht-peptidische Komplexbildner 011

1.6.4.2 Schwermetall-bindende Peptide: Metallothioneine 012

1.6.5 Kompartimentierung 015

1.7 Sonnenblumen und Raps: Stand der Forschung 016

1.7.1 Sonnenblumen (Helianthus annuus) 016

1.7.2 Raps (Brassica napus) 018

1.8 Zielsetzung 020

1.9 Untersuchungsmethodik 020

2 Schwermetalle in Sonnenblumen und Rapspflanzen aus 026

landwirtschaftlichem Anbau

2.1 Sonnenblumenkerne 026

2.2 Rapssamen 026

2.3 Sonnenblumen 027

2.4 Raps 031

3 Anzuchtversuche in Hydrokultur 035

3.1 Sonnenblumen 036

3.2 Raps 038

Inhaltsverzeichnis II

3.3 Schwermetallgehalte in Sonnenblumen- und Raps- 039

pflanzen aus der Anzucht in Hydrokultur

4 Kompartimentierung von Schwermetallen in Organellen von 044

Sonnenblumen und Raps

4.1 Chloroplasten 044

4.2 Mitochondrien und Peroxisomen 046

5 Zwischenfazit 050

6 Schwermetall-Bindungsformen in Sonnenblumen und Raps 051

6.1 Sonnenblumenkernextrakte 052

6.2 Rapssamenextrakte 058

6.3 Sonnenblumenkerne: Extraktion unter reduzierenden 060

Bedingungen

6.4 Rapssamen: Extraktion unter reduzierenden Bedingungen 063

6.5 Sonnenblumenblätterextrakte 065

6.6 Rapsblätterextrakte 069

6.7 Sonnenblumenblätter: Extraktion unter reduzierenden 071

Bedingungen

6.8 Rapsblätter: Extraktion unter reduzierenden Bedingungen 073

6.9 Sonnenblumen- und Rapsstängelextrakte 074

6.10 Sonnenblumenwurzelextrakte 075

6.11 Rapswurzelextrakte 077

6.12 Sonnenblumenwurzeln: Extraktion unter reduzierenden 078

Bedingungen

6.13 Rapswurzeln: Extraktion unter reduzierenden 079

Bedingungen

7 Isolierung von Cadmium-bindenden Substanzen aus Sonnen- 083

blumen- und Rapspflanzen

8 Strukturanalytische Untersuchungen der aus Sonnenblumen- 087

und Rapswurzeln isolierten Cadmium-bindenden Substanzen

Inhaltsverzeichnis III

8.1 Fluoreszenz-HPLC 087

8.2 Aminosäureanalyse der aus Sonnenblumen- und Raps- 088

wurzeln isolierten Cadmium-bindenden Substanzen

8.3 ESI-MS (Ion Trap, LCQ) 091

9 Fazit 093

10 Zusammenfassung 0096

11 Experimenteller Teil 099

11.1 Anzucht von Sonnenblumen- und Rapspflanzen unter 100

Hydrokulturbedingungen

11.2 Herstellung der Pflanzenextrakte 104

11.3 Gelfiltrationschromatographie (GFC) 105

11.3.1 Bestimmung des Ausschlussvolumens 108

11.3.2 Bestimmung des Totalvolumens 108

11.3.3 Kalibration der Säulen 109

11.4 Ionenaustauscherchromatographie (IAC) 111

11.5 Fluoreszenz-HPLC 112

11.5.1 Synthese von Thiolagarose 114

11.5.2 Derivatisierung von Thiolen mit Monobrombiman 114

11.6 Mikrowellengestützter Druckaufschluss 116

11.6.1 System mls 1200 mega 116

11.6.2 System ethos 1600 116

11.7 Atomspektrometrische Verfahren 117

11.7.1 Bestimmung von Cadmium 119

11.7.2 Bestimmung von Kupfer 120

11.7.3 Bestimmung von Nickel 120

11.7.4 Bestimmung von Eisen 121

11.7.5 Bestimmung von Zink 121

11.7.6 Bestimmung von Kupfer mit der DCP 121

11.8 Electrospray-Massenspektrometrie (Ion-Trap-ESI-MSMS) 122

11.9 Bestimmung von Thiolgruppen nach Ellmann 123

11.10 Proteinbestimmung nach Bradford 124

Inhaltsverzeichnis IV

11.11 Gewinnung von Wurzeldruck-Exudat (Xylemsaft) 125

11.12 Isolierung und Bestimmung von Organellen aus 125

Kotyledonen von Sonnenblumen- und Rapskeimlingen

11.12.1 Chloroplasten 125

11.12.2 Mitochondrien und Peroxisomen 126

11.13 Vorbereitung der isolierten Cadmium-Bindungsformen 130

zur Aminosäureanalyse

12 Literaturverzeichnis 131

Anhang

A 1 Weitere Elutionsprofile der Gelchromatographie A1

A 1.1 Sonnenblumenkerne A1

A 1.2 Rapssamen A6

A 1.3 Sonnenblumenblätter A8

A 1.4 Rapsblätter A9

A 1.5 Sonnenblumenwurzeln A10

A 1.6 Rapswurzeln A13

A 1.7 Sonnenblumen- und Rapsstängel A15

A 1.8 Elutionsprofile der IAC A16

A 2 Spektren der ESI-MS und ESI-MSMS A18

Abkürzungsverzeichnis V

Abkürzungsverzeichnis

AAS Atomabsorptionsspektrometrie

ABA Abscisinsäure

AtPCS1 Arabidopsis thaliana Phytochelatin-Synthase Gen

BAGKF Bundesanstalt für Getreide-, Kartoffel- und

Fettforschung

BMVEL Bundesministerium für Verbraucherschutz, Ernährung

und Landwirtschaft

Cys Cystein

DCP Direct Current Plasma (Emissionsspektrometrie)

Dnp Daten nicht präsentiert

EDTA Ethylendiamintetraacetat

ER Endoplasmatisches Retikulum

ESI-MS Electrospray-Ionisation-Massenspektrometrie

EXAFS extended x-ray absorption fine structure

FPLC Fast Protein Liquid Chromatography

FS Frischsubstanz

GCS

γ-Glutamylcysteinyl Synthase

GFC Gelfiltrationschromatographie

Glu Glutamin

Gly Glycin

GS Glutathionsynthase

GSH Glutathion

HEPES N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure)

HPLC High Performance Liquid Chromatography

hsp Hitze Schock Protein (Stressprotein)

IAC Ionenaustauschchromatographie

IARC International Agency for Research and Cancer

kD kilo-Dalton (kg/mol)

mBBr MonoBrombiman

MS Massenspektrometrie

MT Metallothionein

PC Phytochelatin

PCS Phytochelatin-Synthase

PWTI Provisional Tolerable weekly intake

SBK Sonnenblumenkerne

SH Thiol

SM Schwermetall

SpPCS1 Schizosaccharomyces pombe Phytochelatin-Synthase

Gen

Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan

TS Trockensubstanz

XAS X-ray absorption spectrometry

VI Liste der Pflanzennamen

Liste der Pflanzen und ihrer botanischen Bezeichnungen

Champignon Agaricus bisporus

Großsporenchampignon Agaricus macrosporus

Riesenstraußgras Agrostis gigantea

Rotes Straußgras Agrostis tenuis

Steinkraut Alyssum sp.

Löwenmaul Antirrhinum majus

Ackerschmalwand Arabidopsis thaliana

Erdnuss Arachis hypogaea

Meerrettich Armoracia rusticana

Indischer Senf

Brassica juncea

Raps Brassica napus

Kohl Brassica oleracea

Weiße Rübe Brassica rapa

Wiesenschaumkresse Cardaminopsis halleri

Grünalge Chlamydomonas reinhardtii

Gurke Cucumis sativus

Stechapfel Datura innoxia

Rasenschmiele Deschampsia caespitosa

Rotschwingel Festuca rubra

Sonnenblume Helianthus annuus

Kresse Lepidium sativum

Linsen Linum usitatissimum

Apfelbaum Malus domestica

Brotschimmel Neurospora crassa

Tabak Nicotiana tabacum

Reis Oryza sativa

Gartenbohne Phaseolus vulgaris

Erbse Pisum sativum

Busch Psychotria douarrei

Rauwolfie Rauvolfia serpentina

Hundsrose Rosa canina

Färberröte Rubia tinctorum

Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae

Spalthefe Schizosaccharomyces pombe

gewöhnliches Leimkraut Silene vulgaris / cucubalus

Hellerkraut Thlaspi arvense

Gebirgshellerkraut Thlaspi caerulescens

Täschelkraut Thlaspi goesingense

Weizen Triticum aestivum

Galmeiveilchen Viola calaminaria

Mais Zea mays

Einleitung und Zielsetzung 1

1 Einleitung und Aufgabenstellung

Sonnenblumen- und Rapssaaten gehören zu den bedeutendsten Ölsaaten in

der Bundesrepublik Deutschland. In den Jahren 1995/96 wurde die in

Deutschland verarbeitete Menge an Rapssamen (ca. 3300·103 t) und

Sonnenblumenkernen (ca. 450·103 t) nur von der Menge an verarbeiteten

Sojabohnen (ca. 3450·103 t) übertroffen. Die Weltproduktion an Ölsaaten

zeigt Abbildung 1.

Abb. 1: Weltproduktion Ölsaaten (Quelle: Verband dt. Ölmühlen) [1]

Die Raps- und Sonnenblumensaaten werden hauptsächlich zur Gewinnung

von Ölen für die Nahrungsmittelindustrie verwendet. Die Schwermetall-

belastung dieser Öle ist gering, weil bei der Ölproduktion die Schwermetalle

im Pressrückstand verbleiben [2-4]. Der proteinreiche Pressrückstand wird in

der Tierfütterung verwendet, sodass die in den Ölsaaten enthaltenen

Schwermetalle in die Nahrungskette gelangen [1]. TRAULSEN beschreibt in

diesem Zusammenhang, dass etwa 60 % des gesamten in Sonnen-

blumenpflanzen enthaltenen Cadmiums im Pressrückstand nachzuweisen

sind. Für Raps beträgt dieser Anteil etwa 15 % [5].

Sonnenblumen und Raps sind zweikeimblättrige Pflanzen. Im Vergleich zu

anderen zweikeimblättrigen Pflanzen akkumulieren Sonnenblumen, ähnlich

wie einkeimblättrige Getreidepflanzen (z.B. Weizen), deutlich mehr Cadmium

[6-8]. Untersuchungen von BRÜGGEMANN an der BAGKF in Detmold ergaben,

dass der Cadmium- und Nickel-Gehalt in ausgereiften Sonnenblumenkernen

durchschnittlich zehn- bzw. fünfmal höher ist als in Rapssamen (Tabelle 1)

[7]. Ziel der vorliegenden Arbeit ist, die Ursachen dieser unterschiedlichen

Schwermetall-Gehalte von Sonnenblumenkernen und Rapssamen aufzu-

klären.

2 Einleitung und Zielsetzung

Tab. 1: Durchschnittliche Schwermetallgehalte in Saaten von Sonnen-

blumen und Raps [8, 9]

arithmetisches Mittel von

n = 665 Rapssamenmustern (BEE 1995 – 1997) bzw.

n = 249 Sonnenblumenkernmustern (Bundessortenamt, Wertprüfung 1996)

Cadmium Nickel Zink

Ölsaaten [mg/kg FS]

Raps 0,041 ± 0,003 0,41 ± 0,04 41 ± 1

Sonnenblumen 0,365 ± 0,007 2,00 ± 0,08 52 ± 1

Woher stammen die Schwermetalle und wie gelangen sie in die Ölpflanzen?

1.1 Schwermetalle in der Umwelt

Metalle, deren spezifisches Gewicht einen Wert von 4 g/cm3 [10] bzw. 5

g/cm3 [11, 12] überschreitet, werden als Schwermetalle bezeichnet. Schwer-

metalle sind erst durch Verwitterungsprozesse, Vulkanismus und besonders

durch anthropogenen Einfluss (Bergbau, Verbrennung fossiler Brennstoffe

usw.) der Biosphäre vermehrt zugänglich [13]. Am Beispiel des Cadmiums

sollen anthropogen bedingte Emissionen aufgezeigt werden.

Tab. 2: Anthropogen bedingte Cadmiumemissionen (1983) [13, 14, 15]

Anthropogene Ursache Eintrag [103 t/Jahr]

Energiegewinnung 00,79

Stahlproduktion, Raffinerien 05,43

Verarbeitende Industrie 00,6

Müllverbrennung 00,75

Landwirtschaftliche Abwässer 02,2

Urbane Abfälle 04,2

Dünger 00,2

Kohlestaub

07,2

Gesamteintrag

29,2

Der auf menschliche Einflüsse zurückzuführende Schwermetalleintrag in die

Umwelt betrug 1986: 3·104 t Cadmium, 1,1·104 t Quecksilber, 105 t Nickel,

106 t Blei, 2,3·106 t Zink und 2,2·106 t Kupfer [13]. Untersuchungen aus

Deutschland, Österreich und der Schweiz belegen, dass bessere

Filtersysteme und die Einführung des bleifreien Benzins bis 1995 zu einer

Emissionsreduktion von 65 % bei Cadmium und 90 % bei Blei im Vergleich

zum Höchststand der Emissionen führten. Beim Quecksilber beträgt die

Reduktion ungefähr 70 % [16-19]. Dagegen wurde für Nickel keine

Veränderung nachgewiesen [17].

1.2 Physiologische Wirkung von Schwermetallen

Lebende Organismen bestehen zu 80-90 % aus Wasser. Die Trocken-

substanz dieser Organismen enthält 44,5 % Kohlenstoff, 42,5 % Sauerstoff,

Einleitung und Zielsetzung 3

6,5 % Wasserstoff, 2,5 % Stickstoff sowie die Alkali- bzw. Erdalkalimetalle

Kalium (1,9 %), Kalzium (1 %) und Magnesium (0,2 %) [20]. Zudem enthalten

diese Organismen noch Spurenelemente, die für Stoffwechselvorgänge von

großer Bedeutung sind. Nahezu ein Drittel der bekannten Enzyme benötigt

als Kofaktor die Anwesenheit eines Metallions. Beispiele für Metalloenzyme

sind Alkohol-Dehydrogenase und Superoxid-Dismutase (jeweils Zink als

Kofaktor) sowie Ascorbat-Oxidase (Kupfer). Weitere für Enzyme bedeutsame

Schwermetalle sind u.a. Eisen, Kobalt, Mangan und Nickel. Eisen wird als

Bestandteil von Cytochromen, Ferredoxin, Hämoglobin und Leghämoglobin

benötigt. Kobalt wird im Vitamin B12 von Tieren gebraucht, Mangan ist ein

Kofaktor von Enzymen im Photosystem II höherer Pflanzen und Nickel

Bestandteil der Urease [21, 22].

Schwermetalle werden deshalb entsprechend ihrer physiologischen Wirkung

in verschiedene Klassen eingeteilt [23, 24]:

• Nicht-essenzielle Schwermetalle: z.B. Arsen, Blei, Cadmium,

Quecksilber, Platin und Zinn. Sie werden von pflanzlichen und

tierischen Organismen nicht benötigt, in sehr niedrigen Konzentra-

tionen allerdings toleriert.

• Essenzielle Schwermetalle: Pflanzliche und tierische Organismen

benötigen Schwermetalle wie Eisen, Kupfer, Mangan, Nickel und Zink.

Obwohl diese Schwermetalle essenziell sind, weisen sie ein toxisches

Potenzial auf. Die optimale Konzentration der essenziellen Schwerme-

talle umfasst nur einen kleinen Konzentrationsbereich (Abbildung 2)

[25]. Kupfer und Eisen wirken in höheren Konzentrationen durch die

Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies in Pflanzen toxisch [26].

Abb. 2: Abhängigkeit des Wachstums eines pflanzlichen Organismus von

der Schwermetallkonzentration (grafisch bearbeitet nach [26])

Die Tabellen 3 a/b fassen die physiologischen Wirkungen von Cadmium,

Kupfer, Nickel und Zink auf tierische und pflanzliche Organismen zusammen.

toxisch

Mangel

Pflanzenwachstum

tolerierbar Optimum

nichtessentielles

Schwermetall essentielles

Schwermetall

toxisch

Schwermetallkonzentration (Dosis) [mg/kgFS]

4 Einleitung und Zielsetzung

Tab. 3 a: Vergleich der physiologischen Kenndaten von Cadmium und Kupfer

für tierische und pflanzliche Organismen [3, 27-43]

Cadmium Kupfer

Bedeutung für Mensch und Tier

biolog. Bedeutung Enzyme unbekannt; Cd-Thioneine essenziell, Cu-Proteine, Enzyme

Minimalbedarf Essenzialität nicht erwiesen Mensch: 1-3 mg/Tag

Mangelsymptome Muskelschwäche, reduzierte

Futteraufnahme Skelettschäden, Anämie,

Wachstumsstörungen,

Aufnahme oral; inhalativ oral

Akkumulation Nieren, Leber, Plazenta Großhirn, Leber, Niere,

Schilddrüse, Knochenmark

toxische Wirkung Funktionsstörungen der Niere,

kanzerogen, Dekalzifizierung mutagene und karzin. Wirkung,

chronische Toxizität

Bedeutung für Pflanzen

biolog. Bedeutung bisher nicht bekannt essenziell (Enzymbestandteil)

Mangelsymptome bisher nicht bekannt Spitzen- und Blattchlorosen bzw.

-nekrosen, Kümmerwuchs,

Blüten- und Blattansatz behindert

Aufnahme Wurzeln, Blätter Wurzeln

Akkumulation in Wurzeln und Spross in Wurzel und Spross

toxische Wirkung hohe Phytotoxizität in geringen

Konzentrationen toxisch für Algen, phytotoxisch

bei Konzentrationen > 20 mg/kg

Tab. 3 b: Vergleich der physiologischen Kenndaten von Nickel und Zink für

tierische und pflanzliche Organismen [3, 27-38]

Nickel Zink

Bedeutung für Mensch und Tier

biolog. Bedeutung essenziell essenziell (in über 200 Enzymen)

Minimalbedarf Mensch: 25-50 µg/Tag Mensch: 2-10 mg/Tag

Mangelsymptome vermind. Nahrungsaufnahme, Ca-

u. Zn-Stoffwechsel gestört,

Anämie, erhöhte Sterblichkeit

Hautkrankheiten, Sehstörungen,

gestörte Immunabwehr,

Zwergenwuchs

Aufnahme inhalativ, oral inhalativ, oral

Akkumulation versch. Ni-Depots im Körper Prostata, Knochen, Muskeln

toxische Wirkung Allergen, mutagene / kanzerogene

Wirkung, Störung Zn- u. Mg-Stoffw. Anämie, Magen-Darm-Störungen

Bedeutung für Pflanzen

biolog. Bedeutung essenziell essenziell

Mangelsymptome Blattchlorosen u. -nekrosen,

Kümmerwuchs Chlorosen, Nekrosen, Hemmung

Proteinsynthese, Kleinblättrigkeit,

Aufnahme Wurzel Wurzel, Blätter

Akkumulation Zellwand Epidermis rel. hohe Mobilität in Pflanzen

toxische Wirkung Wurzelschäden, Chlorosen,

Ertragsminderung, phytotoxisch bei

Konzentrationen von 1-2 mg/kg

Chlorosen, Hemmung d. Längen-

wachstums, phytotoxisch bei

Konzentrationen > 200 mg/kg

Einleitung und Zielsetzung 5

Die durch den Mangel an essenziellen Schwermetallen ausgelösten

Symptome verschwinden zumeist durch die gezielte Applikation der

entsprechenden Nährelemente. Die durch zu hohe Applikationen bedingten

toxischen Wirkungen von Schwermetallen sind wegen deren Persistenz nicht

ohne weiteres zu beheben. Die biologische Halbwertzeit von Cadmium,

welches von tierischen Organismen in Leber und Niere angereichert wird,

beträgt 25 Jahre [44]. Die Toxizität von Schwermetallen äußert sich in

lebenden Organismen in der Denaturierung von Proteinen, der Permeabili-

tätsveränderung an Membranen und Ionenkanälen sowie der Enzymhem-

mung [21, 45]. Als Folge sind bei Pflanzen z.B. gehemmtes Wurzelwachs-

tum, erniedrigte Photosynthese, Chlorosen, Nekrosen und Schädigungen

des Wasserhaushaltes zu beobachten (Tabelle 3 a/b). Die Folgen der

Schwermetallakkumulation im menschlichen Organismus demonstrieren die

durch eine Cadmiumvergiftung ausgelöste „Itai-Itai-Krankheit“ sowie die von

einer Quecksilbervergiftung hervorgerufene „Minamata-Krankheit“ [46].

1.3 Wirkungspfade für Schwermetalle

Die essenziellen und nicht-essenziellen Schwermetalle werden dem

menschlichen Organismus hauptsächlich über die Ernährung zugeführt.

Folgende Wirkungspfade werden unterschieden:

• Boden - Nahrungspflanze - Mensch

• Boden - Futterpflanze - Nutztier - Mensch

• Boden - (Sickerwasser -) Grundwasser (- Trinkwasser) - Mensch

Nach einer Studie der WHO nehmen Menschen etwa 50 % des Cadmiums

aus pflanzlichen Nahrungsmitteln auf [47]. Die theoretische tägliche

Cadmium-Aufnahme eines Erwachsenen in ländlich und industriell geprägten

Gegenden verdeutlicht Tabelle 4:

Tab. 4: Berechnete hypothetische tägliche Cadmiumaufnahme eines

Erwachsenen [46]

Eine Unterscheidung zwischen Raucher und Nichtraucher ist von Bedeutung,

weil oral aufgenommenes Cadmium zu 4-8 %, inhaliertes Cadmium dagegen zu

15-40 % vom Körper absorbiert wird [46].

Cadmiumquelle

Aufnahme [µg/d]

1. Nichtraucher in ländlicher

Umgebung Luft 0,0005

Ernährung 4

Wasser 2

Gesamt 6

Luft 25

Ernährung 84

Wasser 2

Tabak 4

2. Raucher in industrieller Umge-

bung, der Cadmium-belastete

Nahrungsmittel verzehrt

Gesamt

115

6 Einleitung und Zielsetzung

Tabelle 4 zeigt, dass der Hauptanteil des Cadmiums vom Menschen über die

Nahrung aufgenommen wird. Im ungünstigsten Fall überschreitet die

wöchentliche Cadmiumaufnahme eines Rauchers mit ~800 µg/kg den PTWI-

Wert („Provisional Tolerable Weekly Intake“) von 400-500 µg/kg sehr deutlich

[47-49]. Ein hoher Eintrag von Schwermetallen in die Nahrungskette ist

deshalb unbedingt zu vermeiden, um die alimentäre Belastung des am Ende

der Nahrungskette angesiedelten Menschen so gering wie möglich zu halten.

Es stellt sich daher die Frage: Wie gelangen die benötigten und nicht

benötigten Schwermetalle in pflanzliche Organismen und gibt es

Mechanismen, die möglicherweise eine zu hohe Schwermetallaufnahme

verhindern können?

1.4 Aufnahme und Transport von Schwermetallen in

Pflanzen

Die Aufnahme von Schwermetallen durch Pflanzen aus dem Boden hängt

von verschiedenen Faktoren ab. Die Bodenart, die Schwermetallkonzen-

tration im Boden, Mikroorganismen (Mykorrhizapilze) und der pH-Wert des

Bodens haben einen großen Einfluss auf die Bioverfügbarkeit und damit auf

die Aufnahme der Schwermetalle durch das Wurzelsystem [21]. Eine

Einteilung der Schwermetalle auf Grund einer potenziellen Boden-Pflanze-

Barriere („plant-soil-barrier“) findet sich bei CHANEY [50].

Verschiedene Untersuchungen belegen, dass hohe Cadmiumgehalte im

Boden mit erhöhten Cadmiumgehalten in Sonnenblumenkernen korrelieren

[55 , 56]. Die Bioverfügbarkeit von Cadmium, Nickel und Zink steigt mit

abnehmendem pH-Wert [33, 58]. Ein niedriger pH-Wert des Bodens ist

deshalb ein Faktor, der für eine erhöhte Cadmiumanreicherung in Ölsaaten

verantwortlich gemacht wird [5, 51-57]. Die niedrigen pH-Werte der Böden in

den Hauptanbaugebieten für Sonnenblumen führen in den USA zu einer

erhöhten Belastung der dort geernteten Sonnenblumenkerne mit Cadmium.

Die Cadmiumgehalte dieser Sonnenblumenkerne überschreiten den

Richtwert der Bundesrepublik Deutschland von 0,6 mgCd/kg FS z.T. sehr

deutlich [51, 56].

Die Aufnahme von essenziellen und nicht-essenziellen Schwermetallen

durch Pflanzen erfolgt in der Regel über das Wurzelsystem. Die Zellen der

Wurzelhaare sind mit Hilfe von Protonenpumpen in der Lage, H3O+-Ionen an

die Umgebung abzugeben und im Boden gebundene Kationen freizusetzen.

Der radiale Weitertransport von Wasser und der darin gelösten Nährstoffe

kann auf zwei Arten erfolgen. Entweder apoplastisch in den Zellwänden oder

symplastisch von Zelle zu Zelle, d.h. mit Membrantransport. Der

apoplastische Transport wird in der Endodermis durch den Casparyschen

Streifen unterbrochen. Ab hier erfolgt der Weitertransport ausschließlich

symplastisch bis in die Zellen des Xylem-Parenchyms. Dort erfolgt die

Exkretion von Wasser und den Nährstoffen in die Xylem-Leitgefäße [22]. Das

Xylem dient dem Ferntransport von Wasser und der darin gelösten

Nährstoffe von der Wurzel in Spross und Blätter. Wie das Xylem mit Ionen

beladen wird, ist bisher noch nicht endgültig geklärt. Am Aufnahme-System

Einleitung und Zielsetzung 7

von Aminosäuren in den Symplasten sind wahrscheinlich Aminosäure-

Transporter beteiligt [59-63]. Untersuchungen zur Anionen-Leitfähigkeit des

Plasmalemmas der Xylemparenchymzellen von Gerste-Wurzeln deuten an,

dass die Beladung des Xylems mit K+, NO3- und Cl- ein passiver Prozess ist

[64]. Im Xylem liegen die anorganischen Ionen entweder frei oder an

organische Säuren gebunden vor [65-71]. Nickel wird in Nickel-Hyper-

akkumulatoren in Form eines Nickel-Histidin-Komplexes transportiert [72].

Zwischen den Xylemstrahlen liegt im Leitbündel das Phloem. Im Phloem

werden vor allem in den Blättern gebildete Photosyntheseprodukte wie

Saccharose aber auch Kalium transportiert. Zielpunkte des Phloemstroms

sind sämtliche generativen und vegetativen Pflanzenteile. Der Phloem-

transport beruht auf einer Differenz des osmotischen Potenzials innerhalb

der Siebelemente, die durch Beladung der Siebelemente im Bereich der

„Source“-Gewebe erreicht wird („Druckstrom“-Theorie) [21, 73, 74].

Bisher sind die Transportwege und -mechanismen von Schwermetallionen

innerhalb einer Pflanze nicht vollständig aufgeklärt. Für Blei, Magnesium,

Natrium, Phosphor und Schwefel wird vermutet, dass der Transport

hauptsächlich im Phloem stattfindet, im Gegensatz zu Kalzium, Lithium,

Strontium und Bor, die keine ausgeprägte Phloemmobilität aufweisen [23].

Untersuchungen an Linsen-, Erdnuss- und Weizenpflanzen deuten an, dass

die Cadmium- und Zinkverlagerung in die Saaten überwiegend über das

Phloem erfolgt [75-79]. Experimente zur Translokation von Cadmium mit

109Cd zeigen, dass 95 % des auf Blätter von Weizenkeimlingen applizierten

109Cd dort verbleiben [80]. Ähnliche Untersuchungen an Weizenpflanzen

während der Reifungsperiode beschreiben eine Verlagerung von 9-17 % des

in Blätter oder Pflanzenstiele applizierten 109Cd in das Korn. Zudem wird

beschrieben, dass beim Reifen des Korns die Retranslokation des

Cadmiums von Blättern („Source“) in den Stiel abnahm und gleichzeitig die

Verlagerung in das Korn („Sink“) sich verstärkte [81]. Diese Beobachtung

entspricht den Ergebnissen zur Retranslokation von Kobalt, Nickel, Rubidium

und Zink über das Phloem [78, 79, 82-84]. Allerdings wird von den Autoren

beschrieben, dass die Remobilisierung von Zink [85] und Rubidium [86] aus

Blättern um ein Vielfaches höher ist als die von Cadmium. MARSCHNER [23]

führt in diesem Zusammenhang an, dass es bei dem Übergang von der

Vegetations- zur Reifephase einer Pflanze zu gravierenden Veränderungen

im „Source-Sink-Verhältnis“ kommen kann und reifende Samen die haupt-

sächliche Senke von Schwermetallen für das Phloem werden. Mit Sonnen-

blumen und Raps wurden derartige Untersuchungen zur Remobilisierung von

Schwermetallen bisher nicht durchgeführt.

Für Weizenkörner wurde am Beispiel des Mangans gezeigt, dass Spuren-

elemente, welche über das Xylem transportiert werden, sich überwiegend in

den Spelzen anreichern [87]. Dagegen konnte für Cadmium nachgewiesen

werden, dass die Spelzen nur sehr wenig Cadmium akkumulieren [88]. Für

geschälte Sonnenblumenkerne wird Ähnliches beobachtet. Der Cadmiumge-

halt ist in geschälten Kernen deutlich höher als in den Schalen [89, vgl. 2.3].

Die Aufnahme von Schwermetallionen in die Zelle erfolgt durch spezifische

Membrantransportproteine [90-94], wie CPx-ATPasen. Diese transportieren

8 Einleitung und Zielsetzung

Schwermetalle wie Kupfer, Zink oder Cadmium. Für Grünalgen, das Acker-

schmalwand Arabidopsis thaliana und die Bäckerhefe Saccharomyces

cereviseae sind Nramp-Proteine beschrieben, welche als Transporter für

Cadmium und Eisen fungieren [21, 90, 95-97]. Zudem ist eine ZIP-Genfamilie

beschrieben, welche bei Arabidopsis thaliana, Erbsen und dem Gebirgs-

hellerkraut Thlaspi caerulescens für Fe/Zn-Transporter kodiert [21, 98, 99].

1.5 Elementspeziesanalytik (Bindungsformen)

Die bisher vorgestellten Untersuchungen basieren zum größten Teil auf der

Bestimmung von Schwermetalltotalgehalten. Unterschiede im Schwermetall-

gehalt in den Pflanzenorganen (Wurzel, Stängel, Blatt, Frucht) sind für

Phloem-mobile und nicht-Phloem-mobile Schwermetalle ansatzweise

erklärbar. Allerdings wird nicht deutlich, warum für ein bestimmtes

Schwermetall Unterschiede zwischen verschiedenen Pflanzen wie z.B.

Sonnenblumen und Raps, existieren. Des Weiteren kann das Phänomen so

genannter Metall-Hyperakkumulatoren nicht erklärt werden.

Hyperakkumulatoren tolerieren hohe Konzentrationen bestimmter

Schwermetalle ohne Wachstumsstörungen. Es sind Kupfer- und Kobalt-

akkumulierende sowie mehr als 300 Nickel-akkumulierende Pflanzen

bekannt [100]. Letztere sind zumeist Brassicaceen wie das Steinkraut

Alyssum und das Hellerkraut Thlaspi [101-107]. Arabidopsis und Thlaspi

caerulescens sind Cadmium/Zink-Hyperakkumulatoren [108–112]. Zink-

Hyperakkumulatoren wie das Galmeiveilchen Viola calaminaria und die

Wiesenschaumkresse Cardaminopsis halleri sind auf Abraumhalden zu

finden. Die Existenz von Hyperakkumulatoren zeigt, dass die von Schwer-

metallen ausgehenden Gefährdungen nicht nur von den Elementtotal-

gehalten in den Pflanzen bestimmt werden. Es scheint vielmehr wichtig, in

welcher Zustandsform Schwermetalle vorliegen.

Die meisten Schwermetalle üben ihre Wirkung in einem Organismus nicht als

freie Atome oder Ionen, sondern als Bestandteile von Makromolekülen wie

z.B. Peptiden, Proteinen, Hormonen, Enzymen usw. aus. Die Wirkungsweise

von Schwermetallen hängt ebenso von deren Oxidationsstufe ab. Als

Beispiel sei Chrom genannt, welches in der Oxidationsstufe III essenziell ist,

in der Oxidationsstufe VI als Chromat jedoch ein starkes Zellgift darstellt [26].

In Anbetracht der vielfältigen Erscheinungsformen der Schwermetalle in

verschiedensten Matrices ist die Erfassung von Elementtotalkonzentrationen

nicht ausreichend, um Aussagen über die biologische Wirkungsweise von

Analyten treffen zu können. Dieses gelingt erst anhand der Charakterisierung

einer Verbindung hinsichtlich Oxidationsstufe und Bindungsformen, d.h. der

Kenntnis der Elementspezies [26, 113, 114].

Daher steht heutzutage zur Aufklärung human-, phyto- und ökotoxi-

kologischer Wirkungen von Schwermetallen zumeist eine qualitative und

quantitative Bestimmung der Elementspezies im Vordergrund [26]. Diese so

genannte Elementspeziesanalytik stellt hohe Ansprüche an Probenahme,

Probenlagerung, -aufbereitung und die verwendeten Trenn- und Detektions-

verfahren (vgl. 1.8). Die Kopplung möglichst speziesselektiver Trenn-

Einleitung und Zielsetzung 9

verfahren und Element-spezifischer Nachweisverfahren für das interes-

sierende Spurenelement bilden hierfür die Grundlage.

Diese problemorientierte Speziesanalytik liefert erst die Ergebnisse, die

Aussagen über die Bioverfügbarkeit und biologische Wirkung der Analyte

ermöglichen, wobei allerdings eine projektbegleitende Qualitätssicherung

(z.B. durch Massenbilanzierung, Verwendung von zertifizierten Standards,

Validierung von Methoden) und eine sorgfältige Interpretation der ermittelten

„Endergebnisse“ von großer Bedeutung ist. Verschiedene in der Literatur

beschriebene und verwirklichte methodische Ansätze liefern allerdings

Ergebnisse, die sich häufig sehr unterscheiden. Eine Ursache kann darin

liegen, dass bei der Isolierung von Schwermetall-bindenden Substanzen aus

organischen Matrices mit der Gelchromatographie ein und derselben

Substanz - in Abhängigkeit von der Ionenstärke des verwendeten Puffer-

systems - unterschiedliche Molmassen zugeordnet werden (vgl. 1.6.4.2).

Auch bei den nachfolgend beschriebenen Untersuchungen steht die

Bestimmung der Schwermetallbindungsformen im Vordergrund. Es werden

Untersuchungen vorgestellt, die sich mit Regelungs- und Schutzmecha-

nismen in Pflanzen als Folge eines Schwermetallstresses beschäftigen.

1.6 Wie schützen sich Pflanzen vor Schwermetallen?

Am Beispiel des Cadmiums sollen mögliche Mechanismen für die Toleranz

von Pflanzen gegenüber Schwermetallen aufgezeigt werden [13, 115, 116].

Abbildung 4 illustriert die bisher in pflanzlichen und tierischen Organismen

beobachteten Schutz- und Kontrollmechanismen.

Abb. 4: Mögliche Mechanismen für die Kontrolle des Cadmiumgehaltes in

Pflanzenzellen [grafisch verändert nach 116]

Die in der Abbildung angegebenen Zahlen beziehen sich auf die folgende

Aufstellung möglicher Ursachen für die Schwermetalltoleranz von Pflanzen

• Immobilisierung (1): Schwermetalle, wie z.B. Cadmium, werden an der

Zellwand gebunden,

• Vermeidung (2): Die Pflanze schützt sich vor der Aufnahme des

Schwer-metalles,

10 Einleitung und Zielsetzung

• Aktiver Efflux (3): Unter Energieverbrauch werden die Metallionen bzw.

die Cadmiumkomplexe aus der Zelle entfernt,

• Komplexierung (4): Schwermetallionen werden durch Proteine

komplexiert. Hierbei sind besonders Proteine mit Schwefel-haltigen

funktionellen Gruppen zu nennen. Zu dieser Gruppe von Polypeptiden

werden die Metallothioneine gezählt. Aber auch andere funktionelle

Gruppen körpereigener Substanzen (-COOH, -OH, -NH2) können

Schwermetalle binden.

• Kompartimentierung (5, 6, 7): Schwermetallionen bzw. ihre entsprech-

enden Komplexe werden in der Zellwand oder der Vakuole abgelagert

bzw. gespeichert. Carrierproteine übernehmen den Transport von

Schwermetallen bzw. Schwermetallkomplexen in die Vakuole.

1.6.1 Immobilisierung

In Wurzeln und Blättern von Bohnen Phaseolus vulgaris binden erhebliche

Mengen an Cadmium hauptsächlich an Pektine und Histidinyl-Gruppen in

den Zellwänden [13, 117]. Dotierungsexperimente zur Untersuchung der

Cadmiumverteilung in Bohnen und Tabakpflanzen zeigen größere

Cadmiummengen in Fraktionen, welche die unlöslichen Zellbestandteile

(Zellwände) enthalten [118, 119]. Tomatenzellen aus Zellsuspensions-

kulturen und Zellwände aus Wurzeln des Leimkrautes Silene cucubalus

weisen dagegen vernachlässigbare Cadmiummengen auf. Cadmium-

tolerante und normale Stämme von Silene cucubalus binden jeweils wenig

Cadmium in den Zellwänden [116, 120, 121]. Dagegen ist im Nickel-

toleranten Hyperakkumulator Thlaspi goesingense Nickel zu etwa 70 % an

die Zellwand gebunden [122, 123].

1.6.2 Vermeidung

Ein Weg von Cadmium in die Zelle scheint die Aufnahme über

Kalziumkanäle in der Plasmamembran zu sein [124]. Zudem sind für

Arabidopsis thaliana und Saccharomyces cereviseae Cd/Zn-Transporter

beschrieben [90-97]. Hinweise darauf, dass die Cadmium-Aufnahme für

Pflanzen unvermeidlich ist, liefern Untersuchungen an Tabakzellkulturen.

Diese zeigen eine schnelle Angleichung der Cadmiumkonzentrationen in den

Zellen und der Nährlösung [125].

1.6.3 Aktiver Efflux

Für das Bakterium Staphylococcus ist die plasmidkodierte Fähigkeit

beschrieben, Cadmiumionen unter Energieverbrauch aus der Zelle

auszuschleusen [115, 127]. Bei Ralstonia metallidurans CH34 wird die

Schwermetallresistenz gegenüber Kobalt, Cadmium und Zink auf aktiven

Efflux zurückgeführt [128]. Ein von Bakterien genutztes aktives Effluxsystem

zur Entfernung von Schwermetallen unter Energieverbrauch aus der Zelle ist

nach derzeitigem Kenntnisstand bei Pflanzen von untergeordneter

Bedeutung [126].

Einleitung und Zielsetzung 11

1.6.4 Komplexierung durch zelluläre Metallkomplexbildner

Bei tierischen und pflanzlichen Organismen kommt es als Folge von

Schwermetallstress zur Synthese von Stresspolypeptiden bzw. –proteinen,

die Schwermetalle komplexieren. Die wichtigsten Vertreter dieser Substanz-

klassen sind die Metallothioneine. Ferner kommen organische Säuren als

Komplexbildner infrage. Die potenziell Schwermetall-bindenden Substanzen

enthalten Stickstoff, Schwefel und Sauerstoff als mögliche Bindungspartner.

Die metallischen Elemente werden auf Grund ihrer unterschiedlichen Affinität

gegenüber diesen Bindungspartnern in drei Gruppen eingeteilt [12]:

• Klasse A: Metalle, die Liganden bevorzugt über O-Atome

binden (Alkali-, Erdalkalimetalle, Aluminium)

• Klasse B: Metalle, welche Liganden über schwefelhaltige

Gruppen binden (Silber, Gold, Quecksilber, Platin)

• „Borderline“-Ionen: Metalle, die sich nicht eindeutig zuordnen lassen

(Chrom, Kobalt, Eisen, Nickel, Cadmium, Zink)

1.6.4.1 Nicht-peptidische Komplexbildner

Oxalsäure Äpfelsäure Citronensäure Histidin

Abb. 5: Nicht-peptidische Komplexbildner für Schwermetallionen

Die erhöhte Konzentration von Malaten in Zink-toleranten Ökotypen des

Leimkrautes Silene vulgaris, von Festuca rubra und Psychotria douarrei wird

als Hinweis interpretiert, dass Schwermetalltoleranz u.a. durch organische

Säuren vermittelt wird [129-132]. In Blättern von Silene vulgaris ist der

Malonsäuregehalt in zinktoleranten Pflanzen vier- bis siebenfach erhöht im

Vergleich zu nichttoleranten Pflanzen [133]. In den Wurzeln der Rasen-

schmiele Deschampsia caespitosa steigt der Gehalt an Zitronensäure bei der

Zugabe von Zink [134]. Nickel ist außerdem in einem Nickel-Citrat-Komplex

fixiert [135, 136]. In Vakuolen des Täschelkrautes Thlaspi goesingense liegt

Nickel ebenfalls als Citrat vor [122]. In Alyssum wird von einem Anstieg der

Histidinkonzentration im Xylemsaft in Abhängigkeit von der Nickelkonzen-

tration berichtet [72]. Des weiteren sind Zinkphytate beschrieben [137–140].

Der Nachweis einer Beeinflussung der Schwermetalltoleranz von Pflanzen

durch nicht-peptidische Komplexbildner, ist wegen ihrer konstitutiv bedingten

hohen Konzentration schwer zu führen. Für schwermetallbindende Peptide

und Proteine ist dieser Nachweis einfacher, weil sie von Pflanzen häufig als

Reaktion auf einen Schwermetallstress vermehrt gebildet werden. Wichtigste

Vertreter der Schwermetall-bindenden Peptide sind Metallothioneine.

COOH

H2C

CHHO

COOH

HOOC

NCH

H2C

HC NH2

COOH

H2C

COOH

CCOOH

12 Einleitung und Zielsetzung

1.6.4.2 Schwermetall-bindende Peptide: Metallothioneine

Erstmalig wurde ein Metallothionein 1957 aus der Pferdeniere isoliert [141].

In der Zwischenzeit wurden ähnliche Proteine, die Cadmium, Kupfer oder

Zink binden, in Säugetieren, Vögeln, Fischen, Pilzen und Pflanzen

nachgewiesen [100, 142-149].

Metallothioneine (MT) werden in 3 Klassen unterteilt [150]:

Metallothioneine der Klasse I

Die Metallothioneine der Klasse I (MT I) kommen in Säugetieren und einigen

Pilzen vor. Sie bestehen aus etwa 60 Aminosäuren, wobei aromatische

Aminosäuren, Histidine und Disulfide nicht auftreten. Die Molmasse beträgt

6-7 kD. Bis zu sieben zweiwertige bzw. zwölf einwertige Metallionen können

gebunden werden und zwar als Metall-Thiolat-Cluster in zwei Domänen:

einem Me3Cys9-Cluster und einem Me4Cys11-Cluster (Abbildung 6).

Abb. 6: Strukturmodelle eines MT aus Ratten [151]

basierend auf 2D-NMR Aufnahmen (A) sowie kristallographischen Daten (B). Die β-Domäne enthält

einen Me3Cys9-Cluster und die α-Domäne einen Me4Cys11-Cluster

Metallothioneine der Klasse II

Die MT II wurden aus wirbellosen Tieren, der Bäckerhefe Saccharomyces

cereviseae und Cyanobakterien wie Synechococcus isoliert. Sie unter-

scheiden sich von den MT I durch eine geringere Molmasse sowie durch eine

andere Anordnung der Cysteinbausteine. Bei KÄGI [150] findet sich eine

Übersicht über Metallothioneine der Klasse I und II.

Die Bildung der Metallothioneine der Klasse I und II wird auf Ebene der Gen-

expression von Metallionen, wie Ag+, Cd2+, Cu+/2+ und Zn2+, induziert. Eine

Induktion der MT-Synthese wird auch nach physiologischem Stress in Ver-

bindung mit der Ausschüttung von Stresshormonen beobachtet [152, 153].

Metallothioneine der Klasse I und II in Pflanzen

Aus Weizenembryos wurde bisher das einzige pflanzliche Protein isoliert,

welches Ähnlichkeiten zu Metallothioneinen aufweist [100, 154]. Dieses

sogenannte „early Cys-labeled“ Ec-Protein [155-157] bindet Cd2+ und Zn2+.

Bislang wurden aus Pflanzen 58 verschiedene Gene isoliert, die für

Einleitung und Zielsetzung 13

„Metallothionein-ähnliche“ Proteine kodieren [100]. Aus Arabidopsis thaliana

[158, 159] und Raps [160] wurden entsprechende Gene kloniert.

Die Funktionen der Metallothioneine in Pflanzen sind unklar. Die mRNA-

Transkripte lassen sich in Wurzeln, Spross, Blättern, Blüten, Früchten und

Samen nachweisen [92]. Manche Gene wurden nach Zugabe von Cadmium,

Kupfer oder Zink [158, 159, 161-163] verstärkt exprimiert, andere nicht be-

einflusst [164]. In einigen Fällen führte die Zugabe von Cadmium, Kupfer

oder Zink zu einer geringeren Exprimierung [155, 162, 165]. Diese Ergeb-

nisse lassen vermuten, dass Metallothioneine in Pflanzen nur einen geringen

Anteil an der Schwermetall-Entgiftung und -Homöostase haben [166].

Metallothioneine der Klasse III: Phytochelatine

GRILL gelang 1985 die Charakterisierung zweier durch Cd2+-Ionen

induzierbarer Peptidkomplexe aus Zellkulturen von Rauvolfia serpentina [44,

167]. GRILL bezeichnete diese Peptide als „Phytochelatine“. In der Literatur

werden die MT III auch als Cadystine, γ-Glutamyl-Cysteinyl-Peptide oder

Cadmium-bindende Peptide bezeichnet [44, 168, 169]. Die Ermittlung der

Primärstruktur lieferte mehrere homologe Peptide der allgemeinen Formel:

Abb. 7: Allgemeine Strukturformel von Phytochelatinen [44, 167, 170]

Die Peptide bestehen aus alternierenden Glu-Cys-Einheiten mit einem

carboxyterminalen Glycin. Die Glutamat-Reste bilden wie in Glutathion

(GSH) über ihre γ-Carboxy-Gruppe eine Peptidbindung mit Cystein.

Neben dem Phytochelatin mit carboxyterminalen Glycin gibt es mindestens

fünf weitere Peptide, die sich durch ihre carboxyterminale Aminosäure

voneinander unterscheiden:

• Homo-Phytochelatine mit carboxyterminalem ß-Alanin. Die Namens-

gebung orientiert sich an homo-Glutathion, bei dem das carboxy-

terminale Glycin ebenfalls durch ß-Alanin ersetzt ist [171].

• Hydroxymethyl-Phytochelatine mit der carboxyterminalen Amino-

säure Serin. Aus Gräsern wurde zunächst das Glutathion-Analogon

mit Serin und nachfolgend das entsprechende Phytochelatin aus

Wurzeln von Reispflanzen isoliert [172, 173].

• iso-Phytochelatine bei denen zwei Formen unterschieden werden.

Eines mit carboxyterminalem Glutamat wurde aus Mais (Zea mays)

isoliert [174]. Für Meerrettich (Armoracia rusticana) ist ein iso-

Phytochelatin mit carboxyterminalem Glutamin beschrieben [175].

• Desglycin-Phytochelatine, denen die carboxyterminale Aminosäure

fehlt. Diese Peptide wurden aus Zea mays [176 und S. pombe [177]

isoliert und sind Abbauprodukte von Phytochelatinen [173].

CH2

HO2C

HNH

CH2

HCH2SH

CH2

CO2H

-Glu

γCys Gly

n = 2 - 7

14 Einleitung und Zielsetzung

In zahlreichen höheren Pflanzen werden Phytochelatine nachgewiesen [178-

180]. In Sonnenblumen und Raps sind Phytochelatine in den Blättern

nachgewiesen worden [181, 182]. Eine Besonderheit ist bei einigen Pilzen zu

beobachten, in denen Cu2+ ein Metallothionein induziert, während die

Belastung mit Cd2+ zur Bildung von Phytochelatinen führt [183, 184]. Nahezu

alle Class B und zahlreiche „Borderline“-Ionen aktivieren die Phytochelatin-

Synthase [44, 167, 185-188]. Eine Phytochelatin-Induktion wird nach der

Zugabe von Al3+, Fe2+, Mn2+, MoO4-, Cr3+, U4+, V3+ und von Alkali- bzw.

Erdalkalimetallen nicht beobachtet. Die beschriebene Aktivierung der

Phytochelatin-Synthase (PCS) durch Ni2+, Te4+, W6+, SeO32- war nicht

reproduzierbar [184, 189-192].

Phytochelatine sind nicht genkodiert, sondern werden durch das konstitutiv

exprimierte Enzym γ-Glutamylcysteinyl-Dipeptidyl-Transpeptidase (PCS) mit

Glutathion als Substrat gebildet [193, 194]. Das Enzym wird von Metallionen

aktiviert (Abbildung 8). Für A. thaliana ist erwiesen, dass AtPCS1 für PCS

kodiert [195]. Die Expression dieses Gens in S. cerevisiae, welches keine

PCS bildet, führt zur Übertragung der Cadmium-Resistenz [196-198] .

Abb. 8: Biosynthese von Phytochelatinen (grafisch verändert nach [193])

Bekannte Punkte der Biosynthese mit positiver bzw. negativer Regulierung der

Enzymaktivität oder der Genexpression werden mit ⊕ und ⊖ angezeigt. Anhand

der Modellpflanzen A. thaliana (At), Brassica juncea (Bj) und T. aestivum (Ta)

werden die Regulationsmechanismen beschrieben. HMT1 ist ein Transporter in

der Vakuolmembran für Cd-PC

Die Induktion von Phytochelatinen durch Cadmium ist bisher am intensivsten

untersucht worden [199-202]. Das von Zellen aufgenommene Cadmium

stimuliert die Phytochelatin-Synthase und im Cytoplasma werden LMW-Cd-

PC-Komplexe gebildet („low molecular weight complex“; Molmasse 1,8 kD)

[13]. Der LMW-Komplex besteht größtenteils aus PC3 bei einem SH:Cd-

Verhältnis von 3:1. Für die Spalthefe ist nachgewiesen, dass die LMW-Cd-

PC-Komplexe mit dem ATP-abhängigen HMT1-Transporter aus dem Cytosol

in die Vakuole transportiert werden [203]. Die Autoren beschreiben, dass der

LMW-Komplex in der Vakuole weiteres Cd und zusätzlich Sulfid aufnimmt

und zu einem HMW-Komplex („high molecular weight complex“; 4 kD)

aggregiert. Der HMW-Komplex besteht aus Phytochelatin-Monomeren mit

einer Kettenlänge von n ≥4 mit einem SH:Cd-Verhältnis von 1,5:1. Das

zusätzlich aufgenommene Cadmium gelangt möglicherweise mit einem

Cd2+/H+-Antiporter in die Vakuole [204]. Der HMW-Komplex enthält neben

⊕

Cd - PC

HMT 1

At/Bj

Glu

Cys

+ Gly

Glu

Cys

GSH PCS PC

Cd 2+

Vakuole

mRNA

Gen Gen Gen

Cd 2+

⊕

mRNA

⊕

Cd 2+

GCS

⊕

Einleitung und Zielsetzung 15

Cadmium auch Kupfer und Zink. Je nach Ionenstärke des Puffersystems sind

für den HMW-Komplex Molmassen von bis zu 8 kD beschrieben [202].

GRILL ET AL. konnten Phytochelatinkomplexe mit Cu+, Zn2+ und Pb2+ aus

pflanzlichen Zellkulturen reinigen [44]. Die Rekonstitution von Phytochelatin-

Komplexen gelang mit Cu+, Ag+, Pb2+ und Hg2+ [192, 205-209].

Für Phytochelatine werden verschiedene Funktionen in der Metallentgiftung

und dem Schwermetallmetabolismus diskutiert. In vitro-Experimente haben

gezeigt, dass Kupfer-Phytochelatine die apo-Form des Enzyms Diamino-

Oxidase, welches Kupfer als Kofaktor benötigt, reaktivieren können. Zink-

Phytochelatine reaktivieren die apo-Form der Carboanhydrase [210].

Phytochelatinen wird deshalb eine Funktion bei der Homöostase von

Metallen zugesprochen [100, 201]. Hinweise auf die Bedeutung von

Phytochelatinen für die Schwermetallentgiftung liefern Untersuchungen an

cad1-Mutanten von Arabidopsis und S. pombe, die kein Phytochelatin bilden.

Diese Mutanten sind sensitiver gegenüber Cadmium und Arsenat [194, 195].

Bei niedrigen Cd-Konzentrationen von 0,6 µmol/L ist zudem eine erhöhte

Empfindlichkeit gegenüber Cadmium im Vergleich zu den Wildtypen dieser

Pflanzen festzustellen. Algen reagieren mit der Produktion von

Phytochelatinen auf erhöhte Schwermetallkonzentrationen [211-214].

1.6.5 Kompartimentierung

Die Kompartimentierung von Schwermetallen ist von großer Bedeutung für

die Schwermetalltoleranz von Pflanzen. Das zentrale Entsorgungsorganell in

der Pflanzenzelle ist die Vakuole, welche als größtes Organell bis zu 80 %

des Volumens einer Zelle einnimmt (Abbildung 9).

a: Cytoplasma

b: Plasmalemma

c: Mittellamelle

d: glattes ER

e: Kernhülle mit Kernporen

f: Zellkern mit Nucleoli

g: raues ER

h: Sphaerosomen

i: Tüpfel

k: Chloroplast

l: Zellwand

m: Mikrotubuli

n: Golgi-Vesikel

o: Dictyosom

p: Vakuole

q: Tonoplast

r: Peroxisom

s: Mitochondrium

t: Glyoxysomen

u: Lysosomen

Abb. 9: Schema einer jungen Pflanzenzelle [215]

Gereinigte Vakuolen aus Tabakblättern enthalten praktisch die gesamte

Menge an Cadmium und Phytochelatinen [125, 216, 217]. Zudem wurde

16 Einleitung und Zielsetzung

gezeigt, dass Cadmium-haltige Präzipitate in Vakuolen Cd-Phytochelatin-

Komplexe sind [218]. Möglicherweise spielen in der sauren Vakuole auch

andere Liganden eine Rolle; zumindest in Computersimulationen ist der

Citrat-Cd-Komplex bei vakuolärem pH-Wert vorherrschend [219-221]. In den

Vakuolen des Täschelkrautes ist Nickel in einem Citrat-Komplex fixiert. Für

Zellsuspensionskulturen von Tabakpflanzen ist beschrieben, dass Cadmium

und Zink in der Vakuole abgesondert werden und dort an organische Säuren

gebunden sind [125].

1.7 Sonnenblumen und Raps: Stand der Forschung

In den vorangegangenen Kapiteln wurden die physiologische Wirkung von

Schwermetallen auf tierische und pflanzliche Organismen sowie mögliche

Schutz- und Toleranzmechanismen von pflanzlichen Organismen gegenüber

Schwermetallen ausführlich vorgestellt. Im Folgenden werden bisherige

Ergebnisse der Forschung an Sonnenblumen und Raps entsprechend der

zentralen Thematik dieser Arbeit beschrieben.

1.7.1 Sonnenblumen

Die Sonnenblume (Helianthus annuus) gehört

zur Familie der Korbblütler (Asteraceaen). Sie

stammt aus dem westlichen und mittleren

Amerika. In den Anbaugebieten (Russland,

Nordamerika) ist der Sommer kurz und heiß.

Sonnenblumen wachsen zu 1,5 - 2,5 m hohen

Pflanzen heran. Die Blätter sind herzförmig,

gegenständig bis wechselständig, am Rand

gezähnt und lang gestielt. Die Blütenköpfe sind

mit einer Breite von 10 - 40 cm sehr groß.

Abb. 10: Sonnenblume (Helianthus annuus) [1]

Der Blütenstand ist von Hochblättern, den so genannten Hüllkelchblättern,

umgeben. Die einzelnen Blüten sitzen auf dem Korbboden. Die Frucht der

Sonnenblume ist eine „Achäne“ mit einem Samen, bei der Fruchtwand und

Samenschale fest verbunden sind. Die Früchte sind 0,8-1,7 cm lang, 0,4-0,9

cm breit und enthalten 40-50 % fettes Öl, ca. 25 % Eiweiß sowie

Saccharose, Lecithin, Cholin, Betain und Gerbstoffe. Industrielle Nutzung

finden die Sprossachsen von Sonnenblumen als Ausgangsmaterial für

Faserplatten und Zellulose [222].

Sonnenblumenkerne sind intensiv auf ihre Inhaltstoffe wie Schwermetalle

(vgl. Tabelle 1), Proteine und Fette untersucht worden.

Mithilfe der Gelchromatographie konnten in Sonnenblumenkernextrakten fünf

Proteinfraktionen nachgewiesen werden. Ein 15-S-Globulin mit einer

Einleitung und Zielsetzung 17

Molmasse von >600 kD sowie Helianthinin, ein 11-S-Globulin mit einer

Molmasse von 300-400 kD. Zudem wurden ein 7-S-Globulin (100 kD) und

kleinere Proteine bei 20 kD bzw. <12 kD nachgewiesen [223, 224].

Verschiedene Untersuchungen beschäftigten sich mit der Isolierung und

Charakterisierung von Helianthinin [225, 226-233]. Dabei wurde festgestellt,

dass es aus Untereinheiten von 60 kD sowie 40 kD bzw. 20 kD aufgebaut ist

(Abbildung 11). Diese Bausteine bilden sich aus dem ursprünglichen Protein

durch den Einsatz von Proteasen wie Alcalase [230-233] oder durch

Disulfidbrücken spaltendes Mercaptoethanol [225]. In Kapitel 1.5.4 werden

Schwermetall-bindende Proteine mit Thiol- oder Carboxyl-Gruppen

ausführlich diskutiert. Abbildung 11 zeigt, dass derartige funktionelle

Gruppen auch in den Speicherproteinen aus Sonnenblumenkernen enthalten

sind. Bisher ist allerdings noch ungeklärt, ob die beschriebenen

Speicherproteine eine Rolle bei der Komplexierung von Schwermetallen in

Sonnenblumenkernen spiele.

Abb. 11: Bausteine eines 11-S-Globulins [225]

Das Protein („holoprotein“) besteht aus sechs Untereinheiten, welche jeweils aus

einem acidischen (A) und einem basischen (B) Polypeptid aufgebaut sind. Durch

den Einfluss des Puffersystems (pH 8,0; Phosphat/NaCl-Puffer; 0,05 mol/L)

zerfällt das 11-S-Globulin in seine Untereinheiten [A-B]. Der Einfluss von ME führt

zur Dissoziation in die Polypeptide A und B

Des Weiteren wurde untersucht, ob ein Zusammenhang zwischen dem

Cadmiumgehalt in Sonnenblumenpflanzen und deren Wachstum bzw. einer

Schädigung des Photosystems besteht. Diese Untersuchungen wiesen nach,

dass Pflanzen, die Cadmiumstress ausgesetzt waren, weniger Chlorophyll

und lösliche Saccharide enthalten [57, 210, 234-237]. Ferner wurde

festgestellt, dass Eisen und Cadmium eine Abnahme der Superoxid

Dismutase-Aktivität zur Folge haben [210], während Kupfer deren Aktivität

erhöht. Zudem setzen Cadmium, Eisen und Kupfer die Aktivität von Katalase,

Ascorbat-Peroxidase, Glutathion-Reductase und Dehydroascorbat-

Reductase in Sonnenblumen herab. Die Autoren schließen, dass Cadmium,

18 Einleitung und Zielsetzung

Eisen und Kupfer in Sonnenblumenblättern oxidativen Stress ausüben [210].

JOVANOVIC ET AL. untersuchten die Aufnahme und Verteilung von Uran in

Sonnenblumen-, Soja- und Maispflanzen [238]. Sonnenblumen akkumulieren

um den Faktor zwei bis drei mehr Uran als Mais- und Sojapflanzen. Die

Autoren postulieren, dass Sonnenblumen für die Uranremediation geeignet

seien, weil die höheren Urangehalte keine Wachstumsstörungen auslösen.

Erst wenige Untersuchungen beschäftigten sich mit dem Transport von

Nährstoffen in Sonnenblumen. GLINKA ET AL. stellten fest, dass Abscisinsäure

(ABA), ein in Pflanzen vorliegendes Stresshormon, den Wassertransport und

die Ionenabgabe in das Xylem von Sonnenblumenwurzeln verstärkt [239].

QUINTERO ET AL. untersuchten den Einfluss von ABA, Kalzium und

Quecksilber auf den Wassertransport in Wurzeln von 20 Tage alten

Sonnenblumen [240, 241]. Es gelang, Aquaporine in Sonnenblumenwurzeln

nachzuweisen. Aquaporine sind Membranproteine, die als wasserspezifische

Kanäle möglicherweise den Wassertransport innerhalb der Wurzeln

kontrollieren [242]. Eine Veröffentlichung beschreibt den Einfluss von

Rhizosphärebakterien auf das Wachstum und die Stickstoffaufnahme von

Sonnenblumen [243]. Es wurde gezeigt, dass das Rhizobakterium Rhizobium

sp. YAS34 als Wachstumspromotor wirkt, indem es die Stickstoffaufnahme

erhöht sowie die Auswirkungen von Wasserstress reduziert. Wenig unter-

sucht sind Schwermetallspezies wie Metallothioneine, allerdings wiesen

GALLEGO ET AL. in Sonnenblumenblättern Phytochelatine nach [210, 235].

1.7.2 Raps

Raps (Brassica napus L.) gehört zur Familie der Kreuzblütler (Cruciferen)

und der Gattung Brassica, in der sich ebenfalls Rüben (B. rapa) und

Gemüsekohl (B. oleracea) finden. Raps wird weltweit, insbesondere in China,

der EU und Indien, angebaut. Die Blütezeit des Raps ist von April bis

September. Rapspflanzen sind 60-140 cm hohe Pflanzen mit blaugrünen

Blättern. Rapsblüten sind goldgelb (Abbildung 12a).

a) b)

Abb. 12: Blühender Raps (links) und Fruchtstand von Raps (rechts) [1]

Einleitung und Zielsetzung 19

Die Frucht des Raps (Schote) besteht aus zwei großen, bei der Fruchtreife

meist abspringenden Klappen und einem Plazentar-Rahmen (Replum), in

dem die falsche Scheidewand ("Silberhäutchen") ausgespannt ist. Das

Replum trägt beiderseits die Plazenten mit den Samen [244].

Rapssamen enthalten ca. 42 % fettes Öl, sind 1,5 bis 2,5 mm groß, kugelig

und dunkelbraun. Raps wird zur Gewinnung von fettem Öl angebaut.

Außerdem ist das Rapsschrot mit einem Rohproteingehalt von über 30 % ein

wertvolles Futtermittel [245-247]. Charakteristisch für die Arten der Gattung

Brassica sind die sich von Thiohydroxaminosäureestern ableitenden

Glucosinulate, die in allen Teilen der Pflanze vorkommen [248]. Die

Verwendung von Rapsöl, welches eine ernährungsphysiologisch

hervorragende Fettsäurezusammensetzung hat, war früher durch den Gehalt

an Glucosinulaten (Senfölglycoside) und Erucasäure eingeschränkt. Seit der

Züchtung des so genannten „00“-Raps mit einem geringeren Anteil an

Senfölglycosiden und Erucasäure ist dieses Problem beseitigt.

Im Vergleich zu Sonnenblumen gibt es für Raps weniger Untersuchungen.

Dieses ist möglicherweise auf die taxonomische Ähnlichkeit von Brassica

napus und Arabidopsis [160] zurückzuführen. Wie bei Sonnenblumen wurden

beim Raps die Saaten vor allem wegen ihrer Bedeutung für die Ölgewinnung

und Tierernährung intensiv untersucht. Im Samen von Raps gibt es zwei

Haupt-Speicherproteine, das 12-S-Globulin Cruciferin und das 2-S-Albumin

Napin, die 60 % bzw. 20-30 % der Gesamtproteinmenge ausmachen [249,

250]. Cruciferin ist ein salzlösliches Hexamer mit einer Molmasse von 300-

350 kD welches aus drei Untereinheiten: cru1, cru2/3 und cru4 besteht [251-

253]. Napin ist wasserlöslich (13 kD) und enthält zwei durch Disulfid-

Bindungen gekoppelte Polypeptide (9 kD und 4 kD) [254-256].

Einen Schwerpunkt der Forschung an Raps bildet die Charakterisierung von

so genannten „metallothionein-like-genes“ (vgl. 1.5.4.2). Diese Gene wurden

einerseits in Brassicaceen nachgewiesen [160], aber auch die Expression

von MT II kodierenden Genen in Brassica napus ist beschrieben [246]. Die

Genexpression resultiert in einer stark erhöhten Cadmiumtoleranz der

untersuchten transgenen Pflanzen [257]. In anderen Untersuchungen wurden

Kalzium-bindende Proteine aus Rapsblütenstaub isoliert. Es wurde ein Gen

isoliert, welches für eines dieser Proteine (8,6 kD) kodiert. Das Gen wird als

BPC1 (Brassica napus pollen calcium-binding protein 1) bezeichnet [258].

Eine Veröffentlichung beschreibt die Isolierung von Cadmium- und Thallium-

bindenden Substanzen aus Rapsblättern. Es wurden hoch- (>80 kD) und

niedermolekulare (4,4 kD) Cadmium-Bindungsformen isoliert. Die Amino-

säureanalyse dieser Substanzen ergab keine schwefelhaltigen Aminosäuren

[259], so dass es sich nicht um Metallothioneine handelt. Zudem wurden

Phytochelatine in den Blättern von Raps nachgewiesen [182].

Keine der vorliegenden Veröffentlichungen hat sich den Ursachen für die im

Vergleich zu Rapssamen hohen Cadmium- und Nickelgehalte in

Sonnenblumenkernen gewidmet. Beschrieben ist, dass Sonnenblumen sich

in ihrer Cadmiumaufnahme von anderen zweikeimblättrigen Pflanzen

unterscheiden. Sonnenblumen nehmen ähnlich wie einkeimblättrige Pflanzen

20 Einleitung und Zielsetzung

(z.B. Weizen), größere Mengen an Cadmium auf [6]. Die Ursachen für diese

Unterschiede sind allerdings nicht systematisch untersucht worden.

1.8 Zielsetzung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist, die Ursachen der Unterschiede in den

Cadmium- und Nickelgehalten von Sonnenblumen und Raps aufzuklären.

Folgende Kernfragen stehen dabei im Mittelpunkt:

Lokalisierung von Schwermetallen:

¾

In welchem Maße werden verschiedene Schwermetalle von

Sonnenblumen und Raps akkumuliert?

¾

Existieren Unterschiede bei der Schwermetallakkumulation durch

Sonnenblumen und Raps?

¾

In welchen Pflanzenorganen und Zellorganellen werden die

Schwermetalle bevorzugt akkumuliert?

Transport von Schwermetallen

¾

Inwieweit sind Unterschiede im Schwermetalltransport für die

Unterschiede im Schwermetallgehalt von Sonnenblumen- und

Rapspflanzen verantwortlich? Orientierende Untersuchungen des

Xylemsaftes sollen erste Rückschlüsse ermöglichen.

Analyse der Bindungsformen von Schwermetallen

¾

An welche löslichen und unlöslichen Zellbestandteile sind Schwer-

metalle in Sonnenblumen und Raps gebunden? Lösliche Zellbestand-

teile sind Komplexbildner wie Metallothioneine oder organische

Säuren. Zu den unlöslichen Zellbestandteilen zählen die Zellwände

und Zellmembranen.

¾

Welche Schutz- bzw. Regelungs-Mechanismen (vgl. 1.6) sind an der

Schwermetall-Toleranz von Sonnenblumen und Raps beteiligt?

¾

Unterscheiden sich die von den Ölsaaten genutzten Mechanismen?

1.8 Untersuchungsmethodik

Vor diesem Hintergrund werden bei Sonnenblumen und Raps vergleichende

Untersuchungen bezüglich Verteilung, Transport, Speicherung und

Bindungsformen von Cadmium, Nickel, Eisen, Kupfer und Zink durchgeführt.

Auswahl der analysierten Schwermetalle

Cadmium und Nickel wurden wegen des in Tabelle 1 dargestellten Unter-

schiedes in der Schwermetallakkumulation von Sonnenblumenkernen und

Rapssamen ausgewählt, Kupfer wegen dessen hoher Affinität zu Phyto-

chelatinen [260]. Eisen und Zink wurden als essenzielle Elemente mit

einbezogen. Zudem ist der anthropogen bedingte Elementeintrag in die

Umwelt für die ausgesuchten Schwermetalle sehr hoch [20]. Auf

Untersuchungen für Blei wurde verzichtet, weil der anthropogen bedingte

Eintrag von Blei in die Umwelt während der vergangenen Jahre deutlich

Einleitung und Zielsetzung 21

reduziert wurde [16-19]. Ferner deuten bisherige Untersuchungen an, dass

Blei von Pflanzen überwiegend aus der Luft (40-100 %) und nicht über das

Wurzelsystem aufgenommen wird [261]. Unterschiede in den Bleigehalten

von Pflanzen wären demnach weniger auf pflanzenspezifische als auf

anthropogene Ursachen zurückzuführen.

Abbildung 13 zeigt schematisch die im Rahmen dieser Arbeit vorgesehene

methodische Untersuchungsweise.

Abb. 13: Schematische Darstellung der Untersuchungsmethodik

Extraktion mit Tris-HCl –Puffer

Pflanzengrundorgane

(Lagerung bei - 80°C)

Wässrige Fraktion

Lösliche Bestandteile des

Extraktes

Native Schwermetall-

Bindungsformen

Aminosäurenanalyse Fluoreszenz-HPLC

Strukturanalytische Untersuchungen

der Schwermetall-Bindungsformen

ESI-MS / ESI-MSMS

Isolierung der Schwermetall-Bindungsformen

Sonnenblumen- und Rapspflanzen

¾landwirtschaftlichem Praxis

¾Anzucht in Hydrokultur

Separierung in die Pflanzengrundorgane:

Wurzel, Stängel, Blätter, Frucht

Bestimmung der SM-Totalgehalte

in den Pflanzengrundorganen mit

AAS und DCP

Bestimmung der SM-Gehalte im

Zentrifugationsrückstand und der

wässrigen Fraktion

Isolierung von Organellen;

(Hydrokultur);

Best. der Leitenzyme und der

SM-Totalgehalte

Zentrifugation

Homogenat

Zentrifugationsrückstand

Gewinnung von Xylemsaft

(Hydrokultur); Best. der SM-

Gehalte im Xylemsaft

SM-Gehalte im Homogenat

Fettfraktion

(nur bei Ölsaaten)

Best. der SM-Gehalte in

der Fettfraktion

Schwermetallverteilung

Bindungsformen

Strukturanalytische

Untersuchungen

22 Einleitung und Zielsetzung

Sonnenblumen und Raps aus landwirtschaftlichem Anbau

Zunächst werden die Probenahmen von Sonnenblumen- und Rapspflanzen

aus der landwirtschaftlichen Praxis durchgeführt. Die Probenahme und

Probenaufbereitung sind entscheidende Arbeitsschritte bei der Spezies-

analytik. Denn die unsachgemäße Probenahme und Lagerung der Proben

führt bereits zu einer Veränderung der ursprünglichen („nativen“)

Schwermetallspezies bzw. -Bindungsformen. Deshalb ist bei der

Probenahme auf eine schnelle Überführung der Proben in einen stabilen

Zustand zu achten. Dieses bedeutet im Allgemeinen, dass die Proben nach

Reinigung und Separierung in flüssigem Stickstoff schockgefroren und

anschließend bei – 80°C gelagert werden [26, 113, 262]. Für die eigenen

Untersuchungen werden die erhaltenen Pflanzen zunächst in ihre

Grundorgane Wurzel, Stängel, Blatt, Saaten zerlegt, mit destilliertem Wasser

gewaschen, in flüssigem Stickstoff schockgefroren, homogenisiert und bei

-80°C bis zur weiteren Bearbeitung gelagert. Zwischen der Probenahme auf

dem Feld und dem Ende der Probenaufbereitung im Labor liegen maximal 5

Stunden. Es wird daher angenommen, dass eine Veränderung der

natürlichen („nativen“) Elementspezies weitestgehend vermieden wird (vgl.

1.5).

Anzucht von Sonnenblumen und Raps in Hydrokultur

Sonnenblumen und Raps werden unter definierten Wachstumsbedingungen

in Hydrokultur angezüchtet, wobei Anzuchtversuche in Cadmium-dotierter

Nährlösung von besonderer Bedeutung sind (vgl. 11.1). Verschiedene

Cadmium-Konzentrationen werden angewendet, um den Einfluss von Cd2+

auf die Entwicklung von Sonnenblumen- und Rapspflanzen sowie auf die

Cadmiumaufnahme systematisch zu erfassen (vgl. Kapitel 3).

Schwermetallverteilung in Sonnenblumen und Raps

Die Verteilung von Cadmium, Eisen, Kupfer, Nickel und Zink wird in den

Grundorganen (Wurzel, Stängel, Blätter, Frucht) von Sonnenblumen- und

Rapspflanzen aus dem landwirtschaftlichen Anbau und der Anzucht in

Hydrokultur bestimmt werden. Bei diesen Untersuchungen sollten Element-

spezifische physiologische Barrieren in Sonnenblumen- und Rapspflanzen

identifiziert werden. Es wird z.B. erwartet, dass der Eisengehalt in den

Wurzeln von Sonnenblumen- und Rapspflanzen im Vergleich zum übrigen

Pflanzenteilen sehr viel höher ist [22, 263].

Eine weitere Differenzierung der Metallverteilung erfolgt durch Analyse der

Schwermetallgehalte in verschiedenen Zellorganellen wie Chloroplasten,

Mitochondrien und Peroxisomen. Die Isolierung der Organellen erfolgt aus

Kotyledonen von fünf Tage alten Sonnenblumen- und Rapskeimlingen. Dazu

werden die Keimlingsblätter von Sonnenblumen und Raps in isotonischen

Medien (Mannitol, Saccharose) homogenisiert und über Percoll-Dichte-

gradienten zentrifugiert (vgl. 11.12). Auf diese Weise werden Fraktionen

gewonnen, die Organellen (Chloroplasten, Peroxisomen, Mitochondrien)

oder Zellwände angereichert enthalten [264-268]. In den Fraktionen wird

nach einem mikrowellengestützten oxidierenden Nassaufschluss (vgl. 11.6)

Einleitung und Zielsetzung 23

der Schwermetallgehalt mit der Atomabsorptions- und Atomemissions-

spektrometrie (AAS, DCP) bestimmt. Die Qualität der Analysendaten wird

durch zertifizierte Referenz-Standards überprüft (vgl. 11.7).

Schwermetalltransport

Zur Charakterisierung des Ferntransports in der Pflanze werden auch

Schwermetallkonzentrationen in Xylemsaft bestimmt. Für die Gewinnung von

Xylemsaft (vgl. 11.11) werden 25 Tage alte Sonnenblumen- und

Rapspflanzen aus der Anzucht in Hydrokultur eingesetzt. Die Bestimmung

der Schwermetallgehalte erfolgt nach Nassaufschluss.

Schwermetallbindungsformen

Die bisher geplanten Untersuchungen beschäftigen sich ausschließlich mit

der Bestimmung von Elementtotalgehalten. Wie in Kapitel 1.5 beschrieben,

ist die Bindungsform entscheidend für die Bioverfügbarkeit eines Schwer-

metalles, d.h. für dessen Mobilität und biologische Wirkungsweise. Sowohl

für Sonnenblumen als auch Raps liegen zu den Schwermetallbindungs-

formen nur wenige Erkenntnisse vor (vgl. 1.7). Deshalb sollen verschiedene

Bindungsformen von Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink aus den vegetativen

und generativen Pflanzenteilen von Sonnenblumen und Raps extrahiert und

nachgewiesen werden.

Der Erhalt der „nativen“ Bindungsformen während aller analytischen

Arbeitsschritte stellt die entscheidende Voraussetzung für diese Zielsetzung

dar [26, 269, 270], wobei die Auswahl eines geeigneten Puffersystems für die

Extraktion der Schwermetall-Bindungsformen aus pflanzlichen Matrices von

entscheidender Bedeutung ist, um die Bildung von so genannten

„Artefakten“, d.h. von nicht-nativen Schwermetall-Bindungsformen

weitestgehend zu verhindern. Für Zink, Kupfer und Cadmium sind z.B. pH-

Werte unter 5 zu vermeiden, weil ansonsten diese Schwermetalle aus den

Bindungsformen herausgelöst werden [271]. Von der IUPAC („Comission on

Microchemical Techniques and Trace Analysis“) wurden Anforderungen

beschrieben, die eine bei der Extraktion von Schwermetall-Bindungsformen

eingesetzte Pufferlösung erfüllen sollte [271]:

• geringe Komplexbildungseigenschaften.

• Ausreichend hohe Ionenstärke des Puffers, um Wechselwirkungen der

Schwermetall-Bindungsformen mit dem Säulenmaterial bei der

Gelchromatographie zu unterdrücken.

Ein häufig verwendetes Pufferreagenz ist Tris(hydroxymethyl)aminomethan

(Tris).

Abb. 14: Strukturformel von Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris)

CCH2OH

CH2OH

HOH2C

NH2

24 Einleitung und Zielsetzung

Tris (pKs 8,3) ist über einen weiten pH-Bereich stabil, wobei der gewünschte

pH-Wert der Pufferlösung bevorzugt mit verdünnter Salzsäure eingestellt

wird (vgl. 11.2). Tris-Puffer zeichnet sich durch eine geringe Ionenstärke und

eine geringe Neigung zur Komplexbildung mit zweiwertigen Schwermetall-

ionen aus [272-275] und erscheint daher besonders geeignet, die

Schwermetall-Bindungsformen in ihrer nativen Form zu belassen [271-275].

Häufig wird ein Tris-HCl-Puffer mit einem pH-Wert von 7,4–9 und einer

Konzentration von 10–50 mmol/L zur Extraktion von Schwermetall-

Bindungsformen eingesetzt. Diese Vorgehensweise ist z.B. für Extrakte aus

Rapspflanzen, dem Gras Agrostis gigantea, der Rauwolfie Rauvolfia

serpentina, Hafer, Weizen und zahlreiche weitere Pflanzen beschrieben [44,

143, 259, 271, 276-280]. Im Gegensatz zum Tris-Puffer lassen

Pufferlösungen mit hoher Ionenstärke wie Ammoniumacetat- und

Kaliumchloridlösungen nur die Isolierung von Ionen bzw. niedermolekularen

Schwermetall-bindenden Substanzen zu. Erst bei geringer Ionenstärke sind

mit diesen Puffersystemen auch höhermolekulare Schwermetall-

Bindungsformen nachweisbar [276, 277]. Bei den eigenen Untersuchungen

wird entgaster Tris-Puffer (0,05 mol/L; pH 8,0) zur Extraktion der löslichen

Schwermetall-Bindungsformen aus Sonnenblumen- und Rapspflanzen

verwendet (vgl. Kapitel 6).

Die Ermittlung der Extraktionsausbeuten erfolgt durch eine Bilanzierung der

Schwermetalle. Der Extraktionsrückstand wird ebenfalls auf seinen Schwer-

metallgehalt untersucht, um den Anteil des an unlösliche Zellbestandteile

(Organellmembranen, Zellwände usw.) gebundenen Schwermetalles

abzuschätzen.

Eine Standardmethode zur Trennung von Schwermetall-bindenden

Substanzen unter Erhalt der Bindungsformen, die auch im Rahmen dieser

Arbeit angewendet wird, ist die Gelfiltrationschromatographie (GFC) [26,

259, 262, 271, 277]. Ein UV-Detektor misst die Absorption bei 280 nm und

ein nachgeschalteter Leitfähigkeits-Detektor die zugehörige Leitfähigkeit des

Eluates.

Als Gelmaterial dienen Dextrangele. Diese haben gegenüber Silicagelen den

Vorteil, dass niedermolekulare Proteine in geringerem Maße von dem

Säulenmaterial adsorbiert werden [271, 276, 277, 281-283]. Die

Substanztrennung erfolgt bei der GFC nach der Molekülgröße.

Als Elutionsmittel dient ebenfalls die zuvor bei der Extraktion verwendete

entgaste Tris-HCl-Pufferlösung (0,05 mol/L; pH 8,0). Einige Autoren

beschreiben den Zusatz von Mercaptoethanol zum Elutionspuffer [271, 276,

284, 285]. Das reduktive Milieu soll eine Oxidation der Schwermetall-

Bindungsformen durch Luftsauerstoff bei der Gelfiltration sowie die

Adsorption von Proteinen an der Geloberfläche verhindern.

Freie Cadmium-Ionen im Extrakt werden durch Mercaptoethanol

abgefangen, ein Abspalten von Cadmium aus den nativen Bindungsformen

unter Bildung von Komplexen mit Mercaptoethanol ist dagegen nicht

beschrieben [271]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden die

Schwermetall-bindenden Komponenten daher sowohl unter nicht-

Einleitung und Zielsetzung 25

reduzierenden als auch unter reduzierenden Bedingungen aus den

Pflanzenorganen extrahiert und mit der Gelfiltration getrennt (vgl. 6.3).

Die Kalibration der verwendeten Chromatographiesäulen mit zertifizierten

Proteinstandards (z.B. Albumin) und die Elutionsbedingungen bei der

Gelfiltration sind in Kapitel 11.3 ausführlich beschrieben.

Durch die Analyse der Cadmium-, Kupfer-, Nickel- und Zinkgehalte in den

Fraktionen der Gelfiltration mit AAS und DCP (vgl. 11.7) lassen sich den

löslichen Schwermetall-bindenden Substanzen an Hand der chromatogra-

phischen Kenngrößen Molmassen zuordnen (vgl. 11.3).

Strukturanalytische Untersuchungen der Bindungsformen

Die löslichen Cadmium-Bindungsformen aus Sonnenblumen- und Raps-

wurzeln sowie den Ölsaaten sollen unter Erhalt der Bindungsform von dem

Überschuss an Begleitstoffen getrennt und anschließend strukturanalytisch

untersucht werden. Zur Aufreinigung kann unter anderem die Ionenaus-

tauscher-Chromatographie (IAC) verwendet werden [271, 276, 286-288].

Die IAC (vgl. 11.4) hat den Vorteil, dass die zu isolierende Substanz

konzentriert wird, nachdem zuvor bei der GFC eine Verdünnung erfolgt ist.

Die Cadmium-haltigen Fraktionen der IAC werden durch GFC umgepuffert

und anschließend lyophilisiert.

Die lyophilisierten Cadmium-haltigen Substanzen werden strukturanalytisch

untersucht. Als mögliche Cadmium-bindende Substanzen werden

Phytochelatine vermutet, welche Thiolgruppen enthalten. Mit der HPLC wird

daher geprüft, ob die isolierten Substanzen Thiolgruppen enthalten. Im

Rahmen dieser Arbeit wird die Fluoreszenz-HPLC (vgl. 11.5) nach vor-

heriger Derivatisierung der thiolhaltigen Substanzen mit Monobrombiman

verwendet [199, 289, 290-295]. Diese Methode hat gegenüber der alternativ

anwendbaren Nachsäulenderivatisierung mit Ellmann`s Reagenz den Vorteil

einer um den Faktor 1000 niedrigeren Nachweisgrenze von 3 pmol [290]. Die

optimalen Derivatisierungsbedingungen sind ebenso wie der Gradienten-

verlauf im Rahmen einer dem Projekt angegliederten weiteren Diplomarbeit

erarbeitet worden [296].

Ein Teil der lyophilisierten Cadmium-haltigen Substanzen wird für eine

Aminosäurenanalyse vorbereitet (vgl. 11.13), um an Hand des Aminosäure-

profils zu klären, ob es sich bei den isolierten Cadmium-Bindungsformen um

Phytochelatine handelt oder nicht. Weitere strukturanalytische Informationen

erhoffen wir uns von dem Einsatz der Elektrospray-MS [297, 298].

In den folgenden Kapiteln werden die Ergebnisse der beschriebenen

Untersuchungsmethoden bzw. -verfahren dargestellt und interpretiert.

26 Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau

2 Schwermetalle in Sonnenblumen- und Rapspflanzen

aus landwirtschaftlichem Anbau

Allgemein ist der Schwermetallgehalt in den verschiedenen Pflanzengrund-

organen sehr unterschiedlich [66, 216, 299-301]. Die Schwermetallverteilung

in landwirtschaftlichen Kulturpflanzen zeigt in der Regel einen abnehmenden

Gradienten von der Wurzel über Stiel und Blatt bis zur Frucht [51, 302-304].

Ausnahmen sind Salat, Kohl, Wasserkresse, in denen der Schwermetall-

gehalt in den Wurzeln niedriger ist als im Spross [64]. Für Sonnenblumen

und Raps liegen nur wenige Ergebnisse zur Schwermetallverteilung vor (vgl.

1.7).

Im Folgenden wird deshalb die Verteilung von Cadmium, Nickel, Kupfer,

Eisen und Zink in den Grundorganen (Wurzel, Stängel, Blätter, Frucht) von

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus dem landwirtschaftlichen Anbau

untersucht.

2.1 Sonnenblumenkerne

Die im Rahmen dieser Arbeit untersuchten Sonnenblumenkerne stammen

von Proben der staatlichen „Wertprüfung“ von Sonnenblumenkernen aus

verschiedenen deutschen Anbaugebieten. Ein großer Teil der Untersuchun-

gen wurde an Sonnenblumenkernen der Sorte „Petra“ der Ernten 1996-98

durchgeführt.

Tabelle 5 zeigt die Schwermetallgehalte in den untersuchten bzw. für die

Pflanzenanzucht verwendeten Sonnenblumenkernen.

Tab. 5: Schwermetallgehalte der untersuchten Sonnenblumenkernmuster

Mittelwert; geschälte Sonnenblumenkerne (n = 5);

Mittelwerte; Sonnenblumenkerne der Sorte „Petra“, Ernte 1996-98 (n = 3)

Ölsaaten Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kg TS]

SBK (Mischmuster, geschält) 0,505 4,0 25 56 56

SBK (Sorte Petra, 1996) 0,232 2,3 20 50 36

SBK (Sorte Petra, 1997) 0,215 2,0 18 58 51

SBK (Sorte Petra, 1998) 0,288 2,1 22 49 51

2.2 Rapssamen

Die untersuchten Rapssamen stammen von Mustern der „Besonderen

Ernteermittlung“ (BEE) einer Monitoring-Untersuchung des Bundes und der

Länder, die an der BAGKF in Detmold durchgeführt wurde. Weitere

Rapssamen stammen von Probenahmen auf Feldern in der Nähe von

Detmold (1998, 2000). Die Schwermetallgehalte der untersuchten

Rapssamen sind in Tabelle 6 dargestellt.

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau 27

Tab. 6: Schwermetallgehalte der untersuchten Rapssamenmuster

Mittelwerte, n = 3

Ölsaaten Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kg TS]

Rapssamen (Mischmuster) 0,046 0,46 15 90 44

Rapssamen (BEE 1996) 0,039 0,43 7,5 70 40

Rapssamen (Dt-Mosebeck, 1998) 0,048 0,31 3,3 85 46

Rapssamen (Dt-Mosebeck, 2000) 0,036 0,49 2,6 63 35

Der in Tabelle 1 gezeigte Unterschied der Cadmium- und Nickelakkumulation

in Sonnenblumen- und Rapssamen wird auch beim Vergleich von Tabelle 5

und 6 deutlich. Die untersuchten Sonnenblumenkerne akkumulieren fünf bis

zehnmal so viel Cadmium und Nickel wie Rapssamen. Demgegenüber

unterscheidet sich der Eisen- und Zinkgehalt nur unwesentlich. Auffällig sind

die unterschiedlichen Kupfergehalte. Der Kupfergehalt ist in den

Mischmustern deutlich höher als in den Einzelproben. Eine ähnliche

Beobachtung wird bei den Sonnenblumenkernen der Sorte „Petra“ gemacht,

deren Cadmiumgehalt ebenfalls sehr viel niedriger ist als in den untersuchten

Sonnenblumenmischmustern. Es ist zu vermuten, dass diese Ergebnisse auf

Unterschiede in der Bioverfügbarkeit der Schwermetalle zurückzuführen und

somit geogen bedingt sind.

2.3 Sonnenblumen

Die für diese Untersuchungen verwendeten Sonnenblumenpflanzen

stammen von zwei Standorten. Die erste Probenahme fand im August 1998

in Unterfranken und eine Weitere im August 1999 in der Nähe von Vinsebeck

(Ostwestfalen) jeweils während der Reifeperiode statt. Das Reifestadium der

Sonnenblumenkerne wird anhand des Wasser- und Fettgehaltes der Proben

abgeschätzt. In den nicht ausgereiften Sonnenblumenkernen der Probe-

nahmen in Unterfranken und Vinsebeck ist der Wassergehalt mit 85 %

deutlich höher als in den Ausgereiften mit weniger als 10 %. Dagegen ist der

Fettgehalt in den nicht ausgereiften Sonnenblumenkernen mit etwa 15 %

deutlich niedriger als in den reifen Sonnenblumenkernen mit ca. 50 %.

Tab. 7: Schwermetallgehalte in Sonnenblumenpflanzen aus landwirtschaft-

lichem Anbau während der Reifeperiode (Unterfranken, 1998)

Mittelwerte, n = 5

Pflanzenteil Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kg TS]

Wurzeln 0,785 5,3 17

1500 31

Stängel 0,170 0,4 4,3 46 9,2

Blätter 0,523 2,9 39 255 48

Korb 0,220 1,4 9,3 50 19

Sonnenblumenkerne 0,166 4,2 14 71 47

28 Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau

Auffällig ist der sehr hohe Eisengehalt in den Wurzeln (1500 mg/kg TS),

welcher sich innerhalb der Pflanze nicht in gleichem Maße fortsetzt. Die

Cadmium- und Nickelgehalte sind ebenfalls in den Wurzeln am höchsten.

Zink wird bevorzugt in den Blättern (48 mg/kg TS) und Saaten (47 mg/kg TS)

akkumuliert. Eisen und Kupfer sind Bestandteile des Photosynthese-

apparates, was erklärt, warum die höchsten Kupfer- (39 mg/kgTS) und

erhöhte Eisengehalte (255 mg/kg TS) in den Blättern zu beobachten sind.

Die Cadmium-, Nickel-, Kupfer- und Zinkgehalte sind in den aus Vinsebeck

stammenden Sonnenblumen zumeist etwas höher als in den Sonnen-blumen

aus Unterfranken. Einzig der Eisengehalt ist in den Wurzeln der

Sonnenblumen aus Vinsebeck mit 900 mg/kg TS niedriger als in den

Wurzeln der Sonnenblumen aus Unterfranken. Tabelle 8 vergleicht

exemplarisch die Cadmium- und Nickelgehalte.

Tab. 8: Vergleich der Cadmium- und Nickelgehalte in Sonnenblumen aus der

landwirtschaftlichen Praxis für die Probenahmen 1998 in

Unterfranken und 1999 in Vinsebeck

Tabelle 8 zeigt, dass der Cadmiumgehalt in den Sonnenblumen aus

Vinsebeck höher ist als in den Sonnenblumen aus Unterfranken. Der Nickel-

gehalt ist in den Wurzeln (14 mg/kg TS) und den Kernen (7 mg/kg TS) der

Sonnenblumen aus Vinsebeck in etwa doppelt so hoch wie in den

Sonnenblumen aus Unterfranken. Auffällig ist, dass für beide Sonnenblumen-

pflanzen der Nickelgehalt in den Blättern mit 2-3 mg/kg TS ähnlich hoch ist.

Ein erhöhter Nickelgehalt in den Wurzeln von Sonnenblumen ist anscheinend

nicht mit einer Erhöhung des Nickelgehaltes in den Blättern verbunden.

Der Cadmiumgehalt ist in den nicht ausgereiften Sonnenblumenkernen

(Abbildung 15) mit etwa 0,2 mg/kg TS deutlich niedriger als in den

Ausgereiften mit durchschnittlich 0,4 mg/kg TS (Tabelle 1). Demgegenüber

sind die Kupfer-, Nickel- und Zink-Gehalte in nicht ausgereiften und

ausgereiften Sonnenblumenkernen, bezogen auf die Trockensubstanz, in der

gleichen Größenordnung. Möglicherweise ist die Einlagerung von Cadmium

in die Sonnenblumenkerne zum Zeitpunkt der Probenahme noch nicht

abgeschlossen. Dieses wäre ein Hinweis darauf, dass der Cadmiumgehalt in

SB-Kerne

Blätter

Stängel

Wurzeln

Unterfranken 1998

Vinsebeck 1999

Cadmium Nickel Cadmium Nickel

[µg/kgTS]

0,166

0,523

0,170

0,785

4,21

2,88

0,35

5,32

0,196

1,03

0,29

1,00

7,2

2,40

0,32

13,6

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau 29

den Sonnenblumenkernen ähnlich wie der Cadmiumgehalt in Weizenkörnern

vom Reifestadium abhängt.

Sonnenblumen und Raps sind zweikeimblättrige Pflanzen. Im Gegensatz

zum Raps akkumulieren Sonnenblumen allerdings ähnlich wie

einkeimblättrige Pflanzen (z.B. Weizen) größere Mengen an Cadmium. In

Kapitel 1.4 wurde für Weizen beschrieben, dass Cadmium, Nickel und Zink

während der Reifeperiode in Weizenkörnern angereichert werden. Hierfür

wird eine Remobilisierung dieser Schwermetalle während der generativen

Wachstumsphase über das Phloem verantwortlich gemacht [79-88].

Untersuchungen zum Schwermetallgehalt in den Schalen von Sonnenblu-

menkernen könnten einen ersten Hinweis liefern, dass die für Weizen

beschriebene Remobilisierung von Cadmium, Nickel und Zink über das

Phloem bei Sonnenblumen ebenfalls eine Rolle spielt. Tabelle 9 zeigt die

Schwermetallverteilung in geschälten Sonnenblumenkernen der Ernte 1996:

Tab. 9: Schwermetallgehalte in Schalen und geschälten Kernen von

Sonnenblumen (Mischmuster 1996, geschält)

Mittelwerte; n = 3

Cadmium Nickel Kupfer Zink

[mg/kgTS]

Kerne 0,51 4,0 25 56

Schale 0,20 2,0 21 23

Bei Sonnenblumenkernen ist der Gehalt an Cadmium, Nickel und Zink im

geschälten Kern deutlich höher (Faktor 2-3) als in der Schale. Dem-

gegenüber ist der Kupfergehalt in den Schalen und den geschälten Sonnen-

blumenkernen nahezu identisch. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen

entsprechen den Beobachtungen für Weizenkörner. In den Spelzen von

Weizenkörnern werden Phloem-mobile Schwermetalle wie Cadmium, Nickel

und Zink im Gegensatz zu Xylem-mobilen wie Mangan nur in geringem Maße

angereichert [88]. Es ist daher zu vermuten, dass die höheren

Cadmiumgehalte in den Sonnenblumenkernen wie bei Erdnuss, Weizen, und

Linsen auf einen Cadmiumtransport über das Phloem zurückzuführen sind.

Die Abbildungen 15 a-c zeigen für Sonnenblumenpflanzen der Probenahmen

1998 und 1999 die prozentuale Verteilung von Cadmium, Kupfer, Eisen,

Nickel und Zink in Sonnenblumen- und Rapspflanzen.

Abb. 15 a: Verteilung von Cadmium und Kupfer auf die vegetativen Pflanzen-

teile von Sonnenblumen

Kupfer

Blätter

20%

Sonstiges

10%

Stängel

15%

Wurzeln

20%

SBK

20%

Restkorb

15%

Stängel

25%

Wurzeln

35%

SBK

10%

Blätter

11%

Restkorb

13 %

Sonstiges

6 %

Cadmium

30 Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau

Abb. 15 b: Verteilung von Eisen und Nickel auf die vegetativen Pflanzenteile

von Sonnenblumen

Abb. 15 c: Verteilung von Zink auf die vegetativen Pflanzenteile von

Sonnenblumen

Abbildungen 15 a-c zeigen, welches Pflanzengrundorgan von Sonnenblumen

eine Senke (engl. „sink“) für Schwermetalle darstellt. Cadmium, Kupfer und

Zink werden zu etwa 50-60 % in die oberirdischen vegetativen Pflanzenteile

verlagert. Dagegen ist dieser Anteil für Nickel mit 40 % deutlich geringer.

Sonnenblumenkerne scheinen zu diesem Reifestadium keine Senke für

Cadmium (10 %) und Eisen (5 %) zu sein, während 20-30 % des gesamten

Kupfers, Nickels und Zinks in den Kernen nachzuweisen sind. Sonnen-

blumenstängel sind für Cadmium (25 %) eine Schwermetallsenke. Zudem

wird deutlich, dass die Blätter von Sonnenblumen mit Ausnahme von Kupfer

(20 %) nicht als ausgeprägte Schwermetallsenke fungieren. Die Wurzeln

enthalten zwischen 20 und 35 % des gesamten Cadmiums, Kupfers, Nickels

und Zinks sowie 80 % des gesamten Eisens. Im Übergang von den Wurzeln

zu den oberirdischen Pflanzenteilen existiert für Eisen somit eine besonders

effektive Barriere.

Des Weiteren verdeutlichen die Ergebnisse, dass die Akkumulation von

Cadmium in den nicht ausgereiften Sonnenblumenkernen zum Zeitpunkt der

Probenahme noch nicht abgeschlossen ist. Der in den Sonnenblumen-

kernen enthaltene Cadmiumanteil beträgt etwa 20 % des in den ober-

irdischen Pflanzenteilen enthaltenen Cadmiums (Abbildung 16 a).

TRAULSEN [5] berichtet hingegen, dass dieser Anteil bei ausgereiften

Sonnenblumenkernen mit etwa 60 % sehr viel höher ist. Diese Ergebnisse

weisen darauf hin, dass bei Sonnenblumen ähnlich wie bei Weizen die

Cadmiumeinlagerung während der gesamten Entwicklung der Kerne anhält.

Zink

Blätter

13%

Restkorb

15%

SBK

30%

Wurzeln

17% Stängel

17%

Sonstiges

8 %

Nickel

Sonstiges

15%

Stängel

10%

Wurzeln

30%

SBK

30%

Restkorb

10%

Blätter

Restkorb

SBK

Wurzeln

80%

Stängel

Sonstiges

Eisen

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau 31

2.4 Raps

Im Folgenden werden die Ergebnisse von Untersuchungen an Rapspflanzen

aus landwirtschaftlicher Anzucht vorgestellt. Für Rapspflanzen wurden drei

Probenahmen in Detmold-Mosebeck (Ostwestfalen) durchgeführt. Im Juli

1998 und 2000 jeweils zum Ende der Reifeperiode sowie im April 2000

während der Blütephase von Rapspflanzen.

Tab. 10: Schwermetallgehalte in Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem

Anbau zum Zeitpunkt der Blüte (Detmold-Mosebeck; April 2000)

Mittelwerte; n = 5

Pflanzenteil Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kg TS]

Wurzeln 0,356 1,80 4,64 610 78

Stängel 0,117 0,40 2,86 50 27

Blattstängel 0,261 0,41 1,36 70 13

Blätter 0,255 0,69 3,96 190 28

Blüten (komplett) 0,260 2,20 10,3 130 110

Die höchsten Kupfer- und Zinkgehalte sind in Wurzeln, den Blüten sowie

den Blättern von Rapspflanzen nachweisbar, wobei die höheren Gehalte in

den oberirdischen Pflanzenteilen zu finden sind. Nickel wird hauptsächlich in

den Wurzeln und den Blüten angereichert. Auffällig ist, dass die Blätter mit

0,7 mg/kg TS nur sehr wenig Nickel enthalten. Der Cadmiumgehalt ist in den

Grundorganen von Rapspflanzen mit 0,26-0,36 mg/kg TS ähnlich.

Der höchste Eisen-Gehalt (610 mg/kg TS) wird, wie zuvor bei Sonnen-

blumen, in den Wurzeln von Rapspflanzen beobachtet. Im Gegensatz zu

Sonnenblumen (Tabelle 7) wird Eisen in Rapspflanzen auch zu einem

beträchtlichen Teil in die Blätter und Blüten verlagert.

Wie zuvor bei Sonnenblumen wird auch bei Rapspflanzen die Verteilung der

untersuchten Schwermetalle zwischen den verschiedenen Pflanzenorganen

vergleichend betrachtet, um mögliche Schwermetallsenken zu erkennen.

Abb. 16 a: Verteilung von Cadmium und Kupfer auf die vegetativen Pflanzen-

teile von Raps

Kupfer

Blätter

30%

Wurzeln

16%

Stängel

36%

Blüten

Blattstängel

5 %

Blütenblätter

9 %

Cadmium

Blätter

32%

Wurzeln

22%

Stängel

20%

Blüten

Blütenblätter

6 %

Blattstängel

18 %

32 Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau

Abb. 16 b: Verteilung von Eisen und Nickel auf die vegetativen Pflanzenteile

von Raps

Abb. 16 b: Verteilung von Zink auf die vegetativen Pflanzenteile von Raps

80-85 % des gesamten in der Rapspflanze enthaltenen Cadmiums, Kupfers

und Zinks werden in den oberirdischen Pflanzenteilen angereichert. Dieser

Anteil ist für Nickel mit 65 % und Eisen mit 40 % deutlich geringer. Im

Gegensatz zu Sonnenblumen sind die Blätter bei Rapspflanzen für

Cadmium, Kupfer, Eisen, Nickel und Zink eine bedeutende Schwermetall-

senke. Eisen wird bei Rapspflanzen ebenfalls zum überwiegenden Teil in

den Wurzeln akkumuliert (60 %).

Nachfolgend werden die Schwermetallgehalte in Rapspflanzen beschrieben,

die 1998 und 2000 jeweils zum Ende der Reifungsperiode geerntet wurden.

Während der Reifungsperiode der Rapspflanzen verholzen die Stiele und die

Blätter sterben ab. Daher stehen bei diesen Pflanzen ausschließlich Wurzel,

Pflanzenstiel und die Rapsschoten für die Schwermetallanalytik zur

Verfügung (vgl. Abbildung 12 b). Die Rapsschoten wurden weiter unterteilt.

Es wurden die Schotenklappen, die Scheidewand und die Samen (vgl. 1.7)

separiert [244, 305, 306] und auf ihren Schwermetallgehalt untersucht. Die

Bestimmung der Schwermetall-Verteilungsmuster war bei diesen Pflanzen

nicht möglich, weil die Schoten bei der Ernte aufplatzten und daher eine

Bilanzierung der Biomasse für die Rapssamen nicht möglich war.

Zink

Wurzeln

16%

Stängel

41%

Blüten

Blütenblätter

7 %

Blätter

25 %

Blattstängel

6 %

Nickel

Wurzeln

35%

Blüten

Blätter

28%

Blattstängel

8 %

Blütenblätter

8 %

Stängel

32 %

Eisen

Blüten

Stängel

10%

Wurzeln

58%

Blätter

24%

Blütenblätte

Blattstängel

5 %

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau 33

Tab. 11: Schwermetallgehalte in Rapspflanzen mit reifen Samen aus landwirt-

schaftlichem Anbau (Detmold-Mosebeck; Juli 1998 und 2000)

Mittelwerte; n = 3

Pflanzenteil Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

Erntezeitpunkt 07.98 07.00 07.98 07.00 07.98 07.00 07.98 07.00 07.98 07.00

[mg/kgTS]

Wurzeln 0,265 0,310 3,5 3,7 4,1 4,3 650 625 31 33

Stängel 0,172 0,176 0,5 0,5 1,4 1,4 23 25 9,3 9,5

Schotenklappen 0,220 0,235 0,8 0,8 2,9 3,0 50 52 7,0 7,2

Scheidewand 0,222 0,230 0,7 0,7 3,2 3,1 60 58 7,1 6,9

Samen 0,042 0,037 0,4 0,4 3,4 2,9 74 73 41 42

Für Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen und Zink sind die höchsten Gehalte in

den Wurzeln der Rapspflanzen nachzuweisen. Es sind allerdings einige

Besonderheiten zu erkennen, die möglicherweise Erklärungsansätze für den

zwischen Sonnenblumenkernen und Rapssamen beobachteten Unterschied

im Cadmium- und Nickelgehalt liefern.

Die Cadmiumgehalte von Rapspflanzen zur Blütezeit (Tabelle 10) und zum

Ende der Reifeperiode (Tabelle 11) sind in den Wurzeln und dem Stängel

annähernd gleich. Des Weiteren fällt auf, dass der Cadmiumgehalt in den

Schotenklappen und der Scheidewand ähnlich hoch ist wie im Rest der

Pflanze. Dagegen ist der Cadmiumgehalt in den Rapssamen, welche in die

untersuchten Schoten eingelagert sind, um den Faktor fünf bis sieben

niedriger als im Rest der Rapspflanze. In Kapitel 1.7 ist beschrieben, dass

die Rapssamen in den Rapsschoten in eine Plazenta eingebettet sind. Zum

Untersuchungszeitpunkt ist diese Plazenta vollkommen eingetrocknet,

sodass es nicht mehr möglich war, deren Schwermetallgehalt zu bestimmen.

Trotzdem ist zu vermuten, dass die Plazenta eine physiologische Barriere

darstellt, die den Eintrag von Cadmium in die Rapssamen behindert.

Dagegen wird der Transport der essenziellen Schwermetalle Kupfer, Eisen,

Nickel und Zink anscheinend nicht wesentlich beeinträchtigt. Die Gehalte

dieser Schwermetalle sind in den vegetativen Pflanzenteilen, den Schoten-

bestandteilen und den Samen ähnlich.

Auch für Nickel zeigt sich eine Besonderheit. Der Nickel-Gehalt in Wurzeln

ist um den Faktor fünf bis zehn höher als im Rest der Rapspflanze. Dieser

Unterschied deutet sich auch für Rapspflanzen an, die während der Blütezeit

geerntet wurden. Der Nickelgehalt in den Wurzeln (Tabelle 9) ist um den

Faktor fünf höher als in den Blättern und im Stängel.

Der Eisengehalt ist wie bei Sonnenblumen und den während der

Blüteperiode geernteten Rapspflanzen in den Wurzeln mit 650 mg/kgTS

besonders hoch. Die möglichen Ursachen für diese eisenspezifische Barriere

in Sonnenblumen- und Rapswurzeln werden im Rahmen der Wachstums-

versuche mit Sonnenblumen- und Rapspflanzen unter Hydrokultur-

bedingungen in Kapitel 5 ausführlich beschrieben.

34 Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus landwirtschaftlichem Anbau

Zwischenbetrachtung

Die Untersuchungen zur Schwermetallverteilung von Cadmium, Nickel,

Kupfer, Eisen und Zink haben für Sonnenblumen und Raps aus der

landwirtschaftlichen Praxis einige wichtige Unterschiede aufgezeigt.

9

Die Cadmium-, Nickel-, Kupfer-, Eisen- und Zinkgehalte sind in den

verschiedenen Pflanzenteilen von Rapspflanzen im Allgemeinen

niedriger als in Sonnenblumenpflanzen. Diese Beobachtung entspricht

den Ergebnissen anderer Untersuchungen [5].

9

Bei Rapspflanzen wurden deutliche Hinweise für eine physiologische

Barriere für Cadmium zwischen Schoten (Plazenta) und den Samen

erhalten.

9

Für Nickel deutet sich bei den untersuchten Rapspflanzen im

Gegensatz zu Sonnenblumen eine physiologische Barriere im

Übergangsbereich vom Wurzelsystem zu den oberirdischen

Pflanzenteilen an.

9

Sonnenblumenkerne akkumulieren im Vergleich zu Rapssamen mehr

Cadmium. Es deutet sich an, dass die Akkumulation von Cadmium

während der gesamten Entwicklung der Sonnenblumenkerne anhält.

Möglicherweise findet während der Reifungsperiode, wie beim

Weizen, über das Phloem eine Cadmiumverlagerung aus den Blättern

und dem Stängel in die Sonnenblumenkerne statt.

Anzuchtversuche in Hydrokultur 35

3 Anzuchtversuche in Hydrokultur

Neben den Untersuchungen an Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus der

landwirtschaftlichen Praxis wurden auch Anzuchtversuche unter

Hydrokulturbedingungen durchgeführt (Abbildung 13). Bei der Anzucht in

Hydrokultur ist im Gegensatz zum landwirtschaftlichen Anbau gewährleistet,

dass Faktoren wie

- der pH-Wert des Bodenmaterials,

- die Pflanzenverfügbarkeit der Nährstoffe,

- die Konstanz der Nährstoffkonzentration,

- die Wachstumsbedingungen

bei jeder Anzucht unverändert sind. Es ist daher möglich, durch die Variation

eines Anzuchtparameters - z.B. der Cadmiumkonzentration der Nährlösung -

direkt die Folgen dieser Veränderung zu beobachten [307, 308].

Dabei wurden die folgenden Versuchsbedingungen optimiert bzw. variiert:

1. Optimierung von Keimung, Nährlösung und Anzuchtbedingungen:

Besondere Bedeutung hat die Optimierung der Keimung, weil aus den

Kotyledonen von fünf Tage alten Sonnenblumen- und Rapskeimlingen

Chloroplasten, Mitochondrien und Peroxisomen isoliert werden sollen.

Die angezüchteten Sonnenblumen- und Rapspflanzen werden für die

Gewinnung von Xylemsaft sowie zur Bestimmung der Schwermetall-

verteilung und -Bindungsformen verwendet.

2. Einfluss der Cadmium-Konzentration

Ein Ziel der vorliegenden Arbeit ist die Isolierung von Cadmium-

bindenden Substanzen aus Sonnenblumen- und Rapswurzeln. Um eine

ausreichend hohe Cadmium-Konzentration in den Wurzeln zu

gewährleisten und um mögliche Schutzmechanismen der Pflanzen

gegenüber Cadmiumstress zu erkennen, werden Sonnenblumen- und

Rapspflanzen in Cadmium-dotierter Nährlösung angezogen. Steigende

Konzentrationen von 1, 2, 5, 10, 20 und 50 µmol/L Cadmium sollen

zeigen, wie viel Cadmium die Pflanzen vertragen, ohne stark geschädigt

zu werden. Die hierbei erhaltenen Cadmium-belasteten Pflanzen werden

zudem zur Gewinnung von Xylemsaft und für die Bestimmung der

Schwermetallverteilung unter Cadmiumstress verwendet. Die Konzen-

trationsbereiche wurden ausgewählt, weil bei vergleichbaren Experi-

menten mit Mais die Wachstumsrate bei 9 µmol/L Cadmium um die

Hälfte [309], bei Gerste dagegen erst ab einer Konzentration von 44

µmol/L Cadmium sank [309].

Bei der Interpretation der Ergebnisse von Anzuchtversuchen in Hydrokultur

ist aber zu berücksichtigen, dass die Wachstumsbedingungen nicht den

Verhältnissen der landwirtschaftlichen Praxis entsprechen. Insbesondere die

Bioverfügbarkeit der Schwermetalle ist unter Hydrokulturbedingungen sehr

viel größer als unter natürlichen Bedingungen [283, 310]. Für die Unter-

suchungen ist aber die Reproduzierbarkeit der Wachstumsbedingungen von

36 Anzuchtversuche in Hydrokultur

größter Bedeutung. Diese Reproduzierbarkeit ist nur durch die Anzucht in

Hydrokultur in einer Wachstumskammer annähernd gewährleistet.

Die Beurteilung der Entwicklungsstadien der Sonnenblumen- und Raps-

pflanzen erfolgt nach STAUß ET AL. [311]. Hierbei wird zunächst das Makro-

stadium beurteilt. Bei der Anzucht in Hydrokultur wurde die Anzucht nach 25

Tagen beendet, sodass sowohl für Sonnenblumen als auch Rapspflanzen

das Makrostadium 1 die so genannte Blattentwicklung vorliegt. Die weitere

Einteilung erfolgt nach der Zahl der entfalteten Blattpaare (Sonnenblumen)

bzw. der Anzahl der entfalteten Laubblätter (Raps) (vgl. 11.1).

3.1 Sonnenblumen

Für die Anzucht werden die Sonnenblumenkerne zunächst oberflächen-

entkeimt. Anschließend findet eine Keimung der Saaten statt. Nach zwei

Tagen werden die Sonnenblumenkerne auf Siebe umgesetzt, wo nach

weiteren drei Tagen mehrere Zentimeter lange Wurzeln gebildet wurden (vgl.

Abbildung 17).

Abb. 17: Sonnenblumenkeimlinge in nicht-dotierter Nährlösung

Die Keimlinge sind 5 Tage alt. Sie wurden einen Tag lang dem Licht ausgesetzt

und befinden sich seit einem Tag in der Nährlösung.

a) b)

Abb. 18 a/b: Sonnenblumen in nicht-dotierter Nährlösung (Kontrollpflanzen)

Es sind keine Schädigungen der Pflanzen bzw. des Wurzelsystems zu

erkennen. Die Pflanzen sind insgesamt 25 Tage alt; Entwicklungsstadium: 16.

Anzuchtversuche in Hydrokultur 37

a) b)

Abb. 19 a/b: Anzucht von Sonnenblumen in Hydrokultur mit 1 µmol/L Cd (a)

und 2 µmol/L Cd (b) in der Nährlösung

Die Pflanzen sind bei Zugabe von 1 µmol/L Cd deutlich größer (Entwicklungs-

stadium: 16) als bei der Anzucht mit 2 µmol/L Cd (Entwicklungsstadium: 14).

Gelbfärbung der Blätter ist erkennbar; Kontrollanzucht vgl. Abbildung 19 a.

Die Abbildungen 19 a und b zeigen den Einfluss von Cadmium auf die

Entwicklung von Sonnenblumenpflanzen. Bei einer Cadmium-Konzentration

von 1-2 µmol/L im Nährmedium ist im Gegensatz zu den Kontrollpflanzen

(Abbildung 18 a) eine Gelbfärbung der Blätter zu beobachten, die auf

Schäden im Photosystem hinweist (Chlorose). Diese Vermutung wird auch

von der Veränderung des Chlorophyllgehaltes der Sonnenblumenblätter in

Abhängigkeit vom Cadmiumgehalt der Nährlösung bestätigt (Dnp). Andere

Autoren berichten ebenfalls von einer Gelbfärbung der Blätter von

Sonnenblumen [236, 237, 312, 313]. STOBART ET AL. führen den Rückgang

an Chlorophyll auf die Hemmung der Protochlorophyllid-Reduktase sowie der

δ-Aminolävulinatbildung durch Cadmium zurück [314].

Abb. 20: Entwicklung der Biomasse bei der Anzucht von Sonnenblumen mit

und ohne Cadmiumdotierung der Nährlösung

Cd-Dotierung: Kontrollpflanzen, 2 µmol Cd, 10 µmol Cd, 20 µmol Cd

Bei 1 µmol/L Cadmium im Nährmedium entspricht die Bildung der Biomasse von

Sonnenblumen in etwa der Entwicklung in der Kontrollprobe.

123456789101112131415161718192021

Zeit [Tage]

100

125

150

175

Biomasse [g]

Beginn der Cadmium-

Dotierung

38 Anzuchtversuche in Hydrokultur

Abbildung 20 zeigt für Sonnenblumenpflanzen die Entwicklung der Biomasse

bei der Anzucht in Hydrokultur. Die Dotierung der Nährlösung mit 1 µmol/L

Cadmium hat noch keinen hemmenden Einfluss auf die Entwicklung der

Pflanzen. Die nach 25 Tagen gebildete Biomasse (ca. 170 g) ist ähnlich hoch

wie bei den Kontrollpflanzen in nicht-dotierter Nährlösung mit 175 g. Da-

gegen ist bei einer Cadmiumkonzentration von 2 µmol/L, die nach 25 Tagen

gebildete Biomasse mit 100 g deutlich geringer.

Bei Cadmiumdosen über 20 µmol/L sind die Pflanzen bereits fünf Tage nach

der ersten Dotierung komplett abgestorben. Im Gegensatz zu Mais und

Gerste [309] zeigen Sonnenblumen- und Rapspflanzen schon bei einer sehr

niedrigen Cadmiumkonzentration von 1 µmol/L erste Schäden im Photo-

system. Drastische Einbußen bei der gebildeten Biomasse traten ab einer

Cadmiumkonzentration von 2-3 µmol/L auf (Abbildung 21). Dieses könnte

möglicherweise auf den häufigen Wechsel der Nährlösung zurückzuführen

sein. Vorversuche zeigten, dass ein Wechsel der Nährlösung nach 2 Tagen

in nicht-dotierter Nährlösung eine schnellere Entwicklung der Sonnenblumen-

pflanzen zur Folge hat. Dieser Wechselrhythmus wurde auch bei der Zugabe

von Cadmium eingehalten.

3.2 Raps

a) b)

Abb. 21 a/b: Anzucht von Raps in Hydrokultur

Kontrollanzucht (a) Wachstumsstadium 15;

Dotierung mit 2 µmol/L Cadmium (b); (Wachstumsstadium 14)

Die Abbildungen 21 a und b verdeutlichen, dass auch die Entwicklung von

Rapspflanzen durch Cadmium beeinträchtigt wird. Gezeigt sind die Kontroll-

anzucht sowie Rapspflanzen die in einer mit 2 µmol/L Cadmium dotierten

Nährlösung angezüchtet wurden. Wie zuvor für Sonnenblumen beschrieben,

hat die Dotierung der Nährlösung mit 1 bzw. 2 µmol/L Cadmium auch bei

Rapspflanzen eine Gelbfärbung der Blätter zur Folge. Ebenso ist auch für

Rapsblätter eine Verringerung des Chlorophyllgehaltes in Abhängigkeit vom

Cadmiumgehalt der Nährlösung zu erkennen (Dnp). Bei der Kontrollanzucht

in nicht-dotierter Nährlösung sowie bei der Anzucht in einer mit 1 µmol/L

dotierten Nährlösung, erreichen die Rapspflanzen nach 25 Tagen jeweils das

Entwicklungsstadium 15 und die gesamte gebildete Biomasse ist mit etwa

Anzuchtversuche in Hydrokultur 39

33 g in beiden Fällen ähnlich hoch. Dagegen ist die gebildete Biomasse von

Rapspflanzen, bei einer Cadmium-Konzentration von 2 µmol/L, nach 25

Tagen mit 27 g deutlich geringer und es wird lediglich das Entwicklungs-

stadium 14 erreicht (Abbildung 21 b). Diese Beobachtungen werden von

LARSSON ET AL. bestätigt [313], die beschreiben, dass das Wachstum von

Rapspflanzen bereits ab einer Cadmium-Konzentration von 2 µmol/L stark

reduziert wird.

Zwischenbetrachtung

Zusammenfassend ist zu konstatieren, dass es sowohl für Sonnenblumen als

auch Raps gelungen ist, die Wachstumsbedingungen so zu optimieren, dass

bei der Anzucht in nicht-dotierter Nährlösung keine merklichen Wachstums-

schäden auftreten (Abbildung 19 a und 22 a).

Ebenso gelang es, eine Cadmiumkonzentration zu finden, die eine hohe

Akkumulation von Cadmium in den angezüchteten Pflanzen gewährleistet,

ohne das Pflanzenwachstum zu beeinträchtigen. Für die Anzucht von

Sonnenblumen- und Rapspflanzen wurde eine Cadmiumkonzentration von

1 µmol/L in der Nährlösung gewählt. Bei dieser Konzentration unterscheidet

sich die gebildete Biomasse nicht wesentlich von der gebildeten Biomasse

der, in nicht-dotierter Nährlösung angezüchteten, Pflanzen.

3.3 Schwermetallgehalte in Sonnenblumen- und Raps-

pflanzen aus der Anzucht in Hydrokultur

In den in Hydrokultur angezüchteten Pflanzen werden die Schwermetalltotal-

gehalte der Pflanzenorgane (Wurzel, Stängel, Blatt) bestimmt.

Die Untersuchungen sollen zunächst eine Übersicht über die Schwer-

metallverteilung in 25 Tage alten Sonnenblumen- und Rapspflanzen unter

Hydrokulturbedingungen liefern. Diese Ergebnisse werden mit den Daten für

Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus der landwirtschaftlichen Praxis

verglichen. Ziel ist, den Einfluss der höheren Bioverfügbarkeit der Schwer-

metalle in der Nährlösung auf den Schwermetallgehalt in den Pflanzen zu

bewerten. Zudem sollen diese Untersuchungen mögliche Korrelationen

zwischen dem Cadmiumgehalt und den Gehalten der weiteren untersuchten

Schwermetalle in Sonnenblumen- und Rapspflanzen aufdecken.

Tab. 12: Schwermetallgehalte in den Wurzeln von 25 Tage alten

Sonnenblumen- und Rapspflanzen (Anzucht in Hydrokultur ohne

und mit Cadmiumdotierung der Nährlösung)

Mittelwerte; n= 3

Pflanzenteil Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kgTS]

SB-Wurzeln (Kontrollpflanzen) 0,10 2,2 58 510 10

SB-Wurzeln (Anzucht mit

1 µmol/L Cd) 38,0 1,9 51 630

Rapswurzeln (Kontrollpflanzen) 0,04 2,2 32 740 44

Rapswurzeln (Anzucht mit

1 µmol/L Cd) 22,8 2,1 53 790 88

40 Anzuchtversuche in Hydrokultur

Wie Tabelle 12 veranschaulicht, nimmt erwartungsgemäß bei einer höheren

Cadmiumkonzentration in der Nährlösung der Cadmiumgehalt in den

Sonnenblumen- und Rapswurzeln deutlich zu. Ein ähnliches Verhalten wurde

ebenfalls bei Dotierungsexperimenten mit Vanadium und Beryllium bei

Gerste [283, 315, 316] und Weidelgras [316, 317] beobachtet.

Auffällig ist, dass der Zinkgehalt in Sonnenblumen und Rapswurzeln im

Vergleich zum Zinkgehalt in den Kontrollpflanzen ebenfalls deutlich steigt

(Faktor 2), obwohl sich der Zinkgehalt in der Nährlösung nicht ändert. Diese

Ergebnisse entsprechen den Beobachtungen von anderen Autoren [263,

312], welche von einer Zunahme des Zinkgehaltes in Sonnenblumenpflanzen

berichten, wenn der Cadmiumgehalt in Sonnenblumen durch künstliche

Cadmiumzufuhr ansteigt. Vergleichbare Ergebnisse für Raps liegen zum

jetzigen Zeitpunkt nicht vor. Die Erhöhung des Zinkgehaltes wird von WALKER

auf eine Verringerung des Pflanzenwachstums zurückgeführt [318]. Die

eigenen Untersuchungen haben gezeigt, dass dieser Zusammenhang nicht

besteht. Wie zuvor beschrieben, sind die Anzuchtbedingungen so gewählt

worden, dass keine Beeinträchtigung des Wachstums von Sonnenblumen

bzw. Raps auftrat.

Der Eisen- und Nickelgehalt in den Sonnenblumen- und Rapswurzeln wird

durch die Dotierung der Nährlösung nicht beeinflusst. Dieses kann als

Hinweis auf unterschiedliche Aufnahmemechanismen in Pflanzen für

Cadmium im Vergleich zu Nickel und Eisen gewertet werden.

Ob die beobachtete Beeinflussung des Zinkgehaltes von Sonnenblumen-

und Rapswurzeln durch Cadmium einen Einfluss auf den Schwermetall-

transport in den untersuchten Pflanzen ausübt, wird durch die Analyse von

Xylemsaft überprüft.

Tab. 13: Schwermetallgehalt im Xylemsaft von Sonnenblumen- und Raps-

pflanzen (Anzucht in Hydrokultur ohne und mit Cadmium-Dotierung

der Nährlösung)

Mittelwerte; n = 3

Pflanze Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/mL]

Sonnenblume (Kontrollpflanzen)

0,01 0,06 0,25 1,20 0,37

Sonnenblume (Anzucht mit

1 µmol/L Cd) 0,37 0,04 0,28 1,21 0,69

Raps (Kontrollpflanzen) 0,01 0,09 0,60 1,80 0,92

Raps (Anzucht mit 1 µmol/L Cd) 0,28 0,06 0,45 1,20 1,16

Tabelle 13 zeigt, dass die Dotierung der Nährlösung mit 1 µmol/L Cadmium

eine deutliche Erhöhung des Cadmiumgehaltes im Xylemsaft von

Sonnenblumen- und Rapspflanzen zur Folge hat. Ebenso steigt der

Zinkgehalt im Xylemsaft. Für Sonnenblumenpflanzen ist zu erkennen, dass

der Zinkgehalt im Xylemsaft nahezu doppelt so hoch ist, wenn die

Nährlösung mit 1 µmol/L Cadmium dotiert wird. Demgegenüber verändert

sich der Kupfer-, Eisen- und Nickelgehalt im Xylemsaft von Sonnenblumen-

und Rapspflanzen in Folge der Cadmiumdotierung der Nährlösung nicht. Bei

Anzuchtversuche in Hydrokultur 41

Rapspflanzen ist eine Reduzierung des Eisen- und Kupfergehaltes im

Xylemsaft nach Dotierung der Nährlösung mit Cadmium festzustellen.

Tab. 14: Schwermetallgehalte in Sonnenblumen- und Rapsblättern

(Anzucht unter Hydrokulturbedingungen ohne und mit Cadmium-

Dotierung der Nährlösung)

Mittelwerte; n = 3

Pflanzenteil Cadmium Nickel Kupfer Eisen Zink

[mg/kgTS]

SB-Blätter (Kontrollpflanzen)

0,09 1,64 33 120 130

SB-Blätter (Anzucht mit

1 µmol/L Cd) 26,8 1,10 28 90 120

Rapsblätter (Kontrollpflanzen) 0,05 1,34 102 72 72

Rapsblätter (Anzucht mit

1 µmol/L Cd) 148 1,51 497 70 85

Die Dotierung der Nährlösung mit 1 µmol/L an Cadmium hat eine erhöhte

Anreicherung von Cadmium in den Blättern von Sonnenblumen- und

Rapspflanzen im Vergleich zu den Kontrollpflanzen zur Folge. Dem-

gegenüber sind die Gehalte an Nickel und Zink in den Blättern unverändert.

Der Kupfergehalt in den Sonnenblumenblättern wird von den Cadmium-

gehalten in der Nährlösung nicht beeinflusst, allerdings sinkt der Eisengehalt

in den Blättern. Diese Beobachtungen entsprechen den Ergebnissen der

Untersuchungen von RAJ [312].

Dagegen steigt der Kupfergehalt in den Rapsblättern nach Dotierung der

Nährlösung mit Cadmium deutlich an (Faktor fünf), während für Nickel, Eisen

und Zink keine Veränderungen festzustellen sind. Die Erhöhung des

Kupfergehaltes in den Rapsblättern ist nicht auf einen verstärkten Transport

von Kupfer über das Xylem zurückzuführen (Tabelle 13). Ob in Rapspflanzen

das Phloem am Transport von Kupfer beteiligt ist, konnte im Rahmen dieser

Arbeit nicht untersucht werden.

Für Stängel (Dnp) von Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus

Anzuchtversuchen in Hydrokultur ist ein Zusammenhang zwischen der

Cadmium- und Zinkkonzentration ebenfalls nicht nachweisbar.

Für die in Cadmium-dotierter Nährlösung angezüchteten Sonnenblumen fällt

auf, dass der Cadmiumgehalt in den Wurzeln höher ist als in den Blättern.

Eine ähnliche Anreicherung von Cadmium in den Wurzeln ist auch für

Bohnen, Erbsen, Zwiebeln, Petersilie und Weizen beschrieben worden [319].

Bemerkenswert ist die Anreicherung von Cadmium in den Blättern von

Rapspflanzen aus Anzuchtversuchen in Hydrokultur. Der Transport von

Cadmium in die vegetativen Pflanzenteile von Raps ist anscheinend nicht

behindert. Der Cadmiumgehalt in den Rapsblättern ist um den Faktor fünf

höher als in den Wurzeln. Ein ähnliches Verhalten ist für Mais, Tomaten und

Radieschen beschrieben [319]. TRAULSEN bemerkt in diesem Zusammen-

hang, dass Raps im Vergleich zu Sonnenblumen einen höheren Anteil des

Gesamt-Cadmiums in den vegetativen Pflanzenteilen akkumuliert [5].

Der Nickelgehalt ist in den Sonnenblumenpflanzen aus Hydrokulturver-

suchen um den Faktor 2-5 niedriger als in den Pflanzen aus landwirtschaft-

42 Anzuchtversuche in Hydrokultur

licher Praxis. Die unter Hydrokulturbedingungen angezogenen Rapspflanzen

enthalten in den Wurzeln in etwa gleich viel Nickel wie die Rapspflanzen aus

der landwirtschaftlichen Praxis. In den Rapsblättern ist der Nickelgehalt unter

Hydrokulturbedingungen höher als unter landwirtschaftlichen Bedingungen.

Allerdings ist auch in den angezüchteten Rapspflanzen die vermutete

biochemische Barriere im Übergangsbereich von den Wurzeln zu den

oberirdischen Pflanzenteilen festzustellen.

Für Kupfer und Zink werden deutliche Unterschiede zwischen den

Ölpflanzen beobachtet. Sonnenblumen akkumulieren Kupfer bevorzugt in

den Wurzeln, während Zink überwiegend in den Blättern angereichert wird.

Bei Raps wird dagegen Kupfer zu einem deutlich höheren Anteil in den

Blättern akkumuliert. Zink wird im Gegensatz zu Sonnenblumen in den

Wurzeln und Blättern von Rapspflanzen in gleichem Maße angereichert.

Für Eisen lassen sich keine Unterschiede zwischen Sonnenblumen- und

Rapspflanzen beobachten. Beide Pflanzen akkumulieren Eisen überwiegend

in den Wurzeln, während in der restlichen Pflanze der Eisengehalt deutlich

niedriger ist. Diese Beobachtung gilt auch für die Sonnenblumen- und

Rapspflanzen, die in Cadmium-dotierter Nährlösung angezogen werden. Im

Übergang von Wurzeln zum oberirdischen Teil der Pflanze existiert bei

Sonnenblumen und Raps für Eisen eine Barriere.

Der Transport dieses Metalls in oberirdische Pflanzenteile ist für Sonnen-

blumen und Raps bisher nicht untersucht worden. Bei Tomaten, dem

Ackerschmalwand, Grünalgen und der Bäckerhefe übernehmen spezifische

Eisentransporter wie IRT1 („iron regulated transporter“) und IRT2, welche zur

ZIP-Familie („zinc-iron-protein“) der Metall-Transporter gehören, den

Transport von Eisen in den Spross [320]. Weitere Schwermetalltransporter

aus Grünalgen, der Bäckerhefe und Arabidopsis gehören zur Klasse der

NRAMP-Proteine („natural resistance-associated macrophage protein“). In

Arabidopsis thaliana wurden sechs Pflanzenanaloga der NRAMP-Trans-

porter gefunden. Für AtNRAMP3 und AtNRAMP4 wurde nachgewiesen, dass

sie neben Eisen auch Cadmium in die Pflanze transportieren [21, 90-97]. Auf

Grund der taxonomischen Ähnlichkeit von Arabidopsis thaliana und Brassica

napus erscheint zumindest für Raps eine vergleichbare Steuerung des

Eisentransportes in die oberirdischen Pflanzenteile als wahrscheinlich.

Zwischenbetrachtung

Die Untersuchungen zur Schwermetallverteilung von Cadmium, Nickel,

Kupfer, Eisen und Zink haben für Sonnenblumen- und Rapspflanzen aus

Anzuchtversuchen unter Hydrokulturbedingungen folgende Gemeinsam-

keiten und Unterschiede aufgezeigt.

Gemeinsamkeiten:

• Die Dotierung der Nährlösung mit Cadmium hat eine Schädigung des

Photosystems bei den Ölpflanzen zur Folge. Diese wird durch eine

Gelbfärbung der Blätter sowie durch einen geringeren Chlorophyll-

gehalt der Blätter sichtbar.

• Die Dotierung der Nährlösung mit 1 µmol/L Cadmium hat keine

Beeinträchtigung des Wachstums von Sonnenblumen- und Raps-

Anzuchtversuche in Hydrokultur 43

pflanzen zur Folge. Höhere Cadmiumkonzentrationen in der

Nährlösung führen bei beiden Ölpflanzen zu einer Reduzierung des

Pflanzenwachstums. Oberhalb einer Konzentration von 20 µmol/L

sterben die Pflanzen nach wenigen Tagen ab.

• Sonnenblumen und Raps akkumulieren Eisen in überwiegendem

Maße in den Wurzeln.

• Die erhöhte Aufnahme von Cadmium durch Sonnenblumen- und

Rapswurzeln in einer mit 1 µmol/L Cadmium dotierten Nährlösung hat

eine drastische Erhöhung der Zinkgehalte von Sonnenblumen- und

Rapswurzeln zur Folge. Die Zunahme des Zinkgehaltes ist nicht durch

eine Verminderung des Pflanzenwachstums zu erklären.

• Zudem konnte erstmalig gezeigt werden, dass ein erhöhter

Cadmiumgehalt in Sonnenblumen- und Rapswurzeln nicht nur eine

Erhöhung des Cadmiumgehaltes im Xylemsaft zur Folge hat, sondern

dass sich ebenfalls der Zinkgehalt im Xylemsaft deutlich erhöht.

Unterschiede:

• In Sonnenblumen wird Cadmium verstärkt in den Wurzeln

angereichert, während bei den Rapspflanzen die höheren Cadmium-

gehalte in den Blättern beobachtet werden. Diese Beobachtung

stimmt mit den Ergebnissen bei Sonnenblumen- und Rapspflanzen

aus der landwirtschaftlichen Praxis überein.

• Für Zink ist bei Sonnenblumen eine erhöhte Anreicherung in den

Blättern nachweisbar. Demgegenüber ist bei den Rapspflanzen eine

Gleichverteilung von Zink zwischen den Wurzeln und den Blättern zu

erkennen. Diese Unterschiede werden ebenfalls bei Sonnenblumen-

und Rapspflanzen aus der landwirtschaftlichen Praxis beobachtet.

• Kupfer wird in Sonnenblumen unter Hydrokulturbedingungen

hauptsächlich in den Wurzeln angereichert. Der Kupfergehalt in den

Wurzeln ist mit 55 mg/kgTS etwa doppelt so hoch wie in den Blättern.

Für Rapspflanzen aus Anzuchtversuchen wird dagegen beobachtet,

dass Kupfer bevorzugt in den Blättern akkumuliert wird. Der Kupfer-

gehalt ist in Rapsblättern mit 100-500 mg/kgTS je nach Anzucht-

bedingungen um den Faktor 2-10 höher als in den Wurzeln. In

Sonnenblumen aus landwirtschaftlicher Anzucht ist der Kupfergehalt

in den Blättern mit 40 mg/kgTS etwa doppelt so hoch wie in den

Wurzeln. Bei Rapspflanzen aus der landwirtschaftlichen Praxis sind

die Kupfergehalte in den Wurzeln und den Blättern etwa gleich hoch.

Vergleich landwirtschaftliche Praxis / Anzucht in Hydrokultur

Zusammenfassend ist festzustellen, dass die Ergebnisse der Unter-

suchungen zur Schwermetallverteilung in Sonnenblumen- und Rapspflanzen

aus Anzuchtversuchen in Hydrokultur gut mit den Ergebnissen für Pflanzen

aus der landwirtschaftlichen Praxis übereinstimmen. Die einzige Ausnahme

ist Kupfer, bei dem wahrscheinlich die höhere Bioverfügbarkeit in der

Nährlösung, im Vergleich zum Ackerboden, die Ergebnisse beeinflusst.

44 Anzuchtversuche in Hydrokultur

4 Kompartimentierung von Schwermetallen in

Organellen von Sonnenblumen und Raps

Im bisherigen Verlauf der Untersuchungen wurden Totalgehalte von

Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen und Zink in den Pflanzenorganen von

Sonnenblumen und Raps bestimmt.

Nachfolgend werden Experimente zur Isolierung von Organellen aus

Kotyledonen (Keimblättern) von angekeimten Sonnenblumen- und Raps-

saaten beschrieben. Diese sollen Informationen über die intrazelluläre Ver-

teilung von Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen und Zink in Sonnenblumen und

Raps liefern. Die Isolierung und Trennung der Organellen aus „trockenen“

ungekeimten Sonnenblumenkernen und Rapssamen gelang nicht.

Die Trennung von Plastiden (Chloroplasten), Mitochondrien und

Peroxisomen erfolgt in osmotisch angepassten Medien durch Percoll-

Dichtegradientenzentrifugation [264, 266, 268, 321]. Abbildung 22 zeigt

exemplarisch die Trennung von Chloroplasten, Mitochondrien und Peroxi-

somen aus grünen Sonnenblumenkotyledonen durch Percoll-Dichte-

gradientenzentrifugation.

Der Percollgradient ist so

aufgebaut, dass Peroxi-

somen und Mitochondrien

unterschiedlich weit in den

Gradienten eindringen. Die

beschädigten Organellen

dringen unter den gewählten

Bedingungen nicht in den

Gradienten ein.

Abb. 22: Percolldichtezentrifugation von Homogenaten für die Trennung von

Mitochondrien und Peroxisomen aus Sonnenblumenkotyledonen

Intakte Chloroplasten werden mit dieser Aufarbeitungsmethode nicht isoliert

In Kapitel 1.6.5 wurde erörtert, dass Vakuolen eine bedeutende Senke für

Schwermetalle innerhalb der Zelle darstellen. Mit der zuvor beschriebenen

Methode zur Isolierung von Organellen aus Kotyledonen von Sonnenblumen-

und Rapskeimlingen können allerdings Vakuolen nicht erfasst werden. Eine

Isolationsmethode für Vakuolen aus Sonnenblumen und Raps liegt nicht und

ihre Entwicklung war im Rahmen dieser Arbeit nicht möglich.

4.1 Chloroplasten

Abbildung 23 zeigt ein Verteilungsprofil von Leitenzymen bzw. -substanzen

für Organellen aus grünen Kotyledonen von Sonnenblumenkeimlingen sowie

die Verteilung von Cadmium, Nickel, Kupfer, Zink und Eisen auf 1 mL-

Fraktionen nach Percoll-Dichtezentrifugation.

Bestandteile von Chloroplasten,

Peroxisomen, Mitochondrien

„intakte“ Mitochondrien

„intakte“ Peroxisomen

Anzuchtversuche in Hydrokultur 45

Abb. 23: Verteilung von Schwermetallen im Percoll-Gradienten zur Isolierung

von Chloroplasten aus Kotyledonen fünf Tage alter Sonnenblumen-

keimlinge.

Chloroplasten: Einheit mg/mL;

Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidaseaktivität: Einheit ∆E/min bei 550 nm,

Peroxisomen: Katalaseaktivität: Einheit ∆E/min bei 230 nm.

1 Einheit ng/mL, Cu 1 Einheit 250 ng/mL,

1 Einheit 250 ng/mL, Ni 1 Einheit 10 ng/mL, Zn 1 Einheit 250 ng/mL,

Aufarbeitungsmedium: Phosphatpuffer mit EDTA

Weil Chloroplasten beim Ergrünen aus den Plastiden der ungekeimten

Samen hervorgehen, dürften die Chloroplasten bezüglich Cadmium und

Nickel den Zustand für Plastiden in ungekeimten Samen wiedergeben. Bei

der Isolierung von Chloroplasten aus Sonnenblumenkotyledonen wurde ein

erkennbares Maximum intakter Chloroplasten bei hoher Dichte festgestellt.

Das starke Chlorophyllmaximum bei niedriger Dichte ist auf Thylakoid-

membranen von beschädigten Chloroplasten zurückzuführen. Das Verhältnis

von intakten Chloroplasten zu beschädigten Chloroplasten ist 1:6. Die

Aufarbeitungsmethode ergab eine sehr geringe Ausbeute an „intakten“

Peroxisomen und Mitochondrien.

Der Vergleich der Organellenverteilung mit der Schwermetall-Verteilung im

Gradienten ergab keine Hinweise auf wesentliche Schwermetall-Pools in den

Chloroplasten von Sonnenblumenkotyledonen. Die Hauptanteile der unter-

suchten Schwermetalle wurden im Bereich geringer Dichte nachgewiesen.

Diese Fraktionen enthalten zerstörte Organellen einschließlich der Vakuolen-

bestandteile und Vesikel.

Für Kupfer ist erwartungsgemäß ein Maximum in den Fraktionen der intakten

Chloroplasten (Fraktion 5) zu erkennen, denn Kupfer ist in Form von

Plastocyanin in Chloroplasten enthalten. Plastocyanin enthält pro Molekül

zwei Kupferatome und stellt ein Redoxsystem in der photosynthetischen

Elektronentransportkette des Photosystems dar [22].

Abbildung 24 zeigt, dass aus Rapskeimlingsblättern ebenfalls intakte

Chloroplasten erhalten wurden. Das Verhältnis von intakten zu beschädigten

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

123456789101112131415161718

Fraktion

Organellen [rel. Einheiten]

Elementgehalt [rel. Einheiten]

hohe Dichte geringe DichteCd, Cu, Fe, Ni, Zn

intakte Chloroplasten

46 Anzuchtversuche in Hydrokultur

Chloroplasten beträgt für Raps 1:5, d. h. die Ausbeute an intakten Chloro-

plasten aus Rapskotyledonen ist etwas höher als bei Sonnenblumen und

kann als befriedigend angesehen werden.

Abb. 24: Verteilung von Schwermetallen im Percoll-Gradienten zur Isolierung

von Chloroplasten aus Kotyledonen fünf Tage alter Rapskeimlinge.

Chloroplasten: Einheit mg/mL;

Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidaseaktivität: Einheit ∆E/min bei 550 nm,

Peroxisomen: Katalaseaktivität: Einheit ∆E/min bei 230 nm.

Cd 1 Einheit ng/mL, Cu 1 Einheit 75 ng/mL, Ni 1 Einheit 10 ng/mL,

Zn 1 Einheit 250 ng/mL

Aufarbeitungsmedium: Phosphatpuffer mit EDTA

Der Vergleich der Chloroplastenverteilung mit der Verteilung der unter-

suchten Schwermetalle ergibt auch für Rapskotyledonen keine Hinweise,

dass Chloroplasten, und damit wohl auch die Plastiden der ungekeimten

Samen, eine bedeutende Schwermetallsenke darstellen.

Allerdings wird die Schwermetallverteilung im Percoll-Gradienten durch die

verwendeten Zerkleinerungs- und Aufarbeitungsmedien beeinflusst. Diese

enthalten starke Komplexbildner wie EDTA sowie Phosphate, sodass

möglicherweise die nativen Bindungsformen der untersuchten Schwermetalle

nicht mehr vorliegen. Deshalb wurde in weiteren Untersuchungen auf den

Einsatz der üblicherweise verwendeten Phosphatpuffer verzichtet. Alternativ

wurde ein Aufarbeitungsmedium verwendet, welches 340 mmol/L Sorbitol,

0,4 mmol/L KCl und 2,0 mmol/L Hepes-KOH bei einem pH-Wert von 7,8

enthält [321]. Auf den Einsatz des Chelatbildners EDTA wurde ebenfalls

verzichtet. Bisher ist es allerdings nicht gelungen, intakte Chloroplasten mit

diesem Aufarbeitungsmedium mit ausreichender Ausbeute zu isolieren.

4.2 Mitochondrien und Peroxisomen

Die Abbildungen 25 und 26 zeigen grafisch die Trennung von Peroxisomen

und Mitochondrien aus Sonnenblumen- und Rapskotyledonen unter Einsatz

einer anderen Isolierungs- und Trennmethode an Percoll.

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

12345678910111213141516

Fraktion

Organellen [rel. Einheiten]

Elementgehalt [rel. Einheiten]

hohe Dichte geringe DichteCd, Cu, Ni, Zn

intakte Chloroplasten

Anzuchtversuche in Hydrokultur 47

Abb. 25: Verteilung von Schwermetallen im Percoll-Gradienten zur Isolierung

von Mitochondrien und Peroxisomen aus Kotyledonen fünf Tage

alter Sonnenblumenkeimlinge.

Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidaseaktivität ∆E/min bei 550 nm,

Peroxisomen: Katalaseaktivität ∆E/min bei 230 nm,

Cd 1 Einheit ng/mL, Ni 1 Einheit 40 ng/ml, Fe 1 Einheit 200 ng/mL

Zn 1 Einheit 100 ng/mL

Aufarbeitungsmedium 1 mit EDTA:

Abb. 26: Verteilung von Schwermetallen im Percoll-Gradienten zur Isolierung

von Mitochondrien und Peroxisomen aus Kotyledonen fünf Tage

alter Rapskeimlinge.

Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidaseaktivität ∆E/min bei 550 nm,

Peroxisomen: Katalaseaktivität ∆E/min bei 230 nm,

1 Einheit ng/mL, Ni 1 Einheit 40 ng/ml, Fe 1 Einheit 200 ng/mL

1 Einheit 100 ng/mL

Aufarbeitungsmedium 1 mit EDTA

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

1 3 5 7 9 11 13 15 17 19 21 23 25

Fraktion

Organellen [rel. Einheiten]

Elementgehalt [rel. Einheiten]

Cd, Ni, Fe, Znhohe Dichte niedrige Dichte

Peroxisomen Mitochondrien

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

13579111315171921232527

Fraktion

Organellen [rel. Einheiten]

Elementgehalt [rel. Einheiten]

hohe Dichte niedrige Dichte

Cd, Cu, Fe, Ni, Zn

Peroxisomen Mitochondrien

48 Anzuchtversuche in Hydrokultur

Intakte Peroxisomen wandern infolge ihrer höheren Dichte tiefer in den

Gradienten als intakte Mitochondrien [264]. Der Vergleich der Organellen-

und Schwermetallverteilung im Gradienten zeigt, dass für Sonnenblumen-

kotyledonen (Abbildung 25) im Bereich der Fraktion 7 und 10 zwei Peaks für

Nickel, Zink bzw. für Zink, Eisen und Cadmium auftraten. Für Kotyledonen

von Rapskeimlingen (Abbildung 26) trat im Bereich von Fraktion 11 ein Peak

für Nickel, Cadmium und Zink auf. Es ist anzunehmen, dass sich unter dem

breiten „Peak“ der Verteilung des Leitenzyms für Peroxisomen (Katalase)

verschiedene „Populationen“ von Peroxisomen und gegebenenfalls anderer

zellulärer Bestandteile verbergen, die für die Schwermetallpeaks verant-

wortlich sind. Allerdings ist auch bei der Interpretation dieser Ergebnisse zu

beachten, dass das verwendete Aufarbeitungsmedium EDTA enthält,

welches als starker Komplexbildner die untersuchten Schwermetalle aus den

Bindungsformen lösen kann.

In weiteren Experimenten wurde, aus den zuvor genannten Gründen, auf den

Einsatz von EDTA auch bei der Isolierung von Peroxisomen und Mitochon-

drien verzichtet. Abbildung 27 zeigt exemplarisch für Kotyledonen von Raps

die Ergebnisse dieser Untersuchungen.

Abb. 27: Verteilung von Schwermetallen im Gradienten zur Isolierung von

Mitochondrien und Peroxisomen aus Kotyledonen von fünf Tage

alten Rapskeimlingen.

Mitochondrien: Cytochrom c-Oxidaseaktivität ∆E/min bei 550 nm,

Peroxisomen: Katalaseaktivität ∆E/min bei 230 nm,

1 Einheit ng/mL, Cu 1 Einheit 125 ng/mL, Ni 1 Einheit 20 ng/ml,

Fe 1 Einheit 200 ng/mL, Zn 1 Einheit 100 ng/mL.

Aufarbeitungsmedium 2 ohne EDTA

Die vorgenommenen Veränderungen im Aufarbeitungsmedium haben auf die

Ausbeute an intakten Mitochondrien ebenso wie auf die Verteilung der

Schwermetalle im Gradienten einen beträchtlichen Einfluss. Dagegen scheint

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

1 3 5 7 9 11131517192123252729

Fraktion

Organellen [rel. Einheiten]

0,5

1,5

Schwermetall [rel. Einheiten]

hohe Dichte niedrige Dichte

Cd, Cu, Fe, Ni, Zn

Peroxisomen

Mitochondrien

Anzuchtversuche in Hydrokultur 49

dieses Aufarbeitungsmedium für die Isolierung von Peroxisomen besser

geeignet zu sein, weil der Anteil an intakten Peroxisomen sehr hoch ist.

Die Schwermetalle wandern bei dieser Methode zu einem großen Teil zu

Zonen höchster Dichte (Fraktion 3). Als Bindungspartner kommen für die

Schwermetalle in Fraktion 3 Zellwandbestandteile und Proteinkörper (die

Helianthinin enthalten) infrage [322].

Auffällig ist zudem, dass die Peaks für Cadmium, Eisen, Nickel und Zink in

Fraktion 9 in etwa deckungsgleich zu Peroxisomen sind. In der Literatur ist

beschrieben, dass Peroxisomen u.a. mit Proteinkörpern oder deren

Bestandteilen verunreinigt sein können [322]. Diese Proteinkörper könnten

daher die eigentlichen Schwermetallpools in Fraktion 9 sein. Für Eisen und

Zink ist dies unwahrscheinlich, weil Peroxisomen Eisen in der Katalase und

Zink in der Superoxid-Dismutase enthalten. Die Maxima in der Schwermetall-

verteilung von Eisen und Zink in Fraktion 9 können daher den Peroxisomen

zugeordnet werden. Cadmium und Nickel sind im Schwermetallprofil

deckungsgleich mit Eisen und Zink.

Diese Ergebnisse sind Anhaltspunkte dafür, dass Peroxisomen einen

intrazellulären Teilpool für Cadmium und Nickel darstellen. In welcher Form

diese Elemente vorliegen kann mit der in einem Gradienten enthaltenen

Menge nicht untersucht werden. Das „Poolen“ vieler Gradienten ist dafür

erforderlich.

Die intakten Mitochondrien sind unter den gewählten Bedingungen über

einen weiten Dichtebereich verteilt. Es deutet sich an, dass die

Mitochondrien mit anderen Bestandteilen des Homogenates z.B.

"Microsomen" oder Lipidkörpern assoziiert sind [322]. Dennoch sind für

Cadmium, Nickel, Eisen und Zink Maxima in den Fraktionen 14 und 15

festzustellen, die Mitochondrien zugeordnet werden können.

50 Zwischenfazit

5 Zwischenfazit

Das Ziel dieser Arbeit ist, Unterschiede in der Aufnahme und Verteilung von

Schwermetallen in Sonnenblumen und Rapspflanzen zu erkennen. Im

Vordergrund dieser Untersuchungen stehen die Schwermetalle Cadmium

und Nickel, weil der durchschnittliche Cadmium- und Nickelgehalt in

Sonnenblumenkernen etwa zehn- bzw. fünfmal höher ist als in Rapssamen.

Die bisherigen Ergebnisse zur Schwermetallverteilung in Sonnenblumen-

und Rapspflanzen ergaben einige Besonderheiten, die mögliche

Erklärungsansätze liefern können:

Ölpflanzen aus landwirtschaftlicher Praxis

¾

Der Cadmiumgehalt ist in Rapssamen um den Faktor sechs niedriger

als in den übrigen Pflanzenteilen (Wurzel, Stängel, Blätter, Schoten-

klappen). Die Rapssamen sind in den Rapsschoten in eine Plazenta

eingebettet, die eine physiologische Barriere für Cadmium darstellen

könnte. In Sonnenblumen wurden keine Anzeichen für eine Barriere

gefunden.

¾

Die Nickelgehalte in Wurzeln und Saaten von Sonnenblumen liegen

in ähnlicher Größenordnung (4–5 mg/kg TS Unterfranken bzw. 7-13

mg/kg TS Vinsebeck). Bei Rapspflanzen ist der Nickelgehalt in

Rapswurzeln mit 4 mg/kgTS um den Faktor fünf bis zehnmal höher als

in den Blättern von Rapspflanzen (0,69 mg/kg TS) bzw. Rapssamen

(~0,4 mg/kg TS). Im Gegensatz zu Sonnenblumen existiert für Nickel

in Rapspflanzen möglicherweise eine physiologische Barriere im

Übergang vom Wurzelbereich zum Rapsstängel.

¾

Der Cadmium-, Nickel- und Zinkgehalt ist in geschälten Sonnen-

blumenkernen doppelt so hoch, wie in den Schalen. Es ist daher zu

vermuten, dass die höheren Cadmiumgehalte in den Sonnenblumen-

kernen wie bei Erdnuss, Weizen und Linsen auf einen Cadmium-

transport über das Phloem zurückzuführen sind.

¾

Der Eisengehalt in Sonnenblumen- und Rapspflanzen ist in den

Wurzeln um den Faktor sechs bis zehnmal höher als in den

oberirdischen Pflanzenteilen.

Ölpflanzen aus Hydrokultur

¾

Sonnenblumen- und Rapspflanzen zeigen eine ähnliche Empfind-

lichkeit gegenüber Cadmiumstress. Bei Cadmiumkonzentrationen

über 1 µmol/L sind für beide Ölpflanzen deutliche Einschränkungen

des Pflanzenwachstums festzustellen. Zudem senkt Cadmium den

Chlorophyllgehalt der Blätter (Chlorose).

¾

Durch Dotierung der Nährlösung mit Cadmium steigen bei beiden

Ölpflanzen sowohl die Cadmium-Gehalte als auch die Zink-Gehalte in

den Wurzeln und im Xylemsaft.

¾

Abhängig von den verwendeten Aufarbeitungsmedien werden neben

Eisen und Zink, die in Form von Katalase bzw. Superoxid-Dismutase

in Peroxisomen natürliche Pools bilden, auch Cadmium und Nickel

nachgewiesen.

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 51

6 Schwermetall-Bindungsformen in Sonnenblumen und

Raps

Die bisherigen Ergebnisse der Schwermetallgehalte in Ölpflanzenproben

führten zu der Annahme, dass im Gegensatz zu Sonnenblumen

Rapspflanzen über physiologische Barrieren verfügen, welche für die

Unterschiede der Cadmium- und Nickelgehalte verantwortlich sein könnten.

Wie in Kapitel 1.5 beschrieben, sind für Aussagen über die Bioverfügbarkeit

und die biologische Wirkungsweise von Schwermetallen in Pflanzen

Kenntnisse über Bindungsformen notwendig, die für Sonnenblumen und

Raps bisher nur gering sind (vgl. 1.7). Im weiteren Verlauf der

Untersuchungen werden daher die Bindungsformen von Cadmium, Kupfer,

Nickel und Zink aus Sonnenblumen und Raps extrahiert und analysiert. Im

Einzelnen soll aufgeklärt werden,

¾

ob sich die Cadmium-, Kupfer-, Nickel- und Zink-bindenden

Substanzen in den vegetativen und generativen Pflanzenteilen von

Sonnenblumen bzw. Raps unterscheiden. Dabei ist zu klären, ob

Phytochelatine in Raps- und Sonnenblumenpflanzen eine Rolle bei

der Komplexierung dieser Schwermetalle spielen,

¾

ob Schutz- und Toleranz-Mechanismen, wie z.B. Immobilisierung und

Komplexierung in Raps- und Sonnenblumenpflanzen von Bedeutung

sind (vgl. Kapitel 1.6).

Untersuchungsmethodik

Der Erhalt der Bindungsformen (vgl. 1.8) stellt die entscheidende

Voraussetzung der Charakterisierung nativer Schwermetallbindungsformen

dar [26, 269, 270]. Die Verwendung von Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L) als

Extraktionspuffer (vgl. 1.8) und die gewählten Extraktionsbedingungen (vgl.

11.2) sollen gewährleisten, dass bei der Extraktion die Denaturierung der

ursprünglichen Bindungsformen vermieden wird. Die Trennung der nativen

Schwermetall-Bindungsformen erfolgt mit der Gelfiltrationschromatographie

(GFC) in Kombination mit atomspektrometrischen Verfahren (vgl. 1.8, 11.3).

Die Leistungsfähigkeit des verwendeten Puffersystems sowie der gewählten

Extraktions- und Elutionsbedingungen wurden im Rahmen einer Diplomarbeit

überprüft [278]. Schon durch einmalige Extraktion werden die Hauptanteile

der Schwermetalle aus Sonnenblumenkernen und Rapssamen extrahiert.

Der Einsatz eines Schutzgases (Stickstoff) hat auf die Extrahierbarkeit von

Cadmium, Nickel und Zink aus Sonnenblumenkernen und Rapssamen sowie

die Schwermetallelutionsprofile bei der Gelchromatographie keinen Einfluss.

Dagegen zeigte sich, dass eine Eiskühlung der Proben bei allen

Arbeitsschritten (Homogenisierung, Zentrifugation, Gelfiltration) unbedingt zu

gewährleisten ist. Die Extraktion bei Raumtemperatur führte zum Nachweis

von Cadmium- und Zink-bindenden Substanzen mit deutlich niedrigeren

Molmassen bei gleichzeitig reduzierter Extrahierbarkeit. Es ist zu vermuten,

dass die nativen Bindungsformen durch den Einfluss höherer Temperaturen

zerstört werden [323].

52 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Nachfolgend soll die Extraktion von Schwermetall-bindenden Substanzen

aus Ölsaaten kurz vorgestellt werden (vgl. 11.2):

Das Probenmaterial wird mit einem dreifachen Überschuss an Tris-HCl-

Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L) versetzt und unter Eiskühlung mit einem Ultra-

Turrax homogenisiert. Das Homo-

genat wird zentrifugiert und die

wässrige Fraktion für die GFC

verwendet. Der Zentrifugations-

rückstand wird, ebenso wie die

Fettfraktion, nach Mikrowellen-

druckaufschluss auf den Schwer-

metallgehalt untersucht. In einem

Aliquot der wässrigen Fraktion

werden ebenfalls die Schwer-

metallgehalte bestimmt (Schwer-

metallbilanzierung).

Abb 28: Zentrifugationsfraktionen

von Ölsaatenextrakten

6.1 Sonnenblumenkernextrakte

Es wurden ausgereifte Sonnenblumenkerne der Sorte „Petra“ der Ernten

1996-98 sowie die nicht ausgereiften Sonnenblumenkerne der Probenahmen

in Unterfranken (1998) und Vinsebeck (1999) untersucht. Zum Zeitpunkt der

Untersuchungen sind die Sonnenblumenkerne der Sorte „Petra“ 14 bis 38

Monate alt. In der Zwischenzeit sind diese Proben bei Raumtemperatur unter

Lichtausschluss in Glasgefäßen gelagert worden. Die Sonnenblumenkerne

der Probenahmen in Unterfranken sowie in Vinsebeck sind zum Unter-

suchungszeitpunkt etwa 4 Wochen alt und werden bei - 80°C aufbewahrt.

Tab. 15: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Zentrifugations-

fraktionen von Sonnenblumenkernextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Fett < 10 < 5 < 5 <10 15

Wässrige Fraktion 25 - 45 65 15 - 80 >20 10

Rückstand 50 - 70 30 15 - 70 >70 75

Mit dem Tris-Puffer werden aus Sonnenblumenkernen 65 % des Kupfers,

20 % des Zinks und 10 % des Eisens extrahiert. Cadmium ist zu 25-45 %

und Nickel zu 5-80 % aus Sonnenblumenkernen extrahierbar. Auffällig ist,

dass für Cadmium die Extrahierbarkeit bei den nicht ausgereiften

Sonnenblumenkernen sowie den Sonnenblumenkernen der Sorte „Petra“

(Ernte 1998) mit 45 % am höchsten ist.

Fettfraktion

Rückstand

Wässrige Fraktion

(Überstand/Extrakt)

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 53

Abb. 29: Extrahierbarkeit von Cadmium und Nickel aus Sonnenblumen-

kernen der Sorte „Petra“ in Abhängigkeit von der Lagerungsdauer

Abbildung 29 zeigt, dass der Anteil des aus Sonnenblumenkernen

extrahierbaren Cadmiums in Abhängigkeit vom Alter der untersuchten Probe

von 45 % für Sonnenblumenkerne der Ernte 1998 auf 25 % für die Proben

der Ernte 1996 sinkt. Für Nickel ist keine eindeutige Tendenz zu erkennen.

Nickel ist aus der ältesten Probe (1996) nahezu nicht extrahierbar. Aus den

Sonnenblumenkernen der Ernte 1998 lässt sich Nickel zu etwa 30 %

extrahieren. Demgegenüber wurde für Sonnenblumenkerne von 1997 für

Nickel eine Extrahierbarkeit von 80 % festgestellt.

Die beobachteten Unterschiede in der Extrahierbarkeit dieser Schwermetalle

könnten u.a. folgende Ursachen haben:

1. Cadmium und Nickel sind in den geernteten Pflanzen möglicherweise

an Substanzen gebunden, die während der Lagerung durch den

Einfluss von Luftsauerstoff zu höheren Molmassen aggregieren.

Denkbar ist, dass sich thiolhaltige Schwermetall-bindende Substanzen

über intermolekular gebildete Disulfidbrücken [225, 271] zu Molekülen

mit höherer Molmasse vereinigen. Die aggregierten Schwermetall-

Bindungsformen könnten eine schlechtere Wasserlöslichkeit im

Vergleich zu nicht-aggregierten Bindungsformen aufweisen. Der Zusatz

eines milden Reduktionsmittels zum Extraktionsmedium sollte diesen

Einfluss erkennbar machen (vgl. 6.3).

2. Es ist auch möglich, dass während der Extraktion eine Aggregation der

Schwermetall-Bindungsformen durch den in die Extraktionslösung

eingetragenen Sauerstoff erfolgt (vgl. 1.8). Im Rahmen einer dem

Projekt angegliederten Diplomarbeit [323] wurde festgestellt, dass der

Einsatz von Stickstoff als Schutzgas die Extrahierbarkeit der

untersuchten Schwermetalle aus Sonnenblumenkernen nicht

beeinflusst. Der Einfluss des Luftsauerstoffes bei der Extraktion der

Schwermetall-Bindungsformen ist daher als gering einzuschätzen.

30 35

100

Extrahierbarkeit [%]

SBK "Petra" 1998

(14 Monate alt) SBK "Petra" 1997

(26 Monate alt) SBK "Petra" 1996

(38 Monate alt)

Cadmium Nickel

54 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Die Extrahierbarkeit der untersuchten Schwermetalle aus Sonnenblumen-

kernen hängt in hohem Maße von der Bindungsform der Schwermetalle ab.

Die wasserlöslichen Schwermetall-bindenden Komponenten sind möglicher-

weise Proteine, Peptide oder organische Säuren (vgl. 1.6). Für die nicht in

Lösung befindlichen Schwermetallanteile ist eine Bindung an hochmolekulare

Zellwandbestandteile, aber auch eine Komplexierung durch lipophile

Pflanzeninhaltstoffe denkbar.

Gelchromatographische Auftrennung

Die löslichen Cadmium-, Nickel-, Kupfer- und Zink-bindenden Substanzen im

Extrakt (Wässrige Fraktion der Zentrifugation) werden mit der Gelfiltration

entsprechend ihrer Molekülgröße getrennt. Die verwendeten Gelfiltrations-

medien sind im Experimentellen Teil beschrieben (vgl. 11.3). Der Gesamt-

Trennbereich der verwendeten Gele umfasst einen Molmassenbereich von

0,1 bis 600 kD.

Eisen wird in diese Untersuchungen nicht mit einbezogen, weil der pH-Wert

der Pufferlösung 8,0 beträgt, wobei Eisen-(III)-salze ausgefällt werden.

Um eine bessere Vergleichbarkeit der ermittelten Schwermetall-

Elutionsprofile mit den Daten publizierter Untersuchungen zu gewährleisten,

wird in dieser Arbeit das Elutionsvolumen in Form des von den Säulen-

dimensionen unabhängigen Kav-Wertes dargestellt. Das Eluat wird in

Fraktionen von 1 mL aufgefangen (vgl. Abbildung 30). Die Definition des Kav-

Wertes (11.3) sowie die Nachweisgrenzen für die analysierten

Schwermetalle (11.7) sind im Experimentellen Teil aufgeführt. Dort wird

ebenfalls die Kalibration der verwendeten Chromatographiesäulen mit

zertifizierten Proteinstandards bekannter Molmasse beschrieben (11.3).

Abb. 30: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1996): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 150 ng/mL), Ni (1 Einheit 75 ng/mL)

Zn (1 Einheit 200 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L); Superdex S200.

Fraktionsgröße 1 mL; die Fraktionen sind im Cadmium-Elutionsprofil markiert.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 160 kD 17 kD > 10 kD

Cd Cu Zn

90 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 55

Tab. 16: Sonnenblumenkerne: GFC – Fraktionierbereiche an Superdex S200:

prozentuale Verteilung der Schwermetalle (s. Abb. 30)

Fraktionierbereich / Molmasse [kD]

> 600 300 90 17 < 10

[%]

Cadmium 60 <--------- 40 ---------> 3

Kupfer 5 <--------- 50 ---------> 45

Nickel 7 01 10 65

Zink 20 65

Abbildung 30 zeigt die Elutionsprofile von Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink

für Sonnenblumenkernextrakte (Ernte 1996) und Tabelle 16 die prozentuale

Verteilung dieser Metalle auf ausgewählte Molmassenbereiche. Danach ist

Cadmium hauptsächlich (60 %) an hochmolekulare Substanzen (> 600 KD)

gebunden. Möglicherweise handelt es sich bei den hochmolekularen

Cadmium-Bindungsformen um Globuline (z.B. ein 15-S-Globulin) [226, 227].

Nickel und Zink eluieren überwiegend bei einer Molmasse von 17 kD und im

Totalvolumen der Säule (< 10 kD). Die im Totalvolumen fraktionierenden

Nickel- und Zink-bindenden Substanzen wurden an Superdex Peptide

(Trennbereich 7-0,1 kD; Abbildung A1) weiter aufgetrennt. Nickel und Zink

eluieren dabei wiederum im Totalvolumen (< 0,1 kD) und könnten an

organische Säuren wie Zitronensäure, Äpfelsäure oder Aminosäuren

gebunden sein (vgl. 1.5.4.1).

Die Hälfte des extrahierbaren Kupfers ist über einen weiten Molmassen-

bereich verteilt (15-300 kD), mit Maxima bei 17 kD und 160 kD.

Niedermolekulare Kupferspezies eluieren im Bereich von 2,5 kD sowie im

Totalvolumen (< 0,1 kD).

Abb. 31: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1997): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 100 ng/mL), Ni (1 Einheit 100 ng/mL)

Zn (1 Einheit 300 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abb. 30.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD> 600 kD 90 kD160 kD350 - 300 kD 35 kD

17 kD

56 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Tab. 17: Sonnenblumenkerne: GFC-Fraktionierbereiche an Superdex S200:

prozentuale Verteilung der Schwermetalle (s. Abb. 31)

Fraktionierbereich / Molmasse [kD]

> 600 160 90 35 17 < 10

[%]

Cadmium 35 <----------------60-----------------> 1

Kupfer 4 10 5 10 25 35

Nickel 4 2 2 3 7 75

Zink 1 1 5 5 3 80

Das Elutionsprofil für Sonnenblumenkerne der Ernte 1997 und Tabelle 17

veranschaulichen, dass Cadmium zu 35 % an hochmolekulare Substanzen

(> 600 kD) gebunden ist. Dieser Anteil ist somit deutlich geringer als in den

Sonnenblumenkernen der Ernte 1996 (Abbildung 30). Zudem sind 60 % des

Cadmiums an Substanzen im Bereich von 160-20 kD gebunden. Nickel und

Zink finden sich hauptsächlich in niedermolekularen Fraktionen (< 0,1 kD,

Abbildung A1 im Anhang).

Die extrahierbaren Kupfer-bindenden Substanzen sind über einen weiten

Molmassenbereich verteilt. 25 % des Kupfers sind an Substanzen mit der

mittleren Molmasse von 17 kD gebunden. 35 % des Kupfers erscheinen im

Totalvolumen (< 10 kD), wobei an Superdex Peptide Kupfer-bindende

Substanzen der mittleren Molmasse 2,5 kD fraktionieren (Abbildung A 2).

Für Sonnenblumenkerne der Ernte 1998 (Abbildung A3) ist festzustellen,

dass lediglich 25 % des Cadmiums hochmolekular (> 600 kD) gebunden

sind. 70 % des Cadmiums sind über einen weiten Molmassenbereich (20-

200 kD) verteilt mit Maxima bei 90 kD und 40 kD. Die Untersuchungen an

Sonnenblumenkernen zeigen, dass die abnehmende Extrahierbarkeit von

Cadmium (Abbildung 29) mit einer Zunahme des Anteils an hochmolekularen

Cadmium-bindenden Substanzen korreliert (Tabelle 16, 17).

Abb. 32: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1996 - 98): Vergleich der GFC-

Elutionsprofile der wässrigen Fraktionen von ausgereiften

Sonnenblumenkernen der Ernten 1996 - 98 für Cadmium

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

> 600 kD 90 kD 37 kD < 10 kD

Cd SBK

1998 Cd SBK

1997 Cd SBK

1996

Nachweisgrenze

für Cadmium

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 57

Offenbar werden in Sonnenblumenkernen die Molmassen der Cadmium-

Bindungsformen mit zunehmendem Alter der Probe zu höheren Molmassen

verschoben (Abbildung 32). Entsprechend sinkt die Extrahierbarkeit des

Cadmiums, was auf eine Aggregierung der Cadmium-bindenden Substanzen

während der Lagerung hindeutet.

BRÜGGEMANN ET AL. zeigten, dass die Molmassen der Cadmium-bindenden

Komponenten aus Weizenkörnern ebenfalls vom Alter der Probe abhängen

[326]. In den jüngsten Körnern (1 Jahr) war Cadmium fast vollständig an

Substanzen mit der Molmasse von 15 kD gebunden, während es nach fünf

Jahren nur noch 50 % waren. Allerdings wurden zusätzliche Cadmium-

Bindungsformen bei 30, 60 und 100 kD nachgewiesen. In acht Jahre alten

Körnern waren die 15 kD-Komponenten vollkommen verschwunden und die

Hälfte des Cadmiums eluierte bei Molmassen > 100 kD. Die Autoren ver-

muten, dass es sich bei den höhermolekularen Substanzen um Aggregate

handelt, wobei die Aggregierung über oxidativ gebildete intermolekulare

Disulfidbrücken erfolgt. Wurde die Extraktion bei acht Jahre alten

Weizenkörner unter reduzierenden Bedingungen durchgeführt, fraktionierten

50 % des Cadmiums bei 15 kD und 30 % bei 7 kD [276, 277, 324].

Abb. 33: Sonnenblumenkerne (Unterfranken; 1998): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 3 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 150 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abb. 30.

Kupfer, Nickel und Zink sind in nicht-ausgereiften Sonnenblumenkernen an

niedermolekulare Substanzen (< 0,1 kD) gebunden. Nickel fraktioniert

außerdem bei 100 kD und 2,5 kD (Abbildung A4). Im Gegensatz zu den

ausgereiften Sonnenblumenkernen sind aus nicht-ausgereiften Kernen

niedermolekulare Cadmium-bindende Komponenten extrahierbar (38 kD, 22

kD, 13 kD, 0,5 kD), was belegt, dass die Cadmium-Bindungsformen mit

zunehmendem Reifestadium der Sonnenblumenkerne zu höheren

Molmassen aggregieren.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 300 kD 100 kD 38 kD 22 kD 13 - 10 kD < 10 kD

58 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Auffällig ist in Abbildung 33 der Cadmium-Peak bei einer Molmasse von

etwa 300 kD. In der Literatur finden sich bisher keine Untersuchungen zu

Cadmiumspezies in Sonnenblumenkernen, jedoch ist für Sojabohnen

beschrieben, dass Cadmium, Kupfer und Zink an höhermolekulare

Substanzen (> 100 kD) gebunden sind. Nach dem Zusatz von

Mercaptoethanol zum Extraktions- und Elutionsmittel (Tris-HCl-Puffer; pH

7,4; 0,01 mol/L) eluieren Cadmium, Kupfer und Zink nicht mehr im

Ausschlussvolumen, sondern in einer Fraktion von etwa 10 kD. Die Autoren

postulieren, dass die hochmolekularen Cadmium-, Kupfer- und Zink-

bindenden Substanzen unter dem Einfluss von Mercaptoethanol in

niedermolekulare Substanzen dissoziieren [325]. Zudem ist für Sojabohnen

beschrieben, dass das Speicherprotein Glycinin Cadmium bindet [325, 326].

Glycinin ist ein 12-S-Globulin mit einer Molmasse von 330 kD. Unter dem

Einfluss von Mercaptoethanol dissoziiert es in Untereinheiten mit Molmassen

von 19 kD, 37 kD und 42 kD [225]. Diese Untersuchungen an Sojabohnen

zeigen, dass Speicherproteine in Ölsaaten Cadmium binden. Für

Sonnenblumen aber auch für Raps könnte dies bedeuten, dass auch

Speicherproteine, wie z.B. das 11-S-Globulin Helianthinin (M = 300-350 kD),

Cadmium koordinieren (vgl. Abbildung 33). Der Zusatz eines milden

Reduktionsmittels wie Mercaptoethanol zum Extraktions- und Elutionspuffer

könnte daher erste Hinweise liefern, ob Speicherproteine auch bei Sonnen-

blumenkernen und Rapssamen als Cadmium-Bindungsformen infrage

kommen (vgl. 6.3 und 6.4)

6.2 Rapssamenextrakte

Für diese Untersuchungen werden Rapssamen der „BEE“ 1996 sowie ein

weiteres Rapsmischmuster eingesetzt (Tabelle 6). Die untersuchten Proben

sind zum Zeitpunkt der Untersuchungen 24 bis 48 Monate alt. Während der

Lagerung wurden die Rapssamen in Kunststoffgefäßen bei Raumtemperatur

unter Lichtausschluss aufbewahrt.

Tab. 18: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Rapssamenextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Fett 10 7 6 10 10

Überstand 25 25 25 15 8

Rückstand 65 65 60 70 75

Wie Tabelle 18 zeigt, sind 25 % des Cadmiums, Kupfers und Nickels sowie

15 % des Zinks aus reifen Rapssamen extrahierbar. Im Vergleich zu Sonnen-

blumenkernen sind für Cadmium und Kupfer aus Rapssamen deutlich

geringere Werte ermittelt worden, weil diese Schwermetalle in Rapssamen

vermutlich zu höheren Anteilen an unlösliche Zellstrukturen (Zellwände,

Zellmembranen) gebunden sind. Nickel, Zink und Eisen sind aus Rapssamen

in gleichem Maße extrahierbar wie aus Sonnenblumenkernen.

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 59

Abb. 34: Rapssamen (BEE 1996): Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen

Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 10 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL)

Zn (1 Einheit 60 ng/mL), Extraktionsbedingungen vgl. Abb. 30.

Abbildung 34 veranschaulicht, dass die Cadmium-, Kupfer- und Zink-

bindenden Substanzen in reifen Rapssamen über einen weiten Molmassen-

bereich (300-20 kD) verteilt sind. Hochmolekulare Cadmium-bindende

Komponenten (> 600 kD) sind nicht nachweisbar. Ebenso sind im Gegensatz

zu Sonnenblumenkernen in Rapssamen keine Cadmium-Bindungsformen mit

einer Molmasse von 300 kD zu beobachten. Das in Rapssamen enthaltene

Speicherprotein Cruciferin, ein 12-S-Globulin (Molmasse 300–350 kD),

kommt daher nicht als Cadmium-bindende Substanz infrage. Gleiches gilt für

das 2-S-Globulin Napin (Molmasse 13 kD). Nickel und Zink sind in Raps-

samen an niedermolekulare (< 0,1 kD) aber auch an höhermolekulare

Komponenten (Ni: 40 kD; Zn: 300–40 kD, 25 kD) gebunden.

Zwischenbetrachtung

Die bisherigen Untersuchungen zur Extrahierbarkeit von Cadmium, Kupfer,

Nickel und Zink sowie zu deren Bindungsformen in Sonnenblumenkernen

und Rapssamen haben weitere Unterschiede zwischen den beiden Ölsaaten

aufgezeigt.

¾

Cadmium ist aus Rapssamen nur zu einem geringen Anteil (25 %)

extrahierbar. Es ist daher zu vermuten, dass der Anteil des an unlös-

liche Zellstrukturen (Zellwand, Zellmembran) gebundenen Cadmiums

in Rapssamen höher ist als in Sonnenblumenkernen (40-60 %).

¾

Die Extrahierbarkeit der Cadmium-Bindungsformen aus Sonnen-

blumenkernen ist von der Lagerungsdauer abhängig. Die geringere

Extrahierbarkeit aus älteren Sonnenblumenkernen ist offenbar auf

eine Aggregierung der Cadmium-bindenden Substanzen zurück-

zuführen. Ähnliche Beobachtungen werden für Rapssamen nicht

gemacht.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD190 kD 120 kD 90 kD 40 kD 25 kD

> 600 kD

60 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

¾

Für Sonnenblumenkerne und Rapssamen deutet sich an, dass Nickel

zu einem beträchtlichen Teil (bis zu 90 %) an unlösliche Zellstrukturen

gebunden ist (vgl. Tabelle 15 und 18). Ferner sind die Molmassen der

löslichen Nickel-Bindungsformen aus Sonnenblumenkernen und

Rapssamen sehr niedrig (< 0,1 kD).

¾

Kupfer ist aus Sonnenblumenkernen in höherem Maße (60 %) extra-

hierbar als aus Rapssamen (25 %). Zudem unterscheiden sich die

Molmassen der wasserlöslichen Kupfer-Bindungsformen. In Sonnen-

blumenkernen sind hauptsächlich niedermolekulare (2,5 kD, < 0,1 kD),

in Rapssamen dagegen höhermolekulare Kupfer-Bindungsformen mit

Molmassen von 200-25 kD zu detektieren.

¾

Aus Sonnenblumenkernen und Rapssamen ist Zink nur zu einem

kleinen Anteil (15 %) extrahierbar. Zink ist in beiden Ölsaaten

offensichtlich bevorzugt an unlösliche Zellstrukturen gebunden. Die

löslichen Zink-Bindungsformen aus Sonnenblumenkernen sind nieder-

molekulare Substanzen (< 0,1 kD), während in Rapssamen Zink im

Molmassenbereich von 200-25 kD fraktioniert.

6.3 Sonnenblumenkerne: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Wie in den vorherigen Kapiteln beschrieben, sind die aus Sonnenblumen-

kernen und Rapssamen extrahierten Cadmium-, Kupfer- und Zink-bindenden

Substanzen über einen weiten Molmassenbereich verteilt. Dieses könnte

ebenso wie der für Cadmiumspezies festgestellte Alterungseffekt auf eine

Aggregierung der Schwermetall-Bindungsformen in Sonnenblumenkernen

und Rapssamen deuten (vgl. Abbildung 32 und 34). Diese Hypothese soll

durch den Einsatz eines milden Reduktionsmittels geprüft werden (vgl. 1.8).

In zahlreichen Untersuchungen wird Mercaptoethanol als Disulfidbrücken

spaltendes Reagenz verwendet [67, 188, 225, 270, 276, 284, 324, 325]. Für

die Extraktionsversuche unter reduzierenden Bedingungen werden die

Sonnenblumenkerne der Sorte „Petra“ der Ernten 1996-97 sowie

Sonnenblumenkerne der Probenahmen in Unterfranken (1998) und

Vinsebeck (1999) eingesetzt.

Tab. 19: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Sonnenblumenkernextrakten unter reduzierenden Bedingungen

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Fett 5 10 15 < 5 5

Überstand 65 65 30 20 5

Rückstand 30 25 60 65 90

Bei der Extraktion unter reduzierenden Bedingungen werden 65 % des

Cadmiums und Kupfers in die wässrige Fraktion überführt. Nickel ist zu

etwa 30 %, Zink zu 20 % aus Sonnenblumenkernen extrahierbar. Während

die Extrahierbarkeit von Kupfer, Zink und Eisen von dem milden Reduktions-

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 61

mittel nicht beeinflusst wird, zeigt Abbildung 35, dass ein großer Einfluss auf

die Extrahierbarkeit von Cadmium besteht.

Abb. 35: Einfluss von Mercaptoethanol auf die Extrahierbarkeit von Cadmium

aus Sonnenblumenkernen

Unter nicht-reduzierenden Bedingungen ist Cadmium zu 25-45 % aus

Sonnenblumenkernen zu extrahieren (Tabelle 15). Dagegen steigt die

Extrahierbarkeit unter reduzierenden Bedingungen auf 60 - 70 %.

Abb. 36: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1997): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen.

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 100 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL),

Thiol-Gruppen (1 Einheit 300 mg/L Cysteiniumchlorid)

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L, 10 mmol/L ME),

Superdex S200.

Abbildung 36 veranschaulicht, dass Cadmium unter reduzierenden

Bedingungen überwiegend (50 %) bei einer Molmasse von 25 kD sowie im

Totalvolumen (< 10 kD) eluiert wird. Weitere Cadmium-bindende Substanzen

fraktionieren bei 90 und 430 kD. Nickel eluiert im Totalvolumen (< 0,1 kD).







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



100

Extrahierbarkeit [%]

SBK "Petra"

1996 SBK "Petra"

1997 SBK

Unterfranken

1998

SBK

Vinsebeck

1999

nic

nicht-reduzierende Bedingungen



reduzierende Bedingungen

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

430 kD 150 kD 90 kD 25 kD < 10 kD

Cd Cu Zn

> 600 kD

62 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Zink ist an Substanzen mit der Molmasse von 90 kD, 25 kD, 2,5 kD bzw.

< 0,1 kD gebunden. Kupfer-bindende Komponenten werden bei 150 kD, 25

kD und im Totalvolumen (2,5 kD; < 0,1 kD) beobachtet.

Weil Thiolgruppen, wie z.B. bei Metallothioneinen, die Koordinierung von

Schwermetallen ermöglichen, wurde auch der Thiolgehalt in den Fraktionen

der Gelfiltration bestimmt. Abbildung 36 zeigt Maxima des Elutionsprofiles für

SH-Gruppen-haltige Komponenten im Ausschlussvolumen (> 600 kD), bei

300 kD, 100 kD, zwischen 50 und 15 kD sowie im Totalvolumen. Das

Elutionsprofil für SH-Gruppen zeigt, dass die Cadmium-, Kupfer- bzw. Zink-

bindenden Substanzen im Molmassenbereich von 25 kD Thiolgruppen

enthalten können.

Nachfolgend wird der Einfluss des Reduktionsmittels auf das Elutionsprofil

von Cadmium betrachtet. Auf das Elutionsprofil der Nickel-bindenden

Komponenten hat der Zusatz von Mercaptoethanol keinen Einfluss, daher

wird auf eine weitere Erörterung verzichtet.

Abb. 37: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“, 1997): Vergleich der Elutions-

profile von Cadmium bei der Gelfiltration der wässrigen Fraktion

unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L); unter reduzierenden

Bedingungen werden 10 mmol/L Mercaptoethanol zugesetzt.

Für Cadmium ist festzustellen, dass bei der Gelfiltration unter reduzierenden

Bedingungen keine hochmolekularen Cadmium-bindenden Substanzen

(> 600 kD) mehr zu erkennen sind. Dagegen können Cadmium-bindende

Substanzen mit der Molmasse von 25 kD und 2,5 kD beobachtet werden, die

unter nicht-reduzierenden Extraktions- und Elutionsbedingungen nicht

auftreten. Wie in Kapitel 7.1 angedeutet, führt die Zugabe des milden

Reduktionsmittels zu einer drastischen Veränderung des Cadmium-Elutions-

profiles bei Sonnenblumenkernen. Anzumerken ist an dieser Stelle, dass das

Cadmium-Elutionsprofil für die Sonnenblumenkerne der Ernte 1996 (Sorte

„Petra“) mit dem für die Kerne der Ernte 1997 übereinstimmt (vgl. Abbildung

A9). Diese Beobachtung ist als Hinweis zu werten, dass die Cadmium-

bindenden Substanzen mit zunehmender Lagerungsdauer zu Substanzen

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

nicht-reduzierende Bedingungen

reduzierende Bedingungen

25 kD < 10 kD90 kD 35 kD> 600 kD 430 kD

Nachweisgrenze für

Cadmium

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 63

mit höheren Molmassen aggregieren. Zudem sind die höhermolekularen

Cadmium-Bindungsformen schlechter löslich (vgl. Tabelle 15, Abbildung 32).

6.4 Rapssamen: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Extraktionsversuche mit Rapssamen unter Zusatz von Mercaptoethanol

sollten, wie bereits bei Sonnenblumenkernen, zeigen, ob sich unter reduzie-

renden Bedingungen die Extrahierbarkeit von Cadmium, Kupfer, Nickel oder

Zink verändert. Für diese Untersuchungen werden Rapssamen der „BEE“

1996 sowie ein weiteres Rapsmischmuster eingesetzt (Tabelle 6)

Tab. 20: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Rapssamenextrakten unter reduzierenden Bedingungen

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Fett < 5 < 5 < 10 10 < 5

Überstand 25 25 < 30 10 < 5

Rückstand 70 70 < 60 80 85

Allgemein ist festzustellen, dass die Extrahierbarkeit von Cadmium, Kupfer,

Nickel, Zink und Eisen aus Rapssamen von der Zugabe des Reduktions-

mittels Mercaptoethanol nicht beeinflusst wird. Im Vergleich zu

Sonnenblumenkernen ist die Extrahierbarkeit dieser Schwermetalle aus

Rapssamen sowohl unter oxidierenden als auch reduzierenden Bedingungen

geringer.

Abb. 38: Rapssamen („BEE“ 1996): Schwermetall-Elutionsprofil der

wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 40 ng/mL), Ni (1 Einheit 75 ng/mL)

Zn (1 Einheit 50 ng/mL),

SH-Gruppen (1 Einheit normiert auf 600 mg/L Cysteiniumchlorid)

Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 36.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

85 kD 25 kD < 10 kD40 kD> 600 kD

20 kD

64 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Tab. 21: Rapssamen: GFC-Fraktionierbereiche an Superdex S200:

prozentuale Verteilung der Schwermetalle (s. Abb. 38)

Fraktionierbereich / Molmasse [kD]

> 600 200 - 50 40 30 - 15 < 10

[%]

Cadmium 5 20 50

Kupfer 25 45

Nickel 35 10 40

Zink 50 25 5

Der Vergleich von Abbildung 34 und 38 verdeutlicht, dass auch für Raps-

samenextrakte eine drastische Veränderung der Schwermetallelutionsprofile

durch Zugabe von Mercaptoethanol zu beobachten ist. Abbildung 39

demonstriert diesen Effekt am Beispiel des Elutionsprofiles für Cadmium.

Abb. 39: Rapssamen (1996): Vergleich der Elutionsprofile von Cadmium bei

der Gelfiltration der wässrigen Fraktion unter nicht-reduzierenden

und reduzierenden Bedingungen

Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 37.

Wie bei Sonnenblumenkernen werden auch aus Rapssamen unter reduzie-

renden Bedingungen Cadmium-, Kupfer- und Zink-bindende Substanzen

mit einer Molmasse von 20-25 kD extrahiert (vgl. Abbildung 39). Dieser SH-

Gruppen-reiche Fraktionierbereich (Abbildung 38) enthält 50 % des

Cadmiums, 45 % des Kupfers sowie 25 % des Zinks. Dagegen treten höher-

molekulare Komponenten (> 30 kD) mit SH-Gruppen nur in geringem Maße

auf. Nickel ist in Rapssamen - im Gegensatz zu Sonnenblumenkernen -

hauptsächlich an höhermolekulare Substanzen (85 kD bzw. 40 kD)

gebunden. Der Hauptanteil des Zinks (50 %) sowie 20 % des Cadmiums und

Kupfers ist über einen Fraktionierbereich von 200-50 kD verteilt.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

nicht-reduzierende Bedingungen

reduzierende Bedingungen

90 kD120 kD 20 kD

Nachweisgrenze

für Cadmium

> 600 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 65

Zwischenbetrachtung

Cadmium ist aus Sonnenblumenkernen in größeren Anteilen (25-45 %) zu

extrahieren als aus Rapssamen (25 %). Die Extrahierbarkeit von Cadmium

kann bei Sonnenblumenkernen durch die Zugabe von Mercaptoethanol zum

Extraktionspuffer auf 65 % gesteigert werden. Bei Rapssamen bewirkt der

Zusatz des milden Reduktionsmittels keine Veränderung der

Extrahierbarkeit.

In Sonnenblumenkernen ist Cadmium anscheinend in einem hohen Maße (>

65 %) an zum Teil aggregierte lösliche Proteine und Peptide gebunden.

Dagegen ist bei Rapssamen der Anteil des an lösliche Substanzen

gebundenen Cadmiums mit ca. 20 % sehr viel geringer. Dieses kann als

Hinweis interpretiert werden, dass Cadmium in Rapssamen zu einem

deutlich höheren Anteil (> 70 %) an unlösliche Zellstrukturen gebunden ist

als in Sonnenblumenkernen (< 25 %). Dieses würde bedeuten, dass der

Anteil an mobilem Cadmium in Rapssamen deutlich geringer ist als in

Sonnenblumenkernen (vgl. 1.8). Es ist daher zu klären, ob auch in anderen

Grundorganen von Rapspflanzen (Wurzel, Stängel, Blätter) Cadmium

bevorzugt an unlösliche Zellstrukturen immobilisiert wird. Falls ja, wäre

erklärbar, warum Cadmium in Rapspflanzen zum überwiegenden Anteil in

den vegetativen Pflanzenteilen und nicht in den Samen akkumuliert wird.

Für Nickel lassen sich keine Unterschiede in der Extrahierbarkeit aus

Sonnenblumenkernen und Rapssamen feststellen. Nickel ist in beiden

Ölsaaten bevorzugt an niedermolekulare Substanzen - möglicherweise

organische Säuren (vgl. 1.6.5) - gebunden.

Der Totalgehalt von Kupfer ist in Sonnenblumenkernen und Rapssamen

zwar ähnlich hoch (Tabelle 1), aber die Extrahierbarkeit ist sehr unter-

schiedlich. So lassen sich unabhängig vom Zusatz des Reduktionsmittels

aus Sonnenblumenkernen 60-70 %, aus Rapssamen dagegen lediglich 25 %

des Kupfers extrahieren. Deutliche Unterschiede zeigen sich ebenfalls im

gelchromatographischen Verhalten der Kupfer-bindenden Substanzen von

Sonnenblumenkernen und Rapssamen:

In Sonnenblumenkernen sind fünf Kupfer-haltige Fraktionen bei 170 kD, 25

kD, 17 kD, 2,5 kD und im Totalvolumen (< 0,1 kD) nachweisbar.

Demgegenüber eluieren die Kupfer-bindenden Substanzen aus Rapssamen

ausschließlich bei höheren Molmassen (200-25 kD).

Für die Zink-bindenden Substanzen zeigen sich ebenfalls Unterschiede. In

Sonnenblumenkernen ist Zink hauptsächlich niedermolekular (< 0,1 kD)

gebunden. In Rapssamen ist Zink dagegen bevorzugt an Substanzen mit

Molmassen von 200-15 kD gebunden.

6.5 Sonnenblumenblätterextrakte

Die untersuchten Sonnenblumenblätter stammen von 25 Tage alten Pflanzen

der Anzucht in Hydrokultur und von Pflanzen, die während der Reifeperiode

direkt vom Feld geerntet wurden (Marktbreit in Unterfranken 1998; Vinsebeck

1999). Die untersuchten Blätter waren grün und wiesen keine vertrockneten

Stellen auf. Während die Pflanzen aus Unterfranken in die Pflanzen-

66 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Blätter 11 - 16

Blätter 17 - 12

Blätter 13 - 18

Blätter 19 - 26

grundorgane Wurzel, Stängel,

Blätter und Frucht zerlegt

wurden, sind bei den Sonnen-

blumen aus Vinsebeck (1999)

die einzelnen Sprossabschnitte

untersucht worden. Dazu wurde

der Pflanzenstängel in 4 Teile

mit jeweils 6 Blättern zerlegt

(Abbildung 40). Es sollen

mögliche Unterschiede in den

Schwermetallgehalten und

Bindungsformen für Cadmium,

Nickel, Kupfer, Eisen und Zink in

den einzelnen Sprossabschnit-

ten untersucht werden.

Abb. 40: Unterteilung des Sprosses von Sonnenblumenpflanzen in vier

Abschnitte bei der Probenahme in Vinsebeck (1999)

Für Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink konnten in den Blättern entlang der

Sprossachse von Sonnenblumen keine signifikanten Unterschiede im

Schwermetallgehalt festgestellt werden. Der Eisengehalt in den untersten

Blättern (1-6) ist jedoch etwa doppelt so hoch wie in den übrigen Blättern.

Tab. 22: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Sonnenblumenblätterextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Überstand 20 60 - 70 20 - 50 40 5

Rückstand 80 20 - 30 50 - 80 60 95

Mit dem Tris-HCl-Puffersystem werden etwa 20 % des Cadmiums, 20-50 %

des Nickels, 60-70 % des Kupfers, 40 % des Zinks und 5 % des Eisens in die

wässrige Phase überführt.

Im Vergleich zu Sonnenblumenkernen (25-45 %) ist verhältnismäßig wenig

Cadmium aus Sonnenblumenblättern extrahierbar.

Für Nickel hängt die Extrahierbarkeit stark von Herkunft der Pflanzen und

den Anzuchtbedingungen ab. So zeigen die Pflanzen aus Hydrokultur und

von einem Feld in Marktbreit (Unterfranken) eine hohe Extrahierbarkeit für

Nickel (50 %), während bei den Sonnenblumen aus Vinsebeck

(Ostwestfalen) nur geringe Mengen an Nickel (20 %) aus den Blättern zu

extrahieren sind. Diese geringe Extrahierbarkeit von Nickel gilt sowohl für die

unteren Blätter (1-6) als auch für die obersten Blätter (19-26).

Die Nickelgehalte in den Blättern der Pflanzen aus landwirtschaftlichem

Anbau sind annähernd gleich hoch (vgl. Tabelle 8); ebenso ist das

Reifestadium der Pflanzen vergleichbar, wie der Fettanteil in den Sonnen-

blumenkernen verdeutlicht (vgl. 2.3). Zudem fungieren die Blätter in den

Sonnenblumen aus Unterfranken und Vinsebeck in gleichem Maße als

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 67

Schwermetallsenke (vgl. Abbildung 16b). Es ist deshalb zu klären, ob die

löslichen Nickel-Bindungsformen in Blättern von Sonnenblumen eine Erklä-

rung für die beobachteten Unterschiede liefern können (vgl. Abbildung 42).

Abb. 41: Sonnenblumenblätter (Blätter 1-6; Vinsebeck, 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 10 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 30 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 30.

Abbildung 41 und Abbildung A23 zeigen, dass in Sonnenblumenblättern der

Pflanzen aus Vinsebeck (Blätter 1-6) die Cadmium-, Kupfer-, Nickel- und

Zinkspezies über einen weiten Molmassenbereich verteilt sind.

Cadmium ist überwiegend höhermolekular gebunden (600-50 kD), sowie

Nickel und Zink bevorzugt niedermolekular (30 - <10 kD). An „Superdex

Peptide“ (Abbildung A20) fraktionieren Nickel-bindende Substanzen mit der

Molmasse von 2,5 kD. Der größte Teil des Nickels und Zinks eluiert im

Totalvolumen (< 0,1 kD). Zudem können Kupfer-bindende Substanzen mit

der Molmasse von 28 kD und 3 kD im Eluat nachgewiesen werden. An

Superdex S75 ließen sich die Kupfer-Bindungsformen mit der Molmasse von

28 kD weiter auftrennen, sodass Komponenten bei 26 kD und 19 kD

detektiert wurden (Dnp).

Neben den untersten Blättern (1-6) der Sonnenblumen sind zusätzlich die

obersten Blätter (19-26) der Sonnenblumenpflanzen aus Vinsebeck auf die

Bindungsformen von Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink untersucht worden

(Abbildung A21). Es zeigten sich allerdings keine wesentlichen Unterschiede

in den Schwermetall-Elutionsprofilen.

Gleiches gilt für Sonnenblumenblätter aus der Anzucht in Hydrokultur

(Kontrollanzucht ohne Cd-Dotierung). Cadmium ist an Substanzen mit

Molmassen > 35 kD gebunden. Nickel und Zink eluieren sowohl im

Ausschluss- (> 35 kD) als auch im Totalvolumen (< 1,5 kD). Kupfer ist fast

ausschließlich niedermolekular (< 1,5 kD) gebunden. Zudem fraktionieren

Kupfer-bindende Substanzen bei 20 kD.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD> 600 kD 500 kD320 kD 140 kD 28 kD 20 kD

68 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Es bleibt zu untersuchen, ob die höhere Extrahierbarkeit von Nickel aus

Blättern der Pflanzen aus Unterfranken im Vergleich zu den Sonnenblumen

aus Vinsebeck auf unterschiedliche Bindungsformen zurückzuführen ist.

Abbildung 42 zeigt das Nickel-Elutionsprofil für die Blätter der in Unterfranken

(1998) und Vinsebeck (1999, Blätter 1-6) geernteten Sonnenblumen.

Abb. 42: Sonnenblumenblätter: Vergleich der Elutionsprofile von Nickel bei

der Gelfiltration der wässrigen Fraktion für Sonnenblumen aus

Vinsebeck (Ostwestfalen) und Marktbreit (Unterfranken)

Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 30.

Im Vergleich zu den bisherigen Elutionsprofilen fällt das markante Maximum

für Nickel bei einer Molmasse von 85 kD auf. In diesem Molmassenbereich

sind 20 % des Nickels gebunden. Zudem können, im Gegensatz zu den

Sonnenblumenblättern der Pflanzen aus Vinsebeck, Nickel-bindende

Komponenten mit einer Molmasse von 2,5 kD aus den Blättern der

Sonnenblumen aus Unterfranken extrahiert werden. Der Anteil der

hochmolekularen Nickelspezies (> 500 kD) ist in allen untersuchten

Sonnenblumenblätterproben in einer ähnlichen Größenordnung. Dieses gilt

ebenfalls für den Anteil des an niedermolekulare Substanzen (< 0,1 kD)

gebundenen Nickels.

Diese Beobachtungen können als Hinweise interpretiert werden, dass die

Unterschiede in der Extrahierbarkeit von Nickel auf eine Sortenabhängigkeit

der Bindungsformen zurückzuführen sind.

6.6 Rapsblätterextrakte

Die für diese Untersuchungen verwendeten Blätter stammen von

Rapspflanzen aus der Anzucht in Hydrokultur sowie von der Probenahme im

April 2000 in Detmold-Mosebeck.

100

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Nickelgehalt [ng/mL]

85 kD> 600 kD 500 kD < 10 kD20 kD

SB-Blätter Vinsebeck

(Blätter 1-6)

SB-Blätter (Unterfranken)

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 69

Tab. 23: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Rapsblätterextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Überstand 45 65 15 50 10

Rückstand 55 35 80 50 90

Aus Rapsblättern sind Cadmium und Zink zu etwa 50 % extrahierbar. Die

höchste Extrahierbarkeit mit 65 % weist Kupfer auf. Auffällig ist, dass Nickel

lediglich zu 15 % aus Rapsblättern zu extrahieren ist. Mehr als 80 % des

Nickels sind demnach an unlösliche Zellbestandteile, wie z.B. Zellwände und

Zellmembranen, gebunden. Vergleichbares ist bisher nur für Nickel-Hyper-

akkumulatoren wie das Täschelkraut Thlaspi goesingense beschrieben [120].

Im Vergleich zu Rapssamen (Tabelle 19) ist die Extrahierbarkeit der

Schwermetalle aus Rapsblättern - mit Ausnahme von Nickel - deutlich höher.

Abb. 43: Rapsblätter (Detmold-Mosebeck, April 2000):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 200 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 30.

Die wasserlöslichen Zink- und Nickel-bindenden Substanzen eluieren

nahezu vollständig im Totalvolumen (< 0,1 kD; Abbildung A25). Als

Bindungspartner sind Malat, Citrat und Histidin zu vermuten, wie es für

Blätter des gewöhnlichen Leimkrautes Silene vulgaris beschrieben ist [100].

Höhermolekulare Kupfer-Bindungsformen (> 100 kD) scheinen im

Gegensatz zu nieder-molekularen (< 0,1 kD) weder in Sonnenblumen- noch

in Rapsblättern von Bedeutung zu sein (Abbildung A25). Kupfer ist sowohl in

Raps- als auch Sonnenblumenblättern an Substanzen im Molmassenbereich

von 25-28 kD gebunden.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 170 kD 90 kD 26 kD < 10 kD

80 kD

70 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Die Cadmium-bindenden Substanzen aus Rapsblättern sind über einen

weiten Molmassenbereich (40 - > 600 kD) verteilt. Im Gegensatz zu Sonnen-

blumenblättern werden aus Rapsblättern auch niedermolekulare Cadmium-

Bindungsformen (< 0,1 kD) extrahiert, die 30 % des Cadmiums enthalten und

wohl die leichte Extrahierbarkeit des Cadmiums aus Rapsblättern (65 %)

ermöglichen.

Abb. 44: Vergleich der Cadmium-Elutionsprofile bei der Gelfiltration der

wässrigen Fraktion von Sonnenblumenblättern (Vinsebeck 1999;

Blätter 19-26) und Rapsblättern (Detmold-Mosebeck, 2000)

unter Hydrokulturbedingungen werden ähnliche Unterschiede beobachtet (Dnp)

Bei den Liganden der niedermolekularen Cadmium-Bindungsformen könnte

es sich um Citrate handeln, wie für Zellsuspensionskulturen von

Tabakpflanzen beschrieben ist [123].

Zwischenbetrachtung

Zusammenfassend ist festzustellen, dass Kupfer, Nickel und Zink aus

Rapsblättern in einer ähnlichen Größenordnung wie aus Sonnenblumen-

blättern extrahierbar sind. Cadmium ist aus Rapsblättern in einem höheren

Maße extrahierbar als aus Sonnenblumenblättern.

Deutliche Unterschiede werden zwischen den Schwermetall-Elutionsprofilen

bei Sonnenblumen- und Rapsblättern festgestellt. Cadmium ist in Raps-

blättern zu einem hohen Anteil (> 30 %) niedermolekular (< 0,1 kD) gebun-

den, in Sonnenblumenblättern dagegen ausschließlich höhermolekular.

Nickel ist aus den Blättern von Sonnenblumen, die in Vinsebeck geerntet

wurden, zu 20 % extrahierbar, während aus den Blättern der Sonnenblumen

aus Unterfranken 50 % des Nickels extrahierbar sind. Zusätzlich sind in den

Blättern der Pflanzen aus Unterfranken Nickel-bindende Substanzen der

Molmassen 85 kD und 2,5 kD nachweisbar. In Rapsblättern ist Nickel

ausschließlich niedermolekular gebunden.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

Sonnenblumenblätter Vinsebeck 1999

Rapsblätter Detmold-Mosebeck 2000

< 10 kD90 kD140 kD350 kD> 600 kD

Nachweisgrenze für

Cadmium

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 71

Der Hauptanteil des Kupfers wird sowohl in Sonnenblumen- als auch in

Rapsblättern von Substanzen im Molmassenbereich von 25-28 kD

komplexiert. Kupfer ist ferner niedermolekular (< 0,1 kD) gebunden.

In Sonnenblumenblättern fraktionieren nieder- (< 0,1 kD) und höher-

molekulare Zink-Bindungsformen (> 600 bis 20 kD). Im Unterschied dazu ist

Zink in Rapsblättern ausschließlich niedermolekular (< 0,1 kD) gebunden.

6.7 Sonnenblumenblätter: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Die extrahierbaren Anteile von Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink aus

Sonnenblumenblättern (Vinsebeck 1999, Blätter 19-26) werden durch den

Zusatz von Mercaptoethanol zum Extraktionsmedium nicht beeinflusst.

Abb 45: Sonnenblumenblätter (Blätter 19-26, Vinsebeck, 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion unter reduzie-

renden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 40 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL)

Zn (1 Einheit 250 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 36.

Aber beim Vergleich von Abbildung 45 und Abbildung A17 fällt für Kupfer und

Cadmium unter reduzierenden Bedingungen eine deutliche Veränderung des

Schwermetall-Elutionsprofiles auf.

Kupfer ist hauptsächlich an Substanzen mit der Molmasse von 24 kD

gebunden. Die Schulter des Kupferpeaks zeigt, dass die Auflösung der

Gelfiltration nicht ausreicht, um die Kupferspezies zu trennen. An Superdex

S75 eluieren Kupfer-bindende Komponenten bei 26 kD und 19 kD.

Cadmium ist unter reduzierenden Bedingungen nicht mehr ausschließlich an

hochmolekulare Substanzen gebunden (vgl. Abbildung 46). Zusätzlich zu

hochmolekularen Cadmium-Bindungsformen (300 kD) werden Cadmium-

bindende Substanzen im Totalvolumen detektiert.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

Ni Cd Zn

400 kD 300 kD 24 kD < 10 kD10 kD

72 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Abb 46: Sonnenblumenblätter (Vinsebeck 1999; Blätter 19-26): Vergleich der

Cadmium-Elutionsprofile der wässrigen Fraktion unter nicht-reduzie-

renden und reduzierenden Bedingungen

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L); unter reduzierenden

Bedingungen werden 10 mmol/L Mercaptoethanol zugesetzt. Superdex Peptide.

An Superdex-Peptide (Abbildung 46) fraktionieren niedermolekulare

Cadmium-Bindungsformen im Molmassenbereich von 0,5 - 2,5 kD. Es ist zu

vermuten, dass es sich bei diesen Cadmium-haltigen Substanzen um

Phytochelatin-Monomere handelt, weil GALLEGO ET AL. diese in

Sonnenblumenblättern unter reduzierenden Bedingungen nachwiesen [210,

236]. Die Cadmium-bindende Substanz bei 0,5 kD könnte demnach PC2

(Molmasse 542 g/mol) sein. Die weiteren Cadmium-bindenden Substanzen

bei 0,8, 1,2 und 2,5 kD könnten ebenfalls Phytochelatine darstellen,

entweder Monomere wie PC3 (Molmasse 774 kD) oder PC4 (Molmasse 1 kD)

bzw. Aggregate aus verschiedenen Phytochelatin-Monomeren. Allerdings

steht ein detaillierter Nachweis mit LC-MS und durch eine

Aminosäureanalyse noch aus.

6.8 Rapsblätter: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Die extrahierbaren Anteile von Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink aus

Rapsblättern werden durch den Zusatz von Mercaptoethanol zum

Extraktionsmedium nicht beeinflusst.

Abbildung 44 zeigt, dass Cadmium in Rapsblättern zu erheblichen Anteilen

höhermolekular gebunden ist. Es ist zu vermuten, dass es sich bei diesen

Cadmium-Bindungsformen, wie bei Sonnenblumenblättern, um Aggregate

von niedermolekularen Cadmium-Phytochelatinen handelt, weil OSWALD mit

Tris-HCl-Puffer (pH 8,5; 0,05 mol/L) Cadmium-Phytochelatine aus Raps-

blättern extrahierte [182]. Die Elutionsprofile von Nickel und Zink werden

durch das Reduktionsmittel nicht beeinflusst.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

nicht-reduzierende Bedingungen

reduzierende Bedingungen

> 7 kD < 0,1 kD0,5 kD0,8 kD1,2 kD2,5 kD4 kD 0,2 kD

Nachweisgrenze

für Cadmium

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 73

Abb. 47: Rapsblätter (Detmold-Mosebeck, 2000): Schwermetall-Elutionsprofil

der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 10 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL), Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 36.

Für Kupfer werden bei 320 kD zuvor nicht beobachtete Kupfer-bindende

Substanzen nachgewiesen. Allerdings ist zu vermuten, dass unter reduzie-

renden Bedingungen die nativen Kupfer-bindenden Substanzen teilweise

zerstört werden, weil unter diesen Bedingungen keine niedermolekularen

Kupfer-bindenden Substanzen (< 0,1 kD) mehr nachweisbar sind (Abbildung

A19). Cadmium eluiert an Superdex Peptide unter reduzierenden

Bedingungen ausschließlich bei 0,6 kD (Abbildung 48). Dabei könnte es sich

um die von Oswald beschriebenen Phytochelatine handeln (vgl. 6.7).

Abb. 48: Rapsblätter (Detmold-Mosebeck, 2000): Vergleich der Cadmium-Elu-

tionsprofile der wässrigen Fraktion unter nicht-reduzierenden und

reduzierenden Bedingungen Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 46.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 27 kD < 10 kD

320 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

nicht-reduzierende Bedingungen

reduzierende Bedingungen

Nachweisgrenze für

Cadmium

> 7 kD 0,6 kD < 0,1 kD

74 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Zwischenbetrachtung

Cadmium-bindende Substanzen in Sonnenblumen- und Rapsblättern treten

in einem weiten Molmassenbereich (600-100 kD) auf. Der Einsatz von

Mercaptoethanol führt zur Spaltung dieser Komponenten, da sich die nativen

hochmolekularen Substanzen aus niedermolekularen Untereinheiten

zusammensetzen (vgl. 1.6.4). Aus Rapsblättern können neben hochmole-

kularen auch niedermolekulare Cadmium-Bindungsformen (< 0,1 kD)

extrahiert werden. Letztere sind möglicherweise für höhere Extraktionsgrade

des Cadmiums aus Rapsblättern (65 %) im Vergleich zu Sonnenblumen-

blättern (20 %) verantwortlich. Sie sind unter reduzierenden Bedingungen

allerdings nicht stabil (vgl. Abbildung 48). Nickel und Zink sind in

Sonnenblumenblättern zu 50 % an Substanzen mit Molmassen von 20-600

kD gebunden. Des Weiteren lassen sich niedermolekulare Nickel- und Zink-

Bindungsformen aus Sonnenblumenblättern extrahieren. Dagegen sind

höhermolekulare Nickel- und Zink-bindende Substanzen in Rapsblättern

nicht nachweisbar. In Sonnenblumen- und Rapsblättern sind Kupfer-

bindende Substanzen im Molmassenbereich von 26-28 kD nachweisbar, die

gegenüber Mercaptoethanol stabil sind.

6.9 Sonnenblumen- und Rapsstängelextrakte

Tabelle 24 zeigt, dass Nickel aus den Stängeln von Rapspflanzen fast nicht

(< 5 %) zu extrahieren ist. Dieses gilt auch für Sonnenblumenstängel (20 %).

Cadmium und Zink sind aus Sonnenblumen- und Rapsstängeln in gleichem

Maße herauszulösen. Kupfer ist aus Sonnenblumenstängeln zu 65 %, aus

Rapsstängeln dagegen nur zu 35 % zu extrahieren.

Tab. 24: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Sonnenblumen- und Rapsstängelextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Wässrige Fraktion Sonnenblume 50 60 20 30 < 5

Wässrige Fraktion Raps 40 35

< 5 35 < 5

Die wässrigen Fraktionen aus Sonnenblumen- und Rapsstängeln wurden

ebenfalls mit der GFC untersucht. Die im Anhang dargestellten

Schwermetall-Elutionsprofile (Abbildung A29 und A30) sind zu den

Elutionsprofilen für Sonnenblumen- und Rapswurzeln ähnlich.

6.10 Sonnenblumenwurzelextrakte

Tab. 25: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Sonnenblumenwurzelextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Überstand 40 70 65 35 5

Rückstand 60 30 35 65 95

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 75

Aus Sonnenblumenwurzeln sind Cadmium und Nickel mit 40 % bzw. 65 % zu

deutlich höheren Anteilen extrahierbar als aus den Blättern (Tabelle 23). Im

Vergleich zu den Sonnenblumensaaten (Tabelle 19) sind Cadmium, Kupfer,

Nickel und Zink zu einem größeren Teil aus den Wurzeln extrahierbar.

Abb. 49: Sonnenblumenwurzeln (Vinsebeck, 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 100 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abb. 30.

Cadmium-bindende Komponenten eluieren bei 130 kD und im Totalvolumen

(< 10 kD). Das Elutionsprofil für Cadmium an Superdex S75 und Superdex

Peptide zeigt Peaks bei 6-7 kD (vgl. auch Abbildung A21). Ob es sich bei

diesen Cadmium-Bindungsformen um Phytochelatine handelt, wurde nicht

geklärt. Dieses erscheint zumindest möglich, weil Untersuchungen an

Bohnen-, Mais- und Tomatenwurzeln sowie dem Gras Agrostis gigantea

Phytochelatine identifizierten, die mit Cadmium Komplexe von 10 kD bilden

[44, 140, 141, 269, 270]. Wie zuvor schon für Sonnenblumenkerne und

Sonnenblumenblätter beobachtet, ist Nickel auch in Sonnenblumenwurzeln

bevorzugt an niedermolekulare Komponenten (< 0,1 kD) gebunden

(Abbildung 50). Höhermolekulare Nickel-Bindungsformen eluieren im Mol-

massenbereich von 20-30 kD.

Zink ist überwiegend (60 %) im Totalvolumen (< 10 kD) nachweisbar. Etwa

40 % des Zinks eluieren über einen weiten Molmassenbereich mit Maxima

bei 100 kD und im Ausschlussvolumen. Kupfer eluiert bei 460 kD, 75 kD

sowie im Totalvolumen (< 0,1 kD). Die Kupfer-bindenden Substanzen im

Totalvolumen fraktionieren an Superdex S75 (Abbildung A25) bei 7,5 kD. 30

% des Kupfers eluieren außerhalb des Trennbereiches der verwendeten

Säulen. Auffällig ist das wellenförmige Elutionsprofil für Zink an Superdex

Peptide (Abbildung 50). Zink-bindende Komponenten eluieren bei 0,8 kD.

Weitere Zink-Maxima finden sich bei 1,2 kD und 3,2 kD (vgl. Abbildung 53).

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

460 kD> 600 kD 130 kD 75 kD 30 kD < 10 kD

76 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Abb. 50: Sonnenblumenwurzel (Vinsebeck, 1999): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion.

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 50 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

Cadmium-bindende Substanzen mit einer Molmasse von 10 kD sowie höher-

molekulare Cadmium-, Nickel- und Zink-bindende Komponenten (> 30 kD)

können auch in den Sonnenblumenwurzeln aus der Anzucht in Hydrokultur

nachgewiesen werden (Abbildung A22).

6.11 Rapswurzelextrakte

Tab. 26: Durchschnittliche Schwermetallverteilung auf die Fraktionen von

Rapswurzelextrakten

Fraktion Cadmium Kupfer Nickel Zink Eisen

[%]

Überstand 40 50 10 35 5

Rückstand 60 50 90 65 90

Mit dem verwendeten Puffersystem lassen sich lediglich 10 % des Nickels

aus Rapswurzeln extrahieren. Im Vergleich zu Sonnenblumenwurzeln

(Tabelle 25) ist Nickel aus Rapswurzeln zu einem deutlich geringeren Anteil

extrahierbar, weil es vermutlich überwiegend an unlösliche Zellstrukturen

(Zellwand, Zellmembran) gebunden ist. Der daraus resultierende geringere

Anteil an mobilem Nickel könnte ein Grund für die niedrigen Nickelgehalte in

den oberirdischen Pflanzenteilen von Raps sein (Tabelle 10, 11). Dagegen

ist die Extrahierbarkeit von Cadmium, Kupfer und Zink in Sonnenblumen-

und Rapswurzeln ähnlich hoch.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

0,25-0,15 kD3,2 kD> 7 kD 1,2 kD 0,8 kD < 0,1 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 77

Abb. 51: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 2000):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 10 ng/mL), Ni (1 Einheit 100 ng/mL),

Zn (1 Einheit 250 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 30.

Tab. 27: Rapswurzeln: GFC-Fraktionierbereiche an Superdex S200:

prozentuale Verteilung der Schwermetalle (s. Abb. 51)

Fraktionierbereich / Molmasse [kD]

> 600 90 40 < 10

[%]

Cadmium 20 30 4 4

Kupfer 15 5 10 30

Die aus Rapswurzeln extrahierten Cadmium-Bindungsformen eluieren über

einen weiten Molmassenbereich (> 600-30 kD) mit Maxima bei 90 kD und im

Ausschlussvolumen der Säule (> 600 kD). Kupfer-bindende Substanzen

werden im hochmolekularen Bereich (> 600 kD), bei 40 kD sowie im

niedermolekularen Bereich bei 3,2 kD (Abbildung A31) nachgewiesen.

Nickel und Zink sind bevorzugt niedermolekular (< 0,1 kD) gebunden.

Zwischenbetrachtung

Die Elutionsprofile für die Schwermetall-bindenden Substanzen aus

Sonnenblumen- und Rapswurzeln unterscheiden sich deutlich. Während in

Sonnenblumenwurzeln Cadmium und Kupfer überwiegend an nieder-

molekulare Substanzen (< 15 kD) gebunden sind, treten in Rapswurzeln

Cadmium ausschließlich und Kupfer zu weiten Teilen höhermolekular (> 40

kD) auf. Nickel und Zink sind in Sonnenblumen- und Rapswurzeln bevorzugt

niedermolekular gebunden. Die Molmassen der Nickel- und Zinkspezies in

Sonnenblumenwurzeln liegen bei 2-10 kD. Dagegen sind die

niedermolekularen Zink- und Nickel-bindenden Komponenten aus

Rapswurzeln ausschließlich im Totalvolumen (< 0,1 kD) nachzuweisen.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD> 600 kD 90 kD 40 kD

78 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

6.12 Sonnenblumenwurzeln: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Im Vergleich zur Extraktion ohne Reduktionsmittel (40 %) ist Cadmium unter

reduzierenden Bedingungen zu etwa 75 % aus Sonnenblumenwurzeln

extrahierbar (Dnp). Die Extrahierbarkeit von Nickel, Kupfer und Zink wird von

Mercaptoethanol nicht beeinflusst.

Abb. 52: Sonnenblumenwurzeln (Vinsebeck, 1999): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 100 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 36.

Unter reduzierenden Bedingungen sind Cadmium, Kupfer, Nickel und Zink

überwiegend niedermolekular gebunden (Abbildung 52). Etwa 30 % des

Cadmiums eluieren bei 2,3 kD. Im Ausschlussvolumen (> 7 kD) ist unter

diesen Bedingungen weniger Cadmium nachweisbar als bei der Extraktion

ohne Mercaptoethanol (Abbildung 50). Es ist zu vermuten, dass die

Cadmium-haltigen Substanzen bei 2,3 kD Untereinheiten der zuvor bei 10 kD

fraktionierenden Cadmium-haltigen Substanzen sind. Nickel wird

überwiegend im Totalvolumen (< 0,1 kD) sowie bei 1 kD eluiert.

Der Hauptanteil des Kupfers eluiert bei 0,2 kD. Zudem werden

Kupferspezies mit der Molmasse von 12 kD nachgewiesen. Auffällig ist der

markante Zinkpeak bei 0,8 kD, welcher bei der Extraktion ohne

Mercaptoethanol nicht zu beobachten ist (Abbildung 50).

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

0,8 kD < 0,1 kD2

3 kD> 7 kD 0,2 kD

1 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 79

Abb. 53: Sonnenblumenwurzeln (Vinsebeck 1999): Vergleich der Zink-Elu-

tionsprofile der wässrigen Fraktion unter nicht-reduzierenden und

reduzierenden Bedingungen. Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 46.

Die Zink-bindenden Substanzen bei 3,2 und 1,2 kD werden unter

reduzierenden Bedingungen nicht mehr beobachtet. Möglicherweise handelt

es sich dabei um Aggregate der Substanzen bei 0,8 kD. In der Literatur sind

Zink-Phytate beschrieben [147-150]. Es ist daher wahrscheinlich, das

Phytate (Myoinositol-Hexaphosphat; Molmasse 660 g/mol) in

Sonnenblumenwurzeln an der Komplexierung von Zink beteiligt sind.

Dagegen ist eine Bindung von Zink an Phytochelatine nicht zu vermuten, wie

Untersuchungen von WALDNER ET AL. für verschiedene Gemüsesorten zeigen

[327].

6.13 Rapswurzeln: Extraktion unter reduzierenden

Bedingungen

Der Zusatz von Mercaptoethanol erhöht die Cadmium-Extrahierbarkeit von

40 % auf 70 %. Es ist daher zu vermuten, dass auch in den Rapswurzeln die

hochmolekularen Cadmium-Bindungsformen Aggregate von Untereinheiten

mit sehr viel geringerer Molmasse darstellen. Die Extrahierbarkeit von

Kupfer, Nickel und Zink wird durch Mercaptoethanol nicht beeinflusst.

100

125

150

175

200

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Zinkgehalt [ng/mL]

nicht-reduzierende Bedingungen

reduzierende Bedingungen

> 7 kD

Nachweisgrenze

für Zink

0,8 kD < 0,1 kD1,2 kD3,2 kD

80 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Abb. 54: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 2000): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 15 ng/mL), Ni (1 Einheit 20 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 36.

Tab. 28: Rapswurzeln: GFC-Fraktionierbereiche an Superdex S200:

prozentuale Verteilung der Schwermetalle (s. Abb. 54)

Fraktionierbereich / Molmasse [kD]

> 600 430 - 70 35 12 < 10

[%]

Cadmium 10 30 2 40 10

Kupfer 10 20 10 25 30

Nickel 2 20 5 10 55

Zink 5 15 2 15 55

Zink eluiert überwiegend im Totalvolumen (< 10 kD) und bei 12 kD. An

Superdex Peptide fraktionieren unter reduzierenden Bedingungen zuvor nicht

beobachtete Zink-bindende Komponenten bei 0,5 kD (Abbildung A26). Der

Hauptanteil des Zinks eluiert zusammen mit Nickel bei 0,2 kD. Kupfer ist zu

25 % an Komponenten mit der Molmasse von 12 kD gebunden. Der

überwiegende Anteil des Kupfers eluiert bei 0,6 kD (Abbildung A26).

Abbildung 54 zeigt, dass Cadmium unter reduzierenden Bedingungen zum

größten Teil an Substanzen mit einer Molmasse von 12 kD gebunden ist.

Weiterhin werden Cadmium-haltige Komponenten im Bereich von 1,5-0,5 kD

nachgewiesen. Abbildung 55 veranschaulicht die Veränderungen des

Cadmium-Elutionsprofiles durch die Zugabe von Mercaptoethanol.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD> 600 kD 430 kD 140 kD 70 kD 35 kD

CuCd

12 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 81

Abb. 55: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 2000): Vergleich der Cadmium-

Elutionsprofile der wässrigen Fraktion unter nicht-reduzierenden

und reduzierenden Bedingungen;

Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 37.

Zwischenbetrachtung

Für Sonnenblumen- und Rapswurzeln aus der landwirtschaftlichen Praxis

und der Anzucht in Hydrokultur lassen sich auf Grund der bisherigen

Untersuchungsergebnisse folgende Gemeinsamkeiten und Unterschiede

formulieren:

Gemeinsamkeiten

¾

Cadmium (40 %) und Zink (40 %) sind aus Sonnenblumen- und

Rapswurzeln zu ähnlichen Anteilen extrahierbar.

¾

Durch die Zugabe des milden Reduktionsmittels Mercaptoethanol wird

die Extrahierbarkeit von Cadmium aus Sonnenblumen- und

Rapswurzeln von 40 % auf 70 % erhöht.

¾

Mercaptoethanol beeinflusst die Extrahierbarkeit von Kupfer, Nickel

und Zink weder bei Sonnenblumen- noch bei Rapswurzeln.

Unterschiede

¾

Nickel ist aus Sonnenblumenwurzeln zu 65 % extrahierbar, während

aus Rapswurzeln lediglich 20 % zu extrahieren sind. Der höhere Anteil

an mobilem Nickel in den Wurzeln von Sonnenblumen sollte für die

höheren Nickelgehalte in den vegetativen Pflanzenteilen der

Sonnenblumen im Vergleich zu Rapspflanzen verantwortlich sein.

¾

Cadmium und Kupfer sind in Sonnenblumenwurzeln auch an nieder-

molekulare Komponenten gebunden (15-7 kD). Dagegen ist Cadmium

in Rapswurzeln ausschließlich und Kupfer zu einem hohen Anteil

(40 %) in Fraktionen mittel- bis hochmolekularer Komponenten (< 600

- 40 kD) enthalten. Diese werden durch Mercaptoethanol in Unter-

einheiten mit einer Molmasse von 12 kD gespalten.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Cadmiumgehalt [ng/mL]

Rapswurzeln Detmold-Mosebeck 2000

Rapswurzeln Detmold Mosebeck 2000 (red. Bdgen)

> 600 kD 90 kD 12 kD

Nachweisgrenze

für Cadmium

82 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

¾

Nickel und Zink sind in Rapswurzeln ausschließlich niedermolekular

(< 0,1 kD) gebunden. Dagegen werden aus Sonnenblumenwurzeln

auch Nickel- und Zinkspezies mit Molmassen von 7-10 kD extrahiert.

Diese Zink-Bindungsformen werden unter dem Einfluss von Mercapto-

ethanol in Untereinheiten von 0,8 kD gespalten.

7 Isolierung von Cadmium-bindenden Substanzen aus

Sonnenblumen und Raps

In Kapitel 1.7 ist beschrieben, dass die Cadmium-Bindungsformen in

Sonnenblumen und Raps bisher wenig bekannt sind. Einzig in den Blättern

wurden bisher Cadmium-Phytochelatine nachgewiesen [182, 210, 236].

Daher werden im weiteren Verlauf dieser Arbeit Cadmium-bindende

Komponenten aus Sonnenblumenkernen und Rapssamen sowie aus den

Wurzeln von Sonnenblumen- und Rapspflanzen isoliert und struktur-

analytisch untersucht.

Für die Isolierung der Cadmium-Bindungsformen aus den Wurzeln werden

Pflanzen verwendet, die unter definierten Bedingungen in Cadmium-dotierter

Nährlösung angezogen wurden (vgl. Kap. 3). Es ist notwendig auf die unter

Hydrokulturbedingungen angezüchteten Pflanzen als Modellpflanzen

auszuweichen, weil die Cadmium-bindenden Substanzen in den aus der

landwirtschaftlichen Praxis stammenden Pflanzen in zu geringer

Konzentration vorliegen (vgl. Abbildung 49 und 51).

Die Isolierung der Cadmium-Bindungsformen aus Pflanzenkompartimenten

folgt immer dem gleichen Schema und soll exemplarisch am Beispiel von

Sonnenblumenwurzeln (Abbildung 56) beschrieben werden (vgl. 1.8).

Abb. 56: Sonnenblumenwurzeln (Anzucht in Hydrokultur, 1 µmol/L Cd):

Cadmium-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 5 ng/mL); Extraktionsbedingungen vgl. Abbildung 30.

Zunächst werden die Cadmium-haltigen Substanzen aus dem Molmassen-

bereich von 20 - 35 kD gelchromatographisch von Begleitsubstanzen

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Cadmiumgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 24 kD

30 -

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 83

getrennt (Abbildung 58, gekennzeichneter Bereich) und nachfolgend mit der

Ionenaustauscherchromatographie (IAC) weiter gereinigt (Abbildung 59). Die

Chromatographie an Bio-Scale Q5 ergab, dass die aus Sonnenblumen- und

Rapswurzeln isolierten Cadmium-bindenden Komponenten zunächst

vollständig retardiert werden (Abbildung 57, A34) und anschließend mit

einem NaCl-Gradienten eluiert werden.

Abb. 57: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanzen aus Sonnen-

blumenwurzeln (Molmasse 25kD)

SBK: Cd (1 Einheit 7 ng/mL);

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Laufmittel B: 1 mol/L NaCL in Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L).

Sonnenblumenwurzeln

Sowohl für die unter nicht-reduzierenden (Abbildung 56) als auch unter redu-

zierenden Bedingungen (Abbildung A23) durch GFC isolierten Cadmium-

Bindungsformen lassen sich bei der IAC zwei Hauptfraktionen unterscheiden:

Nicht-reduzierende Bedingungen (Abbildung 57):

Substanz A: 10 % des Cadmiums; 0,10-0,15 mol/L NaCl.

Substanz B: 60 % des Cadmiums; 0,38-0,45 mol/L NaCl.

Reduzierende Bedingungen (Abbildung A33):

Substanz A: 50 % des Cadmiums; 0,10-0,15 mol/L NaCl.

Substanz B: 20 % des Cadmiums; 0,38-0,45 mol/L NaCl.

Die Fraktionen der Cadmium-haltigen Substanzen A und B der IAC werden

gepoolt und anschließend an Sephadex G25 entsalzen.

Die Cadmium-haltigen Fraktionen im Ausschlussvolumen der Entsalzungs-

säule (> 4kD) werden vereinigt und gefriergetrocknet. Es werden unter

reduzierenden Bedingungen 4,6 mg der Substanz A und 1,5 mg der

Substanz B erhalten.

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 18 34 50 66 82 98 114 130 146

Elutionsvolumen [mL]

Volumenanteil Elutionsmittel B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Elementgehalt [rel. Einheiten]

84 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Rapswurzeln

Ebenso wie zuvor für Sonnenblumenwurzeln beschrieben, wurden auch aus

Rapswurzeln Cadmium-haltige Komponenten im Molmassenbereich von 25-

35 kD isoliert (Abbildung A27 und A28). Bei der nachfolgenden IAC werden

für die unter nicht-reduzierenden Bedingungen isolierten Komponenten drei

Cadmium-haltige Fraktionierbereiche nachgewiesen (Abbildung A34):

Substanz I: 02 % des Cadmiums; 0,15 mol/L NaCl,

Substanz II: 40 % des Cadmiums; 0,45 mol/L NaCl,

Substanz III: 25 % des Cadmiums; 0,78 mol/L NaCl.

Unter reduzierenden Bedingungen (Abbildung A34) werden demgegenüber

zwei Cadmium-haltige Fraktionierbereiche beobachtet:

Substanz Ia: 40 % des Cadmiums; 0,15 mol/L NaCl,

Substanz IIa: 40 % des Cadmiums; 0,45 mol/L NaCl.

Bei der Isolierung ohne Zusatz von Mercaptoethanol wurden 1,2 mg der

Substanz I und 6,9 mg der Substanz II erhalten. Substanz III konnte nicht

isoliert werden, weil möglicherweise Cadmium während des Umpufferns

abgespalten wurde.

Die Isolierung der Cadmium-Bindungsformen unter reduzierenden

Bedingungen ergab 4,5 mg der Substanz Ia und 1,5 mg der Substanz IIa.

Sonnenblumenkerne und Rapssamen

Für Sonnenblumenkerne und Rapssamen wurden die Cadmium-Bindungs-

formen des Molmassenbereiches von 20-25 kD ausgewählt (Abbildung 37

und 39), die unter reduzierenden Bedingungen die bevorzugte Bindungsform

für Cadmium sind und möglicherweise Untereinheiten von hochmolekularen

Speicherproteinen wie Helianthinin und Cruciferin darstellen (vgl. 6.1, 6.2).

Abb. 58: Entsalzung der durch IAC gereinigten Cadmium-Bindungsformen

aus Sonnenblumenkernen und Rapssamen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL);

Leitfähigkeit (1 Einheit 0,1 µS); Absorption 280 nm (1 Einheit 0,1 mV).

0,1

0,2

0,3

0,4

-0,04 0,13 0,29 0,46 0,63 0,79 0,96 1,13 1,29

Kav-Wert

Elektr. Leitfähigkeit; Absorption

[rel. Einheiten]

0,2

0,4

0,6

0,8

Elementgehalt [rel. Einheiten]

Abs. 280 nm

Leitfähigkeit

> 4 kD < 1,5 kD

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 85

Wie Abbildung 58 zeigt, eluieren die aus den Sonnenblumenkernen und

Rapssamen isolierten und mit IAC gereinigten Cadmium-bindenden

Komponenten nicht im Ausschlussvolumen (> 4 kD) der Entsalzungssäule,

obwohl dieses auf Grund der Molmasse von 20-25 kD zu erwarten wäre.

Demnach haben sich während der Aufkonzentrierung (IAC, Abbildung A31)

oder der Entsalzung an Sephadex G25 die aus Sonnenblumenkernen und

Rapssamen isolierten Cadmium-bindenden Komponenten chemisch

verändert. Der Verlauf der UV-Absorption bei 280 nm zeigt, dass die

Cadmium-Bindungsformen noch nicht von sämtlichen Begleitstoffen getrennt

werden (Abbildung 58). Es ist daher möglich, dass Cd2+-Ionen aus den

ursprünglichen (nativen) Bindungsformen herausgelöst werden und mit

anderen Komplexbildnern reagieren.

Für die Isolierung der Cadmium-bindenden Komponenten aus

Sonnenblumenkernen und Rapssamen ist somit eine andere Strategie

erforderlich. Denkbar ist z.B. der Einsatz von Ultrafiltration kombiniert mit der

präparativen Isoelektrischen Fokussierung (IEF). Bei dieser Methode würden

die Cadmium-Bindungsformen nach ihrem isoelektrischen Punkt aufgetrennt.

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit war es allerdings nicht mehr möglich,

diese Methoden anzuwenden.

Im Folgenden wurden die aus Sonnenblumen- und Rapswurzeln unter nicht-

reduzierenden und reduzierenden Bedingungen isolierten Cadmium-haltigen

Substanzen durch Fluoreszenz-HPLC, Aminosäureanalyse und ESI-MS

strukturanalytisch untersucht.

8 Strukturanalytische Untersuchungen der aus Sonnen-

blumen- und Rapswurzeln isolierten Cadmium-

bindenden Substanzen

8.1 Fluoreszenz-HPLC

Wie in Kapitel 1.9 beschrieben, wird mit der Fluoreszenz-HPLC geprüft, ob

die aus den Wurzeln isolierten Cadmium-haltigen Substanzen Thiolgruppen

enthalten. Der Nachweis von Thiolgruppen wäre ein Hinweis auf

cysteinreiche Proteine [289-293].

Jeweils ein Teil der aus Raps- und Sonnenblumenwurzeln isolierten und

lyophilisierten Cadmium-bindenden Komponenten wird mit Monobrombiman

derivatisiert (vgl. 11.5). Monobrombiman reagiert mit Thiolgruppen unter

Bildung von fluoreszierenden Thioethern, die mit der Fluoreszenz-HPLC

quantifiziert werden.

Abbildung 59 a zeigt für die aus Rapswurzeln isolierte Substanz IIa das

erhaltene Chromatogramm, das mit den anderen Chromatogrammen der aus

Sonnenblumen- und Rapswurzeln isolierten Cadmium-Bindungsformen

nahezu übereinstimmt (Dnp). Im Vergleich dazu zeigt Abbildung 59 b das

Chromatogramm des reinen Derivatisierungsreagenz.

Da Monobrombiman selbst eine fluoreszierende Substanz ist, wird es aus

dem Derivatisierungsgemisch durch die Reaktion mit Thiolagarose entfernt

(vgl. 11.5), damit keine störenden HPLC-Signale auftreten. Allerdings führt

86 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

die Hydrolyse von Monobrombiman doch zur Bildung weiterer

fluoreszierender Verbindungen [290], deren Signale in Abbildung 59 b zu

erkennen sind.

a) b)

Abb. 59 a/b: Chromatogramme der Fluoreszenz-HPLC für die aus Raps-

wurzeln isolierte Substanz IIa (a) sowie für Monobrombiman (b)

Laufmittel A: 10 % (v/v) Methanol, 0,25 % (v/v) Essigsäure, pH 3,9

Laufmittel B: 90 % (v/v) Methanol, 0,25 % (v/v) Essigsäure, pH 3,9

Detektion: Anregungswellenlänge λex: 268 nm

Emissionswellenlänge

λem: 479 nm

Beim Vergleich von Abbildung 59 a mit 59 b fällt auf, dass die im Chromato-

gramm der Substanz II zu erkennenden Peaks ausschließlich Hydrolyse-

produkten von Monobrombiman zuzuordnen sind. Signale von Thiol-

Gruppen-haltigen Substanzen, wie z.B. Cystein, sind nicht zu erkennen.

Demnach enthalten die aus Sonnenblumen und Rapswurzeln isolierten

Cadmium-haltigen Substanzen keine nachweisbaren Thiolgruppen.

8.2 Aminosäureanalyse der aus Sonnenblumen- und

Rapswurzeln isolierten Cadmium-Bindungsformen

Die lyophilisierten Cadmium-bindenden Substanzen aus Sonnenblumen- und

Rapswurzeln werden zunächst, um das Cystein zu Cystinsäure zu oxidieren,

mit Perameisensäure oxidiert [328] und auf ihre Aminosäuregehalte ana-

lysiert1. Tabellen 29 -31 zeigen die Ergebnisse der Aminosäureanalyse (vgl.

11.13).

1 Herrn Dr. W. Sailmeier von der Deutschen Forschungsanstalt für Lebensmittelchemie in

München-Garching ist für die Durchführung der Aminosäureanalysen zu danken.

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 87

Tab 29: Aminosäureanalyse der aus Sonnenblumenwurzeln unter reduzie-

renden Bedingungen isolierten Cadmium-bindende Substanzen

(Abb. 57)

Aminosäure Substanz A Substanz B

[nmol] [mol %] [nmol] [mol %]

Ser 0,658 23 0,284 20

His 0,604 21 - -

Gly 0,565 20 0,301 21

Ala 0,272 10 0,223 16

Asp 0,207 7 0,112 8

Glu 0,143 5 0,111 8

Val 0,131 5 - -

Cys 0,117 4 0,212 15

Thr 0,112 4 0,045 3

Lys 0,107 4 0,058 4

Leu 0,086 3 0,059 4

Ile 0,069 2 0,046 3

Tab 30: Aminosäureanalyse der aus Rapswurzeln unter nicht-reduzierenden

Bedingungen isolierten Cadmium-bindenden Substanzen (Abb. A33)

Aminosäure Substanz I Substanz II

[nmol] [mol %] [nmol] [mol %]

Ser 0,198 20 0,286 22

His 0,179 18 - -

Gly 0,197 20 0,252 20

Ala 0,137 14 0,161 13

Asp 0,052 5 0,090 7

Glu 0,005 1 0,059 5

Val 0,018 2 0,067 5

Cys 0,08 8 0,222 20

Thr 0,018 2 0,036 3

Lys 0,077 8 0,055 4

Leu - - 0,018 2

ILe 0,019 2 0,024 2

88 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Tab 31: Aminosäureanalyse der aus Rapswurzeln unter reduzierenden

Bedingungen isolierten Cadmium-bindenden Substanzen (Abb. A34)

Aminosäure Substanz Ia Substanz IIa

[nmol] [mol %] [nmol] [mol %]

Ser 0,510 24 0,307 25

His 0,345 16 - -

Gly 0,378 18 0,290 24

Ala 0,233 11 0,123 10

Asp 0,146 7 0,086 7

Glu 0,122 6 - -

Val 0,07 3 - -

Cys 0,096 5 0,167 14

Thr 0,077 4 0,077 6

Phe 0,026 1 0,064 5

Lys - - 0,036 3

Leu 0,059 3 0,240 2

ILe 0,051 3 0,045 4

Die Aminosäureanalysen (Tabelle 29-31) ergeben als Hauptkomponenten

die Aminosäuren Serin, Alanin und Glycin. Auffällig ist, dass die Aminosäure-

analyse für die aus Sonnenblumen isolierte Substanz A (Tabelle 29) die

gleiche Zusammensetzung ergibt wie für die aus Rapswurzeln isolierte

Substanz I (Tabelle 30) und Substanz Ia (Tabelle 31). Diese Cadmium-

haltigen Substanzen sind reich an Histidin, enthalten nur sehr wenig Cystein.

Die aus Sonnenblumenwurzeln isolierte Substanz B und die aus Raps-

wurzeln isolierte Substanz II besitzen die gleiche Aminosäurezusammenset-

zung. Neben den Hauptbestandteilen Serin, Glycin und Alanin enthalten

diese Cadmium-Bindungsformen Cystein, aber kein Histidin.

Die Ergebnisse der Aminosäureanalysen (Tabelle 29-31) in Verbindung mit

der Fluoreszenz-HPLC führen zu der Schlussfolgerung, dass die aus

Sonnenblumen- und Rapswurzeln isolierten Cadmium-bindenden

Substanzen keine Phytochelatine sind. Denn Phytochelatine bestehen

hauptsächlich aus den drei Aminosäuren Glutamin, Cystein, Glycin im

Verhältnis 3:3:1 [44, 143, 167, vgl. 1.6.4]. Diese stöchiometrischen

Verhältnisse entsprechen nicht den Analysenergebnissen.

Möglicherweise handelt es sich bei den isolierten Substanzen um

„Stressproteine“ [13], welche für zahlreiche Pflanzen beschrieben sind und

Schwermetalle über S-freie Donorgruppen koordinieren können. Es wurde

gezeigt, dass die DNA von Zellen, die Cadmiumstress ausgesetzt sind,

mRNA-Transkripte produzieren, welche die Bildung von Stressproteinen

regulieren [13]. In Wurzeln der Gartenbohne Phaseolus vulgaris wurden

Stressproteine mit Molmassen von 42 kD [329] sowie 52 und 19 kD [330]

nachgewiesen. In Zellsuspensionskulturen des großblütigen Stechapfels

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 89

Datura innoxia induzierte Cadmium die Bildung von Stressproteinen mit

Molmassen von 70-20 kD [331]. LEVINSON ET AL. berichten zudem, dass

durch Hitzestress induzierte Proteine bei der Gelfiltration zusammen mit

Proteinen eluieren, die durch Cadmium-, Kupfer-, Quecksilber- bzw.

Zinkstress induziert werden [332]. Die genaue Struktur und die Funktionen

insbesondere der kleineren Stressproteine sind bisher noch nicht aufgeklärt

[13]. Die Bestimmung der Aminosäuresequenz für das Stressprotein hsp70

aus dem Apfelbaum Malus domestica ergab eine Aminosäurekette von

mehreren hundert Aminosäuren [333].

In diesem Zusammenhang könnte auch ein Cadmium-bindendes Protein mit

der Molmasse von 12 kD von Bedeutung sein, welches aus dem Pilz

Agaricus macrosporus isoliert wurde [334].

Tab. 32: Aminosäurezusammensetzung einer Cadmium-bindenden Substanz

aus dem Pilz Agaricus macrosporus [334]

Aminosäure [mol %]

Glutaminsäure 20,3

ara

insäure 15,0

cin 16,5

Alanin 08,2

Serin 07,8

Prolin 07,1

sin 04,6

Threonin 04,3

Phos

hoserin 04,2

Valin 03,6

Leucin 02,5

inin 01,9

Histidin 01,7

Isoleucin 01,6

Phen

lalanin 01,0

Dieses Cadmium-haltige Protein enthält, ähnlich wie die aus Sonnenblumen-

und Rapswurzeln isolierten Substanzen A und I, ebenfalls kein Cystein und

als Hauptbestandteile Glutaminsäure, Asparaginsäure, Glycin, Serin und

Alanin (Tabelle 32). Eine ähnliche Aminosäurezusammensetzung ist auch für

zwei Kupfer-bindende Proteine aus dem Riesenstraußgras Agrostis gigantea

beschrieben [335].

8.3 ESI-MS (Ion-Trap, LCQ)

Für die Untersuchungen mit der ESI-MS stand nur von der aus Rapswurzeln

unter nicht-reduzierenden Bedingungen isolierten Substanz II ausreichend

Probenmaterial zur Verfügung. Abbildung 60 zeigt das Massenspektrum

dieser Substanz.

Bei den im Folgenden präsentierten Messungen mit der ESI-MS handelt es

sich um Vorversuche, die eine weitere Optimierung der Messbedingungen

erfordern. Die gewählten Bedingungen orientieren sich an Untersuchungen

90 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

von YEN ET AL., die mit einem LCQ Ion Trap-Massenspektrometer

(ThermoFinnigan) Phytochelatine nachgewiesen haben [298].

Die massenspektrometrischen Messungen wurden im positiv-Modus

durchgeführt.

Abb. 60: ESI-MS-Spektrum der aus Rapswurzeln unter nicht-reduzierenden

Bedingungen isolierten Cadmium-bindenden Substanz II (LCQ

Advantage, ThermoFinnigan)

Probenaufgabe: 50 µL/min

Temperatur Transferkapillare: 250 °C

Spannung ESI-Nadel 5 kV

Sheath-Gas Stickstoff, 25

Kapillarspannung: 35 V

Tube lens: 5 V

m/z-Bereich: 250-2000

Das registrierte Massenspektrum (Abbildung 60) zeigt keinerlei Ähnlichkeiten

mit den für Phytochelatine publizierten Spektren. Daher kann es sich bei der

aus Rapswurzeln isolierten Cadmium-haltigen Substanz II nicht um ein

Phytochelatin handeln.

Die Massenspektren der Phytochelatine werden unter Electrospray-

Bedingungen von protonierten Molekül-Massenpeaks [M+H]+ und wenigen

Fragment-Ionen dominiert [174], deren zu erwartende m/z-Verhältnisse

(Tabelle 33) mit den aus Abbildung 60 abzulesenden Masse-Ladungs-

Verhältnissen nicht übereinstimmen.

Bei Molekülen mit einer molaren Masse < 1000 g/mol werden in der Regel

einfach positiv bzw. negativ geladene Quasimolekülionen beobachtet. Diese

entstehen durch Protonierung [M+H]+ oder Kationenanlagerung [M+Kat]+ mit

Kat = Na, K bei positiver Ionendetektion. Im Fall von negativer Polarität

werden intensive Ionen des Typs [M-H]- gebildet.

Tabelle 33 gibt einige der für Phytochelatine zu erwartenden Masse-

Ladungsverhältnisse für PC2 und PC3 wieder [188, 297, 298].

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 91

Tab. 33: Aufstellung der für PC2 und PC3 zu erwartenden Massenpeaks bei

der ESI-MS [188, 336]

Die nachfolgend aufgeführten Massenpeaks wurden an einem LCQ-Gerät

(Thermo Finnigan) mit PC2 und PC3 Standardsubstanzen ermittelt.

m/z Phytochelatin Identifikation

538 PC2 [MH]+ intramolekular oxidiertes PC2

539 PC2 [M+1H]+ intramolekular oxidiertes PC2

540 PC2 [MH]+

541 PC2 [M+1H]+

542 PC2 [M+2H]+

562 PC2 [M+Na]+ Bildung von [M+Na] statt [M+H]

578 PC2 [M+K]+ Bildung von [M+Na] statt [M+H]

772 PC3 [M+H]+

794 PC3 [M+Na]+ Bildung von [M+Na] statt [M+H]

810 PC3 [M+K]+ Bildung von [M+Na] statt [M+H]

Es ist zu vermuten, dass Substanz II bei der ESI-MS mehrfach geladene

Fragmentionen bildet. Diese Vermutung wird auch von Stoßexperimenten

(MSMS) mit Helium für Ionen mit dem m/z-Verhältnis von 552,1 bestätigt.

Abbildung 61 zeigt das entsprechende Massenspektrum.

Abb. 61: Spektrum bei der ESI-MSMS der aus Rapswurzeln isolierten

Substanz II (LCQ Advantage, ThermoFinnigan)

Probenaufgabe: 50 µL/min

Temperatur Transferkapillare: 250 °C

Spannung ESI-Nadel 5 kV

Sheath-Gas Stickstoff, 25

Kapillarspannung: 35 V

Tube lens: 5 V

normierte Kollisionsenergie: 20 %

Stoßgas Helium

Bei einer Kollisionsenergie von 40 % ist das Signal bei m/z = 552 nicht mehr

nachweisbar.

92 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Für das Ion (Precursor) mit dem Masse-Ladungsverhältnis 552,1 ist eine

Fragmentierung in Produktionen mit m/z = 278,1 festzustellen (Abbildung

61), wobei ab einer normierten Kollisionsenergie von 40 % ausschließlich die

Fragmentionen vorliegen. Diese Beobachtung ist als ein Hinweis auf eine

Dimerisierung der Cadmium-bindenden Substanz II zu interpretieren und

könnte durch die Annahme einer Vierfach-Ionisierung der Precursor- und

Produkt-Ionen erklärt werden:

Precursor-Ion:

Ionen-Peak [M+H+H+H+H]4+: m/z = 552,1

Masse des Moleküls: 2192,4 g/mol

Produkt-Ion

Produkt-Ionen [M+H+H+H+H]4+: m/z = 278,1

Molekülmasse des Produktes: 1096,2 g/mol

Die aus Rapswurzeln isolierte Cadmium-bindende Substanz wurde auch bei

höherer Temperatur (300 °C) und einer Kapillarspannung von 13 V mit der

ESI-MS untersucht (Abbildung A35). Hierbei überwiegt im Massenspektrum

ein Masse-Ladungsverhältnis von 353,3. Auch dieses ist als Hinweis zu

interpretieren, dass die Cadmium-Bindungsform (Substanz II) aus

Rapswurzeln mehrfach geladene Molekül-Ionen bildet.

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 93

9 Fazit

Das Ziel dieser Arbeit ist, die Ursachen für die unterschiedlichen Cadmium-

und Nickelgehalte in Sonnenblumenkernen und Rapssamen aufzuklären.

Hierzu wurden bei Sonnenblumen und Raps vergleichende Untersuchungen

bezüglich Transport, Verteilung und Bindungsformen von Cadmium und

Nickel sowie Kupfer und Zink durchgeführt.

Cadmium

Die Untersuchungen zur Cadmiumverteilung in Sonnenblumen- und

Rapspflanzen zeigen, dass die niedrigen Cadmiumgehalte in den

Rapssamen auf eine physiologische Barriere zurückzuführen sind.

Der Cadmiumgehalt ist in den Grundorganen (Wurzel, Stängel, Blätter,

Schoten) von Raps annähernd gleich hoch, in den Rapssamen dagegen um

den Faktor sechs niedriger (Tabelle 11). Rapssamen sind in den

Rapsschoten in eine Plazenta eingebettet. Es wird daher vorgeschlagen,

dass die Plazenta eine physiologische Barriere für Cadmium darstellt.

Demgegenüber ist für Sonnenblumen ein abnehmender Gradient für die

Cadmiumverteilung von der Wurzel bis zur Frucht zu beobachten (Tabelle 7).

Die Anteile an löslichen, extrahierbaren Cadmium-Bindungsformen in den

verschiedenen vegetativen Pflanzenteilen von Sonnenblumen und Raps sind

ähnlich (Abbildung 62). Die Löslichkeit dieser Bindungsformen ist daher kein

wesentlicher Faktor für die unterschiedliche Schwermetallverteilung in

Sonnenblumen und Raps.

Abb. 62: Vergleich der Extrahierbarkeit von Cadmium aus den vegetativen

Pflanzenteilen von Raps und Sonnenblumen

Wurzeln Stängel Blätter

Sonnenblumen

Raps

100

Extrahierbarkeit [%]

Sonnenblumen Raps

94 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Im Folgenden werden Ergebnisse der Bindungsform-Analysen, unter

Berücksichtigung der gelchromatographisch getroffenen Zuordnungen von

Molmassen aufgeführt, die bei den untersuchten Ölpflanzen Gemeinsam-

keiten und Ähnlichkeiten für Cadmium charakterisieren.

9In den Sonnenblumenkernen und Rapssamen ist Cadmium

möglicherweise - ähnlich wie in Sojabohnen [325, 326] - an

Speicherproteine, wie Globuline, gebunden. Ferner zeigte sich, dass

die Anteile wasserlöslicher Cadmium-Bindungsformen (40-60 %) in

Sonnenblumenkernen mit steigendem Reifegrad und längerer Lagerzeit

geringer werden, da offenbar niedermolekulare Cadmium-bindende

Komponenten zu höhermolekularen (> 600 kD) aggregieren. Aus Raps-

samen lässt sich Cadmium nur zu einem vergleichsweise geringen

Anteil (25 %) extrahieren.

9In Sonnenblumen- und Rapsblättern sind die Cadmium-bindenden

Substanzen über einen weiten Molmassenbereich (50 - 600 kD) verteilt.

Der Einsatz von Mercaptoethanol führt zur reduktiven Spaltung

(Disulfidbrücken) dieser hochmolekularen Stoffe zu niedermolekularen

Untereinheiten, die vermutlich Phytochelatine darstellen.

9Aus Rapsblättern wurden neben den hochmolekularen auch

niedermolekulare Cadmium-Bindungsformen (< 0,1 kD) extrahiert,

welche wohl die leichte Extrahierbarkeit des Cadmiums aus

Rapsblättern (65 %) ermöglichen. Zum Vergleich: Bei Sonnenblumen-

blättern, die überwiegend hochmolekulare Cadmium-Bindungsformen

enthalten, wurde nur ein Extraktionsgrad von 20 % erreicht.

9Die Elutionsprofile für Schwermetall-bindende Substanzen aus

Sonnenblumen- und Rapswurzeln unterscheiden sich deutlich.

Während in Sonnenblumenwurzeln Cadmium überwiegend an

niedermolekulare Substanzen (< 30 kD) gebunden ist, wird in Raps-

wurzeln Cadmium ausschließlich höhermolekular (> 40 kD) gebunden.

9Aus Sonnenblumen- und Rapswurzeln, die bei der Anzucht in

Hydrokultur Cadmiumstress ausgesetzt waren, konnten Cadmium-

haltige Komponenten isoliert werden, die jeweils reich an Serin, Glycin

und Alanin sind. Mit der IAC konnten zwei Cadmium-haltige

Komponenten anhand ihrer Ladung unterschieden werden. Die

schwächer negativ geladenen Cadmim-Bindungsformen (Substanz A

bzw. Substanz I) enthalten größere Mengen an Histidin, während in den

stärker negativ geladenen Cadmium-Bindungsformen (Substanz B bzw.

Substanz II) kein Histidin nachweisbar ist. Mit der ESI-MS konnte

gezeigt werden, dass es sich bei diesen Substanzen nicht um

Phytochelatine handelt.

Zusammenfassend ist zu konstatieren, dass die unterschiedlichen

Cadmium-Bindungsformen die in Sonnenblumen- und Rapspflanzen

gebildet werden, nicht für die beobachteten Unterschiede im Cadmiumgehalt

von Sonnenblumenkernen und Rapssamen verantwortlich sind.

Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps 95

Nickel

Für Nickel ist zu dagegen festzustellen, dass die Bindungsformen einen

entscheidenden Einfluss auf die Nickel-Verteilung in Sonnenblumen und

Rapspflanzen aufweisen.

Nickel ist aus den Wurzeln und dem Stängel von Sonnenblumen zu einem

hohen Anteil zu extrahieren. Der hohe Extraktionsgrad des Nickels aus

Sonnenblumenwurzeln (65 %) kann als Indiz gewertet werden, dass Nickel in

Sonnenblumen in größerem Maße von der Wurzel in den Spross und damit

auch in die Sonnenblumenkerne verlagert werden kann (Abbildung 63).

Anders dagegen in Rapswurzeln und –stängeln, aus denen Nickel fast nicht

zu extrahieren ist (Abbildung 63).

Abb. 63: Vergleich der Extrahierbarkeit von Nickel aus den vegetativen

Pflanzenteilen von Raps und Sonnenblumen

Dieses ist als Hinweis zu interpretieren, dass Nickel in Rapswurzeln

überwiegend an unlösliche Zellbestandteile gebunden und daher in den

Wurzeln und im Stängel nur zu einem geringen Anteil mobil ist (vgl. 1.6.1).

Ein solches Verhalten ist bisher ausschließlich für Nickel-Hyper-

akkumulatoren wie das Täschelkraut Thlaspi goesingense beschrieben [122,

123].

Diese Beobachtung könnte auch erklären, warum der Nickel-Gehalt in den

Wurzeln von Rapspflanzen mit 4 mg/kgTS um den Faktor 5-10 höher ist als

in den Blättern (0,69 mg/kgTS) bzw. den Samen (~ 0,4 mg/kgTS).

Die Untersuchungen der löslichen Nickel-Bindungsformen zeigen, dass

sowohl in den vegetativen und generativen Pflanzenteilen von Sonnen-

blumen als auch Raps Nickel bevorzugt an niedermolekulare Substanzen

(~ 0,1 kD) gebunden ist. Bei diesen Bindungsformen könnten z.B. nicht-

peptidische Chelatbildner wie Citrat, Malat oder Histidin beteiligt sein.

Wurzeln Stängel Blätter

Raps

Sonnenblumen

100

Extrahierbarkeit [%]

Raps Sonnenblumen

96 Schwermetall-bindende Substanzen in Sonnenblumen und Raps

Abschließend ist festzustellen, dass Rapspflanzen offenbar über eine

physiologische Barriere für Cadmium verfügen, die anscheinend in der

Plazenta, welche die heranreifenden Samen versorgt, lokalisiert ist.

Anders ist die Situation beim Nickel, das sich aus den Wurzeln und dem

Stängel von Rapspflanzen nur spurenweise extrahieren lässt, da es

überwiegend an unlösliche Zellbestandteile gebunden und somit nur gering

mobil ist.

Im Unterschied dazu belegt der hohe Extraktionsgrad des Nickels (65 %) aus

Wurzeln der Sonnenblumen, dass mehr Nickel für den Weitertransport aus

der Wurzel in den Spross bis zu den Samen verfügbar ist als in Raps.

Zusammenfassung 97

10 Zusammenfassung

Sonnenblumen- und Rapssaaten, die eine große Bedeutung für die

menschliche Ernährung (Speiseöle) und als Futtermittelzusatzstoffe

(proteinhaltige Pressrückstände) in der Tiermast haben, enthalten

toxikologisch relevante Schwermetalle. Ölsaaten stellen daher eine

Eintragsquelle für Schwermetalle in die Nahrungskette dar. Untersuchungen

an der BAGKF Detmold hatten ergeben, dass trotz der physiologischen

Ähnlichkeit beider Saaten der Cadmium-Gehalt von Sonnenblumenkernen (~

0,5 mg/kg TS) zehnmal und der Nickel-Gehalt (~ 5 mg/kg TS) fünfmal höher

ist als in Rapssamen. Derartig auffällige Unterschiede traten bei Kupfer,

Eisen und Zink nicht auf. Mit welchen Schutzmechanismen gelingt es den

Rapspflanzen, die Schwermetallkonzentrationen niedriger zu halten?

Aus dieser Fragestellung resultierte die zentrale Zielsetzung dieser Arbeit,

die einen Beitrag zur Aufklärung der Ursachen für die unterschiedlichen

Schwermetallgehalte von Raps- und Sonnenblumensaaten leistet. Dazu

wurden umfangreiche analytische Untersuchungen zur Verteilung und zum

Transport der Schwermetalle Cadmium, Nickel, Kupfer, Eisen, Zink sowie

ihrer Bindungsformen in Sonnenblumen- und Rapspflanzen durchgeführt.

Neben Ölpflanzen aus landwirtschaftlicher Praxis wurden unter kontrollierten

Bedingungen (Klimakammern) Pflanzen in Hydrokultur mit und ohne

Schwermetalldotierung angezogen und analysiert.

Die Verteilung der Schwermetalle in den Pflanzen wurde durch Analyse

der Schwermetalltotalgehalte der Grundorgane Wurzel, Stängel, Blatt und

Frucht bestimmt. Analysen von Zellorganellen (Chloroplasten, Mitochondrien,

Peroxisomen) auf Schwermetallpools ergaben erste Hinweise zur

intrazellulären Verteilung auf diese Zellkompartimente. Ergebnisse zum

Ferntransport von Schwermetallen wurden durch Analysen von Xylemsaft

erhalten.

Die Ergebnisse zeigen, dass die Cadmium-, Nickel-, Kupfer-, Eisen- und

Zinkgehalte der verschiedenen Pflanzenteile von Rapspflanzen allgemein

niedriger sind als von Sonnenblumenpflanzen. Cadmium ist auf die

vegetativen Pflanzenteile von Raps annähernd gleich verteilt, im Rapssamen

aber mit 0,04 mg/kg TS um den Faktor sechs niedriger enthalten. Allerdings

wurde beim Raps ein Konzentrationssprung zwischen Schote und Samen

festgestellt, bei Sonnenblumen dagegen ein abnehmender Gradient der

Cadmiumgehalte von der Wurzel über den Pflanzenkörper bis zur Frucht und

den Samen.

Rapspflanzen verfügen offenbar über eine physiologische Barriere für

Cadmium, die wohl in der Plazenta, welche die heranreifenden Samen

versorgt, lokalisiert ist. Die Zinkaufnahme stieg sowohl bei Sonnenblumen als

auch beim Raps drastisch in Cadmium-dotierten Nährlösungen an, ein Effekt,

der nicht auf eine Minderung des Pflanzenwachstums durch Cadmiumstress

zurückzuführen ist. Vielmehr stiegen auch die Metallgehalte des Xylemsaftes

der Ölpflanzen an, was eine verstärkte Metallaufnahme nahe legt.

98 Zusammenfassung

Zur Untersuchung, ob in der Pflanzenzelle neben der Vakuole noch andere

Zellorganellen Cadmium und Nickel enthalten, wurden mit einer vormals für

andere Pflanzengewebe erprobten Dichtegradienten-Zentrifugationsmethode

(Percoll) Chloroplasten als Plastiden, Mitochondrien und Peroxisomen aus

angekeimten Samen isoliert und getrennt. Die Ausbeute an intakten

Chloroplasten war gering; Plastiden aus ungekeimten Samen wurden nicht

isoliert.

Bei Raps wurden gute Ausbeuten (Peroxisomen, Mitochondrien) an intakten

Organellen erzielt. Was die intrazelluläre Verteilung anbetrifft, wurden in

gereinigten Sonnenblumen- und Rapsplastiden weder Cadmium noch Nickel

nachgewiesen, wohl aber Kupfer (Plastocyanin enthält Kupfer). In den

Peroxisomenfraktionen wurden dagegen Nickel, Cadmium und Zink

(Superoxiddismutase) gefunden. Der sehr deutliche Einfluss von EDTA auf

die Verteilung der Schwermetalle im Gradienten legt nahe, dass die

Peroxisomenfraktionen heterogen waren oder noch andere Organellen

(Proteinkörper, Endoplasmatisches Retikulum) enthielten. Wegen der

methodenbedingten niedrigen Organellenausbeute waren in den

orientierenden Untersuchungen Analysen der Bindungsformen von

Cadmium, Nickel und andere Schwermetalle nicht möglich.

Schwermetall-Bindungsformen aus den vegetativen und generativen

Pflanzenteilen von Sonnenblumen und Raps konnten mit Methoden der

Speziierungsanalytik nachgewiesen sowie isoliert und charakterisiert werden.

Um zu gewährleisten, dass der native Zustand der löslichen Schwermetall-

Bindungsformen so weit wie möglich erhalten blieb, wurden zunächst

Verfahren der Probenaufbereitung, wie Homogenisierung, Extraktion mit Tris-

HCl-Puffer unter nicht-reduzierenden und reduzierenden Bedingungen

(Mercaptoethanol-Zusatz) und der gelchromatographischen Auftrennung von

Homogenat-Aliquoten in Kombination mit atomspektro-metrischen

Bestimmungsmethoden, optimiert.

Ausführliche Bilanzierungsstudien belegen, dass die Anteile an löslichen,

extrahierbaren Cadmium-Spezies in den verschiedenen vegetativen

Pflanzenteilen von Sonnenblumen und Raps ähnlich sind. Daraus wird

geschlossen, dass die Löslichkeit dieser Bindungsformen kein wesentlicher

Faktor für die unterschiedliche Schwermetallverteilung in Sonnenblumen und

Raps ist.

Anders verhält sich Nickel, das aus Wurzeln und Stängeln von Rapspflanzen

nur in Spuren extrahiert werden konnte. Offensichtlich ist Nickel in Raps-

wurzeln weitgehend wasserunlöslich und somit wahrscheinlich auch in vivo

nicht für den Ferntransport verfügbar. Aus Sonnenblumenwurzeln wurden

65% des Nickels extrahiert. Daraus wird abgeleitet, dass bei Sonnenblumen

mehr Nickel für den Weitertransport aus der Wurzel in den Spross bis zu den

Samen verfügbar ist als in Raps.

Zusammenfassung 99

Die Identifizierung dieser unterschiedlich verteilten und effizienten

„Schwermetall-Barrieren“ wird als ein wesentlicher Beitrag zur Aufklärung der

Mechanismen gewertet, die für die unterschiedlichen Schwermetall-

Konzentrationen in Raps- und Sonnenblumenpflanzen verantwortlich sind.

Im Folgenden werden weitere Ergebnisse der Bindungsform-Analysen, unter

Berücksichtigung gelchromatographisch getroffener Zuordnungen von

Molmassen aufgeführt, die bei den untersuchten Ölpflanzen Gemeinsam-

keiten und Ähnlichkeiten charakterisieren.

In allen Grundorganen der Sonnenblumen- und Rapspflanzen wurden

unterschiedliche Schwermetall-bindende, nieder- und höhermolekulare

Komponenten im Molmassenbereich von 10 - 600 kD nachgewiesen.

Es zeigte sich, dass die Anteile wasserlöslicher Cadmiumspezies (40-60 %)

in Sonnenblumenkernen mit steigendem Reifegrad und längerer Lagerzeit

geringer werden, da offenbar niedermolekulare Cadmium-bindende

Komponenten zu höhermolekularen (> 600 kD) aggregieren. Aus Raps-

samen lässt sich Cadmium nur zu einem vergleichsweise geringen Anteil

(25 %) extrahieren. Noch geringere Extraktionsgrade sind für Nickel sowohl

bei Sonnenblumenkernen als auch bei Rapssamen ermittelt worden.

Der Totalgehalt an Kupfer ist in Sonnenblumenkernen und Rapssamen zwar

ähnlich, aber die Extrahierbarkeit sehr unterschiedlich. Unabhängig vom

verwendeten Redoxmilieu bei der Extraktion (mit und ohne Mercaptoethanol-

Zusatz) sind aus Sonnenblumenkernen 60-70 %, aus Rapssamen dagegen

lediglich 25 % des Kupfers löslich. Diese Bindungsformen des Kupfers sind

in Sonnenblumenkernen hauptsächlich niedermolekulare (<2,5 kD) und in

Rapssamen dagegen höhermolekulare Pflanzeninhaltsstoffe (25 - 200 kD).

Vergleichbare Verhältnisse wurden beim Zink beobachtet, das aus beiden

Ölsaaten nur mit geringen Extraktionsgraden abtrennbar ist (~15 %): In

Sonnenblumenkernen überwiegen niedermolekulare lösliche Zink-Bindungs-

formen (< 0,1 kD), in Rapssamen Molmassenbereiche von 25 - 200 kD.

In Sonnenblumen- und Rapsblättern sind die Cadmium-bindenden

Substanzen über einen weiten Molmassenbereich (100 - 600 kD) verteilt. Der

Einsatz von Mercaptoethanol führt offenbar zur reduktiven Spaltung

(Disulfidbrücken) dieser hochmolekularen Stoffe zu niedermolekularen

Untereinheiten.

Aus Rapsblättern wurden neben den hochmolekularen auch

niedermolekulare Cadmium-Bindungsformen (< 0,1 kD) extrahiert, die wohl

die leichte Extrahierbarkeit des Cadmiums aus Rapsblättern (65 %)

ermöglichen. Zum Vergleich: Bei Sonnenblumenblättern, die überwiegend

hochmolekulare Cadmium-Bindungsformen enthalten, wurde nur ein Extrak-

tionsgrad von 20 % erreicht.

Nickel und Zink sind in Sonnenblumenblättern zu 50 % an Substanzen mit

Molmassen von 20 - 600 kD gebunden. Außerdem lassen sich nieder-

molekulare Nickel- und Zink-Bindungsformen aus Sonnenblumenblättern

100 Zusammenfassung

herauslösen. Dagegen sind höhermolekulare Nickel- und Zink-bindende

Komponenten in Rapsblättern nicht nachweisbar.

Im Molmassenbereich von 26-28 kD wurden aus Sonnenblumen- und

Rapsblättern Kupfer-bindende Substanzen extrahiert, die gegenüber

Mercaptoethanol stabil sind.

Die Elutionsprofile für Schwermetall-bindende Komponenten aus Sonnen-

blumen- und Rapswurzeln unterscheiden sich deutlich. Während in

Sonnenblumenwurzeln Cadmium und Kupfer überwiegend an niedermoleku-

lare Substanzen (< 15 kD) gebunden sind, wird in Rapswurzeln Cadmium

ausschließlich und Kupfer zu weiten Teilen höhermolekular (> 40 kD)

gebunden. Nickel und Zink treten in Sonnenblumen- und Rapswurzeln

bevorzugt niedermolekular auf. Die Molmassen der Nickel- und Zink-

Bindungsformen in Sonnenblumenwurzeln liegen bei 2-10 kD. Dagegen sind

die niedermolekularen Zink- und Nickel-bindenden Komponenten aus

Rapswurzeln ausschließlich im Totalvolumen (< 0,1 kD) nachzuweisen.

Aus den Wurzelextrakten von in Hydrokultur angezüchteten Sonnenblumen-

und Rapspflanzen konnten Cadmium-haltige Substanzen (~ 25 kD) isoliert

und mit ESI-MS, Fluoreszenz-HPLC und Aminosäureanalyse analysiert

werden. Danach handelt es sich bei diesen Cadmium-Bindungsformen nicht

um Phytochelatine (cysteinreiche Peptide), sondern offenbar um andere

Proteine (Stressproteine ?), die das Schwermetall über S-freie Donorgruppen

koordinieren können.

Die im Rahmen dieser Arbeit entwickelten und angewandten Trenn- und

Nachweisverfahren und deren Ergebnisse schaffen eine Grundlage für

weiterführende analytische und pflanzenphysiologische Forschungsarbeiten

(Zellmembranen, Organellen) und Strukturuntersuchungen an isolierten

Schwermetall-Bindungsformen unter Anwendung von z.B. ESI-MSMS,

EXAFS und Röntgenstrukturanalyse.

Experimenteller Teil 101

11 Experimenteller Teil

11.1 Anzucht von Sonnenblumen- und Rapspflanzen unter

Hydrokulturbedingungen

Geräte

Wachstumskammer: Fa Conviron, London, Modell E 15 (bis 10. 99)

Fa Vötsch, Typ 1514/S (ab 05.00)

Kunststoffgefäße, Volumen 2,5 l

Kunststoffsiebe

Aquariumpumpe

Verwendete Reagenzien

Tween-80-Lösung (0,1 %): 0,5 g /500 mL Tween 80 (Fa Merck, Darmstadt,

Nr. 822187)

Natriumhypochloritlösung (0,5 g / 100 mL): 1,5 mL konz. Natriumhypochlorit-

lösung (Riedel-de Haen, Nr. 13440) mit Wasser auf 100 mL auffüllen.

Wasserstoffperoxidlösung (0,75 g/ 100 mL): 1,9 mL Wasserstoffperoxid-

lösung (35 %; Merck Nr. 108600) mit Wasser auf 100 mL auffüllen.

Cadmium-Stammlösung (100 µmol/mL): 5,13 g Cadmiumsulfat-hydrat p.a.

(Merck Nr. 102026) in Wasser lösen und auf 100 mL auffüllen. Die

verwendeten Cd-Lösungen wurden aus dieser Stammlösung angesetzt.

Nährlösung

Die Nährlösung in Anlehnung an Hoagland [307] wurde aus drei

Stammlösungen gebildet. Lösung I und II stellten die Mengenelemente und

Lösung III enthielt die Spurenelemente. Die Zugabe von Nickel zur

Spurenelementlösung war nicht notwendig, da auf Grund von Chemikalien-

verunreinigungen ausreichend Nickel vorhanden war.

Stammlösung I:

• MgSO4 · 7 H2O (Merck Nr. 105886) 149,296 g / 2 l Wasser

• KNO3 (Merck Nr. 5063) 103,132 g / 2 l “

• NH4H2PO4 (Merck Nr. 1126) 146,012 g / 2 l “

Stammlösung II:

• Ca(NO3)2 · 4 H2O (Merck-Nr. 102120) 188,921 g / 2 l Wasser

Stammlösung III (Spurenelementlösung):

• FeCl3 · 6 H2O 00,5406 g / 2 l Wasser

• H3BO3 00,5713 g / 2 l “

• MnCl2 00,2290 g / 2 l “

• ZnSO4 · 7 H2O 00,0500 g / 2 l “

• CuSO4 · 5 H2O 00,0160 g / 2 l “

• Na2MoO4 · 2 H2O 00,0498 g / 2 l “

• Na2SiO4 00,0138 g / 2 l “

• CoCl2 00,0026 g / 2 l “

• KAl(SO4)2 · 12 H2O 00,0095 g / 2 l “

102 Experimenteller Teil

Zum Herstellen der Nährlösung wurden jeweils 50 ml der Stammlösungen in

einen Erlenmeyerkolben pipettiert und auf das Volumen von fünf Litern

aufgefüllt. Eisen wurde der Nährlösung als Fe (III) zugesetzt. In der

Stammlösung III (pH 6,5) lag Eisen daher als amorphes Eisen (III)-Hydroxid

in Form einer rotbraunen gallertartigen Masse vor. Der pH-Wert der

Nährlösung lag bei etwa 5,3. Eisen dürfte in der Nährlösung daher bevorzugt

in Form von mehrkernigen Isoployoxo-Komplexes vorliegen [12]. Unter dem

Einfluss der Wurzelsäuren kann sich dieses allerdings ändern.

In Vorversuchen wurde herausgefunden, dass es sinnvoll ist, die Nährlösung

jeden zweiten Tag zu wechseln und mit einer Aquariumpumpe zu belüften.

Zur Verminderung von Algenwachstum bzw. Aufheizung der Nährlösung in

den Kunststoffbehältern über die Umgebungstemperatur (Strahlungswärme)

wurden die Behälter mit Aluminiumfolie ummantelt. Dieses hatte zur Folge,

dass nur wenig Licht in den Wurzelbereich gelangte und somit die

natürlichen Bedingungen (kein Licht unter der Erde) besser simuliert wurden.

Eine noch effektivere Verringerung des Algenwachstums gelingt, wenn auch

der Boden der Siebe mit Aluminiumfolie ausgelegt wird.

Seit Mai 2000 steht im Institut für Biochemie und Analytik von Getreide und

Kartoffeln der BAGKF in Detmold eine neue Wachstumskammer der Fa

Vötsch Typ VB 1514/S zur Verfügung. Tabelle 34 fasst die Anzucht-

bedingungen für diese Wachstumskammer zusammen:

Tab. 34: Parameter zur Steuerung der Wachstumskammer

Programmschritt Uhrzeit Temperatur

[°C] rel. Feuchte

[%] Beleuchtung

[%]

1 0:01 22 60 42

2 0:31 20 65 00

3 6:00 22 60 42

4 6:31 25 55 99

Arbeitsweise

Die im Folgenden beschriebene Vorgehensweise bei der Keimung und

Anzucht von Pflanzenproben gilt sowohl für die Anzucht von Sonnenblumen

als auch von Raps. Die erhaltenen Pflanzen wurden zur Bestimmung der

Elementgehalte in den Pflanzengrundorganen, zur Gewinnung von Xylemsaft

sowie zur Analyse der Schwermetallbindungsformen verwendet.

Um die Reproduzierbarkeit der Anzuchtversuche zu kontrollieren, wurden

alle Versuche mehrfach und jeweils in zwei Sieben parallel durchgeführt.

1. Oberflächenentkeimung

Um einem Pilzbefall bei der Keimung vorzubeugen, wurde eine Oberflächen-

entkeimung der Sonnenblumenkerne bzw. Rapssamen durchgeführt. Hierzu

wurden eine Tween-80-Lösung, eine Natriumhypochlorit-Lösung und eine

Wasserstoffperoxid-Lösung verwendet.

1. Zunächst wurden die Ölsaaten mit Wasser gewaschen und vorgequollen.

Experimenteller Teil 103

2. Anschließend wurden sie 5 min in einer 0,1 %-igen Tween-80-Lösung

geschüttelt und nachfolgend gründlich mit Wasser gewaschen.

3. Danach wurden die Ölsaaten zwei Minuten mit einer 0,5 %-igen NaOCl-

Lösung geschüttelt. Nachfolgend wurde so lange mit Wasser gewaschen,

bis kein Hypochloritgeruch mehr zu bemerken war.

4. Zuletzt wurde eine Minute in einer 0,75 %-igen Wasserstoffperoxid-

Lösung geschüttelt. Nach nochmaligem gründlichen Waschen mit Wasser

war die Oberflächenentkeimung der Ölsaaten abgeschlossen.

2. Keimung (1. - 4. Tag)

1. Die Ölsaaten wurden nun auf nassem Papier ausgebreitet und in ein Sieb

gelegt, welches in einen Kunststofftrog gestellt wurde. Dieser Behälter war

bis zum Boden des Siebes mit Wasser gefüllt.

2. Das Sieb wurde anschließend mit feuchtem Papier abgedeckt und mit

einem Deckel verschlossen. Der abgedeckte Behälter wurde für 48

Stunden zur Vorkeimung in der Wachstumskammer bei 90 %

Luftfeuchtigkeit und 25°C abgestellt.

3. Die angekeimten Sonnenblumenkerne/Rapssamen wurden auf

verschiedene Siebe verteilt (5 Stück/ 15 Stück pro Sieb) und die

Kunststoffbehälter jeweils bis zum Boden des Siebes mit Wasser gefüllt.

4. Die Siebe wurden mit feuchtem Haushaltspapier abgedeckt und, um ein

Austrocknen der Keimlinge zu verhindern, wurde noch ein Kunststoff-

deckel aufgesetzt.

5. Die Keimung erfolgte nun weitere 2 Tage lang im Dunkeln, wobei täglich

kontrolliert wurde, ob das Papier, welches zum Abdecken der Siebe

diente, noch feucht war. Die Keimung wurde in der Wachstumskammer

bei 90 % Luftfeuchtigkeit und 25°C durchgeführt. Schlecht wachsende

Keimlinge wurden entfernt und ersetzt.

4. Anzucht (5. – 10. Tag)

Nach Abschluss der Keimung, wurde das Wasser in den Kunststoffbehältern

durch undotierte Hoagland-Nährlösung ersetzt.

Während der gesamten Anzucht wurde die Entwicklung der Biomasse durch

Wiegen und die Bestimmung des Entwicklungsstadiums [311] kontrolliert

(Tabelle 36). Um einen möglichen Einfluss durch Ungleichmäßigkeiten in der

Wachstumskammer (Lichtintensitätsgradient, Temperaturgradient, Zugluft)

zu minimieren wurden die Positionen der Siebe täglich nach einem festen

Schema gewechselt.

5. Dotierung der Nährlösungen (11. - 25. Tag)

Die Dotierung mit Cadmium erfolgte durch Zugabe eines definierten

Volumens an Schwermetall-Lösung. Als Ausgangslösung für die Dotierung

der Nährlösung mit Cadmium (Zugabevolumen Cd) diente eine Cadmium-

sulfatlösung mit einem Cadmiumgehalt von 2 mmol/L.

104 Experimenteller Teil

Tab. 35: Cadmiumdotierung bei den Anzuchtversuchen (Volumen der

Nährlösung 1,7 L)

Zugabevolumen Cadmium-Lsg

[ml] Cadmiumkonzentration in der Nährlsg

[µmol/L]

0,000 00

0,085 01

0,170 02

0,850 10

1,700 20

6. Ernte (25. Tag)

1. Die Wurzeln wurden mit Papier vorsichtig abgetrocknet.

2. Die Pflanzenorgane Wurzel, Stängel und Blatt wurden getrennt und zur

Bestimmung der Biomasse jeweils gewogen.

3. Ausmessen der Wurzellänge, Stängellänge und der Blattgröße.

4. Waschen der Wurzeln in einem Sieb mit destilliertem Wasser um eine

Beeinflussung der folgenden Arbeiten und Messungen durch evtl.

anhaftende Reste der Nährlösung zu vermeiden.

5. Die jeweiligen Pflanzengrundorgane wurden im Mörser mit flüssigem

Stickstoff übergossen und homogenisiert.

6. Die homogenisierten Grundorgane wurden in einem geschlossenen

Gefäß im Gefrierschrank bei -80°C bis zur weiteren Verwendung gelagert.

Tab. 36: Codierung der Entwicklungsstadien von dikotylen Pflanzen [311]

Experimenteller Teil 105

11.2 Herstellung der Pflanzenextrakte

Geräte

Ultra-Turrax , Typ 18/10, 20000 U/min, mit 2 K-Schaft aus Titan (Janke &

Kunkel, Staufen)

Kunststoff – Zentrifugengläser, 50 ml (Beckmann, München)

Kühlzentrifuge ´Avanti TM Centrifuge ´ J-25 mit Rotor JA-25.50 (Beckmann,

München)

Analysenwaage MC 210 P (Sartorius, Göttingen)

Retsch – Mühle, Sieb mit Maschenweite 2,0 mm

Verwendete Reagenzien

Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan. (Tris) p.a. (Roth Nr. 4855.2)

Salzsäure 1 mol/L : Salzsäure 32% p.a. (Merck Nr. 100319)

Die eingesetzte Salzsäure wurde durch zweimalige Oberflächen-

verdampfungs–Destillation in einer entsprechenden Apparatur (Modell

Acidest, Fa Heraeus, Hanau) gereinigt. Die verd. Salzsäure wurde in

bidestilliertem Wasser angesetzt.

Mercaptoethanol (Merck Nr. 1.15433)

Extraktionslösungen

Tris-HCl-Puffer 0,05 mol/L, pH 8,0

Die Lösung von 24,228 g Tris in 3,5 L bidestilliertem Wasser wurde mit etwa

120 mL Salzsäure (1,0 mol/L) auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt und auf

4 L aufgefüllt. Die Pufferlösung wurde vor Gebrauch im Wasserstrahlvakuum

(Witt`scher Saugtopf) entgast.

Tris-HCl-Puffer 0,05 mol/L, pH 8,0; 10mmol/L Mercaptoethanol

1 L der entgasten Extraktionslösung wurde unmittelbar vor der Extraktion mit

1,72 mL Mercaptoethanol (10 mmol) versetzt.

Durchführung

Die Ölsaaten wurden zunächst mit einer Titanmühle zu einem feinen Mehl

vermahlen. Bei den übrigen Proben (Blätter, Wurzeln, Pflanzenstiele usw.)

konnte auf einen Einsatz der Mühle verzichtet werden.

Die zu homogenisierenden Substanzen wurden anschließend in einem

Becherglas eingewogen und mit 15 ml je 5 g Probensubstanz an

vorgekühltem (4°C) und entgastem Tris-HCl-Puffer (0,05 mol/L; pH 8,0)

versetzt. Mit einem Ultra-Turrax wurde die jeweilige Probe nachfolgend unter

Eiskühlung fünf Minuten homogenisiert. Die Qualität des Zellaufschlusses

wurde in einigen Fällen mit einem Mikroskop überprüft.

106 Experimenteller Teil

av −

−

Das Homogenat wurde 60 Minuten mit 20000 U/min (42000 g) bei 4°C

zentrifugiert. Die überstehende wässrige Lösung (vgl. Abbildung 20) wurde

entweder abdekantiert oder bei Vorhandensein einer Fettschicht (reife

Ölsaaten) mit einer Kunststoffspritze entnommen. Die wässrige Fraktion

wurde direkt für die Gelchromatographie eingesetzt. In einem Aliquot der

wässrigen Fraktion wurde der Gehalt an Cadmium, Kupfer, Eisen, Nickel und

Zink bestimmt. Die Fettschicht wurde vom Rückstand getrennt und in

Aliquoten vom Rückstand und der Fettschicht wurde nach vorheriger

Homogenisierung der Schwermetallgehalt bestimmt.

11.3 Gelfiltrationschromatographie (GFC)

Die Gelfiltration ist eine Ausschlusschromatographie, d.h. die größten

Moleküle, welche nicht in die Poren des Säulenmaterials diffundieren

können, eluieren im Ausschlussvolumen der Säule (V0). Diesen Molekülen

steht ausschließlich das Volumen zwischen den einzelnen Körnern der

stationären Phase zur Verfügung. Kleinere Moleküle diffundieren in die Poren

des Gels und eluieren im Trennbereich der Säule nach abnehmender

Molekülgröße (Ve). Weil in den Poren des Gels die mobile Phase stagniert,

bewegen sich die Moleküle darin nur durch Diffusion vorwärts und werden

somit gegenüber den Größeren retardiert. Die kleinsten Probenmoleküle, die

vom linearen Trennbereich der Säule nicht mehr erfasst werden, eluieren im

Totalvolumen (Vt) der Säule.

V0, Ve und Vt sind säulenspezifische Werte. Deshalb wurde ein vom Säulen-

volumen unabhängiger Faktor der Kav-Wert definiert. Dieser gewährleistet,

dass die Untersuchungen mit der GFC bei gleichem Säulenmaterial unab-

hängig von Säulenvolumen und Packungsdichte des verwendeten Gels sind.

Wird eine Säule mit Stoffen bekannter Molekularmassen kalibriert, so ist der

Kav-Wert für eine Molekülmasse unabhängig vom Säulenvolumen immer

gleich. Der Kav-Wert ist definiert als:

mit: V

0 = Ausschlussvolumen

e = Elutionsvolumen

t = Totalvolumen

Das Eluat der GFC wird nach dem Säulenausgang durch einen UV-Detektor

und eine Leitfähigkeitsmesszelle geleitet. Die Messung der UV-Absorption

bei 280 nm ermöglicht die Registrierung von aromatischen Aminosäuren und

Proteinen.

Geräte

Niederdruck-Chromatographiesystem bestehend aus Schlauchpumpe, UV-

Detektor (280 nm), Schreiber, Fraktionssammler und Steuereinheit

(Modell Econo, Fa Bio-Rad, München).

Niederdruck-Chromatographiesystem: Schlauchpumpe (Fa Serva,

Heidelberg), UV-Detektor (Fa LKB Uvicord, Gräfelfing; heute Fa

Pharmazia, Modell Detector Unit Type 8303 A), Verstärker (LKB,

Experimenteller Teil 107

Ultraviolet Absorptiometer Control Unit Typ 8301 A), Schreiber und

Fraktionssammler (LKB, Modell 7000 Ultrarac Fraction Collector).

Mitteldruck-Chromatographiesystem (Modell Bio-Logic, Bio-Rad, München):

UV-Detektor, Leitfähigkeitsdetektor, Fraktionssammler (Modell 2128) und

Steuereinheit.

Chromatographieschrank

Polyethylen-Schläuche (Ø 1mm)

Chromatographiesäule Superdex TM 200 HR (Pharmazia)

Chromatographiesäule Superdex S75 (selbst gepackt, prep. grade;

Pharmazia Nr. 17-1044)

Chromatographiesäule Superdex Peptide HR (Pharmazia)

Chromatographiesäule Sephadex G25 (fine, Pharmazia Nr. 17-0032)

Chromatographiesäule Sephadex G50 (superfine, Pharmazia Nr. 17-0041)

Chromatographiesäule Sephadex G100 (fine, Pharmazia Nr. 17-0060)

Verwendete Reagenzien

Tris-HCl-Pufferlösung (0,05 mol/L; pH 8,0; A2.2)

Natriumazid reinst. (Merck Nr. 6688)

Titriplex III p.a. (Merck Nr. 8418)

Reinigungslösungen:

• 100 mg/L Natriumazid in 1000 mL bidest. Wasser zur Vermeidung von

Bakterien.

5,6 mg/L Titriplex III in 1000 mL bidest. Wasser, um vom Säulenmaterial

gebundene Schwermetallionen zu entfernen.

Abb. 64: Verwendetes Mitteldrucksystem (FPLC der Fa. Bio-Rad) für die GFC

Verwendete Säulen

Für die Trennungen mit der GFC wurden fertige Trennsäulen der Fa

Pharmazia mit einem Gesamttrennbereich von 0,1–600 kD verwendet. Die

Packung der Säulen ist ein poröses Material (Polyglucosen). Der

Trennbereich der ausgewählten Säulen erwies sich für die Untersuchungen

als ausreichend. Nur für Sonnenblumenkerne wurden Substanzen in der

Extraktionslösung nachgewiesen, die Molekularmassen von > 600 kD

aufwiesen (vgl. Tabelle 37).

108 Experimenteller Teil

Tab. 37: Trennbereich der Gele für die GFC mit Säulenparametern

(1) linearer Trennbereich

Säulenmaterial Trennbereich(1) Säulenparameter

[kD] Länge [cm]

∅

∅∅

∅ [cm]

Mischungen aus Dextrangel und Agarose

(1) Superdex S 200 10 - 600 090 1,6

(2) Superdex S 75 prep grade 4 - 70 060 1,6

(3) Superdex Peptide HR 0,1 - 7 030 1,0

Dextrangele, vernetzt mit Epichlorhydrin

(4) Sephadex G 25 1 - 5 130 1,6

(5) Sephadex G 50 1,5 - 30 100 5

(6) Sephadex G100 4 - 150 100 5

Die Säulen eins bis vier wurden am Mitteldruck-Chromatographiesystem

betrieben. Die Säulen fünf und sechs an einem Niederdruck-

Chromatographiesystem.

Niederdruck-Chromatographiesystem

Die an diesem System verwendeten Säulen wurden selbst angefertigt. Es

handelt sich um 100 cm lange Säulen aus Plexiglas mit einem

Innendurchmesser von 5 cm.

Etwa 150 g trockenes Sephadex G100 bzw. 250 g trockenes Sephadex G50

wurden in 3 L Tris-HCl-Puffer aufgeschlämmt. Die Suspensionen wurden

zum Quellen des Gels für 24 h (G50) bzw. 72 h (G100) stehen gelassen.

Anschließend wurden die Suspensionen im Wasserstrahlvakuum mit einem

Witt`schen Saugtopf so lange entgast, bis keine Gasblasen mehr aufstiegen.

Danach wurde die Suspension im Kühlraum auf 4°C abgekühlt.

Die 100 cm langen Chromatographiesäulen wurden mit einem weiteren Rohr

um etwa die Hälfte verlängert und die vorbereitete Suspension auf einmal an

einem Glasstab entlang in die Säule gegossen. Danach ließ man die Säule

bei einem Fluss von ca. 1 ml/min absitzen. Wenn das Gelbett über einen

Zeitraum von etwa 6 Stunden nicht weiter absank, wurde das Verlängerungs-

rohr mit dem überstehenden Gel abgenommen und die Säule verschlossen.

Alle GFC-Trennungen mit dem Niederdruck-Chromatographiesystem wurden

in einem Kühlraum bei 4°C mit Tris-HCl-Puffer (0,05 mol/L; pH 8,0) als

Elutionsmittel durchgeführt. Die Schlauchpumpe wurde hinter die Säule

geschaltet und saugte permanent etwa 30 mL/h des Elutionsmittels auf die

Säule. Mit einem UV-Detektor wurde kontinuierlich die Absorption des

Eluates bei 280 nm gemessen und mit einem Zweikanalschreiber

aufgezeichnet. Der Fraktionssammler fing das Eluat in Fraktionen von 15 mL

auf, in denen „offline“ der Cadmium-, Kupfer-, Nickel- und Zinkgehalt

bestimmt wurde.

Experimenteller Teil 109

Mitteldruck-Chromatographiesystem

Alle GFC-Trennungen mit dem Mitteldruck-Chromatographiesystem erfolgten

unter Kühlung bei 4 - 6 °C in einem Chromatographieschrank. Als Elutions-

mittel diente Tris-HCl-Puffer (0,05 mol/L; pH 8,0). Die Säulen wurden mit

einem Volumenstrom von 1mL/min gegen die Schwerkraft betrieben. Das

aufgegebene Probenvolumen betrug bei Superdex S75 und Superdex S200

jeweils 1,5 mL und für Superdex Peptide HR 1,0 mL.

Ein UV-Detektor mit Durchflussküvette maß die Absorption bei 280 nm und

ein nachgeschalteter Leitfähigkeits-Detektor die zugehörige Leitfähigkeit des

Eluats. Diese Werte wurden durch eine angeschlossene Rechnereinheit

kontinuierlich aufgenommen. Der Fraktionssammler fing das Eluat in

Fraktionen zu je 1,0 mL auf. In den Fraktionen wurde der Cadmium-, Kupfer-,

Nickel- und Zinkgehalt ohne Nassaufschluss mit AAS oder DCP analysiert.

Die Reinigungslösungen wurden sowohl am Nieder- als auch am

Mitteldrucksystem regelmäßig auf die Säulen aufgegeben, um eine

Verunreinigung der Säulen zu vermeiden.

11.3.1 Bestimmung des Ausschlussvolumens

Verwendete Reagenzien

Dextranblau (Roth Nr. 5958.1)

Durchführung

Zwei Spatelspitzen Dextranblau wurden in 20 mL bidestilliertem Wasser

gelöst. Von dieser Lösung wurden 10 mL auf die 100 cm langen Säulen des

Niederdruck-Chromatographiesystems bzw. 1,5 mL auf die Säulen des

Mitteldruck-Systems gegeben. Der Volumenstrom betrug für das

Niederdrucksystem 0,5 mL/min und am Mitteldrucksystem 1 mL/min. Bei der

Elution sollte der Farbstoff als schmale Bande über die Säule laufen. Das

Ausschlussvolumen (V0) entspricht dem Elutionsvolumen des Absorptions-

maximum bei 280 nm.

11.3.2 Bestimmung des Totalvolumens

Geräte

Spektralphotometer: Unicam UV-VIS4

Verwendete Reagenzien

Natriumchlorid-Lösung (5 g/100 mL): Natriumchlorid (p.a., Merck Nr. 106404)

Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung (2 g/100 mL) Kaliumdihydrogenphosphat

(p.a.; Merck Nr. 4873, Darmstadt) in Tris-HCl-Pufferlösung.

110 Experimenteller Teil

Verdünnte Salpetersäure: 100 mL konz. Salpetersäure (65 %; p.a.; Merck Nr.

456) mit 200 mL Wasser verdünnt.

Ammoniumvanadat-Lösung: 0,2 g Ammoniummetavanadat (p.a.; Riedel Nr.

31153) in 70 mL heißem Wasser lösen, abkühlen, 2 mL konz.

Salpetersäure (65 %; p.a.; Merck Nr. 456) zugeben und mit Wasser auf

100 mL auffüllen.

Ammoniumheptamolybdat-Lösung: 5 g Ammoniumheptamolybdat-tetrahydrat

(p.a.; Merck Nr. 1182) in 70 mL heißem Wasser lösen, abkühlen und auf

100 mL auffüllen.

Reagenzlösung: Unmittelbar vor der Verwendung werden 20 mL

Ammoniumvanadat-Lösung, 20 mL verdünnte Salpetersäure und 20 mL

Ammoniummolybdatlösung vermischt.

Durchführung

Es wurden 10 mL Kaliumhydrogenphosphatlösung auf die Säulen der

Niederdruck-Gelchromatographie aufgetragen und mit 30 mL/h Tris-HCl-

Puffer eluiert. Von jeder Fraktion (15 mL) wurden 0,5 mL mit 0,5 mL

verdünnter Salpetersäure, 0,75 mL Reagenzlösung und 5 mL Wasser

versetzt. Die Mischung wurde eine Stunde stehen gelassen und die entstan-

dene Gelbfärbung im Photometer bei 430 nm bestimmt. Das Totalvolumen

(Vt) der Säule ist das Eluatvolumen im Maximum der Absorption.

Beim Arbeiten mit den Superdex-Säulen am Mitteldrucksystem (Bio-Logic-

System) wurde stattdessen eine Natriumchloridlösung (5 g/100 mL) zur

Bestimmung des Totalvolumens verwendet. Es wurde kontinuierlich die

Leitfähigkeit im Eluat gemessen. Das Totalvolumen entspricht dem Volumen

des Eluates im Maximum der Leitfähigkeit. Die Bestimmung des Ausschluss-

und Totalvolumens wurde am Mitteldrucksystem in einer Messung

durchgeführt.

11.3.3 Kalibration der Säulen

Verwendete Reagenzien

Eichkit für Gelfiltration, niedermolekular (LMW), aus Rinderserum-Albumin,

Ovalbumin, Chymotrypsinogen A und Ribonuclease A (Pharmazia Nr.

17-0442)

Eichkit für Gelfiltration, hochmolekular (HMW), Ferritin, Katalase, Aldolase

(Pharmazia Nr. 17-0441)

Myoglobin (Serva Nr. 29895)

Cytochrom c (Sigma Nr. C 3381)

Bacitracin (Serva Nr. 14420)

Glutathion (Serva Nr. 23150)

Durchführung

Es wurden je 20 mg von zwei Proteinen mit großer Molmassendifferenz in

Tris-HCl-Puffer gelöst. Auf die 100 cm langen Säulen des Niederdruck-

Experimenteller Teil 111

Systems wurden je 5 mL, auf die Säulen des Mitteldrucksystems je 1 mL

dieser Lösungen aufgegeben und die Proteine unter den zuvor beschrie-

benen Bedingungen eluiert (Tabelle 38, 39).

Tab. 38: Kalibration der am Mitteldrucksystem verwendeten Säulen

Superdex S200 Superdex S75 Superdex

Peptide HR

Kalibriersubstanz

molare

Masse

[g/mol]

log M

Ve [mL] Kav V

e [mL] Kav V

e [mL] Kav

V0 46,3 0, 42,5 0 8,7 0

Ferritin 440.000 5,64 54,7 0,12

Aldolase 158.000 5,20 70,0 0,33

Albumin 67.000 4,83 76,8 0,42 48,6 0,12

Ovalbumin 43.000 4,63 80,6 0,47 51,2 0,17

Chymotrypsinogen 25.000 4,40 100,8 0,75 68,9 0,52

Ribonuclease 13.700 4,14 104,1 0,80 70,9 0,56

Cytochrom c 12.600 4,10

Bacitracin 1.450 3,16 12,0 0,30

Glutathion (ox.) 613 2,79 14,2 0,50

Glutathion (red.) 308 2,49 15,5 0,618

Vt 0118,6 01,00 93,5 1 19,7 1

Tab. 39: Kalibration der am Niederdrucksystem verwendeten Säulen

Sephadex

G100

Sephadex G50

Kalibriersubstanz

molare

Masse

[g/mol]

log M

Ve [mL] Kav V

e [mL] Kav

V0 00650 0,00 0630 0,00

Albumin 67.000 4,83 0948 0,24

Ovalbumin 43.000 4,63 1063 0,34 0660 0,030

Chymotrypsinogen 25.000 4,40 1333 0,56 0815 0,170

Myoglobin 17.200 4,24 0917 0,268

Ribonuclease 13.700 4,14 1513 0,70

Cytochrom c 12.600 4,10 1513 0,70 1004 0,350

Bacitracin 1.450 3,16 1626 0,931

Vt 1880 1,00 1700 1,00

112 Experimenteller Teil

Abb. 65: Kalibrationsgeraden und Kalibrierfunktionen für:

Superdex Peptide HR (y=-2,0788x + 3,796), R2 = 0,9924

Sephadex G50 (y=-1,6306x + 4,6766), R2 = 0,9941

Superdex S75 (y=-1,4612x + 4,9459), R2 = 0,9684

Sephadex G100 (y=-1,4775x + 5,1696), R2 = 0,9849

Superdex S200 (y=-2,0852x + 5,8862), R2 = 0,9906

11.4 Ionenaustauscherchromatographie (IAC)

Geräte

Mitteldruck-Chromatographiesystem (Modell Biologic, Bio-Rad, München) mit

UV-Detektor, Leitfähigkeitsdetektor, Fraktionssammler (Modell 2128) und

Steuereinheit

Ionenaustauschersäule Bio-Scale Q5 Column, (Bio-Rad Nr. 751-0005)

Verwendete Reagenzien

Tris-HCl-Pufferlösung (0,05 mol/L; pH 8,0)

NaCl-Lösung (1 mol/L)

2-Mercaptoethanol (Merck Nr. 112006)

Durchführung

Die Ionenaustauschchromatographie mit starken Anionenaustauschern wird

vielfach zur Isolierung cadmiumbindender Substanzen aus den vegetativen

und generativen Pflanzenteilen von Sonnenblumen- und Rapspflanzen

verwendet. Beispiele sind die IAC an QAE-Sephadex A-25 zur Isolierung von

Phytochelatinen aus Maiswurzeln [286, 288] und die Isolierung von

Phytochelatinen aus Zellextrakten von Rauvolfia serpentina [188].

2,5

3,5

4,5

5,5

0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0

Kav-Wert

log M

Experimenteller Teil 113

Für die eigenen Arbeiten wurde eine vorgepackte Mono-Q5-Säule (5 mL

Säulenvolumen; Biorad, Hercules, CA, USA) verwendet, welche an dem

Mitteldruck-Chromatographiesystem (Bio-Logic-System, Fa Bio-Rad)

betrieben wurde. Die IAC-Trennungen wurden in einem Chromatographie-

schrank bei 4 - 6°C durchgeführt. Etwa 50 mL Probenlösung (gepoolte

Fraktionen der GFC) wurden mit einer Flussrate von 1 mL/min auf die

Austauschersäule aufgegeben. Anschließend wurde der in Tabelle 40

dargestellte Tris-HCl/NaCl-Gradient gestartet. Das Eluat wurde durch einen

UV- (280 nm) und einen Leitfähigkeitsdetektor geleitet und in Fraktionen von

2 mL gesammelt. In den Fraktionen wurden die Cadmium- und Kupfergehalte

„offline“ bestimmt. Die erhaltenen cadmiumhaltigen Fraktionen wurden

gepoolt, an Sephadex G 25 entsalzen, gefriergetrocknet und die getrocknete

Substanz zur Aminosäureanalyse vorbereitet.

Tab. 40: Programm für den Tris-HCl / NaCl-Gradienten bei der IAC

Programmschritt Elutionsvolumen

[mL]

Tris-HCl-

Pufferlösung

[%]

1 mol/L NaCl in

Tris-HCl-Puffer

[%]

NaCl-

Konzentration

[mol/L]

1 isokratisch 00 - 020 100 000 0

2 Gradient 20 - 040 100 - 85 000 - 015 0,00 - 0,15

3 isokratisch 40 - 050 185 015 0,15

4 Gradient 50 - 080 185 - 45 015 - 055 0,15 - 0,55

5 isokratisch 80 - 090 145 055 0,55

6 Gradient 90 - 110 145 - 00 055 - 100 0,55 - 1,0

7 isokratisch 110 - 120 000 100 1,0

11.5 Fluoreszenz-HPLC

Geräte:

Entgaser Degasys-DG-1310 (Fa Gynkotek)

Pumpe P 580 A LPG, HPLC-Pumpe (Fa Gynkotek)

Autosampler GINA 50 (Fa Gynkotek)

Säulenofen T-6300 Column Thermostat (Merck)

Vorsäule LiChrospher RP 18, 40-50 µm, 40 x 4,6 mm (Yenmez)

Säule LiChropsher RP 18, 10 µm, 250 x 4 mm

Detektor HPLC Fluoreszenz-Detektor RF-2000 (Fa Dionex)

Auswertung Gynkosoft Chromatographie-Datensystem, PCD Version

5.50, Gynkotek HPLC, Peakflächenmethode

Verwendete Reagenzien

Acetonitril (gradient grade, 99,8 %, Merck Nr. 100003)

Ammoniumdihydrogencarbonat (p.a., Merck Nr. 101131): 200 mg NH4HCO3

werden in 250 mL bidestilliertem Wasser gelöst (10 mmol/L) und mit

1 mol/L Salzsäure auf einen pH-Wert von 8,0 eingestellt.

114 Experimenteller Teil

Dithiothreitol (für biochemische Zwecke, > 99 %, Merck Nr. 111474)

Epichlorhydrin (Fluka Chemie)

Essigsäure (100 %, Fa Roth)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Titriplex III (p.a. Merck Nr. 108418):

In 100 mL Wasser werden 0,0372 g EDTA (1,0 mmol/L) gelöst

Kaliumdihydrogenphosphat (p.a., Merck Nr. 101960)

Methanol (für HPLC)

Monobrombiman (Fluka Chemie): 25 mg Monobrombiman wurden in 20 mL

Acetonitril gelöst (4,38 mmol/L) und unter Lichtausschluss bei 4°C im

Kühlschrank gelagert. Zur Derivatisierung wurde auf 1 mmol/L verdünnt.

di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat (p.a., Riedel de Haen)

Zur Herstellung eines Phosphatpuffers pH 6,3 werden 2,62 g di-

Natriumhydrogen-phosphat und 7,07 g Kaliumhydrogenphosphat in 1000

mL Wasser gelöst.

Natriumhydroxidplätzchen (p.a., Merck Nr. 106462)

Natriumthiosulfat (wasserfrei, Fluka Chemie): 3,224 g Natriumthiosulfat

wurden in 10 mL Wasser für eine 2 mmol/L Lösung angesetzt.

Sepharose 4B (Pharmazia Biotech)

Elutionsbedingungen

Mobile Phase:

Laufmittel A: 10 % (v/v) Methanol, 0,25 % (v/v) Essigsäure, pH 3,9

Laufmittel B: 90 % (v/v) Methanol, 0,25 % (v/v) Essigsäure, pH 3,9

Flussrate 1 mL/min

Injektionsvolumen: 100 µL

Detektion: Anregungswellenlänge λex: 268 nm

Emissionswellenlänge λem: 479 nm

Fluoreszenz-HPLC:

Bei dieser Methode wird die thiolhaltige Schwermetall-bindende Substanz

zunächst mit Monobrombiman derivatisiert. Monobrombiman ist ein sehr

spezifisches SH-Reagenz und bildet mBBr-SH-Addukte, die stark

fluoreszieren und in Verbindung mit einer HPLC-Trennung bei

Fluoreszenzdetektion zu niedrigen Nachweisgrenzen führen. Im Vergleich

zur Methode mit Nachsäulenderivatisierung ist die Nachweisgrenze bei der

Fluoreszenz-HPLC mit 0,3 pmol um den Faktor 1000 niedriger [290].

Die Trennung der Monobrombimanderivate erfolgte auf einer LiChrospher

RP18 10 µm-Säule (250 x 4 mm; Merck, Darmstadt) mit einer Flussrate von

1 mL/min nach der Methode von NEWTON [291-293] unter Berücksichtigung

der von HACIOSMANOGLU [296] vorgenommenen Modifikationen für

Gradienten und Säulendimension. Um eine Kontamination der Säule zu

vermeiden, wurde eine Vorsäule (LiChrospher RP18, 30-40 µm, 40 x 4,6

mm) vorgeschaltet. Die Trennung erfolgte unter Verwendung des folgenden

Gradienten:

Experimenteller Teil 115

Tab. 41: Gradientenverlauf bei der Trennung von Monobrombimanderivaten

mit der HPLC

Zeit

[min] Laufmittel A

[%(v/v)] Laufmittel B

[%(v/v)]

00 98 002

10 92 008

20 60 040

25 60 040

30 10 090

32 00 100

35 00 100

36 98 002

45 98 002

11.5.1 Synthese von Thiolagarose

Die Thiolagarose wurde nach der von KNEER [199, 289] beschriebenen

Methode hergestellt. 12 g Sepharose 4B wurden in 6 mL 1 mol/L Natron-

lauge suspendiert. Zur Epoxyaktivierung wurden 6 mL Epichlorhydrin

zugesetzt. Die Reaktionslösung wurde 2 Stunden bei 60°C im thermo-

statierten Wasserbad geschüttelt. Das aktivierte Gelmaterial wurde mit

Phosphat-Puffer pH 6,3 gewaschen und in 12 mL dieses Puffers aufge-

nommen. Anschließend wurden 10 mL einer 2 mol/L Natriumthiosulfatlösung

zugegeben und über Nacht auf einem Rundschüttler (100 U/min, RT)

inkubiert. Die erhaltene Thiolagarose wurde mit bidestilliertem Wasser

gewaschen und im Kühlschrank bei 4°C gelagert. Vor Gebrauch wurde die

Thiolagarose durch Suspendieren in einer Lösung von Dithiothreitol (1 h, RT,

vier Spatelspitzen DTT auf 6 mL bidestilliertes Wasser) frisch reduziert.

11.5.2 Derivatisierung von Thiolen mit Monobrombiman

Abb. 66: Reaktionsschema für die Derivatisierung von Thiolen mit

Monobrombiman

Die Derivatisierung erfolgte in Anlehnung an die Methode von KNEER [199,

289]. Der Derivatisierungsansatz setzte sich wie folgt zusammen:

20 µL NH4HCO3 (10 mmol/L)

20 µL EDTA (1 mmol/L)

20 µL Monobrombiman (1 mmol/L)

10 µL wässrige Lösung der thiolhaltigen Substanz

Mit bidestilliertem Wasser wird auf ein Volumen von 250 µL aufgefüllt.

CH3

BrCH2CH3

CH3

RSCH2CH3

HBr

RSH

116 Experimenteller Teil

Dieser Ansatz wurde 30 Minuten bei 40°C in einem thermostatierten

Rundschüttler (100 U/min) unter Lichtausschluss inkubiert. Um

überschüssiges Derivatisierungsreagenz abzufangen, wurden anschließend

ca. 0,5 g frisch reduzierte Thiolagarose in das Derivatisierungsgemisch

gegeben und das Gemisch 20 Minuten bei Raumtemperatur auf einem

Vortex-Mixer geschüttelt. Das Gel wurde mit einer Eppendorf-Zentrifuge (10

min, 10000 g, RT) abzentrifugiert und der klare Überstand nach geeigneter

Verdünnung (in der Regel 1:10) mithilfe der Fluoreszenz-HPLC analysiert.

11.6 Mikrowellengestützter Druckaufschluss

Geräte:

• Detmold:

- Mikrowellenofen, MLS 1200 mega

- Programmsteuerungseinheit, mega 240

- Absaugeinheit, milestone EM-45

- 12 Autoklaven mit 30 Teflonaufschlussgefäßen

- Rotoreinheit, HPR 1000/6

- Temperatur- und Drucksensoreinheit

• Paderborn:

- Mikrowellenofen, mls ethos 1600

- Rotoreinheit, HPR 1000/10

- 10 Autoklaven mit 10 Quarz- und 20

Teflonaufschlussgefäßen

- Temperatur- und Drucksensoreinheit

- Computersteuerung, Softwareversion 3.03

Verwendete Reagenzien

Salpetersäure 65 % reinst. (Merck Nr. 100443), welche vor der Verwendung

durch dreimalige Oberflächenverdampfungsdestillation (Apparatur

Acidest, Fa Heraeus, Hanau) gereinigt wurde.

Wasserstoffperoxid (35 %) reinst. (Merck Nr. 108600)

Durchführung

Für die Bestimmung der Cadmium-, Kupfer-, Eisen-, Nickel- und Zinkgehalte

in den vegetativen und generativen Pflanzenteilen, den Zentrifugations-

rückständen und den bei der Zentrifugation anfallenden Fettfraktionen

wurden die Proben zunächst mit einem Hochtemperatur-Druck-Aufschluss in

einer Mikrowelle aufgeschlossen. Als Aufschlussmittel diente eine Mischung

aus konzentrierter Salpetersäure und Wasserstoffperoxid.

Es wurden jeweils 1,0 g der Probe eingewogen und je nach Höhe des

organischen Anteiles mit 2-4 mL Salpetersäure und 1 mL Wasserstoff-

peroxid versetzt. Nach einem vorgewählten Programm wurde die Lösung im

Autoklaven auf ca. 180°C erhitzt. Die klare Aufschlusslösung wurde mit

bidestilliertem Wasser auf ein Volumen von 25 mL aufgefüllt und die Lösung

zur Messung der Schwermetallgehalte mit der AAS bzw. DCP verwendet.

Experimenteller Teil 117

11.6.1 System mls 1200 mega

Bei diesem System können bis zu 6 Aufschlüsse gleichzeitig angefertigt

werden. Die Aufheizung geschieht mittels einer gepulsten Mikrowellen-

strahlung von bis zu 1200 Watt. Das Temperatur-Zeit-Programm für den

Aufschluss von Sonnenblumen- und Rapsproben wurde selbst entwickelt.

Tab. 42: Programmparameter für den Aufschluss von Ölpflanzenproben mit

dem Mikrowellensystem mls 1200 mega

Programmschritt Leistung [W] Zeit [min]

1 250 1,0

2 000 2,0

3 250 5,0

4 450 5,0

5 400 2,5

6 000 5,0

Die bei den Ölsaaten anfallenden Fettfraktionen wurden nach einem

gesonderten Programm aufgeschlossen.

Tab. 43: Programmparameter für den Aufschluss von Fettfraktionen mit dem

Mikrowellensystem mls 1200 mega

Programmschritt Leistung [W] Zeit [min]

1 250 1

2 0 2

3 250 1

4 0 2

5 250 5

6 0 5

11.6.2 System ethos 1600

Dieses System erlaubt die gleichzeitige Durchführung von bis zu 10

Aufschlüssen. Das Gerät verfügt über eine Temperatur- und Drucksensor-

einheit in den Autoklaven sowie einen zusätzlichen Infrarotsensor zur

Kontrolle der Manteltemperatur der Autoklaven. Des Weiteren ist das „ethos

1600“ computergesteuert mit einer kontinuierlichen Messwerterfassung für

Druck und Temperatur ausgestattet.

Tab. 44: Programmparameter für den Aufschluss von Ölpflanzenproben mit

dem Mikrowellensystem ethos 1600

Programmschritt Leistung [W] Temperatur [°C] Zeit [min]

1 1000 110 3

2 0 110 4

3 1000 160 5

4 1000 175 5

5 0 25 10

Die angegeben Leistungsparameter sind Maximalwerte, die nur über kurze

Zeiträume erreicht werden. Die aktuellen Leistungswerte liegen zumeist

deutlich niedriger (Abbildung 68). Zudem sind die Temperaturwerte nicht als

118 Experimenteller Teil

feste Werte zu verstehen, sondern sie werden zum Ende der angegebenen

Zeiträume erreicht (linearer Anstieg). Sollte zu einem Zeitpunkt des

Aufschlussvorganges einer der vorgegebenen Parameter überschritten

werden, reduziert das System automatisch die Leistung der Magnetrons.

Abbildung 68 zeigt die vorgegebenen Temperaturparameter für den

Aufschluss von Ölsaaten. Zudem werden die Leistungsabgabe (Power) der

Magnetrons, der Temperaturverlauf in der Probe (Temp. 1) sowie die

Manteltemperatur der Aufschlussgefäße (Temp. 2) grafisch dargestellt.

T1 Set Values Pow er Temp. 1 Temp. 2

Time [hh:mm:ss]

00:25:0000:20:0000:15:0000:10:0000:05:0000:00:00

Temperature [°C]

250

200

150

100

Power [Watt]

1.000

950

900

850

800

750

700

650

600

550

500

450

400

350

300

250

200

150

100

Abb. 67: Temperatur-Leistungs-Verlauf beim Aufschluss von Ölsaaten

11.7 Atomspektrometrische Verfahren

Tab. 45: Verwendete Messtechniken sowie zur Verfügung stehende Geräte

Schwermetall Messtechnik Gerät

Fe, Zn Flammen AAS Perkin Elmer Analyst 100

Cd, Cu, Ni Graphitrohrofen-AAS Perkin Elmer ZAAS 3030

Perkin Elmer SIMAA 6000

Cu DCP ARL FISONS DCP SPECTRASPAN 7

Eisen und Zink wurden mit der Flammen-AAS quantitativ bestimmt. Die

Flammentechnik ist unempfindlich gegenüber unspezifischen Untergrund-

absorptionen, sodass auf eine Deuteriumuntergrundkompensation verzichtet

werden kann. Die Nachweisgrenzen der Flammen-AAS waren für die

Bestimmung von Eisen und Zink in den Aufschlusslösungen und in den

Fraktionen der Gelchromatographie ausreichend.

Mit der Graphitrohrofen-AAS wurden Cadmium, Kupfer und Nickel bestimmt.

Diese Schwermetalle können im Vergleich zur Flammen-AAS etwa um den

Faktor 1000 empfindlicher gemessen werden. Die zur Verfügung stehenden

Geräte bieten die Möglichkeit der Zeeman-Untergrundkompensation. Diese

ist der Kompensationstechnik mit Deuteriumlampe deutlich überlegen [270],

sodass Cadmium, Kupfer und Nickel ohne Nassaufschluss in den Fraktionen

Experimenteller Teil 119

der Gelfiltration bestimmt wurden. Zur Absicherung der Methoden wurde ein

zertifiziertes Referenzmaterial der FAO mit der Bezeichnung FAO Standard

Nr. 68; ARC/CL (Weizenmehl) verwendet. Die erhaltenen Messwerte lagen

immer innerhalb der im Zertifikat angegebenen Vertrauensintervalle. Für die

bei der GFC in den Fraktionen auftretenden Matrices existieren keine

Referenzmaterialien. Diese Messungen wurden daher über Wiederfindungs-

raten abgesichert.

Tabelle 46 zeigt die Nachweisgrenzen für die Bestimmung von Cadmium,

Kupfer, Nickel, Eisen und Zink. Die Bestimmung der Nachweisgrenzen

erfolgte nach dem 3-Sigma (blind)-Konzept (DIN-32645, 1994):

Tab. 46: Nachweisgrenzen der Atomabsorptionsspektroskopie und lineare

Messbereiche

a: Nachweisgrenze für die Bestimmung in saurer Lösung

b: Nachweisgrenze bei der Bestimmung in Tris-HCl-Puffer

Schwermetall linearer Messbereich

[ng/mL] Nachweisgrenze

[ng/mL]a Nachweisgrenze

[ng/mL]b

Cadmium 000,5 - 0002,0 00,1 00,1

Kupfer 010,0 - 0100,0 00,5 00,5

Nickel 030,0 - 0080,0 05,0 10,0

Eisen 200,0 - 6000,0 00,1 00,1

Zink 100,0 - 1000,0 10,0 10,0

Geräte

• Graphitrohrofen-AAS: Zeemann AAS 3030 (Perkin Elmer, Überlingen)

- Elektrothermaler Graphitrohrofen HGA 600

- Probenautomat AS-60

- Powersupply für EDL-Lampen

- Cd-EDL

- Ni HKL (Nr. N006-1207), betrieben mit 25 mA

- Pyro-Graphitrohr für L`vov-Plattform (PE Nr.

109322) und L`vov-Plattform aus

Pyrokohlenstoff (PE Nr. 109324)

• Graphitrohrofen-AAS: SIMAA 6000 (Perkin-Elmer, Überlingen)

- Elektrothermaler Graphitrohrofen HGA 700

- Probenautomat AS 72 für 40 oder 80 Proben

- Furnace Cooling System

- Dell Dimension XPS 400 Rechnereinheit

- AAWinLab Software-Version 2.51

- Cd-EDL (PE Nr. 10281)

- Cu, Fe, Ni Multielement-HKL

- THGA Graphitrohr (PE Nr. B0508884)

• Flammen-AAS: Aanalyst 100 (Perkin Elmer, Überlingen)

- Multielement HKL für Ca, Mg und Zn

- Dell Optiplex GXa Rechnereinheit

- AAWinLab Software Version 2.6

• ARL Fisons DCP SPECTRASPAN 7

120 Experimenteller Teil

Verwendete Reagenzien

Cadmium-Stammlösung: 1,000 g/L; Titrisol (Merck Nr. 109989)

Kupfer-Stammlösung: 1,000 g/L, Titrisol (Merck Nr. 109987)

Eisen-Stammlösung: 1,000 g/L, Titrisol (Merck Nr. 102616)

Nickel-Stammlösung: 1,000 g/L, Titrisol (Merck Nr. 107289)

Zink-Stammlösung: 1,000 g/L, Titrisol (Merck Nr. 109929)

Matrixmodifikator: 3 mL Palladiummodifier (Merck Nr. 7289) und 2 mL

Magnesiummodifier (Merck Nr. 5813) mit bidest.

Wasser auf 20 mL auffüllen.

Gase: Acetylen, Luft, Stickstoff, Argon

Salpetersäure (65 %): (Merck Nr. 100443), Verwendung nach dreimaliger

Oberflächenverdampfungsdestillation.

Referenzmaterial: FAO Standard Nr. 68; ARC/CL Wheat flour

Für die Messung der Schwermetallgehalte in den Aufschlusslösungen

wurden die Kalibrationslösungen in 2 % (v/v) Salpetersäure angesetzt. Für

die Bestimmung der Schwermetallgehalte in den Fraktionen der FPLC

wurden die Kalibrationslösungen in Tris-HCL-Puffer (0,05 mol/L; pH 8,0)

angesetzt.

11.7.1 Bestimmung von Cadmium

Gerät: Perkin Elmer ZAAS 3030

Perkin Elmer SIMAA 6000

Wellenlänge: 228,8 nm

Spalt: 0,7 nm

Probenvolumen (ZAAS 3030/ SIMAA 6000): 20 µL / 10 µL

Modifiervolumen (ZAAS 3030/ SIMAA 6000): 20 µL / 5 µL

Messzeit: 3 s

Kalibration: linear, 0,5/1,0/1,5/2,0 ng/mL

Signalauswertung: Peakfläche

Tab. 47: THGA-Temperaturprogramm Perkin Elmer Z 3030 zur Bestimmung

von Cadmium

Schritt Temperatur

[°C] Aufheizzeit

[s] Haltezeit

[s] Interner Gasfluss

[mL/min]

1 150 5 30 300

2 450 5 20 300

3 1600 0 3 300

4 2800 1 2 0

5 20 1 20 300

Experimenteller Teil 121

Tab. 48: THGA-Temperaturprogramm Perkin Elmer SIMAA 6000 zur

Bestimmung von Cadmium

Schritt Temperatur

[°C] Aufheizzeit

[s] Haltezeit

[s] Interner Gasfluss

[mL/min]

1 110 5 20 250

2 150 15 20 250

3 500 10 20 250

4 1600 0 3 0

5 2450 1 3 250

6 20 1 15 250

11.7.2 Bestimmung von Kupfer

Gerät: Perkin Elmer SIMAA 6000

Wellenlänge: 324,8 nm

Spalt: 0,7 nm

Probenvolumen: 10 µl

Modifiervolumen: 5 µl

Messzeit: 5 s

Kalibration: linear, 10/25/50/100 ng/mL

Signalauswertung: Peakfläche

Das im Folgenden für Kupfer beschriebene Messprogramm wurde auch für

die Multielementbestimmung von Cadmium und Kupfer verwendet.

Tab. 49: THGA-Temperaturprogramm SIMAA 6000 zur Bestimmung von

Kupfer bzw. zur Multielementbestimmung von Cadmium und Kupfer

Schritt Temperatur

[°C] Aufheizzeit

[s] Haltezeit

[s] Interner Gasfluss

[mL/min]

1 110 1 20 250

2 130 15 20 250

3 600 10 60 250

4 2050 0 5 0

5 2450 1 3 250

6 20 1 15 250

11.7.3 Bestimmung von Nickel

Gerät: Perkin Elmer Z 3030

Wellenlänge : 232,0 nm

Spalt: 0,2 nm

Probenvolumen: 20 µl

Messzeit: 4 s

Kalibration: linear, 30/50/80 ng/mL

Signalauswertung: Peakfläche

122 Experimenteller Teil

Tab. 50: THGA-Temperaturprogramm Perkin Elmer Z 3030 zur Bestimmung

von Nickel

Schritt Temperatur

[°C] Aufheizzeit

[s] Haltezeit

[s] Interner Gasfluss

[mL/min]

1 150 5 30 300

2 400 10 5 300

3 1400 15 20 300

4 2500 0 5 0

5 2600 1 2 300

6 30 1 20 300

11.7.4 Bestimmung von Eisen

Gerät: Perkin Elmer Aanalyst 100

Wellenlänge: 248,6 nm

Spalt: 0,2 nm

Messzeit: 5 s

Kalibration: linear,

0,2/0,5/1/2/3/4/6 ng/mL

Signalauswertung: Peakfläche

Gasstrom: Acetylen 2,5 L/min

Luft 4 L/min

11.7.5 Bestimmung von Zink

Gerät: Aanalyst 100

Wellenlänge : 213,9 nm

Spalt: 0,7 nm

Messzeit: 5 s

Kalibration: linear,

0,1/0,2/0,4/0,6/0,8/1,0 ng/L

Signalauswertung: Peakfläche

Gasstrom: Acetylen: 2,5 l/min

Luft: 4,0 l/min

11.7.6 Bestimmung von Kupfer mit der DCP

Gerät: ARL Fisons DCP SPECTRASPAN 7

Wellenlänge: 324,75 nm

Messzeit: 10 s

Kalibration: 0,1 – 2,5 µg/L

Signalauswertung: Fläche

Gasstrom: Argon

Tab. 51: Nachweisgrenze der DCP und linearer Messbereich für Kupfer

a: Nachweisgrenze für die Bestimmung in saurer Lösung

b: Nachweisgrenze bei der Bestimmung in Tris-HCl-Puffer

Schwermetall linearer Messbereich

[µg/mL] Nachweisgrenze

[µg/mL]a Nachweisgrenze

[µg/mL]b

Kupfer (DCP) 0,02 – 10 0,002 0,002

Experimenteller Teil 123

11.8 Electrospray-Massenspektrometrie (ESI-MS/ESI-MSMS)

Die ESI-MS ist eine der modernsten Analysetechniken für die Element-

speziesanalytik [270, 297, 298, 335 342-344]. Zur Detektion von Proteinen

und Peptiden dient ein Quadrupol-Massenspektrometer. Die Ionisation der

Proben erfolgt im Elektrospay-Verfahren (Abbildung 76). Die Nachweis-

grenze für die Analyse von Peptiden und Proteinen liegt bei 10-15 mol [292].

Abb. 68: Schematischer Aufbau einer Elektrospray-Ionisationsquelle

Zudem ist es möglich, mit der ESI-MS im so genannten MSMS-Modus zu

messen. Hierbei werden in einer Stoßkammer (Ionenfalle) die entstandenen

Molekülionen mit Helium oder Argon beschossen, wodurch charakteristische

Zerfallsprodukte entstehen. Dieser Prozess wird als „collision-induced

dissociation“ (CID) bezeichnet. Die CID ermöglicht im MSMS-Modus u. a. die

Bestimmung der Aminosäuresequenz von Peptiden wie Phytochelatinen

[297].

Die Ionenfalle („Ion Trap“) besteht im Wesentlichen aus einer Ringelektrode

und zwei Endkappenelektroden mit zentrischen Öffnungen. Die Ring-

elektrode kann als in sich gebogener, an den Enden verbundener

Quadrupolstab verstanden werden [345, 346]. Soll ein größerer

Massenbereich gescannt werden, ist es am günstigsten an der Ringelektrode

ausschließlich mit einer Wechselspannung zu arbeiten, wodurch ein

dreidimensionales, rotationssymmetrisches Quadrupolfeld entsteht. Ionen

der ausgewählten Masse/Ladungs-Verhältnisse werden in diesem Feld auf

stabilen Umlaufbahnen fokussiert. Wenn die Amplitude der

Wechselspannung erhöht wird, werden die Umlaufbahnen der Ionen in

Reihenfolge steigender m/z-Quotienten instabil und die Ionen werden in

Richtung Detektor aus der Falle ausgeworfen. Die Ionenfalle arbeitet

diskontinuierlich; es wird ein bestimmter Zyklus von Füllung und

Massenanalyse durchlaufen. Wichtig ist, eine optimale Füllung der Falle

sicherzustellen. Sind zu viele Ionen in der Falle, stören sie sich gegenseitig

und die Auflösung wird verschlechtert; sind dagegen zu wenig Ionen

eingefangen worden, ist die Empfindlichkeit schlecht. Die Massenanalyse

läuft in folgenden Schritten ab [347]:

124 Experimenteller Teil

Für MS: I. Einfangen der Ionen durch Anlegen einer Wechselspannung an

die Ringelektrode und Einstrom von Helium als Dämpfungsgas.

II. Sequenzielle Massenanalyse und Detektion.

Für MS/MS:

III. Auswahl der gewünschten Ionen:

a) Erhöhung der Amplitude der Wechselspannung.

=>kleinere Massen werden instabil,

b) zusätzliche Waveform-Spannung

=>größere Massen werden instabil,

c) Stabilisierung der gewünschten Masse.

IV. Anlegen einer zusätzlichen Gleichspannung

=>Beschleunigung der Ionen und Fragmentierung

durch Kollision mit den Helium-Atomen.

Gerät

ThermoFinnigan LCQ Advantage

Messbedingungen

1. MS-Betrieb:

Probenaufgabe: 5 µL/min

Temperatur Transferkapillare: 250 °C

Spannung ESI-Nadel 5 kV

Sheath-Gas Stickstoff, 25 scale

Kapillarspannung: 13 V

Tube lens: 05 V

2. MSMS-Betrieb:

Kollisionsgas: Helium

Kollisionsenergie (normiert): 10 – 40 %

11.9 Bestimmung von Thiol-Gruppen nach Ellmann [348]

Geräte

Spektralphotometer (Unicam UV-VIS 4)

Quarzküvetten, Schichtdicke 1 cm

Verwendete Reagenzien

di-Natriumhydrogenphosphat-dihydrat (reinst, Merck Nr. 6576)

Natriumdihydrogenphosphat-monohydrat (p.a., Merck Nr. 6346)

Phosphat-Pufferlösung nach Sörensen (0,1 mol/L; pH 8,0):

236,75 mL di-Natriumhydrogenphosphatlösung (0,2 mol/L) und 13,25 mL

Natriumdihydrogenphosphat-Lösung (0,2 mol/L) im Messkolben mit

destilliertem Wasser auf 500 mL auffüllen.

Experimenteller Teil 125

DTNB-Reagenz: 39,6 mg 5,5´-Dithiobis (2-nitrobenzoesäure) (reinst,

Ellmann`s Reagenz, Serva Nr. 20735) in einem Gemisch aus 5 mL

Phosphatpuffer nach Sörensen und 5 mL Methanol lösen.

Kalibrationslösungen: 100 mg L-Cysteiniumchlorid-Monohydrat (für

biochemische Zwecke, Merck Nr. 2839) in destilliertem Wasser lösen

und auf 100 mL auffüllen. Die Stammlösung wurde mit destilliertem

Wasser auf 5/10/30/50 mg/L verdünnt.

Durchführung

Zu 0,5 mL einer Fraktion der GFC oder der Kalibrationslösung wurden

nacheinander 2,4 mL Phosphatpufferlösung und 0,1 mL DTNB-Reagenz

pipettiert. Es wurde kurz vermischt und sofort in einer Quarzküvette im

Spektralphotometer bei 412 nm gegen Luft die Extinktion gemessen. Als

Blindwert dienten 0,5 mL destilliertes Wasser.

11.10 Proteinbestimmung nach Bradford [349, 350]

Der verwendete Farbstoff Coomassie Brillantblue G-250 oder Servablau-G

liegt in saurer Lösung in einer blauen und einer orangen Form vor. Proteine

binden bevorzugt die blaue Form, wobei ein Komplex entsteht, dessen

Extinktionskoeffizient um vieles größer ist als der des freien Farbstoffes.

Lösung 1: 70 mg Coomassie Brillantblue G-250 (Servablau-G) wurden in 50

mL 96 %-igen Ethanol gelöst.

Lösung 2: 100 mL 86 %-ige Phosphorsäure mit 600 mL Wasser verdünnen.

Farbreagenz: Lösung 1) und 2) wurden gemischt und mit Wasser auf 1 L

aufgefüllt, gut gemischt und wenn nötig filtriert. Eine Eichkurve wurde

anschließend im Bereich von 0-15 µg Protein (Rinderserumalbumin) erstellt.

50 µl Probelösung wurden mit 1 mL Farbreagenz versetzt und 5 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Als Blindwert wurden 50 µl des Puffers der Probe

mit 1 mL Farbreagenz versetzt und anschließend die Extinktion bei 595 nm

bestimmt.

11.11 Gewinnung von Wurzeldruck-Exudat (Xylemsaft)

Die hierbei verwendeten Pflanzen werden in Hydrokultur in der Wachstums-

kammer angezogen. Die Gewinnung des Xylemsaftes wurde während der

Lichtperiode durchgeführt. Mit einem Messer wurde der Stängel der Pflanzen

ca. 3 cm oberhalb der Wurzeln durchgeschnitten, wobei keine Blätter mehr

auf dem übrigen Teil des Stängels verblieben. Um Kontaminationen durch

beschädigte Zellen zu vermindern, wurde der erste Tropfen verworfen. Der

durch den Wurzeldruck herauskommende Saft in Eppendorfgefäßen

gesammelt und bei -80°C bis zur Analyse gelagert. Es wurde das in den

ersten 45 min nach dem Abschnitt austretende Exudat gesammelt [351-353].

126 Experimenteller Teil

11.12 Isolierung von Organellen aus Kotyledonen von

Sonnenblumen- und Rapskeimlingen

11.12.1 Chloroplasten [321]

Geräte

Kühlzentrifuge ´Avanti Centrifuge ´ J-25; Rotor JA-25.50 (Beckmann,

München)

Zentrifugenröhrchen

Schlauchpumpe

Spektralphotometer (Unicam UV-VIS4)

Verwendete Reagenzien

Di-Kaliumhydrogenphosphat

Kaliumdihydrogenphosphat (p.a., Merck, Darmstadt):

Phosphatpuffer (20 mmol/L; pH 7,4) 2,72 g Kaliumdihydrogenphosphat und

4,56 g Di-Kaliumhydrogenphosphat wurden in 1000 mL Wasser gelöst.

Mannit (für die Mikrobiologie; Merck Nr. 105982)

Magnesiumchlorid (p.a.; Merck Nr. 105833)

Rinderserumalbumin (Fraktion V; für Molekularbiologie; Merck Nr. 112003)

Dithiothreitol (für biochemische Zwecke, > 99 %, Merck Nr. 111474)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Titriplex III (p.a. Merck Nr. 108418)

N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure) (HEPES)

Natriumhydroxidplätzchen (p.a., Merck Nr. 106462)

Zerkleinerungsmedium: 6,0126 g Mannitol (330 mmol), 0,1017 g

Magnesiumchlorid (5 mmol), 0,1 g Rinderserumalbumin (0,1 %), 0,0155

g Dithiothreitol (1 mmol) und 0,0293 g EDTA (1 mmol) wurden in 100 mL

Phosphatpuffer (20 mmol, pH 7,4) gelöst.

Waschmedium: 6,0126 g Mannitol (330 mmol) und 0,0293 g EDTA (1 mmol)

wurden in 100 mL Phosphatpuffer gelöst.

Sorbitol (Merck Nr. 103583)

80 %-ige Percolllösung: 3,0058 g Sorbitol (330 mmol/L) und 0,119 g HEPES

(10 mmol/L) wurden in 40 mL Percoll gelöst und mit destilliertem Wasser

auf 50 mL aufgefüllt. Der pH-Wert wurde mit 1 mol/L Natronlauge auf pH

7,8 eingestellt.

40 %-ige Percolllösung: 3,0058 g Sorbitol (330 mmol/L) und 0,119 g HEPES

(10 mmol/L) wurden in 20 mL Percoll gelöst und mit destilliertem Wasser

auf 50 mL aufgefüllt. Der pH-Wert von 7,8 wurde mit 1 mol/L Natronlauge

eingestellt.

Durchführung

Etwa 10 g grüne Kotyledonen von Sonnenblumen- bzw. Rapskeimlingen

(Anzucht vgl. 9.1) wurden geerntet und in 20 mL eisgekühltem Homogenisa-

tionsmedium konserviert. Anschließend wurden die Kotyledonen vorsichtig

im Zerkleinerungsmedium unter Eiskühlung für ca. zwei Minuten gemörsert

(glasierter Porzellanmörser). Das Homogenat wurde durch eine Lage

Experimenteller Teil 127

Miracloth (Calbiochem) und vier Lagen Verbandmull (NOBA Verbandmittel)

gepresst und danach 20 Minuten in einer Kühlzentrifuge (4°C) bei 1500 g

zentrifugiert. Der Bodensatz der Zentrifugation mit den Chloroplasten wurde

in 2 mL Waschmedium aufgenommen. Diese Suspension wurde auf einen

Percollgradienten aufgetragen, welcher aus 6 mL einer 80 %-igen und 12 mL

einer 40 %-igen Percolllösung aufgebaut ist. Der Gradient wurde zentrifugiert

(4°C, 1600 g), mit schwacher Beschleunigung und schwacher Bremse. Nach

der Zentrifugation konnte oberhalb der 80 %-igen Percolllösung eine grüne

Schicht mit intakten Chloroplasten beobachtet werden. Der Gradient wird mit

einer Schlauchpumpe von unten nach oben in Fraktionen von ca. 1 mL

aufgenommen. In den Fraktionen wird der Chlorophyllgehalt gemessen.

Dazu werden 100 µL der Fraktion und 800 µL 80 % Ethanol (v/v) gemischt

und 15 Minuten bei Raumtemperatur verschlossen inkubiert. Darauf folgt für

10 Minuten eine Zentrifugation bei 3000 U/min. Die Absorption des

Überstandes wird bei 652 nm gegen einen Blindwert aus 80 %-igem Ethanol

bestimmt. Die Konzentration an intakten Chloroplasten berechnet sich nach:

mit VF: Verdünnungsfaktor

11.12.2 Mitochondrien und Peroxisomen

Zur Isolierung von Mitochondrien und Peroxisomen wurden verschiedene

Aufarbeitungsmedien ausgetestet. Insbesondere der übliche Zusatz von

EDTA zum Aufarbeitungsmedium ist als problematisch für die Schwermetall-

verteilung anzusehen. Daher wurde bei einigen Untersuchungen auf den

Einsatz von EDTA verzichtet (vgl. Kapitel 5.1), um Vergleichsdaten zu

erhalten.

Geräte

Kühlzentrifuge ´Avanti TM Centrifuge ´ J-25 mit Rotor JA-25.50 (Beckmann,

München)

Schlauchpumpe

Spektralphotometer (Unicam UV-VIS4)

Quarzmikroküvetten 1 mL

Gradientenmischer

Verwendete Chemikalien

Mannit (für Mikrobiologie; Merck Nr. 105982)

Saccharose (für Mikrobiologie; Merck Nr. 107651)

Tricin (N-[(Trishydroxymethyl)-methyl]-glycin) (Merck Nr. 108602)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA), Titriplex III (p.a. Merck Nr. 108418)

Rinderserumalbumin (Fraktion V; für biochem. Zwecke; Merck Nr. 112018)

2-Mercaptoethanol (für Molekularbiologie; Merck Nr. 112006)

Natriumhydroxidplätzchen (p.a., Merck Nr. 106462)

nmE

mLmgtenChloroplasc ∗= 2,34

)652(

]/[)(

128 Experimenteller Teil

Natriumdithionit (technisch; Merck Nr. 106505)

Triton x-100

Wasserstoffperoxid (35 %) (Riedel Nr. 18304)

Cytochrom c (Sigma C 3381)

(N-(2-Hydroxyethyl)piperazin-N´-(2-ethansulfonsäure) (HEPES) (p.a., Roth

Nr. 9105.4)

Di-Kaliumhydrogenphosphat (p.a., Merck Nr. 105099)

Kaliumdihydrogenphosphat (reinst., Merck Nr. 104801)

Phosphatpuffer (10 mmol/L; pH 7,4): 1,36 g Kaliumdihydrogenphosphat und

2,28 g Di-Kaliumhydrogenphosphat wurden in 1000 mL Wasser gelöst.

Aufarbeitungsmedium 1:

5,466 g Mannit (0,3 mol/L), 1,7917 g Tricin (0,1 mol/L) und 0,1 g

Rinderserumalbumin (0,1 %) wurden in 100 mL Wasser gelöst. Bei den

Untersuchungen mit EDTA wurden 0,293 g EDTA (1 mmol/L)

hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 mol/L Natronlauge auf

pH 7,5 eingestellt. Direkt vor der Verwendung wurden 11,7 µL/10mL

Mercaptoethanol (0,014 mmol/L) zugefügt.

Percoll-Saccharose-Gradient 1 (Tricin, pH 7,5):

10,269 g Saccharose (0,3 mol/L), 0,1792 g Tricin (10 mmol) und gege-

benenfalls 0,0292 g EDTA (1 mmol) wurden in 100 mL 100 %-igem

Percoll (für die 100 %-ige Percolllösung) oder in 50 mL Percoll + 50 mL

Wasser gelöst (für die 50 %-ige Percolllösung) bzw. in 15 mL Percoll +

85 mL Wasser (für die 15 %-ige Percolllösung) aufgelöst.

Aufarbeitungsmedium 2:

5,466 g Mannit (0,3 mol/L), 0,5958 g HEPES (0,025 mol/L) und 0,1 g

Rinderserumalbumin (0,1 %) wurden in 100 mL Wasser gelöst. Bei den

Untersuchungen mit EDTA wurden 0,293 g EDTA (1 mmol/L)

hinzugefügt. Der pH-Wert der Lösung wurde mit 1 N Natronlauge auf pH

7,5 eingestellt. Direkt vor der Verwendung des Aufarbeitungsmediums

wurden 10 µL/10mL 2-Mercaptoethanol zugefügt.

Percoll-Saccharose-Gradient 2 (HEPES, pH 7,5):

10,269 g Saccharose (0,3 mol/L) und 0,1192 g HEPES (5 mmol) wurden

analog zu Percoll-Gradienten Lösung 1 entweder in 100 mL Percoll,

50 mL Percoll + 50 mL Wasser oder in 15 mL Percoll + 85 mL Wasser

gelöst.

Durchführung

Die Vorgehensweise zur Isolierung von intakten Mitochondrien und

Peroxisomen aus Kotyledonen von Sonnenblumen und Raps war für beide

Aufarbeitungsmedien identisch.

Zur Vorbereitung des kontinuierlichen Percollgradienten wurden in einem

Zentrifugenröhrchen 5 mL von 100 %-igem Percoll vorgelegt. In einem

Gradientenmischer wurden in Kammer eins 13 mL einer 15 %-igen bzw. in

Kammer zwei 13 mL einer 50 %-igen Percoll-Saccharose-Lösung gegeben.

Unter ständigem Rühren mischte sich ein kontinuierlicher Gradient von

50–15 % der eingesetzten Percolllösung.

Experimenteller Teil 129

Bei der Erstellung des kontinuierlichen Gradienten war darauf zu achten,

dass Turbulenzen im Gradienten vermieden wurden durch:

• Vorsichtiges Öffnen der Verschlussschraube am Gradientenmischer,

• Kontakt des Auslaufstutzens mit der Gefäßwand des Zentrifugenglases,

• geringe Ausfließgeschwindigkeit,

• vorsichtigen Transport der fertigen Gradienten,

• Verwendung von vorgekühlten Reagenzien um einen Temperatur-

gradienten zu vermeiden.

Etwa 10 g der fünf Tage alten nicht-grünen Kotyledonen (Anzucht vgl. 9.1;

Lichtausschluss) wurden mit 20 mL vorgekühltem Aufarbeitungsmedium

unter Eiskühlung gemörsert. Die zermörserten Keimlingsblätter wurden sanft

durch drei Lagen Miracloth (Calbiochem) und eine Lage Verbandmull (NOBA

Verbandmittel) gepresst. Das Filtrat wurde anschließend für zehn Minuten

bei 2500 g zentrifugiert. Der Überstand der Zentrifugation wurde für 20

Minuten bei 11000 g zentrifugiert. Das entstehende Pellet wurde in 2 mL des

jeweiligen Aufarbeitungsmediums aufgenommen und die entstehende

Suspension auf den Percollgradienten aufgetragen.

Abb. 69: Schematischer Aufbau einer Percollgradientenmischeinheit

Der Percollgradient wurde 30 Minuten bei 20000 U/min (44000 g) zentrifu-

giert. Nach der Zentrifugation waren drei verschiedene Zonen

unterscheidbar. Direkt oberhalb des 100 %-igen Percoll war häufig eine

weißlich-trübe Zone zu erkennen, welche intakte Peroxisomen enthielt.

Zudem zeigte sich im mittleren Teil des Gradienten eine Schicht, die intakten

Mitochondrien zuzuordnen war. Oberhalb des eigentlichen Gradienten war

eine Zone mit beschädigten Peroxisomen, Mitochondrien, Chloroplasten und

sonstigen Zellbestandteilen (Abbildung 23). Der Gradient wurde

anschließend mit einer Schlauchpumpe von unten nach oben abgesaugt und

in Fraktionen von etwa 1 mL unterteilt. In den Fraktionen wurden die intakten

Peroxisomen und Mitochondrien anhand organellenspezifischer „Leitenzyme“

bestimmt.

15 % Percoll-

Lösung

15 %

Percoll-

gradient

50 %

50 % Percoll-

Lösung

Kammer 1 Kammer 2

mit Rührer

100 % Percoll-

Lösung (5 mL)

130 Experimenteller Teil

Bestimmung der Leitenzyme

Die Enzymtests wurden photometrisch bei Raumtemperatur durchgeführt.

Zur Messung wurden Quarz- oder Kunststoffküvetten mit einer Schichtdicke

von einem Zentimeter verwendet. Die Messungen erfolgten direkt aus den

Gradientenfraktionen ohne weitere Probenvorbereitung.

• Peroxisomen

Das zur Identifizierung von Peroxisomen verwendete Leitenzym ist Katalase.

Katalase ist konstitutiv in Peroxisomen vorhanden und dient dazu, dass

durch peroxisomale Oxidasen gebildete Wasserstoffperoxid in Sauerstoff und

Wasser zu zersetzen. Diese von AEBI [354] beschriebene Reaktion wurde

zusammen mit den von MÜLLER [264] beschriebenen Modifikationen

eingesetzt, um Peroxisomen nachzuweisen. Die Messung der Enzymaktivität

erfolgte mit einem Spektralphotometer bei 230 nm. Die Messdauer betrug 30

Sekunden. Die Katalaseaktivität errechnete sich aus der Differenz der

Extinktion zu Beginn der Messung und nach 30 Sekunden.

Messpuffer:

Phosphatpuffer (10 mmol/L, pH 7,0) mit 116 µL Wasserstoffperoxid

(35 %, 11,8 mmol/L)

Testansatz:

Referenzküvette: 1020 µL Phosphatpuffer (10 mmol/L; pH 7,0)

Messküvette: 1000 µL Messpuffer

0020 µL Probenlösung

• Mitochondrien

Das zur Bestimmung von intakten Mitochondrien genutzte Enzym ist die

Cytochrom c-Oxidase (Ferrocytochrom c-Sauerstoff Oxidoreduktase). In der

Atmungskette fungiert eine Serie von Cytochromen als Überträger von

Elektronen von Ubichinon auf den Sauerstoff, wobei die letzten Glieder der

Serie (Cytochrom a und a3) Bestandteile eines Enzymkomplexes sind, der

als Cytochrom-Oxidase bezeichnet wird [21, 22]. Die Bestimmung der

Enzymaktivität erfolgt nach Schnarrenberger [355] bei 550 nm im Spektral-

photometer. Die Cytochrom c-Oxidaseaktivität berechnet sich aus der

Differenz der Extinktion vor Messbeginn und nach einer Messdauer von 30

Sekunden.

Messpuffer:

Phosphatpuffer (10 mmol/L, pH 7,0)

Testansatz:

Referenzküvette: 1040 µL Messpuffer

0100 µL Cytochrom c (red.) (0,8 mmol)

Testküvette: 1000 µL Messpuffer

0020 µL Triton x-100 (red., 1 %)

0100 µL Cytochrom c (red.) (0,8 mmol)

0020 µL Probensubstanz

Experimenteller Teil 131

Reduktion des Cytochrom c

1-2 mL Cytochrom c-Lösung (0,8 mmol) wurden in einer Kunststoff-Makro-

messküvette gegeben und mit einer Spatelspitze Natriumdithionit reduziert

(hellroter Farbumschlag). Anschließend wurde so viel Cytochrom c-Lösung

zugegeben, bis diese dunklen Tropfen gerade nicht mehr hellrot wurden (Th.

Betsche, persönl. Mitteilung). Der Reduktionszustand der Cytochrom c-

Lösung wurde durch Messung der Extinktion bei 550 nm gegen

Phosphatpuffer geprüft.

Die Extinktion der reduzierten Cytochrom c-Lösung lag bei etwa 1,8.

11.13 Vorbereitung der isolierten Substanzen zur Amino-

säureanalyse [328, 356]

Geräte und Reagenzien

Gefriertrocknungsanlage,

Reaktionsgefäße mit Deckel, 2,5 mL, (Fa Eppendorf)

Ameisensäure p. a. (98 – 100 %) (Merck Nr. K14306564)

Wasserstoffperoxid-Lösung (35 %) (Riedel Nr. 18304)

Methanol p. a. (Merck Nr. 6009)

Durchführung

950 µL Ameisensäure wurden in einem Reaktionsgefäß mit 50 µL

Wasserstoffperoxid-Lösung gemischt und 2 h bei Raumtemperatur sowie

anschließend in einem Eisbad weitere 30 Minuten, stehen gelassen.

In einem zweiten Reaktionsgefäß wurden 1 mg der isolierten Substanz mit

250 µL Ameisensäure und 50 µL Methanol vermischt und ebenfalls 30

Minuten in einem Eisbad stehen gelassen. Zu diesem Gemisch wurden 0,5

mL der im ersten Reaktionsgefäß entstandenen Perameisensäure

zugegeben und 2,5 Stunden in einem Eisbad stehen gelassen. Anschließend

wurde die Reaktionslösung mit eiskaltem Wasser auf ca. 15 mL aufgefüllt

und die Lösung in der Gefriertrocknungsanlage lyophilisiert, bis nur noch ein

trockener weißer Rückstand vorlag.

132 Literaturverzeichnis

12 Literaturverzeichnis

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A 153 Anhang

A 1: Weitere Elutionsprofile der GFC

A 1.1 Sonnenblumenkerne

Abb. A1: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1997): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 3 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL)

Zn (1 Einheit 750 ng/mL)

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

Abb. A2: Sonnenblumenkerne (Sorte Petra 1998): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL)

Zn (1 Einheit 250 ng/mL),

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 2 kD 0,6 kD 0,3 kD > 0,1 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 160 kD 90 kD 40 kD 20 kD > 10 KD

A 154 Anhang

Abb. A3: Sonnenblumenkerne (Unterfranken; 1998): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 200 ng/mL), Ni (1 Einheit 100 ng/mL)

Zn (1 Einheit 300 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

Abb. A4: Sonnenblumenkerne (äußere SBK; Vinsebeck; 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 100 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 200 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD < 0,1 kD0,5 kD

2,5 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD < 10 kD20 kD

A 155 Anhang

Abb. A5: Sonnenblumenkerne (äußere SBK; Vinsebeck; 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 75 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 500 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

Abb. A6: Sonnenblumenkerne (innere SBK; Vinsebeck; 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 75 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 250 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

0,2 kD> 7 kD

2 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

130 kD220 kD> 600 kD < 10 kD25 kD

35 kD

A 156 Anhang

Abb. A7: Sonnenblumenkerne (geschält): Schwermetall-Elutionsprofil der

wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 200 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL),

Zn (1 Einheit 200 ng/mL), Absorption 280 nm (1 Einheit 50 mV);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G100.

Abb. A8: Sonnenblumenkerne (geschält): Schwermetall-Elutionsprofil der

wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 4 ng/mL), Cu (1 Einheit 200 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL),

Zn (1 Einheit 250 ng/mL) Absorption 280 nm (1 Einheit 50 mV),

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G50.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 30 kD < 1,5 kD17,5 kD 4,5 kD

Abs 280 nm

10 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

Abs 280 nm

> 150 kD 91 kD 62 kD 26 kD 17 kD < 4 kD7 kD10 kD

A 157 Anhang

Abb. A9: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1996): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 100 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 100 ng/mL),

freies SH (1 Einheit normiert auf 300 mg/L Cysteiniumchlorid)

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L, 10 mmol/L ME);

Superdex S200.

Abb. A10: Sonnenblumenkerne (Sorte „Petra“; 1996): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 3 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 75 ng/mL),

Zn (1 Einheit 300 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L, 10 mmol/L ME);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 2,5 kD 0,4 kD 0,2 kD < 0,1 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

150kD 80kD 22 kD < 10 kD

SH Cu

110 kD

A 158 Anhang

Abb. A11: Sonnenblumenkerne (Unterfranken, 1998): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 40 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 150 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L, 10 mmol/L ME);

Superdex S200.

A 1.2 Rapssamen

Abb. A12: Rapssamen (BEE; 1996): Schwermetall-Elutionsprofil der

wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL),

Zn (1 Einheit 500 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD < 0,1 kD0,15 kD

Cu Ni

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

320 kD 100 kD 40 kD 20-17 kD 11 kD < 10 kD

A 159 Anhang

Abb. A13: Rapssamen (Mischmuster, 1996): Schwermetall-Elutionsprofil

der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL), Zn (1 Einheit 200 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G100.

Abb. A14: Rapssamen (Mischmuster; 1996): Schwermetall-Elutionsprofil der

wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 150 ng/mL),

Zn (1 Einheit 500 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G50.

0,0

0,5

1,0

1,5

2,0

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav-Wert

Elementgehlat [rel. Einheiten]

> 35 kD < 1,5 kD16 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 150 kD < 4 kD110 kD 50 kD85 kD

A 160 Anhang

Abb. A15: Rapssamen (BEE 1996): Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen

Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 600 ng/mL), Ni (1 Einheit 100 ng/mL),

Zn (1 Einheit 250 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L, 10 mmol/L ME);

Superdex Peptide HR.

A 1.3 Sonnenblumenblätter

Abb. A16: Sonnenblumenblätter (Blätter Nr. 1-6; Vinsebeck, 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 3 ng/mL), Cu (1 Einheit 30 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 150 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 5 kD 2 kD < 0,1 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 3 kD 1,5 kD < 0,1 kD0,5 kD

Ni Zn

A 161 Anhang

Abb. A17: Sonnenblumenblätter (Blätter 19-26; Vinsebeck, 1999):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 15 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200.

A 1.4 Rapsblätter

Abb. A18: Rapsblätter (Detmold-Mosebeck, 2000):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 200 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 3 kD 0,15 kD< 0,1 kD

Cu Zn

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 10 kD> 600 kD 540 kD350 kD 180 kD 27 kD 17 kD

A 162 Anhang

Abb. A19: Rapsblätter (Detmold-Mosebeck, 2000): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 250 ng/mL)

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME)

Superdex Peptide HR.

A 1.5 Sonnenblumenwurzeln

Abb. A20: Sonnenblumenwurzeln (Unterfranken, 1998):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Ni (1 Einheit 20 ng/mL),

Zn (1 Einheit 80 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD 220 kD 150 kD 30 kD 20 kD < 10 kD

Cd Ni

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 4 kD 0,6 kD < 0,1 kD

A 163 Anhang

Abb A21: Sonnenblumenwurzeln (Unterfranken, 1998):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 40 ng/mL),

Zn (1 Einheit 75 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S75.

Abb. A22: Sonnenblumenwurzeln (Anzucht in Hydrokultur):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 15 ng/mL), Ni (1 Einheit 75 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G100.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,15 0,35 0,55 0,75 0,95 1,15

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

7,5 kD < 4 kD10kD15 kD30 kD> 70 kD 6 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

< 1,5 kD

> 35 kD 10 kD

Abs 280 nm Cu

A 164 Anhang

Abb. A23: Sonnenblumenwurzeln (Anzucht in Hydrokultur; 1µmol/L, Cd):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion unter reduzie-

renden Bedingungen

Cd (1 Einheit 40 ng/mL), Cu (1 Einheit 30 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 100 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME);

Superdex Peptide HR.

A 1.6 Rapswurzeln:

Abb. A24: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 2000): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 75 ng/mL), Ni (1 Einheit 50 ng/mL),

Zn (1 Einheit 300 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

3,2 kD> 7 kD 0,2 - < 0,1 kD

Cu Zn

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

300 kD

> 600 kD < 10 kD20 kD

Cd Cu

32 kD 10 kD16 kD

A 165 Anhang

Abb. A25: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 1998): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 250 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 125 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Sephadex G50.

Abb. A26: Rapswurzeln (Detmold-Mosebeck, 2000): Schwermetall-Elutions-

profil der wässrigen Fraktion unter reduzierenden Bedingungen

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 15 ng/mL), Ni (1 Einheit 25 ng/mL),

Zn (1 Einheit 350 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME)

Superdex S200.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

4,5 kD> 35 kD < 1,5 kD

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

5 kD> 7 kD < 0,1 kD0,2 kD

1,5 kD 0,6 - 0,5 kD

A 166 Anhang

Abb. A27: Rapswurzeln (Anzucht in Hydrokultur;1 µmol/L Cd-Dotierung):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 80 ng/mL), Cu (1 Einheit 25 ng/mL), Zn (1 Einheit 125 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex S200

Abb. A28: Rapswurzeln (Anzucht in Hydrokultur, 1µmol/L Cd):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion unter reduzie-

renden Bedingungen

Cd (1 Einheit 60 ng/mL), Cu (1 Einheit 50 ng/mL), Ni (1 Einheit 10 ng/mL),

Zn (1 Einheit 75 ng/mL);

Extraktions-/Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME);

Superdex Peptide HR.

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 600 kD < 10 kD28 - 24 kD 15 kD

50 kD

Zn Ni

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

300 kD

> 600 kD < 10 kD

CdCu

30 - 24 kD45 kD

A 167 Anhang

A 1.7 Sonnenblumen- und Rapsstängel

Abb. A29: Sonnenblumenstängel (Unterfranken, 1998):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 1 ng/mL), Cu (1 Einheit 20 ng/mL), Ni (1 Einheit 15 ng/mL),

Zn (1 Einheit 75 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR.

Abb. A30: Rapsstängel (Detmold-Mosebeck, 1998):

Schwermetall-Elutionsprofil der wässrigen Fraktion

Cd (1 Einheit 60 ng/mL), Ni (1 Einheit 10 ng/mL);

Extraktions- und Elutionspuffer: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Superdex Peptide HR:

0,5

1,5

2,5

-0,05 0,05 0,15 0,25 0,35 0,45 0,55 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

0,2 - < 0,1 kD4 kD

Cd Ni

0,5

1,5

2,5

-0,10 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 0,60 0,70 0,80 0,90 1,00 1,10 1,20 1,30

Kav - Wert

Elementgehalt [rel. Einheiten]

> 7 kD 2 kD 1,2 kD 0,6 kD 0,3 kD < 0,1 kD

A 168 Anhang

A 1.8 Elutionsprofile der IAC

Abb. A31: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanz aus

Sonnenblumenkernen (Molmasse 25kD) bei der IAC

SBK: Cd (1 Einheit 5 ng/mL)

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer

Laufmittel B: Tris-HCl-Puffer + 1 mol/L NaCL

Abb. A32: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanz aus Rapssamen

(Molmasse 25kD) bei der IAC

SBK: Cd (1 Einheit 1 ng/mL)

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer

Laufmittel B: Tris-HCl-Puffer + 1 mol/L NaCL

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 98 106 114 122 130 138 146 154

Elutionsvolumen [mL]

Volumenanteil Elutionsmittel B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Cadmiumgehalt [rel. Einheiten]

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 10 18 26 34 42 50 58 66 74 82 90 98 106 114 122 130 138 146 154

Elutionsvolumen [mL]

Volumenanteil Elutionsmittel B

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Elementgehalt [rel. Einheiten]

A 169 Anhang

Abb. A33: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanz aus Sonnen-

blumenwurzeln (Molmasse 25kD) unter reduzierenden Bedin-

gungen bei der IAC

SBK: Cd (1 Einheit 20 ng/mL);

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME);

Laufmittel B: 1 mol/L NaCL in Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME).

Abb. A34: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanz aus Rapswurzeln

(Molmasse 25kD) bei der IAC

SBK: Cd (1 Einheit 35 ng/mL);

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L);

Laufmittel B: 1 mol/L NaCL in Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L).

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 122232425262728292102112122132

Elutionsvolumen [mL]

Cadmiumgehalt [rel. Einheiten]

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Volumenanteil Eluent A

II III

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 14 26 38 50 62 74 86 98 110 122 134

Elutionsvolumen [mL]

Cadmiumgehalt [rel. Einheiten]

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Volumenanteil Eluent B

Abs. 280 nm

A 170 Anhang

Abb. A35: Elutionsprofil der Cadmium-bindenden Substanz aus Rapswurzeln

(Molmasse 25kD) unter reduzierenden Bedingungen bei der IAC

SBK: Cd (1 Einheit 75 ng/mL);

Laufmittel A: Tris-HCl-Puffer (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME);

Laufmittel B: 1 mol/L NaCL in Tris-HCl (pH 8,0; 0,05 mol/L; 10 mmol/L ME).

A 3 Spektren der ESI-MS und der ESI-MSMS

Abb. A36: Spektrum bei der ESI-MS der aus Rapswurzeln isolierten

Cadmiumspezies (Substanz II)

Probenaufgabe: 5 µL/min

Temperatur Transferkapillare:

300 °C

Spannung ESI-Nadel 5 kV

Sheath-Gas Stickstoff, 25 scale

Kapillarspannung: 13 V

Tube lens: 5 V

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

2 12 22 32 42 52 62 72 82 92 102 112 122 132

Elutionsvolumen [mL]

Elementgehalt [rel. Einheiten]

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

Volumenanteil Eluent B

Ia IIa