Das endodermale, hepatische Differenzierungspotenzial
von adulten und embryonalen Stammzellen in vitro und in vivo
vorgelegt von
Diplom-Ingenieurin der Biotechnologie
Annika Wulf-Goldenberg
aus Berlin
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
Berichter: Prof. Dr. R. Lauster
Berichterin: Dr. habil. I. Fichtner
Berichter: Prof. Dr. J. Kurreck
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30. März 2010
Berlin 2010
D 83
„Siehst du, Momo“, sagte Beppo Straßenkehrer, „es ist so: Manchmal hat man eine sehr lange Straße
vor sich. Man denkt, die ist so schrecklich lang; das kann man niemals schaffen, denkt man.
Und dann fängt man an, sich zu eilen. Und man eilt sich immer mehr. Jedesmal, wenn man aufblickt,
sieht man, dass es gar nicht weniger wird, was noch vor einem liegt. Und man strengt sich noch mehr
an, man kriegt es mit der Angst, und zum Schluss ist man ganz außer Puste und kann nicht mehr. Und
die Straße liegt immer noch vor einem. So darf man es nicht machen.
Man darf nie an die ganze Straße auf einmal denken, verstehst du? Man muss nur an den nächsten
Schritt denken, dann den nächsten Atemzug, an den nächsten Besenstrich. Und immer wieder nur an
den nächsten.
Dann macht es Freude; das ist wichtig, dann macht man seine Sache gut. Und so soll es sein.
Auf einmal merkt man, dass man Schritt für Schritt die ganze Straße gemacht hat. Man hat gar nicht
gemerkt wie, und man ist nicht außer Puste. Das ist wichtig.“
Michael Ende, aus „Momo“
Für meine Eltern, weil ihr mich gelehrt habt, meine Straße mit Mut und Zuversicht zu gehen.
Z u s a m m e n f a s s u n g 3
I. Zusammenfassung
In der regenerativen Medizin besteht die Hoffnung, pluripotente embryonale und multipotente
adulte Stammzellen für zellbasierte Therapien zu verwenden. Stammzellen, die in Hepatozyten
differenzieren, können möglicherweise als Überbrückungstherapie extrakorporal im Bioreaktor oder
durch intrahepatische Transplantation in Patienten mit akutem Leberversagen eingesetzt werden.
Das Ziel der Arbeit war der Vergleich des endodermal hepatischen Differenzierungspotenzials von
humanen pluripotenten, embryonalen Stammzellen und multipotenten, adulten CD34
+
Stammzellen
aus Nabelschnurblut unter identischen differenzierungsinduzierenden Bedingungen in vitro und in
vivo. In immundefizienten Mäusen wurden unterschiedliche Leberschadensmodelle der Maus
etabliert, um das Engraftment, die Organverteilung und das hepatische Differenzierungs- und
Regenerationspotenzial von humanen Stammzellen nach in vivo Transplantation zu bestimmen.
Mittels Gen- und Proteinexpression und zellulären Strukturen sollten essentielle Schritte der in vitro
und in vivo Differenzierung identifiziert werden.
Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erhalten:
1. Durch Zytokine, hepatisch konditioniertes AML12- und HepG2-Medium und Kokultur mit AML12-
Hepatozyten wurde die hepatische Differenzierung in CD34
+
Zellen in vitro geprüft. Die Analyse der
Genexpressionen der unterschiedlich kultivierten CD34
+
Zellen ergab ein vergleichbares
Genexpressionsprofil. Die Expression von Cytokeratin 19 und E-Cadherin stieg unter den
Kultivierungsbedingungen stark an. Die endodermalen Gene wurden schwach exprimiert: GATA4,
GJB1, KRT8, HNF4A, CEBPA und AFP. Unverändert blieb die Expression von SOX17, FOXA2, ALB und
KRT18. Weder die von AML12- und HepG2 Zellen ins konditionierte Medium sekretierten löslichen
Faktoren noch der direkte Kontakt in Kokultur induzierten die Differenzierung der adulten
Stammzellen in einen hepatischen Phänotyp. Nach Kokultivierung waren jedoch partiell
morphologische Zellveränderungen und Differenzierungsmerkmale bei den Stammzellen durch
Ausbildung von Mikrovilli und Zellfortsätzen nachweisbar.
2. In immundefizienten NOD/SCID Mäusen wurden Leberschadensmodelle induziert: akuter,
chemisch induzierter Leberschaden, chronischer Leberschaden durch Futterdiät und akuter
Leberschaden durch partielle Hepatektomie. Die Leberschadensmodelle dienten zur Prüfung des
Regenerations- und Differenzierungspotenzials und der Funktionalität von Stammzellen in vivo. Die
Transplantationseffizienz der Stammzellen in den Leberschadensmodellen wurde anhand des
Nachweises von humanen Zellen nach Leberschaden im Vergleich zu Zellen in Tieren ohne
Leberschädigung beurteilt. Die Modelle von akuten Leberschäden, chemisch und chirurgisch
Z u s a m m e n f a s s u n g 4
hervorgerufen, scheinen in Verbindung mit verstärkenden Zytokinen wie HGF oder
proliferationshemmenden Mitteln wie Monocrotalin für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation
geeignet zu sein. Die Frequenz an engrafteten humanen Zellen in den hämatopoetischen Organen
wie Knochenmark und Milz war nach Stammzelltransplantation moderat bis hoch. In der Leber
hingegen war das Engraftment niedrig und wurde nur geringfügig durch den Leberschaden erhöht.
3. Zur Differenzierungsinduktion von humanen embryonalen Stammzellen wurde die Wirkung von
hepatisch konditioniertem Medium und Kokultur mit AML12-Hepatozyten in vitro untersucht. Die
Kultivierung der embryonalen SA002-Stammzellen mit hepatisch konditioniertem Medium bewirkte
eine deutliche Veränderung des morphologischen Erscheinungsbildes. Unterschiedliche Zelltypen mit
zellulären Differenzierungsmerkmalen wie Mikrovilli, Gap Junction und granulare Strukturen wurden
nachgewiesen. Die SA002 Stammzellen in Kokultur zeigten eine ähnliche morphologische
Veränderung, die der im konditionierten Medium ähnlich war. Zusätzlich traten gehäuft Zellen mit
einer polygonalen Form auf. Das Genexpressionsprofil beider Proben ergab eine deutliche Zunahme
der endodermalen Marker wie AFP und Albumin und eine Reduktion von FOXA2, SOX17, E-Cadherin
und Connexin 32. Ein Vorteil der Kokultur im Vergleich zum konditionierten Medium ist die
Entstehung von verschiedenen Zelltypen, was ein Anzeichen für eine höhere
Differenzierungsinduktion ist.
4. Die humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 wurden s.c. in immundefiziente Mäuse
transplantiert. Die Pluripotenz wurde durch Entstehung von Teratomen und der Ausbildung der drei
Keimblattstrukturen beurteilt und die spontane Differenzierung bewertet. Die Teratome wurden
sowohl morphologisch mittels Histologie als auch molekularbiologisch mittels Microarray
Technologie bewertet. Morphologisch wurde eine überwiegende Ausbildung von meso- und
endodermalen Keimblattstrukturen und wenig ausgeprägt das Vorhandensein von Zellen
ectodermalen Ursprungs entdeckt. Das Genexpressionsprofil von spontan differenzierten Zellen im
Teratom wurde mit undifferenzierten hES verglichen. Es wurden Transkripte aller drei
Keimblattstrukturen nachgewiesen, jedoch traten gehäuft und mit hoher Intensität Gene der ecto-
und mesodermalen Keimblätter auf. Hier war besonders der Nachweis von neuronalen Genen von
Bedeutung.
Die Ergebnisse der Experimente der endodermalen hepatischen Differenzierungsinduktion in vitro
zeigen, dass der direkte Kontakt der adulten und embryonalen Stammzellen in Kokultur mit
Hepatozyten einen Vorteil der Differenzierungsinduktion gegenüber dem konditionierten Medium
bietet. In den hES änderte sich neben dem Anstieg von endodermalen Genen auch die Morphologie
Z u s a m m e n f a s s u n g 5
der Zellen. Jedoch wurde keine eindeutige Differenzierung in einen funktionellen Hepatozyten
erreicht. Die gewählten in vitro differenzierungsinduzierenden Bedingungen der konditionierten
Medien und der Kokultur ermöglichten den CD34
+
Zellen eine geringfügige Differenzierung in
hepatisch endodermale Zellen. In den humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 kann
durch die in vitro Systeme eine endodermal hepatische Differenzierung induziert werden. Die
gewählten in vitro Bedingungen zeigen, dass der direkte Kontakt in der Kokultur die Differenzierung
effizienter als die konditionierten Medien in den Stammzellen induzieren kann. Es besteht jedoch der
Bedarf, die bestehenden Differenzierungsprotokolle zu verbessern. Die erarbeiteten in vivo Modelle
bilden eine Grundlage zur Testung und zum Vergleich der in vitro differenzierten Zellen.
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