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[de] (orig)
Das endodermale, hepatische Differenzierungspotenzial
von adulten und embryonalen Stammzellen in vitro und in vivo
vorgelegt von
Diplom-Ingenieurin der Biotechnologie
Annika Wulf-Goldenberg
aus Berlin
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktorin der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
Berichter: Prof. Dr. R. Lauster
Berichterin: Dr. habil. I. Fichtner
Berichter: Prof. Dr. J. Kurreck
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 30. März 2010
Berlin 2010
D 83
„Siehst du, Momo“, sagte Beppo Straßenkehrer, „es ist so: Manchmal hat man eine sehr lange Straße
vor sich. Man denkt, die ist so schrecklich lang; das kann man niemals schaffen, denkt man.
Und dann fängt man an, sich zu eilen. Und man eilt sich immer mehr. Jedesmal, wenn man aufblickt,
sieht man, dass es gar nicht weniger wird, was noch vor einem liegt. Und man strengt sich noch mehr
an, man kriegt es mit der Angst, und zum Schluss ist man ganz außer Puste und kann nicht mehr. Und
die Straße liegt immer noch vor einem. So darf man es nicht machen.
Man darf nie an die ganze Straße auf einmal denken, verstehst du? Man muss nur an den nächsten
Schritt denken, dann den nächsten Atemzug, an den nächsten Besenstrich. Und immer wieder nur an
den nächsten.
Dann macht es Freude; das ist wichtig, dann macht man seine Sache gut. Und so soll es sein.
Auf einmal merkt man, dass man Schritt für Schritt die ganze Straße gemacht hat. Man hat gar nicht
gemerkt wie, und man ist nicht außer Puste. Das ist wichtig.“
Michael Ende, aus „Momo“
Für meine Eltern, weil ihr mich gelehrt habt, meine Straße mit Mut und Zuversicht zu gehen.
Z u s a m m e n f a s s u n g 3
I. Zusammenfassung
In der regenerativen Medizin besteht die Hoffnung, pluripotente embryonale und multipotente
adulte Stammzellen für zellbasierte Therapien zu verwenden. Stammzellen, die in Hepatozyten
differenzieren, können möglicherweise als Überbrückungstherapie extrakorporal im Bioreaktor oder
durch intrahepatische Transplantation in Patienten mit akutem Leberversagen eingesetzt werden.
Das Ziel der Arbeit war der Vergleich des endodermal hepatischen Differenzierungspotenzials von
humanen pluripotenten, embryonalen Stammzellen und multipotenten, adulten CD34
+
Stammzellen
aus Nabelschnurblut unter identischen differenzierungsinduzierenden Bedingungen in vitro und in
vivo. In immundefizienten Mäusen wurden unterschiedliche Leberschadensmodelle der Maus
etabliert, um das Engraftment, die Organverteilung und das hepatische Differenzierungs- und
Regenerationspotenzial von humanen Stammzellen nach in vivo Transplantation zu bestimmen.
Mittels Gen- und Proteinexpression und zellulären Strukturen sollten essentielle Schritte der in vitro
und in vivo Differenzierung identifiziert werden.
Im Einzelnen wurden folgende Ergebnisse erhalten:
1. Durch Zytokine, hepatisch konditioniertes AML12- und HepG2-Medium und Kokultur mit AML12-
Hepatozyten wurde die hepatische Differenzierung in CD34
+
Zellen in vitro geprüft. Die Analyse der
Genexpressionen der unterschiedlich kultivierten CD34
+
Zellen ergab ein vergleichbares
Genexpressionsprofil. Die Expression von Cytokeratin 19 und E-Cadherin stieg unter den
Kultivierungsbedingungen stark an. Die endodermalen Gene wurden schwach exprimiert: GATA4,
GJB1, KRT8, HNF4A, CEBPA und AFP. Unverändert blieb die Expression von SOX17, FOXA2, ALB und
KRT18. Weder die von AML12- und HepG2 Zellen ins konditionierte Medium sekretierten löslichen
Faktoren noch der direkte Kontakt in Kokultur induzierten die Differenzierung der adulten
Stammzellen in einen hepatischen Phänotyp. Nach Kokultivierung waren jedoch partiell
morphologische Zellveränderungen und Differenzierungsmerkmale bei den Stammzellen durch
Ausbildung von Mikrovilli und Zellfortsätzen nachweisbar.
2. In immundefizienten NOD/SCID Mäusen wurden Leberschadensmodelle induziert: akuter,
chemisch induzierter Leberschaden, chronischer Leberschaden durch Futterdiät und akuter
Leberschaden durch partielle Hepatektomie. Die Leberschadensmodelle dienten zur Prüfung des
Regenerations- und Differenzierungspotenzials und der Funktionalität von Stammzellen in vivo. Die
Transplantationseffizienz der Stammzellen in den Leberschadensmodellen wurde anhand des
Nachweises von humanen Zellen nach Leberschaden im Vergleich zu Zellen in Tieren ohne
Leberschädigung beurteilt. Die Modelle von akuten Leberschäden, chemisch und chirurgisch
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Z u s a m m e n f a s s u n g 4
hervorgerufen, scheinen in Verbindung mit verstärkenden Zytokinen wie HGF oder
proliferationshemmenden Mitteln wie Monocrotalin für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation
geeignet zu sein. Die Frequenz an engrafteten humanen Zellen in den hämatopoetischen Organen
wie Knochenmark und Milz war nach Stammzelltransplantation moderat bis hoch. In der Leber
hingegen war das Engraftment niedrig und wurde nur geringfügig durch den Leberschaden erhöht.
3. Zur Differenzierungsinduktion von humanen embryonalen Stammzellen wurde die Wirkung von
hepatisch konditioniertem Medium und Kokultur mit AML12-Hepatozyten in vitro untersucht. Die
Kultivierung der embryonalen SA002-Stammzellen mit hepatisch konditioniertem Medium bewirkte
eine deutliche Veränderung des morphologischen Erscheinungsbildes. Unterschiedliche Zelltypen mit
zellulären Differenzierungsmerkmalen wie Mikrovilli, Gap Junction und granulare Strukturen wurden
nachgewiesen. Die SA002 Stammzellen in Kokultur zeigten eine ähnliche morphologische
Veränderung, die der im konditionierten Medium ähnlich war. Zusätzlich traten gehäuft Zellen mit
einer polygonalen Form auf. Das Genexpressionsprofil beider Proben ergab eine deutliche Zunahme
der endodermalen Marker wie AFP und Albumin und eine Reduktion von FOXA2, SOX17, E-Cadherin
und Connexin 32. Ein Vorteil der Kokultur im Vergleich zum konditionierten Medium ist die
Entstehung von verschiedenen Zelltypen, was ein Anzeichen für eine höhere
Differenzierungsinduktion ist.
4. Die humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 wurden s.c. in immundefiziente Mäuse
transplantiert. Die Pluripotenz wurde durch Entstehung von Teratomen und der Ausbildung der drei
Keimblattstrukturen beurteilt und die spontane Differenzierung bewertet. Die Teratome wurden
sowohl morphologisch mittels Histologie als auch molekularbiologisch mittels Microarray
Technologie bewertet. Morphologisch wurde eine überwiegende Ausbildung von meso- und
endodermalen Keimblattstrukturen und wenig ausgeprägt das Vorhandensein von Zellen
ectodermalen Ursprungs entdeckt. Das Genexpressionsprofil von spontan differenzierten Zellen im
Teratom wurde mit undifferenzierten hES verglichen. Es wurden Transkripte aller drei
Keimblattstrukturen nachgewiesen, jedoch traten gehäuft und mit hoher Intensität Gene der ecto-
und mesodermalen Keimblätter auf. Hier war besonders der Nachweis von neuronalen Genen von
Bedeutung.
Die Ergebnisse der Experimente der endodermalen hepatischen Differenzierungsinduktion in vitro
zeigen, dass der direkte Kontakt der adulten und embryonalen Stammzellen in Kokultur mit
Hepatozyten einen Vorteil der Differenzierungsinduktion gegenüber dem konditionierten Medium
bietet. In den hES änderte sich neben dem Anstieg von endodermalen Genen auch die Morphologie
Z u s a m m e n f a s s u n g 5
der Zellen. Jedoch wurde keine eindeutige Differenzierung in einen funktionellen Hepatozyten
erreicht. Die gewählten in vitro differenzierungsinduzierenden Bedingungen der konditionierten
Medien und der Kokultur ermöglichten den CD34
+
Zellen eine geringfügige Differenzierung in
hepatisch endodermale Zellen. In den humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 kann
durch die in vitro Systeme eine endodermal hepatische Differenzierung induziert werden. Die
gewählten in vitro Bedingungen zeigen, dass der direkte Kontakt in der Kokultur die Differenzierung
effizienter als die konditionierten Medien in den Stammzellen induzieren kann. Es besteht jedoch der
Bedarf, die bestehenden Differenzierungsprotokolle zu verbessern. Die erarbeiteten in vivo Modelle
bilden eine Grundlage zur Testung und zum Vergleich der in vitro differenzierten Zellen.
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A b s t r a c t 6
II. Abstract
There is hope for the clinical use of pluripotent embryonic and multipotent adult stem cells as cell-
based therapies in regenerative medicine. Hepatocytes derived stem cells could be utilized
extracorporal in bioreactors as bypass therapy, or through intrahepatic transplantation of patients
with acute liver failure.
The aim of the study was to compare the endodermal hepatic differentiation potential of human
pluripotent embryonic stem cells with multipotent adult CD34
+
stem cells derived from cord blood
under identical differentiation induced conditions in vitro and in vivo. Different liver injury models
were established in immunodeficient mice for determining the engraftment, organ distribution and
hepatic differentiation and regeneration potential of human stem cells after in vivo transplantation.
Crucial events of the endodermal differentiation process should be evaluated in vitro and in vivo by
gene and protein expression, and cellular structural analysis.
Following results were achieved:
1. Cytokines, hepatic conditioned AML12 and HepG2 media and coculture with AML12-hepatocytes
were applied for studying the hepatic differentiation of CD34
+
cells in vitro. The gene expression
analysis of the variously cultivated CD34
+
cells resulted in a similar profile. The expression of
cytokeratin 19 and E-cadherin increased while endodermal genes as GATA4, GJB1, KRT8, HNF4A,
CEBPA und AFP were expressed weakly. No change of gene expression was determined for SOX17,
FOXA2, ALB and KRT18. Differentiation of adult stem cells with a hepatic phenotype was neither
induced by secreted factors of AML12- and HepG2 cells into the conditioned media nor by direct
contact in coculture. Morphological cell changes and differentiation features were partially
detectable by formation of microvilli and cell appendage after cocultivation.
2. Futhermore, liver injury models were induced in immunodeficient mice: acute chemical induced
liver injury, chronic liver injury due to diet and acute liver injury due to partial hepatectomy. The liver
injury models acted for determination of the regenerative and differential potential of stem cells in
vivo. The transplantation efficiency of applied stem cells in liver injury models was estimated by the
detection of human cells after injury compared to the number of human cells in murine organs
without injury. The established models of acute liver injury, chemically or surgically induced, seemed
to be suitable for successful stem cell transplantation in combination with cumulative cytokines as
HGF or proliferation inhibitor monocrotaline. After stem cell transplantation the frequency of
engrafted human cells was moderate to high in hematopoietic organs as bone marrow and spleen.
The engraftment was low in the liver and was only slightly raised up by liver injury.
A b s t r a c t 7
3. The effect of hepatic conditioned media and coculture with AML12 hepatocytes was examined on
the differentiation induction of human embryonic stem cells in vitro. Hepatic conditioned media
caused a morphological change of the embryonic SA002 stem cells. Different cell types were
detected with cellular differentiation characteristics as microvilli, gap junctions and granular
structures. SA002 stem cells in coculture showed a morphological change which looked similar to the
change in the conditioned media. In addition, cells with a polygonal shape were observed. The gene
expression profile of both sets revealed a significant increase of endodermal marker such as AFP and
albumin and a reduction of FOXA2, SOX17, E-cadherin and connexin 32. The coculture was
advantageous over the conditioned media since it induced the formation of many cell types which
suggests a higher differentiation induction.
4. Human embryonic stem cells SA002 were transplanted s.c into immunodeficient mice.
Pluripotency was assessed by appearance of teratomas and formation of the three germ layers.
Furthermore, spontaneous differentiation was evaluated. Teratomas were estimated
morphologically using histology and on the molecular level using Bead Array technology.
Mesodermal and endodermal germ layer structures were detected predominantly, whereas cells
from the ectodermal germ layer could only rarely be found. Gene expression of spontaneously
differentiated cells in the teratoma was compared with undifferentiated hESC. Transcripts of all three
germ layers were discovered, but genes of the ectodermal and mesodermal germ layer appeared
cumulative, especially neuronal genes.
In conclusion, both the direct contact of the coculture and the conditioned hepatic media can induce
an endodermal hepatic differentiation into human embryonic stem cells with increased levels of
gene expression of endodermal genes and morphological changes. However, a well-defined
differentiation into functional hepatocytes was not observed. The culture conditions induced slightly
the differentiation of CD34
+
cells into hepatic endodermal cells. The direct contact of adult and
embryonic stem cells with hepatocytes in coculture seems to have an advantage compared to the
conditioned media by inducing different cell types. There are needs for improving the existing
differentiation protocols. The established in vivo models provide a basis for testing and comparing in
vitro differentiated cells.
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I n h a l t s v e r z e i c h n i s 8
III. Inhaltsverzeichnis
I Zusammenfassung ........................................................................................................................... 3
II Abstract ........................................................................................................................................... 6
III Inhaltsverzeichnis ............................................................................................................................ 8
1 Einleitung ........................................................................................................................... 11
1.1 Übersicht über verschiedene Stammzelltypen und ihre Eigenschaften ............................... 11
1.2 Eigenschaften von embryonalen und adulten Stammzellen mit Fokus auf ihr hepatisches
Differenzierungspotenzial ..................................................................................................... 13
1.2.3 Mechanismen und Strategien zur Differenzierungsinduktion von Stammzellen ......... 18
1.2.4 Experimentelle Tiermodelle zur Prüfung der Qualität und des
Differenzierungspotenzials von Stammzellen ............................................................... 22
1.3 Stammzelltechnologie als Perspektive für die klinische Anwendung ................................... 24
1.4 Ziele ....................................................................................................................................... 26
2 Material und Methoden ...................................................................................................... 27
2.1 Zellbiologische Methoden ..................................................................................................... 27
2.1.1 Verwendete Zellen ........................................................................................................ 27
2.1.2 Isolierung humaner CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut ..................................... 27
2.1.3 Einfrieren und Auftauen von CD34
+
Zellen .................................................................... 28
2.1.4 Beschichtung der Zellkulturplatten mit Matrigel oder Gelatine ................................... 28
2.1.5 Kultivierung der humanen embryonalen Stammzelllinie SA002 ................................... 28
2.1.6 Kultivierung der murinen Hepatozytenzelllinie AML12 ................................................ 29
2.1.7 Kultivierung der humanen Hepatokarzinomzelllinie HepG2 ......................................... 30
2.1.8 Kultivierung der CD34
+
Zellen in serumfreiem Medium mit Zytokinen zur
Differenzierungsinduktion ............................................................................................. 30
2.1.9 Herstellung von hepatisch konditionierten Medien der HepG2 und AML12 Zellen zur
Zelldifferenzierung ......................................................................................................... 31
2.1.10 Differenzierungsansatz der CD34
+
Zell-Kultivierung mit hepatisch konditioniertem
Medium ......................................................................................................................... 31
2.1.11 Kultivierung der embryonalen Stammzelllinie SA002 mit hepatisch konditioniertem
Medium zur Differenzierungsinduktion ........................................................................ 31
2.1.12 Hepatische Differenzierungsinduktion der CD34
+
Stammzellen durch Kokultivierung
mit AML12-Zellen .......................................................................................................... 32
2.1.13 SA002 Zellen in Kokultur mit murinen AML12-Hepatozyten zur hepatischen
Differenzierungsinduktion ............................................................................................. 32
2.2 Tierexperimentelle Methoden .............................................................................................. 33
I n h a l t s v e r z e i c h n i s 9
2.2.1 Verwendete Mäusestämme .......................................................................................... 33
2.2.2 Etablierung von Leberschadensmodellen in immundefizienten Mäusen ..................... 33
2.2.3 Transplantation von Stammzellen in immundefiziente Mäuse .................................... 35
2.2.4 Explantation von murinen Organen und Gewinnung von Zellsuspensionen ................ 37
2.3 Immunologische Methoden .................................................................................................. 37
2.3.1 Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie ...................... 37
2.3.2 Analyse der Zellzyklus-Phasenverteilung ...................................................................... 37
2.3.3 Immunzytochemischer Nachweis von Pluripotenzmarkern auf humanen embryonalen
Stammzellen .................................................................................................................. 38
2.3.4 Immunhistologischer Nachweis von humane Zellen in xenogenen Tumoren .............. 38
2.3.5 Immunfluorenz humaner Zellen in muriner Leber ........................................................ 39
2.3.6 Pathohistologische Untersuchung von Teratomen ....................................................... 39
2.3.7 Serumanalyse ................................................................................................................ 39
2.3.8 Karayotyp-Analyse der SA002-Stammzelllinie .............................................................. 39
2.4 Molekularbiologische Methoden .......................................................................................... 39
2.4.1 RNA-Isolierung ............................................................................................................... 39
2.4.2 Analyse des Expressionsprofils mittels quantitativer Real-Time PCR ........................... 40
2.4.3 Microarray basierte Expressionsprofilanalyse .............................................................. 41
2.4.4 DNA-Isolierung .............................................................................................................. 42
2.4.5 Nachweis menschlicher DNA im Mausgewebe mittels humanspezifischer PCR .......... 42
2.4.6 Quantitative Bestimmung humaner DNA im Mausgewebe und -blut mittels
quantitativer RT-PCR ..................................................................................................... 42
2.4.7 DNA-Genotyping der immundefizienten NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse ........................... 43
2.5 Elektronenmikroskopische Untersuchung ............................................................................ 44
2.6 Dye Transfer zur Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkung ............................................. 44
2.7 Video Imaging ........................................................................................................................ 45
2.8 Statistische Auswertung ........................................................................................................ 45
3 Ergebnisse .......................................................................................................................... 46
3.1 In vitro Charakterisierung und Differenzierungsinduktion von CD34
+
Zellen ....................... 46
3.1.1 Charakterisierung undifferenzierter, nicht-kultivierter CD34
+
Stammzellen ................ 46
3.1.2 In vitro Differenzierungsinduktion von CD34
+
Stammzellen ......................................... 48
3.2 In vivo Differenzierung von CD34
+
Stammzellen in immundefizienten Mäusen .................. 62
3.2.1 Etablierung und Standardisierung von immundefizienten Mausmodellen .................. 62
3.2.2 Systemische CD34
+
Stammzell-Applikation in adulte immundefiziente Mäuse als nicht-
gerichtete Transplantation ............................................................................................ 65
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I n h a l t s v e r z e i c h n i s 10
3.2.3 Evaluierung der gezielten, organspezifischen Transplantation von CD34
+
Stammzellen
in die Leber von NOD/SCID Mäusen .............................................................................. 68
3.2.4 Etablierung und Charakterisierung von Mausmodellen mit Leberschaden in
immundefizienten Mäusen ........................................................................................... 75
3.2.5 Transplantation von undifferenzierten CD34
+
adulten Stammzellen in Mausmodelle
mit Leberschaden .......................................................................................................... 81
3.3 Untersuchungen an humanen embryonalen Stammzellen in vitro und in vivo .................... 87
3.3.1 Charakterisierung von undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen ......... 87
3.3.2 In vitro Differenzierungsinduktion von humanen embryonalen Stammzellen ............. 90
3.4 In vivo Differenzierung und Bewertung der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen .... 94
3.4.1 In vivo Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen ................................. 94
3.4.2 In vivo Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen .............................. 96
3.4.3 Transplantation von 3D kultivierten SA002 Zellen ...................................................... 103
4 Diskussion ......................................................................................................................... 104
4.1 In vitro Differenzierungspotenzial von adulten und embryonalen Stammzellen ............... 104
4.1.1 Endodermales Differenzierungspotenzial von CD34
+
Stammzellen in vitro ............... 104
4.1.2 Endodermales Differenzierungspotenzial von humanen embryonalen Stammzellen in
vitro .............................................................................................................................. 108
4.2 In vivo Differenzierungspotenzial von adulten und embryonalen Stammzellen ................ 110
4.2.1 Systemische Applikation von CD34
+
Zellen in adulte immundefiziente Mäuse .......... 110
4.2.2 Organspezifische Transplantation von CD34
+
Zellen in immundefizienten Mäusen .. 112
4.2.3 Pluripotenz und Keimblattstrukturen von embryonalen Stammzellen nach
Transplantation in Mäuse ............................................................................................ 117
4.2.4 Präklinische Leberschadensmodelle in immundefizienten Mäusen zur Prüfung des
hepatischen Differenzierungs- und Regenerationspotenzials von Stammzellen ....... 120
4.3 Ausblick................................................................................................................................ 126
5 Referenzen ........................................................................................................................ 129
IV Anhang ............................................................................................................................................ 135
V Abkürzungsverzeichnis ..................................................................................................................... 142
VI Publikationsliste .............................................................................................................................. 144
VII Danksagung .................................................................................................................................... 146
Einleitung 11
1 Einleitung
1.1 Übersicht über verschiedene Stammzelltypen und ihre Eigenschaften
Stammzellen werden anhand von zwei Kriterien definiert (Verfaillie et al., 2002): die Fähigkeit zur
Selbsterneuerung und das Potenzial sich in verschiedene Zelltypen zu entwickeln. Abhängig vom
ontogenetischen Alter unterscheidet man zwei Stammzelltypen: embryonale und adulte
Stammzellen mit verschiedenartigem Differenzierungspotenzial der Toti-, Pluri-, Multi- oder
Unipotenz (siehe Abbildung 1).
Abbildung 1 Stammzelltypen mit ihrem Differenzierungspotenzial
Eine einzelne totipotente Stammzelle besitzt ein uneingeschränktes Differenzierungspotenzial und
die Fähigkeit, sich zu einem vollständigen Organismus zu entwickeln. Pluripotente Stammzellen
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Einleitung 12
können sich ebenfalls unbegrenzt teilen, jedoch können sie nur noch differenzierte Zelltypen der drei
Keimblätter (Endoderm, Ektoderm und Mesoderm) ausbilden. Das Differenzierungspotenzial von
multipotenten Zellen ist eingeschränkt, sie können nur zu einer begrenzten Anzahl von
gewebespezifischen Zelltypen ausdifferenzieren.
Die drei sog. Keimblätter sind das Endoderm, Mesoderm und Ektoderm, die sich zu Beginn der
Entwicklung eines Embryos herausbilden und aus denen sich verschiedene Gewebe bzw. Organe
ableiten. Organe des Endoderms sind: Darm, Magen, Leber und Lunge; des Mesoderms: Blutzellen,
Milz, Knochen, Knorpelgewebe, Skelett-, Darm und Herzmuskulatur und des Ektoderms: alle
Sinnesorgane, Bauchspeicheldrüse, Bronchien und Epidermis.
Die einzigen totipotenten Zellen sind die Zygote und die ersten paar daraus entstehenden Zellen (z.B.
4-Zell-Stadium). Embryonale Stammzellen können aus der inneren Zellmasse der Blastozyste isoliert
werden, die nur noch pluripotent sind. Die ersten Techniken zur Kultivierung von murinen
embryonalen Stammzellen (mES) veröffentlichte Evans et al. 1981. 1994 konnte Bongso et al.
humane embryonale Stammzellen aus der Blastozyste isolieren und 1998 wurde die erste
Stammzelllinie von Thomson et al. etabliert. Die meisten Zelllinien, die zurzeit für die Forschung
genutzt werden, wurden aus überschüssigen Embryonen im Rahmen von in vitro Fertilisationen
isoliert. Im voranschreitenden Differenzierungsprozess der pluripotenten Zellen bilden sich
spezialisierte Zellen der drei Keimblätter, die Vorläuferzellen für unterschiedlich, differenzierte
Zelltypen darstellen.
Adulte Stammzellen (unipotente und multipotente Stammzellen) findet man in den meisten
Organen Erwachsener, in denen sie normalerweise abgestorbene oder beschädigte Zellen ersetzen.
Adulte Stammzellen wurden vor allem aus dem Knochenmark, der Haut und dem Dünndarm, aber
auch aus der Lunge, Endothel, Herzmuskulatur, Leber, Gehirn und Pankreas gewonnen. Die
hämatopoetischen (blutbildenden) Stammzellen sind die am besten charakterisierten und
untersuchten Stammzellen und werden routinemäßig in der Klinik eingesetzt. Sie werden aus dem
peripheren Blut, Knochenmark und Nabelschnurblut gewonnen und besitzen in vitro und in vivo ein
linienspezifisches Differenzierungspotenzial in Zellen des blutbildenden Systems. Mesenchymale
Stammzellen sind bindegewebige Vorläuferzellen, die sich als Bestandteile des
Knochenmarkstromas, Fettgewebes oder der Nabelschnur isolieren lassen. Sie können beispielsweise
in Gewebezellen wie Knochen-, Knorpel-, Sehnen-, Skelettmuskel- und Herzmuskelzellen
differenzieren. Stammzellen aus der Leber, Ovalzellen genannt, sind im Bereich der Heringschen
Kanäle lokalisiert und können sowohl zu Hepatozyten als auch Cholangiozyten
(Gallengangsepithelzellen) differenzieren. Schwere Leberschädigungen stimulieren die Proliferation
von Ovalzellen, die dann zur Leberregeneration beitragen.
Einleitung 13
1.2 Eigenschaften von embryonalen und adulten Stammzellen mit Fokus
auf ihr hepatisches Differenzierungspotenzial
1.2.1 Embryonale Stammzellen
Die Kultivierung von undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen (hES) wurde in
Anlehnung an die murinen embryonalen Stammzellen (mES) auf inaktiverten Mausfibroblasten in
speziellem Medium unter Zusatz von basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF) erreicht. Um
die mögliche Kontamination der hES mit tierischen Bestandteilen zu umgehen, wurden die
Kultivierungsbedingungen weiterentwickelt und hES feederfrei (Braam et al., 2008) oder auf
humanen Feederzellen kultiviert (Amit et al., 2003). Die undifferenzierten hES zeichnen sich
morphologisch durch eine flache, kompakte Kolonieform mit einem scharf abgegrenzten Rand und
einem hohen Zellkern-zu-Plasma-Verhältnis aus. Sie besitzen eine hohe Proliferations- und
Telomeraseaktivität. Auf ultrastruktureller Ebene zeichnen sie sich ebenso durch ein großes Kern-zu-
Plasma-Verhältnis und elektronendurchlässiges Zytoplasma mit wenigen Organellen aus (Ullmann et
al., 2006). Wenn die Feederzellen entzogen werden oder suboptimale Kultivierungsbedingungen
bestehen, beginnen die hES spontan in verschiedene Zelltypen unterschiedlicher Keimblätter zu
differenzieren. In vitro wurden Zellen mit unterschiedlicher Morphologie wie schlagende
Kardiomyozyten, pigmentierte Epithelzellen, neuronale Zellen mit Axonen und Dendriten und Zellen
mit mesenchymalen Eigenschaften beobachtet (Odorico et al., 2001).
Pluripotente embryonale Stammzellen exprimieren ein Set von charakteristischen Markern. Murine
und humane ES unterscheiden sich in der Expression dieser Marker (Rao et al., 2004). ES von beiden
Spezies exprimieren Oct3/4, Nanog, und Rex-1 und haben eine hohe alkalische Phosphataseaktivität
und Telomeraseaktivität (Rao et al., 2004; Adewumi et al., 2007). Humane ES exprimieren
ausschließlich die Oberflächenmarker Tra-1-60, Tra-1-81 und SSEA-3 und SSEA-4, wohingegen mES
nur SSEA-1 exprimieren (Thomson et al., 1998). Humane ES haben überwiegend einen normalen
Karyotyp und behalten auch nach langer Kultivierung ihr Differenzierungspotenzial (Amit et al.,
2000). Als weiteres Charakteristikum von undifferenzierten ES und als funktioneller
Pluripotenzmarker gilt die Teratombildung in vivo (Reubinoff et al., 2000). In diesen Teratomen zeigt
die Anwesenheit von Zellen aus allen drei Keimblättern die Pluripotenz.
Um die Differenzierung von embryonalen Stammzellen zu einem gewünschten Zelltyp zu lenken,
bestehen zwei verschiedene Vorgehensweisen: die gerichtete Differenzierung oder die spontane,
ungerichtete Differenzierung aus einer Mischung verschiedener Zellen unterschiedlichen
Keimblatttyps. Die spontane Differenzierung wird durch die „Embryoid Body“ Bildung erreicht, die
Zellen anschließend separiert und adhärent wachsen gelassen. Die Selektion bzw. Anreicherung von
Advertisement
Einleitung 14
differenzierten Zellen ist schwierig, denn oft existieren keine spezifischen Marker, um eine
homogene Population zu erhalten.
Die gerichtete Differenzierung in Zellen des gewünschten Zelltyps wird durch definierte Wachstums-
und Differenzierungsfaktoren, extrazellulären Matrixkomponenten oder indirekt durch Feederzellen
induziert, mit dem Ziel die gesamte Zellpopulation in Richtung des gewünschten Zelltyps zu
differenzieren (Schuldiner et al., 2000). Vor allem für die embryonalen Stammzellen ist die zeitliche
Abfolge und die Konzentrationen wichtig, um die Differenzierung zu kontrollieren.
Die ersten Publikationen zur hepatischen Differenzierung von hES beschreiben die Induktion von
Embryoid Bodies und anschließend adhärenter Kultur unter Zugabe von löslichen Wachstums- und
Differenzierungsfaktoren, um die hepatischen Zellen anzureichern (Lavon et al., 2004; Schwartz et al.,
2005). Es wurde jedoch nur eine geringe Anzahl an hepatischen Zellen gefunden. Einen Erfolg erzielte
man durch die Imitation der Leberentwicklung und der Differenzierung von hES ins definitive
Endoderm (Cai et al., 2007; Agarwal et al., 2008). Vorwiegend wurden hohe Konzentrationen von
ActivinA und geringe Serumanteile zur hES-Kultur gegeben. Anschließend wurden die Zellen
sequentiell mit FGFs, BMPs, HGF und Oncostatin M behandelt. Es wurde ein Anteil von 50%
hepatischen Zellen induziert (Cai et al., 2007; Agarwal et al., 2008). Murine ES konnten nicht nur
durch lösliche Faktoren erfolgreich in reife Hepatozyten differenziert werden (Li et al., 2010),
sondern auch in Kokultur mit fetalen Stromazellen (Fukumitsu et al., 2009). Die Kokultur oder
konditioniertes Medium sind weitere Möglichkeiten der Differenzierungsinduktion von Stammzellen.
In der Kokultur von hES mit fetalen Hepatozyten bildeten sich unter anderem erythroide Zellen,
weitere Differenzierungswege wurden nicht untersucht (Qiu et al., 2008). Auch bei der Kultivierung
von hES mit HepG2 konditioniertem Medium wurde das Augenmerk auf die Bildung mesodermaler
Zellen und hämatopoetische Progenitorzellen gelegt (Lu et al., 2009). Bislang noch nicht näher
beschrieben, ist die Kultivierung von hES mit hepatisch-konditioniertem Medium oder in Kokultur mit
Hepatozyten zur endodermalen Differenzierungsinduktion von hES.
Unter in vivo und in vitro Bedingungen konnten schon eine Vielzahl von Zelltypen aus Stammzellen
isoliert werden. Nicht nur spontane Differenzierung in Embryoid Bodies und Teratomen fand statt,
sondern auch die gerichtete Differenzierung in Kardiomyozyten, Leberzellen, hämatopoetischen
Zellen, Endothelzellen, neuronalen Zellen und Bauchspeicheldrüsenzellen.
Eine anknüpfende Frage ist, ob die Funktion einer verletzten Leber durch Transplantation von hES
verbessert werden kann. Jedoch ist die Bildung von Teratomen ein Problem, wenn ES-Linien als
Quelle der Hepatozytendifferenzierung genutzt werden. Bislang konnte nach der Selektion von
Albumin-positiven Zellen aus Teratomen keine weitere Teratombildung nach Transplantation von
Einleitung 15
Albumin-positiven Zellen in lebergeschädigte Mäuse gefunden werden (Yamamoto et al., 2003). Auch
die Eliminierung von undifferenzierten Zellen konnte zu einem tumorfreien Verlauf und Auffinden
von Hepatozyten in der Mausleber führen (Kumashiro et al., 2005). Transplantationen von
endodermal vordifferenzierten hES in lebergeschädigte Mäusen wurden bislang nur einmal
beschrieben (Agarwal et al., 2008) und eine sporadische Anwesenheit von integrierten Zellen
nachgewiesen.
1.2.2 Adulte hämatopoetische Stammzellen
Adulte hämatopoetische Stammzellen sind phänotypisch charakterisiert durch die Expression von
Oberflächenantigenen wie CD34, CD38 oder CD133 und funktionell anhand von Kulturassays oder
Tierversuchen. Schon 1984 wurde das glykolisierte Transmembranprotein CD34 Antigen als
stammzellassoziiertes Oberflächenmolekül beschrieben (Civin et al., 1984). Ein dem CD34 ähnliches
Expressionsmuster auf hämatopoetischen Stammzellen zeigt das CD133 Antigen (Kobari et al., 2001).
Neben dem CD34 und CD133 Antigen exprimieren Stammzellen weitere differenzierungsabhängige
Oberflächenmoleküle. Dazu gehören unter anderem das CD38 und das HLA-DR Antigen. Diese
Marker werden von sehr frühen hämatopoetischen Stammzellen nur sehr schwach exprimiert und
verstärken sich mit zunehmender Liniendifferenzierung (Petzer et al., 1996).
Im Nabelschnurblut sind bis zu 0,5-1% der mononuklearen Zellen hämatopoetische CD34+ Zellen
(Gluckman et al., 1989). Im Vergleich dazu sind im Knochenmark 1-3% und im peripheren Blut 0,01-
0,3% vom CD34 Phänotyp. Isolierte hämatopoetische Stammzellen aus dem Nabelschnurblut sind die
frühsten adulten Stammzellen, weisen gegenüber Zellen aus Knochenmark oder peripheren Blut ein
höheres Expansions- und Differenzierungspotenzial, eine höhere Lebensfähigkeit (Kakinuma et al.,
2003) und immunologische Verträglichkeit auf. Intensiv wird diskutiert, wie wandlungsfähig
hämatopoetische Stammzellen aus dem Nabelschnurblut sind, ob eine Transdifferenzierung vom
mesodermalen Keimblatt in ein anderes Keimblatt möglich ist und inwiefern sie pluripotenten
Stammzellen ähneln. Aktuell herrscht der Eindruck, dass Nabelschnurblutstammzellen sehr breit
anwendbar sind, in verschiedene Zelltypen differenzieren können und sie verändert werden können.
In Bezug auf ihr Differenzierungspotenzial scheinen sie gegenüber pluripotenten, embryonalen
Stammzellen im Nachteil zu sein, jedoch macht die leichte Entnahme und ethische Unbedenklichkeit
die Nabelschnurblutstammzellen interessant.
Durch das begrenzte Volumen der Nabelschnurpräparate ist der klinische Einsatz von
Nabelschnurblutzellen eingeschränkt und ein vornehmliches Ziel ist die Vermehrung der
Stammzellen. Dabei wurden zwei verschiedene experimentelle Strategien zur in vitro Expansion
angewendet: Kultivierung der HSC mit Zytokinen oder Kultur von HSC mit Feederzellen. Die
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Einleitung 16
Interleukine IL-1, IL-3, IL-6 sowie der Granulozyten-Kolonie-Stimulationsfaktor (G-CSF) und
Erythropoetin (EPO) sind einige Zytokine, die für eine ex vivo Expansion angewendet wurden, als
essentiell erwies sich der Stammzellfaktor (SCF) (Heike et al., 2002). SCF beeinflusst eine Vielzahl von
Parametern, die auf die Proliferation, Adhäsion und andere Funktionen wirken (Ashman, 1999).
Neben der zusätzlichen externen Zytokinsupplementierung der Zellen können auch Feederzellen die
notwendigen Zytokine für die HSC zur Verfügung stellen. Eine Kombination aus inaktivierten
Stromazellen und einem Wachstumscocktail aus SCF, IL-3, IL-6, G-CSF und EPO induzierte die
höchsten Expansionsraten von CD34+ Zellen (Madkaikar et al., 2007).
Der Aspekt der Stammzellplastizität ist in Verbindung mit dem klinischen Einsatz von
hämatopoetischen Stammzellen in der regenerativen Medizin von Bedeutsamkeit. Dabei stellt sich
die Frage, ob die multipotenten hämatopoetischen Stammzellen in der Lage sind unter
physiologischen Bedingungen in nicht-hämatopoetische Zelltypen zu differenzieren bzw. zu
transdifferenzieren. In diesem Zusammenhang konnte in einer Reihe von wissenschaftlichen Arbeiten
gezeigt werden, dass hämatopoetische Stammzellen über ihr blutbildendes Potenzial hinaus in
Hepatozyten, Kardiomyozyten, Endothelzellen oder Zellen des Nervensystems differenzieren können
(Krause et al., 2001). Unterschiedliche Mechanismen und Prozesse werden als Ursache für die in vitro
/ in vivo Resultate diskutiert: Transdifferenzierung, Stressfaktoren, Zellfusion, Dedifferenzierung und
epigenetische Reprogrammierung.
Die Bestimmung der Plastizität hämatopoetischer Stammzellen beruht hauptsächlich auf der
Untersuchung von Zellen aus dem murinen und humanen Knochenmark. Erst in den letzten Jahren
konnte die endodermale Kompetenz von Nabelschnurblutstammzellen nachgewiesen werden. Die
meisten Protokolle zur in vitro Differenzierungsinduktion von CD34+ hämatopoetischen Stammzellen
in Richtung hepatischer Differenzierung setzen Wachstumsfaktoren wie
Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF) und Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF) und Beschichtungen
wie Matrigel ein. In Nabelschnurblutstammzellen konnte durch die Kultivierung mit prohepatogenen
Faktoren die Expression von leberspezifischen Genen wie Albumin, alpha-Fetoprotein und
Cytokeratin-18 und -19 induziert werden (Hong et al., 2005). Die Kultivierung von CD34+
Nabelschnurblutstammzellen in Medium mit HGF, FGF-1, FGF-2, LIF und SCF induzierte nach drei
Wochen die Koexpression von Albumin und Cytokeratin19 in einigen Zellen (Kakinuma et al., 2003).
In hepatische Zellen differenzierten CD34+ Knochenmarkszellen nach der 28tägiger Kultivierung in
Medium mit epidermalen Wachstumsfaktor (EGF), Dexamethason, HGF, Insulin und Kälberserum und
exprimierten Albumin und CK19 RNA (Fiegel et al., 2003). Knochenmarkszellen von Ratten wurden
mit cholestatischem Serum und HGF kultiviert und Hepatozyten-ähnliche Kolonien entstanden mit
Marker für AFP, Albumin, Cytochrome P450-2b1 und HNF-3β (Cai et al., 2004). Unter in vitro
Einleitung 17
Bedingungen konnte gezeigt werden, dass HSC der Maus zu Hepatozyten mit Marker für Cytokeratin-
18, Albumin, Fibrinogen, GATA4, HNF4 und Cyp2b9 transdifferenzieren, wenn sie mit verletztem
Lebergewebe kokultiviert wurden. Da sie durch ein Transwell getrennt waren und in keinen direkten
Zell-Zell-Kontakt getreten sind, konnte in diesem Modell der Prozess der Zellfusion ausgeschlossen
werden (Jang et al., 2004).
Bei der Analyse von Genexpressionsprofilen von humanen Hepatozyten sowie von hämatopoetischen
Stammzellen wurden gemeinsame Merkmale bestimmt, die als potenzielle Erklärung für eine
endodermale Differenzierung dienen. Die Ovalzellen, die Vorläuferzellen der Leber, exprimieren
neben den typischen hepatischen Markern wie CK18, CK19, AFP und Albumin auch das für die HSC
charakteristische Oberflächenmolekül CD34 und andere Stammzellmarker wie c-kit und Thy1. Es
wurde hypothetisch geschlussfolgert, dass sich Ovalzellen aus hämatopoetischen Stammzellen unter
bestimmten Umständen entwickeln können (Fiegel et al., 2003).
Die vorgestellten Arbeiten weisen auf ein endodermales Differenzierungspotenzial hämatopoetischer
Stammzellen hin, jedoch konnten die Ergebnisse der Untersuchungen oft nicht reproduziert werden,
so dass weitere Analysen der hämatopoetischen Stammzellen notwendig sind.
In vivo wurde zunächst durch „Sex-mismatched“-Transplantationen in Ratten (Petersen et al., 1999)
und Mausmodellen (Theise et al., 2000) beobachtet, dass hämatopoetische Stammzellen in vivo zu
Hepatozyten differenzieren können, nachfolgend wurde dies auch für humane Stammzellen (Alison
et al., 2000) gezeigt. Lagasse et al. (2000) konnte ebenfalls zeigen, dass adulte hämatopoetische
Stammzellen in die Leber der Maus engrafteten und dort die reduzierte Aktivität tyrosinämischer
Hepatozyten verbesserten. Diese ersten Ergebnisse wurden mit Stammzellen aus dem Knochenmark
errungen und weitere Untersuchungen zum Differenzierungspotenzial von Stammzellen aus dem
Nabelschnurblut durchgeführt. Nach der Transplantation von Nabelschnurblutstammzellen in Scid-
Mäuse mit partieller Hepatektomie wurde humanes Albumin im Serum von transplantierten Mäusen
gefunden (Kakinuma et al, 2003). Von anderen Gruppen wurden diese Ergebnisse bestätigt (Kollet et
al., 2003; Ishikawa et al., 2003; Newsome et al., 2003; Di Campli et al., 2004). Daraus kann man
schließen, dass verletztes Lebergewebe bei der Induzierung des Transdifferenzierungsprozesses eine
wesentliche Rolle spielt. Neben diesen Publikationen gibt es Studien, die das
Transdifferenzierungspotenzial von hämatopoetischen Stammzellen in Frage stellen (Terada et al.,
2002; Ying et al., 2002). So konnten nach Knochenmarktransplantation in ein Mausmodell mit
Tyrosämie polyploide Hepatozyten detektiert werden (Wang et al., 2003). Desweiteren konnten in
einem experimentell induziertem Leberschaden im Mausmodell keine transdifferenzierten
Hepatozyten der injizierten Stammzellen in der Leber nachgewiesen werden (Kashofer et al., 2006).
Und auch nach der intravenösen Transplantation von adulten hämatopoetischen Stammzellen
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Einleitung 18
konnte keine Differenzierung in nicht-hämatopoetische Gewebetypen beobachtet werden (Wagers
et al., 2002). Statt einer Transdifferenzierung wird der Vorgang der Zellfusion vermutet, bei dem der
Zellkern der Stammzelle mit dem einer reifen liniendeterminierten Zelle verschmilzt (Vassilopoulos et
al., 2003; Wang et al., 2003). Somit bleibt die Frage nach dem Differenzierungspotenzial von
hämatopoetischen Stammzellen noch immer offen und muss durch weitere wissenschaftliche
Untersuchungen geklärt werden.
1.2.3 Mechanismen und Strategien zur Differenzierungsinduktion von Stammzellen
Die zellulären Mechanismen, die zur Entstehung von Hepatozyten aus hämatopoetischen
Stammzellen führen, sind aufgrund der diversen Resultate nicht ausreichend geklärt.
Transdifferenzierung, Fusion, epigenetische Reprogrammierung, Dedifferenzierung und
anschließende Differenzierung von Zellen sind mögliche Mechanismen (Abbildung 2). Der Prozess der
Transdifferenzierung von mesodermalen hämatopoetischen Zellen in endodermale Hepatozyten
beinhaltet den Übergang von mesenchymalen zu epithelialen Zellen. Die Transdifferenzierung von
hämatopoetischen Stammzellen zu hepatischen Zellen verändert die transkriptorische Aktivität von
hämatopoetischen und hepatischen Genen. Ein Wechsel von charakteristischen Genen des
Knochenmarks wie CD45 und der Leber wie Albumin, GATA4, Cyp2b9 und HNF4 wurde in vitro und in
vivo in murinen Fra25Lin- Knochenmarkszellen gezeigt und auf eine Transdifferenzierung
hingewiesen (Jang et al., 2004). Ebenso wurden humane Hepatozyten nach der Transplantation von
CD34+ Nabelschnurblutzellen in neugeborene NOD/SCID/beta2-microglobulin(null) Mäuse und nach
der Infusion in NOD/SCID Mäuse durch die Detektion von humanen Albumin RNA und humaner
zentromerischer DNA beobachtet (Ishikawa et al., 2003; Newsome et al., 2003). Im Gegensatz zur
Transdifferenzierung wird durch die induzierte Fusion von Hepatozyt mit HSC des Knochenmarks
eine heterokaryotypische Hybridzelle produziert, die genetische Elemente von beiden Zelltypen
aufweist (Wang et al., 2003). Die Fusion von CD34+ Nabelschnurblutzellen nach intravenöser
Transplantation in NOD/SCIDγcnull Mäuse mit murinen Hepatozyten wurde durch die gleichzeitige
Expression von murinen und humanen Hauptkompatibilitätskomplex auf humanen Albumin-
positiven Zellen gezeigt (Fujino et al., 2007). Es wurde aber auch die simultane Beobachtung der
Transdifferenzierung von Nabelschnurblutzellen in Hepatozyten von 0,3% und Fusion dieser Zellen
nach der Transplantation in NOD/SCID Mäusen von 0,9% beschrieben (Tanabe et al., 2004). Das
Entstehen einer differenzierten hepatozyten-ähnlichen Zelle mit phänotypischen, hepatischen
Merkmalen wie Albuminsekretion aus einer undifferenzierten Stammzelle wird begleitet von der
Veränderung der Genexpression, im besonderen die Aktivierung der hepatischen
Transkriptionsfaktoren wie HNF4, HNF3β, HNF1, GATA4. Die Differenzierung steht obendrein unter
der Kontrolle von epigenetischen Faktoren. Zur epigenetischen Reprogrammierung der Zellen zählt
Einleitung 19
sowohl die Expression von Transkriptionsfaktoren, die Remodelierung und Modifikation des
Chromatins, DNA Methylierung von CpG Dinucleotiden und Lokalisierung des Chromatins in
spezialisierten nuklearen Regionen (Banas et al., 2007). Diese epigenetischen Mechanismen sind die
molekulare Basis der Stammzellplastizität und werden bei Differenzierung verändert. Die
Modifikatoren wie das Deacetylierungsmittel und Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A (TSA)
(Snykers et al., 2007), DMSO (Sato-Gutierrez et al., 2007; Seo et al., 2005) und Sodiumbutyrat
(Rambhatla et al., 2003) wurden in vitro eingesetzt, um eine hepatische Differenzierung von
embryonalen Zellen zu induzieren. Ein neuer Ansatz ist die Gewinnung von induzierten pluripotenten
Stammzellen aus somatischen Zellen wie den Fibroblasten durch Gentransfer von embryonalen
Transkriptionsfaktoren wie Oct3/4, SOX2 und Klf4 (Dedifferenzierung) (Takahashi et al., 2007). Erste
Untersuchungen belegen, dass diese dedifferenzierten Zellen murinen oder humanen Ursprungs zur
hepatischen Differenzierung induziert werden können (Song et al., 2009).
Abbildung 2 Mögliche Mechanismen, der Entstehung von Hepatozyten aus Blutzellen. 1: Transdifferenzierung,
2:Dedifferenzierung und Differenzierung, 3: Reprogrammierung und Differenzierung
Wesentlich für eine Reprogrammierung von Stammzellen ist die Mikroumgebung. In vivo ist eine
verletzte Umgebung für das Gewebe am geeignetsten, um durch Stammzellen regeneriert zu werden
(Zhou et al., 2009). In vitro wurde der größte Erfolg der phänotypischen Veränderung von
Stammzellen erzielt durch die Imitierung der Mikroumgebung (Soto-Gutierrez et al., 2007).
Experimentelle Bedingungen und Strategien, die die Stammzellen veranlassen zu gewebespezifischen
Zellen wie den Hepatozyten zu werden, basieren auf der Rekonstruktion der Mikroumgebung durch:
- Zugabe von löslichen Faktoren (definierten Wachstumsfaktoren, Faktoren in konditionierten
Medien teilweise unbekannt)
- Zugabe von Zellextrakten (lösliche Faktoren und Zellbestandteile)
- Rekonstruktion der Zellmatrix
- Zell-Zell-Interaktionen
- Modulation des Chromatins
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Einleitung 20
In Abbildung 3 ist die Mikroumgebung in vivo und ihre Imitierung in vitro dargestellt.
Abbildung 3 Darstellung der Mikroumgebung von Stammzellen in vivo und die Imitierung in vitro. Modifiziert nach Snykers
et al., 2009.
Eine einseitig gerichtete Differenzierung der CD34+ Zellen aus dem Blut in hämatopoetische Zellen
wie B-Zellen, Makrophagen oder T-Zellen erfolgt in der Gegenwart von einfachen Cocktails von
Wachstumsfaktoren (Woo et al., 2003). Die erfolgreiche Umgehung der hämatopoetischen,
linienspezifischen Differenzierungsgrenze und der mesodermale - endodermale Übergang werden
durch intra- und extrazelluläre Signale reguliert. Zu den essentiellen, extrazellulären Signalen für die
Hepatozytendifferenzierung in vitro und in vivo zählen folgende Faktoren: Nodal (Activin), FGF, BMP,
HGF und Oncostain M (OSM) (Kinoshita et al., 2002; Lemaigre et al., 2004). Durch die Anwesenheit
von löslichen Faktoren wie Wachstumsfaktoren, Zytokinen und Hormonen kann die Differenzierung
gezielt untersucht werden. Multipotente adulte Progenitorzellen (MAPCs) des adulten Knochenmarks
wurden nach der kombinierten Exposition mit FGF+HGF+Insulin+Transferrin+Dexamethson in Zellen
mit morphologischen, phänotypischen und funktionellen Eigenschaften von Hepatozyten
differenziert (Schwartz et al., 2002). HGF ist wesentlich an der Induktion einer leberspezifischen
Expression von Knochenmarkszellen beteiligt (Shu et al., 2004). An adulten CD34+
Nabelschnurblutstammzellen wurden nach der Kultur mit HGF (Wang et al., 2005) und HGF+FGF
(Nonome et al., 2005) hepatozytenspezifische Marker detektiert.
Einleitung 21
Die Kultivierung von Stammzellen zu gewebespezifischen Zellen mit konditioniertem Medium basiert
auf der Hypothese, dass lösliche, biologisch aktive Faktoren, teilweise unbekannt, von den Zellen ins
Medium abgegeben werden, die eine epigenetische Modifikation der kultivierten Stammzellen
bewirken und eine Differenzierung induzieren. In murinen Knochenmarkszellen konnte eine
hepatische Differenzierung auf morphologischer und molekularer Ebene durch den Gebrauch eines
hepatisch-konditionierten Mediums induziert werden (Chen et al., 2007). Ein weiterer
experimenteller Ansatz zur Differenzierungsinduktion von Stammzellen ist der Einsatz von
zytoplasmatischen Faktoren, die aus permeabilisierten Zellen gewonnen werden (Qin et al., 2005).
Serum aus lebergeschädigten Tieren wurde zur Differenzierung von Knochenmarksstammzellen in
hepatozyten-ähnliche Zellen erfolgreich verwendet (Yang et al., 2009).
Die Kokultur von Stammzellen mit hepatischen und nicht-hepatischen Zelltypen kann eine optimale
in vitro Umgebung schaffen, um die hepatische Differenzierung der Stammzellen zu unterstützen
(Soto-Gutierrez et al., 2007). Die direkte Zell-Zell-Interaktion unter Ausbildung von Zell-Zell-
Kontakten und Austausch von differenzierungsinduzierenden Stoffen durch Gap Junctions bildet die
Grundidee der Differenzierungsinduktion in einer Kokultur. Kokulturen von Stromazellen aus dem
Knochenmark mit primären Hepatozyten wurden anfangs genutzt, um die hepatische Funktion
langfristig in vitro aufrechtzuerhalten (Mizuguchi et al., 2001). Mesenchymale Stammzellen
unterstützen in einer hohen Zelldichte im Vergleich zu einer dünnen Zelldichte die hepatische
Differenzierung und zeigen somit die Bedeutung der interzellulären Kommunikation (Hong et al.,
2005). Endodermale, hepatische Zellen sollen die biologische Nische nachahmen und eine gerichtete
Differenzierung der Stammzellen induzieren. Die Bedeutung von Komponenten der extrazellulären
Matrix wie das natürliche Gerüst Collagen als auch Matrigel sind für zelluläre Entwicklungsprozesse
wichtig und Untersuchungen zur Rolle dieser Komponenten für hepatische Differenzierungsprozesse
in vitro sind teilweise durchgeführt worden (Schwartz et al., 2005).
Es wurde geprüft, ob durch genetische Modifikation wie der Überexpression von leberspezifischen
Transkriptionsfaktoren oder Interferenz mit der Chromatinstruktur die Zelldifferenzierung beeinflusst
werden kann. Zur Induktion des hepatischen Phänotyps wurden murine embryonale Stammzellen
mit dem hepatischen Transkriptionsfaktor HNF3ß transfiziert (Ishizaka et al., 2002). Die direkte
Interferenz mit der Chromatinstruktur wurde mit Sodiumbytyrat an ES durchgeführt, die
Zelldifferenzierung beeinflusst und 10% hepatische Zellen erhalten (Rambhatla et al., 2003). Eine
weitere Zugabe von ActivinA führte zu einer Anreicherung von 70% (Hay et al., 2007). Der
Histondeacetylase-Inhibitor Trichostatin A induzierte in der Kultur von mesenchymalen Zellen
phänotypische und funktionelle Charakteristika von Hepatozyten (Snykers et al., 2007).
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Einleitung 22
Die Arbeit soll Aufschluss über wesentliche Schritte der hepatischen Differenzierung von
Stammzellen in vitro liefern und nicht in einer Methode zur Entwicklung von Hepatozyten in vitro
resultieren.
1.2.4 Experimentelle Tiermodelle zur Prüfung der Qualität und des Differenzierungspotenzials
von Stammzellen
Die Beantwortung von Fragen zur Qualität und Pluripotenz von Stammzellen und die Beurteilung des
Differenzierungspotenzials und der Geweberegeneration der Zellen ist nur unter in vivo Bedingungen
möglich. Hierzu sind Tiermodelle unerlässlich. In vitro können so komplexe biologische Prozesse wie
die Differenzierung nicht vollständig aufgeklärt werden.
Experimentelle Tiermodelle zur Bestimmung des Engraftments und der funktionellen Differenzierung
von Stammzellen wurden etabliert. Die Entdeckung der Prkdcscid Mutation in CB17 Mäusen folgte der
Beobachtung, dass HSCs in diesen Mäusen engraften konnten (Lapidot et al., 1992). Jedoch erfolgte
das Engraftment nur auf einem sehr niedrigen Level und die engrafteten humanen Zellen scheiterten
an der Generierung eines funktionellen humanen Immunsystems. Die Entwicklung der
immundefizienten (B- und T-Zell-Defizienz) non-obese diabetic (NOD)/SCID Maus führte zu einem
höheren Engraftmentlevel von humanen PBMCs (Shultz et al., 1995) und HSC (Lowry et al., 1996;
Pflumio et al., 1996). Außerdem wurde beobachtet, dass die NK-Zell-Aktivität, die einer der
Haupthindernisse beim Engraftment von humanen Zellen ist (Christianson et al., 1996), in den
NOD/SCID Mäusen niedriger ist als in den CB17-scid Mäusen (Shultz, 1995). Für die nächsten zehn
Jahre wurde die NOD/SCID Maus als Model für die humane Immunität genutzt, jedoch eingeschränkt
aufgrund der kurzen Lebensdauer und die verbleibende NK-Zell-Aktivität. Ein Fortschritt war das
Engraftment von humanen Zellen in der immundefizienten NOD/SCID-Maus mit der Zielmutation der
γ-Kette des Interleukin-2-Rezeptors. Unterschiedliche Transplantationsverfahren und
Applikationsrouten in adulten und neugeborenen Mäusen wurden untersucht. Die organspezifische
Transplantation in die Leber ist ein Mausmodell zur Bewertung der in vivo Eigenschaften von
Stammzellen. Die embryonale als auch die postnatale Leber ist das primäre Organ der Hämatopoese
und stellt eine nährstoffreiche Mikroumgebung dar (Palis et al., 1999; Godin et al., 1999), die zu einer
höheren Proliferation von Stammzellen führen soll (Martin und Bhatia, 2005).
Der Vorteil der Transplantation von Stammzellen in geeigneten Tiermodellen gegenüber der in vitro
Differenzierungsinduktion besteht in der Mikroumgebung der Leber mit allen Wachstumsfaktoren,
der Versorgung mit Nährstoffen und anatomischen Gegebenheiten, die den transplantierten Zellen
zur Verfügung stehen. Einige Tiermodelle zur Untersuchung der Leberregeneration sind beschrieben,
doch kaum in immundefizienten Mäusen. Verschiedene Strategien können angewendet werden, um
Einleitung 23
experimentell einen Leberschaden zu induzieren: Tiere genetisch modifizieren, chirurgische
Resektion oder pharmakologische Intervention durch Toxingabe. Genetisch-modifizierte Tiere sind
defizient für ein leberspezifisches Enzym und die transplantierten, regenerationsfähigen Zellen
können detektiert werden. Als Leberschadensmodelle sind unter anderem die Dipeptidyl-Pepditdase
IV (DPPIV) defizienten F344-Ratten (Thompson et al., 1991), das Albumin-Uroplasminogen Aktivator
(alb-uPA) transgene Maussystem (Sandgren et al., 1991) und Mäuse mit Fumarylacetoacetat
Hydrolase-(FAH)-Defizienz (Overturf et al., 1996) bekannt. Beim chirurgischen Eingriff der
Hepatektomie wird ein Teil der Leber abgenommen. Das Modell der 2/3 Hepatektomie in Ratten ist
etabliert (Higgins et Anderson., 1931). Es gibt eine große Anzahl an Toxinen, die einen Leberschaden
oder Zelltod des Leberparenchyms hervorrufen können. Kohlenstofftetrachlorid (CCl4), D-
Galactosiamin, Ethanol, Thioacetamid (TAA) und Acetaminophen werden häufig zur Induktion eines
experimentellen Leberschadens eingesetzt. CCl4 wird in der Leber metabolisiert, das produzierte
Trimethyl-Radikal verletzt die Plasmamembran und führt zum Tod der Hepatozyten (Faber et al.,
1975). TAA induziert chronische Leberzirrhose und Acetaminophen akutes Leberversagen in Ratten
(Zieve et al., 1985). Der Effekt von Ethanol hängt wie bei allen Hepatoxinen von der Dosis und Dauer
der Gabe ab, die einen akuten oder chronischen Leberschaden zur Folge haben. Ein chronischer
Leberschaden kann ebenfalls durch Induktion einer Fettleber hervorgerufen werden. In
immunkompetenten BDF1 Mäusen konnte durch eine Cholin-defiziente Diät und Ethionin-
Supplementierung eine Fettleber induziert werden (Akhurst et al., 2001). Ethionin inhibiert den
Einbau von Methionin und Glycin in Leberproteine, der aufgrund des niedrigen Cholin-Angebots nicht
vollständig revidiert werden kann und in einer Wachstumsinhibierung resultiert (Swendseid et al.,
1952).
Die funktionelle Differenzierung von transplantierten, humanen Zellen in die Leber ist bisher wenig in
xenogenen Modellen untersucht. Auch wenn die durchgeführten Studien eine große Diversität des
Studiendesigns aufweisen, basieren fast alle in vivo Modelle auf der Analyse des
Repopulationspotenzials nach Zelltransplantation in eine verletzte Leber. Eine hepatische
Differenzierung von extrahepatischen Stammzellen wie den hämatopoetischen Stammzellen findet
selten in einem Nicht-Schadensmodell (unverletzte Leber) statt (Stadtfeld&Graf, 2005). Es muss ein
schwerwiegender Schaden vorliegen, um den transplantierten Zellen einen Vorteil zum Ansiedeln
(Homing) und zum Proliferieren im Leberparenchym zu geben (Wagers et al., 2002; Lagasse et al.,
2000). Das Homing von transplantierten Zellen wird beeinflusst von chemotaktisch aktiven
Substanzen wie SCF, SDF-1 und HGF, die von verletzen Leberzellen ins Blut ausgeschieden werden
(Dalakas et al., 2005) und die Stammzellen anlocken. Lokal sekretierte Matrix-Metalloproteinasen
(MMPs) ermöglichen den Zellen die Überwindung der Endothelzell-Barriere, um aus dem Blut ins
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Einleitung 24
Leberparenchym überzutreten (Son et al., 2006). Im Leberparenchym wird die Proliferation der
Stammzellen durch Zytokine (z.B. HGF oder FGF) unterstützt (Abbildung 4).
Abbildung 4 Mechanismus der Leberrepopulation nach Stammzelltransplantation. Das Homing der Zellen wird von
chemotaktisch aktiven Substanzen beeinflusst (SDF-1, HGF). Der Blutstrom kann von den Stammzellen aufgrund von MMPs
verlassen werden. Zusätzlich werden die Stammzellen von HGF oder FGF stimuliert. Modifiziert nach Lysy et al., 2008.
Leberschadensmodelle müssen als Werkzeug zur Prüfung des in vivo hepatischen
Differenzierungspotenzials von Stammzellen gesehen werden, um humane Stammzellen klinknah
testen zu können. Jedoch gibt es bislang kein einheitliches Protokoll und Fragen zur Art des
Leberschadens, Zeitabhängigkeit des Leberstimulus (akuter versus chronischer Leberschaden) und
Gebrauch von Mitteln zur Blockierung der endogenen Leberregeneration sind noch offen.
1.3 Stammzelltechnologie als Perspektive für die klinische Anwendung
Die Zellen eines Organs sind die grundlegenden Bausteine, welche die spezifischen Organfunktionen
ausführen. Kommt es zu einem Funktionsverlust der Zellen, ist häufig eine Schädigung der gesamten
Organfunktion die Folge. Für viele Erkrankungen im Endstadium stellt heutzutage die
Organtransplantation die einzig heilende Behandlungsmöglichkeit dar. Ein grundlegendes Problem
jedoch ist die begrenzte Anzahl von Spenderorganen. Desweiteren kann es aufgrund einer
immunologischen Reaktion zur Abstoßung der Transplantate kommen. Alternative Behandlungen wie
künstliche Organe oder Xenotransplantationen werden teilweise eingesetzt, doch eine verkürzte
Lebensdauer, eingeschränkte Funktion sowie die Übertragung von Krankheiten sind einige Nachteile
dieser Methoden.
Für Erkrankungen, bei denen der Funktionsverlust auf bestimmte Zelltypen zurückzuführen ist,
können Zelltransplantationen die Organtransplantation ersetzen. Beispiele hierfür sind unter
anderem: Typ1-Diabetes, Herzinfarkt, Lebererkrankungen und Querschnittslähmung. Im Falle eines
akuten Leberversagens gehen in kurzer Zeit sehr viele Leberzellen zu Grunde. Gespendete
Einleitung 25
Leberzellen können in bestimmten Fällen die gestörte Organfunktion ersetzen, bis sich die eigenen
Leberzellen regeneriert, sich stabil in das Lebergewebe integriert und dauerhaft den entsprechenden
Stoffwechseldefekt korrigiert haben oder Zeit bis zur Organtransplantation vergangen ist (Strom et
al., 1997). Eine zellbasierte Therapie hat gegenüber einer Organtransplantation den Vorteil, dass sie
weniger invasiv ist (Nussler et al., 2006). Humane Primärhepatozyten sind kommerziell erhältlich,
jedoch übersteigt die Nachfrage das Angebot. Limitierend ist, dass es bislang nicht möglich ist,
humane Primärhepatozyten in vitro zu expandieren. Mit der Generierung von Hepatozyten oder
Zellen mit Hepatozyten-ähnlichen Eigenschaften aus Stammzellen steht langfristig eine mögliche
Alternative zur Deckung eines weiter steigenden Bedarfs an Spenderorganen und humanen
Hepatozyten zur Verfügung. Die Anwendung der Ergebnisse der Stammzellforschung resultiert in
dem Konzept der zellbasierten Therapie. Um keine Abstoßungsreaktion transplantierter, fremder
Zellen befürchten zu müssen, hofft man auf Stammzell-abgeleitete Zellen des Empfängers (induzierte
pluripotente Stammzellen) und auf den Einsatz von „maßgeschneiderten“ Leberzellen für
Zelltherapien.
Die Therapie mit Stammzellen umfasst die Isolierung der Zellen, deren Vermehrung und
Differenzierung in den gewünschten Gewebezelltyp und die anschließende Transplantation in das
geschädigte Gewebe. Hierfür werden zurzeit sowohl embryonale als auch adulte Stammzellen auf
ihre Tauglichkeit untersucht. Die Vorteile von Stammzellen für die regenerative Gewebemedizin
liegen in ihrem Vorhandensein, ihrer Proliferationsfähigkeit und dem möglichen Einsatz von
autologen Zellen. Der klassische Anwendungsfall von Stammzellen in der medizinischen Therapie ist
die Behandlung von Krankheiten des blutbildenden Systems und von Autoimmunkrankheiten mit
hämatopoetischen Stammzellen (HSC). HSC werden aus dem peripheren Blut, dem Knochenmark und
aus dem Nabelschnurblut gewonnen und in Blutbanken gelagert. Zwar sind die embryonalen
Stammzellen von ihren Eigenschaften her die optimalen, aber ihre Gewinnung ist nicht nur schwierig,
sondern auch mit ethisch-moralischen Problemen belastet. Das Nabelschnurblut als Quelle von
Stammzellen ist ethisch unbedenklich, die Stammzellen sind teilweise noch sehr jung und in ihrer
Differenzierung noch nicht festgelegt. Zudem sind sie immunologisch besser verträglich als Zellen aus
dem Knochenmark und haben eine größere Lebensfähigkeit.
Eine weitere therapeutische Möglichkeit von Stammzell-abgeleiteten Leberzellen kann in der
Bereitstellung von humanen Zellen für die extrakorporale Leberunterstützung durch Bioreaktoren
sein, die zur Überbrückung der Leberfunktion bis zur Transplantation oder Regeneration der Leber
dienen. Obwohl durch die Bioreaktortechnologie große Fortschritte in der Expansion von
Stammzellen gemacht wurden (Gerlach et al., 2010), bleiben Tiermodelle unverzichtbare
Bestandteile der präklinischen Forschung, um die Qualität, die Pluripotenz und das
Differenzierungspotenzial von Stammzellen zu prüfen.
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Einleitung 26
1.4 Ziele
Unter gleichen differenzierungsinduzierenden Bedingungen sollte in dieser Arbeit das Potenzial von
pluripotenten, humanen embryonalen Stammzellen und multipotenten, adulten CD34+ Stammzellen
aus Nabelschnurblut verglichen werden. Es sollte bestimmt werden, ob in den beiden
Stammzelltypen eine hepatische Differenzierung unter den gewählten Bedingungen möglich ist. Die
in vitro Differenzierungsinduktion sollte durch Zytokine, konditioniertes Hepatozyten-
Zellkulturmedium als auch durch direkte Zell-Zell-Wechselwirkungen mit Hepatozyten erfolgen. Nach
der Ausarbeitung von Transplantationsmodellen und Leberschadensmodellen in immundefizienten
Mäusen sollten diese Modelle zur Bewertung der in vivo Eigenschaften der Stammzellen bezüglich
Engraftment und Zelldifferenzierung herangezogen werden. Die Anwendung der Modelle sollte
Aufschlüsse über die Funktionalität, Integrität und das regenerative Potenzial der Stammzellen
liefern, die nur in vivo erbracht werden können. Folgende Schwerpunkte wurden untersucht:
In vitro Studien:
- Der Einfluss konditionierter Medien von kultivierten Hepatozyten auf die Differenzierung der
humanen Stammzellen (lösliche Faktoren)
- Die Wirkung einer Kokultur von Stammzellen mit Hepatozyten auf die
Differenzierungsinduktion von adulten und embryonalen Stammzellen (direkter Kontakt und
Austausch von Faktoren)
In vivo Studien:
- Ausarbeitung von Transplantationsmodellen in immundefizienten NOD/SCID Mäusen zur in
vivo Testung von Stammzellen
- Bewertung der in vivo Eigenschaften der Stammzellen bezüglich Engraftment und
Zelldifferenzierung und Dissemination unter Anwendung unterschiedlicher
Transplantationsverfahren und Applikationsrouten in adulten und juvenilen NOD/SCID
Mäusen
- Etablierung von Leberschadensmodellen unterschiedlichen Typs (akut, chronisch) in
NOD/SCID Mäusen zur Bewertung des Regenerations- und Differenzierungspotenzials von
Stammzellen
- Nachweis der Pluripotenz durch Ausbildung von Keimblattstrukturen nach Transplantation
von hES in NOD/SCID Mäuse als in vivo Kriterium für die Qualität von hESC-Präparaten und
ebenso als Modell der spontanen Differenzierung von hES
Die Resultate der Arbeit sollten zur Identifikation von essentiellen Schritten der hepatischen
Differenzierungsinduktion von humanen adulten sowie embryonalen Stammzellen in vitro und in vivo
dienen.
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 27
2 Material und Methoden
2.1 Zellbiologische Methoden
2.1.1 Verwendete Zellen
CD34
+
humane adulte primäre Stammzellen aus Nabelschnurblut (Geburtsklinik: Helios, Berlin-Buch;
Vivantes, Berlin-Friedrichshain; Charite, Berlin-Dahlem; Vivantes, Berlin-Reinickendorf)
SA002 humane embryonale Stemmzelllinie (Cellartis, Göteburg, Schweden; Heins et al., 2004)
HepG2 humane Hepatokarzinomzelllinie (ATCC-Nr. HB 8065)
AML12 murine Hepatozytenzellline (ATCC-Nr. CRL-2254)
mES murine embryonale Stammzellen ((129/SVE, Chemicon, USA, #CMTI-1)
MEF murine embryonale Fibroblasten (Primärzellen aus CD1 Mäusen isoliert)
2.1.2 Isolierung humaner CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut
2.1.2.1 Rechtliche Grundlagen und Spenderauswahlkriterien für die Entnahme von
Nabelschnurblut
Nabelschnurblut ist ein Arzneimittel aus Humanblut und unterliegt somit den Vorschriften des
Arzneimittelgesetzes. Zur Durchführung der Arbeiten wurde eine Genehmigung der Ethikkommission
der Charité, Campus Berlin-Buch eingeholt und das Projekt bei der Ärztekammer Berlin angezeigt.
Eine schriftliche Einwilligungserklärung der Eltern des Kindes lag vor.
Im Einzelnen richtet sich die Spenderauswahl nach den Vorgaben der „Richtlinien zur Gewinnung von
Blut und Blutbestandteilen und zur Anwendung von Blutprodukten“ der Bundesärztekammer.
Schwangere Frauen, bei denen Hinweise auf Erkrankungen bestehen, werden von der Sammlung von
Nabelschnurblut ausgeschlossen. Datenschutz war durch Anonymisierung der Probe gewährleistet.
2.1.2.2 Gewinnung des Nabelschnurblutes
Durch Hebammen und Ärzte der Geburtskliniken wurde die Nabelvene punktiert und das Blut dabei
in einem sterilem 50ml Falcon-Röhrchen aufgefangen und unter Durchmischung mit dem
vorgelegten Heparin (5000 I.E., Braun, Melsungen) antikoaguliert. Für die Untersuchungen wurde nur
Nabelschnurblut eingesetzt, das nicht älter als 10 Stunden sein durfte.
2.1.2.3 Gewinnung humaner CD34-positiver Stammzellen aus Nabelschnurvollblut
Die Isolierung der CD34+ Stammzellen erfolgte nach dem Protokoll der Firma Miltenyi Biotec mit den
entsprechenden Produkten der Firma Miltenyi wie dem Stammzell-Isolierungs-Kit CD34 MicroBeads.
Durch Dichtezentrifugation auf Ficoll-Plaque (PAA, Cölbe) wurden aus dem Vollblut mononukleäre
Zellen isoliert und mit Hilfe von Eisenpartikel-beladenen CD34-Antikörper (MagnetoBeads) über
spezielle Fraktionierungssäulen (Trennsäulen-Typ MS
+
) in CD34
+
Stammzellen aufgetrennt [Miltenyi et
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 28
al. 1990]. Es wurde das Verfahren der direkten Selektion gewählt, welches mononukleäre Blutzellen
mit dem spezifischen monoklonalen Antikörper gegen CD34 markiert, im Magnetfeld zurückhält und
pro Eluat bis zu 10
7
Stammzellen in hoher Reinheit und Viabilität lieferte. Die Charakterisierung der
gewonnenen CD34-positiven Zellen erfolgte im Durchflusszytometer mit Hilfe von Fluorochrom-
konjugiertem Antikörper gegen CD34 und andere hämatopoetische Marker.
2.1.3 Einfrieren und Auftauen von CD34
+
Zellen
Zum Einfrieren wurde nach dem Pelletieren die Zellen in 500µl FKS (Biochrom, Berlin) aufgenommen
und in 500µl einer 20% DMSO-FKS-Lösung (Sigma-Aldrich, Steinheim; Biochrom, Berlin) überführt
und graduell bei -80°C eingefroren. Die Langzeitlagerung erfolgte bei -196°C.
Für das Auftauen eines Kryoröhrchen mit einem Volumen von 1ml wurden 5ml Waschlösung
benötigt. Diese setzte sich aus 2,5ml Dextran 40 (Delta Select, Dreieich), 1,7ml 0,9% NaCl-Lösung
(Braun, Melsung)), 0,65ml 20% humane Albuminlösung (DRK-Blutspende, Springe) und 0,15ml
Pulmozymlösung (Roche Diagnostics, Mannheim) zusammen. Alle Arbeiten erfolgten auf Eis. 2ml der
Lösung wurden in einem Spitzboden-Zentrifugenröhrchen vorgelegt und die Zellen soweit aufgetaut,
dass nur noch ein Eiskern in der Mitte vorhanden war. Die Zellsuspension wurde mit 1ml
Waschlösung vermischt und in das Zentrifugenröhrchen pipettiert. Anschließend wurde das
Kryoröhrchen nochmals mit der Waschlösung gespült. Die Zentrifugation erfolgte bei 435xg ohne
Bremse für 20min. Der Überstand wurde verworfen und die Zellen entweder in PBS oder Medium
aufgenommen.
2.1.4 Beschichtung der Zellkulturplatten mit Matrigel oder Gelatine
Das Matrigel (Becton Dickinson, Heidelberg) wurde auf Eis aufgetaut und in gekühltem DMEM
(Invitrogen, Karlsruhe) ohne Zusätze auf eine Konzentration von 1% (v/v) verdünnt, da es bei über
22°C irreversibel in einen festen Zustand übergeht. Pro cm² Wachstumsfläche wurden 200µl 1%
Matrigel benötigt und für 2h bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde der Überstand abgenommen
und mit PBS gewaschen.
Für die Gelatinebeschichtung wurde eine 0,1%ige Lösung aus Gelatinepulver (Sigma Aldrich,
Steinheim) und pyrogenfreiem Wasser hergestellt und anschließend autoklaviert. Die 300µl/cm²
Gelatine inkubierte für 30min bei 37°C, der Überstand wurde abgenommen und die Platten mit PBS
gewaschen.
2.1.5 Kultivierung der humanen embryonalen Stammzelllinie SA002
Nach Prüfung durch die Ethikkommission am Robert-Koch-Institut wurde eine Erlaubnis zum Import
der bereits vorhandenen humanen embryonalen Stammzelllinie SA002 erteilt.
Für die Kultivierung von hES wurden murine embryonale Fibroblasten (MEF) eingesetzt, die aus CD1
Mäusen 14 Tage nach Befruchtung isoliert wurden. Die Zellen wurden in DMEM (Invitrogen,
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 29
Karlsruhe) mit 10% definiertem FKS (Biochrom, Berlin), 1% L-Glutamin, 1% MNEAA (beides
Invitrogen, Karlsruhe) und 1% Penicillin/Streptomycin (Roche Diagnostics, Mannheim) bis zu einer
Konfluenz von 95-100% herangezogen. Für die Kultivierung wurden nur Zellen bis zur 4. Passage
eingesetzt und dann verworfen. Die konfluenten MEFs wurden mit 0,05% Trysin-EDTA (Roche
Diagnostics, Mannheim) abgelöst und gewaschen. Das Pellet wurde in Medium resuspendiert und zur
Zellinaktivierung mit 30 Gy einer Cs137-Anlage bestrahlt. Für die Bestrahlung wurden max. 1x10
6
/ml
eingesetzt.
Für die mechanische Passagierung der hESC wurden sowohl Gelatine- sowie Matrigel-beschichtete
Center-Wells eingesetzt. In jedes Well wurden 1,3x10
5
MEFs in 2ml ausgesät. Am nächsten Tag
wurde das MEF-Medium abgenommen, die Wells 2x mit PBS gewaschen und das Stammzellmedium
(hES-Medium) (DMEM/F12 mit 20% Knockout Serum Replacer, 1% MNEAA, 1% Glutamax, 0,1mM β-
Mercaptoethanol (alles Invitrogen, Karlsruhe) und 1% Penicillin/Streptomycin (Roche Diagnostics,
Mannheim)) hinzugegeben. Kurz vor Einsatz des Mediums wurde 4ng/ml bFGF (Invitrogen, Karlsruhe)
zugesetzt.
Je nach Größe der Kolonien wurden die Stammzellen alle 5-7 Tage mechanisch passagiert und auf
mehrere neue Center-Wells verteil. Mit Hilfe eines Stem Cell Cutting Tools (Vitrolife, Kumpbaska,
Schweden) wurden die undifferenzierten Kolonien in 200µm x 200µm große Stücke geschnitten.
Nach dem Schneiden wurden mit dem Tool die geschnittenen Kolonien abgelöst, durch die
integrierte Pasteurpipette aufgesaugt und in eine neue Schale etwa 20 dieser Stücke überführt. Ein
Tag nach dem Passagieren wurden die Zellen mit PBS gewaschen und 2ml frisches hES-Medium plus
bFGF hinzugegeben. Anschließend erfolgte ein halber Mediumwechsel alle zwei Tage.
Die Arbeiten wurden nach dem Kultivierungsprotokoll von Cellartis (Göteburg, Schweden)
durchgeführt. Zur Charakterisierung der SA002 Zelllinie wurden die Pluripotenzmarker SSEA-3, SSEA-
4, TRA-1-60, TRA-1-81 und Oct-4 bestimmt und die alkalische Phosphataseaktivität nachgewiesen.
Alle Merkmale waren positiv.
2.1.5.1 Konditioniertes Stammzellmedium
Das konditionierte Stammzellmedium (CM) wurde von inaktivierten, konfluenten MEFs gewonnen
und bewirkt die Proliferation von undifferenzierten hES. Zur Gewinnung von konditioniertem
Stammzellmedium wurden die MEFs mit DMEM/F12 inkl. 20% Knockout Serum Replacer, 1% MNEAA,
1% Glutamax, 0,1mM β-Mercaptoethanol (alles Invitrogen, Karlsruhe) und 1%
Penicillin/Streptomycin (Roche Diagnostics, Mannheim) unter der Zugabe von 4ng/ml bFGF inkubiert.
Die folgenden sieben Tage wurde das Medium täglich erneuert, die Aliquotes gesammelt, gepoolt
und durch einen Filter mit 0,22µm Porengröße steril filtriert. Die Lagerung erfolgte bei -20°C. In den
beschriebenen Versuchen wurde dieses gewonnene konditionierte Stammzellmedium eingesetzt.
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 30
2.1.6 Kultivierung der murinen Hepatozytenzelllinie AML12
Die murine AML12 (ATCC-Nr. CRL-2254) wurde käuflich von ATCC erworben. Diese adhärent
wachsende Zelllinie wurde aus männlichen Tieren des CD1 Mausstamms gewonnen, der transgen für
humanes TGF-α ist. Die Zellen exprimieren auf hohem Level mRNA für Serum- (Albumin, alpha1
Antitrypsin und Transferrin) und Gap Junction Protein (Connexin 32 und 43).
Die Kultivierung der AML12-Zellen erfolgte im DMEM/HAM’s F12 Medium (Invitrogen, Karlsruhe)
(1:1) und der Zugabe von 10% FKS (Biochrom, Berlin), 2,5 mM Glutamax, 2,5 mM HEPES und 5 µg/ml
Insulin/Transferrin/Selenium (alles Invitrogen, Karlsruhe). Je nach Konfluenzgrad wurde die adhärent
wachsende Zelllinie nach drei bis vier Tage passagiert. Dazu wurden die Zellen mit PBS gewaschen
und mit 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung behandelt.
2.1.7 Kultivierung der humanen Hepatokarzinomzelllinie HepG2
Die humane HepG2 Zelllinie (ATCC-Nr. HB 8065) wurde von Frau Dr. R. Stahn, Firma Nemod Berlin-
Buch, erhalten. Die Zelllinie wurde aus dem Tumorgewebe eines 15-jährigen argentinischen Jungen
mit hepatozellularem Karzinom isoliert (Aden et al., 1979). Die Zellen produzieren alpha-Fetoprotein
und Albumin, immunologisch wurde Zytokeratinkeratin nachgewiesen. Es handelt sich um eine
permanent-wachsende, adhärente Hepatozytenkarzinomzelllinie, die aufgrund ihrer Expression von
Hepatozytenmarkern für die Experimente zur Differenzierungsinduktion von Stammzellen gewählt
wurde.
Die verwendete Zelllinie wurde in Gewebekulturflaschen bei 37°C und 5% CO
2
im
Begasungsbrutschrank bei gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden bis zur
Konfluenz kultiviert, mit PBS (Invitrogen, Karlsruhe) und anschließend mit 0,25% Trypsin-EDTA-
Lösung (Roche Diagnostics, Mannheim) behandelt. Nach kurzer Einwirkzeit der Peptidase-Mischung
wurden die Zellen mit einem Gemisch aus DMEM-Medium mit 2mM L-Glutamin (beides Invitrogen,
Karlsruhe) und 10% FKS (Biochrom, Berlin) vorsichtig vom Boden des Gefäßes abgespült und im
Verhältnis 1:6 in eine neue Kulturflasche überführt.
2.1.8 Kultivierung der CD34
+
Zellen in serumfreiem Medium mit Zytokinen zur
Differenzierungsinduktion
Zur serumfreien Kultivierung der CD34
+
Stammzellen wurde das Zellkulturmedium StemSpan
(StemCell Technology, Köln) verwendet, das als hämatopoetisches Stammzell-Expansions-Medium
serumfrei speziell für die optimale Expansion von Stammzellen aus Nabelschnurblut entwickelt
wurde. Das Zellkulturmedium enthält keine Zytokine und ist besonders geeignet, um die Wirkung von
verschiedenen ausgewählten Zytokinen, Wachstumsfaktoren und Differenzierungsfaktoren zu
untersuchen. Ergänzt wurde das Medium mit 1% 100xkonz. Penicillin/Streptomycin (Roche
Diagnostics, Mannheim) und 4mM L-Glutamin (Invitrogen, Karlsruhe), um eine mögliche Infektion
der aseptisch abgenommenen Nabelschnurblutproben zu vermeiden.
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 31
Die Kultivierung der CD34-positiven Stammzellen erfolgte in Anwesenheit des Zytokines
Stammzellfaktor (SCF; Chemicon) in einer Konzentration von 100ng/ml und des
Differenzierungsinduktor Hepatozytenwachstumsfaktor (HGF; Chemicon) in einer Konzentration von
20ng/ml. Die Kultivierung der humanen adulten Stammzellen erfolgte in einer Dichte von 5x10
4
/cm²
in den unterschiedlichen Versuchsansätzen in einem Zeitraum von 7, 10, 14 und 21 Tagen. Alle 4
Tage wurde ein halber Mediumwechsel durchgeführt. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO
2
im
Begasungsbrutschrank bei gesättigter Wasserdampfatmosphäre inkubiert.
2.1.9 Herstellung von hepatisch konditionierten Medien der HepG2 und AML12 Zellen zur
Zelldifferenzierung
5x10
6
AML12-Zellen wurden in eine 150cm²-Zellkulturflasche eingesät und bis zu einem 90%
Konfluenzgrad kultiviert. Der Zellrasen wurde 3x mit PBS gewaschen, um alle Mediumreste zu
entfernen. Anschließend wurde in jede Kulturflasche 30ml modifiziertes DMEM-Medium nach Sautin
et al. (2001) gefüllt. Dieses Medium ist zur serumfreien Kultivierung speziell für die murine
Hepatozytenzelllinie AML12 von Biochrom (Berlin) hergestellt worden. Die AML12-Zellen wurden für
drei Tage mit dem Sautin-Medium kultiviert und anschließend das konditionierte Medium mittels
Sterilvakuumfiltration durch eine Filter mit 0,22µm Porengröße potentielle Zellbestandteile entfernt.
Für die Versuche wurde konditioniertes Medium aus mehreren Flaschen gepoolt und aliquotiert bei -
20°C gelagert.
Die Herstellung von konditioniertem Medium von HepG2 Zellen wurde analog durchgeführt. Statt
des Sautin-Mediums wurden die HepG2-Zellen jedoch im serumfreien Gherardi-Medium nach
Gherardi et al. (1992) kultiviert, dass speziell für die serumfreien Experimente von Biochrom (Berlin)
hergestellt wurde.
2.1.10 Differenzierungsansatz der CD34
+
Kultivierung mit hepatisch konditioniertem Medium
Zur Kultivierung der CD34
+
Stammzellen wurden 6-Well-Platten zuvor mit Matrigel beschichtet. Pro
Well wurden 5x10
5
CD34
+
Zellen mit 3ml hepatisch konditioniertem Sautin bzw. Gherardi-Medium
versetzt mit 20ng/ml HGF und 100ng/ml SCF ausgesät. Am Tag 4 der Kultivierung erfolgte ein halber
Mediumwechsel.
Nach 1, 7 und 10 Tagen wurden die Zellen morphologisch untersucht und am Tag 10 jeweils eine
Probe für die RNA-Isolierung und FACS-Analyse genommen. Die Zellzahl wurde bestimmt, mit 1x10
5
Zellen eine FACS-Analyse durchgeführt und die übrigen Zellen bis zur weiteren Aufarbeitung bei -80°C
eingefroren.
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 32
2.1.11 Kultivierung der embryonalen Stammzelllinie SA002 mit hepatisch konditioniertem
Medium zur Differenzierungsinduktion
Für die Versuche mit 7d hepatisch konditioniertem Sautin-Medium wurden mechanisch passagierte
Stammzellen der Linie SA002 eingesetzt. Das von Hay et al. (2007) beschriebene Protokoll zur in vitro
Differenzierung von hES zu Hepatozyten-ähnlichen Zellen wurde modifiziert.
Dazu wurden 6-Well-Platten mit Matrigel beschichtet und undifferenzierte Stammzellkolonien in
200µm x 200µm große Stücke geschnitten. Etwa 20 Stücke wurden in 2ml konditioniertes
Stammzellmedium (CM) aufgenommen und in 1 Well ausgesät. Zwei Tage nach der hES-Passagierung
erfolgte ein kompletter Mediumwechsel, zusätzlich wurden die Zellen mit PBS gewaschen.
Anschließend wurde jeden zweiten Tag ein halber Mediumwechsel mit CM durchgeführt. Die Zellen
wurden bis zu einer 50-70%igen Konfluenz kultiviert.
Anschließend wurden die hES mit nicht-konditioniertem Stammzellmedium für eine Woche kultiviert,
um eine spontane Differenzierung zu induzieren.
Danach erfolgte ein erneuter Mediumwechsel auf hepatisch konditioniertes Sautin-Medium und eine
Zellkultivierung über eine Zeitraum von 14 Tagen. Zum Zeitpunkt 0 und 14 Tage der Behandlung mit
hepatisch konditioniertem Medium wurden die Zellen morphologisch begutachtet und Proben
genommen. Für die Probenahme wurden die Zellen trypsiniert, zentrifugiert und das Pellet bei -80°C
gelagert.
2.1.12 Hepatische Differenzierungsinduktion der CD34
+
Stammzellen durch Kokultivierung mit
AML12-Zellen
Konfluente AML12-Zellen wurden bei einem Effektor zu Targetverhältnis von 1:5 mit serumfreien
Sautin-Medium bis zu einem Zeitraum von 21 Tagen mit undifferenzierten CD34+ Zellen kultiviert.
Für die Kokultur wurden Matrigel-beschichtete 6-Well-Platten verwendet und 5x10
4
/cm² AML12-
Zellen unbestrahlt in jede Vertiefung eingesät. Nach zwei Tagen wurde der konfluente Zellrasen
zweimal mit PBS gewaschen, auf Sautin-Medium umgestellt und 5x10
5
CD34
+
Zellen pro Well
eingesät. Das Medium wurde mit 20ng/ml HGF und 100ng/ml SCF (beides Chemicon) versetzt. Die
Probenahme sowie die morphologische Begutachtung erfolgten nach 0, 7 und 21 Tagen in Kokultur.
Ein halber Mediumwechsel wurde nach 4 Tagen durchgeführt. Für die Abnahme der CD34
+
Zellen
wurde der Zellrasen mit dem Medium vorsichtig abgespült, um die AML12-Zellen nicht abzulösen,
Zellen sowohl für die FACS-Messung als auch zur RNA-Isolierung abgenommen.
2.1.13 SA002 Zellen in Kokultur mit murinen AML12-Hepatozyten zur hepatischen
Differenzierungsinduktion
Zur Kokultur wurden Center-Wells mit Matrigel beschichtet und anschließend pro Well 4,33x10
5
durch Strahlung inaktiviert (10Gy, Cs137-Quelle) AML12-Zellen eingesät. Am folgenden Tag wurde
der konfluente Zellrasen zweimal mit PBS gewaschen und 2ml konditioniertes Stammzellmedium
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 33
(CM) wurden vorgelegt. Die undifferenzierten hESC-Kolonien wurden, wie zuvor beschrieben,
geschnitten und in konditioniertes Stammzellmedium (CM) aufgenommen. Pro Center-Well wurden
20 hESC-Stücke in 1ml CM ausgesät. Nach zwei Tagen wurde das Medium abgenommen, die Zellen
mit PBS gewaschen und auf Sautin-Medium umgestellt, anschließend wurde alle zwei Tage ein halber
Mediumwechsel durchgeführt. Nach 7 und 14tägiger Kokultur wurden die Zellen morphologisch
begutachtet und für die Probenahme die Stammzellkolonien mit dem Stem Cell Cutting Tool
ausgeschnitten und bei -80°C gelagert.
2.2 Tierexperimentelle Methoden
2.2.1 Verwendete Mausstämme
NOD/SCID NOD.CB17-Prkdc
scid
; (Jackson Laboratories, USA)
NOD/SCID/IL2Rγ
null
NOD.Cg-Prkdc
scid
Il2rg
tm1Wjl
/SzJ (Jackson Laboratories, USA)
CD1 Crl:CD1 (Charles River, Sulzfeld)
129/SVE 129S6/SvEvTac (Taconic, Dänemark)
Alle Experimente wurden unter Beachtung der geltenden Richtlinien für die Haltung und die
Behandlung von Labortieren durchgeführt. Die Versuche wurden zuvor vom Landesamt für
Gesundheit und Soziales des Landes Berlin genehmigt (G0221/03). Immundefiziente männliche und
weibliche NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF)
Bedingungen in klimatisierten Räumen unter konstanten 12-Stunden Hell-Dunkel-Zyklus gezüchtet
und gehalten. Die Tiere erhielten eine ad libitum-Fütterung mit autoklavierten Pellets (ssniff, Soest)
sowie autoklaviertes, angesäuertes Wasser (pH4) zur freien Verfügung. Alle Arbeiten im
Zusammenhang mit den Tieren erfolgten unter der Sterilwerkbank. Alle Mäuse wurden auf ihre
„Leakiness“ getestet und nur Mäuse mit murinen IgG Level unter 100ng/ml im Serum wurden für die
Experimente eingesetzt.
2.2.2 Etablierung von Leberschadensmodellen in immundefizienten Mäusen
In der vorliegenden Arbeit sollten verschiedene Leberschadensmodelle in immundefizienten
NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen etabliert werden. In Anlehnung an beschriebene Modelle
in Ratten oder immunkompetenten Mäusen werden im Folgenden die angewandten Modelle
vorgestellt.
2.2.2.1 Chemisch-induzierter Leberschaden mit Tetrachlorkohlenstoff (CCl
4
)
Tetrachlorwasserstoff wird in der Leberzelle dehalogeniert und freie Radikale bilden sich, die eine
Lipidperoxidation verursachen. Es kommt zur Membranschädigung und Permeabilitätssteigerung,
was zum Wassereintritt und Enzymaustritt und schließlich zum Zelltod der Leberzellen führt. In
Speiseöl wurde CCl
4
(Sigma-Aldrich, Steinheim) gelöst. NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 34
erhielten CCl
4
in der Konzentration von 0,3, 0,4 und 0,5ml/kg intraperitoneal appliziert. Um eine
subakute Leberinsuffizienz zu induzieren wurde CCl
4
einmalig geben. Zur Induktion einer chronischen
Vergiftung, bei der sich eine Leberzirrhose entwickeln kann, wurde 0,25ml/kg i.p. NOD/SCID Mäusen
innerhalb von 14 Tagen viermal appliziert. Es wurde der allgemeine Gesundheitszustand der Tiere
beobachtet und nach 24 Stunden die Leber histopathologisch untersucht.
2.2.2.2 Cholin-defiziente Experimentaldiät
In Kombination mit Ethionin kann eine Cholin-defiziente Diät einen chronischen Leberschaden, die
Fettleber, induzieren (Shinozuka et al., 1978). NOD/SCID Mäuse erhielten über einen Zeitraum von
21 Tagen eine Cholin-defiziente Experimentaldiät (ssniff EF R/M Fettleberinduktion E15650-49;
Soest) mit hohem Kohlenhydratgehalt bei marginaler Proteinversorgung sowie niedrigem
Cholinangebot und 0,15% Ethionin (Sigma-Aldrich, Steinheim) im Wasser. Der Futter- und
Wasserverbrauch und das Körpergewicht wurden an den Tagen 0, 7 und 21 aufgenommen und
dokumentiert. Desweiteren wurden NOD/SCID Mäusen Ethionin in der Konzentration von 0,45% und
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen von 0,03%, 0,075% und 0,15% gegeben. Sieben Tage nach
Versuchsbeginn wurde die Leber histologisch begutachtet und der Anteil von Ovalzellen
durchflusszytometrisch bestimmt. Das Serum von NOD/SCID Mäusen wurde auf die Enzyme AST und
ALT am Tag 7 und 21 untersucht.
2.2.2.3 Partielle Hepatektomie (PHx)
Bei der partiellen Hepatektomie wurden chirurgisch 1/3 der Lebermasse entfernt. Die Versuchstiere
wurden mit 0,4ml Hypnomidate (Janssen-Cilag, Neuss)/20g Maus narkotisiert. Das Abdomen wurde
mit einem medianen Längsschnitt geöffnet. Der oberflächliche links-laterale Leberlappen wurde mit
einem resorbierbaren Faden (Braun, Melsungen) umschlungen und herausgehoben. Der Lappen
wurde abgebunden, um die Blutzufuhr zu unterbrechen. Mit einer Schere wird das Lappenstück
abgeschnitten und 0,9% NaCl-Lösung auf die Schnittfläche zur Unterstützung der Koagulation
getröpfelt. Nach Überprüfung der Blutstillung wurde die Bauchfelldecke mit einem sterilen Faden
zugenäht und die Felldecke mit Klammern zusammengeheftet. Die Tiere wurden während des
Aufwachens unter eine Wärmelampe gelegt. Die Ergebnisse waren reproduzierbar, jedoch ist die
Operation technisch aufwendig durchzuführen.
In einigen Versuchen wurde die Regenerationsfähigkeit der Leber nach PHx durch Monocrotalin
unterbunden. Monocrotalin (Sigma-Aldrich, Steinheim) ist ein Alkaloid, dass ähnlich Retrorsin eine
Hemmung der nativen Hepatozytenproliferation aufgrund der metabolischen Aktivierung im P450-
System der Leber bewirken soll. Die Dosis und Wirkung von Monocrotalin in NOD/SCID Mäusen ist
bislang noch nicht in der Literatur beschrieben. Eine Dosis von 30 und 60 mg/kg wurde wöchentlich
über einen Zeitraum von vier Wochen intraperitoneal (i.p.) injiziert und das Überleben beobachtet.
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 35
Das Befinden der Mäuse wurde geprüft und zehn Tage nach PHx die Leber histopathologisch
untersucht. Desweiteren wurden die leberassoziierten Enzyme Aspartat- und Alanin-Transaminase
im Serum von NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen am Tag d-1, d6, 13, 20 und 31 nach PHx analysiert.
2.2.3 Transplantation von Stammzellen in immundefiziente Mäuse
Transplantationen (Tx) von Stammzellen in immundefiziente Mäuse wurden durchgeführt, um
Fragen zur Qualität und Pluripotenz von Stammzellen und des Differenzierungspotenzials und
Geweberegeneration der Zellen zu beantworten. Die NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
waren, wenn nicht anders angegeben, zum Zeitpunkt der Transplantation 6-8 Wochen alt. Die zu
transplantierenden Tiere wurden vier Stunden vor der Transplantation subletal mit 1,6 Gy in einem
Cs-137-Bestrahlungsgerät bestrahlt. Die neugeborenen, drei Tage alten NOD/SCID Mäuse wurden
einer reduzierten Bestrahlung von 1,2Gy vor Transplantation ausgesetzt.
CD34
+
Stammzellen wurden dem Protokoll entsprechend aufgetaut, in PBS aufgenommen und
Zellzahl und Viabilität bestimmt.
2.2.3.1 Intravenöse Injektion von CD34
+
Stammzellen
Die Injektion von humanen Zellen erfolgte intravenös in die Schwanzvene in einem Gesamtvolumen
von 200 µl. 2x10
5
CD34
+
Zellen wurden in NOD/SCID oder NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse appliziert. Eine
Stimulation der Zellen wurde in einem Experiment mit 100ng/ml SCF 24h vor der Transplantation
durchgeführt. Blut wurde NOD/SCID Mäusen 1, 5 und 20 min nach Injektion abgenommen, um
zeitabhängig humane Zellen mittels Durchflusszytometrie zu analysieren. Der Anteil an humanen
Zellen im Knochenmark und Milz von NOD/SCID Mäusen wurde 1, 14, 28 und 56 Tage nach i.v.
Injektion von CD34
+
Zellen durchflusszytometrisch untersucht. NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen wurden
56 Tage nach Transplantation getötet und Knochenmark, Milz, Blut, Thymus und Leber entnommen.
2.2.3.2 Organspezifische, intrahepatische Transplantation von Nabelschnurblutzellen
Die intrahepatische Transplantation von Nabelschnurblutzellen wurde sowohl in neugeborene (3
Tage alt) als auch adulte NOD/SCID Mäuse durchgeführt. 1x10
5
CD34
+
Zellen bzw. 1x10
7
mononukleare Zellen wurden in einem Transplantationsvolumen von 50µl aufgenommen und
neugeborenen Mäusen durch die Bauchdecke hindurch direkt in die Leber injiziert. Adulte Mäuse
mussten zuvor mit 0,4ml Hypromidate/20g Maus narkotisiert, die Felldecke mit einem kleinen
Schnitt geöffnet und die Zellsuspension langsam in die Leber injiziert werden. 3min, 14d, 42d und
70d nach intrahepatischer CD34
+
Transplantation wurde das Knochenmark, Leber und Milz
entnommen und der Anteil humaner Zellen mittels qRT-PCR oder FACS-Analyse bestimmt.
Histologisch, molekularbiologisch oder immunchemisch wurde die Leber 5min, 1d, 5d und 42d nach
MNC-Zelltransplantation untersucht.
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 36
2.2.3.3 Stammzell-Transplantationen in Leberschadensmodelle immundefizienter Mäuse
CD34
+
Stammzellen wurden dem Protokoll entsprechend aufgetaut, die Zellzahl bestimmt und 2x10
5
CD34
+
Zellen in einem Transplantationsvolumen von 50µl bei intrahepatischer (i.hep.) Tx und 200µl
bei intravenöser (i.v.) Applikation aufgenommen. Juvenile NOD/SCID Mäuse hatten ein Alter von drei
Tagen, alle übrigen Mäuse waren 6-8 Wochen zu Versuchsbeginn alt. Vier Stunden vor
Stammzelltransplanation wurden die juvenilen Mäuse mit 1 Gy und die adulten Mäuse mit 1,6 Gy
einer γ–Quelle bestrahlt.
Schema der Stammzelltransplantationen in immundefizienten Mäusen mit experimentellem
Leberschaden ist in Tabelle 1 dargestellt und der jeweilige Schaden wie oben beschrieben induziert
worden.
Tabelle 1 Design der unterschiedlichen Stammzelltransplantationsversuche in immundefizienten Mäusen mit induziertem
Leberschaden
Mäusestamm
Behandlung Analyse
Chemisch-
induzierter
Schaden
CD34
+
Tx CCl
4
HGF
NOD/SCID d-28 i.v. d0 d1,2,3 d56
NOD/SCID/IL2Rγ
null
d-28 i.v. d0 d1,2,3 d28
NOD/SCID juvenil d-70 i.hep.
d0 d1,2,3 d56
Futterdiät
Futterdiät+0,075%
Ethionin CD34
+
Tx
NOD/SCID/IL2Rγ
null
d-21 bis d0 d0 i.hep.
d84
Partielle
Hepatektomie
Monocrotalin-Gabe
CD34
+
Tx PHx CD34
+
Tx
NOD/SCID/IL2Rγ
null
d28, -d21, -d14, -d7 d0 d0 i.hep.
d56
NOD/SCID juvenil d-56 i.hep.
d0 d56
2.2.3.4 Subcutane Transplantation von embryonalen Stammzellen
Die murinen embryonalen Stammzellen (129/SVE, Chemicon, USA, #CMTI-1) wurden in der Charité
(AG Exp. Chirurgie) kultiviert, enzymatisch gewonnen und im 3D-Reaktor einer Expansion
unterworfen. Die in vivo Eigenschaften der mES wurden vor und 3 Tage nach Bioreaktorexpansion
vergleichend in 129/SVE Mäusen getestet. Pro Maus wurden 1,5x10
7
mES gemischt 1:1 mit Matrigel
(BD, Heidelberg) subcutan transplantiert, das Wachstum der Teratome zweimal wöchentlich
bestimmt und 56 Tage nach Transplantation die Teratome entnommen. Vergleichend zum syngengen
129/SVE Modell wurden 1x10
7
R1 Zellen in NOD/SCID Mäuse subcutan transplantiert, nach 17 Tagen
die Teratome entnommen und für histopathologische Untersuchungen in 4%igem Formalin
eingebettet.
Phänotypisch undifferenzierte, mechanisch oder enzymatisch zerkleinerte Zellkolonien der humanen
embryonalen SA002-Stammzelllinie wurden mit einer Zellzahl von 1x10
6
, 1:1 mit Matrigel gemischt,
in einem Gesamtvolumen von 50µl subcutan weiblichen NOD/SCID Mäusen transplantiert. Das
Körpergewicht und der Gesundheitszustand der Mäuse wurde regelmäßig geprüft und das
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 37
Tertomwachstum 2x wöchentlich gemessen. 50 Tage nach Transplantation wurden die Teratome
entnommen, gewogen, fotografiert und halbiert. Ein Hälfte wurde für die histopathologische
Untersuchung in 4%igem Formalin (Sigma Aldrich, Steinheim) eingebettet. Die andere Hälfte wurde
für Genexpressionanalysen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80°C gelagert. Im 3D-
Bioreaktor für 48 Tage differenzierte SA002-Zellen wurden 1:1 mit Matrigel gemischt und 2,9x10
6
Zellen subcutan NOD/SCID Mäusen transplantiert. Das Teratomwachstum wurde wöchentlich
gemessen, nach 58 Tagen das Teratom entnommen und in 4% Formalin fixiert.
2.2.4 Explantation von murinen Organen und Gewinnung von Zellsuspensionen
Die Explantation von Leber, Milz, Knochenmark und/oder Thymus von immundefizienten Mäusen
erfolgte an den angegebenen Tagen. Hierzu wurden die Mäuse mittels zervikaler Dislokation getötet
und anschließend die Bauchhöhle schnellstmöglich mit einer Schere unter einer Sterilwerkbank
geöffnet und die Organe aseptisch entnommen. Die Organe wurden in vier gleichmäßig große Stücke
geteilt. Ein Stück wurde für histopathologische Untersuchungen in 4%igem Formalin (Sigma-Aldrich,
Steinheim) fixiert, zwei Stücke für PCR-Untersuchungen in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
anschließend bei -80°C gelagert und aus einem Stück wurde für durchflusszytometrische Analysen
eine Zellsuspension gewonnen. Hierzu wurde das jeweilige Stück auf ein steriles Zellsieb mit 70µm
Porengröße (BD Falcon
TM
, Heidelberg) gegeben und mit PBS (Invitrogen, Karlsruhe) suspendiert.
Knochenmarkszellen wurden durch PBS-Spülung des Markraums eines Femurs mit einer Kanüle (26G)
gewonnen und mit einer Spritze resuspendiert, bis eine homogene Einzelzellsuspension entstand. Die
Hälfte der Zellsuspension wurde anschließend mit Antikörpern markiert und durchflusszytometrisch
untersucht. Der zweite Teil der Knochenmarkssupension wurde zentrifugiert (5min, 200xg), das Pellet
schockgefroren und bei -80°C für molekularbiologische Untersuchungen gelagert.
2.3 Immunologische Methoden
2.3.1 Bestimmung von Oberflächenmolekülen mittels Durchflusszytometrie
In der Arbeit wurde die durchflußzytometrische Analyse benutzt, um den Anteil humaner Zellen in
murinen Organen nach Stammzelltransplantation zu bestimmen und die Expression von
Stammzelladhäsionsmolekülen auf adulten Stammzellen in vitro zu untersuchen.
Für die Stammzell-Analyse in vitro wurde der anti-CD34 PE konjugierte monoklonale Antikörper
(clone 581) in Verbindung mit FITC-konjugierten CD45-Antikörper (clone HI30) oder CD38-Antikörper
(clone HIT2, alle BD, Heidelberg) eingesetzt und dem Protokoll des Herstellers gefolgt.
Die gewonnenen Zellsupensionen von Knochenmark, Milz, Thymus oder Leber nach Transplantation
von Stammzellen in immundefiziente Mäuse wurden mit einer Zellzahl von 1x10
6
Zellen mit dem
humanspezifischen Antikörper HLA-A,B,C (HLA-I, clone G46-2.6, BD, Heidelberg) entsprechend dem
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Protokoll des Herstellers markiert. Nach der intrahepatischen Transplantation von MNCs und CD34
+
Zellen in NOD/SCD Mäuse wurden zusätzlich die hämatopoetischen, linienspezifischen Marker CD33
(clone WM53), CD38 (clone HIT2), CD3 (clone UCHT1), CD19 (clone HJB19), CD34 (clone 581), CD4
(clone RPA-T4) und CD8 (clone SK1) bestimmt (alle BD, Heidelberg). Zur Ermittlung von Ovalzellen
nach Induktion einer Fettleber wurde der Anteil an murinen Sca-1 (clone D7, BD) bestimmt.
Um eine ausreichende statistische Sicherheit zu gewährleisten, wurden für die FACS-Messungen 10
6
Zellen innerhalb einer Messung akquiriert von 3-9 Mäusen pro Versuchsansatz. Die Analyse der
durchflußzytometrisch gemessenen Zellpopulation erfolgte durch Dot-Plot-Auftragung (FSC gegen
SSC) und Eingaten der Population in der Density-plot-Auftragung (FL1 gegen FL2).
2.3.2 Analyse der Zellzyklus-Phasenverteilung
Der relative DNA-Gehalt und die Verteilung der Zellen in den einzelnen Zellzyklus-Phasen erfolgte
nach einer Methode von Nicoletti et al. (1991). Propidiumjodid diente als interkalierender DNA-
Farbstoff und lieferte Informationen zum Ploidie-Status der Zellen. Die Bestimmung und Auswertung
der Zellzyklus-Phasen erfolgte am Durchflusszytometer und wurde im Histogramm als Einparameter-
Analyse von FL2-A gegen die Counts dargestellt.
Zu den adulten Stammzellen von mindestens 1 x 10
5
Zellen pro 500 µl in PBS wurden tropfenweise 4
ml 70% eisgekühlter Ethanol (Roth, Karlsruhe) zugesetzt, 60 min auf Eis fixiert und anschließend
zentrifugiert bei 200 x g, 4°C für 5min. Nach dem Waschen mit kalter PBS-Lösung und erneutem
Zentrifugieren wurde das Zellpellet mit 500 µl 0,1% Triton-PBS-Lösung (Ferak, Berlin) , 400µg/ml
RNAse und 50µg/ml Propidiumjodid (beides Sigma, Taufkirchen) für 30 min im Dunkeln bei
Raumtemperatur inkubiert. Die Quantifizierung der fluoreszierenden DNA von wenigstens 10
4
Zellen
erfolgte am FACSCalibur-Durchflusszytometer mit Hilfe der, von Becton Dickinson bereitgestellten
CellQuest Software. Die Ergebnisse wurden als Prozent positive Zellen in der subG
1
-, G
0
/G
1
-, S- bzw.
G
2
/M-Phase angegeben.
2.3.3 Immunzytochemischer Nachweis von Pluripotenzmarkern auf humanen embryonalen
Stammzellen
Die kultivierten SA002-Stammzellkolonien wurden in zeitlichen Abständen auf ihre Pluripotenz
geprüft. Das Medium wurde abgenommen, die Zellen mit PBS gewaschen und anschließend mit
eiskaltem Methanol (Sigma-Aldrich, Steinheim) für 10min fixiert und mit PBS gewaschen. Mit den
verschiedenen Primärantikörpern SSEA-4 (clone MC-813-70, 1:200, Millipore, Schwalbach), TRA-1-60
(1:50), TRA-1-81 (1:50) und Oct-4 (1:100) (alle Santa Cruz, ) wurde die Zellen bei 4°C über Nacht
inkubiert. Es wurde mehrmals mit PBS gewaschen und für 1h mit dem sekundären Antikörper (Cy2-
konjugiert goat anti-mouse IgM bzw. Cy3-konjugiert goat anti-mouse IgG; beide 1:100 verdünnt,
Dianova, Hamburg) inkubiert. Für die TRA-1 Färbung wurde der Cy2 und für die SSEA4 und Oct-4
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 39
Färbung der Cy3 Antikörper eingesetzt. Vor der Analyse im Fluoreszenzmikroskop von Leica wurden
die Zellen mehrmals gewaschen und mit PBS bedeckt.
Zur Bestimmung der Alkalischen Phosphatase-Aktivität wurde ein Kit von Vector Laboratories
verwendet und den Herstellerangaben gefolgt.
2.3.4 Immunhistologischer Nachweis von humanen Zellen in xenogenen Tumoren
Mit Hilfe eines Kryotoms wurden Schnitte (5 µm) von gefrorenen Gewebeproben angefertigt. Diese
wurden auf Glasobjektträger für histologische Untersuchungen gebracht und anschließend
getrocknet. Die Tumorschnitte wurden mit 0,04% Glutaraldehyd für 30min fixiert und die
unspezifischen Bindungsstellen wurden mit Peroxidase für 5min und mit 0,2% BSA inkl. 0,25%
Gelatine für 30min blockiert. Die Proben wurden bei Raumtemperatur für 1 Stunde mit
humanspezifischen CD3 (clone UCHT1, Dako, ) inkubiert und die weitere Färbung wurde mit dem
LSAB-2-System-HRP von Dako entsprechend des Herstellerprotokolls durchgeführt. Die
Gegenfärbung wurde mit Hämatoxylin erreicht.
2.3.5 Immunfluorenz humaner Zellen in muriner Leber
5µm Leberschnitte wurden mit 4%igem Formalin 10min bei Raumtemperatur (RT) fixiert. Endogenes
Maus-IgG wurde mit 1%BSA+5% Ziegenserum in TBS für 30min bei RT blockiert. Der primäre
Antikörper anti-human HLA-I (Acris, ) 1:100 mit Blockierungslösung verdünnt, wurde 90min auf dem
Leberschnitt inkubiert und anschließend mit TBS gewaschen. Der sekundäre Antikörper Cy3 (Zymed,
Berlin) wurde 1:100 in 5% Ziegenserum für 30min mit der Probe inkubiert und anschießend mit TBS
gewaschen. Eingebettet wurde die Probe mit Vectashield Mountin Medium mit DAPI (Vector
Laboratories, USA).
2.3.6 Pathohistologische Untersuchung von Teratomen
Zur Beurteilung der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen in vivo wurden die gebildeten
Teratome auf Zellen der drei Keimblätter mittels H&E-Färbung untersucht.
In einem Mikrotom wurden von in Formalin eingebetteten Teratomen und Lebern 5µm Schnitte
angefertigt und auf Objektträger gezogen. Die Schnitte wurden entparaffiniert (10min in 100% Xylol)
und in einer absteigenden Alkohlreihe (je 2min 100%, 90%, 70% Ethanol) rehydriert. Die Färbung der
Zellkerne erfolgte mit Hämatoxylinlösung (0,1% für 2min) und des Zytoplasmas mit Eosin (0,1% für
2min). Die histologischen Untersuchungen wurden von einem Pathologen (W. Haider, Berlin)
durchgeführt.
2.3.7 Serumanalyse
Der Immunstatus von NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse wurde durch quantitative
Immunglobulin-Bestimmung des Serums mittels ELISA-Technik überprüft. Blut der Mäuse wurde
entnommen, gerinnen gelassen, das Serum durch Zentrifugation (200xg, 5min) separiert und bei -
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20°C gelagert. Mit 5µg/ml Rabbit-Anti-Maus-Immunglobulin (Dako) werden die Platten beschichtet,
1:10 verdünnte Mausseren für 2h zugegeben und mit Peroxidase-konjugierten Rabbit Anti-Maus-
Immunglobulin (Dako) für 1h inkubiert. Die Farbreaktion wird nach Zugabe von Phenylendiamin
(Dako) bei 450nm gemessen.
Die Serumanalyse der leberassoziierten Enzyme Aspartat- und Alanin-Transaminase zur Bestimmung
eines Leberschadens in immundefizienten Mäuse wurde vom Institut für Labormedizin des HELIOS-
Klinikums (Berlin-Buch) durchgeführt.
2.3.8 Karyotyp-Analyse der SA002-Stammzelllinie
Die Analyse und Ermittlung des Karyogramms der SA002-Stammzelllinie wurde vom Institut of
Medical Molecular Diagnostics GmbH, Berlin durchgeführt. SA002 in Passage 41 wurde nach
23maliger mechanischer Passagierung analysiert.
2.4 Molekularbiologische Methoden
2.4.1 RNA-Isolierung
RNA wurde aus den kultivierten CD34
+
Zellen, SA002 Zelllinie und den Teratomen isoliert und
anschließend Expressionsprofile mittels quantitativer Real-Time PCR oder Arraytechnologie
gewonnen.
Die RNA der kultivierten Zellen wurde mit Hilfe des Qiagen Micro Kits isoliert. Die Teratome wurde
durch eine Gewebelyse (TissueLyser II, Qiagen, Hilden) aufgespalten, homogenisiert mit dem
QIAgenshredder und abschließend die Gesamt-RNA mit dem RNeasy Kit (Qiagen, Hilden) isoliert.
Nach Herstellerangaben (Qiagen, Hilden) wurden die Zellen zunächst mit einem Lysepuffer behandelt
und die RNA aus dem Zelllysat über eine chromatographische Säule isoliert. Die RNA wurde mit
RNase-freiem dH
2
O eluiert und bei -80°C gelagert.
Die Konzentration und die Reinheit der RNA wurden mit Hilfe des Nanodrop-Spektrophotometer
(Peqlab, Erlangen) bestimmt. Die Qualität der RNA für die BeadArray-Technologie wurde durch eine
zusätzliche native Agarosegelelektrophorese geprüft.
2.4.2 Analyse des Expressionsprofils mittels quantitativer Real-Time PCR
Die gewonnene Gesamt-RNA wurde mittels Reverse Transkriptase (RT)-Kit (Applied Biosystems,
Darmstadt) in cDNA umgeschrieben. Die cDNA-Synthese wurde den Herstellerangaben entsprechend
durchgeführt. Die Endkonzentration der RNA betrug im 10µl Ansatz 200ng.
Die cDNA wurde mit Hilfe der quantitativen RT-PCR auf die Genexpression einzelner Gene hin
untersucht. Für die Durchführung wurde der TaqMan
TM
verwendet. Der TaqMan Universal Master
Mix und Primer Assay on Demand (Tabelle 2)(Applied Biosystems, Darmstadt) wurden eingesetzt. Es
wurde die in Tabelle 2 dargestellten Gene und als Referenzgen GAPDH betrachtet. Die Ansätze
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 41
wurden für 10min bei 95°C denaturiert und dann 45 Zyklen (15 sec 95°C, 60 sec 60°C) unterzogen. Ein
PCR-Ansatz bestand aus 2µl cDNA-Probe, 10µl Universal Master Mix, 1µl Primermix und 7µl Wasser.
Tabelle 2 Verwendete Oligonukleotide
Marker Gensymbol
Herstellers Marker Gensymbol
Herstellers
AFP AFP Hs00173490_m1 CK19 KRT19 Hs00761767_s1
ALB ALB Hs00609411_m1 E-Cadherin CDH1 Hs00170423_m1
Cx32 GJB1 Hs00702141_m1 GADPH GADPH Hs99999905_m1
Cx43 GJA1 Hs00748445_s1 GATA 4 GATA4 Hs00171403_m1
CD34 CD34 Hs00156373_m1 HNF3β FOXA2 Hs00232764_m1
C/EBPα C/EBPA Hs00269972_s1 HNF4α HNF4A Hs00230853_m1
CK8 KRT8 Hs01630795_s1 Oct-4 POU5F1 Hs01895061_u1
CK18 KRT18 Hs01920599_gh Sox17 SOX17 Hs00751752_s1
Die Auswertung der Ergebnisse erfolgte nach der relativen Quantifizierung. Es wurde die Differenz (∆
c
t
) aus dem vorher festgelegten Schwellenwert (c
t
; Threshold Cycle= Schwellenwert-Zyklus) des
untersuchten Gens und dem Referenzgen GAPDH gebildet (∆c
t
= c
t(Gen)
– c
t(GAPPDH)
). Das
Expressionsniveau wurde entsprechend der Tabelle 3 beurteilt.
Tabelle 3 Auswertungsmatrix der ermittelten ∆ct zur Bestimmung des Expressionsniveaus der untersuchten Gene
∆ct Bewertung Expressionsniveau
0,0 - 4,0 ++++ sehr hoch
4,1 - 8,0 +++ hoch
8,1 - 12,0 ++ mittel
12,1 - 16,0 + gering
2.4.3 Microarray basierte Expressionsprofilanalyse
Mit Hilfe der BeadArray-Technologie wurden die CD34
+
Zellen aus Nabelschnurblut sowie die in vivo
gebildeten Teratome auf die Expression einzelner Gene untersucht. Es wurde der Sentrix HumanRef-
8 v2 Expression BeadChip (Illumina, USA) eingesetzt.
Die Durchführung der isolierten RNA (Proben siehe Tabelle 4) erfolgte nach dem von Illumina
vorgegebenen Protokoll und unter Verwendung der empfohlenen Kits (Illumina TotalPrep RNA
Amplification Kit, USA). 300ng RNA wurde zur Generierung von Biotin-markierter cRNA eingesetzt.
Die Hybridisierung, Waschen, Cy3-Streptavidin-Färbung (Amersham Biosciences und Scannen wurde
an der Bead Station 500 (Illumina, USA) durchgeführt. Entsprechend den Herstellerangaben wurden
die Reagenzien eingesetzt und den Protokollen gefolgt.
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Tabelle 4 Eingesetzte Proben für die Genexpressionsprofil-Analyse
Probenname
Ursprung der RNA Probe
CD34 a CD34+ Stammzellen, nicht-kultiviert (Ausgangspopulation)
CD34 b
CD34+ Zellen kultiviert im
StemSpan
-
Medium
(StemCellTechnologies)
+ 100ng/ml
SCF + 20ng/ml HGF (beides Chemicon) für 10 Tage
CD34 c
CD34+ Zellen kultiviert im konditioniertem Ghera
r
di
-
Medium
(Biochrom, Berlin)
+
100ng/ml SCF + 20ng/ml HGF für 10 Tage
CD34 d
CD34+ Zellen kultiviert
im konditioniertem Sautin
-
Medium
(Biochrom, Berlin)
+
100ng/ml SCF + 20ng/ml HGF für 10 Tage
Teratom A Teratomwachstum für 69 Tage (MV8054-B2)
Teratom B Teratomwachstum für 50 Tage (MV8479-A2)
Teratom C Teratomwachstum für 50 Tage (MV8479-A3)
Teratom D Teratomwachstum für 50 Tage (MV8479-A4)
hESC-1 Undiff. hESC (Stammzelllinie SA002; Passage 35) von einer MEF Kokultur
hESC-2 Undiff. hESC (Passage 36) in Kokultur mit humanen Vorhautfibroblasten; kultiviert in
VitroHES Medium (Vitrolife, Schweden) + 10ng/ml bFGF, Ausgang für Teratom B-D
hESC-3
Undiff.
hESC
(Passage 53) in
Kokult
u
r
mit humanen Vorhautfibroblasten;
kultiviert in
VitroHES Medium (Vitrolife, Schweden) + 10ng/ml bFGF
hESC-4 SCED Kultur (Passage 56) kultiviert in Standard Medium (DMEM/F12, 20% Knockout
SerumReplacer, 1% NEAA, 1% GlutaMax, 0,1mM β-Mercaptoethanol, 10 ng/ml bFGF)
Die Quantile normalizierte RAW Datenfiles wurden für alle Proben mit der BeadStudio V2 Software
(Illumina, USA) generiert und das Cluster Dendrogramm und die Scatterplots gewonnen. Die
funktionelle Anreicherungsanalyse wurde durchgeführt mit DAVID (http://david.abcc.ncifcrf.gov). Die
Veränderung (Fold Change oder ratio) wird ermittelt aus der Division des AVG_Signal am Tag 10
durch AVG_Signal am Tag 0. Ein Fold-Change > 1.0 bedeutet höhere Expression am Tag 10; =1.0 keine
Veränderung und < 1.0 geringere Expression am Tag 10 im Vergleich zum Tag 0. Der p-Wert gibt die
Häufigkeit und Stärke von Genen innerhalb einer GO-Term Gruppe an. Je kleiner der p-Wert, desto
häufiger und stärker werden Gene dieser Gruppe exprimiert. Subjektive Bewertung der mittleren
Signalstärke zum Vergleich mit der qRT-PCR: AVG_Signal >11 +; >20 ++; >100 +++; >1000 ++++
2.4.4 DNA-Isolierung
Die Isolierung genomischer DNA aus Mausgewebe bzw. Mausknochenmarkzellen erfolgte mittels des
QIAamp-Blood- (für 10
7
Zellen) oder QIAamp-Tissue-Systems (für 25 mg Gewebe) (QIAGEN, Hilden).
Es wurde entsprechend der Angaben des Herstellers die DNA isoliert. Nach vollständiger Lyse des
Gewebes wird DNA selektiv an eine Silicamatrix gebunden, anschließend gewaschen und mit Wasser
eluiert. Die so gereinigte DNA wurde bei -20°C gelagert und nach Konzentrationsbestimmung und -
einstellung direkt in der PCR eingesetzt.
2.4.5 Nachweis menschlicher DNA im Mausgewebe mittels humanspezifischer PCR
Der Nachweis humaner Zellen im Mausleber erfolgte durch spezifische PCR-Amplifikation eines etwa
850 bp umfassenden Fragmentes der α-Satelliten-DNA des humanen Chromosoms 17. Die zur PCR
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 43
verwendeten Primer entsprechen dem von Becker et al. (2002) beschriebenen Primerpaar
17α1/17α2. Der 5´Primer (5' GGG ATA ATT TCA GCT GAC TAA ACA G 3') umfasst die Positionen 15-
39 und der 3´Primer (5' TTC CGT TTA GTT AGG TGC AGT TAT C 3') die Positionen 867-891 der Sequenz
HSSATA17 (GenBank-No. M13882). Für die PCR wurden die AmpliTaq-Gold-Polymerase sowie
entsprechende PCR-Reagenzien (Applied Biosystems, Darmstadt) verwendet. Es werden jeweils
200µM von jedem Nukleotid, 250nM von jedem Primer, 2mM MgCl
2
sowie 250ng genomische DNA
eingesetzt. Nach einer initialen DNA-Denaturierung und Taq-Aktivierung bei 94°C für 10 min folgen
35 Zyklen (1 min bei 94°C, 1 min bei 60°C). Abschließend folgte eine Elongation von 10 min bei 72°C.
DNA Proben eine humaner MNC als Positivkontrolle und Lebergewebe einer nicht-transplantierten
NOD/SCID Maus als Negativkontrolle wurden mitgeführt. Die Auswertung erfolgte durch
Auftrennung der PCR-Produkte im Ethidiumbromid-gefärbten 1,75%igen Agarosegel und Bewertung
der Bandintensitäten. Ein plus entspricht einer schwachen Bande und drei +++ einer starken Bande
vergleichbar mit der Positivkontrolle.
2.4.6 Quantitative Bestimmung humaner DNA im Mausgewebe und -blut mittels quantitativer
RT-PCR
Die quantitative Bestimmung humaner DNA im Mausblut oder -gewebe nach
Stammzelltransplantation erfolgte durch eine TaqMan basierte Real-Time PCR (Becker et al., 2002).
Zur Amplifikation des 467 bp langem Fragment der α-Satelliten-DNA des humanen Chromosoms 17
wurde der 3´Primer (5' AAA CGT CCA CTT GCA GAT TCT AG C 3') und die TMsat-Primer (5' 6FAM-CAC
GTT TGA AAC ACT CTT 3'und 5' TamraT TTG CAG GATC p 3') eingesetzt. Die PCR wurde im TaqMan
(Perkin Elmer) unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben durchgeführt. Zusätzlich
enthielt der PCR-Mix 10nM der TaqMan-Probe und es fand keine abschießende Elongation statt.
Serielle Verdünnungsstufen der humanen mononuklearen Zellen aus Nabelschnurblut dienten zur
Generierung der TaqMan-Kalibierungs-Kurve.
2.4.7 DNA-Genotyping der immundefizienten NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
Die genetische Stabilität der NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse wurde bei allen Tieren überprüft. Der IL2Rγ
Rezeptor ist durch die Insertion eines Vektors mit Neomycin-Resistenz mutiert und wird in diesem
Mausstamm nicht exprimiert. Die zur PCR verwendeten Primer detektieren Neomycin und/oder den
IL2Rγ, wobei das Neomycin-Gen in den NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen vorhanden ist und das IL2Rγ-Gen
abwesend ist.
Für die PCR wurden die Tag-Gold-Polymerse sowie entsprechende Reagenzien (Applied Biosystems
GmbH, Weiterstadt) verwendet. Es wurden jeweils 200µM von jedem Nukleotid, 500nM von jedem
Neomycin-Primer (5‘ CTT GGG TGG AGA GGC TAT TC 3‘ und 5‘ AGG TGA GAT GAC AGG AGA TC 3‘),
750nM von jedem IL2Rγ-Primer (5‘ CTT TAT TGA TAA CGA TCT ATC CCT CAC CC 3‘ und 5‘ CTC CAC TCT
GCA GAG TCT ATG GAA TCC 3‘), 2mM MgCl
2
sowie 50ng DNA eingesetzt. Nach einer initialen DNA-
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M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 44
Denaturierung und Taq-Aktivierung bei 94°C für 10 min folgten 15 Zyklen(20 sec bei 94°C, 30 sec bei
64°C, 35 sec bei 72°C) und weitere 30 Zyklen (92°C für 20 sec, 30 sec bei 58°C und 35 sec bei 72°C).
Abschließend folgte eine Elongation von 2 min bei 72°C. Die Auswertung erfolgt durch Auftrennung
der PCR-Produkte im Ethidiumbromid-gefärbten 1.5%igen Agarosegel.
Als Positivkontrolle wurden DNA-Proben von CD-1, NMRI, und NOD/SCID mitgeführt. Diese zeigten
eine Bande von 500bp, die dem IL2Rγ-Gen entspricht, die Neomycin-Bande von 280bp ist abwesend,
da diese Mäuse auch keinen Vektor für Neomycin in sich tragen.
2.5 Elektronenmikroskopische Untersuchung
Ultrastrukturell wurden CD34
+
und SA002 Stammzellen undifferenziert und anschließend nach
Kultivierung mit konditioniertem Sautin-Medium und in Kokultur mit AML12-Zellen untersucht.
Auf einer Matrigel-beschichteten Lumox-Platte (Greiner Bio-One, Frickenhausen) wurden die CD34
+
Stammzellen zwei Tage in StemSpan und die hES auf einer MEF-Feederschicht herangezogen und das
elektronenmikroskopische Bild undifferenzierter Stammzellen aufgenommen. Die Wirkung von
hepatisch konditioniertem Sautin-Medium auf die Morphologie von CD34
+
und humanen
embryonalen Stammzellen wurde bewertet. Die Kokultur der Stammzellen mit den murinen AML12-
Zellen wurde wie oben beschrieben durchgeführt. Die Analyse der kultivierten Zellen erfolgt am Tag
7. Die kultivierten Zellen wurden mit PBS gewaschen und mit dem Fixierer (2% Formalin frisch aus
Paraformaldehyd , 1% Glutaraldehyd (beides Sigma-Aldrich, Steinheim) in 0,1 M Phosphatpuffer) für
zwei Stunden inkubiert. Die weitere Aufarbeitung der Zellen und die anschließende Analyse am
Elektronenmikroskop wurden von der Arbeitsgruppe von Frau Dr. Erdmann am Max-Delbrück-
Centrum (Berlin-Buch) durchgeführt.
2.6 Dye Transfer zur Untersuchung der Zell-Zell-Wechselwirkung
Der Austausch von Stoffen zwischen den CD34
+
Zellen und AML12-Zellen wurde mit fluoreszierenden
Farbstoffen im Durchlusszytometer gemessen. Die CD34
+
Zellen wurden mit dem
zellmembranständigen, rot-fluoreszierenden Farbstoff PKH26 (Sigma-Aldrich, Steinheim) markiert.
1x10
6
Zellen wurden in 100µl Diluent C resuspendiert und mit 100µl 4µM PKH26 5min bei 25°C
inkubiert. Die Färbereaktion wurde mit 1ml FBS (Biochrom, Berlin) für 1min gestoppt und 2ml DMEM
Medium hinzugegeben. Die Zellsuspension wurde dreimal mit Medium gewaschen und 10min bei
400xg, 25°C zentrifugiert. Die AML12-Zellen wurden mit CalceinAM markiert. Für jede CalceinAM-
Färbung wurden trypsinisierte, mit PBS gewaschene und in 1ml vorliegende 5x10
6
AML12-Zellen
eingesetzt. Zu der Zellsuspension wurde 10µl einer 250µM CalceinAM-Lösung gegeben und 30min
bei RT im Dunkeln inkubiert. Mit der 10fachen Menge an Zellkulturmedium wurde die Reaktion
gestoppt und die Zellen dreimal gewaschen. Die CalceinAM-markierten Zellen wurden in einer
Zellzahl von 2x10
5
/ Well in eine 24-Well-Platte eingesät und 4h bei 37°C kultiviert. Anschließend
M a t e r i a l u n d M e t h o d e n 45
wurde das Medium abgenommen und 5x10
4
/Well PKH26-markierte CD34
+
Zellen in
Zellkulturmedium hinzugeben und mit den AML12-Zellen kokultiviert.
Die PKH26-markierten Stammzellen wurden nach 24h durch vorsichtiges Abspülen abgenommen, mit
PBS gewaschen und anschließend am FACS-Calibur (BD, Heidelberg) untersucht. Als Negativkontrolle
dienten nicht-markierte und markierte, nicht-kokultivierte CD34
+
Zellen.
CD34
+
Zellen, die von den AML12-Zellen CalceinAM durch direkten Kontakt aufgenommen haben,
wurden durchflusszytometrisch als doppelt-positive PKH26+ und CalceinAM+ Zellen detektiert, im
Density Plot eingegatet und quantifiziert.
2.7 Video Imaging
Zur „Echtzeit“-Betrachtung von Zellen in einem Mikroskop mit computergestützter Technologie ist
eine Markierung der Zellen mit fluoreszierendem Farbstoff erforderlich. Die CD34
+
Zellen wurden mit
PKH26 markiert wie im Kapitel 2.6 beschrieben. Die AML12-Zellen der Passage 25 wurden 1h bei 37°C
mit 20nmol des grünen-fluoreszierenden 5-Chloromethylfuorescein diacetate (CMFDA, Invitrogen,
Steinheim) inkubiert. 3x10
5
/Well CMFDA-markierte AML12-Zellen wurden in eine 24-Well-Platte
eingesät und für 24h anheften gelassen. In einem parallelen Scratch-Assay wurden der konfluente
Rasen der AML12-Zellen mit einer Pipettenspitze unterbrochen. 1,5x10
5
CD34
+
PKH26-markierte
Zellen wurden in Stammzellmedium hinzugegeben. Alle 5min wurden Durchlicht- und
Fluoreszenzaufnahmen der kokultivierten Zellen unter dem inversen Mikroskop (Axio Observer) mit
einem 20x LD Achroplan Objektiv von der AxioCamMR-Kamera mit der AxioVision-Software (alles
Carl Zeiss MicroImaging) aufgenommen. Über einen Zeitraum von 24h wurden die Zellen beobachtet
und Bilder aufgenommen.
2.8 Statistische Auswertung
Im Ergebnissteil dieser Arbeit wurden für alle Messwerte, im Falle von Drei- und
Mehrfachbestimmungen, der Mittelwert und der mittlere Fehler der Standardabweichung (SEM)
angegeben. Die Berechnung des Standardfehlers des Mittelwertes erfolgte nach der Gleichung:
(
)
( )
n
nn
xxn
SEM 1
2
2
−
−
=
∑ ∑
Die vorgestellten Daten repräsentieren Mittelwerte aus wenigstens 3 Einzelversuchen (n) und sind in
den entsprechenden Abbildungen und Legenden angegeben.
Der Student`s t-Test für gepaarte Daten wurde verwendet für die Signifikantprüfungen. Als signifikant
wurde ein Unterschied bezeichnet, wenn die Irrtumswahrscheinlichkeit kleiner als 5% (p<0,05) war.
Alle Daten wurden mit dem Statistikprogramm STATISTICA ausgewertet.
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E r g e b n i s s e 46
3 Ergebnisse
3.1 In vitro Charakterisierung und Differenzierungsinduktion von CD34
+
Zellen
3.1.1 Charakterisierung undifferenzierter, nicht-kultivierter CD34
+
Stammzellen
Zur Gewinnung humaner CD34-positiver Stammzellen aus Nabelschnurblut wurden die
Blutlymphozyten durch Dichtegradientenzentrifugation auf Ficoll-Paque isoliert und mittels
MagnetoBead Technik (Miltenyi) die gereinigten Stammzellen isoliert. Es wurde das Verfahren zur
direkten Selektion der CD34 Zellisolierung gewählt. Mit der angewendeten MagnetoBead-Isolierung
der CD34
+
Zellen betrug der Anreicherungsfaktor 140 und die mittlere Ausbeute lag bei 0,47%
angereicherte CD34
+
Zellen aus Nabelschnurblut. Aus n=30 Ansätzen wurde eine mittlere Reinheit
von 84,2% ± 1,7% berechnet, bewertet nach der durchflusszytometrischen Analyse der CD34 und
CD45 Markerexpression (Abbildung 5a). Die adulten CD34
+
Stammzellen wurden bezüglich
kontaminierender differenzierter hämatopoetischer Zellen mittels FACS Analyse geprüft und nur eine
sehr geringe Expressionsrate von linienspezifischen Differenzierungsmarkern, wie GlyA, CD15, CD7,
CD14 und CD71, gefunden. Der hämatopoetische Differenzierungsgrad der gereinigten CD34
+
Zellen
wurde durch die Bestimmung des hämatopoetischen Differenzierungsmarkers CD38 bestimmt. 84%
der CD34
+
Zellen exprimieren CD38, jedoch nur mit einer sehr geringen Fluoreszenzintensität (FI=11).
Die gewonnenen Stammzellen sind daher als im Wesentlichen undifferenziert, mit einem Übergang
zu wenig differenzierten hämatopoetischen Zellen zu beschreiben. Die Zellzyklusverteilung der
gereinigten Stammzellen wurde über den unterschiedlichen Zell-DNA-Gehalt durchflusszytometrisch
mittels Propidiumiodid bestimmt. Nach der Isolierung befanden sich ca. 90% der Zellen in der G0/G1
Zellzyklusphase (Abbildung 5b).
Abbildung 5 Charakterisierung von isolierten CD34+ Stammzellen aus Nabelschnurblut. Durchflusszytometrische Analyse
der Marker CD34 und CD45 zur Reinheitsbestimmung (a, Density Plot, eingegatet R2: 90,2% CD34
+
/CD45
+
Zellen) und der
Zellzyklusphasen (b, Histogramm, 89,1% G
0
/G
1
-Phase-Zellen). Elektronenoptische Darstellung undifferenzierter CD34
+
Zellen (c).
2µm
b
c
a
G
0
/G
1
E r g e b n i s s e 47
Die elektronenmikroskopisch untersuchten CD34
+
Stammzellen zeichnen sich durch ein großes Kern-
zu-Plasma-Verhältnis und ein rundes Erscheinungsbild aus. Vereinzelt bildeten sich kleine
Zellfortsätze und im Zellkern ist Euchromatin zu sehen (Abbildung 5c).
Unter Verwendung eines Panels von humanspezifischen Primern wurden mittels quantitativer RT-
PCR Analyse verschiedene RNA-Transkripte in CD34
+
Stammzellen untersucht (Tabelle 5). Die
hämatopoetischen CD34
+
Stammzellen weisen eine deutliche CD34 Markerexpression auf. Auch die
Transkripte für C/EBPα, Cytokeratin18 und E-Cadherin werden moderat exprimiert. Auf mittlerem
Niveau werden die Transkripte für das Gap Junction Protein Connexin43, das Cytokeratin19 und den
Pluripotenzmarker Oct-4 exprimiert. Um den möglichen Anteil von endodermalen Markern in den
isolierten CD34
+
Stammzellen zu bestimmen, wurde die Expression der frühen endodermalen Marker
wie SOX17, HNF3-β, α-Fetoprotein und den späten endodermalen, leberspezifischen Genen wie
HNF4-α, Albumin und GATA4 ermittelt. Die Expression dieser untersuchten Gene konnte nur
schwach oder gar nicht nachgewiesen werden. Die Gesamtgenomanalyse der CD34
+
Zellen wurde mit
der BeadArray Technologie von Illumina durchgeführt. Für die 15 ausgewählten Gene wurde eine
Übereinstimmung von 13 Genen gefunden (Tabelle 5). Keine Übereinstimmung konnte bei den
Genen KRT19 (Cytokeratin19) und POU5F1 (Oct-4) zwischen den Resultaten der beiden Methoden
gefunden werden.
Tabelle 5 Semiquantitative Bewertung der Genexpression von CD34
+
Stammzellen mit Real-Time RT-PCR (TaqMan
Genexpressionsassays, Applied Biosystems, n=3) im Vergleich zu Gesamtgenomanalyse mit BeadArray Technologie
(Illumina, n=2).
Gen Synonym Bedeutung RT-PCR BeadArray
CD34 CD34 Hämatopoetische Stammzelle ++++ ++++
SOX17 SOX17 Endodermspezifisch; geringe
hepatische Differenzierung
+ -/+
FOXA2 HNF3-β - -
AFP α-Fetoprotein
- -
CEBPA C/EBPα
Hohe Expression bei adulten
Hepatozyten
+++ +++
HNF4A HNF4-α -/+ -/+
ALB Albumin -/+ +
KRT18 Cytokeratin18
++/+++ ++
KRT8 Cytokeratin8 Zytoskelett; Zelladhäsion + +
GATA4 GATA4 Embryogenese - -
CDH1 E-Cadherin Zytoskelett; Zelladhäsion ++/+++ ++
GJB1 Connexin32 Gap Junction Protein -/+ -/+
GJA1 Connexin43 +/++ ++
KRT19 Cytokeratin19
Gallenepithelzellen +/++ -
POU5F1 Oct-4 Pluripotenz ++ -
Legende: qRT-PCR: ++++ ∆CT 0,0-4,0; +++ ∆CT 4,1-8,0; ++ ∆CT 8,1-12,0; + ∆12,1-16,0;
BeadArray: ++++ AVG>1000, +++ AVG>100, ++ AVG>20, + AVG>11
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E r g e b n i s s e 48
3.1.2 In vitro Differenzierungsinduktion von CD34
+
Stammzellen
Hämatopoetische CD34
+
Stammzellen haben sich aus dem mesodermalen Keimblatt entwickelt.
Unter Anwendung unterschiedlicher Differenzierungsprotokolle und Differenzierungsinduktoren in
vitro wurde das endodermale, hepatische Differenzierungspotential der Stammzellen aus
Nabelschnurblut geprüft. Folgende in vitro Ansätze zur Induktion der Hepatozyten-spezifischen
Differenzierung von CD34
+
Stammzellen wurden untersucht:
- Kultivierung mit Zytokinen
- Konditioniertes Medium von AML12 und HepG2-Hepatozytenkultur
- Kokultur mit AML12-Zellen
Die CD34
+
Stammzellen wurden, wie in Material und Methoden beschrieben, kultiviert und auf
zellulärer und ultrastruktureller Ebene morphologisch bewertet. Mittels quantitativer RT-PCR und
Gesamtgenomanalyse wurden transkriptionelle Veränderungen anhand der Genexpressionsprofile
der hämatopoetischen Stammzellen nach der Kultivierung ermittelt.
3.1.2.1 Reaktionen von definierten Zytokinen auf CD34
+
Zellen
Für hämatopoetische Stammzellen wurden verschiedene Medien zur Aufrechterhaltung der
Proliferation und Differenzierung entwickelt. Die Wirkungen der Zytokine StemCellFactor (SCF) und
HepatocyteGrowthFactor (HGF) auf die CD34
+
Zellen wurde im serumfreien StemSpan Medium
untersucht. SCF ist ein hämatopoetischer Wachstumsfaktor, der seine Aktivität in den frühen Phasen
der Hämatopoese ausübt. HGF agiert als multifunktionales Zytokin auf Zellen epithelialen Ursprungs
und reguliert das Zellwachstum, die Zellmotilität und Morphogenese nach Bindung an den c-Met-
Rezeptor. HGF ist ein Wachstumsfaktor für hepatisch abgeleitete Zellen.
Morphologische Veränderungen der CD34
+
Zellen nach ein-, sieben- und zehntägiger Kultivierung in
Anwesenheit der Zytokine, bewertet nach Zellform, Adhärenz und Viabilität, waren nicht sichtbar.
Die Zellzahl nahm von 10 x 10
4
Zellen am Tag 0, über 11,6 ± 0,4 x 10
4
Zellen am Tag 1, 22,4 ± 7,9 x 10
4
Zellen am Tag 7 auf 116 ± 19,8 x 10
4
Zellen am Tag 10 zu. Über die Dauer der Kultivierung nahm die
Expression des Stammzellmarkers CD34 auf den Stammzellen ab, so dass nach zehntägiger Kultur nur
noch 8,5 ± 1,1% der Zellen diesen Marker, durchflusszytometrisch analysiert, aufwiesen.
Von den im zytokinhaltigen, serumfreien Medium kultivierten Stammzellen wurde das
Genexpressionsprofil im Vergleich zu nicht-kultivierten, undifferenzierten Stammzellen mittels
BeadArray Technologie eruiert. Es wurden 646 Gene bestimmt, die eine zweifach höhere Expression
in der zytokinkultivierten Gruppe aufwiesen als in der nicht-kultivierten. Analog wurden 925 Gene
weniger stark in den Stammzellen nach zytokinhaltiger Kultur exprimiert. Als Antwort auf die
Kultivierung mit den Zytokinen werden in den Stammzellen verschiedene Signalkaskaden aktiviert. Es
E r g e b n i s s e 49
sollte geprüft werden, ob Gene für die endodermale Differenzierung überexprimiert werden. Das
Markerexpressionsprofil der Stammzellen wurde mittels humanspezifischer quantitativer RT-PCR
Analyse (nicht gezeigt) und Gesamtgenomanalyse bestimmt. Die erhaltenen Resultate sind in Tabelle
6 zusammengestellt. Daraus ist eine sehr geringfügige Zunahme der Expression von endodermalen
Markern AFP, C/EBPα, HNF4A, GATA4, E-Cadherin (CDH1), Connexin32 (GJB1), Cytokeratin 7, 8 und
19 (KRT) nachweisbar. Auch der HGF-Rezeptor c-met (MET) nimmt nach 10tägiger Kultivierung zu,
ebenso der Transkriptionsfaktor WNT3. Eine moderate Abnahme der RNA-Transkripte ist für CD34,
Connexin43 (GJA1), CD38 und Cytokeratin18 (KRT18) zu beobachten, die anderen
Markerexpressionen bleiben im Wesentlichen unverändert. Die stärkste Änderung der
Genexpression der Stammzellen induzierte die Zytokinkombination für das Gen Cytokeratin19 und E-
Cadherin (CDH1) als auch für die hämatopotetischen Marker CD34 und CD38. Gene, die wie HDC und
NUSAP1, im Zusammenhang mit der hämatopoetischen Differenzierung stehen, wurden stärker
exprimiert und JUND und HBB schwächer exprimiert.
Tabelle 6
Genexpression von Markern der endodermalen und hämatopoetischen Differenzierung. Die
signifikanten Gene in zehn Tage kultivierten Stammzellen in serumfreien Medium mit Zytokinen wurden in
Bezug auf ihre Funktion bei der Differenzierung eingeteilt.
Hämatopoetische Marker
Endodermale Marker
Gen-
Symbol
Fold
Change
Gen-
Symbol
Fold
Change
Gen-
Symbol
Fold
Change
HSC CD34 0.04
SOX17 1.0
TDO2 1.0
HSC GJA1 0.3
FOXA2 1.0
WNT3 2.3
HSC CXCR4 2.6
AFP 1.8
WNT3A 1.0
HSC CD38 0.3
GATA4 1.7
WNT11 1.8
HSC KIT 2.3
CEBPA 2.0
IGFBP1 2.1
Undifferenzierte POU5F1 1.1
HNF4A 1.7
TERT 1.1
Undifferenzierte PODXL 0.6
ALB 0.6
T 1.1
Undifferenzierte NANOG 1.0
KRT18 0.7
APOF 1.4
Trophoectoderm CDX2 1.6
KRT8 1.7
TTR 1.7
Ectoderm NES 1.3
KRT19 9.5
PAX6 1.2
Mesoderm GSC 1.6
KRT7 1.6
GATA6 1.0
Myeloide Diff. JUND 0.3
CDH1 29.5
CYP2C9 1.1
Granulozyten Diff CPNE3 0.8
GJB1 2.3
CYP2C19 1.4
Myeloide Diff. HDC 2.5
MET 1.4
CYP3A4 1.4
Granulozyten Diff CBFA2T3 1.4
TF 1.1
CYP7A1 1.2
Erythrozyten Diff NUSAP1 3.9
SERPINA1 2.4
CYP2B6 1.1
Erythrozyten Diff HBB 0.1
TAT 1.5
CYP3A7 1.3
HPRT1 1.0 CYP1A1 1.5
Legende: Der ermittelte Fold-Change (BeadChip) für jedes Gen ist angegeben. Die BeadArray-Technologie ermittelt für
jedes Gen eine durchschnittliche Signalstärke (AVG_Signal). Aus dieser Genexpression am Tag 0 und am Tag 10 wird der
Fold-Change durch Subtraktion berechnet. Die Veränderung (Fold Change) >1.0 bedeutet höhere Expression am Tag 10;
=1.0 keine Veränderung und < 1.0 geringere Expression am Tag 10 im Vergleich zum Tag 0.
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E r g e b n i s s e 50
Anhand der Genexpressionsdaten konnten einige Gene identifiziert werden, die eine Rolle bei der
Teilung und Vermehrung von hämatopoetischen CD34
+
Stammzellen spielen. Da die Zellvermehrung
ein komplexes Wechselspiel ist, das durch Proliferation und Apoptose reguliert wird, konnten sowohl
proliferationsfördernde als proliferationshemmende Gene und zudem apoptoseinduzierende Gene
identifiziert werden. Dabei zeigten sich Gene exprimiert, die eine wichtige Rolle bei der Aktivierung
des Zellzyklus spielen. Neben dem G
1
/S-Phase-regulierenden Zellzyklusgen CCNE2 waren vor allem
Gene hochreguliert, die wie TKK direkt im Mitoseablauf involviert sind oder wie BUB1, KIF4A und
KIF11 für den korrekten Ablauf der Mitose erforderlich sind. Gene, die die DNA-Reparaturproteine
oder Replikationsenzyme kodieren, waren gar nicht bis kaum erhöht. In der Gruppe der
proliferationshemmenden Gene zeigte sich eine erhöhte Expression von BRDA, HIRA, MS4A3 und
CEBPA, die im Zellzyklusarrest involviert sind. Im Zusammenhang mit Zellvermehrung und Apoptose
wurde gefunden, dass die proapoptotischen Gene TP53 und PRKDC runterreguliert wurden. Nur
ADAM10, dessen erhöhte Expression mit dem Ereignis der Apoptose korreliert, war verstärkt
exprimiert (Tabelle 7).
Tabelle 7 Gene für die Proliferation und Apoptose. Gene aus den 10 Tage kultivierten CD34
+
Stammzellen im serumfreien
Medium und der Zugabe von Zytokinen wurden verglichen mit den undifferenzierten, nicht-kultivierten Stammzellen. Der
ermittelte „Fold-Change“ ist für jedes Gen angegeben.
Proliferationsfördernd Proliferationshemmend Apoptoseinduzierend
Gen-Symbol Fold Change Gen-Symbol Fold Change Gen-Symbol
Fold Change
CCNE2 2.1 BRD4 1.5 TP53 0.8
TTK 5.5 HIRA 1.9 PRKDC 0.7
BUB1 4.0 MS4A3 9.2 ADAM10 2.5
KIF4A 3.6 CEBPA 2.0 HSPA1A 1.1
KIF11 4.1
Neben der Proliferation und Apoptose spielen die Zelladhäsion und das Migrationsverhalten der
hämatopoetischen Stammzellen eine wichtige Rolle bei der Differenzierung. In vivo müssen die Zellen
aus dem Blut ins Zielorgan, die Leber, gelangen. Dieser komplexe Vorgang, das Homing, ist in drei
Schritte unterteilt: Rolling, Adhäsion und transendotheliale Migration. Anschließend ist die
Differenzierung der Zellen in der Leber möglich. Die Expression der Gene für die Aktin-bindenden
Proteine ABLIM1, MACF1, TNS1 und MSN wurde runterreguliert. Diese tragen normalerweise zur
Stabilität des Cytoskeletts bei, eine Expressionsverminderung kann Auflösung und Umbildung des
Cytoskeletts bedeuten und auf eine mögliche Differenzierung hindeuten. So sind TNS und VCL als
Bestandteil von fokalen Adhäsionen an der Kopplung der Zelle an die extrazelluläre Matrix beteiligt,
während MACF1 die Bindung von Aktin mit Mikrotubuli und Mikrofilamenten in der Zelle vermittelt
und MSN als Bindeglied zwischen Aktin und Plasmamembran das Cytoskelett stabilisiert. Zudem
wurde mit dem Gen GJA1 (Connexin 43) ein Bestandteil der Gap Junctions unterexprimiert, der durch
die Protein-Phosphatase PP1CB dephosphoryliert und dadurch deaktiviert werden kann. Die
E r g e b n i s s e 51
Beurteilung des Migrationsverhaltens ergibt, dass zum einen Gene hochreguliert wurden, wie CAST,
PTPN12 und CXCR4, die zu einer verstärkten Migration führen, und Gene runterreguliert wurden, wie
NISCH und PNN, die eine verminderte Migration bewirken, d.h. die Migrationsfähigkeit der Zellen
zugenommen hat (Tabelle 8).
Tabelle 8 Gene für Cytoskelett, Adhäsion und Migration. Die signifikanten Gene auf zehn Tage kultivierten Stammzellen in
serumfreien Medium mit Zytokinen wurden in Bezug auf ihre Funktion für die Regulation des Cytoskeletts, der Adhäsion
und des Migrationsverhalten eingeteilt. Der ermittelte „Fold-Change“ ist für jedes Gen angegeben.
3.1.2.2 Die Wirkung von Hepatozyten-konditionierten Medien auf Stammzellen
Es wurde die Wirkung von konditionierten Medien, gewonnen von murinen AML12-
Hepatozytenzellen und humanen HepG2-Hepatozytenzellen, zur hepatischen Differenzierungs-
induktion von CD34
+
Stammzellen untersucht. Die murinen AML12-Zellen exprimieren auf hohem
Level mRNA für Serum- (Albumin, α1Antitrypsion und Transferrin) und Gap Junction-Proteine.
HepG2-Zellen produzieren α-Fetoprotein, Albumin und Transferrin. Geprüft wurde die Hypothese,
inwieweit lösliche Faktoren bei der Konditionierung eine Änderung der Genexpression und damit
gerichtete Differenzierung bei den Stammzellen induzieren. Die AML12-Zellen wurden im
serumfreien Sautin-Zellkulturmedium und die HepG2-Zellen im serumfreien Gherardi-
Zellkulturmedium für drei Tage kultiviert. Mit dem konditionierten Medium der Hepatozyten wurden
die CD34
+
Stammzellen kultiviert (siehe Material und Methoden).
3.1.2.2.1 Wirkung von konditionierten Medium auf die Proliferation, die
Zellmorphologie und Expression von Oberflächenmarkern auf CD34
+
Zellen
Die CD34
+
Zellen wurden für 10 Tage im konditionierten Gherardi-Medium bzw. Sautin-Medium mit
und ohne Zytokine (SCF+HGF) inkubiert und die Zellzahl bestimmt. Die Zellzahl im konditionierten
Gherardi-Medium erhöhte sich um den Faktor 1,2 und mit Zytokinen um 3,7, während eine
Kultivierung im konditionierten Sautin-Medium eine Steigerung um 2,3 und 5,1 im Vergleich zur
Ausgangszellzahl (Abbildung 6a) ergab. Für die weiteren Untersuchungen wurden die CD34
+
Aktin-bindende Proteine Migrationsverhalten
Gen-Symbol Fold Change Gen-Symbol Fold Change
ABLIM1
0.1
CAST
1.6
MACF1
0.3
NISCH
0.9
TNS1
0.8
PNN
0.5
VCL
1.1
PTPN12
1.3
MSN
0.7
CXCR4
2.6
PPP1CB
0.7
GJA1
0.3
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E r g e b n i s s e 52
Stammzellen in den verschiedenen konditionierten Medien mit den Zytokinen SCF und HGF kultiviert.
Die runde und teilweise abgeflachte Morphologie und Vitalität der kultivierten Zellen ist (Abbildung 6
b+c) fotografisch dargestellt.
Abbildung 6
Relativer Zellzahlindex nach 10tägiger Kultur (a). Isolierte CD34
+
Zellen wurden für 10 Tage in Kultur
mit konditioniertem Gherardi- bzw. Sautin-Medium inkubiert. Aus dem Quotienten der bestimmten Zellzahl am
Tag 10 und der Zellzahl vom Tag 0 wurde der jeweilige Zellzahlindex bestimmt. Mittelwert und
Standardabweichung von 3 durchgeführten Experimenten sind angegeben. Die Morphologie von CD34
+
Stammzellen nach 10-tägiger Kultur in kondi. Gherardi (b) bzw. Sautin-Medium (c) inkl. Zytokine.
Die Untersuchung von CD34
+
Stammzellen auf ultrastruktureller Ebene nach Kultur im
konditionierten Sautin-Medium mittels Elektronenmikroskopie zeigte morphologische
Veränderungen in der Zellstruktur im Vergleich zu unbehandelten Zellen. Auf der Zelloberfläche sind
vermehrt Mikrovilli und Zellfortsätze nachweisbar mit der Ausbildung von Zell-Zell-Kontakten
zwischen benachbarten Stammzellen (M. Stecklum, 2009). Im Zytoplasma der Zellen finden sich
vermehrt elektronenoptisch helle Bereiche von intravesikularer Struktur, bei denen es sich
möglicherweise um Phago(ly)somen handelt. Diese morphologischen Veränderungen sind nicht in
allen Zellen nachweisbar, teilweise behalten die Stammzellen ihre ursprüngliche Morphologie
(Abbildung 7a).
Abbildung 7
Elektronenmikroskopische Aufnahme von CD34
+
Zellen nach 7tägiger Behandlung mit hepatisch
konditioniertem AML12-Sautin-Medium (a). Expression von CD34 und CD45 auf kultivierten Zellen im kondi. Gherardi-
Medium (b) und kondi. Sautin-Medium (c), dargestellt im Density-Plot nach durchflusszytometrischer Analyse. R2-Gate
verdeutlicht Anteil an CD34
+
/CD45
+
Zellen.
a
c
b
2µm
a
b
c
32,3% 9,9%
E r g e b n i s s e 53
Mittels FACS-Analyse wurde die CD34 Expression auf den Zellen während der Kultur im
konditionierten Medium bestimmt. Es wurde gefunden, dass der Anteil an CD34
+
Zellen nach
eintägiger Kultur keine deutliche Veränderung gegenüber dem Start der Kultur zeigte, die Expression
des Antigens war noch sehr hoch und die Anzahl an positiven Zellen konstant. Nach 7 Tagen
Kultivierungsdauer nahm die CD34 Expression deutlich ab und die Anzahl der CD34
+
Zellen
verringerte sich auf 32,3% im konditionierten Gherardi-Medium und 9,9% im konditionierten Sautin-
Medium. Abbildung 7b+c zeigt repräsentativ das Ergebnis einer solchen durchflusszytometrischen
Messung unter Angabe der CD34- positiven und –negativen Zellen.
3.1.2.2.2 Genexpressionsprofile von in konditionierten Medien kultivierten CD34
+
Zellen
Von den kultivierten CD34
+
Zellen wurde eine Genexpressionsanalyse mit der BeadArray-Technologie
von Illumina durchgeführt. Die BeadChips repräsentieren ca. 24.000 humane Transkripte pro
gemessene Probe. Genexpressionsprofile wurden von CD34
+
Stammzellen, die im konditionierten
Gherardi-Medium und im konditionierten Sautin-Medium jeweils mit Zytokinen kultiviert worden
sind, generiert und mit undifferenzierten, nicht-kultivierten Stmmzellen verglichen. Mittels
hierarchical clustering (Abbildung 8) wurde gefunden, dass sich die kultivierten Stammzellproben
deutlich von den undifferenzierten CD34+Stammzellen unterscheiden und die kultivierten sich
ähnlicher sind. Mit den erhaltenen Daten wurde eine gerichtete Clusteranalyse durchgeführt, um
Gene zu ermitteln, die unter anderem bei der endodermalen Differenzierung von Bedeutung sind.
Um die differentiell exprimierten Gene in den kultivierten Stammzellen zu bestimmen, wurde die 2-
fache Signaldifferenz („Fold-Change“) im Vergleich zu den nicht-kultivierten, undifferenzierten
Stammzellen bestimmt. Das funktionelle Clustering von Genexpressionsdaten ermöglicht es, ähnliche
Gene in Gruppen einzuteilen und bestimmte Muster in der Expression zu erkennen. Durch die
Zuordnung der Gene in Gruppen lassen sich Homologien und gemeinsame Regulation bestimmter
Gene ermitteln. Ebenso können regulatorische Unterschiede anhand der Transkriptionsprofile
beobachtet werden. Die Zellen wurden daher auf ihr Genexpressionsmuster nach 10tägiger Kultur
untersucht. Von besonderem Interesse waren Gene- oder Gengruppen, die spezifisch für eine
zelluläre Entwicklungsrichtung exprimiert oder reprimiert wurden.
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E r g e b n i s s e 54
Abbildung 8 Hierarchical Clustering zur Visulisierung von Ähnlichkeiten zwischen den Expressionsprofilen der kultivierten
und nicht-kultivierten CD34
+
Zellen. Der euklidische Abstand ist der Maßstab der Ähnlichkeit: Je kleiner desto ähnlicher.
Die CD34
+
Zellen wurden im konditionierten Gherardi-Medium und Sautin-Medium kultiviert, um den
Einfluss der löslichen Faktoren auf die endodermale Differenzierung der Stammzellen zu
untersuchen. Die Veränderung der Genexpression hämatopoetischer und endodermaler Marker im
Vergleich zu den nicht-kultivierten CD34
+
Zellen ist in Tabelle 9 dargestellt. Die Genexpression der
meisten endodermalen Marker wie SOX17, FOXA2, AFP UND HNF4A änderte sich kaum in den
kultivierten Stammzellen. Alle untersuchten Marker wiesen einen leichten Anstieg der Genexpression
auf, jedoch auf geringem Niveau. Auf moderatem Niveau wurden die Gene IFGBP1 und WNT3
exprimiert. Herausragend stärker war die Genexpression von Cytokeratin KRT19, E-Cadherin (CDH1)
und Serinproteaseinhibitor SERPINA1 in Zellen nach Kultur in konditionierten Medien. Die
Genexpression endodermaler Marker war sowohl in Zellen nach Kultivierung im konditionierten
Gherardi-Medium als auch im konditionierten Sautin-Medium gering und eine endodermale
Differenzierung von im konditionierten Gherardi- oder Sautin-Medium kultivierten CD34
+
Zellen
konnte nicht eindeutig nachgewiesen werden. Hingegen induziert das Gherardi-Medium die
hämatopoetische Differenzierung in myeloide (TCEA1) und erythroide Zellen (MAFB) und auch
Keratinozyten (MAP2K1). Das Sautin-Medium induziert nur eine schwache Expression von
hämatopoetischen Markern wie CPNE3, HDC, CBFA2T3 und eine hohe Expression von NUSAP1, der
an der erythroiden Differenzierung beteiligt ist (Tabelle 9).
CD34
+
Zellen (kultiviert im konditionierten Gherardi-Medium)
CD34
+
Zellen (kultiviert im StemSpan-Medium)
CD34
+
Zellen (kultiviert im konditionierten Sautin-Medium)
CD34
+
Zellen (undifferenziert, nicht kultiviert)
E r g e b n i s s e 55
Tabelle 9: Genexpression hämatopoetischer und endodermaler Marker auf 10 Tage kultivierten CD34+ Zellen im kondi.
Gherardi-Medium oder kondi. Sautin-Medium. Die Veränderung der Genexpression wurde auf die nicht-kultivierten
Stammzellen bezogen (Fold-Change).
Hämatopoetische Marker Endodermale Marker
kondi.
Gherardi
kondi.
Sautin
kondi.
Gherardi
kondi.
Sautin
kondi.
Gherardi
kondi.
Sautin
Gen-
Symbol
Fold
Change
Fold
Change
Gen-
Symbol
Fold
Change
Fold
Change
Gen-
Symbol
Fold
Change
Fold
Chang
e
HSC CD34 0.07 0.03 SOX17 1.07 1.22 TDO2 1.08 1
HSC GJA1 0.25 0.31 FOXA2 1.03 1.05 WNT3 2.06 2.15
HSC CXCR4 1.95 2.86 AFP 1.61 1.67 WNT3A
1.3 1
HSC CD38 0.48 3.19 GATA4 1.55 1.3 WNT11
1.91 1.71
HSC KIT 0.98 1.71 CEBPA 2.02 1.67 IGFBP1 2.16 2.43
SC POU5F1 1.08 1.19 HNF4A 1.71 1.84 TERT 1.35 1.27
SC PODXL 0.74 0.79 ALB 1.99 0.72 T 1 1
SC NANOG 1.42 1.22 KRT18 1.15 0.93 APOF 1.12 1.31
Trophoderm CDX2 1.77 1.38 KRT8 1.56 1.63 TTR 1.54 1.85
Ectoderm NES 1.35 1.4 KRT19 2.93 5.56 PAX6 1.47 1.32
Mesoderm GSC 1.77 KRT7 1.17 1.39 GATA6 1.49 1.61
Myeloide Diff. JUND 0.3 0.4 CDH1 16.69 16.68 CYP2C9
1.12 1.28
Granulozyten CPNE3 0.8 1 GJB1 1.98 1.75
CYP2C19
1.63 1.37
Myeloide Zellen
HDC 1.3 0.8 MET 1.48 1.41 CYP3A4
1.08 1.35
Granulozyten CBFA2T3 1.4 1.5 TF 1.13 1.39 CYP7A1
1.49 1.3
Erythrozyten NUSAP1 3.7 5.4 SERPINA 4.97 4.31 CYP2B6
1.05 1.2
Erythrozyten HBB 0 0.6 TAT 1.5 1.44 CYP3A7
1.54 1.75
Myeloide Zellen
TCEA1 2.87 1.26 HPRT1 0.93 1.03 CYP1A1
1.6 1.71
Erythrozyten MAFB 3.99 3.34
Die weitere funktionelle Analyse der exprimierten Gene wurde mit der DAVID Software
(http://david.abcc.ncifcrf.gov) durchgeführt. Es wurden Cluster mit unterschiedlicher Genanzahl
ermittelt. In diesen Clustern wurde nach Vorkommen der verwendeten GO-Begriffe mit
übereinstimmenden Genfunktionen gesucht, um festzustellen, welche Gene reguliert sind und ob
funktionell ähnliche Gruppen von Genen homolog exprimiert werden. Aufgrund der großen Anzahl
der Gene in den Clustern wurden die Cluster mit der höchsten Prozentzahl und die funktionell
interessantesten Gene selektiv in Tabelle 10 und im Anhang dargestellt.
Die Genanalyse zeigte, dass das Genexpressionsmuster in den Stammzellen unter verschiedenen
Kultivierungsbedingungen sich ähnelte verglichen mit den nicht-kultivierten Stammzellen. Am
stärksten und häufigsten wurden Gene exprimiert, die funktionelle Klassifikationen wie Zellzyklus,
Lysosom, Antwort auf Stimulus, Chromosomen, Zellkommunikation, Signaltransduktion und
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E r g e b n i s s e 56
Apoptose aufwiesen. Einige Gene sind involviert in der Zellproliferation, Zytokinbindung, DNA
Replikation, Chemotaxis und Hämatopoese (Anhang).
Tabelle 10
Ausgewählte hochregulierte Genexpressionsprofile von CD34
+
Zellen nach 10tägiger Kultur im StemSpan
Medium, im konditionierten Gherardi-Medium und im konditionierten Sautin-Medium verglichen mit nicht-kultivierten
Stammzellen.
StemSpan-Medium Kondi. Gherardi-Medium Kondi. Sautin-Medium
Term Gene
no % p Gene
no % p Gene
no % p
GO:0008283~cell
proliferation 50 8.04% 5.54E-06 50 8.33% 1.41E-06
GO:0032943~mononuclear
cell proliferation 6 0.96% 0.695 5 0.83% 0.158
GO:0007067~mitosis 38 6.11% 1.19E-16 39 6.50% 3.54E-18 43 7.36% 8.55E-22
GO:0006260~DNA replication
14 2.33% 0.039 19 3.25% 5.24E+10
GO:0007049~cell cycle 61 9.81% 2.16E-08 70 11.67%
3.23E-13 75 12.84%
7.13E-16
GO:0006915~apoptosis 43 6.91% 5.56E-04 48 8.00% 4.75E-06 36 6.16% 0.011
GO:0030154~cell
differentiation 69 11.09%
0.087 73 12.17%
0.010
GO:0042490~mechanorecept
or differentiation 3 0.48% 0.079 3 0.51% 0.072
GO:0005856~cytoskeleton 46 7.40% 0.098 47 7.83% 0.052 54 9.25% 0.001
GO:0005764~lysosome 55 8.84% 6.67E-20 38 6.33% 1.49E-02 31 5.31% 3.57E+02
GO:0007155~cell adhesion 35 5.63% 0.032 36 6.00% 0.01 35 5.99% 0.016
GO:0006928~cell motility 24 3.86% 0.008 21 3.50% 0.029 24 4.11% 0.004
GO:0016477~cell migration 15 2.41% 0.048
16 2.74% 0.016
GO:0050900~leukocyte
migration 6 0.96% 0.003 7 1.17% 3.93E-04 6 1.03% 0.003
Legende: Die ratio aus kultiviert AVG_Signal / nicht-kultiviert AVG_Signal musste > 2.0 sein. Die GO-Terme wurden in der
Annotationskategorie „Gene Ontology“ mit der Datenbank GOTERM ermittelt. Je kleiner der p-Wert, desto häufiger und
stärker werden Gene dieser Gruppe exprimiert.
Das Genexpressionsprofil der CD34
+
Zellen im HepG2
konditionierten Gherardi-Medium
nach
zehntägiger Kultur wurde gegenübergestellt dem Expressionsprofil von nicht-kultivierten
Stammzellen. Dabei wurden 617 Gene ermittelt, die zweifach hochreguliert und 1233 Gene, die
zweifach runter reguliert sind. Es wurden Gene extrem hochreguliert, die zur Apoptose, Lysosom und
Antwort auf Stimulierung gehören (Anhang). Kennzeichnend für das von HepG2 Zellen konditionierte
Medium war die Zunahme von Genen wie Leucin-Zipper-Transkriptionsfaktor und NF kappa B
Transkriptionsfaktor als auch hohe Mengen an Intregrin beta, Intermediärfilament und
Tumornekrosefaktor in den kultivierten Stammzellen. Diese Gruppe exprimierte außerdem die
höchste Anzahl an Genen, die der Apoptose und die geringste Anzahl an Genen, die der Zellmotilität
zugeordnet werden. Zu den stärker exprimierten Genen gehören die Zelladhäsionsmoleküle, die
Zytokin-Rezeptor-Interaktion, NK-Zell-vermittelte Zytotoxität und der FAS Signalweg. Reprimierte
Gene umfassen den Nukleus, Transkription, Aktinzytoskelett und Gap junction.
E r g e b n i s s e 57
Stammzellen, die im
konditionierten Sautin-Medium
kultiviert wurden, exprimierten eine
ähnliche Anzahl von Genen wie Stammzellen im konditionierten Gherardi-Medium, 604
hochregulierte Gene und 1126 runterregulierte Gene verglichen mit den nicht-kultivierten
Stammzellen. Überwiegend wurden Gene hochreguliert, die zum Zellzyklus, externen Stimulus,
Hormonstimulierung und Steroidbiosynthese gehören (Anhang). Außerdem fanden sich gehäuft
Gene, die mit der Mikrotubuli-Zytoskeletts-Organisation und Biogenese verbunden werden, wie
MID1IP1 und KIF11. Verstärkt wurden ebenfalls Gene aus den Gruppen Epidermisentwicklung,
Focaladhäsion, Blutkoagulation und Blutzirkulation exprimiert. In diesem Medium waren allgemein
die meisten Cluster mit hohen Transkriptionsprofilen zum Zellzyklus, DNA-Replikation und
Chromosomen und die wenigsten zur Apoptose zu finden. Runterregulierte Signalwege waren
Adherens Junction, Zelladhäsionsmoleküle, B-Zell-Rezeptor-Signalweg. Des Weiteren wurden Gene
geringfügiger als in den nicht-kultivierten Stammzellen exprimiert, die zum Nukleus,
Transkriptionsfaktorenbindung, Angiogenese, MHC class I Bindung und Chemokinproduktion
gehören.
Die Expression von ausgewählten Genen der funktionellen Eingruppierung GO:0030154~cell
differentiation wird in Tabelle 11 gezeigt. Sowohl das konditionierte Gherardi- als auch Sautin-
Medium bewirkte eine höhere Expression von ASCL2, NDRG2 und SEMA4A in den kultivierten Zellen.
Diese Gene spielen bei der Entwicklung des Nervensystems eine Rolle und beschreiben, dass die
Zellen ektodermale Merkmale exprimieren. Eine weitere Gruppe von Genen, die an der
Blutgefäßbildung und Angiogenese beteiligt sind, umfasst die Gene ANPEP, DHCR7, JAG1 und PSEN1.
Diese wurden leicht stärker von Zellen im konditionierten Sautin-Medium als von Zellen im
konditionierten Gherardi-Medium exprimiert. SORT1 und SRGN sind an der Bildung des Skeletts
beteiligt und wurden in allen Gruppen gleichmäßig exprimiert. Signifikant unterschiedlich wurden die
Gene für die Mechanorezeptor-Differenzierung in zehn Tage kultivierten Zellen im konditionierten
Sautin-Medium exprimiert. GFI1, growth factor independent 1 transcription repressor, und NTRK1,
neurotrophic tyrosine kinase receptor 1, wurden 2,83- und 3,5-fach höher exprimiert als in den nicht-
kultivierten Zellen. Hier unterscheiden sich die Zellen im konditioniertem Sautin-Medium in der
Differenzierung im Verglich zu den Zellen im konditionierten Gherardi-Medium. Der
Tumornekrosefaktor TNF wurde überdurchschnittlich stark von den kultivierten Stammzellen
exprimiert. TNF ist ein multifunktionelles Zytokin, das an der Zellproliferation, Zelldifferenzierung,
Apoptose, Lipidmetabolismus und Koagulation beteiligt ist. Die Proteinkinase C, alpha (PRKCA) spielt
eine Rolle in vielen Prozessen wie Zelladhäsion, -transformation, Zellzyklus und
Chondrozytendifferenzierung (Knorpelzellen).
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E r g e b n i s s e 58
Tabelle 11 Veränderung der Genexpression von ausgewählten Gene aus der GOTERM_BP_ALL Datenbank und der
funktionellen Eingruppierung: GO:0030154~cell differentiation auf im Gherardi- oder Sautin-Medium kultivierten CD34
+
Zellen.
Weitere Marker
kond.
Gherardi
kondi.
Sautin kond.
Gherardi
kondi.
Sautin
Ontologie Gen-
Symbol
Fold
Change
Fold
Change Ontologie Gen-
Symbol
Fold
Change
Fold
Change
Zentralnervensystem ASCL2 3.07 1.87 Knochen SORT1 2.07 1.85
Nervensystem NDRG2 2.43 0.48 Knochen SRGN 1.3 3.42
Nervensystem SEMA4A
5.82 3.32 Mechanorezeptor
GFI1 1.46 2.83
Neuronale Röhre APAF1 2.11 2.09 Mechanorezeptor
NTRK1 1.98 3.5
Blutgefäß ANPEP 3.13 3.47 Leber CEBPG 2.57 1.15
Blutgefäß DHCR7 1.51 3.58 Monozyte Diff SPI1 2.86 1.89
Blutgefäß JAG1 2.04 2.62 Chondroblast Diff PRKCA 12.95 3.24
Blutgefäß PSEN1 2.34 2.37 Keratinozyten MAP2K1
2.41 1.69
Myeloide Diff. TNF 9.8 0.85
Legende: Der Fold-Change der Genexpression auf den kultivierten Stammzellen im Vergleich zu den nicht-kultivierten
Stammzellen ist angegeben. Der der P-Value aller Gene ist >0,01.
3.1.2.3 Kokultur von hämatopoetischen Stammzellen mit AML12-Zellen
In einem direkten Kokulturmodell von CD34
+
Zellen aus Nabelschnurblut mit AML12-Hepatozyten
wurde die Wirkung des direkten Kontakts der Zellen zur Differenzierungsinduktion von
hämatopoetischen Stammzellen geprüft.
Konfluente AML12-Zellen wurden bei einem Effektor zu Targetverhältnis von 1:5 mit serumfreien
Sautin-Medium bis zu einem Zeitraum von 21 Tagen mit undifferenzierten CD34
+
Zellen kultiviert.
3.1.2.3.1 Wirkung der AML12-Kokultur auf die Proliferation, die Zellmorphologie und
Expression von Oberflächenmarkern auf CD34
+
Zellen
Um einen möglichen Effekt der Kokultur von CD34
+
Zellen mit AML12-Zellen auf die Proliferation von
Stammzellen zu untersuchen, wurde die Zellzahl bestimmt. In Kokultur verdoppelten sich während
der siebentägigen Kultivierung die CD34
+
Zellen und nahmen am Tag 21 auf das neunfache des
Ausgangswertes zu. Morphologisch traten während der 7tägigen Kokultivierung kaum
Veränderungen im äußeren Erscheinungsbild der CD34
+
Zellen auf, Zellform und Zellgröße blieben im
Wesentlichen erhalten, nur vereinzelt waren angeheftete Zellen zu erkennen. Jedoch nahm das
mechanische Adhärenzverhalten der Stammzellen an den AML12-Zellen zu, und sie wuchsen als
Aggregate. Die CD34
+
Stammzellen wurden im Bezug auf CD34 Antigenexpression während der
E r g e b n i s s e 59
Kultivierung mittels FACS-Analyse untersucht. Die CD34
+
Stammzellen exprimierten während der
Kultivierung kontinuierlich weniger das CD34-Antigen. Anfangs war die Fluoreszenzintensität auf
einem hohen Niveau und nahm während der Kultivierung ab. Nach 21 Tagen waren nur noch 3,0% ±
0,7% der Zellen CD34 positiv.
3.1.2.3.1.1 Ultrastrukturelle Analyse der Kokultur von CD34
+
Stammzellen mit AML12-
Zellen
Die Kokultur von CD34
+
- und AML12-Zellen wurde mittels Elektronenmikroskopie auf die Ausbildung
von Zell-Zell-Kontakten und morphologischen Differenzierungsparameter untersucht. Die nicht-
kultivierten CD34
+
Stammzellen wiesen keine elektronendichten Bereiche auf, die auf Gap Junction
hindeuten können. AML12-Zellen untereinander wiesen typische Gap Junction-Strukturen der
interzellulären homophilen Wechselwirkung auf (Daten nicht gezeigt). Nach eintägiger Kokultur war
weder ein Zell-Zell-Kontakt zwischen CD34
+
Zellen und murinen Hepatozyten zu beobachten noch
eine morphologische Veränderungen nachweisbar. Nach 7tägiger Kokultivierung zeigten sich,
zumindest partiell, morphologische Zellveränderungen und Differenzierungsmerkmale bei den
Stammzellen durch Ausbildung von Mikrovilli und Zellfortsätzen auf der Zelloberfläche (Stecklum,
2009). Die abgerundete Zellmorphologie und das hohe Kern-zu-Plasma-Verhältnis blieben jedoch
bestehen. Teilweise waren Bereiche von Zell-Zell-Wechselwirkungen durch direkten Kontakt der
Zellmembran der CD34
+
-Zellen mit den AML12-Zellen nachweisbar, jedoch war die Ausbildung von
Gap Junction nicht nachweisbar (Abbildung 9).
Abbildung 9
AML12-Zellen (unten) und CD34
+
Stammzellen (oben) nach 7 Tagen in Kokultur. In (a) ist keine Zell-Zell-
Wechselwirkung zwischen den CD34
+
- und AML12-Zellen zu beobachten. Es sind auch keine morphologischen
Veränderungen nachweisbar. In (b) kommt ein enger Kontakt zwischen beiden Zelltypen zustande und eine leichte
Veränderung der Morphologie zu einer langgestreckteren Zellform der CD34
+
Zellen ist zu beobachten.
2µm 2µm
a
b
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E r g e b n i s s e 60
3.1.2.3.1.2 Live Cell Imaging von CD34
+
Zellen im direkten Kontakt mit AML12-Zellen
Mittels „Live Cell Imaging“ Technologie wurde die Zellmobiliät von CD34
+
Zellen in Echtzeit verfolgt.
Die CD34
+
Zellen wurden mit dem zellmembranständigen Farbstoff PKH26 markiert und die AML12-
Zellen mit CalceinAM. Die Zellen wurden in Kokultur gebracht und das Verhalten über einen Zeitraum
von 24 Stunden unter Einsatz dieser computergestützten Videomikrokopie-Technologie
aufgezeichnet. Es wurde gezeigt, dass die Stammzellen auf dem konfluenten Zellrasen der AML12-
Zellen eine hohe Mobilität aufwiesen. Die CD34
+
Zellen traten zeitweise in losen Kontakt mit
einzelnen Hepatozyten. Der Kontakt war nur temporär, Anheftung und Ablösung der CD34
+
Zellen
waren nachweisbar. Die quantitative Analyse der CD34
+
/AML12-Wechselwirkung erfolgte durch
FACS-Analyse. Die durchflusszytometrische Analyse der CD34
+
Zellen ergab, dass ein geringer
Prozentsatz von 0,4% der Stammzellen CalceinAM von den AML12-Zellen nach 24 Stunden
aufgenommen hat und sich doppeltgefärbt darstellen lässt.
Abbildung 10 Mikroskopie einer direkten Kokultur von PKH26 rot-fluoreszierenden CD34
+
Zellen und grün-fluoreszierenden
CalceinAM AML12-Zellen (a). FACS-Analyse des Dye Transfers zwischen CD34
+
Zellen und AML12-Zellen. Density-Plots von
CD34
+
Zellen zum Zeitpunkt 0 (b) und 24h nach Kokultur (c). 24 Stunden nach Kokultivierung ist ein geringer Prozentsatz der
Zellen doppelt positiv und im oberen, rechten Quadranten zu erkennen.
3.1.2.3.1.3 RT-PCR Expressionsprofil von CD34
+
Zellen in AML12-Kokultur
Im Folgenden wurde geprüft, inwieweit eine direkte Kokultur von hämatopoetischen CD34
+
Stammzellen mit murinen Hepatozyten das Genexpressionsprofil der CD34
+
Zellen verändert. Mittels
humanspezifischer Primer wurde durch quantitative RT-PCR der Einfluss des direkten Kontakts auf
die Genexpression der CD34
+
Zellen untersucht (Tabelle 12). Die Kokultur von CD34
+
Stammzellen mit
AML12-Zellen führte zu einem Anstieg in der Expression von SOX17, der Cytokeratine 8, 18 und 19
(KRT8, KRT18 und KRT19) und der Connexine 32 und 43 (GJB1, GJA1) nach 7 Tagen. Zudem wurde die
Expression von CD34 und E-Cadherin (CDH1) innerhalb der ersten Woche herunterreguliert. Die
Expression von CD34 und SOX17 nahm mit fortschreitender Kultivierungsdauer weiterhin ab. Eine
Zunahme bzw. eine Expression der Gene für HNF3b (FOXA2), α-Fetoprotein (AFP) und Albumin war
nach 21tägiger Kokultur nachweisbar. Somit konnte gezeigt werden, dass durch die Kokultur die
a
c
b
0,02%
0,4%
E r g e b n i s s e 61
frühen endodermalen Marker wie SOX17 nach kurzer Kultivierungsdauer exprimiert werden und die
späteren Marker wie Albumin nach einem längeren Kultivierungszeitraum auf geringem Niveau in
den Stammzellen exprimiert werden.
Tabelle 12 Kokultivierung von CD34
+
Stammzellen mit AML12-Zellenn. Die mRNA wurde zu bestimmten Zeitpunkten isoliert
und ausgewählte Gene mittels semi-quantitativer RT-PCR (TaqMan) bestimmt. Es zeigte sich, dass durch die Kokultur mit
AML12-Zellen die CD34
+
Zellen die Genexpression von CD34 runterreguliert und die endodermalen Marker leicht ansteigen.
Gen 0d 7d 21d
CD34 ++++ +++ ++
SOX17 + ++ +
FOXA2 - - +
AFP - - ++
CEBPA +++ ++++ ++++
HNF4A -/+ -/+ n.b.
ALB -/+ -/+ +
KRT18 ++ +++ n.b.
KRT8 + ++ n.b.
GATA4 - - n.b.
CDH1 ++ + n.b.
GJB1 -/+ ++ n.b.
GJA1 + ++ n.b.
KRT19 ++ +++ n.b.
Legende: qRT-PCR: ++++ ∆CT 0,0-4,0; +++ ∆CT 4,1-8,0; ++ ∆CT 8,1-12,0; + ∆12,1-16,0;
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3.2 In vivo Differenzierung von CD34
+
Stammzellen in immundefizienten
Mäusen
Ziel der präklinischen Untersuchungen war es, Mausmodelle zur in vivo Testung von embryonalen
bzw. adulten Stammzellen zu etablieren und die in vivo Eigenschaften der Stammzellen bezüglich
Engraftment und Zelldifferenzierung zu bewerten. Zur Bewertung der in vivo Eigenschaften der
adulten Stammzellen bezüglich Engraftment und Induktion der Zelldifferenzierung wurden
unterschiedliche Transplantationsverfahren und Applikationsrouten in adulten als auch
neugeborenen immundefizienten NOD/SCID Mäusen eingesetzt. Die transplantierten Stammzellen
wurden bezüglich ihrer Lokalisation, Vermehrung und Differenzierung zu spezifischen Zelltypen in
einzelnen Organen untersucht. Die Integration der Stammzellen in unterschiedliche Zielorgane wurde
anhand von Profilen spezifischer Differenzierungsmarker geprüft.
Zur Modelletablierung wurden in einer ersten Phase adulte CD34
+
Stammzellen verwendet und die
Methoden in weiterführenden späteren Arbeiten auf humane embryonale Zellen übertragen.
3.2.1 Etablierung und Standardisierung von immundefizienten Mausmodellen
Für die geplanten Transplantationsuntersuchungen von Stammzellpräparaten wurden die
immundefizienten Mausstämme NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
geprüft. Die Lebensdauer der
NOD/SCID Mäuse wird mit durchschnittlich 9 Monaten und der NOD/SCID/ IL2Rγ
null
Mäuse wird mit
mehr als 15 Monaten angegeben. Diese Literaturangaben wurden im weiteren Verlauf der Arbeiten
geprüft und bestätigt.
Der Immunstatus der Zucht-Tiere wurde kontinuierlich durch quantitative Immunglobulin (IgG)
Bestimmung mittels ELISA-Technik überwacht. Im Serum beider Mausstämme war kein IgG
nachweisbar. Die Messwerte lagen im untersten Bereich der Nachweisgrenze von <50ng/ml. Als
positiv werden Werte >100ng/ml bis in den µg/ml Konzentrationsbereich eingestuft. Bewertet nach
diesem Kriterium der B-Lymphozytenaktivität sind beide Mausstämme über die Dauer der
Quantifizierung als immundefizient einzuordnen (Abbildung Abbildung 11). Desweiteren wurde der
IgG Spiegel der NOD/SCID Mäuse über die Versuchsdauer eines Langzeitrepopulations-Assays
quantitativ bestimmt. Über den Versuchszeitraum von 150 Tagen wurde ein durchschnittlicher IgG
Wert von 35ng/ml (n=4) bestimmt. Dies deutet auf eine stabile Immundefizienz der Tiere im
Versuchszeitraum hin, so dass die erhaltenden Versuchsergebnisse nicht durch Variabilitäten des
Immunstatus der Tiere beeinflusst waren.
E r g e b n i s s e 63
Abbildung 11 Der Immunstatus der Zuchttiere wurde kontinuierlich durch quantitative Maus-Immunglobulin-Bestimmung
mittels ELISA-Technik überwacht. Exemplarische Daten einer IgG-Serumbestimmung von NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen (Tabelle). Gelanalyse der Gene Neomycin (280bp) und IL2R (500bp) auf Blutleukozyten von NOD/SCID/IL2Rγ
null
(4-
13) Mäusen. Als Positivkontrolle ist die NOD/SCID Maus mit 500bp (3) aufgetragen. (1) ist der Marker und (2) die
Negativkontrolle Wasser.
Durch Genotyping wurde der Grad der IL-2 Rezeptorexpression von Blutleukozyten der
immundefizienten Tiere mittels PCR bestimmt. Literaturdaten belegen, dass die fehlende Expression
des Interleukin-2 Rezeptors mit einer reduzierten NK-Zellaktivität und einer höheren
Transplantationsrate von Stammzellen korreliert. Als Positivkontrolle wurden Blutleukozyten von
immunkompetenten CD-1 und NMRI-Mäusen mitgeführt. Es wurden 2 Gene untersucht: Neomycin,
das durch die Insertion eines Vektors mit Neomycin-Resistenz-Kassette zur Zielmutation von IL2Rγ
eingesetzt wurde und in allen NOD/SCID/IL2Rγ
null
auftreten muss und IL2Rγ, dass detektiert wird,
wenn das Gen aktiv ist, wie in den NOD/SCID Mäusen. Neomycin besitzt 280 Basenpaare und der
IL2Rγ „wild type“ 500bp. Nach der Gelanalyse zeigten nur die Positivkontrollen und die Leukozyten
der NOD/SCID Mäuse eine positive Bande bei 500bp, die dem IL-2 Rezeptorgen entspricht, die
Neomycinbande dagegen war nicht detektierbar (Abbildung 11b). Die 500bp Bande des IL-2
Rezeptors war dagegen in den Proben der NOD/SCID/IL2R
null
Mäuse nicht nachweisbar. Die Resultate
zeigten die genetische Stabilität des IL-2 Rezeptor negativen Mausstammes. Diese waren daher für
die geplanten Transplantationsversuche mit unterschiedlichen Stammzellpräparaten geeignet. Das
Genotyping zur IL-2 Rezeptorexpression der NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse wurde kontinuierlich
durchgeführt und keine Expression des IL-2 Rezeptors nachgewiesen.
NOD/SCID Mäuse besitzen einen rudimentären Anteil an NK-Zellen und eine verminderte Anzahl an
B-Zellen. Um die Immunzellaktivität weiter zu reduzieren und die Transplantationseffizienz zu
Eltern/Tier-Nr. IgG ng/ml
NOD/SCID 189/1 50,2
NOD/SCID 189/2 35,2
NOD/SCID 189/3 17,3
NOD/SCID 190/1 67,1
NOD/SCID 190/2 18,5
NOD/SCID 190/3 85,6
NOD/SCID/IL2Rγ
null
58/1 0
NOD/SCID/IL2Rγ
null
58/2 0
NOD/SCID/IL2Rγ
null
58/3 0
NOD/SCID/IL2Rγ
null
59/1 0
NOD/SCID/IL2Rγ
null
59/2 0
NOD/SCID/IL2Rγ
null
59/3 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
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E r g e b n i s s e 64
erhöhen, wurden die Tiere mit 1,6 Gy einer
137
Cäsium-γ Quelle bestrahlt. Auch die NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse tolerierten diese Strahlendosis.
Die Thymusdrüsen von immundefizienten NOD/SCID Mäusen waren im Vergleich zu einer
immmunkompetenten NMRI Maus als Kontrolle sehr klein. Sie wiesen auch keine deutliche Trennung
von Mark- und Rindenzone auf und waren hypoplastisch (Abbildung 12). Im Thymusgewebe waren
perivaskulär stets nur sehr wenige Lymphozyten bei den immundefizienten Versuchstieren sichtbar.
Der Thymus von NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen ähnelte dem Thymus von NOD/SCID Mäusen.
Abbildung 12 Histopathologische Betrachtung des Thymus einer immunkompetenten NMRI Maus (a) und einer
immundefizienten NOD/SCID Maus (b).
a
b
E r g e b n i s s e 65
3.2.2 Systemische CD34
+
Stammzell-Applikation in adulte immundefiziente Mäuse als
nicht-gerichtete Transplantation
Die Bewertung der in vivo Eigenschaften von adulten Stammzellpräparaten erfolgte in
immundefizienten NOD/SCID und NOD/SCID/IL2R
null
Mäusen.
Zur vergleichenden Bewertung der Engraftmentrate und des Differenzierungspotenzials wurden
unterschiedliche Routen der Stammzellapplikation gewählt. Die systemische Applikation erfolgte
durch intravenöse Stammzelltransplantation und die organspezifische Applikation durch
intrahepatische Transplantation sowohl in adulten als auch in neugeborenen immundefizienten
Mäusen.
3.2.2.1 Systemische Applikation von Stammzellen in NOD/SCID Mäuse
Mittels FACS-Analyse und dem humanspezifischen Antikörper HLA-I wurde nach intravenöser
Applikation der CD34
+
Zellen aus Nabelschnurblut im Kurzzeit-Assay eine schnelle „blood clearance“
der applizierten Stammzellen nachgewiesen mit einer Peakintensität von 5,7% humaner Stammzellen
nach 1 min. Die Anzahl humaner Zellen im Maus-Blut reduzierte sich deutlich nach 5min und 20 min
auf 3,1% und 1,5% humaner Zellen. Mit dem Zytokin SCF über einen Zeitraum von 24 h
vorbehandelte Zellen wiesen eine ca. 1,5fach signifikante Reduktion des Anteils humaner Zellen im
Blut auf, was möglicherweise auf eine stärkere Adhäsion der vorbehandelten Zellen in der
Mikrozirkulation der Maus zurückzuführen ist (Abbildung 13a). Das Langzeitrepopulationsverhalten
systemisch applizierter CD34
+
Zellen wurde zeitabhängig über einen Zeitraum von 56 Tagen mittels
FACS-Analyse (h-HLA-I) bestimmt. Eine zeitliche Zunahme mit hohen Engraftmentraten der
transplantierten Stammzellen wurde in den hämatopoetischen Organen aufgefunden. Am Tag 56
waren im Knochenmark 39,5% und in der Milz 9,8% positive humane Zellen (Abbildung 13b+c).
Signifikant weniger (0,3%) humane Zellen wurden in der Leber und im Thymus (nicht gezeigt)
erblickt. Ca. 50 % der engrafteten humanen Zellen in den Organen exprimierten den
hämatopoetische Differenzierungsmarker CD38. Mit dem Zytokin SCF vorbehandelte Zellen zeigten
im Knochenmark ein 2,5fach reduziertes Engraftment. Die im Knochenmark und der Milz engrafteten
humanen Zellen wiesen eine funktionelle hämatopoetische Integration in das Gewebe über eine
dominante B-Zell (CD19/10) und myeloische Zelldifferenzierung (CD33) auf. Marker für Monozyten,
NK-Zellen, sowie T-Zellen und deren Subpopulationen wurden nur in sehr geringem Maße exprimiert
(Daten nicht gezeigt).
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E r g e b n i s s e 66
0
5,7
3,1
1,3
0
3,2
2,2
1,7
0
1
2
3
4
5
6
7
0 10 20 30
% HLA-I positive humane Zellen (normalized)
min
A 1
A 2
A 3
A 4
A1.1
A1.2
Mean A
B 1
B 2
B 3
B 4
Mean B 0
20
40
60
80
1 14 28 56
% humane Zellen
Tage nach iv Appliaktion
Knochenmark
PBS SCF
0
4
8
12
16
20
1
14
28
56
% humane Zellen
Tage nach iv Applikation
Milz
PBS SCF
Abbildung 13
Zeitabhängige „blood clearance“ von systemisch applizierten CD34
+
Zellen in NOD/SCID Mäusen (a).
4x10
5
CD34
+
Zellen wurden i.v. in bestrahlte Mäuse transplantiert. Unbehandelte (durchgezogene, blaue Linie) bzw.
SCF-vorbehandelte Zellen (gestrichelte, rote Linie) wurden in der murinen Blutzirkulation nach 1, 5 und 20min nach
Applikation mittels FACS analysiert. Die Anzahl an humanen HLA-I positiven Zellen von 10 000 aufgenommenen
Zellen wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind das Resultat von insgesamt drei Experimenten.
Langzeit-Engraftment von unbehandelten und SCF-vorbehandelten Stammzellen in NOD/SCID-Mäusen (b,c).
Unbehandelte und SCF-vorbehandelte Zellen wurden i.v. appliziert und das Knochenmark (b) und die Milz (c)
durchflusszytometrisch mit dem humanspezifischen Antikörper HLA-I analysiert. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM
von 6-9 Mäusen pro Gruppe.
a
b
c
E r g e b n i s s e 67
3.2.2.2 Systemische CD34
+
Applikation in adulte NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
Durch die Defizienz der IL-2 Rezeptorkette in dem immundefizienten NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mausstamm
ist die Funktionalität rudimentärer NK-Zellen und der IgG Spiegel im Blut der Tiere deutlich im
Vergleich zu den Resultaten der NOD/SCID Mäusen erniedrigt. In Anlehnung an den oben
beschriebenen Ansatz (CD34
+
Transplantation in NOD/SCID Mäuse) wurde das Engraftment der
applizierten Stammzellen in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen über den Versuchszeitraum vergleichend in
den Organen Knochenmark, Thymus, Milz und Blut der Tiere quantitativ mittels FACS Analyse
bewertet. In allen geprüften Organen war ein signifikanter Anstieg des Engraftments von humanen
Zellen in den NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen nachweisbar. In den Organen Thymus und Blut war der
Anteil deutlich um die Faktoren 23,6 und 10,3, im Knochenmark und Milz dagegen um den Faktor 1,1
und 1,3 erhöht im Vergleich zum Engraftment von CD34
+
Zellen in NOD/SCID Mäusen (Tabelle 13).
Tabelle 13
Langzeit-Engraftment (d56) von i.v. appliziert CD34
+
Zellen in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse. Die Werte sind
Mittelwert ± SEM von humanen Zellen in murinen Organne durchflusszytometrisch nach HLA-I analysiert
(NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse n=11; NOD/SCID Mäuse n=6).
Knochenmark
Thymus
Milz
Blut
Leber
NOD/SCID/IL
2
Rγ
null
43,0% ± 23,6%
7,1% ± 0,5%
13,0% ± 9,5%
5,8% ± 6,1%
0,3% ± 0,1%
NOD/SCID
39,5%
±
20,7
%
0,3%
±
0,2%
9,8
%
±
9,0%
0,
5
%
±
0,
2
%
0,3%
±
0,1%
Eine hämatopoetische T-Zelldifferenzierung von 2,1% humanen CD3 positive Zellen war im Thymus
der Tiere nachweisbar. Das immundefiziente NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mausmodell erweist sich auf Grund
der hohen Engraftmentrate von transplantierten hämatopoetischen Stammzellen als geeignet
sowohl für Untersuchungen zum Mechanismus als auch der Funktionalität von humanen
Immunzellen in tierexperimentellen Mausmodellen.
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E r g e b n i s s e 68
3.2.3 Evaluierung der gezielten, organspezifischen Transplantation von CD34
+
Stammzellen in die Leber von NOD/SCID Mäusen
Die embryonale und die postnatale Leber ist das primäre Organ der Maushämatopoese und stellt
eine geeignete Mikroumgebung für die hämatopoetische Zelldifferenzierung dar. Die
organspezifische Applikation in die Leber neugeborener immundefizienter Mäuse wurde gewählt, um
sowohl die Engraftmentrate als auch das hämatopoetische Differenzierungspotenzial der
transplantierten hämatopoetischen Stammzellen im Vergleich zur systemischen Applikation zu
erhöhen.
3.2.3.1 Charakterisierung der intrahepatischen Transplantation
Die postnatale Leber von immundefizienten NOD/SCID Mäusen wurde vergleichend zur adulten
Mausleber mittels H&E Färbung charakterisiert. Histopathologisch unterscheiden sich die
untersuchten Lebern von juvenilen und adulten NOD/SCID Mäusen. Die jungen Mäuse besitzen eine
stark entwickelte extramedulläre Hämatopoese. In den Leberschnitten von juvenilen Mäusen werden
zwischen großen Hepatozyten Gebiete der extramedullären Hämatopoese mit kleinen
hämatopoetischen, lymphoiden Zellen gefunden. Diese hämatopoetischen Herde erscheinen als
Cluster oder schnurähnlich (Abbildung 14a). Große Makrophagen sind von hämatopoetischen Zellen
umgeben. Zusätzlich gibt es abgegrenzte Gebiete mit hämatopoetischen Zellen. Sinusoides
Endothelium als auch große Blutgefäße mit Endothelzellen sind sichtbar. Zweikernige Hepatoyzten
sind nur gelegentlich auffindbar. Im Gegensatz dazu sind in den Leberschnitten von adulten Mäusen
neben großen einkernigen Hepatozyten und schmalen Sinusoiden keine Gebiete mit
hämatopoetischen Herden detektierbar (Abbildung 14b).
Abbildung 14 Vergleich einer juvenilen Leber (a) mit einer adulten Leber (b) von NOD/SCID Mäusen nach H&E-Färbung.
Aufnahme 40-fache Vergrößerung.
Die organspezifische Transplantation in neugeborene NOD/SCID Mäuse wurde mit 1x10
5
CD34
+
Stammzellen oder 1x10
7
MNC in einem von Volumen von 50µl durchgeführt. Zur Verstärkung der
Immundefizienz und Erhöhung der Engraftmentrate wurden verschiedene Dosierungen der
Bestrahlung an den neugeborenen Mäusen ausgetestet (0, 0,6 und 1,2Gy). Teilweise war eine
b
a
Makrophage
Lymphozyten
E r g e b n i s s e 69
offensichtlich individuell bedingte Mortalität der Tiere nachweisbar. In einigen ausgewählten
Versuchen wurde daher auf eine weitere Konditionierung der Tiere verzichtet.
3.2.3.2 Intrahepatische Transplantation von Stammzellen in NOD/SCID Mäuse
Die Kinetik des Kurz- und Langzeitengraftments und der Organverteilung von intrahepatisch
transplantierten humanen CD34
+
und MNC Zellen wurde in der postnatalen Mausleber
histopathologisch, molekularbiologisch und durchflusszytometrisch zeitabhängig nach
Transplantation nachgewiesen.
Tabelle 14 1x10
5
CD34
+
Zellen wurden 3Tage alten NOD/SCID Mäusen in die Leber transplantiert. 3min bzw. 14 Tage nach
der Transplantation wurden die Tiere getötet, DNA der Organe isoliert und quantitativ der Anteil an humanen Zellen in den
verschiedenen Mausorganen mittels RT-PCR bestimmt.
Knochenmark Milz Thymus Leber Lunge
3min 0,15% 0,03% 0,13% 0,02% 0,02%
14d 0,54% 0,55% 0,19% 0,01% 0,07%
Nach der intrahepatischen Transplantation von CD34
+
Zellen in die juvenilen NOD/SCID Mäuse
wurden in verschiedenen murinen Organen humane Zellen quantitativ mittels Real-Time PCR
detektiert (Tabelle 14). 3 Minuten nach der Transplantation waren bereits 0,15% der Zellen im
Knochenmark humanen Ursprungs. Ein ebenso hoher Anteil von 0,13% Zellen war im Thymus
detektierbar. In der Milz, Leber und Lunge waren nur 0,02-0,03% humane Zellen nachweisbar. 14
Tagen nach der Transplantation ist der Anteil von humanen Zellen in den untersuchten Organen der
NOD/SCID Mäuse deutlich angestiegen, in der Milz auf 0,55% humane Zellen. Ähnliche Anteile
humaner Zellen wurden im Knochenmark (0,54%) und im Thymus (0,19%), wenige humane Zellen in
der Lunge (0,07%) und der Leber (0,01%) der Mäuse gefunden.
Abbildung 15 Kinetik des Engraftments von CD34
+
Zellen. CD34
+
Zellen wurden intrahepatisch in NOD/SCID Mäuse
transplantiert (4-10Tiere pro Gruppe). Juvenile Mäuse waren zum Zeitpunkt der Transplantation 3 Tage alt und adulte
Mäuse 6 Wochen. Durchflusszytometrisch wurden HLA-I positive Zellen im murinen Knochenmark und Milz 14, 42 und 70
Tage nach der Transplantation detektiert.
Knochenmark
0
10
20
30
40
50
60
14 42 70
Tage nach Transplantation
%HLA-I positive Zellen
juvenile Mäuse adulte Mäuse
Milz
0
2
4
6
8
10
14 42 70
Tage nach Transplantation
% HLA-I positive Zellen
juvenile Mäuse adulte Mäuse
a
b
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E r g e b n i s s e 70
Die weitere Analyse der Kinetik des organspezifischen Engraftments zeigt zeitabhängig über einen
Zeitraum von 70 Tagen einen kontinuierlichen Anstieg humaner Zellen im Knochenmark (Abbildung
15a), der Milz (Abbildung 15b), im Blut und in der Leber. Die Anzahl von humanen Zellen in den
murinen Organen Knochenmark und Milz nach intrahepatischer Transplantation von CD34
+
Stammzellen in juvenile NOD/SCID Mäuse nahm mit der Zeit zu. Die HLA-I positiven Zellen stiegen im
Knochenmark von 0,94% 14 Tage nach Transplantation, über 9,12% 42 Tage nach Transplantation auf
35,3% am 70. Tag nach Transplantation. In der Milz wurde ein ähnlicher Anstieg humaner Zellen
gefunden (0,1%, 2,1% und 4,89%). Die höchsten Engraftmentraten wurden 70 Tage nach
Transplantation in den hämatopoetischen Organen Knochenmark und Milz zu 35,5% und 4,9% sowie
im Blut von 3,5% bestimmt, mit geringen Engraftmentraten von 0,18% in der Leber. Die
intrahepatische CD34
+
Transplantation bewirkte kein Engraftment im Thymus, jedoch nimmt die
Größe und das Gewicht (0,05g ± 0,02g im Vergleich zur Kontrollmäusen 0,015g ± 0,004g) des Thymus
signifikant zu. Nach Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen in adulte Mäuse hingegen
wurde zu den untersuchten Zeitpunkten ein Anteil von 0,09%-1,53% humanen Zellen im
Knochenmark detektiert. Ähnlich ist der Vergleich des Engraftments in der Milz nach intrahepatischer
Stammzelltransplantation in juvenile und adulte Mäuse. Der Anteil humaner Zellen in der Milz von
adulten Mäusen veränderte sich kaum über die Zeit und lag zwischen 0% und 0,24%.
Im Vergleich zu den gereinigten CD34
+
Stammzellen wurden intrahepatisch 1x10
7
MNC juvenilen
NOD/SCID-Mäusen transplantiert. Das entspricht ungefähr 2x10
5
CD34
+
Zellen. Zu unterschiedlichen
Zeitpunkten nach der Transplantation wurde die Leber entnommen und histopathologisch
untersucht. Im Lebergewebe befanden sich diffus verteilte Inseln mit extramedullärer Hämatopoese.
Die endogenen lymphatischen Zellen der extramedullären Hämatopoese der Maus ließen sich
morphologisch nicht von den transplantierten humanen MNC unterscheiden (Abbildung 16a). Die
Organbefunde zeigten, dass sich zwischen den Tiergruppen (5min, 1d, 5d nach Transplantation) auch
molekularbiologisch nach humanspezifischer PCR kaum unterschiedliche Ergebnisse zeigten
(Abbildung 16b). Nach längerer Engraftmentdauer von 42 Tagen vermehrten sich die Stammzellen
und ließen sich immunhistologisch im Lebergewebe finden (Abbildung 16d).
E r g e b n i s s e 71
Abbildung 16 Untersuchungen der Leber nach intrahepatischer MNC Transplantation in NOD/SCID Mäuse. H&E Färbung der
formalinfixierten juvenilen Leber 5min nach MNC Transplantation, Aufnahme 40x (a). Gelanalyse humaner Zellen in der
Leber (b). Fluoreszenzfärbung mit dem humanspezifischen HLA-A,B,C Antikörper (Cy3, rot-fluoreszierend) an nicht-
behandelter Leber (c) und 42 Tage nach intrahepatischer MNC Transplantation, Aufnahme 10x (d).
Im Gegensatz zu intrahepatisch transplantierten CD34
+
Zellen engrafteten MNC zu einem geringeren
Prozentsatz von 0,93% im Knochenmark. Der Anteil an humanen Zellen stieg in der Milz auf 7,77%
und im Thymus auf 22,39% 42 Tage nach intrahepatischer Transplantation von mononukleären
Zellen in Mäuse. Der Anteil humaner Zellen 42 Tage nach Transplantation von MNC und CD34
+
Zellen
ist grafisch in Abbildung 17 vergleichend dargestellt. Mittels Ki67 wurde die Proliferation der
humanen Zellen in den Mausorganen untersucht. Nach intrahepatischer MNC Transplantation
exprimierten 15,4% der humanen Zellen im Thymus Ki67 und in der Milz 4,8% der humanen Zellen.
Neben den Parametern des Anteils der humanen Zellen in den Mausorganen wurde der
Differenzierungsgrad der transplantierten Nabelschnurblutzellen mittels FACS-Analyse untersucht
(Abbildung 18). Transplantierte CD34
+
Zellen zeigten eine B-Zell-Differenzierung (9,1 und 2,10%
CD19
+
) im Knochenmark und Milz auf. Nach MNC Transplantation hingegen fanden sich auf den
engrafteten humanen Zellen keine B-Zellen. Indessen sind die humanen Zellen im Thymus zu T-
Lymphozyten (12,3% CD3
+
Zellen) mit unterschiedlichen T-Zellphänotypen differenziert: 1,7% CD8
und 7,5% CD4 positive T-Lymphozyten. T-Zellen dieses Phänotyps sind auch in der Milz und im
Knochenmark zu finden. Undifferenzierte CD34
+
Stammzellen wurden nur nach CD34
+
Transplantation im Knochenmark und in der Milz detektiert.
+ -
- 5
min
5
min
5
min
5
min
1d 1d 5d 5d
a
c
b
d
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E r g e b n i s s e 72
0
10
20
30
40
50
Knochenmark Milz Thymus
% HLA-I positive Zellen
CD34 MNC
Abbildung 17 Vergleich des Anteils humaner Zellen 42 Tage nach intrahepatischer Transplantation von CD34
+
Zellen und
mononukleären Zellen (MNC) in juvenile NOD/SCID Mäuse. Die humanen Zellen wurden mit HLA-I markiert und
durchflusszytometrisch detektiert. Dargestellt sind die Mittelwerte ± SEM im murinen Knochenmark, Milz und Thymus
Knochenmark Milz Thymus Leber
MNC CD 34 MNC CD34 MNC CD 34 MNC CD 34
HLA-I 0,93±1,58
9,1±16,3 7,7±10,1
2,10±4,34 22,4±27,4 0,01±0,03
1,4±2
0,02±0,03
CD 19 0 6,5±11,6 0 1,46±2,78 0 0 nd nd
CD 38 0,35±0,76
7,9±10,5 4,7±4,2 1,90±2,61 11,9±21,3 0 nd nd
CD 34 0 2,0±5,1 0 0,13±0,41 0 0 nd nd
CD 33 0 1,2±3,6 0 0,40±0,01 0 0 nd nd
CD 3 0,53±0,44
0 7,7±11,5
0 12,3±10,5 0 nd nd
CD 4 0,56±1,12
0 2,1±3,7 0 7,5±7,1 0 nd nd
CD 8 0,42±0,63
0 2,3±3,5 0 1,7±1,3 0 nd nd
Abbildung 18 Hämatopoetisches Differenzierungspotenzial von i.hep. transplantierten Nabelschnurblutzellen. FACS-Analyse
von humanen hämatopoetischen Oberflächenmarkern 42 Tage nach MNC und CD34+ Transplantation im Knochenmark,
Milz, Thymus und Leber von NOD/SCID Mäusen. Dargestellt sind die Mittelwerte in Prozent ± SEM (n=10). nd = nicht
bestimmtHämatopoetische Oberflächenmarker auf humanen Zellen in der Milz von NOD/SCID Mäusen nach
intrahepatischer MNC (a, b) und CD34 Transplantation (c, d). Exemplarische Density-Plot Darstellung positiver Zellen in der
Milz nach MNC bzw. CD34+ Transplantation.
CD
3
CD19
d
c
b
a
CD19
CD
3
0%
10‚2%
2,3%
0%
E r g e b n i s s e 73
3.2.3.3 Antitumorwirkung von intrahepatisch transplantierten MNC
Die Wirkung von intrahepatisch transplantierten MNC auf das Tumorwachstum von SW480
Coloncarzinomzellen in NOD/SCID Mäusen in der Gegenwart und Abwesenheit eines bispezifischen
Antikörper anti-CD3xEpCAM (MT110) ist in Abbildung 19a dargestellt. Der bispezifische Antikörper
kombiniert Bindungsspezifitäten von tumorassoziierten EpCAM-Antigenen und vom CD3 Antigen auf
T-Zellen.
40 Tage nach der intrahepatischen Transplantation von MNC in juvenile NOD/SCID Mäuse, wurden
5x10
6
SW480 Tumorzellen s.c. in Gruppen von 8 Tieren transplantiert. Bei einer Tumorgröße von
0,005cm³ wurde den Tieren PBS oder 10µg bspEpCAMxCD3 Antikörper an 5 aufeinander folgenden
Tagen injiziert. Die intrahepatisch transplantierten MNC induzierten eine Verzögerung des SW480
Tumorwachstums ab dem 48. Tag bis zum 55.Tag verglichen mit dem Tumorwachstum in den
NOD/SCID Mäusen. In Anwesenheit des applizierten bispezifischen EpCAMxCD3 Antikörpers ist das
mittlere Tumorvolumen am Tag 50. und 52. signifikant kleiner als mit PBS-behandelte Tiergruppe
(p<0,05). Nach diesem Zeitraum ist das Tumorwachstum in der Antikörper-behandelten Gruppe
vergleichbar mit der PBS-behandelten Gruppe, bleibt jedoch 1,5fach niedriger. Die intrahepatische
Transplantation von MNC resultiert in einer Zunahme bzw. Akkumulation von humanen CD3
positiven T-Zellen.
Die Tumorproben wurden hinsichtlich morphologischer Parameter von Tumorzellen und die relative
Anzahl an humanen CD3 positiven Zellen mittels immunhistochemischer Färbung mit dem CD3
Antikörper bewertet. Ohne transplantierte MNC sind keine humanen Zellen im SW480 Tumor der
Maus detektierbar. In Tumoren mit intrahepatisch transplantierten MNC waren humane CD3 Zellen
nachweisbar (Abbildung 19b). Diese positiven humanen Zellen sind mehr oder weniger gleichmäßig
im Tumorgewebe verteilt. In den Tumoren der Tiere mit transplantierten MNC in Anwesenheit des
bispezifischen Antikörpers war ein deutlich höherer Anteil an humanen CD3 Zellen detektierbar
(Abbildung 19c). Die CD3 positiven Zellen sind hauptsächlich in Clustern innerhalb des SW480 Tumors
arrangiert. In diesen Gebieten sind 40% der Zellen humane CD3 Zellen.
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E r g e b n i s s e 74
Abbildung 19 Wirkung von MT110 Antikörper auf das Tumorwachstum von SW480 Zellen (Grafik, a). Nachweis von
humanen CD3 Zellen im SW480 Tumor der NOD/SCID Maus. (b) MNC+Tumor (c) MNC+Tumor+MT110.
Antikörper
SW480
*
*
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
40 42 44 46 48 50 52 54
Mean tumor volume (cm³)
Tage nach i.hep. Transplantation von MNC
Tumor
MNC+Tumor
MNC+Tumor+Antikörper
c
b
a
E r g e b n i s s e 75
3.2.4 Etablierung und Charakterisierung von Mausmodellen mit Leberschaden in
immundefizienten Mäusen
Verschiedene Mausmodelle mit Leberschaden wurden in immundefizienten Mäusen etabliert und
charakterisiert, um das Regenerations- und Differenzierungspotenzial von Stammzellen nach in vivo
Transplantation zu ergründen. In der immundefizienten NOD/SCID Maus wurden unterschiedliche,
kliniknahe Leberschadensmodelle in bestrahlten Mäusen induziert:
• Chemisch - induzierter Leberschaden durch CCl
4
- Applikation
• Chronischer Leberschaden durch Cholin-defiziente Futterdiät
• Akuter Leberschaden durch chirurgisch induzierte partielle Hepatektomie
Die Modelle wurden bezüglich des pathologischen Leberschadens histologisch durch Bewertung der
Apoptose/Nekrose und der Aktivität von Leberenzymen im Serum der Tiere beurteilt. Protokolle für
die Durchführung und Etablierung dieser Organschadensmodelle wurden erstellt und bilden eine
wesentliche Grundlage für die Erarbeitung von Standard Operation Procedures (SOP) in
experimentellen Tiermodellen.
3.2.4.1 Chemisch-induzierter akuter Leberschaden durch CCl
4
Applizierter Tetrachlorkohlenstoff (CCl
4
) wird in der zentrolobularen Zone der Leber metabolisiert
und produziert das hochaktive Trichlormethyl-Radikal, dass eine Lipidperoxidation des
endoplasmatischen Retikulums verursacht und die Plasmamembran schädigt. In der Folge steigt der
Spiegel von intrazellulärem Calcium, das zum direkten Tod der Hepatozyten führt (Faber et al., 1975).
NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse wurde i.p. CCl
4
in der Konzentration von 0,3-0,5ml/kg
appliziert. 0,5ml/kg CCl
4
rief ausgeprägte Nebenwirkungen hervor. Die einmalige Gabe von 0,4ml/kg
CCl
4
wurde von beiden immundefizienten Mausstämmen gut vertragen. Die Tiere zeigten keine
wesentlichen Nebenwirkungen. In einem Versuchsansatz wurde ein chronischer Leberschaden durch
viermaliger CCl
4
Gabe von 0,25ml/kg i.p. innerhalb von 14 Tagen in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
induziert, jedoch stieg die Mortalität.
0,4ml/kg CCl
4
wurde NOD/SCID Mäusen einmalig i.p. appliziert, 24 Stunden später wurden die Leber
entnommen und histopathologisch untersucht (Abbildung 20b). Das histologische Bild der
autopsierten Lebern (n=3) war einheitlich. Es wurden im Organquerschnitt zahlreiche
Koagulationsnekrosen, die vorwiegend zentrolobulär lokalisiert waren, nachgewiesen. Eine
entzündliche Demarkation bestand nicht. Die Nekrosen waren in den meisten Fällen von einem Saum
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deutlich vakuolisierter Hepatozyten umgeben. Diese Vakuolisierung kann als frühe Form der
Leberschädigung, die der Nekrose vorangeht, angesehen werden.
Abbildung 20 Histopathologische Untersuchung einer unbehandelten Leber einer NOD/SCID Maus (a) und 24h nach CCl
4
Behandlung (b), 20fache Vergrößerung
3.2.4.2 Chronischer Leberschaden durch Cholin-defiziente Futterdiät
In tierexperimentellen Modellen wird ein chronischer Leberschaden durch Leberentzündung oder
Fettleberinduktion hervorgerufen. Die Administration des Karzinogens Ethionin in Kombination mit
einer Cholin-defizienten Diät induziert eine Proliferation von Ovalzellen und die Induktion einer
Fettleber
(Shinozuka et al., 1978).
In der vorliegenden Modelletablierung erhielten die NOD/SCID Mäuse über einen Zeitraum von 21
Tagen eine Cholin-defiziente Experimentaldiät (ssniff EF R/M Fettleberinduktion E15650-49) mit
hohem Kohlenhydratgehalt bei marginaler Proteinversorgung sowie niedrigem Cholinangebot und
0,15% Ethionin im Wasser. Der Kontrollgruppe wurde weiterhin das Standardfutter und Wasser
gegeben. Das ermittelte Körpergewicht und der Futter- und Wasserverbrauch unterschied sich in den
Gruppen nicht. Das Lebergewicht der Diätgruppe war niedriger als in der Kontrollgruppe (1,19 g bzw.
1,04 g in der Diätgruppe zu 1,43 g bzw. 1,27 g in der Kontrollgruppe nach 7 bzw. 21 Tagen Diät).
Bei einer höheren Dosierung von 0,45% Ethionin wurden NOD/SCID Mäuse morbid und das
Experiment abgebrochen. NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen reagierten sensitiver auf Ethionin, das
Erscheinungsbild der Leber war hell, nekrotisch, brüchig, die Gallenblase gestaut. Die Konzentration
von Ethionin wurde in weiteren Versuchen von 0,15% über 0,075% auf 0,03% reduziert.
Die histopathologische Untersuchung des Lebergewebes von NOD/SCID Mäusen ergab nach
siebentägiger Diät mit 0,15% Ethionin eine feinschaumige Vakuolisierung und geringgradige
Schwellung des Zytoplasmas der Hepatozyten, in geringer bis mittlerer Zahl mittelgroße Fettvakuolen
(Anzeichen für Steatose) und wenigen Einzelzellnekrosen (Abbildung 21a). Eine deutliche
b
a
Vakuolisierung
Nekrosen
E r g e b n i s s e 77
Proliferation von sogenannten „oval cells“ war perivaskulär und in der Umgebung der Gallengänge
sichtbar. Die „oval cells“ wurden als basophile (dunkelblau gefärbte) Zellen mit einem schmalen
eiförmigen Kern erfasst.
Abbildung 21 Histopathologische Untersuchung der Leber einer NOD/SCID Maus nach 7tägiger Futterdiät und Ethioningabe
(40x)(a) und quantitative Bestimmung von Sca-1 positiven Zellen „oval cells“ in der Leber mittels FACS (b).
Die Veränderung in der „oval cell“-Population in der Leber von NOD/SCID Mäusen während Cholin-
defizienter Diät und Ethionin-Gabe (CDE) wurde quantitativ mittels Durchflusszytometrie mit dem
murinspezifischen Antikörper Sca-1 bestimmt (Abbildung 21b). Der Ausgangsanteil an Sca-1 positiven
Zellen von 2,5% stieg unter Diät auf 3,24% und Diät mit Ethionin auf 3,68% in der Leber von
NOD/SCID Mäusen an, war jedoch nicht signifikant. Der Anteil an Sca-1 positiven Zellen in
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen war geringer (unter Diät 2,06% und Diät mit 0,03% Ethionin 2,56% Sca-1
positive Zellen). Die Gruppe mit experimenteller Futterdiät wies einen leicht erhöhten Anteil an
proliferierenden Zellen auf (Anteil von BrdU positive Zellen 3,5% im Vergleich zu 1,75% in der
Kontrollgruppe nach siebentägiger Diät, Daten nicht gezeigt).
Das Serum von NOD/SCID Mäusen wurde auf die leberspezifischen Enzyme Aspartat-
Aminotransferase (AST) und Alanin-Aminotransferase (ALT) unter verschiedenen Futterapplikationen
untersucht. Die Leber-Aminotransferase Aktivität stieg stark nach siebentägiger Diät und
Ethioningabe von 114 U/ml unter Normalfutter auf 390 U/ml an und die ALT von 32 U/ml auf 667
U/ml. Unter alleiniger Futterdiät betrug die AST 191 U/ml und die ALT 26 U/ml (Abbildung 22). Die
Aktivität hatte am siebten Tag ihren Höhepunkt erreicht und nahm zum 21.Tag leicht wieder ab
(Daten nicht gezeigt), jedoch blieb die Enzymaktivität in der CDE Gruppe immer signifikant erhöht.
b
a
Fettvakuolen
Oval cells
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E r g e b n i s s e 78
0
400
800
1200
1600
AST ALT
U/ml
Normalfutter
Diät
Diät+0,15%Ethionin
Abbildung 22 Analyse des Mausserums auf die leberspezifischen Enzyme Aspartat-Aminotransferase (AST) und Alanin-
Aminotransferase (ALT) nach siebentägiger Diät. Anstieg von AST und ALT im Serum von NOD/SCID Mäusen mit Cholin-
defizienter Diät+ Ethionin. Mittelwert ± SEM (n=9).
3.2.4.3 Akuter Leberschaden durch partielle Hepatektomie
Als weiteres Modell des Leberschadens wurde die partielle Hepatektomie (PHx) an immundefizienten
Mäusen etabliert. Im Allgemeinen werden die chirurgischen Modelle des akuten Leberversagens in
totale Hepatektomie, partielle Hepatektomie und Leberdevaskularisation (Unterbinden der
Gefäßversorgung) eingeteilt.
In dem Modell der partiellen Hepatektomie wurde den narkotisierten NOD/SCID Mäusen der links-
laterale Leberlappen abgebunden und abgetrennt. Dies bewirkte in dem Modell eine 30%ige partielle
Hepatektomie. Innerhalb von 24 Stunden erholten sich die Tiere von dem chirurgischen Eingriff. Die
Überlebensrate der NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse betrug mehr als 85%. In einigen
Experimenten erhielten die immundefizienten Mäuse vor der partiellen Hepatektomie den
Proliferationshemmer Monocrotalin einmalig wöchentlich intraperitoneal (i.p.). Monocrotalin ist ein
Alkaloid, dass ähnlich Retrorsin eine anhaltende Hemmung der nativen Hepatozytenproliferation
aufgrund der metabolischen Aktivierung im P450-System der Leber bewirkt und eine Woche nach
Substanzgabe keine Wirkung auf transplantierte Zellen hervorruft (Witek et al., 2005). Die Dosis und
Wirkung von Monocrotalin in NOD/SCID Mäusen ist bislang noch nicht in der Literatur beschrieben.
Eine Dosis von 30 und 60 mg/kg wurde wöchentlich über einen Zeitraum von vier Wochen i.p.
injiziert und die Überlebensrate bestimmt. Die Applikation von 60 mg/kg Monocrotalin führte zu
einer Mortalität von 50% bei NOD/SCID Mäusen. Nach der Gabe von 30 mg/kg Monocrotalin und
anschließender partiellen Hepatektomie überlebten den Eingriff 66% der NOD/SCID Mäuse;
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse hingegen hatten eine Überlebensrate von 90,5%. Bei NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen mit partieller Hepatektomie und Monocrotalin-Gabe betrug der regenerierte Leberlappen
E r g e b n i s s e 79
bereits nach drei Tagen schon 16,9% (0,13g ± 0,01g) des Gesamtlebergewichts (0,77g ± 0,15g) und
nach zehn Tagen war die Leber komplett regeneriert und der regenerierte Leberlappen betrug 30%
des Gesamtlebergewichts (Abbildung 23b).
Abbildung 23 Makroskopische Aufnahme von dem zu abtrennen, links-lateralen Leberlappen vor PHx (a) und
nachgewachsener, regenerierter Lappen nach PHx (b). Histopathologische Untersuchung der Leber von NOD/SCID Mäusen
10 Tage nach partieller Hepatektomie: unberührter, rechter Leberlappen (c), regenerierter, links-laterale Leberlappen (d)
mit mitotischen, diploiden Zellen, 40x Vergrößerung.
Die histopathologischen Untersuchungen der Leber nach partieller Hepatektomie ergaben, dass
nach 10 Tagen keine deutlichen Unterschiede zwischen den Leberproben mit und ohne partielle
Hepatektomie ausgebildet waren. Die histopathologische Bewertung ergab, dass der Anteil kleinerer
Hepatozyten im regenerierten Leberlappen leicht erhöht war (Abbildung 23d). Auch eine
Makrophagen-Aktivierung, sichtbar an einer Vergrößerung der Kerne der Kupffer’schen Sternzellen,
war teilweise nachweisbar. In Einzelfällen fand bei sehr kleinen Hepatozyten eine gerade
abgelaufene Differenzierung statt. Literaturdaten belegen, dass der Prozess der Leberregeneration
sofort nach dem Schaden ausgelöst wird, 16h nach der Resektion beginnt die DNA-Replikation
(Martins et al., 2007).
Die leberassoziierten Enzyme Aspartat- und Alanin-Transaminase wurden im Serum von NOD/SCID/
IL2Rγ
null
Mäusen analysiert. Weder Monocrotalin noch PBS bewirkten einen signifikanten Anstieg der
Enzyme im zeitlichen Verlauf von drei Wochen. Der akute Schaden, verursacht durch die partielle
Hepatektomie, resultierte drei Tage nach der partiellen Hepatektomie (d31 nach erster
Monocrotalin-Gabe) in einen Anstieg auf 162 U/ml bzw. 130 U/ml Aspartat-Transaminase in der
b
a
c
d
diploid
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E r g e b n i s s e 80
Gruppe mit partieller Hepatektomie bzw. Monocrotalin-Gabe und partieller Hepatektomie (Ausgang
durchschnittlich 65 U/ml). Auch die Alanin-Transaminase stieg nach der partiellen Hepatektomie von
durchschnittlich 16 U/ml auf 48 U/ml in der Gruppe mit partieller Hepatektomie bzw. 38,6 U/ml
unter Monocrotalin-Gabe und partieller Hepatektomie, signifikante Unterschiede konnten nicht
ermittelt werden. Nach zwei Wochen waren die erhöhten Enzymwerte wieder auf ihre
Ausgangswerte zurückgefallen. Die Werte im zeitlichen Verlauf sind in Tabelle 15 dargestellt.
d-1 d6 d13 d20 d31
AST (U/ml) PBS + PHx 66,9 ± 9,5 79,2 ± 7,3 121,6 ± 18,9
110,2 ± 18,1
162,4 ± 69,8
Mc + PHx 64,6 ± 9,1 71,3± 3,5 117,5 ± 20,6
108,8 ± 19,2
130,6 ± 34,2
ALT (U/ml) PBS + PHx 16,7 ± 3,3 19,6 ± 4,5 23,3 ± 4,3 22,9 ± 3,2 48,0 ± 33,5
Mc + PHx 15,5 ± 0,7 20,9 ± 3,7 26,5 ± 3,6 25,1 ± 4,4 38,6 ± 16,3
Tabelle 15 Aspartat-Transaminase (AST) und Alanin-Transaminase (ALT) in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen mit partieller
Hepatektomie. Monocrotalin (Mc) bzw. PBS Gabe am d0,7,14 und 21; d28 partielle Hepatektomie (PHx). Mittelwerte aus
n=6 Mäuse ± SEM aus einem exemplarischen Experiment.
Der Anteil an „oval cells“, die das Sca-1 Antigen exprimierten, wurde sieben Tage nach der
Leberresektion durchflusszytometrisch bestimmt. Sowohl im nativen als auch regeneriertem
Leberlappen waren 1,6% bzw. 1,8% Sca-1 positive Zellen. Auch Monocrotalin hatte keinen Einfluss
auf den Anteil positiver Zellen (1,8% bzw. 1,9%).
E r g e b n i s s e 81
3.2.5 Transplantation von undifferenzierten CD34
+
adulten Stammzellen in
Mausmodelle mit Leberschaden
Zur Bewertung der in vivo Eigenschaften der adulten Stammzellen bezüglich Engraftment und
Induktion der Zelldifferenzierung wurden unterschiedliche Transplantationsverfahren und
Applikationsrouten in adulten als auch neugeborenen immundefizienten NOD/SCID Mäusen
eingesetzt.
Die systemische CD34
+
Zellapplikation in adulte NOD/SCID Mäuse und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse
bewirkte einen hohen Anteil an humanen Zellen in den hämatopoetischen Mausorganen. In
neugeborenen NOD/SCID Mäusen wurden CD34
+
Zellen und mononukleäre Zellen intrahepatisch
appliziert und eine Zunahme humaner Zellen in die Leber nachgewiesen. Nach Zelltransplantation in
die Leber von adulten Mäusen war der Anteil humaner Zellen signifikant weniger ausgeprägt.
In immundefizienten Mausmodellen mit Leberschaden wurden Stammzellen transplantiert und das
Verhalten der Stammzellen bei Lebererkrankung und das regenerative Potenzial bestimmt. Die
etablierten Leberschadensmodelle dienten zur Untersuchung der Organintegration und des
leberregenerativen Potenzials von Stammzellen.
3.2.5.1 Transplantation von Stammzellen in Mäuse mit chemisch-induzierten
Leberschaden
CD34
+
Stammzellen wurden NOD/SCID Mäusen systemisch transplantiert. Nach einem Zeitraum von
4 Wochen wurde mit CCl
4
ein Leberschaden induziert. Anschließend wurde HGF dreimal i.p.
appliziert. Vier Wochen später wurden die Organe Milz, Leber, Blut und Knochenmark entnommen
und durchflusszytometrisch auf humane Zellen untersucht. Die Gruppe ohne Leberschaden und mit
CCl
4
Leberschaden wiesen ein vergleichbares Engraftment humaner Zellen im Knochenmark von
17,2% und 20,2% HLA-I positive Zellen (Abbildung 24a) und in der Leber von 0,18% und 0,19%
humane Zellen auf (Abbildung 24b). Die zusätzliche systemische Gabe von HGF zum Leberschaden
bewirkte ein höheres Engraftment sowohl im Knochenmark (32,5%) als auch in der Leber (0,31%)
verglichen mit den anderen zwei Gruppen. Der höhere Anteil an humanen Zellen in der Leber nach
CCl
4
Schaden und HGF Gabe im Vergleich zu CCl
4
Schaden bzw. ohne Schaden wurde mit der
humanspezifischen PCR verifiziert. Die Anwendung dieser Methode belegte einen hohen Anteil
humaner DNA in der Leberprobe mit Schaden und Zytokingabe und moderater Anteil humaner DNA
in den beiden anderen Proben (Daten nicht gezeigt).
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Abbildung 24 2x10
5
CD34
+
Zellen wurden i.v. in 1,6 Gy bestrahlte NOD/SCID Mäuse transplantiert. Nach 28 Tagen wurde
0,4ml/kg CCl
4
und in einigen Mäusen 3x1,5µg HGF i.p. appliziert. Am 56.Tag wurde das Knochenmark (a) und die Leber (b)
durchflusszytometrisch hinsichtlich der Expression von HLA-I positiven Zellen von jeweils drei Mäusen analysiert.
Zur Induktion eines akuten Leberschadens wurde in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen der gleiche
Versuchsaufbau angewendet, jedoch waren die Ergebnisse abweichend. In allen Organen wies die
Gruppe mit chemisch-induziertem Leberschaden deutlich weniger humane Zellen als die
unbehandelte Kontrollgruppe auf (Tabelle 16). Im Knochenmark konnten vier Wochen nach dem
Leberschaden nur 7,47%, im Blut 0,46% und in der Milz 0,3% HLA-I positive Zellen
durchflusszytometrisch detektiert werden. In der Leber waren nach Leberschaden ebenso viele
humane Zellen wie ohne Leberschaden (0,28% bzw. 0,29%). Im Knochenmark von Mäusen ohne
Leberschaden war der Anteil an den humanen Zellen mit der Expression der hämatopoetischen
Marker CD45, CD38, CD34, CD19 und CD10 doppelt so hoch wie in Tieren mit Leberschaden, nur für
den Marker CD14 war das Bild umgekehrt (Daten nicht gezeigt). Es wurden nicht nur humane Zellen
durchflusszytometrisch in den vier aufgeführten Organen detektiert, sondern auch mittels
humanspezifischer PCR in weiteren Organen wie Niere, Lunge, Herz, Thymus und Hirn. Auch in diesen
Organen aller untersuchten Tiere mit CCl
4
induziertem Leberschaden wurde molekularbiologisch ein
hoher Anteil humaner DNA detektiert. In der Leber wurden mittels quantitativer RT-PCR nach
ausgewählten humanspezifischen, leberassoziierte Proteine gesucht und eine schwache Expression
von SOX17 und HNF-3β gefunden, jedoch keine Expression von AFP (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 16 Durchflusszytometische Bestimmung humaner HLA-I positiver Zellen in Organen von NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen. Die Organe wurden 8 Wochen nach i.v. Transplantation von CD34
+
Stammzellen bzw. 4 Wochen nach Setzen des
chemisch-induzierten Leberschadens mit CCl
4
und systemischer HGF-Gabe untersucht. Mittlerer Prozentwert ± SEM für
HLA-I positive humane Zellen in der entsprechenden Organsuspension aus einem Experiment mit sechs Mäusen pro
Gruppe. Im Knochenmark und Milz von Mäusen mit Schaden sind die Werte signifikant (p<0,05) kleiner als ohne Schaden.
Knochenmark Blut Milz Leber
CD34 i.v. 37,56 ± 22,99 8,03 ± 7,49
9,76 ± 9,08
0,29 ± 0,12
CD34 i.v. +CCl
4
+ HGF 7,47 ± 3,70 0,46 ± 0,11
0,30 ± 0,14
0,28 ± 0,31
a
b
E r g e b n i s s e 83
Im Gegensatz zu der systemischen Applikationsroute der Stammzellen in immundefiziente Mäuse
wurde in einem weiteren Experiment neugeborenen NOD/SCID Mäusen CD34
+
Stammzellen
organspezifisch intrahepatisch transplantiert. Zehn Wochen später wurde der Leberschaden mit CCl
4
und HGF-Applikation induziert. Der Anteil an humanen Zellen wurde zum Zeitpunkt des
Leberschadens und acht Wochen nach dem Leberschaden bestimmt (Abbildung 25). Vor
Leberschädigung wurden im Knochenmark 2,8%, im Blut 1,52% und in der Milz 1,13% humane Zellen
detektiert. Nach Leberschädigung reduzierte sich der Anteil humaner Zellen auf 1,63% im
Knochenmark, 0,63% im Blut und 0,22% in der Milz. In der Leber wurde vor und nach dem
Leberschaden ein konstanter Level humaner Zellen auf sehr niedrigem Niveau detektiert. Mittels
humanspezifischer PCR wurden die Daten in der Leber verifiziert und zum Zeitpunkt des
Leberschadens, zwei Wochen nach Leberschaden und acht Wochen nach Schaden der Anteil
humaner Zellen bestimmt. Der Anteil DNA humanen Ursprungs war moderat und blieb im zeitlichen
Verlauf konstant (Daten nicht gezeigt).
Abbildung 25 Einfluss des CCl
4
Schadens auf den Anteil humaner Zellen in ausgewählten Organen. Neugeborenen
NOD/SCID Mäusen wurde intrahepatisch CD34
+
Stammzellen transplantiert, nach zehn Wochen der Anteil humaner Zellen
bestimmt (d0) und durch CCl
4
ein akuter Leberschaden induziert. Dargestellt sind die Einzelwerte von 6 Tieren pro Gruppe
zum Zeitpunkt d0=Leberschaden (offene Symbole) und 56 Tage nach CCl
4
Schaden (ausgefüllte Symbole); schwarze Linie:
Mittelwerte. Nach der CCl
4
Gabe d0 wurde dreimal HGF i.p. appliziert.
Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass das Mausmodell mit akutem Leberschaden durch
CCl
4
Gabe und Applikation vom Zytokin HGF für die Transplantation von Stammzellen geeignet
erscheint. Der alleinige chemisch-induzierte Leberschaden ohne Zytokin induziert kein effizientes
Engraftment der Stammzellen in der Leber. Die zusätzliche Gabe von HGF ist notwendig, um eine
höhere Anzahl an humanen Zellen in den untersuchten Organen zu erreichen. Eine leberspezifische
Anreicherung wurde jedoch nicht gefunden.
2,8
1,63 1,52
0,63 1,13
0,22 0,02 0,02
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
% HLA-I positive Zellen
Knochenmark Blut Milz Leber
d0 CCl4 Schaden d56 nach CCl4 Schaden Mittelwert
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E r g e b n i s s e 84
0
1
2
3
4
5
Knochenmark Milz
% humane Zellen
CD34+ Zellen Diät + CD34+ Zellen
3.2.5.2 Transplantation von Stammzellen im Mausmodell mit chronischem Leberschaden
induziert durch Cholin-defiziente Futterdiät
Ein chronischer Leberschaden wurde durch eine Cholin-defiziente Futterdiät und 0,075% Ethionin im
Trinkwasser in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen über einen Zeitraum von 19 Tagen induziert. Am 21.Tag
wurden den Mäusen CD34
+
Stammzellen organspezifisch in die Leber transplantiert. Das
Knochenmark, Milz und Leber wurde 12 Wochen nach der Transplantation durchflusszytometrisch
untersucht und die HLA-I positiven Zellen in den jeweiligen Organen bestimmt. Als Kontrolle für das
Engraftment wurde einer Gruppe von sechs Mäusen nur die Stammzellen ohne vorherigen
Leberschaden intrahepatisch transplantiert. Der durch die Futterdiät induzierte Leberschaden
bewirkte, dass ein höherer Anteil an humanen Zellen im Knochenmark (1,69%) und in der Milz
(0,88%) gefunden wurde. Im Vergleich zu den Mäusen ohne Schaden wurden nur 0,38% humane
Zellen im Knochenmark und keine humanen Zellen in der Milz detektiert (Abbildung 26a). In der
Leber betrug der Prozentsatz humaner Zellen 0,01% ohne Schaden und 0,02% mit Leberschaden. Die
Leber wurde mittels humanspezifischer PCR weiter analysiert und der Anteil humaner DNA bestimmt
(Abbildung 26b). In den Leberproben mit induziertem Schaden ist der Anteil humaner DNA in drei
von sechs Tieren leicht erhöht gegenüber den Proben ohne Leberschaden. Die quantitative RT-PCR-
Analyse der leberspezifischen Proteine SOX17 und AFP ergab keine Expression, humane HNF3β
Proteine wurden leicht in den Proben mit Leberschaden exprimiert.
Abbildung 26 NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen wurden mit einer Cholin-defizienten, 0,075% angereicherten Futterdiät ernährt.
21Tage nach Beginn der Diät wurden 2x10
5
CD34
+
Zellen i.hep. transplantiert und nach 12 Wochen das murine Knochemark
und Milz mit dem FACS hinsichtlich der Expression von HLA-I positiven Zellen analysiert (a). Humanspezifische PCR der
entsprechenden murinen Leberproben (b). Semiquantitative Bewertung der Bandenintensität auf dem Gel: +++ starke; ++
moderate; + schwache; (+) sehr schwache Intensität der Bande.
3.2.5.3 Transplantation von CD34
+
Zellen in Mäuse mit partieller Hepatektomie
Im Modell der partiellen Hepatektomie wurden CD34
+
Stammzellen nach der Leberresektion
intrahepatisch in NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen transplantiert und acht Wochen nach der
Leber
CD34
+
Zellen
CD34
+
Zellen +
Leberschaden
Tier 1 ++ +++
Tier 2 ++ +++
Tier 3 ++ (+)
Tier 4 (+) +++
Tier 5 ++ ++
Tier 6
+++
+++
a
b
E r g e b n i s s e 85
Transplantation das Engraftment durch die FACS-Analyse mit HLA-I Antikörpern bestimmt. In einer
Versuchsgruppe wurde der Proliferationshemmer Monocrotalin über einen Zeitraum von vier
Wochen vor der Operation und Transplantation einmal wöchentlich i.p. appliziert. Der
Kontrollgruppe wurden Stammzellen ohne Leberresektion transplantiert. Acht Wochen nach
Transplantation wurden die Organe durchflusszytometrisch auf humane HLA-I positive Zellen
untersucht. Das Knochenmark von Mäusen mit partieller Hepatektomie und Monocrotalin enthielt
den höchsten Anteil humaner Zellen (11,77%) verglichen mit 5,34% mit Leberschaden und 0,06%
ohne chirurgischen Eingriff (Tabelle 17). Ähnlich war das Verhältnis der humanen Zellen in der Milz
und der Leber nach partieller Hepatektomie und Monocrotalin zu partieller Hepatektomie. Die
vorherige Gabe von Monocrotalin und partielle Hepatektomie bewirkte, dass 0,18% humane Zellen in
dem Originalleberlappen engrafteten und mit 0,23% humanen Zellen der abgetrennte Leberlappen
regeneriert wurde. Die Prozentsätze der engrafteten humanen Zellen sind in Tabelle dargestellt.
Sowohl der originale Leberlappen als auch der regenerierte Leberlappen wurde mit der
humanspezifischen PCR auf humane Zellen untersucht. Eine starke Expression von humanen Zellen
wurde im regenerierten Leberlappen nach Monocrotalin und partieller Hepatektomie gefunden, aber
auch die alleinige partielle Hepatektomie bewirkte eine starke Expression in regeneriertem
Leberlappen. Reduziert war die Expression im originalen Leberlappen.
Tabelle 17 Engraftment von CD34
+
Zellen nach intrahepatischer Transplantation in adulte, 1,6Gy bestrahlten
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen ± partielle Hepatektomie (PHx). Bestimmung der humanen HLA-I Zellen in murinen Organen
mittels FACS-Analyse 8 Wochen nach Transplantation. Mittelwerte aus einem Experiment mit 8 Mäusen pro Gruppe ± SEM.
% HLA-I positive Zellen
Monocrotalin + PHx + CD34 PHx + CD34 CD34
Knochenmark 11,77 ± 11,57 5,34 ± 4,32 0,06 ± 0,05
Milz 3,64 ± 7,68 3,95 ± 3,38 0,03 ± 0,03
Leber original 0,18 ± 0,21 0,07 ± 0,03 0
Leber regeneriert 0,25 ± 0,27 0,11 ± 0,06
In einem weiteren Versuchsansatz wurde der Einfluss der partiellen Hepatektomie auf schon
engraftete adulte Stammzellen in NOD/SCID Mäusen getestet. Neugeborenen NOD/SCID Mäusen
wurden CD34
+
Zellen intrahepatisch transplantiert und nach 8 Wochen eine 30% Leberresektion
durchgeführt. Der Einfluss der partiellen Hepatektomie auf die Stammzellen wurde nach weiteren
acht Wochen durch Bestimmung des Anteils der HLA-I positiven Zellen in verschiedenen Organen
durchflusszytometrisch ermittelt. Der Anteil humaner Zellen war in der Gruppe mit partieller
Hepatektomie und Monocrotalin am höchsten im Vergleich zur Gruppe mit partieller Hepatektomie
oder ohne Leberschaden. Im Knochenmark befanden sich 1,53% humane Zellen nach
intrahepatischer Transplantation von Stammzellen. Dieser Anteil wurde durch die partielle
Hepatektomie auf 7,1% erhöht und die zusätzliche Gabe von Monocrotalin bewirkte, dass das
Knochenmark zu fast 1/3 aus humanen Zellen bestand (Tabelle 18). Ebenfalls sehr hohe Anteile an
Advertisement
E r g e b n i s s e 86
humanen Zellen konnten in der Milz mit 6,16%, im originalen Leberlappen mit 0,18% und im
regenerierten Leberlappen mit 0,23% aufgefunden werden. Durch die partielle Hepatektomie
erhöhte sich der Wert von 0,007% auf 0,05% im originalen Leberlappen und 0,07% im regenerierten
Leberlappen (siehe Tabelle 18).
Tabelle 18 2x10
5
CD34
+
Zellen wurden i.hep. in neugeborene NOD/SCID Mäuse transplantiert. Nach 8 Wochen wurde eine
partielle Hepatektomie (PHx) durchgeführt und weitere 8 Wochen später das Knochenmark, Milz und Leber
durchflusszytometrisch auf engraftete, humane Zellen untersucht. Mittelwerte aus fünf Mäusen pro Gruppe ± SEM.
% HLA-I positive Zellen
CD34
+
Zellen + PHx + Monocrotalin
CD34
+
Zellen + PHx CD34
+
Zellen
Knochenmark 31,90 ± 20,01 7,10 ± 6,10 1,53 ± 1,42
Milz 6,16 ± 5,06 0,51 ± 0,26 0,05 ± 0,03
Leber original 0,18 ± 0,17 0,05 ± 0,03 0,01 ± 0,01
Leber regeneriert 0,23 ± 0,22 0,07 ± 0,02
Weiterhin wurde der Anteil an humaner DNA in den Leberstücken mit der humanspezifischen PCR
bestimmt. Sowohl im regenerierten als auch originalen Leberlappen wurde in den Gruppen mit
partieller Hepatektomie eine starke Expression humaner DNA detektiert. In der Leber ohne PHx
wurde nur moderate Expression gefunden (Tabelle 19). Mit quantitativer RT-PCR wurden die
Leberproben auf die leberassoziierten Proteine SOX17, HNF3 und AFP untersucht. Weder die
Expression von humanen SOX17 noch von AFP konnte in den Leberstücken detektiert werden. HNF3
hingegen wurde schwach in der Gruppe mit PHx und Monocrotalin, sehr gering in der Gruppe mit
PHx und gar nicht in der Gruppe ohne Leberschaden exprimiert. CD45, ein Protein für Leukozyten,
wurde von der Gruppe mit PHx und PHx+Monocrotalin gleich stark exprimiert (Daten nicht gezeigt).
Tabelle 19 Engraftment von Stammzellen in der Leber 8 Wochen nach partieller Hepatektomie (PHx). CD34
+
Zellen wurden
i.hep. in neugeborene NOD/SCID Mäuse transplantiert und 8 Wochen später die PHx durchgeführt. Humanspezifische PCR
vom originalen und regenerierten Leberlappen.
Tier 1 Tier 2 Tier 3 Tier 4 Tier 5 Tier 6
orig
reg
orig reg
orig reg
orig reg
orig reg
orig reg
CD34 + PHx + Monocrotalin
+++
+++
+++ +++
+++ +++
+++ +++
+++ +++
+++ +++
CD34 + PHx +++
+++
+++ +++
nd +++
+++ +++
+++ +++
++ +++
CD34 ++
+
+
++
+
nd
Legende: Semiquantitative Bewertung der Bandenintensität auf dem Gel: +++ starke; ++ moderate; + schwache; (+) sehr
schwache Intensität der Bande. nd: nicht bestimmt. 3 Gruppen, pro Gruppe 6 Tiere.
Das Mausmodell mit partieller Hepatektomie und Applikation von Monocrotalin stellt ein geeignetes
Modell zur Prüfung des regenerativen Potenzials von Stammzellen dar. Die partielle Hepatektomie
allein induziert kein effizientes Engraftment der Stammzellen in der Leber. Die endogene Hemmung
der Hepatozytenproliferation durch die zusätzliche Gabe von Monocrotalin ist notwendig, um eine
höhere Anzahl an humanen Zellen in den untersuchten Organen zu erreichen. Der Einsatz der
verwendeten Stammzellen zur Leberregeneration ist noch offen.
E r g e b n i s s e 87
3.3 In vitro Untersuchungen an humanen embryonalen Stammzellen
3.3.1 Charakterisierung von undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen
3.3.1.1 Embryonale Mausfibroblasten als Feederzellen für humane embryonale Stammzel-
len
Die Kultivierung und Passagierung der SA002-Stammzelllinie erfolgte auf inaktivierten embryonalen
Mausfibroblasten (MEFs). MEFs fördern das Wachstum und unterdrücken gleichzeitig die Differenzie-
rung von embryonalen Stammzellen durch die Sekretion bestimmter löslicher Faktoren in das Kul-
turmedium. Ausgehend von Literaturdaten und eigenen Untersuchungen wurde die Isolierung von
embryonalen Mausfibroblasten aus CD-1 Mäusen etabliert. Homogene „Feeder-Zellpräparationen“
von ungefähr 1,0x10
8
Zellen/Maus wurden aus 11 Mäuseembryonen pro Maus präpariert. Die Quali-
tät der embryonalen Zellpräparationen wurde mittels quantitativer RT-PCR mit spezifischen
Primerpaaren für TGF-ß1, ActivinA, Gremlin1 und BMP4 kontinuierlich geprüft. Die erhöhte Expressi-
on der mRNA von Gremlin1 und ActivinA zeigt an, dass die MEFs als Feederzellen für die hES geeignet
sind, denn ActivinA unterstützt die Selbsterneuerung von hES und Gremlin1 unterdrückt die Differen-
zierung der hES.
3.3.1.2 Morphologische Charakterisierung und Karyotyp-Analyse der embryonalen
Stammzelllinie SA002
Kultivierte humane embryonale Stammzellen zeichnen sich im undifferenzierten Zustand im Medium
mit bFGF und SerumReplacer auf MEF-Feederzellen durch einen scharf abgegrenzten Rand, eine fla-
che Kolonieform und eine kompakte Struktur mit relativ kleinen, runden Zellen, die ein großes Kern-
zu-Plasma-Verhältnis aufweisen, aus (Heins et al., 2004).
Die SA002-Kolonien wurden auf die Expression von typischen Pluripotenzmarkern
immunzytochemisch untersucht. Die morphologisch undifferenzierten Zellen exprimierten auf einem
hohen Level die Pluripotenzmarker TRA-1-60 (Abbildung 27b) und TRA-1-81. SSEA-4 und Oct4 wur-
den mit einem vergleichbar hohen Expressionsprofil nachgewiesen (Abbildung 27a,d). In einer Viel-
zahl von Zellen einer Kolonie war die Alkalische Phosphatase aktiv. Auf ultrastruktureller Ebene wur-
den die undifferenzierten SA002-Stammzellen morphologisch charakterisiert (MDC, AG Erdmann).
Die Zellen zeichneten sich durch ein großes Kern-zu-Plasma-Verhältnis aus und zeigten im Zytoplas-
ma Zellorganellen wie z.B. Mitochondrien. In den Kernen ist der Nukleus gut vom Euchromatin unter-
scheidbar (Abbildung 27c).
Advertisement
E r g e b n i s s e 88
e
2µm
d
b
a
c
Abbildung 27 Expression von Pluripotenzmarkern auf undifferenzierten SA002-Stammzellen. Immunzytometrische Bestim-
mung von SSEA-4 (a), TRA-1-60 FITC (b) und Oct-4 (d). Undifferenzierte SA002-Zellen auf ultrastruktureller Ebene (c). Die
Zellen sind durch ein großes Kern-Plasma-Verhältnis gekennzeichnet (Nukleus dunkel). Karyogramm der SA002 Stammzel-
len p41; Giemsa-Färbung (e). Für die Zellen konnte der beschriebene Karyotyp 47, XX + 13 nachgewiesen werden.
Zur Überprüfung des stabilen Karyotyps während der Langzeitkultivierung wurden Karyotyp-Analysen
von der embryonalen Stammzelllinien SA002 durchgeführt. Die Analyse und Ermittlung des
Karyogramms wurde von der Firma IMMD Berlin geleistet. Die Stammzelllinie wurde mit Passage 18
in Kultur genommen und bis zur ersten Analyse 23mal mechanisch umgesetzt. Die SA002-
E r g e b n i s s e 89
Stammzellen besitzen den Karyotyp 47, XX + 13, ohne Nachweis von Chromosomenmutationen. Dies
entspricht vollständig den Angaben des Vertreibers Cellartis. In Abbildung 27e ist das Karyogramm
der Passage 41 dargestellt. Auch Änderung der Passagierungsart (enzymatisch statt mechanisch)
bewirkte keine Veränderung im Karyotyp der SA002 Zellen (nicht gezeigt).
3.3.1.3 Genexpressionsanalyse von SA002-Zellen
Zusätzlich zur immunzytochemischen Bewertung der Pluripotenzmarker von SA002-Zellen wurde ein
Genexpressionsprofil der Zellen auf BeadChips basierend bestimmt und das Transkriptom analysiert.
Eine Liste mit Genen, die mit dem Pluripotenzstatus der SA002 Stammzellen assoziiert sind, ist in
Tabelle 20 zusammengestellt. Eine hohe Signalstärke ist mit einer starken Expression assoziiert. Den
embryonalen Stammzellen sind zum Vergleich Werte für adulte CD34
+
Stammzellen gegenüberge-
stellt. Eine außergewöhnlich hohe Signalstärke weist die Alkalische Phosphatase auf. Podocalyxin
wird mit den humanen stammzellspezifischen Antigenen TRA-1-60 und TRA-1-81 assoziiert und wird
moderat stark in hES exprimiert. Die Lefty1 und Lefty2 Proteine werden sehr früh während der Diffe-
renzierung von humanen embryonalen Stammzellen herunterreguliert, jedoch sind sie in undifferen-
zierten embryonalen Stammzellen hochreguliert. Nanog besitzt eine essentielle Rolle bei der Auf-
rechterhaltung der Selbsterneuerung und des pluripotenten Status von humanen embryonalen
Stammzellen. Das ermittelte Expressionslevel ist moderat verglichen mit der alkalischen
Phosphatase. CD24, ein Rezeptor für P-Selektin, ist vor allem in der Tumorbiologie als molekularer
Marker für verschiedene Karzinome und Tumorstammzellen bekannt, jedoch ist die Funktion bislang
unklar. Das sehr hoch exprimierte Gen für das Protein LIN28 scheint in die Entscheidung der embryo-
nalen Stammzellen zwischen Selbsterneuerung und Differenzierung involviert zu sein (Darr &
Benvenisty, 2009). LIF ist ein sekretierendes Glykoprotein, das ein Marker für den embryonalen Im-
plantationsprozess ist, und von murinen embryonalen Stammzellen in vitro zur Aufrechterhaltung
des undifferenzierten Status benötigt wird. Oct4 ist ein Transkriptionsfaktor, der die Selbsterneue-
rung von hES aufrechthält, ein Fehlen von Oct4 geht mit der Differenzierung einher.
a
Advertisement
E r g e b n i s s e 90
Tabelle 20 Embryonale Stammzellmarker exprimiert von SA002 Zellen. Zum Verdeutlichen der hohen Expressionsstärke von
hES, die Signalstärken von adulten CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut im Vergleich.
Gensymbol Definition AVG_Signal
hES CD34
+
ALPL alkaline phosphatase 3088 14
CD24 CD24 molecule 1271 445
DNMT3B DNA-methyltransferase 3beta 907 155
DPPA4 developmental pluripotency associated 4 4151 1028
FGF2 fibroblast growth factor 2 (basic) 59 10
FOXD3 forkhead box D3 42 10
GAL galanin 1625 10
GJA1 gap junction protein 1 (=Connexin43) 2974 39
GREM1 gremlin1 1424 10
INHBE inhibin Beta E 242 10
LEFTY1 left-right determination factor 1 1619 n.d.
LEFTY2 left-right determination factor 2 1136 10
LIF leukemia inhibitory factor 117 10
LIN28 lin-28 homolog 5344 95
NANOG Nanog homeobox 564 n.d.
PODXL
podocalyxin
-
like; carrier of antigens TRA
-
1
-
60 and TRA
-
1
-
81 346 27
POU5F1 Oct4 1773 10
Legende: Die Werte repräsentieren Expressionslevel (durchschnittliche Signalstärken) von undifferenzierten SA002 Zellen
gemittelt aus vier Proben, detektiert auf dem BeadChip (Illumina).
Die hES exprimierten im Vergleich zu den adulten CD34
+
Stammzellen die Pluripotenzmarker mit
hoher Signalstärke. Viele der untersuchten Gene wurden von den hämatopoetischen Stammzellen
gar nicht exprimiert und einige wie CD24, LIN28, DNMT3B und Podocalxin auf sehr niedrigem Niveau.
3.3.2 In vitro Differenzierungsinduktion von humanen embryonalen Stammzellen
Zur Differenzierungsinduktion von humanen embryonalen Stammzellen wurde die Wirkung von he-
patisch konditionierten serumfreien Medium und Kokultur mit murinen AML12 Hepatozyten in vitro
untersucht.
3.3.2.1 Kultivierung humaner embryonaler Stammzellen im hepatisch konditionierten
AML12-Medium
Die undifferenzierten embryonalen SA002-Zellen wurden unter feederfreien Bedingungen im kondi-
tioniertem Stammzellmedium expandiert, innerhalb von sieben Tagen wurde das konditionierte
Stammzellmedium sukzessive entfernt und anschließend zur Induktion der hepatischen Differenzie-
rung das durch AML12-Hepatozyten konditionierte Sautin-Medium zugesetzt. Das Eliminieren des
konditionierten Stammzellmediums führte zum Verlust des kompakten Koloniewachstums mit Aus-
bildung von netzartigen Strukturen sowie Zellaggregaten in Form von Embroid Bodies. Die Umstel-
E r g e b n i s s e 91
lung auf das hepatisch konditionierte Sautin-Medium bewirkte sowohl eine Zunahme der Zellzahl als
auch morphologische Veränderungen der Stammzellen. Nach 14 Tagen war ein konfluenter Zellrasen
und die Ausbildung kompakter Kolonien mit Anteilen von adhärenten Monolayerstrukturen in den
Koloniegrenzbereichen zu erkennen, jedoch war eine zelluläre Zuordnung der Vielzahl gebildeter
Zelltypen nicht möglich (Abbildung 28a). Zur differentiellen Bewertung wurden Semidünnschnitte
von Kolonien in Kultur mit konditioniertem Sautin-Medium angelegt. Die Kolonie erscheint wenig
kompakt und bildet kugelförmige Zellaggregate aus (Abbildung 28b).
Abbildung 28 SA002-Kolonie nach 14 tägiger Behandlung mit konditioniertem Sautin-Medium. Ausbildung von adhärenten
Zellen in der Kolonieperipherie, ausgeprägte Multilayerstruktur innerhalb der Kolonie (Embryoid Body).
(a)Durchlichtmikroskopie, (b) Semidünnschnitt
Die ultrastrukturelle Analyse der 14tägig im hepatisch konditioniertem Sautin-Medium kultivierten
embryonalen Stammzellen ermöglichte die Detektion von granulären Strukturen (Abbildung 29a,b),
die möglicherweise auf die Bildung von Glykogen hinweisen, Zelloberflächenvergrößerungen in Form
von Mikrovilli (Abbildung 29a) und unter den Zellen Zellkontakten, die sich zu einem Schlussleisten-
komplex entwickelten (Abbildung 29c). Im Gegensatz zu den undifferenzierten Stammzellen besaßen
die Zellen ein kleineres Kern-zu-Plasma-Verhältnis.
Abbildung 29 Ultrastrukturelle Analyse von SA002 Kolonien nach 14tägiger Kultur mit hepatisch konditioniertem Sautin-
Medium. Die Oberflächenvergrößerung in Form von Mikrovilli (a), häufig auftretenen granulären Strukturen (a,b) und die
Ausbildung eines Schlussleistenkomplex (c) sind nachweisbar.
b
a
2µm
2µm 1µm
a
b
c
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E r g e b n i s s e 92
Das RNA-Expressionsprofil von SA002-Zellen nach 14tägiger Kultivierung mit hepatisch konditionier-
tem Sautin-Medium wurde mittels Real-Time RT-PCR bestimmt und verglichen mit dem Profil von
Zellen am Tag 0 der Kultivierung. Die Kultivierung der hES mit konditioniertem Sautin-Medium be-
wirkte eine deutliche Zunahme der Expression des endodermalen Markers AFP und Albumin. Im Ge-
gensatz dazu wurde die Expression des Pluripotenzmarkers Oct-4, des Transkriptionsfaktors GATA4
und Connexin32 partiell reduziert. Das Expressionsprofil der Cytokeratine 8, 18 und 19 sowie des
hämatopoetischen Stammzellmarkers CD34 blieb unverändert, ebenso von SOX17, FOXA2, C/EBPα,
HNF4α und Connexin 43 (Tabelle 21).
Tabelle 11 RNA-Expressionsprofil der SA002-Zellen nach 0 und 14tägiger Kultur mit hepatisch konditioniertem Sautin-
Medium ermittelt mittels Real-Time RT-PCR
Gen
Synonym
Tag 0
Tag 14
CD34
CD34
++
++
SOX17
SOX17
++/+++
++
FOXA2
HNF3
-
β
++/+++
++
AFP
α
-
Fetoprotein
+++
++++
CEBPA
C/EBPα
+++
+++
HNF4A
HNF4
-
α
++/+++
++/+++
ALB
Albumin
+/++
++/+++
KRT18
Cytokeratin18
++++
++++
KRT8
Cytokeratin8
+++
+++
GATA4
GATA4
++/+++
++/+++
CDH1
E
-
Cadherin
++++
+++
GJB1
Connexin32
++/+++
++
GJA1
Connexin43
++++
++++
KRT19
Cytokeratin19
++++
++++
POU5F1
Oct
-
4
++++
++/+++
Legende: Mittelwert aus zwei Expressionsanalysen: ++++∆CT 0-4 sehr hohe Expressionsrate; +++∆CT 4-8 hohe Expressions-
rate; ++∆CT 8-12 moderate Expressionsrate; +∆CT 12-16 geringe Expressionsrate
3.3.2.2 Kokultur humaner embryonaler Stammzellen mit AML12-Zellen
Die Kokultur der embryonalen Stammzelllinie SA002 mit der murinen AML12-Hepatozytenzelline
wurde als ein weiteres Differenzierungsmodell mit der Bedeutsamkeit des Austauschs von löslichen
Faktoren durch Zell-Zell-Kontakte untersucht.
Undifferenzierte Stammzellkolonien wurden mechanisch auf konfluente, inaktivierte AML12-Zellen
umgesetzt und im serumfreien Sautin-Medium kultiviert. Die Inaktivierung der AML12-Zellen erfolg-
te, um kein Überwachsen der humanen embryonalen Stammzellen durch die schnell proliferierenden
Hepatozyten während der langen Kultivierungsdauer zu erhalten. Die SA002-Zellen zeigten ein aus-
geprägtes Adhärenzverhalten auf dem AML12 Zellrasen.
E r g e b n i s s e 93
Nach einigen Tagen veränderten die Zellen ihre kompakte Koloniestruktur und am Kolonierand bilde-
ten sich unterschiedliche Zelltypen und Formationen. Die Differenzierung in eine Vielzahl von Zellty-
pen prägte sich während des Kultivierungszeitraums von 14 Tagen weiter aus und zusammenwach-
sende und polygonale Zellstrukturen waren sichtbar (Abbildung 30).
Abbildung 30 Mikroskopische (a) und ultrastrukturelle Analyse (b) von SA002 Stammzellen nach 7tägiger in Kokultur mit
AML12-Zellen. Die kompakte Kolonieform ging verloren und verschiedene Zelltypen entstanden, im Randbereich konnten
polygonale Zellformen beobachtet werden.
Das RNA-Expressionsprofil von SA002-Zellen in Kokultur mit AML12-Zellen wurde am Tag 0 und 14
der Kultivierungsdauer analysiert. In Tabelle 22 sind die Resultate dargestellt. Die Kokultivierung be-
wirkte eine differentielle Veränderung der Markerexpression. Die Marker SOX17 und AFP zeigten
eine deutlich höhere Expression. Moderat stieg die Expression von C/EBPα, HNF4α, Albumin und
Cytokeratin 18. Die Expression des Pluripotenzmarkers Oct-4 war nach 14 tägiger Kokultivierung ge-
ringer als bei undifferenzierten Stammzellen. Ein ähnliches Bild zeigte sich für FOXA2 und E-Cadherin.
Tabelle 22 Das Expressionsprofil von SA002 Zellen nach 0 und 14 Tagen Kokultur mit AML12-Zellen ermittelt mit qRT-PCR.
Gen
Synonym
Tag 0
Tag 14
CD34
CD34
++
++
SOX17
SOX17
+
++/+++
FOXA2
HNF3
-
β
++
+/++
AFP
α
-
Fetoprotein
+
+++
CEBPA
C/EBPα
++
++/+++
HNF4A
HNF4
-
α
+++
+++/++++
ALB
Albumin
-
+
KRT18
Cytokeratin18
+++
++++
KRT8
Cytokeratin8
+++
+++
GATA4
GATA4
++
++
CDH1
E
-
Cadherin
++++
+++
GJB1
Connexin32
++
++
GJA1
Connexin43
++++
++++
KRT19
Cytokeratin19
+++
+++
POU5F1
Oct
-
4
++++
++/+++
Legende: Mittelwert aus zwei Expressionsanalysen: ++++∆CT 0-4 sehr hohe Expressionsrate; +++∆CT 4-8 hohe Expressions-
rate; ++∆CT 8-12 moderate Expressionsrate; +∆CT 12-16 geringe Expressionsrate
b
a
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E r g e b n i s s e 94
3.4 In vivo Differenzierung und Bewertung der Pluripotenz von embryona-
len Stammzellen
Pluripotente embryonale Stammzellen bilden nach Transplantation in immundefiziente Tiermodelle
teratoide Geschwülste, die durch die Ausbildung der drei Keimblattstrukturen von Zellen
mesodermaler, endodermaler und ectodermaler Abstammung charakterisiert sind und ein wesentli-
ches Merkmal der Pluripotenz von embryonalen Stammzellen ist. Die Fähigkeit zur Ausbildung dieser
Keimblattstrukturen aus pluripotenten Stammzellen kann, unter definierten und standardisierten
Bedingungen, als in vivo Kriterium für die Qualität von Stammzellpräparationen als auch für ein in
vivo Modell der spontanen Differenzierung herangezogen werden.
Die murine embryonale Stammzelllinie R1 diente im ersten Versuchsabschnitt als Testzelllinie zur
Testung der Pluripotenz und des spontanen Differenzierungspotenzials von embryonalen Stammzel-
len. Im zweiten Versuchsabschnitt wurden humanen embryonalen Stammzellen der Linie SA002 in
vivo eingesetzt.
3.4.1 In vivo Differenzierung von murinen embryonalen Stammzellen
Von Bedeutung für die Einsetzbarkeit von embryonalen Stammzellen in präklinischen Versuchen ist
die Bereitstellung ausreichender Mengen von undifferenzierten, pluripotenten embryonalen Stamm-
zellen. In der Charité Berlin wurden embryonale R1 Maus-Stammzellen (mES) im 3D-Bioreaktor einer
Expansion unterworfen. Ziel war die Gewinnung ausreichender Zellmengen unter Erhalt der
Pluripotenz der ZelIen. Die in vivo Eigenschaften der embryonalen Stammzellen vor und nach Biore-
aktorexpansion wurden vergleichend nach s.c. Transplantation in syngene 129/SVE Mäusen getestet.
Parameter der Pluripotenz der Zellen war die Teratombildungsrate und die Ausbildung von
mesodermalen, endodermalen und ectodermalen Keimblattstrukturen. Die Bewertung der Zelldiffe-
renzierung erfolgte nach validierten histopatologischen H&E Färbungen von Teratom-
Gewebeschnitten durch einen Tierpathologen.
Vor der Bioreaktorexpansion zeigten die embryonalen Stammzellen R1 nach 56 Tagen ein ausgepräg-
tes Teratomwachstum in 60% der transplantierten Tiere. Das durchschnittliche Teratomgewicht wur-
de zu 1,83 g bestimmt. Die gebildeten Teratome waren von kompakter solider Struktur und wiesen
einen hohen Grad von Gefäßbildung auf. Die histopathologische Analyse zeigte das Vorhandensein
von ausdifferenzierten Gewebestrukturen von Zellen mesodermalen Ursprungs (Knorpelgewebe,
osteoides Gewebe und hämatopoetische Zellen), Zellen ectodermalen Ursprungs wie ausdifferen-
ziertes Nervengewebe, sowie unterschiedlich ausdifferenziertes Drüsenepithelzellgewebe, verhorn-
tes Plattenepithel und ausdifferenziertes organoides Drüsenepithelgewebe mit Zellsekret (endoder-
E r g e b n i s s e 95
maler Ursprung). Die Ausbildung von Gewebestrukturen dieser 3 Keimblätter nach Transplantation
der Zellen belegt die Pluripotenz der embryonalen Stammzellen vor Bioreaktorexpansion (Abb. 31a).
Nach 3D-Expansion im Bioreaktor wurden die embryonalen Zellen unter identischen Bedingungen in
129/SVE Mäusen transplantiert. Es wurde eine vergleichbare Kinetik der Teratombildungsrate zu den
nicht expandierten mES im Versuchszeitraum von 56-81 Tagen gefunden. Das durchschnittliche
Teratomgewicht betrug 1,42 g bei einer Anwachsrate von 60% der Teratome in den Tieren. Die
histopatologische Bewertung der Gewebebildung und Differenzierung ergab das Vorhandensein von
Zellen und Gewebetypen mesodermalen, endodermalen und ectodermalen Ursprungs. Auch hier
wurde ausdifferenziertes osteoides Gewebe mit Knochenbildung und Hämatopoese, Kollagen-reiches
und Kollagen-armes Bindegewebe sowie ausdifferenziertes Muskelfasergewebe gefunden (Abb. 31b).
Abbildung 31 Histologie von H&E gefärbten Teratomschnitten. (a) undifferenzierte mES vor Bioreaktor aus 2D-Kultur, (b)
mES nach dreitägiger Bioreaktorexpansion. 56 Tage nach s.c. Transplantation von mES in 129/SVE Mäuse. Übersicht über
die Ausbildung von Zellen aller drei Keimblätter. Vergrößerung 5x.
Die qualitative Bewertung des Gewebedifferenzierungspotentials von embryonalen R1 Zellen vor und
nach 3D-Bioreaktorexpansion ergab keine wesentlichen Unterschiede im Pluripotenzstatus der Zel-
len. Die Expansion der murinen embryonalen Stammzellen unter 3D-Bedingungen stellt daher eine
geeignete Methode zur Gewinnung pluripotenter muriner Stammzellen in ausreichender Menge dar.
Im Weiteren wurde geprüft, welchen Einfluss das Mausmodell auf die Teratombildungsrate und die
Keimblattdifferenzierung der embryonalen Maus R1 Zellen aufweist. Im Gegensatz zum bisher ange-
wendeten syngenen 129/SVE Mausmodell wurden die Zellen subcutan auf immundefiziente
NOD/SCID Mäuse transplantiert. 17 Tage nach der subcutanen Applikation von 1x10
7
R1 Zellen in
NOD/SCID Mäuse wurden die Teratome der Mäuse histopathologisch bewertet. Die Analyse ergab
ein wenig differenziertes Teratom mit nur einer mäßigen Differenzierung in vereinzelte drüsenepi-
thelartige und mesenchymale Zellstrukturen (endodermale und mesodermale Keimblattstrukturen).
Kennzeichnend ist hier eine hohe Mitoserate von undifferenzierten Zellen, infiltratives Wachstum in
endogenes Mausgewebe und zum Teil ausgedehnte Nekrosen. Bewertet nach dem Parameter der
a
b
Knorpelgewe
be
Nervengewe
be
Drüsenepithel
Advertisement
E r g e b n i s s e 96
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
1 5 9 13
Teratomgewicht (g)
Tier Nr.
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
15 21 28 35 43 50
Tumorvolumen (cm³)
Tage nach s.c. Zellapplikation
MV8017
MV8034
MV8034
-
2
MV8479
Keimblattdifferenzierung von murinen R1 Stammzellen zum Pluripotenzstatus der Zellen, erscheint
die Anwendung des syngenen 129/SVE Mausmodells gegenüber dem xenogenen NOD/SCID Maus-
modell für die murinen embryonalen Stammzellen aussagekräftiger. Für die Transplantation von hu-
manen embryonalen Stammzellen sind immunkompetente 129/SVE Mäuse wegen immunologischer
Abstoßungsreaktionen nicht anwendbar.
3.4.2 In vivo Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen
Die Beurteilung der Qualität der humanen Stammzellpräparate unter in vivo Bedingungen erfolgte
nach den Kriterien der keimblattspezifischen mesodermalen, endodermalen und ectodermalen Diffe-
renzierung der Zellen nach subcutaner Transplantation der humanen embryonalen Stammzellen
(hES) in NOD/SCID Mäuse. Die SA002 Stammzellen wurden auf Feederzellen kultiviert und im undif-
ferenzierten Zustand expandiert. Der Phänotyp der Zellen wurde unter Verwendung humanspezifi-
scher Primer mittels quantitativer RT-PCR und mittels Immunhistologie wie beschrieben bestimmt.
Die humanen embryonalen Stammzellen wurden unter den beschriebenen Kulturbedingungen des
Erhalts des undifferenzierten Phänotyps in ersten Versuchen mechanisch passagiert, so dass für die
durchzuführenden in vivo Mausversuche nur eine limitierende Zellzahl zur Verfügung stand. Höhere
Zellzahlen von embryonalen Stammzellen für in vivo Versuche standen aus den Bioreaktorversuchen
der Charité mit den SA002 Zellen nach enzymatischer Passagierung zur Verfügung.
Phänotypisch undifferenzierte, mechanisch bzw. enzymatisch dissoziierte Zellkolonien wurden der
NOD/SCID Maus subcutan appliziert. Es wurden 1x10
6
Zellen subcutan in Anwesenheit von Matrigel
transplantiert und das Teratomwachstum über einen Zeitraum von 50 Tagen verfolgt (Abbildung
32a). 15 Tage nach der Transplantation waren die Teratome palpabel.
Abbildung 32 Zeitabhängiges Wachstum von Teratomen (a). 1x10
6
hES wurden s.c. in NOD/SCID Mäuse appliziert und das
Tumorvolumen bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte von 2-4 Tieren pro Versuch. (b) Einzelwerte des Teratomgewichts
aus Versuch MV8034 (Tier1-4), MV8054 (Tier5-8), MV8479 (Tier9-12) und MV8043-2 (Tier 13+14) am Tag des Abtötens (50
Tage nach s.c. Transplantation).
a
b
E r g e b n i s s e 97
Über diesen Versuchszeitraum war in den Versuchen ein vergleichbares, langsames
Teratomwachstum nachweisbar mit Teratomgewichten zwischen 0,04-0,25g für den Zeitraum von 50
Tagen (Abbildung 32b) und deutlich geringeren Teratomgewichten von 0,007-0,02g für den kürzeren
Versuchszeitraum von 28d nachweisbar. Im Unterschied zu dem soliden und kompakten Wachstum
der mES Zellen in der NOD/SCID Maus, war das gebildete SA002 Teratom von gallertartiger, flach-
wachsender Konsistenz mit einem geringen Vaskularisierungsgrad.
Die histopathologische Bewertung der Teratome ergab übereinstimmend in den durchgeführten in
vivo Versuchen die mehrheitliche Ausbildung von mesodermalen und endodermalen Keimblattstruk-
turen, weniger ausgeprägt das Vorhandensein von Zelltypen ectodermalen Ursprungs. Das SA002
Teratom im kurzen Versuchszeitraum von 28 Tagen erschien generell als weniger organisiertes und
strukturiertes Gewebe im Vergleich zu den Versuchen der längeren Engraftmentdauer. Zusammen-
fassend stellt sich die pathohistologische Bewertung der gebildeten Teratome wie folgt dar (Abbil-
dung 33): Die Teratome bestanden überwiegend aus epithelialem Gewebe und Bindegewebsantei-
len. Das epitheliale Gewebe bildete an vielen Stellen gut differenziertes Drüsenlumina ohne
intraluminale Bestandteile. Das gebildete Bindegewebe war sowohl kollagenreich als auch
kollagenarm. Das kollagenarme Bindegewebe war häufig in den Randbereichen des Teratoms lokali-
siert. Das gebildete Bindegewebe war teilweise mit zahlreichen reifen Adipozyten durchsetzt. Des
Weiteren waren größere Areale mit myxoiden Zellen und myxoider Grundsubstanz vorhanden. Stel-
lenweise war Pigmentgranula (Melanin) nachweisbar. Eine hämatopoetische Zelldifferenzierung war
durch die Anwesenheit von Lymphozyten-ähnlichen Zellen in einigen Teratomen nachweisbar. Im
Teratom nach d28 waren nur Inseln aus epithelialem Gewebe nachweisbar. Die Zellen der Teratome
wiesen keine signifikante Mitoserate auf.
Abbildung 33 Makroskopische (a) und histologische Bewertung der Teratome 50 Tage nach s.c. Transplantation von hES in
NOD/SCID Mäuse. Exemplarische Darstellung der H&E Färbung von 2 Teratomschnitten (b, c)
c
b
a
Pigmentgranula
Fettgewebe
Bindegewebe
Drüsenlumina
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E r g e b n i s s e 98
3.4.2.1 Genexpressionsprofil von spontan differenzierten hES in vivo
Die nach subcutaner Stammzelltransplantation gebildeten Teratome wurden pathohistologisch,
immunhistochemisch und mittels quantitativer RT-PCR und Genexpressions-Analyse bezüglich der
Pluripotenzmarker, der Expression keimblattspezifischer Marker, insbesondere für „frühe und späte“
endodermale hepatische Differenzierungsmarker charakterisiert. In Hinblick auf das spontane end-
odermale Differenzierungspotenzial von SA002 Zellen unter in vivo Bedingungen nach subcutaner
Applikation in NOD/SCID Mäusen wiesen die Teratome eine ausgeprägte Expression für die
Hepatozytenmarker AFP, Albumin sowie für die Transkriptionsfaktoren HNF-3β, HNF-4α und C/EBPα
auf.
Die Dissemination von humanen Zellen in andere Mausorgane wurde mittels humanspezifischer PCR
überprüft. Sowohl in der Maus-Leber, dem Blut, der Milz, im Knochenmark, der Niere, Herz und Lun-
ge waren keine humanen Zellen am Versuchsende nachweisbar (Daten nicht gezeigt).
Die Genexpressionsprofile von undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen SA002 und
von den gebildeten Teratomen wurden durch ein Gesamtgenom BeadArray-Profil bestimmt und mit-
einander verglichen. Aus jeweils vier Proben eines Zelltyps wurden die Genexpressionsprofile mittels
BeadChip (Illumina, USA) erhalten, der ungefähr 24.000 Gene umfasst, die aus der RefSeq-Datenbank
abgeleitet sind. Transkriptorische Ähnlichkeiten zwischen den verschiedenen Proben wurde mit dem
hierarischen Clustering analysiert. Die Transkriptome der verschiedenen Teratome waren sehr ver-
wandt und die Cluster wiesen untereinander starke Ähnlichkeiten auf. Ebenso zeigte die Clusterana-
lyse eine Anhäufung von ähnlichen Genen in den Proben mit undifferenzierten embryonalen Stamm-
zellen (Abbildung 34a). Die Korrelation zwischen den Expressionsprofilen wurde mit einem
Korrelogramm berechnet. Die Gegenüberstellung von undifferenzierten humanen embryonalen
Stammzellen, die aus heterogenen Passagen stammten, ergab einen Korrelationskoeffizienten im
Bereich von 0,81-0,98. Der Vergleich der Genexpressionsprofile von den Teratomen aus Einzeltieren
zeigte, dass sich die Korrelationskoeffizienten im Bereich von 0,88 bis 0,97 befanden. Das heißt, die
Merkmale innerhalb der hES-Gruppe und innerhalb der Teratom-Gruppe sind sich ähnlich und wei-
chen nur geringfügig in der Expression der Einzelwerte voneinander ab. Die gepoolten hES-Proben im
Vergleich mit den gepoolten Teratom-Proben wiesen einen Korrelationskoeffizienten von 0,81 auf.
Der Scatterplot ermöglicht die Bestimmung von hoch- und runterregulierten Genen (Abbildung 34b
und c). Verglichen mit den hES wurden 591 Gene im Teratom dreifach stärker exprimiert und 689
Gene wurden reprimiert.
E r g e b n i s s e 99
Abbildung 34 Cluster Dendrogramm, Scatterplot und Heatmap. (a) Die hierarische Clusteranalyse zeigt, dass die undiffe-
renzierten humanen embryonalen Stammzellen (hESC-1 bis -4) ein Cluster formen und die Teratome (A-D). (b) Scatterplot
von hoch- und runterregulierten (c) Genen im Teratom verglichen mit hES. (d) Heatmap von 3fach hochregulierten Genen in
hES (d.h. auch 3fach runterregulierten Genen im Teratom) (links) und 3fach hochregulierten Genen im Teratom (rechts)).
Eine funktionelle Annotationsanalyse dieser zwei Probengruppen wurde mit DAVID durchgeführt. Die
funktionelle Genklassifikation von dreifach stärker exprimierten Transkriptomen in Teratomen bzw.
von dreifach schwächer exprimierten Genen in Teratomen verglichen mit undifferenzierten hESC, die
mit der Datenbank SP_PIR_KEYWORDS erreicht wurde, ist in Tabelle 23 dargestellt. Die undifferen-
zierten embryonalen Stammzellen exprimierten einen hohen Anteil an Genen, die im Kontext stehen
mit dem Zellzyklus, Mitose, Zellteilung, DNA-Replikation, ATP-Bindung und Zentromeren. Im Teratom
wurden diese Gene hingegen weniger stark exprimiert. Die in den Teratomen stärker gebildeten
funktionellen Genklassen gehörten zu Signaltransduktion, Differenzierung und extrazellulärer Matrix
(Tabelle 23). Verstärk wurden ebenso Gene aus den Gruppen Neurogenese, Zelladhäsion und Lunge
exprimiert wie das pulmonary surfactant protein D (SFTPD) sowie Gene für die Hirnentwicklung z.B.
Ceroid-lipofuscinosis neuronal protein 5 (CLN5) .
b
c
a
d
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E r g e b n i s s e 100
Tabelle 23
Funktionelle Genklassifikation von dreifach hoch- bzw. runterregulierten Genen in Teratomen vergli-
chen mit undifferenzierten humanen embryonalen Stammzellen.
Im Teratom stark exprimiert Im Teratom schwach exprimiert
Term Count
% PValue Term Count
% PValue
signal 120
24.24%
3.00E-09
cell cycle 38
7.00%
1.70E-10
glycoprotein 141
28.48%
6.12E-08
mitosis 21
3.87%
2.38E-10
developmental protein 38
7.68%
5.68E-07
phosphoprotein 190
34.99%
3.06E-10
differentiation 24
4.85%
4.05E-06
cell division 24
4.42%
5.33E-09
extracellular matrix 18
3.64%
2.94E-05
dna replication 15
2.76%
3.22E-08
secreted 59
11.92%
1.01E-04
centromere 10
1.84%
2.06E-07
neurogenesis 11
2.22%
1.38E-04
nucleus 146
26.89%
7.11E-07
hydroxylation 9
1.82%
1.40E-04
cell cycle control 8
1.47%
5.16E-05
hydroxyproline 7
1.41%
2.12E-04
atp-binding 52
9.58%
3.87E-04
hydroxylysine 6
1.21%
0.00131
nucleotide-binding 63
11.60%
4.14E-04
lipoprotein 28
5.66%
0.00244
chromosomal protein 12
2.21%
4.77E-04
leucine-rich repeat 15
3.03%
0.00417
kinase 38
7.00%
7.64E-04
cell adhesion 19
3.84%
0.00673
apoptosis 19
3.50%
0.00152
triple helix 5
1.01%
0.00815
exonuclease 6
1.10%
0.00267
alternative splicing 158
31.92%
0.01187
transferase 55
10.13%
0.00501
membrane 151
30.51%
0.01338
heparin-binding 7
1.29%
0.00553
lung 3
0.61%
0.01506
cytoplasm 88
16.21%
0.00625
collagen 8
1.62%
0.01732
phosphotransferase 13
2.39%
0.00664
triplet repeat expansion 4
0.81%
0.01991
acetylation 28
5.16%
0.00687
calcium 28
5.66%
0.02252
plasminogen
activation 3
0.55%
0.00692
calmodulin-binding 8
1.62% 0.02351
rrna processing 6
1.10% 0.00711
gpi-anchor 8
1.62% 0.02765
ubl conjugation 20
3.68% 0.0104
Proteoglycan 5
1.01% 0.02916
serine/threonine-
protein kinase 19
3.50% 0.01686
trimer 4
0.81% 0.03001
amino-acid biosynthesis 4
0.74% 0.0182
disease mutation 46
9.29% 0.03257
glutamine
amidotransferase 3
0.55% 0.01835
brain 4
0.81% 0.03289
chelation 3
0.55% 0.02317
cleavage on pair of basic residues 13
2.63% 0.03326
microsome 8
1.47% 0.02732
metalloprotein 8
1.62% 0.03475
angiogenesis 5
0.92% 0.02842
palmitate 10
2.02% 0.03787
exosome 3
0.55% 0.02845
basement membrane 4
0.81% 0.04575
acetylated amino end 7
1.29% 0.03358
gpi-anchor 8
1.47% 0.04449
hydrolase 50
9.21% 0.04764
Die biologischen Prozesse wurden auf Grundlage der GOTERM Datenbank weiter charakterisiert und
ausgewählte Gruppen in Tabelle 24 dargestellt. Im Teratom wurden, verglichen mit den hES, über-
wiegend Gene hochreguliert, die an der Entwicklung von Organen beteiligt sind. Eine hohe Genex-
pression wurde für Gene der Neuronen, Muskeln, Knorpel, Ohr, Gliedmaßen, Lunge und Bronchien
gefunden (Tabelle 24). Gene für Differenzierungsprozesse waren in den undifferenzierten Stammzel-
len bis auf Gene für die Blutgefäßbildung nicht aktiv. Die Anzahl von Genen, die zur Zellmotilität und
zur Migration gehören, ist in beiden Gruppen ähnlich und ermöglicht keine weitere Aussage. Die
Gruppe der Teratome exprimierte signifikant weniger Gene der Zellproliferation verglichen mit den
Stammzellen (42 zu 29 Genen bzw. p-Wert 7x10
5
zu 0,01).
E r g e b n i s s e 101
Tabelle 24
Genfunktionen eingeteilt in biologische Prozesse ermittelt bei der funktionellen Annotation mit der
GOTERM_BP Datenbank. Die mehr als dreifach unterschiedlich exprimierten (hoch bzw. runter) Gene im Tera-
tom verglichen mit den humanen embryonalen Stammzellen wurden mit der Online-Software DAVID analy-
siert.
Im Teratom stark exprimiert Im Teratom schwach exprimiert
Term Count % PValue Count % PValue
GO:0048468~cell development 50
10.10%
1.14E-04
53
9.76%
0.00149
GO:0007399~nervous system development 54
10.91%
7.26E-13
GO:0048699~generation of neurons 22
4.44%
3.07E-06
GO:0007417~ nervous system develoment 20
4.04%
8.38E-06
GO:0022008~neurogenesis 22
4.44%
1.00E-05
GO:0030182~neuron differentiation 19
3.84%
1.76E-05
GO:0048666~neuron development 16
3.23%
3.68E-05
GO:0007420~brain development 14
2.83%
7.70E-05
GO:0001501~skeletal development 14
2.83%
0.00225
GO:0051216~cartilage development 6
1.21%
0.00228
GO:0043583~ear development 6
1.21%
0.00418
GO:0060173~limb development 6
1.21%
0.00501
GO:0048736~appendage development 6
1.21%
0.00501
GO:0001707~mesoderm formation 4
0.81%
0.0131
GO:0030324~lung development 5
1.01%
0.02683
GO:0035295~tube development 9
1.82%
0.01945
GO:0009790~embryonic development 14
2.83%
0.01982
GO:0030323~respiratory tube development 5
1.01%
0.0286
GO:0001568~blood vessel development 13
2.39%
0.00574
GO:0030154~cell differentiation 80
16.16%
1.22E-08
76
14.00%
2.36E-04
GO:0007626~locomotory behavior 12
2.42%
0.00579
7
1.29%
0.01681
GO:0006928~cell motility 19
3.84%
0.00806
25
4.60%
6.05E-04
GO:0016477~cell migration 14
2.83%
0.00945
16
2.95%
0.00794
GO:0007155~cell adhesion 29
5.86%
0.01077
GO:0030198~extracellular matrix organization
and biogenesis 8
1.62%
2.67E-04
GO:0030030~cell projection organization and
biogenesis 16
3.23%
3.31E-04
GO:0008283~cell proliferation 29
5.86%
0.01509
42
7.73%
7.74E-05
GO:0050673~epithelial cell proliferation 5
1.01%
0.0127
GO:0045786~negative regulation of progression
through cell cycle 10
2.02%
0.05071
56
10.31%
1.39E-08
GO:0006915~apoptosis 37
6.81%
0.00173
Die in ihrer Anzahl und Häufigkeit der Gene in Tabelle 25 dargestellten Entwicklungsprozesse für
verschiedene Organe wurden analysiert und die Bedeutung der zugehörigen Gene bestimmt (Tabelle
25). Viele Gene der selektionierten Daten sind an der neuronalen Entwicklung beteiligt, unter ande-
rem die Gene OTX2, EFNB3 und MAP1B, die für Entstehung des Gehirns und des Nervensystems von
Bedeutung sind. Zur Skelett- und Knorpelbildung tragen die Gene BMP4, CDH11 und SOX9 bei. Die
Herzentwicklung wird vom Gen MUH11 repräsentiert und die Lungenentstehung von FOXF2. Weite-
re mesoderme Entwicklungsgene sind LEF1 uns MEST. Gene, die charakteristisch für die endoderma-
len, hepatische Differenzierung sind, wie FOXA2, AFP, Cytokeratin 8,18 und 19 werden auf sehr ge-
ringem Niveau exprimiert (Tabelle 25).
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E r g e b n i s s e 102
Tabelle 25
Funktionelle Annotation mit der GOTERM_BP Datenbank. Analyse von Genen verschiedener Entwick-
lungsprozessen im Teratom. Funktion der mehr als dreifach stärker exprimierten Gene im Teratom verglichen
mit den humanen embryonalen Stammzellen wurde in der Datenbank Entrez Gene ermittelt und der Fold
Change angegeben.
Gene
symbol Official Full Name Relevanz Fold
Change
OTX2 orthodenticle homeobox
2 may play a role in brain and sensory organ development. 2.2
STMN2 stathmin-like 2 neuronal growth-associated protein 18.4
POU4F1
POU class 4 homeobox 1 highly expressed in the developing sensory nervous system 13.8
LRRC4C leucine rich repeat con-
taining 4C member of the netrin family of axon guidance molecules. 3.0
EFNB3 ephrin-B3 important in brain development as well as in its mainten-
ance. 5.5
POU3F2
POU class 3 homeobox 2 expressed predominantly in the central nervous system 4.8
BAIAP2 BAI1-associated protein 2 a brain-specific angiogenesis inhibitor (BAI1)-binding protein 4.2
NTNG1 netrin G1 acts as axon guidance cues 7.8
ASCL1 achaete-scute complex
homolog 1 plays a role in the neuronal commitment and differentiation 15.2
MAP1B microtubule-associated
protein 1B role in development and function of the nervous system. 1.0
EFHD1 EF-hand domain family,
member D1 displays increased expression during neuronal differentiation
3.4
BMP4 bone morphogenetic
protein 4 plays a role in the onset of endochondral bone formation 9.5
CDH11 cadherin 11, type 2, OB-
cadherin function in bone development and maintenance. 6.2
SOX9 SRY (sex determining
region Y)-box 9 It acts during chondrocyte differentiation 8.6
MYH11 myosin, heavy chain 11,
smooth muscle It functions as a major contractile protein 4.4
LEF1 lymphoid enhancer-
binding factor 1 It is expressed in pre-B and T cells. 4.0
MEST mesoderm specific
transcript homolog It plays a role in development. 6.2
FOXF2 forkhead box F2 It is expressed in lung and placenta 3.0
FOXA2 forkhead box A2 activator for liver-specific genes 1.7
AFP alpha-fetoprotein produced by the liver during fetal life, fetal counterpart of
serum albumin 1.3
KRT18 keratin 18 expressed in single layer epithelial tissues of the body 0.6
KRT8 keratin 8 It plays a role in maintaining cellular structural integrity 1.2
GJA1 gap junction protein,
alpha 1 gap junction in the heart 0.3
KRT19 keratin 19 It is specifically expressed in the developing epidermis. 2.4
E r g e b n i s s e 103
3.4.3 Transplantation von 3D kultivierten SA002 Zellen
Humane embryonale SA002 Zellen wurden unter 3-D-Bioreaktorbedingungen (Charité, Berlin) nach
einer Kultivierungszeit von 48 Tagen in vier NOD/SCID Mäusen transplantiert. 2.9x10
6
Zellen wurden
subcutan in Anwesenheit von Matrigel transplantiert und das Teratomwachstum über einen Zeit-
raum von 58 Tagen verfolgt. Die resultierenden Teratome erwiesen sich morphologisch den vorher-
gehenden Versuchen als gallertige und langsam wachsende Teratome mit einem Gewicht von 0,029-
0,039g vergleichbar. Die histopathologische Bewertung nach H&E Färbung ergab die deutliche Aus-
bildung von Zellen endodermalen und mesodermalen Keimblattursprungs. Gut ausdifferenziertes
Knorpelgewebe, lockeres Bindegewebe und strukturiertes Drüsengewebe waren vorherrschende
Gewebedifferenzierungsformen. Die Mitoserate in den Teratomen war nicht sichtbar erhöht. Die
Resultate zur Teratombildung deuten auf die Anwesenheit von pluripotenten Zellen im Pool der dif-
ferenzierten SA002 Zellen nach Bioreaktor-Kultivierung hin.
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D i s k u s s i o n 104
4 Diskussion
4.1 In vitro Differenzierungspotenzial von adulten und embryonalen
Stammzellen
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Ziele verfolgt: Es sollte das
Differenzierungspotenzial von adulten und humanen embryonalen Stammzellen unter gleichen
differenzierungsinduzierenden Bedingungen in vitro und in vivo verglichen werden. Es lag die
Hypothese zugrunde, dass die Analyse auf unterschiedlichen Ebenen durch zellulare, molekulare und
immunologische Parameter die Identifizierung von essentiellen Schritten der in vitro und in vivo
Differenzierung verdeutlicht. In vitro wurde die hepatische Differenzierungsinduktion von
Stammzellen durch Zytokine, hepatisch konditioniertes Medium und Kokultur geprüft. In den
entwickelten experimentellen Leberschadensmodellen immundefizienter Mäuse wurde das
Differenzierungspotenzial der Stammzellen während der Leberregeneration untersucht. Durch den
Transfer von hämatopoetischen Stammzellen in die Mikroumgebung der Leber sollten weitere
Einblicke in das Differenzierungspotenzial von Stammzellen gewonnen werden, sowie weitere
Mechanismen der Proliferation und Differenzierung von Stammzellen untersucht werden.
4.1.1 Endodermales Differenzierungspotenzial von CD34
+
Stammzellen in vitro
In dieser Arbeit wurde das endodermale, hepatische Differenzierungspotenzial von Stammzellen aus
Nabelschnurblut induziert durch Zytokine, konditioniertes Medium von AML12/HepG2 Hepatozyten
und Kokultur mit diesen Zellen in vitro geprüft.
In allen Differenzierungsansätzen konnte morphologisch auf zellulärer Ebene keine Veränderung der
kultivierten Zellen nachgewiesen werden, die auf eine Differenzierung schließen lassen. Auf
ultrastruktureller Ebene dagegen waren mittels Elektronenmikroskopie phänotypische
Veränderungen nach der Kultivierung mit konditioniertem AML12-Sautin-Medium nachweisbar. Es
traten vermehrt Zellfortsätze und Oberflächenvergrößerungen in Form von Mikrovilli auf,
desweiteren intrazelluläre Strukturen, die Phago(ly)sosomen zugeordnet werden können. Die
Analyse des Genexpressionsprofils der im konditionierten AML12-Medium und konditioniertem
HepG2-Medium kultivierten Zellen ergab eine verstärkte Expression von Genen, die Lysosomen
zugordnet sind. Aus der Literatur ist bekannt, dass in Leberzellen der Anteil an Lysosomen hoch ist
(Touster et al., 1973). Die kultivierten Stammzellen bringen möglicherweise eine gute Voraussetzung
zur Übernahme leberspezifischer Aufgaben wie die Entfernung von Partikeln mit.
In Kokultur der CD34
+
Zellen mit AML12-Zellen wurde morphologisch auf zellulärer Ebene keine
Veränderung beobachtet, jedoch eine Zunahme des Adhärenzverhaltens. Auf ultrastruktureller
D i s k u s s i o n 105
Ebene wurden ausgeprägte Zellfortsätze mittels Elektronenmikroskopie bestätigt. In der Literatur
wurde eine Polarisierung und veränderte Zellform von CD34
+
Zellen in Kokultur mit mesenchymalen
Stammzellen nachgewiesen (Freund et al., 2006). Dies steht im Einklang mit unseren Ergebnissen und
deutet auf eine beginnende Differenzierung hin.
Mittels FACS-Analyse wurde eine Veränderung des CD34 Markers auf der Oberfläche der
Stammzellen nach Kultivierung im Medium mit Zytokinen, im konditionierten Medium und Kokultur
gefunden. Mit Dauer der Kultivierung nahm der CD34 Marker ab und nach zehn Tagen exprimierten
nur noch 10% der kultivierten Zellen diesen Marker. Ebenfalls waren die CD34
+
Zellen aus
Nabelschnurblut unter den gewählten Kultivierungsbedingungen fähig zu proliferieren. Die in der
G
0
/G
1
Phase ruhenden Stammzellen traten in den Zellzyklus ein. Auch die Analyse der Genexpression
der Stammzellen nach Kultivierung mit Zytokinen und in den zwei hepatisch-konditionierten Medien
von AML12 und HepG2-Zellen ergab eine hohe Expression von Zellzyklus-assoziierten Genen. Die
beobachtete Reduktion der CD34 Stammzellmarkerexpression kann möglicherweise auftreten, wenn
Zellen in den Zellzyklus übergehen. Colvin et al. (2004) vermuteten, dass die Stammzellen abhängig
von den Zellzyklusphasen einen wechselnden Phänotyp erlangen und in verschiedene Zelltypen
differenzieren. Somit kann die reduzierte CD34 Expression und Eintritt in den Zellzyklus in unseren
Versuchsansätzen mit einer möglichen beginnenden Differenzierung erklärt werden. Eine ähnliche
Annahme ist, dass Stammzellen zu verschiedenen Punkten des Zellzyklus unterschiedliche alternative
Schicksale ereilen wie Selbsterneuerung, Differenzierung, Migration oder Apoptose (Askenasy et al.,
2006). Somit können während eines Zellzyklus Proliferation und phänotypische Veränderungen zur
Differenzierung der Zellen analog stattfinden.
Das Genexpressionsprofil für Gene der Differenzierung, Multipotenz, Selbsterneuerung, Apoptose
und Migration von kultivierten CD34
+
Stammzellen wurde untersucht und eine Änderung der
Genexpression im Vergleich zu undifferenzierten, nicht-kultivierten Stammzellen ermittelt.
CD34
+
Stammzellen, die mit den Zytokinen HGF und SCF kultiviert wurden, exprimierten die
hepatozytenspezifischen Gene wie SOX17, HNF3ß, AFP, HNF4A und verschiedene Gene für die
Cytochrom P450 Enzyme nur schwach. Die Expression von Cytokeratin 19 und E-Cadherin stieg
hingegen stark an. Die Genexpressionsanalyse der kultivierten Zellen ergab eine sehr moderate
Expression der endodermalen Marker Cytokeratin 7 und 8, Connexin 32 und c-Met-Rezeptor nach
Zytokinexposition. Die schwache endodermale Differenzierung von CD34
+
Zellen auf sehr geringem
Niveau ist mit Literaturdaten übereinstimmend, die HGF einzeln zur Differenzierungsinduktion von
CD34
+
Zellen eingesetzt haben (Wang et al., 2005; Nonome et al., 2005). Das Zytokin SCF ermöglichte
die Differenzierung von Hepatozyten nach Leberschaden in Mäusen (Ren et al., 2008) und schien in
unseren Versuchsansatz in Kombination mit HGF ein geeignetes Zytokin zur
Differenzierungsinduktion von Stammzellen.
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D i s k u s s i o n 106
Von AML12- und HepG2-Zellen konditionierte Medien wurden als Erweiterung zu den Zytokinen zur
Differenzierungsinduktion von Stammzellen eingesetzt und geprüft, inwieweit die ins Medium
sekretierten löslichen Faktoren eine endodermale Differenzierung induzieren können. Es lag die
Hypothese zugrunde, dass die Umgebung die Differenzierung der Stammzellen reguliert (Gonzales-
Reyes et al., 2003). Die Analyse der Genexpressionsprofile zeigte eine schwache Expression
endodermaler Gene. Sowohl SOX17, HNF3ß, AFP, GATA4, HNF4A, Cytokeratin 7, 8 und 18 als auch
Gene für die Cytochrom P450 Aktivität wurden nur auf einem geringem Niveau exprimiert. Ein
deutlicher Anstieg wurde für die Transkripte von Cytokeratin 19, E-Cadherin und SERPINA1 in
kultivierten CD34
+
Zellen ausgemacht. Das von HepG2-Zellen konditionierte Gherardi-Medium
induzierte eine stärkere Albumin-Expression in den kultivierten Stammzellen. Möglicherweise sind
die von den humanen HepG2-sekretierten Faktoren aufgrund der Spezieshomogenität reaktiver und
können besser von den CD34
+
Zellen erkannt werden. Im Vergleich der hepatischen
Differenzierungsinduktion durch Zytokine mit der Induktion durch die konditionierten Medien ist
kein Vorteil bzw. keine ausgeprägte endodermale, hepatische Differenzierungsinduktion der
hämatopoetischen Stammzellen durch die konditionierten Medien zu erkennen. Die unbekannten
löslichen Faktoren im konditionierten Medium sind entweder keine starken Induktoren, liegen in zu
geringer Konzentration vor oder die Stammzellen sind nicht fähig auf die Signale zu reagieren. In der
Literatur wurde hingegen gezeigt, dass c-met
+
Zellen - nicht CD34
+
Zellen - aus Nabelschnurblut im
Transwell-System aufgrund von sekretierten Stoffen von zirrhotischen Fettzellen mit transfizierten
HGF eine Hepatozyten-ähnliche Morphologie ausbilden konnten (Wang et al., 2005). Ein von murinen
Hepatozyten konditioniertes Medium bewirkte, dass CD34
+
Zellen ihr hämatopoetisches Potenzial
verloren und endotheliale Charakteristika annahmen (Bordoni et al., 2007). Auch durch HepG2 Zellen
konditioniertes Medium stellte für mononukleäre Zellen eine Mikroumgebung dar, die die
Differenzierung in Fibroblasten- und Hepatozyten-ähnliche Zellen ermöglichte (Zhang et al., 2006).
Die Beobachtungen einer phänotypischen Veränderung zu einer Hepatozyten-ähnlichen Morphologie
der adulten Stammzellen konnten in unserem Versuchsansatz nach Kultivierung mit AML12 und
HepG2 Zellen konditionierten Medien nicht bestätigt werden.
In einem weiteren Versuchsansatz wurde eine direkte Kokultur von CD34
+
Zellen mit AML12-
Hepatozyten angelegt, zur Prüfung der Hypothese, dass der direkte Kontakt einen zusätzlichen
Austausch von Stoffen durch interzellulare Kommunikation ermöglicht. Die Analyse des hepatischen
Expressionsprofils zeigte eine Expressionssteigerung der Cytokeratine 8, 18 und 19. Der Nachweis der
Expressionssteigerung von Markern des Cytoskeletts wie den Cytokeratinen zeigte, dass die Zellen
sich unter Umständen im Übergang vom mesenchymalen in einen epithelialen Zelltyp befinden. Auch
in der Literatur ist beschrieben, dass eine Reorganization des Cytoskeletts einen mesenchymalen
epithelialen Übergang anzeigt und Zeichen einer beginnende Differenzierung ist (Spaderna et al.,
D i s k u s s i o n 107
2008). In eigenen Untersuchungen wurde gezeigt, dass die CD34
+
Zellen nach 7 tägiger Kultivierung
mit HGF und SCF den mesenchymalen Marker Vimentin schwächer exprimierten und den epithelialen
Marker Cytokeratin 18 verstärkt (Wulf-Goldenberg et al., 2008). Eine leichte Verstärkung von
migrationsassoziierten Genen in den kultivierten Stammzellen wurde ebenfalls gefunden. Die
erhöhte Genexpression der Connexine 32 und 43 deutet auf eine mögliche Ausbildung von Zell-Zell-
Kontakten hin, mit denen die Proteine dieser Gene assoziiert sind. Mittels Dye Transfer konnte
gezeigt werden, dass die CD34
+
Zellen mit den AML12 Zellen in Zell-Zell-Kontakt traten und
zumindest einige Stammzellen Stoffe wie den Farbstoff CalceinAM aufgrund des direkten Kontaktes
mit den Hepatozyten aufnahmen. Im Video Imaging war zu sehen, dass die Stammzellen eine hohe
Motilität besitzen und nur kurzzeitig mit den AML12 Zellen in Kontakt traten. Daher wird vermutet,
dass die Differenzierung aufgrund des kurzzeitigen Kontaktes nur begrenzt in Richtung hepatische
Zellen gelenkt wurde. In der Literatur wurde nach der Kokultivierung von murinen
Knochenmarkszellen mit murinen fetalen Leberzellen adhärente hepatische Zellen mit der Expression
von Albumin nachgewiesen (Yamada et al., 2006). Eine so weit fortgeschrittene hepatische
Differenzierung von Stammzellen in Kokultur mit der murinen Hepatozytenzelllinie AML12 konnte in
unserem Ansatz möglicherweise aufgrund der fortgeschrittenen Differenzierung der Hepatozyten im
Gegensatz zu den fetalen Zellen nicht gefunden werden. Weiter konnte in der Literatur gezeigt
werden, dass der direkte Kontakt der Kokultur von murinen Knochenmarkszellen mit murinen nicht-
parenchymalen Leberzellen essentiell zur Differenzierung in Hepatozyten war (Yamazaki et al., 2003).
Die Wahl der Kokultur war somit berechtigt, jedoch konnte in unserem Versuchsansatz mit den
gewählten Methoden der Kokultur mit AML12-Zellen und innerhalb des Kultivierungszeitraums keine
eindeutige Differenzierung der CD34
+
Zellen in die endodermale, hepatische Richtung nachgewiesen
werden, obwohl elektronenmikroskopisch ausgeprägte Zellfortsätze sichtbar waren.
Beurteilt nach weiteren keimblattspezifischen Markern wurden in den im konditionierten Gherardi-
und Sautin-Medium kultivierten Zellen Gene für die erythroide und myeloische Differenzierung
(MAFB, NUSAP1, HDC, TCEA1) und in konditioniertem Sautin-Medium ectodermale Marker des
Nervensystems (ASCL2, NDRG2, SEMA4A) exprimiert. Dies deutet auf die gleichzeitige Expression
mesodermaler, endodermaler und ectodermaler Gene hin, jedoch wurden
differenzierungsspezifische Gene im Allgemeinen schwach exprimiert. Auch Apoptose-induzierende
Gene wurden kaum von Zellen unter Zytokinbehandlung und im konditionierten Sautin-Medium
aktiviert, jedoch wurden Apoptose–assoziierte Gene vermehrt von Zellen aktiviert, die im
konditionierten Gherardi-Medium kultiviert wurden. Grundsätzlich wurden Zellzyklus-assoziierte
Gene am stärksten und häufigsten exprimiert. Somit ermöglichen die verschiedenen
Kultivierungsbedingungen den Stammzellen ihre Viabilität und Selbsterneuerung aufrechtzuerhalten
und führen sie nicht in den frühen Zelltod.
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D i s k u s s i o n 108
Auch wenn nur geringe phänotypische und morphologische Veränderungen in den CD34
+
Zellen zu
beobachten waren, haben Veränderungen in der epigenetischen Landschaft von genregulatorischen
und –kodierenden Regionen aufgrund der ermittelten veränderten Genexpression stattgefunden und
eine Entwicklung der Stammzellen zu differenzierten Nachkommen ermöglicht. Die verschiedenen
Kultivierungsbedingungen bewirkten die Verminderung der Transkription von multipotenten Genen,
während typische endodermale Differenzierungsgene nur schwach in CD34
+
Zellen durch Zytokine,
konditioniertes Medium und Kokultur aktiviert wurden. Aus der ehemals reinen Stammzellpopulation
entstanden unter der Kultivierung verschiedene Zelltypen mit einem unterschiedlichen
Expressionsmuster. Auch in der Literatur ist beschrieben, dass ein Teil der Stammzellen sich
unendlich teilen und der andere Teil der Zellen seine Genexpression ändert und eine Vielfalt von
differenzierten Zellen entsteht (Ho et al., 2005).
4.1.2 Endodermales Differenzierungspotenzial von humanen embryonalen Stammzellen in vitro
Die Kultivierung der embryonalen SA002-Stammzellen mit hepatisch konditioniertem Sautin-Medium
bewirkte eine deutliche Veränderung des morphologischen Erscheinungsbildes. Der induzierte,
konfluente Zellrasen mit unterschiedlichen Zelltypen wies zelluläre Differenzierungsmerkmale wie
Mikrovilli, Gap Junctions sowie granuläre Strukturen auf, die mittels Elektronenmikroskopie
nachgewiesen wurden. Das Genexpressionsprofil der kultivierten hES wurde mittels RT-PCR
untersucht und eine deutliche Zunahme der Transkripte AFP und ALB verzeichnet. Eine reduzierte
Genexpression konnte für HNF-3β, SOX17, E-Cadherin und Connexin 32 beobachtet werden. In der
Literatur ist beschrieben, dass während der embryonalen Leberentwicklung mit fortschreitender
Differenzierung der Leber eine Verminderung der frühen endodermalen Marker wie HNF-3β und
SOX17 nachweisbar ist und die späteren endodermalen Marker wie AFP und ALB anschließend
stärker exprimiert werden (Zaret et al., 2002). Somit deuten unsere Ergebnisse auf eine hepatische
Differenzierung hin, jedoch sollten noch weitere funktionelle hepatische Parameter wie Proteine der
Cytochrom P450 Familie, Alkoholdehydrogenase-Aktivität, Glykogenspeicherung und Aufnahme und
Abgabe von IndoCyaninGreen untersucht werden, um eine detaillierte Aussage über den
Differenzierungsgrad der hES treffen zu können. In der Literatur wurde an murinen embryonalen
Stammzellen gezeigt, dass ein Extrakt aus Pneumozyten die Pneumozytendifferenzierung im
Vergleich zu Wachstumsfaktoren beschleunigen kann (Qin et al., 2005). Bislang wurde in der Literatur
die hepatische Differenzierung von hES durch verschiedene definierte Faktoren induziert, der Einfluss
von hepatisch konditioniertem Medium zur endodermalen Differenzierung von hES wurde jedoch
noch nicht beschrieben. Offen ist ebenso, wie die von AML12 Zellen ins konditionierte Medium
sekretierten Faktoren auf die embryonalen Stammzellen agieren und welche Mechanismen ausgelöst
D i s k u s s i o n 109
werden. Vielleicht inhibieren die sekretierten Faktoren Prozesse der unspezifischen, nicht-gelenkten
Differenzierung oder sie stimulieren die direkte endodermale, hepatische Differenzierung.
Die Anwendung von Modellen der Kokultur von hES mit Hepatozyten zur hepatischen
Differenzierungsinduktion wurde geprüft. Die SA002-Stammzellen in Kokultur mit AML12-Zellen
zeigten eine morphologische Veränderung. Die Entstehung von Mikrovilli, Gap Junctions sowie
granulären Strukturen ist mit dem Einfluss des konditionierten Sautin-Mediums vergleichbar. Jedoch
sind gehäuft Zellen mit einer polygonalen Form aufgetreten, die den hepatisch differenzierten Zellen
von Hay ähnelten (Hay et al., 2007). Die Genexpressionen von SOX17, AFP, ALB und Cytokeratin18
stiegen deutlich in den hES nach 14 tägiger Kokultur mit AML12-Zellen an. Die Expression von
Cytokeratin 8 und 19, GATA4 und Connexin 32 und 43 blieb konstant und von HNF3β nahm leicht ab.
Die Expression des Pluripotenzmarkers Oct-4 war stark reduziert. Die Expression der endodermalen,
hepatischen Differenzierungsmarkern wie SOX17, AFP, CEBPA, HNF4A, ALB und Cytokeratin 18 nahm
zu und deutet auf eine Differenzierung der SA002-Zellen unter den Bedingungen der AML12-Kokultur
hin. Jedoch sollten weitere Untersuchungen durchgeführt werden, um die Expression der
hepatischen Funktionen wie Albuminsekretion, Glykogenspeicherung und P450 Metabolismus zu
bestimmen. Desweiteren sollte das Protokoll modifiziert werden, um eine Optimierung der
hepatischen Differenzierung von hES zu erreichen. In der Literatur wurde ein mehrstufiges Protokoll
beschrieben, in dem die hES durch lösliche Faktoren wie ActivinA erst in Zellen des definitiven
Endoderms differenziert wurden und anschließend eine hepatische, endodermale Differenzierung
der Zellen durch die Kokultur mit Hepatozyten induziert wurde (Hay et al., 2007). Nicht nur die
Kokultur. Auch die von uns im konditionierten Medium kultivierten hES könnten diesem
Mehrphasenprotokoll folgen. Zuerst würde eine Differenzierung aller hES mit definierten löslichen
Faktoren in Zellen des definitiven Endoderm durchgeführt werden und anschließend eine hepatisch,
endodermale Differenzierung der hES durch Kokultivierung oder konditioniertem Medium und einer
extrazellularen Matrix induziert werden. Ein von Komponenten der extrazellularen Matrix
geschaffenes dreidimensionales System wäre für die Differenzierung der Stammzellen von Vorteil.
Eigene Versuche mit einer synthetischen Matrix (PuraMatrix Hydrogel, BD) zeigten, dass durch eine
zusätzliche extrazellulare Matrix die Differenzierung von adulten Stammzellen unterstützt wurde.
Ähnliche Beobachtungen wurden von Kudryavtseva et al. (2003) gemacht. Im Vergleich zur
zweidimensionalen Monolayerkultur würde ein dreidimensionales System die Architektur des
Leberparenchyms simulieren und die Differenzierung in Hepatozyten zu unterstützen.
Es wurden nur wenige Studien der Kokultivierung als Methode der direkten hepatischen
Differenzierungsinduktion von embryonalen Stammzellen publiziert. Murine embryonale
Stammzellen in Kokultur mit HepG2 Zellen exprimierten vermindert Gene der Pluripotenz und
verstärkt leberspezifische Gene (Lee et al., 2009). Die Kokultivierung von mES mit Ratten-
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Hepatozyten zeigte, dass der direkte Kontakt die hepatische Differenzierung unterstützt (Moore et
al., 2008). Bislang wurde noch keine Arbeit der endodermalen Differenzierung von hES durch
Kokultivierung mit Hepatozyten in der Literatur beschrieben. Im Gegensatz zur
Differenzierungsinduktion werden embryonale Stammzellen routinemäßig mit MEF kokultiviert, um
den undifferenzierten embryonalen Stammzell-Phänotyp aufrechtzuerhalten. Dies zeigt, dass die
Kokultivierung mit verschiedenen Effektorzellen eine Methode zur Induktion oder Lenkung der
Differenzierung sein kann. Die elektronenmikroskopische Untersuchung der kokultiverten hES lässt
die Vermutung aufkommen, dass die Kokultur im Vergleich zum konditionierten Medium im Vorteil
ist. Denn die Entstehung von vielen verschiedenen Zelltypen kann ein Anzeichen für eine höhere
Differenzierungsinduktion sein.
4.2 In vivo Differenzierungspotenzial von adulten und embryonalen
Stammzellen
Die immundefizienten Mausstämme NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
wurden für Stammzell-
Transplantationsversuche eingesetzt. Zur Ermittlung des Immunstatus der Tiere wurde der
Immunglobulin-Level bestimmt. Die NOD/SCID Mäuse wiesen einen niedrigen IgG-Gehalt auf, der als
nicht „leaky“ eingestuft wurde. Ein kontinuierliches Überwachen des IgG-Status ist notwendig und
vor Versuchsbeginn durchzuführen, um standardisierte Tiere für die durchzuführenden Versuche zur
Verfügung zu haben. Im Serum von NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen konnte kein IgG festgestellt werden.
Durch eine zusätzliche Gesamtkörperbestrahlung können Rest-Immunzellen in den Mäusen eliminiert
werden, was eine Voraussetzung für das Engraftment von humanen Zellen ist (Ballen et al., 2001).
Die NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse vertrugen die Dosis von 1,6 Gy. Es ist beschrieben, dass
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse radiosensitiver als NOD/SCID Mäuse sind und bei einer Dosis von 4 Gy
sterben (Shultz et al., 2005). In der Literatur wurde der Ig-Gehalt von NOD/SCID Mäusen bestimmt.
Nach 100 Tagen wies eins von elf Tieren ein Ig-Gehalt größer 1µg/ml im Serum auf (Shultz et al.,
1995). In NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen konnte im Alter von 394-426 Tagen kein IgG nachgewiesen
werden (Shultz et al., 2005). Ein Genotyping des durch eine Zielmutation inaktivierten IL2-Rezeptors
wurde bei den NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen kontinuierlich durchgeführt, um den Phänotyp der Tiere
zu bestätigen, denn die weiblichen Tiere sind homozygot und die männlichen Tiere hemizygot für das
Il2rg
tm1Wjl
Allel.
4.2.1 Systemische Applikation von CD34
+
Zellen in adulte immundefiziente Mäuse
Zur Bewertung und Beurteilung der Engraftmentrate und des Differenzierungspotenzials von CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut wurden unterschiedliche Transplantationsverfahren und
Applikationsrouten in immundefizienten Mäusen getestet. Die systemische, intravenöse Applikation
D i s k u s s i o n 111
von hämatopoetischen Stammzellen zur Engraftmentbewertung wird seit vielen Jahren routinemäßig
durchgeführt.
Die Resultate dieser Arbeit zeigen, dass die systemische Applikation von adulten CD34
+
Stammzellen
aus dem Nabelschnurblut in NOD/SCID Mäuse in einer schnellen „blood clearance“ der applizierten
Zellen mit einer Peakintensität nach 1min und anschließender Reduktion von humanen Zellen im
Mausblut resultierte. Das Engraftment nahm im Untersuchungszeitraum von 3 min, 1 Tag, 14 bis 56
Tagen in den hämatopoetischen Organen Knochenmark und der Milz zu.
Die beobachtete, schnelle „blood clearance“ der applizierten humanen Stammzellen aus dem Blut ist
neben einer unspezifischen Adhärenz an den Blutgefäßen mit der Migration zu und dem
Homingprozess der Zellen in Orte der Hämatopoese zu erklären. In eigenen Studien wurden
verschiedene Adhäsionsmoleküle auf CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut untersucht und ihre
Expression bestimmt (Wulf-Goldenberg et al., 2008). In vitro führte eine Kultivierung der Zellen mit
SCF zu einer verstärkten Expression von Integrin-Adhäsionsmolekülen CD11a, CD18 und CD49d und
einer leichten Steigerung von Immunglobulinen und Selektinen. Literaturdaten zeigen, dass die
transendotheliale Extravasation von Leukozyten aus dem Blut ins Gewebe durch Adhäsionsmoleküle
auf den zirkulierenden Zellen ermöglicht wird (Peled et al., 1999). Der Homingprozess von
hämatopoetischen Stammzellen in immundefizienten Mäusen entspricht im Wesentlichen dem Drei-
Phasen-Modell der Leukozytenextravasation aus dem Blut ins Gewebe (Springer, 1995; Voermans et
al., 2001). Daten der Literatur belegen, dass innerhalb der ersten 24 Stunden nach Injektion der
Homingprozess bzw. das aktive Übertreten der Blut/Endothelschranke stattfindet (Oostendorp et al.,
2000) und stehen im Einklang mit der beobachten „blood clearance“. Zur Migration und Homing von
Zellen sind neben Adhäsionsmolekülen auch chemotaktische, aktivierende Stimuli notwendig. SDF-1
ist ein chemotaktisches Agens, welches u.a. die Migration, Mobilisation und Retention von
hämatopoetischen Stammzellen während der steady-state Homöostase und Gewebeverletzung
reguliert (Cottler-Fox et al., 2003) und hat möglicherweise die von uns intravenös applizierten
Stammzellen aus dem Blut in hämatopoetische Organe gelockt.
Wie unsere Daten zeigen, fand eine zeitabhängige Expansion und Proliferation der applizierten
Stammzellen im Knochenmark und in der Milz statt. Die frisch isolierten Stammzellen befanden sich
größtenteils in der G
0
/G
1
Phase. In vitro konnten sie durch SCF und HGF stimuliert werden, was mit
Zunahme der G
2
/M und S-Zellzyklusphase einhergeht. Das Knochenmark und die Milz ist für
hämatopoetische Stammzellen die ursprüngliche Mikroumgebung oder Nische. Literaturdaten
belegen, dass Stammzellen unter in vivo Bedingungen Signale von der Mikroumgebung zur
Selbsterneuerung und Differenzierung erhalten (Morrison&Spradling, 2008). Vermutlich wurde die
Proliferation von den ins Knochenmark und in die Milz migrierten Stammzellen durch Signale der
Nische induziert. Die Migration von Stammzellen zu und ihr Engraftment in unterstützenden
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D i s k u s s i o n 112
Stammzell-Nischen ist von Bedeutung, um durch die dort vorhandenden Faktoren die Langzeit-
Aufrechterhaltung des Stammzellpools zu gewähren.
Die im Knochenmark und in der Milz von NOD/SCID Mäusen engrafteten humanen Zellen
differenzierten größtenteils in B-Zellen oder myeloische Zellen, eine T-Zelldifferenzierung konnte
nicht nachgewiesen werden. Literaturdaten belegen, dass das Vorhandensein und die funktionelle
Aktivität von rudimentären NK-Zellen einen Einfluss auf das hämatopoetische linienspezifische
Differenzierungspotenzial hat (Bernard et al., 2008). Die systemische Applikation von Stammzellen in
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse führte verglichen mit dem Engraftment in NOD/SCID Mäusen zu einem
höheren Engraftment im Knochenmark, Milz, Thymus und Blut. Das Fehlen von NK-Zellen in
NOD/SCID/ IL2Rγ
null
Mäusen ermöglichte den Stammzellen offenbar ein verstärktes Homing und
Engraftment.
4.2.2 Organspezifische Transplantation von CD34
+
Zellen in immundefizienten Mäusen
Xenogene Transplantationsmodelle sind zur Analyse und Bewertung der humanen Hämatopoese in
vivo beschrieben. In der vorliegenden Arbeit wird ein xenogenes Transplantationssystem etabliert
und beschrieben, das den Einfluss des organspezifischen Milieus auf das Engraftment und die
Gewebedifferenzierung von Stammzellen untersucht.
Die histopathologisch untersuchte Leber von neugeborenen NOD/SCID Mäusen wies extramedulläre
Zellansammlungen lymphoider Zellen auf. Adulte Mäuse besaßen diese Cluster der extramedullären
Hämatopoese nicht. In der Literatur ist beschrieben, dass die Hämatopoese ein gewebespezifischer
Prozess ist und die Orte der Hämatopoese sich während der Ontogenese ändern (Timens et al.,
1997). Die fetale Leber ist für hämatopoetische Vorläuferzellen der Ort der Proliferation und
Zellreifung (Palis et al., 1999; Godin et al., 1999). Wir haben in Lebern neugeborener Mäuse
hämatopoetische Zellen als Kolonien um die Hepatoblasten angeordnet gesehen, wie auch von
Sasaki et al. (2000) dargestellt wurde. Diese Kolonien besaßen einen zentralen Makrophagen.
Während der fetalen Hämatopoese können Makrophagen weitere hämatopoetische Zellen
stimulieren (Sasaki et al., 2000). Eventuell können durch die Makrophagen nicht nur die endogenen
Zellen stimuliert werden, sondern ist auch für die von uns intrahepatisch transplantierten
Stammzellen in der Leber von neugeborenen Mäusen, neben der nährstoffreichen Umgebung, ein
Stimulans.
Vor der Transplantation wurden in unserem Versuchsansatz sowohl die juvenilen als auch die
adulten Mäuse mit einer γ-Quelle bestrahlt. Die juvenilen Mäuse wurden aufgrund der aufgetretenen
Mortalität mit einer geringeren Dosis als die adulten Tiere bestrahlt. Literaturdaten belegen diese
Beobachtung, dass neugeborene Mäuse sensitiver auf Bestrahlung reagieren als adulte Mäuse
(Ishikawa et al., 2005). Chicha et al. (2005) führen aus, dass neugeborene NOD/SCID Mäuse im
D i s k u s s i o n 113
Vergleich zu neugeborenen RAG2
-/-
γ
c-/-
Mäusen die Bestrahlung von 2 x 2 Gy nicht tolerieren. Die scid
Mutation führt zu einem generellen DNA Reparationsdefekt und höherer Radiosensitivität als die
RAG Mutation.
Nach Modelletablierung wurde eine organspezifische Transplantation von
Nabelschnurblutstammzellen in die Leber von immundefizienten Mäusen analysiert. Den juvenilen,
neugeborenen NOD/SCID Mäuse wurden 1x10
5
CD34
+
Stammzellen bzw. 1x10
7
MNC intrahepatisch
transplantiert. Das Körpergewicht der Tiere stieg von 1,67g am Tag 1 auf ungefähr 17g nach 42 Tagen
an. Im Zeitraum von bis zu 70 Tagen wiesen die Mäuse mit MNC transplantierten Zellen keine
Nebenwirkungen der Transplantation auf. Ein vergrößerter Thymus wurde in einigen Mäusen nach
CD34
+
Transplantation detektiert. In den verschiedenen Versuchen variierten die Engraftmentlevel in
den Organen, Unterschiede im Mittelwert wurden geprüft.
Die organspezifische Transplantation von CD34
+
Stammzellen in juvenile NOD/SCID Mäuse führte
zu einem guten Engraftment im Knochenmark und in der Milz. Bereits drei Minuten nach
Transplantation wurden in den stark durchbluteten Organen wie Knochenmark, Milz, Leber und
Lunge humane Zellen gefunden. Die Anzahl der humanen Zellen stieg während des
Untersuchungszeitraums von 14, 42 und 70 Tagen kontinuierlich im Knochenmark (von 0,9%, 9,1%,
35,3%) und der Milz (von 0,1%, 2,1%, 4,9%) an. In der Leber war keine Zunahme des Anteils humaner
Zellen nachweisbar. Offensichtlich stellt die postnatale Leber für die Stammzellen keinen geeigneten
Ort der Proliferation mehr dar. Vermutlich werden die Zellen durch Signale in andere
hämatopoetische Organe gelockt und wandern ins Knochenmark und Milz, welche postnatale Orte
der Hämatopoese sind, proliferieren verstärkt und engraften dort.
Eine Zunahme des Engraftments in den hämatopoetischen Organen wurde nur nach intrahepatischer
Transplantation von CD34
+
Zellen in juvenilen Mäusen detektiert. Nach Transplantation von
Stammzellen in die Leber von adulten Mäusen waren in der Leber und weiteren Organen kaum
engraftete humane Zellen zu finden. Martin und Bhatia (2005) vermuten, dass die fetalen
hämatopoetischen Stammzellen in der Mikroumgebung der Leber über den Wnt-Signalweg reguliert
werden. Dies soll zu einem verstärkten Zellzyklus und höherer Proliferation der Stammzellen führen.
In der adulten Leber werden die Stammzellen vom Notch-Signalweg reguliert, der üblicherweise die
Stammzellen nicht zur Proliferation stimuliert. Die von uns intrahepatisch transplantierten
Stammzellen können in der Leber neugeborener Mäuse eventuell durch Signale des Wnt-Signalweges
zur Proliferation stimuliert worden sein. Man konnte auch annehmen, dass ein lokaler Schaden,
hervorgerufen durch die Injektion der Stammzellen in die adulten Leber, die größtenteils in der G
0
-
Zellzyklusphase ruhenden Hepatozyten stimuliert und durch die Ausschüttung von lokal und
systemisch wirksamen Wachstumsfaktoren die CD34
+
Zellen stimuliert werden. Die CD34
+
Zellen
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D i s k u s s i o n 114
wurden in der adulten Leber jedoch nicht zum Proliferieren angeregt. Ren et. al. (2008) beschreiben,
dass SCF in der Mausleber vorkommt und dort u.a. für die Proliferation und Differenzierung von
endogenen Zellen während der hepatischen Differenzierung verantwortlich ist. Jedoch erfuhren die
von uns transplantierten exogenen Stammzellen keine ausreichende Stimulierung zur Proliferation in
der adulten Leber. In der Leber kommen neben SCF auch SDF-1, HGF und MMPs vor, die
chemotaktische und migratorische Funktionen ausüben (Lysy et al., 2008). Diese unterstützen u.a.
perinatal die Migration von Stammzellen aus der Leber ins Knochenmark und in die Milz, aber auch
postnatal wird eine kontinuierliche Rezirkulation von Zellen durch Blut und Gewebe gefunden
(Kikuchi et al., 2006). Die intrahepatisch transplantierten CD34
+
Zellen wurden möglicherweise von
diesen Faktoren ins Knochenmark und in die Milz gelenkt.
Abhängig vom Stammzelltyp wurde das Verhalten der Stammzellen in der adulten Leber geprüft. Für
die intrahepatisch transplantierten adulten CD34
+
Stammzellen bot die adulte Leber kein geeignetes
Milieu zur Proliferation und Differenzierung. Die adulte Leber ist für embryonale Stammzellen nach
intrahepatischer Transplantation hingegen ein geeignetes Mikromilieu zur Bildung von Teratomen
und Differenzierung (Cooke et al., 2006).
Der Einfluss des Alters der Mäuse auf die Engraftmenteffizienz muss ebenso berücksichtigt werden
wie der verwendete Mausstamm. I.p. injizierte fetale Leberstammzellen in einen Tag alte RAG2
-/-
γ
c-/-
Mäuse führten nach 8 wöchiger Engraftmentdauer zu 80% humanen Zellen im Blut, eine Woche alte
Tiere zeigten ca. 30% humane Zellen und weniger als 10% humane Zellen wurden bei Injektion in
zwei Wochen alte Mäuse gefunden (Gimeno et al., 2004). Die intrahepatische Injektion von CD34
+
Nabelschnurblutzellen in bestrahlte RAG2
-/-
γ
c-/-
Mäuse führte zu einem Anteil von >10% humane
CD45
+
Zellen im peripheren Blut und anderen lymphoiden Organen (Chicha et al., 2005). Diese
Prozentangaben des Engraftments verifizierte Gorantla et al. (2007) mit CD34
+
Zellen aus dem
Nabelschnurblut nach intrahepatischer Transplantation in bestrahlte, neugeborene RAG2
-/-
γ
c-/-
Mäuse. Neugeborenen, bestrahlten NOD/SCID/β2m
-/-
und NOD/SCID/IL2rγ
null
Mäusen wurde über die
Gesichtsvene humane CD34
+
Zellen aus dem Nabelschnurblut transplantiert (Ishikawa et al., 2002
und 2005). Im peripheren Blut von NOD/SCID/β2m
-/-
befanden sich nach drei Monaten 12,4% CD45
+
Zellen, im Knochenmark 31,5% und in der Milz 22,6%. Der Anteil an humanen Zellen war in
NOD/SCID/IL2rγ
null
Mäusen in diesen Organen deutlich höher (68,9%, 72,9%, 54,5%). Nach
intrahepatischer CD34
+
Zelltransplantation in neugeborene NOD/SCID/Jak3
null
Mäuse konnte die
Entwicklung eines funktionellen humanen Immunsystems nachgewiesen werden (Okada et al., 2008).
In unserem Versuchsansatz wurden CD34
+
Zellen intrahepatisch in drei Tage alte NOD/SCID Mäuse
transplantiert, was bislang noch nicht beschrieben war. Zehn Wochen nach Transplantation wurden
35,3% humane Zellen im Knochenmark und 4,9% humane Zellen in der Milz detektiert. Dieses
Engraftmentlevel im Knochenmark ist mit dem in der Literatur beschriebenen Engraftment in
D i s k u s s i o n 115
NOD/SCID/β2m
-/-
Mäusen vergleichbar, liegt jedoch eindeutig unter dem Engraftment nach
intrahepatischer Stammzelltransplantation in neugeborene NOD/SCID/IL2rγ
null
Mäuse. Vermutlich
wird ein sehr hohes Engraftment von CD34
+
Zellen nach intrahepatischer Transplantation in wenige
Stunden alte NOD/SCID/IL2rγ
null
Mäuse erreicht.
Untersuchungsgegenstand war weiterhin das Expansions- und Differenzierungspotenzial von
mononukleären Zellen (MNC) nach intrahepatischer Transplantation in juvenile NOD/SCID Mäuse.
Isolierte mononukleäre Zellen stellen eine heterogene Zellpopulation mit Anteilen von B-, T-, NK-,
myeloischen Zellen und Stammzellen dar. In der Leber von juvenilen Mäusen konnten 5 min, 1 Tag
und 5 Tage nach intrahepatischer Transplantation von MNC mit humanspezifischer PCR humane
Zellen nachgewiesen werden. Der Anteil an humanen Zellen änderte sich in der Leber kaum über die
Zeit. Jedoch wurde ein hohes Engraftment im Thymus von 22,39% nach 42 Tagen detektiert. In der
Milz waren 7,77% und im Knochenmark 0,93% humane Zellen zu finden. Im Gegensatz zu der
intrahepatischen CD34
+
Transplantation wiesen transplantierte MNC eine T-Zell-Differenzierung im
Thymus (12,27% CD3
+
) und Milz (7,71%) auf. Nach CD34
+
Transplantation hingegen differenzierten
die Zellen in B-Zellen im Knochenmark und Milz.
Literaturdaten hingegen belegen, dass eine Transplantation von hämatopoetischen Stammzellen in
neugeborene Mäuse der oben beschriebenen Stämme RAG2
-/-
γ
c-/-
, NOD/SCID/β2m
-/-
und
NOD/SCID/IL2rγ
null
zu einem hohen Engraftment mit T-, B- und NK-Zell-Differenzierung führte, die in
der Bildung eines humanen Immunsystems resultierte. Die NOD/SCID Mäuse besitzen im Gegensatz
zu RAG2
-/-
γ
c-/-
, NOD/SCID/β2m
-/-
und NOD/SCID/IL2rγ
null
Mäusen aufgrund ihres genetischen
Hintergrunds noch zu einem geringen Prozentsatz NK-Zellen. Diese können eventuell für die in
unseren Versuchen gezeigte unvollständige Differenzierung von CD34
+
Zellen in hämatopoetische
Zelltypen wie zu T-Zellen verantwortlich sein.
Die MNC enthielten eine Population von 2,5% CD34
+
Stammzellen und 6 Wochen nach
intrahepatischer MNC-Transplantation waren 12% humane T-Zellen im Thymus vorhanden. Die
Herkunft dieser Zellen ist unklar. Entweder wurden die im Thymus vorkommenden T-Zellen aus
Stammzellen neugebildet oder rudimentäre T-Zellen aus den applizierten MNC haben sich vermehrt.
Daten der Literatur zeigen, dass die Halbwertszeit von T-Zellen im SCID-hu Modell weniger als 24
Stunden beträgt (Vanhecke et al., 1995). Daraus lässt sich schlussfolgern, dass die T-Zellen sich
neugebildet haben und nicht aus den applizierten MNC entstammen. Man kann vermuten, dass die
heterogene Zellpopulation aus verschiedenen Zelltypen von Signalen aus dem Thymus angelockt
worden ist, dort proliferierte und differenzierte, denn die Transplantation von CD34
+
Zellen allein
führt zu keinen Engraftment im Thymus und keiner T-Zell-Detektion. Für die Differenzierung von
Stammzellen, enthalten in den MNC, in T-Zellen spricht ebenfalls die Beschreibung von Chicha et al.
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D i s k u s s i o n 116
(2005). Nach der Transplantation von CD3
+
Zellen in neugeborene RAG2
-/-
γ
c-/-
Mäuse waren keine
humanen T-Zellen detektierbar. Demnach sind die T-Zellen aus der Stammzellpopulation innerhalb
der intrahepatisch transplantierten MNC entstanden. Einige Zellen der heterogenen Zellpopulation
agierten möglicherweise als Modulatoren. Die in den MNC enthaltenden B-Zellen wurden nicht in
den murinen Organen detektiert. Nicht geklärt ist, warum keine B-Zellen auffindbar waren und aus
den Stammzellen der MNC sich keine B-Zellen differenzierten. Denn nach intravenöser Applikation
von MNC in adulte NOD/SCID Mäuse statt intrahepatischer Transplantation in neugeborene
NOD/SCID Mäuse wurde alleinig eine B-Zelldifferenzierung und keine T-Zelldifferenzierung gefunden
(Nische et al., 2003). Hieraus lässt sich folgern, dass die Route der Transplantation einen Einfluss auf
die linienspezifische Differenzierung der applizierten hämatopoetischen Zellen hat.
Wie beschrieben, engraften und differenzieren die intrahepatisch transplantierten
Nabelschnurblutzellen in juvenilen immundefizienten Mäusen. Diese präklinischen Modelle können
eingesetzt werden, um die Entwicklung des humanen Immunsystems in vivo als auch
Immunantworten auf Impfstoffe oder Pathogene zu evaluieren (Baenzinger et al., 2006; Watanabe et
al., 2006). Eine Antitumor-Aktivität von rekrutierten, engrafteten adulten Stammzellen in
Tiermodellen ist noch nicht beschrieben. Die angewendete Methode von intrahepatisch
transplantierten Nabelschnurblutzellpräparationen kann als Modell zur Generierung von Zellen mit
Antitumor-Aktivität und der Testung von neuen Medikamenten im humanisierten NOD/SCID
Mausmodell herangezogen werden. Intrahepatisch transplantierte MNC retardierten das SW480
Tumorwachstum und die Anwesenheit eines bispezifischen EpCAM/CD3 Antikörpers reduzierte das
Tumorvolumen signifikant verglichen mit der unbehandelten SW480-Tumorgruppe (Wulf-
Goldenberg et al., 2010, submitted). Die immunhistochemisch analysierten SW480 Tumore zeigten
eine Akkumulation und Clustering von humanen CD3 positiven Zellen in der Tiergruppe mit MNC-
Transplantat und einer Antikörperbehandlung gegenüber der Gruppe mit MNC ohne
Antikörperbehandlung. Dies ist die erste Beschreibung einer Antitumor-Aktivität von intrahepatisch
transplantierten MNC-Nabelschnurblutzellpräparationen und ihre Rekrutierung durch einen
bispezifischen Antikörper, die in einer verstärkten Antitumor-Aktivität von humanen T-Zellen im
SW480 Tumor resultiert. Dieses Maus-Modell kann zur Wirksamkeitsprüfung von humanspezifischen
Antikörpern und zur Selektion und Charakterisierung von Immunzellen mit Antitumor-Aktivität
beitragen.
D i s k u s s i o n 117
4.2.3 Pluripotenz und Keimblattstrukturen von embryonalen Stammzellen nach
Transplantation in Mäuse
Die Ausbildung der drei Keimblattstrukturen von Zellen mesodermaler, endodermaler und
ectodermaler Abstammung ist ein wesentliches Merkmal der Pluripotenz von embryonalen
Stammzellen. Die Fähigkeit zur Ausbildung dieser Keimblattstrukturen aus pluripotenten
Stammzellen kann als in vivo Kriterium für die Qualität von Stammzellpräparationen herangezogen
werden.
Murine embryonale Stammzellen wurden zur Etablierung des Maustransplantationsmodells
eingesetzt. Zur Expansion der Zellen wurde der 3D-Bioreaktor eingesetzt und ausreichende
Zellmengen erhalten (Charité, Berlin). mES wurden subcutan in syngene 129/SVE Mäuse
transplantiert, was zur Teratombildung mit Zellen der drei Keimblattstrukturen führte und die
Pluripotenz der Zellen bewies. Desweiteren wurde die Pluripotenz vor und nach Bioreaktorexpansion
geprüft. Histopathologisch konnten Zellen und Gewebetypen mesodermalen, endodermalen und
ectodermalen Ursprungs vor und nach Bioreaktorexpansion detektiert werden. Die 3D-
Expansionsbedingungen stellten eine geeignete Methode zur Gewinnung pluripotenter, muriner,
embryonalen Stammzellen in ausreichender Menge für die präklinische Testung dar. Die in vivo
Teratombildung der mES erlaubt die Qualitätsbeurteilung des Stammzellpräparates bezüglich des
Pluripotenz- und Differenzierungsstatus der Zellen im gewählten syngenen 129/SVE Mausmodell
und stellt ein geeignetes Teratommodell zur Bestimmung der Embryotoxizität von Substanzen dar.
Die humane embryonale Stammzelllinie SA002 wurde subcutan in immundefiziente NOD/SCID
Mäuse transplantiert und die Qualität und die Pluripotenz der Zellen durch die Ausbildung der drei
Keimblattstrukturen beurteilt. Die gebildeten Teratome hatten ein geringes Gewicht, eine
gallertartige, flache Konsistenz und geringe Vaskularisierung. Die Teratome wurden sowohl
morphologisch mittels Histologie als auch molekularbiologisch mittels BeadArrayTechnologie
charakterisiert. Morphologisch wurde eine überwiegende Ausbildung von meso- und endodermalen
Keimblattstrukturen wie Bindegewebe und Drüsenlumina entdeckt. Wenig ausgeprägt war das
Vorhandensein von Zellen ectodermalen Ursprungs, jedoch wurde Pigmentbildung gesehen. Die
Mitoserate in den Teratomen war gering. Die Transplantation von hES in immundefiziente Mäuse
kann auch als Modell für die Bewertung der spontanen Differenzierung von embryonalen
Stammzellen herangezogen werden. Es wurde das Genexpressionsprofil von undifferenzierten hESC
mit spontan differenzierten Zellen im Teratom verglichen. Die Proben mit differenzierten hES
exprimierten in geringer Anzahl und Intensität Gene, die im Zusammenhang mit dem Zellzyklus, der
Mitose und der Zellteilung stehen. Mit hoher Anzahl und Intensität wurden Gene exprimiert, die für
die Differenzierung von Zellen verantwortlich sind. Es wurden Gene nachgewiesen, die für die
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Bildung von Neuronen (OTX2, STMN2, POU4F1, LRRC4C, NTNG1), Muskeln (MYH11), Gliedmaßen
(BMP4, CDH11, BMP7, SOX9) und Lunge (FOXF2, MGP, SFTPD) wichtig sind. Besonders häufig und mit
hoher Intensität traten Gene der ecto- und mesodermalen Keimblätter auf und weniger häufig Gene
endodermalen Ursprungs. Auf Genexpressionsebene wurden Transkripte aller drei
Keimblattstrukturen nachgewiesen. Das NOD/SCID Mausmodell ist geeignet, um das in vivo
Differenzierungsverhalten von humanen embryonalen Stammzellen nachzuweisen
Die Teratome aus hES wiesen im Vergleich zu den mES in den NOD/SCID Mäusen eine geringere
Wachstumsgeschwindigkeit auf. Eine mögliche Erklärung für das unterschiedliche
Wachstumsverhalten von mES und hES in Mäusen ist neben der Spezies-Spezifität von Zytokinen die
NK-Zellaktivität in NOD/SCID Mäusen, die die hES zerstören können. Vermutlich können die mES
besser auf die von der Maus ausgesendeten Wachstumsfaktoren reagieren und proliferieren
schneller als die hES. Aus der Literatur ist bekannt, dass eine Anzahl an Zytokinen wie LIF, BMP4 und
bFGF eine wichtige Rolle bei der Regulation von mESC und/oder hESC Pluripotenz in Kultur spielen
(Dvorak et al., 2005; Dravid et al., 2005; Xu et al., 2005). LIF ist das entscheidende Zytokin für den
pluripotenten Status von mESC, jedoch für die Aufrechterhaltung der Pluripotenz von hES unwichtig
(Daheron et al., 2004). BMP4 begünstigt zusammen mit LIF die Selbsterneuerung der mESC (Ying et
al., 2003), während die hESC den BMP Antagonisten Noggin zur Unterdrückung der Differenzierung in
vitro benötigen (Xu et al., 2005). Somit benötigen mES und hES unterschiedliche exogene Signale, um
die Pluripotenz und Selbsterneuerung aufrechtzuerhalten.
An hES-Teratomen wurden sowohl nach histopathologischer Begutachtung als auch mittels
Genexpressionsanalyse keine undifferenzierten Zellen und/oder stark proliferierende Zellen in den
entstandenen Tumoren oder die Expression pluripotenter Gene detektiert. Diese Resultate deuten
auf eine Teratombildung aus hES der Linie SA002 in NOD/SCID Mäusen hin und keine Bildung von
malignen Teratokarzinomen. Literaturdaten zeigen, dass hES-abgeleitete Tumore überwiegend
gutartige Teratome sind (Blum und Benvenisty, 2008). Jedoch wurde von mES schon die Bildung von
infiltrativ wachsenden, stark proliferierenden Teratokarzinomen berichtet (Gidekel et al., 2003).
Die spontane Differenzierung von humanen embryonalen SA002 Zellen führte nach s.c.
Transplantation in NOD/SCID Mäuse zur Entstehung von Teratomen mit Zelltypen der drei
Keimblätter. Histologisch wurden semiquantitativ gehäuft Zellen meso- und endodermalen
Ursprungs detektiert. Auf molekularer Ebene wurden mittels Genexpression verstärkt Gene meso-
und ectodermalen Ursprungs wie Neuronen analysiert. Möglicherweise ist die histologische Methode
limitiert und nicht spezifisch genug, um über die wahre Identität der Zellen zu informieren und auch
die ectodermalen Zellen in ihrer gehäuften Genexpression sichtbar zu machen (Przyborski, 2005).
Anderseits wird infolge einer starken Genexpression nicht immer ein zugehöriger differenzierter
D i s k u s s i o n 119
Phänotyp nachwiesen. Unter in vitro Bedingungen ist bekannt, dass die spontane Differenzierung von
hES zur Bildung von Neuronen und Gliazellen führt (Reubinoff et al., 2001; Hornstein et al., 2004).
Auch bei in vivo gebildeten Teratomen aus hES wurde die Dominanz der meso- und ectodermalen
Differenzierung beschrieben. Gertow et al. (2004) injizierten die hESC-Linie HS181 in SCID/beige
Mäuse und beobachteten eine vorherrschende Differenzierung in neuronales Gewebe und Bildung
von Knochen. Dies steht in Einklang mit der von uns gefundenen gehäuften Expression neuronaler
Gene nach s.c. Transplantation von SA002 Zellen in NOD/SCID Mäuse.
Durch die direkte gewebespezifische Applikation kann ein Einfluss eines organspezifischen
Mikromilieus geprüft werden. Eigene Untersuchungen ergaben, dass die organspezifische
intrahepatische Applikation von hES eine „verringerte“ ectodermale Differenzierung im Gegensatz
zur s.c. und der systemischen Applikation hervorruft. Die Fähigkeit der Zellen zur
Keimblattdifferenzierung kann durch das organspezifische Mikromilieu moduliert werden. Der
anatomische Ort ist relevant für die spontane Differenzierung von ES. In der Literatur wurde
beschrieben, dass i.hep. injizierte hES aggressivere und weniger differenzierte Tumore bildeten als
s.c. transplantierte hES (Cooke et al., 2006). Die in das Gehirn von neonatalen Mäusen
transplantierten hES differenzierten in funktionelle Neuronen und integrierten ins Gehirn ohne die
Bildung von Teratomen (Muotri et al., 2005). Dies kann durch eine Umgebung, die reich an
entwicklungsspezifischen Signalen ist, erklärt werden. So scheint es möglich, die spontane
Differenzierung nach s.c. Transplantation von hES in NOD/SCID Mäusen durch eine organspezifische
Transplantation in eine gerichtete Differenzierung zu lenken.
Die Tumorbildung von ES ist eine Einschränkung für die klinische Anwendung von embryonalen
Stammzellen und aufgrund dieser Nebenwirkung ist die Transplantation von hES in Menschen derzeit
unwahrscheinlich. Es wurden jedoch verschiedene Strategien entwickelt, um das tumorigene
Potenzial von hES Transplanten zu vermindern: Entfernung von genetisch modifizierten,
proliferierenden Zellen, vollständige Differenzierung der Zellen vor Transplantation, Aussortieren von
pluripotenten Zellen. Die Strategien sind bislang aber noch nicht ausreichend sicher und weitere
Entwicklungen sind notwendig.
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D i s k u s s i o n 120
4.2.4 Prüfung des hepatischen Differenzierungs- und Regenerationspotenzials von Stammzellen
in präklinischen Leberschadensmodellen
Es wurden drei Leberschadensmodelle in immundefizienten NOD/SCID bzw. NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen etabliert und charakterisiert, um das hepatische Regenerations- und
Differenzierungspotenzial von humanen Stammzellen in vivo zu prüfen: Leberschaden durch
chemische Induktion nach CCl
4
Applikation, durch Cholin-defiziente Futterdiät und durch chirurgisch
induzierte partielle Hepatektomie. Die immundefizienten Mausmodelle mit Leberschaden werden als
kliniknahes Modell von Lebererkrankungen betrachtet. Stammzellen wurden in Mäuse mit
Leberschaden transplantiert, um ihr Verhalten der Stammzellen bei Lebererkrankung zu simulieren.
4.2.4.1 Leberschadensmodelle in immundefizienten Mäusen
In dem Modell des akuten, chemisch-induzierten Leberschadens wurde für die NOD/SCID bzw.
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse eine einmalige Dosis von 0,4ml/kg CCl
4
i.p. ermittelt, die eine
Leberschädigung hervorruft. Histopathologisch wurde ein akuter Leberschaden aufgrund von
zentrolobulären Koagulationsnekrosen von Hepatozyten sichtbar. In der Literatur wurde
beschrieben, dass 10% CCl
4
in C57Bl6 Maus zu einem akuten Leberschaden führte (Khurana et al.,
2007). Diese Dosis ist höher als die für immundefiziente Mäuse ermittelte Dosis. Es wurde berichtet,
das auf die Nekrose folgend benachbarte, proliferierende Hepatozyten AFP sezernierten und die
nekrotische Region innerhalb von 1-2 Wochen wiederhergestellt wurde (Sell et al., 2000). Die
Sekretion von proliferationsinduzierenden Faktoren kann möglicherweise die transplantierten
Stammzellen stimulieren.
Durch Fütterung einer Cholin-defizienten Experimentalfutterdiät und Ethonin im Trinkwasser sollte
ein chronischer Leberschaden durch Leberentzündung, Fettleberinduktion, Zytokinproduktion und
Ovalzellinduktion in NOD/SCID und NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen ausgelöst werden. Ethionin (L-
Homocystein) ist der hepatokarzinogene anti-Metabolit von Methionin. Es inhibiert den Einbau von
Methionin und Glycin in Leberproteine und verhindert die Umwandlung von Methionin zu Cystein
(Swendseid et al., 1952). Die resultierende Wachstumsinhibierung kann durch Cholin oder
Methioningabe kompensiert werden. Cholin ist ein Nährstoff, der bei adäquater Versorgung mit Serin
und Methionin im Körper gebildet werden kann. Das Experimentalfutter stellt eine defizitäre Protein-
und Methioninversorgung mit reduziertem Cholin-Gehalt von 1040 mg/kg auf 410 mg/kg dar. Der
inhibierende Effekt von Ethionin kann aufgrund des niedrigen Cholin-Angebots nicht vollständig
revidiert werden.
Das Futter vertrugen beide Mausstämme gleichermaßen, jedoch reagierten die NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse sensitiver auf Ethionin als die NOD/SCID Mäuse, und die Konzentration musste bei den
D i s k u s s i o n 121
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen von 0,15% auf 0,075% reduziert werden. In einem dreiwöchigen
Behandlungszeitraum waren Fettvakuolen und Proliferation von Ovalzellen in Leberschnitten
sichtbar. Der induzierte chronische Leberschaden führte einen Anstieg der leberspezifischen Enzyme
AST und ALT im Serum der NOD/SCID Mäuse herbei.
In der Literatur wurde bisher das Verhalten von immundefizienten Mäusen unter Cholin-defizienter,
Ethionin-supplementierter Futterdiät noch nicht beschrieben. Immunkompetenten BDF1 und
C57Bl/6 Mäusen wurde eine Cholin-defiziente Diät und 0,15%ige Ethionin-Supplementierung bis zu
sechs Wochen gefüttert und eine effektive Ovalzellinduktion ermittelt (Akhurst et al., 2001; Knight et
al., 2005). Die Serum-AST-Aktivität wurde zeitabhängig in C57Bl/6 Mäusen ermittelt und sieben Tage
nach Start der Diät der Peak von AST erreicht (Knight et al., 2005). Erstmals wurde in dieser Arbeit die
Wirkung einer Cholin-defizienten Diät und Ethionin-Supplemenierung in immundefizienten
NOD/SCID Mäuse mit der Folge der Induktion eines chronischen Leberschadens gezeigt.
Als drittes Leberschadensmodell wurde die partielle Hepatektomie in NOD/SCID und
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen etabliert. Es wurde chirurgisch der links-laterale Leberlappen entfernt.
Um die Selbstregeneration der Leber im Tiermodell nach partieller Hepatektomie zu verlangsamen,
wurde der Proliferationshemmer Monocrotalin mehrmals vor der partiellen Hepatektomie injiziert.
Die ermittelte Dosis Monocrotalin betrug 30mg/kg, welche von den NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen gut
und von den NOD/SCID Mäusen moderat vertragen wurde. Die Tiere erholten sich nach 30%iger
Leberresektion schnell von dem chirurgischen Eingriff und überlebten. Im Serum bestimmte
leberspezifische Enzyme (AST und ALT) stiegen nach der partiellen Hepatektomie an und deuten auf
eine Leberschädigung. Die regelmäßige, alleinige Gabe von Monocrotalin bewirkte noch keine
Ausschüttung der Enzyme. Zehn Tage nach der partiellen Hepatektomie waren die resektierten
Leberlappen vollständig wiederhergestellt und enthielten mitotisch aktive Zellen, die zwei Kerne
auswiesen. Die partielle Hepatektomie führt zu einem akuten Leberschaden, dem eine schnelle
Regeneration folgt, wenn sie nicht durch einen Proliferationshemmer z.B. Monocrotalin verzögert
wird.
Auch in der Literatur wurde die hepatische Resektion untersucht und 16h nach Resektion in Ratten
die beginnende DNA Replikation und damit einhergehende Regenerationsprozess detektiert (Martins
et al., 2007). In einem vergleichbaren Zeitraum von 10 Tagen wie in den NOD/SCID Mäusen wurde
nach 70% Hepatektomie 93% des Lebervolumens in der Ratte wiederhergestellt (Higgins und
Anderson, 1931). Zur Proliferationsinhibierung von Hepatozyten wurde in verschiedenen
Transplantationsmodellen Monocrotalin als Alternative zu Retrorsin eingesetzt. Eine Monocrotalin-
Konzentration von 50mg/kg führte bei immunkompetenten C57BL/6 Mäusen zur
Hepatozyteninhibierung (Witek et al., 2005), für NOD/SCID Mäuse ist diese Konzentration jedoch zu
hoch und eine verminderte Konzentration wurde eingesetzt.
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4.2.4.2 Das Regenerations- und Differenzierungspotenzial von Stammzellen in lebergeschädigten
Mäusen
Zur Prüfung des Stammzellverhaltens bei Leberschädigung wurden NOD/SCID bzw.
NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen CD34
+
Zellen i.v. appliziert und nach einer Zeitspanne von vier Wochen
durch die einmalige Gabe der ermittelten CCl
4
Konzentration ein akuter Leberschaden induziert.
Weder in den hämatopoetischen Organen noch in der Leber rief der induzierte Leberschaden eine
Steigerung des Engraftments nach vier Wochen hervor. Erst die zusätzliche Gabe des humanen
Zytokins HGF verstärkte das Engraftment im Knochenmark und der Leber von NOD/SCID Mäusen fast
um den Faktor zwei. Offen ist die Frage, ob dieser Anteil von 0,2-0,3% humane Zellen in der Leber
durch mehrmalige Gabe von CCl
4
und Entstehen eines chronischen Schadens erhöht werden kann. In
einem Ansatz mit CD34
+
Zellen wurde beschrieben, dass die zusätzliche systemische Applikation von
HGF die Proliferation der humanen Zellen förderte und die Expression von humanem Albumin auf
das Vierfache anstieg (Wang et al., 2003). Der Anstieg des Engraftment humaner Zellen nach
systemischer HGF-Applikation ist mit unseren Ergebnissen übereinstimmend.
In Anlehnung an klinische Krankheitsbilder wurden NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen durch eine
dreiwöchige Cholin-defiziente Futterdiät und 0,075% Ethionin ein chronischer Leberschaden
induziert und dann CD34
+
Stammzellen in die Leber transplantiert. Zwölf Wochen nach
Transplantation waren zu Versuchsende nur wenige humane Zellen sowohl in den hämatopoetischen
Organen (1,7% im Knochenmark; 0,9% in der Milz) als auch in der Leber (0,02%) engraftet, auch
wenn der Anteil an humanen Zellen in den Mäusen mit Leberschaden höher war als in Mäusen ohne
Futterdiät. Die nicht geschädigte Leber von adulten NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäuse unterstützte die
Proliferation und das Ansiedeln von intrahepatisch transplantierten Stammzellen unzureichend. Die
intakte Leber und auch die hämatopoetischen Organe geben vermutlich keine Signale an die
hämatopoetischen Stammzellen ab. Der vor Transplantation induzierte Leberschaden konnte die
Stammzellen nur spärlich zum Homing in der Leber und zur Amplifikation aktivieren und das
Engraftment verbessern. Eine Vermehrung humaner Zellen nach dem Engraftment fällt in vielen
Studien sehr gering aus. Thorgeirsson und Grisham (2006) beschreiben, dass nur 0,0025-0,025% der
transplantierten Zellen engraften und 0,01-0,0001% der Hepatozyten in der Leber ausmachen, was
unsere Werte bestätigt. Eine Vermehrung von engrafteten Zellen wurde gelegentlich nach
Knochenmarkstransplantation in Lebern gefunden, die durch CCl
4
verletzt wurden (Jang et al., 2004).
Jedoch war auch hier die Vermehrung nach dem Engraftment nur sehr gering. Die Möglichkeit, die
erzielten Ergebnisse der Stammzelltransplantation nach Futterdiät in NOD/SCID Mäusen mit Daten in
der Literatur zu vergleichen, ist nicht gegeben.
D i s k u s s i o n 123
Die Kapazität von hämatopoetischen Stammzellen sich an der Regeneration der Leber nach partieller
Hepatektomie zu beteiligen, wurde in adulten NOD/SCID/IL2Rγ
null
Mäusen geprüft. Nach der
partiellen Hepatektomie wurden CD34
+
Zellen aus dem Nabelschnurblut intrahepatisch transplantiert
und acht Wochen später das Engraftment im Knochenmark (5,34%), Milz (3,95%) und Leber
(originaler Lappen: 0,07%; regenerierter Lappen: 0,11%) bestimmt. Das Engraftment war 10-100fach
höher als ohne partielle Hepatektomie. Die partielle Hepatektomie bewirkt, dass transplantierte
humane Zellen sich im Lebergewebe ansiedeln und integrieren können. Eine Vorbehandlung der
Tiere mit Monocrotalin induzierte eine weitere Zunahme der humanen Zellen und erzielte ein
zweifach höheres Engraftment als die partielle Hepatektomie ohne den Proliferationshemmer. Ein
ähnliches Ergebnis wurde auch in dem Modell der intrahepatischen Transplantation von Stammzellen
in neugeborene NOD/SCID Mäuse und 8 Wochen später folgender partieller Hepatektomie
gewonnen. Die Applikation von Monocrotalin vor dem chirurgischen Eingriff bewirkte eine höhere
Anzahl an humanen Zellen in den untersuchten Organen. Dieses Ergebnis stimmt mit der
Beschreibung von Witek et al. (2005) überein, die ein verstärktes Engraftment von transplantierten
Ovalzellen in Monocrotalin-behandelten Ratten fanden. Auch in (DPPIV-)F344 Ratten wurde eine
verbesserte Zellproliferation der transplantierten Hepatozyten in der CCl
4
geschädigten Leber und
vorherige Sensibilisierung der Leber durch Monocrotalin gefunden (Joseph et al., 2006). In Studien
induzierte Monocrotalin Apoptose in Hepatozyten und eine Reduktion der Viabilität von
Kupfferzellen (DeLeve et al., 1999). Es wurde gezeigt, dass durch eine Kupfferzell-Depletion das
Engraftment von transplantierten Zellen in der Leber verbessert werden kann (Joseph et al., 2002).
Die in der Literatur beschriebenen angestiegenen Engraftmentraten und verbesserte
Zellproliferationen nach Monocrotalin-Applikation stehen im Einklang mit unseren Ergebnissen.
Zusammenfassende Bewertung der Leberschadensmodelle
Immundefiziente Mausmodelle mit Leberschaden lassen Untersuchungen humaner Stammzellen zur
Migration zu Orten des Schadens und anschließender Beteiligung der Zellen an der Reparatur und
Überleben zu. Die Transplantationseffizienz der Stammzellen in den drei Leberschadensmodellen
wurde anhand des Anstiegs an humanen Zellen nach Leberschaden im Vergleich zu Zellen in Tieren
ohne Leberschädigung beurteilt. Am besten konnten die Stammzellen in immundefizienten Mäusen
nach Monocrotalin-Behandlung und partieller Hepatektomie engraften und sich vermehren. Auch
die absolute Anzahl an Zellen war in diesem Modell relativ hoch. Ähnlich verhielten sich die humanen
Zellen im Mausmodell mit chemisch-induziertem Leberschaden und HGF-Supplementierung. Das
Modell des chronischen Leberschadens induziert durch eine Cholin-defiziente Futterdiät und Etionin-
Gabe bewirkte eine geringe Zunahme an humanen Zellen auf niedrigem Niveau und scheint für
weitere Stammzelltransplantationen nicht geeignet. Die akuten Leberschäden, chemisch und
chirurgisch hervorgerufen, können für eine erfolgreiche Stammzelltransplantation aussichtsreiche
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D i s k u s s i o n 124
Modelle sein, jedoch nur in Verbindung von Engraftment-verstärkenden Zytokinen wie HGF oder
Hepatozyten-hemmenden und sensibilisierenden Mitteln wie Monocrotalin.
Zusammenfassende Einschätzung des hepatischen Differenzierungs- und Regenerationspotenzials
von CD34
+
Zellen in vivo
Um den transplantierten CD34
+
Stammzellen aus Nabelschnurblut einen Chance zum Ansiedeln,
Proliferieren und Differenzieren zu geben, wurden sie in immundefiziente Mäuse mit geschädigter
Leber transplantiert. Die Leberschadensmodelle dienten als Hilfsmittel zur Steigerung des
Regenerations- und Differenzierungspotenzials von Stammzellen in vivo. Die Frequenz an engrafteten
humanen Zellen in den hämatopoetischen Organen wie Knochenmark und Milz war nach
Stammzelltransplantation moderat bis hoch. In der Leber hingegen war das Engraftment spärlich und
wurde nur geringfügig durch den Leberschaden angehoben.
Das experimentelle Resultat einer Zunahme von humanen Zellen im Knochenmark und in der Milz
nach Schädigung der Leber ist möglicherweise nicht nur auf eine Migration der Zellen aus der Leber
ins Knochenmark zurückzuführen, da nur eine geringe Anzahl an humanen Zellen in der Leber
vorhanden ist. Es kann vermutet werden, dass im Knochenmark und der Milz eine Vermehrung der
humanen Zellen aufgrund eines höheren systemischen Levels an Zytokinen und anderen
proliferationsfördernden Faktoren hervorgerufen wird.
Das geringe Auffinden von humanen Zellen nach der Transplantation in der verletzten Leber kann
von verschiedenen Seiten betrachtet werden. Die Variablen, die die Konversion von
hämatopoetischen Stammzellen in nicht-hämatopoetische Zellen nach in vivo Transplantation
affektieren, sind: Art und Zeit des Schadens, Zelltyp, Zeit der Transplantation und Anzahl der
transplantierten Zellen. Es wurden mehrere Modelle mit Leberschaden untersucht, um mögliche
Limitierungen zu eliminieren. Dabei wurde auch die Zeit des Schadens und die Zeit der
Transplantation variiert.
Ein Leberschaden verletzt Kapillaren in der Leber und die Umgebung um Kapillaren wird hypoxisch.
Im Knochenmark halten sich primitive Stammzellen in hypoxischen Bereichen auf, wo der niedrige
O
2
-Gehalt das Überleben und die Expansion verstärkt (Danet et al., 2003; Ceradini et al., 2004).
Differenzierte Vorläuferzellen halten sich überwiegend in vaskulären Räumen auf. Der
Sauerstoffgehalt in der verletzten Leber kann möglicherweise für die Differenzierung der
Stammzellen zu niedrig gewesen sein.
Desweiteren werden durch einen Leberschaden lokale Chemoattraktants und Wachstumsfaktoren
wie SDF-1 und HGF hochreguliert und freigesetzt (Zhou et al., 2009), die unter anderem die Adhärenz
und die Migration von Zellen beeinflussen. Kupfferzellen in der Leber bilden HGF nach Leberschaden
(Noji et al., 1990) und sekretieren dieses ins Mikromilieu. Unreife CD34
+
/CD38
-
Zellen exprimieren c-
D i s k u s s i o n 125
met, den Rezeptor für HGF, und ermöglichen die Signaltransduktion von HGF (Weimar et al., 1998).
Die lokale Aktivierung von HGF induziert gradientenabhängig eine Stammzellmigration zum
verletzten Gewebe. Der von SDF-1 aufgebaute Gradient unterstützt die Migration und kann das
Ansiedeln von Gewebe-reparierenden Stammzellen im verletzten Leberteil unterstützen (Zhou et al.,
2009). HGF stimuliert nicht nur Hepatozytenüberleben, -migration und –teilung sondern auch die
Aufrechterhaltung bzw. Proliferation von HSC und denkbar auch von den engrafteten Zellen (Weimar
et al., 1998). In unseren Versuchen wurde eine leichte Zunahme an humanen Zellen in der Leber
nach Leberschaden gefunden. Möglicherweise wurden die transplantierten humanen CD34
+
Zellen
von freigesetzten SDF-1 und HGF in die Leber gelockt und zur Proliferation stimuliert.
Die Differenzierung der humanen Zellen in Hepatozyten wurde aufgrund der niedrigen Frequenz
engrafteter Zellen nicht weiter geprüft. Die Engraftmenteffizienz der transplantierten
hämatopoetischen Stammzellen betrug 0,01-0,2% humane Zellen in der Leber und stimmt den in der
Literatur angegebenen Werten von weniger als 1 von 10
4
transplantierten Zellen überein
(Thorgeirsson et al., 2006). Auch wurde von verschiedenen Arbeitsgruppen gezeigt, dass die
Frequenz von Hepatozyten-ähnlichen Zellen entstanden aus hämatopoetischen Stammzellen sehr
niedrig ist (Wang et al., 2003, Kakinuma et al., 2003).
Offen ist bislang welche Mechanismen bei der Bildung von Hepatozyten-ähnlichen Zellen aus HSC
beteiligt sind. Eine Transdifferenzierung der Stammzellen zu Hepatozyten wurde vermutet, jedoch
war eine Reproduktion der Ergebnisse nicht immer möglich (Nygren et al., 2004). Mehrmals wurde
ein Kerntransfer durch Zellfusion zwischen hämatopoetisch-abstammenden Stammzellen und
Hepatozyten beschrieben (Vassilopoulos et al., 2003; Wang et al., 2003).
Generell bestehen Schwierigkeiten, HSC in Leberzellen in vivo zu differenzieren (Rountree et al.,
2007). Die niedrige Frequenz an HSC-abstammenden Hepatozyten stellt für die klinische Anwendung
von HSC als Leberregenerationsquelle ein Hindernis dar. Mesenchymale Stammzellen erscheinen für
die Differenzierung in Hepatozyten geeigneter als hämatopoetische Stammzellen und weisen ein
höheres regeneratives Potenzial in der verletzten Leber auf (Cho et al., 2009).
In der Literatur wurde gezeigt, dass HSC Zytokine wie IL6, TNF-alpha, HGF und andere produzieren
und sekretieren, um die Hepatozytenproliferation zu stimulieren (Fausto et al., 2006). Außerdem
können sie bioaktive Faktoren sekretieren, die das lokale Immunsytem, Wundbildung und Apoptose
unterdrücken und Angiogenese verstärken (Zhou et al., 2009). Ferner können
Knochenmarksstammzellen CCl
4
-induzierte Fibrose der Mausleber durch die Aktivierung von MMP-9
reduzieren (Sakaida et al., 2004). Diese Daten aus der Literatur weisen auf eine indirekte Beteiligung
der in der verletzten Leber angesiedelten hämatopoetischen Stammzellen hin. Möglicherweise ist
der Einsatz von hämatopoetischen Stammzellen zur Unterstützung der Leberregeneration geeigneter
als der Ersatz geschädigter Leberzellen.
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D i s k u s s i o n 126
4.3 Ausblick
In vitro konnte eine endodermale, hepatische Differenzierung von hES, entgegen der CD34
+
Zellen,
durch konditioniertes Medium und Kokultur mit Hepatozyten induziert werden. Jedoch sind weitere
Untersuchungen notwendig, um zu bestimmen, ob die durch Kokultur von hES generierten
Hepatozyten Vorteile gegenüber einer durch Wachstumsfaktoren induzierte Zelldifferenzierung
haben. Außerdem ist eine finale Differenzierung durch die Zugabe von Schlüsselfaktoren denkbar.
Vielleicht ist aber auch die endgültige Differenzierung nur in einer in vivo Umgebung möglich.
In vivo können undifferenzierte hES nach s.c. Transplantation in Mäusen Ursache von Tumorbildung
sein und stellen ein Risiko dar. Präklinische Modelle sind daher unerlässlich zur Prüfung der Qualität,
Sicherheit und Vermeidung von Nebenwirkungen von Stammzellen. Langzeitbeobachtungen nach
Transplantation von hES stehen noch am Anfang der Untersuchungen und sind wichtiger Bestandteil,
um Sicherheit zu gewähren. Wir haben die Qualität von hES in vivo geprüft und in vitro eine
endodermale Differenzierung von hES induziert. Die in vitro Differenzierung führte jedoch zu keiner
vollständigen Differenzierung aller hES, so dass das Risiko der Tumorbildung nach Transplantation in
Leberschadensmodelle bestand. Deshalb wurden die in vitro differenzierten hES, noch mit
undifferenzierten hES verunreinigt, bislang nicht in Leberschadensmodellen getestet.
Erst wenn die differenzierten Stammzellen in präklinischen Modellen keine Nebenwirkungen
hervorrufen, ist ein Einsatz in der regenerativen Medizin möglich. Es gibt die Fiktion, dass Stammzell-
abgeleitete Hepatozyten als Übergangstherapie extrakorporal im Bioreaktor oder durch
intrahepatische Injektion in Patienten mit akutem Leberversagen eingesetzt werden. Eine
Herausforderung ist es, die Tumorigenität der pluripotenten Zellen zu reduzieren aber gleichzeitig ihr
proliferatives Potenzial aufrechtzuerhalten. Desweiteren sollten die differenzierten Stammzellen, die
unter präklinischen Bedingungen eine regenerative Wirkung zeigen, hinsichtlich Nebenwirkungen
charakterisiert werden. Durch Entwicklung neuer Oberflächenmarker oder Markerkombinationen
kann der Zustand der Stammzellen näher beleuchtet werden. Zur Prüfung der funktionellen Integrität
und des regenerativen Potenzials der differenzierten Stammzellen vor Einsatz in der regenerativen
Medizin sind präklinische Modelle mit Organschaden notwendig. Die aus der Klink abgeleiteten
Modelle repräsentieren ein mögliches Einsatzgebiet der differenzierten Stammzellen. Die
präklinischen Modelle können durch die Schaffung neuer knock-out Mäuse und Generierung neuer
Mausstämme weiterentwickelt werden und die regulatorische Bedeutung des ausgeschalteten Genes
für die transplantierten Stammzellen geprüft werden.
Es muss darauf hingewiesen werden, dass der Einsatz von differenzierten pluripotenten Stammzellen
als Zellersatztherapie einen längerfristigen zeitlichen Horizont hat. Derzeit scheint der Einsatz von
pluripotenten Stammzellen für die Entwicklung von Wirkstoffen und Toxizitätstests am
D i s k u s s i o n 127
anwendungsnächsten. An Hepatozyten, aus Stammzellen abgeleitet, könnten Wirkungen von
pharmakologisch aktiven Substanzen auf zellulärer Ebene untersucht werden.
Adulte Stammzellen rufen nach Transplantation in vivo keine unerwünschten Nebenwirkungen wie
pluripotente Stammzellen hervor, besitzen hingegen eine geringere Effizienz, sowohl innerhalb des
Keimblatts als auch Keimblatt übergreifend zu differenzieren. Das beschränktere
Differenzierungspotenzial der adulten hämatopoetischen Stammzellen kann durch nukleare
Reprogrammierung in Stammzellen mit Pluripotenz überwunden werden. Vor einigen Jahren wurden
durch Transduktion von Fibroblasten mit vier Transkriptionsfaktoren induzierte pluripotente Zellen
(iPS) gewonnen (Takahashi et al., 2007), die anschließend zu Haut-, Knochen- und Muskelzellen
reiften. Die induzierten pluripotenten Zellen besitzen eine hES ähnliche Morphologie, haben einen
normalen Karyotyp und exprimieren Oberflächenmarker und Gene, die hES charakterisieren. Mit der
Gewinnung von pluripotenten Stammzellen aus terminal differenzierten B-Zellen durch verschiedene
Faktoren wurde gezeigt, dass eine Reprogrammierung somatischer Zellen möglich ist (Hanna et al.,
2008) und das Genom von differenzierten Zellen auf einen pluripotenten Status zurückgesetzt
werden kann. Um die Gefahr der krebsfördernden Mutationen bei der Transduktion von Genen zu
umgehen, wurden die notwendigen Transkriptionsfaktoren chemisch in die differenzierten Zellen
gebracht und iPS erhalten, ohne das Erbgut zu verändern (Lin et al., 2009). Vor Transplantation von
differenzierten iPS muss wie bei hES die Sicherheit der Präparate hinsichtlich Tumorbildung geprüft
und die potenzielle Gefahr gemildert werden. Strategien zur Eliminierung von undifferenzierten
Zellen beruhen auf der Selektion von differenzierten Zellen von der undifferenzierten Zellpopulation
oder der Eliminierung von pluripotenten Zellen während des Differenzierungsprozesses. Desweiteren
könnte mit spezifischen Agenzien oder Antikörpern in den übrig gebliebenen undifferenzierten hES
Apoptose induziert werden. Die Aufreinigungsprotokolle jedoch benötigen noch Korrekturen und
Ergänzungen. Der Vorteil der iPS ist, dass Körperzellen von Patienten ebenso in iPS reprogrammiert
werden könnten und jeder Patient mit körpereigenen Ersatzzellen versorgt werden könnte. Diese
patientenspezifischen Zellen könnten nach erfolgreicher Differenzierung aufgrund ihrer
Immunkompatibilität risikoarm transplantiert werden.
Die durch Reprogrammierung generierten iPS müssen an validierten, aus der Klinik abgeleiteten
Modellen bezüglich ihrer Qualität, Sicherheit und Vermeidung von Nebenwirkung geprüft werden
und der Bedarf an präklinischen Modellen wird mit Zunahme neuer Zelltypen steigen.
Hypothetisch wäre eine Umwandlung von differenzierten Körperzellen eines Keimblatts in
differenzierte Zelltypen eines anderen Keimblatts ohne die Reprogrammierung in iPS risikoarm. Für
die Umwandlung einer differenzierten, patientenspezifischen Körperzelle in z.B. Hepatozyten müssen
die entsprechenden Faktoren noch gefunden werden. Ohne Gentransfer, wie bei der nuklearen
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Reprogrammierung notwendig, sollten weiterhin Methoden der epigenetischen Modulation durch
unterschiedliche Faktoren zur Differenzierungsinduktion untersucht werden.
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A n h a n g 135
IV. Anhang
Tabelle 1 GO-Terme ermittelt in der Annotationskategorie „Gene Ontology“ mit der Datenbank GOTERM. Im StemSpan-,
konditioniertem Gherardi- und konditioniertem Sautin-Medium wurden CD34+ Zellen kultiviert und mit nicht-kultivierten
Stammzellen verglichen. Die Gene in den kultivierten Stammzellen mussten mindestens 2fach höher als in den nicht-
kultivierten Stammzellen.
C3: CD34+ Zellen (kultiviert im StemSpan-Medium)
Term Gene
no
% p Genes
GO:0008283~cell proliferation 50 8,04% 5,54E-06 KIT, S100A11, ITGAL, WARS, CD40, CENPF,
CREG1, EPGN, CDKN3, ITGAM, PMP22, PRKCD,
CD24, DHCR7, ELA2, NDN, CDKN1B, CD33,
GPNMB, CKS1B, PROK2, ATP6AP1, ADRB2,
QSOX1, PLK1, CLEC11A, LY86, MS4A2,
TNFSF13B, TTK, TPX2, INSIG1, IL6R, NCAPG2,
BRCA1, PRTN3, KIF15, GHRL, GRN, TCIRG1,
CDC25C, DLG7, CCL3L3, CSF1R, KIF2C, S100A6,
LRPAP1, JAG1, BUB1, RACGAP1,
GO:0032943~mononuclear cell
proliferation
6 0.96% 0,695 STAT5A, TNFRSF14, IL18, RIPK2, CD81, IMPDH2,
GO:0007067~mitosis 38 6,11% 1,19E-16 PLK1, SMC2, INCENP, CDCA8, CDC2, PTTG1,
CEP55, DCLRE1A, ZWINT, TTK, TPX2, CENPF,
ASPM, EPGN, NCAPG2, SPC24, SGOL1, NUSAP1,
CDC20, CCNF, NDC80, KIF15, NCAPG, CDCA5,
AURKA, BIRC5, AURKB, CDC25C, NEK6, KIFC1,
DLG7, CCNA2, KIF2C, KIF11, UBE2C, SPAG5,
BUB1, CCNB2,
GO:0006260~DNA replication
GO:0007049~cell cycle 61 9,81% 2,16E-08 FANCD2, KPNA2, INCENP, DHCR24, PTTG1,
ZWINT, DCLRE1A, CENPF, ASPM, EPGN,
UTP14C, SGOL1, CDKN3, CCNF, CDCA5, NCAPG,
HPGD, FLCN, PRC1, NDN, CDKN1B, CCNA2,
GPR132, CKS1B, UBE2C, CCNB2, QSOX1, PLK1,
SMC2, CDCA8, PRKCA, CDC2, CITED2, CEP55,
TTK, TPX2, BRCA1, SPC24, NCAPG2, NUSAP1,
CDC20, NDC80, KIF15, TXNIP, AURKA, BIRC5,
AURKB, CDC25C, NEK6, KIFC1, E2F2, DLG7,
C11ORF82, KIF2C, CCPG1, KIF11, S100A6, GFI1,
SPAG5, BUB1, RACGAP1,
GO:0006915~apoptosis 43 6,91% 5,56E-04 DHCR24, FCER1G, TOP2A, PRKCA, CDC2, SRGN,
HIPK3, ANXA5, IKIP, LY86, TNFSF13B, PSEN1,
CD40, ITGB2, DNASE2, PLEKHF1, APAF1, BRCA1,
SQSTM1, GHRL, CCL2, BIRC5, FADD, MPO,
CD24, NEK6, E2F2, CDKN1B, CTSB, TRIB3, AZU1,
ADAMTSL4, C11ORF82, LITAF, APOE, LGALS1,
CLCF1, TRAF3, PROK2, TNFRSF1B, ACTN1, CD14,
ADRB2,
GO:0030154~cell differentiation 69 11,09% 0,087 ASF1B, DHCR24, ANPEP, SRGN, HIPK3, PSEN1,
HPS6, CD40, SEMA4A, UTP14C, ASCL2, RNF6,
SQSTM1, CD24, SORT1, DHCR7, NDN, CDKN1B,
AZU1, KLF1, ADAMTSL4, LITAF, TRAF3, PROK2,
ECGF1, DFNA5, ADRB2, FCER1G, FADS1, TOP2A,
PRKCA, MAFB, CDC2, ANXA5, IKIP, LY86,
TNFSF13B, ITGB2, DNASE2, PLEKHF1, APAF1,
BRCA1, LYZ, TXNIP, QKI, NTRK1, GHRL, CCL2,
BIRC5, FADD, MPO, RTN4R, NEK6, E2F2, CTSB,
TRIB3, C11ORF82, APOE, LGALS1, CLCF1,
S100A6, GFI1, TNFRSF1B, NPTN, ACTN1, JAG1,
CD14, SPI1, RACGAP1,
Advertisement
A n h a n g 136
GO:0042490~mechanoreceptor
differentiation
3 0,48% 0,079 GFI1, JAG1, NTRK1,
GO:0005856~cytoskeleton 46 7,40% 0,098 PLK1, INCENP, TOP2A, CDC2, KRT1, KIF20A,
LMNA, ARPC1B, TTK, ELMOD2, CAPG, MARCKS,
CENPF, SDCBP, TPX2, CDC42EP4, MYO1F,
BRCA1, CENTD3, NUSAP1, KIF14, CDC20, KIF15,
MID1IP1, AURKA, BIRC5, AURKB, PRC1,
GABARAP, KEL, PDLIM5, KIFC1, ARL8B, NDN,
DLG7, PSTPIP1, TMOD1, KIF2C, KIF11, THAP6,
DSC2, ACTN1, SPAG5, BUB1, CCNB2, RACGAP1,
GO:0005764~lysosome 55 8.84% 6,67E-20 GLA, TMEM55A, SRGN, HLA-DMB, CTSC,
MAN2B1, CTSZ, CD63, CD68, FUCA1, CTSA,
HEXA, CTSS, GBA, SORT1, GABARAP, ARL8B,
TOM1, RNASE2, AZU1, C2ORF18, CTSD, SGSH,
LITAF, LGMN, NPC1, GALC, GLB1, HEXB, ADRB2,
IGF2R, GNS, IFI30, TPP1, NEU1, PSAP, SLC36A1,
DNASE2, PLEKHF1, NAGA, SLC15A3, RAB7B,
P76, MPO, CTSH, NPC2, CTSB, M6PR, CTSL1,
ACP5, GM2A, ASAH1, LAMP2, LIPA, RACGAP1,
GO:0007155~cell adhesion 35 5,63% 0,0318039 LPXN, NINJ2, ITGAL, ARPC1B, PSEN1, SIRPA,
ITGB2, APAF1, CLEC4A, SPP1, STAB1, ITGAM,
CD151, EMILIN2, SLC26A6, CCL2, CD24,
CLDN12, COL6A1, ITGA2B, RAB13, CNTNAP2,
AZU1, PSTPIP1, ENTPD1, ITGB5, CD33, GPNMB,
CD96, DSC2, FBN2, NPTN, ACTN1, TROAP,
CX3CR1,
GO:0006928~cell motility 24 3.86% 0.0076450 CD24, RRAS, FCER1G, ITGAL, PRKCA, CCL3,
ELA2, PPAP2B, NDN, CDKN1B, HMGCR, AZU1,
ARPC1B, PLAUR, FPR1, PSEN1, ITGB2, MARCKS,
SDCBP, HMMR, CENTD3, ACTN1, ITGAM, JAG1,
GO:0016477~cell migration 15 2,41% 0,0483401 RRAS, CD24, FCER1G, PRKCA, ELA2, NDN,
PPAP2B, HMGCR, AZU1, PSEN1, ITGB2, SDCBP,
CENTD3, ITGAM, JAG1,
GO:0050900~leukocyte migration 6 0,96% 0,0034824 FCER1G, PRKCA, ELA2, ITGAM, AZU1, ITGB2,
GO:0030097~hemopoiesis 8 1.29% 0.401860 KIT, ERAF, CLCF1, MAFB, JAG1, KLF1, NTRK1,
SPI1,
GO:0045321~leukocyte activation 13 2.09% 0.034402 CD24, FCER1G, ITGAL, PRAM1, AZU1,
TNFSF13B, CD40, CLCF1, ITGAM, SPI1, PRKCD,
NTRK1, TOLLIP,
GO:0019955~cytokine binding 8 1.29% 0.018600 IL10RB, IFNAR1, IL6R, IFNGR1, ELA2, TNFRSF1B,
IL10RA, CX3CR1,
GO:0006935~chemotaxis 18 2.89% 4,66E+09 CCL2, PTAFR, FCER1G, PRKCA, ELA2, CCL3,
RNASE2, AZU1, PLAUR, FPR1, CCL3L3, ITGB2,
PLAU, ECGF1, PROK2, ITGAM, PLD1, CX3CR1,
GO:0031982~vesicle 30 4.82% 1,20E+11 IGF2R, ANXA2, ATP6V1B2, NEU1, CAPG, TPP1,
SDCBP, GGA2, AGTRAP, FASN, SLC18A2, SYTL2,
SORT1, ATP6V0A1, CALU, CTSB, RAB13, AZU1,
SLC40A1, CTSD, GPNMB, CANX, DNAJC5, YIPF5,
SEC24D, DMXL2, LAMP2, CPA3, SLC1A5, WIPI1,
C5: CD34+ Zellen (kultiviert im kondi.Gherardi-Medium)
Term Gene
no
% p Genes
GO:0008283~cell proliferation 50 8,33% 1,41E-06 S100A11, ITGAL, WARS, CD40, MXD1, RUNX3,
EPGN, GPX1, ITGAM, CDKN3, PMP22, PRKCD,
LAMP3, DBP, ELA2, CDKN1B, CD33, GPNMB,
RB1, CKS1B, PROK2, MAP2K1, ADRB2, PLK1,
LY86, MS4A2, TNFSF12, TNFSF13B, TTK, TPX2,
IL6R, FGFRL1, TGFBI, NCAPG2, BRCA1, PRTN3,
KIF15, DAB2, GHRL, GRN, CDC25C, DLG7,
CSF1R, KIF2C, PCNA, TNF, JAG1, STIL, BUB1,
RACGAP1,
A n h a n g 137
GO:0032943~mononuclear cell
proliferation
5 0.83% 0.15850 STAT5A, CCND3, TNFRSF14, IL18, CD81,
GO:0007067~mitosis 39 6,50% 3,54E-18 CORO1A, PLK1, SMC2, INCENP, CDCA8, CDC2,
CEP55, DCLRE1A, ZWINT, NCAPD3, TTK, TPX2,
ASPM, EPGN, NCAPG2, SPC24, SGOL1, NUSAP1,
CDC20, NDC80, CCNF, KIF15, NCAPG, CDCA5,
AURKA, BIRC5, AURKB, CDC25C, NEK6, KIFC1,
DLG7, CCNA2, KIF2C, KIF11, MAP2K1, TNF,
SPAG5, BUB1, CCNB2,
GO:0006260~DNA replication 14 2.33% 0.03901 S100A11, TOP2A, RRM2, RFC4, FEN1, PPP2CB,
TK1, PCNA, ECGF1, RFC3, DTL, POLQ, GMNN,
MCM10,
GO:0007049~cell cycle 70 11,67% 3,23E-13 FANCD2, CORO1A, KPNA2, INCENP, DHCR24,
DCLRE1A, ZWINT, ASPM, RUNX3, EPGN,
UTP14C, SGOL1, FANCI, CDKN3, CCNF, NCAPG,
CDCA5, HPGD, FLCN, MAPK13, PRC1, CDKN1B,
CCNA2, ATF5, RB1, GPR132, PPP2CB, CKS1B,
MAP2K1, CCNB2, PLK1, SMC2, CDCA8, PRKCA,
PCGF6, CDC2, CEP55, NCAPD3, FICD, TTK, TPX2,
HTATIP2, BRCA1, SPC24, NCAPG2, RASSF2,
NUSAP1, CDC20, GMNN, NDC80, KIF15, AURKA,
BIRC5, AURKB, CDC25C, NEK6, KIFC1, VASH1,
E2F2, DLG7, C11ORF82, KIF2C, CCPG1, KIF11,
PCNA, TNF, SPAG5, BUB1, CCND1, RACGAP1,
GO:0006915~apoptosis 48 8,00% 4,75E-06 GLRX2, DHCR24, FCER1G, TOP2A, PRKCA, CDC2,
HIPK3, ANXA5, LY86, TNFSF12, TNFSF13B,
PSEN1, ITGB2, CD40, DNASE2, PLEKHF1,
RUNX3, APAF1, HTATIP2, BRCA1, GPX1,
SQSTM1, SGPL1, GHRL, CCL2, BIRC5, FADD,
NEK6, DDIT4, CARD9, PRNP, E2F2, TRIB3,
CDKN1B, CTSB, AZU1, CEBPG, ATF5, C11ORF82,
PEA15, PPP2CB, APOE, LGALS1, PROK2,
TNFRSF1B, TNF, CD14, ADRB2,
GO:0030154~cell differentiation 73 12,17% 0,010 CEBPA, ASF1B, DHCR24, ANPEP, HIPK3, PSEN1,
HPS6, CD40, SEMA4A, RUNX3, UTP14C, BAIAP2,
ASCL2, RNF6, GPX1, SQSTM1, SORT1, DDIT4,
PRNP, CDKN1B, AZU1, ATF5, RB1, PEA15,
PPP2CB, MAP2K1, PROK2, ECGF1, DFNA5,
ADRB2, GLRX2, FCER1G, NDRG2, TOP2A,
PRKCA, MAFB, CDC2, ANXA5, LY86, TNFSF12,
TNFSF13B, ITGB2, TCEA1, DNASE2, PLEKHF1,
CLIC4, APAF1, HTATIP2, BRCA1, LYZ, QKI,
SGPL1, ZFP36L1, GHRL, CCL2, BIRC5, FADD,
NEK6, CARD9, E2F2, CTSB, TRIB3, CEBPG,
C11ORF82, APOE, LGALS1, TNFRSF1B, TNF,
JAG1, CCND1, CD14, SPI1, RACGAP1,
GO:0042490~mechanoreceptor
differentiation
GO:0005856~cytoskeleton 47 7,83% 0,052 CEBPA, CORO1A, PLK1, INCENP, TOP2A, CDC2,
KRT1, KIF20A, LMNA, ARPC1B, TTK, ELMOD2,
CAPG, NCKIPSD, TPX2, SDCBP, CLIC4, FILIP1L,
BRCA1, NUSAP1, KIF14, CDC20, KIF15, MID1IP1,
AURKA, BIRC5, AURKB, KLHL2, PRC1, TRIP10,
EPB41L3, KIFC1, DLG7, KIF2C, RB1, LMNB1,
KIF11, PEA15, PPP2CB, RHOF, KY, THAP6, DSC2,
SPAG5, BUB1, CCNB2, RACGAP1,
GO:0005764~lysosome 38 6.33% 1,49E-02 CORO1A, AP3M1, IGF2R, IFI30, HLA-DMB, CTSC,
MAN2B1, PSAP, SLC36A1, CTSZ, DNASE2, CD68,
PLEKHF1, FUCA1, NAGA, SLC15A3, RAB7B,
CTSS, P76, LAMP3, SORT1, CTSH, TRIP10, AGA,
CTSB, RNASE2, AZU1, C2ORF18, CTSD, CTSL1,
M6PR, SGSH, LGMN, ACP5, NPC1, GM2A,
ADRB2, RACGAP1,
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A n h a n g 138
GO:0007155~cell adhesion 36 6,00% 0,0103088 LPXN, AMICA1, PLXNC1, ITGAL, ITGB7,
SIGLEC10, ARPC1B, PSEN1, SIRPA, ITGB2,
APAF1, FGFRL1, CLEC4A, TGFBI, STAB1, SPP1,
ITGAM, EMILIN2, CCL2, NINJ1, FCGBP, CLDN12,
COL6A1, AZU1, ENG, ENTPD1, ITGB5, CD33,
GPNMB, PPP2CB, CD96, DSC2, FBN2, TNF,
TROAP, CX3CR1,
GO:0006928~cell motility 21 3.50% 0.028726 CORO1A, FCER1G, ITGAL, PRKCA, ELA2,
CDKN1B, AZU1, ARPC1B, TNFSF12, PLAUR,
FPR1, PSEN1, ITGB2, SDCBP, CLIC4, ENPP2,
HMMR, MAP2K1, ITGAM, TNF, JAG1,
GO:0016477~cell migration
GO:0050900~leukocyte migration 7 1,17% 3,93E-04 FCER1G, PRKCA, ELA2, TNF, ITGAM, AZU1,
ITGB2,
GO:0030097~hemopoiesis 8 1.33% 0.3547385 RB1, CEBPA, TCEA1, MAFB, TNF, JAG1, CEBPG,
SPI1,
GO:0045321~leukocyte activation 12 2.00% 0.0515515 FCER1G, ITGAL, PAG1, ITGAM, AZU1,
TNFSF13B, CEBPG, PRKCD, SPI1, SWAP70,
CD40, TOLLIP,
GO:0019955~cytokine binding 9 1.50% 0.0041221 IL10RB, IFNAR1, IL6R, IFNGR1, ELA2, TNFRSF1B,
IL10RA, CX3CR1, CCR7,
GO:0006935~chemotaxis 19 3.17% 5,26E+07 CCL2, PTAFR, FCER1G, PRKCA, ELA2, RNASE2,
AZU1, PLAUR, FPR1, CCR7, ITGB2, ENPP2, PLAU,
MAP2K1, ECGF1, PROK2, ITGAM, PLD1,
CX3CR1,
GO:0031982~vesicle 28 4.67% 4,34E+11 GARS, CORO1A, AP3M1, IGF2R, ANXA2,
ATP6V1B2, AP3S2, CAPG, SDCBP, SLC3A2,
CLIC4, AGTRAP, SLC1A4, NKD2, DAB2, SORT1,
CTSB, EHD1, AZU1, GRB2, CTSD, GPNMB, CANX,
C14ORF108, COPB1, SEC24D, SLC1A5, WIPI1,
C7: CD34+ Zellen (kultiviert im kondi.Sautin-Medium)
Term Gene
no
% p Genes
GO:0008283~cell proliferation
GO:0032943~mononuclear cell
proliferation
GO:0007067~mitosis 43 7,36% 8,55E-22 SMC2, PLK1, INCENP, CDCA8, CDC2, PTTG1,
CEP55, DCLRE1A, ZWINT, NCAPD3, TTK, CENPF,
TPX2, ASPM, EPGN, NCAPG2, SPC24, SGOL1,
NUSAP1, CDC20, NDC80, CCNF, KIF15, NCAPG,
CDCA5, AURKA, BIRC5, AURKB, CDC25C, NEK6,
ESPL1, KIFC1, WEE1, DLG7, RCC1, CCNA2,
KIF2C, KIF11, C13ORF34, UBE2C, SPAG5, BUB1,
CCNB2,
GO:0006260~DNA replication 19 3.25% 5,24E+10 S100A11, CDC45L, TOP2A, BLM, RRM2, CDT1,
ORC1L, FEN1, TK1, HMGB2, PCNA, RFC3,
ECGF1, TYMS, DTL, POLQ, GMNN, MCM10,
POLE2,
GO:0007049~cell cycle 75 12,84% 7,13E-16 FANCD2, CKS2, KPNA2, DHCR24, INCENP,
SENP5, PTTG1, DCLRE1A, ZWINT, CENPF, ASPM,
EPGN, UTP14C, SGOL1, FANCI, CDKN3, CCNF,
NCAPG, CDCA5, FLCN, PRC1, ESPL1, CDT1,
RCC1, CCNA2, GPR132, CKS1B, H2AFX,
C13ORF34, UBE2C, CCNB2, QSOX1, PLK1,
SMC2, CDCA8, PRKCA, CDC2, CITED2, CEP55,
NCAPD3, TTK, TPX2, BRCA1, SPC24, NCAPG2,
NUSAP1, AXL, CDC20, GMNN, NDC80, KIF15,
TXNIP, AURKA, BIRC5, AURKB, SASS6, CDC25C,
CDC45L, NEK6, KIFC1, E2F2, WEE1, DLG7,
C11ORF82, KIF2C, KIF11, PCNA, PPBP, S100A6,
A n h a n g 139
GFI1, MTSS1, SPAG5, BUB1, CCND1, RACGAP1,
GO:0006915~apoptosis 36 6,16% 0,0113334 FCER1G, DHCR24, TOP2A, PRKCA, CDC2,
TNFAIP8, SRGN, HIPK3, ANXA5, LY86, PSEN1,
ITGB2, PLEKHF1, APAF1, BRCA1, SQSTM1,
GHRL, BIRC5, CD38, FADD, MPO, CD24, NEK6,
ESPL1, E2F2, AZU1, TIMP3, C11ORF82, APOE,
LGALS1, CLCF1, PROK2, TNFRSF1B, ACTN1,
CD14, ADRB2,
GO:0030154~cell differentiation
GO:0042490~mechanoreceptor
differentiation
3 0,51% 0,0721208 GFI1, JAG1, NTRK1,
GO:0005856~cytoskeleton 54 9,25% 0,0012584 SPTA1, INCENP, STOM, LMNA, ARPC1B, CAPG,
CENPF, CDC42EP4, FILIP1L, MYO1F, CENTD3,
KIF14, MID1IP1, PRC1, ESPL1, EPB41L3,
PDLIM5, CCNB2, EPB42, PLK1, TOP2A, KRT1,
CDC2, KIF20A, TTK, ELMOD2, NCKIPSD, SDCBP,
TPX2, BRCA1, NUSAP1, CDC20, KIF15, AKAP4,
AURKA, BIRC5, AURKB, SASS6, KEL, KIFC1,
TNNT2, DLG7, PSTPIP1, TMOD1, KIF2C, KIF11,
TUBA4A, THAP6, DSC2, MTSS1, ACTN1, SPAG5,
BUB1, RACGAP1,
GO:0005764~lysosome 31 5.31% 3,57E+02 IGF2R, GLA, TMEM55A, GNS, SRGN, IFI30, CTSC,
SLC36A1, CTSZ, CD63, CD68, PLEKHF1, FUCA1,
CTSA, NAGA, SLC15A3, RAB7B, P76, MPO,
CTSH, NPC2, TOM1, RNASE2, AZU1, CTSD,
M6PR, CTSL1, SGSH, GM2A, RACGAP1, ADRB2,
GO:0007155~cell adhesion 35 5,99% 0,015506 LPXN, VCAN, GP9, CEACAM1, ARPC1B, PSEN1,
SIRPA, ITGB2, APAF1, CLEC4A, STAB1, ITGAM,
CD151, EMILIN2, THBS1, SLC26A6, CD24,
CLDN12, MFGE8, ITGA2B, RAB13, CNTNAP2,
AZU1, PSTPIP1, ENTPD1, ITGB5, CD33, GPNMB,
CD96, DSC2, FBN2, ACTN1, MTSS1, TROAP,
CX3CR1,
GO:0006928~cell motility 24 4.11% 0.00394308 CD24, RRAS, FCER1G, PRKCA, ELA2, CAV2, ANG,
CEACAM1, HMGCR, AZU1, ARPC1B, PSEN1,
PLAUR, FPR1, ITGB2, SDCBP, HMMR, CENTD3,
ACTN1, MTSS1, ITGAM, AKAP4, JAG1, THBS1,
GO:0016477~cell migration 16 2,74% 0,0161649 RRAS, CD24, FCER1G, PRKCA, ELA2, CAV2, ANG,
CEACAM1, HMGCR, AZU1, PSEN1, ITGB2,
SDCBP, CENTD3, ITGAM, JAG1,
GO:0050900~leukocyte migration 6 1,03% 0,002746 FCER1G, PRKCA, ELA2, ITGAM, AZU1, ITGB2,
GO:0030097~hemopoiesis 9 1.54% 0.21547572 EPB42, EBP, BLM, CLCF1, MAFB, CD1D, JAG1,
KLF1, NTRK1,
GO:0045321~leukocyte activation 9 1.54% 0.2899418 CD24, FCER1G, BLM, CLCF1, CD1D, ITGAM,
AZU1, NTRK1, PRKCD,
GO:0019955~cytokine binding 10 1.71% 9,76E+11 IL10RB, IFNAR1, IL17RA, IL6R, IFNGR1, ELA2,
TNFRSF1B, IL10RA, CX3CR1, PLP2,
GO:0006935~chemotaxis 17 2.91% 9,67E+09 PTAFR, FCER1G, PRKCA, ELA2, RNASE2, AZU1,
PLP2, PLAUR, FPR1, ITGB2, PLAU, PPBP, ECGF1,
PROK2, ITGAM, PLD1, CX3CR1,
GO:0031982~vesicle 22 3.77% 0.0185147 IGF2R, STOM, CAV2, ATP6V1B2, ANXA2, RAB13,
AZU1, SLC40A1, CTSD, CAPG, GPNMB, SDCBP,
CANX, ABCC4, AGTRAP, DNAJC5, MTSS1, FASN,
SEC24D, DMXL2, SLC1A5, WIPI1,
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A n h a n g 140
Tabelle 2 Gene 2fach hochreguliert in CD34 Zellen kultiviert im konditionierten Gheradi-Medium verglichen mit
undifferenzierten, nicht-kultivierten CD34+ Zellen. Eine Gesamtprobe von 617 Genen wurde mit DAVID analysiert und die
SP_PIR_Keyword Analyse dargestellt. Die Anzahl der Gene, ihre Prozentzahl in diesem Probenset und die P-Werte für jede
Kategorie, die signifikant (p<0.05) überexprimiert sind, sind aufgelistet. Je kleiner der P-Wert desto häufiger und stärker
treten die eingruppierten Gene auf.
Term Count
% PValue Term Count
% PValue
lysosome 30
5.00%
2.30E-19
signal-anchor 20
3.33%
0.015
mitosis 28
4.67%
6.32E-16
cytoplasm 92
15.33%
0.016
cell cycle 47
7.83%
7.43E-15
immune response 12
2.00%
0.017
cell division 31
5.17%
2.10E-13
apoptosis 17
2.83%
0.018
centromere 13
2.17%
1.16E-10
Thiol protease inhibitor 4
0.67%
0.02
Direct protein
sequencing 127
21.17%
4.25E-10
protease 23
3.83%
0.022
phosphoprotein 199
33.17%
5.52E-09
Endonuclease 6
1.00%
0.023
transmembrane protein 45
7.50%
1.69E-07
phospholipid binding 4
0.67%
0.023
Zymogen 19
3.17%
1.71E-05
amino-acid transport 4
0.67%
0.023
glycoprotein 153
25.50%
1.99E-05
amino-acid biosynthesis 4
0.67%
0.023
signal 123
20.50%
2.42E-05
calcium binding 8
1.33%
0.023
cell cycle control 7
1.17%
6.83E-04
lipoprotein 28
4.67%
0.026
disease mutation 62
10.33%
0.00124
ligase 15
2.50%
0.028
cytokine receptor 5
0.83%
0.00131
transmembrane 151
25.17%
0.032
dna condensation 4
0.67%
0.00262
microtubule 11
1.83%
0.034
inflammatory response 8
1.33%
0.00296
amyloid 4
0.67%
0.036
inflammation 5
0.83%
0.003
aminoacyl-tRNA
synthetase 5
0.83%
0.04
hydrolase 61
10.17%
0.00305
nuclease 7
1.17%
0.042
heterodimer 10
1.67%
0.00318
Integrin 5
0.83%
0.043
alzheimer disease 4
0.67%
0.0046
thiol protease 8
1.33%
0.044
surface antigen 6
1.00%
0.00614
Plasmid 3
0.50%
0.047
membrane 183
30.50%
0.00618
atp-binding 45
7.50%
0.048
cysteine proteinase 4
0.67%
0.00728
ATP synthesis 4
0.67%
0.048
phosphotransferase 13
2.17%
0.01267
endoplasmic reticulum 25
4.17%
0.048
ATP 15
2.50%
0.01471
endosome 8
1.33%
0.05
chemotaxis 7
1.17%
0.01496
A n h a n g 141
Tabelle 3 Gene 2fach hochreguliert in CD34 Zellen kultiviert im konditionierten Sautin-Medium verglichen mit
undifferenzierten, nicht-kultivierten Stammzellen. Eine Gesamtprobe von 604 Genen wurde mit DAVID analysiert und die
SP_PIR_Keyword Analyse dargestellt. Die Anzahl der Gene, ihre Prozentzahl in diesem Probenset und die P-Werte für jede
Kategorie, die significant (p<0.05) überexprimiert sind aufgelistet
Term Count % PValue Term Count % PValue
mitosis 34
5.82%
1.37E-22
coenzyme A 5
0.86%
0.0038
cell division 39
6.68%
8.86E-21
phosphotransferase 14
2.40%
0.004
cell cycle 54
9.25%
2.28E-20
EF hand 7
1.20%
0.0047
Direct protein
sequencing 143
24.49%
6.46E-17
membrane protein 8
1.37%
0.006
centromere 15
2.57%
1.72E-13
hydrolase 58
9.93%
0.0061
lysosome 23
3.94%
1.36E-12
atp-binding 49
8.39%
0.0062
sterol biosynthesis 10
1.71%
1.64E-08
microtubule 12
2.05%
0.0117
cholesterol
biosynthesis 9
1.54%
2.45E-08
chromosome partition 4
0.68%
0.0118
transmembrane
protein 45
7.71%
7.33E-08
erythrocyte 4
0.68%
0.0118
disease mutation 75
12.84%
1.63E-07
duplication 14
2.40%
0.0123
lipid synthesis 15
2.57%
1.66E-07
endoplasmic reticulum 27
4.62%
0.0126
steroid biosynthesis 10
1.71%
5.70E-07
autophosphorylation 6
1.03%
0.015
phosphoprotein 185
31.68%
6.75E-07
membrane 174
29.79%
0.0177
signal 124
21.23%
3.35E-06
Thiol protease inhibitor 4
0.68%
0.0185
glycoprotein 150
25.68%
1.39E-05
tyrosine-specific protein
kinase 6
1.03%
0.0189
cell cycle control 8
1.37%
7.40E-05
Endonuclease 6
1.03%
0.0203
calcium binding 12
2.05%
9.35E-05
phospholipid binding 4
0.68%
0.0212
acetylation 34
5.82%
2.70E-04
inflammation 4
0.68%
0.0212
heterodimer 11
1.88%
6.85E-04
nucleotide-binding 57
9.76%
0.0213
Chromosomal
protein 12
2.05%
7.65E-04
fatty acid biosynthesis 5
0.86%
0.0248
surface antigen 7
1.20%
8.99E-04
blood 3
0.51%
0.0258
acetylated amino
end 10
1.71%
0.001006
transforming protein 5
0.86%
0.0269
cytokine receptor 5
0.86%
0.001175
calcium 31
5.31%
0.0326
lectin 13
2.23%
0.001367
blood coagulation 5
0.86%
0.0366
Zymogen 15
2.57%
0.00137
nuclease 7
1.20%
0.0368
nadp 12
2.05%
0.001751
Cataract 5
0.86%
0.0393
ATP 17
2.91%
0.002014
Palmitate 11
1.88%
0.0407
dna replication 9
1.54%
0.002206
alzheimer disease 3
0.51%
0.0447
dna condensation 4
0.68%
0.002411
chemotaxis 6
1.03%
0.0452
cytoplasm 95
16.27%
0.00254
transmembrane 145
24.83%
0.0494
lipoprotein 31
5.31%
0.003317
protease 21
3.60%
0.0499
oxidoreductase 29
4.97%
0.003791
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A b k ü r z u n g s v e r z e i c h n i s 142
V. Abkürzungsverzeichnis
AFP Alpha-Fetoprotein
ALT Alanin-Aminotransferase
AST Aspartat-Aminotransferase
AVG Average
BMP Bone morphogenetic protein
CCl
4
Tetrachlorkohlenstoff
CD Cluster of Differentiation
CDE Cholin-defiziente Diät und Ethionin-Gabe
CK Cytokeratin
CM konditioniertes Stammzellmedium
Cyp Cytochrom P450
DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
EpCAM Epithelial Cell Adhesion Molecule
EPO Erythropoetin
ES embryonale Stammzellen
FACS Fluorescence Activated Cell Sorting
FGF Fibroblast Growth Factor
FITC Fluorescein
FKS Fetales Kälberserum
FL Fluoreszenz
g Erdbeschleunigung
G-CSF Granulozyten-Kolonie-Stimulationsfaktor
Gy Gray
h Stunde
hES humane embryonale Stammzellen
HGF Hepatocyte Growth Factor
HLA Human Leukocyte Antigen
HNF Hepatocyte Nuclear Factor
HSC hämatopoetische Stammzellen
IgG Immunglobulin G
IL Interleukin
l Liter
LIF Leukemia Inhibitory Factor
MACS Magnetic Cell Separation
MEF murine embryonale Fibroblasten
mES murine embryonale Stammzellen
µ mikro
min Minute
MMP Matrix-Metalloproteinasen
MNC mononukleäre Zellen
A b k ü r z u n g s v e r z e i c h n i s 143
n nano
NEAA Non Essential Amino Acids
NK-Zellen natürliche Killerzellen
NOD/SCID Non-Obese Diabetic / Severe Combined Immunodeficiency
OSM Oncostatin-M
PBS Phosphate Buffered Saline
PCR Polymerase-Kettenreaktion
PE Phycoerythrin
PHx partielle Hepatektomie
RT Raumtemperatur
SCF Stem Cell Factor
SSC Side Scatter
SSEA Stage-Specific Embryonic Antigen
TAA Thioacetamid
TRA Tumor Related Antigen
TSA Trichostatin A
Tx Transplantation
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P u b l i k a t i o n s l i s t e 144
VI. Publikationsliste
Fachartikel
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2008) Cytokine-pretreatment of CD34+ cord blood stem
cells in vitro reduces long-term cell engraftment in NOD/SCID mice. European Journal of Cell Biology
87(2):69-80
Heringer-Walther S, Eckert K, Schumacher S-M, Uharek L, Wulf-Goldenberg A, Gembardt F, Fichtner
I, Schultheiss HP, Rodgers K, Walther T. (2009) Angiotensin-(1-7) stimulates hematopoietic progenitor
cells in vitro and in vivo. Haematologica 94(6):857-860
Gerlach JC, Lübberstedt M, Edsbagge J, Ring A, Hout M, Baun M, Rossberg I, Knöspel F, Peters G,
Eckert E, Wulf-Goldenberg A, Björquist P, Stachelscheid H, Urbaniak T, Schatten G, Miki T, Schmelzer
E, Zeilinger K. (2010) Interwoven four-compartment capillary membrane technology for 3D perfusion
with decentral mass exchange to scale-up embryonic stem cell culture. Cells Tissues Organs
192(1):39-49
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2010) Intrahepatically transplanted human cord blood cells
reduce SW480 tumor growth in the presence of bispecific EpCAM/CD3 antibody. Cytotherapy (Zur
Revision)
Stachelscheid H, Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Haider W, Jensen J, Edsbagge J, Rivero M, Strehl R,
Björquist P, Jozefczuk J, Adjaye J, Ring A, Urbaniak T, Bussmann P, Gerlach JC, Zeilinger K. (2010) In
vitro teratoma formation of human embryonic stem cells in 3D multi compartment perfusion culture
bioreactors. Nature Methods (Zur Publikation eingereicht).
Stecklum M, Wulf-Goldenberg A, Erdmann B, Siegert A, Keil M, Eckert K, Adjaye J, Gerlach J, Fichtner
I. (2010) Co-culture of human embryonic SA002 stem cells and CD34 cells with AML12-hepatic cells
and conditioned media induce diverse cell differentiation. (In Vorbereitung)
Wulf-Goldenberg A, Keil M, Eckert K, Haider W, Gerlach JC, Fichtner I. Intrahepatic transplantation
of CD34+ cord blood stem cells into newborn and adult NOD/SCID mice induce differential organ
engraftment and cell differentiation. (In Vorbereitung)
Posterpräsentationen
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2008) In vitro culture models for induction of hepatic
differentiation of adult CD34+ cells. International Congress on Stem Cells and Tissue formation,
Dresden.
Stachelscheid H, Bussmann P, Ring A, Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I, Zeilinger K, Gerlach JC.
(2008) Spontaneous differentiation of human embryonic stem cells in 3D perfusion bioreactors.
International Congress on Stem Cells and Tissue formation, Dresden.
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2007) Coculture systems of CD34+ cells with hepatocytes as
models for induction of hepatic differentiation. Gesellschaft für Stammzellforschung, Würzburg.
P u b l i k a t i o n s l i s t e 145
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2006) Engraftment and differentiation of human
haematopoietic stem cells in NOD/SCID mice. Frauenhofer Life Science Symposium “Cell therapy and
immunology”, Leipzig.
Wulf-Goldenberg A, Eckert K, Fichtner I. (2006) Differential organ engraftment of CD34+ cord blood
stem cells in NOD/SCID mice. Embryonic and Somatic Stem Cells-Regenerative Systems for Cell and
Tissue Repair, Dresden.
Wulf A, Eckert K, Fichtner I. (2006) Intrahepatic transplantation of cord blood cells in NOD/SCID mice
induces B-or T-cell differentiation. Strategies in Tissue Engineering, Würzburg.
Wulf A, Eckert K, Fichtner I. (2005) Cytokine-induced expression of homing related adhesion
molecules on CD34+ cord blood stem cells; hepatic differentiation and cell engraftment in NOD/SCID
mice. World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig.
Wulf A, Eckert K, Fichtner I. (2005) Cytokine-induced expression of homing related adhesion
molecules on CD34+ cord blood stem cells and cell engraftment in NOD/SCID mice. European
Hematology Association, Stockholm.
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D a n k s a g u n g 146
VII. Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen bedanken, die mich bei meiner Arbeit unterstützt haben.
Vielen Dank an Frau Dr. Iduna Fichtner für die Überlassung des interessanten Themas und die
Möglichkeit meine Arbeit in ihrer Arbeitsgruppe anfertigen zu dürfen, sowie hilfreicher Ideen und
Diskussionen.
Mein herzlichster Dank gilt meinem Projektbetreuer Herrn Dr. Klaus Eckert, der mir im Rahmen
dieser Arbeit ermöglicht hat, tiefer in das spannende Forschungsgebiet einzudringen und stets mit
Ideen und zu jeder Zeit vorhandenen Diskussionsbereitschaft zur Seite stand.
Herrn Prof. Dr. Roland Lauster möchte ich für die freundliche Übernahme der Betreuung und
Begutachtung meiner Dissertation danken. Herrn Prof. Dr. Jens Kurreck danke ich für die Erstellung
des Gutachtens und die damit verbundenen Mühen.
Der Firma epo GmbH danke ich für die finanzielle Unterstützung während meiner Promotionszeit und
Herrn Dr. Christian Nowak für weise Ratschläge.
Ganz herzlich möchte ich mich für die stets sehr angenehme Arbeitsatmosphäre in der Arbeitsgruppe
bedanken. Vielen Dank für die Unterstützung in beruflichen und privaten Lebenslagen.
Mein besonderer Dank geht an Monika Becker für ihr großes Engagement und technische
Unterstützung bei der Durchführung der Tierversuche.
Maria Stecklum, als ehemalige und nun erfolgreich abgeschlossene Diplomandin, gilt mein Dank für
ihre unschätzbaren Beiträge zum Gelingen der Arbeit und ihre Hilfsbereitschaft.
Diana Behrens danke ich für ein entspanntes Miteinander während und nach der Arbeit und
zahlreiche aufmunternde Gespräche.
Zudem danke ich Britta Büttner, Margit Lemm, Reiner Zeisig, Jana Rolff, Antje Siegert, Marlen Keil,
Tunς Döser und allen übrigen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe für aufschlussreiche Gespräche,
tröstende Worte, viele helfende Hände sowie technische Ratschläge und einige nette Partys.
Harald Stachelscheid aus der Experimentellen Chirurgie an der Charité Berlin danke ich für die tolle
Zusammenarbeit beim Etablieren der hES Kultur in unseren Arbeitsgruppen und Unterstützung bei
den Video Imaging Aufnahmen.
Dr. James Adjaye und Alessandro Prigione vom Max Plank Institut für Molekulargenetik in Berlin
danke ich für die Möglichkeit der BeadArray Analysen.
Den Mitarbeitern der Geburtskliniken danke ich für die Abnahme der Nabelschnurblutproben.
Meinen Eltern und Schwestern danke ich für die bedingungslose Unterstützung, ihr Vertrauen und
Hilfsbereitschaft in allen Lebenslagen.
Abschließend und von ganzen Herzen danke ich meinem Mann, dass er immer für mich da war, für
seinen steten Optimismus und seine Aufmunterungen.