Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch die Entwicklung pankreasattenuierter Coxsackieviren [original]

Verbesserung des CVB3-Maus-

Myokarditismodells durch die Entwicklung

pankreasattenuierter Coxsackieviren

vorgelegt von

Diplom-Biochemiker

Markian Pryshliak

ORCID: 0000-0003-0001-8270

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- D

r. rer. nat –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster

Gutachter 1: Prof. Dr. Jens Kurreck

Gutachter 2: Prof. Dr. Claus-Thomas Bock

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 15. März 2019

Berlin 2019

Zusammenfassung

Das Coxsackievirus B3 (CVB3)-Maus-Myokarditismodell wird standardmäßig zur Untersuchung der

Virus-induzierten Myokarditis verwendet. Entgegen der CVB3-Infektion im Menschen stellt im

murinen Organismus nicht das Herz, sondern das Pankreas das für die CVB3-Infektion suszeptibelste

Organ dar. Verschiedene klinische Symptome, wie der starke Gewichtsverlust, das schmerzhafte

Hochziehen des Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle, können als direkte Folge der

virusbedingten akuten Pankreatitis angesehen werden. Diese fulminante Ausprägung der Pankreatitis

stellt für die Tiere eine extreme Belastung dar, welche sich von der humanen Präsenz unterscheidet.

Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch

die Entwicklung einer genetisch modifizierten CVB3-Variante, welche durch die Insertion von

microRNA-Zielsequenzen (microRNA-Target Sites, miRNA-TS) eine Pankreasattenuation aufweist.

Die Expressionsanalyse von miRNAs im Pankreas und Herz mittels eines Affymetrix miRNA –Chip-

Assays sowie quantitativer RT-PCR zeigte, dass die miRNA-375 die stärkste Expression im Pankreas

aufwies und nur geringfügig im Herzen exprimiert wird. Darauf basierend wurden drei Kopien der

miRNA-375TS in das 3’ -bzw. 5’-Ende des Genoms der CVB3-Variante rCVB3.1, jeweils in positiver

bzw. negativer Orientierung, inseriert. Die Analyse der daraus resultierenden vier rekombinanten

CVB3-Varianten in vitro zeigte, dass die virale Replikation über die Insertion der miRNA-TS in

positiver Orientierung in die 3’-UTR des Genoms (Virusvariante: CVB3-375TS(3+)) am effektivsten

durch die miRNA-375 unterdrückt wurde. In der pankreatischen Zelllinie EndoC-βH1 wurde,

verglichen mit dem keine TS-Sequenzen enthaltenden Kontrollvirus, die Replikation von CVB3-

375TS(3+) durch die endogene miRNA-375 Expression ca. um vier log10-Stufen verringert. In

isolierten primären embryonalen Kardiomyozyten wurde CVB3-375TS(3+) hingegen nicht

unterdrückt.

Für die in vivo Versuche wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’-Ende des Genoms der

kardiotropen CVB3-Variante H3N inseriert. Es zeigte sich, dass die intraperitoneale (i.p.) Injektion des

generierten Virus (H3N-375TS) in NMRI-Mäusen weder eine Pankreatitis noch eine Myokarditis

verursachte. Hingegen führte die intravenöse (i.v.) Applikation von H3N-375TS in NMRI- als auch

Balb/C-Mäusen zu einer Infektion des Herzens und induzierte je nach Versuchsaufbau eine akute oder

chronische Myokarditis ohne Infektion des Pankreas. Während die akute Myokarditis sich durch

moderate kardiale H3N-375TS-Titer, die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie die

Inflammation und die Zerstörung des Herzgewebes auszeichnete, war die chronische Myokarditis durch

sehr geringe kardiale H3N-375TS-RNA Level ohne detektierbare Virusreplikation sowie durch die

Ausbildung fibrotischer Gewebeareale gekennzeichnet.

Ob und welche Rolle das Pankreas für die Ausbildung der Myokarditis in Mäusen spielt wird in der

Literatur kontrovers diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen nunmehr eindeutig, dass

bei der i.p. Applikation von CVB3 das Pankreas essentiell für die kardiale Infektion ist, wohingegen

bei der i.v. Applikation eine Myokarditis ohne Infektion des Pankreas durch die mittels miRNA-375TS

genetisch modifizierte CVB3-Variante verursacht werden kann. Das H3N-375TS induzierte Modell

erlaubt so die Untersuchung der CVB3induzierten Myokarditis in Mäusen unabhängig von einer

Pankreasinfektion.

Zudem verringerte das pankreasattenuierte H3N-375TS bei NMRI-Mäusen, vor allem aber bei Balb/C-

Mäusen, die auf die Pankreatitis zurückführbaren Schmerzen bzw. das Leiden während der CVB3-

Infektion. Damit verstärkt es nicht nur die wissenschaftliche Relevanz der Myokarditisanalyse im

Mausmodell, sondern es entspricht hinsichtlich der tierschutzrechtlichen Forderungen der 3R-

Richtlinien den beiden Aspekten Reduction und Refinement.

III

Abstract

The coxsackievirus B3 (CVB3) mouse myocarditis model is the standard model to investigate virus-

induced myocarditis. Compared to human, in mice the pancreas but not the heart represents the most

susceptible organ for CVB3 infection. Multiple clinical symptoms, as drastic weight loss, painfull

contraction of the stomac as well as sudden death are direct results of the viral induced pancreatitis.

Thus, the pathogenesis of CVB3 infection differs between mice and men, as in the murine CVB3

induced myocraditis model the pancreas is always co-infected and damaged by CVB3.

This study aimed to improve the mouse myocarditis model by development of a genetically engineered

CVB3 variant, which became pancreas-attenuated by insertion of microRNA-target sites (miRNA-TS)

sequences.

Analysis of miRNA expression in the pancreas and the heart by Affymetrix-miRNA-chip analysis as

well as quantitative RT-PCR revealed that miRNA-375 is the highest expressed miRNA in the pancreas

with minimal expression in the heart. Based on this finding, four miRNA-375 susceptible CVB3 variants

were generated by insertion of three copies of miRNA-375TS in positive or negative orientation into the

3’- or 5’-end of the CVB3 genome of the CVB3 variant rCVB3.1. In vitro it was shown that the

generated CVB3 containing the inserted miRNA-375TS in positive orientation in the 3’UTR of the

CVB3 genome (virus variant: CVB3-375TS(3+)) was strongest suppressed by miRNA-375. In

pancreatic EndoC-βH1 cells replication of CVB3-375TS(3+) was suppressed up to four log10 steps by

endogen miRNA-375 expression compared to a non-targeted control virus. Furthermore, there was no

repression of the virus in isolated primary embryonic mouse cardiomyocytes.

For in vivo experiments, three copies of the miRNA-375TS were inserted into the 3’UTR of the

cardiotropic CVB3 variants H3. Here, the intraperitoneal (i.p.) administration of the engineered virus

H3N-375TS did not result in pancreatic as well as cardiac infection in NMRI mice. However,

intravenous (i.v.) administration of H3N-375TS into NMRI and Balb/C mice resulted in the infection of

the heart and induced acute and chronic myocarditis, respectively, but did not lead to pancreatic

infection. The acute myocarditis was characterized by moderate cardiac titers of replicating H3N-375TS,

cardiac tissue destruction, inflammation and expression of proinflammatory cytokines, whereas chronic

myocarditis developing animals showed rarely H3N-375TS-RNA with no detectable virus replication

and fibrotic tissue areas.

In literature, the role of the pancreas in virus-induced myocarditis is controversly discussed. The present

study clearly shows that the pancreas is essential for cardial infection using i.p. administred CVB3. I.v.

application of genetically modified pancreas-attenuated CVB3 showed, that during this route of

infection CVB3 induced myocarditis can be induced without infection of the pancreas. This allows the

solely investigation of CVB3 induced murine myocarditis independently from a previous pancreas

infection.

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