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Verbesserung des CVB3-Maus-

Myokarditismodells durch die Entwicklung

pankreasattenuierter Coxsackieviren

vorgelegt von

Diplom-Biochemiker

Markian Pryshliak

ORCID: 0000-0003-0001-8270

von der Fakultät III – Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Naturwissenschaften

- D

r. rer. nat –

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. Roland Lauster

Gutachter 1: Prof. Dr. Jens Kurreck

Gutachter 2: Prof. Dr. Claus-Thomas Bock

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 15. März 2019

Berlin 2019

Zusammenfassung

Das Coxsackievirus B3 (CVB3)-Maus-Myokarditismodell wird standardmäßig zur Untersuchung der

Virus-induzierten Myokarditis verwendet. Entgegen der CVB3-Infektion im Menschen stellt im

murinen Organismus nicht das Herz, sondern das Pankreas das für die CVB3-Infektion suszeptibelste

Organ dar. Verschiedene klinische Symptome, wie der starke Gewichtsverlust, das schmerzhafte

Hochziehen des Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle, können als direkte Folge der

virusbedingten akuten Pankreatitis angesehen werden. Diese fulminante Ausprägung der Pankreatitis

stellt für die Tiere eine extreme Belastung dar, welche sich von der humanen Präsenz unterscheidet.

Im Fokus der vorliegenden Arbeit stand die Verbesserung des CVB3-Maus-Myokarditismodells durch

die Entwicklung einer genetisch modifizierten CVB3-Variante, welche durch die Insertion von

microRNA-Zielsequenzen (microRNA-Target Sites, miRNA-TS) eine Pankreasattenuation aufweist.

Die Expressionsanalyse von miRNAs im Pankreas und Herz mittels eines Affymetrix miRNA –Chip-

Assays sowie quantitativer RT-PCR zeigte, dass die miRNA-375 die stärkste Expression im Pankreas

aufwies und nur geringfügig im Herzen exprimiert wird. Darauf basierend wurden drei Kopien der

miRNA-375TS in das 3’ -bzw. 5’-Ende des Genoms der CVB3-Variante rCVB3.1, jeweils in positiver

bzw. negativer Orientierung, inseriert. Die Analyse der daraus resultierenden vier rekombinanten

CVB3-Varianten in vitro zeigte, dass die virale Replikation über die Insertion der miRNA-TS in

positiver Orientierung in die 3’-UTR des Genoms (Virusvariante: CVB3-375TS(3+)) am effektivsten

durch die miRNA-375 unterdrückt wurde. In der pankreatischen Zelllinie EndoC-βH1 wurde,

verglichen mit dem keine TS-Sequenzen enthaltenden Kontrollvirus, die Replikation von CVB3-

375TS(3+) durch die endogene miRNA-375 Expression ca. um vier log10-Stufen verringert. In

isolierten primären embryonalen Kardiomyozyten wurde CVB3-375TS(3+) hingegen nicht

unterdrückt.

Für die in vivo Versuche wurden drei Kopien der miRNA-375TS in das 3’-Ende des Genoms der

kardiotropen CVB3-Variante H3N inseriert. Es zeigte sich, dass die intraperitoneale (i.p.) Injektion des

generierten Virus (H3N-375TS) in NMRI-Mäusen weder eine Pankreatitis noch eine Myokarditis

verursachte. Hingegen führte die intravenöse (i.v.) Applikation von H3N-375TS in NMRI- als auch

Balb/C-Mäusen zu einer Infektion des Herzens und induzierte je nach Versuchsaufbau eine akute oder

chronische Myokarditis ohne Infektion des Pankreas. Während die akute Myokarditis sich durch

moderate kardiale H3N-375TS-Titer, die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie die

Inflammation und die Zerstörung des Herzgewebes auszeichnete, war die chronische Myokarditis durch

sehr geringe kardiale H3N-375TS-RNA Level ohne detektierbare Virusreplikation sowie durch die

Ausbildung fibrotischer Gewebeareale gekennzeichnet.

Ob und welche Rolle das Pankreas für die Ausbildung der Myokarditis in Mäusen spielt wird in der

Literatur kontrovers diskutiert. Die Ergebnisse der vorliegenden Studie zeigen nunmehr eindeutig, dass

bei der i.p. Applikation von CVB3 das Pankreas essentiell für die kardiale Infektion ist, wohingegen

bei der i.v. Applikation eine Myokarditis ohne Infektion des Pankreas durch die mittels miRNA-375TS

genetisch modifizierte CVB3-Variante verursacht werden kann. Das H3N-375TS induzierte Modell

erlaubt so die Untersuchung der CVB3induzierten Myokarditis in Mäusen unabhängig von einer

Pankreasinfektion.

Zudem verringerte das pankreasattenuierte H3N-375TS bei NMRI-Mäusen, vor allem aber bei Balb/C-

Mäusen, die auf die Pankreatitis zurückführbaren Schmerzen bzw. das Leiden während der CVB3-

Infektion. Damit verstärkt es nicht nur die wissenschaftliche Relevanz der Myokarditisanalyse im

Mausmodell, sondern es entspricht hinsichtlich der tierschutzrechtlichen Forderungen der 3R-

Richtlinien den beiden Aspekten Reduction und Refinement.

III

Abstract

The coxsackievirus B3 (CVB3) mouse myocarditis model is the standard model to investigate virus-

induced myocarditis. Compared to human, in mice the pancreas but not the heart represents the most

susceptible organ for CVB3 infection. Multiple clinical symptoms, as drastic weight loss, painfull

contraction of the stomac as well as sudden death are direct results of the viral induced pancreatitis.

Thus, the pathogenesis of CVB3 infection differs between mice and men, as in the murine CVB3

induced myocraditis model the pancreas is always co-infected and damaged by CVB3.

This study aimed to improve the mouse myocarditis model by development of a genetically engineered

CVB3 variant, which became pancreas-attenuated by insertion of microRNA-target sites (miRNA-TS)

sequences.

Analysis of miRNA expression in the pancreas and the heart by Affymetrix-miRNA-chip analysis as

well as quantitative RT-PCR revealed that miRNA-375 is the highest expressed miRNA in the pancreas

with minimal expression in the heart. Based on this finding, four miRNA-375 susceptible CVB3 variants

were generated by insertion of three copies of miRNA-375TS in positive or negative orientation into the

3’- or 5’-end of the CVB3 genome of the CVB3 variant rCVB3.1. In vitro it was shown that the

generated CVB3 containing the inserted miRNA-375TS in positive orientation in the 3’UTR of the

CVB3 genome (virus variant: CVB3-375TS(3+)) was strongest suppressed by miRNA-375. In

pancreatic EndoC-βH1 cells replication of CVB3-375TS(3+) was suppressed up to four log10 steps by

endogen miRNA-375 expression compared to a non-targeted control virus. Furthermore, there was no

repression of the virus in isolated primary embryonic mouse cardiomyocytes.

For in vivo experiments, three copies of the miRNA-375TS were inserted into the 3’UTR of the

cardiotropic CVB3 variants H3. Here, the intraperitoneal (i.p.) administration of the engineered virus

H3N-375TS did not result in pancreatic as well as cardiac infection in NMRI mice. However,

intravenous (i.v.) administration of H3N-375TS into NMRI and Balb/C mice resulted in the infection of

the heart and induced acute and chronic myocarditis, respectively, but did not lead to pancreatic

infection. The acute myocarditis was characterized by moderate cardiac titers of replicating H3N-375TS,

cardiac tissue destruction, inflammation and expression of proinflammatory cytokines, whereas chronic

myocarditis developing animals showed rarely H3N-375TS-RNA with no detectable virus replication

and fibrotic tissue areas.

In literature, the role of the pancreas in virus-induced myocarditis is controversly discussed. The present

study clearly shows that the pancreas is essential for cardial infection using i.p. administred CVB3. I.v.

application of genetically modified pancreas-attenuated CVB3 showed, that during this route of

infection CVB3 induced myocarditis can be induced without infection of the pancreas. This allows the

solely investigation of CVB3 induced murine myocarditis independently from a previous pancreas

infection.

Furthermore, the pancreas-attenuated H3N-375TS reduces pain and thereby suffering of NMRI and

Balb/C mice during CVB3 infection that is commonly related to pancreatitis. Therby, the model not just

facilitates clinical relevance of investigation of vius-induced myocarditis in mice, in terms of animal

welfare aspects, it also fulfills two requirements of the concepts of the 3-Rs, Reduction and Refinement.

Inhaltsverzeichnis

Zusammenfassung .................................................................................................................................. I

Abstract ................................................................................................................................................ III

Inhaltsverzeichnis ................................................................................................................................. V

Abkürzungsverzeichnis ....................................................................................................................... IX

Abbildungsverzeichnis ........................................................................................................................ XI

Tabellenverzeichnis .......................................................................................................................... XIII

1 Einleitung ......................................................................................................................................... 1

1.1 Coxsackievirus B3 (CVB3)........................................................................................................ 1

1.1.1 Taxonomie ........................................................................................................................... 1

1.1.2 Morphologie und Genomstruktur der Picornaviren ............................................................. 2

1.1.3 Replikation und Morphogenese der Picornaviren ............................................................... 4

1.2 Pathogenität der Picornaviren (CVB3) ...................................................................................... 7

1.2.1 Myokarditis im Menschen ................................................................................................... 7

1.2.2 CVB3-Myokarditis im Mausmodell .................................................................................... 9

1.2.3 Antworten des angeborenen Immunsystems auf CVB Infektionen .................................. 11

1.2.4 Antworten des adaptiven Immunsystems auf CVB Infektionen ....................................... 13

1.2.5 Präventive und therapeutische Ansätze gegen CVB-Infektionen ...................................... 14

1.3 Genregulation durch nichtkodierende RNAs ........................................................................... 16

1.3.1 Small-interfering RNA aund microRNA ........................................................................... 16

1.3.2 RNA-Interferenz ................................................................................................................ 17

1.3.3 Insertion von miRNA-Zielsequenzen zur Regulation der viralen Pathogenese bzw. des

viralen Tropismus ............................................................................................................. 19

1.4 Zielsetzung ............................................................................................................................... 23

2 Material und Methoden ................................................................................................................ 26

2.1 Materialien ............................................................................................................................... 26

2.1.1 Geräte ................................................................................................................................ 26

2.1.2 Verbrauchsmaterialien ....................................................................................................... 27

2.1.3 Chemikalien ....................................................................................................................... 27

2.1.4 Puffer und Lösungen ......................................................................................................... 28

2.1.5 Fest- und Flüssignährmedien ............................................................................................. 29

2.1.6 Zelllinien und Kulturmedien ............................................................................................. 29

2.1.7 Bakterienstämme ............................................................................................................... 30

2.1.8 Plasmide ............................................................................................................................ 30

2.1.9 Viren .................................................................................................................................. 30

2.1.10 Enzyme .............................................................................................................................. 31

2.1.11 Restriktionsenzyme ........................................................................................................... 31

2.1.12 Reaktionssysteme und Kits ................................................................................................ 32

2.1.13 DNA-und Proteingrößenstandards .................................................................................... 32

2.1.14 Antibiotika ......................................................................................................................... 33

2.1.15 Antikörper ......................................................................................................................... 33

2.1.16 Oligonukleotide ................................................................................................................. 33

2.1.17 Software ............................................................................................................................. 34

2.2 Methoden ................................................................................................................................. 35

2.2.1 Mikrobiologische Methoden ............................................................................................. 35

2.2.1.1 Anzucht von Bakterien aus Bakterienstocks ............................................................. 35

2.2.1.2 Herstellung chemisch-kompetenter Bakterien ........................................................... 35

2.2.1.3 Herstellung von Bakterienstocks................................................................................ 35

2.2.2 Molekularbiologische Methoden ....................................................................................... 36

2.2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA ..................................................... 36

2.2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA .................................................................................... 36

2.2.2.3 DNA-Gelelektrophorese ............................................................................................ 36

2.2.2.4 Restriktionsverdau ..................................................................................................... 36

2.2.2.5 Extraktion der DNA aus Agarosegelen ..................................................................... 36

2.2.2.6 Ligation der Fragmente ............................................................................................. 37

2.2.2.7 Transformation chemisch kompetenter Zellen .......................................................... 37

2.2.2.8 Generierung von CVB3-cDNA-Klonen .................................................................... 37

2.2.2.9 Sequenzierung ........................................................................................................... 45

2.2.2.10 RNA-Extraktion ........................................................................................................ 45

2.2.2.11 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ............................................................................ 45

2.2.2.12 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkriptase-PCR .............................................. 46

2.2.2.13 Quantifizierung von cDNA mittels quantitativer PCR .............................................. 47

2.2.2.14 Auswertung der relativen Quantifizierung ................................................................ 48

2.2.2.15 Laser Mikrodissektion ............................................................................................... 48

2.2.2.16 Affymetrix miRNA-Chip-Analyse ............................................................................ 49

2.2.3 Zellbiologische Methoden ................................................................................................. 49

2.2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen ........................................................................... 49

2.2.3.2 Einfrieren von Zellen ................................................................................................. 49

2.2.3.3 Kultivierung von Zellen aus Kryostocks ................................................................... 50

VII

2.2.3.4 Zellzahlbestimmung .................................................................................................. 50

2.2.3.5 Transfektion eukaryotischer Zellen ........................................................................... 50

2.2.3.6 Dual-Luciferase Reporter Assay als Fuktionalitätsnachweis der miRNA-375-TS ... 51

2.2.3.7 Zellviabilitätsassay .................................................................................................... 52

2.2.4 Westerblot ......................................................................................................................... 53

2.2.5 Virologische Methoden ..................................................................................................... 53

2.2.5.1 Herstellung von rekombinantem CVB3 .................................................................... 53

2.2.5.2 Aufreinigung der Viren mittels Saccharose-Kissen .................................................. 54

2.2.5.3 Bestimmung des Virustiters mittels Plaque Assay .................................................... 54

2.2.5.4 Infektion von Zellkulturen mit CVB3 ....................................................................... 55

2.2.5.5 MiRNA vermittelte CVB3-Inhibierungsassays ......................................................... 55

2.2.6 CVB3-Myokarditismodell in der Maus ............................................................................. 56

2.2.6.1 Injektion und zeitlicher Ablauf der CVB3-Injektion ................................................. 56

2.2.6.2 Allgemeiner Gesundheitsstatus ................................................................................. 57

2.2.6.3 Histologische Untersuchungen .................................................................................. 57

2.2.6.4 Herzpassagierung von CVB3 .................................................................................... 57

2.2.6.5 Hämodynamische Messung ....................................................................................... 58

2.3 Statistische Auswertung ........................................................................................................... 58

3 Ergebnisse ...................................................................................................................................... 59

3.1 Evaluierung der miRNA .......................................................................................................... 59

3.2 Insertion der miRNA-375TS in das CVB3-Genom ................................................................. 61

3.3 Generierung replikativer CVB3-Varianten .............................................................................. 62

3.4 Wachstumsanalysen und Zellviabilitätsassays der generierten CVB3-Varianten.................... 64

3.5 Reportergenassay mit pMCV-MIR-375 in HEK293T-Zellen ................................................. 66

3.6 Inhibierungsassays mit pMCV-MIR-375 in HEK293T-Zellen ............................................... 66

3.7 Inhibierungsassays mit miRNA-375-Mimics in HeLa-Zellen ................................................. 67

3.8 Endogene miRNA-375-Expression verschiedener Pankreaszelllinien .................................... 68

3.9 Inhibierungsassays mit endogen miRNA-375 exprimierenden Zellen .................................... 69

3.10 Replikation der rekombinanten CVB3-Varianten in primären embryonalen Kardiomyozyten71

3.11 Vergleich des Verlaufs der H3N und rCVB3.1 Infektion in vivo ............................................ 72

3.12 Wachstumsanalyse und Inhibierungsassays mit rekombinantem H3N .................................... 74

3.13 Verlauf der H3N-375TS Infektion in NMRI-Mäusen nach intraperitonealer Applikation ...... 75

3.14 Die intravenöse Applikation von H3N-375TS induziert bei NMRI-Mäusen eine Myokarditis

ohne Ausbildung einer Pankreatitis ................................................................................................... 79

3.15 Herzpassagiertes rekombinantes H3N-375TS induziert eine starke Myokarditis in NMRI-

Mäusen .............................................................................................................................................. 82

VIII

3.16 Das chronische Modell der Mausmyokarditis .......................................................................... 86

3.17 Die intravenöse Infektion von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen eine

akute Myokarditis, aber keine Pankreatitis ....................................................................................... 88

4 Diskussion ...................................................................................................................................... 92

4.1 Evaluierung der miRNAs ......................................................................................................... 93

4.2 Einfluss der Insertion von miRNA-TS auf die Replikation und Zytotoxizität von CVB3 ...... 94

4.2.1 Inhibierung von miRNA-375TS enthaltender CVB3-Varianten durch miRNA-375 ........ 96

4.3 Intraperitoneale Injektion von CVB3 ....................................................................................... 98

4.3.1 rCVB3.1 verursacht keine Myokarditis in NMRI-Mäusen ............................................... 98

4.3.2 H3N induziert eine Myokarditis nach i.v. Applikation in NMRI-Mäuse .......................... 99

4.4 Intravenöse Injektion von CVB3 ........................................................................................... 101

4.4.1 Intravenöse Injektion von H3N-375TS verursacht eine Myokarditis .............................. 102

4.4.2 Vergleich der intraperitonealen und intravenöusen Applikationsrouten ......................... 102

4.4.3 Vergleich des H3N-375TS-Myokarditismodells in NMRI -und Balb/C-Mäusen ........... 105

4.4.4 Herzpassagierung von CVB3 .......................................................................................... 106

4.4.5 Das chronische Modell der CVB3-Mausmyokarditis ..................................................... 107

4.4.6 Hämodynamische Messungen ......................................................................................... 108

4.5 Umsetzung des 3R-Gedankens .............................................................................................. 110

4.6 Ausblick ................................................................................................................................. 111

Literaturverzeichnis .......................................................................................................................... 114

Anhang ............................................................................................................................................... 140

Abkürzungsverzeichnis

Abb. Abbildung

bp Basenpaar(e)

cDNA komplementäre Desoxyribonukleinsäure (complementary desoxy-ribonucleic

acid)

Ct Zyklusschwellenwert (cycle threshold)

CVB3 Coxsackievirus Typ B 3

d Tage (days)

DCM Dilatative Kardiomyopathie

DEPC Diethylpyrocarbonat

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure (desoxy ribonucleic acid)

DNAseI Desoxyribonuklease I

dNTPs Desoxyribonukleosidtriphosphate

E. coli Escherichia coli

EDTA Ethylendiamintetraessigsäure

et al. und andere (et alia)

EtOH Etahnol

FCS fetales Kälberserum (foetal calf serum)

GAPDH Glyzerinaldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase

h Stunden (hours)

IFN Interferon

Ig Immunoglobulin

IL Interleukin

IPTG Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranosid

IRES interne ribosomale Eintrittsstelle (internal ribosome entry site)

kb Kilobasenpaare

kDa Kilodalton

l Liter

m Milli (-gramm, -liter, -mol)

M Mol

MCS Multiple Klonierungsstelle (multiple cloning site)

MgCl2 Magnesiumchlorid

min Minuten

miRNA microRNA

mmHg Millimeter Quecksilbersäule (1 mmHg = Pa)

MOI Multiplizität der Infektion (multiplicity of infection)

mRNA Boten-Ribonukleinsäure (messenger ribonucleic acid)

µ Mikro (-gramm, -liter, -mol; -molar)

n.s. statistisch nicht signifikant

NaCl Natriumchlorid

NFκB nukleärer Faktor kappaB (nuclear factor κB)

NOD Nukleotidbindungs- und Oligomerisierungs-Domäne (nucleotid binding and

oligomerisation domain)

OD Optische Dichte

ORF offener Leserahmen (open reading frame)

p. i. nach der Infektion (post infection)

PAMP pathogenassoziierter molekularer Faktor (pathogen-associated molecular

pattern)

PBS Phosphatgepufferte Salzlösung (phosphate buffered saline)

PCR Polymerasekettenreaction (polymerase chain reaction)

PFA Paraformaldehyd

pfu Lochbildende Einheit (plaque forming unit)

qRT-PCR Quantitative Echtzeit-PCR (quantitative real time PCR)

RdRP RNA-abhängige RNA-Polymerase

RNA Ribonukleinsäure (ribonucleic acid)

RNAseA Ribonuklease A

rpm Umdrehungen pro Minute (rounds per minute)

RT Reverse Transkription

s Sekunden

SEM Standardabweichung des Mittelwertes (standard error of the mean)

SM-Puffer Magnesium Saline Puffer

ss einzelsträngig (single stranded)

THY Todd-Hewitt Bouillon mit Hefeextrakt (Todd-Hewitt with yeast extract)

TLR Toll-like-Rezeptor

TNFα Tumornekrosefaktor α

Tris Trishydromethylaminomethan

ÜS Überstand

UTR untranslatierte Region

vgl. vergleiche

vRNA virale RNA

z. B. zum Beispiel

Abbildungsverzeichnis

Abbildung 1: Struktur der Picornaviren. ................................................................................................. 3

Abbildung 2: Aufbau des Picornavirus-Genoms. .................................................................................... 4

Abbildung 3: Replikation der Picornaviren. ............................................................................................ 5

Abbildung 4: Aufbau des Picornavirus-Genoms und Prozessierung des Polyproteins. .......................... 7

Abbildung 5: Mechanismus der RNA-Interferenz. ............................................................................... 19

Abbildung 6: Insertion pankreasspezifischer miRNA-Target Sites in das CVB3-Genom modifiziert den

viralen Tropismus im Mausmodell. ....................................................................................................... 24

Abbildung 7: Klonierung der MCS in das 3’-Ende des CVB3-Genoms im pMKS1-Plasmid. ............. 39

Abbildung 8: Darstellung des pMKS1-3’MCS-Plasmids mit der MCS am 3’-Ende mit den

Restriktionsschnittstellen AsiSI, XbaI, NdeI und PmeI. ........................................................................ 40

Abbildung 9: Klonierung von drei miRNA-375TS in das Fragment mit der MCS in das 3’-Ende des

CVB3-Genoms. ..................................................................................................................................... 41

Abbildung 10: Klonierung der TS-Sequenzen am Beispiel der miRNA-375TS, die dreifach in das 5’-

Ende des pMKS1-Plasmids inseriert wurden. ....................................................................................... 42

Abbildung 11: Inserierungsstellen der miRNA-375TS- sowie der miRNA-39TS-Sequenzen in das 5’-

bzw. 3’-Ende des CVB3-Genoms. ........................................................................................................ 42

Abbildung 12: Generierung des pMKS1-H3N-Plasmids. ..................................................................... 43

Abbildung 13: Klonierung von drei miRNA-375TS-Kopien in das pMKS1-H3N-Plasmid. ............... 44

Abbildung 14: Klonierung von drei Kopien der miRNA-375TS in das psiCHECK2-Plasmid. ........... 44

Abbildung 15: Produktion rekombinanten CVB3’s einschließlich der Bestimmung des Virustiters

mittels Plaque Assay. ............................................................................................................................ 54

Abbildung 16: Relative miRNA-Expression in den pankreatischen Geweben von Balb/C-Mäusen. ... 60

Abbildung 17: Relative miRNA-Expression in Herz und Pankreas von Balb/C-Mäusen. ................... 61

Abbildung 18: Insertionsstellen der miRNA-375TS und miRNA-39TS-Sequenzen im pMKS1-Plasmid.

............................................................................................................................................................... 62

Abbildung 19: GFP-Expression nach Transfektion von CVB3- cDNA bzw. CVB3-rRNA. ................ 63

Abbildung 20: Wachstumskurven rekombinanter CVB3-375TS und CVB3-39TS-Varianten. ............ 64

Abbildung 21: Zellviabilitätsassays (XTT) der rekombinanten CVB-375TS bzw. CVB3-39TS-

Varianten. .............................................................................................................................................. 65

Abbildung 22: Überprüfung der Funktionalität der inserierten miRNA-375TS mittels Dual-Luciferase-

Reporterassay. ....................................................................................................................................... 66

Abbildung 23: Inhibierung rekombinanter CVB3 mit 3’- bzw. 5’-inserierten miRNA-375TS durch die

............................................................................................................................................................... 67

Abbildung 24: Inhibierung rekombinanter CVB3 mit 3’- bzw. 5’- inserierten miRNA-375TS durch . 68

Abbildung 25: MiRNA-375-Expression verschiedener Zelllinien. ....................................................... 69

XII

Abbildung 26: CVB3-eGFP induziert die Expression des VP1-Proteins in EndoC-βH1-Zellen. ......... 70

Abbildung 27: Inhibierungsassays mit CVB3-375TS(3+) und CVB3-39TS(3+) in EndoβH1-Zellen. 71

Abbildung 28: Replikation von rCVB3.1, CVB3-375TS(3+) sowie CVB3-39TS(3+) in primären

embryonalen Kardiomyozyten. ............................................................................................................. 72

Abbildung 29: Vergleich der Infektion von rCVB3.1 und H3 in NMRI-Mäusen. ................................ 73

Abbildung 30: Wachstumskurvenanalysen und Inhibierungsassays von H3N-375TS, H3N-39TS bzw.

H3N nach Applikation miRNA-375-Mimics. ....................................................................................... 74

Abbildung 31: Die intraperitoneale Injektion von H3N-375TS führt nicht zur Infektion von NMRI-

Mäusen. ................................................................................................................................................. 77

Abbildung 32: Histologische und hämodynamische Analyse intraperitoneal mit H3N-375TS infizierter

NMRI-Mäuse......................................................................................................................................... 78

Abbildung 33: Die intravenöse Applikation von H3N-375TS verursacht in NMRI-Mäusen eine

Myokarditis, aber keine Pankreatitis. .................................................................................................... 81

Abbildung 34: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem oder hochdosoiertem H3N-375TS

verursacht in NMRI-Mäusen eine Myokarditis, aber keine Pankreatitis. ............................................. 83

Abbildung 35: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem oder hochdosiertem H3N-375TS

verursacht in NMRI-Mäusen eine Inflammation des Herzgewebes, jedoch keine des Pankreas. ......... 84

Abbildung 36: Expression der miRNA-375 im Herz- und Pankreasgewebe von H3N-375 infizierten

Mäusen. ................................................................................................................................................. 85

Abbildung 37: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem H3N-375TS verursacht in NMRI-

Mäusen eine chronische Myokarditis, aber keine Pankreatitis. ............................................................. 87

Abbildung 38: Hämodynamische Messungen von intravenös mit H3N-375TS infizierten Mäusen. ... 88

Abbildung 39: Die intravenöse Applikation von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen eine akute

Myokarditis, aber keine Pankreatitis. .................................................................................................... 90

Abbildung 40: Die intravenöse Applikation von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen eine

Inflammation im Herzgewebe, nicht aber im Pankreas. ........................................................................ 91

Abbildung 41: Hämodynamische Messungen von intravenös mit H3N-375TS infizierten Balb/C-

Mäusen. ................................................................................................................................................. 91

Abbildung 42: Histologisches Präparat des endo- und exokrinen Pankreas. ........................................ 94

Abbildung 43: Schematische Darstellung der Angriffsstellen der miRNA und siRNA. ....................... 97

Abbildung 44: Schematische Darstellung der miRNA-7650-Angriffsstelle im CVB3-Genom.

......... 101

Abbildung 45: Schematische Darstellung des Infektionsverlaufes von pankreasattenuiertem und nicht-

pankreasattenuiertem H3N in Abhängigkeit von der Applikationsroute. ........................................... 104

XIII

Tabellenverzeichnis

Tabelle 1: Einige Vertreter der Familie Picornaviridae, deren Wirte und Krankheitsbilder. .................. 2

Tabelle 2: Auslöser der Myokarditis. (modifiziert nach83). ..................................................................... 8

Tabelle 3: Eigenschaften der siRNAs und miRNA (modifiziert nach202). ............................................ 16

Tabelle 4: Geräte. .................................................................................................................................. 26

Tabelle 5: Verbrauchsmaterialien.......................................................................................................... 27

Tabelle 6: Chemikalien. ........................................................................................................................ 27

Tabelle 7: Puffer und Lösungen. ........................................................................................................... 28

Tabelle 8: Verwendete Fest- und Flüssignährmedien. .......................................................................... 29

Tabelle 9: Verwendete Zelllinien mit entsprechendem Kulturmedium und Zusätzen. ......................... 29

Tabelle 10: Verwendete Bakterienstämme. ........................................................................................... 30

Tabelle 11: Verwendete Plasmide. ........................................................................................................ 30

Tabelle 12: Verwendete Viren............................................................................................................... 30

Tabelle 13: Enzyme ............................................................................................................................... 31

Tabelle 14: Restriktionsenzyme zuzüglich Schnittstelle und Inkubationstemperatur. .......................... 31

Tabelle 15: Reaktionssysteme und kommerzielle Kits.......................................................................... 32

Tabelle 16: DNA- und Proteingrößenstandards. ................................................................................... 32

Tabelle 17: Antibiotika, verwendete Konzentrationen und Lösungsmittel. .......................................... 33

Tabelle 18: Antikörper. ......................................................................................................................... 33

Tabelle 19: Verwendete Oligonukleotide. ............................................................................................. 33

Tabelle 20: Verwendete Software-Programme. .................................................................................... 34

Tabelle 21: Zusammensetzung des Eagle-Overay-Mediums. ............................................................... 55

Tabelle 22: Ergebnisse der Affymetrix miRNA-Chip-Analyse ............................................................ 59

Einleitung

1 Einleitung

1.1 Coxsackievirus B3 (CVB3)

Die Bezeichnung Coxsackievirus geht auf die Erstisolation des Virus während der Poliovirusepidemie im

Jahr 1947 durch Gilbert Dalldorf und Grace Sickles im Ort Coxsackie innerhalb des US Bundesstaates

New York zurück. Sie isolierten das Virus aus einem Jungen, der unter akuter schlaffer Myelitis (ASM)

litt. Die Symptomatik und der durch das Virus hervorgerufene Krankheitsverlauf ähnelten stark denen,

welche durch das Poliovirus hervorgerufenen wurden1. Basierend auf der Pathogenität in

Säuglingsmäusen werden Coxsackieviren in zwei Subgruppen unterteilt.2,3 Der Coxsackievirus Subtyp A

(CVA) umfasst bislang 23 beschriebene Serotypen während für den Coxsackievirus Subtyp B (CVB)

aktuell sechs Serotypen beschrieben sind4. Im Allgemeinen induziert CVA in der Maus ASM als Resultat

einer weitreichenden Infektion der Skelettmuskulatur, verbunden mit einer generalisierten Myositis

infolge eines perakuten Infektionsverlaufes3. Der später entdeckte Coxsackievirus Subtyp B wurde aus

einem Patienten mit aseptischer Meningitis isoliert5. Auch wenn sich viele CVB-Infektionen durch einen

milden Krankheitsverlauf auszeichnen6,7, können sie dennoch schwerwiegende Herz-, Nervensystem -

oder Pankreaserkrankungen auslösen3,8. Am häufigsten führen CVB Infektionen jedoch zu einer akuten

Myokarditis, die bei progredientem Krankheitsverlauf zu einer dilatativen Kardiomyopathie (DCM) und

Herzversagen führen 4,8–10.

1.1.1 Taxonomie

Coxsackieviren sind der Familie Picornaviridae untergeordnet, die zur Gattung Enteroviren zählt.11. Der

Familie der Picornaviridae gehören >30 Genera und >75 Serotypen an, von denen die relevantesten

humanpathogenen Vertreter aus dem Genus der Enteroviren stammen, wohingegen veterinärmedizinisch

die Aphthoviren eine größere Bedeutung spielen. So verursachen Aphthoviren bei Tieren die Maul -und

Klauenseuche, während Enteroviren bei Menschen die Hand-Fuß-Mund-Krankheit, Myokarditis

(CVB3), Poliomyelities (Poliovirus), Hepatitis (Hepatoviren) oder Rhinitis (Rhinoviren) auslösen

können10 (Tab. 1). Auch wenn Säugetiere und Vögel den Großteil der Wirte für die meisten Picornaviren

darstellen, wurden sie vereinzelt auch in Reptilien und Fischen nachgewiesen12.

Weiterhin werden Picornaviren hinsichtlich ihrer Säurestabilität in säurestabile und säurelabile Erreger

unterteilt. Säurestabile Erreger wie Enteroviren lösen vornehmlich Infektionen des Magen-Darm-Trakts

aus, da sie marginal bis gar nicht durch das saure Milieu des Magens beeinträchtigt werden13,14,

wohingegen säurelabile Picornaviren wie Rhinoviren meist Infektionen des Nasen-Rachen-Raumes

verursachen13.

Einleitung

Tabelle 1: Einige Vertreter der Familie Picornaviridae, deren Wirte und Krankheitsbilder.

(Modifiziert nach 10).

Gattung

Spezies

Wirt

Krankheit

Aphthovirus Maul-und Klauenseuche Virus Klauentiere Maul-und Klauenseuche

Cardiovirus

Encephalomyokarditisvirus

Säugetiere, Vögel

Encephalitis

Theilovirus Maus Neurologische Erkrankungen

Enterovirus

Coxsackievirus B1-6

Mensch

Myokarditis, Pankreatitis

Enteroviru 71 Mensch Hand-Fuß-Mund-Krankheit

Poliovirus 1-3

Mensch

Poliomyelitis

Rhinovirus

Mensch

Atemwegserkrankungen

Hepatoviren

Hepatitis A

Mensch, Affen

Hepatitis

Kobuvirus

Aichivirus

Mensch

Gastroenteritis

1.1.2 Morphologie und Genomstruktur der Picornaviren

Der Name Picornavirus setzt sich aus pico (lateinisch „sehr klein“) und RNA (Genom) zusammen. Es

handelt sich um nicht behüllte Viren, deren Kapsidgröße zwischen 22-30 nm variiert und eine

ikosaedrische Struktur aufweist. Das Kapsid setzt sich aus zwölf Pentameren zusammen, welche jeweils

aus fünf Protomeren bestehen, die wiederum aus je vier Kapsidproteinen (VP1, VP2, VP3 und VP4)

gebildet werden (Abb. 1A). Die ersten drei Virusproteine, VP1-3, bilden die Oberfläche des Virus,

während das VP4-Protein auf der Innenseite des Kapsids lokalisiert ist (Abb. 1D). Die größten

Strukturproteine sind die VP1-Proteine. Sie bilden innerhalb der Pentamere (5-fache Symmetrieachse)

eine kronenartige Struktur an deren Berührungspunkten eine Spalte entsteht, welche als Canyon

bezeichnet wird (Abb. 1B). Die Canyons kommen bei allen Enteroviren vor und ermöglichen die Bindung

zellulärer Rezeptoren wie z. B. die des very-low-density lipoprotein receptor (VLDL-R) bei einigen

Serotypen humaner Rhinoviren sowie die des decay-accelerating factor (DAF) (CD55) bei verschiedenen

Serotypen der Echoviren und CVB15–18. Neben der 5-fach-Symmetrieachse existiert zudem eine 3-fache

Symmetrieachse, die von den Proteinen VP1, VP2 und VP3 gebildet wird19 (Abb. 1B-C). Das VP4-

Protein kommt nur im Kapsidinneren vor und ist aufgrund seiner positiv geladenen Aminosäurereste mit

der viralen RNA assoziiert17,20.

Das Genom aller Picornaviren besteht aus einem einzelsträngigen RNA-Molekül in positiver Orientierung

und hat eine Länge von 7,2-8,5 kb. Am 5’-Ende ist das Genom kovalent mit dem kleinsten viralen Protein,

dem viral protein genome-linked (VPg) verbunden, welches auch als 3B-Protein bezeichnet wird21–23. Im

Gegensatz zu eukaryotischen mRNAs, die klassischerweise eine 7-Methyl-Guanosin (mtG) Cap-Struktur

am 5’-Ende tragen, die für die Translation notwendig ist24, wird diese bei den Picornaviren durch das

Protein VPg initiiert. Dank der Verkappung werden die mRNAs vor dem Abbau durch zelluläre

Exonucleasen geschützt. Bei den Picornaviren wird das VPg-Protein kovalent an das 5’-Ende der viralen

genomischen RNA gebunden. Auf das VPg-Protein folgt ein etwa 500-1200 nt langer Bereich, die 5’

Einleitung

untranslated region (5’UTR), bestehend aus mehreren Sekundär -und Tertiärstrukturen, welche bei den

Picornaviren die Ribosomen-Eintrittsstelle (internal ribosomal entry site, IRES) ausbilden und damit die

Translations-Initiation ermöglichen21,25–27. Die ersten 100 Nukleotide in der 5’-UTR der Enteroviren

enthalten Kleeblatt-Strukturen, über welche sie an das virale Nichtstruktur-Protein 3C bzw. dessen

Vorläuferprotein 3CDPro binden.28. Durch die zusätzliche Bindung des Wirtproteins poly (rC)-binding

protein (PCBP) erfolgt die Rekrutierung der Polymerase 3D zum Replikationskomplex29–31.

Die 5’UTR endet vor dem Startcodon des viralen Polyproteins. Das 3’-Ende ist polyadenyliert und bildet

den PolyA-Schwanz aus. Auch am 3’-Ende befindet sich eine 30-650 nt lange UTR, die 3’UTR, die nach

dem Stopcodon beginnt und vor dem PolyA-Schwanz des viralen Genoms endet.21,23,32. Innerhalb dieser

beiden nichtkodierenden Bereiche liegt lediglich ein offener Leserahmen (open reading frame, ORF)10

(Abb. 2).

Abbildung 1: Struktur der Picornaviren.

(A) Schematische Darstellung der Struktur von Picornaviren mit der typischen ikosaedrischen Symmetrie. (B) Computermodell

des Poliovirus. Gekennzeichnet sind die 5-fache, 3-fache und 2-fache Achsensymmetrie sowie die Canyons.

des Picornaviruskapsids ist überwiegend mit VP4 (grün) ausgekleidet. Modifiziert nach 17,19,33. [VP: Virales Protein]

Einleitung

Abbildung 2: Aufbau des Picornavirus-Genoms.

Das Genom der Picornaviren besteht aus Struktur- und Nichtstrukturproteinen. Upstream des viralen Polyproteinkomplexes

befindet sich die für die Translations-Initiation nötige Ribosomeneintrisstelle (IRES). Das 3’-Ende ist polyadenyliert (Poly A).

Die Abbildung ist modifiziert nach 34. [VP: Virales Protein, IRES: internal ribosom entry site; P: Protein, pol: Polymerase,

Poly A: polyadenyliert]

1.1.3 Replikation und Morphogenese der Picornaviren

Der produktive Replikationszykus von CVB wird durch die Bindung der Viren an den Coxsackievirus-

Adenovirus-Rezeptor (CAR) initiiert.35–37. Dieses Transmembranprotein wird unter anderem im Herz-

und Pankreasgewebe exprimiert und ist in polarisierten Zellen in den Tight Junctions lokalisiert35, in

welchen die CAR-vermittelte CVB-Aufnahme abhängig von Caveolin, jedoch unabhängig von Dynamin

erfolgt. Im Gegensatz dazu verläuft die CAR-vermittelte CVB Aufnahme in nicht polarisierten Zellen

Caveolin-unabhängig und Dynamin-abhängig38. Während die CVB Serotypen 2, 4 und 6 ausschließlich

CAR für die Bindung und Initialisierung in die Wirtszelle benötigen4,15,39, erfolgt die CVB Bindung bei

den CVB Serotypen 1, 3 und 5 über den Decay accelerating factor (DAF)40–42. Das humane

Transmembranprotein DAF bewahrt die Zellen primär vor der vom Komplementsystem vermittelten

Lyse43. Während der CVB3-Aufnahme fungiert er als Ko-Rezeptor, indem das Virus ihn auf der apikalen

Zellseite bindet und so über intrazelluläre Signalwege eine Umstrukturierung des Aktinzytoskeletts

bewirkt. Dies führt dazu, dass CVB über die Zellmembran zu den Tight Junctions und folglich zum

eigentlichen Initialisierungsrezeptor CAR gelangt44. Im Laufe der Bindung der Viruspartikel an DAF

sowie der Rezeptor-vermittelter Endozytose über CAR in das Zellinnere, ändert sich die Konformation

der viralen Strukturproteine45. Dabei wird das virale Plus-Stranggenom aus den Endosomen in das

Zytoplasma freigesetzt. Im Lebenszyklus der Picornaviren hat die einzelsträngige, virale Plus-Strang-

RNA drei wichtige Aufgaben: Sie dient sowohl als messanger RNA (mRNA) für die Translation des

viralen Polyproteins als auch als Matrize für die RNA-Replikation und stellt zudem das Genom dar,

welches in die Virionen verpackt wird33 (Abb. 3).

Aufgrund ihrer positiven Orientierung wird die virale RNA im Zytoplasma der Wirtszelle direkt

translatiert. Die Translation der viralen RNA wird durch die sich in der 5’UTR befindenden IRES-

Strukturen ermöglicht24,26. Die IRES vermittelt die Bindung des Plus-Stranggenoms an das

endoplasmatische Retikulum der Ribosomen und initiiert so die Translation. Es entsteht ein ca. 240 kDa

großes Polyprotein, welches stufenweise durch die viralen Cysteinproteasen 2APro und 3CDPro

zunächst in die Vorläuferproteine P1, P2 und P3 und dann in die eigentlichen Virusproteine, die

Strukturproteine VP1, VP2, VP3, VP4 sowie die Nichtstruktur-Proteine 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C und 3D

Einleitung

fragmentiert wird46 (Abb. 4). Die Nichstruktur-Proteine, die aus dem Vorläuferprotein P2 hervorgehen

(2A-C), vermitteln primär die Reorganisation zellulärer Membranstrukturen, was dazu führt, dass

Vesikel gebildet werden, an denen die virale RNA-Replikation abläuft47. Die Nichtstruktur-Proteine der

P3 Proteinregion (3A-D) dienen der viralen RNA-Replikation sowie der proteolytischen Prozessierung48.

Abbildung 3: Replikation der Picornaviren.

Schematische Darstellung des Replikationszyklus von Picornaviren modifiziert nach10. [IRES: internal ribosom entry site]

Die prozessierte 3D RNA-abhängige RNA-Polymerase, 3DPol (RdRP) transkribiert das Plus-Stanggenom

der Picornaviren in Minus -Strang-RNA. Das am 5’-Ende der viralen RNA lokalisierte VPg sowie dessen

uridinylierte Derivate dienen dabei als Protein-Primer für die Initiation der Minus-Strang-RNA

Synthese49,50 indem sie an das 3’-PolyA-Ende der viralen RNA binden, was in der Bildung VPg

gebundener PolyU-Produkte am 5’-Ende der Minus-Strang-RNA resultiert. Entsprechend dient die

Minus-Strang-RNA als Matrize für die Plus-Strang-RNA Synthese, indem uridinyliertes VPg dessen

Synthese an komplementären Adenosinbasen am 3’-Ende der Minus-Strang-RNA initiiert. Aus einer

vorliegenden Minus-Strang-RNA können wiederum durchschnittlich sechs bis acht RNA-Plus-Stränge

gebildet werden. Während der akuten Virusinfektion beträgt das Verhältnis von negativen und positiven

RNA-Strängen mitunter 1:100, was wiederum zeigt, dass aus einer viralen Minus-Strang-RNA

zahlreiche Plus-Strangkopien gebildet werden können51.

Da die Wirtsmaschinerie nicht über eine eigene 3DPol verfügt, müssen die Viren die 3DPol selbst kodieren

und prozessieren, so dass sie innerhalb der Picornavirenfamilie extrem hoch konserviert ist46,52.

Einleitung

Die hohe Mutationsrate der Picornaviren resultiert aus der hohen Fehlerrate der 3DPol, die etwa alle 2000

Basen eine Punktmutation inseriert und so das Risiko des Auftretens sogenannter Escape-Mutanten

erheblich verstärkt53. Die reifen Viren verlassen die Wirtszelle über lytische bzw. bisher wenig bekannte

Mechanismen, welche wahrscheinlich an die Autophagosomie geknüpft sind54. Innerhalb des CVB

Replikationszyklus spielt die Autophagie, welche Prozesse des intrazellulären streng regulierten Abbaus

sowie des Recyclings von Proteinen bzw. ganzen Zellorganellen zur Aufrechterhaltung der Homöostase

umfasst, eine bedeutende Rolle. Während der Makroautophagie wird zunächst eine sogenannte

Isolationsmembran generiert, die von verschiedenen Organellen, unter anderem dem

endoplasmatischem Retikulum (ER)55, dem Golgi-Komplex56 oder der äußeren

Mitochondrienmembran57, zur Verfügung gestellt wird. Aus dieser bilden sich die Autophagosomen,

welche die für sie charakteristische Doppelmembran besitzen. Diese wiederum fusionieren mit

Endosomen zu Amphisomen58. Amphisomen oder Autophagosomen vereinen sich mit Lysosomen zu

Autolysosomen in denen über lysosomlae Hydrolasen der Abbau der zellulären Bestandteile erfolgt59.

CVB und auch Polioviren induzieren die Bildung autophagosomenähnlicher Vesikel während ihrer

Replikation, da sie deren Doppelmembran als Struktur für ihre Replikation nutzen. Sowohl in vitro60,61

als auch in vivo62 wurde nachgewiesen, dass die Inhibierung der Autophagie zu einer signifikanten

Reduktion der CVB Replikation führte. In der mit Mäusen durchgeführten Studie führte die spezifische

Deletion des für die Autophagie essentiellen Gens ATG5 in pankreatischen Azinuszellen, zu einer 2000-

fachen Verringerung der CVB3-Titer im Pankreas sowie einer deutlich geringeren Zerstörung des

pankreatischen Gewebes62. Sowohl Polioviren als auch CVB benötigen die Autophagie zur

Unterstützung ihrer Replikation, dennoch unterscheiden sie sich bezüglich ihres Verhaltens gegenüber

der Bildung von Autolysosomen. Während Poliviren die Fusion von Autophagosomen mit Lysosomen

induzieren, scheint CVB diese zu inhibieren, wohlmöglich um der lysosomalen Degradation zu

entgehen61,63. Die Stilllegung verschiedener spezifischer lysosomaler soluble N-ethylmaleimide-

sensitive factor attachment protein receptor (SNAR) Proteine, welche die Autolysosomenbildung

regulieren, zeigte bislang keine eindeutigen Befunde, so dass die genaue Rolle der Autolysosomen für

die Replikation von CVB unklar bleibt61,64.

Die durch das Freiwerden der Virusnachkommenschaft beobachtenden starken morphologischen

Veränderungen der infizierten Zellen werden als cytophatischer Effekt (CPE) bezeichnet65. Der

Replikationszyklus ist nach etwa sechs bis acht Stunden beendet und resultiert in der Entstehung von

bis zu 10000 neuen Viruspartikeln je infizierter Zelle66.

Einleitung

Abbildung 4: Aufbau des Picornavirus-Genoms und Prozessierung des Polyproteins.

Schematische Darstellung des Replikationszyklus von Picornaviren modifiziert nach19. [VP: Virales Protein, IRES: internal

ribosom entry site; P: Protein, pol: Polymerase, Poly A: polyadenyliert; NTR: nichttranslatierte Region]

1.2 Pathogenität der Picornaviren (CVB3)

Infektionen mit Enteroviren resultieren in einem breiten Spektrum klinischer Krankheitsbilder, wie

beispielsweise der aseptischen Meningitis und Meningoenzephalitis (CVA), der Myokarditis und

Perikarditis (CVB und Echoviren), systemischer neotonaler Infektionen (CVB, Echoviren), der

Pankreatitis (CVB) aber auch respiratorischer Krankheiten (Rhinoviren, EC-68)67. Trotz des pathogenen

Potentials verlaufen 50 – 80% der nicht polioviralen Enterovirusinfektionen asymptomatisch68. Dabei

ist das Alter der Patienten stark mit dem klinischen Verlauf der Infektion assoziiert. Infektionen des

Zentralnervensystems betreffen vornehmlich Kinder zwischen 5-15 Jahren, wohingegen sich die

Myokarditis überwiegend bei 20-40 Jährigen manifestieren. Besonders schwere Infektionsverläufe

treten dagegen bei Neugeborenen auf, die sich mitunter in sepsisähnlichen Erkrankungen, Myokarditen

aber auch Infektionen des Zentralnervensystems äußern können67.

1.2.1 Myokarditis im Menschen

Entzündliche Prozesse im Herzmuskel werden nach Soberheim im Jahr 1937 unter der Bezeichnung

Myokarditis zusammengefasst und können sowohl akut als auch chronisch verlaufen69. Die zugrunde

liegenden Ursachen der Myokarditis sind sehr vielseitig und können in Abhängigkeit von den

individuellen Konditionen und Prädispositionen sowie sozioökonomischer Faktoren des Betroffenen zu

stark variierenden Ausprägungen und Krankheitsverläufen führen70–75. Aufgrund dessen, sowie der

Tatsache, dass Myokarditen zum Teil auch asymptomatisch verlaufen können, gestaltet sich die

klinische Diagnose der Myokarditis schwierig76. Vorrangig leiden Betroffene unter Kurzatmigkeit,

Thoraxschmerzen sowie oftmals damit einhergehender Perikarditis bzw. ventrikulärer Arrhythmie, die

zur kurzzeitigen Bewusstlosigkeit und auch zum plötzlichen Tod führen kann77,78. Prinzipiell erleiden

Männer häufiger eine Myokarditis als Frauen, dennoch entwickeln ältere Frauen oftmals schwerere

Einleitung

Krankheitsverläufe, welche mit lebensbedrohlichen kardialen Dysfunktionen bis hin zum Herzversagen

verbunden sein können79,80. Die Symptomatik bei Kindern hingegen ist weniger eindeutig, da sie viele

Parallelen zu anderen Kinderkrankheiten aufweist. Die Symptome können akutes Erbrechen, starke

Kopf- und Bauchschmerzen sowie übermäßige Müdigkeit beinhalten81,82. Neben nicht infektiösen

Ursachen chemischer, physikalischer oder toxischer Natur stellen zahlreiche infektiöse Erreger, darunter

Viren, Bakterien, Protozoen und Pilze, Auslöser der Myokarditis dar83 (Tab. 3). Lag die Prävalenz der

Myokarditis im Jahr 1992 bei etwa 8 / 100000 Erkrankten pro Jahr84 wurde sie innerhalb des Zeitraumes

von 1990 – 2013 bereits bei 22 /100000 Patienten jährlich indiziert85. Dabei werden etwa 20-25% durch

virale Erreger verursacht86. Darunter finden sich neben CVB auch Infektionen mit Adenoviren87, dem

Hepatitis C Virus88, Cytomegaloviren oder dem humanen Immundefizienz-Virus89.

Tabelle 2: Auslöser der Myokarditis. (modifiziert nach83).

Innerhalb der Pathogenese der CVB verursachten Myokarditis spielt der Serotyp B3 die gravierendste

Rolle, dennoch können auch die Serotypen B1, B2, B4 und B5 eine Myokarditis auslösen. Insbesondere

in Amerika und Westeuropa treten Infektionen mit dem Serotyp B6 sehr selten auf82,90. Primär

replizieren CVB nach fäkal-oraler Aufnahme innerhalb des schleimhautassoziierten lymphatischen

Gewebes des Pharynx, können bedingt durch ihre Säurestabilität den Magenraum passagieren und

Infektiöse Ursachen

nicht infektiöse Ursachen

RNA Viren: Picornaviren (Coxsackie A + B,

Echoviren, Polioviren, Hepatitisviren),

Orthomyxoviren (Influenza), Paramyoxoviren

(Respiratorische Syncytial-Virus, Mumps),

Togaviren (Rubella), Flaviviren (Denguefieber,

Gelbfieber)

Autoimmunerkrankungen: Dermatomyositis,

inflammatorische Darmerkrankungen,

Rheumatoide Arthritis, Sjögrens Syndrom,

Lupus erythematodes

DNA Viren: Adenoviren (A1, 2, 3 und 5),

Enteroviren (1 (B19V) und 2), Herpesviren

(humane Herpesviren 6 A/B, Cytomegalieviren,

Epstein-Barr-Viren, Varicella-Zoster-Viren),

Retroviren (HIV)

Medikamente: Aminophyllin, Amphetamine,

Antracyclin, Catecholamine,

Chloramphenicol, Kokain, Cyclophospamid,

Doxorubicin, 5-Fluoruracil, Mesylate,

Methylsergite, Phenytione, Zidovudine

Bakterien: Chlamydien (Clamydophila

pneumoniae/ psittacosis), Haemophilus

influenzae, Legionellen, Pneumophilien, Brucella

clostridium, Francisella tularensis, Neisseria

meningitis, Mykobakterien (Tuberkulose),

Salmonellen, Staphylokokken, Staphylococcus

aureus, Streptococcus pneumonia, Tularemia,

Tetanus, Syphilis,

Vibrio cholera

Hypersensitive Reaktionen bei

Medikamenten: Azitromycine,

Benzodiazepine, Clozapine, Cephalosporine,

Dapsone, Dobutamine, Lithium, Diuretika,

Thiazide, Methyldopa, Mexiletine,

treptomycine, Sulfonamide, Tetanustoxoide,

Tetrazyklinen

Protozoen: Entamoeba histolytica, Leishmania,

Plasmodium falciparum, Trypanosoma cruzi

Hypersensitive Reaktionen bei Toxinen:

Bienen, Vespen, Schwarze Witwe,

Skorpione, Schlangen

Einleitung

letztlich das lymphatische Gewebe des Gastrointestinaltraktes infizieren14,18,91. Der Großteil der

Infektionen verläuft asymptomatisch bzw. führt zu einem schwach ausgeprägten Krankheitsverlauf,

welcher sich mitunter in erkältungsähnlicher Ausprägung, die teils von Durchfallerscheinungen

begleitet wird, kenntlich macht23,82,92. Die im Darm stattfindende Virusvermehrung, welche mit einer

Virämie verbunden ist, kann sich jedoch abhängig von genetischen bzw. gesundheitlichen Dispositionen

oder Komorbiditäten der betroffenen Personen sowie der Virulenz und dem Tropismus des

Virusstammes systemisch über den Blutkreislauf ausbreiten4,82,93–95. Diese sekundäre Virämie betrifft

überwiegend Pankreas, Herz, Hirn und Muskelgewebe96–99. Insbesondere bei Säuglingen kommt es zur

systemischen CVB3-Manifestation, die aufgrund der Multiorganbeteiligung in etwa 50% der Fälle zum

Tode führt. Im Gegensatz dazu erleiden gesunde Erwachsene überwiegend Infektionen des Myokards,

die je nach individueller Kondition ohne Folgeschäden abklingen können82,94. Ursächlich für den

Krankheitsverlauf der CVB3-Myokarditis scheint die Interaktion zwischen Virus- und Wirtsfaktoren zu

sein. Verschiedene Studien zeigten, dass u.a. die Schädigung der Myozyten infolge lytischer

Virusreplikation65,100,101, eine übermäßige proinflammatorische Immunantwort durch T-

Lymphozyten94,102–104 sowie die Schädigung des Myokards über antikörpervermittelte

Autoimmunreaktionen, entscheidend den Grad der Myokarditis beinflussen105–108. Adaptive

Immunmechanismen grenzen die Infektion letztendlich ein und führen zur Eliminierung des Erregers,

so dass eine vollständige Ausheilung erfolgt82. Gelingt keine vollständige Beseitigung des Virus kann

es zu einer chronischen Inflammationsreaktion bzw. zu einer entzündungsfreien Persistenz von CVB3

in den T-Lymphozyten oder Makrophagen kommen. Bei der chronischen Myokarditis kann es, ausgelöst

durch anhaltende proinflammatorische Prozesse und fortschreitende Fibrose, zu ventrikulären

Funktionsstörungen kommen, die im schwersten Fall zu einer tödlich verlaufenden Herzinsuffizienz

führen. Kardiale Dysfunktionen treten jedoch gleichsam innerhalb der akuten Myokarditis auf. Die

DCM weist geringfügige bzw. keine entzündlichen Prozesse im Myokard auf, wobei trotz fehlender

cytophatischer Effekte infolge der lytischen Virusfreisetzung eine Schädigung der Myozyten induziert

wird77,109.

1.2.2 CVB3-Myokarditis im Mausmodell

Die Rolle des Maus-CVB3-Myokarditismodells innerhalb der klinischen Forschung ist von immenser

Bedeutung. Zahlreiche pathophysiologische Erkenntnisse der CVB induzierten Myokarditis beim

Menschen beruhen auf Befunden aus Mausmodellen108,110–113.

Basierend auf den Befunden zur CVB3 induzierten Myokarditis die aus Tierversuchen stammen, gibt es

derzeit drei häufig genutze Maus-Myokarditismodelle. Die experimentelle Autoimmunmyokarditis

(EAM) wird durch Adjuvantien und kardiales Myosin induziert. Das Hybrid-CVB3-Modell, welches

Ähnlichkeiten mit dem EAM aufweist, wird durch herzpassagiertes CVB3 und zerstörte Herzproteine

ausgelöst. Das dritte, klassische Modell, welches auch als Grundlage für die Etablierung der

Einleitung

Pankreasattenuation der vorliegenden Arbeit benutzt wurde, zeichnet sich dadurch aus, dass CVB3 auf

den Zellen kultiviert und aufgereinigt wird.114

Die immense strukturelle und funktionelle Ähnlichkeit des murinen CAR35,37 zu seinem humanen

Analogon36,37 ermöglicht so vermutlich die Replikation humanpathogener CVB-Stämme in Mäusen.

Kardiovirulente CVB-Stämme induzierten in genetisch prädisponierten Mäusen eine der humanen

Myokarditis ähnliche Entzündung des Herzmuskels113.

Jedoch gibt es Unterschiede zwischen der humanen und murinen Präsenz der CVB-Infektion. Im

Gegensatz zum Menschen ist im murinen Organismus, neben dem Herzen das Pankreas das für die

CVB3-Infektion empfindlichsten Organ. Insbesondere das exokrine Pankreas ist sehr stark von

inflammatorsichen Prozessen betroffen 95,115,116. Verschiedene klinische Symptome, wie der starke

Gewichtsverlust, das schmerzhafte Hochziehen des Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle,

können als direkte Folge der virusbedingten akuten Pankreatitis in Mäusen angesehen werden. Diese

fulminante Ausprägung der Pankreatitis stellt für die Tiere eine extreme Belastung dar, welche im

humanen Organismus in dieser Form nicht auftritt116. Ein weiterer gravierender Unterschied liegt darin,

dass im Menschen die CVB3-Replikation im endokrinen Pankreas stattfindet, in Mäusen jedoch im

exokrinen Pankreas.117.

Der Verlauf der Krankheit hängt von verschiedenen Faktoren ab, wie dem verwendeten Mausstamm,

dem Geschlecht, Gewicht und Alter der Tiere, dem Virusstamm bzw. daraus generierten modifizierten

Virusvarianten sowie der Virusdosis95,115,118–120.

Bezüglich ihres Virulenzphänotyps werden drei Typen von CVB3-Stämmen unterschieden, die als

avirulent, pankreovirulent und kardiovirulent bezeichnet werden82,95. Avirulente Stämme induzieren

keine Inflammation im murinen Pankreas- und Herzgewebe und sind oftmals von einer geringeren

Replikation begleitet. Pankreo- und kardiovirulente Stämme replizieren signifikant höher als avirulente.

Dabei induzieren pankreovirulente Stämme inflammatorische Krankheiten im murinen Pankreas,

wohingegen kardiovirulente Stämme zusätzlich eine Myokarditis verursachen. Dabei gilt jedoch, dass

in Mäusen eine akute Myokarditis nicht in Abwesenheit einer Pankreatitis auftritt. Die Pankreatitis

hingegen kann unabhängig von der Entwicklung einer Myokarditis induziert werden95.

Die maximalen viralen Titer sind in vielen Organen etwa 2-4 Tagen nach der Infektion detektierbar

bevor die Viren durch das murine Immunsystem bekämpft werden. Kardiovirulente CVB3-Stämme

können jedoch bis zu 14 Tage nach Infektion im Herzen detektiert werden118. In Abhängigkeit vom

Mausstamm können diese sowohl einen akuten als auch chronischen Verlauf der Myokarditis ausprägen.

Während in C57BL/6 Mäusen intraperitoneal (i.p.) applizierte CVB3 während der akuten Myokarditis

eliminiert werden, entwickeln A.BY/SnJ sowie SWR/J Mäuse eine chronische Erkrankung des Herzens

durch die Persistenz der viralen RNA im Myokard aber auch in der Milz sowie in den

Lymphknoten121,122.

Die murine als auch die humane Myokarditis kann in 3 Phasen unterteilt werden, welche fließend

ineinander übergehen, sodass sich Transitionsprozesse nicht immer eindeutig zuordnen lassen77,123.

Einleitung

Während der initialen, akuten Phase infiziert das Virus die Zielzellen. Sie umfasst den viralen Eintritt

sowie die Replikation des Virus und zudem die dadurch bedingte Aktivierung des Immunsystems. Die

beobachtete Myokardschädigung beruht auf intrazellulären Vorgängen während der Virusreplikation,

die zu einer Verformung der Zellkerne sowie Kondensation des Chromatins führen kann. Zudem kann

es bedingt durch Veränderungen der Membranpermeabilität, aber auch durch viral induzierte

proteolytische Prozesse innerhalb des Zytoskelettes, zur Zytolyse kommen. Diese Zellzerstörung ist

mikroskopisch ersichtlich 77,123,124.

In der sich anschließenden subakuten, autoimmunen Phase erfolgt eine starke Antwort des angeborenen

und adaptiven Immunsystems, welche infolge der anhaltenden sich negativ inotrop auswirkenden

Zytokinfreisetzung und destruktiver Immunprozesse zu einer starken Schädigung des Myokards führen

125,126. Innerhalb der vorangehenden unspezifischen angeborenen Immunantwort kommt es zu einer

starken Infiltration des Herzmuskelgewebes mit Makrophagen und Natürlichen Killerzellen (NK)118,124,

welche von der verstärkten Freisetzung der proinflammatorischen Zytokine Tumornekrosefaktor alpha

(TNFα), Interleukin-1beta (IL-1β), IL-2 und IL-6 sowie Interferon gamma (IFNγ) bzw. auch

antiinflammatorischer Zytokine wie IL-10 begleitet wird127. Die sich anschließende adaptive

Immunantwort erfolgt über zytotoxische T-Zellen und die Sezernierung spezifischer kreuzreaktiver

Antikörper aus B-Zellen128. Auch wenn diese Phase mit fulminanten Gewebsschädigungen verbunden

ist, kommt es in der Regel im Verlauf zu einer Eindämmung der Infektion und der Eliminierung des

Virus. In einigen Mausstämmen kommt es, ähnlich der humanen DCM, zu einer chronischen Phase der

Infektion, die sich durch eine Remodellierung des Myokards auszeichnet, in der es, infolge zunehmender

Dilatation, zu Funktionseinschränkungen und zur DCM kommen kann70.

1.2.3 Antworten des angeborenen Immunsystems auf CVB Infektionen

Die angeborene Immunantwort stellt die initiale Welle schneller zelluläre Reaktionen des

Immunsystems auf eindringende Mikroorganismen bzw. Fremdpartikel dar. Diese werden anhand

sogenannter pathogen-associated molecular patterns (PAMPs) erkannt, welche spezifisch für

bestimmte Gruppen von Pathogenen, nicht jedoch für einzelne Erreger sind129. Virus-spezifische

PAMPs sind beispielsweise ssRNA130, dsRNA131 oder unmethylierte CpG DNA132. Da die viralen

Nukleinsäuren erst erkannt werden können, wenn sie sich frei zugänglich im Zytoplasma befinden, wird

die angeborene Immunantwort ausgelöst nachdem die Virusinfektion bereits erfolgt ist. Die

virusinduzierte Bildung und Freisetzung von Typ I Interferonen (IFN) stellt die häufigste Form der

antiviralen Immunität dar, welche wiederum in der Expression antiviral wirkender Proteine in den

umliegenden Zellen resultiert133. Typ I IFN wiederum gliedern sich in verschiedene Subtypen von IFNα

und eine Form von IFNβ134. Coxsackieviren sind sensitiv gegenüber IFNβ135. Sowohl in Typ I IFN-

Rezeptor Knockout Mäusen136 als auch in IFNβ Knockout Mäusen137 zeigte sich die protektive Rolle

von Typ I IFN bzw. IFNβ während der Frühphase der Infektion mit CVB3. Über die beiden

zytosolischen Erkennungsrezeptoren retinoic acid inducible gene I (RIG-I) und melanoma

differentiation antigen 5 (MDA-5) bzw. den in den endosomalen Membranen lokalisierten Toll-like

Einleitung

Rezeptor 3 (TLR3, erkennt dsRNA) wird die Kinase IKKε/TBK1 aktiviert, welche über die

Phosphorylierung des Interferonregulierenden Faktors 3 (IRF-3) die Transkription von IFNβ

induziert138,139. Für dessen Transkription sind zudem die Transkriptionsfaktoren nuclear factor „kappa-

light-chain-enhancer“ of activated B-cells (NF-κB), activating transcription factor 2 (AFT-2) sowie

cellular-Jun (c-Jun) nötig. Durch die Bindung von IFNβ an die Typ I-Interferonrezeptoren der

umliegenden Zellen erfolgt, vermittelt über den janus activated kinase/signal transducers and activators

of trancription (Jak/STAT) Signalweg, die Expression verschiedener interferonstimulierter Gene und

folglich die Bildung antiviraler Proteine, wie die der Proteinkinase R, welche wiederum der

Virusvermehrung entgegenwirken140,141. Korrelierend mit den Befunden der Typ I-Interferonrezeptor-

und IFNβ-Knockout-Mäuse zeigte sich in MDA-5142 und TLR3143 defizienten Mäusen ebenfalls eine

verstärkte Pankreatitis und erhöhte Letalität in der Frühphase einer CVB3-Infektion, wenngleich keine

Veränderung der viralen Titer, sondern lediglich eine Verzögerung der Virusreplikation zu beobachten

war. Demnach reduziert IFNβ die Sterblichkeit während der CVB-Infektion unabhängig von der

Beeinflussung der viralen Titer.136 Die Aktivierung von IRF-3 erfolgt je nach Erkennungsrezeptor

vermittelt über das Adaptorprotein mitochondrial antiviral-signaling-protein (MAVS; - MD5) bzw.

Toll/interleukin-1 receptor (TIR)-domain-containing adaptor protein inducing interferon beta (TRIF; -

TLR-3). Coxsackieviren wiederum sind in der Lage über die Protease 3C MAVS bzw. TRIF zu spalten

und somit die IFN-Antwort zu unterbinden144. Die ssRNA der Coxsackievieren wird über TLR7 und

TLR8 erkannt, was zur Sekretion von Typ I IFN bzw. anderen proinflammatorischen Zytokinen wie IL-

6 oder TNFα führt. Diese über TLR7/8 vermittelten Signalwege erfolgen, verglichen mit den über TLR3

bzw. MDA5 initiierten, spät innerhalb der Infektion145–147. Auch wenn CVB über verschiedene

Erkennungsrezeptoren erkannt werden kann, scheint der TLR3 eine übergeordnete Rolle in der

Erkennung dieses Virus zu spielen, da TLR3 defiziente Mäuse weder die CVB3- bzw. CVB4-

Replikation kontrollieren konnten, noch die Aktivierung anderer alternativer Signalwege eine

signifikante protektive Wirkung zeigte148,149. Infektionen mit CVB3 zeigten, dass sowohl NK-Zellen,

Makrophagen als auch dendritische Zellen an der Sekretion proinflammatorischer Zytokine bzw. von

Mediatoren beteiligt sind150–152. In Mäusen führte die Depletion von NK-Zellen zu erhöhten CVB3-

Titern in Herz und Pankreas153. Ein adoptiver Transfer von Makrophagen aus Wildtyp-Mäusen in mit

CVB4 infizierte TLR3-Knockout Mäuse verringerte die kardiale Inflammation und resultierte in einer

geringeren Sterblichkeit infolge der Infektion148. In humanen Monozyten bewirkte die Infektion mit

CVB3 die Freisetzung der pro-inflammatorischen Zytokine TNFα, IL-1β und IL-6154,155. Zudem

entwickelten IL-6 defiziente Mäusen infolge einer CVB3-Infektion eine chronische autoimmune

Myokarditis aus156. Somit scheint ein Gleichgewicht zwischen Zeitpunkt, Menge und Dauer der

Sekretion verschiedener Zyto- und Chemokine, welche infolge der CVB3-Infektion exprimiert werden,

den Verlauf der Infektion bzw. die Ausbildung einer angemessenen antiviralen Immunantwort stark zu

beeinflussen.

Einleitung

1.2.4 Antworten des adaptiven Immunsystems auf CVB Infektionen

Das adaptive Immunsystems agiert über zwei verschiedene Formen der Immunantwort157. Die humorale

Immunantwort erfolgt über die von den B-Lymphozyten produzierten Antikörpern, welche infektiöse

Partikel binden147,157. T-Lymphozyten hingegen erkennen über den T-Zell-Rezeptor, einen

Proteinkomplexes auf ihrer Oberfläche, spezifisch Antigenfragmente, die ihnen über die major

histocomatibility complex (MHC)-Moleküle anderer Zellen präsentiert werden157. T-Zellen können

anhand ihrer immunphänotypischen Oberflächenmerkmale, den cluster of differentiation (CD), die als

Ko-Rezeptoren fungieren, in CD4+ und CD8+-T-Zellen unterteilt werden158. CD8+-T-Zellen erkennen

vom MHC-I-Komplex präsentierte Antigene und sezernieren daraufhin Perforine oder andere

apoptotisch wirkende Substanzen, wohingegen CD4+-T-Zellen nur die über den MHC-II Komplex

präsentierten Antigene erkennen. MHC-II Komplexe werden ausschließlich von spezifischen

antigenpräsentierenden Zellen wie DCs, Makrophagen oder B-Zellen exprimiert, während MHC-I-

Komplexe, bis auf wenige Ausnahmen, von allen Zelltypen in Säugetieren exprimiert werden158.

CVB Infektionen induzieren eine starke humorale Immunantwort, bei der sowohl im Menschen159 als

auch im Mausmodell160 in der frühen Infektionsphase zunächst spezifische Immunoglobuline der Klasse

M (IgM) gebildet werden. Die spätere und persistente humorale Immunantwort wird maßgeblich über

die Bildung von Immunoglobulinen der Klasse G (IgG) reguliert160. Während sich im Menschen IgMs

primär gegen das VP1 Protein richten159, wurde das gleiche in Mäusen für IgGs gezeigt160. Die Bildung

großer Mengen von Antikörpern infolge einer CVB Infektion kann jedoch auch verstärkend auf die

durch die Infektion induzierte Immunantwort wirken und zu einer Verstärkung der Infektion führen161.

Eine adäquate Immunantwort kann demnach nur über eine streng regulierte Antikörperfreisetzung

gewährleistet werden kann. Ob bzw. zu welchem Anteil CD4+-T-Zellen die B-Zell-vermittelten

Antikörperreaktionen unterstützen ist bislang nicht eindeutig geklärt. In MHC-II defizienten Mäusen

führte die CVB3-Infektion zur Produktion nicht neutralisierender CVB3-spezifischer IgGs162,

wohingegen T-Zell defiziente Mäuse neutralisierende Antikörper bildeten104,163. Die Bildung CVB3-

spezifischer Antikörper erfolgt dabei geschlechtsspezifisch. So zeigten weibliche Balb/C-Mäuse eine

über die T-Helferzellunterart 2 (Th2) -vermittelte vermehrte Bildung von IgG1-Antikörpern

wohingegen männliche Tiere vermittelt über die T-Helferzellunterart 1 (Th1) IgG2a bildeten164. B-Zell

Knockout Mäuse schafften es nicht die CVB3-Infektion zu eliminieren, sie entwickelten chronische

Infektionen begleitet von hohen Virustitern in verschiedenen Organen, was zu Krankheiten wie

myokardialer Fibrose und ventrikulärer Dilation führte128. Der Transfer von B- und T-Zellen aus CVB3

immunisierten Mäusen in B-Zell Knockout Mäuse zeigte, dass die B-Zellen während der nachfolgenden

CVB3-Infektion entscheidender zur Immunantwort beitrugen als T-Zellen128,165. Bereits 1995 zeigte die

Gruppe um Geller et al., dass der passive Transfer spezifischer Immunoglobuline in ein Kind, welches

an akuter lymphatischer Leukämie litt und zudem eine CVB4 induzierte Meningoenzephalitis aufwies,

die CVB-Titer senken konnte166.

Einleitung

Mäuse die weder ausgereifte B- noch T-Zellen besitzen, entwickeln während einer CVB3-Infektion eine

schwere, tödlich verlaufende Myokarditis, induziert durch extrem hohe virale Titer im Herzen167. Der

Beitrag von T-Zellen an der Immunantwort gegen CVB3-Infektionen unterscheidet sich dabei sehr stark

innerhalb verschiedener Mausstämme. So zeigten T-Zell-defiziente Balb/C-Mäuse104 verglichen zur

Wildtypkontrolle keinerlei Veränderung der CVB Replikation, wohingegen T-Zell-defiziente NFR- und

C3H-Mäuse erhöhte virale Titer aufwiesen168,169. Auch für die T-Zell-Immunantwort zeigte sich, dass

diese immunpathologisch wirkt, so dass trotz Verringerung der viralen Titer die Ausprägung der

Myokarditis verstärkt wird. Im Gegensatz zu vielen anderen Virusinfektionen induziert CVB3 lediglich

eine geringe primäre CD8+-T-Zellimmunantwort, welche jedoch nicht auf die geringe Immunogentität

der CVB-Proteine zurückzuführen ist102,170–172. Vielmehr verhindert das Virus die MHC-I-vermittelte

Präsentation von Antigenen. Dennoch tragen CD8+-Gedächtnis T-Zellen, die bereits auf geringere

Mengen von MHC-Peptiden reagieren als native CD8+-T-Zellen, zum Schutz vor CVB3-Infektionen

bei173. CVB nutzt dabei zwei Mechanismen um der MHC-I Epitoppräsentation zu entgehen. Zum einen

können die viralen Proteine 2B, 2BC und 3A eine Zerstörung des Golgi-Apparates und damit den

Austritt von Proteinen an die Zelloberfläche verhindern. Zum anderen verstärken sie endozytotische

Prozesse, was dazu führt, dass auf der Zelloberfläche präsentierte Proteine wieder internalisiert werden

und somit unzugänglich sind174–179. Im Gegensatz dazu reicht die Menge an durch MHC-II präsentierten

viralen Epitopen aus, um eine effiziente CD4+-T-Zellantwort zu induzieren, was aufgrund des Th1-

basierten Zytokinprofils zur Ausprägung von CD4+-Gedächtnis T-Zellen führt173.

1.2.5 Präventive und therapeutische Ansätze gegen CVB-Infektionen

Obwohl zahlreiche Strategien zur Generierung von Impfstoffe gegen CVB entwickelt wurden, darunter

die Immunisierung mit inaktiviertem Virus, DNA-Plasmide, die virale Proteine exprimieren180 oder

attenuierte Lebendimpfstoffe181, existiert derzeit kein klinisch verfügbarerer Impfstoff.181,182 Da sich

RNA im Gegensatz zu DNA nicht in das zelluläre Genom integrieren kann, scheint der Einsatz RNA-

basierter Vakzine sicherer zu sein. Ein von Hunziker et al. generierter RNA-basierter CVB-Impfstoff

schützte Mäuse zwar vor der CVB3-Infektion, führte jedoch nicht zur Bildung neutralisierender

Antikörper183. Eine 2004 von Yanagawa et al. bzw. 2006 von Lim et al. beschriebene neuartige

Strategie, die sowohl für die therapeutische als auch prophylaktische Anwendung geeignet ist, basiert

auf löslichen Virusrezeptorfusionsproteinen, welche in Mäusen sowohl die CVB-Titer als auch das

Ausmaß der kardialen Inflammation sowie der fibrotischen Veränderungen reduzieren konnte184,185.

Eine weitere Strategie basiert auf der Verabreichung von Immunoglobulinen, welche aufgrund der

resultierenden mitunter nur geringen Antikörpertiter sowie auftretender intratypischer Variation gegen

bestimmte Serotypen kontrovers diskutiert wird186.

In therapeutischen Ansätzen finden antivirale Substanzen wie Ribavirin, welches ursprünglich als Anti-

Picornavirusagenz entwickelt wurde und die Bindung der Virionen an die Wirtszellen unterbindet187,188

bzw. Pleconaril, welches eine starke antivirale Wirkung gegen CVB-Stämme mit Isoleucin bzw. Valin

Einleitung

an Position 1092 in der VP1-Region aufweisen189, Verwendung. Ein neueres antivirales Generikum ist

der Inhibitor TP219. Dieser bindet und depletiert zelluläres Glutathion, was dazu führt, dass das

Virusassembly, nicht aber die Replikation des Virus unterbunden wird. Intraconazol, ein

Breitbandinhibitor von Enteroviren, interferiert mit den Oxysterol-Bindeproteinen, was dazu führte, das

während der Formation viraler Replikationsorganellen der Transport von Cholesterol und

Phoshatidylinositol-4-Phosphat zwischen den Membranen verhindert und somit die

Enterovirusreplikation inhibiert wurde190.

Neben besagten antiviralen Therapeutika, welche überwiegend in die Klasse antiviraler

Breitbandwirkstoffe einzuordnen sind, behandelt ein Großteil der therapeutischen Maßnahmen

ausschließlich Symptome, die durch CVB-Infektionen hervorgerufen werden können, wie

beispielsweise die Herzinsuffizienz bzw. auftretende Herzrhythmusstörungen.

Ein weiterer neuartiger Ansatz zur spezifischen Abwehr von CVB-Infektionen stellt die Nutzung RNA-

Interferenz (RNAi) basierter Strategien dar. Dabei können die Therapieansätze sich sowohl gegen virale,

für die Virusreplikation essentielle Gene bzw. gegen zelluläre Gene, welche im Lebenszyklus der Viren

eine Rolle spielen, richten. 2005 zeigten Yuan et al., dass die CVB-Infektion in HeLa-Zellen und

murinen Kardiomyozyten durch den Einsatz einer small interfering RNA (siRNAs) gegen die Protease

2A verringert wird191. Ebenfalls 2005 zeigten Merl et al., dass in Mäusen eine siRNA, die sich gegen

die 2A-Region von CVB richtet, die Virustiter verringert und das Überleben der Mäuse verlängert. Auch

siRNA-Moleküle, welche gegen die 3CPro-Region von CVB gerichtet sind, verringerten die

Virusreplikation192. Um zu verhindern, dass RNA-Viren, welche schnell Mutanten ausbilden können,

resistent gegen den Einsatz von siRNA Molekülen werden (Escape-Mutanten), wurden mitunter drei

verschiedene siRNA-Moleküle kombiniert. Ein anderer Ansatz zielt darauf ab die Bildung zelleigener

Proteine, welche für die Virusreplikation essentiell sind, mittels spezifischer siRNAs zu reduzieren. So

reduzierte der Einsatz einer CAR-spezifischen siRNAs die CVB3-Replikation193. Spezifische präventive

bzw. therapeutische Ansätze gegen CVB3 konnten bislang klinisch nicht etabliert werden, sind jedoch

in Anbetracht der hohen Morbidität bei immunsupprimierten Patienten und Kleinkindern von

ökonomischer und klinischer Relevanz194.

Um den Einsatz RNAi-basierter Therapiemaßnahmen im Menschen zu evaluieren laufen derzeit etwa

20 klinische Studien bezüglich deren Sicherheit und Verträglichkeit. Lediglich eine dieser klinischen

Studien beinhaltet ein microRNA (miRNA) Therapeutikum, welches von der dänischen Firma Santaris

Pharma entwickelt wurde. SPC3649 (miravirsen) inhibiert die miRNA-122 (miR-122)195. Einige andere

miRNA-Therapeutika befinden sich jedoch derzeit in vorklinischen Studien und zeigen

vielversprechende Ergebnisse. Den Großteil derzeitiger RNAi-Therapeutika in klinischen Studien

stellen siRNAs dar, die überwiegend innerhalb der Krebstherapie bzw. in verschiedenen degenerativen

Erkrankungen getestet werden. Innerhalb der Infektionsforschung konnten hinsichtlich RSV-Viren

bereits zwei Phase 1 Studien erfolgreich in gesunden Probanden abgeschlossen werden196. Basierend

darauf evaluiert Alnylam Pharmaceuticals (Cambridge, MA, USA) aktuell in einer klinischen Studie der

Einleitung

Phase 2b die anti-RSV-Aktivität sowie die Verträglichkeit und Sicherheit von ALN-RSV01 in

erkrankten Probanden197.

1.3 Genregulation durch nichtkodierende RNAs

1.3.1 Small-interfering RNA aund microRNA

Nichtkodierende RNAs sind RNAs, welche keine Proteine kodieren. Bevor die Rolle der

nichtkodierenden Genomregionen erforscht wurde, sah man sie fälschlicherweise zunächst als

nichtfunktionelle Einheiten an198. Durch die Entwicklung neuartiger molekularbiologischer

Technologien war es im Zuge der Genomsequenzierung möglich, neue Klassen nichtkodierender

regulatorischer Elemente zu identifizieren. Die Bedeutung und Funktionen dieser nichtkodierenden

RNAs wurden bedeutsamer als ursprünglich erwartet, als sich zeigte, dass sie über die Modulation der

Genexpression Einfluss auf die Ausprägung des Phänotyps nehmen können199,200. Basierend auf der

Länge ihrer Sequenz unterscheidet man zwischen langen (>200nt) und kurzen (< 200 nt)

nichtkodierenden RNAs. Zu den kurzen nichtkodierenden RNAs zählen unter anderem siRNAs und

miRNAs201, die sich wie Tabelle 4 zeigt, bezüglich ihrer morphologischen und funktionellen

Eigenschaften unterscheiden. Beide Typen kurzer nichtkodierender RNAs spielen eine besondere Rolle

bei der Genregulation und stehen daher im Interesse zahlreicher Untersuchungen202. Das therapeutische

Potential dieser Moleküle konnte bereits für verschiedene Krankheiten nachgewiesen werden, darunter

Krebs und Infektionskrankheiten203–205.

Tabelle 3: Eigenschaften der siRNAs und miRNA (modifiziert nach202).

siRNA

miRNA

Prozessierung

durch Drosha im

Nukleus

entfällt Polycistronisches Primär-Transkript (pri-

miRNA) wird von RNAse III (Drosha) in

Vorläufer miRNA (pre-miRNA) gespalten

Prozessierung

durch Dicer im

Zytoplasma

Doppelsträngige RNA (30-100 bp) Vorläufer miRNA (pre-miRNA) 70-100 bp

lang mit Nichtübereinstimmungen,

Hairpinstruktur

Struktur

RNA-Duplex aus 21-23 Nukleotiden mit

jeweils 2 Nukleotiden-Überhang am 3’

Ende

RNA-Duplex aus 19-25 Nukleotiden mit

jeweils 2 Nukleotiden-Überhang am 3’

Ende

Komplementarität

Vollständig Komplementarität

Unvollständige Komplementarität

Mechanismus der

Genregulation

Endonukleolytische Spaltung der mRNA Translationsrepression

Degradation von mRNA

Ziel-mRNA

Eine

Mehrere (über 100 gleichzeitig)

Anwendung

Therapeutisches Mittel

Diagnostik und Biomarker

Einleitung

Im Vergleich zu konventionellen kleinen therapeutischen Molekülen bieten siRNAs und miRNAs den

Vorteil der spezifischen, personalisierten Therapiemöglichkeit206. Darüber hinaus können theoretisch

gegen alle Gene zielgerichtet therapeutische siRNAs designt werden.

1.3.2 RNA-Interferenz

Bei der RNA-Interferenz (RNAi) handelt es sich um einen natürlich vorkommenden, zellulären Prozess,

welcher eine wichtige Rolle bei der Regulierung der Genexpression spielt und durch die

sequenzspezifische Bindung an die mRNA zum Translationsstop bzw. zur Degradation der mRNA

führt207. Der Mechanismus der RNAi wurde erstmals im Jahr 1998 von Fire und Mello beschrieben. Sie

beobachteten, dass die Injektion kleiner Mengen von dsRNA verglichen mit der Injektion großer

Mengen von Antisense-Transkripten in Caenorhabditis elegans ein stärkeres Silencing der

Genexpression bewirkte208. Dieser Vorgang konnte 2001 auch für Säugetiere nachgewiesen werden209.

Prinzipiell verläuft die RNAi nach einem definierten Muster. Dafür wird dsRNA entweder von

zellulären Genen transkribiert oder von außen in die Zellen eingeführt (Abb. 5). Diese dsRNAs werden

vom Ribonuklease (RNAse) III-like Enzym, welches auch als Dicer bezeichnet wird, im Zytoplasma zu

doppelsträngigen siRNAs prozessiert. Die 21-23 nt langen siRNAs interagieren mit dem sogenannten

RNA induced silencing complex (RISC) und aktivieren diesen. RISC ist ein Multiproteinkomplex, der

unter anderem die Endonuklease Argonaute 2 (AGO2) enthält, welche den passenger-Strang vom

Leitstrang der dsRNA trennt und abbaut. Der Leitstrang assoziiert mit dem RISC und erhält so seine

Spezifität. Dadurch kann RISC über die Sequenz des Leitstranges spezifisch an komplementäre

Sequenzen in der mRNA binden. AGO2 schneidet dann in der Mitte der hybridisierten Sequenz die Ziel

mRNA, so dass spezifisch ein Gen stillgelegt wird (Abb. 5)207,210.

Die durch die miRNAs vermittelte Stilllegung von Genen verläuft ähnlich zu der von siRNAs

posttranskriptional. MiRNA-Gene werden im Zellkern mittels Polymerase II transkribiert, es entstehen

lange ds stem-loop Strukturen, die sogenannten primären miRNAs (pri-miRNAs). Die pri-miRNAs

werden durch den Drosha-Komplex in 70-100 nt lange Duplexstrukturen prozessiert, den precursor

miRNAs (pre-miRNAs). Diese pre-miRNAs werden durch das Transportprotein Exportin-5 über die

Poren der Kernmembran in das Zytoplasma transportiert, wo diese durch den Dicer-Komplex zu 18-

25 nt langen Fragmenten prozessiert werden. Der miRNA-Duplex assoziiert mit RISC zu miRISC. Im

Anschluss wird das miRNA-Duplex entwunden und der passenger-Strang über AGO2 abgetrennt. Der

aktivierte miRISC kann nun spezifisch an die Ziel-mRNAs binden. Dabei bindet miRISC bevorzugt

Zielstrukturen am 3-Ende (3’UTR) innerhalb der mRNA und führt über den RNAi-Mechanismus zum

Abbau der mRNA bzw. zum Translationsabbruch. Bei einer vollständigen Komplementarität zwischen

der mRNA-Sequenz und miRISC kommt es zum Abbau der mRNA, während die in Säugerzellen

häufiger auftretende unvollständige Komplementarität zum Translationsabbruch führt211,212. Seltener

können auch die 5’UTR213,214 bzw. proteinkodierende Bereiche215,216 Bindungsstellen darstellen. So

Einleitung

zeigte Duursma et al., dass die miRNA-148 an die für das humane DNA-Methyltrasnsferase 3b

(DNMT3b)-Protein kodierende Region binden kann215.

Bislang wurden mehr als 1000 zelluläre miRNAs gefunden, die etwa 30% aller tierischen Gene post-

transkriptional regulieren211. Diese Regulation betrifft zahlreiche biologische Mechanismen,

einschließlich Proliferation, Differenzierung, Apoptose sowie die pathogeninduzierte Immunantwort.

Dabei wirken einige zelluläre miRNAs direkt auf die virale Replikation. Beispielsweise begünstigt die

spezifisch in der Leber exprimierte zelluläre miRNA-122 die Replikation des Hepatis C-Virus217,

wohingegen das Humane Immunodefizienz Virus-1 (HIV-1) aktiv die Expression des polycystronischen

miRNA Clusters miRNA-17/92 unterdrückt um effizient replizieren zu können218. Nelson et al. zeigten,

dass die CVB3-Infektion eine verstärkte Expression der miRNA-21 bewirkt, was zu einer Degradation

von Desmin und so zu einer Zerstörung der Desmosomen in HL-1-Zellen und in den Kardiomyozyten

männlicher A/J- Mäuse führte219. Auch die Gruppe um Tong et al. zeigte den Einfluss einer miRNA auf

die Pathogenität von CVB3 in Balb/C-Mäusen220. Hier wurde nachgewiesen, dass die miRNA-10a*

(passenger Strang des miRNA-Duplex, auch als star strand bezeichnet) sich gegen die kodierende

Sequenz der 3D-Polymerase richtet, was zu einer positiven Genregulation und so zu einer verstärkten

Biosynthese des Virus führte220. In CVB3 infizierten Mäusen verstärkte die miRNA-155 die

überschüssige inflammatorische Immunantwort und somit die Schädigung des Myokards. Die

Inhibierung der miRNA-155 wiederum, resultierte in einer geringeren Schädigung des Myokards in der

akuten Phase der Myokarditis in den Mäusen. Daher eignet sich die miRNA-155 als potentielles

therapeutisches Mittel zur Regulation der CVB3 induzierten Myokarditis. 221 Wiederum kodieren einige

dsDNA Viren, wie das Herpes Simplex Virus-1222 oder das Eppstein-Barr-Virus223, miRNAs, welche

die virale als auch die zelluläre Genexpression regulieren können.

Einleitung

Abbildung 5: Mechanismus der RNA-Interferenz.

Schematische Darstellung des RNA-Interferenz Mechanismus modifiziert nach202. [miRNA: microRNA, siRNA: small-

interfering RNA; Pri-miRNA: primäre miRNA, Pre-miRNA: precursor miRNA; ds: doppelsträngig, DICER: Ribonuklease

(RNAse) III-like Enzym; RISC: RNA induced silencing complex; AGO: Argonaute 2 (Endonuklease); UTR: Nichttranslatierte

Region, mRNA: messenger RNA]

1.3.3 Insertion von miRNA-Zielsequenzen zur Regulation der viralen Pathogenese bzw.

des viralen Tropismus

Innerhalb der letzten Jahre etablierte sich die Insertion sogenannter artifizieller miRNA-Zielsequenzen

(target sequences, TS) in ein Transgen als vielversprechende Strategie innerhalb verschiedener

gentherapeutischer Ansätze224. Durch die Bindung der miRNAs an die inserierten miRNA-TS kommt

es zu einer posttranskriptionalen Stilllegung des entsprechenden mRNA-Transkriptes, gegen das sie

gerichtet sind. Diese Methode der Genregulation basiert auf dem in Kapitel 1.3.2. beschriebenen

Einleitung

Mechanismus der RNAi225,226. Dabei werden die miRNAs herkömmlicherweise aus der pri-miRNA

prozessiert, welche über haarnadelförmige Faltung stem-loop Strukturen ausbildet. Die pri-miRNA wird

über RNAse-Proteine im Nukleus als auch im Zytosol in kurze RNA-Duplexstrukturen, bestehend auf

Leit- und Folgestrang, prozessiert212,227–229. Der Leitstrang wird in RISC integriert, während der

Folgestrang, in der Literatur auch als miRNA* bezeichnet, abgebaut wird230. Alternativ können jedoch

auch beide Stränge der RNA-Duplex zu funktionellen reifen miRNAs werden231–233. Die miRNA

assoziiert im RISC mit einem der AGO-Proteine und führt über Basenpaarung mit der entsprechenden

mRNA zur Repression der Proteinsynthese bzw. aktivieren einige miRNAs auch die Translation der

entsprechenden mRNA211,234. Während sich die TS in Pflanzen überwiegend in proteinkodierenden

Regionen befinden, liegen sie in Tieren meist als sich wiederholende Sequenzfolgen in der 3’UTR der

mRNA215,235,236. Die Spezifität der Bindung von miRNA und mRNA beruht auf der perfekten

Übereinstimmung zwischen der seed Sequenz der miRNA und der entsprechenden mRNA. Die seed-

Region ist eine konservierte Sequenz, welche sich an Position 2-7 oder 2-8 des 5’-Endes der miRNA

befindet211,236,237. MiRNAs, welche die gleiche seed-Sequenz besitzen gehören zur selben miRNA-

Familie und regulieren die gleichen mRNA-Transkripte235,238. Neben der Übereinstimmung der seed-

Sequenz wird in Tieren die miRNA-mRNA-Interaktion durch die Nichtübereinstimmung zwischen den

Nukleotiden an Position 9-12 am 5’-Ende der miRNA reguliert, welche wahrscheinlich die AGO2-

vermittelte Spaltung der entsprechenden mRNA verhindern239,240. Zudem reicht die Übereinstimmung

der seed-Sequenz der miRNA mit der entsprechenden mRNA allein nicht zwangsläufig für die

Genrepression aus, so dass zusätzlich eine Komplementarität im Zentrum oder im 3’-Bereich der

miRNA zur Stabilisierung der miRNA-Bindung erforderlich ist. Durch suboptimale Übereinstimmung

in der seed-Region werden insbesondere Komplementaritäten der Nukleotide an Position 13-16 der

miRNA bedeutend235,239. Zusätzlich gilt, dass eine Adenosin-Uracil-reiche Nukleotidsequenz in der

Nähe der Zielsequenz die Repression verstärkt239. Auch wenn für die meisten TS-vermittelten

gentherapeutischen Ansätze eine perfekte Komplementarität zwischen TS und miRNA erforderlich ist,

zeigten beispielsweisen die Studien von Geisler et al. und Denzler et. al., dass eine nicht perfekte

Übereinstimmung zwischen TS und miRNA eine verstärkte Repression verursachten241,242.

Durch die Insertion geeigneter miRNA-TS in ein Transgen kann so die Expression der entsprechenden

mRNA durch über den RNAi-Mechanismus supprimiert bzw. reguliert werden. Normalerweise

vermittelt der Leitstrang der miRNA die Genrepression, sodass die entsprechende artifizielle miRNA-

TS in die jeweilige Expressionskassette des Transkripts inseriert wird. Kim et al. zeigten jedoch, dass

auch der passenger Strang der miRNA zur Regulation der Genexpression befähigt ist243.

Die Wirksamkeit der miRNA-regulierten Transgenexpression hängt von unterschiedlichen Faktoren ab.

So beeinflussen die zell- bzw. gewebespezifische Expression der miRNAs238,244 sowie das

Expressionslevel der jeweiligen miRNA245 den Erfolg der Regulation. Generell gilt, dass stärker

exprimierte miRNAs zu einer stärkeren Suppression der Zielsequenz führen246, dennoch verläuft die

Relation zwischen miRNA-Expression und der Repressionseffektivität nicht linear247. Brown et al.

Einleitung

definierten, dass mindestens 100 Kopien der entsprechenden miRNA / pg sRNA nötig sind, um die

Repression des mit TS modifizierten Transgens zu erzielen248. Wiederum besitzt nicht zwangsläufig

jede stark exprimierte miRNA den gleichen Effekt auf die Transgenexpression bzw. können

unterschiedlich stark exprimierte miRNA teilweise den gleichen Repressionseffekt aufweisen247.

Dennoch wird die entsprechende miRNA idealerweise stark in dem Zielgewebe exprimiert in welchem

das Transgen reprimiert werden soll und nur schwach bis gar nicht in Geweben wo dessen positive

Expression gewünscht ist249.

Neben der Auswahl der geeigneten miRNA beeinflusst die Anzahl der Sequenzwiederholungen241,250

der inserierten miRNA-TS bzw. die Kombination unterschiedlicher miRNA-TS241,251 die Effektivität

des De-Targetings. MiRNA-TS sollten vornehmlich in einer nicht zur Ausbildung von

Sekundärstrukturen neigenden Region des Transgens inseriert werden252. Doch auch wenn die 3’UTR

weniger zur Ausbildung besagter Strukturen neigt, wurden auch in der 5’UTR erfolgreich miRNA-TS

inseriert253,254. Zusätzlich zu dem bereits erwähnten positiven Effekt Adenosin-Uracil-reicher Regionen

für die Insertion von miRNA-TS demonstrierten Grimson et al., dass deren Insertion in unmittelbarer

Nähe eines Stopcodons wenig effektiv ist239. Mehrere Studien zeigten, dass eine Erhöhung der

Kopienzahl der inserierten miRNA-TS bis zu einer bestimmten Anzahl zu einer Verstärkung der

Repression führt. In HuH7-Zellen erhöhte sich der Effekt der Transgenrepression durch die miRNA122a

um etwa 12 % bei der Erhöhung der miRNA-TS-Anzahl von eins auf drei. Wiederum verstärkte sich

der Effekt nur um knapp 3 % wenn sechs miRNA-TS inseriert wurden246. Auch bei der Anzahl der

miRNA-TS spielt die Zielzelle eine Rolle für die Effektivität der Transgenrepression. In Thymozyten

unterschied sich die Effektivität der Repression zwischen zwei und vier inserierten miRNA-181-TS

nicht, wohingegen in peripheren T-Zellen die Repression durch vier miRNA-181-TS verstärkt wurde255.

Da zu hohe Kopienzahlen der inserierten miRNA-TS zu unerwünschten Effekten wie Übersättigung

oder der durch die Ziel-RNA vermittelten Degradation der entsprechenden miRNA führen können256–

258, kann die Insertion von miRNA-TS verschiedener miRNAs die Wirksamkeit der Repression

verstärken248,251. Insbesondere in Vektoren mit einem sehr kleinen Genom, die in ihrer

Verpackungsgröße limitiert sind, kann der Einsatz multipler miRNA-TS problematisch sein259–261.

Zudem erhöht der Einsatz zu vieler miRNA-TS die mögliche Ausbildung von Sekundärstrukturen,

welche so die Zugänglichkeit der miRNA-TS zu RISC unterbinden262. Weitere Punkte, welche die

Wirksamkeit der miRNA-TS-Insertion beeinflussen, sind die Position der Insertion in das Genom bzw.

in das Transkript sowie der Abstand zwischen den mehrfach inserierten miRNA-TS-Kopien263. Auch

wenn gezeigt wurde, dass die Insertion unmittelbar aufeinanderfolgender perfekt komplementärer

miRNA-TS sehr wirksam sein kann264,265, kam es bei nicht perfekter Übereinstimmung zu sterischen

Hinderungen bei der Bindung und somit zu einer Verringerung der Repression265,266. Zu lange

Sequenzen zwischen den miRNA-TS-Kopien können jedoch zur Ausbildung von Sekundärstrukturen

führen. Prinzipiell gelten drei bis sechs miRNA-TS-Kopien mit 4-10 Nukleotiden zwischen den

Einleitung

einzelnen Kopien als empfehlenswert, jedoch ist bei der Insertion von miRNA-TS von unterschiedlichen

miRNAs eine geringere Kopienzahl ausreichend224.

Brown et al. konnten 2007 erstmals zeigen, dass Transgene, denen miRNA-TS in die 3’UTR inseriert

wurden von den korrespondierenden miRNAs effizient abgebaut wurden248. Dafür inserierten sie in ein

GFP-Konstrukt TS, welche von der spezifisch in humanen, embryonischen Stammzellen exprimierten

miRNA-372 erkannt werden. Ausschließlich während differenzierter Stadien, in denen die miRNA-372

nicht exprimiert wird, konnte GFP detektiert werden208. Um off-target Effekte in gesunden Geweben zu

vermeiden bzw. um lediglich ausgewählte Zell- bzw. Gewebetypen zu adressieren, ist es bei der miRNA

vermittelten Suppression einer mRNA entscheidend, eine für die jeweilige Anwendung (Krankheit,

Gewebe, Differenzierungsgrad etc.) spezifische miRNA auszuwählen. Neben der Auswahl solcher

natürlich vorkommender miRNAs zeigten Hirosawa et al. kürzlich das Potential der Kombination aus

TS-vermittelter Suppression und miRNA-responsiver sich wiederholender kurzer palindromischer

Sequenzen, den clusterd regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) und den CRISPR-

assoziierten Systemen (Cas) für die Regulation gentherapeutischer Modulationen. Sie inserierten TS für

die miRNA-21 bzw. für die miRNA-302 in die 3’UTR der Cas9-mRNA (miRNA-Cas9 switch) und

zeigten in HeLa-Zellen (miRNA-21 positiv) sowie in humanen induzierten pluripotenten Stammzellen

(miRNA-302 positiv) zur regulierten, zelltypspezifischen Attenuierung der Cas9-Aktivität in

heterogenen Zellpopulationen267. Für eine Vielzahl gentherapeutischer Anwendungen, wie

beispielsweise die Ursachenforschung von Erbkrankheiten, ist es nötig, eine spezifische Zellpopulation

zu adressieren, so dass die gewählte miRNA spezifisch für deren Abstammung- bzw.

Differenzierungsstatus sein muss248. Induzierte pluripotente Stammzellen ermöglichen die gezielte

Analyse krankheitsspezifischer Zellen bzw. den Einsatz autologer Zellen für die Behandlung

degenerativer Erkrankungen268. Basierend auf der differentiellen Expression der reifen miRNA-let7a in

pluripotenten und sich differenzierenden bzw. differenzierten Zellen konnten mittels eines lentiviralen

Systems, welches auf der Insertion eines Fusionskonstruktes aus miRNA-let7a-TS und GFP basierte,

patientenspezifisch induzierte pluripotente Stammzellen isoliert werden. Potentiell ermöglicht dieser

Ansatz zudem die verlängerte Aufrechterhaltung der Pluripotenz268. Ein weiteres Anwendungsfeld der

miRNA-TS vermittelten Transgenregulation stellt die Regulation des Tropismus tumorspezifischer

onkolytischer Viren dar269. Dabei nutzt man die Tatsache, dass virale Proteine zu einer Inflammation in

den entsprechenden Zellen und deren Tod führen können. Durch den Einsatz tumorspezifischer Viren

kann so der Tod der entarteten Krebszellen vermittelt werden. Der Einsatz von miRNA-TS ermöglicht

dabei die kontrollierte Replikation der onkolytischen Viren, ohne dass diese durch das wirtseigene

Immunsystem attenuiert werden270. Onkolytische Adenoviren welche durch die Insertion von miRNA-

E1ATS modifiziert wurden, zeigten in murinen Hirntumormodellen eine hohe antitumorale Aktivität

und konnten gleichzeitig lang und effektiv in den Gliomen replizieren271. Die Modifikation

onkolytischer Adenoviren mittels miRNA-TS-Insertion wurde unteranderem für die konditionierte

Replikation in der Leber (miRNA-122a253, miRNA-199a272), im Pankreas (miRNA-216a, miRNA-

Einleitung

148a273) sowie in diversen weiteren Strategien verwendet224. Auch in anderen onkolytischen Viren, wie

dem Herpes Simplex Virus274 oder dem Vaccinia Virus275, konnte durch die Insertion von

entsprechenden miRNA-TS die virale Pathogenität für den Wirt reduziert werden, ohne dabei das

onkolytische Potential zu verringern. Zudem kann der Einsatz von miRNA-TS zur Erhöhung der

Sicherheit viraler Impfstoffe beitragen, was bereits mehrfach für Polioviren, Influenza A Viren oder

aber Flaviviren nachgewiesen wurden276.

In Coxsackieviren wurde diese neue Technologie erstmals 2008 von Kelly et al. genutzt, um die

Replikation eines Virus gewebsspezifisch zu supprimieren203. Hierzu wurden die miRNA-TS der

muskelspezifischen miRNA-133 und miRNA-206 in die 3’UTR des Coxsackievirus A21 (CVA21)-

Genom inseriert. Das rekombinante CVA21 wies typische Replikationseigenschaften in Zellen bzw.

Geweben auf, welche die miRNA-133 und miRNA-206 nicht exprimierten. Hingegen replizierte das

modifizierte CVA21 innerhalb des Muskelgewebes deutlich schlechter als der Wildtyp203. Die

Untersuchung der CVB3 ausgelösten Myokarditis in Mäusen unterliegt dem von Tracy et al.

beschriebenen Hypothese, dass auch kardiovirulente CVB3-Stämme keine Myokarditis ohne eine

vorgehende Pankreatitis verursachen können95. Dieser Sachverhalt limitiert die Aussagekraft der in

Mäusen generierten Befunde, da CVB3 induzierte Myokarditen im Menschen keine apperente

Pankreatitis vorhergehen muss. Verschiedene Studien zeigten, dass sich die miRNA-Expressionsmuster

von Herz und Pankreas während der CVB3-Infektion in Mäusen unterscheiden. Durch die Insertion

organspezifischer miRNA-TS in den entsprechenden CVB3-Stamm gegen miRNAs, welche verstärkt

im Pankreas, im Herzen jedoch kaum exprimiert werden, kann so eine gezielte Veränderung des CVB3-

Tropismus im Mausmodell erreicht werden. Dadurch ist es möglich, den Erregertropismus im murinen

System an den humanen anzugleichen und eine Myokarditis ohne Anwesenheit der Pankreatitis zu

untersuchen.

1.4 Zielsetzung

Das Ziel der vorliegenden Arbeit bestand darin pankreasattenuiertes CVB3 zu generieren, um damit ein

CVB3-Maus-Myokarditismodell zu etablieren und dieses auch hinsichtlich tierschutzrechtlicher

Aspekte weiter zu entwickeln. Entgegen der CVB3-Infektion im Menschen stellt im murinen

Organismus nicht das Herz, sondern das Pankreas, das für die CVB3-Infektion suszeptibelste Organ dar.

Verschiedene klinische Symptome, wie der starke Gewichtsverlust, das schmerzhafte Hochziehen des

Bauches sowie schnell auftretende Todesfälle können als direkte Folge der virusbedingten akuten

Pankreatitis angesehen werden. Diese fulminante Ausprägung der Pankreatitis stellt für die Tiere eine

extreme Belastung dar, welche im humanen Organismus in der Form nicht auftritt116.

Für die Entwicklung von pankreasattenuiertem CVB3 sollten miRNA-TS in das CVB3-Genom inseriert

werden, welche komplementär zu pankreasspezifisch exprimierten miRNAs sind. Binden diese

miRNAs an die inserierten CVB3-miRNA-TS, induziert dies im Pankreas den Abbau des CVB3-

Genoms über den Mechanismus der RNAi. Im Herzen hingegen erfolgt aufgrund fehlender Expression

Einleitung

dieser miRNAs keine Degradation des CVB3-Genoms, so dass in diesem Organ eine uneingeschränkte

Virusvermehrung stattfindet (Abb. 6).

Abbildung 6: Insertion pankreasspezifischer miRNA-Target Sites in das CVB3-Genom modifiziert den

viralen Tropismus im Mausmodell.

Replikationseigenschaften eines CVB3, welches mit miRNA-TS pankreasspezifischen miRNAs ausgestattet ist. CVB3 die

miRNA-TS pankreasspezifische miRNAs besitzen, können nicht im Pankreas replizieren. Im Herzen hingegen bleibt ihre

Replikation unbeeinflusst.

1) Im Fokus dieser Arbeit stand zunächst die Identifikation von miRNAs, welche im

Gesamtpankreasgewebe, insbesondere im exokrinen Pankreas, hohe Expressionslevel aufweisen und

gleichzeitig im Herzgwebe gering bis gar nicht exprimiert werden. Dies sollte mittels Affymetrix-

miRNA-Chip-Analyse sowie qRT-PCRs erfolgen. Anschließend sollten, basierend auf den

ausgewählten miRNAs, entsprechende miRNA-TSs in das Genom des CVB3-Stammes rCVB3.1

inseriert werden. Die Insertionen sollten für den CVB3-Plus -bzw. CVB3-Minusstrang in das 5’-

bzw. 3’-Ende des CVB3-Genoms erfolgen, um zu überprüfen, welche Insertionsstelle die

Virusreplikation am effektivsten supprimiert.

2) Daran anschließend sollte das Replikationsverhalten der generierten CVB3-Varianten sowie die

Effizienz der Inhibierung mittels der inserierten miRNA-TS in vitro in verschiedenen Zelllinien

untersucht und quantifiziert werden.

Einleitung

3) Die in vitro evaluierte, mittels miRNA-TS modifizierten CVB3-Varianten sollten in vivo auf ihre

Effizienz überprüft werden. Dafür sollte zunächst mittels einer Dosiseskalationsreihe die

erforderliche initiale Viruslast emittelt werden. Für die Etablierung und Optimierung des Modells

sollte der Outbred Mausstamm NMRI verwendet werden. Zusätzlich sollten ausgewählte

Experimente an dem Inbred-Stamm Balb/C durchgeführt werden. Um objektive Aussagen über die

Auswirkungen der CVB3 induzierten Myokarditis hinsichtlich kardialer Dysfunktionen zu treffen,

sollten hämodynamische Messungen der kardialen Funktionsparameter durchgeführt werden. Ziel

dieses Teilabschnittes war es in zwei Mausstämmen zu überprüfen, ob die in vitro evaluierte CVB3-

miRNA-TS-Variante in vivo eine akute Myokarditis induzieren kann, ohne dass die Mäuse eine

Pankreatitis ausbilden.

4) In weiteren in vivo Versuchen sollte zudem untersucht werden, ob das pankreasattenuierte CVB3

auch eine chronische Myokarditis induziert. Dafür sollte ein 28-tägiges Infektionsmodell

(chronisches CVB3-Modell) in NMRI-Mäusen etabliert und entsprechend der für das akute Modell

eingesetzten Analysemethoden validiert werden.

Material und Methoden

2 Material und Methoden

2.1 Materialien

2.1.1 Geräte

Tabelle 4: Geräte.

Gerätename

Hersteller

Autoklav Laboklav MV80

SHP Steriltechnik AG, Detzel Schloss, D

Advanced Centrifuge J-E

Beckman Coulter, Krefeld, D

Advanced Primus 25 Thermal Cycler

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

CO2-Inkubator HERAcell® 240i

Thermo Scientific, Karlsruhe, D

CO2-Inkubator MCO-20AIc

Sanyo, München, D

Elektrophoreseeinheit PerfectBlue Mini M

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

Elektrophoreseeinheit X-Cell SureLock

Life Technologies, Darmstadt, D

Flaschenfilter 0,22 und 0,45 µm

Millipore, Billerica, Massachusetts, USA

Fluoreszenzmikroskop Observer Z1

Zeiss, Berlin, D

Geldokumentation UV Solo TS

Biometra-Analytik Jena, Jena, D

Gewebehomogenisator VDI 12

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Mikroskop Primo Vert

Zeiss, Berlin, D

NanoDrop 2000

Peqlab Biotechnologie GmbH, Erlangen, D

PALM Laser Microbeam und Pressure Catapulting

Carl Zeiss Microimaging GmbH, Berlin, D

PCR Thermocycler T Personal

Biometra, Göttingen, D

Reaktionsgefäße für 0,5 ml, 1,5 ml

Eppendorf, Köln, D

Schüttelinkubator 37 °C (Typ 3032-3033)

GFL, Burgwedel, D

Sterilbank MSC Advantage 1.8

Thermo Scientific, Karlsruhe, D

Sterilbank MSC 2020 1.2

Thermo Scientific, Karlsruhe, D

Thermomixer Comfort 1,5 ml

Eppendorf, Hamburg, D

Tischzentrifuge 5415R

Eppendorf, Hamburg, D

Tischzentrifuge Heraeus Fresco 17

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D

Tischkühlzentrifuge Sigma 3K30

DJLabcare, Buckinghamshire, England

TriStar2 Multimode Reader LB942

Berthold Technologies, Bad Wildbad, D

Ultrazentrifuge LE80

Beckman Coulter, Krefeld, D

Ultrazentrifuge Optima L-90K

Beckman Coulter, Krefeld, D

Vortexer (Typ REAX top)

Heidolph Instruments, Schwabach, D

V-650 Spectrophotometer

Jasco Inc., Easton, Pennsylvania, USA

Wasserbad 37 °C (Typ F4391)

Haake, Karlsruhe, D

Wasserbad 56 °C, 60 °C (Typ 1002-1012)

GFL, Burgwedel, D

Wipptisch (Typ Rocking Platform WT15)

Biometra, Göttingen, D

Ultraturrax

IKA®-Werke GmbH, Staufen, D

Material und Methoden

2.1.2 Verbrauchsmaterialien

Tabelle 5: Verbrauchsmaterialien.

Bezeichnung

Hersteller

Einweg-Kanülen (0,3 und 0,45 mm)

BD Microlance™ 3, Heidelberg, D

Einweg-Pipetten, serologisch (2, 5, 10 und 25 ml)

Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, D

Einwegskalpell

B Braun, Hessen, D

Einweg-Spritzen (1 ml)

H. Rotert GmbH & Co. KG, Bad Iburg, D

Kryoröhrchen (1,8 ml)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

MicroAmpTM Optical 96-Well Reaction Plate

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D

Mikrotiterplatten, 96 well

Berthold Technologies GmbH, D

Parafilm

Pechiney, GmbH, Düsseldorf, D

Petrischalen (10 cm)∅

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Pipettenspitzen, gestopft (1000, 200, 10 µl)

SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, D

Reaktionsgefäße (0,25, 0,5, 1 und 2 ml)

SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, D

Zellkulturflaschen (25; 75 und 175 cm2)

SARSTEDT AG & Co. KG, Nümbrecht, D

Zellkulturplatten (24, 12 und 6 Vertiefungen)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Zellkulturschalen (10 cm ∅)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Zentrifugenröhrchen (15 und 50 ml)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

2.1.3 Chemikalien

Tabelle 6: Chemikalien.

Bezeichnung

Hersteller

Agarose (universal)

Rapidozym, Berlin, D

Bovines Serumalbumin (BSA)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Bromphenolblau (BPB)

Sigma-Aldrich, München, D

DEPC-gereinigtes Wasser

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D

Dimethyl sulfoxide (DMSO)

Sigma-Aldrich, München, D

Agarose (universal)

Rapidozym, Berlin, D

Bovines Serumalbumin (BSA)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Bromphenolblau (BPB)

Sigma-Aldrich, München, D

Calciumchlorid (CaCl

)

Sigma-Aldrich, München, D

DEPC-gereinigtes Wasser

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D

Dimethyl sulfoxide (DMSO)

Sigma-Aldrich, München, D

dNTPs

Rapidozym, Berlin, D

DNA Loading Dye (6x)

Fermentas, St. Leon-Rot, D

Eagle-Medium Pulver (Gibco™ Essential Medium)

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D

Ethanol

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Ethidiumbromid

Sigma-Aldrich, München, D

Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Fötales Kälberserum (FKS)

C.C. Pro, Oberdorla, D

Hepes (N-2-hydroxyethylpiperazine-N’-

2-ethanesulfonic acid)

Sigma-Aldrich, München, D

Material und Methoden

INT (2-(4-Iodphenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-

phenyltetrazoliumchlorid)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Iso-Propanol

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Kristallviolett

Sigma-Aldrich, München, D

L-Glutamin

PAA Laboratories GmbH, Cölbe, D

LB-Agar

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

LB-Medium

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Lipofectamin 2000

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D

Magnesiumchlorid (MgCl

)

Fermentas, St. Leon-Rot, D

MTT (3-(4,5-Dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-

diphenyltetrazoliumbromid)

VWR International GmbH, Darmstadt, D

Natriumchlorid (NaCl)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Natriumhydrogencarbonat

Merck, Darmstadt, D

Natriumhydroxid (NaOH)

Merck, Darmstadt, D

Natriumpyruvat

Sigma-Aldrich, München, D

NEAA (Non-Essential Amino Acids Solution) 100x

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

Noble-Difco Agar

Becton Dickinson, Heidelberg, D

PBS 1x

PAA Laboratories GmbH, Cölbe, D

Penicillin/Streptomycin

Sigma-Aldrich, München, D

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Polyethylenimin, PEI

Polysciences Europe, Hirschberg, D

Paraformaldehyd (PFA)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Penicillin/Streptomycin

BIOCHROM AG

Phenol/Chloroform/Isoamylalkohol

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Polyethylenimin, PEI

Polysciences Europe, Hirschberg, D

Sodiumdodecylsulfat (SDS)

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Triton-X-100

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

Trypsin 0,25 %/EDTA

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

2.1.4 Puffer und Lösungen

Tabelle 7: Puffer und Lösungen.

Bezeichnung

Zusammensetzung

2x MTT-INT-Färbelösung

100 ml 1x PBS

60 µl Essigsäure

150 mg INT

600 mg MMT

Lysepuffer

20 mM TRIS/HCl, pH 8.0

140 mM NaCl

1 mM EDTA

1% Triton X-100, 1% Protease-Inhibitor

1% Phosphatase-Inhibitor

Material und Methoden

PBS-Puffer, 1x

10x 100 ml PBS-Puffer

Aqua bidest. Ad 1L

TAE-Puffer, 50x

242 g Tris

57 ml Eisessig

100 ml EDTA (0,5 M; pH 8,0)

Aqua bidest. ad 1,0 L

TAE-Gelpuffer, 1x

2 ml 50x TAE-Puffer

Aqua bidest. ad 100 ml

Tris-HCl (1 M; pH 7,5)

121,14 g Tris

Aqua bidest. ad 0,9 L

2.1.5 Fest- und Flüssignährmedien

Tabelle 8: Verwendete Fest- und Flüssignährmedien.

Bezeichnung

Zusammensetzung

LB-Agar (Lennox; pH 7,5)

35 g Agar

Aqua bidest. ad 1L, Autoklavieren

Difco-Agar

3,3 g Difco-Agar

Aqua bidest. ad 100 ml, Autoklavieren

Eagle-Medium

9,61 g MEM-Pulver (Invitrogen 61100-087)

1,7 g Natriumhydrogencarbonat

Aqua bidest. ad 750 ml

1% Penicillin-Streptomycin (P/S), steril filtrieren

LB-Medium (Lennox)

20 g Agar

Aqua bidest. ad 1L, Autoklavieren

2.1.6 Zelllinien und Kulturmedien

Tabelle 9: Verwendete Zelllinien mit entsprechendem Kulturmedium und Zusätzen.

Zelllinie

Beschreibung

Kulturmedium

AR42J

Exokrines Pankreas, Ratte

RPMI 1640

EndoC-βH1

Pankreas, β-Zellen, Human

DMEM + β-Mercaptoethanol

HeLa

Zervixkarzinom, Human

MEM +1 % NEAA, 0,02 M Hepes

HEK293T

Embryonale Nierenzellen, Human

DMEM +1 % Natriumpyruvat

EMCM

Primäre embryonale Kardiomyozyten, Maus

DMEM

INS-1E

Pankreas, endokrin, β-Zellen, Ratte

RPMI 1640, 0,01 M Hepes

MIN6

Pankreas, endokrin, β-Zellen, Maus

DMEM +1 % Natriumpyruvat

PANC-1

Pankreas, epitheloid Karzinom, Human

MEM

Alle Medien wurden von der Firma Gibco bezogen und enthielten zusätzlich 10% FKS, 1% L-Glutamin

und 1% Penicillin/ Streptomycin.

Material und Methoden

2.1.7 Bakterienstämme

Tabelle 10: Verwendete Bakterienstämme.

Bezeichnung

Herkunft

E.coli XL-10 Gold

Stratagene, Kalifornien, USA

2.1.8 Plasmide

Tabelle 11: Verwendete Plasmide.

Bezeichnung

Größe

Expression/Insert

Hersteller

psiCHECK2-amiR-Hexon

6300

Dual Luciferase und HexonTS

Schaar et al. 277

psiCHECK2-amiR-375TS

6356

Dual Luciferase und miRNA375TS

AG Fechner

pCMV-MIR-GFP

6200

GFP

OriGene

pCMV-MIR-375-GFP

6300

miRNA-375 und GFP

OriGene

pCMV-MIR-216a-GFP

6300

miRNA-216a und GFP

OriGene

pMA-RQ-375(-)-39TS

2566

375(-)-39TS-Kassette (je 3x)

Lifetechnology

pMK-RQ-3 MCS

3311

Multiple Cloning Site (MCS)

Lifetechnology

pMK-RQ-5 MCS

3443

MCS

Lifetechnology

pscAAV-GFP

4839

GFP

Fechner et al.278

pMKS1

10365

CVB3-cDNA

Slifka et al. 279[A]

pMKS1-eGFP

11091

CVB3-cDNA, GFP

Feuer et al. 280 [A]

pBKCMV-H3

7565

CVB3-cDNA

Jena, D [B]

pMKS1-H3N

10319

CVB3-cDNA

[C]

[A] – Freundliche Gabe von Prof. Zhao-Hua Zhong, Department of Microbiology, Harbin

Medical University, Harbin 150081, China.

[B] – Freundliche Gabe von A. Henke, Universitätsklinikum Jena, Institut für Virologie und

antivirale Therapie, Jena, Deutschland281.

[C] – In dieser Arbeit hergestellt.

2.1.9 Viren

Tabelle 12: Verwendete Viren.

Plasmid

Virusbezeichnung

Virustiter [pfu/ml]

pMKS1

rCVB3.1

1,2 x 108

pMKS1-eGFP

eGFP-CVB3

1,1 x 108

pMKS1-3’-375TS(+)

CVB3-375TS(3+)

9,4 x 107

pMKS1-3’-375TS(-)

CVB3-375TS(3-)

1,2 x 108

pMKS1-5’-375TS(+)

CVB3-375TS(5+)

4,4 x 107

pMKS1-5’-375TS(-)

CVB3-375TS(5-)

2,7 x 107

pMKS1-3’-39TS(+)

CVB3-39TS(3+)

1,7 x 108

pMKS1-5’-39TS(+)

CVB3-39TS(5+)

4,2 x 107

pMKS1-H3N-375TS

H3N-375TS

2,3 x 108

pMKS1-H3N-39TS

H3N-39TS

2,9 x 108

pMKS1-H3N

H3N

3,1 x 108

pBKCMV-H3

4,4 x 108

Material und Methoden

2.1.10 Enzyme

Tabelle 13: Enzyme

Enzym

Hersteller

Alkalische Phosphatase

Boehringer, Mannheim, D

DNase I

Promega, Mannheim, D

DNA-Polymerase I (Klenow)

New England Biolabs, Schwalbach, D

OptiTherm-DNA-Polymerase

Rapidozym, Berlin, D

Pfu Ultra Polymerase

Thermo Fisher Scientific, Schwerte, D

Proteinase K

Boehringer, Ingelheim, D

T4 DNA-Ligase

New England Biolabs, Schwalbach, D

T4 DNA-Polymerase

New England Biolabs, Schwalbach, D

Trypsin 0,25 %/EDTA

Carl Roth GmbH & Co. KG, Karlsruhe, D

2.1.11 Restriktionsenzyme

Tabelle 14: Restriktionsenzyme zuzüglich Schnittstelle und Inkubationstemperatur.

Restriktionsenzym

Schnittstelle

Inkubations-

temperatur [°C]

Hersteller

AdeI

CACNNN/GTG

GTG/NNNCAC

New England

Biolabs (NEB)

BamHI

G/GATCC

CCTAG/G

NEB

EcoRI

G/AATTC

CTTAA/G

NEB

EcoRV

GAT/ATC

CTA/TAG

NEB

HincII

GTPy/PuAC

CAPu/PyTG

NEB

HindIII

A/AGCTT

TTCGA/A

NEB

KpnI

GGTAC/C

C/CATGG

NEB

MunI

C/AATTG

GTTAA/C

NEB

NdeI

CA/TATG

GTAT/AC

NEB

NotI

GC/GGCCGC

CGCCGG/CG

NEB

PmeI

GTTT/AAAC

CAAA/TTTG

NEB

PvuII

CAG/CTG

GTC/GAC

NEB

SacI

GAGCT/C

C/TCGAG

NEB

SfiI

GGCCGGAG/AGGCC

CCGGC/CTCTCCGG

NEB

Material und Methoden

SmaI

CCC/GGG

GGG/CCC

NEB

SmiI

ATTT/AAAT

TAAA/TTTA

NEB

StuI

AGG/CCT

TCC/GGA

NEB

XbaI

TCC/GGA

AGATC/T

NEB

XhoI

T/CTAGA

GAGCT/G

NEB

2.1.12 Reaktionssysteme und Kits

Tabelle 15: Reaktionssysteme und kommerzielle Kits

Bezeichnung

Hersteller

Cell Proliferation Kit (XTT)

Roche Diagnostics, Mannheim, D

Cy3-siRNA-Kontrolle

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D

Dual-Luciferase Reporter System

Promega, Mannheim, D

EvaGreen Master Mix

Bio-Rad Laboratories, München, D

High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

High Pure Viral RNA Kit

Roche Diagnostics, Mannheim, D

microRNA Expression Plasmids (miRNA-216a, 375)

OriGene, Rockville, USA

miScript microRNA-375 Mimics (192764381)

Qiagen, Hilden, D

miScript Control siRNA (191164157)

Qiagen, Hilden, D

microRNA TaqMan Assay

ThermoFischer GmbH, Schwerte, D

peqGOLD Plasmid Mini Kit

VWR International GmbH, Darmstadt, D

mirVana microRNA Isolation Kit

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

Plasmid Midi Kit

Qiagen, Hilden, D

Plasmid Maxi Kit

Qiagen, Hilden, D

Mouse IL-6: Mm00446190_m 1

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

Mouse IFN-γ: Mm00801778_m1

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

Mouse TNF-α: Mm0043258_m 1

Life Technologies GmbH, Darmstadt, D

Polyethylenimine MAX 4K (PEI Max)

Polysciences, Warrington, USA

QIAEX® II Gel Extraction Kit

Qiagen, Hilden, D

T7 Transkriptionskit

Roboklon, Berlin, D

TRIzol® Reagent

Fisher Scientific GmbH, Schwerte, D

2.1.13 DNA-und Proteingrößenstandards

Tabelle 16: DNA- und Proteingrößenstandards.

Bezeichnung

DNA/Protein]

Hersteller

100 bp Marker

DNA

NEB

2-Log DNA Ladder (0,1 – 10.0 kb)

DNA

NEB

Magic Mark XP (20-220 kDa)

Protein

ThermoFisher

Material und Methoden

2.1.14 Antibiotika

Tabelle 17: Antibiotika, verwendete Konzentrationen und Lösungsmittel.

Antibiotikum

Stammlösung

Lösungsmittel

Endkonzentration

Ampicillin

10 mg/ml

DEPC H

10 µg/ml

Neo/Kanamycin

100 mg/ml

DEPC H

100 µg/ml

Penicillin/ Streptomycin

5000 µg/ml

DEPC H

10 µg/ml

Alle Antibiotika wurden von der Firma Sigma bezogen.

2.1.15 Antikörper

Tabelle 18: Antikörper.

Bezeichnung

Hersteller

CVB3-VP1

Merja Roivainen National Institute for Health and Welfare, Helsinki, Finland

γ-Tubulin

Sigma-Aldrich, München, D

elF4G

Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts, USA

2.1.16 Oligonukleotide

Alle in dieser Arbeit verwendeten Primern sind in Tabelle 19 aufgeführt und wurden von der Firma Life

Technologies, Darmstadt, synthetisiert. Die lyophilisierten Primer wurden in DEPC H2O gelöst, so dass

die Endkonzentration 100 µM betrug

Tabelle 19: Verwendete Oligonukleotide.

Primername

Nukleotidsequenz [5’-3’]

Bemerkung

CVB3 primer 0s

ctc act ata ggg cga att g

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 0as

gtt act tct aag tta cag t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 1s

tta aaa cag cctg tgg gtt

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 1as

tta acc tct ctc aag cta a

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 2s

tta tat atc tct ttg ttg g

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 2as

gtg ttg ttt agc gtt gcg c

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 3s

gta gtg tgt gta ccg gaa g

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 3as

acc aat ggg tgt aat agt t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 4s

ttc agt cgg acg ctc cta g

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 4as

att cta gct ttc tcc taa g

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 5s

tgg gta ata aca cca cga c

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 5as

tac acc gac atc tgg cta t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 6s

gag cac gac cac agc aca t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 6as

ttc cct gac ctc agg taa

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 7s

aat tca ttg agt ggc tca a

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 7as

tga ctg ggc aac act ctt c

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 8s

aca tgc caa tgt cag tga a

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 8as

ttg tac cat cct tat cca

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 9s

gta ggc gtg ctg gac gct a

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 9as

taa ggg taa cct gca ctc g

Genom-Sequenzierung

Material und Methoden

CVB3 primer 10s

tga agg cct tga ggc tct t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 10as

tta atcc ata gtc ctt gc

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 11s

cca tag atg cgt ctt tgc t

Genom-Sequenzierung

CVB3 primer 11as

ccg ttg tct agt tcg gtt

Genom-Sequenzierung

CVB3 forward

ccc tga atg cgg cta atc c

CVB3-Quantifizierung

CVB3 reverse

att gtc acc ata agc agc ca

CVB3-Quantifizierung

CVB3- Sonde

5’FAM- tgc agc gga acc g - MGB

CVB3-Quantifizierung

18 S rRNA forward

cgc ggt tct att ttg ttg gt

18 S rRNA-Quantifizierung

18 S rRNA reverse

agt cgg cat cgt tta tgg tc

18 S rRNA-Quantifizierung

CVB3-3MCS

att aac cct cac act aaa ggg a

Insert-Überprüfung

CVB3-5MCS

tta tat atc tct ttg ttg g

Insert-Überprüfung

2.1.17 Software

Alle in dieser Arbeit verwendeten Programme sind in der Tabelle 20 dargestellt.

Tabelle 20: Verwendete Software-Programme.

Programm

Bezugsquelle

BLAST/ Phi-Blast

http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi

GATC Viewer

GATC Biotech AG, Konstanz, D

Gene Construction Kit 4.0

Textco BioSoftware, Inc., Raleigh, USA

GraphPad Prism 5

GraphPad Software Inc., La Jolla, USA

NEB Cutter

http://www.labtools.us/nebcutter-v2-0/

MicroRNA.org

Microsoft Office

Microsoft, Redmond, USA

PubMed

https://www.ncbi.nlm.nih.gov

Material und Methoden

2.2 Methoden

2.2.1 Mikrobiologische Methoden

2.2.1.1 Anzucht von Bakterien aus Bakterienstocks

Alle in der Arbeit verwendeten Bakterienstämme wurden aus der Stammsammlung der AG Fechner (FG

Angewandte Biochemie, Institut für Biotechnologie, TU Berlin) auf Luria-Bertani-Medium (LB-

Medium) überimpft. Für Großpräparationen wurden die bei -80° C gelagerten Bakterienstocks

aufgetaut, 2-3 ml LB-Medium mit 5 µl der Stocklösung angeimpft und über Nacht bei 37° C unter

Schütteln inkubiert. Im Anschluss wurden damit größere Mengen (200-500 ml) in einem Verhältnis von

1:1000 angeimpft und erneut bei 37° C so lange schüttelnd bei 120 rpm inkubiert bis eine OD (595 nm)

von 0,6 erreicht wurde.

2.2.1.2 Herstellung chemisch-kompetenter Bakterien

Zur Herstellung chemisch-kompetenter Bakterien wurden 2 µl eines E. coli X-Gold-Stocks in 2 ml

antibiotikafreies LB-Medium überführt und über Nacht bei 37° C schüttelnd inkubiert. Anschließend

wurde mit dieser Übernachtkultur 250 ml antibiotikafreies LB-Medium angeimpft und so lange bei 37°

C schüttelnd inkubiert, bis die Kultur eine OD (595 nm) von 0,5 erreicht hatte. Anschließend wurden

die Bakterien in vorgekühlte Zentrifugenröhrchen überführt, 10 min auf Eis inkubiert und bei 3000 g

(4° C) für 5 min pelletiert. Das Pellet wurde in 50 ml eiskalter 0,1 M MgCl2-Lösung resuspendiert und

bei 3000 g (0° C) für 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde ein weiteres Mal in 50 ml einer eiskalten

0,1 M CaCl2-Lösung gelöst, 20 min auf Eis inkubiert und für 5 min bei 3000 g (0° C) zentrifugiert.

Daraufhin wurde das Pellet vorsichtig in 5 ml eiskalter 0,1 M CaCl2-Lösung, welche mit 14 % Glycerin

versetzt war, resuspendiert, in 50 µl Aliquots aufgeteilt, anschließend bei -80° C eingefroren und dort

bis zum Gebrauch gelagert.

Im Anschluss wurden die chemisch-kompetenten Bakterien quantifiziert und auf ihre Reinheit

überprüft. Dazu wurden die Bakterien auf Agar-Platten mit Antibiotikum ausplattiert. Um

Kontaminationen auszuschließen zu können wurden die chemisch-kompetenten Bakterien zusätzlich

auf antibiotikafreien Agar-Platten ausplattiert. ohne Antibiotikum ausplattiert. Die Quantifizierung

erfolgte auf Agar-Platten ohne Antibiotika. Bei einer Kolonienzahl von >250 wurden die chemisch-

kompetenten Bakterien verwendet.

2.2.1.3 Herstellung von Bakterienstocks

800 µl des sterilen LB-Mediums, welches die transformierten Bakterien enthielt, wurden mit 800 µl steril

filtriertem 60% igen Glycerin vermischt und anschließend bei -80° C gelagert.

Material und Methoden

2.2.2 Molekularbiologische Methoden

2.2.2.1 Konzentrationsbestimmung von DNA- und RNA

Die Konzentrations- und Reinheitsbestimmung der DNA- und RNA-Proben erfolgte über das Nanodrop

2000 Spektrophotometer. Die Konzentration der DNA-Proben wurde nach der Formel: Absorption = 1≙

50 ng/µl (für RNA 1≙ 40 ng/µl) bestimmt. Die Reinheit der Proben wurde mittels eines Quotienten aus

Absorption bei 260 nm geteilt durch die Absorption bei 280 nm berechnet. Bei reinen DNA-Proben sollte

dieser zwischen 1,8 und 2,0 liegen und bei reinen RNA-Proben größer als 2,0 sein.

2.2.2.2 Isolierung von Plasmid-DNA

Die Präparation kleiner DNA Mengen (2-3 ml) erfolgte mit dem peqGOLD Plasmid Mini Kit der Firma

PeqLab nach Herstellerangaben. Für größere Massenkulturen (200-500 ml) wurden die Midi- bzw.

Maxi-Kits der Firma Qiagen entsprechend Herstellerangaben verwendet.

2.2.2.3 DNA-Gelelektrophorese

Die Auftrennung der DNA-Fragmente erfolgte in 0,8-2 %-igen Agarosegelen (versetzt mit

Ethidiumbromid (25 µg/ml)) in 1 x TAE Laufpuffer bei einer Spannung von 70-130 V. Hierbei wurden

0,8-1,3 % ige Agarosegele u. a. zur Auftrennung von Plasmiden verwendet und 2 % ige Agarosegele zur

Auftrennung kleinerer PCR-Fragmente (> 1000 bp). Die Agarose wurde in 1 x TAE Laufpuffer gelöst

und bei 600 W in der Mikrowelle aufgekocht. Als DNA-Größenstandard wurde der 2-Log DNA Marker

verwendet.

2.2.2.4 Restriktionsverdau

Die Fragmentierung der DNA-Sequenzen erfolgte mit Hilfe von Restriktionsendonukleasen, welche

Palindromstrukturen mit einer Länge von 4 bis 8 bp in der DNA erkennen und sie in dieser

Erkennungssequenz schneiden. Dabei können Fragmente mit glatten (blunt-ends) oder kohäsiven

(sticky-ends) Enden entstehen. Alle in dieser Arbeit verwendeten Restriktionsenzyme und deren

Erkennungssequenzen sind in Tabelle 14 aufgeführt. Die Zusammensetzung eines Restriktionsansatzes

(25 µl) gestaltete sich wie folgt:

x µl DNA (500 ng)

0,5 µl Restriktionsenzym

2,5 µl 10x SmartCut-Puffer

add 25 µl mit DEPC H2O

Die Reaktion erfolgte bei 37° C für 2 h.

2.2.2.5 Extraktion der DNA aus Agarosegelen

DNA-Fragmente wurden aus dem Agarosegel ausgeschnitten und mit dem Gelextraktions-Kit der

Firma Qiagen (QIAquick Gel Extraction Kit) entsprechend Herstellerangaben extrahiert. Um die

Material und Methoden

Ausbeute und Konzentration der DNA zu erhöhen wurde der Elutionspuffer auf 50° C erwärmt, das

Elutionsvolumen von 50 µl auf 25 µl verringert und die Inkubationsdauer vor Eluation der DNA von

2 min auf 10 min erhöht.

2.2.2.6 Ligation der Fragmente

Die Ligation der DNA-Fragmente erfolgte mit Hilfe der T4 Ligase. Die Zusammensetzung eines

Ligationsansatzes (20 µl) gestaltete sich wie folgt:

1 µl T4 Ligase

2 µl T4 Ligase-Puffer

x µl Insert (300 ng)

x µl Plasmidbackbone (100 ng)

add 20 µl mit DEPC H2O

Das Verknüpfen der Fragmente mit Überhängen (sticky ends) erfolgte bei Raumtemperatur (RT) für

15 min, Fragmente mit glatten Enden (blunt ends) wurden ebenfalls bei RT jedoch für 2 h inkubiert.

Das Verhältnis von Backbone zum Insert lag zwischen 1:3 und 1:12.

2.2.2.7 Transformation chemisch kompetenter Zellen

50 µl chemisch-kompetenter Bakterien (E. coli, X-Gold) wurden auf Eis aufgetaut und mit 1-5 µl des

Plasmid-enthaltenden Transformationsansatzes (Kapitel 2.2.2.6) gemischt. Die Suspension wurde für

30 min auf Eis inkubiert, danach eine Minute lang bei 42° C erhitzt und anschließend für 2 min auf Eis

gestellt. Danach wurden 500 µl antibiotikafreies LB-Medium zugegeben und die Suspension 45 min bei

37° C schüttelnd (300 rpm) inkubiert. 50-200 µl des generierten Ansatzes wurden auf LB-Agar-Platten

mit Antibiotikum (Penicillin oder Kanamycin) (1 mg/ml) ausplattiert und über Nacht bei 37° C im

Brutschrank inkubiert.

2.2.2.8 Generierung von CVB3-cDNA-Klonen

Den Ausgangspunkt der Versuche innerhalb dieser Arbeit bildeten folgende drei Basisplasmide, welche

drei verschiedene Varianten eines infektiösen CVB3-cDNA-Klons beinhalten:

1. pMKS1:

Das pMKS1-Plasmid, welches die cDNA eines infektiösen CVB3 enthält, wurde uns freundlicherweise

von Prof. Lindsay Whitton, Scripps Research Institute, La Jolla, California, USA zu Verfügung

gestellt.10 Das Plasmid enthält zusätzlich 39 bp einer Klonierungssequenz, welche sich unmittelbar

downstream vom Startsignal des CVB3-Polyproteins im 5’-Bereich des CVB3 befindet, und die

Insertion von weiteren Fremdsequenzen ermöglicht.279 Das CVB3-Genom basiert auf der CVB3-

Variante H3.

2. pMKS1-eGFP:

Material und Methoden

Das Plasmid entspricht dem Plasmid pMKS1 und enthält zusätzlich die cDNA des green fluorescent

protein (GFP), welches in die oben erwähnte Klonierungssequenz inseriert wurde280. Dieses Plasmid

wurde uns von Zhao-Hua Zhong, Department of Microbiology, Harbin Medical University, Harbin,

China zur Verfügung gestellt. Das Plasmid bildet nach Transfektion ein CVB3, welches GFP exprimiert.

Diese Variante diente dem Transfektions -bzw. Infektionsnachweis.

3. pBKCMV-H3:

Das CVB3-H3-Plasmid wurde uns von Prof. Dr. A. Henke, Institute of Virology and Antiviral Therapy,

Jena University Hospital, Friedrich Schiller University Jena zur Verfügung gestellt. Das Plasmid enthält

die CVB3-cDNA eines kardiotropen CVB3281. Es diente als Grundlage zur Herstellung von pMKS1279.

Im weiteren Verlauf der Arbeit wurde ein weiteres CVB3-cDNA-Plasmid mit dem Namen pMKS1-

H3N hergestellt. Dieses basiert auf dem Plasmid-Backbone von pMKS1, in welches die CVB3-H3

cDNA aus dem pBKCMV-H3 Plasmid inseriert wurde.

2.2.2.8.1 Klonierung der MCS in das pMKS1-Plasmid

Im Plasmid pMKS1 waren lediglich die beiden Restriktionsschnittstellen BamHI und ClaI geeignet, um

die Insertion einer MCS in die 3’UTR des CVB3 Genoms vornehmen zu können. Daher wurde der

Bereich zwischen diesen Restrikionsschnittstellen von der Firma Life Technologies komplett zusammen

mit MCS, welche vier Restriktionsschnittstellen (AsisI, XbaI, NdeI und PmeI) enthielt, synthetisiert. Die

MCS wurde unmittelbar nach dem Stopcodon des CVB3-Polyproteins in der 3’UTR des Virusgenoms

inseriert.

Da die BamHI-Schnittstelle zweimal im pMKS1-Plasmid vorhanden war, wurde diese mit dem

Restriktionsenzym SacI geschnitten und darauffolgend religiert, um so eine der beiden BamHI-

Schnittstellen zu entfernen. Das synthetisierte Fragment mit der 3’-MCS wurde über BamHI und ClaI

aus dem Plasmid pMK-RQ herausgeschnitten und mittels Ligase in das verkleinerte pMKS1-Plasmid

(pMKS1-SacI) religiert, wodurch das Plasmid pMKS1-SacI-3’MCS entstand. Im nächsten Schritt wurde

die 3’-MCS aus dem Plasmid pMKS1-SacI-3’MCS über StuI und ClaI herausgeschnitten und

anschließend in das pMKS1 kloniert (Abb. 7). Das daraus resultierende Plasmid erhielt die Bezeichnung

pMKS1-3’MCS (Abb. 8).

Material und Methoden

Abbildung 7: Klonierung der MCS in das 3’-Ende des CVB3-Genoms im pMKS1-Plasmid.

[MCS: multiple cloning site]

Material und Methoden

Abbildung 8: Darstellung des pMKS1-3’MCS-Plasmids mit der MCS am 3’-Ende mit den

Restriktionsschnittstellen AsiSI, XbaI, NdeI und PmeI.

Das CVB3-Genom befindet sich zwischen den NotI -und ClaI-Restriktionsschnittstellen in dem pMKS1-Plasmid. [MCS:

multiple cloning site]

2.2.2.8.2 Klonierung der miRNA-375TS in das 3’-Ende des CVB3-Genoms

Der Versuch 100 bp lange Fragmente, die drei Kopien der miRNA-375Ts enthielten (gewonnen aus

dem pMK-RQ-375TS, synthetisiert von der Firma Life Technologies) in die MCS des pMKS1-3’MCS-

Plasmids direkt zu klonieren, war nicht erfolgreich. Aus diesem Grund wurden die 3x miRNA-

375TSs(+) über AsiSI und PmeI-Restriktionsschnittstellen aus dem Plasmid pMK-RQ-375TS in das

Plasmid pMK-RQ (3311bp) mit der 3’-MCS kloniert (Abb. 9).

Das Fragment wurde anschließend über BamHI und ClaI aus dem pMK-RQ herausgeschnitten und

mittels Ligase in das Plasmid pMKS1-SacI inseriert. Im letzten Schritt wurde das Fragment mit der

MCS und den 3x 375TSs über StuI und ClaI in das pMKS1-Plasmid zurück kloniert (Abb. 7).

Das erhaltene Plasmid enthält in der MCS drei Kopien der miRNA-375TS, die je durch 6 bp Spacer

voneinander getrennt sind. Das Plasmid wurde mit pMKS1-375TS(3+) bezeichnet. Das Plus (+)

Material und Methoden

kennzeichnet, dass die miRNA375-TS nach Bildung des CVB3 in der (+)-Strang-RNA des viralen

Genoms ((+)-Orientierung) vorliegt und von der nativen miRNA-375 gebunden werden kann. Das

Minus kennzeichnet, dass die miRNA375-TS in der (-) RNA des viralen Genoms ((-)-Orientierung)

vorliegt, welche im Verlauf der CVB3-Replikation als Matrize für die Synthese der CVB3-Plusstränge

dient.

Abbildung 9: Klonierung von drei miRNA-375TS in das Fragment mit der MCS in das 3’-Ende des CVB3-

Genoms.

[MCS: multiple cloning site]

2.2.2.8.3 Klonierung der MCS in das 5’-Ende des CVB3-Genoms

Für die Klonierung der MCS in das 5’-Ende des CVB3 Genoms wurde die Restriktionsschnittstelle SfiI,

die sich unmittelbar stromab des Startsignals des CVB3-Polyproteins, im 5’-Bereich des CVB3 im

Plasmid pMKS1 befindet, ausgewählt, da die Insertion von Fremdsequenzen an dieser Stelle vom Virus

toleriert wird. Dazu wurden zwei Primer-Paare mit Basenüberhängen synthetisiert, welche miteinander

hybridisiert wurden. Die Basenüberhänge (unterstrichen) entsprechen denen der SfiI-Schnittstelle, die

restliche Sequenz beinhaltet die Restriktionsschnittstellen AsisI, XbaI, NdeI und PmeI, so dass nach dem

Ligieren die SfiI-Schnittstellen zerstört werden. Die MCS am 5’-Ende des CVB3-Genoms beinhaltet die

gleichen Restriktionsschnittstellen wie die MCS am 3’-Ende (Abb. 7). Das erhaltene Plasmid wurde mit

pMKS1-5’MCS bezeichnet.

5’ -GCGATCGCTCTAGACATATGTTTAAAC-GAG-3’ sense

3’ -CTC-CGCTAGCGAGATCTGTATACAAATTTG-5’ antisense

2.2.2.8.4 Klonierung der miRNA-375TS in das 5’-Ende des CVB3-Genoms

Wie bereits bei der Klonierung der miRNA-375TS in das 3’-Ende des CVB3-Genoms, wurde ein

Fragment des pMKS1-5’MCS-Plasmids mit dem cDNA-Klon, welches am 5’-Ende eine MCS besitzt,

über die Restriktionsenzyme NotI und EcoRV rausgeschnitten und in ein kleineres Plasmid (pMK-RQ)

kloniert (Abb. 10). In das erhaltene pMK-RQ-5’MCS-Plasmid wurden drei Kopien der miRNA-375TS

über AsiSI und PmeI inseriert. Aus dem erhaltenen pMK-RQ-5’-375TS-Plasmid wurde das Fragment

über NotI und EcoRV wieder in das pMKS1 zurück kloniert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pMKS1-

375TS(5+) bezeichnet.

Material und Methoden

Auf diese Weise wurden drei Kopien der miRNA-375TS für den CVB3-Plus -bzw. CVB3-Minusstrang

entweder in das 3’-oder 5’-Ende des pMKS1-Plasmids inseriert (Abb. 11).

Darüber hinaus wurden auch drei Kopien der miRNA-39TS für den CVB3-Plusstrang über AsiSI und

PmeI in die beiden Plasmide pMKS1-3’MCS und pMKS1-5’MCS integriert (pMKS1-39TS(3+) und

pMKS1-39TS(5+)), welche zur Herstellung von Kontrollviren dienten.

Abbildung 10: Klonierung der TS-Sequenzen am Beispiel der miRNA-375TS, die dreifach in das 5’-Ende

des pMKS1-Plasmids inseriert wurden.

[MCS: multiple cloning site]

Abbildung 11: Inserierungsstellen der miRNA-375TS- sowie der miRNA-39TS-Sequenzen in das 5’- bzw.

3’-Ende des CVB3-Genoms.

Die Darstellung wurde modifiziert nach34. [VP: Virales Protein, IRES: internal ribosom entry site; P: Protein, pol:

Polymerase, Poly A: polyadenyliert; NTR: nichttranslatierte Region, TS: target site]

Material und Methoden

2.2.2.8.5 Klonierung des pMKS1 Plasmids

Das pMKS1-H3N-Plasmid besteht aus dem pMKS1-Backbone und dem Genom der kardiotropen

CVB3-Variante H3, welches aus dem Plasmid pBKCMV-H3 gewonnen wurde. Dieses Plasmid wurde

generiert, da die SfiI-Schnittstelle am 5’-Ende des kodierenden Bereichs des CVB3-Genoms die

Replikation von rCVB3.1 in vivo stark reduzierte. Die CVB3-cDNA im Plasmid pBKCMV-H3

entspricht der CVB3-cDNA im pMKS-1-Plasmid, nur, dass im pBKCMV-H3-Plasmid keine künstlich

inserierte SfiI-Restriktionsschnittstelle vorhanden ist. Das pBKCMV-H3-Plasmid enthält jedoch zwei

ClaI-Restriktionsschnittstellen, sodass eine Insertion der TS über ClaI und StuI (siehe nächster

Abschnitt) nicht möglich wäre. Daher sollte die SfiI-Restriktionsschnittstellen-freie CVB3-cDNA-

Sequenz aus dem pBKCMV-H3-Plasmid in das pMKS1-Plasmid, welches nur eine ClaI-

Restriktionsschnittstelle besitzt, kloniert werden. Hierzu wurden die Plasmide pMKS1 -und pBKCMV-

H3 mit ClaI und NotI geschnitten und die aus dem Plasmid pBKCMV-H3 isolierte CVB3-H3 cDNA in

den pMKS-1 Plasmidbackbone inseriert (Abb. 12). Das erhaltene Plasmid bekam die Bezeichnung

pMKS1-H3N.

Abbildung 12: Generierung des pMKS1-H3N-Plasmids.

2.2.2.8.6 Klonierung von drei miRNA-375TS Kopien in das pMKS1-H3N Plasmid

Die drei Kopien der miRNA-375TS wurden aus dem pMKS1-375TS(3+)-Plasmid isoliert und in das

pMKS1-H3N-Plasmid übertragen. Hierzu wurden beide Plasmide zunächst mit den

Restriktionsendonukleasen ClaI und StuI geschnitten, um so die drei miRNA-375TS Kopien aus dem

Plasmid pMKS1-375TS(3+) zu isolieren. Im Anschluss wurde das über ClaI und StuI geschnittene

Plasmid pMKS1-H3N mit dem Insert, welches die drei Kopien der miRNA-375TS enthielt, re-ligiert

(Abb. 13). Das erhaltene Plasmid erhielt die Bezeichnung pMKS1-H3N-375TS(3+).

Material und Methoden

Abbildung 13: Klonierung von drei miRNA-375TS-Kopien in das pMKS1-H3N-Plasmid.

2.2.2.8.7 Klonierung von drei miRNA-375TS-Kopien in das psiCHECK2-Plasmid.

Die Klonierung der miRNA-375 -und miRNA-39-TSs in die 3’UTR des psiCHECK2-Plasmids erfolgte

über die Restriktionsschnittstellen AsiSI und PmeI unmittelbar downstream des stop codons der Renilla-

Luciferase-cDNA (Abb. 14).

Abbildung 14: Klonierung von drei Kopien der miRNA-375TS in das psiCHECK2-Plasmid.

Auf die gleiche Weise wurde die Kontrolle mit der Hexon-TS über AsiSI und PmeI in das psiCHECK2-

Plasmid kloniert.

Material und Methoden

2.2.2.9 Sequenzierung

Die Sequenzierung von Plasmid-DNA bzw. PCR-Fragmenten erfolgte durch die Firmen LGC und

SeqLab (Berlin, Deutschland). Dazu wurden in einem Gesamtvolumen von 15 µl, welche entweder 720

bis 1200 ng Plasmid-DNA bzw. 18 ng pro 100 bp des PCR-Produktes, sowie Primer (10 pmol/µl),

beinhaltete an die jeweilige Firma geschickt. Die Sequenzierung erfolgte in beiden Richtungen (sense

und antisense-Strang) (Tab. 19).

2.2.2.10 RNA-Extraktion

Für die Isolierung der Gesamt-RNA aus Zelllinien, Geweben und Viren wurde TRIzol® verwendet. Die

Gewebestücke wurden in einem 5 ml Reaktionsgefäß in 2 ml 1x PBS mit dem Gewebehomogenisator

VDI 12 homogenisiert. Alle Arbeitsschritte erfolgten auf Eis unter dem Abzug entsprechend

Herstellerangaben. Die isolierte RNA wurde in DEPC-H2O für 10 min bei 60° C gelöst und im

Anschluss bei -80° C gelagert. Für die spätere Sequenzierung viraler RNA wurde diese mit dem High

Pure Kit entsprechend Herstellerangaben isoliert. MiRNAs wurden mit Hilfe des mirVana miRNA

Isolation Kits aus Zellen und Geweben entsprechend Herstellerangaben isoliert. Die Quantifizierung der

RNA erfolgte mittels Nanodrop 2000.

2.2.2.11 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)

Die detaillierte Untersuchung bestimmter Fragmente, sowie deren Klonierung bzw. die Sequenzierung

eines DNA-Bereichs ist nur dann möglich, wenn diese in ausreichender Menge vorliegen. Daher wurden

gegenläufige Primer generiert, welche sich jeweils vor bzw. hinter dem zu amplifizierenden Bereich

anlagern. Beim ersten Schritt der PCR wurden die Proben für 5 min auf 95° C erhitzt, um Doppelstränge

aufzutrennen. Im Anschluss erfolgte die Hybridisierung der Primerpaare, indem deren jeweilige

optimale Annealing-Temperatur für 30 s konstant gehalten wurde. Die Primerpaare (Tab. 19) wurden

so designt, dass sie sich in ihrer jeweiligen Annealing-Temperatur, die im Allgemeinen zwischen 50

und 65° C lag, nur minimal unterschieden. Im der darauffolgenden Elongation wurden die Proben für

30 s auf 72° C erhitzt. Die Amplifikation erfolgte in 40 Zyklen. Gemäß der verwendeten Taq-

Polymerase der Firma Rapidozym entsprach die Zusammensetzung des Reaktionsansatzes den

Herstellerangaben. Das Ergebnis der Amplifikation wurde mittels Gelelektrophorese überprüft.

Anschließend wurden amplifizierten Produkte aus dem Gel extrahiert und über Säulen aufgereinigt.

Die Zusammensetzung eines PCR-Ansatzes (20 µl) gestaltete sich wie folgt:

1 µl

forward Primer [10 µM]

1 µl

reverse Primer [10 µM]

2 µl

10x Polymerase-Puffer

0,8 µl

dNTPs (200 µM)

1 µl

Taq-Polymerase (Rapidozym)

x µl

DNA (500 ng)

add 20 µl DEPC-H2O

Material und Methoden

2.2.2.12 cDNA-Synthese mittels Reverser Transkriptase-PCR

Vor der Synthese wurden die RNA-Proben entsprechend der Herstellerangaben mit dem Enzym DNAse

I behandelt gemäß dem unten aufgeführten Reaktionsschema. Für die reverse Transkription wurden

500 ng RNA eingesetzt, hierbei wurde für das Umschreiben der RNA in cDNA das High Capacity cDNA

Reverse Transcription Kit verwendet. Dabei erzeugt eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, die Reverse

Transkriptase, ein RNA/DNA-Hybrid. Generell wurden unspezifisch-bindende Random-Hexamer-

Primer für die reverse Transkription eingesetzt. Für die reverse Transkrition der miRNA wurden hingegen

stem-loop-Primer und für die der 18S-rRNA spezifische 18S-rRNA Primer verwendet (Tab.19). Die

Besonderheit der verwendeten stem-loop-Primer besteht darin, dass sie spezifisch nur an eine bestimmte

miRNA mit 8 Basenpaaren am 3’-Ende binden. Im Verlauf der RT-PCR wird der stem-loop-Primer

komplementär zur miRNA in 5’-3’-Richtung verlängert.

DNAseI-Verdau:

x µl

RNA-Probe

1 µl

DNAse I

1 µl

DNAse I-Puffer

add 20 µl

DEPC-H20

Der DNAseI-Verdau wurde mit 1 µl Stopplösung bei 65 °C für 10 min inaktiviert.

RT-Ansatz (20 µl): RT-Programm:

2 µl

10x RT-Puffer

Aktivierung

50 °C

2 min

0,8 µl

25x dNTPs

Denaturierung

95 °C

10 min

2 µl

10x RT Random Primer

Denaturierung

95 °C

15 s

40 Zyklen

1 µl

Multiscribe RT

Elongation

50 °C

1 min

x µl

RNA (500 ng)

add 20 µl

DEPC-H2O

miRNA-RT-Ansatz (20 µl): RT-Programm:

1,5 µl

10x RT-Puffer

Aktivierung: 50° C

2 min

3 µl

RT-Primer miRNA

Denaturierung: 95° C

10 min

3 µl

RT-Primer u6

Denaturierung: 95° C

15 s

40 Zyklen

0,15 µl

dNTPs (200 µM)

Elongation: 50° C

1 min

1 µl

5 µl

RNA (50 ng)

6,35 µl

DEPC-H2O

Material und Methoden

2.2.2.13 Quantifizierung von cDNA mittels quantitativer PCR

2.2.2.13.1 Quantifizierung von cDNA über TaqMan-Sonden

Die Quantifizierung der cDNA erfolgte mit Hilfe einer relativen quantitativen PCR (q-PCR). Diese

ermöglicht es die Amplifikation einer cDNA-Sequenz spezifisch zu verfolgen. Für die Bestimmung der

Expressionslevel der jeweiligen miRNA (Quantifizierung durchgeführt von Dr. Hazini, Angewandte

Biochemie, TU Berlin) innerhalb der Gewebe oder Zelllinien wurde ein spezifischer miRNA TaqMan

Assay (Bestandteil des mirVana-microRNA-Isolation Kit), für die Bestimmung der Expression der

durch die CVB3-Infektion induzierten Level ausgewählter Zytokine und Interferone wurden

entsprechende TaqMan-Genexpressions Assays der Firma ThermoFisher verwendet. Diese sogenannten

TaqMan-Sonden basieren auf dem Mechanismus des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers

(FRET).282 Dabei wird ein als Donor bezeichneter kurzwelligerer Fluoreszenzfarbstoff angeregt und

überträgt so Energie auf einen als Akzeptor bezeichneten langwelligeren Fluoreszenzfarbstoff, was in

dessen hellerer Emission resultiert. Dies erfolgt ausschließlich, wenn sich Donor und Akzeptor nicht

weiter als 10 nm voneinander entfernt befinden. Die TaqMan-Sonde ist ein Oligonukleotid, welches am

3’-Ende mit einem Quencher (Akzeptor) und an 5’-Ende mit dem Donor markiert ist. Durch die

Hybridisierung der TaqMan-Sonde an die DNA-Sequenz, wird durch die 5’-3’-Exonukleaseaktivität der

Polymerase infolge der Amplifikation das 5’-Ende der Taq-Man-Sonde abgespalten und durch die so

resultierende Trennung von Donor und Akzeptor die bisher vom Quencher unterdrückte Fluoreszenz

emittiert.

Die in cDNA umgeschriebene RNA bzw. miRNA (Kapitel 2.2.2.12) wurde mittels PCR unter

Verwendung der TaqMan-Sonde quantifiziert, welche sich, zusammen mit den forward und reverse

Primern für den loop, im Mastermix des miRNA TaqMan Assay Kits befand.

qPCR-Ansatz (20 µl):

cDNA (umgeschrieben aus miRNA): RT-Programm:

10 µl

TaqMan® Universal Mastermix

Aktivierung: 50° C

2 min

1 µl

TaqMan®MicroRNA Assay (20x)

Denaturierung: 95° C

10 min

1.33 µl

cDNA (Produkt der miRNA-RT-PCR)

Denaturierung: 95° C

15 s

40 Zyklen

7.67 µl

DEPC-H

Elongation: 50° C

1 min

cDNA (umgeschrieben aus RNA): RT-Programm:

10 µl

TaqMan™ Fast Advanced Master Mix

Aktivierung: 50° C

2 min

1 µl

TaqMan®Assay (20x)

Denaturierung: 95° C

10 min

2 µl

cDNA (Produkt der RNA-RT-PCR)

Denaturierung: 95° C

15 s

40 Zyklen

7 µl

DEPC-H

Elongation: 50° C

1 min

2.2.2.13.2 Quantifizierung des CVB3-Genoms über EvaGreen

Die Quantifizierung von CVB3 erfolgte mit Hilfe einer absoluten qPCR. Dafür wurde eine als Standard

Material und Methoden

dienende Verdünnungsreihe (1x106 – 1x101 Kopien/ng) des pMKS1-Plasmid erstellt anhand derer die

jeweilige Plasmidkopienzahl berechnet wurde. Nach der Amplifikation konnte anhand der Ct-Werte des

Standards die entsprechende DNA-Konzentration der CVB3 haltigen Proben bestimmt werden. Für diese

Analyse wurde der Fluoreszenzfarbstoff EvaGreen verwendet, der sich wie auch SYBR-Green in

doppelsträngige DNA einlagert woraus eine verstärkte Fluoreszenz resultiert, welche im gleichen

Fluoreszenzbereiche wie die von SYBR-Green liegt. Im Gegensatz zu SYBR-Green weist EvaGreen

jedoch eine niedrigere PCR-Inhibition auf und verursacht weniger Hintergrundsignal. Zudem ist

EvaGreen sehr stabil und weder zytotoxisch noch mutagen283.

qPCR-Ansatz (20 µl) mit EvaGreen (für CVB3 bzw. 18S):

2 µl

cDNA

0,4 µl

forward

Primer [10 µM]

1,2 µl

reverse Primer [10 µM]

10 µl

EvaGreen Master Mix

add 20 µl

DEPC-H2O

PCR-Programm:

Aktivierung

50° C

2 min

Initiale Denaturierung

95° C

10 min

Denaturierung

95° C

15 s

40 Zyklen

Elongation

50° C

1 min

2.2.2.14 Auswertung der relativen Quantifizierung

Um den ΔCT-Wert zu bestimmen, wurde vom ermittelte Ct-Wert der zu untersuchenden mRNA der

entsprechende Referenz-Ct-Wert der 18S rRNA subtrahiert (Ct mRNA – Ct 18S rRNA). Die

Expressionsstärke der mRNA in Relation zur 18S rRNA ergibt sich aus der Berechnung 2-ΔCt. Um den

Expressionsunterschied zwischen zwei Proben zu bestimmen, wurde der ΔΔCt-Wert (= ΔCt1-ΔCt2)

berechnet. Der relative Expressionsunterschied zwischen Probe 1 und 2 konnte dann anhand der Formel

2-ΔΔCT berechnet werden.

2.2.2.15 Laser Mikrodissektion

Die Laser-Mikrodissektion wurde nach der von Hvid H. beschriebenen Vorgehensweise von Prof. Dr.

Robert Klopfleisch (Institut für Tierpathologie der Freien Universität Berlin) durchgeführt.284 Fünf bis

sechs Pankreasschnitte mit einer Dicke von 8 µm wurden auf einem mit Polyethylennaphthalat

beschichteten Glasobjektträger fixiert. Nach der Fixierung mit 95 % Ethanol bei -30° C wurden die

Schnitte mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt (H&E-Färbung) und in Diethylpyrocarbonat (DEPC)-

Wasser gewaschen. Hämatoxylin dient zur Visualisierung der Zellkerne da es in wässrigen Lösungen

mit Metallionen stark basische Chelate bildet, welche von sauren Zellstrukturen wie DNA oder RNA

Material und Methoden

gebunden werden. Der saure Farbstoff Eosin wird wiederum vorwiegend von basischen

Plasmaproteinen gebunden und ermöglicht die Unterscheidung zwischen baso- und azidophilen

Zellstrukturen. Die Proben wurden mit steigender Ethanolkonzentration (70, 95 und 99 %) dehydriert

und bei RT getrocknet. Im Anschluss wurden die pankreatischen Gewebeproben vom exokrinen

Pankreas und der Langerhans-Inseln mittels PALM Laser und Pressure Catapulting-Verfahren

voneinander getrennt. Das separierte Gewebe wurde in Eppendorfgefäße mit 30 µl Lysepuffer überführt.

2.2.2.16 Affymetrix miRNA-Chip-Analyse

Zunächst wurden die miRNAs über das mirVana miRNA Isolation Kit aus der Gesamt-RNA nach

Herstellerangeben isoliert. Die anschließende Affymetrix miRNA-Chip-Analyse des pankreatischen

Gewebes wurde von der Firma IKDT GmbH (Berlin, Deutschland) durchgeführt, um anhand dieser eine

miRNA-Expressionsanalytik zu generieren.

Die Affymetrix GeneChip miRNA 3.0 Arrays beinhalten ein Setup aus 1789 humanen und 1188

murinen miRNAs und können zudem pre-miRNAs sowie humane kleine nukleläre RNAs (snoRNAs)

und small Cajal-body-specific RNAs (scaRNAs) detektieren.

2.2.3 Zellbiologische Methoden

2.2.3.1 Kultivierung eukaryotischer Zellen

Die Zellen wurden in T75-Zellkulturflaschen mit 12 ml Medium kultiviert. Die Umsetzung erfolgte bei

etwa 95 % Konfluenz indem die Zellen einmal mit PBS gewaschen, anschließend mit 2 ml 0,25

Trypsin/EDTA bei 37° C abgelöst und in 10 ml Medium aufgenommen wurden. Ein

Zentrifugationsschritt (5 min, 1000 rpm) trennte die sedimentierten Zellen vom Überstand. Das

Zellpellet wurde in Kulturmedium gelöst und auf neue Zellflaschen bzw. Zellkulturplatten aufgeteilt.

Der Austausch des Mediums, bzw. das Splitten der Zellen, erfolgte danach alle 2-3 Tage.

2.2.3.2 Einfrieren von Zellen

Da sich die Zellen durch die wiederholte Passagierung in ihren Eigenschaften verändern können, wurden

Kryostocks der Zellen erstellt. Für die Herstellung eines Kryostocks wurden die Zellen bis zu einer

Konfluenz von etwa 80 % kultiviert. Das Kulturmedium wurde abgesaugt, die Zellen einmal mit 1x PBS

gewaschen, anschließend für wenige Minuten bei 37° C mit 0,25 % Trypsin/EDTA inkubiert, danach die

Zellsuspension in ein 15 ml Reaktionsgefäß mit 10 ml Kulturmedium überführt und für 5 min bei

1000 rpm und 4° C zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in FKS mit 5 % DMSO resuspendiert und in

1,5 ml Aliquots je Kryoröhrchen verteilt. Die Kryoröhrchen wurden in einer speziellen mit Isopropanol

gefüllten Box (Abkühlung 1° C/min) für mindestens 24 h bei -80° C gelagert bevor sie für die

Langzeitlagerung in flüssigen Stickstoff überführt wurden.

Material und Methoden

2.2.3.3 Kultivierung von Zellen aus Kryostocks

Die in flüssigem Stickstoff aufbewahrten Kryoröhrchen, mit gefrorenen Zellen, wurden im Wasserbad

bei 37° C aufgetaut, in 10 ml des jeweiligen Zellkulturmediums aufgenommen und für 5 min bei

1200 rpm zentrifugiert, um das im Einfriermedium enthaltene DMSO zu entfernen. Der Überstand wurde

verworfen, das Zellpellet in 12 ml frischem Kulturmedium resuspendiert und in T75-Zellkulturflaschen

ausgesät. Der Wechsel des Mediums erfolgte am nächsten Tag.

2.2.3.4 Zellzahlbestimmung

Um in den Versuchen stets die gleiche Zellzahl einzusetzen, wurde die Zellzahl pro Milliliter bestimmt.

Dafür wurde ein Volumen von 10 µl in Kulturmedium gelösten Zellen auf eine Neubauer-Zählkammer

pipettiert und alle vier Quadranten, bestehend aus je 16 Kleinquadraten, unter dem Mikroskop

ausgezählt. Die Zellzahl berechnete sich anhand folgender Formel:

Zellzahl/ml = durchschnittliche Zellzahl aus 4 Quadraten x 104 (Kammerkonstante)

Die gelösten Zellen wurden entsprechend in Kulturmedium verdünnt und ausgesät.

2.2.3.5 Transfektion eukaryotischer Zellen

Das Einbringen von Plasmid-DNA (Plasmide) bzw. freier RNA/ DNA in höhere eukaryotische Zellen

wird als Transfektion bezeichnet. Für die Transfektion wurden verschiedene Transfektions-Reagenzien

und Methoden verwendet.

Plasmide/ RNA:

In 24-Well-Platten wurden 150000 HEK293T-Zellen pro Well ausgesät und am nächsten Tag bei

70 %-ger Konfluenz mit 100 µl Transfektionsansatz je Well transfiziert. Für einen Transfektionsansatz

wurden 800 ng Plasmid-DNA (abhängig vom Zellkulturgefäß) in ein Eppendorfgefäß vorgelegt und

mit opti-MEM auf 50 µl aufgefüllt und gevortext. In ein separates Eppendorfgefäß wurden 1 µl PEI

Max 40k (2 µg/µl) mit 49 µl opti-MEM vermischt und gevortext. Nach 5 min Inkubation bei

Raumtemperatur (RT) wurden beide Ansätze miteinander vermischt und erneut gevortext. Nach

erneuter Inkubation für 15 min bei RT wurden die Zellen transfiziert.

Zusätzlich zur miRNA-375 exprimiert das pCMV-MIR-375-GFP-Plasmid das grün fluoreszierende

Protein (GFP). Die Transfektionseffizienz wurde 24 h nach der Transfektion mikroskopisch

ausgewertet. Dazu wurde die Anzahl grünfluoreszierender Zellen (GFP wird wird über blaues Licht

angeregt, Absorptionsspektrum zw. 395-475 nm; und emmitiert grünes Licht, GFP-

Emmissionsmaximum: 508 nm) im Verhältnis zur Gesamtzellzahl (visualisiert im Phasenkontrast)

abgeschätzt. Lag die Transfektionseffizienz über 50 % wurden die Transfektionsversuche mit den

Überexpressionsplasmiden fortgesetzt.

Material und Methoden

Transfektionsansatz mit PEI Max bzw. RNAiMAX: (Ansatz pro Well)

Plasmid-DNA: siRNA/ miRNA:

pDNA (800 ng)

µl

min

15 min

opti-MEM

add 50 µl

PEI Max

1 µl

min

opti-MEM

49 µl

siRNA/ miRNA-Mimics:

Für die Transfektion von miRNA-Mimics bzw. siRNAs wurden in 24-Well-Platten 180000 HeLa-Zellen

pro Well ausgesät und am folgenden Tag bei 80 %-ger Konfluenz mit 50 µl Transfektionsansatz

transfiziert. Als Transfektionsreagenz wurde Lipofectamine RNAiMAX nach Herstellerangaben

verwendet. Die Endkonzentration der eingesetzten miRNA-Mimics bzw. siRNAs betrug 25 nM. Die

Transfektionseffizienz wurde mit einer mit einem Fluorophor gelabelten siRNA (Cy3) überprüft.

Herstellung genomischer RNA von CVB3:

Die Transkription des CVB3-cDNA-Klons aus dem Plasmid pMKS1 erfolgte mit Hilfe des T7-

Transkriptionskits. Die CVB3-cDNA befand sich downstream eines T7-Promotors. Dazu wurde

zunächst das Plasmid pMKS1 mit der Restriktionsendonuklease ClaI linearisiert, das Fragment mittels

Gelelektrophorese aufgetrennt, aus dem Gel mit dem QIAquick Gel Extraction Kit extrahiert und

aufgereinigt. Nachdem die DNA-Konzentration im Nanodrop 2000 bestimmt wurde, wurden 2 µg des

linearisierten Plasmid-DNA mit T7-RNA-Polymerase entsprechend den Herstellerangaben transkribiert.

Trankskription mit T7 RNA-Polymerase: (Ansatzvolumen 50 µl)

10 µl Reaktionspuffer 5x

3,6µl NTP-Mix (25 mM je NTP)

2,5 µl Dithiotreitol (DTT) (100 mM)

1 µl Pyrophosphatase

1 µl T7 RNA Polymerase

x µg linearisierte cDNA

add 50 µl DEPC H2O

Nach 2 stündigen Inkubation bei 37 °C wurden die transkribierten Proben 30 min bei 37° C mit DNAseI

inkubiert, mittels RNAeasy-Kit aufgereinigt und anschließend deren Konzentration im Nanodrop 2000

bestimmt. Bis zum Gebrauch wurden die Proben bei -80° C gelagert. Die Intaktheit der viralen RNA

wurde vor den Transfektionsversuchen mittels Gelelektrophorese überprüft. Die Transfektion erfolgte

wie unter Kapitel 2.2.3.5 beschrieben mit RNAiMAX (jedoch auf 6-Well-Platten).

2.2.3.6 Dual-Luciferase Reporter Assay als Fuktionalitätsnachweis der miRNA-375-TS

Die Funktionalität regulatorischer DNA-Sequenzen kann durch sogenannte Reportergen-Analysen

miRNA (10

µM)

3 µl

min

20 min

opti-MEM

47 µl

RNAiMAX

3 µl

min

opti-MEM

47 µl

Material und Methoden

überprüft werden. Dazu wird die zu untersuchende regulatorische DNA-Sequenz direkt vor ein nicht

verwandtes Reporter-Gen in ein Reporterplasmid kloniert. Das generierte Reporterplasmid wird in

eukaryotische Zellen transfiziert, in denen sich die Expression des Reportergens proportional zum

Aktivierungs- bzw. Deaktivierungspotential des inserierten regulatorischen DNA-Fragmentes verhält.

Über die Zugabe eines Substrates, welches von dem Reportergen umgesetzt werden kann, kommt es zu

einem Chemilumineszenzsignal, welches mit einem Luminometer detektiert wird. Die Verwendung

von zwei unterschiedlichen Reportergenen, ermöglicht eine höhere experimentelle Genauigkeit.

Während das experimentelle Reportergen mit den Effekten der experimentellen Parameter korreliert,

stellt das Kontroll-Reportergen eine interne Kontrolle dar. Die Normalisierung der Aktivität des

experimentellen Reportegens auf die des Kontroll-Reportergens minimiert die experimentelle

Variabilität (Pipettiervolumina, Zellzustand, Transfektionseffektivität, etc.). Entscheidend ist, dass sich

die Emissionsspektra der infolge der Substartzugabe resultierenden Chemilumineszenzsignale der

beiden Reportergene voneinander unterscheiden.

Durch den Dual-Luciferase-Assay der Firma Promega wurde überprüft, ob die miRNA-375TS, welche

vor direkt vor das Renilla-Luciferasegen in den Reporterplasmid kloniert wurde, die Expression der

Renilla-Luciferase inhibiert. Diese Expression wurde ins Verhältnis zur Expression der Firefly-

Luciferase gesetzt, deren Expression wiederum nicht durch das Vorhandensein der miRNA-375TS

betroffen sein sollte. Die aus der Umsetzung des im Puffer enthaltenen Luciferins, welches sowohl

Substrat der Firefly- als auch der Renilla-Luciferase darstellt, resultierende Chemilumineszenz

(Emissionsmaximum Renilla: 480 nm, Firefly: 565 nm) wurde luminometrisch detektiert und

zueinander ins Verhältnis gesetzt.

Wie bereits unter Kapitel 2.2.2.8.7 beschrieben, wurden die miRNA-375TS in das 3’UTR eines

psiCHECK2-amiR-375TS-Plasmids integriert. Um die Funktionalität der miRNA-TS zu überprüfen

wurde jede Messung als Duplikate durchgeführt. In 24-Well-Platten wurden 150000 HEK293T-Zellen

ausgesät, welche mit 400 ng pCMV-MIR-375-GFP und 400 ng psiCHECK2-375TS unter Verwendung

von PEI Max kotransfiziert wurden (Kapitel 2.2.3.5). Nach 48 h wurden die Zellen lysiert und die

Reportergenaktivität mit dem TriStar2 Multimode nach Herstellerangaben gemessen.

2.2.3.7 Zellviabilitätsassay

Die Messung der Zellviabilität wurden mit dem Cell Proliferation Kit II (XTT) nach Herstellerangaben

durchgeführt. Das Zellviabilitätsassay basiert auf der photometrischen Messung des Tetrazoliumsalzes

(XTT), welches durch die Dehydrogenase metabolisch aktiver Zellen zu einem orange fluoreszierenden

Formazanprodukt reduziert wird. Die Menge an gebildetem Formazan ist proportional zur Viabilität der

Zellen. In 96-Well-Platten wurden 50000 HeLa-Zellen pro Well ausgesät und nach 24 h bei einer

Konfluenz von 90 % mit einer MOI von 0,001 bzw. 0,0001 an rekombinantem CVB3

(4-fach Bestimmung je Probe) infiziert. Nach 24, 48 und 72 h wurden 50 µl XTT-Substrate zu jeder

Probe pipettiert und nach 4 h Inkubationszeit die Menge an gebildetem Formazan bei 450 nm (Tristar2

Material und Methoden

Multinode Reader LB942) gemessen. Für die Bestimmung der Viabilität wurde der Mittelwert der

Lysekontrollen gebildet (vier Wells mit 50 µl XTT-Substrat und zusätzlich 0,05 % Triton-X) und dieser

von jeder Probe abgezogen. Die Messwerte aller Proben wurden ins Verhältnis zu den unbehandelten

Proben (Mock) gesetzt.

2.2.4 Westerblot

Alle proteinchemischen Analysen wurden extern von Dr. Klaus Knoch am DZD-Paul Langerhans

Institut in Dresden durchgeführt. Die Zellen wurden mit Lysepuffer behandelt und die

Proteinkonzentration mittels BCA-Assay bestimmt. Separat wurden die Zellextrakte auf eine SDS-

PAGE aufgetragen und im Anschluss geblottet. Für die Detektion von CVB3-VP1 wurde ein anti-CVB3-

VP1-Antikörper (1:500 Verdünnung) verwendet, als Kontrolle dienten ein anti-γ-Tubulin (1:2000) und

der polyklonaler Antikörper anti-elF4G (1:1000). Die Membranen wurden mit den benannten

Antikörpern in PBS mit 5 % Magermilchpulver über Nacht bei 4° C inkubiert. Im Anschluss wurden die

Membranen dreimal mit 1x PBS gewaschen und in 5 % Magermilchpulver/PBS mit den

Sekundärantikörpern Ziege-anti-Maus bzw. Ziege-anti-Kanninchen IgGs (1:5000) für eine Stunde bei

RT inkubiert. Als Größenmarker wurde der Magic Mark XP verwendet.

2.2.5 Virologische Methoden

2.2.5.1 Herstellung von rekombinantem CVB3

Transfektion von CVB3-cDNA-Klonen in HEK293T-Zellen:

HEK293T-Zellen wurden auf 6-Well-Platten so ausgesät, dass diese nach 24 h eine Konfluenz von 70-

90% (1-1,2 Mio. Zellen) erreicht hatten. Die Herstellung des Transfektionsansatzes unterteilt sich in

zwei Schritte. Zunächst wurden 3,2 µg Plasmid-DNA mit 200 µl optiMEM vermischt und für 5 min bei

RT inkubiert. Parallel wurden 4 µl PEI Max (2 mg/ml) in 200 µl OptiMEM aufgenommen und für 5 min

bei RT inkubiert. Anschließend wurden beide Ansätze miteinander vermischt, gevortext und 15 min bei

RT inkubiert. In jedes Well wurden vorsichtig 400 µl des Transfektionsansatz pipettiert und die Platte

leicht geschwenkt. Nach 24 bis 48 h wurden die lysierten Zellsuspensionen nach zwei Einfrier-Auftau-

Zyklen in ein 2 ml Eppendorfgefäße überführt und 5 min bei 5000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde

abgenommen und der Virustiter mittels Plaque Assay auf HeLa Zellen bestimmt (Kapitel 2.2.5.3).

Virusamplifikation:

HeLa-Zellen wurden in T175-Zellkulturflaschen bis zu einer Konfluenz von 90 % angezogen,

anschließend wurde das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen mit 1x PBS gewaschen und 20 ml

virushaltigem Kulturmedium ohne FKS mit einer MOI von 5 in die Kulturflasche gegeben.

Nach 30 min Inkubation bei 37° C im Brutschrank (5 % CO2) wurde das Medium abgesaugt und durch

frisches FKS haltiges Kulturmedium ersetzt. 24 h später wurden die Zellkulturflaschen bei -20° C

eingefroren und wieder aufgetaut. Nach zwei weiteren Zyklen aus Einfrieren und Auftauen wurde die

Material und Methoden

Zellsuspension in 50 ml Falconröhrchen überführt und bei 3000 g für 5 min zentrifugiert. Die

Überstände wurden in neue Reaktionsgefäße überführt, aliquotiert und die Virustiter mittels Plaque

Assay (Kapitel 2.2.5.3) bestimmt. Die Lagerung der Viren erfolgte bei -80° C. Die Herstellung von

CVB3 und die Bestimmung der Virentiter sind schematisch in Abbildung 15 dargestellt.

Abbildung 15: Produktion rekombinanten CVB3’s einschließlich der Bestimmung des Virustiters mittels

Plaque Assay.

2.2.5.2 Aufreinigung der Viren mittels Saccharose-Kissen

In ein 12 ml Polyallomer Zentrifugationsröhrchen (zuvor mit 70% EtOH ausgespült und vollständig

getrocknet) wurden 3 ml 30 % ige Saccharose gegeben und das Röhrchen bei

(-20° C) eingefroren. Zehn ml der Virussuspension wurden vorsichtig auf das gefrorene

Saccharosekissen gegeben, so dass ein Abstand von 5 mm zwischen dem Flüssigkeitspiegel und der

oberen Röhrchenkante bestand. Nach Auftauen des Saccharosekissen undaustarrieren des Röhrchens,

erfolgte eine Ultrazentrifugation in der Beckman Optima L-90K mit einem SW41 Rotor für 3 h bei

40000 rpm. Anschließend wurden die Proben auf 4° C gekühlt. Der Überstand wurde aus dem Röhrchen

entfernt und das Pellet in 2 ml 1x PBS (25 mM MgCl2) gelöst. Um die Saccharosereste in der

Virussuspension vollständig zu beseitigen wurden 10 ml 1x PBS (25 mM MgCl2) in ein 12 ml

Polyallomer Zentrifugationsröhrchen vorgelegt und mit 2 ml Virenlysat überschichtet die Röhrchen und

unter den oben aufgeführten Bedingungen erneut zentrifugiert, diesmal jedoch nur für 1,5 h.

Anschließend wurde das Pellet in 200 µl 1x PBS (25 mM MgCl2) gelöst, aliquotiert und eingefroren.

Die Bestimmung des Virustiters erfolgte über einen Plaque Assay (Kapitel 2.2.5.3).

2.2.5.3 Bestimmung des Virustiters mittels Plaque Assay

Die Virentiter wurden mittels Plaque Assay bestimmt. Dafür wurde der zu untersuchende Virusstock in

1x PBS in 1:10-Schritten verdünnt. In 24-Well-Platten wurden 220000 HeLa-Zellen je Well ausgesät

und bei einer Konfluenz von etwa 90% mit den erstellten 1:10-Verdünnungen der zu überprüfenden

Viruslösung infiziert. Zunächst wurde das Kulturmedium vorsichtig abgesaugt, die verdünnten

Virussuspensionen hinzu pipettiert und für 30 min bei 37° C im Brutschrank (5 % CO2) inkubiert.

Daraufhin wurde die Virussuspension vorsichtig abgesaugt und die Zellen mit 500 µl Eagle-Overlay

(Zusammensetzung siehe Tabelle 21) überschichtet. Alle benötigten Komponenten sind in Tabelle 21

dargestellt. Der Difco-Agar wurde in der Mikrowelle (600 W, 1 min) verflüssigt. Alle anderen

Material und Methoden

Komponenten wurden im Wasserbad auf 42° C temperiert. Die aufgewärmten Bestandteile des Eagle

Overlay-Mediums wurden in einem 50 ml Reaktionsgefäß vermischt und weiterhin bei 42° C im

Wasserbad inkubiert. Um zu verhindern, dass die Nährlösung denaturiert bzw. klumpig bzw. fest wird

darf die Temperatur des Wasserbades 42° C nicht unterschreiten.

Nachdem das Eagle-Overlay binnen 15 min bei RT fest wurde, wurde die Kulturplatte für zwei bis drei

Tage (abhängig vom CVB3-Stamm) bei 37° C im Brutschrank (5 % CO2) kultiviert. Die Plaques wurden

abschließend mit 2x MTT-INT-Färbelösung angefärbt (20 µl pro Well), nach weiteren 2 h Inkubation

gezählt und die Anzahl der Plaque Forming Units (pfu) berechnet.

Tabelle 21: Zusammensetzung des Eagle-Overay-Mediums.

2.2.5.4 Infektion von Zellkulturen mit CVB3

Für die Infektionsversuche wurden HeLa -bzw. HEK293T-Zellen verwendet. Dazu wurden die Zellen

auf 24-Well-Platten so ausgesät, dass diese am folgenden Tag zu etwa 90% konfluent waren. Die

benötigte MOI des Virus wurde entsprechend der ausgesäten Zellzahl berechnet. Bei einer MOI von 1

wird theoretisch eine Zelle von einem Viruspartikel befallen. Für diese Berechnung muss die

Konzentration des Virusstocks bekannt sein. Diese wird in pfu pro Milliliter (pfu/ml) angegeben und

wird wie folgt berechnet:

pfu/ml= Zellzahl*MOI 1*Inokulationsvolumen

Virusstammlösung

Die berechnete Virusmenge wurde in 1x PBS aufgenommen, so dass das Inokulationsvolumen für eine

24-Well-Platte 300 µl pro Well betrug. Vor der Infektion wurde das Medium vorsichtig abgesaugt, die

Virussuspension hinzugegeben und für 30 min bei 37° C im Brutschrank (5 % CO2) inkubiert. Im

Anschluss wurde die Virussuspension abgesaugt, die Zellen mit 1x PBS gewaschen, mit frischem

Medium überschichtet und je nach gewünschter Infektionsdauer bei 37° C inkubiert.

2.2.5.5 MiRNA vermittelte CVB3-Inhibierungsassays

Alle Inhibierungsassays wurden entweder mit pCMV-MIR-375 -bzw. pCMV-MIR-216a-

Überexpressionsplasmiden auf HEK293T-Zellen oder mit miRNA-375-Mimics -bzw. siRNAs auf

HeLa-Zellen durchgeführt. Die Zellen wurden mit rekombinanten CVB3-Varianten, welche

Modifikationen am 3’ -oder 5’-Ende besitzen, infiziert. Die Target-Sequenzen (TS) für die miRNA-375

waren entweder für den CVB3-Plus -bzw. CVB3-Minusstrang generiert ((+) -bzw. (-)-Orientierung)).

Als Kontrolle wurde die miRNA-39TS verwendet.

Agar (3,3% ig) [ml]

7,5

12,5

17,5

Eagle Medium [ml]

22,5

37,5

52,5

FKS [ml]

Gesamtvolumen

Overlay-Ansatz [ml]

Material und Methoden

MiRNA-375 vermittelte Inhibierung von rekombinanten CVB3 mit integrierten miRNA-375TS:

Die HEK293T-Zellen wurden entweder mit pCMV-MIR-375 -oder mit pCMV-MIR-216a

(Negativkotrolle) -Expressionsplamiden transfiziert. Nach 24 h wurden diese mit CVB3-375(3+),

CVB3-375(3-), CVB3-375(5+), CVB3-375(5-) bzw. mit der Kontrolle CVB3-39TS infiziert (MOI 0,1).

HeLa-Zellen und miRNA-Mimics/siRNA:

Nachdem zuvor beschriebenen Schema für HEK293T-Zellen wurden auch HeLa-Zellen infiziert. Im

Unterschied zu den HEK293T-Zellen wurden die HeLa-Zellen zunächst mit einer Konzentration von

25 nM miRNA-Mimics bzw. Kontroll-siRNAs transfiziert und nach 4 h Kultivierungszeit mit

rekombinantem CVB3 infiziert. Nach 24 stündiger Infektion, nach zwei Zyklen bestehend aus

Einfrieren und Auftauen wurden die lysierten Zellen samt Medium in Eppendorfgefäße überführt,

zentrifugiert und mittels Plaque Assay die Virustiter bestimmt.

EndoC-βH1-Zellen:

Die EndoC-βH1-Zellen exprimieren endogen miRNA-375. Alle Infektionsversuche mit dieser und

INS-1E-Zelllinie (sowie Westernblots) wurden extern von Dr. Klaus Knoch am DZD-Paul Langerhans

Institut in Dresden durchgeführt.

2.2.6 CVB3-Myokarditismodell in der Maus

2.2.6.1 Injektion und zeitlicher Ablauf der CVB3-Injektion

Alle in dieser Arbeit verwendeten Mäuse wurden unter Einhaltung der deutschen Tierschutzgesetze -und

Verordnungen behandelt. Die Tierexperimente wurden durch das Landesamt für Gesundheit und

Soziales (LAGeSo) Berlin genehmigt. Für die Tierversuche wurden sowohl männliche Balb/C, NMRI

und C57BL/6 (Black 6) als auch weibliche Balb/C und NMRI-Mäuse von Charles River (Sulzfeld, D)

verwendet. Nach der Ankunft wurden die Tiere eine Woche lang im Tierstall adaptiert, bevor

Experimente durchgeführt wurden.

Die Infektion mit CVB3 erfolgte intraperitoneal (i.p.) bzw. intravenös (i.v.). Bei der i.p. Injektion wurden

pro Maus 200 µl der benötigten Virusmenge (5x104-1x108 pfu) in 0,9 % NaCl-Lösung gelöst und mit

einer Spritze appliziert. Die Mäuse wurden dabei manuell fixiert.

Bei der i.v. Applikation wurden 100 µl der Virussuspension (5x106-1x108 pfu) injiziert. Hierzu wurden

die Mäuse mit Isofluran narkotisiert, der Zugang zur Vene jugularis hergestellt und die Virussuspension

mit der Hilfe einer Hamiltonspritze vorsichtig und luftblasenfrei in die linke Vene jugularis injiziert. Im

Anschluss wurden die Wunden vernäht.

Die Tiere wurden täglich gewogen. Bei einer Gewichtsabnahme von 10% wurde zusätzlich Nassfutter

verabreicht, um die Nahrungsaufnahme zu erleichtern.

Material und Methoden

Nach sieben (akutes CVB3-Modell) bzw. 28 (chronisches CVB3-Modell) Tagen wurden die Tiere

mittels Genickbruch getötet. Es wurden Organ -und Blutproben für histologische, molekularbiologische

und labordiagnostische Untersuchungen entnommen.

Organproben vom Pankreas wurden in Trizol überführt und ebenso wie Organproben von Herz in

flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Auswertung bei -80° C gelagert. Die Blutproben wurden

bei 3000 g für 5 min abzentrifugiert, die Blutseren abgenommen und bis zur Verwendung bei -20° C

gelagert.

2.2.6.2 Allgemeiner Gesundheitsstatus

Der allgemeine physiologische Gesundheitsstatus der Mäuse wurde am siebten (akutes CVB3-Modell)

bzw. am 28. Tag (chronisches CVB3-Modell) nach der Infektion mit CVB3 anhand einer Skala von 1-5

(Score 1-5) beurteilt. Ein Score von 5 wurde für Tiere vergeben, die keinerlei Einschränkungen des

Gesundheitszustands zeigten, wohingegen bei einem Score von 1 die Tiere lediglich eine geringe

Aktivität und klinische Anzeichen einer schweren Infektionskrankheit aufwiesen (stark reduzierte

Bewegung, gekrümmte Haltung, struppiges Fell). Der Score wurde stets für alle Tiere einer Gruppe

ermittelt und ist als Mittelwert angegeben.

2.2.6.3 Histologische Untersuchungen

Die Organproben wurden in einer 4 %-igen Formalinlösung fixiert. Etwa 5 µm Große Gewebeproben

wurden geschnitten, in Paraffin eingebettet und mittels H&E Färbung angefärbt, um die Zerstörung und

die Inflammation der Gewebe zu visualisieren.

Mit der Masson-Trichrom-Färbung wurden fibrotischen Bereiche visualisiert. Die hier verwendete

Trichrom-Färbung nach Masson-Goldner kombiniert dieFarbstoffe Eisenhämatoxylin, Azophloxin,

Orange G und Lichtgrün SF, was eine selektive Darstellung von Kernstrukturen, Muskelfasern,

Kollagen, Fibrin und Erythrozyten erlaubt. Um die durch Myokarditis verursachte Inflammation

einzustufen zu können, wurde ein Inflammationsscore vergeben. Dieser lag zwischen 0 (keine

Inflammation); 1 (kleine Inflammationsspots, < 100 inflammatorische Zellen/ Herd); 2 (größere

Inflammationsspots >100 inflammatorischer Zellen/ Herde); 3 (≤ 10% der Querschnittsfläche) und 4

(10-30% der Querschnittsfläche). Die Bewertung der gefärbten Gewebe erfolgte mikroskopisch.

Die histopathologischen Bewertungen wurden durch Prof. Dr. Robert Klopfleisch (Institut für

Tierpathologie der Freien Universität Berlin) bzw. durch Prof. Dr. Karin Klingel (Kardiopathologie im

Institut für Pathologie des Universitätsklinikums Tübingen) durchgeführt.

2.2.6.4 Herzpassagierung von CVB3

Sechs Wochen alte weibliche NMRI-Mäuse wurden mit jeweils 5x106 pfu eines CVB3-Virusstocks

(H3N-375TS) i.p. infiziert. Nach sieben Tagen wurden die Tiere getötet, die Herzen entnommen und

mit dem Ultraturrax in serumfreiem Medium zerkleinert. Nach zwei Zyklen aus Einfrieren und Auftauen

Material und Methoden

wurde die Konzentration der Viren mittels Plaque Assay bestimmt. Mit den Viren wurden HeLa-Zellen

in einer T175-Kulturflasche mit einer MOI von 5 infiziert, mittels Saccharosegradientenzentrifugation

konzentriert und aufgereinigt, und die Titer mittels Plaque Assay bestimmt.

2.2.6.5 Hämodynamische Messung

Die in dieser Studie angewandte Methode der hämodynamischen Messungen wurde durch die

Arbeitsgruppe von Prof. Dr. med. Carsten Tschöpe (Institut für Kardiologie, Charité-

Universitätsmedizin Berlin, Campus Virchow-Klinikum) durchgeführt. Dafür wurden die

entsprechenden infizierten Tiere sowie die jeweiligen Kontrollgruppen am siebten Tag der Infektion

bzw. am 28. Tag der Infektion im chronischen Modell über die intraperitoneale Injektion von 0.8-

1.2 g/kg Urethan und 0.05 mg/kg Buprenorphin anästhesiert. Für die Intubation wurden die Tiere in

Rückenlage fixiert und der Hals überstreckt. Mittels eines in die Trachea eingeführten Plastiktubus

wurden die Tiere maschinell beatmet (Rodent Ventilator Type 7025, Ugo Basile, Comerio VA, Italien).

Der Thorax wurde unter Vermeidung größerer Blutverluste mittels eines Längsschnittes geöffnet und

der linke Ventrikel mit einer 20G Plastikkanüle punktiert. Über diese Kanüle wurde ein 1.2.F Druck-

Volumen-Katheter (Scisense Inc., Ontario, Kanada) in den linken Ventrikel des Herzens eingeführt.

Über den Katheter wurden die linksventrikulären Druck-Volumen-Schleifen detektiert, welche über

einen Mark VII Linearcorder (Graphtec Corp., Tokyo, Japan) bildlich dargestellt zu den entsprechenden

Parametern weiterverarbeitet wurden. Über die Messung der maximalen Druckanstiegsgeschwindigkeit

dP/dtmax (mmHg/s), wurde der links-ventrikuläre systolische Druck, welche die Kontraktilität

beschreibt, quantifiziert. Anhand der Messung der maximalen Druckabfallgeschwindigkeit dP/dtmin

(mmHg/s) wurde der links-ventrikuläre diastolische Druck quantifiziert, welcher wiederum die

Relaxationsfähigkeit (Compliance) beschreibt. Die Messungen wurden für 5 min je Versuchstier

durchgeführt.

2.3 Statistische Auswertung

Alle Daten sind dargestellt als ± standard error of the mean (SEM). Die statistischen Signifikanzen der

in vitro Daten wurden mit dem students-t-Test ausgewertet. Die Auswertung der in vivo Daten erfolgte

mit dem ungepaarten, zweiseitigen Mann-Whitney-U-Test. In beiden Tests wurden die Messwerte

zweier Gruppen ab einem p-Wert von kleiner als 5 % (p≤0,05) als signifikant bewertet. Weitere

vergebene Signifikanzlevel waren kleiner als 1% (p≤0,01) und kleiner als 0,1% (p≤0,001). In den

Abbildungen wurden die Signifikanzen wie folgt dargestellt p≤0.05 = *, p≤0.01 = **, p≤0.001 = ***.

Ergebnisse

3 Ergebnisse

3.1 Evaluierung der miRNA

Um ein Pankreas attenuiertes CVB3 entwickeln zu können, war es zunächst wichtig die Expressionen

der miRNAs im gesamten Pankreas zu bestimmen. Dafür wurde über eine Affimetrix Chip-Analyse, mit

welcher 1188 murine miRNAs detektiert werden können, ermittelt, welche der im gesamten Pankreas

exprimierten miRNAs die stärksten Expressionssignale aufweisen. Für weitere Untersuchungen wurden

die acht mRNAs mit dem höchsten detection above background on gene level (DABG-Signal)

ausgesucht (Tab. 22).

Tabelle 22: Ergebnisse der Affymetrix miRNA-Chip-Analyse

Von den in der Tabelle 22 dargestellten Daten zeigten die miRNAs-375, -200c, -690 und -217 die

stärksten Signale in der Affimetrix mirRNA-Chip-Analyse des Gesamtpankreas, wobei die miRNA-375

das höchste Expressionslevel aufwies.

Das Pankreas gliedert sich in endo -und exokrines Pankreasgewebe. In Mäusen repliziert CVB3 im

exokrinen Pankreas, so dass zumächst sichergestellt werden musste, ob die jeweiligen mRNAs auch in

diesem Teil des Pankreas exprimiert werden. Um jedoch den Schutz des gesamten Pankreas mit Hilfe

von miRNAs vor einer CVB3-Infektion gewährleisten zu können, ist es essentiell, dass diese in beiden

Gewebeteilen des Pankreas stark und miteinander vergleichbar exprimiert werden.

Um dies für die mittels der Affimetrix miRNA-Chip-Analyse identifizierten miRNAs (Tab. 22) zu

überprüfen, wurde das Pankreasgewebe von Balb/C-Mäusen mittels Lasermikrodissektion separiert, um

die Expressionslevel der miRNAs im endo -und exokrinen Pankreas zu bestimmen. Die RNA beider

Gewebefraktionen wurde mittels TRIzol extrahiert und die Expressionslevel der in Tabelle 22

aufgeführten miRNAs mit Hilfe einer qRT-PCR bestimmt. Für die relative Quantifizierung der miRNA

Expression wurde als endogenes Referenztranskript die U6 small nuclear RNA (U6 snRNA) mitgeführt.

Auf diese wurden die Ct-Werte der ermittelten miRNAs normalisiert. Werden üblicherweise sogenannte

Housekeeping-Gene wie die 18S rRNA zur RNA Quantifizierung von RNA verwendet, hat sich für die

Proben-ID

Signal

mmu-miRNA-375

11,74

mmu-miRNA-200c

11,71

mmu-miRNA-690

11,13

mmu-miRNA-217

11,09

mmu-miRNA-216a

10,72

mmu-miRNA-216b

10,24

mmu-miRNA-200b

10,08

mmu-miRNA-200a

9,51

Ergebnisse

miRNA Analyse in Geweben die U6 snRNA bewährt. Die Ergebnisse der qRT-PCR zeigten, dass die

miRNA-375 sowohl im endo- als auch im exokrinen Pankreas am stärksten exprimiert wird (Abb. 16).

Im Vergleich zur miRNA-375 wiesen die miRNAs-200a, -200b, -200c sowie die miRNA-690 eine etwa

um eine log10-Stufe geringere Expression auf und wurden jeweils in beiden Pankreasgeweben

vergleichbar stark exprimiert. Die miRNAs-216a, -216b und -217 wurden stärker im exokrinen Pankreas

exprimiert und zeigten durchschnittlich eine um zwei log10-Stufen niedrigere Expression als die miRNA-

375 (Abb. 16).

Abbildung 16:Relative miRNA-Expression in den pankreatischen Geweben von Balb/C-Mäusen.

Die RNA des Gesamtpankreas sowie die der mittels Laserresektion separierten endo -und exkorinen Pankreasgewebeteile wurde

über TRIzol-Extraktion isoliert und mit einer qRT-PCR auf die Expression verschiedener miRNAs überprüft. Für die

Evaluierung der miRNAs wurden diese auf die Expression der mitgeführten Referenzkontrolle U6 snRNA relativiert. n=1.

Für die Generierung des optimierten CVB3-Maus-Myokarditismodells mittels miRNA-TS regulierter

pankreasattenuierter CVB3-Varianten sollte die ausgewählte miRNA sehr stark im Pankreas und

gleichzeitig möglichst gering im Herzen exprimiert werden. Nur so kann gewährleistet werden, dass ein

effizienter Abbau des CVB3-Genoms im Pankreas erfolgt, wohingegen das Virus im Herzen weiterhin

repliziert. Aus diesem Grund wurden im Anschluss an die Analyse der miRNA-Expression im Pankreas

die Expressionslevel der evaluierten miRNAs im Herzgewebe von Balb/C-Mäusen untersucht (Abb. 17).

Entsprechend der relativen Quantifizierung der pankratischen miRNA-Expression erfolgte diese

innerhalb der Herzgewebe mittels einer relativen qRT-PCR und der Normalisierung auf die endogene

Referenz U6 snRNA. Der Vergleich der Expressionslevel zeigte, dass alle getesteten miRNAs stärker

im Pankreas als im Herzen exprimiert wurden. Die höchsten Expressionslevel im Pankreas wiesen

miRNA-375 und -690 auf. Da die miRNA-375 im Herzen jedoch fast um drei log10-Stufen niedriger

exprimiert wurde als die miRNA-690 und sie in der vorangegangenen quantitativen Expressionsanalyse

Ergebnisse

des endokrinen, vor allem aber des exokrinen Pankreas, die stärkste Expression in beiden Gewebeteilen

aufwies (Abb. 17), wurde sie für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

Abbildung 17: Relative miRNA-Expression in Herz und Pankreas von Balb/C-Mäusen.

Die RNA der murinen Pankreas- und Herzgewebe wurde mittels TRIzol-Extraktion isoliert und über eine qRT-PCR auf die

Expression verschiedener miRNAs überprüft. Für die Evaluierung der miRNAs wurden diese auf die Expression der

mitgeführten Referenzkontrolle U6 snRNA relativiert. n=1.

3.2 Insertion der miRNA-375TS in das CVB3-Genom

Das miRNA-Targeting basiert auf einer kurzen, perfekten Übereinstimmung mit der Ziel mRNA in

Kombination mit weiteren unvollkommenen Übereinstimmungen in deren unmittelbarer Nähe. Diese als

seed-Region bezeichnete Sequenz umfasst etwa 6-8 Nukleotide, welche meist zwischen dem zweiten

und siebten Nukleotid am 5’-Ende der miRNA beginnt285. Die gesamte Sequenz der miRNA-375 (mmu-

Maus) wurde mit Hilfe der Internetdatenbank www.mirbase.org bestimmt und weist nachfolgende

Sequenz auf:

5-UUUGUUCGUUCGGCUCGCGUGA-3 mmu-miRNA-375-3p

Aus der gesamten Sequenz der reifen miRNA-375 wurde die nachstehend aufgeführte komplementäre

miRNA-375TS-Sequenz (synthetisiert von der Firma LifeTechnologies) in drei Kopien in das virale

Genom inseriert.

5-TCACGCGAGCCGAACGAACAAA-3 miRNA-375TS

Mehrere Studien mit miRNA-TS zeigten, dass eine Mehrfachinsertion der gleichen TS nötig ist, um eine

effektive Inhibierung der Virusreplikation zu erzielen.246 Zudem kann über mehrere TS eine stärkere

Inhibierung erreicht werden. Eine Insertion von mehr als drei TS zeigte jedoch keine signifikant stärkere

Ergebnisse

Inhibierung, bzw. kann sich negativ auf die Replikation auswirken, da mit zunehmender Genomgröße

das Virus replikationsträger wird246,279.

Nachdem die zur miRNA-375 komplementäre miRNA-375TS-Sequenz bestimmt wurde, wurde sie in

das pMKS1-Plasmid279, in welches zuvor eine MCS kloniert wurde (pMKS1-3’MCS bzw. pMKS1-

5’MCS), inseriert. Alle durchgeführten Klonierungsschritte sind dem Kapitel 2.2.2.8 zu entnehmen. Die

dabei generierten viralen Vektoren sind in der Tabelle 12 (Kapitel 2.1.9) aufgeführt. Die Insertionsstellen

der komplementären TS in 3’-bzw. 5’- Enden des CVB3-Genoms in das Plasmid pMKS1 sind in

Abbildung 18 dargestellt. Auf die gleiche Weise erfolgte die Insertion der miRNA-39TSs.

Abbildung 18: Insertionsstellen der miRNA-375TS und miRNA-39TS-Sequenzen im pMKS1-Plasmid.

Drei Kopien der miRNA-375TS Sequenz wurden über die Restriktionsschnittstellen AsiSI und PmeI in (+) bzw. (-) Orientierung

in die entsprechende MCS am 5’ -bzw. 3’-Ende des CVB3-Genoms im pMKS1-Plasmid inseriert. Drei Kopien der miRNA-39

wurden in die MCS am 5’ -bzw. 3’-Ende des pMKS1-Plasmids, jeweils in (+) Orientierung, inseriert. [MCS: multiple cloning

site, IRES: internal ribosomal entry site.]

3.3 Generierung replikativer CVB3-Varianten

Um zu überprüfen, ob sich aus den generierten cDNA-Klonen, denen miRNA-TS in das Genom inseriert

wurden, replikationsfähiges Virus bilden kann, wurden zunächst Transfektionsversuche mit dem GFP-

expimierenden Kontrollplasmid pSipo in HEK293T-Zellen durchgeführt. Für die Identifizierung eines

geeigneten Transfektionsreagenz wurden zunächst HEK293T-Zellen in verschiedenen Zellzahlen

ausgesät und unter Verwendung von Lipofectamin2000, PeiMax 40K, und Pei (Kapitel 2.2.3.5) mit dem

pSipo-Kontrollplasmid transfiziert. Es zeigte sich, dass sowohl mit Lipofectamin2000 als auch mit

PeiMax 40K eine gute Transfektionseffizienz in HEK293T Zellen erzielt werden kann, wobei sich

PeiMax 40K bei ähnlicher Effektivität als deutlich kostengünstiger darstellt (Ergebnisse nicht gezeigt).

Ergebnisse

Nach der Identifikation der geeigneten Transfektionsbedingungen (HEK293T, 1200000 Zellen je 6-

Well, PeiMax 40K) konnte die Bildung von replikationsfähigem CVB3 aus den generierten cDNA-

Klonen überprüft werden.

Üblicherweise wird cDNA mittels T7-RNA-Polymerase transkribiert und die darüber gewonnene,

aufgereinigte RNA (virale RNA, vRNA) in die Zellen transfiziert. Die direkte Transfektion eines cDNA-

CVB3-Klons führte aber ebenfalls zur Bildung von replikationsfähigem Virus.

Für den Vergleich zwischen der direkten Transfektion des cDNA-Klons und der vRNA wurden

HEK239T-Zellen entweder mit dem CVB3-eGFP-cDNA-Klon oder mit vRNA dieses Klons transfiziert.

Das im CVB3-eGFP inserierte GFP konnte 24 h nach Transfektion fluoreszenzmikroskopisch beobachtet

werden. Bei den direkt mit cDNA transfizierten HEK293T-Zellen fluoreszierten etwa 10% der Zellen,

bei denen, welche mit der vRNA transfiziert wurden, waren es ca. 80 % (Abb. 19A-B). Das deutet

daraufhin, dass die Replikation vom CVB3-eGFP-vRNA-Klon höher als die des cDNA-Klon sein

könnte. Um größere Virusmengen zu generieren, erfolgte die Transfektion (Kapitel 2.2.5.1) der cDNA-

Klone auf HEK293T-Zellen für insgesamt 48 h bis eine deutliche Zelllyse im Durchlichtmikroskop

ersichtlich war. Anschließend wurden die einzelnen CVB3-Virusvarianten geerntet. Die Virustiter der

über die direkte cDNA-Transfektion in HEK293T-Zellen generierten CVB3-Virusvarianten wurden

anschließend mittels Plaque Assay auf HeLa-Zellen bestimmt (Durchführung siehe Kapitel 2.2.5.3).

Dabei zeigte sich, dass alle generierten CVB3-Virusvarianten einen Titer zwischen 2,7x107 – 1,7x108

pfu/ml aufwiesen. Da vergleichbare Titer an replikationsfähigem CVB3 mit der direkten cDNA-

Transfektionsmethode und mit der vRNA-Methode generiert werden konnten, wurden folgend alle

CVB3-Varianten über die Tramsfektion der cDNA hergestellt. Diese Methode reduzierte den

Zeitaufwand und die Kosten, da sowohl die Synthese und die Aufreinigung der vRNA entfielen.

Abbildung 19: GFP-Expression nach Transfektion von CVB3- cDNA bzw. CVB3-rRNA.

HEK293T-Zellen wurden ausgesät (1,1x106 Zellen je 6-Well) und bei einer Konfluenz von 70-90 % mit einem

Transfektionsgemisch (400 µl) aus 4 µl PeiMax (2 µg/ µl) und (A) cDNA bzw. (B) vRNA des CVB3-eGFP transfiziert. Die

fluoreszenzmikroskopische Auswertung erfolgte nach 24 h. n=2. [cDNA: copy DNA, vRNA, virale RNA.]

Ergebnisse

3.4 Wachstumsanalysen und Zellviabilitätsassays der generierten CVB3-

Varianten

Nach Bestimmung der jeweiligen Virustiter wurden Wachstumskurven der rekombinanten miRNA-TS

enthaltenden CVB3-Varianten auf Hela-Zellen generiert. Bei allen rekombinanten CVB3-Varianten mit

Modifikationen am 3’-Ende war das Wachstum nach 24 h und 48 h mit durchschnittlich 107 pfu/ml

ähnlich im Vergleich zur unmodifizierten CVB3-Kontrolle. Lediglich bei CVB3-39(3+) lag der

Virustiter 8 h und 24 h nach Infektion um etwa eine log10-Stufe niedriger bei 5,8 x 105 bzw. 5 x 106

pfu/ml. Zum Zeitpunkt 48 h war er mit 5x107 pfu/ml hingegen ähnlich hoch wie bei den anderen

Varianten mit 7,2x107 pfu/ml (Abb. 20A). Bei den rekombinanten CVB3-Varianten mit Modifikationen

am 5’-Ende war der Virustiter bei dem unmodifizerten CVB3-Kontrollvirus am höchsten, gefolgt von

den rekombinanten Varianten CVB3-39TS(5+) -und CVB3-375TS(5+). Der niedrigste Virustiter wurde

für CVB3-375(5-) nachgewiesen und lag im Vergleich zum Kontrollvirus nach 24 h und 48 h mehr als

eine log10-Stufe unter diesem (Abb. 20B).

Abbildung 20: Wachstumskurven rekombinanter CVB3-375TS und CVB3-39TS-Varianten.

HeLa-Zellen wurden mit rekombinanten CVB3-Varianten mit (A) integrierten miRNA-TSs am 3’-Ende (CVB3-375(3+) -bzw.

(3-), CVB3-39TS(3+) oder (B) rekombinanten CVB3-Varianten mit inserierten miRNA-TSs am 5’-Ende (CVB3-375(5+) -bzw.

(5-), CVB3-39TS(5+) jeweils mit einer MOI von 0,01 infiziert. Die viralen Titer der Proben wurden zu den angegebenen

Zeitpunkten (0, 8, 24 und 48 h nach Infektion) mittels eines Plaque Assays auf HeLa-Zellen bestimmt. Dargestellt sind

Mittelwerte ± SEM, n=2. (C) Zusätzlich wurde die Plaque-Morphologie der mit den verschiedenen CVB3-Varianten infizierten

HeLa fotographisch dokumentiert. [pi: post infection]

Alle rekombinanten CVB3-Varianten bis auf CVB3-375TS(5-) bildeten etwa gleichgroße Plaques aus

(Abb. 20C). Bei den CVB3-375TS(5-) waren die Plaques deutlich kleiner. Diese Beobachtung lässt

Ergebnisse

darauf schließen, dass die Insertion von miRNA-375TS in den CVB3-Minusstrang ((-)-Orientierung) in

Zusammenhang mit der Insertion in das 5’-Ende des Protein kodierenden Bereichs des CVB3-Genoms

vermutlich zu einer verringerten Fitness des Virus führt. Alle anderen Insertionen von miRNA-TS

wurden hingegen ohne Veränderungen der Virustiter von CVB3 toleriert.

Nach Überprüfung der Replikation der rekombinantem CVB3-Varianten mit den verschiedenen miRNA-

375TS -bzw. miRNA-39TS-Insertionen, wurde deren Zytotoxizität mit Hilfe eines Zellviablitätsassays

(XTT) überprüft. Jede der verwendeten rekombinanten CVB3-Varianten führte nach 72 stündiger

Infektion zu einer vollständigen Lyse des Zellrasens. Die CVB3-375TS-Varianten mit der Modifikation

am 3’-Ende führten bereits nach 48 h Infektion zu einer Lyse in einem Großteil der Zellen. Eine höhere

Zellviabilität wurde bei dem unmodifizierten rCVB3.1 sowie bei CVB3-39TS beobachtet (Abb. 21A).

Mit den rekombinanten CVB3-Varianten mit Modifikationen am 5’-Ende wurden ähnliche Resultate wie

bei den 3’-Ende modifizierten CVB3-Varianten erzielt. Lediglich nach 48 stündiger Infektion mit CVB3-

375TS(5-) wiesen die Zellen noch immer eine sehr hohe Viabilität auf, was auf die Insertion der miRNA-

375TSs in der (-)-Orientierung zurückzuführen ist (Abb. 21B).

Abbildung 21: Zellviabilitätsassays (XTT) der rekombinanten CVB-375TS bzw. CVB3-39TS-Varianten.

HeLa-Zellen wurden mit dem Ursprungsvirus rCVB3.1 bzw. (A) den rekombinanten CVB3-Varianten mit integrierten miRNA-

TSs am 3’-Ende (CVB3-375(3+) -bzw. (3-), CVB3-39TS(3+) oder (B) den rekombinanten CVB3-Varianten mit inserierten

miRNA-TSs am 5’-Ende (CVB3-375(5+) -bzw. (5-), CVB3-39TS(5+) jeweils mit einer MOI von 0,01 infiziert. Die Messung

der Zellviabilität erfolgte 24, 48 h und 72 h nach Infektion. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM, n=3.

Bei allen rekombinanten CVB3-Varianten wurde ein ähnlicher Wachstumsverlauf beobachtet.

Verglichen mit den Modifikationen am 3´-Ende verursachten die Modifikationen am 5’-Ende eine

Ergebnisse

Verringerung der Replikation um etwa eine log10-Stufe (Abb. 20B). Aus diesem Grund wurden für die

in vivo Versuche CVB3-Varianten mit Modifikationen am 3’-Ende ausgewählt.

3.5 Reportergenassay mit pMCV-MIR-375 in HEK293T-Zellen

Bevor die Inhibierbarkeit der miRNA-375TS durch miRNA-375 im Rahmen der Untersuchungen der

miRNA-375TS enthaltenden CVB3 analysiert wurde, wurden initiale Untersuchungen mit einem Dual

Luciferase Reporterassay zur Überprüfung der Funktionalität der miRNA-375TS durchgeführt.

Dafür wurden HEK293T-Zellen für 24 h mit dem miRNA-375 Expressionsplasmid (pCMV-MIR-375)

und dem miRNA-375TS enthaltenden Indikatorplasmid (psiCHECK2-375TS) kotransfiziert. Als

Kontrolle dienten die Plasmide pCMV-MIR-375 und psiCHECK2-HexonTS, welches keine miRNA-

375TS enthält.

Nach der Kotransfektion von HEK293T-Zellen mit dem pCMV-MIR-375 -und psiCHECK2-375TS-

Plasmid kam es im Vergleich zur Kontrollprobe zur Verringerung der Luciferaseaktivität um >92 %,

was zeigt, dass die miRNA-375TS durch die miRNA-375 erkannt wurde und ein Gensilencing eintrat

(Abb. 22). Dies zeigt, dass die miRNA-375TSs funktional sind.

HEK293T-Zellen wurden für 24 h mit den beiden Plasmiden pCMV-MIR-375 und psiCHECK2-375TS kotransfiziert und

mittels Dual Luciferase Reporterassay auf die relative Luciferaseaktivität getestet. Als Kontrolle diente die unter den gleichen

Bedingungen durchgeführte Kotransfektion der beiden Plasmide pCMV-MIR-375 und psiCHECK2-HexonTS. Dargestellt sind

Mittelwerte ± SEM, **p≤0,01, n=3.

3.6 Inhibierungsassays mit pMCV-MIR-375 in HEK293T-Zellen

Nachdem die Funktionalität der miRNA-TS nachgewiesen wurde, konnte die Inhibition der

modifizierten CVB3-Varianten durch die miRNA-375 überprüft werden. Dazu wurden HEK293T-Zellen

mit dem Plasmid pCMV-MIR-375 transfiziert und nach 24 h mit der jeweiligen rekombinanten CVB3-

Variante infiziert. Als Kontrolle wurden HEK293T-Zellen mit dem Plasmid pCMV-MIR-216a, welches

die miRNA-216a exprimiert, transfiziert und entsprechend nach 24 h mit der jeweiligen CVB3-Variante

Abbildung 22: Überprüfung der Funktionalität der inserierten miRNA-375TS mittels Dual-Luciferase-

Reporterassay.

Relative Luciferaseaktivität [%]

Ergebnisse

infiziert. CVB3-375TS(3+) wurde im Vergleich zur Kontrollprobe (CVB3-375TS(3+) und pCMV-MIR-

216a) mit einer Effizienz von 96 % inhibiert. Bei der rekombinanten CVB3-375TS(3-)-Variante konnte

keine Inhibierung der Virusreplikation detektiert werden (Abb. 23A).

Für CVB3-375TS(5+) konnte eine Inhibierungseffizienz von 85 % festgestellt werden. Auch wenn der

Virustiter der CVB3-375TS(5-)-Variante sowohl bei den mit dem pCMV-MIR-375-Plasmid

transfizierten Proben als auch bei den Kontrollproben niedriger als bei den entsprechenden mit CVB3-

39TS infizierten Proben lag, konnte keine signifikante Inhibierung des Virustiters zur entsprechenden

miRNA-Kontrollprobe nachgewiesen werden (Abb. 23B). Weder bei CVB3-39TS(3+) bzw. CVB3-

39TS(5+) kam es zu einer miRNA-375 vermittelten Verringerung der Virustiter.

Abbildung 23: Inhibierung rekombinanter CVB3 mit 3’- bzw. 5’-inserierten miRNA-375TS durch die

miRNA-375.

HEK293T-Zellen wurden mit pCMV-MIR-375 bzw. mit pCMV-MIR-216a (Negativkotrolle) transfiziert und 24 h später

entweder mit (A) CVB3-375TS(3+), CVB3-375TS(3-) oder CVB3-39TS(3+) bzw. mit (B) CVB3-375TS(5+), CVB3-

375TS(5-) oder CVB3-39TS(5+) mit einer MOI von 0,1 infiziert. Nach 24-stündiger Infektion wurden die virushaltigen

Überstände genommen und die jeweiligen Virustier mittels Plaque Assay auf HeLa-Zellen bestimmt. Dargestellt sind

Mittelwerte ± SEM, ***p≤0,001, n.s. = nicht signifikant, n=3.

3.7 Inhibierungsassays mit miRNA-375-Mimics in HeLa-Zellen

Die meisten der bisher durchgeführten CVB3-Infektionsversuche wurden in HeLa-Zellen durchgeführt.

Für die Transfektion großer Plasmide, wie die des rund 6300 kb großen Überexpressionsplasmid der

miRNA-375 (pCMV-MIR-375), erweisen sie sich jedoch als ungeeignet. Unter Verwendung der deutlich

kleineren miRNA-Mimics (21 Nukleotide) kann eine effiziente Transfektion der Hela-Zellen erzielt

werden, so dass die die Inhibierung der Replikation der generierten CVB3-Varianten in HeLa-Zellen mit

miRNA-375-Mimics wiederholt wurde. Dafür wurden HeLa-Zellen zunächst für 4 h mit miRNA-375-

Ergebnisse

Mimics transfiziert und anschließend für 24 h mit der jeweiligen rekombinanten CVB3-Variante

infiziert. Als Negativkontrolle wurden HeLa-Zellen mit einer kommerziellen siRNA transfiziert und

entsprechend für 24 h mit der jeweiligen CVB3-Variante infiziert. CVB3-375TS(3+) wurde im

Vergleich zur siRNA-Kontrollprobe mit einer Effizienz von 93 % durch die Transfektion mit den

miRNA-375-Mimics inhibiert. Im Gegensatz zur Transfektion der HEK293T-Zellen mit pCMV-MIR-

375 (Abb. 23A) konnte in den HeLa-Zellen unter Einsatz von miRNA-375-Mimics auch für die CVB3-

375TS(3-)-Variante eine 99 % ige Inhibierung des Titers festgestellt werden (Abb. 24A). Für CVB3-

375TS(5+) konnte eine Inhibierungseffizienz von 88 % festgestellt werden (Abb. 24B), welche

vergleichbar mit der Inhibierungseffizienz durch die miRNA-375 auf HEK293T-Zellen war (Abb. 23B).

Durch die miRNA-375-Mimics wurde auf den HeLa-Zellen der Virustiter der CVB3-375TS(5-)-

Variante um 91% inhibiert (Abb. 24B). Die Ergebnisse zeigen, dass auf HeLa-Zellen durch den Einsatz

von miRNA-375-Mimics eine effizientere Inhibition von CVB3-375TS(3-) und CVB3-375TS(5-)

erreicht werden konnte als auf den HEK293T-Zellen durch das Überexpressionsplasmid pCMV-MIR-

375. Wie erwartet kam es auch hier zu keiner miRNA-375 vermittelten Inhibierung der CVB3-39TS(3+)

bzw. CVB3-39TS(5+)-Varianten.

Abbildung 24: Inhibierung rekombinanter CVB3 mit 3’- bzw. 5’- inserierten miRNA-375TS durch

miRNA-375-Mimics.

HeLa-Zellen wurden mit miRNA-375-Mimics bzw. mit einer scrambled siRNA (Negativkontrolle) transfiziert und nach 4 h

entweder mit (A) CVB3-375TS(3+), CVB3-375TS(3-) oder CVB3-39TS(3+) bzw. mit (B) CVB3-375TS(5+), CVB3-375TS(5-

), oder CVB3-39TS(5+) mit einer MOI von 0,1 infiziert. Nach 24-stündiger Infektion wurden die virushaltigen Überstände

genommen und die jeweiligen Virustiter mittels Plaque Assay auf HeLa-Zellen bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM,

***p≤0,001, n=3.

3.8 Endogene miRNA-375-Expression verschiedener Pankreaszelllinien

Da in den in vivo Versuchen die Replikation von CVB3 im Pankreas inhibiert werden soll, wurden

zunächst verschiedene pankreatische Zelllinien in vitro bezüglich ihrer Expression der miRNA-375

Ergebnisse

untersucht. Die Identifikation von endogen die miRNA-375 exprimierenden Zelllinien ermöglicht es zu

überprüfen, ob die rekombinanten CVB3-Varianten auch durch physiologische Mengen an miRNA-375,

welche geringer als die nach Transfektion von Überexpressionsplasmiden sind, inhibiert werden können.

Dafür wurden die endogenen miRNA-Expressionslevel im Gesamtpankreasgewebe von Balb/C-Mäusen,

in exokrinen (AR42J) bzw. endokrinen (INS-1E) Pankreaszellen der Ratte sowie in humanen

Pankreaszellen (EndoC-βH1) mittels qRT-PCR unter Verwendung miRNA-spezifischer stem-loop

Primer bestimmt (Kapitel 2.2.2.12). Diese Expressionslevel wurden mit denen verglichen, welche mit

pCMV-MIR-375 transfizierte HEK293T-Zellen nach 24 bzw. 48-stündiger Transfektion aufwiesen.

Abbildung 25: miRNA-375-Expression

verschiedener Zelllinien.

Endogene miRNA-375 Expressionslevel des

Gesamtpankreas von Balb/C-

Mäusen,

endokrinen Pankreaszellen von Ratten (INS-

1E) und der humanen Pankreaszellen (EndoC-

βH1) wurden mittels qRT-

PCR unter

Verwendung miRNA-spzifischer stem-loop

Primer bestimmt. HEK293T-Zellen wurden mit

dem miRNA-375 Expressionsplasmid pCMV-

MIR-375

transfiziert und die Expressionslevel

der miRNA-

375 zu den entsprechenden

Zeitpunkten entsprechend quantifizi

ert. Als

Kontrolle wurden nichttransfizierte HEK293T-

Zellen verwendet.

Alle Werte wurden auf die

Expression der snRNA-

U6 relativiert.

Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. n=3.

[aU:

Array Units, w/o: without-untransfiziert]

Im Pankreas der Balb/C-Mäuse wurde die miRNA-375 am stärksten exprimiert. Die Expression der

miRNA-375 in den Zelllinien INS-1E und EndoC-βH1 wies ein ähnliches Niveau auf. Die nicht

transfizierten HEK293T-Zellen (w/o) zeigten keine nachweisbare Expression der miRNA-375,

wohingegen 24 h nach Transfektion mit dem pCMV-MIR-375-Plasmid eine etwa zweifach und nach

48 h eine siebenfach höhere Expression detektierbar war (Abb. 25).

3.9 Inhibierungsassays mit endogen miRNA-375 exprimierenden Zellen

Nachdem die Inhibierungsassays in HEK293T -bzw. HeLa-Zellen, welche zuvor mit dem pCMV-MIR-

375-Plasmid bzw. den miRNA-375-Mimics transfiziert wurden, zeigten, dass rekombinante CVB3-

Varianten mit miRNA-375TS(+) in den 3’ - bzw. 5’-Enden inhibiert werden, wurden die

Inhibierungsversuche mit endogen miRNA-375 exprimierenden Zelllinien wiederholt.

Ergebnisse

Zunächst wurden INS-1E und EndoC-βH1-Zellen mit CVB3-eGFP mit einer MOI von 0; 1,5; 3 oder 4,5

infiziert, um deren Suszeptibilität für die CVB3-Infektion zu prüfen. Anschließend wurde das Ergebnis

der Infektion durch den Nachweis des CVB3-Proteins VP1 immunhistochemisch bzw. im Western Blot

analysiert. Während in EndoC-βH1 Zellen bei einer CVB3-eGFP MOI von 4,5 VP1 in der

Immunfluoreszenzfärbung nachweisbar war, konnte in INS-1E-Zellen bei der gleichen MOI kein VP1

detektiert werden (Abb. 26A). Die in Abbildung 26A ersichtliche immunohistochemische Färbung zeigt

exemplarisch die Ergebnisse der Infektion mit einer CVB3-eGFP MOI von 4,5, bei der VP1 im roten

Fluoreszenzkanal, die Kernfärbung mit DAPI im blauen Fluoreszenzkanal und die der CVB3-eGFP

Eigenfluoreszenz im grünen Kanal dargestellt wurden.

Abbildung 26: CVB3-eGFP induziert die Expression des VP1-Proteins in EndoC-βH1-Zellen.

(A) Immunohistochemische Analyse von mit INS-1E und EndoC-βH1-Zellen, 24 h infiziert mit CVB3-eGFP, MOI 4,5. Die

Zellen wurden fixiert, gegen virales VP1 (roter Kanal) gefärbt und fluoreszenzmikroskopisch analysiert. Die Kernmorphologie

wurde durch eine DAPI-Färbung (blauer Kanal) visualisiert, die GFP Eigenfluoreszenz ist im grünen Kanal dargestellt. (B) Das

proteinhaltige Lysat von INS-1E und EndoC-βH1-Zellen, 24 h infiziert mit CVB3-eGFP, MOI 0, 1,5, 3 und 4,5 bzw. CVB3

(M16572) oder CVB5 (Faulkner) wurde im Western Blot auf die Expression viralen VP1 und γ-Tubulin (Beladungskontrolle)

untersucht. [VP1: Virus-Kapsidprotein]

Die Ergebnisse des Western Blots bestätigten die in der immunohistochemischen Färbung beobachtete

schlechte Suszeptibilität der Zelllinie INS-1E für CVB3-eGFP (Abb. 26B). Entsprechend der

immunohistochemischen Analyse konnte bei den EndoC-βH1-Zellen, ab einer CVB3-eGFP MOI von

1,5, VP1-Protein mit einer Größe von 33 kDa nachgewiesen werden. Mit einem Anstieg der CVB3-eGFP

Dosis war in dieser Zelllinie eine Zunahme des VP1-Proteins erkennbar (Abb. 26B). Alle Zellen ließen

sich mit CVB3 (M16572) und CVB5 (Faulkner) infizieren, die beide auf pankreatische Zellen mittels

wiederholter Passagierung adaptiert wurden und somit eine starke Infektion der Zelllinien möglich

machten. Als Beladungskontrolle wurde das 55 kDa schwere γ-Tubulin verwendet. Bis auf EndoC-βH1

zeigte keine der getesteten pankreatischen Zelllinien eine gute Suszeptibilität während der Infektion mit

geringen Virusmengen, daher wurde der nachfolgende Inhibierungsassay mit den rekombinanten CVB3

auf EndoC-βH1-Zellen durchgeführt.

Ergebnisse

Die EndoC-βH1-Zellen wurden hierzu mit CVB3-375TS(3+) bzw. als Kontrolle mit CVB3-39TS(3+)

für 24 h mit einer jeweiligen MOI von 1,5 infiziert und die viralen Titer mittels Plaque Assay bestimmt.

Zusätzlich wurde die Inhibierung im Western Blot anhand der Bildung der viralen Proteine VP1 und

eIF4G bzw. dessen prozessierter Form, cleaved eIF4G, überprüft. Der Plaque-Assay zeigte, dass die

endogene miRNA-375 der EndoC-βH1-Zellen die CVB3-375TS(3+) Titer um 99,98 % verringerte, was

einer 8196-fachen Inhibierung entspricht (Abb. 27A).

Der Western Blot bestätige die Inhibierung von CVB3-375TS(3+) in den infizierten EndoC-βH1-Zellen.

Im Vergleich zur Infektion mit CVB3-39TS(3+) konnte in den mit CVB3-375TS(3+) infizierten Proben

kein virales VP1-Protein detektiert werden. Der für die Initiation der Translation zuständige

eukaryotische Translationsinitiationsfaktor 4G (eIF4G), mit einer Größe von 220 kDa, konnte nur in den

nicht infizierten Proben (Mock) bzw. CVB3-375TS(3+) infizierten Proben nachgewiesen werden. Bei

den mit CVB3-39TS(3+) infizierten Proben war dieses abgebaut, so dass seine prozessierte Form cleaved

eIFG4 nachweisbar war, was wiederum auf die Translation der viralen Proteine hindeutet (Abb. 27B).

Abbildung 27: Inhibierungsassays mit CVB3-375TS(3+) und CVB3-39TS(3+) in EndoβH1-Zellen.

EndoC-βH1-Zellen wurden für 24 h mit CVB3-375TS(3+) bzw. -39TS(3+) infiziert (MOI: 1,5). (A) Die viralen Titer im

Zellkulturüberstand wurden mittels Plaque Assay bestimmt. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM, ***p≤0,001, n=2 (B) Western

Blot zum Nachweis viralen VP1-Proteins, eIF4G, cleaved eIF4G und γ-Tubulin (Beladungskontrolle). Nicht infizierte Zellen

(Mock) dienten als Negativkontrolle. (VP1: Virus-Kapsidprotein 1; eIF4G: eukaryotischer Initiationsfaktor der Translation 4).

3.10 Replikation der rekombinanten CVB3-Varianten in primären embryonalen

Kardiomyozyten

Die Optimierung des Maus-Myokarditismodells beruht darauf, dass die mittels miRNA-375TS

modifizierten rekombinanten CVB3-Varianten im Pankreas über den RNAi-Mechanismus eliminiert

werden, ihre Replikation im Herzen jedoch von dieser Modifikation nicht beeinträchtigt wird. Um dies

Ergebnisse

in vitro zu überprüfen, wurden primäre embryonale Mauskardiomyozyten für 24 h mit nicht

modifiziertem rCVB3.1 bzw. mit den rekombinanten Varianten CVB3-375TS(3+) bzw. CVB3-

39TS(3+) jeweils mit einer MOI von 1 infiziert. Die mittels Plaque Assay bestimmten Virustiter zeigten,

dass die neonatalen Mauskardiomyozyten suszeptibel für eine CVB3-Infektion sind und keine der beiden

eingesetzten rekombinanten CVB3-Varianten inhibiert wurde. Die ermittelten Virustiter lagen

durchschnittlich bei 1x107 pfu/ml (Abb. 28). Die primären embryonalen Mauskardiomyozyten wurden

freundlicherweise von Prof. Dr. Anje Behling (Charité – Universitätsmedizin Berlin, Lab Cardiac

infection biology and immunology) zur Verfügung gestellt.

Abbildung 28: Replikation von rCVB3.1, CVB3-375TS(3+) sowie

CVB3-39TS(3+) in primären embryonalen Kardiomyozyten.

Primäre embryonale Mauskardiomyozyten wurden für 24

h entweder mit

rCVB3.1, CVB3-375TS(3+) oder CVB3-39TS(3+) mit einer MOI von

infiziert. Dargestellt sind Mittelwert ±SEM, die statistische Ausw

ertung

erbrachte keine signifikanten Unterschiede, n=2.

3.11 Vergleich des Verlaufs der H3N und rCVB3.1 Infektion in vivo

Die in vitro Versuche zeigten, dass die rekombinante Mutante CVB3-375TS(3+) in Pankreaszellen,

welche endogen miRNA-375 exprimieren, hocheffizient inhibiert wird, wohingegen die rekombinante

CVB3-Mutante CVB3-39TS(3+) bzw. rCVB3.1 (Wildtyp ohne TS) nicht supprimiert wurden. In den

primären embryonalen Mauskardiomyozyten konnte keine Suppression der rekombinanten Varianten

CVB3-375TS(3+), CVB3-39TS(3+) bzw. rCVB3.1 nachgewiesen werden.

Für die Etablierung des murinen in vivo Modells der pankreasattenuierten CVB3-Infektion wurde

zunächst ein weiterer CVB3-Stamm, welcher aus dem pBKCMV-H3-Plasmid generiert wurde,

hergestellt und nachfolgend als H3 bezeichnet. Um zu überprüfen ob rCVB3.1 und H3 eine nachweisbare

Inflammation im Herzen bzw. im Pankreas induzieren können, wurden sechs Wochen alte, weibliche

NMRI-Mäuse mit rCVB3.1 (1x106 pfu) bzw. H3 (1x105 pfu) infiziert. Die mit H3 infizierten Tiere

zeigten eine für das CVB3-Myokarditismodell typische Gewichtsreduktion von ca. 15-20 % innerhalb

des siebentägigen Untersuchungszeitraums (Abb. 29A). Die viralen Titer im Herzen wurden mittels

Plaque Assay, die im Pankreas mittels qRT-PCR, bestimmt. Im Herzen lag der H3-Titer sieben log10-

Stufen höher als der von rCVB3.1 (Abb. 29B). Auch im Pankreas lag die CVB3-Kopienzahl der H3-

Proben zwei log10-Stufen höher als die der rCVB3.1-Proben (Abb. 29C). Das Pankreas aller mit H3

infizierten Tiere war nahezu komplett zerstört und die entsprechenden Inflammationsscores des Pankreas

Ergebnisse

lagen durchgängig bei einem Wert von 3. Bei den mit rCVB3.1 infizierten Tieren wiesen drei Mäuse

einen Score von 2 auf, drei Mäuse einen Score von 1 und eine Maus einen Score von 0 (Abb. 29D).

Auch die kardiale Inflammation der mit H3 infizierten Tiere war mit einem gemittelten Score von 1,7

signifikant höher als die Inflammation im Herzen der mit CVB.3.1 infizierten Tiere, die einen

durchschnittlichen Score von 0,3 aufzeigten (Abb. 29E). Im Gegensatz zu rCVB3.1 kann CVB3-H3 in

Mäusen eine Myokarditis induzieren und wurde in allen nachfolgenden in vivo Untersuchungen

eingesetzt.

Abbildung 29: Vergleich der Infektion von rCVB3.1 und H3 in NMRI-Mäusen.

NMRI-Mäuse wurden i.p. mit rCVB3.1 (1x106 pfu) oder mit H3 (1x105pfu) für sieben Tage infiziert. (A) Der Gewichtsverlauf

wurde im Verlauf der siebentägigen Infektionszeit täglich überprüft. (B) Die kardialen Titer von rCVB3.1 und H3N wurden

mittels Plaque Assay auf HeLa-Zellen bestimmt, jede Probe wurde als technisches Triplikat analysiert. (C) Aus den

Pankreasgeweben wurde virale RNA isoliert und mittels qPCR die Menge der Viruskopien ermittelt, jede Probe wurde als

technisches Triplikat gemessen. (D; E) Pankreas -und Herzgewebe der infizierten NMRI-Mäuse wurden histologisch

aufgearbeitet und bezüglich der Zerstörung bzw. Inflammation beurteilt. (D) Pankreasdestruktion anhand einer

Bewertungsskala von 0 (keine Gewebeveränderung) bis 3 (komplette Organzerstörung). (E) Kardiale Inflammation bewertet

anhand eines Inflammationsscores zwischen 0-4 (0=keine Inflammation, 4= sehr starke Inflammation, Nekrose). Dargestellt

sind jeweils Mittelwerte ± SEM. (B-E) Jedes Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers; **p≤0,01; ***p≤0,001, n=7 Tiere

pro Gruppe. [p.i.: post infection]

rCVB3.1

Ergebnisse

3.12 Wachstumsanalyse und Inhibierungsassays mit rekombinantem H3N

Aufgrund des in Kapitel 3.11 erzielten Befundes wurde das CVB3-H3-Genom aus dem pBKCMV-H3-

Plasmid in das pMKS1-Plasmid kloniert. Das entstandene Plasmid erhielt die Bezeichnung pMKS1-

H3N. Im Anschluss wurden drei Kopien der miRNA-375TS bzw. der miRNA-39TS in positiver

Orientierung aus dem pMKS1-CVB3-375TS(+) bzw. aus dem pMKS1-CVB3-39TS(+)-Plasmid

herausgeschnitten und in das pMKS1-H3N-Plasmid in das 3’-Ende des CVB3-H3-Genoms inseriert. Die

dafür notwendigen Klonierungsschritte erfolgten entsprechend der in Kapitel 2.2.2.8.6 beschrieben

Vorgehensweise. Anschließend wurde aus den cDNA-Klonen, wie in Kapitel 2.2.5.1 beschrieben,

mittels Transfektion in HEK293T-Zellen replikationsfähiges Vollvirus generiert. Die Bezeichnung der

neugenerierten Viren gestaltet sich wie folgt: H3N-375TS, H3N-39TS und H3N (Wildtyp ohne TS). Alle

nachfolgenden in vivo Experimente wurden mit diesen Viren durchgeführt.

Abbildung 30: Wachstumskurvenanalysen und Inhibierungsassays von H3N-375TS, H3N-39TS bzw. H3N

nach Applikation miRNA-375-Mimics.

(A) Wachstumsanalyse: HeLa-Zellen wurden mit H3N-375TS, -39TS bzw. H3N (MOI 0,01) infiziert. Die viralen Titer der

Proben wurden zu den angegebenen Zeitpunkten (0, 8, 24 und 48 h nach Infektion mittels eines Plaque Assays auf HeLa-

Zellen bestimmt, n=2. (B) Inhibierungsassay: HeLa-Zellen wurden mit miRNA-375-Mimics bzw. scrambled siRNA

(Negativkotrolle) transfiziert, nach 4 h wurden diese für 24 h mit den H3N-375TS, -39TS bzw. H3N (MOI 0,1) infiziert. Der

CVB3-Titer im Zellkulturüberstand wurde mittels Plaque-Assay auf HeLa-Zellen bestimmt. n=3. (C) Zusätzlich wurde die

Plaque-Morphologie der mit den verschiedenen CVB3-Varianten infizierten HeLa-Zellen fotographisch dokumentiert. (A und

B) Dargestellt sind Mittelwerte ±SEM, p≤0,001. [pi: post infection].

Die neuklonierten, rekombinanten H3N-Varianten wurden bezüglich ihrer Inhibierbarkeit in HeLa-

Zellen überprüft. Dafür wurde zunächst das Replikationsverhalten der neugenerierten Viren auf HeLa-

Ergebnisse

Zellen binnen 48 h nach Infektion (MOI 0,01) betrachtet. In den auf HeLa-Zellen generierten

Wachstumskurven wiesen alle rekombinanten CVB3-H3N-Varianten sowie der Wildtyp H3N ein

ähnliches Wachstum auf (Abb. 30A). Wie erwartet, entsprach die Plaquemorphologie der CVB3-H3N-

Varianten der von H3N (Abb. 30B). Für den Inhibierungsassay wurden die Zellen transient mit miRNA-

375-Mimics transfiziert und nach 4 h mit einer MOI von 0,1 der entsprechenden CVB3-Variante

infiziert. Auch hier zeigte sich, dass durch die inserierte miRNA-375TS rekombinantes H3N-375TS mit

einer Effizienz von 98,6 % inhibiert werden kann (Abb. 30C). Die Inhibierungseffizienz fiel dabei um

5,6 % höher aus als die, welche durch Infektion mit der CVB3-375TS(3+)-Variante infolge der

Transfektion mit miRNA-375-Mimics erreicht wurde (vgl. Abb. 23A).

3.13 Verlauf der H3N-375TS Infektion in NMRI-Mäusen nach intraperitonealer

Applikation

Um zu überprüfen, inwieweit H3N-375TS in vivo pankreasattenuiert und karditrop ist, wurden NMRI-

Mäuse i.p. mit H3N-375TS, H3N-39TS bzw. H3N jeweils mit einer Virusdosis von 1x105 pfu infiziert.

Den Tieren der Kontrollgruppe (sham) wurde eine 0,9 %-ge NaCl-Lösung injiziert.

Innerhalb des siebentägigen Infektionsverlaufes wiesen Mäuse, die mit rekombinantem H3N-375TS

infiziert bzw. solche denen eine 0,9 % -ge NaCl-Lösung verabreicht wurde, keine Gewichtsreduktion

auf. Hingegen zeigten Mäuse, welche mit rekombinanten H3N-39TS bzw. H3N infiziert wurden, die

für das CVB3-Myokarditismodell typische Gewichtsreduktion von 10-15 % (Abb. 31A). Um den

allgemeinen Gesundheitszustand der Tiere charakteristischer zu beschreiben, wurde dieser anhand

einer Skala von 0-5 (folgend als Gesundheitsscore) bewertet und die Tiere am Ende der

Untersuchungsperiode am Tag 7 nach Infektion entsprechend dieses Scores beurteilt. Unbehandelte

Tiere, ohne gesundheitliche Einschränkung erhielten einen Score von 5, wohingegen sich Tiere mit

einem Score von 0 durch eine sehr geringe Aktivität sowie klinische Anzeichen einer schweren

Infektionskrankheit auszeichneten (reduzierte Bewegung, gekrümmte Haltung, struppiges Fell). Es

wurden alle Tiere innerhalb einer Gruppe bewertet. Darauf beruhend betrug der Score von mit H3N-

39TS bzw. H3N infizierten Tieren jeweils 2,5. Den mit rekombinantem H3N-375TS infizierten

Mäusen wurde ein Score von 4,5 zugeordnet. Auch wenn sie tendenziell struppiges Fell aufzeigten,

waren sie in ihrer Aktivität mit den Kontrolltieren (sham, Score 5) vergleichbar (Abb. 31B). Die

Bestimmung der kardialen CVB3-Titer mittels Plaque Assay zeigte, dass signifikant höhere Titer aus

der Infektion mit H3N-39TS (106 pfu/g Herzgewebe) bzw. H3N (107 pfu/g Herzgewebe) resultierten

als aus der Infektion mit H3N-375TS (101 pfu/g Herzgewebe). Dabei fiel auf, dass lediglich in zwei

der mit H3N-375 infizierten Tieren überhaupt nachweisbare Virusmengen detektiert werden konnten.

Zudem waren die Titer von H3N-39TS eine log10-Stufe niedriger als die von CVB3-H3, was darauf

hindeutet, dass die inserierten miRNA-39TS, einen geringfügig negativen Einfluss auf die Replikation

besaßen (Abb. 31C).

Ergebnisse

Die mittels qRT-PCR ermittelte CVB3-Kopienzahl des rekombinanten H3N-375TS lag im Pankreas

mit durchschnittlich 0,5x101 Kopien pro µg Pankreas-RNA signifikant unter dem von H3N-39TS

(1000-fach höher) bzw. von H3N (10000-fach höher) (Abb. 31D). Entsprechend der kardialen CVB3-

Titer zeigte sich im Pankreas, dass die CVB3-Kopienzahl der H3N-39TS-Proben etwa eine log10-Stufe

unter der von H3N lag. Die pathohistologischen Untersuchungen zeigen in den mit H3N-375TS

infizierten Tieren keine kardiale Inflammation. Hingegen wurde bei den mit H3N-39TS bzw. H3N

infizierten Tieren ein kardialer Inflammationsscore von 1,3 bzw. 2 nachgewiesen (Abb. 31E und

Abb. 32A). Das Pankreas von mit H3N-375TS infizierten Mäusen war vollständig in Takt. Dagegen

war das Pankreas von mit H3N infizierten Tieren fast vollständig (zu 98%) und jenes der mit H3N-

39TS infizierten Tiere überwiegend (78 %) zerstört (Abb. 31F und Abb. 32A).

Ergebnisse

Abbildung 31: Die

intraperitoneale Injektion von

H3N

375TS führt nicht zur

Infektion von NMRI

-Mäusen.

NMRI

-Mäuse wurden mit 1x105 pfu

rekombinante

m H3N-375TS, H3N-

39TS oder H3N infiziert bzw

. es

wurde den Kontrolltieren eine 0,9 %

ge NaCl

-Lösung appliziert. Der

Untersuchungszeitraum

betrug sieben

Tage.

(A) Der Gewichtsverlauf wurde

im Verlauf der siebentägigen

Infektionszeit täglich überprüft

(B).

Der allgemeine Gesundheitszustand

der Mäuse w

urde an Tag sieben nach

Infektion anhand eines Gesundheits

scores bewertet 0 (

klinische

Anzeichen einer schweren

Infektionskrankheit

) -

5 (ohne

gesundheitliche Einschränkungen).

(C)

Die kardialen Titer von H3N-

375T

S, H3N-39TS und H3N wurden

mittels Plaque A

ssay auf HeLa-Zellen

bestimmt, jede Probe wurde als

technisches Triplikat analysiert.

(D)

Aus den Pankreasgeweben wurde die

Gesamt

RNA isoliert und mittels

RT-PCR die CVB3-Kopienzahl pro

Mikrogramm Pankreas

-RNA

ermittelt, jede Probe wurde als

technisches

Triplikat gemessen. (E-F)

Herz

und Pankreasgewebe der

infizierten NMRI

Mäuse wurden

histologisch aufgearbeitet und

bezüglich der Inflammation beurteilt

E. Kardiale Inflammation bewertet

anhand eines Inflammations

scores

zwischen 0

-4 (0=keine Inflammation,

4=sehr starke Inflammation,

Nekrose).

(F) Pankreasinflammation

anhand einer Bewertungsskala von 0

(keine Geweb

veränderung) bis

100% (komplette Organzerstörung).

Dargestellt sind jeweils Mittelwerte

SEM.

(C-F) Jedes Symbol zeigt den

Wert eines Versuchsti

ers, *p≤0,05;

**p

≤0,01; ***p≤0,001, n=7 Tiere pro

Gruppe.

Ergebnisse

Abbildung 32: Histologische und hämodynamische Analyse intraperitoneal mit H3N-375TS infizierter

NMRI-Mäuse.

Mäuse wurden i.p. mit 1x105 pfu H3N-375TS, H3N-39TS bzw. H3N infiziert oder mit NaCl (sham) behandelt. A) Herz- und

Pankreasgewebe der NMRI-Mäuse wurde histologisch aufgearbeitet und mittels H&E-Färbung der Querschnitte analysiert.

Die roten Sterne markieren Pankreasinseln. Dargestellt sind repräsentative Färbungen jeder Gruppe. Die Vergrößerung der

Herzquerschnitte lag bei 25 -und 200-fach, die des Pankreasgewebes bei 200-fach. Die Messung der Hämodynamik erfolgte

sieben Tage nach der Infektion. Die hämodynamische Charakterisierung erfolgte sieben Tage nach der Infektion. Dafür wurden

über 20 min (B) dp/dtmax, ein Maß zur Bewertung der kardialen Kontraktilität, sowie (C) dp/dtmin, ein Maß für die kardiale

Relaxation, der einzelnen Tiere aufgezeichnet. (B-C) Jedes Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt

sind die jeweiligen Mittelwerte ± SEM, *p≤0,05; **p≤0,01; ***p≤0,001, n.s. = nicht signifikant, n=7 Tiere pro Gruppe.

Entsprechend der Erwartungen wurden die rekombinanten H3N-375TS im Pankreas vollständig durch

den miRNA-375TS vermittelten RNAi-Mechanismus supprimiert. Obwohl die miRNA-375 nicht im

murinen Herzgewebe exprimiert wird, kam es dennoch zu keiner kardialen Infektion mit H3N-375. Da

das modifizierte H3N-375TS pankreasattenuiert ist, jedoch keine Myokarditis in den Mäusen

verursachte, deutet dies darauf hin, dass das Pankreas eine essentielle Rolle für die kardiale CVB3-

Ergebnisse

Infektion nach i.p. Applikation des Virus besitzt, da die im Pankreas replizierenden H3-Varianten H3N

und H3N-39TS eine kardiale Infektion verursachten. Dieser Befund bestätigt die Hypothese von Tracy

et al., dass i.p. appliziertes CVB3 zuerst das Pankreas und danach das Herz infiziert, wobei die

pankreatische Virusreplikation essentiell für die Ausbildung einer Myokarditis ist95.

Anhand der durchgeführten hämodynamischen Messungen konnten bei der maximalen

Druckanstiegsgeschwindigkeit (dP/dtmax) signifikante Unterschiede zwischen der uninfizierten

Kontrolle (sham) und den mit H3N-39TS infizierten Mäusen festgestellt werden. Zwischen den mit

H3N-375TS und den mit H3N-39TS infizierten Tieren gab es keine signifikanten Unterschiede, die

Kontraktilität der mit H3N-375TS infizierten Tiere war mit denen der uninfizierten Kontrolltiere

vergleichbar (Abb. 32B). Ebenso zeigten sich Unterschiede bei der maximalen

Druckabfallgeschwindigkeit (dP/dtmin) zwischen den sham-Tieren und den mit H3N-39TS bzw. H3N

infizierten Mäusen, wohingegen die mit H3N-37TS infizierten Mäuse sich nicht signifikant von denen

unifizierter Tiere unterschieden (Abb. 32C).

Die Ergebnisse der i.p. Injektion von H3N-375TS zeigten, dass das pankreasattenuierte Virus wie

erwartet keine Infektion im Pankreas verursacht, jedoch die i.p. Applikationsroute keine Infektion des

Herzens ermöglicht. Nicht pankreasattenuiertes i.p. appliziertes H3N-39TS hingegen führt sowohl zu

einer Pankreatitis als auch zu einer kardialen Infektion.

3.14 Die intravenöse Applikation von H3N-375TS induziert bei NMRI-Mäusen

eine Myokarditis ohne Ausbildung einer Pankreatitis

Aus der Annahme, dass die fehlende Replikation von H3N-375TS im Pankreas verhindert, dass es zu

einer kardialen Infektion kommt, resultierte die Vermutung, dass über die direkte Applikation des Virus

in den Blutstrom eine Infektion des Herzens erfolgen könnte. Daher wurde pankreasattenuiertes H3N-

375 (5x104, 5x105 bzw. 5x106) i.v. in die linke Vene jugularis injiziert, um eine sofortige hämatogene

Ausbreitung auszulösen und direkt das Herz zu infizieren. Der Kontrollgruppe wurde eine 0,9 %-ige

NaCl-Lösung injiziert.

Im Verlauf der siebentägigen Untersuchungsperiode wiesen die infizierten Mäuse, unabhängig von der

injizierten Virusdosis, ein ähnliches Körpergewicht wie die mit NaCl behandelten Kontrolltiere auf

(Abb. 33A). Bezogen auf den allgemeinen Gesundheitszustand gab es keine gravierenden Unterschiede

zwischen den Tieren, die mit unterschiedlichen Dosen rekombinanten H3N-375TS infiziert wurden

bzw. nur geringfügige Unterschiede zur Kontrollgruppe. Die infizierten Tiere hatten struppiges Fell,

zeigten jedoch ein vergleichbares Aktivitätsverhalten wie die nicht infizierten Kontrolltiere (Abb. 33B).

Mit steigender Virus-Dosis stieg der CVB3-Titer im Herzen. So lag der CVB3-Titer bei den mit H3N-

375TS [5x104 pfu] infizierten Mäusen bei 101 pfu/g, der der mit 5x105 pfu infizierten lag etwa 10-mal

höher und der bei einer Dosis von 5x106 lag 50-mal höher. Zudem zeigte sich, dass bei den Mäusen,

denen eine niedrigere Virusdosis injiziert wurde, nur bei einer von vier Mäusen Virus im Herzen

nachweisbar war. Bei der höchsten applizierten Dosis wiesen hingegen drei der vier Mäuse CVB3 im

Ergebnisse

Herzen auf (Abb. 33C). Allerdings konnte nur bei einer von vier untersuchten Mäusen ein hoher

kardialer Virustiter von 106 pfu/g nachgewiesen werden. Mit steigender Virendosis stieg zudem der

kardiale Inflammationsscore an. Dieser lag bei einer viralen Dosis von 5x106 pfu bei 0,7 (Abb. 33D)

und somit höher als bei den niedrigeren Dosierungen, aber signifikant niedriger als nach i.p. Applikation

von H3N-39TS (vgl. Abb. 31E, H3N-39TS, 1,3). Bei keinem der infizierten Tiere konnten CVB3-

Kopien im Pankreas nachgewiesen werden (Ergebnisse nicht gezeigt).

Die pathohistologischen Auswertungen zeigten, dass im Herzen bei einer initial applizierten Virusdosis

von 5x104 pfu keine Inflammation auftrat, wohingegen bei einer Virusdosis von 5x106 pfu größere

Inflammationsherde vorhanden waren (Abb. 33E). Zudem war ersichtlich, dass die Mäuse eine kardiale

CVB3-Infektion entwickelten, ohne dass eine Pankreasinfektion verursacht wurde (Abb. 33C-E).

Die Ergebnisse zeigen, dass die Mäuse nach i.v. Applikation von H3N-375TS eine akute Myokarditis

entwickeln ohne, dass eine Infektion des Pankreas mit einhergehender Pankreatitis auftrat.

Ergebnisse

Abbildung 33: Die

intravenöse Applikation

von H3N-375TS

verursacht in NMRI-

äusen eine

Myokarditis, aber keine

Pankreatitis.

NMRI-Mäuse wurden i.v. mit

H3N-375TS (5x104, 5x105

bzw. 5x106

pfu) infiziert.

bzw. wurde den

Kontrolltieren eine 0,9 %-ge

NaCl-Lösung injiziert. Der

Untersuchungszeitraum

betrug sieben Tage. (A) Der

Gewicht

sverlauf wurde

täglich überprüft (B)

. Der

Gesundheitsstatus der Mäuse

wurde an Tag sieben nach

Infektion anhand eines

Gesundheitsscores bewertet

(0 [klinische Anzeichen einer

schweren

Infektionskrankheit) -5 (ohne

gesundheitliche

Einschränkungen)]. (C) Die

kardialen CVB3-Titer

wurden mittels Plaque Assay

auf HeLa-

Zellen bestimmt,

jede Probe wurde als

technisches Triplikat

analysiert. (D) Das

Herzgewebe der infizierten

NMRI-

Mäuse wurde

histologisch aufgearbeitet

und anhand des

Inflammationsscores

zwischen 0-

4 (0=keine

Inflammation, 4= sehr starke

Inflammation, Nekrose)

bestimmt. (E) Herz- und

Pankreasgewebe der

infizierten NMRI-Mäuse

wurde histologisch

aufgearbeitet und mittels

H&E-

Färbung analysiert.

Dargestellt sind

repräsentative Färbungen

jeder Gruppe. Die

Vergrößerung der

Herzquerschnitte lag bei 25 -

und 200-

fach, die des

Pankreasgewebes bei 200-

fach. (A-D). Dargestellt sind

jeweils Mittelwerte ± SEM,

n=4 Tiere pro Gruppe. (C-D)

Jedes Symbol zeigt den Wert

eines Versuchstiers.

Ergebnisse

3.15 Herzpassagiertes rekombinantes H3N-375TS induziert eine starke

Myokarditis in NMRI-Mäusen

Nicht pankreasattenuierte CVB3-Stämme replizieren nach Infektion über mehrere Tage im Pankreas

und generieren so große Mengen infektiöser Viren, welche letztlich über den Blutstrom zu hohen

kardialen CVB3-Titern führen. Die hier generierte pankreasattenuierte CVB3-Variante hingegen wird

i.v. direkt in den Blutstrom injiziert und gelangt sofort zum Herzen. Infolge der i.v. Applikation

pankreasattenuierter H3N-375TS wurden nur geringe kardiale Virustiter detektiert, was wiederum

potentiell ursächlich für das Ausbleiben hämodynamischer Dysfunktionen sein könnte. Um zu

überprüfen, ob durch Verwendung von herzpassagiertem H3N-375TS eine Verstärkung der kardialen

Infektion und Myokarditis möglich ist, wurde im nächsten Schritt herzpassagiertes (hp) rekombinantes

H3N-375TS, entsprechend der in Kapitel 2.2.6.4 beschriebenen Vorgehensweise, generiert. Das hierfür

verwendete Virus wurde aus dem Tier isoliert, welches nach i.v. Applikation von 5x106 pfu die höchsten

Virustiter im Herzen aufwies (Abb. 32C). Dazu wurden NMRI-Mäuse i.v. mit H3N-375TS hp bzw.

H3N-39TS, jeweils mit einer Dosis von 5x106 pfu, infiziert. Zudem wurden Tiere i.v. mit 1x108 pfu

nicht herzpassagiertem H3N-375TS infiziert, um zu überprüfen ob aus einer erhöhten initial applizierten

Virendosis höhere kardiale CVB3-Titer resultieren. Den Kontrolltieren wurde eine 0,9 %-ge NaCl-

Lösung injiziert. In allen Gruppen wurde keine Gewichtsreduktion über den Untersuchungszeitraum

von sieben Tagen festgestellt. Im Gegenteil kam es eher zur Stagnation bzw. zur Gewichtszunahme der

Tiere (Abb. 34A). Nur an Tag eins wiesen alle Tiere eine leichte Gewichtsreduktion auf, welche auf

den operativen Eingriff zurück zu führen ist.

Tiere, welche mit rekombinantem H3N-375TS hp (5x106 pfu) bzw. mit H3N-375TS (1x108 pfu)

infiziert wurden, zeigten einen Gesundheitsscore von 4,5 bzw. 4 und waren mit den sham-Tieren

vergleichbar (Abb. 34B). Bei den mit H3N-39TS infizierten Tieren, wurde ein reduziertes

Allgemeinbefinden, gekennzeichnet durch eine leicht gekrümmte Haltung und geringere Aktivität,

sichtbar. Trotz unterschiedlicher initialer Virusdosis resultierten aus der siebentägigen Infektion mit der

hp-Variante (initial 5x106 pfu) und der nicht-hp-Variante (initial 1x108 pfu) von H3N-375TS

vergleichbare kardiale CVB3-Titer von etwa 5x104 pfu/g. Der kardiale Titer von H3N-39TS lag in etwa

auf dem gleichen Niveau (Abb. 34C). Wie erwartet, konnten keine CVB3-Kopien der hp- als auch der

nicht-hp-Variante des H3N-375TS im Pankreas nachgewiesen werden. Dagegen wurden im Mittel 7000

CVB3-Kopien pro µg Pankreas-RNA bei den mit H3N-39TS infizierten Tieren nachgewiesen (Abb.

34D). Auch die Pankreaszerstörung wurde nur bei den mit rekombinantem H3N-39TS infizierten Tieren

beobachtet und lag bei fast allen Tieren bei nahezu 100 %. In den Tieren beider mit H3N-375TS

infizierter Gruppen war das Pankreas vollständig intakt (Abb. 34F). Die kardiale Inflammation lag bei

der H3N-375TS hp Infektion mit einem Wert von 1,7 höher als die der nicht-hp Variante (1,4) bzw. als

bei Infektion mit H3N-39TS (1,5) (Abb. 34E).

Ergebnisse

Abbildung 34: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem oder hochdosoiertem H3N-375TS

verursacht in NMRI-Mäusen eine Myokarditis, aber keine Pankreatitis.

NMRI-Mäuse wurden mit 5x106 pfu herzpassagiertem (hp) H3N-375TS (n= 4) oder nicht herzpassagiertem H3N-39TS (n=6)

bzw. H3N-375TS mit 1x108 pfu (n=4) infiziert. Kontrolltieren wurde 0,9 %-ge NaCl-Lösung injiziert (n=4). Der

Untersuchungszeitraum betrug sieben Tage. (A) Der Gewichtsverlauf wurde täglich überprüft (B). Der Gesundheitsstatus der

Mäuse wurde an Tag sieben nach Infektion anhand eines Gesundheitsscores bewertet [0 (klinische Anzeichen einer schweren

Infektionskrankheit) -5 (ohne gesundheitliche Einschränkungen)]. (C) Die kardialen Titer von H3N-375TS, H3N-39TS und

H3N wurden mittels Plaque Assay auf HeLa-Zellen bestimmt, jede Probe wurde als technisches Triplikat analysiert. (D) Aus

den Pankreasgeweben wurde die Gesamt-RNA isoliert und mittels qRT-PCR die CVB3-Kopienzahl ermittelt, jede Probe wurde

als technisches Triplikat gemessen. (E; F) Herz- und Pankreasgewebe der infizierten NMRI-Mäuse wurden histologisch

aufgearbeitet und bezüglich der (E) kardialen Inflammation bzw. (F) pankreatischen Destruktion beurteilt E. Kardiale

Inflammation bewertet anhand eines Inflammationsscores zwischen 0-4 (0=keine Inflammation, 4= sehr starke Inflammation,

Nekrose). (F) Pankreaszerstörung anhand einer Bewertungsskala von 0 (keine Gewebeveränderung) bis 100 % (komplette

Organzerstörung). (C-F) Jedes Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind die jeweiligen

Mittelwerte ± SEM, n.s. = nicht signifikant.

Die pathohistologischen Auswertungen bestätigten die vorherigen Ergebnisse und zeigten, dass das

Pankreas von mit H3N-375TS hp -und nicht-hp infizierten bzw. den nicht infizierten NMRI-Mäusen

unbeschädigt war. Bei Tieren, welche mit H3N-39TS infiziert wurden, war das exokrine

Pankreasgewebe nahezu vollständig zerstört (Abb. 35A).

Ergebnisse

Abbildung 35: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem oder hochdosiertem H3N-375TS

verursacht in NMRI-Mäusen eine Inflammation des Herzgewebes, jedoch keine des Pankreas.

NMRI-Mäuse wurden mit 5x106 pfu herzpassagiertem (hp) H3N-375TS (n=4) oder nicht herzpassagiertem H3N-39TS (n= 6)

bzw. H3N-375TS mit 1x108 pfu (n=4) infiziert. Kontrolltieren wurde 0,9 %-ge NaCl-Lösung injiziert (n=4). Der

Untersuchungszeitraum betrug sieben Tage. (A) Herz- und Pankreasgewebe der infizierten NMRI-Mäuse wurde histologisch

aufgearbeitet und mittels H&E-Färbung der Querschnitte analysiert. Dargestellt sind repräsentative Färbungen jeder Gruppe.

Die Vergrößerung der Herzquerschnitte lag bei 25 -und 200-fach, die des Pankreasgewebes bei 200-fach. (B) Expression von

IL-6, TNFα im Herzgewebe von mit H3N-375TS (1x108 pfu) infizierten bzw. nicht infizierten Mäusen ermittelt über qRT-

PCR. Alle Werte wurden auf die Expression der mitgeführten Referenzkontrolle 18S relativiert. Jedes Symbol zeigt den Wert

eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SEM, *p <0,05; **p<0,01.

Auch wenn die histologische Analyse der kardialen Inflammation vereinzelt größere

Inflammationsherde nach Infektion mit 1x108 pfu an H3N-375TS zeigte, wiesen H3N-375TS hp (5x106

pfu) und H3N-39TS (5x106 pfu) infizierte Tiere eine zueinander ähnliche, nur geringfügig schwächere

kardiale Inflammation auf als Tiere, die mit 1x108 pfu H3N-375TS infiziert wurden. Basierend auf den

gemittelten kardialen Inflammationsscores gab es jedoch keine signifikanten Unterschiede zwischen den

einzelnen Versuchstiergruppen bezüglich der kardialen Inflammation. Dennoch resultierte die Infektion

Ergebnisse

mit H3N-375 hp bzw. die Infektion mit einer höheren initialen Virusdosis in einer Verstärkung der

kardialen Inflammation gegenüber der Infektion mit nicht herzpassiertem H3N-375TS (vgl. Abb. 33D-

E), trotz erfolgreicher Pankreasattenuation. Anschließend wurde die Hämodynamik der mit H3N-375TS

i.v. infizierten Mäuse und der denen 0,9%-ge NaCl injiziert wurde, mittels eines Miniaturherzkatheters

überprüft. Dabei konnten keine Unterschiede bezüglich der systolischen und diastolischen

linksventrikulären Funktion des Herzens zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden (Ergebnisse

nicht gezeigt).

Zur Charakterisierung der Immunantwort der NMRI-Mäuse auf die Infektion mit H3N-375TS wurde

die kardiale Expression der Zytokine IL-6 und TNFα sowie des Typ II-Interferons IFNγ überprüft. Es

ist bekannt, dass es zu einer verstärkten kardialen Expression dieser Mediatoren während der CVB3-

Infektion in Mäusen kommt und diese somit an der Regulation der Immunantwort innerhalb der murinen

CVB3-Infektion beteiligt sind286,287.

Dafür wurde die Expressionen von IL-6, TNFα und IFNγ im Herzmuskelgewebe mittes qRT-PCR

bestimmt. Die Expressionslevel von IL-6, TNFα und IFNγ waren in den mit 1x108 pfu H3N-375TS

infizierten Tieren im Vergleich zu den Kontrolltieren deutlich erhöht (Abb. 35B).

Abbildung 36: Expression der miRNA-375 im Herz- und Pankreasgewebe von H3N-375 infizierten Mäusen.

NMRI-Mäuse wurden mit 1x108 pfu H3N-375TS infiziert bzw. wurde den Kontrolltieren (sham) 0,9% ige NaCl-Lösung

injiziert. Aus den Pankreas -bzw. Herzgeweben wurde die Gesamt-RNA isoliert und mittels qRT-PCR unter Verwendung

miRNA-375 spezifischer stem-loop Primer auf die Expression von miRNA-375 im (A) Herzen und (B) Pankreas analysiert.

(A-B) Jede Probe wurde als technisches Triplikat gemessen. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. n=2.

Um zu untersuchen, ob durch die Infektion von H3N-375TS eine Beeinflussung der endogenen miRNA-

375 Expression erfolgt, wurde die miRNA-375-Expression im Herzen und Pankreas infizierter (H3N-

375TS; 1x108 pfu) und nicht infizierter Tiere mittels qRT-PCR bestimmt. Weder im Herzen (Abb. 36A)

Ergebnisse

noch im Pankreas (Abb. 36B) konnten hierbei signifikanten Unterschiede in der miRNA-375

Expression festgestellt werden. Aufgrund der hohen Fehlerrate der RNA-abhängigen-RNA-Polymerase

von CVB besteht die Möglichkeit, dass es zu Mutationen innerhalb der miRNA-375TS kommt, welche

es den modifizierten Viren ermöglicht den RNAi-vermittelten Abbau ihres Genoms zu umgehen. Daher

wurde die miRNA-375TS-Sequenz von H3N-375TS, welches nach siebentägiger Infektion aus NMRI-

Mäusen isoliert wurde, nach dreimaliger Passagierung des Virus auf HeLa-Zellen, unter Behandlung

mit miRNA-375-Mimics, sequenziert. Die Ergebnisse der Sequenzierung zeigten, dass trotz des hohen

Selektionsdrucks in vitro als auch in vivo keine Mutationen innerhalb der inserierten TS der

rekombinanten Viren auftraten.

3.16 Das chronische Modell der Mausmyokarditis

Schmidtke et al. zeigten, dass NMRI-Mäuse nach Infektion mit CVB3-H3 eine chronische Myokarditis

entwickeln115. Um zu überprüfen, ob die in der vorliegenden Studie generierte CVB3-Variante H3N-

375TS ebenfalls eine chronische Myokarditis verursacht, wurden NMRI-Mäuse mit H3N-375TS hp mit

einer Dosis von 1x108 pfu i.v. infiziert. Den Tieren der Kontrollgruppe wurde eine 0,9 %-ge NaCl-

Lösung injiziert. Die Versuchsdauer betrug 28 Tage.

Initial konnte eine starke Gewichtsabnahme am ersten und zweiten Tag nach der Virusinfektion

beobachtet werden, die in den Kontrolltieren nicht auftrat. Diese ist vermutlich auf die hohe H3N-375TS

hp Dosis von 1x108 pfu in Kombination mit dem operativen Eingriff zurück zu führen. Im Verlauf der

28-tägigen Infektionszeit nahmen die Tiere beider Gruppen um ca. 20 % zu (Abb. 37A). Der kardiale

Inflammationsscore der infizierten Tiere lag im Mittel bei einem Wert von 1 (Abb. 37B). Im Herz

konnten nur sehr niedrige Infektionsraten ermittelt werden, wobei ausschließlich virale RNA, aber keine

infektiösen Viruspartikel detektiert werden konnten (Abb. 37C).

Die histopathologischen Untersuchungen zeigen, dass das Pankreas sowohl bei den infizierten als auch

bei den nicht infizierten NMRI-Mäusen vollständig intakt war. Die Gewebeschnitte der Herzen wurden

mit unterschiedlichen Färbemethoden angefärbt. Bei der H&E Färbung dient Hämatoxylin der

Kernfärbung, Eosin wiederum ermöglicht die Unterscheidung zwischen baso- und azidophilen

Zellstrukturen. Die hier verwendete Trichrom-Färbung nach Masson-Goldner kombiniert die Farbstoffe

Eisenhämatoxylin, Azophloxin, Orange G und Lichtgrün SF, was eine selektive Darstellung von

Kernstrukturen, Muskelfasern, Kollagen, Fibrin und Erythrozyten erlaubt. Diese differenzierte

Darstellung des Bindegewebes ermöglicht somit eine exaktere Beurteilung fibrotischer

Gewebeveränderungen infolge der CVB3-Infektion. So zeigte die Trichromfärbung eindeutige Zeichen

einer chronischen Infektion mit fibrotischen Gewebeveränderung im Herzen der infizierten NMRI-

Mäuse. Dabei waren erhebliche Unterschiede beim Vergleich der Tiere untereinander zu beobachten.

Neben Tieren mit wenigen lokalen fibrotischen Arealen (kardialer Inflammationsscore von 1), gab es

Tiere mit ausgedehnten entzündlich-fibrotischen Veränderungen (kardialer Inflammationsscore von 3)

(Abb. 37D).

Ergebnisse

Abbildung 37: Die intravenöse Applikation von herzpassagiertem H3N-375TS verursacht in NMRI-Mäusen

eine chronische Myokarditis, aber keine Pankreatitis.

NMRI-Mäuse wurden mit 1x108 pfu herzpassagiertem (hp) H3N-375TS hp (n=12) infiziert bzw. es wurde den Kontrolltieren

eine 0,9 %-ge NaCl-Lösung (sham, n=11) injiziert. Der Infektionsverlauf wurde über 28 Tage beobachtet. (A)

Gewichtsverlauf. Das Gewicht wurde im Abstand von zwei Tagen ermittelt. (B) Das Herzgewebe wurde histologisch

aufgearbeitet und bezüglich der Inflammation anhand eines Inflammationsscores zwischen 0-4 (0=keine Inflammation, 4= sehr

starke Inflammation, Nekrose) bewertet (C) Aus den Herzgeweben wurde die Gesamt-RNA über isoliert und mittels qRT-PCR

die CVB3-Kopienzahl pro Mikrogramm Herz-RNA ermittelt, jede Probe wurde als technisches Triplikat gemessen. (D) Herz-

und Pankreasgewebe wurden histologisch aufgearbeitet und mittels Trichrome bzw. H&E-Färbung der Querschnitte analysiert.

Die Vergrößerung der Herzquerschnitte lag bei 25 -und 200-fach, die des Pankreasgewebes bei 200-fach. Dargestellt ist eine

repräsentative Färbung aus jeder Gruppe. (B-C) Jedes Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind

die jeweiligen Mittelwerte ± SEM. Anmerkung 1: Zwei Tage nach der Infektion verstarben zwei der zwölf mit hp H3N-375TS

infizierten Tiere. Die genaue Todesursache wurde nicht weiter untersucht, ist aber vermutlich auf die hohe Dosis des

herzpassagierten Virus (1x108 pfu) bzw. den operativen Eingriff zurückzuführen, da diese Beobachtungen unter der

Verwendung einer gleichen Infektionsdosis nicht herzpassagierten H3N-375TS nicht gemacht wurden. Anmerkung 2: (B)

Eines der histologischen Schnittpräparate der mit 1x108 pfu an H3N-375TS infizierten Mäuse konnte aus technischen Gründen

nicht ausgewertet werden.

Ergebnisse

Auch für das chronische Versuchsmodell wurde am Ende der 28-tägigen Infektionszeit die Funktion des

linken Ventrikels mittels eines Miniaturherzkatheters überprüft. Die systolischen und diastolischen

Messwerte zeigten keinen signifikanten Unterschied zwischen den mit H3N-375TS hp infizierten Tieren

und den uninfizierten Kontrolltieren (Abb. 38A-B).

Die Ergebnisse des 28-tägigen Infektionsversuches belegen dennoch, dass die selektive kardiale

Infektion von NMRI-Mäusen mit pankreasattenuiertem H3N-375TS hp zur Entwicklung einer

chronischen Myokarditis führt.

Abbildung 38: Hämodynamische Messungen von intravenös mit H3N-375TS infizierten Mäusen.

Mäuse wurden i.v. mit 1x108 pfu herzpassagierten (hp) H3N-375TS (n=9) infiziert oder mit NaCl (sham, n=11) behandelt.

Hämodynamische Messungen erfolgten 28 Tage nach der Infektion. Die (A) Kontraktilität (dP/dtmax) und (B) Relaxation

(dP/dtmin) des linken Ventrikels wurden jeweils über einen Zeitraum von 20 min mittels eines Herzkatheters aufgezeichnet.

Jedes Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SEM; n.s. = nicht

signifikant, n=12 Tiere pro Gruppe.

3.17 Die intravenöse Infektion von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen

eine akute Myokarditis, aber keine Pankreatitis

Bei den NMRI-Mäusen handelt es sich um eine Auszucht-Linie, welche eine höhere Variabilität

bezüglich physiologischer Merkmale aufweist und so robuste Ergebnisse liefert, da die Tiere das

physiologisch und genetisch deutlich diversere humane System besser als üblicherweise verwendete

Inzuchtmäuse abbilden. Da jedoch der überwiegende Teil der publizierten Studien, in den das CVB3-

Maus-Myokarditismodells adressiert wurde, Inzuchtlinien wie Balb/C oder C57BL/6 verwendete 287,288,

muss die Reproduzierbarkeit der in der vorliegenden Studie generierten Daten auf eine solche

Inzuchtlinie überprüft werden. Daher wurden Balb/C-Mäuse entsprechend des in Kapitel 3.15

beschriebenen Infektionsschemas für NMRI-Mäuse mit H3N-375TS bzw. mit H3N-39TS i.v. mit einer

Dosis von 5x106 pfu infiziert. Weitere Tiere wurden, wie in Kapitel 3.15 beschrieben, i.v. mit einer

Ergebnisse

Dosis von 1x108 pfu H3N-375TS infiziert. Der Kontrollgruppe wurde eine 0,9 % -ge NaCl-Lösung

injiziert. Mäuse, die mit H3N-39TS infiziert wurden, zeigten im Gegensatz zu NMRI-Mäusen (vgl. Abb.

34A) nach siebentägiger Infektion eine deutliche Gewichtsreduktion (Abb. 39A). Eines der Tiere dieser

Gruppe verstarb infolge der durch die Infektion entwickelten Pankreatitis und Myokarditis vor

Versuchsende. Dieses Ergebnis zeigt, das Balb/C-Mäuse suszeptibler für die Infektion mit H3N-39TS

sind als die in Kapitel 3.15 verwendeten NMRI-Mäuse, was möglicherweise auf das geringere

Körpergewicht der Balb/C-Mäuse bzw. auch auf deren stärkere Homogenität zurück zu führen ist. Die

Tiere der anderen Versuchsgruppen nahmen leicht zu bzw. ihr Gewicht stagnierte (Abb. 39A). Auch

die Beurteilung der physischen Konditionen mit einem Verhaltensscore von 1 zeigte, dass Mäuse,

welche mit H3N-39TS infiziert wurden, klinische Anzeichen einer schweren CVB3-Infektion wie

reduzierte Bewegung, gekrümmte Haltung und struppiges Fell aufwiesen. Tiere der beiden Gruppen,

die mit 5x106 pfu bzw. 1x108 pfu H3N-375TS infiziert wurden, wurden jeweils mit einem

Verhaltensscore von 4 bewertet. (Abb. 39B).

Die kardialen CVB3-Titer der mit H3N-375TS mit einer Dosis von 5x106 pfu bzw. 1x108 pfu infizierten

Tiere lagen jeweils bei 1x104 pfu/g. Bei den mit H3N-39TS infizierten Tieren lag dieser bei ca. 105 pfu/g

und war damit ca. 10x höher (Abb. 39C). Unabhängig von der injizierten Virusdosis konnten keine

CVB3-Kopien im Pankreas der beiden mit H3N-375TS infizierten Gruppen nachgewiesen werden. Bei

den mit H3N-39TS infizierten Tieren wurden hingegen über 5x106 CVB3-Kopien detektiert (Abb.

39D). Die kardiale Inflammation entsprach im Mittel einem Score von 1,7 bei Tieren, die mit

rekombinanten H3N-375TS (5x106 pfu) infiziert wurden. Bei der höheren H3N-375TS-Dosis von 1x108

pfu ergab sich ein kardialer Inflammationsscore von 2, bei der Infektion mit H3N-39TS (5x106 pfu) lag

der Wert bei 2,7 (Abb. 39E). Damit wurde bisher die höchste kardiale Inflammation mit der i.v.

Applikationsroute erreicht bzw. eine Inflammation, die mit der aus der i.p. Injektion von NMRI Mäusen

resultierenden Inflammation vergleichbar ist (vgl. Abb. 39E und Abb. 32E)

Die pathohistologischen Auswertungen bestätigten die bisher erzielten Ergebnisse in Balb/C-Mäusen.

Das Pankreas der mit H3N-375TS infizierten bzw. der nicht infizierten Balb/C-Mäuse blieb intakt und

wies keine entzündlichen Veränderungen auf. Bei den Tieren, welche mit H3N-39TS infiziert wurden,

war das Pankreasgewebe hingegen sehr stark geschädigt (Abb. 39F und Abb. 40). Zudem wiesen diese

Tiere ausgedehnte Inflammationsherde im Herzgewebe auf. Trotz des intakten, entzündungsfreien

Pankreas traten ausgeprägte Inflammationsherde im Herzgewebe der mit H3N-375TS (5x106 pfu) und

H3N-375TS (1x108 pfu) infizierten Tiere auf (Abb. 40).

Ergebnisse

Abbildung 39: Die intravenöse Applikation von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen eine akute

Myokarditis, aber keine Pankreatitis.

Balb/C-Mäuse wurden mit 5x106 bzw. 1x108 pfu H3N-375TS (n=6 bzw. 12) oder mit mit 5x106 H3N-39TS (n=4) infiziert.

Kontrolltieren wurde 0,9 %-ge NaCl-Lösung injiziert (n=12). Der Untersuchungszeitraum betrug sieben Tage. (A) Der

Gewichtsverlauf wurde täglich überprüft. (B) Der Gesundheitsstatus der Mäuse wurde an Tag sieben nach Infektion anhand

eines Gesundheitsscores bewertet (0 [klinische Anzeichen einer schweren Infektionskrankheit) -5 (ohne gesundheitliche

Einschränkungen)]. (C) Die kardialen Titer von H3N-375TS, H3N-39TS und H3N wurden mittels Plaque Assay auf HeLa-

Zellen bestimmt, jede Probe wurde als technisches Triplikat analysiert. (D) Aus den Pankreasgeweben wurde die Gesamt-RNA

isoliert und mittels qRT-PCR die CVB3-Kopienzahl pro Mikrogramm Pankreas-RNA ermittelt, jede Probe wurde als

technisches Triplikat gemessen. (E; F) Herz- und Pankreasgewebe wurden histologisch aufgearbeitet und bezüglich der (E)

kardialen Inflammation bzw. (F) pankreatischen Destruktion beurteilt. (E) Kardiale Inflammation bewertet anhand eines

Inflammationsscores zwischen 0-4 (0=keine Inflammation, 4= sehr starke Inflammation, Nekrose). (F) Pankreaszerstörung

anhand einer Bewertungsskala von 0 (keine Gewebeveränderung) bis 100 % (komplette Organzerstörung). (C-F) Jedes Symbol

zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SEM, *p≤0,05; **p≤0,01.

Anmerkung 1: (C) Sechs Tage nach der Infektion verstarb eines der vier mit H3N-39TS infizierten Tiere. Anmerkung 2: (E)

Eines der histologischen Schnittpräparate der mit 5x106 pfu an H3N-375TS infizierten Mäuse konnte aus technischen Gründen

nicht ausgewertet werden.

Die hämodynamischen Messungen der mit H3N-375TS (1x108 pfu) infizierten Tiere bzw. den nicht

infizierten Kontrolltieren zeigten keine signifikanten Unterschiede bezügliche der Kontraktilität (Abb.

41A) und Relaxation (Abb. 41B) des linken Ventrikels.

Ergebnisse

Abbildung 40: Die intravenöse Applikation von H3N-375TS verursacht in Balb/C-Mäusen eine

Inflammation im Herzgewebe, nicht aber im Pankreas.

Balb/C-Mäuse wurden mit 5x106 bzw. 1x108 pfu H3N-375TS (n=6 bzw. 12) oder mit mit 5x106 H3N-39TS (n=4) infiziert.

Kontrolltieren wurde 0,9 %-ge NaCl-Lösung injiziert (n=12). Der Untersuchungszeitraum betrug sieben Tage. Herz- und

Pankreasgewebe der infizierten NMRI-Mäuse wurde histologisch aufgearbeitet und mittels H&E-Färbung der Querschnitte

analysiert. Dargestellt sind repräsentative Färbungen jeder Gruppe. Die Vergrößerung der Herzquerschnitte lag bei 25 -und

200-fach, die des Pankreasgewebes bei 200-fach. Anmerkung: Eines der histologischen Schnittpräparate der mit 5x106 pfu an

H3N-375TS infizierten Mäuse konnte aus technischen Gründen nicht ausgewertet werden.

Abbildung 41: Hämodynamische Messungen von intravenös mit H3N-375TS infizierten Balb/C-Mäusen.

Mäuse wurden intravenös mit 1x108 pfu H3N-375TS (n=12) infiziert oder mit NaCl (sham, n=10) behandelt. Hämodynamische

Messungen erfolgten sieben Tage nach der Infektion. Die (A) Kontraktilität (dP/dtmax) und (B) Relaxation (dP/dtmin) des

linken Ventrikels (LV) wurden jeweils über einen Zeitraum von 20 min mittels eines Herzkatheters aufgezeichnet. Jedes

Symbol zeigt den Wert eines Versuchstiers, zusätzlich dargestellt sind die jeweiligen Mittelwerte ± SEM. n.s.= nicht

signifikant.

Diskussion

4 Diskussion

Das CVB3-Maus-Myokarditismodell gilt als Standardtierversuchsmodell zur Untersuchung virus-

induzierter Kardiomyopathien. Dennoch unterscheidet sich die murine Präsenz der CVB3-Infektion von

der humanen bezüglich der Schwere der Infektion als auch hinsichtlich des Virustropismus. In

experimentellen CVB3-Infektionsstudien mit Mäusen stellt das Pankreas innerhalb des systemischen

Krankheitsverlaufes das suzeptibelste Organ für die Infektion dar, in welchem eine verstärkte

Replikation des Virus stattfindet110,279. Die infolge der hohen Viruslast ablaufenden

pathophysiolgoischen Prozesse wiederum resultieren in einer extensiven Schädigung des Gewebes.

Diese vorhergehende Replikation des Virus im Pankreas wird vielfach als Voraussetzung für die

kardiale Infektion und somit für die Entwicklung einer Myokarditis angesehen, wohingegen gegenläufig

postuliert wird, dass die Infektion des Pankreas nicht zwingend ausschlaggebend für die kardiale

Infektion in Mäusen ist95,289. Trotz der kontrovers diskutierten Bedeutung des Pankreas für die

Ausprägung der murinen Myokarditis gibt es im Menschen lediglich vereinzelte Fälle, in denen das

Auftreten einer CVB-induzierten Pankreatis und Myokarditis im gleichen Patienten bestätigt

wurde290,291. Frequenter zeigt sich hingegen die Ausprägung CVB-indzierter Kardiomyopatien ohne eine

vorhergehende Pankreatitis. Basierend auf diesen klinischen Befunden verläuft die kardiale CVB-

Infektion im Menschen mit höherer Wahrscheinlichkeit ohne maßgebliche Beteiligung des

Pankreas70,75,292.

Das in der vorliegenden Arbeit etablierte pankreasattenuierte CVB3-Maus-Myokarditismodell

ermöglichte es, auf Grundlage einer generierten gentechnisch modifizierten miRNA-375 suszeptiblen

CVB3-Variante (H3N-375TS), in NMRI- als auch Balb/C-Mäusen, eine CVB3 induzierte Myokarditis

ohne Ausprägung einer Pankreatitis zu induzieren. Die Ergebnisse zeigten, dass sieben Tage nach i.v.

Applikation des Virus replizierendes H3N-375TS im Herzen detektierbar war, welches zu einer

kardialen Schädigung, der Infiltration mononukleärer Immunzellen sowie zur Induktion verschiedener

proinflammatorischer Zytokine im Herzen führte. Bedeutend dabei ist, dass ein i.v. appliziertes

Kontrollvirus (H3N-39TS) sowohl das Pankreas als auch das Herz infizierte, was belegt, dass die i.v.

Infektion per se nicht für die fehlende Pankreasinfektion von H3N-375TS ursächlich war. Diese

pathophysiologischen Reaktionen repräsentieren typische Parameter einer akuten Myokarditis. Zudem

ermöglichte der Einsatz von H3N-375TS die Etablierung eines 28-tägigen chronischen CVB3-Maus-

Myokarditismodells, in welchem die Tiere im Verlauf der Versuchsdauer progressive fibrotische

Veränderungen im Herzen aufwiesen. Mehr noch war am Ende der 28-tägigen Versuchsdauer im

Herzgewebe der Mäuse persistierende virale RNA, aber kein infektiöses Virus nachweisbar, was typisch

für die chronische kardiale CVB3-Infektion in Mäusen ist. Weder im chronischen noch im akuten

Modell zeigten mit H3N-375TS infizierte Versuchstiere eine Infektion bzw. Schädigung des

Pankreasgewebes. Gegenüber der i.v. Applikation waren nach i.p. Applikation von H3N-375TS weder

Diskussion

das Pankreas noch das Herz infiziert. Dies belegt, dass nach i.p. Applikation von CVB3 die Replikation

im Pankreas essentiell für die kardiale CVB3-Infektion ist.

4.1 Evaluierung der miRNAs

Die Erzeugung miRNA suszeptibler Viren durch die genetische Modifikation des viralen Genoms stellt

eine neue, effektive Strategie dar, um gezielt den viralen Gewebs- bzw. Zelltropismus zu regulieren.

Über den wirtseigenen Mechanismus der RNAi kommt es zum Abbau der genetisch modifizierten

viralen RNA, indem die entsprechende endogen exprimierte miRNA an die in das Virusgenom inserierte

miRNA-TS bindet.

Für die Generierung einer pankreasattenuierten CVB3-Variante stellte initial die Auswahl einer

geeigneten miRNA einen entscheidenden Faktor dar. Hierfür wurden, unter Verwendung der

Affymetrix-miRNA-Chip-Analyse sowie qRT-PCRs, die am stärksten exprimierten miRNAs im

murinen Pankreas bestimmt. Dazu zählten die miRNA-375, miRNA-200c, miRNA-690, miRNA-217,

miRNA-216a, miRNA-216b, miRNA-200b, and miRNA-200a (Abb. 16). Auch die Gruppen um Dixit

et al. und Endo et al. zeigten, dass besagte miRNAs verstärkt im Pankreas von Mäusen bzw. Ratten

exprimiert werden293,294. Dagegen sollten diese miRNAs im Herzen fehlen oder möglichst gering

exprimiert sein, um dort die Replikation eines mit korrespondierenden miRNA-TS versehenden CVB3

nicht zu inhibieren. Im Vergleich zu den anderen gemessenen miRNAs wurden die miRNA-375 -und

690 im Pankreas am stärksten exprimiert (insbesondere im exokrinen Pankreas). Da die miRNA-375 im

Herzen fast um drei log10-Stufen niedriger exprimiert wurde als die miRNA-690 (Abb. 17), wurde sie

für die weiteren Untersuchungen ausgewählt.

Das Pankreas besteht Großteils aus Azinuszellen (exokrines Pankreas), nur vereinzelt treten

Langerhanssche Inseln mit Inselzellen auf, welche das endokrine Pankreas bilden. Abbildung 42 zeigt

den H&E gefärbten Querschnitt murinen Pankreasgewebes und verdeutlicht die morphologische

Unterscheidung und Verteilung beider Gewebetypen. Vielfach wurde gezeigt, dass CVB3 in Mäusen

primär in Azinuszellen repliziert und diese zerstört, nicht jedoch in den Langerhansschen Inselzellen

95,185,295,296. Basierend darauf war es wichtig, dass die zu evaluierenden miRNAs hohe Expressionslevel

im exokrinen Pankreas aufwiesen.

Studien der Arbeitsgruppen um Drescher und Bopegamage zeigten jedoch, dass Inselzellen

möglicherweise eine Rolle innerhalb der chronischen Mausmyokarditis spielen297,298. Während der

akuten Phase der CVB3-Infektion wies ausschließlich das exokrine, nicht jedoch das endokrine Pankreas

von i.p. mit CVB3 infizierten Swiss Albino Mäusen Läsionen und nekrotische Veränderungen auf.

Immunhistologische Färbungen des Pankreas zeigten wiederum, dass die beiden viralen Antigene VP1

und 3A sowohl im exokrinen als auch im endokrinen Pankreas nachweisbar waren298. Damit

einhergehend wurde gezeigt, dass Inselzellen sowohl CAR exprimieren als auch für die Infektion mit

CVB suszeptibel sind297. Tracy et al. kamen zu dem Schluss, dass die Persistenz von CVB im Pankreas,

entsprechend der Persistenz im Herzen, ebenfalls auf natürlich auftretenden Deletionen am 5’-Ende des

Diskussion

Genoms basiert. Je nach Länge der Deletion wirkten sich diese variierend auf die sekundäre stem-loop

Struktur aus, gingen jedoch prinzipiell mit einer verlangsamten Replikation und einer Verringerung des

zytophathischen Potentials einher299. Dabei adressierten sie den Effekt der pankreatischen CVB-

Persistenz auf die Ausbildung einer Typ I Diabetes. In Anbetracht des Nachweises von VP1 in den

Inselzellen von Typ I Diabetes Patienten54,300 schlussfolgerten sie, dass CVB nach Abklingen der akuten

Infektion vermutlich in den Inselzellen persistieren kann299.

Da auch Inselzellen (endokrines Pankreas) CAR exprimieren297, sollte der Schutz des gesamten Pankreas

über die Insertion der miRNA-TSs gewährleistet werden. Daher sollte auch das endokrine Pankreas die

ausgewählte miRNA in verstärktem Maße exprimieren. Neben der geringen Expression der miRNA-375

im Herzen (Abb.17), wies sie in beiden Pankreasteilen jeweils die höchsten Expressionslevel auf

(Abb. 16).

Abbildung 42: Histologisches Präparat des endo- und exokrinen Pankreas.

Pankreasgewebe wurde histologisch aufgearbeitet und mittels H&E-Färbung analysiert. Die mikroskopische Vergrößerung des

Pankreasgewebes lag bei 200-fach (vgl. Kapitel 3.16, Abb. 37D).

4.2 Einfluss der Insertion von miRNA-TS auf die Replikation und Zytotoxizität

von CVB3

Für die Effizienz der miRNA-TS basierten Pankreasattenuation von CVB3 musste zunächst die optimale

Insertionsstelle der miRNA-375 in das Genom der CVB3-Variante rCVB3.1 ermittelt werden. Dabei

durfte die Insertion die virale Replikation nicht unspezifisch beeinträchtigen und sollte gleichzeitig eine

effektive pankreasspezifische CVB3-Attenuierung ermöglichen.

Daher wurden TS für die pankreasspezifische miRNA-375 sowohl in positiver als auch negativer-

Orientierung in die 3’-bzw. 5’-Enden des Genoms der CVB3-Variante rCVB3.1 inseriert. Für die nicht

in Mäusen exprimierte miRNA-39 wurden die TS nur in positiver-Orientierung in die 3’- bzw. 5’-Enden

des CVB3-Genoms inseriert. Auf HeLa-Zellen, welche endogen keine der beiden besagten miRNAs

exprimieren, waren die viralen Titer aller rekombinanten CVB3-Varianten mit Modifikationen am

3’-Ende vergleichbar mit dem des unmodifizierten Kontrollvirus rCVB3.1 (Wildtyp). Lediglich der

Diskussion

Virustiter von CVB3-39TS(3+) lag 8 h und 24 h nach Infektion etwa eine log10-Stufe niedriger als der

des Wildtyps. Jedoch erreichte sie 48 h nach Infektion einen Titer, welcher mit denen der anderen CVB3-

Varianten mit Modifikationen am 3’-Ende vergleichbar war. Bei den rekombinanten CVB3-Varianten

mit Modifikationen am 5’-Ende war der Virustiter des Wildtyps am höchsten, gefolgt von den

rekombinanten Varianten CVB3-39TS(5+) und CVB3-375TS(5+). Den niedrigsten Titer wies CVB3-

375TS(5-) auf, der etwa eine log10-Stufe unter dem des Kontrollvirus rCVB3.1 lag (Abb. 20A-B).

Die visuelle Beurteilung der Plaquemorphologie der rekombinanten CVB3-Varianten zeigte, dass bis

auf CVB3-375TS(5-) alle Varianten etwa gleich große Plaques ausbildeten. Die Plaques von CVB3-

375TS(5-) waren deutlich kleiner, was in Anbetracht der ebenfalls verringerten Virustiter ebenfalls auf

deren verminderte Replikation zurückführbar ist (Abb. 20C). Vermutlich führt die Insertion der miRNA-

375TSs in negativer Orientierung in das CVB3-Genom bereits zu einer verlangsamten Replikation, die,

wenn sie am 5’-Ende des Protein kodierenden Bereichs erfolgt, zu einer niedrigeren Replikation führt183.

Da die Insertion der miRNA-TSs am 5’-Ende am Beispiel der CVB3-375TS(5-)-Variante zu einer

verringerten CVB3-Replikation führte, wurden für alle folgenden Versuche nur CVB3-Varianten mit

Modifikationen am 3’-Ende verwendet. Alle anderen Insertionen von miRNA-TS wurden bezüglich des

viralen Replikationsverhaltens von CVB3 toleriert.

Die Insertion der miRNA-375TS bzw. miRNA-39TS in die 3’UTR der CVB3-Variante H3N zeigte

keinen Einfluss auf die virale Replikation (Abb. 30A-B). Die Plaques der CVB3-Variante H3N bzw. der

aus dieser generierten H3N-miRNA-TS-Varianten waren deutlich größer als die der CVB3-Variante

rCVB3.1 bzw. der aus dieser generierten CVB3-miRNA-TS-Varianten (Abb. 30C). Studien zeigten,

dass kardiovirulente CVB3-Varianten, zu denen auch H3N zählt, größere Plaques ausbilden als

pankreovirulente bzw. solche, die nur eine geringgradige Myokarditis in Mäusen auslösen, wie es auch

für rCVB3.1 beschrieben wurde279. Ursächlich für die unterschiedliche Plaquemorphologie könnte sein,

dass kardiovirulente Viren eine stärkere Replikation aufweisen bzw. sich besser an die Wirtszellen

adaptiert haben, was zur Steigerung der viralen Fitness beiträgt. Dadurch wird eine größere

Virusnachkommenschaft produziert, welche wiederum in der gleichen Zeit eine größere Anzahl neuer

Zellen infizieren kann als eine langsamer repliziernde Virusvariante. Folglich werden mehr Zellen

lysiert, was vermutlich auch in der Bildung größerer Plaques resultiert289,301.

Im Gegensatz zu einigen der in der vorliegenden Arbeit hergestellten CVB3-miRNA-TS-Varianten

führte die Infektion mit modifiziertem CVB3, welchem GFP inseriert wurde, zur Ausbildung deutlich

kleinerer Plaques. Die Begründung dafür scheint in der Überschreitung der maximal in das Virusgenom

inserierbaren Nukleotidmengen zu liegen. Durch die Insertion von GFP kann somit das zu große Genom

nicht bzw. nur langsamer in das Virion verpackt werden. Diese Menge an Nukleotiden ist von Virus zu

Virus unterschiedlich, sollte aber 30% des viralen Genoms nicht überschreiten302,303. Aus diesem Grund

wurden nur drei Tandem-Kopien der miRNA-TSs in das CVB3-Genom inseriert.

Diskussion

4.2.1 Inhibierung von miRNA-375TS enthaltender CVB3-Varianten durch miRNA-375

Bezüglich der miRNA-375TS vermittelten Attenuierung der generierten CVB3-Varianten

demonstrierten die in vitro Ergebnisse, dass sowohl die Insertion der miRNA-375TS in das 5’-Ende

unmittelbar upstream der kodierenden Sequenz des VP4, als auch die Insertion unmittelbar downstream

des Stop-Kodons innerhalb der 3’UTR des viralen Genoms, zu einer effizienten Inhibierung der viralen

Replikation führen. In vivo konnte gezeigt werden, dass die Insertion der miRNA-375TS in die 3’UTR,

eine effektive Suppression der Virusreplikation bewirkt, H3N-Varianten mit miRNA-TS-Insertionen in

der 5’UTR wurden nicht getestet. Andere Studien, die ebenfalls Viren mit miRNA-TS ausrüsteten, um

die virale Replikation in einzelnen Organen auszuschließen kamen in Bezug auf die Funktionalität der

Viren zu ähnlichen Ergebnissen, andere aber auch zu davon abweichenden. So zeigten He et al., dass

Insertionen von miRNA-TS für zwei muskelspezifische miRNAs, miRNA-133 und miRNA-206, in die

3’UTR des Virusgenoms nicht durch das Virus toleriert wurden, so dass die modifizierten Viren generell

nicht infektiös waren304. Interessanterweise führte die Insertion dieser miRNA-TSs in die 5’UTR des

Virusgenoms zur gewünschten Attenuierung304.

Andere Studien zeigten, dass Sequenzinsertionen in das 3’-Ende (3’UTR) des Virusgenoms von

Picornaviren besser toleriert werden305. Zudem zeigte die Gruppe um Dunn et al., dass die 5’UTR

entscheidend zur Ausprägung des kardiovirulenten Phänotyps innerhalb verschiedener CVB3-Stämme

beiträgt306, so dass eine Modifikation in diesem Bereich des Virusgenoms eventuell die natürliche

Virulenz negativ beeinflussen könnte.

In einem anderen Fall wurden Mengoviren mit miRNA-TSs ausgestattet. Dabei zeigte sich, dass die

generierten vMV24-Varianten, welcher eine miRNA-TS für die miRNA-124 (exprimiert im

Zentralnervensystem) in die 5’UTR und je eine miRNA-TS für die miRNA-133 und die miRNA-208-

(beide exprimiert im Herzen) in die 3’UTR inseriert wurden, die Virusreplikation spezifisch im

Nervengewebe und im Herzen unterdrückte, ohne das virale onkolytische Potential zu beeinträchtigen307.

Anhand dieser Beispiele können die miRNA-TSs sowohl in die 3’UTR als auch in die 5’UTR bzw. in

Kombination aus beiden, inseriert werden. Vielmehr scheinen der exakte Insertionsort, die ausgewählten

miRNAs bzw. miRNA-TSs sowie deren Anzahl einen Einfluss auf die Replikation bzw. Spezifität zu

haben.

Um die CVB3-Replikation im Pankreas möglichst stark zu supprimieren, wurden die inserierten miRNA-

375TS für den während der Replikation gebildeten CVB3-Minus-RNA-Strang generiert. Der Minus-

RNA-Strang, der während der CVB3-Replikation als Matrize für die Synthese neuer Plus-Stränge dient

und im akuten CVB3-Infektionsverlauf im Pankreas in einem Verhältnis 1 : 50 (Minus : Plusstrang)

vorliegt, sollte dadurch eine 50-fach höhere Suppression im Vergleich zum Plus-mRNA-Strang

ermöglichen308.

In der vorliegenden Studie zeigten sich Unterschiede bezüglich der Attenuierungseffektivität zwischen

rekombinanten CVB3-Varianten mit der miRNA-375TS-Insertion in positiver- bzw. negativer

Orientierung. Lediglich die Replikation von CVB3-375TS(3+) und CVB3-375TS(5+) in Gegenwart der

Diskussion

miRNA-375, nicht jedoch die von CVB3-375TS(3-) bzw. CVB3-375TS(5-), konnten supprimiert

werden (Abb. 43). Hingegen konnte mit den miRNA-375-Mimics auch die Replikation von CVB3-

375TS(3-) bzw. CVB3-375TS(5-) inhibiert werden. MiRNA-Mimics, ähneln strukturell sehr stark

siRNAs. Die Inhibierbarkeit der CVB3-Varianten mit negativ orientierten miRNA-375TS-Sequenzen

mittels miRNA-375-Mimics basiert darauf, dass beide miRNA-Mimics-Stränge in den RISC-Komplex

eingebaut werden können. Bei der miRNA-Prozessierung wird jedoch nur der Leitstrang in den miRISC-

AGO2-Komplex eingebaut (Abb. 5) und somit wird nur die miRNA-375TS(+)-Sequenz im Plus-RNA-

Strang supprimiert211,212.

Mit keinem der Ansätze war es jedoch möglich den CVB3-Minus-RNA-Strang durch miRNA-375 zu

inhibieren, da dieser während der Replikation der CVB3-Plus-RNA-Stränge durch den

Replikationskomplex abgeschirmt wird34,309,310. Aus diesem Grund wurden für die weiteren

Untersuchungen CVB3-Varianten mit den Modifikationen am 3’-Ende mit den TSs in der (+)-

Orientierung verwendet.

Abbildung 43: Schematische Darstellung der Angriffsstellen der miRNA und siRNA.

Mit miRNA-375-Mimics (siRNA) wurden beide CVB3-Plustränge mit den TSs in der (-) und (+)-Orientierung

supprimiert, während die miRNA-375 nur den CVB3-Plusstrang mit den TSs in der (+)-Orientierung inhibierte.

Der CVB3-Minusstrang wurde weder von siRNAs noch von miRNAs supprimiert.

Ein weiterer Faktor, der die Effektivität der Attenuierung beeinflusst, ist die Anzahl der inserierten

miRNA-TS-Kopien. CVB3 ist aufgrund der 3D-Polymerase, welche keine Korrekturlesefunktion besitzt,

stark durch das Auftreten von Mutationen gekennzeichnet, so dass die inserierte miRNA-TS inaktiviert

werden könnte. Zum einen minimiert die Mehrfachinsertion von miRNA-TS-Kopien die

Wahrscheinlichkeit, dass alle inserierten Sequenzen während der CVB3-Replikation Mutationen

unterliegen, zum anderen kann sie den Effekt der Attenuierung verstärken.

Diskussion

In Anbetracht des Sicherheitsfaktors viraler Therapiestrategien verringert die Mehrfachinsertion von

miRNA-TS das Risiko der Entstehung von Escape-Mutanten. So konnten Heiss et al. zeigen, dass die

Schädigung des Zentralnervensystems durch mit Insertion mehrerer miRNA-TS-Kopien in neurotrophen

Flaviviren deutlich reduziert werden kann. Obwohl bereits die Insertion einer miRNA-TS die

Neurovirulenz des Virus verhinderte, erhielt das Virus durch Deletionen bzw. andere Mutationen

innerhalb des viralen Genoms schnell seinen ursprünglichen neurovirulenten Phänotyp zurück. Erst

durch die Erhöhung der Anzahl inserierter miRNA-TS innerhalb der 3’UTR des Virus konnte dessen

neurovirulenter Phänotyp konstant unterbunden werden311.

Brown et al. zeigten, dass die Insertion von vier Tandemkopien einer miRNA-TS am effektivsten zur

Suppression der Transgenexpression führt248. Kelly et al. zeigten, dass diese Effizienz nicht allein von

der Anzahl der miRNA-TS-Kopien, sondern von deren Komplementarität zu der jeweiligen miRNA und

deren Expression im Zielgewebe abhängig sind. So führte die Insertion von zwei Tandemkopien

bestehend aus je zwei verschiedenen miRNA-TS-Elementen (miRNA-133TS und miRNA-206TS) zur

stärkeren Restriktion der Genexpression als die Insertion vier Tandemkopien von nur einer miRNA-

TS203.

Für die Pankreasattenuierung von CVB3 wurden drei vollständig komplementäre miRNA-375TS-

Kopien in das virale Genom (3’UTR) inseriert, wodurch die virale Replikation in transient mit miRNA-

375 transfizierten Zellkulturen etwa 10- bis 100-fach verringert wurde. In pankreatischen EndoC-βH1-

Zellen, welche endogen die miRNA-375 exprimieren, konnte sogar eine 10000-fache Inhibierung

beobachtet werden. Damit wurde eine effiziente Attenuierung bereits mit drei miRNA-375TSs erreicht

werden.

4.3 Intraperitoneale Injektion von CVB3

4.3.1 rCVB3.1 verursacht keine Myokarditis in NMRI-Mäusen

Die Auswertungen der in vivo Experimente, bei denen NMRI-Mäuse mit der CVB3-Variante rCVB3.1

bzw. mit den aus dieser generierten, mittels-TS-modifizierten CVB3-Varianten infiziert wurden, zeigten

keinen für CVB3 typischen Infektionsverlauf. Es konnte keine bzw. nur eine sehr geringe virale

Replikation im Pankreas- und Herzgewebe nachgewiesen werden (Abb. 29).

Basierend auf diesen Ergebnissen wurde geschlussfolgert, dass die über die aus rCVB3.1 hergestellten

miRNA-375TS enthaltenden CVB3-Varianten zu keiner stabilen Induktion der Myokarditis führen

würden und folglich ungeeignet für in vivo Untersuchungen bzw. für die Etablierung eines

pankreasattenuierten CVB3-Maus-Myokarditismodells wären. Dieser Befund steht im Einklang mit den

Daten von Slifka et. al., welche rCVB3.1 entwickelten und zeigten, dass die Infektion von Mäusen mit

dieser CVB3-Variante eine mittelgradige Pankreatitis auslöste, jedoch eine wenig stark ausgeprägte

Myokarditis verursachte279. Das für die Herstellung von rCVB3.1 verwendete pMKS1-Plasmid enthält

das komplette Genom des kardiotrophen CVB3-H3281, in welches eine SfiI -und 3C/3CDPro-

Schnittstellen am 5’Ende der Proteinkodierenden Bereich des Virus inseriert wurden. Ein

Diskussion

Sequenzvergleich der cDNAs von rCVB3.1 und des kardiotropen CVB3 H3, welches für die Herstellung

von rCVB3.1 als parentales Virus verwendet wurde, zeigte, dass bis auf die SfiI -und 3C/3CDPro-

Schnittstellen eine vollständige Sequenzübereinstimmung beider Virusgenome vorlag.

H3 : MGA QVS T… (Knowlton et al.281)

rCVB3.1 : MGA GGA GGG GAL FQG AQV ST… (Slifka et al.279)

Mit der blauen Markierung wurde der Bereich gekennzeichnet, welcher die eingefügte SfiI -und

3C/3CDPro-Schnittstellen enthielt.

Da der kodierende 5’-Bereich wichtig für die virale Replikation ist wird vermutet, dass die Insertion der

SfiI -und 3C/3CDPro-Schnittstellen mit 39 zusätzlichen Nukleotiden die Ursache für die geringe in vivo

Replikation des CVB3 aus dem pMKS1-Plasmid sein könnte183,312,313.

Im Gegensatz zu rCVB3.1 zeigte CVB3-H3 in vivo ein effektives Replikationsverhalten und einen

typischen CVB3-Infektionsverlauf mit Entstehung einer starken Pankreatitis und Myokarditis

(Abb. 29A-E). Bezüglich ihrer pathophysiologischen Präsenz entspricht die verwendete CVB3-Variante

CVB3-H3 der hoch kardiotropen, herzpassagierten H3-Woodruff-Variante 281.

Basierend darauf, sowie in Anbetracht der Ergebnisse der in vitro Versuche, wurden für die in vivo

Experimente ausschließlich rekombinante H3-Varianten (H3N, H3N-375TS und H3N-39TS) mit

Modifikationen am 3’-Ende verwendet, denen die miRNA-TS in positiver Orientierung inseriert wurden.

4.3.2 H3N induziert eine Myokarditis nach i.v. Applikation in NMRI-Mäuse

Mit den neugenerierten CVB3-Varianten H3N (Wildtyp), H3N-39TS (Kontrolle zur Spezifität der

miRNA-TS) und H3N-375TS wurden NMRI-Mäuse i.p. mit einer Dosis von 105 pfu infiziert. Die beiden

CVB3-Varianten H3N und H3N-39TS, nicht jedoch H3N-375TS, verursachten einen typischen Verlauf

einer CVB3-Infektion mit einhergehender Gewichtsreduktion und eingeschränktem Gesundheitszustand.

Es wurde erwartet, dass Mäuse, welche i.p. mit H3N bzw. H3N-39TS infiziert wurden, sowohl im Herzen

als auch im Pankreas hohe Virustiter aufweisen, wohingegen für H3N-375TS infizierte Mäuse keine

oder lediglich geringe Virustiter im Pankreas, aber hohe Virustiter in dem Herz erwartet wurden. Die

Messung der Viruslast in den Gewebeproben sowie die histologischen Untersuchungen bestätigten, dass

die Infektion mit H3N bzw. mit H3N-39TS zu hohen kardialen und pankreatischen CVB3-Titern führte.

Die mit H3N-375TS infizierten Tiere wiesen entsprechend der miRNA-375 vermittelten Attenuierung

eine sehr geringe CVB3-Kopienzahl im Pankreas auf, doch entgegen der Erwartungen konnte auch im

Herzen nur ein geringer Virustiter nachgewiesen werden (Abb. 31C-D). Wie bereits mehrfach erwähnt,

wurde die Rolle des Pankreas für die Entwicklung der CVB3 induzierten Myokarditis im Mausmodell

kontrovers diskutiert.

Kallewaard et al. entwickelten ein Maus-Knockout-Modell, bei dem CAR in den für die Pathogenese

von CVB3 wichtigen Organen, Herz (Hrt-KO) bzw. Pankreas (Panc-KO), deletiert wurde. Bei den mit

CVB3-H3 infizierten Panc-KO-Mäusen wurde im Pankreas ein drei log10-Stufen niedrigerer Virustiter

Diskussion

100

als bei den Kontrolltieren detektiert. Der Virustiter im Herzen war jedoch nur eine log10-Stufe niedriger,

woraus geschlussfolgert wurde, dass die CVB3-Infektion des Pankreas keinen großen Einfluss auf die

Infektion des Herzens besitzt. Der direkte Knockout von CAR im Herzen hingegen zeigte eine stärkere

Auswirkung auf die kardialen CVB3-Titer, da dieser in den mit CVB3-H3 infizierten Hrt-KO-Mäusen

zwei log10-Stufen unter denen der Kontrollgruppe lag. Damit vergleichbare Ergebnisse zeigte der

komibierte Knockout von CAR in Herz und Pankreas und unterstützt damit die Vermutung, dass weniger

die Replikation von CVB3 im Pankreas ausschlaggebend für die kardialen CVB3-Titer ist, als vielmehr

die Expression von CAR im Herzen289.

Damit einhergehend zeigten die Befunde von Gomez et al., welche in einer Studie Balb/C-Mäuse

entweder mit einer pankeovirulenten bzw. mit einer kardiovirulenten CVB3-Variante i.p. infizierten,

dass trotz ähnlich hoher CVB3-Titer im Pankreas nur die kardiovirulente CVB3-Variante eine

Myokarditis induzierte. Ein hoher CVB3-Titer im Pankreas wäre demnach kein Indikator dafür, dass

eine Myokarditis induziert wird295. Auch in NMRI-Mäusen konnte gezeigt werden, dass das Pankreas

eine Rolle während der primären Replikation in CVB3-infizierten NMRI-Mäusen spielt, die virale

Vermehrung im Pankreas jedoch nicht zwingend erforderlich zu sein scheint, um eine akute und/ oder

chronische Myokarditis zu entwickeln115. Dementgegen stehen die Befunde von Tracy et. al., die zeigten,

dass kardiovirulente CVB3-Stämme keine Myokarditis ohne eine vorhergehende Pankreatitis

verursachen können. Dafür verwendeten sie neun sich genotypisch unterscheidende CVB3-Stämme, von

denen einer avirulent für Herz und Pankreas war, acht der neun Stämme eine Pankreatitis

(pankreovirulent) verursachten und von diesen acht wiederum lediglich drei eine Myokarditis

(kardiovirulent) verursachten. Die Studie zeigte, dass alle i.p. applizerten Stämme während der

achttägigen Versuchsdauer effizient im Pankreas replizierten, die kardiovirenten Stämme jedoch

tendentiell höhere Titer und eine längere Persitzenz im Serum, im Pankreas und im Herzen aufwiesen

als die nicht kardiovirulente Stämme. In der gleichen Studie zeigten sie in vitro, dass die kardiovirulenten

Stämme höhere Virustiter erreichten als die nicht kardiovirulenten95.

In einer weiteren Untersuchung zeigten Leipner et al., dass 24 h nach i.p. Injektion des kardiovirulenten

CVB3-Wildtyps in Balb/C -und C57BL/6-Mäusen lediglich im Blutserum, der Milz, dem Pankreas und

dem mesentrialen Lymphsystem CVB3-Titer nachweisbar waren. Das deutet daraufhin, dass in der

frühen Phase die CVB3-Infektion des Pankreas nötig ist und sich von dort ausgehend auf das Herz

ausbreitet118. Demzufolge scheint bei i.p. Applikation von CVB3 das Fehlen der pankreatischen H3N-

375TS Infektion ursächlich für die fehlende Infektion des Herzens mit CVB3 zu sein, so dass hier die

pankreatische Infektion essentiell für die kardiale Infektion ist.

Darüber hinaus zeigen unsere Ergebnisse, dass die auf dem Mechanismus der RNAi basierende Strategie

der Pankreasattenuation mittels H3N-375TS im Vergleich zu dem beschriebenen CAR-KO-Maus-

Modell hocheffizient ist, da nahezu in allen untersuchten Tieren H3N-375TS im Pankreas nicht mehr

detektiert werden konnte, während in Panc-KO-Mäusen die CVB3 Titerbei 1x104 pfu/g lagen289.

Diskussion

101

Zudem soll erwähnt werden, dass die miRNA-39TS-Insertion tendenziell einen, wenn auch nicht

signifikanten, Einfluss auf die CVB3-Replikation zu haben scheint, da die Titer von H3N-39TS sowohl

im Pankreas als auch im Herzen jeweils um ca. eine log10-Stufe niedriger als die von H3N ausfielen.

Auch die kardiale Inflammation sowie die Pankreaszerstörung war bei H3N-39TS geringer als bei H3N,

was aus den geringeren Virustitern resultieren könnte (Abb. 31C-F).

Abbildung 44: Schematische Darstellung der miRNA-7650-Angriffsstelle im CVB3-Genom.

Die grün markierten Stellen symbolisieren die Angriffstelle der miRNA-7650 im CVB3-Genom. Mit den blauen Pfeilen sind

die miRNA-39TSs dargestellt zwischen denen sich jeweils 6 bp lange Spacer-Sequenzen befinden. Angriffstelle der

miRNA-7650, welche über 13 Nukleotide komplementär zum CVB3-Genom ist (grün).

Eine mögliche Ursache hierfür könnte eine unbeabsichtigt generierte Angriffsstelle für die miRNA-7650,

welche ebenfalls im murinen Organismus exprimiert wird314 und sich zwischen der ersten und zweiten

miRNA-39TSs befindet (bei allen CVB3-Varianten mit miRNA-39TSs), sein (Abb. 44). In der Literatur

finden sich keine Aussagen über die miRNA7650 bzw. über deren Expression im Pankreas, sodass diese

Hypothese spekulativ ist und einer experimentellen Überprüfung bedarf.

Dennoch konnte sowohl mit H3N als auch mit H3N-39TS erfolgreich eine Myokarditis induziert werden,

was belegt, dass die miRNA-Insertion per se die Infektiösität von CVB3 in den Mäusen nicht verhindert,

sondern die ausbleibende Infektion des Pankreas mit H3N-375TS spezifisch auf die miRNA-375TS

zurückzuführen ist. Innerhalb der i.p. Applikationsroute könnte somit die fehlende CVB3-Replikation

im Pankreas von H3N-375TS ursächlich für den geringen Virustiter im Herzen und die dadurch

ausbleibende Infektion des Herzens sein.

4.4 Intravenöse Injektion von CVB3

Basierend auf der Hypothese, dass CVB3 im Pankreas repliziert und sich anschließend über die Blutbahn

systemisch ausbreitet und so das Herz infiziert118, konnten Freiberg et al. über die i.v. Applikation von

CVB3 die virämische Ausbreitung des Virus nachahmen und so eine Infektion des Herzens und/oder die

Ausbildung einer Myokarditis verursachen. Doch auch diese Strategie resultierte in der Infektion und

letztlich der Zerstörung des Pankreasgewebes315.

In der vorliegenden Arbeit wurde die pankreasattenuierte CVB3-Variante H3N-375TS i.v. in die linke

Vena jugularis injiziert, um eine sofortige hämatogene Ausbreitung auszulösen und direkt das Herz zu

infizieren. Zudem sollte überprüft werden, ob H3N-375TS, dessen Replikation im Pankreas stark

supprimiert ist, nach i.v. Applikation eine Myokarditis induzieren kann.

Diskussion

102

4.4.1 Intravenöse Injektion von H3N-375TS verursacht eine Myokarditis

Da keine Erfahrungswerte vorlagen musste mit dem Ändern der Applikationsroute auf i.v. zunächst eine

für die Infektion geeignete Infektionsdosis ermittelt werden. Mit steigender Dosis (Kapitel 3.14) von

H3N-375TS (5x104, 5x105 bzw. 5x106 pfu) stieg der Virustiter im Herzen an (Abb. 33C). Entsprechend

stieg auch der kardiale Inflammationsscore und lag bei der höchsten Virusdosis im Mittel bei einem Wert

von 0,7. Im Vergleich dazu resultierte die i.p. Applikation von H3N-39TS (1x105 pfu) in einem höheren

kardialen Inflammationsscore von 1,3.

Dieser Versuch zeigte erstmals, dass durch die i.v. Applikation von H3N-375TS, auch ohne die vorherige

CVB3-Replikation im Pankreas, eine Myokarditis induziert werden kann. Dies wiederum bedeutet, dass

entgegen der Hypothese von Tracy „keine Myokarditis ohne Pankreatitis“95 innerhalb der i.v.

Applikation die Kardiovirulenz demnach nicht zwangsläufig die Replikation des Virus im Pankreas

erfordert. Basierend auf diesem Befund scheinen sich die primäre pankreatische Replikation von i.p.

injiziertem CVB3 und die dadurch verursachte Virämie entscheidend auf die kardiale CVB3-Infektion

und somit auf die Ausprägung der Myokarditis auszuwirken.

Bei der i.v. Injektion von H3N-375TS wurden, wie erwartet, keine CVB3-Kopien im Pankreas infizierter

Mäuse nachgewiesen. Auch die pathohistologischen Untersuchungen zeigten keine Infektionsherde oder

Läsionen im Pankreas (Abb. 33E). Dies bestätigt auch der Gewichtsverlauf der NMRI-Mäuse über die

siebentägige Versuchszeit, da in keinem der mit H3N-375TS infizierten Tiere eine Gewichtsreduktion

festgestellt werden konnte (Abb. 33A). Damit übereinstimmend wurde der allgemeine

Gesundheitszustand der infizierten Mäuse mit einem Score von 4-4,5 bewertet, was ebenfalls bestätigt,

dass die Tiere nahezu klinisch unauffällig waren.

Die Daten zeigen, dass die mit pankreasattenuiertem H3N-375TS infizierten Mäuse keine pankreatische,

jedoch eine stark ausgeprägte kardiale Inflammation aufwiesen, die in Ihrer Ausprägung ähnlich der des

nicht-pankreasattenuierten Kontrollvirus war, welches sowohl im Pankreas als auch im Herzen

replizierte. Dieser Befund deutete darauf hin, dass die pankreatische Virusreplikation infolge der i.v.

Applikation die kardiale Infektion nicht wesentlich beeinflusst.

4.4.2 Vergleich der intraperitonealen und intravenöusen Applikationsrouten

Bezüglich der kardialen Infektion sowie der Ausbildung der Myokarditis weisen das pankreasattenuierte

CVB3-Maus-Myokarditismodell und das klassische CVB3-Maus-Myokarditismodell, bei dem

vollständig aktives CVB3 verwendet wird, starke Ähnlichkeiten auf. Dennoch existieren auch

Unterschiede. Diese beziehen sich weniger auf die Qualität der Infektion als vielmehr auf deren

Quantität. So resultierte die i.v. Applikation von H3N-375TS trotz einer 50-fach höheren initial

applizierten Virsusdosis in ca. 1000-fach geringeren kardialen Virustitern im Vergleich zur i.p.

Applikation des nicht modifizierten H3N. Zwei Befunde bestätigen, dass die geringe kardiale Viruslast

nach i.v. Applikation nicht Resultat einer miRNA-375-vermittelten Attenuierung von H3N-375TS im

Herzen ist. Zum einen wurde die miRNA-375 Expression im Herzen als sehr gering validiert, zum

Diskussion

103

anderen wies die nicht über miRNA-375 attenuierbare H3N-39TS CVB3-Variante vergleichbar

niedrigere kardiale CVB3-Titer nach i.v. Applikation auf. Bei der i.p. Applikation repliziert Wildtyp-

CVB3 zunächst über mehrere Tage im Pankreas. Dort werden große Mengen an CVB3 generiert, die in

die Blutbahn gelangen, sodass das Herz frequent mit einer hohen Viruslast konfrontiert ist, was

wiederum infolge der kardialen Infektion zu hohen CVB3-Titern im Herzen führt95,118. Dementgegen

erfolgt die Infektion des Herzens bei der i.v. Injektion des pankreasattenuierten H3N-375TS

ausschließlich über eine zeitlich limitierte Aufnahme des einmalig in die Blutbahn injizierten Virus.

Zudem unterstützt die Tatsache, dass auch die Erhöhung der i.v. injizierten H3N-375TS Dosis von 5x106

pfu auf 1x108 pfu nicht zu höheren kardialen Titern führte die Vermutung, dass eine Aufnahmekapazität,

eine obere Grenze für das Infektionspotential des Virus, infolge der einmaligen i.v. Injektion besteht. In

der Blutbahn befindet sich eine Vielzahl zellulärer Komponenten des Immunsystems, so dass es zu einer

schnellen Aktivierung der angeborenen Immunantwort kommt. Infolge der Immunreaktion werden unter

anderem proinflammatorische Chemo -und Zytokine wie IL-1, IL-6, TNFα bzw. Typ I und II IFN aus

Makrophagen und Monozyten unmittelbar in den Blutstrom freigesetzt. Dies wiederum könnte mitunter

zur rapiden chemotaktischen Anlockung weiterer Immunzellen wie NK-Zellen bzw. aktivierter T-Zellen

führen und so zu einer schnellen Elimination viraler Pathogene beitragen. Folglich deuten die Ergebnisse

daraufhin, dass die fehlende Pankreasreplikation innerhalb der i.v. Applikation ursächlich für die

geringeren kardialen CVB3-Titer sein könnte.

Mehrere Studien zeigten, dass niedrigere kardiale CVB3-Titer zu einer weniger stark ausgeprägten

akuten Myokarditis führten. Die Versuche von Tracy et al. verdeutlichten die Auswirkungen des

natürlichen Virulenzphänotyps verschiedener CVB3-Varianten auf die Virustiter in Herz und Pankreas

bzw. auf die Ausprägung der Myokarditis95. Horwith et al. beobachteten, dass CVB3 infizierte

transgenen Mäuse, welche in ihren pankreatischen Zellen verstärkt IFNγ exprimierten, geringere

kardiale Virustiter besaßen und seltener eine CVB3 induzierte Myokarditis ausprägten. Sie

schlussfolgerten, dass die frühzeitige Elimenierung der Virämie die Schädigung des Herzens minimiert

und auch die Wahrscheinlichkeit einer CVB3 induzierten autoimmunen Myokarditis reduziert316.

Entsprechend dieser Erwartungen zeigten auch die in der vorliegenden Studie verwendeten Balb/C-

Mäuse, dass die aus der i.v. Applikation von H3N-375TS resultierenden geringeren kardialen Virustiter

mit der verringerten Ausprägung der kardialen Inflammation bzw. der weniger gravierenden

Verschlechterung des Gesundheitsstaus der Mäuse korrelierten.

Diskussion

104

Abbildung 45: Schematische Darstellung des Infektionsverlaufes von pankreasattenuiertem und nicht-

pankreasattenuiertem H3N in Abhängigkeit von der Applikationsroute.

Dargestellt sind das Ausmaß der pankreatischen Replikation, Virämie und der resultierenden kardialen Inflammation nach

intraperitonealer und intravenöser Applikation von pankreasattenuiertem H3N (H3N-375TS) und nicht pankreasattenuiertem

H3N (H3N-39TS). Die roten Linien symbolisieren den Blutkreislauf, die orangefarbenen Querstriche verdeutlichen das

Ausbleiben des jeweiligen betrachteten virologischen/pathophysiologischen Aspektes.

Abbildung 45 zeigt zusammenfassend den Infektionsverlauf von pankreasatteuiertem H3N-375TS und

nicht-pankreasattenuiertem H3N-39TS in Abhängigkeit der i.v. und i.p. Applikationsroute. Bei der i.p.

Applikation von H3N-375TS wurde dieses im Pankreas komplett supprimiert, konnte daher nicht in den

Blutkreislauf gelangen (gestrichelte Linie) und folglich keine kardiale Infektion auslösen. Dagegen

replizierte das i.p. injizierte Kontrollvirus H3N-39TS im Pankreas, gelangte über die Blutbahn in das

Herz und verursachte eine Myokarditis. Demnach ist bei der i.p. Applikationsroute die CVB3-

Replikation im Pankreas essentiell für die Auslösung einer Myokarditis. Nach i.v. Applikation

induzierten sowohl H3N-39TS als auch H3N-375TS eine Myokarditis. Die H3N-375TS-Variante wurde

auch nach i.v. Applikation im Pankreas supprimiert, konnte jedoch durch die direkte Injektion des Virus

in den Blutkreislauf das Herz infizieren. Dennoch unterschieden sich H3N-39TS und H3N-375TS

signifikant bezüglich ihrer kardialen Titer sowie der von ihnen ausgelösten kardialen Inflammation

voneinander. Bei der gleichen initialen Viruslast lagen beide Parameter bei der pankreasattenuierten

Diskussion

105

H3N-375TS-Variante deutlich niedriger. Die Bestimmung der viralen Titer im Herzen erfolgte sieben

Tage nach Infektion. Innerhalb dieses Zeitraums gelangte das nicht-pankreasattenuierte H3N-39TS

infolge der systemischen Ausbreitung über die Blutbahn in das Pankreas, wo es stark replizierte. Von

dort aus gelangte wiederholt H3N-39TS über die Blutbahn zurück zum Herzen. Das pankreasattenuierte

H3N-375TS hingegen replizierte nicht im Pankreas, so dass vermutlich die Viruslast im Blutstrom und

folglich die im Herzen geringer war als die von H3N-39TS.

4.4.3 Vergleich des H3N-375TS-Myokarditismodells in NMRI -und Balb/C-Mäusen

Für das akute CVB3-Maus-Myokarditismodell zeigten sich die Inzucht-Mausstämme wie Balb/C und

C57BL/6 (Black6) als besonders geeignet, da beide eine akute Myokarditis entwickeln108,287. Da CVB3

jedoch im Herzgewebe von Balb/C-Mäusen im Vergleich zu C57BL/6 -Mäusen langsamer eliminiert wird,

wurden in der vorliegenden Studie Balb/C-Mäuse für das akute CVB3-Maus-Myokarditismodell

verwendet118. Ähnlich wie in dem in Kapitel 3.15 beschriebenen Versuchsaufbau wurden Balb/C-Mäuse

i.v. mit H3N-375TS bzw. H3N-39TS mit einer Dosis von 5x106 pfu bzw. H3N-375TS mit 1x108 pfu

infiziert. Der wohl markanteste Unterschied bei der i.v. CVB3-Infektion zwischen NMRI-und Balb/C-

Mäusen wurde anhand der Gewichtskurven sowie der Beurteilung des allgemeinen Gesundheitszustands

deutlich. NMRI-Mäuse verloren über den siebentägigen Versuchszeitraum sowohl nach Infektion mit

H3N-375TS als auch mit H3N-39TS kein Körpergewicht. Balb/C-Mäuse hingegen nahmen ab dem

zweiten Tag nach Infektion mit H3N-39TS stetig ab und verloren insgesamt über 20% Körpergewicht.

Bei den mit H3N-375TS infizierten Mäusen konnte, wie bereits bei den NMRI-Mäusen, keine

Gewichtsreduktion beobachtet werden (Abb. 39A). In beiden Mausstämmen führte, unabhängig von der

Gewichtsabnahme, die Infektion mit H3N-39TS zu einer nahezu kompletten Zerstörung des Pankreas.

Der höchste in Balb/C-Mäusen ermittelte kardiale H3N-39TS-Titer (1x106 pfu/g) war mit dem i.p.

infizierter NMRI-Mäuse vergleichbar, lag aber deutlich über dem i.v. infizierter NMRI-Mäuse (1x104

pfu/g). Zudem war der in mit H3N-39TS infizierten Balb/C-Mäusen ermittelte durchschnittliche

Inflammationsscore von 2,7 der höchste Grad der Inflammation, der innerhalb dieser Studie erreicht

wurde. Der Anstieg dieser beiden Parameter infolge der Infektion mit H3N-39TS im Vergleich zu den

mit H3N-375TS infizierten Gruppen bestätigt die Annahme, dass die CVB3-Replikation im Pankreas als

eine Art „Booster“ wirkt, der die nötige Virämie generiert, welche zu höheren kardialen CVB3-Titern

und der Inflammation im Herzen führt. In den gleichermaßen i.v. infizierten NMRI-Mäusen konnte keine

adäquate Reflektion der kardialen CVB3-Titer in der Ausprägung der Myokarditis festgestellt werden.

Unterschiede zwischen den beiden Mausstämmen bezüglich der CVB3-Suszeptibilät und folglich der

Ausprägung der Myokarditis könnten ursächlich für diese Beobachtungen sein. Bei näherer Betrachtung

der CVB3-Titer im Herzen, der CVB3-Kopien im Pankreas, der Pankreaszerstörung sowie der kardialen

Inflammationsscores einzelner Tiere innerhalb einer Gruppe wird ersichtlich, dass es eine starke

Streuung gab, welche auf die Heterogenität der NMRI-Mäuse zurückführbar sein könnte. Die

Gewichtsunterschiede zwischen NMRI-Mäusen innerhalb einer Gruppe betrugen fast 16%, bei Balb/C-

Diskussion

106

Mäusen war es dagegen nur 5%. Im Durchschnitt waren die NMRI-Mäuse 33% schwerer als Balb/C-

Mäuse, so dass sich bei einer initialen Virusdosis von 5x106 pfu für NMRI-Mäuse eine Viruslast von

1,8x105 pfu/g Körpergewicht und bei den Balb/C-Mäusen 2,8x105 pfu/g Körpergewicht ergab. Trotz der

Gewichtsunterschiede wurde allen Mäusen die gleiche Virusdosis verabreicht, was zu einer

unterschiedlichen Kompensation bzw. Ausprägung der Infektion führen kann. So zeigte die Gruppe um

Li et al. anhand von C57BL/6-Mäusen, dass sich das initiale Körpergewicht in Kombination mit der

initial eingesetzen CVB3-Dosis entscheidend auf die Entstehung bzw. die Präsenz der viralen

Myokarditis auswirkte119. Weisen Inzuchtlinien nur geringe Unterschiede bezüglich des

Körpergewichtes auf, unterscheidet es sich bei Auszuchtstämmen wie dem NMRI-Stamm gravierend, da

die Variationen hier bis zu einem Drittel bzw. Viertel des Gesamtkörpergewichtes ausmachen können.

Die Verwendung einer auf das Körpergewicht der Versuchstiere angepassten Virusdosis könnte demnach

zu einer verringerten Streuung besagter Inflammations- bzw. Infektionsparameter beitragen.

Die erhöhte Suszeptibilität von Balb/C-Mäusen gegenüber der H3N-39TS-Infektion zeigte sich auch in

der Bewertung des allgemeinen Gesundheitsstatus mit einem sehr niedrigen Wert von 1 (Abb. 39B),

wohingegen gleichermaßen i.v. infizierte NMRI-Mäuse einen Wert von 3 aufwiesen (Abb. 34B). Im

Laufe der Versuchsdauer veränderten die Balb/C-Mäuse ihre Physionomie (struppiges Fell), das

Fressverhalten und waren in ihrer Bewegung stark eingeschränkt, was auf die stark ausgeprägte

Pankreatitis zurückführbar scheint. Bei den mit H3N-375TS infizierten Balb/C-Mäusen lag der

allgemeine Gesundheitsstatus hingegen bei einem Wert von 4, das Pankreas blieb unbeschädigt.

Diese Befunde decken sich mit Beobachtungen der Gruppe um Zhang et al., in denen CVB3 infizierte

SWR-Mäuse sich trotz gleicher initial applizierter CVB3-Dosis aktiver als Balb/C-Mäuse verhielten.

Zudem wiesen die SWR-Mäuse, verglichen mit den Balb/C-Mäusen, eine geringere Letalität auf.

Interessanter Weise konnte jedoch in den SWR-Mäusen eine stärker ausgeprägte Myokarditis als in den

Balb/C-Mäusen induziert werden, wenngleich sich der allgemeine Gesundheitszustand der SWR-Mäuse

nur minimal änderte. Die Grundlage hierfür sahen Zhang et al. in der unterschiedlichen Auspägung der

Immunantwort beider Mausstämme auf die CVB3-Infektion301.

Tracy et al. zeigten, dass verschiedene kardiovirulente CVB3-Stämme (CVB3 AS und ZU) in A/J bzw.

C3H/HeJ-Mäusen gleichermaßen zu einer massiven Zerstörung der pankreatischen Azinuszellen führten,

jedoch war der Gesundheitszustand der A/J-Mäuse im Vergleich zur C3H/HeJ-Mäusen deutlich

schlechter. Somit schlussfolgerten auch sie, dass es immunologische oder aber auch genetische Faktoren

geben muss, die zum schlechteren Gesundheitszustand führten95.

4.4.4 Herzpassagierung von CVB3

In dieser Arbeit wurde rekombinantes, kardiotropes H3N-375TS durch die einmalige in vivo

Herzpassagierung in NMRI-Mäusen so verändert, dass es anschließend eine höhere Herzpathogenität

aufwies108. Die neu entstandene rekombinante H3N-375TS hp Variante wies im Vergleich zu ihrer nicht

herzpassagierten Vorläufervariante eine stärkere Tendenz zur Infektion kardialen Gewebes auf, so dass

Diskussion

107

nach erneuter Infektion von NMRI-Mäusen auch bei einer niedrigeren Virusdosis vergleichbare bzw.

höhere kardiale CVB3-Titer sowie eine stärkere Inflammation im Herzen nachgewiesen wurden

(Abb. 34E). Innerhalb der Arbeit wurden keine molekularen Analysen durchgeführt, so dass der genaue

Mechanismus der Adaption von H3N-375TS bisher nicht geklärt ist.

Eine besondere Eigenschaft von Viren, insbesondere RNA-Viren, ist ihre Anpassungsfähigkeit an äußere

Bedingungen. Die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase (RdRP) verfügt über keine proofreading

Funktion, wodurch CVB3 eine hohe Mutationsrate besitzt. Innerhalb eines einzigen Replikationszyklus

baut die RdRP alle 1000-2000 bp einen Fehler in das CVB3-Genom ein317. Dieser Umstand führt

beispielsweise dazu, dass Mutationen im VP1-Protein eine effizientere Bindung von CAR vermitteln

können. Auch wenn alle Strukturproteine (VP1-VP4) an der Rezeptorbindung beteiligt sind, wurde ein

Großteil der Interaktionen mit CAR für das VP1-Protein nachgewiesen18. Einzig die Modifikation der

Aminosäure Threonin-129 im VP1-Protein von CVB4 ist für dessen Virulenz verantwortlich318. Die

Mutation zweier Basen im VP1-Protein von CVB3 führte dazu, dass Lysin durch Serin ersetzt wurde,

was in einer vergrößerten Plaque-Morphologie resultierte312. Veränderungen an Position N63Y des VP3

Proteins von CVB3 führten ebenfalls zur Ausbildung größerer Plaques319.

Während der Passagierung des avirulenten CVB3-Stammes CVB3/0320 wurde dieser durch die

Modifikation eines einzigen Nukleotids kardiovirulent. Allein der Austausch des Nukleotids Cytosin (C)

zu Uracil (U) an Position 234 in der 5’UTR des CVB3-Genoms war dafür ausreichend321.

Deletionen am 5’-Ende von CVB3, speziell in der 5’UTR, können dagegen zu einer niedrigeren

Replikationsrate und fehlerhafter Translation führen183,322.

Bei der Produktion der Viren bzw. auch während der Lagerung der generierten Virusstocks können

Picornaviren, wie alle RNA-Viren, in einer Mischung unterschiedlicher Genotypen vorliegen, welche

als Quasi-Spezies bezeichnet werden. Dabei zeigte sich, dass sich mutierte Genotypen, welche durch die

Mutation einen Selektionsvorteil erhalten hatten, besser durchsetzen konnten als Genotypen ohne die

entsprechende Mutation323,324.

4.4.5 Das chronische Modell der CVB3-Mausmyokarditis

CVB3 induziert in A/J -und NMRI-Mäusen eine chronische Myokarditis, welche einen ähnlichen

Krankheitsverlauf wie beim Menschen hat115,325. Resistente Mausstämme, wie der Stamm C57BL/6,

dagegen entwickeln zwar eine akute, jedoch keine chronische Myokarditis108,287.

Nach akuter und subakuter Phase der CVB3-Infektion, welche sich durch die Virusvermehrung und

Schädigung des Myokards auszeichnen, folgt die chronische Phase der Myokarditis.

Charakteristische Merkmale für die chronische Myokarditis sind die CVB3-mRNA-Persistenz, ohne den

Nachweis funktioneller CVB3-Parktikel, sowie das Auftreten fibrotischer Areale (Remodelling) im

zuvor geschädigten Herzgewebe115,296.

Wie es CVB3 gelingt im Herzen zu persistieren ist bislang noch nicht ins Detail verstanden, jedoch sind

terminale Deletionen im 5´-Bereich der genomischen RNA maßgeblich in die virale Persistenz

Diskussion

108

involviert. 2005 zeigten Kim et al., dass ein Zusammenhang zwischen der Bildung nicht-zytopathischer

Viren aus der genomischen CVB3-RNA mit terminalen Deletionen der 5’UTR und der Persistenz und

bzw. oder der Aufrechterhaltung der persistenten Infektion des Herzens besteht326. Zudem fanden sich

vergleichbare terminale Deletionen der 5’UTR in Biopsien von Patienten mit chronischer

Kardiomyopathie327. Smith et al. zeigten, dass diese terminalen Deletionen der 5’UTR des CVB3-

Genoms verglichen mit unmodifiziertem Wildtyp-CVB3 zur deutlichen Verringerung der

Virusreplikation führten328. Wie bereits in Kapitel 4.1 diskutiert besteht zudem die Annahme der

Persistenz von CVB3 in den pankreatischen Inselzellen, welche ebenfalls auf terminale Deletionen

innerhalb der 5’UTR ihres Genoms zurückführbar ist297–299.

Bei dem in der vorliegenden Arbeit verwendeten heterogenem NMRI-Mausstamm wurden nach 28-

tägiger Versuchsdauer keine infektiösen CVB3-Partikel im Herzen nachgewiesen, hingegen konnten

geringe Mengen von CVB3-mRNA im Herzen detektiert werden, was charakteristisch für die chronische

Myokarditis ist (Abb. 37C).

Mittels der Trichrom-Färbung der Herzgewebeschnitten waren die Veränderungen des Myokards

infolge der CVB3-Infektion sowie fibrotische Veränderungen gut sichtbar. Auch hier zeigte sich

erneut die Heterogenität der NMRI-Mäuse bezüglich der Infektion mit CVB3. So wies eine der mit

H3N-375TS hp infizierten NMRI-Mäuse, welche mit einem Inflammationsscore von 3 bewertet

wurde, viele myofibrillär geschädigte Areale im Myokard auf (Abb.37D, 25-fach Vergrößerung). Bei

einem anderen Tier der gleichen Versuchsgruppe hingegen ergab sich ein kardialer

Inflammationsscore von 1, die Schädigung des Myokards, gemessen an der Häufigkeit sowie der

Größe solcher Areale, war deutlich geringer.

4.4.6 Hämodynamische Messungen

Um weitere objektive Aussagen über die pathophysiologischen Auswirkungen der mit CVB3 induzierten

Myokarditis treffen zu können wurden hämodynamische Messungen der kardialen Funktionsparameter

durchgeführt. Aus der Literatur ist es bekannt, dass hauptsächlich das links-ventrikuläre Myokard von

kardiovirulenten CVB3 attackiert wird288. Aus diesem Grund wurde die maximale

Druckanstiegsgeschwindigkeit [dP/dtmax (mmHg/s)], der links-ventrikuläre systolische Druck, welche

die Kontraktilität beschreibt, sowie die maximale Druckabfallgeschwindigkeit [dP/dtmin (mmHg/s)] des

links-ventrikulären diastolischen Drucks quantifiziert, welche wiederum die Relaxationsfähigkeit

(Compliance) angibt.

Im akuten Modell konnten zwischen den i.p. mit H3N bzw. mit H3N-39TS infizierten NMRI-Mäusen

und den mit 0,9%iger NaCl-Lösung behandelten Kontrolltieren (sham) signifikante Unterschiede

bezüglich dP/dtmax (H3N-39TS vs. sham) und dP/dtmin (H3N als auch H3N-39TS vs. sham) detektiert

werden. Aufgrund der ausbleibenden Replikation von H3N-375TS nach i.p. Applikation gab es keine

signifikanten Unterschiede zwischen den mit H3N-375TS infizierten Mäusen und den Kontrolltieren

(Abb. 32 B-C).

Diskussion

109

Durch die Änderung der Applikationsroute auf i.v. in Kombination mit der Steigerung der applizierten

Virusdosis sowie der Herzpassagierung konnte im akuten Modell die Myokarditis mit deutlichen

histopathologischen Veränderungen auch mit H3N-375TS in NMRI-Mäusen induziert werden. Dennoch

waren die CVB3-Titer im Herzen sowie der kardiale Inflammationsscore geringer als bei den i.p. mit

H3N-39TS bzw. H3N infizierten NMRI-Mäusen. Diese beiden Parameter wurden als Indikatoren

messbarer, hämodynamischer Veränderungen gewertet. Überraschender Weise konnten nach i.v.

Applikation von H3N-375TS weder in Balb/C-Mäusen im akuten Modell, noch in NMRI-Mäuen im

akuten als auch im chronischen Modell, kardiale Dysfunktionen festgestellt werden. Dabei verwunderte,

dass der kardiale Inflammationsscore H3N-375TS (1x108 pfu) infizierter Balb/C-Mäuse bei einem Wert

von 2 lag, was dem Inflammationsscore der i.p. mit H3N infizierten NMRI-Mäusen entsprach, welche

wiederum signifikante Beeinträchtigungen der Hämodynamik aufwiesen. Unter Anbetracht der

kardialen CVB3-Titer wird jedoch ersichtlich, dass das i.v. applizierte H3N-375TS in Balb/C-Mäusen

lediglich 104 pfu/g erreicht wohingegen die von i.p. appliziertem H3N bzw. H3N-39TS etwa zwei- drei

log10-Stufen darüber lagen. Somit könnte der kardiale CVB3-Titer eine entscheidende Rolle für

signifikante hämodynamische Veränderungen spielen. Diese Befunde H3N-375TS infizierter Balb/C-

Mäuse stehen dabei im Kontrast zu vorherigen Daten der Arbeitsgruppe, in denen Balb/C-Mäuse

signifikante kardiale Dysfunktionen zeigten wenn sie i.p. mit Wildtyp-CVB3 infiziert wurden329.

Auch wenn NMRI-Mäuse, wenngleich seltener als Inzuchtmäuse, zur Untersuchung CVB3 induzierter

Myokarditen verwendet wurden, adressierten die bislang publizierten Studien kaum die Auswirkungen

der Infektion auf die Hämodynamik, sondern vielmehr immunologische Parameter. Da der überwiegende

Teil der Studien die chronische Myokarditis an Parametren wie der Expression verschiedener Zytokine

festmacht, sind die Messungen der in der vorliegenden Studie vorgenommen Hämodynamik nicht mit

der Literatur vergleichbar. Für den Vergleich könnten in Folgeexperimenten ebenfalls Zytokin- und

Interferonprofile der H3N-375TS infizierten NMRI-Mäuse im chronischen Modell ermittelt werden.

Schmidtke et al. zeigten, dass in CVB3 infizierten NMRI-Mäusen während der akuten Phase eine

verstärke kardiale Expression der IFNβ- und IL-6 mRNA bis zu sieben Tage nach der i.p. Infektion

messbar war. Die mRNAs von TNFα, IL-1α, IL-10, IL-12 und IFNγ wurden sogar bis zu 14 Tage nach

Infektion im Myokard verstärkt expimiert330. Damit übereinstimmend zeigten Glück et al, dass im

chronischen Modell in CVB3 infizierten NMRI-Mäusen die mRNA-Expression von TNFα, IL-1α, IFN-

γ, IL-10, IL-18, MIP-1a, TGFβ sowie der iNOS bis zu 98 Tagen nach Infektion im Herzen anhielt125. In

einer späteren Studie zeigten Schmitdke et al., dass in NMRI-Mäusen sowohl eine akute als auch

chronische CVB3 induzierte Myokarditis generiert werden kann, doch auch hier wurden keine

hämodynamischen Messungen durchgeführt115. Innerhalb dieser Studie induzierte die CVB3-Infektion

keine gravierenden Verletzungen des Myokards. Zudem zeigte sich, dass es keine pathophysiologische

Verbindung zwischen Herz und Pankreas der infizierten NMRI-Mäuse gab. So stimmte die induzierte

IgG-Antwort sowie der Grad der Pankreaszerstörung als auch die erhöhte Menge an detektierter viraler

RNA in der Milz nicht mit der histopathologischen Analyse des Myokards überein, die nahe zu keine

Diskussion

110

destruktiven Veränderungen aufwies. Im Gegensatz dazu waren hohe persistierende kardiale RNA-Level

des Virus charakteristisch für die Entwicklung der chronischen Myokarditis, woraus geschlussfolgert

wurde, dass eine hohe kardiale Viruslast während der akuten Phase der Myokarditis zusammen mit

großen Mengen von im Herzen persistierender CVB3-RNA geeignete Marker zur Vorhersage der

chonischen Myokarditis darstellen.

Auch der virale Genotyp war ein entscheidender Faktor im Verlauf der CV3-induzierten Infektion des

Herzens in NMRI-Mäusen, insbesondere Aminosäuresubstitutionen innerhalb der viralen

Kapsidproteine, hier VP1, führten zu einer Veränderung des Zelltropismus115. In Abhängigkeit des

spezifischen Aminosäreaustausches innerhalb von VP1 der eingesetzten CBV3-Varianten unterschieden

sich die Viren innerhalb ihres kardialen Replikationsverhaltens bzw. der Mengen an im Herzen

persistierender RNA, was folglich die Ausprägung der chronischen Myokarditis beeinflusste. Vorherige

Untersuchungen der gleichen Arbeitsgruppe zeigten, dass der CVB3-Stamm Nancy auf primären

humanen Fibroblasten keine zytophatischen Effekte verursachte, wohingen die auf Nancy basierende

CVB3-Variante PD, die gleichen Zellen lysierte. Als ursächlich dafür wurden sechs

Aminosäuresubstitutionen im Kapsidprotein VP1 befunden330, durch welche CVB3-PD in vitro über die

Verwendung des zusätzlichen zellulären Rezeptors Heperansulfat einen breiteren Zelltropismus

aufweist.331 In vivo jedoch führten diese Aminosäuremodifikationen zu einer schnelleren Eliminierung

des Virus.115

Wie bereits beim Kapitel 4.4.2 diskutiert repliziert das pankreasattenuierte H3N-375TS nicht im

Pankreas, so dass vermutlich die Viruslast im Blutstrom und folglich die im Herzen zu gering ausfällt,

um das Myokard zu infizieren und signifikante Unterschiede mittels hämodynamischer Messungen zu

detektieren.

4.5 Umsetzung des 3R-Gedankens

Das etablierte Modell ermöglicht unabhängig von der Ausprägung der Pankreatitis die Analyse der

murinen Myokarditis. Zum einen hat dies klinische, zum anderen aber auch tierschutzrechtliche

Relevanz. Die Implementierung der 3R Prinzipien, Replacement, Reduction und Refinement zum Schutz

der für wissenschaftlichen Zwecke verwendeten Tiere stellt dabei sogar eine gesetzliche Richtlinie

dar332, welche im Gesetztestext der Europäischen Union (Richtlinie 2010/63/EU) verankert ist. Darin ist

in 55 Punkten geschildert inwiefern dieser Schutz, wann immer möglich, umzusetzen ist. Im Sinne des

Aspektes Refinement verbesserte das pankreasattenuierte CVB3-Maus-Myokarditismodell das Wohl der

infizierten Tiere auf zwei Wegen. Zum einen führte die pankreasattenuierte CVB3-Variante H3N-

375TS, im Vergleich zu nicht modifiziertem H3N, zu einer Verringerung des Leidens i.v. infizierter

Balb/C-Mäuse, was der ermittelte Verhaltensscore (Abb. 39B; H3N-375TS: Score 4, H3N: Score 1)

verdeutlichte. Zum anderen war auch die i.v. Applikation von H3N-375TS in NMRI-Mäusen mit einer

geringeren gesundheitlichen Beeinträchtigung verbunden als die i.p. Applikation des nicht

pankreasattenuierten H3N. Ursächlich für die bessere Gesundheit der infizierten Mäuse könnte auf den

Diskussion

111

ersten Blick demnach die Pankreasattenuation sein, welche die fulminate Infektion und damit

verbundene Destruktion dieses Gewebes unterbindet. Tracy et al. kamen jedoch zu dem Befund, dass

bei der i.p. Applikation keine direkte Korrelation zwischen dem Grad der Zerstörung des

Pankreasgewebes und dem Wohlbefinden der CVB3 infizierten Mäuse besteht.95 In der hier

vorliegenden Arbeit besaßen i.v. mit CVB3 infizierte NMRI-Mäuse unabhängig von der Infektion bzw.

Zerstörung des Pankreas einen besseren Gesundheitszustand als solche, die i.p. infiziert wurden und

eine stärkere Destruktion des Pankreas aufwiesen. Vielmehr zeigt die vorliegende Studie, dass

möglicherweise eine Korrelation zwischen den kardialen CVB3-Titern und dem Wohlbedinden der

Mäuse besteht. So wiesen Tiere mit hohen kardialen Titern einen schlechten Gesundheitszustand auf,

wohingegen Tiere, welche niedrige kardiale CVB3-Titer zeigten ein verbesserter Gesundheitsscore

zugewiesen werden konnte. Doch auch basierend auf dieser Korrelation wäre es vermessen zu

behaupten, dasss der Grad der kardialen Infektion ausschlaggebend für das Wohlbefinden der infizierten

Tiere steht. Vielmehr indizieren die kardialen Virustiter die Stärke der systemischen Infektion von

CVB3, welche innerhalb einer sehr komplexen Regulation den Gesundheitsstatus der Tiere beeinflusst.

Neben dem Aspekt des Refinement trägt das etablierte Modell auch zur Erfüllung des Aspektes

Reduction bei. In klassischen CVB3-Mausmyokarditismodellen versterben Tiere teilweise vorzeitig vor

dem geplanten Versuchsende bzw. müssen vorzeitig getötet werden. Um trotzdem eine ausreichende,

gleichmäßige Anzahl an Tieren innerhalb aller Versuchsgruppen zu haben, die in die Analyse

eingehenden, ist es daher oftmals nötig größere Tierzahlen einzusetzen. Im Sinne des Aspektes

Reduction ermöglicht die etablierte Pankreasattenuation den Einsatz kleiner Versuchsgruppen, da diese

zu einer weniger fulminanten Ausprägung des Krankheitsverlaufes führt.

4.6 Ausblick

Das in der Arbeit etablierte murine CVB3-Myokarditismodell, welches auf der RNAi vermittelten

Pankreasattenuation mittels miRNA-TS modifiziertem CVB3 basiert, ermöglicht es den Virustropismus

nach i.v. Applikation der modifizierten CVB3-Variante H3N-375TS gezielt zu ändern. Dadurch war es

erstmals möglich in Mäusen eine Myokarditis zu induzieren, ohne dabei eine Pankreatitis auszulösen.

Um das Modell noch effizienter zu machen bzw. es bezüglich pathophysiologischer Aspekte hin zu

verbessern sollten dennoch wichtige Punkte adressiert werden. Ein äußerst gravierender Punkt, welcher

bis dato nahe zu kaum in der Arbeit adressiert wurde, ist die Verwendung weiblicher statt männlicher

Mäuse. Mehrfach wurde gezeigt, dass es geschlechtsspezifische Unterschiede im Verlauf der CVB3

induzierten Myokarditis und damit auch in der Ausbildung der DCM gibt. Dies trifft sowohl auf den

murinen als auch den humanen Organismus zu. Es ist bislang nicht eindeutig geklärt, worauf diese

geschlechtsspezifischen Unterschiede basieren, dennoch konnte gezeigt werden, dass Faktoren des

Immunsystems, hier insbesondere Sexualhormone wie Östrogen und Testosteron, welche zu einer

unterschiedlichen Aktivierung der Th1- bzw. Th2-vermittelten Immunantwort führen, entscheidend dazu

beitragen. Basierend auf den Befunden von McNamara et al., die zeigten, dass männliche Patienten

Diskussion

112

deutlich häufiger eine DCM ausbildeten als weibliche333, publizierten Fairweather et al. 2013 eine

detaillierte Zusammenfassung potentieller pathophysiologischer Kausalitäten dieses Befundes80. Daher

sollten die Versuche im Vergleich mit männlichen Tieren wiederholt werden, um zu überprüfen, ob es

geschlechtsspezifische Unterschiede gibt bzw. ob pankreasattenuiertes CVB3 eine DCM in männlichen

Mäusen induzieren kann. Da jedoch beide Geschlechter von der virus-induzierten Myokarditis betroffen

sind und daher das Verständnis des Krankheitsverlaufes in beiden Geschlechtern von klinischer Relevanz

ist, sollte auch die Analyse in weiblichen Mäusen weiter vorangetrieben werden334 .

Ein weiterer zu untersuchender Faktor ist die Suszeptibilität der beiden verwendeten Mausstämme

NMRI und Balb/C gegenüber der CVB3-Infektion. Hierbei fiel auf, dass für die Etablierung des Modells

der homogenere Inzuchtstamm Balb/C besser geeignet ist, da die Heterogenität des NMRI-Stammes

bereits enorme Schwankungen innerhalb gleichbehandelter Tiere mit sich brachte. Auch wenn die

Heterogenität der NMRI-Mäuse die Situation in der noch diverseren humanen Population besser

widerspiegelt, sollte zumindest für die Etablierungsphase ein homogeneres System gewählt werden,

welches sowohl die Analyse der akuten als auch chronischen Myokarditis ermöglicht. Die Verwendung

des pankreasattenuierten H3N-375 ermöglicht hierbei auch die Untersuchung der Myokarditis,

insbesondere der chronischen Myokarditis, bei hochsuszeptiblen Mausstämmen (schlechter klinischer

Zustand aufgrund der induzierten Pankreatitis), welche in nicht pankreasattenuierten Versuchsmodellen

mitunter frühzeitig im Versuchsverlauf versterben würden.

Um detailliertere Kenntnisse über die systemische Ausbreitung von i.v. appliziertem CVB3 zu gewinnen

sollten die viralen Titer, neben Pankreas und Herz, auch in weiteren Organen innerhalb definierter

zeitlicher Abstände innerhalb des siebentägigen Infektionszeitraumes überprüft werden. Zusätzlich wäre

es interessant, die Viruslast im Blut sowie die Expression verschiedener proinflammatorischer Zytokine

bzw. die generelle Aktivierung verschiedener Signalwege wie die des mitogen activated protein kinase

(MAPK)- oder den JAK/STAT-Weg zu analysieren. In diesem Zusammenhang sollte zudem die

Rekrutierung und Aktivierung verschiedener Immunzellen innerhalb der Organe bzw. im Blut bestimmt

werden.

Bezüglich der Hämodynamik wäre es denkbar eine mehrfach wiederholte i.v. Injektionen von

pankreasattenuierten CVB3-Varianten durchzuführen, um messbare kardiale Dysfunktionen zu erhalten

und so die Untersuchung der Myokarditis ohne Nebenwirkungen der Pankreatitis zu gewährleisten.

Dabei muss jedoch abgewogen werden, ob die damit verbundenen zusätzlichen operativen Eingriff

wiederum nicht eine zu große Belastung für die Tiere darstellen. Zudem wird bereits durch die

Erstinjektion des Virus das Immunsystem aktiviert, so dass zu überprüfen bleibt, ob infolge der

wiederholten Injektionen dieses schnell reagiert und zu einer unmittelbaren Clearance des Virus führt.

Eine Limitierung des Modells ist die i.v Injektion, welche die Handhabung durch den operativen Eingriff

erschwert. In Vorversuchen mit NMRI-Mäusen, welche i.p. mit CVB3-375TS (mit nur einer TS) und

mit CVB3-216aTS (drei TSs) infiziert wurden, ergaben sich die gleichen kardialen CVB3-Titer (Daten

nicht gezeigt). Dadurch könnte, durch den Einsatz einer Kombination von im Pankreas weniger stark

Diskussion

113

exprimierten miRNAs sowie einer weiteren Optimierung der Anzahl der inserierten miRNA-TSs, die

Stärke der induzierten Myokarditis kontrolliert werden.

Zusätzlich zeigten die Befunde von Dixit et al. sowie Endo et al., dass während einer induzierten

Pankreatitis die Expressionslevel der miRNA-216a, -216b bzw. der miRNA-217 deutlich

anstiegen335,336. Basierend auf dem Prinzip „Induction by disease“ wäre es möglich, durch die

Modifikation von CVB3 mit den zuvor erwähnten miRNAs, die CVB3-Replikation während der akuten

Phase der Infektion zu verringern. Dadurch könnte die nötige Virämie, welche zur Ausbildung der

Myokarditis nötig ist, generiert werden ohne CVB3 i.v. applizieren zu müssen, sondern die in der

Mehrheit der publizierten Sudien verwendete i.p. Applikationsroute beizubehalten. Zudem sollte geklärt

werden, welchen Effekt die Insertion der miRNA-TS in das Genom von CVB3 tatsächlich besitzt, da

auch die nicht durch murine miRNAs erkannte miRNA-39TS-Insertion gerinfügige Effekte bezüglich

der Replikation zeigte. Gegebenfalls sollte diese durch eine andere Kontroll-miRNA-TS ersetzt und

überprüft werden bzw. es sollten die Spacer zwischen den miRNA-39TS Kopien verändert werden, um

potentielle Bindesequenzen anderer miRNAs ausschließen zu können.

Literaturverzeichnis

114

Literaturverzeichnis

1. Dalldorf G, Sickles GM. An unidentified, filtrable agent isolated from the feces of children

with paralysis. Science (80- ). 1948;108(2794):61-62.

https://doi.org/doi:10.1126/science.108.2794.61.

2. Melnick JL. My role in the discovery and classification of the enteroviruses. Annu Rev Microbiol.

1996. https://doi.org/doi:10.1146/annurev.micro.50.1.1

3. Gifford R, Dalldorf G. The Morbid Anatomy of Experimental Coxsackie Virus Infection. Am J

Pathol. 1951;27(6):1047-1063. PMC1937323.

4. Garmaroudi FS, Marchant D, Hendry R, et al. Coxsackievirus B3 replication and pathogenesis.

Future Microbiol. 2015;10(4):629-653. https://doi.org/doi:10.2217/Fmb.15.5.

5. Melnick JL, Kaplan AS, Zabin E, Contreras G, Larkum NW. An epidemic of paralytic

poliomyelitis characterized by dual infections with poliomyelitis and Coxsackie viruses. J Exp

Med. 1951;94(6):471-492. https://doi.org/doi:10.1084/jem.94.6.471.

6. Hall CB, Miller DG. The detection of a silent coxsackie B-5 virus perinatal infection. J Pediatr.

1969;75(1):124-127. https://doi.org/doi:10.1016/S0022-3476(69)80112-5.

7. Jenista JA, Powell KR, Menegus MA. Epidemiology of neonatal enterovirus infection. J Pediatr.

1984;104(5):685-690. https://doi.org/doi:10.1016/S0022-3476(84)80944-0.

8. Cooper J. Myocarditis: From Bench to Bedside. Springer Science & Business Media; 2002.

9. Kandolf R. [Virus etiology of inflammatory cardiomyopathy]. Dtsch Med Wochenschr. 2004.

https://doi.org/doi:10.1055/s-2004-831863.

10. Whitton JL, Cornell CT, Feuer R. Host and virus determinants of picornavirus pathogenesis and

tropism. Nat Rev Microbiol. 2005;3(10):765-776. https://doi.org/doi:10.1038/nrmicro1284.

11. Jang SK, Kräusslich HG, Nicklin MJ, Duke GM, Palmenberg AC, Wimmer E. A segment of the

5’ nontranslated region of encephalomyocarditis virus RNA directs internal entry of ribosomes

during in vitro translation. J Virol. 1988. https://doi.org/doi:10.1196/annals.1307.020.

12. Zell R, Delwart E, Gorbalenya AE, et al. ICTV virus taxonomy profile: Picornaviridae. J Gen

Virol. 2017;98(10):2421-2422. https://doi.org/doi:10.1099/jgv.0.000911.

13. Melnick JL. Enteroviruses: Polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses, and newer

enteroviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Channock RM, Melnick JL, Monath TP,

RoizmanB, Straus SE. Fields virology. Fields Virol. 1996.

14. Pallansch MA, Oberste MS, Whitton JL. Chapter 17 Enteroviruses : Polioviruses ,

Coxsackieviruses , Echoviruses, and Newer Enteroviruses. Fields Virol 6th Ed. 2013.

15. Rossmann MG, He Y, Kuhn RJ. Picornavirus-receptor interactions. Trends Microbiol.

2002;10(7):324-331. https://doi.org/doi:10.1016/S0966-842X(02)02383-1.

Literaturverzeichnis

115

16. Bergelson JM, Cunningham JA, Droguett G, et al. Isolation of a common receptor for

coxsackie B viruses and adenoviruses 2 and 5. Science (80- ). 1997.

https://doi.org/doi:10.1126/science.275.5304.1320.

17. Muckelbauer JK, Kremer M, Minor I, et al. The structure of coxsackievirus B3 at 3.5 å resolution.

Structure. 1995;3(7):653-667. https://doi.org/doi:10.1016/S0969-2126(01)00201-5.

18. He Y, Chipman PR, Howitt J, et al. Interaction of coxsackievirus B3 with the full length

coxsackievirus-adenovirus receptor. Nat Struct Biol. 2001. https://doi.org/doi:10.1038/nsb1001-

874.

19. Jiang P, Liu Y, Ma H-C, Paul A V., Wimmer E. Picornavirus Morphogenesis. Microbiol Mol

Biol Rev. 2014;78(3):418-437. https://doi.org/doi:10.1128/MMBR.00012-14.

20. Rossmann MG, Arnold E, Erickson JW, et al. Structure of a human common cold virus and

functional relationship to other picornaviruses. Nature. 1985;317(6033):145-153.

https://doi.org/doi:10.1038/317145a0.

21. Wimmer E. Genome-linked proteins of viruses. Cell. 1982. https://doi.org/doi:10.1016/0092-

8674(82)90335-X.

22. Rueckert RR. Picornaviruses and their replication. Fields BN al, eds Fields Virol 2nd Ed Raven

Press New York. 1990:507-548.

23. Modrow, Falke D, Truyen U, Schätzl H. Viren mit einzelsträngigem, segmentierten RNA-

Genom in Negativstrangorientierung. In: Molekulare Virologie. ; 2010.

https://doi.org/doi:10.1007/978-3-8274-2241-5.

24. Hellen CUT, Sarnow P. Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes

Dev. 2001;15(13):1593-1612. https://doi.org/doi:10.1101/gad.891101.

25. Pelletier J, Sonenberg N. Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a

sequence derived from poliovirus RNA. Nature. 1988. https://doi.org/doi:10.1038/334320a0.

26. Jang SK, Pestova T V., Hellen CUT, Witherell GW, Wimmer E. Cap-independent translation of

picornavirus RNAs: Structure and function of the internal ribosomal entry site. Enzyme. 1990.

https://doi.org/doi:10.1159/000468766.

27. Jackson RJ, Howell MT, Kaminski A. The novel mechanism of initiation of picornavirus RNA

translation. Trends Biochem Sci. 1990. https://doi.org/doi:10.1016/0968-0004(90)90302-R.

28. Vogt DA, Andino R. An RNA element at the 5′-end of the poliovirus genome functions as a

general promoter for RNA synthesis. PLoS Pathog. 2010.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1000936.

29. Herold J, Andino R. Poliovirus RNA replication requires genome circularization through a

protein-protein bridge. Mol Cell. 2001. https://doi.org/doi:10.1016/S1097-2765(01)00205-2.

30. Andino R, Rieckhof GE, Baltimore D. A functional ribonucleoprotein complex forms around the

5′ end of poliovirus RNA. Cell. 1990. https://doi.org/doi:10.1016/0092-8674(90)90170-J.

Literaturverzeichnis

116

31. Parsley TB, Towner JS, Blyn LB, Ehrenfeld E, Semler BL. Poly (rC) binding protein 2 forms a

ternary complex with the 5’-terminal sequences of poliovirus RNA and the viral 3CD proteinase.

RNA. 1997. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.74.22.10359-10370.2000.

32. Price BD, Rueckert RR, Ahlouist P. Complete replication of an animal virus and maintenance of

expression vectors derived from it in Saccharomyces cerevisiae. Proc Natl Acad Sci. 1996.

https://doi.org/doi:10.1073/pnas.93.18.9465.

33. Hogle J, Chow M, Filman D. Three-dimensional structure of poliovirus at 2.9 A resolution.

Science (80- ). 1985;229(4720):1358-1365. https://doi.org/doi:10.1126/science.2994218.

34. Kelly EJ, Hadac EM, Cullen BR, Russell SJ. MicroRNA antagonism of the picornaviral life

cycle: Alternative mechanisms of interference. PLoS Pathog. 2010;6(3).

https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1000820.

35. Tomko RP, Xu R, Philipson L. HCAR and MCAR: The human and mouse cellular receptors for

subgroup C adenoviruses and group B coxsackieviruses. Proc Natl Acad Sci. 1997.

https://doi.org/doi:10.1073/pnas.94.7.3352.

36. Carson SD, Chapman NN, Tracy SM. Purification of the putative coxsackievirus B receptor from

HeLa cells. Biochem Biophys Res Commun. 1997. https://doi.org/doi:10.1006/bbrc.1997.6449.

37. Bergelson JM, Krithivas A, Celi L, et al. The murine CAR homolog is a receptor for coxsackie

B viruses and adenoviruses. J Virol. 1998.

38. Patel KP, Coyne CB, Bergelson JM. Dynamin- and Lipid Raft-Dependent Entry of Decay-

Accelerating Factor (DAF)-Binding and Non-DAF-Binding Coxsackieviruses into Nonpolarized

Cells. J Virol. 2009. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.01016-09.

39. Milstone AM, Petrella J, Sanchez MD, Mahmud M, Whitbeck JC, Bergelson JM. Interaction

with coxsackievirus and adenovirus receptor, but not with decay-accelerating factor (DAF),

induces A-particle formation in a DAF-binding coxsackievirus B3 isolate. J Virol.

2005;79(1):655-660. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.79.1.655-660.2005.

40. Bergelson JM, Mohanty JG, Crowell RL, St John NF, Lublin DM, Finberg RW. Coxsackievirus

B3 adapted to growth in RD cells binds to decay-accelerating factor (CD55). J Virol.

1995;69(3):1903-1906. PMC188804

41. Shafren DR, Dorahy DJ, Ingham RA, Burns GF, Barry RD. Coxsackievirus A21 binds to decay-

accelerating factor but requires intercellular adhesion molecule 1 for cell entry. J Virol. 1997.

PMC191695

42. Shieh JTC, Bergelson JM. Interaction with decay-accelerating factor facilitates coxsackievirus

B infection of polarized epithelial cells. J Virol. 2002;76(18):9474-9480.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.76.18.9474-9480.2002.

43. Nicholson-Weller A, Wang CE. Structure and function of decay accelerating factor CD55. J Lab

Clin Med. 1994. https://doi.org/doi:10.1096/fj.14-264796.

Literaturverzeichnis

117

44. Coyne CB, Bergelson JM. Virus-induced Abl and Fyn kinase signals permit coxsackievirus entry

through epithelial tight junctions. Cell. 2006;124(1):119-131.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2005.10.035.

45. Carson SD, Chapman NM, Hafenstein S, Tracy S. Variations of Coxsackievirus B3 Capsid

Primary Structure, Ligands, and Stability Are Selected for in a Coxsackievirus and Adenovirus

Receptor-Limited Environment. J Virol. 2011;85(7):3306-3314.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.01827-10.

46. van der Linden L, Wolthers KC, van Kuppeveld FJM. Replication and inhibitors of enteroviruses

and parechoviruses. Viruses. 2015. https://doi.org/doi:10.3390/v7082832.

47. Adams P, Kandiah E, Effantin G, Steven AC, Ehrenfeld E. Poliovirus 2C protein forms homo-

oligomeric structures required for ATPase activity. J Biol Chem. 2009.

https://doi.org/doi:10.1074/jbc.M109.031807.

48. Leong LE-C, Cornell CT, Semler BL. Processing Determinants and Functions of Cleavage

Products of Picornavirus Polyproteins. In: Molecular Biology of Picornavirus. ; 2002.

https://doi.org/doi:10.1128/9781555817916.ch16.

49. Xiang W, Cuconati a, Hope D, Kirkegaard K, Wimmer E. Complete protein linkage map of

poliovirus P3 proteins: interaction of polymerase 3Dpol with VPg and with genetic variants of

3AB. J Virol. 1998;72(8):6732-6741.

50. Cathcart AL, Baggs EL, Semler BL. Picornaviruses: Pathogenesis and Molecular Biology. In:

Reference Module in Biomedical Sciences. ; 2015. https://doi.org/doi:10.1016/B978-0-12-

801238-3.00272-5.

51. Hohenadl C, Klingel K, Mertsching J, Hofschneider PH, Kandolf R. Strand-specific detection of

enteroviral RNA in myocardial tissue by in situ hybridization. Mol Cell Probes. 1991.

https://doi.org/doi:10.1016/0890-8508(91)90033-G.

52. Paul A V., Van Boom JH, Filippov D, Wimmer E. Protein-primed RNA synthesis by purified

poliovirus RNA polymerase. Nature. 1998;393(6682):280-284. doi:10.1038/30529.

53. Wells VR, Plotch SJ, DeStefano JJ. Determination of the mutation rate of poliovirus RNA-

dependent RNA polymerase. Virus Res. 2001. https://doi.org/doi:10.1016/S0168-

1702(00)00256-2.

54. Richardson SJ, Leete P, Bone AJ, Foulis AK, Morgan NG. Expression of the enteroviral capsid

protein VP1 in the islet cells of patients with type 1 diabetes is associated with induction of

protein kinase R and downregulation of Mcl-1. Diabetologia. 2013.

https://doi.org/doi:10.1007/s00125-012-2745-4.

55. Hayashi-Nishino M, Fujita N, Noda T, Yamaguchi A, Yoshimori T, Yamamoto A. A subdomain

of the endoplasmic reticulum forms a cradle for autophagosome formation. Nat Cell Biol. 2009.

https://doi.org/doi:10.1038/ncb1991.

Literaturverzeichnis

118

56. Van der Vaart A, Griffith J, Reggiori F. Exit from the Golgi Is Required for the Expansion of the

Autophagosomal Phagophore in Yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 2010.

https://doi.org/doi:10.1091/mbc.E09-04-0345.

57. Hailey DW, Rambold AS, Satpute-Krishnan P, et al. Mitochondria Supply Membranes for

Autophagosome Biogenesis during Starvation. Cell. 2010.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2010.04.009.

58. Berg TO, Fengsrud M, Strømhaug PE, Berg T, Seglen PO. Isolation and characterization of rat

liver amphisomes: Evidence for fusion of autophagosomes with both early and late endosomes.

J Biol Chem. 1998. https://doi.org/doi:10.1074/jbc.273.34.21883.

59. Deretic V, Levine B. Autophagy, Immunity, and Microbial Adaptations. Cell Host Microbe.

2009. https://doi.org/doi:10.1016/j.chom.2009.05.016.

60. Delorme-Axford E, Morosky S, Bomberger J, Stolz DB, Jackson WT, Coyne CB. BPIFB3

regulates autophagy and coxsackievirus B replication through a noncanonical pathway

independent of the core initiation machinery. MBio. 2014.

https://doi.org/doi:10.1128/mBio.02147-14.

61. Wong J, Zhang J, Si X, et al. Autophagosome Supports Coxsackievirus B3 Replication in Host

Cells. J Virol. 2008. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.00641-08.

62. Alirezaei M, Flynn CT, Wood MR, Whitton JL. Pancreatic acinar cell-specific autophagy

disruption reduces coxsackievirus replication and pathogenesis in vivo. Cell Host Microbe. 2012.

https://doi.org/doi:10.1016/j.chom.2012.01.014.

63. Jackson WT, Giddings TH, Taylor MP, et al. Subversion of cellular autophagosomal machinery

by RNA viruses. PLoS Biol. 2005. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pbio.0030156.

64. Itakura E, Kishi-Itakura C, Mizushima N. The hairpin-type tail-anchored SNARE syntaxin 17

targets to autophagosomes for fusion with endosomes/lysosomes. Cell. 2012.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2012.11.001.

65. McManus BM, Chow LH, Wilson JE, et al. Direct myocardial injury by enterovirus: A central

role in the evolution of murine myocarditis. Clin Immunol Immunopathol. 1993.

https://doi.org/doi:10.1006/clin.1993.1113.

66. Bodian D. Histopathologic basis of clinical findings in poliomyelitis. Am J Med. 1949.

https://doi.org/doi:10.1016/0002-9343(49)90130-8.

67. Muehlenbachs A, Bhatnagar J, Zaki SR. Tissue tropism, pathology and pathogenesis of

enterovirus infection†. J Pathol. 2015. https://doi.org/doi:10.1002/path.4438.

68. Modlin JF, Onorato IM, McBean AM, et al. The Humoral Immune Response to Type 1 Oral

Poliovirus Vaccine in Children Previously Immunized With Enhanced Potency Inactivated

Poliovirus Vaccine or Live Oral Poliovirus Vaccine. Am J Dis Child. 1990.

https://doi.org/doi:10.1001/archpedi.1990.02150280102022.

Literaturverzeichnis

119

69. Olsen EGJ. What is myocarditis? Heart Vessels. 1985;1(1):1-3.

https://doi.org/doi:10.1007/BF02072348.

70. Martino TA, Liu P, Sole MJ. Viral infection and the pathogenesis of dilated cardiomyopathy.

Circ Res. 1994.

71. Beck MA, Levander OA, Handy J. Selenium deficiency and viral infection. J Nutr. 2003.

https://doi.org/doi:10.1093/jn/133.5.1463S.

72. Lyden DC, Olszewski J, Feran M, Job LP, Huber SA. Coxsackievirus B-3-induced myocarditis.

Effect of sex steroids on viremia and infectivity of cardiocytes. Am J Pathol. 1987.

PMC1899641.

73. Huber SA, Job LP, Woodruff JF. Sex-related differences in the pattern of coxsackievirus B-3-

induced immune spleen cell cytotoxicity against virus-infected myofibers. Infect Immun. 1981.

PMC350588.

74. Huber SA, Pfaeffle B. Differential Th1 and Th2 cell responses in male and female BALB/c mice

infected with coxsackievirus group B type 3. J Virol. 1994. PMC236456.

75. Grodums EI, Dempster G. Myocarditis in experimental Coxsackie B-3 infection. Can J

Microbiol. 1959;5:605-615. PMC236456.

76. Mahrholdt H, Wagner A, Deluigi CC, et al. Presentation, patterns of myocardial damage, and

clinical course of viral myocarditis. Circulation. 2006.

https://doi.org/doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.105.606509.

77. Mason JW, O’Connell JB, Herskowitz A, et al. A clinical trial of immunosuppressive therapy

for myocarditis. The Myocarditis Treatment Trial Investigators. N Engl J Med. 1995.

https://doi.org/doi:10.1056/NEJM199508033330501.

78. Hufnagel G, Pankuweit S, Maisch B. Therapie der dilatativen Kardiomyopathie mit und ohne

Entzündung. Med Klin. 1998;93(4):240-251. https://doi.org/doi:10.1007/BF03044800.

79. Kytö V, Sipilä J, Rautava P. The effects of gender and age on occurrence of clinically suspected

myocarditis in adulthood. Heart. 2013. https://doi.org/doi:10.1136/heartjnl-2013-304449.

80. Fairweather DL, Cooper LT, Blauwet LA. Sex and Gender Differences in Myocarditis and

Dilated Cardiomyopathy. Curr Probl Cardiol. 2013.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cpcardiol.2012.07.003.

81. G.W. Dec, I.F. Palacios, J.T. Fallon et al. Active myocarditis in the spectrum of acute dilated

cardiomyopathies. N Engl J Med. 1985. https://doi.org/doi:10.1056/NEJM198504043121404.

82. Kim KS, Hufnagel G, Chapman NM, Tracy S. The group B coxsackieviruses and myocarditis.

Rev Med Virol. 2001. https://doi.org/doi:10.1002/rmv.326.

83. Schultheiss H-P, Kühl U, Cooper LT, et al. The management of myocarditis. Eur Heart J. 2011.

https://doi.org/doi:10.1093/eurheartj/ehr165.

Literaturverzeichnis

120

84. Manolio TA, Baughman KL, Rodeheffer R, et al. Prevalence and etiology of idiopathic dilated

cardiomyopathy (summary of a National Heart, Lung, and Blood Institute Workshop). Am J

Cardiol. 1992. https://doi.org/doi:10.1016/0002-9149(92)90901-A.

85. GBD 2013 Mortality and Causes of Death Collaborators. Global , regional and national levels of

age-specific mortality and 240 causes of death , 1990-2013 : A systematic analysis for the Global

Burden of Disease Study 2013. Lancet. 2015. https://doi.org/doi:10.1016/S0140-

6736(14)61682-2.

86. Baboonian C, Treasure T. Meta-analysis of the association of enteroviruses with human heart

disease. Heart. 1997;78(6):539-543. PMC1892342.

87. Pauschinger M, Bowles NE, Fuentes-Garcia FJ, et al. Detection of adenoviral genome in the

myocardium of adult patients with idiopathic left ventricular dysfunction. Circulation. 1999.

https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.99.10.1348.

88. Matsumori A, Matoba Y, Sasayama S. Dilated cardiomyopathy associated with hepatitis C virus

infection. Circulation. 1995. https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.92.9.2519.

89. Maze SS, Adolph RJ. Myocarditis: Unresolved issues in diagnosis and treatment. Clin Cardiol.

1990. https://doi.org/doi:10.1002/clc.4960130203.

90. Strikas RA, Anderson LJ, Parker RA. Temporal and geographic patterns of isolates of nonpolio

enterovirus in the united states, 1970-1983. J Infect Dis. 1986.

https://doi.org/doi:10.1093/infdis/153.2.346.

91. Bodian D. Emerging concept of poliomyelitis infection. Science (80- ). 1955.

https://doi.org/doi:10.1126/science.122.3159.105.

92. Horstmann DM, Mccollum RW, Mascola AD. Viremia in Human Poliomyelitis. J Exp Med.

1954. https://doi.org/doi:10.1084/jem.99.4.355.

93. Chow LH, Gauntt CJ, McManus BM. Differential effects of myocarditic variants of

Coxsackievirus B3 in inbred mice. A pathologic characterization of heart tissue damage. Lab

Invest. 1991. PMID1990209.

94. Woodruff JF. Viral myocarditis. A review. Am J Pathol. 1980. PMC1903609.

95. Tracy S, Höfling K, Pirruccello S, Lane PH, Reyna SM, Gauntt CJ. Group B coxsackievirus

myocarditis and pancreatitis: Connection between viral virulence phenotypes in mice. J Med

Virol. 2000. https://doi.org/doi:10.1002/1096-9071(200009)62:1<70::AID-JMV11>3.0.CO;2-

96. Klingel K, Stephan S, Sauter M, et al. Pathogenesis of murine enterovirus myocarditis: virus

dissemination and immune cell targets. J Virol. 1996. PMC190986.

97. Melnick JL. Enteroviruses: Polioviruses, coxsackieviruses, echoviruses, and newer

enteroviruses. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM, Channock RM, Melnick JL, Monath TP,

RoizmanB, Straus SE. Fields virology. Fields Virol. 1996:655–712.

Literaturverzeichnis

121

98. Xatzipsalti M, Kyrana S, Tsolia M, et al. Rhinovirus viremia in children with respiratory

infections. Am J Respir Crit Care Med. 2005. https://doi.org/doi:10.1164/rccm.200502-315OC.

99. Cheng H-Y, Huang Y-C, Yen T-Y, et al. The correlation between the presence of viremia and

clinical severity in patients with enterovirus 71 infection: a multi-center cohort study. BMC Infect

Dis. 2014. https://doi.org/doi:10.1186/1471-2334-14-417.

100. Kandolf R, Canu A, Hofschneider PH. Coxsackie B3 virus can replicate in cultured human foetal

heart cells and is inhibited by interferon. J Mol Cell Cardiol. 1985.

https://doi.org/doi:10.1016/S0022-2828(85)80019-5.

101. Saraste A, Arola A, Vuorinen T, et al. Cardiomyocyte apoptosis in experimental coxsackievirus

B3 myocarditis. Cardiovasc Pathol. 2003. https://doi.org/doi:10.1016/S1054-8807(03)00077-2.

102. Henke A, Huber S, Stelzner A, Whitton JL. The role of CD8+ T lymphocytes in coxsackievirus

B3-induced myocarditis. J Virol. 1995. PMC189582.

103. Nishio R, Matsumori A, Shioi T, Ishida H, Sasayama S. Treatment of experimental viral

myocarditis with interleukin-10. Circulation. 1999.

https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.100.10.1102.

104. Woodruff JF, Woodruff JJ. Involvement of T lymphocytes in the pathogenesis of coxsackie virus

B3 heart disease. J Immunol (Baltimore, Md 1950). 1974;113(6):1726-1734. PMID4610045.

105. Wolff PG, Kühl U, Schultheiss HP. Laminin distribution and autoantibodies to laminin in dilated

cardiomyopathy and myocarditis. Am Heart J. 1989. https://doi.org/doi:10.1016/0002-

8703(89)90410-9.

106. Caforio ALP, Calabrese F, Angelini A, et al. A prospective study of biopsy-proven myocarditis:

Prognostic relevance of clinical and aetiopathogenetic features at diagnosis. Eur Heart J. 2007.

https://doi.org/doi:10.1093/eurheartj/ehm076.

107. Takata S, Nakamura H, Umemoto S, et al. Identification of autoantibodies with the

corresponding antigen for repetitive coxsackievirus infection-induced cardiomyopathy. Circ J.

2004. https://doi.org/doi:10.1253/circj.68.677.

108. Fairweather DL, Rose NR. Coxsackievirus-induced myocarditis in mice: A model of

autoimmune disease for studying immunotoxicity. Methods. 2007.

https://doi.org/doi:10.1016/j.ymeth.2006.07.009.

109. Esfandiarei M, McManus BM. Molecular biology and pathogenesis of viral myocarditis. Annu

Rev Pathol. 2008. https://doi.org/doi:10.1146/annurev.pathmechdis.3.121806.151534.

110. Vuorinen T, Kallajoki M, Hyypiä T, Vainionpää R. Coxsackievirus B3-induced acute

pancreatitis: analysis of histopathological and viral parameters in a mouse model. Br J Exp

Pathol. 1989. PMC2040566.

111. Ramsingh AI. Coxsackieviruses and pancreatitis. Front Biosci. 1997.

https://doi.org/doi:10.2741/A227.

Literaturverzeichnis

122

112. Gauntt CJ, Godeny EK, Lutton CW. Host factors regulating viral clearance. Pathol

Immunopathol Res. 1988. https://doi.org/doi:10.1159/000157121.

113. Huber SA, Lodge PA. Coxsackievirus B-3 myocarditis. Identification of different pathogenic

mechanisms in DBA/2 and Balb/c mice. Am J Pathol. 1986. PMC1888112.

114. Fairweather D, Stafford KA, Sung YK. Update on coxsackievirus B3 myocarditis. Curr Opin

Rheumatol. 2012. https://doi.org/doi:10.1097/BOR.0b013e328353372d.

115. Schmidtke M, Merkle I, Klingel K, Hammerschmidt E, Zautner AE, Wutzler P. The viral genetic

background determines the outcome of coxsackievirus B3 infection in outbred NMRI mice. J

Med Virol. 2007. https://doi.org/doi:10.1002/jmv.20933.

116. Arnesjo B, Eden T, Ihse I, Nordenfelt E, Ursing B. Enterovirus infections in acute pancreatitis -

a possible etiological connection. Scand J Gastroenterol. 1976. PMID996429.

117. Foulis AK, Farquharson MA, Cameron SO, McGill M, Schönke H, Kandolf R. A search for the

presence of the enteroviral capsid protein VP1 in pancreases of patients with Type 1 (insulin-

dependent) diabetes and pancreases and hearts of infants who died of coxsackieviral myocarditis.

Diabetologia. 1990. https://doi.org/doi:10.1007/BF00403323.

118. Leipner C, Grün K, Schneider I, Glück B, Sigusch HH, Stelzner A. Coxackievirus B3-induced

myocarditis: Differences in the immune response of C57BL/6 and Balb/c mice. Med Microbiol

Immunol. 2004. https://doi.org/doi:10.1007/s00430-003-0199-5.

119. Li M, Wang X, Xie Y, et al. Initial weight and virus dose: Two factors affecting the onset of

acute coxsackievirus B3 myocarditis in C57BL/6 mouse - A histopathology-based study.

Cardiovasc Pathol. 2013;22(1):96-101. https://doi.org/doi:10.1016/j.carpath.2012.06.004.

120. Koenig A, Buskiewicz I, Huber SA. Age-associated changes in estrogen receptor ratios correlate

with increased female susceptibility to coxsackievirus B3-induced myocarditis. Front Immunol.

2017;8(NOV). https://doi.org/doi:10.3389/fimmu.2017.01585.

121. Kandolf R, Sauter M, Aepinus C, Schnorr JJ, Selinka HC, Klingel K. Mechanisms and

consequences of enterovirus persistence in cardiac myocytes and cells of the immune system.

Virus Res. 1999. https://doi.org/doi:10.1016/S0168-1702(99)00041-6.

122. Klingel K, McManus BM, Kandolf R. Enterovirus-infected immune cells of spleen and lymph

nodes in the murine model of chronic myocarditis: a role in pathogenesis? Eur Heart J. 1995.

https://doi.org/doi:10.1093/eurheartj/16.suppl_O.42.

123. Liu J, Xu C, Hsu LC, Luo Y, Xiang R, Chuang TH. A five-amino-acid motif in the undefined

region of the TLR8 ectodomain is required for species-specific ligand recognition. Mol Immunol.

2010. https://doi.org/doi:10.1016/j.molimm.2009.11.003.

124. Yajima T. Viral myocarditis: Potential defense mechanisms within the cardiomyocyte against

virus infection. Future Microbiol. 2011. https://doi.org/doi:10.2217/fmb.11.40.

Literaturverzeichnis

123

125. Glück B, Schmidtke M, Merkle I, Stelzner A, Gemsa D. Persistent expression of cytokines in the

chronic stage of CVB3-induced myocarditis in NMRI mice. J Mol Cell Cardiol. 2001.

https://doi.org/doi:10.1006/jmcc.2001.1416.

126. Shioi T, Matsumori A, Sasayama S. Persistent expression of cytokine in the chronic stage of viral

myocarditis in mice. Circulation. 1996;94(11):2930-2937.

https://doi.org/10.1161/01.CIR.94.11.2930

127. Kawai C. From myocarditis to cardiomyopathy: Mechanisms of inflammation and cell death:

Learning from the past for the future. Circulation. 1999.

https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.99.8.1091.

128. Mena I, Perry CM, Harkins S, Rodriguez F, Gebhard J, Whitton JL. The role of B lymphocytes

in coxsackievirus B3 infection. Am J Pathol. 1999. https://doi.org/doi:10.1016/S0002-

9440(10)65223-6.

129. Takeuchi O, Akira S. Review-Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 2010.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2010.01.022.

130. Crozat K, Hoebe K, Ugolini S, et al. Jinx , an MCMV susceptibility phenotype caused by

disruption of Unc13d : a mouse model of type 3 familial hemophagocytic lymphohistiocytosis.

J Exp Med. 2007. https://doi.org/doi:10.1084/jem.20062447.

131. Alexopoulou L, Holt AC, Medzhitov R, Flavell RA. Recognition of double-stranded RNA and

activation of NF-κB by Toll-like receptor 3. Nature. 2001. https://doi.org/doi:10.1038/35099560.

132. Hemmi H, Takeuchi O, Kawai T, et al. A Toll-like receptor recognizes bacterial DNA. Nature.

2000. https://doi.org/doi:10.1038/35047123.

133. Pestka S, Langer JA, Zoon KC, Samuel CE. Interferons and their Actions. Annu Rev Biochem.

1987. https://doi.org/doi:10.1146/annurev.bi.56.070187.003455.

134. Roberts RM, Liu L, Guo Q, Leaman D, Bixby J. The evolution of the type I interferons. J Interf

Cytokine Res Off J Int Soc Interf Cytokine Res. 1998;18(10):805-816.

https://doi.org/doi:10.1089/jir.1998.18.805.

135. Kühl U, Pauschinger M, Schwimmbeck PL, et al. Interferon-?? treatment eliminates cardiotropic

viruses and improves left ventricular function in patients with myocardial persistence of viral

genomes and left ventricular dysfunction. Circulation. 2003.

https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.0000072766.67150.51.

136. Wessely R, Klingel K, Knowlton KU, Kandolf R. Cardioselective infection with coxsackievirus

B3 requires intact type I interferon signaling: Implications for mortality and early viral

replication. Circulation. 2001. https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.103.5.756.

137. Deonarain R, Cerullo D, Fuse K, Liu PP, Fish EN. Protective role for interferon-beta in

coxsackievirus B3 infection. Circulation. 2004.

https://doi.org/doi:10.1161/01.CIR.0000136824.73458.20.

Literaturverzeichnis

124

138. Jensen S, Thomsen AR. Sensing of RNA Viruses: a Review of Innate Immune Receptors

Involved in Recognizing RNA Virus Invasion. J Virol. 2012.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.05738-11.

139. Liu S, Cai X, Wu J, et al. Phosphorylation of innate immune adaptor proteins MAVS, STING,

and TRIF induces IRF3 activation. Science (80- ). 2015.

https://doi.org/doi:10.1126/science.aaa2630.

140. Honda K, Takaoka A, Taniguchi T. Type I Inteferon Gene Induction by the Interferon Regulatory

Factor Family of Transcription Factors. Immunity. 2006.

https://doi.org/doi:10.1016/j.immuni.2006.08.009.

141. Platanias LC. Mechanisms of type-I- and type-II-interferon-mediated signalling. Nat Rev

Immunol. 2005. https://doi.org/doi:10.1038/nri1604.

142. Wang JP, Cerny A, Asher DR, Kurt-Jones EA, Bronson RT, Finberg RW. MDA5 and MAVS

Mediate Type I Interferon Responses to Coxsackie B Virus. J Virol. 2010.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.00631-09.

143. Negishi H, Osawa T, Ogami K, et al. A critical link between Toll-like receptor 3 and type II

interferon signaling pathways in antiviral innate immunity. Proc Natl Acad Sci U S A. 2008.

https://doi.org/doi:10.1073/pnas.0810372105.

144. Mukherjee A, Morosky SA, Delorme-Axford E, et al. The coxsackievirus B 3Cproprotease

cleaves MAVS and TRIF to attenuate host type I interferon and apoptotic signaling. PLoS

Pathog. 2011. https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1001311.

145. Triantafilou K, Orthopoulos G, Vakakis E, et al. Human cardiac inflammatory responses

triggered by Coxsackie B viruses are mainly Toll-like receptor (TLR) 8-dependent. Cell

Microbiol. 2005. https://doi.org/doi:10.1111/j.1462-5822.2005.00537.x.

146. Wang JP, Asher DR, Chan M, Kurt-Jones EA, Finberg RW. Cutting Edge: Antibody-Mediated

TLR7-Dependent Recognition of Viral RNA. J Immunol. 2007.

https://doi.org/doi:10.4049/jimmunol.178.6.3363.

147. Kemball CC, Alirezaei M, Whitton JL. Type B coxsackieviruses and their interactions with the

innate and adaptive immune systems. Future Microbiol. 2010.

https://doi.org/doi:10.2217/fmb.10.101.

148. Richer MJ, Lavallée DJ, Shanina I, Horwitz MS. Toll-like receptor 3 signalling on macrophages

is required for survival following coxsackievirus B4 infection. PLoS One. 2009.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0004127.

149. Gorbea C, Makar KA, Pauschinger M, et al. A role for toll-like receptor 3 variants in host

susceptibility to enteroviral myocarditis and dilated cardiomyopathy. J Biol Chem. 2010.

https://doi.org/doi:10.1074/jbc.M109.047464.

150. Godeny EK, Gauntt CJ. Murine natural killer cells limit coxsackievirus B3 replication. J

Immunol. 1987. PMID3036947.

Literaturverzeichnis

125

151. Huber SA, Job LP. Cellular immune mechanisms in Coxsackievirus group B, type 3 induced

myocarditis in Balb/C mice. Adv Exp Med Biol. 1983. PMID6307010.

152. Barin JG, Rose NR, Čiháková D. Macrophage diversity in cardiac inflammation: A review.

Immunobiology. 2012. https://doi.org/doi:10.1016/j.imbio.2011.06.009.

153. Gauntt CJ, Godeny EK, Lutton CW, Fernandes G. Role of natural killer cells in experimental

murine myocarditis. Springer Semin Immunopathol. 1989;11(1):51-59.

https://doi.org/doi:10.1007/BF00197084.

154. Henke A, Spengler HP, Stelzner A, Nain M, Gemsa D. Lipopolysaccharide suppresses cytokine

release from coxsackie virus-infected human monocytes. Res Immunol. 1992.

https://doi.org/doi:10.1016/0923-2494(92)80081-U.

155. Henke A, Mohr C, Sprenger H, et al. Coxsackievirus B3-induced production of tumor necrosis

factor-alpha, IL-1 beta, and IL-6 in human monocytes. J Immunol (Baltimore, Md 1950).

1992;148(7):2270-2277. PMID1312105.

156. Poffenberger MC, Straka N, El Warry N, Fang D, Shanina I, Horwitz MS. Lack of IL-6 during

coxsackievirus infection heightens the early immune response resulting in increased severity of

chronic autoimmune myocarditis. PLoS One. 2009.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0006207.

157. Bonilla FA, Oettgen HC. Adaptive immunity. J Allergy Clin Immunol. 2010.

https://doi.org/doi:10.1016/j.jaci.2009.09.017.

158. Wucherpfennig KW, Gagnon E, Call MJ, Huseby ES, Call ME. Structural biology of the T-cell

receptor: insights into receptor assembly, ligand recognition, and initiation of signaling. Cold

Spring Harb Perspect Biol. 2010. https://doi.org/doi:10.1101/cshperspect.a005140.

159. Dorries R, Ter Meulen V. Specificity of IgM antibodies in acute human coxsackievirus B

infections, analysed by indirect solid phase enzyme immunoassay and immunoblot technique. J

Gen Virol. 1983. https://doi.org/doi:10.1099/0022-1317-64-1-159.

160. Lodge PA, Herzum M, Olszewski J, Huber SA. Coxsackievirus B-3 myocarditis. Acute and

chronic forms of the disease caused by different immunopathogenic mechanisms. Am J Pathol.

1987. PMC1899672.

161. Sauter P, Hober D. Mechanisms and results of the antibody-dependent enhancement of

viral infections and role in the pathogenesis of coxsackievirus B-induced diseases. Microbes

Infect. 2009. https://doi.org/doi:10.1016/j.micinf.2009.01.005.

162. Leipner C, Borchers M, Merkle I, Stelzner A. Coxsackievirus B3-induced myocarditis in MHC

class II-deficient mice. J Hum Virol. 1999. PMID10225212.

163. Hashimoto I, Komatsu T. Myocardial changes after infection with Coxsackie virus B3 in nude

mice. Br J Exp Pathol. 1978. PMC2041316.

164. Huber S a, Pfaeffle B. Differential Th1 and Th2 cell responses in male and female BALB/c mice

infected with coxsackievirus group B type 3. J Virol. 1994. PMC236456.

Literaturverzeichnis

126

165. Jarasch N, Martin U, Zell R, Wutzler P, Henke A. Influence of pan-caspase inhibitors on

coxsackievirus B3-infected CD19 + B lymphocytes. Apoptosis. 2007.

https://doi.org/doi:10.1007/s10495-007-0084-6.

166. Geller TJ, Condie D. A case of protracted coxsackie virus meningoencephalitis in a marginally

immunodeficient child treated successfully with intravenous immunoglobulin. J Neurol Sci.

1995. https://doi.org/doi:10.1016/0022-510X(94)00261-L.

167. Chow LH, Beisel KW, McManus BM. Enteroviral infection of mice with severe combined

immunodeficiency. Evidence for direct viral pathogenesis of myocardial injury. Lab Invest.

1992. PMID1309927.

168. Sato S, Tsutsumi LR, Burke A, et al. Persistence of replicating coxsackievirus B3 in the athymic

murine heart is associated with development of myocarditic lesions. J Gen Virol. 1994.

https://doi.org/doi:10.1099/0022-1317-75-11-2911.

169. Schnurr DP, Schmidt NJ. Coxsackievirus B3 persistence and myocarditis in NFR nu/nu and +/nu

mice. Med Microbiol Immunol. 1984. https://doi.org/doi:10.1007/BF02123563.

170. Weinzierl AO, Rudolf D, Maurer D, et al. Identification of HLA-A*01- and HLA-A*02-

restricted CD8+ T-cell epitopes shared among group B enteroviruses. J Gen Virol. 2008.

https://doi.org/doi:10.1099/vir.0.2008/000711-0.

171. Jäkel S, Kuckelkorn U, Szalay G, et al. Differential interferon responses enhance viral epitope

generation by myocardial immunoproteasomes in murine enterovirus myocarditis. Am J Pathol.

2009. https://doi.org/doi:10.2353/ajpath.2009.090033.

172. Voigt A, Jäkel S, Textoris-Taube K, et al. Generation of in silico predicted coxsackievirus B3-

derived MHC class i epitopes by proteasomes. Amino Acids. 2010.

https://doi.org/doi:10.1007/s00726-009-0434-5.

173. Kemball CC, Harkins S, Whitmire JK, Flynn CT, Feuer R, Whitton JL. Coxsackievirus B3

inhibits antigen presentation in vivo, exerting a profound and selective effect on the MHC class

I pathway. PLoS Pathog. 2009. https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1000618.

174. Cornell CT, Kiosses WB, Harkins S, Whitton JL. Inhibition of Protein Trafficking by

Coxsackievirus B3: Multiple Viral Proteins Target a Single Organelle. J Virol. 2006.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.02572-05.

175. Wessels E, Duijsings D, Notebaart RA, et al. A proline-rich region in the coxsackievirus 3A

protein is required for the protein to inhibit endoplasmic reticulum-to-golgi transport. J Virol.

2005. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.79.8.5163-5173.2005.

176. Wessels E, Duijsings D, Niu TK, et al. A Viral Protein that Blocks Arf1-Mediated COP-I

Assembly by Inhibiting the Guanine Nucleotide Exchange Factor GBF1. Dev Cell. 2006.

https://doi.org/doi:10.1016/j.devcel.2006.06.005.

Literaturverzeichnis

127

177. Wessels E, Duijsings D, Lanke KHW, et al. Effects of Picornavirus 3A Proteins on Protein

Transport and GBF1-Dependent COP-I Recruitment. J Virol. 2006.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.01225-06.

178. De Jong AS, Visch HJ, De Mattia F, et al. The coxsackievirus 2B protein increases efflux of ions

from the endoplasmic reticulum and Golgi, thereby inhibiting protein trafficking through the

Golgi. J Biol Chem. 2006. https://doi.org/doi:10.1074/jbc.M511766200.

179. de Jong AS, de Mattia F, Van Dommelen MM, et al. Functional Analysis of Picornavirus 2B

Proteins: Effects on Calcium Homeostasis and Intracellular Protein Trafficking. J Virol. 2008.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.02076-07.

180. Kim YJ, Yun SH, Lim BK, et al. Systemic analysis of a novel coxsackievirus gene delivery

system in a mouse model. J Microbiol Biotechnol. 2009.

https://doi.org/doi:10.4014/jmb.0803.237.

181. Tracy S, Oberste MS, Drescher KM. Group B Coxsackieviruses. Springer Science & Business

Media; 2008.

182. Dan M, Chantler JK. A genetically engineered attenuated coxsackievirus B3 strain protects mice

against lethal infection. J Virol. 2005. https://doi.org/doi:10.1128/jvi.79.14.9285-9295.2005.

183. Hunziker IP, Cornell CT, Whitton JL. Deletions within the 5′UTR of coxsackievirus B3:

Consequences for virus translation and replication. Virology. 2007;360(1):120-128.

https://doi.org/doi:10.1016/j.virol.2006.09.041.

184. Lim CS, Chua JJE, Wilkerson J, Chow VTK. Differential dengue cross-reactive and neutralizing

antibody responses in BALB/c and Swiss albino mice induced by immunization with flaviviral

vaccines and by infection with homotypic dengue-2 virus strains. Viral Immunol. 2006;19(1):33-

41. https://doi.org/doi:10.1089/vim.2006.19.33.

185. Yanagawa B, Spiller OB, Proctor DG, et al. Soluble recombinant coxsackievirus and adenovirus

receptor abrogates coxsackievirus B3-mediated pancreatitis and myocarditis in mice. J Infect

Dis. 2004. https://doi.org/doi:10.1086/382598.

186. Galama JMD, Vogels MTE, Jansen GH, Gielen M, Heesen FWA. Antibodies against

enteroviruses in intravenous Ig preparations: Great variation in titres and poor correlation with

the incidence of circulating serotypes. J Med Virol. 1997.

https://doi.org/doi:10.1002/(SICI)1096-9071(199711)53:3<273::AID-JMV16>3.0.CO;2-I.

187. Crotty S, Maag D, Arnold JJ, et al. The broad-spectrum antiviral ribonucleoside ribavirin is an

RNA virus mutagen. Nat Med. 2000. https://doi.org/doi:10.1038/82191.

188. Crotty S, Andino R. Implications of high RNA virus mutation rates: Lethal mutagenesis and the

antiviral drug ribavirin. Microbes Infect. 2002. https://doi.org/doi:10.1016/S1286-

4579(02)00008-4.

Literaturverzeichnis

128

189. Schmidtke M, Hammerschmidt E, Schüler S, et al. Susceptibility of coxsackievirus B3 laboratory

strains and clinical isolates to the capsid function inhibitor pleconaril: Antiviral studies with virus

chimeras demonstrate the crucial role of amino acid 1092 in treatment. J Antimicrob Chemother.

2005. https://doi.org/doi:10.1093/jac/dki263.

190. Strating JRPM, van der Linden L, Albulescu L, et al. Itraconazole inhibits enterovirus replication

by targeting the oxysterol-binding protein. Cell Rep. 2015.

https://doi.org/doi:10.1016/j.celrep.2014.12.054.

191. Yuan J, Cheung PKA, Zhang HM, Chau D, Yang D. Inhibition of coxsackievirus B3 replication

by small interfering RNAs requires perfect sequence match in the central region of the viral

positive strand. J Virol. 2005. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.79.4.2151-2159.2005.

192. Tan EL, Wong APY, Poh CL. Development of potential antiviral strategy against coxsackievirus

B4. Virus Res. 2010. https://doi.org/doi:10.1016/j.virusres.2010.02.017.

193. Werk D, Schubert S, Lindig V, et al. Developing an effective RNA interference strategy against

a plus-strand RNA virus: Silencing of coxsackievirus B3 and its cognate coxsackievirus-

adenovirus receptor. Biol Chem. 2005. https://doi.org/doi:10.1515/BC.2005.100.

194. Sin J, Mangale V, Thienphrapa W, Gottlieb RA, Feuer R. Recent progress in understanding

coxsackievirus replication, dissemination, and pathogsenesis. Virology. 2015.

https://doi.org/doi:10.1016/j.virol.2015.06.006.

195. Janssen HLA, Reesink HW, Lawitz EJ, et al. Treatment of HCV Infection by Targeting

MicroRNA. N Engl J Med. 2013. https://doi.org/doi:10.1056/NEJMoa1209026.

196. Chakraborty C, Sharma AR, Sharma G, Doss CGP, Lee SS. Therapeutic miRNA and siRNA:

Moving from Bench to Clinic as Next Generation Medicine. Mol Ther - Nucleic Acids. 2017.

https://doi.org/doi:10.1016/j.omtn.2017.06.005.

197. Gottlieb J, Zamora MR, Hodges T, et al. ALN-RSV01 for prevention of bronchiolitis obliterans

syndrome after respiratory syncytial virus infection in lung transplant recipients. J Hear Lung

Transplant. 2016. https://doi.org/doi:10.1016/j.healun.2015.08.012.

198. Hubé F, Francastel C. “Pocket-sized RNA-Seq”: A Method to Capture New Mature microRNA

Produced from a Genomic Region of Interest. Non-coding RNA. 2015;1(2):127-138.

https://doi.org/doi:10.3390/ncrna1020127.

199. Amaral PP, Mattick JS. Noncoding RNA in development. Mamm Genome. 2008.

https://doi.org/doi:10.1007/s00335-008-9136-7.

200. Amaral PP, Dinger ME, Mattick JS. Non-coding RNAs in homeostasis, disease and stress

responses: An evolutionary perspective. Brief Funct Genomics. 2013.

https://doi.org/doi:10.1093/bfgp/elt016.

201. Berindan-Neagoe I, Calin GA. Molecular pathways: microRNAs, cancer cells, and

microenvironment. Clin Cancer Res An Off J Am Assoc Cancer Res. 2014;20(24):6247-6253.

https://doi.org/doi:10.1158/1078-0432.CCR-13-2500.

Literaturverzeichnis

129

202. Lam JKW, Chow MYT, Zhang Y, Leung SWS. siRNA versus miRNA as therapeutics for gene

silencing. Mol Ther - Nucleic Acids. 2015. https://doi.org/doi:10.1038/mtna.2015.23.

203. Kelly EJ, Hadac EM, Greiner S, Russell SJ. Engineering microRNA responsiveness to decrease

virus pathogenicity. Nat Med. 2008;14(11):1278-1283. https://doi.org/doi:10.1038/nm.1776.

204. Bader AG, Brown D, Stoudemire J, Lammers P. Developing therapeutic microRNAs for cancer.

Gene Ther. 2011;18(12):1121-1126. https://doi.org/doi:10.1038/gt.2011.79.

205. Chandra PK, Kundu AK, Hazari S, et al. Inhibition of hepatitis C virus replication by intracellular

delivery of multiple siRNAs by nanosomes. Mol Ther. 2012;20(9):1724-1736.

https://doi.org/doi:10.1038/mt.2012.107.

206. Daka A, Peer D. RNAi-based nanomedicines for targeted personalized therapy. Adv Drug Deliv

Rev. 2012;64(13):1508-1521. https://doi.org/doi:10.1016/j.addr.2012.08.014.

207. Agrawal N, Dasaradhi PVN, Mohmmed A, Malhotra P, Bhatnagar RK, Mukherjee SK. RNA

Interference: Biology, Mechanism, and Applications. Microbiol Mol Biol Rev. 2003;67(4):657-

685. https://doi.org/doi:10.1128/MMBR.67.4.657-685.2003.

208. Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC. Potent and specific genetic

interference by double-stranded RNA in caenorhabditis elegans. Nature. 1998.

https://doi.org/doi:10.1038/35888.

209. Elbashir SM, Harborth J, Lendeckel W, Yalcin A, Weber K, Tuschl T. Duplexes of

21±nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells. Nature. 2001.

https://doi.org/doi:10.1038/35078107.

210. Hammond SM, Boettcher S, Caudy AA, Kobayashi R, Hannon GJ. Argonaute2, a link between

genetic and biochemical analyses of RNAi. Science (80- ). 2001.

https://doi.org/doi:10.1126/science.1064023.

211. Bartel DP. MicroRNAs: Target Recognition and Regulatory Functions. Cell. 2009.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2009.01.002.

212. Ha M, Kim VN. Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2014.

doi:10.1038/nrm3838.

213. Lee I, Ajay SS, Jong IY, et al. New class of microRNA targets containing simultaneous 5′-UTR

and 3′-UTR interaction sites. Genome Res. 2009. https://doi.org/doi:10.1101/gr.089367.108.

214. Grey F, Tirabassi R, Meyers H, et al. A viral microRNA down-regulates multiple cell cycle genes

through mRNA 59′UTRs. PLoS Pathog. 2010.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1000967.

215. Duursma AM, Kedde M, Schrier M, Le Sage C, Agami R. miR-148 targets human DNMT3b

protein coding region. RNA. 2008. https://doi.org/doi:10.1261/rna.972008.

216. Rigoutsos I. New tricks for animal micrornas: Targeting of amino acid coding regions at

conserved and nonconserved sites. Cancer Res. 2009. https://doi.org/doi:10.1158/0008-

5472.CAN-09-0352.

Literaturverzeichnis

130

217. Jopling CL, Yi MK, Lancaster AM, Lemon SM, Sarnow P. Molecular biology: Modulation of

hepatitis C virus RNA abundance by a liver-specific MicroRNA. Science (80- ). 2005.

https://doi.org/doi:10.1126/science.1113329.

218. Triboulet R, Mari B, Lin YL, et al. Suppression of MicroRNA-silencing pathway by HIV-1

during virus replication. Science (80- ). 2007. https://doi.org/doi:10.1007/s10812-011-9439-4.

219. Ye X, Zhang HM, Qiu Y, et al. Coxsackievirus-Induced miR-21 Disrupts Cardiomyocyte

Interactions via the Downregulation of Intercalated Disk Components. PLoS Pathog. 2014.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.ppat.1004070.

220. Tong L, Lin L, Wu S, et al. MiR-10*up-regulates coxsackievirus B3 biosynthesis by targeting

the 3D-coding sequence. Nucleic Acids Res. 2013. https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkt058.

221. Corsten MF, Papageorgiou A, Verhesen W, et al. MicroRNA Profiling Identifies MicroRNA-

155 as an Adverse Mediator of Cardiac Injury and Dysfunction during Acute Viral MyoCarditis.

Circ Res. 2012. https://doi.org/doi:10.1161/CIRCRESAHA.112.267443.

222. Umbach JL, Kramer MF, Jurak I, Karnowski HW, Coen DM, Cullen BR. MicroRNAs expressed

by herpes simplex virus 1 during latent infection regulate viral mRNAs. Nature. 2008.

https://doi.org/doi:10.1038/nature07103.

223. Pfeffer S, Zavolan M, Grässer FA, et al. Identification of Virus-Encoded MicroRNAs. Science

(80- ). 2004. https://doi.org/doi:10.1126/science.1096781.

224. Dhungel B, Ramlogan-Steel CA, Steel JC. Microrna-regulated gene delivery systems for

research and therapeutic purposes. Molecules. 2018.

https://doi.org/doi:10.3390/molecules23071500.

225. Jiang Q, Meng X, Meng L, et al. Small indels induced by CRISPR/Cas9 in the 5′ region of

microRNA lead to its depletion and Drosha processing retardance. RNA Biol. 2014.

https://doi.org/doi:10.1080/15476286.2014.996067.

226. Bartel DP. MicroRNAs: Genomics, Biogenesis, Mechanism, and Function. Cell. 2004.

https://doi.org/doi:10.1016/S0092-8674(04)00045-5.

227. Kim VN, Han J, Siomi MC. Biogenesis of small RNAs in animals. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009.

https://doi.org/doi:10.1038/nrm2632.

228. Okada C, Yamashita E, Lee SJ, et al. A high-Resolution structure of the pre-microrna nuclear

export machinery. Science (80- ). 2009. https://doi.org/doi:10.1126/science.1178705.

229. Bartel DP. Metazoan MicroRNAs. Cell. 2018. https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2018.03.006.

230. Filipowicz W, Bhattacharyya SN, Sonenberg N. Mechanisms of post-transcriptional regulation

by microRNAs: Are the answers in sight? Nat Rev Genet. 2008.

https://doi.org/doi:10.1038/nrg2290.

231. Yang S, Phillips MD, Betel D, et al. Widespread regulatory activity of vertebrate microRNA*

species. RNA. 2011. https://doi.org/doi:10.1261/rna.2537911.

Literaturverzeichnis

131

232. Biasiolo M, Sales G, Lionetti M, et al. Impact of host genes and strand selection on miRNA and

miRNA* expression. PLoS One. 2011. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0023854.

233. Yang X, Du WW, Li H, et al. Both mature miR-17-5p and passenger strand miR-17-3p target

TIMP3 and induce prostate tumor growth and invasion. Nucleic Acids Res. 2013.

https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkt680.

234. Fabian MR, Sonenberg N, Filipowicz W. Regulation of mRNA Translation and Stability by

microRNAs. Annu Rev Biochem. 2010. https://doi.org/doi:10.1146/annurev-biochem-060308-

103103.

235. Brennecke J, Stark A, Russell RB, Cohen SM. Principles of microRNA-target recognition. In:

PLoS Biology. ; 2005. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pbio.0030085.

236. Lewis BP, Burge CB, Bartel DP. Conserved seed pairing, often flanked by adenosines, indicates

that thousands of human genes are microRNA targets. Cell. 2005.

https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2004.12.035.

237. Doench JG, Sharp PA. Specificity of microRNA target selection in translational repression.

Genes Dev. 2004. https://doi.org/doi:10.1101/gad.1184404.

238. Gentner B, Naldini L. Exploiting microRNA regulation for genetic engineering. Tissue Antigens.

2012. https://doi.org/doi:10.1111/tan.12002.

239. Grimson A, Farh KKH, Johnston WK, Garrett-Engele P, Lim LP, Bartel DP. MicroRNA

Targeting Specificity in Mammals: Determinants beyond Seed Pairing. Mol Cell. 2007.

https://doi.org/doi:10.1016/j.molcel.2007.06.017.

240. Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T. RNA interference is mediated by 21- and 22-nucleotide

RNAs. Genes Dev. 2001. https://doi.org/doi:10.1101/gad.862301.

241. Denzler R, McGeary SE, Title AC, Agarwal V, Bartel DP, Stoffel M. Impact of MicroRNA

Levels, Target-Site Complementarity, and Cooperativity on Competing Endogenous RNA-

Regulated Gene Expression. Mol Cell. 2016. https://doi.org/doi:10.1016/j.molcel.2016.09.027.

242. Geisler A, Schön C, Größl T, et al. Application of mutated miR-206 target sites enables skeletal

muscle-specific silencing of transgene expression of cardiotropic AAV9 vectors. In: Molecular

Therapy. ; 2013. https://doi.org/doi:10.1038/mt.2012.276.

243. Kim SJ, Lee CH, Lee S-W. Targeting the MicroRNA Passenger Strand for Regulating

Therapeutic Transgenes. Nucleic Acid Ther. 2015. https://doi.org/doi:10.1089/nat.2015.0543.

244. Sakurai F, Katayama K, Mizuguchi H. MicroRNA-regulated transgene expression systems for

gene therapy and virotherapy. Front Biosci (Landmark Ed). 2011. PMID21622184.

245. Mullokandov G, Baccarini A, Ruzo A, et al. High-throughput assessment of microRNA activity

and function using microRNA sensor and decoy libraries. Nat Methods. 2012.

https://doi.org/doi:10.1038/nmeth.2078.

Literaturverzeichnis

132

246. Geisler A, Jungmann A, Kurreck J, et al. MicroRNA122-regulated transgene expression

increases specificity of cardiac gene transfer upon intravenous delivery of AAV9 vectors. Gene

Ther. 2011. https://doi.org/ doi:10.1038/gt.2010.141.

247. Kozomara A, Hunt S, Ninova M, Griffiths-Jones S, Ronshaugen M. Target repression induced

by endogenous microRNAs: Large differences, small effects. PLoS One. 2014.

https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0104286.

248. Brown BD, Gentner B, Cantore A, et al. Endogenous microRNA can be broadly exploited to

regulate transgene expression according to tissue, lineage and differentiation state. Nat

Biotechnol. 2007. https://doi.org/doi:10.1038/nbt1372.

249. Geisler A, Fechner H. MicroRNA-regulated viral vectors for gene therapy. World J Exp Med.

2016. https://doi.org/doi:10.5493/wjem.v6.i2.37.

250. Brown BD, Naldini L. Exploiting and antagonizing microRNA regulation for therapeutic and

experimental applications. Nat Rev Genet. 2009. https://doi.org/doi:10.1038/nrg2628.

251. Wu C, Lin J, Hong M, et al. Combinatorial control of suicide gene expression by tissue-specific

promoter and microrna regulation for cancer therapy. Mol Ther. 2009.

https://doi.org/doi:10.1038/mt.2009.225.

252. Forman JJ, Coller HA. The code within the code: MicroRNAs target coding regions. Cell Cycle.

2010. https://doi.org/doi:10.4161/cc.9.8.11202.

253. Ylosmaki E, Hakkarainen T, Hemminki A, Visakorpi T, Andino R, Saksela K. Generation of a

Conditionally Replicating Adenovirus Based on Targeted Destruction of E1A mRNA by a Cell

Type-Specific MicroRNA. J Virol. 2008. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.01608-08.

254. Lytle JR, Yario TA, Steitz JA. Target mRNAs are repressed as efficiently by microRNA-binding

sites in the 5’ UTR as in the 3’ UTR. Proc Natl Acad Sci. 2007.

https://doi.org/doi:10.1073/pnas.0703820104.

255. Papapetrou EP, Kovalovsky D, Beloeil L, Sant’Angelo D, Sadelain M. Harnessing endogenous

miR-181a to segregate transgenic antigen receptor expression in developing versus post-thymic

T cells in murine hematopoietic chimeras. J Clin Invest. 2009.

https://doi.org/doi:10.1172/JCI37216.

256. Haas G, Cetin S, Messmer M, et al. Identification of factors involved in target RNA-directed

microRNA degradation. Nucleic Acids Res. 2016. https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkw040.

257. Mayya VK, Duchaine TF. On the availability of microRNA-induced silencing complexes,

saturation of microRNA-binding sites and stoichiometry. Nucleic Acids Res. 2015.

https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkv720.

258. Arvey A, Larsson E, Sander C, Leslie CS, Marks DS. Target mRNA abundance dilutes

microRNA and siRNA activity. Mol Syst Biol. 2010. https://doi.org/doi:10.1038/msb.2010.24.

259. Gentner B, Schira G, Giustacchini A, et al. Stable knockdown of microRNA in vivo by lentiviral

vectors. Nat Methods. 2009. https://doi.org/doi:10.1038/nmeth.1277.

Literaturverzeichnis

133

260. Ebert MS, Neilson JR, Sharp PA. MicroRNA sponges: Competitive inhibitors of small RNAs in

mammalian cells. Nat Methods. 2007. https://doi.org/doi:10.1038/nmeth1079.

261. Grimm D, Büning H. Small but increasingly mighty - Latest advances in AAV vector research,

design and evolution. Hum Gene Ther. 2017. https://doi.org/doi:10.1089/hum.2017.172.

262. Ameres SL, Martinez J, Schroeder R. Molecular Basis for Target RNA Recognition and

Cleavage by Human RISC. Cell. 2007. https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2007.04.037.

263. Tay FC, Lim JK, Zhu H, Hin LC, Wang S. Using artificial microRNA sponges to achieve

microRNA loss-of-function in cancer cells. Adv Drug Deliv Rev. 2015.

https://doi.org/doi:10.1016/j.addr.2014.05.010.

264. Xie J, Xie Q, Zhang H, et al. MicroRNA-regulated, systemically delivered rAAV9: A step closer

to CNS-restricted transgene expression. Mol Ther. 2011.

https://doi.org/doi:10.1038/mt.2010.279.

265. Broderick JA, Salomon WE, Ryder SP, Aronin N, Zamore PD. Argonaute protein identity and

pairing geometry determine cooperativity in mammalian RNA silencing. RNA. 2011.

https://doi.org/doi:10.1261/rna.2778911.

266. Sætrom P, Heale BSE, Snøve O, Aagaard L, Alluin J, Rossi JJ. Distance constraints between

microRNA target sites dictate efficacy and cooperativity. Nucleic Acids Res. 2007.

https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkm133.

267. Hirosawa M, Fujita Y, Parr CJC, et al. Cell-type-specific genome editing with a microRNA-

responsive CRISPR-Cas9 switch. Nucleic Acids Res. 2017.

https://doi.org/doi:10.1093/nar/gkx309.

268. Di Stefano B, Maffioletti SM, Gentner B, et al. A microRNA-based system for selecting and

maintaining the pluripotent state in human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 2011.

https://doi.org/doi:10.1002/stem.726.

269. Bofill-De Ros X, Rovira-Rigau M, Fillat C. Implications of MicroRNAs in Oncolytic

Virotherapy. Front Oncol. 2017. https://doi.org/doi:10.3389/fonc.2017.00142.

270. Ruiz AJ, Russell SJ. MicroRNAs and oncolytic viruses. Curr Opin Virol. 2015.

https://doi.org/doi:10.1016/j.coviro.2015.03.007.

271. Yao W, Guo G, Zhang Q, Fan L, Wu N, Bo Y. The application of multiple miRNA response

elements enables oncolytic adenoviruses to possess specificity to glioma cells. Virology. 2014.

https://doi.org/doi:10.1016/j.virol.2014.04.007.

272. Callegari E, Elamin BK, D’Abundo L, et al. Anti-Tumor Activity of a miR-199-dependent

Oncolytic Adenovirus. PLoS One. 2013. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0073964.

273. Ros XB De, Gironella M, Fillat C. MiR-148a- And miR-216a-regulated Oncolytic Adenoviruses

Targeting Pancreatic Tumors Attenuate Tissue Damage Without Perturbation of miRNA

Activity. Mol Ther. 2014. https://doi.org/doi:10.1038/mt.2014.98.

Literaturverzeichnis

134

274. Fu X, Rivera A, Tao L, De Geest B, Zhang X. Construction of an oncolytic herpes simplex virus

that precisely targets hepatocellular carcinoma cells. Mol Ther. 2012.

https://doi.org/doi:10.1038/mt.2011.265.

275. Hikichi M, Kidokoro M, Haraguchi T, et al. MicroRNA regulation of glycoprotein B5R in

oncolytic vaccinia virus reduces viral pathogenicity without impairing its antitumor efficacy.

Mol Ther. 2011. https://doi.org/doi:10.1038/mt.2011.36.

276. Lauring AS, Jones JO, Andino R. Rationalizing the development of live attenuated virus

vaccines. Nat Biotechnol. 2010. https://doi.org/doi:10.1038/nbt.1635.

277. Schaar K, Geisler A, Kraus M, et al. Anti-adenoviral Artificial MicroRNAs Expressed from

AAV9 Vectors Inhibit Human Adenovirus Infection in Immunosuppressed Syrian Hamsters.

Mol Ther - Nucleic Acids. 2017;8:300-316. https://doi.org/doi:10.1016/j.omtn.2017.07.002.

278. Fechner H, Sipo I, Westermann D, et al. Cardiac-targeted RNA interference mediated by an

AAV9 vector improves cardiac function in coxsackievirus B3 cardiomyopathy. J Mol Med. 2008.

https://doi.org/doi:10.1007/s00109-008-0363-x.

279. Slifka MK, Pagarigan R, Mena I, Feuer R, Whitton JL. Using recombinant coxsackievirus B3 to

evaluate the induction and protective efficacy of CD8+ T cells during picornavirus infection. J

Virol. 2001. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.75.5.2377-2387.2001.

280. Feuer R, Mena I, Pagarigan R, Slifka MK, Whitton JL. Cell cycle status affects coxsackievirus

replication, persistence, and reactivation in vitro. J Virol. 2002.

https://doi.org/doi:10.1016/j.biotechadv.2011.08.021.Secreted.

281. Knowlton KU, Jeon ES, Berkley N, Wessely R, Huber S. A mutation in the puff region of VP2

attenuates the myocarditic phenotype of an infectious cDNA of the Woodruff variant of

coxsackievirus B3. J Virol. 1996. PMC190851.

282. Cardullo RA, Agrawal S, Flores C, Zamecnik PC, Wolf DE. Detection of nucleic acid

hybridization by nonradiative fluorescence resonance energy transfer. Proc Natl Acad Sci U S A.

1988. https://doi.org/doi:10.1109/ISCAS.2008.4542133.

283. Mao F, Leung WY, Xin X. Characterization of EvaGreen and the implication of its

physicochemical properties for qPCR applications. BMC Biotechnol. 2007.

https://doi.org/doi:10.1186/1472-6750-7-76.

284. Hvid H, Thorup I, Oleksiewicz MB, Sjögren I, Jensen HE. An alternative method for preparation

of tissue sections from the rat mammary gland. Exp Toxicol Pathol. 2011.

https://doi.org/doi:10.1016/j.etp.2010.02.005.

285. Mullany LE, Herrick JS, Wolff RK, Slattery ML. MicroRNA Seed Region Length Impact on

Target Messenger RNA Expression and Survival in Colorectal Cancer. PLoS One.

2016;11(4):e0154177. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0154177.

Literaturverzeichnis

135

286. Stein EA, Pinkert S, Becher PM, et al. Combination of RNA interference and virus receptor trap

exerts additive antiviral activity in coxsackievirus B3-induced myocarditis in mice. J Infect Dis.

2015;211(4):613-622. https://doi.org/doi:10.1093/infdis/jiu504.

287. Becher PM, Gotzhein F, Klingel K, et al. Cardiac Function Remains Impaired Despite Reversible

Cardiac Remodeling after Acute Experimental Viral Myocarditis. J Immunol Res. 2017.

https://doi.org/doi:10.1155/2017/6590609.

288. Tschöpe C, Westermann D, Steendijk P, et al. Hemodynamic characterization of left ventricular

function in experimental coxsackieviral myocarditis: Effects of carvedilol and metoprolol. Eur J

Pharmacol. 2004. https://doi.org/doi:10.1016/j.ejphar.2004.03.032.

289. Kallewaard NL, Zhang L, Chen JW, Guttenberg M, Sanchez MD, Bergelson JM. Tissue-Specific

Deletion of the Coxsackievirus and Adenovirus Receptor Protects Mice from Virus-Induced

Pancreatitis and Myocarditis. Cell Host Microbe. 2009;6(1):91-98.

https://doi.org/doi:10.1016/j.chom.2009.05.018.

290. Persichino J, Garrison R, Krishnan R, Sutjita M. Effusive-constrictive pericarditis, hepatitis, and

pancreatitis in a patient with possible coxsackievirus B infection: A case report. BMC Infect Dis.

2016. https://doi.org/doi:10.1186/s12879-016-1752-3.

291. Coplan NL, Atallah V, Mediratta S, Bruno MS, DePasquale NP. Cardiac, pancreatic, and liver

abnormalities in a patient with coxsackie-B infection. Am J Med. 1996;101(3):325-326.

https://doi.org/doi:10.1016/S0002-9343(97)89436-3.

292. Selinka HC, Wolde A, Sauter M, Kandolf R, Klingel K. Virus-receptor interactions of coxsakie

B viruses and their putative influence on cardiotropism. Med Microbiol Immunol. 2004.

https://doi.org/doi:10.1007/s00430-003-0193-y.

293. Kong XY, Du YQ, Li L, et al. Plasma mir-216a as a potential marker of pancreatic injury in a

rat model of acute pancreatitis. World J Gastroenterol. 2010.

https://doi.org/doi:10.3748/wjg.v16.i36.4599.

294. Dixit E, Boulant S, Zhang Y, et al. Peroxisomes Are Signaling Platforms for Antiviral Innate

Immunity. Cell. 2010. https://doi.org/doi:10.1016/j.cell.2010.04.018.

295. Gomez RM, Cui X, Castagnino CG, Berria MI. Differential behaviour in pancreas and heart of

two coxsackievirus B3 variants. Intervirology. 1993. https://doi.org/doi:10.1159/000150334.

296. Merkle I, Tonew M, Glück B, Schmidtke M, Egerer R, Stelzner A. Coxsackievirus B3-induced

chronic myocarditis in outbred NMRI mice. J Hum Virol. 1999. PMID10774554.

297. Drescher KM, Kono K, Bopegamage S, Carson SD, Tracy S. Coxsackievirus B3 infection and

type 1 diabetes development in NOD mice: Insulitis determines susceptibility of pancreatic islets

to virus infection. Virology. 2004. https://doi.org/doi:10.1016/j.virol.2004.06.049.

298. Bopegamage S, Kovacova J, Vargova A, et al. Coxsackie B virus infection of mice: Inoculation

by the oral route protects the pancreas from damage, but not from infection. J Gen Virol. 2005.

https://doi.org/doi:10.1099/vir.0.81249-0.

Literaturverzeichnis

136

299. Tracy S, Smithee S, Alhazmi A, Chapman N. Coxsackievirus can persist in murine pancreas by

deletion of 5′ terminal genomic sequences. J Med Virol. 2015.

https://doi.org/doi:10.1002/jmv.24039.

300. Willcox a., Richardson SJ, Bone a. J, Foulis a. K, Morgan NG. Immunohistochemical analysis

of the relationship between islet cell proliferation and the production of the enteroviral capsid

protein, VP1, in the islets of patients with recent-onset type 1 diabetes. Diabetologia. 2011.

https://doi.org/doi:10.1007/s00125-011-2192-7.

301. Zhang H, Yousef GE, Ouyang X, Archard LC. Characterization of a murine model of

myocarditis induced by a reactivated coxsackievirus B3. Int J Exp Pathol. 1994;75(2):99-110.

PMC2002107.

302. Sakai Y, Kiyotani K, Fukumura M, et al. Accommodation of foreign genes into the Sendai virus

genome: Sizes of inserted genes and viral replication. FEBS Lett. 1999.

https://doi.org/doi:10.1016/S0014-5793(99)00960-6.

303. Hermonat PL, Quirk JG, Bishop BM, Han L. The packaging capacity of adeno-associated virus

(AAV) and the potential for wild-type-plus AAV gene therapy vectors. FEBS Lett.

1997;407(1):78-84. PMID9141485.

304. He F, Yao H, Wang J, et al. Coxsackievirus B3 Engineered To Contain MicroRNA Targets for

Muscle-Specific MicroRNAs Displays Attenuated Cardiotropic Virulence in Mice. J Virol.

2015. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.02933-14.

305. Rohll JB, Moon DH, Evans DJ, Almond JW. The 3’ untranslated region of picornavirus RNA:

features required for efficient genome replication. J Virol. 1995. PMC189727.

306. Dunn JJ, Chapman NM, Tracy S, Romero JR. Genomic determinants of cardiovirulence in

coxsackievirus B3 clinical isolates: localization to the 5’ nontranslated region. J Virol. 2000.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.74.10.4787-4794.2000.

307. Ruiz AJ, Hadac EM, Nace RA, Russell SJ. MicroRNA-Detargeted Mengovirus for Oncolytic

Virotherapy. J Virol. 2016. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.02810-15.

308. Hwang IS, Jun EJ, Ye JS, Joo CH, Lee H, Kim YK. Expression of Plus- and Minus-strand Viral

RNA in Coxsackievirus B3-Infected A/J Mice. J Bacteriol Virol. 2008;38(4):239.

https://doi.org/doi:10.4167/jbv.2008.38.4.239.

309. Egger D, Teterina NL, Ehrenfeld E, Bienz K. Formation of the poliovirus replication complex

requires coupled viral translation, vesicle production, and viral RNA synthesis. J Virol. 2000.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.74.14.6570-6580.2000.

310. Schubert S, Rothe D, Werk D, et al. Strand-specific silencing of a picornavirus by RNA

interference: Evidence for the superiority of plus-strand specific siRNAs. Antiviral Res. 2007.

https://doi.org/doi:10.1016/j.antiviral.2006.10.005.

Literaturverzeichnis

137

311. Heiss BL, Maximova OA, Thach DC, Speicher JM, Pletnev AG. MicroRNA Targeting of

Neurotropic Flavivirus: Effective Control of Virus Escape and Reversion to Neurovirulent

Phenotype. J Virol. 2012. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.07125-11.

312. Zhang H, Blake NW, Ouyang X, Pandolfino YA, Morgan-Capner P, Archard LC. A single amino

acid substitution in the capsid protein VP1 of coxsackievirus B3 (CVB3) alters plaque phenotype

in Vero cells but not cardiovirulence in a mouse model. Arch Virol. 1995;140(5):959-966.

PMID7605207.

313. Massilamany C, Gangaplara A, Basavalingappa RH, et al. Mutations in the 5’ NTR and the non-

structural protein 3A of the coxsackievirus B3 selectively attenuate myocarditogenicity. PLoS

One. 2015. https://doi.org/doi:10.1371/journal.pone.0131052.

314. https://miRBase.org.

315. Freiberg F, Sauter M, Pinkert S, et al. Interspecies Differences in Virus Uptake versus Cardiac

Function of the Coxsackievirus and Adenovirus Receptor. J Virol. 2014.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.00104-14.

316. Horwitz MS, La Cava A, Fine C, Rodriguez E, Ilic A, Sarvetnick N. Pancreatic expression of

interferon-γ protects mice from lethal coxsackievirus B3 infection and subsequent myocarditis.

Nat Med. 2000. https://doi.org/doi:10.1038/76277.

317. Drake JW, Charlesworth B, Charlesworth D, Crow JF. Rates of spontaneous mutation. Genetics.

1998. https://doi.org/doi:citeulike-article-id:610966.

318. Caggana M, Chan P, Ramsingh A. Identification of a single amino acid residue in the capsid

protein VP1 of coxsackievirus B4 that determines the virulent phenotype. J Virol. 1993.

319. Wang Y, Pfeiffer JK. Emergence of a large-plaque variant in mice infected with coxsackievirus

B3. MBio. 2016. https://doi.org/doi:10.1128/mBio.00119-16.

320. Gauntt CJ, Trousdale MD, Labadie DRL, Paque RE, Nealon T. Properties of coxsackievirus B3

variants which are amyocarditic or myocarditic for mice. J Med Virol. 1979.

https://doi.org/doi:10.1002/jmv.1890030307.

321. Tu Z, Chapman NM, Hufnagel G, et al. The cardiovirulent phenotype of coxsackievirus B3 is

determined at a single site in the genomic 5’ nontranslated region. J Virol. 1995.

322. Lévêque N, Garcia M, Bouin A, et al. Functional Consequences of RNA 5′-Terminal Deletions

on Coxsackievirus B3 RNA Replication and Ribonucleoprotein Complex Formation. J Virol.

2017. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.00423-17.

323. Vignuzzi M, Stone JK, Arnold JJ, Cameron CE, Andino R. Quasispecies diversity determines

pathogenesis through cooperative interactions in a viral population. Nature. 2006.

https://doi.org/doi:10.1038/nature04388.

324. Lauring AS, Frydman J, Andino R. The role of mutational robustness in RNA virus evolution.

Nat Rev Microbiol. 2013. https://doi.org/doi:10.1038/nrmicro3003.

Literaturverzeichnis

138

325. Frizelle S, Schwarz J, Huber SA, Leslie K. Evaluation of the effects of low molecular weight

heparin on inflammation and collagen deposition in chronic coxsackievirus B3-induced

myocarditis in A/J mice. Am J Pathol. 1992;141(1):203-209. PMC1886579.

326. Kim K-S, Tracy S, Tapprich W, et al. 5’-Terminal Deletions Occur in Coxsackievirus B3 during

Replication in Murine Hearts and Cardiac Myocyte Cultures and Correlate with Encapsidation

of Negative-Strand Viral RNA. J Virol. 2005. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.79.11.7024-

7041.2005.

327. Bouin A, Nguyen Y, Wehbe M, et al. Major persistent 5′ terminally deleted coxsackievirus B3

populations in human endomyocardial tissues. Emerg Infect Dis. 2016.

https://doi.org/doi:10.3201/eid2208.160186.

328. Smithee S, Tracy S, Chapman NM. Mutational Disruption of cis -Acting Replication Element

2C in Coxsackievirus B3 Leads to 5′-Terminal Genomic Deletions. J Virol. 2015.

https://doi.org/doi:10.1128/JVI.01308-15.

329. Pinkert S, Westermann D, Wang X, et al. Prevention of cardiac dysfunction in acute

coxsackievirus B3 cardiomyopathy by inducible expression of a soluble coxsackievirus-

adenovirus receptor. Circulation

. 2009.

https://doi.org/doi:10.1161/CIRCULATIONAHA.108.845339.

330. Schmidtke M, Glück B, Merkle I, Hofmann P, Stelzner A, Gemsa D. Cytokine profiles in heart,

spleen, and thymus during the acute stage of experimental coxsackievirus B3-induced chronic

myocarditis. J Med Virol. 2000. PMID10897072.

331. Zautner AE, Korner U, Henke A, Badorff C, Schmidtke M. Heparan Sulfates and

Coxsackievirus-Adenovirus Receptor: Each One Mediates Coxsackievirus B3 PD Infection. J

Virol. 2003;77(18):10071-10077. https://doi.org/doi:10.1128/JVI.77.18.10071-10077.2003.

332. Schiffelers MJWA, Blaauboer BJ, Bakker WE, et al. Regulatory acceptance and use of 3R

models for pharmaceuticals and chemicals: Expert opinions on the state of affairs and the way

forward. Regul Toxicol Pharmacol. 2014. https://doi.org/doi:10.1016/j.yrtph.2014.02.007.

333. McNamara DM, Starling RC, Cooper LT, et al. Clinical and demographic predictors of outcomes

in recent onset dilated cardiomyopathy: Results of the IMAC (intervention in myocarditis and

acute cardiomyopathy)-2 study. J Am Coll Cardiol. 2011.

https://doi.org/doi:10.1016/j.jacc.2011.05.033.

334. Howlett SE. Coxsackievirus B3-Induced Myocarditis: New Insights Into a Female Advantage.

Can J Cardiol. 2018. https://doi.org/doi:10.1016/j.cjca.2018.01.086.

335. Dixit AK, Sarver AE, Yuan Z, et al. Comprehensive analysis of microRNA signature of mouse

pancreatic acini: overexpression of miR-21-3p in acute pancreatitis. Am J Physiol Liver Physiol.

2016. https://doi.org/doi:10.1152/ajpgi.00191.2016.

Literaturverzeichnis

139

336. Endo K, Weng H, Kito N, Fukushima Y, Iwai N. MiR-216a and miR-216b as markers for acute

phased pancreatic injury. Biomed Res. 2013;34(4):179-188.

https://doi.org/doi:10.2220/biomedres.34.179.

Anhang

140

Anhang

Anhang 1: Plasmidkarten von dem Plasmid pMKS1 mit -bzw. ohne GFP.

[AmpR: Ampicillin-Resistenzgen; T7: T7-Promotor; VP1, VP2, VP3, VP4: virale Strukturproteine 1-4;

2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D: Nichtstruktur-Proteine; GFP: grün fluoreszierendes Protein.]

Anhang

141

Anhang 2: Plasmidkarten von dem Plasmid pMKS1 mit der multiple cloning site in den 3’ -bzw. 5’-Enden

des CVB3-Genoms.

(A) Modifikationen am 3’-Ende des CVB3-Genoms. Es wurden drei Kopien miRNA-375TS in (+)-Orientierung bzw. in (-)-

Orientierung inseriert. Dem Kontrollvirus wurden drei Kopien der miRNA-39TS in (+)-Orientierung inseriert. (B)

Modifikationen am 5’-Ende des CVB3-Genoms. Die Insertion der TS entspricht denen innerhalb des 3’-Endes. [AmpR:

Ampicillin-Resistenzgen; T7: T7-Promotor; VP1, VP2, VP3, VP4: virale Strukturproteine 1-4; 2A, 2B, 2C, 3A, 3B, 3C, 3D:

Nichtstruktur-Proteine; MCS: multiple cloning site.]

Anhang

142

Anhang 3: Plasmidkarten von dem Plasmid pMKS1-H3N mit der multiple cloning site in den 3’ -bzw. 5’-

Enden des CVB3-Genoms.

Modifikationen am 3’-Ende des CVB3-Genoms mit drei Kopien der miRNA-375TS(+) bzw. miRNA-39TS(+). TS: target site;

[AmpR: Ampicillin-Resistenzgen; T7: T7-Promotor; VP1, VP2, VP3, VP4: virale Strukturproteine 1-4; 2A, 2B, 2C, 3A, 3B,

3C, 3D: Nichtstruktur-Proteine; MCS: multiple cloning site.]

Anhang

143

Anhang 3: Das Plasmid psiCHECK2 mit Hexon-TS bzw. miRNA-375TS(+).