Tolperison
Alter Wirkstoff oder neue Leitstruktur ?
Vom Fachbereich Chemie und Chemietechnik
der Gesamthochschule Paderborn
zur Erlangung des Grades eines
Doktors der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
von
Axel Dietrich
aus Detmold
Paderborn 1999
Referent: Prof. Dr. Gregor Fels
Korreferent: Prof. Dr. Karsten Krohn
Eingereicht am: 16. Februar 1999
Mündliche Prüfung am: 19. März 1999
Die vorliegende Arbeit wurde von August 1996 bis zum Februar 1999 im Fach Organische
Chemie des Fachbereichs 13 der Universität Gesamthochschule Paderborn unter Anleitung von
Herrn Prof. Dr. G. Fels angefertigt.
Herrn Prof. Dr. G. Fels danke ich für die Übertragung des überaus vielseitigen und fachüber-
greifenden Themas, sowie für die großen Freiräume, die mir für eigene Ideen und Inspirationen
gelassen wurden. Seine ständige Diskussionsbereitschaft und seine zahlreichen Impulse haben
wesentlich zum Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Herrn Prof. Dr. K. Krohn danke ich für die Übernahme des Korreferats.
Ganz besonders danken möchte ich Herrn Prof. Dr. A. Tropsha für die Einführung in die
QSAR-Thematik, die Überlassung der Quellcodes und die nette Gastfreundschaft bei einem
Forschungsaufenthalt an der University of North Carolina at Chapel Hill.
Herrn Dr. A. Schrattenholz und Herrn Prof. Dr. A Maelicke gebührt mein Dank für die
Unterstützung bei den biochemischen Untersuchungen und Photoaffinitätsmarkierungen.
Der Firma Strathmann AG & Co., Hamburg danke ich für die finanzielle Unterstützung dieser
Arbeit und Herrn Dr. E. Pfanner der Firma TriTec für die Hilfe bei der Durchführung der
radioaktiven Synthesen.
Herrn Dr. U. Pleiss der Firma Bayer danke ich für die Durchführung der LC/MS Spektren.
Ferner möchte ich mich bei allen Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern, die mich durch das
angenehme Arbeitsklima, die zahlreichen Anregungen und Hilfestellungen unterstützt haben,
bedanken.
Ganz besonderer Dank gilt den Damen und Herren M. Borges, N. Diedrichs, C. Pilger, und
Priv. Doz. Dr. B. Westermann für ihre Unterstützung durch Rat und Tat.
Inhaltsverzeichnis
I
1EINLEITUNG.............................................................................................................. 1
2PHARMAKOLOGISCHER HINTERGRUND .......................................................... 2
2.1 Muskelschmerz............................................................................................................. 2
2.2 Muskelrelaxantien......................................................................................................... 2
2.3 Tolperison - Eigenschaften und Wirkspektrum............................................................... 3
2.4 Wirkmechanismus......................................................................................................... 4
3AUSGANGSSITUATION UND FRAGESTELLUNG................................................ 6
4ORGANISCH-CHEMISCHE METHODEN .............................................................. 8
4.1 Photoaffinitätsmarkierungen.......................................................................................... 8
4.2 Photolabile Gruppen...................................................................................................... 9
4.3 Radiochemische Methoden.......................................................................................... 10
4.4 Experimentelles........................................................................................................... 11
4.4.1 Tritiierung von Tolperison............................................................................................ 11
4.4.2 Hydrierung.................................................................................................................. 12
4.4.3 Hydrogenolyse............................................................................................................. 15
4.4.4 Trifluordiazirinotolperison ........................................................................................... 21
4.4.5 Azidotolperison ........................................................................................................... 25
5BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN............................................................... 31
5.1 Einleitung ................................................................................................................... 31
5.2 Experimentelles........................................................................................................... 32
6QSAR-ANALYSEN.................................................................................................... 34
6.1 Einleitung ................................................................................................................... 34
6.2 Datensätze .................................................................................................................. 35
6.3 Deskriptoren ............................................................................................................... 39
6.3.1 Kier & Hall-Deskriptoren............................................................................................. 39
6.3.2 Atompaar-Deskriptoren................................................................................................ 39
6.4 Methoden.................................................................................................................... 40
6.4.1 GA-PLS...................................................................................................................... 42
6.4.2 Methode der k nächsten Nachbarn (KNN)..................................................................... 45
6.5 Statistische Signifikanz der QSAR-Gleichungen .......................................................... 48
Inhaltsverzeichnis
II
6.6 Ergebnisse und Diskussion.......................................................................................... 50
6.6.1 Aufstellung der primären Gleichungen.......................................................................... 50
6.6.2 Finale Gleichungen (Kreuzvalidierung) ........................................................................ 52
6.6.3 Robustheit (Permutationstest)....................................................................................... 53
6.6.4 PCA-Analysen............................................................................................................. 56
6.6.5 Trainingsdatensatz....................................................................................................... 57
6.6.6 Vorhersagen................................................................................................................ 58
6.6.7 Datenbankrecherchen................................................................................................... 59
7ZUSAMMENFASSUNG UND AUSBLICK.............................................................. 61
8EXPERIMENTELLER TEIL.................................................................................... 64
8.1 Allgemeines................................................................................................................ 64
8.2 Arbeitsvorschriften...................................................................................................... 66
8.3 Biochemische Arbeitsvorschriften ............................................................................... 89
9ABKÜRZUNGEN ...................................................................................................... 91
10 ANHANG ................................................................................................................... 93
10.1 Pharmakologische Tests.............................................................................................. 93
10.2 Datensätze .................................................................................................................. 94
10.3 PCA-Analysen zur Selektion von Ausreißern............................................................. 100
10.4 Primäre Gleichungen................................................................................................. 102
10.5 Finale Gleichungen.................................................................................................... 104
10.6 Trainingsdatensätze................................................................................................... 107
10.7 Vorhersagen.............................................................................................................. 110
10.8 Zufällige Aktivitäten ................................................................................................. 113
10.9 Vertauschte Aktivitäten............................................................................................. 116
10.10Datenbankrecherchen................................................................................................ 119
11 LITERATUR............................................................................................................ 122
Einleitung
1
1 Einleitung
Moderne Methoden der Pharmaforschung schließen neben chemischen, biochemischen,
radiochemischen und pharmakologischen Methoden immer mehr den Einsatz rationeller
computergestützter Verfahren ein. Das Ziel dieser Verfahren liegt häufig in der Untersuchung
von Struktur-Wirkungsbeziehungen, d.h. es wird versucht die chemische Struktur biologisch
aktiver Verbindungen mit ihrer quantifizierten biologischen Wirkung in Beziehung zu setzen.
Dieses kann sowohl qualitativ (Active Analog Approach, Pharmakophorhypothesen) als auch
quantitativ (QSAR-Analysen, engl.: Quantitative Structure Activity Relationship) erfolgen.
Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen Untersuchungen zur Wirkungsweise und Pharmakologie
von Tolperison, dem z.Z. marktführenden Wirkstoff aus der Klasse der Muskelrelaxantien.
Tolperison nimmt aufgrund seiner Eigenschaften unter den Muskelrelaxantien eine Sonder-
stellung ein, da es im Gegensatz zu den meisten Muskelrelaxantien sehr gut verträglich ist und
nur sehr wenige Nebenwirkungen aufweist.
Über die genaue pharmakologische Wirkungsweise und den genauen Wirkort des Tolperisons
ist nur sehr wenig bekannt. Hinweise deuten jedoch auf eine Beeinflussung von Natrium-
kanälen, in geöffnetem Zustand sowohl auf zentralnervöser Ebene als auch auf peripherer
Ebene, hin. Die Kombination der genannten Methoden stellt ein effizientes Werkzeug zur
Untersuchung dieser Fragestellung dar.
Pharmakologischer Hintergrund
2
2 Pharmakologischer Hintergrund
2.1 Muskelschmerz
Muskelschmerzen aufgrund von Erkrankungen des Bewegungsapparates sind in der ärztlichen
Therapie ein äußerst häufiges Phänomen. So litt im Jahr 1997 etwa jeder zweite Bundesbürger
unter Rückenschmerzen, von denen sich jeder dritte in ärztliche Behandlung begab. Das zu
Beginn meist gefahrlose Krankheitsbild wird jedoch zum Problem, wenn der akute Schmerz
nicht ausreichend behandelt wird und sich so leicht zu einem chronischen und damit oft
therapieresistenten muskulären Schmerzzustand entwickelt. Entscheidend für die Aufrecht-
erhaltung der Schmerzsymptomatik ist das Wechselspiel zwischen Schmerz und Muskel-
verspannung. Bedingt durch den Schmerz kommt es zu einer Fehl- bzw. Schonhaltung. Diese
bewirkt über erhöhte Gewebsspannung eine erneute Erregung der Schmerzrezeptoren. Als
Folge dieser Schmerzreize entwickeln sich wiederum schmerzhafte Muskelverspannungen und
der Kreislauf beginnt von vorn. Die wiederholte Reizung der Schmerzzentren führt langfristig
zu strukturellen Veränderungen in den Nervenzellen. Solche Vorgänge werden als Schmerz-
gedächtnisbildung bezeichnet und stellen die zugrundeliegende Pathophysiologie der Chroni-
fizierung von schmerzhaften Muskelverspannungen dar1.
Therapeutisch gilt es, neben der Akutbehandlung der Schmerzsymptomatik, vor allem diesem
Chronifizierungsprozeß entgegenzuwirken, um so den Schmerz-Verspannungskreislauf zu
durchbrechen. Eckpfeiler im Gesamtkonzept bei der Behandlung von Muskelschmerzen stellen
Muskelrelaxantien dar.
2.2 Muskelrelaxantien
Zentrale Muskelrelaxantien (Myotonolytika) sind Arzneimittel, die ihren spezifischen Angriffs-
punkt an den Schaltneuronen der Reflexbögen im Rückenmark haben und so durch Hemmung
der mono- oder polysynaptischen Reflexe zu einer Erschlaffung der quergestreiften Skelett-
muskulatur führen. Sie unterscheiden sich daher von den peripher angreifenden Muskel-
relaxantien, die eine Impulsübertragung vom Nervenende auf den Muskel hemmen (Acetyl-
cholinantagonisten). Darüber hinaus gibt es Verbindungen, für die ein Effekt sowohl auf
zentrale als auch auf periphere Synapsen diskutiert wird2,3.
Pharmakologischer Hintergrund
3
Während die peripher angreifenden neuromuskulären Blocker bei der chirurgischen Anästhesie
als Hilfsmittel zur Erreichung einer ausreichenden Muskelerschlaffung sowie in orthopädischen
Verfahren zur Erleichterung einer Muskelbehandlung eingesetzt werden, ist das Haupt-
indikationsgebiet der zentral angreifenden Interneuronenblocker die ambulante Behandlung
akuter oder chronisch spastischer und hypertoner Zustände der Skelettmuskulatur. Zentrale
Muskelrelaxantien sind in der Regel an der motorischen Endplatte unwirksam und beeinflussen
kaum die Atemmuskulatur oder das Atemzentrum4. Zu der chemisch sehr heterogenen Gruppe
der zentral wirksamen Muskelrelaxantien gehören u.a. Tranquilizer mit myorelaxierenden
Eigenschaften, Anticholinergika und membranstabilisierende Substanzen vom Lokal-
anästhetika-Typ5,6. Im Gegensatz zu den peripher wirksamen neuromuskulären Blockern, die
entweder eine membranstabilisierende oder eine depolarisierende Wirkung zeigen, ist der
Wirkmechanismus der zentral aktiven Wirkstoffe bisher nicht verstanden. Zentrale Muskel-
relaxantien sind weiterhin dafür bekannt, daß die pharmakologische Wirkung dieser Arznei-
mittel nicht nur die motorisch relevanten Strukturen betrifft, sondern daß oft bereits bei
minimalen therapeutischen Dosen zentralnervöse und psychische Nebenwirkungen auftreten.
Abgesehen von einzelnen wenigen Verbindungen wie z.B. Baclofen7 und Tizanidin8 ist eine
systematische Untersuchung der Neuropharmakologie zentraler Muskelrelaxantien sowie eine
Lokalisierung der Bindung im Zentralnervensystem (ZNS) bisher nicht vorgenommen worden.
2.3 Tolperison - Eigenschaften und Wirkspektrum
Um diese systematischen chemischen und biochemischen Untersuchungen vorzunehmen,
kommt dem Muskelrelaxans Tolperison (1) besondere Bedeutung zu, da es wegen seiner
Wirkungsweise eine Sonderstellung unter den Myotonolytika einnimmt. Tolperison (1) wird in
Deutschland unter dem Namen Mydocalm® vermarktet1. Es zeigt eine stabilisierende Wirkung
auf Membranen sowohl bei erregungsleitenden Strukturen für afferente Impulse am peripheren
Nerv als auch für mono- und polysynaptische Reflexe auf spinaler und supraspinaler Ebene.
O
N
1
Abb. 1: Tolperison.
Pharmakologischer Hintergrund
4
Erst seit wenigen Jahren ist Mydocalm® in der Bundesrepublik Deutschland zugelassen, obwohl
es in den Staaten des ehemaligen Ostblocks seit 35 Jahren und auch weltweit erfolgreich in der
Therapie eingesetzt wird9. Es zeigt im Gegensatz zu vielen anderen Muskelrelaxantien nur sehr
wenige Nebenwirkungen und Gegenanzeigen. Zum einen besitzt Tolperison keine sedativen
Eigenschaften, das heißt es wirkt nicht wie andere zentral wirksame Muskelrelaxantien
beruhigend auf den Organismus. Dadurch ist es z.B. möglich, bei der Behandlung mit
Tolperison aktiv am Straßenverkehr teilzunehmen oder beruflich tätig zu sein. Auch mit
Alkohol zeigen sich keinerlei Interaktionen, d.h. die durch Alkohol eingeschränkte Reaktions-
fähigkeit wird durch Tolperison nicht verstärkt. Zum anderen besitzt Tolperison kein Sucht-
potential bzw. verstärkt ein bestehendes Suchtpotential nicht1. Diese Vorteile im Vergleich zu
anderen Präparaten haben Tolperison nicht nur zum Marktführer gemacht, sondern legen es
auch als wertvolle Modellverbindung zur Untersuchung der Ursachen chronischer Muskel-
schmerzen und auf dem Weg zu verbesserten Muskelrelaxantien nahe.
2.4 Wirkmechanismus
Zur Beschreibung des Wirkmechanismus von Muskelrelaxantien muß zwischen zentral und
peripher wirksamen Relaxantien unterschieden werden, wobei der Mechanismus ersterer noch
nicht genau verstanden ist10.
Angriffspunkt der zentral angreifenden Muskelrelaxantien, die auch als Interneuronenblocker
bezeichnet werden, sind zentrale Synapsen des ZNS. Durch Hemmung polysynaptischer
Reflexe kommt es zu einer Erschlaffung hauptsächlich der Bauchdecken- und quergestreiften
Skelettmuskulatur, wohingegen die Atemmuskulatur und das Atemzentrum kaum beeinflußt
werden. Die meisten zentral wirkenden Muskelrelaxantien zeigen darüber hinaus sedierende
und psychisch entspannende Eigenschaften und werden deshalb vor allem als Tranquilizer
eingesetzt11.
Die Motorik der Skelettmuskulatur wird durch das Nervensystem kontrolliert, wobei der
Spannungszustand durch polysynaptische Reflexe aufrechterhalten wird. Die Verknüpfungs-
stelle zwischen der motorischen Nervenfaser und der Skelettmuskelzelle ist die motorische
Endplatte, an der Acetylcholin als chemischer Überträgerstoff dient. Acetylcholin dringt dabei
nach Freisetzung aus Speichern (synaptische Vesikel) in den Nervenendungen (Synapsen)
durch Diffusion zum Rezeptor im Muskel vor und ändert an der neuromuskulären Endplatte den
Membranwiderstand. Dadurch kommt es zu einem Natrium-Einstrom und als Folge davon zur
Depolarisation mit Erregung der Muskelmembran, wodurch eine Kontraktion ausgelöst wird.
Die im synaptischen Spalt lokalisierte Acetylcholinesterase baut Acetylcholin sofort wieder ab.
Pharmakologischer Hintergrund
5
Nach anschließender Repolarisation der Endplattenmembran ist diese für einen neuen Impuls
bereit. Die peripher angreifenden Muskelrelaxantien wirken als Acetylcholinantagonisten, d.h.
sie konkurrieren mit Acetylcholin um die Rezeptorstelle11. Sie hemmen die Impulsübertragung
vom Nervenende auf den Muskel.
Die als stabilisierende Eigenschaft des Tolperisons auf die Membranstruktur beschriebene
Wirkung bezieht sich auf die Beeinflussung einer Schmerzreizleitung. Alle schädigenden und
deswegen schmerzauslösenden Reize destabilisieren die Membranstruktur der ruhenden
Nervenfasern. Hierdurch kommt es zu einer Konformationsänderung des Kanalproteins und
dadurch zur Öffnung des Kanals mit gleichzeitigem Auftreten eines Natrium-Einstroms in die
Nervenzelle. Der durch Depolarisation verursachte Verlust des bioelektrischen Potentials
provoziert unterschiedliche motorische und vegetative Reflexe bzw. Reaktionen über Rücken-
mark und Hirnstamm. Bleibt der Zustand der lokalen Depolarisation erhalten, so führt dies zu
einem häufigen Auftreten von unregelmäßigen Erregungen und dadurch zu potentiell gewebe-
schädigenden Reizen.
In Anwesenheit von Tolperison wird das Aktionspotential der Zelle durch die Erregungswelle
nicht mehr depolarisiert. Die Ursache ist vermutlich eine Blockade von Natriumkanälen durch
das Tolperison, die entscheidend bei der Auslösung von Schmerzreizen sind1. Wird diese
Blockade lange genug aufrechterhalten, so können die bei der Chronifizierung von Muskel-
schmerzen auftretenden strukturellen Veränderungen der Schmerzmatrix wieder zurückgebildet
werden. Auf Grundlage dieser These dient Tolperison auch als Sonde zur Untersuchung der
molekularen Ursachen der Schmerzenstehung1.
Ausgangssituation und Fragestellung
6
3 Ausgangssituation und Fragestellung
Ziel des Projektes ist es, durch Kombination chemischer, biochemischer, radiochemischer und
theoretischer Methoden Einblicke in die Wirkungsweise von Tolperison zu erhalten, um so
Erkenntnisse über die molekularen Ursachen der Schmerzreizleitung zu erlangen.
Ansatzpunkte für die Untersuchungen bieten Photoaffinitätsmarkierungen mit denen eine
Wirksubstanz am Wirkort fixiert und damit seine Bindungsstelle lokalisiert werden kann.
Voraussetzung für die Durchführung solcher Untersuchungen ist der Einsatz radioaktiv
markierter Tolperisonderivate. Durch diese Markierung können sehr kleine Moleküle, z.B.
Wirkstoffe wie das Tolperison, innerhalb eines Gemisches großer Proteine sehr empfindlich
detektiert werden. So können Tolperison-bindende Proteine von nicht-bindenden unterschieden
werden. Zur Verwirklichung dieser Vorgehensweise ist daher zunächst ein Tolperisonderivat zu
synthetisieren, das lediglich radioaktiv markiert ist und daher die gleiche Wirkung zeigt wie
natives Tolperison. Zur Fixierung wird dabei die Lichtabsorption des aromatischen Ring-
systems im Bereich von etwa 270 nm genutzt. Da in diesem Wellenlängenbereich jedoch auch
eine für Proteine kritische Aktivierung erfolgt, erscheint es notwendig, gleichzeitig Synthese-
möglichkeiten zur Darstellung von Tolperisonderivaten mit photolabiler Gruppe zu unter-
suchen, um gegebenenfalls auch im längerwelligen Bereich aktiviert werden zu können.
Als Testsystem für die Photoaffinitätsmarkierungen bietet sich zunächst der Einsatz von
Acetylcholinrezeptoren (AChR) an. Dieses Protein stellt einerseits den potentiellen Wirkort der
peripheren Wirkung von Tolperison dar und andererseits lassen sich diese Rezeptoren auf
einfache Weise gewinnen und aufreinigen und sind bereits mehrfach in Photoaffinitäts-
markierungen eingesetzt worden12,13.
Als Beitrag zu der immer noch unbekannten Wirkungsweise von Muskelrelaxantien soll
Tolperison auf der Basis von quantitativen Struktur-Wirkungsbeziehungen (QSAR, engl.:
Quantitative Structure Activity Relationship) mit anderen Muskelrelaxantien verglichen
werden. Ziel ist es, die Strukturen der untersuchten Wirkstoffe mit den numerischen Werten der
biologischen Wirksamkeit quantitativ in Beziehung zu setzen. Das daraus resultierende
mathematische Modell kann u.a. dazu herangezogen werden, die Wirksamkeit neuer
Verbindungen bereits am Rechner abzuschätzen, ohne auf biologische oder biochemische
Experimente zurück zugreifen. Als ein weiteres Resultat der QSAR-Gleichungen können
Datenbankrecherchen im Hinblick auf Tolperison-ähnliche Verbindungen vorgenommen
Ausgangssituation und Fragestellung
7
werden, um so mögliche bislang unbekannte Kandidaten bzw. Leitstrukturen für wirksamere
Muskelrelaxantien zu finden.
Die Kombination der Methoden stellt einen synergetischen Ansatz auf dem Weg zu neuen
verbesserten Muskelrelaxantien dar und erlaubt neue Einblicke in die molekularen Ursachen
chronischer Schmerzzustände der Muskulatur.
Organisch-chemische Methoden
8
4 Organisch-chemische Methoden
4.1 Photoaffinitätsmarkierungen
Affinitätsmarkierungen wurden entwickelt, um die Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zu
untersuchen. Das Ziel ist häufig, den spezifischen Rezeptor in einer Mischung mehrerer
Kandidaten zu identifizieren. Diese bestehen z.B. aus membrangebundenen Polypeptiden oder
Untereinheiten eines Proteins. Darüber hinaus ist es möglich, auch diejenigen Aminosäure-
untereinheiten zu lokalisieren, die für die Bindung des Liganden verantwortlich sind.
Bei chemischen Affinitätsmarkierungen werden modifizierte Liganden so eingesetzt, daß diese
mit dem Rezeptor kovalent reagieren. Der Einsatz zusätzlich radioaktiv markierter Derivate
unterstützt dabei die Identifikation intakter Rezeptoruntereinheiten und deren Fragmente14.
Bei Photoaffinitätsmarkierungen (Abb. 2) werden modifizierte Liganden eingesetzt, die zwar
chemisch inert sind, aber reaktive Vorstufen darstellen, die durch Bestrahlung im ultravioletten
oder sichtbaren Bereich demaskiert werden können. Die Ziele bei Photoaffinitätsmarkierungen
sind dieselben wie bei chemischen Affinitätsmarkierungen, jedoch bieten sie eine Reihe von
Vorteilen.
Bindung Photolyse Reaktion Isolierung
Abb. 2: Reaktionsabfolge bei Photoaffinitätsmarkierungen. Zur Lokalisierung des spezifischen Rezeptors wird der
photolabile Ligand (l) durch Photolyse aktiviert. Daraufhin erfolgt irreversible Bindung an den Rezeptor
und Identifizierung des markierten Proteins.
Erstens können beim Einsatz eines chemisch inerten Liganden ohne Schwierigkeiten häufig
notwendige Vorarbeiten am Testsystem durchgeführt werden. Zweitens kann die Aktivierung
bei Bedarf initiiert werden. So lassen sich z.B. schwer erreichbare Rezeptoren innerhalb von
Zellen untersuchen, bei denen chemische Derivate schon vor Erreichen ihres eigentlichen
Zielproteins abreagieren können. Generell ist eine Markierung mit photolabilen Verbindungen
einfacher, da sie am Zielort aktiviert werden können.
Organisch-chemische Methoden
9
Ein weiterer wichtiger Vorteil ist, daß die durch Photolyse in situ erzeugten Intermediate meist
viel reaktiver als chemische Derivate sind. Tatsächlich ist es nahezu unmöglich diese reaktiven
Intermediate zu synthetisieren und sie anschließend zu einer Rezeptorpräparation zu geben. Die
photoaktivierten Spezies können sogar mit Kohlenstoff-Wasserstoffbindungen reagieren, die
von den meisten chemischen Reagenzien nicht angegriffen werden.
4.2 Photolabile Gruppen
Ideale photolabile Gruppen sollten folgende Kriterien erfüllen15:
(1) Die Verbindung sollte hinsichtlich der Lagerung und der Bedingungen, der sie beim
eigentlichen Experiment ausgesetzt ist, stabil sein. Von ganz besonderem Interesse sind bei
biochemischen Experimenten der pH-Wert und die Redox-Eigenschaften des Milieus.
(2) Die Verbindung sollte einfach zu synthetisieren sein. Bis zum letzten Schritt, in dem sie
eingesetzt wird, kann die photolabile Gruppe extremen Bedingungen wie z.B. Oxidationen,
Reduktionen oder nukleophilen und elektrophilen Angriffen ausgesetzt sein. Weitere
Beachtung erfordert die Notwendigkeit, daß das Reagenz in radioaktiver Form mit hoher
spezifischer Aktivität benötigt wird.
(3) Die modifizierte Verbindung sollte dem eigentlichen Liganden, den sie imitieren soll, sehr
ähnlich sein. Starke Veränderungen der Struktur, z.B. durch Einbau einer sterisch
anspruchsvollen Gruppe, können die Affinität zum Rezeptor deutlich senken.
(4) Die photolabile Gruppe sollte angemessene photolytische Eigenschaften besitzen. Erstens
sollte die Aktivierung der Gruppe in einem Wellenlängenbereich erfolgen, der für die
anderen Komponenten des Systems ungefährlich ist, d.h. Wellenlängen unter 300 nm
sollten vermieden werden. Zweitens sollte die Photolyse im Hinblick auf Extinktion und
Quantenausbeute effizient sein.
(5) Die kurzlebigen Intermediate sollten sehr reaktiv sein. Hauptproblem sind hier inaktive
Zwischenstufen, die sich durch Umlagerung der reaktiven Intermediate bilden.
(6) Die resultierenden Addukte aus Ligand und Rezeptor sollten stabil in Bezug auf die
nachfolgende Aufarbeitung, z.B. einer Gel-Elektrophorese, sein.
Organisch-chemische Methoden
10
Die für eine Photoaffinitätsmarkierung wichtigsten Gruppen sind in Abb. 3 beschrieben.
Phenylazid Trifluorethyldiazirin Diazoketoverbindungen
N3
F3C
N N N2
O
Abb. 3: Häufig eingesetzte photolabile Gruppen.
Diese Carben- und Nitren-bildenden Gruppen erfüllen fast alle genannten Voraussetzungen,
wobei die aromatischen Azide und die Trifluorethyldiazirine gegenüber den Diazoverbindungen
in bezug auf das Tolperisonmolekül einfacher zu synthetisieren sind, da in Tolperison bereits
ein aromatischer Ring enthalten ist. Ein weiterer Nachteil von Diazoketoverbindungen ist, daß
sie nach ihrer Photoaktivierung instabil hinsichtlich einer Wolff-Umlagerung sind.
Neben diesen beiden Gruppen werden eine Reihe weiterer Gruppen eingesetzt, wie z.B. α,β-
ungesättigte Ketone (Aceto- und Benzophenone)16 und aromatische Nitroverbindungen17. Diese
bilden nach der Photolyse im Gegensatz zu den anderen genannten Gruppen freie Radikale, die
durch homolytische Bindungsspaltung entstehen. Die Absorptionswellenlängen liegen jedoch
häufig in Bereichen in denen Proteine bereits denaturiert werden. Der Vorteil beim Einsatz α,β-
ungesättigter Ketone bezüglich Tolperison ist, daß diese Gruppe bereits im nativen Molekül
enthalten ist und daher lediglich die Notwendigkeit einer radioaktiven Markierung besteht. Auf
diesem Wege kann bereits ein für pharmakologische und biochemische Untersuchungen
wertvolles Molekül erhalten werden, das jedoch im Wellenlängenbereich von unter 300 nm
absorbiert.
4.3 Radiochemische Methoden
Ziel der Synthese ist es, ein isotopen-markiertes Tolperisonderivat mit möglichst hoher
spezifischer Aktivität darzustellen. Aus Gründen des Strahlenschutzes und der Handhabungs-
sicherheit kommen dafür im zur Verfügung stehenden Isotopenlabor nur die Nucleotide 14C und
3H (Tritium) in Frage. Von diesen besitzt Tritium die deutlich kleinere Halbwertszeit, bei dem
die spezifischen Aktivitäten bei etwa 29 Ci/mmol, d.h. etwa 1011 Zerfällen/Sekunde liegen. Bei
Organisch-chemische Methoden
11
der radioaktiven Synthese ist Grundvoraussetzung, alle durchzuführenden Experimente so oft
wie möglich mit den inaktiven Substanzen durchzuführen, um die Reaktion zu optimieren.
Wichtige zu untersuchende Parameter der Synthese sind:
u Einfache Umsetzung und Syntheseführung bei der Markierung möglichst am Ende
des Syntheseweges.
u Hoher Umsatz und hohe Ausbeuten.
u Einfache Aufarbeitung, Isolierung und Reinigung des Produktes.
u Hohe spezifische radioaktive Markierung.
4.4 Experimentelles
Wie zuvor beschrieben, liegt das Hauptaugenmerk dieses Kapitels in Untersuchungen zur
Synthese radioaktiver und photolabiler Tolperisonderivate. Bei den photolabilen Gruppen
wurden die Untersuchungen auf Synthesen von Phenylaziden und Trifluordiazirinen beschränkt.
Beide Gruppen bieten eine Reihe von Vor- und Nachteilen. Die Azide lassen sich auf
einfachem Weg synthetisieren, jedoch liegt ihr Absorptionsmaximum häufig unter 300 nm.
Diazirine hingegen absorbieren erst ab etwa 340 nm, sind jedoch nur mit hohem Aufwand zu
synthetisieren. Zudem ist die Trifluordiaziringruppe sterisch relativ anspruchsvoll. Aufgrund
dieser Unterschiede konzentrierten sich die Syntheseplanungen auf beide Tolperisonderivate.
4.4.1 Tritiierung von Tolperison
Zur radioaktiven Markierung von Tolperison bieten sich verschiedene Verfahren an. Die
einfachste Methode beruht auf der Wilzbach-Tritiierung, bei der die Verbindung durch
Behandlung mit Tritiumgas und -wasser unspezifisch markiert wird. Diese Art der Tritiierung
liefert jedoch nur selten hohe spezifische Markierungen. Zudem müssen die erhaltenen
Produktgemische aufwendig aufgereinigt werden, um labil gebundenes Tritium zu entfernen.
Andererseits ist es aber möglich, die Radioaktivität gezielt in das Molekül einzubringen. Dieses
kann z.B. durch die Einführung von tritiierten Methylgruppen (-CT3) an geeigneten Stellen der
Synthese erfolgen (z.B. durch Methylierung mit CT3I).
Organisch-chemische Methoden
12
Eine weitere effektive Tritiierungsmöglichkeit ist die Hydrierung bzw. die Hydrogenolyse mit
Tritiumgas. Entsprechende Umsetzungen zeichnen sich meistens durch hohe Ausbeuten,
einfache Aufarbeitung, hohe Reinheit und wenige Nebenreaktionen aus. Zusätzlich liegen die
Kosten für molekulares Tritium um mehrere Größenordnungen unter denen für die meisten
kommerziellen tritiierten Bausteine. Nachteil ist die für Wasserstoff typische hohe Flüchtigkeit
bzw. Diffusionsfähigkeit. Diese Problematik kann nur durch hohen apparativen Aufwand gelöst
werden. Daher waren entsprechende Arbeiten nur außerhalb der zur Verfügung stehenden
Labors möglich und wurden in Kooperation mit einem externen Unternehmen durchgeführt.
4.4.2 Hydrierung
Für die Tritiierung eines ungesättigten Tolperisonderivates mittels molekularem Tritium sind
mehrere Reaktionen denkbar18. Literaturbekannt war bereits die nicht-radioaktive Synthese
einer zu Tolperison ähnlichen nicht-radioaktiven Verbindung 3 durch Hydrierung des ent-
sprechenden α,β-ungesättigten Derivates 2 (Schema 1) 19.
N
O
H2
Pd/C
77 %
N
O
2 3
Schema 1: Modellreaktion für die Hydrierung von Tolperison.
Eine entsprechende Umsetzung eines ungesättigten Tolperisons 4 zu Tolperison (1) zeigt
Schema 2.
N
O
H2
Pd/C
N
O
4 1
Schema 2: Hydrierung eines α,β-ungesättigten Tolperisonderivates 4.
Das Edukt 2 der Literatur wurde unter nicht genau beschriebenen Bedingungen mit Pd/C, H2
hydriert und lieferte das gesättigte Produkt in 77 % Ausbeute19.
Organisch-chemische Methoden
13
Zur Synthese des α,β-ungesättigten Tolperisonderivates wurde die entsprechende Vorschrift
weitgehend adaptiert und das Hydrochlorid von 4 konnte so auf zwei Wegen gewonnen werden.
(1) Durch Mannich-Reaktion von 5 zu 6 und anschließender Aldolkondensation mit Form-
aldehyd zu 4 (Schema 3).
N
OO
i ii N
O
5 6 4
Schema 3: Darstellung von 4 über eine Mannich-Reaktion gefolgt von einer Aldolkondensation.
i) HCHO/Piperidin*HCl/EtOH/73 %
ii) HCHO/EtOH/KOH/70 %
(2) Durch eine gekoppelte Mannich-Aldol-Reaktion (Schema 4).
O
N
O
i
5 4
Schema 4: Darstellung von 4 via gekoppelte Mannich-Reaktion/Aldolkondensation.
i) 2 x HCHO/Piperidin*HCl/AcOH/ 80 %
Die Ausbeuten sind bei der zweiten Methode deutlich höher und es können bis zu 80 % erreicht
werden. Die Aufreinigung erfolgt anschließend durch Umkristallisation aus Et2O/EtOH.
Zur Hydrierung wurden zunächst, wie in der Literatur19 beschrieben, Versuche mit Pd/C, H2
unternommen. Dabei wurde das Hydrochlorid in Essigsäure bei Raumtemperatur umgesetzt.
Die Wasserstoffatmosphäre wurde mit Hilfe eines Ballons aufrecht erhalten. Zu Beginn der
Reaktion konnte dünnschichtchromatographisch ein Umsatz in Richtung von Tolperison
beobachtet werden. Wurde die Reaktion jedoch länger als 2 h fortgesetzt, so zeigte sich die
Bildung eines unpolaren Produktes, das als das hydrierte aromatische β-Eliminierungsprodukt 7
der Mannichbase 1 identifiziert werden konnte.
Organisch-chemische Methoden
14
N
O
AcOH
Pd/C
H2
N
O O
+
4 1 7
Schema 5: Versuch zur Hydrierung von 4.
Zusätzlich konnte die Reaktion nicht bis zum vollständigen Umsatz durchgeführt werden, so
daß eine chromatographische Trennung von Edukt und Produkte nötig war. Dies gelang jedoch
nicht, da sich das Edukt 4 auf Kieselgel zersetzte. Auch beim Wechsel zu basischem
Aluminiumoxid konnte keine ausreichende Trennung erreicht werden.
Um die beschriebenen Probleme zu lösen, wurden die Reaktionsbedingungen auf vielfältige
Weise variiert. Neben dem Katalysator wurden zusätzlich Temperatur, Lösemittel, Reaktions-
dauer, Druck und Apparatur verändert und die Reaktion dünnschichtchromatographisch
verfolgt. Einige der untersuchten Bedingungen sind in Tab. 1 aufgelistet.
Lösemittel Katalysator TAmin Apparatur p
[atm] ca.
Umsatz t [h]
EtOH Pd/C RT HCl Ballon 170 % 4
EtOH PtO2RT HCl Ballon 175 % 4
EtOH (PPh3)3RhCl RT HCl Ballon 150 % 12
AcOH Pd/C RT HCl Ballon 190 % 4
EtOH Pd/C 50 °C HCl Durchfluß 140 % 5
EtOH PtO250 °C frei Durchfluß 145 % 5
EtOH Pd/C RT frei Hydrierapparatur 2.5 90 % 4
EtOH Pd/C RT frei Durchfluß 180 % 5
H2OPd/C RT HCl Ballon 140 % 5
H2OPtO2RT HCl Ballon 180 % 5
EtOAc Pd/C RT frei Ballon 180 % 5
1,4-Dioxan Pd/C RT frei Ballon 160 % 5
Aceton Pd/C RT frei Ballon 160 % 5
Et2OPd/C RT frei Ballon 150 % 5
EtOAc Pd/C 40 °C frei Ballon 150 % 5
Tab. 1: Untersuchungen zur Hydrierung eines ungesättigten Tolperisonderivates 4.
Organisch-chemische Methoden
15
Die besten Ergebnisse liefert die Reaktion in Eisessig. Jedoch kann hier kein vollständiger
Umsatz erreicht werden. Der hohe Umsatz bei erhöhtem Druck ist dagegen auf die teilweise
Hydrierung der Carbonylfunktion zurückzuführen.
Die Ergebnisse zeigen, daß die beschriebene Reaktion nur unzureichend für die Synthese von
radioaktiv markiertem Tolperison geeignet ist. Neben niedriger Ausbeute und schwieriger
Aufreinigung ist die maximale spezifische Radioaktivität auf ca. 27 Ci/mmol beschränkt. Die
theoretisch mögliche spezifische Radioaktivität von etwa 54 Ci/mmol, durch Addition von T2,
kann nicht erreicht werden, da im Verlauf der Aufarbeitung das acide Tritium in α-Position zur
Carbonylgruppe gegen Wasserstoff ausgetauscht wird.
4.4.3 Hydrogenolyse
Die Hydrogenolyse stellt einen alternativen Zugang zur Darstellung radioaktiv markierter
Tolperisonderivate dar. Hydrogenolysen werden in der Radiochemie außerordentlich häufig
durchgeführt, besonders in Fällen, in denen die zu markierenden Moleküle aromatische Ringe
tragen. Zu diesem Zweck werden zunächst Derivate synthetisiert, die Halogensubstituenten am
aromatischen System enthalten. Dabei werden in den meisten Fällen Chlor und Brom ein-
gesetzt, die im Verlauf der Hydrogenolyse durch Tritium ersetzt werden20. Der Vorteil dieser
Methode ist, daß durch Mehrfachsubstitution sehr hohe spezifische Aktivitäten erreicht werden
können. Auch der Einsatz von Iod ist möglich, wird jedoch nur in Fällen durchgeführt, in denen
dieses durch nachfolgende Stannylierung-Iodierung21,22,23 gegen radioaktives Iod ausgetauscht
wird.
Die Einführung der Halogene erfolgt an unterschiedlichen Stellen der Synthese. Häufig wird die
Chlorierung der Aromaten mit Chloramin-T durchgeführt. Zur Bromierung hingegen dienen
meist Umsetzungen mit molekularem Brom.
Vorteilhafter zur Einführung von Brom in das Tolperisonmolekül ist die Möglichkeit, das in der
Mannich-Reaktion zum Tolperison einzusetzende Propiophenon 8 direkt zu bromieren
(Schema 6). Dazu wird dieses zu zwei Äquivalenten wasserfreiem Aluminiumtrichlorid
getropft. Die lösemittelfreie Suspension wird anschließend mit Brom versetzt und bei 80 °C
mehrere Stunden gerührt. Nach Aufarbeitung und destillativer Reinigung wird das mono-
bromierte Produkt 9 in einer Ausbeute von 48 % (farblose Kristalle) erhalten.
Organisch-chemische Methoden
16
Br
O
AlCl3
Br2
48 %
O
8 9
Schema 6: Bromierung des Propiophenons 8 zum monobromierten Derivat 9.
Diese Verbindung stellt den zentralen Baustein für die spätere Hydrogenolyse eines daraus
synthetisierten bromierten Tolperisons dar. Zu dessen Darstellung wird das Brompropiophenon
in einer klassischen Mannich-Reaktion mit Formaldehyd und Piperidinhydrochlorid umgesetzt.
Die niedrige Ausbeute von 45 % läßt sich durch Einsatz der reaktiveren Iminiumsalze24 bis auf
85 % erhöhen (Schema 7).
Br
O
+N
Cl-
+CH2Cl2
85 %
Br
O
N
9 10 11
Schema 7: Mannich-Reaktion mit Methylenpiperidiniumchlorid zum bromierten Tolperisonderivat.
Nach Aufarbeitung wird zunächst das freie Amin erhalten, das jedoch zwecks einfacherer
Handhabung und höherer Stabilität in das Hydrochlorid übergeführt wird.
Mit Hilfe des bromierten Derivates wurden erste Versuche zur Hydrogenolyse mit Pd/C, H2 in
Ethanol unternommen. Der Brom-Wasserstoff Austausch (Schema 8) gelang bereits innerhalb
von 90 min quantitativ.
H2
Pd/C
EtOH
Br
O
NH
O
N
11 1
Schema 8: Syntheseweg zur möglichen Tritiierung von Tolperison (1) durch Hydrogenolyse von 11.
Organisch-chemische Methoden
17
Ein weiterer Vorteil dieser Methode liegt darin, daß neben der beschriebenen monobromierten
Verbindung auch das dibromierte Propiophenon 12 dargestellt werden kann. Damit wurde eine
doppelte Tritiierung möglich. Die Synthese dieses dibromierten Propiophenons 12 gelang
analog der beschriebenen Reaktion unter Verwendung einer erhöhten Menge AlCl3 (5 eq.) und
einer zweieinhalbfachen Menge molekularen Broms (Schema 9). Nach Destillation wird ein
farbloser Feststoff in einer Ausbeute von 46 % erhalten.
Br
O
Br
O
AlCl3
Br2
46 %
N+
Cl-Br
O
Br
N
CH2Cl2
88 %
8 12 13
Schema 9: Darstellung eines doppelt bromierten Tolperisonderivates.
Die Darstellung des entsprechenden dibromierten Tolperisons 13 gelang analog mit Methylen-
piperidiniumchlorid in einer Ausbeute von 88 %.
Mehrere Versuchsreihen zeigten, daß Ansätze des Hydrochlorides in Mengen von etwa 0.10 g
in Ethanol unter Verwendung von 10 % Palladium auf Aktivkohle zum gewünschten Erfolg
führten (Schema 10).
EtOH
H2
Pd/C
85 %
Br
O
N
Br
O
N
H
H
13 1
Schema 10: Darstellung von Tolperison durch Hydrogenolyse von 13.
Die Reaktion konnte auf diese Weise bereits nach ca. 3 h beendet werden. Nach basischer
Aufarbeitung und Umwandlung des dadurch gewonnenen Amins in das Hydrochlorid wurde
Tolperison (1) in Ausbeuten von etwa 85 % erhalten. Auf Grundlage dieser Synthese wurde nun
die Hydrogenolyse hinsichtlich Ausbeute, Reinheit, Reaktionsdauer und Isotopeneffekten
optimiert und analysiert. Dabei wurden zunächst die Möglichkeiten der Variation des
Lösemittels und des Katalysators untersucht. Untersuchungen zur Reaktionsführung im
Organisch-chemische Methoden
18
basischen Milieu unter Zusatz von 10 % Triethylamin verringerten die Reaktionszeit auf
90 min. Eine Verbesserung der Ergebnisse konnte durch Einsatz des freien Amins von 13 bei
der Hydrogenolyse erreicht werden, wodurch die Ausbeute auf 90 % erhöht werden konnte.
Eine zusätzliche Steigerung der Ausbeute wurde durch die Optimierung der Aufarbeitung
erreicht. Hierfür wurde der Katalysator nach der Reaktion nicht mehr über Celite, sondern
direkt über eine geeignete Glasfritte filtriert. Nach mehrfachem Waschen des Katalysators und
des Reaktionskolbens mit Ethanol wurden die vereinigten Filtrate eingeengt. Letzte Reste
Triethylamin konnten im Hochvakuum entfernt werden. Das erhaltene freie Amin wurde in
absolutem Diethylether durch Zugabe von Methanol und Acetylchlorid in das Hydrochlorid
überführt. Auf diese Weise wurde Tolperison in nahezu quantitativer Ausbeute erhalten.
Zur Verifizierung dieses Ergebnisses wurden, neben der mehrfachen Wiederholung der
einzelnen Reaktionsschritte, zusätzlich Experimente zur Untersuchung eines möglichen
Isotopeneffektes durchgeführt (Abb. 4). Mehrere Parallelexperimente von Hydrogenolysen mit
Wasserstoff und Deuteriumgas zeigten, daß kein signifikanter Unterschied bei der Ausbeute
festgestellt werden konnte, so daß die beschriebene Reaktion nun mit Tritium durchgeführt
wurde.
Abb. 4: 1H-NMR Spektren von Dibrom-tolperison und nach der Hydrogenolyse mit Wasserstoff und Deuterium
(Bereich von 7 - 9 ppm, aromatische Protonen). Zu erkennen sind die Kopplungen der aromatischen
Protonen nach Umsetzung mit Wasserstoff sowie die Hochfeldverschiebung des Singuletts der
aromatischen Protonen des dibromierten Tolperisons nach Umsetzung mit Deuteriumgas.
BrN
Br
O
H
H
13
H2D2
N
O
H
H
H
H
1
N
O
D
D
H
H
1a
Organisch-chemische Methoden
19
Die Hydrogenolyse wurde in einem speziell für Arbeiten mit Tritium konstruiertem Abzug
zusammen mit einem Mitarbeiter der Firma TriTec durchgeführt (Abb. 5). Dabei wurde
zunächst, wie zuvor beschrieben, das dibromierte Hydrochlorid 13 (130 mg) in das freie Amin
und dieses in den Reaktionskolben übergeführt. Nach Lösen in Ethanol und Triethylamin
erfolgte der Anschluß des Kolbens an die Hydrierungsapparatur.
Abb. 5: Tritiierungsanlage mit Reaktionskolben und UT3-Vorratsbehältern der Firma TriTec, St. Gallen, Schweiz.
Nach Evakuierung wird die Apparatur durch Erhitzen von UT3-Vorratsbehältern mit Tritium
geflutet und die Reaktion durchgeführt. Nach der zuvor ermittelten erforderlichen Reaktionszeit
wird das Lösemittel durch Lyophilisierung (Gefriertrocknen) entfernt. Daraufhin erfolgt die
weitere Aufarbeitung und Umwandlung in das Hydrochlorid wie beschrieben. Zur Analyse der
Ergebnisse wurden zunächst dünnschichtchromatographische Tests durchgeführt, die zeigten,
daß entgegen den nicht-radioaktiven Experimenten kein vollständiger Umsatz erreicht worden
war. Nach der Reaktion lagen immer noch etwa 20 % des Produktes in Form des mono-
bromierten Tolperisons vor.
Zur Trennung des Gemisches wurde daher eine präparative HPLC durchgeführt. Die Verteilung
der Radioaktivität im Vergleich mit der UV-Absorption zeigt Abb. 6. Für spätere Unter-
suchungen und Experimente wurde die Fraktion zwischen 6 und 8 Minuten verwendet.
UT3 Behälter
Reaktionskolben
Organisch-chemische Methoden
20
t [min]
Abb. 6: Reinigung von 3H-Tolperison mittels präparativer HPLC. Zum Vergleich sind die UV-Absorption und die
gemessenen Zerfälle dargestellt.
Das so erhaltene zweifach tritiierte Tolperison wurde mit Hilfe der LC/MS analysiert. Als
Ergebnis wurde Tolperison mit einer spezifischen Aktivität von etwa 50 Ci/mmol erhalten
(Abb. 7). Die im Verlauf der weiteren Untersuchungen eingesetzten absoluten Aktivitäten
wurden mittels Szintillationsspektrokopie ermittelt.
Berechnung der spez. Aktivität
Verbindung M Massezahl % spez. Aktivität
[g/mol] [Ci/mmol]
[3H]-1 247.4 248 26.9 29
[3H]2-1 249.4 250 71.5 58
[3H]3-1 251.4 252 1.6 87
Summe = 100.0 51
Abb. 7: LC/MS Spektrum von 3H-Tolperison. Zu erkennen ist der Anteil von etwa 1 % dreifach tritiiertem
Tolperison. Ursache hierfür ist eine Mehrfachbromierung des Eduktes 13.
Zerfälle
UV Absorption
Organisch-chemische Methoden
21
Um mit dem erhaltenen tritiierten Tolperison Photoaffinitätsmarkierungen durchzuführen,
wurde dieses nach Entfernen des HPLC-Laufmittels in Puffer pH 7 aufgenommen, um auf diese
Weise geeignete Bedingungen für Arbeiten mit Proteinen zu gewährleisten.
4.4.4 Trifluordiazirinotolperison
Neben den Synthesen des radioaktiv markierten Tolperisons wurden Untersuchungen zur
Synthese von Tolperison mit photolabilen Markern durchgeführt.
In bezug auf die Synthese eines Trifluordiazirin-Tolperisons wurden die Möglichkeiten der
Darstellung der Verbindung 14 und der daraus abgeleiteten Verbindung 15 für eine mögliche
radioaktive Synthese untersucht (Abb. 8).
F3C
NN
O
N
F3C
NN
BrO
N
14 15
Abb. 8: Derivate von Tolperison mit einer Trifluordiaziringruppe als photolabilem Marker.
Mögliche Synthesewege zu den geplanten Molekülen verlangen zunächst die Bildung eines
Trifluoracetophenons, das die Ausgangsverbindung zur Synthese der Diazirine ist. Die
Umsetzung zur gewünschten Gruppe erfolgt in einer mehrstufigen Synthese über das ent-
sprechende Oxim, das Tosylat und das Diaziridin25.
Für die erfolgreiche Synthese ist es entscheidend, auf welcher Stufe das eigentliche Tolperison-
gerüst aufgebaut werden soll. Eine Möglichkeit besteht in der Bildung eines
p-Bromo-Propiophenons (16), das nach Schutz als Ketal 17 und nachfolgender Grignard-
Reaktion in das entsprechende Trifluoracetophenon 18 übergeführt wird.
Organisch-chemische Methoden
22
Br
O
Br
O O O O
F3C
O
i) Mg
ii) CF3COOEt
HO(CH2)2OH
p-TsOH
Toluol ∆
16 17 18
Schema 11: Einführung der Trifluoracetylgruppe.
Daran anschließend folgen die Reaktionsschritte zum Diazirin 20, Spaltung des Ketals und
Bildung des gewünschten Produktes 14 durch Mannich-Reaktion.
O O
F3C
O
O O
F3C
HN NH
F3C
N N
O
N
19 20 14
Schema 12: Reaktion zum modifizierten Tolperison.
Dieser Reaktionsweg hat jedoch Nachteile, da zum einen die Darstellung des Ketals 17
schwierig ist und zum anderen der Reaktionsweg insgesamt 9 Stufen umfaßt. Zudem ist die
Darstellung eines entsprechenden bromierten Derivates für eine anschließende Hydrogenolyse
nicht trivial.
Einfacher ist es, die gewünschte Propiophenylgruppe erst nach Aufbau des Diazirins 21 in das
Molekül einzubringen. Die zu diesem Zweck durchzuführende Friedel-Crafts-Acylierung ist
bisher nicht dokumentiert worden, jedoch sollte die Diaziringruppe aufgrund ihrer chemischen
Stabilität für diese Umsetzung geeignet sein15,26.
Organisch-chemische Methoden
23
CF3
NN
O
CF3
NN
O
Cl
LA
21 22
Schema 13: Friedel-Crafts Acylierung.
Zu Beginn der Synthese wird das Trifluoracetophenon 24 nach unterschiedlichen Methoden in
mäßigen Ausbeuten dargestellt. Alle Verfahren basieren auf der Umsetzung von Phenyl-
lithium27 bzw. des entsprechenden Grignardreagenz mit Trifluoressigsäure oder seinen
Derivaten28,29,30. Die im Vergleich zur einfachen Umsetzung von Phenylmagnesiumbromid mit
Trifluoressigsäure31 erreichten Verbesserungen der Ausbeute sind jedoch nur gering (Schema
14).
CF3
O
BrMg
CF3COOH
54 %
23 24
Schema 14: Darstellung von Trifluoracetophenon.
An dieser Stelle der Synthese kann bereits das gewünschte Brom in das Molekül eingeführt
werden. Dazu wird das Trifluoracetophenon mit Dibromisocyanursäure32 in konzentrierter
wasserfreier Schwefelsäure umgesetzt (Schema 15)33. Die Umsetzungen zum bromierten
Diazirin 15 erfolgen wie nachfolgend für das nicht-bromierte Derivat beschrieben.
CF3
O
Br
DBICA
H2SO4
60 %
CF3
O
24 25
Schema 15: Bromierung von Trifluoracetophenon.
Organisch-chemische Methoden
24
Nach der Synthese des Acetophenons 24 erfolgt die Umsetzung zum Oxim 26 mit Hydroxyl-
ammoniumchlorid unter basischen Bedingungen (Schema 16). Beste Ergebnisse werden dabei
unter Einsatz von 2-Propanol und Kaliumhydroxid (Ausbeute 90 %) erreicht.
Zur Umsetzung des Oxims 26 zum Tosylat 27 wird die Literaturvorschrift25 mit Pyrridin und
Toluolsulfonsäurechlorid (Ausbeute 61 %, 5 h Rückfluß) durch die bedeutend einfachere
Methode in CH2Cl2/NEt3 und DMAP (cat.) ersetzt26,34 (Ausbeute nach 10 min Rühren
quantitativ).
CF3
O
CF3
NOH
CF3
NOTs
NH3OHCl
i-PrOH
KOH
90 %
CH2Cl2
NEt3,TsCl
DMAP
quant.
24 26 27
Schema 16: Darstellung des Trifluormethyltosylates.
Aus dem Tosylat 27 wird anschließend das Diaziridin 28 gewonnen25. Dafür wird das Tosylat
27 zunächst in trockenem Diethylether gelöst und die Lösung in einem Hochdruckgefäß auf
-50 °C gekühlt. Nachfolgend wird bei dieser Temperatur Ammoniak einkondensiert, das Gefäß
dicht verschlossen, zur Reaktion auf RT erwärmt und über Nacht gerührt. Zur Aufarbeitung
wird wiederum auf -50 °C gekühlt, das Gefäß geöffnet und der Ammoniak im Abzug
abgedampft. Nach Abfiltrieren des Ammoniumtosylates wird das Produkt 28 in einer Ausbeute
von 87 % erhalten.
CF3
HN NH
CF3
NOTs
NH3
-50 °C
87 %
27 28
Schema 17: Cyclisierung zum Diaziridin.
Die Umsetzung des Diaziridins 28 zum Diazirin 21 erforderte nun eine entsprechenden
Oxidation. Die allgemeine Vorschrift unter Einsatz von frisch erzeugtem Silberoxid25 liefert das
gewünschte Produkt zwar in nahezu quantitativer Ausbeute, einfacher und schneller jedoch ist
die Umsetzung mit elementaren Iod in Triethylamin26,34. Bei anderen Methoden werden t-
BuOCl oder BuOCl als Oxidationsmittel verwendet oder die Swern-Oxidation genutzt35.
Organisch-chemische Methoden
25
CF3
N N
CF3
HN NH Ag2O
od. I2/NEt3
98%
28 21
Schema 18: Oxidation des Diaziridins zum Diazirin.
Nachfolgend wurden die Möglichkeiten der Friedel-Crafts-Acylierung des Diazirins untersucht
(Schema 13, S. 23). Dazu wurde Propionsäurechlorid in polaren aprotischen Lösemitteln
(Dichlorethan oder Dichlormethan) unter Lewissäurekatalyse (AlCl3) mit dem Diazirin 21 zur
Reaktion gebracht. Alle untersuchten Reaktionsbedingungen führten jedoch zur Zersetzung des
Eduktes bzw. es konnte keine Umsetzung festgestellt werden.
Umsetzungen des Diaziridins 28 mit einem Überschuß Lewissäure führte nur zur einer
Acetylierung der freien Aminogruppen, so daß die Synthese nicht weitergeführt wurde.
4.4.5 Azidotolperison
Neben der Trifuordiaziringruppe gehören aromatische Diazo- bzw. die aus diesen zugänglichen
Azidoverbindungen zu den am häufigsten eingesetzten photolabilen Gruppen in der bio-
chemischen Forschung. Neben einer Absorption im Wellenlängenbereich von etwa 250 nm
zeigen die Absorptionsspektren der Azide Schultern bei etwa 285 nm. Elektronenziehende
Gruppen am Aromaten verursachen eine Verschiebung in den längerwelligen Bereich, so daß
diese Gruppen für elektronenarme Aromaten wie z.B. Tolperison geeignet sind. Neben den
beschriebenen Absorptionseigenschaften zeichnen sich Azoverbindungen und Azide durch
einfachen Zugang aus, da sie durch Diazotierung von aromatischen Aminen und anschließender
Umsetzung mit Stickstoffwasserstoffsäure gewonnen werden können.
NH2N3
N2+Cl -
HNO2HN3
R R R
29 30 31
Schema 19: Einführung der Azidogruppe.
Organisch-chemische Methoden
26
Intention nachfolgender Untersuchungen mußte es nun sein, eine Aminogruppe in das
Tolperisonmolekül einzubauen. Hierfür wurde zunächst untersucht, an welcher Stelle auf dem
Syntheseweg zum Diazo- bzw. Azidotolperison die Einführung des Stickstoffs in das Molekül
möglich war. Eine Möglichkeit ist die Einführung einer Nitrogruppe, die nachfolgend durch
Reduktion in eine Aminogruppe übergeführt werden kann.
Erfolgreich zeigte sich in dieser Hinsicht die Umsetzung von 4'-Methylpropiophenon (8) mit
100 %-iger Salpetersäure bei 0 °C. Bei dieser Temperatur konnte eine mögliche Oxidation der
Carbonylgruppe zur Carboxylgruppe vermieden und 4'-Methyl-3'-nitro-propiophenon (32) in
einer Ausbeute von 80 % erhalten werden (Schema 20).
O
NO2
O
100 %-ige HNO3
80 %
8 32
Schema 20: Darstellung von 4'-Methyl-3'-nitro-propiophenon.
Zur weiteren Umsetzung wurde aus diesem Propiophenon mittels Mannich-Reaktion das
Nitroderivat von Tolperison 33 in befriedigender Ausbeute (48 %) erhalten.
O
NO2
N+
Cl-
O
NO2
N
48 %
CH2Cl2
O
NH2
N
Fe
EtOH / HCl
∆
84 %
32 33 34
Schema 21: Darstellung des Nitroderivates von Tolperison.
Zur Überführung der Nitrogruppe in eine Aminogruppe mittels Reduktion eignete sich
vorzugsweise die Umsetzung des Hydrochlorides von 33 mit Eisenpulver in einer siedenden
Mischung aus Ethanol und konz. HCl36 (10 : 1). Nach kurzer Reaktionszeit (30 min) und
basischer Aufarbeitung wird das freie Aminotolperison 34 in einer Ausbeute von 84 % erhalten.
Dieses wird anschließend in einer zweistufigen Reaktion zum Azid umgesetzt (Schema 22).
Organisch-chemische Methoden
27
Hierzu wird das Amin 34 in einer wäßrigen Tetrafluoroborsäure-Lösung mit Natriumnitrit
umgesetzt. Anschließend wird Natriumazid hinzugegeben und das Azid 36 in guter Ausbeute
(82 %) erhalten.
HNO2
BF4-
O
NH2
N
O
N2+BF4-
N
34 35
HN3
inges. 82 %N
N3
O
36
Schema 22: Syntheseweg zu Diazo- und Azidotolperison.
Zur Analyse der Verwendung des Azidotolperisons bei Photoaffinitätsmarkierungen wurde
zunächst sein UV-Spektrum untersucht. Neben der für Tolperison typischen Bande bei 270 nm
erschien eine weitere Bande bei 310 nm, die auf die gewünschte Azidogruppe hinweista.
aNeben dieser UV-Absorption konnte im IR Spektrum eine für aromatische Azide charakteristische Bande bei 2112 cm-1 (s)
mit Fermi Resonanz (∆ν ~ 50 cm-1) nachgewiesen werden.
Organisch-chemische Methoden
28
Abb. 9: Absorptionsspektrum des Azidotolperisons.
Die photolabilen Eigenschaften des Azidotolperisons wurden durch wiederholtes Bestrahlen mit
UV-Licht in methanolischer Lösung untersucht. Dazu wurde der Wellenlängenbereich auf
280-320 nm mit Hilfe eines Interferenzfilters beschränkt. Abb. 9 zeigt die zeitliche
Veränderung der UV-Absorption. Bereits nach 30 min Bestrahlung mit UV Licht geringer
Intensität hat sich die Verbindung zersetzt. Diese Untersuchungen weisen darauf hin, daß die
Verbindung für Photoaffinitätsmarkierungen gut geeignet ist.
Für den Einsatz dieser Verbindung 36 ist die Einführung eines radioaktiven Markers notwendig.
Untersuchungen dazu verliefen analog zu vorangegangenen Experimenten in Richtung eines
bromierten Azidotolperisons 37 (Abb. 10).
N3
Br
N
O
37
Abb. 10: Brom-azido-tolperison.
0 min
2 min
5 min
15 min
30 - 120 min
Organisch-chemische Methoden
29
Als Zugang zu dieser Verbindung bieten sich sowohl die Bromierung des Propiophenons 32 als
auch die Nitrierung des bromierten Propiophenons 9 an. Da jedoch der aromatische Ring des
ersteren sowohl durch die Carbonylgruppe als auch die Nitrogruppe desaktiviert ist, scheint eine
Bromierung wenig erfolgversprechend. Daher wurde die Nitrierung des bromierten Derivates
untersucht. Zufriedenstellende Ergebnisse konnten nur bei -15 °C in 100 %-iger Salpetersäure
erreicht werden, wobei 5'-Bromo-4'-methyl-2'-nitro-propiophenon (38) und das 3'-Bromo
Derivat 39 im Verhältnis 80:20 erhalten wurden (Abb. 11).
BrNO2
O
Br
ONO2
Br
O
100 %-ige
HNO3
-15 °C
+
46 %15 %
9 38 39
Abb. 11: 5'-Bromo-4'-methyl-2'-nitro-propiophenon (38) und 3'-Bromo-4'-methyl-2'-nitro-propiophenon (39).
Nach Umkristallisation und chromatographischer Trennung erfolgten Versuche zur Mannich-
Reaktion dieser Verbindungen. Die klassische Methode mit Formaldehyd, ebenso wie
Reaktionen mit den reaktiveren Imminumsalzen24, führten aufgrund der stark elektronen-
ziehenden Natur des substituierten aromatischen Ringes nur zu minimalen Umsätzen. Das
gewünschte Produkt konnte dabei nicht isoliert werden.
Br
ONO2N+
Cl-Br
NO2
O
N
38 40
Schema 23: Syntheseversuch zum Bromo-nitro-tolperison 40.
Zur Verbesserung der Reaktion wurden die Iminiumsalze nicht in Form ihrer Chloride
eingesetzt, sondern aus N-Piperidinmethylen-benzotriazol gewonnen. Dieser durch klassische
Mannich-Reaktion zugängliche Feststoff37 liegt in flüssiger Phase als 1-N-Piperidinmethylen-
benzotriazol und 2-N-Piperidinmethylen-benzotriazol im Gleichgewicht vor. Um aus dieser
Organisch-chemische Methoden
30
Verbindung die reaktiven Iminiumsalze zu gewinnen, wird sie durch starke Lewissäuren (z.B.
TiCl4) gespalten38.
N
N
N
NTiCl4+N
N
NN+
41 10
Schema 24: Iminiumsalze aus N-Piperidinmethylen-benzotriazol.
Zu diesem Iminiumsalz wird das umzusetzende Keton 38 gegeben. Trotz Einsatz dieser sehr
reaktiven Verbindungen gelang es nicht das 3'-Brom-2'-nitro-propiophenon oder das 5'-Brom-
2'-nitro-propiophenon in befriedigenden Mengen umzusetzen. Auch weitere Versuche, ein
gemischt bromiertes und aminiertes Propiophenon unter Einsatz geschützter Amine zu
synthetisieren, waren bislang nicht erfolgreich. Da jedoch die Azidogruppe aussichtsreich im
Hinblick auf eine Photoaffinitätsmarkierung ist, sind zukünftige weitere Untersuchungen zur
Darstellung eines radioaktiven Analogons nötig.
Biochemische Untersuchungen
31
5 Biochemische Untersuchungen
5.1 Einleitung
Über die genaue Wirkungsweise und den Wirkort von Tolperison sind keine eindeutigen
Angaben in der Literatur zu finden. Es wird davon ausgegangen, daß sowohl zentrale wie
periphere Einflüsse vorhanden sind, wobei es einige Hinweise auf kanalblockierende Eigen-
schaften gibt1. Um Aussagen über wirkstoffbindendes Gewebe und Proteine machen zu können,
werden nachfolgend Photoaffinitätsmarkierungen beschrieben, die mit Hilfe des synthetisierten
radioaktiven Tolperisons durchgeführt wurden. Mit ihrer Hilfe ist es möglich, Aussagen über
die Bindungsorte und Bindungseigenschaften von Tolperison an den untersuchten Proteinen zu
treffen.
Zur Überprüfung der peripheren Wirkungsweise von Tolperison stellt der nicotinische Acetyl-
cholinrezeptor (nAChR) ein gutes Modellsystem dar. Der nAChR zählt zur Familie der
ligandengesteuerten Ionenkanäle. Die Bindung von Acetylcholin (ACh) oder anderer Agonisten
(z.B. Nikotin) bewirkt die vorübergehende Öffnung der rezeptorintegralen Ionenpore. Unter
physiologischen Bedingungen setzt daraufhin ein Kationenstrom ein. Die mit diesem Ladungs-
fluß einhergehende Änderung des Membranpotentials kann bei Überschreiten eine Schwellen-
wertes zu einem Aktionspotential und somit zur Reizweiterleitung führen.
Viele grundlegende Vorstellungen zur Struktur und Funktion von Neurorezeptoren mit
integralem Ionenkanal wurden am Beispiel des nAChR aus dem elektrischen Organ von
elektrischen Rochen oder Aalen (Torpedo oder Electrophorus) entwickelt. Dieses Gewebe
gleicht einem Muskel, der seinen kontraktilen Apparat verloren hat und im wesentlichen nur
noch aus Membranen besteht, die der muskulären Endplattenregion entsprechen39. Die extrem
hohe Konzentration und leichte biochemische Zugänglichkeit des Rezeptorproteins in Elektro-
cyten erlaubten die Identifizierung der Acetylcholinbindungstelle und anderer wichtiger
Domänen40. Die Aufklärung der Primärstruktur des nAChR begründete bis heute Modell-
vorstellungen für ligandengesteuerte Ionenkanäle41.
Aufgrund dieser Eigenschaften dient der nAChR in diesen Untersuchungen als Modellsystem
zur Untersuchung der kanalblockierenden Eigenschaften von Tolperison.
Biochemische Untersuchungen
32
5.2 Experimentelles
Die Photoaffinitätsmarkierungen konnten in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. A. Maelicke an
der Universität Mainz durchgeführt werden. Dafür wurden die entsprechenden Membran-
fraktionen aus dem Gewebe des elektrischen Organs von Torpedo Marmorata gewonnen. Die
daraus erhaltene Proteinmischung hatte eine Konzentration von etwa 3 mg/ml.
Die Überprüfung der Qualität der Membranpräparation durch SDS-PAGE Analyse (Abb. 12)
zeigt erwartungsgemäß die vier Typen von Untereinheiten, wobei im Fall des Rezeptors von
Torpedo Marmorata die α−Untereinheit zweimal vorhanden ist.
Abb. 12: Membranfraktionen von Torpedo Marmorata. Bahn 1 zeigt die getrennte mit Coomassie Blau gefärbte
Membranfraktion, Bahn 2 einen Molekulargewichtsstandard.
Mit Hilfe von Photoaffinitätsmarkierungen wurden anschließend Untersuchungen zur Bindung
von Tolperison an den Acteylcholinrezeptor durchgeführt. Dazu wurden 100 µl der Protein-
lösung in die Photoreaktionsküvette gegeben und 200 µl einer 150 µM Lösung von 3H-
Tolperison hinzugefügt. Nach 15 min Inkubation wird diese Mischung fünfmal einem UV-Blitz
von 2 kJ (254 nm) ausgesetzt. Die resultierende Mischung wird durch SDS-PAGE getrennt und
anschließend zur Analyse die Proteine mittels Western Blot auf Nitrocellulose übertragen. Die
Lokalisierung der proteinisch gebundenen Radioaktivität erfolgt durch Fluorographie auf
Röntgenfilmen. Die Ergebnisse dieser Photoaffinitätsmarkierungen sind in Abb. 13 wieder-
Untereinheiten
des nicotinischen
Acetylcholinrezeptors {δ
γ
β
α
1 2
Biochemische Untersuchungen
33
gegeben. Die detektierte proteinische Radioaktivität ist in Bereichen der Untereinheiten des
nAChR zu erkennen und deutet auf eine Bindung von Tolperison am nAChR hin. Jedoch sind
auch unspezifische Bindungsorte zu erkennen.
Abb. 13: Photoaffinitätsmarkierungen mit kleinen Ligandkonzentrationen. Die Bahn zeigt die fluorographische
Detektion proteinisch gebundener Radioaktivität.
Die Ergebnisse belegen die Eignung des radioaktiven Tolperisons als Photoaffinitätsliganden
und liefern Hinweise auf die kanalblockierenden Eigenschaften von Tolperison. In weiteren
Untersuchungen sind weitergehende Experimente mit dem nAChR notwendig. Neben diesem
sind Aufgrund elektrophysiologischer Messungen bereits Natriumkanäle als mögliche Wirkorte
des Tolperisons identifiziert worden. Analoge Untersuchungen zur vorliegenden Arbeit mit
solchen Kanalproteinen werden genauere Erkenntnisse über den Wirkort von Tolperison liefern.
Bereich der Untereinheiten
des nikotinischen
Acetylcholinrezeptors {
unspezifische
Markierungen
QSAR-Analysen
34
6 QSAR-Analysen
6.1 Einleitung
QSAR-Analysen wurden erstmals von Hansch et al. im Jahre 1964 eingeführt42. Unter der
Annahme, daß Unterschiede in den strukturellen Eigenschaften biologisch aktiver
Verbindungen Unterschiede in den biologischen Aktivitäten verursachen, können quantitative
Modelle aufgestellt werden, die diesen Zusammenhang beschreiben. Konventionelle Methoden
stützen sich dabei auf multiple lineare Regression (MLR).
Viele unterschiedliche Methoden wurden seit den Arbeiten von Hansch entwickelt. Sie
beinhalten sowohl zweidimensionale (2D) als auch dreidimensionale (3D) QSAR-Methoden.
Der Unterschied dieser Methoden basiert auf den strukturellen Parametern, die die Moleküle
beschreiben.
Die meisten 2D-QSAR-Methoden stützen sich auf mit Hilfe der Graphentheorie erhaltene
Graphenindizes. Grundlegende Arbeiten stammen von Randic,43 und Kier und Hall44,45,46. Die
Beschreibung der chemischen Struktur erfolgt dabei auf indirekte Weise und die erhaltenen
Parameter werden erfolgreich bei QSAR-Untersuchungen eingesetzt46. Nachteil der 2D-
Deskriptoren ist ihre Unzulänglichkeit, zwischen Stereoisomeren zu unterscheiden.
Mit der Entwicklung akkurater Computermethoden zur Generierung dreidimensionaler (3D)
Konformationen chemischer Strukturen begann die Entwicklung von QSAR-Methoden unter
Verwendung dreidimensionaler Deskriptoren, um auf diese Weise die Schwierigkeiten und
Probleme, die bei der Verwendung von 2D-Deskriptoren auftreten, zu beseitigen. Die vielleicht
populärste Methode zur Durchführung von 3D-QSAR-Analysen ist die vergleichende
molekulare Feldanalyse (CoMFA, engl. Comparative Molecular Field Analysis)47, die molekül-
graphische Darstellungen mit der PLS-Statistik (engl.: Partial Least Squares) kombiniert und so
breite Anwendung in der medizinischen Chemie und in Toxikologiestudien gefunden
hat48,49,50,51. Grundvoraussetzung für den dreidimensionalen Vergleich der Strukturen
untereinander ist eine sinnvolle Überlagerung der chemischen Verbindungen. Dies kann sowohl
manuell, bei Verbindungen mit ähnlichen Grundgerüsten, als auch automatisch mit Hilfe von
Pharmakophorhypothesen erfolgen. Ist jedoch eine zweifelsfreie Überlagerung nicht möglich,
sind den Anwendungen der 3D-Methoden Grenzen gesetzt.
QSAR-Analysen
35
Neuere Trends sowohl bei 2D- als auch bei 3D-Methoden weisen in Richtung der Entwicklung
optimaler QSAR-Modelle mit Hilfe der Variablenselektion. Unter der Annahme, daß nur ein
Teil der verwendeten Deskriptoren sinnvoll und statistisch signifikant zur Korrelation mit der
biologischen Aktivität ist, werden diese selektiert. Die optimale Auswahl der Deskriptoren
erfolgt durch Kombination stochastischer Suchmethoden mit Korrelationsmethoden. Als
Suchverfahren kommen dabei unter anderem Simulated-Annealing Methoden52, genetische
Algorithmen53 oder evolutionäre Algorithmen54,55,56,57 zum Einsatz. Zur Korrelation der
Deskriptoren mit den biologischen Aktivitäten der untersuchten Verbindungen werden unter
anderem statistische Methoden wie MLR und PLS-Analysen eingesetzt, aber auch künstliche
neuronale Netze (ANN) sind wichtige Hilfsmittel52,53,54,55,56,57. Durch Einsatz dieser
Algorithmen können QSAR-Modelle im Vergleich zu Modellen, die ohne Variablenselektion
erhalten werden, signifikant verbessert werden. Methoden der Variablenselektion wurden dabei
sowohl im Gebiet der 3D-QSAR58,59 als auch der 2D-QSAR eingesetzt.
6.2 Datensätze
Trotz der breiten Anwendung von zentralen MR konnte bisher kein Zielprotein eindeutig
identifiziert werden. Daher sind keine direkten Meßwerte einer Ligandenbindung (d.h. Ki- oder
IC50-Werte) verfügbar. Statt dessen werden meist pharmakologische Tests eingesetzt, die das
Verhalten von Nagetieren nach der Wirkstoffaufnahme beurteilen. Diese Methoden beruhen auf
der Annahme, daß die chemische Struktur und die biologische Aktivität direkt miteinander
korrelieren, obwohl komplexe biologische Daten wie z.B. ED50-Werte aus einer Reihe unter-
schiedlicher unabhängiger Prozesse (z.B. Bioverfügbarkeit, Verteilung, Metabolismus, Bindung
an den Rezeptor) resultieren. Um nun quantitative Beziehungen zwischen chemischer Struktur
und biologischer Aktivität aufzustellen, wurden effektive Dosis-Konzentrationen (ED50)
ausgewählt, um unterschiedliche Pharmaka miteinander zu vergleichen und eine Beziehung
zwischen pharmakologischen Aktivitäten und strukturellen Eigenschaften aufzustellen. Unter
der Voraussetzung, daß eine Gruppe von MR im Hinblick auf (1) die Anzahl unterschiedlicher
Verbindungen mit bekannter Aktivität und (2) die strukturelle Heterogenität vorhanden sein
soll, wurden die möglichen pharmakologischen Tests auf diejenigen beschränkt, die an nicht-
betäubten Mäusen durchgeführt worden sind. Durch eine Literaturrecherche über die letzten 30
Jahre wurde eine Reihe unterschiedlichster Testprozeduren gefunden (Tab. 2, s.a. Anhang,
Kapitel 10.1, S. 93).
QSAR-Analysen
36
Pharmakologischer Test
Literatur 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72
Jahr der Veröffentlichung
1965
1967
1971
1973
1973
1973
1987
1987
1989
1992
1993
1994
1995
Traction-Test + + +
chimney test + +
inclined screen test + + + +
horizontal grid test +
grip strength test + +
Rotarod-Test + ++++R+
pull up test R
morphine-induced Straub tail A + +
PTZ (convulsant) + + + + + + R
antifighting test +R+
spont. motor activity (actimetry) + +
MES (convulsant) +++ M+ +
nicotine induced convulsion +
prolong. hexobar-bital narcosis +M
block of flexor reflex I
strychnine induced convulsion +
loss of righting reflex +R
Tab. 2: Ausschnitt einiger Tests zur Untersuchung der biologischen Aktivität von zentralen Muskelrelaxantien.
ED50 Messung Maus (+), Ratten (R); mittl. Zeit in Minuten Maus (M); % Mäuse geschützt (A);
% Inhibierung Maus (I).
Zur Beurteilung der Ergebnisse der unterschiedlichen Tests existieren jedoch keine zweifels-
freien Regeln in bezug auf eine muskelrelaxierende Wirkung im Vergleich zu möglichen
Nebenwirkungen. So beschreiben die Aussagen unterschiedlicher Autoren für den Rotarod-Test
sowohl eine Messung der Muskelrelaxation, aber auch Effekte wie Verlust der motorischen
Koordination, Ataxie, verminderte generelle Bewegungsfähigkeit, Sedierung, Ermüdung oder
sogar Neurotoxizität. Konsequenterweise wurde vorgeschlagen, daß Vergleiche nur zwischen
den Daten aus ein und demselben Laboratorium sinnvoll sind73.
Dennoch ist allgemein akzeptiert, daß der Straub-Tail-Test, der "inclined screen test" und der
Traction-Test gute Maße für die Muskelrelaxation liefern, wohingegen der "actimetry test", der
"anti fighting test" und der Rotarod-Test die Unterdrückung der ZNS Aktivität beschreiben.
QSAR-Analysen
37
Eine dritte Gruppe von Tests mit dem PTZb Test und dem MESc Test kann eindeutig als Maß
für die Aktivität bei Verkrampfungen angesehen werde.
Um bei QSAR-Untersuchungen der Muskelrelaxantien zu statistisch gesicherten Aussagen zu
gelangen, kamen nur solche Tests in Frage, für die aus der Literatur genügend große Datensätze
zu erhalten waren. Hierzu war es notwendig vom Idealfall kompletter Datensätze aus ein und
demselben Laboratorium abzuweichen. Trotz der Einschränkung ED50 Daten verwenden zu
müssen und trotz der Tatsache, daß Daten aus unterschiedlichen Laboratorien verwendet
werden mußten, wurde versucht, QSAR-Modelle zur Beschreibung muskelrelaxierender
Wirkung aufzustellen. Bei diesem Ansatz spielte die Vergrößerung der Datensätze durch
vorsichtige Kombination der Daten unterschiedlicher Laboratorien die wichtigste Rolle. Dabei
wurde eine Anzahl von "Verknüpfungsverbindungen" verwendet, die in mehreren unter-
schiedlichen Laboratorien untersucht worden sind. So ergeben sich z.B. für den Straub-Tail-
Test für Diazepam Aktivitäten im Bereich von 1 bis 8.3 (Tab. 3). Diese Vergleiche erlaubten
die Auswahl der zuverlässigsten Tests und ermöglichten die Aufstellung von Datensätzen mit
einer ausreichenden Anzahl unterschiedlicher Verbindungen differenzierter chemischer
Struktur.
Muskelrelaxanz Straub Tail Aktivitäten (ED50)
Lit. 74 71 69 75 76
Veröffentlichungsjahr 1992 1994 1992 1974 1983
Tolperison 63
Mephenesin 121
Baclofen 2.8 3.6 5.2
(3.7-7.5)
Diazepam 11.3 1.2
(0.8-1.9) 8.3
(5.7-12.1) 1.2
(0.6-5.1)
Tizanidine 1.4 0.4
Chlordiazepoxide 19
(7.6-29.5) 12
(6.6-20.0)
Gesamtzahl 11 5 3 2 6
Tab. 3: Vergleich der ED50-Werte für unterschiedliche Muskelrelaxantien die mit Hilfe des Straub-Tail-Tests und
in mindestens zwei Arbeitsgruppen untersucht wurden. Die Zahlen in Klammern geben das 95 %
Vertrauensintervall der biologischen Daten an.
b Pentylentetrazol
c Maximaler Elektroschock
QSAR-Analysen
38
Trotz der in Tab. 2 (s.a. Anhang, Tab. 12, S. 93) aufgelisteten großen Anzahl von
Publikationen und unterschiedlichen Tests, mußte für QSAR-Untersuchungen deren Anzahl
durch die zuvor beschriebenen Einschränkungen auf drei Tests reduziert werden. Dabei handelt
es sich um den Rotarod-Test, den Traction-Test und den Straub-Tail-Test. Der Rotarod-Test
wird zur Untersuchung des Einflusses von Wirkstoffen auf die motorische Koordination
eingesetzt und ist als wertvoller Indikator für die ZNS unterdrückende Wirkung akzeptiert77,78.
Bei der Durchführung wird die Fähigkeit von Mäusen untersucht, nach Wirkstoffgabe und unter
verschiedenen Bedingungen ihre Position auf einer rotierenden Rolle beizubehalten. Beim
Traction-Test wird untersucht, inwieweit Mäuse sich auf einen horizontalen Draht hochziehen
können, auf dem sich bereits ihre Vorderpfoten befinden79. Beim Straub-Tail-Test wird
untersucht, in welchem Maße durch direkte Gabe von Morphin auf das Rückenmark Erregung
ausgelöst werden kann80,81.
Als eine Konsequenz dieser Vorgehensweise, bei der Daten unterschiedlicher Laboratorien
verwendet wurden, waren der Literatur für einige Verbindungen mehrere biologische
Aktivitäten zu entnehmen. Da jedoch nur mit jeweils einer Struktur und zugehöriger Aktivität
sinnvolle QSAR-Modelle aufgestellt werden können, mußten die mehrfach vorhandenen
Aktivitäten entfernt werden. Dazu wurde zunächst ein erstes grobes QSAR-Modell aufgestellt,
in dem alle biologischen Aktivitäten enthalten waren, um so diejenigen Aktivitäten heraus-
zufiltern, die für eine abschließende QSAR-Analyse am besten geeignet sind, d.h. diejenigen
Aktivitäten, die mit den verbliebenen Verbindungen im Hinblick auf ein abschließendes Modell
die beste Übereinstimmung zeigten. Alle weiteren Berechnungen wurden mit diesen
verbliebenen Aktivitäten durchgeführt.
Mit Hilfe des beschriebenen Ansatzes war es möglich, drei Datensätze mit einer ausreichenden
Anzahl von Verbindungen (≥ 18) und ausreichender Heterogenität bzgl. der chemischen
Struktur zu erstellen. Somit wurden Trainingsdatensätze mit 24 Verbindungen und 32
Aktivitäten für den Rotarod-Test (RR), 21 Verbindungen und 28 Aktivitäten für den Traction-
Test (TR) und 18 Verbindungen und 26 Aktivitäten für den Straub-Tail-Test (ST) erhalten. Alle
Daten wurden in mg/kg gemessen jedoch in mmol/kg umgerechnet, um ein adäquates Maß für
die biologische Aktivität zu haben (s.a. Anhang, Kapitel 10.2, S. 94).
QSAR-Analysen
39
6.3 Deskriptoren
Zur Beschreibung der chemischen Strukturen der Datensätze wurden ausschließlich 2D-
Deskriptoren eingesetzt. Aufgrund der Heterogenität der Datensätze gelang bisher weder eine
manuelle noch eine automatische zweifelsfreie strukturelle Überlagerung, die Grund-
voraussetzung für die Anwendung von 3D-Verfahren ist.
In dieser Arbeit wurden zwei unterschiedliche 2D-Deskriptoren eingesetzt: molekulare
Konnektivitätsindizes nach Kier und Hall44,45,46 (KH) und Atompaar-Deskriptoren (AP) 82. Die
KH-Deskriptoren wurden mit Hilfe des Programms MolconnX83 berechnet. Die Erzeugung der
AP-Deskriptoren erfolgt mit Hilfe einer uns zur Verfügung gestellten Routine halbmanuell82.
6.3.1 Kier & Hall-Deskriptoren
Die Beschreibung der chemischen Strukturen mit Hilfe von KH-Deskriptoren basiert auf der
Graphentheorie84. Die Kodierung beruht dabei auf dem Skelettgerüst, das durch numerische
Indizes repräsentiert wird, die sowohl die Verzweigung und Topologie als auch die Form und
Größe der Strukturen beschreiben. Die in dieser Arbeit verwendeten molekularen Konnektivi-
tätsindizes lassen sich in drei Gruppen einteilen. Die mΧt molekularen Konnektivitäten, die die
strukturellen Attribute charakterisieren, die Κm Indizes, die die Form der Moleküle beschreiben,
und die Τ-Werte, die individuelle Atome und Gruppen in den Strukturen charakterisieren.
Auf diese Weise werden neben der Größe und Form der Moleküle auch elektronische Faktoren
berücksichtigt, die einen wichtigen Einfluß auf biologische Aktivitäten haben. Da einige der
numerischen Werte der erhaltenen Parameter auf der zufälligen Numerierung der Atome
basieren, wurden die entsprechenden Deskriptoren nicht verwendet. Somit ergeben sich 460
Deskriptoren zur Beschreibung der chemischen Struktur der Datensätze.
6.3.2 Atompaar-Deskriptoren
Die Schlüsselschritte bei der Erzeugung von Atompaar-Deskriptoren sind die Definition
unterschiedlicher Atomtypen und die Klassifizierung unterschiedlicher Distanzklassen.
Atompaare sind einfache Typen von Substrukturen, die mit Hilfe von Atomtypen und dem
kürzesten Graphenabstand zwischen zwei Atomen definiert werden. Die Graphendistanz ist
dabei die kleinste Anzahl von Bindungen, die auf dem Bindungspfad zwischen zwei Atomen in
QSAR-Analysen
40
einer Struktur liegen. Damit folgt die allgemeine Definition von Atompaaren als (Atomtyp a /
Abstand / Atomtyp b), wobei der Abstand im Falle von 2D-Deskriptoren die Graphendistanz
zwischen Atom a und Atom b ist (Abb. 14).
O
N[O.2 / 4 / N.na]
O
N
1
234
Abb. 14: Umwandlung der chemischen Struktur in einen AP-Deskriptor. Graphenabstand zwischen O.2 und
N.na (4 Bindungen).
In diesen Untersuchungen wurden zehn unterschiedliche Atomtypen verwendet. Dabei handelt
es sich um (1) C.ar - aromatischer Kohlenstoff; (2) C.na - nicht aromatischer Kohlenstoff; (3)
N.ar - aromatischer Stickstoff; (4) N.na - nicht aromatischer Stickstoff; (5) O.3 - Sauerstoff, sp3
hybridisiert; (6) O.2 - Sauerstoff, sp2 hybridisiert; (7) S - alle Schwefelatome; (8) P.3 - alle
Phosphoratome; (9) X - Halogene; (10) alle anderen Atome. Werden alle Atomtypen paarweise
kombiniert, so werden 55 unterschiedliche Atompaare erhalten. Als Distanzklassen werden alle
Abstände von null bis vierzehn verwendet. Auf diese Weise wird eine Gesamtzahl von 825
(15 x 55) Deskriptoren zur Beschreibung der chemischen Struktur jeder Verbindung erhalten.
Die Größenordnungen und Varianz der verwendeten Deskriptoren können für einzelne
Moleküle sehr unterschiedlich sein. So ist es möglich, daß bei der Variablenselektion einzelne
Deskriptoren aufgrund ihres großen Wertebereiches unverhältnismäßig stark berücksichtigt
werden. Um dieses Problem zu umgehen, wurden alle Deskriptoren während der Berechnungen
autoskaliert. Dazu werden für jeden Deskriptor der Mittelwert und die Standardabweichung für
alle Verbindungen berechnet und die Deskriptoren auf Grundlage dieser Werte zentriert und
skaliert. Dadurch wird gewährleistet, daß alle Deskriptoren gleichmäßig in der QSAR-Analyse
gewichtet werden.
6.4 Methoden
Nach der Kodierung der Strukturen der Datensätze durch AP- und KH-Deskriptoren erfolgt
zunächst die Untersuchung im Hinblick auf die strukturelle Einheitlichkeit der verwendeten
Verbindungen. Da die Korrelation der biologischen Aktivitäten mit den strukturellen
Parametern aufgrund vorhandener Ähnlichkeiten erfolgt, können nur solche Verbindungen
QSAR-Analysen
41
innerhalb eines Datensatzes sinnvoll eingesetzt werden, die untereinander eine gewisse
Ähnlichkeit aufweisen. So können Verbindungen, die zum übrigen Datensatz wenig ähnlich
sind (Ausreißer), nur schlecht oder gar nicht behandelt werden. Die Ermittlung solcher
Ausreißer kann mit Hilfe der sogenannten Hauptkomponentenanalyse erfolgen85 (PCA, engl.
Principal Components Analysis). Bei diesem Verfahren wird die große Anzahl der verwendeten
Deskriptoren mit Hilfe statistischer Korrelationsverfahren in wenige latente Variablen projiziert.
So lassen sich die strukturelle Vielfalt der Datensätze und die Beziehungen zwischen den
Deskriptoren mit Hilfe weniger unabhängiger Variablen erfassen und übergeordneten Faktoren
den Hauptkomponenten zuordnen. Die visuelle Darstellung dieser zueinander orthogonalen
Hauptkomponenten in einem Diagramm erlaubt die einfache Beurteilung der Ähnlichkeit durch
Betrachtung des Abstandes. So liegen ähnliche Verbindungen nahe beieinander und weniger
ähnliche Verbindungen haben einen größeren Abstand. Die Ergebnisse einer Haupt-
komponentenanalyse für den Rotarod-Test unter Verwendung von Atompaar (AP)-
Deskriptoren zeigt Abb. 15. Es ist zu erkennen, daß die schwarz gekennzeichnete Verbindung
zu keiner der übrigen Verbindungen ähnlich ist. Durch Eliminierung dieser Verbindung kann
verhindert werden QSAR-Modelle schlechterer Qualität zu erhalten.
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -20 -10 0 10 20 30
PC3
Abb. 15: Hauptkomponentenanalyse für den Straub-Tail-Test unter Verwendung der AP-Deskriptoren.
Nach Durchführung der Hauptkomponentenanalyse ergaben sich je nach verwendeter
Deskriptorspezies und Datensatz die in Tab. 4 aufgeführten Ausreißer, die darauffolgend aus
den Datensätzen entfernt und nicht weiter verwendet wurden (s.a. Anhang, Kapitel 10.3, S.
100).
QSAR-Analysen
42
Deskriptoren RR TR ST
KH 4b_1987
MDL_27531_1992 Chlormezanon Memantin
AP 4b_1987 -Carisprodol
Tab. 4: Die aufgrund der Hauptkomponentenanalyse entfernten Verbindungen der Datensätze.
Nach Entfernung der Ausreißer und erneuter Erzeugung der Deskriptoren erfolgte als nächstes
die Aufstellung der mathematischen Modelle. Zu diesem Zweck wurden zwei unterschiedliche
Verfahren verwendet. Zum einen die GA-PLS-Methode, die die PLS-Statistik86 mit einem
genetischen Algorithmus zur Variablenselektion kombiniert. Als zweites Verfahren kam die
Methode der k nächsten Nachbarn (KNN) zum Einsatz. Dabei handelt es sich um eine nicht-
lineare Methode, die zur Variablenselektion einen Simulated Annealing Algorithmus87
verwendet. Die implementierten Programme und die Quellcodes wurden vom Arbeitskreis Prof.
A. Tropsha, University of Chapel Hill, USA zur Verfügung gestellt. Zum optimalen Einsatz
wurden beide Methoden teilweise modifiziert. Die Algorithmen werden nachfolgend kurz
beschrieben.
6.4.1 GA-PLS
Der GA-PLS-Algorithmus wurde wie folgt implementiert.
Schritt 1. Nach Erzeugung der Deskriptoren werden zunächst diejenigen Deskriptoren entfernt,
die bei allen Strukturen die gleichen numerischen Werte hatten.
Schritt 2. Für jeden Datensatz werden die erhaltenen Deskriptoren zufällig numeriert und diese
Numerierung während der nachfolgenden Analyse beibehalten. Zum Zwecke der
nachfolgenden GA Analyse wird zunächst eine Population von 100 unterschiedlichen
Kombinationen dieser Deskriptoren erzeugt, wobei diese Kombinationen durch eine Reihe
binärer Ziffern (d.h. 0 oder 1) repräsentiert werden. Die Anzahl der Ziffern jeder Reihe
entspricht dabei der Anzahl der verwendeten Deskriptoren des zu untersuchenden Datensatzes.
Der Wert 1 bedeutet dabei, daß der entsprechende Deskriptor verwendet wird, eine 0, daß der
Deskriptor zur Aufstellung des QSAR-Modells nicht verwendet wird. Damit repräsentiert jede
Reihe eine zufällige Kombination aller zur Verfügung stehenden Deskriptoren und wird als
Elternteil für die nachfolgende GA gesteuerte Evolution betrachtet (Abb. 16).
QSAR-Analysen
43
Deskriptoren
Eltern-
generation D1D2D3D4D5D6D7D8D9... Dnq2
P1100111011... 1q2 [P1]
P2010011101... 0q2 [P2]
P3111100011... 0q2 [P3]
. ........... .
. ........... .
. ........... .
Pm-2 101111110... 0q2 [Pm-2]
Pm-1 011001110... 1q2 [Pm-1]
Pm011101011... 1q2 [Pm]
Abb. 16: Erzeugung der Elterngeneration.
Schritt 3. Für jedes der Elternteile wird mit Hilfe der PLS-Statistik86 eine QSAR-Gleichung
aufgestellt. Als Qualitätsparameter wird daraus der kreuzvalidierte Korrelationskoeffizient q2
berechnet. Dieser wird erhalten, wenn jede Verbindung des Trainingsdatensatzes einmal
herausgelassen wird und mit Hilfe des sich ergebenden QSAR-Modells der übrigen
Verbindungen vorhergesagt wird. Q2 dient als Güteparameter für die Vorhersagequalität von
QSAR-Modellen. Aussagekräftige Modelle werden bei q2-Werten ab etwa 0.6 erhalten88.
Anschließend wird dieser Wert zur Berechnung der für den GA notwendigen Tauglichkeits-
funktion verwendet. Als Funktion dient dabei [1-(n-1)(1-q2)/(n-c)], wobei q2 der Güteparameter,
n die Anzahl der Verbindungen und c die Anzahl der optimalen Komponenten der PLS-Analyse
ist. Diese Funktion wird zur Steuerung des GA verwendet.
Schritt 4. Zwei Elternteile werden zufällig ausgewählt und zwei Abkömmlinge durch Kreuzung
(d.h. zwei gleich große Abschnitte der binären Reihe werden zwischen zwei Elternteilen
ausgetauscht) erzeugt (Abb. 17).
P41 0 1 0 1 0 1 0 1 ... 1q2 [P4]
⇑⇑ ⇓⇓
Pm-2 1 0 1 1 1 1 1 1 0 ... 0q2 [Pm-2]
↓↓ Kreuzung
Ta1 0 1 0 1 1110... 0
Tb1 0 1 1 1 0101... 1
Abb. 17: Erzeugung der Abkömmlinge durch Kreuzung.
QSAR-Analysen
44
Schritt 5. Jeder Abkömmling wird einer zufälligen Einzelpunktmutation unterworfen, d.h. eine
zufällig ausgewählte 1 (oder 0) wird in eine 0 (bzw. 1) umgewandelt. Daran anschließend wird
für die erzeugten Abkömmlinge eine QSAR-Gleichung aufgestellt und mit der oben
beschriebenen Funktion die Güte der Gleichung berechnet (Abb. 18).
Ta1 0 1 0 1 1110... 0
Tb1 0 1 1 1 0101... 1
↓↓ Mutation
Ta/mut 1000 1 1 1 1 0 ... 0
Tb/mut 1 0 1 1 1 0 1 0 0... 1
↓↓ QSAR
Ta/mut 1 0 0 0 1 1 1 1 0 ... 0q2
[Ta/mut]
Tb/mut 1 0 1 1 1 0 1 0 0 ... 1q2
[Tb/mut]
Abb. 18: Mutation der Abkömmlinge und Aufstellung der neuen QSAR-Gleichungen.
Schritt 6. Wenn der berechnete Wert der Gütefunktion für die Abkömmlinge größer ist als der
Wert für die Elternteile, werden die Elternteile ersetzt, ansonsten werden sie beibehalten. Auf
diese Weise dienen die Schritte 4 bis 6 zur Evolution der anfänglichen Population.
Schritt 7. Die Schritte 4 - 6 werden solange wiederholt, bis ein definiertes Konvergenzkriterium
erreicht wird. Als Konvergenzkriterium wird die Differenz zwischen dem größten und kleinsten
Wert der Gütefunktion gewählt. Während der Berechnungen von 100 Schritten des GA wird die
Differenz errechnet. Wird das Kriterium mindestens 50 mal erfüllt, so werden die
Berechnungen abgebrochen, andernfalls weitere 100 Schritte berechnet. Die Berechnungen der
ersten QSAR-Gleichungen wurden bei einer Differenz von 0.03 abgebrochen, die aller anderen
Berechnungen bei einer Differenz von weniger als 0.02.
Zusammenfassend repräsentiert jedes Elternteil eine QSAR-Gleichung mit zufällig
ausgewählten Variablen. Ziel der Berechnungen ist, ausgehend von der Elternpopulation, die
Evolution der QSAR-Gleichungen hin zu höchsten Werten der Gütefunktion. Im Verlauf der
Berechnungen bleibt die Größe der Population (100) konstant, während der mittlere Wert der
Gütefunktion für die gesamte Population zu hohen Werten konvergiert (Abb. 19).
QSAR-Analysen
45
Deskriptoren
Deskriptoren
Biologische Aktivitäten
Biologische Aktivitäten
Endgültige QSAR-Gleichung
Endgültige QSAR-Gleichung
Kreuzung und Mutation
Kreuzung und Mutation
Evaluierung
Evaluation GA
GA
Strukturen
Strukturen
Konvergenztest
Konvergenztest
1. Gleichung
1. Gleichung
Abb. 19: Flußdiagramm des GA-PLS-Algorithmus.
Um bei der PLS-Analyse eine Überoptimierung zu vermeiden, wurde bei den Berechnungen der
QSAR-Gleichungen die Anzahl der Komponenten auf ein Viertel der Größe der Datensätze
beschränkt.
6.4.2 Methode der k nächsten Nachbarn (KNN)
Die meisten QSAR-Techniken basieren auf der Annahme, daß es zwischen biologischer
Aktivität und molekularen Deskriptoren einen linearen Zusammenhang gibt. Bei Unter-
suchungen von Datensätzen mit strukturell unterschiedlichen Molekülen ist diese Annahmen
nicht immer gerechtfertigt. Zu diesem Zweck wurden in der Literatur eine Reihe nicht-linearer
Verfahren entwickelt. Die meisten dieser Verfahren basieren auf künstlichen neuronalen Netzen
(ANN)89,90,91,92 oder Maschinenlernalgorithmen93,94,95,96. Nachteil dieser Verfahren ist die
Tatsache, daß aufgrund zahlreicher zu optimierender Parameter die Analysen relativ langsam
sind. Als Ausweichmöglichkeit bietet sich hier die Methode der k nächsten Nachbarn (KNN),
angewendet auf QSAR-Probleme, an. Bei dieser Methode werden die biologischen Aktivitäten
nicht mit Hilfe einer linearen Gleichung vorhergesagt, sondern als Mittelwert der Aktivitäten
der k ähnlichsten Moleküle. Eine Variablenselektion wird mit Hilfe eines Simulated Annealing
Algorithmus87 durchgeführt.
QSAR-Analysen
46
Den Verlauf der KNN-QSAR-Methode zeigt Abb. 20.
Deskriptoren
Deskriptoren
Biologische Aktivitäten
Biologische Aktivitäten
Selektion des besten QSAR-Modells
Selektion des besten QSAR-Modells
Kreuzvalidierung
Kreuzvalidierung
Optimierung von q2
durch Variation von k
Optimierung von q2
durch Variation von k
Austausch der
Deskriptoren
Austausch der
Deskriptoren
Strukturen
Strukturen
hypothetisches Pharmakophor durch
zufällige Herausnahme von n Deskriptoren
hypothetisches Pharmakophor durch
zufällige Herausnahme von n Deskriptoren
simulated
annealing
Abb. 20: Flußdiagramm der KNN-Methode
Schritt 1. Zufällige Auswahl von n Deskriptoren (n liegt zwischen 1 und der Anzahl aller
Deskriptoren) als ein hypothetisches topologisches Pharmakophor (HTP). Normalerweise
werden für n unterschiedliche Werte in unterschiedlichen Schritten eingesetzt, bis zufrieden-
stellende Ergebnisse erhalten werden. In dieser Arbeit wurde jedoch die Anzahl der
verwendeten Deskriptoren automatisch ausgewählt und lag zwischen 20 und 80 % aller
Deskriptoren.
Schritt 2. Validierung des HTP durch eine Standard "leave-one-out cross-validation" Methode.
Zu diesem Zweck wird jede Verbindung einmal aus dem Datensatz herausgenommen und die
biologische Aktivität dieser Verbindung mit Hilfe des (gewichteten) Mittelwertes der k
ähnlichsten Moleküle vorhergesagt (k liegt dabei zunächst bei 1). Die Ähnlichkeit wird dabei
durch den euklidischen Abstand zwischen den Verbindungen beschrieben (Gl. 1), wobei nur ein
Teil der Deskriptoren entsprechend dem HTP verwendet wird.
( )
dX X
i j ik jk
k
M
,= −
=
∑2
1
Gl. 1: Berechnung des euklidischen Abstandes zwischen Verbindung i und j.
QSAR-Analysen
47
Aus den Vorhersagen berechnet sich der kreuzvalidierte Korrelationskoeffizient q2 nach Gl. 2.
( )
∑
∑
−
−
−= 2
2
^
21yy
yy
q
i
i
i
Gl. 2: Berechnung des kreuzvalidierten Korrelationskoeffizienten q2.
Dabei sind yi und yi
^ die experimentellen und die vorhergesagten Aktivitäten, y ist der
Mittelwert alle Verbindungen des Trainingsdatensatzes. Beide Summen werden über alle
Verbindungen des Trainingsdatensatzes gebildet. Der erhaltene q2-Wert dient als Maßstab für
die Vorhersagekraft des aufgestellten QSAR-Modells.
Die Berechnungen werden für unterschiedliche Werte von k wiederholt. Normalerweise
entspricht der Maximalwert von k der Anzahl der Strukturen, jedoch zeigte sich, daß die besten
Ergebnisse erhalten werden, wenn k zwischen 1 und 5 liegt. Derjenige Wert von k, der den
höchsten q2-Wert liefert, wird für das aktuelle QSAR-Modell ausgewählt.
Schritt 3. Wiederholung von Schritt 1 und 2 zur Auffindung unterschiedlicher HTP's und
Berechnung des korrespondierenden q2-Wertes. Ziel ist es, das beste HTP zu finden, bei dem q2
maximal wird. Der Optimierungsprozess wird dabei durch einen Simulated Annealing Prozeß
(s.u.) gesteuert, wobei ein zu maximierendes q2 als Steuerungsfunktion fungiert.
Unter einem Simulated Annealing Prozeß wird im allgemeinen die Simulation des
physikalischen Vorgangs des Abkühlens verstanden. Dabei wird das zu untersuchende System
auf eine hohe Temperatur erhitzt (z.B. 200 K) und anschließend langsam abgekühlt. Dabei
nimmt das System entsprechend Boltzmann unterschiedliche Zustände ein, wobei im Gleich-
gewicht die Zustände niedriger Energie bevorzugt werden87.
Angewendet auf die KNN-QSAR-Methode bedeutet dies, daß das zunächst erhaltene Modell
durch eine kleine Störung, d.h. Austausch eines Teils der Deskriptoren durch einen Teil zufällig
ausgewählter, bisher nicht enthaltener Deskriptoren, verändert wird. Diese Veränderung führt
zu einer neuen Lösung des Optimierungsproblems (Vergrößerung von q2). Nachfolgend erfolgt
Berechnung des neuen q2-Wertes und Vergleich mit dem letzten berechneten Wert. Ist der neue
Wert größer oder gleich dem alten Wert, wird der neue akzeptiert und die Berechnung weiter-
QSAR-Analysen
48
geführt. Ist der neue Wert kleiner wird er nur akzeptiert, wenn das Metropolis-Optimierungs-
kriterium87 erfüllt ist:
Tqq newcurr
ernd /)( 22 −−
<
Gl. 3: Metropolis-Kriterium zur Behandlung von Simulated Annealing Untersuchungen.
Dabei ist rnd eine zufällige Zahl zwischen 0 und 1, und T ist ein Parameter analog zur
Temperatur in der Boltzmannverteilung.
Dieser Vorgang wird solange wiederholt, bis das Abbruchkriterium erreicht ist. Jedesmal, wenn
eine neue Lösung akzeptiert wird oder eine voreingestellte Anzahl wiederholter Schritte (10
Schritte) zur Aufstellung eines HTP's kein besseres Ergebnis liefert, wird die Temperatur um 10
% gesenkt (Anfangswert der Temperatur ist 200 K). Die Berechnungen werden abgebrochen,
wenn die Temperatur auf T = 10-6 abgesunken ist oder das Verhältnis zwischen aktueller
Temperatur und Temperatur der besten Lösung gleich 10-6 ist97.
Zusammenfassend optimiert der KNN-Algorithmus sowohl die Anzahl der Nachbarn k wie
auch die optimale Anzahl an Deskriptoren n, um dadurch gute QSAR-Modelle hinsichtlich q2
erhalten.
Im Verlaufe der Untersuchungen mit Hilfe der KNN-QSAR-Methode zeigte sich, daß die
erhaltenen QSAR-Gleichungen abweichend von den Originalarbeiten82 bei mehreren
Durchläufen keine konsistenten Ergebnisse im Hinblick auf Qualität der Modelle und Anzahl
der Deskriptoren ergaben. Aus diesem Grund wurden zur Ermittlung eines optimalen Modells
50 Rechnungen durchgeführt und dasjenige mit dem höchsten q2-Wert ausgewählt.
6.5 Statistische Signifikanz der QSAR-Gleichungen
Um zu überprüfen, ob die erzeugten QSAR-Gleichungen und die daraus erhaltenen Daten
sinnvoll sind, wurden neben der Bewertung mit Hilfe des kreuzvalidierten Korrelations-
koeffizienten q2 zwei unterschiedliche Verfahren eingesetzt. Als erstes wurde jedem Datensatz
ein fünftel der Verbindungen entnommen. Die Auswahl der Verbindungen erfolgte mit Hilfe
der Hauptkomponentenanalyse. Auf diese Weise wurden Verbindungen entnommen, die eine
Ähnlichkeit zu anderen Molekülen aufwiesen. Nach Aufstellung der QSAR-Gleichungen mit
QSAR-Analysen
49
den verbliebenen Verbindungen (Trainingsdatensatz) wurden als Test externe Vorhersagen der
biologischen Aktivität der entnommenen Verbindungen durchgeführt.
Zusätzlich zu diesen Vorhersagen wurden für jeden der Datensätze Permutationstests durch-
geführt und 20 neue Datensätze mit zufälligen Aktivitäten erzeugt, wobei jedoch die neu
erzeugten Aktivitäten im Bereich der experimentell ermittelten Aktivitäten lagen. Ferner
wurden neben den zufälligen Datensätzen 20 weitere Datensätze mit vertauschten Aktivitäten
generiert, d.h. die Aktivitäten der Originaldatensätze wurde untereinander vertauscht. Um die
statistische Signifikanz einer gewonnenen QSAR-Gleichung zu überprüfen, wurde ein
Standard-Hypothesen-Test98 durchgeführt. Zur Überprüfung der Robustheit d.h. der Qualität der
QSAR-Modelle wurden die Ergebnisse der Originaldatensätze mit denjenigen verglichen, die
aus den Datensätzen mit den zufälligen bzw. den vertauschten Aktivitäten erhalten wurden.
Entsprechend dem Standard-Hypothesen-Test werden zwei unterschiedliche Hypothesen
aufgestellt. Hypothese H0: h = µ, und Hypothese H1: h > µ, wobei µ der Mittelwert der q2-Werte
der zufälligen Datensätze und h der q2-Wert des aktuellen Datensatzes ist. Damit bedeutet die
Nullhypothese H0, daß das QSAR-Modell des aktuellen Datensatzes keine signifikante
Verbesserung im Vergleich mit den zufälligen Datensätzen bedeutet, wohingegen die
Alternativhypothese H1 das Gegenteil besagt, d.h. daß das aktuelle Modell signifikant besser ist
als die zufälligen Modelle. Die Entscheidungsfällung basiert auf einem Standard "one-tail" Test,
welcher die nachfolgenden Schritte beinhaltet:
(1) Ermittlung des Mittelwertes von q2 (µ) und dessen Standardabweichung (σ) für die
zufälligen Datensätze.
(2) Berechnung des Z-Wertes entsprechend dem q2-Wert des aktuellen Datensatzes:
Z = (h - µ)/σ
(3) Vergleich dieses Z-Wertes mit tabellierten kritischen Werten von Zc für unterschiedliche
Signifikanzgrenzen (α) zur Ermittlung der Grenze, bei der H0 abgelehnt werden sollte.
Wenn der Z-Wert größer ist als ein bestimmter Zc-Wert, wird angenommen, daß für eine
bestimmte Signifikanzgrenze H0 abgelehnt und H1 akzeptiert wird. In diesem Fall ist das
Ergebnis des aktuellen Datensatzes statistisch besser als die Ergebnisse der zufälligen
Datensätze für die gewählte Signifikanzgrenze.
QSAR-Analysen
50
6.6 Ergebnisse und Diskussion
Die nachfolgenden Untersuchungen beschreiben die QSAR-Analysen der drei erstellten
Datensätze. Dabei wurden die in den Datensätzen enthaltenen Strukturen mit Hilfe der zwei
beschriebenen Deskriptorarten beschrieben. Zur Entwicklung der QSAR-Modelle wurden die
daraus resultierenden 6 Trainingsdatensätze mit Hilfe der zwei beschriebenen QSAR-Methoden
analysiert und auf diese Weise insgesamt 12 QSAR-Modelle zur Beschreibung der muskel-
relaxierenden Wirkung entwickelt.
6.6.1 Aufstellung der primären Gleichungen
Zu Beginn der Analysen wurden die bereinigten Datensätze zunächst einer ersten QSAR-
Analyse unterworfen. Ziel war es, die mehrfach vorhandenen biologischen Aktivitäten aus den
Datensätzen zu entfernen.
Bei der Aufstellung eines solchen ersten Modells mit der KNN-Methode können keine
sinnvollen Aussagen gemacht werden, da die Vorhersage der Aktivitäten durch Mittelwert-
bildung der ähnlichsten Verbindungen erfolgt. Da die ähnlichsten Nachbarn einer bestimmten
Verbindung mit mehrfach vorhandenen Aktivitäten die Verbindung selbst ist, ist die vorher-
gesagte Aktivität eine der doppelt vorhandenen Aktivitäten oder ein Mittelwert aus den
mehrfach vorhandenen Aktivitäten dieser Verbindung. Daher ergibt sich daraus kein
qualitativer Maßstab zur Auswahl bestimmter biologischer Aktivitäten. Die vorhergesagten
Aktivitäten würden in ihrem numerischen Wert unterschiedlich sein.
Für die Vorhersage einer biologischen Aktivität einer bestimmten Verbindung mit Hilfe eines
QSAR-Modells kann sich de facto nur ein einziger Wert ergeben. Daher wurde für die
Aufstellung der primären Modelle ausschließlich das GA-PLS-Verfahren eingesetzt. Die
verwendete PLS-Statistik erlaubt im Gegensatz zur KNN-Methode die Verarbeitung ungenauer
und unpräziser Daten und ist daher in der Lage, mehrfach vorhandene Aktivitäten zu
verarbeiten. Die sich aus einem solchen QSAR-Modell ergebenden vorhergesagten Aktivitäten
haben für jede individuelle Verbindung nur einen einzigen Wert. Zusätzlich sind die so
aufgestellten Datensätzen konsistent, d.h. die mit den vorhandenen Deskriptoren und Statistiken
aufgestellten Modelle basieren alle auf den gleichen Datensätzen und sind so direkt miteinander
vergleichbar.
QSAR-Analysen
51
Mit Hilfe der so berechneten Werte der biologischen Aktivität war es möglich, diejenigen
doppelt vorhandenen Aktivitäten zu eliminieren, die am wenigsten geeignet für diese QSAR-
Gleichungen waren. Dabei wurden diejenigen Aktivitäten mit der kleinsten Differenz zur
wirklichen Aktivität beibehalten. Somit wurden Datensätze erzeugt, die für jede Struktur nur
eine biologische Aktivität enthalten und für die nachfolgenden QSAR-Analysen geeignet
waren. Die Ergebnisse dieser ersten Untersuchungen zeigt Tab. 5, wobei hier r2 und q2 als
Qualitätsparameter angegeben sind. Die Werte dieser Parameter sind für die meisten der
aufgestellten Modelle gut bis sehr gut.
Datensatz Deskriptoren Verbindungen EC50-Werte q2r2
RR KH 30 22 0.78 0.90
AP 31 23 0.78 0.93
TR KH 27 20 0.70 0.87
AP 28 21 0.61 0.82
ST KH 26 18 0.78 0.91
AP 26 18 0.71 0.89
Tab. 5: Ergebnisse der ersten QSAR-Rechnungen.
In Abb. 21 sind für den Datensatz des Rotarod-Test, dessen Strukturen durch die KH-
Deskriptoren beschrieben wurden, die wirklichen biologischen Aktivitäten gegen die
vorhergesagten aufgetragen. Die Verbindungen, die aufgrund ihrer schlechten Vorhersage aus
dem Datensatz entnommen wurden, sind dabei als schwarze Dreiecke markiert (s.a. Anhang,
Kapitel 10.4, S. 102).
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Abb. 21: Güte des ersten QSAR-Modells für den Rotarod Datensatz unter Verwendung der KH-Deskriptoren
und des GA-PLS-Verfahrens. Die Verbindungen mit der größten Differenz zwischen vorhergesagter
und gemessener Aktivität sind als schwarze Dreiecke markiert.
QSAR-Analysen
52
6.6.2 Finale Gleichungen (Kreuzvalidierung)
Mit Hilfe der so erhaltenen Gleichungen wurden nun finale QSAR-Gleichungen aufgestellt.
Dabei wurde sowohl das GA-PLS- als auch das KNN-Verfahren verwendet. Zur Beurteilung
der Güte dieser erhaltenen Gleichungen werden neben dem kreuzvalidierten Regressions-
koeffizienten q2 auch die Standardabweichung SD und der Fischer F-Wert herangezogen (Tab.
6). Anhand der F-Statistik kann entschieden werden, ob die zwischen Deskriptoren und
biologischen Aktivitäten aufgestellte Beziehung zufällig ist oder nicht.
Datensatz Verbind. Methode Deskript. q2SD F
RR 22 GA-PLS KH 0.82 0.19 49.1
23 AP 0.81 0.13 131.4
22 KNN KH 0.03 0.50 11.7
23 AP 0.59 0.47 19.9
TR 20 GA-PLS KH 0.61 0.29 31.3
21 AP 0.76 0.20 111.2
20 KNN KH 0.50 0.54 17.3
21 AP 0.76 0.47 24.5
ST 18 GA-PLS KH 0.78 0.23 35.5
18 AP 0.55 0.30 67.1
18 KNN KH 0.66 0.52 15.1
18 AP 0.71 0.53 15.4
Tab. 6: Ergebnisse der finalen QSAR-Gleichungen.
Die Ergebnisse zeigen, daß für alle verwendeten Datensätze gute QSAR-Gleichungen erhalten
werden, wobei die besten Ergebnisse für die Kombination der GA-PLS-Methode mit AP-
Deskriptoren beobachtet werden. Lediglich für die Kombination Straub-Tail-Test, AP-
Deskriptoren und GA-PLS sind die erhaltenen Ergebnisse nur befriedigend. Für den Datensatz
des Rotarod-Tests in Kombination mit den KH-Deskriptoren und der KNN-Methode konnte
kein geeignetes Modell entwickelt werden.
Die Übereinstimmung zwischen gemessener und berechneter biologischer Aktivität ist in Abb.
22 für die Kombination Rotarod-Datensatz unter Verwendung der KH-Deskriptoren und des
GA-PLS-Verfahrens aufgetragen (s.a. Anhang, Kapitel 10.5, S. 104).
QSAR-Analysen
53
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Abb. 22: Vergleich zwischen aktueller und gemessener Aktivität für den Rotarod-Test unter Verwendung der KH-
Deskriptoren und der GA-PLS-Statistik.
Die erhaltenen Modelle zeigen für die verwendeten Datensätze gute bis sehr gute Korrelationen
zwischen wirklich gemessener Aktivität und durch die Modelle vorhergesagter Aktivität.
6.6.3 Robustheit (Permutationstest)
Zur Validierung der erhaltenen QSAR-Modelle dient der Einsatz von Permutationstests, mit
deren Hilfe überprüft werden soll, ob die Modelle nicht aufgrund zufälliger Eigenschaften gute
Korrelationen von tatsächlicher und berechneter biologischer Aktivität liefern.
Um diese Möglichkeit auszuschließen, werden den Strukturen in den Datensätzen neue, nun
zufällig erzeugte biologische Aktivitäten zugeordnet. Dabei ist es zum einen möglich, die
Aktivitäten innerhalb des Datensatzes untereinander zu vertauschen oder gänzlich neue
Aktivitäten zufällig zu erzeugen, wobei diese jedoch im Bereich der aktuellen Aktivitäten liegen
sollten. Aus den mit diesen neuen Aktivitäten erzeugten Datensätze wurden nun wiederum neue
QSAR-Modelle aufgestellt und die erhaltenen Ergebnisse mit den Ergebnissen der wirklichen
Datensätze verglichen. Zu diesem Zweck werden Histogramme aufgestellt, die die Verteilung
der q2-Werte der geänderten Datensätze erfassen (Abb. 23). Wie hier am Beispiel des RR-Tests
(GA-PLS-Methode, AP-Deskriptoren) zu erkennen ist, liegen die q2 erwartungsgemäß für
zufällige Modelle im Bereich von Null, d.h. diese Modelle besitzen keine Vorhersagekraft.
QSAR-Analysen
54
0
2
4
6
8
10
12
14
16
00.2 0.4 0.6 0.8 1
q2
Häufigkeit
Abb. 23: Histogramm der q2-Werte des RR-Datensatzes (20 Permutationen, zufällige Aktivitäten, KH-
Deskriptoren, GA-PLS-Methode).
Nähere Vergleichsmöglichkeiten bieten die statistischen Werte der geänderten Datensätze. Zum
Vergleich aller geänderter Datensätze mit dem Originaldatensatz dient der Z-Wert. Mit Hilfe
der errechneten Z-Werte wird zunächst der Hypothesentest durchgeführt, um so herauszufinden,
ob die aufgestellten Modelle annehmbar sind. Als Ergebnis wird die Wahrscheinlichkeit
erhalten, mit der das Modell des Originaldatensatzes nicht zufällig ist. Die Ergebnisse der 12
Datensätze zeigen Tab. 7 und Tab. 8 (s.a. Anhang, Kapitel 10.8 und 10.9, S. 113).
Datensatz Deskript. Methode Bereich q2Mittelw. SD Z-Wert Validität
RR KH GA-PLS -0.78 - 0.61 -0.07 0.28 3.36 > 99 %
AP 0.03 - 0.78 0.38 0.22 1.89 > 95 %
KH KNN -0.67 - 0.76 0.35 0.24 - 1.17 -
AP -0.65 - 0.58 0.02 0.43 1.12 > 80 %
TR KH GA-PLS -0.30 - 0.71 0.07 0.33 1.64 > 90 %
AP 0.01 - 0.76 0.46 0.25 1.16 > 80 %
KH KNN 0.05 - 0.66 0.30 0.18 0.58 -
AP 0.21 - 0.64 0.37 0.13 2.05 > 95 %
ST KH GA-PLS -0.18 - 0.83 0.25 0.37 1.61 > 90 %
AP 0.09 - 0.86 0.46 0.25 -0.10 -
KH KNN 0.12 - 0.57 0.34 0.25 1.87 > 95 %
AP -0.24 - 0.61 0.32 0.26 1.27 > 85 %
Tab. 7: Validitätsuntersuchung durch Erstellung zufälliger Aktivitäten.
QSAR-Analysen
55
Datensatz Deskript. Methode Bereich q2Mittelw. SD Z-Wert Validität
RR KH GA-PLS -0.73 - 0.10 -0.23 0.26 4.33 > 99 %
AP -0.07 - 0.73 0.40 0.22 1.88 > 95 %
RR KH KNN -0.27 - 0.39 0.18 0.18 -0.79 -
AP -0.40 - 0.58 0.18 0.33 1.22 > 85 %
TR KH GA-PLS -0.16 - 0.71 0.15 0.30 1.54 > 90 %
AP -0.01 - 0.90 0.51 0.26 0.94 -
TR KH KNN 0.01 - 0.36 0.14 0.09 2.31 > 99 %
AP 0.17 - 0.55 0.32 0.13 2.23 > 99 %
ST KH GA-PLS -0.19 - 0.69 0.21 0.33 1.05 > 80 %
AP -0.22 - 0.91 0.44 0.33 0.34 -
ST KH KNN 0.18 - 0.51 0.33 0.11 2.07 > 99 %
AP 0.11 - 0.64 0.43 0.14 1.58 > 90 %
Tab. 8: Validitätsuntersuchung durch Vertauschen der Aktivitäten.
Um die Ergebnisse der erhaltenen Datensätze auf einfache Weise mit den Ergebnissen der
finalen Gleichungen visuell vergleichen zu können, wird sowohl der q2-Wert als auch der r2-
Wert jedes Models gegen den Korrelationskoeffizienten aufgetragen, der sich zwischen den
wirklichen und den geänderten Aktivitäten ergibt. Je ähnlicher ein geänderter Datensatz dem
Originaldatensatz ist, um so höher ist auch erwartungsgemäß der q2- und r2-Wert des geänderten
Datensatzes. Die Achsenabschnitte der resultierenden Regressiongeraden sind ein Maß für die
Überoptimierung der QSAR-Gleichungen der Trainingsdatensätze. Für den RR-Datensatz unter
Verwendung der AP-Deskriptoren und des GA-PLS-Verfahrens zeigt sich, daß mit den neuen
Aktivitäten auch hohe r2-Werte erreicht werden können. Dies ist ein Hinweis darauf, daß das
Modell zwar nur durchschnittlich ist, da die mittleren q2-Werte der Permutationen nahe bei Null
liegen, besitzt das aufgestellte Modell dennoch Gültigkeit.
QSAR-Analysen
56
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Abb. 24: Validierung des RR-Datensatzes (20 Permutationen, zufällige Aktivitäten, AP-Deskriptoren, GA-PLS-
Methode).
Werden alle zwölf untersuchten Datensätze bzw. Kombinationen von Deskriptoren und
Methoden verglichen, so zeigt sich, daß die besten Ergebnisse beim Einsatz der PLS-Statistik in
Kombination mit den AP-Deskriptoren erreicht werden. Als unzulänglich hinsichtlich Qualität
und Validität stellte sich der Datensatz heraus, der mit Hilfe der Straub-Tail-Test Daten erhalten
wurde. Die Kombination ergibt neben hohen q2- und F-Werten und kleiner Standardab-
weichung auch gute bis sehr gute Validitäten.
6.6.4 PCA-Analysen
Die beste Methode, um die Gültigkeit der erhaltenen Gleichungen zu überprüfen, sind externe
Vorhersagen. Dabei werden auf Grundlage der QSAR-Modelle die biologischen Aktivitäten
von Verbindungen vorhergesagt, die nicht im Modell enthalten sind. In dieser Arbeit wurden
quasi externe Vorhersagen durchgeführt, d.h. die Strukturen der vorherzusagenden
Verbindungen wurden einem gemeinsamen Datensatz entnommen und mit den verbliebenen
Verbindungen wurde ein neues Modell zur Vorhersage aufgestellt. Da Vorhersagen mit QSAR-
Gleichungen nur für strukturell ähnliche Verbindungen sinnvoll sind, wurden nur solche
Verbindungen selektiert, die strukturelle Ähnlichkeiten zu anderen Verbindungen des
Datensatzes aufwiesen. Diese Ähnlichkeit wurde nicht visuell anhand der chemischen Struktur
beurteilt, sondern mit Hilfe von PCA-Analysen ermittelt. In Abb. 25 sind beispielhaft für den
Straub-Tail-Test (KH-Deskriptoren) die Verbindungen durch Punkte repräsentiert, wobei
ähnliche Verbindungen nahe beieinander liegen. Die schwarz markierten Punkte stellen dabei
die zur externen Vorhersage selektierten Verbindungen dar.
QSAR-Analysen
57
-15
-10
-5
0
5
10
15
-15 -10 -5 0 5 10 15
PC1
PC2
Abb. 25: PCA-Analyse des Datensatzes des Straub-Tail-Test unter Verwendung der KH-Deskriptoren. Die
Achsen der Abbildung werden durch die bei der PCA-Analyse erhaltenen Hauptkomponenten
festgelegt.
Auf diese Weise wurden aus einem Datensatz jeweils zwei neue erstellt: Ein Trainingsdatensatz
und ein Testdatensatz mit den vorherzusagenden Verbindungen.
Um die eigentlichen Datensätze nicht zu sehr zu verkleinern, wurde die Anzahl der zu
selektierenden Verbindungen auf ein Maximum von 20 % der ursprünglichen Datensätze
beschränkt, d.h. es wurden 5 Verbindungen beim Rotarod-Test, 4 Verbindungen beim Traction-
Test und 3 Verbindungen beim Straub-Tail-Test zur anschließenden Vorhersage entnommen.
6.6.5 Trainingsdatensatz
Um Vorhersagen der biologischen Aktivität durchführen zu können, müssen zunächst mit Hilfe
des Trainingsdatensatzes neue QSAR-Gleichungen aufgestellt werden. Die Vorgehensweise
entspricht dabei den Untersuchungen mit Hilfe der vollständigen Datensätze. Um mit den auf
diese Weise erhaltenen Gleichungen sinnvolle Vorhersagen durchführen zu können, sind q2-
Werte von etwa 0.6 nötig. Da für die Modelle, die mit der KNN-Methode und den KH-
QSAR-Analysen
58
Deskriptoren aufgestellt wurden, nur noch Werte von etwa 0.5 erreicht wurden, sind diese nicht
mehr für Vorhersagen geeignet.
Die Datensätze des Straub-Tail-Tests erreichen ebenfalls keine guten Werte, so daß
Vorhersagen mit der QSAR-Gleichung für die KH-Deskriptoren und die GA-PLS-Methode
nicht möglich sind (Tab. 9). Die übrigen erreichten q2-Werte lassen darauf schließen, daß die
erhaltenen QSAR-Modelle prinzipiell für eine Vorhersage geeignet sind (s.a. Anhang, Kapitel
10.6, S. 107).
Datensatz Verbind. Methode Deskript. q2SD F
RR 17 GA-PLS KH 0.81 0.19 58.0
18 AP 0.72 0.11 173.6
17 KNN KH 0.51 0.55 13.8
18 AP 0.66 0.51 15.9
TR 16 GA-PLS KH 0.78 0.27 30.7
17 AP 0.90 0.09 382.5
16 KNN KH 0.52 0.57 13.9
17 AP 0.83 0.70 15.0
ST 15 GA-PLS KH 0.38 0.42 17.4
15 AP 0.59 0.31 55.8
15 KNN KH 0.52 0.51 12.5
15 AP 0.65 0.62 12.3
Tab. 9: Ergebnisse der Trainingsdatensätze.
6.6.6 Vorhersagen
Um die biologische Aktivität der Verbindungen der Testdatensätze vorherzusagen, wurden
zunächst die Deskriptoren der Strukturen erzeugt. Mit dieser Information können nun unter
Verwendung der QSAR-Gleichungen, die mit Hilfe der Trainingsdatensätze aufgestellt wurden,
die biologischen Aktivitäten der vorher entnommenen Verbindungen vorhergesagt und
anschließend mit den wirklichen Werten verglichen werden. In Tab. 10 sind die Ergebnisse der
Vorhersage des Rotarod-Tests dargestellt. Dabei wurden die Verbindungen mit Hilfe der AP-
Deskriptoren beschrieben und die zur Vorhersage verwendeten Modelle mit der GA-PLS-
Methode entwickelt.
QSAR-Analysen
59
Methode / Deskript. / Test Verbindung Experiment Vorhersage Differenz
GA-PLS / AP / RR
2k_1978 0,95 1,56 -0.61
2m_1978 1,36 1,84 0.44
5c_1986 0,35 0,74 0.39
84_1973 1,92 1,70 -0.22
Chlorpromazin 2,33 2,20 0.13
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Tab. 10: Vorhersagen biologischer Aktivitäten.
Für diese Kombination ergaben sich befriedigende Vorhersagen. Lediglich für die Verbindung
2k_1978 weicht die vorhergesagte biologische Aktivität stark vom Originalwert ab. Auffällig
ist, daß der Trend der biologischen Aktivität innerhalb des Testdatensatzes gut prognostiziert
wurde (s.a. Anhang, Kapitel 10.7, S. 110). Die Ergebnisse der GA/PLS Analysen in
Kombination mit den KH Deskriptoren sind zur Veröffentlichung eingereicht99.
6.6.7 Datenbankrecherchen
Neben den beschriebenen Vorhersagen neuer Verbindungen bieten die erhaltenen QSAR-
Gleichungen eine weitere Möglichkeit auf dem Weg zu verbesserten und neuen Muskel-
relaxantien. Mit Hilfe der KNN-Methode ist es möglich, Datenbanken zu durchsuchen. Zu
diesem Zweck wird ein subjektiv gewähltes Molekül der jeweiligen Datensätze als Sonde
eingesetzt, wobei in diesen Untersuchungen Tolperison verwendet wurde. Mit Hilfe dieser
Sonde werden in der Datenbank diejenigen Verbindungen herausgesucht, die dieser Sonde am
ähnlichsten sind. Die Ähnlichkeit wird hier wie bei der KNN-QSAR-Methode über den
euklidischen Abstand ermittelt. Es wird jedoch nicht der Abstand zwischen allen die Struktur
beschreibenden Deskriptoren ermittelt, sondern es werden nur diejenigen Deskriptoren
verwendet, die mit Hilfe der QSAR-Untersuchungen als signifikant ermittelt wurden. Auf diese
Weise können zu Tolperison ähnliche Verbindungen gefunden werden, die jedoch zusätzlich
bereits die Voraussetzung erfüllen, in die berechneten QSAR-Gleichungen "zu passen". Als
Grundlage der Recherchen wurden die Ergebnisse der QSAR-Analyse des Rotarod-Datensatzes
QSAR-Analysen
60
in Kombination mit der GA-PLS-Statistik und den AP-Deskriptoren gewählt, da dieses Modell
die größte Validität aufwies.
Um die Recherchen durchzuführen, wurden zunächst die Strukturen der CSD-Datenbank
(Cambridge Structure Database, etwa 70,000 organische Verbindungen) in die verwendeten
Deskriptoren umgewandelt und anschließend diejenigen extrahiert, die aufgrund der QSAR-
Analysen als signifikant erkannt wurden. Daraufhin wurde von jedem Datenbankmolekül der
euklidische Abstand zu Tolperison errechnet. Als Obergrenze des numerischen Wertes des
Abstandes wurde dabei ein Wert von drei verwendet. Auf diese Weise wurden 15
Verbindungen identifiziert (Tab. 11). Die Verwendung höherer Obergrenzen erlaubt die
Identifizierung einer größeren Anzahl von Verbindungen. (s.a. Anhang, Kapitel 10.10, S. 119).
Struktur CSD Bezeichnung Abstand
N
O
N
S
HH
DARXAV 2.45
O
NJALDAB 2.24
N
N
O
ROLKIM 3.00
Tab. 11: Ausschnitt der Ergebnisse der Datenbankrecherchen.
Einige der gefundenen Verbindungen zeigen visuell Ähnlichkeit mit Tolperison (z.B.
JALDAB). Neben diesen sind jedoch auch optisch wenig ähnliche Verbindungen gefunden
worden, die durch subjektive Auswahl wahrscheinlich nicht selektiert worden wären. Die
gefundenen Strukturen stellen potentielle Kandidaten für verbesserte Muskelrelaxantien dar.
Zusammenfassung und Ausblick
61
7 Zusammenfassung und Ausblick
Tolperison (1) ist wegen seiner wenigen Nebenwirkungen und seiner guten Verträglichkeit z.Z.
das am häufigsten verschriebene Medikament zur Behandlung schmerzhafter Muskel-
verspannungen. Die Ursachen dieser chronifizierten Muskelschmerzen sind ebenso wie die
genaue Wirkungsweise und der Wirkort von Tolperison (1) nicht genau bekannt. Hinweise
deuten darauf hin, daß Tolperison (1) sowohl in zentralen als auch peripheren Bereichen
kanalblockierende Eigenschaften besitzt. Die vorliegende Arbeit stellt einen Beitrag zur
Untersuchung der Funktionsweise von Tolperison dar.
Um die peripheren Einflüsse von Tolperison (1) zu untersuchen, wurde der nicotinische
Acetylcholinrezeptor (nAChR) als Modellsystem benutzt. Beim nAChR handelt es sich um
einen unspezifischen, ligandengesteuerten Ionenkanal. Wegen der guten Zugänglichkeit dieses
Rezeptors wurden viele grundlegende Vorstellungen zur Struktur und Funktion von Neuro-
rezeptoren mit integralem Ionenkanal am Beispiel des nAChR aus dem elektrischen Organ von
elektrischen Rochen oder Aalen (Torpedo oder Electrophorus) entwickelt.
Die Analyse der Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen zwischen Tolperison und dem nAChR
wurde mit Hilfe von Photoaffinitätsmarkierungen an membrangebundenen Rezeptoren
durchgeführt. Grundvoraussetzung für diese Art von Untersuchungen ist die Synthese eines
photolabilen Liganden, der durch Licht aktiviert und auf diese Weise eine kovalente Bindung
zum Rezeptor ausbilden kann. Zur Lokalisierung des Liganden im Proteingemisch nach dem
Markierungsexperiment ist der Einsatz von Radioisotopen notwendig. Aus Gründen der
Arbeitssicherheit kommt nur ein schwacher β-Strahler und wegen der benötigten hohen
spezifischen Radioaktivität nur ein vergleichsweise kurzlebiges Derivat in Frage. Daher wurde
in dieser Arbeit ein tritiiertes Derivat von Tolperison ([3H]2-Tolperison, 1b) synthetisiert.
Zusammenfassung und Ausblick
62
O
T
TN
1b
Dies gelang durch Hydrogenolyse eines dibromierten Tolperisons (13) mit Tritiumgas. Es
wurde ein 3H-Tolperison (1b) mit hoher spezifischer Aktivität (50 Ci/mmol) synthetisiert,
dessen Absorption im Wellenlängenbereich von 270 nm für die Photoaffinitätsmarkierungen
genutzt werden konnte. Die Ergebnisse der Photoaffinitätsexperimente deuten auf die bereits
vermutete kanalblockierende Wirkungsweise hin. Aufgrund seiner chemischen Äquivalenz zu
Tolperison, kann 3H-Tolperison auch in pharmakologischen Untersuchungen eingesetzt werden.
Diese liefern genauere Aussagen über die physiologische Verteilung und Lokalisierung des
Wirkortes im Körper. Zusätzlich werden Aufnahme, Verteilung, Metabolismus und Aus-
scheidung von Tolperisons ermittelt.
Zur Verwendung von Tolperison (bzw. seiner Derivate) in einem weniger energiereichen
Wellenlängenbereich konnten in dieser Arbeit verschiedene Synthesewege zu Tolperison-
derivaten mit photolabiler Gruppe aufgezeigt werden. Dabei erwies sich die Synthese eines
Azidotolperisons als sehr effizient. Dieses Derivat kann als Vorstufe für die weitere Synthese
zur Darstellung der entsprechenden tritiierten Verbindung verwendet werden. Mit diesem
sowohl radioaktiven als auch in einem weniger energiereichen Wellenlängenbereich aktivier-
baren Tolperisonderivat, sind dann auch Untersuchungen an empfindlicheren Proteinen
möglich. Hierfür sind aufgrund elektrophysiologischer Messungen bereits Natriumkanäle als
mögliche Wirkorte des Tolperisons identifiziert worden. Analoge Untersuchungen zur vor-
liegenden Arbeit mit solchen Kanalproteinen werden genauere Erkenntnisse über den Wirkort
von Tolperison liefern.
Als Beitrag zu der immer noch unbekannten Wirkungsweise von Muskelrelaxantien wurde
Tolperison auf der Basis von quantitativen Struktur-Wirkungsbeziehungen (QSAR, engl.:
Quantitative Structure Activity Relationship) mit anderen Muskelrelaxantien verglichen. Dabei
wurden die Strukturen der untersuchten Wirkstoffe mit den numerischen Werten ihrer bio-
logischen Wirksamkeit quantitativ in Beziehung zueinander gesetzt. Als biologische Aktivitäten
von Muskelrelaxantien sind jedoch keine direkten Affinitätswerte (z.B. IC50-Werte) verfügbar.
Um trotzdem QSAR-Modelle aufstellen zu können, wurden biologische Daten eingesetzt, die
Zusammenfassung und Ausblick
63
mit Hilfe pharmakologischer Standardtests ermittelt wurden (ED50-Werte). Bei Recherchen der
Literatur der letzten 35 Jahre konnten ausschließlich die Ergebnisse des Rotarod-Tests, des
Traction-Tests und des Straub-Tail-Tests verwendet werden, da nur diese genügend Daten-
mengen für die Durchführung statistisch signifikanter Analysen lieferten.
Um die QSAR-Analysen durchzuführen, wurden die chemischen Strukturen der untersuchten
Wirkstoffe durch zwei Arten zweidimensionaler Deskriptoren beschrieben. Zum einen mit Hilfe
der topologischen Deskriptoren nach Kier & Hall44 und zum anderen durch zweidimensionale
Atompaar-Deskriptoren82.
Um die Matrix der Deskriptoren mit dem Vektor der biologischen Aktivitäten in Beziehung zu
setzen, wurden zwei Methoden angewandt. Zum einen die lineare GA-PLS-Methode, die die
PLS-Statistik mit einem genetischen Algorithmus kombiniert, wobei genetische Algorithmus
zur Selektion signifikanter Deskriptoren innerhalb der Gruppe aller Deskriptoren diente. Zum
anderen wurde die nicht-lineare KNN-Methode eingesetzt. Diese verwendet zur Variablen-
selektion einen Simulated-Annealing-Mechanismus und berechnet die Aktivität einer
Verbindung eines Datensatzes durch dessen nächste Nachbarn. Der Abstand wird dabei durch
die euklidische Distanz bestimmt.
Die Qualität der so erhaltenen mathematische Modelle wurde mittels unterschiedlicher
Verfahren untersucht. Neben der Kreuzvalidierung während der Aufstellung der Modelle,
wurden zusätzlich Vorhersagen der biologischen Aktivität von Verbindungen durchgeführt, die
nicht in den Datensätzen enthalten waren. Zusätzlich wurde die Signifikanz der Modelle durch
Permutationstests untersucht, um so Hinweise darauf zu erhalten, ob die aufgestellten Modelle
auf einer zufälligen Beziehung zwischen biologischer Aktivität und chemischer Struktur
beruhen. Die besten Ergebnisse wurden bei diesen Untersuchungen für den Datensatz des
Rotarod-Tests in Kombination mit den Atompaar-Deskriptoren und der GA-PLS-Methode
erhalten.
Dieses Modell diente in nachfolgend dazu, Hinweise auf zu Tolperison-ähnliche Verbindungen
zu erhalten. Hierfür wurde eine Datenbankrecherche durchgeführt, um so mögliche Kandidaten
bzw. Leitstrukturen für wirksamere und spezifischere Muskelrelaxantien zu ermitteln. Als
mögliche Kandidaten konnten einige zu Tolperison analoge Verbindungen ermittelt werden, die
zukünftig als neue Leitstrukturen für verbesserte Muskelrelaxantien dienen können.
Experimenteller Teil
64
8 Experimenteller Teil
8.1 Allgemeines
Für die analytische Dünnschichtchromatographie wurden mit Kieselgel beschichtete
Aluminiumfertigfolien (Kieselgel 60 F254, 0.2 mm) und mit Aluminiumoxid beschichtete
Aluminiumfertigfolien (Aluminiumoxid 60 F254, neutral, Typ E, 0.2 mm) der Fa. Merck
verwendet. Für die präparative Säulenchromatographie diente Kieselgel 60 (Korngröße 0.040 –
0.063 mm) bzw. Aluminiumoxid 90 (neutral, Aktivitätsstufe II – III, Korngröße 0.063 –
0.200 mm) der Fa. Merck als stationäre Phase. Das jeweils verwendete Laufmittelgemisch ist in
den Vorschriften angegeben. Alle Lösemittel wurden direkt eingesetzt bzw. nach Vorschriften
des Organikum100 oder des Eicher-Tietze101 getrocknet. Für die radioaktive Synthese wurden
ausschließlich Lösemittel mit p.a. Qualität eingesetzt.
Reaktionen, in denen feuchtigkeitsempfindliche Verbindungen auftraten, wurden in
geschlossenen Systemen mit Druckausgleich unter Argon- oder Stickstoffatmossphäre
durchgeführt.
Für die HPLC-Analysen wurde eine L-6000 Pumpe, ein 655A Variable Wavelength UV
Detector, ein 655 A Liquid Chromatograph und ein L-5000 LC Controller der Firma Merck-
Hitachi verwendet. Für präparative HPLC-Trennungen wurde eine Hibar Fertigsäule RT, 250 x
25 mm, LiChrosorb RP-18 (7 µm) der Firma E.Merck eingesetzt. Analytische Trennungen
wurden auf einer LiChrosper 60, RP-select (10 µm) Fertigsäule durchgeführt.
GC-Analysen wurden mit einem Hewlett Packars 5860 Series II Gaschromatograph, einer 25 m
Kapillarsäule, FID Detektor und Integrator D 2500 (Merck-Hitachi) durchgeführt, dabei diente
Stickstoff als Trägergas.
NMR-Spektren wurden auf Bruker Bruker ARX 200 (200/50 MHz) und Bruker ARX 300
(300/75 MHz) aufgenommen. Als Lösemittel diente CDCl3 mit Tetramethylsilan (TMS) mit
internem Standard. Die chemischen Verschiebungen beziehen sich auf die δ-Skala und sind in
ppm angegeben. Die Multiplizitäten der Kohlenstoffatome wurde den zugehörigen DEPT-135-
Spektren entnommen.
Experimenteller Teil
65
Massenspektren wurden mit Hilfe eines VG Fison Autospec aufgenommen. Die GC/MS
Spektren wurden mit einem Fison MD 800 Spektrometer ermittelt.
IR-Spektren wurden unter Verwendung von Nicolet 5DX und 510P FTIR Spektrometern
vermessen. Feststoffe wurden dabei als KBr Preßlinge, Flüssigkeiten als Film zwischen zwei
NaCl-Platten eingesetzt. Zur Aufnahme der UV Spektren wurde ein Shimadzu UV-2101P UV
Spektrometer verwendet.
Schmelzpunkte wurden mit einer Mettler FP 61 Schmelzpunktbestimmungsapparatur in offenen
Kapillaren ermittelt.
Die analytischen Elektrophoresen wurden unter Verwendung einer PHASE Elektrophorese-
apparatur durchgeführt. Die Färbung erfolgte mit Coomassie Blau.
Für die Photoaffinitätsmarkierung wurde eine Blitzlichtlampe mit einer Leistung von 2 kJ
eingesetzt. Zur Untersuchung der Photolabilität wurde eine UV Lampe der Firma Heraeus unter
Verwendung eines Schott Interferenzfilters (315 nm) eingesetzt.
Herrn Prof. H.C. Marsmann und Frau A. Cimurek danke ich für die Messung von NMR-
Spektren.
Für die Aufnahmen der Massenspektren bzw. der GC-Massenspektren danke ich Herrn E. Jonk
und Herrn Dr. P. Schulze von der Universität Bremen.
Experimenteller Teil
66
8.2 Arbeitsvorschriften
2,2,2-Trifluoracetophenon (24)
CF3
O
Methode 1:
Aus 52.5 ml (0.50 mol) Brombenzol und 12.15 g (0.50 mol) Magnesium wird in absolutem
Diethylether ein Grignardreagenz erzeugt. Zu der auf 0 °C gekühlten Lösung werden
anschließend bei intensivem Rühren langsam 12.8 ml (0.16 mol) Trifluoressigsäure getropft. Es
wird für weitere 2 h bei Raumtemperatur gerührt und daraufhin schnell mit gesättigter NH4Cl-
Lösung hydrolisiert. Die wäßrige Phase wird noch zweimal mit Diethylether extrahiert und die
vereinigten organischen Phasen im Vakuum konzentriert. Zur Reinigung wird über eine kurze
Kolonne im Wasserstrahlvakuum destilliert. Man erhält 14.90 g (54 %) 2,2,2-Trifluor-
acetophenon als farblose Flüssigkeit.
Methode 2:
Aus 52.5 ml (0.50 mol) Brombenzol und 12.15 g (0.50 mol) Magnesium wird in absolutem
Diethylether ein Grignardreagenz erzeugt. Diese Lösung wird zu einer auf -78 °C gekühlten und
mechanisch gerührten Lösung von 59.7 ml (0.5 mol) Trifluoressigsäureethylester in Ether
getropft. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur, wird mit gesättigter NH4Cl-Lösung und
anschließend mit verdünnter Salzsäure hydrolisiert. Die wäßrige Phase wird noch zweimal mit
Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen im Vakuum konzentriert. Zur
Reinigung wird über eine kurze Kolonne im Wasserstrahlvakuum destilliert. Man erhält 45.31 g
(52 %) 2,2,2-Trifluoracetophenon als farblose Flüssigkeit.
Methode 3:
Zu einer auf -78 °C gekühlten Lösung von 29.76 ml (59.52 mmol) einer 2 M Phenyllithium-
lösung werden 7.10 ml (59.60 mmol) Trifluoressigsäureethylester in 100 ml Ether getropft.
Anschließend wird für 2 h gerührt. Nach dem Erwärmen auf Raumtemperatur, wird mit
gesättigter NH4CL-Lösung und anschließend mit verdünnter Salzsäure hydrolisiert. Die wäßrige
Experimenteller Teil
67
Phase wird noch zweimal mit Diethylether extrahiert und die vereinigten organischen Phasen
im Vakuum konzentriert. Zur Reinigung wird über eine kurze Kolonne im Wasserstrahlvakuum
destilliert. Man erhält 6.63 g (64 %) 2,2,2-Trifluoracetophenon als farblose Flüssigkeit.
Sdp.: 52 °C / 35 mbar (Lit.25: 46-48 °C/19 mbar). –
D
n20 : 1.455 (Lit.: 1.458102). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.59 (t, 2 H, J = 7.6 Hz, Ar-H), 7.76 (t, 1 H, J = 7.6 Hz, Ar-
H), 8.12 (d, 2 H, J = 7.6 Hz, Ar-H). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 174 [M+] (5). –
2,2,2-Trifluoracetophenon-O-oxim (26)
CF3
NOH
Methode 1:
Eine Lösung von 10.45 g 2,2,2-Trifluoracetophenon (60.03 mmol), 4.58 g (66.12 mmol)
Hydroxylammoniumhydrochlorid und 3.72 g (66.10 mmol) Natriumhydroxid in 60 ml Ethanol
wird für 3 h unter Rückfluß gekocht. Nach Abfiltrieren des ausgefallenen Natriumchlorids wird
das Lösemittel unter reduziertem Druck entfernt und das resultierende Produkt mit Diethylether
aufgenommen. Anschließend wird dreimal mit Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen mit
Natriumsulfat und Entfernen des Lösemittels erhält man 7.89 g (70 %) des Oxims (Lit.25: 87 %)
in Form eines weißen Feststoffs.
Methode 2:
Zu 4.97 g 2,2,2-Trifluoracetophenon (28.7 mmol), 6.10 g (86.2 mmol) Hydroxylammonium-
hydrochlorid und 4.82 g (86.2 mmol) Kaliumhydroxid werden 100 ml Isopropanol gegeben und
die Lösung für 3 h unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird das Lösemittel abgezogen und
der Feststoff mit Diethylether und Wasser aufgenommen. Die organische Phase wird mit 0.1 N
Experimenteller Teil
68
HCl und Wasser gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösemittel i. Vak.
entfernt. Man erhält 4.81 g (91 %) des Oxims in Form eines weißen Feststoffs.
Schmp.: 86-87 °C (Lit.25: 86-86.5 °C). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.4-7.6 (m, 5 H, Ar-H), 8.7 (s, 1 H, NO-H). –
2,2,2-Trifluoracetophenon-O-(p-toluylsufonyl) oxim (27)
CF3
NOTs
Methode 1:
Zu 3.19 g (16.9 mmol) 2,2,2-Trifluoracetophenon-O-oxim und 3.68 (19.3 mmol) Toluolsulfon-
säurechlorid werden 30 ml abs. Pyrridin gegeben und die Lösung für 3 h gekocht. Das
ausgefallene Pyrridinhydrochlorid wird abfiltriert und das Filtrat i. Vak. eingeengt. Nach
Aufnehmen in Diethylether wird mit Wasser, 0.1 N HCl und konz. NaHCO3 gewaschen und
über Magnesiumsulfat getrocknet. Das Produkt kristallisiert bei -20 °C aus. Man erhält 3.42 g
(59 %) des Tosylats in Form farbloser Nadeln.
Methode 2:
Zu 2.21 g (11.6 mmol) 2,2,2-Trifluoracetophenon-O-oxim, 2.21 g (11.6 mmol) Toluolsulfon-
säurechlorid, 1.6 ml (11.6 mmol) Triethylamin und einer Spatelspitze DMAP werden 20 ml
Dichlormethan gegeben und die Lösung für 30 min gekocht. Anschließend wird das Lösemittel
entfernt und der Feststoff in Wasser und Diethylether aufgenommen. Die organische Phase wird
mit verd. HCl und ges. NaHCO3 ausgeschüttelt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach
Entfernen des Lösemittels erhält man 3.98 g (quant.) des Tosylats in Form farbloser Nadeln.
Schmp.: 109 °C (Lit.25: 102 °C). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.52 (s, 1H, Ar-CH3), 7.40-7.61 (m, 7 H , Ar-H). –
Experimenteller Teil
69
3-Trifluormethyl-3-phenyl-diaziridin (28)
CF3
HN NH
In eine in einem Hochdruckgefäß auf -78 °C gekühlte Lösung von 4.07 g (13 mmol) 2,2,2-
Trifluoracetophenon-O-(p-toluylsufonyl)-oxim in 30 ml absolutem Diethylether werden 10 ml
Ammoniak einkondensiert und anschließend fest verschlossen. Danach wird die Lösung auf
Raumtemperatur erwärmt und für 5 h gerührt. Anschließend wird erneut auf -78 °C gekühlt, das
Gefäß geöffnet und der Ammoniak im Abzug verdampft. Anschließend wird Wasser
hinzugegegben. Nach Abfiltrieren des Toluolsulfonsäureamides wird die organische Phase
zweimal mit Wasser gewaschen und anschließend mit Natriumsulfat getrocknet. Nach
Entfernen des Lösemittels erhält man 2.10 g (93 %) als Öl, das bei 0 °C auskristallisiert.
Schmp.: 33 °C (Lit.: 33-35 °C). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.27 und 2.82 (AB-System, 2 H, J = 8.5 Hz, N-H), 7.46 –
7.67 (m, 5H, Ar-H). –
3-Trifluormethyl-3-phenyl-diazirin (21)
CF3
N N
Methode 1:
Zu einer Lösung von 0.50 g (2.71 mmol) des Diaziridins in 5 ml Methanol und 0.30 ml (5.42
mmol) Triethylamin werden nach und nach 0.68 g (2.71 mmol) Iodkristalle gegeben.
Anschließend wird zwei Stunden gerührt (DC-Kontrolle: Diethylether / Hexan 1:1). Nach
Zugabe von Wasser und Diethylether wird die organische Phase abgetrennt, mit
Natriumhydrogensulfitlösung und Wasser gewaschen und anschließend mit Natriumsulfat
getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels erhält man 0.49 g (98 %) des Diazirins in Form
eines hellgelben Öles.
Experimenteller Teil
70
Methode 2:
Zu einer Lösung von 1.02 g des Diaziridins (5.4 mmol) in 25 ml Diethylether werden 2.51 g
frisch zubereitetes Silberoxidd gegeben und für 5 h gerührt. Nach Filtration wird das Lösemittel
entfernt. Man erhält 0.95 g (95 %) des Diazirins in Form eines hellen Öles.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.2 - 7.6 (m, 5H, Ar-H). –
2'-Brom-2,2,2-trifluoracetophenon (25)
CF3
O
Br
Zu einer auf 0 °C gekühlten Lösung von 10.08 g (57.89 mmol) 2,2,2-Trifluoracetophenon in
60 ml konzentrierter Schwefelsäure werden 8.24 g (28.45 mmol) DIBCA32 gelöst in 100 ml
konzentrierter Schwefelsäure getropft. Nach Erwärmen auf RT wird für 1 h gerührt.
Anschließend wird auf Eis gegossen und dreimal mit Diethylether ausgeschüttelt. Die
vereinigten organischen Phasen werden mit ges. NaHCO3 und Wasser gewaschen und über
Natriumsulfat getrocknet. Nach Destillation im Vakuum erhält man 8.72 g (60 %, Lit.33: 62 %)
des bromierten Acetophenons.
Sdp.: 91 °C / 25 mbar (Lit.33: 80 °C / 15 mbar). –
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 7.45 (dd, 1 H, J = 7.9 Hz, 5-H), 7.84 (d, 1 H, J = 7.9 Hz, 6-
H), 8.00 (d, 1-H, J = 7.9 Hz, 4 H), 8.20 (s, 1 H, 2-H). –
d Nach Zugabe von 100 ml 1 N NaOH zu einer kochenden Lösung von 17 g Sibernitrat in 50 ml Wasser wird ausgefallenes
Silberoxid abfiltriert und nacheinander mit Wasser, Aceton und Diethylether gewaschen.
Experimenteller Teil
71
2'-Brom-2,2,2-trifluoracetophenon-O-oxim (42)
CF3
N
O
H
B
r
Eine Lösung von 4.04 g 3'-Bromo-2,2,2-Trifluoracetophenon (28.7 mmol), 5.98 g (86.2 mmol)
Hydroxylammoniumhydrochlorid und 4.82 g (86.2 mmol) Kaliumhydroxid werden in 100 ml
Isopropanol wird für 3 h unter Rückfluß gekocht. Anschließend wird das Lösemittel abgezogen
und der Feststoff mit Diethylether und Wasser aufgenommen. Die organische Phase wird mit
0.01 N HCl und Wasser gewaschen. Nach Trocknen mit Natriumsulfat wird das Lösemittel i.
Vak. entfernt. Nach Destillation erhält man 1.15 g (27 %) (Lit.33: 87 %) des Oxims in Form
farbloser Nadeln.
Sdp.: 131 °C / 26 mbar (Lit.33: 84 °C / 3 mbar). –
Schmp.: 52 °C. –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.42 (dd, 1 H, J = 7.7 Hz, 5-H), 7.50 (d, 1 H, J = 7.7 Hz, 4-
H), 7.67 (d, 1H, J = 7.7 Hz, 6-H), 7.73 (s, 1 H, 2-H), 9.22 (s, 1 H, NO-H). –
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 118.0 (s, CF3), 123.0 (s, C-Br), 123.5 (s, C-1), 127.6 (d, C-6),
128.0 (s, C-NOH), 130.6 (d, C-2), 132.0 (d, C-5), 134.3 (d, C-4). –
2'-Brom-2,2,2-trifluoracetophenon-O-(p-toluylsufonyl) oxim (43)
CF3
N
O
T
s
Br
Zu 1.00 g (3.7 mmol) 2,2,2-Trifluoracetophenon-O-oxim, 0.78 g (4.1 mmol) Toluolsulfonsäure-
chlorid, 1 ml (7.5 mmol) Triethylamin und eine Spatelspitze DMAP werden 20 ml
Dichlormethan gegeben und die Lösung für 5 min gerührt. Nach Einengen wird mit Wasser und
Diethylether aufgenommen. Die organische Phase wird mit 0.1N HCl und ges. NaHCO3
ausgeschüttelt und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels und
Experimenteller Teil
72
Umkristallisation in Hexan erhält man 1.56 g (quant.) (Lit.33: 67 %) des Tosylates in Form
weißer Nadeln.
Schmp.: 84 °C (Lit.33: 81-82 °C). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.51 (s, 3 H, CH3), 7.40 (m, 4 H, 4 CH2), 7.51 (s, 1H, arom.
CH), 7.69 (d, 1 H, J = 7.1 Hz, arom. CH), 7.92 (d, 2 H, J = 9.4 Hz, arom. CH). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 22.23 (q, CH3), 123.27 (s, CF3), 126.75 (d, Carom), 127.50 (s,
Carom), 128.28 (s, Br-Carom), 129.70 (d, Carom), 130,41 (d, Carom), 130.87 (d, Carom), 131.342 (d,
Carom), 135,34 (d, Carom), 146.82 (s, CNOTs). –
2'-Brom-3-trifluormetyl-3-phenyl-diaziridin (44)
CF3
H
N
N
H
B
r
In eine in einem Hochdruckgefäß auf -78 °C gekühlte Lösung von 1.03 g (2.4 mmol) 3'-Bromo-
2,2,2-trifluoracetophenon-O-(p-toluylsufonyl)-oxim in 10 ml absolutem Diethylether werden 10
ml Ammoniak einkondensiert und anschließend verschlossen. Zur Reaktion wird auf
Raumtemperatur gebracht und für 5 h gerührt. Anschließend wird erneut auf -78 °C gekühlt, das
Gefäß geöffnet und der Ammoniak im Abzug verdampft. Anschließend wird Wasser
hinzugegeben. Nach Abfiltrieren des Toluolsulfonsäureamides wird die organische Phase
zweimal mit Wasser gewaschen und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des
Lösemittels erhält man 0.59 g (91 %) (Lit.33: 74 %) als Öl, das aus Hexan in Form farbloser
Nadeln ausfällt.
Schmp.: 39 °C (Lit.33: 41 °C). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 2.30 und 2.87 (AB-Spektrum, 2H, 2 x NH, J = 8.7 Hz), 7.33
(dd, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 7.59 (m, 2H, Ar-H), 7.81 (s, 1H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 120.91 (s, CF3), 123.16 (s, Carom), 126.44 (s, Br-C), 127.21 (d,
Carom), 130.75 (d, Carom), 131.63 (d, Carom), 133.80 (d, Carom), 134.16 (s, NCN). –
Experimenteller Teil
73
2'-Brom-3-trifluormetyl-3-phenyl-diaziridin (45)
CF3
N N
Br
Zu einer Lösung von 0.50 g (1.9 mmol) des Diaziridins in 5 ml Methanol und 0.5 ml
(0.4 mmol) Triethylamin werden nach und nach 0.50 g (2.0 mmol) Iodkristalle gegeben.
Anschließend wird zwei Stunden gerührt (DC-Kontrolle Diethylether / Hexan 1:1). Nach
Zugabe von Wasser und Diethylether wird die organische Phase abgetrennt, mit
Natriumhydrogensulfitlösung und Wasser gewaschen und anschließend mit Natriumsulfat
getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels erhält man 0.23 g (86 %) des Diazirins in Form
eines hellgelben Öls.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 7.37 (dd, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz), 7.48 (s, 1H, Ar-H), 7.52 (d,
1H, Ar-H, J = 7.6 Hz) , 7.69 (d, 1H, Ar-H, J = 7.6 Hz). –
4'-Methyl-3'-nitro-propiophenon (32)
O
NO2
Zu 30 ml in einem Eis / Kochsalzbad auf -10 °C gekühlten Salpetersäure (100 %) werden
langsam 10.04 g (67.5 mmol) 4'-Methyl-propiophenon getropft. Anschließend wird für etwa 2 h
bei etwa -10 °C gerührt (Grünfärbung). Das Gemisch wird auf Eis gegeben, mit Natrium-
hydroxid basifiziert gestellt und die Suspension mit Diethylether extrahiert. Nach Trocknen
über Natriumsulfat wird das Lösemittel i. Vak. entfernt. Anschließende Destillation liefert 10.31
g (80 %) des Nitropropiophenons in Form hellgelber Kristalle.
Schmp.: 55 °C. –
Experimenteller Teil
74
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.25 (t, 3 H, CH3, J = 7.2 Hz), 2.67 (s, 3H, Ar-CH3), 3.02 (q,
2H, CH2, J = 7.2 Hz), 7.47 (d, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 8.09 (d, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 8.51 (s,
1H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 8.53 (q, CH3), 21.00 (q, Ar-CH3), 32.34 (t, CH2), 124.60 (d,
CHarom), 132.17 (d, CHarom), 133.70 (d, CHarom), 136.25 (s, Carom), 138.73 (s, Carom), 149.67 (s,
NO2-Carom), 198.70 (s, C=O). –
C10H11NO3 (193.073893) gef. (HRMS): 193.07433
IR (KBr):
ν
~
= 2990, 2820, 2620, 2510, 2370, 1690, 1510, 1330, 1210 cm-1. –
3'-Nitro-tolperison (33)
O
NO2
N
Methode 1:
3.86 g (20 mmol) 4'-Methyl-3'-nitro-propiophenon, 1.02 g (34 mmol) Paraformaldehyd und
2.54 g Piperidinhydrochlorid werden in 10 ml Ethanol gelöst und für 1 h gekocht. Anschließend
fügt man einen Tropfen konz. Salzsäure hinzu und kocht für weitere 10 min. Bereits
ausgefallenes Produkt wird abgesaugt. Das Filtrat wird im Vakuum eingeengt und mit
Diethylether und Wasser versetzt. Die wäßrige Phase wird mit verdünnter Natronlauge versetzt
und mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet,
eingeengt und im Hochvakuum getrocknet.
Zur Überführung in das Hydrochlorid wird das freie Amin in 10 ml abs. Ether gelöst, mit 1.5 ml
Acetylchlorid versetzt. Zu dieser Lösung werden anschließend 1.5 ml Methanol getropft und für
1 h gerührt. Anschließend wird eingeengt und im Vakuum getrocknet. Man erhält 1.82 g (28 %)
des Hydrochlorides.
Experimenteller Teil
75
Methode 2:
Zu einer Suspension von 2.56 g Methylenpiperidiniumchlorid (19.2 mmol) in 15 ml absolutem
CH2Cl2 wird unter Luftausschluß eine Lösung von 3.71 g (19.2 mmol) 4'-Methyl-3'-nitro-
propiophenon in 5 ml Dichlormethan getropft. Anschließend wird für 12 h gekocht. Die
erhaltene Lösung wird eingeengt, mit Wasser aufgenommen und mit wenig verdünnter
Salzsäure versetzt. Nach Ausschütteln mit Diethylether zur Wiedergewinnung des Eduktes
(1.42 g) wird die wäßrige Phase mit verdünnter Natronlauge versetzt und mit Diethylether
extrahiert. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und im
Hochvakuum getrocknet.
Zur Überführung in das Hydrochlorid wird das freie Amin in 10 ml abs. Ether gelöst, mit 1.5 ml
Acetylchlorid versetzt. Zu dieser Lösung werden anschließend 1.5 ml Methanol getropft und für
1 h gerührt. Anschließend wird eingeengt und im Vakuum getrocknet. Man erhält 3.63 g (57 %)
des Hydrochlorides.
Schmp.: 172 °C (Hydrochlorid). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 8.62 (d, 1 H, 4J = 1.7 Hz, Ar-H), 8.32 (dd, 1 H, 3J = 8.1 Hz,
4J = 1.7 Hz, Ar-H), 7.56 (d, 1 H, 3J = 8.1 Hz), 4.72 (m, 1H, CH), –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 18.87 (q, Ar-CH3), 21.04 (q, CH3), 21.04 (t, CH2), 22.14 (t,
2 x N-CH2-CH2), 37.88 (d, CH), 55.48 (t, CH-CH2-N), 58.78 (t, 2 x N-CH2), 125.44 (d, Carom),
133.21 (d, Carom), 133.91 (s, CH3-Carom), 134.30 (d, Carom), 140.30 (s, Carom), 151.23 (s, Carom-
NH2), 198.29 (s, C=O). –
C16H22N2O3 (290.163042) gef. (HRMS): 290.16248. –
IR (KBr):
ν
~
= 2950, 2840, 2800, 2720, 2640, 2500, 2390, 1680, 1520, 1450, 1350, 1200 cm-1. –
Experimenteller Teil
76
3'-Amino-tolperison (34)
O
NH2
N
0.79 g (2.4 mmol) 3'-Nitro-tolperisonhydrochlorid und 0.27 g Eisenpulver (4.8 mmol) werden
in 30 ml Ethanol gelöst. Nach Zugabe von 6 ml 1N Salzsäure wird für 2 h gekocht. Nach
Filtration über Celite wird das Filtrat mit 1N NaOH basisch gestellt und die wäßrige Phase mit
Diethylether ausgeschüttelt. Nach Trocknen der organischen Phase über Natriumsulfat und
entfernen des Lösemittels erhält man 0.53 g (84 %) des freien Amins in Form eines gelben Öls,
das direkt für die nächste Reaktion eingesetzt werden kann.
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.18 (d, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.39 - 1.58 (m, 6H, 3 x CH2),
2.24 (s, 3H, Ar-CH3), 2.35 - 2.44 (m, 5H, CH2), 2.83 (d und AB-Spektrum, 1H, CH2, J = 7.2
Hz, JA,B = 12,5 Hz), 3.61 - 3.77 (m, 3H, NH2 + CH), 7.14 (d, 1H, Ar-H, J = 7.5 Hz), 7.30 - 7.35
(m, 3H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 17.47 (q, Ar-CH3), 18.00 (q, CH3), 24.71 (t, CH2), 26.43 (t,
2 x N-CH2-CH2), 39.11 (d, CH), 55.32 (t, CH-CH2-N), 62.73 (t, 2 x N-CH2), 114.58 (d, Carom),
119.22 (d, Carom), 128.24 (s, CH3-Carom), 130.87 (d, Carom), 136.30 (s, Carom), 145.32 (s, Carom-
NH2), 204.29 (s, C=O). –
C16H22N4O (260.188863) gef. (HRMS): 260.18923. –
Experimenteller Teil
77
3'-Azido-tolperison (36)
O
N3
N
Zu einer auf 0 °C gekühlten Lösung von 0.30 g (1.15 mmol) 3'-Amino-tolperison in 10 ml
Diethylether werden langsam 2 ml (11.8 mmol) einer wäßrigen 6M Tetrafluoroborsäurelösung
getropft. Dazu werden in 2 ml Wasser gelöstes Natriumnitrit gegeben und für 2 h bei 0 °C
gerührt. Anschließend wird eine Lösung von 75 mg Natriumazid in 1 ml Wasser zu dieser
Mischung gegeben und für weitere 2 h gerührt. Die Lösung wird mit 1N NaOH basifiziert und
mit Diethylether extrahiert. Nach Trocknen über Magnesiumsulfat, Entfernen des Lösemittels i.
Vak. und säulenchromatographischer Reinigung (CH2Cl2 /MeOH 95:5) erhält man 0.27 g (82
%) des Azids in Form eines hellen orangen Öles. Das freie Amin kann mit Methanol und
Acetylchlorid in das Hydrochlorid überführt werden (hellgelbes Pulver).
Schmp.: 151 °C. –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.18 (d, 3H, CH3, J = 6.9 Hz), 1.37 - 1.51 (m, 6H, 3 x CH2),
2.26 (s, 3H, Ar-CH3), 2.33 - 2.39 (m, 5H, CH2), 2.82 (d und AB-Spektrum, 1H, CH2, J = 7.6
Hz, JA,B = 12.6 Hz), 3.67 (m, 1H, CH), 7.24 (d, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 7.63 (d, 1H, Ar-H, J =
7.9 Hz), 7.75 (s, 1H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 17.11 (q, Ar-CH3), 17.91 (q, CH3), 24.65 (t, CH2), 26.37 (t,
2 x N-CH2-CH2), 39.41 (d, CH), 55.41 (t, CH-CH2-N), 62.98 (t, 2 x N-CH2), 117.97 (d, Carom),
124.96 (d, Carom), 131.55 (d, Carom), 135.29 (s, CH3-Carom), 136.57 (s, Carom), 139.62 (s, Carom-
NH2), 203.30 (s, C=O). –
C16H22N4O (286.179361) gef. (HRMS): 286.17923. –
UV (c=1.5 mg / 50 ml H2O): 270 nm, 320 nm. –
IR (Film, THF):
ν
~
= 2744, 2111 (N3-Valenz), 1683, 1604, 1572, 1405. 1303, 1281 cm-1. –
Experimenteller Teil
78
5'-Bromo-4'-Methyl-Nitro-propiophenone (38, 39)
O
Br
NO2
2g (8.8 mmol) 4'-Methyl-3'-bromo-propiophenon werden langsam zu 10 ml auf –15 °C
gekühlter konzentrierter Salpetersäure (100 %) gegeben für 30 min gerührt (DC Kontrolle
Aceton / Hexan 1:1). Die Reaktionsmischung wird auf Eis gegeben und mit Natriumhydroxid
basifiziert. Anschließend wird zweimalig mit Diethylether extrahiert und die vereinigten
organischen Phasen über Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels i. Vak. wird
die Produktmischung zunächst durch Umkristallisation in Diethylether gereinigt. Anschließende
säulenchromatographische (Aceton / Hexan 30 : 70) Trennung liefert 1.10 g des 5'-Bromo-2'-
nitro-propiophenons (46 %, weiße Nadeln), 0.35 g (15 %, hellgelbes Pulver) des 3'-Bromo-2'-
nitro-propiophenons und 0.09 g (4 %, gelbes Öl) des 3'-Bromo-5'-nitro-propiophenons.
5'-Bromo-4'methyl-2'-nitro-propiophenon (38)
Schmp.: 102 °C. –
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.25 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz), 2.52 (s, 3H, Ar-CH3), 2.76 (q,
2H, CH2, J = 7.2 Hz), 7.54 (s, Ar-H), 7.98 (s, Ar-H). –
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 7.92 (q, CH3), 22.73 (q, Ar-CH3), 36.22 (t, CH2), 125.80 (d,
Carom), 130.91 (d, Carom), 131.42 (s, Br-Carom), 141.05 (s, NO2-Carom), 202.61 (C=O). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 273 (M++1), 243 (27), 228 (9), 213 (10), 169 (12), 158 (6), 142
(14) 116 (7), 89 (100), 77 (22), 63 (98). –
C10H10BrNO3 (270.984404) gef. (HRMS): 270.98476. –
IR (KBr):
ν
~
= 3110, 3070, 2980, 2950, 2900, 1710, 1560, 1510, 1340, 1210 cm-1. –
Experimenteller Teil
79
3'-Bromo-4'methyl-2'-nitro-propiophenon (39)
Schmp.: 115 °C. –
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.16 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz), 2.52 (s, 3H, Ar-CH3), 2.92 (q,
2H, CH2, J = 7.2 Hz), 7.47 (d, Ar-H, J = 7.2 Hz), 7.73 (d, Ar-H, J = 7.2 Hz). –
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 7.60 (q, CH3), 22.42 (q, Ar-CH3), 32.84 (t, CH2), 117.18 (s,
Br-Carom), 127.70 (d, Carom), 131.35 (d, Carom), 145.06 (s, NO2-Carom), 196.91 (C=O). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 273 (M++1), 243 (42), 228 (5), 169 (12), 144 (13), 117 (15), 89
(100), 77 (20), 63 (90). –
C10H10BrNO3 (270.984404) gef. (HRMS): 270.98422. –
IR (KBr):
ν
~
= 2990, 2960, 2910, 1700, 1600, 1550, 1360, 1210, 1120 cm-1. –
3'-Bromo-4'methyl-5'-nitro-propiophenon (46)
1H-NMR (300 MHz, CDCl3): δ = 1.16 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz), 2.53 (s, 3H, CH3), 2.91 (q, 2H,
CH2, J = 7.2 Hz), 8.16 (d, Ar-H, J = 1.6 Hz), 8.25 (d, Ar-H, J = 1.6 Hz). –
13C-NMR (75 MHz, CDCl3): δ = 7.62 (q, CH3), 19.46 (q, Ar-CH3), 31.75 (t, CH2), 122.12 (d,
Carom), 127.51 (s, Br-Carom), 135.09 (d, Carom), 136.67 (s, NO2-Carom), 196.72 (C=O). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 273 (M++1), 243 (32), 228 (7), 169 (12), 143 (13), 117 (10), 89
(100), 77 (21), 63 (92). –
C10H10BrNO3 (270.984404) gef. (HRMS): 270.98483. –
IR (KBr):
ν
~
= 3070, 2970, 2950, 2920, 1710, 1550, 1520, 1350, 1200 cm-1. –
Experimenteller Teil
80
N-Piperidinomethylen-benzotriazol (41)
NN
N
N
Eine Mischung von 11 ml (0.13 mol) Formalinlösung (15 % HCHO), 12.5 ml (12.6 mmol)
Piperidin und 15.03 g (0.13 mol) Benzotriazol werden für 2 h unter Rückfluß erhitzt. Der
resultierende Rückstand wird abfiltriert und aus Diethylether umkristallisiert. Man erhält 22.24
g (82 %) des Piperidinomethylenbenzotriazols in Form eines weißen Feststoffs (in Lösung
liegen 1-N und 2-N-Isomere im Gleichgewicht vor).
Schmp.: 91 °C (Lit.: 89.5 - 90.5 °C)
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.30 - 1.38 (m, 2H, CH2), 1.54 - 1.65 (m, 4H, 2 x CH2), 2.60 -
2.72 (m, 4H, CH2-N-CH2), 5.46 (s, 2H, N-CH2-N, 1-N-Isomer), 5.56 (s, 2H, N-CH2-N, 2-N-
Isomer), 7.30 - 8.15 (m, 8H, arom. H, 1-N und 2-N-Isomere). –
3'-Brom-4'-methyl-propiophenon (9)
O
Br
Zu 22.53 g (0.34 mol) mechanisch gerührtem Aluminiumtrichlorid werden langsam 10 ml
(67 mmol) 4'-Methylpropiophenon getropft, so daß die Temperatur nicht über 120 °C steigt. Die
Suspension wird für 1 h bei 80 °C gerührt. Daran anschließend werden langsam 3.5 ml
(70 mmol) Brom zugetropft und die Temperatur unter 160 °C gehalten. Die Mischung wird
weitere 2 h bei 100 °C gerührt. Anschließend wird die zähe Masse schnell auf ein Gemisch von
Eiswasser und konz. Salzsäure (1:1) gegeben und kräftig gerührt. Diese Mischung wird
nachfolgend zweimal mit Diethylether extrahiert und die organische Phase mit Natriumsulfat
getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels i. Vak. wird im Vakuum destilliert. Man erhält 7.42
g (48 %) des bromierten Propiophenons in Form eines weißen Feststoffs.
Experimenteller Teil
81
Schmp.: 35 °C. –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.24 (t, 3H, CH3, J = 7.2 Hz), 2.47 (s, 3H, Ar-CH3), 2.97 (q,
2H, CH2, J = 7.2 Hz), 7.32 (d, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 7.81 (d, 1H, Ar-H, J = 7.9 Hz), 8.14 (s,
1H, Ar-H). –
13C-NMR: 8.58 (q, Ar -CH3), 23.07 (q, CH3), 32.19 (t, CH2), 125.66 (s, CH3-Carom), 127.19 (d,
Carom), 131.30 (d, Carom), 132.42 (d, Carom.), 136.68 (s, Carom.), 143.66 (s, Br-Carom.), 199.60 (s,
C=O). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 227 (M+), 197 (90), 170 (42), 89 (100), 62 (54). –
C10H11BrO (225.999326) gef. (HRMS): 225.99976
IR (KBr):
ν
~
= 3070, 2960, 1770, 1680, 1520, 1380, 1220, 1200 cm-1. –
3',5'-Dibrom-4'-methyl-propiophenon (12)
O
Br
Br
Zu 90.73 g (0.67 mmol) mechanisch gerührtem Aluminiumtrichlorid werden langsam 20 ml
(0.14 mmol) 4'-Methylpropiophenon getropft so das die Temperatur nicht über 120 °C steigt
und die entstehende Suspension anschließend für 1 h bei 80 °C gerührt. Daraufhin werden
langsam 16.7 ml (0.32 mmol) Brom hinzugetropft und die Temperatur bei etwa 160 °C
gehalten. Die Mischung wird weitere 2 h bei 110 °C gerührt. Anschließend wird die zähe Masse
schnell auf ein Gemisch von Eiswasser und konz. Salzsäure (1:1) gegeben und kräftig gerührt.
Diese Mischung wird nachfolgend dreimal mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase
wird mit Natriumsulfitlösung und Wasser gewaschen und anschließend mit Natriumsulfat
getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels i. Vak. wird im Vakuum destilliert. Man erhält
19.42 g (46 %) des doppelt bromierten Propiophenons in Form eines farblosen Feststoff.
Schmp.: 54 °C. –
Experimenteller Teil
82
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.20 (t, 3H, CH3, J = 7.1 Hz), 2.58 (s, 3H, Ar-CH3), 2.92 (q,
2H, CH2, J = 7.1 Hz), 8.02 (s, 2H, 2 x Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 8.41 (q, Ar-CH3), 24.47 (q,. CH3), 32.23 (t, CH2), 126.00 (s,
CH3-Carom), 131.55 (d, Carom), 137.00 (s, Carom), 141.83 (s, Br-Carom.), 198.08 (s, C=O). –
GC-MS (70 eV): m/z (%) = 306 (M+), 276 (31), 248 (17), 207 (12), 169 (29), 89 (100), 73 (27),
63 (54), 57 (45). –
C10H10Br2O (303.909837) gef.: 303.91012. –
IR (KBr):
ν
~
= 3120, 2920, 1780, 1690, 1580, 1390, 1260, 1150 cm-1. –
3'-Brom-tolperison (11)
O
BrN
Methode 1:
5.02 g (22.01 mmol) 3'-Brom-4'-methyl-propiophenon, 0.66 g (22.10 mmol) Paraformaldehyd
und 2.67 (22.10 mmol) Piperidinhydrochlorid werden in 10 ml Ethanol gelöst und für 1 h
gekocht. Anschließend fügt man einen Tropfen konz. Salzsäure hinzu und kocht für weitere 10
min. Bereits ausgefallenes hydrochloriertes Produkt wird abgesaugt. Das Filtrat wird im
Vakuum eingeengt und mit Diethylether und Wasser versetzt. Die wäßrige Phase wird mit
verdünnter Natronlauge versetzt und mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wird mit
Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Zur Überführung in
das Hydrochlorid wird das freie Amin in 10 ml abs. Ether gelöst, mit 1.5 ml Acetylchlorid
versetzt. Zu dieser Lösung werde anschließend 1.5 ml Methanol getropft und für 1 h gerührt.
Anschließend wird eingeengt und im Vakuum getrocknet. Man erhält insgesamt 3.59 g (45 %)
des Hydrochlorides.
Experimenteller Teil
83
Methode 2:
Zu einer Suspension von 1.61 g Methylenpiperidiniumchlorid (12.05 mmol) in 15 ml absolutem
CH2Cl2 wird unter Luftausschluß eine Lösung von 2.75 g (12.10 mmol) 3'-Brom-4'-methyl-
-propiophenon in 5 ml Dichlormethan getropft. Anschließend wird für 2 h gekocht. Die
erhaltene Lösung wird eingeengt, mit Wasser aufgenommen und mit wenig verdünnter
Salzsäure versetzt. Nach Ausschütteln mit Diethylether wird die wäßrige Phase mit verdünnter
Natronlauge versetzt und mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wird mit
Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Zur Überführung in
das Hydrochlorid wird das freie Amin in 10 ml abs. Ether gelöst, mit 1.5 ml Acetylchlorid
versetzt. Zu dieser Lösung werden anschließend 1.5 ml Methanol getropft und für 1 h gerührt.
Anschließend wird die Suspension eingeengt und im Vakuum getrocknet. Man erhält 3.69 g
(85 %) des Hydrochlorides.
Schmp.: 170 °C (Hydrochlorid). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.16 (d, 3H, CH3, J = 6.5 Hz), 1.37 - 1.54 (m, 6H, 3 x CH2),
2.33 - 2.44 (m, 5H CH2-N-CH2 u. 1H, CH-CH2), 2.46 (s, 3H, Ar-CH3), 2.74 - 2.84(m, 1H, CH-
CH2), 3.59 - 3.72 (m, 1H, CH), 7.32 (d, 2H, Ar-H), 7.81 (d, 1H, Ar-H), 8.16 (s, 1H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 14.72 (q, Ar-CH3), 23.34 (q, CH3), 24.24 (t, CH2), 25.92 (t, 2
x CH2), 39.92 (d, CH), 57.85 (t, CH2-N-CH2), 65.23 (CH-CH2), 125.90 (s, CH3-Carom), 127.72
(d, Carom), 132.05 (d, Carom), 133.22 (d, Carom.), 137.43 (s, Carom.), 144.32 (s, Br-Carom.), 197.54 (s,
C=O). –
C16H22BrNO (323.088475) gef. (HRMS): 323.08894. –
IR (KBr):
ν
~
= 2950, 2680, 2470, 1680, 1450, 1220 cm-1. –
Experimenteller Teil
84
3',5'-Dibrom-tolperison (13)
O
BrN
Br
Zu einer Suspension von 0.90 g Methylenpiperidiniumchlorid (6.70 mmol) in 15 ml absolutem
CH2Cl2 wird unter Luftausschluß eine Lösung von 2.05 g (6.70 mmol) 3'-Brom-4'-methyl-
-propiophenon in 5 ml Dichlormethan getropft. Anschließend wird für 2 h gekocht. Die
erhaltene Lösung wird eingeengt, mit Wasser aufgenommen und mit wenig verdünnter
Salzsäure versetzt. Nach Ausschütteln mit Diethylether wird die wäßrige Phase mit verdünnter
Natronlauge versetzt und mit Diethylether extrahiert. Die organische Phase wird mit
Magnesiumsulfat getrocknet, eingeengt und im Hochvakuum getrocknet. Zur Überführung in
das Hydrochlorid wird das freie Amin in 10 ml abs. Ether gelöst, mit 1.5 ml Acetylchlorid
versetzt. Zu dieser Lösung werden anschließend 1.5 ml Methanol getropft und für 1 h gerührt.
Anschließend wird die Suspension eingeengt und im Vakuum getrocknet. Man erhält 2.60 g
(88 %) des Hydrochlorides.
Schmp.: 231 °C (Hydrochlorid). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.16 (d, 3H, CH3), 1.38 - 1.55 (m, 6H, 3 x CH2), 2.32 - 2.44
(m, 4H, CH2-N-CH2), 2.63 (s, 3H, CH3), 2.71 - 2.82 (m, 2H, CH-CH2), 3.47 - 3.62 (m, 1H,
CH), 8.11 (s, 2H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 16.84 (q, Ar-CH3), 24.47 (q, CH3), 24.64 (t, CH2), 26.40 (t, 2
x CH2), 39.80 (d, CH), 55.44 (t, CH2-N-CH2), 63.16 (CH-CH2), 125.96 (s, CH3-Carom), 132.09
(d, Carom), 137.43 (s, Carom), 142.67 (s, Br-Carom), 201.99 (C=O). –
MS (70 eV, CI+): m/z (%) = 403 (M+), 388 (2), 336 (5), 324 (8), 279 (7), 239 (20), 178 (35),
156 (45), 98 (33), 86 (100). –
IR (KBr):
ν
~
= 2980, 2960, 2940, 2650, 2530, 1680, 1520, 1450, 1230, 1200, 1000 cm-1. –
Experimenteller Teil
85
3',5'-Dideutero-tolperison (1a)
O
DN
D
Zu einer Lösung von 0.10 g (0.25 mmol) Dibromtolperison in 15 ml Ethylacetat werden 10 mg
Pd/C (10 %) gegeben und der Reaktionskolben mit Deuterium gespült. Anschließend wird mit
Hilfe eines Ballons eine Deuteriumatmosphäre erzeugt und zur Hydrogenolyse für 2 h gerührt.
Anschließend wird die Reaktionsmischung über Celite filtriert und das Filtrat eingeengt.
Nachfolgend werden 1N NaOH und Diethylether hinzugegeben, die organische Phase wird
abgetrennt und mit Natriumsulfat getrocknet. Nach Entfernen des Lösemittels i. Vak. wird das
freie Amin in abs. Diethylether aufgenommen und mit Acetylchlorid und Methanol in das
Hydrochlorid überführt. Man erhält 70 mg (quant.) des deuterierten Tolperisons.
Schmp.: 191 °C. –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.22 (d, 3H, CH3), 1.30 - 1.72 (m, 6H, 3 x CH2), 2.20 -2.48
(m, 4H, 2 x CH2), 2.48 (s, 3H, CH3), 2.49 und 2.85 (d und AB-Spektrum, J = 7.2 Hz, JA,B =
12,6 Hz, 2H, CH2), 3.78 (m, 1H, CH), 7.95 (s, 2H, Ar-H). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 19.21 (q, Ar-CH3), 22.02 (q, CH3), 22.20 (t, CH2), 22.95 (t,
CH2), 37.32 (d, CH), 52.53 (t, 2 x CH2), 58.60 (CH2), 129.33 (d, Carom), 130.32 (d, Carom.),
132.15 (s, Carom.), 145.55 (s, Carom.), 201.02 (C=O). –
C16H22ClD2NO (247.190517) gef. (HRMS): 247.19067. –
IR (KBr):
ν
~
= 2950, 2640, 2510, 1680, 1510, 1450, 1400, 1190 cm-1. –
Experimenteller Teil
86
3',5'-Ditritium-tolperison (1b)
O
TN
T
Zu 0.14 g (0.32 mmol) 3',5'-Dibromtolperison Hydrochlorid werden 20 ml Diethylether
gegeben und die Suspension mit 20 ml 1N NaOH versetzt. Die organische Phase wird
abgetrennt und die wäßrige Phase noch zweimal mit Diethylether extrahiert. Die vereinigten
organischen Phasen werden mit Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösemittel i. Vak.
entfernt. Mit wenig Diethylether wird daraufhin das freie Amin in den Reaktionskolben
überführt und anschließend im Hochvakuum getrocknet. Dazu werden zunächst 10 ml
Ethylacetat, 4 ml Triethylamin und 15 mg Pd/C (10 %) gegeben und der Kolben an die
Reaktionsapparatur angeschlossen. Nach Evakuierung des Reaktionsraumes wird mit
Tritiumgas geflutet. Nach Druckabfall wird mehrere Male Tritiumgas zugeführt bis der Druck
nach etwa 2 h konstant ist. Auf diese Weise werden insgesamt etwa 0.47 mmol Tritiumgas
eingebracht. Das Reaktionsgemisch wird mit fl. Stickstoff eingefroren und der Reaktionsraum
entgast. Anschließend wird das Lösemittel ablyophilisiert und labiles Tritium zweimal mit ca. 3
ml Methanol entfernt. Der erhaltene Rückstand wird mit 20 ml Methanol über ein
Milliporefilter filtriert und das Lösemittel entfernt. Nach Aufnahme in Diethylether wird mit
wenig 1N NaOH ausgeschüttelt und die organische Phase über Magnesiumsulfat getrocknet.
Zur Gewinnung des Hydrochlorides wird eingeengt und das freie Amin im Hochvakuum
getrocknet. Der erhaltene Rückstand wird mit abs. Diethylether aufgenommen und mit 60 ml
Methanol und 100 ml Acetylchlorid für 30 min gerührt. Nach Entfernen des Lösemittels und
Trocknen im Hochvakuum erhält man 11.4 Ci des gewünschten Hydrochlorides mit
Verunreinigungen des monobromierten tritiierten Tolperison. Zur Reinigung wird eine
präparative HPLC (Laufmittel Methanol / Wasser mit 0.1 % 1N HCl; Gradient 50/50 - 70/30)
durchgeführt. Das daraus erhaltene Tolperison besitzt nach LC/MS Analyse eine spezifischen
Aktivität von 50.7 Ci/mmol.
Experimenteller Teil
87
3-Piperidin-1-p-tolyl-propan-1-on (6)
O
N
13.41 g (0.1 mol) 4'-Methylacetophenon, 5.04 g (0.17 mol) Paraformaldehyd und 12.20 g (0.1
mol) Piperidin werden in 17 ml Ethanol gelöst und für 1 h unter Rückfluß gekocht.
Anschließend werden 0.2 ml konz. Salzsäure hinzugesetzt bis alles Paraformaldehyd in Lösung
gegangen ist und die Lösung heiß filtriert. Nach Abkühlen wird bereits ausgefallenes
Aminoketon abgesaugt und die Mutterlauge bis zur Trockene eingedampft. Man erhält 19.49 g
(73 %) des Aminoketons als Hydrochlorid in Form eines weißen Pulvers. Zur Gewinnung des
freien Amins werden 10 ml einer etherischen Suspension von 2.02 g (7.5 mmol) des Salzes mit
15 ml 1N Natronlauge versetzt, die organische Phase abgetrennt, mit Natriumsulfat getrocknet,
am Rotationsverdampfer eingeengt und im Vakuum getrocknet.
Schmp.: 178 °C (Lit.: 175 °C103). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.43 - 1.59 (m, 6H, 3 x CH2), 2.39 (s, 3H, CH3), 2.41 -2.44
(m, 4H, 2 x CH2), 2.78 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 3.16 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH2), 7.23 (d, Jortho =
8.0 Hz, 2H, 2 x aromat. CH), 7.84 (d, Jortho = 8.0 Hz, 2H, 2 x aromat. CH). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 21.88 (CH3), 24.61 (CH2), 26.27 (2 x CH2), 36.47 (CH2),
54.29 (CH2), 54.87 (2 x CH2), 128.45 (2 x aromat. CH), 129.53 (2 x aromat. CH), 134.80 (quart.
aromat. C), 143.97 (quart. aromat. C), 199.09 (C=O). –
C15H22NOCl (268) ber.: C 67.28 H 8.28 N 5.23
gef.: C 66.09 H 8.93 N 5.97
IR (KBr):
ν
~
= 2980, 2920, 2700, 2520, 1680, 1610, 1450, 1430, 1370, 1300, 1240 cm-1. –
Experimenteller Teil
88
2,3-Didehydro-tolperison (4)
O
N
Methode 1:
2.03 g (7.1 mmol) 3-Piperidin-1-p-toluyl-propan-1-on werden mit 0.21 g (7.1 mmol)
Paraformaldehyd in 15 ml Ethanol gelöst. Dazu werden 0.93 g (16.3 mmol) Kaliumhydroxid in
1.2 ml Wasser gegeben und die Mischung für 4 h gekocht. Anschließend wir die Mischung mit
Wasser versetzt und mit Diethylether ausgeschüttelt. Nach Trocknen der organischen Phase
über Natriumsulfat wird das Lösemittel i. Vak. entfernt. Nach chromatographischer Reinigung
über Al2O3 (PE / EE / NEt3 100:10:2) wird das Produkt mit Acetylchlorid und Methanol in das
Hydrochlorid überführt. Man erhält 1.51 g (70 %) des ungesättigten Tolperisons.
Methode 2:
10.04 g (74.5 mmol) Nor-tolperisonhydrochlorid, 4.51 g (0.15 mol) Paraformaldehyd und 9.02
g (74.5 mol) Piperidinhydrochlorid werden in 100 ml Eisessig gelöst und für 4 h unter Rückfluß
gekocht. Nach Entfernen des Lösemittels wird der Rückstand mit 1N NaOH aufgenommen und
zweimal mit Diethylether ausgeschüttelt. Nach Entfernen des Lösemittels wird das Rohprodukt
chromatographisch über Al2O3 gereinigt (PE / EE / NEt3 100:10:2). Nach Überführung in das
Hydrochlorid mit erhält man 14.51 g (80 %) des ungesättigten Tolperisons.
Schmp.: 127 °C (Hydrochlorid). –
1H-NMR (200 MHz, CDCl3): δ = 1.41 - 1.61 (m, 6H, 3 x CH2), 2.41 (s, 3H, Ar-CH3), 2.31 -
2.55 (m, 4H, CH2-N-CH2), 3.36 (s, 2H, CH2-N), 5.68 (d, 1H, C=CH2, J = 0.8 Hz), 5.95 (d, 1H,
C=CH2, J = 0.8 Hz), 7.23 (d, 2H, Ar-H, J = 8.2 Hz), 7.72 (d, 2H, Ar-H, J = 8.2 Hz). –
13C-NMR (50 MHz, CDCl3): δ = 22.17 (q, Ar-CH3), 22.22 (t, CH2), 23.17 (t, 2 x CH2), 46.16 (t,
CH2-N-CH2), 53.25 (t, CH2), 55.87 (t, =CH2), 56.00 (s, =C), 129, 45 (d, 2 x Carom), 130.43 (d, 2
x Carom), 132.11 (s, Carom), 146.15 (s, Carom), 197.22 (s, C=O). –
C16H21NO (243.162314) gef. (HRMS): 243.16157. –
IR (KBr):
ν
~
= 2930, 2650, 2540, 1680, 1650, 1600, 1450, 1420, 1310, 1240, 1200 cm-1. –
Experimenteller Teil
89
8.3 Biochemische Arbeitsvorschriften
Membranpräparationen aus Torpedo Californica
Die tiefgefrorenen Gewebeproben werden unter Zusatz eines Puffers aus 20 mM NaH2PO4, 0.4
M NaCl, 2 mM EDTA, 0.1 mM PMSF und 0.02 % NaN3 bei pH 7 homogenisiert.
Anschließende Zentrifugation bei 4 °C und 8600 g für 10 min zur Entfernung grober
Zelltrümmer und Sedimentation des Überstandes bei 37000 g für 90 min ergibt eine
Rohpräparation ACh-Bindungsstellen104.
Eine weitere Aufreinigung wird durch Zonenzentrifugation (dreistufiger Sucrose-Gradient:
15,30 und 50 %; 60000 g, 19 h, 4 °C) und anschließende pH 11-Extraktion erreicht105. Dazu
werden die Rohfraktionen mit NaOH pH 11 versetzt und daraufhin bei 20000 g zentrifugiert.
Der Überstand wird verworfen und die Rückstände zur Lagerung in wenig TBP aufgenommen
und bei -20 °C gelagert. Zur Ermittlung der Reinheit und Güte der erhaltenen Proteine wurde
eine analytische SDS-PAGE durchgeführt (s.u.).
Proteinbestimmung
Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wird eine BCA-Analyse durchgeführt. Diese
Methode beruht auf der Reaktion von 4,4'-Dicarboxy-2,2'-bichinolin ("bicinchoninic acid",
BCA) mit Cu+, welches durch Reduktion von Cu2+ durch Proteine in alkalischer Lösung
gebildet wird (Biuret-Reaktion). Der entstehende pupurne Farbkomplex ist gut wasserlöslich
und zeigt eine starke Absorption bei 562 nm106. Das Verfahren hat neben einer hohen
Empfindlichkeit den Vorteil, daß es sich mit sehr kleinen Probenvolumina in Mikrotitierplatten
durchführen läßt.
Analytische SDS-PAGE
Die 10 µl der in TBP aufgenommenen Proteine werden zunächst in 50 µl reduzierendem
Probenpuffer (Sucrose 10 %, Bromphenolblau, SDS 0.1 %, Mercaptoethanol 2 %),
aufgenommen. Diese Mischung wird daraufhin auf einem 12 % SDS-PAGE Gel getrennt und
anschließend mit Coomassie Blau angefärbt.
Experimenteller Teil
90
Photoaffinitätsmarkierung
100 µl einer Proteinlösung der Konzentration von etwa 1 mg /ml wird mit 200 µl einer Lösung
neutral gepufferten Lösung des tritiummarkiertem Tolperison versetzt. Daraufhin wird zunächst
für 15 min inkubiert. Anschließend wird die Mischung fünfmal einem Photoblitz ausgesetzt.
Von dieser Mischung werden jeweils 10 µl auf 50 µl reduzierendem Puffer gegeben und zwei
getrennte SDS-PAGE durchgeführt. Das Probenprotokoll wird anschließend mit Coomassie
Blau zwecks Vergleichsmöglichkeit mit dem Western Blotgel angefärbt.
Western Blots auf Nitrocellulosemembranen
Zur Feststellung der radioaktiven Markierung der Proteine werden diese zunächst mittels
Wester Blot auf eine Nitrocellulose Membran übertragen, wobei zwei Nitrocelluloseabschnitte
eingesetzt werden. Zunächst werden drei Filterpapierblätter in der Größe des zu blottenden Gels
in den Kathodenpuffer (25 mM Tris-Base, 40 mM 6-Aminohexansäure, 20 % Methanol)
getaucht und diese aufeinander auf die Kathode gelegt. Darauf wird blasenfrei das in den
Kathodenpuffer getauchte zu analysierende Gel gelegt. Darauf werden drei in Anodenpuffer I
(30 mM Tris-Base, 20 % Methanol) und drei in Anodenpuffer II (300 mM Tris-Base, 20 %
Methanol) getauchte Filterpapiere gelegt und das Gerät verschlossen. Zum Blotten wird das
Gerät bei 0.8 mA / cm2 Gel und etwa 6 V für 30 - 60 min betrieben.
Fluorographie
Zur Untersuchung der Nitrocellulosen werden diese zunächst für 1 min in En3Hance Flüssigkeit
geschwenkt. Nachdem gründlich abgetropft wurde, werden die Membranen in Haushaltsfolie
verpackt und in einer Dunkelkammer auf einen Röntgenfilm gelegt. Zur Entwicklung wird
lichtdicht verschlossen und für 14 Tage bei -80 °C entwickelt. Nach Entwicklung des Films
werden die darauf enthaltenen Markierungen mit dem Protokollgel verglichen, um zu
beurteilen, welche Proteine radioaktiv markiert worden sind.
Abkürzungen
91
9 Abkürzungen
AcOH Essigsäure
ANN Künstliche neuronale Netze (engl.: Artificial Neural Networks)
AP Atompaar
dDublett
DBICA Di-Brom-isocyanursäure
DMAP N,N-Dimethyl-4-amino-pyrridin
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure
Et2ODiethylether
EtOH Ethanol
GA Genetischer Algoritmus
KH Kier & Hall
KNN Methode der k nächsten Nachbarn
LA Lewissäure
MCI Molekulare Konnektivitätsindizes
MeOH Methanol
MLR Multiple lineare Regression
NEt3Triethylamin
PAGE Polyacrylamid Gel-Elektrophorese.
PCA Principal Components Analysis
PLS Partial Least Squares
Abkürzungen
92
PMSF Phenylmethylsulfonylchlorid
qQuartett
QSAR Quantitative Struktur Wirkungsbeziehungen (engl. quantitative
structure activity relationship)
RR Rotarod-Test
sSingulett
SA Simuliertes Abkühlen (engl.: Simulated Annealing)
SD Standardabweichung
SDS Sodium-dodecyl-sulfat
ST Straub-Tail-Test
tTriplett
TBP Torpedo biologischer Puffer
TR Traction-Test
Ts Tosyl-
ZNS Zentralnervensystem
Anhang
93
10 Anhang
10.1 Pharmakologische Tests
Pharmakologischer Test Biologische Aktivitäten
Literatur
68
107
71
70
108
109
74
110
111
60
66
63
76
112
64
113
69
65
72
114
75
61
62
115
67
Veröffentlichungsjahr
1989
1986
1994
1993
1986
1978
1992
1980
1986
1965
1987
1973
1983
1984
1973
1985
1992
1973
1995
1974
1974
1967
1971
1979
1987
traction-test + + + + + +
chimney test + +
Inclined screen test + + + + + +
horizontal grid test +
grip strength test + +
morphine-induced Straub Tail A+ + + + + I
rotarod-test +++R+ + + + + + +m +
pull up test R
PTZ +R+ + + + + + + + +
antifighting test +++R+ +
actimetry test + + + +
MES + + + + + M+ + +
potentiation of thiopental +M
nicotine induced convulsion +
prolong. hexobarbital narcosis M+me
strychnine induced convulsion +
loss of righting reflex R+ + + +
extensor reflex bR
decerebrate rigidity RbR RI R
thalamolan rigor (alpha rigidity) bR
Tab. 12: Zusammenfassung der für die Messung der muskelrelaxierenden Wirkung verwendeten Tests. ED50
Meßwerte an Mäusen (+), Ratten (R) und modifizierter Test an Mäusen (+m); minimale effektive Dosis
in Mäusen (M); mittl. Zeit in Minuten in Mäusen (me); % Mäuse geschützt (A); % Inhibierung in
Mäusen (I); % Inhibierung in Ratten (IR); effektive Dosis, um Ratten zu blockieren (bR).
Anhang
94
10.2 Datensätze
Rotarod-Test
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
N
N
X
R1
R2
R3
ZY
N
N
S
R1
R1
O
R1
R
2k_1978 R1 = Me, R2 = Me, R3 = H, X = Cl, Y =
Cl,
Z = H
40 109 83_1973 R1 = H, R2 = Et, R3 =H, R = H 31.0 63
2m_1978 R1 = Me, R2 = Et, R3 = H, X = Cl, Y = Cl,
Z = H
16.2 109 84_1973 R1 = H, R2 = Et, R3 =H, R = o-F 3.5 63
2p_1978 R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, X = Cl, Y =
Cl,
Z = H
15.5 109 85_1973 R1 = H, R2 = Et, R3 =H, R = o-Cl 6.4 63
2r_1978 R1 = Me, R2 = H, R3 = Me, X = Cl, Y = F,
Z = F
16.2 109 108_1973 R1 = H, R2 = Et, R3 = Me, R = o-F 6.3 63
109_1973 R1 = H, R2 = Et, R3 = Me, R = o-Cl 3.3 63
diazepam N
N
Cl
O5.4
5.3
1.9
0.98
3.8
109
63
71
69
75
chlordiaz-
epoxid N
N
Cl
NHMe
O
5.3
9.7
63
75
NO
Ph
NCOCHCH2NR4R5
R1
mephenesin
HO
OH
159 107
5c_1986 R1 = H, R4R5 = pyrrolidyl 134 107
5e_1986 R1 = Me, R4R5 = Et2 56.1 107
Anhang
95
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
tolperisone
N
O63
63
107
67
baclofen HOOC NH2
Cl
5.3
7.8
7.7
107
71
69
tizanidine
NS
N
N
NH
Cl
2.3 71 midazolam
N
N
C
l
F
3.3 71
cyclobenz-
aprine
NMe2
6.8 71 4c_1987
N
O
N
O
N
100 67
mdl_27531
_1992
N
N
NSO2Me
99.0 69 Chlorprom-
azine
S
N
N
Cl
1.5 67
4b_1987
N
N
O
N
SO2Me
300 67 2e_1987
N
NO
N
30 67
Tab. 13: ED50 Werte und Strukturen von zentralen Muskelrelaxantien im Rotarod-Test.
Anhang
96
Traction-Test
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
NR2
R3
R4
R
5
R
1
R1
O
N
N
R2
diazepam R1 = CH3, R2 = =O, R3 = H2, R4 = H, R5 =
Cl
2.0
1.6
1.15
1.6
68
70
113
76
2_1983 R1 = H, R2 = H 14.1 76
oxazepam R1 = H, R2 = =O, R3 = OH, R4 = H, R5 =
Cl
8.5 70 8_1983 R1 = H, R2 = F 28.0 76
flurazepam R1 = C2H4N(C2H5)2, R2= =O, R3 = H2, R4
= F, R5 = Cl
3.0 70 33_1983 R1 = F, R2 = H 14.5 76
lorazepam R1 = H, R2 = =O, R3 = OH, R4,R5 = Cl 2.5 70 42_1983 R1 = CH3, R2 = H 46.0 76
clonazepam R1 = H, R2 = O=, R3 = H2, R4 = Cl, R5 =
NO2
16 70
mephenesin
H
O
OH
894 68 eperisone
N
O
64.2 113
chlormeza-
none
S
C
l
O
O O
237 68 baclofen
H
OOC NH2
Cl
45
6.6
36
113
chlordiaxep-
oxid
N
N
N
H
M
e
C
lO
15
3.0
12.5
68
70
76
clobazam N
N
O
O
C
l
51.9 70
Anhang
97
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
ad2239
N
O
O
68.5 113 tolperisone
N
O
156.3
100
113
67
2e_1987
N
N
NO
CH2Ph
30 67 2b_1987
NH
NON
10 67
N
R
O
N
3c_1987 R = H 100 67
3d_1987 R = CH2Ph 50 67
Tab. 14: ED50 Werte und Strukturen von zentralen Muskelrelaxantien im Traction-Test.
Anhang
98
Straub-Tail-Test
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
Diazepam N
N
O
C
l
1.3
1.2
8.3
1.2
1.0
71
69
75
76
74
chlordiaz-
epoxid N
N
C
l
N
H
M
e
O
19
13.0
75
76
Baclofen
H
OOC NH2
Cl
3.6
5.2
2.8
71
69
74
eperisone
N
O
63.6 74
Tizanidine
NS
N
Cl
N
NH
0.4
1.4
71
74
cyclobenz-
aprine
N
7.5 71
Zoxazolami
ne
N
O
NH
2
C
l
32.2 74 afloqualone
N
N
C
H
2
F
O
H
2N
7.8 74
carisprodol
NH2
O
O
O
NH
71.2 74 mephenesin
H
O
OH
121.0 74
mdl_27531
_1992
N
N
NSO2Me
53.7 69 tolperisone
N
O
63.0 74
Anhang
99
Name Struktur ED50 Lit. Name Struktur ED50 Lit.
midazolam
N
N
C
l
F
1.4 71 RGH5002 SiN
F
74
R1
O
R2
2_1983 R1 = H, R2 = H 6.3 76
8_1983 R1 = H, R2 = F 6.0 76
33_1983 R1 = F, R2 = H 10.6 76
42_1983 R1 = CH3, R2 = H 16.0 76
Tab. 15: ED50 Werte und Strukturen von zentralen Muskelrelaxantien im Straub-Tail-Test.
Anhang
100
10.3 PCA-Analysen zur Selektion von Ausreißern
Rotarod-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC1
PC2
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC1
PC3
Traction-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC3
PC2
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC3
PC2
Anhang
101
Straub-Tail-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC3
PC2
-30
-20
-10
0
10
20
30
-30 -10 10 30
PC1
PC2
Anhang
102
10.4 Primäre Gleichungen
Vergleich von vorhergesagter und wirklicher biologischer Aktivität.
Rotarod-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0123
Experiment
Vorhersage
Traction-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-1
0
1
2
3
-1 0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
-1
0
1
2
3
-1 0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
103
Straub-Tail-Test AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
104
10.5 Finale Gleichungen
Vergleich von vorhergesagter und wirklicher biologischer Aktivität.
Rotarod-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Rotarod-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
105
Traction-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Traction-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
106
Straub-Tail-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Straub-Tail-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
107
10.6 Trainingsdatensätze
Vergleich von vorhergesagter und wirklicher biologischer Aktivität.
Rotarod-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Rotarod-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
108
Traction-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Traction-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
109
Straub-Tail-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Straub-Tail-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
110
10.7 Vorhersagen
Vergleich von vorhergesagter und wirklicher biologischer Aktivität.
Rotarod-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Rotarod-Test / KNN
AP-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
111
Traction-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Traction-Test / KNN
AP-Deskriptoren
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
112
Straub-Tail-Test / AP-Deskriptoren
GA-PLS KNN
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
0
1
2
3
0 1 2 3
Experiment
Vorhersage
Anhang
113
10.8 Zufällige Aktivitäten
Rotarod-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.5
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Rotarod-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-0.8
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
114
Traction-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.2 0.4 0.6 0.8 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Traction-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.2 0.4 0.6 0.8 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
115
Straub-Tail-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.2 0.4 0.6 0.8 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Straub-Tail-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
116
10.9 Vertauschte Aktivitäten
Rotarod-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
-1
-0.5
0
0.5
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Rotarod-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-0.6
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
-0.4
-0.2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
117
Traction-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
-0.1
0.1
0.3
0.5
0.7
0.9
1.1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2 q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Traction-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
118
Straub-Tail-Test / GA-PLS
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2 q2
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Straub-Tail-Test / KNN
AP-Deskriptoren KH-Deskriptoren
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
0.8
0.9
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
00.5 1
Korrelation
r2 & q
2
r2
q2
Anhang
119
10.10 Datenbankrecherchen
Rotarod-Test / GA-PLS / AP-Deskriptoren
Struktur CSD Bezeichnung Abstand
N
N
O
O
BILZAX 3.00
N
O
N
S
H H
DARXAV 2.45
N
O
N
ERVITS10 2.83
N
O
GARXWAX 2.65
NJACPAE 2.83
O
NJULCUU 3.00
Anhang
120
Struktur CSD Bezeichnung Abstand
O
NJALDAB 2.24
N
O
KIZHEG 3.00
N
N
O
OMPCAZO 2.83
N
O
N
S
H
RIJWAI 2.45
N
N
O
ROLKIM 3.00
N
O
TIDFIH 2.83
Anhang
121
Struktur CSD Bezeichnung Abstand
NS
N
O
O
TUFCAY 2.83
N
N
O
VINCIM01 2.83
N
O
YUWLAD 3.00
Tab. 16: Ergebnisse der Datenbankrecherche.
Literatur
122
11 Literatur
1Strathmann AG & Co. Mydocalm-Tolperison: Mobil rund um die Uhr,
Informationsbroschüre, 1998.
2Adams, H.J., Ronfeld, R.A., Takman, B.H. Handbook of CNS Agents and Local Anesthetics,
CRC Press Inc, 1986, 327-358.
3McHugh, J., Mok, W.M., Wang, G.K., Strichartz, G. "Irreversible inhibition of sodium
current and batrochotoxin binding by photoaffinity-derivatized local anesthetic" J. Gen.
Physiol., 1995, 105, 267-287.
4Dubinsky, B., Press, J.B. Ullman's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Band A24, VCH-
Verlag, 1993, 209-218.
5Ono, H., Fukuda, H. and Kudo, Y. "Mechanism of Depressent Action of Muscle Relaxants
on Spinal Reflexes : Participation of Membrane Stabilizing Action" J. Pharm. Dyn., 1984, 7,
171-176.
6Kokemohr, H. und Seubert, M. "Medikamentöse Muskelrelaxation und Physiotherapie -
Synergismus oder Widerspruch" Man. Med., 1995, 33, 124-131.
7Misgeld, U., Bijak, M., Jaromilek, W. "A physiological role for GABAB rezeptors and the
effects of baclofen in the mammalian central nervous system" Prog. Neurobiol., 1995, 46,
423-462.
8Coward, D.M. "The pharmacology of clozapine-like, atypical antipsychotics" Neurology,
1994, 44, 6-10.
9Szobor, A. "Mydocalm's thirty-year clinical use" Ther. Hung., 1993, 41, 3-12.
10 McMillen, B.A., Williams, H.L., Lehmann, H., Shepard, P. "On central muscle relaxants,
strychnine-insensitive glycine receptors and two old drugs: zoxazolamine and HA-966" J.
Neural Transm., 1992, 89, 11-25.
11 Pschyrembel klinisches Wörterbuch, 255 Ausg., de Gruyter, 1986, 167, 1104, 1626.
12 Schrattenholz, A., Godovac-Zimmermann, J., Schäfer, H.J., Albuquerque, E.X., Maelicke,
A. "Phototaffinity-Labeling of Torpedo Acetylcholinreceptor by Physostigmine", Eur. J.
Biochem., 1993, 216, 671-677.
Literatur
123
13 Giraudat, J., Galzi, J.L., Revah, F., Changeux, J.P., Haumont, P.Y., Lederer, F. "The
Noncompetitive Blocker [3H]Chlorpromazine Labels Segment M2 but not Segment M1 of
the Nicotinic Acetylcholine Receptor α-Subunit", FEBS Letters, 1989, 253, 190-198.
14 Jacoby, W.B., Wilchek, M. (Eds.) Methods in Enzymology, Vol. XLVI, Academic Press,
1977, 3-14
15 Bayley, H. Photogenerated Reagents in Biochemistry and Molecular Biology, Elsevier,
1983, 25-29.
16 Galardy, R.E., Craig, L.C., Printz, M.P. "Benzophenone Triplet: a New Photochemical Probe
of Biological Ligand-Receptor Interaction", Nature, 1973, 242, 127-128.
17 Möhler, H., Battersby, M.K., Richards,. J.G. "Benzodiazepine Receptor Protein Indentified
and Visualized in Brain by Photoaffinity Label", Proc. Natl. Acad. Sci., 1980, 77, 1666-
1670.
18 Chen, J., Prestwich, G.D. "Synthesis of a Tritium-Labeled Diether Analog of
Phosphatidylinositol 4,5-Bisphosphate", J. Label. Comp. Radiopharm., 1996, 39, 251-258.
19 Gupta, R.C., Nautiyal, P., Jhingran, A.G., Kamboj, V.P., Setty, B.S., Anand, N. "N-
Substituted α-Aminoalkylacrylphenones & Some Related Compounds: A New Class of
Spermicidal Agents", Ind. J. Chem., 1981, 20B, 303-307.
20 Lever, J.R., Johnson, S.M. "Synthesis of Tritiated N1'-Alkyl Derivatives of the Delta Opioid
Receptor Ligand Naltrindole", J. Label. Comp. Radiopharm., 1996, 39, 115-122.
21 Shu, A.Y.L., Yamashita, D.S., Holt, D.A., Heys, J.R. "Synthesis of [125I] Labeled
Photoaffinity Rapamycin Analogs", J. Label. Comp. Radiopharm., 1996, 38, 227-237.
22 Mason, N.S., Lewlett, W.A., Ebert, M.H., Schmidt, D.E., de Paulis, T. "Labeling of (S)-Des-
4-Amino-3-[125I]Iodozacopride (DAIZAC). A High-Affinity Radioligand for the 5-HT-3
Receptor", J. Label. Comp. Radiopharm, 1996, 38, 955-961.
23 Garnes, K.T., Landvatter, S.W., Gallagher, T.F. "Synthesis of 4-[2-(4-Azidophenyl)-5-(3-
iodo-125I-phenyl)-1H-imidazol-4-yl]pyridine (SB 206718-[125I]), a Pyridinyl Imidazole
Cytokine Inhibitor", J. Label. Comp. Radiopharm., 1995, 38, 637-643.
24 Arend, M., Westermann, B. Risch, N. "Moderne Varianten der Mannich-Reaktion", Angew.
Chem., 1998, 110, 1096-1122.
Literatur
124
25 Brunner, J., Senn, H., Richards, F.M "3-Trifluoromethyl-3-phenyl-diazirine: a New Carbene
Generating Group for Photolabeling Experiments", J.Mol. Biol, 1980, 255, 3319-3323.
26 Delfino, J.M., Schreiber, S.L., Richards F.M. "Design, Synthesis, and Properties of a
Photoactivatable Membrane Spanning Phospholipidic Probe", J. Am. Chem. Soc, 1993, 115,
3458-3474.
27 Ahn, Y., Cohen, T. "Cerium(III) Chloride Remarkably Increases the Rates of Formation and
Yields of Ketones in The Reaction of Lithium Carboxylates with Organolithiums",
Tetrahedron Lett., 1994, 35, 203-206.
28 Nakayama, T.A., Khorana, H.G. "Synthesis of a New Photoactivatable Analogue of 11-cis-
Retinal", J. Org. Chem., 1990, 55, 4953-4956.
29 Rühmann, A., Wentrup, C. "Synthesis of a Photoactivatable 9-Z-Oleic Acid For Protein
Kinas C Labeling", Tetrahedron, 1994, 50,3785-3796.
30 Creary, X. "Reaction of Organometallic Reagents with Ethyl Triflouroacetate and
Diethyloxalate. Formation of Trifluoromethyl Ketones and α-Keto Esters via Stable
Tetrahedral Adducts", J. Org. Chem., 1987, 52, 5026-5030.
31 Bergmann, E.D., Pelchowicz, Z., Shani, A. "Some Flourine Containing D.D.T. Analogues",
Israel J. Chem, 1963, 1, 129-135.
32 Gottardi, W. "Über Bromierungen mit Dibromisocyanursäure unter ionischen Bedingungen,
1. Mitt.: Monobromierungen", Monatsh. f. Chem., 1967, 99, 815-822
33 Kogon, A.A., Bochkariov, D.E., Baskunov, B.P., Cheprakov, A.V. "2,3-Dihydroxy-3-{3-[3-
(trifluoromethyl)diazirin-3-yl]phenyl}propionic Acid. A Cleavable Carbene Generating
Reagent Used for Photocrosslinking", Liebigs Ann. Chem., 1992, 879-881.
34 Weber, T., Brunner, J. "2-(Tributylstannyl)-4-[3-(trifluoromethyl)-3H-diazirin-3-yl]benzyl
Alcohol: A Building Block for Photolabeling and Cross-Linking Reagents of Very High
Specific Radioactivity", J. Am. Chem. Soc., 1995, 117, 3084-3095
35 Richardson, S.K., Ife, R.J. "Swern Oxidation of Diaziridines to Diazirines", J. Chem. Soc.
Perkin Trans. I, 1989, 1172-1174.
36 Bellamy, F.D., Chazan, J.B., Dodey, P., Dutartre, P., Ou, K., Pascal, M., Robin, J.
"(Benzoylphenyl)piperidines: A New Class of Immunomodulators", J. Med. Chem., 1991,
34, 1545-1552.
Literatur
125
37 Smith, J.R., Sadd, J.S. "Isomerism of 1- and 2-(N,N-Disubstituted aminomethyl) Benzo-
triazoles; an Investigation by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy", J. Chem. Soc.
Perkin Trans I, 1975, 1181-1184
38 Katritzky, A.R., Lan, X., Yang, J.Z., Denisko, O.V. "Properties and Synthetic Utility of N-
Substituted Benzotriazoles", Chem. Rev., 1998, 98, 409-548.
39 Nachmansohn, D. "Metabolism and function of the nerve cell", Harvey Lectures, 1955, 49,
57-99
40 Galzi, J.-L., Revah, F., Bessis, A., Changeux, J.-P. "Functional Architecture of the Nicotinic
Acetylcholine Receptor: From Electric Organ to Brain", Ann. Rev. Pharamcol., 1991, 31,
37-72
41 Noda, M., Takahashi, H., Tanabe, T., Toyosato, M., Kikyotani, S., Furutani, Y., Hirose, T.,
Takshima, H., Inayama, S., Miyata, T., Numa, S. "Structural Homology of Torpedo
Californica Acetylcholine Receptor Subunits", Nature, 1983, 302, 528-532
42 Hansch, C., Fujita, T. "ρ-σ-π-Analysis. A Method for the Correlation of Biological Activity
and Chemical Structure", J. Am. Chem. Soc., 1964, 86, 1616-1626.
43 Randic, M. "On Characterization of Molecular Branching", J. Am. Chem. Soc., 1975, 97,
6609-6615.
44 Kier, L. B., Hall, L. H., Molecular Connectivity in Chemistry and Drug Research, Academic
Press, New York, 1976.
45 Kier, L. B., Hall, L. H., Molecular Connectivity in Structure-Activity Analysis, Research
Studies Press, Chichester, England, 1986.
46 Hall, L. H., Kier, L. B. "The Molecular Connectivity Chi Indexes and Kappa Shape Indexes
in Structure-Property Modeling" In Lipkowitz, K. B. and Boyd, D. B. (Eds.) Reviews in
Computational Chemistry II, VCH Publishers, 1991, 367-422.
47 Cramer, R. D. III, Patterson, D. E., Bunce, J. D. "Comparative Molecular Field Analysis
(CoMFA). 1. Effect of Shape on Binding of Steroids to Carrier Proteins", J. Am. Chem. Soc.,
1988, 110, 5959-5967.
48 Waller, C. L., Juma, B. W., Gray, L. E. Jr., Kelce, W. R. "Three-Dimensional Quantitative
Structure-Activity Relationships for Androgen Receptor Ligands", Toxicology & Applied
Pharmacology, 1996, 137, 219-227.
Literatur
126
49 Kim, K. H., Martin, Y. C. "Direct Prediction of Dissociation Constants (pKa's) of Clonidine-
Like Imidazolines, 2-Substituted Imidazoles, and 1-Methyl-2-Substituted-Imidazoles from
3D Structures Using a Comparative Molecular Field Analysis (CoMFA) Approach", J. Med.
Chem.,1991, 34, 2056-2060.
50 Cho, S. J., Garsia, M. L., Bier, J., Tropsha, A. "Structure-Based Alignment and Comparative
Molecular Field Analysis of Acetylcholinesterase Inhibitors", J. Med. Chem., 1996, 39,
5064-5071.
51 Cho, S. J., Tropsha, A., Suffness, M., Cheng, Y. C., Lee, K. H. "Antitumor Agents. 163.
Three-Dimensional Quantitative Structure-Activity Relationship Study of 4'-O-
Demethylepipodophyllotoxin Analogs Using the Modified CoMFA/q2-GRS Approach", J.
Med. Chem., 1996, 39, 1383-1395.
52 Sutter, J. M., Dixon, S. L., Jurs, P. C. "Automated Descriptor Selection for Quantitative
Structure-Activity Relationships Using Generalized Simulated Annealing", J. Chem. Inf.
Comput. Sci., 1995, 35, 77-84.
53 Rogers, D., Hopfinger, A.J. "Application of Genetic Function Approximation to Quantitative
Structure-Activity Relationships and Quantitative Structure-Property Relationships", J.
Chem. Inf. Comput. Sci., 1994, 34, 854-866.
54 Kubinyi, H. "Variable Selection in QSAR-Studies. I. An Evolutionary Algorithm", Quant.
Struct.-Act. Relat., 1994, 13, 285-294.
55 Kubinyi, H. "Variable Selection in QSAR-Studies. II. A Highly Efficient Combination of
Systematic Search and Evolution", Quant. Struct.-Act. Relat., 1994, 13, 393-401.
56 Luke, B. T. "Evolutionary Programming Applied to the Development of Quantitative
Structure-Activity Relationships and Quantitative Structure-Property Relationships", J.
Chem. Inf. Comput. Sci., 1994, 34, 1279-1287.
57 So, S. S., Karplus, M. "Evolutionary Optimization in Quantitative Structure-Activity
Relationship: an Application of Genetic Neural Networks", J. Med. Chem., 1996, 39, 1521-
1530.
58 Baroni, M., Costantino, G., Cruciani, G., Riganelli, D., Valigi, R., Clementi, S. "Generating
Optimal Linear PLS Estimations (GOLPE): An Advanced Chemometric Tool for Handling
3D-QSAR-Problems", Quant. Struct.-Act. Relat., 1993, 12, 9-20.
Literatur
127
59 Cho, S. J., Tropsha, A. "Cross-Validated R2-Guided Region Selection for Comparative
Molecular Field Analysis: a Simple Method to Achieve Consistent Results", J. Med. Chem.,
1995, 38, 1060-1066.
60 Sternbach, L.H., Archer, G.A., Earley, J.V., Fryer, R.I., Reeder, E., Wasyliw, N., Randall,
L.O., Banziger, R. "Quinazolines and 1,4-Benzodiazepines. XXV. Structure-Activity
Relationships of Aminoalkyl-subsituted 1,4-Benzodiazepin-2-ones", J. Med. Chem., 1965, 8,
815-821.
61 Hofrichter, G., Roesch, A., Roesch, E., Schenk, G. "Simple Methods for Pharmacologic
Differentiation of Centrally Acting Muscle Relaxants", Arzneim.-Forsch., 1967, 17, 242-245.
62 Ludwig, B.J., Potterfield, J.R. "The Pharmacology of Propanediol Carbamates", Adv.
Pharmacol. & Chemotherapie, 1971, 9, 173-240.
63 Nakanishi, M., Tahara, T., Araki, K., Shiroki, M., Tsumagari, T. "Studies on Psychotropic
Drugs. 18. Synthesis and Structure-Activity Relationships of 5-Phenyl-1,3-dihydro-2H-
thieno(2,3-ε) (1,4) diazepin-2-ones", J. Med. Chem., 1973, 16, 214-219.
64 Ning, R.Y., Randall, L.O. "Quinazolines and 1,4-Benzodiazepines. 58. The Azido Group, a
Novel Pharmacophoric Substituent. 7-Azido-5-phenyl-1,4-benzodiazepines", J. Med. Chem.,
1973, 16, 879-882.
65 Alps, B.J., Harry, T.V.A., Southgate, P.J. "The Pharmacology of Lorazepam, a Broad-
Spectrum Tranquilizer", Curr. Med. Res. Opin., 1973, 1, 239-261.
66 Yamazaki, M., Aoki, Y., Kato, H., Ito, Y., Kontani, H., Koshiura, R. "Centrally Acting
Muscle Relaxant Activities of 2-Methyl-3-pyrrolidinopropiophenone Derivatives", J. Pharm.
Soc. Jpn., 1987, 107, 705-710.
67 Tatee, T., Narita, K., Kurashige, S., Ito, S., Miyazaki, H., Yamanaka, H., Mizugaki, M.,
Sakamoto, T., Fukuda, H. "Isoxazole Derivatives as Centrally Acting Muscle Relaxants. III.
Synthesis and Activity of Conformationally Restricted Analogs", Chem. Pharm. Bull., 1987,
35, 3676-3690.
68 Simiand, J., Keane, P.E., Biziere, K., Soubrie P. "Comparative Study in Mice of Tetrazepam
and Other Centrally Acting Muscle Relaxants", Arch. int. Pharmacodyn., 1989, 297, 272-
285.
Literatur
128
69 Kehne, J.H., Kane, J.M., Miller, F.P., Ketteler, H.J., Braun, D.L., Senyah, Y., Chaney, S.F.,
Abdallah, A., Dudley, M.W., Ogden, A.M., Palfreyman, M.G. "MDL-27,531 Selectively
Reverses Strychnine-Induced Seizures in Mice", Br. J. Pharmacol., 1992, 106, 910-916.
70 Wilson, N.E., Meert, T.F., Shephard, R.A. "A Pharmacological Evaluation of the Pull-up
Test for Muscle Relaxation in Rats", J. Neurosc. Meth., 1993, 50, 359-367.
71 Coward, D.M. "Tizanidine: Neuropharmacology and Mechanism of Action", Neurology,
1994, 44, 6-11.
72 Babbini, M., Torrielli, M.V., Gaiardi, M., Bartoletti, M., De Marchi, F. "Central Effects of
Three Fluorinated Benzodiazepines in Comparison with Diazepam", Pharmacology, 1974,
12, 74-83.
73 Haefely, W., Pieri, L., Polc, P., Schaffner, R. "General Pharmacology and
Neuropharmacology of Benzodiazepine Derivatives", In Handbook of Experimental
Pharmacology, Hoffmeister, F., Stille, G., Eds., Springer: Berlin, 1981, Vol. 55/II, pp 13-
261.
74 Farkas, S., Karparti, E. "The Phamacology of RGH-5002, a New Centrally Acting Muscle
Relaxant With a Long Duration of Action and Less Motor Side Effects", Pharmacol. Res.,
1992, 25, 25-26.
75 Ellis, K.O., Carpenter, J.F. A "Comparative Study of Dantrolene Sodium and Other Skeletal
Muscle Relaxants with the Straub Tail Mouse", Neuropharmacology, 1974, 13, 211-214.
76 Kikumoto, R., Tobe, A., Fukami, H., Egawa, M. "Synthesis and Antianxiety Activity of (ω-
Piperazinylalkoxy)indan Derivatives", J. Med. Chem., 1983, 26, 246-250.
77 Novack, G.D., Zwolshen, J.M. "Predictive Value of Muscle Relaxants in Rats and Cats", J.
Pharmacol. Methods, 1983, 10, 175-180.
78 Kuribara, H., Huguchi, Y., Tadakoro, S. "Effects of Central Depressants on Rotarod and
Traction Performances in Mice", Jap. J. Pharmacol., 1977, 27, 117-126.
79 Simiand, J., Keane, P.E., Biziere, K., Soubrie P. "Comparative Study in Mice of Tetrazepam
and Other Centrally Acting Muscle Relaxants", Arch. int. Pharmacodyn., 1989, 297, 272-
285.
80 Hylden, J.L.K., Wilcox, G.L. "Intrathecal Morphine in Mice: a New Technique", Eur. J.
Pharmacol., 1980, 67, 313-316.
Literatur
129
81 Hasegawa, Y., Kurachi, M., Otomo, S. "Dopamine D2 Receptors and Spinal Cord Excitation
in Mice", Eur. J. Pharmacol. 1990, 184, 207-212.
82 Zheng, W., Dissertation Chapel Hill, USA, 1997.
83 MOLCONN-X version 2.0, Hall Associates Consulting, Quincy, MA, 1993.
84 Hansen, O.J., Jurs, P.C. "Chemical Applications of Graph Theory II: Iso Enumeration", J.
Che. Educ., 1988, 65, 574-588.
85 Franke, R., Gruska, A. "Prinicpal Component Analysis and Factor Analysis", In:
Chemometric Methods in Molecular Design, van de Waterbeemd, H., (Ed), VCH,
Weinheim, 1995, 113-164
86 Wold, S., Ruhe, A., Wold, H. and Dunn, W. J., III "SIAM", J. Sci. Stat. Comput., 1984, 5,
735-742.
87 Kirkpatrick, S., Gelatt, C. D. Jr., Vecchi, M.P. "Optimization by Simulated Annealing",
Science, 1983, 220, 671-680.
88 Böhm, H.-J., Klebe, G., Kubinyi, H., Wirkstoffdesign, Spektrum, Heidelberg, 1996, 388.
89 Andrea, T. A., Kalayeh, H. "Applications of Neural Networks in Quantitative Structure-
Activity Relationships of Dihydrofolate Reductase Inhibitors", J. Med. Chem., 1991, 34,
2824-2836.
90 Ajay. A "Unified Framework for Using Neural Networks to Build QSARs", J. Med. Chem.,
1993, 36, 3565-3571.
91 Manallack, D. T., Ellis, D. D., Livingstone, D. J. "Analysis of Linear and Nonlinear QSAR-
Data Using Neural Networks", J. Med. Chem., 1994, 37, 3758-3767.
92 Maddalena, D. J., Johnston, G. A. "Prediction of Receptor Properties and Binding Affinity of
Ligands to Benzodiazepine/GABA-A Receptors Using Artificial Neural Networks", J. Med.
Chem., 1995, 38, 715-724.
93 Bolis, G., Pace, L., Fabrocini, F. "A Machine Learning Approach to Computer-Aided
Molecular Design", J. Comput. Aided Mol. Des., 1991, 5, 617-628.
94 King, R. D., Muggleton, S., Lewis, R. A., Sternberg, M. J. "Drug Design by Machine
Learning: The Use of Inductive Logic Programming to Model the Structure-Activity
Literatur
130
Relationships of Trimethoprim Analogues Binding to Dihydrofolate Reductase", Proc. Natl.
Acad. Sci., 1992, 89, 11322-11326.
95 King, R. D., Muggleton, S., Srinivasan, A., Sternberg, M. J. "Structure-Activity
Relationships Derived by Machine Learning: The Use of Atoms and Their Bond
Connectivities to Predict Mutagenicity by Inductive Logic Programming", Proc. Natl. Acad.
Sci., 1996, 93, 438-442.
96 Jain, A. N., Dietterich, T. G., Lathrop, R. H., Chapman, D., Critchlow, R. E. Jr., Bauer, B. E.,
Webster, T. A., Lozano-Perez, T. "A Shape-Based Machine Learning Tool for Drug
Design", J. Comput. Aided Mol. Des., 1994, 8, 635-652.
97 Sun, L., Xie, Y., Song, X., Wang, J., Yu, R. "Cluster Analysis by Simulated Annealing",
Computers and Chemistry, 1994, 18, 103-108.
98 Gilbert, N., Statistics, W.B. Sounders, Co, Philadelphia, PA, 1976.
99 Dietrich, A., Cho, S.J., Zheng, W., Tropsha, A., Fels, G. "A QSAR Study of Centrally
Acting Muscle Relaxants Using the GA-PLS Method", J. Comp. Aid. Mol. Des., 1999,
eingereicht
100 Organikum, 19 Ausg., Dt. Verlag der Wiss., 1993.
101 Eicher, T., Tietze, L.F., Organische Chemie, VCH, 1992.
102 Chemikalienkatalog Firma Fluka, 1997/98.
103 Chawla, H.P.S., Gautman, B.C., Vohra, M.M., Kapel, R.S., Anand, N., Patsaik, G.K., Vohra,
M.M., Shrivastava, O.P. "Agents acting on the central nervous system. 3-Tertiary-amino-
propiophenones as central muscle relaxants and diuretics", J. Med. Chem., 1970, 13, 480-
488.
104 Reinhardt, S., Schmiady, H., Tesche, B. Hucho, F. "Functional and Structural Analysis of
Acetylcholine Receptor-Rich Membranes After Negative Staining", FEBS Lett, 1984, 173,
217-221.
105 Schrattenholz, A., Coban, T., Schröder, B., Okonjo, K.O., Kuhlmann, J., Pereira, E.F.R.,
Albuquerque, E.X., Maelicke, A "Biochemical Characterization of a Novel Channel-
Activating Site on Nicotinic Acetylcholine Receptors", J. Recept. Res., 1993, 13, 393-412.
Literatur
131
106 Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D.,
Fujimoto, E.K., Koeke, K.M., Olson, B.J. und Klenk, D.C. "Measurement of protein using
bicinchoninic acid", Anal. Biochem., 1985, 150, 76-85.
107 Tatee, T.; Narita, K.; Kurashige, S.; Ito, S.; Miyazaki, H.; Yamanaka, H.; Mizugaki, M.;
Sakamoto, T.; Fukuda, H. "Isoxazole Derivatives as Centrally Acting Muscle Relaxants. II.
Synthesis and Structure-Activity Relationship of 3-Amino-N-(3-phenyl-5-
isoxazolyl)propanamides", Chem. Pharm. Bull., 1986, 34, 1643-1655.
108 Tatee, T.; Kurashige, S.; Shiozawa, A.; Narita, K.; Takei, M.; Ito, S.; Miyazaki, H.;
Yamanaka, H.; Mizugaki, M.; Skamoto, T.; Fukuda, H. "Isoxazole Derivatives as Centrally
Acting Muscle Relaxants. I. Synthesis and Activity of 5-(3-Aminopropyl) amino-3-
phenylisoxazole Derivatives", Chem. Pharm. Bull., 1986, 34, 1634-1642.
109 Hara, T.; Kayama, Y.; Mori, T.; Itoh, K.; Fujimori, H.; Sunami, T.; Hashimoto, Y.; Ishimoto,
S. "Diazepines. 5. Synthesis and Biological Action of 6-Phenyl-4H-pyrrolo[1,2-
α][1,4]benzodiazepines", J. Med. Chem., 1978, 21, 263-268.
110 Hirai, K, Ishiba, T., Sugimoto, H., Sasakura, K., Fujishita, T., Toyoda, T., Tsukinoki, Y.,
Joyama, H., Hatakeyama, H., Hirose, K. "Peptidoaminobenzophenones, a Novel Class of
Ring-Opened Derivatives of 1,4-Benzodiazepines", J. Med. Chem., 1980, 23, 764-773.
111 Steiner, G., Franke, A., Haedicke, E., Lenke, D., Teschendorf, H.J., Hoffman, H.P.,
Kreiskott, H., Worstmann, W. "Tricyclic Epines. Novel (E)- and (Z)-11H-
dibenz[β,ε]azepines as Potential Central Nervous System Agents. Variation of the Basic Side
Chain", J. Med. Chem., 1986, 29, 1877-1888.
112 Weinhardt, K., Beard, C.C., Dvorak, C., Marx, M., Patterson, J., Roszkowski, A., Schuler,
M., Unger, S.H., Wagner, P.J., Wallach, M.B. "Synthesis and Central Nervous System
Properties of 2-[(Alkoxycabonyl)amino]-4,5-phenyl-2-imidazolines", J. Med. Chem., 1984,
27, 616-627.
113 Ito, T., Hori, M., Furukawa, K., Karasawa, T., Kadokawa, T. "Pharmacological Studies of 1-
(2,3-Dimethyl-4-methoxyphenyl)-2-Methyl-3-(1-Pyrrolidinyl)-1-Propanone Hydrochloride
(AD-2239), A Centrally Acting Muscle Relaxant", Arch. int. Pharmacodyn., 1985, 275, 105-
122.
Literatur
132
114 Cymbalist, M.A., Shapero, M. A "Comparative Study of the Effect of Some Centrally Acting
Sceletal Muscle Relaxants in Mice", J. Pharm. Pharmac., 1974, 26, 109-112.
115 Kameyama, T., Ukai, M. "Effect of Centrally Acting Muscle Relaxants on the Morphine-
Induced Straub Tail Reaction in Mice", Chem. Pharm. Bull., 1979, 27, 1063-1068.
