Proteinase A und Schaumstabilität –
biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen von
Proteinase A aus Saccharomyces cerevisiae
und schaumaktivem Lipidtransferprotein
vorgelegt von
Diplom-Ingenieur Rena Leisegang
Von der Fakultät für Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Ingenieurwissenschaften
- Dr.-Ing. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuß:
Vorsitzender: Prof. Dr. R. Tressl
1. Berichter: Prof. Dipl.-Ing. Dr. U. Stahl
2. Berichter: Dr. F. Nitzsche
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 13. Mai 2003
Berlin 2003
D83
DANKSAGUNG
Diese Arbeit wurde bei der BioteCon GmbH (Potsdam) begonnen und am Fachgebiet Mikrobiologie
und Genetik im Institut Mikrobiologie und Genetik der Technischen Universität Berlin unter Leitung
von Herrn Prof. Dipl.-Ing. Dr. ULF STAHL vollendet. Die Arbeit wurde von der Arbeitsgemeinschaft
industrielle Forschung (AiF, 11387N) und von der Wissenschaftsförderung des Deutschen Brauer-
bundes (B69) finanziell gefördert.
Mein besonderer Dank gilt meinem Doktorvater Herrn Prof. Dipl.-Ing. Dr. ULF STAHL für die
Überlassung des Themas und die wissenschaftliche Betreuung. Für seine Diskussionsbereitschaft und
intensive Unterstützung insbesondere auf der letzten Etappe der Arbeit bedanke ich mich.
Herrn Dr. FRANK NITZSCHE (König-Brauerei GmbH) möchte ich sehr für die Übernahme des
Koreferats und die damit verbundene Mühe danken sowie für die kritischen Diskussionen im Rahmen
des projektbegleitenden Ausschusses der Wissenschaftsförderung des Deutschen Brauerbundes.
Besonderer Dank gilt Herrn Dr. CHRISTOPH PETER, der durch wertvolle Ratschläge und Anregungen
sowie kritisches Hinterfragen entscheidend zum Abschluß dieser Arbeit beigetragen hat.
Dem wissenschaftlichen Leiter der BioteCon GmbH (Potsdam) Herrn Dr. JÜRGEN FREVERT und
seinen Mitarbeitern danke ich für die Möglichkeit Labore und Know-how zu nutzen und für ihren
fachlichen Rat.
Ferner gilt mein Dank Frau TANJA HIRSCHBERGER und Herrn JOHANNES BADER für die gewissenhafte
Durchführung einer Reihe von Versuchen, ebenso Frau Dipl.-Lebensmittelchem. HEIKE RÖHR und
den Herren Dipl.-BrauIng. GEORG KRISTAN und DANIEL STURM für Diskussionsbereitschaft und
(brauprozeßrelevante) Hinweise.
Bedanken möchte ich mich ebenso bei Frau Dr. EVA KÄRGEL für die Korrektur der Arbeit.
Mein Dank gilt weiterhin den Mitarbeitern des Fachgebiets Mikrobiologie und Genetik der TUB in der
Seestraße, besonders der Labore 2 und 3 für Hilfsbereitschaft und angenehme Arbeitsatmosphäre.
Speziell danke ich an dieser Stelle meiner Mutter und meinen Freunden für die andere Art von
Unterstützung, die den notwendigen Ausgleich zur Forschungsarbeit schaffte.
Ich bin meinem Mann Dipl.-Geol. GERNOT VOIGTLÄNDER sehr dankbar, daß er dieses Vorhaben,
besonders in schwierigen Phasen, durch die richtige Mischung Kritik und Ermunterung unermüdlich
unterstützte.
Inhalt
I
I
NHALTSVERZEICHNIS
Tabellenverzeichnis ........................................................................................................................ III
Abbildungsverzeichnis....................................................................................................................IV
Abkürzungsverzeichnis.................................................................................................................... V
I THEORETISCHER TEIL........................................................................................................................ 1
Einfluß physikalischer, chemischer und technologischer Parameter
auf die Bierschaumstabilität ............................................................................................................. 1
1 EINLEITUNG 1
2 SCHAUMBILDUNG, STRUKTUR UND PHYSIK DES SCHAUMS............................................................... 1
3 POSITIVE UND NEGATIVE KOMPONENTEN DER SCHAUMSTABILITÄT
UND IHRE CHEMISCHEN WECHSELWIRKUNGEN ................................................................................. 3
4 TECHNOLOGISCHE PARAMETER UND IHR EINFLUß AUF DIE SCHAUMSTABILITÄT .............................. 7
II PRAKTISCHER TEIL
Proteinase A und Schaumstabilität – biochemische Untersuchungen der Wechselwirkungen
von Proteinase A aus Saccharomyces cerevisiae und schaumaktivem Lipidtransferprotein .......... 10
1 EINLEITUNG..................................................................................................................................... 10
1.1 Proteine in Bier............................................................................................................................... 10
1.1.1 Schaumproteine aus der Gerste....................................................................................................... 10
1.1.2 Chemische und thermische Modifizierungen von Proteinen
während des Mälz- und Brauprozesses........................................................................................... 11
1.2 Enzyme in Bier ............................................................................................................................... 12
1.2.1 Klassifizierung proteolytischer Enzyme ......................................................................................... 12
1.2.2 Proteinasen aus
S. cerevisiae .......................................................................................................... 13
1.2.3 Einfluß von Proteinase A auf den Bierschaum ............................................................................... 15
1.3 Zielsetzungen.................................................................................................................................. 16
2 MATERIAL UND METHODEN..................................................................................................................... 17
2.1 Geräte und Chemikalien ................................................................................................................. 17
2.1.1 Verwendete Geräte.......................................................................................................................... 17
2.1.2 Verwendete Chemikalien................................................................................................................ 17
2.2 Häufig verwendete Medien und Puffer........................................................................................... 19
2.3 Stammhaltung und Zellanzucht ...................................................................................................... 19
2.4 E. coli-Stämme................................................................................................................................ 19
2.5 Klonierung, Plasmide und Primer................................................................................................... 20
2.6 DNA-Arbeitsmethoden................................................................................................................... 21
2.6.1 Polymerasekettenreaktion (PCR).................................................................................................... 22
2.6.2 Restriktion und Ligation ................................................................................................................. 23
2.6.3 Agarose-Gel-Elektrophorese........................................................................................................... 23
2.6.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen und DNA-Sequenzierung................................................. 24
2.6.5 Transformation................................................................................................................................ 24
2.6.6 Plasmid-DNA-Präparation aus
E. coli ............................................................................................ 25
2.7 Proteinexpression und Proteinreinigung ......................................................................................... 25
2.7.1 (His)6-LTP1-Fusionsprotein............................................................................................................ 25
2.7.2 LTP1-Intein-Fusionsprotein............................................................................................................ 26
2.8 Proteinase- und Proteinbestimmungen............................................................................................ 28
2.8.1 Aktivitätsbestimmungen von Proteinase......................................................................................... 28
2.8.2 Proteinbestimmungen nach Lowry und Bradford........................................................................... 28
2.9 Proteinfällung und Proteinkonzentration ........................................................................................ 29
2.9.1 Proteinfällung mit TCA/NaDOC .................................................................................................... 29
2.9.2 Ammoniumsulfatfällung................................................................................................................. 29
2.9.3 Ultrafiltration .................................................................................................................................. 29
2.10 Proteintrennung mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese.................................................. 29
2.11 Proteinfärbung ................................................................................................................................ 30
2.11.1 Coomassiefärbung........................................................................................................................... 30
2.11.2 Silberfärbung .................................................................................................................................. 30
2.12 Immunchemische Analyse (Westernblot)....................................................................................... 31
2.12.1 Elektrotransfer auf Nitrozellulose................................................................................................... 31
Inhalt
II
2.12.2 Immunreaktionen und Detektionen................................................................................................. 31
2.13 Affinitätschromatographie mit Antikörpern.................................................................................... 33
2.14 Gewinnung LTP1-haltiger Proteinpräparationen aus Bier und Gerste............................................ 34
2.15 Reversed-Phase-High-Performance-Liquid-Chromatography (RP-HPLC).................................... 34
2.15.1 Rotationsverdampfer....................................................................................................................... 35
2.15.2 Fraktionierung mittels RP-HPLC.................................................................................................... 35
2.16 Schaumstabilitätsbestimmung nach Ross und Clark....................................................................... 35
2.17 Massenspektrometrie ...................................................................................................................... 36
3 ERGEBNISSE ............................................................................................................................................. 37
3.1 Korrelation zwischen Aktivität von Proteinasen und Stabilität von Bierschaum............................ 37
3.1.1 Minderung der Schaumstabilität durch unterschiedliche Proteinasen............................................. 37
3.1.2 Proteinasen aus
S. cerevisiae und ihr Einfluß auf die Schaumstabilität.......................................... 38
3.2 Verfahren zur Expression und Proteinreinigung von LTP1............................................................ 42
3.2.1 Expression rekombinanter LTP1-Fusionsproteine.......................................................................... 42
3.2.1.1Verwendete Konstrukte.................................................................................................................. 42
3.2.1.2Optimierung.................................................................................................................................... 43
3.2.2 Reinigung rekombinanter LTP1-Fusionsproteine........................................................................... 45
3.2.3 Reinigung von LTP1 aus Bier......................................................................................................... 48
3.2.4 Reinigung von LTP1-haltigen Fraktionen aus Bier und Gerste...................................................... 49
3.3 Unterschiedliche Sensitivität des endogenen und rekombinanten LTP1
sowie des 40 kDa-Proteins gegenüber Proteinase A....................................................................... 52
3.3.1 Einfluß von Proteinase A auf Proteine in Bier................................................................................ 52
3.3.2 Abbau von rekombinantem LTP1 durch Proteinase A ................................................................... 53
3.3.3 Unterschiedliche Proteinase A-Sensitivität von LTP1 aus Gerste und Bier ................................... 54
3.4 Nachweis von LTP1-Abbauprodukten in Bier nach Inkubation mit Proteinase A
aus S. cerevisiae mit Hilfe von Reversed-Phase-HPLC und Massenspektrometrie........................ 57
3.4.1 Analyse von RP-HPLC-Fraktionen im SDS-Gel und Westernblot................................................. 58
3.4.2 Untersuchung der RP-HPLC-Fraktionen mittels Massenspektrometrie ......................................... 60
3.4.3 Untersuchung trypsinbehandelter Fraktionen ................................................................................. 63
3.4.4 Identifizierung von LTP1-Abbauprodukten.................................................................................... 64
4 DISKUSSION ............................................................................................................................................. 66
4.1 Nachweis schaumnegativer Proteinaseaktivitäten .......................................................................... 66
4.2 Reinigung verschiedener LTP1-Formen......................................................................................... 68
4.3 Schaumpositive und proteinasesensitive LTP1-Formen................................................................. 70
4.4 Potentielle Proteinase A-Spaltsequenzen in LTP1.......................................................................... 72
4.5 Ausblick.......................................................................................................................................... 74
5 ZUSAMMENFASSUNG................................................................................................................................ 76
6 LITERATUR............................................................................................................................................... 77
7 ANHANG .................................................................................................................................................. 83
Inhalt
III
T
ABELLENVERZEICHNIS
Tab. 1.1: Proteinasefamilien und ihre spezifischen Inhibitoren..................................................................... 13
Tab. 1.2: Vakuoläre Proteinasen der Hefe S. cerevisiae ................................................................................ 13
Tab. 2.1: Stammlösungen und Arbeitskonzentrationen verwendeter Antibiotika.......................................... 19
Tab. 2.2: Verwendete Bakterienstämme ........................................................................................................ 19
Tab. 2.3: Primersequenzen............................................................................................................................. 20
Tab. 2.4: Verwendete Restriktionsendonukleasen und Puffer........................................................................ 21
Tab. 2.5: Temperatur- und Zeitregime der PCR-Reaktionsansätze................................................................ 22
Tab. 2.6: Puffer und Inkubationsbedingungen der verwendeten Enterokinasen ............................................ 26
Tab. 2.7: Methoden der Silberfärbung ........................................................................................................... 30
Tab. 2.8: Übersicht der im Westernblot verwendeten primären und sekundären Antikörper
sowie der entsprechenden Blocklösungen ...................................................................................... 32
Tab. 2.9: Übersicht der verwendeten Ligand-Matrix-Systeme
zur Reinigung der entsprechenden Proteine.................................................................................... 33
Tab. 2.10: Übersicht der in der RP-HPLC getesteten Säulen........................................................................... 34
Tab. 3.1: Übersicht der zur Dotierung in Bier eingesetzten Proteinasen........................................................ 37
Tab. 3.2: Konzentrationsbestimmung für Carboxypeptidase Y und Proteinase A mittels verschiedener
Methoden ........................................................................................................................................ 41
Tab. 3.3: Übersicht verschiedener Möglichkeiten der LTP1-Gewinnung
und die jeweils erzielten Erträge..................................................................................................... 49
Tab. 3.4: Ausgewählte Massenpeaks und ihre relative Intensität
in den Fraktionen F19, F20 und F21............................................................................................... 60
Tab. 3.5: Zuordnung einzelner Peptidsequenzen zu spezifischen Massen
der Fraktionen F19, F20 und F21.................................................................................................... 62
Tab. 3.6: Ausgewählte Massenpeaks und ihre relative Intensität
in den Fraktionen F19, F20 und F21 nach Trypsinbehandlung ...................................................... 63
Tab. 3.7: Zuordnung einzelner Peptidsequenzen zu spezifischen Massen
der Fraktionen F19, F20 und F21 nach der Trypsinbehandlung. .................................................... 65
Inhalt
IV
ABBILDUNGSVERZEICHNIS
Abb. 1.1: Vergleich von Aminosäuresequenzen verschiedener LTP1 aus Pflanzen. ..................................... 11
Abb. 2.1 Plasmidkarten der Expressionsvektoren pSAm und pTYB1-LTP1. .............................................. 21
Abb. 3.1: Einfluß verschiedener Proteinasen auf die Schaumstabilität von Bier. .......................................... 38
Abb. 3.2: Einfluß von Carboxypeptidase Y (CPY) aus S. cerevisiae auf die
Schaumstabilität von Bier in Abhängigkeit der dotierten Enzymkonzentration. ........................... 39
Abb. 3.3: Einfluß von Proteinase A (PrA) aus S. cerevisiae auf die
Schaumstabilität von Bier nach Inkubation über drei Tage. .......................................................... 39
Abb. 3.4: Einfluß von Proteinase A (PrA) aus S. cerevisiae auf die
Schaumstabilität von Bier nach Inkubation über 6 Wochen. ......................................................... 40
Abb. 3.5: Aufbau des rekombinanten (His)6-LTP1-Fusionsproteins. ............................................................ 43
Abb. 3.6: Aufbau des rekombinanten LTP1-Intein-Fusionsproteins. ............................................................ 43
Abb. 3.7: SDS-Gel-Elektrophorese für (His)6-LTP1-Fusionsprotein-exprimierende
Zellen und gereinigtes Fusionsprotein. .......................................................................................... 44
Abb. 3.8: LTP1-Intein-Fusionsprotein-exprimierende Zellen
des E. coli-Stamms 2566 im Westernblot. ..................................................................................... 45
Abb. 3.9: Reinigung von (His)6-LTP1-Fusionsprotein................................................................................... 46
Abb. 3.10: Proben aus dem Reinigungsprozeß des LTP1-Intein-Fusionsproteins
im Westernblot. .............................................................................................................................. 47
Abb. 3.11: Korrelation der gewonnenen Menge LTP1 in Abhängigkeit
des eingesetzten Biervolumens zur Kapazitätsbestimmung der Affinitätssäule. ........................... 48
Abb. 3.12: Reinigung LTP1-haltiger Fraktionen aus Bier mittels semipräparativer RP-HPLC. ..................... 50
Abb. 3.13: Reinigung LTP1-haltiger Fraktionen aus Gerste mittels semipräparativer RP-HPLC. .................. 51
Abb. 3.14: Nachweis von Proteinen in Bier nach der Inkubation mit Proteinase A. ....................................... 52
Abb. 3.15: Nachweis der Resistenz von rekombinantem (His)6-LTP1-Fusionsprotein in Bier
gegenüber Proteinase A. ................................................................................................................ 53
Abb. 3.16: Nachweis des Abbaus von rekombinantem LTP1 durch Proteinase A
mittels SDS-Gel-Elektrophorese..................................................................................................... 54
Abb. 3.17: Analyse von Proteinpräparationen aus Bier und Gerste nach Inkubation
mit Proteinase A mittels SDS-Gel-Elektrophorese......................................................................... 55
Abb. 3.18: Analyse von Proteinpräparationen aus Bier und Gerste nach Inkubation
mit Proteinase A mittels RP-HPLC. ............................................................................................... 56
Abb. 3.19: Fließschema mit Arbeitsschritten zur Reinigung und Analyse von
LTP1-Abbauprodukten. .................................................................................................................. 57
Abb. 3.20: Fraktionierung von potentiellen LTP1-Abbauprodukten aus Bier
nach Inkubation mit Proteinase A mittels semipräparativer RP-HPLC. ........................................ 58
Abb. 3.21: Analyse von HPLC-Fraktionen hinsichtlich LTP1-Abbauprodukten
mittels SDS-Gel-Elektrophorese. ................................................................................................... 59
Abb. 3.22: Nachweis von LTP1 in HPLC-Fraktionen mittels Westernblotanalyse. ........................................ 59
Abb. 4.1: Fließdiagramm zur Reinigung von LTP1 aus Gerste nach Jegou et al. (2000). ............................. 69
Abb. 4.2: Strukturelle Merkmale des LTP1-Moleküls. .................................................................................. 71
Abb. 4.3: Potentielle Proteinase A-Spaltstellen in LTP1. .............................................................................. 73
Abkürzungen
V
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
AS Aminosäure
BMA BioWhittaker Molekular Applications
BSA Rinderserumalbumin
CBD Chitin-Bindungs-Domäne
CPY Carboxypeptidase Y
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Desoxyribonukleinsäure
DTT 1,4-Dithiothreitol
EDTA Ethylendiamin-N,N,N´,N´-tetraessigsäure
HPLC Hochdruckflüssigkeitschromatographie (high pressure liquid chromatography)
IgG Immunglobulin G
IPTG Isopropyl-ß-D-Thiogalactopyranosid
kDa Kilodalton
LB-Medium Luria-Bertani-Medium
MES ß-Morpholino-Ethansulfonsäure
MS Massenspektrometrie
Mw Molekulargewicht
NaDOC Natriumdesoxycholat
NEB New England Biolabs
OD Optische Dichte
PAA Polyacrylamid
PCMB Sodium p-chloromercuribenzoat
PCR Polymerasekettenreaktion (polymerase chain reaction)
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid
POD Peroxidase
PrA Proteinase A
RP-HPLC Umkehrphasen-Hochdruckflüssigkeitschromatographie
(reversed phase high pressure liquid chromatography)
RT Raumtemperatur
SDS Natriumdodecylsulfat
TCA Trichloressigsäure
TE Tris/EDTA-Puffer
TFA Trifluoressigsäure
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan
Abkürzungen
VI
Nukleinsäuren
A Adenin
C Cytosin
G Guanin
T Thymin
Aminosäuren
A Ala Alanin
C Cys Cystein
D Asp Aspartat
E Glu Glutamat
F Phe Phenylalanin
G Gly Glycin
H His Histidin
I Ile Isoleucin
K Lys Lysin
L Leu Leucin
M Met Methionin
N Asn Asparagin
P Pro Prolin
Q Gln Glutamin
R Arg Arginin
S Ser Serin
T Thr Threonin
V Val Valin
W Trp Tryptophan
Y Tyr Tyrosin
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
1
I THEORETISCHER TEIL
E
INFLUß PHYSIKALISCHER, CHEMISCHER UND TECHNOLOGISCHER PARAMETER
AUF DIE BIERSCHAUMSTABILITÄT
1 EINLEITUNG
Der Schaum des Bieres ist ein Hauptqualitätsmerkmal und als solches von großem Interesse
für Brauer und Konsumenten. Zwar finden sich bei unterschiedlichen Konsumentengruppen
auseinandergehende Vorstellungen hinsichtlich der Schaumqualität, sie bleibt dennoch ein
kritischer Faktor, der den Konsumenten in seiner Produktwahl und in seinem Qualitätsurteil
stark beeinflußt. Grundsätzlich wird der Bierschaum durch eine Vielzahl chemischer Kompo-
nenten und durch zahlreiche physikalische Wechselwirkungen definiert. Die Schaumfor-
schung der vergangenen Jahren beschäftigte sich sowohl mit dem Einfluß verschiedener
Würze- und Bierkomponenten auf die Schaumstabilität als auch mit der eindeutigen
Darstellung einzelner Wechselwirkungen.
2 SCHAUMBILDUNG, STRUKTUR UND PHYSIK DES SCHAUMS
Physikalisch betrachtet umfaßt die Schaumbildung verschiedene Phasen: (i) die
Blasenentstehung, (ii) die Expansionsphase und (iii) den Ablöseprozeß.
Nach Rondeltap et al. (1989) ist die Gassättigung in Sprudelgetränken unzureichend für eine
homogene Blasenbildung, wie sie für Zweiphasensysteme von gelöstem Gas und Flüssigkeit
beschrieben ist. So findet in Bier eine heterogene Blasenbildung statt. In diesem Fall fungie-
ren bereits existierende Blasen bzw. die Oberfläche einer festen Phase (Festpartikel, Contai-
nerwand) als Aktivstellen der Blasenbildung (Prins und van Marle, 1999). Nachdem die Blase
auf einen kritischen Durchmesser angewachsen ist, kommt es zur Ablösung von der Aktiv-
stelle. Die Expansion setzt sich infolge von Diffusion des in der Flüssigkeit gelösten Gases in
die Blase fort, und die Blase steigt nach oben in die Schaumschicht auf.
Ein guter Schaum zeichnet sich durch eine homogene Blasenpackung aus, d. h. alle Blasen
weisen den gleichen Durchmesser auf. Die Ausbildung einer homogenen Blasenpackung wird
durch die Gasdispersion im Bier beeinflußt, die wiederum abhängig vom verwendeten Gas ist
(CO2/N2-Gemische, Anteil CO2) (Fisher et al., 1998). Eine homodisperse Gasverteilung re-
sultiert in kleinen Blasen und einem cremigen Schaum. Im Schaum bilden sich an den Kon-
taktflächen von benachbarten Blasen sogenannte Schaumlamellen, die entstehenden Räume
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
2
zwischen den Schaumblasen werden als Plateauränder bezeichnet. Die ausgebildete Schaum-
struktur ähnelt im Fall einer homogenen Blasenpackung einer Bienenwabenstruktur. Die
physikalische Stabilität des Schaums wird durch Prozesse wie Drainage, Koaleszenz und
Disproportion bestimmt.
Beim Prozeß der Drainage fließt die im Schaum enthaltene Flüssigkeit durch die Schwerkraft
aus den Schaumlamellen und den Plateaurändern in das Bier ab. Das Abfließen der Flüssig-
keit führt zu einer Verminderung der Schichtdicke der Schaumlamelle. Eine verringerte
Schichtdicke führt zum Platzen der Blase bzw. begünstigt Prozesse wie Koaleszenz und
Disproportion. Der Einfluß der Drainage auf die Schaumstabilität ist temperaturabhängig. Bei
niedrigen Temperaturen und somit höherer Viskosität des Bieres findet die Drainage nur
verzögert statt.
Das Verschmelzen zweier Blasen wird als Koaleszenz bezeichnet. Ursache ist der zwischen
den Blasen zerstörte Flüssigkeitsfilm. Häufig wird Koaleszenz der Drainage zugeordnet. Die
Zerstörung des Flüssigkeitsfilms kann durch äußere Einflüsse erfolgen. Zum einen kann die
Zerstörung durch kleine hydrophobe Partikel (z. B. hydrophobe Aminosäure) ausgelöst
werden (hydrophobic particle mechanism; Aronson, 1986), zum anderen durch Kontakt von
oberflächenaktiven Detergenzien mit dem Flüssigkeitsfilm einer Blase (spreading
mechanism; Rondeltap, 1991). Koaleszenz, die im Inneren des Schaums stattfindet, führt zu
größeren Blasen und einer Abnahme der Blasenzahl. Findet Koaleszenz hingegen in der
obersten Schaumschicht statt, entstehen keine größeren Blasen, sondern der Schaum
kollabiert.
Disproportion ist das Ergebnis von Gasdiffusion zwischen den Blasen. Jede Blase befindet
sich in einem stabilen Zustand. In Abhängigkeit vom Durchmesser existiert in der Blase ein
definierter Blaseninnendruck. Treffen zwei Blasen mit unterschiedlichem Durchmesser
(d1 > d2) und somit unterschiedlichen Innendrücken (p1 < p2) aufeinander, entsteht ein
instabiler Zustand. Das Gas der kleinen Blase diffundiert aufgrund des Druckunterschiedes in
die große Blase. Während der Durchmesser der großen Blase zunimmt, verschwindet die
kleine Blase. Der Prozeß der Disproportion wird durch heterogene Blasenpackungen, d. h.
einer Mischung von großen und kleinen Blasen begünstigt.
Physikalische Prozesse wie Drainage, Koaleszenz und Disproportion führen zu einer Abnah-
me des Schaumvolumens. Physikalische Parameter, wie Oberflächenspannung, Viskosität und
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
3
ausgebildete elektrische Doppelschichten können hingegen einen positiven Effekt auf die
Schaumstabilität haben und den Ablauf der oben genannten Prozesse verzögern.
Die Oberflächenspannung wird bestimmt durch oberflächenaktive Inhaltsstoffe des Bieres,
wie z. B. hydrophobe Proteine. Durch Adsorption reichern sich Proteine an der Oberfläche
der Schaumlamelle an. Dabei ist der hydrophobe Proteinteil in die Gasphase, der hydrophile
in die Flüssigkeitsphase ausgerichtet. Die Wechselwirkungen zwischen den einzelnen
Proteinmolekülen führen zur Bildung eines Proteinfilms um die Gasblase. Dadurch wird die
Oberflächenspannung herabgesetzt. Eine niedrige Oberflächenspannung begünstigt kleinere
Schaumblasen und verzögert den Koaleszenz- und den Drainageprozeß (Fisher et al., 1998).
Die Viskosität wird bestimmt durch Kohäsion sowohl zwischen oberflächenaktiven Molekü-
len als auch oberflächenaktiven und oberflächeninaktiven Molekülen in der Phasengrenz-
fläche einer Schaumblase. Die im Ergebnis in der Phasengrenzfläche ausgebildete Molekül-
schicht weist eine höhere Viskosität als die umgebende Flüssigkeit auf, wodurch der
Drainageprozeß verzögert wird.
Eine elektrische Doppelschicht bildet sich durch die Adsorption geladener Moleküle in der
Phasengrenzfläche einer Schaumblase aus. Aufgrund von ausgebildeten Ladungsdifferenzen
stellt sich zwischen zwei Blasen ein definierter Abstand ein, der Drainage, Koaleszenz und
Disproportion verhindert bzw. verzögert (Fath und Sommer, 1985)
3 POSITIVE UND NEGATIVE KOMPONENTEN DER SCHAUMSTABILITÄT UND IHRE
CHEMISCHEN WECHSELWIRKUNGEN
Die Komplexität der Schaumstabilität zeigt sich in einer Vielzahl schaumpositiver und
schaumnegativer Faktoren. Natürliche, schaumstabilisierende Komponenten in Bier sind Pro-
teine mit einem Molekulargewicht (Mw) größer 5 kDa, Melanoidine, Hopfenbitterstoffe (iso-
α-Säuren), niedermolekulare Polyphenole, Metallionen und Polysaccharide (z. B. ß-Glukane).
Die Gruppe der schaumnegativen Faktoren bilden Ethanol, langkettige Alkohole, Lipide und
Fettsäuren. Dazu zählen weiterhin niedermolekulare Stickstoffverbindungen, insbesondere
Peptide und Aminosäuren.
Die im Bier vorhandenen Proteine stammen zum überwiegenden Teil aus der Gerste und sind
oberflächenaktiv. Der Einfluß der im Bier enthaltenen Proteine auf die Schaumqualität wird
in der Literatur sehr kontrovers diskutiert. So wird einerseits davon ausgegangen, daß für die
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
4
Bierschaumstabilität Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht verantwortlich sind
(Asano und Hashimoto, 1980; Yokoi et al., 1989). Andererseits wird angenommen, daß nur
hydrophobe Proteine schaumstabilisierend wirken (Slack und Bamforth, 1983). So wurden
von Onishi und Proudlove (1994) verschiedene Proteinfraktionen aus Bier isoliert und für
diese eine positive Korrelation zwischen Hydrophobizität und Schaumstabilität festgestellt.
Die schaumpositiven Proteine können nach dem Molekulargewicht in zwei Fraktionen unter-
teilt werden: hochmolekulare Proteine (Mw = 35-50 kDa) und niedermolekulare Proteine
(Mw = 5-15 kDa). Proteine mit einem Molekulargewicht größer 50 kDa wurden ebenso als
schaumpositiv beschrieben (Hejgaard und Sørensen, 1975; Asano und Hashimoto, 1980;
Mohan et al. 1992; Sheehan und Skerrit, 1997). Die hochmolekulare Proteinfraktion enthält
hauptsächlich Protein Z, ein 40 kDa großes Protein (Kaersgaard und Hejgaard, 1979; Evans et
al., 1995). Die niedermolekulare Fraktion setzt sich aus dem Lipidtransferprotein 1 (Mw = 10
kDa), sowie Hordein- und Glutelinfragmenten zusammen (Sørensen et al., 1993; Kauffmann
et al., 1994; Lusk et al., 1995; Vaag et al., 1999).
Zahlreiche Untersuchungen zeigen, daß Protein Z von Bedeutung für die Schaumstabilität ist.
So ergibt sich für Protein Z eine gute Schaumstabilität im Zusammenspiel mit dem Lipid-
transferprotein 1 sowie anderen Peptiden und Polysacchariden (Sørensen et al., 1993).
Zusätzlich weist Protein Z nach Douma et al. (1997) physikochemische Eigenschaften auf,
die für eine gute Schaumstabilität notwendig sind und die durch Proteine von 8-18 kDa
verstärkt werden. Andere Untersuchungen belegen, daß die Eliminierung von Protein Z aus
Bier keinen Einfluß auf die Schaumstabilität hat (Hollemans und Tonies, 1989). Nach Evans
et al. (2002) kann das Protein Z in zwei Isoformen Z4 und Z7 unterteilt werden, wobei nur für
Z4 eine Korrelation mit der Schaumstabilität nachgewiesen wurde.
Eine weitere wichtige Rolle für die Schaumstabilität spielt das Lipidtransferprotein 1 (LTP1).
Das 10 kDa große LTP1 ist die Hauptkomponente des Bierschaums. Erst durch das Würze-
kochen entstehen unterschiedliche LTP1-Formen, die im Vergleich zum nativen Gersten-
LTP1 schaumstabilisierende Eigenschaften aufweisen (Bech et al., 1995). Lusk et al. (1995)
zeigten, daß diese Eigenschaften im Zusammenspiel mit iso-α-Säuren verstärkt werden.
Die schaumpositiven Eigenschaften von Protein Z und LTP1 werden durch Wechselwirkun-
gen untereinander sowie durch Wechselwirkungen mit anderen Proteinen, insbesondere mit
Hordeinen verstärkt (Vaag et al., 1999; Sheehan et al., 2000). Hordeine sind Speicherproteine
der Gerste, die nach ihrem Molekulargewicht in vier große Gruppen unterteilt werden (Kreis
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
5
und Shewry, 1992). In Bierschaum wurden Hordeinfragmente mit einem Molekulargewicht
von 23 kDa (Sheehan und Skeritt, 1997) sowie von 17 kDa identifiziert (Vaag et al., 1999).
Für Hordeine wurde auch eine Beteiligung an Trübungen in Bier beschrieben (Sheehan et al.,
2000).
Die die Schaumstabilität bestimmenden Wechselwirkungen sind Protein-Protein-Wechselwir-
kungen. Die Stabilität des dadurch gebildeten Proteinfilms einer Schaumblase wird (i) durch
die beteiligten Proteinkomponenten, (ii) ihrem Verhältnis und (iii) den Wechselwirkungen mit
anderen oberflächenaktiven Substanzen wie Melanoidinen und Glykoproteinen, sowie Isohu-
mulonen und Polyphenolen definiert (Bamforth et al., 1993).
Melanoidine entstehen während des Mälzens, des Maische- und Würzekochens infolge von
Maillardreaktionen zwischen Aminosäuren, Peptiden, Proteinen und reduzierenden Zuckern
(Maillard, 1912; Tressl et al., 1981). Die oberflächenaktiven, geladenen Verbindungen kön-
nen mit Proteinen über Wechselwirkungen polare Komplexe bilden und den schaumpositiven
Effekt verstärken. So kann einerseits der Drainageprozeß im Schaum verzögert und anderer-
seits der negative Einfluß von Lipiden gemindert werden (Keukeleire, 1996). Lusk et al.
(1995) zeigten, daß Melanoidine ebenso in Abwesenheit von Proteinen den Schaum
stabilisieren.
Die in Bier enthaltenen Polyphenole stammen sowohl aus Hopfen als auch aus der Gerste.
Polyphenole sind an einweißfällenden Prozessen beteiligt, die von Bedeutung für die kolloi-
dale Stabilität eines Bieres sind. Des weiteren wurde für niedermolekulare Polyphenole eine
Verstärkung von schaumstabilisierenden Protein-Protein-Wechselwirkungen beobachtet
(Sarker et al., 1995). Diese kann auf Wasserstoffbrückenbindungen zwischen der phenoli-
schen Hydroxylgruppe und dem Sauerstoffmolekül einer Peptidbindung beruhen sowie auf
ionischen und hydrophoben Beziehungen (Derdelinckx et al., 1996).
Aus den oberflächenaktiven Hopfenbitterstoffen (α-Säuren) entstehen während des Würze-
kochens oberflächenaktive lösliche Isohumulone (iso-α-Säuren). Diese weisen, bedingt durch
unterschiedliche aliphatische Seitenketten, verschieden starke schaumpositive Eigenschaften
auf (Keukeleire, 1996). Nach Simpson und Hughes (1993) sind iso-α-Säuren in der Lage, sta-
bilisierende Wechselwirkungen zu Proteinen aufzubauen, die sowohl auf ionischen Dipolbin-
dungen zwischen den negativ geladenen Carboxylgruppen der iso-α-Säuren und den positiv
geladenen Aminogruppen der Proteine als auch auf hydrophoben Bindungen zwischen den
Seitenketten der iso-α-Säuren und den hydrophoben Aminosäureresten der Proteine beruhen.
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
6
Außerdem bewirken Isohumulone eine Erhöhung der Viskosität des Bieres (Yokoi et al.,
1994).
Neben den schaumpositiven oberflächenaktiven Substanzen existieren in Bier weitere
schaumstabilisierender Faktoren, zu denen Glykoproteine, nichtstärkeartige Polysaccharide
und Metallionen zählen.
Glykoproteine sind hochmolekulare Protein-Zucker-Verbindungen aus der Gerste, die
während des Mälzens proteolytisch zu löslichen, niedermolekularen Verbindungen abgebaut
werden (Schuster et al., 1992). Sie können die schaumpositiven Protein-Protein-Wechsel-
wirkungen verstärken (Roberts, 1975).
Beim Abbau von Polysacchariden (Hemicellulosen) während des Mälzens und Maischens
entstehen β-Glukane und Pentosane. Evans et al. (2002) stellten einen direkten
Zusammenhang von β-Glukan-Konzentration, Viskositätserhöhung und Schaumstabilität dar.
Infolge der erhöhten Viskosität wird der Drainageprozeß im Schaum reduziert.
Metallionen gelangen über die Rohstoffe, insbesondere durch das Brauwasser, in das Bier.
Nach einem Modell von Hughes und Simpson (1995) können bi- und trivalente Kationen
(Mn2+, Al3+ und Ni2+) durch Wechselwirkungen mit iso-α-Säuren in die Schaumstruktur
integriert werden und somit direkt die Schaumstruktur stabilisieren. Bamforth et al. (1993)
vertreten die Auffassung, daß dieser Effekt nur durch monovalente Kationen (Na+)
hervorgerufen wird. Da bisher keine Korrelation der Metallionenkonzentration in Bier und der
Schaumstabilität festgestellt wurde, existiert ebenfalls die Annahme, daß die
Metallkonzentration der Würze Einfluß auf den Hefestoffwechsel und die Vitalität der Hefe
hat und somit indirekt die Schaumqualität beeinflußt wird (Evans et al., 2002).
Die Schaumstabilität wird einerseits durch schaumpositive Substanzen und Faktoren,
andererseits durch eine Reihe negativer Faktoren bestimmt. Ethanol und Nebenprodukte des
Hefestoffwechsels, wie langkettige Alkohole, Lipide und freie Fettsäuren, sind der Gruppe
der schaumnegativen Faktoren zuzuordnen. Niedermolekulare Stickstoffverbindungen
(Aminosäuren, Dipeptide, Polypeptide mit Mw < 5 kDa), die während des Mälzens und
Maischens durch proteolytischen Abbau gebildet werden, beeinflussen ebenfalls die Schaum-
qualität negativ.
Die oberflächenaktiven Eigenschaften von Ethanol und langkettigen Alkoholen führen zu
einer Aufhebung der Protein-Protein-Wechselwirkungen im Schaum (Hughes und Wilde,
1997). Dieser Effekt kann ebenso durch oberflächenaktive Lipide und Fettsäuren
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
7
hervorgerufen werden. Ein zerstörter Proteinfilm ermöglicht dann den direkten Kontakt
oberflächenaktiver Alkohol- oder Lipidmoleküle mit der Phasengrenzfläche einer Blase und
begünstigt somit Koaleszenz. Von niedermolekularen Polypeptiden und besonders von
polaren Aminosäuren (Arginin, Lysin, Histidin) werden die schaumstabilisierenden
Beziehungen zwischen Proteinen und iso-α-Säuren negativ beeinflußt (Furukubo et al.,
1993).
Auch im Zusammenhang mit erhöhten Proteinase A-Konzentrationen in Bier ist eine Schaum-
stabilitätsabnahme beobachtet worden. Proteinase A wird von autolysierten Hefezellen
freigesetzt und führt in abgefüllten Bier zum Abbau schaumpositiver Proteine (Muldbjerg et
al., 1993).
4 TECHNOLOGISCHE PARAMETER UND IHR EINFLUß AUF DIE SCHAUMSTABILITÄT
Im Ergebnis eines optimalen Brau- und Mälzprozesses sollten (i) die schaumpositiven Kom-
ponenten in optimalen Konzentrationen und ausgewogenen Verhältnissen vorliegen, (ii) die
schaumnegativen Komponenten hingegen in minimalen Konzentrationen.
Die Konzentration der aus dem Gersteneiweiß gebildeten schaumpositiven Proteine in der
Würze wird durch die verwendete Gerstenspezies sowie Wachstums- und Anbaubedingungen
bestimmt (Narziß et al., 1988; Ishibashi et al., 1997). Generell ist eine gute Gerstenqualität
Voraussetzung für ein gutes Malz.
Beim Mälzen entstehen schaumstabilisierende Proteinformen aus den gelösten Gersten-
eiweißen zum einen durch den proteolytischen Abbau höherer Stickstoffverbindungen, zum
anderen durch teilweise Modifikation (Glykosylierung) und Denaturierung. Gleichzeitig
werden schaumpositive Melanoidine infolge von Maillardreaktionen gebildet. Die
schaumpositiven Eigenschaften eines Malzes werden definiert durch den schaumpositiven
Eiweißgehalt, den Eiweißlösungsgrad und die Viskosität. Gleichzeitig führen allerdings zu
hohe Eiweißgehalte, ein zu hoher Eiweißlösungsgrad und eine zu hohe Viskosität zu
Einbußen bei der Extraktausbeute, der Filtrierbarkeit und der Trübungsstabilität (Bamforth,
1985). Von Bedeutung für die Schaumstabilität ist auch der Grad der während des Mälzens
stattfindenden Modifikationen. So ergibt sich bei einem überlösten Malz infolge zu starken
proteolytischen Abbaus eine geringe Bierschaumstabilität (Ryder et al., 1991).
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
8
Beim Maischen wird der proteolytische Abbau höhermolekularer Stickstoffverbindungen, so
auch von hochmolekularen schaumpositiven Proteinen (Gluteline, Hordeine), fortgesetzt. Ein
vestärkter Abbau findet bei Maischtemperaturen von 50 °C statt (Schuster et al., 1992).
Infolge dieses Abbaus werden Aminosäuren (FAN) freigesetzt, die einerseits essentiell für die
Hefe sind und von ihr verstoffwechselt werden, andererseits in hohen Konzentrationen
Schauminstabilitäten hervorrufen können. Aufgrund der Sequenzähnlichkeiten zu Proteinase-
inhibitoren werden die schaumpositiven Proteine LTP1 und Protein Z nicht durch Proteinasen
während des Maischens abgebaut (Jones und Marinac, 1995). Die gerstenspezifischen Protei-
nasen werden zum größten Teil ab einer Maischtemperatur von 62 °C inaktiviert. Die redu-
zierte Proteinaseaktivität bei höheren Temperaturen führt zu einer Konzentrationszunahme
von Glykoproteinen (Narziß et al., 1982). Eine erhöhte Konzentration an schaumaktiven
Proteinen, insbesondere von Hordeinen ist bei Maischtemperaturen von 71 °C beobachtet
worden (Ishibashi et al., 1997). Während des Maischens findet weiterhin ein Abbau von
Gerstenlipiden zu freien Fettsäuren statt, die in hohen Konzentrationen zu einer Abnahme der
Schaumstabilität führen können.
Schaumnegative Lipide und Fettsäuren werden zusammen mit ausgefällten Proteinen durch
den Läuterprozeß aus der Maische abgetrennt. Nach dem Läutern weisen Würzen mit
geringen Trübungswerten und niedriger Feststoffbelastung demzufolge nur geringe
Konzentrationen schaumnegativer Substanzen auf.
Auch im Verlauf des Würzekochens wird eine hohe Konzentration an Proteinen, darunter
auch schaumpositiver, ausgefällt. Die Konzentration der ausgefällten Proteine kann durch
Optimierung des Kochprozesses, wie schonendes Ankochen, homogenes Erhitzen und kurze
Kochzeiten minimiert werden. Weiterhin entstehen während des Würzekochens
schaumpositive iso-α-Säuren durch die Isomerisierung von Hopfenbitterstoffen. Ihre
Konzentration in der Würze wird durch Qualität und Art des Hopfenproduktes definiert und
ist durch technologische Parameter beeinflußbar (Bamforth, 1998). Die Heißtrubabtrennung
reduziert den Anteil schaumnegativer Substanzen in der Würze, da zusammen mit
koagulierten Proteinen schaumnegativer Lipide und Fettsäuren entfernt werden.
Ein Verlust von schaumpositiven Proteinen tritt während des Gärprozesses infolge der
Kräusenbildung auf. Die Konzentration schaumnegativer Komponenten kann im Verlauf des
Gärprozesses zunehmen. So werden bei einem ungünstigen Gärverlauf verstärkt Neben-
produkte, vor allem C6-, C8- und C10-Fettsäuren sowie höhermolekulare Alkohole gebildet,
die zu Schauminstabilitäten beitragen können. Voraussetzung für einen optimalen Gärprozeß
Einfluß von Parametern auf die Bierschaumstabilität
9
ist eine vitale Hefe mit einem geringen Totzellenanteil. Mit hohen Hefegaben und einer guten
Sauerstoffausstattung der Hefe wird eine schnelle Hauptgärung erreicht und die Bildung
unerwünschter Nebenprodukte stark eingeschränkt. Niedrige Gärtemperaturen sowie niedrige
Temperaturen während der Nachgärung und Lagerung verzögern die Autolyse von
Hefezellen, durch die schaumnegative Zellinhaltsstoffe in das Bier freigesetzt werden. Zu den
schaumnegativen Zellinhaltsstoffen gehören insbesondere Proteinasen, die durch einen Abbau
schaumpositiver Proteine im Bier zur Schauminstabilität beitragen. Der Anteil toter
Hefezellen und die damit verbundene Freisetzung schaumnegativer Substanzen kann durch
eine schnelle Hefeernte gering gehalten werden. Werden bei der Filtration eiweißfällende
Filterhilfsmittel verwendet, bedingt dies einen weiteren Verlust an schaumpositiven
Proteinen.
Schaumpositive Technologien des Mälz- und Brauprozesses sind entscheidend für die
Schaumqualität des fertigen Bieres. Die übermäßige Anreicherung einer schaumpositiven
Komponente führt nicht unmittelbar zu einer verbesserten Schaumstabilität. Außerdem kann
eine übertriebene Optimierung einzelner technischer Parameter negative Auswirkungen auf
andere wichtige Qualitätsmerkmale wie Trübung und Geschmack haben.
1 Einleitung
10
II PRAKTISCHER TEIL
PROTEINASE A UND SCHAUMSTABILITÄT - BIOCHEMISCHE UNTERSUCHUNGEN
DER WECHSELWIRKUNGEN VON PROTEINASE A AUS S. CEREVISIAE UND
SCHAUMAKTIVEM LIPIDTRANSFERPROTEIN
1 EINLEITUNG
1.1 Proteine in Bier
1.1.1 Schaumproteine aus der Gerste
Wichtige Qualitätsmerkmale eines Bieres wie Geschmack, Farbe, kolloidale Stabilität sowie Stabilität
des Schaums werden durch Beteiligung von Proteinen geprägt. Die in Bier enthaltenen Proteine
(3-4 g/l) stammen überwiegend aus der Gerste. Der Eiweißgehalt von Gerstentrockensubstanz liegt
zwischen 8 und 13,5 % (Narziß, 2001). Davon gelangt etwa ein Drittel in das fertige Bier. Ungefähr
30 % des Gesamtproteingehalts sind Gluteline, 37 % Prolamine (Hordein), 15 % Globuline und 11 %
Albumine. Die restlichen 7 % der Gerstenproteine entfallen auf andere Proteingruppen (Narziß, 2001).
Zur Gruppe der schaumpositiven Proteine zählen Hordeine sowie die Albumine Protein Z und
Lipidtransferprotein 1 –LTP1 (Sheehan und Skeritt, 1997; Yokoi et al., 1989; Vaag et al., 1999; Lusk
et al., 1995; Sørensen et al., 1993).
Hordeine sind Reserveproteine mit Molekulargewichten von kleiner 5 kDa bis größer 50 kDa. Sie
sind reich an Glutaminsäure und Prolin. Hordeinfraktionen mit einem Molekulargewicht von 17 bzw.
23 kDa sind im Schaum angereichert (Vaag et al., 1999; Sørensen et al., 1993). Der schaumpositive
Einfluß des 17 kDa Hordeins (ε-1-Hordein) kann in Kombination mit LTP1 verstärkt werden (Vaag et
al., 1999). Für die Ausbildung von Biertrübungen sind ε-Hordeine und δ-Hordeine von Bedeutung
(Sheehan et al.,1999).
Protein Z oder das „40 kDa“ Protein (Mw-40 kDa) ist mit 10-35 mg/l eine der Hauptproteinkompo-
nenten in Bier (Yokoi et al., 1989; Lusk et a1., 1995). Die Aminosäuresequenz des Protein Z besteht
zu 16 % aus Leucinresten sowie anderen hydrophoben Aminosäureresten und zwei Cysteinen.
Protein Z wird aufgrund von Homologien in der Aminosäuresequenz den Serinproteaseinhibitoren zu-
geordnet. Diese inhibitorischen Eigenschaften können die Ursache dafür sein, daß Protein Z während
des Mälzens und Maischens nicht durch proteolytische Enzyme abgebaut wird (Jones und Marinac,
1995; Shimizu et al., 1995). Ursprünglich wurde Protein Z aufgrund seiner physiko-chemischen
Eigenschaften als die bedeutendste Schaumkomponente in Bier charakterisiert (Yokoi et al., 1989).
Neuere Erkenntnisse zeigen allerdings, daß Protein Z nur in Wechselwirkung mit anderen Proteinen
und/oder schaumpositiven Faktoren die Schaumstabilität erhöht (Douma et al., 1997; Sørensen et al.,
1993; Evans et al., 1999b). Ferner wurden für Protein Z Trübungseigenschaften beschrieben
(Bamforth, 1985).
1 Einleitung
11
LTP1 (bLTP1) ist ein hydrophobes Protein und mit 50-90 mg/l (Bech et al., 1994; Vaag et al., 1999)
eine weitere Hauptproteinkomponente in Bier. LTP1 ist im Bierschaum angereichert (Bech et al.,
1995). Bestehend aus 91 Aminosäureresten (Svensson et al., 1986) besitzt LTP1 ein Molekular-
gewicht von 9694 Da. Seine sekundäre Struktur wird durch vier α-Helices geprägt, ein C-terminales
Polypeptid (Asn74-Ile91) ist nicht an der Ausbildung der Sekundärstruktur beteiligt (Heinemann et al.,
1996). LTP1 gehört zur homologen Gruppe der pflanzlichen Lipidtransferproteine (Kader, 1997). Für
diese sind acht hochkonservierte Cysteine charakteristisch (Abb. 1.1), die vier Disulfidbrücken
ausbilden können: Cys3-Cys50, Cys12-Cys27, Cys28-Cys73, Cys48-Cys87 (Desormeaux et al.,
1992). Ebenso wie Protein Z weist bLTP1 Homologien zu Proteaseinhibitoren auf und inhibiert
Aktivitäten von Cystein- und Serinendoproteasen in Gerstenmalz (Jones und Marinac, 1995).
1 11 21 31 41
Gerste bLTP1 LNCGQVDSKM KPCLTYVQGG PGPSGECCNG VRDLHNQAQS SGDRQTVCNC
Weizen LTP1 IDCGHVDSLV RPCLSYVQGG PGPSGQCCDG VKNLHNQARS QSDRQSACNC
Mais LTP1 ISCGQVASAI APCISYARGG SGPSAGCCSG VRSLNNAART TADRRAACNC
51 61 71 81 91
Gerste bLTP1 LKGIARGIHN LNLNNAASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI Y
Weizen LTP1 LKGIARGIHN LNEDNARSIP PKCGVNLPYT ISLNIDCSRV
Mais LTP1 LKNAAAGVSG LNAGNAASIP SKCGVSIPYT ISTSTDCRVN
Abb. 1.1: Vergleich von Aminosäuresequenzen verschiedener LTP1 aus Pflanzen. Eingezeichnet
sind homologe Sequenzbereiche mit mehr als drei übereinstimmenden Aminosäureresten
(hellgrau) sowie acht konservierten Cysteinresten (dunkelgrau).
1.1.2 Chemische und thermische Modifizierungen von Proteinen während des Mälz- und
Brauprozesses
Durch die Proteolyse höhermolekularer Gerstenproteine während der Keimung und des Mälzens durch
Proteinasen und Peptidasen kommt es zur Bildung niedermolekularer Proteine, Peptide und freier
Aminosäuren, die im Verlauf des Mälz- und Brauprozesses thermisch und chemisch modifiziert
werden können. Maillardreaktionen zwischen Aminoverbindungen und reduzierenden Zuckern führen
u. a. durch Glykosylierungen zu vielfältigen Reaktionsprodukten wie Melanoidinen und niedermole-
kularen, flüchtigen Verbindungen (Maillard, 1912; Tressl et al., 1981). Die Voraussetzung für diese
nichtenzymatischen „Bräunungsreaktionen“ bilden hohe Temperaturen, Hydratation und chemische
Wechselbeziehungen der Inhaltsstoffe während des Mälzens und Würzekochens. Potentielle Glykosy-
lierungsstellen in Proteinen sind (Hodge, 1955; Tagami et al., 2000):
• ε-NH2-Gruppe des Lysins
• α-NH2-Gruppe der N-terminalen Aminosäure
1 Einleitung
12
• Guanidinogruppe des Arginins
Glykosylierungen sind sehr spezifisch und stark sauerstoffabhängig. Hexosen und Fruktosen reagieren
bspw. nicht mit allen ε-NH2-Gruppen eines Proteins, sondern nur mit sehr reaktiven Gruppen. Für
bestimmte ε-NH2-Gruppen ist eine Diglykosylierung beobachtet worden (Blakytny et al., 1997;
Prabhakaram et al., 1996). Sauerstoff begünstigt die Bildung von Dicarbonylgruppen (reaktiven
Glukosonen), die wiederum eine höhere Affinität zu Guanidinogruppen zeigen.
Während des Würzekochens findet eine vollständige oder teilweise Denaturierung der Proteine statt,
d. h. ihre Sekundär- und Tertiärstruktur wird durch die Aufhebung von Wasserstoffbrückenbindungen
und hydrophober Wechselwirkungen sowie durch die Reduktion von Disulfidbrücken zerstört. Durch
diese Konformationsänderungen werden Oxidations- und Glykosylierungsreaktionen begünstigt, da
vermehrt Aminosäureste für diese Reaktionen zugänglich werden (Kato et al., 1992).
Für Protein Z wird nur für ein Drittel des Proteins eine Glykosylierung während des Würzekochens
beschrieben (Hejgaard und Kergskaard, 1983). Die Primär- und Sekundärstruktur von bLTP1 kann
hingegen während des Mälz- und Brauprozesses durch Denaturierung, Proteolyse und Maillard-
Glykosylierung signifikant modifiziert werden (Jegou et al., 2000 und 2001). Infolge dieser Denaturie-
rung sinkt die Resistenz von LTP1 gegenüber proteolytischem Abbau. Durch die Aktivität von Endo-
proteinasen während des Mälzens können LTP1-Formen ohne den C-terminalen Aminosäurenrest Tyr
oder ohne die C-terminalen Peptide Ile-Tyr bzw. Ser-Arg-Ile-Tyr entstehen.
Generell bleibt jedoch die primäre LTP1-Sequenz erhalten, während die Sekundär- und Tertiärstruktur
verändert wird. Nach dem Aufbrechen von Disulfidbrücken kann es zu deren Neuordnung kommen,
was wiederum zur Bildung von LTP1-Dimeren und -Oligomeren führen kann (Jegou et al., 2000).
Glykosylierungen können an den vier Lysinresten (Lys9, Lys11, Lys52, Lys72) stattfinden (Jegou et
al., 2000). Beobachtet wurde auch die Oxidation des Aminosäurerestes Met10 (Lusk et al., 1995). Bei
hohen Temperaturen finden Reaktionen von LTP1 mit Hordeinfragmenten, Hopfenverbindungen
und/oder Lipiden statt (Simpson und Hughes, 1995; Hughes und Wilde, 1997). Als Folge dieser
komplizierten Prozesse liegt in Bier eine Mischung unterschiedlich denaturierter und glykosylierter
LTP1-Formen vor. Diesen modifizierten LTP1-Formen wird, im Gegensatz zum nativen Gersten-
protein, eine schaumverstärkende Rolle zugeschrieben (Lusk et al., 1995).
1.2 Enzyme in Bier
1.2.1 Klassifizierung proteolytischer Enzyme
Proteolytische Enzyme (Proteinasen und Peptidasen) sind Hydrolasen, die sowohl spezifisch als auch
unspezifisch wirken. Trypsin bspw. hydrolisiert Peptidbindungen C-terminal der Aminosäurereste Lys
und Arg. Proteolytische Enzyme werden aufgrund bestimmter Kennzeichen der Katalyse in vier
Hauptfamilien unterteilt (Stryer, 1991). Für jede Familie existieren spezifische Inhibitoren (Tab. 1.1).
1 Einleitung
13
Tab. 1.1: Proteinasefamilien und ihre spezifischen Inhibitoren (je ein Beispiel).
Familie Inhibitoren
Serinproteinasen PMSF
Metalloproteinasen EDTA
Thiolproteinasen PCMB
Carboxylproteinasen Pepstatin A
Im katalytischen Zentrum aller Serinproteinasen findet sich eine katalytische Triade aus Ser, His und
Asn. Für die enzymatische Aktivität der Metalloproteinasen ist ein fest in die Peptidstrukur eingebun-
denes Zink- oder Kobaltatom essentiell. Charakteristisch für Thiolproteinasen ist das Vorhandensein
von Cys im aktiven Zentrum. Die Carboxylproteinasen werden oft auch als saure Proteinasen
bezeichnet, da sie meist nur im sauren Milieu aktiv sind.
Für die Schaumstabilität von Bier spielen in erster Linie die aus S. cerevisiae stammenden Proteinasen
eine Rolle. Die aus der Gerste stammenden Proteinasen werden während des Mälz- und Brauprozesses
inaktiviert (Schuster et al., 1992).
1.2.2 Proteinasen aus
S. cerevisiae
Für S. cerevisiae sind über 40 Proteinasen und Peptidasen beschrieben. Einige von ihnen sind gut cha-
rakterisiert, von anderen ist die Funktion noch unbekannt. Für den Hefestoffwechsel essentielle Protei-
nasen und Peptidasen sind in Mitochondrien, dem periplasmatischen Raum und sonstigen Komparti-
menten lokalisiert. Die nicht am Stoffwechsel beteiligten Proteinasen sind in der Vakuole lokalisiert
(Rendueles und Wolf, 1988). In Tabelle 1.2 ist eine Übersicht gut charakterisierter vakuolärer
Proteinasen, ihrer Familienzugehörigkeit sowie des kodierenden Gens gegeben (Jones, 1991).
Tab. 1.2: Vakuoläre Proteinasen der Hefe S. cerevisiae.
Enzyme Familie Gen
Endoproteinasen
Proteinase A (PrA) Carboxylproteinasen PEP4
Proteinase B (PrB) Serinproteinasen PRB1
Carboxypeptidasen
Carboxypeptidase Y (CPY) Serinproteinasen PRC1
Carboxypeptidase S (CPS) Metallo-(Zn)-Proteinasen CPS1
Aminopeptidasen
Aminopeptidase I (ApI) Metallo-(Zn)-Proteinasen LAP4
Aminopeptidase Co (ApCo) Metallo-(Co)-Proteinasen
1 Einleitung
14
Dipeptidyl Aminopeptidase B (DPAP-B) Serinproteinasen DAP2
Im Detail betrachtet werden im Folgenden je ein Vertreter der vakuolären Carboxypeptidasen und
Endoproteinasen.
Carboxypeptidase Y (CPY) ist ein 61 kDa großes Glykoprotein. Das Pre-Protein wird im Endo-
plasmatischen Reticulum (ER) zunächst unter Beteiligung einer Signalpeptidase sowie im späten
Golgiapparat und in den Vakuolen durch PrB und PrA prozessiert (van den Hazel et al., 1996). CPY
wird den Serinproteinasen (E.C. 3.4.16.1) zugeordnet und ist eine Exoproteinase, die fast alle
Aminosäurereste C-terminal bei leicht alkalischem bis neutralem pH-Wert hydrolysiert (Achstetter
und Wolf, 1985).
Proteinase A (PrA) ist ein 42 kDa großes Glykoprotein (Meussdoerffer et al., 1980). Die Prozessie-
rung des Pre-Pro-Proteins erfolgt zuerst im ER durch eine Signalpeptidase, im späten Golgiapparat
und in den Vakuolen dann autokatalytisch durch PrA bzw. durch PrB (Wolff et al., 1996; Jones,
1991). PrA (E.C. 3.4.23.6) zeigt Homologien zu Carboxylproteinasen aus Säugern: z. B. Pepsin
(40,4 %), Cathepsin D (44,1 %), Cathepsin E (45 %) (alle drei aus Schwein) (Faust und Kornfeld,
1989; Ammerer et al., 1986; Woolford et al.1986).
In Abhängigkeit von Wachstumsphasen und Nährstoffbedingungen besitzt Proteinase A u. a. folgende
Funktionen (van den Hazel et al., 1996; Rendueles und Wolf, 1988; Klionsky et al., 1990):
• Aktivierung von Enzymen: z. B. vakuolärer Proteinasen (PrB, CPY und CPS)
alkalischer Phosphatasen, Trehalasen, RNasen und anderer Hydrolasen;
• Stoffwechselregulation durch Inaktivierung und Abbau von Proteinen;
• Entfernung denaturierter, dysfunktioneller Proteine aus der Zelle durch
Proteinabbau;
• Adaptation der Zellen an veränderte Wachstumsbedingungen (Nahrungsangebot,
Streßsituation durch veränderten Proteinumsatz).
Proteinase A weist eine hohe Substratspezifität auf, ihr pH-Optimum liegt zwischen 3 und 6. Versuche
in vitro zeigten, daß dieses Enzym, ähnlich wie Cathepsin D und Pepsin, zwischen hydrophoben
Aminosäureresten spaltet. Bevorzugt wird die Peptidbindung C-terminal des Aminosäurerestes Phe
hydrolysiert (Dreyer et al., 1989). Für die autokatalytische Prozessierung von PrA wurde in der
preproPrA–Sequenz Phe~Ser als Spaltsequenz identifiziert (Wolff et al., 1996). Andere mögliche
Spaltsequenzen für PrA, in starker Abhängigkeit der benachbarten Aminosäurereste, sind:
• Leu~Val (Yokosawa
et al., 1983)
• Phe~Glu ; Leu~Glu (Muldbjerg et al., 1993)
• Phe~Phe (Kondo
et al., 1995 und 1998)
Für die Bestimmung von Proteinase A werden verschiedene Proteine, wie Myoglobin, Insulin A und B
sowie unterschiedliche synthetische Substrate (Caseinderivate) genutzt. Die Sensitivität dieser meist
photometrischen Nachweismethoden ist sehr gering (Perpete et al., 1996). Zur Erhöhung der
1 Einleitung
15
Sensitivität wurden fluoreszenzmarkierte Substrate entwickelt (Yokosawa et al., 1983; Muldbjerg et
al., 1993; Kondo et al., 1995). In der Brauindustrie wird ein photometrischer Nachweis auf der Basis
von Azocasein eingesetzt (Reicheneder und Narziß, 1985). Fluoreszenzmarkierte Substrate finden dort
aufgrund der hohen Eigenfluoreszenz von Bier keine Anwendung.
Extrazelluläre Proteinaseaktivität ist bisher für S. cerevisiae oder nah verwandte Saccharomyces–
Stämme nicht eindeutig festgestellt (Ogrydziak, 1993). Nur für haploide Zellen wurde die Expression
einer extrazellulären Protease BAR1 beschrieben (MacKay et al., 1991). Diese Carboxylproteinase
weist Aktivitätshomologien zu Pepsin und eine hohe Substratspezifität (Spaltung des α-Faktors) auf.
Es gibt allerdings Hinweise, daß auch PrA und CPY sekretiert werden können. Mögliche Ursachen
könnten (i) eine Überexpression und eine damit verbundene Überlastung des Proteintransportsystems,
(ii) ein limitiertes Nährstoffangebot oder (iii) Mutationen im Proteinregulations- und Translokations-
system sein. So wurde für Zellen mit Mutationen im vakuolären Transportweg eine geringe Sekretion
für CPY beobachtet (Valls et al., 1987; Rothmann et al., 1986a). Desweiteren wurde bei
Überexpression des für PrA codierenden PEP4-Gens eine Sättigung des vakuolären Sortier- und
Transportsystems der Hefe beschrieben, infolgedessen ein Teil des Enzyms ins Medium gelangt
(Wolff et al., 1996; Rothmann et al., 1986b).
Unter normalen Bedingungen sekretiert S. cerevisiae keine proteolytischen Enzyme, so daß daher die
extrazelluläre Proteinaseaktivität keine Rolle für die Schaumstabilitätsabnahme spielt.
1.2.3 Einfluß von Proteinase A auf den Bierschaum
Verschiedene Untersuchungen belegen eine negative Korrelation zwischen der Proteinase A-Aktivität
im Bier und der Schaumstabilität: Mit steigender Konzentration von Proteinase A nimmt die Schaum-
stabilität ab (Muldbjerg et al., 1993). Als Hauptursache verstärkter Proteinaseaktivität gilt eine hohe
Anzahl toter Zellen (Kondo et al., 1995), wie sie bei der Bierreifung, bei warmer bzw. zu langer
Lagerung sowie bei zu häufiger Hefeführung auftritt (Muldbjerg et al., 1993; Ormrod et al., 1991;
Reicheneder und Narziß, 1989). Infolge von Streß (Stickstoffmangel, hoher Alkoholgehalt, hohe CO2-
Konzentration) nimmt die Autolyserate der Hefe zu und die Proteinase A-Konzentration erhöht sich.
Proteinase A-Aktivität ist stammspezifisch, sie ist bei obergärigen Hefen höher als bei untergärigen
Hefen (Muldbjerg et al., 1993; Ormrod et al., 1991; Kondo et al., 1995).
Einige Autoren vermuten, daß die beobachtete relativ hohe Konzentration an PrA in manchen Bieren
nicht ausschließlich aus der autolytischen Freisetzung resultiert, sondern bei einigen Braustämmen
auch durch Sekretion in das Bier gelangen könnte (Nelson und Young, 1986; Wolf, 1984; Kondo et
al., 1998).
Die während der Gärung und/oder Reifung und Lagerung freigesetzte Proteinase A führt in nicht
pasteurisierten Bieren zu einem Abbau hydrophober Bierproteine und somit zu einer Abnahme der
1 Einleitung
16
Schaumstabilität (Shimizu et al., 1995; Yokoi et al., 1994). Für Carboxypetidase Y wurde der Einfluß
auf die Schaumstabilität bisher nicht untersucht.
1.3 Zielsetzungen
Die Faktoren, die zu Schaumproblemen im Bier führen, sind sehr komplex und nicht eindeutig geklärt.
Eine Ursache für die Abnahme der Schaumstabilität während der Lagerung ist die durch
proteolytische Enzyme in Bier hervorgerufene Hydrolyse hydrophober, schaumpositiver Proteine.
Eine bedeutende Rolle in diesen Prozessen kommt der aus der Hefe stammenden Proteinase A zu (s.
1.2.3). So sollte im ersten Abschnitt dieser Arbeit (i) der Einfluß verschiedener Proteinasen auf die
Schaumstabilität im Allgemeinen und (ii) der Einfluß von Proteinase A im Besonderen mit folgenden
Fragestellungen untersucht werden:
• Wird die Abnahme der Schaumstabilität unspezifisch durch verschiedene Proteinasen oder
spezifisch durch Proteinasen einer Familie verursacht?
• Wird durch Proteinase A eine bestimmte Proteingruppe im Bier hydrolysiert?
Resultierend aus dem Befund, daß das schaumpositive Lipidtransferprotein (LTP1) als potentielles
Substrat für Proteinase A fungiert, sollten im zweiten Abschnitt der Arbeit die biochemischen
Wechselwirkungen von Proteinase A und LTP1 geklärt werden. Dazu sollte u. a. der Einfluß der
Struktur auf die Proteinasesensitivität anhand von nativen und modifizierten LTP1-Formen untersucht
werden. Folgende Arbeitsschritte waren dafür notwendig:
• Expression und Reinigung rekombinanter LTP1 (rLTP1)
• Reinigung nativen LTP1 aus Gerste und potentiell modifizierter LTP1 aus Bier
• Vergleich der PrA-Sensitivität verschiedener LTP1-Formen
Weiterhin sollten als Grundlage für die Entwicklung eines sensitiven Nachweises von PrA-Konzentra-
tionen in Bier potentielle PrA-Spaltsequenzen im LTP1-Molekül anhand von LTP1-Spaltprodukten
identifiziert werden. Die Reinigung von LTP1-Spaltprodukten sollte mit Hilfe von Reversed Phase-
HPLC, die Identifizierung der potentiellen Spaltsequenzen mittels Massenspektrometrie erfolgen.
2 Material und Methoden
17
2 MATERIAL UND METHODEN
2.1 Geräte und Chemikalien
2.1.1 Verwendete Geräte
Geräte
Elektrotransferapparatur : Hölzel (Wörth, Deutschland)
Elektrophoreskammern: Mini Sub DNA- Cell und Mini Protean® II (Biorad, München,
Deutschland)
Elektroporationsgerät: Biorad Gene Pulser TM (Biorad, München, Deutschland )
Geldokumentation: mit Video Cellcam von Phase GmbH (Hamburg, Deutschland)
HPLC-System: Dionex (Idstein, Deutschland); P580 Pumpen, variabler
Wellenlängendetektor (Model UVD 340S), Autosampler
(Model ASI-100), Fraktionssammler (Foxy™ Jr.)
Magnetrührer: Ikamag REO
Rotationsverdampfer: Laborata 4000 (Heidolph, Schwalbach)
Schüttler: Certomat U (Braun Biotech, Melsungen)
Spektrophotometer: Uvikon XS (Bio-Tek Instruments, Neufahrn)
Thermo-Cycler: GeneAmp 9699 (Perkin Elmer, Norwalk, USA)
Ultraschallgerät: Sonifier 250 (Branson, Danbury, USA)
Zentrifugen: Sorvall RC-5B (Sorvall DuPont, Bad Homburg), Micro Rapid/K und
Mikro22R (Hettich, Tuttlingen)
2.1.2 Verwendete Chemikalien
Nicht aufgelistete Substanzen stammten in der Regel von den Firmen Fluka (Taufkirchen), Merck
(Darmstadt), Serva (Heidelberg), Sigma (Taufkirchen), und Roth (Karlsruhe ) und lagen im Reinheits-
grad p.a. vor. Weitere Firmen: Amersham-Pharmacia (Freiburg), Amicon (Millipore, USA), Appli
Chem (Darmstadt), Becton Dickenson (Heidelberg), Biomol (Hamburg), Biorad (München), BMA
(Walkersville, USA), Boehringer (Mannheim), Chemicon (Temecula, USA), ICN Biomedical (Esch-
wege), Invitrogen (Karlsruhe), Macherey-Nagel (Düren), MBI-Fermentas (Litauen), NEB (Schwal-
bach), Novagen (Schwalbach), Oxoid (Frankfurt am Main), Pierce (Rockford, USA), Qiagen (Hilden),
Riedel de Haen (Taufkichen ), Roch Diagnostics (Mannheim), Stratagene (La Jolla, USA)
Antikörper:
Anti-Carboxypetidase Y (Chemicon, AV 1817)
Anti-Chitin Binding Domain Serum (NEB, S66545)
Penta-His-Antikörper (Qiagen, 34660)
Anti-Maus-IgG-POD-Konjugat (Sigma, A5906)
Anti-Rabbit-IgG-POD-Konjugat (Sigma, A6154)
Enzyme: DNA-modifizierende Enzyme:
BamH I (Amersham-Pharmacia, Nr. E 1010V)
EcoR I (Amersham-Pharmacia, Nr. E 1040Y)
Nde I (NEB, Nr. R 0111S)
Hind III (Amersham-Pharmacia, Nr. E 1059Z)
Sap I (NEB, Nr. R 0569S)
T4 DNA-Ligase (Roche Diagnostics, Nr. 481220)
Taq-Polymerase (Roche Diagnostics, Nr. 1418432)
2 Material und Methoden
18
Proteinasen und Petidasen:
Enterokinase (Boehringer, Nr. 1334115)
Enterokinase, rekombinate (Novagen, Nr. 69066-3)
Carboxypeptidase Y (Sigma, Nr. C- 3888)
Proteinase A (Sigma, P-8892)
Trypsin (Pierce, 20233)
Papain (Sigma, P-4762)
Pepsin (Sigma, P-6887)
Metalloproteinase Typ X (Sigma, P-1512)
Biochemikalien/Chemikalien:
Agar (Becton Dickenson, 1869-08)
Agarose Le Seakem (BMA, Nr.18003411574)
Ammoniumsulfat (Merck, Nr. 101217)
Ammoniumnitrat (Fluka, 09891)
Ampicillin (Roche Diagnostics, Nr. 835269)
Azocasein (Fluka, Nr. 11610)
Bacto Trypton (Oxoid, Nr. L42)
Bromphenol Blau (Merck, Nr. 108122)
Chloramphenicol (Serva, Nr. 16785)
Coomassie blue G250 (Serva, Nr. 17525)
Coumarsäure (Sigma, Nr. C-9008)
3,3- Diaminobenzidin (Sigma, D- 8001)
DTT (Merck, Nr. 111474)
EDTA (Sigma, Nr. E- 5134)
Ethidiumbromid (Merck, Nr. 111615)
Folin-Ciocalteus Reagenz (Sigma, Nr. F- 9252)
Glucose (Serva, Nr. 22720)
Glycin (Merck, Nr.104169)
Hefeextrakt (Serva, Nr. 24540)
Imidazol (Serva, Nr. 26081)
IPTG (Appli Chem, Nr. A1008.0005)
Kaliumchlorid (Merck, Nr. 104936)
Kaliumnatriumtartrat (Merck, Nr. 108087)
Kupfersulfat (Merck, Nr. 102791)
Luminol (Sigma, Nr. A-8511)
Lysozym (Biomol, Nr.5934)
Magnesiumchlorid (Merck, Nr. 105833)
Magnesiumsulfat (Merck, Nr. 105882)
MES (Sigma, Nr. M- 8250)
Milchpulver (Merck, Nr. 15363)
Natriumacetat (Fluka, Nr. 71193)
Natriumazid (Merck, Nr. 106688)
Natriumcarbonat, wasserfrei (Fluka, 71351)
Natriumchlorid (Riedel de Haen, Nr. 31434)
Natriumdesoxycholat (Sigma, Nr. D-6750)
Natriumdihydrogenphosphat (Merck, Nr. 106346)
Natriumdithiosulfat (Merck, Nr. 106512)
Natriumhydroxid (Merck, Nr. 106469)
Ponceau-Rot Crist. 6R (Sigma, Nr. 0644)
PMSF (Merck, Nr. 7349.0005)
Rinderserumalbumin Fraktion V
(Boehringer, Nr. 735086)
Saccharose (Serva, Nr. 35580)
SDS (ICN, Nr. 811030)
Silbernitrat (Merck, Nr. 101510)
Trichloressigsäure (Merck, Nr. 100810)
Tris (Invitrogen, Nr. 15504-020)
Tungstosilicic Säure (Sigma, Nr. T- 2786)
Flüssigkeiten:
Aceton (Roth, Nr. 5025.2)
Bradford Reagenz (Biorad, 500- 0006)
DMSO (Sigma-Aldrich, Nr.15,493-8)
Essigsäure, Eisessig (Merck, 8.18755)
Ethanol, vergällt (Roth, Nr. T- 171.2)
Formaldehyd (Merck, Nr. 4001)
Glycerin (Glycerol) (Roth, Nr. 3783.2)
Isopropanol (Roth, Nr.6752.4)
Methanol (Roth, Nr.6009)
Methanol HPLC Gradient-Grad (Roth, Nr.7342.1)
Polyacrylamid, Rotiphorese Gel 30(Roth, 3029.1)
PCR- H2O (Serva, Nr. 38381)
Salzsäure (Merck, Nr. 100314)
TFA (Fluka, Nr. 91707)
Tween 20 (Merck, Nr. 822184)
Wasserstoffperoxid (Merck, Nr. 107210)
Membranen/ Matrices:
Chitinmatrix (Chitin beads) (NEB, S- 6651L)
CNBr-aktivierte Sepharose 4B
(Amersham Pharmacia, 17-0430-01)
Ni-NTA-Matrix (Qiagen, Nr. 30210 )
Nukleinsäuren:
GeneRulerTM DNA Ladder Mix
(MBI-Fermentas, Nr.SM0331)
λ-DNA (NEB, Nr. N301-1S)
Low DNA mass leader (100 bp-leader)
(NEB, N3231L)
Nukleotide dNTP’s
(Amersham-Pharmacia, Nr. 27203501)
Proteinstandards:
Prestained Marker Broad range (Biorad, 161- 0318)
SDS-Page Broad range (Biorad, 161- 0317)
SDS-Page Low range (Biorad, 161- 0304)
Reinigungs- und Nachweis-Kits:
Intein™-CN-System (NEB, E6900S)
PCR-Purification Kit (Qiagen, Nr. 28106)
Plasmid Midi und Maxi Kit (Qiagen, 12143, 12162)
QuantiCleave™ Protease Assay Kit II
(Pierce, 23263)
Verbrauchsmaterialien
Dialysemembran: SnakeSkinR Dialysis Tubing, Ausschlußgröße 3,5 kDa (Pierce)
Ultrafiltration: YM-3 und YM-10 Membranen, Ausschlußgröße 3 kDa und 10 kDa (Amicon)
Chromatographie-Leersäulen: Biorad
Röntgenfilme: Kodak X-Omatik (Kodak, Berlin)
Membran: Hybond-C- Nitrozcellulosemembran, Poren ∅ 0,45 µm, (Amersham-Pharmacia)
Sterilfilter: (Millex TM-GM, sterile, Millipore, USA)
2 Material und Methoden
19
2.2 Häufig verwendete Medien und Puffer
Medien und Puffer wurden mit entionisiertem Wasser (H2Oent) bzw. mit bidestilliertem Wasser
(H2Obidest) hergestellt und falls nicht anders angegeben bei 121 °C für 20 min autoklaviert.
LB-Medium (pH 7,2):
Bacto Trypton (Oxoid) 1 % Hefeextrakt (Serva) 0,5 %
NaCl (Riedel de Haen) 0,5 % (Agar) (Becton Dickenson) 2 %
2.3 Stammhaltung und Zellanzucht
Die verwendeten E. coli-Stämme (Tab. 2.2) wurden alle 3-4 Wochen auf LB-Agarplatten ausgestri-
chen und nach 24 h Kultivierung bei 37 °C im Kühlraum/Kühlschrank (4 °C) aufbewahrt. E. coli-
Stämme mit Resistenzplasmiden wurden auf LB-Agarplatten unter Zusatz entsprechender Antibiotika
(Tab. 2.1) kultiviert und bei 4 °C aufbewahrt. Als Dauerkulturen wurden die Bakterienstämme im
jeweiligen Anzuchtmedium mit 20 % Glycerin in Kryoröhrchen (Greiner, Frickenhausen) bei –70 °C
gelagert.
Kultivierung von E. coli: Im Allgemeinen wurden E. coli-Stämme als Schüttelkultur in 2 ml oder
100-250 ml LB-Medium bei 37 °C auf einem Rotationsschüttler (250 rpm) bei 37 °C kultiviert.
Antibiotika wurden zur Selektion plasmidtragender Transformanden sterilfiltriert und in der in Tabelle
2.1 dargestellten Konzentration dem Medium zugesetzt.
Tab. 2.1: Stammlösungen und Arbeitskonzentrationen verwendeter Antibiotika.
Antibiotikum Stammlösung [mg/ml] Arbeitskonzentration
[µg/ml]
Ampicillin 100 100
Chloramphenicol 34 20
2.4 E. coli-Stämme
In der vorliegenden Arbeit wurden die in Tabelle 2.2 aufgeführten Bakterienstämme verwendet.
Tab. 2.2: Verwendete Bakterienstämme.
Stamm G e n o t y p Firma
E. coli BL21(DE3) F- λ(DE3) ompT hsdS(rb-mb-) dcm gal Stratagene
E. coli BL21(DE3)pLysS F- λ(DE3) ompT hsdS(rb-mb-) dcm gal pLysS Cmr Novagen
E. coli BL21(DE3)pLysE F- λ(DE3) ompT hsdS(rb-mb-) dcm gal pLysE Cmr Novagen
E. coli BL21XL1-Blue recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA1
lac[F-proAB lacIqZ ∆15::Tn10(tetr)]
Stratagene
E. coli BL21(DE3)-CodonPlus F- λ(DE3) ompT hsdS(rb-mb-) dcm gal endA Tetr Stratagene
E. coli ER2566 F-λ-fhuA2 [Ion] ompT lacZ::T/ gene1 gal sulA11
∆(mcrC-mrr)114::IS10 R(mcr-73::miniTn10-
TetS)2 R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1[dcm]
NEB
2 Material und Methoden
20
Die BL21 Serie von E. coli sind proteasedefiziente (Lon und OmpT Protease) Stämme und, basierend
auf dem T7 RNA Polymerase Expressionssystem, geeignet für eine Überexpression von Proteinen. Sie
können mit Proteinexpressionsvektoren genutzt werden, die unter der Kontrolle des T7-Promotors
stehen.
BL21(DE3)pLysS und pLysE-Stämme enthalten ein Plasmid, das das T7-Lysozym-Gen trägt. T7-
Lysozym verringert die Hintergrundexpression des Zielproteins, ohne jedoch die durch IPTG
induzierte Expression zu beeinflussen. Der BL21(DE3)-CodonPlus-Stamm enthält extra Kopien
seltener E. coli-tRNA-Gene. Dadurch kann die Expression von Genen mit in E. coli selten genutzten
Codons verstärkt werden.
Der ER2566-Stamm ist für die Expression mit pTYB Vektoren (NEB) geeignet, die ebenfalls unter
der Kontrolle des T7-Promotors stehen.
2.5 Klonierung, Plasmide und Primer
Ein auf der Basis des pRSET B-Vektors (Invitrogen, Karlsruhe) konstruiertes pSAm-Plasmid
(Abb. 2.1) (von Fr. A. Niederhaus freundlicherweise zur Verfügung gestellt) wurde für die Expression
eines (His)6-LTP1-Fusionsproteins verwendet. Das pSAm-Plasmid wurde in verschiedene E. coli-
Stämme der BL21-Serie (s. 2.2) transformiert.
Desweiteren wurde die LTP1-Sequenz (Skriver, 1992) ohne Signalsequenz in den pTYB1-Vektor
(IMPACT™ -CN System, NEB) kloniert (Klonierungsstrategie s. Anhang Abb. 7.1). Dazu wurden in
einem ersten Schritt am 5´und 3´ Ende der LTP1-DNA-Sequenz die Restriktionsorte NdeI und SapI
unter Verwendung der Primer tyb1-nde-f und tyb1-sap-r eingeführt. Die DNA wurde mittels PCR
amplifiziert und nach Restriktion mit NdeI und SapI in den pTYB1-Vektor (NdeI/ SapI) kloniert. Die
Richtigkeit des Konstrukts wurde durch Sequenzierung überprüft. Das Plasmid pTYB1-LTP1 (Abb.
1B) wurde zur Expression eines rekombinanten Intein-LTP1-Fusionsproteins in den E. coli-Stamm
ER2566 transformiert.
Tab. 2.3: Primersequenzen.
Name Sequenz
tyb1-nde-f gat ata cat atg ctc aac tgc ggc cag gtt g
tyb1-sap-r act tac gct ctt ccg caa taa atc ctg gag cag tcg atg
2 Material und Methoden
21
Abb. 2.1 Plasmidkarten der Expressionsvektoren pSAm (A) und pTYB1-LTP1 (B). Dargestellt
sind jeweils die für die Klonierung verwendeten Restriktionsorte. Ein Markergen codiert die
Ampicillinresistenz (Amp), welche die Selektion in E. coli ermöglicht. Die heterologe
Expression wird über den T7-Promotor und lacI-Repressor (lacI) kontrolliert. LTP1 – Gen
des Lipidtransferprotein 1; CBD – Gen die Chitin-Bindungs-Domäne; Sce VMA1 Intein –
Gen des Intein aus S. cerevisiae; EK(His)6 – codierender Bereich für Histag
(Enterokinasespaltsequenz und 6 Histidinreste).
2.6 DNA-Arbeitsmethoden
Für gentechnische Arbeiten wurden die in Tabelle 2.4 aufgeführten Restriktionsendonukleasen
verwendet:
Tab. 2.4: Verwendete Restriktionsendonukleasen und Puffer.
Enzym Puffer Hersteller
NdeI NEB4 NEB
BamHI K Amersham-Pharmacia
EcoRI H Amersham-Pharmacia
SapI NEB4 NEB
2 Material und Methoden
22
Für die Ligation, PCR und Plasmidpräparation wurden folgende Enzyme der aufgeführten Firmen
eingesetzt:
• T4-DNA-Ligase und Ligationspuffer (Roche Diagnostics, Mannheim)
• Taq-Polymerase (Roche Diagnostics, Mannheim)
• Lysozym (Biomol, Hamburg)
2.6.1 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Die PCR-Ansätze wurden in einem Volumen von 20 oder 50 µl durchgeführt. Sie enthielten jeweils
• 20 nmol Primer
• 200 µM dNTP´s pro Nukleotid (Amersham-Pharmacia)
• 1x Taq-Polymerasepuffer
• 50-70 ng Plasmid-DNA
• 1,5-2,5 mM MgCl2
• 1U Taq-Polymerase
Die Zugabe der Taq-Polymerase zum Reaktionsansatz erfolgte zuletzt. Die Reaktion erfolgte im
Thermo-Cycler (GeneAmp 9699, Perkin Elmer, Norwalk, USA). Das gewählte Temperatur- und
Zeitregime ist in Tabelle 2.5 beschrieben.
Tab. 2.5: Temperatur- und Zeitregime der PCR-Reaktionsansätze.
Reaktionsphase Temperatur Zeit Zyklen
Initialschmelzen 95 °C 3 min 1 x
Schmelzen 95 °C 30 s
Annealing 58 °C 30 s 25 x
Synthese 72 °C 45 s
Endsynthese 72 °C 10 min 1 x
Die Annealingtemperatur TS für die Primer wurde wie folgt bestimmt:
TS = 69,3+0,41(G+C)-650N-1
G+C – prozentualer Anteil des Primers an Guanin und Cytosin
N – Primerlänge in Basen
Für die Reaktion wurde dann eine Annealingtemperatur von TS-5 °C gewählt. Die DNA-Fragmente
wurden durch Agarose-Gel-Elektrophorese von überschüssigen Primern und Template-DNA getrennt
und mit Hilfe eines Kits von Qiagen (s. 2.6.4.) isoliert.
2 Material und Methoden
23
2.6.2 Restriktion und Ligation
Die Restriktion erfolgte gemäß Sambrook et al. (1989). Es wurden 0,2-1 µg DNA in 2-50 µl Ansätzen
mit einer Endonukleasekonzentration von drei U/µg DNA versetzt. Die Restriktionsansätze enthielten
1/10 des entsprechenden Restriktionspuffers (10-fach) und wurden mindestens eine Stunde bei 37 °C
inkubiert. Für eine Restriktion mit zwei Enzymen wurde der Puffer so gewählt, daß er die höchste
Aktivität beider Enzyme gewährleistete.
Die Ligation erfolgte in einem Gesamtvolumen von 30 µl. Der Ansatz enthielt 1/10 Volumen T4-
Ligasepuffer (10-fach, Roche Diagnostics, Mannheim), sowie Insert- und Plasmid-DNA mit einem
Molverhältnis von 10:1. Nach einer Hitzebehandlung (1 min, 70 °C) wurde der Ansatz langsam auf
Raumtemperatur abgekühlt, 1 U Ligase (Roche Diagnostics) dazugegeben und 12-16 h bei 12 °C
inkubiert.
2.6.3 Agarose-Gel-Elektrophorese
Die Trennung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Fragmenten nach der Restriktion erfolgte
nach ihrem Molekulargewicht mittels horizontaler Flachgel-Elektrophorese. Als Gelmatrix wurde
Agarose (BMA; 1,0 %-1,7 %) in TAE-Puffer verwendet. Den Proben wurden vor dem Auftragen
0,25 Volumenteile Ladungspuffer zugesetzt. Die Auftrennung erfolgte bei einer Spannung von 100 V
im TAE-Puffersystem. Die Gele wurden anschließend für mindestens 10 min in 1x TAE mit 0,1 µg/ml
Ethidiumbromid inkubiert. Die ethidiumbromidgefärbten Banden sind unter UV-Licht sichtbar. Diese
Methode diente auch der Quantifizierung von DNA. Für die Größenbestimmung von DNA-Frag-
menten in der Agarose-Gel-Elektophorese wurden folgende Marker verwendet:
• GeneRuler™ DNA Ladder Mix (MBI-Fermentas, Litauen)
• HindIII gespaltene λ-DNA (Lambda-DNA, NEB)
zur Bestimmung der Konzentration:
• Molekulargewichtsmarker (low, 100 bp-leader, NEB)
Die DNA-Konzentration und Reinheit wurde auch photometrisch über die Extinktion bei 260 und
280 nm bestimmt (OD260=1 ≡ 50 µg/µl; OD260/ OD280=1,2 ≡ rein, Sambrock et al., 1989).
TAE-Puffer (pH 8,3): Ladungspuffer (pH 7,5):
Na-Acetat 20 mM Saccharose 60 %
Tris (pH 8,3) 40 mM Bromphenolblau 0,025 %
EDTA 2 mM EDTA 20 mM
2 Material und Methoden
24
2.6.4 Isolierung von DNA aus Agarosegelen und DNA-Sequenzierung
Zur Isolierung von DNA aus Agarose-Gelen wurde die gewünschte Bande unter UV-Licht aus dem
Gel geschnitten und mittels PCR-Purification-Kits (Qiagen, Hilden) gewonnen. Grundlegend für
diesen Kit ist, daß Agarose in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen geschmolzen und die freigesetzte
DNA an ein Trägermaterial (Glasmilch) gebunden wird. Nach mehreren Waschschritten wurde mit
PCR-H2O (Serva) oder TE-Puffer (pH 8,0) eluiert (Handbuch: PCR-Purification, Qiagen, 1998).
Die Sequenzierung erfolgte durch die Firma Invitek (Berlin, Deutschland) bzw. der AG
Dr. Meissner/TU Berlin.
TE-Puffer (pH 8,0) :
Tris/ HCl (pH 8,0) 10 mM
EDTA 1 mM
2.6.5 Transformation
Für die Transformation von E. coli-Zellen wurde die Elektrotransformationsmethode nach Dower et
al. (1988) angewendet. Dabei wurden 40 µl kompetente Bakterienzellen mit bis zu maximal 5 µl
reiner DNA-Suspension (10 ng) vermischt, 5 min auf Eis gekühlt und in kalten 0,2 cm Küvetten für
4 ms einem elektrischen Impuls von 2,25 kV (Biorad Gene PulserTM; 200 Ω, 25 µF) ausgesetzt. An-
schließend wurde die Zellsuspension schnell in 1 ml SOC-Puffer (Raumtemperatur) resuspendiert und
für eine Stunde bei 37 °C inkubiert, bevor Aliquots auf Selektivmediumplatten (LB+Ampicillin)
ausplattiert wurden.
SOA: SOB: SOC:
Bacto-Trypton 2 % SOA + SOB +
Hefeextrakt 0,5 % KCl 2,5 mM Glukose 20 mM
NaCl 10 mM MgCl2 10 mM
MgSO4 10 mM
Zur Präparation von kompetenten E. coli-Zellen mit hoher Transformationseffektivität wurden 5 ml
LB-Medium mit einer Einzelkolonie angeimpft. Nach 4 h wurden 200 ml einer zweiten Vorkultur mit
200 µl der ersten Vorkultur angeimpft und über Nacht ebenfalls bei 37 °C und 240 rpm inkubiert.
Für die Hauptkultur wurden 5 x 200 ml mit je 1,5 ml der zweiten Vorkultur beimpft und bis zu einer
OD600 von 0,48 bis 0,58 (entspricht ca. 106-107 Zellen/ml) kultiviert. Die Zellkultur kühlte dann 30 min
auf Eis, um anschließend 10 min bei 3000 x g zentrifugiert zu werden. Das Zellpellet wurde vorsichtig
zuerst mit 1 l, im zweiten Schritt mit 0,5 l eiskaltem (4 °C) sterilem H2Odest. resuspendiert, gewaschen
und erneut zentrifugiert. Dem schloß sich ein weiterer Waschschritt mit 20 ml sterilem, eiskaltem
G1ycerol (10 %) an. Nachdem die Zellkonzentration dann mit der Glycerollösung auf 2-3 x 1010
Zellen/ml eingestellt wurde, konnten 40 µl Portionen aliquotiert, in einer Eis/NaCl-Kältemischung
(Massenteile 3:1) eingefroren und bei –70 oC aufbewahrt werden.
2 Material und Methoden
25
2.6.6 Plasmid-DNA-Präperation aus E. coli
Die Isolierung der Plasmid-DNA aus E. coli erfolgte in drei Größenordnungen: Mini-, Midi- und
Maxipräparationen. Sie erfolgte nach dem Prinzip der alkalischen Lyse (Birmboim und Doly, 1979).
Minipräparation für analytische Zwecke: Dazu wurden 1,5 ml einer E. coli-Übernachtkultur (109-1010
Zellen/ml) 5 min bei 3000 x g zentrifugiert und das Pellet in 50 µl TE-Puffer resuspendiert. Die Lyse
erfolgte auf Eis nach Zugabe von 100 µl Lösung I für 5 min. Anschließend wurden 400 µl Lösung II
zugegeben, vorsichtig gemischt und 15 min auf Eis inkubiert. Nach Zentrifugation (10000 rpm,
10 min, 4 °C) wurde der Überstand in eine neues Reaktionsgefäß (1 ml) überführt und die Plasmid-
DNA mit 360 µl kaltem Isopropanol (-20 °C) auf Eis gefällt (15 min). Nach weiterer Zentrifugation
(10000 rpm, 30 min, 4 °C) wurde das Pellet zweimal mit 1 ml 70 % Ethanol gewaschen. Die Plasmid-
DNA wurde nach dem Trocknen in 50 µl PCR-H2Obidest (Serva) gelöst.
Midi- und Maximaßstab: Sequenzierungen oder Klonierungen wurden mit Hilfe des Plasmid Midi und
Maxi Kits (Qiagen, Hilden) nach den Angaben der Hersteller (Handbuch: Plasmid Purification,
Qiagen, 1998) durchgeführt. Die isolierten Plasmide wurden in 100-500 µl PCR-H2Odest (Serva) oder
5 mM Tris/HCl (pH 7,0) gelöst.
Lösung I: Lösung II: TE-Puffer (pH 8,0):
NaOH 0,2 M Natriumacetat (pH 4,8) 0,98 M Tris/HCl (pH 8,0) 10 mM
SDS 1 % NaCl 0,5 M EDTA 1 mM
2.7 Proteinexpression und Proteinreinigung
2.7.1 (His)6-LTP1-Fusionsprotein
Der pRSET-Vektor (s. 2.5) ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, in dem das Zielprotein
(LTP1) N-terminal mit einem (His)6-Tag (Histag) fusioniert ist. Der Histag gestattet die affinitätschro-
matographische Reinigung des Fusionsproteins über eine Nickel-NTA-Matrix. Im Fusionsprotein be-
findet sich zwischen dem LTP1 und dem Histag eine Spaltsequenz für eine Peptidase (Enterokinase),
die eine enzymatische Abtrennung des Histags vom LTP1 ermöglicht.
Expression und Reinigung: Für eine Vorkultur wurden 10 ml LB-Medium (+ Antibiotikum) mit einer
Bakterienkolonie von einer frisch inkubierten LB-Agarplatte (+ Antibiotikum) des entsprechenden
E. coli-Stammes angeimpft und über Nacht bei 37 °C inkubiert. Die Hauptkultur (300 ml) wurde mit
einer OD600 < 0,1 aus der Übernachtkultur angeimpft und weiter bei 37 °C inkubiert. Nach Erreichen
einer OD600 von 0,6-0,7 wurde die Proteinexpression durch die Zugabe von IPTG (Endkonzentration
1 mM) induziert. Nach einer Expressionszeit von 3 h wurden die Zellen durch Zentrifugation (20 min,
4 °C, 5000 rpm) geerntet. Das Zellpellet wurde eingefroren oder wie folgt auf Eis weiter behandelt:
Für die Lyse wurde das Pellet in 6-10 ml Lysepuffer resuspendiert. Nach 1,5-2 h Lyse wurde die
Suspension vier Ultraschallimpulsen für je 10 s ausgesetzt und zwischendurch 60 s auf Eis gekühlt.
Zum Abtrennen der Zelltrümmer wurde das Lysat zentrifugiert (30 min, 4 °C, 10000 rpm). Der
2 Material und Methoden
26
Überstand wurde mit 1-2 ml Ni-NTA-Agarose (Qiagen) versetzt, die zuvor mit 10 ml Waschpuffer I
äquilibriert wurde. Die Inkubation erfolgte rollend in Greinerröhrchen für 1,5 h bei 4 °C. Die
Suspension wurde in 5 ml Chromatographieleersäulen (Biorad) gefüllt. Ungebundenes Protein wurde
mit Waschpuffer I von der Ni-NTA-Säule gewaschen (OD280nm < 0,01), unspezifisch gebundenes
Protein wurde mit Waschpuffer II von der Säule gewaschen. Die Elution erfolgte drei mal mit 0,5-1 ml
Elutionspuffer. Anschließend wurde die Säule mit 20 ml Waschpuffer I reäquilibriert. Zur
Aufbewahrung wurde die Säule mit Waschpuffer I + Natriumazid (0,01 %) versetzt und verschlossen
kühl bei 4°C gelagert.
Lysepuffer: Waschpuffer II:
NaH2PO4 (pH 8,0) 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0) 50 mM
NaCl 300 mM NaCl 300 mM
Imidazol 10 mM Imidazol 100 mM
Waschpuffer I: Elutionspuffe:
NaH2PO4 (pH 8,0) 50 mM NaH2PO4 (pH 8,0) 50 mM
NaCl 300 mM NaCl 300 mM
Imidazol 20 mM Imidazol 200 mM
Enzymatische Abtrennung des (His)6-Tagt mittels Enterokinase: Dazu wurde gereinigtes (His)6-LTP1-
Fusionsprotein mittels Ultrafiltration (Amicon, Ausschlußgröße 10 kDa) konzentriert, zweimal mit
1 ml H2Obidest gewaschen und in entsprechenden Reaktionspuffern verdünnt. Die Versuche wurden
entsprechend den in Tabelle 2.6 dargestellten Bedingungen durchgeführt.
Tab. 2.6: Puffer und Inkubationsbedingungen der verwendeten Enterokinasen.
Enterokinase/ Hersteller Puffer Enzymatischer Ansatz/ Inkubation
Enteropeptidase aus Kälberdarm
(EK)/ Boehringer-Mannheim
(1334115)
Tris/HCl (pH 7,5-7,8)
25 µg (His)6-LTP1-Fusionsprotein
+ 0,6 µg EK; Inkubation bis zu 24 h
bei 37 °C
rekombinante Enterokinase (rEK)/
Novagen (69066-3) 1x rEK Cleavage Buffer 10 µg (His)6-LTP-Fusionsprotein
+ 0,2 U rEK; Inkubation 16 h bei RT
2.7.2 LTP1-Intein-Fusionsprotein
Der pTYB1-Vektor (s. 2.5) des IMPACT™-CN-Systems (Intein Mediated Purification with an
Affinity-Chitin-Binding-Tag von NEB) ermöglicht die Expression eines Fusionsproteins, in dem das
Zielprotein (LTP1) C-terminal mit einem Intein-Chitin-Bindungs-Domänen-Tag fusioniert ist. Die
Chitin-Bindungs-Domäne (CBD) gestattet die affinitätschromatographische Reinigung des Fusions-
proteins über eine Chitinmatrix. Die thiolinduzierbare Spleißaktivität des Proteinspleißelements
(Intein) wird genutzt, um das LTP1 vom Affinitätstag zu separieren (Perler und Adam, 2000).
Expression und Reinigung: Nach der Optimierung von Expressions- und Reinigungsbedingungen
wurde nach folgendem Protokoll gearbeitet: Für eine Vorkultur wurden 10 ml LB-Medium mit einer
2 Material und Methoden
27
Bakterienkolonie von einer frisch inkubierten LB-Agarplatte (+Ampicillin) angeimpft und über Nacht
bei 37 °C inkubiert. Die Hauptkultur (300 ml) wurde aus der Vorkultur mit einer OD600< 0,05
angeimpft. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte bei einer OD600 von 0,5-0,6 mit 0,3 mM
IPTG. Zuvor wurden 2 x l ml Probe der nichtinduzierten Zellen (Zo) entnommen. Die Induktion
erfolgte für 16 h bei 20 °C im Wasserbad. Nach Entnahme der Probe der induzierten Zellen (Zi, 2 x
1 ml) wurde zentrifugiert (5000 x g; 30 min; 4 °C) und das Zellfeuchtgewicht bestimmt. Die Pellets
wurden zur weiteren Verarbeitung bei –20 °C eingefroren. Für die Reinigung wurden die Zellpellets
auf Eis aufgetaut und je g Zellfeuchtgewicht mit 10 ml Lysepuffer versetzt. Nach 1 h Lyse auf Eis
wurde die Zellsuspension 5 Ultraschallimpulsen von 20 s ausgesetzt und zwischendurch auf Eis ge-
kühlt. Nach einer Zentrifugation (15000 x g; 30 min; 4 °C) wurde der Überstand (Ü1) abgenommen
und das Pellet noch einmal im oben eingesetzten Volumen Lysepuffer resuspendiert, um die Ausbeute
an Fusionsprotein zu erhöhen. Diese Suspension lysierte für eine weitere Stunde auf Eis.
Anschließende Ultraschall- und Zentrifugationsschritte erfolgten wie oben beschrieben. Der Überstand
(Ü2) wurde abgenommen und das Zellpellet (Zp) verworfen. Eine vorbereitete Chitinsäule (NEB) mit
einem Bettvolumen von ca. 2,5 ml wurde mit 25 ml Waschpuffer äquilibriert. Die Säule wurde zuerst
mit Ü1, dann Ü2 gravimetrisch beladen, vom jeweiligen Durchfluß eine Probe genommen (D1 und
D2) und der Durchfluß ein weiteres Mal auf die Säule gegeben, um eine maximale Bindung des LTP1-
FP an die Chitinmatrix zu erzielen. Anschließend wurde mit Waschpuffer gewaschen (OD280nm
< 0,001). Über die Säule wurden dann 10 ml (4 x Bettvolumen) Spaltpuffer gegeben, danach die Säule
verschlossen und mit weiteren 7,5 ml Spaltpuffer versetzt. Nach Inkubation über Nacht bei
Raumtemperatur wurde die Säule geöffnet und je 1 ml als Eluat aufgefangen (E1-E4). Vom
Säulenmaterial wurde eine Probe entnommen und mit 3-fach Probenpuffer versetzt (B-Probe: 0,2 g +
100 µl Probenpuffer). Alle dem Reinigungsprozeß entnommenen Proben wurden wie folgt für
Analysen im SDS-Gel und Westernblot vorbereitet: je 40 µl mit 20 µl 3-fach Probenpuffer versetzt,
bei 85 °C 7 min erhitzt und bis zur Analyse bei -20 °C eingefroren. Die restlichen Proben wurden als
Rückstellproben ebenfalls bei –20 °C eingefroren.
Lysepuffer/Waschpuffer: 3-fach Probenpuffer nach NEB (pH 6,8):
Na-PO4-Puffer (pH 8,0) 20 mM Tris/HCl (pH 6,8) 187,5 mM
NaCl 500 mM SDS 6 %
PMSF (100 mM) 20 µM Glycerin 30 %
Spaltpuffer: Bromphenol Blau 0,03 % (w/v)
Na-PO4-Puffer (pH 9,0) 20 mM
NaCl 500 mM
DTT (1 M) 50 mM frisch dazu
2 Material und Methoden
28
2.8 Proteinase- und Proteinbestimmungen
2.8.1 Aktivitätsbestimmungen von Proteinase
Azocaseinmethode: Diese Proteinasenachweismethode beruht auf dem photometrischen Nachweis von
Trichloressigsäure (TCA)-löslichen Produkten, die bei der Spaltung von Azocasein durch Proteinasen
entstehen. Der Nachweis wurde in Anlehnung an die von Reicheneder und Narziß (1989) beschriebene
Methode modifiziert. Zu 1 ml Azocaseinstammlösung wurden 0,1 ml proteasehaltige Probe gegeben
und bei Raumtemperatur für 24 h inkubiert. Dann wurden 0,25 ml des Ansatzes mit 1 ml 5 %iger TCA
versetzt. Der sich bildende Niederschlag wurde abzentrifugiert (2 min, 10000 x g). Vom Überstand
wurde bei 340 nm die Adsorption gemessen und vom ermittelten Wert der Nullwert (t=0) subtrahiert.
Es wurden Doppelbestimmungen durchgeführt.
Azocaseinstammlösung:
MES-Puffer (pH 5,5) 100mM 50 ml
Azocasein 1 g
Methode mit succinyliertem Casein: Ein Nachweistest für Proteinasen von Pierce (QuantiCleave™
Protease Assay Kit II) beruht auf der Modifizierung der Azocaseinmethode. Durch die Succinylierung
des Casein wird eine erhöhte Sensitivität erreicht. Die Absorption wird bei 450 nm bestimmt. Der
Nachweis kann auch in Mikrotiterplatten und somit für kleinere Probenvolumina erfolgen. Es wurden
Doppelbestimmungen nach dem Protokoll des Nachweiskits durchgeführt. Anstelle des Boratpuffers
(pH 8,5) wurde Phosphatpuffer (100 mM, pH 5,5) eingesetzt.
2.8.2 Proteinbestimmungen nach Lowry und Bradford
Die Proteinkonzentrationen wurden während der ersten Projektetappen nach der klassischen Methode
von Lowry et al. (1951) photometrisch bei 750 nm bestimmt. Dazu wurden 20 µl Probe mit 100 µl
Lösung A versetzt, 5 min inkubiert, 800 µl Lösung B dazugegeben und nach weiteren 15 min
Inkubation die Absorption gemessen. Der Blindwert enthielt statt der Probe 20 µl H2Oent.
Für die Proteinbestimmung nach Bradford (1976) wurden 800 µl der gegebenenfalls verdünnten Probe
mit 200 µl Bradford-Reagenz (Biorad) versetzt und nach 10 min Inkubation die Absorption bei
595 nm gemessen. Der Blindwert enthielt 800 µl H2Oent. Es wurden Doppelbestimmungen durch-
geführt und jeweils ein BSA-Standard mitgeführt. Kalibriergeraden für beide Methoden wurden mit
BSA (Sigma) erstellt.
Lösung A:
CuSO4 1 mM
KNaTartrat x 4 H2O 2,125 mM
NaOH 200 mM
Na2CO3 2,5 % (w/v)
SDS 2,5 % (w/v)
Lösung B:
Folin-Ciocalteus-Reagenz 16,7 % (w/v)
2 Material und Methoden
29
2.9 Proteinfällung und Proteinkonzentration
2.9.1 Proteinfällung mit TCA/NaDOC
Die Fällung von Proteinen nach der von Petersen (1977) beschriebenen Methode mit Trichloressig-
säure (TCA) in Gegenwart von Natriumdesoxycholat (NaDOC) diente der Aufkonzentrierung
verdünnter Proteinlösungen zum Auftragen in der SDS-Gel-Elektrophorese. Proben mit geringem Pro-
teingehalt (50-80 µg/ml) wurden mit NaDOC (Endkonzentration 0,15 %) für 10 min bei Raumtempe-
ratur inkubiert und dann mit eiskalter (4 °C) TCA (Endkonzentration 7,5-10 % ) versetzt. Nach 20 min
Inkubation auf Eis wurde zentrifugiert (10 min, 4 °C, 5000 x g), das Pellet zweimal mit Aceton
gewaschen und das Protein anschließend in 0,05 N NaOH resuspendiert.
2.9.2 Ammoniumsulfatfällung
Die Fällung von Proteinen mit Ammoniumsulfat [(NH4)2SO4] diente der Vorbereitung von Protein-
präparationen für die Immunaffinitätschromatographie bzw. Reversed Phase-HPLC. Bier oder Ger-
stenextrakte (s. 2.14) wurden unter Rühren (Magnetrührer + Rührfisch, 100-200 Upm) auf Eis bis zu
einer 40 %igen Sättigung langsam mit (NH4)2SO4 versetzt. Die Suspension wurde bei 4 °C für 4 h
gerührt, dann zentrifugiert (20 min, 10000 x g, 4 °C). Der Überstand wurde langsam unter Rühren auf
Eis mit (NH4)2SO4 bis zu einer Sättigung von 80 % versetzt und weiter über Nacht bei 4 °C gerührt.
Nach Zentrifugation (20 min, 10000 x g, 4 °C) wurden die Pellets in H2Obidest gelöst und über Nacht
gegen 2 x 2 l H2Obidest dialysiert (Dialysemembran: SnakeSkinR Dialysis Tubing, MWCO 3,5 kDa,
Pierce), anschließend durch Zentrifugation (20 min, 8000 x g) ausgefallene Proteine abgetrennt. Die
Proteinpräparationen wurden bis zu 3 Tage bei 4 °C aufbewahrt oder bis zur weiteren Verarbeitung 4-
10 Tage bei -20 °C eingefroren.
2.9.3 Ultrafiltration
Für die Konzentration und das Umpuffern von (His)6-LTP1-Fusionsprotein wurden YM-10
Membranen (Ausschlußgröße 10 kDa), für rekombinantes LTP1 YM-3 Membranen (Ausschlußgröße
3 kDa, Amicon, Millipore, USA) verwendet. Der Überstand wurde zweimal mit PCR-H2Odest (Serva)
gewaschen bevor das Konzentrat in neuem Puffer aufgenommen wurde.
2.10 Proteintrennung mittels SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese
Zur Trennung von Proteinen in der SDS-Polyacrylamid-Gel-Elektrophorese (SDS-PAA) wurde die
etablierte, von Laemmli (1970) beschriebene Methode angewendet. Die Proben wurden zuvor 2:1
bzw. 3:1 mit Probenpuffer versetzt, 7 min bei 85 °C denaturiert, danach mit 50 mM DTT versetzt und
2 min bei 8000 x g zentrifugiert. Proben, die mittels RP-HPLC Fraktionierung gewonnen wurden,
wurden zusätzlich zum Einstellen des pH-Wertes mit 2 µl 1M NaOH vesetzt. Eingesetzt wurden
12 %ige, 15 %ige oder 17,5 %ige Polyacrylamidgele (PAA: Rotiphorese Gel 30, Roth) (Biorad
2 Material und Methoden
30
Miniprotean für kleine Gele: 85 x 55 x 5 mm bzw. große Gele135 x 50 x 5 mm). Die Auftrennung
erfolgte zuerst bei 80 V (Sammelgel), dann für kleine Proteingele bei 100 V (Trenngel) bzw. für große
Proteingele bei 40 V über Nacht (Firma Phase GmbH). Als Molekulargewichtsstandard dienten low
range, broad range und prestained marker der Firma Biorad.
2-fach Probenpuffer (pH 6,8) Trenngel-Stammlösung 4-fach (pH 8,8)
Tris/HCl 125 mM Tris/HCl (pH 8,8) 1,5 M
SDS 4 % SDS 0,4 %
Glycerin 30 % Sammelgel-Stammlösung 4-fach (pH 6,8)
Bromphenol Blau 0,01 % (w/v) Tris/HCl (pH 6,8) 0,5 M
SDS 0,4 %
2.11 Proteinfärbung
2.11.1 Coomassiefärbung
Für eine Färbung der Proteine in SDS-PAA-Gelen wurden diese in Fixier-Coomassie-Färbelösung
(Lösung nur zum Fixieren) für 20 min inkubiert und danach in Coomassie-Färbelösung (Lösung nur
zum Färben, mehrmals verwendbar) für mindestens 1,5 h gefärbt. Anschließend wurde mit
Entfärberlösung entfärbt.
Coomassie-Färbelösung: Entfärber:
Coomassie blue (R 250) 0,75% Methanol 25%
Methanol 16,6% Essigsäure (99,9 % ) 7,5%
Essigsäure (99,9 %) 50%
2.11.2 Silberfärbung
Die Silberfärbung von Proteinen in SDS-PAA-Gelen durch kolloidales Silber erfolgte in Anlehnung
an Merril et al. (1981) (Methode I) bzw. nach Nesterenko et al. (1994) (Methode II). Letztere erlaubte
im Vergleich eine sensitivere Detektion kleiner Proteine (<10 kDa).
Tab. 2.7: Methoden der Silberfärbung.
Methode I Methoden II
Fixierung mind. 20 min 50 % CH3OH; 10 % Glycerol
10 % CH3COOH;
Fixierung > 5 min 10 % CH3OH; 7 % CH3COOH
Waschen 2 x 10 min H2Obidest Waschen 3 x 5 s;
1 x > 5 min; 3 x 5 s
H2Obidest
Entwicklung 0,5 % Tungstosilicic Säure;
0,1 % AgNO3; 0,1 % NH4NO3;
0,14 % HCHO; 2,5 % Na2CO3
Inkubation 5 min
Inkubation 1 min
50 % Aceton
0,016 % Na2S2O3 x H2O
Abstoppen 10 % CH3COOH Waschen 3 x 5 min H2Obidest
Imprägnieren 0,37 % HCHO; 0,27 % AgNO3
Waschen 3 x 5 s H2Obidest
Entwicklung 10-20 s 2 % Na2CO3; 0,004 %
Na2S2O3 x H2O; 0,015 %
HCHO
Abstoppen >30 s 2 % CH3COOH
Fixierung > 30 min 50 % CH3OH
2 Material und Methoden
31
2.12 Immunchemische Analyse (Westernblot)
2.12.1 Elektrotransfer auf Nitrozellulose
Nach der Elektrophorese wurde das Trenngel 5-10 min in Transferpuffer (1-fach) geschüttelt. Der
Transfer des Proteins auf die Nitrozellulosemembran (Poren ∅ 0,45 µm, Hybond-C, Amersham-
Pharmacia) erfolgte mittels einer Elektotransferapparatur (Phase GmbH). Die mit Transferpuffer
angefeuchtete Nitrozellulose und das Gel werden dabei in Transferpuffer getränkte Filterpapiere
gebettet. Die Stromstärke wurde konstant auf 0,8 mA/cm2 Filterpapier eingestellt, die Transferdauer
betrug 1 h. Nach dem Transfer wurde die Nitrozellulose kurz in H2Odest gespült und getrocknet.
Transferpuffer (10-fach) :
Tris/ HCl (pH 8,3) 25 mM
Glycin 192 mM
Methanol 5 % frisch dazu
2.12.2 Immunreaktionen und Detektionen
Detektion mit Ponceau–Rot: Die transferierten Proteine können auf der Membran mittels Ponceau-Rot
angefärbt werden. Dazu wurde die mit H2Odest-gespülte Nitrozellulosemembran für 10 min in
Ponceau-Rot-Färbelösung inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Farbe mit Wasser von der
Membran gewaschen.
Ponceau-Rot-Färbelösung: Ponceau-Rot 2 %
Essigsäure 3 %
Mittels Westernblot wurden verschiedene Proteine nachgewiesen (LTP1, CPY, PrA, CBD, Histag).
Die grundlegende Prozedur war für alle Nachweise gleich, die Zusammensetzung der Blocklösungen
variierte, wie in Tabelle 2.8 dargestellt.
Zum Blocken unspezifischer Bindungen wurde die Membran zunächst 90 min in Blocklösung I
inkubiert. Dann wurde mit primärem Antikörper, entsprechend verdünnt in Blocklösung I, über Nacht
bei 4 °C inkubiert (in seltenen Fällen bei Raumtemperatur für 2h). Anschließend wurde die Membran
5 x für 5-10 min mit Waschpuffer gewaschen. Dem schloß sich eine 10-minütige Inkubation
(Raumtemperatur) mit Blocklösung II an, der dann für weitere 45 min der sekundäre Antikörper (POD
markiertes IgG) beigefügt wurde. Die Membran wurde abschließend wie oben beschrieben
gewaschen. Die Detektion der Proteine erfolgte entweder mittels Diaminobenzidin oder mittels
Chemolumineszenz auf dem Röntgenfilm.
Waschpuffer (pH 7,5):
Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM
NaCl 500 mM
2 Material und Methoden
32
Tab. 2.8: Übersicht der im Westernblot verwendeten primären und sekundären Antikörper
sowie der entsprechenden Blocklösungen.
Primäre Antikörper (eingesetzte
Verdünnung)/Referenz Blocklösung I Blocklösung II Sekundärer
Antikörper
Penta-His-Antikörper (0,05 %)/
Invitrogen
3 % BSA; 0,05 %
Tween 20
5 % Milchpulver;
0,5 % BSA
Anti-Maus-IgG-POD-
Konjugat (0,066 %)
Anti-Proteinase A (unverdünnt)/
Prof. A. Nakano, Universität
Riken, Japan
1 % Milchpulver;
0,1 % Tween 20
5 % Milchpulver;
0,1 % Tween 20
Anti-Maus-IgG-POD-
Konjugat (0,2 %)
Anti-CPY* (0,025 %)/ Chemicon s. Proteinase A s. Proteinase A Anti-Rabbit-IgG-POD-
Konjugat (0,025 %)
Anti-LTP1(0,2 %)/ Dr. E. Evans,
Universität Adelhaid, Australien
1 % BSA; 0,05 %
Tween 20
2,5 % Milchpulver;
0,5 % BSA
Anti-Rabbit-IgG-POD-
Konjugat (0,025 %)
CBD-Serum (0,02 %)/ NEB s. LTP1 s. LTP1 s. LTP1
*CPY-AK wurden affinitätschromatographisch gereinigt (s. 2.13)
Detektion mit Diaminobenzidin: Die Membran wurde 10 min mit 25 mM Tris/HCl (pH 8,0) gewa-
schen und in Substratlösung für 20 min inkubiert. Nach der Farbentwicklung wurde der Blot mit
H2Obidest gewaschen, getrocknet und aufgrund der nachlassenden Blotqualität das Ergebnis
dokumentiert.
Substratlösung:
Diaminobenzidin 50 mg
Tris/HCl (pH 8,0; 25 mM) 100 ml
H2O2 (30 %) 25 µl frisch dazu
Detektion mittels Chemolumineszens und Röntgenfilm: In Gegenwart von H2O2 katalysiert die Peroxi-
dase (POD) die Oxidation von Luminol. Ein Intermediat dieser Reaktion emittiert während des
Übergangs vom angeregten Zustand in den Grundzustand Photonen, die mittels Röntgenfilm detektiert
werden können.
Die Membran wurde 10 min in Tris/HCl-Stammlösung inkubiert, die anschließenden Arbeitsschritte
erfolgten im Dunkeln. Lösung A und Lösung B wurden vermischt und darin die Membran 1-2 min
inkubiert, danach Reste der Lösung abgetupft und die Membran in Folie eingeschlagen. Das Auflegen
eines Films erfolgte je nach Signalintensität 10 s bis 15 min. Der Film wurde 5 min in Entwickler-
lösung entwickelt, mit Wasser gewaschen und mindestens 5 min in Fixierlösung inkubiert. Nach
10 min Wässern wurden die Filme getrocknet.
2 Material und Methoden
33
Tris/HCl-Stammlösung (pH 8,5): 1 M Lösung A (10 ml)
Luminol-Stammlösung: Luminol-Stammlösung 0,1 ml
Luminol (Sigma) 250 mM Coumarsäure-Stammlösung 44 µl
DMSO 4,4 % Tris/HCl (1M; pH 8,5) 1 ml
mit H2Obidest auffüllen
p-Coumarsäure-Stammlösung: Lösung B (10 ml)
p-Coumarsäure (Sigma) 90 mM Tris/HCl (1M; pH 8,5) 1 ml
DMSO 1,5 % H2O2 (30 % ) 6,1 µl
mit H
2Obidest auffüllen
2.13 Affinitätschromatographie mit Antikörpern
Die Affinitätschromatographie beruht auf dem Prinzip der Adsorptionschromatographie, bei dem ein
zu reinigendes Molekül spezifisch und reversibel an einen komplementären Liganden adsorbiert wird,
der wiederum an einer Matrix immobilisiert ist. Erfolgt die Adsorption über einen Antikörper (AK) als
Liganden, handelt es sich um eine Immunaffinitätschromatographie. Die affinitätschromatographische
Reinigung rekombinanter Fusionsproteine erfolgt über Bindung eines Affinitätstags an spezifische
Liganden. In der Arbeit sind dafür fertige Ligandenmatrices der Firmen Qiagen und NEB verwendet
worden (Tab. 2.9)
Tab. 2.9: Übersicht der verwendeten Ligand-Matrix-Systeme zur Reinigung der entsprechen-
den Proteine.
zu reinigendes Protein Ligand/ Matrix
CPY-AK Carboxypeptidase Y/
CNBr-aktivierte Sepharose 4B
Immunaffinitätschromatographie
LTP1
polyklonale anti-LTP1- Antikörper aus Kaninchen /
CNBr-aktivierte Sepharose 4B
Reinigung rekombianter FP
(His)6-LTP1-Fusionsprotein
Nickel-NTA-Matrix (Qiagen)
LTP1-Intein-CBD-Fusionsprotein Chitinmatrix (NEB)
Für die affinitätschromatographische Reinigung von CPY-AK und LTP1 wurden die entsprechenden
Liganden CPY und LTP1-AK an CNBr-aktivierte Sepharose 4B nach der klassischen Methode von
Amersham Pharmacia Biotech (Handbuch: Affinity Chromatography, Amersham Pharmacia Biotech,
1999) gekoppelt. Das Ligand-Sepharose-Konjugat wurde in Leersäulen (Biorad) gepackt. Die Kopp-
lung an CNBr-aktivierte Sepharose erfolgte für CPY mit einer Effizienz von 95 %, für LTP1-AK aus
Kaninchen mit 90 %. Nach Gebrauch wurden die Säulen mit Puffer äquilibriert und mit Natriumazid
(0,01 %) versehen bei 4 °C gelagert.
2 Material und Methoden
34
2.14 Gewinnung LTP1-haltiger Proteinpräparationen aus Bier und Gerste
Proteinpräparationen aus 500 ml Pilsner Bier wurden mittels fraktionierter Ammoniumsulfatfällung (s.
2.9.2) gewonnen. Für Proteinpräparationen aus Gerste (var. Scarlett) wurden 500 g gemahlen und über
Nacht mit 2,5 l H2Odest extrahiert. Durch Zentrifugation (20 min, 10000 x g) wurden die unlöslichen
Bestandteile abgetrennt und die Proteine ebenfalls mittels Ammoniumsulfat (s. o.) gefällt. Nach
Zentrifugation für 20 min bei 10000 x g wurden die Pellets in 25 ml H2Obidest gelöst und 5 ml davon
ü. N. gegen 2 x 2 l H2Obidest dialysiert (Dialysemembran: SnakeSkinR Dialysis Tubing, MWCO
3,5 kDa, Pierce), anschließend nochmal zentrifugiert (20 min, 8000 x g), um ausgefallene Proteine zu
eliminieren. Die Proteinpräparationen wurden bis zu 3 Tage bei 4 °C aufbewahrt oder bis zur weiteren
Verarbeitung 4-10 Tage bei –20 °C eingefroren.
2.15 Reversed-Phase-High-Performance-Liquid-Chromatography (RP-HPLC)
Für die semipräparative RP-HPLC von Proteinpräparationen aus Bier und Gerste wurde das Dionex
HPLC-System (Idstein, Deutschland) verwendet, das aus P580 Pumpen, einem variablen Wellenlän-
gendetektor (Model UVD 340S), einem Autosampler (Model ASI-100) und einem Fraktionssammler
(Foxy™ Jr.) besteht. Für eine optimale Trennung wurden verschiedene Parameter und Säulen (s.
Tab. 2.10) getestet:
- Elutionssysteme: Acetonitril/ H2O, Methanol/ H2O, +/- Trifluoressigsäure (TFA)
- Flußraten
- Detektionswellenlängen
Tab. 2.10: Übersicht der in der RP-HPLC getesteten Säulen.
Säulenmaterial und -parameter Hersteller
C18, 7 µm, 100 Å (gebraucht) Unbekannter tschechischer Hersteller
VYDAC C18, 5 µm, 300 Å (gebraucht) Dionex (Idstein, Deutschland)
HYPERSIL C18, 5 µm, 100 Å Merck (Darmstadt, Deutschland)
NUCLEOSIL C4, 5 µm, 300 Å Macherey und Nagel (Düren, Deutschland)
Nach Optimierung des Verfahrens erfolgte die Trennung mit Nucleosil 300-5 C4 MPN (250 mm x
4 mm, Macherey und Nagel; Düren, Germany), bei einer Flußrate von 0,8 ml/min und 40 °C. Als
Eluenten wurden Wasser mit 0,1 % TFA (Eluent A) und Methanol mit 0,1 % TFA (Eluent B)
verwendet (Wasser und Methanol: HPLC-Gradient-Grad, Roth; TFA für HPLC: Fluka). Die Elution
erfolgte mit einem linearen Gradienten (5 % B für 5 min, ansteigend in 25 min auf 80 % B und für
5 min haltend, s. Anhang Tab. 7.1). Die Säule wurde nach jedem Lauf für 8 min mit 5 % B
äquilibriert. Die Proben wurden vor dem Auftragen mit einem 0,22 µm Sterilfilter (Millex TM-GM,
Millipore, USA) filtriert.
2 Material und Methoden
35
2.15.1 Rotationsverdampfer
Die in der RP-HPLC gewonnenen Fraktionen wurden am Rotationsverdampfer (Laborata 4000,
Heidolph, Schwalbach) eingeengt. Dabei wurde die Temperatur des Wasserbades schrittweise von 55
auf 65 °C und das Vakuum von 200 auf 1000 mbar erhöht, um einen Siedeverzug der Proben zu
vermeiden.
2.15.2 Fraktionierung mittels RP-HPLC
Im Folgenden wird die detaillierte Probenvorbereitung für die in Kapitel 3.2 bis 3.4 dargestellten
Analysen beschrieben werden.
Proben für Untersuchungen im Kapitel 3.2 und 3.3: Zur Fraktionierung mittels RP-HPLC wurden
jeweils 150 µl dialysierte Probe mit einer Proteinkonzentration von ca. 200 µg/ml (bestimmt mittels
Bradford) aufgetragen. Die gewonnenen Fraktionen (Zwei-Minuten-Takt: 1,6 ml; Minutentakt: 0,8 ml)
wurden am Rotationsverdampfer auf 0,45 ml bzw. 0,25 ml eingeengt. Proben, die nach dem Einengen
ein kleineres Volumen aufwiesen wurden mit H2O bidest (Serva) aufgefüllt. Von den Proben wurden für
die Analysen im SDS-Gel und im Westernblot je 25 µl mit 13 µl 3-fach Probenpuffer und 2 µl 1M
NaOH versetzt und bei 85 °C für 7 min erhitzt, dann wurden 2 µl 1 M DTT zugesetzt (s. 2.10).
Proben für Untersuchungen im Kapitel 3.4: Von den proteinasebehandelten und -unbehandelten
Bierproben wurden je dreimal 150 µl Probe aufgetragen und fraktioniert. Die gewonnenen Fraktionen
(Minutentakt: 3 x 0,8 ml) wurden am Rotationsverdampfer von 2,4 ml auf 0,45 ml eingeengt. Für
große SDS-Gele wurden je 35 µl mit 15 µl 3-fach Probenpuffer und 2 µl 1M NaOH versetzt, bei 85 °C
für 7 min erhitzt und 2 µl 1 M DTT zugesetzt (s. 2.10).
3-fach Probenpuffer nach NEB (pH 6,8):
Tris/HCl (pH 6,8) 187,5 mM
SDS 6 %
Glycerin 30 %
Bromphenol Blau 0,03 % (w/v)
2.16 Schaumstabilitätsbestimmung nach Ross und Clark
Die Bestimmung der Schaumstabilität erfolgt nach der von Ross und Clark (1953) entwickelten
Methode. Durch Einleitung von CO2 wird ein Schaumvolumen von 100 ml erzeugt. Als Maß für die
Schaumhaltbarkeit dient die mittlere Lebensdauer der Schaumblasen. Diese wird aus dem Verhältnis
zwischen der Zerfallszeit des Schaumes und dem Logarithmus des Verhältnisses zwischen dem
Volumen des zerfallenen und des noch vorhandenen Schaumes berechnet. Das Protokoll zur
Durchführung ist den Brautechnischen Untersuchungsmethoden entnommen (Mebak, 1993, Bd.2). Die
Schaumzahlen werden ohne Dezimale angegeben. Schaumzahlen >125 belegen eine sehr gute, <110
eine schlechte Qualität.
2 Material und Methoden
36
2.17 Massenspektrometrie
Die Untersuchungen erfolgten am Institut für Molekulare Pharmakologie in Berlin (FMP) mittels
Applied Biosystems Voyager System 404. Für die Trypsinierung der Proben wurden 100 µl (s. 2.15.1)
der gewonnenen, konzentrierten Proben (angenommene Proteinmenge: 50 µg Protein) mit 1 µg
Trypsin versetzt. Die verwendete Probenmatrix α-Hydroxyzimtsäure ist für die Analyse von Peptiden
mit einer Masse von ungefähr 2 kDa geeignet. Eine Übersicht der möglichen, systembedingten
artefakten Hintergundmassen ist im Anhang (Tab. 7.2) gegeben.
3 Ergebnisse
37
3 ERGEBNISSE
3.1 Korrelation zwischen Aktivität von Proteinasen und Stabilität von Bierschaum
Ziel der in diesem Kapitel beschriebenen Arbeiten war es, eine eindeutige Korrelation zwischen der
Aktivität von Proteinasen und der Stabilität von Bierschaum herzustellen und die für den Nachweis
von Proteinasen notwendige Methode zu etablieren. Zu Beginn wurde untersucht, ob eine Minderung
der Schaumstabilität spezifisch von Proteinasen einer Familie hervorgerufen wird oder ob ein Einfluß
für Proteinasen verschiedener Familien nachzuweisen ist. Im weiteren Verlauf wurden der spezifische
Einfluß der Hefeproteinasen Carboxypeptidase Y und Proteinase A betrachtet.
3.1.1 Minderung der Schaumstabilität durch unterschiedliche Proteinasen
Proteinasen werden aufgrund ihrer katalytischen Aktivität in vier Proteinasefamilien unterteilt (s.
1.2.1). Für die Versuche wurden Proteinasen aus jeder Proteinasefamilie in Bier dotiert und nach
dreitägiger Inkubation bei Raumtemperatur die Schaumzahlen nach Ross und Clark (s. 2.16)
bestimmt. Als Bierproben wurden Qualitätsbiere nach Pilsner Art in Flaschen mit Schaumzahlen >110
verwendet. Die eingesetzten Proteinasen sind in Tabelle 3.1 aufgelistet. Proteinase A (PrA) und
Carboxypeptidase Y (CPY) sind die einzigen aus S. cerevisiae gereinigten Proteinasen, die
kommerziell erhältlich sind.
Tab. 3.1: Übersicht der zur Dotierung in Bier eingesetzten Proteinasen.
Proteinase Familie Herkunft
Pepsin (EC 3.4.23.1) Carboxylproteinase Sus scrofa
Papain (EC 3.4.22.2) Thiolproteinase Carica papaya
Trypsin (EC 3.4.21.4) Serinproteinase Bos taurus
Protease Typ X Metalloproteinase Bacillus subtilis
Proteinase A (PrA)
(EC 3.4.26.6)
Carboxylproteinase Saccharomyces
cerevisiae
Carboxypeptidase Y (CPY)
(EC 3.4.16.1)
Serinproteinase Saccharomyces
cerevisiae
Nach der Dotierung hoher Konzentrationen Trypsin (Serinproteinase) und Papain (Thiolproteinase)
wurde keine Abnahme der Schaumstabilität beobachtet (Abb. 3.1). Für die Protease Typ X
(Metalloproteinase) wurde eine geringe Stabilitätsabnahme von 7 Schaumpunkten bestimmt. Hingegen
traten bei Versuchen mit den Carboxypeptidasen Proteinase A (PrA) und Pepsin, sowie der
Serinproteinase Carboxypeptidase Y (CPY) deutliche Stabilitätsabnahmen von 54, 50 bzw. 34
Schaumpunkten auf, was einer prozentualen Stabilitätsabnahme von 43 % für PrA, 40 % für Pepsin
und 27 % für CPY entspricht.
3 Ergebnisse
38
Abb. 3.1: Einfluß verschiedener Proteinasen auf die Schaumstabilität von Bier. Die Inkubation
mit Proteinase erfolgte bei Raumtemperatur über drei Tage. Die Schaumzahlen wurden
nach Ross und Clark von jeweils drei Ansätzen bestimmt. Linke Diagrammsäule – Bier
ohne Proteinase. Zu Bier dotierte Enzymkonzentrationen: Proteinase A – 1,68 µg/ml;
Pepsin – 142 µg/ml; Carboxypeptidase Y – 2,86 µg/ml; Protease Typ X – 25 ng/ml; Papain
– 1,0 µg/ml; Trypsin – 2,4 µg/ml.
3.1.2 Proteinasen aus
S. cerevisiae und ihr Einfluß auf die Schaumstabilität
In weiteren Versuchen wurden für die aus S. cerevisiae stammende Carboxypeptidase Y (CPY) und
für Proteinase A (PrA) die Konzentrationen bestimmt, die in Bier bereits eine Reduktion der
Schaumstabilität hervorrufen. Dazu wurden verschiedene Konzentrationen der jeweiligen Proteinase
in Bier dotiert und nach drei Tagen Inkubation die Schaumzahlen von je drei Ansätzen ermittelt. Für
CPY ergab sich in diesem Versuch bei einer Konzentration von 2,86 µg/ml eine Reduktion der
Schaumstabilität um 17 Punkte, oder 15 % (Abb. 3.2). Diese Abnahme ist im Vergleich zu beobach-
teten 34 Schaumpunkten (27 %) (s. 3.1.1) bei gleicher CPY-Konzentration relativ gering, da
verschiedene Biere verwendet wurden. Für 57 ng/ml wurde eine Abnahme der Stabilität um
11 Schaumpunkte gemessen.
Eine deutliche Verringerung der Schaumstabilität ist auch für Konzentrationen ≥83 ng/ml PrA zu
beobachten (Abb. 3.3). Für 83 ng/ml beträgt die Abnahme 14 Schaumpunkte.
Wurde die Inkubation mit PrA auf 6 Wochen verlängert, zeigte sich bereits für 1 ng/ml PrA eine
Schaumstabilitätsabnahme um 19 Punkte (Abb. 3.4). Für CPY konnte bei längerer Inkubationszeit von
6 Wochen und geringen Enzymkonzentrationen dagegen keine weitere Schaumstabilitätsabnahme
festgestellt werden.
Proteinase A
Pepsin
Carboxypept. Y
Protease Typ X
Papain
Trypsin
Schaumzahlen nach R&C
0
60
80
100
120
140
3 Ergebnisse
39
Abb. 3.2: Einfluß von Carboxypeptidase Y (CPY) aus S. cerevisiae auf die Schaumstabilität
von Bier in Abhängigkeit der dotierten Enzymkonzentration. Die Inkubation mit
Proteinase erfolgte bei Raumtemperatur über drei Tage. Die Schaumzahlen wurden nach
Ross und Clark von jeweils drei Ansätzen bestimmt.
Abb. 3.3: Einfluß von Proteinase A (PrA) aus S. cerevisiae auf die Schaumstabilität von Bier
nach Inkubation über drei Tage. Die Inkubation mit unterschiedlichen Konzentrationen
Proteinase erfolgte bei Raumtemperatur. Die Schaumzahlen wurden nach Ross und Clark
von jeweils drei Ansätzen bestimmt.
Konzentration CPY [µg/ml]
0,000 0,057 0,286 2,860
Schaumzahl nach R&C
0
60
80
100
120
Konzentration Proteinase A [µg/ml]
0,000 0,016 0,083 0,332 0,671
Schaumzahl nach R&C
0
80
100
120
3 Ergebnisse
40
Abb. 3.4: Einfluß von Proteinase A (PrA) aus S. cerevisiae auf die Schaumstabilität von Bier
nach Inkubation über 6 Wochen. Die Schaumzahlen wurden nach Ross und Clark von
jeweils drei Ansätzen bestimmt.
Aus den Untersuchungen zum Einfluß von Proteinasen auf die Schaumstabilität wurden minimale
schaumnegative Konzentrationen von 57 ng/ml für CPY und 83 ng/ml bzw. 1 ng/ml bei längerer Inku-
bation für PrA bestimmt. Daraus resultierend wäre eine Nachweismethode für Proteinasen mit einer
Nachweisgrenze von 1 ng/ml optimal bzw. von 50 ng/ml ausreichend.
In folgenden Versuchen sollte eine Methode zur Bestimmung von Proteinaseaktivität gefunden wer-
den, die es ermöglicht, diese geringen schaumschädigenden Konzentrationen zu quantifizieren. Dazu
wurden verschiedene Verfahren hinsichtlich ihrer Sensitivität verglichen. Getestet wurde die
Azocaseinmethode (s. 2.8.1), die als empfindlichster Nachweis in der Brauindustrie eingesetzt wird.
Dieser Proteinasenachweis beruht auf der photometrischen Bestimmung von Trichloressigsäure
(TCA)-löslichen Produkten, die bei der Spaltung von Azocasein durch Proteinase entstehen. Ein wei-
terhin getestetes kommerzielles Nachweissystem beruht auf einer Modifikation der Azocaseinmethode
(s. 2.8.1). Durch Succinylierung des Caseins wird eine erhöhte Sensitivität erreicht. Die Bestimmung
erfolgt ebenfalls photometrisch. Als alternative Methode eines sensitiven Proteinasenachweises wurde
parallel eine Detektion mittels Antikörpern (Westernblotanalyse, s. 2.12) für CPY und PrA durch-
geführt. Dazu werden die proteinasehaltigen Proben zuerst im SDS-Gel aufgetrennt, die aufgetrennten
Proteine auf eine Nitrozellulosemembran transferiert und die Proteinase mittels entsprechender Anti-
körper detektiert (s. 2.12.2). Die bestimmten Nachweisgrenzen für die einzelnen Methoden sowie die
nach Ross und Clark ermittelten schaumnegativen Proteinasekonzentrationen als Vergleich sind in
Tabelle 3.2 dargestellt.
Konzentration Proteinase A [µg/ml]
0,000 0,001 0,012
Schaumzahl nach R&C
0
60
80
100
120
3 Ergebnisse
41
Tab. 3.2: Konzentrationsbestimmung für Carboxypeptidase Y und Proteinase A mittels
verschiedener Methoden (s. 2.8.1, 2.12, 2.16).
Nachweisgrenzen der Konzentrations-
bestimmung mittels
Azocasein
[mg/ml]
Succinyliertes
Casein
[mg/ml]
Antikörper
(Westernblot)
[µg/ml]
Nachgewiesene
schaumnegative
Konzentrationen nach
R&C
[µg/ml]
Proteinase A 30 5,8 1,75 0,083
Carboxypeptidase Y 100 4 0,2 0,057
Mittels Azocasein konnten beide Hefeproteinasen in relativ hohen Konzentrationen nachgewiesen
werden: 30 mg/ml PrA und 100 mg/ml CPY. Eine sensitivere Konzentrationsbestimmung ist mit dem
Testsystem auf der Basis von succinyliertem Casein möglich. Die Nachweisgrenzen lagen 5-25-fach
unter denen des Azocasein-Systems.
Beim Einsatz von Antikörpern konnten spezifisch sehr geringe Konzentrationen der Hefeproteinasen
nachgewiesen werden. Diese gestatten einen Nachweis von 15-500-fach geringeren Proteinasekonzen-
trationen als die herkömmliche Azocaseinmethode. Als Nachweisgrenzen für PrA und CPY wurden
1,75 µg/ml bzw. 0,2 µg/ml bestimmt. Mit keinem der getesteten Verfahren konnten die nach Ross und
Clark ermittelten geringen schaumnegativen Proteinasekonzentrationen nachgewiesen werden.
Zusammenfassung Kapitel 3.1: Für Proteinasen der Carboxyl- und Serinproteinasefamilien konnte ein
negativer Einfluß auf die Bierschaumstabilität belegt werden. Für die Hefeproteinasen CPY und PrA
wurden 57 ng/ml bzw. 82 ng/ml als schaumschädigende Konzentrationen bestimmt. Bei längerer
Inkubation können auch PrA-Konzentrationen von 1 ng/ml eine Reduktion der Schaumstabilität
bewirken. Bei Vergleich verschiedener Verfahren ermöglicht die Verwendung von Antikörpern den
sensitivsten Nachweis von Proteinasekonzentrationen. Die nach der sehr empfindlichen Ross-und-
Clark-Methode bestimmten schaumnegativen Konzentrationen konnten mit keinem der anderen
getesteten Systeme nachgewiesen werden.
3 Ergebnisse
42
3.2 Verfahren zur Expression und Proteinreinigung von LTP1
Die biochemischen Wechselwirkungen von Proteinase A und LTP1 sollten anhand von nativen und
modifizierten LTP1-Formen untersucht werden. Dazu sollten verschiedene LTP1-Formen aus unter-
schiedlichen Quellen in ausreichender Ausbeute isoliert werden. Die Arbeiten konzentrierten sich auf
(i) die Expression und Reinigung von rekombinanten LTP1-Fusionsproteinen, sowie (ii) die
Gewinnung LTP1-haltiger Proteinpräparationen aus Bier und Gerste.
Für die heterologe Expression rekombianter LTP1 in E. coli wurden zwei Plasmide genutzt (s. 2.5).
Der Ertrag der Expression und Reinigung rekombinanter Proteine wird u. a. durch den verwendeten
E. coli-Stamm, die Zellkulturbedingungen und die Induktionsbedingungen beeinflußt. Die Effizienz
des Zellaufschlusses, die Löslichkeit des rekombinanten Proteins und die Wasch- und
Elutionsbedingungen während der Reinigung sind weiterhin für die Reinheit und Ausbeute eines
rekombinanten Proteins maßgebend. Native und denaturierende Proteinreinigung können ebenso einen
Einfluß auf die Ausbeute zeigen.
Zur Gewinnung von nativen LTP1 und unterschiedlich modifizierten LTP1-Formen wurden Protein-
präparationen aus Bier und Gerste mittels Affinitätschromatographie und Reversed-Phase-HPLC
gereinigt.
3.2.1 Expression rekombinanter LTP1-Fusionsproteine
3.2.1.1 Verwendete Konstrukte
Für die heterologe Expression in E. coli wurde das mit IPTG induzierbare T7 RNA-Polymerase
System genutzt. Ein aus dem Vektor pRSET B (Invitrogen, Karlsruhe) kloniertes Plasmid pSAm
(Abb. 2.1A) wurde von Frau A. Niederhaus zur Verfügung gestellt. In dem auf dieser Grundlage
exprimierten Fusionsprotein (FP) (Abb. 3.5) ist das native LTP1 N-terminal mit sechs Histidinresten
(Histag) fusioniert. Der Histag ermöglicht über spezifische Bindung an eine Ni-NTA-Matrix die
affinitätschromatographische Reinigung des (His)6-LTP1-Fusionsproteins und kann über eine spezifi-
sche Spaltsequenz enzymatisch durch Enterokinase abgetrennt werden. Da dieser zusätzliche enzyma-
tische Schritt mit Proteinverlust verbunden ist, wurde parallel das Plasmid pTYB1-LTP1 (Abb.2.1B)
konstruiert, auf dessen Grundlage die Expression eines LTP1-Intein-Fusionsproteins (s. Abb. 3.6)
möglich ist. Aus diesem FP kann LTP1 ohne zusätzlichen enzymatischen Schritt freigesetzt werden.
Im LTP1-Intein-Fusionsprotein ist das native LTP1 C-terminal mit einem Intein und einer Chitinbin-
dungsdomäne (CBD) fusioniert. Die CBD ermöglicht durch Bindung an eine Chitinmatrix die
Affinitätsreinigung des FPs. Das Intein ist ein aus S. cerevisiae stammendes Proteinspleißelement, das
in Gegenwart von Thiolverbindungen einem spezifischen Spleißprozeß unterliegt, infolge dessen
LTP1 vom Intein-CBD-Tag freigesetzt wird.
3 Ergebnisse
43
Abb. 3.5: Aufbau des rekombinanten (His)6-LTP1-Fusionsproteins. Die affinitätschromato-
graphische Reinigung des exprimierten Fusionsproteins erfolgt über den N-terminalen
Histag (6 Histidinreste), der mittels Enterokinase abgespalten werden kann. Histag: 23 AS,
LTP1: 91 AS
Abb. 3.6: Aufbau des rekombinanten LTP1-Intein-Fusionsproteins. Die affinitätschromato-
graphische Reinigung des exprimierten Fusionsproteins erfolgt über die C-terminale Chitin-
Bindungs-Domäne (CBD). LTP1 kann über einen thiolinduzierbaren, inteinvermittelten
Proteinspleißprozeß aus dem FP freigesetzt werden. Intein-CBD-Tag: 454 AS, LTP1: 91
AS
3.2.1.2 Optimierung
(His)6-LTP1-Fusionsprotein: Es wurden verschiedene E. coli-Stämme mit dem Plasmid pSAm trans-
formiert, um den für eine optimale Expression des (His)6-LTP1-FP geeigneten Stamm zu ermitteln
(s. 2.4). Die Kultivierung der Stämme, Expression und Reinigung des (His)6-LTP1-FPs ist unter 2.7.1
beschrieben.
Die Induktion der Proteinexpression erfolgte für alle Stämme in der logarithmischen Wachstumsphase
mit 1 mM IPTG. Für die Stämme BL21(DE3)pLysS und BL21(DE3)pLysE erfolgte die Zellernte nach
drei Stunden zu Beginn der stationären Wachstumsphase. Für die Stämme BL21(DE3), BL21(DE3)-
XL1-Blue und BL21(DE3)-CodonPlus war nach der Induktion weiterhin ein logarithmisches
Wachstum zu beobachten, so daß die Zellernte nach drei Stunden noch während der logarithmischen
Wachstumsphase erfolgte. Es wurden nichtinduzierte (Zo) und induzierte Zellen (Zi) aller Stämme im
SDS-Gel analysiert. Bei Expression des (His)6-LTP1-FPs sollte in der Probe der induzierten Zellen
eine deutliche Bande mit dem Molekulargewicht von 14 kDa erkennbar sein. In Abb. 3.7A sind
stellvertretend die Ergebnisse für die Stämme BL21(DE3)-pLysS und BL21(DE3)-CodonPlus
dargestellt. Für keinen der getesteten Stämme ist eine 14 kDa Bande zu erkennen. In den durch
Proteinreinigung gewonnenen Eluaten (Abb. 3.7B) wird hingegen eine schwache Bande für das FP
detektiert, die für alle getesteten Stämme von gleicher Intensität ist.
N C
LTP1-Sequenz CBD
Intein
64,8 kDa
55 kDa
13,8 kDa
9,8 kDa
NC
LTP1-Sequenz
Spaltsequenz für Enterokinase
Histag
3 Ergebnisse
44
Abb. 3.7: SDS-Gel-Elektrophorese für (His)6-LTP1-Fusionsprotein-exprimierende Zellen und
gereinigtes Fusionsprotein. (A) nichtinduzierte und mit 1 mM IPTG induzierte Zellen der
E. coli-Stämme BL21(DE3)pLysS und BL21(DE3)-CodonPlus. Aufgetragen wurden 50 µg
Protein – Bestimmung nach Bradford. Die Proteinfärbung erfolgte mit Coomassie. (B)
Eluate E1 und E2 nach der Proteinreinigung (s. 2.7.1). Aufgetragen wurden je 20 µl. Die
Proteinfärbung erfolgte mit Silber (2.11.2).
Keinen Einfluß auf die Expressionshöhe der Proteine zeigten nachfolgend genannte
Kulturbedingungen: (i) das Animpfen der Vorkultur aus einer Gefrierkulutur bzw. mit frisch
transformierten Zellen, um einen möglichen Plasmidverlust in Abhängigkeit vom Alter der
transformierten Zellen auszuschließen und (ii) die Kultivierung der Zellen in Erlenmeyerkolben statt
Schottflaschen, um eine verbesserte Sauerstoffversorgung zu gewährleisten. Die Wachstumsphase der
Zellen zum Zeitpunkt der Induktion und Dauer der Induktion hatten ebenfalls keinen Einfluß auf die
Expressionsstärke.
LTP1-Intein-Fusionsprotein: Das Plasmid pTYP1-LTP1 wurde in den E. coli-Stamm 2566 transfor-
miert. Mit dem transformierten Stamm wurden Versuche zur Bestimmung der optimalen Induktions-
bedingungen für die Proteinexpression durchgeführt. Die Zellen wurden wie unter 2.7.2 beschrieben
bis zur Hauptkultur geführt und die Proteinexpression mit 0,3 mM IPTG während der logarithmischen
Wachstumsphase induziert. Die Induktion erfolgte bei verschiedenen Temperaturen für unterschied-
liche Zeitspannen: Probe A bei 28 °C für 3 h, Probe B bei 28 °C für 5 h, Probe C bei Raumtemperatur
(RT) für 5 h, Probe D bei RT für 14 h. Nichtinduzierte Zellen sowie induzierte Zellen des jeweiligen
Ansatzes wurden im Westernblot mit CBD-Antikörpern analysiert. Das exprimierte LTP1-Intein-FP
hat ein Molekulargewicht von 64,8 kDa. Für die nichtinduzierten Zellen (Zo) ergab sich wie erwartet
kein Signal (s. Abb. 3.8). Eine Bande von entsprechender Größe wurde nur für eine Induktion bei
Raumtemperatur für 14 h detektiert (Probe Di). Keinen Einfluß auf die Expression zeigte eine
Erhöhung der IPTG-Induktionskonzentration auf 1 mM IPTG.
A
kDa
6,5 –
14,4 –
16,9 –
26,6 –
BL21(DE3)-pLysS
IPTG – +
...-CodonPlus
– +
BL21(DE3)-pLysS
E1 E2
...-CodonPlus
E1 E2
B
3 Ergebnisse
45
Abb. 3.8: LTP1-Intein-Fusionsprotein-exprimierende Zellen des E. coli-Stammes 2566 im
Westernblot. Einfluß unterschiedlicher Induktionszeiten und –temperaturen auf die
Expression. Zo – nichtinduzierte Zellen; Zellen nach Induktion mit 0,3 mM IPTG: Ai
(Induktionstemperatur 28 °C, Induktionszeit 3h); Bi (28 °C, 5h); Ci (RT; 5h); Di (RT; 14h);
aufgetragen je 20 µg Protein – mittels Bradford bestimmt. Die Auftrennung der Proben
erfolgte im 15%igen SDS-Gel, die Analyse im Westernblot mit anti-CBD-Antikörper.
3.2.2 Reinigung rekombinanter LTP1-Fusionsproteine
(His)6-LTP1-Fusionsprotein: Der Zellaufschluß erfolgte wie unter 2.7.1 beschrieben. Das im
Überstand gelöste Fusionsprotein (FP) wurde auf eine Ni-NTA-Säule gegeben, an die es via Histag
bindet. Die Elution des (His)6-LTP1-FP erfolgt mit imidazolhaltigem Elutionspuffer. Für eine hohe
Reinheit und Ausbeute des (His)6-LTP1-FPs wurden die Wasch- und Elutionsbedingungen überprüft.
Ziel war es zum einen, unspezifisch an die Ni-NTA-Matrix gebundene Proteine mit Imidazol-
konzentrationen, niedriger als im Elutionspuffer, abzutrennen, zum anderen die spezifische
Imidazolkonzentration für eine Elution des (His)6-LTP1-FPs zu bestimmen. Nach Waschen des an die
Ni-NTA-Matrix gebundenen FPs mit Waschpuffer (50 mM Imidazol) bis zu einer OD280nm< 0,01
wurde mit steigenden Imidazolkonzentrationen eluiert. Die einzelnen Elutionsproben wurden im SDS-
Gel analysiert (Abb. 3.9). In den Elutionsproben mit 60, 80 und 100 mM Imidazol ist eine
zunehmende Bande im Molekulargewichtsbereich von fast 80 kDa zu erkennen, die vermutlich einem
unspezifisch an die Ni-NTA-Matrix gebundenen Protein zugeordnet werden kann. Ab einer
Imidazolkonzentration von 120 mM wird das 13,8 kDa große (His)6-LTP1-FP eluiert. Außerdem
ergeben sich wiederum Banden im Größenbereich von 80 kDa, desweiteren von 26 kDa. Die 26 kDa-
Bande wird durch unvollständig denaturierte (His)6-LTP1-FP-Dimere hervorgerufen. Für die mit 140-
180 mM Imidazol eluierten Proben ergibt sich ein ähnliches, abgeschwächtes Bandenmuster wie für
die 120 mM-Probe. Für Imidazolkonzentrationen > 180 mM konnte kein Elution des FP festgestellt
werden.
LTP1-Intein-FP
(64,8 kDa)
Zo Ai Bi Ci Di
3 Ergebnisse
46
Abb. 3.9: Reinigung von (His)6-LTP1-Fusionsprotein. Abtrennung unspezifisch an die Ni-NTA-
Matrix gebundener Proteine über stufenweise Erhöhung der Imidazolkonzentration im
Elutionspuffer. gr.St. und kl.St. – Proteingrößenstandards broad range und low range
(beide Biorad).
Der Versuch zeigt die Möglichkeit einer Abtrennung unspezifisch an die Ni-NTA-Matrix gebundener
Proteine durch Waschen mit Puffer mit 100 mM Imidazol. Eine vollständige Elution des Zielproteins
wird mit einer Imidazolkonzentration ≥ 180 mM erreicht. Das Protokoll wurde entsprechend angepaßt.
Im Vergleich zur beschriebenen nativen Proteinreinigung wurden mit der denaturierenden
Proteinreinigung keine höheren Proteinausbeuten erzielt. Durchschnittlich konnten 70 µg (His)6-
LTP1-Fusionsprotein aus 100 ml Nährmedium gereinigt werden.
Zur Abtrennung des Histags vom LTP1 wurden Versuche mit verschiedenen Enterokinasen durchge-
führt (Tab. 2.6). Dazu wurde das FP mittels Ultrafiltration konzentriert (s. 2.9.3) und in entsprechende
Reaktionspuffer umgepuffert. Mit der aus Kalbsdarm gereinigten Enterokinase (Boehringer) war eine
partielle Abspaltung des Histags möglich, andererseits war ein Abbau des gesamten Fusionsproteins
zu beobachten. Dieser Abbau kann durch unspezifische, zusätzliche Proteinaseaktivitäten im
Enterokinasepräparat bedingt sein. Um diese zusätzlichen Proteinaseaktivitäten auszuschließen wurde
eine rekombinante Enterokinase (Novogen) getestet, mit der eine enzymatische Abtrennung des
Histags vom (His)6-LTP1-FP nicht möglich war.
LTP1-Intein-Fusionsprotein: In der Abbildung 3.10 sind im Westernblot analysierte Proben eines
Reinigungsprozesses des LTP1-Intein-FP abgebildet. Die Induktion der Proteinexpression erfolgte,
wie unter 3.2.1.2 bestimmt, bei Raumtemperatur für 14 h. In der Probe der induzierten Zellen (Zi) ist
im Vergleich zu den nichtinduzierten Zellen (Zo) eine Bande für das LTP1-Intein-FP mit einem
Molekulargewicht von 64,8 kDa zu erkennen. Da ein erster Zellaufschluß mittels Lyse und Ultraschall
das LTP1-Intein-FP nicht vollständig aus den Zellen freisetzte, wurde für eine effektivere Freisetzung
60 80 100 120 gr.St kl.St 140 160 180 mM
Imidazol
– 49,1
– 34,8
– 28,9
– 20,6
– 14,4
– 7,1
kDa
– 80,0
3 Ergebnisse
47
in den folgenden Versuchen mit dem Zellpellet (Zp) ein zweiter Aufschluß durchgeführt. Trotz dieser
Verfahrensweise ist in der Probe Zp noch LTP1-Intein-FP nachzuweisen und zusätzlich eine Bande
für LTP1 (ca. 10 kDa). LTP1 kann bereits in der SDS-Probe nach Zugabe von DTT und den dadurch
induzierten Spleißprozeß freigesetzt werden. Im Ergebnis eines zweiten Aufschlusses zeigt sich für
den Zellüberstand Ü2 im Vergleich zum Zellüberstand Ü1 (nach dem ersten Aufschluß) eine stärkere
Bande für das FP. Die Zellüberstände wurden nacheinander über die Chitinsäule gegeben. Anhand der
Durchflußprobe D1 ist zu erkennen, daß das im Ü1 gelöste FP vollständig an die Chitinsäule bindet.
Die schwache Bande der Durchflußprobe D2 zeigt dagegen, daß das im Ü2 gelöste FP aufgrund der
begrenzten Säulenkapazität nicht vollständig gebunden wird. Zum Abtrennen des LTP1 vom Intein-
Chitin-Tag ergab sich für den Spleißprozeß eine Inkubation mit 50 mM DTT über Nacht bei
Raumtemperatur als effektiv. In den nach dem Spleißprozeß gewonnenen Eluaten E1 und E2 ist eine
starke, ca. 10 kDa große Bande für das rekombinante LTP1 (rLTP1) zu detektieren.
Abb. 3.10: Proben aus dem Reinigungsprozeß des LTP1-Intein-Fusionsproteins im Western-
blot. Die Auftrennung der Proben erfolgte im 17,5%igen SDS-Gel, die Analyse im
Westernblot mit polyklonalen LTP1-Antikörpern. Zo – nichtinduzierte Zellen; Zi –
induzierte Zellen vor der Ernte; Zp – Zellpellet nach dem zweiten Zellaufschluß; Ü1/Ü2 -
Überstand nach dem ersten und zweiten Zellaufschluß zur Beladung der Chitinsäule;
D1/D2 – Durchfluß nach dem Beladen der Säule; E1/E2 – erstes und zweites Eluat nach
dem induzierten Proteinspleißprozeß; B-Probe – Probe des FP-Matrix-Gemischs; Zo, Zi,
Zp - aufgetragen je 20 µg Gesamtprotein; Ü und D - aufgetragen je 5 µg Gesamtprotein; E
- aufgetragen je 20 µl; B-Probe (an Matrix gebundenes FP) – aufgetragen 5 µl. Ltp-St.:
Standard aus Gerste = 200 ng. rLTP1 – rekombinantes LTP1. Die Gesamtproteinmenge
wurde nach Bradford bestimmt.
Von der Chitinmatrix wurde nach der Elution die sogenannte B-Probe entnommen. Nach optimalem
Spleißprozeß sollte an die Chitinmatrix nur noch die Intein-CBD-Fusion (56 kDa) gebunden sein, die
mittels LTP1-AK nicht zu detektieren ist. Die Bande für das LTP1-Intein-FP in der B-Probe zeigt
jedoch, daß der Spleißprozeß nicht vollständig erfolgte, d. h. nicht gespleißtes LTP1-Intein-FP weiter-
hin an der Chitinmatrix gebunden ist.
Zo Zi Zp B-Pr. Ü1 Ü2 D1 D2 E1 E2 Ltp-St.
LTP1-Intein-FP
(64,8 kDa)
r LTP1
(9,8 kDa)
3 Ergebnisse
48
In dem dargestellten Versuch wurde eine maximale Ausbeute von 125 µg Protein aus 100 ml
Nährmedium erzielt. Geringe Proteinexpression und Verluste, z. B. während der Lagerung der
Zellpellets bei –20 °C, führten im Durchschnitt jedoch zu geringeren Ausbeuten von ≈50 µg/100 ml.
Vorteile des Inteinsystems gegenüber dem Histagsystem sind (i) die Reinigung von LTP1 in einem
Schritt ohne Verwendung einer Peptidase sowie (ii) die relativ hohe Reinheit des gewonnen LTP1
durch die spezifische, Chitin-vermittelte affinitätschromatographische Reinigung.
3.2.3 Reinigung von LTP1 aus Bier
Die Gewinnung von während des Brauprozesses modifizierter LTP1-Formen direkt aus Bier sollte
über die spezifische Bindung von LTP1 an anti-LTP1-Antikörper erfolgen. Dazu wurde eine Immun-
affinitätssäule durch die Kopplung der Antikörper (AK) an die entsprechende Matrix hergestellt (s.
2.13). Für die Probenvorbereitung wurde Pilsner Bier entgast, gefiltert und der pH-Wert für eine
optimale Bindung von LTP1 an die matrixgekoppelten Antikörper auf 7,0-7,5 eingestellt. Im
Westernblot werden Puffer mit diesem pH-Wert für eine Protein-AK-Bindung verwendet. In
Abbildung 3.11 sind die gewonnenen LTP1-Mengen in Abhängigkeit der eingesetzten Biervolumens
dargestellt.
Abb. 3.11: Korrelation der gewonnenen Menge LTP1 in Abhängigkeit des eingesetzten
Biervolumens zur Kapazitätsbestimmung der Affinitätssäule. Reinigung erfolgte über
an eine Sepharosematrix gekoppelte Kaninchen-anti-LTP1-Antikörper (s. 2.13). Eingesetzt
wurde Pilsner Bier mit einer durchschnittlichen LTP1-Konzentration von 50 µg/ml. Die
Bestimmung der LTP1-Konzentration erfolgte nach Bradford.
R2 = 0,8028
0
100
200
300
400
500
600
0 200 400 600 800 1000
Eingesetztes Biervolumen [ml]
LTP1 [µg]
3 Ergebnisse
49
Es ist eine lineare Abhängigkeit zu beobachten. Die Proteinausbeute betrug durchschnittlich 60 µg/
100 ml Bier. Eine Analyse der Eluate im SDS-Gel erbrachte nur eine 10 kDa große Bande für LTP1
(Ergebnis nicht dargestellt), so daß davon ausgegangen wird, daß die ermittelte Gesamtproteinmenge
gleich der gereinigten LTP1-Menge ist. Nach mehreren Versuchen war ein Zusetzen der Säule durch
Bierinhaltsstoffe zu beobachten, was zu einer deutlichen Abnahme der Proteinausbeute führte.
Dadurch konnte die maximale Kapazität der Säule nicht ermittelt werden. Das immunaffinitäts-
chromatographisch gewonnene LTP1 erwies sich bei 4 °C und -20 °C als bedingt lagerfähig und
wurde vorrangig für RP-HPLC-Versuche eingesetzt.
Die beschriebene immunaffinitätschromatographische Methode unter Verwendung von Kaninchen-
anti-LTP1-Antikörpern ist, bei entsprechender Probenvorbereitung, für eine relativ schnelle und ein-
fache Reinigung von LTP1 aus Proben wie Bier, Würze oder Gerste mit gleichbleibend zufrieden-
stellenden Erträgen geeignet.
In der Tabelle 3.3 sind die Ausbeuten aller LTP1-Reinigungsverfahren unter der Annahme dargestellt,
daß die jeweils ermittelte Gesamtproteinmenge der gereinigten LTP1-Menge entspricht.
Tab. 3.3: Übersicht verschiedener Möglichkeiten der LTP1-Gewinnung und die jeweils
erzielten Erträge.
Proteinausbeuten
rekombinantes LTP1 mittels
heterologer Expression in E. coli
endogenes LTP1 mittels
Immunaffinitätschromatographie
Histag-Reinigungssystem
≈70 µg (His)6-LTP1-
Fusionsprotein/ 100 ml
Nährmedium
Intein-Reinigungssystem
≈ 50 µg rekombinantes
LTP1/ 100 ml Nährmedium
≈ 60 µg/100 ml Bier
3.2.4 Reinigung von LTP1-haltigen Fraktionen aus Bier und Gerste
Für die Reinigung LTP1-haltiger Fraktionen aus Bier und Gerste wurden die unterschiedlichen
physiko-chemischen Eigenschaften von Proteinen genutzt. Beim Verfahren der Reversed-Phase-High-
Liquid-Chromatographie (RP-HPLC) können Probengemische mittels verschiedener Säulenmatrices
entsprechend ihrer Hydrophobizität aufgetrennt werden. Die im folgenden beschriebenen Versuche
wurde mit einer C4-Säule (Nucleosil 300-5 MPN, 250 mm x 4 mm, Macherey und Nagel) durch-
geführt. Als Elutionsmittel wurde ein Methanol/Wasser-Gemisch verwendet. Die Auftrennung erfolgte
mit einem Methanolgradienten, wobei die Elution der stärker hydrophoben Proteine zu einem späteren
Zeitpunkt erfolgt als die der weniger hydrophoben. Das für die Auftrennung verwendete Protokoll ist
im Anhang aufgeführt (Tab. 7.1). In einem ersten Reinigungsschritt wurden Proteinpräparationen aus
Bier und Gerste mittels fraktionierter Ammoniumsulfatfällung gewonnen (s. 2.14). Nach der HPLC-
3 Ergebnisse
50
Trennung zeigten die Proteinpräparationen aus Bier einen breiten Peak von Rt = 21 bis 29 min
(Abb. 3.12A). Drei Fraktionen des Peaks (B22, B24 und B26) wurden am Rotationsverdampfer einge-
engt und mittels SDS-Gel und Westernblot auf das Vorhandensein von LTP1 hin untersucht. Eine
deutliche Bande des 10 kDa großen LTP1 ist in allen Fraktionen zu detektieren (Abb. 3.12B). In
Fraktion 26 ist zusätzlich eine 40 kDa große Bande erkennbar, die dem aus der Gerste stammenden
Protein Z (auch 40 kDa-Protein genannt) zuzuordnen ist. Mittels Immundetektion konnte in allen drei
Fraktionen LTP1 nachgewiesen werden (Abb. 3.12C).
Abb. 3.12: Reinigung LTP1-haltiger Fraktionen aus Bier mittels semipräparativer RP-HPLC. (A)
Chromatogramm einer aus Bier mittels Ammoniumsulfatfällung konzentrierten Protein-
präparation. Punktlinie – Wasser/Methanol-Gradient. (B) SDS-Gel der Fraktionen B22, B24
und B26 und (C) Westernblot der Fraktionen B22, B24, B26 mit polyklonalen anti-LTP1-
Antikörpern. LTP1-St: LTP1 aus Gerste.
A
B22
B24
B26
20% B
80% B
95% B
0
100
500
900
10 15 20 25 30
mAU
min
B
MW-St B22 B24 B26
kDa
26,6 –
16,9 –
14,4 –
C
LTP1-St B22 B24 B26
3 Ergebnisse
51
Die Auftrennung von Proteinpräparationen aus Gerste zeigt einen breiten Elutionspeak von Rt= 19 bis
22 min und distinkte Einzelpeaks bei Rt= 22,5; 25; 26 und 26,5 (Abb. 3.13A). In den Fraktionen G20
und G21 konnte mittels Westernblotanalyse LTP1 bestimmt werden (Abb. 3.13B). LTP1 konnte auch
in der Fraktion G19 nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt).
Im Ergebnis der HPLC-Trennung zeigte sich ein differenziertes Trennverhalten von Proteinpräpara-
tionen aus Bier und Gerste. Zurückzuführen ist diese Tatsache möglicherweise auf die während des
Mälz- und Brauprozesses veränderte LTP1-Struktur.
Abb. 3.13: Reinigung LTP1-haltiger Fraktionen aus Gerste mittels semipräparativer RP-HPLC.
(A) Chromatogramm einer aus Gerste mittels Ammoniumsulfatfällung konzentrierten Pro-
teinpräparation. Punktlinie – Wasser/Methanol-Gradient. (B) Westernblot der Fraktionen
G20 bis G26 mit polyklonalen anti-LTP1-Antikörpern.
Zusammenfassung Kapitel 3.2: Für die Expression rekombinanter LTP1-Fusionsproteine wurden zwei
Plasmide genutzt. Die Reinigung der Fusionsproteine erfolgte jeweils über einen Affinitätstag. Um
eine höhere Proteinausbeute zu erzielen wurden verschiedene Parameter der Expression und
Reinigung optimiert. Desweiteren wurde LTP1 immunaffinitätschromatographisch unter Verwendung
von anti-LTP1-Antikörpern aus Bier gereinigt. Die Ausbeute der Reinigungsverfahren lagen bei
0,5 - 0,7 mg/l für rekombinantes LTP1-Fusionsprotein bzw. rekombiantes LTP1 und 0,6 mg/l für
endogenes LTP1 aus Bier. Mittels semipräparativer RP-HPLC konnten aus Gerste- und
Bierproteinpräparationen LTP1-haltige Fraktionen gewonnen werden.
B
G20 G21 G22 G23 G24 G25 G26
A
20%B
80%B
95%B
10 15 20 25 30
mAU
min
0
25
50
140
G19
G22
G20
G23
G24
G25
G26
G21
3 Ergebnisse
52
3.3 Unterschiedliche Sensitivität des endogenen und rekombinanten LTP1 sowie des
40 kDa-Proteins gegenüber Proteinase A
Nachdem für Proteinase A ein direkter Einfluß auf die Schaumstabilität nachgewiesen wurde, sollte
untersucht werden, ob bestimmte Proteine in Bier bevorzugt durch Proteinase A (PrA) abgebaut
werden. Es sollte der Einfluß von Proteinase A direkt auf Proteine in Bier, auf aus Bier und Gerste ge-
reinigte LTP1-haltige Proteinpräparationen sowie auf rekombinante LTP1 und LTP1-Fusionsproteine
untersucht werden.
3.3.1 Einfluß von Proteinase A auf Proteine in Bier
Pasteurisierte Bierproben wurden mit 4,9 bzw. 9,6 µg/ml Proteinase A (PrA) inkubiert und die Proben
parallel mittels SDS-Gel und Westernblot analysiert. In der Abbildung 3.14 sind für die nicht
proteinasebehandelten Probe zwei deutliche Banden mit einem Molekulargewicht von ca. 40 und
10 kDa zu erkennen (Abb. 3.14A, Bahn 1). Die 40 kDa Bande kann dem Protein Z zugeordnet werden.
Bei der 10 kDa Bande handelt es sich um endogenes LTP1, wie durch Westernblotanalyse mit anti-
LTP1-Antikörpern bestätigt wurde (Abb. 3.14B, Bahn 4). Nach Inkubation mit PrA ist im SDS-Gel
noch die 40 kDa-Bande zu erkennen. Die LTP1-Bande kann nach Inkubation mit PrA weder im SDS-
Gel noch im Westernblot nachgewiesen werden. (Abb. 3.14A, Bahnen 2 und 3, Abb. 3.14B, Bahnen 5
und 6). Dieses Ergebnis weist auf eine hohe Sensitivität des endogenen LTP1 gegenüber PrA hin,
während Protein Z unter den gegebenen Bedingungen eine Resistenz gegenüber PrA zeigt. Mögliche
Abbauprodukte konnten mit dem verwendeten SDS-Gelsystem nicht nachgewiesen werden.
Abb. 3.14: Nachweis von Proteinen in Bier nach der Inkubation mit Proteinase A. (A) SDS-Gel-
Elektrophorese - Bahn 1 – ohne PrA; Bahn 2 und 3 – nach Inkubation mit 4,9 µg/ml bzw.
9,8 µg/ml PrA (5 Tage bei Raumtemperatur). St – Polypeptidstandard + BSA. (B)
Westernblot mit polyklonalen anti-LTP1-Antikörpern. Bahn 4: ohne PrA; Bahn 5 und 6 -
nach Inkubation mit 4,9 µg/ml bzw. 9,8 µg/ml PrA. LTP1-St.: LTP1 aus Gerste.
A
Bahn St 1 2 3
kDa
63 –
26,6 –
16,9 –
14,4 –
6,5 –
B
LTP1-St. 456
3 Ergebnisse
53
3.3.2 Abbau von rekombinantem LTP1 durch Proteinase A
Für Abbauversuche mit rekombinantem (His)6-LTP1-Fusionsprotein (s. 3.2.2) wurde pasteurisiertem
Bier 240 µg/ml (His)6-LTP1-Fusionsprotein zugesetzt und mit 8,27 µg/ml PrA für fünf Tage bei
Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Proben im SDS-Gel analysiert. Für die reine
Bierprobe sind die zwei Banden von 10 kDa und 40 kDa Größe für endogenes LTP1 und Protein Z zu
erkennen (Abb. 3.15, Bahn 1). In den mit (His)6-LTP1-Fusionsprotein dotierten Proben wurde eine
zusätzliche Bande von 14 kDa für das rekombinante LTP1-FP detektiert (Abb. 3.15, Bahnen 2 und 3).
In allen PrA-behandelten Proben (Abb. 3.15, Bahnen 3 und 4) ist ein Verschwinden der 10 kDa Bande
des endogenen LTP1 zu beobachten. Das rekombinante LTP1-FP als auch das Protein Z werden
hingegen nicht abgebaut (Abb. 3.15, Bahnen 3 und 4). Ein Abbau des rekombinanten (His)6-LTP1-
Fusionsproteins durch PrA kann möglicherweise konformationsbedingt durch den Histag behindert
werden.
Abb. 3.15: Nachweis der Resistenz von rekombinantem (His)6-LTP1-Fusionsprotein in Bier
gegenüber Proteinase A. Pasteurisiertes Pilsner Bier wurde mit 240 µg/ml (His)6-LTP1-
Fusionsprotein versetzt. Die Inkubation mit 8,27 µg/ml Proteinase A erfolgte bei
Raumtemperatur über fünf Tage. Die Proben wurden im SDS-Gel analysiert. Es wurden je
20 µl aufgetragen. Die Proteinfärbung erfolgte mittels Coomassie.
Anhand des rekombinanten LTP1 (rLTP1) ohne Histag wurde überprüft, inwiefern der Histag im
(His)6-LTP1-FP den Abbau durch PrA verhindert. Das rLTP1 wurde mittels Intein-System
(IMPACT™-CN-System, s. 2.7.2) gereinigt und über Ultrafiltration (s. 2.9.3) konzentriert. Die
Inkubation von 140 µg/ml rekombinanten LTP1 mit 12 µg/ml Proteinase A erfolgte in Na-Citrat-
Puffer (pH 4,6) bei Raumtemperatur für drei Tage. Eine Analyse im SDS-Gel (Abb. 3.16) erbrachte
für die nicht proteinasebehandelte Probe (Bahn 1) eine deutliche Bande für LTP1, die infolge der
Proteinasebehandlung verschwand (Bahn 2). Das rekombinante LTP1 wird im Unterschied zum
rekombinanten Histag-LTP1-FP durch Proteinase A abgebaut, was eine Behinderung von Proteinase A
durch den Histag belegt.
1 2 34
– + + – (His)6-LTP1-FP
– – + + Proteinase A
kDa
– 6,5
– 14,4
– 16,9
– 26,6
3 Ergebnisse
54
Abb. 3.16: Nachweis des Abbaus von rekombinantem LTP1 durch Proteinase A mittels SDS-
Gel-Elektrophorese. rLTP1 wurde mittels INTEIN™-System gereinigt (s. 2.7.2). Die
Inkubation von 140 µg/ml rekombinanten LTP1 erfolgte in Na-Citrat-Puffer (pH 4,6) mit
12 µg/ml Proteinase A bei Raumtemperatur für drei Tage. Die Proteinfärbung erfolgte
mittels Silber. LTP1-St: LTP1 aus Gerste.
3.3.3 Unterschiedliche Proteinase A-Sensitivität von LTP1 aus Gerste und Bier
In weiteren Versuchen sollte der Einfluß von Proteinase A anhand von Proteinpräparationen aus Bier
und Gerste verglichen werden. Dazu wurden Proteinpräparationen aus Bier und Gerste mittels frak-
tionierter Ammoniumsulfatfällung gewonnen (s. 2.9.2). Proben mit einer Proteinkonzentration von
ca. 200 µg/ml wurden mit 12 µg/ml Proteinase A (PrA) inkubiert und nach fünftägiger Inkubation bei
Raumtemperatur mittels SDS-Gel und RP-HPLC analysiert. Im SDS-Gel sind in der
Proteinpräparation aus Bier die typischen 40 und 10 kDa großen Banden für Protein Z und LTP1 zu
erkennen (Abb. 3.17, Bahn 1a). Nach PrA-Behandlung ist die LTP1-typische Bande von 10 kDa
verschwunden (Bahn 1b). Das Ergebnis belegt wiederum die Resistenz des Protein Z gegenüber PrA
unter den gegebenen Bedingungen.
Für die Gerstenproteinprobe ergibt sich ein Proteinmuster zahlreicher Banden mit verschiedenen
Molekulargewichten (Bahn 2a). In der unbehandelten und behandelten Gerstenproteinprobe ist sowohl
die 10 kDa große Bande für LTP1 als auch die 40 kDa Bande für Protein Z zu erkennen. Das
Bandenmuster ändert sich nach Inkubation mit PrA nicht (Bahn 2b). Das LTP1 der
Gerstenproteinpräparation wird demnach nicht durch Proteinase A abgebaut. Ursache für die
Proteinasesensitivität des Bier-LTP1 können mälz- und brauprozeßbedingte Modifikationen sein.
kDa
26,6 –
16,9 –
14
,
4 –
1 2 LTP1-St
Proteinase A – + –
3 Ergebnisse
55
Abb. 3.17: Analyse von Proteinpräparationen aus Bier und Gerste nach Inkubation mit
Proteinase A mittels SDS-Gel-Elektrophorese. Die Proteinpräparationen wurden durch
Ammoniumsulfatfällung gewonnen (s. 2.9.2). 1a – Proteinpräparation aus Bier ohne
Proteinase A; 1b – Proteinpräparation aus Bier nach Inkubation mit Proteinase A; 2a –
Proteinpräparation aus der Gerste ohne Proteinase A; 2b – Proteinpräparation aus der
Gerste nach Inkubation mit Proteinase A. Die Inkubation der Proben mit einer
Proteinkonzentration von ca. 200 µg/ ml erfolgte über fünf Tage bei Raumtemperatur mit 12
µg/ml Proteinase A. Es wurden je 20 µl Probe aufgetragen. St – Proteinstandard (low
range, Biorad). Die Proteinfärbung erfolgte mit Coomassie.
Die im SDS-Gel analysierten Proteinpräparationen aus Bier und Gerste wurden ebenfalls mittels RP-
HPLC untersucht. Dabei ergab sich für die proteinaseunbehandelte Proteinpräparation aus Bier (Abb.
3.17, Bahn 1) ein ähnliches Elutionsprofil wie in vorangegangenen Untersuchungen (Abb. 3.12).
Anhand dieser Untersuchungen können die im Chromatogramm (Abb. 3.18A) gekennzeichneten
Peaks P3 und P4 als LTP1-haltige Peaks charakterisiert werden. Die zu beobachtende Abnahme der
Peakflächen von P3 und P4 nach Inkubation der Probe mit PrA resultiert aus dem Abbau von LTP1.
Gleichzeitig nehmen die Peakflächen von P1 und P2 zu, was vermutlich auf die Entstehung von LTP1-
Abbauprodukten zurückzuführen ist. Analysen der Proteinpräparationen aus der Gerste ergeben für die
unbehandelte und proteinasebehandelte Probe identische Chromatogramme. Das Elutionsprofil ist
ähnlich dem früher bestimmten Elutionsprofil für Gerstenproteine (Abb. 3.13). Die Fraktionen im
Elutionsbereich von ca. Rt= 19 bis Rt= 22 sind demnach LTP1-haltig. Bereits im SDS-Gel war für die
Gerstenpräparationen (Abb. 3.17, Bahn 2b) kein Proteinabbau durch PrA festzustellen. Dies läßt sich
durch die RP-HPLC-Analyse bestätigen, da keine Veränderungen im Chromatogramm nach der PrA-
Inkubation zu beobachten sind.
kDa
- 26,6
- 16,9
- 14,4
1a 1b 2a 2b 3
Protein Z
LTP1
3 Ergebnisse
56
Abb. 3.18: Analyse von Proteinpräparationen aus Bier und Gerste nach Inkubation mit
Proteinase A mittels RP-HPLC. Analysiert wurden die in Abb. 3.17 im SDS-Gel
dargestellten Proteinproben. (A) Chromatogramm einer Proteinpräparation aus Bier vor
der Inkubation mit Proteinase A. Punkt-Strich-Linie - nach der Inkubation mit Proteinase A.
(B) Identische, übereinandergelegte Chromatogramme einer Proteinpräparation aus
Gerste vor und nach der Inkubation mit Proteinase A. Die Inkubation der Proben mit einer
Proteinkonzentration von ca. 200 µg/ml erfolgte über fünf Tage bei Raumtemperatur mit 12
µg/ml Proteinase A.
Zusammenfassung Kapitel 3.3: LTP1, eine der Hauptproteinkomponenten in Bier, wird durch
Proteinase A (PrA) abgebaut, während das Protein Z, eine weitere Hauptproteinkomponenten, nicht
abgebaut wird. Für ein rekombinantes LTP1-Fusionsprotein (His)6-LTP1-FP) und ein rekombinantes
LTP1 ergeben sich ebenfalls unterschiedliche Sensitivitäten gegenüber PrA. Das rekombinante LTP1
unterliegt einem Abbau durch PrA, währenddessen der Abbau des LTP1-Fusionsproteins durch den
Histag behindert wird. Auch das Gersten-LTP1 erwies sich unter gegebenen Bedingungen im
Gegensatz zum Bier-LTP1 als PrA-resistent. Die proteinasesensitive LTP1-Form in Bier wird
vermutlich durch Modifikationen während des Mälz- und Brauprozesses hervorgerufen.
A
20 %B
80%B
95% B
P1 P2
P3 P4
mAU
min
10 15 20 25 30
0
50
200
350
100
B
95%B
20%B
80%B
mAU
min
10 15 20 25 30
0
10
50
120
3 Ergebnisse
57
3.4 Nachweis von LTP1-Abbauprodukten in Bier nach Inkubation mit Proteinase A aus
S. cerevisiae mit Hilfe von Reversed-Phase-HPLC und Massenspektrometrie
In Hinblick auf die Entwicklung eines sensitiven Nachweises für Proteinase A (PrA) in Bier sollten
potentielle Proteinase A-Spaltsequenzen anhand gereinigter LTP1-Abbauprodukte identifiziert
werden.
Im vorangegangenen Abschnitt 3.3.3 war ein differenziertes Trennverhalten in der Reversed-Phase-
HPLC (RP-HPLC) von LTP1-haltigen, PrA-behandelten Proteinpräparationen aus Bier im Vergleich
zu unbehandelten Proteinpräparationen gezeigt worden. Der Abbau von LTP1 durch PrA führt mögli-
cherweise zu einer Anzahl von Peptiden, die aufgrund ihrer unterschiedlichen physiko-chemikalischen
Eigenschaften mittels RP-HPLC getrennt werden können. Die hier beschriebenen Untersuchungen
umfaßten die in Abbildung 3.19 aufgeführten Arbeitsschritte zur Reinigung und Analyse solcher
Peptide. Mit Proteinase A inkubierte Bierproben wurden im SDS-Gel und Westernblot hinsichtlich
potentieller LTP1-Abbauprodukte analysiert werden. Eine Identifizierung möglicher Proteinase A-
Spaltsequenzen erfolgte über Massenspektrometrie.
Abb. 3.19: Fließschema mit Arbeitsschritten zur Reinigung und Analyse von LTP1-
Abbauprodukten
Fraktionierung mittels RP-HPLC
Inkubation von Bier mit Proteinase A
Analyse mittels SDS-
Gel-Elektrophorese
Analyse im Westernblot
Analyse mittels Massen-
spektrometrie
3 Ergebnisse
58
3.4.1 Analyse von RP-HPLC-Fraktionen im SDS-Gel und Westernblot
Es wurde Bier mit 19,6 µg/ml PrA bei Raumtemparatur für drei Tage inkubiert. Mittels RP-HPLC
wurden dreimal 150 µl des Ansatzes getrennt (Abb. 3.20) und jeweils die Fraktionen 17 bis 24
gesammelt und am Rotationsverdampfer eingeengt (ausführliche Beschreibung der Probengewinnung
s. 2.15.2).
Abb. 3.20: Fraktionierung von potentiellen LTP1-Abbauprodukten aus Bier nach Inkubation mit
Proteinase A mittels semipräparativer RP-HPLC. Das Bier wurde bei Raumtemparatur
für drei Tage mit 19,6 µg/ml PrA inkubiert. Schwarze Linie - Chromatogramm der
Bierproteine nach Inkubation mit PrA. Strich-Punkt-Linie - Bierproteine ohne PrA-
Inkubation. Fraktioniert wurden je Trennlauf 150 µl Probe.
Wie im Kapitel 3.2.4 ausgeführt, ist in den Fraktionen B22 und B24 einer unbehandelten Bierprobe
hauptsächlich LTP1 enthalten (Abb. 3.12). Infolge des Abbaus von LTP1 durch Proteinase A kommt
es zu einer Abnahme der Peakflächen der LTP1-haltigen Fraktionen. Gleichzeitig ist die Zunahme
anderer Peakflächen zu beobachten, möglicherweise in Zusammenhang mit der Entstehung von LTP1-
Abbauprodukten. Es wird angenommen, daß die Fraktionen F19 und F20 der proteinasebehandelten
Probe potentielle LTP1-Abbauprodukte enthalten.
Bei bisherigen Untersuchungen konnten für PrA-behandelte Proben keine LTP1-Abbauprodukte im
SDS-Gel oder Westernblot detektiert werden. Einerseits ist keine optimale Auftrennung für kleine
Proteine (Mw < 6 kDa) in 17,5 %igen SDS-Gelen mit kleinem Trenngel (85 x 55 x 5 mm) zu erzielt,
andererseits lassen sich kleine Proteine und Peptide im SDS-Gel durch Coomassiefärbung nur unzu-
reichend anfärben. Daher wurden bei den folgenden Untersuchungen zur Proteinfärbung die
Silberfärbung (s. 2.11.2, Methode II) angewendet und für eine bessere Proteintrennung SDS-Gele mit
größeren Trenngelen (135 x 50 x 5 mm, s. 2.10) eingesetzt. Dieses Gelsystem gestattet außerdem das
Auftragen größerer Probenvolumina.
20%B
80%B
95%B
0
100
200
500
10 15 20 25 30
mAU
min
3 Ergebnisse
59
Für die proteinasebehandelte Probe konnten nur in der Fraktion F21 Proteine mit einem Molekular-
gewicht von ca. 10 kDa detektiert werden (Abb. 3.21). Im Westernblot ließ sich allerdings nicht
bestätigen, daß diese Proteine mit LTP1 identisch sind. Es wurden in keiner Fraktion LTP1-Abbau-
produkte nachgewiesen, da entweder deren Detektion mittels Silberfärbung generell nicht möglich ist
oder ihre Konzentration in den Fraktionen zu gering war. In den Fraktionen F22 bis F24 der nicht
proteinasebehandelten Probe zeigten sich hingegen im SDS-Gel schwache, 10 kDa große Banden. Wie
erwartet konnte hier im Westernblot belegt werden, daß es sich dabei um LTP1 handelt (Abb. 3.22).
Abb. 3.21: Analyse von HPLC-Fraktionen hinsichtlich LTP1-Abbauprodukten mittels SDS-Gel-
Elektrophorese. Die nach Abb. 3.20 aus einer proteinasebehandelten Probe gewonnenen
Fraktionen wurden nach Konzentration am Rotationsverdampfer im 17,5 %igen SDS-Gel
(135 x 50 x 5 mm, s. 2.10) aufgetrennt und die Proteine mittels Silberfärbung angefärbt (s.
2.11.2, Methode II)
Abb. 3.22: Nachweis von LTP1 in HPLC-Fraktionen mittels Westernblotanalyse. Analysiert
wurden Fraktionen, die aus unbehandeltem Bier gewonnen wurden. Die Auftrennung der
Proteine erfolgte im 17,5 %igen SDS-Gel (135 x 50 x 5 mm), die Analyse im Westernblot
mit anti-LTP1-Antikörpern (s. 2.12.2).
St. F17 18 19 20 21 22 23 24 St.
26,6 —
16,9 —
14,4 —
6,5 —
3,5 —
kDa
34,8 —
LTP1-St. F18 19 20 21 22 23 24
LTP1
(9,8 kDa)
3 Ergebnisse
60
3.4.2 Untersuchung der RP-HPLC-Fraktionen mittels Massenspektrometrie
Die aus dem Abbau von LTP1 durch PrA resultierenden Produkte konnten mittels SDS-Gel-Elektro-
phorese nicht nachgewiesen werden. Daher sollten die entsprechenden Fraktionen massenspektro-
metrisch untersucht werden. Die Massenspektrometrie (MS) ist als sensitives Verfahren für den
Nachweis und die Identifikation von Peptiden geeignet. Es wurden sowohl Fraktionen der proteinase-
behandelten Probe (F19, F20, F21), die potentielle Abbauprodukte enthalten können, als auch die
entsprechenden Fraktionen der proteinaseunbehandelten Probe (F19, F20, F21) untersucht. Die
Massenspektren der unbehandelten Kontrollprobe sind im Anhang dargestellt (Abb. 7.2, Abb. 7.3,
Abb. 7.4). Darin wurden im Bereich von 1000 < m/z < 3500 keine Signale erfaßt. In den
Kontrollfraktionen wurden also keine Peptide nachgewiesen.
In den Spektren der behandelten Proben hingegen wurde eine Vielzahl von Signalen erfaßt (s. Anhang,
Abb. 7.5, Abb. 7.6, Abb. 7.7 und Tab. 7.3). Eine Übersicht ausgewählter Massenpeaks für die
Fraktionen der proteinasebehandelten Probe F19, F20 und F21 ist in Tabelle 3.4 dargestellt.
Tab. 3.4: Ausgewählte Massenpeaks und ihre relative Intensität in den Fraktionen F19, F20 und
F21. Werte wurden über Interpolation aus den Massenspektren (Abb. 7.5, 7.6 und 7.7)
berechnet bzw. der Tab. 7.3 (s. Anhang) entnommen. Dargestellt sind Massenpeaks
(m/z ± 1), die in mindestens einer Fraktion mit einer Intensität > 150 detektiert wurden. Grau
hinterlegt sind mögliche systembedingte, artefakte Hintergrundmassen (s. Anhang, Tab.
7.2).
Fraktion 19 Fraktion 20 Fraktion 21
867 326 244 405
1078 170 179 240
1249 - - 219
1377 - - 192
2521 <150 <150 199
2592 - <150 446
2683 241 348 453
2755 <150 158 192
2827 - 210 233
2891 <150 237 295
3055 <150 527 687
3119 - 221 315
3282 <150 443 618
3454 - - 233
Massenpeak (m/z= +/- 1) Intensität je Massenpeak
3 Ergebnisse
61
Nicht alle Peptidmassen wurden in jeder Fraktion detektieren. Dagegen wurden einige Peptidmassen
mit unterschiedlichen Intensitäten in jeder Fraktion nachgewiesen. Da die Trennung in der RP-HPLC
anhand der hydrophoben Eigenschaften erfolgt, ist die Verteilung der einzelnen Peptidmassen über die
Fraktionen abhängig von der Hydrophobizität der entsprechenden Peptide. Generell gilt: je später ein
Peptid eluiert, desto hydrophober ist es. So sind die Massen 1249, 1377 und 3454 nur in der Fraktion
F21 vertreten, d.h. die diesen Massen entsprechenden Peptide werden im Vergleich zu anderen
Peptiden, deren Massen in allen Fraktionen vertreten sind, später eluiert. Diese Peptide sind
vermutlich auch hydrophober als andere Peptide. Anhand der Verteilung der Peptidmasse in den
einzelnen Fraktionen können somit Aussagen über die hydrophoben Eigenschaften des Peptides
getroffen werden. Zu berücksichtigen ist, daß durch systembedingte Faktoren, wie bspw. manuelle
Probenaufgabe, Abweichungen auftreten können, die einen direkten Vergleich der Intensitäten
einzelner Massen in verschiedenen Fraktionen nicht gestattet.
Mit Hilfe des FindPept-Tools der ExPASy Software (Expert Protein Analysis System, Swiss Institute
of Bioinformatics, www.expasy.org) wurden für die in Tabelle 3.4 aufgeführten Peptidmassen
mögliche Peptidsequenzen identifiziert. Nicht berücksichtigt wurden dabei die systembedingten
Hintergrundmassen 867 und 1078. Die Identifizierung erfolgte unter der Annahme, daß alle Cysteine
in reduzierter Form und Methionin in oxidierter Form als Methioninsulfoxid (MSO) vorliegen, was zu
veränderten Massen der entsprechenden Peptide führt. Die Masse eines Peptides mit MSO statt Met in
der Sequenz verändert sich bspw. um + 16 Da. Das FindPept-Tool berücksichtigt weiterhin Abwei-
chungen von ∆ m/z = ± 2 Da. In Tabelle 3.5 sind identifizierte Peptidsequenzen ohne Berück-
sichtigung von posttranslationalen Modifikationen zusammengestellt, sowie ihre Position innerhalb
der LTP1-Sequenz. Aus der Übersicht wird ersichtlich, daß jeder in Tabelle 3.4 aufgeführten Masse
mindestens eine Peptidsequenz zugeordnet werden kann. Für einige Massen finden sich mehrere
Sequenzen, so bspw. für die Masse 2520. Um in solchen Fällen eine Aussage treffen zu können, durch
welche Sequenz die Masse hervorgerufen wird, wurden die identifizierten Peptidsequenzen einem
theoretischen Trypsinverdau (ExPASy Software, www.expasy.org) unterzogen und die Daten mit den
Ergebnissen des praktischen Trypsinverdaus verglichen.
3 Ergebnisse
62
Tab. 3.5: Zuordnung einzelner Peptidsequenzen zu spezifischen Massen der Fraktionen F19,
F20 und F21. Für die in Tab. 3.4 aufgeführten Massen (außer Hintergrundmassen 867 und
1078) wurden mit Hilfe der ExPASy Software/FindPept-Tool Peptidsequenzen identifiziert
unter der Annahme, daß alle Cysteine in reduzierter Form und Methionin in oxidierter Form
als Methioninsulfoxid vorliegen. Ohne weitere Berücksichtigung blieben mögliche
posttranslationale Modifikationen der Peptide. Angegeben ist die Position der Peptidsequenz
innerhalb der LTP1-Sequenz. In Klammern gesetzte AS sind in der ursprünglichen LTP1-
Sequenz flankierende AS.
Masse [M+H]+
m/z = +/-2
Peptidsequenzen
Position in der
LTP1-Sequenz
1249
1249
(G) QVDSKMKPCLT (Y)
(G) PSGECCNGNGVRDL (H)
5-15
23-34
1377 (I) ARGIHNLNLNNAA (S) 55-67
2520 (C) NCLKGIARGIHNLNLNNAAS IPSK (C) 49-72
2520 (C) LKGIARGIHNLNLNNAASIP SKCN (V) 51-74
2520 (G) ECCNGVRDLHNQAQSSGDRQ TVC (N) 26-48
2520 (A) SIPSKCNVNVPYTISPDIDC SRI (Y) 68-90
2592 (A) ASIPSKCNVNVPYTISPDID CSRI (Y) 67-90
2592 (T) VCNCLKGIARGIHNLNLNNA ASIPS (K) 47-71
2592 (D) RQTVCNCLKGIARGIHNLNL NNAA (S) 44-67
2683 LNCGQVDSKMKPCLTYVQGG PGPSGE (C) 1-26
2683 (V) DSKMKPCLTYVQGGPGPSGE CCNGVR (D) 7-32
2683 (D) SKMKPCLTYVQGGPGPSGEC CNGVRD (L) 8-33
2683 (Q) SSGDRQTVCNCLKGIARGIH NLNLN (N) 40-64
2683 (A) SIPSKCNVNVPYTISPDIDC SRIY 68-91
2755 (R) GIHNLNLNNAASIPSKCNVN VPYTIS (P) 57-82
2755 (G) QVDSKMKPCLTYVQGGPGPS GECCNGV (R) 5-31
2755 (A) ASIPSKCNVNVPYTISPDID CSRIY 67-91
2826 (Y) VQGGPGPSGECCNGVRDLHN QAQSSGDR (Q) 17-44
2826 (N) AASIPSKCNVNVPYTISPDI DCSRIY 66-91
2826 (Q) GGPGPSGECCNGVRDLHNQA QSSGDRQT (V) 19-46
2826 (C) GQVDSKMKPCLTYVQGGPGP SGECCNGV (R) 4-31
2826 (V) RDLHNQAQSSGDRQTVCNCL KGIARG (I) 32-57
2891 (P) CLTYVQGGPGPSGECCNGVR DLHNQAQS (S) 13-40
2891 (D) RQTVCNCLKGIARGIHNLNL NNAASIP (S) 44-70
2891 (N) LNNAASIPSKCNVNVPYTIS PDIDCSR (I) 63-89
2891 (L) NNAASIPSKCNVNVPYTISP DIDCSRI (Y) 64-90
3054 (S) SGDRQTVCNCLKGIARGIHN LNLNNAASI (P) 41-69
3054 (R) QTVCNCLKGIARGIHNLNLN NAASIPSKC (N) 45-73
3054 (V) QGGPGPSGECCNGVRDLHNQ AQSSGDRQTV (C) 18-47
3054 (Y) VQGGPGPSGECCNGVRDLHN QAQSSGDRQT (V) 17-46
3054 (L) NNAASIPSKCNVNVPYTISP DIDCSRIY 64-91
3118 (T) YVQGGPGPSGECCNGVRDLH NQAQSSGDRQ (T) 16-45
3118 (L) NLNNAASIPSKCNVNVPYTI SPDIDCSRI (Y) 62-90
3118 (N) LNLNNAASIPSKCNVNVPYT ISPDIDCSR (I) 61-89
3282 (L) NLNNAASIPSKCNVNVPYTI SPDIDCSRIY 62-91
3454 (A) RGIHNLNLNNAASIPSKCNV NVPYTISPDIDC (S) 56-87
3 Ergebnisse
63
3.4.3 Untersuchung trypsinbehandelter Fraktionen
Für eine Idendifizierung von PrA-Spaltprodukten wurden die aus PrA-behandelten Bier gewonnenen
Fraktionen trypsiniert und mittels MS analysiert.
Eine Auswahl einzelner Massenpeaks in den Fraktionen F19, F20 und F21 nach der Trypsinbehand-
lung ist in Tabelle 3.6 dargestellt. Nach einer Trypsinbehandlung könnten in den Proben auch Massen
von Peptiden detektiert werden, die aus einer Trypsineigenspaltung resultieren. Eine Übersicht der
infolge von Trypsineigenspaltung häufig auftretenden Massen ist im Anhang (s. Anhang, Tab. 7.2)
gegeben. Aus einem Vergleich geht hervor, daß keine der in Tabelle 3.6 gelisteten Massen aus einer
Trypsineigenspaltung resultiert.
Tab. 3.6: Ausgewählte Massenpeaks und ihre relative Intensität in den Fraktionen F19, F20
und F21 nach Trypsinbehandlung (s. 2.17). Werte wurden über Interpolation aus den
Massenspektren (Abb. 7.8, 7.9, 7.10) berechnet bzw. der Tab. 7.3 (s. Anhang) entnommen.
Dargestellt sind Massenpeaks (m/z ± 1), die in mindestens einer Fraktion mit einer
Intensität > 150 detektiert wurden. Grau hinterlegt sind mögliche systembedingte, artefakte
Hintergrundmassen (s. Anhang, Tab. 7.2).
Die LTP1-Sequenz enthält sieben potentielle Trypsinspaltsequenzen (s. Anhang, Abb. 7.11). Trypsin
kann C-terminal der Aminosäurereste Argenin und Lysin spalten. Die theoretischen, bei einem
Trypsinverdau von LTP1 entstehenden Peptidmassen, wurden mittels ExPASy Software bestimmt
Fraktion 19 Fraktion 20 Fraktion 21
867 614 205 400
1078 446 156 326
1289 346 161 275
1433 198 - 267
1894 297 317 412
1895 - 337 392
2008 - 229 292
2164 684 416 835
2274 991 489 835
2384 287 <150 183
2551 277 220 267
2777 178 244 225
2891 - 150 <150
3006 - 239 233
3155 198 <100 167
3229 - <150 484
Intensität je Massenpeak
Massenpeak (m/z= +/- 1)
3 Ergebnisse
64
(s. Anhang, Tab. 7.4). Bei einem Vergleich der theoretischen Peptidmassen mit den praktischen
Ergebnissen der Trypsinbehandlung (Tab. 3.6) ergibt sich nur für die Masse 1895 eine Übereinstim-
mung. Schlußfolgernd wird angenommen, daß nach der Trypsinbehandlung das Peptid mit der
Sequenz CNVNVPYTISPDIDCSR in den Fraktionen F20 und F21 vorliegt.
3.4.4 Identifizierung von LTP1-Abbauprodukten
Wie aus Tabelle 3.5 ersichtlich kann einigen Massen der PrA-behandelten Probe nicht eindeutig eine
Peptidsequenz zugeordnet werden. Einige Massen könnten aus bis zu fünf verschiedenen
Peptidsequenzen resultieren. Um hier eine eindeutige Zuordnung zu ermöglichen, wurden die Proben
F19, F20 und F21 einem Trypsinverdau unterzogen. Auf der Grundlage der ermittelten Peptidmassen
sowohl vor als auch nach der Trypsinbehandlung sollten LTP1-Abbauprodukte identifiziert werden,
deren Sequenzen wiederum einen Rückschluß auf mögliche Proteinase A-Spaltsequenzen zulassen.
Jede der in Tabelle 3.5 identifizierten Peptidsequenzen wurde mit Hilfe des FindMod-Tools der
ExPasy Software einem theoretischen Trypsinverdau unterzogen. Die daraus resultierenden Massen
der theoretischen Trypsinspaltprodukte wurden anschließend mit den tatsächlichen Massen der
trypsinbehandelten Proben (Tab. 3.6) verglichen. Die bei übereinstimmenden Massen entsprechende
Peptidsequenz der potentiellen Trypsinspaltprodukte sowie die für den Trypsinverdau genutzten
Ausgangspeptidsequenzen sind in Tabelle 3.7 dargestellt. Nicht jeder in Tabelle 3.5 aufgeführten
Peptidsequenz kann ein Trypsinspaltprodukt zugeordnet werden. Dies resultiert u.a. daraus, daß aus
einigen Peptiden durch die Trypsinierung auch mehrere Produkte entstehen können, deren Massen zu
klein sind, um erfaßt zu werden. Außerdem sind bei der Analyse nur Massen mit einer Intensität >150
berücksichtigt worden (für eine Übersicht aller erfaßten Signale s. Anhang, Tab. 7.3). Sollten also
durch den Trypsinverdau aus einem Peptid Produkte entstehen, deren Massen mit einer geringeren
Intensität erfaßt wurden, so sind diese in Tabelle 3.7 nicht berücksichtigt. Aufgrund der ermittelten
Peptidsequenzen, aus denen nach Trypsinverdau nachweisbare Trypsinspaltprodukte entstehen, läßt
sich eine starke Eingrenzung der potentiellen PrA-Spaltprodukte vornehmen. Anhand der bereits in
Tabelle 3.5 eindeutig identifizierten Peptidsequenzen für die Massen 1371, 3282 und 3454 sowie der
in Tabelle 3.7 zusammengestellten Sequenzen der LTP1-Abbauprodukte spaltet PrA in LTP1 C-
terminal der hydrophoben Aminosäuren Ile54, Ala55, Leu61, Leu63, Ala66, Ala67 und Ile90 sowie C-
terminal der polaren Aminosäuren Gln18, Tyr46, Asp65 und Cys87.
Zusammenfassung Kapitel 3.4: Massenspektrometrische Untersuchungen potentieller LTP1-
Abbauprodukte ergaben, daß Proteinase A im LTP1-Molekül sowohl C-terminal hydrophober (Ala,
Ile, Leu) als auch polarer (Gln, Tyr, Asp, Cys) Aminosäuren spaltet.
3 Ergebnisse
65
Position in
der LTP1-
Sequenz
73-90
73-89
66-89
73-89
19-32
64-89
73-90
73-89
62-89
64-89
73-90
73-89
2007
1894
2551
1894
1288
2777
2007
1894
3005
2777
2007
1894
Potentielle Peptidsequenzen der
Trypsinspaltprodukte und entsprechende Massen
CNVNVPYT ISPDIDCSRI
CNVNVPYT ISPDIDCSR
AASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSR
CNVNVPYT ISPDIDCSR
GG PGPSGECCNG VR
NNAASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSR
CNVNVPYT ISPDIDCSRI
CNVNVPYT ISPDIDCSR
NLNNAASIP SKCNVNVPY TISPDIDCSR
NNAASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSR
CNVNVPYT ISPDIDCSRI
CNVNVPYT ISPDIDCSR
(2520)
(2592)
(2826)
(2826)
(2891)
(3054)
(3118)
(3282)
Ausgangspeptidsequenzen (Mw) für den theoretischen
Trypsinverdau (s. Tab. 3.5)
(A)SIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI (Y)
(A)ASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI (Y)
(N)AASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI Y
(Q)GG PGPSGECCNG VRDLHNQAQS SGDRQT(V)
(L)NNAASIP SKCNVNVPY TISPDIDCSRI (Y)
(L)NNAASIP SKCNVNVPY TISPDIDCSRI Y
(L)NLNNAASIP SKCNVNVPY TISPDIDCSRI (Y)
(L)NLNNAASIP SKCNVNVPY TISPDIDCSRI (Y)
Tab. 3.7: Zuordnung einzelner Peptidsequenzen zu spezifischen Massen der Fraktionen F19, F20 und F21 nach der Trypsinbehandlung.
Alle in Tab. 3.5 dargestellten Peptidsequenzen wurden mit Hilfe der ExPASy Software/ FindMod-Tool theoretisch trypsiniert und die
entstehenden theoretischen Massen mit den in Tab. 3.6 aufgelisteten Massen nach praktischem Trypsinverdau verglichen. Für
übereinstimmende Massen sind die entsprechenden Peptidsequenzen der Trypsinspaltprodukte dargestellt. Die Analyse erfolgte unter
der Annahme, daß alle Cysteine in reduzierter Form und Methionin in oxidierter Form als Methioninsulfoxid vorliegen, ohne weitere
Berücksichtigung möglicher posttranslationaler Modifikationen. Angegeben ist die Aminosäureposition der identifizierten
Trypsinspaltprodukte in der LTP1-Sequenz. Alle Massenangaben mit m/z =+/- 2 Da. In Klammern gesetzte AS sind in der ursprünglichen
LTP1-Sequenz flankierende AS.
4 Diskussion
66
4 DISKUSSION
Ziel der Untersuchungen war die Klärung der Wechselwirkungen von schaumnegativer Proteinase A
aus S. cerevisiae und schaumpositivem Lipidtransferprotein aus Gerste.
Es ergab sich für Proteinasen verschiedener Proteinasefamilien eine Korrelation von zunehmender
Enzymaktivität und Abnahme der Schaumstabilität. Ein eindeutig negativer Einfluß auf die
Schaumstabilität konnte sowohl der aus der Hefe stammenden Carboxylproteinase Proteinase A (PrA)
und der Carboxylproteinase Pepsin als auch der aus der Hefe stammenden Serinproteinase
Carboxypeptidase Y (CPY) nachgewiesen werden. Die nach Ross und Clark bestimmten
schaumnegativen Konzentrationen sind so gering, daß sie mit keiner der getesteten Methode zur
Konzentrationsbestimmung nachgewiesen werden konnten. Der sensitivste Nachweis von PrA- und
CPY-Konzentrationen war unter Verwendung von Antikörpern im Westernblot möglich.
Das Lipidtransferprotein 1 (LTP1) in Bier wird im Gegensatz zu Protein Z durch PrA abgebaut, und
konnte somit eindeutig als Substrat für PrA identifiziert werden. Verschiedene LTP1-Formen wurden
mittels heterologer Expression in E. coli und mittels Immunaffinitätschromatographie bzw. Reversed-
Phase-HPLC aus Bier und Gerste gewonnen. Diese LTP1-Formen weisen gegenüber PrA unter-
schiedliche Sensitivitäten auf. Während rekombinantes LTP1 durch PrA abgebaut wird, ist der Abbau
eines rekombinanten Histag-LTP1-Fusionsproteins und des nativen Gersten-LTP1 vermutlich konfor-
mationsbedingt behindert. Anhand von massenspektrometrischen Analysen des PrA-behandelten
LTP1 wurden potentielle LTP1-Abbauprodukte identifiziert und daraus potentielle PrA-Spalt-
sequenzen abgeleitet.
Aufgrund der Tatsache, daß Proteinase A spezifisch LTP1 in Bier abbaut und somit direkt eine Abnah-
me der Bierschaumstabilität hervorruft, ergibt sich einerseits die Notwendigkeit der Entwicklung eines
sensitiven Nachweises für PrA-Konzentrationen in Bier. Zum anderen ergeben sich für eine praktische
Anwendung Möglichkeiten zur Stabilisierung des Bierschaums durch Reduktion des schaumnegativen
Effektes von PrA.
4.1 Nachweis schaumnegativer Proteinaseaktivitäten
Im Rahmen der Arbeiten sollte untersucht werden, ob die Abnahme der Schaumstabilität unspezifisch
durch verschiedene Proteinasen oder spezifisch durch Proteinasen einer Familie verursacht wird. Dazu
wurde der Zusammenhang von Proteinaseaktivität und Schaumstabilität anhand von Proteinasen
verschiedener, auch in S. cerevisiae vorkommender, Proteinasefamilien untersucht. Hierbei standen
die Hefeproteinasen Proteinase A (PrA) und Carboxypeptidase Y (CPY) im Vordergrund. Für die
Thiolproteinase Papain und Serinproteinase Trypsin konnte kein Einfluß auf die Schaumstabilität
4 Diskussion
67
beobachtet werden, was möglicherweise mit dem pH-Wert zusammenhängt. Ein geringe Abnahme der
Schaumstabilität wurde durch die Metalloproteinase Typ X hervorgerufen.
Die größte Minderung der Schaumstabilität von ca. 40 % wurde durch die tierische Carboxylproteina-
se Pepsin und durch die aus der Hefe stammende Carboxylproteinase Proteinase A hervorgerufen (3 d,
RT). Die dabei eingesetzte Enzymkonzentration von PrA entsprach mit 1,68 µg/ml (57 mU/ml) etwa
1/100 der Pepsinkonzentration (142 µg/ml = 142 mU/ml). Dreyer et al. (1986) geben für gleiche
Pepsin- und PrA-Aktivitäten (0,5 U/ml, 72 h, 10 °C) eine Abnahme der Schaumstabilität von jeweils
ca. 20 % an. Ein direkter Vergleich der Enzymaktivitäten ist aufgrund der unterschiedlichen Bezugs-
systeme zur Bestimmung der Enzymaktivitäten nur bedingt möglich. Auch die Ergebnisse von
Ormrod et al. (1991), sie wiesen für 55 U Pepsin (7 d, RT) eine Stabilitätsabnahme von 12 % nach,
sind nur eingeschränkt vergleichbar, da ein eindeutiger Volumenbezug nicht herzustellen ist.
Pepsin ist eine unspezifische Proteinase, die alle Peptidbindungen spalten kann; bevorzugt jedoch
Peptidbindungen mit hydrophoben und aromatischen Aminosäureresten wie z. B. Phe, Met, Leu und
Trp. Kondo et al. (1998) belegen für PrA ein ähnliches Verhalten. PrA besitzt wie Pepsin eine hohe
Spezifität für hydrophobe Aminosäurereste (Ala, Leu, Ile, Phe, Trp, Val). Für bestimmte Substrat-
peptide zeigen beide Enzyme übereinstimmende kinetische Parameter.
Ein negativer Einfluß auf die Schaumstabilität wurde auch für die aus der Hefe stammende Serinpro-
teinase CPY nachgewiesen. Es ergeben sich für gleiche CPY-Konzentrationen (2,86 µg/ml) in zwei
Versuchen unterschiedliche Schaumstabilitätsabnahmen von ca. 27 bzw. 15 %, da verschiedene
Pilsner Biere eingesetzt wurden.
Eine Überprüfung, ob es bei längerer Inkubation zu einer Verstärkung des schaumnegativen Effektes
der Hefeproteinasen CPY und PrA kommt, führte für CPY zu einem negativen Ergebnis. Bei PrA
hingegen resultierte eine sechswöchige Inkubation in einer Abnahme von 23 % für 12 ng/ml bzw.
16 % für 1 ng/ml. Kondo et al. (1995) zeigten eine eindeutige Korrelation von PrA-Konzentration und
Schaumstabilitätsabnahme. So reduzierte sich die Stabilität im Verlauf von 8 Wochen (30 °C) sogar
um 60 % für 10 ng/ml PrA und mehr als 20 % für 1 ng/ml. Dieser deutlich höhere Stabilitätsverlust ist
temperaturbedingt. Ein Einfluß der Lagertemperatur auf die proteinasebedingte Reduktion der
Schaumstabilität wurde bereits bei Narziß und Reicheneder (1987) festgestellt.
Resultate eigener Untersuchungen lassen schlußfolgern, daß eine Minderung der Schaumstabilität
nicht spezifisch durch Proteinasen einer Familie hervorgerufen wird. Zwar läßt sich eindeutig fest-
stellen, daß alle getesteten Carboxylproteinasen und aus der Hefe stammenden Proteinasen zu einer
Reduktion der Schaumstabilität führen. Ein Rückschluß von den Ergebnissen für die getesteten Thiol-
und Metalloproteinasen auf den Schaumstabilitätseinfluß von Thiol- und Metalloproteinasen aus Hefe
ist allerdings nicht möglich, da sich pflanzliche Proteinasen und solche aus der Hefe hinsichtlich ihres
pH-Optimums unterscheiden (Flukal et al., 1986).
4 Diskussion
68
Für die Hefeproteinasen wurden nach der Methode von Ross und Clark schaumschädigende Konzen-
trationen von 57 ng/ml für CPY und 82 ng/ml für PrA (1 ng/ml bei längerer Inkubation) bestimmt.
Kondo et al. (1995) geben die durchschnittliche PrA-Konzentration in nichtpasteurisierten Bieren mit
0,1–8,7 ng/ml an, während Stamm (2000) für 43 % der Biere einen PrA-Gehalt von 10-100 ng/ml
bestimmt. Daraus schlußfolgernd hält Stamm (2000) eine Nachweismethode mit einer
Detektionsgrenze von 10 ng/ml für ausreichend. Eigenen Untersuchungen und denen von Kondo et al.
(1995) zufolge wäre dagegen eine Nachweisgrenzen von mindestens 1 ng/ml erforderlich.
Die äußerst geringen, bereits schaumnegativen CPY- und PrA-Konzentrationen konnten mit keiner im
Rahmen dieser Arbeit angewendeten Methode nachgewiesen werden. Die in der Brauindustrie einge-
setzte Azocaseinmethode erwies sich mit einer Nachweisgrenze von 30 mg/ml PrA als am wenigsten
sensitiv. Stamm (2000) gibt für diese Methode eine Nachweisgrenze von 2,5 µg/ml PrA an. Grund-
legend orientieren sich beide Protokolle an einer Methode von Reicheneder und Narziß (1989), zeigen
jedoch starke Abweichungen hinsichtlich pH-Wert und Substratkonzentration. Mit einem kommerziel-
len Nachweis auf der Basis von succinyliertem Casein wurden in eigenen Untersuchungen 5-25-fach
niedrigere Konzentrationen CPY und PrA als mit der Azocaseinmethode nachgewiesen. Die
Verwendung von Antikörpern in der Westernblotanalyse gestattet hingegen die sensitivste Detektion
für PrA und CPY mit Nachweisgrenzen von 1,75 bzw. 0,2 µg/ml. Mit dieser Methode ist jedoch keine
Differenzierung aktiver und inaktiver Enzymformen möglich. Alternative Möglichkeiten für einen
sensitiven Nachweis von PrA wären die Verwendung von resorufinmarkiertem Casein als Substrat
(Stamm, 2000) oder ein von Yokosawa et al. (1983) entwickeltes fluoreszenzmarkiertes Substrat.
Beide Methoden sind von Stamm (2000) für die Bestimmung von PrA angewendet und die jeweiligen
Nachweisgrenzen mit 6 ng/ml bzw. 10 ng/ml ermittelt worden. Mit einem fluoreszenzmarkierten Sub-
strat nach Kondo et al. (1995) ist ein Nachweis von 0,5 ng/ml PrA möglich. Inwiefern die in Bier
vorhandene Eigenfluoreszenz (Yokoi et al., 1996) einen fluoreszenzbasierten Nachweis beeinträchtigt,
ist in den jeweiligen Arbeiten nicht beschrieben. Denkbar ist auch ein sensitiver Nachweis auf der
Basis fluoreszenzmarkierter Peptide, die im LTP1 identifizierte, spezifische PrA-Spaltsequenzen
enthalten.
4.2 Reinigung verschiedener LTP1-Formen
Weiterhin wurde der Einfluß der aus S. cerevisiae stammenden Proteinase A auf verschiedene LTP1-
Formen untersucht. Dazu wurden einerseits rekombinantes LTP1 und LTP1-Fusionsprotein mittels
heterologer Expression in E. coli gewonnen, andererseits LTP1-haltige Proteinpräparate aus Bier und
Gerste mit Hilfe von Immunaffinitätschromatographie und RP-HPLC gereinigt. Mit allen
angewendeten Reinigungsverfahren wurden durchschnittlich 0,5-0,7 mg LTP1/l Nährmedium bzw.
Bier gewonnen.
4 Diskussion
69
Untersuchungen ergaben, daß das rekombinante (His)6-LTP1-Fusionsprotein im Gegensatz zum
rekombinanten LTP1 (rLTP1) durch PrA nicht abgebaut wird. Das LTP1-FP wird über den (His)6-Rest
(Histag), der spezifisch an eine Ni-NTA-Matrix bindet, affinitätschromatographisch gereinigt. Der
Histag verändert vermutlich durch die zusätzlichen 23 Aminosäurereste die LTP1-Konformation,
wodurch ein PrA-Abbau des Histag-LTP1-FP offenbar behindert wird. Da es nicht möglich war, den
Histag enzymatisch mit Hilfe einer Peptidase abzuspalten, erfolgte die Reinigung von rekombinantem,
histagfreien LTP1 (rLTP1) mit Hilfe eines anderen Expressionssystems (Intein™-CN-System von
NEB). Die Ausbeuten für das rLTP1 lagen bei 0,5 mg/l. Nach Angaben des Herstellers NEB sind mit
dem Intein-Expressionssystem bei niedriger Proteinexpression Ausbeuten von 1 mg/l zu erzielen. Die
Ausbeuten der Reinigung von LTP1 aus Bier mittels Immunaffinitätschromatographie lagen bei
durchschnittlich 0,6 mg/l. Bei einer Ausgangskonzentration von durchschnittlich 50 mg/l Bier ergibt
sich eine prozentuale Ausbeute von lediglich etwa 1 %. Zurückzuführen ist dies möglicherweise auf
eine durch Bierinhaltsstoffe gestörte Antigen-Antikörper-Bindung. Negativ kann sich zudem die hohe
Kopplungseffizienz der Antikörper (AK) an die Säulenmatrix auswirken und die damit verbundene
sterische Beeinträchtigung benachbarter AK bei der Bindung des Antigens. Generell sollte jedoch ein
optimiertes immunaffinitätschromatographisches Verfahren die Reinigung von LTP1 aus
verschiedenen Medien (Gerste, Malz, Bier) ermöglichen. Ein alternatives Verfahren zur Reinigung
von LTP1 stellt ein Reinigungsprozeß nach Jegou et al. (2000) dar (Abb. 4.1). Der erste Schritt besteht
dabei in einer Extraktion von Proteinen aus Gerste oder Malz, für Bier wäre hier eine Proteinfällung
möglich. Anschließend findet mittels Kationenaustauscher und Gelfiltration eine Vorreinigung der
Proteinpräparationen statt, aus denen dann unter Verwendung von Reversed-Phase-HPLC (RP-HPLC)
verschiedene LTP1-Formen gewonnen werden können.
Abb. 4.1: Fließdiagramm zur Reinigung von LTP1 aus Gerste nach Jegou et al. (2000).
Reversed-Phase-HPLC
Extraktion
Kationenaustauscher
Gelfiltration
4 Diskussion
70
Die RP-HPLC wurde in der vorliegenden Arbeit bereits zur Reinigung von LTP1-haltigen Fraktionen
aus Bier und Gerste eingesetzt. Auffällig ist ein differenziertes Trennverhalten von Protein-
präparationen aus Bier und Gerste in der RP-HPLC. Die Retention von Peptiden wird durch die
Kombination verschiedener Parameter beeinflußt. Insbesondere bestimmen Sekundärstrukturen wie α-
Helices und β-Faltblätter sowie die Tertiärstruktur das Retentionsverhalten. Verändert sich durch
Denaturierung also die LTP1-Struktur, verändert sich zwangsläufig auch das Trennverhalten in der
RP-HPLC.
4.3 Schaumpositive und proteinasesensitive LTP1-Formen
Verschiedene Nachweise (SDS-Gel, Westernblot, RP-HPLC) belegen den spezifischen Abbau von
LTP1 in Bier durch Proteinase A (PrA). Gleichzeitig wurde gezeigt, daß endogenes LTP1 aus Gerste
resistent gegenüber PrA ist. Folglich wird erst während des Mälz- und Brauprozesses eine
proteinasesensitive Form von LTP1 generiert. Dem modifizierten LTP1 in Bier wird im Gegensatz
zum nativen Gerstenprotein eine schaumverstärkende Rolle zugeschrieben (Lusk et al., 1995;
Sørensen et al., 1993). Andererseits kann die Modifikation von LTP1 auch die Ursache für die
veränderte Sensitivität gegenüber Carboxylproteinasen wie Proteinase A (eigene Ergebnisse) und
Pepsin (Lindorff-Larsen et al., 2001) sowie gegenüber einer Endoproteinase (Davy et al., 1999) sein.
Diese Annahme steht jedoch im Widerspruch zu Jegou et al. (2000), die die Glykosylierung von LTP1
und Protein Z für die Resistenz der Proteine gegenüber proteolytischen Enzymaktivitäten während des
Mälz- und Brauprozesses verantwortlich machen.
Natives LTP1 und natives Protein Z zeigen Homologien zu Proteinaseinhibitoren (Jones und Marinac,
1995). Die proteinaseinhibitorischen Eigenschaften schützen beide Proteine während des Mälzens und
Maischens gegen den Abbau durch die zahlreich vorhandenen Proteinasen (Shimizu et al., 1995).
Während des Brauprozesses unterliegen beide Proteine in unterschiedlichem Maße Konformations-
änderungen und Modifikationen der Proteinstruktur durch hitzeinduzierte Denaturierung und hitze-
begünstigte Maillardreaktionen (Jegou et al., 2000 und 2001). Infolgedessen verliert LTP1 im
Gegensatz zu Protein Z seine inhibitorischen Eigenschaften, wie die unterschiedliche Sensitivität
beider Proteine in Bier gegenüber PrA belegt.
Die Sekundärstruktur von LTP1 wird bestimmt durch vier α-Helices (Abb. 4.2), die durch drei kurze
Schleifen getrennt sind, sowie eine C-terminale Peptidsequenz von 18 AS ohne Struktur. Die
Tertiärstruktur wird stabilisiert durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen CO- und NH-Gruppen
besonders in den α-Helices, van der Waals-Kräften, die zwischen dicht gepackten Kohlenwasserstoff-
ketten auftreten, hydrophoben Wechselwirkungen und vier Disulfidbrücken (Abb. 4.2) (Heinemann et
al., 1996).
4 Diskussion
71
—C3…C13… G19——G25…C27C28 …A38——Q44…C48… C50…G57——L63……C73—C87—
Helix HA Helix HB Helix HC Helix HD
Abb. 4.2: Strukturelle Merkmale des LTP1-Moleküls. Bestehend aus 91 Aminosäuren wird die
Struktur des Polypetids durch vier α-Helices geprägt (HA: Cys3-Gly19, HB: Gly25-Ala38,
HC: Arg 44-Gly57, HD: Leu63-Cys73), die durch drei kurze Schleifen getrennt sind sowie
ein C-terminales Polypeptid (Asn74-Ile91). Die Tertiärstruktur wird u. a. durch vier
Disulfidbrücken stabilisiert (Cys3-Cys50, Cys13-Cys27, Cys28-Cys73, Cys48-Cys87).
Bei Temperaturen von 70 °C, wie sie beim Mälzen und Würzekochen vorliegen, können Proteine
denaturieren, wobei der Grad der Denaturierung abhängig vom pH-Wert ist (Belloque und Smith,
1998; Kella und Kinsella, 1988). Bei der Denaturierung von Proteinen kommt es durch Aufhebung
von Wasserstoffbrückenbindungen und van der Waals-Kräften zu einer Veränderung der Sekundär-
und Tertiärstruktur. Für
β
-Lactoglobulin wurde in diesem Zusammenhang beobachtet, daß ein Kochen
zwischen 60 und 70 °C zum größten Teil die α-Helix-Struktur aufbricht (Qi et al., 1997). Andere
Untersuchungen der Sekundärstruktur zeigten, daß wärmebedingte Denaturierungen reversibel sein
können, die bei Temperaturen oberhalb 70 °C hervorgerufenen allerdings irreversibel sind (Iametti et
al., 1996). Eine Denaturierung von
β
-Lactoglobulin ist nach Morgan et al. (1999) nicht zwangsläufig
mit der Reduktion von Disulfidbrücken verbunden.
Anhand dieser Erkenntnisse lassen sich für LTP1 unterschiedliche Denaturierungsgrade, hervorge-
rufen durch Temperaturprozesse des Mälz- und Brauprozesses, vermuten. So ist denkbar, daß nur
einige der vier α-Helices aufgebrochen werden. Durch das Öffnen von Strukturen werden in bestimm-
ten Sequenzabschnitten neben potentiellen Glykosylierungsstellen auch Proteinasespaltsequenzen
zugänglich. Damit ließe sich erklären, warum erst das denaturierte LTP1 durch PrA abgebaut werden
kann. Morgan et al. (1999) haben diesen Effekt bereits für denaturiertes
β
-Lactoglobulin und Pepsin
beobachtet.
Über Strukturveränderungen in LTP1 durch Reduktion und Neuordnung von Disulfidbrücken existie-
ren widersprüchliche Ansichten. Verschiedene Autoren (Jegou et al., 2000; Bech et. al., 1995) ver-
weisen auf Konformationsänderungen im LTP1 durch die Reduktion von Disulfidbrücken während
des Mälz- und Brauprozesses. Die für die chemische Reduktion von Disulfiden notwendigen starken
Reduktionsbedingungen liegen im Bier allerdings nicht vor. Beschrieben wurde weiterhin die hitze-
induzierte Reduktion von Disulfidbrücken (Morgan et al., 1999), die für LTP1 nicht ausgeschlossen
werden kann.
Begünstigt werden im teilweise denaturierten LTP1-Molekül Oxidations- und Glykosylierungs-
reaktionen. Von Lusk et al. (1995) wurden LTP1-Formen mit oxidiertem Met10 identifiziert sowie
C-terminales
Polypeptid
4 Diskussion
72
von Jegou et al. (2000) unterschiedlich glykosylierte LTP1-Formen. Im denaturierten Proteinmolekül
sind Lysinreste außen plaziert und können dort leicht mit reduzierenden Zuckercarbonylgruppen in
Reaktion treten. Potentielle Glykosylierungsstellen im LTP1-Molekül sind außer der ε-NH2-Gruppe in
den vier Lysinresten die N-terminale α-NH2-Gruppe des Leucins sowie die Guanidingruppe der Argi-
ninreste (Tagami et al., 2000). Glykosylierungen finden nicht zwangsläufig an allen potentiellen Grup-
pen statt, sondern nur an den jeweils reaktivsten Gruppen im Proteinmolekül. Für ε-NH2-Gruppen
wurden auch Diglykosylierungen beobachtet (Blakytny et al., 1997). Die Glykosylierungen (Maillard-
reaktionen) unterschiedlich denaturierter LTP1 ergeben eine Mischung unterschiedlich und verschie-
den stark glykosylierter LTP1-Formen. Diese Maillardprodukte verstärken zwar die positiven
Schaumeigenschaften des LTP1, andererseits ist die mit ihnen verbundene, irreversible Konforma-
tionsänderung Ursache für die Sensitivität gegenüber Proteinase A.
4.4 Potentielle Proteinase A-Spaltsequenzen in LTP1
Analysen von Proteinase A-behandelten, LTP1-haltigen Proben in der HPLC zeigten, daß der Abbau
von LTP1 durch PrA zu einer Flächenabnahme der LTP1-haltigen Peaks führt (Abb. 3.18). Gleich-
zeitig war die Zunahme anderer Peakflächen zu beobachten, möglicherweise hervorgerufen durch po-
tentielle LTP1-Abbauprodukte. Eine Untersuchung der entsprechenden Fraktionen im SDS-Gel und
Westernblot erbrachte keinen Nachweis potentieller LTP1-Abbauprodukte. Mit Hilfe der sensitiven
Massenspektrometrie hingegen konnte in den Fraktionen eine Vielzahl möglicher Abbauprodukte
identifiziert werden (Tab. 3.5), deren Anzahl durch eine weitere Massenanalyse nach Trypsinierung
der Fraktionen eingegrenzt wurde. Zur Vereinfachung der Analyse wurden mögliche
posttranslationale und mälz- und brauprozeßbedingte Glykosylierungen, die in einer veränderten
Peptidmasse resultieren, vernachlässigt. Durch die Anlagerung eines Hexoserestes an einen Lysinrest
würde sich die Masse des betroffenen Peptides bspw. um 162 Da erhöhen.
Weiterhin wurde bei der Auswertung vernachlässigt, daß bestimmte Massen auch durch Dimere ein-
zelner LTP1-Fragmente hervorgerufen werden können, da die Proben für die massenspektrometri-
schen Analysen nicht reduziert wurden. Es ist jedoch davon auszugehen, daß ein Teil der Cysteine im
LTP1-Molekül während des Brauprozesses durch Hitze reduziert wird (Morgan et al., 1999).
Anhand der bereits in Tabelle 3.5 eindeutig identifizierten Peptidsequenzen für die Massen 1377, 3282
und 3454 sowie der in Tabelle 3.7 zusammengestellten Sequenzen der LTP1-Abbauprodukte wurden
potentielle PrA-Spaltstellen in LTP1 identifiziert (Abb. 4.3). Demzufolge spaltet PrA C-terminal der
hydrophoben Aminosäuren Ile54, Ala55, Leu61, Leu63, Ala66, Ala67 und Ile90 sowie C-terminal der
polaren Aminosäuren Gln18, Tyr46, Asp65 und Cys87. Von Kondo et al. (1998) wurde gezeigt, daß
PrA bevorzugt C-terminal hydrophober AS spaltet. Dies wird durch die vorliegenden Ergebnisse
bestätigt.
4 Diskussion
73
1 11 21 31 41 51
LNCGQVDSKM KPCLTYVQGG PGPSGECCNG VRDLHNQAQS SGDRQTVCNC LKGIARGIHN
61 71 81 91
LNLNNAASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI Y
Abb. 4.3: Potentielle Proteinase A-Spaltstellen in LTP1. Proteinase A spaltet C-terminal der fett
hervorgehobenen AS. Grau hinterlegt sind die α-helikalen Abschnitte der LTP1-Sequenz.
(s. auch Abb. 4.2)
Bis auf zwei Ausnahmen (Cys87 und Ile90) liegen alle Spaltstellen innerhalb von α-Helices. Dieser
Befund unterstützt die Annahme, daß die Spaltstellen für PrA erst durch Modifikation des LTP1
zugänglich werden. In einer α-Helix eines in Lösung befindlichen Proteins sind die hydrophoben AS
nach innen angeordnet (Stryer, 1991). Bricht die helikale Struktur infolge Hitzeeinwirkung auf,
werden die hydrophoben AS freigelegt und die entsprechenden Peptidbindungen können durch PrA
hydrolysiert werden.
Die Spaltstellen Cys87~Ser88 und Ile90~Tyr91 befinden sich in der C-terminalen Region, in der nach
Jegou et al. (2000) ein partieller Abbau durch Proteinasen stattfinden kann. So wurden LTP1-Formen
ohne den C-terminalen Aminosäurerest Tyr und die C-terminalen Peptide Ile-Tyr sowie Ser-Arg-Ile-
Tyr identifiziert, was auf einen Abbau durch Proteinasen zurückgeführt wird. Es ist möglich, daß diese
LTP1-Formen bereits vor der PrA-Behandlung in den Proben vorlagen, d. h. aufgrund eines bereits im
Bier stattgefundenen Abbaus von LTP1. Andererseits kann die Hydrolyse der Peptidbindungen
Cys87~Ser88 und Ile90~Tyr91 auch durch andere Proteinasen während des Mälz- und Brauprozesses
erfolgt sein, so daß es sich nicht um potentielle PrA-Spaltsequenzen handelt. Denkbar ist auch, daß
Cys87 ursprünglich durch eine Beteiligung an der Disulfidbrücke Cys48-Cys87 (Abb. 4.2) und die
dadurch gegebene Konformation gegen einen PrA-Abbau geschützt ist. Erst nach der Reduktion der
Disulfidbrücke könnte dann die Spaltsequenz Cys87~Ser88 durch PrA hydrolysiert werden.
Die Position der aufgezeigten potentiellen PrA-Spaltstellen in helikalen Bereichen des LTP1-Moleküls
unterstützt die Annahme, daß eine proteinasesensitive LTP1-Form erst während des Mälz- und
Brauprozesses durch Modifikationen wie Denaturierung und Reduktion von Disulfidbrücken generiert
wird. Die Sekundär- und Tertiärstrukturen des nativen LTP1 sind somit verantwortlich für die PrA-
Resistenz des Gersten-LTP1. In diesem Zusammenhang steht auch der Abbau des rekombinanten
LTP1 durch PrA, da eine PrA-Resistenz aufgrund fehlerhaft ausgebildeter Sekundär- und Tertiärstruk-
turen bei einer Expression in E. coli nicht gegeben ist.
4 Diskussion
74
4.5 Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde der negative Einfluß bereits geringer Proteinase A-Konzentrationen
auf die Schaumstabilität belegt. LTP1 in Bier wurde eindeutig als PrA-Substrat identifiziert. Die Un-
tersuchungen zeigen, daß natives Gersten-LTP1 gegenüber PrA resistent ist und das erst mälz- und
brauprozeßbedingte Modifikationen zu einer proteinasesensitiven LTP1-Form in Bier führen. Es konn-
ten für PrA verschiedene Spaltsequenzen im LTP1-Molekül identifiziert werden. Die Ergebnisse
zeigen die Notwendigkeit (i) der Quantifizierung von geringen schaumnegativen PrA-Konzentrationen
in Bier durch geeignete Verfahren sowie (ii) der Reduktion des schaumnegativen Effektes von PrA
bzw. (iii) der Verstärkung des schaumpositiven Effektes von LTP1.
Eine Methode, um PrA-Konzentrationen von 1 ng/ml in Bier nachzuweisen, könnte nach dem derzei-
tigen Forschungsstand entweder auf einer Detektion mittels Antikörper im ELISA oder auf der Basis
fluoreszenzmarkierter Substrate beruhen. Eignen würde sich u. a. ein Substrat mit spezifischen
Spaltsequenzen für PrA, die zuvor anhand des spezifischen PrA-Substrats in Bier, dem LTP1,
identifiziert wurden. Das in dieser Arbeit vorgestellte Modell der potentiellen Spaltsequenzen in LTP1
kann Grundlage für die Entwicklung solcher Substrate sein. Mit einem entsprechenden Assay hätte die
Brauindustrie eine Möglichkeit, geringe PrA-Aktivitäten in Bier nachzuweisen und gegebenenfalls
Maßnahmen zu deren Reduktion einzuleiten. Die von Yokosawa et al. (1983) und Kondo et al. (1995)
entwickelten fluoreszenzmarkierten Substrate zur Ermittlung geringster PrA-Konzentrationen sind
wegen ihrer Komplexität und des analytischen Aufwandes für die Brauindustrie derzeit nicht
praxisrelevant.
Mögliche Maßnahmen zur Reduktion des schaumnegativen Einflusses von PrA wären der Einsatz von
chemischen und physikalischen Methoden, wobei der direkte Zusatz von Enzyminhibitoren als
chemische Methode aufgrund des deutschen Reinheitsgebotes generell ausgeschlossen ist. Denkbar
wäre allerdings die Verwendung immobilisierter Inhibitoren zur Proteinaseinaktivierung (Bürger und
Hartmeier, 1986). Als physikalische Methode kommt eine Hitzebehandlung zur Inaktivierung der
Enzyme (PrA) in Betracht. Dabei ist zu berücksichtigen, daß es bei einer Temperatur von ca. 45 °C zu
einer Zunahme der gesamten proteolytischen Aktivität kommt (Briem, 1994). Vermutlich kann PrA
als Aktivator anderer Proteinasen fungieren. Von Kondo et al. (1995) wird angenommen, daß in Bier
sowohl aktive als auch inaktive PrA-Formen vorliegen, wobei die inaktiven Formen bei höheren Tem-
peraturen durch einen autokatalytischen Prozeß in aktive Formen umgewandelt werden. Daraus leitet
sich ab, daß eine Inhibierung von PrA nur bei deutlich höheren Temperaturen stattfinden kann. Nach
Narziß (2001) sind Temperaturen von 68-75 °C zur Inaktivierung proteolytischer Aktivitäten in Bier
ausreichend, dabei ist die erforderliche Inaktivierungszeit abhängig von der zu inaktivierenden
Ausgangskonzentration an PrA (Stamm, 2000). In der technischen Realisierung wäre dem
Plattenerhitzungsverfahren gegenüber dem Erhitzen nach dem Abfüllen Vorzug zu geben. Durch die
kürzere Verweildauer des Biers bei hohen Temperaturen würden die mit der Wärmebehandlung
4 Diskussion
75
einhergehenden geschmacklichen Veränderungen minimiert. Für eine optimale PrA-Inaktivierungs-
technologie sind Untersuchungen zum kinetischen Verhalten von PrA in Bier in Abhängigkeit von der
Temperatur notwendig.
Proteinase A wird von autolysierten Hefezellen freigesetzt. Eine Reduzierung des Anteils toter
Hefezellen während des Brauprozesses führt somit auch zu geringeren Proteinase A-Konzentrationen.
Technologische Möglichkeiten zur Minimierung des schaumnegativen Einflusses von Proteinase A
beruhen daher (i) auf der Verwendung einer vitalen Hefekultur mit geringem Totzellenanteil, (ii) auf
niedrigen Gär- und Reifetemperaturen sowie (iii) auf einer schnellen Hefeernte nach Beendigung des
Gärprozesses.
Auf der Basis des eindeutigen Zusammenhangs von LTP1-Modifikationen bzw. LTP1-Denaturierung
und Proteinasesensitivität sollte eine mögliche Verstärkung des schaumpositiven Effektes von LTP1
weiter untersucht werden. Dazu ist grundsätzlich zu klären, welche Modifikationen für die Proteinase-
sensitivität verantwortlich sind und welche denaturierten LTP1-Formen sich als besonders proteinase-
empfindlich darstellen bzw. inwiefern Glykosylierungen einen Einfluß auf die Proteinasesensitivität
haben. In einem weiteren Schritt sind die für die entsprechenden Strukturveränderungen technologi-
schen Prozesse und Parameter zu identifizieren und gegebenenfalls brauverfahrenstechnische
Einflußmöglichkeiten vorzuschlagen, in deren Resultat eine weniger proteinasesensitive LTP1-Form
vorliegt und damit eine hervorragende Schaumqualität garantiert wird.
5 Zusammenfassung
76
5 ZUSAMMENFASSUNG
Die biochemischen Untersuchungen der Wechselwirkungen von Proteinase A aus S. cerevisiae und
schaumaktivem Lipidtransferprotein ergaben:
1. Proteinasen verschiedener Proteinasefamilien zeigen eine negative Korrelation von
Proteinaseaktivität und Abnahme der Schaumstabilität in Bier. Ein eindeutig negativer Einfluß auf
die Schaumstabilität wurde sowohl für Proteinasen der Carboxylproteinasefamilie (Proteinase A
und Pepsin), als auch der Serinproteinasefamilie (Carboxypeptidase Y) nachgewiesen.
2. Die schaumnegativen Konzentrationen der Hefeproteinasen Proteinase A (PrA) und
Carboxypeptidase Y (CPY) waren so gering, daß ein Nachweis mit herkömmlichen Methoden zur
Konzentrationsbestimmung nicht möglich war.
3. Von den Proteinhauptkomponenten im Bier unterliegt das schaumpositive Lipidtransferprotein 1
(LTP1) im Gegensatz zum Protein Z einem Abbau durch PrA. Damit wurde LTP1 eindeutig als
spezifisches Substrat für PrA identifiziert.
4. Verschiedene LTP1-Formen besitzen gegenüber PrA unterschiedliche Sensitivitäten. Während
PrA ein in E. coli exprimiertes rekombinantes LTP1 abbaute, wurde der Abbau eines
rekombinanten Histag-LTP1-Fusionsproteins und des nativen Gersten-LTP1 vermutlich
konformationsbedingt behindert. Die proteinasesensitive LTP1-Form in Bier entsteht vermutlich
durch Modifikationen während des Mälz- und Brauprozesses.
5. Als Grundlage für die Entwicklung eines sensitiven Nachweises für PrA-Konzentrationen in Bier
wurden potentielle PrA-Spaltsequenzen im LTP1-Molekül identifiziert. Massenspektrometrische
Untersuchungen potentieller LTP1-Abbauprodukte ergaben, daß PrA in LTP1 sowohl
Peptidbindungen C-terminal hydrophober (Ala, Ile, Leu) als auch polarer Aminosäuren (Gln, Tyr,
Asp, Cys) hydrolysiert.
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7 Anhang
83
7 ANHANG
Tab. 7.1: HPLC-Protokoll für die Auftrennung LTP1-haltiger Fraktionen
aus Gerste und Bier. ........................................................................................................ 84
Tab. 7.2: Übersicht der systemabhängigen, artefakten Hintergrundmassen und der aus
Trypsineigenspaltung resultierenden Fragmentmassen. .................................................. 85
Tab. 7.3: Detektierteb Massen in den massenspektrometrisch untersuchten Proben. .................... 86
Tab. 7.4: Theoretische Massen nach dem Trypsinverdau von LTP1. ............................................ 87
Abb. 7.1: Klonierungsstrategie. ....................................................................................................... 88
Abb. 7.2: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus unbehandlten Bier gewonnenen Fraktion F19. ......................................................... 89
Abb. 7.3: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus unbehandelten Bier gewonnenen Fraktion F20. ....................................................... 90
Abb. 7.4: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus unbehandelten Bier gewonnenen Fraktion F21. ........................................................ 91
Abb. 7.5: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F19. .................................................... 92
Abb. 7.6: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F20. .................................................... 93
Abb. 7.7: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F21. .................................................... 94
Abb. 7.8: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F19 nach der Trypsinbehandlung. ..... 95
Abb. 7.9: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F20 nach der Trypsinbehandlung. ..... 96
Abb. 7.10: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC
aus PrA-behandelten Bier gewonnenen Fraktion F21 nach der Trypsinbehandlung. ..... 97
Abb. 7.11: LTP1-Sequenz mit potentiellen Trypsinspaltsequenzen. ................................................ 98
7 Anhang
84
Tab. 7.1: HPLC-Protokoll für die Auftrennung LTP1-haltiger Fraktionen aus Gerste und Bier.
ColumnOven.Temperature.Nominal = 40
ColumnOven.Temperature.LowerLimit = 5
ColumnOven.Temperature.UpperLimit = 45
Pressure.LowerLimit = 10
Pressure.UpperLimit = 250
%A.Equate = "%A"
%A.Type = Custom
%B.Equate = "%B"
%B.Type = Custom
%C.Equate = "%C"
%C.Type = Automatic
%D.Equate = "%D"
%D.Type = Automatic
3DFIELD.MaxWavelength = 595.2
3DFIELD.MinWavelength = 200.0
3DFIELD.BunchWidth = 1.9
3DFIELD.Step = 0.5
3DFIELD.RefWavelength = 600.0
3DFIELD.RefBandwidth = 1.9
UV_VIS_1.Wavelength = 220
UV_VIS_1.Bandwidth = 4
UV_VIS_1.Step = Auto
UV_VIS_1.Average = On
UV_VIS_1.RefWavelength = 600
UV_VIS_1.RefBandwidth = 1
UV_VIS_2.Wavelength = 280
UV_VIS_2.Bandwidth = 1
UV_VIS_2.Step = Auto
UV_VIS_2.Average = On
UV_VIS_2.RefWavelength = 600
UV_VIS_2.RefBandwidth = 1
0.000 UV.Autozero
Flow = 0.8
%B = 5.0
%C = 0.0
%D = 0.0
Wait Ready
Inject
3DFIELD.AcqOn
UV_VIS_1.AcqOn
UV_VIS_2.AcqOn
UV_VIS_3.AcqOn
Flow = 0.8
%B = 5.0
%C = 0.0
%D = 0.0
5.000%B = 5.0
30.000%B = 80.0
%B = 95.0
35.000%B = 95.0
37.000%B = 5.0
45.000 3DFIELD.AcqOff
UV_VIS_1.AcqOff
UV_VIS_2.AcqOff
UV_VIS_3.AcqOff
Flow = 0.8
%B = 5.0
%C = 0.0
%D = 0.0
End
7 Anhang
85
Tab. 7.2: Übersicht der systemabhängigen, artefakten Hintergrundmassen und der aus
Trypsineigenspaltung resultierenden Fragmentmassen. Artefakte Massen können
z. B. durch Elemente der Probenmatrix (α-Cyano-4-Hydroxyzimtsäure) hervorgerufen
werden.
Hintergrundmassen 868, 878, 917, 1077, 2550, 3154
Trypsinfragmentmassen 3214, 2554, 2275, 2291, 2164, 1154, 1112, 1021, 806, 660
7 Anhang
86
Tab. 7.3: Detektierte Massen in den massenspektrometrisch untersuchten Proben.
Massen in Fraktionen
nach Trypsinbehandlung ohne Trypsinbehandlung
F21 F20 F19 F19 F20 F21
7 Anhang
87
Tab. 7.4: Theoretische Massen nach dem Trypsinverdau von LTP1. Ermittelt wurden die
Peptidsequenzen mit der ExPASy Software (www.expasy.org) unter der Annahme, daß
alle Cysteine in reduzierter Form und Methionin in oxidierter Form als Methioninsulfoxid
vorliegen. Angegeben ist die Position der Peptidsequenzen in der ursprünglichen LTP1-
Sequenz.
Masse
[M+H]+ Peptidsequenz Position in
LTP1-Sequenz
908 QTVCNCLK 45-52
963 LNCGQVDSK 1-9
1305 QTVCNCLKGIAR 45-56
1327 DLHNQAQSSGDR 33-44
1662 GIHNLNLNNAASIPSK 57-72
1895 CNVNVPYTISPDIDCSR 73-89
2060 GIARGIHNLNLNNAASIPSK 53-72
2172 CNVNVPYTISPDIDCSRIY 73-91
2217 DLHNQAQSSGDRQTVCNCLK 33-52
2353 MKPCLTYVQGGPGPSGECCNGVR 10-32
3297 LNCGQVDSKMKPCLTYVQGGPGPSGECCNGVR 1-32
3539 GIHNLNLNNAASIPSKCNVNVPYTISP 57-89
3661 MKPCLTYVQGGPGPSGECCNGVRDLHNQAQSSGDR 10-44
7 Anhang
88
Abb. 7.1: Klonierung des PCR-amplifizierten LTP1-Gens in den pTYB1-Vektor. (s.2.5)
Stop EcoR I
ltp1-Sequenz
BamH I
tyb1-sap-r
CCA ATT CCG ctc aac tgc .............agg att tat TGA GAA TT
GGT TAA GGC
g
a
g
tt
g
ac
g
.............tcc taa ata ACT CTT AA
tyb1-nde-f
1. Präparation der ltp1-DNA-Sequenz über Restriktion mit BamHI und EcoRI aus
dem Plasmid pSAm
2. PCR mit den Primern tyb1-nde-f und
tyb1-sap-r zum Einführen der neuen
Restriktionsorte NdeI und SapI
Nde I Sap I
CAT atg ctc aac tgc ..............agg att tat TGC GGA AGA
GTA TAC
g
a
g
tt
g
ac
g
..............tcc taa ata ACG CCT TCT
3. Restriktion des PCR-Fragments und
des pTYB1-Vektors mit NdeI und SapI
4. Ligation von pTYB1-Vektor und PCR-
Fragment
T atg ctc ... tat
ac gag ... ata ACG
CA
GTA t
TGC TTT
AAA
pTYB1-Vektor restringiert
mit NdeI und SapI
7 Anhang
89
Abb. 7.2: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus unbehandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F19.
7 Anhang
90
Abb. 7.3: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus unbehandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F20.
7 Anhang
91
Abb. 7.4: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus unbehandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F21.
7 Anhang
92
Abb. 7.5: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F19.
7 Anhang
93
Abb. 7.6: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F20.
7 Anhang
94
Abb. 7.7: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F21.
7 Anhang
95
Abb. 7.8: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F19 nach der Trypsinbehandlung.
7 Anhang
96
Abb. 7.9: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F20 nach der Trypsinbehandlung.
7 Anhang
97
Abb. 7.10: Massenspektrogramm der mittels RP-HPLC aus PrA-behandeltem Bier gewonnenen
Fraktion F21 nach der Trypsinbehandlung.
7 Anhang
98
AS 1 LNCGQVDSKM KPCLTYVQGG PGPSGECCNG VRDLHNQAQS SGDRQTVCNC 50
AS 51 LKGIARGIHN LNLNNAASIP SKCNVNVPYT ISPDIDCSRI Y 91
Abb. 7.11: LTP1-Sequenz mit potentiellen Trypsinspaltsequenzen. LTP1 enthält 7 Spalt-
sequenzen für Trypsin: R^X; K^X. Die Spaltung kann rechts (C-terminal) der markierten
Aminosäuren an den Aminosäurepositionen 9, 32, 44, 52, 56, 72 und 89 erfolgen.
