Berlin 2014
D 83
Charakterisierung von Nanopartikel-Protein-
Agglomeraten in biologisch relevanten Medien
vorgelegt von Diplom-Chemiker
Thomas Lang
geboren in Heidelberg
von der Fakultät II - Mathematik und Naturwissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
(Dr. rer. nat.)
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender: Prof. Dr. Reinhard Schomäcker
Gutachter: Prof. Dr. Michael Gradzielski
Gutachter: Prof. Dr. Michael Maskos
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 04.09.2014
„Man muss Dinge so einfach wie möglich machen.
Aber nicht einfacher.“ Albert Einstein
Abstract
In this study, three different kinds of nanomaterials were investigated revealing diverse properties
under physiological conditions. These were stabilizer free alloy nanoparticles from laser ablation,
amorphous silica and poly(organosiloxane) nanoparticles. With regards to in vitro cell studies, size
characterization of nanoparticles took place in cell culture media in presence of fetal bovine serum
proteins. To combine the benefits of different characterization techniques and to compensate single
drawbacks, Static Light Scattering, Dynamic Light Scattering and Asymmetrical Flow Field-Flow
Fractionation were applied. Furthermore, the coupling of Asymmetrical Flow Field-Flow
Fractionation to a prototype online MALLS detector offering minimal sample volume was established.
The alloy nanoparticles exhibited insufficient electrostatic stabilization at physiological salt
conditions, however featuring increased stability after serum protein adsorption. In contrast
amorphous silica nanoparticles were stable at high salt conditions and aggregates were formed rapidly
in presence of proteins. Hence, agglomeration behavior of silica nanoparticles was investigated in
detail by applying a model describing growth behavior of particle-cluster and cluster-cluster
aggregates, which was also derived in this study. Poly(organosiloxane) nanoparticles did not show any
aggregation behavior, though the thickness of the protein corona was investigated by applying Static
Light Scatting experiments representing an alternative approach to already established methods such
as Dynamic Light Scattering, Fluorescence Correlations Spectroscopy or Particle Tracking.
As result for silica nanoparticles in presence of proteins, evidence for the mechanism of bridging
flocculation was provided. The flocculation process was completed after 10 minutes. Furthermore, the
number of bridges was observed being constant independent of the number of particles present.
However the size of the pristine nanomaterial determined the absolute number of bridges. Amorphous
silica nanoparticles with a radius of 10 nm and 15 nm were bridged more efficiently with a factor of
40, compared to amorphous silica nanoparticles with a radius of 60 nm. The number of proteins
participating in a bridge, as well as an increased area of steric hindrance close to the bridging location,
was responsible for a loss of bridging efficiency of proteins in case of larger silica particle species.
The protein corona onto poly(organosiloxane) nanoparticles exhibited a size of 1.5 nm. By PEGylation
of the nanomaterial, the corona decreased to a size of 0.4 nm. These obervations were confirmed by
Asymmetrical Flow Field-Flow Fractionation experiments. These thicknesses corresponded to surface
coverage of 48% and 12%, respectively, considering rigid proteins. The apparent incomplete surface
coverage of the non-PEGylated sample is a result of the unfolding of proteins at colloidal surfaces.
Additionally, a statistically arrangement of adsorbed proteins does not lead to a compact packing,
instead spots of unapproachable surface will be formed, which lower the maximum surface coverage
directly.
Kurzzusammenfassung
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden drei unterschiedliche Nanomaterialien untersucht,
welche unter physiologischen Bedingungen ein unterschiedliches Verhalten aufwiesen. Bei diesen
Materialien handelte es sich um stabilisatorfreie Legierungs-Nanopartikel aus der Laser-Ablation,
amorphe Silica- sowie um Poly(organosiloxan) Nanopartikel. Im Hinblick auf in vitro Zellstudien
wurde eine Größencharakterisierung in Zellmedium in Gegenwart von Proteinen aus fötalem
Rinderserum durchgeführt. Um Vorteile einzelner Charakterisierungsmethoden zu kombinieren und
gleichzeitig Nachteile zu kompensieren, wurden zur umfangreichen Charakterisierung die Statische
Lichtstreuung, die Dynamische Lichtstreuung sowie die Asymmetrische Fluss Feld-Fluss
Fraktionierung angewandt. Weiterhin wurde die Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung mit
einem online MALLS Detektor gekoppelt. Es handelt sich hierbei um einen Prototyp, bei dem durch
einen hydrodynamisch fokussierten Probestrahl eine Minimierung des Probevolumens erfolgt.
Die Legierungs-Nanopartikel wiesen unter physiologischen Salzbedingungen eine nur unzureichende
elektrostatische Stabilität auf, zeigten jedoch höhere Stabilität in Gegenwart von Serumproteinen. Im
Gegensatz hierzu waren amorphe Silica Nanopartikel unter hohen Salzkonzentrationen stabil,
aggregierten jedoch in Gegenwart von Proteinen. Das Agglomerationsverhalten der amorphen Silica
Nanopartikel wurde genauer untersucht, indem hierauf ein in dieser Arbeit hergeleitetes Modell der
Wachstumsfunktionen von Teilchen-Cluster- und Cluster-Cluster-Aggregaten angewandt wurde.
Poly(organosiloxan) Nanopartikel wiesen in Gegenwart von Serumproteinen keine Aggregate auf.
Anhand dieser Probe wurde die Dicke der Proteinkorona durch ein statisches Lichtstreuexperiment
bestimmt, welches einen alternativen Zugang zu bereits etablierten Methoden wie der Dynamischen
Lichtstreuung, der Fluoreszenz Korrelationsspektroskopie oder dem Particle Tracking darstellt.
Als Ergebnis konnte für die Koagulation amorpher Silica Nanopartikel in Gegenwart von
Serumproteinen der Mechanismus der verbrückenden Flockung nachgewiesen werden. Der
Flockungsprozess war nach 10 Minuten abgeschlossen. Weiterhin war die Anzahl der gebildeten
Brücken unabhängig von der vorhandenen Partikelzahl konstant, jedoch bestimmte die Größe der
ursprünglichen Nanopartikel die absolute Anzahl der gebildeten Verbrückungen. Amorphe Silica
Nanopartikel mit einem Radius von 10 und 15 nm wurden mit einem Faktor von 40 effizienter
verbrückt als Partikel mit einem Radius von 60 nm. Die Anzahl der Proteine pro Verbrückung sowie
ein größerer sterisch unzugänglicher Bereich nahe der Verbrückungsstelle sind für die geringere
Verbrückungseffizienz großer Teilchenspezies verantwortlich.
Die Proteinkorona auf Poly(organosiloxan) Nanopartikeln wurde auf eine Dicke von 1,5 nm bestimmt.
Diese verkleinerte sich durch PEGylierung des Nanomaterials auf eine Dicke von 0,4 nm. Diese Funde
wurden mittels Asymmetrischer Fluss Feld-Fluss Fraktionierung bestätigt. Unter der Annahme starrer
Proteine entsprechen diese Werte einer Oberflächenbedeckung von 48% bzw. 12%. Im Falle der nicht-
PEGylierten Probe wurde die scheinbar unvollständige Oberflächenbelegung aufgrund der Entfaltung
der Proteine auf kolloidalen Oberflächen erhalten. Zusätzlich entstehen bei statistischer Verteilung
adsorbierter Proteine keine Dichtestpackungen, sondern sterisch unzugängliche Bereiche auf der
Nanopartikel Oberfläche, wodurch die maximale Oberflächenbelegung nicht 100% entspricht.
Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung ........................................................................................................................................ 1
2 Theoretische Grundlagen................................................................................................................. 3
2.1 Kolloidale Dispersionen .......................................................................................................... 3
2.2 Die Stabilität kolloidaler Dispersionen ................................................................................... 4
2.2.1 Das elektrostatische Potential .......................................................................................... 4
2.2.2 Van-der-Waals Wechselwirkungen ................................................................................. 6
2.2.3 DLVO-Theorie ................................................................................................................ 8
2.2.4 Der Stabilitätsfaktor......................................................................................................... 9
2.2.5 Koagulationskinetik ......................................................................................................... 9
2.3 Kolloide in Gegenwart von Polymeren ................................................................................. 10
2.3.1 Sterische Stabilisierung ................................................................................................. 11
2.3.2 Flockung durch Polymeradsorption............................................................................... 11
2.3.3 Verarmungseffekte ........................................................................................................ 12
2.4 NP unter physiologischen Bedingungen ............................................................................... 13
2.4.1 Ausbildung der Proteinkorona ....................................................................................... 14
2.4.2 Kolloidale Stabilität unter physiologischen Bedingungen ............................................ 16
2.5 Die fraktale Dimension von Aggregaten ............................................................................... 16
2.5.1 Das nicht-fraktale Wachstum kleiner Teilchen-Cluster Aggregate ............................... 18
2.5.2 Das fraktale Wachstum großer Teilchen-Cluster Aggregate ......................................... 20
2.5.3 Die hydrodynamische Raumausfüllung fraktaler Strukturen ........................................ 21
2.5.4 Berechnung der fraktalen Dimension durch eine Reihenentwicklung .......................... 22
3 Charakterisierungsmethoden ......................................................................................................... 25
3.1 Lichtstreuung ......................................................................................................................... 25
3.1.1 Statische Lichtstreuung (SLS) ....................................................................................... 25
3.1.2 Dynamische Lichtstreuung (DLS) ................................................................................. 30
3.1.3 Dynamische Lichtstreuung an polydispersen Proben .................................................... 32
3.1.4 Relevante Mittelwerte ................................................................................................... 33
3.2 Feld Fluss Fraktionierung (FFF) ........................................................................................... 35
3.2.1 Das allgemeine Trennprinzip der FFF ........................................................................... 35
3.2.2 Die Asymmetrische Fluss-Feld Fluss Fraktionierung (AF-FFF)................................... 37
3.2.3 Fraktionierung in der Fluss-FFF .................................................................................... 38
3.2.4 Ioneneffekte in der Fluss-Feld Fluss Fraktionierung ..................................................... 42
4 Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten ............................................ 45
4.1 Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion ................................................... 45
4.1.1 Einrichtung des Durchfluss MALLS-Detektors ............................................................ 47
4.1.2 Kalibrierung ................................................................................................................... 48
4.1.3 Online Molekulargewichts-Bestimmung ....................................................................... 54
4.1.4 Online Trägheitsradien-Bestimmung ............................................................................ 57
4.2 Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten ................................... 61
4.2.1 Berechnung des nicht-fraktalen Wachstum von Teilchen-Cluster- Aggregaten ........... 61
4.2.2 Berechnung des fraktalen Vorfaktors durch eine Reihenentwicklung .......................... 62
4.2.3 Berechnung der Trägheitsradien kleiner definierten Aggregaten .................................. 66
4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion ............................................................................... 67
5 Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien ....................................... 71
5.1 NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen .. 72
5.1.1 Charakterisierung von Legierungs-NP .......................................................................... 73
5.1.2 Charakterisierung von Legierungs-NP in RPMI Medium ............................................. 76
5.1.3 Charakterisierung von Legierungs-NP in RPMI Medium in Gegenwart von
Serumproteinen ............................................................................................................................. 79
5.2 Amorphe Silica Nanopartikel ................................................................................................ 83
5.2.1 Größencharakterisierung amorpher Silica NP ............................................................... 83
5.2.2 Bestimmung der Oberflächenkonzentration .................................................................. 87
5.3 Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen ...................................... 89
5.3.1 Die Konzentrationsabhängigkeit des Aggregationsverhaltens ...................................... 91
5.3.2 Die kolloidale Stabilität proteinbeladener Silica NP ..................................................... 98
5.3.3 Aggregation durch affin bindende Proteine ................................................................. 100
5.3.4 Die Irreversibilität der Aggregation ............................................................................ 103
5.3.5 Vergleich von NexSil8, NexSil20 und NexSil125 unter physiologischen Bedingungen ...
..................................................................................................................................... 105
5.3.6 Koagulationskinetik der amorphen Silica NP in Gegenwart von Proteinen ................ 111
5.3.7 Modell zur Verbrückungseffizienz .............................................................................. 117
5.3.8 Zusammenfassung und Diskussion ............................................................................. 120
5.4 Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel ......................................................... 124
5.4.1 Poly(organosiloxan) Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen .................... 129
5.4.2 Größencharakterisierung der Proteinkorona mittels Fluss-Feld Fluss Fraktionierung 129
5.4.3 Größencharakterisierung der Proteinkorona mittels statischer Lichtstreuung ............. 132
5.4.4 Modelle zur Dateninterpretation .................................................................................. 134
5.4.5 Zusammenfassung und Diskussion ............................................................................. 143
6 Zusammenfassung und Ausblick ................................................................................................. 147
6.1 Zusammenfassung ............................................................................................................... 147
6.2 Ausblick............................................................................................................................... 149
7 Experimentelle Beschreibungen .................................................................................................. 151
7.1 Chemikalien, Nanomaterialien und Lösemittel ................................................................... 151
7.2 Probenpräparation ............................................................................................................... 151
7.3 Verwendete Apparaturen ..................................................................................................... 152
8 Literatur ....................................................................................................................................... 155
9 Abkürzungen und Symbole ......................................................................................................... 163
9.1 Abkürzungen ....................................................................................................................... 163
9.2 Symbole ............................................................................................................................... 164
10 Anhang .................................................................................................................................... 167
10.1 Berechnete Werte der Trägheitsradien von Aggregaten durch eine Reihenentwicklung .... 167
10.2 Zusätzliche Abbildungen ..................................................................................................... 168
11 Danksagung ............................................................................................................................. 173
Kolloidale Dispersionen
___________________________________
-1-
1 Einleitung
Der Einsatz von Nanomaterialien erfuhr besonders im letzten Jahrzehnt einen enormen Aufschwung,
da diese Materialen neuartige Eigenschaften als Nanopartikel im Vergleich zum Feststoff aufweisen.
Bislang stellen solche Materialien ein schwer einzuschätzendes Risiko für Gesundheit und Umwelt
dar.1 Die erhöhte Belastung durch Nanomaterialien in alltäglichen Produkten2,3 erfordert eine
sorgfältige Betrachtung der bioökologischen Folgen.4,5
Die genaue Wirkweise von Nanopartikeln auf Zellen ist unklar, jedoch werden die zytotoxischen
Eigenschaften von Nanomaterialien durch die Größe und Oberfläche der Nanopartikel beeinflusst.6,7
Das Verständnis der Interaktionen von Nanomaterialien mit biologischen Systemen sowie deren
Einfluss auf grundlegende biologische Funktionen erfordert genauere Untersuchungen der komplexen
Vorgänge an der Nano-Bio Grenzfläche.8
Nanopartikel zeigen in biologischer Umgebung eine Veränderung der ursprünglichen kolloidalen
Eigenschaften,9,10 da sich sehr schnell Nanopartikel-Protein Agglomerate ausbilden,11 die sogenannte
Proteinkorona.12 Es wird angenommen, dass diese Korona Zellantworten vermittelt, da diese das
eigentliche Nanopartikel überdeckt und mit der Zelle in Wechselwirkung tritt.13,14
Abhängig von der Art der kolloidalen Stabilisierung der Nanopartikel, kann sich weiterhin die Größe
aufgrund der Formierung von Partikel-Partikel Aggregaten drastisch erhöhen.15 In vivo ergeben sich
zudem verschiedene größenspezifische Mechanismen die den Transport der Partikel bestimmen. Diese
beeinflussen die Zirkulationszeit im Blut, die Extravasion ins Gewebe, die Zellaufnahme, die
Degradation und die Ausscheidung.16,17,18,19
Sowohl die Proteinkorona als auch die kolloidale Stabilität besitzen eine zentrale Stellung im Hinblick
auf die Wechselwirkung der Nanopartikel mit Zellen in physiologischer Umgebung. Nanopartikel in
biologisch relevanten Medien zu charakterisieren und Rückschlüsse auf kolloidale Eigenschaften zu
ziehen bildet eine Grundlage zur Vorhersage der in vivo Eigenschaften von Nanopartikel.20
In dieser Arbeit soll eine zielgerichtete Charakterisierung von Nanopartikeln unter biologisch
relevanten Bedingungen erfolgen. Als Methoden eignen sich Lichtstreuversuche, zur absoluten
Größencharakterisierung von Teilchen in Lösung sowie die Feld Fluss Fraktionierung zur
Auftrennung der Probe sowie zur Charakterisierung polydisperser Systeme. Die Kopplung dieser
Methoden stellt sich hierbei als besonders bevorteilt heraus, da die absolute Größencharakterisierung
stark polydisperser Systeme gelingt.21,22 In Anlehnung an Zellversuche soll die
Nanopartikelcharakterisierung in Gegenwart von Modellmedien erfolgen, die ebenso in in vitro Tests
Verwendung finden.23
Einleitung
___________________________________
-2-
Kolloidale Dispersionen
___________________________________
-3-
2 Theoretische Grundlagen
2.1 Kolloidale Dispersionen
Der Begriff Kolloid wurde von Thomas Graham 1861 eingeführt (von griech. „kollan“ = leimen)24 und
für Stoffe verwendet, die in Lösung unsichtbar waren, dennoch aber von porösen Membranen
zurückgehalten wurden. Allgemein bezeichnet dieser Begriff Verteilungszustände von Materie: eine
kolloidale Dispersion ist die Verteilung eines Stoffes innerhalb eines Dispersionsmittels, wobei das
räumliche Ausmaß der dispergierten Phase mindestens in einer Dimension ≤ 1 µm ist. Bei
Verteilungen eines Stoffes mit einer Größenordnung ≤ 1 nm wird die kolloidale Dispersion von dem
Begriff der Lösung abgegrenzt. Kolloidale Systeme werden in drei Grundtypen unterteilt25:
- zweiphasige Dispersionen
- Lösungen makromolekularer Stoffe
- und Assoziationskolloide
Die Zweiphasensysteme unterscheiden sich in den Aggregatszuständen der kontinuierlichen und der
kolloidal dispersen Phase. Die resultierenden Dispersionen sind in Tabelle 1 zusammengestellt. Die
makromolekularen Lösungen sind einphasige Systeme während die Assoziationskolloide, wie
Mizellen oder Vesikel, sowohl mittels einphasigen (Massenwirkungsgesetz) sowie zweiphasigen
Modellen (Phasentrennung) beschrieben werden.
Tabelle 1: Kolloidale Verteilungen
Kontinuierliche Phase
Disperse Phase
Bezeichnung
fest
fest
festes Sol, Legierung
fest
flüssig
feste Emulsion
fest
gasförmig
fester Schaum
flüssig
fest
Suspension
flüssig
flüssig
Emulsion
flüssig
gasförmig
Schaum
gasförmig
fest
Aerosol, Rauch
gasförmig
flüssig
Nebel
gasförmig
gasförmig
nicht existent
Gelöste Makromoleküle sind im thermodynamischen Sinn „echte Lösungen“, da deren Verhalten in
Lösung von der Wechselwirkung mit dem Lösemittel bestimmt wird. Diese Systeme werden dennoch
den kolloidalen Dispersionen zugerechnet, da sich die räumlichen Ausmaße von Polymerknäulen in
der Größenordnung kolloidaler Dispersionen befinden. Es handelt sich hierbei um ein einphasiges
kolloidales System.
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-4-
Zweiphasige kolloidale Systeme liegen hingegen metastabil vor. Diese Systeme besitzen im Vergleich
zu separierten Phasen einen Zustand höherer freier Enthalpie. Der Grund hierfür liegt in enthalpischen
Wechselwirkungen, den Van-der-Waals (VdW) Kräften. Diese üben auf Dispersionen interpartikuläre
attraktive Kräfte aus, so dass bei nicht stabilisierten Dispersionen unweigerlich eine Aggregation der
Teilchen folgt. Weiterhin sind zweiphasige Dispersionen besonders in wässrigen Systemen entropisch
nicht begünstigt, da der Hydratkäfig an der Grenzfläche eine hoch geordnete Struktur darstellt. Dies
wird durch den „hydrophoben Effekt“ beschrieben.26 Um eine Phasenseparation solcher Systeme zu
vermeiden, müssen an der Grenzfläche stabilisierende Kräfte vorherrschen.
Eine zweiphasige Dispersion wird in der Regel durch Energiebarrieren in Form von repulsiven
elektrostatischen Kräften aufrechterhalten. Die Gesamtwechselwirkung zweier kolloidaler
Oberflächen wird durch die DLVO-Theorie beschrieben, welche auf Grundlage attraktiver VdW-
Wechselwirkungen sowie elektrostatischer Repulsion basiert. Zusätzliche Stabilität einer Dispersion
lässt sich durch die Anwesenheit von adsorbierten Polymeren (sterische Stabilisierung) aber auch
durch hohe Konzentrationen gelöster Polymere (Verarmungstabilisierung) verwirklichen. Im
folgenden Kapitel soll auf die verschiedenen Stabilisierungsmechanismen sowie auf die
Koagulationskinetik kolloidaler Dispersionen näher eingegangen werden.
2.2 Die Stabilität kolloidaler Dispersionen
2.2.1 Das elektrostatische Potential
Grundlage für eine elektrostatische Abstoßung kolloidaler Oberflächen ist das Vorhandensein von
Oberflächenladungen. Vor allem bei wässrigen Dispersionen resultieren diese aus der Ionisierbarkeit
funktioneller Gruppen, zum Beispiel durch die pH-abhängige Adsorption oder Desorption von
Protonen oder Hydroxylionen. Die Gegenionen, die diese Oberflächenladung kompensieren, ordnen
sich innerhalb einer diffusen Ionenschicht um das Kolloid herum an. Nach dem Gouy-Chapman
Modell27,28 wird die Verteilung der Coionen und Gegenionen durch den Verlauf des elektrostatischen
Potentials bestimmt. Dieses Potential fällt von dem Wert des Oberflächenpotentials ψ0 an der
Teilchenoberfläche mit zunehmendem Abstand von der Oberfläche exponentiell ab. Nach Boltzmann
wird die Ionenkonzentration ci durch das Verhältnis der elektrostatischen Anziehungsenergie ziFψ(x)
und der Thermischen Energie RT mit der Wertigkeit der Ionen zi beschrieben.
(1)
ci(x) = ci,o exp �−zi F
R T ψ(x)�
Die Stabilität kolloidaler Dispersionen
___________________________________
-5-
Das Potential ψ(x) im Abstand x von der Oberfläche ist gegeben durch die Verteilung der
Raumladungsdichte ρ(x). Es wird hierfür von der Poisson-Boltzmann-Verteilung ausgegangen mit der
relativen Dielektrizitätskonstante des Dispersionsmittels ε sowie der elektrischen Feldkonstante ε0.
(2)
Die Ladungsdichte resultiert aus der Aufsummierung aller Ionen entsprechend Gleichung (3):
(3)
Für symmetrische Elektrolyte mit z− = z+ = z folgt:
(4)
Die Poisson-Boltzmann-Verteilung der Ladungsdichte, Gleichung (4), führt zu
(5)
Die Lösung dieser Gleichung basiert auf der Annäherung kleiner Potentiale, ψ≤25
zmV, wodurch gilt
sinh y~y.
(6)
κ−1 ist hierbei die Abklingrate, bezeichnet als Debye-Hückel-Länge. Diese Länge wird als Maß für die
elektrostatische Reichweite erachtet und wird vor allem durch die Ionenstärke beeinflusst.
(7)
Dieses Modell nach Gouy-Chapman beschreibt den Verlauf des elektrostatischen Potentials innerhalb
der kontinuierlichen Phasen. Es stößt allerdings auf Schwachstellen zur Beschreibung der
Ionenkonzentration nahe der kolloidalen Oberfläche, da Ionen als Punktladungen ohne Eigenvolumen
erachtet werden. Direkt an der Grenzfläche würde dies bei höheren Oberflächenpotentialen zu
unrealistisch hohen Ionenkonzentrationen führen. Weiterhin zeigten elektrostatisch stabilisierte
Teilchen eine geringere Stabilität als berechnet. Stern führte hierzu ein Modell ein, nach dem ein
gewisser Anteil von Ionen an der Oberfläche innerhalb einer Schichtdicke δ adsorbiert wird.29
ρ(x)=−ε ε0�d2ψ(x)
dx2�
ρ(x)= F �zici= F �zici,o exp �−zi F
R T ψ(x)�
ρ(x)=−2 z coFsinh �z F
R T ψ(x)�
d2ψ(x)
dx2=F
ε ε0 2 z c0sinh �z F
R T ψ(x)�.
ψ(x)=ψ0exp (−κ x)
κ2=2 F2
ε ε0RT z2co
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-6-
Teilchen mit Abständen größer δ folgen dem bereits bekannten Verlauf nach Gouy-Chapman. Im
einfachsten Fall kann ein linearer Verlauf des Potentials von ψ0 auf ψd innerhalb dieser Stern-Schicht
angenommen werden. Im Falle von bewegten Partikeln erfolgt eine Abscherung von Ionen entlang
einer Abscherfläche. Das entsprechende Potential ist durch elektrophoretische Experimente zugänglich
und wird als ζ-Potential bezeichnet.
Das elektrostatische Wechselwirkungspotential zweier gleichgeladener kolloidaler Teilchen
VR lässt sich anhand des Potentialverlaufes herleiten. Für kugelförmige Teilchen mit Abstand H ist
dieses durch folgende Beziehung gegeben:
(8)
Gleichung (8) bezieht sich auf die Wechselwirkungspotentiale einzelner Teilchen. Es erfolgte eine
Umrechnung der molaren Größen der universellen Gaskonstante R sowie der Faraday Konstante F auf
die Bolzmannkonstante kB sowie auf die Elementarladung e0.
2.2.2 Van-der-Waals Wechselwirkungen
Fluktuationen der Elektronendichte innerhalb der Elektronenhülle führen zu attraktiven Kräften von
Atomen.30,31 London und Van der Waals beschrieben 1930 die Wechselwirkung zweier Atome
mithilfe der quantenmechanischen Störungstheorie anhand der Polarisierbarkeiten der Elektronenhülle
α sowie der Frequenz der Ionisierung v.32
(9)
Nach Zusammenfassung aller Konstanten zu C lässt sich die Wechselwirkungsenergie ausdrücken als
(10)
Hierbei bezeichnet A die Hamaker Konstante, welche durch A = π2ρ1ρ2C gegeben ist und eine reine
Stoffeigenschaft für die Wechselwirkung zweier Materialien mit Atomanzahldichten ρ1 und ρ2
darstellt. Die Wechselwirkung zweier Medien 1 und 2 innerhalb eines Medium 3 wird durch die
Lifshitz-Theorie beschrieben. Die Polarisierbarkeit eines Materials durch Medium 3 erfolgt
entsprechend Gleichung (11).
(11)
VR=a
z2∙8ε(kBT)2
e02∙tanh (z/4)2e−κH
w(r)=−3
2α1α2hv1v2
(4πε0)2 r6 (v1+ v2)
EVdW,Atom(r)= −C
r6=−A
r6π2ρ1ρ2
ρ2α2= 2ε0ε3�ε2−ε3
ε2+ε3�
Die Stabilität kolloidaler Dispersionen
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-7-
Die Van-der-Waals Wechselwirkung kolloidaler Teilchen durch ein Medium A131 resultieren aus den
Wechselwirkungen der Atome zweier kolloidaler Teilchen A11 miteinander. Da Kolloide, die sich
gegenseitig annähern, Moleküle des zwischenliegenden Mediums verdrängen, müssen zusätzlich die
Wechselwirkung der Teilchen mit dem Medium A13, sowie die Wechselwirkungen des Mediums mit
sich selbst A33 berücksichtigt werden. Für die Van-der-Waals Wechselwirkung zweier Kolloide durch
ein Medium folgt:
(12)
Diese Überlegung lässt sich auf die Wechselwirkung zweier kolloidaler Teilchen übertragen. Hierzu
wird eine doppelte Integration über das Volumen beider Teilchen unter Berücksichtigung der
jeweiligen Atomanzahldichten ρ1 bzw. ρ2 durchgeführt.
(13)
Die Gesamtwechselwirkung zweier Oberflächen im Abstand r, bezogen auf eine Einheitsfläche, ergibt
sich hieraus zu:
(14)
Die Van-der-Waals Wechselwirkung Va zwischen zwei gleichgroßen, kugelförmigen Teilchen mit
dem Radius a im Abstand H ist durch Gleichung (15) gegeben:
(15)
A131= A11+ A33−2A13
EVdW,Teilchen(r)= ��−C
r6ρ1dV1ρ2dV2
EVdW(r)=−πρ1ρ2 C
12 r2=−A131
12 π r2
VA=−A131
12 ∙a
H
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-8-
2.2.3 DLVO-Theorie
Die Überlagerung der interpartikulären Wechselwirkungen der elektrostatischen Repulsion VR mit der
Van-der-Waals Anziehung VA, Gleichungen (8) und (15), führt zur Gesamtwechselwirkungskurve
VT= VR+ VA.33,34 Ein qualitativer Verlauf des Wechselwirkungspotentials ist in Abbildung 1 A
dargestellt.
Abbildung 1: Qualitative Verläufe der Gesamtwechselwirkungskurve. A) Die Überlagerung der Potentialbeiträge der Van-
der-Waals Anziehung VA sowie der elektrostatischen Repulsion VR. B) Der Einfluss der Ionenstärke auf die
Gesamtwechselwirkungskurve.
Die Wechselwirkung gleichgeladener Teilchen ergibt über den kompletten Kurvenverlauf einen
repulsiven Beitrag der elektrostatischen Kräfte. Da für kurze Abstände die attraktiven Van-der-Waals
Kräfte dominieren, resultiert bei einem Abstand H ~ κ−1 ein Potentialmaximum Vmax.25 Zu kürzeren
Abständen hin fällt die Potentialkurve steil ab, bis schließlich bei Teilchenabständen von H < 0,1 nm
die Bornabstoßung wirksam wird. Dies führt zu einem tiefliegenden primären Minimum des
Potentialverlaufs. Bei größeren Abständen kann im Anschluss an das Potentialmaximum häufig ein
flaches sekundäres Minimum beobachtet werden. Koagulation im sekundären Minimum führt daher zu
Agglomeraten, die sich schon durch sehr geringe Scherkräfte auflösen lassen.
Im Zuge einer qualitativen Veranschaulichung sollen im Folgenden die Van-der-Waals
Wechselwirkungen (VdW-WW) als weitestgehend unabhängig von der Ionenstärke erachtet werden.
Da die elektrostatische Repulsion von dem Elektrolyt sehr stark beeinflusst wird, variiert der Verlauf
der Gesamtwechselwirkungsenergie mit zunehmender Ionenstärke, Abbildung 1 B. Mit Verringerung
der Reichweite der elektrostatischen Repulsion, κ−1, sinkt das Potentialmaximum immer weiter ab, bis
die Potentialbarriere schließlich verschwindet und attraktive Kräfte dominieren. Es folgt die
Koagulation der Probe.
Die Stabilität kolloidaler Dispersionen
___________________________________
-9-
2.2.4 Der Stabilitätsfaktor
Da für elektrostatisch stabilisierte Teilchen immer attraktive Van-der-Waals Kräfte bei kurzen
Abständen dominieren, begründet sich deren Stabilität ausschließlich durch die Potentialbarriere mit
einem Maximum Vmax. Hierdurch liegen solche kolloidalen Dispersionen nicht im
thermodynamischen Gleichgewicht vor, sondern unterliegen allenfalls einer kinetischen Stabilisierung,
sofern Vmax> 0 gilt. Die kinetische Stabilität der Dispersion lässt sich durch die Wahrscheinlichkeit
beschreiben, mit der zwei kollidierende Teilchen die Potentialbarriere überwinden und somit ein
Zusammenstoß zweier Teilchen zur Koagulation führt. Die entsprechende reziproke
Wahrscheinlichkeit wird als Stabilitätsfaktor W bezeichnet. Nach Fuchs35 berechnet sich der
Stabilitätsfaktor nach:
(16)
Der genaue Verlauf von VT trägt nur untergeordnet zum Stabilitätsfaktor bei, hingegen wird der
Stabilitätsfaktor hauptsächlich von der Höhe der Barriere Vmax bestimmt.36 Nach Vereinfachung
folgt:37
(17)
Dispersionen mit einer Energiebarriere von Vmax > 15 kBT werden als stabil erachtet. Es resultieren
Stabilitätsfaktoren von W ≥ 105. Anschaulich bedeutet dies, dass jedes Teilchen gemittelt 105 Stöße
durchläuft, bevor ein Stoß erfolgreich zur Koagulation führt.
2.2.5 Koagulationskinetik
Koagulation erfolgt nach Zusammenstoß zweier Teilchen entsprechend einer bimolekularen Reaktion.
Die Konzentration der Einzelteilchen n1 nimmt daher mit einem kinetischen Gesetz zweiter Ordnung
ab. Hierbei entstehen mit zunehmender Reaktionszeit Dimere, Trimere und Oligomere bis hin zu
größeren Aggregaten. Unter Berücksichtigung der Kollision der Einzelteilchen mit der Gesamtanzahl
der entsprechenden Koagulate ∑n folgt für die zeitliche Abnahme der Einzelteilchen38:
(18)
W = 2a �exp(VTkBT
⁄)dr/r2
∞
2a
W ~ (a1+ a2)−1κ−1exp
(Vmax kBT
⁄)
−dn1
dt = k ∗n1∗�n
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-10-
Die Geschwindigkeitskonstant k hängt von der Stabilität der Dispersion ab. Die maximale
Koagulationsgeschwindigkeit k0 wird erreicht, sofern keine repulsiven Kräfte die Dispersion
stabilisieren. Folglich werden Vmax≤0 und W=1, sodass jeder Zusammenstoß zur Koagulation
beiträgt. Es resultiert die Geschwindigkeitskonstante aus der Brown’schen Teilchendiffusion.
(19)
Dieser Fall, für den k→k0 gilt, wird als schnelle Koagulation bezeichnet. Für stabilisierte Kolloide
muss hingegen der Stabilitätsfaktor berücksichtigt werden. Dieser gibt das Verhältnis der Gesamtzahl
der Stöße zu den Stößen an, die zu Koagulation führen. Dieses Verhältnis findet sich in den
Geschwindigkeitskonstanten wieder.
(20)
2.3 Kolloide in Gegenwart von Polymeren
Der Einfluss von Polymeren auf die Stabilität kolloidaler Dispersionen hängt entschieden davon ab, ob
das Polymer an die Partikeloberfläche adsorbiert oder in Lösung verbleibt. Die Adsorption von
Polymeren führt häufig vor allem bei niedrigen Polymerkonzentrationen zur Flockung, der
sogenannten Verbrückungsflockung. Bei hoher Oberflächenbedeckung der Teilchen kann allerdings
ebenso eine sterische Stabilisierung eintreten.39,40 Im Falle von nicht adsorbierten Polymeren in
Lösung erfolgen „Verarmungseffekte“ im angrenzenden Lösemittelvolumen zwischen zwei sich nahe
stehenden Teilchen. Dieser osmotische „Unterdruck“ führt ab einer bestimmten Polymerkonzentration
zur Flockung der Dispersion, der „Verdünnungsflockung“. Bei sehr hohen Konzentrationen an
Polymeren in Lösung können stabilisierende Effekte hervortreten, die als Verarmungsstabilisierung
bezeichnet wird.41
k0=8πDa =4kBT
3η
W = k0
k
Kolloide in Gegenwart von Polymeren
___________________________________
-11-
2.3.1 Sterische Stabilisierung
Sterische Stabilisierung erfolgt für Teilchen innerhalb einer Hülle aus langkettigen Polymeren, sofern
sich das Makromolekül in einem guten Lösemittel befindet. Der stabilisierende Effekt lässt sich
sowohl enthalpisch als auch entropisch begründen.
Bei Annäherung zweier Teilchen, auf einen Abstand kleiner als die doppelte Konturlänge der
makromolekularen Hülle, beginnen die Polymere sich zu durchdringen und treten in Wechselwirkung.
Die Verzahnung von Segmenten kann als Entmischung von Polymer und Lösungsmittel betrachtet
werden. In einem guten Lösemittel ist dies thermodynamisch nicht begünstigt. Dieser Anteil, der zur
sterischen Stabilität beiträgt, hängt empfindlich von der Lösemittelgüte ab und wird als
Mischungsterm bezeichnet. Bei weiterer Annäherung zweier Teilchen werden die Polymerschichten
komprimiert. Hierbei erfolgt ein Verlust der Konformationsentropie der Polymerknäule. Die
resultierende Abstoßung wird als elastischer Term bezeichnet.
Nähern sich zwei sterisch stabilisierte Teilchen näher als die einfache Konturlänge aneinander an, so
tragen sowohl der Mischungsterm sowie der elastische Term zur Stabilisierung bei. Die gesamte freie
Energie berechnet sich gemäß ∆G = ∆Gmix+∆Gel. Während das Vorzeichen des Mischungsterms
vom Lösemittel abhängt, ist der eleastische Term immer positiv.
2.3.2 Flockung durch Polymeradsorption
Mechanistisch lässt sich bei der Flockung von Kolloiden durch adsorbierte Polymere und
Polyelektrolyte zwischen der Ladungskompensation und der Verbrückung durch das Makromolekül
unterscheiden. Eine vollständige Ladungskompensation (Neutralisation) bedeutet, dass die Summe
aller Ladungen auf der Partikeloberfläche gleich der Gesamtladung der adsorbierten Polyelektrolyten
ist.42 Hierbei muss die Ladungsdichte des Polymers und die Ladungsverteilung auf der Nanopartikel
(NP) Oberfläche aufeinander passen,43 vergleiche hierzu Abbildung 2 a). Zeigt das Makromolekül eine
höhere Ladungsdichte als die Teilchenoberfläche, kann eine vollständige Ladungskompensation nur
erreicht werden, indem sich lokale Überschussladungen ausbilden, welche die Ladungen unbedeckter
Bereiche des Kolloids kompensieren, Abbildung 2 b).44 Bei niedriger Ionenstärke verursachen diese
inhomogenen Überschussladungen eine interpartikuläre, attraktive Wechselwirkung.45 Bei Erhöhung
der Ionenstärke sinkt die Reichweite dieser attraktiven Kräfte, bis die Flockungsgeschwindigkeit
letztlich mit dem Wert der einfachen Destabilisierung durch Salze übereinstimmt.
Während Flockung durch Ladungskompensation mittels Polyelektrolyten empfindlich von dem
Ladungsmuster, der elektrostatischen Reichweite sowie von der Stöchiometrie abhängt, erfolgt
Flockung durch Verbrückung, in Abhängigkeit der Lösemittelgüte und der Kettenlänge, bzw. den
räumlichen Ausmaßen der Makromoleküle.46 Hierbei führen höhere Molmassen, ungeladene Polymere
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-12-
sowie höhere elektrostatische Abschirmung, im Falle von Polyelektrolyten, zu Schlaufen, die weiter
ins Lösemittel ragen und Verbrückungen begünstigen. Besonders langkettige Poylmere führen zu einer
weitgehend irreversiblen Verbrückung, da hier eine konzertierte Desorption aller Bindungsstellen
kinetisch gehindert ist.47
Abbildung 2: Flockung durch Polymere. a) Flockung durch Ladungsneutralisation, b) Mosaik-Modell, c)
Verbrückungsflockung.
Die Brückenbildung ist abhängig vom Belegungsgrad des Polymers auf der Partikeloberfläche. Nach
einem vereinfachten Modell ist die Wahrscheinlichkeit der Verbrückung annähernd proportional zur
belegten Oberfläche (Θ) und zur unbelegten Oberfläche (1−Θ) mit einem Optimum bei halber
Oberflächenbelegung.48 Verbrückende Flockung weist somit eine Konzentrationsabhängigkeit des
eingesetzten Polymers auf, in Relation zur kolloidalen Oberfläche.49
2.3.3 Verarmungseffekte
Oberflächen in Gegenwart von Polymeren besitzen eine Verarmungszone, bei der die Konzentration
des Polymers c2 ab einem Abstand Δ zur Oberfläche hin abnimmt. Dieser Effekt ist durch
Verringerung der Konformationsentropie des Makromoleküls bei Annäherung an die Oberfläche
bedingt. Hierbei entspricht Δ den räumlichen Ausmaßen des verdrängten Polymers. Nähern sich zwei
Oberflächen aneinander an, resultiert ab einem Abstand von H < 2Δ ein Ausschlussvolumen zwischen
den Oberflächen, aus dem Polymere verdrängt werden.
Abbildung 3: Verarmungszone von Polymeren zwischen zwei Oberflächen.50
NP unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-13-
Die Stabilität von Dispersionen wird durch diese Verarmungseffekte direkt betroffen. Durch die
Verdünnung der Polymerkonzentration zwischen zwei sich annähernden Kolloiden folgt ein
„osmotisches Vakuum“ -Π. Unter der Näherung Δ << a sowie H << a resultiert für kugelförmige
Teilchen mit Radius a die attraktive Wechselwirkungsenergie Vdep:51,52
(21)
2.4 NP unter physiologischen Bedingungen
Der Begriff „physiologische Bedingungen“ wird häufig nur unscharf definiert und variiert
entsprechend der Anwendung. Die Bezeichnung „physiologischer Salzgehalt“ bezieht sich häufig auf
Salzkonzentrationen von etwa 150 mM unter Zusatz eines Phosphat- oder Bicarbonat-Puffersystems
bei einem pH von 7,0 - 7,4. Für die NP-Analytik in physiologischer Umgebung wird als erster Schritt
häufig PBS (phosphate buffered saline) als vereinfachtes Modellmedium verwendet. Dieser Puffer
setzt sich aus 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl sowie 12 mM Hydrogen- bzw. Dihydrogenphosphaten
zusammen.
In der Komplexität der Zusammensetzung folgend befinden sich Zellmedien wie RPMI 1640 oder
DMEM. Diese bauen ebenso auf Phosphat- oder Bicarbonat-Puffern auf, besitzen allerdings noch
Nährstoffzusätze wie Glukose, Aminosäuren oder Vitamine um das Überleben einer Zellkultur zu
gewährleisten.
Besonders für die physikochemische Analyse können zu solchen Zellmedien ausgewählte Proteine
zugesetzt werden, wie Rinderserum Albumin (BSA) oder Humanes Serum Albumin (HSA), um
gezielt Wechselwirkungen mit einem spezifischen Protein zu erfassen. Für Zelltests wird hingegen
Human- oder Rinderserum zugegeben um die Gegenwart aller Serumproteine zu gewährleisten.
Typischerweise wird hierfür das Zellmedium mit 1 - 10 Vol.-% Blutserum versetzt.
Für Bereiche der Medizin, Nanobiotechnologie oder Nanotoxikologie sind ebenso Medien wie
Blutserum, Plasma sowie vollständiges Blut von großem Interesse. Die Unterschiede der
Zusammensetzungen dieser Medien wird anhand der Abbildung 4 ersichtlich. Blut lässt sich in
Gegenwart von Gerinnungshemmern durch Zentrifugation in Blutzellen und Plasma auftrennen.
Letztgenanntes beinhaltet Serumproteine sowie Gerinnungsfaktoren. Blutserum hingegen wird durch
Zentrifugation von geronnenem Blut gewonnen, wodurch neben zellulären Bestandteilen ebenso
Gerinnungsfaktoren entfernt werden. Humanserum beinhaltet 91% Wasser, 7% Proteine sowie 2%
Elektrolyte, Nähr- und Abfallstoffe.53
Vdep=−2πa∗Π�Δ−H
2�2
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-14-
Abbildung 4: Bestandteile des menschlichen Blutes.53
Mit zunehmender Komplexität des Mediums steigt nicht nur die Relevanz der NP Analytik unter den
gegebenen Bedingungen, es resultieren weiterhin Einschränkungen sowie Herausforderungen in der
Anwendbarkeit jeweiliger Messmethoden. Diese sind beispielsweise attraktive VdW-
Wechselwirkungen, die in Gegenwart hoher Salzkonzentrationen bei relativ arbeitenden
Messmethoden, wie der AF-FFF, die Messung dominieren können, siehe Kapitel 3.2.4. Ebenso
verursacht die Präsenz von Proteinen bei Methoden, die das Teilchen-Ensemble erfassen, wie der
DLS, eine Verfälschung der Mittelwertsbestimmung, wodurch eine aufwendige Datenevaluation
erfordert wird.
Das Verständnis der Nano-Bio Grenzfläche innerhalb eines Mediums baut daher häufig auf
Untersuchungen innerhalb vereinfachter Modellsysteme auf.54 Für die vorliegende Arbeit war die NP-
Charakterisierung innerhalb entionisiertem Wasser von besonderer Relevanz, sowie in Gegenwart von
3mM NaN3, in PBS-Puffer, in RPMI1640 Medium und, im Hinblick auf Zellversuche, in RPMI 1640
Medium unter Zusatz von 5 Vol.-% fötalem Rinderserum (FCS).
2.4.1 Ausbildung der Proteinkorona
Sobald NP in eine biologische Umgebung gelangen, werden diese durch die Anwesenheit von
Biomolekülen gemäß Sorptionsisothermen bedeckt. Besonders Proteine adsorbieren hierbei an die
Oberfläche kolloidaler Teilchen und bedecken diese. Der Aufbau dieser Proteinkorona ist für
biomedizinische Anwendungen von Nanomaterialien von äußerster Relevanz, da die Wechselwirkung
mit biologischen Systemen nicht mehr von der NP Oberfläche bestimmt, sondern durch die
resultierende Korona vermittelt wird. Die Zusammensetzung der Korona definiert daher die
biologische Identität der Nanopartikel und vermittelt Zellantworten, Nano- und Ökotoxizitäten.4,5
NP unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-15-
Die Ausbildung einer Proteinschicht an glatten Oberflächen wurde zuerst von Vroman im Jahr 1962
untersucht.55 Es wurden reversible Adsorptions- und Desorptionsprozesse von Proteinen vorgefunden.
Hierbei wurden zunächst reichhaltig vertretene Proteine unspezifisch adsorbiert und im späteren
Verlauf durch geringer konzentrierte aber affin bindende Proteine ersetzt. Diese zeitliche Entwicklung
der Zusammensetzung der Proteinkorona wird als Vromaneffekt bezeichnet.56 Dieses Modell der
Proteinbelegung auf glatten Oberflächen wurde direkt auf die Proteinkorona von NP übertragen,
welches zum Konzept der „dynamischen Proteinkorona“ führte.12 Nach diesem Modell befinden sich
adsorbierte Proteine in stetigem Austausch, wodurch die Zusammensetzung der Proteinkorona aus
Adsorptions- und Desorptionsraten jeweiliger der Proteinen resultiert. Es konnte gezeigt werden, dass
diese Ausbildung der Korona ein sehr schneller Prozess ist, der innerhalb weniger Sekunden
stattfindet.11
Bei genauer Untersuchung der Proteinkorona zeigten sich Abweichungen zu diesem rein dynamischen
Modell aufgrund der irreversiblen Adsorption bestimmter Proteine.57 Aktuelle Modelle schlagen eine
Unterscheidung zwischen der „harten“ und der „weichen“ Proteinkorona vor.58,9 Es wird
angenommen, dass die „weiche“ Proteinkorona aus reversibel bindenden Proteinen mit geringen
Bindungsaffinitäten besteht und Austauschprozessen unterliegt. Im Hinblick auf Untersuchungen zur
Zusammensetzung der Korona desorbieren solche „weich“ bindenden Proteine während der
Aufreinigung proteinbeladener NP und entziehen sich so einer nachfolgenden Detektion. Es wird
daher vermutet, dass sich Untersuchungen zur Zusammensetzung der Korona auf die „harte“ Korona
beziehen. Die „harte“ Korona definiert sich folglich als Proteine, die nach Aufreinigung aufgrund
hoher Bindungsaffinitäten noch an der Oberfläche anhaften.
Es konnte gezeigt werden, dass die „harte“ Korona trotz ihrer Beständigkeit einer zeitlichen
Entwicklung59 sowie dynamischen Austauschprozessen unterliegt.57 Daher ist zum einen die Zeit, die
Nanopartikel Proteinen ausgesetzt waren, ein wichtiger Parameter, der die Zusammensetzung der
Korona bestimmt.11,60 Zum anderen wurden physikochemische Eigenschaften der NP gefunden,
welche die Zusammensetzung zusätzlich beeinflussen. Dazu gehören die Größe der NP bzw. die
Oberflächenkrümmung sowie das ζ-Potential,61 die Oberflächenfunktionalitäten,62 die
Hydrophobizität9 sowie die Topologie.63
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-16-
2.4.2 Kolloidale Stabilität unter physiologischen Bedingungen
Durch die erhöhte Salzkonzentration von 150 mM in physiologischen Medien wird besonders die
Stabilität kolloidaler Dispersionen herabgesetzt, sofern diese ausschließlich elektrostatisch stabilisiert
vorliegen.64,65,10 Aufgrund der erhöhten Abschirmung der repulsiven Kräfte sinkt die Koagulationszeit
von Citrat-stabilisierten Silber-NP in RPMI 1640 Medium auf wenige Stunden.66
In Gegenwart von Proteinen modifiziert die Proteinkorona zusätzlich die Stabilität der Dispersionen.
Bezüglich der Proteinkorona konnten sowohl stabilisierende sowie destabilisierende Effekte
beobachtet werden. Hierzu wurden Citrat-stabilisierte Silber-NP mit HSA beladen und durch Zugabe
von K2SO4 destabilisiert. Der Stabilitätsfaktor wurde gemäß Gleichung (19) bestimmt und wies eine
zunehmende Stabilität der NP mit erhöhter HSA-Beladung auf.67 Weitere Forschungsarbeiten zeigten
hingegen einen destabilisierenden Effekt der Proteinkorona, wie im Falle von Silica-NP in Gegenwart
des globulären Proteins Lysozym.68 Es wurde angenommen, dass sich diese beobachteten Effekte auf
die Anwesenheit von sterisch stabilisierenden Proteinen zurückführen lassen sowie, im Falle der
Agglomeration, eine Folge der Verbrückung durch Proteine, Ladungskompensation und
Ladungsinhomogenitäten sind.
Nanopartikel, die mit Polymeren an der Oberfläche modifiziert vorliegen, werden häufig als
biokompatibel bezeichnet. Diese sterische Stabilisierung beugt nicht nur Koagulation der Teilchen mit
sich selbst vor sondern minimiert ebenso Wechselwirkungen mit biologischen Komponenten. Ein
bekannter Vertreter solcher Polymere ist Poly(ethylenoxid) (PEO).69,70,71 Aufgrund der verminderten
Proteinadsorption werden ebenso proteinvermittelte Zellantworten unterdrückt, einschließlich der
Opsonierung (Zellaufnahme, hier im Besonderen durch Phagozytose) durch das retikuloendotheliale
System (RES), welches die Gesamtheit aller phagozytierenden Zellen zusammenfasst. Folglich
werden Zellantworten des Immunsystems wie beispielsweise durch Makrophagen oder dentritische
Zellen unterdrückt.
2.5 Die fraktale Dimension von Aggregaten
Allgemein gilt für Partikel mit identischer Topologie, dass deren Molekulargewicht M mit
zunehmendem Radius R wächst, entsprechend Gleichung (22).
(22)
Die Fraktale Dimension df bezeichnet die Dimension, in der sich ein Körper, ein Teilchen oder eine
Struktur erstreckt. Eine Vollkugel besitzt volle Ausbreitung in alle drei Dimensionen, eine Scheibe
wächst in zwei Dimensionen und ein Stäbchen breitet sich nur in eine Dimension aus. Die fraktalen
Dimensionen sind entsprechend dieser Reihenfolge df= 3, 2, 1.
M~Rdf
Die fraktale Dimension von Aggregaten
___________________________________
-17-
Analog zu diesen einfachen Körpern weisen auch Aggregate ein fraktales Wachstum auf. Ein Beispiel
aus der Biologie ist das Kollagen, das bei Aggregation eine 1-dimensionale Struktur ausbildet,
wodurch eine Faser mit df= 1 entsteht. Das Molekulargewicht einer Mizelle wächst, unter
Vernachlässigung der Membrandicke, proportional zur Oberfläche, df= 2. Im Gegensatz zu diesen
hoch geordneten Strukturen, die sich durch ein „self assembly“ ausbilden, erfolgt die Strukturbildung
einer Koagulation von kugelförmigen NP auf statistische Weise. Es kann gezeigt werden, dass diese
Strukturen ebenso fraktalen Gesetzen folgen.72 Es werden nicht-ganzzahlige fraktale Dimensionen
erhalten, die zur Klassifizierung der Aggregate dienen.
Das fraktale Wachstum hängt von der Kinetik des Aggregationsprozesses ab. Es wird zwischen
diffusionslimitierter Aggregation (DLA) und reaktionslimitierter Aggregation (RLA) unterschieden.
Der geschwindigkeitsbestimmende Schritt ist entsprechend die Diffusion der Teilchen im Falle der
schnellen Koagulation bzw. die Reaktion (eine erfolgreiche Anlagerung zweier Teilchen) im Falle
einer kinetischen Barriere der Kolloide. Weiterhin wird unterschieden ob sich Einzelteilchen an ein
bestehendes Cluster anlagern (Teilchen-Cluster Aggregate) oder ob sich Aggregate aus Cluster-
Untereinheiten zusammensetzen (Cluster-Cluster Aggregate). Die fraktalen Dimensionen der
verschiedenen Aggregationsprozesse können durch Experimente, Simulationen sowie Berechnungen
ermittelt werden.73,74,75,76
Tabelle 2: Fraktale Dimensionen verschiedener Aggregationsmechanismen.
Prozess
df
DLA Cluster-Cluster
1,7-1,8
DLA Teilchen-Cluster
2,5-2,6
RLA Cluster-Cluster
2,0-2,1
RLA Teilchen-Cluster
2,8-3,0
Die Größe eines Aggregats wird durch die Aggregationszahl N beschrieben. Für streng monodisperse
Proben ist das Molekulargewicht proportional zur Aggregationszahl. Aus Gleichung (22) folgt, unter
Einführung eines normierten Radius �Ra�, Gleichung (23). Die Normierung erfolgt anhand des Radius
eines einzelnen Teilchens a. In Abhängigkeit der Messmethodik können verschiedene Radien zur
Quantifizierung der Aggregate herangeführt werden. Pragmatisch sind die Verwendungen des
hydrodynamischen Radius Rh, des Trägheitsradius Rg sowie die Abmessung einer TEM Projektion
des Agglomerates Rl.77
(23)
N = kg�Rg
a�df= kh�Rh
a�df= kl�Rl
a�df
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-18-
Die Bedeutung des fraktalen Vorfaktors k kann auf verschiedene Weisen interpretiert werden. Anhand
Gleichung (22) wird ersichtlich, dass es sich vereinfacht um einen Proportionalitätsfaktor handelt. Bei
einer Auftragung von log(N) gegen log(R a
⁄) entspricht k dem Achsenabschnitt für R →a. Für große
Aggregationszahlen R→∞ ist der fraktale Vorfaktor eine Funktion der Raumausfüllung p, mit ds der
Dimension des Raums.74
(24)
Die Berechnung der Vorfaktoren für Geometrien ganzzahliger fraktaler Dimensionen76 ergibt kg=
1,73 für df= 1, kg= 1,8 für df= 2 sowie kg= 1,6 für df= 3. Letzteres entspricht in Gleichung (24)
einer Raumausfüllung von p(3)=74%, entsprechend einer hexagonal dichtesten Packung. Für die
fraktalen Dimensionen von df= 1 und 2 verliert Gleichung (24) jegliche Anschauung, p(df)
entspricht hier einer Raumausfüllung im df-dimensionalen Raum, der mit 3-dimensionalen Objekten,
Vollkugeln, gepackt ist. Es resultieren theoretische Raumausfüllungen größer 100%.
Aus Gleichung (23) wird ersichtlich, dass dem fraktalen Wachstum des hydrodynamischen Radius und
dem Trägheitsradius verschiedene fraktale Vorfaktoren zugrunde liegen. Der Grund hierfür liegt in der
einheitlichen Normierung der Radien durch den Radius eines einzelnen Teilchens, a. Der normierte
Trägheitsradius ergibt für N = 1 einen Wert von kg= 0,775, der normierte hydrodynamische Radius
einen Wert von kh= 1. Folglich weist das fraktale Wachstum des Trägheitsradius im Log-Log Plot
einen „offset“ auf. Die Umrechnung der fraktalen Vorfaktoren gelingt anhand Gleichung (25).
(25)
2.5.1 Das nicht-fraktale Wachstum kleiner Teilchen-Cluster Aggregate
Die in Tabelle 2 zusammengestellten fraktalen Dimensionen von Aggregaten werden erst für große
Aggregationszahlen gültig, da sie einen hohen Packungsfaktor zugrunde legen. Im Vergleich hierzu ist
das Wachstum kleiner Aggregate nur wenig untersucht. Ein Versuch die räumlichen Ausmaße solcher
kleinen Aggregate zu erfassen, wurde mittels Sedimentationsexperimenten angestrebt.78,79 Es wurden
empirisch folgende Zusammenhänge gefunden:
Takayasu und Galembeck: N = �Rh
a�1,72 gültig für N ≤ 4 (26)
Reynolds und Goodwin: N = 0,6 ∗�Rh
a�3 gültig für N ≤ 6 (27)
kg= p(df)�ds+ 2
ds�df2
⁄
kg
kh=�Rh
Rg�df
Die fraktale Dimension von Aggregaten
___________________________________
-19-
Beiden Versuchen lagen Polystyrol-NP zugrunde, die unter Salzzusatz koaguliert wurden. Die
genauen Versuchsbedingungen mögen sich durchaus unterschieden haben, ein Vergleich der
empirischen Formeln mit Gleichung (23) zeigt jedoch schon in beiden Fällen ein mangelhaftes Model
der Fit-Parameter. Während Reynolds und Goodwin ein fraktales Wachstum willkürlich in drei
Dimensionen annehmen und ausschließlich den fraktalen Vorfaktor den Messdaten anpassen (kh=
0,6), ignorierten Takayasu und Galembeck den fraktalen Vorfaktor vollständig, hierfür wird jedoch
berücksichtigt, dass ein Agglomerat nicht notwendigerweise in drei Dimensionen anwächst.
Die Ursache, weshalb die empirisch bestimmten Formeln eine nur sehr geringe Menge an
Aggregationszahlen erfassten, liegt in der fehlerhaften Annahme, dass kleine Aggregate fraktalem
Wachstum unterliegen.80,73 Das Wachstum kleiner Aggregate erfolgt im Wesentlichen durch Teilchen-
Cluster Aggregation. Diese zeichnet sich durch einen grundlegenden Unterschied der fraktalen
Struktur im Vergleich zu Cluster-Cluster Aggregaten aus: Fraktale Objekte sind skaleninvariant. Das
bedeutet, ein fraktales Objekt besteht aus Untereinheiten, die dem Gesamtobjekt selbstähnlich sind.
Die Untereinheiten von Cluster-Cluster Aggregaten sind also Cluster. Somit besitzen Cluster-Cluster
Aggregate, gemäß Gleichung (23), eine identische fraktale Dimension und Raumausfüllung wie ihre
Untereinheiten.81 Die Untereinheiten von Teilchen-Cluster Aggregaten sind Teilchen, vereinfacht sind
dies monodisperse Vollkugeln. Sofern ein Teilchen-Cluster nicht zu einer großen Vollkugel schmilzt,
besitzen Teilchen-Cluster keine Selbstähnlichkeit mit ihren Untereinheiten. Folglich lassen sich
Teilchen-Cluster nicht als fraktale Objekte beschreiben.82 Dieser Sachverhalt ändert sich erst für große
Aggregationszahlen.
Anhand eigens durchgeführter analytischer Zentrifugationsexperimente ließen sich die
Sedimentationskoeffizienten kleiner Aggregate auflösen. Abbildung 5 stellt eine solche Messung dar.
Hierbei wurde ein Polystyrol-Latex-Standard mit einem Partikelradius von 100 nm mittels
analytischer Zentrifugation aufgetrennt. Die Sedimentationskoeffizienten wurden direkt gemäß
Gleichung (115), Seite 96, in kugeläquivalente hydrodynamische Radien umgerechnet. Man erkennt
neben dem Hauptpeak mit einem hydrodynamischen Radius von 101 nm definierte Banden
entsprechend größeren Radien.
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-20-
Abbildung 5: Fraktogramm eines Polystyrol Latex Standards mit einem Radius von 200 nm. Die Messung wurde an einer
Scheibenzentrifuge durchgeführt mit 24000 rpm.
Mit Ausnahme des Zwei-Teilchen-Clusters mit einem hydrodynamischen Radius von Rh,2=116 nm
besitzen größere Aggregate eine Vielzahl von Anordnungsmöglichkeiten. Im Falle des Drei-Teilchen-
Clusters sind das eine lineare Anordnung, welche aufgrund von elektrostatischer Repulsion
thermodynamisch begünstigt ist, eine trianguläre Anordnung, welche sich durch VdW-
Wechselwirkungen sowie durch Minimierung der kolloidalen Oberfläche bevorzugt bilden könnte,
sowie eine statistische Anlagerung, die sich aufgrund eines diffusionslimitierten Anlagerungsschrittes
ausbildet. Eine genaue Zuordnung der Banden zu Agglomerationszahlen gestaltet sich jedoch als
schwierig. Nach Smoluchowski ist in einem frühen Stadium der Agglomeration die
Häufigkeitsverteilung kleiner Agglomerate in der Reihenfolge
Monomer > Dimer > Trimer > Tetramer.38 Folglich wird in Abbildung 5 die Fläche unterhalb
einzelner Banden mit zunehmender Größe der Aggregate kontinuierlich kleiner, mit Ausnahme der
Bande bei 121 nm, welche besonders niedrig erscheint. Diese Bande entspricht daher nicht der
Gesamtheit aller Drei-Teilchen-Cluster, sondern nur einem kleinen Teil mit definierter Anordnung der
Untereinheiten. Die Hauptfraktion des Trimers sedimentierte mit Größen von 127 nm. Es schließt sich
das Tetramer mit einer Größe von 136 nm an.
2.5.2 Das fraktale Wachstum großer Teilchen-Cluster Aggregate
Die Berechnungen und Simulationen des fraktalen Wachstums von Teilchen-Cluster Aggregaten
vereinfachen sich im Fall der diffusionslimitierten Aggregation. Hierbei entsteht ein Cluster aus einem
Keimpartikel, an das sich ein Teilchen annähert und anhaftet. Es entstehen zufällige und verzweigte
Strukturen. Computersimulationen im 2- bis 6-dimensionalen Raum83 ergaben für große
Agglomerationszahlen ein fraktales Wachstum von Teilchen-Cluster Aggregaten von df≅5ds6
⁄.
Die fraktale Dimension von Aggregaten
___________________________________
-21-
Im Gegensatz zu kleinen Clustern entstehen bei großen Teilchen-Cluster Aggregaten fraktale
Strukturen durch die sich immer wiederholende und gleichartige Anlagerung eines Teilchens. Dies
basiert auf der Brown’schen Teilchenbewegung mit einer Dimension der Flugbahn von dw= 2.
Hierdurch können einzelne Teilchen nicht tief in das Cluster frei penetrieren, sondern werden von
äußeren Ästen abgefangen. In Übereinstimmung mit Simulationen für große Agglomerationszahlen
hängt die fraktale Dimension gemäß Gleichung (28) von der Dimension des Raums ds sowie von der
Dimension der Flugbahn dw ab.73
(28)
2.5.3 Die hydrodynamische Raumausfüllung fraktaler Strukturen
Die hydrodynamischen Eigenschaften von Aggregaten können durch das
Modell einer porösen Kugel beschrieben werden.84,85 Der translationale
Reibungskoeffizient ft eines Aggregates mit kugelsymmetrischer
Dichteverteilung zum Keimursprung und Umkugelradius R wird zu einer
Funktion der internen Permeabilität f(K). 86 Entsprechend der Stokes-
Einstein Gleichung führt dies zu einem kugeläquivalenten
hydrodynamischen Radius.87
(29)
Es wird angenommen, dass der normierte hydrodynamische Radius �Rh
R� von der fraktalen Dimension
des Aggregates abhängt, da eine kompaktere Füllung des Raums innerhalb des Radius R mit einer
Erhöhung der fraktalen Dimension einhergeht. Die Auftragung der normierten hydrodynamischen
Radien �Rh
R� aus Simulationen von Teilchen-Cluster- und Cluster-Cluster-Aggregaten im 2- bis 6 -
dimensionalen Raum88,74 folgen einem gemeinsamen Verlauf bei Auftragung gegen die Variable
(df−1) (ds−1)⁄, als Maß für die Raumausfüllung.
df=(ds2+ dw−1)
(ds+ dw−1)
ft=6πηR∗f(K)=6πηR∗�Rh
R�
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-22-
Abbildung 6: Generalisierung der Abhängigkeit des normierten hydrodynamischen Radius Rh
R von der fraktalen Dimension
eines Aggregates df.89 ● CCA, dw= 1; ○ TCA, dw= 1; ∎ TCA dw= 2; ∇ CCA (DLA & RLA) simuliert von Chen et al.88;
∆ CCA (DLA) Simuliert von Sorensen74; □ berechnete Werte für definierte lineare Partikel-Cluster mit 2, 4 und 8 Partikeln.
Dieser Verlauf lässt sich durch eine Annäherung, Gleichung (30), beschreiben.89
(30)
Aggregate mit der fraktalen Dimension von df= 1 werden als hydrodynamisch leer erachtet, eine
fraktale Dimension von df= ds entspricht einem hydrodynamisch ausgefüllten Raum. Es konnte
gezeigt werden, dass dieser allgemeine Verlauf des normierten hydrodynamischen Radius ebenso für
definierte oligomere Strukturen gültig ist.90
2.5.4 Berechnung der fraktalen Dimension durch eine Reihenentwicklung
Die folgende Herleitung basiert vollständig auf den Berechnungen von Gmachowski.80 Die hier
aufgeführten Gleichungen (31), (34), (35), (38) und (39) sind nicht konsistent mit Gleichung (23). Die
Auswirkungen werden in Kapitel 4.2.2 diskutiert.
Wie bereits beschrieben, zeigen kleine Aggregate kein fraktales Wachstumsverhalten. Anschaulich
bedeutet dies, dass die Dimension, mit der ein Aggregat anwächst, für die einzelnen
Wachstumsschritte nicht konstant ist, sondern eine Funktion der Aggregatgröße i bzw. j darstellt.
Gleichung (23) (Seite 17) ändert sich zu:
(31)
Rh
R=�1,56 −�1,228 −df−1
ds−1�2−0,228
i = �Rh,i
a�di, j = �Rh,j
a�dj
Die fraktale Dimension von Aggregaten
___________________________________
-23-
Für große Aggregate konvergiert die Dimension des Wachstumsschrittes gegen einen konstanten
Wert,73 das Wachstum kleiner Aggregate muss jedoch separat betrachtet werden. Hierbei erfolgt die
Anlagerung eines Teilchens oder eines Aggregates an ein bereits vorhandenes Aggregat mit einem
Abstand der Zentren Rc zueinander, dem Kollisionsradius. Dieser setzt sich additiv aus den
Kollisionsradien der einzelnen kollidierenden Aggregate bzw. Teilchen Rc,i und Rc,j zusammen.
(32)
In Gleichung (32) wird zugrunde gelegt, dass der über den hydrodynamischen Radius normierte
Kollisionsradius �Rc
Rh� für einen gegebenen Aggregationsmechanismus konstant ist. Im Falle der
Teilchen-Cluster Aggregation wird der Kollisionsradius durch die Dimension der Flugbahn des
annähernden Teilchens bestimmt, gemäß Gleichung (28). Im 3-dimensionalen Raum folgt aus
Gleichung (28) und (30):
(33)
Bei der Kollision zweier Cluster bzw. eines Teilchens (j = 1) mit einem Cluster berechnet sich die
Agglomerationszahl N = i + j:
(34)
Der zugehörige Umkugelradius des entstehenden Aggregates kann durch den aus Gleichung (30)
bekannten normierten hydrodynamischen Radius berechnet werden. Es folgt aus Gleichung (34):
(35)
Durch Einsetzen des Ausruckes für den Kollisionsradius aus Gleichung (33) in Gleichung (32), sowie
die Ausdrücke der hydrodynamischen Radien Rh,i und Rh,j und des Umkugelradius Rdij, Gleichungen
(31) und (35), folgt Gleichung (36):
(36)
Rc=�Rc,i+ Rc,j�=�Rc,i
Rh,iRh,i+Rc,j
Rh,jRh,j�=�Rc
Rh��Rh,i+ Rh,j�
�Rc
Rh�=�Rc
R� ��1,56 −�1,228 −3
2 + dw�2−0,228�
�
i + j = �Rh,ij
a�dji
Rdij= adij�Rh
R�−dij(i + j)
i + j =
⎣
⎢
⎢
⎡
�1,56 −�1,728 −dij
2
�2−0,228
�1,56 −�1,228 −
3
2+dw�
2
−0,228
⎦
⎥
⎥
⎤
dij
∗�i1di
⁄+ j1dj
⁄�dij
Theoretische Grundlagen
___________________________________
-24-
Für den Fall der Teilchen-Cluster Aggregation gilt j = 1, dw= 2 sowie dij= di+1. Gleichung (36)
vereinfacht sich zu:
(37)
Gleichung (37) erlaubt die stufenweise Berechnung der Dimension eines Wachstumsschritts di+1 auf
der zugrundeliegenden Dimension des vorangehenden Aggregats di durch eine Reihenentwicklung.
Für große Werte von i nähert sich die Dimension des Wachstums einer Dimension df von 2,5 an.
Die Berechnung des fraktalen Vorfaktors kg gelingt anhand Gleichung (23) und (31) mit N = i. Es
folgt:
(38)
Mit den Ausdrücken für den normierten hydrodynamischen Radius �Rh
R� aus Gleichung (30), sowie
dem Verhältnis �Rg
R�=�df
2+df�12
⁄ gemäß Sorensen74 folgt für den fraktalen Vorfaktor des
Trägheitsradius:
(39)
Aus Gleichungen (37) und (39) lassen sich anhand der fraktalen Dimension sowie den fraktalen
Vorfaktoren die Trägheitsradien in Abhängigkeit der Agglomerationszahl berechnen. Diese sind in
Abbildung 25, Seite 68, durch eine Auftragung log(N) gegen log �Rg
a� dargestellt, wobei Werte bis
N = 20 in Tabelle 27, Seite 167, zusätzlich zusammengefasst wurden. Sowohl die Auftragung als
auch die tabellarische Zusammenfassung befinden sich in Kapitel 4.2.2 zum Vergleich zu eigens
hergeleiteten Werten. Nach Gleichung (37) startet das Wachstum ausgehend von einem einzelnen
Partikel zum Zwei-Teilchen-Cluster mit einer fraktalen Dimension von df,2= 1,76. Mit zunehmender
Agglomeratgröße wächst die fraktale Dimension stetig an. Bei N = 20 beträgt die fraktale Dimension
df,20= 1,97. In Übereinstimmung zu Berechnungen nach Honda73 konvergiert schließlich die fraktale
Dimension des Wachstums gegen einen Wert von limN→∞df= 2,5.
(i + 1)1d
i+1
⁄= 1,080 ∗��1,56 −�1,728 −di+1
2�2−0,228�∗�i1d
i
⁄+ 1�
kg�Rg
a�df=�Rh
R�df�R
a�df
k
g
=��1,56 −�1,728 −df
2�2−0,228�df∗�2 + df
df�df2
⁄
Lichtstreuung
___________________________________
-25-
3 Charakterisierungsmethoden
3.1 Lichtstreuung
Allgemein versteht man unter Lichtstreuung die Ablenkung des Lichts durch dessen Wechselwirkung
mit Materie. In der Physik werden Lichtstreuexperimente als analytische Methode zur
Charakterisierung von Makromolekülen eingesetzt.91 Man unterscheidet zwischen Statischer
Lichtstreuung (SLS) und Dynamischer Lichtstreuung (DLS). Im ersten Fall erfolgt die Detektion der
Streuintensität über einen Zeitraum gemittelt. Hierbei kann das Molekulargewicht als Gewichtsmittel
Mw, der Zentrifugenmittelwert (z-Mittel) des Trägheitsradienquadrats < Rg2>z und der zweite
Virialkoeffizient A2, als Maß für Polymer-Lösemittel-Wechselwirkungen, bestimmt werden. Bei der
Dynamischen Lichtstreuung hingegen werden die zeitlichen Intensitätsfluktuationen der
Streuintensität gemessen. Sie geben Aussage über die thermische Bewegung der Teilchen. Dies führt
zu dem z-Mittel des Diffusionskoeffizienten <D>Z bzw. dem hydrodynamischen Radius Rh.
3.1.1 Statische Lichtstreuung (SLS)
Trifft eine Welle auf ein Molekül, so induziert der oszillierende elektrische Feldvektor E
�
�
, (40), in der
Elektronenhülle des Teilchens einen oszillierenden Dipol m
�
�
�
, (41).
(40)
(41)
α
E
0
t
x
λ
c
: Polarisierbarkeit
: Amplitude
: Zeit
: Strecke in Ausbreitungsrichtung
: Wellenlänge
: Ausbreitungsgeschwindigkeit
Der induzierte oszillierende Dipol wirkt nun selbst als Emitter elektromagnetischer Strahlung, welche
isotrop und senkrecht zum Oszillator ausgerichtet ist.
�E
�
�
�= E0exp �2iπ�c
λt−1
λx��
m
�
�
�
= αE
�
�
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-26-
Im Folgenden sollen zwei Fälle betrachtet werden:
a) Die Streuung an kleinen Teilchen mit Durchmessern d < 1
20 λ, wobei jedes Teilchen als ein
einzelnes Streuzentrum betrachtet werden kann.
b) Die Streuung an großen Teilchen d > 1
20 λ . Hier befinden sich in einem Teilchen mehrere
Streuzentren, die durch einen Gangunterschied zusätzliche Interferenz erzeugen.
Streuung an kleinen Teilchen
Betrachtet man Lichtstreuung an stark verdünnten Lösungen kleiner Teilchen d < 1
20 λ, so ist die
gemessene Streuintensität unabhängig vom Winkel. Die Streuintensität Is, unter Vernachlässigung der
Streuintensität des Lösemittels, hängt nur von dem Streuvermögen der gelösten Teilchen b2, deren
Massenkonzentration c und der osmotischen Kompressibilität �∂π
∂c� ab, siehe Gleichung (42).
(42)
b2
�∂π
∂c�
: Streuvermögen
: osmotische Kompressibilität
Das Streuvermögen eines einzelnen gelösten Teilchens (43) wird auch als Kontrastfaktor K
bezeichnet.
(43)
K
λ
NA
nD,0
�∂nD
∂c�
: Kontrastfaktor
: Wellenlänge des einfallenden Lichts
: Avogadro Konstante
: Brechungsindex des Lösemittels
: Brechungsindex Inkrement
Die osmotische Kompressibilität erhält man durch Ableiten des osmotischen Drucks nach der
Konzentration. A2 bezeichnet den zweiten Virialkoeffizienten, welcher die Abweichung vom idealen
Verhalten des osmotischen Drucks aufgrund von interpartikuläten Wechselwirkungen (WW) angibt.
Is~ b2RT c
�∂π
∂c�
b2= K = 4π2
λ04NAnD,0
2�∂nD
∂c�2
Lichtstreuung
___________________________________
-27-
(44)
Durch die Kenntnis des Streuvermögens und der osmotischen Kompressibilität der Teilchen soll das
Rayleigh-Verhältnis RR als absolute Streuintensität der Probe eingeführt werden. Die gemessene
Streuintensität der Lösung ILsg. setzt sich additiv aus der Streuintensität des Lösemittels ILM und der
Probe Is zusammen. Das Rayleigh-Verhältnis gibt die auf die Apparatur normierte Streuintensität
wieder und ist somit unabhängig vom experimentellen Aufbau.
(45)
ILsg.
I
LM
rD
2
V
: Streuintensität der Lösung
: Streuintensität des Lösemittels
: Abstand Probe – Detektor
: Streuvolumen
In der Praxis findet jedoch Gleichung (46) Anwendung. Die Normierung über das Streuvolumen und
den Probe-Detektor Abstand erfolgt durch die Kalibrierung der Apparatur. Hierzu wird an der
jeweiligen Apparatur die Streuintensität eines Standards mit bekannter absoluter Streuintensität
ermittelt, wozu üblicherweise Toluol verwendet wird.
(46)
RStd.
IStd.
: Rayleighverhältnis des Standards
: Streuintensität des Standards
Durch die Auftragung von Kc
RR für verschiedene Konzentrationen und die Extrapolation von c→0 lässt
sich sowohl A2 als auch die Molare Masse der Probe ermitteln (siehe Gleichung(47)).
(47)
Bei dem gemessenen Molekulargewicht handelt es sich um das Gewichtsmittel Mw. Definitionen von
Mittelwerten erfolgen in Kapitel 3.1.4.
�∂π
∂c�=RT(1
M+ 2A2c+. . . )
RR = IsrD
2
V=�ILsg.−ILM�rD
2
V
RR =�ILsg.−ILM�RStd.
IStd.
Kc
RR = 1
Mw+ 2A2c
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-28-
Streuung an großen Teilchen
Teilchen, die größer als 1
20 λ sind, zeigen aufgrund intramolekularer Interferenzen der gestreuten
Strahlung eine messbare winkelabhängige Streuintensität, welche durch den Gangunterschied der
Streuzentren verursacht werden.
Abbildung 7 zeigt eine lineare Polymerkette mit Z Streuzentren.
Abbildung 7: Schematische Darstellung der Lichtstreuung an einem großen Teilchen.
Der Abstand zweier Streuzentren ist gegeben durch rij. Der Koordinatenursprung wurde in den
Massenschwerpunkt gelegt, wobei unter homogener Dichteverteilung Gleichung (48) gilt.
(48)
In Abbildung 7 bezeichnen k
�
s und k
�
0 die Wellenvektoren des einfallenden und des gestreuten Lichts;
sie spannen den Streuvektor q
�
auf, siehe Gleichung (49). Gleichung (50) gibt den Betrag des
Streuvektors an.
(49)
(50)
Die Winkelabhängigkeit der Streuintensität ist gegeben durch den Formfaktor P(q). Man erhält durch
die Aufsummierung aller Streubeiträge über alle Streuzentrenpaare Gleichung (51).
�ri= 0
Zi
q
�
= k
�
s−k
�
0
|q
�
|=4πsin �ϴ
2�
λ
Lichtstreuung
___________________________________
-29-
(51)
In erster Näherung kann in einer Taylorentwicklung nach dem zweiten Term abgebrochen werden:
(52)
Die Doppelsumme lässt sich weiter vereinfachen.
(53)
Da der Koordinatenursprung im Massenschwerpunkt liegt, gilt für das Trägheitsradienquadrat
(54)
Durch Einsetzen von Gleichung (53) und (54) in Gleichung (52) erhält man für den Formfaktor:
(55)
Unter Berücksichtigung des Formfaktors erhält man den Bezug zum winkelabhängigen Rayleigh-
Verhältnis R(ϴ):
(56)
Gleichung (56) lässt sich nach Einsetzen des Formfaktors weiter vereinfachen. Unter der Annahme
kleiner Werte für das Produkt q2Rg2 folgt Gleichung (57), welche als Zimmgleichung bekannt ist.
(57)
Die Zimm-Gleichung besitzt eine zentrale Stellung in der Polymeranalytik. Durch winkel- und
konzentrationsabhängige Streuintensitätsmessungen lassen sich neben dem Molekulargewicht und
dem zweiten Virialkoeffizienten auch der Trägheitsradius bestimmen. Eine geeignete Auftragung
gelingt durch den Zimm-Plot, siehe Abbildung 8.
P(q)=1
Z2��exp (−iq
�
rij)
Z
j≠i
Zi= 1
Z2���sin�q rij�
q rij �
Z
j≠i
Zi
P(q)= 1 −q2
6Z2��(rij2)
Z
j≠i
Zi
���rij2�=��ri2+ rj2
Zj
Zi
Z
j≠i
Zi=2Z �ri2
Zi
Rg2=1
Z�ri2
Zi
P(q)= 1 −1
3q2Rg2
Kc
R(
ϴ
)= 1
MwP(q)+2A2c
Kc
R(
ϴ
)=1
Mw�1 + 1
3q2〈Rg2〉z�+ 2A2c
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-30-
Abbildung 8: Zimm-Plot.91
Bei einem Zimm-Plot werden die gemessenen Rayleigh-Verhältnisse als Kc/R aufgetragen. Die
winkel- und die konzentrationsabhängigen Messungen teilen sich hierbei eine gemeinsame Abszisse.
Die Werte für Kc/R werden gegen q2 + k*c aufgetragen, wobei k eine Konstante bezeichnet, die zum
Anpassen der beiden Skalen eingeführt wird. Es können sowohl die winkelabhängigen Messungen auf
q = 0 extrapoliert werden, als auch die konzentrationsabhängigen Messungen auf c = 0. Die Zimm-
Gleichung (57)vereinfacht sich mit q = 0 bzw. c = 0, sodass aus der Steigung eines linearen Fits das
Trägheitsradienquadrat bzw. der zweite Virialkoeffizient ermittelt werden können. Durch zweifache
Extrapolation (im gezeigten Zimm-Plot wurde zuerst der Streuvektor und dann die Konzentration
extrapoliert) erhält man das Molekulargewicht der Probe als inversen Ordinatenabschnitt.
3.1.2 Dynamische Lichtstreuung (DLS)
Während in der statischen Lichtstreuung zeitlich gemittelte Intensitäten gemessen werden, erfolgt in
der dynamischen Lichtstreuung die Betrachtung der Streuintensitätsfluktuationen als Funktion der
Zeit. Die Ursache der Fluktuationen liegt in der Brown‘schen Molekularbewegung der Teilchen,
welche zu Anzahldichtefluktuationen der Streuteilchen im Streuvolumen führt. Diese zeitlichen
Intensitätsschwankungen innerhalb weniger Picosekunden bis hin zu Sekunden lassen sich durch eine
Zeit-Intensitäts-Autokorrelationsfunktion g2 darstellen.
(58)
Hierbei wird die Intensität zu einem Zeitpunkt t mit der Intensität nach einer vergangenen Zeit t + τ
multipliziert. Dieses Produkt wird für verschiedene Korrelationszeiten über die komplette Messzeit
gemittelt. Abbildung 12 zeigt zur Veranschaulichung zwei Korrelationszeiten zu verschiedenen
Messzeiten.
g2(τ)=〈I(q, t)∗I(q, t + τ)〉t
Lichtstreuung
___________________________________
-31-
Abbildung 9: Zeitliche Streuintensität-Fluktuationen.
Für den Grenzfall der unendlichen Verdünnung der diffundierenden Teilchen gibt die Siegert-Relation
den Zusammenhang zwischen der Brown‘schen Molekularbewegung und der
Autokorrelationsfunktion wieder.
(59)
〈I(q,t)〉2
: Basislinie
g1(τ) entspricht der Fourier-Transformation der van-Hove Auto-Korrelationsfunktion Gs.
(60)
Diese beschreibt die Wahrscheinlichkeit, mit welcher ein Teilchen innerhalb der Zeit τ die Strecke ∆R
zurücklegt. Der mittlere quadratische Abstand, den ein Teilchen durch die Brown‘sche Bewegung
zurücklegt, ist gegeben durch:
(61)
Die Fourier-Transformierte van Hove Gleichung liefert:
g1(τ)=�g2(τ)
〈I(q,t)〉2−1
Gs�R
�
�
,τ�=2π
3�∆R2(τ)�32exp �−3∆R2(τ)
2〈∆R2(τ)〉�
〈∆R2(τ)〉=6Dτ
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-32-
(62)
Für eine monodisperse Probe erhält man somit einen monoexponentiellen Verlauf mit einer
Abklingrate von Dq2. Alternativ kann die Abklingrate durch die Relaxationszeit τD beschrieben
werden:
(63)
Über die Stokes-Einstein Beziehung, Gleichung (64), lässt sich unter Kenntnis des
Diffusionskoeffizienten der hydrodynamische Radius ermitteln.
(64)
3.1.3 Dynamische Lichtstreuung an polydispersen Proben
Für polydisperse Proben kann für g1(τ) kein monoexponentiell abfallender Verlauf angenommen
werden; eine Auswertung gelingt hier durch die Kumulanten-Analyse. Hierbei wird g1(τ) als
Überlagerung einzelner monoexponentiell abfallender Funktionen angenommen. Unter der Annahme
einer Gaußverteilung der amplitudengewichteten Größenverteilungen lässt sich ln g1(τ) als
Reihenentwicklung beschreiben, die nach dem zweiten Glied abgebrochen wird:
(65)
Aus dem ersten Kumulaten kann der z-gemittelte Diffusionskoeffizient hergeleitet werden,
(66)
der zweite Kumulant beschreibt die Abweichung des linearen Verlaufes in ln g1(τ).
(67)
µ2 ist ein Maß für die Polydispersität einer Pobe. Monodisperse Proben ergeben Werte von µ2< 0,05,
stark poydisperse Proben liefern Werte von µ2> 0,1.
g1(τ)=exp �−q2〈∆R2(τ)〉tτ6�=exp(−Dq2τ)=exp �−τ
τD�
τD=1
Dq2
Rh=kBT
6πηD
ln g1(q, τ)=−Ґ1τ+1
2! Ґ2τ2−. . .
Ґ1= Dq2=1
τD
Ґ2= µ2
2!
Lichtstreuung
___________________________________
-33-
(68)
Für polydisperse Proben liefert die dynamische Lichtstreuung winkelabhängige
Diffusionskoeffizienten, da der Formfaktor Pk(q) mit in die Messung des Mittelwertes einfließt:
(69)
Man bezeichnet die winkelabhängigen Diffusionskoeffizienten daher als apparent. Da Pk(0)= 1 gilt,
führt die Extrapolation von q→0 zu dem tatsächlichen Diffusionskoeffizienten. Dynamische
Lichtstreumessungen an polydispersen Proben liefern somit das z-Mittel für den
Diffusionskoeffizienten bzw. das inverse z-Mittel des hydrodynamischen Radius.
(70)
3.1.4 Relevante Mittelwerte
Da je nach Messmethodik verschiedene Mittelwerte erzielt werden, sollen an dieser Stelle kurz
geläufige Mittelwerte vorgestellt werden. Die wichtigsten Vertreter sind der Zahlenmittelwert 〈X〉n,
der Gewichtsmittelwert 〈X〉w, sowie der Zentrifugen- oder auch z-Mittelwert 〈X〉z. Entsprechend
dieser Reihenfolge wird der Messparameters Xk jeder Fraktion nicht nur mit der Teilchenanzahlen Nk
gewichtet, sondern zusätzlich mit M0, M1 bzw. mit M2 gewichtet. Gleichungen (71) - (73) definieren
diese Mittelwerte für das Molekulargewicht, sowie den Trägheitsradius aus der statischen
Lichtstreuung. Das Verhältnis 〈M〉w〈M〉n
⁄ skaliert mit der Breite der Verteilung. Es wird daher als
qualitatives Maß für die Polydispersität verwendet, der sogenannte Polydispersitätsindex PDI.
(71)
(72)
(73)
Mk
Nk
Rg,k
2
: Molekulargewicht der k-ten Komponente
: Teilchenanzahl der k-ten Komponente
: Trägheitsradienquadrat der k-ten Komponente
µ2=Ґ2
Ґ12
〈D〉z,app(q)=∑NkMk2Pk(q)Dk
∑NkMk2Pk(q)
〈D〉z ~ 1
〈Rh
−1〉z
〈M〉n=∑NkMk
∑Nk
〈M〉w=∑mkMk
∑mk=∑NkMk2
∑NkMk
〈Rg2〉z=∑NkMk2Rg,k
2
∑NkMk2
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-34-
Das ρ-Verhältnis gibt das Verhältnis von �〈Rg2〉z zu 〈Rh〉1/z an. Dieses Verhältnis ist für bestimmte
Partikelformen charakteristisch; Tabelle 3 zeigt solche Werte für verschiedene Strukturen.
(74)
Durch Lichtstreuung lassen sich sowohl �〈Rg2〉z als auch 〈Rh〉1/z bestimmen wodurch Aussagen über
die geometrische Form der untersuchten Partikel getroffen werden können. Dies gelingt allerdings nur
für monodisperse Proben, da es sich, bei den durch die Lichtstreuung ermittelten Radien, um
unterschiedliche Mittelwerte handelt. Hierbei ist das z-Mittel immer größer als das inverse z-Mittel.
Folglich sind die gemessenen ρ-Verhältnisse für polydisperse Proben immer größer als die zu
erwartenden Werte.
Tabelle 3: ρ-Verhältnisse für verschiedene Topologien.
Struktur ρ-Verhältnis
harte Kugel
Hohlkugel
dickwandige Mizelle
Ellipse
Gauß-Knäuel in gutem LM
0,775
1
0,775 – 1
0,775-4
1,505
ρ=�〈Rg2〉z
〈1
Rh〉Z−1
Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
___________________________________
-35-
3.2 Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
Die Feld-Fluss-Fraktionierung (FFF) bezeichnet eine Familie von Fraktionierungsmethoden zur
Größenauftrennung und Charakterisierung von Proteinen, Polymeren und Partikeln.92 Zu den
wichtigsten Vertretern zählen die Thermische FFF, die Sedimentations-FFF, die Elektrische FFF und
die Fluss-FFF. Die Vorteile der Feld-Fluss-Fraktionierung gegenüber chromatographischen Methoden
wie z.B. der Größenausschluss-Chromatographie liegen in dem sehr breiten und variabel wählbaren
Separationsbereich von wenigen Nanometern bis hin zu hundert Mikrometern.
3.2.1 Das allgemeine Trennprinzip der FFF
Die Probenfraktionierung in der FFF erfolgt innerhalb eines Trennkanals mit einer Höhe von 50 –
500 µm unter Einwirkung eines senkrecht dazu wirkenden Kraftfeldes, Abbildung 10. Durch
Wechselwirkung der Probe mit dem angelegten Feld wird die Partikelwolke gegen die in Feldrichtung
liegende Kanalwand, die Akkumulationswand, transportiert. Diese lokale Erhöhung der Konzentration
bewirkt eine gerichtete Diffusion der Teilchen in entgegengesetzter Richtung zum angelegten Feld.
Hierdurch bildet sich innerhalb dieser Teilchenwolke ein Konzentrationsprofil aus.
Der für jede Fraktion charakteristische mittlere Abstand zur Akkumulationswand hängt sowohl von
der Stärke des Feldes, als auch vom Diffusionskoeffizenten der Teilchen ab, und somit, über die
Stokes-Einstein Beziehung, ebenfalls vom hydrodynamischen Radius der Teilchen. Die
Elutionsgeschwindigkeit der Probe steht in direktem Zusammenhang mit der
Strömungsgeschwindigkeit der laminaren Schicht, in der sich die entsprechenden Teilchen aufhalten.
Im Allgemeinen befinden sich kleine Moleküle, aufgrund des höheren Diffusionskoeffizienten, im
Mittel weiter im Kanalinneren als große Moleküle und werden aufgrund des parabolischen
Flussprofils vor den großen Molekülen eluiert.93,94,95
Abbildung 10: Schema eines Trennkanals. Die schwarzen Balken repräsentieren die Profilaufsicht auf den Kanal. Die Probe
wird durch Wechselwirkung mit dem Kraftfeld gegen die Akkumulationswand gedrängt.
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-36-
Das beschriebene, generelle Trennprinzip kann mit einer Vielzahl physikalischer Felder kombiniert
werden. Durch die Wahl eines auf die Probe abgestimmten Feldes kann eine Auftrennung erzielt
werden. Hieraus resultieren unterschiedliche Methoden der FFF, die sich bereits etablierten:94,96,97,98
Sedimentations-FFF:
Bei dieser Methode der FFF befindet sich die Probe in einem rotierenden Ringkanal. Hierbei führt die
angelegte Zentrifugalkraft zu einer Sedimentation der Teilchen, wobei eine Separation aufgrund der
unterschiedlichen Dichten der Teilchen und dem Laufmittel erreicht wird.
Thermische FFF:
In der Thermischen FFF befindet sich der Trennkanal zwischen zwei temperierbaren Abgrenzungen,
welche einen Temperaturgradienten innerhalb des Kanals erzeugen. Dieser Messaufbau induziert eine
thermische Diffusion der Probe. Die Separation der Komponenten erfolgt nun aufgrund des Soret-
Koeffizienten ST = DT/D der einzelnen Fraktionen, wobei der thermische Diffusionskoeffizient DT
durch die chemische Zusammensetzung des Analyten beeinflusst wird.
Elektrische FFF:
Durch das Anlegen eines elektrischen Feldes an einen Trennkanal lassen sich geladene Teilchen in
Abhängigkeit ihrer elektrophoretischen Mobilität voneinander fraktionieren. Aufgrund von
Schwierigkeiten in der technischen Umsetzung zur Vermeidung von Elektrolytgas ist diese
Untermethode nicht etabliert.
Symmetrische Fluss-FFF:
In der Symmetrischen Fluss-FFF wird ein Querfluss als physikalisches Feld eingesetzt, der senkrecht
zur laminaren Strömung innerhalb des Kanals wirkt. Dies kann durch eine für die Probe
undurchlässige Membran an der Akkumulationswand und einer Fritte an der gegenüberliegenden
Wand des Kanals bewerkstelligt werden. Partikel innerhalb des Trennkanals werden durch die
induzierte Driftgeschwindigkeit in Richtung der Akkumulationswand abgelenkt.
Abbildung 11: Schematische Darstellung eines Trennkanals der Symmetrischen Fluss-FFF.
Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
___________________________________
-37-
3.2.2 Die Asymmetrische Fluss-Feld Fluss Fraktionierung (AF-FFF)
Die Asymmetrische Fluss-FFF (AF-FFF) stellt eine Weiterentwicklung der Symmetrischen Fluss-FFF
dar und basiert auf demselben Trennprinzip mit vereinfachtem Aufbau.99,100,101 Ein AF-FFF Kanal
besitzt lediglich eine semipermeable Seite an der Akkumulationswand, eine Eintrittsöffnung für den
Hauptstrom in den Kanal und zwei Ausgänge, für Haupt- und Querfluss. Ein schematischer Aufbau ist
in Abbildung 12 dargestellt, ein Vergleiche zur Symmetrischen Fluss-FFF ist in Abbildung 11 gezeigt.
Der Querfluss kommt durch kontinuierliches Abführen des Lösemittels an der semipermeablen
Akkumulationswand zustande.
Abbildung 12: Schematische Darstellung eines Trennkanals der Asymmetrischen Fluss-FFF.
Das Fundament eines AF-FFF Kanals bilden ein Edelstahlblock auf dessen Oberseite sich eine Fritte
zur Abführung des Querflusses befindet, sowie eine Gummi-Abdichtungen für den aufliegenden
Kanal. Eine Membran trennt die Fritte zum Kanal hin ab. Der eigentliche Trennkanal wird von einem
Spacer aus Mylarfolie mit definierter Dicke und durch eine aufliegende PMMA-Platte abgegrenzt.
Dieser Spacer gibt sowohl die Kanalhöhe als auch die Kanalform vor, wobei sich eine trapezoidale
Kanalform bewährt hat, um gleichmäßige Flussprofile zu gewährleisten.102
Abbildung 13: Aufbau eines AF-FFF Trennkanals.
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-38-
3.2.3 Fraktionierung in der Fluss-FFF
Die Fraktionierung bzw. Retention in der Symmetrischen Fluss-FFF sowie der Asymmetrischen Fluss-
FFF basiert auf der Ausbildung eines querflussinduzierten Konzentrationsprofils der Partikel innerhalb
des Trennkanals. Elution der Probe erfolgt anhand des axialen Transportes der Partikel durch den
Kanal innerhalb laminarer Geschwindigkeitsprofile.
Das feldinduzierte Konzentrationsprofil
Durch das Anlegen eines physikalischen Feldes erfährt die Probe zwei Kräfte. Zum einen ist das die
feldinduzierte Kraft F, welche durch Wechselwirkung der Probe mit dem Feld erzeugt wird. Im Falle
der Fluss-FFF wird ein Querfluss angelegt, welches die Driftgeschwindigkeit U der Teilchen in
Richtung der Akkumulationswand bewirkt. Zum anderen resultiert durch die Verschiebung der
Partikelwolke ein Konzentrationsgefälle dc(x)
dx , welches zu einer gerichteten Diffusion D der Teilchen
entgegengesetzt der Feldrichtung führt. Der Stofftransport J parallel zur Feldrichtung ist somit
gegeben als:
(75)
x
c(x)
D
U
: Abstand zur Akkumulationswand
: Konzentration bei x
: Diffusionskoeffizient
: Driftgeschwindigkeit der Teilchen
Im Gleichgewichtszustand resultiert ein Gesamtteilchenfluss von J = 0. Dies führt zu Gleichung (76):
(76)
Nach Integration und Lösen von Gleichung (76) folgt das Konzentrationsprofil der Probe:
(77)
c0
: Konzentration an der Akkumulationswand
l
: effektive Schichtdicke
Das Konzentrationsprofil der Probe ist somit eine exponentiell abfallende Funktion mit der höchsten
Konzentration an der Akkumulationswand und sinkender Konzentration im Kanalinneren. Die
J = −Ddc(x)
dx + Uc(x)
Ddc(x)
dx =Uc(x)
c(x)= c0exp �−x|U|
D�= c0exp �−x
l�
Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
___________________________________
-39-
effektive Schichtdicke l lässt sich als der charakteristische Abstand der Teilchen zur
Akkumulationswand definieren. Dieser hängt von der Driftgeschwindigkeit ab, sowie von der
Brown‘schen Eigendiffusion der Probe. Bei hohen Querflüssen oder geringer Diffusion der Probe
nimmt daher die effektive Schichtdicke ab.
(78)
Den Diffusionskoeffizienten erhält man nach Stokes-Einstein, Gleichung (79). Die
Driftgeschwindigkeit lässt sich durch den angelegten Querfluss ermitteln, der über die
Akkumulationswand abgeführt wird, Gleichung (80).
(79)
(80)
V
c
A
η
Rh
: Querflussrate
: Fläche der Akkumulationswand
: Viskosität des Lösemittels
: hydrodynamischer Radius der Probe
Das parabolische Flussprofil
Der Kanalfluss fließt innerhalb von laminaren Schichten durch den Kanal und weist hierbei ein
parabolisches Flussprofil auf. Die Geschwindigkeit v(x) im Abstand x von der Kanalwand lässt sich
anhand der Navier-Stokes Gleichung beschreiben:
(81)
∆p
η
L
〈v(x)〉
w
: Druckdifferenz entlang des Kanals
: Viskosität des Lösemittels
: Kanallänge
: mittlere Geschwindigkeit des Lösemittels
: Kanalhöhe
l = D
|U|
D = kBT
6πηRh
U = V
c
A
v(x)=∆p
2ηLx(w−x)= 6〈v(x)〉 �x
w−�x
w�2�
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-40-
Retention
Allgemein ist das Retentionsverhältnis R als das Verhältnis der mittleren Geschwindigkeit der Probe v�
zur Geschwindigkeit des Lösemittels 〈v(x)〉 definiert. Die Retention kann weiterhin durch das
Verhältnis der Totzeit t0 zur Retentionszeit tR bzw. des Totvolumens V0 zum Retentionsvolumen VR
ausgedrückt werden (siehe Gleichung (9)).
(82)
In der FFF ergibt sich die Retention aus den unterschiedlichen Fließgeschwindigkeiten der laminaren
Schichten. Sie steht somit mit dem mittleren Abstand der Probe zur Akkumulationswand l in
Zusammenhang. Als Maß für die Retention wird der dimensionslose Retentionsparameter λ
eingeführt, welcher als das Verhältnis von effektiver Schichtdicke zur Kanalhöhe definiert ist:
(83)
Eine gute Näherung der Retention liefert die Annahme sehr dünner Schichten, so dass l→0 gilt.
Hierdurch lässt sich Gleichung (81) vereinfachen, sodass der quadratische Anteil vernachlässigbar
wird. Setzt man nun Gleichung (83) und (81) in (82) ein, so erhält man für die Retention:
(84)
Aus Gleichung (78) lässt sich der Retentionsparameter bestimmen. Es gilt:
(85)
Zur Bestimmung der Retention soll die Näherung sehr dünner Schichten aus Gleichung (11)
angenommen werden, wodurch sich für das Retentionsverhältnis folgendes ergibt:
(86)
Mit bekannter Totzeit t0=A w
V lässt sich nach Einsetzen des Ausdruckes der Retention aus Gleichung
(82) die Retentionszeit berechnen:
(87)
R = v
〈v(x)〉=t0
tR=V0
VR
λ=l
w
lim
l→oR = 6λ
λ=l
w=kBT A
6πηRhV
cw
R = kTA
πηRhV
cw
tR=πηV
cw2
V
kBT∗Rh
Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
___________________________________
-41-
Anhand von Gleichung (87) wird ersichtlich, von welchen Parametern die Retentionszeit abhängt. Da
innerhalb einer Methode die Viskosität, die Temperatur, der Querfluss (sofern kein Querfluss-Gradient
angewandt wird), der Detektorfluss sowie die Kanalhöhe konstant bleiben, wird die Retentionszeit
proportional zum hydrodynamischen Radius der Probe. Mit voranschreitender Elutionszeit eluieren
Partikel in der Reihenfolge von klein nach groß.
Abbildung 14 stellt eine schematische Zusammenfassung des Fraktionierungsprozesses dar. Ein
kompletter Trennvorgang umfasst die Probeninjektion bzw. Fokussierung, Relaxation und Elution der
Probe. Bei der Probeninjektion werden die Flüssigkeitsströme, ausgehend vom Eluateinlass
und -auslass, so geleitet, dass sie sich an der Injektionsstelle treffen und die Probe auf Höhe des
Injektionsports fokussieren, vgl. Abbildung 13. Währenddessen wird der Querfluss konstant über die
Membran abgeführt, die Probe erfährt hierdurch bereits das angelegte Feld in Form einer Drift gegen
die Membran. Durch Relaxation der Probe stellt sich das Konzentrationsprofil, gemäß Gleichung (77),
mit der effektiven Schichthöhe l ein, (78). Während des Elutionsmodus fließt der Laminarfluss durch
den Trennkanal, der durch das Querflussfeld überlagert wird. Retention erfolgt anhand des
ausgebildeten Konzentrationsprofils der Probe in Schichthöhen langsamerer Geschwindigkeit. Die
Elutionszeit ist proportional zum hydrodynamischen Radius der Probe gemäß Gleichung (87).
Abbildung 14: Überblick über den Fraktionierungsvorgang anhand eines vereinfachten Schemas.
Charakterisierungsmethoden
___________________________________
-42-
3.2.4 Ioneneffekte in der Fluss-Feld Fluss Fraktionierung
Das in Kapitel 3.2.3 vorgestellte Modell zur Ausbildung eines Konzentrationsprofils der Probe
innerhalb eines AF-FFF Trennkanals wurde stark vereinfacht, da es Wechselwirkungen zwischen
Teilchen bzw. zwischen Teilchen und Akkumulationswand vernachlässigt. Da es nicht gelingt die
Wechselwirkungen zu beseitigen, beeinflussen diese die Ausbildung des Konzentrationsprofils in
gleicher Weise wie das äußere angelegte Feld. Die Gesamtkraft Ftotal, die auf die Partikel wirkt, setzt
sich zusammen gemäß:103
(88)
mit FeF der Kraft des externen Feldes, welche eine Drift gegen die Akkumulationswand bewirkt, FP−P
den Partikel-Partikel Wechselwirkungen, die von jedem einzelnen NP ausgehen, und FP−W den
Partikel-Membran Wechselwirkungen, die im Allgemeinen in entgegengesetzter Richtung zum
angelegten physikalischen Feld wirken. Die beiden letztgenannten Wechselwirkungen resultieren aus
einer Überlagerung attraktiver Van-der-Waals Kräfte sowie aus repulsiven elektrostatischen Kräften.
Im Allgemeinen können die genannten Partikel-Partikel Wechselwirkungen im Falle von sphärischen
Teilchen als isotrop erachtet werden. Unabhängig von der Isotropie der Teilchen tragen jedoch nur
Kräfte zur Ausbildung des Konzentrationsprofils bei, die senkrecht zur Akkumulationswand wirken.
Der axiale Anteil der Kräfte, welcher eine Bandenverbreiterung zu Folge hätte, wird bei dieser
Überlegung vernachlässigt
Das nicht-ideale Verhalten der Partikelwolke führt bei Aufkonzentration der Teilchenzahl im
Trennkanal verstärkt zu interpartikulären Wechselwirkungen. Hierdurch können Einflüsse der
Probenkonzentration innerhalb des Trennkanals auf das Retentionsverhalten beobachtet werden.104
Generell werden daher geringe Mengen an Salz dem Elutionsmittel hinzugegeben, üblicherweise eine
Ionenstärke von 1 – 10 mM, um den Einfluss der langreichweitigen elektrostatischen
Wechselwirkungskräfte zu minimieren.
Weiterhin beeinflusst eine Variation der Ionenstärke direkt die Retention. Quing und Schimpf
untersuchten die salzabhängige Fraktionierungsleistung an Polystyrol-Latices verschiedener
Größen.105 Mit erhöhter Ionenstärke wurde eine bessere Trennleistung erhalten. Hierfür wurden vor
allem eine Verringerung der Partikel-Membran Wechselwirkungskräfte verantwortlich gemacht, die in
entgegengesetzter Richtung zum angelegten Querfluss wirken.
Zur Verbesserung der Trennleistung kann die Ionenstärke allerdings nicht unbegrenzt erhöht werden.
Mit zunehmendem Salzgehalt und einer entsprechend abnehmenden elektrostatischen Stabilisierung
der Dispersion kommen vermehrt hydrophobe Wechselwirkungen zum Vorschein, die zur
Probenadsorption an der Membran führen. Es lassen sich zwei Fälle unterscheiden. Zum einen ist das
Ftotal= FeF+ FP−P+ FP−W
Feld Fluss Fraktionierung (FFF)
___________________________________
-43-
eine reversible Adsorption mit der Folge einer Bandenverbreitung sowie einer Peakasymmetrie.106
Zum anderen kann die Probe irreversibel adsorbieren, was zu einem Probenverlust führt.107,108
Besonders bei Anwendungen der FFF für biologische Fragestellungen werden physiologische
Ionenstärken des Eluats von 150 mM interessant. Bei solch hohen Ionenstärken ergaben sich
Wiederfindungsraten unter 50%.109 Eine Probencharakterisierung mittels der FFF unter
physiologischen Bedingungen bleibt daher weiterhin in der Umsetzung herausfordernd.
Neben Effekten, die allgemein von der Ionenstärke ausgehen, können weiterhin ionenspezifische
Einflüsse auf das Elutionsverhalten beobachtet werden. Abbildung 15 zeigt Elugramme von
Polystyrol-Latices, die in Gegenwart verschiedener Salze fraktioniert wurden. Sowohl eine Variation
des Kations als auch des Anions verursachten eine Verschiebung der Elutionsbanden bei gleicher
Ionenstärke. Im Falle des Anions wurde eine kürzere Retentionszeit in Gegenwart von SCN- Ionen im
Vergleich zu Cl- Ionen gefunden. Mit Variation der Kationen erfolgte die relative Reihenfolge der
Elutionszeiten des Latex-Standards entsprechend Na+ < K+< Cs+.103
Diese ionenspezifischen Funde lassen sich anhand der lyotropen Reihe erklären: Spezifische
Ioneneffekte resultieren aus der Wertigkeit, der Polarisierbarkeit sowie dem Radius der Ionen in
Lösung. Der ionenspezifische Einfluss auf die kolloidale Stabilität findet sich in der kritischen
Koagulationskonzentration ccc wieder. Eine empirische Reihenfolge der fällenden Wirkung von
Salzen auf dispergierte Proteine wurde von Hofmeister aufgestellt.110,111 Hierbei steigt die fällende /
destabilisierende Wirkung mit den chaotropen Eigenschaften der Ionen. Der beobachtete spezifische
Ioneneffekt in der AF-FFF folgt ebenfalls dieser Reihenfolge. Es konnte von Scherer für eine Vielzahl
von Anionen und Kationen gezeigt werden, dass der spezifische Ioneneffekt in der AF-FFF der
Hofmeister Reihenfolge unterliegt.112
Abbildung 15: Normierte AF-FFF Fraktogramme von A) Polystyrol Latices mit einem hydrodynamischen Radius von 25 nm
mit Variation des Elektrolyt Anions und B) einer Mischung aus Latices mit Radien von 10 nm und 25 nm mit Variation des
Elektrolyt Kations. Elektrolytkonzentration 1 mM, Spacer 190 µm, Detektorfluss 1 mL/min und Querfluss von 2 auf
0 mL/min über 1200 s.112
___________________________________
-44-
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
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-45-
4 Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
4.1 Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
Ein zentraler Inhalt dieser Forschungsarbeit zielt auf die Charakterisierung von Aggregaten ab. Da
solche Systeme stark größendispers vorliegen, eignet sich für eine solche Charakterisierung vor allem
eine Vorfraktionierung der Probe, sowie eine Kopplung an eine online Detektion. Besonders bevorteilt
sind absolut arbeitende Detektoren, wie beispielsweise eine statische Lichtstreuapparatur.
Für die online Lichtstreudetektion wurde der Prototyp DARK II der Firma Consenxus GmbH
verwendet. Es handelt sich um einen Mehrwinkel Lichtstreudetektor mit hydrodynamischer
Probenfokussierung. Der Aufbau der Streuzelle ist in Abbildung 16 dargestellt. Die Seitenansicht des
Querschnitts zeigt das Flussprofil innerhalb des Zellenvolumens. Das Eluat fließt durch das
Streuvolumen als Flüssigkeitsstrahl parallel zum Hilfsstrom. Letzterer kommt durch eine
Umwälzpumpe und zwei Platten mit Lochbohrungen an Ober- und Unterseite der Streuzelle zustande,
wodurch ein homogener Fluss erzeugt wird. In definierten Winkeln zum eintretenden Laser-Strahl
befinden sich auf das Streuvolumen gerichtete Linsen, die mit optischen Fasern verbunden sind. Durch
diese wird das gestreute Licht zu den Detektoren geleitet. Der Verlauf des Laser-Strahls durch die
Zelle wird in der Aufsicht auf die geöffnete Streuzelle ersichtlich. Der Laser-Strahl gelangt über einen
Kanal (e), Abbildung 16, in das Innere der Zelle und trifft dort auf den senkrecht dazu stehenden
Flüssigkeitsstrom (a) der die Probe mitführt. Das gestreute Licht verlässt die Zelle über Sichtfenster in
definierten Winkeln und gelangt über optische Fasern zu den jeweiligen Detektoren.
Abbildung 16: Aufbau des Online MALLS Detektors Dark II. Links: Schematischer Aufbau, Seitenansicht des Querschnitts.
Rechts: Aufsicht auf die geöffnete Streuzelle. a) Eintrittsöffnung für Eluat b) Abgrenzungsplatte mit Lochbohrungen c)
Sichtfenster für Detektoren d) Halterung für Adapter e) Laser-Eintrittsöffnung f) Laser.
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
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-46-
Der DARK II Detektor besitzt einen verhältnismäßig aufwendigen Aufbau der Streuzelle im Vergleich
zu herkömmlichen online MALLS Detektoren. Alternative Streuzellen werden unter Anderem von
Wyatt Technology Europe GmbH unter der Produktbezeichnung DAWNTM produziert. Ein
entsprechender schematischer Aufbau ist in Abbildung 17 veranschaulicht. Die DAWNTM Streuzelle
besteht aus einem Glaskörper mit Lochbohrung, die einen gemeinsamen Kanal für den Probenfluss
und den LASER darstellt. Da der Laserstrahl parallel zum Probenfluss geführt wird, tritt an jedem
Punkt innerhalb des Kanals Streuung auf. Das Streulicht wird an der Grenzfläche Eluat/Glas
gebrochen und die Intensität wird in der Streuebene winkelabhängig gemessen.113 Aus einem solchen
Aufbau resultieren folgende Beeinträchtigungen sowohl für die statische als auch für die dynamische
Lichtstreumessung:
• Reflexionen nahe des Streuzentrums durch die angrenzende Glasoberfläche der Kanalwand
• die inhärente Bandenverbreitung durch das Detektorinnenvolumen von 0,76 mL
• der Beitrag einer gerichteten Bewegung ν
�
mit q
�
ν
�
≠0 auf die Korrelationsfunktion
Abbildung 17: Schematischer Aufbau von online MALLS Streuzellen im Vergleich.
Der DARK II Detektor minimiert diese Störquellen durch die hydrodynamische Fokussierung der
Probe. Die Probe wird mit einer Düse von 0,5 mm im Durchmesser in das Zellenvolumen injiziert.
Das Probenvolumen ist um einen Faktor 200 kleiner als das Detektorvolumen des DAWNTM, zudem
befindet sich die Küvettenwand in räumlichem Abstand zum Streuvolumen und ermöglicht die
Positionierung von Sichtblenden innerhalb der Zelle zur Verminderung von Reflexionen. Weiterhin
begünstigt dieser Aufbau die online DLS-Detektion, da die gerichtete Bewegung der Probe senkrecht
zur Streuebene verläuft. Diese gerichtete Bewegung lässt sich durch einen zusätzlichen Term in der
Korrelationsfunktion g1(q, τ) beschreiben.114
(89)
g1(q, τ)=exp(iq
�
v
�
τ)exp(−Dq2τ)
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
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-47-
Unter der Annahme, dass der hydrodynamisch fokussierte Probenstrahl innerhalb der Zelle nicht
schräg verläuft, pulsiert oder Turbulenzen zeigt, gilt: q
�
ν
�
= 0 und der Term der gerichteten Bewegung
entfällt.
4.1.1 Einrichtung des Durchfluss MALLS-Detektors
Es wurde zunächst die korrekte Funktionsweise der Streuzelle überprüft, bevor der DARK II Detektor
kalibriert werden konnte. Hierzu wurde die Elutionsbande von Partikeln einheitlicher Größe
aufgezeichnet, die in die Elution des FFF-Kanals ohne Querfluss injiziert wurden. Als Probe wurde
der Latex Größenstandard PS-50 der Firma Duke Scientific Corporation mit einem Durchmesser von
46 nm verwendet. Durch die Elution ohne angelegtes Querflussfeld entstehen sehr scharfe Peaks, die
sich ebenso eigneten, um den Versatz zwischen den Detektoren zu bestimmen. Abbildung 18 zeigt
solche Elutionsbanden.
Zunächst wurde die Streuzelle als „geschlossener Kreislauf“ zur hydrodynamischen Fokussierung
betrieben. Hierfür wurden 20 µL der Probe PS-50 mit einer Flussrate von 0,1 mL/min in den AF-FFF
Kanal, der mit einer Laminarflussrate von 0,9 mL/min durchströmt wurde, injiziert. Der Detektorfluss
betrug somit 1 mL/min. Nach ca. 45 Sekunden konnte anhand der Streuintensität innerhalb des
MALLS Detektors ein Signal beobachtet werden, das nach 20 Sekunden das Maximum erreichte und
während den folgenden 200 Sekunden abfiel.
Mehrmaliges Reproduzieren dieser Messungen führte zu einer stetigen Erhöhung der Basislinie, die
erst nach Austausch der Umwälzflüssigkeit wieder auf ein Grundniveau abfiel. Folglich reicherte sich
Probe im Zellenvolumen aufgrund mangelhafter hydrodynamischer Fokussierung an. Zur
Unterstützung der hydrodynamischen Fokussierung wurde die Fließgeschwindigkeit des
Umwälzkreislaufs erhöht. Als Folge eluierten die Proben als schmalere Banden im Vergleich zu
langsameren Geschwindigkeiten des Umwälzkreislaufs. Die Ursache der schmaleren Banden lag in
dem schnelleren Abtransport der Probe, die sich bei unzureichender hydrodynamischer Fokussierung
im Streuvolumen ansammelt. Die kontinuierliche Erhöhung der Basislinie konnte trotz des erhöhten
Hilfsstroms beobachtet werden. Höhere Fließgeschwindigkeiten als 25 mL/min konnten nicht
umgesetzt werden, da die Streuzelle durch den zu hohen Druck undicht wurde.
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
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-48-
Abbildung 18: AF-FFF Elutionsbanden von Polystyrol Latex, Rh = 23 nm. Die Probe wurde ohne Querfluss in die Elution
injiziert. Es wurde die Flussrate des Umwälz-Kreislaufs variiert.
Um die hydrodynamische Fokussierung auch bei niedrigen Fließgeschwindigkeiten des Hilfskreislaufs
zu bewerkstelligen, wurden die Flüsse in der Streuzelle abgewandelt. Es wurde von einem
geschlossenen Kreislauf auf ein „offenes Sytem“ gewechselt, dargestellt in Abbildung 18. Beim
offenen System verlässt der Hilfskreislauf mit dem Probenstrahl die Zelle. Es entsteht ein Mantelstrom
um den Probenstrahl, der diesen einengt und die hydrodynamische Fokussierung erzwingt. Das offene
System hatte im Vergleich zum geschlossenen System schon bei niedrigen Flussraten des Hilfsstroms
schmale Banden zur Folge. Ebenso konnte eine stetige Erhöhung der Basislinie nach mehrmaliger
Reproduktion des Versuchs nicht beobachtet werden. Entsprechend wurde die Probe effizient vom
Streuvolumen abtransportiert und eine Anreicherung der Probe in der Streuzelle konnte nicht
beobachtet werden. Im Folgenden wurde die Streuzelle als offenes System betrieben.
4.1.2 Kalibrierung
Störfaktoren von Lichtstreuexperimenten können Reflektionen an den Zellwänden sowie fehlerhafte
Justierungen des Strahlengangs und der Detektorsichtfenster sein. Im Folgenden soll die korrekte
Funktionsweise der Apparatur anhand einer Kalibrierung sowie deren Anwendung auf eine Probe
überprüft werden.
Zur Kalibrierung herkömmlicher Lichtstreuapparaturen wird typischer Weise Toluol verwendet, das
sich durch eine hohe Streuintensität auszeichnet. Diese kommt durch Dichtefluktuationen zustande,
die ausschließlich durch die Temperatur beeinflusst werden. Eine solche Kalibrierung gelang mit dem
DARK II Detektor aus folgendem Grund nicht. Beim vollständigen Füllen der Streuzelle mit Toluol
ergibt sich das Streuvolumen der Kalibrierung aus der Schnittmenge des Sichtfensters der Detektoren
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
___________________________________
-49-
mit dem Laserstrahl. Das Streuvolumen der Probe hingegen wird zusätzlich durch die
hydrodynamische Fokussierung bestimmt. Die Kalibrierung musste folglich am hydrodynamisch
fokussierten Probenstrahl erfolgen. Da die räumlichen Ausmaße des Probestrahls von den
Fließgeschwindigkeiten des Hüllstroms sowie des Kanalflusses abhängen, wurden zur Kalibrierung
die Flussbedingungen einer Messung, einschließlich AF-FFF Fraktionierung, nachgestellt. Als
Standard diente die Probe NexSil20, deren absolute winkelabhängige Streuintensität durch eine
herkömmliche Lichtstreuapparatur der Firma ALV-GmbH ermittelt wurde, siehe Abbildung 21. Eine
ausführliche Charakterisierung der Probe befindet sich in Kapitel 5.2.
Die Kalibrierung erfolgte über die gesamte Fläche der Elugramme der winkelabhängigen Streusignale
I(Ɵ) dVsowie der Fläche unter dem Konzentrationssignal IRI dV (für die Konzentrationsbestimmung
wurde ein Brechungsindex Detektor (RI) verwendet). Es resultiert die volumendifferenzierte Zimm
Gleichung.
(90)
A2 wurde unter der Annahme sehr verdünnter Lösungen vernachlässigt. Der hierdurch verursachte
Fehler kann wie folgt abgeschätzt werden: Der zweite Virialkoeffizient wurde für NexSil20 auf
A2= 2,915 ∗10−5mol mL
g2 bestimmt, siehe Abbildung 21. Das Elugramm der höchsten zur
Kalibrierung verwendeten Konzentration der NP ist in Abbildung 22 dargestellt. Dieses zeigt am
Peakmaximum (hier kommt der zweite Virialkoeffizient am stärksten zum Tragen) eine Konzentration
der Probe von c = 6,4 ∗10−5 g/mL. In der Zimmgleichung wird das reziproke Molekulargewicht der
Probe mit einem Wert von 1 Mw
⁄= 6,9 ∗10−8 mol/g berücksichtigt. Hierzu addiert sich das Produkt
2 A2∗c, welches einen Wert von 2 A2∗c = 3,8 ∗10−9mol/g ergibt. Im Falle der höchsten
Konzentration am Peakmaximum verursacht der zweite Virialkoeffizienten somit relativ zu 1 Mw
⁄
einen Beitrag zur Zimmgleichung von 5,3%. Bei Vernachlässigung von A2 entspricht dies dem damit
einhergehenden maximalen Fehler.
Zur Berechnung der absoluten Streuintensität bzw. zu absoluten Konzentrationen wurden die
Kalibrierungsfaktoren K(Ɵ)LS und KRI eingeführt. In Gleichung (91) bezeichnet K(Ɵ)LS die
winkelabhängigen Kalibrierungsfaktoren der Lichtstreusignale, analog bezeichnet KRI den
Kalibrierungsfaktor des RI Detektors in Gleichung (92).
(91)
(92)
K c dV
R(Ɵ) dV =1
Mw∗�1 + 1
3Rg2q2�
R(Ɵ) dV = K(Ɵ)LS∗I(Ɵ) dV
c dV = KRI∗IRI dV
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-50-
Der Kalibrierungsfaktor des RI Detektors konnte durch die Elution einer Konzentrationsreihe von
NexSil20 ermittelt werden. Durch eine Auftragung der eingesetzten Gesamtmasse minj.= c dV gegen
die Fläche unter dem RI Signal ARI= IRI dV resultierte der Kalibrierungsfaktor KRI aus der Steigung,
Abbildung 19.
Abbildung 19: Kalibrierung des RI Detektors anhand der injizierten Gesamtmasse m = c dV sowie der Fläche unterhalb der
Elutionsbande ARI.
Die Kalibrierung des MALLS Detektors gestaltete sich etwas aufwendiger. Bei bekanntem
Molekulargewicht und Trägheitsradius und unter Zuhilfenahme der Konzentration aus Gleichung (92)
folgt direkt, aus Gleichung (90), die absolute Gesamtstreuintensität der eluierenden Probe R(Ɵ) dV.
Gleichung (91) liefert letztlich die Kalibrierungsfaktoren des MALLS Detektors K(Ɵ)LS.
Die Vergleichsmessung mittels herkömmlicher Lichtstreuapparatur ergab Trägheitsradien der Probe
NexSil20 von 25 nm. Diese großen Radien sind durch geringfügige Aggregation bedingt, welche die
winkelabhängige Streuintensität der einzelnen NP überlagert. Diese Aggregate separierten sich in der
AF-FFF von der Hauptfraktion und eluierten innerhalb der Spülbande, Abbildung 19. Die Flächen der
winkelabhängigen Streuintensitäten der Hauptfraktion wiesen relativ zueinander reproduzierbare
Werte auf. Die Spülbande hingegen erzielte eine nur schlechte Reproduzierbarkeit der
Streuintensitäten der Winkel relativ zueinander. Folglich zeigte die Probe an der Hauptbande wohl
definierte Trägheitsradien, der Anteil der Probe im Spülpeak war nicht reproduzierbar größendefiniert.
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
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-51-
Abbildung 20: Elugramm des online MALLS Detektors bei einem Streuwinkel von 90° (unkalibriert). Querfluss 2,5 mL/min;
Detektorfluss 1 mL/min.
Da die relativen Streuintensitäten der Winkel zueinander sehr empfindlich angepasst werden müssen,
war die Spülbande somit zur Kalibrierung des Trägheitsradius ungeeignet. Um eine korrekte
Winkelabhängigkeit durch die Kalibrierung zu erhalten, ohne einen Teil der Probe innerhalb der
Spülbande zu verwerfen, wurden zunächst nur die winkelabhängigen Streuintensitäten relativ
zueinander kalibriert. Hierfür wurde der Hauptfraktion ein Trägheitsradius von 11,7 nm zugrunde
gelegt (siehe Kapitel 4.1.4). Der winkelabhängige Teil der Zimmgleichung lieferte die Verhältnisse
der Streuintensitäten zueinander R(0°)dV
R(Ɵ)dV= 1 + 13Rg2q2, vgl. (90). Einsetzen von (91) und Integrieren
der Streuintensitäten über die Hauptbande der jeweiligen Winkel ergab normierte
Kalibrierfaktoren Knorm(θ)LS, welche die Streuintensitäten der jeweiligen Winkel relativ zueinander
anpassen:
(93)
Anschaulich betrachtet, wurde das Molekulargewicht aus der Zimmgleichung gekürzt. Ein Zimmplot
mit diesen normierten Kalibrierfaktoren besitzt eine korrekte Winkelabhängigkeit, der
Y-Achsenabschnitt verläuft jedoch nicht durch den Wert 1 Mw
⁄, sondern durch 1. Es wurde für alle
Winkel Knorm(θ)LS -Werte berechnet. Einzige Unbekannte in Gleichung (93) sind noch K(0°)LS
sowie I(0°) dV um auf K(θ)LS zurück zuschließen.
Auf Grundlage der normierten Kalibrierfaktoren ließen sich die Intensitäten I(q2→0) extrapolieren.
Die Integration I(0°) dV erfolgte über die Hauptfraktion plus Spülbande. Diese extrapolierte
Streuintensität wurde gemäß Gleichung (91) der absoluten Streuintensität des Standards angepasst,
welche anhand einer „Batchmessung“ ermittelt wurde, siehe Abbildung 21. Es wurde eine
Knorm(θ)LS=K(θ)LS
K(0°)LS∗I(0°) dV =1
I(θ) dV ∗�1 + 1 3
⁄Rg2q2�
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
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-52-
Streuintensität des Standards von Kc dV
R dV= 6,99 ∗10−8 mol/g ermittelt. Durch Gleichung (93) folgte
aus den normierten Kalibrierfaktoren die absoluten Kalibrierfaktoren K(θ)LS.
Tabelle 4: Kalibrierfaktoren des online MALLS-Detektors DARK II.
Θ
50°
70°
90°
110°
130°
Einheit
K(θ)LS
2,014 1,742 1,006 0,992 1,478 10
-10
cm
-1
Die berechneten Kalibrierfaktoren des DARK II sind in Tabelle 4 für die fünf Detektoren,
entsprechend fünf Messwinkeln, zusammengefasst. Die Kalibrierfaktoren resultierten aus einer
Konzentrationsreihe aus fünf Konzentrationen. Die verwendeten Konzentrationen der NexSil20 NP
reichten von 0,91 mg/mL bis 4,55 mg/mL; mit einer Injektionsschleife von 11 µL entsprach dies einer
injizierten Gesamtmasse von 10,0 µg bis 50,1 µg. Abbildung 21, rechte Seite, zeigt den
zugrundeliegenden online Zimm-Plot bezüglich der Volumenintegrale über die Hauptbande. Die
Messungen der einzelnen Konzentrationen ergaben konstante Kcd V/RdV-Werte, folglich war der
zweite Virialkoeffizient A2 tatsächlich vernachlässigbar. Die Messung der höchsten Konzentration
ergab um 10% zu hohe KcdV/RdV-Werte. Der Grund hierfür war ein Sprung in der Laserintensität,
welcher bei Diodenlasern durch Schwankungen der Stromzufuhr oder der Temperatur bedingt ist. Der
verwendete Laser besitzt eine eigene Regelung der Stromzufuhr sowie ein Peltierelement zur
konstanten Kühlung. Dennoch übertragen sich Schwankungen der Raumtemperatur auf die
Laserleistung, die ohne geeignete Messung der Laserintensität nicht korrigiert werden kann. Die
Häufigkeit solcher Intensitätssprünge konnten durch eine 24 stündige Vorwärmphase des Lasers
verringert werden, wobei dennoch Sprünge mit Intensitätsschwankungen von etwa 10% in Abständen
weniger Stunden auftraten.
Der beobachtete Intensitätssprung, der der Messung mit der höchsten Konzentration der NP zugrunde
lag, schlug sich direkt in den Kalibrierfaktoren nieder. Die entsprechende Messung wurde daher zur
Kalibrierung vollständig verworfen. Der online Zimmplot der Hauptfraktion ergab ein
Molekulargewicht von Mw = 1,29·107 g/mol und zeigte somit ein geringeres Molekulargewicht als die
Batchmessung, die zusätzlich von Aggregaten beeinflusst wurde. Die Winkelabhängigkeit ergab
schwankende Werte, aufgrund des kleinen Trägheitsradius von 11,7 nm, nahe der mittels statischer
Lichtstreuung auflösbaren Größe.
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
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-53-
Abbildung 21: Zimmplot der Probe NexSil20. Links: Messung erfolgte mittels herkömmlicher Mehrwinklel Lichtstreuanlage
von ALV als "batch-Messung". Rechts: Messung erfolgte "online" durch den DARK II Detektor an der Hauptfraktion der
AF-FFF Elutionsbande.
In Abbildung 21 bezeichnen die Punkte „×{Winkel}“ die für die Kalibrierung berechneten Sollwerte der
Winkelabhängigkeit der Streuintensität. Bei der verwendeten Laser-Wellenlänge von 513 nm zeigen
NP mit einem Trägheitsradius von 11,8 nm eine relative Abnahme der Streuintensität von 50° zu 130°
von ca. 3%. Dieser Wert liegt an der Grenze der Messgenauigkeit der Lichtstreuapparaturen.
Unabhängig von der Größe der Teilchen des Kalibrierstandards ergibt sich die Genauigkeit der
Kalibrierung aus der Empfindlichkeit der Photomultiplier. Voraussetzung ist, dass die relative
Winkelabhängigkeit bekannt ist. Hierbei äußern sich fehlerhafte Annahmen des Trägheitsradius bei
Teilchen mit d > λ/20 stärker in der resultierenden Winkelabhängigkeit, welche in die Kalibrierung
einfließt. Allgemein sind daher kleinere Standards mit d < λ/20 zur Kalibrierung bevorzugt zu
wählen.
Die Reproduzierbarkeit dieser Messungen und somit die Genauigkeit des DARK II Detektors zu
online SLS Messungen unterlag den Schwankungen der Laser-Intensität. Es konnten, anhand der
kontinuierlichen Streuintensitätsmessungen der Basisline, Sprünge der Laser-Intensität von 10%
beobachtet werden. Die Auswirkungen auf die Kalibrierung solcher „Sprünge“ sind in Abbildung 21
dargestellt. Die gesamte Messung der höchsten Konzentration ergab um 10% zu niedrige Werte
bezüglich der absoluten Streuintensitäten auf allen Winkeln. Der Fehler der Streuintensität ist direkt
proportional zum Fehler des berechneten Molekulargewichts. Um eine solche Fehlerquelle zu
vermeiden sollte die Messung der Kalibrierung möglichst zeitnahe folgen.
Zusammenfassend wurde der Detektor mit gleicher Probe aber bei unterschiedlichen Konzentrationen
fünf Mal kalibriert. Der Einfluss des zweiten Virialkoeffizienten auf die Streuintensität konnte nicht
beobachtet werden. Die Winkelabhängigkeit der Streuintensitäten lag innerhalb der Messgenauigkeit
< 3%. Im Folgenden wird der Detektor zur zeitaufgelösten Charakterisierung getestet.
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-54-
4.1.3 Online Molekulargewichts-Bestimmung
Die mittels Gleichung (91) berechneten Kalibrierfaktoren des MALLS Detektors erlauben nicht nur
die Berechnung der Streuintensitäten der Volumenintegrale, sondern ebenso die Berechnung der
absoluten Streuintensität zu jedem Zeitpunkt der Elution. In Anlehnung an herkömmliche
Lichtstreuung kann Gleichung (46) auf die online Lichtstreuung angepasst werden:
(94)
Eine Auftragung von 1/R(Ɵ) gegen q2 und lineare Extrapolation für q2→0 liefert für jeden
Zeitpunkt der Elution 1/R(0°). Unter Vernachlässigung von A2 vereinfacht sich Gleichung (57) zu
(95).
(95)
In Gleichung (95) wurde angenähert, dass die Fraktionen der Probe, die in der AF-FFF aufgetrennt
werden, monodispers eluieren. Der Index „w“ des Molekulargewichts, der für das Gewichtsmittel
steht, wurde daher ausgelassen. Tatsächlich besitzt die AF-FFF inhärente Bandenbreite, die eine
Größendispersität der Fraktionen bedingt.
Abbildung 22 zeigt die Elugramme der Proben NexSil8 und NexSil20. Die Konzentrationen wurden
mit einem RI-Detektor ermittelt. Das Konzentrationssignal wurde nicht als willkürliche Maßeinheit
(als „arbitrary units“, a.u.) angegeben, sondern stellt absolute Konzentrationen dar, die auf Grundlage
der Kalibrierung, Gleichung (92), berechnet wurden. Auf gleiche Weise wurden die absoluten
Streuintensitäten berechnet und die Winkelabhängigkeit auf R(0°) extrapoliert. Gleichung (95)
resultierte in der online Molekulargewichtsbestimmung, ebenfalls dargestellt in Abbildung 22. Die
Molekulargewichtskurve zeigte Oszillationen aufgrund der pulsierenden Pumpe des Hüllstroms zur
hydrodynamischen Fokussierung.
R(Ɵ)=�ILsg.−ILM�RStd.
IStd.
=(I(Ɵ) −I(Ɵ)Basisline)∗K(Ɵ)LS
K c
R(0°)=1
M
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
___________________________________
-55-
Abbildung 22: AF-FFF-Elugramm der Proben NexSil8 und NexSil20 mit online-Molekulargewichtsbestimmung. Querfluss
2,5 mL/min; Detektorfluss 1 mL/min.
Die online Molekulargewichtsbestimmung wies für die Probe NexSil20 ein kontinuierliches
Wachstum auf. Dies lässt sich durch die Fraktionierung der AF-FFF von kleinen zu großen Teilchen
begründen selbst bei gegebener, enger Größendispersität. Die Probe NexSil8 zeigte zu Beginn der
Elution (t < 230 s) ein annähernd konstantes Molekulargewicht da ein geringer Teil der Probe noch
innerhalb des Voidpeaks bei 210 Sekunden eluierte und somit nicht der Fraktionierung unterlag. Ab
einer Elutionszeit von 230 Sekunden konnte auch bei dieser Probe ein kontinuierliches Wachstum des
Molekulargewichtes beobachtet werden.
Bei identischen Elutionszeiten der Proben, zwischen 240 bis 280 Sekunden, wurden für NexSil8
niedrigere Molekulargewichte als für die Probe NexSil20 ermittelt. Die Molekulargewichtskurven der
beiden Proben verliefen folglich nicht deckungsgleich. Der Grund hierfür lag in der Verbreitung der
Elutionsbanden. Diese wird nicht nur durch die Größenverteilung der Probe verursacht, sondern
beruhte vor allem auf dem Fraktionierungsprinzip der AF-FFF. Trotz Überlappung der Elugramme
ergab die Probe NexSil20 über die komplette Elutionsbande daher größere Molekulargewichte als
NexSil8.
Eine Auswertung der Streuintensitäten am Bandenmaximum ergab Molekulargewichte von
3,87·106 g/mol für NexSil8 bzw. 1,24·107 g/mol für NexSil20. Diese Molekulargewichte sind
proportional zur dritten Potenz des hydrodynamischen Radius, mit einer Abweichung von 4%, vgl.
Tabelle 12, Seite 85. Neben dem Molekulargewicht am Bandenmaximum (MMax) wurden ebenso die
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-56-
gewichtsgemittelten Molekulargewichte (〈M〉w) über die komplette Bande der Hauptfraktion
berechnet, Gleichung (72) führt zu Gleichung (96):
(96)
Vi bezeichnet das Volumen jeder Fraktion, das sich aus der Detektorflussrate und den Zeitintervallen
zwischen den Datenpunkten ergibt. Bei konstanter Detektorflussrate von V
= 1 mL/min und einem
Zeitintervall von ∆t = 0,2 s berechnet sich das Volumen jeder Fraktion als Vi= 3,33 µL. Vi ist somit
eine Konstante und kann aus Gleichung (96) gekürzt werden. Die Ergebnisse des gewichtsgemittelten
Molekulargewichts sind in Tabelle 5 wiedergegeben.
Tabelle 5: Zusammenfassung der online gemessenen Molekulargewichte durch den DARK II Detektor im Vergleich zur
Batchmessung.
Probe
MMax
/ g/mol
〈M〉w
/ g/mol
〈M〉w,Batch
/ g/mol
NexSil8 3,87·106 4,32·106 4,42·106
NexSil20
1,24·107
1,36·107
1,44·107
Die Proben wiesen ein höheres über die komplette Elution gewichtsgemitteltes Molekulargewicht auf,
als es am Peakmaximum gemessen wurde. Bei symmetrischen Elutionsbanden der
Massenkonzentration sowie einer linear verlaufenden Molekulargewichtskurve müssen diese Werte
übereinstimmen. Der Grund für die hier abweichenden Werte liegt in der Bandenasymmetrie, die
besonders stark bei der Probe NexSil8 aufgrund der Überlappung mit dem „Voidpeak“ auftrat.
Das anhand der „Batchmessung“ bestimmte Molekulargewicht ergab für beide Proben im Vergleich
zur online MALLS Bestimmung größere Werte. Die geringfügige Aggregation der Probe NexSil20
wurde bereits im vorherigen Kapitel erwähnt. Die Probe NexSil8 wies in der „Batchmessung“ ebenso
die Anwesenheit von Aggregaten auf, dies spiegelt sich in dem gemessenen Trägheitsradius von
30 nm statt den berechneten 7,8 nm wieder. Eine durch Aggregation bedingte Verfälschung des
Molekulargewichts zu größeren Werten hin ist in der Batchmessung zu erwarten.
Die berechneten Werte der zeitaufgelösten Molekulargewichtsbestimmung sind nicht unplausibel,
dennoch wird die winkelabhängige Streuintensitätsdetektion am empfindlichsten von Störquellen wie
einer fehlerhaften Justierung oder Reflexionen innerhalb der Streuzelle beeinflusst. Dies soll im
folgenden Kapitel überprüft werden.
〈M〉w=∑Mi mi
∑mi=∑Mi ci Vi
∑ci Vi=∑Mi ci
∑ci
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
___________________________________
-57-
4.1.4 Online Trägheitsradien-Bestimmung
In der vorliegenden Arbeit wurde der DARK II online MALLS Detektor zur Charakterisierung von
NP-Aggregaten verwendet. Als Grundlage diente die online-Bestimmung des Trägheitsradius als Maß
für die Größe eines Aggregates. Die Funktionsfähigkeit des Detektors zur Bestimmung von
Trägheitsradien soll im Folgenden am Beispiel einer geringfügigen aggregierten Probe NexSil125.3a
gezeigt werden.
Die winkelabhängige Streuintensität muss zur online Trägheitsradien-Bestimmung sehr genau
bestimmt werden. Vor allem kleine Partikel, mit Durchmessern nahe λ20
�, zeigen eine nur schwach
ausgeprägte Winkelabhängigkeit. Durch die beobachteten Intensitätsschwankungen des Lasers würden
sich die relativen Streuintensitäten der gemessenen Winkel zueinander nicht verändern. Die
Winkelabhängigkeit wäre hierdurch unbeeinflusst. Dennoch wirken sich Intensitätsschwankungen des
Lasers auf die Streuintensität des Lösungsmittels aus und gemäß Gleichung (94) ebenso auf die
Basisline des Elugramms der Streuintensitäten. Bei nicht konstanter Basisline würde die
winkelabhängige Streuintensität der Probe durch die des Lösungsmittels überlagert. Letztere ergibt
sich aus der Geometrie des Streuvolumens, im Idealfall gilt IBasisline∝ 1sin(θ)
�. Die
winkelabhängige Streuintensität der Probe würde somit verfälscht.
Um die Gültigkeit der Kalibrierung zu gewährleisten wurde das Zeitfenster zwischen Messung und
Kalibrierung optimiert. Die Kalibrierung erfolge innerhalb der Messung mit der Probe NexSil20, die
zur eigentlichen Probe beigemengt wurde. Diese Vorgehensweise setzt voraus, dass sowohl Probe als
auch Kalibrierstandard nicht miteinander Wechselwirken sowie vollständig separierte Elutionsbanden
aufweisen. Im Folgenden soll eine stark polydisperse Probe mittels online SLS größencharakterisiert
werden. Hierfür wurde die Probe NexSil125.3a verwendet. Es handelt sich hierbei um amorphe Silica
NP, die drei Jahre alterten und Aggregation aufzeigten. Der hydrodynamische Radius der primären
Partikel wurde mittels DLS bestimmt und betrug 58,6 nm (anhand der frischen Probe NexSil125),
siehe Kapitel 5.2. Die gealterte Probe diente ausschließlich der Charakterisierung des Trägheitsradius
einer möglichst breiten Verteilung, um die korrekte Funktionsweise des online MALLS Detektors
über eine breite Trägheitsradienskala sicher zu stellen. Die in den übrigen Kapiteln dieser Arbeit
verwendete Probe NexSil125 wurde frisch bestellt und wies keine Aggregation auf.
Das Elugramm der Probe einschließlich Kalibrierung ist in Abbildung 23 dargestellt. Es wurden die
normierten Streuintensitäten der fünf Messwinkel, von 50° - 130° in 20° Schritten, aufgetragen. Die
Normierung erfolgte anhand des Kalibrierungsstandards NexSil20. Die auf einen Winkel von 0°
extrapolierte Streuintensität wurde am Bandenmaximum des Standards bei 320 Sekunden auf 1
normiert. Die winkelabhängige Abstufung erfolgte auf Grundlage des bekannten Trägheitsradius von
11,7 nm durch die Beziehung I(0°)
I(θ)= 1 + 13
�Rg2q2. Die Probe separierte sich während der Elution
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-58-
vollständig von der Kalibrierung. Der Kalibrierstandard eluierte als scharfe Bande von
280 bis 380 Sekunden, die Probe eluierte als breite Bande zwischen 600 bis 1000 Sekunden
Elutionszeit.
Während der Elution der Probe NexSil125.3a spalteten sich die winkelabhängigen Streuintensitäten
voneinander auf. Am Maximum bei 690 Sekunden wurde eine Abnahme der Streuintensität von 44%
bei einem Winkel von 130° gemessen, relativ zu der auf 0° extrapolierten Intensität. Mit
fortschreitender Elutionszeit spalteten sich diese Streuintensitäten noch weiter voneinander auf,
verursacht durch das Anwachsen des Trägheitsradius mit fortschreitender Elutionszeit.
Durch eine Auftragung von I(0°)
I(θ) gegen q2 wurden die Trägheitsradien der eluierenden Fraktion aus der
Steigung berechnet. Diese Winkelabhängigkeit ist stichprobenhaft für zwei Messzeiten, am
Bandenmaxmimum und an der Schulter der Probe NexSil125.3a, in Abbildung 23 dargestellt. Es
konnte für alle Messzeiten eine lineare Abhängigkeit der winkelabhängigen Streuintensitäten
beobachtet werden. Dies ist ein Hinweis darauf, dass die beobachte Winkelabhängigkeit ausschließlich
durch intrapartikulare Interferenz bedingt war und nicht durch Reflexionen oder Leuchten der
Streuzelle bzw. von der winkelabhängigen Streuintensität der Basislinie oder der Streuintensität der
Probe beeinflusst wurde.
Die online Trägheitsradien wurden in Abbildung 23 für jeden Zeitpunkt der Elution zusammen mit
dem Elugramm geplottet. Die Trägheitsradien sind auf der rechten Skala in Rot dargestellt. Die
Trägheitsradienkurve zeigte einen kontinuierlichen Anstieg mit zunehmender Elutionszeit, selbst
innerhalb der schmalen Bande der Kalibrierung. Die Trägheitsradien stiegen bis zu einem Maximum
bei ca. 950 Sekunden an, anschließend fiel die Größe wieder ab. Dieses Verhalten konnte bei dem
gegebenen Kanalaufbau reproduzierbar beobachtet werden. Es handelt sich hierbei um sterische,
vorzeitige Elution großer Aggregatspezies, die sich mit der normalen Elution überlagerte.
Online Kopplung der AF-FFF an eine MALLS Detektion
___________________________________
-59-
Abbildung 23: Links: AF-FFF-Elugramm von NexSil125 mit Aggregaten bei t=600s-1000s. Es wurde während der Messung
mit NexSil20 kalibriert bei t=320s, die Trägheitsradien wurden online gemessen (rechte Skala, rot), zum Vergleich wurden
Fraktionen gesammelt und mittels DLS charakterisiert (rechte Skala, blau). Rechts: Die Winkelabhängigkeit der online SLS-
Messung zeigt einen linearen Verlauf des Formfaktors.
Die gemessenen online Trägheitsradien wurden mit einem herkömmlichen Streuexperiment
entsprechender Fraktionen verglichen. Hierzu wurden kontinuierlich Fraktionen von 40 Sekunden
gesammelt und größencharakterisiert. Die Streuintensitäten dieser Fraktionen waren zu gering für eine
Statikmessung, es wurden daher dynamische Lichtstreumessungen durchgeführt. Die Ergebnisse der
hydrodynamischen Radien sind ebenfalls in Abbildung 23 als blaue Punkte eingefügt. Diese zeigten
ebenso wie die Trägheitsradien ein kontinuierliches Wachstum mit steigender Elutionszeit.
Das Verhältnis von Trägheitsradien zu hydrodynamischen Radien liefert das ρ-Verhältnis. Es wurden
Werte von 0,88 am Anfang der Elutionsbande, 0,97 am Maximum bis zu 1,4 an der Schulter der
Bande gefunden. Erwartete Werte der ρ-Verhältnisse lägen bei 0,775 bezüglich der freien NP.
Dimere, Trimere und höhere Aggregate können vereinfacht als Ellipsen aufgefasst werden mit ρ-
Verhältnisse von 0,775 - 4, vgl. Tabelle 3. Anhand Abbildung 5, Seite 20, wurden hydrodynamische
Radien kleinerer Aggregate erfasst. Es wurden normierte hydrodynamische Radien des Dimers
�Rh
a�N=2= 1,14 sowie des Trimers �Rh
a�N=3= 1,19 bis 1,24 bestimmt. Ebenso wurden
Trägheitsradien des Dimers, des trigonalen Trimers und des linearen Trimers hergeleitet, siehe Tabelle
7. Es resultieren ρ-Verhältnisse des Dimers von ρ = 1,05, sowie für das Trimer, abhängig der
Anordnung, von ρ = 1,17 bis ρ = 1,48. Das Elugramm der Probe NexSil125.3a weist
entsprechende Radien zwischen 800 und 900 Sekunden Elutionszeit auf, einhergehend mit dem steilen
Anstieg des Trägheitsradius auf einen Wert von ρ = 1,4. Der beobachtete sprunghafte Anstieg der
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-60-
Trägheitsradienkurve ist folglich durch die Elution kleiner Aggregate bedingt, die große ρ-Verhältniss
aufweisen.
Zusätzlich wird das ρ-Verhältnis durch die Größendispersität beeinflusst, Messwerte ergeben
grundsätzlich höhere Werte aufgrund des verschiedenen Mittelwerts des Trägheitsradius 〈Rg2〉z und des
hydrodynamischen Radius 〈1
Rh〉z. Besonders kleine Aggregate, wie Dimere oder lineare Trimere,
weisen eine hohe Anisotropie auf. Dies verursacht nicht nur, wie oben erwähnt, hohe ρ-Verhältnisse,
sondern auch eine zusätzliche Bandenverbreiterung im Trennkanal und somit erhöhte Dispersität der
Fraktionen.
Nicht-sphärische Partikel müssen in ihrem Retentionsverhalten gesondert betrachtet werden.115,116,117
Theoretische Modelle hierzu berücksichtigen einen Verlust der Entropie sofern sich nicht-sphärische
Partikel der Akkumulationswand nähern, da sie in ihrer Rotationsbewegung eingeschränkt sind. Dies
wird als „sterisch-entropischer Elutionsmodus“ bezeichnet und bezieht sich auf eine vorzeitige Elution
solcher Partikel im „sterischen Modus“.102 Dieser Sachverhalt würde für die Probe NexSil125.3a erst
relevant, sofern die normale Elution von sterischer Elution überlagert wird. Partikel würden unter
solchen Bedingungen durch sterisch-entropische Elution zusätzlich verfrüht eluieren. Der
kontinuierliche Anstieg der hydrodynamischen Radien in Abbildung 23 spricht jedoch gegen eine
Überlagerung der sterischen bzw. sterisch-entropischen Elution.
Der online MALLS Detektor wurde folglich erfolgreich in Betrieb genommen. Die Kalibrierung
mittels NexSil20 wurde auf Silica-Partikel anderer Größe angewandt und erzielte plausible Verläufe
der zeitaufgelösten Molekulargewichts- sowie Trägheitsradienkurve.
In der vorliegenden Arbeit konnte der DARK II online MALLS Detektor zur Charakterisierung von
NP-Aggregaten verwendet werden. Im Folgenden soll weiterhin ein Modell zum Wachstum von
Teilchen-Cluster- sowie zu Cluster-Cluster-Aggregaten vorgestellt und diskutiert werden.
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-61-
4.2 Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
Im Theorieteil wurden bereits unterschiedliche Modelle zum Wachstum von Teilchen-Cluster-
Aggregaten (TCA) sowie zu Cluster-Cluster Aggregaten (CCA) vorgestellt. Im Folgenden soll das
Prinzip einer stufenweisen Berechnung der einzelnen Wachstumsschritte aufgegriffen werden und
ebenfalls auf den fraktalen Vorfaktor übertragen werden.
4.2.1 Berechnung des nicht-fraktalen Wachstum von Teilchen-Cluster- Aggregaten
Eine qualitative Beschreibung eines Aggregates gelingt anhand der Bestimmung des Trägheitsradius.
Zur Bestimmung der Wachstumsfunktion des Aggregates, siehe Gleichung (23), müssen einige
Annahmen bezüglich der Art des Aggregationsprozesses getroffen werden. Das im Folgenden
hergeleitete Modell wird sich auf eine diffusionslimitierte Aggregation (DLA) beziehen und soll den
Prozess einer Teilchen-Cluster Aggregation (TCA) darstellen. Ebenfalls wurden diese Ergebnisse mit
Simulationen zu Cluster-Cluster Aggregaten (CCA) aus der Literatur.
Die Berechnung der fraktalen Dimension von DLA Teilchen-Clustern aus Kapitel 2.5.4 basiert auf der
Annahme, dass der fraktale Vorfaktor kh= 1 ist. Dies wird aus einem Vergleich der Gleichungen (23)
und (31) ersichtlich. Ein Aggregat der Größe N = 1 besitzt den hydrodynamischen Radius eines
einzelnen Teilchens Rh= a. Für diesen Fall folgt tatsächlich aus Gleichung (23) kh= 1. Da das
anwachsende Aggregat jedoch nicht die Raumerfüllung einer Vollkugel besitzt, ist kh nicht konstant.
Dies resultiert direkt aus dem nicht-fraktalen Wachstum von Teilchen-Cluster Aggregaten. Folglich
darf kh in Gleichung (23) nicht ignoriert werden.
Durch konsequentes Einsetzen des fraktalen Vorfaktors in Gleichungen (31) - (35) folgt die Korrektur
von Gleichung (37). Diese entspricht der Reihenentwicklung der Dimension des Wachstumsschrittes
unter Berücksichtigung von kh:
(97)
Im Unterschied zu Gleichung (37) müssen nun zusätzlich die Verhältnisse der fraktalen Vorfaktoren
berücksichtigt werden, diese sind kh,i+1 kh,i
⁄ sowie kh,i+1 kh,1
⁄. Da die Berechnung der Vorfaktoren aus
der fraktalen Dimension erfolgt, der Zusammenhang beider Parameter jedoch noch unbekannt ist, wird
die Lösung der Gleichung (97) vorerst nicht lösbar, jedoch iterativ annäherbar. Zur Vereinfachung der
Problematik soll zunächst angenommen werden, dass kh während nur eines Wachstumsschrittes
annähernd konstant bleibt, so dass gilt: kh,i+1 kh,i
⁄= 1 und kh,i+1 kh,1
⁄= 1. Dies sind die Startwerte
(i + 1)1d
i+1
⁄= 1,080 ∗��1,56 −�1,728 −di+1
2�2−0,228�∗�kh,i+1
kh,i∗i1d
i
⁄+kh,i+1
kh,1�
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-62-
der iterativen Näherung, welche in Kapitel 4.2.2 wieder aufgegriffen werden soll. Besonders für große
Aggregationszahlen i→∞ kann angenommen werden, dass der Vorfaktor kh,∞ von kh,1 abweicht.
Durch das Vernachlässigen der Werte kh,i+1 kh,i
⁄ sowie kh,i+1 kh,1
⁄ berechnen sich für N = 5 um 1%
zu geringe Werte für di im Vergleich zur iterativen Näherung. Dieser Fehler wird mit zunehmender
Agglomerationszahl größer. An dieser Stelle soll dem Ergebnis dieser Berechnung vorausgegriffen
werden, dass eine Teilchen-Cluster Aggregation ab einer Aggregatgröße von 5 - 6 Einzelteilchen in
eine Cluster-Cluster Aggregation übergeht, siehe Abbildung 25.
Die Berechnung des fraktalen Vorfaktors des Träheitsradius kg erfolgte in der Herleitung nach
Gmachowski80 anhand Gleichung (38). Unter Berücksichtigung des fraktalen Vorfaktors des
hydrodynamischen Radius kh resultiert, an dessen Stelle, Gleichung (98).
(98)
Entsprechend der Berechnung von Gleichung (39) folgt Gleichung (99).
(99)
Gleichung (99) ist das korrigierte Ergebnis von Gmachowski80 zur Berechnung des fraktalen
Vorfaktors kg. Wie sich zeigt, berechnete Gmachowski fälschlicher Weise das Verhältnis kgkh
⁄ in
Abhängigkeit der fraktalen Dimension, allerdings nicht kg. Gleichung (99) ist nicht uninteressant, da
es zur Berechnung des ρ-Verhältnisses führt. Gemäß Gleichung (25) folgt für fraktale Objekte:
ρ=�khkg
⁄�df. Gleichung (99) liefert allerdings keinen Beitrag zur Beschreibung des Wachstums von
Aggregaten, da kh unbekannt bleibt.
4.2.2 Berechnung des fraktalen Vorfaktors durch eine Reihenentwicklung
Die folgende Berechnung bezieht sich auf das fraktale Wachstum des Trägheitsradius. Obwohl die
Herleitung nach Gmachowski auf dem Wachstum des hydrodynamischen Radius basiert lässt sich die
fraktale Dimension gemäß Gleichung (23) sowohl auf den hydrodynamischen Radius als auch auf den
Trägheitsradius anwenden.
Die Dimension des Wachstums kann gemäß Gleichung (37) für jeden Wachstumsschritt berechnet
werden. Aus der logarithmischen Darstellung von Gleichung (23) folgt für diesen Fall des nicht
fraktalen Wachstums Gleichung (100). Durch eine log-log Auftragung ist die Dimension des
kg,i�Rg
a�df= kh,i�Rh
R�df�R
a�df
kg
kh=��1,56 −�1,728 −df
2�2−0,228�df∗�2 + df
df�df2
⁄
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-63-
Wachstumsschrittes di die Steigung zwischen zwei Punkten, log(ki) ist der entsprechende
Achsenabschnitt eines Wachstumsschrittes, siehe Abbildung 24. Da die Agglomerationszahl N nur
ganze Werte annehmen kann und die Steigung bekannt ist, erfolgt anhand eines bekannten
Wertepaares �i�Rg
a�i
� � die vollständige Ausfüllung des Graphen.
Abbildung 24 dient der Veranschaulichung zur Berechnung der Vorfaktoren. Jedes Wertepaar kann
durch zwei Wachstumsgeraden beschrieben werden. Die erste Gerade entspricht dem
Wachstumsschritt, mit dem das Aggregat gebildet wurde. Dieser Wachstumsschritt erfolgte mit der
Steigung di. Die zweite Gerade entspricht dem sich anschließenden Wachstumsschritt mit ebenfalls
bekannter Steigung di+1.
Abbildung 24: Aggregatgröße und Aggregationsszahl im log-log-Plot. Die Aggregation lässt sich durch stufenweise
Wachstumsfunktionen beschreiben, für den Fall: df nicht konstant.
Mit Ausnahme für N = 1 gilt für jedes Wertepaar �i�Rg
a�i
� �:
(100)
und
(101)
Die Kombination beider Gleichungen (100) und (101) liefert die Reihenentwicklung des Vorfaktors
ki+1 aus ki, Gleichung (102).
log(i)= log(ki)+ di∗log �Rg
a�i
log(i)= log(ki+1)+ di+1∗log �Rg
a�i
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-64-
(102)
Hierbei sind alle Werte sowohl für di als auch für di+1, gemäß Gleichung (37), bekannt. Gleichung
(102) benötigt allerdings einen Startwert für ki um alle folgenden ki+1 zu berechnen. Ein
Wachstumsschritt zu i = 1 entspräche der Erschaffung eines Primärpartikels im leeren Raum,
ebenfalls ist Gleichung (102) für i = 1 nicht lösbar, da sowohl d1 als auch k1 unbekannt bleiben. Der
kleinste mögliche Wert der Agglomerationszahl ist i = 2. Der Wachstumsschritt zu i = 2 erfolgt
anhand des Wachstums vom Primärpartikel zum Dimer, vgl. Abbildung 24. Aufgrund der hohen
Symmetrie einer Vollkugel hat die Anlagerung einer zweiten Vollkugel keine Vorzugsorientierung,
das Wertepaar �2�Rg
a�2
� � ist somit festgesetzt. kg,2 resultiert aus Gleichung (100), der Wert für �Rg
a�2
wurde berechnet und beträgt �Rg
a�2= 1,263. Die Dimension des Wachstumsschrittes d2 berechnet
sich anhand Gleichung (37). Es folgt (103).
(103)
An dieser Stelle soll kurz auf den Wert k1 näher eingegangen werden. Wie im vorherigen Abschnitt
erwähnt wurde, ist dieser Wert nicht existent. Dennoch wird der Vorfaktor des hydrodynamischen
Wachstums kh,1 in Gleichung (97) explizit benötigt. Für den hydrodynamischen Radius des
Primärpartikels (N = 1) gilt, dass der Punkt �log 1 log �R𝐡
a�1
� � auf der Y-Achse liegt. Jede Gerade, die
durch diesen Punkt gelegt wird, besitzt denselben y-Achsenabschnitt log�kh,2�. Daher verläuft die
hypothetische Wachstumsgerade vom leeren Raum zum Primärpartikel ebenfalls durch diesen Punkt.
Für den Spezialfall i = 1 wird daher definiert kh,1≔ kh,2. Diese Überlegung gilt nicht für den
Trägheitsradius, da gilt log �Rg
a�1≠0, folglich liegt die Zuordnung des Primärteilchens nicht auf dem
y-Achsenabschnitt. Die Reihenentwicklung wird für den Trägheitsradius im Folgenden erst ab dem
Dimer berechnet.
Wie im vorherigen Kapitel erwähnt, unterlag Gleichung (97) der Annahme kh,i+1 kh,i
⁄= 1 sowie
kh,i+1 kh,1
⁄= 1. Die Reihenentwicklung des fraktalen Vorfaktors des Trägheitsradius lässt sich
entsprechend Gleichung (102) ebenso auf den hydrodynamischen Radius übertragen. Es gilt wie
bereits diskutiert kh,2= 1. Es folgen entsprechend Gleichung (102) alle Werte kh,i+1 kh,i
⁄ sowie
kh,i+1 kh,1
⁄. Diese korrigierten Werte lassen sich in Gleichung (97) erneut einsetzen und liefern die
Werte der ersten iterativen Näherung von di. Mit Excel wurde dieser iterative Schritt 10000-mal
wiederholt, das Ergebnis ist in Tabelle 6 dargestellt.
log(ki+1)= log(i)−di+1
di∗log �i
ki�
log(2)= log�kg,2�+ d2∗log ��Rg
a�2�
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-65-
Tabelle 6: Iterative Annäherung der Gleichung (102) in (97).
N
Startwerte
Iterative Näherung (10000 Schritte)
di
kh,i+1 kh,i
⁄
kh,i+1 kh,1
⁄
di
kh,i+1 kh,i
⁄
kh,i+1 kh,1
⁄
2 1,756 1,00 1,00 1,756 1,00 1,00
3
1,770
1,00
1,00
1,770
0,99
0,99
4
1,789
1,00
1,00
1,795
0,98
0,98
5
1,809
1,00
1,00
1,826
0,98
0,96
6
1,827
1,00
1,00
1,860
0,97
0,93
7
1,843
1,00
1,00
1,893
0,97
0,90
8
1,858
1,00
1,00
1,923
0,97
0,87
9
1,871
1,00
1,00
1,950
0,97
0,84
10
1,883
1,00
1,00
1,971
0,97
0,82
11
1,894
1,00
1,00
1,988
0,98
0,80
12
1,905
1,00
1,00
2,001
0,98
0,79
13
1,914
1,00
1,00
2,011
0,99
0,78
14
1,923
1,00
1,00
2,019
0,99
0,77
15
1,931
1,00
1,00
2,028
0,99
0,76
16
1,938
1,00
1,00
2,036
0,99
0,75
17
1,946
1,00
1,00
2,047
0,98
0,74
18
1,952
1,00
1,00
2,059
0,98
0,72
19
1,959
1,00
1,00
2,073
0,98
0,71
20
1,965
1,00
1,00
2,087
0,98
0,69
Anhand der Gleichungen (97) und (102) ergibt sich der komplette Verlauf der normierten
Trägheitsradien bei Aggregation der Probe. Die Werte wurden für eine Aggregatgröße bis N = 20 in
Tabelle 27 wiedergegeben. Die Werte nach Gmachowski, Gleichungen (37) und (39), wurden
ebenfalls berechnet. Zum Vergleich zu Cluster-Cluster Aggregation wurden die Werte aus
Simulationen für diffusionslimitierte Aggregate von Sorensen,74 Brasil118 und Wu119 herangezogen.
Diese Aggregate folgen einem fraktalen Wachstum der Form:
(104)
N = 1,19 ± 0,1 ∗�Rg
a�1,82±0,04
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-66-
4.2.3 Berechnung der Trägheitsradien kleiner definierten Aggregaten
Da im vorherigen Kapitel die Trägheitsradien von kleinen TC-Aggregaten berechnet wurden, sollen
nun ebenfalls die Trägheitsradien von kleinen, definierten Aggregaten hergeleitet werden, wie
beispielsweise einem vier-Teilchen-Cluster in linearer Anordnung im Vergleich zur kompakten
tetragonalen Anordnung. Die hieraus resultierenden Trägheitsradien dienen als Vergleich zu den
berechneten Trägheitsradien von TC-Aggregaten als Referenzpunkte.
Die Berechnung der Trägheitsradien soll kurz beschrieben werden: Der Trägheitsradius ist allgemein
durch Gleichung (105) definiert. Hierbei wird ein Objekt in n Massepunkte unterteilt, wobei jedem
Punkt ein Abstand zum Schwerpunkt Si zugeteilt werden kann.
(105)
Die Berechnung des Trägheitsradius von Aggregaten gelingt durch die
Einführung des Abstandes S
�
c, der Strecke vom Schwerpunkt des
Aggregates zum Schwerpunkt einer Untereinheit. Es folgt Gleichung
(106) bzw. für die Summe des Quadrats ∑S
�
i2
ni Gleichung (107).
(106)
(107)
Da bei der Summe ∑S
�
ci
nci alle Vektoren vom Masse-Schwerpunkt ausgehen folgt: ∑S
�
ci
nci = 0. Durch
Einsetzen von (107) in (105) berechnet sich der Trägheitsradius des Aggregates als Ausdruck des
Trägheitsradius der Untereinheiten und des Abstands der Untereinheiten vom Schwerpunkt.
(108)
Diese berechneten Werte sollen im Folgenden als Referenzpunkte dienen. Es ist zu erwarten, dass
keine Aggregate existieren können, welche „lockerer“ als eine lineare Anordnung bzw. „dichter“ als
eine Dichtestpackung vorliegen.
Rg2=1
n�S
�
i2
ni
S
�
i= S
�
c+ S
�
ci
�S
�
i2
ni=�S
�
c2
nc+�S
�
ci2
n
ci + 2 �S
�
c
nc∙�S
�
ci
n
ci
Rg2=1
n�S
�
c2
nc+1
n�S
�
ci2
n
ci = RZentren
2+ Rg,Kugel
2
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-67-
Tabelle 7: Berechnung der Trägheitsradien definierter Strukturen. a=Radius; l=Kantenlänge. Es gilt l=2a.
Agglomerationszahl
Anordnung
Umkugelradius
R2
Zentren
R
g
2
R
g
/a
1
-
-
0 R
h
2
0,6 R
h
2
0,775
2
Linear
-
1 R
h
2
1,6 R
h
2
1,263
3
Triangel
l/3 ∙√3
4/3 R
h
2
1,93 R
h
2
1,39
(3-linear) Linear - 8/3 Rh2
3,267
Rh2 1,80
4
Tetraeder
l/4 ∙√6
1,5 R
h
2
2,1 R
h
2
1,45
(4-linear)
Linear
-
5 R
h
2
5,6 R
h
2
2,36
8
Oktaeder
l/2 ∙√2
2 R
h
2
2,6 R
h
2
1,61
12 Ikosaeder
l/4 ∙�10 + 2√5
3,62 Rh2 4,22 Rh2 2,05
10
1 Kern+9 Satelliten
l
36/10 R
h
2
4,2 R
h
2
2,04
11
1 Kern+10 Satelliten
l
40/11 R
h
2
4,23 R
h
2
2,05
12
1 Kern+11 Satelliten
l
44/12 R
h
2
4,27 R
h
2
2,07
13
1 Kern+12 Satelliten
l
48/13 R
h
2
4,29 R
h
2
2,07
4.2.4 Zusammenfassung und Diskussion
Alle hier berechneten Werte wurden in Abbildung 25 durch einen log-log Plot dargestellt. Zum
Vergleich dieser Werte wurden ebenfalls die Trägheitsradien der kleinen definierten Aggregate
berechnet. Die Ergebnisse können Tabelle 7 entnommen werden. Diese definierten Strukturen
repräsentieren die Grenzen innerhalb derer die Trägheitsradien sinnvolle Werte darstellen. Folglich
dürfen die berechneten Trägheitsradien einer gegebenen Aggregationszahl nicht kleiner sein als die
entsprechenden Trägheitsradien einer Dichtestpackung bzw. nicht größer sein als die einer linearen
Anordnung.
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-68-
Abbildung 25: Berechnetes Wachstum der Trägheitsradien für die Dichtespakungen von Aggregaten eines Trimers, Tetramers und Oktamers, für eine lineare Anordnung, für
den Stufenwachstum von Teilchen-Cluster Aggregaten berechnet nach „Dissertation Thomas Lang 2014“ sowie nach „Gmachowski 2002“ und für fraktale Cluster-Cluster
Aggregate anhand Simulationen.
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-69-
Die berechneten Werte von Gmachowski zeigen anfangs einen flachen Verlauf, bevor die Kurve bei
einer Aggregationszahl von N = 12 kompaktere Aggregate aufweist als in der vorliegenden Arbeit
berechnet wurden. Bei der Berechnung nach Gmachowski ist auffällig, dass bis zu einer
Aggregationszahl von N = 3 zu lockere Aggregate berechnet wurden. Diese müssten noch
ausgedehnter vorliegen als eine lineare Anordnung von Einzelteilchen.
Die in dieser Arbeit berechneten Werte des Trägheitsradius nach Gleichungen (37) und (102) liegen
komplett zwischen den aufgezeigten Grenzen der linearen und der kompakten Anordnung der
Aggregate. Die berechneten Werte verlaufen mit etwas kompakteren Werten dicht entlang eines
fraktalen Wachstums von Cluster-Cluster Aggregaten aus Simulationen. Für N = 4,5 und 6 wurden
Dimension des Wachstumsschrittes von df= 1,82 ± 0,04 berechnet. Diese tangieren den Verlauf der
fraktalen Cluster-Cluster Wachstumsfunktion mit einem fraktalen Vorfaktor von kg = 0,11.
Die beobachteten Verläufe der Funktionen der Teilchen-Cluster Aggregate (TCA) sowie der Cluster-
Cluster Aggregate (CCA) lassen sich qualitativ durch die Skaleninvarianz fraktaler Objekte
begründen: Es bedeutet, ein fraktales Objekt sieht immer gleich aus, unabhängig davon ob man es
vergrößert oder verkleinert. Fraktale Untereinheiten sind sich selbst ähnlich. Die Folge ist, dass die
Untereinheiten der Cluster-Cluster Aggregate aus Clustern mit identischem fraktalem Vorfaktor sowie
identischer fraktaler Dimension bestehen müssen. Teilchen-Cluster Aggregate weisen erst für große
Agglomerationszahlen eine fraktale Struktur auf,73 folglich ist zu erwarten, dass solche Aggregate in
einer log-log Auftragung für die hier gezeigten Agglomerationszahlen N < 20 von einem linearen
Wachstum abweichen. Cluster-Cluster Aggregate hingegen sind skaleninvariant, dies bedingt den
linearen Verlauf des Aggregatwachstums in der log-log Auftragung. Dieser lineare Verlauf ist
allerdings erst gültig ab einer Aggregatgröße von N > 10 .74
Es stellt sich die Frage, woraus die Untereinheiten der CCA mit N~10 bestehen. Anhand von
Abbildung 25 wird ersichtlich, dass TCA mit einer Größe von N~ 4 bis 6 mit identischer fraktalen
Dimension anwachsen sowie einen ähnlichen fraktalen Vorfaktor aufweisen wie CCA. Es liegt die
Vermutung nahe, dass die Untereinheiten der CCA eine hohe Selbstähnlichkeit zu den TCA mit N~ 4
bis 6 aufweisen. Demzufolge bestünden kleine Cluster-Cluster Aggregate aus (Teilchen-Cluster)-
(Teilchen-Cluster) Aggregaten mit einer gemittelten Größe der TCA von N~ 4 bis 6. Die berechneten
TCA Werte sind im Vergleich zu den simulierten CCA Werte etwas kompakter, da sie „links-
verschoben“ vorliegen. Dennoch liegen alle Werte innerhalb des von Sorensen, Wu und Brasil
bestimmten Grenzen, siehe Gleichung (104).
Es muss angemerkt werden, dass die hier abgebildeten Wachstumsfunktionen für Aggregate die
zugrundeliegende Statistik des Aggregationsprozesses vollständig ignorieren, indem sie für jede
Agglomerationszahl einen definierten Trägheitsradius darstellen. Tatsächlich liegen bei gegebener
Entwicklung von Methoden zur Charakterisierung von Aggregaten
___________________________________
-70-
Agglomerationszahl immer Größenverteilungen zugrunde. Dies wird beispielsweise bei der
Beschreibung von diffusionslimitierten CCA der Simulationen nach Sorensen ersichtlich.74 Abbildung
26 zeigt eine Auftragung der Agglomerationszahl N gegen den Trägheitsradius. Die ermittelte Gerade
der Steigung df= 1,78 beschreibt einen Mittelwert bei gegebener Agglomerationszahl.
Abbildung 26: Simulationen des Trägheitsradius bei Diffusionslimitierter Cluster-Cluster Aggregation nach Sorensen.74
Weiterhin wurden in den zugrundeliegenden Veröffentlichungen von Gmachowski Annahmen
getroffen, die kritisch hinterfragt werden sollten. Beispielsweise bezieht sich das Modell zur
Berechnung der Kollisionsradien auf fraktale Objekte. Dennoch wurde dieses Modell auf Teilchen-
Cluster Aggregate angewandt, die vor allem bei kleinen Agglomerationszahlen keine fraktale Struktur
aufweisen. Ebenso wurde in Gleichung (32) angenommen, dass zwei kollidierende Aggregate der
Größe i und j ein identisches Verhältnis von Kollisionsradius zu hydrodynamischen Radius aufweisen.
Sofern beide fraktale Aggregate eine identische Raumausfüllung sowie fraktale Dimension aufweisen
kann diese Annahme plausibel sein, für TCAs ist diese Annahme falsch. Ein einzelnes Teilchen besitzt
einen Kollisionsradius entsprechend dem hydrodynamischen Radius, dies ist unabhängig von der
Raumausfüllung des Agglomerationspartners Rc,1
Rh,1≠Rc,j
Rh,j.
Zusammenfassend stellen die von Gmachowski erarbeiteten Grundlagen zum fraktalen Wachstum, ein
stark vereinfachtes Modell dar. Dieses beinhaltet die empirische Erfassung der Raumausfüllung in
Abhängigkeit der fraktalen Dimension sowie die Einführung von Kollisionsradien in Abhängigkeit
dieser genannten Raumausfüllung. Durch das Vernachlässigen des fraktalen Vorfaktors resultierte ein
fragwürdiger Verlauf der Trägheitsradien mit ausgedehnteren Aggregaten als es ein 1-Dimensionales
Wachstum darstellt. Die in der vorliegenden Dissertation erarbeitete Korrektur der Berechnung
unterliegt immer noch einigen Annahmen von Gmachowski, jedoch ist das Ergebnis plausibel und
lässt sich sehr simpel ausdrücken: Die Wachstumsfunktion der Aggregate beschreibt ab dem Dimer
eine stetige Zunahme der Fraktalen Dimension von df= 1,75 auf df= 1,83, so dass sich das
Wachstum bei einer Aggregatgröße von N = 5 dem einer Cluster-Cluster Aggregation annähert.
Modellentwicklung zum nicht-fraktalen Wachstum von Aggregaten
___________________________________
-71-
5 Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
Das DFG-Schwerpunktprojekt SPP1313, Biological Responses to Nanoscale Particles, untersucht
„grundlegende Wechselwirkungsprozesse zwischen Nanopartikeln und biologischen Systemen auf der
zellulären und molekularen Ebene“.120 Es ergeben sich Fragestellungen, die innerhalb des
Schwerpunktprojekts in drei interdisziplinäre Forschungsfelder gegliedert werden:
- Herstellung und Charakterisierung von Nanopartikeln
- Der Übergang von Nanopartikeln in die biologische Umwelt und ihre Interaktionen mit dieser
- Der Einfluss von Nanopartikeln auf grundlegende biologische Funktionen
Durch zusätzliche Untergliederung lassen sich anhand eines Flussdiagramms die Verknüpfungsstellen
erkennen. Abbildung 27 zeigt den Inhalt einzelner Forschungsschwerpunkte sowie deren
Abhängigkeiten und verdeutlicht den interdisziplinären Charakter des Forschungsprojektes.
Abbildung 27: Forschungsschwerpunkte innerhalb des SPP1313 und deren Verknüpfungspunkte.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-72-
In diesem Kapitel soll auf die Charakterisierung kolloidaler Teilchen eingegangen werden,
insbesondere in Gegenwart biologisch relevantener Medien. Die untersuchten Nanopartikel weisen
hohe Relevanz für biomedizinische Anwendungen auf. Die untersuchten Partikel sind:
- aus der Laser-Ablation stammende, stabilisatorfreie Legierungs-NP die bei Implantatabrieb
auftreten können
- großtechnisch hergestellte Silica NP, die alltäglichen Produkten beigemengt werden
- im Labormaßstab synthetisierte, multifunktionelle Poly(organosiloxan) NP mit potentieller
medizinischer Anwendung.
Im Hinblick auf Zellversuche wurden die Partikel in RPMI 1640 Zellmedium, sowie unter Zusatz von
fetalem Rinderserum (FCS), welches als Modell für proteinhaltige Umgebung diente, untersucht.
5.1 NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-
Legierungen
Die gepulste Laser-Ablation in Flüssigkeiten (PLAL) ermöglicht die Darstellung von Nanostrukturen
direkt aus dem Festkörper. Hierbei wird eine in Flüssigkeit vorliegende Metalloberfläche mit einem
Laser mit Energiedichten von 108 bis 1010 W/cm2 bestrahlt. Abhängig von Energiedichte und
Pulsdauer entstehen Plasma, Dämpfe oder nano- bis mikrometergroße Metalltropfen, die mit der
umgebenen Flüssigkeit Nanopartikel formen.121 Die größenkontrollierte Synthese gelingt durch
Anpassung der Laser-Parameter wie Wellenlänge, Energiedichte und Pulsdauer.122
Im Gegensatz zu herkömmlichen NP-Syntheserouten benötigt die PLAL keine Vorstufen oder
Additive, die an der Oberfläche adsorbieren. Dies ist besonders für Folgereaktionen der NP relevant,
da diese Oberflächenbelegung die weitere Funktionalisierung erschwert.123,124,125 Für die Anwendung
in der Biologie oder Medizin können somit NP auch ohne Liganden oder Stabilisatoren hergestellt
werden. Die Vorteile liegen in der Erzeugung des reinen Materials in Nanometermaßstab. Die
Wechselwirkungsprozesse zwischen Nanopartikeln und biologischem System werden nicht durch
einen Stabilisator verfälscht, der die Cytotoxizität bei biologischen Anwendungen stark beeinflusst.126
Allerdings führt die Abwesenheit eines Stabilisators während der Darstellung zu breiten
Größenverteilungen.121
NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen
___________________________________
-73-
5.1.1 Charakterisierung von Legierungs-NP
Die in dieser Arbeit verwendeten Legierungen wurden von der Arbeitsgruppe von Prof. Stephan
Barcikowski an der Universität Duisburg-Essen mittels PLAL in Abwesenheit von Stabilisatoren
hergestellt. Diese bestanden aus: AuAg, NiTi und CoCrWNiFeMn. Die Proben dienen zur Simulation
von Implantatabrieb, der im menschlichen Körper bei mechanischer Beanspruchung solcher
Ersatzteile stattfindet. Abbildung 28 zeigt TEM Aufnahmen dieser NP-Legierungen. Die Durchmesser
der Partikel lagen zwischen 2 und 60 nm. Eine quantitative Größenauswertung der TEM-Abbildungen
gestaltete sich jedoch als schwierig, da eine Größenverteilung dieses Ausmaßes nur stichprobenhaft
erfasst wurde. Die gezeigten Bilder erlaubten eine nur sehr grobe Größen- und
Verteilungseinschätzung, die Funde waren: kolloidal und kleiner als 60 nm.
Abbildung 28: a), b), c) Ergebnis der Mehrwinkel DLS von NP-Legierungen mit linearer Regression der
Winkelabhängigkeit. d), e), f) TEM Aufnahmender Legierungen der Reihenfolge entsprechend: AuAg, NiTi und
CoCrWNiFeMn.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-74-
Die Partikel wurden zusätzlich mit der dynamischen Lichtstreuung in wässrigem Medium ohne Zusatz
von Salzen vermessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 zusammengefasst. Die gemessenen
hydrodynamischen Radien ergaben 60 nm für AuAg, 62 nm für CoCrWNiFeMn und 64 nm für NiTi-
Partikel. Ebenso wurden die µ2-Werte bei 90° ermitelt, als Maß für die Polydispersität. Diese zeigten
für alle Proben Werte von 0,08 - 0,09. Es kann angenommen werden, dass Proben mit µ2-Werten
kleiner als 0,05 annähernd monodispers sind. Werte größer als 0,2 sind so breit verteilt, dass ein
Kumulantenfit zur Beschreibung der Autokorrelationsfunktion nicht mehr geeignet ist. Die
Autokorrelationsfunktion muss für diesen Fall als bimodale oder trimodale Größenverteilung
beschrieben werden.
Eine Verfälschung der DLS Messung durch Lichtadsorption der Probe wird ausgeschlossen: Die
Stammlösungen der Proben waren leicht gefärbt, jedoch würde bei Lichtadsorption der Probe eine
lokale Erhitzung des Lösemittels erfolgen.127 Die Verfälschungen einer DLS Messung durch
Lichtadsorption der Probe ist eine direkte Folge dieser lokalen Erwärmung. Es folgen Oszillationen
innerhalb der Korrelationsfunktion durch Konvektionsströme in der Streuküvette sowie eine niedrige
Gesamtamplitude in g1 aufgrund verringerter Laserintenistät bei Lichtadsorption und durch
Aufweitung des Laserstrahls aufgrund des Effekts der „thermischen Linse“. Vor allem in organischen
Lösemitteln wie beispielweise in Benzol spielen diese Prozesse eine größere Rolle als in Wasser. Die
Wärmekapazität von Benzol ist mit einem Wert von Cp = 1,7 kJ/kgK um einen Faktor von 2,5
niedriger als der von Wasser mit einem Wert von Cp =4,2 kJ/kgK. Ebenfalls ist die Konvektion durch
lokales Erhitzen aufgrund des geringeren Volumenausdehnungskoeffizienten von Wasser mit
g = 0,2*10-3 K-1 im Vergleich zu Benzol mit einem Wert von g = 1,2*10-3 K-1 vermindert. Es konnte
bei der DLS Messung der Legierungs NP in Wasser weder eine Aufweitung des Strahls, Oszillationen
in g1 noch ein schwaches Korrelationssignal beobachtet werden.
Bei den aus der DLS stammenden hydrodynamischen Radien handelt es sich um 〈Rh〉1/z-Mittelwerte.
Wie zu erwarten fallen 1/z-Mittelwerte größer als Zahlenmittelwerte aus. Es wurden daher
grundsätzlich größere Radien in der DLS gemessen, als sie im TEM im zahlenmäßigen Durchschnitt
beobachtet wurden. Die TEM Abbildungen zeigten jedoch eine Größenverteilung der Durchmesser
von 2 nm bis 60 nm (Radien von 1 nm bis 30 nm), während gemittelte Radien in der DLS größer als
60 nm gefunden wurden. Diese Diskrepanz der Größe der Partikel lässt sich nicht vollständig durch
die 1/z-Mittelwertsbildung der DLS erklären.
Die Autokorrelationsfunktion fiel mit µ2-Werten von 0,08 ebenso unerwartet schmal aus, entsprechend
waren die gemessenen Radien in der DLS enger verteilt als diejenigen aus den TEM-Abbildungen.
Auch wenn kleine Partikel nur sehr gering ins Gewicht fallen, sollten sie den Verlauf der
Autokorrelationsfunktion bei kurzen Relaxationszeiten prägen. Relaxationszeiten von 2 -10 nm großen
Partikel, wie sie im TEM zu sehen waren, konnten in der DLS nicht beobachtet werden.
NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen
___________________________________
-75-
Aggregation von stabilisatorfreien Legierungs-NP konnten bereits an Gold NP nach zweitätiger
Lagerung nachgewiesen werden. Hierbei wurden Gold NP sowohl in Milli-Q-Wasser als auch in
wässriger 0,2 mM Natriumphosphatlösung (NaPP) hergestellt und mittels AF-FFF
größencharakterisiert. Das entsprechende Elugramm ist in Abbildung 29 dargestellt. Die Anwesenheit
von Natriumphosphat führt zu einer zusätzlichen Stabilisierung der NP, da sich bei asymmetrischen
Salzen Anionen und Kationen relativ zueinander ungleich in der elektrischen Doppelschicht
anreichern.25 Das AF-FFF Elugramm der phosphat-stabilisierten NP zeigt eine breite asymmetrische
Bande, welche auf Partikel-Membran Wechselwirkungen hindeuten kann, aber auch durch die
Größenverteilung der Probe bedingt sein kann. Sofern die Gold NP in Wasser ohne Phosphatzusatz
hergestellt und gelagert wurden, kann eine niedrigere Bande der primären Partikel beobachtet werden
sowie eine Schulter und ein „Tailing“ zu längeren Elutionszeiten hin. Dies deutet auf eine
geringfügige Aggregation der stabilisatorfreien Gold NP, welche bereits nach zweitätiger Lagerung
eintrat.
Abbildung 29: AF-FFF Elugramm von Gold NP, welche mittels Laser Ablation in Milli-Q-Wasser (blau) sowie in Gegenwart
von 0,2 mM Natriumphosphat (rot) hegestellt und zwei Tage gelagert wurden. Spacer 350µm, Querfluss 1 mL/min,
Detektorfluss 1 mL/min.
Eine mögliche Erklärung der zu großen hydrodynamischen Radien der NiTi-, AuAg-, und
CoCrWNiFeMn-NP aus DLS-Messungen im Vergleich zu den TEM-Messungen könnte daher
ebenfalls Aggregation der Proben sein. Da diese gezielt ohne Stabilisator hergestellt wurden, sind die
NP ausschließlich elektrostatisch stabilisiert. ζ-Potentialmessungen ergaben ζ-Potentiale in Milli-Q-
Wasser von -25 bis -32 mV. Diese sind in Tabelle 8 zusammengefasst. Partikel mit Beträgen des
Potentials größer 20 mV können allgemein als stabil erachtet werden. Es handelt sich allerdings
hierbei um eine kinetische Stabilisierung. Da die NP nicht auf direktem Wege von der Universität
Duisburg-Essen bezogen wurden, sondern über das Institut für Arbeits-, Sozial- und Umweltmedizin,
nach dortiger mehrmonatiger Lagerung, ist eine Alterung der Probe sehr wahrscheinlich. Somit
würden die TEM Bilder die Größen der einzelnen Partikel abbilden, während die von der DLS
erfassten hydrodynamischen Radien ebenso von Aggregaten geprägt sind.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-76-
5.1.2 Charakterisierung von Legierungs-NP in RPMI Medium
Die in dieser Arbeit untersuchten NP-Legierungen zeigten sowohl in Milli-Q-Wasser, als auch in
Gegenwart von 5 mM NaCl negative ζ-Potentiale von -25 bis -32 mV und können daher unter diesen
Bedingungen als elektrostatisch stabilisiert erachtet werden. In Gegenwart von RPMI 1640 Medium
stiegen die Potentiale allerdings auf bis zu -15 mV der AuAg-, auf -14 mV der CoCrWNiFeMn- und
auf -12 mV im Falle der NiTi-NP-Legierungen an, vergleiche Tabelle 8. Der Grund liegt in der
erhöhten Salzkonzentration des RPMI 1640-Mediums. Hierdurch werden die Oberflächenladungen an
der Partikeloberfläche abgeschirmt, wodurch ebenso der Betrag des ζ-Potentials sinkt und damit auch
die interpartikulären abstoßenden Kräfte. Im Allgemeinen sind kolloidale Dispersionen mit Beträgen
der ζ-Potentiale niedriger als 20 mV lediglich schwach stabilisiert, sofern deren Stabilisierung
ausschließlich elektrostatischer Natur ist.
Tabelle 8: ζ-Potentiale der Anorganischen NPs in Gegenwart von Wasser, 5mM NaCl Lösung und in RPMI 1640 Medium.
Die Messung erfolgte mit einem Malvern Zetasizer.
ζ-Potential
in H2O
in 5mM NaCl
in RPMI
ζ-Potential
Signalbreite
Signalbreite
Signalbreite
ζ-Potential
Signalbreite
AuAg
-31 mV
±9mV
-30 mV
±12 mV
-15 mV
±22 mV
NiTi
-32 mV
±10mV
-29 mV
±11 mV
-12 mV
±24 mV
CoCrWNiFeMn
-25 mV
±9 mV
-25 mV
±11 mV
-14 mV
±32 mV
Das Resultat der verringerten elektrostatischen Stabilisierung in Gegenwart des RPMI 1640-Mediums
spiegelte sich in den Messungen der hydrodynamsichen Radien wider. In Tabelle 9 wurden die
Ergebnisse der DLS zusammengefasst. Sowohl für AuAg- als auch für NiTi-NP zeigte sich ein
Zuwachs des hydrodynamischen Radius auf entsprechend 125 nm bzw. 223 nm. Zugleich konnte ein
erhöhter µ2-Wert gemessen werden, der auf eine breitere Größenverteilung im Vergleich zu den in
Wasser vorliegenden Proben schließen lässt. Beide Befunde lassen auf die Aggregation der Proben
aufgrund der Verringerung der repulsiven elektrostatischen Kräfte zurückschließen. NiTi bildete
hierbei größere Aggregate, deren hydrodynamische Radien in der Messung wahrscheinlich durch die
Filtergrenze von 450 nm im Durchmesser limitiert wurden.
Im Vergleich hierzu erzielte die Probe CoCrWNiFeMn ein anderes Ergebnis. In Gegenwart von
RPMI-Medium wurde ein um 7% kleinerer hydrodynamischer Radius als in salzfreier Umgebung
gemessen. Ebenso war der µ2-Wert nicht merklich erhöht. Im Gegensatz zu den AuAg- bzw. NiTi-NP
scheint die Probe trotz abgeschwächter elektrostatischer Stabilisierung nicht zu aggregieren. Die
Abnahme des Radius um 4 nm ist durch einen erhöhten Messfehler zu erklären, da alle Proben stark
schwankende Streuintensitäten zeigten, wodurch die Basislinie der Autokorrelationsfunktion nicht
immer auf Null abfiel. Der zugehörige Effekt "partielles heterodyning" wird im folgenden Kapitel
disutiert. Der hierdurch verursachte Fehler wird auf bis zu 10% abgeschätzt.
NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen
___________________________________
-77-
Tabelle 9: Hydrodynamische Radien der Anorganischen NPs in Gegenwart von Wasser und in RPMI 1640 Medium.
DLS
in H2O
in RPMI
Rh /nm
µ2
Rh /nm
µ2
AuAg
60,2
0,08
125
0,13
NiTi
64,2
0,08
223
0,14
CoCrWNiFeMn
62,3
0,09
58
0,1
Das unterschiedliche Verhalten der Proben AuAg und NiTi im Vergleich zur Probe CoCrWNiFeMn
lässt sich nicht ausschließlich durch das Absenken der elektrostatisch repulsiven Kräfte erklären, da
alle Proben ähnliche ζ-Potentiale aufwiesen, vergleiche Tabelle 8. Das Absenken der elektrostatischen
Potentialbarriere VT beeinflusst zunächst die Geschwindigkeit mit der die Koagulation stattfindet,
siehe Gleichung (17) und (20). ζ-Potentiale von -14 mV der CoCrWNiFeMn-NP bedeuten nicht, dass
schnelle Koagulation (bei Abwesenheit abstoßender Kräfte, VT < 0) stattfindet. Vielmehr muss an
dieser Stelle auf die Anwesenheit von Sekundäreffekten hingewiesen werden, ausgehend von der
Partikelform, einer ungleichmäßigen Ladungsverteilung, Verunreinigungen und Alterungsprozesse,
die für eine zusätzliche Destabilisierung verantwortlich sind.25 Das Ausmaß dieser Sekundäreffekte
unterscheidet sich bei allen Proben und kann nur schwer erfasst werden. Wie die Probe
CoCrWNiFeMn zeigt, reicht die Verminderung der elektrostatischen Stabilisierung durch den hohen
Salzgehalt in RPMI-Medium nicht aus um die Proben in dem Zeitfenster von Probenpräparation bis
Messung (etwa 10 Minuten) nachweislich zu aggregieren. Das Aggregationsverhalten der Proben
AuAg und NiTi muss daher durch Sekundäreffekte erklärt werden.
Fehlerdiskussion bei partiellem Heterodyning
Einige der diskutierten Messungen zeigten Intensitätsschwankungen aufgrund sedimentierender sehr
großer Teilchen im Streuvolumen. Reflektionen des primären Laserlichtes an solch großen Teilchen
erzeugt Störlicht, welches sich mit der eigentlichen Korrelation überlagert. Dieser Effekt wird als
„partielles Heterodyning“ bezeichnet und kann die Messung verfälschen. Im Folgenden soll der Effekt
des "partiellen Heterodynings" beschrieben werden und die Größe eines solchen Fehlers auf die
eigentliche Messung abgeschätzt werden.
Partielles Heterodyning entsteht durch Überlagerung des gestreuten Primärlichtes mit korrelierendem
Streulicht einer zweiten Lichtquelle. Dies erzeugt entweder einen biexponentiellen Verlauf von g1
oder, bei sehr langsamen Relaxationszeiten eine Basisline B. Tatsächlich wird in der dynamischen
Lichtstreung nicht g1 gemessen, sondern g2. Im Falle einer Basisline muss daher das gemischte
binomische Produkt beachtet werden:
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-78-
(109)
In Gleichung (109) wird ersichtlich, dass durch das gemischte binomische Produkt ein zusätzlicher
exponentieller Term gemessen wird, in dem die Amplitude der Basislinie mit eingeht. Dieser
zusätzliche Term würde in g1 eine Amplitude von √2AB besitzen und eine doppelt so große
Abklingrate aufweisen. Korrelationsfunktionen mit einem Größenunterschied um einen Faktor von
zwei separieren nicht, sondern überlappen. Abhängig von dem Amplitudenanteil der Basisline würden
gemittelt bis zu doppelt so großen hydrodynamische Radien gemessen, wie sie tatsächlich vorhanden
sind. In diesem Falle berechnet sich der reziproke gemittelte hydrodynamische Radius 1/〈Rh〉 aus der
Amplitudengewichtung gemäß Gleichung (110).
(110)
Zusätzlich wurde angenommen, dass die Gesamtamplitude g1,τ=0 nicht notwendigerweise gleich 1
sein muss. Durch das Verhältnis g1,τ=0
2= A2+2AB + B2 sind alle Amplituden in Gleichung (110)
festgesetzt.
Hieraus berechnen sich die apparenten Größenzunahmen, welche in Tabelle 10 zusammengefasst sind.
Im Falle des partiellen Heterodynings ergeben sich schon früh relativ hohe Fehler im ermittelten
Radius, auch ohne merklich erhöhte Basisline. Eine Basisline von 0,02 beispielsweise kann bei der
Auswertung sehr leicht übersehen werden, der Fehler des Ergebnisses beträgt allerdings schon 10%.
Tabelle 10: Faktoren des apparenter Größenzuwachses des hydrodynamischen Radius bei partiellem Heterodyning in
Abhängigkeit der Basisline B.
Apparenter
Größenzuwachs
Gesamtamplitude von g
1
(entspricht g1,τ=0)
1
0,9
0,8
0,7
Basisline B
0
+0%
+0%
+0%
+0%
0,02
+9%
+10%
+10%
+11%
0,05
+14%
+15%
+15%
+16%
0,1
+19%
+20%
+21%
+22%
0,15
+23%
+24%
+25%
+27%
0,2
+26%
+27%
+29%
+31%
g2(τ)−1 = �g1(τ)�2=�A∗exp �−τ
τ
D
�+ B�2=
= A
2
∗exp �−
τ
12
� ∗τD�+2AB ∗exp �−
τ
τD�+ B
2
1
〈Rh〉=
A∗1
Rh+√2AB ∗1
2Rh
A + √2AB
NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen
___________________________________
-79-
Die zuvor vermessenen Proben aus der Laser-Ablation zeigten Intensitätsschwankungen aufgrund
sedimentierender großer Teilchen. Messungen mit erkennbaren Basislinien wurden zwar verworfen,
Tabelle 10 zeigt allerdings einen schon sehr ausgeprägten Effekt bei Basislinien kleiner 0,05. Da für
Messungen typische Gesamtamplituden bei etwa 0,9 lagen und Messungen mit Basislinien von 0,02
nicht verworfen wurden, muss nach Tabelle 10 für die in diesem Kapitel charakterisierten Proben ein
Fehler von bis zu 10% angenommen werden.
5.1.3 Charakterisierung von Legierungs-NP in RPMI Medium in Gegenwart von
Serumproteinen
Im Hinblick auf Zellversuche wurden die Proben ebenso in Gegenwart von Serumproteinen
größencharakterisiert. Hierzu wurden DLS-Messungen in RPMI 1640-Medium in Gegenwart von
1 Vol.-%, 5 Vol.-% und 10 Vol.-% fötalem Rinderserum (FCS) durchgeführt. Da sich die
Korrelationsfunktionen der Serumproteine mit der Korrelationsfunktion der Nanopartikel überlappten,
wurde eine Multikomponentenanalyse nach Rausch et al. 2010 durchgeführt.128
DLS Multikomponentenanalyse
Bei der Multikomponentenanalyse wurde die Korrelationsfunktion der Nanopartikel von der Funktion
der Serumproteine separiert. Als Referenz diente die winkelabhängige DLS von fötalem Rinderserum
(FCS) in RPMI Medium. Aufgrund der breiten Größenverteilung von Serumproteinen stellten sich
eine monoexponentiell abfallende, sowie eine biexponentiell abfallende Anpassung an g1 als
ungeeignet heraus. Die Autokorrelationsfunktionen wurden daher als triexponentiell abfallende
Funktion beschrieben:
(111)
mit A, B und C, den Amplituden der Einzelkomponenten und τD,i= 1/Diq2 den Relaxationszeiten der
einzelnen Komponenten. Für alle gemessenen Winkel konnte die Korrelationsfunktion von FCS in
RPMI in drei Komponenten zerlegt werden. Abbildung 30 zeigt eine solche Zerlegung von g1 bei 90°.
Für die eigentlichen Messungen zur Größenbestimmung der Nanopartikel wurde mit dem Unterschied
verfahren, dass in Gleichung (111) die Relaxationszeiten τD,2 und τD,3 nicht variabel sondern als
Parameter angenommen wurden. Als Werte für τD,2 und τD,3 wurden die zuvor ermittelten Größen der
Korrelationsfunktion von FCS festgesetzt, die sich in der Mischung aus NP und Serumproteinen
g1(τ)= A ∗exp �−τ
τD,1�+ B ∗exp �−τ
τD,2�+ C ∗exp �−τ
τD,3�
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-80-
wiederfinden sollten. Die Relaxationszeit τD,1 wurde angefittet und beschreibt die Korrelation der NP,
diese wird allerdings noch durch die dritte Komponente in FCS überlagert.
In der dynamischen Lichtstreuung separieren sich zwei Autokorrelationsfunktionen erst ab einem
Faktor von etwa fünf voneinander. Die dritte Komponente in FCS, τD,1, konnte daher nicht von der
Korrelation der NP abgegrenzt werden, da diese Relaxazionszeit mit einem entsprechenden
hydrodynamischen Radius von 60 nm zu dicht an der eigentlichen Größe der NP lag.
Abbildung 30: Autokorrelationsfunktion bei Ɵ=90°. Links: 5% FCS/RPMI. Rechts: 1% NiTi-NP in 5% FCS/RPMI. Die
Autokorrelationsfunktionen wurden in jeweils drei Komponenten zerlegt um die Korrelation der Nanoparikel isoliert zu
betrachten.
Als Ergebnis lässt sich mittels Multikomponentenanalyse die Korrelation der NP erfassen, welche in
Gegenwart von Serumproteinen vorliegen. Anhand einer winkelabhängigen Auftragung der
Diffusionskoeffizienten gelingt in gleicher Weise zu herkömmlichen DLS Messungen die
Extrapolation gegen 𝑞2= 0.
Ergebnisse der Größencharakterisierung in Gegenwart von Serumproteinen
Fötales Rinderserum (FCS) weist einen Proteingehalt zwischen 38 g/L bis 50 g/L auf.129,130,131,132 Der
genaue Proteingehalt des Serums wurde von Christoph Bantz bestimmt und betrug 47,8 g/L, sodass
die Konzentration an Proteinen während des Versuches 0,48 g/L, 2,4 g/L sowie 4,8 g/L betrug.
Zusätzlich wurde die Konzentration der Nanopartikel variiert. In Tabelle 11 bezeichnet cinj. die
Konzentration mit der Nanopartikel dem Medium zugegeben wurden. Hierbei wurde 1 Volumenanteil
der Nanopartikel zu 9 Volumenanteilen Medium gegeben. Es fand folglich eine Verdünnung von 1/10
statt, die resultierende Konzentration ist als c0 angegeben.
NP-Legierungen aus der LASER-Ablation: AuAg-, NiTi-, CoCrWNiFeMn-Legierungen
___________________________________
-81-
Tabelle 11: Hydrodynamische Radien ermittelt durch die winkelabhängige dynamische Lichtstreuung. Die Radien der NP in
Gegenwart von 1%, 5%, und 10% FCS wurden mit Hilfe der Multikomponentenanalyse ausgewertet. Werte in kursiv können
durch partielles Heterodyning verfälscht sein. Dieser Fehler wird auf bis zu +10% apparenter Größenzuwachs abgeschätzt.
DLS
cinj. /
µg/mL
c0 /
µg/mL
in H
2
O
in RPMI
in RPMI
+1% FCS
in RPMI
+ 5% FCS
in RPMI
+ 10% FCS
Rh /nm
µ2
Rh /nm
µ2
Rh/nm
Rh/nm
Rh/nm
AuAg
10
1
60,2
0,08
125
0,13
77
63
50
5
84
82,6
83,2
100
10
89,3
96,2
NiTi
10
1
64,2
0,08
223
0,14
83
82,7
50
5
86
89,3
86,8
100
10
95,4
95,5
CoCrWNiFeMn
10
1
62,3
0,09
58
0,1
82
76,1
50
5
87
83,7
74,1
100
10
91
83,4
82,7
300
30
91,2
90,1
Da die Autokorreleationsfunktionen sowohl Nanopartikel als auch Serumproteine erfassen, wurde zur
Isolation der Korrelation der Nanopartikel eine Multikomponentenanalyse durchgeführt. Die
Vorgehensweise wurde im vorherigen Kapitel beschrieben. Die Korrelation des FCS konnte in drei
Einzelkomponenten zerlegt werden, von denen zwei Komponenten mit so kleinen Relaxationszeiten
korrelieren, dass sie von der gesamten Autokorrelationsfunktion der NP plus FCS separiert werden
konnten. Die dritte Komponente des FCS korrelierte in Größenbereichen der Nanopartikel und konnte
nicht separiert werden. Die vollständige Isolation des NP-Signals gelang folglich nicht vollständig,
sondern wurde noch von einem kleinen Anteil der Korrelation von FCS überlagert.
Die Größen der Nanopartikel bzw. der Agglomerate in Gegenwart von FCS zeigten eine nur geringe
Abhängigkeit der Konzentrationsverhältnisse von NP zu Proteinen. Dies ist ein Hinweis darauf, dass
die Multikomponentenanalyse erfolgreich war und der hydrodynamische Radius der NP nicht mehr
von dem Mittelwert der hydrodynamischen Radien der Proteinen abhängt. Dennoch wurde ein
gewisser Einfluss der Mischungsverhältnisse auf die gemessene Größe erhalten. Besonders stark war
dies bei der Probe AuAg ausgeprägt, mit ermittelten Größen zwischen 63 nm und 96 nm. Die
Ergebnisse der übrigen Proben lagen innerhalb dieser Spanne. Im Gegensatz zu den Messungen in
RPMI-Medium ohne FCS konnte nicht zwischen Proben differenziert werden, die keine oder
ausschließlich sehr große Aggregate aufwiesen.
Im Einzelnen wurde beobachtet, dass die CoCrWNiFeMn-Legierungspartikel in RPMI-Medium ohne
Serumproteine, innerhalb des Zeitrahmens der Messung, ausreichend stabilisiert vorlagen. In
Gegenwart von Proteinen bildeten diese Kolloide Aggregate mit Größen von 76 -91 nm. Hingegen
zeigten NiTi-NP in RPMI-Medium Aggregate mit Größen nahe der Filtrationsgrenze von 223 nm.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-82-
Dies lässt darauf schließen, dass ebenso noch größere Agglomerate als 223 nm vorhanden sind, die
sich der Detektion des Lichtstreuexperimentes durch Filtrationsverlust entziehen. In Anwesenheit von
Serumproteinen bildeten NiTi-NP ebenso Aggregate mit ähnlicher Größe wie AuAg- bzw.
CoCrWNiFeMn-NP von 83-96 nm. Folglich glichen sich die Proben bei Proteinadsorption in ihrem
Aggregationsverhalten aneinander an.
Die elektrostatische Stabilität der Kolloide wird sehr stark durch physiologische Salzkonzentrationen
herabgesetzt. Der durch die Proteinkorona vermittelte stabilisierende Effekt ist bereits in der Literatur
bekannt. Es konnte für Citrat-stabilisierte NP gezeigt werden, dass in Gegenwart destabilisierender
Salze die Stoßeffizienz mit zunehmender Proteinbeladung sinkt.66 Dieser stabilisierenden Effekt der
Proteinkorona konnte ebenso in der vorliegenden Größencharakterisierung der NiTi-NP, Tabelle 11,
beobachtet werden, die in Abwesenheit von Serumproteinen stark aggregierten, in Gegenwart von
Proteinen jedoch eine ähnliche Größe aufwiesen wie die Vergleichsproben. Da die Proben schon im
Vorhinein stark polydispers / agglomeriert vorlagen, erschwert dies zusätzlich die weitere
Charakterisierung unter physiologischen Bedingungen. An dieser Stelle soll daher bei den bereits
getroffenen qualitativen Aussagen ohne weiterführende NP-Analytik verblieben werden. Wie bereits
erwähnt, dienten die Proben der Simulation von Implantatabrieb. Sollte dieser im Nanometermaßstab
stattfinden, kann aufgrund des stabilisierenden Effektes der Proteinkorona die Probe vor weiterer
Agglomeration geschützt werden. Kolloidale Teilchen verbleiben somit in der Nano-Größenordnung,
zumindest für den hier betrachteten experimentellen Zeitrahmen von 10 min.
Die Charakterisierung sowie der Vergleich dreier kolloidaler Materialien mit ähnlicher Größe,
Größenverteilung sowie elektrostatischer Stabilisierung unter physiologischen Bedingungen
verdeutlicht die Komplexität zur Vorhersage des Agglomerationsverhaltens. Da die Proben bereits im
Vorhinein agglomeriert vorlagen, erschwerte dies die Erfassung des nachfolgenden
Aggregationsverhaltens in biologisch relevanten Medien. In den folgenden Kapiteln sollen gut
definierte kolloidale Systeme vorgestellt werden, mit deren Hilfe das Agglomerationsverhalten sowie
die Größencharakterisierung der Proteinkorona gezielt erfasst werden können. Im Einzelnen handelt es
sich hierbei um großtechnisch hergestellte Silica NP, welche ein deutliches Aggregationsverhalten in
Gegenwart von Proteinen zeigen, Kapitel 5.2, sowie multifunktionelle Poly(organosiloxan) NP,
welche in Anwesenheit von Proteinen nicht aggregieren und somit eine gezielte
Größencharakterisierung der Proteinkorona erlauben, Kapitel 5.4.
Amorphe Silica Nanopartikel
___________________________________
-83-
5.2 Amorphe Silica Nanopartikel
Amorphe Silica Nanopartikel finden ein breites Anwendungsfeld in großtechnischen Produkten. Sie
sind unter anderem Bestandteil von Farben und Beschichtungen, Dichtungen, Druckerfarbe und Toner,
Klebstoffen, Reifen sowie von elektrischen und thermischen Isolierungen. Zudem reihen sich
Produkte hinzu, denen Menschen im Alltag direkt ausgesetzt sind. Hierzu zählen eine Vielzahl von
Kosmetikprodukten wie Deodorants, Zahnpasta, Gele, Cremes, Puder und Lotionen aber auch
Nahrungsmittel, denen Silica NP gepulvert zugesetzt werden.133 Die Toxizität von Nanopartikeln ist
im allgemeinen noch unverstanden, dennoch sind die durch Silica NP bedingte zytotoxische Wirkung
sowie Entzündungsreaktionen der Lunge bekannt.23
Christoph Bantz beschäftigte sich bereits im Zuge seiner Dissertation an der Universität Mainz in der
Arbeitsgruppe von Prof. Michael Maskos mit der Charakterisierung von Silica NP unter
physiologischen sowie nicht-physiologischen Bedingungen.134 Die verwendeten Silica NP zeigten eine
hohe Stabilität, selbst in Gegenwart physiologischer Salzkonzentrationen. Die NP aggregierten jedoch
unter Zugabe von Serumproteinen. Die Größe der Agglomerate hing zudem vom Verhältnis der
Proteinmenge zur Konzentration der NP ab. Weiterhin konnte über 48 Stunden eine zeitabhängige
Zunahme der Agglomeratgröße beobachtet werden.
Im Hinblick auf Zellversuche wurden in der vorliegenden Forschungsarbeit drei verschieden große
amorphe Silica NP charakterisiert, diese waren kommerziell erhältlich und stammen vom selben
Hersteller Nyacol Nanotechnologies. Die Charakterisierung erfolgte in entionisiertem Wasser, in
3 mM NaN3, in RPMI 1640 Zellmedium sowie in Zellmedium unter Zusatz von Serumproteinen.
5.2.1 Größencharakterisierung amorpher Silica NP
Nach Herstellerangaben lagen die mittels TEM gemessenen Durchmesser der amorphen Silica NP bei
8 nm, 20 nm und 125 nm. Hieraus resultiert die Probenbenennung NexSil8, NexSil20 und NexSil125.
Eigene Messungen ergaben Abweichungen zu den Größenangaben des Herstellers. Abbildung 31 zeigt
eine TEM Aufnahme der Probe NexSil20.134 Als Ergebnis konnten bei allen Proben im TEM größere
Durchmesser gefunden werden, als vom Hersteller angegeben wurden. Bei der in Abbildung 31
gezeigten Probe NexSil20 wurde statt 20 nm, nach Herstellerangaben, ein mittlerer Durchmesser von
31,4 nm ± 3,8 nm gemessen.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-84-
Abbildung 31: Links: Winkelabhängigkeit der hydrodynamischen Radien der Proben NexSil8, NexSil20 und NexSil125 in
H2O. Rechts: TEM-Abbildung von NexSil20 zeigt Radien von 15,7 nm ± 1,9 nm.
Da amorphe Silica NP im TEM durch den Trocknungsprozess sowohl schrumpfen können, als auch
durch Verformung einen fehlerbehafteten Größeneindruck vermitteln können, wurden die Proben
mittels DLS charakterisiert. Die Winkelabhängigkeit der apparenten Diffusionskoeffizienten wurde als
reziproker hydrodynamischer Radius in Abbildung 31 dargestellt, durch eine Auftragung 1 Rh
⁄(∝D)
gegen q2. Die Ergebnisse sind in Tabelle 12 zusammengestellt. In Wasser betrugen die ermittelten
hydrodynamischen Radien 12,6 nm, 19,1 nm und 60,4 nm, entsprechend NexSil8, NexSil20 und
NexSil125. Die µ2 Werte fielen bei den kleineren Proben NexSil8 und NexSil20 mit Werten von 0,16
und 0,24 sehr hoch aus. Dies lässt entweder auf eine sehr breite Größenverteilung schließen, auf die
Anwesenheit von Aggregaten oder auf einen zusätzlichen Beitrag der interpartikulären
Wechselwirkungen auf die Korrelationsfunktion durch einen kollektiven Diffusionskoeffizienten.
Die genauere Betrachtung der Winkelabhängigkeit der apparenten Diffusionskoeffizienten weist einen
annährend linearen Verlauf auf. Dies wird im Allgemeinen durch eine breite Größenverteilung sowie
durch geringfügige Aggregation der Probe bedingt. Hingegen konnte eine Überlagerung durch einen
statischen Strukturfaktor aufgrund kollektiver Diffusion, etwa in Form eines nicht linearen Verlaufs
der Winkelabhängigkeit oder einer negativen Steigungen in S(q), nicht beobachtet werden. Einen
Hinweis auf die Anwesenheit von Aggregaten gaben die Autokorrelationsfunktionen, welche
reproduzierbar bei allen Winkeln einen biexponentiellen Verlauf zeigten. Beispielsweise konnten für
die Probe NexSil20 hydrodynamische Radien bei entsprechend 15 nm gefunden werden plus einen
Anteil geringer Amplitude mit zugehörigen Radien größer 60 nm. Die Probe NexSil8 wies Radien von
10 nm auf sowie ebenfalls Radien größer 60 nm.
Amorphe Silica Nanopartikel
___________________________________
-85-
Abbildung 32: Winkelabhängige DLS Messungen von NexSil8, NexSil20 und NexSil125.
Die semipräparative Fraktionierung der Proben durch die AF-FFF erlaubte die weitere
Charakterisierung der Hauptfraktion mittels DLS. Da die Fraktionierung in Anwesenheit von 3 mM
NaN3 erfolgte, wurden weiterhin die unfraktionierten Proben in Gegenwart von 3 mM NaN3 mittels
DLS vermessen. Die winkelabhängigen Ergebnisse der DLS sind in Abbildung 32 dargestellt bzw. in
Abbildung 33 für die mittels AF-FFF vorfraktionierten NP. Die unfraktionierten Proben zeigen kleine
Abweichungen zu den Messungen in entionisiertem Wasser, aufgrund einer stärkeren Abschirmung
der elektrostatischen Teilchen-Teilchen Wechselwirkungen durch den geringen Salzzusatz. Die
fraktionierten Proben hingegen ergaben große Abweichungen im Ergebnis im Vergleich zu den
unfraktionierten Proben. Die gemessenen hydrodynamischen Radien der fraktionierten Proben
NexSil8 und NexSil20 lagen bei 10,1 nm und 15,1 nm. Diese entsprechen jeweils der kleinen
Komponente der unfraktionierten Proben bei biexponentieller Auswertung der
Autokorrelationsfunktionen. Die µ2-Werte aller fraktionierten Proben waren kleiner als 0,05, folglich
wiesen die Hauptfraktionen, nach Abtrennung der Aggregate, sehr enge Größenverteilungen auf.
Zusammenfassend wurden die Größen der amorphen Silica NP auf hydrodynamische Radien von
10 nm, 15 nm und 59 nm bestimmt. Die primären Partikel zeigten in DLS eine enge Größenverteilung
allerdings wiesen die Proben NexSil8 und NexSil20 einen kleinen Anteil an Aggregaten auf.
Tabelle 12: Zusammenfassung der mittels DLS gemessenen hydrodynamsichen Radien der Proben NexSil8, NexSil20 und
NexSil125 sowie µ2 Werte bei Ɵ=90°.
DLS in H2O in 3 mM NaN3 in RPMI Medium
in 3 mM NaN
3
fraktioniert (AF-FFF)
Rh / nm
µ2
Rh / nm
µ2
Rh / nm
µ2
Rh / nm
µ2
NexSil8
12,6
0,24
12,8
0,18
12,6
0,18
10,1
<0,05
NexSil20
19,1
0,16
17,5
0,14
18,3
0,19
15,1
<0,05
NexSil125
60,4
<0,05
58
<0,05
56,8
<0,05
58,6
<0,05
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-86-
Abbildung 33: Dynamische Lichtstreuung der Proben NexSil8 und NexSil20 und NexSil125 nach der Fraktionierung mittels
AF-FFF.
Amorphe Silica Nanopartikel
___________________________________
-87-
5.2.2 Bestimmung der Oberflächenkonzentration
Zur Oberflächenberechnung wurde das Modell einer Vollkugel zugrunde gelegt. Die
Flächenkonzentration A
VLsg.
berechnet sich gemäß Gleichung (112).
(112)
Das Volumen der NP VNP wird nicht nur von der Trockendichte und der Trockenmasse der in Lösung
vorliegenden amorphen Silica bestimmt sondern auch von dem Grad der Quellung, welcher direkt das
Volumen der NP erhöht. Die Bestimmung der Menge an Wasser, die sich in dem amorphen Silica
Netzwerk befindet gelang mithilfe der Thermisch Gravimetrischen Analyse (TGA). Hierbei wird eine
Probe erwärmt, während der Masseverlust gravimetrisch bestimmt wird. Standardanwendungen liegen
in der Bestimmung von Zersetzungstemperaturen von Makromolekülen, ebenso kann auch die
Verdampfung von Wasser gravimetrisch erfasst werden. Abbildung 34 zeigt ein solches TGA-
Diagramm der Probe NexSil20. Es wurde die zeitliche Änderung der Gewichtsabnahme −∆TG
aufgetragen. Die Erwärmung des Probentiegels erfolgte mit einer Heizrate von 1 °C/min, ausgehend
von 35 °C beim Start der Messung. Die Probe wurde während der Messung durch einen
Stickstoffstrom umspült wodurch die komplette Verdampfung des Wassers schon vor Erreichen der
Siedetemperatur erfolgte.
Bei den untersuchten Proben konnte ein zweistufiger Masseverlust beobachtet werden, entsprechende
TGA-Diagramme befinden sich für die Probe NexSil20 in Abbildung 34. Die TGA-Diagramme der
Proben NexSil8 sowie NexSil125 weisen einen ähnlichen Verlauf auf, diese befinden sich im Anhang,
Abbildung 52. Da die Proben unter Stickstoffumströmung gehalten wurden, konnte der Wasserverlust
ab einer Temperatur von 40 °C beobachtet werden und war bei 90 °C bereits abgeschlossen. Zur
Berechnung der Quellung der Silica NP wurde zugrunde gelegt, dass die zweite Stufe des
Masseverlustes durch Wasser innerhalb des Silica-Netzwerkes entsteht.
A
VLsg.
=4πRh2
VLsg.
=3 VNP
Rh VLsg.
mit VNP=4
3πRh3
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-88-
Abbildung 34: TGA der NexSil20-Stammlösung. Der beobachtete Gewichtsverlust erfolgte durch das Verdampfen von
Wasser. Wasser im Silica-Netzwerk verdampft verzögert und führt zu einem zweistufigen Masseverlust.
Für die erste Stufe des Wasserverlustes wurde im Anschluss an das Maximum ein steil abfallender
Verlauf angenommen. Das bis dahin verdampfte Wasservolumen entspricht folglich
Wassermolekülen, die mit dem Silica-Netzwerk nicht wechselwirken. Das nachfolgend verdampfende
Wasser wird der Quellung der NP zugeordnet. Da es sich bei den Auftragungen um Masseänderungen
handelt, resultiert die Gesamtmasse des Wassers aus der Fläche unterhalb der Kurven, unter
Berücksichtigung des angenommenen Verlaufs nach Erreichen des ersten Maximums.
Zusätzlich zur Masse des Wassers wurde gleichzeitig, als Tiegelrückstand, die Trockenmasse an Silica
erhalten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 13 zusammengefasst. Unter Verwendung der Trockendichte
von Silica ρ= 2,2 g/mL135 sowie der Dichte von Wasser ρ= 1,0 g/mL erfolgte die Umrechnung in
Volumenanteile, unter Annahme idealen Verhaltens. Der Volumenanteil von Quellungswasser
entsprach je nach Probe zwischen 17,4% bis 20,2% des Trockenvolumens an Silica. Unter
Berücksichtigung dieser Quellung resultieren Dichten der Silica NP in Lösung von 1,96 g/mL bis
1,99 g/mL, welche somit mit Literaturwerten mit Dichten von ρ= 2,0 g/mL und niedriger
übereinstimmen.136
Die Berechnung der Oberfläche erfolgte anhand Gleichung (112), für das Volumen der NP wurde das
Trockenvolumen plus Quellungsvolumen verwendet.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-89-
Tabelle 13: Zusammenfassung der TGA Ergebnisse. Bestimmt wurde die Massekonzentration an Silica der Stammlösung
w%, das Maß der Quellung als Volumenanteil von Wasser innerhalb eines Partikels V% sowie die Oberflächenkonzentration
der Stammlösung.
TGA w%Silica cSilica/ g/mL V%Quellung A / m2/mL
NexSil8
28,7
331
18,6
64,4
NexSil20
47,8
637
17,4
73,1
NexSil125
47,3
607
20,2
21,3
Die Oberflächenbestimmung der amorphen Silica NP wird beim Vergleich des
Aggregationsverhaltens unter physiologischen Bedingungen eine wichtige Rolle spielen, Kapitel 5.3.5.
Vergleichende Experimente können unter identischer Teilchenzahl, identischer Oberflächen- oder
Massenkonzentration durchgeführt werden. Da das Aggregationsverhalten mit der Proteinadsorption
an der kolloidalen Oberfläche in Verbindung gebracht werden kann, werden Experimente bei
identischer Oberflächenkonzentration interessant. Es darf jedoch nicht außer Acht gelassen werden,
dass bei unterschiedlicher Größe der NP und identischer Oberflächenkonzentration die Teilchenzahlen
variieren, welche einen direkten Einfluss auf die Aggregationskinetik nehmen.
5.3 Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
Bei der NP-Charakterisierung unter physiologischen Bedingungen ergeben sich spezielle
Herausforderungen. Dies resultierte im Falle von DLS Messungen in einer aufwendigen Auswertung
zur Isolation der Korrelation der NP von der Korrelation der Proteine. Zudem erfasst die DLS nur
Mittelwerte und keine Verteilungen. Sehr breite Größenverteilungen einer Probe, besonders im Falle
von Aggregation innerhalb einer biologischen Matrix, können mittels DLS nur schwer erfasst werden.
Im Folgenden soll die Charakterisierung von amorphen Silica NP unter physiologischen Bedingungen
ausführlich behandelt und diskutiert werden. Da die Befunde von starker Aggregation geprägt waren
reichte die DLS als alleinige Charakterisierungsmethode nicht aus. Die Versuche wurden daher
zusätzlich mittels Asymmetrische Fluss-Feld Fluss Fraktionierung (AF-FFF) sowie der Analytischen
Ultrazentrifuge (AUZ) durchgeführt. Es ergeben sich Vor- und Nachteile der jeweiligen
Messmethoden, diese sind in Tabelle 14 zusammengefasst.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-90-
Tabelle 14: Vergleich von Charakterisierungsmethoden zu hydrodynamischer Eigenschaften kolloidaler Teilchen.
*Messungen werden durch Bandenverbreitung beeinflusst, aufgrund von Diffusion (AUZ) bzw. aufgrund der inhärenten
Partikelverteilung innerhalb der laminaren Schichten (AF-FFF).
DLS
AF-FFF
AUZ
Absolutmethode
--------
(Absolutmethode
*
)
Unter physiologischen Bedingungen
--------
Unter physiologischen Bedingungen
--------
Charakterisierung von Verteilungen
*
Charakterisierung von Verteilungen
*
--------
Semi-präparativ
Onlinekopplung möglich
--------
Sowohl die AF-FFF als auch die AUZ zeichnen sich durch die Darstellung von Größenverteilungen
aus. Die AUZ benötigt keine Kalibrierung und ist prinzipiell als Absolutmethode zu betrachten,
dennoch unterliegen die gemessenen Verteilungen der Sedimentationskoeffizienten einer
Bandenverbreitung durch Diffusion der Probe. Das Zusammenwirken von Diffusion und
Sedimentation wird durch die Lammsche Differentialgleichung beschrieben (113).
(113)
Die AF-FFF hingegen ist keine Absolutmethode. Nach Gleichung (78) wird eine Retention
ausschließlich durch die Kanalhöhe und durch das von außen anliegende physikalische Feld, dem
Querfluss, bestimmt. Dennoch haben Teilchen-Teilchen und Teilchen-Membran Wechselwirkungen
starken Einfluss auf das Retentionsverhalten, vgl. Kapitel 3.2.4. Diese Wechselwirkungen können als
zusätzliches physikalisches Feld betrachtet werden, das auf die Probe einwirkt. Hierdurch wird die
Retention zusätzlich durch das Eluat und dessen Salzgehalt sowie durch die Oberflächeneigenschaften
der Probe und der Membran beeinflusst.103 Weiterhin verhindern diese Wechselwirkungen die
Funktionsfähigkeit der AF-FFF unter physiologischen Bedingungen. Mit zunehmendem Salzgehalt
und zunehmender Abschirmung der Oberflächenladungen dominieren attraktive Wechselwirkungen
den Fraktionierungsprozess, was eine Bandenasymmetrie durch Adsorptions- und
Desorptionsgleichgewichte,106 unvollständige Elution der Probe109 bis hin zur kompletten Adsorption
der Probe unter physiologischen Bedingungen zur Folge hat.107,108 Die Vorteile der AF-FFF liegen in
der semipräparativen Fraktionierung137,138,139,140 sowie in der Kopplungsmöglichkeit an eine Vielzahl
von Detektoren, unter anderem auch an absolut arbeitende Detektoren wie online MALLS bzw. online
SAXS.141,142,143,22 Die Kopplung der AF-FFF ermöglicht somit eine absolute Charakterisierung mit
vorgeschalteter Fraktionierung.
�dc
dt�r=�1
r��d
dr��r D �dc
dr�−S ω2r2c�
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-91-
5.3.1 Die Konzentrationsabhängigkeit des Aggregationsverhaltens
Die zuletzt vorgestellten Charakterisierungsmethoden sollen in diesem Kapitel Anwendung zur
Charakterisierung von Agglomeraten Anwendung finden. Anhand der gegebenen Vor- und Nachteile
jeweiliger Messmethoden soll eine umfassende Charakterisierung erfolgen.
In gleicher Weise wie in Kapitel 5.1.3 „Charakterisierung von Legierungs-NP in RPMI Medium in
Gegenwart von Serumproteinen“ wurde die Probe NexSil20 sowohl in RPMI 1640 Medium als auch
in Gegenwart von Serumproteinen charakterisiert. Die Probe wurden zu einem Teil der Konzentration
c10x = 64 g/L mit neun Teilen RPMI 1640 Medium bzw. mit neun Teilen RPMI 1640 Medium, dem
zuvor 5 Vol.-% fötales Rinderserum (FCS, Proteingehalt etwa 50 g/L) zugesetzt wurde, gemischt. Es
resultiert in beiden Fällen eine Konzentration der NP von c0 = 6,4 g/L. In Gegenwart von FCS wird
eine Konzentration an Serumproteinen von 3,15 g/L angenommen. Die NP wurden den
physiologischen Bedingungen für 10 Minuten ausgesetzt bevor sie charakterisiert wurden. Da, wie
bereits beschrieben, Proben im AF-FFF Kanal nicht bei physiologischen Salzkonzentrationen eluieren,
erfolgte ausschließlich der Mischvorgang unter physiologischen Bedingungen. Die AF-FFF wurde mit
3mM NaN3 betrieben. Vergleichsmessungen der DLS und der AUZ hingegen fanden unter
physiologischen Bedingungen statt.
Abbildung 35: AF-FFF Elugramm von NexSil20 in 5% FCS/RPMI Medium. Eine Verringerung der Konzentrationen der
Silica NP führt zu einer Verzögerung der Elutionszeiten aufgrund Aggregation der Probe. Querfluss 2,5mL/min;
Detektorfluss 1mL/min.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-92-
Abbildung 35 zeigt das AF-FFF Elugramm der Probe NexSil20 in Medium ohne den Zusatz von
Serumproteinen. Die amorphen Silica NP besitzen keine chromophoren oder fluorophoren Gruppen,
ebenso erwies sich die Detektion des Brechungsindex bei den vorliegenden Konzentrationen als nicht
ausreichend sensitiv. Da die Probe durch den online MALLS Detektor sehr empfindlich detektiert
werden konnte, gibt das Elugramm die Streuintensität bei einem Winkel von 90° wieder. Es ist zu
beachten, dass das gezeigte Signal nicht proportional zur Massenkonzentration ist, sondern in erster
Annäherung zusätzlich proportional zum Molekulargewicht der Partikel bzw. der Agglomerate. Die
erste Bande, die im Elugramm bei 200 Sekunden erscheint wird als „voidpeak“ bezeichnet. Diese
Bande entsteht durch die Elution unfraktionierter Masse, in Form von Probenbestandteilen geringer
Größe oder Verunreinigungen, die sich während der Fokussierung im Trennkanal ansammeln. Die
eigentliche Probe eluierte als scharfe Bande zwischen 250 und 350 Sekunden. Der Querfluss wurde
bei 1320 Sekunden abgeschaltet, die sich anschließende Bande wird als „Spülpeak“ bezeichnet.
Die DLS Messungen der amorphen Silica NP in RPMI 1640 Medium ergaben ähnliche
hydrodynamische Radien sowie µ2-Werte, wie sie auch in entionisiertem Wasser gefunden wurden,
vgl. Tabelle 12. Das Medium RPMI 1640 induzierte entsprechend keine Aggregation der Probe
innerhalb des experimentellen Zeitfensters von 10 Minuten. Dieses Ergebnis wurde durch die AF-FFF
Messung bestätigt. Die Probe eluierte als schmale Bande bei 300 Sekunden. Durch das zu Grunde
liegende Trennprinzip der AF-FFF stellt sich im Trennkanal innerhalb der laminaren Schichten ein
Konzentrationsprofil der Probe ein. Zusätzlich zeigt der Fokusfleck der Probe innerhalb des
Trennkanals bei festgesetzter Fokussierungsdauer eine definierte Größe. Dies führte notwendiger
Weise zu der vorliegenden Bandenbreite von 250 bis 350 Sekunden. Die Elutionsbande der Probe
entspricht der einer monomodalen Größenverteilung der primären Partikel.
Die Bandenbreite sowie die Retention änderten sich in Anwesenheit von Serumproteinen. Hierzu
wurden NexSil20 in verschiedenen Konzentrationen zu RPMI 1640 Medium, dem 5 Vol.-% FCS
zugesetzt wurde, gegeben. Die resultierenden Konzentrationen der NP betrugen 1 x c0, 0,6 x c0,
0,4 x c0, 0,3 x c0, 0,2 x c0 und 0,1 x c0 mit c0 = 6,4 g/L. Diese Verdünnungsangaben beziehen sich auf
die vorliegenden Konzentrationen nach dem Mischen der Probe. Abbildung 35 gibt die
entsprechenden AF-FFF Elugramme wieder.
Zunächst soll das Elugramm der Probe „1 x c0 in Medium + 5% FCS“ diskutiert werden. Dieses wies
eine Bande bei 300 Sekunden auf, die im Vergleich zur Probe ohne FCS zu geringfügig höheren
Elutionszeiten verschoben war. Dies kann einerseits durch die Elution zweier Populationen in der AF-
FFF bedingt sein, die im Trennkanal in Wechselwirkung treten, andererseits kann dieses Verhalten
aber auch durch die Adsorption von Proteinen erklärt werden. Durch die Ausbildung der
Proteinkorona gewannen die Nanopartikel an Größe hinzu, folglich verschob sich die Bande der
Hauptfraktion zu späteren Elutionszeiten. Durch die Kalibrierung der AF-FFF ließ sich ein
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-93-
Größenzuwachs von 0,8 nm berechnen. Dieser Wert ist unter dem Vorbehalt zu betrachten, dass sich
bei einer Oberflächenmodifizierung der Partikel durch Proteinadsorption die Teilchen-Teilchen und
Teilchen-Membran Wechselwirkungen verändern. Das Retentionsverhalten wird in diesem Fall nicht
ausschließlich durch den Größenzuwachs verursacht, sondern ebenso durch die modifizierten
Oberflächeneigenschaften. Im Anschluss an die Hauptfraktion konnte bei einer Elutionszeiten von
450 Sekunden eine Schulter beobachtet werden. Die entsprechenden Radien von 30 nm lassen sich
nicht durch die Dicke der Proteinkorona erklären sondern durch die Proteinadsorption induziert
Aggregation der Probe. Sowohl die Proteinadsorption, als auch die Aggregation, führen zu einer
Zunahme des Molekulargewichts. Da die Fläche unter dem Lichtstreusignal proportional zum
Molekulargewicht ist, erklärt die vorliegende Agglomeration den beobachteten Flächenzuwachs unter
dem Lichtstreusignal von 20%.
Im Folgenden sollen ebenso die Elugramme der Proben „0,6 x c0 bis 0,1 x c0 in Medium + 5% FCS“
diskutiert werden. Mit abnehmender Partikelkonzentration konnte hier eine Verringerung der
Signalintensität der ursprünglichen Hauptfraktion, korrespondierend mit den primären Partikeln,
beobachtet werden. Die entsprechende Bande verschob sich zu späteren Elutionszeiten, von 300
Sekunden, bezüglich der Konzentration 1 x c0, auf bis zu 350 Sekunden für die Konzentration 0,1 x c0.
Die beobachtete Verschiebung der Bande der primären Partikel suggeriert ein kontinuierliches
Wachstum der Proteinkorona bei Verringerung der NP-Konzentration. Die veränderten Elutionszeiten
der Konzentration 0,1 x c0 entspricht einem Größenzuwachs von 3,0 nm im Vergleich zur Probe ohne
Serumproteine, auf Grundlage der AF-FFF Kalibrierung. Es wurde bereits diskutiert, dass die
Retention durch Modifizierung der Oberflächeneigenschaften im Falle der Proteinadsorption
beeinflusst werden kann. Im Falle von Teilchen-Membran Wechselwirkungen zeigt sich zudem eine
Beladungsabhängigkeit des Trennkanals auf die Retention der Probe.105,104 Da die Konzentrationen der
NP um einen Faktor 10 variiert wurden, von 1 x c0 auf 0,1 x c0, ändert sich ebenso die
Membranbeladung. Im Falle von Teilchen-Membran Wechselwirkungen würde man einen Einfluss
der Membranbeladung auf das Retentionsverhalten auch ohne gleichzeitiges Anwachsen der
Proteinkorona erwarten.
Durch die Variation der Konzentration der NP ergaben sich neben dem Versatz der Elutionszeit der
ursprünglichen Hauptfraktion ebenso Auswirkungen auf die Schulter, entsprechend den Aggregaten.
Je geringer die eingesetzte Partikelkonzentration war, desto stärker prägte sich die Fraktion der
Aggregate aus, bis die Aggregate letztlich die Hauptfraktion ausmachten. Das Elugramm der Probe
0,1 x c0 zeigte schließlich die Bande der primären Partikel als sehr schwach ausgeprägte Schulter bei
350 Sekunden, der Hauptteil der Probe eluierte als breitverteilte Größenfraktion der Aggregate. Auf
die Größencharakterisierung der Aggregate, anhand der Kalibrierung der AF-FFF, soll an dieser Stelle
nicht weiter eingegangen werden. Vielmehr wird die Größencharakterisierung der Verteilung in
Kapitel 5.3.5 „Vergleich von NexSil8, NexSil20 und NexSil125 unter physiologischen Bedingungen“
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-94-
anhand der Kopplung eines absolut arbeitenden online MALLS Detektors an die AF-FFF wieder
aufgegriffen.
Die in Abbildung 35 gezeigten Elugramme stellen einen Konzentrationsbereich der NP in Gegenwart
von Proteinen dar, der mit starken Änderungen im Aggregationsverhalten behaftet war. Die
Konzentrationen der nun folgenden Versuche wurden so gewählt, dass diese zwei unterschiedliche
Aggregationsverhalten repräsentieren. Die hohe Konzentration 1 x c0 wies hierbei vorwiegend primäre
Partikel auf, die niedrigste Konzentration 0,1 x c0 hingegen Aggregate.
Obwohl die Proben unter physiologischen Bedingungen präpariert wurden, erfolgten die Messungen
der AF-FFF nicht in selbiger Umgebung. Messungen mit PBS-Puffer als Eluat resultierten in
vollständiger Probenadsorption auf der Membran aufgrund der unzureichender Stabilisierung bei
Abschirmung der Ladung sowie der Abwesenheit von Tensiden, siehe Kapitel 3.2.4. Die Ergebnisse
der AF-FFF wurden daher mit alternativen Methoden bestätigt, die unter physiologischen
Bedingungen arbeiten, vergleiche Tabelle 14. Abbildung 36 gibt die zugehörigen Ergebnisse der
winkelabhängigen DLS wieder. Die Größencharakterisierung der amorphen Silica NP wurde bereits in
Kapitel 5.2 diskutiert. Die primären Partikel wiesen einen Radius von 15 nm auf, aufgrund
geringfügiger Aggregation wurde in der DLS ein gemittelter hydrodynamischer Radius von 18 nm
gemessen.
In DLS-Messungen wurde weiterhin die Konzentrationsabhängigkeit der NP auf die Größe der
Aggregate bestätigt, sofern Serumproteine gegenwärtig waren. Lagen die NP mit einer Konzentration
von c = c0 vor, so erhöhte sich der hydrodynamische Radius von 15 nm auf 33 nm. Dies ist in
Übereinstimmung mit den entsprechenden Elugrammen der AF-FFF, welche bei der Konzentration c0
die Hauptfraktion plus Schulter, bestehend aus freien Partikeln plus kleine Aggregate, zeigten. Im
Falle der NP Konzentration c = 0,1 x c0 wurde in der DLS ein gemittelter hydrodynamischer Radius
von 200 nm gemessen. Dies entspricht dem hydrodynamischen Radius von Aggregaten, die in der AF-
FFF bei selbiger Konzentration als breite Verteilung mit späten Elutionszeiten gefunden wurden.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-95-
Abbildung 36: Winkelabhängige DLS-Messung von NexSil20 unter physiologischen Bedingungen. Aggregation der Probe in
Gegenwart von Proteinen führt zu einer starken Zunahme des hydrodynamsichen Radius. Die Messungen zeigen eine
deutliche Konzentrationsabhängigkeit der Nanopartikel auf den gemittelten hydrodynamischen Radius.
Ähnliche Ergebnisse wurden mithilfe der Analytischen Ultrazentrifuge erzielt. Die Grundlage bildete
ein „Integrales Sedimentationsexperiment“. Hierbei wird die Zentrifugenzelle komplett mit der Probe
gefüllt. Durch Sedimentation im Gravitationsfeld entsteht eine Konzentrationsverteilung, deren
zeitliche Änderung über die komplette Höhe der Zentrifugenzelle detektiert wird. Die
Rotationsgeschwindigkeit wird so hoch gewählt, dass die Sedimentationsgeschwindigkeit dr dt
⁄
vorwiegend vom Sedimentationskoeffizienten bestimmt wird und der Einfluss des
Diffusionskoeffizienten verhältnismäßig klein wird. Die Geschwindigkeit, mit der sich die
Konzentrationsfront gegen die Akkumulationswand bewegt, führt zur Berechnung des
Sedimentationskoeffizieten.
(114)
Die Bezeichnung „Integrales Sedimentationsexperiment“ bezieht sich auf die kontinuierliche
Konzentrationsmessung aller Partikel, die bis zu ihrer Sedimentation im Zellvolumen verbleiben. Das
Differential der Konzentration der in Lösung verbleibenden Partikel gegen die entsprechenden
Sedimentationskoeffizienten führt zur Sedimentationskoeffizientenverteilung g(s).
Die Messungen der AUC erfolgten vollständig unter physiologischen Bedingungen, in
Übereinstimmung zur DLS. Die Zentrifugenzelle wurde mit einer Mischung aus RPMI-Medium,
5 Vol% FCS sowie Silica NP mit einer Konzentration von c = c0 bzw. c = 0,1 x c0 befüllt. Die
zugehörigen Verteilungen der Sedimentationskoeffizieten sind in Abbildung 37 dargestellt. In
s = dr dt
⁄
ω2r
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-96-
Abwesenheit von Proteinen sedimentiert die Probe NexSil20 als monomodale Verteilung mit einem
Sedimentationskoeffizienten von 460 Svedberg. Der kugeläquivalente Durchmesser berechnet sich aus
dem Sedimentationskoeffizienten, der Viskosität des Lösungsmittels sowie dem Dichteunterschied des
Lösungsmittel und der Probe ρNP−ρLM gemäß Gleichung (115).
(115)
Legt man den mittels DLS gemessenen Durchmesser der Probe von d = 30,2 nm zugrunde,
entspräche dies einer Dichte der Silica NP von ρSilica= 1,9 g/L. Der Unterschied zu Literaturwerten
der Trockendichte von ρSilica,trocken= 2,2135 resultiert aus der Quellung der NP.136 In Gegenwart von
Serumproteinen zeigt sich im Fall der hohen Konzentration an NP c = c0 eine Verschiebung der
Sedimentationskoeffizienten, sowie eine Schulter. Eine Zuordnung des Durchmessers der
proteinbeladenen Silica NP gelang nicht, da sich in Anwesenheit von Serumproteinen die Viskosität
des Lösungsmittels sowie die Dichte der Probe bei Proteinadsorption ändern.
Im Falle der niedrigen Konzentration der Silica NP c = 0,1 x c0 bildete sich, neben der Fraktion der
primären Partikel, eine Fraktion mit größeren und breit verteilten Sedimentationskoeffizienten aus.
Diese Fraktion entspricht den Aggregaten, die bereits im AF-FFF Experiment vorlagen. Die Befunde
der DLS sowie der AUC stützen somit die Beobachtungen der AF-FFF Messungen, die eine
konzentrationsabhängige Aggregation der Probe erfassten.
Abbildung 37: Ergebnisse der AUC. Links: Verteilung der Sedimentationskoeffizienten von NexSil20 in Gegenwart von
Proteinen unter physiologischen Bedingungen, Geschwindigkeit 5000 rpm. Rechts: AUC im Highspeed-Modus nach
Sedimentation der NP: Das Fraktogramm in integraler Form ergibt die Gesamtmasse an freiem Protein, Geschwindigkeit
60000 rpm.
di=�18ηsi
ρNP−ρLM
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-97-
Die AUC bot weiterhin die Möglichkeit, die Menge an ungebundenen Proteinen zu detektieren. Da
Serumproteine sowohl kleiner sind, als auch eine geringere Dichte als Silica NP aufweisen,
sedimentierten diese nicht bei den zuvor gewählten Rotationsgeschwindigkeiten von 5000 rpm. In
einem zweiten Schritt, nach vollständiger Sedimentation der Silica NP, wurde die
Rotationsgeschwindigkeit auf 60000 rpm erhöht. Die in Lösung verbliebenen Proteine sedimentierten
mit Sedimentationskoeffizienten von etwa 4 Svedberg. Abbildung 37 rechts zeigt das zugehörige
Fraktogramm in Integraler Form. ∆J bezeichnet das Signal des Interferenzdetektors. Dieses ist
proportional zur Gesamtmasse an Proteinen, die in dem Bereich von 2 bis 10 Svedberg sedimentierten.
Das Signal von 5% FCS in RPMI ohne NP wurde als Bezugspunkt auf 100% gesetzt. Im Vergleich
hierzu wurden in Gegenwart von Silica NP, im Falle der hohen Konzentration von c = c0, 18% der
vorhandenen Serumproteine adsorbiert. Im Falle der niedrigen Konzentration von c = 0,1 x c0,
wurden nur 2% der Proteine adsorbiert. Die Menge an adsorbierten Proteinen ist somit etwa
proportional zur eingebrachten Oberfläche der NP. Obwohl beim Aggregationsverhalten eine
Konzentrationsabhängigkeit der eingebrachten NP beobachtet werden konnte, war die Menge an
adsorbiertem Protein pro Oberfläche konstant.
Anhand der in Lösung verbleibenden Proteinmenge lassen sich Rückschlüsse auf die Proteinkorona
ziehen. Unter der Annahme, dass es sich bei der adsorbierten Proteinmasse ausschließlich um
Albumin handelt, wurden pro Milliliter 3,94 ∗1015 Proteine auf 2,55 ∗1014 Silica NP adsorbiert.
Dies entspricht 16,4 Proteinen pro NP. Diese Anzahl ist sehr niedrig, unter der Berücksichtigung, dass
die Oberfläche eines einzelnen NP von ANP ≈2900 nm2 Platz für etwa 100 Albuminproteine bietet.
Eine mögliche Erklärung liegt in der Unterscheidung zwischen „weicher“ und „harter“ Proteinkorona
in Sedimentationsexperimenten. Durch Sedimentation der NP wirken Scherkräfte, welche die
dynamischen („weichen“) Anteile der Korona abscheren. Der „weiche“ Anteil der Korona verbleibt
während der Sedimentation der NP folglich in Lösung. Die oben getroffen Aussage, die Menge
adsorbierter Proteine sei proportional zur NP Oberfläche, muss daher differenzierter betrachtet
werden: Die Menge an hart bindenden Proteinen ist proportional zur eingebrachten Oberfläche der
NP; Aussagen zum „weichen“ Anteil der Proteinkorona gelingen jedoch anhand dieses Experimentes
nicht.
Allgemein wurde in diesem Kapitel gezeigt, dass eine Konzentrationsabhängigkeit des
Aggregationsverhaltens existiert. Diese Beobachtung wurde mittels AF-FFF, DLS sowie AUC
bestätigt. Nach Smoluchowski ist dies nicht verwunderlich, da die Aggregationsgeschwindigkeit von
der Teilchenzahl abhängt. Auf einen wichtigen Aspekt wurde jedoch noch nicht genauer eingegangen:
je höher die Teilchenzahl, desto weniger Aggregate wurden gefunden. Dieser Trend ist genau
entgegen den Gesetzmäßigkeiten der Aggregationskinetik nach Smoluchowski. Eine ausführliche
Erklärung folgt in Kapitel 5.3.6 „Koagulationskinetik der amorphen Silica NP in Gegenwart von
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-98-
Proteinen“. Doch zunächst müssen hierfür einige Grundlagen betrachtet werden, wie zum Beispiel die
Charakterisierung der kolloidalen Stabilität proteinbeladener NP sowie die Differenzierung zwischen
einer Koagulation und einer verbrückenden Flockung.
5.3.2 Die kolloidale Stabilität proteinbeladener Silica NP
Das zuvor beschriebene Aggregationsverhalten der Silica NP in Gegenwart von Proteinen impliziert
einen destabilisierenden Effekt, der von adsorbierten Proteinen im Allgemeinen ausgeht. Unter diesem
Gesichtspunkt ließe sich das konzentrationsabhängige Aggregationsverhalten schlicht als
Verdünnungs-/Anreicherungsexperiment deuten, wodurch bei zunehmender Oberflächenbelegung
vermehrt Aggregation stattfände. Dass dieser Sachverhalt das hier vorliegende nur unzureichend
beschreibt folgt anhand der Bestimmung der Menge an adsorbiertem Protein. Es konnte zuvor gezeigt
werden, dass die Oberflächenbelegung der hart bindenden Proteine an Silica NP, im Gegensatz zum
Aggregationsverhalten, von den Konzentrationsverhältnissen unabhängig ist. Die Proteinkorona ist,
bezogen auf hart bindende Proteine, folglich bei nicht-aggregierten NP in gleicher Weise wie bei
aggregierten NP ausgeprägt.
Ein weiterer Nachweis dafür, dass die Proteinkorona sowohl im Falle der hohen Konzentration c = c0
als auch der niedrigeren Konzentration c = 0,1 x c0 gleichermaßen ausgeprägt ist und diese
Proteinhülle nicht notwendiger Weise zu Aggregation führt, resultiert aus Messungen des ζ-Potentials.
Da die AF-FFF eine semi-präparative Fraktionierung ermöglicht, wurden entsprechende Fraktionen
dieser Konzentrationen zur weiteren Charakterisierung gesammelt. Abbildung 38 gibt die Bereiche der
gesammelten Fraktionen mithilfe von Balken über dem AF-FFF Elugramm wieder. Von den
Fraktionen wurden, ohne weitere Aufarbeitung, ζ-Potentiale gemessen. Die AF-FFF wurde mit 3 mM
NaN3 betrieben, entsprechend erfolgte die ζ-Potential Messung unter identischen Bedingungen. In
Abwesenheit von Proteinen wurde ein ζ-Potential der Silica NP von -27 mV gemessen. In
Anwesenheit von Proteinen stieg der an der Hauptbande erfasste Wert auf -11 mV an. Die Ausbildung
der Proteinkorona führte folglich zu einer Veränderung der ursprünglichen Oberflächeneigenschaften.
Die Banden, die im Elugramm den Aggregaten zugeordnet werden konnten, erzielten ebenso erhöhte
ζ-Potentiale. Diese lagen bei -10 mV im Falle der geringfügig aggregierten Probe, sowie bei -9 mV
der vollständig aggregierten Probe.
Die ζ-Potential Messungen ergaben einen nur kleinen Unterschied zwischen der nicht aggregierten
Probe und der aggregierten Probe von 2 mV. Zudem zeichnete sich ein Trend ab, dass größere
Aggregate höhere ζ-Potentiale aufwiesen, als kleinere Aggregate. Diese Beobachtung muss allerdings
durch die Messgenauigkeit relativiert werden. Jeweils zehn Messdurchläufe des ζ-Potentials
resultierten in Standardabweichungen je nach Fraktion von σ = 2-3 mV. Der vorliegende Trend war
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-99-
somit kleiner ausgeprägt als der Fehler der Messungen. Dieser Trend konnte daher nicht eindeutig
belegt werden.
Die Berechnung der ζ-Potentiale wurde nach Hückel genähert, dieses Modell ist gültig für κa << 1.
Die Debye-Länge bei 3 mM Salzgehalt liegt bei 6 nm, so dass für NexSil20 gilt: κa ≈ 2,5. Die
Henry-Funktion liefert F(κa = 2,5)= 1,1 anstelle der Hückelnäherung F(κa≪1)= 1.144 Durch die
Auswertung nach Hückel wurden somit um 10% zu hohe Werte ermittelt. Im Vergleich zur
Standardabweichung lag dieser Fehler innerhalb der Messungenauigkeit.
Abbildung 38: AF-FFF-Elugramme von NexSil20 in Gegenwart von Proteinen. Die Balken zeigen den Bereich der
gesammelten Fraktionen deren ζ-Potential bestimmt wurde. Querfluss 2,5mL/min; Detektorfluss 1mL/min.
Unabhängig von der untersuchten Fraktion zeigte sich bei Proteinadsorption eine verminderte
elektrostatische Stabilisierung der Nexsil20. Da die elektrostatische Abstoßung eine kinetische
Barriere darstellt, führt eine Verminderung der stabilisierenden Kräfte im Allgemeinen zu einer
schneller ablaufenden Koagulation der Probe. Christoph Bantz konnte im Zuge seiner Dissertation
diesen Alterungsprozess solcher proteinbeladener Silica NP innerhalb eines Zeitfensters von 48
Stunden nachweisen.134 Der in der hier vorliegenden Forschungsarbeit relevante Zeitrahmen, zwischen
Probenpräparation und Messung, betrug 10 Minuten. Zudem trat die Trübung, welche mit der
gefundenen Aggregation einhergeht, innerhalb weniger Sekunden ein. Die zeitliche Diskrepanz legt
nahe, dass die beobachtete Aggregation nicht durch einen, durch verringerte elektrostatische
Stabilisierung bedingten Alterungsprozess, hervorgerufen wurde.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-100-
Hintergrund: Koagulation innerhalb Zeitspannen < 1 Sekunde sind typisch für eine barrierefreie
Aggregation, der sogenannten schnellen Koagulation. Ein alternativer Agglomerationsprozess mit
geringfügig langsameren Geschwindigkeiten ist die Flockung von Kolloiden mit Makromolekülen,
anhand eines verbrückenden Mechanismus, Kapitel 2.3.2. Nachfolgend soll daher ebenfalls ein
verbrückender Mechanismus adsorbierter Proteine berücksichtigt und diskutiert werden, der das
Agglomerationsverhalten von Silica NP beschreibt.
5.3.3 Aggregation durch affin bindende Proteine
Von der verbrückenden Flockung von Kolloiden mit Polymeren ist bekannt, dass das Makromolekül
mit der kolloidalen Oberfläche nicht nur stark wechselwirkt, sondern aufgrund mehrerer
Bindungsstellen irreversibel adsorbiert wird, siehe Kapitel 2.3. Dieser Sachverhalt soll im Folgenden
anhand des affinen Bindungscharakters verbrückender Proteine bestätigt werden.
Der Einfluss von selektiv bindenden Proteinen auf das Aggregationsverhalten soll anhand der zwei-
stufigen Zugabe von NP zu Serumproteinen ermittelt werden, siehe Abbildung 39. Hierzu wurde eine
5%ige FCS Lösung in RPMI zentrifugiert, um für nachfolgende Zentrifugationsschritte konstante
Startbedingungen zu setzen (1). Zum Überstand wurden NexSil20 NP mit einer Konzentration von
c10x= 6,4 g/L in einem Mischungsverhältnis 1/10 zugegeben. Die resultierenden
Konzentrationsverhältnisse entsprechen der Probe cNP= 0,1 x c0 in 5% FCS/RPMI, von der bekannt
ist, dass Silica NP vorwiegend in Agglomeraten vorliegt (Kapitel 5.3.1). Diese Mischung wurde
wiederum zentrifugiert, wodurch Silica NP mitsamt hart bindenden Proteinen entfernt wurden.
Ungebundene Proteine sollten mit 100-fach kleineren Sedimentationskoeffizienten als NexSil20 in
Lösung verbleiben (2), vgl. Abbildung 37. Anschließend erfolgte nochmalig die Zugabe von NexSil20
mit selbiger Konzentration c10x= 6,4 g/L (3). Nach jedem Einzelschritt wurde anhand der
dynamischen Lichtstreuung der gemittelte hydrodynamische Radius der in Lösung verbleibenden
Fraktionen ermittelt.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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Abbildung 39: Versuchsschema einer zweistufigen NP-Zugabe zu einer 5% FCS Lösung: Zu einer zentrifugierten Lösung
FCS in RPMI Medium wurden NexSil20 NP zugegeben, anschließend wurde abzentrifugiert und zum Überstand wiederum
NexSil20 NP zugegeben. Die einzelnen Stufen wurden mittels Mehrwinkel DLS größencharakterisiert.
Die Streuintensität des Serums bei einem Streuwinkel von 90° sank nach erstmaliger NP Zugabe und
nachfolgender Zentrifugation um 24%. Simultan verringerte sich die gemittelte Größe aller in Lösung
verbleibenden Serumprotein-Fraktionen von 9,8 nm auf 8,9 nm. Folglich adsorbierten Fraktionen des
Serums die vorwiegend größere Radien als 8,9 nm aufwiesen. Bei Serumfraktionen solcher Größen
handelt es sich in der Regel um Proteine bestehend aus mehreren Polypeptidketten. Diese oligomere
Struktur (Quartärstruktur) tritt insbesondere bei Proteinen mit Molekulargewichten > 100 kDa auf,
identische Untereinheiten werden als Protomere bezeichnet.145 Hierbei assoziieren
Proteinuntereinheiten meist über nicht kovalente Bindungen. Die Kontaktregion zweier Untereinheiten
besitzt große Ähnlichkeit zum inneren eines monomeren Proteins, im Besonderen sind das ein hoher
Anteil an unpolare Seitenketten sowie Wasserstoffbrücken.
Die bevorzugte Adsorption solcher Proteine ist nicht unplausibel, da die gegenseitige Anlagerung von
hydrophoben Domänen in wässriger Umgebung, die zu Proteinagglomeration führt, ebenso wie die
Adsorption selbiger Domänen an kolloidale Oberflächen entropisch begünstigt ist. Die bevorzugte
Adsorption großer Proteine konnten ebenso anhand einer Proteomanalyse der Proteinkorona auf Silica
NP in Humanserum bestätigt werden.61 Die Zusammensetzung der Proteinkorona zeigte eine
Anreicherung hochmolekularer Serumproteine mit Molekulargewichten > 250 kDa.
Die Abnahme der Streuintensität um 24% war unerwartet hoch. Experimente mittels AUC, Abbildung
37, zeigten, dass unter identischen Konzentrationsverhältnissen ca. 2% der Proteinmasse an NexSil20
adsorbiert wurde. Die Zentrifugation in der Laborzentrifuge erfolgte unter weniger kontrollierten
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-102-
Bedingungen als in einer AUC. Es kann daher nicht gewährleistet werden, dass in dem vorliegenden
Experiment ebenso nur 2% der Proteinmasse adsorbierte. Dennoch soll die nachfolgende Abschätzung
verdeutlichen, dass die Streuintensitätsabnahme von 24% durch die Adsorption stark streuender,
großer Proteinkomplexe bedingt war.
Da die Streuintensität mit dem Molekulargewicht skaliert, führt die Adsorption von großen
Proteinoligomeren zu einer erhöhten Abnahme der Streuintensität. Der gemittelte hydrodynamische
Radius der Serumproteine beträgt nach Adsorption durch Silica NP nur noch 90% der ursprünglichen
Größe. Dieser sank von 9,8 nm auf 8,9 nm. Unter der Annahme, Proteine verhielten sich wie
Gaußknäule mit einer fraktalen Dimension von df= 2, sinkt das gemittelte Molekulargewicht anhand
Gleichung (22) auf einen Wert von 81%. Da die absolute Streuintensität sowohl mit der Konzentration
als auch mit dem Molekulargewicht skaliert, fällt die Streuintensität bereits unter Vernachlässigung
des Konzentrationsverlustes an Proteinen um 19% ab. Diese sehr grobe Abschätzung verdeutlicht,
dass der Verlust der Streuintensität hauptsächlich durch die Adsorption großer Serumfraktionen
bedingt war und weniger durch die verringerte Massenkonzentration an Proteinen.
Wiederholte Zugabe von NexSil20 zum Überstand (2) ergab einen gemittelten hydrodynamischen
Radius von 21 nm. Im Vergleich zu NexSil20 in Abwesenheit von Proteinen wurde eine Erhöhung des
hydrodynamischen Radius von 3,1 nm erhalten. Es kann nicht ausgeschlossen werden, dass die
gemessene Autokorrelationfunktion von kleinen Aggregaten wie Dimeren und Trimeren überlagert
wird, zudem lies sich die Korrelation der Proteine nicht separieren. Der Größenzuwachs von 3,1 nm
kann daher nicht ausschließlich der Proteinkorona zugeteilt werden.
Wie in Kapitel 5.3.1 gezeigt wurde, besitzen NexSil20 NP für den diskutierten Konzentrationsbereich
von cNP= 1 x c0 bis 0,1 x c0 unabhängig von ihrer Konzentration identische Oberflächenbelegungen
von hart bindenden Proteinen. Der Begriff „hart bindend“ bezieht sich hier auf adsorbierte Proteine,
welche den Scherkräften eines Zentrifugationsexperimentes widerstehen. Im Allgemeinen erfolgt eine
Proteomanalyse der „harten“ Korona nach mehrmaligem Waschen des Pellets, sodass der dynamische
Anteil der Korona entfernt wird. Dennoch konnte eine zeitliche Entwicklung der in diesem Sinne
beständigen Korona nachgewiesen werden.61 Die Zusammensetzung der harten Korona wird daher
ebenfalls, wenn auch in geringerem Maße als die weiche Korona, durch Assoziations- und
Dissoziationskonstanten einzelner Proteine geprägt. Es kann angenommen werden, dass Proteine bei
Verringerung der kolloidalen Oberfläche um Bindungsplätze konkurrieren, so dass sich bevorzugt
affin bindende Proteine auf der Oberfläche repräsentieren. Die Oberflächenbelegung hoch affin
bindender Proteine sollte somit mit Abnahme der NP Konzentration zunehmen, koexistent konnte
Aggregation beobachtet werden. Das hier vorliegende Experiment beschreibt die vorgeschaltete
Entfernung von affin bindenden Proteinen. In Abwesenheit dieser Proteine konnte keine Aggregation
beobachtet werden.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-103-
Die Vermutung liegt nahe, dass für Aggregation affin bindende Proteine verantwortlich sind. In der
Literatur ist bekannt, dass sich einzelne Proteine auf Dispersionen entweder stabilisierend oder
destabilisierend auswirken können.67,68 Für das Protein Fibronektin konnte eine destabilisierende
Wirkung auf Silica NP beobachtet werden. Ein Zusammenhang zu Bindungsaffinitäten, insbesondere
zur Abgrenzung des Fibronektins zu Proteinen, welche nicht destabilisierend wirken, wurde nicht
diskutiert. Für den allgemeinen Fall der Flockung von Kolloiden durch Polymerzugabe wird
mechanistisch klar abgegrenzt, ob das Polymer adsorbiert wird oder in Lösung verbleibt, siehe
Kapitel 2.3. In Lösung verbleibende Polymere weisen höchstens einen schwach destabilisierenden
Effekt durch osmotische Drücke auf (Verdünnungs-Destabilisierung). Adsorbierende Polymere
hingegen führen zu irreversibler Flockung.
5.3.4 Die Irreversibilität der Aggregation
Zur weiteren Charakterisierung der Aggregate wurde die Reversibilität der Aggregation überprüft.
Eine Auflösung von Koagulaten, genannt Peptisation, kann erfolgen wenn sich elektrostatisch
stabilisierte Kolloide im Potentialdiagramm (DLVO-Diagramm) in einem sekundären Minimum
befinden oder wenn sich das primäre Minimum innerhalb des kleinsten Annäherungsabstandes der
Teilchen befindet, dem „distance of closest approach“, so dass ein Teilchen das tiefliegende
Potentialminimum nicht erreichen kann.146,147 In beiden Fällen müssen die Teilchen eine nur geringe
Energiebarriere überwinden um zu redispergieren. Hingegen zeigt eine auf Flockung beruhende
Verbrückung von NP irreversiblen Charakter.47 Flockung aufgrund von Verarmungseffekten ist durch
Verdünnung unterhalb der kritische Volumenkonzentration oder durch Scherung reversibel.148
Die Reversibilität bzw. Irreversibilität der Agglomeration der Silica NP soll anhand des folgenden
Versuchs diskutiert werden. Es wurde zunächst ein Konzentrationsverhältnis der NP und der Proteine
geschaffen, von dem bekannt ist, dass Silica NP weitestgehend unaggregiert vorliegen. Das System
wurde hierauf in einen instabilen Zustand versetzt. Anschließend wurde wieder das
Konzentrationsverhältnis der Startbedingungen des Versuches geschaffen. Die genaue
Versuchsdurchführung gestaltete sich wie folgt:
(A) Die Probe der Konzentration an NP cNP= 1 x c0= 6,4 g/L wurde auf bisherige Weise unter
physiologischen Bedingungen und in Gegenwart von 5% FCS hergestellt.
(B) Die bereits hergestellte Probe A) wurde mit RPMI-Medium1640 mit 5% FCS 1 zu 10
verdünnt (cNP= 0,1 x c0= 0,64 g/L).
(C) Die NP wurden wieder zu cNP= 1 x c0= 6,4 g/L aufkonzentriert, indem zu 99 Teilen der
Probe B) 1 Teil NexSil20 mit einer Konzentration cadd=100 x c0=640 g/L zugegeben
wurden
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-104-
Abbildung 40: Verdünnung und Aufkonzentration von NexSIl20 in RPMI Medium + 5 Vol.-% FCS. Links: AF-FFF
Elugramm. Rechts: Ergebnis der Mehrwinkel DLS.
Abbildung 40 zeigt die resultierenden AF-FFF Elugramme dieser Proben sowie die dynamischen
Lichtstreumessungen. Probe A wurde bereits in Kapitel 5.3.1 beschrieben, das Elugramm ist daher
identisch und zeigt die Hauptfraktion der freien NP, sowie eine Schulter kleinerer Aggregate. Durch
Verdünnung dieser Probe zu cNP= 0,1 x c0 verschwand die Bande der unaggregierten NP fast
vollständig und es bildete sich eine breite Bande ab 400 Sekunden über das komplette Elugramm aus,
entsprechend einer breiten Größenverteilung von Aggregaten. Dieses Aggregationsverhalten stimmt
mit dem überein, welches bereits bei der Probe, die auf direktem Wege hergestellt wurde, mit cNP=
0,1 x c0 gefunden wurde. Nachfolgende Zugabe von NexSil20 NP führte zu einer erneuten Ausbildung
der Bande unaggregierter NP, zusätzlich blieb die Fraktion der Aggregate allerdings erhalten. Probe C
wurde nochmals nach vier Stunden mittels AF-FFF charakterisiert, das Elugramm blieb unverändert.
Eine Peptisation konnte folglich nicht beobachtet werden.
Im Gegensatz zu den AF-FFF Messungen, erfolgten die dynamischen Lichtstreuversuche vollständig
unter physiologischen Bedingungen. Qualitativ zeigten Proben A und B ähnliches Verhalten wie die
Proben, die direkt zu den Konzentrationen cNP= 1 x c0 bzw. 0,1 x c0 verdünnt wurden, obgleich
Probe B hier etwas größere Radien erzielte. Probe C bestätigte die Funde der AF-FFF, die DLS
Messung zeigte eine stark ausgeprägte Winkelabhängigkeit, da bei großen Streuwinkel die kleineren
Aggregate sowie freie NP stark ins Gewicht fielen. Die auf einen Streuwinkel von Θ=0°
extrapolierten Messwerte erzielten ähnliche <1/z>-Mittelwerte des hydrodynamischen Radius wie
Probe B.
Die Fraktion der Aggregate blieb nach Verdünnung unterhalb der kritischen Flockungskonzentration
unverändert. Die Aggregation von NexSil20 in Gegenwart von Proteinen kann in dem betrachteten
Konzentrationsbereich folglich als irreversibel erachtet werden.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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5.3.5 Vergleich von NexSil8, NexSil20 und NexSil125 unter physiologischen Bedingungen
Der Einfluss der Größe auf das Aggregationsverhalten amorpher Silica NP unter biologisch relevanter
Umgebung soll im Folgenden gezeigt werden. Hierzu wurden die in Kapitel 5.2 charakterisierten
Proben NexSil8, NexSil20 und NexSil125 verwendet. Die Charakterisierung in Gegenwart von
RPMI 1640 Medium, in Abwesenheit von Proteinen, wurde bereits diskutiert. Hierbei wurde keine
Aggregation innerhalb des betrachteten Zeitfensters gefunden. Der in Gegenwart von FCS-Proteinen
untersuchte Konzentrationsbereich der Oberflächen reichte von 0,73 m2/mL bis 0,073 m2/mL. Dies
entsprach den Konzentrationen der Probe NexSil20 von cNP = 1 x c0 bis cNP = 0,1 x c0. Unter
Berücksichtigung gleicher Oberflächen berechnen sich die Ausgangskonzentrationen der Silica NP aus
c0,NexSil8 = 3,8 g/L, c0,NexSil20 = 6,4 g/L sowie c0,NexSil125 = 20,8 g/L. Die Proben wurden auf
bereits genannte Weise hergestellt, nämlich durch Mischen eines Teils der Probe mit neun Teilen
RPMI 1640 Medium unter 5% FCS Zusatz. Die Charakterisierung erfolgte anhand der Kopplung der
AF-FFF an den MALLS Detektor zur online Trägheitsradien-Bestimmung. Zunächst sollen die bereits
diskutierten Grenzen dieses Konzentrationsbereiches betrachtet werden.
Im Falle der Konzentration ANP = 0,73 m2/mL = 1 x A0 in Gegenwart von 5% FCS eluierten die
Proben als enge Größenverteilungen, links in Abbildung 41. Die Probe NexSil8 eluierte bei den
kürzesten Elutionszeiten gefolgt von NexSil20. NexSil125 zeigte die höchste Retention, diese Probe
besaß jedoch auch die größte Bandenbreite. Dass diese Bandenbreite nicht durch eine breite
Größenverteilung der Probe verursacht wurde, zeigte sich in der Auswertung des online-
Trägheitsradius. Während die Trägheitsradien der Proben NexSil8 und Nexsil20 mit zunehmender
Elutionszeit stetig anwuchsen, bildete die Trägheitsradienkurve der Probe NexSil125 während der
eluierenden Bande nahezu ein Plateau aus. Die vorliegende Bandenbreite wurde Diffusion der Probe
innerhalb des Trennkanals bedingt, die mit längerer Verweilzeit (Retention) zunimmt. Mit Ausnahme
der Schulter der Probe NexSil20 wies an den Elugrammen nichts auf eine Aggregation der Probe hin.
Im Falle der Konzentration ANP = 0,1 x A0 bildeten sich in Anwesenheit von 5% FCS sehr breite
Elutionsbanden aus, Abbildung 41, rechts. Bei den Proben NexSil8 und NeSil20 konnten die Banden
der primären NP wiedergefunden werden, zusätzlich können Banden späterer Elutionszeit beobachtet
werden. Diese entsprechen Aggregaten, die sich über das komplette Elugramm erstreckten. Die Bande
der Probe NexSil125 wurde im Vergleich hierzu nur sehr gering verbreitert. Die Trägheitsradienkurve
dieser Probe ergab ebenso die kleinsten Werte.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-106-
Abbildung 41: AF-FFF Elugramme von NexSil8, NexSil20 und NexSil125 in Gegenwart von Proteinen. Die Proben lagen
bei identischer Oberflächenkonzentration vor, der Trägheitsradius wurde online gemessen. Links: Die
Oberflächenkonzentration A0 = 0,73 m2/mL entspricht der Konzentration von NexSil20 von c=1*c0=6,4 mg/mL. Rechts: Die
Oberflächenkonzentration A0 = 0,073 m2/mL entspricht der Konzentration von NexSil20 von c=0,1*c0=0,64 mg/mL. Zum
Vergleich der Proben wurde der Querfluss als Gradient angelegt und viel innerhalb von 1000 s von 2 mL/min auf 0 ab;
Detektorfluss 1 mL/min.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-107-
Beim Vergleich der Trägheitsradien wurden unterschiedliche Verläufe beobachtet. Die Probe NexSil8
erzielte bei späten Elutionszeiten, ab 800 Sekunden, die größten Trägheitsradien. Der relative
Massenanteil an Probe, der dieses Maximum des Trägheitsradius verursacht, muss allerdings als sehr
gering erachtet werden, obgleich diese Fraktion im Elugramm stark ausgeprägt vorlag. Der Grund für
die dort gemessene hohe Streuintensität wird nicht durch die Konzentration bedingt, sondern durch
das, mit solch großen Trägheitsradien einhergehende, hohe Molekulargewicht der eluierenden
Aggregate. Die Trägheitsradienkurve der Probe NexSil20 verlief während der Elution der freien,
unaggregierten NP auf gleichem Niveau wie die übrigen Proben. Zeitgleich zur Elution der breit
größenverteilten Fraktion der Aggregate erfolgte ein steiler Anstieg der Trägheitsradien mit
anschließend flacherem Verlauf dieser Kurve im Vergleich zu den übrigen Proben. Dieser flache
Verlauf lässt auf eine schlechte Fraktionierung rückschließen bzw. auf eine höhere Bandenverbreitung
jeweiliger Trägheitsradien-Fraktionen. Gründe hierfür liegen in der Beschaffenheit von Aggregaten,
diese weisen nicht nur eine ausgeprägte Größendispersität auf, sondern auch eine Uneinheitlichkeit der
Anisotropie sowie disperse/inhomogene Oberflächeneigenschaften bei Proteinadsorption.
Die Unterschiede der Trägheitsradienkurven begründen sich in der Überlagerung der Trägheitsradien
einzelner Fraktionen, die in unterschiedlichen Konzentrationsverhältnissen vorlagen. Allen
Trägheitsradienkurven gleich war ein Maximum zwischen 900 und 1000 Sekunden. Zudem eluierte
keine Bande nach einem Zeitpunkt von 1000 Sekunden. Dies lässt darauf schließen, dass hier ein
Inversionspunkt der Trennleistung vorlag, ab dem die Proben der sterischen Elution unterlagen. Dies
bedeutet, Fraktionen, die anhand ihres Diffusionskoeffizienten zu späteren Zeitpunkten als 1000
Sekunden eluieren müssten, eluieren aufgrund ihrer Größe vorzeitig. Dies verursacht eine lokale
Erhöhung der Trägheitsradienkurve, sowie eine zusätzliche Schulter der Streuintensität kurz vor Ende
der Elution, insbesondere bei der Probe NexSil8.
Die abgebildeten Verläufe der Trägheitsradienkurven wurden durch Reproduktion bestätigt. Zusätzlich
wurden neben den in Abbildung 41 dargestellten Konzentrationsverhältnissen ebenso
Oberflächenkonzentrationen von ANP = 0,73 m2/mL; = 0,365 m2/mL; = 0,146 m2/mL; = 0,073 m2/mL;
= 0,0548 m2/mL und = 0,0365 m2/mL in 5% FCS eingebracht. Dies entspricht für NexSil20 einem
Konzentrationsbereich von cNP = 1 x c0 bis cNP = 0,05 x c0. Zum besseren Vergleich des
konzentrationsabhängigen Aggregationsverhaltens der Proben wurde von der gemessenen
Intensitätsverteilung auf eine Massenverteilung umgerechnet, Gleichung (116). Unter der Annahme,
dass es sich bei Silica NP mit Proteinkorona um größeneinheitlichen Vollkugeln handelt, ist das
Molekulargewicht proportional zur Agglomerationszahl N. Es folgt für die Konzentration zu jedem
Elutionszeitpunkt:
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-108-
(116)
Die Berechnung der Agglomerationszahl N erfolgte anhand der gemessenen Trägheitsradien, auf
Grundlage des in Kapitel 4.2 hergeleiteten Modells zum Wachstum von Aggregaten, vgl. Abbildung
25. Für N < 6 wurde das berechnete stufenweise Wachstum von Teilchen-Cluster Aggregaten
zugrunde gelegt. Die einzelnen Werte für den fraktalen Vorfaktor kg,i sowie für die Dimension des
Wachstumsschrittes dieses Modells sind in Tabelle 27, Seite 167, zusammengefasst. Für N≥6 wurde
die fraktale Wachstumsfunktion für Cluster-Cluster Aggregate angewandt, Gleichung (104). Die
Dicke der Verbrückung wurde auf 3,8 nm abgeschätzt, dies entspricht etwas mehr als der Dicke eines
Albumin-Proteins. Grundlage hierfür war die online Trägheitsradienbestimmung der Fraktion
NexSil20 plus Proteinkorona, Abbildung 42. Der Trägheitsradius der freien Partikel mit Korona wuchs
um 1,3 nm an, dies entspricht nach dem Modell einer Vollkugel einem hydrodynamischen Radius von
1,9 nm. Der Radius der freien Partikel a in Gleichung (116) wird daher auf a = RH,Silica+ 1,9 nm
abgeschätzt.
300 320 340 360 380 400 420 440 460 480 500
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
I (θ) / norm.
t / s
I (0)° extrapol.
I (50°)
I (70°)
I (90°)
I (110°)
I (130°)
R
g
= 13,0 nm
Maximum bei 340 s
5
10
15
20
25
30
35
40
R
g
/ nm
Abbildung 42: Ausschnitt des AF-FFF Elugramms von NexSil20 c = 0,1*c0 in Gegenwart von Proteinen. Im gezeigten
Ausschnitt eluieren nicht-aggregierte NP mit Proteinkorona bei t = 340 s gefolgt von größeren Aggregaten ab t > 380 s. NP
mit Proteinkorona wiesen 1,3 nm größere Trägheitsradien als unbeladene NP auf. Anhand des Modells einer Vollkugel folgt
ein Radienzuwachs von Rh, Korona = 1,9 nm.
Die Aggregatmasse der Agglomeratgröße N ergibt sich aus der Aufsummierung aller Massen m =
c ∆V innerhalb von Volumina mit den Grenzen: V(N −0,5) bis V(N + 0,5). Folgendes Beispiel soll
als Verdeutlichung dienen: Die Masse eines Tetramers (N = 4) berechnet sich anhand der
Aufsummierung aller Massen innerhalb solcher Elutionsvolumina für die eine Agglomerationsgröße
c∝I(o°)extrapol.
N=I(o°)extrapol.
kg,i∗�R
g
a�d
𝑖
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-109-
von N = 3,5 bis N = 4,5 gemessen wurde. Die Berechnung der Massenverteilung erfolgte anhand
Gleichung (117).
(117)
Bei der Berechnung der Massenverteilung wurde die Bandenverbreitung der AF-FFF nicht
berücksichtigt, hierdurch unterliegt jede Fraktion einer inhärenten Polydispersität. Die Auswertung der
Trägheitsradien jeder Fraktion ist somit ein gemittelter Wert. Die aus Gleichung (117) erhaltene
Verteilung unterliegt somit einer „Verbreitung“. Für die Probe NexSil20 sind die Verteilungen der
Aggregatgrößen bei den erwähnten Konzentrationen der Silica NP in Abbildung 43 dargestellt.
Abbildung 43: Aggregatgröße von NexSil20 in Gegenwart von Serumproteinen in Abhängigkeit der eingesetzten NP
Konzentration.
Die Aggregatgrößenverteilungen der Proben NexSil8 und NexSil125 befinden sich im Anhang,
Abbildung 54, relevante Größen der Proben wurden in Tabelle 15 zusammengestellt. Die dargestellten
Größen sind der relative Massenanteil an nicht aggregiertem Primärteilchen (m%1), der Mittelwert der
Aggregatgröße als Gewichtsmittel (<N>w) entsprechend der Abbildung 43 und der Mittelwert der
Aggregatgröße als Zahlenmittel nach Umrechnung ni= mi/Mi.
mN% = �c ∆V
V(N+0,5)
V(N−0,5)∗100
∑c ∆V
∞
0
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-110-
Tabelle 15: Relevante Größen der konzentrationsabhängigen Aggregatgrößenverteilung der Proben NexSil8, NexSil20 und
NexSil125.
A
NP
/
m2/mL
m%
1
(Masse
Primärteilchen)
<N>
w
<N>
n
NexSil8
NexSil20
NexSil125
NexSil8
NexSil20
NexSil125
NexSil8
NexSil20
NexSil125
0,6
86,9
87,3
83,3
1,9
1,9
1,2
1,1
1,1
1,2
0,3
90,2
75,6
72,0
2,3
4,0
1,3
1,1
1,2
1,2
0,12
78,3
67,0
55,7
3,8
6,4
1,6
1,2
1,4
1,3
0,06
48,5
31,5
49,9
8,3
33,5
1,7
1,6
2,6
1,4
0,045
57,1
13,5
42,2
8,3
37,8
1,8
1,4
4,9
1,5
0,03
33,8
15,1
35,2
17,6
41,7
1,9
2,1
4,1
1,6
Obwohl zuvor angenommen wurde, dass im Falle der höchsten Konzentration kaum Aggregate
vorlagen, konnte quantifiziert werden, dass alle Proben mit 15% ihrer Masse bereits aggregiert waren.
Mit abnehmender Partikelkonzentration sank bei allen Proben der relative Massenanteil der freien
Primärteilchen weiter ab. Bei der niedrigsten hier gemessenen NP Konzentration lag bei der Probe
NexSil20 der größte Massenanteil innerhalb von Aggregaten vor, nur 15% der NP waren nicht
aggregiert. Die Proben NexSil8 und NexSil125 wiesen Masseanteile von ca. 35% an Einzelteilchen
auf. Die Probe NexSil8 wies ebenfalls kontinuierlich sinkende Werte der relativen Masseanteile freier
NP auf, wobei dennoch stark schwankende Werte erhalten wurden. Dies ist durch einen hohen Fehler
des Trägheitsradius bezüglich der Primärpartikel von NexSil8 bedingt, da sich die entsprechenden
Trägheitsradien an der unteren Auflösungsgrenze der winkelabhängigen Streuintensität befinden.
Der Mittelwert der Agglomerationszahl <N>w gibt qualitativen Aufschluss über die Größe der
Aggregate. Die betrachteten Proben zeigten ein kontinuierliches Anwachsen der Aggregatgröße mit
abnehmender NP Konzentration. Hierbei wies NexSil20 die größten Aggregate auf, gefolgt von
NexSil8. Die Probe NexSil125 zeigte prinzipiell den gleichen Trend im Aggregationsverhalten, jedoch
wurden sehr viel kleinere Aggregate erhalten, vor allem lagen hier Dimere und Trimere vor.
Zusammenfassend wurde ein konzentrationsabhängiges Aggregationsverhalten beobachtet. Eine
Erniedrigung der NP Konzentration erzielte bei allen Proben mehr und größere Aggregate. Sowohl die
gemittelte Aggregatgröße als auch der aggregierte Masseanteil zeigte die relative Reihenfolge der
Proben zueinander:
NexSil20 > NexSil8 >> NexSil125.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-111-
Diese Reihenfolge ist unter dem Vorbehalt zu betrachten, dass die relativen Teilchenkonzentrationen
der Proben zueinander nicht übereinstimmten. So berechnen sich bei identischen Oberflächen die
Teilchenzahlen im Verhältnis N2
N1=r12
r22, da gilt Ai= Ni∗4πri2. Die Teilchenkonzentrationen der
Proben NexSil8, NexSil20 und NexSil125 liegen daher bei identischer Oberfläche im Verhältnis
33,3 : 14,5 : 1 vor. Dies schlägt sich in der Koagulationskinetik nieder. Für einen direkten Vergleich
des Aggregationsverhaltens der drei Proben soll daher im Folgenden die Aggregationskinetik
untersucht werden.
5.3.6 Koagulationskinetik der amorphen Silica NP in Gegenwart von Proteinen
Die Koagulationskinetik kann entweder durch Variation der Zeit oder durch Variation der
Teilchenzahlen erfasst werden. Da bereits Messungen bei unterschiedlicher NP-Konzentration
durchgeführt wurden, lassen sich diese Ergebnisse durch Umrechnung auf Teilchenzahlen direkt zur
Untersuchung der Koagulationskinetik verwenden.
Die Koagulationskinetik wurde bereits in Kapitel 2.2.5 eingeführt, siehe Gleichung (18).
Smoluchowski leitete anhand der Koagulationskinetik Ausdrücke für die zeitliche Entwicklung der
Teilchenkonzentration im Einheitsvolumen kleiner Koagulate n1, n2, n3, … sowie die zeitliche
Änderung der Gesamtzahl aller Teilchen ∑n her.38
(118)
(119)
In den Gleichungen (118) und (119) lassen sich, mit Ausnahme der Geschwindigkeitskonstante k, alle
Parameter für die Proben NexSil8, NexSil20 sowie NexSil125 anhand der konzentrationsabhängigen
Charakterisierungen der Silica-Agglomerate berechnen, Kapitel 5.3.5: n0 resultiert aus der
ursprünglichen Teilchenanzahl pro mL, welche sich anhand der Größe der NP sowie der bekannten
Dichte und der eingesetzten Massenkonzentration bestimmen lässt, vgl. Kapitel 5.2.2. t entspricht der
Zeit zwischen Mischen der Probe und Messen und wird auf 10 Minuten = 600 s angenähert. Die
Anzahl der Primärteilchen n1, welche nach 600 Sekunden in Lösung verbleiben, wurde bereits
indirekt über den Masseanteil der Primärteilchen bestimmt m%1, siehe Tabelle 15, da gilt n1
n0=
m%1100
�. Es folgt �n1
n0=�m%1100
�. Die Summe aller Agglomerate ∑n berechnet sich aus der
�n1
n0=1
1 + k n0 t
∑n
n0=1
1 + k n0 t
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-112-
Anzahl der ursprünglichen Teilchenzahl sowie der mittleren (zahlengemittelten) Agglomerationszahl.
Vereinfachtes Beispiel: Wenn 500 Teilchen dimerisieren, entstehen 250 Agglomerate; bilden sich im
schnitt Pentamere, so liegen nur noch 100 Agglomerate vor. Es gilt: ∑n
n0=1〈N〉n
�. 〈N〉n wurde
ebenfalls konzentrationsabhängig für die Proben NexSil8, NexSil20 sowie NexSil125 im vorherigen
Kapitel bestimmt, zusammengefasst in Tabelle 15. Die hieraus berechneten Werte für
n0,�n1
n0 sowie ∑n
n0 sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt, die absoluten Teilchenzahlen
n0 beziehen sich auf 1 mL.
Tabelle 16: Fortschritt der Koagulation anhand relativer Teilchenanzahlen des Einzelteilchens n1n0
⁄ sowie der Abnahme der
Gesamtteilchenzahl ∑n n0
⁄ von NexSil8, -20 und -125 nach 10 Minuten in Abhängigkeit der ursprünglichen Teilchenzahl n0
bezogen auf 1mL.
𝐧𝟎
�𝐧𝟏
𝐧𝟎
∑𝐧
𝐧𝟎
NexSil8
NexSil20
NexSil125
NexSil8
NexSil20
NexSil125
NexSil8
NexSil20
NexSil125
5,9E+14
2,6E+14
1,8E+13
0,93
0,93
0,91
0,91
0,92
0,85
2,9E+14
1,3E+14
8,8E+12
0,95
0,87
0,85
0,93
0,83
0,85
1,2E+14
5,1E+13
3,5E+12
0,88
0,82
0,75
0,85
0,74
0,76
5,9E+13
2,6E+13
1,8E+12
0,69
0,57
0,71
0,64
0,38
0,72
4,4E+13
1,9E+13
1,3E+12
0,75
0,37
0,65
0,69
0,21
0,67
2,9E+13
1,3E+13
8,8E+11
0,58
0,39
0,59
0,48
0,24
0,63
Auftragungen von 1/�n1
n0 gegen n0 bzw. 1/ ∑n
n0 gegen n0 sollten gemäß den Gleichungen (118) und
(119) lineare Verläufe aufweisen, wobei die Geschwindigkeitskonstante unter Berücksichtigung der
Zeit aus der Steigung = t ∗k erhalten wird. Eine Auftragung gemäß Gleichung (119) ist für die Probe
NexSil20 in Abbildung 44 dargestellt. Diese zeigt einen typischen Verlauf, wie er ebenso für die
übrigen beiden Proben gefunden wurde, siehe Anhang.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-113-
Abbildung 44: Widerlegung der Koagulationskinetik gemäß Gleichung (119) für die Probe NexSil20. Das hergeleitete
Fitmodell beschreibt keinen linearen Verlauf dieser Auftragung.
Im Gegensatz zum Koagulationsverhalten gemäß Smoluchowski konnte für keine der Proben ein
linearer Verlauf der Messdaten gefunden werden. Dies wird bereits aus Tabelle 16 ersichtlich. Der
Fortschritt der Agglomeration lässt sich anhand des Terms 1/ ∑n
n0 erfassen. Je größer dieser Wert ist,
desto mehr Teilchen müssen sich innerhalb von Aggregaten aufhalten. Gemäß Gleichung (119)
skaliert dieser Wert mit der vorangeschrittenen Zeit t, mit der Geschwindigkeitskonstante k sowie der
ursprünglichen Teilchenzahl im Einheitsvolumen n0. Tabelle 16 zeigt genau entgegengesetztes
Verhalten mit Änderung der Teilchenzahl n0 (sowohl k als auch t werden als konstant betrachtet), wie
es anhand der Koagulationskinetik erwartet würde.
Eine mögliche Erklärung des beobachteten Agglomerationsverhaltens liegt in einem zeitlich vorher
ablaufenden Agglomerationsschritt, der nach 10 Minuten bereits abgeschlossen ist und nicht mehr die
nachfolgende Koagulationskinetik prägt. Ein solcher Schritt wäre die verbrückende Flockung der NP
mit Proteinen, die mit Geschwindigkeiten nahe der schnellen Koagulation abläuft.47 Die
Geschwindigkeit dieser Flockung unterläge der zeitlichen Abnahme der Oberfläche, die mit
verbrückungsfähigen Proteinen belegt ist. Sollten diese Proteine innerhalb des Messfensters von 10
Minuten aufgebraucht sein, kommt die verbrückende Flockung zum Erliegen. Als erste Annäherung
soll angenommen werden, dass die verbrückende Flockung beendet und die Anzahl an gebildeten
Brücken B innerhalb einer Konzentrationsreihe konstant sind. Durch jede Verbrückung wird die
Teilchenzahl herabgesetzt, dargestellt in Abbildung 45.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-114-
Abbildung 45: Schematische Darstellung der veränderten Startbedingungen der Koagulationskinetik nach Smoluchowski.
Die Anzahl der anfänglichen Teilchen n0 wird um die Anzahl der Brücken B verringert.
Da mit jeder Brücke die Teilchenanzahl um eins abnimmt, startet die Koagulationskinetik gemäß
Gleichung (119) mit n′0= n0−B. Es folgt die modifizierte Gleichung:
(120)
Wie sich im Nachfolgenden noch herausstellen wird, ist das Produkt k∗t vernachlässigbar klein. Die
Funktion Y = 1/(1 + ax) wird für kleine a zu Y = 1 −ax. Es folgt nach Umformung:
(121)
Eine Auftragung von ∑n gegen n0 sollte einen quadratischen Anteil mit dem Vorfaktor der
Geschwindigkeitskonstante aufweisen. Tatsächlich zeigen alle Proben einen linearen Verlauf ohne
Einfluss von k∗t. Die entsprechenden Graphiken sind in Abbildung 46 dargestellt.
∑n
n0−B=1
1 + k (n0 −B) t
�n = n0−B−k t (n0−B)2
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-115-
Abbildung 46: Abnahme der Teilchenanzahl durch Aggregation der Proben NexSil8, NexSil20 sowie NexSil125 in
Gegenwart von 5% FCS.
Die Anzahl der Verbrückungen B werden aus dem Schnittpunkt mit der X-Achse erhalten da hier gilt
n0= B. Die Ergebnisse sind in Tabelle 17 wiedergegeben.
Tabelle 17: Anzahl der Verbrückungen der Proben NexSil8 NexSil20 und NexSil125.
Linearer Fit an
Abbildung 46
NexSil8
NexSil20
NexSil125
Steigung 0,94 0,96 0,87
y-Achsenabschnitt -1,14 E13 -1,30 E13 -2,73 E11
Verbrückungen
(x-Achsenabschnitt)
1,22 E13 1,35 E13 3,13 E11
Eine anschauliche Interpretation dieses Fitmodells bedeutet, dass unabhängig von der Konzentration
der NP 1,2 ∗1013−1,3 ∗1013 Verbrückungen aufgebaut werden, noch bevor eine nachweisbare
Koagulation aufgrund der verminderten elektrostatischen Stabilisierung stattfindet. NexSil125, das
sich im Aggregationsverhalten deutlich abhob, wies hierbei im Vergleich zu den kleineren Proben nur
einen Bruchteil der Verbrückungen auf (3,1 ∗1011). Koagulation entsprechend einer Kinetik nach
Smoluchowski konnte innerhalb der beobachteten 10 Minuten anhand des fehlenden quadratischen
Terms nicht nachgewiesen werden.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-116-
Zum Fitmodell nach Gleichung (121) wurde eine Abweichung der Messdaten festgestellt. Es müsste
eine Steigung der Fitgerade von 1 vorliegen, die angefitteten Steigungen lagen jedoch bei 0,87 im
Falle des NexSil125 und bei 0,96 für NexSil20. Am Beispiel der Probe NexSil125 bedeutet dies, dass
alle Werte für ∑n unabhängig von der anfänglichen Teilchenzahl n0 um 13% zu niedrig sind. Zwei
Ursachen können hierfür verantwortlich sein. Zum einen ist es möglich, dass die Probe NexSil125 zu
13% der Gesamtteilchenzahl als Dimer vorliegt. Da dieser Befund unabhängig von n0 ist, muss dieser
Agglomerationsprozess vor dem Experiment eingetreten sein. Folglich wäre die Probe bereits in der
Stammlösung gealtert. Eine andere Erklärung resultiert aus der breiten Größendispersität einzelner
Teilchen. Sofern Primärteilchen existieren, die größere Trägheitsradien aufweisen als ein Dimer
zweier Primärteilchen mittlerer Größe, Fall würden Dimere gemessen obwohl tatsächlich nur große
Primärteilchen vorlägen.
Von Christoph Bantz wurde die Teilchengröße der Probe NexSil125 anhand einer Auszählung von
TEM Abbildungen vermessen. Der 1σ-Bereich dieser Auszählung zeigte eine breite Größenverteilung
mit Radien von RTEM=50,4 nm ± 16,5 nm. Dies entspricht normierten Radien von �RTEM
a�= 1 ±
0,33. Mit dem Modell einer harten Kugel folgt für den normierten Trägheitsradius ein 1σ-Bereich von
�Rg
a�= 0,775 ± 0,254. Die Folgen dieser breiten Größendispersität auf die Steigung der Auftragung n0
gegen ∑n soll anhand der folgenden Abschätzung verdeutlicht werden:
Zur Berechnung des Masseanteils an aggregierter Probe wurde dem Monomer ein normierter
Trägheitsradius von �Rga
⁄�N=1= 0,775 zugeteilt. Partikel mit Trägheitsradien größer als
�Rga
⁄�N=1,5= 1,03 wurden als Dimere gewertet, vgl. Gleichung (117). Dies bedeutet, ein einzelnes
Partikel, welches um mehr als Δ�Rga
⁄�= +0,255 vom Mittelwert der normierten Trägheitsradien
abweicht, würde fälschlicherweise als Dimer gewertet. Der Anteil der Primärteilchen, welcher
fälschlicherweise als Dimer gewertet wurde, lässt sich unter der Annahme einer Gaußverteilten
Größendispersität berechnen. Dieser Anteil entspräche dem einseitigen Flächenanteil der
Gaußfunktion der Werte �Rga
⁄�> 1,03. Anhand der TEM-Auszählung wird σ als 0,254
angenommen. Es folgt (122).
(122)
Da sich Gleichung (122) nicht auf eine elementare Stammfunktion zurückführen lässt, wurde die
Lösung anhand einer Tabelle der Flächeninhalte der Standardnormalverteilung ermittelt.149 Bei einer
gegebener Größenverteilung der Probe NexSil125 werden 16% der Probe scheinbar als Dimere
gewertet, ohne dass eine tatsächliche Aggregation vorliegt. Da diese Berechnung auf einer TEM-
�1
�2π∗0,2542
+∞
1,03 ∗exp �−��Rg
a�−0,775�2
2∗0,254
2
� d �Rg
a�= 0,16
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
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-117-
Auszählung basiert, handelt es sich hierbei um Teilchenzahlen (n%1 = 84%; n%2 = 16%). Weiterhin
senkt jedes Dimer die Summe aller Teilchen ∑n um eins herab. Hieraus resultiert eine erwartete
Steigung der Probe NexSil125 in Abbildung 46: ∑n
n0=𝑛0−𝑛%2
n0= 0,84.
Die breite Größenverteilung erklärt somit die beobachtete Steigung von 0,87. Eine geringe
Abweichung der erwarteten von der beobachteten Steigung liegt in der Genauigkeit der
Trägheitsradienmessung, der Genauigkeit der TEM Auszählung sowie der Annahme einer
gaußförmigen Größenverteilung.
Das angewandte Fitmodell beschreibt folglich die Messdaten sehr gut. Die Linearisierung anhand
Gleichung (121) zeigt für alle Proben eine konstante Anzahl an Verbrückungen, unabhängig von der
eingesetzten Teilchenzahl. Dies legt nahe, dass die Kinetik für alle Proben bereits nach 600 Sekunden
vollständig abgeschlossen ist. Es zeigte sich, dass die Proben NexSil8 und NexSil20 ähnlich viele
Proteinbrücken (1,2 ∗1013−1,3 ∗1013) ausbilden. Die Probe NexSil125 wurde mit 3,1 ∗1011
Brücken wesentlich ineffizienter verbrückt. Die Verbrückungseffizienz soll daher im Folgenden
genauer diskutiert werden.
5.3.7 Modell zur Verbrückungseffizienz
Wie bereits im vorherigen Kapitel gezeigt wurde, bilden die Proben NexSil8 und NexSil20 innerhalb
des untersuchten Konzentrationsbereichs der NP in Gegenwart von 5 Vol.-% Serumproteinen in RPMI
Medium 1,2 ∗1013−1,3 ∗1013 Verbrückungen aus. Die Probe NexSil125 hebt sich hiervon mit nur
3,1 ∗1011 Verbrückungen deutlich ab. Die Anzahl der Brücken muss jedoch nicht mit der Anzahl der
verbrückenden Proteine übereinstimmen, da eine einzelne Verbrückung aus mehreren Proteinen
bestehen kann. Aus diesem Sachverhalt ergibt sich eine mögliche Ursache des unterschiedlichen
Agglomerationsverhaltes der Proben NexSil125 im Vergleich zu den beiden kleineren Partikelspezies.
Die Größenverhältnisse der Silica NP sind in Abbildung 47 schematisch dargestellt, wobei die Größe
der Proteine so angepasst wurde, dass eine Verbrückung von 4 nm entsteht. Anhand der gezeigten
Größenverhältnisse wird ersichtlich, dass im Falle der Probe NexSil8 nur ein Protein pro Verbrückung
innerhalb des interpartikulären Raums platzfindet, hingegen passen mehrere Proteine zwischen den
interpartikulären Raum zweier NexSil125 Teilchen.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
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-118-
Abbildung 47: Vergleich der Größenverhältnisse der Proben NexSil8, NexSil20 sowie NexSil125 bei Verbrückung durch
Proteine mit einer Dicke von 4 nm. Die Kollisionsbox zeigt den dichtest möglichen Abstand eines nachfolgenden
Agglomerationsschrittes an. Jede Verbrückung führt zu einer sterisch blockierten Oberfläche, auf der keine weiteren
Verbrückungen stattfinden können.
Als stark vereinfachtes Modell würde die Probe NexSil125 ineffizienter durch Proteine verbrückt
werden, da im Vergleich zu den kleineren NP mehrere Proteine an einer einzelnen Verbrückung
teilnehmen können. Dies erklärt jedoch nicht die hohe Diskrepanz der Anzahl der Verbrückungen von
NexSil125 mit 3,1 ∗1011 Brücken zu NexSil8 mit 1,2 ∗1013. Sofern zwei NexSil8 NP tatsächlich
durch nur ein Protein verbrückt würden, entspräche dies etwa 40 Proteinen innerhalb einer NexSil125
Verbrückung. Anhand der Darstellung der Größenverhältnisse der NP sowie der Proteine, Abbildung
47, erscheint eine Anzahl von 40 Proteinen pro Brücke als unrealistisch groß. Das Vorhandensein
mehrerer Proteine pro Verbrückung reicht daher als alleinige Erklärung der ineffizienteren
Verbrückung von NexSil125 nicht aus.
Die geringe Verbrückungseffizienz der Probe NexSil125 kann weiterhin durch eine sterisch blockierte
Oberfläche in direkter Nachbarschaft zur Brücke bedingt sein. Proteine, die innerhalb des Bogenmaßes
von 26πr (= 60°) von einer Verbrückung entfernt adsorbiert wurden, können aus sterischen Gründen
keine weiteren Verbrückungen eingehen. Für die Proben NexSil8, NexSil20 und NexSil125 entspricht
dies Abständen von 10,5 nm, 15,7 nm sowie 62,8 nm, innerhalb derer keine weitere Verbrückung
zustande kommen kann. Im Falle des NexSil8 wird dieser Abstand bereits durch zwei benachbarte
Albumin Proteine aufgespannt, welche eine Kantenlänge von jeweils 8,4 nm besitzen.54 Folglich
besitzt NexSil8 keine sterisch blockierte Oberfläche, da bereits das der Brücke benachbarte Protein
verbrückend wirken kann. Der sterisch blockierte Raum wird durch das verbrückende Protein voll
ausgefüllt. Im Falle des NexSil20 wird hierfür ein Protein benötigt, welches eine Oberfläche mit
Kantenlänge größer 15,7/2 nm bedeckt. Die Probe NexSil125 hingegen zeichnet sich durch eine große
sterisch blockierte Oberfläche aus. Die Größe der sterisch blockierten Oberfläche soll anhand der
folgenden Rechnung abgeschätzt werden.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-119-
Im dreidimensionalen Raum lassen sich um eine Vollkugel maximal 12 weitere Vollkugeln
(Satelliten) dichtest gepackt anordnen. Jede der Vollkugeln belegt eine Oberfläche der zentralen
Vollkugel von AKugel12
�. Die sterische Blockierung ragt jedoch über AKugel12
� hinaus, da neben der
Fläche direkt unterhalb des Satelliten noch weiterhin die Hälfte der Fläche unterhalb des
Nachbarsatelliten nicht verbrücken kann. Vergleiche hierzu Abbildung 47, die sterische Blockierung
erfolgt innerhalb eines Winkelmaßes von 120°, obwohl AKugel12
� einem Winkelmaßes von 60°
entspricht. Die sterisch blockierte Fläche ist doppelt so groß wie die der einfachen Fläche unterhalb
eines Satelliten, diese beträgt somit Ablockiert=AKugel6
� (Grund: Jeder Satellit hat 5
Nachbarsatelliten. Die Fläche unterhalb eines Satelliten entspricht 1 ∗ A/12, weiterhin werden 5 mal
die Fläche eines Fünftels des Nachbarsatelliten sterisch blockiert, dies entspricht nochmals einer
Fläche von 1 ∗ A/12).
Diese Überlegung der sterischen Blockierung gilt nicht nur für die zentrale Vollkugel, ebenso gilt dies
für das verbrückte Nachbarteilchen. Dieses bildet in gleicher Weise eine Proteinkorona aus, welche
potentiell verbrücken kann, sofern sich Proteine außerhalb des sterisch blockierten Bereichs befinden.
Die blockierte Oberfläche pro Brücke B entspricht somit Ablockiert
B=AKugel3
�.
Tabelle 18: Flächeninhalte der sterisch blockierten Oberfläche in direkter Nachbarschaft zu einer Verbrückung.
AKugel / nm2
Ablockiert
B=AKugel3
�
NexSil8
1282
427
NexSil20
2865
955
NexSil125
42273
14091
Tabelle 18 gibt den absoluten Oberflächeninhalt zwischen zwei NP an, der pro Verbrückung sterisch
blockiert wird. Sämtliche Proteine, die dort adsorbieren, können nicht mehr verbrückend wirken.
Sofern die Anzahl der zur Verbrückung befähigten Proteine limitiert ist, senkt eine Adsorption solcher
Proteine innerhalb dieses Raums direkt die Anzahl der maximal möglichen Verbrückungen. Im Falle
des NexSil125 ist die sterisch blockierte Oberfläche um einen Faktor 33 größer als bei der Probe
NexSil8.
NexSil8 und NexSil20 weisen eine ähnliche Anzahl an Verbrückungen auf. Dies legt nahe, dass die
Anzahl der Proteine pro Brücke sowie die Anzahl der sterisch blockierten Proteine identisch sind. Im
einfachsten Falle handelt es sich hierbei um ein einziges Protein, welches sowohl verbrückt als auch
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-120-
den sterisch blockierten Raum vollständig ausfüllt. Für ein Protein im Größenbereich eines Albumins
ist dies für NexSil20 nicht möglich. Proteomanalysen der Proteinkorona auf Silica NP zeigen
allerdings, dass sich besonders Serumproteine größer 250 kDa in der Korona anreichern,61 welche den
Raum der sterischen Blockierung ausfüllen können. Ebenfalls weisen überhaupt erst große
Makromoleküle die Eigenschaft auf, zwei Teilchen zu verbrücken, da sowohl eine Mindestdistanz der
gegenseitigen elektrostatischen Repulsion überbrückt werden muss, als auch mehrere Bindungsstellen
zu einer festen Verbrückung ausgebildet werden müssen.47 Sofern sich NexSil8 NP tatsächlich durch
ein einziges Protein verbrücken lassen resultiert für NexSil125 eine sterische Blockierung der 33-
fachen Fläche, annähernd der Oberfläche für 33 Protein identischer Größe, welche zur weiteren
Verbrückung inaktiviert werden. Dies bedingt direkt die beobachtete geringe Effizienz der
Verbrückung der Probe NexSil125.
5.3.8 Zusammenfassung und Diskussion
Im Hinblick auf Zellversuche wurden amorphe Silica NP mit hydrodynamischen Radien von 10,1 nm,
15,1 nm und 58,6 nm im Zellmedium RPMI 1640 zur Erfassung des Agglomerationsverhaltens
größencharakterisiert. Innerhalb des untersuchten Zeitfensters von 10 Minuten konnte trotz der
Verminderung der elektrostatischen Stabilisierung keine Agglomeration beobachtet werden. Der
Grund liegt in der ungewöhnlich hohen Stabilität amorpher Silica NP, welche durch eine die NP
umschließende „Gel-Schicht“ vermittelt wird.136
In Gegenwart von Serumproteinen erfolgte Agglomeration der Silica NP. Die Charakterisierung
erfolgte unter Bedingungen analog zu Zellversuchen. Hierfür wurden die Proben zu RPMI 1640
Zellmedium gegeben, dem 5 Vol.-% FCS zugesetzt wurden (dies entspricht einer Proteinkonzentration
von 2,5 g/L).
Das Agglomerationsverhalten wurde zunächst qualitativ erfasst. Es wurde i) eine
Konzentrationsabhängigkeit der NP auf die Größe der Aggregate beobachtet, ii) anhand des
Zetapotentials der Agglomerate festgestellt, dass die Koagulation nicht durch Ladungsneutralisation
verursacht wurde. Weiterhin konnte iii) Agglomeration auf hoch affin bindende Proteine
zurückgeführt werden, da eine Agglomeration ausblieb sofern solche Proteine zuvor entfernt wurden.
Agglomeration erfolgte iv) irreversibel und v) schnell. Diese phänomenologischen Beobachtungen
decken sich mit Ergebnissen zur Flockung von kolloidalen Dispersionen mit Polymeren.25
Mechanistisch handelt es sich hierbei um eine Verbrückung von NP mit Makromolekülen. Diese
Beobachtungen sollen im daher Folgenden gesondert diskutiert und mechanistisch auf Koagulation,
aufgrund verringerter elektrostatischer Stabilisierung, bzw. auf eine verbrückende Flockung bezogen
werden.
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-121-
i) Die Konzentrationsabhängigkeit der NP auf das Agglomerationsverhalten
Der Einfluss der NP Konzentration auf das Agglomerationsverhalten ist nichts Ungewöhnliches. Die
Koagulationskinetik nach Smoluchowski38 wird direkt durch die Teilchenzahl bestimmt, siehe
Gleichung (18). Entgegen der Erwartung lagen Silica NP in Gegenwart von Serumproteinen jedoch
bei geringer Teilchenkonzentration stärker aggregiert vor als bei hoher Konzentration. Mit der
Koagulationskinetik nach Smoluchowski ist dies nicht in Einklang zu bringen. Dieses Phänomen lässt
sich anhand eines verbrückenden Mechanismus leicht erklären, da nach einem vereinfachten Modell
die Verbrückung eine Funktion der Oberflächenbelegung ist. Nach Smellie und LaMer ist die
Wahrscheinlichkeit zur Brückenbildung proportional zum Belegungsgrad Θ sowie zum Belegungsgrad
der unbelegten Oberfläche (1 −Θ) mit einem Maximum bei Θ= 0,5.48 Bei einer
Oberflächenbelegung kleiner 50% an hart bindenden und verbrückungsfähigen Proteinen würde nach
diesem Modell, in Übereinstimmung mit den hier vorliegenden experimentellen Beobachtungen, die
Probe mit abnehmender Teilchenzahl stärker agglomerieren.
ii) Keine vollständige Ladungsneutralisation
Eine vollständige Ladungskompensation einer kolloidalen Oberfläche ist mit Polyelektrolyten in der
Praxis nur schwer umsetzbar, da das Ladungsmuster der kolloidalen Oberfläche und des
Makromoleküls übereinstimmen müssen.43 Ebenfalls wurden in der vorliegenden Arbeit
Zetapotentiale der Proteinbeladenen NP von etwa -10 mV gemessen. Die Oberflächenladung wurde
erwartungsgemäß nicht komplett neutralisiert, jedoch ist zu erwarten, dass die Probe längerfristig
koagulieren wird. Dieser Prozess wurde in den folgenden 48 Stunden beobachtet. Eine detaillierte
Untersuchung war Bestandteil der Dissertation von Christoph Bantz.134
iii) Die Agglomeration wurde durch die harte Proteinkorona vermittelt
Zunächst erscheint es kurios, dass nach Entfernung affin bindender Proteine, welche etwa 2% der
Gesamtmasse der Proteine in Lösung entspricht, eine Agglomeration von Silica NP ausbleibt. Nach
der DLVO Theorie ist es nicht direkt ersichtlich, dass die kolloidale Stabilität proteinbeladener NP
von der Bindungsaffinität der Proteinkorona zur Silica Oberfläche beeinflusst wird. Ein möglicher
Zusammenhang ergibt sich aus der Nettoladung verbrückender Proteine. Sofern diese aufgrund
positiver Ladungen verbrückend wirken, bedingen diese sowohl hohe Bindungsaffinität zur negativ
geladenen kolloidalen Oberfläche als auch gleichzeitig ein Herabsenken der elektrostatischen
Stabilisierung. Im Falle der verbrückenden Agglomeration resultiert der Zusammenhang zwischen
Bindungsaffinität und Verbrückungsfähigkeit der Proteine direkt anhand des zugrundeliegenden
Mechanismus. Proteine müssen an zwei Oberflächen hart binden um zu verbrücken. Eine
Proteinanalyse der verbrückenden Proteine ist in Planung und wird für ein weiterführendes
Verständnis des Agglomerationsprozesses sehr aufschlussreich sein.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-122-
iv) Die Irreversibilität der Agglomeration
Eine Irreversibilität der Agglomeration kann sowohl für verbrückende Agglomeration als auch für
Koagulation durch eine verminderte elektrostatische Stabilisierung beobachtet werden. Ein
wesentlicher Unterschied beider Mechanismen ist die Folge der Irreversibilität auf die
Reproduzierbarkeit der Messdaten. Da der verbrückende Mechanismus sehr schnell abläuft
(Koagulationszeiten sind nur wenig länger als eine barrierefreie Koagulation47) und die Aggregation
vom Mischungsverhältnis des Kolloids zum Makromolekül abhängt, erfolgt eine empfindliche
Abhängigkeit der Agglomeration von den Arbeitsbedingungen, wie der Art der Polymerzugabe, des
Mischvorgangs, des Schüttelns oder des Rührens.49 Eine solche Abhängigkeit konnte anhand einer
mehrstufigen Zugabe von Silica NP zu Serumproteinen ebenfalls nachgewiesen werden. Hierbei
entstanden Aggregate mit gemittelten hydrodynamischen Radien von 250 nm in Gegenwart eines
Großteils nicht aggregierter NP, vgl. Abbildung 40.
v) Die hohen Geschwindigkeitsraten der Verbrückung
Die kolloidale Stabilität ist kinetischer Natur, sodass die Höhe der kinetischen Barriere Vmax die
Geschwindigkeitsrate der kontinuierlich ablaufenden Koagulation bestimmt. Es konnte gezeigt
werden, dass die Proteinkorona-vermittelte elektrostatische Stabilisierung im Vergleich zu den
ursprünglichen amorphen Silica NP verringert ist. Die kontinuierlich ablaufende Koagulation wurde
von Christoph Bantz innerhalb von 48 Stunden beobachtet.134 Eine kontinuierlich ablaufende
Koagulation konnte in den ersten 10 Minuten jedoch nicht nachgewiesen werden, vgl. Abbildung 44.
Die Probe trübte sich innerhalb weniger Sekunden und blieb die restlichen 10 Minuten unverändert.
Von der verbrückenden Flockung ist bekannt, dass Teilchen mit Geschwindigkeitsraten nahe der
barrierefreien Koagulation verbrücken.47 Der Zeitrahmen von 10 Minuten war daher zu lang, um die
Geschwindigkeitskonstante der Verbrückung von Silica NP mit Proteinen zu bestimmen, dennoch
konnte anhand eines kinetischen Modells gezeigt werden, dass der Prozess der Verbrückung für alle
Proben unabhängig der Teilchenzahl n0 nach 10 Minuten vollständig abgeschlossen war. Dies führt zu
der Schlussfolgerung, dass der Agglomeration der Silica NP in Gegenwart von Proteinen ein
zweistufiger Prozess zugrunde liegt. Dies sind eine verbrückende Flockung mit kurzen
Koagulationszeiten innerhalb von wenigen Sekunden sowie eine nachfolgende Koagulation aufgrund
der verringerten elektrostatischen Stabilisierung, welche sich während eines Zeitrahmens von 48
Stunden nachweisen lässt.
Die quantitative Erfassung des Agglomerationszustandes gelang durch die Kopplung der AF-FFF an
eine online MALLS Detektion. Es wurden an den fraktionierten Proben online Trägheitsradien erfasst
und anhand eines eigens hergeleiteten Modells zum Wachstum von DLA Teilchen-Cluster Aggregaten
bis N < 5 sowie von Cluster-Cluster Aggregates für N≥6 die Häufigkeitsverteilungen der
Amorphe Silica Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
___________________________________
-123-
Agglomerationszahlen berechnet. Hierbei konnte der Fortschritt der Koagulation nicht mit dem
Modell der Koagulationskinetik nach Smoluchowski in Einklang gebracht werden. Die Messdaten
ließen sich jedoch durch eine Modifizierung dieses kinetischen Modells beschreiben, welche einen
vorgeschalteten, bereits abgeschlossenen Prozess der Verbrückung berücksichtigt.
Es konnte in Gegenwart einer konstanten Menge an Serumproteinen eine konstante Anzahl an
gebildeten Brücken gemessen werden, unabhängig von der Gesamtzahl der vorliegenden Teilchen.
Die untersuchten Teilchenkonzentrationen erfassten hierbei einen Bereich von 2,9*1013 – 5,9*1014
Teilchen von NexSil8, 1,3*1013 – 2,6*1014 Teilchen von NexSil20 sowie 8,8*1011 – 1,8*1013 Teilchen
pro Milliliter für die Probe NexSil125. Die Proben NexSil8 und NexSil20 bildeten mit 1,2 ∗1013 bzw.
1,3 ∗1013 Brücken pro Milliliter ähnlich viele Verbrückungen aus. Die Probe NexSil125 hob sich
hiervon mit 3,1 ∗1011 Verbrückungen pro Milliliter deutlich ab. Die Ursache liegt in der relativen
Größe der NP im Vergleich zu den adsorbierten Proteinen. Obwohl alle Experimente, welche die
Proben NexSil8, NexSil20 sowie NexSil125 vergleichen, unter identischen
Oberflächenkonzentrationen durchgeführt wurden, erzeugt eine einzelne Verbrückung der Probe
NexSil125 eine benachbarte Fläche von 14000 nm2, welche zur weiteren Verbrückung sterisch
unzugänglich ist. Proteine die innerhalb dieser Fläche adsorbieren sind nicht verbrückungsfähig. Dies
senkt direkt die Verbrückungseffizienz der Probe NexSil125. Für die Proben NexSil8 sowie NexSil20
wurde anhand der relativen Größen begründet, dass zwei benachbarte Proteine diesen Bereich der
sterischen Blockierung überspannen können. Das der Brücke benachbarte Protein ist bereits zur
weiteren Verbrückung befähigt. Hierdurch entfällt die sterische Blockierung der auf der Oberfläche
adsorbierten Proteinen. Weiterhin wird für die Proben NexSil8 sowie NexSil20 aufgrund der relativen
Größenverhältnisse zu Proteinen gewährleistet, dass nur ein Protein an einer Verbrückung teilnehmen
kann. Dies führt zu einer hohen Verbrückungseffizienz dieser beiden Proben im Vergleich zur Probe
NexSil125.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-124-
5.4 Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
Poly(organosiloxan) Nanopartikel (POS) weisen bezüglich ihrer Architektur sowie ihrer
Funktionalisierungsmöglichkeiten eine hohe Diversität auf.150,151,152,153 Dies erlaubt, im Gegensatz zu
kommerziell erhältlichen Produkten, eine für biologische oder medizinische Fragestellungen
maßgeschneiderte Architektur.154,23,155 Die in dieser Arbeit verwendeten Poly(organosiloxan)
Nanopartikel wurden von Frau Olga Koshkina im Zuge ihrer Dissertation synthetisiert.156 Diese
Poly(organosiloxan) NP besitzen einen Kern-Schale Aufbau mit chromophoren Gruppen im Kern,
eine carboxylierte bzw. PEGylierte Oberfläche zur sterischen Stabilisierung sowie für biokompatible
Eigenschaften. Diese Partikel werden daher als multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
bezeichnet.
Die Synthese derartiger Nanopartikel beruht auf dem Sol-Gel Prozess, welches die Hydrolyse und
Kondensation von alkoxysubstituierten Silanen in wässrigen Dispersionen bezeichnet. Hierzu wurde
Diethoxydimethylsilan (D) zum Kettenwachstum, Triethoxymethylsilan (T) zum Quervernetzen und
Ethoxytrimethylsilan (M) zum Kettenabbruch genutzt. Die verwendeten Monomere sind in Abbildung
48 dargestellt. Zusätzlich wurden chromophore Gruppen wie Chlormethylphenyl- bzw. Rhodamin-B
markierte Trimethoxysilane, eingesetzt. Die Kondensationsreaktion erfolgte sauer katalysiert in
Gegenwart von Dodecylbenzolsulfonsäure als Tensid. In einem zweiten Schritt wurde um diesen Kern
eine Schale in gleicher Weise synthetisiert. Diese wird aus dem di- und trifunktionellen Monomer
unter Zusatz von Trimethoxysilylpropyl-Succinsäureanhydrid dargestellt. Hierbei dient das
Succinsäureanhydrid zur Oberflächenfunktionalisierung mit Carboxylgruppen. Die
Kondensationsreaktion der Kettenenden wurde mittels Ethoxytrimethylsilan (M) abgebrochen, dieser
Schritt wird als „endcapping“ bezeichnet. Es resultierten Carboxyfunktionalisierte
Poly(organosiloxan) NP, die im Folgenden mit der Abkürzung TPSA3 benannt werden.
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-125-
Abbildung 48: Schematischer Syntheseweg zur Darstellung carboxylierter und PEGylierter Poly(organosiloxan) NP.
In einer anschließenden Synthese wurde die Oberfläche PEGyliert. Hierzu wurden die
Carboxygruppen an der Oberfläche der NP mit N-Hydroxysuccinimid zum Reaktivester umgesetzt.
Die Kopplung von aminofunktionalisiertem PEG-2000 erfolgte durch Dicyclohexylcarbodiimid
(DCC). Diese Probe wird im Folgenden als NHS06 bezeichnet.
Abbildung 49: Links: TEM Abbildung von Poly(organosiloxan) NP, TPSA3. Rechts: Ausgezählte Radienverteilung der
TEM-Messung aus 85 Messwerten.
Die Größencharakterisierung der Proben erfolgte zunächst anhand von TEM Aufnahmen, die von
Olga Koshkina durchgeführt wurden. Abbildung 49 zeigt eine solche TEM Aufnahme der Probe
TPSA3 sowie eine Größenauszählung über 85 Messwerte. Die Größenauszählung bezog sich auf die
Größe der Primärteilchen, wenn auch die TEM Abbildung den Eindruck vermittelt, die Probe läge
größtenteils agglomeriert vor. Bei der beobachteten Aggregation handelt es sich um ein Messartefakt
und wird von der Probenpräparation hervorgerufen. Hierbei wird die Probe getrocknet, welches zur
100nm
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-126-
Aggregation führt. Tatsächlich kann eine geringfügige Aggregation der Probe nicht ausgeschlossen
werden, dies wird jedoch anhand von DLS Messungen zu einem späteren Zeitpunkt diskutiert. Die
Auszählung der Partikelgrößen ergab einen Zahlenmittelwert des Radius von 10 nm, allerdings wurde
eine Größenverteilung von 5 – 14 nm gefunden.
Zum Vergleich dieses Ergebnisses mit Messungen der Lichtstreuung wurden anhand dieser
Auszählung relevante Mittelwerte (< RTEM>n, < RTEM>1/z, �< Rg,TEM
2>z) von Radien berechnet,
welche in Kapitel 3.1.4 eingeführt wurden. Eine Berechnung des gemittelten Molekulargewichtes
erfolgte nach Gleichung (138), unter der Annahme einer Trockendichte von 1,23 solcher
Poly(organosiloxan) NP.157 Zur Berechnung der Trägheitsradien wurde das ρ-Verhältnis einer harten
Kugel zugrunde gelegt. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 19 zusammengefasst. Auf eine
entsprechende Auswertung der Probe NHS06 wurde verzichtet, da die PEGylierung aufgrund des
geringen Kontrastes im TEM nicht nachweisbar war.
Tabelle 19: Mittelwerte der Radienverteilung der Probe TPSA3.
Probe
Größen
Berechnete Werte anhand der Größenauszählung
TPSA3
< RTEM>n
9,9 nm
< RTEM>1/z
11,5 nm
�< Rg,TEM
2>z
9,2 nm
ρ−Verhältnis
0,8
< M >n
3,4x106 g/mol
< M >w
4,4 x106 g/mol
PDI
1,3
Zur Charakterisierung der Proben mittels Lichtstreuung wurden sowohl statische als auch dynamische
Lichtstreumessungen durchgeführt. Für die Werte des Brechungsindex Inkrements wurden
Literaturwerte verwendet.158 Diese betrugen für die Probe TPSA3 �dn
dc�Silox= 0,107 mL/g,157 für die
Probe NHS06 wurde ein gemitteltes Brechungsindexinkrement bestehend aus den Werten von
PEG �dn
dc�PEG= 0,135 mL/g und Poly(organosiloxan) �dn
dc�Silox angenommen. Die Berechnung des
gemittelten Brechungsindexinkrements erfolgte anhand Gleichung (123). Da der Massenanteil an PEG
innerhalb der Probe NHS06 unbekannt war wurde Gleichung (124) zur Hilfe genommen. Diese
entspricht der Zimm-Gleichung bei der das Brechnungsindexinkrement aus dem Kontrastfaktor isoliert
wurde. Die Molmasse des Poly(organosiloxan) NP MSilox entspricht dem Molekulargewicht der Probe
TPSA3, es resultierten zwei Gleichungen mit zwei Unbekannten. Die Ergebnisse sind in Tabelle 20
zusammengestellt.
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-127-
(123)
(124)
Die Zusammensetzung der Probe NHS06 ergab das Verhältnis von MSilox+PEG
MSilox = 1,85, die Probe
besteht somit zu 54% aus Poly(organosiloxan) und zu 46% aus PEG-2000. Das gemittelte
Brechungsindexinkrement ergab einen Wert von 0,120 mL/g.
Die Messgrößen, die aus der SLS und DLS resultierten, sind in Tabelle 20 dargestellt. Der Zuwachs
des Molekulargewichts durch die PEGylierung betrug 3,59 ∗106 g/mol. Dies entspricht 1800 PEG
Polymeren pro Partikel. Legt man einen hydrodynamischen Radius von 15 nm zugrunde, entspricht
dies einer Oberflächendichte von 0,6 PEG Molekülen pro nm2. Anhand der Mark-Houwink Beziehung
wurde mittels GPC Messungen für PEG ein Durchmesser von d = 0,0382 ∗M0,6∗nm/(g/mol)0,6
bestimmt.159 Dies entspricht für PEG-2000 einem Durchmesser von 3,7 nm, wobei sich ein PEG
Knäuel stark verformen würde, um eine solche dichte PEGylierungsschicht zu erreichen.
Berechnungsfehler entstanden hier durch das Vorliegen einer Größenverteilung. Unter
Vernachlässigung einer Größendispersität berechnete sich die Oberflächenbelegung als: Θ∝
〈Mcoating〉w
〈R〉2. Die korrekte Formel müsste lauten: Θ∝〈Mcoating〉n
〈R2〉. Für Mittelwerte gilt: 〈R〉2<〈R2〉
sowie 〈M〉n<〈M〉w. Die berechnete Oberflächenbelegung ist somit ohne Berücksichtogung der
Größendispersität tendenziell zu groß.
Die Probe NHS06 zeigte aufgrund der PEGylierung einen Zuwachs des hydrodynamischen Radius
von 5 nm im Vergleich zu der Probe TPSA3. Der Durchmesser eines freien PEG-2000 Knäuels wurde
mittels Mark-Houwink Beziehung auf 3,7 nm abgeschätzt. Die beobachtete Radienzunahme bei der
DLS-Messung wird daher als geringfügig zu groß erachtet. Diese Diskrepanz von 1,3 nm kann durch
die eingeschränkte Beweglichkeit der Polymerkette bei Ankopplung des Knäuels an eine Oberfläche
bedingt sein. Zusätzlich kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Probe NHS06 partielle aggregiert
vorliegt. Es wurde ein ρ-Verhältnis von 0,9 berechnet. Für kugelförmige Teilchen würde ein ρ-
Verhältnis von 0,78 erwartet werden. Dieser zu hohe Wert wird durch die Polydispersität der Probe
verursacht, welche bereits bei der Probe TPSA3 beobachtet wurde.
�dn
dc�=�dn
dc�PEG(Mw−MSilox)+�dn
dc�SiloxMSilox
Mw
K′�dn
dc�2∗c
R=1
Mw
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-128-
Tabelle 20: Messgrößen aus Lichtstreuversuchen der Proben TPSA3 und NHS06.
Probe
Größe aus LS
Messwerte
TPSA3
< Rh>1/z
15,0 nm
µ2
0,13
< M >w
4,23 x106 g/mol
�< Rg2>z
10,3 nm (±3,5 nm)
ρ−Verhältnis
0,7 (0,5-0,9)
NHS06
< Rh>1/z
20,0
µ2
0,06
< M >w
7,82 x106 g/mol
�< Rg2>z
18,3nm
ρ−Verhältnis
0,9
Mittels DLS der Probe TPSA3 wurden größere hydrodynamische Radien gemessen als sie in der
Radienauszählungen der TEM Abbildungen bestimmt wurden. Dieser Unterschied ist auf die
Genauigkeit der TEM Auszählung zurückführen: Diese wird sowohl durch statistische Fehler
beeinflusst, da 85 Messwerte innerhalb nur einer TEM Abbildung lediglich stichprobenhaft eine
Größenverteilung wiedergeben, als auch durch systematische Fehler, wie unscharfe Kontrastgrenzen,
eine Größenseparation der NP entlang des TEM-Grids oder Trends in der Wahrscheinlichkeit, mit der
bestimmte Größen von der auszählenden Person erfasst werden.
Die µ2-Werte von 0,13 lassen auf eine breite Größenverteilung der Probe schließen, ebenso kann dies
durch geringfügige Aggregation bedingt sein. Diese würde die Ergebnisse der Lichtstreuung zu
größeren Mittelwerten verschieben. Der Trägheitsradius hingegen ergab Werte nahe der
Auflösungsgrenze mit 10,3 nm. Dieser Wert ist allerdings stark fehlerbehaftet, die Trägheitsradien der
Verdünnungsreihe der SLS schwankten zwischen 7 - 14 nm. Eine sinnvolle Berechnung des ρ-
Verhältnisses gelang nicht, die Werte schwankten zwischen 0,5 - 0,9 nm.
Die Proben TPSA3 und NHS06 wurden weiterhin mittels AF-FFF untersucht, siehe Abbildung 50.
Am Bandenmaximum wurden entsprechend der Kalibrierung Radien von 13,9 nm für TPSA3 und
23,9 nm für NHS06 gefunden. Es konnte eine starke Bandenasymmetrie beobachtet werden, welche
durch Partikel-Membran-Wechselwirkungen verursacht wird.160,103,106 Diese Wechselwirkungen
beeinflussen die Retention maßgeblich, auf Grundlage der Kalibrierung werden hierdurch fehlerhafte
Werte ermittelt. Die oben erwähnten Größen von 13,9 nm und 23,9 nm konnten somit durch AF-FFF
nicht zuverlässig bestimmt werden. Dennoch erlaubt das AF-FFF Elugramm Aussagen über die
Größenverteilung zu treffen. Es wurde jeweils nur eine Bande gefunden, entsprechend einer einzigen
Größenverteilung. Ebenso konnte mit dieser Methode keine Aggregation der Probe beobachtet
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-129-
werden, zum Vergleich hierzu siehe Abbildung 35. Eine ausführlichere Diskussion der Ergebnisse zur
AF-FFF erfolgt in Kapitel 5.4.2.
5.4.1 Poly(organosiloxan) Nanopartikel unter physiologischen Bedingungen
Die Charakterisierung der Proben TPSA3 und NHS06 in Gegenwart von Proteinen führte zu
besonderen Herausforderungen. Die Charakterisierung mittels DLS war nicht möglich, da die
hydrodynamischen Radien der Proben zu dicht an der Größenverteilung der Proteine des FCS lagen.
Folglich konnten Einzelkomponenten nicht mittels Multikomponentenanalyse voneinander separiert
werden, vgl. Kapitel 5.1.3.
Vorversuche zur Fraktionierung der Proben in Gegenwart von FCS mittels AF-FFF ergaben eine
verzögerte Retention. Im Gegensatz zu dem Verhalten amorpher Silica NP in Gegenwart von
Proteinen zeigten die Proben TPSA3 und NHS06, unabhängig der eingesetzten Konzentration der NP,
keine Aggregation. Zur Größencharakterisierung der sich ausbildenden Proteinkorona soll in diesem
Kapitel ein neuartiger Ansatz gewählt werden. Hierzu wurde neben der AF-FFF die statische
Lichtstreuung herangezogen.
5.4.2 Größencharakterisierung der Proteinkorona mittels Fluss-Feld Fluss Fraktionierung
Für die AF-FFF Messungen wurden ohne zusätzliche Verdünnung oder Aufkonzentration jeweils ein
Teil der Probe-Stammlösung zu neun Teilen RPMI 1640 Medium zugegeben. Die Konzentrationen
der Stammlösungen betrugen 9,4 mg/mL für TPSA3 sowie 1,4 mg/mL für NHS06. Anhand der mittels
Lichtstreuung bestimmten Größen konnten die Oberflächenkonzentrationen nach Verdünnung
berechnet werden. Diese betrugen in RPMI Medium 0,16 m2/mL für TPSA3 sowie 0,018 m2/mL für
die Probe NHS06. Die Oberflächenkonzentrationen beider Proben waren somit zwar nicht identisch,
lagen jedoch innerhalb eines ähnlichen Messbereichs, welcher ebenfalls für die amorphen Silica NP
Anwendung fand.
Die Elugramme, dargestellt in Abbildung 50, zeigen für beide Proben eine monomodale
Größenverteilung, jedoch wurde vor allem bei der Probe TPSA3 eine starke Bandenasymmetrie
beobachtet. Die Bande steigt innerhalb von 30 Sekunden bis zu ihrem Maximum steil an und fällt über
100 Sekunden wieder auf das Grundniveau ab. Diese Bandenasymmetrie wird durch Teilchen-
Membran Wechselwirkungen hervorgerufen und führt typischerweise zu einem beladungsabhängigen
Retentionsverhalten.104 Die auf Grundlage der Kalibrierung erhaltenen Radien stimmen für TPSA3 mit
13,9 nm annähernd mit der DLS Messung mit 15,0 nm überein, siehe Tabelle 20. Abweichungen
ergeben sich durch die FFF als Relativmethode sowie durch den reziproken z-Mittelwert des
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-130-
hydrodynamischen Radius der DLS. Die Probe NHS06 zeigte ein schlechtes Signal/Rausch-
Verhältnis, einerseits durch die niedrigere Konzentration, andererseits durch weniger Farbstoff pro
Masse. Die mittels AF-FFF berechneten Radien der Probe NHS06 lagen mit 23,9 nm im Vergleich zu
den DLS Messungen mit 20 nm, unerwartet hoch. Die Ursache liegt in der Oberflächenmodifizierung
mit PEG. Hierdurch befinden sich die Ladungen der Carboxylfunktionalisierung des ursprünglichen
TPSA3s nicht mehr an der Oberfläche und das elektrostatische Potential wird, als Funktion des
Abstandes zur Oberfläche, geschwächt. Wie bereits in Kapitel 3.2.4 beschrieben, führt dies zu einer
verzögerten Elution und entsprechend der Kalibrierung zu einem apparenten Größenzuwachs.
Ebenso wurden TPSA3- und NHS06-NP in Gegenwart von Proteinen charakterisiert. Hierzu wurden
diese Proben in Zellmedium RPMI 1640 unter Zusatz von 5 Vol.-% FCS in gleicher Weise zum
vorherigen Versuch 1/10 verdünnt. Die Elugramme zeigten einen ausgeprägten Voidpeak, aufgrund
von Proteinen, die zu klein waren um eine Retention zu erfahren. Die daran anschließende
Elutionsbande wies bei beiden Proben eine verzögerte Retention auf und entsprach einem
Radienzuwachs von 1,8 nm für TPSA3 und 0,6 nm für NHS06. Es liegt die Vermutung nahe, dass
dieser Größenzuwachs der Dicke der Proteinkorona entspricht, was allerdings nicht notwendiger
Weise der Fall sein muss. Durch Absorption von Proteinen werden neben der gemessenen Größe der
NP ebenso die Teilchen-Teilchen- und Teilchen-Membran-Wechselwirkungen verändert und somit
das Retentionsverhalten beeinflusst. Bei beiden Proben liegt jedoch der Verschiebung der Banden eine
Proteinadsorption zugrunde. Die genaue Bestimmung der Dicke dieser Korona wird im folgenden
Kapitel nochmals aufgegriffen.
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-131-
Abbildung 50: AF-FFF von TPSA3 und NHS06 in Gegenwart von RPMI 1640 und RPMI 1640 + 5%FCS.
Eine alternative Größenbestimmung der NP mittels AF-FFF basierte auf der Schwerpunktsberechnung
der Elutionsbande. Der Schwerpunkt ist gemäß Gleichung (125) definiert. Hierbei bezeichnet Ri den
Radius, welcher mittels Kalibrierung ermittelt wurde, absi entspricht der gemessenen Absorption der
Fraktion i.
(125)
Die Absorption ist proportional zur Massekonzentration der jeweiligen Fraktion abs.i∝mi, sofern die
detektierte Absorption nicht durch Lichtstreuung überlagert wird. Das Volumen jeder Fraktion ist
konstant. Anhand Gleichung (126) wird ersichtlich, dass es sich bei dem Schwerpunkt der
Elutionsbande um einen Gewichtsmittelwert des Radius handelt.
(126)
< R > = ∑Riabs.i
∑abs.i
< R > = ∑Rimi
∑mi= ∑RiNiMi
∑NiMi= < R >w
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-132-
Es ist zu berücksichtigen, dass es sich bei der Elutionsbande nicht um tatsächliche Größenverteilungen
handelt, sondern dass die Elutionsbande einer Bandenverbreitung unterliegt. Diese wird sowohl
inhärent durch das Fraktionierungsprinzip als auch durch Wechselwirkungen bedingt. Bei
achsensymmetrischer Bandenverbreiterung um den Schwerpunkt bleibt dieser unverändert. Der
anhand des Schwerpunktes berechnete Größenzuwachs bei Proteinadsorption betrug für die Probe
TPSA3 3,7 nm und für die Probe NHS06 0,9 nm. Somit sind diese Werte größer als die am
Bandenmaximum errechnete Radienzunahme. Mögliche Erklärungen sind die Erhöhung der
Bandenasymmetrie durch veränderte Wechselwirkungen sowie eine breitere Größenverteilung bei
Proteinadsorption. Die Ergebnisse sind in Tabelle 26, Seite 143, zusammengefasst.
Im Folgenden soll die Größencharakterisierung der Proteinkorona mittels AF-FFF Messungen als
Vergleich zu den Ergebnissen der SLS-Messungen dienen. Weiterhin soll die qualitative Beobachtung
festgehalten werden, dass sich die Elutionsbanden durch Proteinadsorption nur verschieben, sich
jedoch keine neuen Elutionsbanden ausbilden. Letzteres würde auf die Anwesenheit von NP-NP-
Aggregaten hindeuten. In den folgenden Betrachtungen wird klar unterschieden werden, ob eine
monomodale Größenverteilung von NP-Proteinagglomeraten vorliegt, oder ob gleichzeitig NP-NP-
Agglomerate anwesend sind.
5.4.3 Größencharakterisierung der Proteinkorona mittels statischer Lichtstreuung
Sowohl TPSA3 als auch NHS06 zeigten bei Lichtstreuexperimenten eine erhöhte absolute
Streuintensität sobald Serumproteine gegenwärtig waren. Diese Erhöhung der Streuintensität kann
Rückschlüsse über die Masse an adsorbierten Proteinen liefern. In diesem Kapitel soll die
Streuintensitätserhöhung quantifiziert werden. Das hierauf folgende Kapitel wird sich mit Modellen
zur Dateninterpretation befassen.
Die Streuintensität der NP abzüglich der Streuintensität des Lösemittels bzw. der Serumproteine soll
zunächst definiert werden. Im Folgenden bezieht sich der Index 1 auf die Messungen der NP in RPMI
1640 Medium, der Index 2 bezieht sich auf Messungen der NP, die in RPMI 1640 Medium unter
Zusatz von 5 Vol.-% Serumproteinen vorlagen:
I1= INanopartikel inRPMI−IRPMI
I2= INP in FCS−IFCS
Das RPMI Medium mit und ohne Proteinzusatz wurde als Lösungsmittel betrachtet und gemäß
Gleichung (46) von der Gesamtstreuintensität abgezogen.
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-133-
Anhand einer umgestellten Zimm-Gleichung (127) konnten die Verhältnisse der Streuintensitäten der
NP mit und ohne Proteinkorona I(Ɵ)1
I(Ɵ)2 berechnet werden (128).
(127)
(128)
Es bezeichnen I(Ɵ)1 und I(Ɵ)2 die Messwerte der SLS sowie Rg,1 den Trägheitsradius der NP ohne
adsorbierte Proteine, siehe Tabelle 20. Alle Parameter auf der linken Seite in Gleichung (128) waren
somit bekannt, die rechte Seite sollte einen linearen Verlauf der Auftragung gegen q2 ergeben. Diese
Linearisierung erlaubte die Extrapolation gegen q2 = 0 der Streuintensitätsverhältnisse I�q2→0�1
I(q2→0)2, sowie
die Ermittlung des Trägheitsradius der NP mit Proteinkorona Rg,2 aus der Steigung. Abbildung 51
zeigt eine solche geeignete Auftragung.
01x10
14
2x10
14
3x10
14
4x10
14
5x10
14
6x10
14
7x10
14
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
TPSA3
NHS06
I
1
/I
2
*(1+1/3R
g,1
2
q
2
)
q
2
/ cm
-2
Y = 1,722E-16 q
2
+ 0,724
Y = 7,393E-17 q
2
+ 0,318
Abbildung 51: Verhältnis der Streuintensitäten, gemäß Gleichung (128), von NP in RPMI zu NP in RPMI + 5Vol% FCS. Die
eingesetzten NP waren TPSA3 und NHS06.
Die linearen Fits ergaben für die beiden Proben TPSA3 und NHS06 in Gegenwart von Serumproteinen
Trägheitsradien Rg,2 von jeweils 26 nm. Diese Werte sind mit hohen Fehlern behaftet, da auf der
Ordinate der Trägheitsradius der freien NP Rg,1 zugrunde gelegt wurde. Der Fehler der Steigung des
linearen Fits und folglich die Berechnung des Trägheitsradius der NP plus Proteine skaliert somit
k′�dn
dc�2 c
I(Ɵ)∗r
D
2
V=1
M�1 + 1
3R
g
2q2�
I(Ɵ)1
I(Ɵ)2∗�1 + 1
3R
g,1
2q2�=rD
2
V
rD
2
V∗k′
k
′
∗�dn
dc�1 2
�dn
dc�2
2
∗c1
c2∗M1
M2∗�1 + 1
3R
g,2
2q2�
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-134-
direkt mit dem Fehler der Trägheitsradienberechnung der freien NP. Für TPSA3 lag der
Trägheitsradius mit 10 nm an der unteren Auflösungsgrenze der SLS.
Die Problematik des Winkelabhängigen Fehlers entfiel bei der Extrapolation von q2→0, sowohl
TPSA3 als auch NHS06 ergaben den erwarteten linearen Verlauf. Der Ordinatenabschnitt bezeichnete
das Verhältnis der auf q2 = 0 extrapolierten Streuintensitäten:
YTPSA3=I(0°)1
I(0°)2= 0,318
YNHS06=I(0°)1
I(0°)2= 0,724
Y ist somit die reziproke Zunahme der Streuintensität. Die Streuintensität der Probe TPSA3 stieg
somit um 214% in Gegenwart von Serumproteinen an, die Probe NHS06 zeigte, relativ zur
Streuintensität der freien NP, einen Anstieg um nur 38%.
5.4.4 Modelle zur Dateninterpretation
Y beschreibt das Verhältnis der Streuintensität der Freien NP (Index 1) zu der Streuintensität der NP
in Gegenwart von Serumproteinen (Index 2), extrapoliert auf q →0.
(129)
Entsprechend Gleichung (127) wird die Streuintensität bei θ=0°, unter Vernachlässigung des
zweiten Virialkoeffizienten, durch das Brechungsindexinkrement, die Konzentration sowie dem
Molekulargewicht bestimmt. Es folgt Gleichung (130).
(130)
Anhand verschiedener Modelle zum Agglomerationsvorgang von NP mit Proteinen lassen sich
ausgehend von Gleichung (130) Schlüsse über die Proteinkorona ziehen. Im Folgenden sollen drei
Modelle hergeleitet werden, welche Grenzfälle der NP-NP bzw. NP-Protein Agglomeration darstellen.
Y = I(0°)1
I(0°)2
Y = �dn
dc�1 2
�
dn
dc�2
2
∗c1
c2∗M1
M2
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-135-
5.4.4.1 Grenzfall 1: Zunahme der Streuintensität durch Aggregation der Nanopartikel (nur
minimale Proteinadsorption) – Modell A
Eine Aggregation der Probe kann in Anwesenheit von Proteinen schon bei sehr geringer Menge an
adsorbierten Proteinen erfolgen. Gerade unter physiologischen Ionenstärken mit Debye-Längen von
etwa 0,8 nm liegen kolloidale Dispersionen nur schwach stabilisiert vor und Sekundäreffekte, die zur
Koagulation führen, treten verstärkt auf.25 So induzieren schon einzelne adsorbierte Proteine eine
Ladungsinhomogenität auf der NP-Oberfläche, welche die Dispersion zusätzlich destabilisiert.
Grenzfall 1 beschreibt daher eine Koagulation der Probe ohne Ausbildung einer Proteinkorona. Die
Streuintensität erhöht sich aufgrund der Zunahme des Molekulargewichts der entstehenden Aggregate.
Von einer Molekulargewichtserhöhung aufgrund von adsorbierten Proteinen soll in dieser Betrachtung
abgesehen werden, dieser Fall wird als Grenzfall 2 betrachtet werden.
Es können zwei Annahmen getroffen werden. Zum einen bleibt die Konzentration der Probe in
Lösung konstant, es folgt c1= c2. Darüber hinaus ändert sich die Zusammensetzung der Probe nicht,
es gilt �dn
dc�1=�dn
dc�2. Aus Gleichung (130) folgt direkt die Zunahme des Molekulargewichts,
Gleichung (131).
(131)
Die gemessenen Werte von Y lagen bei 0,318 für TPSA3 und bei 0,72 für NHS06. Sollte
ausschließlich Aggregation der Probe vorliegen, entspräche dies im Gewichtsmittel einer
Verdreifachung bzw. dem 1,4-fachung des Molekulargewichts. Dies entspräche im Mittel einem
Trimer des TPSA3 bzw. teilweise Dimerisierung der Probe NHS06, veranschaulicht in Tabelle 21.
Tabelle 21: Lichtstreu-Intensitätszunahme durch Aggregation der Probe ohne Proteinadsorption.
Probe
M
2
/M
1
Veranschaulichung – Modell A
TPSA3 3,14
NHS06 1,38
M2
M1= 1
Y
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-136-
5.4.4.2 Grenzfall 2: Zunahme der Streuintensität durch Adsorption von Proteinen (keine NP
Koagulate) – Modelle B1 & B2
Grenzfall 2 beschreibt ausschließliche Proteinadsorption, ohne dass eine Aggregation der Probe
stattfindet. Grundlage hierfür ist, dass die NP nach Ausbildung der Proteinkorona ausreichend
stabilisiert vorliegen. Es liegt ein Massetransfer von Proteinen in Lösung auf die Grenzfläche der NP
vor. Die Auswirkungen auf ein statisches Streuexperiment sollen nun betrachtet werden.
Bei dem Adsorptionsvorgang bleibt die Anzahl der Nanopartikel unverändert (N1= N2). Die
Massenkonzentration erhöht sich jedoch, da die Nanopartikel die Masse in Form von Proteinen
adsorbieren. Die Konzentration ändert sich entsprechend Gleichung (132).
(132)
Zusätzlich ändert sich die Zusammensetzung der Probe, und somit der Kontrastfaktor der NP mit
Korona �dn
dc�2. Es wird für die weitere Berechnung ein gemittelter �dn
dc�-Wert angenommen.
(133)
Index 1 entspricht den Poly(organosiloxan) NP, Index P entspricht den adsorbierten Proteinen. Hieraus
folgt: m1+ mP= m2 . Gleichung (132) lässt sich umstellen zu (134):
(134)
Durch Einsetzen von Gleichung (134) in Gleichung (133) folgt die Berechnung des gemittelten
Brechungsindexinkrements, in Abhängigkeit der Zunahme des Molekulargewichts bei
Proteinadsorption:
(135)
Die gemessene Zunahme der Streuintensität 1 Y
⁄ konnte mittels Gleichung (130) beschrieben werden.
Hier sind nun sowohl die Konzentration der NP bei Proteinadsorption bekannt, Gleichung (132), als
auch das Brechungsindexinkrement, Gleichung (135). Nach Einsetzen der genannten Gleichungen in
(130) und Umformen folgt hieraus die Zunahme des Molekulargewichts durch Proteinadsorption in
Abhängigkeit der beobachteten Streuintensitätszunahme (137).
c1
c2= m1
V
V
m2= M1N1
M2n2=M1
M2 |mit: N1= N2
�dn
dc�2=�dn
dc�1m1+�dn
dc�PmP
m1+ mP
M2
M1=m1+ mP
m1
�dn
dc�2=M1
M
2
�dn
dc�1+M1
M
2
�dn
dc�P�M2
M
1
−1�
= M1
M2�dn
dc�1+�dn
dc�P−M1
M2�dn
dc�P=M1
M2�dn
dc�1+�dn
dc�P�1−M1
M2�
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-137-
(136)
(137)
Für das Brechungsindexinkrement wurde für TPSA ein Wert von 0,107 mL/g angenommen bzw.
0,120 für NHS06, siehe Kapitel 5.4. Für die adsorbierten Proteine wurde der Wert von 0,193 mL/g für
BSA verwendet.158 Denaturiertes BSA weist einen geringeren �dn
dc�-Werte von 0,17 mL/g auf. Da
Proteine durch Adsorption denaturieren können, wurde sowohl der native als auch der denaturierte
Fall betrachtet. Die Ergebnisse der Molekulargewichtserhöhung durch Proteinadsorption sind in
Tabelle 22 zusammengefasst.
Tabelle 22: Zuwachs des Molekulargewichts durch Proteinadsorption für den betrachteten "Grenzfall 2" - Ausschließlich
Proteinadsorption, keine NP-NP Aggregation.
M2/M1
nativ
denaturiert
TPSA3
1,43
1,49
NHS06
1,11
1,12
Die Probe TPSA3 zeigte eine Molekulargewichtszunahme von 43% bzw. 49% im Falle der
Denaturierung der Proteine; für die PEGylierte Probe NHS06 ergab sich einen deutlich geringerer
Wert von nur 11% bzw. 12% bei Denaturierung von Proteinen. Das Einsetzen der Werte von
denaturierten Proteinen ergab nur einen geringen Einfluss auf die Zunahme der Partikelmasse. Um
anhand der berechneten Molekulargewichte Rückschlüsse auf die Proteinkorona zu ziehen, wurden
zwei Modelle, B1 und B2, erarbeitet. Diese beschreiben die Ausbildung einer sphärischen Korona mit
homogener Dichteverteilung, sowie die Umrechnung der adsorbierten Masse in eine äquivalente
Anzahl an Proteinen.
�1
Y=��dn
dc�1M1
M2+�dn
dc�P�1−M1
M2��
�
dn
dc�1∗M2
M1
M2
M1=��1
Y−1��dn
dc�1
�
dn
dc�P+ 1
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-138-
Modell B1: Berechnung der Dicke der Proteinkorona (homogene Masseverteilung der Korona)
Die Dicke der Proteinkorona um das NP lässt sich unter der Annahme einer
scharf definierten und sphärischen Proteinkorona mit homogener
Dichteverteilung berechnen. Allgemein gelten folgende Zusammenhänge für
Volumen, Masse und Radius einer Vollkugel:
(138)
Durch das Addieren einer sphärischen Hülle um die NP-Vollkugel wächst der Radius der
ursprünglichen Vollkugel Rh,1 um einen Faktor �Rh,2
Rh,1� an. Dieser Faktor kann als normiertes
Wachstum der Kugel betrachtet werden. Das Ausmaß des Wachstums hängt vom Volumen der Hülle
bzw. von der Masse und Dichte der Hülle gemäß Gleichung (139) ab.
(139)
Um dieses Beispiel auf die Proben TPSA3 sowie NHS06 zu übertragen sollen sich Index 1 auf die NP
und Index 2 auf die NP mit Proteinkorona beziehen, Index P bezeichnet die Proteinhülle. Mit MP=
M2−M1 folgt:
(140)
Die hydrodynamischen Radien Rh,1 für TPSA3 und NHS06 wurden mittels DLS bestimmt, siehe
Tabelle 20. Die Umrechnung auf Zahlenmittelwerte der hydrodynamischen Radien erfolgte durch eine
Abschätzung anhand der TEM Abzählung. Es wurde hier ein Verhältnis von 〈Rh〉1/z
〈Rh〉n= 1,16 gefunden,
siehe Tabelle 19. Die Festkörperdichte solcher Poly(organosiloxan) NP beträgt 1,23 g/mL.157 Da das
Maß der Quellung jedoch unbekannt ist, wurde die Dichte anhand der Lichtstreumessungen berechnet.
Unter der Annahme des PDI von 1,3 (Tabelle 20), folgt für TPSA3 〈M〉n=〈M〉w
PDI = 3,27 ∗106 g/mol.
Die Dichte 1 berechnet sich aus: ρ1,TPSA=〈M〉n
NA∗43
⁄π〈Rh〉n3= 0,60g/mL. Dies entspricht einer Quellung
von 51% im Vergleich zur Festkörperdichte. Ein ähnliches Ergebnis lieferte bereits die TEM-
Auszählung der Probe TPSA3 im Vergleich zur DLS Messung. Es wurden Radien von 〈RTEM〉1/z=
11,5 nm und 〈RDLS〉1/z=15,0 nm ermittelt. Dem Radienzuwachs der DLS Messung liegt eine
V = M
Na ρ=4
3πRh
3
�Rh,2
Rh,1�3=V2
V1= V1+ VP
V1= 1 + MP
ρPρ1
M1
�Rh,2
Rh,1�3= 1 + �M2
M1−1�ρ1
ρP
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-139-
Quellung von 55% zugrunde. Selbige Berechnung zur Dichte wurde für die Probe NHS06
durchgeführt, es folgte ρ1,NHS06= 0,47 g/mL.
Die Dichte von Proteinen wurde aus GPC Messungen anhand der Mark-Houwink Beziehung von
Proteinen ermittelt. Der Radius von Proteinen wächst hier mit der Funktion
R = 0,081 nm �M∗mol/g
3.159 Die Dichte berechnet sich entsprechend ρP=m
V=M
Na∗4
3πR3=
0,75 g/mL.
Tabelle 23: Berechnung der Dicke der Proteinkorona für das Modell der homogenen Dichteverteilung der Proteine.
Berechnung
der
Koronadicke
< Rh,1>n
nativ
denaturiert
Rh,2
Rh,1
Dicke der Korona
Rh,2
Rh,1
Dicke der Korona
TPSA3
12,9 nm
1,108
1,40 nm
1,122
1,57 nm
NHS06
17,2 nm
1,022
0,39 nm
1,024
0,42 nm
Die berechneten Dicken der Korona sind in Tabelle 23 zusammengefasst. Es ergaben sich Werte von
1,4 -1,6 nm für TPSA3 und 0,4 nm für NHS06, je nach verwendeten �dn
dc�-Werten nativer bzw.
denaturierter Proteine.
Modell B2: Berechnung der Masse der Proteinkorona (inhomogene Masseverteilung der
Proteinkorona)
Im Falle einer nicht sphärischen Proteinkorona lässt sich deren
Dicke nur schwer definieren. Ein kugeläquivalenter
hydrodynamischer Radius Rh,2 ist für die hydrodynamischen
Eigenschaften der NP in Lösung zwar relevant, trägt allerdings
kaum zur Beschreibung der Proteinkorona bei. Die
Betrachtung einer nicht sphärischen Proteinkorona ist vor
allem dann von Bedeutung, wenn die gemittelten räumlichen
Ausmaße der Korona die Größe einzelner Proteine unterschreitet.
Anhand der Ergebnisse der SLS Messungen, siehe Tabelle 22, ließ sich die Gesamtmasse der
adsorbierten Proteine MP bestimmen. Diese Masse wurde aus der Differenz des Molekulargewichts
mit Korona M2 und dem Molekulargewicht der ursprünglichen NP M1berechnet.
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-140-
(141)
Gleichung (141) beschreibt die Umrechnung der gemessenen Molekulargewichtszunahme der
NP �M2
M1� bei Proteinadsorption auf das anteilige Molekulargewicht der Proteine MP. Die Ergebnisse
sind in Tabelle 24 wiedergegeben. Es wurde eine Gesamtmasse an Proteinen von 1,90 - 2,16 MDa je
TPSA NP gefunden, sowie 0,85 - 0,97 MDa je NHS06 NP.
Tabelle 24: Masse der adsorbierten Proteine MP auf TPSA bzw. NHS06.
M
1
x 106/ g/mol
MP x 106/ g/mol
nativ
denaturiert
TPSA3
4,43
1,90
2,16
NHS06
7,82
0,85
0,97
Berechnung des Besetzungsgrades der NP Oberfläche (Annahme: Ausschließlich Albumin adsorbiert)
Zur Veranschaulichung des Ergebnisses werden im Folgenden einige Annahmen getroffen, die mit
großen Fehlern behaftet sind, da sie auf einem stark vereinfachten Modell beruhen. Die folgende
Berechnung dient ausschließlich einer qualitativen Betrachtung. Hierfür wurde angenommen, dass es
sich bei der Gesamtmasse des adsorbierten Proteins ausschließlich um BSA handelt. Da BSA 60% der
in Serum vorhandenen Proteine ausmacht, soll diese Näherung für weitere Berechnungen dienen.
Tatsächlich würde man erwarten, dass eine Vielzahl an Proteinen adsorbieren.11
BSA besitzt eine Masse von 66kDa und kann im Querschnitt durch die Abmaße eines gleichseitigen
Dreiecks mit einer Seitenlänge von 8,4 nm angenähert werden, die Dicke entspricht 3 nm.161 Die
Anzahl der BSA Teilchen pro NP ergibt sich aus der Molmasse eines BSA Teilchens im Verhältnis
zur Gesamtmasse von adsorbiertem Protein pro NP. Weiterhin wurde der Belegungsgrad unter der
Annahme berechnen, dass ein BSA Protein mit der flachen Seite an der Oberfläche adsorbiert. Die
Querschnittsfläche des Proteins wurde entsprechend einem gleichseitigen Dreieck berechnet und
ergab ABSA= a2√3
4=30,5 nm2. Zur Berechnung der Fläche der NP wurde das Zahlenmittel des
Radius verwendet. Hierfür wurde der 1/z-Mittelwert durch DLS bestimmt und anhand der TEM
Auszählung ein Verhältnis von <Rh>1/z
<Rh>n= 1,16 zugrunde gelegt, siehe Tabelle 19. Der Belegungsgrad
ergab sich aus Θ=NBSA∗ABSA
ANP . Es wurde hierfür angenähert, dass sich BSA auf der Oberfläche nicht
entfaltet und eine vollständige Belegung der NP Oberfläche keine Freiräume aufgrund von sterischer
Blockierung erzeugt.
MP= M2−M1=��M2
M1�−1�∗M1
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-141-
Tabelle 25: Anzahl adsorbierter Proteine und Oberflächenbelegung auf TPSA3 bzw. NHS06. Als stark vereinfachtes Modell
wurde für die Vielzahl adsorbierter Proteine die Größe und Fläche von Albumin angenommen.
Oberfläche NP
M
P
x 106 / g/mol
(nativ/denat.)
Vielfache von
Albumin*
Belegungsgrad 𝚯
(nativ/denat.)
TPSA3
2101 nm2
1,90 / 2,16
28 / 33
41% / 48%
NHS06
3735 nm2
0,85 / 0,97
13 / 15
11% / 12%
In Tabelle 25 wurden die berechneten Werte zusammengefasst. Die Belegungsgrade ergaben Werte
von 41% für TPSA3 bzw. 11% für NHS06. Die abweichenden Belegungsgrade für denaturiertes BSA
basieren ausschließlich auf dem veränderten Brechungsindexinkrement. Die berechneten
Belegungsgrade waren mit 48% für TPSA3 sowie 12% für NHS06 wenig höher. Ebenso wäre zu
erwarten, dass sich bei Entfaltung des Proteins die Auflagefläche ABSA erhöht. Die Belegungsgrade
wären somit als zu klein berechnet worden.
Trotz des sehr vereinfachten Modells, dass ausschließlich Albumin adsorbiert, wurden
Belegungsgrade berechnet, die in Übereinstimmung mit den theoretischen Dicken einer
kugeläquivalenten Proteinkorona liegen. Die in Modell B1 berechneten Dicken lagen bei 1,4 - 1,6 nm
und 0,4 nm bezüglich der Korona auf TPSA3 und NHS06. Diese sind somit dünner als die Dicke eines
BSA Proteins. Ein Belegungsgrad kleiner 100% ist anhand dieses Modells plausibel.
Mittelwertsbetrachtung
Da es sich bei den Ergebnissen von Lichtstreuexperimenten immer um Mittelwerte handelt, stellen
ebenso die daraus berechneten Molekulargewichte der Proteinkorona aus Tabelle 23 und Tabelle 24
Mittelwerte dar. In diesem Abschnitt soll abgeschätzt werden, welcher Mittelwert für das
Molekulargewicht der Proteinkorona gemessen wurde.
Da sich für den betrachteten Grenzfall 2 die Teilchenanzahl nicht ändert, gilt: NP= N1= N2. Durch
Einsetzen der Definition des Zahlenmittelwerts, Gleichung (71), ergeben sich in Gleichung (141)
identische Nenner, es folgt:
(142)
Die gemessenen Molekulargewichte, sowie die Molekulargewichtszunahme sind jedoch keine Zahlen-
sondern Gewichtsmittelwerte, entsprechend gilt M1=〈M1〉w und M2
M1=〈M2〉w
〈M1〉w. Die Umrechnung von
〈MP〉n auf 〈MP〉w gelingt über den PDI gemäß Gleichung (143).
〈MP〉n=∑NkMP
N=∑Nk(M2−M1)
N=〈M2〉n−〈M1〉n
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-142-
(143)
Für den Fall, dass die Polydispersitäten während des Adsorptionsprozesses unverändert bleiben, so
dass gilt: PDIP=PDI1=PDI2, handelt es sich bei 〈MP〉 tatsächlich um einen Gewichtsmittelwert,
vgl. (143). Dies würde bedeuten, dass die relativen Größenverteilungen der NP, der NP mit Korona,
sowie der isolierten Korona identisch sind. Folglich wäre die Menge an adsorbiertem Protein
proportional zur Masse des NP. Tatsächlich besitzen kleine Partikel eine größere Oberfläche im
Verhältnis zur Masse und sollten bei Proteinadsorption im Molekulargewicht stärker als große NP
anwachsen. Dies führt unweigerlich zu einer engeren Größenverteilung, es folgt: PDI2<PDI1.
Aus Gleichung (143) wird ersichtlich, dass der Mittelwert von 〈MP〉 mit PDI1 und PDI2 korreliert.
〈MP〉 wird zu einem Zahlenmittel wenn gilt: 〈MP〉n= 〈M2〉w−〈M1〉w. Einsetzen in Gleichung (143)
führt zu (144).
(144)
(145)
Durch das bekannte Verhältnis 〈M2〉w
〈M1〉w= 1,43 für TPSA3, Tabelle 22, sowie der bekannten
Größenverteilung PDI1= 1,3 aus der TEM Auszählung resultiert aus Gleichung (145) PDI2= 1,19.
Diese Herleitung unterlag der Annahme, dass es sich bei MP um einen Zahlenmittelwert handelt.
Es werden somit zwei Grenzen festgesetzt: für PDI2=PDI1= 1,3 handelt es sich bei 〈MP〉 um einen
Gewichtsmittelwert, für PDI2= 1,19 handelt es sich bei 〈MP〉 um einen Zahlenmittelwert.
Anschaulich betrachtet bedeutet dies, dass je enger die Verteilung der NP mit Korona ausfällt, desto
stärker fließen kleine Molekulargewichte der Korona in die Mittelwertsbildung von 〈MP〉 ein.
Aufgrund der größeren Oberfläche kleiner Partikel kann angenommen werden, dass der PDI bei
Proteinadsorption sinkt. Ob der PDI bis auf einen Wert von 1,19 sinkt, lässt sich schwer abschätzen.
Mit einem PDI2 zwischen 1,19 bis 1,3 resultiert eine grobe Einschätzung des Mittelwertes, dieser liegt
zwischen dem Gewichts- und dem Zahlenmittelwert.
〈MP〉w
PDIP=〈M2〉w
PDI2−〈M1〉w
PDI1
〈M2〉w−〈M1〉w=〈M2〉w
PDI2−〈M1〉w
PDI1
PDI2=1
1 + �1PDI1
�−1�∗〈M
1
〉
w
〈M2〉w
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
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-143-
5.4.5 Zusammenfassung und Diskussion
In diesem Kapitel wurden Modelle hergeleitet, die die Zunahme der Streuintensität von NP bei
Proteinadsorption quantifizieren. Diese Modelle behandelten die Grenzfälle der ausschließlichen
Agglomeration (Grenzfall 1) sowie der Ausbildung einer Proteinkorona (Grenzfall 2). Anhand von
Vergleichsmessungen mittels AF-FFF, die Einblicke in die Größenverteilungen ergaben, ließen sich
diese Grenzfälle voneinander unterscheiden.
Eine Betrachtung des Grenzfalles 1 erzielte eine Abschätzung von Agglomerationszahlen, sofern die
Probe tatsächlich koaguliert. Es konnte ausgeschlossen werden, dass dieser Grenzfall 1 vorlag.
Trimere der Probe TPSA3 sowie Dimere der Probe NHS06 konnten in der AF-FFF nicht beobachtet
werden. Grenzfall 1 kann folglich nur sehr untergeordnet stattfinden. Aus Grenzfall 2 resuliert die
Berechnung der Koronadicke aus der Zunahme der Streuintensität. Berechnungen hierzu zeigten, dass
eine Erhöhung der Streuintensität um einen Faktor 3,1 im Falle des TPSA3 gerade einmal von einer
Korona stammt, die 1,4 – 1,6 nm dick ist. Der Grund hierfür ist die gleichzeitige Zunahme der
Massenkonzentration sowie des Molekulargewichts der NP bei Proteinadsorption. Anschaulich wird
die Proteinadsorption in der Zimmgleichung quadratisch gewichtet. Dies erlaubt ein genaues Messen,
sofern systematische Fehler minimiert werden. Hierzu zählen Unsicherheiten in der Annahme der
Proteindichte sowie des Brechungsindexinkrement in Abhängigkeit des Denaturierungszustandes.
Auswertungen der Elutionsbanden der AF-FFF entsprechend dem Flächenschwerpunkt waren
unzureichend. Aufgrund veränderter Teilchen-Membran Wechselwirkung nahm mit Proteinadsorption
die Bandenasymmetrie zu, welches den Schwerpunkt der Bande stark beeinflusste. Auswertungen am
Bandenmaximum hingegen ergaben eine Dicke der Korona von 1,8 nm für TPSA3 sowie 0,6 nm für
NHS06. Die berechneten Ausmaße der Korona sind in Tabelle 26 zusammengefasst. Eine
Umrechnung der adsorbierten Masse anhand der SLS in kugeläquivalente Dicken der Proteinkorona,
Modell B1, liefert gute Übereinstimmung mit AF-FFF Messungen. Abweichungen resultieren aus dem
Trennprinzip der AF-FFF als Relativmethode.
Tabelle 26: Berechnete Dicken der Proteinkorona aus AF-FFF Experimenten und Lichtstreumessungen im Vergleich. Den
mit (*) markierten Werten liegt ein Zuwachs der Bandenasymmetrie bei Proteinadsorption zugrunde. (**) Der Belegungsgrad
unterlag sehr groben Annäherungen, siehe Text.
Dicke der Korona / Belegungsgrad**
AF-FFF
SLS
am Peakmax.
Schwerpunkt
der Fläche*
Proteine
nativ
Proteine
denaturiert
TPSA3
1,8 nm / --
3,7 nm / --
1,40 nm / 41%
1,57 nm / 48%
NHS06
0,6 nm / --
0,9 nm / --
0,39 nm / 11%
0,42 nm / 12%
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-144-
Typische Dicken von Proteinkoronen hängen im Allgemeinen von den genauen Versuchsbedingungen
ab. Aufgrund der komplexen Zusammensetzung der Mischung von Plasmaproteinen beziehen sich
Modellsysteme zur Dickenbestimmung der Korona auf die Anwesenheit nur einer Proteinspezies. Die
Abmessungen der Korona solcher Modellsysteme hängt hierbei vom Belegungsgrad ab, welcher
entsprechend einer Adsorptionsisothermen sowohl von der Proteinkonzentration als auch von der
Bindungsaffinität des Proteins bestimmt wird.162
Bei voller Belegung ist die Dicke der Korona charakteristisch für das adsorbierte Protein. Anhand von
Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) wurde eine aus Albumin bestehende Korona auf eine
Dicke von 3,3 nm bestimmt. Transferrin erzeugt bei vollständiger Belegung eine Koronadicke von
7 nm.161 Bindungskurven in Form von Langmuir Adsorptionsisothermen sollten in diesem
Zusammenhang jedoch kritisch hinterfragt werden. Eine Proteinadsorption an NP weist häufig
Irreversibilität auf, reversible Proteinadsorption wurde vor allem erst bei der Ausbildung von
Multilayer-Koronen gefunden.163 Diese überschreiten jedoch die Dicke der einfachen Proteinbelegung.
Neben der Bestimmung der hydrodynamischen Ausmaße der Korona mittels FCS kann die Menge an
adsorbiertem Protein durch CD Spektroskopie anhand der Proteinentfaltung bei Adsorption bestimmt
werden.164 Hierbei resultierte der Belegungsgrad entsprechend der Adsorptionsisothermen aus der
Proteinkonzentration sowie derer Bindungsaffinität. Im Falle von Proteinadsorption an PVP-
funktionalisierte NP konnte jedoch ein substantiell davon abweichender Verlauf des CD Spektrums
beobachtet werden. Es konnte in diesem Fall keine komplette Entfaltung der Proteine beobachtet
werden. Erklärungen hierfür erscheinen nicht trivial und verdeutlichen die Komplexität der
Proteinadsorption an NP. Die verminderte Proteinadsorption an sterisch stabilisierten NP ist intensiv
erfoscht und ist vor allem für die Biodistribution, Biokompatibilität sowie für die therapeutische
Effizienz von NP für medizinische Anwendungen äußerst relevant.165 Ebenso wurde für die hier
untersuchte Probe NHS06, die mittels PEO funktionalisiert vorlag, nur eine sehr geringe
Proteinadsorption gefunden.
Die Probe TPSA3 zeigte eine Oberflächenbelegung von 48%. Da die Oberflächenbelegungen
typischerweise „apparenten“ Langmuirisothermen folgen,163 entspräche die gemessene
Oberflächenbelegung nur einem einzigen Messwert entlang einer Bindungskurve mit unbekanntem
kd-Wert. Die Beschreibung der Adsorptionsisotherme wird jedoch im Falle von Serumproteinen sehr
komplex und entsprechend herausfordernd. Die Bindungskurve ergäbe sich aus der Überlagerung der
Adsorption einer Vielzahl von Proteinen mit jeweiligen Konzentrationen und kd-Werten.
Die Umrechnung bzw. Annäherung der Oberflächenbelegung in eine Dicke der Korona entspräche
1,4 bis 1,6 nm. Mittels AF-FFF wurden bezüglich der Dicke der Korona mit 1,8 nm geringfügig
größere Werte gemessen. Diese entsprechen im Vergleich zur LS einer Differenz von 0,2 bis 0,4 nm.
Multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel
___________________________________
-145-
Verschiedene Ursachen tragen zu den abweichenden Werten bei. Einerseits liegen Größenunterschiede
von 0,4 nm unterhalb der angenommenen Auflösung der AF-FFF. Zusätzlich handelt es sich bei der
AF-FFF um eine Relativmethode, wodurch sich veränderte Oberflächeneigenschaften direkt auf die
Retention auswirken. Entgegen dieser geringen Abweichung beider Messmethodiken bestätigt die AF-
FFF ebenfalls den Befund, dass die Korona nicht dichtest mit Proteinen gepackt vorliegt, da eine
Dicke von 1,8 nm ebenfalls dünner ist, als eine komplette Schicht Albumin (Dicke 3,3 nm).
Zusammenfassend wurde mittels AF-FFF eine Koronadicke gemessen, die dünner war, als eine
durchgehende Albumin Schicht, sowie mittels SLS ein Belegungsgrad von 48% bestimmt. Entgegen
den in der Literatur diskutierten Modellen zur Korona ist es fraglich, ob die Definition einer
Monolayer-Korona einem Belegungsgrad von 100% entspricht. Dies würde, anhand eines statistisch
ablaufenden Adsorptionsprozesses, zu einer kompakten Anordnung von Proteinen auf der NP-
Oberfläche führen, ohne zwischenliegende, sterisch blockierte Totvolumina. Bei irreversibler
Adsorption wäre ein Belegungsgrad kleiner 100% plausibel wenn auch mit 48% etwas gering.
Dennoch stellt das hier vorgestellte Verfahren eine hoch empfindliche Methode zur
Molekulargewichtsbestimmung der Proteinkorona dar: die adsorbierte Proteinmasse erhöht die
Streuintensität quadratisch, zusätzlich ist das Brechungsindexinkrement der Proteinkorona, das gemäß
Gleichung (130) ebenfalls quadratisch in die Streuintensität einfließt, mit einem Wert von �dn
dc�=
0,193 mL/g fast doppelt so groß wie das Brechungsindexinkrement der Poly(organosiloxan) NP.
Hierdurch führt schon geringe Proteinadsorption zu einem starken Anstieg der Streuintensität. Dieses
Verfahren unterliegt jedoch systematischen Fehlerquellen in der Abschätzungen der Modellparameter
wie der Oberfläche der NP, der Dichten sowie dem Brechungsindexinkrement der Probe und der
Proteine.
Die Vorteile dieses Verfahrens liegen in der direkten Erfassung des Molekulargewichts der
Proteinkorona. Zur Umrechnung auf die Dicke der Korona müssen Annäherungen zu den Dichten der
NP sowie der Proteine in Lösung getroffen werden. Im Gegensatz hierzu kann anhand der
hydrodynamischen Eigenschaften der Nanopartikel mittels alternativen Messmethoden wie FCS oder
„Particle Tracking“ direkt auf die Größe der Korona geschlossen werden. Häufig wird allerdings
zugrunde gelegt, dass die Proteinkorona den Raum hydrodynamisch vollständig ausfüllt. Ebenfalls
müssen auch hier Modelle entwickelt sowie Annäherungen getroffen werden, mit deren Hilfe die
hydrodynamische Dicke der Korona in eine Proteinmasse bzw. in eine Albumin-äquivalente Anzahl
der adsorbierten Proteine errechnet werden können.
Die Charakterisierung proteinbeladener NP mittels SLS bietet einen alternativen Zugang zur
Erfassung des Molekulargewichts der Korona, welches mittels anderen Messverfahren nicht direkt
zugänglich ist. Eine Ausnahme hierzu bilden jedoch analytische Zentrifugationsversuche. Es eigenen
sich zwei experimentelle Ansätze:
Charakterisierung von Nanopartikeln in biologisch relevanten Medien
___________________________________
-146-
A) Die Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten proteinbeladener NP. Gemäß Gleichung (115),
Seite 96, skaliert der kugeläquivalente hydrodynamische Radius mit der Quadratwurzel der
Sedimentationskoeffizienten. Bei dieser Methode müssen jedoch ebenfalls Annahmen zur Dichte der
NP-Protein-Agglomerate getroffen werden. Zusätzlich fließt das Modell einer harten Kugel mit ein, da
in Gleichung (115) der Reibungskoeffizient nach Stokes zugrunde liegt:
(146)
Die Bestimmung der Sedimentationskoeffizienten würde analog zu „Modell B1“ die Dicke der
Proteinkorona erzielen, sofern die strukturabhängigen Reibungskoeffizienten der NP-Protein-
Agglomerate denen einer Vollkugel entsprechen.
B) Ein Gleichgewichtsexperiment zwischen Diffusion und Sedimentation: Das
Sedimentationsgleichgewicht erfolgt gemäß der Lamm-Gleichung (113), Seite 90, wenn gilt: �dc
dt�r=
0. Für polydisperse Systeme mit Komponenten i hängt das Konzentrationsprofil d ln ci vom
Molekulargewicht ab. Für ideale Lösungen folgt:
(147)
𝜈2 bezeichnet das spezifische partielle Volumen der NP-Protein-Agglomerate, ρ beschreibt die Dichte
der Lösung. Da sich ν2 reziprok zur Dichte der Probe verhält, muss für das Gleichgewichtsexperiment
ebenfalls die Dichte der NP-Protein-Agglomerate ermittelt werden. Als Ergebnis wird das
Molekulargewicht der NP mit Proteinkorona erhalten, analog zu „Modell B2“ des SLS Experimentes.
Die Durchführung solcher Zentrifugationsexperimente sowie der Vergleich mit SLS- und AF-FFF
Experimenten soll an dieser Stelle in Ausblick gestellt werden.
FR=6πηRhdr
dt
d ln ci(1 Mi
⁄)= r dr (1−ν2ρ)ω2(R T)⁄
Zusammenfassung
___________________________________
-147-
6 Zusammenfassung und Ausblick
6.1 Zusammenfassung
In der vorliegenden Forschungsarbeit wurden drei unterschiedliche Nanomaterialien in biologisch
relevanter Umgebung untersucht. Bei den Nanopartikeln handelte es sich um aus der Laserablation
stammende stabilisatorfreie Legierungs-NP, um kommerziell erhältliche großtechnisch hergestellte
amorphe Silica-Nanopartikel sowie nicht-kommerzielle, im Labormaßstab synthetisierte,
multifunktionelle Poly(organosiloxan) Nanopartikel. Im Hinblick auf Zellversuche wurden die Partikel
unterschiedlicher Größe in RPMI 1640 Zellmedium sowie mit Zusatz von fötalem Rinderserum
(FCS), welches als Modell für proteinhaltige Umgebung diente, charakterisiert.
TEM-Abbildungen der Legierungs-NP zeigten eine breite Größenverteilung der einzelnen Teilchen
mit Radien zwischen 1 nm bis 30 nm. Anhand von DLS Messungen wurden wesentlich größere
Teilchen mit gemittelten hydrodynamischen Radien von 60 nm ermittelt. Die Proben lagen somit in
Lösung schon im Voraus aggregiert vor. Die Proben wurden ebenfalls in Gegenwart von RPMI
Zellmedium charakterisiert. Hierbei stieg das Zetapotential von -30 mV auf -15 mV an. Die
Verringerung der elektrostatischen Stabilisierung führte im Falle von NiTi- sowie AuAg-
Legierungspartikel zu einer zusätzlichen Koagulation der Teilchen. Bei den CoCrWNiFeMn-
Legierungs-Partikeln konnten auch innerhalb des Messfensters von 10 Minuten keine erhöhten
hydrodynamischen Radien gemessen werden. Unterschiede im Aggregationsverhalten können mit
Sekundäreffekten wie der Anisotropie der Teilchenform, ungleichmäßige Ladungsverteilung oder
einer Verunreinigung der Probe zusammenhängen. In Gegenwart von Serumproteinen innerhalb des
RPMI Zellmediums konnte qualitativ ein stabilisierender Effekt für die NiTi- sowie AuAg-Proben
beobachtet werden. Allgemein wiesen die drei untersuchten Legierungspartikel in Umgebung von
Serumproteinen ähnliche hydrodynamische Größen der Agglomerate auf. Folglich glichen sich die
Proben durch Proteinadsorption in ihrem Aggregationsverhalten aneinander an.
Kommerziell erhältliche Silica Nanopartikel mit hydrodynamischen Radien von etwa 10 nm, 15 nm
und 60 nm wiesen in RPMI Zellmedium eine erhöhte Stabilität auf und Aggregation blieb aus. In
Gegenwart von Serumproteinen konnte jedoch eine Aggregation der Nanopartikel beobachtet werden.
Analog zu Zelltests wurde die Charakterisierung der Agglomerate bei konstantem Proteingehalt
durchgeführt und die Konzentration der NP variiert. Die Agglomerate wurden unter physiologischen
Bedingungen mittels DLS größencharakterisiert sowie, aufgrund der instrumentellen
Einschränkungen, unter nicht-physiologischen Bedingungen mittels AF-FFF aufgetrennt. Die Größe
der Agglomerate wurde durch die Konzentration der NP beeinflusst. Mit sinkender Konzentration der
NP wurden vermehrt und größere Aggregate gefunden. Besonders für Zelltests ist dieses
phänomenologische Ergebnis relevant, da Toxizitätsstudien ebenfalls mit variierender NP-
Konzentration durchgeführt werden. Dass sich hierbei jedoch die Größe des Nanomaterials ändert,
Zusammenfassung und Ausblick
___________________________________
-148-
wird nicht berücksichtigt. Weitere phänomenologische Funde waren, dass die Koagulation nicht durch
Ladungsneutralisation bedingt ist, dass Agglomeration auf hoch affin bindende Proteine zurückgeführt
werden kann sowie dass Agglomeration irreversibel ist und schnell innerhalb weniger Sekunden
erfolgt. Anhand Untersuchungen zur Koagulationskinetik konnte die Aggregation mechanistisch auf
eine verbrückende Flockung zurückgeführt werden. Es wurde hierfür ein Modell hergeleitet, welche
das Wachstum von Teilchen-Cluster sowie Cluster-Cluster beschreibt. Mittels einer online-
Trägheitsradienbestimmung konnte anhand von AF-FFF Elugrammen die Verteilung von
Agglomerationszahlen bestimmt werden, welche für die Auswertung der Koagulationskinetik
erforderlich war.
Als Ergebnis der Koagulationskinetik wurde eine konstante Anzahl an gebildeten Brücken ermittelt.
Dieses ist unabhängig von der Gesamtzahl der vorliegenden Silica-Teilchen. Die Anzahl der
Verbrückungen wurde jedoch von der Größe der Nanopartikel bestimmt. Amorphe Silica NP mit
einem Radius von 60 nm wurden um einen Faktor 40 ineffizienter durch Proteine verbrückt als
Partikel mit einem Radius von 10 nm bzw. 15 nm. Die Ursache liegt in der relativen Größe der NP im
Vergleich zu den adsorbierten Proteinen. Einerseits können bei großen Nanopartikeln mehr Proteine
an einer einzelnen Verbrückung involviert sein, andererseits besitzen große Nanopartikel eine der
Brücke benachbarte Fläche die zur weiteren Verbrückung sterisch blockiert ist. Bei den beiden
kleineren Nanopartikel-Spezies wird diese Fläche bereits von dem der Brücke benachbarten Protein
überspannt.
Die räumlichen Ausmaße der Proteinkorona auf amorphen Silica Nanopartikel konnte mittels
Lichtstreuversuchen nicht direkt bestimmt werden, da die Aggregation der Proben die Messungen
dominierte. Anhand von Sedimentationsexperimenten mittels AUC konnte die Menge an adsorbierten
Proteinen einer Oberflächenbelegung von 16% zugeordnet werden. Es handelte sich hierbei um
Proteine der „harten“ Proteinkorona, welche den zugrundeliegenden Scherkräften eines
Sedimentationsexperimentes wiederstanden. Die „weiche“ Proteinkorona konnte nicht detektiert
werden.
Die Dicke der Proteinkorona wurde auf Poly(organosiloxan) Nanopartikel mittels statischer
Lichtstreuung bestimmt. Hierzu wurden geeignete Modelle hergeleitet, welche eine beobachtete
Zunahme der Streuintensität durch Teilchen-Teilchen Agglomeration sowie durch Protein-Teilchen
Agglomeration beschreiben. Unter der Annahme starrer Proteine entsprach die gemessene Zunahme
der Streuintensität einer Oberflächenbelegung von 48% auf Carboxy-funktionalisierten
Poly(organosiloxan) Nanopartikeln sowie von 12% auf PEGylierten Poly(organosiloxan)
Nanopartikeln. Im Falle der nicht-PEGylierten Nanopartikel wurde eine scheinbar unvollständige
Oberflächenbelegung erhalten. Diese wird durch die Entfaltung der Proteine auf der Oberfläche
verursacht, wodurch diese eine größere Fläche als starre Proteine einnehmen. Zudem ist ein
Ausblick
___________________________________
-149-
Belegungsgrad von 100% anhand eines statistisch ablaufenden Adsorptionsprozesses, aufgrund von
sterisch blockierten Totvolumina zwischen den Proteinen, nicht wahrscheinlich. Die Dicke der
Proteinkorona wurde ebenso mittels AF-FFF bestimmt und wies, in Übereinstimmung zu den
Ergebnissen der statischen Lichtstreuung, Dicken von 1,5 nm auf den nicht-PEGylierten Nanopartikel
sowie 0,4 nm auf den PEGylierten Proben auf.
6.2 Ausblick
In der vorliegenden Arbeit wurde das Aggregationsverhalten amorpher Silica NP nur stichprobenhaft
behandelt, da dies nur anhand dreier Größen der Teilchen erfolgte. Hierbei wiesen Partikel mit Radien
von 10 nm und 15 nm ähnliches Agglomerationsverhalten auf, Teilchen mit Radien von 60 nm wurden
hingegen ineffizienter verbrückt. Die Gründe hierfür in der relativen Größe von NP zu Proteinen zu
suchen ist zwar plausibel, jedoch spekulativ. Für genauere Erkenntnisse müssen ebenso NP mit Radien
zwischen 15 nm und 60 nm in Betrachtung gezogen werden sowie NP mit deutlich größeren Radien
als 60 nm. Weiterhin bilden diese Untersuchungen eine gute Grundlage neben der Größe weitere
Eigenschaften zu identifizieren, welche Einfluss auf das Agglomerationsverhalten zeigen.
Insbesondere sind hier der Einfluss der Oberflächenladung, der Funktionalität sowie die Art der
Stabilisierung zu nennen.
Besonderes Interesse sollte hierbei der Proteinkorona zukommen. Wie in dieser Forschungsarbeit
nachgewiesen werden konnte, ist die Anzahl der maximalen Verbrückungen limitiert und nur ein
geringer Teil der Proteine ist für die Aggregation amorpher Silica NP verantwortlich. Die
Identifikation solcher Proteine trägt zum Verständnis der Agglomerationsvorgänge von Nanopartikeln
in Gegenwart von Serumproteinen bei. Als Grundlage der Proteomanalyse der „verbrückenden“
Korona eignet sich die semi-präparative Probenfraktionierung mittels AF-FFF, wodurch die Korona
auf einzelnen Partikeln getrennt von der Korona auf Agglomeraten untersucht werden kann.
Im Hinblick auf eine semi-präparative Fraktionierung als Grundlage einer alternativen Aufreinigung
von Partikel-Protein-Agglomeraten muss die AF-FFF optimiert werden. Erste Versuche wurden
bereits unternommen, waren jedoch nicht mehr Teil dieser Forschungsarbeit. Die ersten Ergebnisse
zeigten eine nur schlechte Abtrennung ungebundener Proteine von der NP-Fraktion innerhalb des
Trennkanals, obwohl sich die Elutionsbanden der Proteine von der der NP separierten. Der Grund
hierfür lag in der reversiblen Adsorption von Proteinen auf der Membran, wodurch geringe Mengen an
Proteinen kontinuierlich eluierten. Eine Optimierung des Verfahrens kann durch eine
Funktionalisierung der Membran erfolgen, wofür sich zum Beispiel eine PEGylierung der Membran
oder eine „anti-fouling“ Beschichtung eignen würde.
Zusammenfassung und Ausblick
___________________________________
-150-
Die Proteinkorona konnte auf carboxylierten sowie auf PEGylierten Poly(organosiloxan) NP
bezüglich ihrer Dicke charakterisiert werden. Unterschiede der Oberflächenbeschaffenheit sollten sich
jedoch nicht nur in der Gesamtmenge adsorbierter Proteine widerspiegeln, sondern ebenfalls in der
Zusammensetzung der Korona. Für biomedizinische Anwendungen sind biokompatible
Beschichtungen wie PEG von besonderer Relevanz. Es konnte bereits gezeigt werden, dass die Menge
an adsorbierten Proteinen mit der PEGylierungsdichte sinkt.166 Zudem beeinflusst die Kettenlänge des
PEGs die Zytotoxizität der Partikel.167 Eine Verknüpfung von einheitlichen Versuchen zur
Bestimmung der Zusammensetzung der Proteinkorona von definierten Nanomaterialien in
Abhängigkeit der PEGylierungsdichte, Kettenlänge und Oberflächenkrümmung würden zu einem
weiterführenden Verständnis der Wechselwirkungen zwischen biologischen Systemen und der Nano-
Grenzfläche führen.
Chemikalien, Nanomaterialien und Lösemittel
___________________________________
-151-
7 Experimentelle Beschreibungen
7.1 Chemikalien, Nanomaterialien und Lösemittel
Das Zellkulturmedium RPMI 1640 ohne Phenolrot wurde von der Firma Gibco Life Technologies
bezogen, Fötales Kälberserum (FCS Gold) stammt von PAA. Wasser wurde mit einer Milli-Q Anlage
(Sartorius, Deutschland) entionisiert.
Die Legierungs-Nanopartikel bestehend aus NiTi, AuAg bzw. CoCrWNiFeMn wurden durch das
Institut für Arbeitsmedizin, Sozialmedizin und Umweltmedizin zugeliefert. Diese Partikel stammen
ursprünglich vom Arbeitskreis Prof. Barcikowski der Universität Duisburg-Essen. Die amorphen
Silica Nanopartikel stammen von Nyacol Nanotechnologies und wurden über die Firma Nordmann
Rassmann GMBH & Co. als Muster zu Verfügung gestellt. Multifunktionelle Poly(organosiloxan)
Nanopartikel wurden von Frau Dr. Olga Koshkina im Zuge ihrer Dissertation synthetisiert.156 Die
hierfür verwendeten Chemikalien Trimethoxymethylsilan, Diethoxydimethylsilan,
Ethoxytrimethylsilan, p-Chlormethylphenyl-trimethoxysilan sowie 3-(Triethoxysilyl)-
propylbernsteinsäureanhydrid), stammen von ABCR, 2-(N-Morpholino)ethansulfonsäure (MES) von
Roth und wurden ohne weitere Aufreinigung verwendet.
7.2 Probenpräparation
Die Probenherstellung zur Charakterisierung erfolgte über zwei Stufen. Zunächst wurde die Probe mit
Milli-Q Wasser auf das 10-fache der gewünschten Konzentration vorverdünnt. Anschließend wurden 9
Volumenteile des Zielmediums (RPMI1640 oder RPMI1640 / 5 Vol.-% FCS) in einem 5 mL
Rollrandglas vorgelegt und 1 Volumenteil der Probe mittels Eppendorf-Pipette während stetigem
Schütteln schnell zugegeben. Hierdurch erfolgte eine Verdünnung des Zielmediums auf 90% des
Gesamtvolumenanteils. Die Mischungen wurden jeweils für 10 Minuten bei Raumtemperatur gelagert.
Die resultierenden Konzentrationsangaben der Nanopartikel lagen für die Legierungs-Nanopartikel bei
1, 5 und 10 µg/mL. Die amorphen Silica NP wurden so verdünnt, dass sie unabhängig ihrer Größe
eine identische Oberflächenkonzentration von 0,73 m2/mL aufwiesen. Entsprechende Konzentrationen
lagen für NexSil8 bei c0 = 3,8 mg/mL, für NexSil20 bei c0 = 6,4 mg/mL sowie für NexSil125 bei c0 =
20,8 mg/mL. Weiterhin wurden jeweils Konzentrationsreihen bis zu cNP = 0,05 c0 hergestellt.
Poly(organosiloxan) NP wurden in der Konzentration eingesetzt, in der sie nach der Synthese
vorlagen. Nach Verdünnung in Medium lagen die Konzentrationen des TPSA3 bei 0,94 mg/mL sowie
bei NHS06 bei 0,14 mg/mL. Vor den jeweiligen Charakterisierungen wurden die Proben mittels
MilexTM-HV-Filtern filtriert, Porengröße Ø = 450 nm.
Experimentelle Beschreibungen
___________________________________
-152-
7.3 Verwendete Apparaturen
Lichtstreuung
Die Lichtstreumessungen erfolgten an einer Anlage der Firma ALV. Diese besteht aus einem He-Ne-
Laser (λ = 633 nm) und einem CGS-3 Goniometer. Die Korrelation des Streusignals erfolgte mit
einem LSE-5004 Digitalkorrelator bei einer konstanten Temperatur von 296 K. Die Auswertung der
Daten wurde mit der Software HDRC (bereitgestellt von Prof. Dr. Manfred Schmidt, Institut für
physikalische Chemie, Johannes Gutenberg-Universität Mainz) durchgeführt. Falls nicht anders
angegeben, wurde die Autokorrelationsfunktion mittels biexponentieller Fitfunktion bestimmt. Die μ2-
Werte wurden mit dem Kumulanten-Fit bei 90° angegeben. Die Proben wurden mit einem MilexTM-
HV-Filter mit Porengröße Ø =450 nm filtriert.
Asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung
Die AF-FFF-Messungen wurden in einer Anlage der Firma CONSENXUS GmbH durchgeführt. Diese
ist aus einer constaMETRIC® 3200 Flusspumpe (Thermos Separations), aus einer Knauer WellChrom
Micro-Star K-100 Injektionspumpe, aus einem Kanal mit 190 μm Spacer, einem Liqui-Flow® von
Bronkhorst Hi-Tec und aus einem ERC3114 Degasser aufgebaut. Es wurde eine Membran aus
Polyethersulfon (MWCO 10 kDa) verwendet. Sofern im Text nicht anders angegeben, wurde mit
einem Querflussgradient gearbeitet. Dieser fiel innerhalb von 1250 Sekunden von 2,5 mL/min auf
0 mL/min ab. Die Detektion des UV-Vis Signals erfolgte mit einem Waters 486-Absorptionsdetektor,
online-Fluoreszenzdetektion erfolgte an einem Merck F1100-Fluoreszenzdetektor. Die online-
Mehrwinkel Lichtstreudetektion erfolgte an dem online-MALLS Detektor DARK II der Firma
CONSENXUS GmbH mit einer Laser der Wellenlänge λ = 532 nm. Es wurde an den Winkeln 50°,
70°, 90°, 110°, 130° die Streuintensität detektiert.
Die Kalibrierung des Detektors sowie jegliche Auswertungen der winkelabhängigen Streuintensität
erfolgten mittels Excel. Die erforderlichen Gleichungen befinden sich im Text. Messwerte wurden mit
einer Rate von 0,2/s tabellarisch erfasst und ausgewertet.
Lichtabsorption der POS NP wurden entsprechend der Absorptionsbande von Rhodamin-B bei einer
Wellenlänge von λ = 540 nm detektiert. Ebenfalls erfolgte die Anregung des Farbstoffes bei
λ = 540 nm sowie die Detektion des Fluoreszenzsignals bei λ = 580 nm.
Verwendete Apparaturen
___________________________________
-153-
Analytische Ultrazentrifugation
Die Messungen der analytischen Ultrazentrifugation wurden von Frau Dr. Antje Völkel am Max-
Planck-Institut für Kolloid- und Grenzflächenforschung an einer XL-I Ultrazentrifuge (Beckman-
Coulter, Palo Alto, CA) durchgeführt. Die Sedimentationsgeschwindigkeit der NexSil20 NP wurde bei
5000 rpm ermittelt, Proteine sedimentierten mit Rotationsgeschwindigkeiten von 60000 rpm. Alle
Versuche erfolgten bei 25 °C in 100 mM RPMI 1640 Medium sowie ebenfalls in Gegenwart von 5
Vol.-% FCS.
Thermogravimetrische Analyse
Die TGA-Messungen wurden an einer TG/DTA 220-Anlage von Seiko mit einem Platin-Tiegel als
Referenz durchgeführt. Die Proben wurden unter Stickstoff mit einer Heizrate von 1°C/min erhitzt.
ζ-Potential-Messungen
Die ζ-Potential Messungen wurden mit einem Zetasizer Nano der Firma Malvern Instruments bei
295 K in einer Dip-Zelle durchgeführt. Die Messungen erfolgten innerhalb der im Text angegeben
Medien. Zur Auswertung wurde nach Hückel genähert. Der damit einhergehende Fehler für Partikel
κa~1 wird im Text diskutiert.
Experimentelle Beschreibungen
___________________________________
-154-
Verwendete Apparaturen
___________________________________
-155-
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[165] Aggarwal, P.; Hall, J. B.; McLeland, C. B.; Dobrovolskaia, M. A.; McNeil, S. E. Advanced
Drug Delivery Reviews. 2009, 61 (6), 428–437.
[166] Walkey, C. D.; Olsen, J. B.; Guo, H.; Emili, A.; Chan, W. C. W. J. Am. Chem. Soc. 2012, 134
(4), 2139–2147.
[167] Bleul, R. Herstellung, Charakterisierung und Funktionalisierung polymerer Nanopartikel und
Untersuchung der Wechselwirkungen mit biologischen Systemen; Dissertation, Freie Universität,
2014.
Abkürzungen
___________________________________
-163-
9 Abkürzungen und Symbole
9.1 Abkürzungen
AF-FFF
AUC
BSA
CAFFFE
CCA
ClBz-T
D
DBS
DLA
DLS
DLVO-Theorie
FCS
FFF
M
MALLS
NP
PEG
PMMA
POS
PS
RES
RLA
RI
SLS
T
TCA
TEM
UV
VdW
WW
Asymmetrisch Fluss Feld-Fluss Fraktionierung
Analytische Ultrazentrifuge
Albumin aus bovinem Serum
circulare asymmetrische Fluss Feld-Fluss Fraktionierung
Cluster-Cluster Aggregat
p-Chlormethylphenyltrimethoxysilan
Diethoxydimethylsilan
Dodecylbenzolsulfonsäure
diffusionslimitierte Aggregation
dynamische Lichtstreuung
Derjaguin, Landau, Verwey und Overbeek-Theorie
fötales Rinderserum
Feld-Fluss Fraktionierung
Ethoxytrimethylsilan
Vielwinkelstreuer (engl. „multi angle laser light scattering”)
Nanopartikel
Poly(ethylenglycol)
Polymethylmethacrylat
Poly(organosiloxan)
Polystyrolstandard
Retikuloendotheliales System
reaktionslimitierte Aggregation
Brechungsindex (engl. „refractive index”)
statische Lichtstreuung
Trimethoxymethylsilan
Teilchen-Cluster Aggregat
Transmissionselektronenmikroskop
ultravioletter Bereich des Spektrums
Van-der-Waals
Wechselwirkung
Abkürzungen und Symbole
___________________________________
-164-
9.2 Symbole
Allgemeine Symbole
A
d
D
E
F
kB
kBT
m
M
NA
η
r
R
ρ
S
t
T
Θ
V
ω
<X>n
<X>w
<X>z
<X>1/z
Fläche
Durchmesser
Diffusionskoeffizient
Energie
Kraft
Boltzmann-Konstante
Thermische Energie
Masse
Molekulargewicht
Avogadro-Konstante
Viskosität
Radius
universelle Gaskonstante
Dichte
Sedimentationskoeffizient
Zeit
Temperatur
Grad der Oberflächenbelegung
Volumen
Winkelgeschwindigkeit
Zahlen-Mittelwert
Gewichts-Mittelwert
Zentrifugen-Mittelwert
Reziproker Zentrifugen-Mittelwert
Symbole zum Thema der Feld-Fluss Fraktionierung
J
L
λ
ΔP
U
R
t0
Stofftransport
effektive Schichtdicke
dimensionsloser Retentionsparameter
Druckdifferenz
Driftgeschwindigkeit
Retentionsverhältnis
Totzeit
Symbole
___________________________________
-165-
t
R
V
c
v(x)
w
Retentionszeit
Querflussrate
Fließgeschwindigkeit der Lamelle an Positions x
Kanaldicke
Symbole zum fraktalen Wachstum
d
f
ds
dw
f(k)
kg
kh
N, i, j
R
Rc
Rg
Rh
RL
fraktale Dimension
Dimension des Raums
Dimension der Flugbahn eines Teilchens
interne hydrodynamische Permeabilität
fraktaler Vorfaktor des Trägheitsradius
fraktaler Vorfaktor des hydrodynamischen Radius
Agglomerationszahl
geometrischer Umkugelradius
Kollisionsradius
Trägheitsradius
hydrodynamischer Radius
geometrischer Radius der TEM Projektion
Symbole zur Kolloidstabilität
a
A
α
ci
e0
ε
ε0
F
h
H
κ-1
k0
k
n0
Teilchenradius
Hamaker Konstante
Polarisierbarkeit der Elektronenhülle
Ionenkonzentration des Ions i
Elementarladung
relative Dielektrizitätskonstante
elektrische Feldkonstante
Faraday-Konstante
Planck‘sches Wirkungsquantum
Abstand zweier Teilchen
Abklingrate des elektrostatischen Potentials
Geschwindigkeitskonstante bei schneller Koagulation, Vmax ≤ 0
Geschwindigkeitskonstante
Teilchenzahl im Einheitsvolumen bei t = 0
Abkürzungen und Symbole
___________________________________
-166-
n
i
Σn
N
ν
Ψ0
Ψ(x)
VA
VR
VT
Vmax
W
zi
Teilchenzahl mit Agglomerationszahl i im Einheitsvolumen
Gesamtzahl aller Teilchen im Einheitsvolumen
Agglomerationszahl
Frequenz der Elektronenoszillation in der Elektronenhülle
Oberflächenpotential
elektrostatisches Potential
VdW-Beitrag zum Gesamtpotentialverlauf
elektrostatischer Beitrag zum Gesamtpotentialverlauf
Gesamtpotentialverlauf
Potential am Maximum von VT
Stabilitätsfaktor
Wertigkeit des Ions i
Symbole zur Lichtstreuung
A, B, C
A2
b2, K
c
dπ/dc
dn/dc
E->
I
K(Θ)LS
KRI
λ
g1
g2
Γ1, Γ2
nD
P(q)
𝑞
q
RR
τ
τD
Amplituden in g
1
Zweiter Virialkoeffizient
Streuvermögen, Kontrastfaktor
Ausbreitungsgeschwindigkeit von Licht
osmotische Kompressibilität
Brechungsindex Inkrement
Elektrischer Feldvektor
Streuintensität
Kalibrierfaktor des MALLS Detektors
Kalibrierfaktor des RI Detektors
Wellenlänge
Amplitudenkorrelationsfunktion
Intensitätskorrelationsfunktion
Kumulant 1, 2
Brechungsindex
Formfaktor
Streuvektor
Betrag des Streuvektors, |q|
absolute Streuintensität
Korrelationszeit
Relaxationszeit
Berechnete Werte der Trägheitsradien von Aggregaten durch eine Reihenentwicklung
___________________________________
-167-
10 Anhang
10.1 Berechnete Werte der Trägheitsradien von Aggregaten durch eine
Reihenentwicklung
Tabelle 27: Berechnete Werte von normierten Trägheitsradien aus Gleichungen (97) und (102) für nicht-frakales Wachstum
bei DLA Teilchen-Cluster Aggregation. Die Werte sind ebenfalls in Abbildung 25 dargestellt.
Gmachowski 2002
Dissertation Thomas Lang 2014
N
di
kg,i
�Rg
a�i
di
kg,i
�Rg
a�i
2
1,756
1,009
1,477
1,756
1,324
1,263
3
1,770
1,022
1,838
1,770
1,320
1,591
4
1,790
1,040
2,123
1,795
1,304
1,867
5
1,809
1,058
2,359
1,826
1,279
2,110
6
1,827
1,075
2,563
1,860
1,247
2,327
7
1,843
1,090
2,742
1,893
1,212
2,525
8
1,858
1,104
2,903
1,923
1,179
2,706
9
1,871
1,117
3,050
1,950
1,149
2,875
10
1,883
1,128
3,186
1,971
1,123
3,032
11
1,894
1,138
3,311
1,988
1,102
3,181
12
1,905
1,148
3,429
2,001
1,086
3,323
13
1,914
1,157
3,539
2,011
1,073
3,458
14
1,923
1,165
3,644
2,019
1,062
3,587
15
1,931
1,173
3,743
2,028
1,051
3,711
16
1,938
1,180
3,838
2,036
1,038
3,831
17
1,946
1,187
3,929
2,047
1,024
3,946
18
1,952
1,193
4,015
2,059
1,007
4,057
19
1,959
1,199
4,099
2,073
0,988
4,164
20
1,965
1,205
4,179
2,087
0,968
4,268
Anhang
___________________________________
-168-
10.2 Zusätzliche Abbildungen
Abbildung 52: TGA von NexSil8 und NexSil125.
Abbildung 53: Konzentrationsabhängige AF-FFF Elugramme von NexSil8 und NexSil125 in Gegenwart von FCS. Die
Konzentrationen c0 von NexSil8, NexSil20 und NexSil125 wurden so gewählt, dass die Proben identische
Oberflächenkonzentrationen besitzen mit A0 = 0,6 m2/mL.
Zusätzliche Abbildungen
___________________________________
-169-
Abbildung 54: Prozentuale Massenverteilung innerhalb von Aggregaten mit Agglomerationszahl N. Die Proben NexSil8,
NexSil20 und NexSil125 wurden bei identischen Oberflächenkonzentrationen mit 5% FCS Lösung in RPMI 1640 Medium
geflockt.
Anhang
___________________________________
-170-
Abbildung 55: Koagulationskinetik nach Smoluchowski. Das Modell ist zur Linearisierung der Messdaten ungeeignet.
01x10
10
2x10
10
3x10
10
4x10
10
5x10
10
6x10
10
7x10
10
0,065
0,066
0,067
0,068
0,069
0,070
1/Rh / 1/nm
q2 / cm-2
Rh = 15,0 nm
µ2 = 0,13
TPSA3 in Gly-Puffer
01x10
10
2x10
10
3x10
10
4x10
10
5x10
10
6x10
10
7x10
10
0,049
0,050
0,051
0,052
0,053
0,054
R
h
= 20,0 nm
µ
2
= 0,06
1/R
h
/ nm
q
2
/ cm
-2
NHS06 in H2O
Abbildung 56: Links: dynamische (oben) und statische Lichtstreuung (unten) der Probe TPSA3. Rechts: dynamische (oben)
und statische Lichtstreuung (unten) der Probe NHS06; in den vorliegenden Messdaten ist das Brechungsindexinkrement
gemäß Gleichung (123) noch nicht korrigiert.
0,00E+000 2,00E+014 4,00E+014 6,00E+014
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
2,2
2,4
n
0
/ Σn
n
0
/ 1 mL
Auftragung zur Koagulationskinetik nach von Smoluchowski
für die Probe NexSil8
0,00E+000 5,00E+012 1,00E+013 1,50E+013 2,00E+013
1,1
1,2
1,3
1,4
1,5
1,6
1,7
1,8
Auftragung zur Koagulationskinetik nach von Smoluchowski
für die Probe NexSil125
n
0
/ Σn
n
0
/ 1 mL
Zusätzliche Abbildungen
___________________________________
-171-
Kalibrierung der AF-FFF zu Poly(organosiloxan) NP:
Die Kalibrierung erfolgte durch NexSil20 und NexSil125. Fraktionen wurden gesammelt und mittels
DLS vermessen. Salz: 3mM NaN3, Flussprofiel: Gradient von 2,5mL/min zu 0 mL/min. Detektorfluss
1mL/min.
0100 200 300 400 500 600 700 800
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
ILS (90) / norm.
t / s
0
20
40
60
80
Rh aus DLS
Kalibriergerade:
R
h
= 0,118 nm/s * t - 0,79 nm
Abbildung 57: Kalibrierung der AF-FFF: Die Kalibrierung erfolgte durch das Sammeln der Fraktionen und DLS Messungen.
Anhang
___________________________________
-172-
Zusätzliche Abbildungen
___________________________________
-173-
11 Danksagung
Hiermit möchte ich mich bei allen, die zum Erfolg dieser Arbeit beitragen haben bedanken:
Zunächst möchte mich sehr herzlich bei Prof. Dr. Michael Maskos bedanken. Promotionsarbeiten
unter seiner Betreuung sind grundsätzlich durch zielführende wissenschaftliche Diskussionen
seinerseits sowie durch ein sehr hohes Maß an Selbständigkeit und Eigenverantwortung seitens des
Doktoranden geprägt. Beides habe ich während meiner Doktorandenzeit sehr zu schätzen gelernt hatte.
Ich möchte mich ebenso bei meinem Erstgutachter Prof. Dr. Michael Gradzielski für die Betreuung an
der TUB sowie für anregende Diskussionen bedanken.
Bei Dr. habil. Andreas Thünemann möchte ich mich im Besonderen für einen zunächst unscheinbaren
Kommentar zu einem meiner Vorträge bedanken: Seiner Einschätzung nach, machten Literaturwerte
keinen Sinn, ich solle es nochmals überprüfen und selbst nachrechnen. Hieraus resultieren wichtige
„Puzzleteile“ dieser Arbeit.
Dr. Annabelle Bertin möchte ich für die vorübergehende Betreuung an der BAM während einer Phase
der personellen Umstrukturierung danken.
Ebenfalls möchte ich dankend Dr. Karl Fischer sowie PD Dr. Wolfgang Schärtl an der Universität
Mainz für Hilfestellungen, im Besonderen zu Lichtstreumessungen, erwähnen. Ein großes
Dankeschön gebührt Dr. Wolfgang Schupp, welcher jederzeit Hilfestellungen und Problemlösungen
zur AF-FFF sowie dem Dark II Lichtstreudetektor bot. Ich möchte ebenso Dr. Anna Musyanovych am
Fraunhofer ICT-IMM für zielführende Hinweise zum Thema der verbrückenden Flockung danken.
Bei Dr. Antje Völkel am Max-Planck Institut in Golm möchte ich mich für AUC-Messungen
bedanken. Weiterhin danke ich Dr. Ulrike Braun sowie Dietmar Neubert für TGA-Messungen.
Dr. Olga Koshkina möchte ich für die Synthese sowie Bereitstellung ihrer NP danken, sowie für die
Bewerkstelligung vieler organisatorischer Aufgaben, welche die gesamte Arbeitsgruppe betrafen.
Christoph Bantz, Dr. Lennart Treuel sowie Dr. Patrick Knappe möchte ich für hilfreiche Diskussionen
danken. Ich bedanke mich bei Dr. Raphael Thiermann für die konstante Instandhaltung der ALV-
Lichtstreuapparatur. Bei Kyriakos-Alexandros Eslahian möchte ich mich für die effiziente
Zusammenarbeit bedanken. Ebenfalls bedanke ich mich bei allen Korrekturlesern: Anica Wünsche
von Leupoldt, Regina Bleul, Dr. Raphael Thiermann, Sibylle von Bomhard, Setta Aro, Dr. Kathrin
Friedemann sowie Kyriakos-Alexandros Eslahian. Großer Dank gebührt allen Mitgliedern meines
Arbeitskreises in Berlin sowie in Mainz, welche für eine angenehme Zeit sorgten.
Dankeschön!
Danksagung
___________________________________
-174-
