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Vor- und nachgeschaltete Signalwege der Go2α

αα

α-vermittelten

Regulation der vesikulären Monoaminspeicherung

Vorgelegt von

Diplom Ingenieur

Christian Blex

aus Berlin

von der Fakultät III Prozesswissenschaften

der Technischen Universität Berlin

zur Erlangung des akademischen Grades

Doktor der Ingenieurwissenschaften

- Dr.-Ing. -

genehmigte Dissertation

Promotionsausschuss:

Vorsitzender: Prof. Dr. U. Stahl

Berichter: Prof. Dr. R. Lauster

Berichterin: Prof. Dr. G. Ahnert-Hilger

Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 21. Juli 2008

Berlin 2008

D83

Inhaltsverzeichnis

1 Zusammenfassung 1

2 Abstract 2

3 Einleitung 3

3.1 Neuronale Kommunikation an Synapsen 3

3.2 Die Variabilität der vesikulären Neurotransmitterspeicherung

beeinflusst die synaptische Übertragung 4

3.3 Neurotransmittertransport in synaptische Vesikel 5

3.4 Transport und Speicherung von Monoaminen in

synaptischen Vesikeln 7

3.4.1 Monoaminerge Neurotransmitter 7

3.4.2 Speicherung monoaminerger Neurotransmitter 8

3.5 Heterotrimere G-Proteine beeinflussen den

Neurotransmittertransport in synaptische Vesikel 11

3.5.1 Eigenschaften heterotrimerer G-Proteine 11

3.5.2 Goα - eine in Neuronen und neuroendokrinen Zellen exprimierte

Untereinheit heterotrimerer G-Proteine 12

3.5.3 Lokalisation heterotrimerer G-Proteine auf synaptischen Vesikeln -

Regulation der vesikulären Neurotransmitterspeicherung 14

3.6 Fragestellung 16

4 Materialien und Methoden 17

4.1 Chemikalien 17

4.2 Geräte und Apparaturen 19

4.3 Puffer und Lösungen 21

4.4 Medien 24

4.4.1 Mikrobielle Medien 24

4.4.2 Zellkulturmedien 25

4.5 Antikörper 26

4.5.1 primäre Antikörper 26

4.5.2 sekundäre Antikörper 26

4.6 Nukleinsäuren 26

4.6.1 Oligonukleotide 26

4.6.2 Vektoren 28

4.6.3 cDNA 29

4.7 Methoden 29

4.7.1 DNA-Techniken 29

4.7.2 Yeast-Two-Hybrid-Methoden 33

Inhaltsverzeichnis

4.7.3 Protein-Techniken 35

4.7.4 Zellkulturarbeiten 38

4.7.5 Neurotransmitteraufnahmetests 39

4.7.6 Versuchstiere 42

4.7.7 HPLC-Analytik 42

4.7.8 Versuchsdurchführung und -auswertung 45

5 Ergebnisse 46

5.1 Modellsysteme zur Untersuchung der Regulation von VMAT1 und

VMAT2 durch heterotrimere G-Proteine 46

5.2 Einfluss der ersten intravesikulären Schleife des VMAT2 auf die

G-Protein-vermittelte Regulation der Monoaminspeicherung 48

5.2.1 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife beeinflusst

die Expression der VMAT2-Konstrukte in CHO-Zellen nicht 49

5.2.2 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife verändert

den Monoamintransport in transfizierten CHO-Zellen nicht 50

5.2.3 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife des VMAT2

führt in CHO-Zellen zu einem Verlust der Regulation durch G-Proteine 51

5.3 Die intravesikuläre Erkennungsstruktur des VMAT1 52

5.3.1 Eine α1-Rezeptor-ähnliche Struktur reguliert die Monoaminspeicherung

durch den VMAT1 52

5.3.2 Auch in VMAT1-transfizierten Zellen ist die erste intravesikuläre Schleife an

der G-Protein-vermittelten Regulation beteiligt 53

5.4 Zytoplasmatische Strukturen des VMAT2 die an der

Signaltransduktion beteiligt sein könnten 55

5.4.1 Die Substitution der Aminosäuren P273-D292 durch 5 Glyzinreste

führt zum Verlust der Transportaktivität des VMAT2 56

5.4.2 Deletionen im C-terminalen Bereich des VMAT2 beeinflussen die

G-Protein-vermittelte Regulation des VMAT2 nicht 57

5.5 Nachgeschaltete Signaltransduktionswege der G-Protein-

vermittelten Regulation der VMAT 58

5.5.1 Einfluss von DbcAMP auf die G-Proteinregulation der VMAT 58

5.5.2 Die Überexpression von CAPS1 und CAPS2 steigert die

Monoaminaufnahme in CHO-VMAT-Zellen 59

5.6 Bedeutung der Regulation des vesikulären Monoamintransports

durch heterotrimere G-Proteine 61

5.6.1 Die Inaktivierung von Go2α durch Pertussistoxin führt zu einer

Verminderung der Monoaminaufnahme in PC12 Zellen 61

5.6.2 Die Inaktivierung von Go2α durch Pertussis Toxin führt in BON-Zellen

zu einem verminderten Monoamingehalt 62

5.6.3 Go2α-Deletionsmutanten haben gegenüber Wildtyptieren einen

verminderten striatalen Dopaminspiegel 63

5.6.4 Verhaltensveränderungen bestätigen den veränderten

Dopaminmetabolismus in Go2α-Deletionsmutanten 64

Inhaltsverzeichnis

III

5.7 Identifizierung von möglichen Zielen der Go2α

αα

α -vermittelten

Signaltransduktion durch das Yeast-two-Hybrid-System 68

5.7.1 Vorgehensweise bei der cDNA-Durchmusterung mittels

Yeast-two-Hybrid-System 68

5.7.2 Vorbereitende Arbeiten 72

5.7.3 Sequenzielle Transformation von bait- und prey-Vektoren 73

5.7.4 Charakterisierung der Interaktionspartner 75

5.7.5 Überprüfung der Spezifität der Interaktionspartner 78

6 Diskussion 81

6.1 Faktoren die den vesikulären Neurotransmittertransport

beeinflussen 82

6.2 Domänen der VMAT sind an der Regulation der Monoamin-

speicherung durch Go2α

αα

α beteiligt 84

6.3 Nachgeschaltete Signalwege der Regulation des Monoamin-

transports durch Go2α

α α

α 89

6.3.1 Die Adenylylzyklase kann den vesikulären Monoamintransport

beeinflussen 89

6.3.2 Die Überexpression von CAPS erhöht die Speicherfähigkeit vesikulärer

Strukturen in CHO-Zellen 90

6.4 Physiologische Funktion der Regulation der vesikulären

Monoaminaufnahme durch Go2α

αα

α 91

6.5 Direkte Interaktionspartner von Go2α

αα

α 94

6.5.1 Spezifische Go2α-Interaktionspartner 95

6.5.2 Interaktionspartner, die mit beiden Goα-Isoformen interagieren 98

6.5.3 Proteine die mit beiden Goα-Isoformen und mit Gqα interagieren 99

6.5.4 Zusammenfassung Yeast-two-Hybrid-Screening 100

6.6 Ausblick 102

7 Abkürzungen 104

8 Literaturverzeichnis 106

Zusammenfassung

1 Zusammenfassung

Die Grundlage der neuronalen Signalübertragung ist die regulierte Freisetzung vesikulärer

Neurotransmitter in den synaptischen Spalt. Die synaptische Signalübertragung unterliegt

dabei einer Vielzahl regulatorischer prä- und postsynaptischer Prozesse. Die Beeinflussung

des vesikulären Füllungszustandes stellt dabei eine Möglichkeit dar, die synaptische Über-

tragung präsynaptisch zu modulieren. Vorangegangene Arbeiten konnten zeigen, dass der

Füllungszustand monoaminerger Vesikel durch die Go2α-Untereinheit heterotrimerer G-

Proteine reguliert wird. Der vesikuläre Füllungszustand ist dabei das auslösende Signal der

G-Proteinregulation. Die daran beteiligten zellulären Prozesse und Signaltransduktionswege

sowie die Bedeutung dieser Regulation in vivo sind aber bisher unverstanden.

Ziel dieser Arbeit war es daher, vor- und nachgeschaltete Signalwege zu identifizieren und

physiologische Effekte der Inaktivierung von Go2α zu analysieren.

Monoamine werden durch zwei Isoformen des vesikulären Monoamintransporters (VMAT) in

Vesikeln gespeichert. In Neurotransmitteraufnahmeexperimenten mit CHO-Zellen, die mit

verschiedenen mutierten Konstrukten des VMAT2 transfiziert, als stark vereinfachtes Mo-

dellsystem dienten, konnte gezeigt werden, dass die erste intraluminale Schleife des

VMAT2 an der Signaltransduktion aus dem Vesikellumen beteiligt ist. Ähnliche Untersu-

chungen mit dem VMAT1 legen eine vergleichbare Bedeutung der ersten intraluminalen

Schleife als intravesikuläre Rezeptorstruktur nahe.

Einen weiteren Schwerpunkt der Arbeit bildete die Identifikation potentieller nachgeschalte-

ter Signalproteine. Dabei stellte sich heraus, dass die Proteine CAPS1 und CAPS2 in der

Lage sind, den vesikulären Monoamintransport und die Speicherfähigkeit für Monoamine zu

erhöhen. Durch systematisches Durchmustern einer cDNA-Bibliothek mit konstitutiv aktivem

Go2α in einem Yeast-two-Hybrid-System wurden 15 Proteine identifiziert, die als potentielle

Zielproteine an der G-Proteinregulation der VMAT beteiligt sind. Darüber hinaus konnten

verschiedene, dabei identifizierte Go2α-bindende Proteine bereits im Zellkern lokalisiert

bzw. assoziiert mit dem Zytoskelett nachgewiesen werden und deuten auf eine Funktion von

Go2α an diesen Strukturen hin.

In genetisch veränderten Mäusen, die nicht in der Lage sind, Go2α zu exprimieren, konnten

im Striatum, einer Gehirnregion die besonders an der motorischen Feinregulation beteiligt

ist, verminderte Dopaminspiegel festgestellt werden. Diese verminderten Monoaminspiegel

korrelieren mit einer verminderten Bewegungsaktivität der Go2α-defizienten Mäuse nach

Stimulation des dopaminergen Systems mittels Amphetamin und Kokain. Zusätzlich bleibt

nach mehrfacher Behandlung mit Kokain die in Wildtyptieren einsetzende substanzvermittel-

te Sensibilisierung aus, die auf zusätzliche Störungen des dopaminergen Systems hinweist.

Abstract

2 Abstract

The basic principle of neural communication involves regulated exocytosis of neurotransmit-

ter molecules into the synaptic cleft. Neuronal communication at the synapse depends on

several regulatory mechanisms which are localized pre- or postsynaptically. Vesicular filling

represents one possibility of influencing synaptic transmission presynaptically. Previous ex-

periments showed that activation of Go2α, a brain and neuroendocrine cell specific subunit

of heterotrimeric G-proteins, modulates filling of synaptic vesicles with monoamines. Vesicu-

lar filling itself was shown to be the preceding step of the Go2α-regulation. Further evidence

of participating intracellular signalling cascades was missing.

Therefore the aim of the project was to identify possible upstream and downstream signal-

ling molecules as well as to determine the impact of Go2α inactivation in vitro and in vivo.

Monoamine storage in vesicles is mediated by the activity of two isoforms of the vesicular

monoamine transporter (VMAT). Neurotransmitter uptake experiments using CHO-cells

transfected with wildtype and mutant VMAT2-cDNA proved that the first intravesicular loop

of VMAT2 is required for Go2α-activation. Similar experiments using VMAT1-cDNA-

constructs also indicated that the first intralumenal loop of the VMAT shows receptor like

properties.

The investigation of potential downstream targets revealed the proteins CAPS1 and CAPS2

to enhance vesicular transport and storage capacity for monoamines. Furthermore a yeast

two hybrid screening of a mouse brain cDNA-library using GTPase deficient Go2α as bait

identified 15 potential downstream effectors. Besides a possible role in regulating vesicular

filling, some of the identified proteins are localized in the nucleus or associated with the cy-

toskeleton. These observations point to further functions of Go2α at other subcellular struc-

tures.

Analysis of Go2α-knockout mice revealed reduced dopamine-amounts in the striatum, a

brain region involved in movement control. Decreased striatal dopamine levels correlate with

reduced locomotor-activity of the knockout mice compared to wildtype animals after chal-

lenging the monoaminergic system using amphetamine and cocaine. Additionally knockout

mice lack drug-induced sensitization after repeated application of cocaine indicating further

disturbances of the dopaminergic system.

Einleitung

3 Einleitung

3.1 Neuronale Kommunikation an Synapsen

Die Grundlage jeglicher Funktionen eines Organismus bildet die Abstimmung zwischen ver-

schiedenen spezialisierten Zellen und Geweben, um in geeigneter Weise auf Umweltreize

zu reagieren. Das kann durch direkte Zell-Zellinteraktion oder indirekt über die Freisetzung

von Botenstoffen aus signalauslösenden Zellen einerseits und die Erkennung dieser Boten-

stoffe durch Zielzellen andererseits erfolgen. Beide Prozesse sind auch an der Informati-

onsverarbeitung im zentralen Nervensystem beteiligt und kontrollieren dadurch eine Vielzahl

von Körperfunktionen, wie z.B. die Wahrnehmung und Verarbeitung äußerer Reize, die Aus-

führung von Bewegungen, aber auch die Entstehung von Emotionen, Lernvorgänge und

Gedächtnisleistungen. Die indirekte Signalübertragung zwischen Neuronen, die im mensch-

lichen Gehirn auf mehr als sieben Billionen beziffert werden (Webster, 2001), erfolgt dabei

über die Freisetzung von Neurotransmittern an spezialisierte Strukturen zwischen Neuronen

- den Synapsen.

Grundprinzip dieser chemischen Signalübertragung ist zunächst ein ankommender elektri-

scher Impuls, das Aktionspotential, der an der präsynaptischen Membran zur Öffnung span-

nungsabhängiger Kalziumkanäle führt. Ausgelöst durch den Einstrom extrazellulärer Kalzi-

umionen in das Zytoplasma, kommt es zur regulierten Freisetzung von Neurotransmittern

aus sekretorischen Vesikeln in den synaptischen Spalt. Die dabei von einem einzelnen sy-

naptischen Vesikel abgegebene Menge wird auch als Neurotransmitterquantum bezeichnet.

Die Weitergabe der Information erfolgt an der postsynaptischen Membran durch Aktivierung

membranständiger Rezeptoren, bei denen es sich um Ionenkanäle (ionotroper Rezeptor)

handeln kann, die eine schnelle Signalleitung ermöglichen (1-10 ms). Alternativ können Re-

zeptoren beteiligt sein, die intrazelluläre Signalwege aktivieren (metabotroper Rezeptor), um

so den Ionentransport an der Plasmamembran zu beeinflussen. Letztgenannte Prozesse

laufen deutlich langsamer ab (100 ms - min). Durch Aktivierung dieser postsynaptischen

Rezeptoren kann dann entweder ein erregendes oder ein inhibitorisches Signal in der

postsynaptischen Zelle durch De- oder Hyperpolarisierung der Plasmamembran ausgelöst

werden. Eine Depolarisation wird dabei durch eine Erhöhung der Ionenleitfähigkeit für Natri-

um-, Kalium- und Kalziumionen erreicht. Eine Verminderung der Erregbarkeit einer Zelle

durch Hyperpolarisation wird hingegen durch eine erhöhte Ionenleitfähigkeit für Chloridionen

bewirkt. Ob ein inhibitorisches oder exzitatorisches Signal ausgelöst wird, hängt von der Art

des Neurotransmitters und dem Rezeptortyp ab.

Neurotransmitter können aufgrund ihrer Struktur eingeteilt werden. Die häufigsten Neu-

rotransmitter im ZNS sind die Aminosäuren Glutamat, Glyzin sowie γ-Aminobuttersäure

(GABA). Daneben sind auch noch Azetylcholin, die Monoamine Dopamin, Noradrenalin,

Einleitung

Adrenalin, Serotonin und Histamin sowie die Purine ATP und Adenosin bekannte Neu-

rotransmitter. Neben diesen klassischen Neurotransmittern gibt es auch Neuropeptide, dar-

unter Enkephaline, Endorphine, Cholezystokinin und die Substanz P, die eher neuromodula-

torisch wirken.

Um nach der Aktivierung postsynaptischer Rezeptoren die Signalübertragung zu beenden,

müssen die Neurotransmitter wieder aus dem synaptischen Spalt entfernt werden. Azetyl-

cholin wird dazu durch die Azetylcholinesterase gespalten. Das Cholin wird dann über

Plasmamembranrezeptoren wieder aufgenommen. Für die anderen klassischen Neu-

rotransmitter existieren ebenfalls Plasmamembranrezeptoren, die die freigesetzten Neu-

rotransmitter wieder in das Zytoplasma transportieren. Dabei zeichnen sich die Plasma-

membrantransporter für Serotonin (SERT), Dopamin (DAT), Noradrenalin (NET), GABA

(GAT1-GAT4) und Glyzin (GLYT1-GLYT2) dadurch aus, dass sie die Neurotransmitter über

einen Natrium- und Chloridkotransport in die Zelle transportieren. Der Glutamattransport aus

dem synaptischen Spalt erfolgt durch die exzitatorischen Aminosäuretransporter (EAAT1-

EAAT5), die durch Kotransport von Natriumionen und Protonen sowie einen Antiport von

Kaliumionen angetrieben werden. Für Neuropeptide sind keine Plasmamembrantransporter

bekannt, sie werden durch membrangebundene Peptidasen gespalten.

3.2 Die Variabilität der vesikulären Neurotransmitterspeicherung

beeinflusst die synaptische Übertragung

Untersuchungen an der neuromuskulären Endplatte führten zur Definition der kleinsten Ein-

heit der synaptischen Übertragung - des Neurotransmitterquantums - worunter ein einzelnes

mit Neurotransmittern gefülltes Vesikel verstanden wird (Katz, 1971). Obwohl davon ausge-

gangen wurde, dass diese Neurotransmitterquanta invariabel sind, stellte sich heraus, dass

nicht nur postsynaptische Parameter einen Einfluss auf die synaptische Übertragung haben

können, sondern auch, dass die Menge des vesikulären Neurotransmitters variiert und somit

ebenfalls die synaptische Übertragung verändern kann.

Voraussetzung für die Beeinflussung der synaptischen Übertragung durch unterschiedliche

vesikuläre Neurotransmittermengen ist, dass die postsynaptischen Rezeptoren einer Sy-

napse unter physiologischen Bedingungen nicht mit Neurotransmittern gesättigt sind. Das

konnte neben metabotropen Rezeptoren, die teilweise auch durch Neurotransmitterfreiset-

zung benachbarter Synapsen aktiviert werden, auch für ionotrope Rezeptoren gezeigt wer-

den (Forti et al., 1997; Liu et al., 1999). Neben der vesikulären Neurotransmittermenge ha-

ben auch die Wahrscheinlichkeit von Exozytoseprozessen, die Größe der Synapsen und die

Anzahl postsynaptischer Rezeptoren einen Einfluss auf die synaptische Übertragung

(Murthy et al., 1997; Nusser et al., 1997).

Einleitung

Parameter, die den vesikulären Neurotransmittergehalt, also das Neurotransmitterquantum,

beeinflussen, sind die Neurotransmitterkonzentration im Zytoplasma sowie der Transport

und unspezifischer Verlust über die Vesikelmembran.

Auf die intrazelluläre Neurotransmitterkonzentration haben sowohl der Transport über die

Plasma- und Vesikelmembran als auch die Biosynthese und der Abbau der Neurotransmit-

ter einen Einfluss. So zeigen Deletionsmutanten des DAT schwerwiegende Veränderungen

im Dopaminstoffwechsel. Homozygote Deletionsmutanten zeigen einen fünffach erhöhten

extrazellulären Dopaminspiegel und eine um 75 % reduzierte Freisetzung von Dopamin

nach elektrischer Stimulation. Insgesamt war der Gesamtdopamingehalt dieser Tiere in der

Gehirnregion des Striatums, die ca. 80 % aller dopaminergen Endknöpfe des Mäusegehirns

enthält, um 95 % reduziert (Jones et al., 1998). Dies zeigt, dass die vesikuläre Neurotrans-

mitterkonzentration in starkem Maße von der Wiederaufnahme durch Plasmamembranre-

zeptoren aus dem synaptischen Spalt abhängt.

Auch Veränderungen des Neurotransmitterstoffwechsels, wie z.B. nach Aktivierung des

Schlüsselenzyms der Dopaminbiosynthese, der Tyrosinhydroxylase, führen in Zellen zu

einer verstärkten Produktion von Dopamin (Chang et al., 2002). Die Beeinflussung der vesi-

kulären Neurotransmittermenge durch die Applikation des Dopaminsynthesevorläufers L-

DOPA führte sowohl in PC12-Zellen (Pothos et al., 1998a) als auch in dopaminergen Neu-

ronen (Pothos et al., 1998b) zu einer Erhöhung der freigesetzten Neurotransmitterquanten,

die mit Hilfe der amperometrischen Detektion an Karbonfaserelektroden bestimmt werden

konnten (Mosharov & Sulzer, 2005). Hingegen führt eine verminderte Aktivität der Tyrosin-

hydroxylase zu einer Verminderung der freigesetzten Neurotransmitterquanten. Auch die

Verringerung der vesikulären Transporterzahl beeinflusst die Speicherung und Freisetzung

von Neurotransmittern. So führt, z.B., die Überexpression der vesikulären Transporter für

Monoamine und Azetylcholin zu einer Erhöhung der Neurotransmitterquanten (Pothos et al.,

2000; Song et al., 1997). Im Gegensatz dazu führt die Reduktion dieser Transporter zu einer

verminderten Neurotransmitterfreisetzung (Fon et al., 1997; Travis et al., 2000; Prado et

al.,2006).

Wie die vorangegangenen Ausführungen und Beispiele zeigen, ist der vesikuläre Neu-

rotransmittergehalt variabel und wird von einer Vielzahl von Faktoren beeinflusst. Einer die-

ser Faktoren ist auch der vesikuläre Neurotransmittertransport, dessen grundlegende Me-

chanismen im folgenden Abschnitt näher beschrieben werden sollen.

3.3 Neurotransmittertransport in synaptische Vesikel

Nach der synaptischen Signalübertragung werden die Neurotransmitter aus dem Extrazellu-

lärraum ins Zytosol transportiert und anschließend über vesikuläre Neurotransmit-

tertransporter in sekretorischen Vesikeln gespeichert. Die sekretorischen Vesikel lassen sich

Einleitung

in zwei Klassen unterteilen: Kleine synaptische Vesikel in Neuronen (small synaptic vesic-

les; SSV) und ihre Analoge in neuroendokrinen Zellen (small synaptic-like microvesicles;

SLMV) sowie die großen elektronendichten Vesikel (large dense-core vesicles; LDCV). SSV

und SLMV speichern niedermolekulare Neurotransmitter, LDCV enthalten zusätzlich ver-

schiedene Neuropeptide als Kotransmitter. Unabhängig vom Vesikeltyp erfolgt die Neu-

rotransmitterspeicherung über die vesikulären Neurotransmittertransporter. Dabei werden

Monoamine durch die vesikulären Monoamintransporter (VMAT), Azetylcholin über den ve-

sikulären Azetylcholintransporter (VAChT), Glutamat über vesikuläre Glutamattransporter

sowie GABA und Glyzin über den vesikulären inhibitorischen Aminosäuretransporter (VIAAT

bzw. VGAT) in das Vesikellumen transportiert. Wie auch der Plasmamembrantransport ist

dieser Transport energieabhängig und wird durch einen Antiport von Protonen aus dem Ve-

sikellumen ins Zytoplasma angetrieben. Der dafür notwendige Protonengradient über die

Vesikelmembran wird durch die Aktivität der vakuolären ATP-abhängigen Protonenpumpe

(vATPase) erzeugt. Neben dem Protonengradient (∆pH) ergibt sich durch Anreicherung po-

sitiver Ladungen im Vesikellumen zusätzlich auch ein elektrischer Gradient (∆Ψ). Beide

werden als elektrochemischer Gradient zusammengefasst (∆µH

) und bilden gemeinsam

die Triebkraft für den Neurotransmittertransport entgegen dem Konzentrationsgradienten

(Johnson, 1988). Die Aktivität verschiedener vesikulärer Neurotransmittertransporter hängt

in unterschiedlichem Maße von ∆pH und ∆Ψ ab. Die Aktivität der VMAT und VAChT hängt

stärker vom ∆pH ab und die der vesikulären Glutamattransporter stärker von ∆Ψ (Johnson,

1988; Maycox et al., 1988; Carlson et al., 1989). Der vesikuläre GABA-Transport hängt von

beiden Anteilen gleichermaßen ab.

Neben der Aktivität der vakuolären ATPase wird der elektrochemische Gradient über die

Vesikelmembran zusätzlich durch die Anwesenheit von Chloridionen beeinflusst. Isolierte

synaptische Vesikel zeigen nach Inkubation mit ATP nur eine geringe Ansäuerung. Fügt

man zusätzlich Chloridionen zu, steigt die Ansäuerung stark an. Ursache hierfür ist wahr-

scheinlich die Tatsache, dass in die Vesikel aufgenommenes Chlorid den elektrischen Anteil

des elektrochemischen Potentials ∆Ψ reduziert und die Protonenpumpe dadurch einen grö-

ßeren pH-Gradienten aufbauen kann. Somit können beide Anteile des elektrochemischen

Gradienten unabhängig von einander reguliert werden (Johnson, 1988). Intrazelluläre Io-

nenkanäle, die die vesikuläre Ansäuerung beeinflussen, sind in der Literatur beschrieben

(Jentsch et al., 2005).

Im Mittelpunkt dieser Arbeit stehen der vesikuläre Transport und die Speicherung von Mo-

noaminen. Die zugrunde liegenden Prozesse werden im nächsten Abschnitt eingehend be-

schrieben.

Einleitung

3.4 Transport und Speicherung von Monoaminen in synaptischen

Vesikeln

3.4.1 Monoaminerge Neurotransmitter

Zu den monoaminergen Neurotransmittern gehören Histamin und Serotonin sowie die Kate-

cholamine Adrenalin, Dopamin und Noradrenalin. Kennzeichen dieser Neurotransmitter ist

eine namengebende primäre Aminogruppe, die über eine Ethylgruppe mit einer aromati-

schen Ringstruktur verbunden ist. Die Grundgerüste dieser Neurotransmitter sind die Ami-

nosäuren Tyrosin, Tryptophan und Histidin, aus denen sie nach verschiedenen Biosynthe-

seschritten gebildet werden. Die Zellkörper der monoaminergen Neuronen sind hauptsäch-

lich in den Regionen des Hirnstamms und des Hypothalamus lokalisiert, von wo aus sie wei-

te Bereiche des Gehirns innervieren und dadurch viele Gehirnfunktionen beeinflussen. Im

Folgenden soll kurz auf die Lokalisation und Bedeutung der genannten Neurotransmitter

eingegangen werden.

Dopamin ist an vielen Gehirnfunktionen beteiligt und entfaltet seine Wirkung über fünf be-

kannte Dopaminrezeptoren (D1-D5), bei denen es sich um metabotrope Rezeptoren han-

delt. Ausgehend von ihren Ursprungsgebieten in der Substantia nigra pars compacta und

Formatio reticularis innervieren dopaminerge Neurone ein Hauptzielgebiet, das Striatum, wo

ca. 80% des gesamten Dopamins des Gehirns lokalisiert sind. Dopamin hat in dieser Regi-

on einen starken Einfluss auf die Motorik. So führt ein Dopaminmangel, wie er z.B. bei Mor-

bus Parkinson auftritt, zu einem Bewegungsmangel und zu Muskelsteifheit. Eine weitere

wichtige Funktion im Belohnungssystem des Gehirns wird der dopaminergen Innervation

des Nucleus accumbens aus der Area tegmentalis ventralis zugeschrieben, in denen beloh-

nende Stimuli zur Dopaminfreisetzung führen. Zusätzliche innervieren dopaminerge Fasern

den Cortex, wo sie den Informationsfluss aus anderen Gehirnarealen modulieren und Moti-

vation, Emotionen, Gedächtnis und Aufmerksamkeit beeinflussen. Ebenfalls hemmt Dopa-

min - ausgehend vom Nucleus infundibularis - die Freisetzung des Hypophysenhormons

Prolaktin.

Noradrenalin, das neben seiner Funktion als Neurotransmitter im ZNS und Neuronen des

sympathischen Nervensystems auch durch chromaffine Zellen der Nebenniere als Hormon

gebildet und freigesetzt wird, entsteht intravesikulär durch die Hydroxylierung von Dopamin

durch die Dopamin-β-hydroxylase. Durch Noradrenalin werden drei Familien adrenerger

Rezeptoren - α1, α2 bzw. β-Rezeptoren - aktiviert. Der prädominante Rezeptor im Nerven-

system ist der α2

A/D

-Rezeptor, der die neuronale Erregbarkeit reduziert. Hauptlokalisation-

sorte noradrenerger Neurone ist der Locus coeruleus, von dem, wie auch von anderen no-

radrenergen Kerngebieten, zahlreiche Gehirnregionen innerviert werden. Aktiviert durch

sensorische Stimuli, besitzt das Noradrenalinsystem eine große Bedeutung für Aufmerk-

Einleitung

samkeit und Wachheit, ist aber ist auch für die Ausbildung des Langzeitgedächtnisses wich-

tig.

Neurone des ZNS, die Adrenalin als Neurotransmitter sezernieren, sind im verlängerten

Rückenmark lokalisiert. Projektionen aus diesen Kerngebieten ziehen ins Rückenmark, wo

sympathische Neurone beeinflusst, aber auch verschiedene Gehirnregionen innerviert wer-

den. Das Adrenalinsystem ist mit der Kontrolle autonomer Funktionen wie Blutdruck und

Atmung verbunden.

Wie die zuvor beschriebenen Katecholamine innervieren serotonerge Neurone viele Ge-

hirnareale und sind daher an der Regulation verschiedener physiologischer Funktionen und

Verhaltensweisen, darunter Essen, Schlafen, zirkadiane Rhythmik und Hormonsekretion der

Hypophyse beteiligt. Dabei sind die serotonergen Neurone hauptsächlich in den Rapheker-

nen des Mittelhirns und des verlängerten Rückenmarks lokalisiert. Bisher sind sieben Re-

zeptorfamilien für Serotonin bekannt (5-HT1-7), die - mit Ausnahme des 5-HT3-Rezeptors -

metabotrope Rezeptoren sind. Viele dieser Rezeptoren und der Serotoninplasma-

membrantransporter (SERT) sind die pharmakologischen Zielstrukturen zur Behandlung von

Depressionen, Angstzuständen, Psychosen, Migräne sowie Übelkeit und Erbrechen und

unterstreichen die Bedeutung von Serotonin im ZNS.

Neben dem Vorkommen von Histamin in den Mastzellen, ist Histamin auch ein Neurotrans-

mitter. Histaminerge Neurone finden sich hauptsächlich im Hypothalamus, von wo aus sie in

die Großhirnrinde, weitere hypothalamische Areale und in den Hirnstamm projizieren. Aber

auch andere Gehirnareale zeigen in unterschiedlichem Maß eine histaminerge Innervation.

Bisher sind vier verschiedene metabotrope Histaminrezeptoren (H1-H4) bekannt. Generell

scheint Histamin die Erregbarkeit von Neuronen im ZNS zu steigern und die Aktivierung

histaminerger Neurone die Wachheit und Erregbarkeit zu steigern. Bestätigt werden diese

Beobachtungen durch die, durch Histaminrezeptorantagonisten (Antihistaminika) ausgelöste

Müdigkeit. Zusätzlich ist Histamin an der Hypophysenregulation und an der Kontrolle vege-

tativer Funktionen, wie z.B. der Thermoregulation und dem Glukose- und Lipidstoffwechsel,

beteiligt.

3.4.2 Speicherung monoaminerger Neurotransmitter

Der Monoamintransport in Vesikel erfolgt durch zwei strukturell ähnliche vesikuläre Monoa-

mintransporter (VMAT), die aus PC12-Zellen (VMAT1, Liu et al., 1992) und dem Rattenge-

hirn isoliert wurden (VMAT2, Liu et al., 1992; Liu et al., 1994; Erickson et al., 1992). Für bei-

de Transporter wird von einer Topologie aus 12-Transmembrandomänen mit zytoplasmati-

scher Lokalisation von N- und C-Terminus ausgegangen. Entsprechend dieser Topologie

besitzen VMAT1 und VMAT2 eine große intravesikuläre Schleife zwischen den Trans-

membrandomänen 1 und 2, die in das Vesikellumen ragt. Diese luminale Schleife enthält

Einleitung

drei (VMAT1) bzw. vier (VMAT2) Glykosylierungsstellen (Henry et al., 1994). Der Sequenz-

vergleich zwischen VMAT1 und VMAT2 ergab eine 78-prozentige Homologie der beiden

Transporter auf Aminosäureebene (Schuldiner et al., 1995). Die größte Divergenz existiert

dabei in der luminalen Schleife. Beide Transporter unterscheiden sich hinsichtlich ihres Vor-

kommens und ihrer pharmakologischen Eigenschaften.

VMAT2 wird hauptsächlich im Gehirn exprimiert, tritt aber auch in einer Vielzahl peripherer

Zellen, darunter Neuronen des symphatischen Nervensystems, enterochromaffinen Zellen

(Peter et al., 1995; Erickson et al., 1996) und Thrombozyten (Lesch et al., 1993; Höltje et al.,

2003) auf. Die VMAT1-Expression ist im Gegensatz dazu überwiegend auf periphere Zellen

beschränkt und kommt im Gehirn nur in Neuronen der Epiphyse (Zirbeldrüse) vor (Hayashi

et al., 1999). Während der ZNS-Entwicklung in Ratten konnte in einigen Gehirnarealen vo-

rübergehend eine Koexpression beider VMAT-Isoformen beobachtet werden (Hansson et

al., 1998).

Die Neurotransmitter Dopamin, Noradrenalin, Adrenalin und Serotonin werden von beiden

VMAT-Isoformen transportiert. Beide Transporter unterscheiden sich dabei bezüglich ihrer

Affinität gegnüber den beschriebenen Substraten. Die K

-Werte des VMAT1 liegen im mik-

romolaren Bereich, die Affinität des VMAT2 ist mit K

-Werten im submikromolaren Bereich

in Ratten (Peter et al., 1994) und Menschen (Erickson et al., 1996) höher. Ein zusätzliches

Unterscheidungsmerkmal beider VMAT ist der Transport von Histamin, der durch VMAT2

mit 30-100-fach höherer Affinität erfolgt. Beide Transporter können durch Inhibitoren blo-

ckiert werden. Ein gemeinsamer Inhibitor der VMAT ist Reserpin, der durch Bindung auf

zytoplasmatischer Seite der Transporter die Monoaminaufnahme blockiert (Darchen et al.,

1989; Scherman & Henry, 1984). Ein weiterer Inhibitor, Tetrabenazin, ist je nach Spezies

zehn- (Ratte) bzw. hunderfach (Mensch) effektiver in der Wirkung auf VMAT2 als VMAT1

(Peter et al., 1994; Erickson et al., 1996).

Der Monoamintransport durch die VMAT erfolgt im Austausch gegen zwei Protonen aus

dem vesikulären Lumen (Johnson et al., 1981; Knoth et al., 1981). Da die Monoamine intra-

zellulär ausschließlich im protonierten Zustand transportiert werden, reduziert sich dadurch

die intravesikuläre Ladung nur um eine positive Ladung, wodurch die stärkere Abhängigkeit

von ∆pH gegenüber ∆Ψ erklärt werden kann. Durch den Transport und die Speicherung im

Vesikel werden die Monoamine um den Faktor 10

-10

gegenüber dem Zytosol angerei-

chert. In den LDCV und SSV einer Synapse des Blutegels konnten Serotoninkonzentratio-

nen von 270 mM gemessen werden (Bruns et al., 2000). In chromaffinen Granula kann von

einer noch höheren Konzentration bis in den molaren Bereich ausgegangen werden (Ed-

wards, 2007).

Die hohe Substrataffinität der VMAT und die damit verbundene Speicherung von Monoami-

nen im Vesikel ist aufgrund der hohen intrazellulären Toxizität der Monoamine und ihrer

Einleitung

Oxidationsprodukte physiologisch sinnvoll (Chaudry et al., 2008). Es bestehen starke struk-

turelle Ähnlichkeiten zwischen VMAT und bakteriellen Transportern, die für die Vermittlung

von Antibiotikaresistenzen verantwortlich sind (Schuldiner et al., 1995). Somit kommt den

VMAT zusätzlich zur Neurotransmitterspeicherung eine Entgiftungsfunktion für Zellen zu.

Belege für eine Schutzfunktion in Zellen lieferten Mausdeletionsmutanten des VMAT2. Ho-

mozygote VMAT2-Deletionsmutanten starben direkt nach der Geburt und heterozygote Tie-

re zeigten eine stärkere Anfälligkeit gegenüber MPTP (1-Methyl-4-Phenyl-1,2,3,6-

Tetrahydropyridin). Dabei handelt es sich um eine Substanz, die zum Auslösen von Parkin-

sonsymptomen in Nagetieren genutzt wird. Sie wird nach der Oxidation zu MPP

durch den

VMAT in die Vesikel transportiert, wodurch ihre toxische Wirkung reduziert wird (Takahashi

et al., 1997, Gainetdinov et al., 1998).

Einleitung

Abbildung 1: Dargestellt sind die vorhergesagte Struktur der VMAT mit Hilfe des Programmes TOPO2

(http://www.sacs.ucsf.edu/TOPO2/) sowie die Strukturformeln bekannter Substrate und

Inhibitoren mit ihren K

- bzw. IC

-Werten (Peter et al., 1994; Partilla et al., 2006).

3.5 Heterotrimere G-Proteine beeinflussen den Neurotransmitter-

transport in synaptische Vesikel

3.5.1 Eigenschaften heterotrimerer G-Proteine

Heterotrimere Guaninnukleotid-bindende-Proteine bilden eine Unterfamilie der Enzyme, die

GTP hydrolysieren können (Bourne et al., 1990). Sie bestehen aus einer α-, β- und γ-

Untereinheit und sind als molekulare Schalter der Plasmamembran bekannt, die extrazellu-

läre, heptahelikale Rezeptoren der Plasmamembranen aktivierende Stimuli an intrazelluläre

Effektorsysteme weiterleiten. Durch die Kombination aus 23 α-, 5 β- und 12 γ-Untereinheiten

ergeben sich mehr als 1000 mögliche Heterotrimere, wodurch verschiedene vor- und nach-

geschaltete Signaltransduktionswege miteinander verknüpft werden können. Eingeschränkt

Einleitung

werden diese Kombinationsmöglichkeiten durch die Expressionsmuster der Untereinheiten

in verschiedenen Geweben. Anhand ihrer Untereinheiten können G-Proteine in vier Familien

- Gsα, Gi/oα, Gq/11α bzw. G12/13α - eingeteilt werden. Im Grundzustand liegt der Komplex

aus β- und γ-Untereinheit und einer GDP-bindenden α-Untereinheit vor. Bindet dieser Kom-

plex an einen aktivierten heptahelikalen Rezeptor, kommt es zum Austausch von GDP ge-

gen GTP in der α-Untereinheit. Diese dissoziiert daraufhin vom βγ-Komplex. Sowohl α-

Untereinheit als auch βγ-Komplex können die Aktivität vieler Effektoren, wie z.B. Enzyme

oder Ionenkanäle, beeinflussen. Beendet wird dieses Signal durch die intrinsische GTPase

Aktivität der Gα-Untereinheit. Dadurch kommt es zu einer Reassoziation mit dem βγ-

Komplex und der Signalzyklus kann erneut beginnen. Die intrinsische GTPase-Aktivität der

α-Untereinheit kann durch Effektoren (Arshavsky and Bownds, 1992; Berstein et al., 1992;

Kozasa et al., 1998) aber auch durch Proteine der RGS-Familie (regulators of G-Protein

signalling) verstärkt werden (Ross & Wilkie, 2000; Hollinger & Hepler 2002; Neubig & Side-

rovski, 2002). In Experimenten können durch den Einsatz von GTP-Analoga wie z.B. GTPγS

oder GMP-P(NH)P, die durch die GTPase-Aktivität der Gα-Untereinheit nur schwer hydroly-

siert werden können, Gα-Proteine in aktiviertem Zustand fixiert werden.

Neben der „klassischen“ Aktivierung durch heptahelikale Rezeptoren der Plasmamembran

weisen Untersuchungen darauf hin, dass auch andere Proteine ohne Beteiligung eines Re-

zeptors heterotrimere G-Proteine aktivieren können. Dazu gehören GAP-43 (Strittmatter et

al., 1991), Ric8A (Synembryn, Tall et al., 2003), PBP (Phosphatidylethanolamin bindendes

Protein, Kroslak et al., 2001), Presenilin (Smine et al., 1998), Cystein String Protein (Nato-

chin et al., 2005) und ein partiell gereinigtes Protein aus der NG108-15 Zelllinie (Sato et al.,

1996; Ribas et al., 2002). Funktionelle Durchmusterungen in Hefen identifizierten zusätzlich

eine Reihe weiterer Proteine, die als AGS-Proteine (Activators of G-Protein Signalling) be-

zeichnet werden und sich in ihrem Aktivierungsmechanismus unterscheiden (Cismowski

2006).

3.5.2 Goα

αα

α - eine in Neuronen und neuroendokrinen Zellen exprimierte

Untereinheit heterotrimerer G-Proteine

Goα wurde von zwei unabhängigen Forschergruppen identifiziert (Neer et al.1984; Stern-

weis & Robishaw, 1984). Goα gehört zur Gi/o-Familie. Diese ist dadurch gekennzeichnet,

Substrat für die ADP-Ribosylierung durch Pertussistoxin aus Bordetella pertussis zu sein,

wodurch das Goα in seiner inaktiven Konformation fixiert wird. Gemeinsam mit Giα macht

Goα in Membranpräparationen des Gehirns bis zu 1,5 % des Proteingehaltes aus (Stern-

weis & Robishaw, 1984). Neben seinem Vorkommen in Neuronen wird Goα in endokrinen

Zellen sowie im Herzen exprimiert. Wie in Kapitel 3.5.1 beschrieben, lässt sich Goα nicht

nur durch heptahelikale Rezeptoren aktivieren, sondern auch durch mindestens zwei Prote-

Einleitung

ine, GAP43 und das Alzheimer amyloid precursor-Protein (Strittmatter et al., 1991; Nishimo-

to et al., 1993). Neben der Inhibierung von neuronalen Ca

-Kanälen sind nur wenige direkte

Effektoren der Goα-Untereinheit bekannt (Qin et al., 1997, Kinoshita M et al., 2001). Bin-

dungsstudien an Hirnschnitten von Goα-Deletionsmutanten belegen, dass Dopamin D

Rezeptoren mit Goα verknüpft sind (Jiang et al., 2001). In Neuroblastomazellen scheint Goα

aktivierende und hemmende Effekte von D

-Rezeptoren auf die Adenylatzyklase zu vermit-

teln (Watts et al., 1998). Die Überexpression von konstitutiv aktivem Goα (GoαQ205L) führt

zu einer Interaktion mit der src-Kinase (Ram & Iyengar, 2001), transformiert NIH-3T3-

Fibroblasten (Kroll et al., 1992), aktiviert die MAP-Kinase-Kaskade in CHO-Zellen (van Bie-

sen et al., 1996), die Phospholipase C in Xenopus Oozyten (Moriarty et al., 1990) und auch

Kalium-Kanäle in Neuronen (van Dongen et al., 1988). Wie diese Effekte ausgelöst werden

bzw. welche Effektoren durch Goα angesprochen werden ist dabei aber unklar. Erschwert

wird diese Tatsache dadurch, dass zwei verschiedene Spleißvarianten von Goα existieren -

Go1α und Go2α - und in Untersuchungen häufig nur von Goα die Rede ist, wobei aber

Go1α gemeint ist. Darüber hinaus existiert eine dritte Isoform, Go3α, die durch posttransla-

tionale Deamidierung des Asparagins an Position 346 zu Asparaginsäure aus Go1α hervor-

geht (Exner et al., 1999).

Abbildung 2: Sequenzvergleich der C-Termini beider Goα

αα

α-Isoformen der Maus. Orange markiert sind

die 25 in den beiden Isoformen unterschiedlichen Aminosäuren.

Trotz der hohen Homologie beider Goα-Isoformen, interagieren beide Spleißvarianten mit verschiedenen Rezep-

toren und Effektoren.

Um direkte Interaktionspartner der Goα-Untereinheiten zu identifizieren, wurden zahlreiche

Yeast-two-hybrid-Untersuchungen und Koimmunopräzipitationen durchgeführt. Für Goα

bzw. Go1α konnten die direkten Interaktionen mit RGS14 (Traver et al., 2000), RGS17,

Rap1Gap, IP6 (KIAA 0514; Jordan et al., 1999), Purkinje cell protein2 (Pcp2, Luo & Denker,

1999), G-Protein-Induced-Protein-of-Neurite-outgrowth 1&2 (GRIN1&2; Chen et al., 1999;

Nakata & Kozasa 2005) nachgewiesen werden. Isoformspezifische Untersuchungen für

Goα2 fehlen bisher komplett, obwohl gezeigt werden konnte, dass beide Spleißvarianten

von Goα mit verschiedenen Rezeptoren (Kleuss et al., 1991; Dhingra et al., 2002) oder Ef-

fektoren (Man-Son-Hing et al., 1992) interagieren.

Die Bedeutung von Goα im Nervensystem

wird durch ausgeprägte Defizite von Goα-

defizienten Mäusen deutlich. Sie weisen neben verschiedenen neurologischen Symptomen

Einleitung

wie Tremor, Krampfanfällen, auffälligen Bewegungsmustern und Hyperalgesie eine hohe

postnatale Sterblichkeit auf (Jiang et al., 1998). Morphologisch zeigt das Gehirn jedoch kei-

ne Veränderungen (Valenzula et al., 1997).

3.5.3 Lokalisation heterotrimerer G-Proteine auf synaptischen Vesikeln -

Regulation der vesikulären Neurotransmitterspeicherung

Neben der Vermittlung der Signale von heptahelikalen Rezeptoren und der damit verbunde-

nen Lokalisation an der Plasmamembran ist bekannt, dass Untereinheiten heterotrimerer G-

Proteine auch intrazellulär vorkommen. Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine der Gi/o-

Familie sind mit dem Golgi-Apparat (Ercolani et al., 1990; Stow et al., 1991; Wilson et al.,

1994; Montmayeur & Borrelli, 1994; Denker et al., 1996), dem endoplasmatischen Retiku-

lum (Audigier et al., 1988), Endosomen (Ali et al., 1989; Zheng et al., 2004), dem Zytoskelett

(Rasenick et al., 1990; Roychowdhury et al., 1999; Chen et al., 2003) und dem Zellkern as-

soziiert (Willard & Crouch, 2000).

Gleichermaßen lassen sich auf sekretorischen Granula und Vesikeln (Toutant et al., 1987;

Aronin & DiFiglia, 1992) α-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine finden. Dabei hat sich

gezeigt, dass verschiedene synaptische Vesikel Unterschiede in ihrer G-Proteinverteilung

aufweisen (Ahnert-Hilger et al., 1994). Über die Bedeutung und Funktionsweise sowie vor-

und nachgeschaltete Signalwege existieren nur wenige Informationen.

Von Bedeutung sind vesikel-assoziierte heterotrimere G-Proteine bei Neurotransmitterauf-

nahme und -speicherung in sekretorischen Vesikeln. Erste Hinweise auf die Beteiligung von

G-Proteinen an diesen Prozessen zeigten Experimente an PC12-Zellen, einer Zelllinie, die

aus einem Phaeochromozytom der Ratte hervorgegangen ist. In permeabilisierten PC-12-

Zellen, die ausschließlich VMAT1 exprimieren, konnte der Transport markierter Monoamine

in Vesikel durch Zugabe der schwer hydrolysierbaren GTP-Analoga GTPγS bzw. GMP-

P(NH)P vermindert werden.

Bei der Charakterisierung des für die Reduktion verantwortlichen G-Proteins stellte sich her-

aus, dass Go2α aber nicht Go1α, Gi1α und Gi2α die vesikuläre Serotoninaufnahme in

PC12-Zellen vermindert (Ahnert-Hilger et al., 1998). Gleiche Beobachtungen konnten an

einer Pankreaskarzinoidzelllinie (BON-Zellen), die sowohl VMAT1 als auch VMAT2 expri-

miert, gemacht werden. Beide VMAT-Isoformen werden durch Go2α reguliert. Exozyto-

seprozesse spielen bei dieser Regulation keine Rolle. Dies zeigten Experimente mit Teta-

nustoxin, das die Vesikelfusion mit der Plasmamembran verhindert (Höltje et al., 2000).

Auch in Vesikelpräparationen und permeabilisierten Raphe-Neuronen kann die vesikuläre

Serotoninaufnahme durch Zugabe von GMP-P(NH)P bzw. rekombinantem Go2α gehemmt

werden (Höltje et al., 2000). Elektronenmikroskopisch werden diese Daten durch die Lokali-

sation von Go2α auf VMAT2-haltigen SSV serotonerger Nervenendigungen untermauert

Einleitung

(Höltje et al., 2000). Neuere Untersuchungen des Proteoms Clathrin-ummantelter Vesikel

(Blondeau et al., 2004) und synaptischer Vesikel (Burrè et al., 2006, Takamori et al., 2006)

bestätigen ebenfalls das Vorkommen von Go2α bzw. Goα auf synaptischen Vesikeln.

Neben dem Vorkommen im Gehirn wird VMAT2 auch in Thrombozyten exprimiert. In den

Thrombozyten ist VMAT2 gemeinsam mit dem Plasmamembrantransporter SERT an der

Speicherung von Serotonin beteiligt. Das Serotonin wird durch enterochromaffine Zellen

freigesetzt und bei der Passage durch die Kapillaren des Magen-Darm-Traktes in die

Thrombozyten aufgenommen, wo es in den vesikulären Strukturen, sogenannten dense

bodies, gespeichert wird. Die Synthese von Serotonin aus Tryptophan ist in Blutplättchen

nicht möglich. Auch in Thrombozyten führt die G-Proteinaktivierung durch GMP-P(NH)P zu

einer verminderten Neurotransmitterspeicherung. In diesen Organellen wird dieser Prozess

durch Gqα reguliert, wie Versuche an permeabilisierten Thrombozyten aus Gqα-

Deletionsmutanten zeigen (Höltje et al., 2003). Experimente an Thrombozyten aus Tryp-

tophanhydroxylase1(Tph1)-Deletionsmutanten, deren Thrombozyten weniger als 10 % Se-

rotonin gegenüber Wildtypthrombozyten enthalten, ließen erstmals die Schlussfolgerung zu,

dass der vesikuläre Füllungszustand ein vorgeschaltetes Signal der G-Protein vermittelten

Regulation der Neurotransmitteraufnahme ist. In den nahezu leeren Thrombozyten aus

Tph1-Deletionsmutanten fehlt die Gqα-vermittelte Verminderung der Serotoninspeicherung,

kann aber durch Vorinkubation mit Serotonin wiederhergestellt werden (Höltje et al., 2003).

Ähnliche Beobachtungen wurden an mit VMAT transfizierten CHO-Zellen gemacht. Diese

Zellen enthalten keine für Serotoninsynthese und -speicherung nötigen Enzyme und Trans-

porter. Nach Transfektion mit VMAT2 bzw. VMAT1 und Permeabilisierung der Zellen - sie

enthalten keinen Plasmamembrantransporter - kann der Monoamintransport in intrazelluläre

Kompartimente gemessen werden (Brunk et al., 2006). In diesem zellulären Testsystem

kann eine G-Protein-vermittelte Hemmung der Monoaminaufnahme erst nach Vorbeladung

der intrazellulären Kompartimente mit Monoaminen beobachtet werden (Brunk et al., 2006).

Dabei eignen sich für VMAT1 und VMAT2 nicht alle Monoamine gleichermaßen. So führt

z.B. die Vorbeladung mit Adrenalin in permeabilisierten VMAT1-transfizierten Zellen in nach-

folgenden Neurtotransmitteraufnahmetests zur Auslösung einer G-Protein-vermittelten

Hemmung. Im Gegensatz dazu fehlt in VMAT2-transfizierten Zellen diese Adrenalinwirkung

(Brunk et al., 2006).

Die zuletzt beschriebenen Ergebnisse belegen, dass eine Signaltransduktionskaskade, die

im Vesikellumen beginnt, an der G-Proteinaktivierung beteiligt ist. Eine Erkennungsstruktur,

die an der Bestimmung der intravesikulären Monoaminkonzentration beteiligt ist, unter-

scheidet sich in VMAT1- und VMAT2-transfizierten CHO-Zellen. Da diese Zellen nicht die

Enzymausstattung für Synthese und Speicherung von Monoaminen haben, scheinen die

VMAT Bestandteil der intravesikulären Rezeptorstruktur zu sein.

Einleitung

3.6 Fragestellung

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit sollten deshalb folgende Fragestellungen untersucht

werden:

Sind die VMAT Bestandteil einer intravesikulären Rezeptorstruktur? Wenn ja, welche Do-

mänen der Transporter sind an einer Signaltransduktion aus dem Lumen ins Zytoplasma

beteiligt?

Welche weiteren Signalmoleküle beeinflussen die Monoaminspeicherung in Vesikeln und

welche nachgeschalteten Signaltransduktionsmoleküle interagieren direkt mit aktiviertem

Go2α?

Welche Bedeutung hat die durch Go2α -Protein-vermittelte Regulation für den Organismus

bzw. welche Folgen hat die Inaktivierung von Go2α?

Materialien und Methoden

4 Materialien und Methoden

4.1 Chemikalien

40% Acrylamid/Bisacrylamid-Stammlösung (40,19:1) Roth (Karlsruhe)

L-Adeninhemisulfatsalz Sigma (Schnelldorf)

Adrenalin Sigma (Schnelldorf)

Agar-Agar Sigma (Schnelldorf)

Agarose Roth (Karlsruhe)

Aluminiumoxid Sigma (Schnelldorf)

3-Aminotriazol (3-AT) Sigma (Schnelldorf)

Ammoniumpersulfat (APS) Sigma (München)

Ampicillin Roth (Karlsruhe)

AmpliTaq DNA Polymerase Applied Biosystems

(Darmstadt)

Ascorbinsäure Sigma (München)

Bafilomycin Sigma (Schnelldorf)

Bicinchoninsäure (BCA) Sigma (Schnelldorf)

Bromphenolblau Roth (Karlsruhe)

Bovines Serum Albumin, Fraktion V (BSA) Roth (Karlsruhe)

Dibutyryl-cAMP (DbcAMP) Sigma (Schnelldorf)

Dibutyryl-cGMP (DbcGMP) Sigma (Schnelldorf)

Kollagen Typ VII Sigma (Schnelldorf)

1,4-Diazabizyklo[2.2.2]oktan (DABCO) Sigma (Schnelldorf)

3,4-Dihydroxybenzylaminhydrobromid (DHBA) Sigma (Schnelldorf)

3,4-Dihydroxyphenylessigsäure Sigma (Schnelldorf)

Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma (Schnelldorf)

Dithiothreitol (DTT) Sigma (Schnelldorf)

[7,8-

H]Dopamin GE Healthcare (München)

3,4-Dihydroxyphenethylamin-hydrochlorid (Dopamin) Sigma (Schnelldorf)

Enhanced-Chemiluminescence-Reagenzien (ECL) GE Healthcare (München)

Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Roth (Karlsruhe)

Ethylenglykolbis(2-aminoethyl-)tetraacetat (EGTA) Roth (Karlsruhe)

Essigsäure Roth (Karlsruhe)

Ethanol Merck (Darmstadt)

Ethidiumbromid Roth (Karlsruhe)

Geneticin Invitrogen (Karlsruhe)

Glukose Sigma (Schnelldorf)

Materialien und Methoden

Glyzerin Merck (Darmstadt)

Glyzin Sigma (Schnelldorf)

5´-Guanolylimidodiphosphat (GMP-P(NH)P) Sigma (Schnelldorf)

Hefeextrakt Roth (Karlsruhe)

Heptansulfonsäure Sigma (Schnelldorf)

N-2-Hydroxyethylpiperazin-N´-2-ethansulfonsäure (HEPES) Sigma (Schnelldorf)

5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) Sigma (Schnelldorf)

5-Hydroxytryptamin-Hydrochlorid Sigma (Schnelldorf)

5-Hydroxy-[

H]-tryptamintrifluoracetat ([

H]-Serotonin) GE Healthcare (München)

Kaliumchlorid Sigma (Schnelldorf)

Kaliumhydroxid Roth (Karlsruhe)

Kaliumglutamat Sigma (Schnelldorf)

Kanamycin Sigma (Schnelldorf)

Kupfersulfat Sigma (Schnelldorf)

Lipofectamin Invitrogen (Karlsruhe)

Lithiumazetat Sigma (Schnelldorf)

Low Molecular Weight-Marker (LMW) GE Healthcare (München)

Magermilchpulver Molkerei Heideblume

(Elsorf)

Magnesiumchlorid Sigma (Schnelldorf)

Mass-Ruler-DNA-Marker Fermentas (St. Leonrot)

Methanol Merck (Darmstadt)

Mowiol 4-88 Sigma (Schnelldorf)

Di-Natrium-Adenosin-5´-Triphosphat (Na

-ATP) Sigma (München)

Natriumazetat Sigma (Schnelldorf)

Natriumbicarbonat Sigma (Schnelldorf)

Natriumcarbonat Sigma (Schnelldorf)

Natriumchlorid Sigma (Schnelldorf)

Natriumdodecylsulfat (SDS) Sigma (Schnelldorf)

Natriumhydrogenphosphat Roth (Karlsruhe)

Natriumhydroxid Sigma (Schnelldorf)

Di-Natriumtartrat Sigma (Schnelldorf)

Nigericin Sigma (Schnelldorf)

Noradrenalinbitartrat Sigma (Schnelldorf)

Oktansulfonsäure Sigma (Schnelldorf)

Optiphase HighSafe 3 Szintillationsflüssigkeit Beckman Coulter (Krefeld)

PageRuler - Protein Marker Fermentas (St. Leonrot)

Materialien und Methoden

Perchlorsäure Sigma (Schnelldorf)

Pertussistoxin (Ptx) List Biological Laboratories

Piperazin-N,N´-bis-(2-ethansulfonsäure) (Pipes) Sigma (Schnelldorf)

Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) Sigma (Schnelldorf)

Polyethylenglykol (PEG 3350) Sigma (Schnelldorf)

Ponceau S Sigma (Schnelldorf)

Porablot Macherey & Nagel (Düren)

Protease-Inhibitor-Cocktail Sigma (Schnelldorf)

Restriktionsenzyme Fermentas (St. Leonrot)

Reserpin Sigma (Schnelldorf)

RNAse A Roth (Karlsruhe)

Synthetic Dropout(SD)-Pulver (Medienzusatz) Clontech (Saint-Germain-

en-Laye, Frankreich)

Saccharose Roth (Karlsruhe)

Salzsäure Sigma (Schnelldorf)

Sulfosalicylsäure Sigma (Schnelldorf)

N,N,N´,N´-Tetramethylethylendiamin (TEMED) Sigma (Schnelldorf)

Tetrabenazin Sigma (Schnelldorf)

Trichloressigsäure Sigma (Schnelldorf)

Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Tris) Merck (Darmstadt)

Triton X-100 Roth (Karlsruhe)

Trypsin Sigma (Schnelldorf)

Trypton Roth (Karlsruhe)

Tween 20 Merck (Darmstadt)

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-ß-D-galaktopyranosid (X-Gal) Roth (Karlsruhe)

5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galaktopyranosid (X-α-Gal) Neolab (Heidelberg)

Yeast Nitrogen Base (YNB) Sigma (Schnelldorf)

zyklisches Adenosin 3´,5´-monophosphat (cAMP) Sigma (Schnelldorf)

zyklisches Guanosin 3´,5´-monophosphat (cGMP) Sigma (Schnelldorf)

4.2 Geräte und Apparaturen

Elektrophorese

Alle Geräte für die Elektrophorese stammen von BioRad (München).

Power/Pac 200/300 Spannungsgerät

TransBlot SD Semidry Elektrophorese Transferzelle

Mini Protean II Elektrophorese-Kammer

Mini-Sub Cell GT/ Wide Mini-Sub Cell GT

Materialien und Methoden

Mikroskope

Leica DMIL Kontrastiermikroskop

Leica DMLB Epifluoreszenz-Mikroskop mit Durchlichteinrichtung

Homogenisierung von Gewebe

Heidolph Rührer RZR 2021

Wheaton Homogenisator

Photometer

GeneQuant II (Pharmacia Biotech)

Anthos Labtec HT-2 Mehrzweck-Mikrotiterplattenlesegerät

Dynatech MR 500 Mikrotiterplattenlesegerät

Zentrifugen

Beckman J2-HS Kühlzentrifuge

Rotoren: JA-14, JA-20

Beckmann Optima Max Ultrazentrifuge

Rotoren: TLS 55, TLA 100.4, TLA 100.1

Beckmann Optima L-90K Ultrazentrifuge

Rotoren: Ti 70, SW 40

Eppendorf Kühlzentrifuge 5417 R

HPLC

Beckman Coulter LC 118 Pumpenmodul

Beckman Coulter LC 508NM Autosampler

Chromsystems Elektrochemischer Detektor CLC 100

Säulenthermostat Jetstream (FlowSpek AG)

Sonstige

Beckman LS 6500, Liquid Szintillation Counter

BioDoc Analyse (Video Dokumentationssystem)

Sterilarbeitsbänke Heraeus HeraSafe 18 / 2 bzw. Heto-Holten Safe 2010

Zellkulturbrutschränke bzw. Inkubatoren: Heraeus BB16CU / BBD 6220 bzw. T 6120

Materialien und Methoden

4.3 Puffer und Lösungen

Kollagenlösung

1 ml Kollagenlösung (1 mg / ml in 0,1% Eisessig)

32 ml 30 % Ethanol

Einfrierlösung

28 ml Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)

12 ml DMSO

10 mM HEPES

Homogenisierungslösung für HPLC-Proben

100 mM Perchlorsäure (HClO

)

0,4 mM Na

PBS (Phosphate Buffered Saline)

140 mM NaCl

10 mM KCl

6,4 mM Na

HPO

2 mM KH

pH 7,4

PEG/LiAc-Lösung

Diese Lösung wurde vor jeder Transformation frisch aus folgenden sterilen Stammlösungen

hergestellt:

8 ml 50 % (w/v) Polyethylenglykol 3350

1 ml 10 x Tris-EDTA-Puffer

1 ml 1 M Lithiumazetat

1,1 x TE/LiAc-Lösung

1,1 ml 10 x Tris-EDTA-Puffer

1,1 ml 1M Lithiumazetat

7,8 ml steriles ddH

Trypsinlösung

0,25 % Trypsin

1 mM EDTA

in PBS

Lösungen für die Proteinbestimmung

Lösung A

1 % (w/v) BCA

17 % (w/v) Na

0,16 % (w/v) 2,3-Na

(Dinatriumtartrat)

0,4 % (w/v) NaOH

0,95 % (w/v) NaHCO

Lösung B

4 % (w/v) CuSO

in ddH

Materialien und Methoden

Lösungen für Immunoblots

TS-(Tris-Saline) Puffer

20 mM Tris

150 mM NaCl

pH 7,5 (HCl)

TS-Tween-Puffer

20 mM Tris

150 mM NaCl

0,1 % (v/v) Tween 20

pH 7,5 (HCl)

Antikörperlösung

1,5 % (w/v) BSA

in TS-Puffer

Magermilchlösung

5 % (w/v) Magermilchpulver

0,1 % (v/v) Tween 20

in TS Puffer

Lösungen für Elektrophorese

Probenpuffer

200 mM Tris

400 mM DTT

8 % (w/v) SDS

0,4 % (w/v) Bromphenolblau

40 % (v/v) Glyzerin

Elektrophoresepuffer

25 mM Tris

200 mM Glyzin

3,5 mM SDS

Ponceau S-Färbelösung

0,3 % (w/v) Ponceau S

3 % (w/v) Trichloressigsäure

3 % (w/v) Sulfosalizylsäure

in ddH

Proteintransferpuffer

200 mM Glyzin

25 mM Tris

1,3 mM SDS

20 % (v/v) Methanol

Tris I-Puffer (4x)

500 mM Tris

0,4 % (w/v) SDS

pH 6,8 (HCl)

Tris II-Puffer (4x)

1,5 M Tris

0,4 % (w/v) SDS

pH 8,8 (HCl)

Materialien und Methoden

Sammelgel

0,5 ml Acrylamid/Bisacrylamid (40,19:1)

2,5 µl TEMED

25 µl 10% APS

1,25 ml Tris I-Puffer

3,25 ml ddH

Trenngele

% Acrylamid/Bisacrylamid 5% 8% 10% 12% 15%

Tris II -Puffer 2,5 ml

Acrylamid/Bisacrylamid (40%;19:1) 1,25 ml 2 ml 2,5 ml 3 ml 3,75 ml

ddH

O 6,25 ml 5,5 ml 5 ml 4,5 ml 3,75 ml

TEMED 5 µl

10% APS 50 µl

Lösungen für Polymerase Kettenreaktion (PCR)

TAE (Tris-Azetat-EDTA)-Puffer

40 mM Tris

2 mM EDTA

pH 8,5 (Essigsäure)

TE (Tris-EDTA)-Puffer

10 mM Tris

1 mM EDTA

pH 8,0 (HCl)

Probenpuffer

20 % (w/v) Ficoll 400

100 mM EDTA

1,0 % (w/v) SDS

0,25 % (w/v) Bromphenolblau

Lösungen für Vesikelpräparationen und Neurotransmitteraufnahme

Homogenisierungspuffer

320 mM Saccharose

4 mM HEPES

pH 7,4 (NaOH)

KG (Kaliumglutamat)-Puffer (1x)

150 mM Kaliumglutamat

20 mM Pipes

4 mM EGTA

2,8 mM MgCl

(durch Komplexbildung ca. 1mM freies Mg

)

pH 7,0 (KOH)

KG (Kaliumglutamat)-ATP-Puffer

KG-Puffer

2 mM Na

-ATP

Materialien und Methoden

Natrium-Puffer

10 mM Glukose

5 mM KCl

140 mM NaCl

5 mM NaHCO

1 mM MgCl

1,2 mM Na

HPO

20 mM HEPES

pH 7,4 (NaOH)

Tyrode HEPES (TH)-Puffer

134 mM NaCl

0,34 mM Na

HPO

2,9 mM KCl

12 mM NaHCO

10 mM HEPES

5 mM Glukose

1 mM MgCl

pH 7,3 (HCl)

Lösungen für die Immunfluoreszenz

Blocklösung

0,1 % (v/v) Triton X-100

5,0 % (v/v) NGS (normal goat serum)

2,0 % (w/v) BSA (bovine serum albumine)

in PBS

Mowiol

2,4 g Mowiol 4-88

6,0 g Glyzerol

6,0 ml ddH

12 ml 0,2 M Tris(HCl) pH 8,5

0,6 g DABCO

Paraformaldehydlösung

4 % (w/v) Paraformaldehyd

0,1 M Phosphatpuffer

(pH 7,4)

4.4 Medien

4.4.1 Mikrobielle Medien

Alle hier aufgeführten Medien wurden für 20 Minuten bei 121 °C autoklaviert. Bei Medien,

die Glukose enthielten, wurde diese als 20-fache Stammlösung separat sterilisiert und nach

dem Autoklavieren zugegeben. Für die Herstellung von festen Medienplatten wurde vor dem

Autoklavieren Agar-Agar mit einer Konzentration von 20 g / l zugegeben.

Luria Bertani (LB)-Medium

10 g / l Trypton

5 g / l Hefeextrakt

5 g / l NaCl

pH 7,0

Materialien und Methoden

YPD-Medium

20 g / l Pepton

10 g / l Hefeextrakt

20 g / l Glukose

pH 6,5

YPDA-Medium

wie YPD-Medium, jedoch mit dem Zusatz von 30 mg / l L-Adeninhemisulfatsalz

Minimalmedium

6,7 g / l YNB (Yeast Nitrogen Base)

20 g / l Glukose

0,6 g / l SD-Pulver-Zusatz (Menge variierend entsprechend Herstellerangaben)

Einfrier-Medien

wie LB, YPDA- oder Minimalmedium, jedoch mit Zusatz von Glyzerin, so dass die Endkon-

zentration 15 % (v/v) betrug

Medienzusätze

Die hier aufgeführten Medienzusätze wurden nach dem Autoklavieren und Abkühlen des

Mediums auf ca. 55°C zugegeben.

Medienzusatz Stammlösung Konzentration im Medium

Ampicillin 100 mg / ml 100 µg / ml

Kanamycin 25 mg / ml 25 µg / ml

X-Gal 20 mg / ml 40 µg / ml

X-α-Gal 20 mg / ml 2 mg / ml

3-AT 1 M 1 mM

4.4.2 Zellkulturmedien

Alle für die Zellkultur angegebenen Medienbestandteile wurden von der Firma Biochrom AG

(Berlin) bezogen. Bei Transfektionen kam zusätzlich das Medium Optimem (Invitrogen,

Karlsruhe) zum Einsatz.

Medium für BON- und CHO-Zellen

180 ml DMEM/HAM’s F12

20 ml Kälberserum (FBS)

2 ml L-Alanylglutamin (200 mM)

2 ml Penicillin (10.000 U) / Streptomycin 10.000 µg / ml)

Medium für PC12-Zellen

170 ml RPMI 1640

20 ml Pferdeserum (HS)

10 ml Kälberserum (FBS)

2 ml L-Alanylglutamin (200 mM)

2 ml Penicillin (10.000 U) / Streptomycin 10.000 µg / ml)

Einfriermedium

60 ml DMEM

40 ml Kälberserum (FBS)

Materialien und Methoden

4.5 Antikörper

4.5.1 primäre Antikörper

Anti-Gqα

Calbiochem, La Jolla,Ca ,USA

polyklonal, Kaninchen

Anti-Goα

(Klon 101.1, 101.4) freundlicherweise von Prof. Jahn,

monoklonal, Maus MPI für biophysikalische Chemie zur Ver-

fügung gestellt, Göttingen, Deutschland

Anti-GAL4-DNA-Bindungsdomäne Clontech

monoklonal, Maus Saint-Germain-en-Laye

Frankreich

Anti-GAL4-Aktivierungsdomäne Clontech

monoklonal, Maus Saint-Germain-en-Laye

Frankreich

Anti-Synaptophysin (Klon 7.2) Synaptic Systems

monoklonal, Maus Göttingen, Deutschland

Anti-VMAT1 Chemicon International

polyklonal, Kaninchen Schwalbach, Deutschland

Anti-VMAT2 Synaptic Systems

polyklonal, Kaninchen Göttingen, Deutschland

4.5.2 sekundäre Antikörper

Ziege-Anti-Kaninchen IgG Vector Laboratories

Peroxidase gekoppelt Burlingham, USA

Ziege-Anti-Maus IgG Vector Laboratories

Peroxidase gekoppelt Burlingham, USA

Ziege-Anti-Kaninchen IgG MoBiTec GmbH,

MFP488 gekoppelt Göttingen, Deutschland

Ziege-Anti-Maus IgG MoBiTec GmbH

MFP590 gekoppelt Göttingen, Deutschland

4.6 Nukleinsäuren

4.6.1 Oligonukleotide

Alle verwendeten Oligonukleotide wurden von TIB-MOLBIOL (Berlin) synthetisiert und sind

in 5’-3’-Orientierung angegeben.

Primerpaar für die ortsspezifische Mutagenese einer EcoR1-Schnittstelle in Gqα (Ratte):

EcorGQ-fwd: AGG CAG CCC GAG AGT TTA TTC TGA AGA TGT TC

EcorGQ-rev: GAA CAT CTT CAG AAT AAA CTC TCG GGC TGC CTG

Materialien und Methoden

Primerpaar für die ortsspezifische Mutagenese von Q205L in Go2α:

Go2Q205L-f: TTG ACG TTG GGG GCT TAC GTA GTG AAC GTA AGA AGT GG

Go2Q205L-R: ACT TCT TAC GTT CAC TAC GTA AGC CCC CAA CGT CA

Primerpaar für die Klonierung von Go1/2α (EcoRI/SalI):

GOfw: ACC GAA TTC ATG GGA TGT ACT CTG AGC

GO1rev: AAT GTC GAC TCA GTA CAA GCC ACA GC

GO2rev: AAT GTC GAC TCA GTA CAA GCC ACA GCC CCG CAG A

Primerpaar für die Klonierung von Gqα (EcoRI/XhoI):

Gqfw: AGC GAA TTC ATG ACT CTG GAG TCC

Gqrev: AGC CTC GAG TTA GAC CAG ATT GTA CTC C

Primerpaar für die Amplifikation von pACT2-Bibliotheksfragmenten:

pACT25091f: CTA TTC GAT GAT GAA GAT ACC CCA CCA AAC C

pACT24978: AGT GAA CTT GCG GGG TTT TTC AGT ATC TAC G

Primer für die Klonierung von mutiertem VMAT2 im Bereich der ersten luminalen Schleife:

VMAT2-1: AAG CTT GCC GCC ATG GCC CTG AGC GAT CTG G

VMAT2-2: GAA TTC GCC GCC GCC GCC GCC AAC CAC GAC GGT GAG

CAG CAT G

VMAT2-3: GAA TTC GAT TTC CGT AGA GTT TTT CTC ATG C

VMAT2-4: GAA TTC GTC CCT TCG GAC TGT CCC AG

VMAT2-5: GAA TTC CAA GTT GGG CTG CTG TTT GCC

VMAT2-6: ACG CTC GAG TCA GTC ACT TTC AGA TTC TTC

Primer für die Klonierung von mutiertem VMAT1 im Bereich der ersten luminalen Schleife:

VMAT1-1: ATC GGA TCC GCC GCC ATG CTC CAG GTT GTT CTG

VMAT1-2: ATC GAA TTC GCC GCC GCC GCC GCC CAC CAC CAC AGT GAG

CAG CAT

VMAT1-3: CTC GAA TTC CAG AGA AGA GTT GCT GTC TTT G

VMAT1-4: CAG AAT TCC CAA AAA ACA ACT GCT TGC AAG G

VMAT1-5: CTG AAT TCC GGA TTG GGA TTC TAT TTG C

VMAT1-6: ACA CTC GAG TTA CTC CCC GCT GCT AGG ATC

Primer für die Klonierung von C-terminal mutierter VMAT2-cDNA:

VMAT2-1: AAG CTT GCC GCC ATG GCC CTG AGC GAT CTG G

VMAT2∆

∆∆

∆Crev: GCG CCT CGA GTC AAA GGA AAA AGC AGA GAG GAG C

VMAT2∆

∆∆

∆Cmed: GCG CCT CGA GTC AGT CAC TTT CAG ATT CTT CAT CAT CAC

CGA TGG GAA GGA AAA AGC AGA GAG GAG C

Primer für die Klonierung mutierter VMAT2 mit Deletion der Schleife zwischen TMD VI & VII:

VMAT2-1: AAG CTT GCC GCC ATG GCC CTG AGC GAT CTG G

VMAT2TM6re: ATG GGC CGC CGC CGC CGC CGC CCT GGA GCA CAA AGA

GCT G

VMAT2TM7fw: CAG GGC GGC GGC GGC GGC GGC CCA TAC ATC CTC ATC

GCT G

VMAT2-6: ACG CTC GAG TCA GTC ACT TTC AGA TTC TTC

Materialien und Methoden

4.6.2 Vektoren

pACT2 (Clontech): Dieser Vektor kodiert die in die Multiple Cloning Site (MCS) klonierten

Fragmente als Fusion mit der GAL4-Aktivierungsdomäne. Für die Selektion in E.coli trägt

der Vektor das β-Laktamase-Gen, für die Selektion in S.cerevisiae zusätzlich das LEU2-

Gen.

pcDNA3.1 (Invitrogen): Dieser Vektor ermöglicht die Expression einer gewünschten cDNA

in Säugerzellen. Für die Selektion in Säugerzellen dient das Neomycinresistenz-Gen, für die

Selektion in E.coli enthält der Vektor außerdem das β-Laktamase-Gen.

pEGFP-(del2)-C3: Dieser Vektor wurde freundlicherweise von Herrn Dr. Christian Derst

(Charité, Institut für Integrative Neuroanatomie, Berlin) zur Verfügung gestellt. Dieser modifi-

zierte Vektor ist durch Deletion der Basen 1341 (A) und 1342 (T) des Vektors pEGFP-C1

(Clontech) entstanden. Der Vektor kodiert das enhanced green fluorescent protein (EGFP)

gefolgt von der MCS. Für die Generierung stabiler Zelllinien dient das Neomycinresistenz-

Gen. Für die Selektion in E. coli ist dem Neomycinresistenz-Gen ein bakterieller Promotor

vorgeschaltet, der die Selektion mittels Kanamycin ermöglicht.

pGBKT7 (Clontech): Dieser Vektor ermöglicht die Expression von Proteinen als Fusionspro-

teine mit der GAL4-DNA-Bindungsdomäne. Der Vektor enthält das Kanamycinresistenz-Gen

für die Selektion in E.coli und das TRP1-Gen für die Selektion in S.cerevisiae.

pGBKT7lam (Clontech): Dieser Vektor kodiert ein Fusionsprotein der GAL4-DNA-

Bindungsdomäne mit humanem Lamin C. Es ist bekannt, dass Lamin C kaum mit anderen

Proteinen interagiert (Bartel et al., 1993; Ye & Worman, 1995). Der Vektor dient während

eines Yeast-Two-Hybrid-Screenings als Negativkontrolle.

pGBKT7p53 (Clontech): Dieser Vektor kodiert ein Fusionsprotein der GAL4-DNA-

Bindungsdomäne mit murinem p53. Es ist bekannt, dass murines p53 mit dem großen SV40

T-Antigen interagiert (Li & Fields, 1993; Iwabuchi et al., 1993). In Kombination mit pGADT7T

dient dieser Vektor als Positivkontrolle für ein Yeast-Two-Hybrid-Screening.

pGADT7 (Clontech): Dieser Vektor kodiert Fusionsproteine mit der GAL4-Aktivierungs-

domäne. Der Vektor enthält das β-Laktamase-Gen für die Selektion in E.coli und das LEU2-

Gen für die Selektion in S.cerevisiae.

Materialien und Methoden

pGADT7T (Clontech): Dieser Vektor kodiert für das Fusionsprotein aus GAL4-

Aktivierungsdomäne und dem großen SV40 T-Antigen. Es ist bekannt, dass das SV40 T-

Antigen mit murinem p53 interagiert. Gemeinsam mit pGBKT7p53 dient dieser Vektor als

Positivkontrolle in einem Yeast-Two-Hybrid-Screening.

4.6.3 cDNA

4.6.3.1 cDNA-Bibliothek

Für das Yeast-Two-Hybrid-Screening wurde eine Mouse Brain MATCHMAKER cDNA Libra-

ry (Clontech, Lot#: 4030478), die im E.coli Stamm BNN132 vorlag, verwendet. Als mRNA-

Quelle dieser Bibliothek dienten 200 Gehirne von 200 männlichen BALB/c Mäusen im Alter

von 9-12 Wochen. Die cDNA lag in die Xho I und EcoR I Restriktionsschnittstellen des Vek-

tors pACT2 kloniert vor. Die Anzahl unabhängiger Klone betrug 3,5x10

. Die klonierte cDNA

lag in einem Größenbereich von 400-4000 bp vor.

4.6.3.2 cDNA von α

αα

α-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine

Die cDNA für die Gα-Untereinheiten Go1α

(Ratte), Go2α (Hamster) und Gqα (Maus) wur-

den freundlicherweise von Prof. Dr. Lutz Birnbaumer, National Institute of Environmental

Health Sciences, Research Triangle Park, North Carolina, in pAGA2 zur Verfügung gestellt.

4.7 Methoden

4.7.1 DNA-Techniken

4.7.1.1 Herstellung und Transformation kompetenter E. coli

Um E.coli Zellen kompetent für die DNA-Aufnahme zu machen, wurde der Z-Competent E.

coli Transformation Kit & Buffer Set der Firma Zymo Research eingesetzt. Dafür wurde zu-

nächst eine Übernacht(ÜN)-Kultur mit 50 µl Zellen aus der Glyzerinstammlösung des ent-

sprechenden Stammes (DH5α) in LB-Medium bei 240 rpm und 30°C angesetzt. Von dieser

ÜN-Kultur wurden dann 500 µl abgenommen, um 50 ml LB-Medium zu beimpfen. Dann er-

folgte eine Weiterkultivierung bei 240 rpm und Raumtemperatur (RT) bis eine OD

600

von 0,4-

0,6 errreicht wurde (ca. 3 h). Anschließend wurden die Bakterien entsprechend den Herstel-

lervorschriften gewaschen und in Puffer resuspendiert und als 100 µl Aliquots bei -80 °C

eingefroren oder direkt für Transformationen eingesetzt.

Für die Transformation wurden 1-5 µl DNA (ca. 10 ng) mit 100 µl kompetenten Zellen ge-

mischt und für 30 Minuten auf Eis inkubiert. Danach wurden 400 µl LB-Medium zugegeben

und der gesamte Ansatz für 1 h bei 240 rpm und 37 °C inkubiert. Schließlich wurden 2 x 250

µl der transformierten Zellen auf LB-Agar-Platten mit entsprechendem Selektionsantibioti-

kum ausplattiert.

Materialien und Methoden

4.7.1.2 Isolation von Plasmid-DNA aus E.coli

Ausgewählte E.coli Kolonien wurden in 2 ml LB-Medium mit geeignetem Selektions-

antibiotikum über Nacht bei 37°C angezogen. Am nächsten Tag wurden die Bakterien in

einer Tischzentrifuge bei 6000 x g sedimentiert und die Plasmid-DNA mit Hilfe des Quantum

Prep Plasmid Miniprep-Kits der Firma Biorad gemäß Herstellerangaben präpariert.

Um Plasmidmengen im größeren Maßstab zu gewinnen, erfolgte das Animpfen von 50 ml

LB-Medium mit Selektionsantibiotikum und Kultivierung bei 37°C und 220 rpm in sterilen

Erlenmeyerkolben über Nacht. Die Plasmid-DNA wurde nach Zentrifugation bei 6000 x g mit

Hilfe des Quantum Prep Plasmid Midiprep Kit der Firma Biorad gemäß Herstellerangaben

aufgearbeitet.

Für die Isolation der cDNA-Bibliothek nach der Amplifikation wurde der Qiagen Plasmid Gi-

ga Kit verwendet.

4.7.1.3 Konzentrationsbestimmung von DNA-Lösungen

Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde über die Absorption bei einer Wellenlänge von

260 nm bestimmt. Der Konzentrationsberechnung basiert dabei auf folgender Gleichung:

c = OD

260

x 50 µg / ml x VF

c : Konzentration der DNA-Lösung [µg / ml]

260

: Optische Dichte bei einer Wellenlänge von 260 nm

VF : zu berücksichtigender Verdünnungsfaktor der untersuchten DNA-Lösung

4.7.1.4 Konzentration von DNA durch Fällung

Mittels Ethanolpräzipitation wurde die Plasmid-DNA aus einer wässrigen Lösung gefällt.

Dazu wurde die wässrige Phase mit 1/10 Volumen 3 M Natriumazetat pH 4,5 versetzt und

anschließend das zwei- bzw. zweieinhalbfache Volumen Isopropanol bzw. eiskalter Ethanol

zugegeben. Dieser Ansatz wurde danach bei 20.000 x g und 4°C für 15 Minuten zentrifu-

giert. Der Überstand wurde verworfen, das Pellet einmal mit 70 % Ethanol gewaschen und

nach wiederholter Zentrifugation in einem gewünschten Volumen TE-Puffer resuspendiert.

4.7.1.5 Restriktion von DNA mit Endonukleasen

Der Restriktionsansatz wurde in einem Volumen von 15 µl durchgeführt, bestehend aus 1,5

µl eines geeigneten 10-fach Puffers (je nach Enzym), ca. 3 µg DNA sowie 1,5 U Restrikti-

onsenzym / µg DNA. Die Restriktion erfolgte für zwei Stunden bei dem für das Restriktions-

enzym spezifischen Temperaturoptimum. Anschließend wurde der Restriktionsansatz mit

Materialien und Methoden

Probenpuffer gemischt und durch Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Für präparative

Zwecke wurden die dreifachen Mengen des beschriebenen Ansatzes verwandt.

4.7.1.6 Agarose-Gelelektrophorese

Die Auftrennung von DNA-Fragmenten unterschiedlicher Größe erfolgte mittels Agarose-

Gelelektrophorese. Dazu wurden je nach untersuchtem Größenbereich der Fragmente un-

terschiedlich konzentrierte Agarosegele verwandt. Für kleine Fragmente von 0,2 kbp bis 3

kbp wurden 2-prozentige Agarosegele bzw. für Fragmente von 0,5 – 10 kbp 1-prozentige

Agarosegele benutzt. Dazu wurde die Agarose mit TAE-Puffer in eine 250 ml Schraubfla-

sche gegeben und in einer Mikrowelle aufgekocht, bis die Agarose vollständig gelöst war.

Die Agaroselösung wurde dann mit 1 µg / ml Ethidiumbromid versetzt und in den vorbereite-

ten Rahmen (Biorad) gegossen. Die Elektrophorese wurde bei 60-100 V in 1x TAE-Puffer

durchgeführt, wobei als Größenstandard 5 µl Mass-Ruler-DNA-Ladder-Marker (Fermentas)

verwendet wurde. Abschließend wurde die DNA unter UV-Licht (254 nm) sichtbar gemacht

und fotografiert.

4.7.1.7 Gelelution

Das gewünschte DNA-Fragment wurde nach der Auftrennung im Agarosegel mit einem

Skalpell ausgeschnitten und mit Hilfe des NucleoSpin Extract II Kit der Firma Macherey-

Nagel (Düren) gemäß Herstellerangaben aufgereinigt.

4.7.1.8 Ligation von DNA-Fragmenten

Die Ligation von DNA-Fragmenten, wurde mit Hilfe der T4-DNA-Ligase durchgeführt, die

sowohl in der Lage ist, zwei glatte (blunt-) oder zwei überstehende, komplementäre (sticky-)

Enden durch Knüpfung kovalenter Phosphodiesterbindungen zwischen der 3’-

Hydroxylgruppe eines Nukleotids und der 5’-Phosphatgruppe eines weiteren Nukleotids in

doppelsträngiger DNA miteinander zu verknüpfen. Für die Ligation wurden Vektoren mit

DNA-Fragmenten im Verhältnis von 1:3 (Vektor : DNA-Fragment) eingesetzt. Im Ligations-

ansatz von 10 µl wurden 1 µl 10-fach Ligasepuffer (Fermentas), 1 µl T4-Ligase (1U / µl) so-

wie ca. 100 ng Vektor-DNA mit entsprechender Menge Fragment-DNA gemischt und 1

Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 16°C inkubiert. Anschließend wurde das

Enzym für 10 Minuten bei 75°C hitzeinaktiviert.

4.7.1.9 Polymerasekettenreaktion

Die Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde zur Amplifikation von DNA-Sequenzen unter

Einsatz spezifischer Primer verwandt. Die so erhaltenen DNA-Fragmente dienten einerseits

analytischen Zwecken, wurden aber auch zur Generierung spezifischer DNA-Fragmente,

z.B. für die Klonierung, eingesetzt. Für analytische Zwecke wurde die AmpliTaq-DNA Poly-

Materialien und Methoden

merase (Applied Biosystems) verwendet, für präparative Zwecke die Pfu-Polymerase (Fer-

mentas), die sich durch Ihre proofreading-Aktivität (3’-5’-Exonukleaseaktivität) von der Taq-

Polymerase unterscheidet. In einem initialen Denaturierungsschritt wurde die doppelsträngi-

ge DNA-Matrize für 3 Minuten bei 95°C denaturiert. Anschließend folgten je nach Verwen-

dungszweck mehrere Zyklen (25 - 40) aus Denaturierung (95°C), Anlagerung (58-65°C, je

nach Schmelztemperatur des verwendeten Primerpaares) und Verlängerung (72°C, Tempe-

raturoptimum der DNA-Polymerasen) des gewünschten DNA Abschnitts. Danach wurde ein

abschließender Elongationsschritt durchgeführt, um zu gewährleisten, dass alle Amplifikati-

onen abgeschlossen waren. Danach wurden die PCR-Produkte bei 4°C gekühlt und schließ-

lich bei -20°C eingefroren. Zur Kontrolle der PCR-Bedingungen, und um Verunreinigungen

auszuschließen, wurden immer Positiv- und Negativkontrollen (keine DNA-Matrize) mitge-

führt. Der folgende PCR-Ansatz stellt einen Standardablauf dar, der gegebenenfalls an den

Parametern Hybridisierungstemperatur bzw. Anzahl der Zyklen modifiziert wurde.

Ansatz Temperaturzyklus

50 µl Gesamtvolumen T in °C Dauer Zyklen

5,0 µl 10 x PCR Puffer 95 3 min

1,0 µl dNTP Mix (10 µM) 95 30 s 

1,0 µl 5’-Primer (10 µM) 58 30 s 25-40

1,0 µl 3’-Primer (10 µM) 72 1 min / kbp DNA 

0,15 µl Taq Polymerase (5 U / µl) 72 10 min

5,0 µl DNA-Matrize (wenn möglich, 3 ng / µl) 4 bis zum Einfrieren

36,85 µl ddH2O

4.7.1.10 Ortsspezifische Mutagenese

Die ortsspezifische Mutagenese wurde genutzt, um aus der cDNA, die die G-Protein

α−Untereinheiten Go1α, Go2α, Gqα kodiert, jeweils die konstitutiv aktiven Untereinheiten

herzustellen. Diese konstitutiv aktiven Mutanten können einmal gebundenes GTP nicht

mehr hydrolysieren. Die Wildtyp cDNA wurde freundlicherweise durch Prof. Lutz Birnbau-

mer, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, North

Carolina, zur Verfügung gestellt.

Das Prinzip des verwendeten QuikChange II-Kits (Stratagene) basiert auf der Verlängerung

an spezifischer Stelle mutierter, komplementärer Primerpaare, wodurch Punktmutationen in

die neusynthetisierte doppelsträngige DNA eingebaut wurden. Die nichtmutierte, dop-

pelsträngige und durch die Dam-Methylierung gekennzeichnete Ursprungs-DNA wurde an-

schließend durch Behandlung mit DpnI, einer Restriktionsendonuklease, die nur die methy-

lierte Erkennungssequenz 5’-GA

TC-3’ identifiziert, abgebaut. Nach Transformation der

mutierten DNA in kompetente E.coli Zellen wurden die verbliebenen nicks der neusyntheti-

Materialien und Methoden

sierten doppelsträngigen DNA durch die bakterieneigene Ligase verknüpft. Dadurch konnte

die Plasmid-DNA normal repliziert werden.

4.7.1.11 DNA-Sequenzierung

Soweit nicht anders angegeben, wurden alle Klonierungsarbeiten mit einer folgenden Se-

quenzierung auf ihre Richtigkeit überprüft. Sowohl diese Sequenzierungen als auch Se-

quenzierungen von Vektoren aus identifizierten Klonen des Yeast-Two-Hybrid-Screenings

wurden mit Hilfe der ABI BigDye-Terminator-Chemie durch die Firma SMB Services in Mo-

lecular Biology (Berlin) analysiert.

4.7.1.12 Amplifizierung der cDNA-Bibliothek

Um ausreichend Plasmid-DNA für ein Screening der cDNA-Bibliothek zu erhalten, musste

die vorhandene Mouse Brain Matchmaker cDNA Bibliothek, die als Flüssigkultur im E. coli

Stamm BNN132 vorlag, vervielfältigt werden. Zuerst musste der Titer der cDNA-Bibliothek

bestimmt werden, um bei der folgenden Amplifikation die nötige Anzahl unabhängiger Klone

zu gewährleisten. Dazu wurden 10 µl eines Aliquots der cDNA-Bibliothek in 1 ml LB Medium

resuspendiert und verschiedene Verdünnungen vorbereitet. Von diesen Verdünnungen wur-

den 50 bzw. 100 µl auf LB / Amp-Agarplatten verteilt und für 48 h bei 30°C inkubiert und

anschließend unter Berücksichtigung der Verdünnungsfaktoren der Titer bestimmt. An-

schließend wurden 265 150-mm-Platten mit je ca. 40000 cfu (colony forming unit) beimpft,

um so die Anzahl der unabhängigen Klone von 3,5 x 10

der cDNA-Bibliothek mit einem

zusätzlichen Sicherheitsfaktor von drei beizubehalten. Feste Nährmedien gewährleisten

dabei besser ein gleichmäßigeres Wachstum unterschiedlicher Klone, als eine Flüssigkultur.

Die Platten wurden anschließend für 48 Stunden bei 30°C inkubiert. Danach wurden je Plat-

te 5 ml LB-Medium zugegeben und die Kolonien mit einem Drigalski-Spatel abgelöst und in

einer sterilen 1l-Flasche vermischt. Anschließend wurde die Zellsuspension für 4 Stunden

bei 30°C und 200 rpm inkubiert. Zwei Drittel der Zellsuspension wurden mit Glyzerin bis zu

einer Endkonzentration von 25 % versetzt und als 50 ml Aliquots bei –80°C gelagert. Das

verbleibende Drittel wurde für die Plasmidpräparation verwandt

4.7.2 Yeast-Two-Hybrid-Methoden

Als Grundlage zur Identifikation von Proteininteraktionspartnern diente der Matchmaker

GAL4 Two-Hybrid System 3 - Kit der Firma Clontech. Das zugrunde liegende Prinzip war,

dass ein Köderprotein (bait) als Fusionsprotein mit der DNA-Bindungsdomäne des GAL4-

Transkriptionsfaktors in Hefe exprimiert wird. Wurde eine cDNA-Bibliothek als Fusionsprote-

in (Beute oder prey) mit der Aktivierungsdomäne des GAL4-Transkriptionsfaktors in der

gleichen Hefezelle exprimiert und kam es zu einer Bindung zwischen bait und prey, wurde

Materialien und Methoden

dadurch der GAL4-Transkriptionsfaktor rekonstituiert und die Expression verschiedener Re-

portergene ermöglicht. Die für das Screening verwendeten Hefestämme Y187 und AH109

sind auxotroph bezüglich verschiedener Aminosäuren bzw. Nukleinbasen. Erst durch die

Expression des Reportergens wurde das Wachstum auf bestimmten Minimalmedien und

somit die Selektion nach Interaktionspartnern möglich.

4.7.2.1 Herstellung kompetenter Hefezellen

Um Hefezellen kompetent für die DNA-Aufnahme zu machen, wurden 3 ml YPDA-Medium

mit einer frisch gewachsenen Hefekolonie inokuliert. Die Hefezellsuspension wurde bei

30°C über Nacht für 8-12 Stunden inkubiert. Danach wurden 50 ml YPDA-medium mit 5 µl

dieser Übernachtkultur beimpft und bei 30°C und 250 rpm inkubiert, bis eine OD

600

von

0,15-0,3 erreicht war. Anschließend wurden die Zellen für 5 Minuten bei Raumtemperatur

und 700 x g zentrifugiert, in 100 ml YPDA Medium resuspendiert und bei 30°C und 250 rpm

bis zu einer OD

600

von 0,4-0,5 kultiviert. Dann wurden die Hefezellen bei 700 x g und Raum-

temperatur zentrifugiert und das Pellet dann in 60 ml sterilem ddH

O gewaschen. Nach er-

neuter Zentrifugation bei gleichen Bedingungen wurden die Zellen in 3 ml 1,1 x TE/LiAc-

Lösung resuspendiert und zu gleichen Teilen auf zwei 1,5 ml Eppis verteilt. Die Zellen wur-

den danach in einer Tischzentrifuge bei maximaler Umdrehungszahl für 15 Sekunden zentri-

fugiert und in 600 µl 1,1 x TE/LiAc-Lösung resuspendiert.

Für Transformationen in kleinerem Maßstab wurde alternativ der Frozen-EZ Yeast Trans-

formation II-Kit der Firma Zymo Research gemäß Herstellerangaben eingesetzt.

4.7.2.2 Transformation kompetenter Hefezellen

Je nachdem, ob die Hefezellen mit einzelner Vektor-DNA oder einer gesamten cDNA-

Bibliothek transformiert werden sollten, wurden unterschiedliche Mengen der benötigten

Reagenzien verwendet. Die im Folgenden angegebenen Werte wurden für die Transforma-

tion mit der cDNA-Bibliothek verwendet. Die Angaben in Klammern entsprechen den Trans-

formationen mit einzelner Vektor-DNA, bei denen alternativ auch der Frozen-EZ Yeast

Transformation II–Kit der Firma Zymo Research gemäß Herstellerangaben verwendet wur-

de.

In einem sterilen, vorgekühlten 15 ml Zentrifugenröhrchen wurden 10 µg (1 µg) Vektor-DNA

mit 20 µl (5 µl) frisch denaturierter Heringssperma-DNA gemischt und mit 600 µl (50 µl)

kompetenten Hefezellen versetzt. Anschließend wurden 2,5 ml (0,5 ml) einer PEG/LiAc Lö-

sung zugegeben und der Ansatz für 45 (30) Minuten bei 30°C schüttelnd inkubiert. Danach

wurden 160 µl (20µl) DMSO zugegeben und bei 42°C in einem Wasserbad inkubiert. Der

Ansatz wurde dabei im Abstand von 5 Minuten vorsichtig gemischt. Für die Transformation

mit der cDNA-Bibliothek folgte nach Zentrifugation der Zellen bei 700 x g für 5 Minuten eine

Materialien und Methoden

90-minütige Inkubation bei 30°C in YPD-Plus Spezialmedium (Yeastmaker Yeast Transfor-

mation System 2). Bei Transformationen im kleinen Maßstab wurde dieser Schritt ausgelas-

sen. Nach erneuter Zentrifugation der Hefezellen bei 700 x g (20.000 x g) für 5 Minuten (15

Sekunden), wurde der Überstand abgesaugt und das Pellet in 15 ml (1ml) 0,9% NaCl-

Lösung resuspendiert. Je 150 µl (100 µl) des Transformationsansatzes wurden auf 150 mm

(100 mm) Selektionsnährmedien ausplattiert. Parallel wurde eine dekadische Verdünnungs-

reihe des Transformationsansatzes angelegt und zur Bestimmung der Transformationseffi-

zienz ebenfalls auf geeigneten Selektionsnährmedien ausplattiert.

Die Medienplatten wurden dann bei 30°C inkubiert, bis ein Koloniewachstum beobachtet

werden konnte (7-14 Tage).

4.7.2.3 Isolation von Plasmid-DNA aus S.cerevisiae

Um die Plasmid-DNA aus den gewachsenen Hefekolonien wieder zu isolieren, wurden zu-

nächst Flüssigkulturen (3ml) der verschiedenen Hefekolonien in SD-QDO (quadruple-

dropout

Medium mit 1 mM 3AT angesetzt. Nach Kultivierung über 2 Tage bei 30°C wurde

ein Aliquot der Zellen zum Anlegen von Glyzerinstammkulturen verwendet. Die restlichen

Zellen wurden bei 20.000 x g in einer Tischzentrifuge sedimentiert. Danach wurden mit Hilfe

des Zymoprep II Yeast Plasmid Minipreparation Kit (Zymo Research) die Plasmide isoliert

und lagen abschließend in 10 µl ddH

0 gelöst vor. Da Plasmide in Hefen nur in geringerer

Kopiezahl je Zelle vorliegen, konnte die so isolierte DNA nicht mit den gängigen Methoden

untersucht werden. Deshalb musste sie zunächst wieder in den Stamm E.coli (DH5α) trans-

formiert und amplifiziert werden, damit eine angemessene Menge für Agarosegelelektropho-

rese, Restriktonsverdau und schließlich Sequenzierung zur Verfügung stand.

4.7.2.4 Verpaarung von Hefezellen

Die Verpaarung der unterschiedliche Vektoren tragenden Hefestämme AH109 und Y187

erfolgte im Mikrotiterplattenformat. Dazu wurde je gewünschter Verpaarung 160 µl YPD-

Medium in die Vertiefungen der Mikrotiterplatten gefüllt und 20 µl einer frischen Hefezell-

suspension beider Stämme zupipettiert. Die frische Hefezellsuspension wurde durch Lösen

einer Hefekolonie in 1 ml YPD-Medium hergestellt. Die Mikrotiterplatten wurden danach bei

30 °C für 16 Stunden auf einem Plattformschüttler b ei 200 rpm inkubiert. Anschließend wur-

den je 100 µl der verschiedenen Kulturen auf geeigneten Selektionsmedien ausplattiert.

4.7.3 Protein-Techniken

4.7.3.1 Proteinbestimmung

Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurde die BCA Methode (Smith et al., 1985) ver-

wandt. Die Bestimmung wurde in 96-Loch-Mikrotiterplatten mit je 20 µl Probenvolumen /

Materialien und Methoden

Vertiefung durchgeführt. Neben den untersuchten Proben wurden bei jeder Bestimmung der

Leerwert sowie verschiedene Verdünnungen einer BSA-Standardlösung (50 – 800 µg/ml) in

0,4% Triton X-100-Lösung mitgeführt, um die jeweilige Standardgerade zu ermitteln. An-

schließend wurden je Vertiefung 200 µl einer Mischung der Lösungen A und B im Verhältnis

50:1 zugegeben und für 30 Minuten bei 60°C inkubiert. Die Mikrotiterplatten wurden an-

schließend für 10 Minuten gekühlt und die Extinktion bei 550 nm in einem Mikrotiterplatten-

lesegerät bestimmt. Anhand der mitgeführten BSA-Konzentration wurde eine Standardgera-

de ermittelt und durch lineare Regression die Proteinkonzentrationen der Proben bestimmt.

4.7.3.2 SDS-PAGE

Die SDS-PAGE (sodiumdodecylsulfate polyacrylamide gel electrophoresis) ist ein Verfahren

zur Auftrennung von Proteinen und Peptiden nach Ihrem Molekulargewicht (Laemmli, 1970).

Dazu wurden die Proben nach Ermittlung der Proteinkonzentration mit 4x Probenpuffer ver-

setzt und für 5 Minuten bei 95°C inkubiert. Anschließend wurden die Proben auf Eis gekühlt

und auf vorbereitete, 0,75 mm dicke Gele, bestehend aus einem 3,75 %igem Sammelgel

und einem 8-12%igem Trenngel, aufgetragen. Als Größenstandard diente entweder der

LMW-Marker (GE-Healthcare) oder die PageRuler Prestained Protein Ladder (Fermentas).

Die Elektrophorese erfolgte in der Mini Protean II Elektrophorese-Kammer (BioRad) mit 1-

fach Laufpuffer zunächst bei 80V. Nachdem die Proben das Trenngel erreicht hatten, wurde

die Spannung auf 160 V erhöht, bis die Lauffront das Gelende erreicht hatte.

4.7.3.3 Western-Blot und Chemolumineszenzdetektion

Mittels Western Blot wurden die elektrophoretisch aufgetrennten Proteine aus der SDS-

PAGE im Semi-Dry-Verfahren auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Dazu wurde das

Trenngel vom Sammelgel getrennt und in Transferpuffer gelagert. Gleichzeitig wurden vier

Schichten vorbereitetes Filterpapier (Whatman) in Transferpuffer getränkt und auf der Ano-

denfläche einer TransBlot SD-Kammer (Biorad) luftblasenfrei aufgelegt. Anschließend wur-

den die Nitrozellulosemembran und das Trenngel in definierter Orientierung aufgelegt und

zum Abschluss wieder vier Lagen Filterpapier darüber geschichtet. Nach Auflage der Ka-

thode wurde mit einer konstanten Stromstärke von 0,3 A / Gel für 45 Minuten geblottet. Ab-

schließend wurde die Nitrozellulosemembran für 2 Minuten in Ponceau S-Lösung angefärbt

und dann mehrfach mit destilliertem Wasser gewaschen, um die Übertragung der Proteine

zu überprüfen. Gegebenenfalls wurde die Nitrozellulosemembran zerschnitten, um eine In-

kubation mit verschiedenen Antikörpern zu ermöglichen. Im Anschluss daran wurde die

Membran, um unspezifische Bindungsstellen zu blockieren, für eine Stunde in Magermilch-

lösung inkubiert. Die Behandlung mit dem jeweiligen Erstantikörper erfolgte in Antikörperlö-

sung über Nacht bei 4°C. Am nächsten Tag wurde je viermal 15 Minuten mit Magermilchlö-

Materialien und Methoden

sung gewaschen und die Membran mit Meerrettichperoxidase-gekoppeltem Zweitantikörper

in Antikörperlösung für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurde fünfmal 10

Minuten mit TS-T-Puffer und abschließend zweimal 5 Minuten mit TS-Puffer gewaschen.

Die Detektion der Proteine erfolgte durch Inkubation des Blots mit ECL-Lösung und an-

schließender Exposition eines Fotofilms (GE Healthcare) in einer Filmkassette. Die Entwick-

lung des Fotofilms erfolgte vollautomatisch in der Cura 60 (AGFA).

4.7.3.4 Gewinnung von Proteinproben aus Hefezellen

Für die Aufarbeitung von Hefeproteinen wurde der Yeast Protein Kit der Firma Zymo Re-

search eingesetzt. Dazu wurden 500 µl einer frisch gewachsenen Hefekultur bei 5.000 x g in

einer Tischzentrifuge abzentrifugiert und gemäß Herstellerangaben mit Zymolyase und Ly-

sepuffer inkubiert. Für die SDS-PAGE wurden die Proben abschließend direkt mit 4x-

Probenpuffer versetzt.

4.7.3.5 Gewinnung von Proteinproben aus Zelllinien

Zur Gewinnung von Proteinproben aus Zelllinien wurden fünf 100 mm Schalen der ge-

wünschten Zelllinien bis zur Konfluenz kultiviert. Danach wurden die Zellen geerntet (siehe

4.7.4.1) und in 1 ml Homogenisierungspuffer mit Proteaseinhibitoren resuspendiert und in

einem Kugelhomogenisator (EMBL) aufgeschlossen. Das so gewonnene Lysat wurde direkt

mit dem SDS-Ladepuffer vermischt. Alternativ wurde das Zelllysat bei 1.000 x g zentrifugiert

um größere Zellbruchstücke zu entfernen, der verbliebene Überstand für 30 Minuten bei

360.000 x g und 4 °C. Das gewonnene Pellet wurde in Homogenisierungspuffer resuspen-

diert und mit entsprechendder Menge 4x-SDS-Probenpuffer gemischt. Für die SDS-PAGE

wurden 5-15 µl aufgetragen.

4.7.3.6 Fluoreszenznachweis von Proteinen

Zum Anfärben intrazellulärer Proteine mittels fluoreszenzmarkierter Antikörper bzw. zum

Nachweis GFP-markierter Proteine, wurde wie folgt vorgegangen. Die Zellen wurden wie

üblich in 100 mm Zellkulturschalen, denen Deckgläschen zugegeben wurden, ausgesät.

Nach Erreichen der Konfluenz wurden die bewachsenen Deckgläschen herausgenommen

und zweimal mit je 2 ml PBS gewaschen. Anschließend erfolgte die Fixierung in 4 % Para-

formaldehydlösung für 20 Minuten. Nach der Fixierung wurden die Zellen zweimal mit je 2

ml PBS gewaschen.

Zum Nachweis GFP-markierter Proteine wurden die Deckgläschen dann für 5 Sekunden in

ddH

O gespült und nach gründlicher Entfernung des Wassers auf Objektträger verbracht.

Dazu wurden kurz vorher für jedes Deckgläschen 10 µl Mowiol auf den Objektträger pipet-

tiert und die Deckgläschen luftblasenfrei aufgelegt.

Materialien und Methoden

Für den Nachweis durch fluoreszenzmarkierte Antikörper wurden die Deckgläschen nach

dem Waschen für 60 Minuten in Blocklösung inkubiert und danach mit dem Erstantikörper in

Blocklösung enweder für 90 Minuten bei 37 °C oder über Nacht bei 4 °C inkubiert. Danach

wurde zweimal für 10 Minuten mit PBS gewaschen und die Deckgläschen für 90 Minuten

mit fluoreszenzmarkiertem Zweitantikörper bei Raumtemperatur im Dunkeln inkubiert. Ab-

schließend wurde zweimal mit 2 ml PBS gewaschen, 5 Sekunden in ddH

O gespült und die

Deckgläschen mit Mowiol auf einem Objektträger befestigt. Bis zur mikroskopischen Analy-

se wurden die Objektträger bei 4 °C und vor Licht geschützt aufbewahrt.

4.7.4 Zellkulturarbeiten

4.7.4.1 BON und CHO-Zellen

BON- und CHO-Zellen wurden auf 100 mm Schalen bzw. in Mikrotiterplatten ausgesät und

bis zur Semikonfluenz bei 37°C und 5% CO

kultiviert.

Zum Umsetzen wurde das Medium entfernt und die Zellen mit 5 ml PBS gespült. Anschlie-

ßend wurden die Zellen mit 1 ml (1:10) Trypsin-Lösung behandelt. Diese wurde sofort abge-

saugt und die Zellen für 2 min in den Brutschrank gestellt. Danach wurden die Zellen mit 1

ml PBS von der Platte gespült und bei 1300 x g für 2 min zentrifugiert. Die sedimentierten

Zellen wurden in 1 ml Medium aufgenommen und entsprechend der gewünschten Dichte

ausgesät.

4.7.4.2 PC12-Zellen

PC12-Zellen wurden auf 100 mm Schalen, die zuvor mit Kollagen beschichtet wurden aus-

gesät und bis zur Konfluenz bei 37°C und 10% CO

kultiviert.

Die Kollagenbeschichtung der 100 mm Zellkulturschalen erfolgte über Nacht mit 3 ml einer

Kollagenlösung unter der Sterilbank.

Zum Umsetzen wurde das Medium entfernt und die Zellen mit 5 ml PBS gespült. Anschlie-

ßend wurden die Zellen mit 1 ml (1:10) Trypsin-Lösung behandelt. Diese wurde sofort abge-

saugt und die Zellen für 2 Minuten in den Brutschrank gestellt. Danach wurden die Zellen

mit 1 ml PBS von der Platte gespült und bei 1.300 x g für 2 min zentrifugiert. Die sedimen-

tierten Zellen wurden in 1 ml Medium aufgenommen und entsprechend der gewünschten

Dichte ausgesät.

4.7.4.3 Einfrieren von Zellen

Zum Einfrieren adhärent wachsender Zellen wurde das Medium entfernt und mit 5 ml PBS

gewaschen. Anschließend wurden die Zellen mit 1 ml (1:10) Trypsin-Lösung behandelt.

Diese wurde sofort abgesaugt und die Zellen für 2 min in den Brutschrank gestellt. Danach

Materialien und Methoden

wurden die Zellen mit 1 ml PBS von der Platte gespült und bei 1.300 x g für 2 min zentrifu-

giert.

Das Zellpellet wurde dann in 1 ml Einfriermedium resuspendiert und zu je 500 µl in Kryo-

röhrchen gefüllt. Die Zellsuspension wurde dann mit 500 µl einer Einfrierlösung versetzt, die

tropfenweise und unter Schwenken des Kryoröhrchens zugegeben wurde. Die Kryoröhrchen

wurden über Nacht in Isopropanol bei -80°C gelagert und am darauffolgenden Tag in flüssi-

gen Stickstoff überführt.

4.7.4.4 Auftauen von Zellen

Die Zellen wurden schnell im Wasserbad bei 37°C aufgetaut und in 10 ml Kulturmedium

resuspendiert. Danach wurden die Zellen bei 80 x g für 4 Minuten abzentrifugiert und in ei-

ner 100 mm Kulturschale ausgesät.

4.7.4.5 Generierung stabil transfizierter CHO-Zelllinien

CHO-Zellen wurden unter Standardbedingungen in 6-Loch-Mikrotiterplatten bis zur Semi-

konfluenz kultiviert. Anschließend wurde das Medium abgesaugt, einmal mit 2 ml PBS ge-

waschen und die Zellen mit 400 µl Optimem für 1 h bei 37°C und 5 % CO

kultiviert.

Gleichzeitig wurden 0 µg, 1 µg bzw. 2 µg Vektor-DNA mit 100 µl Optimem versetzt und mit

100 µl einer Lipofectamin/Optimem Lösung (50 µl Lipofectamin / ml Optimem) für 45 min bei

Raumtemperatur inkubiert. Danach wurden weitere 200 µl Optimem zugegeben und jeweils

der Gesamtansatz von 400 µl zu den Vertiefungen der Mikrotiterplatte gegeben.

Die CHO-Zellen wurden dann für 4 Stunden bei 37°C und 5% CO

weiterkultiviert. Danach

wurde je Vertiefung 800 µl Standard CHO-Medium zugegeben und unter gleichbleibenden

Bedingungen inkubiert.

Nach 48 Stunden wurde das Medium gegen ein Standard-CHO-Medium mit 400 µg / ml

Geneticin ausgetauscht und die Zellen ca. 1 Woche mit täglichem Mediumwechsel weiter-

kultiviert, bis alle nicht-transfizierten Zellen abgestorben waren. Die verbliebenen Zellen wur-

den dann vereint, auf eine Zellkonzentration von ca. 1-2 Zellen / 100 µl Medium eingestellt

und in einer 96-Loch-Mikrotiterplatte (100 µl / Vertiefung) ausgesät. Wachsende Zellklone

wurden bis zur Konfluenz kultiviert und mittels größerer Mikrotiterplatten (48-Loch und 24-

Loch Mikrotiterplatten) expandiert, bis ausreichend Zellen für weitere Untersuchungen und

zum Einfrieren zur Verfügung standen

4.7.5 Neurotransmitteraufnahmetests

4.7.5.1 Subzelluläre Fraktionierungen

Zur Präparation von Synaptosomen und synaptischen Vesikeln wurde die Methode von Hell

und Jahn (Hell & Jahn, 1998) in modifizierter Form angewandt. Zunächst wurden die Mäuse

Materialien und Methoden

mit Ether betäubt und anschließend dekapitiert. Das Gehirn wurde nach Öffnung des Schä-

deldaches entnommen und sofort in 4 °C kalten Homogenisierungspuffer (5 ml / g Gewebe),

der mit Proteaseinhibitorcocktail versetzt wurde, überführt. Anschließend wurde das Gehirn

in einem Wheaton-Homogenisator zehnmal bei 900 rpm homogenisiert (Homogenat) und

dann bei 1.400 x g

max

für 10 Minuten zentrifugiert. Danach wurde der so gewonnene Über-

stand (Supernatant 1; S1) bei 14.000 x g

max

für 15 Minuten zentrifugiert und das Pellet (P2),

das die Synaptosomen enthält, gewonnen. Diese Synaptosomenpräparation wurde für Ver-

suche in 1 ml Natriumpuffer aufgenommen oder durch Zugabe eines zehnfachen Volumens

Wasser, das mit Proteaseinhibitoren und 10 mM HEPES (pH 7,4) versetzt war, durch drei-

maliges Homogenisieren im Wheaton-Homogenisator bei 2.000 rpm lysiert. Das Lysat wur-

de danach bei 29.000 x g

max

für 20 Minuten zentrifugiert, um größere Membranfragmente

und verbliebene Synaptosomen (LP1) von der im Überstand (LS1) befindlichen Vesikelfrak-

tion zu trennen. Der LS1 wurde dann in einem letzten Zentrifugationsschritt bei 350.000 x

max

für 30 Minuten zentrifugiert. Das so gewonnene klare Pellet (LP2) enthält synaptische

Vesikel. Es wurde mit einer 27G-Kanüle in geeignetem Puffer resuspendiert und für Versu-

che verwendet.

4.7.5.2 Permeabilisierung von Zellen und Synaptosomen

Die Untersuchung der Neurotransmitteraufnahme an Vesikeln von Zellen und Synaptoso-

men war auch ohne Vesikelpräparation möglich. Dafür mussten die Zellen bzw. Synapto-

somen jedoch mit Hilfe des aus Streptococcus pyogenes stammenden porenformenden

Toxins Streptolysin O (SLO) permeabilisiert werden. Das ermöglichte die direkte Messung

der Neurotransmitteraufnahme ohne Beeinflussung durch die Neurotransmittertransporter

der Plasmamembran.

Das Prinzip der Permeabilisierung beruht darauf, dass SLO bei 4 °C in seiner monomeren

Form an das Cholesterol der Plasmamembran bindet und durch Erwärmung auf mindestens

Raumtemperatur eine Porenbildung (ca. ∅12 nm) induziert wird. Zuvor wurde zur Reduktion

von Disulfidbrücken 1 mM Dithiothreitol (DTT) zugegeben. Die Bestimmung der hämolyti-

schen Aktivität des Toxins (HE / ml) erfolgte nach der Methode von Ahnert-Hilger (Ahnert-

Hilger et al., 2000).

Die Zellen wurden nach dem Ablösen von den 100 mm Schalen (siehe 4.7.4.1 bzw. 4.7.4.2)

in 1 ml PBS gewaschen und dann bei 1.300 x g für 2 Minuten zentrifugiert. Der Überstand

wurde verworfen und das Pellet in einem zehnfachen Volumen KG-Puffer resuspendiert.

Danach wurde die Zellsuspension mit ~ 50 HE/ml SLO versetzt und der Ansatz für 10 Minu-

ten auf Eis inkubiert. Anschließend wurden die Zellen bei 1.300 x g für 2 Minuten bei 4°C

zentrifugiert und in einem geeigneten Volumen KG-ATP-Puffer resuspendiert. Die mit SLO

Materialien und Methoden

versetzten Zellen konnten nun für die Neurotransmitteraufnahme bei 37°C verwendet wer-

den. Dadurch wurde gleichzeitig die Porenbildung induziert.

Mit den in Natrium-Puffer resuspendierten Synaptosomen wurde analog verfahren. Zu-

nächst erfolgte eine Zentrifugation bei 16.000 x g für 2 Minuten. Der Überstand wurde ent-

fernt und das Pellet mit zehnfachem Volumen KG-Puffer resuspendiert und ~5000 HE/ml

SLO zugesetzt. Danach wurde bei 16.000 x g und 4°C für 2 Minuten zentrifugiert und die

Synaptosomen in KG-ATP-Puffer aufgenommen. Die so präparierten Synaptosomen wur-

den für die Neurotransmitteraufnahmeexperimente genutzt.

4.7.5.3 Monoaminaufnahme in Synaptosomen und Zellen

Die wie unter 4.7.5.2 beschrieben vorbereiteten Zellen oder Synaptosomen wurden in KG-

ATP-Puffer resuspendiert und entweder mit verschiedenen Substanzen (Substrate, Inhibito-

ren, Aktivatoren) bei 37 °C vorinkubiert und dann zu je 25 µl in Reaktionsgefäße überführt

oder direkt zu je 25 µl in verschiedene Reaktionsgefäße pipettiert. Soweit nicht anders an-

gegeben, wurde die Monoaminaufnahme durch Zugabe von je 25 µl KG-ATP-Puffer mit 80

nM [

H]-Serotonin bzw 100 nM [

H]-Dopamin, 2 µM Ascorbinsäure ohne bzw. mit Zusätzen

(wie z.B. Aktivatoren, Inhibitoren oder unmarkiertem Substrat) für 10 Minuten bei 37°C

durchgeführt. Die unspezifische Aufnahme bzw. Bindung des [

H]-Monoamins wurde in Ge-

genwart von 6 µM Reserpin ermittelt, das irreversibel an den vesikulären Monoa-

mintransporter (VMAT) bindet und so die spezifische Aufnahme von Serotonin in das Vesi-

kel verhindert. Die Monoaminaufnahme wurde durch Lagern der Proben auf Eis sowie die

Zugabe von 500 µl eiskaltem KG-Puffer gestoppt. Anschließend wurden die Proben bei

16.000 x g zentrifugiert. Der Überstand wurde abgesaugt und verworfen und die individuel-

len Pellets für 20 Minuten mit 0,4% Triton-X100 in H

O bei 42°C lysiert. Von dem so erhal-

tenen Lysat wurde eine definierte Menge abgenommen, mit 4 ml Szintillationsflüssigkeit

versetzt und im Beckman Coulter LS 6500 vermessen. Das übrige Lysat jeder Probe wurde

für eine Proteinbestimmung verwendet. Die von den Zellen bzw. Synaptosomen aufgenom-

mene Monoaminmenge wurde wie folgt berechnet:

Monoamin

= 1/60 Bq x dpm x 1/(m

Protein

x 1/1000 x A

)

Monoamin

: Monoaminaufnahme, bezogen auf die Proteinmenge der Probe [pmol / mg]

Protein

: Proteinmenge der untersuchten Probe [mg]

dpm

: Zerfälle pro Minute (1 dpm = 1/60 Bq)

: spezifische Aktivität des tritiierten Monoamins [TBq / mmol]

Die durch Zugabe von Reserpin ermittelte unspezifische Aufnahme wurde von den ermittel-

ten Werten der Neurotransmitteraufnahme subtrahiert. Alle Versuche wurden in Dreifachbe-

stimmungen durchgeführt. Die Angaben stellen Mittelwerte und Standardabweichung dar.

Materialien und Methoden

4.7.5.4 Monoaminaufnahme in synaptische Vesikel

Für die Messung der Monoaminaufnahme in synaptische Vesikel wurden von den re-

suspendierten Pellets (LP2) aus der subzellulären Fraktionierung (siehe 4.7.5.1) je 25 µl in

individuelle Reaktionsgefäße (Beckman) überführt. Anschließend wurde die Monoaminauf-

nahme durch Zugabe eines gleichen Volumens KG-ATP-Puffer mit 80 nM [

H] Serotonin

bzw. 100 nM [

H] Dopamin und 2 µM Ascorbinsäure ohne bzw. mit Zusätzen gestartet. Wie

unter Punkt 4.7.5.3 beschrieben, wurde auch hier die unspezifische Aufnahme durch Zuga-

be von 6 µM Reserpin ermittelt. Die Inkubation erfolgte für 10 Minuten bei 25°C. Pro Bedin-

gung wurden jeweils Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die Monoaminaufnahme wurde

ebenfalls durch Lagern der Proben auf Eis und die Zugabe von 400 µl eiskaltem KG-Puffer

gestoppt. Anschließend wurden die Proben bei 540.000 x g

max

für 10 Minuten zentrifugiert.

Danach wurde der Überstand abgenommen und verworfen. Die Pellets wurden dann 20

Minuten mit 0,4% TritonX-100 bei 42°C inkubiert. Von dieser Suspension wurde ein definier-

ter Teil im Beckman Coulter LS 6500 vermessen. Der andere Teil wurde für die Proteinbe-

stimmung verwendet. Die Berechnung der aufgenommenen Monoaminmenge erfolgte wie

unter 4.7.5.3 beschrieben.

4.7.6 Versuchstiere

Sowohl der Wildtypstamm 129/SvxC57/BL als auch die isoformspezifischen Go2α-

Deletionsmutanten (Dhingra et al., 2002) wurden freundlicherweise von Prof. Lutz Birnbau-

mer, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park, North

Carolina, zur Verfügung gestellt. Alle Tiere wurden sowohl im MPI für Molekulare Genetik,

Berlin-Dahlem als auch in den Tierställen der Charité (Philippstr.; Hessische Str.) gezüchtet.

Die Go2α-Deletionsmutanten ließen sich untereinander verpaaren. Für Versuche mit hete-

rozygoten Tieren wurden die Deletionsmutanten mit Wildtyp-Mäusen gekreuzt und die

Nachkommen (heterozygote Tiere) nach dem Erreichen der Geschlechtsreife untereinander

verpaart. Die so generierten Würfe enthielten sowohl Wildtyp- und heterozygote Tiere als

auch Go2α-Deletionsmutanten. Für alle Versuche wurden vier bis zwölf Wochen alte Mäuse

verwendet. Wurden mehrere Stämme in einem Experiment benötigt, so wurden Tiere glei-

chen Geschlechts und Alters verwendet.

4.7.7 HPLC-Analytik

4.7.7.1 Aufarbeitung von Zellen

Wie unter Punkt 4.7.4.1 beschrieben, wurden die Zellen nach Wachstum bis zur Konfluenz

bzw. Inkubation mit Verbindungen, wie Toxinen, Substraten, Inhibitoren oder Aktivatoren,

von den Kulturschalen abgelöst, jedoch fünfmal mit 0,5 ml PBS gewaschen. Danach wurden

Materialien und Methoden

die Zellen in einem Gesamtvolumen von 800 µl resuspendiert und je 200 µl Aliquots direkt

verwendet oder in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei -80 °C aufbewahrt.

4.7.7.2 Präparation von Gehirnregionen

Zur Präparation der verschiedenen Gehirnareale wurden die Mäuse getötet und dekapitiert.

Die Gehirne wurden entnommen und auf einer mit Trockeneis gekühlten Aluminiumfolie

derart gelagert, dass die Hemisphären auf ihrer Dorsalseite liegen. Die Gehirne wurden ei-

nige Minuten auf der Folie gelagert, bis sie durchgefroren waren, und dann bis zur Präpara-

tion der verschiedenen Gehirnteile bei –80°C in 50 ml Falcon-Tubes aufbewahrt. Für jede

Gehirnregion wurde nach der Präparation das Gewicht bestimmt. Die Präparation der Ge-

hirnregionen erfolgte auf einer Kühlplatte bei –20°C durch Frau Dr. Irene Brunk. Folgende

Gehirnregionen konnten präpariert werden: Bulbus olfactorius, Frontalcortex, Septum, Stria-

tum, Hypothalamus, Cerebellum, Corpus amygdaloideum, Parietalcortex, Hippocampus und

Hirnstamm. Nach der Präparation wurden die Gehirnareale entweder bei –80°C gelagert

oder für die Messung mittels HPLC (high performance liquid chromatography) vorbereitet.

4.7.7.3 Probenvorbereitung für die HPLC

Vor der HPLC-Analyse wurden die Zellen mit dem gleichen Volumen kalter Homogenisie-

rungslösung versetzt. Für Gewebe wurde 10 µl / mg Gewebe der eiskalten Homogenisie-

rungslösung verwandt. Nach Zugabe der Homogenisierungslösung wurde die Probe mit

einem Ultraschallstab für 30 Sekunden homogenisiert. Anschließend wurde das Homogenat

bei 16.000 x g bei 4°C für 20 Minuten zentrifugiert und der Überstand in neue Reaktionsge-

fäße überführt. Für die Bestimmung von Serotonin konnte die vorliegende Probe jetzt direkt

für die HPLC-Analyse verwendet oder musste noch verdünnt werden. Das Probenvolumen

betrug 20 µl.

Für die Bestimmung von Katecholaminen war es nötig, vor der Injektion noch eine Extrakti-

on an Aluminiumoxid durchzuführen. Dazu wurde die Probe, je nach geplanter Verdünnung,

vor der HPLC-Analyse mit 1/10 Volumen internen Standards Dihydroxybenzylamin (DHBA)

gemischt (Endkonzentration während der HPLC-Messung 250 nM bzw. 500 nM) und mit 1

ml 1 % Al

(in 1M Tris, pH 8,6) versetzt und für 10 Minuten bei 4°C geschüttelt. Danach

wurde das Aluminiumoxid bei maximaler Geschwindigkeit in einer Tischzentrifuge sedimen-

tiert und die Pellets zweimal mit 1 ml ddH

O gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation wur-

de der Überstand verworfen, das Pellet in einem geeigneten Volumen 0,2 M Perchorsäure

resuspendiert und für 10 Minuten bei 4 °C schüttelnd inkubiert. Abschließend wurde zentri-

fugiert und der Überstand in neue Eppendorfreaktionsgefäße überführt. Der Überstand wur-

de dann für die HPLC-Messung verwendet oder zuvor in geeignetem Maße verdünnt. Für

die Analyse wurden 20 µl appliziert.

Materialien und Methoden

4.7.7.4 Bestimmung von Monoaminen sowie deren Abbauprodukten mittels

HPLC-EC

Der Monoamingehalt der Proben wurde mittels HPLC und elektrochemischer Detektion

bestimmt. Die Messungen wurden unter den folgenden Bedingungen durchgeführt. Als Säu-

le diente eine 125 mm (∅ 4mm) LiChroCART-Kartusche (Merck), die mit dem Material Pu-

rospher STAR (RP-18 endcapped; 5 µm) gefüllt war. Die Säulentemperatur während der

Messung betrug 37°C, es wurde eine Flussrate von 1 ml / min eingestellt und für 20 Minuten

gemessen. Das am Detektor angelegte Potential betrug + 0,65 V.

Für die Bestimmung von Serotonin (5-HT) und 5-Hydroxyindolessigsäure (5-HIAA) wurde

eine mobile Phase, bestehend aus 0,1 M Natriumacetat; 0,1 mM EDTA; 0,35 mM Heptan-

sulfonsäure und 5% (v/v) Methanol (pH 4,5) verwandt. Als Standard wurde nach jedem drit-

ten Probenlauf 20 µl eines Gemisches definierter Konzentrationen von 5-HT und 5-HIAA

injiziert.

Für die Bestimmung der Katecholamine wurde eine mobile Phase, bestehend aus 0,1 M

Natriumphosphat; 0,1 mM EDTA; 0,75 mM Oktansulfonsäure und 5 % (v/v) Methanol (pH

5,0) verwandt. Als Standard wurde nach jedem dritten Probenlauf ein Gemisch von No-

radrenalin, Adrenalin, Dopamin, Dihydroxyphenylessigsäure sowie DHBA definierter Kon-

zentration injiziert.

Bei der Bestimmung von Serotonin wurde vor jeder Messung eine Kalibriergerade durch

Applikation definierter Konzentrationen einer Standardlösung sowie Applikation von Stan-

dardlösungen zwischen den Proben erstellt. Durch lineare Regression wurde dann für die

jeweiligen Proben die Konzentration an 5-HT bzw. 5-HIAA berechnet.

Bei der Bestimmung der Katecholamine wurde bei allen Proben der interne Standard Di-

hydroxybenzylamin mitgeführt. Durch Ermittlung des Kalibrierfaktors von DHBA und den

analysierten Katecholaminen konnte so die Konzentration in den einzelnen Proben be-

stimmt werden. Die dabei genutzten Gleichungen lauten wie folgt:

= (m

x A

DHBA

) / ( m

DHBA

x A

)

KAProbe

= KF

x A

DHBAProbe

: Kalibrierfaktor des jeweiligen Katecholamins

: Masse des Katecholamins in der Kalibrierlösung

: Fläche des Katecholamin-Peaks der Kalibrierlösung

DHBA

: Masse von DHBA in der Kalibrierlösung

DHBA

: Fläche des DHBA-Peaks der Kalibrierlösung

KAProbe

: Masse des Katecholamins der untersuchten Probe

DHBAProbe

: Fläche des DHBA-Peaks der Probenlösung

Materialien und Methoden

Die ermittelte Masse des jeweiligen Monoamins wurde bei der Vermessung von Gehirnarea-

len auf die Masse des untersuchten Gewebes, bei Zellen auf die Proteinmenge der jeweili-

gen Probe bezogen.

4.7.8 Versuchsdurchführung und -auswertung

Alle biochemischen Experimente wurden, falls nicht anders angegeben, dreimal wiederholt.

Für einzelne Meßwerte wurden dabei jeweils Dreifachbestimmungen durchgeführt. Die in

Kapitel 5 angegebenen Daten zeigen die Mittelwerte repräsentativer Einzelexperimente. Die

Fehlerbalken der ermittelten Messwerte stellen die ermittelte Standardabweichung dar. Die

Ausnahme bilden hierbei die HPLC- und Verhaltensexperimente, in denen die Fehlerbalken

den mittleren Standardfehler widerspiegeln. Signifikante Unterschiede mit einer Fehlerwahr-

scheinlichkeit von p ≤ 0,05 sind mit einem Stern markiert. Für die Untersuchung ob die ge-

messenen Unterschiede signifikant sind, wurde in allen biochemischen Untersuchungen der

Student’sche t-Test für unabhängige Proben verwendet. Die Verhaltensexperimente wurden

mittels ANOVA und falls notwendig, mit Duncan’s post-hoc-Test analysiert.

Ergebnisse

5 Ergebnisse

5.1 Modellsysteme zur Untersuchung der Regulation von VMAT1

und VMAT2 durch heterotrimere G-Proteine

Der Ausgangspunkt für die durchgeführten Untersuchungen war die Beobachtung, dass die

Aktivierung heterotrimerer, vesikelassoziierter G-Proteine in Neurotransmitteraufnahmeex-

perimenten zu einem verminderten Transport von Monoaminen durch VMAT1 und VMAT2

führt. Es stellte sich heraus, dass in neuroendokrinen Zellen und Neuronen die aktivierte

Gα-Untereinheit Go2α (Ahnert-Hilger et al., 1998; Höltje et al., 2000) und in Thrombozyten

aktiviertes Gqα (Höltje et al., 2003) für die Regulation der Neurotransmitteraufnahme ver-

antwortlich ist. Die G-Protein-vermittelte Regulation der Neurotransmitteraufnahme stellt

einen in zahlreichen Modellsystemen beobachtbaren Effekt dar, dessen genaue

Signaltransduktionsmechanismen aber noch nicht verstanden sind. Wie Untersuchungen an

Thrombozyten von Tryptophanhydroxylase-Deletionsmutanten und in mit VMAT2 transfizier-

ten CHO-Zellen zeigten, ist die G-Proteinregulation von der Füllung der Vesikel mit Neu-

rotransmitter abhängig (Höltje et al., 2003; Brunk et al., 2006). Einen Überblick der Modell-

systeme und repräsentative Ergebnisse von Neurotransmitteraufnahmeversuchen in den

jeweiligen Systemen, zeigt Abbildung 3.

In allen Modellsystemen konnte in Neurotransmitteraufnahmeversuchen durch Zugabe des

schwer hydrolysierbaren GTP-Analogons GMP-P(NH)P eine Verminderung der Neu-

rotransmitteraufnahme beobachtet werden. GMP-P(NH)P fixiert Gα-Untereinheiten in ihrem

aktivierten Zustand und bestätigt dadurch die Bedeutung von G-Proteinen bei der Neu-

rotransmitterspeicherung. Die ermittelten Daten sind nach Abzug der unspezifischen Bin-

dung des tritiierten Neurotransmitters in der Gegenwart von Reserpin zusätzlich als GMP-

P(NH)P vermittelte Hemmung in Prozent dargestellt. Dadurch werden die aufgeführten Ab-

bildungen vereinfacht und ein Vergleich verschiedener Proben erleichtert.

Neben der Untersuchung frisch präparierter Vesikel aus dem Gehirn der Maus wurden auch

die neuroendokrinen Zelllinien PC12 und BON verwendet, die die für die Synthese und

Speicherung von Monoaminen nötigen Enzyme und Transporter exprimieren. PC12-Zellen

entstammen einem Phäochromozytom der Ratte (Greene & Tischler, 1976), BON-Zellen

stammen aus einem humanen Karzinoid des Pankreas (Evers et al., 1991). Beide Zelllinien

exprimieren den VMAT1, BON-Zellen, die in einer Mischpopulation vorliegen, zusätzlich

auch den VMAT2.

Auch Thrombozyten besitzen alle für die Monoaminspeicherung nötigen Transporter, nicht

jedoch die für den Monoaminstoffwechsel nötigen Enzyme. Die Neurotransmitterspeiche-

rung in Vesikeln wird in Thrombozyten durch Gqα reguliert.

Ergebnisse

Abbildung 3: Modelle zur Untersuchung der Neurotransmitteraufnahme.

Ergebnisse

Nach Austausch von GDP gegen das schwer hydrolysierbare GTP-Analogon GMP-P(NH)P werden durch vesi-

kelassoziierte G-Proteine bislang unbekannte Signaltransduktionswege aktiviert, durch die es zu einer vermin-

derten Neurotransmitteraufnahme kommt. In vitro kann man diese Effekte durch Neurotransmitteraufnahmeex-

perimente an synaptischen Vesikelpräparationen der Maus, aber auch an einfacheren Systemen wie neuroen-

dokrinen Zelllinien, transfizierten CHO-Zellen und Thrombozyten untersuchen. Für alle Modellsysteme sind die

Ergebnisse von [

H]-Serotoninaufnahmeversuchen dargestellt. Je Modell wurden dabei drei Ansätze, bestehend

aus je drei Messwerten, eine Kontrolle (ohne Zusätze), eine Probe mit 20 µM GMP-P(NH)P und eine Probe mit 6

µM Reserpin aufgeführt. In allen Modellsystemen kann durch die Zugabe von GMP-P(NH)P eine Reduktion der

[

H]-Serotoninaufnahme gegenüber der Kontrollbedingung beobachtet werden. Mit der Zugabe von 6 µM Reser-

pin kann die unspezifische Aufnahme von [

H]-Serotonin bestimmt werden. Zieht man diese unspezifische Auf-

nahme jeweils von den Ergebnissen der Kontrollbedingung und der Aufnahme in Gegenwart von GMP-P(NH)P

ab, können diese Ergebnisse auch vereinfacht als GMP-P(NH)P-vermittelte Hemmung dargestellt werden. Dabei

setzt man den Wert der [

H]-Serotoninaufnahme als 100 % und berechnet die prozentuale Hemmung durch

GMP-P(NH)P.

Neben den Diagrammen der repräsentativen Versuchsergebnisse der verschiedenen Modelle werden deren

Besonderheiten erläutert.

NT: Neurotransmitter, K: Kontrolle, G: 20 µM GMP-P(NH)P, R: 6 µM Reserpin

Der Einsatz von CHO-Zellen, die auch Go2α exprimieren, ermöglicht durch gezielte Muta-

genese und Transfektion die Untersuchung rekombinanter VMAT. Zu berücksichtigen ist

dabei, dass eine G-Protein-vermittelte Hemmung der Neurotransmitteraufnahme erst nach

Vorbeladung der intrazellulären Kompartimente zu beobachten ist.

5.2 Einfluss der ersten intravesikulären Schleife des VMAT2 auf

die G-Protein-vermittelte Regulation der Monoamin-

speicherung

Wie Untersuchungen an Thrombozyten von Tph1-Deletionsmutanten gezeigt haben, ist die

Voraussetzung für die G-Protein-vermittelte Hemmung des Monoamintransports der Fül-

lungszustand der Vesikel (Höltje et al. 2003). Es muss also ein vesikulärer Rezeptor existie-

ren, der den intravesikulären Monoaminspiegel detektiert. Es konnte gezeigt werden, dass,

im Gegensatz zum VMAT1, die für die VMAT2-Regulation verantwortliche Struktur durch

5HT1B-Agonisten aktiviert und durch 5HT1B-Antagonisten inhibiert werden kann (Brunk et

al. 2006). Diese Beobachtungen bestätigten sich auch in CHO-Zellen die mit rVMAT2 trans-

fiziert wurden.

Da CHO-Zellen nicht über die Enzymausstattung verfügen, um Monoamine zu synthetisie-

ren und zu speichern, lässt das die Hypothese zu, dass der VMAT2 selbst an der Messung

der intravesikulären Monoaminkonzentration beteiligt ist. Da zwischen VMAT1 und VMAT2

Unterschiede bezüglich der pharmakologischen Charakterisierung der vesikulären Erken-

nungsstruktur vorliegen, wie die pharmakologische Charakterisierung mit 5HT1B-Agonisten-

und Antagonisten gezeigt hat, sollte sich diese rezeptorähnliche Struktur zwischen VMAT1

und VMAT2 unterscheiden.

Ein Proteinsequenzvergleich von VMAT1 und VMAT2 zeigt, dass die am stärksten variablen

Regionen im Bereich der ersten großen intravesikulären Schleife zu finden sind. Der Se-

quenzvergleich dieser Region ist gemeinsam mit einem Modell des VMAT2 in Abbildung 4

dargestellt. Über die Funktion und Bedeutung dieser Schleife für die Transporteraktivität gibt

es keine Informationen, sie enthält jedoch fünf potentielle Glykosylierungsstellen.

Ergebnisse

Abbildung 4: Schematische Darstellung des rVMAT2 sowie eines Sequenzalignements von rVMAT1

und rVMAT2 im Bereich vor und nach der ersten luminalen Schleife.

Die farblich markierten Bereiche der ersten intravesikulären Schleife zeigen eine starke Variabilität zwischen

VMAT1 und VMAT2. Der am stärksten variable Bereich ist rot markiert. Für die schematische Darstellung des

VMAT2 wurde die Transmembranprotein-Display-Software TOPO2 verwendet

(http://www.sacs.ucsf.edu/TOPO2/). Das Sequenzalignment wurde mit der Software Clustal W

(http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html; Chenna et al., 2003) erstellt.

5.2.1 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife beeinflusst die

Expression der VMAT2-Konstrukte in CHO-Zellen nicht

Um zu untersuchen, ob Teile der ersten intravesikulären Schleife an der intravesikulären

Bestimmung der Monoaminkonzentration beteiligt sind, wurden cDNA’s für rekombinante

Transportermoleküle hergestellt. Ausgehend von der VMAT2-cDNA der Ratte, die im Vektor

pcDNA3.1 vorlag, wurden mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) und Religation der gene-

rierten cDNA-Fragmente mutierte cDNA’s des VMAT2 erzeugt. Es wurden zwei verschiede-

ne cDNA-Konstrukte hergestellt. Bei einem wurde die gesamte erste intravesikuläre Schleife

(∆P42-V130) durch 5 Glyzinreste substituiert. Da nicht bekannt war, ob komplette Deletio-

nen dieser Schleife mit einem Funktionsverlust verbunden sind, wurde zusätzlich nur der

zwischen VMAT1 und VMAT2 am stärksten variable, zentrale Bereich (∆Q61-T113) der ers-

ten intravesikulären Schleife deletiert. Die so erzeugten cDNA’s wurden nach Klonierung in

den Vektor pcDNA3.1 sequenziert und anschließend in CHO-Zellen transfiziert. Nach Selek-

tion und Vereinzelung wurden die transfizierten Zellklone herangezogen und durch Immun-

fluoreszenz auf die Expression der VMAT2-Konstrukte überprüft. Ein Schema der erzeugten

Ergebnisse

VMAT2-Konstrukte sowie die Immunfärbung mit Anti-VMAT2-Antikörper ist in Abbildung 5

dargestellt. Dabei zeigte sich, dass die verschiedenen, mutierten VMAT-Konstrukte, wie

auch die unveränderten VMAT2, durch den Antikörper erkannt werden und in den stabil

transfizierten CHO-Zellen vorliegen.

Abbildung 5: Schematische Darstellung der ersten luminalen Schleife des rVMAT2 und der mutierten

rVMAT2-Konstrukte sowie Nachweis der Proteinexpression in stabil transfizierten CHO-

Zellen.

Ausgehend von der cDNA des rVMAT2 wurden VMAT2-Konstrukte hergestellt, denen der zentrale Teil der lumi-

nalen Schleife (rot; Aminosäuren Q61-T113) entfernt wurde bzw. bei denen die gesamte luminale Schleife durch

fünf Glyzinreste (blau) ersetzt wurde. Mit diesen Konstrukten wurden CHO-Zellen stabil transfiziert. Die Überprü-

fung der Expression der transfizierten Transportermoleküle erfolgte durch Immunfärbung und ist jeweils darunter

dargestellt. Alle diese Arbeiten erfolgten in Zusammenarbeit mit Dr. S. Rachakonda.

5.2.2 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife verändert den

Monoamintransport in transfizierten CHO-Zellen nicht

Nach Überprüfung der Expression der verschiedenen VMAT2-Konstrukte wurde anschlie-

ßend deren Funktionalität in Neurotransmitteraufnahmetests untersucht. In Versuchen mit

permeabilisierten CHO-Zellen, die mit Wildtyp- oder mutiertem VMAT2 transfiziert waren,

zeigte sich unter identischen Reaktionsbedingungen eine gleichmäßige [

H]-

Serotoninaufnahmerate von 4-5 pmol / mg Protein (Abbildung 6). Weitere [

H]-

Serotoninaufnahmeexperimente mit ansteigenden Konzentrationen nichtmarkierten Seroto-

nins wurden zur Ermittlung der K

-Werte der verschiedenen Transporterkonstrukte durchge-

führt. Die Kinetiken dafür sind in Abbildung 6 aufgeführt. Aus den Kinetiken wurde mittels-

nichtlinearer Regression durch Einsatz der Software GraphPadPrism der K

-Wert berech-

Ergebnisse

net. Für den VMAT2 und VMAT2∆P42-V130 wurden vergleichbare K

-Werte von 13 bzw.

12 µM ermittelt. Der K

-Wert für VMAT2∆Q61-T113 war mit 6 µM leicht erniedrigt.

Abbildung 6: Kinetik des Serotonintransports von CHO-Zellen die mit VMAT2-cDNA bzw. mutierten

VMAT2-cDNA-Konstrukten transfiziert sind.

Stabil transfizierte CHO-Zellen wurden permeabilisiert und die Serotoninaufnahme für 10 Minuten bei 37°C un-

tersucht. Für die verschiedenen transfizierten Zelllinien war eine gleichmäßige [

H]-Serotoninaufnahme zu beo-

bachten. In Folgeexperimenten wurden bei der [

H]-Serotoninaufnahme steigende Mengen nichtmarkierten Se-

rotonins zugesetzt, um die für die Kinetiken höheren Konzentrationen einzustellen. Die Kinetiken wurden mit der

GraphPadPrism Software ausgewertet. Die dabei bestimmten K

-Werte lagen im Bereich von 6 - 13 µM.

5.2.3 Die Deletion der ersten intravesikulären Schleife des VMAT2 führt

in CHO-Zellen zu einem Verlust der Regulation durch G-Proteine

Um zu überprüfen, ob sich die Deletion der ersten intravesikulären Schleife auf die G-

Protein-vermittelte Regulation des Monoamintransports auswirkt, wurden die verschiedenen

transfizierten VMAT-Zelllinien nach Permeabilisierung der Plasmamembran mit 1 mM No-

radrenalin vorinkubiert, um die intrazellulären Strukturen mit Monoaminen zu füllen. Alterna-

tiv erfolgte die Inkubation mit 500 nM Anpirtolin, einem 5HT1B-Rezeptoragonisten. Für bei-

de Substanzen war bekannt, dass sie in CHO-Zellen die G-Protein-vermittelte Hemmung

induzieren. Anschließend wurde die vesikuläre Serotoninaufnahme in An- und Abwesenheit

von GMP-P(NH)P bestimmt. Die induzierte Hemmung ist in Abbildung 7 auch bei CHO-

Zellen zu beobachten, die mit der Wildtyp VMAT2 cDNA transfiziert waren. Hingegen ist in

Ergebnisse

Zellen, die mit VMAT2∆Q61-T113 bzw. VMAT2∆P42-V130 transfiziert waren, diese G-

Protein-vermittelte Regulation nicht mehr oder nur sehr schwach ausgeprägt.

Abbildung 7: GMP-P(NH)P-vermittelte Hemmung der Serotoninaufnahme in permeabilisierten CHO-

Zellen, die mit verschiedenen rVMAT2-Konstrukten transfiziert sind.

Stabil transfizierte CHO-Zellen wurden permeabilisiert und für 10 Minuten bei 37°C mit 1 mM Noradrenalin bzw.

500 nM des 5HT1B-Agonisten Anpirtolin inkubiert. Anschließend wurde die Serotoninaufnahme mit und ohne

100 µM GMP-P(NH)-P durchgeführt. Die Serotoninaufnahme ohne GMP-P(NH)P wurde als 100 % festgelegt, die

durch GMP-P(NH)P verursachte prozentuale Hemmung ist dargestellt.

Die durch eine GMP-P(NH)P vermittelte Hemmung nach Vorinkubation mit 1 mM Noradrenalin bzw. 500 nM

Anpirtolin ist in mit Wildtyp-VMAT2-DNA transfizierten Zellen deutlich. CHO-Zellen, die mit mutierter VMAT2-

cDNA transfiziert sind, zeigen nach der Vorinkubation keine bzw. nur eine geringe GMP-P(NH)P vermittelte

Hemmung.

5.3 Die intravesikuläre Erkennungsstruktur des VMAT1

5.3.1 Eine α

αα

α1-Rezeptor-ähnliche Struktur reguliert die Monoamin-

speicherung durch den VMAT1

In Anlehnung an die Beobachtung, dass eine 5HT1B-Rezeptor-ähnliche Struktur für die Be-

stimmung des intravesikulären Monoamingehalts im VMAT2-System verantwortlich ist, wur-

den die zur Verfügung stehenden Systeme CHO-VMAT1-Zellen sowie PC12-Zellen, für die

Charkterisierung des VMAT1 untersucht. Untersuchungen in CHO-VMAT1-Zellen, die von

Frau Dr. Irene Brunk ausgeführt wurden, zeigten, dass im Gegensatz zu CHO-VMAT2-

Zellen nicht eine 5-HT1B-ähnliche, sondern eine α1-Rezeptor-ähnliche Struktur an der Be-

stimmung der intravesikulären Monoaminspiegel beteiligt ist (Brunk et al., 2006). Um die

Ergebnisse

dabei erzielten Beobachtungen in einem weiteren System zu untersuchen, wurden PC12-

Zellen, die ausschließlich den VMAT1 exprimieren, untersucht. Nach der Permeabilisierung

wurden die PC12-Zellen mit 500 nM des α1-Rezeptorantagonisten Prazosin vorinkubiert. Im

darauffolgenden [

H]-Serotoninaufnahmetest mit und ohne GMP-P(NH)P konnte nach Pra-

zosin-Vorbehandlung im Gegensatz zu unbehandelten Zellen und solchen, die mit dem

5HT1B-Rezeptorantagonisten Isamoltan behandelt wurden, keine G-Protein-vermittelte

Hemmung mehr beobachtet werden (Abbildung 8).

Abbildung 8: Effekte des α

αα

α1-Rezeptorantagonisten Prazosin und des 5HT1B-Rezeptorantagonisten

Isamoltan auf die GMP-P(NH)P-vermittelte Hemmung der [

H]-Serotoninaufnahme in

permeabilisierten PC-12 Zellen.

Nach einer Vorinkubation permeabilisierter PC12-Zellen mit 500 nM Prazosin ist im Gegensatz zur Vorinkubation

mit 500 nM Isamoltan und zu Kontrollbedingungen keine durch GMP-P(NH)P verursachte Hemmung zu beo-

bachten.

Die Neurotransmitteraufnahme wurde nach zehnminütiger Vorinkubation der permeabilisierten Zellen mit Prazo-

sin bzw. Isamoltan durchgeführt. Die Serotoninaufnahme ohne GMP-P(NH)P wurde als 100% festgelegt, die

durch das GTP-Analogon verursachte Hemmung der Neurotransmitteraufnahme in Prozent ist dargestellt.

5.3.2 Auch in VMAT1-transfizierten Zellen ist die erste intravesikuläre

Schleife an der G-Protein-vermittelten Regulation beteiligt

Um zu überprüfen, ob an der α1-Rezeptor-ähnlichen Struktur des VMAT1 auch die erste

intravesikuläre Schleife beteiligt ist, wurden wie bei der Untersuchung des VMAT2 (5.2.1),

cDNA-Konstrukte des VMAT1 hergestellt, denen Teile der ersten intravesikulären Schleife

Ergebnisse

fehlen. Für das Konstrukt VMAT1∆H62-V117 wurden CHO-Zellen transfiziert und nach der

Selektion und Vereinzelung stabil transfizierte Zelllinien erzeugt. Mittels Immunfluoreszenz

konnte die Expression des Konstruktes nachgewiesen werden. Auch in funktionellen Tests

der Transporteraktivität konnte eine reserpinsensitive [

H]-Serotoninaufnahme beobachtet

werden, die allerdings um den Faktor vier kleiner war, als bei vergleichbaren Wildtyp-

konstrukten. Nach Vorbeladung permeabilisierter Zellen und Vorinkubation mit 1 mM Adre-

nalin bzw. 500 nM des α1-Rezeptoragonisten Cirazolin war in mit VMAT1 transfizierten

Zellen eine G-Protein-vermittelte Hemmung zu beobachten. Das war auch bei den

VMAT1∆H62-V117-Konstrukten zu erkennen, im Vergleich mit CHO-VMAT1-Zellen aller-

dings in einem signifikant geringeren Ausmaß (Abbildung 9). Diese Beobachtung deutet

darauf hin, dass auch bei VMAT1 die erste intravesikuläre Schleife an der G-Protein-

vermittelten Regulation beteiligt ist.

Abbildung 9: GMP-P(NH)P-vermittelte Hemmung der Serotoninaufnahme in permeabilisierten CHO-

Zellen, die mit verschiedenen rVMAT1-Konstrukten transfiziert sind.

Mit rVMAT1 und mutierter VMAT1-cDNA stabil transfizierte CHO-Zellen wurden permeabilisiert und für 10 Minu-

ten mit 1 mM Adrenalin bzw. 500 nM des α1-Agonisten Cirazolin inkubiert. Anschließend wurde die Serotoni-

naufnahme mit und ohne GMP-P(NH)P gemessen. Die Serotoninaufnahme ohne GMP-P(NH)P wurde als 100 %

festgelegt, die durch GMP-P(NH)P vermittelte Hemmung in Prozent ist dargestellt.

Die durch GMP-P(NH)P vermittelte Hemmung in CHO-Zellen mit mutierten VMAT1-Konstrukten ist nach der

beschriebenen Vorbehandlung gegenüber Wildtyp rVMAT1-Zellen deutlich reduziert. Die Expression der Trans-

portermoleküle wurde durch Immunfärbung nachgewiesen.

Ergebnisse

5.4 Zytoplasmatische Strukturen des VMAT2 die an der

Signaltransduktion beteiligt sein könnten

Wie die vorangegangenen Untersuchungen zeigten, besitzen der VMAT2 und auch der

VMAT1 eine rezeptorähnliche Struktur, die in das Vesikellumen ragt und nach Aktivierung

durch intravesikuläre Monoamine zu einer Aktivierung der Go2α-Untereinheit führt. Ob diese

Aktivierung direkt durch den VMAT ausgelöst wird oder andere Signalmoleküle dazwi-

schengeschaltet oder zusätzlich daran beteiligt sind, ist unklar. In einem nächsten Schritt

sollte deshalb überprüft werden, ob zytoplasmatische Anteile des VMAT2 an dieser Signal-

weiterleitung beteiligt sind. Da VMAT-regulierende Signale beider VMAT-Isoformen durch

die gleiche G-Proteinuntereinheit Go2α vermittelt werden, sollten homologe Bereiche an der

Signalweiterleitung ins Zytosol beteiligt sein. Zytoplasmatische Bereiche die einen hohen

Grad an Homologie aufweisen sind der N- und C-terminale Anteil der Transporter und die

Region zwischen den Transmembrandomänen VI und VII. In einem ersten Ansatz wurden

deshalb mutierte cDNA des VMAT2 hergestellt, bei der die Region zwischen den Trans-

membrandomänen VI und VII durch fünf Glyzinreste ausgetauscht wurde. Bei zwei weiteren

Konstrukten wurde der C-terminale Bereich nach der Transmembrandomäne XII (Aminosäu-

ren R472-D515) entfernt oder der mittlere Teil des C-Terminus, die Aminosäuren R472 –

Y504 (hellblau, siehe Abbildung 10), deletiert.

Abbildung 10: Schematische Darstellung des rVMAT2 sowie verschiedener Sequenzvergleiche von

rVMAT1 und rVMAT2 im N-terminalen Bereich, zwischen Transmembrandomäne 6 und 7

sowie im C-terminalen Bereich.

Da sowohl VMAT1 und VMAT2 an der Signalübermittlung aus dem Vesikellumen beteiligt sind, galt es herauszu-

finden, welche zytoplasmatischen Bereiche an der Signalweiterleitung beteiligt sein könnten. Die Neurotransmit-

terspeicherung wird bei beiden Transportern durch Go2α reguliert. Daher sollten homologe Bereiche für die

Signaltransduktion ins Zytoplasma eher in Betracht kommen. Die farblich markierten Bereiche kennzeichnen

Ergebnisse

stärker homologe zytoplasmatische Transporterregionen des VMAT2, die mittels Mutagenese ganz oder teilwei-

se entfernt wurden. Die Region zwischen Transmembrandomäne VI und VII (dunkelblau) wurde gegen 5 Glyzin-

reste substituiert. Der mittlere Teil des C-Terminus (hellblau) wurde einzeln oder in Kombination mit der unmit-

telbar C-terminalen Region (lila) deletiert. Für die Darstellung des rVMAT2 wurde das Programm TOPO2 ver-

wendet. Der Sequenzvergleich wurde mit der Software Clustal W erstellt; A: N-Terminus; B: Region zwischen

Transmembrandomäne VI und VII; C: C-Terminus.

5.4.1 Die Substitution der Aminosäuren P273-D292 durch 5 Glyzinreste

führt zum Verlust der Transportaktivität des VMAT2

Wie unter Punkt 5.4 gezeigt, wurden VMAT2 cDNA-Konstrukte hergestellt, bei denen die

Aminosäuren P273-D292 der zytoplasmatischen Region zwischen Transmembrandomäne

VI und VII gegen 5 Glyzinreste ausgetauscht wurden. Die Konstrukte wurden in CHO-Zellen

transfiziert, und nach Vereinzelung wurden stabil transfizierte CHO-Zelllinien selektiert. Die

Expression des mutierten VMAT2 konnte mittels Immunfluoreszenz überprüft werden. Im

Gegensatz dazu konnte in keinem der 23 untersuchten CHO-Zellklone in [

H]-Serotonin-

aufnahmeexperimenten eine Neurotransmitteraufnahme und -speicherung nachgewiesen

werden (Abbildung 11). Gemeinsam mit den Fluoreszenzdaten deutet das darauf hin, dass

die Deletion der Aminosäuren P273-D292 zu einem Verlust der Transportaktivität des VMAT

führt.

Abbildung 11: Serotoninaufnahme in permeabilisierten CHO-Zellen, die mit rVMAT2 und rVMAT2-

Konstrukten transfiziert sind. Bei den veränderten VMAT-Konstrukten wurde der zy-

toplasmatische Bereich zwischen den Transmembrandomänen 6/7 gegen 5 Glyzinreste

substituiert.

Mit rVMAT2 und mutierter VMAT2-cDNA stabil transfizierte CHO-Zellen wurden permeabilisiert und für 10 Minu-

ten die Serotoninaufnahme gemessen. Von den mutierten rVMAT2-Konstrukten sind 4 Klone (von 24) mit der

höchsten Neurotransmitteraufnahme abgebildet. Die Expression der Transportermoleküle wurde durch Immun-

färbung nachgewiesen.

Ergebnisse

5.4.2 Deletionen im C-terminalen Bereich des VMAT2 beeinflussen die

G-Protein-vermittelte Regulation des VMAT2 nicht

Für die Untersuchung C-terminaler Sequenzen wurden mittels PCR und zwei unterschiedli-

cher Rückwärtsprimer zwei verschiedene cDNAs hergestellt. Mit diesen cDNA-Konstrukten

wurden CHO-Zellen stabil transfiziert und durch Immunfluoreszenz und [

H]-Neurotrans-

mitteraufnahmetests charakterisiert. Sowohl für CHO-VMAT2∆R472-D515, als auch für

CHO-VMAT2∆R472-Y504 konnten Klone identifiziert werden, die in Neurotransmitterauf-

nahmetests vergleichbare Neurotransmitteraufnahmeraten zeigten wie CHO-VMAT2-Zellen.

Wurden C-terminal mutierte VMAT exprimierende Zelllinien permeabilisiert und mit No-

radrenalin vorbeladen, so zeigten sie in [

H]-Serotoninaufnahmetests nach Zugabe von

GMP-P(NH)P - wie auch der VMAT2-Wildtyp - eine G-Protein-vermittelte Verminderung der

Neurotransmitteraufnahme, die in Abbildung 12 dargestellt ist. Eine Beteiligung des C-

Terminus an einer Signaltransduktion aus dem Vesikellumen ist daher unwahrscheinlich.

Abbildung 12: GMP-P(NH)P- vermittelte Hemmung der Serotoninaufnahme in permeabilisierten CHO-

Zellen, die mit verschiedenen C-terminal veränderten rVMAT2-Konstrukten transfiziert

sind.

Mit rVMAT2 und mutierter rVMAT2-cDNA stabil transfizierte CHO-Zellen wurden permeabilisiert und für 10 Minu-

ten mit 1 mM Noradrenalin inkubiert. Anschließend wurde die Serotoninaufnahme mit und ohne GMP-P(NH)P

gemessen. Die Serotoninaufnahme ohne GMP-P(NH)P wurde als 100 % festgelegt, die durch GMP-P(NH)P

vermittelte Hemmung in Prozent ist dargestellt.

Ergebnisse

Zwischen C-terminal mutierten und Wildtyp-rVMAT2-Konstrukten konnte kein Unterschied in der durch GMP-

P(NH)P vermittelten Hemmung beobachtet werden. Die Expression der Transportermoleküle wurde durch Im-

munfärbung nachgewiesen.

5.5 Nachgeschaltete Signaltransduktionswege der G-Protein-

vermittelten Regulation der VMAT

5.5.1 Einfluss von DbcAMP auf die G-Proteinregulation der VMAT

Durch Untersuchungen an permeabilisierten PC12-Zellen konnten Nakanishi und Kollegen

(Nakanishi et al., 1995a, Nakanishi et al., 1995b) zeigen, dass cAMP die vesikuläre Neu-

rotransmitteraufnahme konzentrationsabhängig vermindert. In ersten Versuchen zur Aufklä-

rung der beteiligten nachgeschalteten Signaltransduktionswege sollte deshalb der Einfluss

von DbcAMP auf die Serotoninaufnahme sowohl in permeabilisierten BON-Zellen, als auch

in permeabilisierten PC12-Zellen, untersucht werden. Gleichzeitig sollte der Einfluss der

cAMP-Behandlung auf die G-Protein-vermittelte Regulation der VMAT überprüft werden.

Dazu wurden BON bzw. PC12-Zellen für zwei Stunden mit dem membrangängigen cAMP-

Analogon DbcAMP (300 µM) inkubiert, danach permeabilisiert und ein [

H]-

Serotoninaufnahmetest durchgeführt.

In beiden neuroendokrinen Zelllinien zeigte sich, dass durch die Vorbehandlung mit

DbcAMP die Neurotransmitteraufnahme reduziert wurde. Wie in Abbildung 13 dargestellt ist,

konnte die G-Protein-vermittelte Reduktion der Neurotransmitteraufnahme auch nach der

DbcAMP-Vorbehandlung beobachtet werden. In neuroendokrinen Zellen scheinen daher

cAMP und GMP-P(NH)P die Monoaminaufnahme auf unterschiedliche Weise zu beeinflus-

sen, wodurch ein alleiniger Einfluss des aktivierten G-Proteins auf die Adenylylzyklase aus-

geschlossen werden kann.

Ergebnisse

Abbildung 13: GMP-P(NH)P- vermittelte Hemmung der Serotoninaufnahme in permeabilisierten BON

und PC12-Zellen mit und ohne Vorinkubation mit DbcAMP.

BON und PC12-Zellen wurden 2 h mit und ohne 300 µM DbcAMP in serumfreien Medium inkubiert. Anschlie-

ßend wurde die Serotoninaufnahme bestimmt.

In BON und PC12-Zellen führte eine Vorinkubation mit DbcAMP zu einer Reduktion der Neurotransmitterauf-

nahme. Die durch GMP-P(NH)P vermittelte Hemmung bleibt nach DbcAMP-Vorbehandlung bestehen und be-

trägt wie bei unbehandelten Zellen ca. 75 % (BON-Zellen) und ca. 40 % (PC12-Zellen).

5.5.2 Die Überexpression von CAPS1 und CAPS2 steigert die

Monoaminaufnahme in CHO-VMAT-Zellen

Ein weiteres Protein, von dem erst kürzlich ein Einfluss auf die Monoaminspeicherung ge-

zeigt werden konnte, ist CAPS1 (calcium-dependent activator protein for secretion). Speidel

und Mitarbeiter (Speidel et al., 2005) konnten in CAPS1-Deletionsmutanten zeigen, dass die

Granula chromaffiner Zellen weniger gefüllt waren. Das ist auf eine verminderte Speiche-

rungsfähigkeit zurückzuführen. Daher sollte CAPS1 und eine zweite Isoform CAPS2 in

CHO-VMAT1- und CHO-VMAT2-Zellen exprimiert und die Neurotransmitteraufnahme in

permeabilisierten Zellen untersucht werden. Dazu wurden CHO-VMAT1 und CHO-VMAT2

Zellen transient mit pcDNA3.1CAPS1IRESEGFP bzw. pcDNA3.1CAPS2IRESEGFP (freund-

licherweise zur Verfügung gestellt von Prof. Nils Brose, MPI für experimentelle Medizin, Göt-

tingen) transfiziert. Die Expression von CAPS1 und CAPS2 wurde mittels EGFP-

Fluoreszenz nachgewiesen. Die Zellen wurden dann mit SLO permeabilisiert und [

H]-

Serotoninaufnahmetests mit steigenden Konzentrationen nicht-markierten Serotonins unter-

zogen. Dabei zeigte sich nach transienter Transfektion beider CAPS-Isoformen eine gestei-

gerte Serotoninaufnahme über einen weiten Konzentrationsbereich - sowohl in CHO-

Ergebnisse

VMAT1, als auch in CHO-VMAT2-Zellen (Abbildung 14). CAPS-Proteine sind daher ein Fak-

tor, der die Neurotransmitteraufnahme steigern kann.

Abbildung 14: Einfluss der transienten Expression von CAPS1 bzw. CAPS2 auf die Neurotransmitter-

aufnahme in CHO-VMAT1 und CHO-VMAT2-Zellen.

Ergebnisse

Stabil transfizierte CHO-VMAT-Zellen wurden transient mit CAPS1 bzw. CAPS2 oder zur Kontrolle nur mit EGFP

transfiziert. Für die Neurotransmitteraufnahme wurden die Zellen permeabilisiert und die Serotoninaufnahme für

10 Minuten bei 37°C untersucht. [

H]-Serotonin wurde mit steigenden Mengen nichtmarkiertem Serotonin ge-

mischt, um die für die Kinetiken höheren Konzentrationen einzustellen.

Die Kontrolle der CAPS1- bzw. CAPS2-Expression erfolgte durch Nachweis der EGFP-Färbung.

5.6 Bedeutung der Regulation des vesikulären Monoamin-

transports durch heterotrimere G-Proteine

5.6.1 Die Inaktivierung von Go2α

αα

α durch Pertussistoxin führt zu einer

Verminderung der Monoaminaufnahme in PC12 Zellen

Neben der Untersuchung der Signaltransduktionswege, die die Monoaminspeicherung in

synaptischen Vesikeln beeinflussen, war ein weiterer zentraler Untersuchungsschwerpunkt,

Hinweise für die Relevanz der G-Protein vermittelten Regulation zu finden.

In einem ersten Ansatz sollte daher analysiert werden, inwiefern eine Inaktivierung von

Go2α die Serotoninaufnahme in PC12-Zellen beeinflusst. Die G-Proteinuntereinheit Go2α

sollte durch Behandlung mit Pertussistoxin inaktiviert werden. Bei diesem Toxin handelt es

sich um ein Toxin des Bakteriums Bordetella pertussis, das durch seine ADP-

Ribosyltransferaseaktivität spezifisch die Gα-Untereinheiten heterotrimerer G-Proteine der

Gi/o Klasse inaktiviert, indem sie in ihrer GDP-gebundenen Form fixiert werden.

Da nach G-Protein-Aktivierung eine Verminderung der Neurotransmitterspeicherung auftritt,

wurde erwartet, dass bei der Inaktivierung des G-Proteins eine gesteigerte Neurotransmitte-

raufnahme beobachtet werden kann. Wie in Abbildung 15 dargestellt, konnte nach 24-

stündiger Vorinkubation von PC12-Zellen mit Pertussis-Toxin das Gegenteil - eine vermin-

derte [

H]-Serotoninaufnahme - beobachtet werden.

Ergebnisse

Abbildung 15: Serotoninaufnahme in permeabilisierten PC12-Zellen nach Vorinkubation mit Pertussis

Toxin (Ptx).

Die Zellen wurden für 24 h in serumfreien Medium mit bzw. ohne 300 nM Ptx inkubiert. Danach wurden die Zel-

len permeabilisiert und die Serotoninaufnahme gemessen.

Nach einer Inaktivierung der Gi/o-α-Proteine durch Ptx-Behandlung war eine Reduktion der Neurotransmit-

teraufnahme zu beobachten.

5.6.2 Die Inaktivierung von Go2α

αα

α durch Pertussis Toxin führt in BON-

Zellen zu einem verminderten Monoamingehalt

In einem nächsten Schritt sollte überprüft werden, inwiefern die Serotoninspeicherung in

intrazellulären Speicherorganellen durch die Inaktivierung von Go2α beeinflusst wird. Dazu

sollten einerseits unter normalen Bedingungen kultivierte BON-Zellen sowie BON-Zellen, die

in Gegenwart erhöhter Serotoninkonzentrationen kultiviert wurden, untersucht werden. Wie

unter Punkt 5.6.1 beschrieben, wurden Zellen dazu für 24 Stunden mit bzw. ohne Pertus-

sistoxin kultiviert. Nach der Zellernte wurden die Zellen durch mehrfache Passage durch

eine 27G-Kanüle aufgeschlossen und in einem ersten Zentrifugationschritt der postnukleäre

Überstand gewonnen. In einem zweiten hochtourigen Zentrifugationsschritt wurden Memb-

ranfraktion (MF) und Zytosol voneinander getrennt. Die gesammelten Fraktionen wurden

dann mittels HPLC-EC und Proteinbestimmung analysiert und der Serotoningehalt be-

stimmt. Dabei zeigte sich nach Ptx-Behandlung sowohl bei BON-Zellen, die unverändert

bzw. zusätzlich in Gegenwart von 30 µM Serotonin kultiviert wurden, in der Membranfraktion

und in der zytosolischen Fraktion ein verminderter Serotoningehalt (siehe Abbildung 16).

Ergebnisse

Abbildung 16: Serotoningehalt in Membranfraktion (MF) und Zytosol von mit und ohne Pertussis Toxin

(Ptx) behandelten BON Zellen nach 24-stündiger Inkubation mit und ohne 30 µM Seroto-

nin.

Die Zellen wurden nach der Inkubation von den Zellkulturschalen gelöst und in Homogenisierungspuffer re-

suspendiert. Anschließend erfolgte der Aufschluss durch 40-faches Resuspendieren mit einer 27G-Nadel. Nach

der Zentrifugation bei 3000 x g wurde der postnukleare Überstand bei 350.000 x g sedimentiert (MF). Der ver-

bliebene Überstand (Zytosol) wurde ebenfalls mittels HPLC-EC vermessen.

Nach Behandlung mit 300 nM Ptx ist in allen Fraktionen eine signifikante Reduktion des Serotoningehalts zu

verzeichnen. Auch nach Vorinkubation in der Gegenwart mit 30 µM Serotonin, wodurch der Serotoningehalt

insgesamt erhöht ist, ist eine Abnahme des Serotoningehaltes nach Vorinkubation mit Ptx zu beobachten.

5.6.3 Go2α

αα

α-Deletionsmutanten haben gegenüber Wildtyptieren einen

verminderten striatalen Dopaminspiegel

Da in den vorangegangenen Experimenten mit PC12 und BON-Zellen die Beeinflussung

des Monoaminspiegels durch Inaktivierung von Go2α gezeigt werden konnte, sollte nach-

folgend der Einfluss der Deletion von Go2α auch in vivo im Mausmodell untersucht werden.

Die Deletionsmutanten (Dhingra et al., 2002) wurden freundlicherwiese durch Prof. Lutz

Birnbaumer, National Institute of Environmental Health Sciences, Research Triangle Park,

North Carolina, zur Verfügung gestellt. Bei den folgenden Untersuchungen wurden die Ge-

hirnregionen Frontalkortex, Hippocampus, Bulbus olfactorius, Hypothalamus und Cerebel-

lum präpariert und ausgewogen. Der jeweilige Monoamingehalt wurde mittels HPLC-EC

bestimmt und auf die untersuchte Menge Feuchtgewicht bezogen (pg / mg Feuchtgewicht).

Die Analysen wurden in Kooperation mit Frau Prof. Dr. Hörtnagl durchgeführt. In Untersu-

chungen des Gesamthirns von zwei (P2), vier (P4) und acht (P8) Tage alten Wildtypmäusen

und Go2α-Deletionsmutanten konnten keine Unterschiede des Gehalts an Serotonin, Do-

pamin und Noradrenalin und deren Metaboliten beobachtet werden. Bei zwölf Tage alten

Ergebnisse

Tieren war es erstmals möglich, die Gehirnregionen Hippocampus, Hypothalamus, Frontal-

cortex sowie Striatum zu präparieren und getrennt zu untersuchen. Dabei zeigte sich ein

verminderter Dopamingehalt des Striatums, der auch in adulten Tieren beobachtet werden

konnte (Abbildung 17). In allen anderen Regionen konnte keine signifikante Veränderung

des Monoamingehalts beobachtet werden.

Abbildung 17: HPLC-EC-Analyse des Striatums von Wildtyp und Go2α

αα

α-Deletionsmutanten von P12-

und adulten Mäusen.

Das Striatum wurde aus tiefgefrorenem Gehirn auf einer Kühlplatte (-20°C) präpariert und dann mittels HPL C-EC

vermessen. Pro Versuchsgruppe wurden die Gehirnareale von sechs Tieren analysiert. Angegeben sind Mittel-

wert +/- SEM.

Sowohl P12 als auch adulte Tiere zeigen eine Verminderung des Dopamingehalts im Striatum von Go2α-

Deletionsmutanten gegenüber Wildtypmäusen.

Die Bestimmung der Monoamine erfolgte in Zusammenarbeit mit Frau Professor Dr. Heide Hörtnagl, Institut für

Pharmakologie der Charitè.

5.6.4 Verhaltensveränderungen bestätigen den veränderten

Dopaminmetabolismus in Go2α

αα

α-Deletionsmutanten

Da eine Vielzahl von Gehirnfunktionen über Dopamin reguliert wird, (u.a. Bewegung, Kogni-

tion sowie Emotionen) und das dopaminerge System leicht durch verschiedene Substanzen

beeinflussbar ist, sollte in Versuchen überprüft werden, ob sich der im Striatum veränderte

Dopamingehalt auch auf Verhaltensebene wiederspiegelt. Das war insbesondere von Inte-

resse, da Go2α-Deletonsmutanten scheinbar keine offensichtlichen Veränderungen aufwei-

sen (Jiang et al., 1998; Dhingra et al., 2000; 2002). Bei Kooperationspartnern, der Arbeits-

gruppe von Prof. Dr. Rainer Spanagel am Zentralinstitut für seelische Gesundheit in Mann-

heim, wurden Wildtyptiere und Go2α-Deletionsmutanten einer repetitiven Behandlung mit

den Psychostimulantien Kokain bzw. Amphetamin unterzogen. Die durch Substanzgabe

Ergebnisse

induzierte Bewegung wurde nach jeder Applikation zur Ermittlung der substanzinduzierten

Sensitivierung gemessen. Nach der vierten Applikation wurden die Mäuse einem Conditio-

ned Place Preference Test (CPP-Test) unterzogen. Dabei zeigten sich im CPP-Test, der ein

Maß für die substanzvermittelten Belohnungseffekte und damit den Einsatz von Suchtver-

halten ist, keine Unterschiede zwischen beiden Gruppen (nicht gezeigt). Im Gegensatz dazu

traten Unterschiede in der substanzinduzierten Bewegung zwischen Wildtyptieren und

Go2α-Deletionsmutanten bei einzelner und wiederholter Substanzapplikation auf. Bei der

Einzelapplikation konnte beobachtet werden, dass die Go2α-Deletionsmutanten eine gerin-

gere Bewegungsaktivität aufweisen. Diese ergibt aber nur nach Gabe von Amphetamin ei-

nen signifikanten Unterschied. Bei wiederholter Substanzgabe war bei Wildtyptieren zu be-

obachten, dass sowohl bei Amphetamin, als auch bei Kokain, eine mit jeder Injektion zu-

nehmende Bewegungsrate - die substanzvermittelte Sensibilisierung - auftritt. Hingegen ist

diese substanzvermittelte Sensibilisierung bei den Go2α-Deletionsmutanten nur nach Am-

phetamininjektion, allerdings auf einem verminderten Niveau, zu beobachten. Nach wieder-

holter Injektion von Kokain war keine Sensibilisierung in Go2α-Deletionsmutanten zu erken-

nen (Abbildung 18).

Ergebnisse

Abbildung 18: Einfluss der akuten und wiederholten Injektion von Kokain bzw. Amphetamin auf die

Bewegungsaktivität von Wildtyp und Go2α

αα

α-Deletionsmutanten.

Nach Adaption an die Umgebung erhielten die Mäuse entweder eine Salz-, Kokain- (10 mg/kg; i.p.)

oder Am-

phetamininjektion (2 mg/kg; i.p.). Einzelapplikationen erhöhten die Bewegungsaktivität in Wildtypmäusen und

auch in Go2α-Deletionsmutanten. Dabei ist die Bewegungsaktivität in Go2α-Deletionsmutanten etwas geringer

als in Wildtypmäusen.

Mehrfachinjektionen von Kokain und Amphetamin führen bei Wildtyptieren zu einer Sensibilisierung (Erhöhung

der Bewegungsaktivität) nach wiederholter Substanzapplikation. Bei Go2α-Deletionsmutanten ist das nur nach

Injektionen mit Amphetamin zu beobachten, nicht aber nach Injektionen mit Kokain.

Diese Experimente wurden durch die Arbeitsgruppe von Prof. Dr. R. Spanagel am Zentralinstitut für seelische

Gesundheit in Mannheim durchgeführt.

Um zu untersuchen, ob die beobachteten Verhaltensunterschiede durch unterschiedliche

Effekte von Kokain und Amphetamin bei der Neurotransmitteraufnahme und -speicherung in

beiden Genotypen beruhen, wurden abschließend Kontrollexperimente an Synaptosomen

durchgeführt. Dabei dienten intakte Synaptosomen als System für die zelluläre Aufnahme

und Speicherung und permeabilisierte Synaptosomen als System für die vesikuläre Auf-

Ergebnisse

nahme und Speicherung. An intakten Synaptosomen konnte gezeigt werden, dass sowohl 5

µM Kokain als auch 10 µM Amphetamin die zelluläre Dopaminaufnahme komplett hemmen

(Abbildung 19A). In permeabilisierten Synaptosomen ist bei beiden Genotypen in Gegen-

wart von 10 µM Amphetamin eine signifikant verminderte Aufnahme von Dopamin zu erken-

nen (19B). Die Behandlung mit 5 µM Kokain führt in den Go2α-Deletionsmutanten zu einer

leichten Verminderung der Neurotransmitteraufnahme. An intakten, mit

H-Dopamin vorbe-

ladenen Synaptosomen des Gesamthirns und des Striatums konnte verifiziert werden, dass

Amphetamin im Gegensatz zu Kokain in der Lage ist, nicht nur die Dopaminaufnahme zu

blockieren, sondern zusätzlich auch Dopamin in den Extrazellulärraum freizusetzen. Wie

Abbildung 19 C und D zu entnehmen ist, erfolgt die Freisetzung in Wildtyptieren und Go2α-

Deletionsmutanten gleichermaßen.

Abbildung 19: Einfluss von Kokain und Amphetamin auf die Neurotransmitteraufnahme und deren

Freisetzung in bzw. aus Synaptosomen von Wildtyptieren und Go2α

αα

α-

Deletionsmutanten.

A:Die Neurotransmitteraufnahme in intakte Synaptosomen wurde mit 100 nM [

H]-Dopamin sowie zusätzlich mit

und ohne 5 µM Kokain (Kok.) bzw. 10 µM Amphetamin (Amph.) für 10 Minuten bei 37°C gemessen. Die unspezi-

fische Aufnahme wurde in Gegenwart von 20 µM GBR-12909 gemessen und vom Ergebnis der jeweiligen Mes-

Ergebnisse

sungen abgezogen. Sowohl Kokain als auch Amphetamin blockieren die [

H]-Dopaminaufnahme in die Synapto-

somen komplett.

B:Um den Einfluss auf die vesikuläre Neurotransmitteraufnahme zu untersuchen, wurden Synaptosomen beider

Stämme permeabilisiert und die reserpinsensitive [

H]-Dopaminaufnahme mit und ohne Kokain bzw. Ampheta-

min (Konzentrationen siehe A) bestimmt. Nur Amphetamin ist in der Lage, auch die vesikuläre [

H]-

Dopaminaufnahme zu reduzieren. In Go2α-Deletionsmutanten ist auch eine leichte Verminderung zu beobach-

ten.

C+D: Untersucht wurde auch der Einfluss von Kokain und Amphetamin auf die Freisetzung von [

H]-Dopamin

aus zuvor vorbeladenen Synaptosomen des Gesamthirns bzw. des Striatums. In beiden Fällen ist eine Freiset-

zung durch Amphetamin zu beobachten, die im Striatum erwartungsgemäß deutlicher ist.

5.7 Identifizierung von möglichen Zielen der Go2α

αα

α -vermittelten

Signaltransduktion durch das Yeast-two-Hybrid-System

Trotz der unter 5.5 identifizierten Faktoren cAMP und CAPS, die die Neurotransmitterauf-

nahme beeinflussen, bleibt der Zusammenhang mit der durch Go2α−vermittelten Reduktion

der Neurotransmitteraufnahme und -speicherung ungeklärt. Zusätzlich belegen die unter 5.6

durchgeführten Untersuchungen, dass Go2α offensichtlich für die Regulation des Dopa-

minmetabolismus von Bedeutung ist, wobei möglicherweise beteiligte Signalkaskaden aber

unbekannt sind. Deshalb sollte in einem weiteren Ansatz durch Verwendung des Yeast-two-

Hybrid-Systems (Y2H) gezielt nach möglichen Effektoren der Go2α-Untereinheit gesucht

werden. Obwohl die Isoformen von Goα einen großen Anteil am Gehirngesamtprotein aus-

machen - gemeinsam mit Giα mehr als 1,5 % des Membranproteins (Sternweis & Robis-

haw, 1984) - wurde bisher nur nach Interaktionspartnern der Go1α-Isoform gesucht. Diese

unterscheidet sich aber in der GTPase-Domäne, die für die Interaktion mit Effektoren ver-

antwortlich ist, von Go2α.

Als Köderprotein (bait) für das Y2H-System wurde daher Go2αQ205L verwendet. Es han-

delt sich dabei um eine mutierte Gα-Untereinheit, die noch in der Lage ist, GTP zu binden,

der aber die GTPase Aktivität fehlt. Dadurch bleibt die G-Protein-Untereinheit konstitutiv

aktiv (Kroll et al., 1992). Mit diesem bait wurde eine cDNA-Bibliothek aus dem Mäusegehirn

durchgemustert.

5.7.1 Vorgehensweise bei der cDNA-Durchmusterung mittels Yeast-two-

Hybrid-System

Im Folgenden wird zunächst kurz die Vorgehensweise bei der Durchmusterung der cDNA-

Bibliothek beschrieben. Diese ist in Form eines Fließschemas auch in Abbildung 20 darge-

stellt. In den folgenden Abschnitten wird dann genauer auf die dabei beobachteten Ergeb-

nisse eingegangen.

Zu Beginn der Untersuchungen wurden, durch das Wachstum auf verschiedenen Minimal-

medien, die verwendeten Hefestämme AH109 und Y187 bezüglich ihres Phänotypes cha-

rakterisiert. Beide Stämme wuchsen nicht auf Minimalmedien ohne Tryptophan bzw. Leuzin.

Das war die Voraussetzung für die Selektion transformierter Hefezellen nach Einbringen der

Yeast-two-Hybrid-Vektoren für die Durchmusterung. Für die Selektion von transformierten

Ergebnisse

Hefezellen mit prey-Vektoren (pACT2), in denen die cDNA-Bibliothek vorlag, diente Leuzin

als Wachstumsmarker. Für die Selektion von transformierten Hefezellen mit bait-Vektoren

(pGBKT7), diente die Tryptophanauxotrophie der verwendeten Stämme. Um auszuschlie-

ßen, dass während der Durchmusterung ein Wachstum auch ohne Reportergenaktivierung

erfolgen konnte, durften beide Hefestämme ebenso nicht auf Minimalmedien ohne Adenin

bzw. Histidin wachsen. Sowohl Adenin als auch Histidin dienen im Stamm AH109 durch die

Reportergenprodukte ADE2 und HIS3 als Nachweis der Proteininteraktion. Beide Hefe-

stämme, AH109 und Y187, zeigten die gewünschten Wachstumseigenschaften. Allerdings

wies der Stamm AH109 ein leichtes Hintergrundwachstum auf Medium ohne Histidin auf.

Deshalb wurde dem Minimalmedium 1 mM 3-AT zugesetzt, wodurch das Hintergrundwachs-

tum, das vermutlich durch eine leichte konstitutive Expression des His3-Proteins verursacht

wird, unterbunden wurde. Bei 3-AT handelt es sich um einen Inhibitor des His3-Proteins.

Anschließend wurde der Hefestamm AH109 mit dem Vektor pGBKT7-GO2Q205L transfor-

miert, der das Fusionsprotein der Gal4-DNA-Bindungsdomäne mit dem konstitutiv aktiven

G-Protein Go2α, im Folgenden als

Gal4-DNABD-GO2QL bezeichnet, kodiert. Danach wur-

de die Expression dieses Fusionsproteins überprüft und getestet, ob das Protein Gal4-

DNABD-GO2QL allein einen Einfluss auf die Aktivierung der Reportergene (Wachstums-

marker) hat. Zur selben Zeit wurde der Titer der cDNA-Bibliothek aus dem Gehirn der Maus

bestimmt. Die cDNA-Bibliothek lag im Vektor pACT2, mit dem der Stamm E.coli BNN1202

transformiert wurde, vor. Die cDNA-Bibliothek wurde durch Wachstum auf LB-Medienplatten

amplifiziert. Danach wurde die cDNA mittels Plasmidpräparation isoliert und für die an-

schließende Transformation verwendet. Der mit dem bait-Vektor transformierte Hefestamm

AH109 wurde in Selektionsmedium ohne Tryptophan (SD-Trp) angezogen und kompetent

für die DNA-Aufnahme gemacht. Dann stand er für die Transformation zur Verfügung. Wäh-

rend einer ersten Transformation in kleinerem Maßstab wurde dann die bei der Transforma-

tion benötigte Menge der cDNA-Bibliothek optimiert, um eine möglichst große Anzahl unab-

hängiger Klone der cDNA-Bibliothek zu untersuchen. Ausgehend von der Transformations-

effizienz der Testtransformation wurde dann eine Durchmusterung im großen Maßstab

durchgeführt. Nach der Transformation wurden die Hefezellen auf QDO-Medium mit 3-AT

und X-α-Gal für 14-Tage inkubiert. Die gewachsenen Hefeklone wurden dann noch dreimal

nacheinander auf Selektionsmedium rekultiviert. Einerseits sollte das Wachstum überprüft

und andererseits die Anzahl unrelevanter cDNA-Plasmide in den Hefezellen für die nachfol-

gende Analytik reduziert werden. Anschließend wurde die Plasmid-DNA aus den Hefezellen

isoliert. Durch eine PCR mit dem pACT2 spezifischen Primerpaar wurde dann das cDNA-

Insert aller Klone amplifiziert und die Größe durch Agarosegelelektrophorese bestimmt.

Ähnlich große Fragmente wurden dann in einem weiteren Schritt mit einem häufig schnei-

denden Restriktionsenzym verdaut und in einem weiteren Elektrophoreseschritt analysiert,

Ergebnisse

um mögliche Dopplungen bei der Sequenzierung auszuschließen. Abschließend wurden die

Klone in dem E.coli Stamm DH5α amplifiziert, um ausreichend Material für die nachfolgende

Sequenzierung zu gewinnen. Nach Erhalt der Sequenzen wurden diese mittels BLAST (Ba-

sicLogicalAlignmentSearchTool)-Suche des European Bioinformatics Institute (EBI) mit Da-

tenbanken verglichen und in einem nächsten Schritt mit dem Program ClustalW (ebenfalls

EBI) Sequenzvergleiche ausgewertet. Bereits nach der Sequenzanalyse erkennbar falsch

positive Klone wurden durch Abgleich mit Datenbanken bekannter, falsch positiver Interakti-

onspartner ausgeschlossen (van Criekinge & Beyaert, 1999). Ebenso ausgeschlossen wur-

den Klone, die keine Protein-kodierenden Sequenzen enthielten. Auch der einheitliche Le-

serahmen von Gal4-DNA-AD mit dem jeweiligen Insert wurde geprüft und bei weiteren Un-

tersuchungen berücksichtigt, auch wenn bekannt ist, dass in Hefezellen translationelle Le-

serahmenverschiebungen auftreten können. Abschließend wurde der Hefestamm AH109

erneut mit den cDNAs der identifizierten Interaktionspartner transformiert, um danach eine

Verpaarung mit dem Hefestamm Y187 durchzuführen. Dieser lag neben dem bait-Vektor

auch mit verschiedenen Kontrollvektoren transformiert vor. So sollte die Interaktion der Klo-

ne mit Go2α

sowie die Spezifiät für diese Gα-Isoform überprüft werden.

Ergebnisse

Abbildung 20: Schematischer Ablauf des durchgeführten Yeast-two-hybrid-Screenings.

Eine ausführliche Beschreibung erfolgt im Text unter Punkt 5.7.1.

Ergebnisse

5.7.2 Vorbereitende Arbeiten

Zuerst wurde das Wachstum der beiden Hefestämme AH109 und Y187 auf Minimalmedien

jeweils ohne Tryptophan oder Leuzin (Vektormarker) bzw. Adenin oder Histidin (Reporter-

genmarker) überprüft. Bis auf den Stamm AH109, der auf Histidinmangelmedien ein leichtes

Hintergrundwachstum zeigte, wuchs keiner der beiden Stämme auf den Einzelselektions-

nährmedien. Um das Hintergrundwachstum zu verhindern, genügte es, dem Medium 1 mM

3-AT zuzusetzen.

Danach wurden beide Stämme mit den Vektoren pGBKT7Go2αWT, pGBKT7Go2αQ205L,

pGBKT7-lam und pGADT7T transformiert. Nach Wachstum auf den Selektionsmedien SD-

Trp bzw. SD-Leu wurden je 3ml-Flüssigkulturen angesetzt und nach 24 Stunden die Zellen

abzentrifugiert und das Hefegesamtprotein isoliert. Das Gesamtprotein wurde dann durch

SDS-PAGE aufgetrennt und auf Nitrozellulose geblottet. Die Proteine wurden dann mit anti-

Gal4-DNA-BD-Antikörper (Clontech) inkubiert (siehe Abbildung 21). Dabei zeigte sich, dass

in beiden Hefestämmen ein Fusionsprotein von ca. 62 kDa gebildet wird, das der erwarteten

Größe aus Go2α (40 kDa) und der Gal4-DNA-BD (22 kDa) entspricht. Auch für das Kon-

trollprotein Lamin C kann in beiden Hefestämmen die Expression eines ca. 40 kDa großen

Proteins beobachtet werden. Im Gegensatz dazu kann im Proteinextrakt aus Hefezellen, die

mit pGADT7T transformiert wurden und keine Gal4-DNA-BD enthalten, keine Proteinex-

pression nachgewiesen werden.

Für die Vervielfältigung der cDNA-Bibliothek musste zunächst der Titer der vorhanden

E.coli-Suspension bestimmt werden. Der Titer der verwendeten cDNA Bibliothek betrug

4,875 x 10

cfu / ml. Um die Anzahl unabhängiger Klone der cDNA-Bibliothek von 3,5 x 10

bei der Amplifikation aufrechtzuerhalten, wurde sicherheitshalber die dreifache Menge an

Klonen der cDNA-Bibliothek ausplattiert. Dazu wurden 215 µl der cDNA-Bibliothek à ca.

40000 cfu / 150 mm Medienplatte auf insgesamt 263 Medienplatten verteilt und für 48 h bei

30°C kultiviert. Abschließend wurden die Zellen in LB-Medium resuspendiert und von der

Hälfte der geernteten Zellen die Plasmid-DNA isoliert.

Ergebnisse

Abbildung 21: Western-Blot mit einem Anti-Gal4-DNA-BD Antikörper. Aufgetragen sind verschiedene

Hefeproteinaufarbeitungen der Stämme Y187 und AH109, die mit verschiedenen Kon-

troll- und bait-Vektoren transformiert sind.

Die Expression des Fusionsproteins aus Go2α-Untereinheit und Gal4-DNA-BD mit einer Größe von ca. 63 kDa

kann in beiden Hefestämmen nachgewiesen werden. Auch mit dem Kontrollvektor pGBKT7-lam transformierte

Zellen zeigen die Expression eines Fusionsproteins von ca. 40 kDa. Als Negativkontrolle konnte in Hefezellen,

die mit dem Fusionsprotein aus Gal4-Aktivierungsdomäne und dem SV40T-Antigen transformiert wurden, mit

dem Antikörper gegen die Gal4-DNA-BD kein Protein nachgewiesen werden.

5.7.3 Sequenzielle Transformation von bait- und prey-Vektoren

Bei der sequenziellen Transformation wurden die Hefezellen, nach Transformation des He-

festammes AH109 mit dem bait-Vektor (siehe 5.7.1), erneut kompetent zur DNA-Aufnahme

gemacht und mit der zuvor gewonnen cDNA der cDNA-Bibliothek transformiert. Um dabei

einerseits eine hohe Transformationsrate zu erzielen und gleichzeitig abschätzen zu kön-

nen, wie groß der Transformationsansatz gewählt werden muss, um eine größtmögliche

Anzahl an Klonen der cDNA-Bibliothek zu untersuchen, wurde zunächst eine Testtransfor-

mation mit verschiedenen Konzentrationen der cDNA-Bibliothek durchgeführt. Dabei stellte

sich nach Bestimmung der Transformationseffizienz auf SD-Leu-Trp-Medium heraus, dass

die Konzentration von 10 µg / Transformationsansatz am besten war. Die für Testzwecke

generierten Transformanten wurden neben der Bestimmung der Transformationseffizienz

unter stringentesten Bedingungen auf QDO-Medium ausplattiert und für 14 Tage bei 30°C

inkubiert. Gewachsene Kolonien wurden wie die, der nachfolgend beschriebenen Biblio-

theks-Durchmusterung behandelt. Nach der Optimierung der zu verwendenden cDNA-

Konzentration wurde eine sequenzielle Transformation (siehe Abbildung 22) im Biblio-

Ergebnisse

theksmaßstab durchgeführt. Dazu wurden 4 x 50 ml YPDA-Medium mittels einer Vorkultur

des bait-tragenden Hefestammes AH109 angezogen, kompetent für die DNA-Aufnahme

gemacht und bei einer Konzentration von 10 µg / 600 µl kompetenter Zellen mit der cDNA

transformiert. Die Transformanten wurden auf 100 150 mm QDO-Medienplatten verteilt und

gleichzeitig eine dekadische Verdünnungsreihe zur Bestimmung der Transformationseffi-

zienz und der Anzahl der durchgemusterten Klone auf SD-Leu-Trp-Medium angelegt. Nach

14-tägiger Inkubation bei 30°C waren 246 Kolonien g ewachsen, wobei insgesamt 3,24x10

Klone durchgemustert wurden. Gemeinsam mit der Testtransformation, bei der ca. 5x10

Klone durchgemustert wurden, entsprach die Anzahl der durchgemusterten Klone ungefähr

der Anzahl unabhängiger Klone der cDNA-Bibliothek. Der empfohlene Sicherheitsfaktor von

drei, um auch seltene Interaktionspartner sicher zu identifizieren und insgesamt 1,05 x 10

Klone durchmustern zu können, konnte vermutlich aufgrund ungünstigerer Transformati-

onsbedingungen nicht erreicht werden. Da jedoch unter den stringentesten Bedingungen

246 Klone zu analysieren waren, wurde von zusätzlichen Transformationen abgesehen.

Abbildung 22: Schematische Darstellung der Vorgehensweise bei der Durchführung der sequenziellen

Transformation.

Zu Beginn wurden 4x 200 ml YPDA-Medium mittels einer Vorkultur des mit dem bait-Vektor transformierten

Stammes AH109 auf 5x10

Zellen / ml eingestellt. Nach Erreichen der Zelldichte von 2x10

Zellen / ml wurden

die Hefezellen kompetent zur DNA-Aufnahme gemacht und mit der cDNA-Bibliothek, die im Vektor pACT2 vor-

lag, transformiert. Danach wurden die Hefezellen auf 100 QDO-Platten ausplattiert. Gleichzeitig wurden je 100 µl

einer dekadischen Verdünnungsreihe auf SD-Trp-Leu-Platten verteilt, um die Anzahl der durchgemusterten Klo-

ne zu bestimmen.

Nach 14 Tagen konnte das Wachstum von 246 Kolonien beobachtet werden, wobei 3,24 x 10

Klone untersucht

worden sind.

Ergebnisse

5.7.4 Charakterisierung der Interaktionspartner

Die 246 gewachsenen Klone wurden dann noch dreimal nacheinander auf QDO-Medium

reselektiert, um das Wachstum zu überprüfen. Zusätzlich sollten überzählig transformierte

Vektor-DNA der cDNA-Bibliothek in den gewachsenen Kolonien reduziert werden, um da-

durch die nachfolgende Charakterisierung der Interaktionspartner zu erleichtern. Da unter

den 246 gewachsenen Kolonien auch Dopplungen einzelner Klone auftraten und es zu auf-

wendig gewesen wäre, die cDNA von 246 Klonen zu sequenzieren und auszuwerten, wurde

die Anzahl der zu analysierenden Klone wie im Folgenden beschrieben und in Abbildung 23

dargestellt, reduziert. Zunächst wurde die komplette Vektor-DNA der Hefezellen isoliert und

das cDNA-Fragment durch pACT2-spezifische Primer amplifiziert. Auf diese Weise konnten

Rückschlüsse auf die Größe des enthaltenen cDNA-Fragments gezogen werden. Die cDNA-

Fragmentgröße aller 246 Klone wurde ermittelt und es wurden Gruppen von cDNA-

Fragmenten ähnlicher Größe gebildet, deren Identität in einem weiteren Restriktionsschritt

mit dem häufig schneidenden Restriktionsenzym, BsuRI, untersucht wurde. Abschließend

wurde der E. coli -Stamm DH5α jeweils mit allen einzigartigen Klonen (Größe, Fragment-

muster) transformiert und auf LB-Amp-Platten nach Klonen die den jeweiligen prey-Plasmid

enthalten, selektiert. Dadurch konnte die gewöhnlich in Hefen vorliegende niedrige Vektor-

zahl durch Vermehrung in E.coli erhöht werden, um nach der Isolation aus E.coli ausrei-

chend Material für eine Sequenzierung zur Verfügung zu haben. Abschließend wurden die

cDNA-Fragmente von 78 Klonen sequenziert.

Abbildung 23: Analyse der cDNA-Inserts der gewachsenen Klone zum Auffinden identischer Klone.

Die gewachsenen Klone wurden für die weitere Analytik in QDO-Medium angezogen. Anschließend wurde die

Plasmid-DNA isoliert. Durch Amplifikation der Insert-DNA mittels Polymerasekettenreaktion wurden die Klone

nach Fragmentgrößenbereichen sortiert. Durch anschließende Restriktion der PCR-Fragmente mit BsuRI, einem

häufig schneidenden Restriktionsenzym, konnten Klone mit gleichem Insert identifiziert werden. In der gewählten

Abbildung zeigen z.B. die Klone 1,2,4 und 5 eine ähnliche Fragmentgröße. Nach dem Verdau mit BsuRI können

die identischen Klone 1,2 und 4 identifiziert werden. Klon 5 weist ein anderes Bandenmuster auf.

5.7.4.1 Sequenzanalyse der identifizierten Interaktionspartner

Von den ermittelten Sequenzen wurden Regionen des Vektors und die Linkerregion entfernt

und mit dem Programm BLAST des EBI homologe Sequenzen identifiziert. Danach wurde in

Ergebnisse

Sequenzvergleichen mit dem Programm ClustalW überprüft, in welchen Bereichen die se-

quenzierten Klone mit den Sequenzen der Datenbank übereinstimmen. Nur wenn es sich

dabei um proteinkodierende Bereiche handelte, wurden die Klone als potentielle Interakti-

onspartner in Erwägung gezogen. Ebenso wurden Klone nicht weiter analysiert, von denen

aus Datenbanken bzw. Literatur (van Criekinge & Beyaert, 1999) bekannt war, in Y2H-

Durchmusterungen falsch positive Signale zu liefern. Darunter waren während der durchge-

führten Durchmusterung PCNA (proliferating cell nuclear antigen), Ribosomales Protein

L17, die mitochondrial kodierten Proteine ATPsynthase Protein 6, Ubiquinol Cytochrom C

Reduktase und Propionyl-CoA-Carboxylase. Abschließend wurde überprüft, ob der Lese-

rahmen der identifizierten Interaktionspartner in der richtigen Abfolge zur Gal4-DNA-AD vor-

lag. Leserahmenverschiebungen zwischen beiden Domänen konnten als Hinweis darauf

herangezogen werden, dass der Interaktionspartner möglicherweise ein falsch positives

Signal liefert. Allerdings ist von Hefen auch bekannt, dass sie translationale Leserahmen-

verschiebungen zulassen. Daher wurden diese Klone nicht aussortiert. Eine Liste der identi-

fizierten Interaktionspartner zeigt Tabelle 1. Neben der Bezeichnung der identifizierten In-

teraktionspartner sind dort zusätzlich der Genname, die Uniprot-Zugangsnummer, die Län-

ge der Proteinsequenz, falls möglich die Länge der vom Klon kodierten Sequenz, mit etwai-

gen zusätzlichen Aminosäuren, angegeben.

Ergebnisse

Tabelle 1: Ergebnis der Sequenzierung der Plasmid-DNA aus den untersuchten Klonen des Yeast-

two-hybrid-Screenings.

Angegeben sind der Name der jeweiligen Proteine sowie etwaige abweichende Bezeichnungen. Für jedes Prote-

in ist die Uniprot-Zugangsnummer sowie die Länge der zugehörigen Proteinsequenz angegeben. Unter Sequen-

zen ist die tatsächlich kodierte Aminosäuresequenz aller Klone eines Proteins mit exakter Positionsangabe ver-

zeichnet (fettgedruckt). Etwaige zusätzliche Aminosäuren sind angegeben.

Nicht fettgedruckte Kandidatenproteine stellten sich in späteren Tests als falsch positiv heraus.

5.7.5 Überprüfung der Spezifität der Interaktionspartner

Um einerseits die Interaktion der identifizierten prey-Proteine mit dem Fusionsprotein Gal4-

DNA-BD-GO2QL zu kontrollieren, und darüber hinaus die Spezifität für Go2α gegenüber

anderen Gα-Untereinheiten zu testen, wurden verschiedene Hefeverpaarungen der unter-

schiedlich transformierten Stämme AH109 und Y187 durchgeführt. Die während der Durch-

musterung identifizierten potentiellen Interaktionspartner wurden genutzt, um den Hefe-

stamm AH 109 zu transformieren, wodurch sichergestellt ist, dass wirklich nur der jeweilige

prey-Vektor in den jeweiligen Transformanten vorliegt. Der Stamm Y187 wurde mit den Vek-

toren transformiert, die für konstitutiv aktives Go2α (pGBKT7Go2αQ205L), konstitutiv akti-

ves Go1α (pGBKT7Go1αQ205L), konstitutiv aktives Gqα (pGBKT7GqαQ209L), humanes

Lamin C (pGBKT7laminC) bzw. die unveränderte Gal4-DNA-bindende Domäne (pGBKT7)

kodieren. Alle Interaktionspartner in AH109 wurden mit jedem der Kontrollvektoren in Y187

verpaart und die diploiden Zellen auf SD-Leu-Trp angezogen. Anschließend wurden die

diploiden Zellen auf QDO-Selektionsmedium überführt. Nach sieben bzw. 14 Tagen wurde

das Wachstum überprüft. Zu Kontrollzwecken wurde AH109 mit dem Vektor pGADT7T und

Y187 mit den Vektoren pGBKT7-p53 bzw. pGBKT7-laminC transformiert. Bei der Verpaa-

rung dieser Kontrollvektoren war - wie zu erwarten - Wachstum bei diploiden Zellen zu er-

kennen, die mit Vektoren für die Fusionsproteine von p53 und SV40-T-Antigen ausgestattet

waren. Gleichzeitig war kein Wachstum bei der Kombination der Fusionsproteine von Lamin

C und p53 zu erkennen.

Für die Fusionsproteine der Interaktionspartner mit den verschiedenen Kontrollproteinen

konnten folgende Beobachtungen, die auch in Abbilung 24 dargestellt sind, gemacht wer-

den. Für die Proteine Synaptotagmin XI und c-erb-α3 konnte mit keinem der eingesetzten

Kontrollvektoren, auch nicht mit pGBKT7Go2αQ205L, Wachstum auf QDO-Medium beob-

achtet werden, was auf eine falsch positiv angezeigte Interaktion hinweist.

Ergebnisse

Abbildung 24: Kontrollexperimente zur Bestätigung der Interaktion mit konstitutiv aktivem Go2α

αα

α mit-

tels Hefeverpaarung. Gleichzeitig wurde getestet, ob die im Screening identifizierten

Klone auch mit der konstitutiv aktiven Go1α

αα

α Isoform oder mit konstitutiv aktivem Gqα

αα

interagieren.

Ergebnisse

Der Hefestamm AH109 wurde mit der isolierten Plasmid-DNA aus Kandidatenklonen bzw. Kontroll-DNA

(pGADT7-T) transformiert und auf SD-Leu ausplattiert. Die gewachsenen Kolonien wurden mit dem unterschied-

lichen Plasmiden tragenden Stamm Y187 verpaart. Die verschiedenen Y187-Klone für die Verpaarung mit Kon-

troll-DNA enthielten pGBKT7-p53 oder pGBKT7-laminC. Für die Kandidatenklone erfolgte eine Verpaarung mit

Y187-Zellen, die entweder mit Plasmiden der Fusionsproteine aus Gal4-DNA-BD mit konstitutiv aktiven Gα-

Untereinheiten (Go2α, Go1α, Gqα) oder mit den Kontrollvektoren pGBKT7 bzw. pGBKT/-laminC transformiert

waren. Die verpaarten Hefezellen (A-G) werden dann auf SD-Leu-Trp kultiviert und danach das Wachstum auf

QDO+3AT+Xα-Gal getestet.

Wie erwartet, zeigten verpaarte Zellen mit dem p53-Fusionsprotein und dem SV40-T-Antigen-Fusionsprotein

Wachstum auf QDO-Medium und eine deutliche Blaufärbung des Nährmediums (F), wohingegen verpaarte Zel-

len mit SV40-T-Antigen-Fusionsprotein und Lamin-C-Fusionsprotein kein Wachstum zeigen(G).

Für die Plasmide der Kandidatenklone konnten fünf verschiedene Wachstumsschemata beobachtet werden:

1. kein Wachstum bei A, B, C, D oder E; die Klone konnten als falsch positiv aussortiert werden

2. Wachstum nur von A; diese Klone lassen auf eine alleinige Interaktion des Proteins mit der konstitutiv

aktiven Isoform Go2α schließen

3. Wachstum von A und B; diese Klone interagieren offensichtlich mit beiden Goα-Isoformen aber nicht

mit Gqα

4. Wachstum von A, B und C; diese Klone interagieren sowohl mit beiden Goα-Isoformen und Gqα

5. Wachstum auf D oder E; diese Klone zeigen auch Wachstum mit den Kontrollvektoren und sind deshalb

ebenfalls als falsch positiv auszusortieren

6. eine Sonderstellung nehmen Rap1Gap und Girdin ein, da bereits nach 7 Tagen starkes Wachstum von

A zu erkennen war und erst nach 14 Tagen auch Wachstum von B beobachtet werden konnte; das lässt

auf eine stärkere Interaktion mit Go2α als mit Go1α schließen

Für die Proteine Fabp3, Pcbp1 und Ubp1 konnte auch Wachstum mit den Kontrollproteinen

Lamin C und der Gal4-DNA-bindenden Domäne allein beobachtet werden. Diese Proteine

scheinen die Reportergene daher unspezifisch zu aktivieren.

Das Protein Synembryn zeigt Wachstum mit den konstitutiv aktiven Goα- und Gqα-

Untereinheiten und ist somit nicht für Goα spezifisch. Der größte Teil der identifizierten

Go2α-Interaktionspartner zeigt ebenfalls Wachstum mit Go1α, darunter Armcx1, die identifi-

zierten RGS-Proteine, GPSM1 und 2, Tnfaip8 und das Apolipoprotein A1-ähnliche Protein.

Die einzigen Proteine, die spezifisch nur mit Go2α wechselwirken, sind Pcp2, Eya4 und das

Protein KIAA1045. Eine Sonderstellung nehmen Rap1Gap sowie Girdin ein, die bereits

nach einer Woche starkes Wachstum mit dem Go2α-Fusionsprotein aufwiesen. Nach zwei

Wochen zeigten sich für beide Proteine auch vereinzelte Kolonien nach Verpaarung mit

dem Stamm Y187, der mit dem Go1α-Fusionsprotein transformiert war. Dadurch kann man

auf eine stärkere Interaktion mit konstitutiv aktivem Go2α als mit konstitutiv aktivem Go1α

schließen.

Diskussion

6 Diskussion

Im Rahmen dieser Arbeit wurden Funktion und Bedeutung von Teilen eines Signaltransduk-

tionsprozesses untersucht, der entscheidenden Einfluss auf die Menge an in synaptischen

Vesikeln gespeicherten Monoaminen hat. Da die Freisetzung der gespeicherten Monoamine

infolge eines Aktionspotentials unabhängig vom Füllungszustand erfolgt, d.h. leere und ge-

füllte Vesikel mit gleicher Wahrscheinlichkeit mit der Plasmamembran fusionieren können

(van der Kloot et al., 2000), kann über eine variable Füllung der Vesikel die postsynaptische

Antwort moduliert werden. Das ist insbesondere deshalb möglich, weil durch einzelne Exo-

zytoseprozesse nicht alle postsynaptischen Rezeptoren gesättigt werden. Da die Monoami-

ne zumeist über metabotrope Rezeptoren an vielen verschiedenen Zielzellen wirken und

nicht auf die postsynaptische Membran einer Zielzelle beschränkt sind, gewinnt diese Modu-

lation der Transmitterfreisetzung im ZNS zusätzlich an Bedeutung. Das ist insbesondere

wichtig, weil Monoamine an vielfältigen Gehirnfunktionen, wie der Steuerung von Bewegun-

gen, Motivation, Emotionen, Gedächtnis sowie Aufmerksamkeit beteiligt sind (siehe 3.4.1).

Untersuchungen an neuroendokrinen Zellen (Ahnert-Hilger et al., 1998; Höltje et al., 2000),

permeabilisierten Thrombozyten (Höltje et al., 2003) und transfizierten CHO-Zellen (Brunk et

al., 2006) belegen, dass die Verminderung des vesikulären Monoamintransports durch hete-

rotrimere G-Proteine ein häufiges Prinzip ist und in allen VMAT exprimierenden Zellen beo-

bachtet werden kann. Neben Gehirnfunktionen werden durch dieses Regulationsprinzip da-

her auch weitere wichtige Körperfunktionen, wie z.B., die endokrine Hormonfreisetzung aus

der Nebenniere, beeinflusst.

Einen Schwerpunkt dieser Arbeit bildete die Untersuchung, welche Strukturen der vesikulä-

ren Neurotransmittertransporter für die G-Protein vermittelte Regulation von Bedeutung

sind. Hierzu wurden bereits einige Vorarbeiten geleistet. Deren Resultate werden deshalb

unter 6.2 gemeinsam mit den Ergebnissen dieser Arbeit dargestellt. Im Anschluss wird die

Untersuchung in der Literatur beschriebener Einflussfaktoren der vesikulären Neurotrans-

mitterspeicherung im Hinblick auf die Beteiligung an der Regulation durch Go2α diskutiert.

Danach werden Untersuchungen zu Dopaminspeicherung und -metabolismus in Zellen, in

denen die Go2α-Untereinheit inaktiviert wurde, und in Go2α-Deletionsmutanten der Maus

analysiert. Den Schlusspunkt bildet die Identifizierung nachgeschalteter Zielproteine von

Go2α mittels Y2H-Screening. Go2α reguliert die VMAT im ZNS und in neuroendokrinen

Zellen und kann darüber hinaus den Dopaminstoffwechsel beeinflussen. Über welche nach-

geschalteten Effektoren von Go2α diese Regulation bzw. Beeinflussung erfolgen könnte, ist

bisher nicht bekannt. Prinzipielle durch Go2α veränderbare Einflussgrößen der vesikulären

Monoaminspeicherung werden unter Punkt 6.1 dargestellt.

Diskussion

6.1 Faktoren die den vesikulären Neurotransmittertransport

beeinflussen

Alle im Folgenden aufgeführten Parameter können die vesikuläre Neurotransmitteraufnah-

me beeinflussen. Sie kommen daher als Regelgrößen in Frage, die durch Go2α-vermittelte

Signalkaskaden moduliert werden können. Neben den Parametern, die den vesikulären

Monoamintransport erhöhen, zählen dazu unter in vivo-Bedingungen auch alle Prozesse,

die die intrazelluläre Monoaminkonzentration beeinflussen. Bei der in vitro-Untersuchung

von Transportprozessen in permeabilisierten Zellen und an Vesikeln sind diese die Mono-

aminkonzentration beeinflussenden Faktoren zu vernachlässigen.

In jedem Fall von Bedeutung ist die Triebkraft für den Neurotransmittertransport in synapti-

sche Vesikel - der Protonengradient über die Vesikelmembran. Dieser wird durch die vakuo-

läre H

-ATPase (v-ATPase) generiert, die strukturell und funktionell mit der mitochondrialen

F0/F1-ATPase verwandt ist. Im Gegensatz zur F0/F1-ATPase nutzt die v-ATPase die Hyd-

rolyse von ATP, um Protonen in das Vesikellumen zu pumpen. Der Protonengradient über

die Vesikelmembran hat einerseits einen pH-Gradienten (∆pH) und andererseits einen elek-

trischen Gradienten (∆Ψ) zur Folge, die gemeinsam zum elektrochemischen Gradienten

∆µH+ zusammengefasst werden. Die direkte Regulation der v-ATPase in Säugern ist bisher

nicht untersucht. Dafür liegen zahlreiche Informationen vor, dass vor allem Chloridionen zu

einer sekundären Aktivierung der vATPase führen können. Durch Cl

-Transport in die Vesi-

kel wird ∆Ψ

vermindert, wodurch die vATPase mehr Protonen in das Vesikellumen pumpen

kann. Dadurch ist es gleichzeitig möglich, ∆pH und ∆Ψ unabhängig voneinander zu regulie-

ren. Die VMAT transportieren Monoamine im Austausch gegen zwei Protonen in das Vesi-

kellumen. Da die Monoamine in protonierter Form transportiert werden, ergibt sich eine stär-

kere Abhängigkeit von ∆pH gegenüber ∆Ψ. Neben der Aktivität der v-ATPase kann somit

auch die intraluminale Chloridkonzentration die Monoaminspeicherung im Vesikel durch die

Modulation von ∆µH+ beeinflussen.

Neben der Regulation des elektrochemischen Gradienten kann auch die Aktivität der VMAT

selbst zu einer veränderten Monoaminspeicherung führen, wie mit der Überexpression der

VMAT gezeigt werden konnte (Pothos et al., 2000). Zusätzlich sind dabei auch weitere

posttranslationale Modifizierungen der VMAT, die deren Aktivität ändern, denkbar.

Neben den zuvor genannten Faktoren, die ausnahmslos den Transport in die Vesikel modi-

fizieren, kann auch der unspezifische Verlust an Monoaminen aus dem Vesikellumen die

Neurotransmitterspeicherung beeinflussen (Eisenhofer et al., 2004). Insbesondere die Lipid-

zusammensetzung und der Proteingehalt der Vesikelmembran könnten durch Veränderung

der Membranpermeabilität dazu beitragen.

Diskussion

Ein bedeutender in vivo regulierter Parameter ist die zytoplasmatische Monoaminkonzentra-

tion, die durch den Plasmamembrantransport sowie synthetisierende und abbauende Stoff-

wechselwege beeinflusst wird.

Abbildung 25: Schema der Faktoren, die die vesikuläre Monoaminspeicherung maßgeblich beeinflus-

sen und daher Zielstrukturen der Go2α

αα

α-vermittelten Signaltransduktion sein können.

Zu diesen Faktoren zählen einerseits alle Mechanismen, die die zytoplasmatische Monoaminkonzentration ver-

ändern, andererseits alle Mechanismen, die den Transport und die Speicherung von Monoaminen im Vesikel

beeinflussen.

Die zytoplasmatische Monoaminkonzentration wird einerseits durch die Wiederaufnahme extrazellulärer Mono-

amine im Kotransport von Natrium- und Chloridionen über verschiedene Plasmamembrantransporter erhöht.

Zusätzlich erhöht die Biosynthese der Monoamine die zytosolische Monoaminkonzentration. Dafür sind in dem

Schema stellvertretend die Schlüsselenzyme der verschiedenen Biosynthesewege angegeben (TH: Tyrosin-

hydroxylase; TPH: Tryptophanhydroxylase; HDC: Histidindecarboxylase). Gleichzeitig kann die zytoplasmatische

Monoaminkonzentration durch abbauende Biosynthesewege, die über die Monoaminooxidasen (MAO) verlau-

fen, vermindert werden.

Zu den Faktoren, die den vesikulären Monoamintransport und die Monoaminspeicherung beeinflussen, zählen

zunächst alle Parameter, die die Triebkraft des Neurotransmittertransports - den elektrochemischen Gradienten

über die Vesikelmembran (∆µH+) - verändern. Dazu zählt primär die v-ATPase, durch deren Aktivität der Proto-

nengradient über die Vesikelmembran hergestellt wird. Sekundär kann dieser Protonengradient auch durch

Transport von Cl

in das Vesikellumen moduliert werden. Durch Verminderung von ∆Ψ können dadurch mehr

Protonen in das Vesikellumen gepumpt und ein höherer ∆pH erreicht werden. Zusätzlich kann auch die direkte

Beeinflussung des VMAT die transportierte bzw. gespeicherte Monoaminmenge verändern. Neben den Trans-

portprozessen, die Monoamine in das Vesikellumen überführen, können auch Variationen unspezifischer Verlus-

te über die Vesikelmembran (gepunkteter Pfeil) die vesikuläre Monoaminmenge verändern. Ein denkbarer Pa-

rameter hierfür ist die Membranpermeabilität, die durch Faktoren, wie z.B. Lipidzusammensetzung oder Protein-

gehalt, moduliert werden könnte.

MA: Monoamin; +: Erhöhung; -: Verminderung; ClC: Chloridkanal; VMAT: vesikulärer Monoamintransporter

Diskussion

6.2 Domänen der VMAT sind an der Regulation der Monoamin-

speicherung durch Go2α

αα

α beteiligt

Untersuchungen an permeabilisierten Thrombozyten von Tryptophanhydroxylase-1-

Deletionsmutanten der Maus (Walther et al., 2003; Höltje et al., 2003) führten zu der grund-

legenden Idee, dass die vesikulären Monoamintransporter selbst an der Signaltransduktion,

die den vesikulären Füllungszustand reguliert, als vorgeschaltete Rezeptorstruktur beteiligt

sind. Untersuchungen an mit VMAT1 bzw. VMAT2 transfizierten und permeabilisierten

CHO-Zellen stützen dabei die zuvor gemachten Beobachtungen (Brunk et al., 2006). Der

Vorteil dieser beiden „vereinfachten“ Modellsysteme ist, dass sie erlauben, die Neurotrans-

mitteraufnahme und deren Regulation an quasi leeren Vesikeln zu untersuchen. Vorausset-

zung dabei ist die Permeabilisierung der Plasmamembran, wodurch Beeinflussungen der

Transportprozesse durch Plasmamembrantransporter ausgeschlossen werden können.

Die Tryptophanhydroxylase-1 (Tph1) ist das Schlüsselenzym der Serotoninsynthese aus-

serhalb des ZNS. Das extraneuronale Serotonin wird zu einem Großteil in den vesikulären

Strukturen der Thrombozyten gespeichert. Fehlt die Tph1, sind nur noch 6% der Menge des

Serotonins gegenüber Wildtypthrombozyten nachweisbar, wobei andere Monoamine ver-

nachlässigt werden können (Höltje et al., 2003). In Untersuchungen an diesen leeren

Thrombozyten stellte sich heraus, dass die durch G-Proteinaktivierung verursachte Vermin-

derung der Neurotransmitterspeicherung in permeabilisierten, leeren Vesikeln fehlt, aber

durch Vorbeladung mit Serotonin bzw. Noradrenalin wieder hergestellt werden kann. Dies

war der erste Hinweis darauf, dass die Füllung des Vesikels mit Monoaminen das auslösen-

de Signal der G-Protein-vermittelten Signaltransduktion am Vesikel ist (Höltje et al., 2003).

Unbekannt war aber, welcher, ins vesikuläre Lumen ragende Rezeptor, dafür verantwortlich

war.

Untersuchungen an permeabilisierten CHO-Zellen die mit VMAT1 bzw. VMAT2 transfiziert

wurden, unterstützen die zuvor beschriebenen Beobachtungen. Wie die „leeren“ Thrombo-

zyten der Tph1-Deletionsmutanten stellen CHO-Zellen ein monoaminfreies System dar, zu-

sätzlich fehlen die Transporter der Plasmamembran und die VMAT. Auch in VMAT-CHO-

Zellen kann die G-Protein-vermittelte Hemmung der Monoaminspeicherung durch Vorbela-

dung mit Monoaminen, die allerdings erst nach einer Permeabilisierung der Plasma-

membran erfolgen konnte, induziert werden (Brunk et al., 2006). Dafür sind, vermutlich auf-

grund der Lokalisation der VMAT auf - gegenüber sekretorischen Vesikeln - größeren intra-

zellulären Kompartimenten (Liu et al., 1997), höhere Konzentrationen an Monoaminen von

300 µM - 1 mM nötig. Da der VMAT ein breites Substratspektrum besitzt, kann die G-

Protein-vermittelte Regulation durch Vorbeladung mit jeglichem Monoamin erfolgen. Über-

raschenderweise bildet Adrenalin hierbei eine Ausnahme. Obwohl Adrenalin ein Substrat für

beide VMAT-Isoformen ist, kann es nur in VMAT1-transfizierten CHO-Zellen eine G-Protein-

Diskussion

vermittelte Regulation auslösen. Darüber hinaus hebt Adrenalin in allen VMAT2-

Modellsystemen, VMAT2-CHO-Zellen, Thrombozyten der Ratte und in synaptischen Vesi-

kelpräparationen eine durch andere Monoamine ausgelöste G-Protein vermittelte Verminde-

rung des Monoamintransports wieder auf (Brunk et al., 2006). Diese Experimente in CHO-

Zellen bestätigen, dass die Füllung vesikulärer Strukturen die Voraussetzung der Regulation

des Monoamintransports durch G-Proteine ist. Sie lassen erstmals den Schluss zu, dass die

VMAT selbst an dieser Regulation beteiligt sind. Wie bereits mehrfach erwähnt wurde, sind

CHO-Zellen ein komplett monoaminfreies System. Deshalb ist es unwahrscheinlich, dass

zelleigene monoaminsensitive Rezeptoren an der Auslösung und Weiterleitung beteiligt

sind. Geht man von einer Beteiligung der VMAT am Regulationsprinzip aus, lässt sich zu-

sätzlich feststellen, dass die beteiligten Strukturen für die beiden Isoformen verschieden

sind, wie die unterschiedliche Wirkung von Adrenalin zeigt.

In nachfolgenden Experimenten wurden die rezeptorartigen Strukturen von VMAT1 und

VMAT2 genauer charakterisiert. Durch den Einsatz verschiedener Agonisten und Antagonis-

ten in den verschiedenen Modellsystemen (siehe 5.1) konnte für den VMAT2 gezeigt wer-

den, dass 5HT1B-Rezeptoragonisten und -antagonisten in der Lage sind, die G-Protein-

vermittelte Hemmung zu induzieren bzw. zu blockieren (Brunk et al., 2006). Im Gegensatz

dazu sind 5HT1B-Agonisten und Antagonisten in VMAT1-Systemen wirkungslos. So kann

der 5HT1B-Rezeptoragonist Anpirtolin in CHO-VMAT2-Zellen eine G-Protein-vermittelte

Regulation der Neurotransmitteraufnahme induzieren, nicht aber in CHO-VMAT1-Zellen

(Brunk et al., 2006). In CHO-VMAT1-Zellen scheint eine α1-rezeptorartige Struktur als aus-

lösendes Signal der G-Proteinregulation verantwortlich zu sein, wie in Experimenten mit

dem α1-Rezeptoragonist Cirazolin gezeigt werden konnte (Brunk et al., 2006). Diese Beo-

bachtungen für den VMAT1 werden durch Teile dieser Arbeit unterstützt. So kann in per-

meabilisierten PC12-Zellen, die ausschließlich den VMAT1 exprimieren, durch den Einsatz

des α1-Rezeptorantagonisten Prazosin, nicht aber durch den 5HT1B-Rezeptorantagonisten

Isamoltan, die G-Protein vermittelte Hemmung nahezu vollständig aufgehoben werden. Die-

se Ergebnisse unterstützen die Beobachtung, dass sich die vesikulären Rezeptorstrukturen

für VMAT1 und VMAT2 unterscheiden. Aufgrund der Gültigkeit in allen VMAT1- bzw.

VMAT2-Systemen unterstützen diese Ergebnisse ein weiteres Mal, dass die VMAT selbst

an der Regulation des vesikulären Füllungszustandes beteiligt sind. Sowohl in Thrombozy-

ten als auch in CHO-Zellen konnten bisher keine 5HT1B-Rezeptoren nachgewiesen werden

(Walther et al., 2003; Pullarkat et al., 1998), wodurch die Beteiligung zelleigener, klassischer

heptahelikaler Rezeptoren zusätzlich unwahrscheinlich wird.

Unter der Einbeziehung der zuvor beschriebenen Ergebnisse, dass beide VMAT eine rezep-

torähnliche Struktur besitzen, die in beiden Isoformen verschieden ist, sollte festgestellt

Diskussion

werden, welche in das Vesikellumen ragenden Regionen der VMAT daran beteiligt sein

könnten. In der Literatur sind bereits zahlreiche Beispiele für funktionell relevante Aminosäu-

ren und Bereiche der VMAT beschrieben. Für die Substraterkennung des VMAT2 wichtige

Regionen sind die Bereiche der Transmembrandomänen III-IV, V-VIII sowie IX-XII, wobei

zusätzlich N-terminale Regionen die Substrataffinität beeinflussen können (Peter et al.,

1996). Innerhalb der Transmembrandomänen wurden zahlreiche Aminosäuren mit gelade-

nen Seitenketten charakterisiert, die essentiell für Substratbindung und Transport sind. So

verursachen Mutationen der Aminosäuren Lysin (K139) in TMDII, Aspartat (D33, D427,

D461) in den Transmembrandomänen I, X und XI eine Verringerung der Substrataffinität

bzw. beeinflussen den Monoamintransport (Merickel et al., 1995a; Peter et al., 1996, Meri-

ckel et al., 1997). Darüber hinaus ist bekannt, dass die Mutation der Serinreste S180-S182

(Ende TMDIII) zu Alanin den Serotonin und Histamintransport blockiert (Merickel et al,

1995b). Auch der Prolinrest P237 (TMD V; Finn 3rd & Edwards, 1998), Tyrosin an Position

434 (TMD XI; Peter et al., 1996) und Phenylalanin an Position 464 (TMD XII, Finn 3rd &

Edwards 1997) beeinflussen entscheidend die Substraterkennung und den Transport des

VMAT2. Neben den Aminosäuren der Transmembranregionen konnten auch in den lumina-

len und zytoplasmatischen Schleifenregionen bedeutende Aminosäuren identifiziert werden,

die den Transport oder die Substrataffinität beeinflussen. Dazu gehören die Aminosäuren

A315 (Schleife VII/VIII Finn 3rd & Edwards, 1998), K328 (Schleife VII/VIII), A440 und K446

(TMD XI/XII; Finn 3rd & Edwards, 1997).

Abbildung 26: Bereiche des VMAT2, die für den Monoamintransport von Bedeutung sind.

Dargestellt ist die Topologie des rVMAT2. Die schwarzgefüllten und viereckigen Aminosäuren gehören zu Berei-

chen des VMAT2, die einen Einfluss auf den Monoamintransport haben. Für rot markierte Aminosäuren konnte

durch ortsspezifische Mutagenese eine entscheidende Bedeutung für Monoamintransport und -erkennung durch

den VMAT2 gezeigt werden. Für Literaturangaben und Erläuterungen siehe Text (4.2).

Auf diesen Informationen basierend, erschien es nicht sinnvoll, Regionen der intraluminalen

Regionen der Schleifen VII/VIII und XI/XII zu substituieren. Das Hauptaugenmerk richtete

sich aus mehreren Gründen auf die große intravesikuläre Schleife zwischen den Trans-

Diskussion

membrandomänen I und II. Einerseits handelt es sich um einen Bereich, in dem sich

VMAT1 und VMAT2 - zwischen denen eine Sequenzhomologie zu 62% besteht -, beson-

ders unterscheiden. Dadurch könnte das unterschiedliche pharmakologische Verhalten der

beiden Transporter erklärt werden. Andererseits handelt es sich um einen ausgeprägten

luminalen Bereich des VMAT2, für den zum Zeitpunkt der Überlegungen noch keine Struk-

tur-Funktionsbeziehungen vorlagen, und dessen Bedeutung unklar war. Neuere Untersu-

chungen schildern eine Bedeutung dieser Schleife bzw. deren Glykosylierungsstellen bei

der Sortierung des VMAT innerhalb verschiedener Membrankompartimente in PC12-Zellen

(Yao & Hersh, 2007). Wie die intraluminalen Glykosylierungsstellen die Sortierung, die ja

eher über zytoplasmatisch orientierte Motive reguliert wird, wie z.B. das C-terminale Isoleu-

zin-Leuzinmotiv des VMAT2 (Tan et al., 1998), beeinflussen, bleibt dabei aber ungeklärt.

Allerdings unterstützt diese Hypothese die nachfolgend beschriebenen Beobachtungen ei-

ner Signaltransduktion aus dem Vesikellumen. Die Signaltransduktion aus luminalen Struk-

turen ist bereits beschrieben worden. Ein bekanntes Beispiel für derartige Signaltransdukti-

onsmechanismen ist der KDEL-Rezeptor, der für die Retention luminaler Proteine mit KDEL-

Sequenz im endoplasmatischen Retikulum verantwortlich ist (Scheel & Pelham, 1998).

Unsere Untersuchungen an den VMAT2-Mutanten der Schleife zwischen den Trans-

membrandomänen I/II in CHO-Zellen, VMAT2∆P42-V130 bzw. VMAT2∆Q61-T113 belegen,

dass diese Bereiche des VMAT2 für den Neurotransmittertransport von Serotonin nicht be-

nötigt werden. Sie sind ein erster Hinweis darauf, dass diese Bereiche regulatorische Funk-

tionen besitzen. Nachfolgende Experimente an permeabilisierten CHO-Zellen dieser VMAT-

Konstrukte zeigen, dass die Schleife zwischen TMDI/II - und somit der VMAT2 selbst - an

der Regulation des Monoamintransports in die Vesikel beteiligt ist. Diese Beobachtung

stützt die Theorie, dass das Vesikel unter Beteiligung des VMAT2 selbst in der Lage ist,

seinen Neurotransmittergehalt über die Aktivierung vesikelassoziierter heterotrimerer G-

Proteine zu regulieren. Die gewonnen Daten belegen nicht nur, dass der VMAT2 neben sei-

ner Transporterfunktion auch rezeptorartige Anteile besitzt, sondern sind auch ein Beispiel

dafür, dass Signaltransduktionswege auf der luminalen Seite von Endomembransystemen

initiiert werden können.

Die für alle VMAT2-Konstrukte beobachteten K

-Werte weichen teilweise um zwei Zehner-

potenzen von den in der Literatur beschriebenen K

-Werten ab (Peter et al., 1994). Das

wird vermutlich durch unterschiedliche Versuchsbedingungen, insbesondere die Tempera-

tur, hervorgerufen. Im Vergleich zu den CHO-Zellen, die mit dem Wildtyp-VMAT2 transfiziert

wurden, zeigen sich dagegen vergleichbare K

und V

max

-Werte, wodurch eine verlässliche

Basis für die ermittelten Daten besteht. Die vergleichbaren V

max

von Wildtyp-VMAT2 und

VMAT2∆P42-V130 bzw. VMAT2∆Q61-T113, bestätigen nicht nur eine vergleichbare Sero-

tonintransportrate, sondern auch vergleichbare Proteinexpressionsraten in den stabil trans-

Diskussion

fizierten CHO-Zelllinien zusätzlich zur Proteinexpressionskontrolle mittels Immunfluores-

zenzfärbung des VMAT2.

Die Experimente mit VMAT1 und VMAT1∆H62-V117 transfizierten CHO-Zellen unterstützen

die Beobachtungen, die zuvor für den VMAT2 gemacht wurden. Die Deletion von Bereichen

der ersten intraluminalen Domäne führt auch beim VMAT1 zu einer Verminderung der G-

Protein-vermittelten Inhibition des Neurotransmittertransports. Im Gegensatz zum VMAT2

führt die Deletion des zentralen Bereiches der ersten intravesikulären Schleife beim VMAT1

nur zu einer partiellen Aufhebung der G-Protein-vermittelten Hemmung. Die Ursache dafür

könnte eine nur teilweise Deletion der Rezeptorstruktur sein. Allerdings erwies sich die

Transfektion von CHO-Zellen mit dem VMAT1 insgesamt schwieriger als mit dem VMAT2.

Die hergestellten VMAT1∆H62-V117-Zellen wiesen gegenüber dem VMAT1-Wildtyp eine

stark verminderte Serotoninaufnahme auf. Für VMAT1-Konstrukte mit kompletter Schleifen-

deletion war es leider nicht möglich, stabil transfizierte und funktionelle Zellklone herzustel-

len. Beide Beobachtungen deuten auf eine reduzierte Expression, veränderte Sortierung

oder verminderte Transporteigenschaften der modifizierten Transportermoleküle hin. Die

Beobachtung einer verminderten G-Proteinhemmung der Serotoninaufnahme nach Deletio-

nen der ersten intraluminalen Schleife beim VMAT1 bedarf daher zusätzlicher Überprüfung.

Unter der Voraussetzung, dass der VMAT2, ähnlich G-Protein-gekoppelten Rezeptoren der

Plasmamembran, intravesikuläre Signale ins Zyoplasma leitet, sollten sich auch auf der zy-

toplasmatischen Seite Bereiche befinden, die an der Signaltransduktion beteiligt sind. Die

Untersuchungen hierzu erbrachten jedoch nur unbefriedigende Ergebnisse. Deletionen in C-

terminalen Bereichen, wie bei den Mutanten VMAT2∆R472-D515, denen der unmittelbare

C-Terminus fehlt, als auch VMAT2∆R472-Y504, dem mittlere Anteile des C-Terminus feh-

len, führen nicht zu einem Funktionsverlust des VMAT2. Allerdings kann auch in diesen

VMAT2-Mutanten, wie auch bei mit Wildtyp-VMAT2 transfizierten CHO-Zellen, nach Vorbe-

ladung mit Monoaminen eine G-Protein-vermittelte Verminderung des Monoamintransports

beobachtet werden. Die Beteiligung an einer Signaltransduktion aus dem Vesikellumen, die

zur Aktivierung von Go2α führt, ist daher für den VMAT2 C-Terminus unwahrscheinlich. Ein

weiterer Bereich des VMAT2, der in dieser Arbeit untersucht wurde, ist die zytoplasmatische

Schleife zwischen den Transmembrandomänen VI und VII. Die Schleife wurde komplett

gegen 5 Glyzinreste ausgetauscht. Trotz mehrfacher Versuche, funktionelle, stabil transfi-

zierte Zelllinien zu generieren, zeigten die klonierten Zelllinien zwar eine Expression der

mutierten Transportermoleküle, aber keine Transportaktivität. Da bekannt ist, dass die

Transmembrandomänen V-VIII bedeutenden Anteil an der Substraterkennung und dem

Transport haben (Peter et al., 1996) ist es möglich, dass diese Schleife essentiell für Sub-

straterkennung und Transport ist, oder aber durch den Austausch gegen 5 Glyzinreste die

beteiligten Transmembrandomänen VI und VII ungünstig zueinander positioniert sind. Um

Diskussion

die letztere Möglichkeit auszuschließen, könnten Konstrukte mit kleineren Substitutionen

hergestellt und erneut getestet werden. Der einzige zytoplasmatische bisher nicht unter-

suchte Bereich ist die N-terminale Region des VMAT2. Diese Region wurde aufgrund einer

Beteiligung an der Substraterkennung (Peter et al., 1996) bisher nicht untersucht. Da sich

diese Region in räumlicher Nähe zur ersten intraluminalen Schleife befindet, könnte auch

der Austausch kleinerer Bereiche des N-Terminus sinnvoll sein. Die komplette Deletion des

N-Terminus scheint aufgrund der Beteiligung an der Substraterkennung weniger sinnvoll.

Zusammenfassend belegen die erzielten Ergebnisse, dass die erste intraluminale Schleife

des VMAT2, und vermutlich auch des VMAT1, an der intraluminalen Erkennungsstruktur für

Monoamine beteiligt und für die Auslösung der G-Protein vermittelten Regulation des Mo-

noamintransports essentiell sind. Allerdings bleibt weiter unklar, wie die Signaltransduktion

ins Zytoplasma erfolgt. Deletionen und Substitutionen an zytoplasmatischen Anteilen der

VMAT2 lieferten diesbezüglich keine Hinweise. Ob vesikelassoziierte G-Proteine direkt mit

dem VMAT interagieren, konnte im Rahmen dieser Arbeit ebenfalls nicht endgültig geklärt

werden. Die Überprüfung der direkten Interaktion von Go2α und VMAT2 durch Koimmu-

nopräzipitation bzw. chemische Quervernetzung ist nicht gelungen. Alternativ wäre auch

denkbar, dass die Aktivierung des vesikelassoziierten Go2α über einen weiteren Zwischen-

schritt erfolgt. Die Aktivierung von heterotrimeren G-Proteinen unabhängig von heptahelika-

len Rezeptoren ist insbesondere für G-Proteine der Gi/o-Familie mehrfach beschrieben (sie-

he 3.5.1).

6.3 Nachgeschaltete Signalwege der Regulation des

Monoamintransports durch Go2α

α α

6.3.1 Die Adenylylzyklase kann den vesikulären Monoamintransport be-

einflussen

Für Go2α sind in der Literatur bisher keine Isoform-spezifischen nachgeschalteten Signal-

transduktionswege beschrieben. Die verfügbaren Informationen beschränken sich auf Goα,

wobei zu berücksichtigen ist, dass alle Goα-Isoformen für die beschriebenen Effekte in Fra-

ge kommen. Dass sich Go1α und Go2α in all ihren Funktionen gleichen, ist durch die Kopp-

lung mit verschiedenen Rezeptoren und Effektoren (siehe 3.5.2) sowie bereits beschriebe-

nen unterschiedlichen Funktionen (Dhingra et al., 2002) auszuschließen.

In einem ersten Ansatz wurde daher überprüft, inwieweit die Aktivierung der Adenylylzykla-

se als potentielles nachgeschaltetes Signal möglich ist. cAMP, das durch die Adenylylzykla-

se gebildet wird, wurde bereits von Watts und Cumbay (Watts et al., 1998; Cumbay & Watts,

2001) mit der Goα-Untereinheit in Verbindung gebracht. Sie konnten zeigen, dass die Akti-

vierung des D

-Rezeptors über Goα zu einer Erhöhung des intrazellulären cAMP-Spiegels

führt. Erhöhungen des cAMP-Spiegels führten in PC12-Zellen zu einer verminderten vesiku-

Diskussion

lären Monoaminaufnahme (Nakanishi et al., 1995 a; b). Durch Experimente in mit DbcAMP

vorbehandelten PC12-Zellen konnte eine verminderte Monoaminaufnahme bestätigt wer-

den. Die gleichzeitige Aktivierung von G-Proteinen durch GMP-P(NH)P führt dabei zu einer

zusätzlichen Verminderung der Monoaminaufnahme. Unter der Annahme, dass die Adeny-

lylzyklase an der Regulation beteiligt ist, deutet die weitere Verminderung der Monoami-

naufnahme durch GMP-P(NH)P auf eine zügige Aktivierung der Adenylylzyklase hin, die

zusätzlich zur DbcAMP den lokalen cAMP-Spiegel erhöht. Ebenso ist denkbar, dass es sich

um gänzlich verschiedene Signalwege handelt, die unabhängig voneinander die vesikuläre

Monoaminaufnahme beeinflussen.

6.3.2 Die Überexpression von CAPS erhöht die Speicherfähigkeit

vesikulärer Strukturen in CHO-Zellen

Ein weiteres wichtiges Signalmolekül, das an nachgeschalteten Signalwegen beteiligt sein

könnte, ist CAPS (Calcium-dependent activator-protein for secretion). Dafür werden zwei

Isoformen beschrieben, die sich in ihrem Expressionsmuster hinsichtlich Zeit und Ort unter-

scheiden (Speidel et al., 2003). Beide Isoformen ähneln in ihrem Expressionsmuster

Go2α mit einer starken Expression vor allem in Gehirn und neuroendokrinen Zellen. Ein

weiteres Argument für eine Beteiligung von CAPS an der Regulation der Monoaminspeiche-

rung lieferten Untersuchungen an embryonalen chromaffinen Zellen von CAPS1-

Deletionsmutanten der Maus (Speidel et al., 2005). Dabei konnte beobachtet werden, dass

nach Deletion von CAPS1 70 % der fusionierten LDCV keine Monoamine enthielten und

eine Beeinflussung der Monoaminaufnahme oder Speicherung wahrscheinlich ist. Die Er-

gebnisse in mit CAPS1 und CAPS2 transfizierten CHO-VMAT Zelllinien belegen, dass un-

abhängig von transfizierten CAPS-Isoformen und untersuchten VMAT-Isoformen, die Über-

expression von CAPS zu einer verstärkten Monoaminaufnahme führt. Das belegt in Übe-

reinstimmmung mit den Untersuchungen an CAPS1-Deletionsmutanten die Bedeutung von

CAPS für die Monoaminspeicherung. Fehlt CAPS, führt das zu einer verminderten Mono-

aminspeicherung. Die Überexpression führt zu einer Erhöhung der Monoaminspeicherung.

Allerdings zeigten Untersuchungen in PC12 Zellen, in denen die CAPS1-Expression mittels

RNA-Interferenz nachweislich inaktiviert wurde, ebenfalls eine Erhöhung der vesikulären

Neurotransmitterspeicherung. Ursache dafür ist vermutlich die Verminderung ablaufender

Exozytoseprozesse (Fujita et al., 2007). Experimente an hippokampalen Neuronen belegen

eine funktionelle Bedeutung der CAPS-Proteine bei der Ausbildung der Fusionskompetenz

auch kleiner synaptischer Vesikel (Jokusch et al., 2007). Dadurch könnten Veränderungen

während des Exozytoseprozesses, wie sie durch Fujita und Kollegen beobachtet wurden,

erklärt werden. Im Vergleich dazu zeigen die Ergebnisse in CHO-VMAT-Zellen, die bekann-

termaßen nicht über vesikuläre Exozytoseprozesse Monoamine freisetzen können, dass

nicht nur die Exozytose beeinflusst wird. Die CAPS-Proteine scheinen ähnlich Go2α den

Diskussion

Monoamintransport oder die Monoaminspeicherung in intrazellulären Strukturen zu beein-

flussen.

Die Wirksamkeit von sowohl CAPS1 als auch CAPS2 in CHO-VMAT-Zellen, lässt sich mit

der hohen Homologie zwischen beiden Isoformen von 78-79 % erklären, mit der vermutlich

auch ähnliche Funktionen assoziiert sind. In vivo führen nur die unterschiedlichen räumli-

chen und zeitlichen Expressionsmuster zu funktionellen Unterschieden der beiden CAPS-

Isoformen, die in bestimmten Zelltypen oder zu bestimmten Entwicklungszeitpunkten nötig

sind (Speidel et al., 2003).

Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Beobachtungen dieser Arbeit für die

Hypothese sprechen, dass die CAPS-Proteine die vesikuläre Monoaminspeicherung regu-

lieren können. Möglicherweise wirken sie dabei in einem gemeinsamen Signaltransdukti-

onsweg mit Go2α. Darauf hindeuten könnten Untersuchungen an C. elegans, wobei die In-

aktivierung von Goα den Phänotyp einer unc-31 (CAPS) Mutation unterdrückt (Speidel et

al., 2005). Monoaminspeicherung oder -transport könnten dabei direkt, wie unter 6.1 be-

schrieben, durch Beeinflussung des vesikulären Monoamintransportsystems oder der

Membranpermeabilität gegenüber Monoaminen reguliert werden.

6.4 Physiologische Funktion der Regulation der vesikulären

Monoaminaufnahme durch Go2α

αα

Die Hemmung der vesikulären Monoaminspeicherung durch die Aktivierung heterotrimerer

G-Proteine kann in vitro in vielen verschiedenen Testsystemen beobachtet werden. Sie stellt

ein generelles Regulationsprinzip dar. Da die Aktivierung von Go2α in einer verminderten

Neurotransmitteraufnahme resultiert, sollte die Inaktivierung des G-Proteins zu einer gestei-

gerten vesikulären Monoaminaufnahme führen. Überraschenderweise führt die Inaktivierung

von Go2α durch Pertussistoxin ebenfalls zu einer verminderten Neurotransmitteraufnahme

während 10-minütiger Messung in PC12-Zellen. Darüber hinaus führt die Langzeitinkubation

von BON-Zellen in Gegenwart von Pertussistoxin nicht nur zu einer Verminderung des vesi-

kulären Dopaminspiegels, sondern auch zu einer Verminderung des zytoplasmatischen Do-

pamingehaltes. Einschränkend ist hierbei anzumerken, dass die ermittelten Messwerte nicht

unbedingt die physiologischen Bedingungen widerspiegeln. So wurden diese Beobachtun-

gen an Zellen gemacht, die teilweise in Gegenwart hoher Serotoninkonzentration kultiviert

wurden. Zusätzlich mussten die Zellen für die HPLC-Messungen subzellulär fraktioniert

werden, wodurch Verschiebungen zwischen zytoplasmatischen und vesikulären Serotonin-

kompartimenten wahrscheinlich sind. Generell belegen die Beobachtungen jedoch, dass der

Serotoninspiegel nach Go2α-Inaktivierung durch Pertussitoxin insgesamt reduziert ist. Man

könnte die Beobachtungen an BON- und PC12-Zellen auf die Vermutung zurückführen,

dass andere durch G-Proteine der Gi/o-Familie vermittelte Effekte, die ebenfalls durch Per-

Diskussion

tussistoxin beeinflusst werden, diese überraschende Beobachtung hervorrufen. Weiterfüh-

rende Untersuchungen im Gehirn von Go2α-Deletionsmutanten legen jedoch die Annahme

nahe, dass die Inaktivierung von Go2α für die beobachteten Pertussistoxineffekte verant-

wortlich ist. Auch die genetische Deletion von Go2α in Mäusen führt zu einem verminderten

Dopaminspiegel in der Gehirnregion des Striatums. Da hierzu keine subzellulären Fraktio-

nen für die Untersuchung herangezogen wurde, lässt sich nicht eindeutig sagen, ob nur die

vesikuläre, die zytoplasmatische oder die extrazelluläre Dopaminmenge vermindert ist. Am

wahrscheinlichsten ist jedoch, dass alle zellulären Kompartimente gleichermaßen betroffen

sind. Dafür sprechen einerseits die zuvor genannten Beobachtungen an den BON-Zellen,

aber andererseits auch die Tatsache, dass der zytoplasmatische Dopaminspiegel aufgrund

der intrazellulär toxischen Wirkung von Dopamin stark reguliert wird (Ben Shachar et al.,

2004). Sollte weniger Dopamin vesikulär gespeichert werden können, würde der ansteigen-

de zytoplasmatische Dopaminspiegel zu einer Feedback-Inhibition der Tyrosinhydroxylase,

dem Schlüsselenzym der Dopaminbiosynthese, und zum vermehrtem Abbau von Dopamin

durch die Monoaminooxidase führen. Dadurch würde sich auch zytoplasmatisch ein niedri-

ger Dopaminspiegel einstellen. Interessanterweise sprechen Quantifizierungen des VMAT2

und der Tyrosinhydroxylase genau für ein derartiges Szenario in den Goα2-

Deletionsmutanten. So ist die Expression des VMAT2 auf Vesikeln von Go2α-

Deltionsmutanten gegenüber Wildtyptieren signifikant erhöht, wohingegen das Expressions-

niveau der Tyrosinhydroxylase gegenüber Wildtyptieren signifikant vermindert ist (Dr. I.

Brunk, persönliche Mitteilung). Die Deletion von Go2α verursacht also entweder einen ver-

minderten Transport in die Vesikel oder verändert deren Speicherfähigkeit so, dass ein er-

höhter Efflux, der über den VMAT2 vermittelt, oder unvermittelt über die Vesikelmembran

erfolgen kann (Floor et al., 1995). Eine verminderte Expression der Tyrosinhydroxylase und

damit verbunden eine verminderte Dopaminsynthese wirken einem erhöhten, zytoplasmati-

schen Dopaminspiegel entgegen, führen aber insgesamt zu einem erniedrigten zellulären

Dopamingehalt. Zusätzlich tragen die erhöhte Expression des VMAT2 auf Vesikeln und der

damit verbundene stärkere Dopamintransport in die Vesikel ebenfalls zu einer Stabilisierung

der zytoplasmatischen Dopaminkonzentration bei. Gleichzeitig wird dadurch sichergestellt,

dass mehr Dopamin in den Vesikeln für die interneuronale Kommunikation zur Verfügung

steht. Diese kompensatorischen Mechanismen führen vermutlich dazu, dass Go2α-

Deletionsmutanten keine offensichtlichen phänotypischen Veränderungen zeigen.

Diese dynamische Gegenregulation der Zellen erklärt auch, dass nur für Dopamin und nur

in der Region des Striatums eine signifikante Verminderung des Monoaminspiegels nach-

gewiesen werden kann. Im Striatum enden ca. 80 % aller dopaminergen Fasern des Ge-

hirns (Siegel et al., 1998), wodurch in dieser Region eine sehr hohe Dopaminkonzentration

von ca. 15 ng / mg Feuchtgewicht gemessen werden kann. Somit sind auch Veränderungen

Diskussion

des Dopaminspiegels in dieser Region am einfachsten zu detektieren. Die Untersuchung

jüngerer Tiere bis zu einem Alter von 12 Tagen gestattet keine regionenspezifische Unter-

suchung des Striatums, weshalb die Unterschiede im Dopaminspiegel auch erst danach

detektiert werden können. Bei der Untersuchung der verschiedenen Regionen der P12- und

adulten Go2α-Deletionsmutanten ist in vielen Regionen und auch für verschiedene Monoa-

mine eine tendenzielle aber nicht signifikante Verminderung gegenüber den Wildtyptieren zu

beobachten. Naheliegend ist, dass auch andere Monoamine in ihrer Konzentration leicht

vermindert sind, sich aber aufgrund der diffusen Projektion in viele verschiedene Gehirnare-

ale mit der gewählten Methode keine Unterschiede nachweisen lassen. Interessant wären

diesbezüglich Untersuchungen zu Unterschieden im Monoamingehalt des Blutes und neu-

roendokriner Zellen von Wildtypmäusen und Go2α-Deletionsmutanten, da hier ebenfalls

hohe Monoaminkonzentrationen vorliegen.

Die Auswirkungen des verminderten Dopaminspiegels im Striatum spiegeln sich zusätzlich

in der verminderten Bewegungsaktivität der Go2α-Deletionsmutanten wieder, die durch Ga-

be der Bewegungsaktivität-stimulierenden Substanzen Kokain und Amphetamin beibehalten

bzw. verstärkt wird. Beide Substanzen wirken auf die Dopamintransporter der Plasma-

membran. Kokain blockiert sie, wodurch die Wiederaufnahme von Dopamin ausbleibt, und

eine erhöhte extrazelluläre Konzentration die Folge ist. Amphetamin führt neben der Blo-

ckade der Plasmamembrantransporter zu einer zusätzlichen Freisetzung intrazellulären Do-

pamins in den Extrazellularraum, wodurch die extrazelluläre Konzentration im Striatum

ebenfalls erhöht wird. Die Wirkung beider Substanzen wurde an permeabilisierten und intak-

ten Synaptosomen verifiziert, wobei aber in vitro keine Unterschiede in der Substanzwirkung

zwischen Wildtypmäusen und Go2α-Deletionsmutanten beobachtet werden konnten. Die

Dopaminwirkung im Striatum wird hauptsächlich durch D1 und D2 Rezeptoren vermittelt, die

über die Aktivierung verschiedener neuronaler Verschaltungen (Steigerung des sogenann-

ten direkten, Hemmung des sogenannten indirekten Weges) zu gesteigerter motorischer

Aktivität (flüssiger Bewegungsablauf) führen, wodurch die erhöhte Bewegungsaktivität nach

Kokain- bzw. Amphetamingabe erklärt werden kann. Da auch in den Go2α-

Deletionsmutanten nach Kokain- bzw. Amphetaminapplikation eine Erhöhung der Bewe-

gungsaktivität zu beobachten ist - jedoch gegenüber Wildtyptieren in geringerem Maße -

liegt hiermit ein direktes Korrelat für die verminderten Dopaminspiegel im Striatum vor. Auch

wenn die dabei beobachteten Unterschiede nur nach Amphetamingabe signifikant sind. Dar-

über hinaus fehlt in Go2α-Deletionsmutanten die Kokain-induzierte Sensibilisierung. Dabei

handelt es sich um einen dopaminvermittelten Effekt, der in verschiedenen Spezies beo-

bachtet werden kann, und häufig als Test für einsetzendes Suchtverhalten genutzt wird

(Sanchis-Segura & Spanagel, 2006). Die wiederholte Applikation gleicher Dosen Kokain

führt dabei zu einer gesteigerten Bewegungsaktivität, die sich mit fortschreitender Applikati-

Diskussion

on noch verstärkt. Die Untersuchung des Suchtverhaltens im Conditioned Place Preference

Test ergab keine Unterschiede zwischen Go2α-Deletionsmutanten und Wildtyptieren. Daher

deutet die fehlende Sensibilisierung nach der Kokainbehandlung in den Go2α-

Deletionsmutanten auf zusätzliche Veränderungen in der vor- bzw. nachgeschalteten, durch

Dopamin vermittelten, Signaltransduktion hin. Im Gegensatz dazu ist es überraschend, dass

nach wiederholter Amphetaminapplikation eine Sensibilisierung zu beobachten ist. Im Ver-

gleich zu Wildtyptieren erfolgt die Sensitivierung auf niedrigerem Niveau. Das wird vermut-

lich ebenfalls durch den verminderten Monoaminspiegel verursacht.

Zusammenfassend führt die Deletion von Go2α zu einem reduzierten Dopaminspiegel im

Striatum. In Verhaltensexperimenten, in denen nach Applikation von Kokain und Ampheta-

min die Bewegungsaktivität gemessen wird, spiegelt sich der verminderte Dopaminspiegel

wieder. Gleichzeitig scheinen weitere Störungen des dopaminergen Systems vorzuliegen.

Der verminderte Dopaminspiegel ist höchstwahrscheinlich auf den reduzierten vesikulären

Dopamintransport in die Vesikel oder eine Abnahme von deren Speicherfähigkeit zurückzu-

führen. Die genauen molekularen Ursachen bleiben dabei aber unverstanden. Die durchge-

führten Untersuchungen belegen, dass die Regulation des vesikulären Monoamintransports

durch Go2α von entscheidender Bedeutung für die optimale Speicherung von Dopamin ist.

Darüber hinaus konnte gezeigt werden, dass leichte Veränderungen in der Dopaminspei-

cherung auf vesikulärer Ebene, trotz einer Gegenregulation der Zellen, zu systemischen

Veränderungen führen können.

6.5 Direkte Interaktionspartner von Go2α

αα

Wie die zuvor beobachteten Effekte des verminderten Dopaminspiegels im Striatum durch

Go2α hervorgerufen werden, ist unbekannt. In der Literatur sind für Go2α keine Interakti-

onspartner beschrieben. Untersuchungen zu Goα fokussieren dabei bisher auf Go1α. Zu-

dem lieferten die Untersuchungen zu den zuvor beschriebenen Signalmolekülen cAMP und

CAPS (siehe 6.3) keine Informationen, ob deren Wirkung auf den vesikulären Monoa-

mintransport mit der von Go2α-vermittelten Regulation verbunden ist.

In einem weiteren Schritt sollten daher direkte Interaktionspartner von Go2α identifiziert

werden, um nachfolgende Schritte möglicherweise beteiligter Signalkaskaden aufzudecken.

Das ist einerseits für das Verständnis der Regulation des vesikulären Monoamintransports

von Bedeutung und andererseits auch für das Verständnis der Rolle von Go2α in ZNS und

neuroendokrinen Zellen, über die bis bis heute noch keine Informationen vorliegen. Insbe-

sondere unter Berücksichtigung der verminderten Dopaminspiegel in Go2α-Deletions-

mutanten könnten direkte Interaktionspartner Hinweise darauf liefern, über welche Signal-

wege sowohl die vesikuläre als auch die zytoplasmatische Monoaminkonzentration reguliert

werden.

Diskussion

Für das Auffinden direkter Interaktionspartner wurde das Yeast-two-hybrid System genutzt.

Dabei wurde eine cDNA-Bibliothek aus dem Gehirn der Maus mit der konstitutiv aktiven

Go2αQ205L-Untereinheit durchgemustert. Dadurch sollten Interaktionspartner identifiziert

werden, die als Effektoren nach Go2α-Aktivierung in Frage kommen. Bei der Durchmuste-

rung der Bibliothek wurden ca. 3,5 x 10

Klone untersucht. Dieser Wert entspricht der An-

zahl unabhängiger Klone der cDNA-Bibliothek. Dadurch konnte ein Großteil der Klone der

Bibliothek analysiert werden. Es kann allerdings nicht ausgeschlossen werden, dass seltene

Transkripte während des durchgeführten Screenings nicht identifiziert wurden. Von den

durchgemusterten Klonen zeigten 246 unter den stringentesten Wachstumsbedingungen

eine Koloniebildung. Durch Plasmidisolation, PCR und Restriktionsverdau konnten identi-

sche Klone identifiziert, und die Anzahl der zu sequenzierenden Klone auf 78 verringert

werden. Von den 78 Klonen kodierten 56 Proteine, wobei von einigen Proteinen verschie-

dene Klone aufgetreten sind. Nach Abzug der offensichtlich falsch positiven Klone verblie-

ben insgesamt 20 mögliche Interaktionspartner. Von diesen 20 Klonen konnten in Verpaa-

rungsexperimenten 15 Interaktionspartner bestätigt werden. Die anderen fünf Klone wurden

aufgrund unspezifischer Interaktion mit den Kontrollproteinen, bzw. aufgrund fehlender In-

teraktion mit Go2αQ205L in Kontrollexperimenten, ausgeschlossen. Die zuletzt genannten

falsch positiven Klone sind erklärbar, da die Hefekolonien während der Durchmusterung

mehrere AD-Bibliotheksvektoren tragen können. Ein großer Anteil der identifizierten Klone

zeigt in Spezifitätsuntersuchungen Interaktionen mit beiden Goα-Isoformen.

6.5.1 Spezifische Go2α

αα

α-Interaktionspartner

Ein spezifischer Go2α-Interaktionspartner ist Eya4. Eya4 ist Bestandteil einer Familie

transkriptioneller Aktivatoren (Eya 1-4), die sich zusätzlich durch eine Proteinphosphata-

seaktivität auszeichnen. Neben einer Lokalisation im Zellkern, die im Drosophilaprotein

durch mehrere Kernlokalisationssequenzen verankert ist, ist daher eine Funktion auch aus-

serhalb des Zellkerns denkbar. Dazu geben Untersuchungen Anlass, die in C. elegans eine

Interaktion von Eya-Proteinen mit Membranproteinen belegen (Li et al., 2004). Darüber hin-

aus interagieren Eya1(Maus) mit den heterotrimeren G-Proteinuntereinheiten Gzα, Gi2α

und Eya2 (Mensch) mit Gi1-3α (Ozaki et al., 2002; Embry et al., 2004; Fan et al., 2000), die

in überwiegendem Maße zytoplasmatisch lokalisiert sind. Während der embryonalen Ent-

wicklung zeigt Eya4 eine breites Expressionsmuster. In adulten Tieren zeigen lediglich die

Skelettmuskeln ein starkes Vorkommen an Eya4-m-RNA (Borsani et al., 1999). Die Beob-

achtung einer Interaktion von Go2α mit Eya4 während des Yeast-two-hybrid-Screenings

lassen jedoch auch den Schluss zu, dass im adulten Gehirn eine funktionelle Interaktion

auftritt, da die cDNA-Bibliothek aus dem adulten Gehirn stammt. Das ist von besonderem

Interesse, da Mutationen von Eya4 zu Taubheit (DFNA10 nonsyndromic hearing loss) füh-

Diskussion

ren können (Wayne et al., 2001; Pfister et al., 2002). Verbunden mit dem niedrigen m-RNA-

Vorkommen von Eya 4 im Gehirn, ist eine Bedeutung für die vesikuläre Monoaminspeiche-

rung aber eher unwahrscheinlich.

Das Protein Pcp2 (Purkinje cell protein 2), das in Purkinjezellen des Kleinhirns und in bipola-

ren Neuronen der Retina exprimiert wird, interagiert auch mit Go2α. Die Interaktion von

Pcp2 mit Go1α wurde mittels Yeast-two-hybrid- und GST-Pulldowntests nachgewiesen.

Pcp2 fungiert dabei als Nukleotidaustauschfaktor und stimuliert den Austausch von GDP

gegen GTP (Luo & Denker, 1999). Die Identifikation als spezifischer Bindungspartner von

konstitutiv aktivem Go2α steht den Ergebnissen von Luo und Denker entgegen. Möglicher-

weise besitzt Pcp2 neben der Bedeutung als Nukleotidaustauschfaktor weitere Funktionen

bei der Regulation von G-Proteinen, die unabhängig von der GTPase-Aktivität sind, wie z.B.

die Lokalisation an bestimmten intrazellulären Signalkomplexen. Aufgrund des spezifischen

Expressionsmusters scheidet Pcp2 jedoch als nachgeschaltetes Signal der G-Protein-

regulation der Monoaminaufnahme aus.

Ein drittes, spezifisch nur mit Go2α interagierendes Protein ist KIAA1045. Dabei handelt es

sich um ein Protein mit 427 Aminosäuren, für das zwei Isoformen beschrieben sind. Das

Protein konnte neben der m-RNA auch auf Proteinebene in Synaptosomen aus dem Mäu-

segehirn nachgewiesen werden, wobei eine Phosphorylierung an S348 als posttranslationa-

le Modifikation gezeigt werden konnte (Munton et al., 2007). Die auf der HUGE-

Proteindatenbank hinterlegten Expressiondaten zeigen eine starkes Vorkommen von

KIAA1045-mRNA im Gehirn, wobei in allen untersuchten Gehirnarealen eine mittlere bis

hohe Expressionsrate beobachtet werden konnte (http://www.kazusa.or.jp/huge/index.html).

Einziges strukturelles Merkmal, das einen Hinweis auf die Funktion des identifizierten Prote-

ins geben kann, ist eine Zinkfingerregion des PHD Typs (plant homeodomain) im Bereich

der Aminosäuren 129-190. Proteine mit PHD-Finger sind höchstwahrscheinlich im Kern lo-

kalisiert und vermutlich an Transkriptionskontrolle und Chromatinregulation beteiligt (Bienz,

2006). Berücksichtigt man, dass auch G-Proteine, insbesondere der Gi/o-Familie, nukleär

lokalisiert sein können, ist mit dem übereinstimmenden Expressionsmuster von Go2α und

KIAA1045 eine höchst interessante Interaktion identifiziert worden. Es bedarf deshalb weite-

rer Untersuchungen zur Funktion und Bedeutung von KIAA 1045. Aufgrund des Expressi-

onsmusters könnte KIAA 1045 an der Regulation der vesikulären Monoaminaufnahme be-

teiligt sein. Aufgrund der wahrscheinlichen Lokalisation und transkriptionsregulierenden

Funktion im Zellkern sind die vermittelten Effeke der Interaktion beider Proteine vermutlich

eher länger anhaltend und für die beobachteten Effekte an synaptischen Vesikeln, die in-

nerhalb weniger Minuten beobachtet werden können, nicht verantwortlich. Interessant für

zukünftige Fragestellungen ist, ob KIAA 1045 an der transkriptionellen Kontrolle wichtiger

Enzyme des Monoaminmetabolismus beteiligt ist.

Diskussion

Eine Sonderstellung unter den spezifischen Go2α-Interaktionspartnern nehmen die Proteine

Rap1Gap und Girdin ein. Sie zeigen in den Spezifitätsuntersuchungen sowohl mit konstitutiv

aktivem Go1α als auch mit konstitutiv aktivem Go2α eine Interaktion. Allerdings deutet die

Beobachtung eines schnelleren und wesentlich stärkeren Koloniewachstums nach einer

Woche bzw. zwei Wochen bei beiden Proteinen auf eine stärkere Interaktion mit konstitutiv

aktivem Go2α hin. Rap1Gap, ein Protein, das die GTPase-Aktivität des kleinen G-Proteins

Rap1 stimuliert, zeigt eine gewebespezifische Expression in Gehirn, Schilddrüse und ande-

ren Geweben. (Polakis et al., 1991; Rubinfeld et al., 1991). Rap1Gap existiert in zwei Iso-

formen (Rap1GapI; Rap1GapII), die sich durch 31 N-terminale Aminosäuren unterscheiden.

Diese kommen nur in Rap1GapII vor. Rap1GapII ist zu unterscheiden von Rap1Gap2, das

als weitere verwandte Isoform in Thrombozyten gefunden wurde, allerdings nur 50 %-

Sequenzhomologie aufweist (Schultess et al., 2005). Die Inaktivierung von Rap1Gap führt

zu erhöhter Zelldifferenzierung, vermutlich über Rap1. Rap1Gap wird deshalb als mögliches

Tumorsuppressorprotein angesehen. Rap1Gap kann durch mehrere Kinasen, darunter die

cAMP-abhängige Kinase, phosphoryliert werden. Die Interaktion von Rap1Gap mit mehre-

ren Gα-Untereinheiten ist mehrfach beschrieben (Meng et al., 1999; Jordan et al., 1999).

Besonders auffällig bei den von Meng sowie Jordan und Kollegen durchgeführten Untersu-

chungen ist, dass Rap1Gap offensichtlich weniger mit konstitutiv aktivem Go1α als mit Wild-

typ Go1α interagiert. Diese Ergebnisse stimmen mit den in dieser Arbeit durchgeführten

Spezifitätsuntersuchungen überein. Die Interaktion von Rap1Gap mit konstitutiv aktivem

Go1α ist erst nach längerer Inkubationszeit der Hefezellen und auch nur in geringem Um-

fang (wenige Kolonien) zu beobachten. Interessanterweise zeigt konstitutiv aktives Go2α

ein genau gegensätzliches Verhalten bei Interaktionsstudien mit Rap1Gap - eine nach kur-

zer Zeit beobachtbare starke Interaktion (viele Kolonien). Obwohl sich Go1α und Go2α nur

in wenigen Aminosäuren ihrer GTPase-Domäne unterscheiden, zeigen sie bezüglich der

Interaktion mit Rap1Gap entgegengesetztes Verhalten. Da die Beteiligung von Goα und

Rap1Gap an Differenzierungsprozessen neuronaler Zellen (Neuritenwachstum; He et al.,

2006) beobachtet wird, sind die vorliegenden Ergebnisse besonders interessant. Bezüglich

der Regulation des Monoamintransports stellt Rap1Gap ein sehr interessantes Zielmolekül

dar. Neben der spezifischen Interaktion mit konstitutiv aktivem Go2α sind die starke Expres-

sion im Gehirn, die Beeinflussbarkeit durch cAMP-abhängige Kinasen und das Vorkommen

einer Thrombozytenisoform im Zusammenhang mit der Regulation des Monoamintransports

von Bedeutung.

Girdin oder auch GIV (Galpha interacting vesicle associated protein; Anai et al., 2005; Eno-

moto et al., 2005; Simpson et al., 2005, Le-Niculescu et al., 2005) ist ein weiteres nachge-

schaltetes Signal, das an der Regulation des vesikulären Monoamintransports beteiligt sein

könnte. Girdin wurde sowohl auf DNA als auch auf Proteinebene überwiegend in Gehirn und

Diskussion

Hoden, aber auch in Herz, Fettgewebe, Lunge und Milz nachgewiesen. Darüber hinaus wird

Girdin auch in hohem Maße in PC12-Zellen exprimiert. Für die Interaktion von Girdin mit

Gi3α ist eine Region zwischen den Aminosäuren 1399-1481 verantwortlich, die auch in den

beiden, während des Yeast-two-hybrid-Screenings identifizierten, Klonen enthalten ist. Gir-

din kommt auf allen Vesikeln im Zytoplasma vor, ist aber auf COPI-Vesikeln in der cis-Golgi-

Region vermehrt lokalisiert und scheint aufgrund seiner Struktur Membrankompartimente

mit den Mikrotubuli zu verbinden. Durch die Lokalisation auf Vesikeln ist Girdin möglicher-

weise an der vesikulären Neurotransmitterspeicherung beteiligt. Über welche Mechanismen

es dabei wirken könnte, ist bisher aber unklar.

6.5.2 Interaktionspartner, die mit beiden Goα

αα

α-Isoformen interagieren

Zu den Proteinen, die während des Yeast-two-hybrid-Screenings mit beiden Goα-Isoformen

interagieren, gehört das auf dem X-Chromosom kodierte Protein ALEX1 (Armadillo repeat

containing X-linked 1). Strukturell ist dieses Protein durch eine vorhergesagte Trans-

membrandomäne und zwei Wiederholungen des armadillo-Aminosäuremotives, das aus 42

Aminosäuren besteht, gekennzeichnet. Homologien bestehen zu humanem Importin α und

zum vakuolären Protein 8 in Hefe (Vac8p). ALEX1 wird, neben anderen Geweben, zu einem

hohen Maße im Gehirn exprimiert (Kurochkin et al., 2001). Aufgrund seiner vermutlichen

Membranlokalisation und Homologie zu Proteinen, die auf intrazellulären Strukturen lokali-

siert sind, und des starken m-RNA-Vorkommens im Gehirn kann ALEX1 relevant für die

Regulation von Neurotransmittermetabolismus und -speicherung sein.

Das Protein AGS3 wurde durch funktionelle Tests in Hefen identifiziert, in denen es in Ab-

wesenheit eines benötigten G-Protein gekoppelten Rezeptors heterotrimere G-Proteine ak-

tivieren konnte (Takesono et al., 1999). Wie der Mechanismus der G-Proteinaktivierung er-

folgt, ist dabei aber unklar (De Vries et al., 2000). Der C-terminale Anteil des Proteins ent-

hält vier G-Protein-regulatorische Motive (GPR-Motiv; bzw: GoLoco-Motiv) die auch in zahl-

reichen anderen Proteinen, darunter die zuvor beschriebenen Pcp2 und Rap1Gap, vor-

kommen. AGS3 zeigt in Gehirn und Leberhomogenat die höchste Immunreaktivität und

kann subzellulär sowohl in Zytosol als auch in der partikulären Fraktion nachgewiesen wer-

den (De Vries et al., 2000). Auch PC12-Zellen exprimieren AGS3. Darüber hinaus konnte

gezeigt werden, dass AGS3 in einem Yeast-two-Hybrid-Screening mit allen Giα-Isoformen

und Go1α aber nicht mit Gqα, Gzα, Gsα,oder G12α interagiert. Diese Beobachtungen

stimmen mit den nachgewiesenen Interaktionen von AGS3 mit konstitutiv aktivem Go1α und

Go2α, aber nicht Gqα, überein. Die kürzesten identifizierten AGS3-Klone enthielten minimal

die letzten drei der insgesamt vier C-terminalen GPR-Motive. Anscheinend ist für die Bin-

dung an AGS3 der Aktivierungsstatus des G-Proteins nicht von Bedeutung. Die Beeinflus-

Diskussion

sung der vesikulären Monoaminaufnahme aufgrund der zuvor zusammengefassten Eigen-

schaften durch AGS3 ist denkbar.

Neben AGS3 wurden weitere Regulatorproteine heterotrimerer G-Proteine als Interaktions-

partner beider Goα-Proteine identifiziert. Darunter waren die RGS-Proteine 17 (RGSz2), 19

(GAIP) und 20 (RGSz1), die zur RZ/A-Familie gehören und RGS14, das zur R12-Familie der

RGS-Proteine gehört. Für die RZ/A-Familie der RGS-Proteine ist bekannt, dass sie spezi-

fisch nur mit den Gα-Untereinheiten der i/o-Familie und Gzα interagieren. Eine Selektivität

gegenüber Gi/oα wird auch für RGS14 beschrieben. Für alle identifizierten RGS-Proteine ist

die Expression im Gehirn bekannt. RGS17 wird darüber hinaus auch in neuroendokrinen

Zellen exprimiert. Eine Besonderheit von RGS17 ist, dass es subzellulär auch im Zellkern

lokalisiert ist. Eine in der Literatur beschriebene Interaktion von RGS17 mit Gqα konnte für

konstitutiv aktives Gqα in dieser Arbeit nicht bestätigt werden (Mao et al., 2004). Auch die

für RGS19 beschriebene GAP-Aktivität bezüglich Gqα in vitro konnte während des Yeast-

two-Hybrid-Screenings nicht durch eine Interaktion bestätigt werden. RGS14 enthält neben

der RGS-Domäne zwei Rap-bindende Domänen sowie ein GoLoco-Motiv, wie es auch für

AGS3, Rap1Gap und Pcp2 beschrieben wurde. RGS14 ist im Affengehirn hauptsächlich mit

der Membranfraktion assoziiert. Mikroskopische Untersuchungen zeigen zusätzlich, dass

RGS14 in überwiegendem Maße zytoplasmatisch und dabei eher postsynaptisch lokalisiert

ist. Geringe Mengen RGS14 können auch im Zellkern nachgewiesen werden. In der Region

der Substantia nigra konnte RGS14 nur in Tyrosinhydroxylase-negativen Neuronen nach-

gewiesen werden. Prinzipiell könnten alle beschriebenen RGS-Proteinvarianten an der Re-

gulation der vesikulären Monoaminaufnahme und des Monoaminmetabolismus beteiligt

sein. Lediglich die Beteiligung von RGS14 ist aufgrund der subzellulären und zellulären Lo-

kalisation fraglich.

Für das dem Apolipoprotein AI-bindenden Protein ähnliche Transkript, das während des

Screenings identifiziert wurde, liegt noch kein Nachweis auf Proteinebene vor. Für das ver-

wandte Protein APOA1BP wurden die Expression im Gehirn und ein gleichzeitig hoher Li-

quorspiegel nachgewiesen. Über Interaktionen mit G-Proteinen oder andere Isoformen ste-

hen derzeit keine Informationen zur Verfügung. Da das Protein jedoch sezerniert wird, ist

eine Beteiligung an intrazellulären Signaltransduktionswegen eher unwahrscheinlich.

Ein weiteres Protein, für das noch keine Interaktionen mit G-Proteinen beschrieben ist, ist

das TNF-α-induzierte Protein 8 (TNFAIP8; SCC-S2; GG2-1). Dabei handelt es sich um ein

antiapoptotisches Protein, dessen Transkript eine ubiquitäre Gewebeverteilung aufweist.

6.5.3 Proteine die mit beiden Goα

αα

α-Isoformen und mit Gqα

αα

α interagieren

Das Protein Synembryn (Ric8) wurde erstmals in C. elegans identifiziert, wo Mutationen des

Synembryngens vermutlich durch Interaktionen mit Goα bzw. Gqα sowohl die synaptische

Diskussion

100

Übertragung, als auch die Spindelpolbewegungen während der Emryogenese beeinflusst

(Miller et al., 1996; Miller et al., 2000; Miller & Rand, 2000). Durch Yeast-two-Hybrid-

Untersuchungen konnte gezeigt werden, das Synembryn mit vielen verschiedenen Gα-

Untereinheiten interagiert, darunter Goα, Giα und Gqα. Für Goα und Gqα wird auch eine

Interaktion mit den konstitutiv aktiven Gα-Untereinheiten und Synembryn beschrieben (Tall

et al., 2003). Aufgrund seiner Bedeutung bei der synaptischen Übertragung in C. elegans ist

die Beteiligung an der Regulation des vesikulären Monoamintransports denkbar.

6.5.4 Zusammenfassung Yeast-two-Hybrid-Screening

Wie in den vorhergehenden Ausführungen gezeigt wurde, konnten durch das Yeast-two-

hybrid-Screening verschiedene Interaktionspartner identifiziert werden, die an der Regulati-

on des vesikulären Monoamintransports durch Go2α beteiligt sein könnten. Insbesondere

Rap1Gap, Girdin, AGS3, die identifizierten RGS-Proteine sowie Synembryn sind aufgrund

ihrer Beteiligung an der Regulation von Goα, der Assoziation mit synaptischen Vesikeln

bzw. der Beeinflussung der synaptischen Übertragung die wahrscheinlichsten nachgeschal-

teten Signaltransduktionsmoleküle. Andere Proteine, wie Eya4, Pcp2, sowie das APOAIBP-

ähnliche Protein, scheiden wegen ihres geringen und begrenzten Expressionsmusters im

Gehirn sowie der Sezernierung und des extrazellulären Vorkommens aus, bzw. ist eine Re-

gulation der vesikulären Neurotransmitterspeicherung eher unwahrscheinlich. Um die Liste

der potentiell bedeutenden Proteine weiter einzugrenzen, sollten, wenn der Proteinnachweis

durch verfügbare Antikörper möglich ist, in allen verwendeten Testsystemen, darunter sy-

naptische Vesikel und alle Zelllinien, das Vorkommen und die subzelluläre Lokalisation der

Proteine überprüft werden. Wenn es die Antikörper zulassen, sollte ebenfalls die in-vitro-

Interaktion mit konstitutiv aktivem Go2α durch Immunpräzipitationsexperimente bestätigt

werden. Alternativ ist weiterhin denkbar, dass keines der identifizierten Proteine in dem von

uns untersuchten Signaltransduktionsweg eine Rolle spielt. Denkbar wäre, dass multimere

Proteinkomplexe, die durch das Y2H-Screening nicht hätten identifiziert werden können,

Go2α am Vesikel regulieren. Dafür spricht, dass keines der identifizierten Proteine in Unter-

suchungen des Vesikelproteoms nachgewiesen werden konnte. Allerdings kann man dem

entgegnen, dass auch der VMAT2 in diesen Untersuchungen nicht identifiziert werden konn-

te. Als Bestandteil der Vesikel monoaminerger Neuronen ist die Konzentration des VMAT2

für massenspektrometrische Nachweismethoden - im Vergleich zu häufigeren vesikulären

Membranproteinen - vermutlich zu gering. Hilfreich hierbei wäre die Immunisolation von

Go2α-Proteinkomplexen und anschließende massenspektrometrische Analyse der isolierten

Proteine, um in einem komplementären Ansatz mit Vesikeln assoziierte und mit Go2α-

interagierende Proteine zu identifizieren. Dadurch könnten während des Yeast-two-Hybrid-

Screenings identifizierte Proteine bestätigt werden und gleichzeitig multimere Interaktions-

Diskussion

101

partner von Go2α identifiziert werden. Darüber hinaus könnten potentielle Interaktionspart-

ner in verschiedenen Testsystemen der vesikulären Monoaminaufnahme überexprimiert

bzw. ausgeschaltet werden, um gegebenenfalls eine Beeinflussung des Monoa-

mintransports zu beobachten und dadurch Rückschlüsse auf eine Beteiligung am Go2α-

Signalweg zu ziehen.

Neben der Identifikation potentieller Go2α-Interaktionspartner bestätigen die Ergebnisse des

durchgeführten Yeast-two-Hybrid-Screenings, dass die Unterschiede von 25 Aminosäuren

zwischen Go1α und Go2α deutliche Unterschiede in ihrer Spezifität zu nachgeschalteten

Signaltransduktionsproteinen verursachen. Dafür sprechen Beobachtungen, dass während

des durchgeführten Screenings spezifisch nur mit konstitutiv aktivem Go2α interagierende

Proteine Eya4, Pcp2 und KIAA1045 gefunden werden konnten. Bezüglich der Spezifität wä-

re es interessant zu untersuchen, ob die jeweiligen Goα-Isoformen auch in ihrer Wildtypkon-

formation die spezifischen Interaktionsmuster aufweisen. So existieren in der Literatur für

Pcp2 deutliche Hinweise auf eine Interaktion mit Wildtyp-Go1α in Yeast-two-hybrid-

Experimenten. Während des in dieser Arbeit durchgeführten Screenings mit konstitutiv akti-

vem Go1α, konnte hingegen keine Interaktion nachgewiesen werden. Ebenso scheint die

Interaktion von Girdin und Rap1Gap gleichermaßen schwächer mit konstitutiv aktivem Go1α

zu erfolgen, wohingegen in der Literatur eine stärkere Interaktion mit Wildtyp-Go1α be-

schrieben ist.

Beide Goα-Isoformen scheinen zusätzlich in Abhängigkeit von ihrem Aktivierungszustand

antagonistisch zu wirken. Zukünftig ist daher eine differenziertere Betrachtungsweise bei

Prozessen nötig, die durch Goα vermittelt werden.

Unabhängig von dieser scheinbar antagonistischen Wirkungsweise beider Goα−Isoformen

wurden neben zahlreichen bekannten Gα-Interaktionspartnern durch das Yeast-two-hybrid-

Screening neuartige Goα-Interaktionspartner identifiziert, darunter Eya4, das bisher uncha-

rakterisierte Protein KIAA1045, ALEX1, TNFAIP8 und das dem Apolipoprotein AI bindenden

Protein ähnliche Protein. Insbesondere für diese Proteine ist es wichtig, die Interaktion mit

Goα durch weitere Methoden zu überprüfen und nachzuweisen, dass die Interaktion intra-

zelluzlär auch möglich ist. Besonders auffällig ist, dass zahlreiche der identifizierten Proteine

auch im Zellkern vorkommen können bzw., dass eine Assoziation mit dem Zytoskelett vor-

liegt. Die nukleäre Lokalisation ist für die Interaktionspartner Eya4 als transkriptionellen Ak-

tivator und KIAA1045 mit seiner Zinkfingerdomäne wahrscheinlich und konnte auch für

RGS14 und RGS17 beobachtet werden. Die Beeinflussung nukleärer Prozesse durch

Go2α scheint daher wahrscheinlich. Wie bereits unter 3.5.3 beschrieben, ist für zahlreiche

Gα-Untereinheiten auch eine Loaklisation im Zellkern beobachtet worden.

Diskussion

102

Proteine, die Go2α mit einer Funktion im Zytoskelett in Verbindung bringen, sind Girdin und

Synembryn. Girdin, das über eine N-terminale Mikrotubuli-bindende Domäne verfügt und

zusätzlich membranassoziiert vorliegen kann, verbindet vesikuläre Kompartimente - auf de-

nen Go2α nachgewiesen werden kann - mit den Mikrotubuli des Zytoskeletts. Ebenso

scheint Synembryn an der Spindelausbildung durch Generierung von Zugkräften astraler

Mikrotubuli beteiligt zu sein. Dadurch verbindet es ebenfalls Go2α mit einer Zellkernlokalisa-

tion und den Mikrotubuli.

6.6 Ausblick

Im Rahmen der vorliegenden Arbeit konnten viele Aspekte der Regulation des vesikulären

Monoamintransports durch heterotrimere G-Proteine und der daran beteiligten Signaltrans-

duktionswege untersucht werden.

So konnte gezeigt werden, dass der VMAT2 über seine erste intraluminale Schleife an der

Signaltransduktion, die die vesikuläre Füllung beeinflusst, beteiligt ist. Offen geblieben ist

jedoch, wie dabei die Signaltransduktion ins Zytoplasma erfolgt. Eine aussichtsreiche, bis-

her nicht untersuchte Struktur des VMAT2 ist dabei der N-Terminus. Gegebenenfalls sollte

zusätzlich eine erneute Untersuchung der zytoplasmatischen Schleife zwischen den TMD

VI/ VII, bei der anstelle der kompletten Schleife nur kleinere Ausschnitte entfernt werden,

stattfinden.

Durch die Identifizierung vieler potentieller Go2α-Interaktionspartner während des Yeast-

two-Hybrid-Screenings ergeben sich zwingend Untersuchungen, die die Interaktion auf zu-

sätzlichem Wege, z.B. über Koimmunpräzipitation, nachweisen können. In einem komple-

mentären Ansatz wäre die Aufreinigung von Go2α-Proteinkomplexen verschiedener Zellen

und Gewebe über eine Immunaffinitätschromatographie mit anschließender Proteinidentifi-

zierung sinnvoll. Dadurch könnten neben der Bestätigung der in dieser Arbeit identifizierten

Proteine auch multimere Interaktionspartner identifiziert und ein besseres Verständnis betei-

ligter Signalkomplexe erreicht werden. Zusätzlich dazu sollte die Analyse der zellulären und

subzellulären Lokalisation der identifizierten Proteine in monoaminsynthetisierenden Zellen

und Gehirnregionen im Mittelpunkt stehen, um mögliche physiologische Interaktionen wäh-

rend der Neurotransmitterspeicherung nachzuweisen. In einem nächsten Schritt könnte

dann durch gezielte Deletion identifizierter physiologischer Interaktionspartner die Beein-

flussung der Neurotransmitterspeicherung untersucht werden.

Die festgestellten verminderten Monoaminspiegel im Striatum und damit assoziierte motori-

sche Defizite von Go2α-Deletionsmutanten belegen erstmals die Bedeutung für das mono-

aminerge System. Für die Bestätigung der verminderten Monoaminspeicherung in den Ve-

sikeln wären Untersuchungen zur Bestimmung der freigesetzten Monoamine mittels Ampe-

rometrie sinnvoll. Dadurch könnte zusätzlich überprüft werden, ob auch andere monoamin-

Diskussion

103

erge Zellen, so z.B. neuroendokrine Zellen des Nebennierenmarks, ebenfalls verminderte

Monoaminspiegel aufweisen. Darüber hinaus wären zusätzliche Verhaltensexperimente, die

weitere mit vermindertem Monoaminspiegel assoziierte Krankheiten, wie z.B. Parkinson

oder Depressionen, untersuchen, sinnvoll.

Sollte Go2α die Vesikelpermeabilität beeinflussen, wäre auch die Untersuchung weiterer

Neurotransmittersysteme auf Veränderungen in den Go2α-Deletionsmutanten sinnvoll.

Abkürzungen

104

7 Abkürzungen

°C Grad Celsius

3-AT 3-Aminotriazol

A Adenosin / Ampere

ADP Adenosindiphosphat

AGS Activator of G-Protein signalling

ATP Adenosintriphosphat

bait Köder

BCA Bicinchoninsäure

BON humane Pankreaskarzinoidzelllinie

bp Basenpaar

BSA Rinderserumalbumin

C Cytidin

c Konzentration

Kalziumionen

cAMP zyklisches Adenosinmonophosphat

CAPS calcium-dependent activator protein for secretion

cDNA Komplementär-DNA

cfu Kolonie bildende Einheiten (colony forming units)

CHO Zelllinie aus den Ovarien des chinesischen Hamsters

ClC Chloridkanal

cpm counts per minute / Zählungen pro Minute

CPP-Test conditioned place preference test

∆µH+ elektrochemischer Gradient

Da Dalton

DAT Dopaminplasmamembrantransporter

DbcAMP Dibutyryl-cAMP

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

DMSO Dimethylsulfoxid

DNA Desoxyribonukleinsäure

dNTP Desoxyribonukleosidtriphosphat

∆pH pH-Gradient

dpm disintegration per minute / Zerfälle pro Minute

DTT Dithiothreitol

∆Ψ elektischer Gradient

EAAT exzitatorischer Aminosäuretransporter

ECL Enhanced Chemiluminescence

EDTA Ethylendiamintetraacetat

EGFP enhanced green fluorescent protein

EGTA Ethylenglykolbis(2-aminoethyl-)tetraacetat

FBS fötales Kälberserum

G Guanosin

GABA γ-Aminobuttersäure

GAP GTPase-aktivierendes Protein

GDP Guanosindiphosphat

GEF Guanylnukleotidaustauschfaktor

GFP green fluorescent protein

GMP-P(NH)P 5´-Guanylylimidodiphosphat

GPCR G-Protein gekoppelter Rezeptor

G-Protein G-Protein

GTP Guanosintriphosphat

GTPase GTP-spaltende Enzyme

GTPγS Guanosin-5´-O-(thiotriphosphat)

h Stunde

O Wasser

HDC Histidindekarboxylase

HPLC-EC Hochleistungsflüssigchromatografie mit elektrochemischer Detektion

mittlere inhibitorische Konzentration

Michaelis-Menten-Konstante

LB Luria Bertani Medium

LDCV Large Dense Core Vesicles

L-DOPA Dihydroxyphenylalanin

MA Monoamin

Abkürzungen

105

MAO Monoaminooxidase

MF Membranfraktion

min Minute

MPP+ 1-Methyl-4-phenylpyridinium

MPTP 1-Methyl 4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridin

NET Noradrenalinplasmamembrantransporter

OD Optische Dichte

PAGE Polyacrylamidgelelektrophorese

PBS phosphatgepufferte Salzlösung

PC12 Phäochromozytomzelllinie der Ratte

Pcp Purkinje cell protein

PCR Polymerasekettenreaktion

PEG Polyethylenglykol

Pi Phosphatanion

Pipes Piperazin-N,N´-bis [2-ethansulfonsäure]

prey Beute

Ptx Pertussistoxin

QDO Quadruple-Dropout-Medium

Rap1Gap Rap1-GTPase aktivierendes Protein

RGS Regulator of G-Protein signalling

RNA Ribonukleinsäure

RNAse Ribonuklease

rpm Umdrehungen pro Minute (revolutions per minute)

RT Raumtemperatur

s Sekunde

screening Durchmusterung

SD Synthetisches Dropoutmedium

SDS Natriumdodezylsulfat

SEM mittlerer Standardfehler

SERT Serotoninplasmamembrantransporter

SLMV Small synaptic-like microvesicles

SLO Streptolysin O

SSV Small synatic vesicles

T Thymidin

TAE Tris-acetat-EDTA

TE Tris-EDTA

TH Tyrode HEPES

TMD Transmembrandomäne

TPH Tryptophanhydroxylase

Tph1 Tryptophanhydroxylase 1

Tris Tris(hydroxymethyl)-aminomethan

U Unit (Einheit der Enzymaktivität)

ÜN über Nacht

UV Ultraviolett

v/v Volumen pro Volumen

VAChT vesikulärer Azetylcholintransporter

vATPase vakuoläre ATPase

VF Verdünnungsfaktor

VGAT vesikulärer GABA-Transporter

VIAAT vesikulärer inhibitorischer Aminosäuretransporter

VMAT vesikulärer Monoamintransporter

Vmax Maximalgeschwindigkeit enzymatischer Reaktionen

w/w Gewicht pro Gewicht

w/v Gewicht pro Volumen

Wt Wildtyp-Mäuse

x g Erdbeschleunigung

X g

max

maximale Erdbeschleunigung (Zentrifugation)

X-α-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-α-D-galactopyranosid

X-Gal 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranosid

Y2H Yeast two hybrid

YE Hefeextrakt

YNB Yeast Nitrogen Base

z.B. zum Beispiel

ZNS Zentrales Nervensystem

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gleichberechtigter Autor

Tagungsbeiträge:

The first intravesicular domain of vesicular monoamine transporters serves as recep-

tor-like structure in G-protein mediated regulation of monoamine storage

Blex C, Brunk I, Rachakonda S, Winter S, Höltje M, Walther D and Ahnert-Hilger G;

Präsentation auf dem 7. Treffen der deutschen Neurowissenschaftlichen Gesellschaft, Göttingen

2007

Modulated monoamine storage in Gαo2-/- mice alters behavioural responses following co-

caine but not amphetamine treatment

Brunk I, Sanchis-Segura C, Blex C, Sternberg J, Perreau-Lenz S, Hörtnagl H, Spanagel R and Ah-

nert-Hilger G

Lebenslauf

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Danksagung

Mein besonderer Dank gilt Frau Professor Dr. Gudrun Ahnert-Hilger für die Überlassung des

Themas und auch für die intensive und geduldige Betreuung während der gesamten Arbeit.

Herrn Professor Dr. Roland Lauster danke ich sehr für die unkomplizierte Übernahme der

Betreuung und Begutachtung dieser Arbeit seitens des Instituts für Biotechnologie der

Technischen Universität Berlin.

Frau Professor Dr. Heide Hörtnagl danke ich für die Durchführung von großen Teilen der

Monoaminbestimmungen mittels HPLC und Ihre Hilfe bei der Methodenetablierung in unse-

rer Arbeitsgruppe.

Herrn Professor Dr. Lutz Birnbaumer danke ich für die Überlassung der Goα-Knockout-

Mausmodelle und die cDNAs von Goα und Gqα.

Für ihre kompetente fachliche Anleitung und moralische Unterstützung möchte ich mich ins-

besondere bei Irene und Krishna bedanken.

Ursel, die mir besonders bei der Herstellung stabil transfizierter Zelllinien eine große Hilfe

war, gebührt ebenso großer Dank.

Für die Mithilfe in vielen kleinen und großen Dingen sowie das gute Arbeitsklima danke ich

auch all meinen weiteren Kollegen am Institut für Anatomie der Charitè, ausdrücklich: An-

nett, Birgit, Christian, Elisabeth, Jan, Jens, Johannes, Karin, Mahesh, Marion, Markus, Phi-

lipp, Suzan und Thomas.

Franziska und Irene danke ich an dieser Stelle außerordentlich für das Korrekturlesen und

die Suche nach Tippfehlern.

Meiner Frau Franziska, unseren Familien und Freunden danke ich für die aus- und andau-

ernde Unterstützung in jeglicher Art und Weise, Franziska auch insbesondere für Ihre Ge-

duld.