DISSERTATION
Partielle Charakterisierung der neuartigen humanen Polyomaviren
HPyV9 und HPyV12
vorgelegt von
Dipl.-Ing. Sarah-Verena Korup-Schulz
geb. in Berlin
von der Fakultät III – Prozesswissenschaften
der Technischen Universität Berlin
zur Erlangung des akademischen Grades
Doktor der Naturwissenschaften
- Dr. rer. nat. -
genehmigte Dissertation
Promotionsausschuss:
Vorsitzender Prof. Dr. Roland Lauster
1. Gutachter: Prof. Dr. Jens Kurreck
2. Gutachter: Prof. Dr. Juri Rappsilber
3. Gutachterin: Prof. Dr. Annette Mankertz
Tag der wissenschaftlichen Aussprache: 1. Februar 2017
Berlin 2017
Inhalt
1
Inhalt
Inhalt ........................................................................................................................................... 1
Abstract ...................................................................................................................................... 5
Zusammenfassung ...................................................................................................................... 6
Abkürzungsverzeichnis .............................................................................................................. 8
Tabellenverzeichnis .................................................................................................................. 13
Abbildungsverzeichnis ............................................................................................................. 15
1 Einleitung .............................................................................................................................. 17
1.1 Polyomaviren .................................................................................................................. 17
1.1.1 Bisher beschriebene humane Polyomaviren ............................................................ 19
1.1.2 Das humane Polyomavirus 9 ................................................................................... 20
1.1.3 Das humane Polyomavirus 12 ................................................................................. 21
1.1.4 Assoziation von PyV mit Erkrankungen des Menschen .......................................... 22
1.2 Der virale Vermehrungszyklus und Zellkultursysteme von Polyomaviren .................... 26
1.3 Das Polyomavirus-Genom und alternative Spleißvorgänge in der frühen Genomregion
.............................................................................................................................................. 28
1.3.1 Die frühe Genregion: Tumor-Antigene ................................................................... 29
1.3.2 Alternative Spleißvorgänge der frühen Genregion .................................................. 33
1.4 Zielstellung und Vorgehensweise ................................................................................... 36
2 Material ................................................................................................................................. 38
2.1 Humane Organproben und Seren ................................................................................... 38
2.2 Tierische Seren ............................................................................................................... 38
2.3 Eukaryotische Zelllinien ................................................................................................. 38
2.4 Viren ............................................................................................................................... 39
2.5 Bakterienstämme ............................................................................................................ 39
2.6 Nukleinsäuren, Nukleotide, Marker ............................................................................... 40
2.6.1 Plasmidkonstrukte/Vektoren .................................................................................... 40
2.6.2 Marker ...................................................................................................................... 40
2.6.3 Synthetische Genome ............................................................................................... 40
2.6.4 Synthetisch hergestellte VP1-Sequenzen ................................................................. 40
2.6.5 Synthetisch hergestellte TAg(78aa)-Sequenzen ...................................................... 42
2.6.6 Primer ....................................................................................................................... 42
2.7 Antikörper ....................................................................................................................... 43
2.8 Enzyme ........................................................................................................................... 44
Inhalt
2
2.9 Chemikalien und Reagenzien ......................................................................................... 44
2.10 Puffer und Lösungen .................................................................................................... 45
2.11 Nährmedien .................................................................................................................. 46
2.12 Verbrauchsmaterialien .................................................................................................. 46
2.13 Molekularbiologische Kits ........................................................................................... 46
2.14 Geräte ............................................................................................................................ 47
2.15 Software ........................................................................................................................ 47
3 Methoden ............................................................................................................................... 48
3.1 Molekularbiologische Methoden .................................................................................... 48
3.1.1 Design von Inserts zur Expression von His-Tag-Fusionsproteinen ......................... 48
3.1.2 Klonierung ............................................................................................................... 48
3.1.3 TAE-Agarose-Gelelektrophorese ............................................................................ 50
3.1.4 Reinigung von Nukleinsäuren .................................................................................. 50
3.1.5 cDNA-Synthese ....................................................................................................... 51
3.1.6 DNA-/RNA-Konzentrationsbestimmung ................................................................ 52
3.1.7 PCR-Techniken ........................................................................................................ 52
3.2 Proteinbiochemische Methoden ..................................................................................... 56
3.2.1 Expression von His-Tag-Fusionsproteinen .............................................................. 56
3.2.2 Isolierung von Proteinen aus E. coli mit BugBuster® Protein Extraction Reagent . 56
3.2.3 Aufreinigung über Affinitätschromatographie ........................................................ 57
3.2.4 Dialyse ..................................................................................................................... 57
3.2.5 Isolierung von Proteinen aus Zellkultur ................................................................... 58
3.2.6 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA Protein Assay Kit ........................ 58
3.2.7 SDS-PAGE .............................................................................................................. 58
3.2.8 Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau R-250 ......................................................... 59
3.2.9 Western Blot (immunologischer Nachweis membrangebundener Proteine) ........... 59
3.3 Immunologische Methoden ............................................................................................ 60
3.3.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) .................................................... 60
3.3.2 Immunfluoreszenzassay (IFA) ................................................................................. 62
3.4 Tierexperimentelle Methoden......................................................................................... 63
3.5 Zytologische Methoden .................................................................................................. 63
3.5.1 Kultivierung von adhärenten Zelllinien ................................................................... 63
3.5.2 Kultivierung von Suspensionszellen ........................................................................ 64
3.5.3 Einfrieren ................................................................................................................. 64
Inhalt
3
3.5.4 Auftauen ................................................................................................................... 65
3.5.5 Bestimmung der Zellzahl ......................................................................................... 65
3.5.6 Transfektion ............................................................................................................. 65
3.5.7 Anreicherung von PyV-Partikeln mittels Ultrazentrifugation und
Elektronenmikroskopie ..................................................................................................... 66
3.5.8 Real-Time-Aufzeichnung der Zellviabilität ............................................................. 66
3.6 Bioinformatische Methoden: Vorhersage von Spleißstellen in der frühen Genregion von
PyV ....................................................................................................................................... 68
4 Ergebnisse ............................................................................................................................. 69
4.1 Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12 in Patienten mit malignen Erkrankungen des
GIT........................................................................................................................................ 69
4.2 Seroreaktivität gegen diverse PyV-Proteine ................................................................... 70
4.2.1 Herstellung von Antigenen ...................................................................................... 71
4.2.2 Kapsomer-basierter ELISA: Prävalenz von anti-HPyV9- und anrti-HPyV12-VP1-
Antikörpern ....................................................................................................................... 74
4.2.3 TAg(78aa)-ELISA: Seroreaktivität gegen HPyV9-, HPyV12-, BKPyV- und
MCPyV-TAg(78aa) .......................................................................................................... 76
4.2.4 Zusammenfassung .................................................................................................... 85
4.3 Testung von Zelllinien zur Identifikation eines in vitro-Replikationssystems für HPyV9
und HPyV12 ......................................................................................................................... 86
4.3.1 Optimierung der Transfektionsbedingungen ........................................................... 86
4.3.2 Testung des xCELLigence™ zur Identifikation von für HPyV9 und HPyV12
permissiven Zelllinien ....................................................................................................... 87
4.3.3 Protokoll zur Identifikation eines in vitro-Replikationssystems für HPyV9 und
HPyV12 ............................................................................................................................. 89
4.3.4 Beobachtung physiologischer Effekte im Lichtmikroskop ...................................... 90
4.3.5 Nachweis viraler Genexpression .............................................................................. 92
4.3.6 Detektion viraler Proteine ........................................................................................ 95
4.3.7 Detektion von Viruspartikeln im EM ...................................................................... 97
4.3.8 Zusammenfassung .................................................................................................... 97
4.4 Spleißvorgänge der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 .................................. 98
4.4.1 Die early region von HPyV9 ................................................................................... 98
4.4.2 Die early region von HPyV12 ............................................................................... 100
4.4.3 Zusammenfassung .................................................................................................. 105
5 Diskussion ........................................................................................................................... 106
5.1 Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12 .................................................................... 106
Inhalt
4
5.2 Seroprävalenz von HPyV9- und HPyV12-VP1 ............................................................ 107
5.3 Seroprävalenz von HPyV9-, HPyV12-, BKPyV- und MCPyV-TAg(78aa) ................ 109
5.4 Testung von Zelllinien zur Etablierung eines in vitro-Replikationssystems für HPyV9
und HPyV12 ....................................................................................................................... 112
5.5 Spleißen der frühen Genregion ..................................................................................... 116
6 Fazit und Ausblick .............................................................................................................. 120
Eidesstattliche Erklärung ........................................................................................................ 121
Referenzen .............................................................................................................................. 122
Danksagung ............................................................................................................................ 133
Abstract
5
Abstract
Eleven novel human polyomaviruses (PyVs) and various animal PyVs have been identified
during the last ten years. Basic characteristics like tissue tropism, cellular entry and infection
mechanisms of these viruses will be the subject of future studies. The present thesis deals with
the partial characterization of two novel human PyVs, the human polyomaviruses 9 (HPyV9)
and 12 (HPyV12). Both were recently discovered, HPyV9 in the serum of a renal transplant
recipient and HPyV12 in metastatic liver tissue. Here, genoprevalence and seroprevalence of
HPyV9 and HPyV12 were analysed in different subject groups, cell lines were searched that
support their replication, and HPyV9 and HPyV12 tumor antigens (TAg) were identified on
the mRNA level. In tissue samples of patients suffering from malignant diseases of the gastro-
intestinal tract (GIT), quantitative PCR yielded genoprevalences of 0 % for HPyV9 and 2.8 %
for HPyV12. In ELISA based on viral major capsid protein (VP1), seroprevalence of HPyV9
was significantly higher in sera from patients with non-malignant diseases of the GIT (59 %)
than that in sera of patiens with malignant diseases of the GIT (37 %, p=0.02), and in sera of
blood donors (32 %, p=0.04). VP1 seroprevalences of HPyV12 (8 % in blood donors, 20 % in
patients with malignant diseases of the GIT, 25 % in patients with non-malignant diseases of
the GIT) were generally lower and without significant differences (p>0.05). Similarly, ELISA
based on the common N-terminus (78 amino acids) of T antigens of either PyV revealed sero-
reactivities of 17 % - 39 %. These data did not indicate any clear association of HPyV9 and
HPyV12 with diseases of the GIT. Among the 12 cell lines tested to support HPyV9 and
HPyV12 replication by transfection of synthetic genomes, the Vero cell line allowed the
strongest increase in VP1 mRNA copies. Occasionally, cytopathic effects were observed, and
viral proteins detected in immunofluorescence assay. Analysis of the early gene region of
both viruses on the mRNA level resulted in identification of spliced LTAg- and small TAg-
encoding mRNAs. In addition, so far unknown alternative TAgs (HPyV9-145T and HPyV12-
84T) were identified. The results presented here contribute to the partial characterization of
HPyV9 and HPyV12. Future studies concerning geno- and seroprevalence of the two PyV
with alternative and larger sample panels are needed as the present results gave only first in-
sights. The limitations of the protocol to test cell lines as potential in vitro replication systems
might be overcome by further optimization and inclusion of primary cell lines. Characteriza-
tion of the transforming potential of the identified LTAg splice variants will be of specific
interest as they can be assumed to play a role in the oncogenic transformation of host cells
and in pathogenesis.
Zusammenfassung
6
Zusammenfassung
Im letzten Jahrzehnt wurden elf neue humane Polyomaviren (PyV) und zahlreiche tierische
PyV identifiziert. Die Charakteristika dieser PyV wie Gewebetropismus, zelluläre Eintritts-
und Infektionsmechanismen sind bislang ungeklärt. Humanes PyV 9 (HPyV9), im Serum
eines Nierentransplantat- Empfängers entdeckt, und Humanes PyV 12 (HPyV12), in Proben
von kolorektalen Lebermetastasen identifiziert, sind zwei neuartige humane PyV, deren parti-
elle Charakterisierung Gegenstand der vorliegenden Dissertation ist. Dies umfasst die Unter-
suchung ihrer Genoprävalenz in Gewebeproben von Patienten mit malignen Erkrankungen
des Gastrointestinaltraktes (GIT), der VP1 (Hauptkapsidprotein )-basierten Seroprävalenz von
HPyV9- und HPyV12 und der Seroreaktivität gegen HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in Se-
ren von Blutspendern (n=100), Patienten mit malignen (n=54) und mit nicht-malignen Er-
krankungen des GIT (n=32). Hinzu kommt die Etablierung eines Protokolls für die Identifika-
tion potentieller Zelllinien als in vitro-Replikationssysteme für die beiden PyV, welche u. a.
die Analyse von Spleiß-Mechanismen der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 erlau-
ben. Die mittels quantitativer PCR in Gewebeproben ermittelte Genoprävalenz lag bei 0 % für
HPyV9 und bei 2,8 % für HPyV12 und deutet nicht auf einen Gewebetropismus der beiden
PyV in den vorliegenden Materialien hin. Zur Bestimmung der Seroprävalenz von HPyV9-
und HPyV12-VP1 wurde ein Kapsomer-basierter ELISA verwendet. Die Seroprävalenz von
HPyV9-VP1 war in Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT signifi-
kant höher als in jenen von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT und in jenen von
Blutspendern (59 % vs. 37 % (p=0,02) und vs. 32 % (p=0,04). Die HPyV12-VP1-
Seroprävalenz lag bei 8 % (Blutspender), 20 % (Patienten mit malignen Erkrankungen des
GIT) und 25 % (Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT) (Unterschiede nicht
signifikant, p>0,05). Zur Bestimmung der Seroreaktivitäten gegen die ersten 78 N-terminalen
Aminosäuren wurde ein TAg-basierter ELISA angewendet. Seroreaktivitäten von 17 % bis
39 % für HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) in allen drei Serengruppen deuteten auf eine Prä-
senz von IgG-Antikörpern gegen diese Antigene in der allgemeinen Bevölkerung hin. In Se-
ren von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT war die HPyV9-TAg(78aa)-
Seroreaktivität signifikant höher als in jenen von Blutspendern (39 % vs. 34 %, p=0,04). Das
Protokoll zur Untersuchung von Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro-Replikationssystem
für beide Viren identifizierte die Vero-Zelllinie als vergleichsweise gut geeignet. Sie zeigte
die stärkste Zunahme an VP1-mRNA-Kopien beider PyV und erlaubte die Beobachtung zyto-
pathischer Effekte, die Anfärbung viraler Proteine im Immunfluoreszenzassay und die Analy-
se von Spleiß-Vorgängen der frühen Genregionen. Neben für das kleine und große T-Antigen
Zusammenfassung
7
kodierenden, gespleißten mRNAs wurden die bisher unbekannten, alternativen Spleiß-
Produkte HPyV9-145T und HPyV12-84T detektiert. Für HPyV12 wurden weitere Spleiß-
Varianten identifiziert, die nicht-kanonische Spleiß-Sequenzen aufwiesen. Die präsentierten
Ergebnisse tragen erste Erkenntnisse zur Charakterisierung der neuartigen HPyV9 und
HPyV12 bei. Die Schlussfolgerungen zur Geno- und Seroprävalenz erfordern weitere Analy-
sen mit alternativen bzw. größeren Probengruppen. Das Protokoll zur Testung von Zelllinien
sollte weiter optimiert und ggf. auf primäre Zelllinien ausgeweitet werden. Von gesondertem
Interesse wird die Untersuchung des transformierenden Potentials der neuartigen Spleiß-
Varianten der T-Antigene sein, da für diese ein Zusammenhang mit der onkogenen Transfor-
mation von Wirtszellen sowie ein Einfluss auf die Pathogenese vermutet werden kann.
Abkürzungsverzeichnis
8
Abkürzungsverzeichnis
293TT Humane embryonale Nierenzellen, die SV40-LTAg überexprimieren
6x/8x-His 6-/8-fach Histidin-Tag
aa Amino acid (deutsch: Aminosäure)
AIDS Acquired Immune Deficiency Syndrome (deutsch: erworbenes Immun-
defektsyndrom)
ALTO Alternate frame of the Large T Open reading frame (deutsch: Alternati-
ve zum Leserahmen des großen Tumor-Antigens)
APS Ammoniumpersulfat
as Anti-sense
ATP Adenosintriphosphat
BCA Bicinchinonsäure
Bp Basenpaare
BJAB Humane Epstein-Barr-Virus-negative B-Lymphozyten-Zelllinie aus
einem Patienten mit Burkitt-Lymphom
BPCV Bandicoot papillomatosis carcinomatosis virus (PyV aus dem Nasen-
beutler)
BSA Bovines Serumalbumin
BSC-1 Simiane Nierenepithelzellen aus Cercopithecus aethiops
Bub1 Budding uninhibited by benzimidazoles 1 (Mitotischer Checkpunkt Ser-
in-/Threonin-Proteinkinase)
CAM Chorioallantoismembran
CBP CREB-binding Protein (deutsch: CREB-bindendes Protein), transktipri-
oneller Ko-Aktivator
CDK2 Cyclin-dependent kinase 2 (deutsch: Cyklin-abhängige Kinase 2)
cDNA Complementary DNA
CI Cell index (deutsch: Zellindex)
COV Cut-off value (deutsch: Schwellenwert)
CPE Cytopathic effect (deutsch: zytopathischer Effekt)
CR1 Conserved region 1 (deutsch: konservierte Region 1)
CREB cAMP response element-binding protein (deutsch: cAMP Antwortele-
ment-bindendes Protein), Transkriptionsfaktor
CRL7 Cullin-Ring E3 Ubiquitin-Ligase 7
Abkürzungsverzeichnis
9
Da Dalton
DAPI 4’-6-Diamidin-2-phenylindol
DMSO Dimethylsulfoxid
DNA Deoxyribonucleic acid (deutsch: Desoxyribonukleinsäure)
DSMZ Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
DTT Dithiothreitol
E. coli Escherichia coli
E2F eukaryotischer Transkriptionsfaktor 2
ECL Enhanced Chemiluminescence (deutsch: verstärkte Chemilumineszenz)
ELISA Enzyme-linked immunosorbent assay
EM Elektronenmikroskop
ER Endoplasmatisches Retikulum
Erk Extrazellulär regulierte Kinase
FD Fast Digest
FDU Fast Digest Unit
FKS Fötales Kälberserum
Geq Genome equivalent (deutsch: Genomäquivalent)
GIT Gastrointestinaltrakt
HFGC Human fetal glial cells (deutsch: Humane fötale Gliazellen)
His Histidin
hNPC Human embryonic neuronal progenitor cells (deutsch: humane embry-
onale neuronale Vorläuferzellen)
hpi Hours post infection (deutsch: Stunden nach Infektion)
HPTE Human proximal tubule epithelial cells (deutsch: Humane Nie-
renepithelzellen)
HRPO Horseradish peroxidase (deutsch: Meerrettichperoxidase)
Hsc heat shock cognate (deutsch: Hitzeschockprotein)
IFA Immunofluorescence assay (deutsch: Immunfluoreszenztest)
IPTG Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
IRS1 Insulin-Rezeptor Substrat 1
JCRB Japanese Collection of Research Bioresources Cell Bank
Abkürzungsverzeichnis
10
KBp Kilobasenpaare
KI Konfidenzintervall
LB Luria-Bertani
LD Long distance (deutsch: lange Strecke)
LPyV B-Lymphotropes Polyomavirus
LTAg Large tumor antigen (deutsch: Großes Tumor-Antigen)
mAK monoklonaler Antikörper
MAPK Mitogen-aktivierte Proteinkinase
MCC Merkel cell carcinoma (deutsch: Merkel-Zell-Karzinom)
miRNA microRNA
MPyV Murines Polyomavirus
mTAg Middle tumor antigen (deutsch: Mittleres Tumor-Antigen)
MWCOV Molecular weight cut off value (deutsch: Molekulargewichts-
Schwellenwert)
NCCR Non-coding control region (deutsch: Nicht-kodierende Kontrollregion)
NE-AA Non-essential amino acids (deutsch: nicht-essentielle Aminosäuren)
NGS Next generation sequencing
NLS Nuclear localization signal (deutsch: nukleäres Lokalisation-Signal)
NTA Nitrilotriessigsäure
NTC Non-template control
OBD Origin-binding domain (deutsch: Ursprung-bindende Domäne)
ORI Origin of replication (deutsch: Ursprung der Replikation)
p. i. Post infection (deutsch: nach der Infektion)
PAGE Polyacrylamide gel electrophoresis (deutsch: Polyacrylamid-
Gelelektrophorese)
PBS Phosphate buffered saline (deutsch: Phosphat-gepufferte Salzlösung)
PI3K Phosphatidylinositol-3-Kinase
PML Progressive multifokale Enzephalopathie
Pen/Strep Penicillin/Streptomycin
PHFG Primary human fetal glial cells (deutsch: Primäre humane fötale Glia-
zellen)
Abkürzungsverzeichnis
11
PP2A Proteinphosphatase 2A
pRb Retinoblastom-Protein
PrEC Primary human prostate epithelial cells (deutsch: Primäre humane
Prostata-Epithelzellen)
PVDF Polyvinylidenfluorid
qPCR Quantitative PCR
RB Retinoblastom
Ref. Referenz
rev Reverse (deutsch: umgekehrt)
RING Really Interesting New Gene (strukturelle Proteindomäne welche das
Motiv Cys3HisCys4 enthält)
RNA Ribonucleic acid (deutsch: Ribonukleinsäure)
rpm Revolutions per minute (deutsch: Umdrehungen pro Minute)
RPTEC Primary human renal proximal tubule epithelial cells (deutsch: Primäre
humane Nierenproximaltubuläre Epithelzelle)
s Sense (deutsch: Sinn)
SA12 Simian Agent 12 (deutsch: Simianes Agens 12)
SAP Shrimp alkaline phosphatase (deutsch: Alkalische Phosphatase der
Krabbe)
SDS Sodium dodecyl sulfate (deutsch: Natriumdodecylsulfat)
SLE Systemischer Lupus Erythematodes
SOC-Medium Super optimal broth (SOB) Medium mit 20mM Glucose
STAg Small tumor antigen (deutsch: kleines Tumor-Antigen)
SV40 Simianes Virus 40
TAg Tumor-Antigen
TAg (78aa) die bei LTAg und STAg gemeinsamen N-terminalen 78 aa
TEMED Tetramethylethylendiamin
TMB 3,3’,5,5’-Tetramethylbenzidin
truncTAg Truncated T antigen (deutsch: verkürztes Tumor-Antigen)
U Unit (deutsch: Einheit)
UV Ultraviolett
Abkürzungsverzeichnis
12
VHR Variable and host range region (deutsch: variable Region, die die
Wirtsspezifität determiniert)
VP1 Virales Protein 1
Zn Zink
Tabellenverzeichnis
13
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1 Seroepidemiologie der bekannten humanen PyV .................................................... 20
Tabelle 2 Übersicht über bestehende in vitro-Replikationssysteme für HPyV und die hieraus
gewonnenen Erkenntnisse ........................................................................................................ 27
Tabelle 3 SV40-LTAg: Funktionelle Domänen, ihre Motive, Positionen, aa-Sequenzen und
spezifische Funktionen ............................................................................................................. 30
Tabelle 4 Alternative Spleißformen der klassischen TAg bei verschiedenen PyV, ihre Größe
und ihre Funktion ..................................................................................................................... 35
Tabelle 5 Verwendete Zelllinien, ihre Beschreibung und Herkunft ........................................ 38
Tabelle 6 Verwendete Viren bzw. Virusgenome, die dazugehörigen GenBank- Nummern und
ihre Herkunft ............................................................................................................................ 39
Tabelle 7 Verwendete Bakterienstämme und ihr Genotyp ...................................................... 39
Tabelle 8 Verwendete Plasmidkonstrukte und ihre Herkunft .................................................. 40
Tabelle 9 Übersicht der synthetisch hergestellten VP1-Sequenzen ......................................... 40
Tabelle 10 Übersicht der synthetisch hergestellten TAg(78aa)-Sequenzen ............................. 42
Tabelle 11 Verwendete PCR-Assays ....................................................................................... 42
Tabelle 12 Verwendete Primärantikörper ................................................................................ 43
Tabelle 13 Verwendete Sekundärantikörper ............................................................................ 43
Tabelle 14 Überblick über den Einsatz der verschiedenen Restriktionsenzyme ..................... 49
Tabelle 15 Restriktionsansätze für herkömmliche und Fast Digest-Enzyme .......................... 49
Tabelle 16 Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes zur Dephosphorylierung von
restringiertem Vektor ............................................................................................................... 50
Tabelle 17 Reaktionsansatz für die Ligation von Inserts mit Vektor ....................................... 50
Tabelle 18 Reaktionsansatz und Zyklerprogramm für cDNA-Synthese .................................. 52
Tabelle 19 PCR-Ansatz und Zyklerbedingungen für konventionelle PCRs ............................ 52
Tabelle 20 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Mycoplasmen-PCR ........................ 53
Tabelle 21 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für PCR zur generischen Detektion von
PyV ........................................................................................................................................... 53
Tabelle 22 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Nested LD-PCR .............................. 54
Tabelle 23 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für qPCR .............................................. 55
Tabelle 24 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Sequenzierung nach Sanger ........... 55
Tabelle 25 Rezeptur für selbstgefertigte Polyacrylamid-Gele ................................................. 58
Tabelle 26 Rezeptur für 4 x Laemmli-Puffer ........................................................................... 59
Tabelle 27 Verdünnungen von Primärantikörpern im Western Blot ....................................... 60
Tabelle 28 Verdünnungen von Primärantikörpern im IFA ...................................................... 63
Tabelle 29 Übersicht über adhärente Zelllinien und ihre Nährmedien .................................... 64
Tabelle 30 Analyse von Tumorexzisaten mit HPyV12-VP1-spezifischer qPCR .................... 69
Tabelle 31 Daten von Patienten mit positivem Ergebnis aus der HPyV12-VP1-qPCR .......... 70
Tabelle 32 Blutspenderseren mit positiver Reaktion im ELISA gegen VP1 von HPyV9,
HPyV12 oder gegen VP1 beider PyV ...................................................................................... 75
Tabelle 33 Patientenseren positiv jeweils gegen VP1 von HPyV9 und HPyV12 oder gegen
beide PyV ................................................................................................................................. 76
Tabelle 34 Blutspenderseren positiv jeweils gegen TAg(78aa) von HPyV9, HPyV12 und
BKPyV ..................................................................................................................................... 78
Tabellenverzeichnis
14
Tabelle 35 Ergebnisse aus dem TAg(78aa)-ELISA bezüglich Doppel- oder Dreifachreaktivität
gegen HPyV9, HPyV12 und BKPyV in der Kontrollgruppe ................................................... 78
Tabelle 36 TAg(78aa)-ELISA-Reaktivitäten der Seren von Patienten mit nicht-malignen und
mit malignen Erkrankungen des GIT, unterteilt nach Geschlecht. .......................................... 79
Tabelle 37 Ergebnisse aus dem TAg(78aa)-ELISA bezüglich Doppel- oder Dreifachreaktivität
gegen HPyV9, HPyV12 und BKPyV innerhalb der zwei Patientengruppen ........................... 80
Tabelle 38 Seren von Blutspendern und Patienten (nicht-maligne und maligne Erkrankungen)
mit Reaktivität gegen das VP1 und das TAg(78aa) von HPyV9 und HPyV12 ....................... 82
Tabelle 39 Übersicht der Ergebnisse für Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen ... 83
Tabelle 40 Übersicht der Ergebnisse für Seren von Patienten ohne malignen Erkrankungen . 84
Tabelle 41 Zusammenfassung der Ergebnisse des Kapsomer-basierten ELISA ..................... 85
Tabelle 42 Zusammenfassung der Ergebnisse des TAg-basierten ELISA .............................. 85
Tabelle 43 Transfektionsbedingungen der für die Replikationstestung von HPyV9 und
HPyV12 verwendeten Zelllinien .............................................................................................. 86
Tabelle 44 Kopienzahl der HPyV9-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (=25 ng RNA) für acht mit
HPyV9-Genomen transfizierte Zelllinien ................................................................................ 93
Tabelle 45 Kopienzahl der HPyV12-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (=25 ng RNA) für neun
mit HPyV12-Genomen transfizierten Zelllinien ...................................................................... 94
Tabelle 46 Spleiß-Sequenzen für HPyV9-sTAg, -LTAg, und -145T ...................................... 99
Tabelle 47 Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Motive aller experimentell bestimmten HPyV12-
TAg-mRNAs .......................................................................................................................... 104
Tabelle 48 Auftreten der HPyV12-TAg-Varianten in den diversen Zelllinien ...................... 105
Abbildungsverzeichnis
15
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1 Schematische Darstellung eines Polyomaviruspartikels. .................................... 18
Abbildung 2 Genomkarte von HPyV9 ..................................................................................... 21
Abbildung 3 Genomkarte von HPyV12 ................................................................................... 22
Abbildung 4 Ausprägungen des MCC. .................................................................................... 24
Abbildung 5 An Trichodysplasia spinulosa erkrankter Patient. .............................................. 25
Abbildung 6 Das reguläre Spleiß-Muster der frühen Genregion von PyV .............................. 29
Abbildung 7 Die Domänen von LTAg und sTAg am Beispiel von SV40. .............................. 32
Abbildung 8 Schema der Intron-spannenden PCR zur Identifikation von gespleißtem LTAg 53
Abbildung 9 Schema der Nested Long-Distance PCR ............................................................. 54
Abbildung 10 Das xCELLigence™-System. ........................................................................... 67
Abbildung 11 Konsensus-Spleiß-Stellen von Major- und Minor-Klasse Introns .................... 68
Abbildung 12 Alters- und Geschlechtsverteilung der Spender der für die vorliegenden
Untersuchungen zur Verfügung stehenden Seren. ................................................................... 71
Abbildung 13 Repräsentative Darstellung der Wachstumskurven von E. coli RosettaBlueTM
(DE3)pLacI nach der Transformation mit VP1-Konstrukten .................................................. 72
Abbildung 14 Aufreinigung von VP1-Proteinen. .................................................................... 73
Abbildung 15 Identifikation von VP1-rekombinanten Plasmiden in E. coli-Klonen. ............. 73
Abbildung 16 Testung von Seren gesunder Blutspender und Patienten mit malignen und
nicht-malignen Erkrankungen auf Reaktivität gegen HPyV9-VP1 und HPyV12-VP1 mittels
Kapsomer-basiertem ELISA. ................................................................................................... 75
Abbildung 17 Testung von Seren gesunder Blutspender und Patienten mit malignen und
nicht-malignen Erkrankungen auf Reaktivität gegen LTAg (78aa) von HPyV9, HPyV12,
BKPyV und MCPyV mittels ELISA. ....................................................................................... 77
Abbildung 18 Korrelationsanalysen der Seroreaktivitäten gegen HPyV9-, HPyV12- und
BKPyV-TAg(78aa). ................................................................................................................. 81
Abbildung 19 Korrelationsanalyse von Seren, die im ELISA positiv gegen VP1 und
TAg(78aa) eines PyV waren .................................................................................................... 82
Abbildung 20 Beobachtung von PyV-Infektionen mittels xCELLigence™ . .......................... 89
Abbildung 21 Zytopathische Effekte sechs Tage nach Transfektion von Vero-Zellen mit
HPyV9-Genomen. .................................................................................................................... 90
Abbildung 22 Synzytienbildung nach der Transfektion von Vero-Zellen mit HPyV9-
Genomen. ................................................................................................................................. 91
Abbildung 23 Plaque-ähnliche Formationen nach der Transfektion von Verozellen mit
HPyV12-Genomen. .................................................................................................................. 91
Abbildung 24 Kopienzahl der HPyV9-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (entspricht 25 ng RNA)
zu verschiedenen Erntezeitpunkten in sechs Zelllinien, Quantifizierung mittels spezifischer
HPyV9-VP1-qPCR................................................................................................................... 92
Abbildung 25 Kopienzahl der HPyV12-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (entspricht 25 ng
RNA) zu verschiedenen Erntezeitpunkten in neun Zelllinien, Quantifizierung mittels
spezifischer HPyV12-VP1-qPCR ............................................................................................ 94
Abbildung 26 Spezifische Anfärbung von HPyV12-VP1 bei Plaque-Bildung. ....................... 95
Abbildung 27 Spezifische Anfärbung von HPyV12-VP1. ....................................................... 96
Abbildungsverzeichnis
16
Abbildung 28 Schema der experimentell ermittelten mRNAs der frühen Genregion von
HPyV9. ................................................................................................................................... 100
Abbildung 29 Schema der experimentell ermittelten mRNAs der frühen Genregion von
HPyV12. ................................................................................................................................. 101
Abbildung 30 Schema weiterer experimentell ermittelter mRNAs der frühen Genregion von
HPyV12. ................................................................................................................................. 103
Abbildung 31 Alignment der N-terminalen 78 aa der frühen Genregionen von BKPyV,
HPyV9, HPyV12 und MCPyV............................................................................................... 111
1 Einleitung
17
1 Einleitung
Bis zu den 1950er Jahren wurde ein Zusammenhang zwischen Viren und der Entstehung von
Krebs ausgeschlossen. Sarah Stewart war eine der ersten Forscherinnen, die sich mit diesem
Thema beschäftigte, und spielte somit eine wichtige Rolle in der Entwicklung des For-
schungsfeldes Virale Onkologie (1). Ludwig Gross experimentierte im Jahr 1951 mit zell-
freien Extrakten von an Leukämie erkrankten Mäusen und zeigte, dass diese in neugeborenen
Mäusen für die Entstehung von Tumoren in der Ohrspeicheldrüse verantwortlich waren (2).
Sarah Stewart bestätigte diese Ergebnisse, und zusammen mit Bernice Eddy identifizierte sie
1959 in den zellfreien Extrakten ein Virus, welches für die Entstehung einer Vielzahl von
Tumoren verantwortlich war (3). Basierend auf ihren Resultaten benannten sie dieses Virus
mit Polyoma, wobei das Präfix lat. poly- für viele und das Suffix lat. –oma für Tumor steht.
Bei dem von ihnen entdeckten Polyomavirus (PyV) handelte es sich um das Murine Po-
lyomavirus (MPyV). Seither wurden diverse, mit dem MPyV verwandte Polyomaviren in
Säugetieren und Vögeln identifiziert.
Die ersten humanen PyV, BKPyV und JCPyV, wurden 1971 entdeckt (4, 5). Erst ab dem Jahr
2007 wurden weitere 11 humane Vertreter der Virusfamilie Polyomaviridae identifiziert (sie-
he S. 19). Die gehäufte Entdeckung neuer humaner PyV in weniger als 10 Jahren hat diese
Virusfamilie wieder in den Fokus der Forschung gerückt. Einige der humanen PyV sind mit
Erkrankungen assoziiert (siehe S. 22). Zum Beispiel ist eine Assoziation des Merkel-Zell-PyV
(MCPyV) mit einer humanen Tumorerkrankung (Merkel-Zell-Karzinom, MCC) belegt. Da
alle PyV sogenannte Tumor-Antigene (TAgs) exprimieren und daher als potentiell tumorigen
betrachtet werden, ist diese Virusfamilie von grundsätzlichem Forschungsinteresse (siehe S.
28). Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit der ersten Charakterisierung der kürz-
lich am Robert Koch-Institut im Fachgebiet 12 „Mumps, Masern, Röteln und Viren bei Ab-
wehrschwäche“ entdeckten, neuartigen humanen PyV HPyV9 und HPyV12.
1.1 Polyomaviren
Polyomaviren sind kleine, unbehüllte DNA-Viren mit einer Kapsidgröße von 45-55 nm. Jedes
Kapsid setzt sich aus 72 Kapsomeren ikosahedrisch zusammen, wobei jedes Kapsomer aus
fünf Haupt-Strukturproteinen (viral protein 1, VP1) besteht, die über intramolekulare Disul-
fid-Brücken stabilisiert werden (6). VP1 stellt den Hauptbestandteil des viralen Kapsids dar,
wobei jedes VP1 mit einem VP2 oder VP3 verankert ist, welche zur Innenseite des Kapsids
gerichtet sind (Abbildung 1). Das VP1 bestimmt die Antigenität und die Rezeptorspezifität
des jeweiligen PyV (7).
1 Einleitung
18
Abbildung 1 Schematische Darstellung eines Polyomaviruspartikels.
VP1 ist Haupt-Bestandteil des Kapsids und bildet zusammen mit VP2 und VP3 das Kapsid. Die genomische DNA ist mit
Histonen verpackt (http://education.expasy.org/images/Polyomaviridae_virion.jpg, Stand 24.02.16)
Das zirkuläre, doppelsträngige PyV Genom ist mit Histonen verpackt (8). Die typische Orga-
nisation des bidirektional abgelesenen Genoms der Polyomaviren umfasst in einer Richtung
die Gene für das VP1, VP2 und VP3 (späte Genregion) und in entgegengesetzter Richtung die
für das Large Tumor-Antigen (LTAg) und das Small Tumor-Antigen (sTAg) (frühe Genregi-
on). Beide Regionen sind durch eine nicht-kodierende Region (NCCR, non-coding control
region) getrennt. Weitere Details zur Organisation des PyV-Genoms sind Kapitel 1.3 (siehe
S. 28) zu entnehmen.
Polyomaviren wurden zunächst mit Papillomviren in einer Virusfamilie (Papovaviridae) zu-
sammengefasst. Seit dem Jahr 2000 sind PyV von den Papillomviren taxonomisch getrennt
und der Familie Polyomaviridae zugeordnet (9). Weiterhin wurde zunächst die Einteilung in
die drei Genera Orthopolyomavirus, Wukipolyomavirus und Avipolyomavirus diskutiert (10).
Eine einheitliche Klassifizierung und Nomenklatur gab es dabei nicht. Die Benennung erfolg-
te meist nach der assoziierten Erkrankung, dem Ort der Entdeckung oder mittels fortlaufender
Nummerierung. Erst im Jahr 2016 wurde eine einheitliche Klassifizierung und Nomenklatur
vorgeschlagen und vom Exekutiv-Komitee des International Committee on Taxonomy of Vi-
ruses akzeptiert. Hierbei sind die PyV-Spezies nach dem latinisierten Wirtsnamen benannt
und in 4 Genera (Alpha-, Beta-, Gamma-, und Deltapolyomavirus) eingeteilt (11).
1 Einleitung
19
1.1.1 Bisher beschriebene humane Polyomaviren
Die ersten humanen PyV, BKPyV und JCPyV, wurden 1971 entdeckt und nach den Initialen
der Index-Patienten benannt (4, 5). Seit 2007 wurden weitere humane Vertreter der Po-
lyomaviridae identifiziert:
• Karolinska Institutet PyV (KIPyV) (12)
• Washington University PyV (WUPyV) (13)
• Merkel Cell PyV (MCPyV) (14)
• HPyV6 (15)
• HPyV7 (15)
• Trichodysplasia spinulosa-assoziiertes PyV (TSPyV) (16)
• HPyV9 (17)
• Malawi PyV (MWPyV) – auch HPyV10/MXPyV – (18-20)
• Saint Louis PyV (STLPyV) (21)
• HPyV12 (22)
• HPyV13 (23).
Humane PyV (HPyV) sind weltweit verbreitet. Tabelle 1 gibt einen groben Überblick über die
serologischen Durchseuchungsraten von HPyV, welche bei 23-90 % liegen können. In die
angegebenen Seroprävalenzen sind jedoch Daten aus Studien mit Proben verschiedenster ge-
ographischer Herkunft, pathologischer Hintergründe und diversen Untersuchungsmethoden
eingeflossen. An dieser Stelle wird daher auf einen Review von Ehlers und Wieland verwie-
sen, welcher eine sehr detaillierte Übersicht über die Herkunft der in den jeweiligen Studien
verwendeten Proben gibt (24).
1 Einleitung
20
Tabelle 1 Seroepidemiologie der bekannten humanen PyV
Humanes PyV
Seropositive Individuen (%)
Referenz
BKPyV
55-90
(25-28)
JCPyV
44-90
(25-28)
KIPyV
55-90
(25)
WUPyV
69-98
(25)
MCPyV
60-87
(15, 25, 29-32)
HPyV6
69
(15, 29)
HPyV7
35-45
(15, 29)
TSPyV
75
(29, 33, 34)
HPyV9
25-47
(33, 35-37)
HPyV10/MXPyV/MWPyV
42-75
(38, 39)
STLPyV
68-70
(40)
HPyV12
23
(22)
HPyV13
-
-
- bisher nicht untersucht
1.1.2 Das humane Polyomavirus 9
Das Humane Polyomavirus 9 (HPyV9) wurde im Serum eines immunsupprimierten Nieren-
transplantatempfängers mit PCR-basierten Methoden entdeckt (17). Später wurde das
HPyV9-Genom ebenfalls auf humaner Haut gefunden (41). Eine erste Studie zur Detektion
von HPyV9-DNA im Serum von immunsupprimierten Patienten nach einer Nierentransplan-
tation ergab eine Genoprävalenz von 33 bis 46 % (42). In ersten serologischen Untersuchun-
gen zeigten 47 % der Erwachsenen (n=328) und 20 % der Kinder (n=101) Antikörper gegen
das VP1 von HPyV9 (35). Weitere Untersuchungen geben eine Durchseuchung der allgemei-
nen Bevölkerung von 25 % an (33, 36, 37, 43). HPyV9 ist genetisch nah mit dem B-
Lymphotropen Polyomavirus (LPyV) der afrikanischen grünen Meerkatze verwandt. Die VP1
beider Viren sind zu 87 % identisch und kreuzreagieren in einem Kapsomer-basierten ELISA
(35, 36, 44).
1 Einleitung
21
Abbildung 2 Genomkarte von HPyV9
Das HPyV9-Genom umfasst 5026 Bp und wird bidirektional abgelesen. Es gliedert sich in eine frühe Genregion,
welches für small T (kleines Tumor-Antigen) und large T (großes Tumor-Antigen) kodiert, und eine späte Gen-
region, welche für VP1-3 (Virale Proteine 1-3) kodiert. Die jeweiligen kodierenden Sequenzen sind als Balken in
Rot (frühe Region) und Blau (späte Region) dargestellt. Die Spitzen zeigen die Transkriptionsrichtung an.
NCCR: Nicht-kodierende Kontrollregion (orange markiert).
Abbildung 2 zeigt das Genom von HPyV9, welches eine Länge von 5026 Bp hat und über die
für PyV typische Genomorganisation verfügt (siehe S. 28). Lednicky et al. publizierten die
Sequenz eines HPyV9-Genoms, welche sich von der NCCR des 2011 entdeckten HPyV9 un-
terscheidet (45).
1.1.3 Das humane Polyomavirus 12
Das Humane Polyomavirus 12 (HPyV12) wurde erstmals in Lebermetastasen von Patienten
mit einer malignen Erkrankung des Kolons detektiert (22). Erste serologische Daten ergaben
eine Seroprävalenz von 23 % in Erwachsenen (n=299) und 17 % in Kindern (n=74) (22). Die
primäre Infektion erfolgt demnach in der Kindheit (12 % positive Individuen in der Alters-
gruppe 2 bis 5 Jahre, 26 % in der Altersgruppe 6 bis 11 Jahre). Ein Unterschied zwischen
weiblichen und männlichen Individuen konnte nicht festgestellt werden.
HPyV9
5026 Bp
VP2
large T
NCCR
small T
VP3
VP2
VP1
1 Einleitung
22
Abbildung 3 Genomkarte von HPyV12
Das HPyV12-Genom umfasst 5033 Bp und wird bidirektional abgelesen. Es gliedert sich in eine frühe Genregi-
on, welches für small T (kleines Tumor-Antigen) und large T (großes Tumor-Antigen) kodiert sowie einen hypo-
thetischen ALTO-Leserahmen beinhaltet, und eine späte Genregion, welche für VP1-3 (Virale Proteine 1-3)
kodiert. Die jeweiligen kodierenden Sequenzen sind als Balken in Rot (frühe Region) und Blau (späte Region)
dargestellt. Die Spitzen zeigen die Transkriptionsrichtung an. NCCR: Nicht-kodierende Kontrollregion (orange
markiert).
HPyV12 verfügt über ein Genom von 5033 Bp und ebenfalls über die für PyV typische Ge-
nom-Organisation (siehe Abbildung 3). Des Weiteren verfügt HPyV12 über einen hypotheti-
schen ALTO-Leserahmen (46). Es konnte keine nahe Verwandtschaft zu einem bisher be-
kannten humanen oder tierischen PyV festgestellt werden (22).
1.1.4 Assoziation von PyV mit Erkrankungen des Menschen
Die Primärinfektion mit PyV zeigt meist einen milden oder asymptomatischen Verlauf und
resultiert in einer lebenslangen Persistenz (47). Bei immunsupprimierten Individuen können
PyV jedoch schwerwiegende Erkrankungen hervorrufen.
BKPyV steht bei Empfängern von Nieren- und Knochenmark-Transplantaten mit Nephropa-
thie und hämorrhagischer Zystitis in Zusammenhang (48). Im schlimmsten Fall kann hieraus
HPyV12
5033 Bp
VP1
VP2 VP3
small T
Alto
large T
small T
NCCR
1 Einleitung
23
der Verlust des Nieren-Transplantates resultieren. Des Weiteren wird BKPyV als Co-Faktor
von Prostatakrebs diskutiert (49-53).
JCPyV wird mit der Entstehung von progressiver multifokaler Leukoenzephalopathie (PML)
in AIDS-Patienten und Patienten, bei denen die T-Zell-Infiltration unterdrückt ist, in Zusam-
menhang gebracht (54). Bei PML handelt es sich um eine degenerative Erkrankung des Zent-
ralnervensystems, welche mit motorischen und kognitiven Störungen einhergeht. Auch die
Beteiligung von JCPyV an anderen Erkrankungen wie z.B. systemischer Lupus erythemato-
des SLE wurde untersucht (55).
Das MCPyV ist mit einem seltenen, sehr aggressiven Hauttumor, dem Merkel-Zell-Karzinom
(Merkel cell carcinoma, MCC), assoziiert und damit das erste humane PyV, für das ein ur-
sächlicher Zusammenhang mit einer Tumorerkankung im Menschen nachgewiesen ist (14).
MCC tritt bevorzugt bei älteren Personen auf, doch auch UV-Exposition, Organtransplantati-
on oder HIV-Erkrankung gelten als Risikofaktoren. Beispiele für das klinische Bild eines
MCC sind in Abbildung 4 dargestellt. Die Inzidenz des MCC hat in den letzten Jahren deut-
lich zugenommen und geht mit einer Mortalitätsrate von 35 % bis 50 % einher (56-60). Zur-
zeit werden verschiedene Behandlungsmethoden getestet; bisher ist aber keine Therapie zur
Heilung von fortgeschrittenem MCC verfügbar.
1 Einleitung
24
Abbildung 4 Ausprägungen des MCC.
Klinische Beispiele für das Merkelzellkarzinom. A: Läsion des Augenlids, zunächst als schnell wachsendes
Hagelkorn verkannt. B: MCC an der Gesäßbacke eines HIV-Patienten. C: Läsion des Fingers. D: MCC an einem
sonnenexponierten Hautbereich eines Mannes. Mit freundlicher Genehmigung von (61)
88 % aller MCC-Patienten weisen Antikörper gegen MCPyV-VP1 auf (25, 31, 62, 63), und in
67 % bis 100 % aller MCC-Tumoren liegt das MCPyV-Genom in das Wirtsgenom integriert
vor, wobei der LTAg-Leserahmen mutiert ist (14, 64-70). MCPyV exprimiert in den MCC-
Tumoren sTAg und in 38 % der MCC-Fälle eine trunkierte LTAg-Form (truncTAg), der die
DNA-bindende Domäne und die Helikase-Aktivität fehlen (66, 68-70). Hierdurch wird die
virale Replikation unterbunden. Die potentielle Onkogenität hingegen bleibt erhalten (69).
Das truncTAg unterstützt vermutlich die Zellteilung in MCC-Zelllinien, indem es den Tumor-
suppressor pRB inhibiert (71-74).
Das TSPyV ist assoziiert mit der Krankheit Trichodysplasia spinulosa, einer seltene Erkran-
kung der Hautfollikel, welche bei stark immunsupprimierten Individuen nach Transplantation
auftritt, bevorzugt im Gesicht (75, 76). Patienten mit Trichodysplasia spinulosa bilden auf der
Nase Spicules, dornartige Hornhautveränderungen, aus (siehe Abbildung 5). Aus ihnen wurde
1 Einleitung
25
das TSPyV erstmals isoliert. Eine TSPyV-Infektion kann erfolgreich durch orale Verabrei-
chung von Valganciclovir und Cidofovir behandelt werden (16, 77).
Abbildung 5 An Trichodysplasia spinulosa erkrankter Patient.
A: Insbesondere an der Nase sind charakteristische spicules (dornartige Hautfortsätze) ausgebildet. B: Aus den
spicules wurde das TSPyV identifiziert. Mit freundlicher Genehmigung von (16).
Für KIPyV und WUPyV wurde eine Assoziation mit Erkrankungen des Respirationstraktes
vermutet, bisher aber nicht bestätigt (78-80). Ebenso kontrovers wird die Beteiligung von
MWPyV/HPyV10 an der Entstehung von Analwarzen betrachtet (18, 20).
HPyV7 wurde kürzlich mit einem juckenden Ausschlag bei Lungentransplantierten in Ver-
bindung gebracht (81). HPyV6, HPyV9, HPyV12 und HPyV13 wurden bisher mit keiner Er-
krankung assoziiert. Gleichwohl werden alle humanen PyV aufgrund der Expression von Tu-
mor-Antigenen als potentiell tumorigen betrachtet (siehe S. 28).
1 Einleitung
26
1.2 Der virale Vermehrungszyklus und Zellkultursysteme von Polyomavi-
ren
Beim Vermehrungszyklus von PyV wird zwischen der lytischen Infektion permissiver Wirts-
zellen und der abortiven Infektion nicht-permissiver Zellen unterschieden. Bei ersterer führt
die frühe Genexpression zur Replikation viraler DNA, gefolgt von der späten Genexpression
und der Bildung und Freisetzung produktiver viraler Nachkommen. Dies führt zum Tod der
Wirtszelle. Im Detail bindet ein Polyomavirus zunächst an Zelloberflächenrezeptoren, wobei
je nach PyV die involvierte Zelloberflächenstruktur sehr spezifisch sein kann (82, 83). Die
Virus-Rezeptor-Interaktion determiniert die Wirtsspezifität und den Gewebetropismus eines
PyV. Aktuelle Studien zeigen jedoch am Beispiel von HPyV9, dass PyV an spezielle Wirte
adaptieren können (84). Das PyV wird per Endozytose in die Wirtszelle aufgenommen und
zum Endoplasmatischen Retikulum (ER) transportiert (85, 86). Es gibt Hinweise dafür, dass
beim Übergang des PyV aus dem ER in das Zytosol mit dem ER-assoziierte Abbau-
Stoffwechselwege zum Einsatz kommen (85-89). Im Zytosol beginnt das sogenannte disas-
sembly, der Abbau des Viruspartikels, wahrscheinlich mit Hilfe von eukaryotischen Chapero-
nen der Hsp70-Familie (90). Nachfolgend wird die virale DNA in den Nukleus transportiert
und es beginnt die Expression der frühen Gene. Die genauen Vorgänge des Eintritts in den
Zellkern sind bis dato unbekannt und die vorliegenden Studien haben teilweise konträre Er-
gebnisse. Bei BKPyV findet der Eintritt ungefähr 24 Stunden nach der Infektion statt (91). Es
folgt die DNA-Replikation, neue Genome und Kapsid-Proteine werden produziert und zu
neuen Virionen zusammengebaut (assembly), welche dann die Wirtszelle durch Lyse verlas-
sen (lytische Infektion) (92, 93). In einer nicht-permissiven Zelle verläuft die Infektion abor-
tiv. Dies geht mit einer Expression von Tumor-Antigenen einher, welche Produkte von Tu-
morsuppressorgenen wie p53 und pRB binden. Dies kann dann in einer onkogenen Transfor-
mation resultieren (94).
Die beschriebenen Erkenntnisse wurden überwiegend durch Arbeiten in Zellkultursystemen
mit dem simianen Polyomavirus SV40 sowie mit BKPyV erhalten. In vitro-
Replikationssysteme stellen ein ideales Werkzeug zur Untersuchung der Biologie eines Virus
und insbesondere des viralen Vermehrungszyklus dar, denn hierin ist es möglich, das Virus
unter Bedingungen zu analysieren, die mit der in vivo-Situation vergleichbar sind.
Es existieren Zellkultursysteme für BKPyV, JCPyV und das simiane SV40 sowie erste Ansät-
ze für ein Zellkultursystem für MCPyV (siehe Tabelle 2). Für alle weiteren humanen Po-
lyomaviren sind gegenwärtig keine Zellkultursysteme verfügbar. Bei der Passagierung von
1 Einleitung
27
SV40, BKPyV und JCPyV wurden jeweils Virusisolate verschiedener Herkunft verwendet.
Die Kultivierung von BKPyV wurde in seiner natürlichen Wirtszelle, in primären humanen
Nierenepithelzellen, untersucht (91). In dieser Zelllinie findet ein lytischer Vermehrungszyk-
lus von BKPyV statt, welcher mit einer starken Expression des Tumor-Antigens einhergeht.
In weiteren Zelllinien der Niere, der Prostata und der Speicheldrüsen konnte ebenfalls eine
produktive Infektion beobachtet werden (95-98). Für JCPyV wurden Gliazellen und Oli-
godendrozyten als Zellkultursysteme etabliert (99, 100). Bei Versuchen, ein geeignetes Zell-
kultursystem für MCPyV zu etablieren, wurde ein alternativer Ansatz gewählt: Für das
MCPyV wurden drei Zelllinien identifiziert, die eine Replikation eines synthetischen - auf
einer Konsensus-Sequenz mehrerer MCPyV-Genome basierenden - MCPyV-Genoms erlaub-
ten. Es konnte jedoch keine Übertragung neuer viraler Partikel und deren Freisetzung aus der
Zelle beobachtet werden (101). Weitere Studien stellen humane dermale Fibroblasten und
PFSK-1-Zellen als potentielle permissive Zelllinien für MCPyV vor (105, 106).
Tabelle 2 Übersicht über bestehende in vitro-Replikationssysteme für HPyV und die hieraus gewonnenen
Erkenntnisse
HPyV
permissive Zelllinie
Erkenntnisse/Beobachtungen
Ref.
BKPyV (Stamm
ATCC VR-837)
HPTE
Lytische Infektion
TAg Expression 36 h p. i.
Replikation viraler DNA
Expression der Kapsid-DNA und Produktion von Virus-
Nachkommen 48 h p. i.
Stärkste Expression von TAg 7 Tage p. i.
(91)
293
CPE
Vermehrung
BKPyV Stamm
Dunlop, TU
BKV-transformierte
BSC-Zellen
PrEC, RPTEC
Expression eines truncTAgs
Lytische Infektion
(95)
BKPyV/JCPyV
Archetypen
293TT
HUV-EC-C
Effiziente Vermehrung
(96,
97)
BKPyV
Speicheldrüsen-
Zelllinie
Produktive Infektion
(98)
BKPyV Stamm
UT und Dele-
tionsderivate
SVG (primäre fetale
Gehirnzellen mit
SV40-LTAg)
Expression später viraler Proteine VP1, VP2/3, Agnopro-
tein
(102)
JCPyV Stamm
586
SK-EP
HFGC
PHFG
Kein CPE nach 4 Wochen
Effiziente Vermehrung
(5,
100)
1 Einleitung
28
Rat2
JCPyV Stamm
Mad1/SVEΔ
humane primäre
Astrozyten
Ansteigende Expression von TAg 5 Tage p. i.
Späte Proteine (VP1, Agnoprotein)
Akkumulation von TAg und VP1 im Nukleus
Agnoprotein perinukleär lokalisiert
(103)
JCPyV Stamm
Mad1
hNPC/ Oligodendro-
zyten
Produktive Infektion in beiden Zelltypen
(99)
MCPyV
(MCPyV-HF,
synthetisches
Konsensus-
Genom)
Hek293, H1299,
PFSK-1
Virale DNA-Replikation
Detektion von Partikeln im EM
Keine Übertragung von Zelle zu Zelle
Peak der Protein-Expression 2-4 Tage p. i. in PFSK-1
Kontinuierliche Protein-Expression über 12 Tage in 293
und H1299
(101,
104)
MCPyV
Humane dermale
Fibroblasten
ermöglichen einen gesamten Lebenszyklus von MCPyV
(105)
MCPyV
PFSK-1
semi-permissives Replikationssystem, miRNA-Analysen
(106)
1.3 Das Polyomavirus-Genom und alternative Spleißvorgänge in der frühen
Genomregion
Das PyV-Genom besitzt eine Größe von ungefähr 5 bis 5,5 Kbp, wird bidirektional abgelesen
(vergleiche Abbildung 2 und Abbildung 3) und gliedert sich in drei Regionen:
• Die frühe Region, welche für die regulatorischen Tumor-Antigene (LTAg, sTAg) ko-
diert.
• Die späte Region, die für die Gene der Struktur-Proteine VP1, VP2 und VP3 kodiert.
Diese Leserahmen sind in entgegengesetzter Richtung und überlappend angeordnet.
• Die nicht-kodierende regulatorische Region (NCCR). Die NCCR ist zwischen der frü-
hen und der späten Region lokalisiert und trägt die Motive (origin of replication, Bin-
destellen für LTAg, Transkriptionspromotoren etc.) für die Regulation der DNA-
Replikation und der Transkription.
Für einige PyV wurden zusätzliche frühe Genprodukte beschrieben. Hierzu gehören Tumor-
Antigen- (TAg) Varianten (siehe hierzu ausführlich S. 29), das Agnoprotein (SV40 (107),
BKPyV, JCPyV, weitere Säugetier-PyV, siehe Review (108)), eine miRNA (SV40 (109,
110), SA12 (78), BPCV (111), MPyV (112), BKPyV (113), JCPyV (113), MCPyV (114,
1 Einleitung
29
115), (92)), das VP4 von SV40 (116) und das ALTO Protein von MCPyV (46) und TSPyV
(117).
1.3.1 Die frühe Genregion: Tumor-Antigene
Aus der frühen Region der PyV-Genome werden durch alternatives Spleißen regulär mRNAs
erzeugt, die für mindestens zwei TAg partiell unterschiedlicher Sequenz kodieren. Von in der
Regel ungespleißter mRNA wird sTAg (ca. 180 aa) translatiert (Abbildung 6, A). STAg-
kodierende mRNAs weisen bei einigen PyV ein Intron auf, das hinter dem Stopp-Kodon des
sTAg positioniert ist und damit den sTAg-Leserahmen nicht unterbricht (Abbildung 6, B). Bei
den sTAg-kodierenden mRNAs anderer PyV liegt die Spleißdonor-Stelle kurz vor dem Stopp-
Kodon des sTAg-Leserahmens. Hierdurch entsteht ein zweites, sehr kurzes Exon (Abbildung
6, C). Durch zwei Spleiß-Stellen, die sich in der Mitte des sTAg-Leserahmens (Spleiß-Donor)
und hinter dem Stopp-Kodon des sTAg-Leserahmens (Spleiß-Akzeptor) befinden, wird mit-
tels Spleißen eine mRNA gebildet, die zwei Exons beinhaltet und für ein längeres Genprodukt
kodiert (>700 aa), das LTAg (Abbildung 6, D). Bei einigen PyV liegt das zweite Exon in ei-
nem Leseraster, der sich von dem des 1. Exons (Leseraster 1) unterscheidet (zum Beispiel bei
MCPyV in Leseraster 3 (69)). Das 1. Exon des LTAg-Leserahmens kodiert für circa 70 aa
und ist identisch mit dem 5´-Bereich des sTAg-Leserahmens.
Abbildung 6 Das reguläre Spleiß-Muster der frühen Genregion von PyV
(A) sTAg-kodierende ungespleißte mRNA. (B) Intron hinter dem Stopp-Kodon; der sTAg-Leserahmen ist nicht
unterbrochen. (C) Ein Intron im sTAg-Leserahmen; Leserahmen besteht aus 2 Exons. (D) Durch alternatives
Spleißen entsteht der durch ein Intron unterbrochene LTAg- Leserahmen.
sTAg
Exon
Transkript
Intron
LTAg
sTAg
Terminationskodon
A
B
C
D
sTAg
1 Einleitung
30
TAg übernehmen wichtige Aufgaben während der viralen Transkription und Replikation
(118-121). STAg und LTAg sorgen dafür, dass die infizierte Zelle in die S-Phase des Zellzyk-
lus eintritt (121, 122). Hierdurch werden die für die Virusvermehrung notwendigen Bedin-
gungen geschaffen. Zusätzlich ist das LTAg durch seine Helikase-Aktivität in der Lage, zellu-
läre Replikationsfaktoren für die Replikation der Virus-DNA zu rekrutieren (121). Ebenfalls
ist es an der Transformation von Wirtszellen beteiligt. Nachfolgend sind die Domänen des
LTAg und ihre Funktion am Beispiel des SV40-LTAg detailliert beschrieben. Tabelle 3 und
Abbildung 7 illustrieren dies.
Tabelle 3 SV40-LTAg: Funktionelle Domänen, ihre Motive, Positionen, aa-Sequenzen und spezifische
Funktionen
Domäne
Motiv
Position
aa
Interaktion mit
Funktion
Ref.
J
CR1
13-17
LMDLL
Ko-Aktivator der Tran-
skription p300, Protei-
ne der RB-Familie
homolog zu conserved
region 1 (CR1) der
Adenovirus frühen
Genregion 1A,
Inhibition
(121,
123-
129)
Hsc70
42-47
HPDKGG
Proteinen der Hsc70-
Familie
Aktivierung der ATPa-
se-Funktion für effizi-
ente virale DNA-
Replikation
Linker
YGS/T
86-88
YGT
korrekte Faltung der J-
Domäne
Bub1
91-95
WEQWW
Checkpoint-Protein der
mitotischen Spindel
CUL7
98-102
FNEEN
Cullin 7 (CUL7), Insu-
lin-Rezeptor-Substrat 1
(IRS1)
Transformation der
Wirtszelle
LXCXE
103-107
LFCSE
Proteine der RB-
Familie (pRB), Re-
tinoblastoma-ähnliche
Proteine 1 und 2 (p130,
p107)
Arretierung des Zell-
Zyklus in S-Phase,
Transformation der
Wirtszelle
NLS
126-132
PKKKRKV
Karyopherine
Transport von LTAg in
den Zellkern
Helikase
Zn-Finger
302-317
CLKCIKKEQ
PSHYKYH
DNA-Polymerase α-
Primase-Komplex, p53
(95,
121,
130)
ATPase 1
426-433
GPIDSGKT
Helikase und ATPase-
Aktivität, origin-
binding domain, Zink-
Finger-bindendes Mo-
tiv
ATPase 2
503-510
GSVKVNLE
1 Einleitung
31
An Position 13-17 zeigt die J-Domäne leichte Sequenz-Homologie zur konservierten Region
1 (CR1) der frühen Genregion 1A von Adenoviren. Analog zur Funktion in Adenoviren wird
hier eine Bindung an den Ko-Aktivator der Transkription p300 und eine Inhibition der Aktivi-
tät von Proteinen der Retinoblastom-Familie angenommen (124, 125, 128, 129). Über das
HPDKGG-Motiv interagiert das LTAg mit Proteinen der Familie der Hitzeschockproteine 70
(Hsp70) und aktiviert deren ATPase-Funktion, ein Vorgang, der für eine effiziente virale
DNA-Replikation erforderlich ist (123, 126, 127, 131). Die sich anschließende Linker-
Domäne beginnt mit dem hoch-konservierten YGS/T-Motiv (Position 86-88), welches ver-
mutlich eine wichtige Funktion für die korrekte Faltung der J-Domäne einnimmt (46). Das
nachfolgende Motiv Bub1 (budding uninhibited by benzimidazoles 1) ist ein Erkennungsmo-
tiv für ein Spindel-Kontrollpunkt-Protein und erlaubt es dem LTAg, in die Bildung des mito-
tischen Spindel-Kontrollpunkt und die Anordnung der Chromosomen in der Spindel einzu-
greifen, was in zellulärer Aneuploidie resultiert (132, 133). An Position 98 bis 102 befindet
sich eine Region für die Interaktion von LTAg mit Cullin7 (CUL7), einer zentralen Kompo-
nente der Cullin-Ring-E3-Ubiquitin-Ligase 7 (CRL7), und mit dem Insulin-Rezeptor-Substrat
1 (IRS1). Die Bindung von LTAg an CUL7 schützt IRS1 vor einem CRL7-vermittelten Ab-
bau und sorgt für eine Aktivierung der Stoffwechselwege Phosphatidylinositol-3-Kinase
(PI3K)/Proteinkinase B (AKT) und der extrazellulär-regulierten Kinase (ERK)/Mitogen-
aktivierten Proteinkinase (MAPK) (134-136). Beides wirkt pro-proliferativ. Zudem beinhaltet
die Linker-Region die ebenfalls stark konservierten Motive LXCXE und PKKKRKV. Das
LXCXE-Motiv bindet an das Retinoblastom-Protein (pRb) und an die Retinoblastom-
ähnlichen Proteine 1 (p107) und 2 (p130). Diese Interaktion von LTAg mit Proteinen des Rb-
E2F-Stoffwechselweges resultiert in unkontrolliertem Eintritt der Wirtszelle in die S-Phase
des Zellzyklus, dem vom PyV bevorzugten Zustand für eine erfolgreiche virale Replikation
und Transformation der Wirtszelle (121, 137-140).
1 Einleitung
32
Abbildung 7 Die Domänen von LTAg und sTAg am Beispiel von SV40.
LTAg verfügt über die funktionellen Domänen J-Domäne (blau), OBD (grün) und die Helikase-ATPase-Domäne
(rot). Die bekannten Interaktionspartner sind abgebildet. sTAg verfügt ebenfalls über die J-Domäne am N-
Terminus. Der C-Terminus unterscheidet sich deutlich von jenem des LTAg und verfügt über zwei Zink-Finger-
Motive (lila), welche mit PP2AC und PP2AA interagieren (grün). Abbildung modifiziert nach (47, 130, 141).
Das Motiv PKKKRKV stellt das Signal zum Transport in den Zellkern (NLS, Nuclear locali-
zation signal) dar und erlaubt einen Karyopherin-vermittelten Transport des LTAg in den
Nukleus (47, 142-144). Karyopherine α erkennen hierbei das Motiv PKKKRKV, Karyopheri-
ne β vermitteln den Transport des Komplexes durch den zentralen Kanal der nukleären Pore
(145). Neben der J- und der Linker-Domäne verfügt das LTAg über eine Helikase-Domäne,
welche eine intrinsische Helikase, eine ATPase-Aktivität, eine Origin-binding domain (OBD)
und eine Zink-Finger-Domäne umfasst. Die Helikase-Domäne ist für die virale DNA-
Replikation nötig und vermittelt die Bindung von LTAg an den Tumorsuppressor p53. p53
sorgt für die Expression von Genen, die als eine Reaktion auf zelluläre Stresssignale einen
Stopp des Zellzyklus oder eine Apoptose einleiten (146). LTAg verhindert durch seine Inter-
aktion mit p53 diesen Prozess, indem es dessen Fähigkeit, an DNA zu binden, blockiert (47,
147). Die Fähigkeit von p53 an Ko-Aktivatoren der Transkription, wie CBP (oder E1A) und
p300, zu binden, bleibt hingegen erhalten. Hieraus resultierend ergibt sich ein Komplex von
LTAg mit CBP/p300, wobei LTAg an Position K697 acetyliert wird. Dies verbessert die Sta-
bilität des LTAg (148). Die LTAg OBD bindet eine Sequenz in der Nähe des viralen ORI und
initiiert die Replikation. Die LTAg-Helikase-Domäne assembliert am ORI zu einem Hexa-
mer, welches in der Lage ist, DNA zu schmelzen und die zwei DNA-Stränge am ORI zu ent-
winden (149-154).
Pol α
N
HPDKGG
WD/AAWW
FNEEN
LXCXE
J-Domäne
CX2CX7HX3H
C
OBD Zn
ATPase 1
ATPase 2
NLS
CR1 Hsc70
Cul7
Bub1
YGS/T
RBs
E2Fs
KPNA
KPNB
R-PA Pol α
p53
CBP
p300
Fbw7
N
HPDKGG
J-Domäne
CR1 Hsc70
Zn Zn C
PP2ACPP2AA
CX2CX7HX3H
Helikasedomäne
LTAg
sTAg
1 Einleitung
33
Der C-Terminus des LTAg ist unstrukturiert, variabel und bestimmt die Wirtsspezifität des
PyV, abgekürzt VHR, variable and host range region. Er bindet an das Tumorsuppressor-
Protein Fbxw7 (F-box/WDWD repeat containing protein), welches als Substrat-
Erkennungsprotein für Cullin 1 dient (155). Cullin 1 ist wichtig für die Bildung der RING
Ligase. Fbxw7 sorgt des Weiteren für den Abbau von Cyclin E, c-Myc, Notch, c-Jun und
Presenilin 1 (156-164). Die Bindung von LTAg an Fbxw7 konkurriert mit phosphoryliertem
Cyclin E, welches die Fähigkeit des LTAg, an Cyclin E zu binden und es zu ubiquitinieren,
unterbindet. Dieser Prozess stellt einen bedeutenden Eingriff in den Zellzyklus dar. Cyclin E
bildet einen Komplex mit der Cyclin-abhängigen Kinase (CDK2), was in der Phosphorylie-
rung nachgeschalteter Proteine resultiert. Hierzu gehört bspw. die Phosphorylierung von pRb,
welches E2F freisetzt und den Übergang des Zellzyklus aus der G1 in die S-Phase unterstützt.
Der Komplex CBP/p300 und E2F stellen ebenfalls Substrate für Cyclin E/CDK2 dar. Die
Phosphorylierung dieser Proteine stimuliert die Transkription während des Zellzyklus.
Die ersten ca. 78 aa des sTAg sind identisch zu denen des LTAg. Demnach enthält sTAg
ebenfalls das CR1-Motiv und das HPDKGG-Motiv der J-Domäne. Spezifische Funktionen
des sTAg entstehen durch seinen vom LTAg verschiedenen C-Terminus. sTAg verfügt hier
über ein die Protein-Phosphatase 2A (PP2A)-Untereinheit bindendes Motiv, welches aus zwei
Zn-Finger-Motiven besteht (165-167). PP2A ist eine ubiquitär vorhandene Serin/Threonin-
Phosphatase und spielt eine Rolle beim Erhalt der Zell-Homöostase. Sie interagiert mit einer
Vielzahl von intrazellulären Stoffwechselwegen, an denen Kinasen beteiligt sind. PP2A be-
steht aus den drei Untereinheiten A (strukturelle Untereinheit), B (regulatorische Unterein-
heit) und C (katalytische Untereinheit) und liegt primär in der trimeren Form BAC vor (168).
sTAg ähnelt in seiner Funktion der Untereinheit B und bindet über das CXXXPXC-Motiv der
zweiten Zn-Finger-Domäne an den N-Terminus der Untereinheit A. Dieser Vorgang unter-
bindet die Bildung des funktionellen Enzymkomplexes BAC (167). Die erste Zn-Finger-
Domäne des sTAg interagiert mit der Untereinheit C. Die Inhibition der PP2A durch sTAg
erhöht die Aktivität der normalerweise durch PP2A inhibierten Kinasen, was meist einen
vermehrten Zellzyklus zur Folge hat (169, 170).
1.3.2 Alternative Spleißvorgänge der frühen Genregion
Ein Großteil der bekannten Polyomaviren weist alternative Spleißformen der klassischen
LTAg und sTAg auf. Unter Nutzung diverser Spleißsequenzen entstehen verkürzte Genpro-
dukte, für die häufig regulatorische Funktionen identifiziert wurden. Tabelle 4 gibt einen
Überblick über die bisher beschriebenen alternativen TAg. Hierzu gehört das truncTAg des
1 Einleitung
34
BKPyV, bei welchem die ersten 133 aa identisch zu denen des LTAg sind und die J-Domäne
sowie die Bindestelle für Proteine der pRb-Familie, für die E3-Ubiquitin-Ligase, für CUL7
und für Bub1erhalten bleiben (95). Bei JCPyV wurden T‘135, T‘136 und T‘165 identifiziert, wel-
che durch das Herausschneiden eines zweiten Introns unter Verwendung der gemeinsamen
Donor-, aber einer alternativen Akzeptor-Spleißstelle entstehen (171-175). Das T‘136 stellt
hierbei das Hauptprodukt in JCPyV-transformierten Zellen dar. Es bindet an p107 und p130
und verändert deren Phosphorylierungszustände, resultierend in einem verstärkten Abbau von
Proteinen der pRb-Familie. Ein 57kT, welches bis auf das Fehlen der ORI-Domäne identisch
zum LTAg ist, wurde bei MCPyV identifiziert (69, 101). Das tinyTAg von MPyV stimuliert
über sein J-Motiv die ATPase-Aktivität von Hsc70 (176). Das STLPyV verfügt über ein
229T, welches die DnaJ-Domäne mit dem HPDKGG-Motiv konserviert, dessen Funktion
jedoch bisher nicht untersucht wurde (21). Bei SV40 wurde ein 17kT identifiziert, für welches
diverse Funktionen bestimmt werden konnten (133, 177, 178). Eine aktuelle Publikation be-
legt zudem, dass TSPyV ebenfalls wie MPyV ein mTAg exprimiert, für welches transformie-
rende Eigenschaften beschrieben wurden (117, 179-181).
1 Einleitung
35
Tabelle 4 Alternative Spleißformen der klassischen TAg bei verschiedenen PyV, ihre Größe und ihre
Funktion
PyV
TAg
Größe
Beschreibung und Funktion
Ref.
BKPyV
truncTAg
136 aa
Lokalisation im Nukleus
dereguliert vermutlich das Zellwachstum während der Infek-
tion
(95)
JCPyV
T‘
135
, T‘
136
,
T‘165
- alle drei sind Phosphoproteine und in lytisch infizierten
Zellen zu finden
- fördern den Abbau von Proteinen der pRb-Familie
- kooperieren mit einem mutierten Ras-Protein und immor-
talisieren Fibroblasten von Rattenembryonen
- beteiligt an einer effizienten viralen DNA-Replikation
(171-175)
MCPyV
57kT
47kDa
identisch zu LTAg, jedoch ohne die ORI-Domäne
(69, 101)
MPyV
tiny TAg,
mTAg
enthält die die J-Domäne und stimuliert die ATPase-Aktivität
von Hsc70
imitiert aktivierte Transmembranrezeptoren für Wachstums-
faktoren mit assoziierter Kinase-Aktivität (MAPK, PI3K)
(176)
(179-181)
STLPyV
229T
enthält die J-Domäne mit dem HPDKGG-Motiv
(21)
SV40
17kT
- fördert die Transformation von Ratten- und humanen
Fibroblasten
- reduziert p130-Level
- stimuliert den Eintritt der Zelle in die S-Phase durch In-
duktion der E2F Freisetzung
- bindet an Bub1, es kann zu einer vorzeitigen Seneszenz
kommen
- fördert den Abbau von Proteinen der pRb-Familie
- kooperiert mit einem mutierten Ras-Protein
- immortalisiert Fibroblasten von Rattenembryonen
(133, 172,
178)
TSPyV
mTAg, tiny
TAg, 21kT
bisher nicht untersucht; mTAg könnte ähnlich wie das des
MPyV agieren
(117)
LPyV
LT‘, sT‘,
N200
unbekannt
(182)
1 Einleitung
36
1.4 Zielstellung und Vorgehensweise
Relevanz
Humane PyV sind von besonderem Interesse für die klinische Virologie, da für einige Vertre-
ter dieser Virusfamilie eine Assoziation mit schweren Erkrankungen nach Reaktivierung in
immunsupprimierten Individuen nachgewiesen wurde (siehe 1.1.4 Assoziation von PyV mit
Erkrankungen des Menschen). Das MCPyV ist bisher das einzige humane PyV, für welches
eine Assoziation mit einer Tumorerkrankung sicher nachgewiesen wurde. Alle PyV exprimie-
ren jedoch Tumor-Antigene, welche transformierende Eigenschaften haben und in der infi-
zierten Zelle unter anderem den Eintritt in die Synthese-Phase des Zellzyklus, die Replikation
viraler DNA und die Inhibition von Tumorsuppressoren vermitteln (siehe 1.3 Das Polyomavi-
rus-Genom und alternative Spleißvorgänge in der frühen Genomregion). Neu identifizierte
PyV werden daher ebenfalls als potenziell tumorigen betrachtet. Zur Abschätzung ihrer
Public-Health-Relevanz sind die Charakterisierung ihrer genetischen und biologischen Eigen-
schaften und die Untersuchung ihrer Pathogenitätsmechanismen von beträchtlichem Interesse.
Zur Gruppe der neuen, bisher nur wenig charakterisierten humanen PyV zählen HPyV9 und
HPyV12 (siehe 1.1.2 Das humane Polyomavirus 9 und 1.1.3 Das humane Polyomavirus 12).
Sie sind Gegenstand dieser Dissertation.
Zielstellung
Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist die Untersuchung der genetischen und biologischen
Eigenschaften von HPyV9 und HPyV12 mit den im Folgenden vorgestellten Schwerpunkten
und den jeweils verwendeten Methoden.
1) Bestimmung der Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12 in Tumor- und Gesundgewebe
von Patienten mit malignen Erkrankungen des Gastrointestinaltraktes (GIT) mittels
• VP1-spezifischer qPCR
• Next Generation Sequencing (NGS)
2) Erfassung der Seroprävalenz von HPyV9 und HPyV12 im Serum einer Patientengruppe
mit maligner Erkrankung des GIT, einer Patientengruppe mit nicht-maligner Erkrankung des
GIT und in einer in Alter und Geschlecht angepassten Kontrollgruppe mittels
• Kapsomer-basiertem ELISA (Untersuchung der Testseren auf Reaktivität ge-
gen das VP1 von HPyV9 und HPyV12)
1 Einleitung
37
• TAg-basiertem ELISA (Untersuchung der Testseren auf Reaktivität gegen den
N-Terminus (78 aa) der frühen Genregion von HPyV9, HPyV12, BKPyV und
MCPyV)
3) Etablierung eines geeigneten in vitro-Replikationssystems für HPyV9 und HPyV12 mittels
• Transfektion viraler DNA in diverse Zelllinien
• Beobachtung physiologischer Effekte auf die Wirtszellen, die durch eine mög-
liche Infektion hervorgerufen wurden, im Lichtmikroskop
• Testung des xCELLigence™-Systems für die beschriebene Fragestellung
• Gewinnung von mRNA, Synthese von cDNA, Nachweis viraler Transkripte
via qPCR
• Detektion viraler Proteine im Western Blot und im Immunfluoreszenz-Assay
(IFA)
• Detektion von Viruspartikeln im Elektronenmikroskop (EM)
4) Untersuchung der Spleiß-Vorgänge der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12 mittels
• Gewinnung von DNA, Isolierung von mRNA, Synthese von cDNA, Nachweis
viraler Spleißvorgänge via konventioneller und Nested long-distance PCR
(LD-PCR)
• Sequenzierung
• bioinformatischer Analyse der erhaltenen Sequenzen
Die unter den Punkten 1 bis 4 aufgeführten Arbeitsziele sollen der partiellen Charakterisie-
rung von HPyV9 und HPyV12 dienen und erste Daten zur Einschätzung ihres pathogenen
Potenzials erbringen.
2 Material
38
2 Material
2.1 Humane Organproben und Seren
Tumor- und Gewebe-Proben und Seren von Patienten mit malignen und nicht-malignen Er-
krankungen des GIT wurden an der Klinik für Allgemein-, Viszeral- und Transplantationschi-
rurgie der Charité Universitätsmedizin Berlin in Kooperation mit Dr. med. Rosa Schmuck
asserviert. Die Studie wurde von der lokalen Ethik-Kommission der Charité Universitätsme-
dizin Berlin genehmigt (Genehmigungsnummer EA2/144/11), eine schriftliche Einwilligung
aller beteiligten Probanden/Probandinnen liegt vor. Die Aufklärung über die Probenentnahme
und die Dokumentation erfolgte im Vorfeld der Operation durch den behandelnden Arzt. Alle
Prozeduren verliefen entsprechend den ethischen Standards der Helsinki Erklärung aus dem
Jahre 1975. Seren von gesunden Blutspendern wurden von Dr. J. Hofmann, Institut für Viro-
logie, Charité Universitätsmedizin Berlin, beigesteuert. Die Seren wurden für die Publikation
von Scuda et al. gesammelt, welcher auch das entsprechende Ethik-Statement zu entnehmen
ist (17). Die Lagerung von Gewebeproben erfolgte bei -80 °C, die Lagerung von Seren bei -
20 °C. Eine Übersicht der Erkrankungen der Patienten, von denen die Gewebeproben stam-
men, befindet sich in Tabelle 30. Die Übersicht der malignen und nicht-malignen Erkrankun-
gen der Serumspender findet sich in Tabelle 40 bzw. Tabelle 39.
2.2 Tierische Seren
Mausseren mit Reaktivität gegen VP1 Proteine humaner PyV wurden erzeugt. Hierfür wurden
je VP1-/TAg(78aa)-Antigen 7 Balb/c-Mäuse immunisiert. Einen Tag vor der Immunisierung
wurde ein Negativserum gewonnen. Immunisiert wurde mit je 20 µg aufgereinigtem Protein
in einem Volumen von 100 µl PBS durch intraperitoneale Applikation in das untere Drittel
des Abdomens. Nach der Grundimmunisierung an Tag 1 erfolgten drei Booster-Injektionen an
Tag 14, 28 und 56. An Tag 85 wurden die Mäuse unter Isofluran-Narkose entblutet. Zur Ge-
winnung von Serum wurde das geronnene Blut für 10 Minuten bei 2000 x g zentrifugiert und
der Serumüberstand in ein neues Gefäß überführt. Die Lagerung erfolgte bei -20 °C. Die Be-
treuung, Immunisierung und Tötung der Tiere erfolgte in der tierexperimentellen Anlage des
RKI.
2.3 Eukaryotische Zelllinien
Tabelle 5 Verwendete Zelllinien, ihre Beschreibung und Herkunft
Zelllinie
Beschreibung
Quelle
HEK293
Humane embryonale Nierenepithelzellen
ATCC® CRL-1573™
293-4T
Humane embryonale Nierenepithelzellen, die konsti-
tutiv MCPyV-sTAg und –LTAg exprimieren
PD Dr. Fischer, Universitätsklinikum
Hamburg-Eppendorf, D
2 Material
39
NIH/3T3
Embryonale Fibroblasten der Maus
ATCC® CRL-1658™
Vero C1008
Nierenepithelzellen der grünen Meerkatze (Cerco-
pithecus aethiops)
ECACC # 85020206
A549
Humane Epithelzellen eines Lungen-Karzinoms
Dr. Moens, Universität von Tromsø, N
ATCC® CCL-185™
HeLa
Humane Epithelzellen eines Zervix-Karzinoms
ATCC® CCL-2™
Huh7
Humane Epithelzellen eines Leber-Karzinoms
Fachgebiet ZBS1, RKI, Berlin, D
JCRB0403
RH
Humane Nierenzellen
Fachgebiet FG12, RKI, Berlin, D
Cos-7
Fibroblasten-ähnliche Nierenzellen der grünen Meer-
katze (Cercopithecus aethiops), die mit einer SV40-
Mutante transformiert wurden und SV40-TAg expri-
mieren
ATCC® CRL-1651™
BJAB
Humane B-Lymphozyten des Burkitt-Lymphoms
DSMZ ACC 757
A375
Humane Epithelzellen eines Melanoms
Dr. Moens, Universität von Tromsø, N
ATCC® CRL-1619™
SW-480
Humane Epithelzellen eines Kolon-Adenokarzinoms
Dr. Moens, Universität von Tromsø, N
ATCC® CCL-228™
2.4 Viren
Tabelle 6 Verwendete Viren bzw. Virusgenome, die dazugehörigen GenBank- Nummern und ihre Her-
kunft
PyV
GenBank
Herkunft
HPyV9
HQ696595
siehe 2.6.3
HPyV12
NC_020890
siehe 2.6.3
MCPyV
HM011538
-
BKPyV
NC_001538
Prof. Wieland, Nationales Referenzzentrum für Papillom- und Po-
lyomaviren, Köln, D
BKPyV Stamm
NC_001538
J. Manzetti, Universität Basel, CH
BFDPyV
NC_004764
-
SV40 Stamm 776
AF316139.1
Prof. Hanssen Rinaldo, Universität Tromsø, N
SV40 Stamm 777
AF332699.1
Prof. Matz, Universitätsklinikum Bonn, D
2.5 Bakterienstämme
Tabelle 7 Verwendete Bakterienstämme und ihr Genotyp
Bakterienstamm
Genotyp
Firma
E. coli RosettaBlueTM
(DE3)pLacI Competent Cells
Rosetta(DE3)pLacI F– ompT hsdSB(rB–mB)gal dcm
(DE3) pLacIRARE2 (CamR)
Novagen®/Merck,
Darmstadt, D
E. coli DH5α
F-φ80dlacZΔM1Δ(lacZYA-argF)U169deoR,recA1
endA1hsdR17(rk- mk + phoA supE44 λ- thi-1 gy-
rA96 relA1
Invitrogen, Carlsbad,
USA
2 Material
40
2.6 Nukleinsäuren, Nukleotide, Marker
2.6.1 Plasmidkonstrukte/Vektoren
Tabelle 8 Verwendete Plasmidkonstrukte und ihre Herkunft
Vektor
Herkunft
pTriEx™-1.1-6HN
Dr. T. Finsterbusch, RKI
pcDNA-YFP
Dr. H. Geyer, RKI
pAny/VP1
MrGene GmbH, Regensburg, D
pMA-T/VP1
GeneArt®, LifeTechnologies, Carlsbad, USA
pMA-T/TAg(78aa)
GeneArt®, LifeTechnologies, Carlsbad, USA
pTriEx™-1.1-6HN/VP1
Kloniert
pTriEx™-1.1-6HN/TAg(78aa)
Kloniert
pBMH-HPyV12
GeneArt®, LifeTechnologies, Carlsbad, USA
pMSCV
puro
-HPyV9
Dr. N. Scuda, RKI
2.6.2 Marker
GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, D
Quick Load® 1 kb Extend DNA Ladder NEB, Ipswich, USA
PageRuler™ Prestained Protein Ladder Fermentas, St. Leon-Rot, D
2.6.3 Synthetische Genome
HPyV9-Genom: Vorarbeit von Dr. N. Scuda in der Arbeitsgruppe. Im Bereich des VP1-Gens
ist das Genom über eine KpnI-Schnittstelle in den Vektor pMSCVpuro eingebracht (Ampicil-
lin-Resistenz). Es ergibt sich ein Konstrukt von 8652 Bp.
HPyV12-Genom: Das synthetisierte Genom (Biomatik, Ontario, CA) wurde mit dem Restrik-
tionsenzym ApaI geschnitten, an Position 2165 Bp geöffnet und mit einem Standardvektor
(pBMH, 2907Bp, Ampicillin-Resistenz) ligiert. Das gesamte Konstrukt hat eine Größe von
7940 Bp.
2.6.4 Synthetisch hergestellte VP1-Sequenzen
VP1-Sequenzen (ohne Start-Kodon), Kodon-optimiert für die Expression in E. coli und ver-
sehen mit Schnittstellen für die Restriktionsenzyme BamHI und XhoI, wurden kommerziell
synthetisch hergestellt (Tabelle 9). Ein „T“ wurde für einen korrekten Leserahmen eingefügt.
Tabelle 9 Übersicht der synthetisch hergestellten VP1-Sequenzen
PyV
VP1
Firma
HPyV9
GGATCCTGCA CCTCAACGTA AGCGTCAAGA GTGTGGCGCC TGTCCTGTGA AAAAAACCTG
TCCAACCCCT GCTCCTGTTC CTAAACTGCT GGTGAAGGGC GGTGTAGAAG TTCTGGAAGT
CCGTACTGGT CCCGATGCTA TTACCCAAAT CGAGGCCTAC CTGAACCCTA GAATGGGCAA
CAACAACCCA ACCGACGAAT TGTACGGTTA CTCCGCCGAT ATCAACGTTG CTTCCTCCAA
GGCTAGTGAT AACCCGAACG CTACTACTCT GCCAACTTAC TCTGTGGCTG TGATCAAACT
CCCTATGCTG AACGAGGATA TGACCTGTGA CACCCTCCTC ATGTGGGAGG CCGTTTCCGT
AAAAACTGAA GTGATGGGCA TTTCGAGTCT GGTGAACCTC CATCAAGGCG GCAAATACAT
CTACGGCTCC TCTTCCGGTA CTATCCCGGT ACAGGGAACC ACGCTCCACA TGTTCTCTGT
MrGene GmbH,
Regensburg, D
2 Material
41
TGGTGGCGAA CCATTGGAAC TCCAGGGACT GGTGGCTTCT TCAACCACAA CATACCCCAC
GGATATGGTG ACTATCAAAA ACATGAAACC CGTGAACCAG GCTTTGGACC CAAACGCCAA
GGCATTGCTC GACAAGGACG GCAAATACCC CGTCGAAGTG TGGTCACCCG ATCCTTCCAA
AAACGAAAAC ACCCGTTACT ACGGCTCATT CACTGGCGGT GCTACAACTC CACCCGTAAT
GCAATTCACG AACTCGGTGA CTACTGTGCT GCTGGACGAG AACGGTGTTG GTCCTCTGTG
TAAGGGCGAC AAATTGTTCC TGTCCGCTGT GGATATTGTC GGAATCCATA CCAACTACTC
GGAGAGCCAA AACTGGAGAG GATTGCCTCG CTACTTCAAC GTGACCCTGA GAAAACGTGT
CGTCAAAAAC CCCTACCCCG TGTCCTCATT GCTGAACTCA TTGTTCTCCG GCCTCATGCC
TCAAATTCAG GGCCAACCGA TGGAGGGAAC TTCTGGTCAA GTGGAGGAAG TGAGGATCTA
CCAAGGAACC GAAGGTCTCC CAGGTGATCC CGATCTGGAT CGTTACGTGG ACAAATTCTG
CCAAAACCAA ACTGTGCCCC CTCGCTCCAA CGACCAATAA CTCGAG
HPyV12
GGATCCTGGT CTGCTGCTGA AAAAAGGCGT GAAATGCAAC TTCCTGCAGG TTATGGCACC
AAAACGTAAA ACCACGTGCT CCTCCAAAAA AACATGCCCA CAGCCGTCTA GTGTTCCGAA
ACTGATCATC AAAGGCGGTA TTGAGGTTCT GGATGTGAAA ACCGGTGACG ATTCGATTAC
ACAGATTGAA GCGTTTCTGA ATCCTCGTAT GGGCGTGAAC GATGAAACCA ACACCTGGTA
TGGCTTTAGC GAACAGGTCA CAGTGGCAAC AGCTCGTGAG ACAGATCGCC CTCCAAAAGA
ACAAATGCCG TATTATTCCT GTGCCCGTAT CCCTCTGCCT CTGCTGAATG AGGACATGAC
TTGTAACACC CTGCTGATGT GGGAAGCAGT GAGCGTTAAA ACGGAGGTGA TCGGTAGTAA
CACACTGATG AACGTCCACG ACTATATGAC CCGTACGGAT AATGGTGTAG GCCATCCGGT
CGTAGGATCA ACCTATCACA TGTTCGCCGT TGGTGGAGAA CCGCTGGATC TGCAAGGAAT
TCAACAGTCC CATCTGGTCC AGTATCCTGA AGGGCTGATT GTGCCTAAAA GCGTAACCGA
CGTGACAGCG AAAATCCAAT GCCTGGACCC TTCTGCCAAA GCAAAACTGG ATAAAGATGG
CAAATATCCG ATCGAGACTT GGTCACCTGA TCCAAGCCGT AACGAGAATA CACGCTATTT
CGGGAACTAT TATGGTGGTC TGACAACTCC GCCAGTACTG ACCTTTACCA ACACAGTGAC
GACCATTCTG CTGGACGAAA ATGGAGTGGG TCCTCTGTGT AAAGGAGATG GGCTGTTTCT
GTCTTGCTGT GACGTTATGG GCTGGTTTAC AGCCGGTAGT GGTACTCATC AACGTTTCCG
TGGCCTGCCA CGTTATTTCA ATGTTCAGCT GCGCAAACGT GCCGTTCGTA ACCCATATCC
GGTTAGTGCT CTGCTGACAA GCCTGTTTAC CAACATGATG CCTCGTATGA GTGGTCAACC
GATGATTGGA AACAAATCCC AGGTCGAAGA AGTTCGTGTG TATGAAGGCC TGGAACAGCT
GCCTGGTGAT CCGGACATGG AACGCCATAT CGACGAATTT GGCCAGGAGA TTACCCCAGT
CCCTTAACTC GAG
GeneArt®, Life-
Technologies,
Carlsbad, USA
BKPyV
GGATCCTGCA CCGACTAAAC GTAAAGGTGA ATGTCCTGGA GCAGCCCCGA AAAAACCAAA
AGAACCGGTT CAGGTGCCGA AACTGCTGAT CAAAGGTGGT GTTGAAGTGC TGGAGGTGAA
AACAGGTGTG GATGCCATCA CGGAAGTGGA ATGCTTTCTG AACCCGGAAA TGGGAGATCC
TGACGAGAAT CTGCGTGGCT TTAGCCTGAA ACTGAGCGCC GAGAACGATT TTAGCAGCGA
TAGTCCGGAG CGTAAAATGC TGCCGTGTTA TAGCACAGCC CGTATTCCTC TGCCAAATCT
GAACGAAGAT CTGACGTGTG GTAATCTGCT GATGTGGGAA GCTGTTACCG TACAGACCGA
GGTTATTGGT ATTACGAGCA TGCTGAACCT GCACGCTGGT AGCCAAAAAG TTCACGAACA
TGGCGGTGGA AAACCGATTC AAGGGAGCAA CTTTCACTTC TTTGCCGTTG GCGGAGAACC
ACTGGAGATG CAAGGTGTTC TGATGAATTA TCGTAGCAAA TATCCAGATG GAACAATCAC
CCCAAAAAAC CCGACAGCCC AGTCTCAAGT CATGAATACC GACCACAAAG CCTATCTGGA
CAAAAACAAC GCCTATCCGG TGGAATGTTG GGTGCCTGAT CCGAGCCGTA ACGAGAATGC
CCGCTATTTT GGAACCTTCA CCGGTGGCGA AAATGTTCCT CCTGTCCTGC ATGTGACAAA
CACAGCGACA ACAGTTCTGC TGGACGAGCA AGGAGTGGGT CCTCTGTGTA AAGCGGATTC
CCTGTATGTT AGCGCCGCTG ACATCTGTGG ACTGTTCACC AATTCTAGCG GCACACAGCA
ATGGCGTGGT CTGGCACGTT ATTTCAAAAT CCGTCTGCGC AAACGTTCTG TGAAAAATCC
ATATCCGATC TCATTTCTGC TGTCCGATCT GATCAATCGT CGTACTCAAC GTGTCGATGG
TCAACCAATG TATGGGATGG AGAGTCAGGT GGAGGAGGTC CGTGTATTCG ACGGTACGGA
ACGCCTGCCT GGTGATCCTG ATATGATTCG CTATATCGAT AAACAAGGCC AGCTGCAAAC
AAAAATGCTG TAACTCGAG
MrGene GmbH,
Regensburg, D
BFDPyV
GGATCCTTCC CAAAAAGGCA AAGGCTCGTG TCCCCGTCCT CAACAGGTTC CTAGACTGCT
GGTGAAAGGC GGTATCGAAG TGCTGGATGT GAAATCTGGT CCCGACTCTA TCACTACCAT
CGAGGCCTAC CTCCAACCAC GCCCCGGTCA AAAAAACGGT TACTCCACGG TCATCACTGT
TCAAGCCGAG GGCTACCAAG ATGCTCCTCA CTCCACTGAG GTCCCTTGCT ACTCCTGTGC
TCGTATTCCA CTGCCAACGA TCAACGACGA CATCACTTGC CCAACACTGC TCATGTGGGA
GGCTGTTTCC GTAAAAACCG AAGTTGTGGG AGTGTCCTCA ATCCTCAACA TGCACTCTGG
TGCTTTCCGT GCCTTCAACG GATACGGTGG TGGATTCACG ATTTGTGGTC CTCGTATTCA
TTTCTTCTCC GTCGGTGGCG AACCATTGGA TCTCCAGGCT TGTATGCAAA ACTCAAAAAC
GGTGTACCCT GCTCCTCTCA TTGGTCCTGG CGAGGGCGAG CGCCGTGAAA CCGCTCAAGT
CTTGGATACT GGCTACAAGG CGAGACTGGA CAAGGATGGT TTGTACCCAA TCGAATGTTG
GTGTCCCGAT CCTGCTAAAA ACGAGAACAC CCGCTACTAC GGTAACCTCA CTGGTGGACC
TGAGACCCCT CCTGTATTGG CCTTCACAAA CACCACTACA ACGATTCTGC TGGACGAAAA
CGGTGTCGGT CCTCTGTGTA AAGGAGATGG CCTGTTCTTG TCTGCCGCCG ATGTTGCTGG
AACATACGTG GACCAACGTG GTAGACAATA CTGGCGTGGA CTGCCTCGTT ACTTCTCGAT
TCAACTCCGT AAACGTAACG TGAGAAACCC TTACCCCGTG TCTGGACTGC TGAACTCTCT
GTTCAACGAC CTCATGCCTA GAATGACTGG TCAATCAATG CAGGGCTCCG ACGCTCAAGT
GGAGGAAGTG AGAGTCTACG AGGGTATGGA GGGATTGGCT CCTGAAATCG ACATGCCCCC
MrGene GmbH,
Regensburg, D
2 Material
42
TAAAGCTCCC CGTTAACTCG AG
2.6.5 Synthetisch hergestellte TAg(78aa)-Sequenzen
TAg(78aa)-Sequenzen (ohne Start-Kodon), Kodon-optimiert für die Expression in E. coli und
versehen mit Schnittstellen für Restriktionsenzyme (5‘ BamHI, 3‘ XhoI) wurden synthetisch
hergestellt (GeneArt®, LifeTechnologies, Carlsbad, USA) (Tabelle 10). Das „T“ wurde für
einen korrekten Leserahmen eingefügt.
Tabelle 10 Übersicht der synthetisch hergestellten TAg(78aa)-Sequenzen
PyV
TAg(78aa)
HPyV9
GGATCCTGATCAGACCCTGAGCCTGGAAGAACGTAATGAACTGATGGATCTGCTGCAGCT-
GACCCGTGCAGCATGGGGTAATCTGAGCCTGATGAAAAAAGCATATAAAACCGT-
GAGCAAAATCTATCACCCGGATAAAGGTGGTAATCCGGAAAAAATGCAGCGTCTGAAT-
GAACTGTTTCAGAAACTGCAGGTTACCCTGCTGGAAATTCGTAGCAATTGTGGTAGCAGCAGCAGCCTCGAG
HPyV12
GGATCCTGATAGCATTCTGACCTTTGCAGAACGTCAGCTGCTGATTAGCCTGCTGAAAATTT-
CAGGTGATACCTTTGGTAATGTTCCGGCAATGGCACGTGCATA-
TAAACTGGCAGCAAAACGTCTGCATCCGGATAAAGGTGGTAATGAAGCAGAAATGAAAAAACT-
GAACGAACTGTGGAACAAATTCAAAGACGGCATTTATAACCTGCGTGAAGTTAAACCGAGCCTGCATCCGCTCGAG
BKPyV
GGATCCTGATAAAGTGCTGAATCGTGAAGAAAGCATGGAACTGATGGATCTGCTGGGTCTG-
GAACGTGCAGCATGGGGTAATCTGCCGCTGATGCGTAAAGCATATCTGCGTAAAT-
GCAAAGAATTCCATCCGGATAAAGGTGGCGACGAGGATAAAATGAAACGTATGAATACCCTG-
TACAAAAAAATGGAACAGGATGTGAAAGTTGCACACCAGCCGGATTTTGGCACCTGGTCACTCGAG
MCPyV
GGATCCTGATCTGGTTCTGAATCGTAAAGAACGTGAAGCACTGTGTAAACTGCTGGAAATT-
GCACCGAATTGCTATGGTAATATTCCGCTGATGAAAGCAGCATTTAAACGTAGCTGTCT-
GAAACATCATCCGGATAAAGGTGGTAATCCGGTGATTATGATGGAACTGAATACCCTGTGGTCA-
AAATTTCAGCAGAACATTCATAAACTGCGCAGCGATTTTAGCATGTTCGATGAACTCGAG
BFDPyV
GGATCCTGCAAGCCTGCGTCGTCTGACCGAACTGCTGGGTCTGCCGGTTACCGCAAC-
CGCAGCAGATATCAAAACCGCATATCGTCGTACCGCACTGAAATATCATCCG-
GATAAAGGTGGTGATGAAGAAAAAATGAAAGAACTGAACACCCTGATGGAAGAATTTCGT-
GAAACCGAAGGTCTGCGTGCAGATGAAACCCTGGAAGATAGCGATCCGGAACCGGAAGAAAGCGGTTATCTCGAG
2.6.6 Primer
Alle Primer wurden von der Firma Metabion International AG (Martinsried, D) synthetisiert.
Sonden für die qPCR wurden von der Firma Applied Biosciences (LifeTechnologies, Carls-
bad, USA) hergestellt.
Tabelle 11 Verwendete PCR-Assays
Beschreibung
ID
Ziel-Gen
Primer (5‘3‘)
PyV-Konsensus-
PCR
4956s
4956as
4957s
4957as
VP1
1. Runde
CCtGAtCCttCTA(r/i)(r/i)AATGA(r/i)AA*
AAtAAgAagcatCAgAT(n/i)TTyCC(n/i)CC*
2. Runde
ATGAgAATGGaGTgGGCCC(n/i)CT(n/i)TG(y/i)AA(r/i)G*
CCCTCATAtAttCtAACyTCyTC(h/i)AC(y/i)TG*
HPyV9 qPCR
5252s
5252as
5253
VP1
gTTgATATTgTTggAATTCACACT
gTCCCTgAATTTgAggCA
FAM™-TCTAAGGAAACGGGTTGT-MGB-NFQ
HPyV9 (intron-
5599s
LTAg
AGAGGGTGGAGGGGCTGAAGGT
2 Material
43
spannend)
5602as
TGCTGCAACTTACAAGAGCAGC
HPyV9 Nested
LD PCR
6567s
6567as
6568s
6568as
LTAg
1. Runde
ACTCTGTCTTTGGAGGAGAGA
TCTTCAATAACAATTCCATGCAGGG
2. Runde
TCTTTGGAGGAGAGAAATGAGCT
ACAATTCCATGCAGGGGATCT
HPyV12 qPCR
5931s
5931as
5932
VP1
gTgggAAgCTgTCAgTgTgA
CCACCTACTgCAAACATgTg
FAM™-ACTACAggATggCCTACCCCATTgTCAgTC-TAMRA™
HPyV12 LTAg-
Intron
6395s
6395as
LTAg
TGCACCCAGACAAGGGAGGCA
TGGGCTGGCTCAGGCTCTTCA
HPyV12 Nested
LD PCR
6577s
6577as
6578s
6578as
6579s
6579as
LTAg
1. Runde
TGGATTCAATTCTCACCTTTGCA
TCATCTGCTTCTGTAACAATATCATG
2. Runde
TCTCACCTTTGCAGAGAGACA
GCTTCTGTAACAATATCATGTAAGGGG
3. Runde
ACCTTTGGTAATGTCCCTGCT
ATCATGTAAGGGGTCACGGC
HPyV12-LTAg
5’-Bereich
6577s
5698as
LTAg
TGGATTCAATTCTCACCTTTGCA
TTGATTTTGGCGGCGTAGCCT
Mycoplasmen-
PCR
GGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT
TGCACCATCTGTCACTCTGTTAACCTC
M13
CAGGAAACAGCTATGAC
GTAAAACGACGGCCAG
*i: Inosin, r: Purin (A/G), n: any (G/A/T/C), h: (A/C/T), y: Pyrimidin (C/T)
2.7 Antikörper
Tabelle 12 Verwendete Primärantikörper
Primärantikörper
Typ/Region/Epitop/Position
Hersteller
anti-HPyV9-VP1
monoklonal/HI-Loop/DIVGIHTNYSES/270-281
Abmart, Shanghai, CN
anti-HPyV9-TAg
monoklonal/erste 78 aa/HPDKGGNPEKMQ/42-53
Abmart, Shanghai, CN
anti-HPyV12-VP1
monoklonal/BC-Loop/ARETDRPPKE/90-99
Abmart, Shanghai, CN
anti-HPyV12-TAg
monoklonal/erste 78 aa/MDSILTFAER/1-10
Abmart, Shanghai, CN
Maus-anti-Poly-His IgG
monoklonal
Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Tabelle 13 Verwendete Sekundärantikörper
Sekundärantikörper
Typ/Region/Epitop
Hersteller
Kaninchen anti-human IgG, HRPO
polyklonal, Fcγ-Fragment
Dianova, Hamburg, D
Ziege anti-Maus-IgG, HRPO
polyklonal
Dianova, Hamburg, D
2 Material
44
Ziege anti-Maus-IgG, Cy3
polyklonal, Fab-Fragment
Dianova, Hamburg, D
2.8 Enzyme
Benzonase® Nuklease Novagen®/Merck, Darmstadt, D
rLysozym™ Novagen®/Merck, Darmstadt, D
Platinum® Taq DNA-Polymerase Invitrogen, Carlsbad, USA
TaKaRa Ex Taq Clontech, Kalifornien, USA
AmpliTaq Gold® DNA-Polymerase Applied Biosystems, Warrington, UK
T4 DNA-Ligase Fermentas, St. Leon-Rot, D
SuperScript® II Reverse Transcriptase Invitrogen, Carlsbad, USA
BamHI 5‘…G|GATCC…3‘ NEB, Ipswich, USA
3‘…CCTAG|G…5‘
FD ApaI 5‘…GGGCC|C…3‘ ThermoScientific, Waltham, USA
3‘…C|CCGGG…5‘
FD KpnI 5‘…GGTAC|C…3‘ ThermoScientific, Waltham, USA
3‘…C|CATGG…5‘
SalI 5‘…G|TCGAC…3‘ NEB, Ipswich, USA
3‘…CAGCT|G…5‘
XhoI 5‘…C|TCGAG…3‘ NEB, Ipswich, USA
3‘…GAGCT|C…5‘
2.9 Chemikalien und Reagenzien
Acrylamid Roth, Karslruhe, D
Ampicillin Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
APS Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Blasticidin S Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
Bromphenolblau Serva, Heidelberg, D
BSA Serva, Heidelberg, D
Chloramphenicol Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Coomassie Brilliant Blau R-250, Roti-Blue® Roth, Karlsruhe, D
DMSO Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
dNTP PCR-Mix Metabion, Martinsried, D
ECL™ Western Blotting Analysis System GE Healthcare, Buckinghamshire, GB
EDTA Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
FKS Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
GeneJuice® Novagen®/Merck, Darmstadt, D
Glucose Merck, Darmstadt, D
Glycin Roth, Karslruhe, D
Harnstoff Merck, Darmstadt, D
Imidazol Roth, Karslruhe, D
IPTG Roth, Karslruhe, D
Isopropanol Roth, Karslruhe, D
2 Material
45
L-Glutamin GE Healthcare, Buckinghamshire, GB
Magermilchpulver Roth, Karslruhe, D
Methanol Roth, Karslruhe, D
Na2HPO4 Merck, Darmstadt, D
NaCl Roth, Karslruhe, D
NaOH Roth, Karslruhe, D
Natriumazid Roth, Karslruhe, D
Natrium-Pyruvat Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
NE-AA (Nicht-essentielle Aminosäuren) Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
Nickel-NTA Affinity Gel (50 % Slurry) Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
Paraformaldehyd Roth, Karslruhe, D
Penicillin/Streptomycin Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
Oligo(dT)16 Roche Applied Biosciences, Mannheim, D
Schwefelsäure Roth, Karslruhe, D
SDS Roth, Karslruhe, D
SOC-Medium Invitrogen, Carlsbad, USA
Sukrose Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
TAE-Puffer 10 x Roth, Karslruhe, D
TEMED Roth, Karslruhe, D
TMB Plus2 Substrat Kem-En-Tec, Taastrup, DK
Tris Merck, Darmstadt, D
Trypsin PAN-Biotech, Aidenbach, D
Tween20 Roth, Karslruhe, D
Wasser Sigma-Aldrich, St. Louis, USA
X-tremeGENE HP Roche Applied Biosciences, Mannheim, D
Zeocin Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
2.10 Puffer und Lösungen
10x PBS
80 g NaCl
2 g KCl
14,4 g Na2HPO4 x 2H2O
2,4 g KH2PO4
ad 1000 ml H2O bidest.
PBST
1 x PBS
0,05 %Tween20
PBSTM
1 x PBST
0,5 % Milchpulver
Antikörper-Puffer IFA
2 % BSA
0,2 % NaN3
in 1 x PBS
HEPES (0,5 M)
23,8 g HEPES, 100 ml H2O, pH 7,2
Paraformaldehyd (4 %, metha-
nolfrei)
1 ml Paraformaldehyd (16 %, methanolfrei)
3 ml 1 x PBS
Ladepuffer PCR
5 Teile Bromphenolblau, 7 Teile Sukroselösung
Tris-Glycin-SDS-Puffer (10 x)
29 g Tris
144 g Glycin
10 g SDS
ad 1 l H2O bidest
Transferpuffer
30 ml 1 x Tris-Glycin-Puffer
10 ml Methanol
2 Material
46
50 ml H2O bidest
Denaturierender Lösepuffer,
pH 8,0
8 M Harnstoff
0,1 M NaH2PO4
0,01 M Tris-HCl
Denaturierender Waschpuffer
pH 6,3
8 M Harnstoff
0,1 M NaH2PO4
0,01 M Tris-HCl
Denaturierender Elutionspuffer
pH 4,5
8 M Harnstoff
0,1 M NaH2PO4
0,01 M Tris-HCl
Äquilibrierpuffer pH 8,0
50 mM NaH
2
PO
4
0,3 M NaCl
Imidazol-Waschpuffer pH 8,0
50 mM NaH
2
PO
4
0,3 M NaCl
20 mM Imidazol
Imidazol-Elutionspuffer pH 8,0
50 mM NaH
2
PO
4
0,3 M NaCl
500 mM Imidazol
Dialysepuffer 4 M Urea, pH 8,5
4 M Harnstoff
20 mM Tris-HCl
Dialysepuffer 2 M Urea, pH 8,5
2 M Harnstoff
20 mM Tris-HCl
Dialysepuffer 0 M Urea, pH 8,5
20 mM Tris-HCl
Dialysepuffer Imidazol
100 mM NaCl
10 mM NaH2PO4
10 mM Imidazol
2.11 Nährmedien
DMEM Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
EMEM Invitrogen/Gibco®, Paisley, GB
LB-Agar 300 ml LB-Agar (Eigenherstellung RKI), 150 µl IPTG
(1 M), 300 µl X-Gal (40 mg/ml), 300 µl Ampicillin
(100 mg/ml)
LB-Medium 172 mM NaCl, 1 % Bakto-Trypton, 0,5 % Hefeextrakt
SOC-Medium Invitrogen, Karlsruhe, D
2.12 Verbrauchsmaterialien
4-10 % Tris-Glycin-Fertiggele ThermoScientific, Waltham, USA
Immobilon®-P Transfer Membran (PVDF) Millipore/Merck, Darmstadt, D
Precellys Keramikkügelchen 1,4 mm peQLab, Erlangen, D
Ultrazentrifugenröhrchen Ultra-Clear™ open-top Beckman Coulter, Brea, USA
2.13 Molekularbiologische Kits
Big Dye terminator cycle sequencing kit Appl. Biosystems, Warrington, UK
BugBuster® Protein Extraction Kit Novagen®/Merck, Darmstadt, D
2 Material
47
DNeasy® Blood & Tissue Kit Qiagen, Hilden, D
MSB® Spin PCRapace & MSB® Vario CleanUp Stratec, Birkenfeld, D
NucleoSpin® Gel and PCR Clean-Up Kit Macherey & Nagel, Düren, D
Pierce® BCA Protein Assay Kit ThermoScientific, Waltham, USA
Total RNA Isolation Kit Macherey & Nagel, Düren, D
Turbo DNA-free™ Kit Ambion, Austin, USA
Z-Competent E. coli Transformation Kit and Buffer Sets™ Zymo Research, Orange, USA
2.14 Geräte
Geräte, die der üblichen Laborausstattung entsprechen, sind nicht gesondert aufgeführt.
BioDocAnalyse Biometra, Göttingen, D
Bio-Rad Mini-PROTEAN® Tetra Cell Bio-Rad, Hercules, USA
FastPrep24 MP Biomedicals, Santa Ana, USA
Mikroplattenleser FLUOstar Omega BMG, Ortenberg, D
Mikroplatten-Washer ELx405 Select CW BioTek, Winooski, USA
Mx3000P™, qPCR System Stratagene, LaJolla, USA
NanoDrop™ 8000 ThermoScientific, Waltham, USA
xCELLigence™ ACEA Biosciences Inc., Mannheim, D
Fluoreszenzmikroskop AxioVision Carl Zeiss AG, Oberkochen, D
Trans-Blot® Semi-Dry Bio-Rad, Hercules, USA
Electrophoretic Transfer Cell
Ultrazentrifuge L8-70M Beckman Coulter, Brea, USA
Ultrospec 10 Amersham Biosciences/ GE
Healthcare, Buckinghamshire, GB
2.15 Software
Geneious R7 7.1.4 Biomatters, Auckland, NZ
GraphPad Prism 5 GraphPad Software, Inc., LaJolla, USA
MxPro-Mx3005P v4.10 Stratagene, LaJolla, USA
ZEN lite 2012 Zeiss AG, Oberkochen, D
RTCA-Software 1.2 ACEA Biosciences Inc., Mannheim, D
3 Methoden
48
3 Methoden
3.1 Molekularbiologische Methoden
3.1.1 Design von Inserts zur Expression von His-Tag-Fusionsproteinen
Die Sequenzen diverser Polyomavirus-VP1 und -TAg(78aa) wurden für das Anfügen eines N-
terminalen 6x-His-Tags ohne das Start-Kodon verwendet, für die Expression in E. coli kodon-
optimiert und mit für die Klonierung adäquaten Restriktionsschnittstellen versehen. Am 5‘-
Ende wurde eine BamHI- und am 3‘-Ende eine XhoI-Schnittstelle angefügt. Des Weiteren ist
nach der BamHI-Schnittstelle ein T für einen korrekten Leserahmen (siehe S. 40) eingefügt.
Die für die N-Termini (78 aa) von fünf PyV (HPyV9, HPyV12, BKPyV, MCPyV und
BFDPyV) kodierenden DNA-Sequenzen wurden ohne Stopp-Kodon verwendet, so dass für
eine optimale Aufreinigung dieser kleinen Proteine ein N-Terminaler 6x-His-Tag und ein C-
Terminaler 8x-His-Tag angefügt wurden. Die in den Klonierungsvektor einzufügenden Se-
quenzen beinhalteten keine SalI-Schnittstellen. Diese Bedingung ist für eine schnelle Identifi-
kation korrekt klonierter Inserts nötig. Bei SalI-Restriktion des religierten Vektors, welcher
eine SalI-Schnittstelle besitzt, ergibt sich ein Fragment der Vektorgröße. Bei Einfügen des
Inserts entsteht eine zweite SalI-Schnittstelle und es entstehen nach Restriktion mit SalI zwei
Fragmente.
3.1.2 Klonierung
Für die Expression von His-Tag-Fusionsproteinen kam das pTriEx™-1.1-Vektorsystem (No-
vagen®) mit einem modifizierten Klonierungsvektor pTriEx™-1.1-6HN zum Einsatz. Synthe-
tisch hergestellte Sequenzen lagen in Standardvektoren (pAnyAmp/pMA-T) vor und wurden
in Z-kompetente E. coli DH5α transformiert (S. 48), in Übernachtkulturen angereichert
(S. 49) und die Plasmid-DNA isoliert (S. 49). Von Kolonien, für die per Sequenzierung
(S. 55) eine korrekte Lage des Inserts bestätigt wurde, wurden Glycerol-Dauerkulturen ange-
legt (S. 49) und die Inserts durch Einsatz diverser Restriktionsenzyme (S. 49) mit dem Klo-
nierungsvektor pTriEx™-1.1-6HN ligiert (S. 50). Das erhaltene Konstrukt wurde durch
Transformation in Z-kompetente E. coli DH5α amplifiziert und anschließend aufgereinigt.
Mit einem SalI-Kontrollverdau wurden Klone mit Insert identifiziert (S. 49) und diese an-
schließend durch eine Sequenzierung (S. 55) auf ihre Korrektheit überprüft.
3.1.2.1 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli
Für die Amplifikation von Plasmid-DNA wurde diese in Z-kompetente E. coli DH5α trans-
formiert. Z-kompetente E. coli DH5α wurden mit Hilfe des Z-Competent E. coli Transforma-
tion Kit and Buffer Sets™ entsprechend dem Herstellerprotokoll erhalten. Der Vorteil dieser
3 Methoden
49
chemisch kompetenten E. coli liegt darin, dass eine Transformation ohne Hitzeschock-
Prozedur unter geringem Aufwand möglich ist. E. coli Rosetta blue (DE3)placI wurde für die
Überexpression rekombinanter Proteine verwendet (S. 56). Das Protokoll verlief nach Anga-
ben des Herstellers.
3.1.2.2 Übernachtkulturen
Übernachtkulturen wurden durch Animpfen von 5 ml LB-Medium mit geeigneten Antibiotika
mit jeweils einer Kolonie und Inkubation über Nacht bei 37 °C und 200 rpm angelegt. Für die
Langzeitlagerung bei -80° C wurden Glycerol-Dauerkulturen aus 800 µl Kultur und 200 µl
Glycerin angesetzt.
3.1.2.3 Restriktionen
Nachfolgend sind die verwendeten Restriktionsenzyme (Tabelle 14) und –ansätze (Tabelle
15) dargestellt. Der Einsatz erfolgte nach Herstellerangaben.
Tabelle 14 Überblick über den Einsatz der verschiedenen Restriktionsenzyme
Restriktionsenzym
Einsatz
BamHI und XhoI
Doppelverdau His-Tag-Fusionsproteine
Doppelverdau Klonierungsvektor
SalI
Test auf korrekt eingefügte Inserts
KpnI und ApaI (Fast Digest-Enzyme)
Herauszuschneiden synthetischer HPyV9- und
HPyV12-Genome aus Plasmiden
Restriktionsansätze für einen Doppelverdau wurden wie folgt angesetzt:
Tabelle 15 Restriktionsansätze für herkömmliche und Fast Digest-Enzyme
Komponente
Volumen [µl]
Endkonzentration
Komponente
Volumen [µl]
Endkonzentration
Puffer 3 (10 x)
1,5
1 x
Puffer FD
2
1 x
BamHI (20 000 U/ml)
1
20 U
Enzym FD
1,5
1,5 FDU
XhoI (20 000 U/ml)
1
20 U
BSA 10 x
1,5
1 x
DNA
x
2 µg
DNA
x
1 µg
ddH
2
O
ad 15 µl
ddH
2
O
ad 20 µl
Gesamt
15
Gesamt
20
3.1.2.4 Dephosphorylierung
Die Enden von mit Restriktionsenzymen verdauten Vektoren (3.1.2.4) wurden für nachfol-
gende Ligationen mit SAP (Shrimp Alkaline Phosphatase) phosphoryliert, um eine Religation
3 Methoden
50
des Vektors mit sich selbst zu verhindern. Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist
Tabelle 16 zu entnehmen, das Protokoll war gemäß Herstellerangaben.
Tabelle 16 Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes zur Dephosphorylierung von restringiertem Vektor
Komponente
Volumen in µl
Endkonzentration
SAP
2
SAP-Puffer 10 x
3
1 x
DNA
x
3 µg
ddH
2
O
ad 15 µl
Gesamt
30
3.1.2.6 Ligation
Die Ligation von Inserts mit Vektoren und die Religation von HPyV9- und HPyV12-
Genomen nach Herausschneiden aus Plasmidkonstrukten wurde mithilfe der T4 DNA-Ligase
(Fermentas, St. Leon-Rot, D) vorgenommen (Reaktionsansätze siehe Tabelle 17).
Tabelle 17 Reaktionsansatz für die Ligation von Inserts mit Vektor
Komponente
Volumen
Endkonzentration
Ligase Puffer 10 x
2 µl
1 x
T4 DNA-Ligase
1 µl
Vektor (linearisiert)
x µl
50 ng
Insert (3x molare Menge)
x µl
x ng
ddH
2
O
ad 20 µl
Gesamt
20 µl
3.1.3 TAE-Agarose-Gelelektrophorese
Es wurden Gele mit 0,7-1,5 % Agarose in TAE-Puffer (S. 45) zur Auftrennung von DNA-
Fragmenten der Größe nach eingesetzt. Dem Agarose-Gel und dem Laufpuffer wurde Gel-
Red® zum Anfärben von Nukleinsäuren zugesetzt. Die Auswertung der Gele erfolgte mit dem
Geldokumentationssystem BioDocAnalyse (Biometra, Göttingen, D).
3.1.4 Reinigung von Nukleinsäuren
Die Reinigung von DNA aus dem Agarosegel erfolgte durch Ausschneiden der gewünschten
Banden mit dem Skalpell und nach Angaben des Herstellers mit dem NucleoSpin® Gel and
PCR Clean-Up Kit (Macherey & Nagel). Die Elution erfolgte in 20 µl PCR-H2O.
Die Reinigung von DNA aus PCR-Reaktionen erfolgte mit dem MSB® Spin PCRapace &
MSB® Vario CleanUp (Stratec, Birkenfeld, D) nach Angaben des Herstellers. Die Elution
erfolgte in 20 µl PCR-H2O.
3 Methoden
51
Die Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli DH5α wurde mit dem QIAprep® Miniprep Kit
(Qiagen) nach Angaben des Herstellers durchgeführt. Die Elution erfolgte in 50 µl PCR-H2O.
Die DNA-Präparation aus Gewebe-Proben wurde mit dem DNeasy® Blood & Tissue Kit nach
folgendem Protokoll durchgeführt:
• Homogenisierung der Gewebe-Proben mit 5 Precellys Keramikkügelchen, 180 µl
ATL-Puffer und 20 µl Proteinase K (20 mg/ml) für 40 Sekunden bei 4 m/s in einem
FastPrep24-Gerät (MP Biomedicals, Santa Ana, USA)
• Zentrifugation der Proben für 1 Minute bei 10 000 rpm
• Zugabe von 4 µl RNase A (100 mg/ml)
• Inkubation für 2 Minuten bei Raumtemperatur
• Zugabe von 200 µl AL-Puffer und sofortiges Vortexen
• 10-minütige Inkubation bei 70 °C und 900 U im Thermoschüttler
• Zugabe von 200 µl Ethanol (100 %)
• Auftragen des Gemisches auf DNeasy Mini-Säulen
• Zentrifugation von 1 Minute bei 8 000 rpm, Verwerfen des Filtrats
• Waschen der Säule mit 500 µl AW1-Puffer und 500 µl AW 2-Puffer
• Elution in 200 µl auf 70 °C temperiertem AE-Puffer. Die Säule mit dem AE-Puffer
3 Minuten inkubieren und anschließend 2 Minuten bei 8 000 rpm zentrifugieren
• Lagerung der eluierten DNA bei -20 °C
Die Isolation von RNA erfolgte mit dem Total RNA Isolation Kit von Machery & Nagel nach
Angaben des Herstellers. Anschließend wurde das Turbo DNA-freeTM Kit von Ambion für
einen zusätzlichen DNase-Verdau nach dem Protokoll des Herstellers angewendet. Die Lage-
rung der RNA erfolgte bis zur weiteren Verwendung bei -80 °C.
3.1.5 cDNA-Synthese
Die cDNA-Synthese wurde mithilfe der RNA-abhängigen DNA-Polymerase SuperScript® II
Reversen Transkriptase (Invitrogen) und Oligo(dT)-Primern durchgeführt. Zum Ausschließen
einer DNA-Kontamination wurde für jede Probe eine Kontrolle ohne Reverse Transkriptase
mitgeführt. Die Zusammensetzung des cDNA-Syntheseansatzes und die Zykler-Bedingungen
sind Tabelle 18 zu entnehmen. cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gela-
gert.
3 Methoden
52
Tabelle 18 Reaktionsansatz und Zyklerprogramm für cDNA-Synthese
Komponente*
Endkonzentration
µl/Reaktion
Zyklerbedingungen
Puffer 5 x
1 x
4
65 °C
5 min
dNTP-Mix (2,5 mM each)
50 nM
0,4
37 °C
2 min
Oligo(dT)16-Primer
25 mM
1 µl
42 °C
50 min
DTT
10 mM
2 µl
70 °C
15 min
SS® Reverse Transkriptase
100 U
0,4
4 °C
Pause
RNA
500 ng
x
H
2
O
ad 20
Gesamtvolumen
20
*Ansätze auf Eis pipettiert
3.1.6 DNA-/RNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration von DNA und RNA wurden mit dem NanoDrop™ 8000 bei 260 nm und
280 nm bestimmt.
3.1.7 PCR-Techniken
In dieser Arbeit kamen je nach Fragestellung diverse PCR-Techniken zum Einsatz. Konventi-
onelle PCR wurde zur Amplifikation von Produkten bis ca. 1 Kbp eingesetzt (siehe 3.1.7.1).
Die unter 3.1.7.2 beschriebene Mycoplasmen-PCR ist ebenfalls eine konventionelle PCR mit
zu 3.1.7.1 alternativen Bedingungen. Eine Zwei-Runden-PCR mit degenerierten Primern
wurde genutzt, um einen hoch-konservierten Bereich verschiedener bekannter und bisher un-
bekannter PyV zu amplifizieren (3.1.7.3). Bei längeren Amplifikaten (> 1 Kbp) kamen das
Enzym TaKaRa Ex Taq, überlappende Primer und bis zu drei PCR-Runden zum Einsatz
(3.1.7.4). qPCR wurde für eine Quantifizierung eingesetzt (3.1.7.5).
3.1.7.1 Konventionelle PCR
Die Zusammensetzung des Ansatzes und die Zyklerbedingungen für die konventionelle PCR
sind Tabelle 19 zu entnehmen.
Tabelle 19 PCR-Ansatz und Zyklerbedingungen für konventionelle PCRs
Komponente
Endkonzentration
µl/Reaktion
Zyklerbedingungen
Puffer 10 x
1 x
2,5
95 °C
12 min
1 x
MgCl
2
(25 mM)
2 mM
2
95 °C
30 sec
45 x
dNTP-Mix (10 mM each)
200 µM
0,5
Tm*
30 sec
DMSO (≥99,9 %)
~5 %
1,25
72 °C
3 min
s-/as-Primer
1 µM
2,5
72 °C
15 min
1 x
AmpliTaq Gold®
2 U
0,4
4 °C
Pause
Template
~300 ng
x
H
2
O
ad 25
Gesamtvolumen
25
* Temperatur je nach verwendetem Primerpaar (2.6.6)
3 Methoden
53
Abbildung 8 zeigt, wie die konventionelle PCR als intron-spannende PCR bei der Analyse
von Spleiß-Events des LTAg eingesetzt wurde.
Abbildung 8 Schema der Intron-spannenden PCR zur Identifikation von gespleißtem LTAg
3.1.7.2 Mycoplasmen-PCR
Die Mycoplasmen-PCR wurde basierend auf Kuppeveld et al. mit einem vereinfachten Zyk-
ler-Programm durchgeführt (183). Zellkulturüberstände wurden für 5 Minuten bei 95 °C in-
kubiert und in destilliertem Wasser 1:10 verdünnt in die PCR eingesetzt. Der PCR-Ansatz und
das Zykler-Protokoll sind Tabelle 20 zu entnehmen.
Tabelle 20 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Mycoplasmen-PCR
Komponente
Endkonzentration
µl
Zyklerbedingungen
Puffer 10 x
1 x
5
95 °C
5 min
1 x
MgCl
2
(50 mM)
1,5 mM
1,5
95 °C
30 sec
dNTP-Mix (10 mM each)
200 µM
1
55 °C
30 sec
40 x
Primer s*
200 nM
1
72 °C
15 sec
Primer as*
200 nM
1
4 °C
Pause
Platinum® Taq
1 U
0,2
Probe
1:10
10
H
2
O
ad 50
Gesamtvolumen
50
*Primer siehe S. 42. Zu erwartendes PCR-Amplifikat: 280 Bp
3.1.7.3 Generische PCR
Die generische PCR amplifiziert einen hoch konservierten Bereich der VP1-Gene der PyV
und wurde im nested-Format durchgeführt. Es wurde die DNA-Polymerase AmpliTaq Gold®
verwendet. Der PCR-Ansatz und das Zykler-Programm für die PyV-Konsensus-PCR sind
Tabelle 21 zu entnehmen.
Tabelle 21 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für PCR zur generischen Detektion von PyV
Komponente
Endkonzentration
Mix Runde 1/2
Zyklerbedingungen (Runde 1/2)
Puffer 10 x
1 x
2,5 µl
95 °C
12 min
1 x
MgCl
2
(25 mM)
2 mM
2 µl
95 °C
30 sec
15 x
dNTP-Mix (10 mM each)
200 µM
0,5 µl
46/50 °C
30 sec
DMSO (≥99,9 %)
~5 %
1,25 µl
72 °C
2 min
s-/as-Primer
1 µM
2,5 µl
72 °C
15 min
1 x
AmpliTaq Gold®
2 U
0,4 µl
4 °C
Pause
Template
~300 ng
x/1,5 µl*
H
2
O
ad 25
Gesamtvolumen
25 µl
*1,5 µl der ersten Runde wurden in die zweite Runde eingesetzt. Zu erwartende PCR-Amplifikate: 800 Bp (1. Runde), 250 Bp (2. Runde)
N - - C
IntronExon 1Exon 2
3 Methoden
54
3.1.7.4 Nested Long-Distance PCR
Eine Nested Long-Distance (LD) PCR wurde eingesetzt, um >2 Kbp große Amplifikate der
frühen Region von PyV zu erhalten. Tabelle 22 gibt die verwendeten Mengen für die PCR-
Ansätze und die Bedingungen für den PCR-Zykler an. Abbildung 9 zeigt, wie die Nested LD-
PCR eingesetzt wurde, um nahezu das gesamt LTAg zu amplifizieren.
Tabelle 22 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Nested LD-PCR
Komponente
Endkonzentration
Mix Runde 1/2/3
Zyklerbedingungen (Runde 1/2/3)
Puffer (20 mM MgCl
2
)
1 x
5 µl
94 °C
5 min
1 x
dNTP-Mix (je 2,5 mM)
400 µM
8 µl
98 °C
20 sec
15 x
s-/as-Primer
1 µM
4 µl
Tm °C
30 sec
Ex Taq Polymerase
2,5 U
0,5 µl
70 °C
6 min
Template
2,5/1*/1* µl
98 °C
20 sec
15 x
H
2
O
ad 50
Tm °C
30 sec
70 °C
6 min + 5 sec
72 °C
30 min
1 x
4 °C
Pause
Gesamtvolumen
50
*2,5 µl cDNA wurden pro PCR in Runde 1 eingesetzt, 1 µl der ersten wurde in die zweite Runde eingesetzt, 1 µl der zweiten wurde in die
dritte Runde eingesetzt
Abbildung 9 Schema der Nested Long-Distance PCR
3.1.7.5 qPCR
Die qPCR wurde als TaqMan®-PCR durchgeführt, bei der eine sequenzspezifische Sonde,
flankiert von zwei Primern, zum Einsatz kommt. Bei der HPyV9-spezifischen Sonde handelte
es sich um eine MGB-Sonde (Minor-Groove-Binder). Die HPyV12-spezifische Sonde ist mit
FAM™ und TAMRA™ markiert. Tabelle 23 gibt die Reaktionsansätze und die Zyklerbedin-
gungen für die qPCR an.
N - - C
IntronExon 1Exon 2
3 Methoden
55
Tabelle 23 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für qPCR
Komponente
Endkonzentration
µl
Zyklerbedingungen
Puffer 10 x
1 x
2,5
95 °C
5 min
1 x
MgCl
2
(25 mM)
2 mM
2
95 °C
15 sec
45 x
dNTP-Mix (2,5 mM
100 µM
1
Tm °C
30 sec
s- Primer
200 nM
1
4 °C
Pause
as-Primer
200 nM
1
Sonde
100 nM
0,375
Platinum®Taq
1 U
0,2
Template
1/5*
H
2
O
ad 25
Gesamtvolumen
25
*Es werden 1 µl cDNA und 5 µl Standard pro Reaktion eingesetzt
Die Auswertung der quantitativen PCR erfolgte mit Hilfe einer Standardgerade. Den Standard
stellte jeweils ein VP1-Amplifikat einer konventionellen PCR als Verdünnungsreihe mit 106
bis 1 Kopie/µl unter Zugabe von jeweils 1 ng/µl Bakteriophage λ-DNA dar (3.1.7.1).
3.1.7.6 Sequenzierung
Die Sequenzierung wurde nach der Kettenabbruchmethode von Sanger durchgeführt (184).
Verwendet wurde hierfür das BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit von Applied
Biosystems. Tabelle 24 gibt die Komponenten des Reaktionsansatzes und die Zyklerbedin-
gungen für die Sequenzierung an.
Tabelle 24 Reaktionsansatz und Zyklerbedingungen für Sequenzierung nach Sanger
Komponente
Endkonzentration
µl
Zyklerbedingungen
ABI Terminator Puffer 5 x
1 x
1,5
96 °C
2 min
1 x
s- Primer
100 nM
0,5
96 °C
1 sec
25 x
as-Primer
100 nM
0,5
Tm °C
5 sec
BigDye v3.1 Terminator Reagenz
1
60 °C
4 min
Template
150-300 ng
x
4 °C
Pause
H
2
O
ad 10
Gesamtvolumen
10
Die Auswertung der mittels der ABI-Software Sequence-Analysis erzeugten Sequenzen er-
folgte mit der Software Geneious 7.1.4.
3.1.7.7 NGS-Analyse von Proben-Pools
Für eine NGS-Analyse wurden Proben-Pools der Gewebeproben der Charité (S. 38) herge-
stellt. Analysiert wurden die Pools Tumorgewebe-Leber, Normalgewebe-Leber, Tumorgewe-
3 Methoden
56
be-Galle, Normalgewebe-Galle, Tumorgewebe-Colon und Normalgewebe-Colon. Es wurden
pro Proben-Pool zehn DNA-Proben (je 200 ng) des gleichen Gewebetyps ausgewählt und je
Probe 200 ng DNA in ein Reaktionsgefäß gegeben. Das Volumen des Pools betrug maximal
50 µl. Die anschließende Probenvorbereitung, die Analyse im Illumina HiSeq 1500 und die
bioinformatische Aufarbeitung und Auswertung wurden vom Sequenzierungsservice des RKI
(ZBS1) durchgeführt und sind daher hier nicht im Detail aufgeführt.
3.2 Proteinbiochemische Methoden
3.2.1 Expression von His-Tag-Fusionsproteinen
Die Konstrukte pTriEx™-1.1-6HN/VP1 und pTriEx™-1.1-6HN/TAg(78aa) wurden in E. coli
RosettaBlueTM (DE3)pLacI transformiert (3.1.2.1) und die E. coli über Nacht auf LB-Platten
mit 80 µg/ml Ampicillin, 30 µg/ml Chloramphenicol und 1 % Glucose bei 37 °C inkubiert.
Von Kolonien wurden Übernachtkulturen in LB-Medium mit 80 µg/ml Ampicillin, 30 µg/ml
Chloramphenicol und 1 % Glucose angelegt und bei 30 °C über Nacht bei 200 rpm geschüt-
telt. Hiervon wurden anschließend Hauptkulturen 1:20 in LB-Medium mit 80 µg/ml Ampicil-
lin, 30 µg/ml Chloramphenicol und 1 % Glucose angeimpft. Nach einer Inkubation bei 37 °C
und 200 rpm bis zu einer OD600nm von 1,2 wurde die Kultur mit LB-Medium mit 80 µg/ml
Ampicillin und 30 µg/ml Chloramphenicol 1:2 verdünnt. Es folgte die Induktion der Expres-
sion der viralen Proteine mit 500 µM IPTG für 2 Stunden bei 37 °C und 200 rpm. IPTG sorgt
durch Repressorbindung für das Freiwerden des Promotors für die RNA-Polymerase und so-
mit für die Transkription des Zielgens (Lactose-Operon-Modell). Nachfolgend wurden die E.
coli für 20 Minuten bei 8000 x g und 4 °C pelletiert und der Überstand dekantiert.
3.2.2 Isolierung von Proteinen aus E. coli mit BugBuster® Protein Extraction Reagent
Die in E. coli überexprimierten Proteine wurden mithilfe des BugBuster® Protein Extraction
Reagent nach Angaben des Herstellers isoliert. Dabei wurde Benzonase® Nuklease
(25 U/1 ml Lysat) zur Verringerung der Viskosität des Lysates durch chromosomale DNA
eingesetzt. 200 U rLysozym™ wurde jedem Milliliter Lysat zugegeben, um das Murein der
Bakterienzellwände aufzuschließen. In E. coli überexprimierte Proteine werden entweder im
Zytosol, teilweise aber auch in den Inclusion Bodies eingelagert (185-187). Je nach Bedarf
wurden die vom Hersteller des BugBuster® Protein Extraction Reagent empfohlenen Proto-
kolle für die Aufreinigung der löslichen Fraktion (TAg(78aa), 3.2.3.2) oder der Inclusion Bo-
dies angewendet (VP1, 3.2.3.1).
3 Methoden
57
3.2.3 Aufreinigung über Affinitätschromatographie
Die in E. coli überexprimierten Proteine wurden über Bindung ihres His-Tags an Nickel-
NTA-Beads aufgereinigt. Poly-Prep Chromatography Columns dienten hierbei als Säulen und
ermöglichten Wasch- und Elutionsschritte. Unter 3.2.3.1 und 3.2.3.2 sind die Bedingungen für
die Aufreinigung der VP1 unter denaturierenden und für die Aufreinigung von TAg(78aa)
unter nativen Bedingungen beschrieben.
3.2.3.1 Aufreinigung von VP1 unter denaturierenden Bedingungen
Bei der Aufreinigung der überexprimierten VP1 kamen harnstoffhaltige Puffer (2.10) und ein
pH-Gradient zum Einsatz. Harnstoff denaturiert die Proteine und ermöglicht deren Bindung
an die Nickel-NTA-Beads in Gegenwart eines hohen pH-Wertes (denaturierender Lösepuffer,
pH 8,0). Ein denaturierender Elutionspuffer mit einem pH 4,5 verdrängt das über den His-Tag
an die Säule gebundene VP1.
Zu Beginn wurde das unter 3.2.2 beschriebene Pellet aus Inclusion Bodies in denaturierendem
Lösepuffer resuspendiert. Je Probe wurden mit einem 1 ml Ni-NTA-Bead-Aliquot drei
Waschschritte mit 1 ml denaturierendem Lösepuffer durchgeführt. Anschließend wurde das
resuspendierte Pellet für 1 Stunde bei Raumtemperatur mit dem 1 ml Ni-NTA-Bead-Aliquot
auf dem Rotationsschüttler inkubiert. Die Suspension wurde dann vollständig in die Poly-
Prep Chromatography Column überführt und die Säule zwei Mal mit 5 ml denaturierendem
Waschpuffer gewaschen. Es folgten zwei Elutionsschritte mit je 1 ml denaturierendem Eluti-
onspuffer. Das zweite Eluat enthielt die größte Menge an VP1 und wurde in der Dialyse
(3.2.4) aufbereitet.
3.2.3.2 Aufreinigung von TAg(78aa) unter nativen Bedingungen
Bei der Aufreinigung der TAg(78aa) wurde die unter 3.2.2 beschriebene lösliche Fraktion
verwendet. Je Probe wurden mit einem 1 ml Ni-NTA-Bead-Aliquot drei Waschschritte mit
1 ml Äquilibrierpuffer (2.10) durchgeführt. Anschließend wurde die lösliche Fraktion für
2 Stunden bei Raumtemperatur mit dem 1 ml Ni-NTA-Bead-Aliquot auf dem Rotations-
schüttler inkubiert. Die Suspension wurde dann vollständig in die Poly-Prep Chromatography
Column überführt und die Säule zwei Mal mit 5 ml Imidazol-Waschpuffer (2.10) gewaschen.
Es folgte ein Elutionsschritt mit 1 ml Imidazol-Elutionspuffer (2.10). Das Eluat wurde in der
Dialyse (3.2.4) aufbereitet.
3.2.4 Dialyse
Eine Dialyse mit einem Harnstoff-Gradienten (4 M, 2 M, 0 M, S. 45) bzw. einem 10 mM
Imidazol-Puffer (S. 45) wurde vorgenommen, um den Harnstoff (verringert die Stabilität der
3 Methoden
58
Proteine) und das Imidazol (verfälscht ELISA-Ergebnisse) aus den Proteinproben zu entfer-
nen. Für VP1 wurden hierbei Dialyseschläuche mit einem MWCOV von 12 – 14 kDa und für
TAg(78aa) solche mit einem MWCOV von 6 – 8 kDa verwendet. Die Dialyseschläuche wur-
den vor der Verwendung 5 Minuten in Wasser gekocht und mit Wasser gespült. Die Dialyse
wurde anschließend in drei Schritten mit jeweils dem 500-fachen Volumen des Eluates unter
Rühren bei 4 °C für 4 Stunden durchgeführt.
3.2.5 Isolierung von Proteinen aus Zellkultur
Proteine wurden zur Analyse im Western Blot aus transfizierten Zellen isoliert. Hierfür wur-
den der Zellkulturüberstand abgenommen, die Zellen einmal mit 1 x PBS gewaschen und die
Zellen mit 600 µl RIPA-Puffer, 6 µl Phosphatase-Inhibitor-Cocktail und 18 µl EDTA pro 24-
Kavität für 15 Minuten bei 4°C inkubiert. Lysierte Zellen wurden in ein 1,5 ml-Eppendorf-
Röhrchen überführt, für 10 Minuten bei 10 000 x g zentrifugiert und der Überstand in ein
neues Gefäß überführt. Proteine wurden bei -80°C gelagert.
3.2.6 Proteinkonzentrationsbestimmung mittels BCA Protein Assay Kit
Der Pierce® BCA Protein Assay Kit, ein Bicinchoninsäure-Assay, ermöglicht die photometri-
sche Bestimmung von Proteinkonzentrationen und wurde nach Angaben des Herstellers
durchgeführt.
3.2.7 SDS-PAGE
Die Sodiumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) stellt eine zweidi-
mensionale, diskontinuierliche Zonen-Elektrophorese dar. Verwendet wurden je nach experi-
mentellem Hintergrund selbst präparierte 10 % Gele (1 mm, siehe Tabelle 25) und 4-10 %
Tris-Glycin-Fertiggele.
Tabelle 25 Rezeptur für selbstgefertigte Polyacrylamid-Gele
Reagenz
Trenngel (10%)
Sammelgel (4%)
ddH
2
O
8,2 ml
12,2 ml
Tris-HCl 1,5M pH8,8
5 ml
-
Tris-HCl 0,5M pH6,8
-
5 ml
Acrylamid/Bis- 37,5%
6,6 ml
2,6 ml
SDS (20%)*
100 µl
100 µl
APS**
200 µl
200 µl
TEMED***
100 µl
100 µl
* Zerstört Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine **Polymerisationsinitiator ***Polymerisationskatalysator
Die Proben wurden vor der Analyse mit 4 x Laemmli-Puffer (Tabelle 26) versehen und für 5
Minuten bei 95 °C im Heizblock denaturiert.
3 Methoden
59
Tabelle 26 Rezeptur für 4 x Laemmli-Puffer
Endkonzentration Reagenz
Volumen/Mengen
200 mM Tris-HCl
1,5 ml 1 M Tris-HCl, pH6,8
8% SDS
0,6 g
40% Glycerol*
3 ml 100% Glycerol
400 mM DTT**
3 ml 1 M DTT
Bromphenolblau***
0,03 g
*sorgt für ein Absinken der Proben in die Geltaschen **sorgt für eine Denaturierung der Sekundär- und Tertiärstrukturen der Proteine
***färbt die Lauffront des Gels an
Die Elektrophorese mit Fertiggelen wurde für 40 Minuten bei 100 V durchgeführt. Bei selbst
gegossenen Gelen wurden die Proteine zunächst 10 Minuten bei 80 V im Sammelgel fokus-
siert und anschließend für weitere 50 Minuten bei 100 V im Trenngel aufgetrennt.
3.2.8 Färbung mit Coomassie-Brilliant-Blau R-250
Für eine Anfärbung von Proteinbanden im Polyacrylamidgel erfolgte eine Färbung mit
Coomassie Brilliant Blue R250 (Roti-Blue, 5 x). Dieser Triphenylmethanfarbstoff bindet un-
spezifisch an basische Seitenketten der Aminosäuren. Hierfür wurde das Gel über Nacht in
einer Lösung von 10 ml Methanol, 10 ml Roti-Blue 5 x und 30 ml Wasser bei Raumtempera-
tur auf dem Schüttler inkubiert. Die anschließende Entfärbung nicht gebundenen Farbstoffs
wurde mit Wasser durchgeführt.
3.2.9 Western Blot (immunologischer Nachweis membrangebundener Proteine)
Bei einer Western Blot-Prozedur wurden die in der SDS-PAGE (3.2.7) aufgetrennten Proteine
mit einer Trans-Blot® Semi-Dry Electrophoretic Transfer Cell (Bio-Rad, Hercules, USA) auf
eine Polyvinylidenfluorid (PVDF)-Membran transferiert. Das SDS-Gel wurde nach der Elekt-
rophorese zur Entfernung des SDS in Transferpuffer für 30 Minuten äquilibriert. Die PVDF-
Membran wurde für 30 Sekunden in Ethanol aktiviert und anschließend ebenfalls in Transfer-
puffer äquilibriert. Es folgte der Zusammenbau eines Blot-Sandwichs, bei welchem ein Fil-
terpapier, die PFDV-Membran, das SDS-Gel und ein weiteres Filterpapier übereinander ge-
schichtet wurden. Alle Bestandteile wurden mit Transferpuffer getränkt. Der Pluspol befand
sich bei diesem Aufbau unter dem Blot-Sandwich, der Negativpol darüber, so dass die Protei-
ne mit ihrer negativen Ladung aus dem SDS-Gel auf die PVDF-Membran übertragen werden.
Es wurde für 1 Stunde eine Stromstärke von 1 – 2 mA pro cm² PVDF-Membran angelegt.
Unspezifische Bindungsstellen auf der Membran wurden durch eine Inkubation für 1 Stunde
bei Raumtemperatur und 200 rpm in 5 % Milchpulver und 0,05 % Tween20 in PBS (PBSTM)
blockiert. Es folgt die Inkubation mit einem spezifischen Primärantikörper in 1:10 verdünn-
tem PBSTM für 1 Stunde bei Raumtemperatur und 200 rpm. Die Verdünnungen der Pri-
märantikörper sind Tabelle 27 zu entnehmen. Nach 3 Waschschritten à 10 Minuten mit
3 Methoden
60
0,05 % Tween20 in PBS (PBST) wurde die Membran mit einem Ziege-anti-Maus-IgG Se-
kundärantikörper in 1:10 verdünntem PBSTM für 1 Stunde bei Raumtemperatur und 200 rpm
inkubiert. Es folgten 3 Waschschritte à 10 Minuten mit PBST und die Detektion der Immun-
reaktion mit dem ECL™ Western Blotting Analysis System nach Angaben des Herstellers.
Tabelle 27 Verdünnungen von Primärantikörpern im Western Blot
Antikörper
Verdünnung
anti-HPyV9-VP1
1:50
anti-HPyV9-TAg
1:10
anti-HPyV12-VP1
1:200
anti-HPyV12-TAg
1:100
3.3 Immunologische Methoden
3.3.1 Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA)
Bei beiden in dieser Arbeit durchgeführten ELISA handelte es sich um indirekte ELISA. Für
den VP1-basierten ELISA lag bereits ein publiziertes Protokoll vor (17, 35). Die Parameter
Antigenmenge und Serumverdünnung für den TAg(78aa)-ELISA wurden mithilfe von aus
immunisierten Mäusen gewonnenen positiven Kontrollseren (3.4) optimiert. Im Kapsomer-
basierten VP1-ELISA wurden 96-Kavitäten-Polystyrol-Mikrotiterplatten mit den Antigenen
HPyV9- und HPyV12-VP1 beschichtet. Sie dienten je nach VP1 zum Nachweis von Po-
lyomavirus-spezifischen Antikörpern in humanem Serum. Im TAg(78aa)-basierten ELISA
erfolgte die Beschichtung von Mikrotiterplatten mit den Antigenen HPyV9-, HPyV12-,
MCPyV-, BKPyV- und BFDPyV-TAg(78aa).
Das Protokoll war wie folgt:
• Inkubation von 50 ng Antigen/pro Kavität in 100 µl PBS für 1 Stunde bei 37 °C
• 6 Waschschritte mit 200 µl PBS mit 0,05 % Tween20 (PBST) pro Kavität
• Inkubation der beschichteten Mikrotiterplatten mit 200 µl PBSTM für 2 Stunden bei
37 °C, um unspezifischen Bindungen durch die zu testenden Seren und das eingesetzte
Konjugat vorzubeugen
• Verdünnung der Seren 1:200 in PBSTM Inkubation von 100 µl je Kavität für 1 Stunde
bei 37 °C
• 6 Waschschritte mit je 200 µl PBST/Kavität
3 Methoden
61
• Inkubation mit 100 µl Konjugat/Kavität für 1 Stunde bei Raumtemperatur (gegen den
Fc-Teil humaner IgG-Antikörper gerichteter, an eine Meerrettichperoxidase (HRPO)
gekoppelter Antikörper)
• 6 Waschschritte mit 200 µl PBST/Kavität zum entfernen des überschüssigen Konjuga-
tes
• Inkubation mit 50 µl 3,3‘,5,5‘-Tetramethylbenzidin (TMB)/Kavität für 10 Minuten bei
Raumtemperatur
• Stoppen der Reaktion durch Zugabe von 50 µl Schwefelsäure
• Messung des Farbumschlages von blau zu gelb im Photometer bei einer Wellenlänge
von 450 nm
Alle Waschvorgänge wurden mit einem Mikroplatten-Washer (BioTek ELx405 Select CW)
durchgeführt. Jedes Serum wurde auf Reaktivität gegen die verschiedenen Polyomavirus-VP1
und -TAg(78aa) getestet, inklusive dem BFDPyV-VP1/-TAg(78aa). Dieser Ansatz identifi-
ziert die Reaktivität der Serumantikörper, die lediglich auf einer unspezifischen Wechselwir-
kung mit Polyomavirus-Strukturen oder ggf. Verunreinigungen aus der Überexpression in
E. coli beruht und in der späteren Auswertung berücksichtigt werden muss. Zusätzlich gab es
für jedes Serum eine Serumkontrolle, welche die unspezifische Reaktivität der Serumantikör-
per mit der Mikrotiterplatte und den eingesetzten Reagenzien darstellt. Eine Spalte Kavitäten
in der Mitte der Mikrotiterplatte wurde für Blanks reserviert, Kavitäten ohne Antigen und
ohne Serum. Die Blanks repräsentieren das Hintergrundsignal, welches durch die Mikrotiter-
platte und die Reagenzien hervorgerufen wird. Als Positivkontrollen dienten für den VP1-
basierten ELISA in vorherigen Experimenten wiederholt positiv getestete Seren und im
TAg(78aa)-basierten ELISA die für die Optimierung der Parameter eingesetzten Kontrollse-
ren aus immunisierten Mäusen (3.4). Nach der Testung der gesamten Seren erfolgte die Be-
rechnung des Cut-off-Wertes (COV). Hierfür wurden die Seroreaktivitäten der getesteten Se-
ren für die diversen Antigene in der folgenden Berechnung verwendet:
Rechenschritt (1): absolute Extinktion Serum in Antigen-beschichteter
Kavität minus Blank
Rechenschritt (2): absolute Extinktion Serumkontrolle minus Blank
(negative Werte werden auf null gesetzt)
Rechenschritt (3): (1) minus (2) = Nettoextinktion des Serums
3 Methoden
62
Alle negativen Nettoextinktionen wurden gemittelt und mit der einfachen Standardabwei-
chung aller negativen Nettoextinktionen addiert. Der sich ergebende Wert war der COV für
das jeweilige Antigen. Nach Abzug der Nettoextinktion für BFDPyV (negative Nettoextink-
tionen wurden gleich null gesetzt) von der Nettoextinktion des Serums ließ sich mit Hilfe des
errechneten COV bestimmen, ob ein Serum positiv oder negativ für das entsprechende Anti-
gen war.
3.3.2 Immunfluoreszenzassay (IFA)
Bei einem indirekten Immunfluoreszenzassay (IFA) kommen ein Primär- und ein Sekun-
därantikörper zum Einsatz. Hierfür wurden Zellen in der 24-Kavitäten-Zellkulturplatte auf
Glasplättchen ausgesät. Vor dem IFA wurden Zellkulturüberstände gesammelt und die Zellen
einmal mit 1 x PBS gewaschen. Nach Fixieren der Zellen mit 200 µl 4 % Paraformaldehyd in
PBS für 20 Minuten bei Raumtemperatur wurde wie folgt vorgegangen:
• 2 Waschschritte mit 500 µl 1 x PBS je Kavität
• Permeabilisierung mit 150 µl 0,2 % TritonX-100 in 1 x PBS je Kavität für 15 min bei
Raumtemperatur
• 3 Waschschritte mit 500 µl 1 x PBS je Kavität
• Inkubation mit 150 µl Primärantikörperverdünnung/Kavität Primärantikörper (kom-
merziell erworbene monoklonale Antikörper gegen spezifische VP1- bzw. TAg-
Regionen (siehe 2.7) verdünnt (Tabelle 28) in Antikörper-Puffer (siehe 2.10)) für eine
Stunde bei 37 °C und 200 rpm
• 3 Waschschritte mit 500 µl 1 x PBS je Kavität
• Inkubation mit 150 µl Sekundärantikörperverdünnung/Kavität 1:100 in Antikörper-
Puffer (siehe 2.10) (Ziege-anti-Maus-Fab-IgG-Cy3) für 45 Minuten bei 37 °C und
200 rpm.
• 5 Waschschritte mit 500 µl 1 x PBS je Kavität
• Kurzes Eintauchen der Glasplättchen in A. bidest und Aufkleben dieser mit einem
Tropfen Mowiol auf einen Objektträger
• Trocknung der Präparate für mindestens 3 Stunden bei 4 °C im Dunkeln
3 Methoden
63
Tabelle 28 Verdünnungen von Primärantikörpern im IFA
Antikörper
Verdünnung
anti-HPyV9-VP1
1:100
anti-HPyV9-TAg
1:100
anti-HPyV12-VP1
1:200
anti-HPyV12-TAg
1:200
Die Betrachtung der Präparate erfolgte mit dem Fluoreszenzmikroskop AxioVision (Zeiss
AG, Oberkochen, D).
3.4 Tierexperimentelle Methoden
Tierexperimentelle Methoden kamen in dieser Arbeit für die Herstellung polyklonaler Antise-
ren aus der Maus als Positivkontrolle für ELISA- und Western Blot-Analysen zum Einsatz. Es
wurden Balb/c-Mäuse mit jeweils 20 µg aufgereinigtem Antigen HPyV12-, HPyV9-,
BKPyV-, MCPyV- oder BFDPyV-TAg(78aa) immunisiert. Hierfür wurden die Antigene mit-
tels präparativer SDS-Gelelektrophorese aufgetrennt (Gel-Dicke 1,5 mm, breite Auftragstas-
che). Die Herstellung der SDS-Gele, die Probenvorbereitung und die Gelelektrophorese wur-
den wie in 3.2.7 beschrieben durchgeführt. Es folgte eine Färbung mit Coomassie Brilliant
Blue R250 (siehe 3.2.8). Die gewünschte Antigen-Bande wurde ausgeschnitten und in 100 µl
PBS im FastPrep24 (MP Biomedicals, Santa Ana, USA) 5 Precellys Keramikkügelchen bei
4 m/s für 40 Sekunden zerkleinert. Der Überstand wurde in neue Gefäße überführt und für die
Immunisierung der Mäuse eingesetzt (siehe 2.2).
3.5 Zytologische Methoden
3.5.1 Kultivierung von adhärenten Zelllinien
Alle Zelllinien (siehe Tabelle 5; detaillierte Informationen unter 2.3) wurden im Brutschrank
bei 37 °C und mit 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Je nach Grundfläche der
Flasche (25 cm², 75 cm² und 175 cm²) wurden die Zellen in 8 ml, 18 ml und 40 ml Zellkul-
turmedium kultiviert. Für jede Zelllinie wurde das Medium mit den entsprechenden Zusätzen
für ein optimales Wachstum verwendet (Tabelle 29). Das fötale Kälberserum (FKS) wurde
vor Zugabe zu den Nährmedien für 30 Minuten bei 56 °C inaktiviert. Das Passagieren der
Zellen erfolgte je nach Zelllinie zwei bis drei Mal pro Woche in einem Verhältnis von 1:4 bis
1:12. Die Zellen wurden hierfür nach Abnahme des verbrauchten Kulturmediums mit 3-7 ml
1 x PBS gewaschen und der Zellrasen anschließend durch Zugabe von Trypsin/EDTA vom
Boden der Zellkulturflasche gelöst. Die Menge an zugegebenem Trypsin/EDTA wurde je
nach Fläche der Zellkulturflasche angepasst (25 cm², 0,5 ml; 75 cm², 0,75 ml; 175 cm², 1 ml).
3 Methoden
64
Nach Zugabe des Trypsins erfolgt eine Inkubation für 5-15 min bei 37 °C im Brutschrank, bis
sich die Zellen komplett vom Flaschenboden gelöst hatten. Anschließend wurden die Zellen
in frischem Kulturmedium aufgenommen und resuspendiert. Der gewünschte Anteil der Zel-
len wurde zur Weiterkultivierung in neue Kulturflaschen mit bereits vorgelegtem Nährmedi-
um überführt.
Tabelle 29 Übersicht über adhärente Zelllinien und ihre Nährmedien
Zelllinie
Medium
Zusätze
293-4T
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep, 5µg/ml Blasticidin S, 1% NE-AA*,
100µg/ml Zeocin, 2mM L-Glutamin
NIH/3T3
DMEM
5 % FKS, 1 % Pen/Strep
A375
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
A549
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
Cos-7
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
HEK293
DMEM
5 % FKS, 1 % Pen/Strep
HeLa
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
Huh7
DMEM
10% FKS, 1% Pen/Strep, 1% NE-AA*, 10mM Natrium-Pyruvat
RH
DMEM
5 % FKS, 1 % Pen/Strep
SW480
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
Vero
DMEM
10 % FKS, 1 % Pen/Strep
*Nicht-essentielle Aminosäuren, 100x
3.5.2 Kultivierung von Suspensionszellen
Die Suspensionszelllinie BJAB wurde in RPMI-Medium mit 10 % FKS, 1 % L-Glutamin und
1 % Pen/Strep bei 37 °C mit 5 % CO2 und 90 % Luftfeuchtigkeit kultiviert. Für die Passagie-
rung wurden die Zellen für 5 Minuten bei 300 x g pelletiert, der Überstand dekantiert und das
Zellpellet in frischem Nährmedium resuspendiert. Der gewünschte Anteil wurde für die Wei-
terkultivierung in eine neue Zellkulturflasche überführt.
3.5.3 Einfrieren
Die Zellen wurden nach Abnahme des verbrauchten Kulturmediums mit 1 x PBS gewaschen,
durch Zugabe von Trypsin/EDTA und Inkubation bei 37 °C im Brutschrank vom Boden der
Zellkulturflasche gelöst und in frischem Zellkulturmedium aufgenommen. Durch Zentrifuga-
tion bei 300 x g für 8 min wurden die Zellen pelletiert und anschließend das Kulturmedium
dekantiert. Das Zellpellet wurde in 10 % DMSO (Dimethylsulfoxid) in FKS resuspendiert
und 1 ml Aliquots auf Kryoröhrchen verteilt. Das Einfrieren der Zellen erfolgte unter Zuhilfe-
nahme einer CoolCell® Einfrierbox (BioCision, SanRafael, USA). Diese ermöglicht eine
3 Methoden
65
langsame Temperaturabsenkung der Zellen von 1 °C/min und ist dementsprechend besonders
schonend. Die Zellen wurden zunächst über Nacht bei -70 °C gekühlt und anschließend bis
zur weiteren Verwendung bei -150 °C gelagert.
3.5.4 Auftauen
Für den Auftauprozess der Zellen wurden die Kryoröhrchen nach Entnahme aus dem Stick-
stofftank in handwarmem Wasser aufgetaut und in ein 15 ml-Zentrifugenröhrchen mit bereits
vorgelegtem Kulturmedium überführt. Durch Zentrifugation bei 300 x g für 8 min wurde das
DMSO entfernt. Der Überstand wurde dekantiert, das Zellpellet in 1 ml Kulturmedium resus-
pendiert und in eine 25 cm² Zellkulturflasche mit vorgelegtem Nährmedium überführt.
3.5.5 Bestimmung der Zellzahl
Die Zellzahlbestimmung erfolgte mit der Neubauer-Zählkammer. Hierfür wurden unter beide
Seiten des aufgelegten Deckglases 10 µl der Zellsuspension pipettiert und unter dem Licht-
mikroskop die Zellzahl in vier Großquadraten gezählt und hieraus der Mittelwert gebildet
(Zellengezählt). Die Anzahl der Zellen pro Milliliter ergab sich aus Formel (1):
(1)
4
10⋅= gezählt
Zellen
ml
Zellzahl
.
3.5.6 Transfektion
Es wurden synthetische Genome von HPyV9 und HPyV12 in diverse eukaryotische Zelllinien
transfiziert. Hierfür wurden die Zelllinien circa 20 Stunden vor der Transfektion in den ge-
wünschten Zellkulturplatten ausgesät. Die Transfektion erfolgte je nach Zelllinie mit dem
Transfektionsreagenz X-tremeGENE HP (Gemisch aus Lipiden und weiteren Komponenten
in 80 % Ethanol) oder mit dem Transfektionsreagenz GeneJuice® (nicht-toxisches, zelluläres
Protein und eine geringe Menge eines neuartigen Polyamins). Durchgeführt wurden die Pro-
zeduren nach Angaben der Hersteller. Beide Transfektionsreagenzien werden durch eine ein-
fache Handhabung und geringe Zytotoxizität charakterisiert. Die Dichte ausgesäter Zellen,
das verwendete Transfektionsreagenz, das Verhältnis an eingesetzter DNA zu Transfektions-
reagenz und die Menge an zugegebenem Transfektionskomplex wurde für jede verwendete
Zelllinie individuell optimiert (siehe Tabelle 43). Nötige Verdünnungen der DNA wurden in
OptiMEM® Reduced Serum Medium vorgenommen. Die Transfektionseffizienz wurde am
Fluoreszenzmikroskop per Sichtkontrolle bewertet. Berücksichtigt wurden hierbei die Anzahl
grün fluoreszierender Zellen und die Morphologie der Zellen. Es wurden die Transfektions-
bedingungen gewählt, die bei einem intakten Zellrasen und gesunder Morphologie der Zellen
in dem größten Anteil grün-fluoreszierender Zellen resultierten.
3 Methoden
66
3.5.7 Anreicherung von PyV-Partikeln mittels Ultrazentrifugation und Elektronenmikro-
skopie
Es wurden Kulturüberstände von mit HPyV12- und HPyV9-Genomen transfizierten Zellen
ultrazentrifugiert, um Viruspartikel für die elektronenmikroskopische Analyse anzureichern.
Hierfür wurden die Zelltrümmer der Kulturüberstände durch zentrifugieren für 10 Minuten
bei 1600 x g und 4 °C entfernt. 5 ml Saccharoselösung (30 %) wurden in Ultrazentrifugen-
röhrchen vorgelegt und mit den Überständen überschichtet. Nach der Ultrazentrifugation für 3
Stunden bei 32 000 x g und 4 °C unter Vakuum wurde der Überstand fraktioniert abgenom-
men. Das Pellet wurde getrocknet, in 100 µl 0,5 M HEPES-Puffer (pH 7,2) gelöst und ein
Aliquot mit Paraformaldehyd (5 %) für 2 Stunden inaktiviert. Die weitere Probenaufbereitung
und die elektronenmikroskopische Analyse erfolgten durch die Serviceeinheit für Elektro-
nenmikroskopie, das Kompetenzzentrum „Bildgebende Verfahren“ am Robert Koch-Institut.
3.5.8 Real-Time-Aufzeichnung der Zellviabilität
Das xCELLigence™-System bietet eine nicht-invasive Real-Time-Aufzeichnung des biologi-
schen Status der analysierten Zellen. Es setzt sich aus einem Analyse-Gerät und einer im In-
kubator lokalisierten Station mit einer speziellen 96-Kavitäten-Zellkulturplatte (E-Plate) zu-
sammen. Die E-Plate verfügt über mikroelektronische Biosensoren im Boden der Platte, wel-
che durch Messung der Impedanz Änderungen im Zellwachstum aufzeichnen. Diese Ände-
rungen werden als dimensionsloser Cell Index CI ausgegeben. Der CI repräsentiert die Zell-
zahl, die Morphologie der Zellen und den Grad der Zelladhäsion. Der zytopathische Effekt
bei einer Virusinfektion der Zellen führt somit zu einer deutlichen Änderung des CI. Abbil-
dung 10 veranschaulicht, wie die Impedanz und somit der CI durch Änderungen im Zell-
wachstum beeinflusst werden.
3 Methoden
67
Abbildung 10 Das xCELLigence™-System.
A: In einer Kavität ohne Zellen ist der Cell Index (CI) gleich Null. B: Bei Anwesenheit einer Zelle wird ein CI
gemessen. C: Der CI verdoppelt sich für zwei Zellen und steigt bei weiterer Proliferation. D: Bei starker Adhä-
renz der Zellen steigt der aufgezeichnete CI weiter an. Modifiziert nach Diplomarbeit Sarah Korup
In einer Kavität ohne Zellen oder mit nicht anwachsenden Zellen ist der CI gleich Null, denn
die Impedanz der Elektroden wird hauptsächlich durch die Ionen an der Grenzfläche zwischen
Elektrode und Lösung und in dem Medium bestimmt. Werden adhärente Zellen in die Kavitä-
ten der E-Plate eingesät, setzen sich diese an den Oberflächen der Sensorelektroden ab und
wirken als Isolatoren. Die Ionen-Situation an der Grenzfläche von Elektrode und Medium
ändert sich und führt zu einem Ansteigen der Impedanz. Je mehr Bereiche der Elektroden
durch Zellen abgedeckt werden, desto größer ist die Impedanz-Änderung und desto höher
wird der CI. Das xCELLigence™-System wurde auf seine Eignung für eine schnelle Testung
diverser Zelllinien zur Identifikation eines in vitro-Replikationssystems für HPyV9 und
HPyV12 getestet. Hierfür wurde zunächst getestet, ob mit dem xCELLigence™-System eine
Infektion von bereits bekannt permissiven Zelllinien mit SV40 und BKPyV beobachtbar ist.
In weiteren ausführlichen Experimenten wurde untersucht, ob das xCELLigence™-System
zur Beobachtung einer Infektion bei bisher unbekannten PyV-Wirtszell-Kombinationen ge-
eignet ist.
Kavität der E-Plate
mit Zellen
ohne Zellen
Z
Elektrode
Z = Z
0
Hintergrund
ZZ = Z
Zelle 1
Impedanz
Z = Z
Zelle 2
Verdoppelte Impedanz
Z
Z = Z
Zelle 3
Impedanz weiter erhöht
Z
Zellproliferation
Zellen mit
starker Adhäsion
Zeit
CI
Zeit
CI
Zeit
CI
Zeit
CI
A
B
C
D
3 Methoden
68
In die Zwischenräume der Kavitäten der E-Plate wurde 1 x PBS pipettiert. Die erste Messung
erfolgte mit 50 µl Zellkulturmedium pro Kavität für eine Hintergrund-Bestimmung. An-
schließend wurden die für die verschiedenen Zelllinien optimierten Zellzahlen für 96-
Kavitäten-Zellkulturplatten (siehe S. 86) in 100 µl Medium ausgesät und das Experiment ge-
startet. Nach ca. 16 Stunden Inkubation erfolgte die Zugabe von Virus bzw. die Transfektion
(siehe 3.5.6). Zur Beobachtung von PyV-Wachstum im xCELLigence™-System wurden
1,2 x 1010 und 5,9 x 1010 SV40-Partikel in das Medium von Vero-, Cos-7- und HEK293-
Zellen gegeben. Dieselben Zelllinien wurden mit zwei Volumina (10 µl, 50 µl) einer BKPyV-
Suspension mit unbekanntem Titer infiziert. Der CI wurde über einen Zeitraum von bis zu elf
Tagen aufgezeichnet. Die Auswertung der Impedanzmessung erfolgte mit der RTCA-
Software 1.2.
3.6 Bioinformatische Methoden: Vorhersage von Spleißstellen in der frühen
Genregion von PyV
Die frühen Genregionen von HPyV9 und HPyV12 wurden mithilfe des Human Genome Spli-
ce Finder Tools (http://www.umd.be/HSF3/index.html; (188)), analysiert. Dies resultierte in
potentiellen Spleißstellen, die den kanonische Spleißstellen (189, 190) und dem bisher be-
kannten Spleißmuster und konservierten Positionen von PyV entsprechen (siehe Abbildung
11).
Abbildung 11 Konsensus-Spleiß-Stellen von Major- und Minor-Klasse Introns
Die Größe der Buchstaben repräsentiert die Häufigkeit, mit der ein Nukleotid an der entsprechenden Position
auftritt. Den schwarz gefärbten Bereichen wird eine Rolle bei der Intron-Erkennung zugeschrieben. Modifiziert
nach (189).
5‘-Spleiß-Stelle 3‘-Spleiß-Stelle
Verzweigungsstelle
Minor-Intron
Major-Intron
5‘-Exon 3‘-Exon
4 Ergebnisse
69
4 Ergebnisse
Das Ziel dieser Dissertation war die partielle Charakterisierung der neuartigen humanen Po-
lyomaviren HPyV9 und HPyV12. Es wurden erste Daten zur Genoprävalenz von HPyV9 und
HPyV12 in Proben von gesundem und erkranktem Gewebe von Patienten mit malignen Er-
krankungen des GIT und zur Reaktivität der Seren dieser Patienten sowie in Seren gesunder
Blutspender gegen das VP1 und das TAg(78aa) dieser beiden Viren erhoben (siehe 4.1 und
4.2). Diverse Zelllinien wurden auf ihre Eignung als in vitro Replikationssystem für HPyV9
und HPyV12 untersucht (4.3). In diesem Rahmen konnten gespleißte, für TAgs kodierende
mRNAs identifiziert werden (4.4).
4.1 Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12 in Patienten mit malignen Er-
krankungen des GIT
Es wurden Proben von 107 Patienten untersucht. Von jedem Patienten wurden während der
Entfernung des Tumors eine Probe aus dem Tumorgewebe und eine Probe aus umliegendem
Gewebe entnommen (siehe S. 38). Nach Extraktion der DNA (siehe S. 50) aus den Gewebe-
proben wurden 250 ng DNA in der qPCR (siehe S. 54) untersucht. Es wurde in jeder qPCR
ein Standard zur Erstellung einer Standardgerade mitgeführt. Die erhaltene Gleichung für die
Standardgerade diente der Berechnung der Kopienzahlen. Des Weiteren gab es auf jeder
PCR-Platte eine Non-Template Control (NTC). Die Untersuchung der 214 oben beschriebe-
nen Proben mit einer HPyV9-VP1-qPCR lieferte keine positiven Proben. Tabelle 30 gibt eine
Übersicht über die Verteilung der Krankheiten innerhalb der 214 untersuchten Proben und
zeigt das Ergebnis der HPyV12-spezifischen qPCR.
Tabelle 30 Analyse von Tumorexzisaten mit HPyV12-VP1-spezifischer qPCR
Erkrankung Patienten (n) qPCR-positiv (n) Kopienzahl/ µg DNA
Kolon-Karzinom (Kolorektale Le-
bermetastase)
34 3 1-30
Cholangiozelluläres Karzinom 24
Hepatozelluläres Karzinom 21 1 1-30
Klatskin-Karzinom 9
Sigma-Karzinom/Kolon-Karzinom 7
Rectum-Karzinom 4 1 1-12
Nebennieren-Karzinom 3
Cardia-Karzinom 2
Blinddarm-Karzinom 1 1 1-12
Gallenblasen-Karzinom 1
Oesophagus-Karzinom 1
Σ 214 6 1-30
4 Ergebnisse
70
In den beschriebenen Proben wurde eine HPyV12-Genoprävalenz von 2,8 % (n=214) be-
stimmt. Positive Proben wurden innerhalb der Leber- und Darmproben identifiziert, sowohl in
gesundem als auch in Tumor-Gewebe (Tabelle 31). Die Anzahl der positiven Proben war zu
gering, um Hinweise auf einen Zusammenhang mit einer Erkrankung, dem Geschlecht oder
dem Alter der Patienten zu geben.
Tabelle 31 Daten von Patienten mit positivem Ergebnis aus der HPyV12-VP1-qPCR
Probe Probentyp Organ Erkrankung des Patienten Geschlecht Alter
1
Tumorgewebe
Leber
Kolorektale Lebermetastase
weiblich
76
2
Normalgewebea
Leber
Kolon-Karzinom
weiblich
77
3
Tumorgewebe
Leber
Hepatozelluläres Karzinom
männlich
72
4
Normalgewebea
Leber
Kolon-Karzinom
männlich
69
5
Normalgewebea
Kolon
Appendix-Karzinom
männlich
58
6
Tumorgewebe
Kolon
Rectum-Karzinom
männlich
63
a Makroskopisch unverändertes, den Tumor umgebendes Gewebe
Zusätzlich wurden je nach Organ (Darm, Galle, Leber) und Gewebetyp (Normal-/ Tumorge-
webe) Pools aus 10 Proben mit jeweils 200ng DNA mittels Next Generation Sequencing
(NGS) analysiert (3.1.7.7 NGS-Analyse von Proben-Pools). Die NGS-Analyse erfolgte als
Dienstleistung innerhalb des Robert Koch-Institutes von der Abteilung ZBS1. Es wurden di-
verse Herpesviren und Bakteriophagen detektiert, jedoch keine PyV (Daten nicht gezeigt).
4.2 Seroreaktivität gegen diverse PyV-Proteine
Es wurde die Seroreaktivität gegen HPyV9- und HPyV12-VP1 und die Seroreaktivität gegen
HPyV9-, HPyV12-, BKPyV- und MCPyV-TAg(78aa) im Serum von 54 Patienten mit malig-
nen Erkrankungen des GIT (bspw. Tumore, Karzinome und Metastasen des GIT (Tabelle
39)), 32 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen des GIT (bspw. Transplantationen (siehe
Tabelle 40)) und von 100 gesunden Blutspendern mittels ELISA bestimmt. Die Blutspender-
gruppe wurde in Alter und Geschlecht der Patientengruppe angepasst. Es ergaben sich Ab-
weichungen, da nicht für alle Alterskategorien der Patientenseren genügend passende Blut-
spenderseren zur Verfügung standen (siehe Abbildung 12).
4 Ergebnisse
71
Abbildung 12 Alters- und Geschlechtsverteilung der Spender der für die vorliegenden Untersuchungen
zur Verfügung stehenden Seren.
Kontrollgruppe der Blutspender (hellblau) im Vergleich zur Patientengruppe (dunkelblau). Für einige Alters-
gruppen und auch bezüglich des Geschlechts ergaben sich Abweichungen, da nicht für alle Kategorien ausrei-
chend Kontrollseren zur Verfügung standen.
In beiden ELISA-Formaten (VP1-ELISA und TAg-ELISA) wurde BFDPyV-VP1 bzw. -
TAg(78aa) als Kontrolle mitgeführt und die für diese gemessene Extinktion individuell von
den für die HPyV9- und HPyV12-Antigene gemessenen Extinktionen subtrahiert. Einflüsse
durch E. coli-Rückstände oder unspezifische Effekte, die durch hoch-konservierte PyV-
Proteinmotive entstehen, wurden so ausgeschlossen. Ebenfalls wurden Serumkontrollen (Hin-
tergrundsignal verursacht durch Eigenfärbung der Seren) und Blank-Werte (Hintergundsignal
verursacht durch Reagenzien) ermittelt und in der Auswertung berücksichtigt, um Verfäl-
schungen durch die Färbung von Serum oder durch das Material der verwendeten ELISA-
Platten auszuschließen (zur Berechnung siehe S. 60).
4.2.1 Herstellung von Antigenen
Die für die ELISA-Analyse benötigten Antigene wurden durch Expression von VP1 und
TAg(78aa) in E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI erhalten. Die VP1 von HPyV12, HPyV9
und BFDPyV lagen bereits im Expressionsvektor pTriEx™-1.1-6HN vor und konnten ohne
weitere Vorarbeiten exprimiert werden. Nach Transformation der Expressionsplasmide wur-
den die E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI bis zu einer OD600nmvon 1,2 kultiviert, dann mit
LB-Medium ohne Glucose 1:2 verdünnt, um die Katabolit-Repression anzuregen und mit
IPTG die Expression der rekombinanten Proteine induziert. Abbildung 13 zeigt drei repräsen-
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
männlich weiblich
Seren [%]
Blutspender
Patienten
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
21-30 31-40 41-50 51-60 61-70 71-80 81-90
Seren [%]
Alterskategorie
Blutspender
Patienten
AB
4 Ergebnisse
72
tative Wachstumskurven für E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI bis zur gewünschten
OD600nmvon 1,2.
Abbildung 13 Repräsentative Darstellung der Wachstumskurven von E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI
nach der Transformation mit VP1-Konstrukten
Es wurde bis zu einer OD600nm von 1,2 (grüne Linie) kultiviert. Nach einer Verdünnung der Kultur auf
OD600nm erfolgte die Induktion der Proteinexpression mit IPTG
Nach der Aufreinigung der rekombinanten Proteine aus den Inclusion Bodies der E. coli Ro-
settaBlueTM (DE3)pLacI wurden diese mithilfe des His-Tags über Nickel-NTA-Säulen unter
denaturierenden Bedingungen isoliert. Über eine nachfolgende Dialyse fanden eine weitere
Aufreinigung und eine Umpufferung der isolierten Proteine für den späteren Einsatz im ELI-
SA statt. Frisch exprimierte Antigene wurden im Western Blot mit einem Anti-His-
Antikörper auf ihre Reinheit geprüft und anschließend im ELISA mit Seren bekannter Reakti-
vität getestet. Abbildung 14A zeigt den Reinheitsgrad der Proteine während der verschiede-
nen Schritte der Prozedur am Beispiel von BFDPyV-VP1 und Abbildung 14B einen Nach-
weis von His-Tag-gekoppeltem Protein im Western Blot.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
1,1
1,2
1,3
0120 150 165 195 210 215 220 225
OD
600nm
Zeit [min]
HPyV12-VP1
HPyV9-VP1
BFDPyV-VP1
Induktion mit IPTG
4 Ergebnisse
73
Abbildung 14 Aufreinigung von VP1-Proteinen.
A: Darstellung eines VP1-Aufreinigungsgradienten am Beispiel von BFDPyV-VP1. 1 PageRuler™ Prestained
Protein Ladder (Fermentas, St. Leon-Rot, D), 2 Suspension nach Inkubation mit der Nickel-NTA-Säule, 3 erstes
Wascheluat, 4 zweites Wascheluat, 5 Eluat 1, 6 Eluat 2, 7 Eluat 1 nach der Dialyse, 8 Eluat 2 nach der Dialyse.
B: aufgereinigtes BFDPyV-VP1 (zweimal 500ng), nachgewiesen über den His-Tag mittels αHis-Antikörper. Für
BFDPyV-VP1 wird ein Molekulargewicht von ca. 43 kDa erwartet.
Für die Expression der TAg(78aa)-Antigene wurden die kodierenden Sequenzen für die ersten
78aa, die das LTAg und das sTAg jedes PyV teilen, zunächst für die Expression in E. coli
kodon-optimiert und von geeigneten Restriktionsschnittstellen flankiert kommerziell synthe-
tisch hergestellt. Die Sequenzen wurden ohne das Start-Kodon verwendet, um nach späterer
Klonierung in den Expressionsvektor einen N-terminalen His-Tag anzufügen. Ein zusätzli-
ches Nukleotid „T“ wurde am Anfang der Sequenz für einen korrekten Leserahmen eingefügt.
Durch das Fehlen eines Stopp-Kodons entstanden Konstrukte mit zwei His-Tags (am N-
Terminus und am C-Terminus). Die Konstrukte wurden per Sequenzierung auf Korrektheit
der Sequenzen geprüft und in den Expressionsvektor pTriEx™-1.1-6HN kloniert. Korrekte
Klone wurden mit einem SalI-Verdau identifiziert (Abbildung 15) und per Sequenzierung
bestätigt. Alle verwendeten Konstrukte verfügten über eine korrekte Sequenz.
Abbildung 15 Identifikation von VP1-rekombinanten Plasmiden in E. coli-Klonen.
Es ist beispielhaft ein SalI-Verdau dargestellt. 1 Vektor ohne Insert ergibt zwei Banden bei ca. 2 und 3 Kbp,
2 Vektor mit Insert ergibt eine Bande bei ca. 5,5 Kbp, 3 Kontrolle mit verdautem pTriEx™-1.1-6HN. Marker:
1 kb-GeneRuler (Fermentas, St. Leon-Rot, D).
~43kDa
~70
~100
~130
~55
~40
~35
~25
~15
~10
~170
2 3 45678
1
AB
5kb
3kb
1kb
1 2 3
4 Ergebnisse
74
Es folgte die Expression in E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI analog zur Expression der
VP1-Konstrukte (siehe oben). Anschließend wurden die TAg(78aa) mithilfe der His-Tags aus
der löslichen Fraktion der E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI unter nativen Bedingungen
isoliert, die Proteine in einer nachfolgenden Dialyse weiter gereinigt und die Imidazol-
Konzentration von im Elutionspuffer enthaltenen 500 mM auf 10 mM gesenkt. Die Wachs-
tumskurven für E. coli RosettaBlueTM (DE3)pLacI transformiert mit TAg(78aa)-
Konstrukten, der Aufreinigungsgradient und der Nachweis von rekombinantem Protein im
Western Blot mithilfe eines αHis-Antikörpers erfolgten analog zur Expression von VP1 und
sind hier nicht zusätzlich abgebildet (siehe hierzu Abbildung 13 und Abbildung 14).
4.2.2 Kapsomer-basierter ELISA: Prävalenz von anti-HPyV9- und anrti-HPyV12-VP1-
Antikörpern
Mittels Kapsomer-basiertem ELISA wurde die Seroreaktivität der Blutspenderseren und der
Patientenseren gegen das VP1 von HPyV9 und HPyV12 untersucht. Es ergaben sich die
COV-Werte von 0,019 für HPyV9-VP1 und 0,036 für HPyV12-VP1. Die Pprävalenz von
anti-HPyV9-VP1-Antikörpern war bei der Patientengruppe mit nicht-malignen Erkrankungen
mit 59 % (KI(95%, 42 % - 74 %)) signifikant höher als in der Blutspendergruppe mit 32 %
(p=0,04, KI(95%, 24 % - 42 %)) und ebenfalls höher als in der Patientengruppe mit malignen
Erkrankungen mit 37 % (p=0,02, KI(95%, 25 % - 50 %)) (Abbildung 16).
4 Ergebnisse
75
Abbildung 16 Testung von Seren gesunder Blutspender und Patienten mit malignen und nicht-malignen
Erkrankungen auf Reaktivität gegen HPyV9-VP1 und HPyV12-VP1 mittels Kapsomer-basiertem ELISA.
Die Unterschiede der Reaktivität für HPyV9-VP1 zwischen Blutspendern und Patienten mit malignen Erkran-
kungen bzw. mit nicht malignen Erkrankungen sind signifikant. Alle weiteren Unterschiede zwischen den Grup-
pen sind nicht signifikant.
Für anti-HPyV12-VP1-Antikörper wurden Prävalenzen von 8 % (KI(95%, 4 % - 15 %)) bei
den Blutspendern und 20 % (KI(95%, 12 % - 33 %)) bei den Patienten mit und 25 %
(KI(95%, 13 % - 42 %)) bei den Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen erhalten. Der
Unterschied zwischen den untersuchten Gruppen war für HPyV12-VP1 nicht signifikant (un-
abhängiger T-Test, p=0,05).
Im Folgenden wurden die erhaltenen Daten für die Kontrollgruppe nach Geschlecht unter-
sucht (Tabelle 32). Für HPyV9-VP1 waren 33 % der Seren von männlichen und 29 % der
Seren von weiblichen Individuen der Kontrollgruppe positiv. Bei HPyV12-VP1 waren es je-
weils 7 % und 10 %. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede (p=0,44 für HPyV9-
VP1, p=0,09 für HPyV12-VP1) zwischen Seren von männlichen und weiblichen Blutspen-
dern. Auch für eine bestimmte Altersgruppe ergaben sich keine signifikanten Unterschiede
(Daten nicht dargestellt).
Tabelle 32 Blutspenderseren mit positiver Reaktion im ELISA gegen VP1 von HPyV9, HPyV12 oder ge-
gen VP1 beider PyV
HPyV9-VP1 HPyV12-VP1 Doppelinfektion
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
23
9
32
5
3
8
4
3
7
Gesamt [%]*
33
29
32
7
10
8
6
10
7
*Prozentzahlen bezogen auf 100 Blutspenderseren (26 w, 74 m)
p=0,02
p=0,04
32%
8%
37%
20%
59%
25%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
HPyV9-VP1 HPyV12-VP1
Blutspender (n=100)
Patienten mit malignen
Erkrankungen (n=54)
Patienten mit nicht-
malignen Erkrankungen
(n=32)
4 Ergebnisse
76
Bei der Betrachtung von Doppelinfektionen mit HPyV9 und HPyV12 ergaben sich keine sig-
nifikanten Unterschiede bezüglich Geschlecht (Tabelle 33) oder Altersgruppe (Daten nicht
dargestellt).
Tabelle 33 Patientenseren positiv jeweils gegen VP1 von HPyV9 und HPyV12 oder gegen beide PyV
HPyV9-VP1 HPyV12-VP1 HPyV9- und HPyV12-VP1
Patienten (nmE) m w Gesamt m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 14 5 19 6 2 8 6 2 8
Gesamt [%]
*
61 56 59 26 22 25 26 22 25
Patienten (mE) m w Gesamt m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 9 11 20 6 5 11 2 1 3
Gesamt [%]
*
28 52 37 18 24 20 6 5 6
*Prozentzahlen bezogen auf 32 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen (9 w, 23 m) und 54 Patienten mit malignen Erkrankungen (21 w,
33 m), nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE = mit malignen Erkrankungen
Es fällt auf, dass alle Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen, die positiv gegen
HPyV12-VP1 waren, dies auch für HPyV9-VP1 waren (siehe Doppelinfektion). Bei der Pati-
entengruppe mit malignen Erkrankungen war das hingegen nicht der Fall. Doppelreaktivitäten
wurden hier nur selten detektiert (6 %). Des Weiteren ließ sich ein leichter Trend zu einer
Infektion mit HPyV9 und HPyV12 im höheren Alter erkennen, besonders bei der Patienten-
gruppe mit malignen Erkrankungen (Daten nicht dargestellt).
4.2.3 TAg(78aa)-ELISA: Seroreaktivität gegen HPyV9-, HPyV12-, BKPyV- und MCPyV-
TAg(78aa)
Zur Ermittlung der Reaktivität gegen den bei LTAg und sTAg gemeinsamen N-Terminus von
HPyV9, HPyV12 und BKPyV und MCPyV wurden jeweils die N-terminalen 78 aa exprimiert
und im ELISA eingesetzt. Seren von 32 Patienten mit nicht-malignen und von 54 Patienten
mit malignen Erkrankungen des GIT und von 100 gesunden Blutspendern wurden getestet.
Die Blutspendergruppe wurde bezüglich ihrer Alters- und Geschlechtsverteilung der Patien-
tengruppe angeglichen (Abbildung 12). Es ergaben sich die folgenden COV-Werte: 0,052 für
HPyV9-TAg(78aa), 0,044 für HPyV12-TAg(78aa), 0,076 für BKPyV-TAg(78aa) und 0,054
für MCPyV-TAg(78aa).
Die Ergebnisse der serologischen Untersuchung für TAg(78aa) ist in Abbildung 17 grafisch
dargestellt. Es ergaben sich Seroreaktivitäten von 34 % (Blutspender, KI(95%, 25 % - 44 %)),
17 % (Patienten mit malignen Erkrankungen, KI(95%, 9 % - 29 %)) und 34 % (Patienten mit
nicht-malignen Erkrankungen, KI(95%, 20 % - 52 %)) für HPyV9-TAg(78aa). Ebenfalls
4 Ergebnisse
77
34 % (KI(95%, 25 % - 44 %)) der Blutspender wurden positiv auf IgG-Antikörper gegen
HPyV12-TAg(78aa) getestet, während die Seroreaktivität bei Patienten mit malignen Erkran-
kungen bei 39 % (KI(95%, 27 % - 52 %)) und bei Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen
bei 31 % (KI(95%, 18 % - 49 %)) lag. Bezüglich HPyV12-TAg(78aa) ist die Seroreaktivität
in der Patientengruppe mit malignen Erkrankungen signifikant höher als in der Kontrollgrup-
pe (p=0,04). Die weiteren, sich zwischen der Blutspendergruppe und den Patientengruppen
ergebenden Unterschiede für die jeweiligen Antigene waren statistisch nicht signifikant (Un-
abhängiger T-Test, HPyV9-TAg(78aa): Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen versus
Kontrolle p=0,68, Patienten mit malignen Erkrankungen versus Kontrolle: p=0,43, HPyV12-
TAg(78aa): Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen versus Kontrolle p=0,93, BKPyV-
TAg(78aa): Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen versus Kontrolle p=0,9, Patienten mit
malignen Erkrankungen Patienten versus Kontrolle: p=0,18). Nachfolgend wurden die erho-
benen Daten bezüglich verschiedener Parameter der Seren analysiert.
Abbildung 17 Testung von Seren gesunder Blutspender und Patienten mit malignen und nicht-malignen
Erkrankungen auf Reaktivität gegen LTAg (78aa) von HPyV9, HPyV12, BKPyV und MCPyV mittels
ELISA.
Der Unterschied in der Reaktivität gegen HPyV12-TAg(78aa) ist zwischen Blutspendern und Patienten mit ma-
lignen Erkrankungen statistisch signifikant. Alle weiteren Unterschiede sind nicht signifikant.
Positive Seren der Kontrollgruppe (Blutspender)
Die in Abbildung 17 grafisch dargestellten Ergebnisse für die Kontrollgruppe wurden nach
ihrer Verteilung bezüglich Geschlecht (Tabelle 34) und Altersgruppen der Blutspender (Daten
nicht dargestellt) untersucht. Im HPyV9-(TAg78aa)-ELISA sind 48 % der weiblichen Kon-
p=0,04
34% 34%
43%
0%
17%
39%
57%
0%
34% 31%
44%
0%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100% Blutspender (n=100)
Patienten mit malignen
Erkrankungen (n=54)
Patienten mit nicht-
malignen Erkrankungen
(n=32)
4 Ergebnisse
78
trollseren positiv, während es bei den Männern nur 28 % sind. Dieser Unterschied ist signifi-
kant (p=0,02). Für HPyV12- und BKPyV-TAg(78aa) traf dies nicht zu (p=0,61 und p=0,81).
Tabelle 34 Blutspenderseren positiv jeweils gegen TAg(78aa) von HPyV9, HPyV12 und BKPyV
HPyV9-TAg(78aa) HPyV12-TAg(78aa) BKPyV-TAg(78aa)
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
19
15
34
23
11
34
28
15
43
Gesamt [%]*
28
48
34
33
35
34
41
48
43
*Prozentzahlen bezogen auf 100 Blutspenderseren (26 w, 74 m)
Bezüglich der Verteilung nach Altersgruppen ergaben sich keine Auffälligkeiten (Daten nicht
dargestellt).
Doppel- und Dreifach-Reaktivität gegen TAgs in der Kontrollgruppe
Die nachfolgende Tabelle 35 stellt die Ergebnisse für Doppel- und Dreifach-Reaktivität in-
nerhalb der Kontrollseren dar. Betrachtet wurden Seren, die gleichzeitig positiv im HPyV9-
TAg(78aa)- und im HPyV12-TAg(78aa)-ELISA, gleichzeitig positiv im HPyV12-TAg(78aa)-
und im BKPyV-TAg(78aa)-ELISA bzw. gleichzeitig positiv im HPyV9-TAg(78aa)- und im
BKPyV-TAg(78aa)-ELISA waren. Entsprechend waren Seren mit einer Dreifach-Reaktivität
gleichzeitig positiv im HPyV9-TAg(78aa)-, HPyV12-TAg(78aa)- und im BKPyV-
TAg(78aa)-ELISA.
Tabelle 35 Ergebnisse aus dem TAg(78aa)-ELISA bezüglich Doppel- oder Dreifachreaktivität gegen
HPyV9, HPyV12 und BKPyV in der Kontrollgruppe
Doppelreaktivität gegen
HPyV9/HPyV12
Doppelreaktivität gegen
HPyV12/BKPyV
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
10
8
18
10
6
16
Gesamt [%]*
14
26
18
14
19
16
Doppelreaktivität gegen
HPyV9/BKPyV
Dreifachreaktivität
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
8
6
14
4
4
8
Gesamt [%]*
12
19
14
6
13
8
*Prozentzahlen bezogen auf 100 Blutspenderseren (74 m, 26 w)
Wurden die Ergebnisse auf Doppel-Reaktivität mit zwei der untersuchten PyV bzw. auf Drei-
fach-Reaktivität auf HPyV9, HPyV12 und BKPyV hin untersucht, so zeigten sich keine Auf-
fälligkeiten (Tabelle 35). 18 % aller Blutspenderseren wiesen Doppel-Reaktivität von
HPyV12 und HPyV9, 16 % von HPyV12 und BKPyV und 14 % von HPyV9 und BKPyV auf.
Für Dreifach-Reaktivität lag der Anteil bei 8 %. Unterschiede bezüglich des Geschlechtes
4 Ergebnisse
79
traten bei den ersten drei erwähnten Kombinationen auf, waren jedoch nicht signifikant
(p>>0,05).
Positive Seren der Patientengruppen: Verteilung nach Alter und Geschlecht
Die nachfolgende Tabelle 36 zeigt die in Abbildung 17 für die Seren von Patienten mit nicht-
malignen und malignen Erkrankungen dargestellten Ergebnisse nach Geschlecht. Ein Trend
bezüglich des Alters war für beide Patientengruppen nicht erkennbar (Daten nicht dargestellt).
Die sich bei der Unterteilung positiver Seren nach Geschlecht ergebenden Unterschiede waren
statistisch nicht signifikant (T-Test, alle p >>0,05).
Tabelle 36 TAg(78aa)-ELISA-Reaktivitäten der Seren von Patienten mit nicht-malignen und mit malig-
nen Erkrankungen des GIT, unterteilt nach Geschlecht.
HPyV9-TAg(78aa) HPyV12-TAg(78aa) BKPyV-TAg(78aa)
Patienten (nmE) m w Gesamt m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 7 4 11 8 2 10 11 3 14
Gesamt [%]
*
27 44 34 34 22 31 48 33 44
Patienten (mE) m w Gesamt m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 3 6 9 12 9 21 16 15 31
Gesamt [%]
*
9 29 17 36 43 39 48 71 57
*Prozentzahlen bezogen auf 32 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen (23 m, 9 w) und 54 Patienten mit malignen Erkrankungen (33 m,
21 w), nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE = mit malignen Erkrankungen
Doppel- und Dreifach-Immunreaktion gegen TAgs innerhalb der Patientengruppen
In der Gruppe der Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen waren drei Seren doppelt
ELISA-positiv für HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) (9 %), sechs Seren doppelt positiv für
HPyV12- und BKPyV-TAg(78aa) (19 %) und fünf Seren doppelt positiv für HPyV9- und
BKPyV-TAg(78aa) (16 %). Nur ein Serum war dreifach ELISA-positiv für alle Viren (3 %).
Dementsprechend war eine Doppel- bzw. Dreifach-Immunreaktion gegen diese PyV-TAgs
selten (siehe Patienten (nME) in Tabelle 37). Ebenso verhielt es sich in der Gruppe der Pati-
enten mit malignen Erkrankungen. Die Anzahl der Seren, die doppelt positiv für zwei PyV
waren, war niedrig (siehe Patienten (mE) in Tabelle 37). Im Vergleich zu den Patienten mit
nicht-malignen Erkrankungen gab es hier eine etwas größere Zahl von Patientenseren, die
eine Dreifachreaktivität aufwies (9 %).
4 Ergebnisse
80
Tabelle 37 Ergebnisse aus dem TAg(78aa)-ELISA bezüglich Doppel- oder Dreifachreaktivität gegen
HPyV9, HPyV12 und BKPyV innerhalb der zwei Patientengruppen
Doppelreaktivität
HPyV9/HPyV12
Doppelreaktivität
HPyV12/BKPyV
Patienten (nmE) m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 3 0 3 5 1 6
Gesamt [%]
*
13 0 9 22 11 19
Patienten (mE) m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 1 5 6 7 7 14
Gesamt [%]
*
3 24 11 21 33 26
Doppelreaktivität
HPyV9/BKPyV Dreifachreaktivität
Patienten (nmE) m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 3 2 5 1 0 1
Gesamt [%]
*
9 22 16 4 0 3
Patienten (mE) m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n] 2 5 7 1 4 5
Gesamt [%]
*
6 24 13 3 19 9
*Prozentzahlen bezogen auf 32 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen (23 m, 9 w) und 54 Patienten mit malignen Erkrankungen (33 m,
21 w), nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE = mit malignen Erkrankungen
Test auf Kreuzreaktion der verwendeten Antigene
Es wurde eine Korrelationsanalyse mit den Netto-Absorptionen der im BKPyV-, HPyV9- und
HPyV12-TAg(78aa)-ELISA positiven Seren durchgeführt, um eine mögliche Kreuzreaktion
der verwendeten Antigene auszuschließen. Untersucht wurde die Korrelation der gemessenen
Netto-Absorptionen für HPyV9-TAg(78aa) mit denen für HPyV12-TAg(78aa) (Abbildung 18
A), jene für BKPyV-TAg(78aa) mit denen für HPyV9-TAg(78aa) (Abbildung 18 B) und jene
für BKPyV-TAg(78aa) mit denen für HPyV12-TAg(78aa) untersucht (Abbildung 18 C). Es
ergaben sich jeweils Korrelationskoeffizienten von 0,0598; 0,0601 und -0,0628. Da die Kor-
relationskoeffizienten deutlich kleiner als 1 sind, korrelieren die Daten nicht und eine Kreuz-
reaktion der verwendeten Antigene BKPyV-, HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) kann ausge-
schlossen werden.
4 Ergebnisse
81
Abbildung 18 Korrelationsanalysen der Seroreaktivitäten gegen HPyV9-, HPyV12- und BKPyV-
TAg(78aa).
A: Korrelation zwischen im ELISA positiven Seren gegen HPyV12- und HPyV9-TAg(78aa), B: Korrelation
zwischen im ELISA positiven Seren gegen HPyV9- und BKPyV-TAg(78aa), C: Korrelation zwischen im ELISA
positiven Seren gegen HPyV12- und BKPyV-TAg(78aa). Es ist jeweils der Korrelationskoeffizient angegeben.
Seroreaktivität gegen VP1 und TAg(78aa) eines PyV
Im Folgenden wurde die Anzahl an Seren der drei untersuchten Gruppen analysiert, die im
ELISA auf beide Antigene VP1 und TAg(78aa) eines PyV reagierten. Tabelle 38 zeigt, wel-
che Anzahl an Blutspenderseren positiv auf das VP1 und das TAg(78aa) eines PyV reagier-
ten. Insgesamt wiesen 9 % der Blutspenderseren Antikörper gegen VP1 und gegen TAg(78aa)
von HPyV9 auf. Von 9 Seren der weiblichen Blutspender, die positiv für HPyV9-VP1 waren,
reagierten 5 zusätzlich positiv im HPyV9-TAg(78aa)-ELISA. Dies entsprach 19 % aller weib-
lichen Blutspenderseren (nicht signifikant, T-Test, p >>0,05). Bei den männlichen Seren
(n=74) waren es nur 4 Seren (5 %), die doppelt positiv gegen HPyV9-VP1 und HPyV9-
TAg(78aa) reagierten (ebenfalls nicht signifikant, T-Test, p >>0,05). Insgesamt wiesen 2 %
der Blutspenderseren Antikörper gegen VP1 und gegen TAg(78aa) von HPyV9 auf. Kein Se-
rum von männlichen Blutspendern war doppelt positiv für HPyV12-VP1 und -TAg(78aa) und
nur für 2 von 31 Seren von Frauen der Kontrollgruppe traf dies zu (6 %).
Tabelle 38 zeigt zudem, welche Anzahl an Patientenseren (nicht-maligne und maligne Er-
krankungen) positiv im VP1- und im TAg(78aa)-ELISA für ein PyV waren. Alle Unterschie-
de zwischen den Geschlechtern sind nicht signifikant (T-Test, p >>0,05). Bei HPyV9 waren
es 8 Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen (25 %) und 5 Seren von Patienten
mit malignen Erkrankungen (8 %). Nur sehr wenige Seren insgesamt waren positiv für VP1
und TAg(78aa) von HPyV12 (zwei Blutspenderseren, zwei Seren von Patienten mit nicht-
malignen und vier Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen).
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Netto-Absorption HPyV9-TAg(78aa)
Netto-Absorption HPyV12-TAg(78aa)
Korrelationskoeffizient: 0,0598
A
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Netto-Absorption BKPyV-TAg(78aa)
Netto-Absorption HPyV9-TAg(78aa)
Korrelationskoeffizient: 0,0601
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Netto-Absorption BKPyV-TAg(78aa)
Netto-Absorption HPyV12-TAg(78aa)
C
Korrelationskoeffizient: -0,0628
B
4 Ergebnisse
82
Tabelle 38 Seren von Blutspendern und Patienten (nicht-maligne und maligne Erkrankungen) mit Reak-
tivität gegen das VP1 und das TAg(78aa) von HPyV9 und HPyV12
HPyV9 HPyV12
Blutspender m w Gesamt m w Gesamt
Gesamt [n]
4
5
9
0
2
2
Gesamt [%]*
5
19
9
0
6
2
Patienten (nmE)
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
5
3
8
2
0
2
Gesamt [%]*
22
33
25
9
0
6
Patienten (mE)
m
w
Gesamt
m
w
Gesamt
Gesamt [n]
2
3
5
2
2
4
Gesamt [%]*
6
14
9
6
10
7
*Prozentzahlen bezogen auf 100 Blutspenderseren (26 w, 74 m) und auf 32 Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen (9 w, 23 m) und 54
Patienten mit malignen Erkrankungen (21 w, 33 m) und 100 Blutspenderseren (26 w, 74 m), nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE =
mit malignen Erkrankungen
Es wurde die Korrelation zwischen den Netto-Absorptionen der Seren, die im ELISA positiv
gegen VP1 und TAg(78aa) eines PyV reagierten, untersucht. Abbildung 19 zeigt die Ergeb-
nisse.
Abbildung 19 Korrelationsanalyse von Seren, die im ELISA positiv gegen VP1 und TAg(78aa) eines PyV
waren
Dargestellt ist jeweils die Netto-Absorption der Seren, die ELISA-positiv gegen VP1 und TAg(78aa) eines PyV
waren. A Seren, die ELISA-positiv gegen HPyV9-VP1 und –TAg(78aa) waren. B Seren, die ELISA-positiv
gegen HPyV12-VP1 und –TAg(78aa) waren. Es ist jeweils der Korrelationskoeffizient angegeben.
Der Korrelationskoeffizient für HPyV9-VP1 und -TAg(78aa) lag bei -0,0036, jener für
HPyV12-VP1 und -TAg(78aa) bei 0,1236. Demnach konnte keine Korrelation festgestellt
werden. Das bedeutet, dass Seren, die im ELISA positiv gegen das VP1 eines PyV reagierten,
nicht zwingend auch IgG-Antikörper gegen das TAg(78aa) des gleichen PyV aufwiesen.
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Netto-Absorption HPyV9-VP1
Netto-Absorption HPyV9-TAg(78aa)
Korrelationskoeffizient: -0,0036
A
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
0,0 0,5 1,0 1,5 2,0
Netto-Absorption HPyV12-VP1
Netto-Absorption HPyV12-TAg(78aa)
Korrelationskoeffizient: 0,123614
B
4 Ergebnisse
83
TAg-reaktive Patientenseren: Verteilung nach Erkrankungen
Die nachfolgenden Tabellen (Tabelle 39 und Tabelle 40) stellen dar, welche Anzahl an Seren
von Patienten mit malignen Erkrankungen und mit nicht-malignen Erkrankungen reaktiv ge-
gen das TAg(78aa) von HPyV9, HPyV12 und BKPyV waren. So waren es bei HPyV9-
TAg(78aa) zwei Seren von Patienten mit Karzinomen der Galle, vier von Patienten mit Er-
krankungen der Leber und zwei der Speiseröhre. Einen Hinweis auf einen Zusammenhang
zwischen einer Seroreaktion auf HPyV9-TAg(78aa) und einer Erkrankung ergab sich hier-
durch nicht. Für HPyV12-TAg(78aa) sind vereinzelt positive Seren bei Patienten fast aller
Erkrankungen zu finden. Auffällig ist die höhere Anzahl HPyV12-TAg(78aa)-positiver Seren
bei Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen (39 %) (nicht signifikant im Vergleich mit
HPyV9-TAg(78aa), unabhängiger T-Test, p>0,05). Gleiches gilt für BKPyV-TAg(7aa), wo
67 % aller Seren von Patienten mit kolorektalen Lebermetastasen seroreaktiv gegen BKPyV-
TAg(78aa) waren (signifikant, unabhängiger T-Test, im Vergleich zu HPyV9-TAg(78aa)
p=0,0005, im Vergleich zu HPyV12-TAg(78aa) p= 0,01). Zudem waren 50 % aller Seren von
Patienten mit cholangiozellulärem Karzinom und 44 % aller Proben von solchen mit hepato-
zellulärem Karzinom positiv im BKPyV-TAg(78aa)-ELISA. Da diese sowie ein Großteil der
Erkrankungen nur durch ein oder wenige Seren vertreten waren, können keine eindeutigen
Schlüsse gezogen werden.
Tabelle 39 Übersicht der Ergebnisse für Seren von Patienten mit malignen Erkrankungen
Erkrankung Probenanzahl Seroreaktiv gegen TAg(78aa) von
HPyV9 HPyV12 BKPyV
MCPyV
Blinddarm-Karzinom
1
0
0
1
0
Cholangiozelluläres Karzinom
8
2
5
4
0
Gallenblasen-Karzinom
2
0
1
1
0
Hepatozelluläres Karzinom
9
3
2
4
0
Klatskin-Karzinom
4
0
0
2
0
Kolon-Karzinom
1
0
1
1
0
Kolorektale Lebermetastase
18
1
7
12
0
Magen-Karzinom
2
0
1
1
0
Nebennieren-Karzinom Lebermetastase
1
0
1
1
0
Neuroendokriner Tumor
1
0
0
0
0
Pankreas-Karzinom
1
1
1
1
0
Rektum-Karzinom
3
0
1
2
0
Speiseröhren-Karzinom
2
2
0
1
0
Zwölffingerdarm-Karzinom
1
0
1
0
0
Ʃ
54
9
21
31
0
4 Ergebnisse
84
Betrachtet man die TAg(78aa)-positiven Seren der Patientengruppe mit nicht-malignen Er-
krankungen, ergaben sich geringe Auffälligkeiten (Tabelle 40). 50 % der Seren dieser Patien-
tengruppe mit Lebertransplantationen waren positiv gegen HPyV12-TAg(78aa) (4 von 8). Bei
HPyV9- und BKPyV-TAg(78aa) waren es jeweils nur 25 % (2 von 8). Gegen BKPyV-
TAg(78aa) positiv reagierende Seren fanden sich vermehrt bei Bypass-Patienten und solchen
mit Gallenblasenentfernung (jeweils 3 von 4). Alle Erkrankungen waren jeweils nur durch
wenige Proben vertreten (n=1 bis 8). Ein Zusammenhang zwischen Seroreaktivität gegen
TAg(78aa) eines PyV und einer bestimmten nicht-malignen Erkrankung war daher nicht er-
kennbar.
Tabelle 40 Übersicht der Ergebnisse für Seren von Patienten ohne malignen Erkrankungen
Erkrankung Probenanzahl
Seroreaktiv gegen TAg(78aa) von
HPyV9
HPyV12
BKPyV
MCPyV
Appendizitis
3
0
1
1
0
Bypass
4
1
1
3
0
Darmverschluss
1
1
0
0
0
Dünndarm- und Lebertransplantation
1
1
1
0
0
Gallenblasenentfernung
4
2
1
3
0
Hernie
2
1
0
1
0
Lebertransplantation
8
2
4
2
0
Pankreastransplantation
1
2
0
0
0
Periphere arterielle Verschlusskrankheit
2
0
0
1
0
Schilddrüsenvergrößerung
3
0
2
2
0
Sigmadivertikulitis
1
0
0
0
0
Zwölffingerdarm-Adenom
1
1
0
1
0
Zystadenom
1
0
0
0
0
Ʃ
32
11
10
14
0
4 Ergebnisse
85
4.2.4 Zusammenfassung
Im Kapsomer-basierten ELISA wurden folgende Seroprävalenzen ermittelt:
Tabelle 41 Zusammenfassung der Ergebnisse des Kapsomer-basierten ELISA
Blutspender
Patienten mE
Patienten nmE
HPyV9-VP1
32 %
37 %
59 %
HPyV12-VP1
8 %
20 %
25 %
nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE = mit malignen Erkrankungen
Signifikante Ergebnisse (unabhängiger T-Test): 59 % HPyV9-VP1-Seroprävalenz in Patien-
ten mit nicht-malignen Erkrankungen im Vergleich zu 37 % in Patienten mit malignen Er-
krankungen (p=0,02) und zu 32 % in den Blutspendern (p=0,04).
Mit dem TAg-basierten ELISA wurden erstmals Seroreaktivitäten gegen den N-Terminus von
drei humanen PyV vergleichend bestimmt.
Tabelle 42 Zusammenfassung der Ergebnisse des TAg-basierten ELISA
Blutspender
Patienten mE
Patienten nmE
BKPyV
43 %
57 %
44 %
HPyV9
34 %
17 %
31 %
HPyV12
34 %
39 %
34 %
MCPyV
0 %
0 %
0 %
nmE = mit nicht-malignen Erkrankungen, mE = mit malignen Erkrankungen
Signifikante Ergebnisse (unabhängiger T-Test):
• 39 % HPyV12-TAg(78aa)-Seroreaktivität in Patienten mit malignen Erkrankungen im
Vergleich zu 34 % in der Blutspendergruppe (p=0,04).
• 67 % BKPyV-TAg(7aa)-Seroreaktivität bei Patienten mit kolorektalen Lebermetasta-
sen (p=0,0005) im Vergleich zu 6 % HPyV9-TAg(78aa)-Seroreaktivität und 39 %
HPyV12-TAg(78aa)-Seroreaktivität (p=0,01) in der gleichen Patientengruppe.
• 48 % HPyV9-TAg(78aa)-Seroreaktivität bei weiblichen Blutspendern versus 28 % bei
Seren von männlichen (p=0,02)
Die Ergebnisse des VP1-ELISA und des TAg-ELISA korrelieren nicht.
4 Ergebnisse
86
4.3 Testung von Zelllinien zur Identifikation eines in vitro-
Replikationssystems für HPyV9 und HPyV12
Es wurden diverse Zelllinien auf ihre Eignung als Replikationssystem für HPyV9 und
HPyV12 untersucht. HPyV9 und HPyV12 konnten bisher mit PCR-Methoden und serologisch
detektiert werden. Replizierende Viruspartikel liegen für beide PyV jedoch nicht vor. Daher
wurden die Genome von HPyV9 und HPyV12 synthetisch hergestellt (S. 40) und per Trans-
fektion in Zellen eingebracht. Es erfolgte in einem ersten Schritt die Optimierung der indivi-
duellen Transfektionsbedingungen für alle verwendeten Zelllinien (S. 86). In einem zweiten
Schritt wurde ein Real-Time-Analyse-Gerät auf seine Tauglichkeit für ein schnelles Screening
diverser Zelllinien getestet (S. 87). Das nach den Vorversuchen etablierte Protokoll (S. 89)
umfasste letztendlich die Beobachtung physiologischer Effekte (S. 90), den Nachweis viraler
Gene (S. 92), viraler Proteine (S. 95) und von Viruspartikeln (S. 97).
4.3.1 Optimierung der Transfektionsbedingungen
Für die Identifikation einer Zelllinie, die die Replikation von HPyV9 oder HPyV12 ermög-
licht, wurden zunächst für eine Auswahl von Zelllinien jeweils die Anzahl auszusäender Zel-
len, das Transfektionsreagenz (X-tremeGENE HP, GeneJuice®), das Verhältnis von DNA zu
Transfektionsreagenz im Transfektionsmix und das Volumen an zugegebenem Transfekti-
onsmix optimiert. Tabelle 43 gibt einen Überblick über die Resultate des Optimierungspro-
zesses.
Tabelle 43 Transfektionsbedingungen der für die Replikationstestung von HPyV9 und HPyV12 verwende-
ten Zelllinien
Zelllinie
Zellzahl pro 96er-Kavität/
Zellzahl pro 24er-Kavität Transfektionsmix
Mix pro 96er-Kavität/
Mix pro 24er-Kavität
A549
8,5 x 103/3 x 104
1 µg DNA : 3 µl X-tremeGENE HP
15 µl/20 µl
Vero
8 x 103/2 x 104
1 µg DNA : 4 µl X-tremeGENE HP
20 µl/50 µl
RH
7 x 103/6 x 104
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
10 µl/25 µl
Cos-7
6 x 103/4 x 104
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
5 µl/25 µl
3T3
8 x 103/6 x 104
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
5 µl/25 µl
BJAB
6 x 104/3 x 105
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
10 µl/50 µl
A375
n. g./4 x 104
1 µg DNA : 3 µl X-tremeGENE HP
n. g./25µl
293-4T
n. g./6 x 104
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
n. g./25µl
SW480
n. g./6 x 104
1 µg DNA : 2 µl X-tremeGENE HP
n. g./25µl
HEK293
1,2 x 104/5 x 104
1 µg DNA : 2 µl GeneJuice®
5 µl/25 µl
HeLa
1 x 104/3 x 104
1 µg DNA : 2 µl GeneJuice®
10 µl/25 µl
Huh-7
4 x 103/4 x 104
1 µg DNA : 2 µl GeneJuice®
5 µl/20 µl
n. g.: Diese Zelllinien wurden im 96er-Kavitäten-Format nicht getestet.
4 Ergebnisse
87
Die Transfektionsrate für die einzelnen Zelllinien wurde nach Transfektion eines Plasmids
(pcDNA-YFP, siehe 2.6.1 Plasmidkonstrukte/Vektoren), welches eine vergleichbare Größe
wie die später zu transfizierenden Konstrukte aufwies und für ein grün-fluoreszierendes Pro-
tein kodiert, im Fluoreszenzmikroskop beurteilt (siehe 3.5.6 Transfektion).
4.3.2 Testung des xCELLigence™ zur Identifikation von für HPyV9 und HPyV12 permissi-
ven Zelllinien
Es wurde die Tauglichkeit des xCELLigence™-Systems (3.5.8 Real-Time-Aufzeichnung der
Zellviabilität) für ein schnelles Screening diverser Zelllinien auf ihre Eignung als Replikati-
onssystem für HPyV9 und HPyV12 untersucht. Das xCELLigence™-Systems zeichnet dabei
den Effekt einer Infektion auf die Zellviabilität in Echtzeit auf. Mithilfe des xCELLigence™
konnte eine Infektion von Zellen mit PyV beobachtet werden. Es wurden HEK293-, Vero-
und Cos-7-Zellen ausgesät und circa 18 h später SV40-Virus (1,2 x 1010 und 5,9 x 1010 Ge-
nomäquivalente) und BKPyV (10 µl, 50 µl (Zelllysate mit unbekanntem Titer)) zugegeben
(S. 39). Je zwei Volumina wurden eingesetzt, um einen konzentrationsabhängigen Effekt zu
erzielen. In Abbildung 20 ist jeweils der dimensionslose Zellindex CI über einen Zeitraum
von 13 Tagen dargestellt. Die Zelllinien wurden ca. 18 h (siehe Pfeil) nach der Aussaat mit
zwei Volumina der gekennzeichneten Viren infiziert. In jedem Experiment wurden nicht-
transfizierte Zellkontrollen und mit pcDNA-YFP-transfizierte Zellkontrollen mitgeführt.
Bei HEK293-Zellen ließ sich nach der Zugabe beider PyV keine Veränderung im Wachstum
der Zellen beobachten, lediglich bei der Zugabe von 50µl BKPyV-haltigem Zellkulturüber-
stand (blau) war ein etwas früheres Absterben der HEK293-Zellen im Vergleich zur Zellkon-
trolle zu beobachten (Abbildung 20A). Weiterhin konnte für BKPyV kein Effekt nach Zugabe
auf Vero- und Cos-7-Zellen beobachtet werden (Abbildung 20B, C, grün, blau). Die Zugabe
von SV40 zeigte einen konzentrationsabhängigen Effekt auf das Wachstum von Vero- und
Cos-7-Zellen (Abbildung 20B, C). Ungefähr 4,5 Tage nach Zugabe von 1,2 x 1010 SV40-
Viruspartikel begannen Vero-Zellen abzusterben (erkennbar an einem sinkenden CI ab der
zweiten vertikalen Linie). Im Zeitraum davor unterschied sich der Verlauf des CI (rot) nicht
auffällig von der Zellkontrolle (unterbrochene Linie). Nach Zugabe von 5,9 x 1010 SV40-
Viruspartikeln (gelb) war dieser Effekt bereits nach ca. 3 Tagen zu sehen (erkennbar an einem
sinkenden CI ab der ersten vertikalen Linie). Abbildung 20C zeigt, dass bei Cos-7-Zellen der
CI direkt nach der Zugabe von SV40 abnimmt. Über circa einen Tag erholten sich die Zellen
etwas, der CI stieg über einen Zeitraum von ebenfalls einem Tag, dann starben die Cos-7-
4 Ergebnisse
88
Zellen ab (an Tag 6 bei Zugabe von 5,9 x 1010 Viruspartikeln, an Tag 7 bei Zugabe von 1,2 x
1010 Viruspartikeln).
Zeit [d]
CI
012345678910 11 12 13
0
1
2
3
4
5
HEK293 SV40 1,2 x 10
10
HEK293 SV40 5,9 x 10
10
HEK293 BKPyV 10µl
HEK293 BKPyV 50µl
Zellkontrolle
A
Zeit [d]
CI
012345678910 11 12 13
0
5
10
15
20
Vero SV40 1,2 x 10
10
Vero SV40 5,9 x 10
10
Vero BKPyV 10µl
Vero BKPyV 50µl
Zellkontrolle
B
4 Ergebnisse
89
Abbildung 20 Beobachtung von PyV-Infektionen mittels xCELLigence™ .
Ca. 18 h nach der Zellaussaat (Pfeil) wurde mit SV40 (rot: 1,2 x 1010 Genomäquivalente; gelb: 5,9 x 1010 Ge-
nomäquivalente) und BKPyV (grün: 10 µl BKPyV-haltigen Zellkulturüberstands; blau: 50 µl BKPyV-haltigen
Zellkulturüberstands) infiziert. Es ist der dimensionslose Zellindex CI über einen Zeitraum von 13 Tagen ge-
zeigt. Die Zellkontrolle ist jeweils als gepunktete Linie dargestellt. A HEK293-Zellen, B Vero-Zellen, C Cos-7-
Zellen
In nachfolgenden Versuchen wurden die Genome von HPyV9 und HPyV12 in diverse Zellli-
nien transfiziert und das Zellwachstum anschließend im xCELLigence™ beobachtet. Ausführ-
liche Studien mit HPyV9 wurden hierbei in der Masterarbeit von Claudia Lucke durchgeführt
und im Rahmen dieser Doktorarbeit betreut. In einem Experiment konnte ein Effekt der
Transfektion von HPyV9 in Vero-Zellen beobachtet werden. Dies konnte jedoch nicht repro-
duziert werden (Vergleiche hierzu „Untersuchungen zur Etablierung eines Zellkultursystems
für das Humane Polyomavirus 9“, Masterarbeit Claudia Lucke, Robert Koch-Institut 2013).
Für HPyV12 konnte nach der Transfektion in diverse Zelllinien keine Veränderung des CI
beobachtet werden (Daten nicht dargestellt). Dementsprechend wurde das xCELLigence™
für weitere Versuche nicht verwendet.
4.3.3 Protokoll zur Identifikation eines in vitro-Replikationssystems für HPyV9 und
HPyV12
Für die weitere Identifikation geeigneter Zellkultursysteme für HPyV9 und HPyV12 wurde
folgendes Protokoll entwickelt:
Zeit [d]
CI
012345678910 11 12 13
0
5
10
15
Cos-7 SV40 1,2 x 10
10
Cos-7 SV40 5,9 x 10
10
Cos-7 BKPyV 10µl
Cos-7 BKPyV 50µl
Zellkontrolle
C
4 Ergebnisse
90
1) Aussaat von Zellen im 24-Kavitäten-Format
2) Transfektion mit dem Genom von HPyV9 oder HPyV12 ca. 18 h nach Aussaat
3) Ernte von RNA aus den Zellen 0, 1, 3, 6, 9, 13 Tage nach der Transfektion (T0, T1,
T3, T6, T9, T13)
4) Extraktion der RNA, Verdau von DNA, Synthese von cDNA
5) Analyse der cDNA mit einer VP1-spezifischen qPCR
6) Isolierung von Proteinen
7) Nachweis viraler Proteine in IFA und Western Blot
8) Nachweis von Viruspartikeln im EM
4.3.4 Beobachtung physiologischer Effekte im Lichtmikroskop
Zellen von 12 Zelllinien (3T3, Cos-7, HEK293, HeLa, Huh-7, RH, Vero, BJAB, 293-4T,
A375, A549, SW480) wurden nach der Transfektion der Genome von HPyV9 und HPyV12
mithilfe eines Lichtmikroskops auf das Auftreten physiologischer Veränderungen untersucht.
Physiologische Effekte durch die Transfektion von HPyV9 und HPyV12 konnten bei Vero-
Zellen in Form von geschädigtem, sich ablösendem Zellrasen, Aggregaten absterbender Zel-
len und der Bildung von Synzytien beobachtet werden, wohingegen Kontrollzellen (trans-
fiziert mit pcDNA-YFP, S. 40) einen dichten Zellrasen aufwiesen. Abbildung 21 und Abbil-
dung 22 zeigen repräsentative Bilder von sich ablösendem Zellrasen und einer Synzytie.
Abbildung 21 Zytopathische Effekte sechs Tage nach Transfektion von Vero-Zellen mit HPyV9-Genomen.
Nach Fixierung sind Zellen zu erkennen, die beginnen, sich aus dem Zellrasen zu lösen (Beispiele: siehe Pfeile).
Lichtmikroskopische Aufnahme im Durchlicht.
100µm
4 Ergebnisse
91
Abbildung 22 Synzytienbildung nach der Transfektion von Vero-Zellen mit HPyV9-Genomen.
Abgebildet sind fixierte Zellen sechs Tage nach der Transfektion mit HPyV9-Genomen. Es ist die Bildung einer
Riesenzelle (Synzytium) zu erkennen. Synzitien sind multi-nukleäre Riesenzellen, welche durch die Fusion be-
nachbarter Zellen entstehen. Der vergrößerte Ausschnitt zeigt das Synzytium (schwarz umrandet). Zum Ver-
gleich siehe Vero-Zellen in normaler Größe in Abbildung 21. Lichtmikroskopische Aufnahme im Durchlicht.
Abbildung 23 stellt ein repräsentatives Bild Plaque-ähnlicher Formationen dar, die in Vero-
Zellen sechs Tage nach der Transfektion mit HPyV12-Genomen beobachtet werden konnten.
Abbildung 23 Plaque-ähnliche Formationen nach der Transfektion von Verozellen mit HPyV12-
Genomen.
Fixierte Vero-Zellen, sechs Tage nach der Transfektion mit HPyV12-Genomen. Es sind Plaque-ähnliche Zell-
veränderungen erkennbar (siehe Pfeile).
100µm
100µm
4 Ergebnisse
92
Sowohl nach HPyV9- als auch nach HPyV12-Transfektion traten physiologische Verände-
rungen insgesamt nur in geringem Maße und nur in Vero-Zellen ab sechs Tagen nach Trans-
fektion auf. Die Zelllinien 3T3, Cos-7, HEK293, HeLa, Huh-7, RH, BJAB, 293-4T, A375,
A549 und SW480 zeigten nach Transfektion keine Veränderungen unter lichtmikroskopischer
Beobachtung.
4.3.5 Nachweis viraler Genexpression
Ergebnisse der HPyV9-VP1-spezifischen qPCR
Es wurden 3T3-, Cos-7-, HEK293-, HeLa-, Huh-7-, RH-, Vero- und BJAB-Zellen auf ihre
Eignung als Zellkultursystem für HPyV9 getestet. Als Indikator für die Replikation wurde
hier die Akkumulation von VP1-Transkripten mittels qPCR-Analyse von cDNA gemessen
(siehe 3.1.7.5 qPCR). In die qPCR wurde 1 µl cDNA des 20 µl Ansatzes eingesetzt, welcher
mit 500 ng RNA angesetzt wurde. Abbildung 24 zeigt die Kopienzahlen von HPyV9-VP1-
Transkripten in 1 µl cDNA (entspricht ca. 25 ng RNA) zu den Erntezeitpunkten T0, T1, T3,
T6, T9 und T13 nach Transfektion.
Abbildung 24 Kopienzahl der HPyV9-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (entspricht 25 ng RNA) zu verschie-
denen Erntezeitpunkten in sechs Zelllinien, Quantifizierung mittels spezifischer HPyV9-VP1-qPCR
In allen Zelllinien nahm die Kopienzahl der HPyV9-VP1-Transkripte mit der Zeit zu
(Abbildung 24, Tabelle 44). Drei Tage nach der Transfektion (T3) war bei 6 von 8 Zelllinien
1
10
100
1000
10000
100000
0136913
Kopienzahl der VP1-Transkripte
Tage nach der Transfektion
3T3
BJAB
Cos-7
HEK293
HeLa
Huh-7
RH
Vero
4 Ergebnisse
93
bereits eine deutliche Zunahme an HPyV9-VP1-Transkripten zu verzeichnen. Der Zeitpunkt
des Maximums variierte zwischen den getesteten Zelllinien, überwiegend wurde die höchste
VP1-Kopienzahl jedoch an Tag 6 und Tag 9 nach der Transfektion detektiert (siehe fett ge-
druckte Werte in Tabelle 44). Insgesamt konnten maximale Kopienzahlen in BJAB- (T6),
HEK293- (T9) und in Vero-Zellen (T3) erreicht werden. Ab T9 nahm bei allen Zelllinien die
VP1-Kopienzahl wieder ab.
Tabelle 44 Kopienzahl der HPyV9-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (=25 ng RNA) für acht mit HPyV9-
Genomen transfizierte Zelllinien
Erntezeitpunkt
Cos-7
HeLa
Vero
HEK293
Huh-7
RH
3T3
BJAB
T0
0
0
1
0
1
0
0
0
T1
30
n. u.
6
n. u.
n. u.
n. u.
6
1410
T3
4960
52
39292
2240
3560
2570
41
365
T6
158
n. u.
30379
11400
2930
2480
55
20900
T9
637
626
7005
17100
7690
4180
24
1225
T13
8
77
539
1670
1580
4
20
0
n.u.: nicht untersucht; die für jede Zelllinie erhaltenen Maximalwerte sind fett dargestellt
Ergebnisse der HPyV12-VP1-spezifischen qPCR
Zur Identifikation eines für HPyV12 geeigneten Replikationssystems wurde zunächst die Ko-
pienzahl in 1 µl cDNA (entspricht 25 ng RNA) der HPyV12-VP1-Transkripte zu den Zeit-
punkten T0, T1, T3, T6, T9 und T13 nach Transfektion von 293-4T-, 3T3-, A375-, A549-,
HEK293-, HeLa-, RH-, SW480- und Vero-Zellen mit HPyV12-Genomen bestimmt
(Abbildung 25).
4 Ergebnisse
94
Abbildung 25 Kopienzahl der HPyV12-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (entspricht 25 ng RNA) zu ver-
schiedenen Erntezeitpunkten in neun Zelllinien, Quantifizierung mittels spezifischer HPyV12-VP1-qPCR
In 3T3-, A549-und RH-Zellen konnte nur eine minimale Zunahme von HPyV12-VP1-Kopien
verzeichnet werden (Tabelle 45). In allen weiteren Zelllinien wurde bereits 1 Tag nach der
Transfektion ein leichter und nach 3 Tagen ein deutlicher Anstieg der HPyV12-Kopienzahl
detektiert. Der Zeitpunkt, an dem der individuelle Maximalwert erreicht wurde, variierte zwi-
schen T3 und T9 (siehe fett gedruckte Werte in Tabelle 45). Insgesamt war die Genexpression
von HPyV12-VP1 ca. 10-fach schwächer als die von HPyV9-VP1 (Tabelle 44).
Tabelle 45 Kopienzahl der HPyV12-VP1-Transkripte in 1 µl cDNA (=25 ng RNA) für neun mit HPyV12-
Genomen transfizierten Zelllinien
Erntezeitpunkt
A375
A549
HeLa
Vero
HEK293
293-4T
RH
3T3
SW480
T0
0
0
0
0
0
0
0
0
0
T1
9
22
0
n. u.
4
16
0
0
9
T3
38
10
156
420
20
178
3
0
88
T6
267
4
108
2270
10
615
3
1
243
T9
3
1
10
1725
19
1070
0
3
105
T13
1
1
1
282
5
576
0
0
217
n. u.: nicht untersucht, die für jede Zelllinie erhaltenen Maximalwerte sind fett dargestellt
1
10
100
1000
10000
0136913
Kopienzahl der VP1-Transkripte
Tage nach der Transfektion
293-4T
3T3
A375
A549
HEK293
HeLa
RH
SW480
Vero
4 Ergebnisse
95
4.3.6 Detektion viraler Proteine
Im IFA sollten die viralen Proteine HPyV9-VP1, HPyV9-TAg, HPyV12-VP1 und HPyV12-
TAg mittels monoklonaler Antikörper und einem Cy3-gekoppelten Sekundärantikörper nach
Genom-Transfektion in diverse Zelllinien detektiert werden (S. 43 und S. 62). Dies erfolgte
sechs Tage nach Transfektion und Fixierung der Zellen. Abbildung 26 zeigt eine erfolgreiche
Färbung von HPyV12-VP1 unter Verwendung des mAks anti-HPyV12-VP1 (Tabelle 12) in
transfizierten Vero-Zellen. Im rechten Teil des Bildes ist eine Plaque-ähnliche Struktur sicht-
bar (siehe Pfeile). In der Mitte haben sich bereits Zellen abgelöst.
Abbildung 26 Spezifische Anfärbung von HPyV12-VP1 bei Plaque-Bildung.
Vero-Zellen, sechs Tage nach der Transfektion mit HPyV12-Genomen fixiert und angefärbt mit anti-HPyV12-
VP1-mAK (S. 43). Das Bild zeigt eine Plaque-ähnliche Veränderung im Zellrasen (siehe Pfeile). In der Mitte
haben sich die Zellen bereits komplett abgelöst. Durchlicht-Bild und Anfärbung (Ziege-anti-Maus-IgG-Cy3)
sind zusammengeführt.
Abbildung 27 zeigt ebenfalls mit HPyV12-transfizierte Vero-Zellen. Es sind zwei Stellen er-
kennbar, wo sich die Bildung von Plaques ankündigte. Am oberen Rand des rechten Plaques
(siehe auch Ausschnitt) ist deutlich die spezifische Anfärbung mit dem anti-HPyV12-VP1-
mAK (Tabelle 12) erkennbar. Die Analyse von weiteren Zelllinien unter den gleichen Bedin-
100µm
4 Ergebnisse
96
gungen erbrachte kein Ergebnis, das dem mit Vero-Zellen erzielten ähnelte oder anderweitig
auf Virusvermehrung schließen ließ.
Abbildung 27 Spezifische Anfärbung von HPyV12-VP1.
Das Bild zeigt Vero-Zellen sechs Tage nach der Transfektion mit HPyV12-Genomen, fixiert und angefärbt mit
anti-HPyV12-VP1-mAK (S. 43). Es sind zwei Plaque-ähnliche Veränderungen im Zellrasen zu erkennen (siehe
schwarze Pfeile). Es zeigte sich eine Anfärbung von HPyV12-VP1 im Zytoplasma und eine leichte Färbung der
Zellkerne. Durchlicht-Bild und Anfärbung (Ziege-anti-Maus-IgG-Cy3) sind zusammengeführt. Der Ausschnitt
zeigt die Anfärbung des rechten Plaques mit dem Sekundärantikörper Ziege-anti-Maus-IgG-Cy3. Es sind spezifi-
sche Anfärbungen von HPyV12-VP1 in Form kleiner roter Punkte zu erkennen (weiße Pfeile).
An mit HPyV9-Genomen transfizierten Zelllinien (3T3, Cos-7, HEK293, HeLa, Huh-7, RH,
Vero) wurden mit dem anti-HPyV9-VP1-monoklonalen Antikörper (Tabelle 12) keine deutli-
chen Färbungen erhalten. Eine Anfärbung von HPyV9- und HPyV12-TAg mit den mAK
(Tabelle 12) war ebenfalls nicht erfolgreich (Daten nicht gezeigt).
Die Anfärbung von viralen Proteinen in transfizierten Vero-, HEK293- und BJAB-Zellen (S.
58) mittels mAK (Tabelle 12) in der Western Blot-Analyse (S. 59) gelang nicht.
100µm
4 Ergebnisse
97
4.3.7 Detektion von Viruspartikeln im EM
In der elektronenmikroskopischen Analyse von Zellkulturüberständen von mit HPyV9- und
HPyV12-Genomen transfizierten Vero-Zellen nach Ultrazentrifugation (S. 66) wurden keine
Viruspartikel nachgewiesen.
4.3.8 Zusammenfassung
Zur Identifikation eines geeigneten in vitro-Replikationssystems wurden für beide PyV diver-
se Zelllinien getestet. Hierfür wurden die synthetischen Genome in die Zelllinien 3T3, Cos-7,
HEK293, HeLa, Huh-7, RH, Vero, BJAB (HPyV9) und 293-4T, 3T3, A375, A549, HEK293,
HeLa, RH, SW480, Vero (HPyV12) transfiziert. Die Zelllinien wurden nach folgenden Krite-
rien beurteilt:
• Beobachtung von physiologischen Effekten einer Infektion im Lichtmikroskop
• Zunahme der VP1-Kopienzahl über der Zeit, ermittelt mit einer spezifischen qPCR zu
verschiedenen Ernte-Zeitpunkten T0, T1, T3, T6, T9, T13.
• Anfärbung viraler Proteine mit monoklonalen Antikörpern
• Nachweis im Elektronenmikroskop.
Physiologische Effekte nach einer Transfektion mit HPyV9- und HPyV12-Genomen wurden
nur in Vero-Zellen beobachtet: sich ablösende Zellen und Plaque-ähnliche Formationen liefer-
ten Anzeichen für eine Virusreplikation. Die Genexpression von HPyV9-VP1 verzeichnete in
Vero-, HEK293- und BJAB-Zellen einen deutlichen Anstieg. Es konnte in Vero-Zellen eine
maximale Kopienzahl von 39292 in 1 µl cDNA nachgewiesen werden. Für HPyV12-VP1-
Kopien war der Anstieg der Kopienzahl in 293-4T und in Vero-Zellen am deutlichsten. Mit
einem Maximalwert von 2270 Kopien in 1 µl cDNA in Vero-Zellen war die Zunahme hier
deutlich geringer als bei HPyV9-VP1. Die maximalen Kopienzahlen wurden bei beiden PyV
in Vero-Zellen bereits drei (HPyV9) bzw. sechs (HPyV12) Tage nach der Transfektion er-
reicht. Die Anfärbung viraler Proteine gelang nur nach einer Transfektion von HPyV12-
Genomen in Vero-Zellen mit einem monoklonalen Antikörper gegen HPyV12-VP1.
Vero-Zellen sind hiermit aus den getesteten Zelllinien am geeignetsten für Untersuchungen
der beiden PyV. Sechs Tage nach der Transfektion lassen sich deutliche Effekte nachweisen.
Es konnten bisher jedoch elektronenmikroskopisch keine viralen Partikel der beiden PyV de-
tektiert werden.
4 Ergebnisse
98
4.4 Spleißvorgänge der frühen Genregion von HPyV9 und HPyV12
Eine Auswahl der in 4.3 als potentielle in vitro-Replikationssysteme für HPyV9 und HPyV12
untersuchten Zelllinien Vero, HeLa, HEK293, 293-4T, A375, A549, SW480, RH und 3T3
diente in weiterführenden Untersuchungen der Analyse von Spleißvorgängen der frühen Re-
gion beider Viren. Hierfür wurde wie folgt vorgegangen:
1) Analyse von cDNA mit einer konventionellen PCR zur Identifikation des Introns von
gespleißter LTAg-mRNA
2) Verwendung einer Nested LD-PCR zur Amplifikation von nahezu vollständiger ge-
spleißter LTAg-mRNA
3) Anwendung weiterer konventioneller PCRs zur Identifikation der Sequenzen von al-
ternativ gespleißten TAg-mRNAs, wenn die LD-PCR ohne Ergebnis war oder keine
ausreichenden Sequenzinformationen liefern konnte
4.4.1 Die early region von HPyV9
Gemäß bioinformatischer Vorhersage wird von der frühen Region des HPyV9 eine mRNA
transkribiert, die einen für ein 189 aa umfassendes sTAg kodierenden ungespleißten Lese-
rahmen enthält (Position 1 bis 570; Abbildung 28A). Durch Herausspleißen eines Introns
(352 Bp; Position 238 bis 589) aus prä-mRNA entsteht eine mRNA, die einen für ein 680 aa
umfassendes LTAg kodierenden, gespleißten Leserahmen (2043 Bp) enthält. Die genannten
Spleißpositionen wurden zunächst theoretisch mittels bioinformatischer Analyse bestimmt,
wobei nach Sequenzmotiven gesucht wurde, die den bei Eukaryonten bekannten Konsensus-
Spleiß-Sequenzen entsprechen (3.6 Bioinformatische Methoden: Vorhersage von Spleißstel-
len in der frühen Genregion von PyV). Alle im folgenden Text erwähnten Positionsangaben
beziehen sich auf die Länge und Position der genomischen early region (Position 1 = erstes
Nukleotid des LTAg-Startkodons).
In Abbildung 28A sind die für HPyV9 vorhergesagten TAg-mRNAs und die für die experi-
mentelle Identifikation von gespleißten mRNAs verwendeten Primer schematisch dargestellt.
Es wurde RNA von Vero-Zellen 6 Tage nach der Transfektion mit HPyV9-Genomen geerntet
und cDNA synthetisiert (S. 50). Zunächst wurde mit den Primern 5599s/5602as eine Intron-
spannende PCR durchgeführt, um die tranfizierten Zellen auf Vorhandensein von gespleißter
TAg-Sequenz hin zu untersuchen. Anschließend wurde mit einer Nested LD PCR und den
Primern 6567s/as (1. PCR-Runde) und 6568s/as (2. PCR-Runde) die nahezu vollständige
LTAg-mRNA amplifiziert.
4 Ergebnisse
99
In der Intron-spannenden PCR flankieren die Primer 5599s und 5602as das vorhergesagte
Intron in geringem Abstand. Mit dieser PCR wurden drei Introns identifiziert (Abbildung
28B). Eine Intron-Analyse der Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Motive ergab, dass diese den
Konsensus-Spleiß-Sequenzen entsprechen (siehe Tabelle 46).
Tabelle 46 Spleiß-Sequenzen für HPyV9-sTAg, -LTAg, und -145T
TAg
Spleiß-Donor
Spleiß-Akzeptor
LTAg
CAG|gtagct (80)
atttttttttag|GG (86)
sTAg
AAT|gtaagt (88)
tattttgttcag|AG (87)
145T
CAG|gtagct (80)
tattttgttcag|AG (87)
Exon-Sequenz in Großbuchstaben, Intron-Sequenz in Kleinbuchstaben
Score für den Konsensus-Wert des Human Splice Finders (siehe S. 68) in Klammern (Bereich von 0-100)
Das vorhergesagte LTAg-Intron wurde bestätigt. Zwei weitere Introns unterschieden sich
vom vorhergesagten in Länge und Spleiß-Donor- und Akzeptor-Sequenzen sowie deren Posi-
tionen.
Das Intron von Position 572 bis 731 (160 Bp) beginnt mit dem ersten Nukleotid hinter dem
Terminationskodon des für sTAg vorhergesagten Leserahmens. Nach Übersetzen des Tran-
skriptes im Exon 1 (Exon 2 liegt hinter dem Terminationskodon) entsteht ein 189 aa großes
Protein. Es entspricht dem vorhergesagten HPyV9-sTAg. Das entstandene Protein entspricht
der Sequenz des vorhergesagten, da das Stopp-Codon am Ende des Exons 1 auftritt und das
zweite Exon nicht kodiert.
Das zweite, nicht vorhergesagte Intron (Position 238-731) nutzt das gleiche Spleiß-Donor-
Motiv wie das für LTAg-mRNA vorhergesagte; das Intron ist jedoch etwas länger (494 Bp)
als das vorhergesagte Intron (352 Bp). Exon 1 kodiert für 79 aa, welche mit denen des LTAg
und des sTAg identisch sind. Exon 2 wird im 3. Leserahmen abgelesen und kodiert für weite-
re 66 aa, gefolgt von einem Stopp-Kodon. Das von dieser mRNA translatierte 145 aa Protein
wurde vorläufig 145T genannt. Mit der Nested LD PCR wurden die Ergebnisse der Intron-
spannenden PCR bestätigt, und es ergaben sich nach Sequenzierung der >2 KBp großen Pro-
dukte mittels primer walking keine weiteren Introns in der gesamten early region. Zwischen
den Bindungsstellen der in der 2. Runde der LD-PCR verwendeten Primer 6568s/6568as
wurden die Sequenzen vollständig experimentell bestätigt, wie in Abbildung 28B schematisch
dargestellt (rot unterstrichene Bereiche). Kurze Bereiche vor dem Sense- und nach dem Anti-
Sense-Primer wurden theoretisch abgeleitet.
4 Ergebnisse
100
Abbildung 28 Schema der experimentell ermittelten mRNAs der frühen Genregion von HPyV9.
A Vorhergesagte sTAg- und LTAg-mRNAs. B Experimentell bestimmte TAg-mRNAs: LTAg-mRNA mit vor-
hergesagtem Intron, sTAg-mRNA mit nicht vorhergesagtem Intron und mRNA eines alternativ gespleißten TAg,
welche in einem Protein mit 145 aa resultiert (145T). Die mit roter Linie unterlegten Bereiche sind experimentell
mittels PCR und Sequenzierung bestimmt. Für die nicht rot-unterstrichenen Bereiche gibt es keine experimentel-
len Daten. Die Positionsangaben stehen für erstes und letztes Nukleotid des jeweiligen Exons.
Die Entstehung der drei Transkripte wurden im Rahmen der Masterarbeit von Claudia Lucke
in sechs Zelllinien (HEK293, Vero, HeLa, Huh-7, 3T3 und Cos-7) und zu diversen Erntezeit-
punkten bestätigt (vergleiche hierzu „Untersuchungen zur Etablierung eines Zellkultursystems
für das Humane Polyomavirus 9“, Masterarbeit Claudia Lucke, Robert Koch-Institut 2013).
4.4.2 Die early region von HPyV12
Für HPyV12 wurde mittels bioinformatischer Analysen eine kodierende Sequenz von 1-
549 bp für das sTAg (182 aa) vorhergesagt. Das LTAg (709 aa) entsteht durch Spleißen der
frühen Region. Das Intron ist 399 nt lang (Position 214-612) und generiert eine für LTAg
kodierende mRNA-Sequenz von 2127 nt (Exon 1: 1-213, Exon 2: 613-2526). Alle im folgen-
den Text erwähnten Positionsangaben beziehen sich auf die Länge und Position der genomi-
schen TAg-Sequenz (Position 1 = erstes Nukleotid des LTAg-Startkodons). In Abbildung
29A sind die für HPyV12 vorhergesagten TAg mRNAs und die für die experimentelle Identi-
fikation von gespleißten mRNAs verwendeten Primer schematisch dargestellt. In Abbildung
29B sind die experimentell bestimmten mRNAs der frühen Genregion von HPyV12 abgebil-
det, deren Spleiß-Donor und -Akzeptor-Sequenzen den für Eukaryonten bekannten Konsen-
Leseraster 1
Leseraster 2
Leseraster 3
sTAg
Exon
Transkript
Intron
LTAg
A Vorhergesagte TAg
B Experimentell bestimmtes TAg
145T
Primer
sTAg
in der PCR amplifizierte Sequenz
Terminationskodon
5602as
5599s
6567s
6568s 6568as
6567as
LTAg
4 Ergebnisse
101
sus-Sequenzen entsprechen. Mit der Intron-spannenden PCR konnte das vorhergesagte LTAg-
Intron (Position 214 bis 612) identifiziert werden. Zusätzlich wurde ein alternatives Intron
detektiert, welches den gleichen Spleiß-Donor wie das vorhergesagte Intron und einen ande-
ren Spleiß-Akzeptor nutzt (Position 214 bis 627). Durch das Herausspleißen eines um 14 Bp
längeren Introns (313 Bp) entsteht eine Verschiebung des Leserahmens in Exon 2 um zwei
Nukleotide. Das Exon 2 wird hierdurch im 3. Leserahmen abgelesen, so dass nach 13 Kodons
ein Stopp-Kodon auftritt. Dieses Transkript kodiert für ein 84 aa-Protein, welches die ersten
71 aa mit dem vorhergesagten LTAg teilt. Das alternativ gespleißte TAg wurde vorläufig
HPyV12-84T genannt. Mit Ausnahme der ersten 89 nt wurde die mRNA-Sequenz des
HPyV12-84T-Leserahmes experimentell bestätigt.
Abbildung 29 Schema der experimentell ermittelten mRNAs der frühen Genregion von HPyV12.
A Vorhergesagte sTAg- und LTAg-mRNAs. B Experimentell bestimmte TAg-mRNAs: LTAg-mRNA mit vor-
hergesagtem Intron und mRNA von alternativ gespleißtem TAg, die für ein Protein mit 84 aa kodiert (84T). Die
mit roter Linie unterlegten Bereiche sind experimentell mittels PCR bestimmt. Für die nicht rot-unterstrichenen
Bereiche gibt es keine experimentellen Daten. Die Positionsangaben stehen für erstes und letztes Nukleotid des
jeweiligen Exons.
Das vorhergesagte LTAg-Intron wurde in allen getesteten Zelllinien und zu verschiedenen
Zeitpunkten detektiert. HPyV12-84T-mRNA wurde nur in Vero-Zellen neun Tage nach der
Transfektion identifiziert. Das LTAg-Intron (Position 214 bis 612) verfügt über Konsensus-
Spleiß-Sequenzen, ebenso wie das Intron der 84T-mRNA. Das LTAg wurde in einer zusätzli-
chen PCR bis zur Position 1024 experimentell bestimmt (siehe Abbildung 29, Primer 6577s
Leseraster 1
Leseraster 2
Leseraster 3
Exon
Transkript
Intron
Primer
in der PCR amplifizierte Sequenz
Terminationskodon
sTAg
LTAg
A Vorhergesagte TAg
B Experimentell bestimmte TAg (Konsensus Spleiß-Sequenzen)
84T
LTAg
6395as
6395s
6577s
6578s
6579s 6579as
6578as
6577as
5698as
6577s
6579s 6579as
4 Ergebnisse
102
und 5698as). Die Nested LD-PCR ergab keine komplette LTAg-Sequenz. Stattdessen wurde
eine Vielzahl von mRNAs detektiert, die für weitere TAg-Varianten kodieren. Diese wurden
in Anlehnung an die obigen TAg-Varianten vorläufig benannt (Abbildung 30). Besonderheit
dieser mRNAs ist, dass sie vollständig oder zum Teil Spleiß-Motive enthalten, die keine Ähn-
lichkeit zu den den Konsensus-Spleißmotiven aufweisen (in Abbildung 30 orange schattiert
markiert, vergleiche auch Tabelle 47). Die mRNAs der TAg-Varianten 71T, 79T, 85T und
98T teilen das erste Exon mit LTAg (und entsprechend auch den N-Terminus von sTAg). Bei
71T und 85T startet das Intron am Konsensus-Spleiß-Donor ab Position 214. Das folgende
Intron erstreckt sich bei 71T bis Position 1619. Exon 2 des 71T beginnt mit einem Stopp-
Codon, sodass Exon 3 nicht abgelesen wird. 85T verfügt über ein Intron von Position 214 bis
802 und ein kurzes 2. Exon, welches im 3. Leserahmen abgelesen wird (14 aa). Die Spleiß-
Akzeptoren der Introns entsprechen nicht den Konsensus-Spleiß-Sequenzen. Bei 79T und 98T
ist bereits der Spleiß-Donor eine Nicht-Konsensus-Sequenz. An Position 229 und 276 beginnt
jeweils ein langes Intron, welches sich fast über die restliche frühe Genregion erstreckt. Am
C-Terminus wird lediglich ein kurzes Exon 2 angefügt, welches für 3 (im 2. Leserahmen)
bzw. 6 aa (im 3. Leserahmen) und für ein Stopp-Codon kodiert. Ähnlich ist die 128T‘–mRNA
strukturiert: auf Exon 1 (1-255) folgt ein langes Intron und am Ende ein kurzes 2. Exon, wel-
ches im 2. Leserahmen abgelesen wird und für 43 aa kodiert. 115T, 115T‘, 128T, 134T, 136T,
145T, 148T und 154T beinhalten das vorhergesagte LTAg-Intron mit den Konsensus-Spleiß-
Sequenzen (Position 214 bis 612). Exon 2 ist bei den 8 mRNAs unterschiedlich lang und vari-
iert von Position 713 bis 782. Die nachfolgenden Introns weisen alle Nicht-Konsensus-Spleiß-
Motive auf und variieren ebenfalls in der Länge. Entsprechend ergeben sich für die dritten
Exons jeder Variante unterschiedliche Längen und Leserahmen. Alle zuletzt genannten TAg-
Varianten teilen jeweils am N-Terminus etwas mehr als 100 aa mit LTAg. Die C-Termini der
Proteine unterscheiden sich von dem des LTAg. Eine weitere Variante, das 346T, zeigt ein
bisher nicht vorhergesagtes Intron von nur 85 Bp (Position 542 bis 626). Exon 2 ist 161 Bp
lang und wird im zweiten Leserahmen übersetzt. Ein zweites Intron von Position 785 bis 2184
(1400 Bp) sorgt dafür, dass das Exon 3 (339 Bp von Position 2185 bis 2526) dieser Variante
wieder im gleichen Leserahmen wie LTAg abgelesen wird (Leserahmen 1). Entsprechend ist
346T identisch mit den ersten 180 aa von sTAg bzw. mit den ersten 71 aa und den letzten
113 aa von LTAg.
4 Ergebnisse
103
Abbildung 30 Schema weiterer experimentell ermittelter mRNAs der frühen Genregion von HPyV12.
Es sind die alternativ gespleißten Produkte der frühen Genregion von HPyV12 dargestellt. Diese HPyV12-TAg-
Varianten kodieren für Proteine unterschiedlicher Größe und wurden nach der vorhergesagten aa-Länge benannt.
Produkte gleicher Größe wurden zusätzlich mit ‘benannt. Es handelt sich um mRNAs, die teilweise Konsensus-
Spleißsequenzen (grün schattiert) und teilweise Nicht-Konsensus-Spleißsequenzen (rot schattiert) verwenden.
Das Rb-Binde-Motiv LXCXE wurde als Stern über dem Exon eingezeichnet. Nur die rot-unterstrichenen Berei-
che beruhen auf experimentellen Daten. Die Positionsangaben stehen für erstes und letztes Nukleotid des jewei-
ligen Exons.
136T
145T
346T
154T
134T
79T
128T
115T‘
115T
128T‘
98T
71T
148T
85T
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Leseraster 1
Leseraster 2
Leseraster 3
Exon
Transkript
Intron
in der PCR amplifizierte Sequenz
Terminationskodon
Rb-Motiv (685-699)
4 Ergebnisse
104
Die farblichen Markierungen in Abbildung 30 geben an, welche Spleiß-Sequenzen der Kon-
sensus-Sequenz entsprechen (grün) und welche hiervon abweichen (orange). Vergleiche hier-
zu auch Tabelle 47, welche die Spleiß-Akzeptoren und -Donoren für alle erhaltenen Produkte
der frühen Genregion von HPyV12 angibt.
In Abbildung 30 ist zusätzlich zu erkennen, dass bei einem Großteil der abgeleiteten Proteine
(8 von 14) die ersten >100 aa des N-Terminus mit LTAg identisch sind und die Rb-
Bindestelle (mit * gekennzeichnet) vorhanden ist.
Tabelle 47 Spleiß-Donor- und -Akzeptor-Motive aller experimentell bestimmten HPyV12-TAg-mRNAs
Intron 1
Intron 2
TAg
Spleiß-Donor
Spleiß-Akzeptor
Spleiß-Donor
Spleiß-Akzeptor
LTAg
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
-
-
84T
GAG|gtaaag (84)
caatcctcatag|GA (81)
-
-
71T
GAG|gtaaag (84)
gtttaaaaacag|TA (79)
AAG|atttaa ( - )
ataatattaaag|CA
(72)
79T
TAC|atccag ( - )
atccatatgtac|CA ( - )
-
-
85T
GAG|gtaaag (84)
cctcattttcta|AG ( - )
-
-
98T
AAT|ttgatt ( - )
taccacagaaat|AG ( - )
-
-
115T
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
TGA|gccagc ( - )
catagtggccta|AC
( - )
115T‘
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
AAG|agcctg ( - )
cagagatcatct|AG
( - )
128T
GAG|gtaaag (84)
caatcctcatag|TA (81)
CTG|cttccc ( - )
atattgtaaagc|CA
( - )
128T‘
TTG|ggtgct ( - )
ataccttctttg|CG ( - )
-
-
134T
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
ATA|tacatg ( - )
agagatagaaaa|AA
( - )
136T
GAG|gtaaag (84)
caatcctcatag|TA (81)
GAG|ccaata ( - )
aaaaaaaactgc|CT
( - )
145T
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
GAG|ccagcc ( - )
aaaaaaaactgc|CT
( - )
148T
GAG|gtaaag (84)
taaaatttacag|TA (80)
CAC|ttcatc ( - )
ataccttctttg|GC
( - )
154T
GAG|gtaaag (84)
caatcctcatag|TA (81)
CAG|gagcca ( - )
tagaaaaaaaac|TG
( - )
346T
TAG|gtaaag (98)
caatcctcatag|GA (81)
CTT|cccgaa ( - )
cagattttccca|CC
( - )
Exon-Sequenz in Großbuchstaben, Intron-Sequenz in Kleinbuchstaben
Score für den Konsensus-Wert des Human Splice Finders (siehe S. 68) in Klammern (Bereich von 0-100)
Kanonische Spleiß-Motive sind grün eingefärbt; abweichende Motive in orange
Tabelle 48 stellt den zellulären Ursprung der detektierten HPyV12-TAg-Varianten dar. Insge-
samt wurden zehn der TAg-Varianten in je einer Zelllinie gefunden, fünf in zwei oder mehr
Zelllinien gefunden und 2 Varianten zu mehreren Zeitpunkten detektiert. Bei 128T handelt es
sich um eine besonders häufig auftretende HPyV12-TAg-Variante, sie wurde zu mehreren
Zeitpunkten und in vier verschiedenen Zelllinien detektiert.
4 Ergebnisse
105
Tabelle 48 Auftreten der HPyV12-TAg-Varianten in den diversen Zelllinien
HeLa
HEK293
Vero
293-4T
A375
A549
SW480
RH
3T3
sTAg - - - - - - - - -
LTAg
+
+
+
+
+
+
-
-
-
84T
-
-
++
-
-
-
-
-
-
71T
-
+
-
-
-
-
-
-
-
79T
-
+
-
-
-
-
-
-
-
85T
+
+
-
-
-
+
-
-
-
98T
-
-
-
+
-
-
-
-
-
115T
+
+
-
-
+
-
-
-
-
115T'
-
-
-
+
-
-
-
-
-
128T
++
++
+
-
+
-
-
-
-
128T'
-
-
-
-
-
+
-
-
-
134T
-
+
-
-
-
-
-
-
-
136T
+
-
-
-
-
-
-
-
-
145T
+
-
-
-
-
-
-
-
-
148T
-
+
-
-
-
-
-
-
-
154T
+
-
-
-
-
-
-
-
-
346T
+
-
-
+
-
-
-
-
-
+ zu einem Zeitpunkt nach Transfektion detektiert; ++zu mehreren Zeitpunkten nach Transfektion detektiert
4.4.3 Zusammenfassung
Für HPyV9 wurden für LTAg und sTAg kodierene mRNAs erstmals experimentell nachge-
wiesen. Es wurden für die mRNA von sTAg ein bisher unbekannter Spleißvorgang und eine
zusätzliche, durch alternatives Spleißen entstehende TAg-Variante, 145T, identifiziert. Die
145T-mRNA entsteht über kanonische Spleißmotive. Für HPyV12 konnte die für das LTAg
kodierende mRNA nur partiell nachgewiesen, das vorhergesagte Intron jedoch bestätigt wer-
den. Die vorhergesagte sTAg-mRNA wurde bei den Analysen nicht gefunden. Es wurde je-
doch eine alternativ gespleißte, für eine bisher nicht beschriebene TAg-Variante 84T kodie-
rende, mRNA identifiziert. 84T entsteht unter Verwendung kanonischer Spleißmotive. Zudem
wurden 14 mRNAs detektiert, welche über ein oder zwei Introns verfügen, deren Exon-
Intron-Grenzen keine Ähnlichkeit zu den kanonischen Spleißmotiven aufweisen.
5 Diskussion
106
5 Diskussion
Die in dieser Dissertation durchgeführten Studien tragen zu einer ersten, partiellen Charakte-
risierung der beiden neuartigen PyV HPyV9 und HPyV12 bei. Die erhaltenen Ergebnisse er-
lauben einen ersten Einblick in die Genoprävalenz und Seroprävalenz beider Viren in be-
stimmten Probengruppen und in die Seroreaktivität verschiedener Gruppen von Individuen
gegen den aminoterminalen Bereich der TAg beider Viren. Zudem zeigen die hier durchge-
führten Experimente erste Zelllinien auf, die als mögliche in vitro-Replikationssysteme in
Frage kommen, denn diese Zelllinien erlaubten im Rahmen dieser Dissertation die Analyse
von Spleiß-Produkten der frühen Genregion und die Identifikation bisher unbekannter TAg-
Varianten von HPyV9 und HPyV12. Die erhaltenen Daten zeichnen noch kein abgeschlosse-
nes Bild. Sie unterstützen jedoch den aktuellen Forschungsstand zu neuartigen PyV und ge-
ben erste Anhaltspunkte für weitere, intensivere und breiter angelegte Studien.
5.1 Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12
Dieses Teilprojekt sollte einen Beitrag zur Klärung des Gewebe-Tropismus der beiden neuar-
tigen humanen PyV liefern. Grundlage war die Frage, ob neuartige humane PyV mit malignen
Erkrankungen des GIT assoziiert sind, da HPyV12 in entsprechendem Gewebe erstmals de-
tektiert wurde. Es existiert bereits eine Vielzahl an Studien zur Präsenz von DNA diverser
Viren in erkranktem Gewebe des GIT, deren Ergebnisse jedoch nicht konsistent sind (191). In
der vorliegenden Arbeit konnte keine Assoziation der hier erstmals untersuchten HPyV9 oder
HPyV12 mit Erkrankungen des GIT festgestellt werden. Die Genoprävalenz von HPyV9 war
0 % und jene von HPyV12 2,8 %, sowohl in Tumor- als auch in Kontrollgewebe. Die in die-
ser Studie erhobenen Daten geben keinen Hinweis auf einen Gewebetropismus der beiden
neuartigen humanen PyV. Die geringe Genoprävalenz von HPyV12 in den untersuchten Ge-
webetypen weist darauf hin, dass es noch ein anderes, bisher nicht identifiziertes Gewebe
bzw. Körperkompartiment geben muss, für das die Anwesenheit des HPyV12 spezifisch ist.
Bezüglich HPyV9 lieferten die Ergebnissen von Trusch et al. erste Hinweise, dass HPyV9
vermehrt in Nierentransplantierten nachzuweisen ist (35). Eine aktuelle Studie von van der
Meijden et al. stützt diese Ergebnisse (42). Sie wiesen HPyV9-DNA in 21 % ihrer Serumpro-
ben von immunsupprimierten Nierentransplantierten (n=101) nach. Drei Monate nach der
Transplantation erreichte die Viruslast ein Maximum. Auch die HPyV9-Seroprävalenz stieg
in einem 18-monatigen Follow-Up-Experiment von 30 % auf 46 %. Die HPyV9-
Seroprävalenz lag bei ~30 % in der Kontrollgruppe und es konnte keine DNA detektiert wer-
5 Diskussion
107
den. Entsprechend überrascht es nicht, dass HPyV9 in der in der vorliegenden Arbeit unter-
suchten Probengruppe nicht gefunden wurde.
Bei der Interpretation der hier erzielten Ergebnisse ist zu beachten, dass die Trennung der
Proben in Tumormaterial und gesundes Gewebe nicht eindeutig war, da es sich bei dem ge-
sunden Material um an den Tumor angrenzendes Gewebe handelte, welches bei der chirurgi-
schen in sano-Entfernung des Tumors gewonnen wurde. Das Probensortiment war ver-
gleichsweise klein (n = 214) und die Verteilung der Erkrankungen nicht ausgewogen. Leber-
gewebe war mit 55 % der Proben überrepräsentiert, wohingegen Magen- und Speiseröhren-
gewebe mit jeweils nur ein bis zwei Proben deutlich unterrepräsentiert war (siehe auch S. 69).
Eine zusätzliche Analyse einer Auswahl der Proben mit NGS ergab keinen Nachweis von
PyV und bestätigte die qPCR-Ergebnisse.
Die erhobenen Ergebnisse sprechen gegen die eingangs beschriebene Vermutung, die neuarti-
gen PyV HPyV9 und HPyV12 seien mit Erkrankungen des GIT assoziiert. Im PyV-
Forschungsfeld resultieren jedoch üblicherweise eine Vielzahl an Genoprävalenz-Studien in
negativen Ergebnissen, und Studien mit positiven, belastbaren Ergebnissen bezüglich Ge-
noprävalenz und Tropismus sind selten. So wurden allein für HPyV9 fünf Studien mit mehr
als 1800 Proben durchgeführt, die in Genoprävalenzen von 0 bis 4 % resultierten (24). Dies
verdeutlicht, welche Herausforderung es darstellt, den Tropismus von HPyV zu bestimmen.
5.2 Seroprävalenz von HPyV9- und HPyV12-VP1
Diese Studie liefert Daten zur Seroprävalenz von HPyV9 und HPyV12 in der beschriebenen
Gruppe von Patienten mit malignen Erkrankungen des GIT, in einer Gruppe von Patienten mit
nicht-malignen Erkrankungen des GIT und in einer Kontrollgruppe, die aus gesunden Blut-
spendern bestand. Die Untersuchung der Seroprävalenz erfolgte mit einem Kapsomer-
basierten ELISA. Diese Methode stellt eine übliche Vorgehensweise zur Bestimmung der
Seroprävalenz von PyV dar und analysiert die Reaktivität von Testseren gegen das Oberflä-
chenprotein VP1. Dieses ist ein Zielantigen des Immunsystems und bestimmt die Antigenität
und Rezeptor-Spezifität eines PyV. Die Seroprävalenz diverser PyV ist unter 1.1 tabellarisch
dargestellt (Tabelle 1). Die in dieser Dissertation ermittelte Seroprävalenz von 32 % für
HPyV9 und 8 % für HPyV12 in der Kontrollgruppe, 37 % für HPyV9 und 20 % für HPyV12
in der Patientengruppe mit malignen Grunderkrankungen und 59 % für HPyV9 und 25 % für
HPyV12 in jener ohne maligne Grunderkrankungen liegen in den bisher publizierten Berei-
5 Diskussion
108
chen für HPyV9 (25-47 %) und HPyV12 (~25 %). Lediglich die höhere Seroprävalenz von
HPyV9 in Seren von Patienten mit nicht-malignen Erkrankungen im Vergleich zu den beiden
anderen Gruppen war signifikant (p=0,02 und p=0,04). Zur Erklärung dieser Ergebnisse wur-
de die Gabe von Blutprodukten innerhalb der beiden Patientengruppen analysiert, da diese
Ursprung diverser Viren sein können (192, 193). 34 % der Patienten mit nicht-malignen Er-
krankungen erhielten Blutprodukte, 43 % waren es bei den Patienten mit malignen Erkran-
kungen. Entsprechend lässt sich hier kein Zusammenhang ableiten. Zudem hatte es keinen
Einfluss auf die Seroreaktion eines Patienten, ob ein von weiteren Bestandteilen gereinigtes
Erythrozytenkonzentrat oder Fresh Frozen Plasma verabreicht wurde, welches noch Zytoki-
ne, Proteine und ggf. Viruspartikel enthält. Insgesamt lassen die Patientendaten und die gerin-
ge Probenanzahl keine statistisch abgesicherten Aussagen zu und können nur erste Hinweise
liefern.
Eine aktuelle Studie deutet darauf hin, dass das HPyV12-VP1 nicht ab dem ermittelten ersten
ATG, sondern ab einem internen ATG abgelesen wird. Dieses befindet sich an Position der
Start-ATGs verwandter PyV und lässt ein um 16 aa N-terminal kürzeres HPyV12-VP entste-
hen (194). Eine vergleichbare Situation ist bekannt für das VP1 von drei weiteren PyV, Ha-
PyV, JCPyV und SV40. In der vorliegenden Dissertation wurde das 380 aa große VP1 ab
Position 1 als Antigen verwendet. Die hier ermittelten Seroprävalenzen wurden in Literatur-
daten eingeordnet, die ebenfalls mit dem VP1 ab Position 1 erzeugt wurden (22). Insgesamt
sind die bisher erhaltenen Seroprävalenzen für HPyV12-VP1 gering im Vergleich zu denen
anderer PyV. Zudem waren die für HPyV12-VP1 erhaltenen OD450nm-Werte (maximal ge-
messene OD450nm 0,55) im Vergleich zu denen für HPyV9-VP1 gemessenen (maximal gemes-
sene OD450nm 2,14) gering. Dieses Phänomen ließe sich damit erklären, dass das verwendete
Antigen einen artefiziellen N-Terminus hatte und möglicherweise in seiner dreidimensionalen
Struktur verändert war. Es wurde berichtet, dass mit dem N-terminal längeren VP1 keine
VLPs erzeugt werden konnten, im Gegensatz zu dem um 16 aa kürzeren Protein (194). Eine
zukünftige Analyse der Seren mit einem VP1 mit mutmaßlich korrektem N-Terminus
(364 aa) ist wünschenswert, um erste repräsentative Ergebnisse für die Seroprävalenz des ei-
gentlichen HPyV12-VP1 zu ermitteln und zu analysieren, ob sich Unterschiede zu den bisher
erhobenen Daten bezüglich der gemessenen OD450nm-Werte und der Seroprävalenz ergeben.
Die erhobenen Seroprävalenzen für HPyV9- und HPyV12-VP1 geben keinen Hinweis auf
eine Assoziation dieser neuartigen humanen PyV mit Erkrankungen des GIT. Für HPyV12-
VP1 wäre es, wie bereits erwähnt, sinnvoll, den experimentellen Ansatz mit einem 364 aa
5 Diskussion
109
großen VP1 ab der zweiten Translations-Startstelle des für VP1 kodierenden Leserahmens zu
wiederholen.
5.3 Seroprävalenz von HPyV9-, HPyV12-, BKPyV- und MCPyV-TAg(78aa)
Neben der üblichen Bestimmung der Seroprävalenz, bei der die Reaktivität von Testseren
gegen das Oberflächenprotein VP1 bestimmt wird, wurde in dieser Studie die Reaktivität der
Testseren gegen die ersten 78 aa, die bei LTAg und sTAg identisch sind, bestimmt. Der
TAg(78aa)-basierte ELISA ist ein bisher selten verwendetes Format. Nur wenige Studien
setzten bisher LTAg bzw. Bereiche hiervon als antigene Komponente im ELISA ein (siehe
unten). Das diesem Ansatz zugrunde liegende Studiendesign orientierte sich an Versuchen
von Paulson et al., welche davon ausgehen, dass TAg nur exprimiert wird, wenn das PyV in
eine Wirtszelle eintritt und in den Nukleus transportiert wird. Eine Antikörper-Antwort gegen
TAg sei daher nur zu erwarten, wenn geschädigtes oder sterbendes Gewebe das TAg freisetzt
(zum Beispiel bei einer Tumorbildung) (195). In ihrer Publikation stellen Paulson et al. vor,
dass Antikörper gegen MCPyV-VP1 keinen geeigneten klinischen Marker für das MCC dar-
stellen, da in der allgemeinen Bevölkerung mit 65,9 % bereits eine deutliche Seroreaktivität
gegen MCPyV-VP1 nachweisbar ist. Antikörper gegen TAg müssten hingegen spezifisch mit
einer Erkrankung assoziiert sein, denn TAg sind nicht im Viruskapsid vorhanden und werden
nur nach Eintritt des Virus in Wirtszellen exprimiert, wo sie sich im Nukleus befinden. TAg
lösen eine Antikörper-Antwort nur aus, wenn sterbendes oder erkranktes Gewebe diese frei-
setzt und dem Immunsystem präsentiert. Dies ist bei MCPyV beispielsweise der Fall, wenn
MCC persistent TAg exprimieren. Paulson et al. bestätigten die Korrektheit ihrer Hypothese:
1,7 % der allgemeinen Bevölkerung verfügen über Antikörper zur Erkennung von MCPyV-
LTAg und 0,9 % gegen MCPyV-sTAg. Die Seroreaktivität von MCPyV-LTAg und -sTAg lag
bei MCC-Patienten hingegen bei 25,9 % und 40,5 %. Sie zeigten zudem, dass es ausreicht, die
ersten 78 Aminosäuren, die beide TAg gemeinsam haben, als Antigen im ELISA einzusetzen,
um diesen Effekt nachzuweisen. Analog hierzu wurde in dieser Arbeit ein ELISA basierend
auf HPyV9- und HPyV12-TAg(78aa) etabliert. MCPyV- und BKPyV-TAg(78aa) dienten als
Kontroll-Antigene, um die erhaltenen Ergebnisse mit denen der oben genannten Publikation
vergleichen zu können.
Durch die im Rahmen dieser Dissertation durchgeführten Untersuchungen wurden hohe Prä-
valenzen für HPyV9-TAg(78aa) (17 – 34 %), HPyV12-TAg(78aa) (31 – 34 %) und BKPyV-
TAg(78aa) (43 – 57 %) in allen drei untersuchten Stichproben ermittelt. Somit verfügten so-
5 Diskussion
110
wohl die Gruppe Gesunder als auch die beiden Patientengruppen über IgG-Antikörper gegen
HPyV9-, HPyV12- und BKPyV-TAg(78aa). Dies schließt neben LTAg und sTAg alternativ
gespleißte TAg ein, deren N-Terminus identisch mit denen von LTAg und sTAg ist (siehe
hierzu auch S. 100 und S. 101).
Frühere Studien ergaben für BKPyV-TAg deutlich geringere Seroreaktivitäten von < 1 %
(196, 197). Zudem deutet der Nachweis von anti-TAg-Antikörpern auf eine produktive Infek-
tion hin, wohingegen das Vorhandensein von anti-VP1-Antikörpern auf eine produktive und
latente Infektion hindeuten kann (197). 1997 hatten Rekvig et al. die Expression von TAg in
SLE-Patienten und eine starke Korrelation zwischen der Häufigkeit BKPyV-PCR-positiver
Urinproben und mittlere Titer der anti-BKPyV-TAg-Antikörper nachgewiesen. Eine häufige
oder andauernde Expression von TAg resultierte in hohen, stabilen Titern (198). In einer Stu-
die mit 33 SLE-Patienten, 32 Patienten mit rheumatoider Arthritis/Sjögren‘s Syndrom und 27
zufällig ausgewählten Patienten mit Autoimmunerkrankungen lagen die Seroreaktivitäten
gegen BKPyV-LTAg jeweils bei 55 %, 34 % und 33 %. Eine Gruppe von 20 gesunden Blut-
spendern ergab eine Seroreaktivität gegen BKPyV-LTAg von 5 % (199). Diese Ergebnisse
wurden mittels eines indirekten IgG-ELISA unter Einsatz des gesamten BKPyV-LTAg (Mal-
tose-bindendes Fusionsprotein) als antigene Komponente erhalten. Die in dieser Dissertation
erhaltenen Seroreaktivitäten gegen BKPyV-TAg(78aa) von 43 – 57 % in den drei untersuch-
ten Serengruppen lagen eventuell deshalb höher, weil sie den Nachweis von Antikörpern ge-
gen das truncTAg einschließen, bei welchem die ersten 133 aa identisch mit denen des
BKPyV-LTAg sind (95). Bei einem ELISA mit dem gesamten BKPyV-LTAg als Antigen
war dies möglicherweise nicht der Fall. Dies gilt ebenfalls für die Studie von Paulson et al.,
die für ihre Kontrollgruppe eine Seroreaktivität von 2,1 % (bzw. 2,2 % in der Gruppe der
MCC-Patienten) gegen BKPyV-LTAg und von 1,1 % (bzw. 0,7 % in der Gruppe der MCC-
Patienten) gegen BKPyV-sTAg angaben. Sie verwendeten das gesamte BKPyV-LTAg bzw. –
sTAg (Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine) als Antigene und wiesen ggf. das truncTAg
nicht nach. Eine Erklärung hierfür wäre, dass bei einer Beschichtung mit TAg(78aa) als Anti-
gen der N-terminale Bereich ca. neunmal stärker präsentiert wird, als dies bei einer Beschich-
tung mit dem gesamten LTAg (694 aa) der Fall wäre. Entsprechend ist bei einer Beschichtung
mit TAg(78aa) die Wahrscheinlichkeit, dass Antikörper an die N-terminalen 78 aa binden
deutlich höher als bei einer Beschichtung mit gesamtem LTAg, wo ein großer Bereich mit
den restlichen aa des LTAg bereits blockiert wird. Bei MCPyV hingegen wurde festgestellt,
dass die Epitope der nachgewiesenen IgG-Antikörper im gemeinsamen N-terminalen 78 aa-
umfassenden Bereich lagen (195). In der vorliegenden Studie konnten weder bei der Kon-
5 Diskussion
111
trollgruppe noch bei der Patientengruppe IgG-Antikörper gegen MCPyV nachgewiesen wer-
den. Paulson et al. verfügten für ihre Untersuchungen über eine Stichprobe von 520 nicht-
MCC Patienten und wiesen eine Seroreaktivität von 1,7 % gegen von MCPyV-LTAg und
0,9 % gegen MCPyV-sTAg nach. Dies macht das Ergebnis der vorliegenden Studie von 0 %
gegen MCPyV-TAg(78aa) mit den deutlich geringeren Fallzahlen (n= 100 bzw. n=32 bzw.
n=54) plausibel. Es kann ausgeschlossen werden, dass das Antigen MCPyV(78aa) defekt vor-
lag, da dieses erfolgreich mittels der erzeugten Mausseren im Western Blot getestet wurde
(S. 63). Eine Kreuzreaktion der im TAg(78aa)-ELISA BKPyV-, HPyV9- und HPyV12 positi-
ven Seren ist ebenfalls unwahrscheinlich, da BKPyV-, HPyV9-, HPyV12- und MCPyV-
TAg(78aa) lediglich <=46 % identisch sind. (Abbildung 31 zeigt ein diesbezügliches aa A-
lignment). Eine Kreuzreaktivität ist erst bei deutlich höheren Prozentwerten zu erwarten, da
für VP1 eine Identitätsgrenze von ungefähr 75 % postuliert wurde (44).
Abbildung 31 Alignment der N-terminalen 78 aa der frühen Genregionen von BKPyV, HPyV9, HPyV12
und MCPyV.
Identische aa, die die Mehrheit an einer Position darstellen, sind farbig unterlegt. Die DnaJ-Domäne ist mit
schwarzer Linie markiert. Die Sequenzen sind zu maximal 46 % identisch.
Zudem zeigte eine Analyse der Daten, dass diese nicht korrelieren (Korrelationskoeffizienten
~0,06 für alle drei TAg(78aa), Abbildung 18). Die DnaJ-Domäne stellt in den gewählten An-
tigenen einen hoch konservierten Bereich dar. Sie kann in dieser Studie jedoch nicht für eine
Kreuzreaktion verantwortlich sein. Da MCPyV(78aa) das DnaJ-Motiv ebenfalls beinhaltet,
müssten im Fall einer Kreuzreaktion bei einer Testung alle gegen BKPyV-, HPyV9- und
HPyV12-TAg(78aa) positiven Seren auch gegen MCPyV-(78aa) positiv reagieren. Dies war
nicht der Fall; für MCPyV-TAg(78aa) wurden keine positiven Seroreaktivitäten gemessen.
In der Patientengruppe mit malignen Erkrankungen war die Seroreaktivität von HPyV12-
TAg(78aa) signifikant höher als bei der Kontrollgruppe (39 % vs. 34 %, p=0,04, siehe S. 76).
Dies kann ein erster Hinweis darauf sein, dass Patienten mit malignen Erkrankungen häufiger
Antikörper gegen HPyV12-TAg(78aa) haben, als gesunde Individuen. Falls HPyV12-TAg
dem Immunsystem nur präsentiert wird, wenn es in Wirtszellen eintritt, in den Nukleus trans-
DnaJ Domäne
1. BKPyV
2. HPyV9
3. HPyV12
4. MCPyV
5 Diskussion
112
portiert wird und zur Freisetzung von geschädigtem Gewebe führt, ließe sich schlussfolgern,
dass dies bei Patienten mit malignen Erkrankungen häufiger der Fall ist als bei gesunden
Blutspendern. Interessanterweise deuten die in dieser Dissertation ermittelten Daten darauf
hin, dass die untersuchten PyV bei allen drei Studiengruppen aktiv replizieren, sodass ihr TAg
dem Immunsystem präsentiert wird.
Insgesamt ist die Anzahl untersuchter Seren bisher zu gering, um eindeutige Aussagen treffen
zu können. Die erhobenen Daten geben jedoch einen ersten Hinweis darauf, dass Antikörper
gegen TAg(78aa) der drei PyV in der allgemeinen Bevölkerung nachweisbar sind. Zudem
weist die Analyse der Ergebnisse der Blutspender darauf hin, dass weibliche Individuen häu-
figer serologisch auf HPyV9-TAg(78aa) reagieren als männliche (48 % vs. 28 %). Dieser Un-
terschied ist signifikant (p=0,02, siehe S. 77).
Limitationen der Studie
Die Schwäche der vorliegenden Studie liegt darin, dass in dem zur Verfügung stehenden Zeit-
raum deutlich weniger Seren als geplant akquiriert werden konnten. Hierdurch ergaben sich
kleine Stichproben, so dass die statistischen Aussagen nur erste bzw. begrenzte Hinweise auf
Zusammenhänge zwischen Erkrankungen und den beiden neuartigen humanen PyV HPyV9
und HPyV12 geben können.
5.4 Testung von Zelllinien zur Etablierung eines in vitro-
Replikationssystems für HPyV9 und HPyV12
In vitro-Zellkultursysteme liefern entscheidende Hinweise zu den Charakteristika und zum
Lebenszyklus eines Virus. Das Ziel der Etablierung eines in vitro-Replikationssystems für
HPyV9 und HPyV12 umfasste das Einbringen synthetisierter viraler DNA in diverse Zellli-
nien, die Beobachtung von durch eine Infektion verursachten physiologischen Effekten auf
die Wirtszellen, die Gewinnung von mRNA für den Nachweis viraler Transkription, die De-
tektion viraler Proteine und die Detektion von Viruspartikeln im EM.
In Pilot-Experimenten wurde das xCELLigence™-System, welches eine Real-Time-
Aufzeichnung der Zellviabilität ermöglicht, auf seine Eignung für eine Hochdurchsatz-
Testung verschiedener Zelllinien verwendet. Ergebnis dieser Experimente war, dass im
xCELLigence™-System prinzipiell eine Infektion von Zellen mit einem Polyomavirus be-
obachtbar ist, es sich jedoch nicht für ein schnelles Screening von Zelllinien zur Identifikation
eines in vitro-Replikationssystems eignet. So konnte das Absterben von mit SV40 infizierten
5 Diskussion
113
Vero- und Cos-7-Zellen aufgezeichnet werden. Nach einer Transfektion mit dem Genom von
HPyV9 oder HPyV12 konnte im xCELLigence™-System bis zu einer Kultivierungsdauer von
13 Tagen kein Effekt beobachtet werden. Dies lässt sich mit der langen Replikationszeit von
PyV sowie damit, dass unter den getesteten Zelllinien keine für diese neuartigen PyV permis-
sive Zelllinie vorhanden war, erklären. Anzuchtprotokolle von BKPyV sehen teilweise bis zu
drei Wochen Passagierung vor. Eine solche Kultivierungsdauer ließ sich im Rahmen dieser
Dissertation nicht realisieren, da das xCELLigence™-Gerät von einer benachbarten Arbeits-
gruppe prioritär genutzt wurde und daher zeitlich nur eingeschränkt verfügbar war. Zudem
wurden im xCELLigence™-System low passage 293-Zellen mit BKPyV infiziert (S. 87). Es
konnte kein Effekt beobachtet werden, obwohl diese Zelllinie als besonders geeignet zur Un-
tersuchung einer lytischen BKPyV-Infektion unter Bildung eines deutlichen CPE gilt und
dieser in den hier durchgeführten Experimenten lichtmikroskopisch zu erkennen war (200,
201). Dies verdeutlicht, dass selbst bei Verwendung der richtigen Kombination aus Wirtszelle
und PyV ein Effekt im xCELLigence™-System nicht zwingend beobachtbar sein muss.
Im 24-Kavitäten-Format konnten physiologische Effekte bereits sechs Tage und eine Zunah-
me an VP1-Kopien innerhalb der ersten Tage (T3, T6, T9) nach der Transfektion beobachtet
werden. Für HPyV9 wurden sieben Zelllinien auf ihre Eignung als in vitro-
Replikationssystem getestet. Die VP1-Kopienzahlen nahmen in Vero- und HEK293-Zellen
am deutlichsten zu. Bereits nach drei Tagen war das Maximum an VP1-Kopien in Vero- und
nach 9 Tagen in HEK293-Zellen zu verzeichnen. Von neun Zelllinien, die als Zellkultursys-
tem für HPyV12 getestet wurden, zeigten Vero- und 293-4T-Zellen die höchsten HPyV12-
VP1-Kopienzahlen, allerdings im Vergleich zu HPyV9 insgesamt deutlich geringer. Die Zell-
linien A375, A549 und SW480 wurden für HPyV12 getestet, da in diesen eine starke Promo-
toraktivität der frühen Generegion von HPyV12 berichtet worden war (202). Es war jedoch
keine auffällig starke Zunahme der Kopienzahl der HPyV12-VP1-Transkripte in diesen Zell-
linien zu verzeichnen (siehe Abbildung 25).
Der Nachweis viraler mRNAs gelang mit dem etablierten Protokoll in allen untersuchten Zell-
linien und zu allen Zeitpunkten (außer T0). In Vero-Zellen ließen sich die Ergebnisse am bes-
ten reproduzieren. Ebenso war die Zunahme an VP1 in Vero-Zellen für beide PyV am stärks-
ten. Grund hierfür kann die einfache Transfizierbarkeit dieser Zelllinie sein. Insgesamt sind
Vero-Zellen sensitiv für die Infektion mit diversen Viren, wie auch mit SV40, und werden
intensiv für virale Replikationsstudien genutzt (203). Vero-Zellen stammen aus dem Nie-
renepithel der Grünen Meerkatze und werden durch eine schwache Immunantwort charakteri-
5 Diskussion
114
siert (Verlust des Typ I-Interferon Gen-Clusters und der Gene für Zyklin-abhängige Kinas-
einhibitoren) (204). Möglicherweise war die Menge viraler Partikel zu gering oder Vero-
Zellen haben nicht den passenden Eintrittsrezeptor (Ganglioside), um eine sekundäre Infekti-
on von HPyV9 oder HPyV12 zu ermöglichen. BKPyV benötigt beispielsweise die Gangliosi-
de GD1b und GT1b als Eintrittsrezeptoren. Diese sind auf der Oberfläche von Vero-Zellen
vorhanden und erlauben eine Infektion von Vero-Zellen mit BKPyV (205). Es bleibt jedoch
zu klären, welche Eintrittsrezeptoren HPyV9 und HPyV12 benötigen und ob diese auf der
Oberfläche von Vero-Zellen vorhanden sind. Khan et al. stellen in einer aktuellen Publikation
N-Glycolyl-Neuraminsäure (Neu5Gc) als potentiellen Eintrittsrezeptor für HPyV9 vor (206).
Diese werden vom Menschen normalerweise nicht synthetisiert und können nur durch eine
spezielle Diät erlangt werden. Auf der Oberfläche von Vero-Zellen sind sie hingegen zu fin-
den (207). Für HPyV12 sind bisher keine Informationen zu den verwendeten Eintrittsrezepto-
ren bekannt.
Zusammenfassend lässt sich feststellen, dass die Transkriptionsmaschinerien der getesteten
Zelllinien (mit Ausnahme von A549, RH und 3T3) die Transkription der frühen (S. 98) und
der späten Gene (S. 92) von HPyV9 und HPyV12 prinzipiell ermöglichen. In einigen wenigen
Fällen konnte ein CPE beobachtet werden (S. 90). Ein Nachweis viraler Proteine im Western
Blot und die Detektion von Viruspartikeln aus Kulturüberständen transfizierter Zellen waren
auf Basis dieses Protokolls jedoch nicht erfolgreich (S. 95-97). Die Passagierung infizierter
Zellen bzw. die Infektion von Zellen mit Kulturüberständen transfizierter Zellen gelang nicht
(Daten nicht gezeigt). Im IFA konnte HPyV12-VP1 in wenigen Zellen mit einem monoklo-
nalen Antikörper detektiert werden (S. 95). Diese Fakten geben Hinweise auf die Entstehung
einer sehr geringen Menge viraler Partikel.
Entgegen den Erwartungen war für HPyV9 in BJAB-Zellen kein auffälliger Effekt zu ver-
zeichnen, obwohl HPyV9 und LPyV eng verwandt sind und letzteres gut in BJAB-Zellen re-
pliziert. Brade et al. konnten LPyV aus BJAB-Zellen isolieren und eine persistent mit LPyV
infizierte Zelllinie etablieren (208). In der vorliegenden Dissertation wurde in BJAB-Zellen
eine vergleichsweise starke Zunahme an HPyV9-VP1-Kopien 1 bis 6 Tage nach der Transfek-
tion des Genoms beobachtet (S. 92). Es zeigte sich jedoch kein CPE und es gelang kein
Nachweis von viralen Proteinen im Western Blot oder von Viruspartikeln im EM.
Andere Studien beschreiben den Effekt, dass die Replikation eines PyV durch gleichzeitige
Expression einer frühen PyV-Genregion unterstützt werden kann (101). Dieser Effekt ließ
sich in dieser Dissertation nicht nachweisen. Die Transfektion von HPyV9- und HPyV12-
5 Diskussion
115
Genomen in 293-4T-Zellen, die stabil MCPyV-sTAg und -LTAg exprimieren, führte nicht zu
höheren Kopienzahlen als die Transfektion von Zellen, die über keine solche Expression ver-
fügen. Es gibt zudem Hinweise darauf, dass PyV mit rearrangements in der NCCR eine ver-
stärkte Replikation aufweisen, wohingegen das archetypische Virus auf eine Persistenz im
Wirt ausgelegt ist (209). So wurden zum Beispiel rearrangierte Varianten von BKPyV aus
dem Urin an Nephropathie erkrankter Nierentransplantatempfänger isoliert und konnten in
Zellkultur erfolgreich propagiert werden. Die Kultivierung von archetypischem BKPyV hin-
gegen gelang nicht und resultierte in der Entstehung von in der NCCR rearrangierten Varian-
ten (210). Zusammenfassend deuten die geringe Genoprävalenz von HPyV9 und HPyV12 und
der Nachweis nur weniger Kopien der Viren (17, 22) sowie die in der vorliegenden Arbeit
vorgestellten Ergebnisse darauf hin, dass es sich bei diesen beiden Viren um archetypisches
HPyV9 und HPyV12 handeln könnte, deren Hauptziel die Persistenz ist und sich daher
schlecht isolieren und kaum propagieren lassen.
Limitationen des Protokolls
Nach 13 Tagen wurde in allen Zelllinien ein Rückgang der VP1-Kopienzahlen beobachtet.
Dies liegt wahrscheinlich an der Verwendung des 24-Kavitäten-Formats. Spätestens nach 13
Tagen sind die Nährstoffe im Kulturmedium verbraucht (500 µl) und Abbauprodukte haben
sich angesammelt. Wenn man eine produktive Infektion erzielen möchte, ist die Wahl eines
anderen Formats bzw. die Passagierung evtl. infizierter Zellen zu empfehlen. Ebenso scheint
für den Nachweis viraler Partikel in Zellkulturüberständen dieser Ansatz nicht geeignet zu
sein. Empfehlenswert wäre ein Aufschließen der Zellen, denn ggf. ermöglicht die gewählte
Zelllinie nur eine Auswahl an viralen Replikations- und Expressions-Mechanismen, jedoch
letztlich nicht die Bildung von Viruspartikeln, die einen lytischen Zyklus eingehen und die
Wirtszelle erfolgreich lysieren/verlassen können. Der Aufschluss der Nuklei, in denen die
Virusreplikation stattfindet, stellt einen weiteren denkbaren Ansatz dar (93).
Zellkultursysteme können helfen, den Lebenszyklus und weitere Charakteristika von Viren zu
verstehen. Hierfür wird jedoch ein System benötigt, in welchem das zu untersuchende Virus
replizieren kann und die molekularen Mechanismen im Idealfall unter den gleichen Bedin-
gungen ablaufen wie im natürlichen Wirt. Der Erfolg eines Zellkultursystems hängt jedoch
von der Identifikation einer tauglichen Zelllinie ab. Besonders einfach ist dies, wenn das Vi-
rus selbst aus der Zellkultur isoliert wurde. Schwierig ist es jedoch, wenn eine für ein spezifi-
sches PyV geeignete permissive Zelllinie erst identifiziert werden muss (was der Fragestel-
lung der vorliegenden Dissertation entspreicht). An dieser Stelle sind in vitro-Modelle limi-
5 Diskussion
116
tiert, denn ohne eine taugliche Zelllinie findet keine produktive Virusinfektion statt. In der
vorliegenden Dissertation konnten semi-permissive Zelllinien identifiziert werden, in denen
frühe und späte Genexpression von HPyV9 und HPyV12 und bei beiden PyV alternative TAg
nachgewiesen, jedoch keine Bildung infektiöser Viruspartikel beobachtet werden konnte.
Vergleicht man die im Rahmen dieser Dissertation erhaltenen Ergebnisse mit anderen Studien
zur Kultivierung von PyV, so lassen sich die erhaltenen Erkenntnisse als vielversprechend
interpretieren. Häufig gelingt die Identifikation eines geeigneten in vitro-Replikationssystems
erst Jahrzehnte nach der Entdeckung eines Virus (vergleiche hierzu auch Tabelle 2, welche
eine Übersicht über bisherige Kultivierungsstudien mit HPyV gibt). So wurde für MCPyV
beispielsweise erst im Jahr 2016 ein in vitro-Replikationssystem mit humanen dermalen Fib-
roblasten publiziert, welche eine produktive MCPyV-Infektion erlauben und als Zielzellen
des Virus in der humanen Haut vorgestellt wurden (105). Das in dieser Dissertation erarbeite-
te Protokoll zur Identifikation eines in vitro-Replikationssystems für neuartige PyV bietet
trotz einiger kontrovers zu diskutierenden Aspekte einen wertvollen Ausgangspunkt für wei-
tere Analysen (siehe auch nachfolgendes Kapitel) und konnte bereits erfolgreich auf andere
PyV und erweiterte Fragestellungen übertragen werden (siehe Masterarbeiten am RKI von
Hannah Preugschas, Partial genetic and serological characterization of novel polyomaviruses
in pig, rat and common shrew, 2014, und Daniela Fischer, Novel mammalian polyomavirus-
es: Investigation of alternative large T antigen splicing and seroprevalence, 2015).
5.5 Spleißen der frühen Genregion
Bioinformatische Vorhersagen der Spleißvorgänge und -produkte der frühen Region neu iden-
tifizierter PyV beruhen auf Kenntnissen über BKPyV, MCPyV, MPyV und SV40, bei denen
das Spleißen bereits intensiver untersucht wurde. Bei neu identifizierten PyV orientiert man
sich entsprechend an Konsensus-Spleißsequenzen in der frühen Genregion und an den bisher
bekannten Spleißprodukten (S. 68). Die theoretisch vorhergesagten Spleißvorgänge müssen
jedoch experimentell bestätigt werden. Des Weiteren erlauben Transkriptionsstudien, neben
den für LTAg und sTAg kodierenden Spleißprodukten auch solche zu detektieren, die für
alternative TAg kodieren. Die Expression solcher alternativer TAg, die wichtige Funktionen
bei der Transformation von Wirtszellen einnehmen, wurde für eine zunehmende Anzahl von
PyV bestätigt (S. 28). Alle PyV werden aufgrund der Expression von TAg als potentiell tumo-
rigen eingestuft. Dennoch erfolgt die Infektion von permissiven Wirtszellen nicht-
transformierend, resultierend in der Lyse der infizierten Zellen (211). Bei der Infektion nicht-
5 Diskussion
117
permissiver Zellen kann kein lytischer Replikationsweg stattfinden und es kommt zur onko-
genen Transformation der Wirtszelle (3).
Es wurden gespleißte mRNAs identifiziert, die für HPyV9-LTAg, -sTAg und für ein nicht
bekanntes alternatives TAg (HPyV9-145T) kodieren. Alle Produkte wurden in verschiedenen
Zelllinien, zu verschiedenen Zeitpunkten und von verschiedenen Experimentatoren reprodu-
ziert; ein Hinweis darauf, dass es sich nicht um einzelne Zufallsprodukte handelt. Das
HPyV9-145T verfügt über das CR1- und das Hsc70-Motiv. Es weist C-terminal jedoch kei-
nerlei Homologie zu den bekannten LTAg-Motiven auf, da das zweite Exon in einem anderen
Leserahmen translatiert wird (+2). Die CR1-Bindestelle ähnelt in seiner Funktion der E1A-
Region von Adenoviren, welche an den Transkriptions-Ko-Aktivator p300 bindet und Protei-
ne der Rb-Familie in vitro inhibiert (124, 125, 128). Das nachfolgende Hsc70-Motiv ermög-
licht eine Interaktion des TAgs mit Rb-E2F-Komplexen. Dies resultiert in der Spaltung der
Komplexe und somit einem unkontrollierten Eintritt der Zelle in die S-Phase des Zellzyklus
(137). Da dieser Vorgang essentiell für die Transformation von Zellen ist, kann für HPyV9-
145T ebenfalls ein transformierendes Potenzial vermutet werden.
Für HPyV12 konnten das erste LTAg-Exon vollständig und das zweite LTAg-Exon nur teil-
weise experimentell bestimmt werden. Grund hierfür ist wahrscheinlich das Vorhandensein
der alternativ gespleißten Produkte der frühen Genregion (siehe unten), deren Amplifikation
in der PCR in kurzen PCR-Produkten resultierte. Diese konkurrierten während der PCR mit
dem langen PCR-Produkt der LTAg-mRNA und verhinderten seine ausreichende Amplifika-
tion. Es bleibt weiterführenden Versuchen überlassen, die C-terminale Sequenz des LTAg
experimentell zu bestätigen. Dies ist insbesondere nötig, um zu bestimmen, ob HPyV12 ein
voll funktionsfähiges LTAg inklusive der wichtigen funktionellen Domänen (siehe S. 32)
exprimiert. Neben dem LTAg konnte ein bis dato nicht beschriebenes HPyV12-84T gefunden
werden, welches ebenfalls die N-terminalen CR1- und Hsc70-Motive enthält. Es verfügt zu-
sätzlich über eine hydrophobe Domäne am C-Terminus für eine Membranbindung, wie sie
bereits für das MTAg des murinen PyV beschrieben wurde (179). Das MTAg ist ein memb-
ran-assoziiertes Protein, welches am N-Terminus Identität mit sTAg aufweist und die zellulä-
re Proliferation stimuliert (212). HPyV12-84T könnte MTAg funktionell ähneln und trans-
formierende Eigenschaften haben, abhängig von einer Bindung an PP2A und an die Protein-
Tyrosinkinase der Src-Familie und von der Bildung eines Signalkomplexes auf der Zell-
membran (179). Zudem wurden diverse HPyV12-TAg-Varianten detektiert, die nicht über
kanonische Spleißstellen verfügen. Es kann jedoch ausgeschlossen werden, dass es sich um
5 Diskussion
118
einzelne Zufallsprodukte handelte: 10 Produkte wurden in jeweils einer Zelllinie, fünf jedoch
in zwei oder mehr Zelllinien gefunden. Bei einer Variante gelang die Detektion zu mehreren
Zeitpunkten. Von diesen 15 unkonventionellen TAg-Varianten konservieren acht das Rb-
Bindemotiv LXCXE, welches an der Dysregulation der E2F-vermittelten Transkription betei-
ligt ist und für den Eintritt der Wirtszellen in die S-Phase des Zellzyklus, den für eine Virus-
replikation favorisierten Zustand, sorgt. Es ist zu vermuten, dass diese Produkte transformie-
rende Eigenschaften aufweisen, da sie neben dem Rb-Motiv zusätzlich am N-Terminus über
das CR1- und das Hsc70-Motiv verfügen.
Die Konservierung dieser Motive in der N-terminalen Domäne innerhalb der Mitglieder der
PyV-Familie deutet auf spezifische Elemente hin, die wichtige Funktionen einnehmen. Be-
schrieben wurden bereits die TAg-Varianten MTAg und tinyT von MPyV, 17kT (SV40),
truncTAg (BKPyV), die T’135, T‘136, T‘165 (JCPyV), 57kT (MCPyV) und 229T (STLPyV). Sie
bestehen aus einer zum LTAg/sTAg identischen Region (ca. 130 aa) am N-Termius, gefolgt
von einigen wenigen aa am C-Terminus (ca. 4-6 aa). Diesen Produkten wurden ebenfalls
transformierende Eigenschaften zugeschrieben.
Das Ergebnis dieser Dissertation legt nahe, dass HPyV9-145T und HPyV12-84T Funktionen
im Zusammenhang mit der Transformation einnehmen, vergleichbar mit denen anderer ver-
kürzter TAg, da sie über die gleichen Proteindomänen verfügen. Gleiches gilt für die diversen
TAg-Varianten, welche unter Nutzung nicht-kanonischer Spleißsequenzen entstehen. Sie ver-
fügen ebenfalls über diese Proteindomänen und sind in der Lage, das Zellwachstum während
der Infektion zu deregulieren. Es bleibt jedoch ungeklärt, ob die nicht-kanonischen Spleißse-
quenzen in vivo genutzt werden.
Das unter 5.4 vorgestellte neu etablierte Protokoll bietet eine Voraussetzung, um die Funktion
der alternativen TAg weiter studieren zu können und damit Einblick in die Rolle dieser Prote-
ine bei der Pathogenese zu bekommen. Dies ist besonders interessant, da die Expression al-
ternativer TAg-Formen eine weit verbreitete Eigenschaft der PyV ist und mittlerweile für di-
verse PyV beschrieben wurde. Die Expression solcher TAg-Formen, denen zumeist eine
transformierende Funktion zugeschrieben wird, lässt bei HPyV9 und HPyV12 eine Beteili-
gung an der Pathogenese dieser Viren vermuten. In zukünftigen Studien sollte daher das
transformierende Potenzial dieser alternativen TAg (HPyV9-145T und HPyV12-84T) analy-
siert werden. In weiterführenden Versuchen sollte außerdem getestet werden, welche Rolle sie
während einer lytischen Funktion in primären Zellkulturen spielen.
5 Diskussion
119
Das Auftreten von mRNAs, welche N-terminale Domänen des LTAg beinhalten, wurde für
andere PyV als Teil der viralen Strategie zur unabhängigen Regulierung bestimmter Aktivitä-
ten durch die betroffenen Domänen beschrieben. Es handelt sich offenbar um einen Mecha-
nismus zur Regulation der Funktionen des LTAg, denn die Expression dieser Domänen kann
bestimmte LTAg-Funktionen verstärken, indem einerseits mehr Kopien der entsprechenden
Domäne vorliegen oder andererseits eine alternative Regulation der LTAg-Aktivitäten in der
Wirtszelle stattfindet (176).
Zusammenfassend hat die vorliegende Dissertation einen erstmaligen Einblick in die Ge-
nomorganisation zweier neuartiger humaner PyV und in die Transkription der frühen Region
von HPyV9 und HPyV12 erbracht. HPyV9 exprimiert nach Transfektion des Genoms in di-
verse Zelllinien drei mRNAs. Nach der Translation entstehen das LTAg, ein gespleißtes sTAg
und eine trunkierte TAg-Form, das 145T. Für HPyV12 hingegen konnte die Expression eines
Teils der mRNA für LTAg und für eine trunkierte TAg-Form (84T) sowie zahlreiche unkon-
ventionell gespleißte mRNAs nachgewiesen werden, deren hypothetische Produkte entspre-
chend ihrer Größe präliminär benannt wurden. Für alle alternativen TAg bleibt ihre Funktion
während der lytischen Infektion und der Transformation von Wirtszellen zu untersuchen. Die
Expression von TAg-Varianten ist innerhalb der Familie der PyV konserviert; ein Hinweis
darauf, dass diesen Proteinen eine wichtige Funktion in der Pathogenese zukommt.
Toptan et al. publizierten 2016 den Nachweis früher Genprodukte einer Vielzahl von PyV auf
Proteinebene (106). Hierbei ließen sich das HPyV12-145T und das HPyV12-153T zwei der
dort vorgestellten Proteine (bei 16 und 18 kDa) zuordnen. Weitere der hier vorgestellten frü-
hen Genprodukte konnten von Toptan et al. vermutlich aufgrund der geringen Auftrittshäu-
figkeit nicht gefunden werden. Hinweise hierfür liefert die Studie von Theiss et al., welche
demonstrieren, dass bei mangelnder Abundanz eines Transkriptes der Nachweis desselben
erschwert wird (213).
5 Diskussion
120
6 Fazit und Ausblick
Die vorliegende Arbeit liefert erste Erkenntnisse zu den Charakteristika der Polyomaviren
HPyV9 und HPyV12. Die Schlussfolgerungen aus den einzelnen Teilstudien ergaben neue
Fragen und kontrovers zu diskutierende Aspekte, die zukünftige, detailliertere Untersuchun-
gen erfordern. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen deuten nicht auf eine Asso-
ziation von HPyV9 und HPyV12 mit Geweben des GIT hin; ihr Tropismus bleibt somit unge-
klärt. Zudem zeigte die ermittelte HPyV9- und HPyV12-Genoprävalenz keine Assoziation
mit Erkrankungen des GIT. Die HPyV9-VP1-basierte Serologie dieser Arbeit lässt ebenfalls
keinen Zusammenhang mit dieser Patientengruppe erkennen, vermutlich liegt ein solcher eher
bei Nierentransplantatempfängern vor, wie aktuelle Studien zeigen (42). Die HPyV12-VP1-
basierte Serologie sollte unter Verwendung eines um 16 aa N-terminal verkürzten VP1-
Leserahmens untersucht werden (194). Die vorgestellte TAg(78aa)-basierte Serologie bietet
den erstmaligen Nachweis von gegen HPyV9- und HPyV12-TAg gerichteten IgG-
Antikörpern. Dies umfasst LTAg, sTAg und wie der letzte Studienteil dieser Dissertation ge-
zeigt hat, diverse TAg-Varianten. Die mittels TAg(78aa)-ELISA ermittelte Seroprävalenz war
deutlich höher als auf Basis der wenigen, bisher publizierten, aus TAg-ELISAs erhaltenen
Daten erwartet (auch in der allgemeinen Bevölkerung, S. 109). Eine detailliertere Untersu-
chung der hier erhaltenen Ergebnisse sollte Gegenstand zukünftiger Experimente sein und die
Erklärung der hier ermittelten Seroreaktivitäten unterstützen. Ein weiteres Resultat dieser
Dissertation war die Testung eines neuen Protokolls zur Identifikation von Zelllinien, die als
in vitro-Replikationssysteme für PyV geeignet sind (S. 89). Das Protokoll ließ die Transkrip-
tion viraler mRNA und die Translation des viralen VP1 erkennen und konnte bereits erfolg-
reich für Forschungsarbeiten an neuartigen tierischen PyV genutzt werden. Es lieferte wert-
volle neue Erkenntnisse zu TAg-Spleißprodukten von HPyV9 und HPyV12, indem es die
experimentelle Bestätigung vorhergesagter Spleißprodukte und die Detektion zusätzlicher
Varianten ermöglichte (S. 98). Weitere Studien sind jedoch zur Klärung der Bedeutung der
detektierten Non-Konsensus-Spleiß-Sequenzen erforderlich (S. 100). Die durch Nutzung die-
ser Spleißsequenzen entstandenen mRNAs wurden mehrheitlich in jeweils verschiedenen
Zelllinien detektiert und sind daher keine Zufallsprodukte. Insbesondere die Untersuchung
des transformierenden Potentials der von diesen mRNAs kodierten TAg-Varianten erscheint
daher geboten.
Eidesstattliche Erklärung
121
Eidesstattliche Erklärung
Hiermit versichere ich, dass ich die vorliegende Dissertation selbstständig und ohne fremde
Hilfe verfasst habe. Es wurden keine anderen als die angegebenen Quellen und Hilfsmittel
verwendet. Die den benutzten Quellen wörtlich oder inhaltlich entnommenen Stellen sind als
solche kenntlich gemacht.
Berlin, den __________________________________________________________________
Referenzen
122
Referenzen
1. Fulghieri C, Bloom S. 2014. Sarah elizabeth stewart. Emerg Infect Dis 20:893-895.
2. Gross L. 1951. Pathogenic properties, and "vertical" transmission of the mouse leukemia
agent. Proc Soc Exp Biol Med 78:342-348.
3. Eddy BE, Borman GS, Grubbs GE, Young RD. 1962. Identification of the oncogenic
substance in rhesus monkey kidney cell culture as simian virus 40. Virology 17:65-75.
4. Gardner SD, Field AM, Coleman DV, Hulme B. 1971. New human papovavirus (B.K.)
isolated from urine after renal transplantation. Lancet 1:1253-1257.
5. Padgett BL, Walker DL, ZuRhein GM, Eckroade RJ, Dessel BH. 1971. Cultivation of
papova-like virus from human brain with progressive multifocal leucoencephalopathy. Lancet
1:1257-1260.
6. Nilsson J, Miyazaki N, Xing L, Wu B, Hammar L, Li TC, Takeda N, Miyamura T,
Cheng RH. 2005. Structure and assembly of a T=1 virus-like particle in BK polyomavirus. J
Virol 79:5337-5345.
7. Neu U, Wang J, Macejak D, Garcea RL, Stehle T. 2011. Structures of the major capsid
proteins of the human Karolinska Institutet and Washington University polyomaviruses. J
Virol 85:7384-7392.
8. Meneguzzi G, Pignatti PF, Barbanti-Brodano G, Milanesi G. 1978. Minichromosome from
BK virus as a template for transcription in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 75(3):1126–1130.
9. Van Regenmortel MHaF, C. M. 2000. Virus taxonomy: classification and nomenclature of
viruses. Seventh report of the International Committee on Taxonomy of Viruses. Acad Press
103:166–87.
10. Johne R, Buck CB, Allander T, Atwood WJ, Garcea RL, Imperiale MJ, Major EO,
Ramqvist T, Norkin LC. 2011. Taxonomical developments in the family Polyomaviridae.
Arch Virol 156:1627-1634.
11. Polyomaviridae Study Group of the International Committee on Taxonomy of V,
Calvignac-Spencer S, Feltkamp MC, Daugherty MD, Moens U, Ramqvist T, Johne R,
Ehlers B. 2016. A taxonomy update for the family Polyomaviridae. Arch Virol 161:1739-
1750.
12. Allander T, Andreasson K, Gupta S, Bjerkner A, Bogdanovic G, Persson MA, Dalianis
T, Ramqvist T, Andersson B. 2007. Identification of a third human polyomavirus. J Virol
81:4130-4136.
13. Gaynor AM, Nissen MD, Whiley DM, Mackay IM, Lambert SB, Wu G, Brennan DC,
Storch GA, Sloots TP, Wang D. 2007. Identification of a novel polyomavirus from patients
with acute respiratory tract infections. PLoS Pathog 3:e64.
14. Feng H, Shuda M, Chang Y, Moore PS. 2008. Clonal integration of a polyomavirus in
human Merkel cell carcinoma. Science 319:1096-1100.
15. Schowalter RM, Pastrana DV, Pumphrey KA, Moyer AL, Buck CB. 2010. Merkel cell
polyomavirus and two previously unknown polyomaviruses are chronically shed from human
skin. Cell Host Microbe 7:509-515.
16. van der Meijden E, Janssens RW, Lauber C, Bouwes Bavinck JN, Gorbalenya AE,
Feltkamp MC. 2010. Discovery of a new human polyomavirus associated with
trichodysplasia spinulosa in an immunocompromized patient. PLoS Pathog 6:e1001024.
17. Scuda N, Hofmann J, Calvignac-Spencer S, Ruprecht K, Liman P, Kuhn J, Hengel H,
Ehlers B. 2011. A novel human polyomavirus closely related to the african green monkey-
derived lymphotropic polyomavirus. J Virol 85:4586-4590.
18. Buck CB, Phan GQ, Raiji MT, Murphy PM, McDermott DH, McBride AA. 2012.
Complete genome sequence of a tenth human polyomavirus. J Virol 86:10887.
19. Yu G, Greninger AL, Isa P, Phan TG, Martinez MA, de la Luz Sanchez M, Contreras
JF, Santos-Preciado JI, Parsonnet J, Miller S, DeRisi JL, Delwart E, Arias CF, Chiu CY.
2012. Discovery of a novel polyomavirus in acute diarrheal samples from children. PLoS One
7:e49449.
Referenzen
123
20. Siebrasse EA, Reyes A, Lim ES, Zhao G, Mkakosya RS, Manary MJ, Gordon JI, Wang
D. 2012. Identification of MW Polyomavirus, a Novel Polyomavirus in Human Stool. J Virol
86:10321-10326.
21. Lim ES, Reyes A, Antonio M, Saha D, Ikumapayi UN, Adeyemi M, Stine OC, Skelton R,
Brennan DC, Mkakosya RS, Manary MJ, Gordon JI, Wang D. 2013. Discovery of STL
polyomavirus, a polyomavirus of ancestral recombinant origin that encodes a unique T antigen
by alternative splicing. Virology 436:295-303.
22. Korup S, Rietscher J, Calvignac-Spencer S, Trusch F, Hofmann J, Moens U, Sauer I,
Voigt S, Schmuck R, Ehlers B. 2013. Identification of a novel human polyomavirus in
organs of the gastrointestinal tract. PLoS One 8:e58021.
23. Mishra N, Pereira M, Rhodes RH, An P, Pipas JM, Jain K, Kapoor A, Briese T, Faust
PL, Lipkin WI. 2014. Identification of a novel polyomavirus in a pancreatic transplant
recipient with retinal blindness and vasculitic myopathy. J Infect Dis 210:1595-1599.
24. Ehlers B, Wieland U. 2013. The novel human polyomaviruses HPyV6, 7, 9 and beyond.
APMIS 121:783-795.
25. Kean JM, Rao S, Wang M, Garcea RL. 2009. Seroepidemiology of human polyomaviruses.
PLoS Pathog 5:e1000363.
26. Knowles WA, Pipkin P, Andrews N, Vyse A, Minor P, Brown DW, Miller E. 2003.
Population-based study of antibody to the human polyomaviruses BKV and JCV and the
simian polyomavirus SV40. J Med Virol 71:115-123.
27. Knowles WA. 2006. Discovery and epidemiology of the human polyomaviruses BK virus
(BKV) and JC virus (JCV). Adv Exp Med Biol 577:19-45.
28. Randhawa P, Viscidi R, Carter JJ, Galloway DA, Culp TD, Huang C, Ramaswami B,
Christensen ND. 2009. Identification of species-specific and cross-reactive epitopes in human
polyomavirus capsids using monoclonal antibodies. J Gen Virol 90:634-639.
29. Nicol JT, Robinot R, Carpentier A, Carandina G, Mazzoni E, Tognon M, Touze A,
Coursaget P. 2013. Age-specific seroprevalences of merkel cell polyomavirus, human
polyomaviruses 6, 7, and 9, and trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus. Clin
Vaccine Immunol 20:363-368.
30. Pastrana DV, Tolstov YL, Becker JC, Moore PS, Chang Y, Buck CB. 2009. Quantitation
of human seroresponsiveness to Merkel cell polyomavirus. PLoS Pathog 5:e1000578.
31. Touze A, Gaitan J, Arnold F, Cazal R, Fleury MJ, Combelas N, Sizaret PY, Guyetant S,
Maruani A, Baay M, Tognon M, Coursaget P. 2010. Generation of Merkel cell
polyomavirus (MCV)-like particles and their application to detection of MCV antibodies. J
Clin Microbiol 48:1767-1770.
32. Sasnauskas K, Buzaite O, Vogel F, Jandrig B, Razanskas R, Staniulis J, Scherneck S,
Kruger DH, Ulrich R. 1999. Yeast cells allow high-level expression and formation of
polyomavirus-like particles. Biol Chem 380:381-386.
33. Chen T, Mattila PS, Jartti T, Ruuskanen O, Soderlund-Venermo M, Hedman K. 2011.
Seroepidemiology of the newly found trichodysplasia spinulosa-associated polyomavirus. J
Infect Dis 204:1523-1526.
34. van der Meijden E, Kazem S, Burgers MM, Janssens R, Bouwes Bavinck JN, de Melker
H, Feltkamp MC. 2011. Seroprevalence of trichodysplasia spinulosa-associated
polyomavirus. Emerg Infect Dis 17:1355-1363.
35. Trusch F, Klein M, Finsterbusch T, Kuhn J, Hofmann J, Ehlers B. 2012. Seroprevalence
of human polyomavirus 9 and cross-reactivity to African green monkey-derived lymphotropic
polyomavirus. J Gen Virol 93:698-705.
36. Nicol JT, Touze A, Robinot R, Arnold F, Mazzoni E, Tognon M, Coursaget P. 2012.
Seroprevalence and cross-reactivity of human polyomavirus 9. Emerg Infect Dis 18:1329-
1332.
37. Delbue S, Tremolada S, Branchetti E, Elia F, Gualco E, Marchioni E, Maserati R,
Ferrante P. 2008. First identification and molecular characterization of lymphotropic
polyomavirus in peripheral blood from patients with leukoencephalopathies. J Clin Microbiol
46:2461-2462.
38. Berrios C, Jung J, Primi B, Wang M, Pedamallu C, Duke F, Marcelus C, Cheng J,
Garcea RL, Meyerson M, DeCaprio JA, the TSG. 2014. Malawi polyomavirus is a
Referenzen
124
prevalent human virus that interacts with known tumor suppressors. J Virol
doi:10.1128/JVI.02328-14.
39. Nicol JT, Leblond V, Arnold F, Guerra G, Mazzoni E, Tognon M, Coursaget P, Touze A.
2014. Seroprevalence of human Malawi polyomavirus. J Clin Microbiol 52:321-323.
40. Lim ES, Meinerz NM, Primi B, Wang D, Garcea RL. 2014. Common exposure to STL
polyomavirus during childhood. Emerg Infect Dis 20:1559-1561.
41. Sauvage V, Foulongne V, Cheval J, Ar Gouilh M, Pariente K, Dereure O, Manuguerra
JC, Richardson J, Lecuit M, Burguiere A, Caro V, Eloit M. 2011. Human polyomavirus
related to African green monkey lymphotropic polyomavirus. Emerg Infect Dis 17:1364-1370.
42. van der Meijden E, Wunderink HF, van der Blij-de Brouwer CS, Zaaijer HL, Rotmans
JI, Bavinck JN, Feltkamp MC. 2014. Human polyomavirus 9 infection in kidney transplant
patients. Emerg Infect Dis 20.
43. Nicol JT, Robinot R, Carpentier A, Carandina G, Mazzoni E, Tognon M, Touze A,
Coursaget P. 2013. Age-specific seroprevalence of Merkel cell polyomavirus, Human
polyomaviruses 6, 7 and 9 and Trichodysplasia Spinulosa-associated polyomavirus. Clin
Vaccine Immunol doi:10.1128/CVI.00438-12.
44. Moens U, Van Ghelue M, Song X, Ehlers B. 2013. Serological cross-reactivity between
human polyomaviruses. Rev Med Virol 23:250-264.
45. Lednicky JA, Butel JS, Luetke MC, Loeb JC. 2014. Complete genomic sequence of a new
Human polyomavirus 9 strain with an altered noncoding control region. Virus Genes 49:490-
492.
46. Carter JJ, Daugherty MD, Qi X, Bheda-Malge A, Wipf GC, Robinson K, Roman A,
Malik HS, Galloway DA. 2013. Identification of an overprinting gene in Merkel cell
polyomavirus provides evolutionary insight into the birth of viral genes. Proc Natl Acad Sci U
S A 110:12744-12749.
47. DeCaprio JA, Garcea RL. 2013. A cornucopia of human polyomaviruses. Nat Rev
Microbiol 11:264-276.
48. Kuypers DR. 2012. Management of polyomavirus-associated nephropathy in renal transplant
recipients. Nat Rev Nephrol 8:390-402.
49. Balis V, Sourvinos G, Soulitzis N, Giannikaki E, Sofras F, Spandidos DA. 2007.
Prevalence of BK virus and human papillomavirus in human prostate cancer. Int J Biol
Markers 22:245-251.
50. Das D, Wojno K, Imperiale MJ. 2008. BK virus as a cofactor in the etiology of prostate
cancer in its early stages. J Virol 82:2705-2714.
51. Fioriti D, Russo G, Mischitelli M, Anzivino E, Bellizzi A, Di Monaco F, Di Silverio F,
Giordano A, Chiarini F, Pietropaolo V. 2007. A case of human polyomavirus Bk infection
in a patient affected by late stage prostate cancer: could viral infection be correlated with
cancer progression? Int J Immunopathol Pharmacol 20:405-411.
52. Lau SK, Lacey SF, Chen YY, Chen WG, Weiss LM. 2007. Low frequency of BK virus in
prostatic adenocarcinomas. APMIS 115:743-749.
53. Zambrano A, Kalantari M, Simoneau A, Jensen JL, Villarreal LP. 2002. Detection of
human polyomaviruses and papillomaviruses in prostatic tissue reveals the prostate as a
habitat for multiple viral infections. Prostate 53:263-276.
54. Ferenczy MW, Marshall LJ, Nelson CD, Atwood WJ, Nath A, Khalili K, Major EO.
2012. Molecular biology, epidemiology, and pathogenesis of progressive multifocal
leukoencephalopathy, the JC virus-induced demyelinating disease of the human brain. Clin
Microbiol Rev 25:471-506.
55. Lu MC, Yin WY, Liu SQ, Koo M, Tung CH, Huang KY, Lai NS. 2015. Increased
prevalence of JC polyomavirus viruria was associated with arthritis/arthralgia in patients with
systemic lupus erythematosus. Lupus 24:687-694.
56. Agelli M, Clegg LX, Becker JC, Rollison DE. 2010. The etiology and epidemiology of
merkel cell carcinoma. Curr Probl Cancer 34:14-37.
57. Albores-Saavedra J, Batich K, Chable-Montero F, Sagy N, Schwartz AM, Henson DE.
2010. Merkel cell carcinoma demographics, morphology, and survival based on 3870 cases: a
population based study. J Cutan Pathol 37:20-27.
Referenzen
125
58. Reichgelt BA, Visser O. 2011. Epidemiology and survival of Merkel cell carcinoma in the
Netherlands. A population-based study of 808 cases in 1993-2007. Eur J Cancer 47:579-585.
59. Schrama D, Ugurel S, Becker JC. 2012. Merkel cell carcinoma: recent insights and new
treatment options. Curr Opin Oncol 24:141-149.
60. Van Keymeulen A, Mascre G, Youseff KK, Harel I, Michaux C, De Geest N, Szpalski C,
Achouri Y, Bloch W, Hassan BA, Blanpain C. 2009. Epidermal progenitors give rise to
Merkel cells during embryonic development and adult homeostasis. J Cell Biol 187:91-100.
61. Heath M, Jaimes N, Lemos B, Mostaghimi A, Wang LC, Penas PF, Nghiem P. 2008.
Clinical characteristics of Merkel cell carcinoma at diagnosis in 195 patients: the AEIOU
features. J Am Acad Dermatol 58:375-381.
62. Carter JJ, Paulson KG, Wipf GC, Miranda D, Madeleine MM, Johnson LG, Lemos BD,
Lee S, Warcola AH, Iyer JG, Nghiem P, Galloway DA. 2009. Association of Merkel cell
polyomavirus-specific antibodies with Merkel cell carcinoma. J Natl Cancer Inst 101:1510-
1522.
63. Tolstov YL, Pastrana DV, Feng H, Becker JC, Jenkins FJ, Moschos S, Chang Y, Buck
CB, Moore PS. 2009. Human Merkel cell polyomavirus infection II. MCV is a common
human infection that can be detected by conformational capsid epitope immunoassays. Int J
Cancer 125:1250-1256.
64. Laude HC, Jonchere B, Maubec E, Carlotti A, Marinho E, Couturaud B, Peter M,
Sastre-Garau X, Avril MF, Dupin N, Rozenberg F. 2010. Distinct merkel cell
polyomavirus molecular features in tumour and non tumour specimens from patients with
merkel cell carcinoma. PLoS Pathog 6:e1001076.
65. Martel-Jantin C, Filippone C, Cassar O, Peter M, Tomasic G, Vielh P, Briere J, Petrella
T, Aubriot-Lorton MH, Mortier L, Jouvion G, Sastre-Garau X, Robert C, Gessain A.
2012. Genetic variability and integration of Merkel cell polyomavirus in Merkel cell
carcinoma. Virology 426:134-142.
66. Rodig SJ, Cheng J, Wardzala J, DoRosario A, Scanlon JJ, Laga AC, Martinez-
Fernandez A, Barletta JA, Bellizzi AM, Sadasivam S, Holloway DT, Cooper DJ, Kupper
TS, Wang LC, DeCaprio JA. 2012. Improved detection suggests all Merkel cell carcinomas
harbor Merkel polyomavirus. J Clin Invest 122:4645-4653.
67. Sastre-Garau X, Peter M, Avril MF, Laude H, Couturier J, Rozenberg F, Almeida A,
Boitier F, Carlotti A, Couturaud B, Dupin N. 2009. Merkel cell carcinoma of the skin:
pathological and molecular evidence for a causative role of MCV in oncogenesis. J Pathol
218:48-56.
68. Schmitt M, Wieland U, Kreuter A, Pawlita M. 2012. C-terminal deletions of Merkel cell
polyomavirus large T-antigen, a highly specific surrogate marker for virally induced
malignancy. Int J Cancer 131:2863-2868.
69. Shuda M, Feng H, Kwun HJ, Rosen ST, Gjoerup O, Moore PS, Chang Y. 2008. T antigen
mutations are a human tumor-specific signature for Merkel cell polyomavirus. Proc Natl Acad
Sci U S A 105:16272-16277.
70. Chang Y, Moore PS. 2012. Merkel cell carcinoma: a virus-induced human cancer. Annu Rev
Pathol 7:123-144.
71. Bhatia K, Goedert JJ, Modali R, Preiss L, Ayers LW. 2010. Immunological detection of
viral large T antigen identifies a subset of Merkel cell carcinoma tumors with higher viral
abundance and better clinical outcome. Int J Cancer 127:1493-1496.
72. Busam KJ, Jungbluth AA, Rekthman N, Coit D, Pulitzer M, Bini J, Arora R, Hanson
NC, Tassello JA, Frosina D, Moore P, Chang Y. 2009. Merkel cell polyomavirus
expression in merkel cell carcinomas and its absence in combined tumors and pulmonary
neuroendocrine carcinomas. Am J Surg Pathol 33:1378-1385.
73. Houben R, Shuda M, Weinkam R, Schrama D, Feng H, Chang Y, Moore PS, Becker JC.
2010. Merkel cell polyomavirus-infected Merkel cell carcinoma cells require expression of
viral T antigens. J Virol 84:7064-7072.
74. Shuda M, Arora R, Kwun HJ, Feng H, Sarid R, Fernandez-Figueras MT, Tolstov Y,
Gjoerup O, Mansukhani MM, Swerdlow SH, Chaudhary PM, Kirkwood JM, Nalesnik
MA, Kant JA, Weiss LM, Moore PS, Chang Y. 2009. Human Merkel cell polyomavirus
Referenzen
126
infection I. MCV T antigen expression in Merkel cell carcinoma, lymphoid tissues and
lymphoid tumors. Int J Cancer 125:1243-1249.
75. Kazem S, van der Meijden E, Kooijman S, Rosenberg AS, Hughey LC, Browning JC,
Sadler G, Busam K, Pope E, Benoit T, Fleckman P, de Vries E, Eekhof JA, Feltkamp
MC. 2012. Trichodysplasia spinulosa is characterized by active polyomavirus infection. J Clin
Virol 53:225-230.
76. Matthews MR, Wang RC, Reddick RL, Saldivar VA, Browning JC. 2011. Viral-
associated trichodysplasia spinulosa: a case with electron microscopic and molecular detection
of the trichodysplasia spinulosa-associated human polyomavirus. J Cutan Pathol 38:420-431.
77. Holzer AM, Hughey LC. 2009. Trichodysplasia of immunosuppression treated with oral
valganciclovir. J Am Acad Dermatol 60:169-172.
78. Cantalupo P, Doering A, Sullivan CS, Pal A, Peden KW, Lewis AM, Pipas JM. 2005.
Complete nucleotide sequence of polyomavirus SA12. J Virol 79:13094-13104.
79. Csoma E, Meszaros B, Asztalos L, Konya J, Gergely L. 2011. Prevalence of WU and KI
polyomaviruses in plasma, urine, and respiratory samples from renal transplant patients. J
Med Virol 83:1275-1278.
80. Rao S, Garcea RL, Robinson CC, Simoes EA. 2011. WU and KI polyomavirus infections in
pediatric hematology/oncology patients with acute respiratory tract illness. J Clin Virol 52:28-
32.
81. Ho J, Jedrych JJ, Feng H, Natalie AA, Grandinetti L, Mirvish E, Crespo MM, Yadav D,
Fasanella KE, Proksell S, Kuan SF, Pastrana DV, Buck CB, Shuda Y, Moore PS, Chang
Y. 2015. Human polyomavirus 7-associated pruritic rash and viremia in transplant recipients.
J Infect Dis 211:1560-1565.
82. Dugan AS, Eash S, Atwood WJ. 2006. Update on BK virus entry and intracellular
trafficking. Transpl Infect Dis 8:62-67.
83. Dugan AS, Gasparovic ML, Atwood WJ. 2008. Direct correlation between sialic acid
binding and infection of cells by two human polyomaviruses (JC virus and BK virus). J Virol
82:2560-2564.
84. Stehle T, Khan ZM. 2014. Rules and exceptions: sialic acid variants and their role in
determining viral tropism. J Virol 88:7696-7699.
85. Bennett SM, Jiang M, Imperiale MJ. 2013. Role of cell-type-specific endoplasmic
reticulum-associated degradation in polyomavirus trafficking. J Virol 87:8843-8852.
86. Jiang M, Abend JR, Tsai B, Imperiale MJ. 2009. Early events during BK virus entry and
disassembly. J Virol 83:1350-1358.
87. Geiger R, Andritschke D, Friebe S, Herzog F, Luisoni S, Heger T, Helenius A. 2011.
BAP31 and BiP are essential for dislocation of SV40 from the endoplasmic reticulum to the
cytosol. Nat Cell Biol 13:1305-1314.
88. Goodwin EC, Lipovsky A, Inoue T, Magaldi TG, Edwards AP, Van Goor KE, Paton
AW, Paton JC, Atwood WJ, Tsai B, DiMaio D. 2011. BiP and multiple DNAJ molecular
chaperones in the endoplasmic reticulum are required for efficient simian virus 40 infection.
MBio 2:e00101-00111.
89. Walczak CP, Ravindran MS, Inoue T, Tsai B. 2014. A cytosolic chaperone complexes with
dynamic membrane J-proteins and mobilizes a nonenveloped virus out of the endoplasmic
reticulum. PLoS Pathog 10:e1004007.
90. Chromy LR, Oltman A, Estes PA, Garcea RL. 2006. Chaperone-mediated in vitro
disassembly of polyoma- and papillomaviruses. J Virol 80:5086-5091.
91. Low J, Humes HD, Szczypka M, Imperiale M. 2004. BKV and SV40 infection of human
kidney tubular epithelial cells in vitro. Virology 323:182-188.
92. Imperiale MJ. 2014. Polyomavirus miRNAs: the beginning. Curr Opin Virol 7C:29-32.
93. Eash S, Manley K, Gasparovic M, Querbes W, Atwood WJ. 2006. The human
polyomaviruses. Cell Mol Life Sci 63:865-876.
94. Tognon M, Corallini A, Martini F, Negrini M, Barbanti-Brodano G. 2003. Oncogenic
transformation by BK virus and association with human tumors. Oncogene 22:5192-5200.
95. Abend JR, Joseph AE, Das D, Campbell-Cecen DB, Imperiale MJ. 2009. A truncated T
antigen expressed from an alternatively spliced BK virus early mRNA. J Gen Virol 90:1238-
1245.
Referenzen
127
96. Broekema NM, Imperiale MJ. 2012. Efficient propagation of archetype BK and JC
polyomaviruses. Virology 422:235-241.
97. Hanssen Rinaldo C, Hansen H, Traavik T. 2005. Human endothelial cells allow passage of
an archetypal BK virus (BKV) strain--a tool for cultivation and functional studies of natural
BKV strains. Arch Virol 150:1449-1458.
98. Jeffers LK, Madden V, Webster-Cyriaque J. 2009. BK virus has tropism for human
salivary gland cells in vitro: implications for transmission. Virology 394:183-193.
99. Darbinyan A, Kaminski R, White MK, Darbinian-Sarkissian N, Khalili K. 2013.
Polyomavirus JC infection inhibits differentiation of oligodendrocyte progenitor cells. J
Neurosci Res 91:116-127.
100. Shinohara T, Nagashima K, Major EO. 1997. Propagation of the human polyomavirus,
JCV, in human neuroblastoma cell lines. Virology 228:269-277.
101. Neumann F, Borchert S, Schmidt C, Reimer R, Hohenberg H, Fischer N, Grundhoff A.
2011. Replication, gene expression and particle production by a consensus Merkel Cell
Polyomavirus (MCPyV) genome. PLoS One 6:e29112.
102. Henriksen S, Tylden GD, Dumoulin A, Sharma BN, Hirsch HH, Rinaldo CH. 2014. The
human fetal glial cell line SVG p12 contains infectious BK polyomavirus (BKPyV). J Virol
doi:10.1128/JVI.00696-14.
103. Radhakrishnan S, Otte J, Enam S, Del Valle L, Khalili K, Gordon J. 2003. JC virus-
induced changes in cellular gene expression in primary human astrocytes. J Virol 77:10638-
10644.
104. Feng H, Kwun HJ, Liu X, Gjoerup O, Stolz DB, Chang Y, Moore PS. 2011. Cellular and
viral factors regulating Merkel cell polyomavirus replication. PLoS One 6:e22468.
105. Liu W, Yang R, Payne AS, Schowalter RM, Spurgeon ME, Lambert PF, Xu X, Buck CB,
You J. 2016. Identifying the Target Cells and Mechanisms of Merkel Cell Polyomavirus
Infection. Cell Host Microbe 19:775-787.
106. Toptan T, Yousem SA, Ho J, Matsushima Y, Stabile LP, Fernandez-Figueras MT,
Bhargava R, Ryo A, Moore PS, Chang Y. 2016. Survey for human polyomaviruses in
cancer. JCI Insight 1.
107. Jay G, Nomura S, Anderson CW, Khoury G. 1981. Identification of the SV40 agnogene
product: a DNA binding protein. Nature 291:346-349.
108. Gerits N, Moens U. 2012. Agnoprotein of mammalian polyomaviruses. Virology 432:316-
326.
109. Alwine JC, Dhar R, Khoury G. 1980. A small RNA induced late in simian virus 40 infection
can associate with early viral mRNAs. Proc Natl Acad Sci U S A 77:1379-1383.
110. Sullivan CS, Grundhoff AT, Tevethia S, Pipas JM, Ganem D. 2005. SV40-encoded
microRNAs regulate viral gene expression and reduce susceptibility to cytotoxic T cells.
Nature 435:682-686.
111. Chen CJ, Kincaid RP, Seo GJ, Bennett MD, Sullivan CS. 2011. Insights into
Polyomaviridae microRNA function derived from study of the bandicoot papillomatosis
carcinomatosis viruses. J Virol 85:4487-4500.
112. Sullivan CS, Sung CK, Pack CD, Grundhoff A, Lukacher AE, Benjamin TL, Ganem D.
2009. Murine Polyomavirus encodes a microRNA that cleaves early RNA transcripts but is
not essential for experimental infection. Virology 387:157-167.
113. Seo GJ, Fink LH, O'Hara B, Atwood WJ, Sullivan CS. 2008. Evolutionarily conserved
function of a viral microRNA. J Virol 82:9823-9828.
114. Lee S, Paulson KG, Murchison EP, Afanasiev OK, Alkan C, Leonard JH, Byrd DR,
Hannon GJ, Nghiem P. 2011. Identification and validation of a novel mature microRNA
encoded by the Merkel cell polyomavirus in human Merkel cell carcinomas. J Clin Virol
52:272-275.
115. Seo GJ, Chen CJ, Sullivan CS. 2009. Merkel cell polyomavirus encodes a microRNA with
the ability to autoregulate viral gene expression. Virology 383:183-187.
116. Daniels R, Sadowicz D, Hebert DN. 2007. A very late viral protein triggers the lytic release
of SV40. PLoS Pathog 3:e98.
Referenzen
128
117. van der Meijden E, Kazem S, Dargel CA, van Vuren N, Hensbergen PJ, Feltkamp MC.
2015. Characterization of T Antigens, Including Middle T and Alternative T, Expressed by the
Human Polyomavirus Associated with Trichodysplasia Spinulosa. J Virol 89:9427-9439.
118. Gjoerup O, Chang Y. 2010. Update on human polyomaviruses and cancer. Adv Cancer Res
106:1-51.
119. Imperiale MJ, Major EO. 2007. Polyomaviruses. Fields Virology 5th edn:2263–2298.
120. Moens U, Van Ghelue M, Johannessen M. 2007. Oncogenic potentials of the human
polyomavirus regulatory proteins. Cell Mol Life Sci 64:1656-1678.
121. Sullivan CS, Pipas JM. 2002. T antigens of simian virus 40: molecular chaperones for viral
replication and tumorigenesis. Microbiol Mol Biol Rev 66:179-202.
122. Ahsan N, Shah K. 2002. Polyomaviruses: An Overview. Graft 5:S9-S18.
123. Campbell KS, Mullane KP, Aksoy IA, Stubdal H, Zalvide J, Pipas JM, Silver PA,
Roberts TM, Schaffhausen BS, DeCaprio JA. 1997. DnaJ/hsp40 chaperone domain of
SV40 large T antigen promotes efficient viral DNA replication. Genes Dev 11:1098-1110.
124. Fattaey AR, Harlow E, Helin K. 1993. Independent regions of adenovirus E1A are required
for binding to and dissociation of E2F-protein complexes. Mol Cell Biol 13:7267-7277.
125. Ikeda MA, Nevins JR. 1993. Identification of distinct roles for separate E1A domains in
disruption of E2F complexes. Mol Cell Biol 13:7029-7035.
126. Sawai ET, Butel JS. 1989. Association of a cellular heat shock protein with simian virus 40
large T antigen in transformed cells. J Virol 63:3961-3973.
127. Sullivan CS, Gilbert SP, Pipas JM. 2001. ATP-dependent simian virus 40 T-antigen-Hsc70
complex formation. J Virol 75:1601-1610.
128. Wang HG, Rikitake Y, Carter MC, Yaciuk P, Abraham SE, Zerler B, Moran E. 1993.
Identification of specific adenovirus E1A N-terminal residues critical to the binding of cellular
proteins and to the control of cell growth. J Virol 67:476-488.
129. Yaciuk P, Carter MC, Pipas JM, Moran E. 1991. Simian virus 40 large-T antigen expresses
a biological activity complementary to the p300-associated transforming function of the
adenovirus E1A gene products. Mol Cell Biol 11:2116-2124.
130. Arora R, Chang Y, Moore PS. 2012. MCV and Merkel cell carcinoma: a molecular success
story. Curr Opin Virol 2:489-498.
131. Silver PA, Way JC. 1993. Eukaryotic DnaJ homologs and the specificity of Hsp70 activity.
Cell 74:5-6.
132. Cotsiki M, Lock RL, Cheng Y, Williams GL, Zhao J, Perera D, Freire R, Entwistle A,
Golemis EA, Roberts TM, Jat PS, Gjoerup OV. 2004. Simian virus 40 large T antigen
targets the spindle assembly checkpoint protein Bub1. Proc Natl Acad Sci U S A 101:947-
952.
133. Gjoerup OV, Wu J, Chandler-Militello D, Williams GL, Zhao J, Schaffhausen B, Jat PS,
Roberts TM. 2007. Surveillance mechanism linking Bub1 loss to the p53 pathway. Proc Natl
Acad Sci U S A 104:8334-8339.
134. Fei ZL, D'Ambrosio C, Li S, Surmacz E, Baserga R. 1995. Association of insulin receptor
substrate 1 with simian virus 40 large T antigen. Mol Cell Biol 15:4232-4239.
135. Hartmann T, Xu X, Kronast M, Muehlich S, Meyer K, Zimmermann W, Hurwitz J, Pan
ZQ, Engelhardt S, Sarikas A. 2014. Inhibition of Cullin-RING E3 ubiquitin ligase 7 by
simian virus 40 large T antigen. Proc Natl Acad Sci U S A 111:3371-3376.
136. White MF. 2002. IRS proteins and the common path to diabetes. Am J Physiol Endocrinol
Metab 283:E413-422.
137. Butel JS. 2000. Viral carcinogenesis: revelation of molecular mechanisms and etiology of
human disease. Carcinogenesis 21:405-426.
138. Chen S, Paucha E. 1990. Identification of a region of simian virus 40 large T antigen
required for cell transformation. J Virol 64:3350-3357.
139. Goodrich DW, Wang NP, Qian YW, Lee EY, Lee WH. 1991. The retinoblastoma gene
product regulates progression through the G1 phase of the cell cycle. Cell 67:293-302.
140. Sullivan CS, Cantalupo P, Pipas JM. 2000. The molecular chaperone activity of simian
virus 40 large T antigen is required to disrupt Rb-E2F family complexes by an ATP-dependent
mechanism. Mol Cell Biol 20:6233-6243.
Referenzen
129
141. Gupta T, Saenz Robles MT, Pipas JM. 2015. Cellular transformation of mouse embryo
fibroblasts in the absence of activator E2Fs. J Virol 89:5124-5133.
142. Fontes MR, Teh T, Kobe B. 2000. Structural basis of recognition of monopartite and
bipartite nuclear localization sequences by mammalian importin-alpha. J Mol Biol 297:1183-
1194.
143. Kalderon D, Roberts BL, Richardson WD, Smith AE. 1984. A short amino acid sequence
able to specify nuclear location. Cell 39:499-509.
144. Kalderon D, Smith AE. 1984. In vitro mutagenesis of a putative DNA binding domain of
SV40 large-T. Virology 139:109-137.
145. Percipalle P, Clarkson WD, Kent HM, Rhodes D, Stewart M. 1997. Molecular interactions
between the importin alpha/beta heterodimer and proteins involved in vertebrate nuclear
protein import. J Mol Biol 266:722-732.
146. Bond GL, Hu W, Levine AJ. 2005. MDM2 is a central node in the p53 pathway: 12 years
and counting. Curr Cancer Drug Targets 5:3-8.
147. Lilyestrom W, Klein MG, Zhang R, Joachimiak A, Chen XS. 2006. Crystal structure of
SV40 large T-antigen bound to p53: interplay between a viral oncoprotein and a cellular tumor
suppressor. Genes Dev 20:2373-2382.
148. Poulin DL, Kung AL, DeCaprio JA. 2004. p53 targets simian virus 40 large T antigen for
acetylation by CBP. J Virol 78:8245-8253.
149. Borowiec JA, Hurwitz J. 1988. Localized melting and structural changes in the SV40 origin
of replication induced by T-antigen. EMBO J 7:3149-3158.
150. Bullock PA. 1997. The initiation of simian virus 40 DNA replication in vitro. Crit Rev
Biochem Mol Biol 32:503-568.
151. Dean FB, Bullock P, Murakami Y, Wobbe CR, Weissbach L, Hurwitz J. 1987. Simian
virus 40 (SV40) DNA replication: SV40 large T antigen unwinds DNA containing the SV40
origin of replication. Proc Natl Acad Sci U S A 84:16-20.
152. Li D, Zhao R, Lilyestrom W, Gai D, Zhang R, DeCaprio JA, Fanning E, Jochimiak A,
Szakonyi G, Chen XS. 2003. Structure of the replicative helicase of the oncoprotein SV40
large tumour antigen. Nature 423:512-518.
153. Li TC, Takeda N, Kato K, Nilsson J, Xing L, Haag L, Cheng RH, Miyamura T. 2003.
Characterization of self-assembled virus-like particles of human polyomavirus BK generated
by recombinant baculoviruses. Virology 311:115-124.
154. Mastrangelo IA, Hough PV, Wall JS, Dodson M, Dean FB, Hurwitz J. 1989. ATP-
dependent assembly of double hexamers of SV40 T antigen at the viral origin of DNA
replication. Nature 338:658-662.
155. Welcker M, Clurman BE. 2005. The SV40 large T antigen contains a decoy phosphodegron
that mediates its interactions with Fbw7/hCdc4. J Biol Chem 280:7654-7658.
156. Holdeman R, Nehrt S, Strome S. 1998. MES-2, a maternal protein essential for viability of
the germline in Caenorhabditis elegans, is homologous to a Drosophila Polycomb group
protein. Development 125:2457-2467.
157. Koepp DM, Schaefer LK, Ye X, Keyomarsi K, Chu C, Harper JW, Elledge SJ. 2001.
Phosphorylation-dependent ubiquitination of cyclin E by the SCFFbw7 ubiquitin ligase.
Science 294:173-177.
158. Li J, Pauley AM, Myers RL, Shuang R, Brashler JR, Yan R, Buhl AE, Ruble C, Gurney
ME. 2002. SEL-10 interacts with presenilin 1, facilitates its ubiquitination, and alters A-beta
peptide production. J Neurochem 82:1540-1548.
159. Moberg KH, Mukherjee A, Veraksa A, Artavanis-Tsakonas S, Hariharan IK. 2004. The
Drosophila F box protein archipelago regulates dMyc protein levels in vivo. Curr Biol 14:965-
974.
160. Nateri AS, Riera-Sans L, Da Costa C, Behrens A. 2004. The ubiquitin ligase SCFFbw7
antagonizes apoptotic JNK signaling. Science 303:1374-1378.
161. Strohmaier H, Spruck CH, Kaiser P, Won KA, Sangfelt O, Reed SI. 2001. Human F-box
protein hCdc4 targets cyclin E for proteolysis and is mutated in a breast cancer cell line.
Nature 413:316-322.
Referenzen
130
162. Tetzlaff MT, Yu W, Li M, Zhang P, Finegold M, Mahon K, Harper JW, Schwartz RJ,
Elledge SJ. 2004. Defective cardiovascular development and elevated cyclin E and Notch
proteins in mice lacking the Fbw7 F-box protein. Proc Natl Acad Sci U S A 101:3338-3345.
163. Welcker M, Orian A, Jin J, Grim JE, Harper JW, Eisenman RN, Clurman BE. 2004.
The Fbw7 tumor suppressor regulates glycogen synthase kinase 3 phosphorylation-dependent
c-Myc protein degradation. Proc Natl Acad Sci U S A 101:9085-9090.
164. Yada M, Hatakeyama S, Kamura T, Nishiyama M, Tsunematsu R, Imaki H, Ishida N,
Okumura F, Nakayama K, Nakayama KI. 2004. Phosphorylation-dependent degradation of
c-Myc is mediated by the F-box protein Fbw7. EMBO J 23:2116-2125.
165. Andrabi S, Hwang JH, Choe JK, Roberts TM, Schaffhausen BS. 2011. Comparisons
between murine polyomavirus and Simian virus 40 show significant differences in small T
antigen function. J Virol 85:10649-10658.
166. Arroyo JD, Hahn WC. 2005. Involvement of PP2A in viral and cellular transformation.
Oncogene 24:7746-7755.
167. Mungre S, Enderle K, Turk B, Porras A, Wu YQ, Mumby MC, Rundell K. 1994.
Mutations which affect the inhibition of protein phosphatase 2A by simian virus 40 small-t
antigen in vitro decrease viral transformation. J Virol 68:1675-1681.
168. Kamibayashi C, Estes R, Lickteig RL, Yang SI, Craft C, Mumby MC. 1994. Comparison
of heterotrimeric protein phosphatase 2A containing different B subunits. J Biol Chem
269:20139-20148.
169. Cicala C, Avantaggiati ML, Graessmann A, Rundell K, Levine AS, Carbone M. 1994.
Simian virus 40 small-t antigen stimulates viral DNA replication in permissive monkey cells. J
Virol 68:3138-3144.
170. Howe AK, Gaillard S, Bennett JS, Rundell K. 1998. Cell cycle progression in monkey cells
expressing simian virus 40 small t antigen from adenovirus vectors. J Virol 72:9637-9644.
171. Bollag B, Prins C, Snyder EL, Frisque RJ. 2000. Purified JC virus T and T' proteins
differentially interact with the retinoblastoma family of tumor suppressor proteins. Virology
274:165-178.
172. Boyapati A, Wilson M, Yu J, Rundell K. 2003. SV40 17KT antigen complements dnaj
mutations in large T antigen to restore transformation of primary human fibroblasts. Virology
315:148-158.
173. Prins C, Frisque RJ. 2001. JC virus T' proteins encoded by alternatively spliced early
mRNAs enhance T antigen-mediated viral DNA replication in human cells. J Neurovirol
7:250-264.
174. Trowbridge PW, Frisque RJ. 1995. Identification of three new JC virus proteins generated
by alternative splicing of the early viral mRNA. J Neurovirol 1:195-206.
175. Bollag B, Kilpatrick LH, Tyagarajan SK, Tevethia MJ, Frisque RJ. 2006. JC virus T'135,
T'136 and T'165 proteins interact with cellular p107 and p130 in vivo and influence viral
transformation potential. J Neurovirol 12:428-442.
176. Riley MI, Yoo W, Mda NY, Folk WR. 1997. Tiny T antigen: an autonomous polyomavirus
T antigen amino-terminal domain. J Virol 71:6068-6074.
177. Boyapati A, Wilson M, Yu J, Rundell K. 2003. SV40 17KT antigen complements dnaj
mutations in large T antigen to restore transformation of primary human fibroblasts. Virology
315:148-158.
178. Zerrahn J, Knippschild U, Winkler T, Deppert W. 1993. Independent expression of the
transforming amino-terminal domain of SV40 large I antigen from an alternatively spliced
third SV40 early mRNA. EMBO J 12:4739-4746.
179. Cheng J, DeCaprio JA, Fluck MM, Schaffhausen BS. 2009. Cellular transformation by
Simian Virus 40 and Murine Polyoma Virus T antigens. Semin Cancer Biol 19:218-228.
180. Dilworth SM. 2002. Polyoma virus middle T antigen and its role in identifying cancer-related
molecules. Nat Rev Cancer 2:951-956.
181. Fluck MM, Schaffhausen BS. 2009. Lessons in signaling and tumorigenesis from
polyomavirus middle T antigen. Microbiol Mol Biol Rev 73:542-563, Table of Contents.
182. Gupta T, Robles MT, Schowalter RM, Buck CB, Pipas JM. 2016. Expression of the small
T antigen of Lymphotropic Papovavirus is sufficient to transform primary mouse embryo
fibroblasts. Virology 487:112-120.
Referenzen
131
183. van Kuppeveld FJ, Johansson KE, Galama JM, Kissing J, Bolske G, van der Logt JT,
Melchers WJ. 1994. Detection of mycoplasma contamination in cell cultures by a
mycoplasma group-specific PCR. Appl Environ Microbiol 60:149-152.
184. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR. 1977. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.
Proc Natl Acad Sci U S A 74:5463-5467.
185. Baneyx F, Mujacic M. 2004. Recombinant protein folding and misfolding in Escherichia
coli. Nat Biotechnol 22:1399-1408.
186. Ventura S, Villaverde A. 2006. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends
Biotechnol 24:179-185.
187. Wilkinson DL, Harrison RG. 1991. Predicting the solubility of recombinant proteins in
Escherichia coli. Biotechnology (N Y) 9:443-448.
188. Desmet F-O, Hamroun D, Lalande M, Collod-Béroud G, Claustres M, Béroud C. 2009.
Human Splicing Finder: an online bioinformatics tool to predict splicing signals. Nucleic acids
research 37:e67-e67.
189. Patel AA, Steitz JA. 2003. Splicing double: insights from the second spliceosome. Nat Rev
Mol Cell Biol 4:960-970.
190. Burset M, Seledtsov IA, Solovyev VV. 2001. SpliceDB: database of canonical and non-
canonical mammalian splice sites. Nucleic Acids Res 29:255-259.
191. Chen H, Chen XZ, Waterboer T, Castro FA, Brenner H. 2015. Viral infections and
colorectal cancer: a systematic review of epidemiological studies. Int J Cancer 137:12-24.
192. Bihl F, Castelli D, Marincola F, Dodd RY, Brander C. 2007. Transfusion-transmitted
infections. J Transl Med 5:25.
193. Zia M, Taha HM, Ricci C. 2014. Transfusion-Transmitted Diseases. Medscape.
194. Norkiene M, Stonyte J, Ziogiene D, Mazeike E, Sasnauskas K, Gedvilaite A. 2015.
Production of recombinant VP1-derived virus-like particles from novel human
polyomaviruses in yeast. BMC Biotechnol 15:68.
195. Paulson KG, Carter JJ, Johnson LG, Cahill KW, Iyer JG, Schrama D, Becker JC,
Madeleine MM, Nghiem P, Galloway DA. 2010. Antibodies to merkel cell polyomavirus T
antigen oncoproteins reflect tumor burden in merkel cell carcinoma patients. Cancer Res
70:8388-8397.
196. Andreassen K, Moens U, Nossent H, Marion TN, Rekvig OP. 1999. Termination of human
T cell tolerance to histones by presentation of histones and polyomavirus T antigen provided
that T antigen is complexed with nucleosomes. Arthritis Rheum 42:2449-2460.
197. Rekvig OP, Bendiksen S, Moens U. 2006. Immunity and autoimmunity induced by
polyomaviruses: clinical, experimental and theoretical aspects. Adv Exp Med Biol 577:117-
147.
198. Rekvig OP, Moens U, Sundsfjord A, Bredholt G, Osei A, Haaheim H, Traavik T,
Arnesen E, Haga HJ. 1997. Experimental expression in mice and spontaneous expression in
human SLE of polyomavirus T-antigen. A molecular basis for induction of antibodies to DNA
and eukaryotic transcription factors. J Clin Invest 99:2045-2054.
199. Bredholt G, Olaussen E, Moens U, Rekvig OP. 1999. Linked production of antibodies to
mammalian DNA and to human polyomavirus large T antigen: footprints of a common
molecular and cellular process? Arthritis Rheum 42:2583-2592.
200. Greenlee JE, Narayan O, Johnson RT. 1978. Effects of BK virus infection on primary
cultures of rodent and primate cells. Proc Soc Exp Biol Med 158:437-441.
201. Knowles WA. 2001. Propagation and assay of BK virus. Methods Mol Biol 165:19-31.
202. Moens U, Van Ghelue M, Ludvigsen M, Korup-Schulz S, Ehlers B. 2015. Early and late
promoters of BK polyomavirus, Merkel cell polyomavirus, Trichodysplasia spinulosa-
associated polyomavirus and human polyomavirus 12 are among the strongest of all known
human polyomaviruses in 10 different cell lines. J Gen Virol 96:2293-2303.
203. Sheets R. 2000. History and Characterization of the vero cell line. Report for the Vaccines
and Related Biological Products Advisory Group.
204. Osada N, Kohara A, Yamaji T, Hirayama N, Kasai F, Sekizuka T, Kuroda M, Hanada
K. 2014. The genome landscape of the african green monkey kidney-derived vero cell line.
DNA Res 21:673-683.
Referenzen
132
205. Low JA, Magnuson B, Tsai B, Imperiale MJ. 2006. Identification of gangliosides GD1b
and GT1b as receptors for BK virus. J Virol 80:1361-1366.
206. Khan ZM, Liu Y, Neu U, Gilbert M, Ehlers B, Feizi T, Stehle T. 2014. Crystallographic
and glycan microarray analysis of human polyomavirus 9 VP1 identifies N-glycolyl
neuraminic acid as a receptor candidate. J Virol 88:6100-6111.
207. Ibarra CP, M. 2010. Host Responses to Pathogenic Escherichia coli, p 122-141. In Torres
AG (ed), Pathogenic Escherichia coli in Latin America 2010. Bentham Science Publishers.
208. Brade L, Vogl W, Gissman L, zur Hausen H. 1981. Propagation of B-lymphotropic
papovavirus (LPV) in human B-lymphoma cells and characterization of its DNA. Virology
114:228-235.
209. Imperiale MJ, Jiang M. 2015. What DNA viral genomic rearrangements tell us about
persistence. J Virol 89:1948-1950.
210. Rubinstein R, Schoonakker BC, Harley EH. 1991. Recurring theme of changes in the
transcriptional control region of BK virus during adaptation to cell culture. J Virol 65:1600-
1604.
211. zur Hausen H. 2008. Novel human polyomaviruses--re-emergence of a well known virus
family as possible human carcinogens. Int J Cancer 123:247-250.
212. Ichaso N, Dilworth SM. 2001. Cell transformation by the middle T-antigen of polyoma virus.
Oncogene 20:7908-7916.
213. Theiss JM, Gunther T, Alawi M, Neumann F, Tessmer U, Fischer N, Grundhoff A. 2015.
A Comprehensive Analysis of Replicating Merkel Cell Polyomavirus Genomes Delineates the
Viral Transcription Program and Suggests a Role for mcv-miR-M1 in Episomal Persistence.
PLoS Pathog 11:e1004974.
Danksagung
133
Danksagung
Mein herzlichster Dank gilt Dr. Bernhard Ehlers dafür, dass er mir ermöglicht hat, diese Ar-
beit in seiner Arbeitsgruppe und unter seiner Betreuung anzufertigen. Meinem Doktorvater
Prof. Jens Kurreck danke ich zutiefst für seine Geduld und die Unterstützung sowie Prof. An-
nette Mankertz und Prof. Juri Rappsilber für ihre Gutachtertätigkeit.
Mein weiterer Dank gilt einer Vielzahl von Menschen, ohne die die Fertigstellung dieser Ar-
beit unmöglich gewesen wäre. Die folgende Liste erhebt jedoch keinen Anspruch an Voll-
ständigkeit.
Danke an
für
Claudia Lucke
schönste gemeinsame Laborzeit
Dr. Aleksandar Radonic
NGS-Analysen
Dr. Jörg Hofmann
Seren
Dr. Matthias Budt
Geduld am Lichtmikroskop
Dr. Rosa Schmuck
Gewebeproben, Seren, wissenschaftliche Anregungen
Dr. Sebastian Voigt
wissenschaftlichen Austausch, Probenmaterial
Dr. Ugo Moens
Zelllinien, wissenschaftlichen Austausch
Dr. Wojciech Dabrowski
NGS-Analysen, Korrekturlesen
Julia Manzetti
BKPyV
Kollegen bei FG12 und ZBS1
wissenschaftlichen Austausch und Unterstützung
Lars Möller
Geduld am Elektronenmikroskop
PD Andreas Nitsche
Benutzung des xCELLigence™
Prof. Bertfried Matz
SV40
Prof. Christine Hanssen Rinaldo
SV40
Prof. Ulrike Wieland
BKPyV
Sequenzierlabor
die Sequenzierung zahlloser Proben
