Clonage et expression eucaryonique des constructions de type sauvage et chimérique des facteurs de croissance des fibroblastes 1 et 7

Alexander Marmé

Le docteur Med. Clonage et expression eucaryonique de la nature et des constructions chimères des facteurs de croissance des fibroblastes 1 et 7 né le 16 juillet 1968 à Freiburg Examen de maturité le 10 mai 1988 à Freiburg Norbert Fusenig L'objectif de ce travail était de cloner les constructions de type sauvage FGF1 et FGF7 ainsi que les constructions dans lesquelles la région du pont est échangée entre les isotopes FGF1 et FGF7. Cette région du pont est une région C-terminale qui présente de grandes différences de séquence chez toutes les isoformes. Elle contient les acides aminés 115121 chez FGF1 et les acides aminés 154-163 chez FGF7. Ces structures doivent ensuite être exprimées dans les cellules mammaires.

Une première étape a été la clonation des constructions de type sauvage de FGF1 (W1 et

dW1) et FGF7 (W7 et dW7), ainsi que les chimères Ch 1/7 et Ch7/1 dans le vecteur 3 de la pCDNA. La chimère Ch 1/7 commence par la séquence FGF1 à laquelle rejoint la région du pont et le terminal C de FGF7. La chimère Ch 7/1 commence par la séquence FGF7 qui rejoint ensuite la région du pont et les terminaux C de la FGF1. Toutes les constructions ont été vérifiées à l'aide d'analyses de restriction et de séquencement et l'exactitude de la séquence a été établie.

Parce que les constructions du N-terminal commençant par la séquence FGF1 n'ont pas de séquence de signal

Pour permettre l'exportation de ces protéines de la cellule, les structures W1, dW1 et Ch 1/7 ont été clonées respectivement à la séquence de signal Ig-Heavy Chain ou à la séquence de signal hst/KS3. Toutes ces constructions ont pu être synthétisées dans un procédé de traduction in vitro. Les structures W1, dW1, W7 et Ch 1/7 ont pu être exprimées dans des cellules COS, où W7 a pu être purifiée du milieu nutritionnel et détectée par des anticorps spécifiques dans le procédé Western Blot. Les protéines recombinant W1, dW1 et Ch 1/7 n'ont pu être détectées que dans les préparations extraites de la cellule. La détection d'une protéine purifiée provenant du moteur de narcissisme n'a été possible ni chez les constructions à séquence de signal Ig-Heavy Chain ni chez les constructions à séquence de signal hst/KS3.

En effet, les protéines recombinantes non détectées après la transfection des cellules COS

dW7 et Ch 7/1 ont pu être synthétisés à la fois lors de la séquentiation et dans les procédés de traduction in vitro, il est probable que le manque de preuve ne résulte pas d'une absence d'expression dans les cellules transférées, mais d'une non-identification par les anticorps utilisés.

Les protéines recombinant W1, dW1 et Ch 1/7 n'ont pas été exportées de la cellule, même après la clonation de deux séquences de signaux N différentes. Ces constructions ont été optimisées de manière à être considérées comme les meilleures conditions pour l'exportation de la protéine et la sécrétion du peptide de signal. Il est donc peu probable qu'une nouvelle tentative de transfection transitoire de cellules COS avec une structure contenant une séquence de signal différente soit couronnée de succès. Il convient donc de poursuivre une transfection stable des cellules NIH3T3 à l'aide de ces structures. Si cette approche réussit, les constructions clonées dans le cadre de ce travail peuvent certainement apporter une contribution importante à la compréhension de l'action et des mécanismes de régulation de la famille des facteurs de croissance des fibroblastes.