Martin Granzow
Dr. med.
Größe, Gestalt und Grenzen dreidimensional rekonstruierter Territorien
von Interphasechromosomen in menschlichen Fruchtwasserzellkernen
Geb.: 17.03.1970 in Heidelberg
Reifeprüfung: 11.5.1989
Studiengang der Fachrichtung Medizin ab SoSe 1991.
Physikum: 22.3.1993 an der Universität zu Mainz.
Klinisches Studium in Mannheim und Heidelberg.
Praktisches Jahr in Mannheim.
3. Staatsexamen: 2.6.99 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Humangenetik
Doktorvater: Prof. Dr. med. Thomas Cremer
Die experimentellen Untersuchungen dieser Arbeit wurden mit Fluoreszenz in situ
Hybridisierung (FISH), konfokaler Laserscanning-Mikroskopie und computergestützter
Bildverarbeitung an menschlichen Fruchtwasserzellen durchgeführt. Die Territorien von
Interphasechromosomen wurden selektiv und unterscheidbar sichtbar gemacht, um zum einen
die Messung morphologischer Parameter zu ermöglichen und zum anderen das mögliche
Überlappen von direkt benachbarten Chromosomenterritorien zu untersuchen.
Die morphologischen Parameter, die berechnet wurden, stellen das Volumen, die
Oberflächengröße und einen Rundheitsfaktor, der Volumen in Relation zur Oberfläche setzt,
von den einzelnen Territorien dar. Das Volumen und die Oberflächengröße wurden mit dem
DNA-Gehalt der jeweiligen Chromosomen in Bezug gesetzt.
Die Untersuchung bezüglich des Überlappens von Chromatin benachbarter
Chromosomenterritorien wurde mit zwei in unterschiedlicher Farbe gefärbten Chromosomen
durchgeführt, um eine eindeutige Unterscheidung zwischen beiden treffen zu können.
Berechnung morphologischer Daten von Interphasechromosomen
Insgesamt wurden neun verschiedene Experimente durchgeführt, die jeweils zwei
Chromosomen direkt miteinander vergleichen konnten. Die Vergleiche erfolgten zwischen
den Chromosomen 4 und 8, 4 und 10, 4 und 16, 4 und 19, sowie zwischen Chromosom 8 und
2 (in zwei Experimenten), 8 und 13, 2 und 11 und 18 und 19. Alle Experimente zusammen
genommen ergibt das die Untersuchung von 456 Zellkernen mit 1824
Chromosomenterritorien.
Signalintensitäten der Interphasehybridisierungen
In drei dieser Experimente konnte nachträglich festgestellt werden, daß die Intensitäten der
Fluoreszenzsignale, die von den Chromosomenterritorien aufgenommen wurden, zwischen
den beiden Chromosomenpaaren nicht gleich stark waren, sondern ein Paar stärkere Signale
aufwies als das zusammen mit diesem im selben Experiment hybridisierte. Da im Rahmen der
computergestützten Bildverarbeitung und Berechnung der Parameter dieselben
Schwellenwerte für alle vier Chromosomenterritorien aus Gründen der Vergleichbarkeit
gewählt wurden, mußten die schwächer gefärbten Territorien kleiner ausfallen, als dies bei
gleichstarker Fluoreszenzintensität der beiden Chromosomenpaare der Fall gewesen wäre.
Die betreffenden Experimente 4/8, 4/10 und 2/8 wurden aus der weiteren Auswertung
ausgeschlossen. Die beschriebene Fehlerquelle bei Untersuchungen mit diesen Methoden
verlangt nach einer Standardisierung mit internen Kontrollen, um dreidimensionale
Rekonstruktionen von Chromosomenterritorien vergleichen zu können. Die verbleibenden
sechs Experimenten zeigten keine Unterscheide in der Signalintensität der
Chromosomenterritorien.
Vergleiche zwischen Chromosomenterritorien sind nur innerhalb eines
Experimentes durchführbar
Die Vergleiche zwischen den Werten der mehrfach in verschiedenen Experimenten
untersuchten Chromosomen machen deutlich, daß solche Vergleiche zwischen verschiedenen
Experimenten nur sehr bedingt möglich sind. Die Vergleiche der Volumen und
Oberflächengrößen der Territorien des gleichen Chromosoms in unterschiedlichen
Experimenten zeigen signifikante Unterschiede in ihren Verteilungen. Dies kann an natürlich
vorkommenden Unterschieden von Chromosomengrößen bei in Kultur gehaltenen Zellen und
an der Schwellenwertabhängigkeit der Parameter liegen. Die Werteverteilungen der
Rundheitsfaktoren zeigten jedoch ebenso signifikante Unterschiede, obgleich der
Rundheitsfaktor unabhängig vom Schwellenwert ist.
Die Korrelation der Volumen und der Oberflächengrößen von Territorien mit
dem DNA-Gehalt der Chromosomen
Die Volumen der untersuchten Chromosomenterritorien konnten in drei Vergleichen gut mit
dem DNA-Gehalt korreliert werden. Die Ergebnisse zeigten, daß der Volumenvergleich der
Chromosomen 4/16, 4/19 und 8/13 gut mit dem Vergleich des entsprechenden DNA-Gehalts
in Einklang zu bringen waren. Bei den Experimenten 2/8, 2/11 und 18/19 wies das
Chromosomen mit dem niedrigeren DNA-Gehalt ein größeres Volumen auf, als es der DNA-
Gehalt erwarten ließe. Diese Ergebnisse machen deutlich, daß der DNA-Gehalt nicht generell
als Indikator für das Volumen des entsprechenden Chromosomenterritoriums in
Interphasekernen betrachtet werden kann.
Bei den Vergleichen der Oberflächengrößen zeigte lediglich das Experiment der
Chromosomen 8 und 13 eine gute Übereinstimmung mit dem DNA-Gehalt. Alle übrigen
Vergleiche wiesen den Chromosomen mit dem niedrigeren DNA-Gehalt größere Oberflächen
zu. Die Oberflächengrößen von Chromosomenterritorien können also nur selten durch den
DNA-Gehalt abgeschätzt werden.
Unterschiede zwischen den Parametern homologer Chromosomen in Interphase-
kernen
Die Untersuchung der Experimente auf Unterschiede in Volumen, Oberflächengröße und
Form homologer Chromosomenterritorien konnte zeigen, daß sich die Volumen und
Oberflächengrößen im Mittel lediglich um weniger als den Faktor 1,3 unterscheiden und in
den meisten Fällen um weniger als das 1,5-fache variiert. Die Form der Territorien homologer
Chromosomen, durch den Rundheitsfaktor ausgedrückt, weicht etwas mehr voneinander ab.
Der Rundheitsfaktor differiert in den untersuchten Zellkernen im Mittel um weniger als den
Faktor 1,6, zeigt aber in Einzelfällen recht große Unterschiede.
Territorien benachbarter Chromosomen zeigen eine auf die Randbereiche
beschränkte Vermischung des Chromatins
Vierzig Zellkerne, die in einem Zwei-Farben-FISH-Experiment mit unterschiedlichen Farben
gefärbt wurden, konnten nach Aufnahmen mit dem CLSM und dreidimensionaler
Bildverarbeitung rekonstruiert werden. Die Kerne zeigen eng benachbarte Territorien von
mindestens zwei der Chromosomen X und 7. Die dreidimensionale Rekonstruktion mit
Darstellung der Oberflächengrenzen zeigte in keinem Fall ein ausgeprägtes gegenseitiges
Durchdringen von Chromatin der Territorien. Vielmehr war die Vermischung von Chromatin
auf Randbereiche beschränkt, die offen läßt, inwiefern derzeitige Präparationstechniken
und/oder Auflösungsgrenzen des verwendeten konfokalen Mikroskops hierfür verantwortlich
sind, oder ob sich hier tatsächliche in vivo-Verhältnisse zeigen.
Es könne zwei Schlußfolgerungen aus den durchgeführten Untersuchungen gezogen werden.
Erstens kann die Größe der Interphaseterritorien nicht in jedem Fall mit dem DNA-Gehalt der
entsprechenden Chromosomen korreliert werden.
Zweitens findet eine Vermischung von Chromatin benachbarter Chromosomenterritorien
höchstens in den Randbereichen statt. Der Territorienkern bleibt vom Chromatin anderer
Chromosomen unberührt.
