Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die onko-suppressive Aktivität von Parvoviren H-1 und MVM zugrunde liegen
Zhi-Hua Ran
Dr. Med. Untersuchung der molekularen Mechanismen, die die onko-suppressive Aktivität von Parvoviren H-1 und MVM zugrunde liegen Geburtsdatum: 12.07.1962 A-Ebene: 07.1980 Studien: Medizin. 09.198007.1985 Klinische Studien: 09.198307.1985 Praktikjahr: 09.198407.1985 Absolvierung: 07.1985. Shanghai Zweite Medizinische Universität Thema: DKFZ-ATV Lehrer: Prof. Jean Rommelaere, Ph.D. Um die parvoviralen onkolytischen Wirkungen besser zu verstehen, wurden die molekularen Mechanismen, die die Wechselwirkungen zwischen Viren und Zellen unterstreichen, durch drei verschiedene Ansätze sowohl in vivo als auch in vitro untersucht.
Um die onkolytische Aktivität von Parvoviren zu erklären, wurde eine mögliche Verbindung zwischen einerseits der Expression des Tumorunterdrückungsproteins p53 und andererseits der Zytotoxizität, die mit einer H-1-Virusinfektion verbunden ist, gesucht. Zu diesem Zweck wurde für die vorliegende Studie ein aus einer endogenen P53-Hepatomzelllinie abgeleitetes Wild-Type (wt) p53-Induktionssystem ausgewählt. Wt p53 Aktivität kann in diesen Zellen (benannt 4P) induziert werden, wenn der Induktor, 4-OH-Tamoxifen, hinzugefügt wird. Bei der optimalen Konzentration von 4-OH-Tamoxifen (750 nM) wurde festgestellt, dass die Induktion von p53-Expression keine nachweisbaren Auswirkungen auf die Wachstumsmerkmale uninfizierter Zellen hat. Dies ermöglichte es, das induzierbare System zur Analyse der Auswirkungen von p53 auf die Zellvernichtung durch Parvovirus H-1 zu verwenden. Unsere Daten deuten darauf hin, dass in diesem System die Expression von p53 nicht mit einer signifikanten Veränderung der Empfindlichkeit der Zellen gegenüber der zytotoxischen Wirkung von Parvovirus H-1 verbunden war. Daher kann keine eindeutige Schlussfolgerung über einen möglichen Einfluss von p53 auf die Zellempfindlichkeit für eine Parvovirusinfektion getroffen werden. In der Tat kann das getestete Zellsystem durch sein unberührtes Wachstum in Anwesenheit von p53 und durch seine besondere Resistenz gegen einige DNA-schädliche Wirkstoffe unterschieden werden und kann nicht repräsentativ für die normalen
functioning of p53. 2. Die Frage nach der Gewebespezifität und der Entwicklungsregelung des MVM P4-Promotors wurde mit Hilfe eines transgenen Ansatzes angesprochen. Dies ist ein wichtiges Thema für das Verständnis der Onkolyse, denn der Promoter P4 leitet die Transkriptionseinheit, die die parvoviralen zytotoxischen Proteine (benannt NS) kodiert. Es wurden drei transgene Mauslinien untersucht, zwei, in denen das LacZ-Reporter-Gen unter die direkte Kontrolle von P4 (P4-LacZ-Konstruktion) gestellt wurde, und eine, die den (P4-NS-P38-LacZ) Konstruktion unterhält, in der LacZ-Expression durch den NS-induzierbaren Parvovirale-Promoter P38 angetrieben wird. Die P4-LacZ-transgenen Mauslinien wurden auf P4-Aktivität in vivo getestet. In beiden Fällen wurde festgestellt, dass der P4-Promoter während der Embryogenese still bleibt. Um die möglichen Gründe für einen solchen Mangel an Transgenexpression zu bestätigen und weiter zu untersuchen, wurden 27 Primärzellkulturen aus Embryonen hergestellt, die aus allen drei transgenen Mauslinien stammen. Normale 3T3-Zelllinien und ihre SV40-transformierten Derivate wurden aus diesen primären Zellkulturen weiter etabliert. Die verschiedenen Zelllinien ermöglichten es, die Aktivität des P4-Promotors in vitro sowohl qualitativ (Bluo-gal-Färbung) als auch quantitativ (chemilumineszierende Berichterstatter-Analysen) zu messen. Again, the P4 promoter was
bei normalen und SV40-transformierten 3T3-Zellen schweigend gefunden. Zwei Beweise deuten darauf hin, dass die Transgene vorhanden waren. Erstens wurde ein positives Signal durch DNA-Hybridisierung erhalten. Zweitens führten NS1-Proteine, die nach Infektion von P4-NS-p38-LacZ-transgenen Zellkulturen mit MVM produziert wurden, zur Aktivierung des P38-Promotors und zur Expression des Berichterstatter-Gens. Andere Beobachtungen deuten darauf hin, dass unser Versagen bei der Erkennung der P4-Aktivierung während der Embryogenese wahrscheinlich auf den Stamm der untersuchten Mäuse und/oder das Muster der Transgenintegration bei den getesteten Tieren zurückzuführen ist. Unsere Arbeit zeigt, dass der vorgeschlagene Ansatz machbar ist und auch auf andere Mäuse ausgedehnt werden sollte.
Neue Erkenntnisse über die Mechanismen, mit denen Parvovirus H-1 Zelltod verursacht, wurden in Hela-Zellen und in SV40-transformierten Ratten-Fibroblasten (P1) gewonnen, die für die Überlebensfaktoren bcl-2 oder hsp27 induzierbar gemacht wurden. Durch morphologische Analyse (Hoechst / PI Doppelfärbung) wurde bei P1-Zellen nach einer H-1-Virusinfektion nekrotischer Zelltod beobachtet. H-1-Virus-induzierte Zellvernichtung erfolgt über einen bcl-2 und hsp27 unempfindlichen Weg im P1-Zellsystem.
Biochemische (PARP-Spaltung) und morphologische (Hoechst/PI-Doppelfärbung) Analysen
Es wurde darauf hingewiesen, dass auch bei Hela-Zellen nach einer H-1-Virus-Infektion ein nekrotischer Tod aufgetreten ist, obwohl einige Veränderungen, die charakteristisch für Apoptose sind, frühzeitig ausgelöst werden können. Die H-1-Virus-Infektion der Hela-Zellen begleitete eine schnelle Abnutzung der intrazellulären NAD-Stores. Die Stimulation der NAD-Produktion hatte keine erkennbare Wirkung auf den Zelltod. Im Vertrag wurde festgestellt, dass die Hemmung von NAD-verbrauchenden Enzymen den Todesmodus von Nekrose auf Apoptose in einem Bruchteil der Hela-Zellen verschiebt. Diese Daten zeigen, dass Parvoviren Zellen sowohl durch nekrotische als auch durch apoptotische Prozesse töten können, und weisen auf die ADP-Ribosylierung als neues Parameter für die Entscheidung, ob Zellen in den einen oder anderen Todesweg eingebunden werden.