Desi Wisdhajanti Soegiarto
Dipl. Biol.
Vitamin-D-Rezeptor defiziente Mäuse als Modell für die Vitamin-D-abhängige Rachitis
Typ II
Geboren am 27.12.1965
Reifeprüfung am 28.04.1984
Studiengang der Fachrichtung Biologie vom WS 1986/87 bis SS 1993
Vordiplom am 25.01.1989 an der Universität Heidelberg
Diplom am 27.05.1993 an der Universität Heidelberg
Promotionsfach: Humangenetik
Doktorvater: Prof. Dr. Werner Buselmaier
In dieser Dissertationsarbeit wurde eine Mausmutante (VDRtmNeu1-Mäuse) mit inaktiviertem
Vitamin-D-Rezeptor (VDR)-Gen erstellt. Das VDR-Gen der Maus wurde aus der Gen-
bibliothek der 129/SvJ-Maus-DNA in λ-DASHII unter Verwendung der ersten zwei kodie-
renden Exons des VDR-Gens als Sonden isoliert. Das VDR-Gen wurde mittels homologer
Rekombination zwischen dem endogenen Gen und einem Targeting-Vektor ausgeschaltet. Die
Sequenzen 5' (6 kb lang) und 3' (2,7 kb lang) vom erstkodierenden Exon 2, welches die erste
Zinkfingerregion der DNA-Bindungsdomäne kodiert, wurden für die Stellen der homologen
Rekombination verwendet. Wie viele andere Steroidrezeptorgene wird das VDR-Gen in
bestimmten Geweben und zu einem bestimmten Zeitpunkt nur schwach exprimiert. Die Ex-
pression des Gens läßt sich deswegen schwer detektieren. Der Einbau der bakteriellen lacZ-
Kassette in das Konstrukt ermöglichte eine sensitivere Methode für die Expressionsanalyse des
VDR-Gens. Die lacZ-Kassette wurde mit den ersten drei Aminosäuren des Exons 2 des VDR-
Gens fusioniert, so daß das Reportergen unter Regulation des endogenen Promotors und unter
Verwendung des endogenen Startcodons des VDR-Gens exprimiert wurde. Der Targeting-
Vektor wurde mit einer Neomycinphosphotransferase (neo)-Kassette für die positive und
einem Herpes-simplex-Thymidinkinase (HSV-tk)-Gen für die negative Selektion der homo-
logen Rekombination ausgestattet. Der linearisierte Vektor wurde durch Elektroporation in
embryonale Stammzellen (ES-Zellen) der Maus der Linie R1 bzw. E14 eingeschleust. Die
Integration des Vektors wurde mit dem positiven Selektionsmetabolit G418 (Geneticin) und
dem negativen Selektionsmetabolit Gancyclovir (GANC) selektioniert. Die homologe Re-
kombination wurde mittels Southern-Blot-Hybridisierung 5' und 3' von der Integrationsstelle
überprüft. Bei der Transfektion des Vektors in die ES-Zellen der R1-Linie ergaben sich acht
positive Klone von insgesamt 288 selektierten Klonen, während sich bei der Elektroporation
des Vektors in die E14 ES-Zelllinie nur ein Klon von 187 selektierten als positiv erwies. Zur
Erstellung der chimären Mäuse wurden die positiven ES-Klone mit Morulae des Mausstammes
CD1 aggregiert. Die Embryonen trugen scheinträchtige Mäuse, in deren Uteri die Embryonen
transferiert wurden. Durch Verpaaren mit Mäusen des Stammes CD1 wurde anhand der
Fellfarbe die Keimbahntransmission der chimären Mäuse getestet. Nur bei den chimären
Mäusen aus dem Klon der E14 ES-Zelllinie wurde die Mutation an die Nachkommen
weitergegeben. Für die Züchtung der Mausmutante wurden die Chimären mit den Mäusen des
Stammes C57BL/6 verpaart und die Nachkommen mittels Southern-Blot-Hybridisierung
genotypisiert. Homozygote Tiere wurden durch Verpaaren von heterozygoten Mäusen
erhalten.
Durch den Nachweis der ß-Galaktosidase-Aktivität konnte die breite Expression des VDR
analysiert werden. Die Expression des VDR ist bereits am Tag 10,5 pc zu detektieren und
persistiert während der embryonalen Entwicklung bis zum adulten Zustand. Nicht nur in den
klassischen Zielorganen des 1α,25(OH)2D3, wie Knochen und Niere, und in der Neben-
schilddrüse konnte die Expression des VDR nachgewiesen werden, sondern auch in Geweben,
die nicht direkt in die Kalziumhomöostase involviert sind, z.B. im Pankreas, in der Leber, in
den Reproduktionsorganen, im Zentralnervensystem und im Herz. Trotz der breiten Expression
des VDR während der embryonalen Entwicklung haben VDRtmNeu1-Mäuse nach der Geburt
keinen Phänotyp. Die heterozygoten (+/-) Mäuse zeigen selbst im Alter von zwölf Monaten
keine phänotypischen Veränderungen. Bis zum Absetzen vom Muttertier lassen sich die
homozygoten (-/-) Mäuse von den Wildtyp (+/+) und +/- Mäusen nicht unterscheiden.
Weibliche und männliche +/- und -/- Mäuse sind fertil und können miteinander verpaart
werden. Die Phänotype der -/- Nachkommen eines -/- Muttertieres sind stärker ausgeprägt als
bei -/- Mäusen einer +/- Mutter. Das Alter der +/- und -/- Mäuse wird durch die Inaktivierung
des VDR nicht beeinträchtigt, jedoch starben ein paar -/- Mäuse frühzeitig (im Alter von sechs
Monaten). Bereits eine Woche nach dem Absetzen vom Muttertier lassen sich die Phänotype
der -/- Mäuse erkennen. Die -/- Mäuse entwickeln Alopezie und einen sekundären
Hyperparathyreoidismus. Durch die Messung des Gesamtkalziumgehalts im Serum wird eine
Hypokalzämie festgestellt, die jedoch nicht bei allen -/- Tieren vorliegt. Die -/- Mäuse zeigen
typische Veränderungen am Knochen. Das Skelett der -/- Mäuse erscheint auf dem
Röntgenbild als Folge einer Knochenmineralisationsstörung transparenter als das der +/+ oder
der +/- Mäuse. Durch die Ossifikationsstörung wird das Längenwachstum des Knochens
gestört. Die Mineralisationsstörung führt im Epiphysenfugenbereich zu Erweiterungen, die an
den Rippen als rachitischer Rosenkranz bezeichnet werden. Zahlreiche Pseudofrakturen, sog.
Looser-Umbauzonen, sind z.B. an den Rippen zu finden. Somit zeigen -/- VDRtmNeu1-Mäuse
Phänotype, die den Symptomen der VDDR Typ II-Patienten entsprechen. Die VDRtmNeu1-
Mausmutante soll als Tiermodell für die Untersuchung dienen, um neue Expressionsdomäne
des VDR zu finden und um sowohl die genomischen als auch die nicht-genomischen
Wirkungen des Vitamin D3 in den sowohl klassischen als auch nicht-klassischen Zielorganen
zu klären.
