Jens Hanke
Dr. sc. hum.
Physikalische Kartierung des Chromosom III von Trypanosoma cruzi
Geboren am 17.05.1966 in Frankfurt am Main
Reifeprüfung am 10.06.1985
Studiengang der Fachrichtung Biologie vom WS 1987/88 bis SS 1993
Vordiplom am 23.08.1989 an der Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt
Diplom am 17.09.1993 an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg
Promotionsfach: Experimentelle Pathologie
Doktorvater: Prof. Dr. med. Angel Alonso
Trypanosoma cruzi ist ein parasitisch lebender Protozoe, der beim Menschen die sogenannte
Chagas-Krankheit hervorruft. Weltweit sind von dieser Krankheit, für die zur Zeit weder
wirksame Medikamente noch zuverlässige diagnostische Methoden existieren, etwa 16-18
Millionen Menschen betroffen. In den meisten Fällen führt sie zum Tod der betroffenen
Patienten. Um ein besseres Verständnis von biochemischen Vorgängen und währen der
Infektion ablaufende Interaktionen mit dem Wirt zu erhalten, wurde das Trypanosoma cruzi
Genomprojekt gestartet, das im Rahmen des Spezialprogrammes ”Research And Training In
Tropical Disease” (TDR) von der WHO finanziert wird. Zu den Zielen des Projekts gehört
neben der Herstellung von geeigneten DNA-Bibliotheken, der EST-Sequenzierung und dem
Aufbau von Datenbanken auch die Sequenzierung des gesamten Genoms.
Ein wichtiges Hilfsmittel für das Sequenzieren von großen genomischen Bereichen ist eine
hochauflösende physikalische Karte, durch deren Verwendung eine hohe Datenredundanz
vermieden und die Sequenzierung wesentlich beschleunigt werden kann. Eine solche Karte
soll durch das Ordnen einer Cosmidbibliothek für das gesamte Genom von T. cruzi hergestellt
werden. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Herstellung und Analyse dieser
Cosmidbibliothek, durchgeführt. Zusätzlich erfolgte die physikalische Kartierung von
Chromosom III, die als Pilotprojekt wichtige Informationen über die noch weitgehend
unbekannte Struktur des Genoms von T. cruzi und die Tauglichkeit der angewandten
Methoden liefern sollte.
Die für die Kartierung notwendige Chromosom III-Bibliothek wurde durch eine Selektion
von Chromosomen-spezifischen Klonen aus der gesamt-genomischen Bibliothek hergestellt.
Zu diesem Zweck wurden die 28.000 Klone der gesamt-genomischen Bibliothek in einem
Raster hoher Dichte auf Filter aufgebracht (18.432 Klone pro Filter) und Chromosomen-
spezifische Klone durch eine Hybridisierung von Chromosom III-DNA identifiziert.
Die Kartierung von Chromosom III erfolgte durch die Identifikation von Klonen mit
überlappenden Sequenzen. Durch Hybridisierungen einzelner Sonden auf Klonfilter der
gesamten Chromosom III-Bibliothek konnten benachbarte Klone identifiziert werden. Durch
die parallele Bearbeitung aller Klone konnten pro Experiment große Datenmengen produziert
werden, die anschließend mit einem speziellen Computerprogramm ausgewertet wurden. Mit
dieser Methode konnte eine nahezu vollständige Karte des Chromosoms, bestehend aus 26 zu
ca. 30% überlappenden Klonen, hergestellt werden.
Über die Kartierung von Chromosom III hinaus zeigt diese Arbeit für die weitere Kartierung
von T. cruzi wichtige Erkenntnisse. So werden beispielsweise bei der Kartierung des
gesamten Genoms cDNAs statt genomischer DNA als Hybridisierungssonde verwendet
werden. Weiterhin werden Sondengemische zur Anwendung kommen, die den nötigen
Arbeitsaufwand für das mehr als 70 mal größere Gesamt-Genom reduzieren werden. Obwohl
das Genom aufgrund seiner komplizierten Struktur wohl nie an einem Stück kartiert werden
wird, wird eine vollständige Abdeckung der nicht-repetitiven Bereiche, selbst in einer
Vielzahl von Contigs, äußerst nützlich sein für die Identifizierung und Charakterisierung von
Genen, die die Grundlage der Pathogenität des Organismus darstellen.
