Physikalische Kartierung des Chromosoms III von Trypanosoma cruzi
Jens Hanke
Dr. Sc. Hum. Physikalische Kartierung des Chromosoms III von Trypanosoma cruzi Geboren am 17.05.1966 in Frankfurt am Main Reifeprüfung am 10.06.1985 Studiengang der Fachrichtung Biologie von WS 1987/88 bis SS 1993 Vordiplom am 23.08.1989 an der Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt Diplom am 17.09.1993 an der Ruprecht-Karls-Universität Heidelberg Promotionsfach: Experimentelle Pathologie Doktorvater: Prof. Dr. med. Angel Alonso Trypanosoma cruzi ist ein parasitisch lebendes Protozoa, das den Menschen die sogenannte Chagas-Krankheit auslöst. Weltweit sind etwa 16 bis 18 Millionen Menschen von dieser Krankheit betroffen, für die es derzeit weder wirksame Medikamente noch zuverlässige Diagnosemethoden gibt. In den meisten Fällen führt sie zum Tod der betroffenen Patienten. Um ein besseres Verständnis für biochemische Prozesse zu erhalten und die laufenden Interaktionen der Infektion mit dem Gastgeber zu erhalten, wurde das Trypanosoma cruzi Genomprojekt gestartet, das im Rahmen des WHO-Spezialprogramms Research And Training In Tropical Disease (TDR) finanziert wird. Zu den Zielen des Projekts gehören die Erstellung geeigneter DNA-Bibliotheken, die EST-Sequenzierung und die
Erstellung von Datenbanken sowie die
Sequenzierung der gesamten Datenbank
Genoms. Ein wichtiges Hilfsmittel für die Sequenzierung großer genomischer Bereiche ist eine hochauflösende physikalische Karte, mit der eine hohe Datenredundanz vermieden und die Sequenzierung wesentlich beschleunigt werden kann. Eine solche Karte soll erstellt werden, indem man eine Cosmid-Bibliothek für das gesamte Genom von cruzi ordnet. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde die Herstellung und Analyse dieser Cosmid-Bibliothek durchgeführt. Darüber hinaus wurde Chromosom III physisch abgebildet, das als Pilotprojekt wichtige Informationen über die noch weitgehend unbekannte Struktur des Cruzi-Genoms und die Eignung der angewandten Methoden liefern sollte.
Die Chromosomen,
die für die Kartierung notwendig sind
III-Bibliothek wurde durch eine Selektion von
Chromosomen-spezifischen Klonen aus der
Dazu wurden die 28.000 Klone der gesamten Genombibliothek in einem Raster mit hoher Dichte auf Filter (18.432 Klone pro Filter) und Chromosomen-spezifische Klone durch eine Hybridisierung von Chromosom-III-DNA identifiziert.
Die
Chromosom III wurde durch die Identifizierung von
Überlappende Sequenzen. Durch die
Hybridisierung einzelner Sonden auf
Klonfilter der
gesamten Chromosom
In der Bibliothek III konnten Nachbarklone identifiziert werden.
Die parallele Verarbeitung aller Klone konnte pro Experiment große Datenmengen erzeugen.
Sie wurden anschließend mit einem speziellen Computerprogramm ausgewertet.
Mit dieser Methode konnte eine fast vollständige Chromosomenkarte erstellt werden, bestehend aus 26 bis etwa 30% überlappenden Klonen. Über die Chromosom-III-Mapping hinaus zeigt diese Arbeit wichtige Erkenntnisse für die weitere Kartierung von Cruzi. So werden zum Beispiel cDNA als Hybridizationssonde verwendet, anstatt genomischer DNA, um das gesamte Genom zu kartografieren. Weiterhin werden Sondenchemikalien angewendet, die die Arbeitsanstrengung für das über 70-mal größere Gesamtgenom reduzieren. Obwohl das Genom aufgrund seiner komplizierten Struktur wohl nie auf einem Stück abgebildet werden wird, wird eine vollständige Abdeckung der nicht-repetitiven Bereiche, selbst in einer Vielzahl von Contigs, für die Identifizierung und Charakterisierung der Gene, die die Grundlagen für die Krankheitserrechnung des Organismus darstellen, äußerst nützlich sein.