Extraction quantitative du facteur de croissance transformant bêta, du facteur de croissance analogue à l'insuline I et de l'ostéocalcine de la matrice osseuse

Katrin Wol

Dr. sc. hum

Extraction quantitative du facteur de croissance transformant bêta, du facteur de croissance analogue à l'insuline I et

Osteocalcin aus der Knochenmatrix

geboren am 8. 6. 1962 in Mannheim

Abitur am 22.5.1981

Studiengang der Fachrichtung Chemie vom SS 1982 bis WS 90/91

Vordiplom am 20.06.1985 an der Universität Heidelberg

Diplomprüfung am15. 06. 1990 an der Universität Heidelberg

Docteur père: Docteur privé: Docteur médecin: J. Archer

La matrice osseuse est le plus grand organe de mémoire du corps pour les facteurs de croissance TGF.

und

IGF-I sowie für das Matrixprotein Osteocalcin. Ces protéines produites par les ostéoblastes sont intégrées dans la formation osseuse et peuvent être libérées sous forme active lors de la réabsorption osseuse par les ostéoblastes. Il est donc supposé qu'ils jouent un rôle important dans la formation des os ultérieurs. Les données in vitro et l'effet osteoanabolique de la TGFin sur les animaux d'expérimentation suggèrent que la TGF semble associer la fonction des ostéoblastes à celle des ostéoclastes. Cependant, jusqu'à présent, il n'y avait pas de données humaines in vivo à l'appui de cette hypothèse. L'extraction quantitative de TGF, IGF-I et d'ostéocalcine de la matrice osseuse humaine permet donc d'obtenir des informations importantes sur les processus métaboliques de l'os et fournit également des informations importantes sur leur importance dans la régulation des processus de transformation.

Avec un hydrochlorure de guanidine de 4 M dans l'eau, une solution d'EDTA de 10% peut être utilisée.

nen TGF-

, IGF-I und II und

L'ostéocalcine obtenue à partir de quantités d'échantillons comprises entre 5 et 20 mg, par exemple lors d'une biopsie de jamshidi, est extraite quantitativement dans des tubes à micro-centrifuge à l'aide d'un dialyseur dans un délai de 24 heures à 4 °C. Après cette extraction, des traces des protéines étudiées ont pu être détectées dans le collagène résiduel obtenu avec ces réactifs, même après un traitement avec une collagénase hautement purifiée, tout en montrant que ces protéines ne sont pas attaquées par la collagénase utilisée. Les pertes causées par des liaisons non spécifiques aux vaisseaux d'extraction et à la membrane de dialyse peuvent être presque totalement évitées par l'ajout d'un mg d'albumine/mL à la solution d'extraction. Après l'extraction, les échantillons doivent être dialysés pendant trois jours à 4 °C contre PBS ou 0,01 M acide acide pour renaturer les protéines. Il n'est pas nécessaire de décentraliser à l'avance le résidu d'extraction. Aucune dégradation de la profondeur mesurée n'a été observée lors de l'extraction et de la dialyse ultérieure.

Après cette période, le taux de récupération des protéines extraites (en % ± standard deviation) était de 94,54 % ± 8,43 % pour le TGF, de 91,71 % ± 5,48 % pour le IGF-I et de 99,54 + 4,14 % pour l'ostéocalcine, selon ce qui a été démontré par l'ajout de premières quantités de ces protéines à des échantillons extraits par RIA ou bioassay. Avant l'extraction, les échantillons doivent être nettoyés mécaniquement avec du scalpel ou biologiquement avec des larves de chauve-souris, après quoi ils doivent être lavés sans cellules avec de l'eau et détoxifiés à l'aide d'un diisopropyléthère. Ces étapes de nettoyage ne provoquent aucune perte d'échantillons. Les os intacts peuvent être conservés jusqu'à sept jours à 37 °C. Par conséquent, les échantillons déchiquetés à l'aide d'une scie osseuse doivent être broyés avec un moulin à poudre refroidi au nitrogène et doivent être stockés jusqu'à l'extraction à -80 °C, alors qu'il y a des pertes significatives à une température de stockage supérieure à -80 °C. Après l'extraction, le TGF, l'IGF-I et l'ostéocalcine peuvent être détectés directement à partir des stands d'extraction. TGF doit être acidifié et neutralisé à pH 2,8 juste avant la mesure pour obtenir une dissociation de ses protéines de liaison également extraites. Für die IGF-

Détermination Les protéines de liaison extraites peuvent être saturées avec un excès d'IGF-II (pour la détermination de l'IGF-I). D'autres interférences avec d'autres composants de la matrice osseuse extraite n'ont pas été observées. Les résultats peuvent être liés soit à la pondération qui reflète la proportion minéralisée de l'os, soit à la teneur en collagène des échantillons par l'équilibrage du résidu d'extraction dessolé séché, soit à la détermination de la teneur en hydroxyproline du résidu. La variabilité des mesures était de 14,5% pour le TGF, de 12,8% pour l' IGF-I et de 17,8% pour l' ostéocalcine. Ces valeurs se situent dans la gamme des coefficients de variation indiqués par les fabricants des analyses de ra dioimmuno-assays ou ELISAs utilisés.

Lors de l'étude de la matrice osseuse de 386 femmes en bonne santé osseuse,

Abnahme der TGF-

- les concentrations observées avant la ménopause avec une dépendance à l'âge

La diminution de l'exposition osseuse a été associée. Après la ménopause, il y a eu une augmentation de 30% de la concentration de TGF dans la matrice osseuse, corrélative à l'augmentation de l'activité de remodelage osseux à ce moment-là. En revanche, aucune corrélation n'a été trouvée avec la concentration de TGF dans la masse osseuse. Ces résultats correspondent au rôle postulé du facteur coupling TGFal, c'est-à-dire un facteur dont l'activité dans l'os est régulée parallèlement au degré de dégradation osseuse et qui relie la croissance osseuse et la dégradation osseuse, assurant ainsi un équilibre osseux neutre, quel que soit le degré de dégradation osseuse. La concentration de TGF n'est pas correlative avec la perte de masse osseuse qui survient après la ménopause. C'est-à-dire que la diminution de la masse osseuse en fonction de l'âge ne peut être attribuée à une modification de la concentration de TGF, mais est la conséquence d'autres anomalies systémiques et locales. En outre, cette étude a montré que les mesures de la concentration de TGF dans la matrice osseuse ne sont utiles pour éclairer les maladies du métabolisme osseux que si, en même temps, on connaît le statut de la transformation osseuse

Les quantités d'ostéocalcin ou d'autres paramètres biochimiques de l'os

chenumbaus, z.B. die Pyridinolin-

Les liens croisés dans l'urine peuvent être déterminés.

-in-vivo-Werte

Les femmes en bonne santé osseuse peuvent servir d'indices de référence pour évaluer les changements

Détecter les maladies osseuses et ainsi obtenir de nouvelles informations sur leur pathogenèse.