MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du

193 ekaia ZIENTZIA eta TEKNOLOGIA ALDIZKARIA ISSN 0214-9001 – eISSN 2444-3255 Ekaia, 2022, 42, 193-206 https://doi.org/10.1387/ekaia.22644 * Harremanetan jartzeko / Corresponding author: José Antonio Rodríguez. Genetika, Antropologia Fisikoa eta Animalien Fisiologia Saila, Zientzia eta Teknologia Fakultatea, Leioa (UPV/EHU), Sarriena auzoa, zg (48940 Leioa, Bizkaia, Euskal Herria). – [email protected] – https://orcid.org/0000-0002-2823-3733 Nola aipatu / How to cite: García-Santisteban, Iraia; Olazabal-Herrero, Anne; Rodríguez, José Antonio (2022). «MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du». Ekaia, 42, 2022, 193-206. (https://doi.org/10.1387/ekaia.22644). Jasotze-data: 2021, martxoak 22; Onartze-data: 2021, azaroak 8. ISSN 0214-9001 - eISSN 2444-3255 / © 2022 UPV/EHU Lan hau Creative Commons Aitortu-EzKomertziala-LanEratorririkGabe 4.0 Nazioartekoa lizentzia baten mende dago MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du (MARk4 interaction modulates the dynamic subcellular localization of USP21 deubiquitinase) Iraia García-Santisteban1,2, Anne Olazabal-Herrero1,3,4, José Antonio Rodríguez1* 1 Genetika, Antropologia Fisikoa eta Animalien Fisiologia Saila (UPV/EHU) 2 Biocruces-Bizkaia osasun Ikerketa Institutua (Barakaldo) 3 Department of oncology, Georgetown University (Washington, DC) 4 Department of Internal Medicine, Yale University School of Medicine (New Haven, CT) LABURPEnA: USP21 deubikuitinasa nukleoaren eta zitoplasmaren artean translokatzen da, eta zentrosoman ere koka daiteke, baina kokapen azpizelular konplexu hori nola modulatzen den ezezaguna da. Proteomika-analisiaren bidez, MARk4 kinasa zentrosomala identifikatu da USP21 proteinaren balizko interaktore gisa. Lan honetan, USP21/MARk4 interakzioa balioztatzen dugu, eta USP21 proteinan MARk4 lotura-eskualdea identifikatu. Gure emaitzen arabera, MARk4ekiko interakzioak USP21en nukleoaren eta zitoplasmaren arteko kokapen dinamikoa erregula dezake, zitoplasmarekiko atxikipena areagotuz. Bestalde, gure datuek bi proteinen kokapen zentrosomala oso dinamikoa dela erakusten dute, eta USP21en dinamika zentrosomala MARk4en bidez modula daitekeela iradokitzen dute. HITZ GAkoAk: USP21, MARk4, kokapen zentrosomala, garraio nukleo-zitoplasmikoa, proteina-proteina elkarrekintza. AbstrAct: The deubiquitinase USP21 shuttles between the nucleus and the cytoplasm and can also localize to the centrosome, but how this complex subcellular localization is modulated remains unknown. A proteomics analysis has identified the centrosomal kinase MARK4 as a potential USP21-interacting partner. In this work, we validate the USP21/MARK4 interaction, identifying the MARK4-binding region of USP21. Our results indicate that MARK4 interaction may regulate USP21 nucleocytoplasmic shuttling dynamics, increasing its retention in the cytoplasm. On the other hand, our data show that the centrosomal localization of both proteins is highly dynamic, and suggest that USP21 centrosomal dynamics might be modulated by MARK4. KEyWORDS: USP21, MARK4, centrosomal localization, nucleocytoplasmic transport, proteinprotein interaction. 194 Ekaia, 2022, 42, 193-206 Iraia García-Santisteban, Anne Olazabal-Herrero, José Antonio Rodríguez 1. SARRERA Ubikuitinaren proteasa espezifikoak (ingelesez Ubiquitin Specific Proteases, USPs) itu-proteina ugariren ubikuitinazio-maila modulatzen duten entzima deubikuitinatzaileak (deubikuitinasak) dira. Entzima horiek hainbat funtzio zelularren funtsezko alderdiak erregulatzen dituzte, hala nola geneen adierazpena eta ziklo zelularraren progresioa [1]. USP21 proteina familia honetako kidea da, eta zelularen konpartimentu desberdinetan kokatzen diren substratu ugari dauzka: nukleoan H2A histona [2] eta FoXM1 [3] transkripzio-faktorea deubikuitinatzen ditu, eta zitoplasman Rip1 [4] eta RIG-I [5] ituak ditu. Autore batzuek USP21ek mikrotubuluei eta zentrosomei lotutako funtzioen erregulazioan zeregin garrantzitsua betetzen duela deskribatu dute [6], adibidez Gli1 transkripzio-faktorea zentrosoman bahitzea eta egonkortzea [7]. USP21en funtzioaren eta erregulazioaren alderdi ugari oraindik ezezagunak dira. Haren substratuen kokapen heterogeneoa kontuan hartuta, litekeena da USP21en banaketa azpizelularra zehazten duten mekanismoek garrantzi handia izatea haren funtzioa erregulatzeko. Alde horretatik, USP21en domeinu amino-terminalak esportazio nuklearreko seinale bat (ingelesez Nuclear Export Signal, NES) duela erakutsi genuen [8]. Garraio-seinale horren bitartez, CRM1 (chromosome region maintenance factor 1) esportazio-hartzaileak USP21en banaketa nukleozitoplasmatiko dinamikoa modulatzen du. Bestalde, USP21en kokapen zentrosomala ezaguna bada ere [6], oraindik ez dago argi USP21 molekulak zentrosomarekiko lotura egonkorra mantentzen duen, ala proteinaren kokapen zentrosomikoak ere izaera dinamikoa duen. Aipatzekoa da duela urte batzuk identifikatutako USP21en zentrosomara lotzeko motiboak [6] haren NESa ere biltzen duela [8]. Jakina da NES duten proteina batzuen kokapen zentrosomala NES seinaleak berak erregulatzen duela [9], USP21 proteinaren kokapen zentrosomala ere NES menpekoa izan litekeela iradokiz. Garraio-seinaleen jardueraz gain, proteina baten kokapen zelularra konpartimentu azpizelular desberdinetako beste proteinekin duen interakzioen bidez ere modula daiteke. Eskala handiko proteomika azterketa batean, USP21 lotu dezaketen 17 proteina identifikatu zituzten [10], besteak beste MARk1-4 proteinak. MARk (Microtubule Affinity Regulating Kinases) proteinak mikrotubuluen afinitatea erregulatzen duten serina/treonina taldeko kinasak dira [11], eta zelularen prozesu desberdinen erregulazioan parte hartzen dute, hala nola mikrotubuluen dinamikan eta zelularen polaritatean [12]. Funtzio horietaz gain, USP21 deubikitinasaren bidezko MARk kinasen egonkortzeak Hippo seinaleztapen bidea erregulatzen duela deskribatu da [13]. GFP-USP21ek MARk1, MARk2 eta MARk3rekin duen interakzioa berretsi da [6]. Hala ere, USP21en eta MARk4ren arteko interak- https://doi.org/10.1387/ekaia.22644 195 MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du zioa balioztatzeke dago. Gainera, oraindik ez da ikertu MARk proteinek USP21en kokapen-dinamikan izan dezaketen eragina. Gure ikerketa honetan, USP21en kokapen zentrosomala oso dinamikoa eta NESarekiko independentea dela erakusten dugu. Gainera, MARk4ren eta USP21en arteko elkarrekintza balioztatzen dugu, eta MARk4 lotze-gunea USP21en eskualde amino-terminalean mapatu. Horretaz gain, MARk4 elkarrekintzak USP21en banaketa nukleozitoplasmikoa eta kokapen zentrosomala modulatzen lagundu dezakeela erakusten dugu. 2. MATERIALAK ETA METoDoAK 2.1. Plasmidoen eraikuntza Flag-HA-etiketekin markatutako giza USP21 kodetzen duen plasmidoa J.W. Harper-en laborategitik lortu genuen (Harvardeko Medikuntza Eskola) Addgenen bidez (#22574 plasmidoa). YFP-USP21 WT eta NESm kodetzen dituzten plasmidoen eraikuntza aurretik deskribatuta dago [8]. USP21 delezio-mutante multzoa sortzeko, USP21en 1-208, 71-565 eta 209-565 aminoazido eskualdeek kodetzen dituzten DNA zatiak PCR bidez anplifikatu genituen fideltasun handiko Pfu UltraII HS DNA polimerasa (Stratagene) erabiliz, eta pEYFP-C1 plasmidoan (Clontech) sartu genituen XhoI eta EcoRI errestrikzio-guneak erabiliz. MARk1, MARk2 eta MARk3ren cDNAak (HsCD00079951, HsCD00003690, HsCD00005836, hurrenez hurren) PlasmIDen erosi genituen, eta HA-MARk4 kodetzen duen plasmidoa D. Alessi-ren laborategitik (MRC Protein Phosphorylation Unit, Dundee-ko Unibertsitatea) eskuratu genuen. Proteina horien YFP bertsioak kodetzen dituzten plasmidoak sortzeko, MARken cDNAak PCR bidez anplifikatu genituen, eta pEYFP-C1 plasmidoan azpiklonatu genituen XhoI / EcoRI (MARk1), SalI / kpnI (MARk2), XhoI / kpnI (MARk3) edo HindIII / BamHI (MARk4) errestrikzio-guneak erabiliz. Eraikitako plasmidoak Sanger sekuentziazio bidez baieztatu ziren. 2.2. zelulen kultiboa, transfekzioa eta tratamendua HeLa eta HEk293T zelulak DMEM (Dulbecco’s modified Eagle’s medium) medioan hazi genituen, % 10 idi-umeki seroa (ingelesez fetal bovine serum, FBS), 100 U/ml penizilina eta 100 μg/ml estreptomizina (Invitrogen) gehituta. Transfekzioak X-tremeGENE9 transfekzio erreaktiboarekin (Roche Diagnostics) egin genituen fabrikatzailearen argibideei jarraituz. Adierazitako esperimentuetan, kultibo medioari 6 ng/ml leptomizina B (LMB) (Apollo Scientific) gehitu genion. 196 Ekaia, 2022, 42, 193-206 Iraia García-Santisteban, Anne Olazabal-Herrero, José Antonio Rodríguez 2.3. Immunofluoreszentzia eta fluoreszentzia mikroskopia Beirazko estalkietan hazitako zelulen fixapena % 3,7 formaldehidoarekin 30 minutuz giro tenperaturan edo metanol hotza (–20ºC) erabiliz 5 minutuz burutu genuen. Formaldehidoan fixatutako zelulak iragazkortze-soluzioarekin (% 0,2 Triton X-100, Sigma) inkubatu ziren 10 minutuz giro tenperaturan. Immunofluoreszentzia egiteko protokoloa aurretik deskribatu dugu [14]. Anti-γ-tubulina (Abcam, 1:200), anti-Flag (Sigma, 1:300) eta anti-HA (Santa Cruz Biotechnology, 1:300) antigorputz primario gisa erabili genituen, eta Alexa Fluor 594 saguaren aurkako IgG (Invitrogen) antigorputz sekundario gisa. Hoechst 33285 DNA koloratzailea (Sigma) gehitu genuen nukleoak ikusteko. Estalkiak Vectashield-ekin (Vector Laboratories) muntatu genituen beirazko portetan. Prestakinak Zeiss Axioskop fluoreszentzia-mikroskopioa edo olympus Fluoview FV500 mikroskopio konfokala erabiliz aztertu genituen. Emisio espektroen gainjartzea saihesteko, fluorokromo bakoitzaren argazkiak banan-banan eskuratu genituen. 2.4. Fluorescence recovery After Photobleaching (FrAP) esperimentua HeLa zelulak 35 mm-ko ibiTreat kultibo-plaketan (Ibidi) hazi genituen. FRAP esperimentua transfekzioa egin eta 24 ordutara burutu genuen, LEICA LCS SP2 AoBS mikroskopioaren 63 handipen-objektiboa erabiliz. kitzikapen-laserraren potentzia % 10ean ezarri genuen, eta intereseko eskualdea % 100eko laser potentzia bidez zuritu zen. kitzikapen aurreko hamar eta ondorengo berrogeita hamar irudi hartu genituen, 1.635 segundoko denbora tartearekin. Esperimentu bakoitzeko sei zelula indibidual aztertu genituen, eta esperimentuak gutxienez bi aldiz errepikatu genituen. Irudiak ImageJ softwarearen bidez prozesatu genituen, eta datuak Microsoft Excel eta GraphPad Prism programak erabiliz aztertu genituen. Berreskurapenaren denbora erdia (t1/2) eta zatiki mugikorra (Fm) http://www.embl.de/eamnet/frap/html/overview.html webgunean azaltzen den moduan kalkulatu genituen. 2.5. Ko-immunoprezipitazioa (ko-IP) eta immunoplapaketa IP Lysis buffer (Pierce) erabiliz, zelulak lisatu, eta GFPren aurkako immunoprezipitazioa GFP-Trap_M erreaktiboa (Chromotek) erabiliz burutu genuen, fabrikatzailearen argibideei jarraituz. Immunoprezipitatutako proteinak immunoplapaketaren bidez aztertu genituen. Horretarako, proteina laginak % 10eko SDS-PAGE geletan kargatu, elektroforesiaren bidez banatu eta nitrozelulosa mintzera transferitu genituen. Mintzak TTBStan disolbatutako % 5eko gantzik gabeko esnetan blokeatu genituen ordu batez, eta anti-HA (Santa Cruz Biotechnology, 1:400, gauean zehar 4 ºC-tan) edo anti-GFP (Chromotek, 1:1000, ordu bat giro-tenperaturan) antigorputz primarioekin inkubatu genituen. Mintzak peroxidasarekin konjugatutako antigorputz sekundario batekin inkubatu genituen (Amersham edo Santa-Cruz, https://doi.org/10.1387/ekaia.22644 197 MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du 1:3.000). Garbitu ondoren, mintzak ECL edo Femto kimiolumineszentzia erreaktiboak erabiliz (Thermo Scientific) errebelatu genituen. 2.6. Analisi estatistikoak Artikuluko esperimentu bakoitzaren erreplika kopurua dagokion irudiaren oinean adierazita dago. Analisi estatistikoak Student-en t-testaren bidezko konparaketaren bidez burutu dira; P-balioa <0.05 denean esangura estatistikoa dagoela kontsideratu da. 3. EMAITzAK ETA EzTABAIDA 3.1. USP21en kokapen zentrosomala oso dinamikoa eta nESarekiko independentea da USP21 deubikuitinasa mikrotubuluetan, zitoeskeletoan eta zentrosoman koka daitekeela frogatu da aurretiaz [6]. Zelula bizien azterketa zinetikoek agerian utzi dute zentrosomako hainbat proteina (adibidez, γ-tubulina) zentrosoman egonkor mantentzen diren bitartean [15] beste batzuk (adibidez, BARD1) etengabe ari direla zentrosomara joan eta etorri [16]. USP21en kokapen zentrosomalaren dinamika ikertzeko, zelula bizien FRAP azterketa egin genuen YFP-USP21ekin transfektatutako HeLa zeluletan. 1A irudian agertzen den bezala, kitzikapenaren osteko YFP-USP21 fluoreszentzia zentrosomala azkar berreskuratu zen. Berreskurapenaren denbora erdia (t1/2) 17,36 segundokoa izan zen, eta zatiki mugikorra (Fm) % 77,41koa. Datu hauen arabera, YFP-USP21en kokapen zentrosomala oso dinamikoa da, eta proteina guztiaren parte txiki bat (~% 23) bakarrik geratzen da zentrosomarekin egonkor lotuta. Beraz, gure taldeko aurreko datuen [8], eta ikerketa honetako emaitzen arabera, USP21 zelularen konpartimentu desberdinen, hau da, nukleoaren, zitoplasmaren eta zentrosomaren artean etengabe garraiatzen den proteina da. 1B irudian azaltzen den moduan, zentrosoma lotzeko motiboak (ingelesez, centrosome binding motif, CBM, 122-174 amino azidoak) [8] USP21en NESa (134-152 amino azidoak) [9] biltzen du. Jakina da NES motiboek proteina batzuk, hala nola nukleofosmina, BARD1 eta RGS14, zentrosomara bideratzen dituztela [9, 16, 17]. Izan ere, NESetan eragindako mutazio inaktibatzaileek proteina hauen kokapen zentrosomala asko murrizten dute [9, 16, 17]. USP21en NESa inaktibatzen duten bi mutazio puntualek (L142A / L144A) [8], ordea, ez zuten haren kokapen zentromala indargabetu (1B irudia). Beraz, gure datuen arabera, NESa duten beste proteina zentrosomal batzuek ez bezala, USP21ek ez du CRM1en menpeko NES funtzionalik behar bere kokapen eta dinamika zentrosomala mantentzeko. Horrela, zentrosoºma lotzeko motiboa eta USP21en NESa, fisikoki gainjarriak diren arren, funtzionalki independenteak direla esan dezakegu. 198 Ekaia, 2022, 42, 193-206 Iraia García-Santisteban, Anne Olazabal-Herrero, José Antonio Rodríguez 1. irudia. USP21en kokapen zentrosomala oso dinamikoa eta NESarekiko independentea da. (A) YFP-USP21 dinamika zentrosomala aztertzeko FRAP analisia. Goiko argazkiek YFP-USP21 proteina fluoreszentea erakusten dute, kitzikapenaren aurretik eta kitzikapenaren ostean; lauki txikien barneko irudiek zentrosomari dagokion fotozuritutako zatia handipen gehiagoz erakusten dute. Beheko grafikoan berreskurapen-kurba eta FRAP parametroak agertzen dira: berreskurapenaren denbora erdia (t1/2) eta zatiki mugikorra (Fm). Grafikoa eta parametroen balioak hiru esperimentu independentetan aztertutako 18 zelulatatik eratorritakoak dira. (B) Goiko irudiak USP21 proteinaren irudikapen eskematikoa erakusten du: esportazio nuklearreko seinalearen (NES, 134-152 aa), zentrosoma lotzeko motiboa (CBM, 122-174 aa) eta domeinu katalitikoa adierazten dira. Beheko argazkiek erakusten dute bai YFP-USP21 WT, eta bai YFP-USP21 NESm ere zentrosoman kokatzen direla γ-tubulina endogenoarekin batera. Zentrosomari dagokion zatia handipen gehiagoz erakusten da lauki txikietan. Zelulen nukleoak Hoechstekin tindatu genituen (DNA panelak). https://doi.org/10.1387/ekaia.22644 199 MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du 2. irudia. USP21en eskualde amino-terminalak MARk4rekin lotzeko eremua biltzen du. (A) Irudiek HEk293T zelulen GFP-trap bidezko koimmunoprezipitazio analisiaren emaitzak erakusten dituzte. HA-MARk4 YFP-USP21ekin batera transfektatu zen edo, kontrol negatibo gisa, YFPbektorearekin. HA-MARk4k YFP-USP21ekin batera immunoprezipitatu du, baina ez YFP kontrolarekin. Puntuzko lerroek panelak gel bereko bi irudik osatutako konposatuak direla adierazten dute. (B) Irudiek MARk4 lotzeko gunea mapatzeko erabili ditugun USP21 delezio-mutanteen irudikapen eskematikoa erakusten dute. Azpian, immunoprezipitazio-analisiaren emaitzak, 1-208 eta 71-565 USP21 zatiek, baina ez 209-565 zatiak, HAMARk4rekin interakzionatzen dutela erakusten dutenak. Puntuzko lerroek adierazten dute panelak gel bereko bi irudik osatutako konposatuak direla. 200 Ekaia, 2022, 42, 193-206 Iraia García-Santisteban, Anne Olazabal-Herrero, José Antonio Rodríguez 3.2. MARK4 interakzio-gunea USP21en eskualde amino-terminalean kokatzen da Proteomikako analisi global baten bidez, deubikuitinasen interaktoma (hau da, entzima hauekin interakziona dezakeen proteina multzoa) deskribatu da [10]. Analisi honek USP21ekin lotu daitezkeen 17 proteina identifikatu zituen, eta haien artean mikrotubuluen afinitatea erregulatzen duten kinasen familiako lau kideak (MARk1-4) aurkitzen dira. Eskala handiko azterketa proteomikoak proteina baten interaktoma ezagutzen hasteko baliotsuak diren arren, aurkikuntzak modu independentean baieztatu behar dira. Izan ere, deubikuitinasen interaktoman zerrendatutako «konfiantza handiko kide» potentzialen % 30 inguru ezin izan zen metodo independente bat erabiliz balioztatu [10]. Alde horretatik, USP21ek MARk1-3rekin duen elkarrekintza baieztatu den arren [6], USP21 eta MARk4ren arteko elkarrekintza oraindik ere balioztatzeke dago. 2A irudian erakusten den bezala, transfektatutako HEk293T zeluletan HA-MARk4 proteina YFP-USP21ekin batera immunoprezipitatu zen, eta ez YFP-bektorearekin. Emaitza horiek proteomikako datuak berresten dituzte, eta MARk4 proteina USP21en interaktore gisa balioztatzen dute. USP21en MARk4 lotzeko gunea identifikatzeko, ko-IP esperimentuak egin genituen YFP-USP21 delezio-mutante sorta batekin (2B irudia). Gure emaitzen arabera, MARk4 lotzeko eskualdea USP21 domeinu katalitikoaren kanpoaldean dago, eta 71-208 aminoazidoen segmentua biltzen du. Aurreko behaketekin konbinatuta, gure aurkikuntzek USP21en eremu amino-terminala bere kokapena eta beste proteina batzuekin duen elkarrerakintza erregulatzen duen eskualde kritikoa dela diote. 3.3. MARK4k USP21en banaketa nukleozitoplasmikoa modulatzen du MARk proteinak zitoplasman eta mintzetan koka daitezke [11, 18-21] eta MARk4, USP21en antzera, zentrosoman eta mikrotubuluen zitoeskeletoan ere koka daitekeela jakinarazi da [22]. Hori jakinda, geure buruari galdetu genion ea MARk proteinak, eta bereziki MARk4, USP21en kokapena modulatzeko gai ziren. MARk proteinen elkarrekintzak USP21en mugimendu nukleozitoplasmiko dinamikoa modulatzeko gaitasuna ebaluatzeko asmoz, YFP-MARk1-4 proteinak Flag-HA-USP21ekin batera adierazi genituen HEk293T zeluletan. kontrol negatibo gisa, Flag-HA-USP21 YFP-bektorearekin batera adierazi genuen. Proteina bakoitzaren kokapen nukleozitoplasmatikoa fluoreszentzia mikroskopiaren bidez zehaztu genuen, bai tratatu gabeko zeluletan, bai leptomizina B (LMB) konposatuarekin tratatutako zeluletan. LMBk CRM1ek eragindako esportazio nuklearra inhibitzen du [23]. Aurreko ikerketen emaitzekin bat eginez [11, 18-21], YFP-MARk proteinak zitoplasman ageri ziren, eta YFP-MARk1-3 mintz plasmatikoan ere koka zitezkeela zirudien, batez ere YFP-MARk2 (3A irudia). LMB tratamenduak ez zuen YFP-MARk1-4 metaketa nuklearra eragin, CRM1ek eragindako esportazio nuklearrak proteina horien kokapen zitoplasmatikoaren bitartekaritzan parte hartzen ez duela iradokiz. https://doi.org/10.1387/ekaia.22644 201 MARK4ren interakzioak USP21 deubikuitinasaren kokapen azpizelular dinamikoa erregulatzen du 3. irudia. MARk4k USP21en mugimendu nukleozitoplasmikoa modulatzen du. (A) Argazkiek Flag-HA-USP21 (gorria) eta YFP-bektorea edo YFP-MARk1-4 proteinak (berdeak) kodetzen dituzten plasmidoekin transfektatutako HEk293T zelulen adibide adierazgarriak erakusten dituzte, tratatu gabeko eta LMBrekin tratatutako zeluletan. Zelulen nukleoak Hoechstekin tindatu genituen (DNA panelak). (B) A ataleko esperimentuaren azterketa semikuantitatiboa. Grafikoak Flag-HAUSP21en lokalizazio nuklearra (N) edo nukleozitoplasmikoa (NC) erakusten du, ehunekotan (%). Barra bakoitzak gutxienez 3 esperimentu independenteren batez bestekoa (± desbideraketa estandarra) adierazten du. Lagin bakoitzeko gutxienez 200 transfektatutako zelula ebaluatu ziren. Izartxoek YFP-MARk4 ko-adierazpenak Flag-HA-USP21en lekualdatze nuklearra nabarmenki murriztu duela adierazten dute (p = 0,006; Studenten t-testa). MARk1-3 ko-adierazpenaren eragina FlagHA-USP21en lekualdatze nuklearrean ez zen esanguratsua izan (ns).