Caracterización genómica de la anchoa europea (Engraulis encrasicolus)

Leioa 21 de junio de 2023 Trabajo Fin de Grado Grado en Biología Caracterización genómica de la anchoa europea (Engraulis encrasicolus) Autor/a: Nerea Rubio Almeida Director/a: Luis Javier Chueca Simón Codirector/a: Iratxe Zarraonaindia Martínez Índice Resumen/Abstract 1 1. Introducción 2 2. Objetivos 5 3. Materiales y Métodos 5 3.1. Construcción de librerías y secuenciación 5 3.2. Ensamblaje del transcriptoma 5 3.3. Ensamblaje del genoma 6 3.4. Anotación de repeticiones 6 3.5. Predicción de genes y anotación funcional 7 3.6. Comparación del genoma ensamblado y anotación con especies relacionadas 7 3.7. Genoma mitocondrial 7 4. Resultados 8 4.1. Transcriptoma 8 4.2. Ensamblaje del genoma 9 4.3. Anotación de repeticiones y funcional del genoma 11 4.4. Mitogenoma 13 5. Discusión 13 6. Conclusión 15 7. Bibliografía 16 8. Anexo y material complementario 21 I. Tabla con Software utilizados en este estudio 21 II. Disponibilidad de material suplementario 21 III. Listado de los organismos de referencia para la anotación funcional 21 IV. Árbol filogenético del orden Clupeiformes 22 V. Glosario con abreviaturas y terminología básica 22 1 Resumen La anchoa europea, Engraulis encrasicolus (Linnaeus, 1758), es un pequeño pez teleósteo con un amplio rango de distribución que comprende la costa Atlántica de Europa y África occidental, el Mar Mediterráneo y el Mar Negro. Muestra una gran capacidad de dispersión, dando lugar a dos ecotipos genéticamente diferenciados como resultado de aislamientos, dispersiones y colonizaciones pasadas. Se trata de una especie sobreexplotada con gran importancia comercial, particularmente en el mar Cantábrico. La ausencia de recursos genómicos de la anchoa, su amplia distribución y dinámica poblacional, dificulta comprender sus requisitos fisiológicos y ecológicos. En este trabajo, se emplearon las tecnologías de secuenciación de Illumina y PacBio, para generar lecturas cortas (RNA-seq) y largas (HiFi) que fueron utilizadas para el posterior ensamblaje del transcriptoma y genoma, respectivamente, mediante herramientas bioinformáticas. Se obtuvo un genoma con una longitud de 918,56 megabases, formado por 27.218 cóntigos, una longitud de cóntigo N50 de 38,21 kilobases y con una integridad de BUSCO del 60%. Un 45,86% del ensamblaje está formado por elemento repetitivos y se predijeron un total de 35.742 genes codificantes de proteínas. Para complementar la anotación funcional del genoma se ensambló el transcriptoma de huevo de anchoa resultando en 349 megabases con una integridad del 48,7%. Además, se obtuvo el mitogenoma con una longitud de 16.677 pares de bases. Este estudio proporciona un conjunto de datos ómicos y el primer borrador del genoma para Engraulis encrasicolus, que aportará la base para la creación uno de mayor calidad. La disponibilidad de un genoma de referencia permitirá comprender su estructura y función, así como ser utilizado en estudios genómicos comparativos con otros cupléidos. A su vez, representa un recurso esencial para la conservación, gestión y explotación sostenible de la anchoa. Abstract The European anchovy, Engraulis encrasicolus (Linnaeus, 1758), is a small teleost fish with a wide distribution range that includes the Atlantic coast of Europe and western Africa, the Mediterranean Sea and the Black Sea. It has a great dispersal capacity, giving rise to two genetically differentiated ecotypes as a result of past isolations, dispersals, and colonizations. It is an overexploited species with great commercial importance, particularly in the Cantabrian Sea. The absence of genomic resources of the anchovy, its wide distribution and population dynamics, makes more difficult to understand its physiological and ecological requirements. In this work, Illumina and PacBio sequencing technologies were used to obtain short (RNA-seq) and long (HiFi) reads that were used for the subsequent assembly of the transcriptome and genome, respectively, using bioinformatics tools. A genome with a length of 918.56 megabases 2 was obtained, made up of 27,218 contigs, an N50 contig length of 38.21 kilobases and with a 60% BUSCO integrity. A 45.86% of the assembly was formed by repetitive elements and a total of 35,742 protein-coding genes were predicted. To complement the functional annotation of the genome, the anchovy egg transcriptome was assembled, resulting in 349 megabases with 48.7%. integrity. Furthermore, the mitogenome with a length of 16,677 base pairs was obtained. This study provides a set of omic data and the first draft genome of Engraulis encrasicolus, which will provide the basis for the creation of a higher quality one. The availability of a reference genome will allow to understand its structure and function, as well as to be used in comparative genomic studies with other clupleid fishes. In turn, it represents an essential resource for the conservation, management and sustainable exploitation of the anchovy. 1. Introducción La anchoa europea, Engraulis encrasicolus (Linnaeus, 1758), es un pequeño pez teleósteo con un amplio rango de distribución costera y en la plataforma continental (Montes et al., 2016). Su extensión geográfica comprende la costa atlántica de Europa y África occidental, el Mar Mediterráneo y el Mar Negro (Ferrer et al., 2016). Al igual que otras especies pelágicas, la anchoa muestra un comportamiento de cardumen y migratorio, así como una gran capacidad de dispersión tanto en estado larvario como adulto (Agostini y Bakun, 2002). Actualmente, se distinguen dos linajes con diferente comportamiento y morfología como resultado de aislamientos, dispersiones y colonizaciones pasadas (Zarraonaindia et al., 2012). Se ha asociado esta diferenciación con la heterogeneidad del hábitat (Bembo et al., 1996), el clima (Silva et al., 2014), la distancia geográfica y las características oceánicas (Borrell et al., 2012; Zarraonaindia et al., 2012), que daría lugar a la existencia de dos ecotipos genéticamente diferenciados (Le Moan et al., 2016). Se trata de una especie con gran importancia comercial y pesquera internacionalmente, particularmente en el mar Cantábrico (Ferrer et al., 2016). En los últimos años, la alta demanda comercial ha desencadenado una sobreexplotación del recurso (Ferrer et al., 2016), donde históricamente numerosas pesquerías de anchoa han sufrido colapsos en sus stocks como en el mar Negro (1990), mar de Alborán (2001) y por último en el golfo de Bizkaia (2005), que no se recuperó hasta 2011. Debido a ello, y a pesar de que su abundancia sigue siendo alta, su biomasa y el tamaño medio de los individuos ha disminuido drásticamente (Van Beveren et al., 2014). De esta manera, la pesca es uno de los factores, que junto otros, influyen en la pérdida de diversidad génica (Ruggeri et al., 2016). 3 Su amplia distribución y dinámica poblacional, dificulta el seguimiento de su historia demográfica y la identificación de la procedencia de adultos, juveniles y huevos (Catanese et al., 2020). Para comprender completamente la base genética desde el punto de vista evolutivo y ecológico, es necesario conocer la composición de genes y elementos reguladores de diferentes individuos o poblaciones. Para ello, se precisa conocer el genoma de E. encrasicolus como herramienta de referencia. De esta manera, se puede evaluar la estructura genética y dinámica de la(s) población(es) de anchoa. Así como, realizar estudios genéticos sobre su historia de vida y rasgos ecológicos, que será fundamental para la conservación de la especie y la correcta gestión del stock en la pesca. El avance de las tecnologías de secuenciación de nueva generación ha supuesto una gran revolución en la obtención de genomas de organismos no modelo. Estas nuevas técnicas de secuenciación permiten obtener de manera masiva y paralela gran cantidad de secuencias de ADN y ARN en poco tiempo y con una mayor calidad y precisión. Actualmente, existen dos plataformas de secuenciación principales. Por un lado, las plataformas de secuenciación de lecturas cortas (secuenciación de segunda generación), representadas por Illumina, que producen lecturas de longitudes menores de 500 pares de bases (Alkan et al., 2010). Por otro lado, las plataformas de secuenciación de lecturas largas (secuenciación de tercera generación), representadas por PacBio y Oxford Nanopore Technologies (ONT), con una contigüidad y un perfil genético más completo, pero están limitadas debido a el rendimiento, el costo y la precisión (Metzker, 2010). La principal desventaja de la secuenciación de lecturas largas es su elevada tasa de error del 11-15 % (Rhoads & Au, 2015). Sin embargo, las lecturas individuales se pueden corregir usando, por ejemplo, lecturas de Illumina más precisas, que presentan una tasa de error de 1-1,5% (Cao et al., 2017). Alternativamente, se puede deducir una secuencia de consenso confiable a partir de lecturas de PacBio de alta cobertura (mayor de cincuenta veces) a través de herramientas bioinformáticas (Xie et al., 2020). Los sistemas PacBio más recientes muestran longitudes de lectura promedio muy mejoradas de más de diez kilobases, que permiten resolver regiones repetidas genómicas largas que no se pueden descifrar usando lecturas cortas de Illumina (Petit et al., 2017). Para mejorar la calidad de los ensamblajes, se desarrollaron lecturas de alta fidelidad (HiFi) para generar secuencias largas (con más de diez kilobases de longitud) con una tasa de error del 0,1% (Wenger et al., 2019). La secuenciación PacBio, secuenciación de tercera generación (TGS), es un método de secuenciación a tiempo real y de forma continua, es decir, no hay pausa entre el proceso de 4 lectura. A diferencia de otros métodos de secuenciación, PacBio permite obtener longitudes de lectura mucho más largas y ejecuciones a mayor velocidad. El mecanismo se basa en ligar adaptadores de horquilla a ambos extremos de la secuencia de ADN objetivo, generando así un ADN circular monocatenario, denominado SMRTbell (Travers et al., 2010). Posteriormente, se carga la muestra en un chip (celda SMRT), con numerosos pocillos de unión “guía de ondas de modo cero” (ZMW). En la parte inferior de cada ZMW, se inmoviliza un ADN polimerasa encargado de la replicación (Rhoads & Au, 2015). Debido a que los nucleótidos se encuentran marcados con fluorescencia, a medida que la polimerasa retiene una base, se produce un pulso de luz que identificando la base unida (Eid et al., 2009). Después de que la polimerasa replica una hebra del ADN objetivo, como el ADN es monocatenario por la unión mediante los adaptadores, continúa incorporando las bases del adaptador y posteriormente la replicación de la hebra complementaria (Rhoads & Au, 2015). Este proceso se repite hasta que la polimerasa de degrada, de manera que se obtienen múltiples copias. Finalmente, se obtiene un registro de los pulsos de luz emitidos en cada ZMW, que permiten identificar la secuencia de bases (Rhoads & Au, 2015). A partir de las lecturas generadas, se puede obtener las lecturas HiFi (CCS), que derivan de una secuencia de consenso tras múltiples pases de un SMRTbell, produciendo lecturas más precisas a partir de sublecturas individuales ruidosas (Wenger et al., 2019). El enfoque de Illumina logra una amplificación en puente de ADN, mediante la unión de fragmentos de ADN monocatenarios a una matriz (Steemers & Gunderson 2005). Los fragmentos de ADN a secuenciar se colocan sobre un soporte sólido, que contiene secuencias de ADN complementarias a los adaptadores de cada fragmento (Morozova, & Marra, 2008). De esta manera permite que cada fragmento se pueda anclar a la matriz (Morozova, & Marra, 2008). Una vez anclados los segmentos, la polimerasa los replica, generando una hebra reversa complementaria. La hebra original es retirada; mientras que la hebra reversa, a través de una secuencia terminal, se pliega y se ancla a su respectiva secuencia complementaria creando el “puente” (Morozova, & Marra, 2008). Posteriormente, la polimerasa genera una hebra complementaria idéntica a la original, que resulta en dos hebras clonadas del segmento inicial. Este proceso se repite masivamente hasta formar millones de copias de cada fragmento. Finalmente, se retiran las hebras reversas y se añaden oligonucleótidos marcados con fluorescencia de manera, que permite la identificación de la secuencia (Rubio et al., 2020). Esto se repite de simultáneamente con todos los fragmentos. La exactitud de la secuenciación es determinada por la intensidad de la señal, y la longitud de las lecturas, por el número de ciclos realizados (Rubio et al., 2020). 5 2. Objetivos El objetivo de este estudio es generar por primera vez un borrador del genoma de la anchoa europea (siendo el segundo para la familia Engraulidae) que pueda servir como base para futuras investigaciones genómicas. Esto ayudará a ampliar el conocimiento sobre la familia Engraulidae y proporcionará una referencia para especies relacionadas. El ensamblaje del genoma permitirá analizar las dinámicas poblacionales, así como comprender la influencia de factores abióticos y bióticos en la especie y su diversidad genética. 3. Materiales y Métodos 3.1. Construcción de librerías y secuenciación A partir de la extracción de ADN de un ejemplar adulto, se construyó una biblioteca SMRTbell siguiendo las instrucciones del kit “SMRTbell Express Prep v2.0 wiht Low DNA Input Protocol” (Pacific Biosciences, Menlo Park, CA). Se realizaron dos series de secuenciación de células SMRT en modo de secuenciación de consenso circular (CCS) en el Sequel System II con “Sequel II Sequencing Kit 2.0”. También se estimó el tamaño del genoma mediante citometría de flujo. Además, se secuenció el ARN total obtenido de 10 huevos y 3 larvas de anchoa mediante Illumina 150 ARN-seq de extremo emparejado, a partir de la construcción de dos librerías de ADN complementario de inserción de 250-300 pares de bases (pb), una para las muestras de huevos y otra para la de larvas. A partir de las lecturas de ADN y ARN obtenidas, se prosiguió con una serie de análisis bioinformáticos de los datos (Figura 1, Anexo I, Anexo II). 3.2. Ensamblaje del transcriptoma Se comenzó analizando la calidad de las secuencias de ARN obtenidas a partir de las muestras de huevo y de larva mediante el programa FastQC v0.11.9 (Andrews, 2010) y se resumieron los resultados para su visualización utilizando la herramienta MultiQC v1.9 (Ewels et al., 2016). La secuencia de ARN de huevo se limpió con Trimommatic v0.39 (Bolger et al., 2014), que eliminó los adaptadores utilizados con Illumina y las secuencias de mala calidad (Phred < 30). A partir de estas secuencias, se ensambló el transcriptoma mediante Trinity v2.11.0 (Grabherr et al., 2011& Haas et al., 2013). La calidad del ensamblaje fue evaluada con BUSCO v4.1.4 (Manni et al., 2021) utilizando como base de datos de referencia “actinopterygii_odb10”. Se analizó la distribución de las lecturas, mediante backmap v0.5 (Ewels et al., 2016; Li et al., 2009; Li, 2013; Li, 2018; Okonechnikov et al., 2016; Quinlan & Hall, 2010; R Core Team, 2021; Schell et al., 2017) que alinea las lecturas de Illumina respecto al transcriptoma. 6 Para obtener una mayor representación de la expresión génica de la especie, se descargaron los datos de estudios previos disponibles en la base de datos European Nucleotide Archive (ENA). Del primer estudio (PRJNA348159) (ENA, 2016), se descargaron secuencias obtenidas a partir de juvenil y tejido de ovario, testículo, riñón, hígado y juvenil. El segundo estudio (PRJNA261165) (ENA, 2014), aportó secuencias obtenidas de tejido muscular. En ambos casos, tras eliminar los adaptadores mediante Trimommatic v0.39, se realizó una segunda limpieza de las secuencias mediante Cutadapt v2.8 (Martin, 2011) donde se eliminaron las primeras 15 bases de las secuencias para el estudio PRJNA348159 y las 10 primeras bases de las secuencias correspondientes al estudio PRJNA261165. Se comprobó los resultados con FastQC y MultiQC para continuar con el ensamblaje mediante Trinity v2.11.0, la evaluación de la calidad del ensamblaje con BUSCO v4.1.4 y el mapeo y cobertura mediante backmap v0.5. Los resultados obtenidos a partir de los tres análisis de la integridad del transcriptoma, mediante BUSCO, fueron combinados mediante el script de phyton3 “generate_plot.py”. 3.3. Ensamblaje del genoma Las lecturas de ADN obtenidas mediante la secuenciación de PacBio se ensamblaron con dos herramientas diferentes, Hifiasm v0.16.1 (Cheng et al., 2021) y Flye v2.9 (Kolmogorov et al., 2019). La integridad de los ensamblajes obtenidos fue analizada utilizando BUSCO v5.2.2 con la base de datos odb10. Debido a que el genoma ensamblado con Hifiasm presentó la mayor contigüidad e integridad, fue seleccionado para análisis posteriores. Además, utilizando las lecturas obtenidas a partir de Hi-C, se realizó un tercer ensamblaje mediante Hifiasm v0.16.1 y su evaluación de integridad con BUSCO v5.2.2. Los dos genomas ensamblados con Hifiasm se compararon en términos de contigüidad usando Quast v5.0.2 (Gurevich et al., 2013). Tras evaluar la comparativa entre ensamblajes, se decidió continuar con el genoma obtenido mediante Hifiasm y solo con las lecturas de PacBio. Para evaluar la distribución y cobertura de las lecturas frente al genoma, así como estimar el tamaño real del genoma, se empleó la herramienta backmap v0.5. Por último, se evaluó una posible contaminación en el ensamblaje usando BlobTools v1.1.1 (Laetsch & Blaxter, 2017), que evalúa la cobertura, el contenido de GC y la similitud de la secuencia contra cada secuencia de la base de datos NCBI-BLAST v2.12.0. 3.4. Anotación de repeticiones Se ejecutó RepeatModeler v2.0 (Flynn et al., 2020) para construir de novo, a partir del ensamblaje, una biblioteca con las repeticiones. La biblioteca generada con las repeticiones de Engraulis encrasicolus se combinó con una biblioteca de repeticiones disponible para el pez 7 cebra (Danio rerio), (RepBase27.03.) (Bao et al., 2015; giriREPBASE, 2023), que se anotó y enmascaró usando RepeatMasker v4.1.4 (Tarailo & Chen, 2009). El genoma de referencia resultante, se alineó con las secuencias de ARN de diferentes tejidos (las de huevo obtenidas mediante Illumina y las procedentes de PRJNA348159) mediante HISAT2 (Kim et al., 2015). 3.5. Predicción de genes y anotación funcional Después de mapear las secuencias repetidas, se realizó una predicción de genes por homología utilizando la herramienta GeMoMa v1.8 (Keilwagen et al., 2019) junto con 11 especies de la clase Actinopterygii como organismos de referencia (Anexo III, Anexo IV). Primero, desde las lecturas mapeadas de ARN, los intrones se extrajeron y filtraron por los módulos GeMoMa ERE y DenoiseIntrons. Una vez eliminados los intrones, se ejecutó GeMoMa Pipeline para cada especie de referencia, como herramienta de alineación. Finalmente, las 11 anotaciones de genes se combinaron en una anotación final utilizando los módulos GeMoMa GAF y AnnotationFinalizer. Mediante GeMoMa Extractor, se obtuvieron tanto los CDS (secuencias codificantes) como las proteínas, las cuales fueron analizadas mediante BUSCO v5.2.2. A partir de las proteínas extraídas, InterProScan v5.39.77 (Jones et al., 2014) se utilizó para predecir motivos y dominios, así como su ontología génica (GO). Posteriormente, fueron anotados por búsqueda BLAST contra el Base de datos Uni-Prot con un límite de valor e de 10−6. A partir de la anotación funcional, se extrajeron las isoformas de las proteínas de mayor longitud y posteriormente se eliminó las duplicaciones con Agat v0.7.0 (Dainat, 2023). Después de cada anotación, se realizó una extracción de proteínas con GeMoMa Extractor para su posterior análisis con BUSCO v5.2.2. 3.6. Comparación del genoma ensamblado y anotación con especies relacionadas Para la comparativa, mediante BUSCO v5.2.2, se utilizó el genoma y las proteínas extraídas de varias especies filogenéticamente cercanas (Anexo IV). Las especies a comparar fueron Coilia nasus (GCA_007927625.1, Xu et al., 2019), Sardina pilchardus (GCA_003604335.1, Louro et al., 2019) y Alosa sapidissima (GCA_018492685.1, Rhie et al., 2021), además de E. encrasicolus. 3.7. Genoma mitocondrial Se ensambló el genoma mitocondrial a partir de las lecturas PacBio HiFi mediante la herramienta informática MitoHIFI (Uliano et al., 2023). Tras el ensamblaje, la anotación se 14 recuperación de genes completos dependen del origen de las lecturas, ya que la expresión génica varía en función del tejido y del momento. Los genes que se estén expresando en el huevo durante el desarrollo embrionario son diferentes a los que se expresan durante la fase adulta. Debido a ello, no se recupera la totalidad de los genes a partir del ARNm mediante BUSCO y los recuperados son diferentes para los transcriptomas ensamblados a partir de ARN-seq de distinto origen. La combinación de diferentes ensamblajes con datos de ARN-seq generados a partir de diferentes etapas de desarrollo ofrece un medio para producir transcriptomas de una calidad aún mayor, que a su vez darán como resultado un ensamblaje y anotación del genoma más completa. El ensamblaje mediante Hifiasm y a partir de lecturas procedentes PacBio, ha sido la herramienta con mejores resultados, ya que recupera un mayor porcentaje de genes completos. Utilizando las lecturas de PacBio, el ensamblaje presenta mayor contigüidad, ya que se obtiene un N50 de 38,21 kb mientras que para Hi-C de 37,24 kb. En C. nasus, para un ensamblaje a nivel de cromosoma de 851,67 Mb, presenta un N50 de 35,42 Mb (Ma et al., 2023). Para un ensamblaje de mayor calidad se esperarían valores similares para E. encrasicolus, ya que una mayor longitud de N50 indica menor número de brechas en el ensamblaje y por tanto mayor contigüidad. La ventaja de haber utilizado secuencias de lectura largas, es que permite atravesar fácilmente las regiones más repetitivas y ayudar a llenar los espacios entre cóntigos, aumentando así la longitud de las secuencias ensambladas y, a su vez, mejora las estadísticas N50 (Logsdon et al., 2020). Se estima que el tamaño del genoma es de 1,49 Gb, menor a los esperado por citometría de flujo, con un 60% mapeado en el ensamblaje. Este coincide con el 60% de los genes recuperados en BUSCO, lo que parece indicar que se está perdiendo esa fracción del genoma. La pérdida de genes puede deberse a errores en la secuenciación, a una baja calidad de las lecturas secuenciadas o de la propia muestra, o a la base de datos utilizada para evaluar la integridad del ensamblaje del genoma. Utilizando como base de datos de referencia “actinopterygii_odb10” para el análisis BUSCO se recupera un 72,3% de genes completos para S. pilchardus, mientras que utilizando “actinopterygii_odb9” se recupera un 84,2 % (Louro et al.,2019). Esta es una versión anterior que contiene mayor número de genes ortólogos, que aumenta la posibilidad de recuperar mayor número de genes. Las lecturas de PacBio utilizadas no presentan contaminación de otros organismos en la muestra. Blobtools no detectó contaminaciones según el contenido de GC y la distribución de cobertura. La detección mínima del filo Arthropoda o Proteobacteria probablemente se deba a secuencias altamente conservadas en los diferentes filos. 15 El contenido de repeticiones estimado para el genoma de la anchoa (45,48%) es ligeramente superior al porcentaje de elemento repetidos en C. nasus (41,32%) (Ma et al., 2023) y en S. pilchardus (40,7 %) (Louro et al., 2019). La predicción del número genes codificantes de proteínas es menor para E. encrasicolus, que para S. pilchardus y A. sapidissima, ajustándose a lo esperado teniendo en cuenta que en el ensamblaje del genoma se recupera una mayor proporción de genes. A su vez, la integridad de los genes, codificantes de proteínas, anotados es del 62%, valor similar a la integridad del ensamblaje del genoma, lo que indica que para el ensamblaje obtenido la anotación es de alta calidad. Los valores de BUSCO son similares también para C. nasus (64,9%) y S. pilchardus (62,9%), mientras que para A.sapidissima recupera un 98,7%. Se observa que la integridad de los genes codificantes de proteínas es mayor cuanto mayor es la integridad del ensamblaje. Por último, la longitud del genoma mitocondrial de Engraulis encrasicolus presenta una longitud similar (16.677 pb) a otras especies de la familia Engraulidae, como es Engraulis rigens con un mitogenoma de 16.690 pb de longitud (Sun, 2019). Esto sugiere que el ADN mitocondrial se encuentra muy conservado en esta familia e incluso en los vertebrados, ya que comparten la estructura con otros teleósteos y vertebrados (Chen et al., 2017; Shan et al., 2016; Wen et al., 2017; Zou et al., 2017). 6. Conclusión En el presente estudio, se utilizó una estrategia combinada que involucra las tecnologías Illumina y PacBio para el ensamblaje de novo del genoma y transcriptoma del huevo de Engraulis encrasicolus. Se obtuvo un genoma con una longitud de 918,56 Mb, estimando que corresponde al 60% del tamaño total del genoma, formado por 27.218 cóntigos y una longitud de cóntigo N50 de 38,21 kb. Un 45,86% del ensamblaje está formado por elemento repetitivos y se predijeron un total de 35.742 genes codificantes de proteínas. Además, se construyó el mitogenoma que proporciona las bases para detectar marcadores mitocondriales de alta resolución que permiten la identificación de especies. El borrador del genoma obtenido por primera vez en este trabajo, así como la predicción de genes, y su anotación funcional, servirá como punto de partida para obtener un ensamblaje de mayor calidad, a nivel de cromosoma. Además, este genoma servirá como un recurso para futuros estudios genómicos, evolutivos, poblacionales y de la biología de la conservación de la anchoa europea. Para ello, es necesario secuenciar una mayor cantidad de lecturas largas con la finalidad de intentar mejorar la contigüidad e integridad del genoma obtenido. 16 7. Bibliografía Agostini, V. N. & Bakun, A. (2002). ‘Ocean triads’ in the Mediterranean Sea: physical mechanisms potentially structuring reproductive habitat suitability (with example application to European anchovy, Engraulis encrasicolus). Fisheries Oceanography, 11(2), 129-142. doi:10.1046/j.1365-2419.2002.00201.x. Alkan, C., Sajjadian, S., & Eichler, E. E. (2010). Limitations of next-generation genome sequence assembly. 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Nombre Versión Enlace AGAT 0.7.0 https://github.com/NBISweden/AGAT AUGUSTUS 3.4.0 https://github.com/Gaius-Augustus/Augustus backmap 0.5 https://github.com/schellt/backmap BlobTools 1.1.1 https://github.com/DRL/blobtools BUSCO 4.1.4 & 5.2.2 https://busco.ezlab.org/ Cutadapt 2.8 https://cutadapt.readthedocs.io/en/stable/ FastQC 0.11.9 https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/ Flye 2.9 https://github.com/fenderglass/Flye GeMoMa 1.8 http://www.jstacs.de/index.php/GeMoMa Hifiasm 0.16.1 https://github.com/chhylp123/hifiasm HISAT2 2.2.1 http://daehwankimlab.github.io/hisat2/ Interproscan 5.39.77 https://github.com/ebi-pf-team/interproscan Maker 2.31.10 https://github.com/Yandell-Lab/maker MitoHIFI 2.2 https://github.com/marcelauliano/MitoHiFi MITOS 1 http://mitos.bioinf.uni-leipzig.de/index.py MultiQC 1.9 & 1.10 https://multiqc.info/ Ncbi-blast 2.14.0 https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi RepeatMasker 4.1.4 https://www.repeatmasker.org/ RepeatModeler 2.0 https://github.com/Dfamconsortium/RepeatModeler/blob/master/RepeatModeler Samtools 1.15.1 https://github.com/samtools/samtools Trimmomatic 0.39 http://www.usadellab.org/cms/?page=trimmomatic Trinity 2.11.0 https://github.com/trinityrnaseq/trinityrnaseq/wiki Quast 5.0.2 https://github.com/ablab/quast Anexo II. Disponibilidad de material suplementario. El código empleado en este trabajo está subido en un repositorio de Github, que se puede consultar en: https://github.com/ljchueca/Engraulis_encrasicolus_genome.git. Anexo III. Listado de los organismos cuyo genoma y anotación se utilizó como referencia para la anotación funcional de Engraulis encrasicolus. Orden Familia Especie Acceso GenBank Clupeiformes Engraulidae Coilia nasus * Clupeiformes Clupeidae Alosa sapidissima GCA_018492685.1 Clupeiformes Clupeidae Alosa alosa GCA_017589495.2 Clupeiformes Clupeidae Clupea harengus GCA_900700415.2 Clupeiformes Denticipitidae Denticeps clupeoides GCA_900700375.1 Cypriniformes Cyprinidae Cyprinus carpio GCA_018340385.1 Cypriniformes Cyprinidae Carassius auratus GCA_003368295.1 Carangiformes Carangidae Seriola lalandi GCA_002814215.1 22 Orden Familia Especie Acceso GenBank Centrarchiformes Centrarchidae Micropterus salmoides GCA_014851395.1 Batrachoidformes Batrachoididae Thalassophryne amazonica GCA_902500255.1 Perciformes Cyclopteridae Cyclopterus lumpus GCA_009769545.1 * El genoma de esta especie no está disponible en el GenBank, se ha obtenido de la base de datos GigaScience Database (Xu et al., 2019). Anexo IV. Árbol filogenético del orden Clupeiformes basado en secuencias de ADN nuclear y mitocondrial (Li & Ortí, 2017). Anexo V. Glosario con abreviaturas y terminología básica. Término o sigla Definición ADN Ácido desoxirribonucleico. Anotación Asignación de una función a un gen conocido. ARN Ácido ribonucleico. ARN-seq Secuenciación de ARN. Biblioteca Representación del conjunto de ADN o ADN complementario. La de ADNc se construye mediante retrotranscripción de los ARNm, y por lo tanto solo representa las regiones codificantes de proteínas del genoma. CDS Coding Sequence es parte del ARNm o secuencia genómica que codifica una secuencia de proteína. Cobertura Estimación de la proporción del genoma que ha sido secuenciada. Cóntigo Secuencia contigua: secuencia de ADN que procede de dos o más secuencias que se superponen en sus extremos y se pueden juntar en una sola secuencia no redundante. Ensamblaje de novo Ensamblado de un genoma basado únicamente en la información que contienen las lecturas, sin necesidad de comparación con un genoma de referencia. 23 Término o sigla Definición Ensamblado Proceso por el cual los fragmentos cortos del ADN secuenciados se juntan en fragmentos más grandes hasta reconstruir el genoma. Gb Gigabase: unidad de medida para designar la longitud del ADN. Es igual a mil millones de bases. Kb Kilobase: unidad de medida para designar la longitud del ADN. Es igual a mil de bases. Lectura Secuencia del ADN continúa obtenida de un secuenciador. L50 Dado un conjunto de cóntigos, cada uno con su propia longitud, el L50 se define como el recuento del menor número de cóntigos cuya longitud suma la mitad del tamaño del genoma. L75 El recuento del menor número de cóntigos cuya longitud suma el 75% del tamaño del genoma. Mapeado Alineamiento de cada una de las lecturas de ADN a una posición en el genoma de referencia. Mb Megabase: unidad de medida para designar la longitud del ADN. Es igual a 1 millón de bases NGS Next generation sequencing es la tecnología de secuenciación masiva que surgió después de la de Sanger. N50 Es la longitud máxima de cóntigo que representa al menos el 50 % de la longitud total del ensamblaje. N75 Es la longitud máxima de cóntigo que representa al menos el 75 % de la longitud total del ensamblaje. PCR Reacción en cadena de la polimerasa. Profundidad Media del número de veces que cada base de un genoma secuenciando tiene una lectura que alinea en esa posición.