Przyczynek do poznania zmienności genetycznej polskich osobników tasiemca psiego Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758) (Cyclophyllidea: Dipylidiidae) na podstawie analizy sekwencji genu kodującego podjednostkę 28S rybosomalnego RNA

1 Agnieszka Mizio1, Paweł J. Domagała1, 2 , Barbara Lis1, 3 Przyczynek do poznania zmienności genetycznej polskich osobników tasiemca psiego Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758) (Cyclophyllidea: Dipylidiidae) na podstawie analizy sekwencji genu kodującego podjednostkę 28S rybosomalnego RNA https://doi.org/10.5281/zenodo.17365183 1 Uniwersytet Opolski, Instytut Biologii, ul. Oleska 22, 45-052 Opole, Polska 2 e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0003-1005-7193 3 e-mail: [email protected], ORCID: 0000-0002-3292-1109 Abstract: Contribution to the knowledge of the genetic diversity of the flea tapeworm Dipylidium caninum (Linnaeus, 1758) (Cyclophyllidea: Dipylidiidae) from Poland, based on the sequence analysis of the gene encoding the 28S ribosomal RNA subunit. This paper presents the results of a study on the molecular divergence of the flea tapeworm Dipylidium caninum from Poland, based on the analysis of the 28S nuclear subunit sequence. The results showed no differences between samples from Poland and a populations from different countries and continents. The association of genetic variation with host rather than geographical location was confirmed. Key words: flea tapeworm, Dipylidium caninum, Eucestoda, 28S, rDNA, nuclear DNA, Poland. WSTĘP Tasiemiec psi Dipylidium caninum (Linnaeus, 1785) to kosmopolityczny, celozoiczny endopasożyt ssaków z rodziny psowatych i kotowatych, np. psów, kotów lub lisów, u których w jelicie cienkim bytuje jego dojrzałe stadium. Żywicielami pośrednimi tego tasiemca są różne gatunki pcheł np. Ctenocephalides canis (Curtis, 1826), Pulex irritans Linnaeus, 1758 i wszołów Trichodectes canis (De Geer, 1778). Człowiek może być przypadkowym żywicielem ostatecznym tego tasiemca (Molina et al. 2003, Rousseau et al. 2022, Szwaja et al. 2011, Taylor & Zitzmann 2011). Dla żywiciela ostatecznego postacią inwazyjną tasiemca psiego jest cysticerkoid, który rozwija się w jamie ciała żywicieli pośrednich. Do inwazji tasiemca psiego dochodzi w wyniku przypadkowego połknięcia żywiciela pośredniego, czyli pchły lub wszoła. Dojrzały tasiemiec osiąga 15-70 cm długości i 2-3 mm szerokości. Jego skoleks zaopatrzony jest w cztery przyssawki i stożkowate rostellum z 1-8 rzędami haczyków (Taylor & Zitzmann 2011). Apolizyjna strobila składa się z 60-175 proglotydów. Każdy człon zaopatrzony jest ROCZNIK MUZEUM GÓRNOŚLĄSKIEGO W BYTOMIU PRZYRODA Vol. 31 (online 010): 1–7 ISSN 0068-466X, eISSN 2451-0467 (online) Bytom, 16.10.2025 2 w podwójny zestaw obojnaczych układów rozrodczych i dwa otwory płciowe (stąd angielska nazwa tasiemca: „double-pored dog tapeworm”), po jednym na każdej bocznej krawędzi członu (Szwaja et al. 2011). Dojrzałe człony tasiemca odrywają się i aktywnie, lub w sposób bierny wraz z kałem, opuszczają organizm żywiciela ostatecznego przez odbyt. Dojrzały człon ma ok. 12 mm długości i do 3 mm szerokości, a kształtem przypomina nasiona dyni. Zawiera jaja zebrane w pakiety (od 3 do 30 jaj), które trafiają do sierści psów lub kotów. Jaja te, zawierające onkosfery, zjadane są przez mające aparat gębowy typu gryzącego larwy pcheł lub wszoły. W jamie ciała owadów w ciągu trzech miesięcy onkosfery przekształcają się w cysticerkoidy (Rousseau et al. 2022, Szwaja et al. 2011). W przypadku człowieka, na inwazję tasiemca psiego najbardziej narażone są małe dzieci, ze względu na ich bliski i często niekontrolowany kontakt z psami i kotami. Co ciekawe, tasiemiec psi został stwierdzony nawet u niemowląt, które, być może raczkując po podłodze, przypadkowo połknęły zarażoną pchłę (Molina et al. 2003, Rousseau et al. 2022, Szwaja et al. 2011, Taylor & Zitzmann, 2011). W niniejszej pracy autorzy przedstawiają wyniki badań nad pokrewieństwem okazów tasiemca D. caninum pochodzących z Polski, w oparciu o analizę sekwencji podjednostki jądrowej 28S. Uzyskane sekwencje okazów krajowych porównano dodatkowo z dostępnymi sekwencjami tego gatunków pozyskanymi z bazy NCBI GenBank. Warto dodać, że jest to pierwsza tego typu praca badawcza w Polsce wykorzystująca sekwencje D. caninum, które zebrane zostały na terenie Polski. MATERIAŁ I METODY Materiał do badań stanowiły człony tasiemców pobrane z okolic odbytu kotów domowych oraz z ich kału. Łącznie do badań pozyskano człony od 6 okazów tasiemców. Szczegółowe dane na temat miejsca zebrania okazów przedstawiono w tabeli 1. Zebrane człony do czasu izolacji materiału genetycznego zostały umieszczone w 96% roztworze etanolu i przechowywane w temperaturze –20°C. Izolację materiału genetycznego wykonano przy użyciu zestawu Sherlock AX firmy A&A Biotechnology (zgodnie z protokołem producenta). Profil reakcji PCR opracowano na podstawie danych przedstawionych przez Abdullah et al. (2019) i Beugnet et al. (2014) i składał się z denaturacji inicjującej w temperaturze 95°C przez 2 minuty, następnie 40 cykli (95 °C przez 20 s, 66 °C przez 5 s, 72 °C przez 30 s). Reakcja kończyła się elongacją końcową trwającą 5 minut w temperaturze 72°C. Do przeprowadzenia reakcji PCR wykorzystano gotową mieszaninę reakcyjną PCR Mix Plus firmy A&A Biotechnology oraz parę starterów DC28S-1R: 5’-CACATTCAACGCCCGACTCCTGTAG-3’, DC28S-1F:5’- GCATGCAAGTCAAAGGGTCCTACG-3’ (Beugnet et al. 2014). Oczyszczenie i sekwencjonowanie uzyskanych produktów PCR zostało wykonane w firmie A&A Biotechnology (Gdańsk). Uzyskane sekwencje sprawdzono pod kątem ich poprawności oraz jakości, wykorzystując wyszukiwarkę BLAST oraz program FinchTV. Dalsze analizy przeprowadzono w programie Mega 11 (Tamura et al. 2021) gdzie wykonano przyrównanie sekwencji przy użyciu algorytmu ClustalW oraz obliczono dystans molekularny korzystając z modelu p-distance. W przeprowadzonych analizach wykorzystano 67 sekwencji pozyskanych z NCBI Genbank (Tabela 2). Analizę haplotypów wykonano przy użyciu programu DnaSP v.6 (Rozas et al. 2017) oraz PopArt (Leigh et al. 2016), wykorzystując metodę Median-joining (Bandel et al. 1999). Wszystkie uzyskane sekwencje zdeponowano w NCBI GenBank pod numerami akcesyjnymi: PV768808-PV768813. 3 WYNIKI I DYSKUSJA W wyniku przeprowadzonych analiz uzyskano sześć sekwencji o długości 604 pz. Wszystkie sekwencje pochodzące od okazów z terenu Polski nie wykazują różnic pomiędzy sobą. Na podstawie przeprowadzonej analizy haplotypów okazów krajowych oraz 67 sekwencji pozyskanych z bazy NCBI GenBank wykazano obecność tylko czterech haplotypów. Wszystkie sekwencje pochodzące z Polski należą do Haplotypu nr 1 (Hap_1), podobnie jak okazy z szeregu innych krajów m.in. Francji, Niemiec, Portugalii, Węgier czy Chin, USA i Nowej Zelandii. Drugi najliczniejszy haplotyp to haplotyp nr 3 (Hap_3), do którego należą 34 sekwencje pochodzące z różnych lokalizacji. Podobnie jak w przypadku haplotypu nr 1 należą do niego sekwencje pochodzące z kilku krajów i kontynentów. Pojedyncze sekwencje pochodzące z Iraku oraz Federacji Saint Kitts i Nevis zaklasyfikowano odpowiednio do Haplotypu nr 2 (Hap_2) i haplotypu nr 4 (Hap_4). Szczegółowe dane przedstawione na temat przynależności konkretnych haplotypów przedstawiono w tabeli 1 i 2 oraz wygenerowanej sieci haplotypów (Ryc. 1). Obliczony dystans molekularny pomiędzy haplotypem nr 1 a haplotypem nr 3 wynosi ponad 5%, a sekwencje te różnią się w 35 pozycjach (Tabela 3). Uzyskane wyniki analiz wyraźnie wskazują na brak powiązania konkretnego haplotypu z lokalizacją geograficzną. Wykazany brak korelacji haplotypów z konkretnym stanowiskiem potwierdza wcześniejsze badania, które wskazywały, że zmienność genetyczna D. caninum nie jest związana z daną lokalizacją, a z konkretnymi żywicielami (East et al. 2013, Labuschagne et al. 2018). Rodzaj Dipylidium jest monotypowy, jednakże w roku 2017 Low i współpracownicy na podstawie analizy dystansu genetycznego zasugerowali obecność dwóch oddzielnych gatunków, które morfologicznie klasyfikowane są jako D. caninum. Dalsze badania przeprowadzone przez Beugneta i współpracowników (2014) oraz Labuschagne i współpracowników (2018) potwierdziły obecność dwóch genotypów związanych z żywicielami. Na podstawie swoich badań autorzy wyróżnili genotyp koci, obecny prawie wyłącznie u pcheł zebranych na kotach domowych oraz genotyp psi, spotykany u pcheł żerujących na psach. Wyniki uzyskane podczas eksperymentalnych zakażeń wykazały znaczące różnice biologiczne między dwoma genotypami w odniesieniu do ich związku z żywicielem. Okres między zakażeniem pasożytem a wytworzeniem proglotydów był znacznie dłuższy w przypadku genotypu psiego niż kociego (Beugnet et al. 2018). Analizowane przez nas okazy pochodzące z terenu Polski należy zaklasyfikować do genotypu kociego, co jest zbieżne z ich pochodzeniem, gdyż wszystkie krajowe okazy zostały zebrane od kota domowego. Uzyskane wyniki bazują na małej próbie badawczej, niemniej jednak przynoszą wartościowe dane na temat zmienności genetycznej tasiemca psiego w Polsce, jak również potwierdzają korelację genotypu z żywicielem. Ze względu na bardzo interesujące wyniki sugerowane jest przeprowadzenie dalszych badań bazujących na większej próbie badawczej pobranej od różnych żywicieli ostatecznych oraz pośrednich. Przedstawione w niniejszej pracy badania prowadzono w ramach realizacji pracy magisterskiej pierwszego autora, wykonywanej pod opieką prof. dr hab. Barbary Lis w Instytucie Biologii Uniwersytetu Opolskiego. 4 Lp. No. Numer ewidencyjny Registration number Miejsce zbioru Place of collection Charakterystyka Characteristic Haplotyp Haplotype 1. AM1 Opole suchy człon Hap_1 2. AM5 Opole świeży człon Hap_1 3. AM6 Opole świeży człon Hap_1 4. AM7 Opole świeży człon Hap_1 5. AM8 Opole świeży człon Hap_1 6. AM9 Opole suchy człon Hap_1 Tabela 1. Dane lokalizacyjne zebranych okazów Dipylidium caninum wraz z ich charakterystyką i przypisanym haplotypem. Table. 1. Location data of collected Dipylidium caninum specimens along with their characteristics and assigned haplotype. Tabela 2. Lista sekwencji Dipylidium caninum pozyskanych z NCBI GenBank wraz z przypisanymi haplotypami. Table. 2. List of Dipylidium caninum sequences obtained from NCBI GenBank with assigned haplotypes. Lp. No. Numer akcesyjny Accession number Kraj pochodzenia Country of origin Haplotyp Haplotype 1. MG575740 USA Hap_1 2. MG575742 Francja Hap_1 3. MG575743 Azja Hap_1 4. MG575741 Nowa Zelandia Hap_1 5. MH040824 Słowenia Hap_1 6. MH040825 Słowenia Hap_1 7. MH040826 Słowenia Hap_1 8. MH040827 Francja Hap_1 9. MH040828 Francja Hap_1 10. MH040829 Węgry Hap_1 11. MH040830 Niemcy Hap_1 12. MH040831 Portugalia Hap_1 13. MH040853 USA Hap_1 14. MH040854 USA Hap_1 15. MH040855 USA Hap_1 16. MH040856 USA Hap_1 17. MH040857 USA Hap_1 18. MH040858 USA Hap_1 19. MH040859 USA Hap_1 20. MH040860 USA Hap_1 21. MH040861 USA Hap_1 22. MH045472 Nowa Zelandia Hap_1 23. MH045473 Nowa Zelandia Hap_1 24. MH045474 Francja Hap_1 25. MH045475 Chiny Hap_1 26. MH045476 Chiny Hap_1 27. MH045477 RPA Hap_1 5 Lp. No. Numer akcesyjny Accession number Kraj pochodzenia Country of origin Haplotyp Haplotype 28. MH045478 RPA Hap_1 29. MH045479 RPA Hap_1 30. MH045480 RPA Hap_1 31. MH045481 RPA Hap_1 32. MG774549 Iran Hap_2 33. MH182478 USA Hap_3 34. OL376660 Irak Hap_3 35. OL413444 Irak Hap_3 36. MH182476 USA Hap_3 37. MH182477 USA Hap_3 38. MH040832 RPA Hap_3 39. MH040833 Czechy Hap_3 40. MH040834 Francja Hap_3 41. MH040835 Francja Hap_3 42. MH040836 Włochy (Sycylia) Hap_3 43. MH040837 Włochy (Sycylia) Hap_3 44. MH040838 Włochy (Sycylia) Hap_3 45. MH040839 Włochy (Sycylia) Hap_3 46. MH040840 Włochy (Sycylia) Hap_3 47. MH040841 Francja Hap_3 48. MH040842 Włochy (Sycylia) Hap_3 49. MH040843 Włochy (Sycylia) Hap_3 50. MH040844 Włochy (Sycylia) Hap_3 51. MH040845 Włochy (Sycylia) Hap_3 52. MH040846 Włochy (Sycylia) Hap_3 53. MH040847 Włochy (Sycylia) Hap_3 54. MH040848 Włochy (Sycylia) Hap_3 55. MH040849 Włochy (Sycylia) Hap_3 56. MH040850 Włochy (Sycylia) Hap_3 57. MH040851 Francja Hap_3 58. MH040852 Francja Hap_3 59. MH045463 RPA Hap_3 60. MH045464 RPA Hap_3 61. MH045465 RPA Hap_3 62. MH045466 RPA Hap_3 63. MH045467 RPA Hap_3 64. MH045468 RPA Hap_3 65. MH045469 RPA Hap_3 66. MH045470 RPA Hap_3 67. MT048289 Federacja Saint Kitts i Nevis Hap_4 6 Tabela 3. Lista miejsc zmiennych pomiędzy sekwencjami haplotypów. Table. 3. List of variable sites between haplotype sequences. Pozycja nukleotydu w przyrównaniu Nucleotide position in the alignment Haplotyp 14 40 42 53 54 55 57 60 62 64 66 75 77 Hap_1 TC C G C TCTG G A T T Hap_2 C T T - - C G G C TG C C Pozycja nukleotydu w przyrównaniu Nucleotide position in the alignment Haplotyp 80 83 88 121 138 139 175 195 196 199 205 210 212 Hap_1 G C T T GCCAC C T A G Hap_2 A T C C - - T T T T C G A Pozycja nukleotydu w przyrównaniu Nucleotide position in the alignment Haplotyp 216 217 226 250 253 266 588 594 598 Hap_1 - - C G A T C C C Hap_2 G C G AG C T T T Ryc. 1. Sieć haplotypów skonstruowana z wykorzystaniem algorytmu Median-Joining. Kolory odpowiadają pochodzeniu geograficznemu analizowanych sekwencji. Pod nazwą haplotypów podano liczbę osobników do nich zaklasyfikowanych. Poprzeczne kreski odpowiadają liczbie mutacji pomiędzy haplotypami. Fig. 1. Haplotype network constructed using the Median-Joining algorithm. Colors correspond to the geographic origin of the analyzed sequences. The number of individuals assigned to each haplotype is indicated below the haplotype name. Hatch marks represent the number of mutations between haplotypes. 7 PIŚMIENNICTWO Abdullah S., Helps C., Tasker S., Newbury H., Wall R. 2019. Pathogens in fleas collected from cats and dogs: distribution and prevalence in the UK. Parasites & Vectors 12: 71. DOI: 10.1186/s13071-019-3326-x. Bandelt H.J., Forster P., Röhl A. 1999. Median-joining networks for inferring intraspecific phylogenies. Molecular Biology and Evolution 16: 37-48. DOI: 10.1093/oxfordjournals.molbev.a026036. Beugnet F., Labuschagne M., Fourie J., Guillot J., Farkas R., Cozma V., Halos L., Hellmann K., Knaus M., Rehbeing S. 2014. Occurrence of Dipylidium caninum in fleas from client-ownedcats and dogs in Europe using a new PCR detection assay. Veterinary Parasitology 205: 300–306. DOI: 10.1016/j.vetpar.2014.06.008 Beugnet F., Labuschagne M., de Vos C., Crafford D., Fourie J. 2018. Analysis of Dipylidium caninum tapeworms from dogs and cats, or their respective fleas; Part 2. Distinct canine and feline host association with two different Dipylidium caninum genotypes. Parasite 25: 31. DOI: 10.1051/parasite/2018029. East M. L., Kurze C., Wilhelm K., Benhaiem S., Hofer H. 2013. Factors influencing Dipylidium sp. infection in a freeranging social carnivore, the spotted hyaena (Crocutacrocuta). International Journal for Parasitology: Parasites and Wildlife 2: 257–265. Leigh J. W., Bryant D. 2015. PopART: Full-feature software for haplotype network construction. Methods in Ecology and Evolution 6: 1110–1116. Labuschagne M., Beugnet F., Rehbein S., Guillot J., Fourie J., Crafford D. 2018. Analysis of Dipylidium caninum tapeworms from dogs and cats, or their respective fleas; Part 1. Molecular characterization of Dipylidium caninum: genetic analysis supporting two distinct species adapted to dogs and cats. Parasite 25: 30. DOI: 10.1051/parasite/2018028. Low V.L., Prakash B.K., Tan T.K., Sofian-Azirun M., Anwar F.H.K., Vinnie-Siow W.Y., Abubakar S. 2017. Pathogens in ectoparasites from free-ranging animals: Infection with Rickettsia asembonensis in ticks, and a potentially new species of Dipylidium in fleas and lice. Veterinary Parasitology 245: 102–105. Molina C. P., Ogburn J., Adegboyega P. 2003. Infection by Dipylidium caninum in an infant. Archives of Pathology & Laboratory Medicine 127(3): 157–159. DOI: 10.5858/2003-127-e157-IBDCIA. Rozas J., Ferrer-Mata A., Sánchez-DelBarrio J.C., Guirao-Rico S., Librado P., Ramos-Onsins S.E., SánchezGracia A. 2017. DnaSP 6: DNA sequence polymorphism analysis of large datasets. Molecular Biology and Evolution 34: 3299–3302. DOI: 10.1093/molbev/msx248. Rousseau J., Castro A., Novo T., Maia C. 2022. Dipylidium caninum in the twenty-first century: epidemiological studies and reported cases in companion animals and humans. Parasites & Vectors 15: 131. DOI: 10.1186/ s13071-022-05243-5. Szwaja B., Romański L., Ząbczyk M. 2011. A case of Dipylidium caninum infection in a child from the southeastern Poland. Wiadomości Parazytologiczne 57(3): 175–178. Tamura K., Stecher G., Kumar S. 2021. MEGA11: Molecular Evolutionary Genetics Analysis Version 11. Molecular Biology and Evolution 38(7): 3022–3027. Taylor T., Zitzmann M. B. 2011. Dipylidium caninum in a 4-month old male. Clinical Laboratory Science 24(4): 212–214. Accepted: 7 July 2025; published: 16 October 2025 Licensed under a Creative Commons Attribution License http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/