Toxicity of selected strains of cyanobacteria in in vivo and in vitro tests

UNIVERZITET U NOVOM SADU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA BIOLOGIJU I EKOLOGIJU TOKSIČNOST ODABRANIH SOJEVA CIJANOBAKTERIJA U IN VIVO I IN VITRO TESTOVIMA -DOKTORSKA DISERTACIJAMentor: Prof. dr Jelica Simeunović Kandidat: Petar Davidović Novi Sad, 2023. godine Zahvalnica Prvenstveno želim da izrazim zahvalnost svojoj mentorki prof. dr Jelici Simeunović, čije vođstvo, posvećenost i podrška tokom mog istraživačkog rada su bili od neprocenjive vrednosti, a od koje sam mnogo naučio, ne samo o nauci i mikrobiologiji, već i o profesionalnosti, poštenju i upornosti. Zahvaljujem se članovima komisije prof. dr Mihajli Đan, prof. dr Draganu Radnović, dr Aleksandru Pavić i doc. dr Dajani Blagojević na utrošenom vremenu i izuzetno korisnim savetima i komentarima u vezi ove doktorske disertacije. Zahvaljujem se prof. dr Zorici Svirčev na vremenu koje je izdvojila za pregled doktorske disertacije, kao i za vredne sugestije i komentare. Izražavam veliku zahvalnost profesorima i kolegama sa Katedre za mikrobiologiju na izuzetnoj saradnji, kolegijalnosti i pomoći u radu. Posebnu zahvalnost dugujem doc. dr Dajani Blagojević i dr Oliveri Babić na velikoj pomoći pri eksperimentalnom radu i vrednim savetima. Zahvaljujem se svojim prijateljima i kolegama Kuzmanović Ani i Gavrić Damiru koji su uvek bili izvor podrške i učinili moj istraživački rad daleko prijatnijim i inspirativnijim. Zahvaljujem se kolegama sa Katedre za genetiku pod rukovodstvom prof. dr Mihajle Đan, koji su svojim radom i korisnim savetima u velikoj meri doprineli sprovođenju predstavljenih istraživanja. Takođe, izražavam iskrenu zahvalnost prof. dr Milošu Tanurdžiću i članovima Škole bioloških nauka na Univerzitetu Kvinslend u Brizbejnu (Australija), čija stručnost i pomoć su bili presudni u proširenju mog razumevanja oblasti genomike i bioinformatike i oblikovanju toka ovog istraživanja. Zahvaljujem se prof. dr Nebojši Andrić i prof. dr Sonji Kaišarević, kao i istraživačima i saradnicima sa Katedre za fiziologiju životinja i Katedre za hidrobiologiju, koji su obezbedili eksperimentalne modele korišćene tokom ovog istraživanja i čiji saveti su bili od neizmernog značaja za sprovođenje eksperimenata. Zahvaljujem se članovima Naučnog instituta za veterinarstvo Novi Sad koji su omogućili da deo istraživanja u okviru disertacije bude sproveden u laboratorijama instituta. Duboko sam zahvalan svojoj porodici i prijateljima, bez čije podrške i razumevanja ovaj rad ne bi bio moguć. Zahvaljujem se Ministarstvu nauke, tehnološkog razvoja i inovacija i Fondu za nauku Republike Srbije na finansiranju Programa naučnoistraživačkog rada (Ev. Br. 451-03-47/202301/200125) i projekta pod nazivom „Molecular Methods for Supporting Microalgae as Biofactories“ (Ev. Br. 6445349), u okviru kojih su realizovana istraživanja ove doktorske disertacije. II УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ Природно-математички факултет КЉУЧНA ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА1 Врста рада: Докторска дисертација Име и презиме аутора: Петар Давидовић Ментор (титула, име, презиме, звање, институција) др Јелица Симеуновић, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Наслов рада: „Токсичност одабраних сојева цијанобатерија у in vivo и in vitro тестовима“ Језик публикације (писмо): Српски (латиница) Физички опис рада: Унети број: Страница - 229 Поглавља - 7 Референци - 508 Табела - 26 Слика - 15 Графикона - 40 Прилога - 1 Научна област: Биологија Ужа научна област (научна дисциплина): Микробиологија Кључне речи / предметна одредница: Цијанобактерије, Artemia salina, Daphnia magna, Danio rerio, Експресија гена, Цитотоксичност, Геномика Резиме на језику рада: Цијанобактерије представљају разноврсну групу микроорганизама познатих по продукцији високо потентних природних токсина који представљају озбиљну претњу по здравље људи, животиња и животне средине. Ови цијанотоксини се разликују по својој хемијској структури и механизму деловања, а често се у истом окружењу могу наћи различите класе, што чини процену њихових токсичних ефеката изазовном. Континуиран развој и усавршавање тестова за прецизнију детекцију, карактеризацију и процену ризика од цијанотоксина је главни императив, те се на глобалном нивоу све чешће наглашава потреба за приступом који би омогућио свеобухватно проучавање цијанотоксичности и праћење ефеката на различитим биолошким нивоима. У циљу решавања ових III изазова, развијају се различити алтернативни тестови и примењују модел организми, међу којима су у фокусу у погледу њихове корисности у унапређењу нашег разумевања ове области, водени кичмењаци и бескичмењаци. У складу са тим, формулисани су примарни циљеви ове докторске дисертације који су подразумевали процену акутне токсичности екстраката одабраних сојева цијанобактерија in vivo, код акватичних бескичмењака (Artemia salina и Daphnia magna) и кичмењака (Danio rerio) и идентификовање фактора који доводе до модулације њихове токсичности, укључујући доступност хранљивих материја, фотопериод и фазе раста. Додатно, истражени су токсични ефекти који се манифестују на молекуларном нивоу два модел организма, анализом релативних промена у експресији гена који реагују на токсине, како би се дефинисали неки од механизама токсичног деловања одабраних сојева. Поред тога, in vitro тест базирани на употреби ћелијске линије хуманог неуробластома је коришћен како би се одредио цитотоксични и неуротоксични потенцијал испитаних сојева. Коначно, један од основних циљева истраживања је подразумевао испитивање метаболичког потенцијала одабраних сојева да продукују одређене типове цијанобактеријских токсина користећи имунотест, геномску и биоинформатичку анализу. У серији тестова акутне токсичности, сојеви цијанобактерија су анализирани коришћењем D. magna, A. salina и D. rerio (зебрица) као модел организама. Резултати су показали да сојеви цијанобактерија испољавају токсичне ефекте зависне од дозе и времена излагања, са варијацијама специфичним за испитани сој. У тестовима са моделом D. magna, утврђена је отпорност ових организама према интрацелуларним екстрактима већине сојева, изузев соја Microcystis aeruginosa PCC 7806, који је показао одређени ниво токсичности, узрокујући мање од 25% смртности након 48 сати излагања. У анализи експресије гена користећи јединке D. magna као модел организме, утврђено је да су гени повезани са детоксикацијом, растом и репродукцијом реаговали на излагање цијанобактеријама. Гени попут cyp360A8, gst и p-gp су се показали као осетљиви индикатори токсичности цијанобактерија, показујући промене зависне од примењене дозе екстраката. Такође су детектоване значајне промене у експресији гена cyp314, што имплицира потенцијалан ефекат на процесе пресвлачења и раста код ових организама. Тестирањем токсичности сојева на модел организму D. rerio, утврђени су различити сублетални ефекти, као што су морфолошке абнормалности и измењене стопе излегања. Специфични ефекти су варирали у зависности од испитиваног соја, трајања излагања и концентрације екстракта. У анализи експресије гена код модел организма D. rerio, уочене су значајне промене у експресији гена повезаних са метаболизмом ксенобиотика (ahr2 и cyp1A1) и стрес ендоплазматског ретикулума (bip). Најзначајније промене су утврђене код гена abcb4, који је био значајно индукован након излагања сојевима цијанобактерија, што указује на активацију механизма мултиксенобиотске резистенције. Слични ефекти примећени код D. magna указују на заједнички механизам за метаболизам токсичних цијанобактеријских једињења код оба модел организма. У тестовима са врстом A. salina утврђена је токсичност свих цијанобактеријских сојева, при чему су водени сојеви (M. aeruginosa PCC 7806, Oscillatoria DTD-Bečej, Oscillatoria K3 и Oscillatoria Z1) показали укупно највећу токсичност. Додатно, откривена је позитивна корелација између концентрације азота и токсичности сојева, и повећана токсичност већине сојева након гајења у азотом богатијем окружењу. Оптимални нивои фосфора су стимулисали токсичност већине сојева до прага од 0.04 g L-1, изнад којег нису примећене значајне промене. Такође је испитан утицај IV трајања излагања светлости на токсичност цијанобактерија, уз уочене сличности у одговору сојева који припадају истом роду цијанобактерија на продужено излагање светлости током култивације. Добијени резултати утицаја фазе раста на токсичност наглашавају значајан ефекат фазе раста на продукцију токсичних метаболита тестираних сојева. Утврђено је да је највећа токсичност забележена у екстрактима већине сојева добијених током стационарне фазе раста (након 21 и 35 дана култивације). У случају сојева рода Oscillatoria регистровано је значајно прогресивно повећање токсичности и током фазе експоненцијалног раста и након уласка у стационарну фазу, што указује на континуирану производњу токсичних једињења током свих фаза раста. Након испитивања ефектата цијанобактеријских екстраката на ћелије хуманог неуробластома, утврђена је дозно-зависна цитотоксичност код већине сојева. Варијабилност у одговору ћелија примећена је при продуженом излагању специфичним сојевима, што указује на различите саставе екстраката и њихов ефекат на овај тип ћелија. Након употребе ензимског теста (ELISA) у детекцији еквивалената микроцистина (MC-LR) у екстрактима цијанобактерија, утврђена је веома ниска концентрација за већину сојева. Овај резултат сугерише да микроцистини и нодуларини нису примарно одговорни за уочену токсичност у примењеним биолошким тестовима. Значајан допринос ове докторске дисертације огледа се у формирању колекције секвенци генома аутохтоних водених и земљишних сојева цијанобактерија изолованих са подручја Републике Србије, представљајући прва таква истраживања на овим просторима. С обзиром на то да на светском нивоу постоји стална потреба за допуњавањем геномских база цијанобактерија новим секвенцама, резултати ових истраживања ће значајно допринети доступности нових 9 секвенцираних генома који припадају родовима Anabaena, Nostoc i Oscillatoria. Геномском анализом цијанобактеријских сојева је откривена изузетна разноликост метаболичких путева, са специфичним кластерима гена одговорним за производњу различитих токсичних једињења. Кластери гена за биосинтезу микроцистина откривени су искључиво у геному терестричног соја Ностоц LC1B, у складу са резултатима ELISA тестова. У геномима водених сојева Oscillatoria K3 и Oscillatoria Z1 идентификовани су кластери гена за производњу цитотоксина цилиндроспермопсина са значајном покривеношћу. Код осталих испитаних сојева су детектовани кластери гена за производњу специфичних токсичних једињења, као што су анабенопептин, микровиридин Ј, микровиридин Н9, јамајкамид А, сцитоцикламид А, ностоклид Н9, хектоклорин и пуваинафицин Ф. У циљу доказивања продукције и идентификације таквих токсичних метаболита и дубљег разумевања њихове активности, неопходна су даља испитивања и примена протеомских и метаболомских анализа. Датум прихватања теме од стране надлежног већа: 12.11.2020. Датум одбране: (Попуњава одговарајућа служба) V Чланови комисије: (титула, име, презиме, звање, институција) Председник: др Драган Радновић, редовни професор, Природноматематички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: др Јелица Симеуновић, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: др Михајла Ђан, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: др Дајана Благојевић, доцент, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: др Александар Павић, виши научни сарадник, Институт за молекуларну генетику и генетичко инжењерство Напомена: 1 Аутор докторске дисертације потписао је и приложио следеће Обрасце: 5б – Изјава о ауторству; 5в – Изјава o истоветности штампане и електронске верзије и о личним подацима; 5г – Изјава о коришћењу. Ове Изјаве се чувају на факултету у штампаном и електронском облику и не кориче се са тезом. VI UNIVERSITY OF NOVI SAD FACULTY OF SCIENCES KEY WORD DOCUMENTATION1 Document type: Doctoral dissertation Author: Petar Davidović Supervisor (title, first name, last name, position, institution) dr Jelica Simeunović, full professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad Thesis title: “Toxicity of selected strains of cyanobacteria in in vivo and in vitro tests” Language of text (script): Serbian (latin) Physical description: Number of: Pages - 229 Chapters - 7 References - 508 Tables - 26 Illustrations - 15 Graphs - 40 Appendices - 1 Scientific field: Biology Scientific subfield (scientific discipline): Microbiology Subject, Key words: Cyanobacteria, Artemia salina, Daphnia magna, Danio rerio, Gene expression, Cytotoxicity, Genomics VII Abstract in English language: Cyanobacteria are a diverse group of organisms known for producing highly potent cyanotoxins which pose significant threats to human, animal, and environmental health. These toxins have diverse chemical structures and toxicity mechanisms and several toxin classes can be present simultaneously, making it difficult to assess their toxic effects using physico-chemical methods. Continued development and refinement of assays is necessary for their improved detection, characterization, and risk assessment and emphasizes the need for a multi-level approach to studying cyanotoxicity. To address these challenges, alternative tests and model organisms among aquatic vertebrates and invertebrates are continually explored for their utility in advancing our understanding of this field. The primary objectives of this doctoral dissertation were to evaluate the acute toxicity of extracts of selected cyanobacterial strains in vivo, in aquatic invertebrate (Artemia salina and Daphnia magna) and vertebrate (Danio rerio) organisms and identify factors that lead to modulation of their toxicity, including nutrient availability, light period and growth phase. Furthermore, the study aimed to explore the toxic effects manifesting at the molecular level by analyzing the relative changes in the expression of toxin-responsive genes, in order to define some of the mechanisms of toxic action of the selected strains. Additionally, in vitro tests using a human neuroblastoma cell line were utilized to determine their cytotoxic and neurotoxic potential. Lastly, the research aimed to examine the potential of selected strains to produce the best studied groups of cyanobacterial toxins using an immunoassay and various bioinformatics tools. In a series of acute toxicity tests, cyanobacteria strains were evaluated using Daphnia magna, Artemia salina, and Danio rerio (zebrafish) as model organisms. The results showed that cyanobacterial strains exhibited doseand time-dependent toxic effects, with variations specific to the strain. D. magna proved resistant to most strains, except for Microcystis aeruginosa PCC 7806, which exhibited mild toxicity, causing less than 25% mortality after 48 hours of exposure. In contrast, D. rerio displayed strain-dependent sublethal effects, such as morphological abnormalities and altered hatching rates. The specific effects varied based on the strain, exposure duration, and concentration. In the gene expression analysis using D. magna as the model organism, the study revealed that genes related to detoxification, growth, and reproduction responded to cyanobacterial exposure. Genes like cyp360A8, gst, and p-gp were sensitive indicators of cyanobacterial toxicity, displaying dosedependent changes. The study also noted significant shifts in the cyp314 gene expression, implying potential impacts on molting and growth processes, warranting further investigation. In the analysis of gene expression in Danio rerio (zebrafish), significant changes were observed in genes related to xenobiotic metabolism (ahr2, cyp1A1) and endoplasmic reticulum stress (bip). Notably, the abcb4 gene was prominently induced after exposure to specific cyanobacterial strains, indicating the activation of a multixenobiotic resistance mechanism. Similar effects observed in D. magna suggested a shared mechanism for metabolizing toxic cyanobacterial compounds in both model organisms. The A. salina tests indicated toxicity in all cyanobacterial strains, with aquatic strains, including M. aeruginosa PCC 7806, Oscillatoria DTDBečej, Oscillatoria K3, and Oscillatoria Z1, exhibiting the highest toxicity. Furthermore, the study investigated the relationship between cyanobacterial VIII growth conditions and toxicity. It revealed a positive correlation between nitrogen concentration and strain toxicity, particularly in nitrogen-rich environments. Optimal phosphorus levels stimulated toxicity in most strains up to a threshold of 0.04 g L-1, beyond which no significant changes were observed. The influence of light exposure duration on cyanobacterial toxicity was also examined, with observed similarities in the response of strains belonging to the same cyanobacterial genus to prolonged exposure to light during cultivation. The research also emphasized the impact of growth phases on toxicity. It found that the highest toxicity was recorded in extracts of most strains obtained after 21 and 35 days of cultivation, particularly during the stationary growth phase. Interestingly, for strains of the genus Oscillatoria, a significant progressive increase in toxicity was observed during the exponential growth phase and continued after entering the stationary phase, suggesting continuous production of toxic compounds throughout all growth phases. Moreover, the study investigated the effects of cyanobacterial extracts on human neuroblastoma cells, revealing dose-dependent cytotoxicity of most strains. Variability in the response of cells was noted with prolonged exposure to specific strains, indicating different compositions of extracts and their effects on cell types. Тhe study used an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) to assess the content of microcystin (MC-LR) equivalents in cyanobacterial extracts, which was found to be very low in most strains. This result suggested that microcystins and nodularins were not primarily responsible for the observed toxicity in the applied bioassays. Lastly, genomic analysis of the cyanobacterial strains uncovered a remarkable diversity of metabolic pathways, with specific gene clusters responsible for the production of various toxic compounds. Gene clusters for microcystin biosynthesis were detected exclusively in the genome of the terrestrial strain Nostoc LC1B, consistent with ELISA results. In the genomes of aquatic strains Oscillatoria K3 and Oscillatoria Z1, gene clusters for the production of the cytotoxin cylindrospermopsin were identified with significant coverage. Furthermore, other strains displayed gene clusters for the production of specific toxic compounds, such as anabenopeptin, microviridin J, microviridin N9, jamajkamid A, scitocyclamide A, nostoclide N9, hectochlorin, and puvainaphicin F. To confirm the production of these identified toxic metabolites and gain a deeper understanding of their activity, further testing and the application of proteomic and metabolomic analysis were deemed necessary. Sequencing the entire genomes of these strains marked a significant contribution to the understanding of cyanobacteria in the Republic of Serbia, representing the first comprehensive research of its kind in the region. The data contributed to the availability of sequenced genomes for genera Anabaena, Nostoc, and Oscillatoria, enhancing our global knowledge of these organisms and their potential impacts on aquatic ecosystems and human health. Accepted on Scientific Board on: 12.11.2020. XV Slika 39. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc 2S3B na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ............................................................................... 110 Slika 40. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc LC1B na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ............................................................................... 112 Slika 41. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc Z1 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ............................................................................... 113 Slika 42. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Oscillatoria DTDBečej na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ................................................................ 115 Slika 43. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Oscillatoria K3 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ............................................................................... 116 Slika 44. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Oscillatoria Z1 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. ............................................................................... 117 Slika 45. Različite grupe biotestova i njihove prednosti u ispitivanju cijanobakterijske toksičnosti .................................................................................................................................................................. 148 Slika 46. Uticaj cijanobakterijskih ekstrakata (1 – Anabaena Č2; 2 – Anabaena Č5; 3 – Microcystis aeruginosa PCC 7806; 4 – Nostoc 2S1; 5 – Nostoc 2S3B; 6 – Nostoc LC1B; 7 – Nostoc Z1; 8 – Oscillatoria DTD-Bečej; 9 – Oscillatoria K3; 10 – Oscillatoria Z1) na vijabilnost SH-SY5Y ćelija predstavljen kao procenat citotoksičnosti (%CI) utvrđen nakon 24h (A) i 72h (B) izlaganja.. ............................................................................................................................................... 150 Slika 47. Grafički prikaz koncentracije MC-LR ekvivalenata u uzorcima cijanobakterijskih kultura utvrđene primenom ELISA testa za mikrocistine ............................................................................... 154 Slika 48. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Anabaena Č2 .................................................................................................................................................................. 157 Slika 49. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Anabaena Č5 .................................................................................................................................................................. 159 Slika 50. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Nostoc 2S1 .................................................................................................................................................................. 160 Slika 51. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Nostoc 2S3B .................................................................................................................................................................. 161 Slika 52. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Nostoc LC1B .................................................................................................................................................................. 163 Slika 53. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Nostoc Z1 . 164 Slika 54. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Oscillatoria K3 .................................................................................................................................................................. 165 Slika 55. Biosintetički klasteri i podudaranja specifičnih regiona u genomu soja Oscillatoria Z1 .................................................................................................................................................................. 167 XVI Lista tabela Tabela 1. Prikaz najbolje istraženih grupa cijanotoksina, do sada identifikovanih producenata i biosintetičkih gena .................................................................................................................................. 25 Tabela 2. Odabrani sojevi cijanobakterija iz Novosadske kolekcije kultura cijanobakterija (NSCCC) i Pasterove kolekcije kultura (PCC). ..................................................................................... 43 Tabela 3. Sastav mineralne podloge BG 11 po recepturi opisanoj u Rippka i sar. (1979). .... 45 Tabela 4. Prikaz subletalnih i letalnih promena koje se mogu detektovati u definisanim vremenskim tačkama kod ispitivanih embriona D. rerio nastalih usled izlaganja dejstvu cijanobakterijskih ekstrakata .................................................................................................................. 49 Tabela 5. Spisak korišćenih prajmera i njihovih nukleotidnih sekvenci u biotestu D. magna ...... 52 Tabela 6. Spisak korišćenih prajmera i njihovih nukleotidnih sekvenci u biotestu D. rerio .......... 53 Tabela 7. Sastav veštačke morske vode - ASW podloga (Artificial sea water) .......................... 56 Tabela 8. Akutna toksičnost cijanobakterijskih DMSO ekstrakata u biotestu D. magna, posle 24 i 48h izlaganja. ......................................................................................................................................... 63 Tabela 9. Uticaj koncentracije azota na akutnu toksičnost odabranih sojeva u biotestu Artemia salina. ....................................................................................................................................................... 123 Tabela 10. Uticaj promene koncentracije azota tokom kultivacije na toksičnost ispitivanih sojeva - Rezultati jednosmerne ANOVA analize.. ........................................................................................ 126 Tabela 11. Uticaj koncentracije fosfora na akutnu toksičnost odabranih sojeva u biotestu Artemia salina. R .................................................................................................................................................... 131 Tabela 12. Uticaj promene koncentracije fosfora tokom kultivacije na toksičnost ispitivanih sojeva - Rezultati jednosmerne ANOVA analize.. ........................................................................................ 134 Tabela 13. Uticaj svetlosnog režima na akutnu toksičnost odabranih sojeva u biotestu Artemia salina. ....................................................................................................................................................... 137 Tabela 14. Uticaj svetlosnog režima tokom kultivacije na toksičnost ispitivanih sojeva - Rezultati jednosmerne ANOVA analize.. ........................................................................................................... 140 Tabela 15. Uticaj faze rasta kulture na akutnu toksičnost odabranih sojeva u biotestu Artemia salina. ....................................................................................................................................................... 143 Tabela 16. Uticaj faze rasta kulture na toksičnost ispitivanih sojeva - Rezultati jednosmerne ANOVA analize. .................................................................................................................................... 146 Tabela 17. Inhibitorne koncentracije (IC50 i IC10) i intervali poverenja od 95% za uticaj ekstraktata cijanobakterija na vijabilnost ćelija SH-SY5Y (µg mL-1). .......................................... 151 Tabela 18. Koncentracije MC-LR ekvivalenata u uzorcima cijanobakterijskih kultura utvrđene primenom ELISA testa za mikrocistine. Rezultati su prikazani kao ppb (engl. parts per billion; jedan deo na milijardu), uz vrednosti standardne greške (SEM) za svaki od rezultata. ......... 153 Tabela 19. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Anabaena Č2 .......................................................................................................................................... 156 Tabela 20. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Anabaena Č5 .......................................................................................................................................... 158 Tabela 21. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Nostoc 2S1 .............................................................................................................................................. 159 Tabela 22. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Nostoc 2S3B ........................................................................................................................................... 160 Tabela 23. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Nostoc LC1B ............................................................................................................................................ 162 XVII Tabela 24. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Nostoc Z1 ................................................................................................................................................ 163 Tabela 25. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Oscillatoria K3 ........................................................................................................................................ 164 Tabela 26. Predviđeni biosintetički klasteri i podudaranja genskih sekvenci u genomu soja Oscillatoria Z1 ........................................................................................................................................ 166 XVIII Lista skraćenica abcb4 Gen koji kodira membranski protein koji je član superfamilije ATP-vezujućih kasetnih (ABC) transportera AChE Acetilholinesteraza ADDA 3-amino-9-metoksi-2,6,8-trimetil-10-fenildeka-4,6-dienoična kiselina ahr2 Aril-ugljovodonični receptor ALS Amiotrofična lateralna skleroza AMPA α-amino-3-hidroksi-5-metilisoksazol-4-propionska kiselina, glutamatni receptor ANOVA Analize varijanse ASW Veštačka morska voda (engl. Artificial sea water) Bax Pro-apoptotički član porodice gena Bcl-2 (engl. Bcl-2 Associated X-protein) Bcl-2 Proteini porodice B-ćelijskog limfoma-2 koji regulišu programiranu ćelijsku smrt BG11 Tečna mineralna podloga za cijanobakterije (engl. Blue Green Algae Medium) BGK Biosintetički genski klaster BLAST Alat za pretragu lokalnog poravnanja (engl. The Basic Local Alignment Search Tool) bip Gen koji kodira vezujući imunoglobulinski protein (engl. Binding Immunoglobulin Protein) BMAA β-metilamino-L-alanin Caco-2 Ćelijska linija izvedena iz tkiva kolorektalnog adenokarcinoma čoveka CaMKII Ca2+/kalmodulin zavisna protein kinaza II cDNK Komplementarna DNK CI 95% Interval poverenja od 95% (engl. Confidence interval 95%) CI% Procenat citotoksičnosti Ct Prag ciklusa PCR reakcije (engl. Cycle Threshold) CYN Cilindrospermopsin CYP450 Citohrom P450 superfamilija enzima cyp1a1 Citohrom P450 familija 1, podfamilija A cyp314 Citohrom P450 familija 314 cyp360 Citohrom P450 familija 3 D-Glu D-glutaminska kiselina D-MeAsp D-eritro-metilasparaginska kiselina XIX DMSO Dimetil sulfoksid DNK Dezoksiribonukleinska kiselina EC50 efektivna koncentracija; koncentracija pri kojoj se javlja ispitivani efekat kod 50% tretiranih jedinki ELISA Enzimski imuno-vezujući test EPD Edem perikardijalne duplje ER stres Stres endoplazmatskog retikuluma EŽK Edem žumančane kese FET Test akutne toksičnosti sa ribljim embrionom (engl. Fish embryo toxicity assay) FTS Fetalni teleći serum GSH Glutation GST Glutation-S transferaza GTX II Gonijautoksin II GTX II/III Mešoviti gonijautoksin II plus III HepG2 Ćelijska linija izvedena iz humanog hepatoma HPLC Tečna hromatografija visokih performansi iRNK Informaciona RNK LArg L-arginin LAP Linearni peptidi koji sadrže azole/azoline LC50 Letalna koncentracija koja dovodi do letalnog efekta kod 50% izloženih jedinki LPS Lipopolisaharid MALDI-TOF Matricom potpomognuta laserska jonizacija MAPK Mitogen aktivirajuće protein kinaze MC Mikrocistin MC-LA Mikrocistin-LA, leucin, alanin MC-LR Mikrocistin-LR, leucin, arginin MC-RR Mikrocistin-RR, arginin, arginin mcy Geni mikrocistin sintetaze MC-YR Mikrocistin-YR, tirozin, arginin MeDhb N-metildehidrobutirin MEM Minimum Essential Medium Eagle MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide] XX NeK2 Serin/treonin-protein kinaza NEO Neosaksitoksin NGS Metoda sekvenciranja nove generacije (engl. Next Generation Sequencing) NMDA N-metil-D-aspartat, glutamatni receptor NOD Nodularin NRPS Neribozomalne peptidne sintetaze NSCCC Novosadska kolekcija kultura cijanobakterija OATP Organski transportni sistem anjona OECD Organizacija za ekonomsku saradnju i razvoj (engl. Organisation for Economic Co-operation and Development) OGD Deformiteti glave i oka ORF Otvoreni okvir čitanja (engl. Open reading frame) p53 Tumor protein p53 PCC Pasterova kolekcija cijanobakterija (engl. Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria) PCR Lančana reakcije polimeraze P-gp P-glikoprotein PKS Poliketid sintaze PP1 Protein fosfataza tipa 1 PP2A Protein fosfataza tipa 2A PPIA Test inhibicije protein fosfataze (engl. Protein Phosphate Inhibition Assay) qPCR Kvantitativna lančana polimerazna reakcija RNK Ribonukleinska kiselina rpl Ribozomalni protein RiPP Ribozomalno sintetisani i post-translaciono modifikovani peptidi RT-qPCR Kvantitativna lančana polimerazna reakcija u realnom vremenu (engl. realtime quantitative PCR) SD Skeletni deformiteti SH-SY5Y Ćelijska linija humanog neuroblastoma SNP Polimorfizam pojedinačnih nukleotida (engl. Single Nucleotide Polymorphism) STX Saksitoksin TP Ukupan fosfor (engl. Total Phosphorus) USEPA Agencija za zaštitu životne sredine Sjedinjenih Država (engl. United States Environmental Protection Agency) XXI vtg Gen koji je odgovoran za produkciju istoimenog prekursora žumančanog proteina vitelina WHO Svetska zdravstvena organizacija (engl. World Health Organization) 7-deoxyCYN 7-deoksi-cilindrospermopsin 7-epi-CYN 7-epi-cilindrospermopsin 1. Uvod 2 1.1. Cijanobakterije (Modro-zelene alge) Cijanobakterije (Cyanophyta, Cyanophyceae, Cyanoprokaryota, Cyanobacteria) su ubikvitarna grupa morfološki raznovrsnih i ekološki izuzetno značajnih prokariotskih mikroorganizama. Poznate su takođe pod nazivom modro-zelene alge zbog morfoloških i metaboličkih sličnosti sa eukariotskim algama, kao i činjenice da poseduju hlorofil umesto bakteriohlorofila i sposobnosti oksigene fotosinteze (Palmer, 1962). Međutim, nakon primene modernijeg integrativnog taksonomskog pristupa koji uključuje biohemijske, ekološke, genetičke i molekularne analize, utvrđeno je da se radi o oksigenim fototrofnim bakterijama (Holt i sar., 1994). Istraživanja ultrastrukture ćelija cijanobakterija jasno pokazuju nedostatak jedra i drugih organela, kao i prisustvo peptidoglikanskog ćelijskog zida i lipopolisaharidne spoljašnje membrane, što su karakteristike Gram-negativnih Eubakterija (Vincent, 2009). Međutim, ćelijski zid cijanobakterija karakteriše deblji sloj peptidoglikana (10 – 40 nm) u poređenju sa tipičnim Gram-negativnim bakterijama (2 – 6 nm) (Hoiczyk i Hansel, 2000). Postoje podaci koji svrstavaju cijanobakterije među najstarije forme života na Zemlji. Najstariji poznati fosilni ostaci filamentoznih organizama, u velikoj meri nalik današnjim cijanobakterijama, pronađeni su u Zapadnoj Australiji (Schopf i Packer, 1987). Procenjeno je da su ovi nalazi stari između 3.3 i 3.5 milijardi godina, što ujedno predstavlja i najstariji dokumentovan nalaz očuvane mikrobiote. Kao jedna od najstarijih grupa oksigenih fotoautotrofa, smatra se da su cijanobakterije imale izuzetno značajnu ulogu u inicijalnoj oksigenaciji atmosfere pre približno 2.32-2.45 milijarde godina (Schirrmeister i sar., 2013). Akumulacija kiseonika u atmosferi je dovela do biološke inovacije u vidu aerobne respiracije, kao metabolički i energetski daleko efikasnijeg procesa u odnosu na anaerobni tip, čime je omogućen nastanak kompleksnih, višećelijskih, energetskiefikasnih eukariotskih organizama (Dismukes i sar., 2000). Jedan od mogućih dokaza se može pronaći u činjenici da pored oksigene fotosinteze određene, danas prisutne vrste, imaju sposobnost da vrše anoksigenu fotosintezu uz upotrebu vodonik-sulfida kao donora elektrona (Holland, 2006). Smatra se da su upravo cijanobakterije koje poseduju obe navedene adaptacije igrale fundamentalnu ulogu u globalnom ciklusu ugljenika, kiseonika i sumpora u proterozojskim okeanima (Hamilton i sar., 2018). Činjenica da cijanobakterije danas opstaju u širokom spektru različitih akvatičnih i terestričnih staništa, pripisuje se upravo ovako dugom periodu evolutivne adaptacije. Iako se prvenstveno javljaju u površinskim vodama, njihova nesvakidašnja sposobnost tolerancije promena temperature, intenziteta svetlosti i saliniteta (Ierson, 2017), kao i niz specifičnih fizioloških, metaboličkih i biohemijskih karakteristika, omogućili su im opstanak u staništima koja odlikuju ekstremni uslovi, među kojima su slatine, termalni izvori, pa i pustinje i zaleđena okruženja (Buratti i sar., 2017). Cijanobakterije su često prvi organizmi koji nastanjuju ogoljene površine stena ili zemljišta, gde predstavljaju značajne komponente funkcionalnih procesa kruženja nutritivnih elemenata (Whitton, 1992). Često se javljaju u asocijacijama sastavljenih od različitih vrsta prokariotskih i eukariotskih mikroorganizama koji formiraju koherentne, slojevite strukture u vidu pokrivača ili biofilmova i takve asocijacije predstavljaju predominantne i ponekad čak i jedine oblike života u pojedinim ekstremnim staništima. Ipak, cijanobakterije se najefikasnije razvijaju u slatkovodnim, marinskim i braktičnim ekosistemima (Kulasooriya, 2011), gde je njihova dominacija uslovljena varijetetom njima svojstvenih fizioloških prednosti. U poređenju sa ostalim prokariotskim grupama mikroorganizama, morfologija cijanobakterija je posebno raznovrsna i kompleksna (Castenholz, 2015). Građu njihovog vegetativnog tela 3 (talusa) može odlikovati jednoćelijska, kolonijska ili višećelijska filamentozna (končasta) forma sa lažnim ili pravim grananjem (Kulasooriya, 2011; Castenholz, 2015). Veličina samih ćelija cijanobakterija može varirati između 0.5 µm (npr. vrste roda Prochlorococcus) i 50-100 µm (kod određenih vrsta rodova Chroococcus i Oscillatoria). U slučaju jednoćelijskih i kolonijskih formi, oblik ćelija može biti sferičan, štapićast ili fuziforman, dok ćelije filamentoznih cijanobakterija mogu biti diskoidnog ili valjkastog oblika, sa trihomima koji mogu dostići milimetarske dužine (Garcia-Pichel, 2009). Talusi cijanobakterija filamentozne forme mogu biti sastavljeni od istovetnih ćelija, kada se označavaju kao homocitni talusi, dok se forme koje pored ćelija tipične strukture sadrže i pojedine specijalizovane ćelije nastale diferenciranjem od vegetativnih nazivaju heterocitnim (Blaženčić, 1998). Razmnožavanje cijanobakterija se najčešće odvija putem proste ćelijske deobe kod jednoćelijskih i kolonijskih oblika, dok kod filamentoznih oblika specijalizovane strukture poput hormogonija ili hormocisti mogu imati ulogu u reprodukciji (Campbell i Meeks, 1989; Meeks i Elhai, 2002). Hormogonije su kratki, pokretni delovi filamenata koji se u povoljnim uslovima mogu transformisati u samostalne jedinke, što omogućava cijanobakterijama da se brzo šire i kolonizuju nova staništa (Damerval i sar., 1991). S druge strane, hormociste se javljaju u grupama i okružene su zajedničkim debelim omotačem, štiteći ćelije od ekstremnih temperatura, suše ili drugih nepovoljnih faktora okoline (Blaženčić, 1998). Kada se uslovi poboljšaju hormociste mogu klijati, a nove jedinke mogu izrasti iz ovih zaštićenih struktura. Cijanobakterije odlikuje povoljan energetski balans, kao i niska konstanta energetske homeostaze, što znači da im je potrebno manje energije za održavanje normalnog funkcionisanja i strukture ćelija u odnosu na ostale fitoplanktonske organizme (Forchhammer i Selim, 2019). Na ovaj način je cijanobakterijama omogućeno da održe svoje populacije čak i u uslovima slabijeg intenziteta svetlosti ili pri veoma niskim koncentracijama nutrijenata dostupnih u okruženju (Jones i sar., 2018). Fotosintetski pigmenti cijanobakterija uključuju pored hlorofila a i karotenoida, pomoćne pigmente - fikocijanin, alofikocijanin i fikoeritrin (Vincent, 2009), što im omogućava korišćenje svetlosti iz spektra između 400 i 700 nm talasne dužine, uključujući i zonu zelenog svetla (550-650 nm) koju apsorbuju daleko efikasnije u odnosu na većinu grupa zelenih algi i biljaka. Pored toga, pojedine vrste, specifično planktonski oblici, obrazuju vodonepropusne proteinske strukture nazvane “gasne vakuole” sa ulogom u promeni vertikalnog položaja u vodi (Mogany, 2014). Sposobnost regulacije vertikalnog položaja u vodi predstavlja veliku kompetitivnu prednost nad mnogim fitoplanktonskim vrstama koje ne mogu dospeti do izvora nutrijenata nižih nivoa vodenog stuba, u kojima se cijanobakterije nesmetano razvijaju upravo zahvaljujući specifičnom sastavu fotosintetičkih pigmenata. Mnoge vrste mikroalgi takođe poseduju aktivne sisteme za transport ugljendioksida i bikarbonata, međutim, istraživanja su pokazala da su ovi sistemi znatno efikasniji kod cijanobakterija (Boqiang i sar., 2013) i obezbeđuju im kompetitivnu prednost u uslovima povećane pH vrednosti, što je jedna od karakteristika eutrofnih jezera. Određene grupe filamentoznih cijanobakterija predstavljaju ključne biokatalizatore u ciklusu azota (Howarth i sar., 1988; Latysheva i sar., 2012) zahvaljujući procesu konverzije atmosferskog azota do amonijaka koji katališe enzim nitrogenaza, koja biva ireverzibilno inhibirana u prisustvu molekularnog kiseonika. Zapravo, cijanobakterije su jedini azotofiksatorski organizmi koji proizvode kiseonik kao sporedni proizvod fotosintetičkog procesa i istovremeno mogu regulisati neizbežno prisustvo molekularnog kiseonika sa suštinski anaerobnim enzimom (Berman-Frank i sar., 2003). Normalno funkcionisanje ovog osetljivog procesa omogućavaju specifične karakteristike strukture i metaboličke aktivnosti specijalizovanih ćelija - heterocisti prisutnih u talusu određenih vrsta (Mella-Herrera i sar., 2010). CIjanobakterije takođe mogu skladištiti esencijalne nutrijente u vidu glikopeptida, lipidnih inkluzija, 10 cijanobakterija se javljaju širom sveta (Carmichael, 1992; Simeunović i sar., 2005; Wood i sar., 2007; Drobac i sar., 2013). Putevi direktnog izlaganja uključuju ingestiju toksina hroničnim unosom kontaminirane pijaće vode, dermalni kontakt tokom rekreacionih aktivnosti, inhalaciju aerosolizovanih čestica ili intravenozni unos tokom medicinskih procedura (EPA, 2014). Indirektno izlaganje se može ostvariti putem konzumacije životinjskih ili biljnih proizvoda koji su prethodno bili izloženi cijanotoksinima, nakon čega se usled bioakumulacije toksični efekti mogu intenzivirati (Drobac i sar., 2013; Svirčev i sar., 2013). Bioakumulacija cijanotoksina se dešava u tkivima vodenih kičmenjaka i beskičmenjaka, uključujući ribe, školjke, zooplankton i organizme zoobentosa. Toksini se mogu akumulirati u ribama u značajnim količinama ako se riba uzgaja ili živi u vodama sa čestim cvetanjem cijanobakterija (Svirčev i sar., 2011). Zabeleženi efekti izloženosti ljudi i životinja toksinima iz ove grupe variraju od iritacije disajnih puteva, upale oka i kontaktnog dermatitisa do oštećenja jetre i bubrega, promena na nivou nervnog sistema, razvoja tumora, pa čak i smrti, pri čemu je ozbiljnost ovih efekata u velikoj meri određena dozom toksina kojoj je individua izložena (Slika 3) (Torokne i sar., 2001; Pilotto i sar., 2004; Abdallah i sar. (2021). Postoji veliki broj dokumentovanih slučajeva intoksikacije ljudi usled izlaganja cijanobakterijama i/ili cijanotoksinima. Toksično cvetanje cijanobakterija u vodama koje se koriste za vodosnabdevanje ili u rekreativne svrhe može predstavljati ozbiljan zdravstveni rizik za ljudsku populaciju (Falconer, 2007). Prvi potvrđen i dokumentovan slučaj trovanja povezan sa cijanobakterijama se desio na ostrvu Palm Island u Kvinslendu, Australija, 1979. godine (Byth, 1980). Cijanotoksinima je tada bilo izloženo 139 dece i 10 odraslih, pri čemu su simptomi uključivali povraćanje, glavobolju, bolove u stomaku s hepatomegalijom, letargiju, dijareju, acidozu i oštećenje jetre, bubrega, pluća i intestinuma. Navedeni simptomi su bili povezani sa konzumacijom vode za piće iz rezervoara kontaminiranog cijanobakterijama vrste Cylindrospermopsis raciborskii. Najpoznatiji slučaj trovanja ljudi sa letalnim ishodom, poznat pod nazivom “Karuaru sindrom”, desio se na klinici u hemodijalizu u Brazilu 1996. godine. Tada je za hemodijalizu pacijenata upotrebljena voda iz rezervoara u kojem je došlo do cvetanja cijanobakterija. Koncentracija cijanotoksina mikrocistina je bila 19.5 µg/L, a od posledica trovanja je umrlo 76 pacijenata (55%) (Carmichael i sar., 2001). Hronično izlaganje pojedinim grupama cijanotoksina, kao što je slučaj sa mikrocistinima, je povezano sa povećanom incidencom karcinoma jetre ili hroničnim oštećenjem i bolestima jetre (Svirčev i sar., 2017; Zheng i sar., 2017; Liu i sar., 2018; He i sar., 2018), kao i kolorektalnim karcinomom, karcinomom tankog creva (Zhou i sar., 2002; Svirčev i sar., 2013; Svirčev i sar., 2017) ili karcinomom želuca (Xu i sar., 2003), što je uslovilo da Internacionalna agencija za istraživanje kancera (IARC) toksin mikrocistin-LR klasifikuje kao moguću karcinogenu supstancu za čoveka (grupa 2B) (IARC, 2006). Važno je napomenuti da iako cijanobakterijske vrste sa potencijalom za produkciju toksina mogu biti prisutne u određenom okruženju, to ne mora nužno da čini životnu sredinu toksičnom, pošto se toksini ne proizvode konstantno u dovoljno visokim koncentracijama da predstavljaju rizik po zdravlje ljudi i životinja (Szlag i sar., 2015). Zapravo, toksičnost cijanobakterija je veoma varijabilna i kao takvu ju je izuzetno teško predvideti, čak i nakon identifikacije producenta i utvrđivanja njegove brojnosti u posmatranoj mikrobnoj zajednici. Ispitivanja Merel i sar. (2013) su pokazala da određeni sojevi imaju sposobnost da aktiviraju ili deaktiviraju gene povezane sa biosintezom toksina, u zavisnosti od uslova okoline. Neki od ovih specifičnih uslova, pretežno dostupnost hranljivih materija, temperatura i intenzitet svetlosti, mogu predstavljati važne trigerujuće faktore u produkciji toksina. Iz ovih razloga, razvoj preciznih i pouzdanih metoda za detekciju i kvantifikaciju toksičnosti cijanobakterija u različitim sredinama je od velikog značaja. 11 Poseban problem predstavlja veliki broj potencijalno toksičnih metabolita koje cijanobakterije mogu proizvoditi. Moguće je grubo klasifikovati ove metabolite prema njihovom toksičnom mehanizmu delovanja i ciljnom organu ili sistemu organa na hepatotoksine, neurotoksine, citotoksine, dermatotoksine i iritante (Tabela 1, Slika 5) (Wiegand i Pflugmacher, 2005; Meriluoto i sar., 2017). Slika 3. Prikaz nekih od mogućih toksičnih efekata cijanotoksina i kliničkih simptoma kod ljudi (Adaptirano iz Abdallah i sar. (2021)). 1.3.1. Hepatotoksični cijanotoksini Hepatotoksični peptidni cijanotoksini su najrasprostranjenija i najbolje proučena klasa cijanobakterijskih toksina. Cijanobakterije proizvode izuzetno širok spektar bioaktivnih peptida, među kojima osnovne klase čine mikrocistini, nodularini, eruginozini, mikroginini, cijanopeptolini, anabenopeptini, anabenopetidi, mikroviridini, ciklamidi (cijanobaktini) i nostoficini sa različitim stepenom toksičnosti (Mazur-Marzec i sar., 2013). Ovi jedinstveni ciklični peptidi poseduju različite bioaktivnosti, uključujući inhibiciju različitih grupa enzima (Janssen, 2019). Međutim, da bi se u potpunosti razumeli efekti i potencijalne opasnosti ovih peptida u životnoj sredini, istraživanja njihove biosinteze i toksičnosti na različitim biološkim nivoima organizacije su ključna za adekvatnu procenu rizika. Kao najčešće registrovani i najpotentniji izdvajaju se ciklični heptapeptidni mikrocistini (MC) i pentapeptidni nodularini (NOD) (Slika 5) (Rinehart i sar., 1988). Produkcija mikrocistina je zabeležena kod pripadnika nekoliko rodova slatkovodnih cijanobakterija, prvenstveno Microcystis, Nostoc, Anabaena, Anabaenopsis i Planktothrix (Merwe 2014), iako su ovi toksini detektovani i kod pojedinih terestričnih sojeva rodova Nostoc i Hapalosiphon (Prinsep i sar., 1992; Oksanen i sar., 2004), dok su nodularini detektovani kod vrste Nodularia spumigena (Sivonen i Jones, 2009) kao i kod pojedinih vrsta roda Nostoc (Gehringer i sar., 2012; Jokela i sar., 2017). Mehanizam toksičnog delovanja mikrocistina i 12 nodularina se temelji na inhibiciji aktivnosti enzima serin-treonin protein fosfataza tipa 1 i tipa 2A (PP1 i PP2A) u eukariotskim ćelijama, putem vezivanja za katalitičke subjedinice ovih enzima odgovorne za regulacije procesa replikacije DNK, ćelijske diferencijacije, metabolizma, apoptoze i drugih ćelijskih funkcija (Slika 4) (Campos i Vasconcelos, 2010). Blokiranjem aktivnih mesta protein fosfataza, ovi toksini sprečavaju formiranje holoenzima i time inhibiraju njihovu aktivnost, što dovodi do hiperfosforilacije proteina, disrupcije citoskeletnih struktura prevashodno u ćelijama jetre, poremećaja u njihovom obliku i na kraju do uništenja ćelije, nakon čega dolazi do hemoragije (Vasconcelos, 2001; Falconer, 2003). Međutim, da bi ispoljili svoje toksično dejstvo, toksini moraju prvo dospeti do ciljnog mesta delovanja. U slučaju mikrocistina, kako se radi o hidrofilnom molekulu, toksin ne može stupiti u ćelije pasivnim transportom već se apsorbuje aktivno zahvaljujući organskom transportnom sistemu anjona (OATP), nakon čega ulazi u hepatocite aktivnošću transportera žučne kiseline i OATP (Runnegar i sar., 1981). Kako isti transporteri mogu biti prisutni i u srcu, plućima, slezini, pankreasu, bubrezima i krvnomoždanoj barijeri, drugi organski sistemi i procesi takođe mogu biti pod uticajem ovih toksina. In vitro studije toksičnosti MC rađene sa imortalizovanim ćelijskim linijama koje nisu jetrene (epitelne ćelije, endotelne ćelije, ćelije humanog karcinoma debelog creva, ćelije humanog epidermoidnog karcinoma, ćelijska linija humanog neuroblastoma i druge) su pokazale da i organi kao što su kao što su bubrezi, pluća, creva i mozak mogu biti oštećeni ovim toksinima (Ito i sar., 2002; Botha i sar., 2004; Lankoff i sar., 2004; Žegura i sar., 2008). Kako su, međutim, potrebne veće koncentracije MC i duže vreme izlaganja da bi se izazvali efekti slični onima u hepatocitima, evidentno je da toksičnost direktno zavisi od koncentracije i trajanja izloženosti, što je određeno balansom između apsorpcije, detoksikacije i eliminacije MC iz ćelija. Utvrđene vrednosti LC50 (koncentracija koja dovodi do letalnog efekta kod 50% tretiranih jedinki) za mikrocistin-LR (MC-LR) na miševima (Swiss Webster i BALB/c sojevi) nakon 24 časovnog tretmana, kreću se od 5 do 10.9 mg kg-1 za oralnu primenu (Lovell i sar., 1989; Robinson i sar., 1989; Fawell i sar., 1999; Chernoff i sar., 2020) i 25 do 158 µg kg-1 za intraperitonealnu primenu(Lovell i sar., 1989; Robinson i sar., 1989; Fawell i sar., 1999; Kuiper-Goodman i sar., 1999; Boaru i sar., 2006; Chernoff i sar., 2020). Oštećenje jetre i hepatocita izazvano u oba slučaja je manifestovano na sličan način, pri čemu su hemoragija i apoptoza najizraženije promene (Runnegar i sar., 1981; Kuiper-Goodman i sar., 1999; Gupta i sar., 2003; Merel i sar., 2013). Pored toga, izlaganje mikrocistinu uzrokuje zagušenje (kongestiju) jetre krvlju, povećanje odnosa mase jetre i ukupne telesne mase i smanjenje nivoa glukoze i ukupnog proteina u serumu obolelih jedinki miša (Lovell et al., 1989; Robinson et al., 1989; Chorus et al., 2000). Vrednosti LC50 utvrđene za miševe nakon tretmana nodularinom (intraperitonealna injekcija) kreću se od 30 do 50 mg kg-1 (Terao et al., 1994; Runnegar et al., 2002). Iako je inhibicija protein fosfataza kod sisara smatrana ključnim mehanizmom toksičnog dejstva, pojedini radovi ukazuju na alternativne targete mikrocistina u ćelijama, kao što su aldehid dehidrogenaza II (Chen i sar., 2006) i ATP-sintaza (Mikhailo i sar., 2003), što je takođe jedno od mogućih objašnjenja za raznovrsne opisane efekte u izloženim organizmima. Neke od do sada opisanih specifičnih posledica aktivnosti mikrocistina u ćelijama pod uticajem uključuju povećanje oksidativnog stresa, narušavanje strukture i funkcije mitohondrija i disrupciju citoskeleta, što može potencijalno biti okidač apoptotičkih procesa (Campos i Vasconcelos, 2010; Lezcano i sar., 2012). Dodatno, utvrđeno je da mikrocistini mogu imati genotoksično i mutageno dejstvo (Štraser i sar., 2011; Žegura, 2016; Herrera i sar., 2018), prvenstveno usled formiranja reaktivnih vrsta kiseonika što dovodi do oksidativnog stresa i oštećenja DNK. Primenom mikronukleus testa, utvrđeno je da čak i koncentracije mikrocistina koje nisu direktno 13 citotoksične mogu značajno uticati na ćelijske linije poput Vero-E6 i HepG2, izazivajući hromozomske aberacije u vidu prekida ili gubitka hromozoma (Menezes i sar., 2013; Dias i sar., 2014). Poznato je takođe da dugotrajno izlaganje dejstvu mikrocistina može potencijalno dovesti do razvoja karcinoma jetre ili kolorektalnog karcinoma (Campos i Vasconcelos, 2010; Žegura i sar., 2011; Faltermann i sar., 2016). Smatra se da u osnovi mehanizma promocije nastanka tumora kod MC-LR leži interakcija sa mehanizmima reparacije DNK i specifičnim genima uključenim u proces apoptoze. Jedan od ovih gena je p53, koji funkcioniše kao transkripcioni transaktivator, igrajući ključnu ulogu u sistemu reparacije DNK, apoptozi i putevima supresije tumora (Takumi i sar., 2010). Protein P53 je supstrat za PP2A enzim (Takumi i sar., 2010) i stoga se smatra da njegova aktivnost može biti direktno regulisana od strane MC-LR. Nakon izlaganja MC-LR, p53 podleže hiperfosforilaciji, što dovodi do značajnog povećanja nivoa ekspresije ovog gena, čime se remeti normalan ćelijski ciklus i mehanizam supresije razvoja tumora (Guzman i sar., 2003). Pored p53, MC-LR takođe utiče na Bcl-2 familiju proteina, koji su većinski vezani za spoljašnju membranu mitohondrija i uključeni u regulaciju mitohondrijalne permeabilnosti i oslobađanje apoptogenih proteina (Fu i sar., 2005). Poznato je da MC-LR može izazvati povećanje u ekspresiji Bax proteina, proapoptotičkog člana porodice Bcl-2 (Fu i sar., 2005), dok je zabeleženo značajno smanjenje ekspresije Bcl-2, antiapoptotičkog proteina (Svirčev i sar., 2011). Iz sposobnosti MC-LR da inhibira ključne regulatorne proteine proizilazi povećanje aktivnosti protein kinaza kao što su mitogen aktivirajuće protein kinaze (MAPK), Ca2+/kalmodulin zavisna protein kinaza II (CaMKII) i NeK2 kinaza. Ovaj tip interakcije takođe može rezultirati promenom ćelijskih signalnih puteva, regulacijom apoptoze, povećanjem proliferacije i potencijalnom indukcijom razvoja tumora (Campos i Vasconcelos, 2010). Predloženo je nekoliko mehanizama za procese detoksikacije mikrocistina, uključujući aktivnost efluksnih proteinskih transportera poput P-glikoproteina (P-gp) i formiranje konjugata sa glutationom (GSH) pomoću glutation-S transferaza (GST), čime se olakšava njihovo izbacivanje iz ćelija (Campos i Vasconcelos, 2010). Međutim, u tom pravcu su potrebna dalja istraživanja da bi se u potpunosti razumeli i istražili ovi mehanizmi. 14 Slika 4. Šema usvajanja mikrocistina preko multispecifičnog OATP transportnog sistema aktivnog u različitim tipovima animalnih ćelija, toksičnog dejstva, biotransformacije i izlučivanja ovog toksina (Adaptirano iz Campos i Vasconcelos (2010)) 1.3.2. Citotoksični cijanotoksini Posebnu grupu cijanotoksina predstavljaju citotoksini koji izazivaju morfološke ili funkcionalne promene na nivou ćelija različitih tkiva i organa kičmenjaka. Cilindrospermopsini se javljaju kao grupa najbolje istraženih i najpotentnijih cijanobakterijskih citotoksina. Cilindrospermopsin (CYN) i njegovi analozi, sulfovani trociklični alkaloidi guanidina, se primarno produkuju od strane cijanobakterijske vrste Cylindrospermopsis raciborskii (Raphidopsis raciborskii) (Ohtani i Moore 1992; Kinnear, 2010). Identifikovani su, međutim i drugi producenti, uključujući vrste Umezakia natans, Aphanizomenon ovalisporum i vrste rodova Raphidopsis, Anabaena i Lyngbya. Nekoliko prirodnih kongenera cilindrospermopsina je do sada identifikovano, uključujući 7-deoksicilindrospermopsin (7-deoxy-CYN) (Norris i sar., 1999), 7-epi-cilindrospermopsin (7-epi-CYN) (Banker i sar., 2000), kao i 7-deoksi-desulfo-cilindrospermopsin i 7-deoksi-desulfo-12acetilcilindrospermopsin (Wimmer i sar., 2014). Iako su zvanično klasifikovani kao hepatotoksini, ovi toksini utiču na više organskih sistema i razlikuju se od prethodno opisane grupe po mehanizmu dejstva. U dosadašnjim istraživanjima je utvrđeno da cilindrospermopsin dovodi do ćelijske smrti kod miševa, pri čemu su zabeležene LC50 vrednosti od približno 2 mg kg-1 nakon 24 časa od intraperitonealne aplikacije (Ohtani i Moore, 1992; Falconer i sar., 1999; Runnegar i sar., 2002) i 0.2 mg kg-1 nakon 5-6 dana izlaganja (Sivonen i Jones, 2009). Ingestija CYN kod miševa može dovesti do oštećenja jetre, ali može uticati i na druge organe, uključujući bubrege, pluća, timus, slezinu, nadbubrežne žlezde i srce (Humpage i sar., 2005). Ovakvi slučajevi su posebno česti kada se ekstrakti cijanobakterija koji sadrže CYN ubrizgavaju intraperitonealno, jer je utvrđeno da mogu biti toksičniji i pokazati širi opseg toksičnosti u odnosu na prečišćen toksin (Humpage i sar., 2000; Shaw i sar., 2000; Puddick i sar., 2021). Inhibicija ćelijskog rasta i citotoksičnost su zabeleženi kod niza različitih ćelijskih linija sisara, uključujući ćelije jetre, bubrega, želuca i creva (Fessard i Bernard, 2003; Bain i sar., 2007; Neumann i sar., 15 2007; Froscio i sar., 2009). Pored primarnih hepatocita glodara, najčešće korišćene imortalizovane ćelijske linije su Caco-2, izvedene iz humanog kolorektalnog adenokarcinoma i HepG2 ćelije, izvedene iz humanog hepatocelularnog karcinoma. Utvrđeno je da su imortalizovane ćelije jetre osetljivije od crevnih, sa EC50 (koncentracija pri kojoj se javlja ispitivani efekat kod 50% tretiranih jedinki) vrednošću od približno 4 mg mL-1 registrovanom nakon 24 h izlaganja za HepG2 ćelije i redukcijom aktivnosti CYP450 metabolita u jetri (Gutiérrez-Praena i sar., 2019). U slučaju Caco-2 ćelija, najčešće zabeleženi efekti su povećana ćelijska permeabilnost i intracelularna koncentracija reaktivnih vrsta kiseonika (ROS) (Remirez i sar., 2002; Pichardo i sar., 2017; Gutiérrez-Praena i sar., 2019). Istraživanja su pokazala da je cilindrospermopsin potentan inhibitor sinteze proteina, što predstavlja rani indikator izlaganja ovom toksinu koji se javlja i pri subtoksičnim koncentracijama. Ovu pravilnost potvrđuju rezultati rada Froscio i sar. (2003), gde je zabeležena potpuna inhibicija sinteze proteina kod primarnih hepatocita Wistar pacova već nakon 4-časovnog izlaganja 0.5 µM CYN, dok je ćelijska smrt utvrđena pri koncentracijama od 1-5 µM i nakon 18 časova izlaganja. Uprkos značajnom negativnom efektu cilindrospermopsina, malo se zna o mehanizmu interferencije cilindrospermopsina sa kompleksnom mašinerijom sinteze proteina u ćelijama čoveka. Poznato je, međutim, da toksin ometa elongacionu fazu ovog procesa i da je uracilni domen u strukturi toksina značajan za održavanje biološke aktivnosti in vivo (Banker i sar., 2010). Takođe su opisani genotoksični efekti cilindrospermopsina, prvenstveno mogućnost vezivanja za DNK, čime se može izazvati fragmentacija DNK molekula (Humpage i sar., 2005). Pored toga, utvrđeno je smanjenje količine dostupnog redukovanog glutationa čak i pri niskim koncentracijama cilindrospermopsina koje se inače smatraju netoksičnim (0.8-1.6 µM), najverovatnije putem inhibicije GSH sinteze (Runnegar i sar., 1994). Toksin uzrokuje nastanak metaboličkih poremećaja, uključujući oksidativna oštećenja povezana sa smanjenim koncentracijama redukovanog glutationa i oslabljenom sintezom glutationa. Primećeni su, takođe znatno slabiji toksični efekti kod životinja koje nemaju evolutivno naprednije sisteme metabolisanja toksina (npr. jetru ili hepatopankreas), što je slučaj i sa kičmenjačkim vrstama u ranim fazama razvoja. Takođe, cilindrospermopsin je jedinstven među cijanobakterijskim toksinima po tome što izaziva toksičnost in utero. U istraživanju Rogers i sar. (2007), tretman cilindrospermopsinom (8-128 µg kg-1) tokom kasne gestacije kod miševa (gravidne jedinke CD-2, Swiss-Webster) je doveo do povećanja broja mrtvih štenaca, prevremenog izleganja i značajnog smanjenja telesne mase štenaca. Autori su povezali rezultate sa potencijalnom nemogućnošću CYN da prođe kroz placentalnu barijeru i predložili da CYN može uticati na proizvodnju steroidnih hormona in vivo, što je moglo dovesti do opisanih štetnih efekata. Uprkos značajnim istraživačkim naporima, mehanizam dejstva CYN je i dalje u određenoj meri nepoznat. 1.3.3. Neurotoksični cijanotoksini 1.3.3.1. Anatoksini Anatoksini su alkaloidni toksini rastvorljivi u vodi, koji se povezuju sa velikim brojem slučajeva humanih i animalnih trovanja, među kojima je u prošlosti bilo i onih sa fatalnim ishodom (Wood i sar., 2007; Puschner i sar., 2010; Faassen i sar., 2012; Fastner i sar., 2018). Produkcija cijanotoksina pod nazivom anatoksin-a je prvi put utvrđena kod Kanadskog soja vrste Anabaena flos-aquae od strane Devlin i sar. (1977), koji su ovaj toksin nazvali “veoma brzim fakotorom smrti” (eng. Very Fast Death Factor, VFDF), jer je izuzetno smrtonosan po domaće i divlje životinje. Od tada je, međutim, produkcija ovog toksina zabeležena i kod drugih 16 cijanobakterijskih vrsta, među kojima su Anabaena circinalis, Aphanizomenon sp., Cylindrospermum sp. i Planktothrix sp. (Sivonen i Jones, 1999). Tri forme anatoksina su do sada opisane: Anatoksin-a i homoanatoksin-a koji su alkaloidi opisani kao sekundarni amini, dok je guanitoksin (prethodno poznat pod nazivom anatoksin-a(s)) opisan kao jedinstveni fosfatni estar cikličnog N-hidroksiguanina (Puschner, 2007). Anatoksin-a i njegov homolog homoanatoksin-a su dvociklični sekundarni amini sa molekulskim masama između 165 i 179 daltona, strukturno slični alkaloidima. Anatoksin-a i homoanatoksin-a imaju opseg LC50 od približno 200-250 µg kg-1 kod miševa (intraperitonealna injekcija, nakon 24 h), dok je kod guanitoksina za isti parametar utvrđena vrednost od 20 µg kg-1 (Carmichael i sar., 1990; Schatz i sar., 2007). Mehanizam dejstva kod ptica i sisara se sastoji u oponašanju dejstva neurotransmitera acetilholina i naknadnom ireverzibilnom vezivanju za nikotinske acetilholinske receptore (Wonnacott i sar., 2000), čime se stimulišu kontrakcije mišićnih ćelija, što može izazvati depolarišuću blokadu nervno-mišićnih veza (Falconer, 1998). Specifično, natrijumovi voltažno zavisni kanali nakon vezivanja toksina ostaju praktično blokirani u otvorenom stanju, što omogućava “upliv” natrijumovih jona i kontinuiranu produkciju akcionog potencijala, što dovodi do hiperstimulacije mišićnih ćelija. Kada se efekat proširi do respiratornih mišića, dolazi do konvulzija usled nedostatka kiseonika u mozgu i gušenja (Carmichael i sar., 1990). Ovi toksini imaju približno 20 puta veći afinitet za acetilholinske receptore nego acetilholin ili nikotin i efekti su dugoročniji jer ne dolazi do razgradnje usled aktivnosti acetilholinesteraze s obzirom na to da je anatoksin-a otporan na delovanje ovog enzima (Puschner, 2007). Guanitoksin je takođe primarno neurotoksičan cijanotoksin, međutim, za razliku od prethodno navedenog toksina, strukturno je sličniji organofosfatima. Otkriven je primarno kod vrsta Anabaena flos-aquae i A. lemmermannii i potentan je inhibitor enzima acetilholin-esteraze (Sarma, 2013). Iako su organofosforni holinesterazni inhibitori otkriveni i kod terestričnih bakterija (npr. Streptomyces antibioticus) guanitoksin je jedini primer koji se javlja kod cijanobakterija (Fattorusso i Taglialatela-Scafati, 2007). Reakcija sa ciljnim enzimom se sastoji iz fosforilacije i formiranja specifičnog kompleksa koji čini enzim nefunkcionalnim, što dovodi do preterane stimulacije mišićnih ćelija usled nemogućnosti degradacije acetilholina. Kao što je već navedeno, hemijska struktura se razlikuje u odnosu na anatoksin-a, jer je guanitoksin N-hidroksiguanidin metil fosfatni estar sa molekularnom masom od 252 daltona (Hyde i Carmichael, 1991). Razlog za dodatak “s” u originalnom nazivu toksina (anatoksin-a(s)) leži u karakterističnoj hipersalivaciji primećenoj kod laboratorijskih miševa izloženih ovom toksinu (Solter i Beasley, 2013). Nasuprot relativno stabilnom anatoksinu-a, guanitoksin se smatra veoma nestabilnim molekulom. 1.3.3.2. Saksitoksini Saksitoksini (STX) su toksini produkovani prvenstveno od strane slatkovodne cijanobakterijske vrste Aphanizomenon flos-aquae (Adelman i sar., 1982). Međutim, pored ove vrste, u slatkovodnim i braktičnim okruženjima, u okviru nekoliko cijanobakterijskih rodova takođe se mogu pronaći producenti ovih toksina, među kojima su Anabaena circinalis, Anabaena lemmermanni, Aphanizomenon flos-aquae, Cylindrospermopsis raciborskii, Lyngbya wollei i Planktothrix sp. (Rodgers i sar., 2018). Ovi toksini predstavljaju neke od najpotentnijih neproteinskih toksina poznatih danas, sa LC50 vrednošću od 10 µg kg-1 kod miševa, dok se letalnom dozom za čoveka smatra 1 mg prečišćene supstance (Bower i sar., 1981). Radi se o neurotoksičnim alkaloidima triciklične strukture, čiji se molekularni skelet sastoji iz dve guanidinske grupe. Intoksikacija ljudi se najčešće javlja kao posledica ingestije kontaminiranih akvatičnih organizama. Usled blokade natrijumovih kanala izazvane STX-om, ne može doći do 17 generisanja akcionog potencijala neophodnog za kontrakciju mišića (Chen i sar., 1996). Specifično, toksični efekti saksitoksina se primarno ogledaju u blokiranju voltažno zavisnih natrijumovih kanala u mijelizovanim i nemijelizovanim nervima, što rezultira u relaksaciji vaskularne glatke muskulature, depresiji akcionog potencijala srčanog mišića i inhibiciji aksonalne transmisije do skeletnih mišića (Evans, 1972; Kao, 1993). Blokirajući otvaranje kanala, protok natrijuma u neuron je zaustavljen, što dovodi do mišićne paralize i smrti usled onemogućene respiracije kod sisara (Merwe, 2014). Natrijumovi voltažno zavisni kanali senzornih nerava su mnogo podložniji blokadi saksitoksinima od onih u motornim neuronima, zbog čega senzorni abnormaliteti uglavnom prethode paralizi i parezi. Saksitoksini takođe deluju na kalcijumove kanale L-tipa koji imaju ulogu u stvaranju akcionog potencijala u srčanom mišiću (Stefanopoulos i sar., 2022), ali nivo inhibicije nije tako izražen kao kod natrijumovih kanala (Llewellyn, 2006). Kada je reč o ovom mehanizmu toksičnog delovanja, potrebno je spomenuti jamajkamid i kalkitoksin kao dodatne toksine cijanobakterija koji ispoljavaju neurotoksičnu aktivnost blokiranjem natrijumovih voltažno zavisnih kanala (Edwards i sar., 2004; LePage i sar., 2005). 1.3.3.3. β-metilamino-L-alanin (BMAA) Jedinstvena aminokiselina β-metilamino-L-alanin (BMAA), je prvobitno izolovana iz ploda cikasa kao produkt simbiontskog cijanobakterijskog soja roda Nostoc, koji se razviju u kontaktu sa korenom ove biljke (Cox i sar., 2003). Od prvog nalaza ovog metabolita, njegova produkcija je opisana kod predstavnika brojnih cijanobakterijskih redova (Chroococcales, Nostocales, Oscillatoriales, Pleurocapsales, Stigonematales) u različitim životnim sredinama (Cox i sar., 2005). Zabeležena je takođe akumulacija BMAA u brojnim morskim organizmima koji se koriste u ljudskoj ishrani poput ribe, rakova, ostriga i školjki (Jonasson i sar., 2010), međutim, akutno trovanje usled ingestije ovog toksina nije do sada opisano. Jednom kada se unese, BMAA se vezuje za proteine u organizmu, nakon čega može funkcionisati kao endogeni neurotoksični rezervoar koji polako oslobađa toksin direktno u cerebralno tkivo (Murch i sar., 2004). Direktna veza između dejstva ovog toksina i efekata u humanom ili animalnom organizmu još uvek nije u potpunosti opisana, iako trenutni dokazi ukazuju na povezanost između izloženosti BMAA i podložnosti neurogenerativnim bolestima poput amiotrofične lateralne skleroze (ALS) i Parkinsonove bolesti (Spencer i sar., 1987). Poznato je međutim da BMAA ima sposobnost prolaska kroz krvno-moždanu barijeru, nakon čega izaziva neurotoksične efekte putem uticaja na centralni nervni sistem. Pri niskim koncentracijama, BMAA može interagovati sa svim osnovnim tipovima glutamatnih receptora (NMDA, AMPA i kainatni receptori) čija aktivacija dovodi do značajnog povećanja intracelularnog nivoa Ca2+ i povećane stimulacije motoneurona (Lobner, 2009). Ova promena dovodi do povećanog stresa endoplazmatskog retikulma i aktivacije Ca2+-zavisnih mehanizama ćelijske apoptoze. 1.3.4. Dermatotoksični cijanotoksini U dermatotoksične cijanotoksine se ubrajaju apliziatoksini, lingbiatoksini i debromoapliziatoksini koji izazivaju kontaktne kožne i gastrointestinalne iritacije kao i različite tipove alergijskih reakcija (Kaebernick i Neilan, 2001; Briand i sar., 2003). Inicijalno, apliziatoksini i debromoapliziatoksini su izolovani iz vrste Stylocheilus longicauda, međutim, od tada su identifikovani i kod drugih cijanobakterijskih vrsta (Tang i sar., 2019). Pored toga što uzrokuju teške oblike dermatitisa nakon direktnog izlaganja, ovi toksini mogu delovati kao promoteri 18 tumora putem kompetitivnog vezivanja za protein kinazu C (Chorus i Bartram, 1999). Lingbiatoksine prvenstveno proizvodi Lyngbya majuscula, cijanobakterijska vrsta koja se javlja u priobalnim vodama u tropskoj i suptropskoj klimi (Osborne i sar., 2001). Sličan mehanizam delovanja, uključujući akutni kontaktni dermatitis i promociju tumora je prisutan i kod lingbiatoksina (Jeffrey i Liskamp, 1986). 1.3.5. Lipopolisaharidi Lipopolisaharidi (LPS; endotoksini) su ćelijski konstituenti većine Gram-negativnih bakterija. To su krupni (molekulske mase 200 do 1000 kDa), termostabilni (do 100°C), imunogeni molekuli, rezistentni na delovanje proteolitičkih enzima (Smulders i sar., 2012). Ćelijski zid Gramnegativnih bakterija se ponekad opisuje kao omotač, jer ovaj termin preciznije opisuje labavo prikačen sloj LPS materijala, koji je lociran na spoljašnjem delu tankoslojnog peptidoglikana. Spoljašnji sloj LPS omotača formira specifičnu barijeru, efektivnu protiv difuzije egzo-enzima u spoljašnju sredinu. Ovo predstavlja evolucionu karakteristiku čiji je razvoj omogućio ovim organizmima da prežive i umnože se u okruženjima sa niskim koncentracijama organskih nutrijenata (Sile, 2013). Iako blisko povezan sa ćelijskim omotačem, LPS konstantno biva odbacivan u spoljašnju sredinu. Mogu se izdvojiti tri specifična regiona kada je reč o strukturi LPS - unutrašnji region (jezgro), nazvan lipid A; središnji oligosaharidni sloj; spoljašnji polisaharidni lanac. Lipidna komponenta (Lipid A) predstavlja hidrofobni segment LPS koji je lociran u bazi ove strukture, na spoljašnjoj membrani. Poznato je da je lipidna komponenta odgovorna za toksične efekte ispoljene tokom infekcije Gram-negativnim bakterijama i da je to deo molekula koji je reaktivan in vivo (Smulders i sar., 2012). Iako su cijanobakterijski LPS često citirani u literaturi o cijanobakterijama kao toksini odgovorni za razne zdravstvene efekte kod ljudi, od kožnih osipa do gastrointestinalnih, respiratornih i alergijskih reakcija, većina zvaničnih istraživačkih izveštaja opisuje cijanobakterijski LPS kao slabo toksičan u poređenju sa LPS prisutnih kod pripadnika bakterijske familije Enterobacteriaceae (Stewart i sar., 2006). 19 Slika 5. Prikaz strukture toksikološki najznačajnijih grupa cijanotoksina (Modifikovano iz Dittmann i Wiegand (2006)) Koncentracije cijanobakterijskih toksina u spoljašnjoj sredini su generalno veoma niske (0.1 – 10 µg L-1) u poređenju sa toksinima prisutnim u samim ćelijama cijanobakterija (Lindholrn i Meriluoto, 1991). Cilindrospermopsini su izuzetak, jer se visoke koncentracije ekstracelularnih toksina mogu naći tokom svih faza životnog ciklusa cijanobakterija koje ih produkuju (Chen i sar., 2011). Objavljen je veliki broj istraživanja koja se tiču pojave cijanotoksina u površinskim vodama, posebno mikrocistina, koji su najrasprostranjeniji cijanotoksini, odgovorni za najveći broj registrovanih slučajeva trovanja ljudi i životinja (Chorus i Bartram, 1999) i najveće koncentracije ovih toksina (do 25 mg L-1 na svetskom nivou) (Sivonen i Jones, 1999) su zabeležene u toku cvetanja vode. Sa druge strane, maksimalne detektovane koncentracije ostalih grupa, poput cilindrospermopsina i anatoksina u površinskim vodama su iznosile do 3.3 mg L-1 (Sivonen i Jones, 1999). Utvrđeno je da se koncentracije mikrocistina na području Vojvodine mogu kretati od 0.95 do 603.51 µg L-1 (Simeunović, 2009). Kako se karakteristika produkcije toksina kod cijanobakterija održala tokom njihove duge evolucije, uprkos visokoj metaboličkoj „ceni“, jasno je da je biološka funkcija ovih metabolita izuzetno važna. Informacije vezane za svrhu produkcije toksina od strane cijanobakterija, kao i funkcionalna ekološka uloga ovih, sa energetskog stanovišta nepovoljnih, bioaktivnih metabolita, su i dalje oskudne i potrebna su dodatna istraživanja u ovom pravcu. Iako je jasno da toksini obezbeđuju određenu prednost cijanobakterijama u njihovom prirodnom okruženju i dalje je nejasno na koji način. Postavljeno je međutim nekoliko hipoteza, koje su podržane rezultatima istraživanja sprovedenih proteklih godina. Cijanotoksini kao mehanizam zaštite od predatorstva/ispaše - Postoje dokazi da cijanotoksini imaju značajan uticaj na strukturu populacija zooplanktona, što je dovelo do razvoja hipoteze da su ovi toksini nastali kao mehanizam zaštite od zooplanktonskih predatora (Lampert, 1981; DeMott i sar., 1991). Rezultati istraživanja Jang i sar. (2003) rađenih sa četiri 26 Cijanotoksin Poznate produkujuće vrste/rodovi Osnovni mehanizam toksičnog dejstva u eukariotskim ćelijama Najpotentniji kongeneri Geni uključeni u biosintezu Pristupni brojevi u genskim bazama Oscillatoria sp. Cilindrospermopsin Cylindrospermopsis raciborskii Aphanizomenon ovalisporum Umezakia natans Raphidopsis sp. Anabaena sp. Lyngbya sp. Citotoksičnost, hepatotoksičnost, genotoksičnost; Inhibicija sinteze proteina, inhibicija sinteze glutationa, DNK fragmentacija 7-deoksicilindrospermopsin 7-epi-cilindrospermopsin, 7-deoksi-desulfocilindrospermopsin 7-deoksi-desulfo-12acetilcilindrospermopsin cyr A-O aoa A-C EU140798 AF395828 FJ418586 Saksitoksin Anabaena circinalis Anabaena lemmermanni Cylindrospermopsis raciborskii Lyngbia wollei Planktothrix sp. Aphanizomenon sp. Neurotoksičnost; Blokiranje voltažno zavisnih natrijumovih kanala Saksitoksin Neosaksitoksin Dekarbamoilsaksitoksin Gonijatoksin 1 sxt A-Z DQ787200 27 Slika 7. Šema strukturne organizacije genskih klastera za biosintezu najčešćih i najbolje proučenih cijanotoksina (modifikovano iz Pearson i sar. (2016)) Rezultati bioinformatičkih analiza genoma cijanobakterijskih sojeva različitog porekla, koji su do sada neistraženi u ovom kontekstu, predstavljaju dragocen resurs kada se radi o unapređenju saznanja o genetičkoj osnovi cijanobakterijske toksičnosti. Ovaj pristup je od izuzetne važnosti za dalja istraživanja, jer omogućava identifikaciju i karakterizaciju ključnih gena i metaboličkih puteva koji su uključeni u produkciju cijanotoksina, čime se omogućava preciznije razumevanje njihovog toksigenog potencijala. Dopuna postojećih baza podataka genomskim podacima novih sojeva cijanobakterija je ključna zbog trenutnog nedostatka sveobuhvatnih informacija, jer bi se na taj način značajno olakšao proces karakterizacije neistraženih sojeva. Ovo je posebno značajno u regionima poput Srbije, gde istraživanja ovog tipa još uvek nisu sprovedena i gde ovakvi pristupi otvaraju put ka obogaćivanju saznanja dostupnih u okviru naučne zajednice i pružaju osnovu za razvoj efikasnijih strategija zaštite životne sredine i javnog zdravlja. 28 1.5. Metode detekcije cijanotoksina i njihovih toksičnih efekata Pravovremeno utvrđivanje prisustva toksičnih cijanobakterija i njihovih produkata u životnoj sredini je od izuzetnog značaja pre svega za adekvatnu procenu rizika, kako po životnu sredinu, tako i za sve organizme koji dolaze u kontakt sa takvom sredinom. U cilju detekcije i istraživanja cijanobakterijske toksičnosti, razvijene su i prilagođene različite metode. Među njima se javljaju analitičke tehnike sa ulogom u direktnom prepoznavanju toksina u različitim uzorcima kao biohemijski testovi koji se baziraju na specifičnim interakcijama toksina sa antitelima ili enzimima. Sa druge strane, biološki testovi koji koriste žive organizme ili ćelije u kulturi, koriste se u detekciji i kvantifikaciji toksičnih efekata cijanobakterija, dok molekularne metode poput lančane reakcije polimeraze dodatno omogućavaju identifikaciju toksigenog potencijala ciljanjem gena uključenih u proizvodnju toksina. Uprkos brojnim metodama koje su danas dostupne, kako bi se zaštitilo ljudsko zdravlje i izbegla potencijalna opasnost koju predstavljaju cijanobakterijski toksini, javlja se potreba za razvojem novih metoda sa ciljem efikasnije detekcije različitih grupa cijanobakterija i njihovih toksičnih produkata. Važnost odabira metode se ogleda u tome da bi usvojena metoda trebalo da biti pouzdana, precizna i selektivna, kako bi se detektovao toksični organizam ili sam toksin i dobili pouzdani rezultati dovoljno brzo (Zhu i sar., 2014). Metoda bi takođe morala pored same potvrde prisustva toksičnog agensa, obezbediti i informacije o biološkoj aktivnosti toksina. Upravo zbog potrebe za selektivnom i osetljivom detekcijom toksina razvijene su, prvenstveno u proteklih nekoliko decenija, mnoge metode bazirane na direktnoj i indirektnoj detekciji agenasa ovog tipa. Sa jedne strane, moguće je direktno prepoznavanje toksina upotrebom antitela ili merenjima uz pomoć masene spektrometrije (Duracova, 2018). Direktni instrumentalni eseji zavise od dostupnosti sofisticirane opreme, kao što je to u slučaju tečne hromatografije visokih performansi (HPLC) i metoda kombinovanih sa masenom spektrometrijom kakva je MALDI-TOF (matricom potpomognuta laserska jonizacija) (Zhu i sar., 2014). Sa druge strane, pojedine funkcionalne odlike toksina se mogu upotrebiti za njihovu detekciju, jer predstavljaju okidače za veoma specifične reakcije u organizmu životinja ili određenim ćelijama. Pored toga, cijanobakterijske vrste ili geni uključeni u produkciju toksina se mogu detektovati uz pomoć molekularnih metoda. Ovi indirektni eseji mogu obezbediti dragocene informacije, posebno kada je cilj detekcija nepoznatog toksičnog agensa. 1.5.1. Imunološki eseji Imunoeseji su bioanalitičke metode u kojima kvantifikacija analizirane supstance zavisi od interakcije antigena (analita) sa specifičnim antitelom. Suštinski, ove metode se baziraju na reakciji kompetitivnog vezivanja između određene količine označenog analita i varijabilne količine neoznačenog analita u uzorku za ograničen broj veznih mesta na visoko specifičnom antitelu (Oku i sar., 1988). Kada se ovi reagensi pomešaju i inkubiraju, analit se vezuje za antitelo formirajući na taj način imunološki kompleks. Određenim fizičkim ili hemijskim separacionim tehnikama, ovaj kompleks se odvaja od nevezane frakcije reagenasa. Analiza se sprovodi merenjem aktivnosti probe (npr. fluorescencije ili produkta enzimske aktivnosti) (Cox i sar., 2004). Metode koje se baziraju na kompeticiji između slobodnih i označenih antigena za ograničen broj veznih mesta na antitelu se označavaju kao kompetitivne metode. Ovi tipovi eseja se koriste za detekciju toksina malih molekulskih masa, kakav je monociklični heptapeptid mikrocistin (Zhu i sar., 2014). Što se tiče nekompetitivnih eseja, dva osnovna tipa se mogu koristiti za detekciju peptidnih toksina mikroorganizama. Takozvani sendvič enzimski imunoesej se može koristiti samo za detekciju makromolekula, kakvi su proteinski toksini, koji poseduju barem dva 29 odgovarajuća mesta za vezivanje antigena. U drugom slučaju, čvrsta faza se direktno dovodi u kontakt sa toksinom i količina vezanog toksina se određuje pomoću specifičnih označenih antitela. U oba slučaja, detektovani odgovor u eseju je direktno proporcionalan koncentraciji ciljnog antigena. Većina imunoeseja za konačno očitavanje koristi imunoreagense, međutim, detekcija niskih koncentracija toksina često zahteva amplifikaciju signala i stoga su različite metode kakva je fluorescencija, luminiscencija i masena spektrometrija upotrebljivane za poboljšanje osetljivosti (Zhu i sar., 2014). Iako su imunoesejske metode primenjivane u detekciji toksina mikroorganizama brojne, enzimski imuno-vezujući test (ELISA test), kao i modifikacije ovog testa, se navode kao neke od najpopularnijih tehnika za ovu primenu. ELISA test koristi osnovni imunološki koncept antigenskog vezivanja za specifično antitelo, što omogućava detekciju veoma malih količina ciljnih proteina, peptida ili antitela u tečnim uzorcima. Testovi ovog tipa koriste enzimima označene antigene i antitela kako bi se izvršila detekcija bioloških molekula. Zahvaljujući hromogenom enzimskom supstratu, obezbeđuje se vidljiva promena boje ili fluorescencija, što ukazuje na prisustvo antigena (Gan i sar., 2012). Količina nastale boje je proporcionalna količini vezanog antitela i samim tim antigena prisutnog u početnoj smeši. Alternativne forme ELISA testa uključuju sendvič i kompetitivni ELISA test koji su prethodno opisani. Zbog svoje osetljivosti ELISA test se predlaže kao efikasna i brza skrining procedura za detekciju različitih cijanotoksina u uzorcima vode (Sivonen i Jones, 1999). Komercijalno dostupni ELISA test kompleti su često korišćeni u cilju detekcije cijanotoksina, budući da ne zahtevaju skupu opremu niti specijalnu obuku za sprovođenje testiranja. Testovi bazirani na ovom principu su adaptirani za detekciju nodularina, cilindrospermopsina, saksitoksina i β-N-metilamino-L-alanina (BMAA) (Gaget i sar., 2017). Ovakvi testovi mogu biti sprovedeni koristeći sveže sakupljene uzorke, kao i prezervirane uzorke, zbog čega je moguća detekcija i kvantifikacija intracelularnih ali i ekstracelularnih toksina u supernatantu. Kada se radi o mikrocistinima, detekcija se sprovodi na osnovu antitela dizajniranih za prepoznavanje karakteristične β aminokiseline (ADDA), prisutne kod gotovo svih do danas poznatih toksina ove grupe. Osnovna prednost korišćenja ELISA testova je u tome što su se pokazali efikasnim, čak i prilikom detekcije mikrocistina u koncentracijama nižim od onih propisanih od strane Svetske zdravstvene organizacije (WHO) (1 µg L-1) (Mountfort i sar., 2005; Zhu i sar., 2014). Nedostatak je u tome što se na ovaj način ne obezbeđuju nikakve informacije o tome koji su kongeneri prisutni u mešavini MC toksina. Pored ELISA testova, dostupni su i biohemijski testovi koji koriste karakteristične efekte povezane sa mehanizmom delovanja specifičnih cijanotoksina, omogućavajući detekciju njihove aktivnosti u uzorcima. Zbog svoje sposobnosti da inhibiraju aktivnost protein fosfataza tipa 1 (PP-1) i 2A (PP-2A), mikrocistini i nodularini se mogu efikasno detektovati korišćenjem biohemijskog testa poznatog kao test inhibicije protein fosfataze (Protein Phosphate Inhibition Assay - PPIA). Ova metoda je poznata po svojoj jednostavnosti, brzini, osetljivosti i ponovljivosti, što je čini pouzdanim kolorimetrijskim pristupom u evaluaciji toksičnih efekata mikrocistina i nodularina. Merenje se može postići korišćenjem radio-izotopskih tehnika koje se oslanjaju na radioaktivno obeležene supstrate ili kolorimetrijskim testovima koji koriste supstrate kao što je p-nitrofenil fosfat (Sanseverino i sar., 2017). Sa druge strane, za detekciju neurotoksičnih anatoksina se koristi esej inhibicije acetilholinesterazne (AChE) aktivnosti. Kako je inhibicija izazvana ovim toksinima ireverzibilna, reakcija se odvija sve dok sav dostupan toksin ne reaguje sa enzimom (Devic i sar., 2002). Najznačajnija negativna strana ovog testa je vezana za njegovu 30 selektivnost, jer mnogi toksini kao što su organofosfati i karbamati, koji se koriste kao insekticidi, takođe mogu da inhibiraju aktivnost enzima AChE (Devic i sar., 2002; Miglione i sar., 2021). 1.5.2. Biotestovi Osnovna uloga modela biotesta leži u razumevanju fenomena koji su previše složeni ili apstraktni da bi bili izmereni direktnim pristupom. U istraživanju životne sredine to bi moglo uključivati sagledavanje zakonitosti koje vladaju u određenom ekosistemu ili predviđanje ponašanja ili interakcije određenih elemenata tih sistema. U takvim slučajevima, često je korisno posmatrati specifične žive organizme koji reaguju čak i na suptilne promene u svom okruženju. Iako su izuzetno korisni, modeli predstavljaju samo bliske aproksimacije i nikada nisu tačne replike fenomena koji opisuju, a njihova preciznost u velikoj meri zavisi od trenutnog stanja naučnih saznanja u datoj oblasti (Frigg i Hartmann, 2020). Iz ovih razloga, kao rezultat naučnog napretka i otkrića, konstantno se pojavljuju noviji i unapređeniji modeli. Testovi koji implementiraju takve žive sisteme nazivaju se bioeseji. U toksikologiji, bioeseji su specifični testovi koji se sastoje od kvalitativnih i kvantitativnih merenja toksičnih efekata koji su izazvani u model organizmima nakon određenog perioda izlaganja toksičnom agensu. Oni pružaju brzu i relativno jednostavnu metodu za skrining uzoraka zasnovanu na biološkom odgovoru na toksične efekte. Uočene promene i akumulirani podaci se obično koriste za procenu uticaja supstance na životnu sredinu ili za predikciju fiziološkog odgovora kod ljudi (Gallagher, 2002; Hassan i sar., 2016). Takođe postoje mnoge potencijalne krajnje tačke koje se mogu pratiti, od promena na molekularnom nivou, ćelijskih promena, promena specifičnih fizioloških parametara, pa do promena u pokretljivosti i ponašanju organizma. Potencijalni odgovori na čijoj se detekciji baziraju različiti bioeseji su takođe raznovrsni i uključuju mortalitet, pokretljivost i ponašanje, rast i reprodukciju kao i fiziološke i biohemijske parametre kakvi su fotosinteza, sinteza proteina i promene u genskoj ekspresiji u organizmu (Erzinger, 2018). Postoji međutim, nekoliko ograničenja bioeseja. Prvo, realne koncentracije toksikanta na specifičnom mestu dejstva se mogu značajno razlikovati od onih prvobitno primenjenih u testu, prvenstveno zbog faktora koji utiču na apsorpciju i transport toksina do ciljnog mesta delovanja. Kao drugo, u organizmu dolazi do metaboličke transformacije toksina, što može uticati na njihovu koncentraciju bilo inaktivacijom toksičnih metabolita ili aktivacijom toksina prisutnih u neaktivnoj formi (Srivastava, 2002). Većina studija koje se bave efektima cijanotoksina se sprovode posmatranjem promena koje nastaju u živom organizmu nakon izlaganja toksinima u nekom obliku, obično prečišćenom pojedinačnom toksinu, iako se sirovi ekstrakti i biomasa nastala tokom cvetanja takođe često analiziraju (Freitas i sar., 2014). U velikom broju zemalja tokom 1980-ih, studije o pojavi, distribuciji i učestalosti toksičnih cijanobakterija sprovedene su koristeći biotest sa miševima koji je bio prvi metod razvijen za detekciju cijanotoksina u vodi, iako je suštinski dizajniran za procenu njihovih efektata u živim sistemima (Mahmood i Carmichael, 1986; Codd i Poon, 1988). U ovom eseju, uzorci su ubrizgavani u eksperimentalne životinje intraperitonealno, nakon čega je praćen nastanak odgovora (nastanak simptoma) u toku narednih 72 h. Ovaj test, koji je do nedavno bio deo rutinske procedure za praćenje cijanotoksina, ima nekoliko značajnih nedostataka. Među najvažnijim su pitanja troškova i održavanja, testu takođe nedostaje osetljivost i specifičnost, posebno u otkrivanju cijanotoksina u niskim koncentracijama (Nicholson i Burch, 2001) i takođe često nailazi na oštre kritike iz etičkih razloga. Stoga su uloženi značajni napori da se otkriju i primene nove metode koje bi predstavljale alternativu testu sa miševima. 31 Neke analitičke tehnike pogodne za kvantitativno određivanje toksina postale su dostupne tek kasnih 1980-ih, ali upravo tada dolazi do porasta u broju istraživanja vezanih za specifične cijanotoksine (Sivonen i Jones, 1999). U dostupnoj literaturi , kao neke od postojećih alternativa esejima sa sisarima, za otkrivanje toksičnosti cijanobakterija navode se procedure testiranja koje uključuju određene vrste beskičmenjaka, kao što su test sa artemijama (Artemia salina – brine shrimp) i biološki testovi sa račićima kao što su dafnije (najčešće Daphnia sp. i Ceriodaphnia sp.) ili Thamnocephalus platyurus i testovi sa insekatskim vrstama poput pripadnika roda Chironomus (Lee i sar., 1999; McElhiney i sar., 2005; Ibelings i sar., 2015). Među kičmenjačkim model organizmima, najbolji rezultati kada se radi o detekciji i karakterizaciji cijanobakterijske toksičnosti su postignuti koristeći testove sa zebricama (Danio rerio) i japanskom medaka ribom (Oryzias latipes) i njihovim embrionima. Pored toga, in vitro testovi koji koriste humane ćelije u kulturi su razvijeni kao alternativa tradicionalnim biološkim testovima sa čitavim organizmima, čime je omogućeno proučavanje efekata cijanotoksina na specifična ciljna tkiva ili organe u kontrolisanom okruženju. 1.5.2.1. Artemia salina bioesej Bioesej sa artemijama je prvi put opisan od strane Michael i sar. (1956), nakon čega su dodatne modifikacije uveli Meyer i sar. (1982) i Solis i sar. (1993). Test sa vrstom A. salina je standardizovan i komercijalno dostupan (Arttoxkit, 1995). Radi se o brzom i jeftinom testu, bez potrebe za prethodnim održavanjem kulture, jer su A. salina ciste (jaja) komercijalno dostupne u liofiliziranoj formi i mogu se stoga čuvati tokom nekoliko godina na temperaturi od -20°C. Iz jaja čuvanih na ovaj način, larve se mogu izleći i primeniti u eksperimentima u roku od 24h, bez potrebe za specijalnom opremom. Uniformnost eksperimentalnih grupa se može postići upotrebom jedinki koje su u istoj fazi razvića i odgovarajućeg geografskog porekla, što su faktori koji mogu značajno uticati na rast, reprodukciju i preživljavanje ispitivanih jedinki. Integracija NAM (new approaching methods) u eksperimentalnu proceduru (Solis i sar., 1993) je omogućila istovremenu analizu velikog broja uzoraka i različitih koncentracija ispitivanog agensa na jednoj ploči. Ova platforma je omogućila da bioesej sa artemijama postane alternativa testovima citotoksičnosti na ćelijama, posebno pogodnu za laboratorije koje nemaju uslove za održavanje ćelijskih linija. Zbog navedenih karakteristika, ovaj test je do sada prvenstveno korišćen kao brza procedura za ispitivanje toksičnih metabolita u velikom broju uzoraka (Jaki i sar., 1999; Piccardi i sar., 2000). Biotest sa artemijama je uspešno primenjivan u testiranju aktivnosti različitih cijanotoksina (Bláha i sar., 2017). Poređenje uspešnosti Artemia eseja i bioeseja sa miševima u ispitivanju toksičnosti cijanobakterijskih metabolita je pokazalo visok stepen sličnosti i dobru korelaciju između dobijenih rezultata, čime se potvrđuje upotrebna vrednost ovog testa u istraživanju cijanobakterijske toksičnosti (Vezie i sar., 1996; Lee i sar., 1999). Kao primer se mogu navesti rezultati rada Vezie i sar. (1996), gde je upoređena efikasnost različitih testova kada se radi o utvrđivanju toksičnosti neokarakterisanih cijanobakterijskih uzoraka. Cijanobakterijski sojevi koji nisu izazvali toksične efekte kod izloženih miševa (NIH Swiss outbred mice) izazvali su nisku stopu mortaliteta kod artemija (uglavnom ispod 13%). Od 15 sojeva hepatotoksičnih za miševe, 13 je bilo veoma toksično za artemije (mortalitet iznad 90%). Stopa mortaliteta kod artemija je takođe bila u korelaciji sa koncentracijom hepatotoksina u ekstraktima ispitanih sojeva. Jedan od prepoznatih nedostataka testa sa artemijama, međutim, jeste smanjena rastvorljivost i biodostupnost nekih supstanci u slanom medijumu neophodnom za normalno funkcionisanje artemija. Iako se može ispitivati niz krajnjih tačaka toksičnog delovanja, uključujući subletalne efekte kao što su stopa izleganja i 32 stopa rasta neonata i promene u ponašanju larvi (šablonu kretanja) (Libralato i sar., 2016), u testiranju toksičnosti cijanobakterija, najveći broj istraživanja je podrazumevao utvrđivanje stope mortaliteta kao krajnju tačku. 1.5.2.2. Daphnia bioeseji Vrste roda Daphnia (Múeller) su značajni indikatori promena u različitim tipovima akvatičnih ekosistema, gde se često javljaju kao primarni konzumenti algi, bakterija i protozoa (Tessier i sar., 2000). Pored toga, dafnije često predstavljaju dominantnu formu zooplanktona u različitim akvatičnim staništima, od oligotrofnih do eutrofnih, gde čine kvalitetnu i visoko kaloričnu hranu za veliki broj akvatičnih predatora, zbog čega su esencijalna komponenta lancaca ishrane hidroekosistema. Njihova primena u toksikološkim ispitivanjima datira od početka dvadesetog veka, usvajanjem propisa o akutnim (OECD, 2004) i hroničnim (OECD, 2012) testovima toksičnosti. Od tada su testovi sa dafnijama u širokoj primeni kada se radi o monitoringu sredinskih polutanata u akvatičnim ekosistemima. Iako je imobilizacija (izostanak kretanja kod jedinki) najčešće korišćen parameter toksičnosti u esejima sa ovim vrstama, definisani su i subletalni parametri, što omogućava detekciju i praćenje toksinima izazvanih promena u ranijim fazama intoksikacije (Bownik, 2020). Među osnovnim karakteristikama, koje doprinose vrednosti ovog modela u toksikološkim ispitivanjima, nalazi se sposobnost klonalne reprodukcije (Hebert i Ward, 1972). Zahvaljujući ovoj osobini, moguće je postići i održavati genetičku uniformnost populacija i obezbediti stabilnu i konstantnu genetičku osnovu sa kojom se rezultati mogu porediti. Kako su u potpunosti sekvencirani genomi sojeva vrsta Daphnia pulex i Daphnia magna (Colbourne i sar., 2005; Lee i sar., 2019), omogućen je uvid u molekularne mehanizme koji leže u osnovi toksičnih odgovora ovih organizama. Fiziološke promene koje nastaju pod uticajem cijanotoksina koje se tiču preživljavanja, rasta i stope ishrane kod dafnija su dobro istražene (DeMott i sar., 1991; Rohrlack i sar., 1999; Ferrão-filho i sar., 2008; Herrera i sar., 2015). Za razliku od ovih efekata, promene na molekularnom i genetičkom nivou do danas nisu dovoljno ispitane. Mali broj podataka je dostupan o uticaju cijanobakterija na ekspresiju gena kod Daphnia magna pri čemu je pokazan efekat na gene koji kodiraju enzime uključene u procese glikolize i regulacije stresa (Schwarzenberger i sar., 2009) kao i na aktivnost enzima glutationS transferaze (GST), značajnog za proces detoksifikacije kod jedinki nakon izlaganja (Nogueira i sar., 2004). 1.5.2.3. Thamnocephalus platyurus bioesej Bioesej koji koristi larve slatkovodnih rakova vrste Thamnocephalus platyurus (Fairy shrimp - vilinski škampi) je uspešno korišćen u skriningu cijanobakterijske toksičnosti, posebno kada se radi o mikrocistinima i cilindrospermopsinima (Kozma Törökné i sar., 2000). Radi se o brzom i standardizovanom biološkom testu koji se primenjuje u analizi različitih hemijskih agenasa, uzoraka površinskih i podzemnih voda, otpadnih voda, kao i cijanobakterijskih ekstrakata i prečišćenih cijanotoksina. Razvijen je komercijalni komplet pod nazivom Thamnotoxkit F, koji obezbeđuje sve neophodne materijale za sprovođenje šest 24-časovnih testova mortaliteta u mikrotitar pločama, koristeći larve ovog organizma. U definisanim ISO protokolima (ISO 14380, 2011) opisana je procedura za određivanje letalnih efekata različitih toksikanata na model organizmu vrste Thamnocephalus platyurus, kao i brzi test za ispitivanje subletalnih efekata nakon jednog sata izlaganja. Opisani su takođe 60-minutni test inhibicije ishrane i 24-časovni test mortaliteta, koji se izvode prema standardnim operativnim procedurama Rapidtoxkit i Thamnotoxkit F kompleta, redom. Iako je utvrđena statistički značajna korelacija između nivoa 33 hepatotoksičnih i neurotoksičnih cijanotoksina u uzorcima i stope mortaliteta u testovima sa ovom vrstom, odgovor jedinki T. platyurus se smatra nespecifičnim jer su izuzetno osetljive na različite metabolite prisutne u ekstraktima cijanobakterija i zabeleženi su letalni efekti čak i u ekstraktima koji nisu sadržali poznate grupe cijanotoksina (Tarczynska i sar., 2000; Torokne, 2000; Maršalek B., 2004). Iz tog razloga su testovi ove grupe od značaja kada se radi o ispitivanju toksičnosti prečišćenih cijanotoksina ali ne i cijanobakterijskih ekstrakata ili uzoraka cvetanja cijanobakterija. 1.5.2.4. Chironomus bioeseji Vrsta Chironomus riparius se koristi u testovima toksičnosti dizajniranim sa ciljem procene efekata zagađujućih i toksičnih supstanci koje su potencijalno štetne za organizme bentosa. Poznato je da toksični sekundarni metaboliti koji se oslobađaju tokom cvetanja cijanobakterija u vodenim ekosistemima mogu uticati na beskičmenjake koji nastanjuju bentos (Shahmohamadloo i sar., 2020a) jer se nakon cvetanja ćelije cijanobakterija talože na dnu basena i kontaminiraju ove zajednice. Ova insekatska vrsta je osetljiva na promene u kvalitetu vode i koristi se kao model organizam za procenu toksičnosti uzoraka vode, praćenje kvaliteta vode i zdravlja ekosistema. Postupci ispitivanja toksičnosti su adaptirani u cilju procene efekata akutnog (OECD No. 235, 2011) i hroničnog (OECD No. 218, 2004b; OECD No. 233, 2010) izlaganja hironomida različitim toksičnim agensima. U osnovi, ove metode predstavljaju modifikacije prethodno opisanih testova akutne imobilizacije na Daphnia sp.. U testovima sa hironomidama se koriste larve inicijalne faze razvoja C. riparius (najčešće) ili C. dilutus i C. ioshimatsui, koje su nasumično odabrane iz kultivisane populacije. Larve se izlažu određenom opsegu koncentracija ispitivane supstance tokom 48h ukoliko je cilj merenje akutne toksičnosti i 44 dana kada se radi o hroničnom testu. Među krajnjim tačkama toksičnog delovanja koje se mogu meriti kada se radi o hroničnom izlaganju navodi se ukupan broj jedinki koje dosegnu adultni stadijum, stopa razvoja i fekunditet, dok se kao osnovna krajnja tačka u akutnim testovima beleži imobilizacija (mortalitet) prema OECD standardima. Za razliku od zooplanktonskih organizama koji se hrane filtracijom vode, larve bentosnih beskičmenjaka poseduju snažne mandibule koje se koriste za griženje i razlaganje hrane. Ovaj mehanizam ishrane može potencijalno povećati njihovu izloženost intracelularnim toksinima iz cijanobakterija, što je jedan od razloga zašto su istraživanja koja se tiču cijanotoksičnosti sa ovim modelom uglavnom usmerena na izloženost putem ishrane (Stanković i sar., 2020; Stanković i sar., 2022). Iako istraživanja sa ciljem ispitivanja cijanobakterijske toksičnosti sa ovim modelom nisu brojna, Chironomus bioeseji su se pokazali kao korisni u proceni uticaja cijanotoksina na beskičmenjačke organizme koji nastanjuju bentos. 1.5.2.5. Danio rerio bioesej Zebrice (Danio rerio) predstavljaju dobro poznat i ustanovljen model organizam u toksikološkim ispitivanjima, od onih koja se tiču efekata na molekularnom nivou, do testova u okviru kojih se prate promene na čitavom organizmu ili u njegovom ponašanju. Među mnogim prodobnostima ovog modela navodi se jeftino održavanje, male dimenzije jedinki što olakšava manipulaciju, lako gajenje i razmnožavanje ovih organizama i visok fekunditet. Jedna od bitnih karakteristika ovog model sistema, ogleda se u ex utero razvoju embriona, što značajno pojednostavljuje manipulaciju i izlaganje toksičnim supstancama (Langheinrich, 2003). Međutim, najveća prednost modela embriona zebrice u odnosu na ostale beskičmenjačke i kičmenjačke medele, ogleda se u skoro potpunoj optičkoj transparentnosti embriona, što, uz činjenicu da se embriogeneza odvija 34 relativno brzo i ex utero, omogućava vizualizaciju promena u morfološkim strukturama unutrašnjih organa uz pomoć svetlosne mikroskopije. Drugi značajan razlog za široku upotrebu i prihvaćenost embriona zebrica kao validne alternative eksperimentima sa sisarskim modelima jeste činjenica da embrioni zebrice starosti do 120 časova nakon fertilizacije ne potpadaju pod Regulativu Evropskog parlamenta (2010/63/EU) o dobrobiti životinja. Međutim, larvalni stadijumi nakon petog dana se hrane nezavisno i stoga su zaštićeni. Pored navedenih karakteristika, genom vrste Danio rerio je u potpunosti sekvenciran, pri čemu je utvrđen visok nivo homologije genoma zebrice sa humanim genomom (približno 74%) (Howe i sar., 2013). Zahvaljujući visokom stepenu molekularno-genetičke i fiziološke sličnosti između zebrica i sisara, uključujući čoveka je omogućeno bolje razumevanje mehanizama koji leže u osnovi zabeleženih toksikoloških promena. Prepoznavanje ovih karakteristika je usmerilo veliki broj istraživanja efekata izlaganja zebrica toksičnim metabolitima cijanobakterija na rane faze u razvoju ovih organizama. Razvoj embriona je strogo regulisan i pažljivo koordinisan proces koji zahteva niz specifičnih, vremenski osetljivih interakcija među ćelijama (Bonneau i sar., 2011). Iz tog razloga, deformiteti kod embriona i larvi vrste Danio rerio, nastali kao posledica izlaganja toksičnim supstancama, mogu imati značajne i dugoročne efekte na njihov razvoj i preživljavanje. Tip i intenzitet ovih efekata u velikoj meri zavise od vrste i koncentracije toksičnog agensa (Rücker i sar., 2007). U tom smislu, poseban problem mogu predstavljati toksini čiji targeti uključuju strukture DNK ili specifične segmente procesa ćelijske deobe i puteva diferencijacije. Ovo je od posebnog značaja u vodenim sredinama, gde je rizik od hronične izloženosti životinja u ranim fazama ontogeneze potencijalno najveći. Uprkos velikom značaju zebrice kao animalnog model sistema u ispitivanju toksičnosti, primetan je nedostatak podataka o toksičnim efektima cijanobakterija na molekularnom nivou i njihovom uticaju na ekspresiju gena ovih organizama. Ova vrsta istraživanja može omogućiti bolje razumevanje složenih interakcija između cijanobakterija i kičmenjačkih organizama na genetičkom i molekularnom nivou. 1.5.2.6. Oryzias latipes bioesej Medaka (Oryzias latipes) su slatkovodne ribe malih dimenzija koje pokazuju veliku sličnost sa zebricama, uključujući mnoge karakteristike koje se smatraju vrednim u testovima toksičnosti. Kao i zebrice, embrioni medaka ribica su providni tokom ranih faza u razvoju, što ih čini idealnim za proučavanje uticaja toksičnih supstanci na razvoj i funkciju organa (Shima i Shimada, 1994). Medaka takođe imaju kratak životni ciklus, pri čemu se njihova jaja mogu izleći u roku od nedelju dana, a njihov potpuni razvoj traje samo oko dva meseca, što omogućava brže testiranje i procenu toksičnih razvojnih efekata (Kasahara i sar., 2007; Le Manach i sar., 2018). Dodatna podobnost u upotrebi medaka ribica kada se radi o ispitivanju toksičnosti leži u jednostavnosti i niskoj ceni održavanja u poređenju sa drugim modelima kičmenjaka, jer ne zahtevaju veliki prostor, što ih čini atraktivnom opcijom za istraživače koji rade u ograničenim laboratorijskim prostorima (Shima i Shimada, 1994). Pored toga, genom ovog organizma je u potpunosti sekvenciran 2007. godine, čime je omogućeno ispitivanje mehanizama toksičnosti na molekularnom nivou (Kasahara i sar., 2007). Istraživanja vezana za ispitivanje toksičnosti cijanobakterija sa ovim modelom su prvenstveno fokusirana na histopatološke promene koje su rezultat akutnog i hroničnog izlaganja, kao i na molekularne i reproduktivne efekte koji čine osnovu ovih promena (Djediat i sar., 2011; Trinchet i sar., 2011; Le Manach i sar., 2018). 35 1.5.3. Molekularne metode Došlo je do značajnog napretka u oblasti toksikologije u poslednjih 50 godina, delimično zahvaljujući razvoju i unapređivanju molekularnih tehnika i sve većem razumevanju uticaja toksičnih jedinjenja na osnovne ćelijske i molekularne procese. Molekularne metode u ovoj oblasti se najčešće baziraju na detekciji producenata toksina u ispitivanom uzorku na osnovu prisustva gena koji kodiraju toksine od interesa. Takođe, danas se do značajnih informacija o potencijalnoj toksičnosti ispitivane supstance može doći pre detekcije fiziološkog odgovora, ispitivanjem transkripcionih (iRNK) i translacionih produkata ekspresije gena izloženog organizma (Singh i sar., 2018). U idealnom slučaju, ove promene u ekspresiji gena, koje su potencijalno povezane sa primarnim efektima ispitivane supstance, mogu biti identifikovane pre nego što se pojave bilo kakve fenotipske promene. Identifikovanje ovih promena i njihovo povezivanje sa štetnim efektima je ključno za pronalaženje karakterističnih biomarkera i za generisanje hipoteza o mehanizmima delovanja toksina. 1.5.3.1. PCR metode Metode bazirane na lančanoj reakciji polimerizacije (PCR), su neke od najčešće korišćenih metoda za detekciju toksina u različitim uzorcima i ispitivanje njihovih efekata. PCR tehnike se mogu opisati kao brze in vitro procedure za enzimsku amplifikaciju specifičnih DNK sekvenci (u čistim uzorcima ili kompleksnim smešama) koristeći dva oligonukleotidna prajmera koji hibridizuju sa naspramnim lancima DNK i okružuju sekvencu od interesa. Specifičnost tradicionalne PCR metode obezbeđuju upravo oligonukleotidni prajmeri koji započinju cikluse uzastopnih replikacija in vitro. Nakon svakog ciklusa, udvostručuje se količina DNK sekvence od interesa, odnosno dolazi do eksponencijalnog porasta u količini ciljne sekvence. U klasičnoj PCR proceduri, vizuelizacija i analiza proizvoda amplifikacije se postiže upotrebom agarozne gelelektroforeze, međutim, daljim razvojem metode, potreba za ovim korakom je prevaziđena. Kvantitativna lančana polimerazna reakcija ili qPCR je metoda koja ima značajno niži prag detekcije u odnosu na klasičnu PCR metodu i zahvaljujući upotrebi specifičnih proba za obeležavanje nastalog produkta omogućava praćenje toka reakcije i olakšava proces kvantifikacije dobijenog proizvoda. Zapravo, mogućnost praćenja amplifikacije proizvoda u toku reakcije je osnovna prednost u odnosu na klasičnu PCR detekciju, jer nije neophodna naknadna potvrda nastanka amplifikata pomoću agaroznog gela (Babalola, 2014). Kao što je slučaj sa qPCR, primenom RT-qPCR (real-time quantitative PCR) metode, može se istovremeno detektovati i meriti brojnost amplifikovane DNK. Međutim, RT-qPCR kao početni materijal u reakciji koristi RNK, koja se reverzno transkribuje u komplementarnu DNK (cDNK) koristeći reverznu transkriptazu i specifične prajmere (Bustin, 2000). cDNK se potom koristi kao matrica za klasičnu PCR reakciju. RT-qPCR se može izvesti u jednom koraku, u okviru jedne reakcije, ili u 2 uzastopna koraka. Protokoli koji uključuju jedan korak se smatraju adekvatnijim zbog smanjenog rizika od kontaminacije (Wong i Medrano, 2005). Osnovna prednost upotrebe PCR metode za detekciju toksigenih organizama je u tome što se detekcija može uspešno izvršiti na osnovu jedne ćelije u roku od sat vremena i manje, nasuprot konvencionalnim metodama koje zahtevaju dane ili čak nedelje. Međutim, osnovni nedostatak je u tome što DNK sekvenca koja se detektuje mora biti prethodno poznata i takođe, što DNK sekvenca na kojoj se bazira dijagnostički test mora biti jedinstvena za dati mikroorganizam, kako bi se izbegla interferencija i dobijanje lažno pozitivnih rezultata. Iako metoda ukazuje samo na potencijalan rizik od sinteze toksina i ne obezbeđuje informacije o realnim koncentracijama toksina u uzorku, real-time PCR 3. Materijal i metode 43 3.1. Testirani sojevi cijanobakterija, kultivacija i priprema ekstrakata 3.1.1. Kultivacija odabranih sojeva cijanobakterija Cijanobakterijski sojevi čija toksična svojstva su eksperimentalno ispitivana predstavljaju sojeve koji pripadaju Novosadskoj kolekciji kultura cijanobakterija (NSCCC) Departmana za biologiju i ekologiju Prirodno-matematičkog fakulteta u Novom Sadu. Među odabranim sojevima, nalazili su se predstavnici rodova Nostoc, Anabaena, Oscillatoria i Microcystis, među kojima je 5 terestričnih sojeva i 5 akvatičnih sojeva (Tabela 2, Slika 9). Toksični referentni soj Microcystis aeruginosa PCC 7806, dobijen je iz Pasterove kolekcije kultura (PCCPasteur Culture Collection of Cyanobacteria). Kod ovog soja je potvrđena produkcija mikrocistina i stoga je u većini testova korišćen kao pozitivna kontrola. Svi sojevi izuzev referentnog soja su autohtoni, izolovani sa područja Vojvodine (Srbija). Tabela 2. Odabrani sojevi cijanobakterija iz Novosadske kolekcije kultura cijanobakterija (NSCCC) i Pasterove kolekcije kultura (PCC). Naziv soja Red Izvor (kolekcija) Originalno poreklo Oblast (A) Anabaena Č2 Nostocales NSCCC Terestrična sredina/černozem Srbija, Vojvodina (B) Anabaena Č5 Nostocales NSCCC Terestrična sredina/černozem Srbija, Vojvodina (C) Nostoc 2S1 Nostocales NSCCC Terestrična sredina/solonjec Srbija, Vojvodina (D) Nostoc Z1 Nostocales NSCCC Jezero Zobnatica Srbija, Vojvodina (E) Nostoc 2S3B Nostocales NSCCC Terestrična sredina/černozem Srbija, Vojvodina (F) Nostoc LC1B Nostocales NSCCC Terestrična sredina /livadska crnica Srbija, Vojvodina (G) Oscillatoria DTD-Bečej Oscillatoriales NSCCC Kanal Dunav-TisaDunav Srbija, Vojvodina (H) Oscillatoria Z1 Oscillatoriales NSCCC Jezero Zobnatica Srbija, Vojvodina (I) Oscillatoria K3 Oscillatoriales NSCCC Jezero Krivaja Srbija, Vojvodina (J) Microcystis aeruginosa PCC 7806 Chroococcales PCC Braakman rezervoar Holandija 44 A) B) C) D) E) F) G) H) I) J) Slika 9. Fotografije odabranih cijanobakterijskih sojeva A) Anabaena Č2; B) Anabaena Č5; C) Nostoc 2S1; D) Nostoc Z1; E) Nostoc 2S3B; F) Nostoc LC1B; G) Oscillatoria DTD-Bečej; H) Oscillatoria Z1; I) Oscillatoria K3; J) Microcystis aeruginosa PCC 7806 Kao osnovni medijum za kultivaciju sojeva korišćena je sintetička, tečna mineralna podloga BG11 (Tabela 3) (Rippka i sar., 1979), koja podržava rast širokog spektra terestričnih i slatkovodnih cijanobakterijskih vrsta. Pripreme podloge su uključivale modifikacije u sadržaju azota u formi natrijum-nitrata (NaNO3) u zavisnosti od karakteristika gajenih sojeva, pa je tako podloga bez dodatka azota korišćena prilikom gajenja svih heterocistnih sojeva sa sposobnošću azotofiksacije u uslovima smanjene dostupnosti azota, dok je za neheterocitne sojeve pripremana podloga uz dodatak NaNO3. Soj M. aeruginosa PCC 7806 je gajen u modifikovanoj BG11 podlozi (mBG11), koja je podrazumevala dodatak 0.8 g L-1 NaNO3 tokom pripreme podloge. Početna pH vrednost svih podloga je iznosila 7.5. Dodatne modifikacije osnovne podloge za gajenje cijanobakterija su uvođene u zavisnosti od eksperimentalne procedure i biće opisane u odgovarajućim poglavljima. Aksene kulture su gajene u erlenmajer posudama zapremine 250 ml, pri temperaturi od 24 ± 1°C uz svetlosni režim od 16 časova svetlosti i 8 časova mraka i intenzitet svetlosti od 4760 do 5710 lx. Sve kulture su gajene 21 dan, odnosno, do ulaska u stacionarnu fazu rasta. Nakon toga, pristupljeno je izdvajanju biomase i pripremi ekstrakata za testiranja. 45 Tabela 3. Sastav mineralne podloge BG 11 po recepturi opisanoj u Rippka i sar. (1979). Komponente Količina u g L-1 NaNO3 1.5 K2HPO4 x 3H2O 0.04 MgSO4 x 7H2O 0.075 CaCl2 x 2H2O 0.036 Na2CO3 0.020 Limunska kiselina 0.006 Fe – amonijum citrat 0.006 EDTA 0.001 A5 (rastvor oligoelemenata)* 1 mL L-1 *A5 – sastav A5 mešavine oligoelemenata (g L-1): H3BO3 (2.86); MnCl2 x 4H2O (1.81); ZnSO4 x 7H2O (0.222); MoO3 x 2H2O (0.390); CuSO4 x 5H2O (0.079); Co(NO3)2 x 6H2O (0.0494). 3.1.2. Priprema intracelularnih ekstrakata Nakon perioda kultivacije, vlažna cijanobakterijska biomasa je izdvojena iz medijuma pipetiranjem ili filtracijom pomoću vakuum pumpe i sterilnih filtera poroziteta 0.45 μm (Sartorius, Nemačka). Potpuna dehidratacija biomase je postignuta 24-časovnom liofilizacijom uz upotrebu Christ Alpha 2-4 LD plus aparata (Christ, Nemačka). Nakon isušivanja, biomasa je izmerena i odgovarajuća količina je izdvojena, potopljena u 1 mL rastvarača (dihlormetan-etanol 1:1 – DMSO ekstrakcija (dimetil sulfoksid, Sigma, SAD) ili 75% metanol – metanolna ekstrakcija) i odložena na 4°C preko noći. U zavisnosti od eksperimentalne procedure sprovedene u narednoj fazi testiranja, kao rastvarač je primenjen 75% metanol (metanolna ekstrakcija) ili dihlormetanetanol (1:1) (DMSO ekstrakcija). U slučaju metanolne ekstrakcije, drugi dan ekstrakcije je podrazumevao oslobađanje aktivnih metabolita iz ćelija indukovano sonikacijom u ultrazvučnom vodenom kupatilu tokom 10 min. (u ciklusima od 30 sekundi). Ekstrakti su zatim centrifugirani (Eppendorf 5424 R) tokom 15 min. na 5000 rpm, a supernatanti izdvojeni i odloženi na 40C do primene u eksperimentima. U slučaju DMSO ekstrakcije, nakon sonikacije od 5 min., ekstrakti su vorteksirani u dva ciklusa po 2 min. i zatim centrifugirani tokom 5 min. na 12.000 rpm. Izdvojeni supernatanti su uparavani kako bi se uklonio rastvarač i onemogućila potencijalna interferencija sa eksperimentom. Nakon uparavanja, isušeni ekstrakti su resuspendovani u 200 µL čistog (98%-99%) rastvora DMSO, nakon čega su odloženi u zamrzivač na -20° C do upotrebe. 46 3.2. Akutna toksičnost cijanobakterijskih sojeva na nivou čitavog organizma - biotestovi toksičnosti sa akvatičnim model organizmima 3.2.1. Biotest Daphnia magna - uslovi gajenja kulture i osnovna eksperimentalna procedura Organizmi upotrebljeni u toku eksperimenata predstavljaju kulturu D. magna Laboratorije za hidrobiologiju Departmana za biologiju i ekologiju, Prirodno-matematičkog fakulteta u Novom Sadu. Jedinke su uzgajane u standardnoj sintetičkoj podlozi pripremljenoj prema USEPA propisima (USEPA, 2002), kontrolisane pH vrednosti od 8.0 ± 0.5. Podloga korišćena za gajenje dafnija je takođe korišćena u pripremnoj fazi kao i u toku samog eksperimenta. Populacije su održavane u staklenim posudama zapremine 2 L, pri osvetljenosti po režimu 16 h svetlosti-8 h mraka i temperaturi od 20 ± 2 0C. Za ishranu dafnija korišćena je biomasa mikroalge Chlorella vulgaris kao i rastvor pekarskog kvasca, jednom dnevno, pet dana sedmično, dok je medijum obnavljan dva puta svake sedmice. Sve eksperimentalne kulture su formirane pomoću neonata starosti do 24 h, dobijenih isključivo klonalnom reprodukcijom, čime je osigurana genetička uniformnost svih jedinki uz održanje prirodne genetičke varijabilnosti. Tokom testiranja, korišćeno je deset neonata na 25 mL test rastvora u četiri ponavljanja za svaku koncentraciju tretmana. Pre izlaganja ekstraktima cijanobakterija test organizmi nisu hranjeni 24 sata. Test medijumi nisu obnavljani, a životinje nisu hranjene ni u jednom od eksperimenata. U cilju korišćenja juvenilnih jedinki približno iste starosti, u početnoj fazi eksperimenta gravidne ženke su izdvajane u zasebne posude sa medijumom. Medijum je aerisan 24 h pre upotrebe, nakon čega je merena koncentracija rastvorenog kiseonika, kako bi se osiguralo da prevazilazi 3 mg L-1. Jedinke su zatim ostavljane 1-2 dana do izleganja neonata. Nakon izleganja, neonate su izdvajane u staklenu čašu sa medijumom. Serija razblaženja je pripremljena za svaki od cijanobakterijskih ekstrakata (koncentracije 150 mg mL-1 – priprema opisana u potpoglavlju 3.1.2) u staklenim tikvicama zapremine 200 mL. Po 25 mL pripremljenih tretman rastvora je prebačeno u sterilne čaše zapremine 50 mL. Za svaku korišćenu koncentraciju su pripremljena četiri replikata. Poslednji korak je uključivao aplikaciju eksperimentalnih organizama, gde je 10 neonata dodato u svaku čašu pasterovom pipetom koja je proširena kako ne bi došlo do povrede jedinki tokom rukovanja. 3.2.2. Biotest Daphnia magna - osnovna eksperimentalna procedura Testovi akutne toksičnosti sa D. magna su sprovedeni u skladu sa standardnim protokolom ISO 6341 (CSN ISO 6341, 1996). Sintetički medijum koji se koristi za kultivaciju dafnija je takođe korišćen za pripremu četiri koncentracije (100, 150, 200 i 250 µg mL-1) DMSO tipa ekstrakta, kao i za kontrole. Dodatno, dodate su DMSO kontrole sa odgovarajućim opsegom koncentracija da bi se testirala inertnost DMSO u primenjenim koncentracijama, zajedno sa kontrolama medijuma bez dodatog ekstrakta ili rastvarača. Koncentracija DMSO rastvarača u eksperimentu bila je niža od 0.1%. Vijabilnost test organizama je praćena nakon 24 i 48 h izlaganja pomoću kompaktnog stereomikroskopa (Olympus SZX7, Tokyo, Japan), pri čemu je primarni mereni toksični efekat bila imobilizacija testiranih jedinki. Podaci o akutnoj toksičnosti su predstavljeni kao procenat prosečnog mortaliteta u četiri ponavljanja ± standardna devijacija (SD). Rezultati su prikazani tabelarno pomoću Microsoft Office Excel 365 programa. 47 3.2.3. Biotest Danio rerio - gajenje i održavanje eksperimentalnih jedinki i dobijanje embriona Jedinke vrste Danio rerio (zebrica) AB soja (divlji tip) korišćene u eksperimentima su ustupljene Laboratoriji za fiziologiju životinja od strane Dr. Zsolt Csenki sa Szent Istvan Univerziteta (Godollo, Mađarska). Populacije su održavane u akvarijumima zapremine 30 L (~1L po jedinki), pod kontrolisanim uslovima koji su uključivali temperaturu (28°C), svetlosni režim (14:10 h svetlost/mrak), kao i stabilne vrednosti pH (8.4) i rastvorenog kiseonika (~80%). Kao medijum za gajenje ribica u akvarijumima korišćena je filtrirana vodovodska voda (česmuša) obogaćena komercijalno dostupnim aditivima (Easy-Life Fluid Filter Medium, The Netherlands). Ribice su hranjene živim, juvenilnim jedinkama vrste Artemia salina (Dajana Artemia Egg Mix) i komercijalno dostupnom hranom za ribice u ljuspicama (Sera Vipan Nature Tropical Flakes, Heinsberg, Germany) dva puta dnevno, sedam dana u sedmici. Embrioni zebrica su dobijani parenjem adultnih jedinki postavljanih na mrest u prilagođenim akvarijumima (mrestilicama) preko noći, po šemi 3 ženke i 2 mužjaka. Pored uspostavljanja osnovnih, gore navedenih uslova, priprema mrestilica je uključivala i postavljanje zaštitne pregradne mrežice, čija je uloga sprečavanje kanibalizma embriona od strane adulta, kao i dodatnih elemenata koji su doprineli imitaciji prirodnog okruženja ribica pogodnog za mrest. Sam mrest i fertilizacija su se dešavali ujutru, 30 minuta nakon paljenja svetla. Najkasnije 60 minuta nakon fertilizacije, embrioni su sakupljani i izvršeno je njihovo pregledanje i selekcija pod lupom (Nikon SMZ800N, Tokyo, Japan). Birani su vitalni embrioni, kod kojih nije bilo uočljivih malformacija u vidu koagulacije ili anomalija vezanih za ćelijsku deobu. Odgovarajući embrioni su korišćeni u daljem testiranju. Kako embrioni korišćeni u ovim eksperimentima nisu bili stariji od 5 dana, nije bila neophodna dozvola etičke komisije za dobrobit životinja Univerziteta u Novom Sadu niti licenca po Direktivi Evropskog Saveta 2010-63-EU. 3.2.4. Biotest Danio rerio - osnovna eksperimentalna procedura Test embrionalne akutne toksičnosti je sproveden po opisanoj proceduri testa toksičnosti ribljeg embriona (Fish embryo toxicity test (FET)) (OECD, 2013) uz manje modifikacije. Eksperimenti su izvođeni u sterilnim mikrotitar pločama sa 24 bunarića, pri čemu je u svaki bunarić ploče najpre dodato 2 mL rekonstruisanog ribljeg medijuma, koji se sastojao od autoklavirane Milipure vode sa dodatkom 2 mM CaCl2, 0.5 mM MgSO4, 0.75 mM NaHCO3 i 0.075 mM KCl (ISO 73461:1996). Sledeći korak je uključivao dodavanje odgovarajućih količina cijanobakterijskih ekstrakata kako bi se u pločama dobio raspon od 5 različitih koncentracija (100, 120, 160, 200 i 250 µg mL-1). Embrioni su izlagani uticaju ekstrakata u grupama po 12, odnosno 3 embriona po otvoru ploče sa 4 replikata za svaku od primenjenih koncentracija. Kontrolne grupe su se sastojale od čistog ribljeg medijuma (negativna kontrola) i medijuma sa dodatkom DMSO (kontrola rastvarača), pri čemu koncentracija DMSO primenjena u eksperimentima nikada nije prelazila 0.1%. Embrioni su nakon dodavanja u ploče inkubirani na 28 °C, uz održavanje svetlosnog režima od 14h svetlosti: 10h mraka. U intervalima od 24h vršena je provera njihove vijabilnosti i beležene su promene uzrokovane tretmanima pomoću mikroskopa (Slika 10). Beležene promene su uključivale koagulaciju embriona, srčani rad, razvoj somita, deformaciju kičme, nedostatak odvajanja pupoljka repa, zakrivljenje repa u larvalnoj fazi, pigmentaciju, razvoj očiju, srčani edem (SE), edem žumančane kese (EŽK), zakasnelo izleganje/izostanak izleganja ( 48 Slika 10. Prikaz eksperimentalne procedure ispitivanja akutne toksičnosti ispitivanih sojeva kod embriona vrste D. rerio 49 Tabela 4). Test je smatran validnim ukoliko kod 90% embriona u kontrolnoj grupi nisu primećeni letalni ili subletalni efekti tokom ukupnog perioda izlaganja. Na kraju perioda izlaganja, na osnovu pozitivnog ishoda u bilo kojoj od navedenih tačaka su izračunate EC50 vrednosti. U slučajevima kada je toksičnost ekstrakata bila nedovoljna za izračunavanje EC50 vrednosti, korišćen je parameter EC10 koji je mogao biti izračunat kod većine testiranih sojeva. Parametar EC10 je izabran sa ciljem aproksimacije koncentracije bez efekta NOEC (engl. No effect concentration), stavljajući EC10 i EC50 na suprotne krajeve spektra toksičnosti. Rezultati su izraženi kao srednje vrednosti tri ponavljanja ± SD. Značajnost razlika zabeleženih za tretmane i netretiranu kontrolu je utvrđena na osnovu analize varijanse (ANOVA) i Dunnet post-hoc testova, pri čemu su kao dovoljno jak dokaz protiv nulte hipoteze prihvatane vrednosti p<0.05. GraphPad Prism 9 softver je korišćen za statističku analizu podataka i prikaz rezultata. Slika 10. Prikaz eksperimentalne procedure ispitivanja akutne toksičnosti ispitivanih sojeva kod embriona vrste D. rerio 50 Tabela 4. Prikaz subletalnih i letalnih promena koje se mogu detektovati u definisanim vremenskim tačkama kod ispitivanih embriona D. rerio nastalih usled izlaganja dejstvu cijanobakterijskih ekstrakata Kategorija Razvojni proces Vreme (hpf) 24 48 72 96 120 Letalni efekti Koagulacija embriona ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Izostanak formiranja somita ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Izostanak odvajanja repa ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Odsustvo srčanog rada ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Efekti na rast i razvoj Edem perikardijalne duplje ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Edem žumančane kese ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Zakasnelo izleganje/izostanak izleganja n.d. n.d. n.d. ⚫ ⚫ Deformiteti kičme ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Malformacija repa n.d. ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Izostanak cirkulacije krvi n.d. ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Malformacije glave ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ deformiteti oka (promene u veličini i obliku oka) ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Izostanak pigmentacije očiju/tela n.d. ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ Izostanak kretanja embriona/larve ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ ⚫ *n.d. – nije detektabilno 3.3. Akutna toksičnost cijanobakterijskih sojeva na molekularnom nivou i nivou ćelije 3.3.1. Biotest Daphnia magna - analiza relativnih promena u genskoj ekspresiji Efekti izlaganja cijanobakterijskim sojevima na ekspresiju odabranih gena kod vrste D. magna analizirani su korišćenjem tri različite koncentracije ekstrakata (Slika 11). Početna koncentracija sastojala se od 0.1 mL odgovarajućeg ekstrakta dodatih u 200 mL medijuma (što odgovara najvišoj korišćenoj koncentraciji od 75 µg mL-1). Preostale dve koncentracije su dobijene dvostrukim razblaženjima (37.5 i 18.75 µg mL-1). Kako bi se isključila mogućnost uticaja ekstrakcionog sredstva na ishod eksperimenta, kontrolna serija uzoraka (bez tretmana) je pripremljena sa rastvorom DMSO koji je prethodno korišćen za solubilizaciju ekstrakata cijanobakterija, u istom opsegu koncentracija kao i tretman. Dodatno, pripremana je kontrola koja se sastojala iz podloge bez dodatih ekstrakata ili DMSO rastvarača. Koncentracije DMSO u medijumima za izlaganje nikada nisu prekoračile 0.05%. Na ovaj način pripremljeni eksperimentalni tretmani su ostavljani tokom 48 h, uz provere vijabilnosti neonata na svaka 24 h. Jedinke kod kojih nije uočeno kretanje su smatrane uginulim i uklanjane su iz eksperimenta. 51 Nakon izlaganja, neonate su sakupljene u kivete zapremine 1.5 mL, potopljene u 350 µL reagensa za stabilizaciju tkiva (RNAlater) i odložene na -80°C. 3.3.1.1. Biotest Daphnia magna - ekstrakcija RNK i kvantitativna „real time“ PCR (RTPCR) metoda U pripremnoj fazi, uzorci su otapani na ledu u cilju izdvajanja RNA-later reagensa. Ekstrakcija ukupne RNK je sprovedena pomoću komercijalnog kompleta Rneasy Mini Kit (Qiagen, Nemačka) prateći uputstva navedena u protokolu proizvođača. Nakon ekstrakcije, čistoća i ukupna koncentracija izolovane RNK je potvrđena spektrofotometrijski pomoću NanoDrop 1000 spektrofotometra (Nanodrop Techologies Inc. Wilmington, SAD) merenjem apsorbanci uzoraka na talasnim dužinama od 260, 280 i 230 nm, nakon čega su uzorci odloženi na -80°C. Reverzna transkripcija je sprovedena koristeći QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Nemačka) na osnovu protokola proizvođača. Dobijena komplementarna DNK (cDNK) je razblažena do koncentracije od 10 ng µL-1 i odložena na -20°C. Kvantifikacija ekspresije gena sprovedena je primenom metode kvantitativne analize lančane reakcije polimeraze u realnom vremenu (Quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR). Analize su vršene upotrebom Mastercycler ep Gradient S uređaja (Eppendorf, Nemačka) i Power SYBR Green Master Mix (Applied biosystems, SAD). Za postavku reakcija, korišćene su polipropilenske ploče sa 96 bunarčića (ThermoFisher Scientific, SAD). Reakciona smeša zapremine 13.05 µL se sastojala iz 5.25 µL Power SYBR Green Master Mix, 1000 nM rastvora prajmera (Forward+Reverse) i 25 ng cDNK rastvorene u DNase RNase Protease Free H2O. Čistoća konstituenata smeše je testirana u svakoj ploči dodatkom triplikata negativne kontrole koja se sastojala samo od reakcione smeše, bez cDNK. Amplifikacioni program podešen na PCR instrumentu je uključivao inicijalnu denaturaciju na 95ºC tokom 10 min., nakon čega je sledilo 40 ciklusa koji su se sastojali od dva koraka: 15 s na 95ºC i 60 s na 60ºC. Temperaturni opseg od 65ºC do 95ºC za krivu topljenja je podešen u svakoj reakciji. Kod test organizma D. magna, testiran je uticaj ekstrakata na ekspresiju 5 gena (cyp314, cyp360A, gst, pgp, vtg), dok je kao endogena kontrola upotrebljen gen β-actin koji je konstitutivno eksprimovan u svim eksperimentalnim grupama. Sekvence prajmera za referentni i sve ciljne gene su prikazane u Tabela 5. 58 Slika 13. Šema eksperimenata sa ciljem ispitivanja uticaja različitih faktora kultivacije i faza rasta na toksičnost cijanobakterija u biotestu A. salina 3.5. Utvrđivanje toksigenog potencijala ispitivanih sojeva 3.5.1. Utvrđivanje produkcije mikrocistina kod odabranih sojeva primenom imunološkog eseja - ELISA test Uzorci ispitivanih cijanobakterijskih sojeva su podvrgnuti ELISA testu za detekciju ukupne produkcije mikrocistina uz pomoć komercijalnog kompleta QuantiPlate Kit for Microcystins High Sensitivity (Envirologix Inc., SAD). Eksperiment je sproveden u laboratorijama Naučnog instituta za veterinarstvo “Novi Sad” u Novom Sadu. Test se bazira na kompeticiji mikrocistina u uzorcima sa enzimom (peroksidaza rena) obeleženim mikrocistinom, prisutnim na površini bunarića ploče, za ograničen broj veznih mesta na antitelima. Kao što je slučaj kod svih kompetitivnih imunotestova, koncentracija ispitivanog agensa u uzorcima je obrnuto proporcionalna intenzitetu boje koja se pojavljuje u bunarićima ploče. Prva, pripremna faza je uključivala odlaganje uzoraka na -80°C tokom 12h. Nakon otapanja uzoraka u vodenom kupatilu na 35°C, izvršena je disrupcija integriteta cijanobakterijskih ćelija u ultrazvučnom kupatilu u 3 ciklusa po 30 sekundi. Nakon sonikacije, 2 mL svakog uzorka je profiltrirano kroz filtere poroznosti 0.22 µL kako bi se uklonili suspendovani ćelijski konstituenti. Uzorci pripremljeni na ovaj način su podvrgnuti ELISA testu po uputstvima proizvođača. Svi uzorci, uključujući 4 standarda i negativnu kontrolu su testirani u duplikatima. Spektrofotometrijska merenja su izvršena na talasnim dužinama od 450 i 650 nm pomoću čitača mikrotitar ploča (Asys Expert Plus UV, Biochrom, Velika Britanija). Navedeni opseg detekcije kompleta je 0.1-1.2 ppb. Koncentracije MC-LR ekvivalenata prisutne u testiranim cijanobakterijskim uzorcima su izračunate na osnovu standardne krive i izražene u µg L-1. Rezultati dobijeni za soj Microcystis aeruginosa PCC 7806, koji je poznat producent mikrocistina, su upotrebljeni kao pozitivna kontrola. 59 3.5.2. Utvrđivanje potencijala za produkciju toksina na osnovu prisustva mcy gena i drugih genskih klastera odgovornih za biosintezu najznačajnijih grupa cijanotoksina u sekvenciranim genomima sojeva U okviru ovog istraživanja su prvi put sekvencirani genomi odabranih devet cijanobakterijskih sojeva u cilju detekcije genskih klastera odgovornih za biosintezu najznačajnijih grupa cijanotoksina. Referentni soj Microcystis aeruginosa PCC 7806 nije uključen kao deo ove faze istraživanja, jer je kompletna sekvenca genoma ovog soja već okarakterisana i dostupna u NCBI (National Center for Biotechnology Information) bazi podataka (ID: 267872) (Frangeul i sar., 2008). Sirovi podaci na osnovu kojih su sprovedene analize su pohranjeni i dostupni u sledećem dokumentu (https://drive.google.com/drive/folders/1kTXEcMm9OLgBB-4UnsYsEuwB_GzV5gED). 3.5.2.1. Ekstrakcija DNK i priprema za sekvenciranje genoma cijanobakterija Po 100 mL sveže kulture svakog od sojeva je sakupljeno u sterilne tube od 50 mL i centrifugirano na 6000 g tokom 10 min. Supernatant koji se sastojao iz iskorišćenog BG11 medijuma je odlivan, dok je koncentrovana biomasa u talogu sakupljana i resuspendovana u 5-10 mL svežeg sterilnog medijuma. Iz uzoraka biomase koncentrovane na ovaj način, izdvajano je 1.8 mL za ekstrakciju DNK pomoću komercijalnog kompleta DNeasy PowerLyzer Microbial Kit (Qiagen). Protokol ekstrakcije je većinski sproveden po uputstvima proizvođača kompleta, uz prilagođavanje procedure predviđene za liziranje ćelija, kako bi se povećali prinosi DNK, uzele u obzir karakteristike ćelijskih omotača svakog pojedinačnog cijanobakterijskog soja i potencijalna fragmentacija DNK svela na minimum. Biomasa sojeva čije ćelije se teže liziraju usled prisustva rigidnijih omotača (npr. sojevi roda Oscillatoria), je zamrznuta u tečnom azotu i homogenizovana pomoću tučka i avana, dok su ćelije preostalih sojeva razbijane pomoću 0.5 g sterilnih silikonskih kuglica dijametra 0.1 mm uz upotrebu homogenizatora (BeadBug Microtube Homogenizer, 115V (Benchmark Scientific, SAD)), pri brzini od 2800-3200 rpm tokom 2x20 sekundi. Kvalitet i prinos izolata je određen upotrebom NanoDrop 1000 spektrofotometra (Nanodrop Techologies Inc. Wilmington, SAD) i QFX fluorometra (DeNovix). Uzorci su dodatno analizirani horizontalnom gel elektroforezom na 1% agaroznom gelu. Sekvenciranje kompletnih genoma je dalje sprovedeno u dva pristupa: 1. Uzorci svih sojeva su sekvencirani Illumina metodom sekvenciranja nove generacije (NGS) uslužno u kompaniji Macrogen Europe (Amsterdam, Holandija). Priprema biblioteka za sekvenciranje pomoću Illumina platforme je izvršena koristeći TruSeq Nano DNA i TruSeq DNA PCR Free komercijalne komplete. Ovom metodom su generisani kratki sirovi fragmenti/očitavanja (raw reads) dužine ~151 bp, uparenih krajeva. 2. Uzorci dva soja koji su se pokazali kao najtoksičniji tokom testiranja (Oscillatoria K3 i Nostoc LC1B) su dodatno sekvencirani pomoću PromethION platforme (Oxford Nanopore Technologies, Oxford, United Kingdom) prilikom istraživačke posete Školi bioloških nauka na Univerzitetu Kvinslend (Australija). Dodatna provera kvaliteta uzoraka DNK je izvršena pomoću TapeStation Analysis 4.1.1 (Agilent Technologies) softvera u okviru Genomic DNK ScreenTape platforme. Neobrađeni (sirovi) podaci dobijeni nakon nanopore sekvenciranja su konvertovani iz fast5 u fastq format pomoću Albacore softvera, koji je deo MinKNOW paketa. Ovom metodom su generisani znatno duži sirovi fragmenti dužine ~10.000 bp. 60 3.5.2.2. De novo sastavljanje genoma, metagenomsko grupisanje sekvenci i anotacija Provera kvaliteta sirovih očitavanja dobijenih nakon Illumina sekvenciranja je izvršena pomoću FastQC softvera (Verzija 0.11.9) (Irews, 2010), nakon čega su sekvence obrađene i profiltrirane pomoću Trimmomatic softvera (Verzija 0.36) (Bolger i sar., 2014) i dobijeni prečišćeni fajlovi sa očitavanjima visokog kvaliteta. Za de novo sastavljanje genoma upotrebljen je SPAdes softver (Verzija 3.15.4) (Bankevich i sar., 2012), čime je postignuto spajanje kratkih očitavanja u duže sekvence, takozvane kontige (contig) kao i njihovo povezivanje u skafolde (scaffolds) u kojima redosled kontiga odgovara onom prisutnom u originalnom genomu iz kog potiču. Nastavak analiza je zahtevao izdvajanje onih kontiga koji pripadaju genomu ciljnog cijanobakterijskog soja od kontiga poreklom od ostalih bakterijskih grupa iz asocijacije. Trimmomatic fajlovi koji su sadržali prečišćena kratka očitavanja i SPAdes fajlovi sastojani od sastavljenih kontiga, su upotrebljeni za metagenomsko binovanje (binning), odnosno proces grupisanja očitavanja i sastavljenih kontiga u diskretne BIN-ove u odnosu na pripadnost odgovarajućem genomu, odnosno, u grupacije u kojima svaka grupa predstavlja jedan određeni genom. Algoritam MaxBin2 softvera (Verzija 2.2.7) (Wu i sar., 2016), koji je primenjen u ovu svrhu, koristi nukleotidni sastav (frekvencije tetranukleotidnih sekvenci), pokrivenost kontiga (prosečan broj očitavanja po bazi u okviru kontiga) i prisusutvo gena koji predstavljaju filogenetske markere, kako bi grupisao sekvence u odgovarajuće BIN-ove. Klaster sastavljen isključivo od cijanobakterijskih sekvenci je odabran uz pomoć Kraken2 softvera (Verzija 2.1.1) (Wood i Salzberg, 2014) koji omogućava pridavanje taksonomskih obeležja sekvencama u okviru BINa. Karakteristike odabranog BIN-a, kao što su procenat guanin-citozin parova (GC%), ukupna dužina svih sekvenci (koja bi trebala odgovarati procenjenoj veličini cijanobakterijskog genoma) kao i broj i veličina grupisanih kontiga, su utvrđene pomoću Quast softvera (Verzija 5.2.0) (Mikheenko i sar., 2018). Za detaljnu anotaciju i identifikaciju ORF je upotrebljen Prokka softver (Verzija 1.14.6) (Seemann, 2014), dok je za detekciju i analizu genskih klastera za biosintezu sekundarnih metabolita korišćen antiSMASH softver (Verzija 6.1.1) (Medema i sar., 2011) (Slika 14). 61 Slika 14. Prikaz koraka obrade sirovih očitavanja nakon sekvenciranja, sastavljanja i anotacije cijanobakterijskih genoma 3.5.2.3. Procedura hibridnog sastavljanja genoma Provera kvaliteta sirovih očitavanja dobijenih upotrebom PromethION platforme je izvršena pomoću NanoPlot softvera (Verzija 1.36.2) (De Coster i sar., 2018). Dobijen je set od 5348994 očitavanja, pri čemu je srednja dužina očitavanja bila 5741.8 za soj Oscillatoria K3 i set od 2218310 očitavanja, srednje dužine od 8252.3 za soj Nostoc LC1B. Za dobijanje korigovanih kontiga na osnovu sirovih očitavanja, upotrebljen je Flye Softver (Verzija 2.9.1) (Kolmogorov i sar., 2020). Genomske sekvence za oba soja su dobijene kombinovanjem podataka dobijenih pomoću dva navedena pristupa, koristeći Unicycler softver (Verzija 0.5.0) (Wick i sar., 2017). Unicycler pojednostavljuje proces sastavljanja genoma kombinovanjem više alata u jedan sveobuhvatan paket i proizvodi kontige sa manje grešaka u sklapanju od drugih hibridnih asemblera. Softver prvo koristi SPAdes alat za sklapanje Illumina kratkih očitavanja, uz primenu različitih procedura prečišćavanja kako bi se odredila najjednostavnija struktura prilikom sklapanja sa ispravkama eventualnih grešaka pri čitanju. Nakon toga, Unicycler koristi duga očitavanja kako bi se premostile praznine preostale nakon poravnavanja kratkih očitavanja, nakon čega se dobijaju konačne “konsenzus” sekvence. Na ovaj način se istovremeno koriste prednosti oba pristupa, uključujući preciznost koju obezbeđuju kratka očitavanja i pokrivenost koja se dobija primenom dugih očitavanja. Konačno, Unicycler koristi Bowtie2 (Verzija 2.5.0) (Langmead i sar., 2009) i Pilon (Verzija 1.20) (Walker i sar., 2014) softvere da poboljša nacrt sklopa, prvenstveno eliminisanjem SNP-ova (Single Nucleotide Polymorphism) i indela. Dodatna prednost korišćenja Unicycler-a je njegova sposobnost da prepozna komponente genoma kao kružne, što eliminiše potrebu za dodatnim koracima cirkularizacije. Kao i u prethodno opisanoj proceduri, za detekciju i analizu genskih klastera za biosintezu sekundarnih metabolita korišćen je antiSMASH softver. 4. Rezultati i diskusija 63 4.1. Akutna toksičnost cijanobakterijskih sojeva na nivou čitavog organizma – biotestovi toksičnosti sa akvatičnim model organizmima 4.1.1. Biotest Daphnia magna - toksičnost ispitivanih sojeva u testu imobilizacije Test akutne toksičnosti sa vrstom D. magna je upotrebljen kako bi se utvrdio uticaj ispitivanih ekstrakata autohtonih zemljišnih i vodenih sojeva na preživljavanje ove grupe organizama. Rezultati dobijeni u eksperimentima su sumirani u Tabela 8. U kontrolnim grupama nisu zabeleženi letalni efekti nakon 48h izlaganja i pokretljivost test organizama je bila bez vidljivih promena tokom eksperimenta. Kod većine sojeva nisu zabeleženi letalni efekti tokom tretmana i pokretljivost test organizama je ostala nepromenjena do kraja eksperimentalnog perioda. Toksični efekti koji su zabeleženi su u velikoj meri bili zavisni od doze, sa najvišim stepenom imobilizacije primećenim u grupama tretiranim sa 250 µg mL-1 ekstrakata. Pored toga, efekti su se intenzivirali nakon dužeg izlaganja, jer su samo male promene u preživljavanju dafnija uočene nakon 24 sata, dok je nakon 48 sati stopa mortaliteta dostigla približno 20% kod pojedinih sojeva. Posle 48 sati, letalni efekti su primećeni samo u dve grupe sa najvišim koncentracijama (200 i 250 µg mL-1) soja Nostoc Z1 i Oscillatoria K3, pri čemu stopa mortaliteta u ovim slučajevima nije prelazila 15%. U slučaju soja Microcystis aeruginosa PCC 7806, efekti su bili nešto izraženiji i uočljivi čak i nakon 24 sata, pri čemu je mortalitet zabeležen samo u slučaju najveće koncentracije ekstrakta soja (2.5% ± 0.43). Posle 48 sati toksični efekti su se intenzivirali, sa 22.5% (250 µg mL-1) i 20% (200 µg mL-1) mortaliteta zabeleženog u grupama sa najvišim koncentracijama ekstrakta. Efekti toksičnih cijanobakterija i prečišćenih cijanotoksina na preživljavanje, reprodukciju i ishranu jedinki roda Daphnia nakon akutnog i hroničnog izlaganja su dobro istraženi i opisani u dostupnoj literaturi (Nizan i sar., 1986; Hietala i sar., 1995; Maršalek i sar., 2004; Dao i sar., 2010; Ortiz-Rodríguez i sar., 2012; Pawlik-Skowrońska i sar., 2019). Rezultati većine dosadašnjih istraživanja ukazuju na značajan negativan uticaj cijanobakterijskih metabolita na ove procese kod dafnija i najčešće ih povezuju sa mikrocistinom ili cilindrospermopsinom kao uzročnim agensima. U radu Pawlik-Skowrońska i sar. (2019), utvrđena je akutna toksičnost prečišćenog MC-LR toksina kod jedinki vrste Daphnia pulex nakon 24 h izlaganja, sa smanjenjem u stopi preživljavanja do nivoa od približno 80% pri koncentraciji od 1.66 µg mL-1 i 60% pri koncentraciji od 3.32 µg mL-1. U istom radu, izlaganje anatoksinu-a je izazvalo smanjenje u stopi preživljavanja jedinki na nivo od 33% pri koncentraciji od 1.66 µg mL-1, pokazujući mnogo jači efekat od onog registrovanog u slučaju MC-LR pri istoj koncentraciji. Sa druge strane, Tarczynska i sar. (2001) su definisali vrednosti LC50 (48h) od 511–5705 µg mL-1 za prečišćene ekstrakte cijanobakterija, na osnovu testiranja 17 uzoraka cijanobakterijskog cvetanja sa jedinkama D. magna. Međutim, rezultati istraživanja Sotero-Santos i sar. (2006) dobijeni nakon izlaganja jedinki vrste Daphnia similis i Ceriodaphnia silvestrii ekstraktima dobijenih iz uzoraka cijanobakterijskog cvetanja u kojima je dominirala vrsta Microcystis aeruginosa su ukazali na intenzivniju akutnu toksičnost sa LC50 (24h) vrednostima od 186.61 i 155.11 µg mL-1. Dodatno, u istraživanju Smutná i sar. (2014), ispitana je akutna i hronična toksičnost ekstraktata dobijenih iz osam uzoraka cijanobakterijskog cvetanja kod jedinki vrste D. similis i C. silvestrii. Zabeležene su varijacije u intenzitetu akutne toksičnosti u odnosu na tip uzorka gde su se LC50 (48h) vrednosti kretale između 107.9 i >1200 µg mL-1. Međutim, nakon hroničnog izlaganja (21 dan) utvrđeni su značajno intenzivniji dozno-zavisni letalni efekti i uticaj na reprodukciju test organizama. Rezultati navedenih istraživanja ukazuju na to da nasuprot prečišćenim cijanotoksinima, kada se 64 radi o cijanobakterijskoj biomasi ili prečišćenim ekstraktima, tip i intenzitet efekata, kao i letalna koncentracija, u velikoj meri zavise od ispitivanog cijanobakterijskog soja, kao i trajanja ekspozicije. Iako su koncentracije ekstrakata primenjene u ovoj doktorskoj disertaciji komparabilne efektivnim koncentracijama opisanim u drugim radovima, nije utvrđen statistički značajan uticaj na preživljavanje jedinki D. magna, što može biti posledica relativno kratkog vremenskog perioda izlaganja tokom testova akutne toksičnosti. Tabela 8. Akutna toksičnost cijanobakterijskih DMSO ekstrakata u biotestu D. magna, posle 24 i 48h izlaganja. Mortalitet (%) Naziv soja Koncentracija ekstrakta (µg mL-1) 24h izlaganja 48h izlaganja Anabaena Č2 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 Anabaena Č5 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 Microcystis PCC 7806 100 0 0 150 0 5 ± 0.5 200 0 20 ± 1 250 2.5 ± 0.43 22.5 ± 0.82 Nostoc 2S1 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 Nostoc 2S3B 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 Nostoc LC1B 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 Nostoc Z1 100 0 0 150 0 0 200 0 10 ± 0.71 250 0 15 ± 0.50 Oscillatoria DTD-Bečej 100 0 0 150 0 0 200 0 0 65 Mortalitet (%) Naziv soja Koncentracija ekstrakta (µg mL-1) 24h izlaganja 48h izlaganja 250 0 0 Oscillatoria K3 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 12.5 ± 0.43 Oscillatoria Z1 100 0 0 150 0 0 200 0 0 250 0 0 * Vrednosti su izražene kao srednja vrednost mortaliteta od n = 4 ponavljanja ±SD Relativno niska toksičnost zabeležena u testovima akutne toksičnosti takođe bi mogla biti posledica aktiviranja zaštitnih mehanizama uključenih u detoksikaciju štetnih jedinjenja kod dafnija, što u većini slučajeva može uspešno ublažiti toksične efekte. Drugo moguće objašnjenje za ovakav rezultat se može pronaći u načinu izlaganja test organizama. U ovom radu, jedinke su bile direktno izložene dejstvu bioaktivnih agenasa cijanobakterija rastvorenih u vodenom medijumu. Međutim, usvajanje cijanobakterijskih ćelija koje proizvode cijanotoksine (prvenstveno mikrocistine) putem ishrane je opisano kao primarni mehanizam intoksikacije kod dafnija (Rohrlack i sar., 2005). Varenjem ćelija cijanobakterija oslobađaju se mikrocistini koji se akumuliraju u šupljini srednjeg creva, odakle se mogu transportovati direktno u krvotok. Iako ovo otkriće nije začuđujuće, pošto se dafnije hrane neselektivnom filtracijom i izložene su toksičnim cijanobakterijama u svom prirodnom okruženju, ovaj nalaz direktno povezuje stopu ishrane sa preživljavanjem izloženih dafnija. Stoga se može pretpostaviti da mehanizam intoksikacije drugim cijanobakterijskim toksinima takođe uključuje ishranu. U istraživanju Haney i sar. (1995), smanjena brzina ishrane je utvrđena kod vrste Daphnia carinata izložene filtratima soja Aphanizomenon flos-aquae, kao i prečišćenom saksitoksinu, što je utvrđeno na osnovu učestalosti pokreta torakalnih izraštaja. Dodatno, primećena je povećana stopa postabdominalnog odbacivanja akumuliranog materijala, verovatno zbog prisustva toksičnih jedinjenja prisutnih u medijumu. Jedinke su mogle da se oporave do nivoa aktivnosti koji je bio prisutan pre tretmana mnogo brže nakon izlaganja čistom saksitoksinu nego filtratu, što ukazuje na mogućnost interakcije različitih metabolita prisutnih u filtratima kojom se povećava ukupna toksičnost. Pored toga, kontradiktorni rezultati istraživanja interakcije dafnija sa toksičnim cijanobakterijama mogu se objasniti sposobnošću ovih organizama da razviju toleranciju na toksine cijanobakterija, koji su često prisutni u njihovom prirodnom okruženju. Postoje indikacije o promenjenoj osetljivosti ovih životinja na cijanotoksine, posebno nakon što su prethodno bile izložene određenim metabolitima cijanobakterija ili ćelijskim konstituentima (Nandini, 2000; Gustafsson i Hansson, 2004; Lindsay i sar., 2006). Značajan uticaj na preživljavanje, rast i reprodukciju primećen je kod D. magna jedinki izloženih soju M. aeruginosa (Gustafsson i Hansson, 2004). Takođe je utvrđeno da test organizmi koji su prethodno bili izloženi toksičnom soju pokazuju povećanu toleranciju (preživljavanje i brzinu rasta) na toksične efekte, što implicira da su dafnije sposobne da se prilagode prisustvu toksičnih sojeva roda Microcystis, ukoliko su im obezbeđeni odgovarajući uslovi za aklimatizaciju (Ortiz-Rodríguez i sar., 2012). Negativan efekat na preživljavanje i fekunditet je utvrđen i kod jedinki vrste D. pulex nakon izlaganja 66 filamentima sojeva Anabaena flos-aquae i A. affinis, kao i prečišćenom anatoksinu-a (Claska i Gilbert, 1998). 4.1.2. Biotest Danio rerio - toksičnost ispitivanih sojeva u testu embriona zebrice U ovom radu je sprovedeno ispitivanje uticaja ekstrakata 10 cijanobakterijskih sojeva na embrio-larvalni razvoj jedinki vrste Danio rerio. Uočeni efekti koji su se najčešće javljali kao posledica tretmana ekstraktima cijanobakterija su grupisani u četiri osnovne kategorije: edemi perikardijalne komore, edemi žumančane kese, skeletni deformiteti (lordoza, kifoza, skolioza i zakrivljenost repa) i deformiteti glave i oka. Dodatno je praćena stopa izleganja, odnosno, tretmanom izazvana pojava preranog ili zakasnelog izlaska jedinki iz horiona. U kontrolnim grupama je zabeležen normalan razvoj embriona na osnovu opisa dostupnog u Kimmel i sar. (1995) i broj zabeleženih malformacija nikada nije prelazio 10%. Rezultati ispitivanja na ovom modelu ukazuju na potencijal odabranih sojeva da izazovu niz subletalnih toksičnih efekata kod izloženih embriona u različitim fazama razvoja. Utvrđene su značajne razlike u izazvanim efektima između ekstrakata različitih sojeva. Dodatno, za ekstrakte gotovo svih ispitanih sojeva je utvrđena vremenski i dozno-zavisna toksičnost. Abnormalnosti u razvoju su primećene kod jedinki izloženih ekstraktima soja Anabaena Č2 pri koncentracijama većim od 120 µg mL-1, pri čemu je pojava perikardijalnog edema bila najosetljiviji pokazatelj toksičnog dejstva (Slika 15A). Ovaj efekat je bio primetan već nakon 48 sati izlaganja, i često je praćen zakrivljenjima kičme (lordoza) i repa. Ukupna stopa malformacija je značajno odstupala od kontrole samo pri najvišoj testiranoj koncentraciji (250 µg mL-1) nakon 96 sati od fertilizacije, gde su deformiteti bili najizraženiji i utvrđeni kod preko 40% testiranih jedinki. Dodatno, zakasnelo izleganje ili odsustvo izleganja do kraja eksperimentalnog perioda primećeno je kod jedinki tretiranih najvišim koncentracijama ekstrakta (200 i 250 µg mL-1) (Slika 15C). Nije bilo moguće odrediti EC50 vrednosti za posmatrane kategorije efekata, jer frekvencija njihove pojave nije prelazila 40% u primenjenom opsegu koncentracija (EC50 > 250 µg mL-1). Međutim, za indikatore toksičnog dejstva kao što su pojava edema perikardijalne duplje i skeletnih deformiteta utvrđena je granična vrednost EC10 (120hpf) od 145.04 µg mL-1 odnosno 248.15 µg mL-1 (Slika 15B). (A) 67 (B) EC50 EC10 95% CI R2 EPD >250 145.04 / 0.93 EŽK >250 >250 / 1 SD >250 248.15 / 0.49 OGD >250 >250 / 1 (C) (D) Slika 15. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Anabaena Č2 u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. (A) Frekvencija 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena u zavisnosti od vremena izlaganja i koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju statistički značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične efektivne vrednosti EC50 i EC10, 95% interval poverenja (95% CI) za EC50 vrednost i R-kvadrat; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. Deformiteti skeleta su identifikovani kao najosetljiviji parametar prilikom testiranja ekstrakata soja Anabaena Č5, dok su preostali zabeleženi efekti uključivali perikardijalne edeme i edeme žumančane kese (Slika 16). Ovi efekti su uglavnom primećeni nakon 72 sata izlaganja i postajali su intenzivniji i brojniji sa produženim tretmanom (Slika 16A). Nakon primene koncentracija ekstrakata nižih od 200 µg mL-1, malformacije su primećene kod relativno malog procenta jedinki (7.14-10.41%), pri čemu su zakrivljenost kičme i repa jedini efekti zabeleženi među testiranim grupama u ovom opsegu. Pojava edema perikardijalne duplje kod izloženih jedinki konstatovana je samo nakon primene dve najviše koncentracije ekstrakta, dok su edemi žumančane kese primećeni tek nakon što su embrioni bili izloženi najvišoj koncentraciji ekstrakta (250 µg mL-1). Utvrđeno je da je stopa pojave subletalnih efekata bila statistički značajna nakon 120 sati izlaganja u grupi od 200 µg mL-1 i nakon 72 sata u grupi od 250 µg mL-1. Utvrđena 74 Testiranjem ekstrakata soja Nostoc LC1B, utvrđena je dozno-zavisna razvojna toksičnost kod izloženih jedinki, sa izraženim skeletnim i srčanim abnormalnostima (Slika 20D). Rezultati su pokazali da su najizraženije malformacije uočene kod eksponiranih embriona zebrice bile deformacije skeleta, perikardijalni edem i edem žumančane kese, koji su, za razliku od ostalih testiranih sojeva, bili primetni u određenoj meri pri svim ispitivanim koncentracijama ekstrakata. Efekti su bili najizraženiji u opsegu koncentracija od 160-250 µg mL-1, pri čemu su statistički značajne promene većinom zabeležene nakon 72 sata izlaganja (Slika 20A). Najčešći štetni efekti primećeni kod jedinki tretiranih ekstraktima ovog soja su bili perikardijalni edemi, koji su zabeleženi kod 50.55% eksperimentalnih organizama u grupama izloženim najvećoj koncentraciji ekstrakta. Pored toga, primećeno je postepeno povećanje u frekvenciji pojave skeletnih deformiteta kod jedinki sa produženim izlaganjem, dostižući maksimalnu vrednost od 38.8% nakon 120 sati izloženosti. Dodatno, utvrđen je uticaj tretmana na stopu izleganja zebrica (Slika 20C). U grupi izloženoj najvećoj koncentraciji, 80% jedinki se izleglo pre kraja eksperimenta, a samo 65% se izleglo pre vremenske tačke od 96 sati. Pri koncentraciji ekstrakta od 200 µg mL-1, izleganje je izostalo kod približno 10% izloženih jedinki. Granična EC50 vrednost nije mogla biti izračunata u datom opsegu koncentracija. Međutim, EC10 vrednosti su utvrđene za efekte edema perikardijalne duplje i skeletne deformitete i iznosile su 87.6 i 53.96 µg mL-1 ekstrakta (Slika 20B). (A) (B) EC50 EC10 95% CI R2 EPD >250 87.60 / 0.58 EŽK >250 >250 / 0.08 SD >250 53.96 / 0.64 OGD >250 >250 / 0.10 (C) 75 (D) Slika 20. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Nostoc LC1B u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. (A) Frekvencija 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena u zavisnosti od vremena izlaganja i koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju statistički značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične efektivne vrednosti EC50 i EC10, 95% interval poverenja (95% CI) za EC50 vrednost i R-kvadrat; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. Izloženost embriona ekstraktima soja Nostoc Z1 rezultirala je dozno-zavisnom toksičnošću (Slika 21A). Zapaženi razvojni abnormaliteti kod izloženih larvi su uključivali deformacije skeleta i edeme žumančane kese (Slika 21D). Incidenca deformacija skeleta nije prelazila 25%, a pojava edema žumančane kese nije prelazila 10% ni u jednoj od ispitivanih grupa. Međutim, utvrđeno je da se intenzitet uočenih promena povećava sa primenjenom koncentracijom ekstrakta. Promene su bile primetne tek nakon 72 sata izlaganja dejstvu ekstrakata, međutim, nakon ove vremenske tačke nije bilo većih promena u broju i intenzitetu malformacija. Na osnovu rezultata statističkog testa, ni u jednoj od eksperimentalnih grupa nije izračunata značajna razlika u incidenci ukupnih deformiteta. Referentne EC50 vrednosti su bile izvan primenjenog opsega koncentracija ekstrakta, međutim, za efekat skeletnih deformiteta je utvrđena EC10 vrednost od 204.9 µg mL-1 (Slika 21B). 76 (A) (B) LC50 LC10 95% CI R2 EPD >250 >250 / 1 EŽK >250 >250 / 0.74 SD >250 204.9 / 0.78 OGD >250 >250 / 1 (C) (D) Slika 21. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Nostoc Z1 u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. (A) Frekvencija 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena u zavisnosti od vremena izlaganja i koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju statistički značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične efektivne vrednosti EC50 i EC10, 95% interval poverenja (95% CI) za EC50 vrednost i R-kvadrat; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. 77 Subletalni efekti izloženosti različitim koncentracijama ekstrakta soja Oscillatoria DTD-Bečej na embrione zebrice su uključivali prvenstveno deformacije skeleta u vidu zakrivljenosti kičme i repa (Slika 22D). Primećeni su takođe edemi perikardijalne duplje, edemi žumančane kese, kao i deformiteta oka kod pojedinih jedinki, ali u znatno manjem broju embriona u odnosu na ostale primećene promene. Pojava skeletnih deformiteta, koji su se manifestovali u vidu lordoze i zakrivljenja pupoljka repa, bila je najčešća u grupama izloženim koncentracijama ekstrakta od 200 i 250 µg mL-1 (Slika 22A). Ovaj tip efekta je prvi put uočen nakon 48 sati izlaganja u malom procentu (4.5%) u obe grupe, pri čemu su do kraja eksperimenta skeletni deformiteti uočeni kod 40.9% jedinki pri koncentraciji od 200 µg mL-1 i 68.18% jedinki pri koncentraciji od 250 µg mL-1. Uočene kičmene malformacije nisu bile prisutne u grupi sa najnižom koncentracijom ekstrakta, dok su u koncentracijama nižim od 200 µg mL-1 bile uočljive kod manje od 20% izloženih zebrica do kraja eksperimenta. Perikardijalni edemi su uočeni u ranijim tačkama merenja (48 i 72 hpf), međutim, nije bilo vidljivih efekata ovog tipa nakon 96 sati izlaganja, što ukazuje na reverzibilnu prirodu ove promene. Dobijena EC50 (120 hpf) vrednost za efekat pojave skeletnih deformiteta kod test jedinki je iznosila 162.5 µg mL-1 (Slika 22B). (A) (B) EC50 EC10 95% CI R2 EPD >250 225.97 / 0.55 EŽK >250 >250 / 0.08 SD 162.5 79.67 / 0.60 OGD >250 249.50 / 0.16 (C) 78 (D) Slika 22. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Oscillatoria DTD-Bečej u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. (A) Frekvencija 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena u zavisnosti od vremena izlaganja i koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju statistički značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične efektivne vrednosti EC50 i EC10, 95% interval poverenja (95% CI) za EC50 vrednost i R-kvadrat; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. Razvojni deformiteti nastali kao rezultat izlaganja ekstraktima soja Oscillatoria K3 uključivali su deformitete kičme u vidu skolioze, lordoze i zakrivljenosti repnog pupoljka, kao i smanjenu veličinu oka i edeme žumančane kese koji su uočeni u svim koncentracijskim grupama, dok su perikardijalni edemi primećeni nakon primene koncentracija većih od 80 µg mL-1 (Slika 23A, Slika 23D). Trend smanjenja broja i intenziteta edema sa produženim izlaganjem zabeležen kod nekih od prethodno spomenutih sojeva je primećen i kod ovog soja u grupama izloženim dejstvu dve najveće koncentracije ekstrakta. Pri nižim koncentracijama, procenat jedinki sa ovim tipom promene nije prelazio 33.38%. Procenat test organizama sa uočljivom skoliozom i lordozom bio je posebno visok nakon izlaganja ekstraktima ovog soja, dostižući do 69.6% u grupi izloženoj najvećoj primenjenoj koncentraciji ekstrakta. Kod izloženih larvi je takođe uočen usporen ili zaustavljen razvoj očiju, u odnosu na kontrolnu grupu jedinki. Ovaj tip toksičnog efekta je zabeležen kod 60.6% jedinki u tretmanu sa najvećom koncentracijom. Dodatno, iako su stopa i vreme izleganja tekli očekivano, približno 15% embriona nije izašlo iz horiona do kraja eksperimenta (Slika 23C). Granične vrednosti EC50 (120 hpf) su izračunate za efekte skeletnih (215.6 µg mL-1) i deformiteta glave i oka (231.7 µg mL-1) (Slika 23B). Vrednosti EC10 su dobijene za sve tipove malformacija i iznosile su 163.65 µg mL-1 (EPD), 121.51 µg mL-1 (EŽK), 120.22 µg mL-1 (SD), 154.78 µg mL-1 (OGD). 79 (A) (B) EC50 EC10 95% CI R2 EPD >250 163.65 / 0.47 EŽK >250 121.51 / 0.39 SD 215.6 120.22 198.3 - 240.8 0.83 OGD 231.7 154.78 212.2 - 266.2 0.75 (C) 80 (D) Slika 23. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Oscillatoria K3 u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. (A) Frekvencija 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena u zavisnosti od vremena izlaganja i koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju statistički značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične efektivne vrednosti EC50 i EC10, 95% interval poverenja (95% CI) za EC50 vrednost i R-kvadrat; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. Najzastupljenija promena prouzrokovana izlaganjem test organizama ekstraktima soja Oscillatoria Z1 je bila pojava skeletnih deformiteta (Slika 24D). U grupama koje su bile izložene najvećoj koncentraciji ekstrakta, skeletni deformiteti su primećeni kod 100% jedinki nakon 120 sati izlaganja, dok je 21.4% registrovano nakon 24 sata izlaganja u istoj grupi (Slika 24A). Ovaj tip promene se manifestovao u vidu skolioze, lordoze i zakrivljenosti pupoljka repa, koji su bili primetni nakon 48 sati tretmana, pre izlaska jedinki iz horiona. Pored toga, kod velikog broja jedinki je primećena pojava edema žumančane kese (64.28% pri koncentraciji od 250 µg mL-1) i edema perikardijuma (57.14% pri koncentraciji od 250 µg mL-1), pri čemu su ove promene takođe bile primetne od 48. sata izlaganja i postajale su intenzivnije i brojnije sa dužim vremenom ekspozicije. Kod određenog broja jedinki (35.71% pri koncentraciji od 250 µg mL-1), primećena je pojava očiju manjih dimenzija u odnosu na kontrolnu grupu, što ukazuje na nepravilan ili usporen razvoj očiju. Referentne EC50 (120 hpf) vrednosti su izračunate za efekat pojave edema perikardijalne duplje (244.7 µg mL-1), edema žumančane kese (237.6 µg mL-1) i skeletnih deformiteta (199.6 µg mL-1). U slučaju efekta pojave deformiteta glave i oka, utvrđena je granična EC10 (120 hpf) vrednost (201.06 µg mL-1), dok je EC50 vrednost bila izvan testiranog opsega koncentracija (Slika 24B). Ekstrakti ovog soja su imali najizraženiji uticaj na izleganje ispitivanih organizama u odnosu na sve testirane sojeve (Slika 24C). U grupi tretiranoj najvećom koncentracijom ekstrakta, kod 30% jedinki nije došlo do izleganja do kraja eksperimentalnog perioda, dok je pri koncentraciji od 200 µg mL-1 inhibirano izleganje 15% jedinki. 81 (A) (B) EC50 EC10 95% CI R2 EPD 244.7 207.53 232.8 - 259.6 0.87 EŽK 237.6 117.85 194.9 - 486.2 0.62 SD 199.6 149.42 157.5 - 226.2 0.71 OGD >250 201.06 / 0.90 (C) 82 (D) Slika 24. Rezultati testiranja akutne toksičnosti ekstrakata soja Oscillatoria Z1 u biotestu sa embrionima vrste D. rerio. Svi rezultati su izraženi kao srednje vrednosti 3 ponavljanja ± SD, dok su vrednosti predstavljene u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta (A) Frekvencija pojave 4 najzastupljenije kategorije subletalnih promena beleženih u funkciji vremena izlaganja i primenjene koncentracije ekstrakta. Zvezdice (*) označavaju značajne statistički razlike između kontrolne i tretirane grupe utvrđene na osnovu dvosmerne ANOVA analize i Dunnet-ovih post-hoc testova (* P < 0.05; ** P < 0.001); (B) Granične vrednosti letalnosti LC50 i LC10, 95% interval poverenja (95% CI) dobijen za LC50 vrednost i R-kvadrat.; (C) Stopa izleganja tokom eksperimenta za svaku koncentracijsku grupu; (D) Zabeležene promene kod embriona i larvi u tretman grupama i slike jedinki u kontrolnoj grupi. Korišćene skraćenice: EPD – edem perikardijalne duplje, EŽK – edem žumančane kese, SD – skeletni deformitet, OGD – deformiteti glave i oka, DO – deformitet oka, ZI – zakasnelo izleganje. U poslednje vreme, zebrice postaju sve popularniji model organizam kada se radi o istraživanju toksičnosti cijanobakterija zbog svoje izuzetne vrednosti u proučavanju subletalnih efekata koji proizlaze iz akutne i hronične izloženosti. Brojne eksperimentalne studije ukazuju na to da cijanobakterijski toksini mogu izazvati značajne promene u embrionalno-larvalnom razvoju vodenih organizama i predlažu upotrebu vrste Danio rerio kao adekvatnog model organizma za ispitivanje cijanobakterijske toksičnosti (Lindsay i sar., 2006; Berry i sar., 2009; Ghazali i sar., 2009). Na osnovu EC50 vrednosti određenih u ovom radu, najosetljiviji sub-letalni parametri cijanobakterijske toksičnosti su bili skeletni deformiteti, potom edemi perikardijalne duplje i edemi žumančane kese kao indikatori kardiotoksičnosti i hepatotoksičnosti, zatim deformiteti glave i oka, i na kraju izmenjenu stopu izleganja ili izostanak izleganja, što ukazuje na to da ekstrakti ispitivanih cijanobakterijskih sojeva najveći uticaj imaju na pravilan razvoj tela zebrica. Od deset ispitanih sojeva, najveća toksičnost je zabeležena u slučaju akvatičnih sojeva Oscillatoria K3 i Oscillatoria Z1, gde su najizraženiji efekti uočeni pri koncentracijama ekstrakta od 200 i 250 µg mL-1. Efekti slični onima opisanim u ovom istraživanju su zabeleženi u radu Wang i sar. (2020), koji su ispitali toksični i teratogeni potencijal različitih koncentracija čistog cilindrospermopsina u testu sa embrionima zebrice. Utvrđeno je da izlaganje višim koncentracijama CYN (20, 200 i 2000 nM) dovodi do značajno usporenog srčanog rada, pojave edema žumančane kese i perikardijuma, kao i telesnih deformiteta kao što su smanjena dužina tela i smanjena veličina očiju. Pored toga, stopa izleganja je značajno smanjena u ovim grupama u poređenju sa kontrolnom grupom. Kako je ispitivanjem genoma sojeva Oscillatoria K3 i Oscillatoria Z1 takođe utvrđen potencijal za produkciju cilindrospermopsina na osnovu prisustva gena uključenih u biosintezu ovog cijanotoksina (Potpoglavlje 4.5.2), postoji mogućnost da je prisustvo cilindrospermopsina u ispitivanim ekstraktima odgovorno za zabeležene efekte tokom testiranja. Definitivno povezivanje nastalih efekata sa cilindrospermopsinom kao uzročnim 83 agensom ipak zahteva dodatne hemijske analize kako bi se potvrdila produkcija ovog toksina kod datih sojeva. Slično tome, u istraživanju koje su sproveli Moraes i sar. (2022), izlaganje dejstvu CYN je rezultiralo smanjenim rastom jedinki i abnormalnostima u razvoju kao što su edem perikardijuma i žumančane kese, kao i odsustvo ribljeg mehura. Takođe je utvrđeno da izlaganje koncentracijama CYN od 10 μg L-1 i višim dovodi do povećane smrtnosti ovih organizama u kasnijim fazama razvoja. Dodatno, efekti dva soja vrste Raphidopsis raciborskii (T2 i T3), su testirani u hroničnim i akutnim eksperimentima sa larvama zebrice i odraslim jedinkama (Zagatto i sar., 2012). Tokom akutnog testiranja nije utvrđen značajan uticaj nijednog od sojeva na preživljavanje odraslih zebrica, međutim, oba soja su negativno uticala na preživljavanje larvi, uzrokujući do 40% smrtnosti nakon četiri dana izlaganja i 100% smrtnosti do kraja eksperimenta (7 dana). U navedenim istraživanjima, malformacije su se pojavile nakon primene nižih koncentracija cijanobakterijskih metabolita u odnosu na koncentracije primenjene u ovom radu, međutim, spektar uočenih promena je takođe bio manji. Ova razlika može biti posledica primene izdvojenog i prečišćenog cilindrospermopsina, nasuprot neprečišćenim ekstraktima sojeva testiranih u ovom radu koji sadrže mešavinu različitih potencijalno toksičnih metabolita zbog čega može doći do potencijacije, aditivnog ili sinergističkog efekta. Slični razvojni deformiteti su, međutim, takođe zabeleženi kod larvi zebrica direktno izloženih saksitoksinu rastvorenom u tečnom medijumu (Pavagadhi i sar., 2012). U ovom radu, izlaganje embriona koncentraciji od 481± 40 µg L-1 rezultiralo je morfološkim abnormalnostima, uključujući edeme očiju, perikardijuma i žumančane kese, zakrivljenost kičme i repa, kao i kraniofacijalne deformitete. Dodatno, primećeni su senzomotorički poremećaji, sa totalnom paralizom koja se manifestovala nakon produženog izlaganja, na šta su razvijeniji embrioni bili posebno osetljivi. Većina subletalnih efekata, uključujući paralizu i fiziološke abnormalitete, se pokazala kao reverzibilna nakon prenošenja larvi u čistu vodu, što je u skladu sa opisanim mehanizmom delovanja saksitoksina. Na osnovu ovih i ranijih zapažanja, autori su zaključili da pojava malformacija kod zebrica može biti povezana sa otežanim kretanjem, što je uzrok neravnoteže tečnosti u organizmu i stoga nastanka edema. Ovaj zaključak je u skladu sa rezultatima dobijenim u ovom radu, jer su skeletni deformiteti kod jedinki izloženih dejstvu ekstrakata u većini slučajeva bili praćeni pojavom edema. Iako nisu uočene promene koje se mogu pripisati neurotoksičnom delovanju ekstrakata, kao što je paraliza čitavih jedinki (izostanak kretanja), primećeni kičmeni i repni deformiteti su izazvali usporeno ili otežano kretanje kod jedinki pod uticajem. Ekstrakti sojeva Microcystis aeruginosa PCC 7806 i Nostoc LC1B su takođe ispoljili visoku toksičnost u testu, pri čemu su edemi perikardijalne duplje i skeletne malformacije bili najčešći i najizraženiji zabeleženi efekti. Pored toga, primećena je kongestija krvi, odnosno, akumulacija krvnih zrnaca u predelu perikardijuma i žumanca. Istraživanja koja se odnose na nastanak malformacija i razvojnu toksičnost mikrocistina nakon direktnog izlaganja embriona zebrice su brojna i dok su neki od prvih eksperimentalnih rezultata pružili vrlo malo dokaza o takvim efektima (Oberemm i sar., 1997), novije studije ukazuju na pojavu značajnih razvojnih defekata kod izloženih jedinki. Wang i sar. (2005) su pokazali da prečišćen MC-LR nakon mikroinjekcije uzrokuje uginuće embriona na dozno i vremenski zavisan način i pojavu malformacija kod preživelih jedinki. Slično rezultatima dobijenim u ovom radu za ekstrakte soja M. aeruginosa PCC 7806, među najčešćim razvojnim defektima su se javljali edemi perikardijalne duplje i skeletni deformiteti (prvenstveno zakrivljenje repa) koji su se pogoršavali sa produženim izlaganjem. Vrlo je verovatno da horionska membrana onemogućava prodor mikrocistina u određenoj meri, što bi moglo objasniti odsustvo letalnog efekta i manji intenzitet malformacija u našem istraživanju. U istraživanju Oberemm i sar. 90 (A) (B) (C) (D) (E) Slika 27. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Microcystis aeruginosa PCC 7806 na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). 91 Nivoi ekspresije gena D. magna izloženih ekstraktima Nostoc 2S1 prikazani su na Slika 28. Utvrđeno je da je nivo ekspresije gena cyp314 bio statistički značajno manji nakon primene najveće koncentracije ekstrakta, dok je nivo u grupi izloženoj dejstvu ekstrakta u koncentraciji od 37.5 µg mL-1 bio poput kontrolne vrednosti (Slika 28A). Pri najnižoj ispitanoj koncentraciji ekstrakta, uočeno je smanjenje niova ekspresije gena cyp314 u odnosu na kontrolu, međutim, ova promena nije bila statistički značajna. Slično tome, ekspresija gena cyp360A8 je bila smanjena pri nižim koncentracijama ekstakta, ali je povećana približno 6.5 puta (p=0.0305) u grupi izloženoj najvećoj koncentraciji ekstrakta (75 µg mL-1) (Slika 28B). Iako geni cyp314 i cyp360A8 kodiraju proteine iste superfamilije, različiti obrasci njihove ekspresije u ovom slučaju mogu biti posledica različitih bioloških funkcija koje njihovi genski produkti obavljaju u organizmu D. magna. Gen cyp314 je ključan za proces presvlačenja, što direktno utiče na rast i razvoj ovih organizama, dok cyp360A8 značajno doprinosi detoksifikaciji, uključujući eliminaciju toksina i drugih supstanci. Utvrđeno je da je ekspresija gena gst bila inhibirana u sve tri eksperimentalne grupe, međutim, ove vrednosti nisu statistički značajno odstupale od kontrolnih (Slika 28C). Nivoi ekspresije gena vtg i p-gp su bili niži od kontrolnih nakon izlaganja najnižoj koncentraciji ekstrakta, međutim, u grupama izloženim višim koncentracijama nije bilo statistički značajnog odstupanja od kontrolnih vrednosti (Slika 28D; Slika 28E). (A) (B) 92 (C) (D) (E) Slika 28. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc 2S1 na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Relativne promene nivoa ekspresije gena nakon tretmana ekstraktima soja Nostoc 2S3B prikazane su na Slika 29. Nivoi transkripcije gena cyp314 su bili smanjeni u svim grupama u odnosu na kontrolu, pri čemu se u odgovor na povećanje koncentracije ekstrakta ekspresija ovog gena postepeno smanjivala (Slika 29A). Ekspresija gena cyp360A8 je bila povećana približno 2.5 puta u grupi sa koncentracijom od 75 µg mL-1 i smanjena u preostale dve grupe, međutim, ove promene nisu izazvale značajnu razliku u odnosu na nivoe zabeležene u kontrolnim grupama (Slika 29B). Ekspresija gst gena je bila inhibirana u tretmanu sa najvišom koncentracijom, dok preostale dve grupe nisu značajno odstupale od kontrole (Slika 29C). Sa druge strane, izlaganje test organizama koncentraciji ekstrakta od 75 µg mL-1 je rezultiralo statistički značajnom indukcijom p-gp gena (7.3 puta povećanje u odnosu na kontrolu, p<0.0001), bez značajnih promena u grupama nižih koncentracija ekstrakta. Nisu primećene značajne promene u ekspresiji gena vtg ni u jednoj od tretiranih grupa. 93 (A) (B) (C) (D) 94 (E) Slika 29. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc 2S3B na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Rezultati istraživanja pokazuju da su nivoi ekspresije oba gena koji pripadaju citohrom p450 familiji bili slični onima u kontrolnoj grupi nakon primene ekstrakta soja Nostoc LC1B (Slika 30A; Slika 30B). Međutim, u određenoj meri je primetna razlika u ekspresiji ova dva gena pri višim koncentracijama ekstrakta. U slučaju gena cyp314, povećanje nivoa ekspresije je zabeleženo samo pri najvišoj koncentraciji ekstrakta, dok je ekspresija gena cyp360A8 bila neznatno indukovana i u grupi izloženoj dejstvu koncentracije od 37.5 µg mL-1. Za gen gst uočeno je povećanje ekspresije od 2.9 puta u odnosu na kontrolu nakon primene najveće koncentracije ekstrakta (Slika 30C). Slično tome, ekspresija vtg gena bila je povećana 3.6 puta u odnosu na kontrolu u grupi izloženoj najvećoj koncentraciji ekstrakta (Slika 30D), dok je kod gena p-gp uočeno dozno-zavisno povećanje u ekspresiji do maksimalne promene u odnosu na kontrolu od 2.7 puta pri najvećoj koncentraciji (Slika 30E). Međutim, ni za jednu od navedenih promena nije utvrđeno da su bile statistički značajne. (A) (B) (C) (D) 95 (E) Slika 30. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc LC1B na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Rezultati promena u nivoima ekspresije gena kod D. magna izloženih ekstraktima Nostoc Z1 pokazuju da je tretman u većini slučajeva rezultirao značajnim promenama u ekspresiji praćenih gena (Slika 31). Statistički značajne razlike uočene su u slučaju oba gena CYP familije, pri čemu je ispoljen drugačiji obrazac u ekspresiji ta dva gena. Indukcija ekspresije cyp314 gena uočena je pri delovanju nižih koncentracija ekstrakata soja Nostoc Z1, sa povećanjem od 3.2 (37.5 µg mL-1) odnosno 4.6 puta (18.75 µg mL-1) (Slika 31A). Za razliku od navedenog gena cyp familije, suprotan efekat je zabeležen kod gena cyp360A8, čija ekspresija je značajno povećana u svim grupama u poređenju sa kontrolama i može se primetiti rastući trend sa primenjenom koncentracijom ekstrakta (Slika 31B). Najveće povećanje nivoa ekspresije, od približno 6.5 puta u odnosu na kontrolnu vrednost, zabeleženo je u grupi sa najvišom koncentracijom ekstrakta (75 µg mL-1) i smanjivalo se po dozno-zavisnom trendu u preostale dve grupe. Uočeno je povećanje nivoa ekspresije gena koji kodira glutation S-transferazu (gst) u eksperimentalnoj grupi izloženoj 75 µg mL-1 ekstrakta, ali nije utvrđeno da je statistički značajno u odnosu na kontrolu (Slika 31C). Kao što se može videti, najizraženiji indukcioni odgovor je dobijen za p-glikoprotein (pgp) u grupi sa koncentracijom ekstrakta od 75 µg mL-1, koji se povećao oko 7.5 puta (p<0.0001) u odnosu na kontrolu, dok je pri koncentraciji od 18.75 µg mL-1 ekspresija povećana 96 6.4 puta (Slika 31E). Utvrđeno je da tretmani nisu značajno uticali na ekspresiju gena koji kodira vitelogenin (vtg), iako je u odnosu na kontrolu zabeleženo blago dozno-zavisno povećanje (Slika 31D). (A) (B) (C) (D) (E) Slika 31. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc Z1 na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). 97 Promene u ekspresiji odabranih gena nastale kao odgovor na izlaganje ekstraktima soja Oscillatoria DTD-Bečej su prikazane na Slika 32. Rezultati pokazuju da je tretman rezultirao značajnim promenama u ekspresiji gena cyp314 i p-gp. Gen cyp314 je bio statistički značajno indukovan samo u grupi sa najvećom koncentracijom ekstrakta sa povećanjem nivoa ekspresije od 6.8 puta (p=0.0205) (Slika 32A). Nivoi ekspresije p-gp gena su porasli po sličnom obrascu, pri čemu je najizraženija promena u odnosu na kontrolu uočena delovanjem najveće koncentracije ekstrakta, koja je bila 5.8 (p=0.0393) puta veća od kontrole (Slika 32E). Promene preostalih testiranih gena (cyp360A8, gst i vtg) su pratile sličan obrazac, sa smanjenjem nivoa ekspresije pri nižim koncentracijama u odnosu na kontrolne vrednosti i povećanjem od približno dva puta pri najvišoj testiranoj koncentraciji ekstrakta. (A) (B) 98 (C) (D) (E) Slika 32. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Oscillatoria DTD-Bečej na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Utvrđeno je da ekstrakti soja Oscillatoria K3 nisu izazvali značajne promene u nivoima ekspresije cyp gena, pri čemu je indukcija ekspresije (oko 1.9 puta u odnosu na kontrolu) zabeležena u grupama sa najnižom koncentracijom i nije bilo većih odstupanja od kontrolnih vrednosti u preostalim tretmanima (Slika 33A, Slika 33B). Međutim, primećene su značajne promene u ekspresiji gena gst i p-gp. Utvrđeno je da je ekspresija gst inhibirana u grupi sa najvišom koncentracijom, sa smanjenjem nivoa ekspresije četiri puta u odnosu na kontrolu (Slika 33C). Sa druge strane, ekspresija p-gp je značajno povećana u grupi od 75 µg mL-1, pokazujući povećanje od 3.6 puta (p=0.0489) u poređenju sa kontrolom (Slika 33E). Sličan trend je primećen i za ekspresiju vtg, iako povećanje nije bilo statistički značajno (Slika 33D). 99 (A) (B) (C) (D) (E) Slika 33. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Oscillatoria K3 na relativne nivoe ekspresije pet odabranih gena kod test organizama vrste D. magna: (A) cyp314, (B) cyp360A8, (C) gst, (D) vtg i (E) p-gp. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao kolone sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). 106 U slučaju gena cyp1a1 i bip je uočen najintenzivniji inhibitorni efekat pri najvišoj dozi ekstrakata, dok su pri nižim dozama nivoi ekspresije bili oko 3 puta viši od kontrolnih (Slika 36A; Slika 36B). Sličan trend se može primetiti u slučaju gena p53 i ahr2, sa nivoima ekspresije približnim kontroli pri nižim koncentracijama i značajnom inhibicijom pri koncentraciji od 100 µg mL-1 (Slika 36C; Slika 36D). Nivoi ekspresije gena vtg1 i abcb4 bili su slični kontrolnim, osim pri najvišoj testiranoj koncentraciji, gde je došlo do inhibicije gena vtg1 i indukcije gena abcb4 (Slika 36E; Slika 36F). (A) (B) (C) (D) 107 (E) (F) Slika 36. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Anabaena Č5 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Rezultati ispitivanja dejstva ekstrakata soja Microcystis aeruginosa PCC 7806 ukazuju na značajno odstupanje u ekspresiji gena abcb4 u odnosu na vrednosti dobijene u kontrolnoj grupi (Slika 37F). Utvrđeno je da je izlaganje koncentracijama ekstrakta većim od 60 µg mL-1 rezultiralo dozno-zavisnim povećanjem ekspresije ovog gena, uz statistički značajnu promenu pri najvišoj primenjenoj koncentraciji (4.46 puta, p=0.0417) u odnosu na kontrolu. Utvrđeno je takođe povećanje nivoa ekspresije gena bip od 3.37 puta (p=0.8355) pri najvećoj koncentraciji, dok su pri nižim koncentracijama nivoi ekspresije bili manji od kontrolnih, što je bilo posebno izraženo pri koncentraciji od 80 µg mL-1 (Slika 37B). Uočeni obrazac ekspresije bip gena može ukazivati na moguću zavisnost regulacije aktivnosti ovog gena od doze toksičnih metabolita prisutnih u ekstraktu testiranog soja, kao i na karaktersitike mehanizma odgovora jedinki D. rerio na stres endoplazmatskog retikuluma u čiju medijaciju je uključen ovaj gen. U slučaju gena p53, utvrđeno je dozno zavisno smanjenje ekspresije, koje je bilo 3 puta manje od kontrolne u najvišoj koncentracijskoj grupi (Slika 37C). Sličan obrazac dozne zavisnosti nivoa ekspresije je primećen kod gena ahr2, međutim, nivoi ekspresije su u ovom slučaju pri višim koncentracijama bili slični kontrolnim vrednostima (Slika 37D). Značajnije promene su uočene samo pri najnižoj koncentraciji, gde je zabeleženo povećanje od približno dva puta u odnosu na kontrolnu vrednost. Nivo ekspresije gena vtg1 povećao se za oko dva puta pri koncentracijama od 60 i 100 µg mL-1, dok je zabeleženo smanjenje u odnosu na kontrolu pri koncentraciji od 80 µg mL-1 (Slika 37E). Ova nelinearnost u zabeleženom odgovoru ukazuje na kompleksnost regulacije gena vtg1 i na moguće interakcije između različitih ćelijskih faktora. 108 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Slika 37. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Microcystis aeruginosa PCC 7806 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Izlaganje ekstraktima soja Nostoc 2S1 je izazvalo dozno zavisno povećanje u ekspresiji gena cyp1a1, bip i p53, koje je bilo posebno izraženo u grupama izloženim najvišoj koncentraciji ekstrakta (Slika 38). Najveće promene u odnosu na kontrolne vrednosti su uočene u slučaju gena 109 cyp1a1 i bip, kod kojih su zabeležena povećanja od 3.50 (p=0.2459) i 5.20 (p=0.0170) nakon izlaganja dejstvu najviše koncentracije ekstrakta, pri čemu je utvrđeno da je indukcija ekspresije bip gena bila statistički značajna (Slika 38A; Slika 38B). Sličan efekat je zabeležen kada se radi o ekspresiji gena p54, gde je registrovano dozno-zavisno povećanje nivoa ekspresije do nivoa približno tri puta većeg od kontrolnog u grupi izloženoj ekstraktu u koncentraciji od 100 µg mL-1 (Slika 38C). Iako su nivoi ekspresije preostala tri gena (ahr2, vtg1 i abcb4) bili u većem broju slučajeva približni kontrolnim, takođe se može uočiti porast u nivou ekspresije u skladu sa primenjenom koncentracijom ekstrakta (Slika 38D; Slika 38E; Slika 38F). (A) (B) (C) (D) 110 (E) (F) Slika 38. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc 2S1 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Ispitivanjem dejstva ekstrakata soja Nostoc 2S3B nisu utvrđene statistički značajne promene u odnosu na kontrolu u bilo kojoj od koncentracijskih grupa (Slika 39). Najveće promene u odnosu na kontrolu su zabeležene kod gena bip i vtg, pri čemu uočena odstupanja nisu bila veća od 2.4 puta (Slike 39B i 39E). Geni cyp1a1 i bip su imali blago povišene nivoe ekspresije pri nižim koncentracijama (Slike 39A i 39B), dok su pri najvišoj koncentraciji nivoi bili smanjeni, posebno u slučaju gena cyp1a1. Sa druge strane, u slučaju gena p53 se može uočiti znatno niži nivo ekspresije pri koncentraciji od 60 µg mL-1 dok veće koncentracije ekstrakta nisu izazvale veće promene u odnosu na kontrolne vrednosti (Slika 39C). Sličan obrazac je uočen u rezultatima dobijenim za gen ahr2, sa smanjenjem nivoa ekspresije u sve tri tretman grupe, pri čemu je najniža koncentracija ekstrakta u ovom slučaju takođe ispoljila najizraženiji inhibitorni efekat na ekspresiju ovog gena (Slika 39D). Gen vtg1 je imao snižene nivoe ekspresije pri nižim koncentracijama dok je pri najvišoj koncentraciji ekstrakta zabeležena ekspresija približno 2 puta veća u odnosu na kontrolu (Slika 39E). Praćenjem ekspresije gena abcb4 nije uočeno značajno odstupanje u poređenju sa kontrolnim vrednostima (Slika 39F). 111 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Slika 39. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc 2S3B na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Među testiranim genima nakon izlaganja svih test grupa dejstvu ekstrakata soja Nostoc LC1B, utvrđena je značajna promena u ekspresiji abcb4 gena u odnosu na kontrolnu grupu (Slika 40F). U grupi sa najvećom koncentracijom (100 µg mL-1), ekspresija gena abcb4 je statistički značajno 112 indukovana, pokazujući povećanje od 5.46 puta u poređenju sa kontrolnom grupom (p = 0.0230). Pored toga, cyp1a1 i ahr2 geni su pokazali značajno smanjene nivoe ekspresije u poređenju sa kontrolnom grupom pri delovanju svih testiranih koncentracija ekstrakta (Slika 40A; Slika 40D). Ova promena u regulaciji ekspresije može biti pokazatelj inhibitornih efekata primenjenih ekstrakata cijanobakterija na ekspresiju navedenih gena i procese u koje su oni uključeni. Nisu primećene značajne promene u ekspresiji za preostale testirane gene, bip, p53 i vtg1, u bilo kojoj od preostalih eksperimentalnih grupa. Međutim, kod u slučaju gena bip i p53, može se uočiti dozno-zavisno smanjenje nivoa ekspresije, pri čemu je potencijalno inhibitoran efekat ekstrakata bio posebno izražen nakon primene koncentracija većih od 60 µg mL-1 (Slika 40B; Slika 40C). Slično tome, ekspresija gena vtg1 je bila smanjena pri najvišoj koncentraciji ekstrakta, dok su u preostale dve grupe registrovane vrednosti u nivou kontrole (Slika 40E). (A) (B) (C) (D) 113 (E) (F) Slika 40. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc LC1B na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Kao odgovor na izlaganje ekstraktima soja Nostoc Z1 došlo je do povećanja u ekspresiji gotovo svih praćenih gena kod test organizama (Slika 41). Može se takođe primetiti da je kod većine gena indukcija postajala intenzivnija u skladu sa povećanjem koncentracije ekstrakata refelektujući dozno-zavisni trend. Najizraženije promene su uočene u ekspresiji gena cyp1a1, bip i ahr2. U slučaju gena cyp1a1, nivoi ekspresije u sve tri koncentracijske grupe su bili približni, međutim, najznačajnije odstupanje (4.10 puta, p= 0.0500) je zabeleženo u grupi sa najvećom koncentracijom (100 µg mL-1) (Slika 41A). Slični rezultati su dobijeni u slučaju gena bip i ahr2, gde je najveća primenjena koncentracija izazvala povećanje od 6.88 (p= 0.0018) (Slika 41B) odnosno 7.50 (p=0.0003) puta (Slika 41D). Zabeležena je takođe indukcija ekspresije gena p53 u sve tri tretman grupe, gde je pri najnižoj koncentraciji ekstrakta ekspresija povećana dva puta u odnosu na kontrolne vrednosti, dok su više koncentracije izazvale povećanje od 2.5 do 3 puta (Slika 41C). Primećena je takođe dozno-zavisna indukcija povećanje nivoa ekspresije gena vtg1 i abcb4, sa maksimalnim povećanjima oko 3.5 puta u odnosu na kontrolu (Slika 41E; Slika 41F). 114 (A) (B) (C) (D) (E) (F) Slika 41. Efekti tri različite koncentracije ekstrakta cijanobakterijskog soja Nostoc Z1 na relativne nivoe ekspresije šest odabranih gena kod test organizama vrste D. rerio: (A) cyp1a1, (B) bip, (C) p53, (D) ahr2, (E) vtg1 i (F) abcb4. Promene u nivoima ekspresije gena u odnosu na netretirane DMSO kontrolne grupe su predstavljene kao stubići sa srednjim ± SD vrednostima tri nezavisna eksperimenta. Zvezdice (*) označavaju značajne razlike između kontrolne i tretirane grupe (* P < 0.05; ** P < 0.001). Izlaganje test organizama ekstraktima soja Oscillatoria DTD-Bečej nije dovelo do statistički značajnijih promena u ekspresiji odabranih gena (Slika 42). Međutim, na osnovu dobijenih podataka se mogu uočiti određene pravilnosti. Utvrđeno je povećanje nivoa ekspresije gena 115 cyp1a1 i ahr2 u tretman grupama sa višim koncentracijama ekstrakta, ali ovo povećanje nije dostiglo nivo veći od 1.7 do 2 puta u poređenju sa kontrolnom grupom (Slika 42A; Slika 42D). Nasuprot tome, bip i vtg1 geni su pokazali značajno smanjenje ekspresije u svim koncentracijskim tretmanima (Slka 42B; Slika 42E). Nivoi ekspresije ovih gena bili su 3 do 4 puta niži od kontrolne grupe, što ukazuje na inhibitorne efekte primenjenih cijanobakterijskih ekstrakata. Primećen je sličan trend u nivoima ekspresije gena p53 i abcb4, pri čemu je došlo do inhibicije u grupama izloženim najnižim koncentracijama ekstrakta, dok su vrednosti ostale na nivou kontrole pri višim koncentracijama (Slika 42C, Slika 42F). (A) (B) (C) (D) 122 za regulaciju reprodukcije kod oviparnih riba putem sinteze hepatičnog vitelogenina (vtg) (Arukwe i sar. 2003). Osam funkcionalnih vtg gena je potvrđeno u genomu zebrice (Yilmaz i sar., 2018), među kojima se smatra da je vtg1 najizraženiji i stoga se najčešće koristi u testiranju toksičnosti cijanobakterija. U ovom radu, utvrđena je indukcija ekspresije gena vtg1 kod gotovo svih sojeva roda Nostoc, pri čemu je najveća promena (približno 3 puta) utvrđena kod test organizama izloženih ekstraktima vodenog soja Nostoc Z1. Statistički značajna indukcija je, međutim, utvrđena samo nakon primene ekstrakata soja Anabaena Č2. Tretman ekstraktima ovog soja je izazvao povećanje u nivou ekspresije vtg1 gena u svim koncentracijskim grupama od 4.11 do 5.87 puta u odnosu na kontrolu, pri čemu je najveća promena utvrđena nakon primene najniže koncentracije ekstrakta (60 µg mL-1). U rezultatima dosadašnjih istraživanja, takođe se mogu naći analize promena u normalnim funkcijama endokrinog sistema zebrica izazvanih dejstvom cijanobakterijskih toksina, iako je takvih istraživanja relativno malo i odnose se uglavnom na mikrocistine. Prijavljena je modulacija funkcije endokrinog sistema i poremećaj oogeneze kod ženki zebrice izloženih dejstvu 2, 10 i 50 µg L-1 MC-LR tokom 21 dana (Zhao i sar., 2015). Nivoi transkripcije vtg1 gena jetre (zajedno sa drugim faktorima koji regulišu oogenezu) kao i nivoi vtg hormona u plazmi, su pokazali dozno zavisan odgovor na prisustvo toksina, povećavajući se kod jedinki izloženih koncentraciji od 10 µg L-1 MC-LR i opadajući kada je primenjena veća koncentracija (50 µg L-1) što je u saglasnosti sa rezultatima dobijenim za soj Anabaena Č2 testiranom u ovoj doktorskoj disertaciji u slučaju kojeg je zabeležen isti trend promene ekspresije gena. Pored toga, izloženost MC-LR rezultirala je smanjenim uspehom oplodnje i izleganja ženki zebrice iz obe tretirane grupe, što predstavlja indikaciju transgeneracijskih efekata mikrocistina. Povećana ekspresija gena za vitelogenin je utvrđena i u radu Rogers i sar. (2011) nakon izlaganja larvi zebrice dejstvu liofilizirane biomase soja Microcystis aeruginosa, kao i prečišćenom MC-LR u koncentracijama 100-1000 µg L-1. Zabeleženo je povećanje nivoa ekspresije vtg gena od 619.3 puta kod larvi izloženih dejstvu liofiliziranih ćelija ovog soja (50 mg ćelija L-1), dok u grupi izloženoj čistom MC-LR toksinu nije bilo sličnih promena. Falfushynska i sar. (2021) su detektovali indukciju vtg2 izoforme ovog gena kod izloženih zebrica nakon tretmana cijanopeptolinom CP1020, koja se sastojala od povećanja od 6 puta u odnosu na kontrolne vrednosti. 4.3. Uticaj različitih faktora kultivacije i faza rasta na toksičnost cijanobakterija Artemia salina biotest je upotrebljen kako bi se ispitala akutna toksičnost odabranih sojeva cijanobakterija i analizirale potencijalne izmene u intenzitetu toksičnosti uzrokovane promenom različitih parametara kultivacije. Specifično, analiziran je uticaj koncentracije dostupnih azotnih i fosfornih jedinjenja tokom kultivacije, efekat modifikacije svetlosnog režima (broja svetlih sati), kao i uticaj dužine trajanja kultivacije, odnosno toksičnost u različitim fazama rasta cijanobakterijskih kultura. Ovaj esej je izabran za primenu jer se pokazao korisnim u testiranju ekstrakata hepatotoksičnih (Campbell i sar., 1994) i neurotoksičnih cijanobakterijskih izolata (Lahti i sar., 1995; Lee i sar., 1999) i utvrđena je dobra korelacija između koncentracije toksina u uzorcima i uočenih stopa mortaliteta. Zbog toga se danas intenzivno koristi u istraživanju biološke aktivnosti cijanobakterija, prvenstveno kao brzi postupak skrininga toksičnih jedinjenja u situacijama kada je potrebno ispitati veliki broj uzoraka (Chaumot i sar., 2014; Tokodi i sar., 2018). Kao primarni producenti, cijanobakterije zavise od azota i fosfora kao esencijalnih makronutrijenata. Kako naseljavaju dinamične ekosisteme koje karakterišu sezonske fluktuacije 123 i periodični nedostaci hranljivih materija, ovi organizmi moraju da se prilagode stalno promenljivim uslovima što se dešava putem aktivacije različitih fizioloških odgovora koji mogu biti specifični za određeni cijanobakterijski soj (Pimentel i Giani, 2014). Dokazana je i dokumentovana važnost azota kao ekološkog faktora koji može da indukuje proizvodnju određenih metabolita u cijanobakterijama kao što su fikobiliproteini (Simeunović i sar., 2013) i određena fenolna jedinjenja (Blagojević i sar., 2018). Međutim, stepen do kog su promene u koncentracijama azota i fosfora povezane sa toksičnim cvetanjem cijanobakterija i njihovom proizvodnjom toksina i dalje nije u potpunosti razjašnjen. Osnovna svrha ovog dela istraživanja je proširenje saznanja na ovom polju korišćenjem sojeva različitih rodova cijanobakterija, ne ograničavajući se na sojeve roda Microcystis koji su opsežno proučeni i zastupljeni u literaturi. Rezultati ovog istraživanja mogu doprineti boljem razumevanju složenih mehanizama modulacije cijanobakterijske toksičnosti i obezbediti osnovu za unapređenje strategija upravljanja životnom sredinom i kontrole cijanobakterijskih populacija. 4.3.1. Biotest Artemia salina - uticaj koncentracije azota na akutnu toksičnost odabranih sojeva U ovom radu, biotest Artemia salina je korišćen za ispitivanje uticaja različitih koncentracija azota u formi natrijum-nitrata (NaNO3) na toksičnost odabranih sojeva cijanobakterija, dok je koncentracija fosfora održavana optimalnom za rast kulture po recepturi za podlogu BG11 (0.04 g L-1). Dobijeni rezultati eksperimenta i statističke analize su ukazali na povećanu toksičnost većine sojeva nakon gajenja u azotom bogatijem okruženju (Tabela 9, Tabela 10, Prilog 1). 124 Tabela 9. Uticaj koncentracije azota na akutnu toksičnost odabranih sojeva u biotestu Artemia salina. Rezultati su kategorisani na osnovu primenjene koncentracije azota u tri nivoa: 0, 0.8 i 1.5 g NaNO3 L-1, kao i perioda izlaganja test organizama (24 i 48 sati). Osnovne parametre čine granična vrednost letalnosti LC50, 95% interval poverenja (95% CI) dobijen za ovu vrednost, granična vrednost LC10 i R-kvadrat. Svi rezultati su izraženi u mikrogramima po mililitru (µg mL-1) primenjenog ekstrakta. 24h ekspozicije 48h ekspozicije Naziv soja LC50 LC10 LC50 95% CI R2 LC50 LC10 LC50 95% CI R2 mBG11 (0 g NaNO3 L-1) Anabaena Č2 >10000 / / 0.88 8433.34 2564.92 / 0.82 Anabaena Č5 2660.72 2124.75 1923.09 - 3614.09 0.94 1879.31 1667.77 2844.46 - 4213.87 0.92 Microcystis aeruginosa PCC 7806 567.54 245.58 406.44 - 781.62 0.97 400.86 183.45 250.03 - 616.59 0.95 Nostoc 2S1 2312.06 1779.02 1599.55 - 3221.06 0.93 1905.46 1529.01 1465.54 - 2454.70 0.96 Nostoc 2S3B > 10000 / / 0.63 > 10000 / / 0.64 Nostoc LC1B > 10000 570.16 / 0.82 > 10000 236.59 / 0.86 Nostoc Z1 > 10000 231.73 / 0.81 8109.61 383.70 / 0.82 Oscillatoria DTD-Bečej > 10000 3523.70 / 0.92 6165.95 3483.37 5382.69 - 7144.96 0.89 Oscillatoria K3 790.67 738.93 472.06 – 922.01 0.99 790.67 738.93 472.06 – 922.01 0.99 Oscillatoria Z1 352.37 206.50 200.44 - 602.56 0.94 282.48 163.78 177.01 - 439.54 0.95 125 24h ekspozicije 48h ekspozicije Naziv soja LC50 LC10 LC50 95% CI R2 LC50 LC10 LC50 95% CI R2 mBG11 (0.8 g NaNO3 L-1) Anabaena Č2 >10000 / / 0.86 >10000 / / 0.87 Anabaena Č5 2162.71 1800.85 1402.81 - 3388.44 0.89 2162.71 1800.85 1402.81 - 3388.44 0.89 Microcystis aeruginosa PCC 7806 48.50 16.96 17.25 - 92.68 0.96 30.19 19.66 17.33 - 102.82 0.99 Nostoc 2S1 3235.93 2511.81 192.75 - 6279.10 0.74 3235.93 2511.81 192.75 - 6279.10 0.74 Nostoc 2S3B >10000 / / 0.74 >10000 / / 0.74 Nostoc LC1B >10000 / / 0.73 >10000 / / 0.72 Nostoc Z1 >10000 / / 0.91 5571.85 1129.83 968.27 - 3509.16 0.83 Oscillatoria DTD-Bečej 2238.72 1089.77 968.27 - 3206.99 0.81 2238.72 1089.77 968.27 - 3206.99 0.81 Oscillatoria K3 281.83 184.96 157.76 - 514.04 0.92 168.26 127.39 137.08 - 209.41 0.98 Oscillatoria Z1 339.62 223.19 189.67 - 633.86 0.93 319.15 210.29 188.36 - 555.90 0.94 mBG11 (1.5 g NaNO3 L-1) Anabaena Č2 >10000 / / 0.9336 >10000 / / 0.9336 Anabaena Č5 >10000 / / 0.9180 >10000 / / 0.9180 Microcystis aeruginosa PCC 7806 48.86 25.99 25.00 - 74.98 0.9755 31.18 16.52 11.64 - 54.57 0.9773 126 24h ekspozicije 48h ekspozicije Naziv soja LC50 LC10 LC50 95% CI R2 LC50 LC10 LC50 95% CI R2 Nostoc 2S1 >10000 / / 0.8000 >10000 / / 0.6995 Nostoc 2S3B >10000 / / 0.8000 >10000 / / 0.6995 Nostoc LC1B 676.08 147.47 126.47 - 2511.88 0.8640 580.76 131.59 74.64 - 2338.83 0.8417 Nostoc Z1 1153.45 561.48 117.48 - 8279.42 0.6293 1078.94 529.27 148.25 - 5260.17 0.6648 Oscillatoria DTD-Bečej 613.76 298.77 968.27 - 3206.99 0.8153 613.76 298.77 968.27 - 3206.99 0.8153 Oscillatoria K3 114.02 79.70 98.17 - 131.52 0.9286 101.39 70.87 89.53 - 113.24 0.9846 Oscillatoria Z1 344.34 221.21 162.92 - 785.23 0.9010 344.34 221.21 162.92 - 785.23 0.9010 127 Tabela 10. Uticaj promene koncentracije azota tokom kultivacije na toksičnost ispitivanih sojeva - Rezultati jednosmerne ANOVA analize. Značajnost je označena p-vrednostima ≤ 0.05. Naziv soja SS df MS F (DFn, DFd) P-vrednost Anabaena Č2 797.6 5 159.5 5.575 0.0451 Anabaena Č5 1426 5 285.3 1.036 0.3732 Microcystis aeruginosa PCC 7806 2478 5 495.7 4.625 0.0648 Nostoc 2S1 1943 5 388.5 2.773 0.1299 Nostoc 2S3B 1436 5 287.3 7.576 0.0104 Nostoc LC1B 4304 5 860.7 11.10 0.0082 Nostoc Z1 2811 5 562.1 3.323 0.1214 Oscillatoria DTD-Bečej 4104 5 820.7 8.045 0.0162 Oscillatoria K3 911.4 5 182.3 1.747 0.2452 Oscillatoria Z1 44.71 5 8.943 0.4039 0.5951 Ekstrakti soja Microcystis aeruginosa PCC 7806 su ispoljili deset puta veću toksičnost nakon kultivacije soja u okruženju sa 0.8 g L-1 natrijum nitrata u odnosu na okruženje bez azota. Najniža vrednost LC50 od 30.19 µg mL-1 je dobijena primenom ekstrakata ovog soja i sa daljim povećanjem koncentracije azota ova vrednost se neznatno promenila (31.18 µg mL-1). Ovaj soj je korišćen kao pozitivna kontrola, pri čemu je konstatovano da uočena razlika u toksičnosti nije bila statistički značajna. U većini dosadašnjih istraživanja je opisana direktna pozitivna korelacija između prisustva azota i proizvodnje toksina u toksigenim cijanobakterijama, posebno ne-azotofiksirajućim sojevima kakvi su pripadnici roda Microcystis (Vezie i sar., 2002; Downing i sar., 2005; Harke i Gobler, 2013; Horst i sar., 2014). Toksični sojevi cijanobakterija generalno imaju veće zahteve u pogledu nivoa azota i fosfora u svom okruženju u poređenju sa sojevima koji nisu toksični, verovatno zbog većih energetskih i materijalnih zahteva procesa biosinteze toksina (Vezie i sar., 2002). Kako jedna od poznatih uloga azota u cijanobakterijama uključuje pojačanu sintezu proteina i intracelularnih koncentracija proteina, smatra se da dostupne koncentracije azota utiču na proizvodnju peptidnih toksičnih metabolita (Ownby i sar., 1979). Slično rezultatima dobijenim u ovom radu, Sevilla i sar. (2010) nisu otkrili značajne razlike između uslova niske i visoke koncentracije nitrata nakon ispitivanja efekata ograničenja azota na proizvodnju toksina kod soja M. aeruginosa PCC 7806. Takođe, Stolte i sar. (2002) su otkrili da iako dodavanje nitrata doprinosi povećanoj proizvodnji biomase i količine nodularina (takođe cikličnog neribozomalnog peptida) u kulturama soja vrste Nodularia spumigena, stope proizvodnje nodularina ostaju u istom nivou bez obzira na izvor azota, odnosno formu azotnog jedinjenja. U datom radu, maksimalne stope rasta bile su najveće kada su nitrati ili amonijum joni bili dostupni kao dodatni izvor azota, ali stope proizvodnje nodularina nisu se značajno razlikovale među kulturama sa različitim izvorima azota. Međutim, nekoliko istraživanja je 128 pokazalo da veće koncentracije azotnih jedinjenja u životnoj sredini dovode do povećanja brzine rasta i sadržaja mikrocistina toksičnih sojeva M. aeruginosa (Downing i sar., 2005; Beversdorf i sar., 2015), iako nije ispitana sama toksičnost nakon promene uslova sredine. U istraživanju Chaffin i sar. (2018) takođe je utvrđena povećana proizvodnja biomase i intenzivirana sinteza mikrocistina kao odgovor na kontinuiran i pulsni priliv azotnih jedinjenjima u različitim formama (nitratom, amonijum jonima i ureom). Utvrđeno je takođe da se koncentracija mikrocistina i ekspresija pojedinačnih mcy gena povećava u uslovima deficita azotnih jedinjenja, što ukazuje na komplikovaniji odnos ili čak varijabilnost odgovora od soja do soja (Ginn i sar., 2010; Pimentel i Giani, 2014). U vezi sa tim, Harke i Gobler (2013) su otkrili da u uslovima niskih koncentracija neorganskog azota, regulacija mnogih gena uključenih u sintezu peptida u genskom regionu mikrocistin sintetaze (mcyA-F) dovodi do smanjenja sadržaja mikrocistina po ćeliji. Ukoliko se takva povezanost između dostupnosti izvora azota i biosinteze mikrocistina javlja u slučaju ostalih cijanotoksina, to bi potencijalno moglo objasniti povećanu toksičnost testiranih sojeva nakon kultivacije u uslovima bogatijim azotom koja je uočena u ovom istraživanju. Međutim, suprotan efekat je registrovan u slučaju sojeva roda Anabaena, za koje je utvrđeno da su toksičniji nakon gajenja u uslovima nižih koncentracija natrijum nitrata. Specifično, sojevi Anabaena Č2 i Anabaena Č5 su ispoljili najveću toksičnost (LC50 = 8433.34 i LC50 = 1879.31 µg mL-1) nakon kultivacije u uslovima bez dodatog natrijum-nitrata, nakon 48 h izlaganja test organizama. Činjenica da toksičnost ovih sojeva nije opala nakon kultivacije u azotom siromašnijoj podlozi se može potencijalno objasniti time što testirani sojevi roda Anabaena obrazuju heterociste i poseduju sposobnost azotofiksacije. Poznato je da je stopa asimilacije azota od strane cijanobakterija blisko povezana sa dostupnošću izvora azota i da ograničenje hranljivih materija ne utiče samo na metaboličke procese, već ima potencijal da moduliše mehanizme koji su u osnovi proizvodnje cijanotoksina (Pimentel i Giani, 2014). Geni koji su povezani sa procesom azotofiksacije obično nisu eksprimirani u kulturama koje su snabdevene dovoljnim količinama azotnih jedinjenja (Herrero i sar., 2001). Međutim, regulacija ekspresije ovih gena može biti posebno složena, s obzirom na to da je podložna cirkadijalnom ritmu kod nekih cijanobakterija i može biti ograničena na heterociste kod vrsta koje ih poseduju (Chen i sar., 1998). Postoje istraživanja koja ukazuju na to da je biosinteza cijanotoksina povezana upravo sa nedostatkom azotnih jedinjenja, povećavajući se pod stresom izazvanim azotnim “izgladnjivanjem” (Neilan i sar., 2013; Pimentel i Giani, 2014). Povećanje toksičnosti u uslovima niskih koncentracija azota slična onoj dobijenoj u ovom radu je opisana kod soja vrste Lyngbya wollei u radu Yin i sar. (1997), gde je nitrogenazna aktivnost predložena kao moguća strategija preživljavanja koja takođe ovom soju omogućava dominaciju u rezervoaru iz kog je izolovan. Kada je reč o sojevima roda Nostoc u ovom radu, ekstrakti soja Nostoc 2S1, slično rezultatima dobijenim za sojeve roda Anabaena, ispoljili su najveću toksičnost nakon kultivacije u podlozi bez dodatog natrijum-nitrata (LC50 = 1905.46 µg mL-1), uz dozno-zavisno smanjenje toksičnosti sa porastom koncentracije nitrata u podlozi. U slučaju ekstrakata soja Nostoc 2S3B, zabeležena je toksičnost slabog intenziteta (LC50>10000 µg mL-1), bez uočljive promene u odnosu na modifikaciju uslova kultivacije u pogledu dostupnog azota. Ovakva promena standardnih uslova kultivacije se najjače odrazila na toksičnost soja Nostoc LC1B, za koji je, nakon gajenja u podlozi bez azota i sa 0.8 g L-1 NaNO3, LC50 vrednost bila viša od maksimalne primenjene doze. Međutim, nakon povećanja koncentracije nitrata u podlozi, zabeleženo je značajno smanjenje vrednosti LC50 (F (1.7-6.8) = [11.10], p = 0.0082) do nivoa od 676.08 µg mL-1 i 580.76 µg 129 mL-1 nakon 24 i 48h izlaganja eksperimentalnih organizama. Slično tome, utvrđena je dozna zavisnost toksičnosti ekstrakata soja Nostoc Z1 u odnosu na koncentraciju NaNO3, pri čemu je maksimalna LC50 (48 h) vrednost od 1078.94 µg mL-1 zabeležena nakon izlaganja test jedinki ekstraktima dobijenim nakon kultivacije sa 1.5 g L-1 NaNO3. Sličan efekat je zabeležen u slučaju sojeva roda Oscillatoria, sa povećanom toksičnošću u okruženju sa visokim sadržajem azota, pri čemu je statistički značajna razlika zabeležena u toksičnosti soja Oscillatoria DTD-Bečej (F (1.7-7.1) = [11.10], p = 0.0162), gde se LC50 vrednost umanjila deset puta (sa 6165.95 na 613.76 µg mL-1) nakon povećanja raspoloživog azota u medijumu za gajenje. Izuzev soja M. aeruginosa PCC 7806 kao pozitivne kontrole, sojevi koji pripadaju rodu Oscillatoria, gajeni u prisustvu veće koncentracije azota, ispoljili su najveću toksičnost u ovom testu, sa vrednostima LC50 od 101.39 µg mL-1 (Oscillatoria K3), 344.34 (Oscillatoria Z1) i 613.76 µg mL-1 (Oscillatoria DTD-Bečej). Metcalf i sar. (2002) su pokazali da su jedinke A. salina izuzetno osetljive na prisustvo prečišćenog cilindrospermopsina kao i na ekstrakte soja Rhaphidopsis raciborsii (ex. Cylindrospermopsis raciborskii) koji je producent ovog toksina. U navedenom radu, cijanobakterijski ekstrakti su ispoljili veću toksičnost (LC50 (48h) = 1680 - 2420 µg mL-1 suve biomase) u odnosu na prečišćen toksin (LC50 (48h) = 2860 µg mL1). Rezultati LC50 vrednosti koje su dobijene za sojeve roda Oscillatoria značajno su niže u odnosu na vrednosti navedene u datom radu, što ukazuje na njihovu visoku toksičnost ispoljenu prema artemijama. Predstavljeni rezultati u ovom istraživanju pokazuju da su intracelularni ekstrakti većine ispitivanih sojeva, uzgajanih u prisustvu azota ispoljili jače toksične efekte od onih zabeleženih kada je korišćena kultura gajena u medijumu smanjenih koncentracija ili bez dostupnog izvora azota. Rezultati dati u Tabeli 9 jasno pokazuju da dostupnost azota kao bitnog organogenog elementa značajno utiče na toksičnost sojeva Anabaena Č2, Nostoc 2S3B, Nostoc LC1B i Oscillatoria DTD-Bečej. Pored toga u većini slučajeva, toksični efekti su se povećali sa dužim vremenom ekspozicije artemija ekstraktima sojeva ukazujući na vremenski zavisnu toksičnost. Ovaj trend može biti pokazatelj pozitivne korelacije između stope mortaliteta test organizama i dužine izloženosti potencijalno toksičnim metabolitima cijanobakterija. Takođe se može uočiti da se toksičnost povećavala sa porastom primenjene koncentracije ekstrakata, što ukazuje na zavisnost letalnog efekta od koncentracije ekstrakta. Na osnovu utvrđenih graničnih LC50 vrednosti u ovom istraživanju, može se zaključiti da su najveću toksičnost ispoljili ekstrakti soja Microcystis aeruginosa PCC 7806 koji je producent mikrocistina i sojeva Oscillatoria K3 i Z1, koji su potencijalni producenti cilindrospermopsina, dok je najniža toksičnost utvrđena za ekstrakte soja Nostoc 2S3B. 4.3.2. Biotest Artemia salina - uticaj koncentracije fosfora na akutnu toksičnost odabranih sojeva Poznato je da koncentracija fosfora igra ključnu ulogu u primarnoj produkciji slatkovodnih ekosistema i nastanku cijanobakterijskog i algalnog cvetanja (Davis i sar., 2010). Odnos između dostupnih koncentracija fosfora i cijanobakterijske toksičnosti je multifaktorski, a tačni mehanizmi još nisu u potpunosti opisani. Jedna teorija govori u prilog tome da povišeni nivoi fosfora promovišu rast cijanobakterija, na osnovu kog se proporcionalno povećava i stopa proizvodnje toksina (Kurmayer, 2011). Pored toga, obogaćivanje fosforom može dovesti do promene sastava mikrobne zajednice, potencijalno favorizujući cijanobakterije sa sposobnošću proizvodnje toksičnih jedinjenja. Stres izazvan nedostatkom fosfora takođe može izmeniti 130 aspekte metaboličke regulacije cijanobakterija i na taj način dovesti do povećane proizvodnje cijanotoksina (Pimentel i Giani, 2014). Kako bi se ispitao uticaj različitih koncentracija fosfora u kultivacionom medijumu na toksičnost odabranih cijanobakterijskih sojeva u ovom istraživanju je upotrebljen Artemia salina biotest. Dobijeni rezultati govore u prilog tome da većina ispitanih sojeva ispoljava više nivoe toksičnosti nakon kultivacije u prisustvu većih koncentracija fosfora. Ipak, za mnoge sojeve je najveća toksičnost dostignuta sa koncentracijom P od 0.04 g L-1 i nije se menjala sa daljim povećanjem koncentracije fosfora (Tabela 11, Tabela 12, Prilog 1). Izuzetak je soj Anabaena Č5, čija toksičnost je nastavila da raste sa povećanjem koncentracije fosfora iznad ove granice i koji se ujedno pokazao najtoksičnijim sojem u ovom testiranju, sa izračunatom LC50 vrednošću od 199.98 µg mL-1 u grupi gajenoj sa 0.06 g L-1 K2HPO4. Sa druge strane, drugi predstavnik roda Anabaena, soj Anabaena Č2, nije pokazao značajnu toksičnost i nisu zabeležene veće promene nakon povećanja koncentracije fosfora u kultivacionom medijumu. Ukupno najveća toksičnost je registrovana za soj Microcystis aeruginosa PCC 7806, sa LC50 vrednošću u opsegu od 30-50 µg mL-1 u grupama od 0.04 i 0.06 g L-1 K2HPO4, što su deset puta veće vrednosti od onih dobijenih za grupu gajenu sa 0.02 g L-1 K2HPO4. Sličnu pravilnost su registrovali Rapala i sar. (1997) prilikom ispitanja značaja nivoa fosfata korišćenog pri kultivaciji azotofiksirajućeg Anabaena spp. kada se radi o uticaju na rast i stopu biosinteze hepatotoksičnog MC-RR. Na osnovu rezultata je, pored pozitivnog uticaja na rast soja, utvrđeno značajno povećanje intracelularnih koncentracija ovog hepatotoksina sa povećanjem koncentracije PO4sa 0.05 mg L-1 na 5.5 mg L-1 (Z8 medijum). Takođe je utvrđena značajna pozitivna korelacija između vremena kultivacije i koncentracije fosfora, što znači da se do završetka 24 dana kultivacije smanjila koncentracija toksina u ćelijama koje su uzgajane pod ograničenjem fosfora, dok se koncentracija toksina povećala u ćelijama koje su uzgajane pri višim koncentracijama fosfata. Dodatno, u radu Vezie i sar. (2002), najveća koncentracija mikrocistina je takođe utvrđena pri najvećim kombinovanim koncentracijama azota i fosfora gde je i rast biomase bio najveći, međutim, komparabilno velika toksičnost je zabeležena i pri najnižim koncentracijama hranljivih materija, pri uslovima slabog rasta kulture. Većina sojeva roda Nostoc testiranih u ovom istraživanju, među kojima su Nostoc 2S3B, Nostoc LC1B i Nostoc Z1, takođe je pokazala povećane nivoe toksičnosti pri višim koncentracijama fosfora, pri čemu je najveća toksičnost primećena u slučaju koncentracije od 0.04 g L-1 K2HPO4. Soj Nostoc 2S1 je ispoljio najnižu toksičnost, bez promene u odnosu na koncentraciju fosfora dostupnu tokom kultivacije. Sojevi roda Oscillatoria su pokazali najveći nivo toksičnosti nakon kultivacije u medijumu sa 0.04 g L-1 K2HPO4. U okviru ove grupe, soj Oscillatoria K3 je bio najtoksičniji, sa LC50 vrednošću od 250.61 µg mL-1 nakon 48 sati izlaganja račića. Osim pozitivne kontrole, najtoksičniji sojevi bili su Anabaena Č5 i Oscillatoria Z1, koji su pokazali najveću toksičnost u grupama sa visokim sadržajem fosfora. Iako postoji vrlo malo dostupnih informacija o toksičnosti cijanobakterija kod testiranih organizama nakon uzgoja u različitim uslovima dostupnosti fosfata, postoje informacije o različitim stopama proizvodnje određenih cijanotoksina. Slično rezultatima dobijenim u ovom radu, Sivonen (1990) su otkrili da proizvodnja hepatotoksina dezmetil-3-mikrocistina-RR od strane sojeva vrste Oscillatoria agardhii zavisi od koncentracije ortofosfata, pri čemu niski nivoi fosfora podstiču njegovu proizvodnju, dok veće koncentracije nemaju nikakav dodatni efekat. 131 Ovakvi rezultati ukazuju na postojanje praga zasićenja fosfornim jedinjenjima kada se radi o proizvodnji mikrocistina, iznad kog se stopa produkcije drastično smanjuje ili čak zaustavlja. Toporowska i sar. (2016) su takođe povezali produkciju anatoksina-a od strane soja Dolichospermum spp. (ex. Anabaena) sa temperaturom vode i smanjenjem koncentracije dostupnih fosfata. Smanjenje koncentracije fosfata u ovom slučaju nije uticalo na brzinu umnožavanja biomase, ali je značajno povećalo produkciju anatoksina-a i transkripciju gena povezanih sa biosintezom ovog toksina. Slični rezultati su dobijeni u radu Kramer i sar. (2018) koji su kod istog soja utvrdili da je stopa transkripcije gena povezanih sa sintezom anatoksinaa najveća u uslovima ograničene dostupnosti i azota (N) i fosfora (P). б) Не 2. Прикупљање података 2.1 Методологија за прикупљање/генерисање података 2.1.1. У оквиру ког истраживачког нацрта су подаци прикупљени? а) експерименти, квантификација штетних промена насталих након излагања одабраних модел организама дејству цијанобактеријских екстраката, анализа промена у експресији гена квантитативном „real time“ PCR (RT-PCR) методом, спектрофотометријска анализа потенцијалне цитотоксичности и неуротоксичности екстраката одабраних сојева, испитивање токсигеног потенцијала испитиваних сојева применом имунолошког есеја као и биоинформатичком анализом генских кластера одговорних за синтезу цијанотоксина. 2.1.2 Навести врсте мерних инструмената или стандарде података специфичних за одређену научну дисциплину (ако постоје). спектрофотометар, уређај за мерење релативне експресије гена (qPCR), програмски пакети за биоинформатичку 2.2 Квалитет података и стандарди 2.2.1. Третман недостајућих података а) Да ли матрица садржи недостајуће податке? Да Не 2.2.2. На који начин је контролисан квалитет података? Квалитет података је контролисан статистичким анализама, коришћењем контролних експеримената и поређењем добијених резултата са доступним литературним подацима из релевантних извора. 2.2.3. На који начин је извршена контрола уноса података у матрицу? Поређењем добијених података са доступним литературним подацима. 3. Третман података и пратећа документација 3.1. Третман и чување података 3.1.1. Подаци ће бити депоновани у Репозиторијуму докторских дисертација у Универзитету у Новом Саду (CRIS) и Заједничком порталу свих докторских дисертација и извештаја комисија о њиховој оцени на универзитетима у Србији (NARDUS). 3.1.2. URL адреса https://www.cris.uns.ac.rs/index.jsf и https://nardus.mpn.gov.rs/ 3.1.3. DOI: / 3.1.4. Да ли ће подаци бити у отвореном приступу? а) Да б) Да, али после ембарга који ће трајати до ___________________________________ в) Не 3.1.5. Подаци неће бити депоновани у репозиторијум, али ће бити чувани. Образложење Докторска дисертација са прилогом ће бити депонована у Репозиторијуму докторских дисертација у Универзитету у Новом Саду (CRIS) и Заједничком порталу свих докторских дисертација и извештаја комисија о њиховој оцени на универзитетима у Србији (NARDUS). 3.2 Метаподаци и документација података 3.2.1. Који стандард за метаподатке ће бити примењен? 3.2.1. Навести метаподатке на основу којих су подаци депоновани у репозиторијум. 3.3 Стратегија и стандарди за чување података 3.3.1. До ког периода ће подаци бити чувани у репозиторијуму? неограничено 3.3.2. Да ли ће подаци бити депоновани под шифром? Да Не 3.3.3. Да ли ће шифра бити доступна одређеном кругу истраживача? Да Не 3.3.4. Да ли се подаци морају уклонити из отвореног приступа после извесног времена? Да Не Образложити 4. Безбедност података и заштита поверљивих информација Овај одељак МОРА бити попуњен ако ваши подаци укључују личне податке који се односе на учеснике у истраживању. За друга истраживања треба такође размотрити заштиту и сигурност података. 4.1 Формални стандарди за сигурност информација/података Истраживачи који спроводе испитивања с људима морају да се придржавају Закона о заштити података о личности (https://www.paragraf.rs/propisi/zakon_o_zastiti_podataka_o_licnosti.html) и одговарајућег институционалног кодекса о академском интегритету. 4.1.2. Да ли је истраживање одобрено од стране етичке комисије? Да Не 4.1.2. Да ли подаци укључују личне податке учесника у истраживању? Да Не 5. Доступност података 5.1. Подаци ће бити а) јавно доступни б) доступни само уском кругу истраживача у одређеној научној области ц) затворени 5.4. Навести лиценцу под којом ће прикупљени подаци бити архивирани. Ауторство – некомерцијално – без прераде 6. Улоге и одговорност 6.1. Навести име и презиме и мејл адресу власника (аутора) података Петар Давидовић; [email protected]; [email protected] 6.2. Навести име и презиме и мејл адресу особе која одржава матрицу с подацимa Петар Давидовић; [email protected]; [email protected] 6.3. Навести име и презиме и мејл адресу особе која омогућује приступ подацима другим истраживачима Петар Давидовић; [email protected]; [email protected]