Development and implementation of new sensor and biosensor solutions integrated into Lab-on-Chip concept

UNIVERZITET U NOVOM SADU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA FIZIKU Razvoj i implementacija novih senzorskih i biosenzorskih rešenja primenom koncepta Laboratorija-na-čipu DOKTORSKA DISERTACIJA Mentor: Kandidat: Dr Vesna Bengin Ivana Kundačina Dr Vasa Radonić Novi Sad, 2023. godine UNIVERZITET U NOVOM SADU PRIRODNO-MATEMATIČKI FAKULTET DEPARTMAN ZA FIZIKU Razvoj i implementacija novih senzorskih i biosenzorskih rešenja primenom koncepta Laboratorija-na-čipu DOKTORSKA DISERTACIJA Mentor: Kandidat: Dr Vesna Bengin Ivana Kundačina Dr Vasa Radonić Novi Sad, 2023. godine УНИВЕРЗИТЕТ У НОВОМ САДУ ОБРАЗАЦ – 5а ПРИРОДНО-МАТЕМАТИЧКИ ФАКУЛТЕТ КЉУЧНA ДОКУМЕНТАЦИЈСКА ИНФОРМАЦИЈА 1 Врста рада: Докторска дисертација Име и презиме аутора: Ивана Кундачина Ментор (титула, име, презиме, звање, институција) Др Весна Бенгин, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Др Васа Радонић, научни саветник, Институт Биосенс, Универзитет у Новом Саду Наслов рада: Развој и имплементација нових сензорских и биосензорских решења применом концепта Лабораторија-на-чипу Језик публикације (писмо): Српски (латиница) Физички опис рада: Унети број: Страница 132 Поглавља 3 Референци 263 Табела 9 Слика 52 Графикона / Прилога / Научна област: Физика Ужа научна област (научна дисциплина): Наука о сензорима / Примењена физика Кључне речи / предметна одредница: Лабораторија-на-чипу, микрофлуидика, микроталасни сензор, импедансни сензор, електрохемијски биосензори Резиме на језику рада: У оквиру докторске дисертације развијено је неколико сензорских и биосензорских решења за примене у контроли квалитета хране, животне средине, ћелијској пољопривреди и биомедицини. Развијена је платформа Лабораторија-на-чипу (ЛОЦ) са интегрисаним микроталасним сензором за идентификацију и детекцију мешања јестивих уља на бази таласног феномена дизајнираних површинских плазмонских поларитона. Оптимизација дизајна и јединичне ћелије сензора испитани су применом софтверског алата CST Microwave Studio, а израда сензора урађена применом јефтине, хибридне технологије израде. Валидација сензора одрађена је са узорцима јестивих уља, где је сензор показао добре линеарне карактеристике и велику осетљивост детекције диелектричне пермитивности узорака. Такође, развијена је и ЛОЦ платформа са интегрисаним импедансним сензором за мониторинг раста ћелија унутар микробиореактора. Реализација сензора урађена је применом инкџет штампе, а интеграција 1 Аутор докторске дисертације потписао је и приложио следеће Обрасце: 5б – Изјава о ауторству; 5в – Изјава o истоветности штампане и електронске верзије и о личним подацима; 5г – Изјава о коришћењу. Ове Изјаве се чувају на факултету у штампаном и електронском облику и не кориче се са тезом. у ЛОЦ платформу урађена је комбиновањем поли(метил метакрилата) – ПММА са стакленом подлогом. Валидација детекције урађена је култивацијом сисарских ћелија током 96 сати унутар ЛОЦ платформе, а процена биомасе импедансним приступом упоређена је са приступом обраде микроскопских слика. Предложени импедансни сензор успешно је детектовао све фазе раста ћелија и почетак фазе одумирања. Нова технологија израде електрода предложена је на бази златних листића и примењена за електрохемијску детекцију бактерија E. coli, S. Typhimurium и тумор биомаркера HER2. Предложени сензори испитани су у погледу стабилности сигнала, осетљивости и специфичности детекције, а релевантни параметри детекције процењени из модела еквивалентног електричног кола. Електроде реализоване на бази златних листића показале су бољу осетљивост и већу специфичну површину у поређењу са комерцијалним електродама. Интеграција електрохемијског сензора у ЛОЦ платформу са микрофлуидичним мешачима реализована је за примену у детекцији глукозе. Перформансе мешања микрофлуидичних мешача на бази серпентине испитане су применом софтвера Comsol Multiphysics, а реализација платформе урађена је комбиновањем технологија 3Д штампе и ПММА потпорних слојева. Предложени концепт детекције показан је на примеру концентрације глукозе у ацетатном пуферу и медијуму ћелијске културе. Датум прихватања теме од стране надлежног већа: 8. 7. 2022. Датум одбране: (Попуњава одговарајућа служба) Чланови комисије: (титула, име, презиме, звање, институција) Председник: Др Жељка Цвејић, редовни професор, Природноматематички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: Др Горан Стојановић, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: Др Весна Бенгин, редовни професор, Природно-математички факултет, Универзитет у Новом Саду Члан: Др Васа Радонић, научни саветник, Институт Биосенс, Универзитет у Новом Саду Напомена: UNIVERSITY OF NOVI SAD FACULTY OF SCIENCES KEY WORD DOCUMENTATION 2 Document type: Doctoral dissertation Author: Ivana Kundacina Supervisor (title, first name, last name, position, institution) Dr. Vesna Bengin, full professor, Faculty of Science, University of Novi Sad Dr. Vasa Radonic, principal research fellow, BioSense Institute, University of Novi Sad Thesis title: Development and implementation of new sensor and biosensor solutions integrated into Lab-on-Chip concept Language of text (script): Serbian language (latin) Physical description: Number of: Pages 132 Chapters 3 References 263 Tables 9 Illustrations 52 Graphs / Appendices / Scientific field: Physics Scientific subfield (scientific discipline): Sensing technology / Applied physics Subject, Key words: Lab-on-a-chip, Microfluidics, Microwave sensor, Impedimetric sensor, Electrochemical biosensor Abstract in English language: In this doctoral dissertation, several sensor and biosensor solutions were developed for applications in food quality control, environmental monitoring, cellular agriculture and healthcare. Lab-on-a-chip (LOC) platform with an integrated microwave sensor was developed for the identification and detection of mixing of edible oils based on the wave phenomenon of spoof surface plasmon polaritons. Optimization of sensor configuration and unit cells were investigated using the CST Microwave Studio software tool, and sensor fabrication was performed using low-cost, hybrid fabrication technology. The validation of the sensor was done with samples of edible oils, where the sensor showed good linear characteristics and high sensitivity in detecting the dielectric permittivity of the samples. In addition, a LOC platform with an integrated impedimetric sensor was developed for cell growth monitoring inside the microbioreactor. The sensor was realized using inkjet printing, and the integration into the LOC platform was done by combining poly(methyl methacrylate) - PMMA with a glass substrate. Validation of the detection was done by cultivation of mammalian 2 The author of doctoral dissertation has signed the following Statements: 5б – Statement on the authority, 5в – Statement that the printed and e-version of doctoral dissertation are identical and about personal data, 5г – Statement on copyright licenses. The paper and e-versions of Statements are held at he faculty and are not included into the printed thesis. cells for 96 hours inside the LOC platform, and biomass estimation using an impedance approach was compared with an image processing approach. The proposed impedance sensor successfully detected all phases of cell growth. A novel fabrication technology for electrode fabrication was proposed based on gold leaves and applied for the electrochemical detection of bacteria E. coli, S. Typhimurium, and cancer biomarker HER2. The proposed sensors were tested for signal stability, sensitivity, and specificity, and the relevant detection parameters were estimated from the equivalent electric circuit model. Finally, gold leaf electrodes (GLEs) showed better sensitivity and bigger specific surface compared to commercial electrodes. The integration of the electrochemical sensor into the LOC platform with microfluidic mixers was realized for application in glucose detection. The mixing performance of serpentine-based microfluidic mixers was tested using Comsol Multiphysics software, and the platform was realized by combining 3D printing technologies and PMMA support layers. The proposed detection concept is demonstrated for the detection of glucose in acetate buffer and cell culture medium. Accepted on Scientific Board on: July 8, 2022 Defended: (Filled by the faculty service) Thesis Defend Board: (title, first name, last name, position, institution) President: Dr. Zeljka Cvejic, full professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad Member: Dr. Goran Stojanovic, full professor, Faculty of Technical Sciences, University of Novi Sad Member: Dr. Vesna Bengin, full professor, Faculty of Sciences, University of Novi Sad Member: Dr. Vasa Radonic, principal research fellow, BioSense Institute, University of Novi Sad Note: Najvećuzahvalnost zarealizacijudoktorskedisertacijedugujem mentoru,drVasiRadoniću.HvalaVamnaneizmernomstrpljenju,pruženimprilikamazasticanjeznanjaiusavršavanje, kao i na ukazanom poverenju. Veliku zahvalnost dugujem i dr Sanji Kojić, dr Nikolini Janković i prof. dr Bojanu Petroviću, čija su podrška, korisni saveti i pruženo znanje bili od velikog značaja tokom master i doktorskih studija. Takođe, zahvalna sam i kolegama iz Centra za senzorske tehnologije i Centra za biosisteme instituta Biosens. Hvala vam što ste uvek bili tu za mene. Raditi zajedno s vama je veliko zadovoljstvo. Zahvalna sam i prof. dr Željki Cvejić i Katedri za opštu fiziku na nesebičnom deljenju znanja, korisnim savetima i podršci tokom celog školovanja. Na kraju, zahvalila bih se i prof. dr Vesni Bengin na prilikama da učim i usavršavam se radeći sa modernom opremom i s vrhunskim stručnjacima iz oblasti koje me interesuju. Ovaj rad posvećujem suprugu, porodici i prijateljima. Vaša podrška mi je bila glavna inspiracija. Ivana Kundačina Sadržaj Uvod 1 1 Senzor na bazi dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti 5 1.1 Teorijskiuvod .................................. 6 1.2 Pregled relevantnih istraživanja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11 1.3 Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti 12 1.3.1 Disperzione krive jediničnih ćelija periodičnih struktura metalnogvoda................................. 12 1.3.2 Optimizacija dimenzija i broja jediničnih ćelija . . . . . . . . . . . 15 1.3.3 Hibridna tehnologija izrade SSPP senzora . . . . . . . . . . . . . . 19 1.3.4 Eksperimentalna validacija performansi SSPP senzora . . . . . . 20 1.4 Diskusijaizaključak .............................. 22 2 LOC platforma kao mikrobioreaktor sa integrisanim impedansnim senzorom za monitoring rasta ćelija 25 2.1 Pregled relevantnih istraživanja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26 2.2 Teorijskiuvod .................................. 27 2.2.1 Kriva disperzije bioloških materijala . . . . . . . . . . . . . . . . . 27 2.2.2 Princip detekcije impedansnog senzora . . . . . . . . . . . . . . . 29 2.3 Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija . . . . . . . . . . . . 30 2.3.1 Struktura LOC platforme . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30 2.3.2 Priprema MRC-5 ćelija za kultivaciju unutar LOC platforme . . . 31 2.3.3 Karakterizacija senzora i rezultati merenja impedanse . . . . . . . 32 2.4 Poređenje izmerenih rezultata, modela ekvivalentnog kola i rezultata obradeslike ................................... 36 2.4.1 Obrada mikroskopskih slika . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 36 2.4.2 Fitovanje rezultata ekvivalentnim električnim kolom . . . . . . . 38 2.5 Diskusijaizaključak .............................. 40 3 Nove tehnologije realizacije elektrohemijskih biosenzora 42 3.1 Teorijskiuvod .................................. 43 3.1.1 Elektrohemijski procesi na površini elektrode . . . . . . . . . . . 44 SADRŽAJ 3.1.2 Potencijal na razdelnoj površini elektrode i tečne faze . . . . . . . 45 3.1.3 Ciklična voltametrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47 3.1.4 Elektrohemijska impedansna spektroskopija . . . . . . . . . . . . 51 3.1.5 Hronoamperometrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54 3.2 Pregled relevantnih istraživanja . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55 3.3 Tehnologija izrade elektroda na bazi zlatnih listića . . . . . . . . . . . . . 57 3.4 Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića . . . . . . . . . . . . . . . 58 3.4.1 Skenirajuća elektronska mikroskopija i energetska disperzivna spektroskopija.............................. 59 3.4.2 Optička profilometrija . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 60 3.4.3 Planarni dvoelektrodni sistem na bazi zlatnih listića . . . . . . . . 61 3.5 Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića . . . . . . . . . . . . . 63 3.5.1 Funkcionalizacija elektroda za detekciju E. coli ........... 65 3.5.2 Karakterizacija koraka funkcionalizacije . . . . . . . . . . . . . . . 67 3.5.3 Elektrohemijska detekcija E. coli ................... 68 3.5.4 Diskusija i zaključak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70 3.6 Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića . . . . . . . 73 3.6.1 Funkcionalizacija elektroda za detekciju S. Typhimurium . . . . . 74 3.6.2 Karakterizacija koraka funkcionalizacije . . . . . . . . . . . . . . . 74 3.6.3 Elektrohemijska detekcija S. Typhimurium . . . . . . . . . . . . . 75 3.6.4 Diskusija i zaključak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 3.7 Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića . . 80 3.7.1 Ispitivanje uticaja tehnologije izrade i geometrije na performanse senzora.................................. 81 3.7.2 Funkcionalizacija elektroda za detekciju HER2 . . . . . . . . . . . 86 3.7.3 Flourescentnitest............................ 87 3.7.4 Raman spektroskopija površine biosenzora . . . . . . . . . . . . . 88 3.7.5 Elektrohemijska detekcija HER2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90 3.7.6 Detekcija HER2 u ćelijskom medijumu . . . . . . . . . . . . . . . 93 3.7.7 Diskusija i zaključak . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.8 LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima..................................... 98 3.8.1 Mikrofluidika i tehnologije izrade mikrofluidičnih čipova . . . . 99 3.8.2 Elektrohemijsko-enzimsko određivanje koncentracije glukoze . . 100 3.8.3 Teorijska i numerička analiza . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101 3.8.4 OptimizacijaperformansimešanjaprimenomsofteraComsolMultiphysics .................................103 3.8.5 Izrada i karakterizacija LOC platforme . . . . . . . . . . . . . . . 105 SPISAK SLIKA 2.1 Kriva disperzije bioloških materijala. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28 2.2 (a) Šematski prikaz poprečnog preseka LOC platforme; (b) Ekvivalentno električno kolo kapacitivnosti slojevite strukture LOC platforme sa ćelijama. ..................................... 30 2.3 Višeslojna struktura mikrofluidične platforme sa dimenzijama u mm. . . 31 2.4 (a) Inkdžet štampani impedansni senzor na staklu; (b) Slika sa profilometra inkdžet štampanih elektroda; (c) SEM slika inkdžet štampanih elektroda pri uvećanju ×3000; (d) Postavka eksperimenta. Portabilni potenciostat PalmSens smešten je unutar CO2inkubatora zajedno sa mikrobioreaktorom sa impedansnim senzorom. . . . . . . . . . . . . . . 33 2.5 Moduoimpedanse(|Z|),realni(Re)iimaginarni(Im)deoimpedansena učestalostima: (a) 90, (b) 50, and (c) 10 kHz u toku 96 h kultivacije MRC-5 ćelija unutar mikrobioreaktora. Greške na graficima predstavljaju standardnu devijaciju izračunatu za 8 ponovljenih merenja. (d) Kontrolna merenja. Poređenje između svežeg i medijuma nakon kultivacije, tj. medijuma nakon 96 h kultivacije u pogledu modula impedanse, Re i Im dela......................................... 35 2.6 (a) Poređenje rezultata merenja impedansnog senzora sa rezultatima fitovanja ekvivalentnim električnim kolom predstavljenim u unutrašnjosti grafika. (b) Poređenje kapaciteta ćelija iz fitovanog modela i procenta pokrivenosti površine senzora ćelija dobijena pomoću obrade mikroskopskihslika................................... 40 3.1 Šematski prikaz dvosloja na razdelnoj površini između elektrode i tečne faze......................................... 48 3.2 (a) Promena potencijala u toku vremena u cikličnoj voltametriji; (b) Primer cikličnog voltamograma. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49 3.3 (a) Šematski prikaz ekvivalentnog električnog kola i razdelne površine elektrode i kapi; (b) Primer Nikvistovog dijagrama. . . . . . . . . . . . . 54 3.4 (a) Zavisnost potencijala od vremena u hronoamperometriji; (b) Zavisnost struje od vremena u hronoamperometriji. . . . . . . . . . . . . . . . 55 3.5 (a) Šematski prikaz koraka izrade elektroda na bazi zlatnih listića; (b) Zlatni listići laminirani na PVC podlogu pre laserske ablacije; (c) Zlatni listići laminirani na PVC podlogu posle laserske ablacije. . . . . . . . . . 58 3.6 SEM analiza površine elektroda na bazi zlatnih listića; (a) Jedan sloj zlatnih listića na PVC podlozi; (b) Dva sloja zlatnih listića na PVC podlozi. 60 3.7 (a) Rezultati EDS analize elektrode sa jednim slojem zlatnih listića; (b) Rezultati EDS analize elektrode sa dva sloja zlatnih listića; (c) Maseni udeo elemenata za elektrode sa jednim i dva sloja zlatnih listića. . . . . . 61 SPISAK SLIKA 3.8 (a) Površina zlatnih elektroda snimljena optičkim profilometrom; (b) 3D prikaz elektroda snimljen pomoću optičkog profilometra. . . . . . . . . . 62 3.9 (a) Dimenzije planarnog dvoelektrodnog sistema na bazi zlatnih listića; Dimenzije na slici predstavljene su u mm; (b) Postavka eksperimenta sa eksternom Ag/AgCl referentnom elektrode; (c) Postavka eksperimenta za dvoelektrodni sistem; (d) Postavka eksperimenta. . . . . . . . . . . . . 63 3.10 Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića; (a) CV u 0,5 M sumpornoj kiselini za brzinu skeniranja od 0,5 V/s; (b) CV u 10 mM kalijum fero/fericijanida u PBS puferu tokom 25 ciklusa; (c) Nikvistov dijagram za 10 mM fero/fericijanida u PBS puferu za 5 različitih elektroda; (d) Procena ponovljivosti izrade elektroda pomoću parametra otpora prenosunaelektrisanja................................ 64 3.11 (a) CV u 10 mM fero/fericijanidu u PBS puferu za brzine skeniranja u opsegu 0,1 do 1 V/s; (b) Zavisnost pikova oksidacije i redukcije 10 mM fero/fericijanida u PBS puferu od korena brzine skeniranja; (c) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije fero/fericijanida u PBS puferu; (d) Modul impedanse na 1 Hz i 100 kHz za različite koncentracije fero/fericijanida u PBS puferu u opsegu 0,001 mM - 0,1 mM i 0,1 mM - 10 mM,respektivno................................. 65 3.12 Šematski prikaz slojeva funkcionalizacije površine zlatne radne elektrode za specifičnu detekciju E. coli. ....................... 66 3.13 (a) SEM slika površine zlatne elektrode sa obeleženim organskim materijalom na površini; (b) SEM slika površine zlatne elektrode sa MPA i obeleženim organskim materijalom na površini; (c) Kontaktni ugao površine radne elektrode na bazi zlatnih listića; (d) Kontaktni ugao površine radne elektrode na bazi zlatnih listića modifikovane sa MPA. . . . 67 3.14 (a) Nikvistovi dijagrami nakon svakog od koraka funkcionalizacije biosenzora. Unutrašni grafik: Ekvivalentno električno kolo korišćeno za fitovanje rezultata; (b) Otpor prenosu naelektrisanja za različite korake funkcionalizacije. ................................ 68 3.15 (a) Rezultati detekcije E. coli za koncentracije u opseg 101-107cfu/mL; (b) Rezultati fitovanja ekvivalentnim električnim kolom: Otpor prenosu naelektrisanja u funkciji koncentracije bakterija. Unutrašnji grafik: Ekvivalentno električno kolo korišćeno za fitovanje rezultata. . . . . . . . 69 3.16 Specifičnost detekcije biosenzora. Relativna promena signala 𝛿(%)= 𝑅𝑐𝑡 (𝑐𝑐)−𝑅𝑐𝑡(𝐵𝑆𝐴) 𝑅𝑐𝑡 (𝐵𝑆𝐴)za različite koncentracije specifične E. coli i nespecifičnih bakterija E. aerogenes iB. subtilis......................... 70 3.17 Šematski prikaz funkcionalizacije površine zlata za detekciju salmonele. 74 SPISAK SLIKA 3.18 Karakterizacije površine radne elektrode merenjem kontaktnog ugla pre i nakon nanošenja merkaptoundekanoične kiseline. (a) Zlato; (b) Zlato sa merkaptoundekanoičnom kiselinom. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75 3.19 (a) Ekvivalentno kolo korišćeno za fitovanje rezultata; (b) Otpor prenosu naelektrisanja za različite korake funkcionalizacije; (c) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije bakterija; (d) Otpor prenosu naelektrisanja u funkciji različitih koncentracije salmonele. . . . . . . . . . . . . 76 3.20 Specifičnost detekcije biosenzora. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77 3.21 (a) Komercijalna sito-štampana elektroda Dropsens 220AT; (b) Planarna elektroda na bazi zlatnih listića; (c) Integrisan sistem elektroda na bazi zlatnihlistićaumikrofluidičnirezervoar;(d)Realizovaniplanarnidizajn; (e) Realizovani 3D dizajn. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 82 3.22 (a) Voltamogram zlata u 0,5 M sumpornoj kiselini; (b) Randles-Ševičkov dijagram u 10 mM kalijum fero/ferijcijanidu u PBS puferu; (c) Pikovi oksidacije i redukcije u funkciji korena brzine skeniranja; (d) Stabilnost signala tokom 25 ciklusa u 10 mM kalijum fero/fericijanidu u PBS puferu. 84 3.23 Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije redoks para u vodi, kalijum hloridu i PBS puferu. Unutrašnji grafici predstavljaju odziv senzora za čist elektrolit bez redoks para; (a) Planarna elektroda na bazi zlatnih lisića; (b) Elektrode na bazi zlatnih listića integrisane u mikrofluidičnu komoru. ..................................... 85 3.24 Šematski prikaz procesa funkcionalizacije površine zlata. . . . . . . . . . 87 3.25 (a) Fluorescentni test vezivanja antigen HER2 - antitelo Tmab; (b) Fluorescentni test vezivanja pL - antitelo Tmab. . . . . . . . . . . . . . . . . . 88 3.26 (a) Raman spektroskopija zlata, zlata sa MUA, zlata sa MUA i proteinom L u opsegu od 100 do 2000 cm−1; (b) Dekonvolucija pikova u u opsegu od 1200 do 1800 cm−1za zlato sa MUA, i nakon nanošenja pL. . . . . . . 89 3.27 (a) Koraci funkcionalizacije elektrode na bazi zlatnih listića; (b) Zasićenje elektrode na bazi zlatnih listića herceptinom (Tmab); (c) Detekcija tumor biomarkera HER2 elektrode na bazi zlatnih listića; (d) Koraci funkcionalizacije Dropsens elektrode; (e) Zasićenje Dropsens elektrode herceptinom (Tmab); (f) Detekcija tumor biomarkera HER2 Dropsens elektrodom. ................................... 91 3.28 Relativna promena signala elektrode na bazi zlatnih listića i komercijalnih Dropsens elektroda; (a) Za različite koncentracije herceptina (Tmab); (b) Za različite koncentracije tumor biomarkera HER2. . . . . . . . . . . . 92 SPISAK SLIKA 3.29 Specifičnost detekcije HER2 senzora. Relativna promena otpora prenosu naelektrisanjaizračunatajepremaizrazu: 𝛿(%)=𝑅𝑐𝑡(𝑐𝑐)−𝑅𝑐𝑡(1000 𝑛𝑔/𝑚𝐿 𝑇𝑚𝑎𝑏) 𝑅𝑐𝑡 (1000 𝑛𝑔/𝑚𝐿 𝑇𝑚𝑎𝑏) 93 3.30 Kontrolna merenja sa ponavljajućom inkubacijom medijuma. Relativna promena otpora prenosu naelektrisanja izračunata je prema izrazu: 𝛿(%)=𝑅𝑐𝑡 (𝑐𝑐)−𝑅𝑐𝑡(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑗𝑢𝑚) 𝑅𝑐𝑡 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑗𝑢𝑚)............................ 94 3.31 (a) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije HER2 u medijumu; Unutrašnji grafik: Električno kolo za fitovanje rezultata; Tačke na grafiku predstavljaju merenja, dok kriva predstavlja fitovane rezultate; (b) Relativna promena otpora prenosu naelektrisanja u zavisnosti od koncentracije HER2 u medijumu. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95 3.32 Šematski prikaz koncepta detekcije glukoze. . . . . . . . . . . . . . . . . 102 3.33 (a) Dizajn mikromešača sa obeleženim probama korišćenim u simulacijama. Dimenzije na slici su u mm; (b) Vrednosti indeksa mešanja za odnos protoka jednak 0,33; (c) Poređenje rezultata simulacija i eksperimenta mešanja boja u mikrofluidičnom mešanju za protok jednak 67 𝜇L/min na ulazima, nakon prve serpentine i na izlazu. . . . . . . . . . . 104 3.34 (a) Višeslojna struktura predložene LOC platforme; (b) 3D profil mikrofluidičnog kanala dobijenog stereolitografijom; (c) Finalni izgled LOC platforme sa integrisanom Dropsens elektrodom. . . . . . . . . . . . . . 105 3.35 Rezultati elektrohemijske detekcije glukoze; (a) Ispitivanje potencijala oksidacije vodonik peroksida (H2O2); Ciklusi 1-2 snimljeni su u acetatnom puferu. Ciklusi 3-4 snimljeni nakon dodavanja kapi GOx. Ciklusi 5-6 snimljeni nakon dodavanja kapi fruktoze. Ciklusi 7-8 snimljeni nakon dodavanja kapi glukoze; (b) Intenzitet pika oksidacije sa slike (a) na 0,9 V vs. Ag/AgCl RE; (c) Rezultati hronoamperometrije za detekciju glukoze pripremljene u acetatnom puferu; Unutrašnji grafik: Uvećani prikaz kontrolnih merenja i malih koncentracija Glc; (d) Kalibraciona kriva detekcije glukoze u acetatnom puferu. Signal je predstavljen kao relativna promena vrednosti u odnosu na signal acetatnog pufera, 𝛿(%)=100 × (𝐼𝑘𝑜𝑛𝑐. −𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟)/𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟; Unutrašnji grafik: Uvećani prikaz kalibracione krive za glukozu u opsegu 0,05 - 2,5 mg/mL. . . . . . . . . 108 SPISAK SLIKA 3.36 (a) Rezultati hronoamperometrije za različite koncentracije glukoze u ćelijskom medijumu. Unutrašnji grafik: Kalibraciona kriva za medijum; (b) Kalibraciona kriva u ćelijskom medijumu na ulazu u LOC platformu; Realna koncentracija je izračunata množenjem izmerene koncentracije sa odnosom protoka i faktorom 2 koji predstavlja razblaženje nakon mešanja u čipu. Signal je izračunat sledećim izrazom: 𝛿(%)=100 × (𝐼𝑘𝑜𝑛𝑐. −𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟)/𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟...............................109 Spisak tabela 1.1 Poređenje osetljivosti i linearnosti odziva senzora za različite periode jediničnećelije.................................. 17 1.2 Dielektrična permitivnost uzoraka ulja i uzoraka izmešanog palminog i ricinusovogulja.................................. 21 1.3 Poređenje predloženog SSPP senzora za merenje dielektrične permitivnosti sa drugim predloženim rešenjima u karakterizaciji ulja u pogledu principa detekcije, zapremine uzorka, osetljivosti i kompleksnosti izrade. 24 2.1 Rezultati obrade mikroskopskih slika. Srednje vrednosti i standardne devijacije pokrivenosti površine senzora tokom 96 h kultivacije ćelija. . . 38 2.2 Mikroskopske slike i proces obrade slike u cilju detekcije koncentracije ćelija u mikrobioreaktoru. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 39 3.1 Metode detekcije, dinamički opsezi i limit detekcije E. coli iz prethodnih istraživanja. ................................... 72 3.2 Metode detekcije, dinamički opsezi i limit detekcije S. Typhimurium iz prethodnihistraživanja............................. 79 3.3 Poređenje elektroaktivnih površina i faktora hrapavosti komercijalne Dropsens elektrode, planarne elektrode na bazi zlatnih listića i elektrode na bazi zlatnih listića integrisane u mikrofluidičnu komoru (3D). . . . . 83 3.4 Metode detekcije, dinamički opsezi i limit detekcije HER2 iz prethodnih istraživanja. ................................... 97 Rečnik stranih izraza •engl. Lab-on-a-chip - Laboratorija na čipu, LOC •engl. Surface Plasmon Polariton - Površinski plazmonski polaritoni, SPP •engl. Spoof Surface Plasmon Polariton - Dizajnirani (Lažni) površinski plazmonski polaritoni, SSPP •engl. Printed Circuit Board - Tehnologija štampanih ploča, PCB •engl. Ground - masa •engl. Polyvinyl chloride - Polivinil-hlorid, PVC •engl. Poly(methyl methacrilate) - Poli(metil metakrilat), PMMA •engl. Xurography - Ksirografija •engl. Vector network analyzer - Vektorski analizator mreže, VNA •engl. SubMiniature version A connectors - Površinski montirani konektori, SMA •engl. Scale down approach - Strategija smanjivanja razmere •engl. Alternative current - Naizmenična struja, AC •engl. Direct current - Jednosmerna struja, DC •engl. Scanning electron microscopy - Skenirajući elektronski mikroskopija, SEM •engl. Cyclic voltammetry - Ciklična voltametrija, CV •engl. Electrochemical impedance spectroscopy - Elektrohemijska impedansna spektroskopija, EIS •engl. Chronoamperometry - Hronoamperometrija, CA •engl. Squared wave voltammetry - Voltametrija pravougaonog talasa, SWV •engl. Solution resistance - Otpor rastvora, Rsol •engl. Charge transfer resistance - Otpor prenosu naelektrisanja, Rct REČNIK STRANIH IZRAZA •engl. Warburg element - Varburgov element, W •engl. Double layer capacitance - Kapacitivnost dvojnog sloja, Cdl •engl. Coffee ring effect - Efekat kafene mrlje •engl. Energy Dispersive Spectroscopy - Energetska disperzivna spektroskopija, EDS •engl. Self-assembled monolayer - Samoorganizujući sloj •engl. Mercaptopropionic acid - Merkaptopropionična kiselina, MPA •engl. Bovine Serum Albumin - Goveđi serumski albumin, BSA •engl. Mercaptoundecanoic acid - Merkaptoundekanoična kiselina, MUA •engl. Diferential Pulse Voltammetry - Diferencijalna pulsna voltametrija, DPV •engl. Gold leaf electrode - Elektroda na bazi zlatnih listića, GLE •engl. Deionized water - Dejonizovana voda, DI •engl. Glucose - glukoza, Glc •engl. Computer Numeric Control - Računarska numerički upravljana mašina, CNC Uvod Razvoj savremenih mikro i nanotehnologija uneo je niz novina u oblast razvoja senzora,upogledudizajna senzora,načina izradekao iprimene novihmaterijala u cilju smanjivanja dimenzija senzora i povećanja osetljivosti detekcije. Pored razvoja samih senzora, savremena istraživanja orijentisana su i na njihovu integraciju u kompaktne multifunkcionalne platforme, poznate kao Laboratorija-na-čipu (engl. Lab-on-a-chip (LOC)). LOC platforme često koriste koncept mikrofluidike i primene mikrokanala za manipulaciju fluidom, rezervoare za skladištenje fluida, kao i optičke i elektronske komponente za detekciju promena u analitu. Razvoj ovakvih sistema zahteva multidisciplinaran pristup i predstavlja jednu od aktuelnih tema savremene nauke. Aktuelna istraživanja u ovoj oblasti usmerena su na razvoj mikrofluidičnih platformi koje integrišu senzore i biosenzore, sa ciljem detekcije bakterija u hrani i vodi, tumor biomarkera, monitoringa različitih parametara životne sredine, kontroli kvaliteta hrane, kao i u novijim istraživanjima posvećenim razvoju kultivisanog mesa, itd. Zbog mogućnosti detekcije u realnom vremenu, mikrotalasni senzori predstavljaju odlično rešenje za širok opseg primena uključujući merenje dielektrične permitivnosti, kontrolu kvaliteta hrane, detekciju biomolekula, itd. Međutim, veliki nedostatak mikrotalasnih senzora zasnovan je na nemogućnosti detekcije sa velikom osetljivošću i oni se uglavnom primenjuju u oblastima gde se ne zahteva detekcija malih promena dielektrične permitivnosti. Jedan od obećavajućih fenomena za ultraosetljivu detekciju promene dielektrične permitivnosti zasniva se na površinskim plazmonskim polaritonima (engl. Surface Plasmon Polaritons, SPP) odnosno površinskom talasu koji nastaje sprezanjem fotona i slobodnih elektrona na razdelnoj površini između metala i dielektrika. Ove oscilacije karakteristične su po tome što su fizički vezane za razdelnu površinu dva materijala, najčešće metala i dielektrika, i samim tim omogućavaju jaka lokalna polja i interakciju na dimenzijama manjim od konvencionalnog limita difrakcije, zbog čega su veoma moćan alat za realizaciju visokoosetljivih senzorskih i biosenzorskih sistema. Međutim, SPP talasi se prostiru na razdelnoj površini provodnik/dielektrik na optičkim učestalostima i zbog toga se primenom koncepta dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona (engl. Spoof Surface Plasmon Polariton - SSPP) omogućava njihovo prostiranje i u dalekom infracrvenom, mikrotalasnom i terahercnom opsegu učestalosti. Ovaj koncept omogućen je primenom dizajniranih senzorskih konfiguracija, kao i plazmoničnih metamaterijala, koji omogućavaju imitaciju SPP propagacije na pomenutim učestalostima. Primenom pomenutog principa, u okviru doktorske diser1 UVOD tacije razvijen je senzor za detekciju malih promena dielektrične permitivnosti velike osetljivosti. Analizom konfiguracije senzora ispitani su različiti oblici jedinične ćelije, kao i njihov uticaj na osetljivost senzora na male promene dielektrične permitivnosti. Velika osetljivost detekcije dielektrične permitivnosti ima potencijalnu primenu u kontroli kvaliteta hrane, gde dielektrična permitivnost predstavlja jedan od bitnih parametara kvaliteta. U okviru glave 1 doktorske disertacije biće predstavljeni rezultati simulacija, optimizacije, realizacije i eksperimentalne verifikacije LOC platforme sa integrisanim senzorom na bazi SSPP talasa za identifikaciju i kontrolu kvaliteta jestivih ulja. Pored mikrotalasnog senzora, u okviru doktorske disertacije razvijeno je i LOC rešenje za praćenje životnog ciklusa ćelije unutar mikrobioreaktora primenom impedansnog senzora. Naime, principi detekcije senzora za bioanalize često su zasnovani na električnim osobinama ćelija, za koje je ustanovljeno da ispoljavaju različito ponašanje u zavisnosti od opsega učestalosti koji se koristi za analize. Većina realnih materijala pokazuje i dielektrična i provodna svojstva zbog postojanja kako dipola, tako i slobodnih nosilaca naelektrisanja koji se kreću kroz materijal. Kod materijala sa heterogenom strukturom (kao što su biološki materijali) pri kretanju slobodnih nosilaca naelektrisanja u polju, može doći i do nagomilavanja naelektrisanja na unutrašnjim razdelnim površinama. U heterogenim sistemima, unutrašnje razdvajanje naelektrisanja dovodi do formiranja efektivne unutrašnje polarizacije i stoga se na makroskopskom nivou, za opis sistema koriste veličine dielektrična permitivnost i provodljivost. Pomenute veličine zavisne su od učestalosti, a njihova promena opisana je disperzionom karakteristikom. Napredak mikrofluidike i senzorskih tehnologija doveo je do razvoja novih metoda monitoringa rasta ćelija, kako u makro tako i u mikrosistemima. U okviru glave 2 doktorske disertacije predstavljena je realizacija mikrofluidične platforme sa mikrobioreaktorom i integrisanim impedansnim senzorom u cilju monitoringa rasta ćelija tokom procesa kultivacije u minijaturizovanoj platformi koja predstavlja simulator velikog bioreaktorskog sistema u smanjenim razmerama. Impedansni senzor sa interdigitalnim dizajnom elektroda realizovan je u procesu inkdžet štampe. Metod izrade mikrofluidične platforme predstavlja brzo i efikasno rešenje za izradu simulatora smanjenih razmera za montinoring rasta ćelija, što može naći primenu u npr. procesu razvoja kultivisanog mesa. U predloženom sistemu, sisarske ćelije MRC-5 korišćene su kao model adherentnih ćelija, a senzor je uspešno detektovao sve faze rasta ćelija (lag, eksponencijalnu, stacionarnu, i fazu odumiranja) tokom 96 h kultivacije ćelija sa ograničenim nutrijentima. Kombinovanjem impedansnog pristupa sa obradom slike, predložena je platforma koja može da posluži za praćenje biomase u realnom vremenu i napredni sistem praćenja rasta ćelija u mikrobioreaktoru, tj. sistemu smanjenih razmera. 2 1.1. Teorijski uvod 𝐸𝑑=(𝐸𝑥𝑑,0, 𝐸𝑧𝑑)𝑒−𝑘𝑧𝑑𝑧+𝑖(𝑘𝑥𝑥−𝜔𝑡),(1.1.5) 𝐻𝑚=(0, 𝐻𝑦𝑚,0)𝑒−𝑘𝑧𝑚 𝑧+𝑖(𝑘𝑥𝑥−𝜔𝑡),(1.1.6) 𝐸𝑚=(𝐸𝑥𝑚,0, 𝐸𝑧𝑚)𝑒−𝑘𝑧𝑚 𝑧+𝑖(𝑘𝑥𝑥−𝜔𝑡),(1.1.7) gde 𝐻𝑑i𝐸𝑑opisuju magnetno i električno polje u dielektriku, dok 𝐻𝑚i𝐸𝑚opisuju magnetno i električno polje u metalu, respektivno. Komponenta 𝑥talasnog vektora označena je sa 𝑘𝑥, dok su 𝑧-komponente talasnog vektora u dielektriku i metalu opisane sa 𝑘𝑧𝑑 i𝑘𝑧𝑚, respektivno. Komponente 𝑥električnog polja predstavljene su sa 𝐸𝑥𝑑 i𝐸𝑥𝑚 u dielektriku i metalu, dok su 𝑧-komponente električnog polja predstavljene sa 𝐸𝑧𝑑 i 𝐸𝑧𝑚 u dielektriku i metalu, respektivno. Analogno, 𝑦-komponente magnetnog polja u dielektriku i metalu predstavljene su sa 𝐻𝑦𝑑 i𝐻𝑦𝑚, respektivno. Na osnovu prve i treće Maksvelove jednačine, kao i graničnih uslova za razdelnu površinu dva materijala, izveden je uslov za postojanje SPP talasa na razdelnoj površini dve sredine [39]. Granični uslovi koji važe za razdelnu površinu metal-dielektrik na slici 1.1 su: 𝐸𝑥𝑑 =𝐸𝑥𝑚 =𝐸𝑥, dok za pravacnormalan na razdelnupovršinu važi granični uslov 𝜀𝑑𝐸𝑥𝑑 =𝜀𝑚𝐸𝑥𝑚 i za magnetno polje 𝐻𝑦𝑑 =𝐻𝑦𝑚 =𝐻𝑦. Prema graničnim uslovima za razdelnu površinu između metala i dielekrika, tangencijalna komponenta vektora električnog i magnetnog polja je kontinualna. Veza između dielektričnih permitivnosti i normalnih komponenata talasnih vektora data je sledećim izrazom i predstavlja uslov postojanja površinskih plazmonskih polaritona: 𝑘𝑧𝑑 𝑘𝑧𝑚 =−𝜀𝑑 𝜀𝑚 ,(1.1.8) a disperzija talasnog broja definisana je izrazom: 𝑘𝑥=𝑘0r𝜀𝑑𝜀𝑚 𝜀𝑑+𝜀𝑚 ,(1.1.9) odnosno: 𝑘𝑠𝑝𝑝 =𝑘0r𝜀𝑑𝜀𝑚 𝜀𝑑+𝜀𝑚 .(1.1.10) Na slici 1.2 predstavljena je kriva opisana disperzionom relacijom, definisanom izrazom(1.1.10), za SPP talasenarazdelnojpovršinidielektrikapermitivnosti 𝜀𝑑imetala 𝜀𝑚, bez gubitaka. Linija svetlosti odgovara ravanskom talasu u slobodnom prostoru ispunjenim dielektrikom. Disperziona kriva SPP talasa ima nelinearnu karakteristiku i uvek je sa desne strane u odnosu na liniju svetlosti, što ukazuje da su SPP talasi 9 1.1. Teorijski uvod ”sporiji” u odnosu na talas u slobodnom prostoru. Takođe, kao posledica sprezanja fotona i površinskih plazmona, SPP talasi pokazuju veći ukupni moment impulsa u slobodnom prostoru u odnosu na svetlost na istoj učestalosti. Slika 1.2: Kriva disperzije SPP talasa. Kao što je prethodno pomenuto, SPP talasi imaju evanescentna polja koja prodiru i u dielektrik i u metal. Evanescentno polje SPP talasa prostorno slabi u smeru normalnom na razdelnu površinu i u dielektriku i metalu, slika 1.1b. U ovom slučaju, dubina prodiranja polja u dielektrik i metal, respektivno, definisana je kao 𝛿𝑑=1/𝑘𝑧𝑑 i 𝛿𝑚=1/𝑘𝑧𝑚 kada električno polje opada na vrednost 1/𝑒. Dubina prodiranja SPP talasa u dielektrik i metal data je izrazima (1.1.11) i (1.1.12): 𝛿𝑑=1 𝑘 𝜀𝑑+𝜀𝑚 −𝜀2 𝑑 1 2,(1.1.11) 𝛿𝑚=1 𝑘 𝜀𝑑+𝜀𝑚 −𝜀2 𝑚 1 2.(1.1.12) Iz prethodnih izraza može se videti da električna polja SPP talasa opadaju eksponencijalnosarastojanjemodrazdelnepovršinedvesredine.Naosnovumalihdubinaprodora električnih polja SPP talasa u dielektriku i metalu, električna polja SPP koncentrisana su uglavnom blizu razdelne površine, a koncentracija polja značajno je povećana na razdelnoj površini. Bez obzira na to, koncentracija polja SPP talasa opada brzo od razdelne površine duž 𝑧pravca, a koncentracija polja veća je u dielektriku nego u metalu [39]. 10 1.2. Pregled relevantnih istraživanja Kao što je prethodno opisano, osobine SPP talasa u opsegu optičkih učestalosti moguće je ”preneti” i na opsege učestalosti mikrotalasa primenom koncepta dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona. Ovaj koncept iskorišćen je za realizaciju mikrotalasnih SSPP struktura na bazi različitih geometrija jediničnih ćelija, a u okviru disertacije za realizaciju mikrotalasnog senzora za visokoosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti tečnih analita. 1.2 Pregled relevantnih istraživanja Dosadašnja istraživanja dovela su do realizacije različitih planarnih konfiguracija koje podržavaju propagaciju SSPP talasa, a zasnovane su na gradijentnim otvorima [37], rešetkama [37], cik-cak žlebovima [40], žlebovima sa kružnim peč rezonatorima [41] i disk rezonatorima [42]. Osim toga, svojstva SSPP talasa korišćena su za realizaciju filtera [43–45], antena [46, 47] i talasovodnih sistema [48–50]. Uprkos njihovom velikom potencijalu za senzorske primene, samo nekoliko senzora zasnovanih na SSPP-u je predloženo u literaturi, uključujući senzor za merenje indeksa prelamanja i debljine materijala [51], senzor za procenu sadržaja vode u ljudskom tkivu [52] i detektor Šotkijeve diode [53]. Svi predloženi senzori, zasnovani na SSPP talasima, koriste jedinične ćelije sa češljastom strukturom visokoosetljivih svojstava. Senzor za procenu sadržaja vode u ljudskom tkivu [52], zasnovan na planarnom plazmonskom talasovodu, realizovan je u tehnologiji štampanih ploča (engl. Printed Circuit Board, PCB) i pokazao je sposobnost za in vivo merenja sadržaja vode u tkivu kože sa potencijalom za rane dijagnostičke primene. S druge strane, detektor Šotkijeve diode zasnovan na SSPP-u takođe je realizovan u PCB tehnologiji, gde je SSPP konfiguracija omogućila značajno povećanje osetljivosti detekcije [53]. Iako je senzorsko rešenje zasnovano na češljastoj strukturi metamaterijala pokazalo izuzetno visoke performanse u osetljivosti za merenje debljine i indeksa prelamanja, senzor nije eksperimentalno realizovan [51]. Pored toga, na bazi SPP fenomena predložen je senzor za merenje dielektrične permitivnosti sa visokom osetljivošću, takođe realizovan u PCB tehnologiji [54]. Generalno, senzori za detekciju promene dielektrične permitivnosti nalaze praktičnu primenu u karakterizaciji materijala [55–57], merenju vlažnosti zemljišta [58, 59], kontroli kvaliteta hrane [60, 61], mešavini fluida [62, 63], itd. Jedna od potencijalnih primena mikrotalasnih senzora u kojima osetljiv odziv može pružiti vredne informacije o uzorku je kontrola kvaliteta jestivih ulja. U tom smislu, dielektrična spektroskopija se koristi za detekciju falsifikata ulja [64], određivanje hemijskog sastava [65, 66], kontrolu kvaliteta jestivih ulja [67], određivanju degradaciju ulja prilikom prženja [68, 69], karakterizaciju kulinarskih ulja [27], određivanje vremena korišćenja ulja [28] i identifikaciju ulja [29, 70]. U nastavku disertacije biće predstavljen senzor na bazi SSPP 11 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti talasa realizovan za detekciju malih promena dielektrične permitivnosti jestivih ulja u cilju identifikacije ulja i detekcije izmešanih uzoraka. 1.3 Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti Prethodno opisan princip dizajniranih površinskih plazmona iskorišćen je za realizaciju senzora za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti tečnih analita. Primenom numeričkih simulacija ispitan je potencijal detekcije dve vrste jediničnih ćelija u pogledu osetljivosti detekcije uzoraka male dielektrične permitivnosti. Takođe, niz jediničnih ćelija optimizovan je u pogledu broja jediničnih ćelija i njihovih dimenzija, dajući optimalan dizajn SSPP senzora. Konačno, senzor je realizovan primenom jeftine hibridne tehnologije, a njegove performanse validirane sa uzorcima jestivih ulja [10, 11]. 1.3.1 Disperzione krive jediničnih ćelija periodičnih struktura metalnog voda Za potencijalnu primenu dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona u senzorskimtehnologijama,predloženajenovajediničnaćelijaiupoređenasastandardnom jediničnomćelijomčešljastestrukturemetalnogvoda.Dimenzijejediničnećelijeoptimizovane su tako da se opseg učestalosti kom asimptotski teže disperzione krive uklopi u mikrotalasne učestalosti zbog jednostavnosti izrade senzora milimetarskih dimenzija. Simulirana geometrija sadrži rezervoar u kom se nalazi uzorak dielektrične permitivnosti 𝜀𝑢𝑧𝑜𝑟𝑘𝑎 i optimizovanu češljastu strukturu metalnog voda koja se nalazi iznad i ispod rezervoara. S obzirom na to da se princip detekcije dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona obezbeđuje nizom jediničnih ćelija u strukturi, performanse senzora i linearnost odziva ispitani su za različite vrednosti perioda jedinične ćelije. Takođe, ispitana je zavisnost broja jediničnih ćelija i gubitaka u strukturi. Centralni element senzora je SSPP struktura, odnosno jedinična ćelija, čije geometrijske karakteristike određuju ponašanje SSPP strukture. Naime, fenomen SSPP u takvim kolima omogućava niskofrekventno ponašanje strukture na učestalostima koje odgovaraju rezonantnom ponašanju ćelijske jedinice. Drugim rečima, na učestalostima koje su bliske rezonantnoj učestalosti jedinične ćelije, talas postaje više konfiniran, a odgovarajuće disperzione karakteristike počinju odstupati od svetlosne linije, sve do učestalosti koja ne dozvoljava propagaciju, a koju karakteriše transmisiona nula u odzivu SSPP strukture. U tom smislu, prvo je predložena nova jedinična ćelija, prikazana na slici 1.3a, 12 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti koja pruža kompaktniju strukturu u poređenju sa konvencionalnom češljastom strukturom, prikazanom na slici 1.3b, zahvaljujući dvema simetričnim strukturama koje formiraju T-oblikovanu prazninu. Ako pretpostavimo da su jedinične ćelije rezonantne ćelije sa njihovom efektivnom induktivnošću i kapacitivnošću, može se primetiti da dok predložena jedinična ćelija ima sličnu efektivnu kapacitivnost prema masi (engl. ground) kao češljasta struktura, njena efektivna induktivnost je značajno veća, a kao rezultat toga, predložena jedinična ćelija ima nižu rezonantnu učestalost. Za dobijanje disperzione relacije predložene jedinične ćelije i češljaste strukture, korišćen je CST Microwave Studio 2021®3. Problem je rešen koriščenjem Eigenmode solver-a. Ponavljajuća jedinica opisana je periodom 𝑑, širinom žleba 𝑎, dužinom žleba ℎi ukupnom visinom jedinice 𝑤i debljinom materijala 𝑡. Slika 1.3: (a) Predložena jedinična ćelija; (b) Jedinična ćelija češljaste strukture. U simulacijama je pretpostavljena potencijalna tehnologija izrade senzora, pa su za parametre korišćeni parametri materijala kao pri izradi senzora. Za modelovanje senzorske platforme zajedno sa komorom za tečne uzorke korišćeni su sledeći parametri za simulacije materijala: sloj aluminijuma debljine 40 𝜇m modelovan je tako da ima električnu provodljivost 3,56 ×107S/m. PVC folija debljine 80 𝜇m modelovana je sa dielektričnom permitivnošću 3,3 i tangensom ugla gubitaka (tan 𝛿) 0,15, dok je PMMA debljine 2 mm modelovan sa dielektričnom permitivnošću 2,6 i tan 𝛿0,02. Iako rezultati simulacija pokazuju da osobine 3M trake imaju zanemarljiv doprinos rezultatima, modelovana je kao tanak film dielektrične permitivnosti 3. Višeslojna struktura predloženog SSPP senzora prikazana je na slici 1.4. Kao što je opisano u uvodnom delu, princip detekcije senzora zasniva se na SSPP strukturi, koja je realizovana korišćenjem provodnih slojeva 1 i 7, dok slojevi 2 - 6 služe kao dielektrične podloge i istovremeno sadrže mikrofluidični rezervoar za uzorak. Zbog 3modul MW &RF &OPTICAL |Periodic Structures |FSS, Metamaterial Unit Cell |Dispersion Diagram 13 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti postupka izrade, koji će biti detaljnije objašnjen u sekciji 1.3.3, slojevi su napravljeni od aluminijuma (Al) (slojevi 1 i 7), PVC folije (slojevi 2 i 6), poli(metil metakrilata) (PMMA) (sloj 4) i 3M obostrano lepljivih traka (slojevi 3 i 5). Osim toga, provodni slojevi optimizovani su da imaju gladak prelaz između mikrostrip linija i konektora u pogledu prilagođenja impedanse 50 W-skom standardu. Slika 1.4: Višeslojna struktura SSPP senzora za detekciju dielektrične permitivnosti. U cilju optimizacije performansi detekcije, ispitani su disperzioni dijagrami dve jedinične ćelije iste površine otiska. Češljasta jedinična ćelija okarakterisana je sa četiri parametra prikazana na slici 1.3 - period 𝑑, udaljenost između žlebova 𝑎, dužina žleba ℎ, širina strukture 𝑤, i njihovi odnosi 𝑎=0,4𝑑,ℎ=0,8𝑑,𝑤=𝑑, dok je predložena jedinična ćelija okarakterisana sa još dva dodatna geometrijska parametra - širina savijenih struktura 𝑏=0,067𝑑, i udaljenost između savijenih oblika i dubine žleba 𝑥= 0,2(𝑤−ℎ). Naime, svi parametri jediničnih ćelija funkcija su perioda 𝑑, što omogućava skaliranje strukture promenom njegove vrednosti. Slika 1.5a predstavlja rezultate simulacija u kojima su upoređeni disperzioni dijagrami za različite vrednosti jedinične ćelije sa periodom 𝑑za predloženu i češljastu jediničnu ćeliju. Rezultati simulacija pokazuju da disperzioni dijagrami u slučaju obe ispitane jedinične ćelije značajno odstupaju od linije svetlosti. Takođe, u oba slučaja porast perioda 𝑑dovodi do smanjenja učestalosti površinskih plazmona, međutim, 14 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti predložena struktura jedinične ćelije pokazuje nižu učestalost površinskih plazmona u poređenju sa češljastom strukturom, što ukazuje na veću efektivnu induktivnost i posledično nižu rezonantnu učestalost. Slika 1.5: (a) Disperziona kriva češljaste strukture i predložene jedinične ćelije za vrednosti perioda 𝑑u opsegu 2,5 - 10 mm; (b) Disperziona kriva češljaste i predložene jedinične ćelije za period 𝑑=7,5mm za različite vrednosti dielektrične permitivnosti 𝜀𝑟u opsegu 1 - 5; (c) Zavisnost učestalosti površinskih plazmona od dielektrične permitivnosti za češljastu i predloženu jediničnu ćeliju. 1.3.2 Optimizacija dimenzija i broja jediničnih ćelija Pored disperzionih dijagrama, analizirana je osetljivost i linearnost detekcije cele strukture senzora. Slika 1.6 prikazuje odgovore senzora za period jedinične ćelije u opsegu od 2,5 - 10 mm, respektivno i različite vrednosti dielektričnih permitivnosti uzoraka u opsegu 1 - 5. Grafici 1.6a-d predstavljaju koeficijent transmisije u zavisnosti od učestalosti, dok unutrašnji grafik svakog od grafika predstavlja zavisnost položaja transmisione nule i dielektrične permitivnosti tečnog analita. Kao i u slučaju disper15 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti zionih krivih, položaj transmisionih nula na graficima 1.6a-d prikazuje pomeranje ka nižim učestalostima sa porastom perioda jedinične ćelije. Tabela 1.1 sumira sve parametre osetljivosti i linearosti kalibracionih krivih, predstavljenih na unutrašnjim graficima slika 1.6 za različite periode jedinične ćelije. Osetljivost je analizirana prema izrazu 𝑓𝑚𝑎𝑥 −𝑓𝑚𝑖𝑛 𝜀𝑚𝑎𝑥 −𝜀𝑚𝑖𝑛 , gde su 𝜀𝑚𝑎𝑥 i𝜀𝑚𝑖𝑛 maksimalna i minimalna vrednost dielektrične permitivnosti uzorka, dok su 𝑓𝑚𝑎𝑥 i𝑓𝑚𝑖𝑛 učestalosti transmisionih nula koje odgovaraju 𝜀𝑚𝑎𝑥 i𝜀𝑚𝑖𝑛, respektivno. Može se primetiti da se najbolja linearost postiže u strukturi sa periodom 𝑑= 7,5 mm, odnosno R2= 0,964, dok je osetljivost 569 MHz/epsilon u opsegu dielektrične permitivnosti 1 - 5. Iako strukture sa 𝑑= 2,5, 5 i 10 mm pokazuju bolju osetljivost, dobra linearost je jedna od najvažnijih svojstava senzora i zbog toga je odabrana vrednost od 7,5 mm kao optimalna vrednost perioda jedinične ćelije za realizaciju senzora. 16 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti Slika 1.6: Simuliran odziv senzora za uzorke dielektrične permitivnosti u opsegu 1 - 5 za periode jedinične ćelije: (a) 𝑑= 2,5 mm; (b) 𝑑= 5 mm; (c) 𝑑= 7,5 mm; (d) 𝑑= 10 mm. Unutrašnji grafici: Kalibracione krive transmisionih nula u funkciji dielektrične permitivnosti. Tabela 1.1: Poređenje osetljivosti i linearnosti odziva senzora za različite periode jedinične ćelije Period jedinične ćelije 𝑑(mm) Osetljivost (MHz/epsilon) Linearnost R2Fit 2,5 757,5 0,8956 -0,718𝜀+ 16,982 5 718,8 0,962 -0,7124 𝜀+ 9,486 7,5 532,1 0,964 -0,5633 𝜀+ 6,7239 10 611,19 0,8932 -0,5772 𝜀+ 5,7012 U sledećim rezultatima simulacija, period jedinične ćelije fiksiran je na 𝑑= 7,5 mm zbog odličnih linearnih karakteristika i kompaktnih dimenzija jednostavnih za izradu 17 1.3. Senzor na bazi SSPP za ultraosetljivu detekciju dielektrične permitivnosti senzora. Dalja analiza obuhvata poređenje odziva SSPP struktura sa različitim brojem jediničnih ćelija. Konkretno, dijagrami disperzije i učestalosti površinskih plazmona dobijaju se pod pretpostavkom da je struktura beskonačna, dok realni senzor dozvoljava konačan broj jediničnih ćelija. Stoga se mogu očekivati razlike između idealnih i realističnih slučajeva, a analizom je dobijen broj jediničnih ćelija koji pruža dobar odnos veličine strukture i ukupnih performansi senzora. Slika 1.7 prikazuje rezultate simulacija za broj jediničnih ćelija 5, 7 i 9, za vrednosti dielektrične permitivnosti 1, 3 i 5, gde se vidi da nema značajnih razlika u položaju transmisionih nula, a samim tim ni u potencijalu osetljivosti detekcije. Rezultati pokazuju da struktura sa 9 jediničnih ćelija pokazuje dublje transmisione nule u poređenju sa 5 i 7 jediničnih ćelija koje pokazuju slično ponašanje. S druge strane, rezultati na slici 1.7 takođe pokazuju da broj jediničnih ćelija određuje gubitke u strukturi i pokazuje da struktura sa manjim brojem jediničnih ćelija ima manje gubitke. Stoga, 7 jediničnih ćelija je izabrano kao dobar kompromis između veličine senzora i dovoljno duboke transmisione nule da budu detektabilne u merenjima i svojstava sa malim gubicima. Slika 1.7: Odziv mikrotalasnog na bazi SSPP talasa za broj jediničnih ćelija 5, 7 i 9 za uzorke dielektrične permitivnosti 1, 3 i 5. Optimizovana struktura SSPP senzora sa periodom jedinične ćelije 𝑑=7,5 mm i optimalnim brojem jediničnih ćelija 7, izrađena je primenom hibridne tehnologije izrade, koja je opisana u nastavku. 18 Glava 2 LOC platforma kao mikrobioreaktor sa integrisanim impedansnim senzorom za monitoring rasta ćelija Pri proučavanju složenih velikih sistema često se koristi strategija smanjivanja razmere (engl. scale down approach), gde se veličina i složenost sistema smanjuju dok se značajni fizičko-hemijski procesi u sistemu zadržavaju. Ovaj pristup omogućava razvoj i optimizaciju kompleksnih makroprocesa i njihovo dublje razumevanje, s obzirom na to da je broj parametara i promenljivih značajno smanjen u mikrookruženju. Pored toga, ovaj pristup smanjuje potrebu za skupom i velikom opremom, smanjuje količinu korišćenih reagenasa i materijala i omogućava lakšu kontrolu procesnih parametara [76, 77]. Korišćenje pristupa smanjenih razmera, posebno mikrofluidičnih platformi integrisanih sa različitim senzorskim tehnologijama može biti veoma korisno za različite bioprocesekakobi serešiliproblemikojinastajupovećanjemdimenzijasistema[78–80]. Mikrofluidika omogućava manipulaciju malim količinama tečnosti reda mikrolitara u mreži specifično dizajniranih mikrokanala imitirajući složene makroprocese kao što su mešanje tečnosti, separaciju čestica, itd. Integracija senzora u mikrofluidične platforme dovela je do razvoja koncepta LOC [81, 82] i organ-na-čipu [83, 84], koji mogu simulirati složene biološke sisteme u kontrolisanom okruženju. Ove platforme pokazale su potencijal da unesu velike izmene u polja medicine i biotehnologije omogućavajući brzo i precizno testiranje lekova i medicinskih tretmana i analiza, kao i u boljem razumevanju funkcionisanja bioloških sistema. U okviru doktorske disertacije pomenuti pristup iskorišćen je za realizaciju LOC platforme sa mikrobioreaktorom za kultivaciju ćelija i integrisanim impedansnim senzorom za praćenje rasta ćelija. Impedansni senzor sa interdigitalnim dizajnom elektroda realizovan je inkdžet štampom i integrisan u LOC platformu, odnosno simulator smanjenih razmera bioreaktora. Predloženi metod, integrisan u jednostavan minijaturizovani LOC sistem, pokazuje potencijal za primenu u različitim istraživanjima kao što su organ-na-čipu, za testiranje lekova i ispitivanje ćelija i tkiva, optimizaciju sistema kultivisanog mesa i sl. Potencijal predložene platforme sa integrisanim impedansnim senzorom testiran je na MRC-5 ćelijama, koje su korišćene kao model adherentnih će25 2.1. Pregled relevantnih istraživanja lija sisara. Predloženi senzor precizno je detektovao sve faze rasta ćelija tokom perioda kultivacije od 96 h sa ograničenim hranljivim materijama. Kombinovanjem rezultata impedansnog merenja sa tehnikama obrade mikroskopskih slika tokom rasta ćelija, razvijen je novi pristup za praćenje biomase u realnom vremenu uz naprednu kontrolu praćenja rasta ćelija u mikrobioreaktorima. U teorijskom uvodu biće opisan princip rada impedansnog senzora, kao i dielektrične osobine bioloških materijala biće opisane za različite opsege učestalosti u cilju razumevanja principa detekcije. U eksperimentalnom delu, rezultati izmerene impedanse biće upoređeni sa rezultatima predloženog modela ekvivalentnog električnog kola koje opisuje ponašanje senzora, kao i rezultatima obrade mikroskopskih slika u cilju procene biomase unutar LOC platforme. 2.1 Pregled relevantnih istraživanja Pristup smanjenih razmera posebno je relevantan za istraživanja u oblasti kultivisanog mesa, koje se smatra održivom alternativom tradicionalnoj proizvodnji mesa, zbog svog potencijala za etičan i održiv bioproces zasnovan na kultivaciji ćelija i tehnikama tkivnog inženjeringa. Kultivisano meso potencijalno nudi rešenja za velike probleme u tradicionalnim metodama proizvodnje mesa [85]. Tradicionalna poljoprivreda ima ogroman uticaj na zagađenje [86] i klimatske promene [87], dok se istovremeno suočava sa izazovima primene antibiotika i fungicida, kao i sa patogenima i bolestima u sistemima stočarske proizvodnje [88]. Iz tog razloga proizvodnja kultivisanog/laboratorijski uzgojenog mesa ima ogroman potencijal da ublaži sve navedene probleme vezane za konvencionalnu proizvodnju mesa. Proizvodnja mesa u velikim razmerama posebno je važna jer su Ujedinjene nacije predvidele da će porast stanovništva dostići 10 milijardi ljudi u narednih 30 godina, što će rezultirati povećanom potražnjom za hranom za više od 70% [89]. Potencijal ove oblasti već je prepoznat u svetskim okvirima imajući u vidu da je EFSA1donela određene regulative i da su pojedine zemlje već usvojile regulative za proizovodnju i distribucije proizvoda od kultivisanog mesa [90]. Međutim, proces proizvodnje kultivisanog mesa je i dalje veoma skup, pa je smanjenje troškova proizvodnje jedan od glavnih prioriteta i atraktivnih oblasti istraživanja. U tom smislu, senzori mogu biti od posebne pomoći u proizvodnoj skali jer omogućavaju poboljšanu kontrolu u procesu i ponovnu optimizaciju procesa kultivacije, uštedu na korišćenju medijuma za kultivaciju i snižavanje ukupne cene bioprocesa. U literaturi su predložena različita senzorska rešenja za praćenje relevantnih parametara rasta ćelija u bioreaktoru [91, 92]. Biomasa jedan je od najvažnijih parametara za praćenje tokom kultivacije ćelija 1European Food Safety Authority 26 2.2. Teorijski uvod u bioreaktorima jer direktno opisuje prirast rasta ćelija. Mnoge neinvazivne tehnike zasnovane na brojanju ćelija hemocitometrima [93], bliskoj infracrvenoj spektroskopiji [94] i dielektričnoj spektrometriji [95] predložene su za praćenje biomase. Pored prethodno navedenih tehnika, koje se smatraju tehnikama direktnog monitoringa, predložene su i indirektne metode zasnovane na merenju koncentracije glukoze i laktata [96], oslobođenih gasova tokom bioprocesa [97] i promene redoks potencijala [98]. Sva navedena rešenja imaju svoje nedostatke, a njihova integracija u bioreaktore je i dalje izazovan zadatak za komercijalne primene. Impedansni princip detekcije rasta ćelija pokazao je obećavajući potencijal za praćenje biomase korišćenjem naizmenične struje (AC) u radio-frekventnom opsegu [99, 100]. Naime, dielektrična svojstva ćelija zavise od učestalosti primenjenog polja. Kao heterogene strukture, ćelije su sačinjene od izolacionih membrana i okružene provodnom citoplazmom, kao i provodnim medijumom za kultivaciju. Drugim rečima, ćelije se mogu posmatrati kao mali kondenzatori, pa se njihova kapacitivna svojstva mogu koristitizapraćenjerastatokom vremena.Poredtoga,impedansa,kaokompleksnaveličina, sadrži informacije o provodnim osobinama sistema za kultivisanje (koji obuhvata ćelije sa medijumom za kultivaciju) i informacije o kapacitivnim svojstvima sistema za kultivaciju kroz realne i imaginarne delove, respektivno. Ove informacije iskorišćene su za izračunavanje karakteristika kao što su vijabilnost ćelija, proliferacija i adhezija ćelija na podlogu [101–105]. Nedavne studije pokazale su da je ovaj pristup efikasan i u 2D i 3D sistemima kultivisanja ćelija, odnosno i za adherentne ćelije u monoslojevima i za slobodno plutajuće ćelije u suspenzijama [106]. Shodno tome, impedansni metod postao je koristan pristup u brojnim biološkim oblastima, uključući testiranje lekova, ispitivanje kretanja ćelija i tkivnog inženjeringa [102, 107–109]. 2.2 Teorijski uvod 2.2.1 Kriva disperzije bioloških materijala Generalno, pojava disperzije u različitim opsezima učestalosti može se razmatrati na osnovu orijentacije dipola i kretanja nosilaca naelektrisanja. Na nižim učestalostima, dipoli se lako orijentišu u pravcu primenjenog polja, dok nosioci naelektrisanja na svom putu imaju veliku verovatnoću za zahvatanje u nekom od defekata materijala ili na unutrašnjim razdelnim površinama. Iz tih razloga, na nižim učestalostima karakteristična je velika vrednost dielektrične permitivnosti i mala vrednost provodljivosti. Sa porastom učestalosti, smanjuje se sposobnost dipola da isprate promene u električnom polju i polarizacija opada. S druge strane, nosioci naelektrisanja prelaze kraće razdaljine unutar materijala i verovatnoća za njihovo rasipanje se smanjuje. Iz tih razloga, sa 27 2.2. Teorijski uvod porastom učestalosti, permitivnost opada, a provodljivost u materijalu raste. U heterogenim materijalima, kao što su biološki, dolazi do pojave nekoliko celina na krivoj disperzije, slika 2.1. Opadajuće, stepeničaste promene u dielektričnoj permitivnosti sa porastom učestalosti, određuju 4 oblasti (𝛼,𝛽,𝛾, i 𝛿) i posledica su različitih mehanizama polarizacije koji rezultiraju dielektričnom relaksacijom na određenoj učestalosti. Od nižih ka višim učestalostima dominantne su migraciona relaksacija, zatim orijentaciona (dipolna), jonska i elektronska polarizacija, respektivno. Na nižim učestalostima (10 Hz - 10 kHz) 𝛼disperzija nastaje usred tangencijalnog toka nosilaca naelektrisanja po površini. U opsegu učestalosti (10 kHz - 10 MHz) dešava se nagomilavanje naelektrisanja na ćelijskoj membrani usred različitih vremena relaksacije nosilaca naelektrisanja, tj. Maksvel-Vagnerovog efekta na razdelnoj površini ćelijske membrane. Ova oblast učestalosti naziva se 𝛽disperzija. Dodatni doprinos 𝛽disperziji daje i polarizacija proteina i drugih organskih makromolekula. Osobine biosistema u ovom opsegu učestalosti pogodne su za detekciju brojnosti ćelija unutar sistema jer se ćelije ponašaju kao dipoli i ovaj princip biće iskorišćen u predlogu senzora za biomasu, što će detaljnije biti opisano u nastavku. Opseg učestalosti 0,1 - 5 GHz odgovara 𝛿disperziji, koja se iskazuje kod nekih proteinskih rastvora i neće biti predmet istraživanja doktorske disertacije. Konačno, na učestalostima iznad 0,1 GHz EM talasi prolaze kroz ćelijsku membranu i interaguju direktno sa unutarćelijskim sadržajem. U ovom opsegu učestalosti dešava se relaksacija molekula vode, što dovodi do 𝛾disperzije, i ne mogu se detektovati doprinosi pojedinačnih ćelija signalu zbog doprinosa koji potiče od molekula vode i unutarćelijskog sadržaja [100, 110, 111]. Iz tog razloga za detekciju primenom impedanse ispitane su učestalostiu oblastima 𝛼i𝛽disperzijeza detekciju rasta ćelija unutarmikrobioreaktora. Slika 2.1: Kriva disperzije bioloških materijala. 28 2.2. Teorijski uvod 2.2.2 Princip detekcije impedansnog senzora Kao heterogene strukture, biološki materijal ispoljava i provodne i dielektrične osobine u primenjenom AC polju. Ponašanje ovih sistema opisano je veličinama kao što su dielektrična permitivnost i provodljivost, koje su funkcije primenjene učestalosti i imaju karakteristike disperzije. Predloženi impedansni pristup za praćenje rasta ćelija zasniva se na promeni dielektrične permitivnosti medijuma sa ćelijama sa povećanjem brojnosti ćelija. Kao što je opisano u poglavlju 2.2.1, osetljivost detekcije zavisi od opsega učestalosti koji se koristi za merenja i u okviru istraživanja ispitana je osetljivost detekcije impedansnog senzora za učestalosti u oblasti 𝛼i𝛽disperzije. Naime, građa ćelijske membrane određuje kapacitivne osobine samih ćelija zbog mogućnosti akumulacije naelektrisanja u naizmeničnom polju. Pored kapacitivnih svojstava, ćelije pokazuju i visok otpor za jednosmernu struju (DC) i niskofrekventnu naizmeničnu struju. Zbog toga je opseg učestalosti do 100 kHz pogodan za očitavanje biomase, jer se na površini membrane nakupljaju naelektrisanja, a ćelije se ponašaju kao dipoli. Sistem ćelija u medijumu može se posmatrati kao kolekcija sferičnih kondenzatora, a kapacitivnost sistema raste sa povećanjem broja ćelija. Impedansni pristup pogodan je za praćenje rasta ćelija, jer samo žive ćelije poseduju prethodno opisane osobine zahvaljujući ćelijskoj membrani koja omogućava razdvajanje naelektrisanja. Pomenute kapacitivne osobine detektabilne su merenjem impedanse i taj princip je iskorišćen za pračenje rasta ćelija unutar LOC platforme. Predložena platforma napravljenja je iz nekoliko delova: staklena podloga koristi se kao podloga na kojoj se realizuje senzor, na koji je nadograđena mikrofluidična komora sa ćelijama. U predloženom LOC sistemu, staklo prekriveno SU-8 rezistom predstavlja podlogu za kultivaciju ćelija, slika 2.2a. Sloj SU-8 rezista nanesen je na impedansni senzor u cilju sprečavanja direktnog kontakta između senzora i ćelija u cilju detekcije samo kapacitivnih svojstava merenog sistema. Model adherentnih ćelija, MRC-5, korišćen u eksperimentima, lepi se za podlogu, raste u jednoj ravni i iz tog razloga predstavljen je kao monosloj na slici 2.2a. Iznad sloja ćelija, komoru za kultivaciju ispunjava medijum, koji obezbeđuje hranljive materije za rast ćelija u toku kultivacije. U predloženom sistemu, imaginarni deo impedanse je dominantan u ukupnoj impedansi i odražava broj ćelija u sistemu, dok realni deo oslikava električnu provodljivost medijuma i ćelija. Predloženi sistem sa integrisanim senzorom može se posmatrati kao skup sferičnih kondenzatora, gde se kapacitivnost svakog sloja može odrediti na osnovu njihovih dielektričnih svojstava i rastojanja od površine senzora, slike 2.2a i 2.2b. Ukupna kapacitivnost zavisi od svojstava korišćenih materijala (staklo, SU-8, kao i ćelije i medijum). S obzirom na to su svi ostali parametri u sistemu konstantni, imaginarni deo impedanse određen je koncentracijom ćelija. Sa druge strane, realni 29 2.3. Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija deo impedanse, koji je povezan sa električnom provodljivošću medijuma oko senzora, može pružiti informacije o promenama u medijumu oko senzora, kao što su prisustvo jona ili promene u jonskoj jačini rastvora. Slika 2.2: (a) Šematski prikaz poprečnog preseka LOC platforme; (b) Ekvivalentno električno kolo kapacitivnosti slojevite strukture LOC platforme sa ćelijama. 2.3 Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija 2.3.1 Struktura LOC platforme Za izradu višeslojne LOC platforme korišćeni su transparentni i biokompatibilni materijali - staklo i poli(metil metakrilat) - PMMA (Oracal Polikarbonati, Srbija). Impedansni senzor realizovan je u formi interdigitalnih elektroda, ištampanih na staklu debljine 2 mm. Za štampanje senzora korišćeno je mastilo sa 15% srebrnih nanočestica (Agfa-Gevaert N.V., Mortsel, Belgija). Senzor i staklo, prekriveni su SU-8 3000 rezistom debljine 8 𝜇m (Micro Chem, Ujedinjeno Kraljevstvo). Gornji i srednji slojevi senzora izrađeni su u PMMA pločama debljine 2 mm, dok su konekcioni slojevi izrađeni u 3M dvostrano lepljivoj traci (3M™GPT-020F, St. Paul, MN 55144-1000, Minneapolis, MN, USA). Višeslojna struktura predložene mikrofluidične platforme prikazana je na slici 2.3. Predložena platforma sadrži mikrobioreaktor i impedansni senzor integrisane u kompaktni, multifunkcionalni čip koji se sastoji od nekoliko različitih slojeva realizovanih korišćenjem tehnologije laserskog mikromašinstva. Kao što je spomenuto u sekciji 2.2.2, staklo (sloj 5) se koristi kao podloga za impedansni senzor koji je realizovan primenom inkdžet štampe. Dizajn predloženog senzora ima oblik interdigitalnog kondenzatora, a njegova struktura optimizovana je parametrima inkdžet štampanja kako bi se dobila dobra rezolucija štampanog sloja. Prethodna istraživanja koriste SU-8 rezist u različitim biomedicinskim primenama zbog njegove dobre biokompatibilnosti i optičke transparentnosti [112, 113]. Iz tog razloga sloj SU-8 rezista iskorišćen je za pokrivanje interdigitalnih elektroda i nanesen je primenom Dr Blade tehnike [114]. Zbog neprovodnih osobina filma SU-8 omogućena je detekcija kapacitivnih svojstava 30 2.3. Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija merenog sistema. Komora mikrobioreaktora za uzgajanje ćelija ima zapreminu od 1,5 mL i realizovana je u srednjem sloju (sloj 3) koji sadrži ulazne i izlazne otvore i komoru sa zaobljenim dizajnom ivica kako bi se sprečilo stvaranje vazdušnih mehura unutar čipa. Komora je zatvorena sa gornje strane (sloj 1) i donje strane (sloj 5), gde su otvori za ulaz i izlaz poravnati sa slojem 1. Impedansni senzor poravnat je kako bi se uklopio u komoru, dok se veza sa senzorom obezbeđuje pomoću konekcionih prstiju koji se nalaze van komore. Veza između slojeva omogućena je sa dva međusobno povezana sloja, 2 i 4, koji su realizovani u istom dizajnu kao sloj 3. Slika 2.3: Višeslojna struktura mikrofluidične platforme sa dimenzijama u mm. 2.3.2 Priprema MRC-5 ćelija za kultivaciju unutar LOC platforme Pre zasejavanja u mikrobioreaktorsku platformu, ćelije MRC-5 (humani fibroblasti ATCC CCL-171) uzgajane su u standardnim bocama za tkivo (Costar, 25 cm2) u ćelijskom medijumu (DMEM, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, SAD) sa 4500 mg/L glukoze, dopunjene sa 10% fetalnim goveđim serumom i 1% serum rastvor antibiotika/antimikotika (Sigma-Aldrich). Ćelije su zasejane u koncentraciji od 0,7×106ćelija, inkubirane na 37 °C u atmosferi sa 100% vlažnosti sa 5% CO2u CO2inkubatoru (ICO50, 31 2.3. Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija MEMMERT, Schvabach, Nemačka) i pasažirane dva puta nedeljno. Za zasejavanje ćelija u mikrobioreaktor, čelije u t25 flaskovima su tripsinizirane korišćenjem 0,25% tripsinEDTA (Serva, Nemačka), prebrojane i zasejane u koncentraciji od 50.000 ćelija/mL. Za kultivacijuunutar mikrobiorektora korišćenje iDMEMsa glukozom, fetalnimgoveđim serumom i antibiotikom/antimikotikom. 2.3.3 Karakterizacija senzora i rezultati merenja impedanse Slika 2.4a predstavlja impedansni senzor realizovan tehnikom inkdžet štampe sa interdigitalnim dizajnom elektroda na staklu, pre integracije u mikrofluidičnu plaftormu. Karakterizacija realizovanog interdigitalnog dizajna urađena je profilometrom i skenirajućim elektronskim mikroskopom (SEM), slike 2.4b i 2.4c. Prednost inkdžet štampanja ogleda se u mogućnosti realizacije oštrih i glatkih ivica, kao što se može videti na slikama profilometra, slika 2.4b. S druge strane, slike skenirajućeg elektronskog mikroskopa daju dodatne informacije o defektima štampanog sloja na mikroskali, što može uticati na performanse senzora. Na slici 2.4c pored sastava i granulaste strukture napravljene od nanočestica srebra, SEM slika prikazuje da površina senzora nema oštećenja i da postoji uniformnost štampanog sloja. Pre upotrebe, senzor je očišćen sa izopropanolom pre integracije u mikrofluidičnu platformu. Merenja impedanse odrađena su potenciostatom (PalmSens4, Holandija), smeštenim u CO2inkubator, povezanim preko Bluetooth-a sa računarom i softverom PSTrace 5.8. Na ovaj način izbegnuto je pomeranje mikrobioreaktora iz inkubatora i potencijalna kontaminacija ćelija i ćelijskog medijuma, slika 2.4d. 32 2.3. Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija Slika 2.4: (a) Inkdžet štampani impedansni senzor na staklu; (b) Slika sa profilometra inkdžet štampanih elektroda; (c) SEM slika inkdžet štampanih elektroda pri uvećanju ×3000; (d) Postavka eksperimenta. Portabilni potenciostat PalmSens smešten je unutar CO2inkubatora zajedno sa mikrobioreaktorom sa impedansnim senzorom. Slika 2.5 predstavlja rezultate merenja impedansnog senzora tokom 96 h kultivacije MRC-5 ćelija na tri različite učestalosti u opsegu 5 kHz - 100 kHz. U toku prva 2 h kultivacije ćelija, usled lepljenja ćelija na površinu senzora može se videti nagli pad u modulu i imaginarnom delu impedanse. Dalje analiza rezultata zavisi od analizirane učestalosti na kojoj se posmatraju rezultati merenja senzora, usled različitog ponašanja biološkog materijala u različitim opsezima učestalosti. Naime, prema krivoj disperzije opisanoj u sekciji 2.2.1, u 𝛼fazi i opsegu učestalosti 10 Hz - 10 kHz, dešava se tangencijalni tok jona na površini ćelija. Rezultati na slici 2.5a na učestalosti od 10 kHz prikazuju da senzor može da prepozna rast ćelija unutar mikrobioreaktora bez mogućnosti da detektuje lag fazu rasta. Pored toga, stacionarna faza i faza odumiranja se ne mogu razlikovati. S druge strane, na većim učestalostima, koje odgovaraju 𝛽fazi krive disperzije, dešava se nagomilavanje naelektrisanja na ćelijskoj membrani. Ova 33 2.3. Realizacija LOC platforme za monitoring rasta ćelija osobina omogućava detekciju ćelija unutar plafrome i praćenje njihovog rasta u toku vremena. Slika 2.5b i 2.5c prikazuje izmerene rezultate na 50 kHz i 90 kHz u toku 96 h kultivacije, respektivno. U ovom opsegu učestalosti, senzor može da detektuje različite faze rasta ćelija: pad i lepljenje na površinu senzora, lag fazu, eksponencijalnu fazu, stacionarnu fazu i fazu odumiranja. Rezultati, međutim, pokazuju da je promena impedanse kvantitativno veća na 50 kHz u poređenju sa 90 kHz, indukujući blagi porast dielektrične permitivnosti ćelija do 100 kHz, kao što je prethodno opisano u poglavlju 2.2.1, slika 2.1. Konačno, zbog ograničenih nutrijenata dostupnih za rast ćelija, nakon 60 h kultivacije, faza odumiranja počinje. Mrtve ćelije se odlepljuju sa površine tokom faze odumiranja, rezultujući porastom impedanse u merenjima senzora. Na kraju faze odumiranja, raspad ćelija dovodi do blagog porasta impedanse. Nakon 96 h kultivacije, kontrolna merenja impedanse svežeg medijuma i korišćenog medijuma urađena su radi utvrđivanja doprinosa merenom signalu. Naime, rezultati na slici 2.5d prikazuju malu razliku u opsegu učestalosti 5 - 20 kHz između realnog dela svežeg medijuma i medijuma nakon kultivacije ćelija. Realni deo impedanse na slici 2.5d pokazuje veće vrednosti za medijum nakon kultivacije u poređenju sa svežim medijumom. Naime, tokom procesa kultivacije, ćelije koriste nutrijente iz medijuma (koji su elektroliti) i pretpostavlja se da se usled smanjenja nutrijenata u toku kultivacije dolazi do opadanja provodljivosti medijuma, tj. porasta realnog dela impedanse korišćenog medijuma. S druge strane, imaginarni deo impedanse ne pokazuje značajne promene između svežeg medijuma i medijuma nakon kultivacije ćelija. Na osnovu ovih rezultata, pretpostavlja se da doprinos signalu impedanse daju samo ćelije koje rastu na površini senzora, a ne zbog promene svojstava medijuma u toku kultivacije, posebno na većim učestalostima koje su se pokazale bolje za opisanu primenu. 34 2.5. Diskusija i zaključak mase i daje dobre rezultate tokom procesa rasta ćelija, dok u slučaju odumiranja ćelija predloženi metod ne daje pouzdane rezultate. U slučaju većih bioreaktora, primena ove metode je limitirana zbog nepraktičnosti dobijanja slika bez dodatnih manipulacija ili uzorkovanja. S druge strane, predloženo rešenje merenja impedanse predstavlja jedan od glavnih doprinosa ove disertacije i kao takav može se koristiti za detekciju svih faza rasta ćelija sa visokom pouzdanošću. Predloženi impedansni senzor može biti prilagođen i redizajniran za integraciju, kako u sisteme LOC i organa-na-čipu, tako i u različite komercijalne bioreaktore za monitoring biomase. S obzirom na to da predloženi impedansni senzor ima mogućnost detekcije svih faza rasta može naćiprimenu i u različitim biomedicinskim analizima na ćelijama i tkivima, testiranju lekova, itd. Pored svih navedenih prednosti, LOC platforma je realizovana u isplativnoj i jednostavnoj tehnologiji, koja omogućava brzu izradu minijaturizovanih sistema, što otvara mogućnost za širok spektar primena u biotehnološkim i medicinskim istraživanjima. Rezultati ovih istražzivanja publikovani su u okviru rada u naučnom časopisu i predstavljeni na dve međunarodne konferencije. 41 Glava 3 Novetehnologijerealizacijeelektrohemijskihbiosenzora Poslednjih godina, istraživanja u oblasti biosenzora nalaze veliko interesovanje kako nauke, tako i industrije zbog velike potrebe za specifičnim testovima za detekciju i analizu bioloških uzoraka. Posebnu ekspanziju biosenzori nalaze u brzim biomedicinskim testovima kao što su COVID 19 testovi, testovi za trudnoću, detekciju tumor biomarkera, ali svoju primenu sve više nalaze i u detekciji kvaliteta hrane, kontaminenata u vodi i zemljištu i sl. Tokom proteklih nekoliko godina, došlo je do značajnog napretkaurazvojunovihbiosenzorakojipreuzimajukonvencionalnemetodekaoštosu kolorimetrijski, fluorescentni, magnetni i elektrohemijski biosenzori [121–125]. Među različitim tipovima biosenzora, elektrohemijski biosenzori se izdvajaju kao vodeći kandidati zbog svoje podobnosti za primenu na terenu, izuzetne osetljivosti, selektivnosti, ekonomičnosti i pristupačnosti. Međutim, njihova komercijalizacija ostala je relativno ograničena zbog izazova proizvodnje zlatnih elektroda, koje su najčešće korišćene podloge za realizaciju elektrohemijskih senzora i zbog stabilnosti funkcionalizovanog sloja biomolekula. Iako se većina biosenzora oslanja na kvalitativnu detekciju, kao daje informaciju da li je određeni bioelement prisutan u uzorku ili nije, često je neophodno i kvantitativno odrediti koncetracije i prisustvo specifičnih biomolekula u nekom uzorku, jer određene koncetracije mogu izazvati negativne efekte po ljudsko zdravlje. Elektrohemijski biosenzori imaju ogroman potencijal da unesu novine u način na koji se vrši dijagnostika bolesti, praćenje zdravstvenog stanja, ali i analize bioloških procesa. Razvojem elektrohemijskih biosenzora, otvara se mogućnost brze, specifične i visokoosetljive detekcije proteina, enzima, biomolekula, hormona ili genetičkih materijala, čak i u veoma niskim koncentracijama. Potencijalno tržište elektrohemijski senzori pronalaze u medicini, zaštiti živote sredine, bezbednosti hrane, farmaciji, itd. [126–129]. Iako postoji veliko potencijalno tržište za pomenute elektrohemijske biosenzore, i dalje postoji veliki broj izazova koje treba prevazići da bi se realizovali jeftini, portabilni i osetljivi sistemi. U okviru doktorske disertacije razvijena je nova tehnologija izrade zlatnih elektroda na bazi listića zlata. Predstavljena tehnologija prevazilazi postoje42 3.1. Teorijski uvod će tehnologije u pogledu jednostavnosti i ceni izrade elektroda. Takođe, usled velike hrapavosti površine realizovanih elektroda, pomenuta tehnologija daje veću specifičnu površinu za detekciju u poređenju sa drugim tehnologijama izrade. Na taj način, omogućena je veća osetljivost detekcije bez korišćenja dodatnih pojačavača signala ili nanomaterijala. U ovom poglavlja biće dat teorijski uvod sa opisom procesa koji se dešavaju na razdelnoj površini elektrode i tečne faze, kao i opis elektrohemijskih tehnika korišćenih za detekciju kod realizovanih biosenzora. U okviru eksperimentalne sekcije biće predstavljena tehnologija izrade, karakterizacija realizovanih elektroda primenom tehnika skenirajuće elektronske mikroskopije, profilometrije, Raman spektroskopije, kontaktnog ugla i energetske disperzivne spektroskopije. Takođe, u okviru eksperimentalnog dela, biće ispitan uticaj geometrije i površinske strukture elektroda na elektrohemijski odziv. Značajan doprinos ove disertacije predstaljva i razvoj protokola za funkcionizaciju površine elektrode biomolekulima. Pored toga, predložene elektrode na bazi zlatnih listića biće upoređene sa komercijalnim sito-štampanim zlatnim elektrodama u pogledu potencijala za biosenzorske primene. Potencijalne primene predložene tehnologije izrade elektroda biće ispitane za biosenzorska rešenja, otvarajući mogućnost za jeftinu, osetljivu i brzu detekciju bakterija E. coli,S. Typhimurium i tumor biomarkera HER2. 3.1 Teorijski uvod Elektrohemija je grana hemije koja se bavi proučavanjem interakcija između hemijskih supstanci i električne energije. Veliki deo ove oblasti bavi se proučavanjem hemijskih promena izazvanih prolaskom struje kroz uzorak, kao i proizvodnjom elektrona u hemijskim reakcijama. Elektrohemija obuhvata niz različitih pojava (kao što su elektroforeza i korozija), uređaja (kao što su senzori, biosenzori, baterije i gorivne ćelije) i tehnologija (kao što su elektrodepozicija metala i masovna proizvodnja aluminijuma i hlora) [130–132]. Oblast elektrohemije koja proučava prenos elektrona u hemijskoj reakciji između elektrode i reagujućih molekula, najčešće u tečnoj fazi, naziva se dinamička elektrohemija. Dinamička elektrohemija opisuje procese koji se odigravaju na razdelnoj površini između tečne faze i metalne elektrode, što je ujedno i interesna oblast za detekciju kod elektrohemijskih biosenzora. Pomenuti procesi na površini elektrode zavise od velikog broja parametara, kao što su opseg potencijala, transportni procesi između rastvora i elektrode, reaktivnost rastvora, priroda površine elektrode, kao i struktura razdelne površine rastvora i elektrode [133]. U narednim poglavljima biće opisani elektrohemijski procesi koji se odvijaju na 43 3.1. Teorijski uvod razdelnoj površini između elektrode i tečne faze. Ovaj opis obuhvata kako Faradejeve tako i nefaradejeve procese, uz dodatno objašnjenje dvojnog sloja na razdelnoj površini elektrode i tečne faze. Tehnike ciklične voltametrije, elektrohemijske impedansne spektroskopije i hronoamperometrije biće opisane teorijski, a u okviru eksperimentalnog dela i primenjene za karakterizaciju površine elektrode i detekciju bakterija E. coli,S. Typhimurium i tumor biomarkera HER2. 3.1.1 Elektrohemijski procesi na površini elektrode Elektrohemijska ćelija podrazumeva troelektrodni sistem, koji uključuje radnu, referentnu i pomoćnu elektrodu. Radna elektroda je mesto gde se dešavaju elektrohemijski procesi i predstavlja glavni deo elektrohemijske ćelije. Kod biosenzorskih sistema, radna elektroda je funkcionalizovana bioprepoznatljivim elementom i omogućava specifičnu detekciju željene komponente u tečnoj fazi. Referentna elektroda obezbeđuje konstantan potencijal u odnosu na koji se meri potencijal radne elektrode, dok pomoćna elektroda omogućava zatvaranje električnog kola. Produkti elektrohemijske reakcije na površini elektrode su elektroni, koji se usmeravaju i razmenjuju između potenciostata i elektrode kontrolom potencijala pomoću potenciostata. Ključni koncepti u elektrohemiji koji opisuju na koji način električne struje utiču na elektrohemijske reakcije na elektrodama opisani su Faradejevim i nefaradejevim procesima. Ovi procesi su od suštinskog značaja za razumevanje elektrohemijskih sistema i igraju ključnu ulogu u mnogim tehničkim i naučnim primenama. Faradejevi zakoni pružaju kvantitativni okvir za analizu elektrohemijskih reakcija, dok nefaradejevi procesi igraju ključnu ulogu u optimizaciji brzine i efikasnosti ovih reakcija. Faradejevi procesi Pod Faradejevim procesima podrazumevaju se elektrohemijske reakcije koje direktno učestvuju u prenosu naelektrisanja između tečne faze i elektrode. Ovi procesi nazvani su po britanskom naučniku Majklu Faradeju, koji je prvi put istražio proces elektrolize i elektrohemijske reakcije sredinom 19. veka. Faradejevi zakoni opisuju kvantitativnu vezu između količine hemijske supstance koja se menja tokom elektrohemijske reakcije i količine naelektrisanja koje protekne kroz elektrolit. Faradejeva elektroliza se odnosi na proces gde se elektrohemijska reakcija dešava primenom potencijala na elektrodu uronjenu u elektrolit, gde se prenos naelektrisanja omogućava putem jona u rastvoru. Na anodi se obično dešava oksidacija (gubitak elektrona), dok se na katodi odvija redukcija (dobijanje elektrona). Količina supstance koja se menja tokom elektrolize proporcionalna je količini prenetih elektrona i može se izračunati prema Faradejevim zakonima [132, 133]. 44 3.1. Teorijski uvod Princip merenja elektrohemijskih biosenzora zasniva se na detekciji elektrona koji su izgenerisani u Faradejevim procesima na razdelnoj površini metala i tečne faze. Naime, za karakterizaciju radne elektrode biosenzora uglavnom se koristi redoks par, koji se u elektrohemijskom procesu oksiduje i redukuje pod dejstvom potencijala. U tom procesu dolazi do razmene elektrona sa potenciostatom i omogućena je kvantifikacija dostupnosti centara interakcije na površini elektrode za oksido-redukcionu reakciju. Natajnačinopisujese”zauzetost”površineelektrodesaprethodnodetektovanimkomponentama. Za detekciju elektrona dobijenih kao produkt hemijske reakcije, koriste se različite elektrohemijske tehnike, što će detaljnije biti opisano u nastavku. Nefaradejevi procesi Nefaradejevi procesi su elektrohemijske reakcije koje ne učestvuju direktno u prenosunaelektrisanja,većutičunabrzinuiefikasnostFaradejevihprocesa.Oviprocesi se odvijaju na elektrodama i mogu uključivati adsorpciju/desorpciju jona i molekula, promene površinske strukture elektrode i stvaranje difuzionog sloja na elektrodi. Jedan od ključnih nefaradejevih procesa je adsorpcija i desorpcija jona ili molekula na površini elektrode. Adsorpcija se odnosi na prijanjanje hemijskih komponenata na površinu elektrode, dok desorpcija predstavlja njihovo oslobađanje. Ovi procesi mogu značajno uticati na brzinu faradejevih reakcija, jer promene površinske pokrivenosti mogu otežati ili ubrzati reakcije. Nefaradejevi procesi takođe uključuju stvaranje difuzionog sloja oko elektrode. Ovaj sloj se formira usled razlike u koncentraciji jona na površini elektrode i u elektrolitu, što može usporiti brzinu hemijske reakcije. Takođe, kod nefaradejevih procesa ne dolazi do razmene elektrona sa elektrodom [132, 133]. Pri elektrohemijskoj detekciji u slučaju biosenzora, Faradejevi procesi oksidacije i redukcije redoks para omogućavaju praćenje zauzetosti površine detekovanim uzorkom. S druge strane, nefaradejevi procesi ne učestvuju direktno u izmerenom signalu (jer nema razmene elektrona sa elektrodom), ali se njihov doprinos može detektovati u vidu skladištenja naelektrisanja na površini elektrode. U nastavku poglavlja biće opisan potencijal na razdelnoj površini elektrode, kao i formiranje dvojnog sloja usled različito naelektrisanih jona koji postoje u elektrohemijskim sistemima. 3.1.2 Potencijal na razdelnoj površini elektrode i tečne faze Potencijal na razdelnoj površini između elektrode i tečne faze opisuje interakciju i reaktivnost elektrode i uzorka. Ima značajan uticaj na brzinu elektrohemijskih reakcija, adsorpciju specifičnih molekula i jona na površini elektrode, kao i na promene u hemijskom sastavu elektrolita u blizini elektrode. 45 3.1. Teorijski uvod Odnos između električnog potencijala, koncentracije jona i temperature u elektrohemijskim reakcijama opisuje Nernstova1jednačina, predstavljena izrazom (3.1.1). Iz izraza (3.1.1) vidi se da potencijal elektrode zavisi od koncentracije jona u rastvoru i može biti pozitivan ili negativan. Na osnovu Nernstove jednačine omogućeno je izračunavanje električnog potencijala elektrode za različite koncentracije oksidovanih (𝑐𝑐𝑜𝑥) i redukovanih (𝑐𝑐𝑟𝑒𝑑) jona na različitim temperaturama. Takođe, korisna je za proučavanje ravnotežnih stanja u elektrohemijskim ćelijama i određivanje promena potencijala tokom elektrohemijskih reakcija. U izrazu (3.1.1) 𝐸predstavlja električni potencijal elektrode, 𝐸0standardni potencijal elektrode za jediničnu koncentraciju jona, 𝑅gasnu konstantu, 𝑇temperaturu, a 𝐹Faradejevu konstantu. 𝐸=𝐸0+𝑅𝑇 𝑛 𝑓 ln 𝑐𝑐𝑜𝑥 𝑐𝑐𝑟𝑒𝑑 (3.1.1) Prethodni izraz opisuje elektrohemijske reakcije na površini elektrode pri promeni potencijala. Naime, ako se promeni potencijal elektrode, rastvor koji je u kontaktu sa elektrodom mora imati koncentracioni odnos aktivnih oksidovanih i redukovanih jona, kako je naznačeno u Nernstovoj jednačini, odnosno mora doći do elektrohemijske reakcije. Iz tog razloga Nernstova jednačina predstavlja jednu od osnovih jednačina za razumevanje elektrohemijskih procesa na površini elektrode [133]. Formiranje dvojnog sloja na površini elektrode Kada se uspostavi ravnoteža na površini elektrode, na razdelnoj površini elektrode i tečne faze postoji elektrostatička sila između elektrode i nosilaca naelektrisanja, koja formira odvajanje pozitivnih i negativnih nosilaca naelektrisanja. U ovakvom sistemu postoje i Braunovo kretanje i entropijska sila, koje homogenizuju raspodelu različitih nosilaca naelektrisanja na većoj udaljenosti od razdelne površine, u rastvoru. Pored jona koji određuju površinsko naelektrisanja ili tzv. površinskih jona, u rastvoru postoje i tzv. kontra joni, koji su naelektrisani suprotno od naelektrisanja površinskih jona. Iako je očuvana ukupna neutralnost u sistemu, raspodela nosilaca naelektrisanja u blizini razdelne površine je nehomogena i razlikuje se nekoliko slojeva. U sloju najbližem elektrodi, koncentracija kontra jona je najveća i opada sa rastojanjem od površine, dok se koncentracija površinskih jona menja obrnutno. Takve nehomogene raspodele jona u blizini razdelne površine tečne faze i elektrode dovode do formiranja tzv. dvojnog sloja, slika 3.1. Dvojni sloj, kao što i sam naziv kaže, sastoji se od dva sloja, Šternovog2sloja i Gujevog3sloja (takođe nazvanog difuzni dvojni sloj). U Šternovom sloju električni potencijal linearno opada kroz čvrsto vezani sloj 1engl. Walther Nernst 2engl. Otto Stern 3engl. Louis Georges Gouy 46 3.1. Teorijski uvod određujućih i kontra jona, do Helmholcove4ravni. Daljim povećanjem rastojanja od površine elektrode, nakon Helmholcove ravni, nalazi se Gujev sloj ili difuzioni dvojni sloj. U Gujevom sloju, kontra joni slobodno difunduju dok ne dostignu usrednjenu koncentraciju u rastvoru, a električni potencijal opada aproksimativno prema relaciji: 𝐸∝𝑒−𝜅(ℎ−𝐻),(3.1.2) gde je ℎ≥𝐻debljina Šternovog sloja, 1/𝜅Debaj-Hikelova5konstanta, koja se takođe koristi za opisivanje dvojnog sloja: 𝜅=s𝐹2Í𝑖𝑐𝑖𝑍2 𝑖 𝜀𝑟𝜀0𝑅𝑇 .(3.1.3) U izrazu (3.1.3) 𝜀0predstavlja permitivnost vakuuma, 𝜀𝑟dielektričnu permitivnost rastvora, a 𝑐𝑖i𝑍𝑖koncentraciju i valencu kontra jona tipa 𝑖(𝑖predstavlja opštu oznaku za različite vrste jona). Ova jednačina pokazuje da električni potencijal u blizini čvrste površine opada sa povećanjem koncentracije i valentnim stanjem kontra jona, a raste sa povećanjem dielektrične permitivnosti rastvora eksponencijalno. Veća koncentracija i valenca kontra jona bi dovela do smanjene debljine i Šternovog i Gujevog sloja. U teoriji, Gujev difuzioni sloj se završava u tački gde električni potencijal dostiže nulu, što bi bio slučaj samo kada je rastojanje od čvrste površine beskonačno. Međutim, u praksi, debljina dvojnog sloja je obično približno 10 nm ili veća. Ravan koja razdvaja usko vezani sloj tečnosti od ostatka tečne faze naziva se klizeća ravan. Električni potencijal na klizećoj ravni naziva se zeta potencijal i poznat je kao parametar koji određuje stabilnost koloidnih disperzija [134]. Opisani procesi na razdelnoj površini elektrode i tečne faze određuju u velikoj meri i odziv i osetljivost elektrohemijskih biosenzora. Tehnike ciklične voltametrije, elektrohemijske impedansne spektroskopije i hronoamperometrije korišćene su u eksperimentalnom delu za karakterizaciju i detekciju u biosenzorskim sistemima. Teorijske osnove ovih elektrohemijskih tehnika biće predstavljene u narednim poglavljima. 3.1.3 Ciklična voltametrija Jedna od najčešće korišćenih elektrohemijskih tehnika za proučavanje procesa na površini elektrode je ciklična voltametrija (CV). Ova tehnika omogućava opisivanje brzine, mehanizma i kinetike reakcija elektroaktivnih supstanci. Kao rezultat ciklične voltametrije dobija se zavisnost struje u funkciji promene potencijala i dobijeni grafici nazivaju se ciklični voltamogrami ili samo voltamogrami. 4engl. Hermann von Helmholtz 5engl. Peter Debye iErich Hückel 47 3.1. Teorijski uvod Slika 3.1: Šematski prikaz dvosloja na razdelnoj površini između elektrode i tečne faze. U cikličnoj voltametriji potencijal radne elektrode postepeno se menja tokom vremena dok se meri struja koja prolazi kroz elektrodu. Opisana promena potencijala u vremenu prikazana je na slici 3.2a. Tipično, potencijal radne elektrode menja se linearno u vremenu do zadate maksimalne vrednosti potencijala u odnosu na referentnu elektrodu, nakon kog se vrši smanjenje potencijala do minimalne zadate vrednosti potencijala prema izrazu: 𝐸=𝐸𝑖±𝜈𝑡, (3.1.4) gde je 𝐸𝑖inicijalni potencijal, 𝜈predstavlja brzinu skeniranja (izražava se u V/s), a 𝑡 vreme skeniranja. Inicijalni potencijal, 𝐸𝑖, bira se tako da elektroaktivne komponente nisu ni oksidovane ili redukovane. Potencijal se zatim menja do maksimalne 𝐸𝑚𝑎𝑥 ili minimalne vrednosti 𝐸𝑚𝑖𝑛, kada se vrši okretanje smera skeniranja. Uzastopnim ponavljanjem promene potencijala, vrši se skeniranje uzorka i iz tog razloga tehnika nosi naziv ciklična voltametrija. Važni parametri u CV tehnici su veličine struje oksidacionog pika koja se dešava na anodi, 𝐼𝑝,𝑎 i redukcionog pika na katodi 𝐼𝑝,𝑐, kao i potencijali pri kojima se javljaju pikovi na anodi i katodi, 𝐸𝑝,𝑎 i𝐸𝑝,𝑐, respektivno [130, 135, 136]. 48 3.1. Teorijski uvod Slika 3.2: (a) Promena potencijala u toku vremena u cikličnoj voltametriji; (b) Primer cikličnog voltamograma. U slučaju elektrohemijskih biosenzora, redoks par jona gvožđa6najčešće se koristi za karakterizaciju površine biosenzora. U tom slučaju Faradejevi procesi oksidacije i redukcije redoks para su reakcije od interesa i daju mogućnost povezivanja izmerenih parametara svake od elektrohemijskih tehnika sa kvantitetom detektovanog uzorka. Opseg potencijala za CV bira se na način da u okviru voltamograma budu jasno definisani pikovi oksidacije i redukcije gvožđa, slika 3.2b. Promenom potencijala iznad ravnotežnog stanja, vrši se prenos elektrona sa molekula u rastvoru na elektrodu i obrnuto. U slučaju jona gvožđa, Fe3+, elektron sa elektrode može da pređe na jon redukujući ga u Fe2+stanje, izraz (3.1.5): Fe3+(𝑎𝑞)+e−(𝑚) → Fe2+(𝑎𝑞).(3.1.5) Suprotno, kada se od Fe2+oduzima elektron molekul se oksiduje, a elektroda prima jedan elektron: Fe2+(𝑎𝑞) → Fe3+(𝑎𝑞)+e−(𝑚).(3.1.6) Na osnovu izraza (3.1.5) i (3.1.6) može se zaključiti da je redoks par Fe3+/Fe2+ reverzibilan i iz tog razloga sam voltamogram ima simetrične pikove struje oksidacije i redukcije gvožđa. Potencijali na kojima se dešava oksidacija i redukcija razdvojeni su iz razloga difuzije analita do/od površine elektrode pri procesima oksidacije i redukcije [133]. Pre elektrohemijskih eksperimenata, elektrode se uglavnom podvrgavaju cikličnoj voltametriji u kiselini u cilju skidanja nečistoća sa njihove površine. Pri oksidaciji i redukciji zlata u kiselini vrši se uklanjanje nečistoća sa površine elektrode. Iz tog razloga ponavljanjem ciklične voltametrije u kiselini tokom nekoliko desetinaciklusa,vršisečišćenjeelektrodekaodeostandardnogprotokola.Sobziromna todaserastvorinajčeče prave uvodi,opsegmerenog potencijala,tzv. prozor potencijala 6U slučaju realizovanih elektrohemijskih biosenzora, karakterizacija površine vrši se redoks parom kalijum ferocijanida i kalijum fericijanida. 49 3.1. Teorijski uvod bira se tako da krajnji potencijal bude potencijal oksidacije dovodi do cepanja vode: Anoda (oksidacija) : 2H2O→O2+4H++4e−,(3.1.7) a krajnji potencijal redukcije dovodi do redukcije vodonika: Katoda (redukcija) : 4H++4e−→2H2.(3.1.8) U ovom procesu, molekuli vode na anodi razlažu se na kiseonik, protone H+i elektrone e−, izraz (3.1.7), dok se na katodi protoni i elektroni kombinuju da formiraju molekule vodonika, izraz (3.1.8). Primena ciklične voltametrije, pored karakterizacije sastava elektrode, omogućava i procenu aktivne površine elektrode koja učestvuje u elektrohemijskoj reakciji, pomoću Randles-Ševičkove jednačine. Randles-Ševičkova jednačina Randles-Ševičkovajednačinaopisujevezuizmeđu difuzijei elektrohemijskihprocesa na površini elektrode. Može se koristiti za određivanje elektrohemijski aktivne (ili elektroaktivne) površine elektrode, ukoliko su poznati koeficijent difuzije i koncentracija redoks para. Za idealno ravnu metalnu elektrodu, očekuje se da će elektroaktivna površina biti jednaka geometrijskoj površini elektrode. Međutim, to nije slučaj kada postoje nečistoće na elektrodi, kada su elektrode porozne ili funkcionalizovane specifičnim bioprepoznatljivim elementima (kao što su DNK, aptameri, antitela i sl.). Pored procene elektroaktivne površine elektrode, jednačina omogućava i procenu difuzionog koeficijenta nepoznatog redoks para. Randles-Ševičkova jednačina je predstavljena izrazom (3.1.9): 𝑖𝑝=2,69 ·105·𝐴·𝐶·𝑛3/2·𝐷1/2·𝜈1/2,(3.1.9) gde je 2,69·105C mol√Vkonstanta u kojoj figurišu Faradejeva konstanta 𝐹, univerzalna gasna konstanta 𝑅, i temperatura (300 K). Dalje, u izrazu (3.1.9), 𝐴predstavlja elektroaktivnu površinu u cm2,𝑖𝑝je anodni pik struje, 𝐷difuzioni koeficijent (6,1 ·10−6cm2/s [137] za [Fe(CN)6]4−), 𝑛broj elektrona koji učestvuje u polureakciji (1 za [Fe(CN)6]4−), 𝜈brzina skeniranja (0,5 V/s) i 𝑐koncentracija [Fe(CN)6]4−jona u mol/cm3. U praksi, Randles-Ševičkova jednačina najčešće se koristi u eksperimentima gde se uzorak meri u seriji različitih brzina skeniranja. To se radi kako bi se generisao takozvani Randles-Ševičkov grafik, koji prikazuje zavisnost maksimalne struje redoks reakcije od kvadratnog korena brzine skeniranja. Iz Randles-Ševičkovog grafika može se proceniti reverzibilnost redoks reakcije. Naime, da bi redoks reakcija bila potpuno 50 3.3. Tehnologija izrade elektroda na bazi zlatnih listića realizovati sa veoma malom rezolucijom i uskim razmakom između elektroda. 3.3 Tehnologija izrade elektroda na bazi zlatnih listića Zlatni listići, korišćeni za izradu elektroda, koriste se u različitim oblastima, uključujući slikarstvo, ukrašavanje umetničkih dela, ikona, nameštaja, arhitektonskih elemenata, a u novije vreme i kao jestiva dekoracija hrane. Proces proizvodnje zlatnih listića podrazumeva topljenje i oblikovanje zlatne smese koja se potom izvlači kroz valjke i stanjuje sve dok se ne stvori veoma tanak film. Potom se pomenuti listići seku na male kvadrate koji se utiskuju u potporni papir omogućavajući njihovo pakovanje i korišćenje. Najčešće se koristi 24-karatno zlato jer ima najveći udeo zlata u materijalu i može se postići debljina listića od svega par mikrona [151]. Opisani zlatni listići iskorišćeni su za izradu elektroda kombinovanjem procesa laminacije i laserske ablacije zlata. Potencijal ovako izrađenih elektroda ispitan je za različite primene u biosenzorskoj detekciji bakterija i tumor biomarkera pomoću imobilizovanih antitela na površini zlata, o čemu će biti više reči u nastavku. U okviru doktorske disertacije razvijena je nova tehnologija izrade elektroda na bazi zlatnih listića sa mogućnošču realizacije različitih planarnih i 3D konfiguracija senzora. Predložena tehnologija omogućava brzu izradu velikog broja elektroda i primene u velikom broju oblasti, sa prednostima u pogledu jednostavnosti izrade, niske cene i visoke osetljivosti detekcije. Šematskiprikazpostupkaizradeelektrodapredstavljenjenaslici3.5a.Predložene zlatne elektrode napravljene su kao višeslojna struktura od potpornog (neprovodnog) sloja, na koji se nanose slojevi zlatnih listića dimenzija 80 mm ×80 mm (Pozlata Dimitrijević, Srbija). Potporni sloj za zlatne listiće sastoji se od četiri sloja polivinil hlorid (PVC) folija (ImageLast A4 125 Micron Laminating Pouch), debljine 125 𝜇m. PVC folije sadrže lepak koji se u procesu laminacije, pod dejstvom toplote, oslobađa i lepi za naredni sloj. Pre laminacije, na PVC podlogu nanosi se izolacioni sloj od politetrafluoretilen (PTFE, Wurth, Srbija) spreja koji čini površinu hidrofobnom. Ovaj korak izvršen je kako bi se sprečilo razlivanje kapi tečnih uzoraka tokom merenja. Konačno, na površinu PVC podloge nanosi se zlato toplom laminacijom na 180 °C (LaminatorPDA3330C,PINGDA,Kina)dvalistićazlata,jednogzadrugim,kojiseusled oslobađanja lepka sa PVC folije lepi na površinu PVC podloge. Slika 3.5b predstavlja laminirane zlatne listiće na PVC podlogu, na kom se zatim laserskom ablacijom dobija serija od 18 elektroda, slika 3.5c. Nakon procesa laminacije zlatnih listića i PVC podloge, dizajn elektroda izrađen je laserskom ablacijom korišćenjem Nd:YAG lasera (Power Line D-100, Rofin-Sinar, Nemačka). Laser u procesu ablacije formira mrežu gusto zbijenih linija, koje se me57 3.4. Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića đusobno preklapaju 80%, i prolazeći po zadatom dizajnu vrši uklanjanje materijala, odnosno ablaciju zlata. Za pomenuti proces laser je korišćen u engl. hatch režimu rada sa parametrima struje 26,2 A, učestalosti 65 kHz, i brzinom kretanja snopa od 500 mm/s.Ablacijomzlatarealizujesedizajnelektrode prethodnonacrtanuCADsoftveru. U okviru rezultata istraživanja biće predstavljeni dizajnovi planarnih dvoelektrodnih i troelektrodnih elektroda na bazi zlatnih listića, kao i 3D troelektrodni sistem. Slika 3.5: (a) Šematski prikaz koraka izrade elektroda na bazi zlatnih listića; (b) Zlatni listići laminirani na PVC podlogu pre laserske ablacije; (c) Zlatni listići laminirani na PVC podlogu posle laserske ablacije. 3.4 Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića Karakterizacija predloženih elektrona na bazi zlatnih listića urađena je pomoću tehnika skenirajuće elektronske mikroskopije, energetske disperzivne spektroskopije i optičke profilometrije u cilju vizualizacije površine i određivanja njenog elementarnog sastava. 58 3.4. Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića 3.4.1 Skenirajuća elektronska mikroskopija i energetska disperzivna spektroskopija Da bi se omogućilo posmatranje objekata na nanoskali, potrebno je prevazići ograničenja optičke mikroskopije usled talasne dužine fotona u vidljivom spektru. Iz tog razloga skenirajući elektronski mikroskop koristi talasnu dužinu snopa elektrona kojima se bombarduje uzorak da bi se omogućilo posmatranje objekata na mikro i nanoskali. Pored mogućnosti posmatranja uzoraka na mikro i nanoskali, skenirajući elektronski mikroskopi često imaju dodatne mogućnosti za kvalitativno i kvantitativno određivanje sastava uzoraka. Određivanje elementarnog sastava uzorka vrši se tehnikom energetske disperzivne spektroskopije (EDS). Kod ove tehnike meri se energija X zraka koji su nastali interakcijom električnog snopa i atoma ispitivanog materijala. Na osnovu energije X zraka može se zaključiti o kom se elementu radi (kvalitativna analiza), a na osnovu broja pristiglih fotona jedne iste energije određuje se koliko detektovanog elementa ima (kvantitativna analiza). Kao izlazna informacija dobija se EDS spektar koji predstavlja broj X zraka detektovanih na određenoj energiji. U cilju vizualizacije površine realizovanih elektroda na bazi zlatnih listića i procene udela elemenata u sastavu elektroda, odrađena je karakterizacija elektroda primenom skenirajuće elektronske mikroskopije i energetske disperzivne spektroskopije. Primenom pomenute dve tehnike ispitan je uticaj broja slojeva zlatnih listića nanetih na PVC podlogu na hrapavost površine i sadržaj elemenata. Za opisane eksperimente korišćen je skenirajući elektronski mikroskop (SEM, Hitachi TM3030, Japan). Slike 3.6a i b prikazuju slike skenirajućeg elektronskog mikroskopa snimljene sa jednim i dva sloja zlatnih listića na PVC podlogu, respektivno. Kao što je opisano u poglavlju 3.3, pri laminaciji se oslobađa lepak na PVC foliji i omogućava lepljenje zlatnog listića na površinu PVC podloge. Lepak prodire kroz tanak i porozan sloj jednog sloja zlatnog listića što se vidi kao tačkaste izbočine na slici 3.6a. Na ovim mestima omogućava se vezivanje dodatnog sloja zlatnog lista, povećavajući na taj način hrapavost površine, a samim tim i osetljivost elektrode. S druge strane, slika 3.6b prikazuje površinu elektrode sa dva zlatna listića na kojoj nema tragova lepka. Pretpostavka o lepljenju zlata na lepak koji prodire kroz pore jednog sloja zlatnih listića potvrđena je kroz EDS rezultate, gde su predstavljeni EDS spektri za jedan i dva sloja zlatnih listića, slika 3.7a i b, respektivno. Naime, oba spektra sadrže pikove koji potiču od M𝛼(2,123 keV) i L𝛼(9,713 keV) zlata, kao i K𝛼liniju ugljenika (0,277 keV), dok je K𝛼linija kiseonika (0,525 keV) detektovana samo kod uzorka sa jednim slojem zlatnih listića [152]. Na grafiku 3.7c predstavljeni su grafički i tabelarno rezultati elementarnog sastava uzoraka, gde je detektovan veći sadržaj ugljenika i kiseonika (koji 59 3.4. Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića Slika 3.6: SEM analiza površine elektroda na bazi zlatnih listića; (a) Jedan sloj zlatnih listića na PVC podlozi; (b) Dva sloja zlatnih listića na PVC podlozi. potiču najverovatnije od lepka PVC folije). Skenirajuća elektronska mikroskopija i energetska disperzivna spektroskopija pomogle su u procesu optimizacije izrade elektroda na bazi zlatnih listića, s potvrdom njihovog sastava i hrapavosti površine. Dodatna vizualizacija površine elektroda urađena je optičkom profilometrijom. 3.4.2 Optička profilometrija Optička profilometrija je sofisticirana tehnika za karakterizaciju površine materijala sa visokom preciznošću i rezolucijom. Ova tehnika omogućava neinvazivno merenje topografskih karakteristika površine putem analize interferencije svetlosnih talasa. Glavni princip optičke profilometrije leži u poređenju faznih razlika između referentnog i reflektovanog svetlosnog zraka koji je prošao kroz interakciju sa površinom. Analizom ovih interferograma, moguće je rekonstruisati visinske profile površine sa velikom tačnošću. Optička profilometrija je posebno korisna za merenje mikrostrukturnih karakteristika, kao što su hrapavost, reljef i visinske promene. U cilju procene hrapavosti elektroda sa dva sloja zlatnih listića odrađena je karakterizacija optičkom profilometrijom. U tu svrhu korišćen je optički profilometar (Huvitz Panasis, Južna Koreja). Slika 3.8a prikazuje površinu zlatnih elektroda gde se vidi hrapav reljef i velika efektivna površina, a dodatnu potvrdu hrapavosti reljefa daje 3D slika prikazana na slici 3.8b, u rasponu od nekoliko desetina mikrona, kao rezultat dodatnog sloja zlata. Prikazani rezultati potvrđuju veliku hrapavost i efektivnu površinu elektrode, stvarajući na taj način veći broj centara za interakciju u senzorskim i biosenzorskim 60 3.4. Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića Slika 3.7: (a) Rezultati EDS analize elektrode sa jednim slojem zlatnih listića; (b) Rezultati EDS analize elektrode sa dva sloja zlatnih listića; (c) Maseni udeo elemenata za elektrode sa jednim i dva sloja zlatnih listića. primenama. U narednom poglavlju tehnologija izrade elektrode na bazi zlatnih listića iskorišćena je za realizaciju planarnih dvoelektrodnih i troelektrodnih sistema, zajedno sa 3D sistemom, gde je troelektrodni sistem integrisan unutar mikrofluidične platforme. 3.4.3 Planarni dvoelektrodni sistem na bazi zlatnih listića Inicijalni dizajn elektroda na bazi zlatnih listića ispitan je za dvoelektrodni sistem sa radnom elektrodom poluprečnika 2,5 mm. Rastojanje između kontakata dizajnirano je da iznosi 2,54 mm, što odgovara standardnim elektronskim komponentama. Dimenzije izrađene radne i pomoćne elektrode prikazane su na slici 3.9a. Ovaj dizajn omogućava elektrohemijsku detekciju korišćenjem male zapremine uzorka sa zapreminom kapi 80 𝜇L. Merenja cikličnom voltametrijom predstavljenog dvoelektrodnog sistema urađena su pomoću Ag/AgCl eksterne referentne elektrode (CHI 111 Ag/AgCl, 3 M KCl, CH Instruments, USA) uronjene u kap na površini elektrode, slika 3.9b. Držač elektrode sa pinovima na rastojanju 2,54 mm korišćen je za povezivanje radne i pomoćne elektrode sa potenciostatom. Senzor se u držač ubacuje kao USB, a eksterna Ag/AgCl referentna elektroda povezana je spoljnim kablom i uronjena u kap na površini elektrode. Merenja elektrohemijske impedansne spektroskopije vršena su u dvoelektrodnom 61 3.4. Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića Slika 3.8: (a) Površina zlatnih elektroda snimljena optičkim profilometrom; (b) 3D prikaz elektroda snimljen pomoću optičkog profilometra. sistemu tako da se pomoćna i referentna elektroda povezuju na isti potencijal, slika 3.9c. Postavka eksperimenta predstavljena je na slici 3.9d. Potenciostat Palmsens4 (Potenciostat/Galvanostat/Analizator impedanse, PalmSens BV, Netherlands), povezan je na računar programom PCTrace 5.8, a držač za elektrode povezan na potenciostat. Ciklična voltametrija (CV) sumporne kiseline urađena je radi karakterizacije kristalnosti i utvrđivanja sastava elektrode. Kao što je rečeno, karakterizacijom površine elektrode pomoću ciklične voltametrije dobijaju se karakteristični pikovi oksidacije i redukcije metala, što ujedno predstavlja i njegov prepoznatljivi izgled voltamograma. Slika 3.10a prikazuje oksidacioni pik na +1,3 V (u odnosu na Ag/AgCl referentnu elektrodu) i redukcioni pik na +0,80 V (u odnosu na Ag/AgCl referentnu elektrodu), što odgovara karakterističnom voltamogramu zlatnih elektroda, bez dodatnih pikova koji bi ukazivali na prisustvo nečistoća na površini elektrode. Elektroda je zatim okarakterisana po pitanju stabilnosti i reproducibilnosti izrade, što su važni faktori kod samostalno napravljenih materijala i uređaja. Stabilnost signala elektrode ispitana je korišćenjem redoks probe 10 mM kalijum fero/fericijanida (K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]) u PBS puferu. Prikazani voltamogram na slici 3.10b prikazuje Fe2+/Fe3+redoks reakciju sa jasno definisanim pikovima oksidacije i redukcije. Intenzitet pikova prikazuje jednake vrednosti tokom 25 snimanja što pokazuje dobru stabilnost signala realizovanih elektroda. Elektrohemijska impedansna spektroskopija (EIS) korišćena je za prikazivanje ponovljivosti izrađenih elektroda u rastvoru Fe2+/Fe3+, slika 3.10c. Impedansni spektri sastoje se od polukružnog dela čiji je prečnik izračunat kao otpor prenosu naelektrisanja(engl.chargetransferresistanceRct)ilinearnogdelakojipredstavljaproces kontrolisan difuzijom. Izuzetna ponovljivost dobijena je koristeći pet različitih elektroda, sa ponovljivim odzivom niske varijabilnosti, posebno u polukružnom delu spektra, slike 3.10c i 3.10d. 62 3.5. Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića Slika 3.9: (a) Dimenzije planarnog dvoelektrodnog sistema na bazi zlatnih listića; Dimenzije na slici predstavljene su u mm; (b) Postavka eksperimenta sa eksternom Ag/AgCl referentnom elektrode; (c) Postavka eksperimenta za dvoelektrodni sistem; (d) Postavka eksperimenta. ElektrodesuzatimokarakterisaneCVmetodomkoristećikalijumfero/fericijanidni redoks probu u PBS puferu za različite brzine skeniranja. Kao što je prikazano na slici 3.11a,struja sepovećava sa povećanjem brzine skeniranja. Intenzitet oba pika oksidacije anjona i redukcije katjona redoks probe u odnosu na kvadratni koren brzine skeniranja pokazuju linearan odnos, slika 3.11b. Linearnost ukazuje na to da je difuzija kontrolisala oksidaciju/redukciju jona na površini elektrode, dok simetričnost faradejskih pikova ukazuje reverzibilnost redoks para. Konačno, procenjena je zavisnost signala impedanse kalijum fero/fericijanida od njegove koncentracije u PBS puferu, slika 3.11c. Linearni opseg modula impedanse primećen je na učestalostima 1 Hz i 100 kHz za koncentracije redoks probe u rasponu od 0,001 mM do 0,1 mM i 0,1 mM do 10 mM, respektivno, slika 3.11d. Rezultati pokazuju da elektroda omogućava pouzdanu i osetljivu detekciju impedanse kalijum fero/fericijanid sa učestalostima u opsegu od 1 Hz do 100 kHz. Potencijal ovako okarakterisanih elektroda na bazi zlatnih listića ispitan je za detekciju E. coli iS. Typhimurium, kao i tumor biomarkera HER2. 3.5 Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića U sektorima zdravstva i poljoprivrede, E. coli nije samo član najrelevantnijih patogena koji se prenose hranom i vodom, već je i glavni rezervoar gena otpornosti na 63 3.5. Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića Slika 3.10: Karakterizacija elektroda na bazi zlatnih listića; (a) CV u 0,5 M sumpornoj kiselini za brzinu skeniranja od 0,5 V/s; (b) CV u 10 mM kalijum fero/fericijanida u PBS puferu tokom 25 ciklusa; (c) Nikvistov dijagram za 10 mM fero/fericijanida u PBS puferu za 5 različitih elektroda; (d) Procena ponovljivosti izrade elektroda pomoću parametra otpora prenosu naelektrisanja. antibiotike. Sojevi E. coli pretežno su bezopasni komensali u gastrointestinalnom traktu sisara i ptica i mogu boraviti, nezavisno od domaćina, u vodi, zemljištu i sedimentima. Kada se prilagodi vancrevnim nišama kod ljudi, E. coli može da izazove bolesti koje značajno opterećuju zdravstvene sisteme na globalnom nivou, kao što su infekcije urinarnog trakta, pijelonefritis, sepsa i meningitis [153]. Pored toga, E. coli je fekalna indikatorska bakterija u ispitivanju kvaliteta vode u životnoj sredini [154] i važan indikator u proceni bezbednosti hrane [155]. U literaturi su predloženi različiti biosenzori zasnovani na antitelima za otkrivanje E. coli u cilju brze dijagnostike i poboljšanja mera zdravstvene zaštite [156–161]. Većina njih zasniva se na korišćenju komercijalnih sitoštampanih elektroda na bazi zlata i ugljenika. Iako postoji veliki broj rešenja u literaturi njihova komercijalna primena još nije zaživela najviše zbog skupih tehnologija izrade, loše ponovljivosti izrade, nestabilnih signala itd. 64 3.5. Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića Slika 3.11: (a) CV u 10 mM fero/fericijanidu u PBS puferu za brzine skeniranja u opsegu 0,1 do 1 V/s; (b) Zavisnost pikova oksidacije i redukcije 10 mM fero/fericijanida u PBS puferu od korena brzine skeniranja; (c) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije fero/fericijanida u PBS puferu; (d) Modul impedanse na 1 Hz i 100 kHz za različite koncentracije fero/fericijanida u PBS puferu u opsegu 0,001 mM - 0,1 mM i 0,1 mM - 10 mM, respektivno. 3.5.1 Funkcionalizacija elektroda za detekciju E. coli Elektrode na bazi zlatnih listića funkcionalizovane su sa specifičnim antitelom koje prepoznaje celu ćeliju E. coli kako bi se omogućilo otkrivanje bakterija bez preliminarnelizećelija,slika3.12.Predloženibiosenzorrealizovanjevišestrukiminkubacijama kapi na radnoj elektrodi. Samoorganizujući monosloj12 merkaptopropionične kiseline (3-Merkaptopropionična kiselina, Sigma Aldrich) formiran je tokom inkubacije preko noćina4°Cod1𝜇L10mM MPApripremljeneuetanolu.Merkaptopropioničnakiselina (MPA13) sadržitiolnu grupu sa jakim afinitetomza vezivanje za površinu zlata i karboksilnu grupu na drugom kraju lanca, koja omogućava vezivanje amino grupe antitela. 12engl. self-assembled monolayer 13engl. Mercaptopropionic acid 65 3.5. Biosenzor za detekciju E. coli na bazi zlatnih listića Aktivacija karboksilnih grupa MPA urađena je kroz 1 h inkubacije 10 𝜇L kapi 50 mM Nhidroksi sukcinimida (NHS, Sigma Aldrich)/50 mM N-(3-dimetilaminopropil)-N-etil karbodiimid hidrohlorida (EDC, Sigma Aldrich) pripremljenih u PBS puferu. Nakon toga, 1 h inkubacije antitela (ab137967, Abcam, SAD) omogućava kovalentno vezivanje na površini zlata i konačno, u cilju sprečavanja nespecifičnog vezivanja, 50 𝜇g/mL goveđeg serumskog albumina - BSA14 (Sigma Aldrich) inkubiran je 20 minuta na sobnoj temperaturi. Svaki korak funkcionalizacije okarakterisan je putem impedansne spektroskopije, prikazanog u odeljku sa rezultatima. Slika 3.12: Šematski prikaz slojeva funkcionalizacije površine zlatne radne elektrode za specifičnu detekciju E. coli. Dabiseprocenilaefikasnostfunkcionalizacije,izvršenajeSEMvizualizacijapovršine elektrode pre i posle imobilizacije i blokiranja antitela, slika 3.13b. SEM slika zlata pokazala je površinu svetlije boje u poređenju sa bojom funkcionalizovane elektrode što ukazuje da su biološki molekuli sa slabim naelektrisanjem imobilisani. SEM slike za modifikovane elektrode pokazale su nasumičnu distribuciju tamnih mrlja kada se posmatra u režimu sekundarnih elektrona rasejanih unazad koji odgovaraju organskim molekulima vezanim za površinu zlata, slika 3.13a i 3.13b. Potvrda formiranja MPA monosloja na površini zlata prikazana je merenjem kontaktnog ugla (Kruss Scientific, Nemačka). Inicijalno merenje kontaktnog ugla urađeno je na očišćenoj elektrodi, a nakon potapanja u etanolni rastvor MPA, elektrode su ponovo okarakterisane merenjem kontaktnog ugla sa vodom. Slike 3.13c i d pokazuju da se početne vrednosti kontaktnog ugla kapi vode smanjuje sa 70,7(4)°na 53,53(27)° nakon nanošenja MPA na površinu. Ove vrednosti ukazuju na povećanje hidrofilnosti površine nakon nanošenja monosloja MPA. 14engl. Bovine Serum Albumin 66 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića koraka pokazuje uspešnu modifikaciju površine elektrode, potvrđujući povećanu hidrofilnost i vezivanje bioloških molekula. Elektrohemijska detekcija E. coli uspešno je izvedena, sa veoma niskim limitom detekcije od 2 cfu/mL. Osetljivost ovog senzora je veoma niska, što ga čini veoma korisnim alatom za rano otkrivanje bakterijskih infekcija. Takođe, senzor je pokazao visoku specifičnost za E. coli, bez značajnog odgovora na druge bakterije koje su testirane. Predstavljeni rezultati pokazuju da predloženi elektrohemijski senzor može da pruži brzu i pouzdanu detekciju E. coli, što je od suštinskog značaja za bezbednost hrane i kontrolu zaraznih bolesti. Predložena tehnologija može imati široku primenu u različitim industrijama doprinoseći poboljšanju zdravstvene zaštite i kvaliteta životne sredine. 3.6 Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Salmonela se ističe kao visoko prepoznat patogen odgovoran za pojavu brojnih bolesti koje se prenose hranom [173, 174]. Podatak Svetske zdravstvena organizacije govori da je salmonela odgovorna za 58 incidenata u vezi sa bezbednošću hrane u 86 država [175]. Godišnji broj slučajeva salmoneloze u Evropskoj Uniji u 2021. iznosio je 60.050, sa 773 epidemija izazvanih hranom i 11.785 slučajeva hospitalizacije [176]. Infektivna doza salmonele potrebna za izazivanje bolesti koje se prenose hranom, koju treba da unese generalno zdrava osoba, relativno je visoka i procenjuje se na 105cfu/g [177], ali taj prag je znatno niži u slučaju osetljive populacije (mladi, stari, trudnice,itd.).Salmonelozasetradicionalnovezujezakonzumiranjehraneživotinjskog porekla, konzumiranje mesa, mleka, jaja itd., a poslednjih godina javlja se porast i kontaminiranog voća i povrća [178, 179]. Salmonella Typhimurium (S. Typhimurium) najveći je izazivač bolesti među svim infekcijamauzrokovanim Salmonelom.Ovajsojpoznatje poizazivanju bolničkihinfekcija i teških slučajeva trovanja hranom, često dovodeći do komplikacija koje ugrožavaju život i visoke stope smrtnosti. Konvencionalne metode detekcije za S. Typhimurium uključuju kultivisanje na agar pločama [180], enzimske imunološke test (ELISA) [181] i primenu polimerazne lančane reakcije (PCR) [182]. Iako se ove tehnike smatraju zlatnim standardima ili preporučenim metodama detekcije, postoji rastuća potreba za razvojem praktičnijih i preciznijih metoda ispitivanja koje mogu zadovoljiti potražnju za jeftinim testiranjem na terenu. Elektrode na bazi zlatnih listića iskorišćene su za realizaciju biosenzora za S. Typhimurium, imobilizacijom antitela na površinu radne elektrode. Elektrohemijska karakterizacija urađena je nakon svakog koraka funkcionalizacije, a merenje kontaktnog 73 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Slika 3.17: Šematski prikaz funkcionalizacije površine zlata za detekciju salmonele. ugla iskorišćeno kao dodatna potvrda formiranog monosloja na elektrodi. Specifičnost detekcije ispitana je sa infektivnom dozom bakterija B. subtilis iS. enteritidis, a granična vrednost detekcije eksperimentalno određena. 3.6.1 Funkcionalizacija elektroda za detekciju S. Typhimurium BiosenzorzadetekcijuS.Typhimuriumrealizovanjeanalognokaoprethodnoopisani biosenzor za E. coli, samo što je umesto MPA korišćena 11-merkaptoundekanoična kiselina (MUA). MUA se koristi kao samoorganizujući monosloj koji ima dugačak alkanskilanac,kojise s jednestranezavršava satiolom,asa druge strane sakarboksilnom grupom. Ukratko, tiol sa jedne strane MUA lanca se vezuje za zlato, dok drugi kraj ostaje slobodan za vezivanje antitela. Aktivacija karboksilnih grupa vrši se NHS/EDC hemijom, a vezivanje antitela je omogućeno kroz vezivanje amino veze antitela za karboksilnu grupu, slika 3.17. U cilju sprečavanja nespecifičnog vezivanja za površinu elektrode, BSA protein je nanesen kao poslednji sloj funkcionalizacije pre nanošenja bakterija. 3.6.2 Karakterizacija koraka funkcionalizacije U cilju utvrđivanja formiranja samoorganizujućeg monosloja na površini radne elektrode, odrađena su merenja kontaktnog ugla u cilju procene hidrofilnosti površine. Naime, kontaktni ugao je prvo izmeren za očišćenu, nefunkcionalizovanu elektrodu, a zatim nakon prekonočne inkubacije na 4 °C 10 mM MUA u etanolu. Kontaktni ugao kapi vode na površini zlata i nakon formiranja samoorganizujućeg monosloja opao je 74 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Slika 3.18: Karakterizacije površine radne elektrode merenjem kontaktnog ugla pre i nakon nanošenja merkaptoundekanoične kiseline. (a) Zlato; (b) Zlato sa merkaptoundekanoičnom kiselinom. sa 70,7(4)°na 9,6(4)°. Ovaj rezultat potvrđuje formiranje monosloja MUA i pokazuje povećana hidrofilna svojstva MUA, slika 3.18. Model ekvivalentnog električnog kola korišćen je za kvantifikaciju procesa funkcionalizacije kroz poređenje Rct parametra posle MUA, imobilizacije antitela (Ab) i BSA koraka, slika 3.19a. Predloženo ekvivalentno električno kolo konstruisano je na osnovu oblika krive u Nikvistovom dijagramu izmerene impedanse. Naime, kao što je prethodno opisano u poglavlju 3.1.4, proces difuzije jona do površine elektrode opisuje se Varburgovim elementom u kolu. Sloj MUA, stvara kapacitivan sloj na površini elektrode i zbog toga velika vrednost imaginarnog dela dominira u ukupnoj impedansi i na Nikvistovom dijagramu. Pri manjim učestalostima oblik grafika počinje da poprima oblik polukruga, međutim, nedovoljno da bi polukrug bio vidljiv, slika 3.19c. Iz tog razloga, predstavljeno kolo za fitovanje rezultata ne sadrži Varburgov element jer je njegov doprinos vidljiv na niskim učestalostima, koje su u ovom slučaju zamaskirane velikom kapacitivnošću MUA sloja. Elektrohemijska karakterizacija slojeva odrađena je nakon svakog sloja funkcionalizacije sa 10 mM kalijum fero/fericijanidom, slika 3.19b. Rezultati otpora prenosu naelektrisanja pokazuju rastući trend Rct koji dokazuje formiranje MUA, Ab i BSA slojeva na površini zlata, respektivno. 3.6.3 Elektrohemijska detekcija S. Typhimurium Prethodno opisani biosenzor testiran je sa S. Typhimurium i dve nespecifične bakterije, gram-negativnu S. enteritidis i gram-pozitivnu B. subtilis. Detekcija S. Typhimurium testirana je serijom bakterijskih razblaženja u opsegu 101-107cfu/mL, dok su testovi specifičnosti rađeni sa infektivnom koncentracijom S. enteritidis iB. subtilis, 75 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Slika 3.19: (a) Ekvivalentno kolo korišćeno za fitovanje rezultata; (b) Otpor prenosu naelektrisanja za različite korake funkcionalizacije; (c) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije bakterija; (d) Otpor prenosu naelektrisanja u funkciji različitih koncentracije salmonele. 103cfu/mL. Svaka koncentracija bakterija inkubirana je 20 minuta, a zatim isprana MiliQ vodom. EIS karakterizacija urađena je sa kapi redoks para 10 mM kalijum fero/fericijanida od 80 𝜇L. Svako merenje ponovljeno je sa novom kapi redoks para tri puta i izračunate srednja vrednost i standardna devijacija. Konačno,rezultatiimpedansezarazličitekoncentracijeS.Typhimuriumasupredstavljeni na slici 3.19c. Rezultati pokazuju visoke vrednosti impedanse i Rct u opsegu od nekoliko stotina kOhma. Senzor je ispitan sa koncentracijom bakterija do 107cfu/mL, pokazujući širok dinamički opseg detekcije bez indikacija o zasićenju na površini. Kalibracionakriva predstavljena je kroz Rct uodnosunakoncentracijubakterija, slika 3.19d, sa rastućom količinom ćelija S. Typhimurium, prikazujući linearni trend sa jednačinom 𝑦=70,891𝑥+146,29,iR2vrednošću od 0,9276. Isti pristup korišćen je za ispitivanje specifičnosti detekcije za B. subtilis iS. enteritidis. Zbog male razlike između Rct parametra između različitih elektroda, relativna promena Rct u odnosu na BSA funkcionalizovanu GLE, 𝛿(izračunato u %), upoređena je za različite koncentracije specifičnih i nespecifičnih bakterija, slika 3.20. Rezultati pokazuju da je predloženi biosenzor eksperimentalno detektovao koncentraciju 102 cfu/mL S. Typhimurium, što je manje od infektivne doze ove bakterije. 76 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Slika 3.20: Specifičnost detekcije biosenzora. 3.6.4 Diskusija i zaključak U tabeli 3.4 predstavljene su metode detekcije na bazi razvijenih biosenzora, njihovi dinamički opsezi i limiti detekcije za S. Typhimurium. Inovativni pristupi realizovani su u prethodnim istraživanjima za detekciju bakterija. Naime, novija istraživanja predlažu polimerne filmove sa kalupom utisnutih bakterija u filmu za selektivnu detekciju bakterija [183]. Elektrohemijsko utiskivanje pojedinačnih ćelija S. Typhimurium sprovedeno je formiranjem homogenog polimernog sloja na površini elektrode. Uklanjanje utisnutih bakterijskih ćelija iz ovog polimernog matriksa stvara specifičan kalup za vezivanje bakterija, koji se koristi za njihovo specifično prepoznavanje (ponovno vezivanje). Cikličnom voltametrijom urađena je kvantifikacija vezanih mesta bakterija i na ovaj način ostvaren je širok dinamički opseg detekcije i dobar limit detekcije od 47 cfu/mL. Druge metode za detekciju S. Typhimurium, predlažu pojačanje elektrohemijskog signala pomoću ferocena, čiji se atom gvožđa reverzibilno može oksidovati i redukovati. Elektrohemijski biosenzor zasnovan na ferocenu (Fc)-funkcionalizovanim nanokompozitima konstruisanim za pojačanje elektrohemijskog signala za detekciju S. Typhimurium. Magnetne čestice u kombinaciji sa antitelom korišćene su za hvatanje ciljanih bakterija, a ferocen korišćen kao signalni marker pri testiranju. Ovaj biosenzor pokazao je nisku granicu detekcije od 3 cfu/mL i širok dinamički opseg detekcije [184]. Razvijeni su i elektrohemijski biosenzori koji koriste magnetnu separaciju bakterija detektovanih magnetnim nanočesticama sa antitelima. Oba pristupa koriste sličan princip obeležavanja bakterija sekundarnim antitelima sa enzimom. Impedansni biosenzor kombinuje magnetne nanočestice sa antitelima i njihovo obeležavanje sekundarnim antitelima sa enzimom, postižući širok dinamički opseg detekcije S. Typhimurium sa niskim limitom detekcije od 101cfu/mL [185]. Slično, elektrohemijski biosenzor koristi zlatne nanočestice dispergovane u hitozanskom hidrogelu i sekundarno antitelo sa 77 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića enzimom kao marker za označavanje bakterija i detekciju signala diferencijalne pulsne voltametrije koji potiče od enzima. Ovaj senzor takođe ostvaruje širok linearni opseg sa niskom granicom detekcije od 5 cfu/mL [186]. Sličan princip obeležavanja bakterija sekundarnim antitelom koristi se i za detekciju na ugljeničnoj elektrodi modifikovanoj magnetnim nanočesticama, gde se sekundarno antitelo sa zlatnim nanočesticama detektuje diferencijalnom pulsnom voltametrijom [187]. Pored antitela, često se u literaturi pojavljuju i aptameri kao bioprepoznatljivi elementi. Aptameri predstavljaju oligonukleotide, sintetisane za specifičnu detekciju željene bakterije. Biosenzor na bazi ugljeničnih elektroda modifikovanim zlatom i nanoporoznim zlatom pokazao se pogodnim za detekciju S. Typhimurium u širokom opsegu od 6,5×102do 6,5×108cfu/mL, sa granicom detekcije od 1 cfu/mL [188]. Pomenute modifikacije značajno utiču na povećanje specifične površine senzora, a samim tim i na dobre performanse detekcije. Još jedna od direktnih metoda detekcije pomoću aptamera omogućena je konjugacijom aptamera i kopolimera na površini elektrode [189]. Ovaj pristup pokazao je dobar dinamički opseg i limit detekcije. U poređenju sa prethodno opisanim biosenzorima, predloženi biosenzor na bazi zlatnih listića za detekciju S. Typhimurium ima velik dinamički opseg detekcije i u tom pogledu je jednako dobar kao i senzori predstavljeni u tabeli 3.4, dok mu je limit detekcije nešto lošiji u poređenju sa drugim senzorima. Međutim, predloženo rešenje predstavlja direktan metod detekcije bakterija i prevazilazi sve opisane senzore u pogledu jednostavnosti i cene izrade. Iako je limit detekcije nešto manji od prethodno opisanih senzora, on je i dalje značajno niži od doze bakterija koja može da izazove infekciju. Konačno, predloženi biosenzori na bazi zlatnih listića predstavljaju perspektivnu opciju za ekonomičnu i brzu izradu senzora za detekciju bakterija, uključujući E. coli iS. Typhimurium, s veoma širokim dinamičkim opsegom detekcije i niskim limitom detekcije koji su daleko ispod infektivnih doza. Rezultati istraživanja pokazuju odličnu linearnost i visoku specifičnost u detekciji i kao dodatna prednost, realizovani biosenzori pokazuju performanse koje su jednake ili bolje od biosenzora baziranih na naprednim nanomaterijalima. Na ovaj način postignute su bolje ili jednako dobre performanse, pri čemu su izbegnuti kompleksni proizvodni procesi i visoki troškovi. 78 3.6. Biosenzor za detekciju S. Typhimurium na bazi zlatnih listića Tabela 3.2: Metode detekcije, dinamički opsezi i limit detekcije S. Typhimurium iz prethodnih istraživanja Metod detekcije Materijal Dinamički opseg (cfu/mL) LD (cfu/mL) Ref. Ciklična voltametrija Zlatne sito-štampane elektrode sa kalupnim polimerom za detekciju bakterija 102-10947 [183] Ciklična voltametrija/Diferencijalna pulsna voltametrija Sito-štampane ugljenične elektrode sa nanokompozitom ferocena 101-1073 [184] Impedansa Magnetna separacija magnetnih nanočestica sa antitelima 101-10610 [185] Diferencijalna pulsna voltametrija Ugljenična elektroda modifikovana hidrogelom sa zlatnim nanočesticama 101-1055 [186] Diferencijalna pulsna voltametrija Ugljenična elektroda sa magnetnim česticama 103-106143 [187] Ciklična voltametrija/Impedansa Ugljenične elektrode sa elektrodeponovanim zlatom i nanoporoznim zlatom 6,5×1026,5×1061 [188] Impedansa Sito-štampane zlatne elektrode modifikovane kopolimerom 102-1083 [189] Impedansa Elektroda na bazi zlatnih listića 102-10771 Rezultati 79 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića 3.7 Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića HER2 je proteinski receptor koji igra ključnu ulogu u regulaciji rasta i deobe ćelija. Kod zdravih osoba, prisustvo ovog receptora je od suštinskog značaja za održavanje zdravog tkiva, ali mutacije koje dovode do prekomerne ekspresije HER2 receptora povezane su sa agresivnim oblicima karcinoma dojke. Koncentracija HER2 tumor biomarkera u krvi zdravih osoba nalazi se u opsegu 4 - 14 ng/mL, dok se kod pacijentkinja sa karcinomom dojke nalazi u opsegu 15 - 75 ng/mL [190]. Ovaj podatak koristi se za dijagnostiku i nadzor pacijentkinja u lečenju. Pacijentkinje se povišenim nivoom HER2 biomarkera ulaze u protokol lečenja sa Herceptinom. Herceptin je monoklonalno antitelo posebno dizajnirano da cilja HER2 receptore na površini tumorskih ćelija i blokira ih od primanja signala rasta. Otkriće ovog biomarkera i razvoj metoda za njegovu detekciju predstavljaju značajan korak ka personalizovanom pristupu u dijagnostici i lečenju pacijentkinja sa ovom bolešću. Istraživanja i detekcija HER2 biomarkera je od višestrukog značaja za pacijentkinje, s obzirom na to da prisustvo HER2 pozitivnog statusa značajno utiče na prognozu i terapijski pristup karcinomu dojke. Pacijentkinje sa HER2 pozitivnim karcinomom dojke često imaju agresivniji oblik bolesti i lošiju prognozu u poređenju sa HER2 negativnim pacijentkinjama. Dakle, rano otkrivanje ovog biomarkera omogućava bržu i ciljanu terapiju. Ovo smanjuje neželjene efekte terapije i povećava šanse za uspešno lečenje. Takođe, istraživanje HER2 biomarkera doprinosi razvoju novih terapijskih agenasa i poboljšava razumevanje molekularnih mehanizama karcinoma dojke [191]. Uokvirudoktorskedisertacijerazvijenjebiosenzornabazizlatnihlistićazadetekciju tumor biomarkera HER2. Naime, inovativan vid imobilizacije antitela na površini zlata, posredstvom proteina L, kao i osetljivost detekcije ispitani su na komercijalnim zlatnim sito-štampanim elektrodama i elektrodama na bazi zlatnih listića. Potvrda vezivanja antigen-antitelo urađena je pomoću fluorescentnog testa, a vezivanje proteina L za samoorganizujući sloj merkaptoundekanoične kiseline na površini zlatne elektrode potvrđen pomoću Raman spektroskopije. Inicijalno, u cilju ispitivanja uticaja geometrije na performanse senzora, urađena je karakterizacija komercijalnih sito-štampanih elektroda, planarnih elektroda na bazi zlatnih listića i elektroda na bazi zlatnih listića integrisanih u mikrofluidičnu komoru, svaka od njih sa radnom elektrodom prečnika 4 mm. Pomenute elektrode upoređene su u pogledu elektroaktivne površine i faktora hrapavosti. U nastavku eksperimenata, urađeno je poređenje performansi detekcije planarnih elektroda na bazi zlatnih listića i elektroda na bazi zlatnih listića integrisanih u mikrofluidičnu komoru u pogledu planarne i neplanarne (trodimenzionalnoj, 3D) postavke elektroda. Konačno, planarne elektrode na bazi zlatnih listića i komercijalne, 80 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića sito-štampane elektrode upoređene su u pogledu osetljivosti detekcije tumor biomarkera HER2, gde su elektrode na bazi zlatnih listića pokazuju veću osetljivost detekcije HER2 tumor biomarkera. Potencijal primene prethodno realizovanog senzora ispitan je za detekciju tumor biomarkera HER2 u ćelijskom medijumu. 3.7.1 Ispitivanje uticaja tehnologije izrade i geometrije na performanse senzora U cilju ispitivanja uticaja tehnologije izrade elektroda i geometrije elektroda na osetljivost detekcije, ispitane su komercijalne planarne zlatne elektrode realizovane sito-štampom (Dropsens 220AT, Metrohm), planarne elektrode na bazi zlatnih listića15 i elektrode na bazi zlatnih listića integrisane u mikrofluidičnu komoru (neplanarni dizajn). Dizajnovi elektroda predstavljeni su na slici 3.21. Slika 3.21a predstavlja komercijalnu Dropsens 220AT elektrodu realizovanu tehnologijom sito-štampe. Dropsens elektroda sadrži radnu i pomoću elektrodu koje su napravljene od zlatne paste, dok je referentna elektroda napravljena od srebro/srebrohloridne (Ag/AgCl) paste. Slika 3.21b predstavlja troelektrodnu planarnu elektrodu na bazi zlatnih listića, gde je troelektrodni sistem realizovan u zlatu. Slika 3.21c predstavlja trodimenzionalni sistem, gde su elektrode na bazi zlatnih listića integrisane sa gornje i donje stanje mikrofluidične komore. Naime, u gornjem sloju, na PVC podlozi, realizovana je radna elektroda, koja zatvara mikrofluidični rezervoar sa gornje strane. U donjem sloju realizovane su referentna i pomoćna elektroda, koje sa donje strane zatvaraju mikrofluidični rezervoar. Uvođenjem zlatne referentne elektrode na bazi zlatnih listića izbegnuto je korišćenje eksterne referentne elektrode. Fotografije realizovane planarane i 3D strukture predstavljene su na slikama 3.21d i e, respektivno. Karakterizacija opisane tri elektrode urađena je u pogledu sastava, efektivne površine i stabilnosti signala kroz eksperimente ciklične voltametrije. Elektrode na bazi zlatnih listića, u planarnoj i 3D konfiguraciji, upoređene su po pitanju osetljivosti za različite koncentracije redoks para kalijum fero/fericijanida pripremljenim u vodi, kalijum hloridu i PBS puferu. 15engl. gold leaf electrode (GLE) 81 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Slika 3.21: (a) Komercijalna sito-štampana elektroda Dropsens 220AT; (b) Planarna elektroda na bazi zlatnih listića; (c) Integrisan sistem elektroda na bazi zlatnih listića u mikrofluidični rezervoar; (d) Realizovani planarni dizajn; (e) Realizovani 3D dizajn. Ciklična voltametrija u 0,5 M sumpornoj kiselini urađena je na komercijalnoj i elektrodama na bazi zlatnih listića u cilju utvrđivanja sastava i karakterizacije površine zlata. Rezultati na slici 3.22a pokazuju da svaka od elektroda pokazuje karakteristične pikove oksidacije i redukcije zlata, na 0,9 V i 0,5 V u odnosu na sito-štampanu Ag/AgCl referentnu elektrodu. Potencijali oksidacije i redukcije zlata kod elektroda na bazi zlatnih listića se razlikuju zbog različitih referentnih elektroda, tj. Ag/AgCl elektrode u slučaju komercijalne elektrode i zlatne referentne elektrode kod elektroda na bazi zlatnih listića. Takođe, oblik voltamograma kod elektroda na bazi zlatnih listića pokazuje uske i oštre pikove, što ukazuje na brzu elektrohemijsku reakciju, dok su pikovi oksidacije i redukcije zlata kod komercijalnih elektroda širi što ukazuje na sporiju reakciju, maseni transport ili difuziju u elektrohemijskoj ćeliji. U cilju ispitivanja efektivne površine komercijalne zlatne sito-štampane elektrode, planarne elektrode na bazi zlatnih listića i integrisanih elektroda u mikrofluidični rezervoar, odrađena je serija eksperimenata sa 10 mM kalijum fero/fericijanidom pripremljenim u PBS puferu. Serija voltamograma napravljena je različitim brzinama skeniranja u opsegu 0,1 V/s - 1 V/s sa korakom 0,1 V/s, slika 3.22b. Svaka od elektroda pokazuje jednake pikove oksidacije i redukcije kompleksa gvožđa i pravilan rast struje oksidacije i redukcije u zavisnosti od brzine skeniranja. Analizom rezultata sa prethodnih grafika, predstavljeni su pikovi oksidacije kompleksa gvožđa u zavisnosti od korena brzine skeniranja, slika 3.22c. Rezultati pokazuju linearan porast struje oksidacije sa korenom brzine skeniranja. Naime, sa porastom brzine skeniranja, veća 82 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića vezivanja pL za površinu. Snimanja su vršena laserom talasne dužine 532 nm u opsegu talasnih brojeva od 100 do 2000 cm−1, snagom 9 mW i 10 snimanja sa vremenom ekspozicije od 20 s. Za snimanje je korišćen Raman Horiba XploRA Plus. U cilju utvrđivanja formiranog samoorganizujućeg monosloja na zlatu potrebno je utvrđivanje veze između tiolne grupe MUA i metala. Ranija istraživanja pokazuju da se -SH grupa vezuje za zlato hemisorpcijom [192, 193]. Pik koji potiče od Au-S veze detektovan je u spektru na 260 cm−1, što je u skladu sa prethodnim objavljenim rezultatima [194–196], slika 3.26a. Za analizu Raman spektra nakon nanošenja pL, odrađena je dekonvolucija pikova u oblasti talasnih brojeva 1200 - 1800 cm−1u cilju detekcije amino grupa proteina L. Sa Ramanovom spektroskopijom, nekoliko vibracionih modova može se koristiti za detekciju i analizu strukture proteina. Sledeća tri pika su od glavnog interesa za identifikaciju različitih potvrda proteinske strukture: amid I (vibracija istezanja C=O u opsegu1600–1690cm−1),amidII (1480–1580 cm−1) i amid III (oba povezanasaspregnutim C–N istezanjem i N–H savijajuće vibracije peptidne grupe 1230–1300 cm−1). Talasni broj amidnih modova odražava strukturu glavnog polipeptidnog lanca bez obzira na bočne grupe [197]. Rezultati predstavljeni na slici 3.26b prikazuju pojavljivanje dva karakteristična pika na 1556 cm−1i na 1756 cm−1nakon nanošenja pL, što odgovara pikovima amid II i amid III veza. Slika 3.26: (a) Raman spektroskopija zlata, zlata sa MUA, zlata sa MUA i proteinom L u opsegu od 100 do 2000 cm−1; (b) Dekonvolucija pikova u u opsegu od 1200 do 1800 cm−1za zlato sa MUA, i nakon nanošenja pL. 89 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Primenom Raman spektroskopije na uzorku zlata naparenog na staklenu podlogu, potvrđeno je postojanje veza između MUA i zlata, kao i imobilizacija pL na površini. Na ovaj način potvrđeno je postojanje veza funkcionalizacije na površini pre same elektrohemijske detekcije. 3.7.5 Elektrohemijska detekcija HER2 U cilju realizacije elektrohemijskog biosenzora za detekciju tumor biomarkera HER2, elektrohemijski je ispitano vezivanje svakog od slojeva funkcionalizacije za površinu radne elektrode, kao što je opisano u poglavlju 3.7.2. Elektrode na bazi zlatnih listića upoređene su sa komercijalnim Dropsens elektrodama u pogledu osetljivosti i dinamičkog opsega detekcije. Rezultati na slici 3.27a i d, predstavljaju rezultate elektrohemijske karakterizacije elektrohemijskom impedansnom spektroskopijom nakon svakog od koraka funkcionalizacije za elektrodu na bazi zlatnih listića (GLE) i komercijalnu Dropsens elektrodu (DS). U cilju dobijanja potpunog polukruga sa difuzionim repom, koncentracija od 1 mM MUA korišćena je u slučaju elektroda na bazi zlatnih listića, dok je u slučaju DS elektroda korišćena koncentracija od 10 mM. U oba slučaja nakon nanošenja samoorganizujućeg sloja MUA, nanosi se 100 𝜇g/mL pL, a zatim i 50 𝜇g/mL BSA pripremljenim u PBS puferu. U oba slučaja, DS i GLE elektrode, pokazuju rast impedanse ukazujući na formiranje svakog od slojeva funkcionalizacije na površini. Dalja procedura funkcionalizacije podrazumeva uzastopne inkubacije rastućih koncentracija Herceptina u opsegu 0,1 ng/mL do 1000 ng/mL, slika 3.27. Sa porastom koncentracije Tmab, raste i broj vezanih antitela za pL na površini elektrode, što se ogleda porastom impedanse. Konačno, ovako funkcionalizovana elektroda izložena je rastućoj koncentraciji tumor biomarkera HER2 u opsegu 0,1 ng/mL do 1000 ng/mL. Rezultati na slici 3.27c i f prikazuju rastući trend impedanse za porast koncentracije HER2, s tim da se u slučaju DS elektroda jasno uočava saturacija za koncentracije iznad 10 ng/mL, dok se kod elektroda na bazi zlatnih listića ne uočava saturacija ni za koncentraciju 1000 ng/mL. 90 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Slika 3.27: (a) Koraci funkcionalizacije elektrode na bazi zlatnih listića; (b) Zasićenje elektrode na bazi zlatnih listića herceptinom (Tmab); (c) Detekcija tumor biomarkera HER2 elektrode na bazi zlatnih listića; (d) Koraci funkcionalizacije Dropsens elektrode; (e) Zasićenje Dropsens elektrode herceptinom (Tmab); (f) Detekcija tumor biomarkera HER2 Dropsens elektrodom. Konačno, rezultati su fitovani sa ekvivalentnim kolom predstavljenim na slici 3.3. Relativna promena signala izračunata je u odnosu na BSA funkcionalizovanu elektrodu za Tmab saturaciju, dok je za HER2 detekciju izračunata u odnosu na 1000 ng/mL Tmab. Rezultati na slici 3.28a pokazuju rastući trend sa porastom koncentracije antitela Tmab bez naznaka saturacije signala, dok se u slučaju komercijalne elektrode, slika 3.28a, saturacija javlja nakon 100 ng/mL. Odziv detekcije Tmab za GLE opisan je linearnom jednačinom 𝑦=39,978𝑥+62,195,R2=0,9854, dok je na Dropsens elektrodi odziv opisan sa 𝑦=14,118𝑥+17,774,R2=0,9763. Obe elektrode pokazuju dobru linearnost detekcije herceptina pomoću predložene konfiguracije. S druge strane, u slučaju detekcije tumor biomarkera, slika 3.28b, elektroda na bazi zlatnih listića pokazuje linearan rastući trend, 𝑦=12,145𝑥+24,589,R2=0,9507, dok se kod komercijalne elektrode kriva detekcije HER2 prikazuje tipičan sigmoidan oblik sa zasićenjem nakon 10 ng/mL. 91 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Slika 3.28: Relativna promena signala elektrode na bazi zlatnih listića i komercijalnih Dropsens elektroda; (a) Za različite koncentracije herceptina (Tmab); (b) Za različite koncentracije tumor biomarkera HER2. Prethodni rezultati pokazuju značajno bolje performanse detekcije senzora realizovanog pomoću elektroda na bazi zlatnih listića u poređenju sa komercijalnim elektrodama. U nastavku istraživanja, ispitana je specifičnost detekcije predloženog biosenzora sa nespecifičnim proteinima pripremljenim u PBS puferu. Takođe, finalna validacija specifičnosti detekcije odrađena je detekcijom tumor biomarkera u kompleksnoj matrici, ćelijskom medijumu, koji sadrži veliki broj nespecifičnih komponenata. Grafik na slici 3.29 predstavlja upoređene odzive detekcije za različite koncentracije specifičnog biomarkera HER2 i nespecifičnih proteina kao što su antitelo za E. coli, BSA i fibrinogen (FBG), testirani u koncentraciji od 100 ng/mL. Predstavljeni rezultati pokazuju da je signal specifičnog biomarkera znatno veći u poređenju sa nespecifičnim, dok je odziv senzora za najmanju ispitanu koncentraciju od 0,1 ng/mL HER2 u nivou signala nespecifičnih proteina. U realnim uzorcima, retko se pronalaze velike koncentracije nespecifičnih proteina, tako da ovaj rezultat ne umanjuje potencijal detekcije predloženog senzora. 92 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Slika 3.29: Specifičnost detekcije HER2 senzora. Relativna promena otpora prenosu naelektrisanja izračunata je prema izrazu: 𝛿(%)=𝑅𝑐𝑡 (𝑐𝑐)−𝑅𝑐𝑡(1000 𝑛𝑔/𝑚𝐿 𝑇𝑚𝑎𝑏) 𝑅𝑐𝑡 (1000 𝑛𝑔/𝑚𝐿 𝑇𝑚𝑎𝑏) . Sledeći korak u validaciji performansi senzora ispitan je za primenu biosenzora za detekciju u kompleksnoj matrici ćelijskog medijuma. 3.7.6 Detekcija HER2 u ćelijskom medijumu Medijum za kultivaciju ćelija (Gibco CO2Independent Medium, Fisher Scientific) pripremljen je sa 10% seruma (Fetal Bovine Serum, Sigma), 1% antibiotika (PenicillinStreptomycin, Sigma), 1% L-glutamina i 88% medijuma. Ovakav medijum razređen je u odnosu 1:10 sa DI vodom, a različite koncentracije tumor biomarkera HER2 pripremljene u opsegu od 0,1 ng/mL do 1000 ng/mL. S obzirom na to da je medijum kompleksna matrica, gde postoji veliki broj nespecifičnih komponenata koje mogu prividno da doprinesu signalu i izazovu pogrešan utisak detekcije specifičnog biomarkera, kontrolni test zasićenja površine elektrode inkubacijom medijuma bez specifičnog biomarkera, odrađen je ponavljajućom inkubacijom medijuma na zasićenoj elektrodi. Naime, inicijalno zasićenje senzora odrađeno je tokom 2 h inkubacije medijuma bez tumor biomarkera, a nakon toga ponavljajuća inkubacija medijuma u toku 20 min urađena je da bi se potvrdila konstantnost signala bez tumor biomarkera, odnosno da bi se utvrdilo da doprinos signala potiče od specifičnog biomarkera, a ne od nespecifičnih komponenata medijuma, koji mogu ostati na površini usled elektrostatičkih ili drugih interakcija, slika 3.30. 93 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Grafik na slici 3.30 prikazuje relativnu promenu otpora prenosu naelektrisanja za ponavljajuće inkubacije medijuma na elektrodi u odnosu na elektrodu zasićenu inkubacijom tokom 2 h. Rezultati prikazuju konstantan signal nakon ponavljajuće inkubacije medijuma, što potvrđuje da je elektroda zasićena nespecifičnim komponentama iz medijuma i da doprinos porastu impedanse u eksperimentima sa specifičnim biomarkerom ne potiče od medijuma. Slika 3.30: Kontrolna merenja sa ponavljajućom inkubacijom medijuma. Relativna promena otpora prenosu naelektrisanja izračunata je prema izrazu: 𝛿(%)=𝑅𝑐𝑡 (𝑐𝑐)−𝑅𝑐𝑡(𝑚𝑒𝑑𝑖𝑗𝑢𝑚) 𝑅𝑐𝑡 (𝑚𝑒𝑑𝑖𝑗𝑢𝑚) . Finalna validacija detekcije tumor biomarkera u medijumu odrađena je inkubacijom tokom 20 min za rastuće koncentracije tumor biomarkera na elektrodi prethodno zasićenoj medijumom. Rezultati odziva senzora za različite koncentracije tumor biomarkera predstavljeni su na slici 3.31. Grafik na slici 3.31a prikazuje oblik Nikvistovog dijagrama bez difuzionog repa i iz tog razloga predloženo električno kolo za fitovanje rezultata, predstavljeno na unutrašnjem grafiku, ne sadrži Varburgov element. Takođe, rezultati pokazuju rastući trend impedanse za porast koncentracije tumor biomarkera HER2. Kriva zavisnosti relativne promene otpora prenosu naelektrisanja, predstavljena je na slici 3.31b, gde se vidi linearna zavisnost detekcije, opisana jednačinom 𝑦=16,62𝑥+29,765,R2=0,9431. Predstavljeni rezultati prikazuju odličan potencijal detekcije predloženog senzora i u kompleksnim uzorcima, poput ćelijskog medijuma. 94 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Slika 3.31: (a) Nikvistovi dijagrami za različite koncentracije HER2 u medijumu; Unutrašnji grafik: Električno kolo za fitovanje rezultata; Tačke na grafiku predstavljaju merenja, dok kriva predstavlja fitovane rezultate; (b) Relativna promena otpora prenosu naelektrisanja u zavisnosti od koncentracije HER2 u medijumu. 3.7.7 Diskusija i zaključak U okviru doktorske disertacije razvijen je senzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi novog načina imobilizacije Herceptina posredstvom proteina L. VezivanjeHerceptinaiproteinaL, kao iproteina L iHER2potvrđenoje fluorescentnimtestom. Imobilizacija samoorganizujućeg monosloja MUA potvrđena je Raman spektroskopijom, kao i vezivanje proteina L za karboksilne grupe MUA. Na taj način potvrđeno je vezivanje svih komponenata sloja bioprepoznatljivih elemenata i pre same elektrohemijske detekcije. Elektrohemijskom impedansnom spektroskopijom potvrđeno je vezivanje svake od komponenata na elektrodama na bazi zlatnih listića. Potencijal detekcije predloženog biosenzora validiran je detekcijom HER2 biomarkera u ćelijskom medijumu. Pored predstavljene primene senzora za detekciju HER2 biomarkera, predloženi senzor pokazuje i potencijal detekcije samih antitela (Herceptina) posredstvom proteina L, što može potencijalno imati primenu u farmaceutskoj industriji. U okviru doktorske disertacije prvi put je upotrebljen protein L za orijentisanu imobilizaciju antitela na površini elektrode. Naime, direktna imobilizacija antitela na površini biosenzora u opštem slučaju ne garantuje optimalnu orijentaciju vezanih antitela. Iz tog razloga u literaturi su predložene imobilizacije proteina A i G, proteina bakterijskog porekla, koji se uglavnom koriste u prečišćavanju antitela kao kovalentno vezani za agarozu ili kao biokonjugovane nanočestice [198, 199]. Prednost proteina L u odnosu na proteine A i G ogleda se u njegovoj mogućnosti vezivanja pored monoklonalnih antitela i fragmenata antitela, s obzirom na region antitela za koji se vezuje 95 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića [200]. Kao što je rečeno u krvi zdravih osoba nalazi se u opsegu 4 - 14 ng/mL, dok se kod pacijentkinja sa karcinomom dojke nalazi u opsegu 15 - 75 ng/mL. Rezultati istraživanja pokazuju da je predloženi senzor na bazi zlatnih listića uspešno detektovao ove opsege koncentracija. Limit detekcije procenjen je na osnovu srednje vrednosti izmerenog signala bez biomarkera i standardne devijacije merenja. Naime dodavanjem trostruke vrednosti standardne devijacije srednjoj vrednosti signala bez biomarkera i procenjena na osnovu kalibracione krive. Limiti detekcije procenjeni su na 0,02 ng/mL u PBS puferu, dok je 0,03 ng/mL limit detekcije procenjen u medijumu što je značajno manje od vrednosti HER2 koja se detektuje kod zdravih osoba i kod HER2 pozitivnih pacijentkinja. Tabela 3.4 poredi predložene biosenzore za HER2 iz literature. Naime, predloženi senzori koriste napredne nanotehnologije u cilju povećanja osetljivosti detekcije senzora. Kao i kod prethodnih senzora najčeše korišćene podloge za elektrohemijsku detekciju su zlatne [201, 202] i ugljenične elektrode [203–207]. U cilju povećanja efektivne površine pomenutih elektroda primenjuju se nanomaterijali poput nanočestica zlata [206, 208], rodijuma [190], gvožđa [208], itd., dok se često koriste i 2D nanomaterijali poput grafena i grafen oksida [190]. Novija istraživanja koriste i metaloorganske mreže (eng. Metal–organic framework, MOF) za realizaciju biosenzora sa izuzetno osetljivim osobinama detekcije [208, 209]. Svaki od predloženih senzora limitom detekcije i dinamičkim opsegom detekcije odgovara potrebama osetljivosti i specifičnosti detekcije HER2 tumor biomarkera. Međutim, predložene tehnologije zahtevaju skupu opremu, hemikalije i obučeno osoblje za realizaciju svakog od opisanih senzora. Iako pojedina rešenja imaju bolji limit i dinamički opseg detekcije, s obzirom na opseg detekcije neophodan za komercijalnu upotrebu, ove osobine nisu neophodne za upotrebu u praksi. S druge strane, predloženo rešenje na bazi zlatnih listića prevazilazi sva druga rešenja u pogledu jednostavnosti i cene izrade senzora za direktnu detekciju HER2 biomarkera bez dodatnih pojačavača signala. Na ovaj način elektrode na bazi zlatnih listića, pored detekcije bakterija, pokazale su veliki potencijal i za primenu u detekciji biomarkera. 96 3.7. Biosenzor za detekciju tumor biomarkera HER2 na bazi zlatnih listića Tabela 3.4: Metode detekcije, dinamički opsezi i limit detekcije HER2 iz prethodnih istraživanja. Metod detekcije Materijal Dinamički opseg (ng/mL) LD (ng/mL) Ref. Diferencijalna pulsna voltametrija Grafenom modifikovane nanočestice rodijuma 10 - 500 0,667 [190] Diferencijalna pulsna voltametrija GCE sa PEDOT i peptidni hidrogel 0,1 - 1000 45×10−3[203] Voltametrija pravougaonog impulsa Cd2+- aptamer@AMNFs@ZIF-67 nanokompozit 0 - 1 4,8×10−6[209] Diferencijalna pulsna voltametrija GCE sa PEG i peptidom 0,001 - 1000 4,4×10−4[205] Voltametrija pravougaonog impulsa Zlatne elektrode 0,001 - 0,1 4,7×10−5[201] Diferencijalna pulsna voltametrija Zlatne elektrode 0,1 - 100 0,08 [202] Diferencijalna pulsna voltametrija Ugljenične elektrode modifikovane Fe3O4 nanočesticama 5×10−450 2×10−5[207] Diferencijalna pulsna voltametrija Zlatne nanočestice@HRP@ZIF-8 50×10−6−50 16,8×10−6[208] Elektrohemijska impedansna spektroskopija Elektrode na bazi zlatnih listića 0,1 - 1000 0,02 Rezultati 97 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima 3.8 LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima Senzori za glukozu17 (Glc) predstavljaju važan aspekt istraživanja i razvoja u biomedicini i zdravstvu. Potreba za naprednim senzorima proizlazi iz važnosti praćenja glukoze u različitim biološkim uzorcima, uključujući krv, urin, intersticijsku tečnost, znoj, dah, pljuvačku i očne tečnosti [210, 211]. Pored toga, monitoring glukoze često se koristi u prehrambenom sektoru za kontrolu kvaliteta i bezbednosti hrane [212]. S obzirom na to da je glukoza glavni nutrijent za rast ćelija, biosenzori za monitoring glukoze nalaze primenu i u ćelijskim kulturama zbog važnosti uvida u njihov metabolizam. Ramanova spektroskopija, tečna hromatografija visokih performansi (HPLC) i druge skupe i dugotrajne spektroskopske tehnike mogu se koristiti za praćenje glukoze u ćelijskoj kulturi [213]. Do sada su predložene različite metode za detekciju glukoze, kao što su enzimski testovi [214], kolorimetrijski testovi [215] i biosenzori [216]. Enzimski testovi koriste enzime kao što je glukoza oksidaza18 (GOx) za pretvaranje glukoze u vodonik peroksid (H2O2), koji se zatim detektuje pomoću kolorimetrijskog indikatora. Biosenzori na bazi fluorescencije [217] ili elektrohemijski biosenzori [218], omogućavaju precizno praćenje nivoa glukoze u realnom vremenu, omogućavajući zamenu medijuma po potrebi kako bi se obezbedio optimalan rast i produktivnost ćelija. Najčešći metod za detekciju glukoze u mikrofluidičnim sistemima zasniva se na enzimskim reakcijama, gde enzim katalizuje oksidaciju glukoze da bi se stvorio vodonik peroksid. Detekcija vodonik peroksida može se vršiti korišćenjem različitih tehnika, kao što su elektrohemijske ili optičke metode. Senzori za glukozu su od suštinskog značaja u mnogim aspektima biomedicinskog istraživanja i razvoja, a novija istraživanja kombinuju prethodno pomenute principe sa kontrolom i manipulacijom tečnostima na submilimetarskoj skali, čineći senzore delovima kompleksnih minijaturizovanih sistema za analizu i eksperimente na mikroskali [219–221]. Kao što je opisano u uvodnom delu disertacije LOC sistemi sadrže više integrisanih operacija kao što su mešanje na mikroskali [222], separacija čestica [223], DNK ekstrakcija i amplifikacija [224], detekcija [225] itd. VažnideloviLOC sistemasumikrofluidični mešači[226, 227],koji semoguklasifikovati kao aktivni ako spoljašnja energija aktuatora ubrzava proces mešanja, ili pasivni koji radi bez spoljašnjih aktuatora. Nedavno predloženi aktivni mikromešači koriste akustičko aktiviranje [228], električno polje [229], magneto-hidrodinamičku silu [230], itd., kao eksterni aktuator mešanja. Aktivni mešači omogućavaju brže mešanje i kraću 17engl. Glucose, Glc 18engl. Glucose oxidase, GOx 98 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima 3.8.5 Izrada i karakterizacija LOC platforme Predložena LOC platforma realizovana je kao višeslojna struktura, sa srednjim slojem sa mikrofluidičnim kanalima napravljenim u SLA tehnologiji na štampaču Formlabs Form3. LOC platforma je realizovana u hibridnoj tehnologiji izrade, koja koristi PMMA potporne slojeve i 3D štampani sloj sa mikrofluidičnim kanalima. Mikrofluidični kanali realizovani su tehnologijom stereolitografije (SLA). Savitljiva transparentna smola sa 80A tvrdoće po Šoru korišćena je za izradu sloja mikrofluidičnih kanala. Ovaj materijal je odabran s obzirom na to da nakon štampe ima odgovarajuću savitljivost i dobro prijanja na PMMA slojeve. Zatvaranje kanala i dobra adhezija omogućeni su primenom male sile, odnosno spajanjem slojeva šrafovima. U toku inicijalnih ispitivanja predloženi čip je izdržao protoke i do 15 mL/min bez curenja. Slika 3.34: (a) Višeslojna struktura predložene LOC platforme; (b) 3D profil mikrofluidičnog kanala dobijenog stereolitografijom; (c) Finalni izgled LOC platforme sa integrisanom Dropsens elektrodom. Predložena smola i tehnologija 3D štampe omogućavaju izradu kanala dimenzije 200 𝜇m×200 𝜇m. Visina kanal podešena je na 100 𝜇m, dok su ostali parametri odabrani da prate uputstvo proizvođača [256]. Model je štampan direktno na ploču štampača tako da kanali budu usmereni na gore, da bi se izbegla potreba za potpornim strukturama. Nakon štampe, kanali su detaljni isprani izopropanolom (Sigma-Aldrich) i nakon toga ostavljeni potopljeni u izopropanolu 20 min. Nakon toga, mikrofluidiči kanali su dodatno isprani sa izopropanolom pod pritiskom iz šprica da bi se uklonili ostaci rezina iz unutračnjosti kanala. Nakon ispiranja, štampani sloj ostavljen je da se 105 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima osuši u toku noći, nakon čega se u procesu učvršćivanja izlaže UV svetlu u opsegu talasnih dužina 365 nm i 400 nm (Anycubic Wash and Cure v1). Mikrofluidični mešači, realizovani u sloju 2, sadrže tri ulaza za medijum, sirćetnu kiselinu i enzim. Na kraju drugog mešača nalazi se komora sa integrisanom Dropsens elektrodom na koju se dalje nadovezuje izlaz iz čipa. Sloj 2, zajedno sa Dropsens elektrodom nalazi se između slojeva 1 i 3, koji su realizovani tehnologijom laserskog mikromašinstva u PMMA slojevima debljine 2 mm i 6 mm, respektivno. Dodatno, sloj 3 sadrži prostor za ubacivanje elektrode, dobijen graviranjem površine pomoću CO2 lasera (parametri: snaga 35 W, brzina 15 mm/s). 3D profil realizovanog mikrokanala pokazuje jasno definisane ivice i uniformne zidove kanala, slika 3.34b, dok slika 3.34c predstavlja realizovani čip sa integrisanom elektrodom. Ukupne dimenzije čipa su 69,25 mm ×46,65 mm sa poluprečnikom ulaza od 1 mm, poluprečnikom šrafova 1,5 mm i poluprečnikom komore od 4 mm. Takođe, dužina mešača je 38,4 mm, dok je njegova širina 8,2 mm. 3.8.6 Rezultati detekcije glukoze U svim elektrohemijskim eksperimentima, sito-štampane Dropsens elektrode korišćene su nakon čišćenja u 0,5 M sumpornoj kiselini u opsegu potencijala od -0,2 V do 1,5 V u odnosu na Ag/AgCl referentnu elektrodu, brzinom skeniranja 0,5 V/s i brojem ciklusa 60. Nakon čišćenja, elektrode su isprane MiliQ vodom i integrisane u LOC plaformu. Princip detekcije glukoze zasniva se na elektrohemijskoj detekciji vodonik peroksida, koji predstavlja proizvod reakcije glukoze i glukoza oksidaze. Da bi se pronašao potencijal oksidacije vodonik peroksida, ciklična voltametrija je odrađena sa malom brzinom skeniranja od 0,05 V/s da bi se omogućilo manuelno dodavanje dodatne kapi na površinu elektrode (opseg potencijala -0,2 V do 1,5 V vs. Ag/AgCl RE, 8 ciklusa). Na taj način omogućeno je praćenje reakcije u realnom vremenu. Nakon toga hronoamperometrija je iskorišćena za različite koncentracije glukoze tokom 60 s na fiksnom potencijalu oksidacije vodonik peroksida, 0,9 V vs. Ag/AgCl RE. Rastvori glukoze, glukoza oksidaze i fruktoze napravljeni su u 50 mM acetatnom puferu (pH 5,1). UpredloženojLOCplatformisaintegrisanimsenzorom,molekuliglukoze(D-(+)- Glukoza, Sigma-Aldrich) se oksiduju u hemijskoj reakciji sa enzimom, GOx (Glukoza oksidaza od Aspergillus Niger, Tip X-S, Sigma-Aldrich), duž mikrofluidičnog toka. Nakon potpunog mešanja sa medijumom (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-high, Sigma-Aldrich) od interesa i određenog vremena, proizvod reakcije, vodonik peroksid se oksiduje i proizvodi elektrohemijski signal na određenom potencijalu. Na slici 3.35a prikazani su rezultati eksperimenta ciklične voltametrije gde se ispituju specifičnost i potencijal oksidacije vodonik peroksida. U ovom eksperimentu, 106 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima nakon svaka dva ciklusa dodaje se dodatna kap od 40 𝜇L analita. Prva dva ciklusa u cikličnom voltamogramu, prikazanom na slici 3.35a, sadrže signal od acetatnog pufera. Ciklusi 3 i 4 predstavljaju signal nakon dodavanja kapi od 1 mg/mL GOx, a ciklusi 5 i 6 predstavlja signal nakon dodavanja kapi od 5 mg/mL fruktoze. Intenzitet oksidacionih pikova na 0,9 V prikazan je na slici 3.35b. Rezultati pokazuju da mešavina fruktoze i enzima nije dala odgovor, što je i očekivano s obzirom na to da je GOx nespecifičan enzim za fruktozu. Pored toga, ciklusi 5 i 6 pokazuju da se nakon dodavanja kapi glukozeproizvoditipičanotisakprstavodonikperoksidauvoltamogramu,štorezultira povećanjem struje. Kalibracija elektrohemijskog senzora urađena je u acetatnom puferu. Rezultati hronoamperometrije za različite koncentracije glukoze u acetatnom puferu tokom vremena predstavljene su na slici 3.35c. Koncentracija glukoze izmerena je u opsegu od 0,1 mg/mL do 50 mg/mL. Kalibraciona kriva detekcije glukoze u acetatnom puferu prikazana je na slici 3.35d, gde je signal za različite koncentracije glukoze predstavljen kao relativna promena u odnosu na odgovor acetatnog pufera izmeren posle 60 s reakcije. Može se videti da se koncentracija vodonik peroksida povećava sa povećanjem koncentracije glukoze, što rezultira eksponencijalnim povećanjem izlazne struje. Područje od interesa za detekciju glukoze u ćelijskom medijumu predstavljeno je na unutrašnjem grafiku slike 3.35d. 107 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima Slika 3.35: Rezultati elektrohemijske detekcije glukoze; (a) Ispitivanje potencijala oksidacije vodonik peroksida (H2O2); Ciklusi 1-2 snimljeni su u acetatnom puferu. Ciklusi 3-4 snimljeni nakon dodavanja kapi GOx. Ciklusi 5-6 snimljeni nakon dodavanja kapi fruktoze. Ciklusi 7-8 snimljeni nakon dodavanja kapi glukoze; (b) Intenzitet pika oksidacije sa slike (a) na 0,9 V vs. Ag/AgCl RE; (c) Rezultati hronoamperometrije za detekciju glukoze pripremljene u acetatnom puferu; Unutrašnji grafik: Uvećani prikaz kontrolnih merenja i malih koncentracija Glc; (d) Kalibraciona kriva detekcije glukoze u acetatnom puferu. Signal je predstavljen kao relativna promena vrednosti u odnosu na signal acetatnog pufera, 𝛿(%)=100 ×(𝐼𝑘𝑜𝑛𝑐. −𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟)/𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟; Unutrašnji grafik: Uvećani prikaz kalibracione krive za glukozu u opsegu 0,05 - 2,5 mg/mL. S obzirom na to da je sadržaj glukoze jedan od najvažnijih parametara u procesu kultivisanja ćelija, koncentracija glukoze je takođe izmerena u medijumima za gajenje ćelija. Rezultati hronoamperometrije za različite koncentracije glukoze u ćelijskom medijumu prikazani su na slici 3.36a. Medijum sa 4,5 mg/mL glukoze razblažen je da bi se detektovale različite koncentracije glukoze, dok je pH vrednost medijuma konstantna. S obzirom na to da je pH medijuma 7,4, njegova pH vrednost se prvo podešava na 5,1 podešavanjem odgovarajućih brzina protoka na 0,33 na ulazu u prvi mešač, kao što je predstavljeno u rezultatima simulacija, slika 3.33b. Mešanje inicijalnog uzorka dovodi do smanjenja ukupne koncentracije glukoze u uzorku, ali rezultira bržim vremenom reakcije sa enzimom. Rezultati merenja nakon mešanja sa enzimom i detekcije 108 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima prikazani su na slici 3.36a za različite koncentracije glukoze, uključujući razblaženja sirćetnom kiselinom (Acetic Acid ACS Reagent >=99.7%, Sigma-Aldrich) i enzimom. Signal u medijumu je niži u poređenju sa čistim acetatnim puferom (unutrašnji grafik na slici 3.35d) zbog prisustva drugih jona u medijumu, kao što su L-glutamin, natrijum piruvat, natrijum bikarbonat, itd. Za praktičnu primenu važno je da se ponovo izračuna početna koncentracija glukoze u makrosistemu, pre ulaska u LOC, razblaži se sirćetnom kiselinom i reaguje sa enzimom. Kalibraciona kriva detekcije glukoze u ćelijskom medijumu prikazana je na slici 3.36b, gde je odgovor senzora predstavljen u funkciji stvarne koncentracije glukoze, pre ulaska u LOC. Signal je predstavljen kao relativna promena u odnosu na acetatni pufer. Konačno, može se videti da predloženi sistem omogućava merenje glukoze u realnom vremenu u tečnom analitu sa linearnom promenom struje sa koncentracijom glukoze. Slika 3.36: (a) Rezultati hronoamperometrije za različite koncentracije glukoze u ćelijskom medijumu. Unutrašnji grafik: Kalibraciona kriva za medijum; (b) Kalibraciona kriva u ćelijskom medijumu na ulazu u LOC platformu; Realna koncentracija je izračunata množenjem izmerene koncentracije sa odnosom protoka i faktorom 2 koji predstavlja razblaženje nakon mešanja u čipu. Signal je izračunat sledećim izrazom: 𝛿(%)=100 ×(𝐼𝑘𝑜𝑛𝑐. −𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟)/𝐼𝑝𝑢 𝑓 𝑒𝑟. 3.8.7 Diskusija i zaključak Predloženi koncept ima nekoliko prednosti za potencijalnu upotrebu u različitim biomedicinskim primenama. Naime, koncentracija glukoze u krvi je najrasprostranjenija mera za praćenje nivoa šećera u krvi. Normalni nivoi glukoze u krvi su između 0,7 i 1 mg/mL [257], a sve više od toga može ukazivati na dijabetes ili neko drugo zdravstveno stanje. Pljuvačka takođe sadrži glukozu, ali je koncentracija mnogo niža u odnosu na krv, obično se kreće od 5×10−4do 10−3mg/mL [258]. Koncentracija glukoze u pljuvački koristi se za praćenje promena nivoa šećera u krvi, a koristi se i u nekim dijagnostičkim testovima. Koncentracija glukoze u urinu varira u zavisnosti od nivoa 109 3.8. LOC platforma za monitoring glukoze u realnom vremenu u tečnim analitima glukoze u krvi, u rasponu od 0 - 0,20 mg/mL ili više, u zavisnosti od nivoa glukoze u krvi [259]. Predloženi koncept omogućava detekciju prethodnih opsega koncentracija i stoga se može koristiti za primene sa ovim tečnim uzorcima. Pored toga, zbog sistema protoka kroz LOC platformu, nema potrebe za imobilizacijom enzima na površini senzora što omogućava dužu upotrebu senzora jer se izbegava zasićenje imobilisanog enzima. Nedavno su predložena različita rešenja za detekciju glukoze zasnovana na LOC sistemima koji uključuje mikromešače. Detekcija glukoze unutar LOC platformi rađena je spektroskopskim [260, 261], kolorimetrijskim [262] ili elektrohemijskim metodama [263]. Međutim, nijedan od ovih predloženih sistema nije testiran na stvarnim uzorcima, i nijedan od njih nije dizajniran za integraciju sa velikim sistemima poput bioreaktora. Predloženi koncept detekcije može automatski prikupljati uzorke bez potrebe za ručnim uzorkovanjem i može omogućiti merenja u realnom vremenu. Predloženi čip može da omogući praćenje hranljivih materija u ćelijskom medijumu dok, u isto vreme, sprečava potencijalnu kontaminaciju medijuma tokom procesa uzorkovanja. Pored toga, predloženi čip omogućava prilagođavanje reakcije prema pH vrednosti, što je pogodno za merenja u procesu kultivacije ćelija gde se glukoza i pH menjaju tokom vremena. U ovom radu predložen je novi 3D štampani mikrofluidični čip sa integrisanim mikromešačimanabaziserpentinaielektrohemijskimsenzoromzadetekcijuglukozeu tečnom analitu. Izvršene su numeričke simulacije za optimizaciju performansi mešanja i korišćen je teorijski model mešanja fluida za podešavanje ulaznih protoka fluida prema pH vrednostima uzorka. Potencijal detekcije predstavljen je na primeru merenja koncentracija glukoze u acetatnom puferu i medijumu ćelijske kulture. Predloženi čip koristi male količine uzoraka i reagenasa, a rezultati pokazuju linearni odziv i dobru osetljivost. Na osnovu predstavljenih rezultata vidi se veliki potencijal za direktno praćenje parametara u realnom vremenu u makrosistemima kao što su bioreaktori gde se glukoza i pH menjaju tokom vremena. Predložena platforma ima veliki potencijal za različite primene u procesima gde mikrosistem može da omogući praćenje relevantnih parametara za makrosisteme kao što su bioreaktori. 110 Zaključak U okviru doktorske disertacije analizirano je nekoliko senzorskih i biosenzorskih rešenja za primene u kontroli kvaliteta hrane i životne sredine, ćelijskoj poljoprivredi i biomedicini. Razvijena je LOC platforma sa integrisanim mikrotalasnim senzorom za identifikaciju i detekciju mešanja jestivih ulja, kao i LOC platforma sa integrisanim impedansnim senzorom za monitoring rasta ćelija unutar mikrobioreaktora. Takođe, ispitan je potencijal nove tehnologije izrade elektroda na bazi zlatnih listića za detekciju bakterija E. coli,S.Typhimurium i tumor biomarkera HER2. Integracija elektrohemijskog senzorauLOC platformusa mikrofluidičnim mešačimarealizovanajeza primenu u detekciji glukoze u ćelijskom medijumu. Mikrotalasni senzori, iako su korisni u mnogim aplikacijama, često nisu dovoljno osetljivi za detekciju malih promena u dielektričnoj permitivnosti. U tom kontekstu, fenomeni površinskih plazmonskih polaritona i dizajniranih površinskih plazmonskih polaritona predstavljaju obećavajuću opciju za izuzetno osetljive senzore. Kroz simulacije, optimizaciju i eksperimentalnu verifikaciju, u okviru ove doktorske disertacije razvijena je LOC platforma sa integrisanim senzorom zasnovanim na SSPP talasima za identifikaciju jestivih ulja. Eksperimentalna verifikacija senzora potvrdila je visoku osetljivost predloženog senzora na male promene dielektrične permitivnosti uzorka, a senzor je pokazao i odlične osobine linearnosti detekcije. Takođe, hibridni pristup izrade ovog senzora omogućio je brzu i jednostavnu pripremu, smanjenje količine uzoraka potrebnih za testiranje i visoku osetljivost, bez potrebe za skupom opremom i složenim procedurama. U okviru doktorske disertacije istraženo je rešenje za praćenje biomase primenom LOC pristupa za kultivaciju ćelija, integracijom novog impedansnog senzora u mikrobioreaktor. Predstavljeno istraživanje ispituje mogućnosti dva pristupa za monitoring rasta ćelija unutar minijaturizovanog sistema za praćenje biomase tokom vremena: impedansnog pristupa i pristupa obrade slike. Rezultati su pokazali da se metod obrade slike može koristiti za grubu procenu biomase. Međutim, u slučaju većih bioreaktora, primena ove metode je limitirana zbog nepraktičnosti dobijanja slika bez dodatnih manipulacija ili uzorkovanja. S druge strane, predloženo rešenje merenja impedanse može se koristiti za detekciju svih faza rasta ćelija sa visokom pouzdanošću. Predloženi impedansni senzor može biti prilagođen i redizajniran za integraciju u različite komercijalne bioreaktorezamonitoringbiomase. Pored svihnavedenih prednosti,LOC platforma je realizovana u isplativnoj i jednostavnoj tehnologiji, koja omogućava brzu 111 ZAKLJUČAK izradu minijaturizovanih sistema, što otvara mogućnost za širok spektar primena u biotehnološkim i medicinskim istraživanjima. Biosenzorske tehnologije doživljavaju nagli razvoj poslednjih godina zbog mogućnosti osetljive detekcije malih koncentracija bakterija, virusa, tumor biomarkera itd. Ovi biosenzori imaju potencijal za brzu i tačnu analizu, čime pružaju značajnu prednost u dijagnostici, kontroli kvaliteta hrane, i zdravstvenoj zaštiti u poređenju sa drugim rešenjima i standardnim laboratorijskim metodama detekcije. U okviru doktorske disertacije razvijena je nova tehnologija izrade elektroda na bazi zlatnih listića, gde se pojedinačna podloga za realizaciju senzora može realizovati po ceni i do 10 puta manjoj od tržišne cene. Takođe, doprinos istraživanjima ostvaren je i u razvoju protokola funkcionalizacije površine zlata za imobilizaciju antitela na površini elektrode. Na ovaj način realizovani su senzori za detekciju bakterija E. coli i Salmonella Typhimurium sa limitima detekcije od 2 cfu/mL i 71 cfu/mL, respektivno, što predstavlja značajno manje koncentracije od infektivnih doza ovih bakterija. Takođe, u okviru doktorske disertacije razvijen je novi protokol imobilizacije antitela na površini zlata posredstvom proteina L, koji pored orijentisane imobilizacije antitela, nudi mogućnost i detekcije ili imobilizacije i fragmenata antitela. Na ovom principu realizovan je senzor za tumor biomarker HER2 sa veoma niskim limitom detekcije od 0,02 ng/mL, što je niže od koncentracije koja se sreće kod HER2 pozitivnih pacijentkinja, a i kod zdravih ljudi. Integracija elektrohemijskih biosenzora u LOC platformu realizovana je u 3D štampanom mikrofluidičnom čipu sa integrisanim mešačima na bazi serpentina. Primenom softverskog alata Comsol Multiphysics optimizovane su performanse mešanja, a potencijal detekcije LOC platforme pokazan je na primeru detekcije glukoze u acetatnom puferu i medijumu za kultivaciju ćelija. Predložena LOC platforma pokazuje značajan potencijal za praćenje parametara ćelijskog medijuma u realnom vremenu u makrosistemima poput bioreaktora. Konačno, doktorska disertacija predstavlja multidisciplinarni pristup primenjen u oblastima senzora i biosenzora, istražujući širok spektar primena, od analize hrane i životne sredine do praćenja bioloških procesa i dijagnostike. Predstavljeni rezultati imaju potencijal da unaprede razumevanje i rešavanje ključnih problema u različitim oblastima, uz primenu brzih i jeftinih tehnoloških rešenja. Rezultati ove doktorske disertacije publikovani su u četiri rada kategorije M21, jednim radom kateogrije M22 i četiri konferencijska rada. Takođe, očekuje se publikacija još jednog rada u naučnom časopisu. 112 Bibliografija 1. Garcia-Vidal, F. J. i dr. Spoof surface plasmon photonics. Rev. Mod. Phys. 94, 025004 (2022.). 2. Liu, Y. & Zhang, X. Metamaterials: a new frontier of science and technology. Chem. Soc. Rev. 40, 2494–2507 (2011.). 3. Fan, J. i dr. A review of additive manufacturing of metamaterials and developing trends. Materials Today 50, 303–328 (2021.). 4. Xiao, S. i dr. Active metamaterials and metadevices: a review. Journal of Physics D: Applied Physics 53, 503002 (2020.). 5. Kumar, R., Kumar, M., Chohan, J. S. & Kumar, S. Overview on metamaterial: History, types and applications. Materials Today: Proceedings 56. 3rd International Conference on Contemporary Advances in Mechanical Engineering, 3016–3024 (2022.). 6. Abdolrazzaghi, M., Nayyeri, V. & Martin, F. Techniques to Improve the Performance of Planar Microwave Sensors: A Review and Recent Developments. Sensors 22 (2022.). 7. Cao,Y.,Ruan,C.,Chen,K.&Zhang,X.Researchonahigh-sensitivityasymmetric metamaterial structure and its application as microwave sensor. Scientific Reports 12 (2022.). 8. Rashedul Islam, M. i dr. Metamaterial sensor based on reflected mirror rectangular split ring resonator for the application of microwave sensing. Measurement 198, 111416 (2022.). 9. Govind, G. & Akhtar, M. J. Metamaterial-Inspired Microwave Microfluidic Sensor for Glucose Monitoring in Aqueous Solutions. IEEE Sensors Journal 19, 11900– 11907 (2019.). 10. Podunavac, I., Radonic, V., Bengin, V. & Jankovic, N. Design of Spoof Surface Plasmon Polariton-based Sensor for Low Dielectric Constant Liquid Samples. 2021 15th International Conference on Advanced Technologies, Systems and Services in Telecommunications (TELSIKS), 121–124 (2021.). 11. Podunavac, I., Radonic, V., Bengin, V. & Jankovic, N. Microwave Spoof Surface Plasmon Polariton-Based Sensor for Ultrasensitive Detection of Liquid Analyte Dielectric Constant. Sensors 21 (2021.). 113 BIBLIOGRAFIJA 12. Saadat-Safa, M., Nayyeri, V., Ghadimi, A., Soleimani, M. & Ramahi, O. M. A pixelated microwave near-field sensor for precise characterization of dielectric materials. Scientific reports 9, 13310 (2019.). 13. Muñoz-Enano, J. i dr. Planar phase-variation microwave sensors for material characterization: A review and comparison of various approaches. Sensors 21, 1542 (2021.). 14. Tiwari, N. K., Singh, S. P. & Akhtar, M. J. Novel Improved Sensitivity Planar Microwave Probe for Adulteration Detection in Edible Oils. IEEE Microwave and Wireless Components Letters 29, 164–166 (2019.). 15. Zhang, X., Ruan, C., Wang, W. & Cao, Y. Submersible High Sensitivity Microwave Sensor for Edible Oil Detection and Quality Analysis. IEEE Sensors Journal 21, 13230–13238 (2021.). 16. Erdoğan,M. i dr. Determination offryingsunfloweroilusagetimefor local potato samples by using microwave transmission line-based sensors. Measurement 163, 108040 (2020.). 17. Rossignol, J. i dr. Critical influence of dielectric sensitive material and manufactured process in microwave gas-sensing: Application of ammonia detection with an interdigital sensor. ACS omega 5, 11507–11514 (2020.). 18. Bogner, A. i dr. Planar microstrip ring resonators for microwave-based gas sensing: Design aspects and initial transducers for humidity and ammonia sensing. Sensors 17, 2422 (2017.). 19. Li, F., Zheng, Y., Hua, C. & Jian, J. Gas sensing by microwave transduction: Review of progress and challenges. Frontiers in Materials 6, 101 (2019.). 20. Li, Z., Xue, Q., Wang, Q., Zhang, H. & Duan, X. Biomolecules detection using microstrip sensor with highly-ordered nanowires array u2019 IEEE SENSORS (2019.), 1–4. 21. Jha, A. K., Havelka, D., Krivosudsk` y, O. & Cifra, M. TRL calibrated coplanar microwave sensor for characterization of biomolecules u2017 IEEE MTT-S International Microwave and RF Conference (IMaRC) (2017.), 1–5. 22. Omer, A. E. i dr. Low-cost portable microwave sensor for non-invasive monitoring of blood glucose level: Novel design utilizing a four-cell CSRR hexagonal configuration. Scientific Reports 10, 1–20 (2020.). 23. Zapasnoy, A. S. i dr. Application of broadband microwave near-field sensors for glucose monitoring in biological media. Applied Sciences 11, 1470 (2021.). 24. Fu, L. i dr. A miniaturized differential microwave microfluidic sensor with high decoupling. IEEE Microwave and Wireless Components Letters 31, 909–912 (2021.). 114 BIBLIOGRAFIJA 106. Morgan, H., Sun, T., Holmes, D., Gawad, S. & Green, N. G. Single cell dielectric spectroscopy. Journal of Physics D: Applied Physics 40, 61 (2006.). 107. Carvell, J. P. & Dowd, J. E. On-line measurements and control of viable cell density in cell culture manufacturing processes using radio-frequency impedance. Cytotechnology 50, 35–48 (2006.). 108. Yoo, T. i dr. The real-time monitoring of drug reaction in HeLa cancer cell using temperature/impedance integrated biosensors. Sensors and Actuators B: Chemical 291, 17–24 (2019.). 109. Pan, Y. i dr. 3D cell-based biosensor for cell viability and drug assessment by 3D electric cell/matrigel-substrate impedance sensing. Biosensors and Bioelectronics 130, 344–351 (2019.). 110. Nasir, N. & Al Ahmad, M. Cells electrical characterization: dielectric properties, mixture, and modeling theories. Journal of Engineering 2020, 1–17 (2020.). 111. Metze, S., Ruhl, S., Greller, G., Grimm, C. & Scholz, J. Monitoring online biomass with a capacitance sensor during scale-up of industrially relevant CHO cell culture fed-batch processes in single-use bioreactors. Bioprocess and biosystems engineering 43, 193–205 (2020.). 112. Matarèse, B. F. i dr. Use of SU8 as a stable and biocompatible adhesion layer for gold bioelectrodes. Scientific reports 8, 5560 (2018.). 113. Nemani, K. V., Moodie, K. L., Brennick, J. B., Su, A. & Gimi, B. In vitro and in vivo evaluation of SU-8 biocompatibility. Materials Science and Engineering: C 33, 4453–4459 (2013.). 114. Berni, A., Mennig, M. & Schmidt, H. u Sol-Gel Technologies for Glass Producers and Users (urednici Aegerter, M. A. & Mennig, M.) 89–92 (Springer US, Boston, MA, 2004.). 115. Huang, T., Yang, G. & Tang, G. A fast two-dimensional median filtering algorithm. IEEE transactions on acoustics, speech, and signal processing 27, 13–18 (1979.). 116. Pizer, S. M. i dr. Adaptive histogram equalization and its variations. Computer vision, graphics, and image processing 39, 355–368 (1987.). 117. Canny, J. A computational approach to edge detection. IEEE Transactions on pattern analysis and machine intelligence, 679–698 (1986.). 118. Sobel, I. & Feldman, G. An Isotropic 3x3 Image Gradient Operator 2015. 119. Soille, P. i dr. Morphological image analysis: principles and applications 3(Springer, 1999.). 120. Ragoisha, G. & Bondarenko, A. EIS spectrum analyser 2016. 121 BIBLIOGRAFIJA 121. Dai, G. i dr. Electrochemical determination of salmonella typhimurium by using aptamer-loaded gold nanoparticles and a composite prepared from a metalorganic framework (type UIO-67) and graphene. Microchimica Acta 186 (2019.). 122. Ma, X., Lin, X., Xu, X. & Wang, Z. Fabrication of gold/silver nanodimer SERS probes for the simultaneous detection of salmonella typhimurium and Staphylococcus aureus. Microchimica Acta 188 (2021.). 123. Chen, M., Pan, L. & Tu, K. A fluorescence biosensor for salmonella typhimurium detection in food based on the nano-self-assembly of alendronic acid modified upconversion and gold nanoparticles. Analytical Methods 13, 2415–2423 (2021.). 124. Bruno, J. G. Syringe filter-based DNA aptamer-enzyme-linked colorimetric assay of salmonella on lettuce. Journal of Microbiological Methods 193, 106406 (2022.). 125. Wang, L. & Lin, J. Recent advances on magnetic nanobead based biosensors: From separation to detection. TrAC Trends in Analytical Chemistry 128, 115915 (2020.). 126. Sumitha, M. & Xavier, T. Recent advances in electrochemical biosensors – A brief review. Hybrid Advances 2, 100023 (2023.). 127. Singh, A. i dr. Recent Advances in Electrochemical Biosensors: Applications, Challenges, and Future Scope. Biosensors 11 (2021.). 128. Wu, J., Liu, H., Chen, W., Ma, B. & Ju, H. Device integration of electrochemical biosensors. Nature Reviews Bioengineering 1, 346–360 (2023.). 129. Pereira da Silva Neves, M. M., González-García, M. B., Hernández-Santos, D. & Fanjul-Bolado, P. Future trends in the market for electrochemical biosensing. Current Opinion in Electrochemistry 10, 107–111 (2018.). 130. Bard, A. J., Faulkner, L. R. & White, H. S. Electrochemical methods: Fundamentals and applications (Wiley, 2022.). 131. Brett, C. & Brett, A. Electrochemistry: Principles, Methods, and Applications isbn: 9780198553885 (Oxford University Press, 1993.). 132. Bagotsky, V. Fundamentals of Electrochemistry isbn: 9780471700586 (Wiley, 2005.). 133. Fisher,A.ElectrodeDynamicsisbn:9780191848988(OxfordUniversityPress,2009.). 134. Guozhang Cao, W. Y. Nanostructures and Nanomaterials: Synthesis, Properties and Applications By Guozhang Cao. isbn: 1-86094-415-9. (Imperial College Press, 2004.). 135. Ozkan, S. A. i dr. Electroanalysis in biomedical and pharmaceutical sciences voltammetry, Amperometry, biosensors, applications (Springer Berlin, 2016.). 136. Elgrishi, N. i dr. A practical beginner’s guide to cyclic voltammetry. Journal of Chemical Education 95, 197–206 (2017.). 122 BIBLIOGRAFIJA 137. Chowdhury, D. R., Spiccia, L., Amritphale, S. S., Paul, A. & Singh, A. A robust iron oxyhydroxide water oxidation catalyst operating under near neutral and alkaline conditions. J. Mater. Chem. A 4, 3655–3660 (2016.). 138. Paixão, T. R. Measuring electrochemical surface area of nanomaterials versus the randlesševčík equation. ChemElectroChem 7, 3414–3415 (2020.). 139. Lazanas, A. C. & Prodromidis, M. I. Electrochemical Impedance SpectroscopyA Tutorial. ACS Measurement Science Au 3, 162–193 (2023.). 140. Bobrinetskiy, I. i dr. Advances in nanomaterials-based electrochemical biosensors for foodborne pathogen detection. Nanomaterials 11, 2700 (2021.). 141. Vidic, J. i dr. Gold surface functionalization and patterning for specific immobilization of olfactory receptors carried by nanosomes. Analytical Chemistry 79, 3280–3290 (2007.). 142. Sui, Y. & Zorman, C. A. Inkjet printing of metal structures for electrochemical sensor applications. Journal of The Electrochemical Society 167, 037571 (2020.). 143. Singh, M., Haverinen, H. M., Dhagat, P. & Jabbour, G. E. Inkjet printing—process and its applications. Advanced materials 22, 673–685 (2010.). 144. Bernalte, E., Marın-Sánchez, C., Pinilla-Gil, E. & Brett, C. M. Characterisation of screen-printed gold and gold nanoparticle-modified carbon sensors by electrochemical impedance spectroscopy. Journal of Electroanalytical Chemistry 709, 70–76 (2013.). 145. https://www.dropsens.com/en/screen_printed_electrodes_pag.html. 146. https://www.palmsens.com/knowledgebase-article/screen-printed-and-filmelectrodes/. 147. https://www.nanoshel.com/product/screen-printed-electrodes-biosensors. 148. Prasertying, P. i dr. Gold leaf electrochemical sensors: Applications and nanostructure modification. Analyst 146, 1579–1589 (2021.). 149. Matsui,Y.,Hamamoto,K.,Kitazumi,Y.,Shirai,O.&Kano,K.Diffusion-controlled mediated electron transfer-type bioelectrocatalysis using microband electrodes as ultimate amperometric glucose sensors. Analytical Sciences 33, 845–851 (2017.). 150. Zamani, M. i dr. Surface requirements for optimal biosensing with disposable gold electrodes. ACS Measurement Science Au 2, 91–95 (2021.). 151. https://barnabasgold.com/how-is-gold-leaf-made/. 152. chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/http://ramontxrf. 260mb.net/Periodic_Table_and_X-ray_Energies.pdf. 123 BIBLIOGRAFIJA 153. Manges, A. R. i dr. Global extraintestinal pathogenic Escherichia coli (ExPEC) lineages. Clinical microbiology reviews 32, 10–1128 (2019.). 154. Kotsiri, Z. i dr. Sensitive detection of E. coli in artificial seawater by aptamercoated magnetic beads and direct PCR. Applied Sciences 9, 5392 (2019.). 155. Marin, M., Nikolic, M. V. & Vidic, J. Rapid point-of-need detection of bacteria and their toxins in food using gold nanoparticles. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety 20, 5880–5900 (2021.). 156. Tang, Y., Li, Z., Luo, Q., Liu, J. & Wu, J. Bacteria detection based on its blockage effect on silicon nanopore array. Biosensors and Bioelectronics 79, 715–720 (2016.). 157. Dastider, S. G., Barizuddin, S., Dweik, M. & Almasri, M. A micromachined impedance biosensor for accurate and rapid detection of E. coli O157: H7. RSC advances 3, 26297–26306 (2013.). 158. Zhang, J. i dr. An on-site, highly specific immunosensor for Escherichia coli detection in field milk samples from mastitis-affected dairy cattle. Biosensors and Bioelectronics 165, 112366 (2020.). 159. El Ichi, S. i dr. Microconductometric immunosensor for label-free and sensitive detection of Gram-negative bacteria. Biosensors and bioelectronics 54, 378–384 (2014.). 160. Bonnet, R. i dr. Highly labeled methylene blue-ds DNA silica nanoparticles for signal enhancement of immunoassays: application to the sensitive detection of bacteria in human platelet concentrates. Analyst 143, 2293–2303 (2018.). 161. Vidic,J.&Manzano,M.Electrochemicalbiosensorsfor rapidpathogendetection. Current Opinion in Electrochemistry 29, 100750 (2021.). 162. Dos Santos, M. B. i dr. Highly sensitive detection of pathogen Escherichia coli O157: H7 by electrochemical impedance spectroscopy. Biosensors and Bioelectronics 45, 174–180 (2013.). 163. Maalouf, R. i dr. Label-free detection of bacteria by electrochemical impedance spectroscopy: comparison to surface plasmon resonance. Analytical chemistry 79, 4879–4886 (2007.). 164. Laczka,O.idr.Improvedbacteriadetectionbycouplingmagneto-immunocapture and amperometry at flow-channel microband electrodes. Biosensors and Bioelectronics 26, 3633–3640 (2011.). 165. Ropero-Vega, J. L., Redondo-Ortega, J. F., Galvis-Curubo, Y. J., Rondón-Villarreal, P. & Flórez-Castillo, J. M. A bioinspired peptide in TIR protein as recognition molecule on electrochemical biosensors for the detection of E. coli O157: H7 in an aqueous matrix. Molecules 26, 2559 (2021.). 124 BIBLIOGRAFIJA 166. Varshney, M. & Li, Y. Interdigitated array microelectrode based impedance biosensor coupled with magnetic nanoparticle–antibody conjugates for detection of Escherichia coli O157: H7 in food samples. Biosensors and Bioelectronics 22, 2408–2414 (2007.). 167. Gunasekaran, D., Gerchman, Y. & Vernick, S. Electrochemical detection of waterborne bacteria using bi-functional magnetic nanoparticle conjugates. Biosensors 12, 36 (2022.). 168. Lin, Y.-H. i dr. Disposable amperometric immunosensing strips fabricated by Au nanoparticles-modified screen-printed carbon electrodes for the detection of foodborne pathogen Escherichia coli O157: H7. Biosensors and Bioelectronics 23, 1832–1837 (2008.). 169. Safavieh,M., Ahmed,M.U., Tolba,M.& Zourob,M.Microfluidic electrochemical assay for rapid detection and quantification of Escherichia coli. Biosensors and Bioelectronics 31, 523–528 (2012.). 170. Fatema, K. N., Liu, Y., Cho, K. Y. & Oh, W.-C. Comparative study of electrochemical biosensors based on highly efficient mesoporous ZrO2-Ag-G-SiO2 and In2O3-G-SiO2 for rapid recognition of E. coli O157: H7. ACS omega 5, 22719– 22730 (2020.). 171. Khan, S. i dr. In Silico and electrochemical studies for a ZnO–CuO-based immunosensor for sensitive and selective detection of E. coli. ACS omega 6, 16076–16085 (2021.). 172. Galikowska, E. i dr. Specific detection of Salmonella enterica and Escherichia coli strains by using ELISA with bacteriophages as recognition agents. European journal of clinical microbiology & infectious diseases 30, 1067–1073 (2011.). 173. Jung, Y. i dr. Prevalence, Levels, and Viability of Salmonella in and on Raw Chicken Livers. Journal of Food Protection 82, 834–843 (2019.). 174. https://collections.plos.org/collection/ferg2015/. 175. https://www.who.int/newsroom/factsheets/detail/salmonella- (nontyphoidal). 176. Authority, E. F. S. & European Centre for Disease Prevention and Control. The European Union One Health 2021 Zoonoses Report. EFSA Journal 20, e07666 (2022.). 177. Kothary, M. H. & Babu, U. S. Infective dose of foodborne pathogens in volunteers : A Review. Journal of Food Safety 21, 49–68 (2001.). 125 BIBLIOGRAFIJA 178. Park, S. i dr. Risk factors for microbial contamination in fruits and vegetables at the preharvest level: a systematic review. Journal of food protection 75, 2055–2081 (2012.). 179. Hanning, I. B., Nutt, J. & Ricke, S. C. Salmonellosis outbreaks in the United States due to fresh produce: sources and potential intervention measures. Foodborne pathogens and disease 6, 635–648 (2009.). 180. Kang, D., Rhee, M. & Costello, M. Development of a miniaturized four-culture method for the rapid enumeration of four bacterial groups in ground beef. Letters in Applied Microbiology 36, 197–202 (2003.). 181. Kumar, R., Surendran, P. & Thampuran, N. Evaluation of culture, ELISA and PCR assays for the detection of Salmonella in seafood. Letters in Applied Microbiology 46, 221–226 (2008.). 182. Santos, P. D., Widmer, K. W. & Rivera, W. L. PCR-based detection and serovar identification of salmonella in retail meat collected from wet markets in Metro Manila, Philippines. PLOS ONE 15 (2020.). 183. Khalid, S. A., Hassan, R. Y. A., El Nashar, R. M. & El-Sherbiny, I. M. Voltammetric determination of Salmonella typhimurium in minced beef meat using a chipbased imprinted sensor. RSC Adv. 12, 3445–3453 (6 2022.). 184. Bu, S.-J. i dr. Ferrocene-functionalized nanocomposites as signal amplification probes for electrochemical immunoassay of Salmonella typhimurium. Microchimica Acta 187, 1–8 (2020.). 185. Huang, F. i dr. An ultrasensitive impedance biosensor for Salmonella detection based on rotating high gradient magnetic separation and cascade reaction signal amplification. Biosensors and Bioelectronics 176, 112921 (2021.). 186. Xiang, C. i dr. Sensitive electrochemical detection of Salmonella with chitosan– gold nanoparticles composite film. Talanta 140, 122–127 (2015.). 187. Afonso, A. S. i dr. Electrochemical detection of Salmonella using gold nanoparticles. Biosensors and Bioelectronics 40. Selected Papers from the World Congress on Biosensors, 121–126 (2013.). 188. Ranjbar, S., Shahrokhian, S. & Nurmohammadi, F. Nanoporous gold as a suitable substrate for preparation of a new sensitive electrochemical aptasensor for detection of Salmonella typhimurium. Sensors and Actuators B: Chemical 255, 1536–1544 (2018.). 126 BIBLIOGRAFIJA 189. Sheikhzadeh, E., Chamsaz, M., Turner, A., Jager, E. & Beni, V. Label-free impedimetric biosensor for Salmonella Typhimurium detection based on poly [pyrroleco-3-carboxyl-pyrrole] copolymer supported aptamer. Biosensors and Bioelectronics 80, 194–200 (2016.). 190. Sadeghi, M., Kashanian, S., Naghib, S. M. & Arkan, E. A high-performance electrochemicalaptasensorbasedongraphene-decoratedrhodiumnanoparticles to detect HER2-ECD oncomarker in liquid biopsy. Scientific Reports 12 (2022.). 191. Dieci, M. V., Miglietta, F., Griguolo, G. & Guarneri, V. Biomarkers for HER2positive metastatic breast cancer: Beyond hormone receptors. Cancer Treatment Reviews 88, 102064 (2020.). 192. Ulman, A. Formation and structure of self-assembled monolayers. Chemical reviews 96, 1533–1554 (1996.). 193. Love, J. C., Estroff, L. A., Kriebel, J. K., Nuzzo, R. G. & Whitesides, G. M. Selfassembled monolayers of thiolates on metals as a form of nanotechnology. Chemical reviews 105, 1103–1170 (2005.). 194. Nyamekye, C. K., Weibel, S. C. & Smith, E. A. Directional Raman scattering spectra of metal–sulfur bonds at smooth gold and silver substrates. Journal of Raman Spectroscopy 52 (2021.). 195. Holze, R. The adsorption of thiophenol on gold–a spectroelectrochemical study. Physical Chemistry Chemical Physics 17, 21364–21372 (2015.). 196. Levin, C. S. i dr. Chain-length-dependent vibrational resonances in alkanethiol self-assembled monolayers observed on plasmonic nanoparticle substrates. Nano Letters 6, 2617–2621 (2006.). 197. Rygula, A. i dr. Raman spectroscopy of proteins: A Review. Journal of Raman Spectroscopy 44, 1061–1076 (2013.). 198. Parkkila, P., Härkönen, K., Ilvonen, P., Laitinen, S. & Viitala, T. Protein A/Gbased surface plasmon resonance biosensor for regenerable antibody-mediated capture and analysis of nanoparticles. Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects 654, 130015 (2022.). 199. Romih, T. i dr. The Effect of Preconditioning Strategies on the Adsorption of Model Proteins onto Screen-Printed Carbon Electrodes. Sensors 22 (2022.). 200. Kittler, S., Besleaga, M., Ebner, J. & Spadiut, O. Protein L—More Than Just an Affinity Ligand. Processes 9(2021.). 201. Shen, C. i dr. Self-Assembled DNA Generated Electric Current Biosensor for HER2 Analysis. Analytical Chemistry 89, 10264–10269 (2017.). 127 BIBLIOGRAFIJA 202. Ou, D. i dr. A dual-aptamer-based biosensor for specific detection of breast cancer biomarker HER2 via flower-like nanozymes and DNA nanostructures. J. Mater. Chem. B 7, 3661–3669 (2019.). 203. Wang, W., Han, R., Chen, M. & Luo, X. Antifouling Peptide Hydrogel Based Electrochemical Biosensors for Highly Sensitive Detection of Cancer Biomarker HER2 in Human Serum. Analytical Chemistry 93, 7355–7361 (2021.). 204. Wignarajah, S., Chianella, I. & Tothill, I. E. Development of Electrochemical Immunosensors for HER-1 and HER-2 Analysis in Serum for Breast Cancer Patients. Biosensors 13 (2023.). 205. Yang, X. i dr. An electrochemical biosensor for HER2 detection in complex biological media based on two antifouling materials of designed recognizing peptide and PEG. Analytica Chimica Acta 1252, 341075 (2023.). 206. Li, D., Zhang, W., Miao, M., Liu, Y. & Yang, H. A high-performance PEDOT:PSS platform electrochemical biosensor for the determination of HER2 based on carboxyl-functionalized MWCNTs and ARGET ATRP. New J. Chem. 47, 15579– 15587 (2023.). 207. Shamsipur, M., Emami, M., Farzin, L. & Saber, R. A sandwich-type electrochemical immunosensor based on in situ silver deposition for determination of serum level of HER2 in breast cancer patients. Biosensors and Bioelectronics 103, 54–61 (2018.). 208. Wang, L. i dr. An electrochemical biosensor to identify the phenotype of aggressive breast cancer cells. Chem. Commun. 59, 3890–3893 (2023.). 209. Zhang, Y. i dr. A novel electrochemical biosensor based on AMNFs@ZIF-67 nano composite material for ultrasensitive detection of HER2. Bioelectrochemistry 150, 108362 (2023.). 210. Bruen, D., Delaney, C., Florea, L. & Diamond, D. Glucose sensing for diabetes monitoring: recent developments. Sensors 17, 1866 (2017.). 211. Chen, C. i dr. Recent advances in electrochemical glucose biosensors: a review. RSC Advances 3, 4473–4491 (2013.). 212. Mishra, G. K., Barfidokht, A., Tehrani, F. & Mishra, R. K. Food safety analysis using electrochemical biosensors. Foods 7, 141 (2018.). 213. Matthews, T. E. i dr. Glucose monitoring and adaptive feeding of mammalian cell culture in the presence of strong autofluorescence by near infrared Raman spectroscopy. Biotechnology progress 34, 1574–1580 (2018.). 214. Amor-Gutiérrez,O.,Costa-Rama,E.&Fernández-Abedul,M.T.basedenzymatic electrochemical sensors for glucose determination. Sensors 22, 6232 (2022.). 128 BIBLIOGRAFIJA 215. Xiao, J. i dr. Microfluidic chip-based wearable colorimetric sensor for simple and facile detection of sweat glucose. Analytical chemistry 91, 14803–14807 (2019.). 216. Scognamiglio, V. & Arduini, F. The technology tree in the design of glucose biosensors. TrAC Trends in Analytical Chemistry 120, 115642 (2019.). 217. Gong, P. i dr. Optical fiber sensors for glucose concentration measurement: A review. Optics & Laser Technology 139, 106981 (2021.). 218. Yu, M. i dr. Gold nanostructure-programmed flexible electrochemical biosensor for detection of glucose and lactate in sweat. Journal of Electroanalytical Chemistry 882, 115029 (2021.). 219. Nunes, J. & Stone, H. Introduction: Microfluidics 7, 6919–6920 (ACS Publications, 2022.). 220. Convery, N. & Gadegaard, N. 30 years of microfluidics. Micro and Nano Engineering 2, 76–91 (2019.). 221. Niculescu, A.-G., Chircov, C., Bırcă, A. C. & Grumezescu, A. M. Fabrication and applications of microfluidic devices: A review. International Journal of Molecular Sciences 22, 2011 (2021.). 222. Agarwal, A.,Salahuddin,A., Wang, H.& Ahamed,M. J.Design anddevelopment of an efficient fluid mixing for 3D printed lab-on-a-chip. Microsystem Technologies 26, 2465–2477 (2020.). 223. Hochstetter, A. Lab-on-a-chip technologies for the single cell level: Separation, analysis, and diagnostics. Micromachines 11, 468 (2020.). 224. Cunha, M. L. i dr. Sample preparation for lab-on-a-chip systems in molecular diagnosis: a review. Analytical Chemistry 94, 41–58 (2021.). 225. Dkhar, D. S., Kumari, R., Malode, S. J., Shetti, N. P. & Chandra, P. Integrated labon-a-chip devices: Fabrication methodologies, transduction system for sensing purposes. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 223, 115120 (2023.). 226. Li, Z. i dr. A review of microfluidic-based mixing methods. Sensors and Actuators A: Physical, 113757 (2022.). 227. Bayareh, M., Ashani, M. N. & Usefian, A. Active and passive micromixers: A comprehensive review. Chemical Engineering and Processing-Process Intensification 147, 107771 (2020.). 228. Chen, Z. i dr. Acoustofluidic micromixers: From rational design to lab-on-a-chip applications. Applied Materials Today 26, 101356 (2022.). 129 BIBLIOGRAFIJA 229. Ding, H. i dr. Mixing mechanism of a straight channel micromixer based on lightactuated oscillating electroosmosis in low-frequency sinusoidal AC electric field. Microfluidics and Nanofluidics 25, 1–15 (2021.). 230. Chen, Y., Fan, X. & Kim, C. N. A new electromagnetic micromixer for the mixing of two electrolyte solutions. Journal of Mechanical Science and Technology 33, 5989– 5998 (2019.). 231. Raza, W., Hossain, S. & Kim, K.-Y. Effective mixing in a short serpentine splitand-recombination micromixer. Sensors and Actuators B: Chemical 258, 381–392 (2018.). 232. Pradeep, A., Raveendran, J., Ramachandran, T., Nair, B. G. & TG, S. B. Computational simulation and fabrication of smooth edged passive micromixers with alternately varying diameter for efficient mixing. Microelectronic Engineering 165, 32–40 (2016.). 233. Duša, A., Podunavac, I., Kojić, S. & Radonić, V. Design and Simulation of Microfluidic Micro-Mixer with Parallelogram Barriers uIEEE EUROCON 2019-18th International Conference on Smart Technologies (2019.), 1–3. 234. Enders, A., Siller, I. G., Urmann, K., Hoffmann, M. R. & Bahnemann, J. 3D printed microfluidic mixers—a comparative study on mixing unit performances. Small 15, 1804326 (2019.). 235. Tabeling, P. Introduction to Microfluidics isbn: 9780199588169 (OUP Oxford, 2010.). 236. SushantaK.Mitra,S.C.MicrofluidicsandNanofluidicsHandbookisbn:9780429093371 (CRC Press, 2012.). 237. Raj M, K. & Chakraborty,S.PDMS microfluidics: A mini review.JournalofApplied Polymer Science 137, 48958 (2020.). 238. Sivashankar, S. i dr. A “twisted” microfluidic mixer suitable for a wide range of flow rate applications. Biomicrofluidics 10 (2016.). 239. Papautsky, I. & Peterson, E. Micromolding. Encyclopedia of Microfluidics and Nanofluidics; Li, D., Ed.; Springer US: Boston, MA, USA, 1256–1267 (2008.). 240. Tsao, C.-W.&Wu, Z.-K. PolymerMicrochannel and Micromold SurfacePolishing for Rapid, Low-Quantity Polydimethylsiloxane and Thermoplastic Microfluidic Device Fabrication. Polymers 12, 2574 (2020.). 241. Phan, T. H. T. & Kim, S.-J. Super-hydrophobic microfluidic channels fabricated via xurography-based polydimethylsiloxane (PDMS) micromolding. Chemical Engineering Science 258, 117768 (2022.). 130