DEVELOPMENT OF A MONOMER IN THE FORM OF A MOLECULAR ADDITION OF METFORMIN WITH BENZOFUROXAN, A NITRIC OXIDE DONOR

__________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 188 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) DESENVOLVIMENTO DE UM MONÔMERO EM FORMATO DE UMA ADIÇÃO MOLECULAR DA METFORMINA COM O BENZOFUROXANO, UM DOADOR DE ÓXIDO NÍTRICO DEVELOPMENT OF A MONOMER IN THE FORM OF A MOLECULAR ADDITION OF METFORMIN WITH BENZOFUROXAN, A NITRIC OXIDE DONOR Kamoni Santos de Souza, Antônio José de Souza Calixto (orientador), Arthur Felinto Mendes Ricciotti (orientador) Universidade Católica de Santos, Iniciação Científica do Ensino Médio, Curso de Farmácia E-mail para contato: [email protected] RESUMO – Diabetes Mellitus (DM) é caracterizada principalmente pela hiperglicemia. A OMS definiu o cloridrato de metformina como medicamento essencial por sua ação antidiabética. Pacientes com DM apresentam angiopatias e neuropatias, causadoras do ferimento crônico UPD devido à baixa concentração de óxido nítrico (NO), neurotransmissor encontrado em baixas concentrações nos pacientes diabéticos. Com o objetivo de remediar danos teciduais, está sendo proposta a criação de uma adição molecular entre a metformina e o benzofuroxano (doador de NO) com uma composição monomérica, como forma de amenizar os danos causados pela baixa concentração de óxido nítrico. Palavras-chave: Metformina; Benzofuroxano; Adição Molecular; Fármaco. ABSTRACT – Diabetes mellitus (DM) is mainly characterized by hyperglycemia. The WHO has defined metformin hydrochloride as an essential medicine due to its antidiabetic action. Patients with DM have angiopathies and neuropathies, which cause chronic UPD injury due to low concentrations of nitric oxide (NO), a neurotransmitter found in low concentrations in diabetic patients. To remedy tissue damage, the creation of a molecular addition between metformin and benzofuroxan (NO donor) with a monomeric composition is being proposed as a way to mitigate the damage caused by low nitric oxide concentration. Keywords: Metformin, Benzofuroxan, Molecular Addition, Drug __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 189 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) 1 INTRODUÇÃO A Diabetes Mellitus (DM) é um conjunto de doenças crônicas caracterizadas pela hiperglicemia. Essa patologia é dividida em 2 grupos, a DM Tipo 1, definida como deficiência absoluta na secreção de insulina, e a DM Tipo 2, apresentada como deficiência parcial na secreção da insulina e uma resistência parcial à insulina. Pacientes de ambas DM apresentam angiopatias através da baixa circulação sanguínea nas regiões periféricas e lesões nos vasos; e neuropatias evidenciadas na perda da sensibilidade nervosa. Estas complicações patológicas da DM acarretam o desenvolvimento da Úlcera do Pé Diabético (UPD) (De Paula, 2008; American Diabetes Association, 2010; SBD, 2019). O desenvolvimento de UPDs se dá pela estagnação na fase inflamatória no processo da cicatrização dos tecidos, tendo em vista que, a regeneração dos tecidos necessita do óxido nítrico (NO) para o êxito cicatricial. O neurotransmissor NO em pessoas portadoras da DM é encontrado em baixa concentração; ademais sua ação imunorreguladora no trato gastrointestinal é evidenciada pela pesquisa desenvolvida por Villa et al. (2006) (Flora Filho; Zilberstein, 2000; Malone-Povolny; Maloney; Schoenfisch, 2019) Devido a necessidade de intervenção medicamentosa em alguns portadores de DM, a Organização Mundial da Saúde (OMS), apresentou como medicamento essencial para o tratamento da DM o cloridrato de metformina, que atua como fármaco antidiabético por meio da diminuição da absorção da glicose nos intestinos, melhora da sensibilidade à insulina e redução da produção de glicose no fígado (Brasil, 2000; Metformin, 2023). Dessa forma, a partir do artigo de Koh et al. (2013), que apresenta uma adição molecular da metformina com outros ácidos, está sendo sugerida a criação de um fármaco por meio de uma adição molecular na forma de um monômero da metformina e do benzofuroxano (doador de NO). O benzofuroxano se juntaria com a molécula de metformina, gerando um fármaco por adição molecular, que manteria a funcionalidade da metformina e abrandaria as complicações da DM pelo doador de NO. O presente estudo tem como objetivo o desenvolvimento de um fármaco a partir de uma adição molecular da metformina com o benzofuroxano, buscando abrandar os efeitos que as angiopatias e neuropatias causam nos portadores de DM. Destrinchando este objetivo, devemos alcançar por meio da pesquisa, a geração do benzofuroxano a partir de uma rota sintética, a obtenção da metformina com suas aminas livres e a síntese do fármaco utilizando as __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 190 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) características de ácido do benzofuroxano com a base, levando a formação de um produto de adição molecular entre ambos por uma reação entre o ácido e a base. 2 METODOLOGIA Por meio de pesquisa experimental, foram utilizada uma abordagem retrossintética para a ordenação da obtenção dos compostos. A coleta de dados foi realizada através das características químicas e físicas apresentadas pelas moléculas obtidas, sendo sua análise realizada por meio da Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC). Figura 1: Retrossíntese. 2.1 Síntese do Benzofuroxano (4.1) A preparação do benzofuroxano foi orientada a partir de um estudo “Síntese, propriedades espectroscópicas, eletroquímicas e antioxidantes de derivados de benzofuroxano e 2H-benzimidazol 1,3-dióxido derivados: Efeitos da conjugação com receptor de elétrons 1,2,3-triazol-1,2,4-oxadiazol” (Mayer, et al. (2024), tradução nossa). Figura 2: Obtenção do Benzofuroxano (4.1). Condições: i) KOH, EtOH, 343,15K, 300s; resfriar até 273,15K, NaClO aquoso, 273,15-278,15K, 3.600s; então, HCl aquoso. Em um erlenmeyer com capacidade de 2,5×104m3, foi diluído 5×104kg (2,75 mmol) de ácido 4-amino-3-nitrobenzóico em 2,7×105m3 de etanol, após a dissolução, foi adicionado __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 191 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) 3,02×104kg (5,38 mmol) de KOH e mistura foi submetida à aquecimento até a temperatura de 343,15K; ao submeter o aquecimento a mistura, é evidente a aparição de um precipitado alaranjado, a mistura foi resfriada até alcançar uma temperatura na faixa de 273,15-278,15K. Após alcançar a faixa de temperatura desejada, foram adicionados 2,7×105m3 de hipoclorito de sódio 5% de maneira controlada por 1.800s com o sistema em agitação, logo depois da adição do hipoclorito de sódio, a mistura se manteve em agitação por 5.400s. A solução gerada passou pelo processo de acidificação com HCl 6m até o pH 1, aferido com auxílio de fitas de pH, após essa acidificação, foram adicionados 4,05×105m3 de água destilada, a mistura resultante deste processo foi extraída com clorofórmio (3 vezes 2,7×105m3). Por fim, a fase orgânica foi seca com sulfato de sódio anidro, filtrada e teve o solvente removido por rotoevaporação. Em seguida, a mistura foi submetida a uma recristalização com clorofórmio e isolada. 2.2 Obtenção da Metformina Livre (6) A preparação da metformina livre foi orientada pelo artigo “Um novo derivado da metformina, HL010183, inibe a proliferação e a invasão de células de câncer de mama triplonegativas” (Koh, et al. (2013), tradução nossa). 2.2.1. Obtenção das Metforminas Livres 1, 2, 3 e 4 Figura 3: Obtenção da Metformina Livre (6). Em um erlenmeyer com capacidade de 2,5×104m3, foi dissolvido 2,006×104kg (1,21 mmol) de cloridrato de metformina em 4×106m3 de isopropanol (i-PrOH), após a dissolução do cloridrato de metformina, foi adicionado 8,8×105kg (1,57 mmol) de hidróxido de potássio (KOH) ao erlenmeyer. Essa mistura foi submetida ao aquecimento até alcançar a temperatura de 323,15K e ficou em agitação por 7.200s com auxílio de um aquecedor e agitador magnético, e uma barra magnética; após esse processo, foram adicionados 5×106m3 de acetona para a solubilização da metformina, em seguida a solução foi filtrada a vácuo e para o total __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 192 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) aproveitamento do composto, o erlenmeyer foi lavado duas vezes com aproximadamente 9×106m3 de isopropanol. Com a metformina ficando na parte filtrada, devido sua dissolução na acetona, a mistura foi transferida para um balão e conectada a um sistema de destilação a vácuo para a retirada dos solventes, o processo de destilação a vácuo ocorreu 2 vezes, com a presença de aquecimento através de um banho de vaselina e agitação com auxílio de um agitador e uma barra magnética, e buscando uma extração total dos solventes da metformina, foi utilizado uma fonte de calor em um sistema a vácuo para extinguir a presença de solventes na forma livre da metformina. 2.2.2. Obtenção da Metformina Livre 5 Em um erlenmeyer com capacidade de 2,5×104m3, foi dissolvido 4×104kg (2,42 mmol) de cloridrato de metformina em 7×106m3 de isopropanol (i-PrOH), após a dissolução do cloridrato de metformina, foi adicionado 1,4×104kg (2,5 mmol) de hidróxido de potássio (KOH) ao erlenmeyer. Essa mistura foi submetida ao aquecimento até alcançar a temperatura de 323,15K e ficou em agitação por 7.200s com auxílio de um aquecedor e agitador magnético e uma barra magnética; após esse processo, foram adicionados 1×105m3 de acetona para a solubilização da metformina, em seguida a solução foi filtrada a vácuo e para o total aproveitamento do composto, o erlenmeyer foi lavado duas vezes com aproximadamente 7×106m3 de isopropanol e 1×105m3 de acetona. Com a metformina ficando na parte filtrada, devido sua dissolução na acetona, a mistura foi transferida para um balão e conectada a um sistema de destilação a vácuo para a retirada dos solventes, o processo de destilação a vácuo ocorreu 2 vezes. No primeiro processo de destilação, foi utilizado o aquecedor e agitador magnético para melhorar as condições de entropia do sistema, o banho de vaselina foi usado para aquecer o sistema de maneira uniforme e promover uma melhor retirada dos solventes, já na 2º destilação a vácuo, foram adicionados mais 1×105m3 de isopropanol e 2,5×105m3 de acetona, e o aquecimento foi retirado, mas a agitação continuou. Após a máxima secagem do material na destilação a vácuo, o composto foi depositado em um vidro de relógio e mantido na estufa por aproximadamente 432.000s ininterruptos, neste período de tempo, a temperatura foi controlada no intervalo de 338,15-343,15K. __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 193 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) 2.3 Obtenção do Monômero de Metformina com Benzofuroxano (7) Figura 4: Obtenção do Monômero de Metformina com o Benzofuroxano (7) Em um erlenmeyer foi dissolvido 7,2×105kg (0,56 mmol) da metformina em 8×106m3 de isopropanol, após a dissolução da metformina, foi adicionado 7,94×105kg (0,44 mmol) de benzofuroxano. Essa mistura foi aquecida e mantida na temperatura de 323,15K durante 7.200s de agitação com auxílio de uma barra magnética e de um aquecedor e agitador magnético. Após esse processo, foram adicionados 2×105m3 de acetato de etila para a formação de um precipitado, em seguida a solução foi filtrada a vácuo, e para o total aproveitamento o erlenmeyer foi lavado com 9×106m3 de acetona e 5×106m3 de isopropanol. O resíduo de filtração foi retido em um papel de filtro, que posteriormente foi mantido em local ventilado para a total evaporação dos solventes. 3 RESULTADOS E DISCUSSÃO 3.1 Obtenção do Benzofuroxano Foi obtido 3,8×104kg (76% de rendimento) do suposto benzofuroxano, com tonalidade alaranjada e textura sólida, apresentando Ponto de Fusão (PF) entre 395,15-398,65K. Conforme sugestão do orientador, essa molécula passou por duas etapas de análise, uma antes de sua recristalização e outra após. A divisão das etapas de análise foi fundamentada no empirismo, que previa uma alta taxa de pureza e de acordo com o PF esperado sem ser submetida ao processo de recristalização, no entanto, os resultados obtidos da primeira análise foram discrepantes se comparados com os resultados do artigo de Mayer et al. (2024), no artigo é descrito o rendimento de 75% e PF entre 397,75-398,65K, já o composto obtido antes da recristalização apresentava rendimento de 96,7% e PF entre 391,15-393,15K. __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 194 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) 3.2 Métodos de Obtenção da Metformina Livre Posto que, é necessário a molécula da metformina estar com suas aminas livres para a formação da adição molecular, foram testadas diversas rotas sintéticas buscando esse resultado. Na primeira rota, houve a tentativa de obtenção por meio da adição de hidróxido de sódio (NaOH), referenciado por Aurélio (2021). Este método consiste na alteração do pH da solução, que indicaria a disponibilidade de aminas livres, e a posterior extração. Inicialmente este método se mostrou promissor alterando o pH da solução, no entanto, após um período de tempo, o pH voltava a contração inicial; os resultados não foram promissores pois a metformina é considerada uma solução tampão. A segunda rota foi sugerida pelo orientador, com a finalidade empírica, sendo usado o carbonato de sódio (Na2CO3) com a finalidade de alterar o pH da solução com o cloridrato de metformina. Ao utilizarmos o NaOH, que é considerado uma solução básica forte, vimos que a força dessa solução não foi suficiente para a liberação das aminas da metformina, dito isso, houve a sugestão de utilizar uma solução mais fraca para analisarmos a reação da molécula. Utilizando o mesmo parâmetro reacional do primeiro método, o pH, vimos que ao adicionarmos o Na2CO3, não alterada em nada o pH da solução. A terceira rota foi realizada uma tentativa de obtenção por intermédio do artigo de Koh et al. (2013), que na primeira tentativa de obtenção, houve sucesso reacional e a formação da suposta metformina livre. 3.3 Obtenção das Metforminas 1, 2, 3 e 4 3.3.1. Metformina 1 Foi obtido 1,76×104kg (70% de rendimento) da suposta metformina livre 1, com tonalidade bege e textura sólida, detinha PF entre 392,15-393,15K. Figura 5: HPLC Metformina 1. __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 195 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) A partir de uma análise do HPLC, podemos identificar a falta de pureza na suposta molécula de metformina 1. De acordo com a pesquisa de Koh et al. (2013), o PF é correspondente, visto que, em sua pesquisa ele apresente PF entre 392,15-393,15K, entretanto, o autor descreve o seu composto como um “sólido branco”, divergindo na coloração do composto adquirido em nossa reação. Essa mudança de tonalidade pode indicar divergência do composto obtido para o composto desejado, mas, com a apresentação de PF idêntico ao esperado, a alteração de tonalidade teve baixo impacto na continuidade sintética. 3.3.2. Metformina 2 Foi obtido 2,039×104kg (41% de rendimento) da suposta metformina livre 2, com tonalidade inicial bege e textura sólida e tonalidade final esverdeada com textura sólida, detinha PF entre 386,15-387,15K. Figura 6: HPLC Metformina 2. Figura 7: Comparativo de Tonalidades Metformina 2. __________________________________________________________________________________ Anais do Congresso Brasileiro de Iniciação Científica Vol2 nº4 (2025) 196 Ensino Médio (Ciências Exatas, Ciências Biológicas e da Saúde, Ciências Sociais) Na figura 7, podemos identificar, da esquerda para a direita, o primeiro balão que contém a suposta metformina 2 com sua tonalidade inicial e o segundo balão, que contém a metformina 2 com sua tonalidade alterada. Ao fim do processo reacional, o composto foi armazenado em local protegido da luz, sua tonalidade inicial era semelhante a suposta primeira metformina, no entanto, alguns dias depois, quando o composto foi verificado, sua coloração se encontrava esverdeada, mas, os padrões de PF continuavam como o esperado para a metformina com aminas livres. Devido sua alteração de cor, o composto foi submetido a novos processos de purificação, acarretando o seu baixo rendimento; entretanto, não foi possível remover essa tonalidade esverdeada. Os processos que envolviam esse composto foram realizados da mesma forma, buscando analisar, de maneira empírica, o comportamento dessa molécula, supostamente impura. Paralelamente, com a análise no HPLC da suposta molécula de metformina 2, podemos perceber um pico quase que único, indicando uma alta pureza do composto obtido. 3.3.3. Metformina 3 e 4 Ambas metformina tiveram sua coleta impossibilitada devido a textura viscoso dos compostos, resultando na ausência de teste de PF e aferição de seu rendimento. 3.4 Obtenção da Metformina 5 Foi obtido 3,1×104kg (77,5% de rendimento) da suposta metformina livre 5, com tonalidade bege clara e textura sólida, detinha PF entre 388,15-403,15K. Após a sequência de resultados inconclusivos, houve a alteração de alguns passos para a formação do composto desejado, essa alteração teve como justificativa a percepção visual, que identificou a alteração da textura do composto no processo da segunda destilação a vácuo. Diante dessa alteração reacional, o composto se apresentou menos viscoso, entretanto, continuava apresentando dificuldade na hora de coletar o composto gerado. A partir do manuseio para a retirada do composto do balão reacional, percebemos que ao deixar o composto exposto ao ambiente, ele se apresentava mais viscoso, resultando na conclusão que: a metformina absorve a umidade do ar, sabendo disto, submetemos o composto ao processo de secagem, que possibilitou sua coleta e análise. Ao compararmos a facilidade de obtenção da suposta metformina 1 com a dificuldade de sua obtenção depois da suposta metformina 2, podemos considerar que, com o processo de