PROCEDIMENTOS FÍSICO-QUÍMICOS PARA ANÁLISES DOS INDICADORES DE DETERIORAÇÃO EM AMOSTRAS DE MEL

Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 1 Publicação do Grupo de Pesquisa Insecta do Centro de Ciências Agrárias, Ambientais e Biológicas da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia. ____________________________________________________________________ PROCEDIMENTOS FÍSICOQUÍMICOS PARA ANÁLISES DOS INDICADORES DE DETERIORAÇÃO EM AMOSTRAS DE MEL Nadison Barbosa Santana Samira Maria Peixoto Cavalcante da Silva Carlos Borges Filho Emerson Dechechi Chambó Geni da Silva Sodré Carlos Alfredo Lopes de Carvalho DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.18012337 Boletim Técnico-Científico Insecta Volume 5 | Número 1 2025 Cruz das Almas – Bahia – Brasil ISSN: 2763-6887 Sobre os Autores: Nadison Barbosa Santana é Engenheiro Agrônomo/UFRB e Mestrando em Ciências Agrárias/UFRB. Samira Maria Peixoto Cavalcante da Silva é Engenheira Agrônoma/UFRB, Mestre em Ciência Animal/UFRB e Doutora em Ciências Agrárias/UFRB com estágio sanduiche no Instituto Politécnico de Bragança, Portugal Carlos Borges Filho é Bacharel em Ciência e Tecnologia de Alimentos/UNIPAMPA, Mestre e Doutor em Bioquímica/UNIPAMPA e Doutor em Ciência e Tecnologia dos Alimentos/UFSM Emerson Dechechi Chambó é Biólogo e Mestre em Zootecnia/UNIOESTE e Doutor em Zootecnia/UEM Geni da Silva Sodré é Engenheira Agrônoma/UFBA, Mestre em Ciências (Entomologia)/USP e Doutor em Ciências (Entomologia)/USP. Carlos Alfredo L. de Carvalho é Engenheiro Agrônomo/UFBA, Mestre em Ciências Agrárias/UFBA e Doutor em Ciências (Entomologia)/USP. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 2 Apresentação O Boletim Técnico Científico Insecta tem por objetivo divulgar técnicas e informações científicas de aplicação na entomologia e áreas afins, de maneira clara e objetiva, contribuindo para suprir lacunas da literatura brasileira ou ampliando as informações disponíveis sobre temas específicos, focando no estudo dos insetos, seus produtos ou nas suas relações com outras áreas do conhecimento. Pretende-se colaborar na divulgação de técnicas e ferramentas que ajudem na execução de ensaios técnicos e científicos, assim como, revisões e impressões sobre temas específicos da entomologia e áreas correlatas. Neste número  abordado o tema PROCEDIMENTOS FÍSICOQUÍMICOS PARA ANÁLISES DOS INDICADORES DE DETERIORAÇÃO EM AMOSTRAS DE MEL, o quarto e último número consecutivos sobre a temática, uma importante contribuição para os interessados no desenvolvimento de produtos e subprodutos biotecnológicos das abelhas. Conselho Editorial Sobre o Grupo de Pesquisa Insecta: Durante o período da UFBA (1992-2005), passaram pelo INSECTA, em algum nível de formação, os seguintes profissionais (em ordem alfabética): Adriana Martins da Silva Bastos, Adriana P. S. de Almeida, Adriano Fernandes Vinhas, Alberto Magno Matos de Almeida, Alina Cecília Alves Magalhães; André Leonardo Vasconcelos Souza; Andréia Santos do Nascimento; Antônio Jorge de Araújo Carvalho; Antônio Marcos da Silva Neves; Bruno Costa de Magalhães; Bruno de Almeida Souza; Candice Ferreira de Brito Damasceno; Carlos Augusto Vital; Carlos Costa Bichara Filho; Carlos Henrique Pereira Viana; Cecínio dos Santos Neto; Cerilene Santiago Machado; Cosme da Silva Farias; Cristovam Alves de Lima Júnior; Denilce Menezes Lopes; Edmilson Santos Silva; Edson Fernandes Araújo; Emile Suze da Paz Santos; Eveline Germano; Florisvaldo Mesquita dos Santos; Geni da Silva Sodré; Gilberto Marcos de Mendonça Santos; Gilberto Mascarenhas Dias; Gilson Oliveira Santana; Henrique Batalha Filho; Isabelle Brito Leite; Ivanete Melo Sobral; Jaylson Araujo dos Santos; João Anízio Dourado Mendes; Jomary Maurícia Leite Serra; Jorge de Andrade dos Santos; José Carlos Araújo Mercês Júnior; José Dionísio Borges de Macêdo; Jucelho Dantas da Cruz; Jucinalva Bastos de Almeida Costa; Juraci Nunes dos Santos Júnior; Kely Tomaz Souza; Lana Clarton; Lorena Andrade Nunes; Luciana de Jesus Rodrigues; (continua no próximo número). Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 PROCEDIMENTOS FÍSICO-QUÍMICOS PARA ANÁLISES DOS INDICADORES DE MATURIDADE DO MEL Nadison Barbosa Santana1*, Samira Maria Peixoto Cavalcante da Silva2, Carlos Borges Filho3, Emerson Dechechi Chambó4, Geni da Silva Sodré5 & Carlos Alfredo Lopes de Carvalho6 DOI: https://doi.org/10.5281/zenodo.18012337 _____________________________________________________________________________ 1 Discente do Curso de Mestrado em Ciências Agrárias da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas-BA. https://orcid.org/0000-0003-2976-2650 2 San’Mielle Hidromelaria Ltda, Cruz das Almas-BA. https://orcid.org/0000-0001-8275-4575 3 Docente da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas-BA. https://orcid.org/0000-00022744-5945 4 Docente da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas-BA. https://orcid.org/0000-00033507-3106 5 Docente da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas-BA. http://orcid.org/0000-0002-61844720 6 Docente da Universidade Federal do Recôncavo da Bahia (UFRB), Cruz das Almas-BA. http://orcid.org/0000-00023306-3003 * Autor correspondente: [email protected] _____________________________________________________________________________ Resumo: Este manual técnico descreve os procedimentos físico-químicos utilizados na determinação dos principais indicadores de deterioração do mel: acidez, atividade diastásica e teor de hidroximetilfurfural (HMF). As metodologias apresentadas seguem protocolos reconhecidos por órgãos reguladores, possibilitando a avaliação da qualidade do mel conforme os critérios exigidos pela legislação vigente. Palavras-chave: Análise instrumental; Produtos apícolas; Qualidade do mel. Abstract: This technical manual describes the physicochemical procedures used to determine the main indicators of honey deterioration: acidity, diastase activity, and hydroxymethylfurfural (HMF) content. The methodologies presented follow protocols recognized by regulatory agencies, enabling the assessment of honey quality according to the criteria required by current legislation. Keywords: Instrumental analysis; Bee products; Honey quality. O mel é uma substância elaborada pelas abelhas a partir do néctar, uma secreção floral rica em açúcares como frutose e glicose. Sua composição varia conforme as fontes vegetais, espécies de abelhas, condições meteorológicas, estágio de maturação e práticas de manejo, fatores que influenciam diretamente sua qualidade (SILVA et al., 2021). O controle de qualidade é essencial para assegurar que o produto atenda aos padrões aceitáveis. As análises físicoquímicas exigidas pela legislação brasileira (BRASIL, 2000) para garantir a qualidade do mel puro incluem indicadores de deterioração como acidez, atividade diastásica e teor de hidroximetilfurfural (HMF), cujos níveis podem refletir práticas inadequadas de processamento e armazenamento (SILVA et al., 2020; SILVA et al., 2021; BRASIL, 2023). Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 2 Acidez A acidez do mel está diretamente relacionada à presença de ácidos orgânicos, os quais ocorrem naturalmente em diferentes proporções conforme a origem botânica do néctar. Entre os principais ácidos identificados estão o ácido glucônico predominante além do tartárico, málico, cítrico e succínico, que conferem características sensoriais específicas ao produto (SUTO; KAWASHIMA; NAKAMURA, 2020; KEKE; CINKMANIS, 2019; SUN et al., 2023). A intensidade da acidez pode ser influenciada por práticas de processamento, como o aquecimento, que afeta não apenas a acidez, mas também os teores de açúcares redutores e a atividade enzimática (SILVA et al., 2022). Estudos demonstram que a acidez é um dos parâmetros-chave na avaliação da estabilidade e qualidade microbiológica do mel, com impacto direto na sua segurança alimentar (ALAM et al., 2023). A acidez livre é expressa em miliequivalentes por quilograma (meq·kg⁻¹) e determinada por titulação ácido-base utilizando solução de NaOH 0,05 N e fenolftaleína como indicador (A.O.A.C., 1990). O princípio analítico baseia-se na neutralização dos ácidos presentes, sendo que o ponto final da titulação é caracterizado pelo surgimento de coloração rosa persistente por 10 segundos. De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel (BRASIL, 2000), o valor máximo permitido de acidez livre é de 50 meq·kg⁻¹, sendo valores superiores indicativos de fermentação, degradação ou adulteração. pH O pH do mel representa a concentração de íons hidrogênio livres na matriz aquosa do produto, estando diretamente associado à sua acidez potencial. Em geral, os valores de pH do mel variam entre 3,4 e 6,1, com média aproximada de 3,9, refletindo sua natureza levemente ácida (IURLINA; FRITZ, 2005). Essa acidez contribui para a estabilidade microbiológica do mel, inibindo o crescimento de bactérias, leveduras e fungos, e atuando como um fator natural de preservação (ALAM et al., 2023). Além disso, o pH influencia diretamente a formação de compostos de degradação térmica, como o hidroximetilfurfural (HMF), sendo considerado um parâmetro crítico no monitoramento da integridade química do mel (CARVALHO et al., 2005). Condições mais ácidas favorecem reações de Maillard, caramelização e desidratação de açúcares, sobretudo quando associadas ao aquecimento excessivo, favorecendo a formação de HMF (LORENTE et al., 2023). Embora o pH não seja um parâmetro exigido pela legislação brasileira para o controle de qualidade do mel (BRASIL, 2000). É reconhecido que a acidez titulável constitui um parâmetro Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 3 analítico qualitativo relevante na avaliação da acidez de alimentos, sendo amplamente utilizada em conjunto com outras análises físico-químicas para caracterizar propriedades de qualidade sensorial e composição ácido-base dos produtos alimentícios (SADLER; MURPHY, 2010). A determinação do pH é realizada por leitura direta em pHmetro devidamente calibrado com soluções tampão padrão (pH 7,0 e pH 4,0), utilizando-se amostras diluídas em água destilada. O intervalo ideal para o pH do mel situa-se entre 3,5 e 4,5, o que favorece sua estabilidade físico-química e prolonga a conservação do produto (BRASIL, 2023). Atividade diastásica A atividade diastásica refere-se à ação da enzima diástase (α-amilase), presente naturalmente no mel, cuja principal função é a hidrólise de polissacarídeos, como o amido, em açúcares redutores. Essa enzima é secretada pelas glândulas salivares e hipofaríngeas das abelhas operárias, sendo sensível a condições de processamento térmico e ao tempo de armazenamento (VOLDŘICH et al., 2009; MESKELE et al., 2022). Do ponto de vista analítico, a atividade da diástásica é um indicador amplamente utilizado para avaliar o frescor do mel e a ocorrência de degradações enzimáticas induzidas por calor. Altas temperaturas, mesmo por curtos períodos, podem inativar a enzima, comprometendo a qualidade e autenticidade do produto (ANTONY; BALACHANDRAN; MOHANAN, 2014; HUANG et al., 2019). Portanto, o monitoramento da atividade diastásica é essencial tanto para os apicultores quanto para os laboratórios de controle de qualidade. A metodologia descrita baseia-se no princípio do método descrito por Schade et al. (1958) e posteriormente modificado por White et al. (1959) e Hadorn (1961), é reconhecido e descrito Codex Alimentarius (CAC, 1990). A técnica consiste na preparação de uma solução tamponada de amido-mel, que é submetida à incubação em banho-maria a 40 °C. Em intervalos regulares, são retiradas alíquotas da mistura, às quais se adiciona solução de iodo. A absorbância é medida a 660 nm, sendo o ponto final determinado quando se atinge o valor inferior a 0,235. A atividade diastásica é expressa em unidades Göthe, correspondendo ao volume (em mL) de solução de amido a 1% hidrolisado por 1 g de mel em 1 hora, a 40 °C. De acordo com o Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade (BRASIL, 2000), méis de qualidade aceitável devem apresentar no mínimo 8 unidades Göthe. Para méis com baixa atividade enzimática natural, permite-se o limite mínimo de 3 unidades, desde que o teor de HMF seja inferior a 15 mg·kg⁻¹. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 4 Hidroximetilfurfural (HMF) O hidroximetilfurfural (HMF) é um composto orgânico formado a partir da degradação térmica de monossacarídeos, como glicose e frutose, sob condições ácidas e de aquecimento. Sua presença no mel é um marcador amplamente reconhecido para avaliar a qualidade, o frescor e o grau de processamento térmico a que o produto foi submetido (LORENTE et al., 2023). A formação de HMF ocorre por diferentes mecanismos, incluindo reações de Maillard, caramelização e desidratação ácida de hexoses, sendo intensificada por altas temperaturas e períodos prolongados de armazenamento (SILVA et al., 2020; TOLEDO et al., 2022). Em concentrações elevadas, o HMF pode indicar práticas inadequadas de processamento ou conservação, além de estar associado a potenciais riscos toxicológicos (NESRIN, 2022). Por essas razões, o HMF é classificado como um contaminante químico de processamento, sendo monitorado por órgãos reguladores em diversos países. A legislação brasileira, por meio da Instrução Normativa nº 11 (BRASIL, 2000), estabelece que o teor máximo permitido de HMF no mel é de 60 mg·kg⁻¹. No entanto, valores inferiores são recomendados para méis considerados frescos ou de qualidade superior. Em casos de baixa atividade diastásica (< 8 unidades Göthe), o limite de HMF não deve ultrapassar 15 mg·kg⁻¹. A determinação do HMF é realizada por espectrofotometria na região do ultravioleta, com leitura da absorbância em 284 nm (máxima absorção do HMF) e 336 nm (para correção de interferências), conforme descrito nos métodos oficiais da AOAC (1990). O cálculo do teor de HMF é baseado na diferença de absorbâncias, ajustada pelo fator de diluição e pelo peso da amostra, segundo a equação validada pelo Codex Alimentarius (CAC, 1990). Estudos experimentais demonstram que o aquecimento do mel a temperaturas acima de 60 ºC por longos períodos resulta em aumento exponencial da concentração de HMF, frequentemente ultrapassando os limites estabelecidos pelas normas técnicas (LORENTE et al., 2023). Assim, o controle da temperatura durante o processamento e a adequação das condições de armazenamento são essenciais para garantir a estabilidade química e a segurança do produto. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 5 Procedimentos para análises: pH (AOAC, 1990) Materiais: Balança analítica Medidor de pH Bécher de 100 mL Bastão de vidro Determinação do pH Soluções tampão utilizadas: • Solução tampão padrão pH 7,0 • Solução tampão padrão pH 4,0 Procedimento I: calibração do pHmetro 1º Passo: ligar o equipamento (pHmetro); 2º Passo: lavar o eletrodo com água destilada; 3º Passo: inserir o eletrodo na solução tampão pH 7,0 e aguardar estabilização da leitura até apresentar três pontos de igualdade ou leitura constante;4º Passo: lavar novamente o eletrodo e realizar a calibração com a solução tampão pH 4,0. Observação: Não é necessária a calibração com solução tampão pH 3,0 para este procedimento. O procedimento descrito é visualmente esquematizado na Figura 1. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 6 Figura 1. Representação esquemática do procedimento para calibração do pHmetro e determinação do pH em amostras de mel. Procedimento II: preparo da amostra e análise 1º Passo: pesar 10,0 g da amostra de mel; 2º Passo: adicionar 75 mL de água destilada; 3º Passo: homogeneizar a solução até completa dissolução; 4º Passo: realizar a leitura direta do pH com eletrodo devidamente calibrado. Observação: cada amostra de mel deve ser analisada em, no mínimo, três repetições, a fim de assegurar a reprodutibilidade dos resultados. O procedimento descrito para preparo da amostra e leitura direta do pH está representado na Figura 2. Figura 2. Representação esquemática do procedimento de preparo da amostra e leitura direta do pH. Observação: a determinação do pH pode ser realizada em paralelo com a análise de acidez. Para isso, deve-se iniciar com o preparo da amostra, conforme descrito na Figura 1. Em Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 7 seguida, realiza-se a leitura direta no pHmetro, e, posteriormente, procede-se com a titulação para determinação da acidez livre (Figura 6). ACIDEZ (A.O.A.C, 1990) Materiais: Balança analítica Agitador magnético Barra magnética (peixinho Bastão de vidro Bécher de 100 mL Bureta em um suporte universal Reagentes • Hidróxido de sódio (NaOH). • Fenolftaleína (C₂₀H₁₄O₄). • Etanol anidro (C₂H₅OH). Procedimento I: preparação da solução de NaOH 0,1 mol·L⁻¹ A solução de hidróxido de sódio deve ser preparada no dia da análise, a fim de garantir estabilidade e precisão na titulação. 1° Passo: pesar 4,1 g de hidróxido de sódio (NaOH) sólido; 2° Passo: dissolver completamente o NaOH em uma pequena quantidade de água destilada; 3° Passo: Transferir quantitativamente a solução para um balão volumétrico de 1.000 mL e completar o volume com água destilada. Observação: caso seja necessário ajustar o volume total da solução conforme a quantidade de amostras analisadas, recomenda-se aplicar regra de três proporcional para manter a concentração final desejada (0,1 mol·L⁻¹). Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 14 Figura 10. Representação esquemática do procedimento de preparo da solução de cloreto de sódio 0,5 mol·L⁻¹. Procedimento V: preparo da solução de amido solúvel 1º Passo: pesar 2,0 g de amido solúvel anidro; 2º Passo: misturar com 90 mL de água destilada em um erlenmeyer de 250 mL; 3º Passo: levar rapidamente à ebulição sob agitação constante. Após o início da fervura, reduzir o aquecimento e manter em ebulição moderada por 3 minutos. Em seguida, cobrir o frasco e deixar esfriar à temperatura ambiente; 4º Passo: transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Observação: esta solução deve ser preparada no mesmo dia da análise. O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 11. (solúvel na figura) Figura 11. Representação esquemática do procedimento de preparo da solução de amido solúvel. Procedimento VI: padronização da solução de amido 1º Passo: pipetar 5,0 mL da solução de amido em um frasco contendo 10 mL de água destilada e homogeneizar a mistura; Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 15 2º Passo: transferir 1,0 mL da solução diluída para frascos graduados de 50 mL, contendo, cada um, 10 mL da solução padrão de iodo 0,0007 N; 3º Passo: homogeneizar e completar o volume com água destilada até atingir a diluição ideal para a padronização; 4º Passo: realizar a leitura da absorbância em espectrofotômetro a 660 nm, que deve apresentar valor entre 0,760 ± 0,020; 5º Passo: repetir a padronização sempre que uma nova solução de amido for preparada. O procedimento descrito encontra-se representado esquematicamente na Figura 12. Figura 12. Representação esquemática do procedimento de padronização da solução de amido. Determinação: atividade diastásica 1º Passo: pesar 10,0 g da amostra de mel; 2º Passo: adicionar 5,0 mL da solução tampão de acetato (pH 5,3); 3º Passo: adicionar 20 mL de água destilada e dissolver a amostra por agitação, a frio; 4º Passo: transferir a solução para um balão volumétrico de 50 mL contendo 3,0 mL da solução de cloreto de sódio 0,5 mol·L⁻¹, e completar o volume com água destilada. Observação: é essencial que o mel esteja tamponado antes da adição da solução de cloreto de sódio. 5º Passo: pipetar 10 mL dessa solução para um frasco graduado e colocá-lo em banhomaria a 40 ± 2 °C, juntamente com um frasco contendo cerca de 6,5 mL da solução de amido; 6º Passo: após 15 minutos, ainda no banho-maria, pipetar 5,0 mL da solução de amido e adicionar à solução de mel; agitar e iniciar o cronômetro; 7º Passo: a cada 5 minutos, retirar alíquotas de 1,0 mL da mistura e transferir para frascos graduados; 8º Passo: adicionar rapidamente 10 mL da solução de iodo padronizada; Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 16 9º Passo: homogeneizar e completar o volume com água destilada conforme padronização anterior; 10º Passo: determinar a absorbância da amostra a 660 nm e anotar o tempo decorrido entre a adição da solução de amido e a reação com o iodo; 11º Passo: repetir a coleta de alíquotas em intervalos de 5 minutos até que a absorbância medida seja inferior a 0,235. 12º Passo: cálculo e expressão dos resultados: plotar os valores de absorbância em função do tempo (minutos), preferencialmente em papel milimetrado ou utilizando software gráfico apropriado. Traçar uma linha reta com base nos três últimos pontos da curva para estimar o tempo necessário para que a reação atinja a absorbância de 0,235. A atividade diastásica, expressa em unidades Göthe, é calculada pela seguinte fórmula: 𝐴𝑡𝑖𝑣𝑖𝑑𝑎𝑑𝑒 𝑑𝑖𝑎𝑠𝑡á𝑠𝑖𝑐𝑎 (𝑈 𝐺𝑜¨𝑡ℎ𝑒) = 300 𝑇 onde: t = tempo (em minutos) para a reação atingir absorbância de 0,235. O valor representa o volume (em mL) da solução de amido a 1% hidrolisado pela enzima presente em 1 g de mel, durante 1 hora, à temperatura de 40 °C. O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 13. Figura 13. Representação esquemática do procedimento para determinação da atividade diastásica em amostras de mel. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 17 HIDROXIMETIL FURFURAL (HMF) (A.O.A.C., 1990) Materiais Espectrofotômetro Balança analítica Bécher de 50 mL Papel filtro Bastão de vidro Balão volumétrico de 50mL e 100 mL Pipeta de 1 mL e 10 mL e pera Tubo (18 x 150 mm) Funil Erlenmeyer Espátula Cubeta de quartzo de 10 mm. Reagentes utilizados • Ferrocianeto de potássio trihidratado: K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O • Acetato de zinco diidratado: Zn(CH₃COO)₂·2H₂O • Bissulfito de sódio: NaHSO₃ Procedimento I: preparo da solução de Carrez I 1º Passo: pesar 15,0 g de ferrocianeto de potássio trihidratado (K₄[Fe(CN)₆]·3H₂O); Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 18 2º Passo: dissolver completamente em água destilada sob agitação; 3º Passo: transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 14. Figura 14. Representação esquemática do procedimento de preparo da solução de Carrez I. Procedimento II: preparo da solução de Carrez II 1º Passo: pesar 30,0 g de acetato de zinco diidratado (Zn(CH₃COO)₂·2H₂O); 2º Passo: dissolver completamente em 50 mL de água destilada sob agitação; 3º Passo: transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 15. Figura 15. Representação esquemática do procedimento de preparo da solução de Carrez II. Procedimento III: preparo da solução de bissulfito de sódio a 0,20% 1º Passo: pesar 0,20 g de bissulfito de sódio (NaHSO₃); 2º Passo: dissolver completamente em 50 mL de água destilada; Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 19 3º Passo: transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 100 mL e completar o volume com água destilada. Observação: a solução deve ser preparada e utilizada no mesmo dia da análise. O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 16. Figura 16. Representação esquemática do procedimento de preparo da solução de bissulfito de sódio a 0,20%. Procedimento IV: preparo da solução da amostra de mel para análise de HMF 1º Passo: pesar 5,0 g da amostra de mel em um béquer de 50 mL; 2º Passo: adicionar 25 mL de água destilada à amostra; 3º Passo: homogeneizar até completa dissolução do mel; 4º Passo: transferir quantitativamente para um balão volumétrico de 50 mL; 5º Passo: adicionar 0,5 mL da solução de Carrez I e homogeneizar; 6º Passo: adicionar 0,5 mL da solução de Carrez II e homogeneizar novamente; 7º Passo: completar o volume do balão com água destilada até o menisco; 8º Passo: filtrar a solução, desprezando os primeiros 10 mL do filtrado; 9º Passo: utilizar a solução devidamente filtrada no procedimento espectrofotométrico (ver Procedimento II). O procedimento descrito está representado esquematicamente na Figura 17. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 20 Figura 17. Representação esquemática do procedimento de preparo da amostra de mel para análise de hidroximetilfurfural (HMF). Procedimento V: preparo das soluções amostra e branco para análise espectrofotométrica 1º Passo: pipetar 5,0 mL da solução de mel previamente filtrada em cada um de seis tubos de ensaio (18 × 150 mm); 2º Passo: em dois dos tubos, adicionar 5,0 mL de água destilada e homogeneizar bem (amostra A); 3º Passo: realizar a leitura da absorbância da amostra A em espectrofotômetro, utilizando célula de quartzo (cubeta) de 10 mm, nas faixas de 284 nm e 336 nm; Observação: a calibração (zeragem) do espectrofotômetro deve ser feita com a solução branco, preparada conforme descrito abaixo. A preparação das soluções da amostra e do branco segue a orientação descrita na Tabela 1. Tabela 1. Preparação da solução amostra e da solução branco Adição no tubo de teste Amostra Branco Solução Mel 5,0 mL 5,0 mL Água destilada 5,0 mL - 0,2% de Bissulfito de Na - 5,0 mL Observação adicional: caso a absorbância da amostra em 284 nm exceda o valor de 0,600, deve-se realizar nova diluição proporcional da solução de mel com água destilada e da solução branco com solução de bissulfito de sódio a 0,20%, mantendo o volume total para ambas. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 21 Os passos acima estão representados esquematicamente na Figura 18. Figura 18. Representação esquemática do procedimento de preparo das soluções amostra e branco para determinação do teor de HMF por espectrofotometria. Procedimento VI Cálculo e expressão dos resultados 𝐻𝑀𝐹 𝑒𝑚 𝑚𝑔.𝑘𝑔−1 = (𝐴284 − 𝐴336)𝑋 149,7 𝑋 5 𝑋 𝐷 𝑊 Onde • A284 = absorbância em 284 nm • A336 = absorbância em 336 nm • D = fator de diluição caso seja necessária • W = peso em g da amostra de mel • Fator = 149,7 = 126 𝑋 1000 𝑋 1000 16830 𝑋 10 𝑋 5 • 126 = peso molecular do HMF • 16830 = absorção molar do HMF em λ = 284 nm • 1000 = conversão de g para mg • 10 = conversão de 5 g para 50 ml • 1000 = conversão do mel de g para kg • 5 = valor teórico do peso da amostra Agradecimentos Aos Consultores ad hoc pelas contribuições e sugestões. À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), Código de Financiamento 01. E ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), por meio do Processo 305950/2021-5. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 22 Referências Bibliográficas ANTONY, N.; BALACHANDRAN, S.; MOHANAN, P. V. Effect of surfactants on catalytic activity of diastase α-amylase. Journal of Surfactants and Detergents, v. 17, p. 703-708, 2014. DOI: 10.1007/s11743-013-1531-8. ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS (AOAC). Official Methods of Analysis of the AOAC. 15th ed. Washington, DC: AOAC International, 1990. 1018 p. ALAM, F.; MAROOF, K.; CHOON MING, N.; KHALIL, M. I.; GAN, S. H. Compounds, and Microbial Growth. Honey: Composition and Health Benefits, p. 167-185, 2023. DOI: 10.1002/9781119113324.ch12 BRASIL, Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento. Instrução Normativa nº 11, de 20 de outubro de 2000. Regulamento Técnico de Identidade e Qualidade do Mel, Brasília, 2000. BRASIL. Características físico-químicas dos principais produtos meliponícolas e legislações e regulamentos técnicos de identidade e qualidade (RTIQs) na meliponicultura. Brasília: Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento MAPA, 2023. CODEX ALIMENTARIUS COMMISSION (C.A.C.). Recommended Methods of Analysis and Sampling. Codex Alimentarius, v. 13. 2. ed. Rome: FAO/WHO, 1990. CARVALHO, C. A. L. de; SOUZA, B. de A.; SODRÉ, G. da S.; MARCHINI, L.C.; ALVES, R. M. de O. Mel de abelhas sem ferrão: contribuição para a caracterização físico-química. 1. ed. Cruz das Almas-BA: Gráfica e Editora Nova Civilização, v. 1. 32p., 2005. HUANG, Z.; LIU, L.; LI, G.; LI, H.; YE, D.; LI, X. Nondestructive determination of diastase activity of honey based on visible and near-infrared spectroscopy. Molecules, v. 24, n. 7, p. 1244, 2019. DOI: 10.3390/molecules24071244. IURLINA, M. O.; FRITZ, R.. Characterization of microorganisms in Argentinean honeys from different sources. International Journal of food Microbiology, v. 105, n. 3, p. 297-304, 2005. DOI: 10.1016/j.ijfoodmicro.2005.03.017. KEKE, A.; CINKMANIS, I. Determination of organic acids in honey samples from Latvian market by high-performance liquid chromatography. Research for Rural Development v. 1, p. 229-233, 2019. DOI: 10.22616/rrd.25.2019.034. LORENTE, E. J. S.; ALVARADO ÁLVAREZ, H. J.; CASTRO CANO, J. M.; SO-SA ARIAS, B. M.; PUGA LASCANO, S. A. Evaluation of hydroxymethylfurfural content in commercial and artisanal bee honey from Los Ríos-Babahoyo. Revista Bionatura, 2023; v.8 n.1 p. 4. DOI: 10.21931/RB/2023.08.01.4. MESKELE, D. K.; DAMTO, T.; GEMEDA, M.; LAGGASE, G. Assessment of diastase levels in different floral honey from Oromia region, Ethiopia. Open Journal of Analytical and Bioanalytical Chemistry, v. 6, n. 1, p. 024-029, 2022. DOI: 10.17352/ojabc.000027. NESRIN, İ. Ç. L. İ. Evaluation of HMF levels in unbranded flower honeys in terms of food safety. Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Dergisi, v. 69, n. 4, p. 431-436, 2022. DOI: 10.33988/auvfd. 886000. TOLEDO, B. S.; DA COSTA CIPRIANO, L.; DE CASTRO PEREIRA, T. R.; MANO, S. B.; DA CRUZ, A. G.; ESMERINO, E. A.; MÁRSICO, E. T. Hydroxymethylfurfural in honey: a public health problem. The Journal of Engineering and Exact Sciences, v. 8, n. 11, p. 15097-01e, 2022. DOI: 10.18540/jcecvl8iss11pp15097-01e. SADLER, G. D.; MURPHY, P. A. pH and titratable acidity. In: NIELSEN, S. S. (ed.). Food analysis. 4. ed. Boston: Springer, 2010. p. 219–238. DOI: 10.1007/978-1-4419-1478-1_13. SILVA, T.M.F.D.S.S, ÁVILA, S.; MATOS, M.G.; JUNKERT, A.M.; TOLABDINI FRIZON, C.N.; PONTAROLO, R.; FERREIRA, S.M.R. Effect of preservation methods on antimicrobial activity, and nutritional and microbiological quality of Melipona quadrifasciata bee honey. Journal of Food Processing and Preservation, v. 46, n. 10, p. e16917, 2022. DOI: 10.1111/jfpp.16917. SILVA, I. P.; MACHADO, C. S.; SILVA, M. OLIVEIRA DA; SILVA, S. M. P. C. DA; CALDAS, M. J. M.; COSTA, M. A. P. DE C.; SODRÉ, G. da S.; CARVALHO, C. A. L. Mel: uma jornada na qualidade. A Interface do Conhecimento sobre Abelhas 2. . Ponta Grossa: Atena, 2020. cap. 11, p. 153–166. DOI: 10.22533/at.ed.368200110. Boletim Técnico-Científico Insecta, v.5, n.1, 2025 23 SILVA, L. R.; SILVA, S. M. P. C.; SOUZA, C. M.; SANTOS, G. S. R.; NASCIMENTO, A. S.; SILVA, I. P.; SODRÉ, G. da S.; CARVALHO, C. A. L. de. Parâmetros de qualidade do mel de abelhas sociais. In: SANTANA, A. L. A.; LOURES, D. R. S.; GONZAGA, I. V. F.; BRITO, J. Á. G. (org.). Zootecnia em foco. 1. ed. Cruz das Almas, BA: EDUFRB, 2021. v. XI, p. 11–31. SCHADE, J. E.; MARSH, G. L.; ECKERT, J. E. Diastase activity and hydroxy‐methyl‐furfural in honey and their usefulness in detecting heat alteration. Journal of Food Science, v. 23, n. 5, p. 446-463, 1958. DOI: 10.1111/j.13652621.1958.tb17592.x. SUN, L.; SHI, F.; HE, X., CAI, Y., YU, Y., YAO, D.; WEI, X. Establishment and application of quantitative method for 22 organic acids in honey based on SPE-GC–MS. European Food Research and Technology, v. 249, n. 2, p. 473484, 2023. DOI: 10.1007/s00217-022-04146-0. SUTO, M.; KAWASHIMA, H.; NAKAMURA, Y. Determination of organic acids in honey by liquid chromatography with tandem mass spectrometry. Food Analytical Methods, v. 13, n. 12, p. 2249-2257, 2020. DOI: 10.1007/s12161-02001845-w. VOLDŘICH, M.; RAJCHL, A.; ČÍŽKOVÁ, H.; CUHRA, P. Detection of foreign enzyme addition into the adulterated honey. Czech Journal of Food Sciences, v. 27, n. Special Issue 1, p. Detection of Foreign Enzyme Addition into the Adulterated Honey. Czech J. Food Sci., 27: S280, 2009. DOI: DOI:10.17221/1066-CJFS.