Prevalencia del déficit de vitamina B12 en mayores de 60 años hospitalizados. Estudio del polimorfismo C677T de la enzima 5-10 MTHFR en pacientes con déficit de vitamina B12

UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DPTO. DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD TESIS DOCTORAL “PREVALENCIA DEL DÉFICIT DE VITAMINA B12 EN MAYORES DE 60 AÑOS HOSPITALIZADOS Y ESTUDIO DEL POLIMORFISMO C677T DEL GEN DE LA ENZIMA 5,10-MTHFR EN PACIENTES CON DÉFICIT DE VITAMINA B12” Dª. María Belén Alonso Ortiz Las Palmas de Gran Canaria 29 Noviembre de 2013 UNIVERSIDAD DE LAS PALMAS DE GRAN CANARIA DPTO. DE CIENCIAS MÉDICAS Y QUIRÚRGICAS FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD PROGRAMA DE DOCTORADO: AVANCES EN MEDICINA INTERNA. BIENIO. 2002-2004 TESIS DOCTORAL “PREVALENCIA DEL DÉFICIT DE VITAMINA B12 EN MAYORES DE 60 AÑOS HOSPITALIZADOS Y ESTUDIO DEL POLIMORFISMO C677T DEL GEN DE LA ENZIMA 5,10-MTHFR EN PACIENTES CON DÉFICIT DE VITAMINA B12” Dª. María Belén Alonso Ortiz Dirección: Dra. Dª. Alicia Conde Martel La Directora La Doctoranda Las Palmas de Gran Canaria, a 29 de noviembre de 2013 Dña. Alicia Conde Martel, Doctora en Medicina y Profesora Titular de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Las Palmas de Gran Canaria CERTIFICA: Que el trabajo titulado: “PREVALENCIA DEL DÉFICIT DE VITAMINA B12 EN MAYORES DE 60 AÑOS HOSPITALIZADOS Y ESTUDIO DEL POLIMORFISMO C677T DEL GEN DE LA ENZIMA 5,10-MTHFR EN PACIENTES CON DÉFICIT DE VITAMINA B12” ha sido realizado bajo mi dirección por la Licenciada en Medicina y Cirugía Dña. María Belén Alonso Ortiz, considerando que es APTA para su defensa ante Tribunal y reúne las condiciones exigibles para optar al grado de DOCTORA. Para que conste, expido y firmo esta certificación en Las Palmas de Gran Canaria a 29 de noviembre de 2013. Fdo. Dra. Dña. Alicia Conde Martel Profesora Titular del Dpto. de Ciencias Médicas y Quirúrgicas Universidad de Las Palmas de Gran Canaria A mis padres y a Raúl, Agradecimientos A mis padres, por haberme dado la vida, unos valores increíbles y la mejor educación. A Raúl, por ser el mejor amigo y compañero del mundo. A Mario y Nina, mis segundos padres. A Salesa y familia, por considerarme “una más” de la familia. A la Dra. Alicia Conde, directora de este proyecto, por descubrirme el maravilloso mundo de la Vitamina B12, por sus buenos consejos, asesoramiento contínuo y paciencia infinita. A la Dras. Sofía Pérez y Amel Arkuch por ser desde un principio “mis referentes “en la difícil tarea de convertirme en médico internista. Al Dr. Noel Lorenzo y al Dr. Eladio Pardillo por su amistad, apoyo y ayuda constante. A mis compañer@s del Servicio de Medicina Interna, enfermer@s y auxiliares del Servicio de Medicina Interna por su incalculable ayuda en la realización de este proyecto. A los Dres. José Carlos Rodríguez y Francisco Rodríguez Esparragón por su colaboración, asesoramiento y buenos consejos. A la Dra. Yolanda Pérez y a la Sra. Lidia, compañeras de la Unidad de Investigación. Sin vuestra ayuda este proyecto no hubiese sido posible. A la Dra. Ainara Arín por su amistad, profesionalidad, comprensión y asesoramiento en este proyecto. A Juan Verona, por ser el mejor ilustrador médico de este planeta y un gran amigo. 4 10.- Relación entre el déficit de Vitamina B12 y la aparición de eventos cardiovasculares, reingresos o éxitus en los pacientes estudiados 139 11.- Exitus durante e ingreso y seguimiento 141 E. DISCUSIÓN 145 1.- Prevalencia del déficit de Vitamina B12 y análisis bibliográfico 147 1.1 Déficit de Vitamina B12 y relación con la edad 155 1.2 Déficit de Vitamina B12 y relación con el género 156 1.3 Déficit combinado de Vitamina B12 y ácido fólico 157 2.- Diagnóstico del déficit de Vitamina B12 159 3.- Aproximación diagnóstica del déficit de Vitamina B12 161 4.- Alteraciones clínico-analíticas y enfermedades asociadas 167 5.- Polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR 175 5.1 Prevalencia de las formas genotípicas 175 5.2 Relación entre el polimorfismo C677T, niveles de Vitamina B12 y homocisteína en plasma 177 5.3 Relación entre el polimorfismo C677T y la presencia de anemia en los pacientes con déficit de Vitamina B12 181 6.- Eventos cardiovasculares, reingresos y mortalidad. Relación con déficit de Vitamina B12, homocisteína y polimorfismo C677T 182 F. CONCLUSIONES 195 G. BIBLIOGRAFÍA 199 H. ANEXOS 273 1. Indice de abreviaturas 275 5 6 7 A. INTRODUCCIÓN 8 9 A. INTRODUCCIÓN 1.- VITAMINA B12 1.1 Generalidades 1.1.1 Concepto La Vitamina B12 fue descubierta hace 60 años. Sin embargo, sus efectos bioquímicos, fisiológicos y neurológicos todavía no han sido completamente definidos (Solomon LR, 2007). La Vitamina B12 es conocida también con el nombre de Cobalamina (Cbl), debido a que contiene un átomo de Cobalto en su estructura química (Dali-Youcef N, 2009; Kozyraki R, 2013) (Figuras 1 y 2). Es la única vitamina que presenta esta característica. Existen además otras particularidades que la convierten en un compuesto heterogéneo e hidrosoluble muy especial. Es la vitamina más grande y compleja de todas (Watanabe F, 2007). Tiene un peso molecular de 1.335 Da y se encuentra en diferentes formas, siendo las más activas la Hidroxi-cobalamina (OHCbl) y la Cianocobalamina (CN-Cbl) (Battersby AR, 1994; Watanabe F, 2007; Stover PJ, 2010). Además, por la importancia de sus actuaciones a nivel celular resulta esencial para que nuestro organismo funcione correctamente (Iqtidar N, 2012; Bosco C, 2012). Las fuentes fundamentales de la Vitamina B12 son las carnes rojas y en mucha menor proporción pescados, leche y huevos (Wolters M, 2004; Hoffman R, 2005; Allen LH, 2008; Brito A, 2012). Esta vitamina hidrosoluble pertenece al complejo B y ha sido la última en descubrirse. Este hecho ocurrió en 1948 en los Laboratorios Merck por los químicos Karl Folkers y Rockers quienes aislaron a partir de hígado de vacuno la Ciano-cobalamina, reconociéndola como el factor anti-anemia perniciosa (Olson RE, 2001). En 1962, Dorothy Crowfoot Hodgkin publicó la estructura de este compuesto habiéndola elucidado mediante la difracción de rayos X. En 1964, le concedieron el Premio Nobel de Química por sus estudios (Glusker JP, 1994; Scott JM, 2012; Kozyraki R, 2012) (Foto 1a). En 1978, la Vitamina B12 fue totalmente sintetizada por el químico de origen suizo Albert Eschenmoser (Garritz A, 1999) (Foto 1b). 10 Las necesidades diarias de Vitamina B12 en niños son de 1,2 µg y de 2,5 a 5 µg en adultos y personas de edad avanzada, no existiendo grandes variaciones en relación a la edad y el sexo (Weng SC, 2008; Stover PJ, 2010; Schrier SL, 2012). La Vitamina B12 se almacena en el hígado (50%). Las reservas son aproximadamente de 2-3 mg (Lechner K, 2005; Chatthanawaree W, 2011; Schrier SL, 2012). La Vitamina B12 se excreta en la bilis y se reabsorbe a través de la circulación enterohepática de una manera dependiente del factor intrínseco (FI). Debido a este proceso y a la absorción renal una ingesta diaria de 1-2 µg de Vitamina B12 es suficiente para mantener unos niveles adecuados en el organismo (Iqtidar N, 2012; Kozyraki R, 2012; Hughes CF, 2013). Así la Vitamina B12 se va utilizando a medida que el organismo lo necesita. Las cantidades que se almacenan pueden satisfacer nuestras necesidades por un periodo de 3 a 5 años si por alguna razón cesa el aporte ó no se absorbe (Hoffman R, 2005; Rufenach P, 2008; Schrier SL, 2012). También es sintetizada activamente por numerosas bacterias intestinales, pero su aprovechamiento es mínimo, ya que se elimina mayoritariamente por las heces (Ermens AA, 2003; Wolters M, 2004; Brito A, 2012). Figura 1. Estructura química de la Vitamina B12. Fuente: Dali-Youcef N. An update on cobalamin deficiency in adults. QJM 2009; 102 (1):17-28. 11 Fuente: www.diamond.ac.uk ; www. chemistry.about.com/ 1.1.2 Estructura química: 1.1.2 Estructura química Arriba. Figura 2. Estructura molecular en 3D de la Vitamina B12. Abajo. Foto 1a. La Dra. Dorothy Crowfoot Hodgkin, recibió el Premio Nobel de Química en 1964 por sus interesantes aportaciones a la biología molecular. A la derecha. Foto 1b. El químico suizo Dr.Albert Eschenmoser. 12 1.1.2 Estructura química La Vitamina B12 estructuralmente presenta características similares a las de las porfirinas. Pertenece a la familia de los compuestos tipo “corrinoides” resultantes de la unión de cuatro anillos pirrólicos (anillo de Corrina) alrededor de un átomo central de Cobalto (Co++) (Ermens AA, 2003; Wolters M, 2004; Shane B, 2008; Dali-Youcef N, 2009; Stover PJ, 2010). En esta estructura el átomo de Cobalto tiene seis valencias, cuatro de las cuales establecen enlaces covalentes con los correspondientes anillos pirrólicos. La quinta valencia se une a un nucleótido, la 5-6 dimetilbencimidazol, y la sexta se une a radicales diferentes originando los diferentes derivados de la Cobalamina: Cianocobalamina, Hidroxicobalamina, Metilcobalamina y Desoxiadenosilcobalamina (Forrellat Barrios M, 1999) (Tabla 1 y Figura 3). Las formas que actúan como coenzimas en los humanos son la Metil y Desoxiadenosilcobalamina (conocida también como Coenzima B12) (Battersby AR, 1994; Aguirre Errasti C, 2002; Ermens AA, 2003; Pérez V, 2005; Stover PJ, 2010; Kozyraki R, 2012). La Ciano-cobalamina, forma sintética de la Vitamina B12 es la más utilizada con fines clínicos (O’Leary F, 2010; Stover SJ, 2010). Su fórmula molecular es C63H88CoN14O14P, contiene un 4% de Cobalto y se presenta como cristales de color rojo oscuro a la luz polarizada (Foto 2). La otra forma sintética es la Hidroxicobalamina, la cual también se comercializa en nuestro país. Generalmente, se presenta como combinación con otras Vitaminas del grupo B. Tabla 1. Derivados de la Cobalamina. Fuente: Forrellat M. Vitamina B12: metabolismo y aspectos clínicos de su deficiencia. Rev Cub Hem Inmunol Hemoter 1999; 15 (3):159-174. Radical Nombre del derivado CN- (ciano) Cianocobalamina OH- (hidroxilo) Hidroxicobalamina CH3 (metilo) Metilcobalamina 5'desoxiadenosil Desoxiadenosilcobalamina 13 Figura 3. Estructura química de los derivados de la Cobalamina. Fuente: www.chm.bris.ac.uk Foto 2. Cristales de Cianocobalamina en luz polarizada. Fuente: www.chm.bris.ac.uk 20 Síndrome de malabsorción alimentaria (SMA): En los últimos años el Síndrome de malabsorción alimentaria o Síndrome de la no disociación de la Vitamina B12 de su proteina portadora se ha identificado como primera causa de deficiencia de Vitamina B12 entre las personas de edad avanzada, dejando en un segundo lugar a la anemia perniciosa (Andrès E, 2004; Bosco C, 2012; Braillard O, 2012). Este síndrome fue descrito por primera vez en el año 1995 por el Dr. Ralph Carmel (Carmel R, 1995). Se caracteriza por la incapacidad de la liberación de la Cobalamina de los alimentos ó de las proteínas de transporte intestinal, y en particular en presencia de hipoclorhidria, donde la absorción de la Cobalamina libre permanece normal (Andrès E, 2004). Como muestran varios estudios el SMA queda definido por la deficiencia de Vitamina B12 sérica que no se explica por deficiencia dietaria con resultado del test de Schilling normal (Carmel R, 1995; Andrès E, 2003; Dali-Youcef N, 2009). Actualmente, dicho test está en desuso en la práctica clínica habitual (Carmel R, 2007; Cattan D, 2011; Nafil H, 2012) (Tabla 4). Tabla 4. Criterios diagnósticos del Síndrome de malabsorción alimentaria (SMA). 1 Nivel de Cobalamina sérica <150 pmol/L. 2 Resultado de la prueba estándar de Schilling (con Cianocobalamina marcada con cobalto58) normal, o el resultado de la prueba modificada de Schilling (utilizando el radiactivo de cobalamina unida a la proteína de los alimentos) anormal. 3 No deficiencia dietaria de Cobalamina (consumo > 2 µg por día). 4 La existencia de un factor predisponente de deficiencia cobalamínica: - Gastritis atrófica crónica e infección por Helicobacter pylori. - Sobrecrecimiento bacteriano gástrico ó intestinal: aclorhidria, Sdr de Ogilvie, VIH - Ingestión crónica de antiácidos (anti-H2 o inhibidores de la bomba de protones) ó biguanidas (metformina). - El alcoholismo crónico. - La gastrectomía ó cirugía de bypass gástrico. - Insuficiencia pancreática exocrina. - Idiopática (relacionada con la edad). NOTA: Según varios autores, los 3 primeros criterios son necesarios para realizar el diagnóstico de SMA. Fuente: Andrès E. Vitamin B12 (cobalamin) deficiency in elderly patients. CMAJ 2004; 171(3): 251-259. 21 Este síndrome está causado principalmente por una atrofia gástrica. Más del 40% de los pacientes mayores de 80 años tienen atrofia gástrica que puede o no estar relacionada con la infección por Helicobacter pylori (Pautas E, 1999; Carmel R, 2001). Desde finales de los años 90, varios autores han demostrado que la infección por H. Pylori per se produce un déficit de Vitamina B12 (Kaptan K, 2000; Vitale G, 2011; Kozyraki R, 2013). Otros factores que contribuyen al SMA son la proliferación microbiana intestinal (que puede ser causada p.e por el tratamiento con antibióticos); la ingestión a largo plazo de biguanidas como la metformina (Bauman WA, 2002; Andrès E, 2002) y antiácidos, incluyendo los antagonistas de los receptores H2 (Howden CW, 2000; Andrès E, 2003; Bosco C, 2012) y los inhibidores de la bomba de protones (especialmente en los pacientes con Síndrome de Zollinger-Ellison) (Valuck RJ, 2004; Hirschowitz BI, 2008), el alcoholismo crónico (Kaltenbach G, 1995; Herrmann W, 2008), la cirugía o reconstrucción gástrica (p.e, cirugía de bypass de la obesidad) (Provenzale D, 1992; Aarts EO, 2011; Schrier SL, 2012); la insuficiencia pancreática exocrina (Carmel R, 2000; Andrès E, 2003) y el Síndrome de Sjögren (Andrès E, 2001; Andrès E, 2006). Anemia Perniciosa (AP): La anemia perniciosa es una causa clásica de deficiencia Cobalamínica y constituye en la actualidad una de las causas más frecuentes entre los pacientes de edad avanzada: entre el 20 y 50% de los casos conforme a lo publicado en varios estudios (Pruthi RK, 1994; Lee GR, 1999; Bosco C, 2012; Andrès E, 2012) y mayor del 15% en dos series de pacientes franceses (Andrès E, 2002; Loukili NH, 2004). Incluso, según una revisión publicada en enero de 2013 la anemia perniciosa es la causa más frecuente de déficit grave de Vitamina B12 (Stabler SP, 2013). Se trata de una enfermedad autoinmune que se caracteriza por la destrucción de la mucosa gástrica, especialmente de la mucosa fúndica. La respuesta inmune se dirige contra la H+/K+ ATPasa gástrica (Stabler SP, 2013), de tal forma que las secreciones gástricas son de neutras a ligeramente ácidas, incluso en presencia de gastrina (que normalmente aumenta la acidez) y contienen poco ó ningún factor intrínseco (Nicolas 22 JP, 1994; Toh BH, 1997; Toh BH, 2004; Andrés E, 2012), lo que conlleva a una malabsorción de la Vitamina B12 y ulterior deficiencia. En un estudio inglés, la prevalencia de la anemia perniciosa en los individuos mayores de 65 años fue del 2% (Clarke R, 2003) y en otro estudio realizado previamente la prevalencia fue del 2% en las mujeres y del 1% en hombres (Carmel R, 1996). Estudios posteriores, refieren una prevalencia del 0,9% en población general y del 2% en pacientes mayores de 65 años (García-Carrasco M, 2008; Andrès E, 2012). Dado su amplio espectro de manifestaciones clínicas, la anemia perniciosa es una “gran simuladora”. Su diagnóstico por lo tanto debe ser sospechado y considerado ante la presencia de manifestaciones neurológicas y hematológicas de origen indeterminado (Andrès E, 2012). Biológicamente se caracteriza por la presencia de anticuerpos anti factor intrínseco (FI) en sangre. Su presencia es patognomónica de este tipo de anemia. Sin embargo, sólo el 70% de los pacientes con anemia perniciosa presentan estos anticuerpos (Hvas AM, 2006). Además, en función de las técnicas diagnósticas empleadas el rendimiento diagnóstico puede ser bajo. Así p.e con la técnica de inmunoensayo, la sensibilidad resulta ser baja para los anticuerpos anti FI, del orden del 37% en los estudios más recientes y hasta del 50% según otros autores (Andrès E, 2012), mientras que la especificidad es del 100%; para los anticuerpos anti-células parietales, la sensibilidad es del orden de 81,5%, mientras que la especificidad alcanza el 90,3%, aunque otros autores obtienen una sensibilidad del 50% y una especificidad de 0,98% (Andrès E, 2004; Loukili NH, 2004). La combinación de ambos anticuerpos para el diagnóstico de la anemia perniciosa tiene una sensibilidad del 73% y una especificidad de 100% (Lahner E, 2009). La asociación con enfermedades autoinmunes como la diabetes tipo 1, la tiroiditis autoinmune (en particular, la tiroiditis de Hashimoto), o el vitiligo es frecuente (Perros P, 2000; Andrés E, 2005; Banka S, 2011; Stabler SP, 2013). Otras asociaciones también descritas son el síndrome de Sjögren, la enfermedad celíaca y la insuficiencia suprarrenal (enfermedad de Addison) (Andrés E, 2005). También se han documentado casos de síndrome autoinmune múltiple que incluyen entre sus hallazgos la presencia de la anemia perniciosa (Humbert P, 1988; Gaches F, 1993). 23 Además, En los últimos años se ha postulado sobre el posible papel potencial del Helicobacter pylori (HP) en la patogénesis de la gastritis autoinmune y la anemia perniciosa (Zittoun J, 2001; Toh BH, 2004). Sin embargo, hay resultados discordantes y no concluyentes sobre esta asociación (Alderuccio F, 2000; Andrès E, 2004; Stabler SP, 2013). No obstante, debe tenerse en cuenta que las pruebas serológicas para el HP pueden resultar negativas en etapas avanzadas de la anemia perniciosa, ya que el crecimiento de este organismo no es óptimo en un entorno alcalino, esto es en presencia de atrofia inmune asociada con aclorhidria (Andrès E, 2004). Deficiencia nutricional: Constituye una causa frecuente en países de menor desarrollo socioeconómico como Cuba, Venezuela, Perú, Kenia o India en los cuales la ingesta dietaria insuficiente de Vitamina B12 puede suponer la causa más frecuente de déficit (Arnaud J, 2001; Refsum H, 2001; Soberon M, 2004; Meertens L, 2005; McLean ED, 2007; Sukla KK, 2012). Sin embargo, la deficiencia nutricional de Cobalamina es rara entre los adultos sanos de los países industrializados, incluso entre las personas de edad avanzada. Según la experiencia francesa esta causa supone menos del 5% de los casos (Andrès E, 2003; Dali-Youcef N, 2009), salvo en vegetarianos estrictos (Herrmann W, 2003; Borghoutti FF, 2009; Elmadfa I, 2009; Gilsing AM, 2010; Gammon CS, 2012), ancianos con dietas muy restrictivas o alteraciones muy importantes en la dentición que conlleven una baja ingesta de alimentos (Andrès E, 2004). Ciertamente, se puede evidenciar este deficiencia vitamínica de forma más frecuente en pacientes con dietas vegetarianas estrictas, entre los cuales el déficit puede presentarse hasta en el 50% de los individuos (Gilsing AM, 2010) y en personas ya desnutridas, tales como individuos muy mayores, pacientes institucionalizados en centros psiquiátricos o pacientes hospitalizados en los que se han objetivado prevalencias de deficiencia de Vitamina B12 de hasta el 60% (Russell RM, 1992; Herbert V, 1994; Iqbal MP, 2005). Los estudios sobre la ingesta dietética de personas de edad avanzada en los Estados Unidos han demostrado que hasta un 50% puede tener una ingesta 24 insuficiente de Cobalamina (<2 µg/día) (Russell RM, 1992). Este tipo de estudios, sin embargo, son extremadamente difíciles de realizar porque se basan principalmente en la historia dietética (Andrès E, 2000). Además, incluso si está presente, la deficiencia dietética no resulta sintomática hasta que las reservas hepáticas están agotadas. Otras causas de déficit de Cobalamina: Ya hemos mencionado que las resecciones parciales del estómago pueden condicionar un déficit de Cobalamina con relativa frecuencia. Esto puede deberse tanto a una disminución del ácido clorhídrico (HCl), pepsina y factor intrínseco secundarios a la resección como a la atrofia gástrica posterior del muñón o en relación a cuadros de sobrecrecimiento bacteriano (Oh R, 2003; Frank P, 2010). Otro motivo frecuente en nuestro medio lo constituyen el grupo de enfermedades del ileon terminal como p.e la enfermedad inflamatoria intestinal (EII) (Yacut M, 2010), la celiaquía en la que el porcentaje de déficit de Vitamina B12 puede alcanzar hasta el 41% (Dahele A, 2001), patología tumoral óo resecciones a este nivel (Coull DB, 2007). Otras causas muy infrecuentes en nuestro medio, pero que es obligado mencionar son la parasitosis intestinal por Diphylobotrium Latum (Forrellat Barrios M, 1999; Baik HW, 1999; Stabler SP, 2004; Nielsen MJ, 2012; Kozyraki R, 2012) o el Síndrome de Immerslund-Grasbeck en el cual hay una alteración a nivel de los receptores específicos situados en el ileon terminal. En estos últimos, es característico la coexistencia de proteinuria (Forrellat Barrios M, 1999; Kozyraki R, 2012). 1.2.2 Epidemiología 1.2.2.1 Prevalencia El déficit de la Vitamina B12 es frecuente en nuestro medio, y especialmente en la población mayor de 60 años. Dependiendo de los criterios diagnósticos empleados la prevalencia varía entre un 5 y un 40% (Carmel R, 2000; Wolters M, 2004; Dali-Youcef N, 2009; Lee-Guzman, 2011). Incluso en estudios recientes se observa una gran variabilidad en la prevalencia de esta carencia vitamínica que oscila entre el 7% de un estudio brasileño realizado en 500 pacientes ambulatorios (Xabier JM, 2010) y el 44,6% de una muestra de 838 pacientes ingresados en el H. Universitario Jordan de Amman 25 (Barghouti FF, 2009). Esta variabilidad puede explicarse por los diferentes puntos de corte empleados por los autores para definir el déficit de Vitamina B12 y las técnicas de laboratorio empleadas. Además de existir influencias alimentarias, sociales y/o genéticas de los individuos estudiados (Black AK, 1994; Miller JW, 2006; Fakhrzadeh H, 2006; Gil Prieto R, 2008; Chatthanawaree W, 2011; Laillou A, 2012). Es de reseñar que está carencia es más frecuente en población blanca y entre los latinos que en afroamericanos y asiáticos (Carmel R, 1999; Figlin E, 2003; Chatthanawaree W, 2011). En algunos estudios se ha constatado que el déficit de Cobalamina es más frecuente en los varones (Figlin E, 2003, Flicker LA, 2004; Fora MA, 2005; Johnson MA, 2010; Hinds HE, 2011) y que la prevalencia aumenta de forma progresiva con la edad (Nilsson-Ehle H, 1991; Wahlin A, 2002; Clarke R, 2004; Obeid R, 2004; Clarke R, 2007; Loikas S, 2007; Campbell AK, 2003; Allen LH, 2009; Johnson MA, 2010; Evatt ML, 2010; Lee-Guzman C, 2011) (Tabla 5-6), y especialmente en los pacientes mayores hospitalizados (Lindenbaum J, 1994; van Asselt DZ, 2000; Yüksel S, 2006). Tabla 5. Prevalencia por edad de los niveles séricos de Vitamina B12 según el NHANES* (2001-2004). Niveles Vitamina B12 9-13 años 14-18 años 19-30 años 31-50 años ≥ 51 años ≤150 pg/mL 0 0,2% 0,2% 0,5% 1,2% 151-200 pg/mL 0,1% 0,6% 1,5% 1,0% 2,0% 201-250 pg/mL 0,6% 2,5% 5,2% 6,1% 5,1% 251-300 pg/mL 1,6% 5,4% 7,9% 6,9% 6,2% 301-350 pg/mL 4,2% 9,4% 11,3% 10,7% 8,9% 351-400 pg/mL 5,4% 9,2% 13,1% 13,5% 10,7% >400 pg/mL 88,0% 72,7% 60,8% 61,2% 65,8% Fuente: Evatt ML. Vitamin B12 deficiency: detection and diagnosis. Why vitamin B12 deficiency should be on your radar screen. Disponible en: www.cdc.gov/ncbddd/b12/detection.html. 26 1.2.2.2 Mortalidad No se ha demostrado que los niveles bajos de Vitamina B12 estén directamente relacionados con aumento de la mortalidad. Al contrario, se ha observado que niveles más altos de Vitamina B12 se asocian con mayor mortalidad (Geissbühler P, 2000; Hemmersbach-Miller M, 2005). Así Geissbühler en un estudio de 161 pacientes con cáncer demostró que un nivel elevado de Vitamina B12 en sangre constituye un factor predictor de mortalidad independiente en pacientes con cáncer avanzado (Geissbühler P, 2000). Otro estudio realizado en nuestro hospital, sobre 366 pacientes nonagenarios que ingresaron por cualquier motivo y a los que se determinaron los niveles séricos de Cbl, evidenciaron cifras significativamente más elevadas de Vitamina B12 sérica entre los pacientes que fallecieron, incluso después de excluir a los pacientes que padecían un proceso tumoral (Hemmersbach-Miller M, 2005). Otros estudios, sin embargo, aseveran que no está claro si los niveles séricos de Vitamina B12 se relacionna directamente con la mortalidad o constituyen un marcador de mal pronóstico. Se propone en ese mismo trabajo la realización de más estudios para aclarar este respecto (Tal S, 2010). Tabla 6. Prevalencia por edad de la deficiencia bioquímica de Vitamina B12 según el NHANES (2001-2004). Edad (Años) Vitamina B12 ≤ 200 pg/mL y AMM ≥ 270 nmol/L Vitamina B12 >200 pg/mL y AMM ≥ 270 nmol/L 9-13 años 0,1% 2,5% 14-18 años 0,2% 3,7% 19-30 años 0,4% 3,5% 31-50 años 0,6% 3,6% ≥ 51 años 1,6% 7,9% * NHANES: National Health and Nutrition Examination Survey. ** Bioquímicamente el déficit sérico de Vitamina B12 se define por: niveles séricos de Vitamina B12 ≤200 pg/mL y Acido Metil-malónico (AMM)≥ 270 nmol/L o niveles séricos de Vitamina B12>200 pg/mL y AMM ≥ 270 nmol/L. Fuente: Evatt ML. Vitamin B12 deficiency: detection and diagnosis. Why vitamin B12 deficiency should be on your radar screen. Disponible en: www.cdc.gov/ncbddd/b12/detection.html. 27 1.2.2.3 Medidas preventivas En 1996, se introdujeron en los EE.UU los productos de granos de cereal fortificados con ácido fólico y desde 1998, esta fortificación se hizo obligatoria. Esta medida consiguió reducir el número de defectos del tubo neural a la mitad, sin embargo ha tenido poco impacto sobre la mortalidad cardiovascular (Robertson J, 2005). Desde que la fortificación de harina con ácido fólico se ha generalizado, la Vitamina B12 constituye un importante determinante del aumento de los niveles de homocisteína en plasma (Hcy). En una revisión publicada en este año 2013 se concluye que el déficit de Vitamina B12 es por este motivo la causa más frecuente de hiperhomocisteinemia (Hhcy) (Stabler SP, 2013). Además este hecho, contribuye a enmascarar e incluso agravar el déficit clínico y bioquímíco de Cobalamina (Aguirre Errasti C, 2001, Morris MS, 2007; Selhub J, 2009; Bryan RH, 2010; Bailey RL, 2011; Hughes CF, 2013). Dada la alta prevalencia del déficit de Vitamina B12 a nivel mundial y especialmente en las personas mayores varios autores han planteado la posibilidad de considerar la fortificación de harina y/o otros alimentos con Vitamina B12 (Fora MA, 2005; Fakhrzadeh H, 2006; Carmel R, 2008; Green R, 2009; Stover PJ, 2010). En una revisión reciente Carmel considera en base a la evidencia científica que la fortificación de alimentos con Vitamina B12 es racional, eficaz y segura (Carmel R, 2011). De hecho en EE.UU la fortificación de cereales con Vitamina B12 se considera una fuente de alimentación de esta vitamina muy importante entre las personas mayores. Algunos autores concluyen que mientras no se establezca la obligatoriedad de fortificar la harina con Cbl en Europa la deficiencia de Vitamina B12 seguirá siendo frecuente (Godfrey PO, 2010). 1.2.3 Fases y etapas del déficit de la Vitamina B12 Se ha estimado que hay un retraso de 5 a 10 años entre el inicio de la deficiencia de Cobalamina y la aparición de manifestaciones clínicas. Esto ocurre en parte por la existencia de importantes depósitos hepáticos (>1,5 mg) y la circulación enterohepática (Carmel R, 2000; Dali-Youcef N, 2009; Scott JM, 2012). 28 Ya Herbert propusó en los años 90 diferenciar cuatro estadios ó fases del déficit de Vitamina B12 (Herbert V, 1994). De forma que en los estadios iniciales I o II los pacientes suelen encontrarse asintomáticos mientras que los pacientes en estadio III o IV ya tienen síntomas y signos relacionados con la deficiencia de esta vitamina (Tabla 7). Otros trabajos como el de Pérez y su grupo hacen referencia a las distintas etapas que se pueden evidenciar en la deficiencia de Cobalamina (Pérez V, 2005) (Tabla 8). Tabla 7. Fases del déficit de Vitamina B12 según Herbert. Manifestación Comentarios I Depleción de los niveles séricos circulantes de Vitamina B12 Típicamente asintomáticos. Pueden permanecer así durante años. II Depleción de los depósitos celulares de Vitamina B12 Pueden estar asintomáticos y permanecer así durante años. III Evidencia bioquímica del déficit (↑AMM y ↑Hcy) La Vitamina B12 es necesaria para la conversión de estos compuestos. IV Signos y síntomas clínicos de deficiencia de Vitamina B12 El espectro de manifestaciones clínicas es amplio y la secuencia de desarrollo de los síntomas varía de forma notable. Fuente: Herbert V. Vitamin B-12 and elderly people. Am J Clin Nutr 1994; 59 (5):1093-1095. Tabla 8. Etapas de la deficiencia de Vitamina B12. Indicador Normal Deplección VB12 DVB12 funcional temprana Anemia por DVB12 AMM N ¿? ↑ ↑ Hcy N ↑ ↑↑ ↑↑ B12 sérica N ↓ ↓ ↓↓ Eritrocitos N N N Anemia macrocítica Otros N N N Hipersegmentación núcleos neutrófilos Abreviaturas: VB12: Vitamina B12. DVB12: Déficit de Vitamina B12. AMM: Acido metilmalónico. Hcy: homocisteína. N: Normal. Fuente: Pérez V, Hertramp E, Olivares M. Folato y Vitamina B12 en pediatría: Mirada actual. Rev Ped Elec (en linea) 2005; 2 (2): 44-52. 29 1.2.4 Consecuencias del déficit de Vitamina B12 Las alteraciones hematológicas y neuropsiquiátricas son las manifestaciones clínicas más frecuentes (Andrès E, 2004; Andrès E, 2012; Stabler SP, 2013). Sin embargo con frecuencia no están presentes. Según Lechner, aunque la prevalencia del déficit de Vitamina B12 es frecuente, sólo el 5-10% de los pacientes son sintomáticos (Lechner K, 2005). Las principales manifestaciones clínicas son muy heterogéneas y de gravedad variable; van desde condiciones más leves, como la neuropatía sensorial común y/o anomalías aisladas como la macrocitosis y la hipersegmentación de los neutrófilos, a trastornos graves, incluida la esclerosis combinada de la médula espinal, anemia hemolítica e incluso la pancitopenia (Carmel R, 2000; Andrès E, 2003; Chatthanawaree W, 2011; Andrès E, 2012; Iqtidar N, 2012; Stabler SP, 2013). Fuente:www.telmeds.org/atlas/hematologia/serie-roja/anomalias-de-tamanoanisocitosis/macrocitos/; www.basesmedicina.cl/hematologia/15_3_anemia_mega/contenidos.htm 36 1.2.5 Diagnóstico del déficit de Vitamina B12 La deficiencia de Vitamina B12 es un problema de salud pública mundial. Sin embargo, no existe consenso en cuanto a su diagnóstico (Snow CF, 1999; Aguirre Errasti C, 2002; Green R, 2005; Hvas AM, 2006; Solomon LR, 2007; Evatt ML, 2010; Langan RC, 2011; Iqtidar N, 2012; Hughes CF, 2013). No obstante, se han elaborado algoritmos diagnósticos en este sentido teniendo en cuenta evitar procedimientos cruentos y exploraciones innecesarias tales como el mielograma, aunque en algunos casos resulta necesario para descartar hemopatías. (Andrès E, 2004) Varios autores coinciden en la existencia de grupos de riesgo en los que deberían ser medidos los niveles séricos de Vitamina B12: pacientes mayores de 65 años malnutridos, institucionalizados o ingresados en hospitales psiquiátricos así como en aquellos con manifestaciones hematológicas y neuropsiquiátricas sugestivas de deficiencia de Vitamina B12 (Andrès E, 2004; Evatt ML, 2010; Chatthanawaree W, 2011; Braillard O, 2012) (Tabla 11). Tabla 11. Factores de riesgo para presentar un déficit de Vitamina B12. Disminución de la absorción ileal • Enfermedad de Crohn. • Resección ileal. • Sobrecrecimiento bacteriano. Disminución de los niveles de F. Intrínseco • Gastritis atrófica. • Anemia perniciosa. • Síndrome postgastrectomía. Factores genéticos • Deficiencia de Transcobalamina II. Disminución de la ingesta • Personas mayores. • Institucionalizados/ ingresados. • Vegetarianos. Uso prolongado de medicación • Metformina. • Inhibidores de la bomba de protones. • Anti-H2 (Ranitidina). Adaptado de: Langan RC. Update on Vitamin B12 Deficiency. Am Fam Physician 2011; 83 (12):1425-1430. 37 1.2.5.1 Definición/es del déficit de Vitamina B12 Los trabajos publicados en los últimos 15 años han proporcionado varias definiciones de deficiencia de Cobalamina, con diferentes puntos de corte de los niveles séricos de la Vitamina B12. Estas variaciones se podrían explicar por las diferentes poblaciones estudiadas y kits diagnósticos utilizados (Snow CF, 1999; Zittoun J, 1999; Klee GG, 2000; Hughes CF, 2013). Las diferentes sensibilidades y especificidades de estos tests han llevado a que a día de hoy no dispongamos de un test único y definitivo para el diagnóstico de la deficiencia de Vitamina B12, especialmente en pacientes de edad avanzada (Braillard O, 2012; Hughes CF, 2013). En la actualidad, esta deficiencia se definen a menudo por la determinación de niveles séricos disminuídos de Cobalamina (<150 pmol /L o <200 pg /mL) (Snow CF, 1999; Langan RC, 2011; Iqtidar N, 2012) coexistiendo con la elevación de los niveles plasmáticos de homocisteína (>13 µmol/L) y acido metilmalónico (>0,4 mmol/L), dos componentes de la vía metabólica de la Cobalamina (Dali-Youcef N, 2009). Andrès y su grupo compararon pacientes con déficit de Vitamina B12 y pacientes controles emparejados por edad y sin complicaciones para determinar los puntos de corte de los niveles de Cobalamina sérica. Basándose también en parte del trabajo de Klee y su grupo (Klee GG, 2000) establecieron las siguientes definiciones de diagnóstico de deficiencia de Cobalamina para los pacientes de edad avanzada (Tabla 12). La primera definición es más fácil de realizar e interpretar, pero requiere que las muestras de sangre se extraigan en 2 días separados (Andrès E, 2004). Tabla 12. Definiciones de la deficiencia de Vitamina B12 en las personas de edad avanzada. • Nivel de Cobalamina sérica <150 pmol/L en 2 ocasiones separadas. • Nivel de Cobalamina sérica <150 pmol/L y nivel total de homocisteína sérica >13 µmol/L o ácido metilmalonico >0,4µmol/L (en ausencia de insuficiencia renal y deficiencia de ácido fólico y Vitamina B6) Fuente: Andrès E. Vitamin B12 deficiency in the elderly. CMAJ 2004; 171 (3):251-259. 38 1.2.5.2 Determinación sérica de los niveles de Vitamina B12 Clásicamente el diagnóstico del déficit de Vitamina B12 se ha basado en la determinación plasmática de la misma, circunstancia que se ha venido realizando desde los años 50. De forma habitual el diagnóstico se ha establecido por niveles bajos de Vitamina B12 séricos, generalmente por debajo de 200 pg/mL junto con la evidencia clínica de enfermedad (Snow CF, 1999; Oh R, 2003; Allen LH, 2009; Langan RC, 2011). Recientemente, en un informe de la Organización Mundial de la Salud (OMS) se recomienda la cifra de 200 pg/mL como punto de corte sugestivo de deficiencia de Vitamina B12 (Walker PF, 2011). Este mismo límite también ha sido sugerido por otros autores (Snow CF, 1999; Gielchinsky Y, 2001; Goland S, 2003; Allen LH, 2004; Evatt ML, 2010; Langan RC, 2011; Bosco C, 2012). Sin embargo, es bien conocido que únicamente la determinación de los niveles de Vitamina B12 en plasma es poco sensible dependiendo de los puntos de corte que se consideren (Aguirre Errasti C, 2002; Refsum H, 2004; Evatt ML, 2010; Langan LC, 2011; Carmel R, 2011; Boulat O, 2012; Braillard O, 2012; Berg RL, 2013). Así en 1994, Matchar estableció que el valor predictivo positivo de esta prueba era de tan sólo un 22% (Matchar DB, 1994). No obstante, Clarke comunica una mayor sensibilidad y especificidad (del 75,7% y 72,4%, respectivamente) cuando el punto de corte se establece en 200 pmol/L, esto es por encima de 250 pg/mL (Clarke R, 2007). A pesar de la sensibilidad moderada de la determinación de la Cobalamina (64-85% según el punto de corte), se utiliza comúnmente en el ámbito clínico debido a su bajo costo y disponibilidad en la mayoría de los centros. Sin embargo, su especificidad es elevada (84%) (Braillard O, 2012) (Tabla 13). 39 Tabla 13. Sensibilidad y especificidad de la Vitamina B12 vs Holotranscobalamina. Abreviatura : HoloTC : Holotranscobalamina Adaptado de: Braillard O. Hypovitaminose B12 : quoi de neuf ?. Rev Med Suisse 2012; 8: 1805-1810. Así según Lechner, la determinación sérica de Cobalamina es el mejor test diagnóstico de inicio, pero los resultados deben ser interpretados con cautela, puesto que un nivel normal no excluye la deficiencia (Lechner K, 2005). De tal forma que marcadores de la actividad de la Cobalamina, tales como la Hcy sérica y/o el ácido metilmalónico pueden ser útiles en esta situación (Aguirre Errasti C, 2001; Lechner K, 2005; Schneede J, 2005; Willis CD, 2011; Chatthanawaree W, 2011). No obstante, algunos investigadores concluyen que únicamente la determinación de niveles séricos por debajo de 150 pmol/L constituye ya una alta probabilidad de padecer una deficiencia de Vitamina B12 (Miller JW, 2006; Langan RC, 2011; Braillard O, 2012) (Tabla 14). Tabla 14. Puntos de corte aceptados para definir el déficit de Vitamina B12. Cifras de Vitamina B12 Conclusión diagnóstica >300 pmol/L Déficit improbable 150-300 pmol/L Zona gris o borderline <150 pmol/L Déficit muy probable Equivalencia: 150 pmol/L= 200 pg/mL. Adaptado de: Braillard O. Hypovitaminose B12: quoi de neuf ? Rev Med Suisse 2012; 8: 1805-1810. Si sólo se tiene en cuenta este criterio como diagnóstico de déficit de Vitamina B12 en las personas mayores puede haber errores (Aguirre Errasti C, 2001; Solomon LR, 2007; Palacios G, 2013) (Tabla 15). Determinación sérica Punto de corte Sensibilidad Especificidad Vitamina B12 145 pmol/L 53% 84% Vitamina B12 180 pmol/L 64% 64% HoloTC 32 pmol/L 83% 60% HoloTC 21 pmol/L 64% 88% 40 Tabla 15. Determinantes de los niveles séricos de Vitamina B12 en ancianos. Valores bajos “falsos” Valores normales/altos “falsos” • Deficiencia de folato. • Mieloma múltiple. • Infección por VIH. • Bajos niveles de haptocorrina. • Niveles altos de haptocorrina: .- Trastornos mieloproliferativos. .- Enfermedad renal. • Liberación incrementada a los tejidos: .- Enfermedad hepática. • Baja/ausencia de Transcobalamina. • Baja afinidad de los polimorfismos de la TC. • Trastornos hereditarios del metab. de la Cbl. • Terapia reciente con Cbl. • Análogos de la Cbl: .- Terapia con Oxido nítrico. .- Altas dosis de vitamina C. .- Sobrecrecimiento bacteriano. • Errores en los test diagnósticos. Abreviaturas: TC: Transcobalamina. Metab: Metabolismo. Cbl: Cobalamina. Adaptado de: Solomon LR. Disorders of cobalamin (vitamin B12) metabolism: emerging concepts in pathophysiology, diagnosis and treatment. Blood Rev 2007; 21 (3):113-130. 1.2.5.3 Otros biomarcadores Homocisteína (Hcy) y Acido Metilmalónico (AMM) La carencia en los tejidos de la Cobalamina altera el funcionamiento de las dos reacciones fundamentales que ya hemos comentado con anterioridad (Figura 5), la desmetilación de la homocisteína a metionina y la isomerización de Metilmalónico CoA a SuccinilCoA, lo que se traduce en una elevación de los niveles de ácido metilmalónico (AMM) en sangre y/u orina y elevación de homocisteína en sangre que se normalizan tras la suplementación de Vitamina B12 (Wiersinga WJ, 2005; Mazokopakis EE, 2012; Stabler P, 2013). La elevación del AAM en sangre y/u orina y la hiperhomocisteinemia son consideradas por algunos autores como el “patrón de oro” para el diagnóstico tisular del déficit de Vitamina B12. De hecho se considera que si la los niveles de AMM y homocisteína están dentro de los valores normales se puede descartar casi con toda probabilidad que nos encontremos ante un caso de déficit de Cobalamina (Allen RH, 1990; Lindenbaum J, 1990; Savage DG, 1994; Aguirre Errasti C, 2001; Chatthanawaree W, 2011; Stabler SP, 2013). 41 Ya en 1992 Pennipacker describió que si se aceptaba el aumento de los niveles de homocisteína y de acido metilmalónico así como su normalización tras tratamiento sustitutivo como criterios diagnósticos de déficit de Vitamina B12, aproximadamente la mitad de los pacientes tenían niveles de Vitamina B12 por encima de 200 pg/mL (Pennypacker LC, 1992). Otros estudios encontraron hallazgos similares, sugiriéndose que se podía producir un importante infradiagnóstico, del 10 al 26% si sólo se tenían en cuenta para el diagnóstico los niveles séricos bajos de Vitamina B12 (Stabler SP, 1995). En 1994 en un importante estudio longitudinal de 406 pacientes con déficit de Vitamina B12, se constataba que el 98,4% presentaba niveles elevados de AMM y un 95,9% hiperhomocisteinemia (Savage DG, 1994). Lindenbaum estableció que la determinación combinada de ambos suponía una sensibilidad del 99,8% (Lindenbaum J, 1994). Por su parte, Klee en una revisión exhaustiva repasa varios trabajos que reconocen de igual forma que las variaciones al alza de ambos marcadores son muy sensibles y específicos de la deficiencia funcional de la Vitamina B12 (Klee GG, 2000). Estudios más recientes apuntan también en esta dirección (Brito A, 2012; Boulat O, 2012; Stabler SP, 2013; Herrmann W, 2013). No obstante, los puntos de corte de ambos metabolitos para definir una posible deficiencia de Vitamina B12 aún no están bien definidos (Valente E, 2011). Así en el estudio de Bailey et al. se analizó una serie de más de 12.600 individuos americanos. Entre los individuos que presentaban niveles de Vitamina B12 por debajo de 200 pg/mL, sólo del 22 al 44% de los mismos tenían concentraciones elevadas de AMM (dependiendo del punto de corte), y sólo el 32% tenían concentraciones elevadas de Hcy en plasma (Bailey RL, 2011). Igualmente, Campbell comunicó un incremento de los niveles de AMM en plasma (<350 nmol/L) y de Hcy en plasma (>13 µmol/L) en el 46% y en el 51% de los pacientes con niveles bajos de Vitamina B12 en plasma (<200 pg/mL), respectivamente (Campbell AK, 2003). Por tanto, en los últimos años la investigación de esta deficiencia ha venido liderada por la determinación de estos biomarcadores que se han consolidado como marcadores más sensibles, además de más precoces para determinar un estado de deficiencia de 42 Cobalamina (Hvas AM, 2006; Braillard O, 2012). No obstante y aún cuando la determinación de AMM en suero puede tener un lugar en los algoritmos diagnósticos propuestos en varios trabajos (Berg RL, 2013), este indicador de insuficiencia cobalamínica se encuentra falsamente elevado en los casos de deterioro de la función renal (Schneede J, 2005), circunstancia que ocurre frecuentemente en los pacientes añosos. Además, por otra parte, hay estudios que informan que los niveles séricos de AMM se encuentran con frecuencia elevados como se reporta en un estudio de pacientes mayores realizado en el Norte de los EE.UU (Morris MS, 2002). También es bien conocido el aumento de las cifras de homocisteína con el aumento de la edad. Así en un estudio reciente español con 167 pacientes institucionalizados se objetivaron cifras elevadas de Hcy en 100 individuos (66% de la muestra), mientras que el déficit de Vitamina B12 se evidenció sólo en 18 (11%) (Albers U, 2012). De todo ello se deduce que tanto la determinación de los niveles de homocisteína como de AMM no ha sido completamente validada como examen clínico de rutina de la deficiencia de Cobalamina. Además de tratarse de una prueba cara y la no disponibilidad en todos los centros, se suma la posibilidad de falsos positivos (Ray JG, 2005; Langan RC, 2011; Willis CD, 2011; Chatthanawaree W, 2011) (Tabla 16). Hay que advertir que para el diagnóstico de déficit de la Vitamina B12 la elevación del AMM es mucho más específica que la hiperhomocisteinemia (Oh R, 2003; Langan RC, 2011; Chatthanawaree W, 2011; Stabler SP, 2013). Tabla 16. Causas de falsos positivos de niveles elevados de homocisteina y AMM. Homocisteína • Edad. • Insuficiencia renal. • Terapia con L-Dopa. • Déficit de Acido fólico. • Hiperhomocisteinemia familiar. Acido metilmalónico (AMM) • Edad. • Insuficiencia renal. • Depleción de volumen. Adaptado de: Shobha V. Vitamin B12 deficiency & levels of metabolites in an apparently normal urban south Indian elderly population. Indian J Med Res 2011; 134:432-439. 43 Holotranscobalamina (holoTC) Herzlich y Herbert postularon que el cambio más temprano que tiene lugar en los pacientes con un balance negativo de Vitamina B12 es el descenso en la concentración de la holotranscobalamina (Herzlich B, 1988). La determinación de la holotranscobalamina (holoTC) es el último marcador que se ha incorporado en la práctica clínica habitual para el diagnóstico de la deficiencia de Cobalamina y puede convertirse en los próximos años en una prueba básica para el diagnóstico del déficit de Vitamina B12 (Andrès E, 2004; Herrman W, 2005; Langan RC, 2011). Sobretodo, su principal interés radica en la capacidad de detectar los casos de deficiencia subclínica de la Cobalamina (Boulat O, 2012; Fragasso A, 2012; Herrmman W, 2013). Como ya mencionamos previamente, la holoTC ó complejo Transcobalamina IIVitamina B12 representa la porción biodisponible de Vitamina B12 (Clarke R, 2007; Chatthanawaree W, 2011). Presenta pocas variaciones a los largo del día, pudiendo hacerse la medición de la misma en ayunas o no (Braillard O, 2012). También aumenta sus valores en pacientes con insuficiencia renal, aunque en menor medida que el AMM y la homocisteína. Además, todavía hay muchas situaciones en las que no se ha podido validar su utilidad como p.e en las enfermedades hepáticas, alteraciones hematológicas, deficiencia concomitante de ácido fólico o consumo de alcohol (Willis CD, 2011; Braillard O, 2012). 1.2.5.4 Pros y contras de los diferentes biomarcadores Según Allen y su grupo, en los modelos de regresión múltiple, tanto el AMM como la homocisteína predijeron las mismas carencias funcionales que los niveles bajos de Vitamina B12 plasmáticos (Allen LH, 2004). Por otra parte, Miller demostró que la determinación sérica de Vitamina B12 y holoTC total tienen la misma exactitud diagnóstica en la detección de la deficiencia de Vitamina B12 metabólica. Incluso, según 44 el mismo autor la medición de ambos (holoTC y Vitamina B12) ofrece un mejor diagnóstico para la deficiencia de Vitamina B12 que cualquier test solo (Miller JW, 2006). Por su parte Boulat, establece que en la deficiencia clínica de la Vitamina B12, tanto la determinación de Cobalamina como la de holotranscobalamina tienen un rendimiento muy similar como pruebas diagnósticas (Boulat O, 2012). A continuación se muestra en la siguiente tabla las ventajas y desventajas de los test de laboratorios más utilizados habitualmente para el diagnóstico del déficit de Vitamina B12 (Hvas AM, 2006; Chatthanawaree W, 2011; Braillard O, 2012; Stabler SP, 2013) (Tabla 17). Tabla 17. Pros y contra de los test de laboratorios usados para el diagnóstico del déficit de Vitamina B12. Tests en plasma Justificación y ventajas Desventajas Cobalamina (Cbl) • Disminución del déficit de Vit.B12. • Fácilmente accesible. • Barato. • Variación en el intervalo de referencia debido a los diferentes métodos uitilizados. Sensibilidad y especificidad discutible. • Falso positivo si se reduce la haptocorrina. • Falso negativo si haptocorrina se incrementa (p.e en la leucemia mieloíde crónica). Ácido metilmalónico (AMM) • Incremento en el déficit de Vit. B12. • Alta sensibilidad. • No accesible fácilmente. • Caro. • Especificidad discutible: falso positivo si disminución de la función renal. Homocisteína total (Hcy total) • Incremento en el déficit de Vit. B12. • Alta sensibilidad. • Se requiere un procedimiento especial para el manejo de la muestra. • Baja especificidad, influenciados por los factores de estilo de vida (fumar, ingesta de alcohol, consumo de café). • Falso positivo en la deficiencia de folato y en el déficit de vitamina B6. •Falso positivo con reducción de función renal. Holotranscobalamina (holoTC) •Disminución en el déficit de Vit. B12. •Se espera que tenga una alta sensibilidad • La especificidad no es muy alta. • No disponibilidad en todos los centros. • No validada si existen comorbilidades. Adaptado de: Hvas AM. Diagnosis and treatment of vitamin B12. An update. Haem 2006; 9:1506-1512. Braillard O. Hypovitaminose B12: quoi de neuf ?. Rev Med Suisse 2012; 8:1805-1810. 1.2.5.5 Aproximación diagnóstica del déficit de Vitamina B12 No se recomienda la realización de más test ó pruebas si en la realización de la historia clínica se documenta insuficiencia dietaria como p.e en los vegetarianos (Hvas AM, 2006). 45 Incluso en los pacientes mayores en los que el diagnóstico de déficit de Vitamina B12 es obvio en base a los hallazgos clínicos y analíticos y su equipo se plantean la posibilidad de no realizar más pruebas diagnósticas (Hvas AM, 2006; Langan RC, 2011; Stabler SP, 2013). Según la situación particular de cada caso, se pueden realizar unas y otras determinaciones (Evatt ML, 2010) (Tabla 18). Fuente: Evatt ML. Vitamin B12 deficiency: detection and diagnosis. Why vitamin B12 deficiency should be on your radar screen www.cdc.gov/ncbddd/b12/detection.html. La cuestión del screening sigue siendo todavía un tema a debate. El razonamiento para la realización del mismo es la detección precoz del déficit de Vitamina B12 (Hvas AM, 2006; Stabler SP, 2013). En los últimos años, numerosos algoritmos diagnósticos han sido propuestos (Andrès E, 2004; Ray JG, 2005; Braillard O, 2012; Berg RL ,2013) para el estudio de los pacientes con probable déficit de Vitamina B12 como el que se muestra a continuación (Andrès E, 2004) (Figura 8). Tabla 18. Medidas de aproximación diagnóstica del déficit de Vitamina B12. Problema Objetivo Determinaciones sugeridas Pacientes con síntomas o signos hematológicos, neurológicos o ambos. Confirmar la sospecha de deficiencia de Vitamina B12. Vitamina B12 sérica. Pacientes con síntomas ó signos hematológicos, neurológicos o ambos debidos con baja probabilidad a déficit de Vitamina B12. Asegurarse de la deficiencia de Vitamina B12. Vitamina B12 , AMM y Hcy. Pacientes asintomáticos con enfermedad conocida que causa déficit de Vitamina B12. Determinar si se ha desarrollado ya el déficit de Vitamina B12. AMM (los cambios metabólicos preceden a la deficiencia de Vitamina B12) Pacientes asintomáticos en los que accidentalmente se encuentran niveles bajos de Vitamina B12 o altos de Hcy. Determinar si existe déficit de Vitamina B12. AMM Abreviaturas: AMM: Acido Metilmalónico. Hcy: Homocisteina. 52 hiperhomocisteinemia incrementa la expresión de NF-kappa B, MCP-1 e interleucina 8 (IL-8) en las células endoteliales (Ungvari Z, 2004; Marosi K, 2012). 2.3 Metabolismo de la homocisteína La homocisteína desempeña una importante función metabólica al participar en un sistema de transferencia de grupos metilo. La metionina cede su grupo metilo en una reacción catalizada por una metil-transferasa, y da lugar a la S-adenosilhomocisteína, la cual se desprende por hidrólisis de la adenosina, y se obtiene homocisteína libre (Chichizola C, 2003; Aguirre Errasti C, 2009; Brustolin S, 2010; Sukla KK, 2012; Bhargava S, 2012; Lippi G, 2012) (Figura 10). Como ya citamos previamente, la Hcy se metaboliza fundamentalmente por dos vías: la vía de la remetilación y la vía de la transulfuración (Henning BF, 1999; Gellekink H, 2005; Rosenson RS, 2012). La vía de la remetilación permite la recuperación de Figura 10. Metabolismo de la homocisteína. Abreviaturas: MAT: Metionina adenosiltransferasa. MTHF: Metilentetrahidrofolato. Fuente: Sánchez C. Vitaminas B y homocisteína en la insuficiencia renal crónica. Nutr Hosp 2007; 22(6):61-71. 53 metionina mediante dos rutas de transferencia de un grupo metilo (Bhargava S, 2012): Ruta 1. Desde la betaína se transfiere un grupo metilo a la Hcy. En esta reacción, catalizada por la betaína-homocisteína metiltransferasa, la homocisteína se transforma en metionina y la betaína lo hace en dimetilglicina. Ruta 2. Desde el 5metiltetrahidrofolato, el mayor donador de unidades metilo en la reconversión de homocisteína a metionina (sintetizado a partir del 5,10-Metilenotetrahidrofolato por la enzima Metilenotetrahidrofolato reductasa), se transfiere el grupo metilo a la homocisteína. En esta 2ª ruta, catalizada por la 5-metiltetrahidrofolato-homocisteína-Smetiltransferasa o metionina sintasa (MS), el coenzima enzimático necesario es la Metil-cobalamina (forma coenzimática de la Vitamina B12) (Chichizola C, 2003; Zhou SJ, 2012). La vía de transulfuración representa una alternativa en caso de que la metionina esté en relativo exceso en el organismo y no se requiera su recuperación, y permite la síntesis del aminoácido cisteína. Su reacción clave es catalizada por la Cistationina B Sintasa (CBS), que tiene como grupo prostético al fosfato de piridoxal, derivado de la Vitamina B6 (Meier M, 2001; Marosi K, 2012; Lippi G, 2012; Halsted CH, 2013) (Figura 10). 2.4 Prevalencia de la hiperhomocisteinemia A pesar de la alta importancia de la determinación de la homocisteína sérica, existen pocos estudios sobre la prevalencia de hiperhomocisteinemia en pacientes hospitalizados (Ventura P, 2001; Marengoni A, 2004; Viña Rodríguez JJ, 2006; Damelan K, 2010; Lietava J, 2012). En estudios comunitarios publicados en los años 90 ya se estableció una prevalencia en personas mayores entre un 30 y un 56% (Pennypacker LC, 1992; Joosten E, 1993). En 2007, un estudio realizado entre 557 individuos sanos canarios demostró una prevalencia global del 21,4% (Henríquez P, 2007). En 2001, un grupo italiano sobre una serie de 600 pacientes ingresados en un Servicio de Geriatría observaron hiperhomocisteinemia en el 61% de los individuos (365/600) (Ventura P, 2001); por su parte, Marengoni y su grupo objetivaron unos niveles de Hcy superiores a 12 µmol/L en el 74% de los varones y 69% de las mujeres (Marengoni A, 2004); Posteriormente, otro estudio español realizado en 337 pacientes hospitalizados mayores de 65 años, constató que el 47,2% tenían hiperhomocisteinemia (Hcy >15 µmol/L) (Viña Rodríguez JJ, 2006). 54 En 2010, en una cohorte de 183 pacientes con diagnóstico clínico y radiológico de enfermedad cerebrovascular el 61% de los sujetos presentaba hiperhomocisteinemia, siendo el segundo factor de riesgo cardiovascular tras la hipertensión arterial en cuanto a prevalencia (Damelan K, 2010); por su parte Lietava y su grupo demostraron una prevalencia de hiperhomocisteinemia del 32,9% en pacientes con cardiopatía isquémica crónica frente al 13,6% en una población control (Lietava J, 2012). 2.5 Etiología de la hiperhomocisteinemia El aumento de la homocisteína plasmática puede ser debido tanto a causas adquiridas como hereditarias (Haynes WG, 2002; Aguirre Errasti C, 2009; Yang B, 2013; Rosenson RS, 2013). Dentro de las primeras destacan principalmente la disminución de ácido fólico, Vitamina B12 y Vitamina B6. Éstas están disminuidas en 1/3 de las enfermedades cardiovasculares isquémicas que presentan un aumento de la homocisteína (Pinto Sala X, 2004) (Tabla 22). Las causas hereditarias se deben a la alteración de alguna de las enzimas que tiene relación con el metabolismo de la homocisteína. De ellas cabe destacar la enzima Metilentetrahidrofolatorreductasa (MTHR) por ser la causa genética más frecuente de hiperhomocisteinemia (Pinto Sala X, 2004). También hay que mencionar las interrelaciones de las vitaminas anteriormente reseñadas en el metabolismo de la homocisteína (Sukla KK, 2012). En casos de hiperhomocisteinemia, aunque los valores de estas vitaminas estén en límites normales, si se suplementan, disminuyen incluso hasta en un 95% de los casos los niveles de homocisteína (Coppola A, 2000; Lonn E, 2006; Martí-Carvajal AJ, 2013). Tabla 20. Límite superior de referencia para las concentraciones de homocisteína (μmol/L) en situación de ayuno en distintos grupos de población. Fuente: Pintó Sala X. La homocisteína en la prevención de las enfermedades cardiovasculares. Jano 2004; 67(1541): 75-78. Grupo Individuos que Individuos que no consumen suplementos consumen suplementos de folatos de folatos Embarazo 8 10 Niños (<15 años) 8 10 Adultos (15-65 años) 12 15 Ancianos (>65 años) 16 20 55 Tabla 21. Mecanismos de lesión y oclusión vascular en la hiperhomocisteinemia. Tabla 5. Causas de hiperhomocisteinemia Tabla 5. Causas de hiperhomocisteinemia Abreviaturas: HSP-70: heat shock proteins. LP(a): Lipoproteína A. sICAM-1: Molécula de adhesión intercelular soluble. TX: Tromboxano. VCAM-1: Vascular cell adhesion molecule 1. vWF: von Willebrand factor. Tabla 22. Causas de hiperhomocisteinemia. 1. Causas hereditarias: Mecanismo Grado • MTHFR C677T. (homocigosidad). • CBS (heterocigosidad). • Homocisteinuria. ↓ remetilación Hcy. ↓ transulfuración Hcy. ↓ remetilación Hcy y/o transulfuración. ↑ ↑ ↑↑↑ 2. Causas adquiridas: Mecanismo Grado 2.1 Factores nutricionales: • Déficit de Folato. • Déficit de Vitamina B6. • Déficit de Vitamina B12. ↓ remetilación Hcy. ↓ remetilación Hcy. ↓ transulfuración Hcy. ↑↑ ↑↑↑ ↑ 2.2. Consumo de café Interferencia con la Vit. B6. ↑ requerimientos grupo metilo. 2.3. Tóxicos: • Tabaquismo. • Alcohol. Interferencia con la Vit. B6, B12 y ácido fólico. Interferencia con la Vit. B6, B12 y fólico. Inhibición enzimática. (↑) (↑) 2.4. Procesos patológicos: • Insuficiencia renal. • Psoriasis severa • Cáncer. • Artritis reumatoíde • Hipotiroidismo. Alteración remetilación. Proliferación celular (>consumo de folatos). Alteración enzimática. ↑↑ ↑ 2.4. Fármacos: • Oxido nitroso. • Metotrexato. • Teofilina. • Antiepilépticos. • Colestipol y colestiramina. • Acido nicotínico. • Fibratos. • Trimetroprim. • Metfotmina. Inactivación de la MS. Inhibición de la DHFR. Inhibición de la piridoxalcinasa. Depleción de folatos. ↓ Absorción AF y Vit. B12. Antagonismo de la Vit. B6. Activacion de PPARα ? Función renal. Inhibición de la DFHR. Inhibición de la absorc. Vit. B12 ↑↑ ↑ ↑ ↑ (↑) ↑ ↑ ↑ (↑) • Ciclosporina A. • Levodopa. Alt. función renal. Competición por metilación. dependiente de la SAM. ↑ ↑ Abreviaturas: AF: Acido fólico. CBS: Cistationina B Sintasa. DHFR: Dihidrofolato Reductasa. Hcy: Homocisteína. MS: Metionina Sintasa. PPARα: Receptores activados de proliferación de los peroxisomas tipo α. SAM: Adenosil Metionina. Fuente: Pintó Sala X. La homocisteína en la prevención de las enfermedades cardiovasculares. Jano 2004; 67(1541): 75-78. 1. Peroxidación lipídica, producción de H202 y peroxinitrito. 2. Lesión y disfunción endotelial, proliferación de células musculares lisas, síntesis de colágeno. 3. Lesión de la estructura celular, lesión mitocondrial, expresión de HSP-70,metaloproteinasas. 4. Aumento de la quimiotaxis y adhesión leucocitaria: aumento de VCAM-1,sICAM-1,vWF. 5. Aumento de la coagulación sanguínea: aumento de la expresión de factor tisular, inactivación de la proteína C, activación del factor V. 6. Aumento de la agregación plaquetaria: aumento de producción de TXA2 y TXB2. 7. Disminución de la fibrinolisis: aumento de PAI-1; disminución de la trombomodulina en la superficie de las células endoteliales; aumento de la unión de la LP(a) a la fibrina; disminución de la expresión de heparan sulfato. 56 2.6 Consecuencias de la hiperhomocisteinemia Hiperhomocisteinemia y riesgo cardiovascular La relación entre las concentraciones de Hcy y el riesgo cardiovascular es continuo y gradual (Kamdi SP, 2013), aunque no parece existir un valor umbral a partir del cual se inicie o desparezca el riesgo. Dicha relación se observa tanto en los varones como en las mujeres así como en las personas de edad media y avanzada (Ueland PM, 2000). En cuanto a la relación de la hiperhomocisteinemia y la enfermedad arterial coronaria, Humphrey y su grupo consideraron 26 estudios en el modelo final que mostró un 2050% más de riesgo de EAC por cada incremento de 5 μmol/L en el nivel de Hcy medida; el resultado de riesgo relativo combinado (RR) para los eventos coronarios fue de 1,18 (IC del 95%: 1,10-1,26) por cada incremento de 5 μmol/L en el nivel de Hcy, independientemente de los factores de riesgo cardiovascular tradicionales (Humphrey LL, 2008). También se ha observado relación entre la hiperhomocisteinemia y la enfermedad arterial periférica (EAP). Khandanpour demostró a través del análisis de 14 estudios relevantes que los niveles de Hcy fueron significativamente elevados en los pacientes con enfermedad arterial coronaria en comparación con los controles (Khandanpour N, 2009). En 2005, se publica un metánalisis que relaciona la hiperhomocisteinemia con enfermedad trombótica venosa (ETV). Tras analizar 24 estudios retrospectivos (n=3.289) y tres estudios prospectivos (n=476 casos), concluyeron que un aumento de los niveles de homocisteína en plasma de 5 µmol/L se asociaban con un riesgo adicional del 27% de presentar ETV en estudios prospectivos, y un 60% más de riesgo en estudios retrospectivos (den Heijer M, 2005). 57 3. GEN DE LA ENZIMA 5,10-METILENTETRAHIDROFOLATO REDUCTASA 3.1 Generalidades La 5,10-Metilentetrahidrofolatoreductasa (MTHFR) es una enzima clave en el metabolismo de la homocisteína y del ácido fólico (Bjelland I, 2003). Su disfunción se relaciona con un aumento de los niveles de Hcy en sangre (Sukla KK, 2012; Mahalle N, 2013). Esta enzima cataliza la reducción del 5,10-Metilentetrahidrofolato (5,10-MTHF) a 5-Metiltetrahidrofolato (5-MTHF), que constituye la principal forma de folato circulante y co-sustrato de la remetilación de la Hcy a metionina (Zittan E, 2007; Ozbek Z, 2008; Marosi K, 2012) (Figura 10). Por tanto, constituye un precursor crítico en la cascada de reacciones que conducen a la metilación de diversas moléculas, incluyendo el ADN (García-Robles R, 2011). El gen de la enzima 5,10-MTHFR contiene 2,2 kilobases, está localizado en el cromosoma 1 (1p36.3) y codifica una proteína de 77 kDa (Goyette PM, 1998; Trabetti E, 2008; Malinowska A, 2009; Sensoy N, 2012) (Fig. 11). Figura 11. Localización y representación esquemática del gen de la enzima 5,10Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). Fuente: Trabetti E. Homocysteine, MTHFR gene polymorphisms and cardio-cerebrovascular risk. J Appl Genet 2008; 49(8): 267-282 58 3.2 Variantes genéticas Se han descrito hasta 29 mutaciones que afectan al gen de la enzima 5,10-MTHFR, ya sea en su funcionalidad, cantidad o ambas, lo que produce un aumento de la concentración de los niveles de homocisteína en el plasma y los tejidos (Ueland PM, 2001; Bjelland I, 2003; Sukla KK, 2012). De estas mutaciones hay dos polimorfismos de un solo nucleótido (SNP, del inglés simple nucleotide polymorphism), la C677T y la A1298C que se han asociado con una disminución de la actividad de esta enzima (García-Robles R, 2011). La mutación genética más frecuente es la C677T de la enzima 5,10metilentetrahidrofolato reductasa. Esta mutación fue identificada inicialmente por Kang y demostrada posteriormente por Frosst (Kang SS, 1991; Frosst P, 1995). Existen 3 presentaciones genotípicas para este polimorfismo, la forma CC (normal) y dos formas anómalas: la forma CT (genotipo heterocigoto) y la forma TT (genotipo mutado). Estas mutaciones producen una disminución de la actividad enzimática del 30% para la forma CT y del 50-60% para la forma TT (Frosst P, 1995; Malinowska A, 2009; Miyaki K, 2010; Marosi K, 2012). Esta última forma también llamada termolábil se caracteriza por una mutación puntual en la posición 677 del exón 4 del gen, que consiste en una transición de una citosina (C) por timina (T). Esta mutación determina la sustitución del aminoácido alanina por valina en el dominio catalítico de la enzima. Como consecuencia, los niveles plasmáticos de homocisteína de los individuos que presentan dicha variante pueden verse alterados, alcanzándose con frecuencia el estado de hiperhomocisteinemia. Así varios autores han demostrado que la condición homocigota TT del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR se relaciona de forma significativa con hiperhomocisteinemia (James SJ, 1999; Selhub J, 2008; Coppedè F, 2009). Incluso un metánalisis realizado por Brattsröm demostró que los individuos que presentan el genotipo TT tienen incrementados los niveles de Hcy en un 25% (Brattsröm L, 1998). También, en condiciones de baja ingesta de folatos, el genotipo TT se asocia a hiperhomocisteinemia (Martínez Frías ML, 2004; González Martín-Moro B, 2005; Yang Q, 2012), disminución de la concentración de folatos en el plasma, disminución de la metilación del DNA genómico, enfermedad cardiovascular, algunos tipos de cáncer y a una menor respuesta a la suplementación con folatos (Jacques PF, 1996). 59 3.3 Prevalencia de las formas genotípicas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR Diversos estudios han demostrado variaciones étnicas y regionales para las frecuencias alélicas y genotípicas de esta mutación (Rodríguez Esparragón F, 2003; Holm PI, 2007; Barbosa PR, 2008; Kumar J, 2009; Qin X, 2012; Sukla KK, 2012). Así p.e mientras en la población japonesa se demuestra una prevalencia entre el 26 y el 37% (Papapetrou C, 1996; Sohda S, 1997; Nishio K, 2008), en poblaciones afro-americanas se presenta en un porcentaje mucho más bajo (2-11%) (Stevenson RE, 1997; Dilley A, 2001; Carmel R, 2003). En un amplio estudio realizado en más de 7.000 recién nacidos de diferentes etnias procedentes de distintas áreas de Europa, Asia, América, Oriente Medio y Australia, se observó que la distribución del alelo T mostraba una marcada variación étnica y geográfica. Así el genotipo homocigoto TT fue frecuente en China (20%), sur de Italia (26%) y Méjico (32%). Se observó también cierto gradiente en Europa con aumento de su prevalencia de norte a sur y en China de forma inversa, con descenso del norte al sur. El genotipo TT fue poco frecuente en los recién nacidos con ancestros africanos, algo más frecuente en los de origen europeo y aún más frecuente en los recién nacidos americanos con ancestros hispanos (Wilcken B, 2003) (Tabla 23). De forma global en la población caucásica su incidencia es de aproximadamente el 40% para las formas heterocigotas y del 5-15% para las formas homocigotas (Botto LD, 2000; Cortese C, 2001; Martínez Frías ML, 2004; Sánchez-Marín B, 2006; Holm PI, 2007). A diferencia de lo que ocurre en otras mutaciones, como la del Factor V Leiden (Rees DC, 1995; Bhaijee F, 2012; van Mens TE, 2013) o la C282Y y H63D en la hemocromatosis (Merryweather-Clarke AT, 1998; Hernaez F, 2011; Trifa AP, 2012), que son relativamente frecuentes en toda Europa, el polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10MTHFR es más frecuente en España y otros países del área mediterránea en comparación con el norte de Europa (Wilcken B, 2003;González Martín-Moro B, 2005; García Hernández MC, 2007). Es decir, en Europa, esta prevalencia se incrementa del norte hacía el sur, con valores bajos entre el 4 y 7% en Finlandia, Helsinki y Rusia, valores intermedios entre 8-10% en Francia y Hungría y, valores más elevados en 60 España (12-15%) (Gil-Prieto R, 2009) y norte de Italia (14-18%) (Girelli D, 1998; Motti C, 1998; Botto LD, 2000). Esta variabilidad interterritorial también se observa en otras zonas del mundo (Abbate R, 1998; Chavez L, 2002; Zittan E, 2007; Kumar J, 2009; Isordia-Salas I, 2010). En este sentido, la prevalencia de esta mutación es menor en África comparada con Europa y Asia (Hambaba L, 2008; Ibrahim S, 2009; Rahimi Z, 2009), aunque se han encontrado hallazgos discordantes de hasta un 44,9% en indígenas brasileños y de un 4,5% en grupos de Sri Lanka (Schneider JA, 1998). Tabla 23. Alelo y frecuencia de las formas genotípicas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR por área y origen étnico a nivel mundial. Genotipo (No)* Genotipo (%) Frecuencia Alelo CC CT TT T Área Muestra No CC CT TT (%) (%) (%) 95% IC (%) Europa Italia, Sicilia 468 138 236 94 29 50 20,1 16,7 a 24,0 45,3 Italia, Campania 500 172 196 132 34 39 26,4 22,7 a 30,4 46,0 Italia, Veneto Italianos blancos 385 128 198 59 33 51 15,3 12,1 a 19,3 41,0 Otros 47 27 15 5 57 32 10,6 4,6 a 22,6 26,6 España, multicentro Españoles blancos 601 265 265 71 44 44 11,8 9,5 a 14,6 33,9 Otros 51 24 20 7 47 39 13,7 6,8 a 25,7 33,3 Francia, Estrasburgo 178 72 85 21 40 48 11,8 7,8 a 17,4 35,7 Países Bajos 188 97 79 12 52 42 6,4 3,7 a 10,9 27,4 Finlandia, Helsinki 545 293 230 22 54 42 4,0 2,7 a 6,0 25,1 Hungría 378 165 171 42 44 45 11,1 8,3 a 14,7 33,7 Rusia 587 312 234 41 53 40 7,0 5,2 a 9,3 26,9 Medio Oeste Israel 210 120 72 18 57 34 8,6 5,5 a 13,1 25,7 China Norte, etnia Han 643 201 315 127 31 49 19,8 16,9 a 23,0 44,2 Sur, etnia Han 430 167 228 35 39 53 8,1 5,9 a 11,1 34,7 Oceanía Australia Blancos 288 146 119 23 51 41 8,0 5,4 a 11,7 28,6 Otros 75 40 27 8 53 6 10,7 5,5 a 19,7 28,7 America Méjico 500 91 248 161 18 50 32,2 28,3 a 36,4 57,0 USA, Atlanta Blancos 300 142 126 32 47 42 10,7 7,7 a 14,7 31,7 Negros 298 231 59 8 78 20 2,7 1,4 a 5,2 12,6 Hispanos 62 22 29 11 35 47 17,7 10,2 a 29,0 41,1 Asiáticos 26 16 9 1 62 35 3,8 0,7 a 18,9 21,2 Otros, desconocidos 100 63 32 5 63 32 5,0 2,2 a 11,2 21,0 Canadá, Alberta Blancos 240 136 90 14 57 38 5,8 3,5 a 9,6 24,6 Otros 30 17 13 0 57 43 0,0 0,0 a 11,4 21,7 Total 7130 Fuente: Wilcken B. Geografical and ethnic variation of the 677C>T allele of 5, 10 MTHFR: findings from over 7000 newborns from 16 areas world wide. J Med Genet 2003; 40: 619-625. 61 3.4 Consecuencias clínicas Como ya se ha mencionado previamente, los pacientes afectados por esta mutación suelen experimentar una elevación de las concentraciones plasmáticas de homocisteína (D’Angelo A, 2000; Yajnik CS, 2006; González-Porras JR, 2007). Varios meta-análisis han concluido que los individuos con el genotipo TT del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR tienen un mayor riesgo de padecer enfermedad arterial coronaria (EAC) (Wald DS, 2002; Klerk M, 2002). Walds et al. demostraron un 21% de riesgo adicional de presentar EAC en los individuos con la forma TT vs la forma CC (Wald DS, 2002). Klerk y su grupo tras la revisión de 40 estudios observacionales que incluían más de 11.000 casos y 12.758 controles, concluyen que los individuos con el genotipo TT tenían un 16% (OR, 1,16; IC 95%: 1,05 a 1,28) más de probabilidades de presentar EAC en comparación con los individuos que presentan el genotipo CC (Klerk M, 2002). Sin embargo, otros metanálisis obtienen resultados diferentes y no observaron este aumento del riesgo trombótico (Brattström L, 1998; Lewis SJ, 2005). En 1998, Brattström y su grupo publicaron un trabajo en el que analizaron 23 estudios que sumaban más de 12.000 individuos. No se demostró asociación con EAC ni con enferemedad trombótica venosa (Brattström L, 1998). Posteriormente, otro metanálisis publicado en 2005 en el que se englobaron 26.000 casos y 31.183 controles tampoco encontró asociación entre la forma TT y la EAC (Lewis SJ, 2005). También se ha relacionado esta mutación con un mayor riesgo de presentar un ictus (Holmes MV, 2011; Sarecka-Hujar B, 2012). En un metanálisis del año 2011, con independencia del nivel de folato para los participantes homocigotos para el alelo T en comparación con los homocigotos para el alelo C, la OR fue de 1,37 (IC 95%: 1,251,50); La OR para individuos heterocigotos (forma CT) fue 1,14 (IC 95%: 1,08-1,21). Resultados para diferentes subtipos de ictus siguieron un distribución similar (Holmes MV, 2011). Un reciente metanálisis realizado en niños y adolescentes (822 casos y 1.552 controles) revela que el genotipo TT del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR es más común en pacientes con accidente cerebrovascular que en los controles (p=0,04, OR =1,57, IC 95%:1,02-2,41) (Sarecka-Hujar B, 2012). Sin embargo, en el metanálisis de Wald los resultados no fueron concluyentes. Analizaron 68 4Evaluar la prevalencia de las formas genotípicas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en pacientes con déficit de Vitamina B12 en relación con un grupo control. 5.- Analizar si las formas genotípicas anómalas de la enzima 5,10-MTHFR se relacionan con menores niveles de Vitamina B12. 6.- Evaluar la prevalencia de hiperhomocisteinemia en pacientes con déficit de Vitamina B12 y compararla con la prevalencia en un grupo control. 7.- Analizar si la coexistencia de formas anómalas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR se relaciona con mayores cifras de homocisteína plasmática en pacientes con déficit de Vitamina B12. 8.- Evaluar si existen diferencias en cuanto a la presencia de patología cardiovascular, reingresos y mortalidad entre los pacientes con déficit de Vitamina B12 y formas anómalas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR con respecto a la forma CC. 9.- Analizar la relación entre el valor de la Vitamina B12 y la mortalidad. 69 C. PACIENTES Y MÉTODO 70 71 PACIENTES Y MÉTODO 1.- Descripción del estudio El estudio consta de dos partes diferentes, con distinto diseño para la consecución de cada uno de los dos objetivos generales planteados. En la primera parte se realiza un estudio descriptivo transversal para establecer la prevalencia del déficit de Vitamina B12 en pacientes hospitalizados en el Servicio de Medicina Interna de un hospital de tercer nivel. En la segunda parte, realizada posteriormente, se realiza un estudio de casos – control, siendo los casos una serie de pacientes hospitalizados en los que se diagnostica un déficit de Vitamina B12, en los cuales se evalúa la presencia de la mutación C677T del gen de la enzima Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) comparándose con un grupo control. 2.- Población La población a estudio corresponde al área de Salud Norte de Las Palmas de Gran Canaria. Se trata de pacientes que ingresaron en el Servicio de Medicina Interna del Hospital Universitario de Gran Canaria Dr. Negrín y que cumplían los criterios de inclusión que se exponen a continuación. Este Servicio tiene asignadas 96 camas de hospitalización para una población de referencia de aproximadamente 450.000 habitantes residentes. 3.- Muestra. Primera parte del estudio Para el cálculo del tamaño de la muestra se consideró una prevalencia de déficit de Vitamina B12 del 15% de la población, con un nivel de confianza del 95% y una precisión de 0,04, por lo que para tener un tamaño significativo de la muestra, se necesitaban 306 pacientes. Finalmente fueron estudiados 350 pacientes. 72 A. Criterios de inclusión 1. Paciente ingresado en Medicina Interna por cualquier motivo con edad igual o superior a 60 años. B. Criterios de exclusión 1. Creatinina en plasma igual o mayor de 2 mg/dL, por la posibilidad de falsa elevación del valor de homocisteína (Hcy) y acido metilmalónico (AMM). 2. Fallecimiento o abandono de la hospitalización en las 48 horas iniciales (antes de concluir los análisis de laboratorio y anamnesis completa). No se excluyeron a los pacientes con diagnóstico previo de déficit de Vitamina B12. 4.- Muestra. Segunda parte del estudio Tras la finalización de la primera parte del estudio se recogieron de forma consecutiva 119 pacientes hospitalizados en el Servicio de Medicina Interna diagnosticados de déficit de Vitamina B12 durante el ingreso. 5.- Técnica de muestreo La inclusión de los pacientes, en ambas partes del trabajo se realizó mediante muestreo consecutivo. 6.- Variables analizadas a) En todos los pacientes se recogieron las siguientes variables: - Edad y sexo. - El motivo de ingreso en planta de hospitalización. - Antecedentes personales incluyendo la presencia de diabetes mellitus, hipertensión arterial (HTA), cardiopatía (valvular, isquémica, arritmogénica, o hipertensiva), enfermedad obstructiva pulmonar crónica (EPOC), nefropatía, enfermedad cerebrovascular aguda, arteriopatía periférica, 73 hepatopatía, neoplasia, ulcus péptico, depresión, demencia, artropatía, enfermedad de Crohn, pancreatitis crónica y resección gástrica ó ileal. - Hábitos tóxicos: consumo activo o pasado de tabaco y/o alcohol. - Tratamiento farmacológico previo (con especial énfasis en el consumo de inhibidores de la bomba de protones o antagonistas de los receptores H2, antidiabéticos orales tipo metformina y anticonvulsivantes) - Determinaciones analíticas en protocolo de ingreso hospitalario incluyendo la hemoglobina (Hb), hematocrito (Hto), volumen corpuscular medio (VCM), amplitud de distribución eritrocitaria (ADE), velocidad de sedimentación glomerular (VSG), leucocitos totales y porcentaje de linfocitos, plaquetas, creatinina, bilirrubina total (BT), lactato deshidrogenasa (LDH), fosfatasas alcalinas (FA), gamma glutamil transferasa (GGT), proteínas totales, albúmina, T4 libre (T4L), hormona tiroestimulante (TSH), patrón de hierro (sideremia, transferrina, índice de saturación de transferrina (IST) y ferritina), colesterol total y fracciones c-LDL y c-HDL, proteína C Reactiva (PCR), Vitamina B12 y acido fólico. Los métodos empleados fueron los siguientes: Hemograma: Con el analizador automático CELL-DYN® 4000 (Abbott científica S.A) se obtuvieron los siguientes parámetros:  Leucocitos totales, contados, diferenciados y clasificados por medio de dispersión óptica con láser y fluorescencia. Se definen así el número de leucocitos totales /μL y de linfocitos /μL.  Hemoglobina: Se analiza colorimétricamente con un reactivo sin cianuro.  Hematocrito y volumen corpuscular medio: Calculados de los datos de distribución del contaje de glóbulos rojos, que a su vez se realiza por impedancia eléctrica.  Plaquetas: Se analizó de forma doble por óptica y por luminiscencia. 74 Bioquímica: Con el analizador Cobas (Roche Diagnostics) se obtuvieron los siguientes datos:  Creatinina: Mediante método enzimático.  Glucemia: Por el método enzimático hexoquinasa.  Vitamina B12 y ácido fólico: Por electroquimioluminiscencia (ECLIA).  Homocisteina total: Inmunoturbidimetría.  Acido Metilmalónico: Cromatografía de gases-Espectrometría de masas.  Proteínas totales: Método Biuret punto final.  Ferritina: Electroquimioluminiscencia (ECLIA).  Transferrina: Turbidimetría.  Colesterol total, HDL y triglicéridos: método enzimático.  Colesterol LDL: estimación mediante la fórmula de Friedwald si los triglicéridos son menores de 300 mg/dL.  Hormonas: Con el analizador INMULITE® 2000 (DPC) se obtuvo la T4 libre y la hormona tirotropa (TSH), ambas por quimioluminiscencia.  Albúmina sérica: Con el analizador DADE BEHRING. BN II® mediante nefelometría.  Ferritina: Test inmunológico in vitro (técnica sándwich).  Indice de saturación de la Transferrina (IST): Se cálculo mediante la siguiente fórmula: TIBC: capacidad de fijación total de hierro.  AST (Aspartato aminotransferasa): Test ultravioleta, sin activación piridoxalfosfato. Por la IFCC (Federación Internacional de Química Clínica).  ALT (Alanina aminotransferasa): Test ultravioleta, sin activación piridoxalfosfato según la IFCC (Federación Internacional de Química Clínica).  Fosfatasa alcalina: Test colorimétrico-enzimático.  LDH (Lactato deshidrogenasa): Test colorimétrico-enzimático. 75 Mediante los autoanalizadores ARCHITECT.i2000sr y ARCHITECT c8000 de ABBOTT Diagnostics se analizaron los siguientes parámetros:  GGT (Gammaglutamiltransferasa): Test colorimétrico-enzimático. Por el autoanalizador ARCHITECT.i2000sr. ABBOTT Diagnostics.  T4 libre y TSH (Thyroid stimulating hormone): Método de inmunoquimioluminiscencia de micropartículas (CMIA).  Albúmina sérica: Método colorimétrico, verde de bromocresol. ARCHITECT c8000. ABBOTT Diagnostics. b) En los pacientes con déficit de Vitamina B12 analítico se recogieron además:  La presencia de manifestaciones digestivas asociadas al déficit de Vitamina B12 como glositis o dispepsia.  La presencia de manifestaciones neurológicas como parestesias, déficit sensitivo, dificultad para la marcha, olvidos o deterioro cognitivo, entre otros.  Las siguientes determinaciones analíticas: Acido fólico y Vitamina B12 de control, acido metilmalónico (AMM), homocisteína (Hcy), anticuerpos antifactor intrínseco y anti-células parietales y serología de Helicobacter pylori.  Según lo considerara el médico responsable del paciente se indicó la realización de endoscopia digestiva alta (EDA). Para establecer el diagnóstico de déficit de Vitamina B12, déficit de folato y/o hiperhomocisteinemia se establecieron los siguientes criterios: Parámetros analíticos Criterios diagnósticos de deficiencia Vitamina B12 2 determinaciones consecutivas en plasma <200 pg/mL Folato 1 determinación en plasma <3 ng/mlL Homocisteína 1 determinación en plasma >15 µmol/L En los 119 pacientes con déficit de Vitamina B12 incluidos en la segunda parte del estudio, se realizó además estudio genético para el polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR). 76 7.- Grupo control (segunda parte del estudio) El grupo control para el estudio genético del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR, estuvo constituido por 117 individuos sanos obtenidos de forma aleatoria de una de las bases de datos de la Unidad de Investigación del mismo hospital, los cuales ya tenían realizado este estudio genético, con una distribución del sexo en porcentaje similar. Estos controles presentaron niveles normales en plasma de Vitamina B12, ácido fólico, hemoglobina, hematocrito y creatinina. Dado que el polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR es un rasgo hereditario no se consideró la edad de los controles en su selección. 8.- Seguimiento de los pacientes En ambos grupos de pacientes se realizó un seguimiento durante 4 años a través del sistema informático interno del hospital (Tabaiba® y Plan Día), así como el portal web www.necropolis.com. Dichas aplicaciones sirvieron para comprobar si los pacientes seleccionados habían reingresado en planta de hospitalización y/o si habían fallecido. Se analizó en todos los casos si el motivo del fallecimiento había sido por evento cardiovascular o no. 9.- Amplificación por PCR y análisis de la mutación C677T del gen de la enzima 5,10Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) 9.1.- Extracción del ADN por el método de Salting out Para la extracción del ADN de los 119 pacientes con déficit de Vitamina B12 e individuos sanos del grupo control se utilizó el protocolo de extracción de ADN conocido con el nombre de Salting out (Figura 12). Esta técnica fue descrita originariamente por Miller & John y cols. (Miller SA, 1988; John SW, 1991) y modificado por Lahiri y Nurnberger (Lahiri DK, 1991). En nuestro caso utilizamos 500 µL de sangre periférica anti-coagulada con EDTA que se transfirió a microtubos de 10 µL en los que se añadió 3 µL de RBCL (del inglés, red blood cell 77 lysis - lisis celular de glóbulos rojos), compuesto de 10 mM Tris-HCl, 400 mM NaCl 2 mM, Na2EDTA y pH 8,2 (Foto 4). Los microtubos se agitaron durante 15 minutos y se centrifugaron durante 2 minutos a 14.000 xg. El sobrenadante se desechó y el proceso se repitió en varias oportunidades hasta obtener un precipitado claro, sin trazas de hemoglobina. Después, se añadió a las muestras 80 µL de tampón de Proteinasa K®, 40μL de Proteinasa K® 20U/mg (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU), 20μL de SDS® (Dodecil sulfato sódico, Sigma Chemical C, Steinheim, Alemania) en 20v/ve 240μL de agua ultrapura con homogeneización en agitador Vortex durante 15 segundos. Posteriormente, los microtubos se incubaron en un baño de agua a 56° C durante 40 minutos con agitación suave durante 20 minutos y se retiraron después para alcanzar la temperatura ambiente. Se añadieron 100 µL de NaCl saturado (6M) con agitación nuevamente en Vortex y centrifugación durante 5 minutos a 14.000xg. El sobrenadante se transfirió a otro microtubo que contenía 100 µL de NaCl (6M), que se centrifugó durante 5 minutos a 14.000 xg. A continuación, se transfirió a otro microtubo de 15 µL, al que se añadieron 800μL de etanol absoluto frío. Los tubos son vertidos e invertidos suavemente varias veces para conseguir la precipitación del ADN y se centrifugaron a 14.000 xg durante 2 minutos. Se descartó el sobrenadante y se añadió a las muestras 500μL de etanol de 70 V/v frío, seguido de una centrifugación adicional a 14.000xg durante 2 minutos. Posteriormente, se descartó nuevamente el sobrenadante y se dejaron reposar los microtubos durante varias horas a temperatura ambiente. Por último, se procedió a la hidratación del ADN con 50 µL de agua ultrapura (Figura 12). En comparación con el método clásico de extracción de ADN por precipitación con sales, se realizaron algunas modificaciones por el estado de coagulación que presentaban muchas de las muestras de sangre de los pacientes incluidos en el estudio. Así, en las a muestra de sangre coagulada se requirió un tratamiento de choque térmico para conseguir la solubilización del coágulo, así como un mayor volumen de RCLB y mucho más tiempo de agitación en el Vórtex, para conseguir con éxito eliminar todos los eritrocitos. 84 10.- Análisis bibliográfico Se realizó un análisis de las referencias bibliográficas encontradas en MEDLINE, SciELO, Web of Science y SCOPUS. Se efectuó una búsqueda de los estudios publicados a partir del 1 de enero de 1990 hasta el 31 de diciembre de 2012. Se seleccionaron sólo aquellos artículos publicados en español, inglés, francés o alemán. La estrategia de búsqueda se basó en las palabras clave en inglés “Vitamin B12 deficiency”, “cobalamin deficiency”, “vitamin deficiences”, “nutritional status”, en combinación con “prevalence”, “elderly patients” y “hospitalized patients”. Inicialmente, se consideraron todos los estudios realizados en individuos mayores de 14 años (clásicamente, límite de edad de atención pediátrica). Se excluyeron aquellos estudios realizados en embarazadas y puérperas, enfermos renales crónicos, en diálisis o ya trasplantados, al igual que los estudios realizados en pacientes con patologías tumorales o infectados por VIH. Asimismo se descartaron los estudios de intervención, de ingesta dietética de micronutrientes o tratamiento sustitutivo así como aquellos en los que no fue posible conseguir el resumen o el artículo completo. La revisión bibliográfica se completó con una búsqueda manual de las referencias bibliográficas de las revisiones identificadas en la estrategia de búsqueda (Figura 14). 85 Figura 14. Diagrama de flujo sobre la selección de estudios. Estudios potenciales (Medline, SCOPUS...) (n=961) Excluidos tras revisión de los resúmenes o lectura completa de los artículos (n=72) Revisiones o casos clínicos (n=114) Estudios duplicados (n=24) Estudios en embarazadas y puérperas (n=56) o recién nacidos/niños y adolescentes (n=76) Estudios de intervención (n=49) Estudios sobre ingesta de micronutrientes (n=17) Estudios sobre tratamiento sustitutivo (n=9) Estudios en animales (n=6) Estudios en ERC/diálisis/transplante (n=9) Estudios sobre cáncer (n=39) o VIH (n=15) Excluidos por no estar relacionados con el tema de estudio (n=211) Excluídos por no disponer de los resúmenes o de los artículos completos (n=56) Excluídos por estar escritos en otros idiomas (n=37)* Estudios identificados para una mayor evaluación (n=657) Estudios localizados mediante búsqueda manual (n=12) Estudios seleccionados (n=183) * idiomas distintos del español, inglés, francés y alemán Abreviaturas: ERC: Enfermedad renal crónica. VIH: Infección del virus de la inmunodeficiencia humana. 86 11.- Análisis estadístico El análisis de los datos recogidos se realizó con el programa estadístico SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versión 16.0 para Windows (Chicago. IL, USA). Inicialmente se realizó un análisis descriptivo, presentándose las variables categóricas como frecuencias y porcentajes y las continuas como media y desviación estándar. Para las variables cuantitativas se analizó si seguían una distribución normal o no mediante el test de Kolmogorov-Smirnov. Se estimó la prevalencia del déficit de Vitamina B12 con su correspondiente intervalo de confianza al 95%. Se analizaron las diferencias clínicas y analíticas entre los pacientes con déficit de Vitamina B12 y sin déficit. La relación entre variables cualitativas se estudió con el test de Chi2 o el test exacto de Fisher. Para analizar las relaciones entre variables cuantitativas de los dos grupos de pacientes se utilizó el test T-Student o el test U de Mann Whitney en función de que dichas variables siguieran o no una distribución normal. La relación entre variables cuantitativas se realizó con el coeficiente de correlación de Pearson o de Spearman (en función de que la distribución de variables fuera normal o no). La relación entre variables cuantitativas de más de dos grupos se analizó mediante el análisis de la varianza utilizando posteriormente los contrastes de Scheffé. Para comparar la supervivencia entre los pacientes con y sin déficit de Vitamina B12 se utlizó el test de Log-rank. Se consideró un nivel de significación de p<0,05. 87 D. RESULTADOS 88 89 RESULTADOS PARTE PRIMERA ESTUDIO DESCRIPTIVO. PREVALENCIA DEL DÉFICIT DE VITAMINA B12. ANÁLISIS BIBLIOGRÁFICO. 1. CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA Se estudiaron 350 pacientes, de los cuales 197 eran mujeres (56,3%) y 153 eran hombres (43,7%). La edad media fue de 78 ± 8,2 años, 79,1 años en las mujeres y 76,7 en los varones (p=0,006). Predominaron los pacientes comprendidos entre 71-80 años con 88 mujeres (44,7%) y 64 hombres (41,8%). Los pacientes nonagenarios estuvieron representados por 16 mujeres (8,1%) y 8 hombres (5,2%) (Tabla 24). Tabla 24. Distribución de la muestra por grupos de edad y sexo (n=350) Rangos de edades (años) Total 60-70 71-80 81-90 >90 Sexo H Totales 39 64 42 8 153 % Hombres 25,5% 41,8% 27,5% 5,2% 100,0% % Rangos de edades 57,4% 42,1 % 39,6% 33,3% 43,7 % M Totales 29 88 64 16 197 % Mujeres 14,7% 44,7% 32,5% 8,1% 100,0% % Rangos de edades 42,6% 57,9% 60,4% 66,7% 56,3% Total Totales 68 152 106 24 350 % Total 19,4% 43,4% 30,3% 6,9% 100,0% % Rangos de edades 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% Abreviaturas: H: Hombres. M: Mujeres. 1.1 Prevalencia del déficit de Vitamina B12 En la muestra estudiada la prevalencia del déficit de Vitamina B12 fue del 13,1% (IC 95%: 9,5-16,8%) (46 casos de 350). Cinco pacientes tenían el diagnóstico previo de déficit de Vitamina B12, todas mujeres. 90 De los 46 pacientes con déficit de Vitamina B12, la mayoría, 30 (65,2%) presentaban niveles entre 150-200 pg/mL. Sólo 8 pacientes presentaban niveles séricos por debajo de 99,9 pg/mL (17,4%) (Tabla 25). Tabla 25. Distribución de los pacientes con déficit plasmático de Vitamina B12. (n=46) Déficit de Vitamina B12 Niveles plasmáticos n % Leve 150-200 pg/mL 30 65,2 Moderado 100-149,9 pg/mL 8 17,4 Grave <99,9 pg/mL 8 17,4 TOTAL 46 100,0 Entre los 304 pacientes restantes, 242 pacientes (69,1%) presentaron niveles plasmáticos de Vitamina B12 entre 200-850 pg/mL y 62 pacientes con niveles superiores a 850 pg/mL o en rango de hipervitaminosis (17,7%). En los 46 pacientes con déficit de Cobalamina predominaron los pacientes de sexo femenino con 32 mujeres (69,5%) y 14 hombres (30,6%), siendo más elevada casi de forma significativa la prevalencia de déficit de Vitamina B12 entre las mujeres que entre los varones (16% vs 9,3%; p=0,06). Sin embargo, al ajustar por la edad se perdía esta tendencia hacia la significación estadística (p=0,41). La edad media de los pacientes con déficit de Vitamina B12 fue significativamente superior 81,5 años ± 7,8, a la de los pacientes sin déficit de 77,6 ± 8,2 (p=0,003). Al ajustar la edad por el sexo se seguía manteniendo la asociación significativa entre el déficit de Vitamina B12 y la edad (p<0,018). En el grupo de los pacientes con déficit de Vitamina B12 predominaron los pacientes con edades comprendidas entre los 81 y 90 años (20 pacientes, 43,4%). En todos los grupos de edad predominaron las mujeres (Tabla 26). 91 Tabla 26. Distribución de la muestra por niveles plasmáticos de Vitamina B12, rangos de edad y sexo (n=350) Abreviaturas: H: Hombres. M: Mujeres. RANGOS DE EDADES (años) Rangos de niveles de Vitamina B12 (pg/mL) Total <200 200-850 >850 60-70 SEXO H Totales 1 25 13 39 % de Hombres 2,6% 64,1% 33,3% 100,0% % de Rangos B12 25,0% 54,3% 72,2% 57,4% M Totales 3 21 5 29 % de Mujeres 10,3% 72,4% 17,2% 100,0% % de Rangos B12 75,0% 45,7% 27,8% 42,6% Total Totales 4 46 18 68 % de SEXO 5,9% 67,6% 26,5% 100,0% % de Rangos B12 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% % del total de déficit 8% 71-80 SEXO H Totales 5 54 5 64 % de Hombres 7,8% 84,4% 7,8% 100,0% % de Rangos B12 31,3% 47,4% 22,7% 42,1% M Totales 11 60 17 88 % de Mujeres 12,5% 68,2% 19,3% 100,0% % de Rangos B12 68,8% 52,6% 77,3% 57,9% Total Totales 16 114 22 152 % de SEXO 10,5% 75,0% 14,5% 100,0% % de Rangos B12 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% % del total de déficit 34% 81-90 SEXO H Totales 7 26 9 42 % de Hombres 16,7% 61,9% 21,4% 100,0% % de Rangos B12 35,0% 39,4% 45,0% 39,6% M Totales 13 40 11 64 % de Mujeres 20,3% 62,5% 17,2% 100,0% % de Rangos B12 65,0% 60,6% 55,0% 60,4% Total Totales 20 66 20 106 % de SEXO 18,9% 62,3% 18,8% 100,0% % de Rangos B12 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% % del total de déficit 43% Más de 90 SEXO H Totales 1 6 1 8 % de Hombres 12,5% 75,0% 12,5% 100,0% % de Rangos B12 16,7% 37,5% 50.0% 33,3% M Totales 5 10 1 16 % de Mujeres 31,3% 62,5% 6,3% 100,0% % de Rangos B12 83,3% 62,5% 50,0% 66,7% Total Totales 6 16 2 24 % de SEXO 25,0% 66,7% 8,3% 100,0% % de Rangos B12 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% % del total de déficit 13% 92 1.2 Antecedentes médicos Los antecedentes médicos más frecuentes fueron la hipertensión arterial (HTA) (246, 70,3%), la cardiopatía sin especificar (185, 53%), la diabetes mellitus tipo 2 (DM-2) (145, 41,4%) y la dislipemia (DLP) (127, 36,7%). Al analizar los antecedentes no se encontraron diferencias significativas en los antecedentes de los pacientes en función de la presencia o no de déficit de Vitamina B12 (Tabla 27). Sin embargo, ningún paciente con hepatopatía o con consumo de alcohol moderado ó abusivo presentó déficit de esta Vitamina de forma casi significativa (p=0,05 en ambos casos) (Tabla 27 y 28). Así, aunque la DM-2 fue más prevalente en los pacientes con déficit que sin déficit al igual que los pacientes con antecedente de ictus que fueron más prevalentes en ese mismo grupo no se encontraron diferencias significativas (45,7% vs 40,8; p 0,53 y 21,7% vs 13,2%; p=0,12, respectivamente). Lo mismo ocurrió en relación con la arteriopatía periférica (13% vs 9%, p=0,36) y el ulcus péptico (8,7% vs 6,3%, p=0,47) (Tabla 27). Tabla 27. Distribución de la muestra según antecedentes médicos y déficit ó no de Vitamina B12 (n = 350) Antecedentes médicos Total n=350 % Déficit Vit. B12 (< 200pg/mL) n= 46 % No déficit Vit. B12 (> 200 pg/mL) n=304 % p HTA 246 70,3 32 69,5 214 70,4 0,90 Cardiopatía: 185 53 22 47,8 163 53,6 0,46 • C. Isquémica 108 31 11 24 97 32 0,27 • C. Valvular 51 14,6 6 13 45 14,8 0,75 • C. Hipertensiva 48 13,8 6 13 42 14 0,88 DM-2 145 41,4 21 45,7 124 40,8 0,53 DLP 127 36,6 12 26,1 115 37,8 0,12 Arritmias 95 27 13 28,3 82 27 0,85 Artritis 82 23,4 11 24 71 23,4 0,93 Neoplasias 73 21 10 22,2 63 20,7 0,81 Broncópatas: 69 19,7 9 19,6 60 19,7 0,97 • EPOC 41 11,7 4 8,7 37 12,2 0,49 Demencias 51 14,6 4 8,7 47 15,5 0,22 Ictus 50 14,3 10 21,7 40 13,2 0,12 Arteropatía periférica 33 9,4 6 13 27 9 0,36 Ulcus péptico 23 6,6 4 8,7 19 6,3 0,47 Hepatopatías: • VHC 22 9 6,3 2,6 0 0 - - 22 9 7,2 3 0,05 0,23 Depresión 17 5 4 8,7 13 4,3 0,19 Hipotiroidismo 16 4,6 3 6,5 13 4,3 0,49 Tuberculosis 15 4,3 2 4,3 13 4,3 0,98 Pancreatitis 5 1,5 0 - 5 1,4 0,38 Hipertiroidismo 1 0,3 0 - 1 0,3 0,69 Abreviaturas: HTA: Hipertensión arterial. DM-2: Diabetes mellitus tipo 2. DLP: Dislipemia. EPOC: Enfermedad pulmonar obstructiva crónica. VHC: Virus de la hepatitis C. 93 1.3 Hábitos tóxicos El tabaquismo activo se encontró en 26 pacientes, siendo más prevalente entre los pacientes sin déficit de Vitamina B12, pero sin alcanzar la significación estadística (2,2% vs 8,2%; p=0,14). El alcoholismo activo se documentó en 24 pacientes (7%), ninguno de ellos con déficit de Vitamina B12. Globalmente 80 pacientes eran ex-fumadores (23%) y 38 pacientes ex-bebedores (11%) sin encontrarse diferencias estadísticamente significativas entre el grupo de pacientes con déficit y sin déficit de Vitamina B12 (Tabla 28). Tabla 28. Distribución de la muestra según hábitos tóxicos y déficit ó no de Vitamina B12. (n=350) Hábitos tóxicos: Total n=350 % Déficit Vit. B12 (< 200pg/mL) n=46 % No Déficit Vit. B12 (>200pg/mL) n=304 % p Tabaquismo 26 7,4 1 2,2 25 8,2 0,14 Alcoholismo 24 7 0 - 24 8 0,05 Ex-tabaquismo 80 23 8 17,4 72 23,7 0,34 Ex-alcoholismo 38 11 4 8,7 34 11,2 0,81 1.4 Medicación previa al ingreso En nuestro estudio los fármacos más usados por orden de frecuencia fueron los diuréticos (167, 47,7%), los antiagregantes (156, 44,5%), seguido de los inhibidores de la bomba de protones (IBP) (118, 33,7%) y los inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (IECAs) (103, 29,4%). Tomaban metformina, 47 pacientes (13,4%), ranitidina 20 pacientes (5,7%) y anticomiciales 13 pacientes (3,7%). A excepción del tratamiento con IECAS (29,4% vs 15,2%, p=0,02), que fue menos frecuente en los pacientes con déficit no se observaron diferencias significativas en el análisis bivariante entre los pacientes con y sin déficit de Vitamina B12 (Tabla 29). 100 Tabla 35. Manifestaciones no hematológicas relacionadas con el déficit de Cobalamina (n= 46) Manifestaciones no hematológicas n % Comunes/Clásicas Neurológicas 6 13 Polineuritis 2 4,3 Esclerosis combinada subaguda 2 4,3 Babinski 2 4,3 Ataxia 0 - Digestivas 1 2,1 Glositis de Hunter 1 2,1 Ictericia 0 - Total 7 15,2 Raras Incontinencia urinaria 1 2,1 Incontinencia fecal 0 - Neurológicas 0 - Sindrome cerebeloso 0 - Total 1 2,1 En estudio Neuropsiquiátricas 21 45,6 Deterioro cognitivo 8 17,3 Síndrome depresivo 6 13,0 Ictus 5 10,8 E. de Parkinson 2 4,3 Esclerosis múltiple 0 - Fuente: Clasificación adaptada de de Andrés E. Update for nutrient-deficient anemias. Conn‘s Current Therapy 2012.pp 840-841 1.10 Estudio etiológico La endoscopía digestiva alta (EDA) se realizo en 4 pacientes (8,7%) con déficit de Vitamina B12 y en 27 pacientes (8,9%) sin déficit (p=0,56). Macroscópicamente mediante el estudio endoscópico se describió atrofia gástrica en 1 paciente (25%) con déficit de Vitamina B12 y en 5 pacientes (19,2%) sin déficit (p= 0,078). La biopsia gástrica se realizo en 3 pacientes (75%) con déficit y en 14 pacientes (31,9%) sin déficit de Cobalamina, (p=0,38). Sin embargo, la atrofia gástrica previamente descrita en los pacientes con déficit no se confirmó en la biopsia y sí en 4 101 de los pacientes (28,6%) sin déficit, (p=0,38). En ninguno de los casos se informó de la presencia de Helicobacter pylori. La displasia gástrica se describió en 7 de los 14 pacientes sin déficit de Cobalamina en que se realizó biopsia (50%), p=0,18. La serología para Helicobacter pylori se realizó en 12 pacientes (29,3%) con déficit Vitamina B12 y en 2 pacientes (33,3%) sin éste, siendo en todos lo casos negativa, p=0,83. El estudio baritado de esófago-estómago y duodeno sólo se realizó en 3 pacientes sin déficit de Vitamina B12 sin obtenerse resultados patológicos. 1.11 Mortalidad y reingresos Fallecieron durante el ingreso 19 pacientes (16 sin déficit de Vitamina B12 vs 3 con déficit, p=0,66). La presencia de déficit de Vitamina B12 no se relacionó con la mortalidad (p= 0,72). El valor medio de la Vitamina B12 en plasma fue superior en los pacientes que fallecieron sin relacionarse de forma significativa con la mortalidad (774,4 pg/mL en los fallecidos vs 615 pg/mL en los vivos; p= 0,43). Considerando los pacientes con valores elevados de B12 (>800 pg/mL) tampoco se observó asociación significativa con la mortalidad hospitalaria (p= 0,36). Durante el seguimiento fallecieron 179 pacientes (158 sin déficit vs 21 con déficit, p=0,63). Los pacientes con déficit de Vitamina B12 mostraron una supervivencia similar a los pacientes sin déficit (p=0,69) (Gráfica 1). 102 Gráfica 1. Gráfica de supervivencia de los pacientes con déficit y sin déficit de Vitamina B12 (n=350) p= 0,69 Sin embargo, los niveles elevados de Vitamina B12 plasmática (>800 pg/mL) se asociaron a una mayor mortalidad durante el seguimiento (p=0,016) (Gráfica 2). Esta significación se mantiene incluso tras ajuste de la edad. De igual forma se observó asociación entre la mortalidad y la elevación de los niveles de Vitamina B12 si elevamos el punto de corte a 1000 pg/mL (p=0,03) (Gráfica 3). No se observaron diferencias significativas en los valores de Vitamina B12 en los pacientes que reingresaron (p=0,41). Tiempo en meses 9080706050403020100 Supervivencia acumulada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 103 Gráfica 2. Gráfica de supervivencia de los pacientes con niveles de Vitamina B12 en plasma mayores y menores de 800 pg/mL (n=350) Gráfica 3. Gráfica de supervivencia de los pacientes con niveles de Vitamina B12 en plasma mayores y menores de 1000 pg/mL (n=350) p=0,03 Tiempo en meses 9080706050403020100 Supervivencia acumulada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1-censored 0-censored 1 0 B12 > 800 pg/ml p=0,016 p=0,76 Tiempo en meses 9080706050403020100 Supervivencia acumulada 1,0 0,8 0,6 0,4 0,2 0,0 1-censored 0-censored 1 0 B12 > 1000 104 2. ANÁLISIS BIBLIOGRAFICO Se identificaron inicialmente 961 estudios, pero finalmente se analizaron 183 estudios. De los trabajos que se rechazaron, 211 no estaban relacionados con el objetivo de nuestro estudio; 114 eran revisiones ó casos clínicos únicos; 72 estudios fueron excluídos tras revisión de los resúmenes ó lectura completa del artículo; 76 estudios estaban realizados en individuos con edades inferiores a los 14 años y 56 estudios en mujeres gestantes ó puérperas. Otros 56 estudios no se pudieron revisar de forma íntegra al disponer únicamente del resumen ó abstract (Figura 14). La distribución por años se puede ver en la gráfica 4. Entre 1990 y 1999 se revisaron 34 estudios (18,6%), mientras que entre el 2000 y el 2012, se analizaron 149 estudios (81,4%), correspondiendo sólo al año 2012, 22 estudios (12%). Gráfica 4. Distribución de los estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 por años (1990-2012). n=183 Sólo en Europa se localizan 68 estudios (37,1%), de los cuales 20 corresponden a España. América con 59 (32,2%) y Asia con 42 (23%) le siguen en frecuencia. A continuación Oceanía con 12 estudios (6,5%) y por último el continente africano con 2 (1,1%). El país de todo el mundo que más estudios aporta es EE.UU con 37 (20,2%). Los siguientes países que participan con más estudios son España, Inglaterra y Holanda con 20, 9 y 8 estudios respectivamente (11%, 5% y 4,4% respectivamente) (Gráfica 5). 105 Gráfica 5. Distribución de los estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 según continente-país (1990-2012). n=183 En relación al ámbito de estudio, 27 se realizaron en el ámbito hospitalario en todo el mundo (14,7%), de los cuales 5 (18,5%) se efectuaron en España (uno en la isla de Tenerife, aunque no como objetivo principal) (Viña Rodríguez JJ, 2006), y otros 5 en EE.UU (18,5%) (Bunting RW, 1990; Bell IR, 1990; Brett AS, 1994; Matchar DB, 1994; Dharmarajan TS, 1994). La distribución por orden de frecuencia se muestra en la tabla 36. Tabla 36. Distribución de los estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 según el ámbito (1990-2012). n=183 Las características generales de todos los estudios se describen a continuación en las siguientes tablas, atendiendo a la clasificación previa (Tabla 36). Los criterios diagnósticos empleados para definir el déficit de Vitamina B12 varían entre los 103 y Tipo de estudio n % Estudios ambulatorios en pacientes (mundo) 73 39,9 Estudios ambulatorios en sanos (mundo) 57 31,1 Estudios en pacientes hospitalizados 27 14,7 Estudios en pacientes diabéticos 14 7,7 Estudios en pacientes institucionalizados y ambulatorios (España) 7 3,8 Estudios ambulatorios en sanos (España) 5 2,7 TOTAL 183 100,0 68 (37,1%) 59 (32,2%) 42 (23%) 12 (6,5%) 2 (1,1%) Europa América Asia Oceanía África 106 los 230 pmol/L. Más del 95% de los estudios emplearon sólo como biomarcador de déficit la determinación de los niveles plasmáticos de Vitamina B12. El punto de corte más empleado fue 150 pmol/L (200 pg/mL) (85 estudios, 46,7%), similar al utilizado por nosotros (Tablas 37-42). En los 27 estudios revisados en pacientes hospitalizados, la prevalencia media del déficit de Vitamina B12 fue del 14%. Si se excluyen 3 estudios que mostraron una prevalencia muy elevada (63,4%, 43%, 33%) (Iqbal MP, 2005; Arora S, 2011; van Oijen MG, 2007), la prevalencia de déficit de B12 fue del 10% (24 estudios, n=9.632). (Tabla 37). En estos 27 trabajos, en pacientes hospitalizados, la prevalencia del déficit de Vitamina B12 varió entre el 3,7% (Bell IR, 1990) y el 24% (Marengoni A, 2004). En 14 de los 27 estudios se utilizó el valor de 200 pg/mL (o 150 pmol/L) como punto de corte para definir el déficit de Vitamina B12 (Tabla 37). En los 5 trabajos realizados en nuestro país en pacientes hospitalizados la prevalencia media de déficit de Vitamina B12 fue del 10% (Rodríguez Fernández S, 2005; Viña Rodríguez JJ, 2006; Mateos-Polo L, 2009; Pérez-Bocanegra C, 2009; Vega de Céniga M, 2011), oscilando entre el 6,3 % (Pérez-Bocanegra C, 2009) y el 15,7% (Vega de Céniga, 2011). Otros estudios realizados en España, pero en individuos sanos observan cifras entre el 0% (Haller J, 1991) y el 12% (Aranceta J, 1994) con un promedio de prevalencia de déficit de Vitamina B12 del 6,2% (Tabla 38). Un estudio realizado en Canarias objetivó una prevalencia del 3,7% en el grupo de individuos entre los 18 y 64 años, mientras que en el grupo de 65 a 76 años la prevalencia fue del 8,5% (Henríquez P, 2007) (Tabla 38). Respecto a 5 estudios realizados en pacientes institucionalizados en nuestro país las cifras varían entre el 1,9 (Aparicio Vizuete A, 2005) y el 16,5% (Vázquez-Pedrazuela, 2012) con una prevalencia media de déficit de Vitamina B12 de un 12,1% (Huerta JM, 2004; Aparicio Vizuete A, 2005; González-Gross M, 2007; Vázquez-Pedrazuela M, 2012; Albers U, 2012). Se revisaron 14 estudios de pacientes diabéticos. Sólo uno de estos estudios hacía referencia a pacientes con diabetes tipo 1 en el que la prevalencia obtenida fue del 54% (Koshy AS, 2012). En los trece estudios restantes se observa una gran variabilidad de 107 cifras de prevalencia del déficit de Vitamina B12 que oscilan entre el 2% (Herrmman W, 2008) y el 67% (Satyanarayana A, 2011) con una prevalencia media del 20%. En tres estudios españoles, todos ellos publicados en el año 2012, la prevalencia de esta deficiencia fue del 8,6%, 17% y 26,7% obteniéndose una prevalencia media del 17,4% (Mariño Suárez JE, 2012; Calvo Romero JM, 2012; Ouvarovskaia V, 2013). Sólo un estudio de los revisados fue de intervención (de Jager J, 2010) donde las prevalencias de niveles plasmáticos bajos de Vitamina B12 en los dos grupos de estudio variaron entre el 1,6 y 9,9% y el 2,2 y el 2,7%, respectivamente. En 8 estudios (57,1%) el punto de corte definitorio de déficit de Cobalamina fue de 200 pg/mL (Tabla 42). A nivel mundial la prevalencia de déficit de Vitamina B12 en individuos sanos ha sido muy variable, con un promedio del 16,4% excluyendo tres estudios realizados en vegetarianos (Kwok T, 2002; Waldmann A, 2004; Gilsing AM, 2010). En nueve estudios se alcanzan prevalencias superiores al 40% (Gielchinsky Y, 2001; Refsum H, 2001; Arnaud J, 2001; Kwok T, 2002; Fora MA, 2005; Yajnik CS, 2006; Gulvadi C, 2007; Gilsing AM, 2010; Walker PF, 2011) describiéndose en uno de ellos un 75% de déficit de Vitamina B12, aunque en pacientes vegetarianas (Kwok T, 2002,). Otros 3 estudios se han realizado en la India (Refsum H 2001; Yajnik CS, 2006; Gulvadi C, 2007), con un alto porcentaje de población vegetariana y otros 3 en países muy distintos a nuestro medio como Israel (Gielchinsky Y, 2001), Cuba (Arnaud J, 2001) y China (Kwok T, 2002) (Tabla 39). En relación a la prevalencia del déficit de Vitamina B12 en función del sexo, revisamos 25 estudios en que se analizó este aspecto. La prevalencia media en varones fue un 17,5% frente a un 14,3% en mujeres. En 16 de los 25 estudios (64%) se constató que esta deficiencia era más frecuente entre los varones. Sólo en 7, la prevalencia resultó más frecuente en mujeres (28%) (Quinn K, 1996; McNeill G, 2002; Gamble MV, 2005; Fakhrzadeh H, 2006; Thuesen BH, 2010; Arora S, 2011; Vázquez-Pedrazuela MC, 2012) (Tabla 43). 108 Tabla 37. Estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 realizados en pacientes hospitalizados en el mundo (1990-2012). n=27 Autor Año N Edad Def. B12 (%) País Criterios diagnósticos Ambitos Bunting RW. 1990 250 >70 6,4 USA Vit. B12 < 148 pmol/L Hospitalizados Bell IR. 1990 102 >65 3,7 USA Vit. B12 < 150 pg/mL Hospitalizados Psiquiátricos Joosten E. 1993 286 (P) 64 (C) 61-97 65-98 5 6 Alemania P. Bajos Vit. B12 < 103 pmol/L Ambulatorios Hospitalizados Brett AS. 1994 162 17-90 4,3 USA Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados Psiquiátricos Matchar DB. 1994 1599 ¿? 5,2 USA Vit. B12 < 180 pg/mL Ambulatorios y hospitalizados Stott DJ. 1997 472 63-101 13 R. Unido Vit. B12 < 175 pmol/L Ambulatorios y hospitalizados Andrès E. 1998 ¿? 65-98 5 Francia Vit. B12 < 150 pmol/L Hospitalizados Silver H. 2000 644 ¿? 18,9 Israel Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados Psiquiátricos Dharmarajan TS. 2000 466 65-102 6 USA Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados Chui CH. 2001 3741 >70 <70 6,6 4,5 China Vit. B12 < 140 pmol/L Hospitalizados Shahar A. 2001 640 >65 15 Israel Vit. B12 < 150 pmol/L Hospitalizados SallesMontaudon N. 2003 196 EM 85 13,3 Suiza ¿? Hospitalizados Marengoni A. 2004 214 > 65 24 Italia Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados Paillaud E. 2004 94 EM 82 7 Francia Vit. B12 < 200 ng/L Hospitalizados Iqbal MP. 2005 224 (P) 126(C) 30-70 63,4 3,2 Pakistán Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados 224 con IAM Dzieniszewski J. 2005 206 16-87 6,8 Polonia Vit. B12 < 150 pg/mL Hospitalizados Rodríguez S. 2005 70 EM 83 14,2 España ¿? Hospitalizados Sdr anémico Viña JJ. 2006 337 >65 9 España Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados van Oijen MG. 2007 229 EM 62 33 Holanda Vit. B12 < 203 ng/L Hospitalizados U. Coronaria van Oijen MG. 2007 376 EM 65 7 Holanda Vit. B12 < 150 pmol/L Cardiópatas Wang YH. 2009 827 >60 19,7 China ¿? Hospitalizados Pctes NRL Corcoran TB. 2009 129 EM 40 6,2 Australia Vit. B12 < 160 pmol/L UMI Mateos-Polo L. 2009 214 25-102 8,4 España ¿? Hospitalizados Sdr anémico PérezBocanegra C. 2009 95 60-99 6,3 España ¿? Hospitalizados Sdr anémico Tal S. 2010 1570 >65 15 Israel Vit. B12 < 200 pmol/L Hospitalizados Arora S. 2011 422 16-74 43 India Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados Vega de Céniga M. 2011 420 (CI) 204 (ECE) EM 66 EM 72 6,7 15,7 España Vit. B12 < 197 pg/mL Ambulatorios y hospitalizados Alonso B. 2012 350 60-94 13 España Vit. B12 < 200 pg/mL Hospitalizados 109 Equivalencia límite inferior de Vitamina B12: 145 pmol/L = 200 pg/mL. Abreviaturas: Pctes NRL: pacientes con patologías neurológicas. IAM: Infarto agudo de miocardio. CI: Claudicación intermitente. ECE: Estenosis crítica de extremidades Tabla 38. Estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 realizados ambulatoriamente en individuos sanos en España (1990-2012). n=5 Autor Año N Edad Def. B12 (%) Provincia Criterios diagnósticos Ambitos Haller J. 1991 398 75-80 0 La Coruña Vit. B12 < 111 pmol/L Ambulatorios EURONUT Aranceta J. 1994 ¿? 25-60 12 P. Vasco Vit. B12 < 200 pg/mL Ambulatorios Henríquez SP. 2000 606 18-64 65-76 3,7 8,5 Canarias Vit. B12 < 200 pg/mL Ambulatorios ENCA García Closas R. 2002 378 18-75 1,9 Cataluña Vit. B12 < 199 pg/mL Ambulatorios Planells E. 2003 384 25-60 11 Granada ¿? Ambulatorios Abreviatura: EURONUT-Seneca: Survey in Europe on nutrition and the elderly, a concerted action. H: Hombres. M: Mujeres. ENCA: Encuesta nutricional de Canarias. Tabla 39. Estudios de prevalencia de déficit de Vitamina B12 realizados ambulatoriamente en individuos sanos en el mundo (1990-2012). n=57 Autor Año N Edad Def. B12 (%) País Criterios diagnósticos Ambitos Haller J. 1991 2500 75-80 1,6-10 España y otros Vit. B12 < 150 pg/mL Ambulatorios EURONUT Nilsson-Ehle H. 1991 973 70 81 4,6 7,2 Suecia Vit.B12 < 130 pmol/L Ambulatorios E. longitudinal Lindenbaum J. 1994 548 (P) 117 (C) 65-99 22-63 5,3 1,7 USA Vit. B12 < 200 pg/mL Ambulatorios Cristal HA. 1994 410 75-85 5,3 USA Vit. B12 < 150 pg/mL Ambulatorios Black AK. 1994 92 > 20 25 México Vit.B12 < 103 pmol/L Medio rural Tungtrongchit r R. 1995 87 (H) 19 (M) ¿? 2,3 - Tailandia ¿? Ambulatorios Albañiles Quinn K. 1996 58 >65 3 (H) 2 (M) Canadá Vit. B12 < 220 pg/mL Ambulatorios Rissanen PM. 1996 90 73-94 4,4 Finlandia Vit. B12 < 111 pmol/L Ambulatorios De Carvalho MJ. 1996 157 (H) 180 (M) 18-62 5 Francia Vit. B12 < 110 pmol/L Ambulatorios ESVITAF Brussaard JH. 1997 444 20-79 3,6 Holanda Vit. B12 < 100 pmol/L Donantes Wright JD. 1998 8085 20-99 3 USA Vit. B12 < 200 pg/mL NHANES III Bernard MA. 1998 303 65-89 6 USA Vit. B12 < 200 pg/mL Veteranos Fenech M. 1998 49 (H) 57 (M) 18-32 - 4,4 Australia Vit. B12 < 150 pmol/L Ambulatorios Andrade JJ. 1999 204 60-75 8,8 Indonesia Vit. B12 < 148 pmol/L Ambulatorios Ray JG. 2000 637 EM 58 3,3 Canadá Vit. B12 < 120 pmol/L Ambulatorios Gielchinsky Y. 2001 270 >18 >60 Israel Vit. B12 < 200 ng/L Donantes Refsum H. 2001 204 27-55 47 India Vit. B12 < 150 pmol/L Ambulatorios 116 117 PARTE SEGUNDA ESTUDIO DE LA MUTACION C677T DEL GEN DE LA ENZIMA 5,10-MTHFR EN PACIENTES CON DÉFICIT DE VITAMINA B12. CASOS-CONTROL. De los 119 pacientes con déficit de Vitamina B12, 68 eran mujeres (57%) y 51 eran varones (43%). La edad media fue de 77,4 años (DE: 7,5, rango: 60 a 94 años), 77,9 (DE: 7,6) en las mujeres y 76,7 (DE: 7,4) en los varones (p=0,39). En los 117 controles la distribución por sexo fue similar, con 66 mujeres (56,4%) y 51 varones (43,6%). La edad media fue de 54,1 años (DE: 8,8). En la tabla 44 se puede observar la distribución de los pacientes por edad y sexo. En ambos sexos, predominaron los pacientes con edad comprendida entre los 70 y 79 años con 34 mujeres (28,6% del total de la muestra) y 23 varones (19,3% del total de la muestra). Tabla 44. Distribución de la muestra por grupos de edad y sexo (n=119). Rangos de edad (años) Total 60-69 70-79 80-89 ≥ 90 Sexo H Totales 9 23 17 2 51 % Hombres 17,6% 45,1% 33,3% 3,9% 100,0% % Rangos de edad 50% 40,4% 45,9 % 28,6% 42,9% M Totales 9 34 20 5 68 % Mujeres 13,2% 50% 29,4% 7,4% 100,0% % Rangos de edad 50% 59,6% 54,1% 71,4% 57,1% Total Totales 18 57 37 7 119 % Total 15,1% 47,9% 31,1% 5,9% 100,0% % Rangos de edad 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 100,0% 1.- Relación entre los valores de Vitamina B12 y características demográficas Los valores de Vitamina B12 en plasma en los 119 pacientes con déficit vitamínico oscilaron entre un valor mínimo de 32,1 y un máximo 199,9 pg/mL, con un valor medio de 151,3 pg/mL (DE: 42,2). 118 En los 117 controles oscilaron entre un mínimo de 210,0 pg/mL y un máximo de 990,0 (pg/mL) con un valor medio de 486,9 pg/mL (DE: 198,0). Al analizar la relación entre los valores de Vitamina B12 en plasma y la edad en los pacientes con déficit no se observó asociación entre ambos, ni de forma global (p=0,9), ni al considerarla por rangos de edad (Tabla 45). En los controles, aunque ninguno tenía déficit de Vitamina B12, si se observó una correlación inversa entre los niveles de Vitamina B12 y la edad, es decir a mayor edad menores niveles de Vitamina B12 (p= 0,04). Tablas 45. Distribución de los niveles de Vitamina B12 en plasma según la edad. (n=119). Rangos de edad Mujeres Hombres Total % Vit. B12 Media (pg/mL) p 60-70 años 9 9 18 15,1 147,39 ± 50,40 0,93 71-80 años 34 23 57 47,9 150,01 ± 40,49 81-90 años 20 17 37 31,1 154,46 ± 44,30 >90 años 5 2 7 5,8 154,85 ± 23,70 Al analizar la relación entre los valores séricos de la Vitamina B12 y el sexo, dentro del grupo de pacientes con déficit de Cobalamina, si se observó que los varones presentaron un valor medio de Vitamina B12 significativamente superior (160,9 pg/mL) al de las mujeres (144,1 pg/mL) (p=0,024). Esta asociación se mantenía ajustando por la edad (p= 0,03). Sin embargo, en los controles, no se observaron diferencias significativas en los valores de Vitamina B12 en función del género (p=0,23) (Tabla 46). Tablas 46. Distribución de los niveles de Vitamina B12 en plasma según el sexo en el grupo de pacientes y en el grupo control. Mujeres 68 (57%) Hombres 51 (43%) Total 119 (100%) p Vitamina B12 (pg/mL) Media ± DE (CASOS) 144,07 ± 46,1 160,9 ± 34,5 151,3 ± 42,2 0,024 Mujeres 66 (56%) Hombres 51 (44%) Total 117 (100%) p Vitamina B12 (pg/mL) Media ± DE (CONTROLES) 506,4 ± 210,8 460,8 ± 178,3 486,9± 198 0,23 119 Los pacientes con déficit de B12 se clasificaron en función de los niveles de Cobalamina (Cbl) en suero, distinguiéndose 3 grupos: 1) Déficit leve: 150-200 pg/mL, 2) Déficit moderado: 100-149,9 pg/mL y 3) Déficit grave: < 99,9 pg/mL. El número de pacientes incluido en cada grupo está representado en la siguiente tabla (Tabla 47). La mayor parte, en concreto 72 (60,5%), presentaron un déficit ligero de Vitamina B12. Tabla 47. Distribución de los pacientes con déficit plasmático de Vitamina B12 (n=119). 2.- Otros biomarcadores relacionados con el déficit de la Vitamina B12 2.1 Acido metilmalónico (AMM) Se observó una elevación de los niveles de ácido metilmalónico en plasma (>0,56 mmol/L) en 41 pacientes (55,4%) de los 75 en los que se pudo determinar su valor. No se observaron diferencias significativas de su incremento en función de la edad (p=0,35) o el sexo (p=0,24). Se observó asociación inversa significativa entre los valores de Vitamina B12 y ácido metilmalónico (p< 0,001) (Gráfica 4). Déficit de Vitamina B12 Niveles plasmáticos n % Leve 150-199,9 pg/mL 72 60,5 Moderado 100-149,9 pg/mL 32 27 Severo < 99,9 pg/mL 15 12,5 120 Gráfica 4. Relación entre los niveles de ácido metilmalónico y Vitamina B12. p<0,001 2.2 Homocisteína (Hcy) Los niveles séricos de homocisteína en plasma oscilaron entre 6,8 y 321,7 µmol/L. La mayoría de los pacientes, 84 (79,2%), presentó hiperhomocisteinemia (homocisteína >15 µmol/L). Entre los pacientes con elevación de Hcy predominaron las mujeres con 52 (83,9%), frente a 32 varones (72,7%) sin ser la diferencia significativa (p=0,16) (Tabla 48). Los niveles de Hcy se correlacionaron de forma inversa significativa con los valores de Vitamina B12 en plasma (p< 0,001) (Gráfica 5) y de forma casi significativa con los de ácido fólico (p=0,08), pero no con la edad (p=0,72) (Gráfica 6). Acido Metilmalónico umol/L 4035302520151050 Vitamina B12 pg/ml 200 150 100 50 0 121 Gráfica 5. Relación entre los niveles de homocisteína plasmática y Vitamina B12. p<0,001 Gráfica 6. Relación entre los niveles de homocisteína plasmática y ácido fólico. p=0,008 Homocisteína umol/l 1501351201059075604530150 Vitamina B12 pg/ml 200 175 150 125 100 75 50 25 0 122 Tabla 48. Distribución de la homocisteína entre los casos de déficit de Cobalamina y los controles. Niveles de Hcy en plasma Casos n=106 Controles n=116 Total Hcy <15 µmol/L 22 93 115 20,8% 80,2% 51,8% Hcy >15 µmol/L 84 23 107 79,2% 19,8% 48,2% En relación al grupo control, se observó una elevación de la Hcy en 23 controles (19,8%). A diferencia de lo que ocurrió en los pacientes con déficit de Vitamina B12, en los controles se observó un porcentaje significativamente superior de varones con elevación de homocisteína (34% de varones (17) vs 9% de mujeres (6); p<0,001). También los niveles de homocisteína se correlacionaron directamente con la edad (p= 0,003) y de forma inversa con los niveles de Vitamina B12 (p=0,01) y ácido fólico (p= 0,006). Se clasificaron a los pacientes en función de los niveles de homocisteína en plasma. Se distinguieron cuatro grupos, 1) Normal: Niveles de homocisteína <15 µmol/L, 2) hiperhomocisteinemia leve: 15-29,9 µmol/L; 3) hiperhomocisteinemia moderada: 3049,9 µmol/L y 4) hiperhomocisteinemia grave: ≥50 µmol/L. El número de pacientes incluido en cada grupo está representado en la tabla 49. La mayor parte de los pacientes (56, 52,8%), tenían hiperhomocisteinemia ligera. Tabla 49. Distribución de los pacientes según los niveles de homocisteína en plasma. (n=106). No se observaron diferencias significativas en los valores de homocisteína en función del sexo (p= 0,28) o de la edad (p=0,9) (Tabla 50 y 51). Valores de homocisteína Niveles plasmáticos n % Normal <15 µmol/L 22 20,8 Elevación leve 15-29,9 µmol/L 56 52,8 Elevación moderada 30-49,9 µmol/L 21 19,8 Elevación grave ≥50 µmol/L 7 6,6 123 Tabla 50. Distribución de los valores de homocisteína en función del sexo. (n=106). Tabla 51. Distribución de los valores de homocisteína en función de la edad. (n=106). Niveles de Hcy en plasma Mujeres n=62 Hombres n=44 Total n=106 p n % n % n % <15µmol/L 10 16,1 12 27,3 22 20,8 0,28 15-29,9 µmol/L 33 53,2 23 52,3 56 52,8 30-49,9 µmol/L 13 21 8 18,2 21 19,8 ≥50 µmol/L 6 9,7 1 2,3 7 6,6 Niveles de Hcy en plasma Rango de edades (años) p 60-69,9 n=14 70-79,9 n=51 80-89,9 n=34 >90 n=7 Total n=106 <15 µmol/L 3 21,4% 9 17,6% 9 26,5% 1 14,3% 22 20,8% 0,9 15-29,9 µmol/L 7 50% 31 60,8% 14 41,2% 4 57,1% 56 52,8% 30-49,9 µmol/L 2 14,3% 9 17,6% 8 23,5% 2 28,5% 21 19,8% ≥ 50 µmol/L 2 14,3% 2 3,9% 3 8,8% 0 -- 7 6,6% 124 2.3 Acido fólico Los niveles de acido fólico en plasma oscilaron entre un valor mínimo de 1,55 ng/mL y un máximo de 20 ng/mL, con un valor medio de 8,2 ng/mL (DE: 3,9). Sólo 4 pacientes (3,4%) presentaron déficit de ácido fólico. Se observó una asociación inversa significativa entre los valores de Vitamina B12 y los valores de ácido fólico en plasma (p= 0,002) (Gráfica 7). Gráfica 7. Relación entre los niveles de VitaminaB12 plasmática y ácido fólico. p=0,002 Vitamina B12 pg/ml 200150100500 Acido Fólico ng/mL 20 15 10 5 0 125 3.- Antecedentes médicos Como antecedentes más frecuentes de los pacientes estudiados cabe destacar la hipertensión arterial (HTA) que es el antecedente médico más frecuente de la muestra (69,7%), le siguen después la diabetes mellitus tipo 2 (DM) (47,1%); la dislipemia (DLP) (33,6%) y la cardiopatía estructural (50,4%), especialmente la cardiopatía isquémica (27,7%) (Tabla 52). Tabla 52. Distribución por orden de frecuencia de los antecedentes médicos en los pacientes con déficit de Vitamina B12 (n=119). Antecedentes n % Hipertensión arterial (HTA) 83 69,7 Cardiopatía estructural: ● Isquémica ● Valvular ● Hipertensiva 60 50,4 33 27,7 16 13,4 10 18,4 Diabetes Mellitus (DM) 56 47,1 Dislipemia (DLP) 40 33,6 Insuficiencia cardiaca 37 31,1 Arritmia (sin especificar) 29 24,4 Neoplasia 23 19,3 Exfumador 23 19,3 Demencia 13 10,9 Exbebedor 10 8,4 Accidente cerebrovascular 9 7,6 Depresión 8 6,7 Disfunción tiroidea ● Hipotiroidismo ● Hipertioridismo 8 3 6,7 2,5 EPOC 8 6,7 Arteriopatía periférica 7 5,9 Hepatopatía 4 3,2 Ulcus 3 2,5 4.- Tratamientos previos De los 119 pacientes cabe destacar que 43 (36,1%) estaban recibiendo tratamiento con inhibidores de la bomba de protones (IBP) y 28 pacientes (23,5%) tomaban metformina. Después de los antiagregantes (46, 38,7%), los IBP eran el grupo de fármacos más consumido seguido por los diuréticos de asa, los antagonistas de los receptores de la 132 Tabla 57. Manifestaciones no hematológicas relacionadas con el déficit de Vitamina B12. (n=119) 8.-Aproximación etiológica del déficit de Vitamina B12 Dentro de las causas conocidas relacionadas con el déficit de Vitamina B12, en nuestro estudio la gastritis atrófica no autoinmune resultó ser la causa más frecuente (20,1%). La anemia perniciosa pudo demostrarse en 13 casos (10,9%) y la ingesta insuficiente en 5 casos (4,2%). Ningún paciente era vegetariano. Sólo 2 pacientes de los 119 (1,6%) tenían el antecedente de cirugía gástrica previa (uno de ellos según la técnica Billroth I y el otro con la técnica Billroth II) (Tabla 58). Manifestaciones no hematológicas n % Comunes/Clásicas Neurológicas 48 40,3 Polineuritis 22 18,4 Esclerosis combinada subaguda 12 10,1 Babinski 10 8,4 Ataxia 4 3,36 Digestivas 3 2,5 Glositis de Hunter 3 2,5 Ictericia 0 - Total 51 42,8 Raras Incontinencia urinaria 5 4,2 Incontinencia fecal 2 1,6 Neurológicas 0 - Síndrome cerebeloso 0 - Total 7 5,8 En estudio Neuropsiquiátricas 89 74,7 Deterioro cognitivo 32 26,8 Síndrome depresivo 25 21 Ictus 17 14,2 Enfermedad de Parkinson 15 12,6 Esclerosis múltiple 0 - 133 Tabla 58. Aproximación etiológica de los pacientes con déficit de Vitamina B12. (n=119) n % Gastritis atrófica no autoinmune 24 20,1 Anemia perniciosa 13 10,9 Ingesta insuficiente 5 4,2 Gastrectomía 2 1,6 Síndrome de Sjögren 1 0,8 Se realizó endoscopia digestiva alta (EDA) a 32 de los 119 pacientes (26,8%), efectuándose biopsia a 28 de ellos (23,5% del total y 87,5% de los pacientes sometidos a endoscopia). Se observó atrofia gástrica no autoinmune en 24 casos (20,1% del total y 75% de endoscopias) y displasia en 5 (4,2% del total y 15,6% de los sometidos a endoscopia), coexistiendo con atrofia en 4 de ellos. La realización de EDA se relacionó con una menor edad (74,2 años vs 78,3; p=0,010), y con menores niveles de Vitamina B12 (133,2 pg/mL vs 156,8 pg/mL; p=0,029), pero no con los valores de hemoglobina (10,8 vs 11,2 g/dL; p=0,49), ni con la presencia de anemia (p=0,8). La realización de biopsia gástrica se relacionó con valores mayores del VCM (97,7 vs 85,3 fL, p=0,001) y con mayores valores de ferritina (276,5 vs 78,9 ng/mL; p=0,024). Los pacientes con atrofia o displasia no mostraron diferencias significativas en los valores de Vitamina B12, hemoglobina, VCM o edad. Presentaron anticuerpos anticélulas parietales 23 pacientes (19,3%) de los 72 en que se realizó estudio de autoinmunidad (31,9%) y anticuerpos anti factor intrínseco en 13 (10,9% del total y 18,1% de los casos evaluados). Se observó la coexistencia de ambos anticuerpos en 7 pacientes. Se realizó serología de H. Pylori (HP) en 109 pacientes, siendo positiva en 46 (42,2%). En ningún paciente de los que se efectuó la biopsia se detectó esta infección. Los pacientes con serología HP positiva mostraron unos valores de Vitamina B12 significativamente superiores (162,4 vs 142,8 pg/mL; p=0,012) y una menor frecuencia de positividad de anticuerpos frente a factor intrínseco y/o células parietales (18,5% vs 47,4%; p=0,017). La prevalencia de serología positiva de HP fue significativamente más frecuente en varones (62,5%) que en mujeres (26,2%), (p< 0,001). 134 No se observó diferencia en los niveles de Hb en función de la presencia o no de esta infección (Hb: 11,4 g/dL vs 10,9 g/dL; p=0,21), ni en la prevalencia de ferropenia en función de la presencia de esta infección. Los 3 pacientes que presentaron déficit de ácido fólico mostraron una serología positiva para HP (p= 0,039). Sólo 27 pacientes (58,7%) recibieron tratamiento erradicador de la infección por H. Pylori. En relación a otras condiciones que pueden favorecer una deficiencia de Vitamina B12, los fármacos relacionados con la malabsorción de la Vitamina B12 fueron el grupo más prevalente. Dentro de éstos, los IBP fueron los fármacos más consumidos (36,1%). El abuso de alcohol fue la segunda situación más frecuente (10 pacientes, 8,4%). Únicamente 2 pacientes padecían pancreatitis crónica (1,6%) (Tabla 59). Tabla 59. Condiciones asociadas al déficit de Vitamina B12. (n=119) n % Fármacos: ● IBP ● Aspirina ● Metformina ● IECAS ● Ranitidina 43 41 28 25 2 36,1 34,4 23,5 21 1,6 Abuso de alcohol 10 8,4 Pancreatitis crónica 2 1,6 Abreviaturas: IBP: Inhibidores de la bomba de protones. IECAs: Inhibidores de la enzima convertidora de Angiotensina. No se observó relación entre el consumo previo de IBP y el déficit de Vitamina B12 (157,6pg/mL vs 147,7 pg/mL; p=0,21). Tampoco se observó diferencia en los valores de Cobalamina en función de que los pacientes estuvieran recibiendo tratamiento con metformina o no (152 pg/ml vs 151 pg/mL; p=0,9). 9.- Polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) Entre los 119 pacientes con déficit de Vitamina B12 se encontraron 52 (47,7%) que presentaron la forma CC, del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR, otros 52 pacientes presentaron la forma CT y 15 pacientes (12,6%) presentaron la forma TT de este gen. Por tanto, de forma global predominaron las formas anómalas de expresión de este polimorfismo en 67 pacientes (60,3%) (Tabla 60). 135 En el grupo control, formado por 117 individuos, predominaron los pacientes con la forma heterocigótica (CT) del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR con 60 pacientes (51,3%) seguidos de 48 pacientes (41%) que presentaban la forma CC de este polimorfismo y solamente 9 pacientes (7,7%) presentaron la forma homocigótica (TT). De forma global, al igual que en los casos con déficit de Vitamina B12, predominaron las formas anómalas (CT+TT) con 69 controles (59%) (Tabla 60. Gráfica 10). Tabla 60. Distribución del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en los pacientes con déficit de Vitamina B12 y en los controles. Polimorfismo C677T del gen de la MTHFR Déficit deVit. B12 n=119 Controles n=117 p 1 TT (Patológico) 15 12,6% 9 7,7% 0,3 2 CT 52 43,7% 60 51,3% 3 CC (Normalidad) 52 43,7% 48 41% 1+2 TT+CT 67 60,3% 69 59% Aunque la forma TT fue más frecuente en los pacientes con déficit de Vitamina B12 (12,6%) que en el grupo control (7,7%), la diferencia no alcanzó la significación estadística (p=0,3). Gráfica 10. Distribución del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10MTHFR en los pacientes con déficit de Vitamina B12 y en los controles. Controles (n=117) Pacientes (n=119) 41% 51,3% 7,7% 136 9.1 Relación entre las distintas formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) con los niveles de Vitamina B12 y homocisteína en plasma Entre los pacientes con déficit de Vitamina B12 cuando se compararon los niveles de Vitamina B12 en función del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR, el valor medio de la Cobalamina fue inferior en los pacientes con la forma CT. Sin embargo, no se observaron diferencias significativas en los valores medios de Cobalamina entre los distintos grupos, ni en el grupo de pacientes (p=0,21), ni en el grupo de controles (p=0,57). En cuanto a los valores de homocisteína, el grupo de pacientes con la forma CT del polimorfismo C677T de la enzima 5,10-MTHFR, mostró los niveles más elevados de Hcy, y valores más bajos de Cobalamina. Sin embargo, la diferencia no alcanzó la significación estadística (p=0,12) (Tabla 61). En los controles se observaron unos niveles de homocisteína en plasma significativamente superiores en el grupo que presentaba la forma TT siendo la diferencia estadísticamente significativa mediante el análisis de la varianza (p= 0,022). Las diferencias se establecieron con el grupo CC (p=0,017) y rozaron la significación con la forma CT (p=0,069) (Tabla 62). Tabla 61. Valores de Vitamina B12 y homocisteína en función del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo de casos (n=119) CC n=52 CT n=52 TT n=15 p Vitamina B12 pg/mL ± Media (DE) 156,7 ± 34,6 143,6 ± 50,2 159,1 ± 32,7 0,21 Homocisteína µmol/L ± Media (DE) 23,8 ± 14,4 37,8 ± 52,1 22,2 ± 9,3 0,12 Tabla 62. Valores de Vitamina B12 y homocisteína en controles en función del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo control (n=117) CC n=48 CT n=60 TT n=9 p Vitamina B12 pg/mL ± Media (DE) 497,1 ± 212,8 470,3 ±181,3 541,6 ± 229,9 0,57 Homocisteína µmol/L ± Media (DE) 11,9 ± 3,7 12,8 ± 3,8 15,8± 4,2 0,002 137 En el gráfico 6 se puede observar el rango de valores de Vitamina B12 en plasma, que osciló entre 120-199,9 pg/mL en los pacientes con la forma TT del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR entre 30-199,9 pg/mL en los pacientes con la forma CT y entre 60-199,9 pg/mL en los pacientes con la forma CC. Gráfico 6. Niveles de Vitamina B12 y polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo de pacientes con déficit de Vitamina B12 (n=119). En el gráfico 7 se puede observar el comportamiento de los valores de la Vitamina B12 en función del polimorfismo del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo control. Gráfico 7. Niveles de Vitamina B12 y formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo de controles sin déficit de Vitamina B12 (n=117). Abreviaturas: Polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR: 1.- TT; 2.- CT y 3.- CC. Nivel de Vit. B12 en Plasma vs Polimorfismos, Base de 119 pacientes con déficit de B12 0 50 100 150 200 0 1 2 3 4 Polimorfismos Nivel de Vit. B12 Plasma Nivel de Vit. B12 en Plasma vs Polimorfismos, Base de Control de 117 pacientes sin déficit de Vit. B12 0 500 1,000 1,500 2,000 2,500 0 1 2 3 4 Polimorfismos Nivel de Vit. B12 Plasma 138 9.2 Relación entre las distintas formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-Metilentetrahidrofolato reductasa (MTHFR) y la presencia de anemia en los pacientes con déficit de Vitamina B12 En relación con el comportamiento del polimorfismo C677T de la enzima 5,10MTHFR y la presencia de anemia en los pacientes con déficit de Vitamina B12, 83 pacientes (69,7%) presentaron anemia. Ésta resultó ser más frecuente en el grupo con la forma TT (80%, 12 pacientes) que en los otros grupos (63 y 73%) pero sin alcanzar la significación estadística (p=0,37) (Tabla 63). Tabla 63. Distribución de las distintas formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR y casos de anemia en el grupo de pacientes con déficit de Vitamina B12 (n=119). CC n=52 CT n=52 TT n=15 p Anemia (83) (%) 33 (63,5%) 38 (73,1%) 12 (80%) 0,37 No anemia (36) (%) 19 (36,5%) 14 (26,9%) 3 (20%) Al agrupar los pacientes con las formas CT y TT, y compararla con los pacientes con la forma CC, los valores de hemoglobina del primer grupo fueron inferiores a los del segundo grupo (10,8 g/dL vs 11,6 g/dL, p=0,052) de forma casi significativa. En consonancia con lo anterior, el porcentaje de pacientes con anemia en el primer grupo, (formas CT ó TT) fue de un 74,6% frente al 63,5% del grupo que presentaba la forma CC, sin alcanzar la significación estadística. Sin embargo, al considerar los pacientes en los que el motivo de ingreso fue la presencia de anemia, si se observó que los pacientes con las formas CT ó TT del polimorfismo C677T de la enzima 5,10-Metilentetrahidrofolatoreductasa (MTHFR) ingresaron con más frecuencia por este motivo de manera significativa (p=0,046; 3,8%, vs 14,9%). (Tabla 64). 139 Tabla 64. Distribución de los pacientes según las formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5-10 MTHFR y según el motivo de ingreso (anemia u otros) (n=119). Motivo de Ingreso Polimorfismo C677 del gen de la enzima 5,10-MTHFR Total n=119 p CC n=52 CT o TT n=67 Anemia (%) 2 (3,8%) 10 (14,9%) 12 (10%) 0,04 Otro motivo (%) 50 (96,2%) 57 (85,1%) 107 (90%) 10.- Relación entre el déficit de Vitamina B12 y la aparición de eventos cardiovasculares, reingresos o éxitus en los pacientes estudiados No se observaron diferencias significativas entre los antecedentes personales, incluyendo enfermedades cardiovasculares o el motivo de ingreso en función de la presencia de los distintas formas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10MTHFR a excepción del motivo de ingreso por anemia, el cual se presentaba con más frecuencia entre los pacientes con las formas CT ó TT, como ya se mencionó anteriormente (p=0,046). Los pacientes con las formas CT o TT no presentaron con mayor frecuencia los diagnósticos o antecedentes de cardiopatía isquémica, accidente cerebrovascular, arteriopatía periférica o trombosis venosa profunda (Tabla 65). Tabla 65. Patologías vasculares y formas genotípicas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5,10-MTHFR en el grupo de pacientes (n=119). Polimorfismo CC n=52 Polimorfismo CT o TT n=67 p Cardiopatía isquémica * 16 (30,8%) 25 (37,3%) 0,46 ACV* 9 (17,3%) 11 (16,4%) 0,89 Arteriopatía* 3 (5,8%) 4 (6,0%) 0,96 TVP* 3 (3,8%) 2 (3,0%) 0,79 *Antecedente o diagnóstico durante el ingreso. ACV: Accidente cerebrovascular. TVP: Trombosis venosa profunda 140 Reingresos Reingresaron 43 pacientes, 19 por causa cardiovascular. De los 43 pacientes que reingresaron, 40 tenían niveles plasmáticos elevados de homocisteína y 3 presentaban niveles normales (p= 0,004) (Tabla 66). Los reingresos por causa cardiovascular no se asociaron con niveles de homocisteína alta (p=0,22) (Tabla 67). Tabla 66. Reingreso por cualquier causa y niveles de homocisteína plasmática (n=106). Hcy <15 µmol/L Hcy >15 µmol/L TOTAL p No reingreso 19 (86,4%) 44 (52,4%) 63 (59,4%) 0,004 Reingreso 3 (13,6%) 40 (47,6%) 43 (40,6%) TOTAL 22 (20,7%) 84 (79,2%) 106 Tabla 67. Reingreso por causa cardiovascular y niveles de homocisteína plasmática (n=106). Hcy <15 µmol/L Hcy >15 µmol/L TOTAL p No reingreso 20 (90,9%) 67 (79,8%) 87 (82,1%) 0,22 Reingreso 2 (9,1%) 17 (20,2%) 19 (17,9%) TOTAL 22 (20,7%) 84 (79,2%) 106 (100%) Los reingresos por causa cardiovascular tampoco se asociaron con las formas genotípicas CC frente a las formas anómalas CT+TT ni con la forma TT (p=0,36 y p=0,32) (Tabla 68 y 69). Tabla 68. Reingreso por causa cardiovascular y formas genotípicas del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5-10 MTHFR (n=119). Tabla 69. Reingreso por causa cardiovascular y forma TT del polimorfismo C677T del gen de la enzima 5-10 MTHFR (n=119). No reingreso CV Reingreso TOTAL p No TT 83 (86,5%) 21 (91,3%) 104 (87,4%) 0,32 TT 13 (13,5%) 2 (8,7%) 15 (12,6%) TOTAL 96 (80,7%) 23 (19,3%) 119 (100%) No reingreso CV Reingreso TOTAL p CC 40 (41,7%) 12 (52,2%) 52 (43,7%) 0,36 CT+TT 56 (58,3%) 11 (47,8%) 67 (56,3%) TOTAL 96 (80,7%) 23 (19,3%) 119 (100%) 141 11.- Exitus durante el ingreso y en el seguimiento Durante su estancia hospitalaria sólo fallecieron dos pacientes (1,7%). Ambos pacientes presentaban la forma CC del polimorfismo C677T del gen de la enzima MTHFR. En los cuatro años de seguimiento (2006-2010) se documentaron 34 fallecimientos (28,6%). Los valores de Vitamina B12 en plasma fueron similares en ambos grupos (fallecidos y no fallecidos) sin obtenerse la significación estadística (153,3 pg/mL vs 150,5 pg/mL; p=0,74) (Tabla 70 y Gráfica 11). Las cifras de homocisteína en plasma fueron mayores en el grupo de pacientes fallecidos, sin ser la diferencia significativa (p=0,58) (Tabla 73). Tabla 70. Niveles medios de Vitamina B12 y homocisteína y muertos vs vivos. (n=119) Muertos n=34 Vivos n=85 p Vitamina B12 (pg/mL) Media ± DE 153,3 ± 40,3 150,5 ± 43 0,74 Homocisteína (µg/L) Media ± DE 32,5 ± 24,8 28,4 ± 24 0,58 Gráfica 11. Niveles medios de Vitamina B12 y homocisteína y muertos vs vivos. (n=119) 244 Meier M, Janosik M, Kery V, Kraus JP, Burkhard P. Structure of human cystathionine beta-synthase: a unique pyridoxal 5'-phosphate-dependent heme protein. EMBO J 2001; 20 (15): 3910-6. Memişoğullari R, Yildirim HA, Uçgun T, Erkan ME, Güneş C, Erbaş M. et al. Prevalence and etiology of anemias in the adult Turkish population. Turk J Med Sci 2012; 42 (6): 957-963. Mendoza Bermúdez C, de la Espriella Pérdomo M. Manifestaciones neuropsiquiátricas del déficit de vitamina B12. Rev Colomb Psiquiat 2008; 37 (1): 129-139. Merryweather-Clarke AT, Shearman JD, Robson KJ, Pointon JJ, Liu YT, Bomford A. et al. Hemochromatosis-related mutation detection. Blood 1998; 91 (7): 2620-1. 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FI: Factor intrínseco. GGT: Enzima gamma-glutamil transpeptidasa. GPX: Enzima glutation peroxidasa. H: Hombres. H+: Hidrógeno. Hb: Hemoglobina. HCl: Acido clorhídrico. Hcy: Homocisteína. HDA: hemorragia digestiva alta. HDL: Lipoproteínas de alta densidad. Hhcy: Hiperhomcisteinemia. HP: Helycobacter Pylori. HSP-70: del inglés, heat shock proteins. HTA: Hipertensión arterial. HoloTC: Holotranscobalamina. Hto: Hematocrito. I: Institucionalizados. IAM: Infarto agudo de miocardio. IBP: Inhibidores de la bomba de protones. ICC: Insuficiencia cardiaca congestiva. IECA: Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina. IL: Interleucina. IST: Indice de saturación de la transferrina. 277 ITU: Infección del tracto urinario. K+: Potasio. M: mujeres. MAT: Enzima Metionina adenosiltransferasa. MCP-1: del inglés, monocyte chemoattractant protein-1. MS: Metionin Sintasa. NHANES: del inglés, National Health and Nutrition Examination Survey. NF-kappa B: del inglés, nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells. NS: No significación estadística. LDH: Lactado deshidrogenasa. LDL: Lipoproteínas de baja densidad. LM: Lesionados medulares. OH-Cbl: Hidroxi-Cobalamina. O: Omnívoros. OR: Odds ratio. P: Proteínas animales. P: Pacientes. PCR: Reacción en cadena de la polimerasa. Pctes NRL: Pacientes con patologías neurológicas. PN: Polineuropatía. PPAR α: Receptores activados de proliferación de los peroxisomas tipo α. R: Proteína R. RR: Riesgo relativo. RTI: Reconstrucción del tránsito intestinal. SAM: Enzima Adenosil Metionina. SALSA: Sacramento Area Latino Study on Aging. Sdr: Síndrome. SCA: Síndrome coronario agudo. sICAM-1: Moléculas de adhesión intercelular solubles. SNP: del inglés, simple nucleotide polymorphism SMA: Síndrome de malabsorción alimentaria. T: Timina. T4L: Tiroxina libre. TC: Transcobalamina. 278 THF: Tetrahidrofolato. TI: Tiroiditis de Hashimoto. TNF: Factor de necrosis tumoral. TSH: Hormona tiroestimulante. TT: Forma genotípica anómala del polimorfismo del gen de la enzima Metilen tetrahidrofolato reductasa (MTHFR). TVP: Trombosis venosa profunda. TX: Tromboxano. UCI: Urticaria crónica idiopática. V: Vegetarianos. VCAM: del inglés, vascular cell adhesion molecule 1. VCM: Volumen corpuscular medio. VHC: Virus de la hepatitis C. VIH: Virus de la inmunodeficiencia humana. vWF: del inglés, von Willebrand factor. Vx: Veganos estrictos. 279 280